KR101178173B1 - 닭 인터페론-알파 유전자를 발현하는 살모넬라 균주 및 이를 함유하는 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 닭 인터페론-알파 유전자를 발현하는 살모넬라 균주 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 닭 인터페론-알파 유전자 발현벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는 약독화된 살모넬라 균주 (Salmonella typhimurium) 및 이를 포함하는 항바이러스용 또는 면역증강용 조성물에 관한 것이다. 또한 더 구체적으로는 상기 조성물의 경구투여용 사료첨가제로서의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 약독화된 살모넬라 균주는 항생제 내성을 염려할 필요가 없고 단기간 내에 항바이러스 효과 또는 면역반응 증강 효과를 나타내어 각종 바이러스 및 세균 감염 등에 신속한 저항성을 부여할 수 있으며 경구 투여에 의하여 재조합 단백질의 생산을 편리하게 유도할 수 있으므로, 고기능성 사료 첨가제로서 널리 사용될 수 있다.
닭 인터페론-알파 (chicken interferon-alpha, chIFN-α), 살모넬라 발현 벡터, 약독화된 살모넬라 균주, 사료 첨가제, 경구 투여, 항바이러스, 조류독감, 전염성기관지염, 전염성 F낭염, 뉴캐슬병
Description
본 발명은 닭 인터페론-알파 유전자 발현벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는 약독화된 살모넬라 균주 (Salmonella typhimurium) 및 이를 포함하는 항바이러스 활성용 또는 면역증강용 조성물에 대한 것이다.
인터페론은 바이러스 감염에 대하여 숙주에 강력한 저항성을 부여해주는 사이토카인으로 알려져 있다. 또한, 인터페론은 선천성 면역과 적응 면역을 조절함으로써 각종 미생물 감염에 대한 숙주의 면역반응을 조절함으로써 저항성을 높여준다. 그 외 인터페론은 각종 세포의 성장에 영향을 주고, 염증성 질환을 조절할 수 있는 능력을 갖고 있다. 인터페론은 두 개의 주요 그룹으로 나뉘어지는데 인터페론 감마(γ)가 포함된 type II 인터페론과 인터페론 알파(α), 베타(β), 델타(δ), 카파(κ), 람다(λ) 및 오메가(ω) 등이 포함된 type I 인터페론으로 나누어진다. Type II 인터페론은 주로 항원 또는 림프구 자극인자(mitogen)에 의하여 T 세 포, 자연살해 세포(natiral killer cell), B 세포 및 수지상 세포(dendritic cell)에 의하여 생산된다. 또한, type I 인터페론은 각종 바이러스를 비롯한 미생물 감염에 의하여 다양한 세포로부터 초기에 생산되는 강력한 면역조절 및 항바이러스성 물질로서, 생산된 type I 인터페론에 의하여 이웃 세포들이 감염에 대하여 저항을 갖게 됨으로써 숙주가 미생물 감염에 대하여 살아남을 수 있게 된다. 이와 같은 닭에서 생산되는 인터페론 알파를 포함한 type I 인터페론은 각종 바이러스 감염, 즉 전염성 기관지염 바이러스 (infectious bronchitis virus, IBV), 전염성 F 낭염 바이러스(infectious bursal disease virus, IBDV), 뉴-캐슬병 바이러스(New castle disease virus, NDV) 및 조류독감 바이러스 (Avian influenza virus, AI) 등 다양한 바이러스 감염에 대한 증식을 억제할 수 있을 것으로 여겨진다.
지금까지 인터페론을 비롯한 생물학적 활성을 나타내는 사이토카인의 발현은 대장균 발현 벡터를 이용하여 시도되어 왔다. 그러나, 대장균에 의한 외래 단백질의 생산은 발현 벡터의 선택을 위해 항생제 내성 마커를 사용해야 하므로, 항생제 내성 균주가 출현하는 경우 숙주에 직접적인 투여에 어려움이 있었다. 또한, 대부분 순수 정제하는 과정을 거치거나 세포 파괴 분획의 형태로 사용되어야 함으로, 농가에 응용되기에는 비용이 많이 소모되었다. 더욱이 대장균은 장 관계 내에 머물러 외래 단백질을 생산하기 때문에, 숙주의 몸 전체에 사이토카인의 효과를 부여할 수 없는 단점도 가진다.
한편, 살모넬라 균주는 장관계의 Peyer's patch의 M세포를 통과해 Peyer's patch내 또는 림프절에서 사이토카인을 발현함으로써 paracrine (인접세포에 작용) 또는 endocrine (먼거리에 존재하는 세포에 작용) 형태의 효력을 발휘할 수 있으므로, 살모넬라는 이와 같은 M 세포를 통과해 숙주 전체에 효과를 발휘할 수 있는 사이토카인 유전자를 발현할 수 있다. 이와 같은 살모넬라 균주를 함유하는 조성물과 관련하여, 대한민국 등록특허 제10-0790377호에서는 인터페론 감마를 발현하는 살모넬라 균주를 함유하는 항바이러스용 조성물에 관하여 개시하고 있으며, 또한 대한민국 등록특허 제10-0790377호에서는 인터페론 감마를 발현하는 살모넬라 균주 및 이를 함유하는 항암 치료용 조성물에 관하여 개시하고 있다. 상기 등록특허에서 개시하고 있는 살모넬라 균주는 약독화된 살모넬라 균주로서, aro A, aro B의 유전자를 변형시켜서 균주의 대사에 비정상이 일어나게 만듦으로써 약독화된 살모넬라 균주를 사용하여, 인터페론 감마가 발현되도록 형질전환된 살모넬라 균주 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로 상기 조성물은 특히 바람직하게는 비경구 투여임을 개시한 바 있다.
