CN111154654A - 一种弓形虫双基因缺失虫株及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种弓形虫双基因缺失虫株的构建方法及其在作为弱毒疫苗中的应用。该弓形虫双基因缺失虫株是在弓形虫RHΔKu80虫株的基础上，利用CRISPR/Cas9基因敲除技术，同时敲除弓形虫虫株中的DNA损伤诱导蛋白1基因(ddi1)和紫外剪切修复蛋白23基因(rad23)两个基因，获得ΔΔddi1rad23双基因缺失虫株。通过实验证明：ΔΔddi1rad23双基因缺失虫株的生长繁殖能力和毒力明显降低，使用该虫株免疫小鼠后再次攻击强毒株能够对小鼠提供较好的保护，可有效抵抗弓形虫再次感染。本发明的弓形虫双基因缺失虫株有作为弓形虫弱毒活疫苗的潜力，为进一步研制弓形虫弱毒疫苗奠定基础。

Description

一种弓形虫双基因缺失虫株及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种弓形虫双基因缺失虫株及其构建方法与应用，特别涉及泛素-蛋白酶体系统中的两个穿梭蛋白基因缺失的弓形虫虫株及其构建方法与在作为弓形虫弱毒疫苗中的应用。
背景技术
龚地弓形虫(Toxoplasma gondii，简称弓形虫)是一种专性细胞内寄生原虫，隶属于顶复亚门，几乎感染所有的温血动物和人，是一种危害严重的人兽共患病原。弓形虫感染广泛，危害宿主的形式多样，对不同宿主、不同生长或生理阶段的危害程度也有很大差异。在宿主免疫力正常的情况下，大多为隐性感染；婴儿、免疫抑制患者感染弓形虫可能导致严重或致命的疾病，弓形虫感染还是导致妊娠动物和孕妇发生流产、死胎及其他繁殖生殖障碍的重要原因，在我国常有仔猪急性弓形虫病的报道。
目前，弓形虫病的防治手段主要是磺胺类药物用于急性弓形虫病的治疗，但并不能彻底治愈弓形虫病。上个世纪九十年代，在欧洲有一种弱毒疫苗应用于预防绵羊弓形虫病引起的流产，但因为效果及其公共卫生问题，未能够广泛应用；迄今未见其它商品化疫苗应用于人和动物的弓形虫病预防。因此，研发弓形虫病疫苗具有重要应用价值。
DNA损伤诱导蛋白1(ddi1)和紫外剪切修复蛋白23(rad23)都属于UBL-UBA穿梭蛋白家族，该家族蛋白是泛素-蛋白系统的重要组成成分，主要功能是识别和转运泛素化蛋白到蛋白酶体进行降解，这对于维持细胞内蛋白质及氨基酸的稳态具有重要作用，除此之外，还参与DNA损伤修复、细胞周期调控等生命过程，但迄今尚无其在弓形虫中的研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种弓形虫双基因缺失虫株及其构建方法与在作为弓形虫弱毒疫苗中的应用。
为了实现上述目的，本发明首先提供了一种弓形虫双基因缺失虫株的构建方法。
本发明提供的弓形虫双基因缺失虫株的构建方法包括如下步骤：抑制或沉默弓形虫虫株中的DNA损伤诱导蛋白1基因和紫外剪切修复蛋白23基因的表达，得到所述弓形虫双基因缺失虫株；
所述DNA损伤诱导蛋白1基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示；
所述紫外剪切修复蛋白23基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。
上述方法中，所述抑制或沉默弓形虫虫株中的DNA损伤诱导蛋白1基因和紫外剪切修复蛋白23基因的表达为敲除弓形虫虫株中的DNA损伤诱导蛋白1基因和紫外剪切修复蛋白23基因。
进一步的，所述敲除弓形虫虫株中的DNA损伤诱导蛋白1基因和紫外剪切修复蛋白23基因为将所述弓形虫虫株中的DNA损伤诱导蛋白1基因和紫外剪切修复蛋白23基因均替换为抗性基因。
更进一步的，所述将弓形虫虫株中的DNA损伤诱导蛋白1基因和紫外剪切修复蛋白23基因均替换为抗性基因的方法为基于CRISPR/Cas9介导的同源重组技术。所述方法包括如下步骤：
1)将含有抗性基因甲的同源重组片段和靶向DNA损伤诱导蛋白1基因的CAS9质粒导入弓形虫虫株中，使所述弓形虫虫株中的DNA损伤诱导蛋白1基因替换为抗性基因甲，经过筛选和鉴定，得到缺失DNA损伤诱导蛋白1基因的弓形虫虫株；
所述含有抗性基因甲的同源重组片段依次包括DNA损伤诱导蛋白1基因上游同源臂、抗性基因甲和DNA损伤诱导蛋白1基因下游同源臂；
2)将含有抗性基因乙的同源重组片段和靶向紫外剪切修复蛋白23基因的CAS9质粒导入所述缺失DNA损伤诱导蛋白1基因的弓形虫虫株中，使所述缺失DNA损伤诱导蛋白1基因的弓形虫虫株中的紫外剪切修复蛋白23基因替换为抗性基因乙，经过筛选和鉴定，得到缺失DNA损伤诱导蛋白1基因和紫外剪切修复蛋白23基因的弓形虫虫株；
所述含有抗性基因乙的同源重组片段依次包括紫外剪切修复蛋白23基因上游同源臂、抗性基因乙和紫外剪切修复蛋白23基因下游同源臂。
所述1)中，所述抗性基因甲具体可为氯霉素抗性基因。
所述含有抗性基因甲的同源重组片段的核苷酸序列具体如序列表中序列3所示；其中第1-1030位核苷酸序列为DNA损伤诱导蛋白1基因上游同源臂序列(5’同源臂序列)、第1031-3216位核苷酸序列为氯霉素抗性基因序列、第3217-4215位核苷酸序列为DNA损伤诱导蛋白1基因下游同源臂序列(3’同源臂序列)。
所述靶向DNA损伤诱导蛋白1基因的CAS9质粒具体为pSAG1-CAS9-U6gRNA(ddi1)。所述pSAG1-CAS9-U6gRNA(ddi1)质粒为将pSAG1-CAS9-U6gRNA(UPRT)质粒中靶向UPRT基因的sgRNA序列替换为靶向ddi1基因的sgRNA序列后得到的质粒。
所述2)中，所述抗性基因乙具体可为乙胺嘧啶抗性基因；
所述含有抗性基因乙的同源重组片段的核苷酸序列具体如序列表中序列4所示；其中第1-1009位核苷酸序列为紫外剪切修复蛋白23基因上游同源臂(5’同源臂序列)、第1010-4057位核苷酸序列为乙胺嘧啶抗性基因、第4058-5062位核苷酸序列为紫外剪切修复蛋白23基因下游同源臂(3’同源臂序列)。
所述靶向紫外剪切修复蛋白23基因的CAS9质粒具体为pSAG1-CAS9-U6gRNA(rad23)。所述pSAG1-CAS9-U6gRNA(rad23)质粒为将pSAG1-CAS9-U6gRNA(UPRT)质粒中靶向UPRT基因的sgRNA序列替换为靶向rad23基因的sgRNA序列后得到的质粒。
上述方法中，所述1)中，所述筛选所使用的培养基为含有20μM氯霉素的药筛培养基。
所述鉴定所使用的引物由鉴定5’同源重组引物(F：GTGTGTGTCACCTGTCCTAT和R：TGATTTTTTTCTCATGCATT)、鉴定3’同源重组引物(F：GGACATCACCAACCACAACGA和R：CAAGCGCCATACGCAAAAGCT)和特异扩增ddi1基因引物(F：GTGAGGATCGCTTGGTTTCGTAT和R：TCCCTTCTCGTCATCTCTCTGGT)组成。
所述2)中，所述筛选所使用的培养基为含有1μM乙胺嘧啶的药筛培养基。
所述鉴定所使用的引物由鉴定5’同源重组引物(F：TGAGGAAAGCTCACAGCCTC和R：GGTGTCGTGGATTTACCAGTC)、鉴定3’同源重组引物(F：CTCAACAAGGAACGCATCAAG和R：TGTAGAGAACTCATGCTACCG)和特异扩增rad23基因引物(F：AGGACAGCACGACCAAAATAGC和R：TGAAGACAAAGGGAGGAAGCCA)组成。
上述方法中，所述弓形虫虫株为具有DNA损伤诱导蛋白1基因和紫外剪切修复蛋白23基因的弓形虫虫株，包括Ⅰ型弓形虫虫株、Ⅱ型弓形虫虫株、Ⅲ型弓形虫虫株。进一步的，所述弓形虫虫株为Ⅰ型弓形虫虫株。更进一步的，所述Ⅰ型弓形虫虫株为弓形虫RH虫株或弓形虫RHΔKu80虫株。
