CN108220217B

CN108220217B - 一种用于递送及表达外源抗原的减毒单核细胞增生李斯特氏菌及其应用

Info

Publication number: CN108220217B
Application number: CN201810074093.0A
Authority: CN
Inventors: 曾海娟; 刘箐; 王艳; 汪冠豪
Original assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Current assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2018-01-25
Filing date: 2018-01-25
Publication date: 2021-02-09
Anticipated expiration: 2038-01-25
Also published as: CN108220217A

Abstract

本发明提供了一种用于递送及表达外源抗原的减毒单核细胞增生李斯特氏菌，包括一种缺失毒力基因actA和inlB，并缺失了两个生长相关的基因dal与dat的单核细胞增生李斯特氏菌减毒株，其中含有携带dat基因的质粒。进一步的，上述减毒单核细胞增生李斯特氏菌其保藏号为CGMCC NO：14649。本发明还提供了上述的一种减毒单核细胞增生李斯特氏菌作为活疫苗载体和免疫佐剂的用途。本发明由于分别对两个毒力基因及两个生长相关基因的敲除，保证了载体的安全性。同时实验结果也表明，该用于递送及表达外源抗原的减毒单核细胞增生李斯特氏菌疫苗载体具有良好的免疫性，能够引起多种细胞炎症因子及免疫T淋巴细胞的增殖。

Description

一种用于递送及表达外源抗原的减毒单核细胞增生李斯特氏菌及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种单核细胞增生李斯特氏菌，具体来说是一种用于递送及表达外源抗原的减毒单核细胞增生李斯特氏菌及其应用。

背景技术

单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes，Lm)具有较强的生存能力，pH在4.5–9，温度在0-45℃均可增殖，单增李斯特氏菌是典型的胞内寄生菌，李斯特氏菌溶血素O，是一种由hly基因编码的溶细胞素，能够在细胞膜上形成孔道，使得李斯特氏菌能够穿过诸如巨噬细胞、树突状细胞等的细胞膜，然后进入细胞质中增殖。处于胞内的李斯特氏菌，所分泌的蛋白能够被蛋白酶降解，降解后的蛋白多肽可被MHC-Ⅰ类分子所递呈；同时，被吞噬的外源性蛋白也可直接被MHC-Ⅱ分子所递呈。由于能够同时激活CD4及CD8分子介导的抗原特异性免疫应答，因此减毒李斯特氏菌是一个具有很大应用前景的疫苗载体。

然而，单增李斯特氏菌是一种重要的食源性致病菌，能感染免疫力低的小孩、孕妇和老人，从安全性考虑，菌株的减毒是很有必要的。在单增李斯特氏菌侵袭宿主细胞时，毒力基因inlB及actA在细胞识别、粘附、内在化及细胞间的运动上发挥重要作用。D-丙氨酸(D-Ala)为细菌细胞壁肽聚糖的重要组成成分。在单核细胞增生李斯特氏菌中，存在两个基因与D-Ala合成相关：基因dal与dat。当这两个基因全部缺失时，单增李斯特氏菌菌壁的合成及菌体的增殖只能依靠外源性D-丙氨酸。

目前，国内对致病菌的防治方法相对落后，主要依赖大规模使用抗生素，但抗生素的使用导致微生物产生耐药性，并可能使食品存在药物残留。研究发现，金黄色葡萄球菌对红霉素的耐药率达33.3％，沙门菌对萘啶酸的耐药率为50％。疫苗，可通过免疫途径提高动物自身免疫力，降低抗生素的使用量，是预防致病菌感染的有效途径。目前，国内使用的疫苗主要是传统的灭活疫苗及亚单位疫苗，存在免疫周期长，免疫效果差等缺点。

发明内容

针对目前国内生产中存在的抗生素滥用，传统疫苗免疫周期长、效果差的现状，本发明提供了一种用于递送及表达外源抗原的减毒单核细胞增生李斯特氏菌及其应用，所述的这种一种用于递送及表达外源抗原的减毒单核细胞增生李斯特氏菌及其应用可以解决现有的抗生素滥用导致环境污染、食品抗生素残留及疫苗免疫周期长、效果差的问题。

本发明提供了一种用于递送及表达外源抗原的减毒单核细胞增生李斯特氏菌，包括一种缺失毒力基因actA和inlB，并缺失了两个生长相关的基因dal与dat的单核细胞增生李斯特氏菌减毒株，所述的单核细胞增生李斯特氏菌减毒株中含有携带dat基因的质粒。