또한, 살모넬라 균주의 경우, 외래 단백질 발현에 이용되는 항생제 마커의 이용은 여전히 투여에 장애를 줄 수 있는바, 펩티도글리칸 (peptidoglycan)발현에 관계되는 aspartate β-semialdehyde dehydrogenase (Asd)의 유전자를 결핍시킴으로써 살모넬라균 (Asd-)은 정상적인 배양조건에서 자라지 못하고 DAP(diaminopimelic acid)의 존재 하에 증식가능하게 된다. 이에 따라, Asd 유전자를 갖고 있는 플라스미드에 사이토카인 유전자를 같이 클로닝함으로써 항생제 선택 마커를 이용하지 않고도 외래 단백질이 생산될 수 있는 체계의 약독화 살모넬라 제작이 가능해진다.
이에 본 발명자들은, 닭으로부터 인터페론-알파 (chicken interferon-α)유전자를 분리하여 그의 염기서열을 결정하고, 이를 포함하는 살모넬라 발현 벡터로 형질전환된 약독화 살모넬라 균주를 제작하고, 상기 살모넬라 균주 또는 이를 포함하는 조성물이 닭 인터페론 알파의 항바이러스 활성 또는 면역증강 활성 효과를 닭 숙주 전체에 나타낼 수 있음을 확인함으로써, 본 발명은 성공적으로 완성하였다.
본 발명은 닭 인터페론-알파 유전자 발현벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는 약독화된 살모넬라 균주 (Salmonella typhimurium)를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 상기 살모넬라 균주를 함유하는 항바이러스 활성 또는 면역 증강 활성을 갖는 조성물을 제공하고자 하며, 바람직하게는 상기 조성물의 경구투여용 사료 첨가제로서의 용도를 제공하고자 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 닭 인터페론-알파 유전자 발현 벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는 약독화된 살모넬라 균주 (Salmonella typhimurium) 및 이를 포함하는 항바이러스 활성용 또는 면역 증강용 조성물을 제공한다. 이러한 본 발명의 살모넬라 균주 또는 이를 포함하는 조성물은 닭 인터페론 알파의 다양한 생물학적 활성을 닭 숙주 전체에 효과를 나타낼 수 있음을 확인 하기 위하여, 본 발명에서는 항생제 선택 마커를 이용하지 않고도 닭 인터페론 알파의 발현을 이루면서 편리하게 경구 투여가 가능하게 할 수 있는 약독화 살모넬라를 이용함으로써, 장관계 뿐만 아니라 숙주 몸 전체 (total system)에 닭 인터페론 알파의 효과를 미칠 수 있는 닭 인터페론 알파 발현 약독화 살모넬라 균주를 제작하였고, 상기 살모넬라 균주 배양 농축액에서 닭 인터페론 알파 발현을 확인하였다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
본 발명의 제 1 견지에 의하면, 본 발명은 닭 인터페론-알파 유전자 발현 벡터로 형질 전환된 것을 특징으로 하는 약독화된 살모넬라 균주에 관한 것이다.
본 발명에 있어, 상기 닭 인터페론-알파 유전자를 코딩하는 유전자는 상용화된 어떤 인터페론-알파 발현 플라스미드로부터도 입수할 수 있으나, 바람직하게는 상기 인터페론-알파 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 발현벡터는 상기 인터페론-알파를 발현시킬 수 있는 프로모터와 클로닝을 위한 멀티클로닝사이트를 가지고 있는 어떤 발현벡터도 사용할 수 있으나, 바람직하게는 pYA3560(chIFN-α)인 것이 바람직하다(도 1 참고).
본 발명에 있어서, 살모넬라(Salmonella typhimurium) 균주는 장티푸스를 유발하는 group D Salmonella에 속하는 병원균으로서, 본 발명에서는 상기 살모넬라 균주의 병원성을 없애기 위하여 약독화된 (attenuated) 살모넬라균주를 사용하였는 바, 약독화란 살아있는 병원체의 독성을 인공적으로 약하게 한 것으로, 병원체의 필수 대사에 관여하는 유전자를 변이시켜 체내에서 질병을 일으키지 못하고, 면역 체계만을 자극해서 면역성을 유도하는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서 살모넬라 상기 약독화된 살모넬라 균주(숙주)는 아스팔테이트 베타-세미알데하이드 디하이드로게나제 (aspartate β-semialdehyde dehydrogenase, Asd) 유전자가 결핍된 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium) 균주인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 상기 Asd 결핍 살모넬라 균주는 살모넬라 티피뮤리움 χ8501균주일 수 있다. 이러한 Asd 결핍 살모넬라 균주, Asd 유전자를 포함하는 플라스미드에 닭 인터페론-알파 유전자를 함께 클로닝하는 것을 이용하여 제작할 수 있으며, 이러한 균주는 항생제 선택 마커를 이용하지 않고도 닭 인터페론-알파 단백질을 생산할 수 있다. 따라서 상기 제작된 약독화된 살모넬라 균주는 경구 투여방법으로 다양한 재조합 단백질의 강력한 생리 활성들을 숙주의 장 관계 뿐 만아니라 몸 전체에 미치게 할 수 있다.