按照上述方法构建得到的弓形虫双基因缺失虫株也属于本发明的保护范围。
为了实现上述目的，本发明又提供了如下a1)-a4)中任一所述的应用：
a1)按照上述方法构建得到的弓形虫双基因缺失虫株在作为弓形虫疫苗或弓形虫弱毒疫苗或弓形虫弱毒活疫苗中的应用；
a2)按照上述方法构建得到的弓形虫双基因缺失虫株在制备弓形虫疫苗或弓形虫弱毒疫苗或弓形虫弱毒活疫苗中的应用；
a3)按照上述方法构建得到的弓形虫双基因缺失虫株在制备预防和/或抵抗弓形虫感染的产品中的应用；
a4)按照上述方法构建得到的弓形虫双基因缺失虫株在制备预防和/或治疗弓形虫病的产品中的应用。
为了实现上述目的，本发明最后还提供了如下b1)-b5)中任一种产品。
b1)弓形虫疫苗；
b2)弓形虫弱毒疫苗；
b3)弓形虫弱毒活疫苗；
b4)预防和/或抵抗弓形虫感染的产品；
b5)预防和/或治疗弓形虫病的产品。
本发明提供的产品的活性成分为按照上述方法构建得到的弓形虫双基因缺失虫株。
本发明提供了一种利用CRISPR/Cas9技术构建弓形虫双基因缺失虫株的方法，该虫株的特点是以弓形虫RHΔKu80虫株为母源虫株，敲除其功能蛋白基因ddi1和rad23，获得一株毒力显著减弱的双基因缺失虫株(ΔΔddi1rad23)。使用该虫株免疫小鼠后再次攻击强毒株能够对小鼠提供较好的保护，说明经该虫株免疫的动物能有效抵抗弓形虫的再次感染。本发明的双基因缺失虫株(ΔΔddi1rad23)有作为弓形虫弱毒活疫苗的潜力，为进一步研制弓形虫弱毒疫苗奠定基础。
附图说明
图1为pTCR-ddi1-CD质粒图谱和pSAG1-CAS9-U6gRNA(ddi1)质粒图谱。
图2为CRISPR/Cas9介导的ddi1基因敲除示意图。
图3为Δddi1虫株的PCR鉴定。
图4为pDHFR-rad23质粒图谱和pSAG1-CAS9-U6gRNA(rad23)质粒图谱。
图5为CRISPR/Cas9介导的在Δddi1虫株上敲除rad23基因的示意图。
图6为ΔΔddi1rad23虫株的PCR鉴定。
图7为ΔΔddi1rad23虫株的噬斑实验和小鼠毒力试验。
图8为ΔΔddi1rad23虫株对小鼠的免疫保护实验。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
下述实施例中的弓形虫RHΔKu80虫株是具有DNA损伤诱导蛋白1基因(ddi1)和紫外剪切修复蛋白23基因(rad23)的Ⅰ型弓形虫虫株，可在HFF细胞上连续传代。弓形虫RHΔKu80虫株记载于文献“Li M,Wang H,Liu J,et al.The apoptotic role of metacaspasein Toxoplasma gondii[J].Frontiers in microbiology,2016,6:1560.”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的pSAG1-CAS9-U6gRNA(UPRT)质粒记载于文献“Shen B,Brown K M,Lee T D,et al.Efficient gene disruption in diverse strains of Toxoplasmagondii using CRISPR/CAS9[J].MBio,2014,5(3):e01114-14.”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的pTCR-CD质粒和pDMG质粒(含有DHFR药物筛选框)记载于文献“LiM,Wang H,Liu J,et al.The apoptotic role of metacaspase in Toxoplasma gondii[J].Frontiers in microbiology,2016,6:1560.”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、弓形虫ΔΔddi1rad23虫株的构建方法
1、pSAG1-CAS9-U6gRNA(ddi1)质粒的构建
1)利用E-CRISP(http://www.e-crisp.org/E-CRISP/)设计特异性靶向ddi1基因的sgRNA序列，具体如下：GGATCCACAGGTGGACGACG。
2)以pSAG1-CAS9-U6gRNA(UPRT)为模板，分别采用1号片段引物、2号片段引物和3号片段引物进行PCR扩增(在片段2上游引物以及片段3下游引物加入靶向ddi1基因的sgRNA)，分别扩增得到片段1、片段2和片段3。引物序列如下：
1号片段引物(5’→3’)：
F：TCACTATAGGGCGAATTGGGTACC；
R：CGCGCACTTTGTCTCGTCGC。
2号片段引物(5’→3’)：
F：GGATCCACAGGTGGACGACGGTTTTAGAGCTAGAAATAG；
R：CAATTCGCCCTATAGTGAGTCG。
3号片段引物(5’→3’)：
F：GACGAGACAAAGTGCGCGAG；
R：CGTCGTCCACCTGTGGATCCAACTTGACATCCCCATTTA。
3)PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切取目的条带进行胶回收，并采用多片段无缝连接试剂盒(pEASY-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit，TRANSGEN)将回收得到的DNA片段进行多片段无缝连接，50℃连接30min，得到连接产物。连接产物转化DH5α感受态细胞，轻柔混匀，冰水浴30min，42℃热击60s，冰水浴3min，随后加入600μL LB液体培养基，37℃摇床(200rpm)培养1h，将菌液涂于氨苄(Amp)抗性的LB固体培养基上，37℃培养12-16h，挑取单菌落进行PCR及测序鉴定，鉴定正确的菌液扩大培养后，采用质粒提取试剂盒(Hipure Plasmid MaxiPrep Kit质粒提取试剂盒，TRANSGEN)提取目的质粒pSAG1-CAS9-U6gRNA(ddi1)(图1)，测定浓度备用。
pSAG1-CAS9-U6gRNA(ddi1)质粒为将pSAG1-CAS9-U6gRNA(UPRT)质粒中靶向UPRT基因的sgRNA序列替换为靶向ddi1基因的sgRNA序列后得到的质粒。
2、pTCR-ddi1-CD质粒的构建
1)从ToxoDB数据库获得ddi1基因的上下游同源臂序列。
2)以弓形虫RHΔKu80虫株的基因组DNA为模板，分别采用5’同源臂引物和3’同源臂引物进行PCR扩增，分别扩增得到5’同源臂和3’同源臂。以pTCR-CD质粒为模板，采用CAT-RFP药物筛选框引物进行PCR扩增，扩增得到CAT-RFP药物筛选框。以pTCR-CD质粒为模板，采用pTCR-CD载体骨架引物进行PCR扩增，扩增得到pTCR-CD载体骨架。引物序列如下：
5’同源臂引物(5’→3’)：
F：TAGGGCGAATTGGGTACCAACAAGACGTTTACAGGACAG；
R：CTTGGAGAACGCCGCGACGAAATTTCTCA；
3’同源臂引物(5’→3’)：
F：GGATCCACTAGAGATATCGTACGCCAGTGTCACTGGAAA；
R：AAGAGAGCTTTCTGTCACTGAGACGG；
CAT-RFP药物筛选框引物(5’→3’)：
F：GTCGCGGCGTTCTCCAAGAAGCTTGATATGCATGTCCGC；