进一步的，上述的用于递送及表达外源抗原的减毒单核细胞增生李斯特氏菌其保藏号为CGMCC NO：14649。

本发明还提供了上述的一种用于递送及表达外源抗原的减毒单核细胞增生李斯特氏菌作为活疫苗载体的用途。

本发明还提供了上述的一种用于递送及表达外源抗原的减毒单核细胞增生李斯特氏菌作为免疫佐剂的用途。

本发明还提供了上述的一种用于递送及表达外源抗原的减毒单核细胞增生李斯特氏菌在制备抗单增李斯特氏菌的免疫用途。

本发明还提供了一种疫苗载体，以上述的一种用于递送及表达外源抗原的减毒单核细胞增生李斯特氏菌作为载体，在携带外源抗原基因时起加强免疫激活的作用。

本发明是以单增李斯特氏菌野生株EGDe毒力基因actA及inlB缺失的菌株(EGDeAB)为亲本，利用同源重组的方法构建进一步缺失基因dal及dat的菌株(EGDeABdd)，所述的减毒菌株在无外源D-丙氨酸添加时不能生长繁殖，这四个基因的缺失保证了该减毒株作为活疫苗载体的安全性。再通过质粒pERL3回补单增李斯特氏菌的dat基因后成功构建了活疫苗载体株(EGDeABdd-dat)。实验表明，该载体恢复了生长繁殖的能力，同时回补的基因可起到筛选的作用，使得质粒上同时携带的外源抗原基因稳定存在，能有效解决一般质粒携带外源基因表达不稳定的问题。同时由于dat起到了筛选的作用，质粒在不依赖抗生素的情况下可以稳定存在于缺失菌株中。

通过质粒回补dat基因后缺失株恢复了生长繁殖的能力，质粒携带的dat基因成功代替了抗生素筛选的作用，使质粒稳定存在于系统中。该减毒株在正常培养基中恢复生长繁殖能力，对细胞及小鼠的侵袭性显著降低，可引起小鼠巨噬细胞及小鼠脾细胞较强的免疫反应，表明该减毒菌株可作为一种潜在的活疫苗载体，具有良好的安全性及免疫原性。

本发明构建的减毒活疫苗载体可用于携带外源抗原基因，构建成新型疫苗中的核酸疫苗，该载体通过质粒表达的方式可以持续不断地产生抗原蛋白，为机体提供持续的免疫刺激，以此来降低免疫周期，提高免疫效果。质粒通过回补dat基因并携带外源抗原基因而表达相应抗原蛋白，能有效解决普通质粒携带外源基因表达不稳定的问题，为李斯特氏菌活疫苗载体的研发开辟了新的途径。实验验证该减毒株在无外源D-丙氨酸添加时正常生长繁殖，对巨噬细胞及小鼠免疫实验表明，该载体具有良好的安全性及免疫原性，能够引起多种免疫因子及特异性T淋巴细胞的增殖，可作为一种新型的细菌、病毒及肿瘤疫苗的载体或佐剂。

本发明的用于递送及表达外源抗原的减毒单核细胞增生李斯特氏菌包含单增李斯特氏菌基因actA/inlB/dal/dat的敲除及质粒pERL3回补的dat基因。该载体通过单增李斯特氏菌基因敲除质粒pKSV7，以野生型菌株EGDe为亲本，分别敲除actA/inlB/dal/dat四个基因得到的菌株EGDeABdd，并通过质粒pERL3回补基因dat后得到。

本发明的用于递送及表达外源抗原的减毒单核细胞增生李斯特氏菌，将actA/inlB/dal/dat四基因敲除而实现减毒，其半数致死剂量LD50为5×10⁸CFU/mL，与野生型EGDe(LD50为5×10⁵CFU/mL)相比毒力降低了3个数量级，其不仅相对于单增李斯特氏菌野生株毒力明显减弱，组织切片染色表明该载体具有良好的安全性。同时相关免疫实验表明该载体具有良好的免疫原性，可引起巨噬细胞及小鼠脾细胞多种炎症因子产生的提高，且能引起抗原特异性T淋巴细胞的增殖。

本发明的用于递送及表达外源抗原的减毒单核细胞增生李斯特氏菌，分类命名：单核细胞增生李斯特氏菌Listeria monocytogenes，(EGDeΔactA/inlB/dal/dat-dat)，本文中简写为EGDeABdd-dat，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院(中科院微生物研究所)，保藏日期为2017年9月20日，保藏号为CGMCC NO：14649。

本发明人的研究表明，该减毒疫苗载体对Caco-2细胞及C57BL/6小鼠的侵袭性显著降低；诱导Caco-2细胞凋亡能力显著减弱，并能引起小鼠巨噬细胞Raw264.7及小鼠脾细胞较强的免疫反应；引起抗原特异性CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8a+T细胞数量的增加。