또한, 바람직하게는 상기 형질전환된 살모넬라 균주는 살모넬라 티피뮤리움 χ8501(chIFN-α)균주일 수 있다.
또한, 본 발명에서 닭 인터페론-알파 단백질을 발현하는 살모넬라 균주는 당업계에서 통상적으로 사용하는 형질전환 방법에 의하여 제조 가능하다.
본 발명의 제 2견지에 의하면, 본 발명은 상기에서 설명한 살모넬라 균주를 함유하는 것을 특징으로 하는 항바이러스 활성용 또는 면역 증강용 조성물에 관한 것이다. 상기 항바이러스 활성 및 면역 증강 활성은 닭 인터페론-알파가 발현됨으로 인한 어떤 바이러스에 대한 활성 또는 면역 증강활성일 수 있으나, 바람직하게는 닭 전염성 기관지 염(infectious bronchitis, IB), 전염성 F낭병(infectious bursal disease, IBD), 조류독감(avian influenza, AI), 뉴-캐슬병(New Castle disease, ND) 또는 닭 전염성 후두기관지염(Infectious Laryngotrachitis, ILT) 등의 원인 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 가질 수 있다.
또한 본 발명에 있어서, 상기 조성물에 함유된 살모넬라 균주는 항생제 내성을 염려할 필요 없이 단기간 (12 시간 내지 24시간)내에 면역 반응을 나타내어 각종 바이러스 및 세균 감염 등에 신속한 저항성을 부여할 수 있고, 경구 투여에 의하여 재조합 단백질의 생산을 편리하게 유도할 수 있으므로, 상기 살모넬라 균주를 함유하는 조성물은 경구투여용 사료 첨가제인 것이 가장 바람직하다.
또한 본 발명에 있어서, 상기 조성물에 포함되는 살모넬라 균주는 가장 바람직하게는, 그 배양액 내 단백질 기준으로 0.1 내지 100㎍/ml, 바람직하게는 0.2 내지 50㎍/ml, 보다 바람직하게는 0.38 내지 3.0㎍/ml의 농도로 첨가될 수 있다.
이와 같이 본 발명에 의하는 경우, 백신에 의하여 나타나는 저항성 (백신 투여 후 7 내지 10일 째 나타남)과 달리, 경구 투여 후 12 내지 24시간 안에 장관계에서 닭 인터페론- 알파를 생산하여 짧은 시간 내에 닭 숙주에서 저항성을 나타낼 수 있게 된다.
특히, 생리활성을 갖는 사이토카인의 투여는 생산 단가가 높고 투여 시에 어 려움이 있는 주사 또는 순수 정제된 단백질을 이용해야 하는데 반하여, 상기 경구 투여가 가능한 약독화된 살모넬라 균주를 포함하는 본 발명의 조성물은 장 관계 뿐만 아니라 숙주 전체 (total system)에 닭 인터페론-알파가 발현되어 면역증강 효과를 미칠 수 있고 사료 첨가제로서 배합가능하며 편리하게 투여 가능하다. 즉, 상기 약독화된 살모넬라 균주 배양 후 단 한번의 원심분리로 약독화 살모넬라 균주를 농축하여 사료와 함께 또는 단독으로 경구 투여할 수 있다.
또한, 대장균 등의 세균을 이용한 외래 사이토카인 발현은 항생제 선택 마커를 이용하기 때문에 숙주에 직접 투여하는 경우 향후 항생제 내성 균주가 출현할 염려가 있어 살아 있는 상태로 투여할 수 없는데, 본 발명의 조성물은 약독화 살모넬라 균주를 세균 증식에 필수적인 펩티도글리칸 합성에 이용되는 asd 유전자가 결핍된 것을 사용하고 동시에 항생제 선택 마커가 포함되지 않은 Asd발현 플라스미드를 이용함으로써 항생제 내성 균주의 출현을 배제시킬 수 있다.
