CN108018253B - 一种减毒单核细胞增生李斯特氏菌及其疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种减毒单核细胞增生李斯特氏菌，在敲除李斯特氏菌EGDe毒力基因actA及inlB的基础上，再缺失dal与dat基因。上述的一种减毒单核细胞增生李斯特氏菌的保藏号为CGMCC NO：14611。本发明还提供了上述的减毒单核细胞增生李斯特氏菌作为疫苗的用途。本发明的单增李斯特氏菌的减毒疫苗，由于采用了基因敲除技术对两个毒力基因及两个生长相关基因的敲除，保证了减毒菌株的安全性。实验结果表明，该疫苗具有良好的免疫原性，能引起细胞多种免疫因子产生，并能产生较高的免疫保护效果。

Description

一种减毒单核细胞增生李斯特氏菌及其疫苗

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种单增李斯特氏菌，具体来说是一种减毒单核细胞增生李斯特氏菌、及其疫苗。

背景技术

单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes，Lm)是一种重要的食源性致病菌，在自然环境中广泛分布。Lm具有较强的生存能力，pH在4.5–9，温度在0-45℃均可增殖，在干酪、原奶、冰淇淋、生肉、海鲜及方便食品，如：熟肉、熏鱼中均有检出。单增李斯特氏菌可穿透肠道屏障、胎盘屏障和血脑屏障，引起哺乳动物和人的肠胃炎、败血症、孕畜流产及脑膜炎等。超过99％的单增李斯特氏菌感染是由于食用了被该菌污染的食物，死亡率达30％以上。单增李斯特氏菌是典型的胞内寄生菌，它可通过李斯特氏菌溶血素、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C和卵磷脂酶的裂解作用下逃离吞噬小体，并在细胞质中增殖。

目前，国内对致病菌的防治方法相对落后，主要依赖大规模使用抗生素，但抗生素的使用导致微生物产生耐药性，并可能使食品存在药物残留。研究发现，金黄色葡萄球菌对红霉素的耐药率达33.3％，副溶血性弧菌对四环素和复方磺胺甲恶唑耐药率分别为2.1％和3.2％，沙门菌对萘啶酸的耐药率为50％。研发高效疫苗，通过免疫途径提高动物自身免疫力，降低抗生素的使用量，是预防致病菌感染的有效途径。

D-丙氨酸(D-Ala)，为细菌细胞壁肽聚糖的重要组成成分。在单核细胞增生李斯特氏菌中，存在两种途径生成D-Ala：基因dal编码丙氨酸消旋酶(Alr)，可将L-Ala转化为D-Ala；基因dat编码D-氨基酸氨基转移酶蛋白，可将D-谷氨酸与丙酮酸通过转氨作用生成D-Ala与α-酮戊二酸，当dal与dat基因全部缺失时，由于不能合成D-Ala，在无外源D-Ala添加时，该dal/dat双基因缺失菌株将发生溶菌死亡。

发明内容

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种减毒单核细胞增生李斯特氏菌、及其疫苗，所述的这种减毒单核细胞增生李斯特氏菌、及其疫苗要解决现有技术中抗生素滥用导致环境污染及食品抗生素残留的问题。

本发明提供了一种减毒单核细胞增生李斯特氏菌，在敲除李斯特氏菌EGDe毒力基因actA及inlB的基础上，再缺失dal与dat基因。

进一步的，上述的一种减毒单核细胞增生李斯特氏菌的保藏号为CGMCC NO：14611。

本发明还提供了上述的减毒单核细胞增生李斯特氏菌作为疫苗的用途。

本发明以单核细胞增生李斯特氏菌野生株EGDe actA及inlB双毒力基因缺失株(EGDeΔactA/inlB)为亲本，利用同源重组的方法进一步构建缺失了基因dal及dat的菌株(EGDeΔactA/inlB/dal/dat，EGDeΔABdd)。实验验证该缺失株在无外源D-丙氨酸添加时，在正常的培养基及环境下不能生长繁殖，需添加外源D-丙氨酸才能生长繁殖。相关细胞及动物实验表明，该缺失菌株具有良好的安全性及免疫原性，可作为一株新型的减毒单增李斯特氏菌疫苗。