R：GATATCTCTAGTGGATCCCCCTC；
pTCR-CD载体骨架引物(5’→3’)：
F：GTGACAGAAAGCTCTCTTACTAGTATGCATGTCCCGCGT；
R：GGTACCCAATTCGCCCTATAGTGA。
3)PCR产物胶回收后，使用多片段无缝连接试剂盒将三个片段(5’同源臂、3’同源臂和CAT-RFP药物筛选框)连入pTCR-CD载体骨架，50℃连接30min，得到连接产物。连接产物转化感受态细胞，操作同上，获得pTCR-ddi1-CD质粒(图1)。
4)以pTCR-ddi1-CD质粒为模板，采用5’同源臂上游引物和3’同源臂下游引物大量扩增用于同源重组的DNA片段，并将PCR产物加入1mL 100％无水乙醇(提前在-20℃预冷)，14000×g、4℃离心12min，弃上清，1mL 75％乙醇(提前在-20℃中预冷)洗涤2次，14000×g、4℃离心5min，最后用电转缓冲液溶解，得到同源模板，其核苷酸序列如序列表中序列3所示，其中第1-1030位核苷酸序列为5’同源臂序列、第1031-3216位核苷酸序列为CAT-RFP药物筛选框序列、第3217-4215位核苷酸序列为3’同源臂序列。
3、ddi1基因敲除虫株(Δddi1)的构建
1)收取从HFF细胞中新释放的RHΔKu80速殖子，经5μm聚碳酸树脂滤器过滤后，1000×g离心6min，弃上清，得到纯化的速殖子。将750μL Cytomix电转缓冲液与步骤1获得的pSAG1-CAS9-U6gRNA(ddi1)质粒和步骤2最终醇沉得到的同源模板混匀，同时加入纯化后的速殖子，混匀后，转移到无菌的电击杯中，在电压2050V、电容25F和电阻∞条件下电击转染，静置5min，转移到HFF细胞中培养。37℃培养24h后使用含有20μM氯霉素的药筛培养基(DMEM培养基+2％胎牛血清+20μM氯霉素)继续传代培养。
2)收集经药物筛选获得药物抗性的速殖子，提取基因组DNA，PCR鉴定是否正确重组，鉴定引物如下：
鉴定5’同源重组引物(5’→3’)：
F：GTGTGTGTCACCTGTCCTAT；
R：TGATTTTTTTCTCATGCATT；
鉴定3’同源重组引物(5’→3’)：
F：GGACATCACCAACCACAACGA；
R：CAAGCGCCATACGCAAAAGCT。
3)PCR鉴定正确重组后，通过有限稀释法进行单克隆虫株的筛选，具体方法如下：收集新鲜释放的速殖子并计数，取100个速殖子接种提前铺满HFF细胞(美国ATCC，编号为
Figure BDA0002388692800000071
SCRC-1041TM)的96孔板，有限稀释法连续稀释六个梯度，37℃培养箱培养7天，挑选孔中只有1个噬斑的速殖子接种到铺好HFF细胞的24孔板。待虫子释放，取1/3提取基因组进行重组和单克隆鉴定。重组鉴定引物同步骤2)，单克隆鉴定引物序列如下：
特异扩增ddi1基因引物(5’→3’)：
F：GTGAGGATCGCTTGGTTTCGTAT；
R：TCCCTTCTCGTCATCTCTCTGGT。
基因敲除示意图如图2所示：PCR1(鉴定5’同源重组引物)用于鉴定ddi1的5’同源臂是否成功重组到弓形虫基因组中，PCR2(鉴定3’同源重组引物)用于鉴定ddi1的3’同源臂是否成功重组到弓形虫基因组中，PCR3(特异扩增ddi1基因引物)用于鉴定弓形虫基因组中是否还有ddi1基因。若RHΔKU80的PCR1和PCR2无特异扩增条带，PCR3有特异扩增条带，敲除株正好相反，则说明ddi1被成功敲除。
经上述筛选和鉴定，得到弓形虫Δddi1虫株。弓形虫Δddi1虫株的鉴定结果如图3所示。从图中可以看出：弓形虫RHΔKU80虫株(WT)的PCR1和PCR2无特异扩增条带，PCR3有特异扩增条带(大小为731bp)，而弓形虫Δddi1虫株的PCR1和PCR2有特异扩增条带(大小为1718bp和1515bp)，PCR3无特异扩增条带。将鉴定成功的单克隆接种T25培养瓶扩大培养，再次鉴定无误后及时冻存保种。
4、pSAG1-CAS9-U6gRNA(rad23)质粒的构建
1)利用E-CRISP(http://www.e-crisp.org/E-CRISP/)设计特异性靶向rad23基因的sgRNA序列，具体如下：GTCCTTGATCTTCTGTGCGT。
2)以pSAG1-CAS9-U6gRNA(UPRT)为模板，分别采用1号片段引物、2号片段引物和3号片段引物进行PCR扩增(在片段2上游引物以及片段3下游引物加入靶向rad23基因的sgRNA)，分别得到1号片段、2号片段和3号片段。引物序列如下：
1号片段引物(5’→3’)：
F：TCACTATAGGGCGAATTGGGTACC；
R：CGCGCACTTTGTCTCGTCGC；
2号片段引物(5’→3’)：
F：GTCCTTGATCTTCTGTGCGTGTTTTAGAGCTAGAAATAG；
R：CAATTCGCCCTATAGTGAGTCG；
3号片段引物(5’→3’)：
F：GACGAGACAAAGTGCGCGAG；
R：ACGCACAGAAGATCAAGGACAACTTGACATCCCCATTTA。
3)PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切取目的条带进行胶回收，并采用多片段无缝连接试剂盒(pEASY-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit，TRANSGEN)将回收得到的DNA片段进行多片段无缝连接，50℃连接30min，得到连接产物。连接产物转化DH5α感受态细胞，轻柔混匀，冰水浴30min，42℃热击60s，冰水浴3min，随后加入600μL LB液体培养基，37℃摇床(200rpm)培养1h，将菌液涂于氨苄(Amp)抗性的LB固体培养基上，37℃培养12-16h，挑取单菌落进行PCR及测序鉴定，鉴定正确的菌液扩大培养后，采用质粒提取试剂盒(Hipure Plasmid MaxiPrep Kit质粒提取试剂盒，TRANSGEN)提取目的质粒pSAG1-CAS9-U6gRNA(rad23)(图4)，测定浓度备用。
pSAG1-CAS9-U6gRNA(rad23)质粒为将pSAG1-CAS9-U6gRNA(UPRT)质粒中靶向UPRT基因的sgRNA序列替换为靶向rad23基因的sgRNA序列后得到的质粒。
5、pDHFR-rad23质粒构建
1)从ToxoDB数据库获得rad23基因的上下游同源臂序列。
2)以弓形虫RHΔKu80虫株的基因组DNA为模板，分别采用5’同源臂引物和3’同源臂引物进行PCR扩增，分别扩增得到5’同源臂和3’同源臂。以pDMG质粒(含有DHFR药物筛选框)为模板，采用DHFR药物筛选框引物进行PCR扩增，扩增得到DHFR药物筛选框。以pTCR-CD质粒为模板，采用pTCR-CD载体骨架引物进行PCR扩增，扩增得到pTCR-CD载体骨架。引物序列如下：
5’同源臂引物(5’→3’)：
F：TAGGGCGAATTGGGTACCGTCCTCATCTTCTCTTAACTT；
R：TGTCGCTCGCTGCCTCTCTGTAGA；
3’同源臂引物(5’→3’)：
F：GGGGATCGATCCACTAGTTCGCCTCCGTCGCGTCAGTCT；
R：TCTCCGACGGCACCGTGTGTCT；
DHFR药物筛选框引物(5’→3’)：
F：GAGAGGCAGCGAGCGACACTAGCATGTCATTCGATTTT；
R：ACTAGTGGATCGATCCCC；
pTCR-CD载体骨架引物(5’→3’)：