또한 인터페론은 강력한 항바이러스 효과 외에 다양한 백신에 대한 면역 반응을 증강시킬 수 있으므로, 닭 인터페론-알파 발현 약독화 살모넬라 균주는 백신과 같이 투여되어 백신의 면역반응을 증강시키는 면역증강 사료 첨가제 등으로 사용될 수 있다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 닭 인터페론-알파 (chicken interfron-α) 유전자 발현벡터로 형질전환된 살모넬라 균주 및 이를 포함하는 항 바이러스 활성용 또는 면역증강 활성용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 약독화된 살모넬라 균주는 항생제 내성을 염려할 필요가 없고 단기간 (12 시간 내지 24 시간) 내에 면역 반응을 나타내어 각종 바이러스 및 세균 감염 등에 신속한 저항성을 부여할 수 있으며 경구 투여에 의하여 재조합 단백질의 생산을 편리하게 유도할 수 있으므로, 고기능성 사료 첨가제로서 널리 사용될 수 있다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1. 바이러스, 세포 및 세균의 배양>
닭 인터페론 알파의 항바이러스 효과를 측정하기 위해 사용된 바이러스주는 전염성 F낭병 (infectious bursal disease, IBD-215 strain), 뉴-캐슬병(New Castle disease, ND Lasota strain) 및 조류독감 (Avian influenza, AI H9N2 CE01310 국내분리주)을 유발하는 바이러스가 이용되었으며, 10-12일 정도 부화란을 이용하여 증폭된 바이러스를 준비하였다. 항바이러스 효과 측정시 이용되는 조류 섬유아세포 배양주(Chicken embryonic fibroblast)는 10-12일 정도 부화된 발육란으로부터 태아로부터 준비되었다. 발육된 태아를 무균적으로 수집하고 머리, 날개 및 다리를 제거하였다. 몸체를 작은 조각으로 절단하고 1 mM EDTA가 포함된 PBS (pH 7.5)으로 2회 세척하고 다시 혈청이 포함되지 않은 DMEM으로 1회 세척 후 trypsin-PBS로 실온에서 30분간 몸체 조직을 분쇄하였다. 거어즈로 큰 조각은 걸러내고 다시 800×g에서 10분간 원심분리하고 얻어진 조류 섬유아세포는 DMEM 배지 (Dulbecco's modified Eagle medium)에 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum)과 항생제 페니실린 (100 U/ml) 및 스트렙토마이신 (100 ㎍/ml)이 포함된 세포배양액을 이용하여 5% CO2 배양기에서 유지되었다.
또한, 대장균 (Escherichia coli) χ6212 (F-λ-Φ80Δ(lacZYA-argF) endA1 recA1 hsdR17 deoR thi-1 glnV44 gyrA96 relA1 ΔasdA4)과 살모넬라 엔테리카 (Salmonella enterica serovar Typhimurium) χ8501 (hisG Δcrp-28 ΔasdA16)은 DAP(50 ㎍/ml)이 포함된 LB 배지 (Luria-Bertani broth)를 사용하여 배양되었다. asd 유전자를 발현하는 플라스미드 pYA3560을 이용하여 chIFN-α 유전자를 발현하는 살모넬라 균주를 선별할 때에는 DAP을 포함하지 않은 LB 아가배지를 사용하였다.
<실시예 2. 닭 비장세포의 배양 및 자극>
20일령 정도의 닭을 치사시킨 후 닭 비장을 꺼내 비장의 캡슐을 메쉬(mesh)를 이용하여 비장세포 현탁액을 준비하고, 협잡된 적혈구는 NH3Cl 저장 용액 (hypotonic solution)을 37℃에서 10분간 처리하여 용해시켰다. 다시 회수된 비장 세포는 PBS 완충용액(pH 7.4)으로 두 번 세척하고 마지막에 10% 우태아 혈청, 페니실린 (100 U/ml)-스트렙토마이신 (100 ㎍/ml) 및 2 mM L-글루타민이 포함된 RPMI 배지를 사용하여 재현탁하였다. 살아있는 세포의 수는 트립판 블루 방법 (trypan blue exclusion)에 의하여 계수하고 5×106 세포/ml의 농도로 맞추어 24-웰 배양 플레이트에서 배양하였다. 분리된 비장세포는 10 ㎍/ml lipopolysaccharide (LPS, Sigma, St. Louis, MO) 존재하에 48시간 동안 배양하여 LPS 자극을 시행하였다.