本发明提供的单增李斯特氏菌基因actA/inlB/dal/dat的敲除株，是通过单增李斯特氏菌基因敲除载体pKSV7分别敲除actA/inlB/dal/dat四个基因得到。

本发明所述疫苗，将actA/inlB/dal/dat四基因敲除而实现减毒的单增李斯特氏菌减毒疫苗，其不仅相对于单增李斯特氏菌野生株毒力明显减弱，同时具有很好的免疫原性，对接种过疫苗株的小鼠具有良好的保护效果，并且敲除株的毒力发生显著性降低，具有良好的安全性。

本发明的一种减毒单核细胞增生李斯特氏菌，其分类命名为：单核细胞增生李斯特氏菌Listeria monocytogenes，(EGDeΔactA/inlB/dal/dat)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院(中科院微生物研究所)，保藏日期为2017年9月13日，保藏号为CGMCC NO：14611。

本发明人的研究表明，该减毒株在正常培养基中不能生长繁殖，该减毒疫苗对Caco-2细胞的侵袭性显著降低，诱导细胞凋亡能力显著减弱，并能引起小鼠巨噬细胞及小鼠脾细胞较强的免疫反应；以构建的该单增李斯特氏菌的减毒疫苗作为免疫原免疫BALB/c小鼠，四免后7天采血，间接酶联免疫测定小鼠血清效价可达1:12800；采用20倍半数致死剂量的野生型李斯特氏菌EGDe进行攻毒，其保护效率可达100％，而对照组全部死亡。

本发明和已有技术相比较，其技术进步是显著的。本发明的单增李斯特氏菌的减毒疫苗，由于采用了基因敲除技术对两个毒力基因及两个生长相关基因的敲除，保证了减毒菌株的安全性。实验结果表明，该疫苗具有良好的免疫原性，能引起细胞多种免疫因子产生，并能产生较高的免疫保护效果。

附图说明

图1是本发明实施例中重组质粒的双酶切鉴定结果，M：DL 10000marker；1-2：重组质粒。

图2是本发明实施例中重组质粒电转化鉴定结果，M：500bp marker；1-3：阳性克隆；b4：阴性对照。

图3是本发明实施例中菌株缺失dal基因的PCR鉴定结果，a：引物P1/P4扩增产物b：引物dal-F/dal-R扩增产物1-2：未敲除菌株；3：敲除菌株；4a：阴性对照；4b：阳性对照；M：500bp marker。

图4是本发明实施例中菌株缺失dat基因的PCR鉴定结果，a：引物1/4扩增产物b：引物dat-F/dat-R扩增产物1-2：单克隆菌株；3：阴性对照；4：阳性对照；M1：500bp marker；M2：DL1 000marker。

图5是本发明实施例中不同浓度的D-丙氨酸对缺失株生长的影响。

图6是本发明实施例中不同菌株对细胞的侵袭性比较，*：P＜0.05，**：P＜0.01。

图7是本发明实施例中图7不同菌株诱导细胞凋亡实验结果，*：P＜0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001。

图8是本发明实施例中小鼠不同器官的载菌量比较，**：P＜0.01，***：P＜0.001。

图9是本发明实施例中小鼠巨噬细胞免疫因子测定结果，*：P＜0.05，***：P＜0.001。

图10是本发明实施例中小鼠脾细胞免疫因子测定结果，***：P＜0.001。

图11是本发明实施例中免疫保护实验结果。

具体实施方式

以下结合附图介绍本发明的具体实施方式：

首先介绍本发明实施例中所使用的试剂与仪器：

主要试剂

细菌总DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒天根生化科技(北京)有限公司；PCR相关试剂、RT-PCR相关试剂、DNA连接酶、限制性内切酶TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司；脑心浸液培养基(BHI)北京陆桥技术有限公司；氨苄青霉素、氯霉素及其他常规试剂国药集团化学试剂有限公司。