F：ACACGGTGCCGTCGGAGAACTAGTATGCATGTCCCGCGT；
R：GGTACCCAATTCGCCCTATAGTGA。
3)PCR产物胶回收后，使用多片段无缝连接试剂盒将三个片段(5’同源臂、3’同源臂和DHFR药物筛选框)连入pTCR-CD载体骨架，50℃连接30min，得到连接产物。连接产物转化感受态细胞，操作同上，获得pDHFR-rad23质粒(见图4)。
4)以pDHFR-rad23质粒为模板，采用5’同源臂上游引物和3’同源臂下游引物大量扩增用于同源重组的DNA片段，并将PCR产物加入1mL 100％无水乙醇(提前在-20℃预冷)，14000×g、4℃离心12min，弃上清，1mL 75％乙醇(提前在-20℃中预冷)洗涤2次，14000×g、4℃离心5min，最后用电转缓冲液溶解，得到同源模板，其核苷酸序列如序列表中序列4所示，其中第1-1009位核苷酸序列为5’同源臂序列、第1010-4057位核苷酸序列为DHFR药物筛选框序列、第4058-5062位核苷酸序列为3’同源臂序列。
6、弓形虫ddi1、rad23双基因缺失虫株(ΔΔddi1rad23)的构建
收取步骤3中获得的弓形虫Δddi1虫株新释放的速殖子，经5μm聚碳酸树脂滤器过滤后，1000×g离心6min，弃上清，得到纯化的速殖子。将750μL Cytomix电转缓冲液与步骤4获得的pSAG1-CAS9-U6gRNA(rad23)质粒和步骤5最终醇沉得到的同源模板混匀，同时加入纯化后的Δddi1速殖子，混匀后电转染(同步骤3)。37℃培养24h后使用含有1μM乙胺嘧啶的药筛培养基(DMEM培养基+2％胎牛血清+1μM乙胺嘧啶)继续传代培养。
按照步骤3中的方法进行筛选和鉴定，得到弓形虫ddi1、rad23双基因缺失虫株(ΔΔddi1rad23)。基因敲除示意图如图5所示。引物序列如下：
鉴定5’同源重组引物(5’→3’)：
F：TGAGGAAAGCTCACAGCCTC；
R：GGTGTCGTGGATTTACCAGTC；
鉴定3’同源重组引物(5’→3’)：
F：CTCAACAAGGAACGCATCAAG；
R：TGTAGAGAACTCATGCTACCG；
特异扩增rad23基因引物(5’→3’)：
F：AGGACAGCACGACCAAAATAGC；
R：TGAAGACAAAGGGAGGAAGCCA。
弓形虫ΔΔddi1rad23虫株的鉴定结果如图6所示。从图中可以看出：弓形虫Δddi1虫株的PCR1和PCR2无特异扩增条带，PCR3有特异扩增条带(大小为926bp)，而弓形虫ΔΔddi1rad23虫株的PCR1和PCR2有特异扩增条带(大小为1307bp和1629bp)，PCR3无特异扩增条带。
弓形虫ΔΔddi1rad23虫株为将弓形虫RHΔKu80虫株中的ddi1基因替换为序列3第1031-3216位所示的DNA分子(CAT-RFP药物筛选框)，且将rad23基因替换为序列4第1010-4057位所示的DNA分子(DHFR药物筛选框)后得到的弓形虫虫株。
实施例2、弓形虫ΔΔddi1rad23虫株的增殖能力和毒力测定
一、弓形虫ΔΔddi1rad23虫株的增殖能力测定
通过噬斑实验综合评定弓形虫的入侵、增殖和释放能力。具体步骤如下：收集新释放的弓形虫ΔΔddi1rad23和RHΔKu80虫株的速殖子，计数后分别将500个弓形虫ΔΔddi1rad23虫株释放的速殖子和500个弓形虫RHΔKu80虫株释放的速殖子接种到铺满HFF细胞的6孔板中，培养7天，4％多聚甲醛室温固定10min，结晶紫染色20min，PBS洗涤，观察噬斑面积大小。
结果显示：弓形虫ΔΔddi1rad23虫株形成的噬斑面积较RHΔKu80虫株显著减小(图7)，表明缺失ddi1和rad23后，弓形虫虫株的生长繁殖能力受到显著抑制。
二、弓形虫ΔΔddi1rad23虫株的毒力测定
将弓形虫虫株接种小鼠，每组5只小鼠，根据弓形虫虫株的不同，分为如下两组：
ΔΔddi1rad23：将弓形虫ΔΔddi1rad23虫株新释放的速殖子腹腔接种6周龄雌性BALB/c小鼠，每只小鼠接种1×102个。
RHΔKu80：将弓形虫RHΔKu80虫株新释放的速殖子腹腔接种6周龄雌性BALB/c小鼠，每只小鼠接种1×102个。
接种后逐日观察各组小鼠临床症状并记录其存活情况，30天后统计各组小鼠存活率。
结果显示：接种弓形虫ΔΔddi1rad23虫株的小鼠30天内没有死亡，存活率为100％，而接种弓形虫RHΔKu80虫株的小鼠存活率为0(图7)。表明缺失ddi1和rad23后，弓形虫虫株的毒力明显下降。
实施例3、弓形虫ΔΔddi1rad23虫株对小鼠具有良好的免疫保护效果
一、实验方法
ΔΔddi1rad23免疫组：以含有弓形虫ΔΔddi1rad23虫株速殖子的PBS溶液(PBS溶液购自北京索莱宝科技有限公司，pH为7.4)腹腔接种(接种方式为注射)5只6周龄雌性BALB/c小鼠，每只小鼠接种1×102个；30天后每只小鼠再次以含有弓形虫RHΔKu80虫株速殖子的PBS溶液进行腹腔接种，每只小鼠接种1×104个。
RHΔKu80对照组：以含有弓形虫RHΔKu80虫株速殖子的PBS溶液腹腔接种(接种方式为注射)5只6周龄雌性BALB/c小鼠，每只小鼠接种1×102个。
PBS对照组：以等体积PBS溶液腹腔接种(接种方式为注射)5只6周龄雌性BALB/c小鼠；30天后每只小鼠以含有弓形虫RHΔKu80虫株速殖子的PBS溶液进行腹腔接种，每只小鼠接种1×104个。
接种后观察临床症状及记录死亡时间和死亡率。
二、实验结果
BALB/c小鼠腹腔接种弓形虫ΔΔddi1rad23虫株、弓形虫RHΔKu80虫株和PBS溶液后发现：RHΔKu80对照组小鼠在8天内全部死亡，其它两组小鼠全部存活。
30天后对ΔΔddi1rad23免疫组和PBS对照组的小鼠再次接种弓形虫RHΔKu80虫株后发现：PBS注射组小鼠在7天内全部死亡，经弓形虫ΔΔddi1rad23虫株免疫过的小鼠在30天内全部存活(图8)。说明免疫过弓形虫ΔΔddi1rad23虫株的小鼠获得了抵抗Ⅰ型强毒株感染的能力，具有成为弓形虫弱毒疫苗的潜力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>中国农业大学
<120>一种弓形虫双基因缺失虫株及其构建方法与应用
<160>4
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>1584
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>1
atgcagatct ccattgcaga cgacgattcg ggcgtcgtct tttctctgga agtcagcgcg 60
gggacaaccg tcgacgcgct gaaggcgctc atcgaagcgg agacgcgcat tcctcccaac 120
gagcagcaac tcctcgtgga catgcagccg ataagcagag atgctgcgac cgtgggcgcc 180
gccggcattc cagacgggag tatgattctc gttcgacgtc tcccggaggc gcctgttcct 240
gcgcttgctg cgtctccgcc cagcgtgggc tccacggacg cggtcgcgcc tcctgtctct 300
ggagcgagcg gacggagccg acaagcggga tccacaggtg gacgacgggg acaacaaagt 360
ctgcagtcgc tctttgactt ttcgaacatt gtggtgaagg atggaaaagc caaggcgcag 420