<실시예 3. 전체 닭 RNA 추출 및 닭 인터페론-알파 유전자 증폭>
LPS로 자극된 닭 비장세포로부터 전체 RNA를 분리하기 위하여, RNA 추출 키트 (easy-BLUE total RNA extraction kit; iNtRON Biotech., Daejeon, Korea)를 사용하였다. 자극된 비장세포를 원심분리 (3500×g, 15분)하여 상층액을 제거하고 PBMC를 회수한 다음 easy-BLUE 용액 750㎕에 재현탁하였다. 또한 15초간 강하게 혼합한 후 상온에서 5분간 방치하고 클로로포름 용액 200를 넣고 또 다시 15초간 강하게 혼합하였다. 그 결과 얻은 세포는 13,000 rpm, 4℃에서 15분간 원심분리하고 상층액을 조심스럽게 회수하였다. 회수된 상층액에 동량의 이소프로판올을 넣고 조심스럽게 섞은 후 10분간 상온에 방치한 다음 다시 13,000 rpm, 4℃에서 15분간 원심분리하였다. 얻어지는 침전물에 70% 에탄올을 넣어 세척한 후 RNase가 없는 증류수에 녹인 후 닭인터페론-알파(chicken interferon-alpha, chIFN-α) 유전자 증폭에 사용하였다. chIFN-α유전자를 증폭시키기 위하여, 서열번호: 2의 프라 이머 F1 (5'-ATG GCT GTG CCT GCA AGC CCA-3') 및 서열번호: 3의 프라이머 F2 (5'-CTA AGT GCG CGT GTT GCC TGT-3')를 사용하였다. 이로부터 얻은 cDNA는 분리된 전체 RNA 5 ㎍를 역 프라이머와 혼합하여 5분간 끓인 후, 즉시 얼음에 넣고 5분간 냉각시켜 10,000 rpm에서 1분간 원심분리하였다. 첫 번째 cDNA 가닥 (first-strand cDNA)은 5 ㎍ 전체 RNA와 40 유닛 RNAsin (Promega사 제품), 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 3 mM MgCl2, 75 mM KCl, 10 mM DTT, 0.4 mM dATP, 0.4 mM dCTP, 0.4 mM dTTP, 0.4 mM dGTP, 역프라이머를 첨가한 50 ㎕ 반응액에 넣고 50℃에서 2분간 반응시킨 다음, 4 유닛 역전사효소 (SUPERSCRIPT II RNaseH- Reverse transcriptase, GIBCO BRL)를 첨가하여 50℃에서 50분간 반응시켜 합성하였다. 합성된 cDNA 10 ㎕는 chIFN-α 특이 프라이머 F1, F2를 넣고 95℃, 5분간 변성시킨 후 50℃ 1분, 72℃ 2분, 92℃ 1분씩 30 순환과정으로 증폭 반응시킨 다음 72℃ 10분간 반응시켜 증폭을 마무리하였다. 증폭된 chIFN-α 유전자는 아가로스 젤을 이용하여 분석하고 서열번호 1의 582 bp 유전자의 증폭을 확인하였다(도 2 참조).
<실시예 4. 닭 인터페론-알파 유전자의 염기서열 분석>
LPS 자극된 닭 비장세포로부터 증폭된 chIFN-α 유전자는 클로닝벡터 pCR®2.1-TOPO (Invitrogen)에 클로닝하고 서열번호 4의 M13 프라이머 (5'-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3')를 이용하여 자동화 서열분석기 (ABI PRISM 3730 fluorescent Big Dye Terminator v.3.1)로 분석하였다(도 3 참조).
<실시예 5. 닭 인터페론-알파 발현 벡터의 제작>
약독화 살모넬라 균주 (Asd-)에서 재조합 발현 벡터로 이용되는 pYA3560 벡터에 증폭된 chIFN-α 유전자를 클로닝하기 위하여, chIFN-α 유전자를 클로닝한 pCR®2.1-TOPO 벡터와 pYA3560 벡터를 제한 효소 EcoRI로 절단하였다. 상기 유전자 절편은 아가로스 상에서 분리 키트 (MEGA-spinTM Agarose extraction kit; iNtRON)를 이용하여 순수 정제하고, T4 DNA 라이게이즈 (New England Biolab)를 이용하여 라이게이션하였다. E. coli χ6212를 숙주 박테리아로 하여 diaminopimelic acid (DAP, Sigma)가 존재하지 않는 LB 아가배지에서 발현 벡터 pYA3560(chIFN-α)로 형질전환된 E. coli χ6212균주를 선별하였다. 상기 재조합 발현 벡터 pYA3560(chIFN-α)는 E. coli χ6212로부터 DNA를 분리하여 제한 효소 EcoRI로 절단하여 확인하고 유전자 삽입의 방향성을 확인하기 위하여 유전자 염기서열에 의하여 확인하였다(도 4 참조).
<실시예 6. 닭 인터페론-알파를 발현하는 약독화된 살모넬라 균주의 제작>
서열번호 1의 chIFN-α 유전자가 클로닝된 재조합 발현 벡터 pYA3560(chIFN-α)를 전기충격법 (electroporation)에 의하여 살모넬라 티피뮤리움 (S. typhimurium) χ8501에 형질전환(transformation)시키고 형질전환된 살모넬라 티피뮤리움 χ8501(swIFN-α) 균주를 얻었다. 살모넬라 티피뮤리움은 DAP (50 ㎍/ml)이 포함된 LB 배지에서 로그 상태 (mid-log phase)까지 배양한 후 멸균된 차가운 (ice-cold) WB 용액 (WB = 10% ultrapure glycerol, 90% distilled water, v/v)을 이용하여 두 번 세척하였다. 준비된 살모넬라 티피뮤리움 χ8501 (1×108 cfu)을 0.2 cm 큐벳에 넣고 플라스미드 0.1 ㎍과 섞은 다음 유전자 펄서 (Bio-Rad Gene Pulser)를 이용하여 2.5 kV, 25 ㎌, 200 Ω에서 전기충격을 가한 후 큐벳에서 회수하였다. 이로부터 얻은 세포는 DAP을 넣지 않은 LB 배지 1 ml에 넣고 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 형질전환된 살모넬라균을 선별하기 위하여 배양된 균주 100 ㎕를 다시 DAP을 넣지 않은 LB 아가배지에 스프레딩하고 형성되는 콜로니를 선별하였다. 재조합 발현 벡터 pYA3560(chIFN-α)에 의하여 형질전환된 살모넬라 균주는 LB 배지에서 다시 배양하고 플라스미드 DNA를 분리한 다음 제한 효소 EcoRI로 분절하여 유전자의 존재를 확인하였다(도 4 참조).