本发明和已有技术相比较，其技术进步是显著的。本发明的单增李斯特氏菌的减毒活疫苗载体或佐剂，由于采用了基因敲除技术分别对两个毒力基因及两个生长相关基因的敲除，保证了载体的安全性。同时实验结果也表明，该疫苗载体具有良好的免疫性，能够引起多种细胞炎症因子及免疫T淋巴细胞的增殖。

附图说明

图1是本发明实施例中回补基因dat的PCR鉴定结果，M：DL 1000marker；1-4：扩增的dat基因。

图2是本发明实施例中重组质粒的构建示意图。

图3是本发明实施例中重组质粒的电转化鉴定结果，M：DL 1000marker；N：阴性对照；1-4：挑取的单菌落。

图4是本发明实施例中对构建的疫苗载体的生长能力进行评价。

图5是本发明实施例中不同菌株对细胞的侵袭性比较。

图6是本发明实施例中不同菌株诱导细胞凋亡的实验结果。

图7是本发明实施例中菌株对小鼠不同器官的载菌量比较。

图8是本发明实施例中显微镜观察的疫苗载体组小鼠肝脏组织形态。

图9是本发明实施例中小鼠巨噬细胞炎症因子测定结果。

图10是本发明实施例中小鼠脾细胞炎症因子测定结果。

图11是本发明实施例中流式细胞仪测定减毒疫苗载体株诱导特异性T淋巴细胞增殖情况。

具体实施方式

以下结合附图介绍本发明的具体实施方式：

首先介绍本发明实施例中所使用的试剂与仪器：

主要试剂

细菌总DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒天根生化科技(北京)有限公司；PCR相关试剂、RT-PCR相关试剂、DNA连接酶、限制性内切酶TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司；脑心浸液培养基(BHI)北京陆桥技术有限公司；卡那霉素、红霉素及其他常规试剂国药集团化学试剂有限公司；细胞凋亡试剂盒、CD4及CD8荧光抗体美国BD公司。

主要仪器

凝胶成像仪、Nanodrop 2000C购自Thermo Scientific；PCR热循环仪、荧光实时定量PCR仪购自美国Applied Biosystems公司；Mini-power电泳仪、电穿孔仪购自美国伯乐公司；流式细胞仪购自美国BD公司；SpectraMax M2多功能酶标仪购自美国分子仪器公司。

实施例1 活疫苗载体的构建

1.引物及基因扩增

根据GenBank登录的单核细胞增生李斯特氏菌EGDe基因dat的序列(Gene ID：985722)(如SEQ ID NO.1所示)，用Primer3Input设计扩增引物P1/P2，全长978bp。相关引物序列见表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 基因dat回补所需要引物

以EGDe的DNA为模板，利用引物P1/P2扩增dat基因全长。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳进行纯化并割胶回收。扩增片段大小如图1所示，在978bp左右处可见明显条带，表明成功扩增dat基因。

2.重组质粒的构建

扩增并割胶回收的dat基因经一步克隆试剂盒，连接到经酶Sma I及Sal I切过的质粒pERL3中(质粒构建方式如图2)，并转化到大肠杆菌DH5α中。涂布含卡那霉素的LB平板并培养过夜后挑菌，引物P3/P4进行鉴定。

3.重组质粒电转化鉴定

感受态细胞EGDeABdd制备：100mL培养基中加入2mL过夜培养的细菌，37℃培养OD_600nm在0.4左右；加入青霉素G终浓度10μg/mL，37℃培养OD＝0.6左右；6000rpm，5min离心收集菌体，5mL预冷的3.5×SMHEM洗液(50mL 3.5×SMHEM配方为：蔗糖，16.293g；HEPES，0.0834g；MgCl₂·6H₂O，0.0356g)洗2次；1mL 3.5×SMHEM重悬，即为单增李斯特氏菌EGDeABdd的感受态细胞。

鉴定为阳性的含重组质粒的大肠杆菌DH5α经扩大培养后，由质粒抽提试剂盒抽提浓缩重组质粒，并按11.25kv/cm，4ms的条件电转化至感受态细胞EGDeABdd中，涂布含有红霉素抗性的平板培养36～48h左右，单菌落用引物P3/P4进行鉴定。由图3可以看出，挑取的1-4号单克隆细菌株均在440bp左右扩增出条带，鉴定为阳性结果，表明重组质粒已经电转化至感受态EGDeABdd中，获得通过质粒回补后菌株(EGDeABdd-dat)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)中，保藏号为CGMCC NO：14649。