actcggcagc gagagacgac gccgcggccg gcgaggtcgg caactcacca tgcatcttct 480
gcggagagga cggagggccg ggcaggcaca ccgcctctct ccgacgacga gtatctcaag 540
caacaagcgc agacgctcat caacgtctgt gctgcgcagg aagccactct cagtgtgtta 600
gcgctggaga atccgcctct gggcgaggtg ctgcggcagg cagtgaagga gtccagagaa 660
ggcaggggcg agacagaaag cttcggcaaa ctcgtggagc acttgcgaaa gcaactcgaa 720
gaaagaagaa aggcagagga gtcgcgactg cagcagctga actctgcact ggccaatccg 780
ctgtcggcgg cggcccaggc attcatgatg aaggagattc atgagaagca agtggaggac 840
aactacctgc tcgcgcaaga gcatttgccc gaagcctttg gctccgtgta catgttgttc 900
atcgacatcg aagtgaacgg ggtgccgatc aaggccttcg tcgacagcgg ggcgcagagc 960
accttcatgt cttacgcatg cgcgcagaag tgcagtctgc tgcgtctgat ggatacacga 1020
taccgtggcg tcgctcaggg cgtcggaaag acggaaatcg tcgggaaaat tcacttggcg 1080
acgctcaaga tcggccagcg cttcttcccc tccagcttca ccgtcctcca ggacaacaaa 1140
gtcgagttcc tcttcggcct cgacctcctg cgcagatacc agtgctgcat agacctgaag 1200
aaaagcgttc tgcgcatcga caacgaagaa atcccattct tgagtgaaaa ggatatcacc 1260
aagggcatgt tcggccgcgc cgatacaccc aacagtctcg gttcccccac cgcaacttcc 1320
tcaggcgaag acaagaaaat ggacgtcgat tcttcctcct cttcttcctc ttcatcgtcc 1380
tcttccgctt cgcctgggcc tctccgacag cagagtacaa ccagcctgga gcctcaagat 1440
gaagccaaag ttcagcaact cgtcgatctc ggttttctcc gcacagacgc tgtggacgct 1500
ctcgccatag caggcggcaa tgtcgaggcc gctgctactt tcctctttaa ccagcaacaa 1560
catgaccaag aaaacctctc ttga 1584
<210>2
<211>1143
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>2
atgaagctgc gcatccggac gctgagcaat gaggaggcgg agctcgaggt cggggcggag 60
gagacagtcc tgaatgtgaa ggaaaaggtg gaacagcggt ggcctcacat gcctgccgcg 120
cgtcagaagc tggtgcatgc aggaaagatt ctcgccgacg cacagaagat caaggactgc 180
tctgccctca aggaaaacga ccgcctcgtc gtcatggtca ccaaggctgt ctcgcagcct 240
gctgtgtctt cctcaacggc ggcgtctgca gctcccgcgt ctgccgcctc gccttcgcct 300
gcagaaacac agagagggag ttctgcagca ggctcgaccg cgggagacgg agaatctgcg 360
aagtcggaga cgcctggggg gtctggtaac gcgtcgggca actctggagg tcctgcaaat 420
ccagcgcatg cgtcgtcacc ctcctcagcg cccgatgcga cttcagaggg tctcagccgc 480
gcggccgcag agtccgcgct cttcacaggt cctcaactcg aggagacttt gacgcacttg 540
gtcgccatgg gatttcctcg cagccaagcc gaggaggcga tgcgagcagc cttcaacaac 600
cccgaccgtg cggttgagta tttgatgaat ggcatgccgc ctgaggtctc tgcaatgctc 660
ggtggagaca gcgcagagac tcaggaggcg catggcgatg tccctccgga agagggtgat 720
gccgagggag acgaagacga cgaaaatcct ctcggcgctc tcaggcacca tccggcgttc 780
aaccaaattc gacaaatggt ccaggccaat ccggcgatgc tgccccaggt tctgcaactg 840
attggaaatt caaacccaca gcttctggaa ctcatcacgc agaatcaaga cgctttcctg 900
gaaatgcttc agagcgacca gggggaggga gagacgggtg cggcaggcac aggaggcttt 960
gctgcacctg ggatcattca aatgactgcc gaggaaatgg aagctctgca aaggctcgag 1020
tctctcggct tctctcgtca ccaggctgtt gaagcgtatc ttgcctgcga cagaaatgag 1080
gaaatggcgg cgaattacct gtttgagaat ctgaacgact tgggagacga tgccggcgat 1140
tga 1143
<210>3
<211>4215
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>3
aacaagacgt ttacaggaca gccggaggag aaggtctggg cagggttagg gcggaacgaa 60
gcagtagaga gtggtgacgc tgacgataca ggaaagagaa taaaagataa aacgaggaac 120
gaaagagagc gcgtttgttg agaggccagt acttcgaaca caagacgaga agaatgccgt 180
cgggaggctt tggctgcgaa aaagcgcgca acgttgcagt gctacgccat ggcaaagacg 240
caagaaacaa aggtttctct cgtgccaagg tcttggtttt tctcttttcg aatttcagcg 300