<실시예 7. 약독화된 살모넬라 균주에서 닭 인터페론-알파의 발현 확인>
약독화된 살모넬라 균주로부터 닭 인터페론-알파가 발현되어 세포 외로 분비되는지 여부를 확인하기 위하여, 형질전환된 S. typhimurium χ8501(pYA3560/chIFN-α)을 DAP을 넣지 않은 LB 배지에서 각각 12시간, 18시간 및 24시간 동안 배양하고 7,000 rpm에서 원심분리하고 상층액을 회수하여 세균을 분리하였다. 세포상층액은 차가운 trichloroacetic acid(TCA, Sigma) 용액을 이용하여 농축시키고 SDS-PAGE와 웨스턴 블럿을 이용하여 분석하였다. 농축된 단백질을 SDS-PAGE에 의하여 크기 별로 전개시킨 후 니트로셀룰로스 막 (nitrocellulose membrane)으로 옮긴 다음, chIFNA-α단백질의 존재를 chIFN-α에 대한 단일클론항체 UMCh3-IFNa (Serotec)을 이용하여 확인하였다(도 5 참조).
<실시예 8. 닭 인터페론-알파를 발현하는 약독화된 살모넬라 균주의 전염성 F낭염 바이러스(IBDV)에 대한 항바이러스 효과 조사>
상기 형질전환된 약독화 살모넬라 균주으로부터 발현된 배양액 내에서의 닭 인터페론-알파의 항바이러스 효과를 조사하기 위하여, 세포 배양액을 이용하여 세포병변 억제 정도를 측정하였다. S. typhimurium χ8501(pYA3560/chIFN-α) 균주는 18시간 동안 배양하고 배양액을 회수한 다음 불필요한 유기산들을 컷-오프 막 (cut-off membrane; Amicon Ultra-15, cut-off size= 15,000 dalton)을 이용하여 제거하고 농축하였다. 농축된 배양액은 BCA 단백질 분석용액 (protein assay reagent; Pierce, Rockford, IL)을 이용하여 단백질을 정량하고 -70℃에 보관하였다. 닭 전염성 F낭염 바이러스(Infectious bursal disease virus, IBDV)에 대한 배양액의 항바이러스 효과를 측정하기 위하여 10 일정도 부화된 발육란으로부터 조류 섬유아세포 (chicken embryonic fibroblast, CEF)를 준비하여 96-웰 마이크로플레이트에 5×104 세포/웰 농도로 분주하고 24시간 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 형성된 세포단층을 확인한 후 기존의 배양액을 버리고 우태아 혈청이 포함되지 않은 DMEM 배양액으로 두 번 세척하였다. S. typhimurium χ8501(chIFN-α)의 배양 액을 단백질 기준 3.0 ㎍/㎕를 최고 농도로 하여 두 배씩 계열 희석하여 각 웰에 처리한 다음 다시 12시간 동안 배양하였다. 상기 배양액에 전처리된 CEF 세포를 다시 우태아 혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지로 두 번 세척하고, 우태아 혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지로 희석된 IBDV IBD-215 strain을 CEF 세포 단층에 접종하였다. 1시간 30분간 배양한 후 5% 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배지를 넣고 각 웰당 100 ㎕의 양으로 맞추어 배양액을 처리하지 않은 바이러스 대조군 (virus control)에서 세포병변 현상이 일어날 때까지 배양하였다.
그 다음 바이러스 대조군에서 세포병변 현상이 관찰되면 기존의 배양액을 버리고 크리스탈 바이올렛 용액 (crystal violet; 2% w/v in 70% methanol)을 100 ㎕씩 각 웰에 분주하고 5분간 상온에서 방치하여 살아있는 세포를 고정시켰다. 흐르는 물로 과량의 크리스탈 바이올렛을 제거하고 건조한 다음 살아있는 세포를 기록하였다. 그 다음 각 웰에 메탄올을 100 ㎕씩 분주하여 크리스탈 바이올렛을 용해시켜 각 웰의 살아있는 세포의 수를 비교하였다(도 6 참조).