主要仪器

凝胶成像仪、Nanodrop 2000C购自Thermo Scientific；PCR热循环仪、荧光实时定量PCR仪购自美国Applied Biosystems公司；Mini-power电泳仪、电穿孔仪购自美国伯乐公司；SpectraMax M2多功能酶标仪购自美国分子仪器公司。

实施例1基因缺失菌株的构建

1基因dal缺失株的构建

1.1引物

根据GenBank登录的基因序列(Gene ID：986294)，用Primer3 Input设计扩增上游同源臂引物P1/P2，下游同源臂引物P3/P4。连接后PCR引物为P1/P4，全长1342bp(如SEQ IDNO.1所示)，缺失片段大小为1202bp(如SEQ ID NO.2所示)。相关引物序列见表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1基因dal敲除所用的引物序列

1.2穿梭重组质粒的构建

利用引物P1/P2及P3/P4分别扩增dal基因的上下游同源臂，经EcoR I单酶切后连接酶进行过夜连接。再以连接体系为模板，引物P1/P4对连接产物进行扩增。扩增产物经DNA回收试剂盒割胶纯化回收，经Sal I、Sma I双酶切。酶切纯化后的片段，与经Sal I、Sma I酶切的穿梭质粒pKSV7连接，并转化至大肠杆菌DH5α中，涂布含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB固体培养基培养。

由图1可知，经双酶切后，片段大小约为1342bp，与dal上下游同源臂大小一致，表明重组质粒连接成功。

1.3电转化与同源重组

挑取LB平板的单菌落培养，利用P1/P4进行PCR鉴定。鉴定为阳性的克隆抽提质粒后进行双酶切鉴定，并送华大基因测序。测序正确的重组质粒经11.25kv/cm、4ms电转化至感受态EGDeΔactA/inlB中，氯霉素(10μg/mL)抗性平板培养36-48h后，引物P1/P4对平板上的单菌落进行鉴定。鉴定为阳性的克隆在42℃和氯霉素双重压力下传10代，使之发生单交换同源重组。然后在30℃无抗性条件下传8代，末代培养物划线于无抗性BHI平板。

由图2可知，1-3号单克隆均检出为阳性，大小约为1342bp，表明目的基因已经缺失，获得了缺失dal基因的菌株EGDeΔactA/inlB/dal。

1.4缺失株的鉴定

挑取BHI平板上的单菌落于液体培养基30℃培养，分别用引物P1/P4及引物LF/LR进行PCR鉴定，鉴定成功的菌株分别划线于BHI平板及含氯霉素(10μg/mL)抗性平板，37℃培养。

如图3a所示，引物P1/P4扩增出1342bp左右的条带(a3)，而未敲除菌株(a1、a2)扩增出约2544bp的条带；如图3b所示，引物dal-F/dal-R未扩增出条带(b3)，而未敲除株扩增出约428bp的条带(b1、b2)，表明3号为疑似敲除株，经氯霉素抗性进一步鉴定，该克隆不能在抗性平板上生长，确定3号为敲除株。

2基因dat缺失株的构建

2.1引物

根据GenBank登录的基因序列(Gene ID：985722)，用Primer3 Input设计扩增上游同源臂引物P1/P2，下游同源臂引物P3/P4。连接后PCR引物为P1/P4，全长1 980bp(如SEQ IDNO.3所示)，缺失片段大小为839bp(如SEQ ID NO.4所示)。相关引物序列见表2，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表2基因dat敲除所用的引物序列

2.2基因缺失株的构建

基因dat缺失的重组质粒的构建方法同1.2，测序正确的重组质粒电转化至感受态EGDeΔactA/inlB/dal中，筛选方法如同1.3。引物1/4及引物TF/TR对筛选后的菌株进行PCR鉴定。由图4可以看出，1号与2号菌株引物1/4可以扩增出约1980bp的条带，而对应的引物TF/TR不能扩增出片段，表明目的基因已经缺失，即在缺失actA、inlB及dal基因的菌株上进一步缺失了dat基因，获得了菌株EGDeΔactA/inlB/dal/dat，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)中，保藏号为CGMCC NO：14611。