tgtttcttgg aagacttgtt tcgctcggct tcttccgcag gaccctcttc tcaacgtctg 360
cgtttccatt tctcgcgatc ttctggaact tccgcgttgt tctcagcaaa gcgcttgcga 420
gccttctttc gcctttgtgt cttggtttct cttcctggaa ctccacgaga aagagcaagg 480
aaggaaaaaa gaacgaggct tccactgtcg tttccttcgt tgtccatggg tgttctagac 540
gccttctcat ctccacagat ttccaaagat tggagattga caagtcctca gctcaaggaa 600
gatattcgca catctgtata cgcacaggca gctgctgagc aagacacggg ccgtctagtt 660
ttttggattt ctctgcaatt tctcaaagca catcgacggc ttctgtctct tccggataac 720
acaacatctc cacaaggaca tccctttttg ttattacggg cactcgaccc cccctcctcc 780
cgcccgccgg cagcctcgca gcttttctgc atcctttctg gtgtcttctc tttctcttcc 840
atctctctgt ttgtgctctt accttctctc gtgtctcgtc gtcgtcggct cttctcctgg 900
tcctaacctt tctgtctgtc tctctcccgt tcttcggagg ctgctgccat cgcagtgttc 960
gtccttcgtc cccgtgacgc cttttctttt ccgcgaaggc ctgagaaatt tcgtcgcggc 1020
gttctccaag aagcttgata tgcatgtccg cgttcgtgaa attctctgat caagcggagt 1080
gatcaccaat catcgtctca gcgggatgac gttgcggcaa gggccggctc gcggtgggca 1140
gtcagatgcc gaacgtaact caggacggct tgcgctcatc gcagaacagg ggtggtgcct 1200
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ttggcatttt ttcttgaatt ccctttttcg acaaaatgca tgagaaaaaa atcactggat 1560
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atgctcatcc ggaattccgt atggcaatga aagacggtga gctggtgata tgggatagtg 1800
ttcacccttg ttacaccgtt ttccatgagc aaactgaaac gttttcatcg ctctggagtg 1860
aataccacga cgatttccgg cagtttctac acatatattc gcaagatgtg gcgtgttacg 1920
gtgaaaacct ggcctatttc cctaaagggt ttattgagaa tatgtttttc gtctcagcca 1980
atccctgggt gagtttcacc agttttgatt taaacgtggc caatatggac aacttcttcg 2040
cccccgtttt caccatgggc aaatattata cgcaaggcga caaggtgctg atgccgctgg 2100
cgattcaggt tcatcatgcc gtctgtgatg gcttccatgt cggcagaatg cttaatgaat 2160
tacaacagta ctgcgatgag tggcagggcg gggctggagg atccatggac aacaccgagg 2220
acgtcatcaa ggagttcatg cagttcaagg tgcgcatgga gggctccgtg aacggccact 2280
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ttcttgcccc cccgaggggg atccactaga gatatcgtac gccagtgtca ctggaaatcc 3240
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cggcaactgc tggaatactt gtacagcggt ttttaacaaa gataactgag agctcccaat 4080
tcgaatagca acgatgatgg gaactagcaa tagcggtgct tgtgtgtcct tcccgttcca 4140
ccagcaacgg aacttccatt ctctccccct gacaaaatca cagtagctac cgtctcagtg 4200
acagaaagct ctctt 4215
<210>4
<211>5062
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>4
gtcctcatct tctcttaact tctccgtgtc taccgcggcc gctgcgtttt ccaagccctc 60
cgtttcttct ttcgcagatc gcggcagcct tacggtctat ccgcggcctg tgtggattga 120
atcttcgcca tgtaagaaaa cgaaacagtc tttccctggc ggcagctgtt tcttcagata 180
ctcctgctgt ggcgcgtccc ggctttctat gctccgcacc accccagaag accagggaaa 240
ctcgtctgtc tcctcaggtg gctgtggtgc tgtgttcgaa aacttgttcc tgcgggcatc 300
tttcgcgttt ctcttttgtt ttccagactg ttacggttgc agttccttcg gtggacgcac 360
gtccggaaac agcacggaac tccatccgtt ttttcatgtg cctgtgcacc ctgcgtttct 420
cctcgtcgcg tccacggctc tgtgtgtgtc tgcacatcca gagaaaaaac ggtcctcttc 480
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gaaacatcta cccggggttg gcgatcgaga gagggtcttc gttttccggg acttgcttca 720
gcttctgcga atcgctctcc accgcgcgac tttgcgtctg gactcgagag cctgagctct 780
ccggacactg tcgctctgtt gtcgtcggcc gttccccagc ctgtggcggc catgactcga 840
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cgccccggtg ctgttccata tgcgtgactt tcccgcaatt ttttcagact ttcaggaaag 1140