<실시예 9. 닭 인터페론-알파를 발현하는 약독화된 살모넬라 균주의 뉴 캐슬병바이러스에 대한 항바이러스 효과 조사>
형질 전환된 약독화 살모넬라 균주로부터 발현된 배양액 내의 닭 인터페론-알파의 항바이러스 효과를 또 다른 바이러스로서 뉴캐슬병바이러스(New Castle disease virus, NDV Lasota strain)에 대하여 수행하였다. 조류 섬유아세포 (chicken embryonic fibroblast, CEF)를 준비하여 96-웰 마이크로플레이트에 5×104 세포/웰 농도로 분주하고 24시간 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 형성된 세포단층을 확인한 후 기존의 배양액을 버리고 우태아 혈청이 포함되지 않은 DMEM 배양액으로 두 번 세척하였다. S. typhimurium χ8501(pYA3560/chIFN-α)의 배양액을 단백질 기준 3.0 ㎍/㎕를 최고 농도로 하여 두 배씩 계열 희석하여 각 웰에 처리한 다음 다시 12시간 동안 배양하였다. 상기 배양액에 전처리된 CEF 세포를 다시 우태아 혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지로 두 번 세척하고, 우태아 혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지로 희석된 NDV Lasota strain을 CEF 세포 단층에 접종하였다. 1시간 30분간 배양한 후 5% 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배지를 넣고 각 웰당 100 ㎕의 양으로 맞추어 배양액을 처리하지 않은 바이러스 대조군 (virus control)에서 세포병변 현상이 일어날 때까지 배양하였다.
그 다음 바이러스 대조군에서 세포병변 현상이 관찰되면 기존의 배양액을 버리고 크리스탈 바이올렛 용액 (crystal violet; 2% w/v in 70% methanol)을 100 ㎕씩 각 웰에 분주하고 5분간 상온에서 방치하여 살아있는 세포를 고정시켰다. 흐르는 물로 과량의 크리스탈 바이올렛을 제거하고 건조한 다음 살아있는 세포를 기록하였다. 그 다음 각 웰에 메탄올을 100 ㎕씩 분주하여 크리스탈 바이올렛을 용해시켜 각 웰의 살아 있는 세포의 수를 비교하였다(도 7 참조).
<실시예 10. 닭 인터페론-알파를 발현하는 약독화된 살모넬라 균주의 발육란 을 이용한 조류독감 바이러스에 대한 항바이러스 효과 조사>
형질전환된 약독화 살모넬라 균주로부터 발현된 배양액내의 닭 인터페론-알파의 생체내 항바이러스 효과를 접근하기 위하여 발육란을 이용하여 측정되었다. 생체내 항바이러스 효과를 측정하기 위하여 이용된 바이러스는 조류독감 바이러스 (Avian inlfuenza virus H9N2 CE01310 국내 분리주)를 이용하여 평가되었다. 10-12일 정도 부화된 발육란에 S. typhimurium χ8501(pYA3560/chIFN-α)의 배양액을 단백질 기준 700 ㎍, 350 ㎍, 175 ㎍, 87 ㎍, 그리고 43 ㎍에 해당되는 양을 각각 5개의 발육란의 양막 내에 주입하고 24 시간동안 부화기에서 배양하였다. 상기 배양액이 주입된 발육란에 다시 각 발육란에 AI H9N2 바이러스 4 HA unit/egg 또는 40 HA unit/egg를 주입하고 다시 72시간동안 37℃에서 배양하였다. 다시 조류독감 바이러스를 주입한 발육란으로부터 양막액을 회수하여 존재하는 조류독감 바이러스의 양을 혈구 응집반응 (hemagglutination assay)에 의하여 측정하였다.
혈구응집반응은 닭 적혈구를 이용하여 측정되었다. 닭으로부터 Alsever solution을 이용하여 수집된 혈액을 PBS (pH=7.4)로 3회 원심, 세척하고 50% 현탁액 상태로 4℃에 보관하였다. 조류독감 바이러스로 접종된 발육란으로부터 회수된 양막액 50㎕을 취하여 96-웰 플레이트에서 2진 계열 희석하고 준비된 50% 닭 적혈구를 희석하여 0.6% 닭 적혈구 현탁액 50 ㎕를 희석된 양막액에 혼합하였다. 1시간 동안 37℃에서 배양한 후 닭 적혈구의 응집을 판독하여 양막액 내에 존재하는 조류독감 바이러스의 양을 분석하였다. 존재하는 조류 독감 바이러스의 양은 단위 부피(50 ㎕)당 hemagglutination unit (HA unit)으로 표시하였다 (도 8 참조).
그 결과, 본 발명의 약독화된 살모넬라 균주는 37℃에서 배양시 12 시간 내에 재조합 닭 인터페론-알파를 발현하는 것으로 관찰되었고, 배양액 내 단백질 기준으로 0.38 ㎍/ml 이상의 농도에서 전염성 F낭염 바이러스와 뉴캐슬병바이러스를 비롯한 다양한 바이러스의 증식을 억제할 수 있는 항바이러스 효능을 나타내는 것을 알 수 있었다. 또한, 생체내에서의 항바이러스 효과를 발육란을 이용하여 조류독감바이러스에 대한 항바이러스 효과를 측정하였을 때 각 발육란에 43 ㎍/egg를 주입하였을 때 5 발육란 중 3개의 발육란에서 조류 독감바이러스 증식이 유도되었고, 175 ㎍/egg에서는 1개의 발육란에서 조륙 독감 바이러스가 증식되었고, 350 ㎍/egg에서는 5개의 발육란 중 조류독감 바이러스의 증식이 관찰되지 않았다. 따라서, 적어도 43 ㎍이상이 주입된 발육란에서 조류 독감 바이러스를 비롯한 다양한 바이러스의 숙주내 증식을 억제하는 것으로 보여진다.