实施例2缺失株的特性鉴定及安全性评估

1.最佳D-丙氨酸浓度的确定

采用酶标仪测定生长曲线的方式确定敲除株(EGDeΔABdd)的最佳D-丙氨酸浓度。挑取平板上的单菌落37℃过夜培养约15h后，按1:100将EGDe转接到BHI培养基，EGDeΔABdd转接到含有不同D-丙氨酸浓度(0、100、200μg/mL)的BHI培养基中，37℃摇床培养。每间隔1h吸取样品于96孔酶标板中，酶标仪测定600nm处的光密度值(OD值)后继续37℃摇床培养，连续测12小时。

由图5可以看出，缺失菌株在无外源D-丙氨酸补充时不能生长，而D-丙氨酸添加浓度为200μg/mL时生长速度高于100μg/mL，且平台期菌浓度高于EGDe，因而200μg/mL作为最适添加浓度。

2.细胞侵袭实验

将生长良好的Caco-2细胞消化并转移至12孔细胞培养板中，过夜培养。后按细菌：细胞＝100：1加入EGDe及减毒疫苗株EGDeΔABdd共培养3h。侵袭结束后，换用庆大霉素(400μg/mL)37℃处理30min。再用1％Triton X-100裂解细胞，释放细菌。每孔充分吹打并收集至离心管中，生理盐水梯度稀释涂布BHI平板，置于37℃培养箱培养并计数。

由图6可以看出，侵袭过程中不添加D-丙氨酸时，减毒疫苗株的侵袭力约为野生株EGDe的1/10，而仅敲除actA及inlB的菌株的侵袭力明显高于减毒疫苗株，约为减毒疫苗株的5倍，表明构建的该减毒疫苗株细胞毒性明显减弱。

3.细胞凋亡实验

常规方法培养Caco-2细胞，以感染复数(MOI)＝100分别接种EGDe及减毒疫苗株EGDeΔABdd，共培养3h后弃上清，胰酶消化，收集细胞。异硫氰酸荧光素标记的膜联素V/碘化丙啶(annexinV-FITC/PI)双染色结合流式细胞术检测细胞凋亡率。由图7可以看出，疫苗株与野生株EGDe相比，诱导细胞凋亡能力显著降低，表明该疫苗株具有良好的安全性。

4.小鼠器官载菌量

将实验小鼠每3只为1组，分为对照组及实验组，尾静脉分别注射野生型李斯特氏菌EGDe及减毒疫苗株EGDeΔABdd，剂量为2×10⁷CFU。于注射24h后无菌取出小鼠脾脏及肝脏称重、研磨，生理盐水梯度稀释涂布BHI平板，置于37℃培养箱培养并计数。由图8可以看出，减毒疫苗株器官的载菌量明显低于野生型李斯特氏菌，进一步表明缺失四个基因后构建的该疫苗株毒力明显减弱，对细胞的侵袭性明显降低。

实施例3缺失株的免疫效果评价

1.小鼠巨噬细胞免疫因子测定

将生长良好的小鼠巨噬细胞Raw264.7消化并转移至6孔细胞培养板中，待测细菌过夜培养后，按细菌：细胞＝100：1加入减毒疫苗株EGDeΔABdd，PBS作为空白对照，共培养3h后，提取细胞RNA并反转录为cDNA，RT-PCR检测相关炎症因子，相关炎症因子引物按照NCBI公布的序列，由软件Prime 3设计。

由图9可以看出，以空白对照组产生的细胞因子以1计算，减毒疫苗组的细胞因子TNF-α，IL-6，IL-1β的产生量较空白对照组显著增加，表明该减毒疫苗能够引起巨噬细胞免疫反应的产生。

2.小鼠脾细胞免疫因子测定

将减毒疫苗株EGDeΔABdd及空白对照PBS按照1×10⁸CFU的剂量腹腔注射C57BL/6小鼠，24h后取小鼠脾细胞研磨并提取总RNA，转录为cDNA后RT-PCR检测相关炎症因子产生情况。

由图10，对照组炎症因子表达量以1表示，实验组IL-6及IFN-γ的表达量显著提高，分别约为对照组的25倍及70倍，存在显著性差异，表明构建的该减毒疫苗株具有良好的免疫原性，可诱导小鼠产生较强的免疫反应。