acaggctccg gaacgatctc gtccatgact ggtaaatcca cgacaccgca atggccccca 1200
gcacctctat ctctcgtgcc aggggactaa cgttgtatgc gtctgcgtct tgtctttttg 1260
cattcgcttt ccaaaaaaga gagccatccg ttcccccgca cattcaacgc cgcgagtgcg 1320
gtttttgtct tttttgagtg gtaggacgct tttcatgcgc gaactacgtg gacattaagt 1380
tccattctct ttttcgacag cacgaaacct tgcattcaaa cccgcccgcg gaagatccga 1440
tcttgctgct gttcgcagtc ccagtagcgt cctgtcggcc gcgccgtctc tgttggtggg 1500
cagccgctac acctgttatc tgactgccgt gcgcgaaaat gacgccattt ttgggaaaat 1560
cggggaactt cattctttaa aagtatgcgg aggtttcctt tttcttctgt tcgtttcttt 1620
ttctcgggtt tgataaccgt gttcgatgta agcactttcc gtctctcctc cgtgctttgt 1680
tcgacatcga gaccaggtgt gcagatcctt cgcttgtcga tccggagacg cgtgtctcgt 1740
agaacctttt cattttacca cacggcagtg cggagcactg ctctgagtgc agcagggacg 1800
ggtgaagttt cgctttagta gtgcgtttct gctctacggg gcgttgtcgt gtctgggaag 1860
atgcagaaac cggtgtgtct ggtcgtcgcg atgaccccca agaggggcat cggcatcaac 1920
aacggcctcc cgtggcccca cttgaccaca gatttcaaac actttcgtcg tgtgacaaaa 1980
acgacgcccg aagaagccag tcgcctgaac gggtggcttc ccaggaaatt tgcaaagacg 2040
ggcgactctg gacttccctc tccatcagtc ggcaagagat tcaacgccgt tgtcatggga 2100
cggaaaaact gggaaagcat gcctcgaaag tttagacccc tcgtggacag attgaacatc 2160
gtcgtttcct cttccctcaa agaagaagac attgcggcgg agaagcctca agctgaaggc 2220
cagcagcgcg tccgagtctg tgcttcactc ccagcagctc tcagccttct ggaggaagag 2280
tacaaggatt ctgtcgacca gatttttgtc gtgggaggag cgggactgta cgaggcagcg 2340
ctgtctctgg gcgttgcctc tcacctgtac atcacgcgtg tagcccgcga gtttccgtgc 2400
gacgttttct tccctgcgtt ccccggagat gacattcttt caaacaaatc aactgctgcg 2460
caggctgcag ctcctgccga gtctgtgttc gttccctttt gtccggagct cggaagagag 2520
aaggacaatg aagcgacgta tcgacccatc ttcatttcca agaccttctc agacaacggg 2580
gtaccctacg actccgtggt tctcgagaag agaaggaaga ctgacgacgc agccactgcg 2640
gaaccgagca acgcaatgag ctccttgacg tccacgaggg agacaactcc cgtgcacggg 2700
ttgcaggctc cttcttcggc cgcagccatt gccccggtgt tggcgtggat ggacgaagaa 2760
gaccggaaaa aacgcgagca aaaggaactg attcgggccg ttccgcatgt tcactttaga 2820
ggccatgaag aattccagta ccttgatctc attgccgaca ttattaacaa tggaaggaca 2880
atggatgacc gaacgggcgt tggtgtcatc tccaaattcg gctgcactat gcgctactcg 2940
ctggatcagg cctttccact tctcaccaca aagcgtgtgt tctggaaagg ggtcctcgaa 3000
gagttgctgt ggttcattcg cggcgacacg aacgcaaacc atctttctga gaagggcgtg 3060
aagatctggg acaagaatgt gacacgcgag ttcctcgatt cgcgcaatct cccccaccga 3120
gaggtcggag acatcggccc gggctacggc ttccagtgga gacacttcgg cgcggcatac 3180
aaagacatgc acacagacta cacagggcag ggcgtcgacc agctgaagaa tgtgatccag 3240
atgctgagaa cgaatccaac agatcgtcgc atgctcatga ctgcctggaa tcctgcagcg 3300
ctggacgaaa tggcgctgcc gccttgtcac ttgttgtgcc agttctacgt gaacgaccag 3360
aaggagctgt cgtgcatcat gtatcagcgg tcgtgcgatg tcggcctcgg cgtccccttc 3420
aacatcgctt cctattcgct tttgacgctc atggttgcac acgtctgcaa cctaaaacct 3480
aaggagttca ttcacttcat ggggaacacg catgtctaca cgaaccatgt cgaggcttta 3540
aaagagcagc tgcggagaga accgagaccg ttccccattg tgaacatcct caacaaggaa 3600
cgcatcaagg aaatcgacga tttcaccgcc gaggattttg aggtcgtggg ctacgtcccg 3660
cacggacgaa tccagatgga gatggctgtc tagcggaaat acagaagctg cccgtctctc 3720
gttttcctct cttttcggag ggatcaggga gagtgcctcg ggtcggagag agctgacgag 3780
ggggtgccag agacccctgt gtcctttatc gaagaaaagg gatgactctt catgtggcat 3840
ttcacacagt ctcacctcgc cttgttttct ttttgtcaat cagaacgaaa gcgagttgcg 3900