实施例2 缺失株的特性鉴定及安全性评估

1.载体生长能力测定

采用酶标仪测定生长曲线的方式确定敲除株通过质粒回补后菌株(EGDeABdd-dat)的生长能力。挑取平板上的单菌落37℃过夜培养约15h后，按1:100转接到新鲜的BHI培养基，37℃摇床培养。每间隔1h吸取样品于96孔酶标板中，酶标仪测定600nm处的光密度值(OD值)后继续37℃摇床培养，连续测12小时。

由图4可以看出，缺失菌株EGDeABdd在正常的培养基中(无外源D-丙氨酸补充时)不能生长，而回补dat基因后的菌株恢复了生长能力，表明质粒携带的dat基因已经成功表达为相应蛋白，并能够合成自身需要的D-丙氨酸。

2.细胞侵袭实验

将生长良好的Caco-2细胞消化并转移至12孔细胞培养板中，过夜培养。后按细菌：细胞＝100：1加入EGDe及减毒疫苗载体株EGDeABdd-dat共培养2h。侵袭结束后，换用庆大霉素(400μg/mL)37℃处理30min。再用1％Triton X-100裂解细胞，释放细菌。每孔充分吹打并收集至离心管中，生理盐水梯度稀释涂布BHI平板，置于37℃培养箱培养并计数。

由图5可以看出，减毒载体株对Caco-2细胞的侵袭力与野生株EGDe相比有显著差异(侵袭力约降75％)，表明回补株毒力明显减弱。而仅敲除actA及inlB的菌株EGDeAB及减毒株EGDeABdd(在侵袭过程中添加200μg/mL的D-丙氨酸)的侵袭力与质粒回补菌株EGDeABdd-dat无明显差异，进一步表明回补的基因成功表达。

3.细胞凋亡实验

常规方法培养Caco-2细胞，以感染复数(MOI)＝100分别接种EGDe及减毒疫苗载体株EGDeABdd-dat，共培养3h后弃上清，胰酶消化，收集细胞。异硫氰酸荧光素标记的膜联素V/碘化丙啶(annexinV-FITC/PI)双染色结合流式细胞术检测细胞凋亡率。由图6可以看出，构建的载体株与EGDe相比，诱导细胞凋亡能力显著降低(P＜0.001)，表明构建的该减毒疫苗载体具有良好的安全性。

4.小鼠器官载菌量

将实验小鼠每3只为1组，分为对照组及实验组，腹腔分别注射野生型李斯特氏菌EGDe及减毒疫苗株EGDeABdd-dat，剂量为2×10⁷CFU。于注射24h后无菌取出小鼠脾脏及肝脏研磨制成单细胞悬液，生理盐水梯度稀释涂布BHI平板，置于37℃培养箱培养并计数。由图7可以看出，减毒疫苗株器官的载菌量明显低于野生型李斯特氏菌，进一步表明缺失四个基因后构建的该疫苗株毒力明显减弱，对细胞的侵袭性明显降低。

5.小鼠肝脏组织切片评估

将实验小鼠每3只为1组，分为对照组及实验组，腹腔分别注射PBS及减毒疫苗载体株EGDeABdd-dat，剂量为5×10⁷CFU(0.1倍LD50)。于注射72h后取肝脏甲醛固定后，石蜡包埋并切片，苏木素/伊红染色后显微镜下观察组织形态。由图8可以看出，正常小鼠的肝脏组织切片染色后可见细胞排列整齐，而疫苗载体组小鼠肝脏切片染色后可见轻微炎症反应(箭头处)，未见明显组织损伤情况，表明构建的该疫苗载体具有良好的安全性。

实施例3 缺失株的免疫效果评价

1.小鼠巨噬细胞免疫因子测定

将生长良好的小鼠巨噬细胞Raw264.7消化并转移至6孔细胞培养板中，待测细菌过夜培养后，按细菌：细胞＝100：1加入减毒疫苗载体株EGDeABdd-dat，PBS作为空白对照，共培养3h后，提取细胞RNA并反转录为cDNA，RT-PCR检测相关炎症因子，相关炎症因子引物按照NCBI公布的序列，由软件Prime 3设计。

由图9可以看出，以空白对照组细胞因子的表达量以1表示，减毒疫苗组的细胞因子TNF-α，IL-6，IL-1β的相对表达量较空白对照组显著增加，分别约为对照组的20倍、80倍、160倍，表明该减毒疫苗能够引起巨噬细胞免疫反应产生。

2.小鼠脾细胞免疫因子测定

将减毒疫苗载体株EGDeABdd-dat及空白对照PBS按照5×10⁷CFU的剂量腹腔注射6-8周龄C57BL/6小鼠，24h后取小鼠脾细胞研磨并提取总RNA，反转录为cDNA后，采用RT-PCR检测相关炎症因子产生情况，结果如图10所示。