3.小鼠血清效价测定

小鼠采取腹腔注射剂量为1×10⁸CFU的减毒疫苗株，间隔4天免疫一次，第四次免疫后7天尾静脉取血，分离血清，倍比稀释后间接ELISA测定小鼠血清抗体效价。以测定结果/阴性结果的2.1倍为界限，使该比值大于2.1的测定结果判定为阳性。阳性结果中血清的最大稀释倍数为小鼠血清的抗体效价。在该实验中，阴性对照值为0.091，稀释倍数为12800的血清效价为0.237，因而小鼠血清效价确定为12800。

4.免疫保护实验

将小鼠每15只为1组分为实验组及对照组，实验组接种疫苗进行免疫，免疫方式为腹腔注射剂量为1×10⁸CFU的减毒疫苗株，间隔4天免疫一次，对照组腹腔注射生理盐水。第四次免疫后7天，采用20倍半数致死剂量(1×10⁷CFU)的野生型李斯特氏菌EGDe攻毒，每天观察实验组及对照组小鼠死亡情况。由图11可以看出，对照组15只小鼠在攻毒7天内全部死亡，而实验组小鼠无死亡，保护率为100％。

序列表

<110> 上海理工大学

<120> 一种减毒单核细胞增生李斯特氏菌及其疫苗

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1342

<212> DNA

<213> Listeria monocytogenes

<400> 1

ccgcgatgcc tcaatactta gttaatcacc aggaccgact aaaacaattg aaaaagaaca 60

tcaaaacaga ttacccaggt gttttttttg caggaatgag ctacgaaggt gtgggtattc 120

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<210> 2

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<400> 2

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<210> 3

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<212> DNA

<213> Listeria monocytogenes

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ttggaattac agccagtcaa ggacaatggt tatcgactgg atttatgtta gttaatggtg 1860

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<210> 4

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<212> DNA

<213> Listeria monocytogenes

<400> 4

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ccgcggatat cagtttggtg atggtgtata tgaagtagtt cgtctatata atggaaaatt 120

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tagaaacgag cgtcaattcg ttgaaggtgg aacggcgatt acagaagaag atgtgcgctg 420

gttacgctgt gatattaaga gcttaaacct tttaggaaat attctagcaa aaaataaagc 480

acatcaacaa aatgctttgg aagctatttt acatcgcggg gaacaagtaa cggaatgttc 540

tgcttcaaac gtttctatta ttaaagatgg tgtattatgg acgcatgcgg cagataactt 600

aatcttaaat ggtatcactc gtcaagttat cattgatgtt gcgaaaaaga atggcattcc 660

tgttaaagaa gcggatttca ctttaacaga ccttcgtgaa gcggatgaag tgttcatttc 720

aagtacaact attgaaatta cacctattac gcatattgac ggagttcaag tagctgacgg 780

aaaacgtgga ccaattacag cgcaacttca tcaatatttt gtagaagaaa tcactcgtg 839

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

attcccgggc cgcgatgcct caatactta 29

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

attgaattcc gcggtctatt tcaatccat 29

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

attgaattcc aaggcgtgat aatggtacg 29

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

attgtcgact gccctgcatt catcattt 28

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tttagatgag gctctggctc 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtggctgtaa taaggaagca g 21

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

attcccgggt tcacgcggaa aaaggtatct c 31

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

attgaattca tctcgagtct ctccttgcat agt 33

<210> 13

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

attgaattcc atgtggcgaa ttagtgtttg c 31

<210> 14

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

attgtcgact ggtataatct gtggcgaatc c 31

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

agctcgtgaa gtacctagaa acgag 25

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gttttccgtc agctacttga actc 24

Claims (2)

1.一种减毒单核细胞增生李斯特氏菌，其特征在于：在敲除李斯特氏菌EGDe毒力基因actA及inlB的基础上，再缺失dal与dat基因，所述减毒单核细胞增生李斯特氏菌的保藏号为CGMCC NO：14611。

2.权利要求1所述的减毒单核细胞增生李斯特氏菌制备疫苗的用途。

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