ggtgacgcag atgtgcgtgt atccactcgt gaatgcgtta tcgttctgta tgccgctaga 3960
gtgctggact gttgctgtct gcccacgaca gcagacaact ttccttctat gcacttgcag 4020
gatgaattcc tgcagcccgg gggatcgatc cactagttcg cctccgtcgc gtcagtctcc 4080
cgggtgtctt tgttttctcg cgctgaagca tgtctccgtt tctcccctca gtctcgtggt 4140
gacgaaggag agaagccgcg caggcttctt ctgctcgggc aactggaggt agcctccctg 4200
cgggcgtttc gtgcatgcgc gaagtgcagt gtctgtacgc tttcgtttct cttccgagtc 4260
gaccgcggta cgaggttgtg tgcagaccca ggcgactctt gtctaccgaa ctgcccagat 4320
gtctccgcag agaccttctg tcatctgtga atcgcgattt cgtatttgga gcggagactc 4380
gagagagaag ccttcccgcg ctgcctccgc ggggcttgtt tagcgcaggt tttcttgcgg 4440
ccgtcgagcc actcgaaaag gcactcccgg cagctgcggt tgaattgcgg ggagccgtga 4500
gagaacgaca tctcctttcg acgcgtctgt ctttcgtaca gacgcagaca ctgagaaggc 4560
ctcgcctctt gcgactcgct cgcctcctcg gtcttgcgca ccaggagaca aatcgagctg 4620
cgtccccact tggatcgatg gagtgtacat tcaccacgag ggcgagacga cgcgggtgaa 4680
gcgaccgatc aggcgcgccg aacacggctg ttgcgcgctg cccacagtcc gcgttttctg 4740
aaatcggtgc gaagcaaaaa agaggcttga gaggactgtg aacttctaga gaagtctctg 4800
cagactgaga atcctgacac agaggagttt gaggtgctcc accgacgcca gacatggatc 4860
gcgtagacac ctcaaaatgg aacagagggc gtttccacgc tcgggggcgg tgtctcgctt 4920
cctcgagaaa cgcgctggcc ccggcgtgca gagacatgcc cactcctcag aaacgcattt 4980
tctgacgctg cgcatagaca ggcgcctttc taggtgcaag cacatgaaga tagagaccaa 5040
agacacacgg tgccgtcgga ga 5062

Claims (10)

1.一种弓形虫双基因缺失虫株的构建方法，包括如下步骤：抑制或沉默弓形虫虫株中的DNA损伤诱导蛋白1基因和紫外剪切修复蛋白23基因的表达，得到所述弓形虫双基因缺失虫株；
所述DNA损伤诱导蛋白1基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示；
所述紫外剪切修复蛋白23基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述抑制或沉默弓形虫虫株中的DNA损伤诱导蛋白1基因和紫外剪切修复蛋白23基因的表达为敲除弓形虫虫株中的DNA损伤诱导蛋白1基因和紫外剪切修复蛋白23基因。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述敲除弓形虫虫株中的DNA损伤诱导蛋白1基因和紫外剪切修复蛋白23基因为将弓形虫虫株中的DNA损伤诱导蛋白1基因和紫外剪切修复蛋白23基因均替换为抗性基因。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述将弓形虫虫株中的DNA损伤诱导蛋白1基因和紫外剪切修复蛋白23基因均替换为抗性基因的方法为基于CRISPR/Cas9介导的同源重组技术。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
1)将含有抗性基因甲的同源重组片段和靶向DNA损伤诱导蛋白1基因的CAS9质粒导入弓形虫虫株中，使所述弓形虫虫株中的DNA损伤诱导蛋白1基因替换为抗性基因甲，经过筛选和鉴定，得到缺失DNA损伤诱导蛋白1基因的弓形虫虫株；
所述含有抗性基因甲的同源重组片段依次包括DNA损伤诱导蛋白1基因上游同源臂、抗性基因甲和DNA损伤诱导蛋白1基因下游同源臂；
2)将含有抗性基因乙的同源重组片段和靶向紫外剪切修复蛋白23基因的CAS9质粒导入所述缺失DNA损伤诱导蛋白1基因的弓形虫虫株中，使所述缺失DNA损伤诱导蛋白1基因的弓形虫虫株中的紫外剪切修复蛋白23基因替换为抗性基因乙，经过筛选和鉴定，得到缺失DNA损伤诱导蛋白1基因和紫外剪切修复蛋白23基因的弓形虫虫株；
所述含有抗性基因乙的同源重组片段依次包括紫外剪切修复蛋白23基因上游同源臂、抗性基因乙和紫外剪切修复蛋白23基因下游同源臂。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述1)中，所述抗性基因甲为氯霉素抗性基因；
所述含有抗性基因甲的同源重组片段的核苷酸序列如序列表中序列3所示；
所述靶向DNA损伤诱导蛋白1基因的CAS9质粒为pSAG1-CAS9-U6gRNA(ddi1)；
所述2)中，所述抗性基因乙为乙胺嘧啶抗性基因；
所述含有抗性基因乙的同源重组片段的核苷酸序列如序列表中序列4所示；
所述靶向紫外剪切修复蛋白23基因的CAS9质粒为pSAG1-CAS9-U6gRNA(rad23)。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述弓形虫虫株为具有DNA损伤诱导蛋白1基因和紫外剪切修复蛋白23基因的弓形虫虫株；
或，所述弓形虫虫株具体为弓形虫RH虫株或弓形虫RHΔKu80虫株。
8.按照权利要求1-7任一所述方法构建得到的弓形虫双基因缺失虫株。
9.如下a1)-a4)中任一所述的应用：
a1)按照权利要求1-7任一所述方法构建得到的弓形虫双基因缺失虫株在作为弓形虫疫苗或弓形虫弱毒疫苗或弓形虫弱毒活疫苗中的应用；
a2)按照权利要求1-7任一所述方法构建得到的弓形虫双基因缺失虫株在制备弓形虫疫苗或弓形虫弱毒疫苗或弓形虫弱毒活疫苗中的应用；
a3)按照权利要求1-7任一所述方法构建得到的弓形虫双基因缺失虫株在制备预防和/或抵抗弓形虫感染的产品中的应用；
a4)按照权利要求1-7任一所述方法构建得到的弓形虫双基因缺失虫株在制备预防和/或治疗弓形虫病的产品中的应用。
10.如下b1)-b5)中任一种产品，其活性成分为按照权利要求1-7任一所述方法构建得到的弓形虫双基因缺失虫株；
b1)弓形虫疫苗；
b2)弓形虫弱毒疫苗；
b3)弓形虫弱毒活疫苗；
b4)预防和/或抵抗弓形虫感染的产品；
b5)预防和/或治疗弓形虫病的产品。
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