由图10可以看出，由Th1细胞分泌的IL-6因子约升高为对照组的20倍，由Th2细胞分泌的IFN-γ细胞因子约升高为对照组的80倍，表明构建的该减毒疫苗载体可以诱导小鼠脾细胞特异性免疫T淋巴细胞的增值。

3.脾脏T细胞亚群的测定

将6-8周龄C57BL/6小鼠随机分成2组，每组6只，腹腔注射减毒疫苗载体株EGDeABdd-dat，同时设空白对照组。间隔3天免疫一次，在第3次免疫后的第7天，各组小鼠取脾脏，获得脾细胞悬液，并对细胞进行计数，用流式细胞仪(FACS)染色缓冲液稀释调整使其浓度为10⁷个/mL，分别用PE-CD8a的单抗、FITC-CD4的单抗及PECy5-CD3的单抗各5μL与脾脏细胞混合，4℃避光反应30min，FACS测定CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8a+T细胞的数量。由图11可见，构建的活疫苗载体能够引起CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8a+T细胞数量显著增加，表明减毒疫苗载体株在毒力降低的前提下仍具有良好的激发免疫应答的能力。

序列表

<110> 上海理工大学

<120> 一种用于递送及表达外源抗原的减毒单核细胞增生李斯特氏菌及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 978

<212> DNA

<213> Listeria monocytogenes

<400> 1

tataattgaa aaaattaact gctgcaaagc ttagttttgc ggcagtttct ttgtttcatt 60

aagtttttag atagttccaa aaattaacta tgcaaggaga gactcgagat gaaagtatta 120

gtaaataacc atttagttga aagagaagat gccacagttg acattgaaga ccgcggatat 180

cagtttggtg atggtgtata tgaagtagtt cgtctatata atggaaaatt ctttacttat 240

aatgaacaca ttgatcgctt atatgctagt gcagcaaaaa ttgacttagt tattccttat 300

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gggaatgtct atttacaagt gactcgtggt gttcaaaacc cacgtaatca tgtaatccct 420

gatgatttcc ctctagaagg cgttttaaca gcagcagctc gtgaagtacc tagaaacgag 480

cgtcaattcg ttgaaggtgg aacggcgatt acagaagaag atgtgcgctg gttacgctgt 540

gatattaaga gcttaaacct tttaggaaat attctagcaa aaaataaagc acatcaacaa 600

aatgctttgg aagctatttt acatcgcggg gaacaagtaa cggaatgttc tgcttcaaac 660

gtttctatta ttaaagatgg tgtattatgg acgcatgcgg cagataactt aatcttaaat 720

ggtatcactc gtcaagttat cattgatgtt gcgaaaaaga atggcattcc tgttaaagaa 780

gcggatttca ctttaacaga ccttcgtgaa gcggatgaag tgttcatttc aagtacaact 840

attgaaatta cacctattac gcatattgac ggagttcaag tagctgacgg aaaacgtgga 900

ccaattacag cgcaacttca tcaatatttt gtagaagaaa tcactcgtgc atgtggcgaa 960

ttagtgtttg caaaataa 978

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cccaccccgg aattcccggg gtataattga aaaaattaac t 41

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aagcttggct gcaggtcgac gttattttgc aaacactaat t 41

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agctcgtgaa gtacctagaa acgag 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agctcgtgaa gtacctagaa acgag 25

Claims

1.一种用于递送及表达外源抗原的减毒单核细胞增生李斯特氏菌，其特征在于：包括一种缺失毒力基因actA和inlB、并缺失了两个生长相关的基因dal与dat的单核细胞增生李斯特氏菌减毒株，所述的单核细胞增生李斯特氏菌减毒株中含有携带dat基因的质粒，所述的单核细胞增生李斯特氏菌减毒株的保藏号为CGMCC NO：14649。

2.权利要求1所述的一种用于递送及表达外源抗原的减毒单核细胞增生李斯特氏菌制备活疫苗载体的用途。

3.权利要求1所述的一种用于递送及表达外源抗原的减毒单核细胞增生李斯特氏菌制备免疫佐剂的用途。

4.权利要求1所述的一种用于递送及表达外源抗原的减毒单核细胞增生李斯特氏菌在制备抗单增李斯特氏菌的免疫制剂的用途。

5.一种疫苗载体，其特征在于：以权利要求1所述的一种用于递送及表达外源抗原的减毒单核细胞增生李斯特氏菌作为载体，用于携带外源抗原基因时起免疫激活的作用。