따라서, 본 발명의 약독화된 살모넬라 균주 및 이로부터 발현되는 닭 인터페론-알파는 경구 투여 후 12시간 이내에 장관계에서 효과적으로 생산될 수 있고, 그로부터 이루어진 닭 인터페론-알파는 닭 숙주는 전염성 F낭염, 전염성 기관지염, 뉴캐슬병, 전염성 후두기관지염, 조류독감을 비롯한 다양한 바이러스 감염에 대하여 신속한 저항성을 나타낼 수 있음으로 유용한 경구 전달체로 평가되었다.
본 발명은 일 실시예를 참고로 설명되었으나, 이는 예시적인 것에 불과하며, 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의해 정해져야 할 것이다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 약독화된 살모넬라 균주는 항생제 내성을 염려할 필요가 없고 단기간 내에 면역반응을 나타내어 각종 바이러스 및 세균 감염 등에 신속한 저항성을 부여할 수 있으며 경구 투여에 의하여 재조합 단백질의 생산을 편리하게 유도할 수 있으므로, 고기능성 사료 첨가제로서 널리 이용될 수 있다.
도 1은 닭 인터페론-알파(chIFN-α)를 발현하는 약독화된 살모넬라 균주의 제작 과정 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 닭 비장세포로부터 유래한 닭 인터페론-알파(chIFN-α) 유전자를 RT-PCR로 증폭시킨 유전자 산물을 나타낸 것이다.
도 3은 닭 인터페론-알파(chIFN-α)의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 4는 닭 인터페론-알파 유전자를 포함하는 클로닝 벡터 pCR2.1-TOPO(A) 및 약독화된 살모넬라 발현 벡터 pYA3560(B)를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 형질전환된 살모넬라 균주의 배양액 내에서 닭 인터페론-알파 단백질의 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 닭 인터페론-알파 (chIFN-α) 발현 약독화 살모넬라 균주 배양액의 전염성 F 낭염 바이러스(IBDV)에 대한 항바이러스 효과를 나타낸 것이다.
도 7은 닭 인터페론-알파 (chIFN-α) 발현 약독화 살모넬라 균주 배양액의 뉴캐슬(New Castle) 바이러스(NDV)에 대한 항바이러스 효과를 나타낸 것이다.
도 8은 닭 인터페론-알파 (chIFN-α) 발현 약독화 살모넬라 균주 배양액의 조류독감 바이러스 (Avian influenza virus, AIV)에 대한 발육란을 이용한 항바이러스 효과를 나타낸 것이다.
<110> Industrial Cooperation Foundation Chonbuk National University
<120> A bacterium salmonella expressing chicken interferon alpha
protein and composition thereof
<160> 4
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 606
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> chicken interferon-alpha
<400> 1
gaattcgccc ttatggctgt gcctgcaagc ccacagcacc cacgggggta cggcatcctg 60
ctgctcacgc tccttctgaa agctctcgcc accaccgcct ccgcctgcaa ccaccttcgc 120
ccccaggatg ccaccttctc tcacgacagc ctccagctcc tccgggacat ggctcccaca 180
ctaccccagc tgtgctcaca gcacaacgcg tcttgctcct tcaacgacac catcctggac 240
accagcaaca cccggcaagc cgacaaaacc acccacgaca tccttcagca cctcttcaaa 300
atcctcagca gccccagcac tccagcccac tggaacgaca gccaacgcca aagcctcctc 360
aaccggatcc accgctacac ccagcacctc gagcaatgct tggacagcag cgacacgcgc 420
tcccggacgc gatggcctcg caaccttcac ctcaccatca aaaaacactt cagctgcctc 480
cacaccttcc tccaagacaa cgattacagc gcctgcgcct gggaacacgt ccgcctgcaa 540
gctcgtgcct ggttcctgca catccacaac ctcacaggca acacgcgcac ttagaagggc 600
gaattc 606
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
atggctgtgc ctgcaagccc a 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
ctaagtgcgc gtgttgcctg t 21
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
caggaaacag ctatgac 17
Claims (10)
- 닭 인터페론-알파 유전자 발현벡터로 형질전환되고 아스팔테이트 베타-세미알데하이드 디하이드로게나제 (aspartate β-semialdehyde dehydrogenase, Asd) 유전자가 결핍된 것을 특징으로 하는 약독화된 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium) 균주.
- 제 1 항에 있어서, 상기 인터페론-알파 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 살모넬라 균주.
- 제 1 항에 있어서, 상기 발현벡터는 pYA3560(chIFN-α)인 것을 특징으로 하는 살모넬라 균주.
- 제 1항에 있어서, 상기 Asd 결핍 살모넬라 균주는 살모넬라 티피뮤리움 χ8501 균주인 것을 특징으로 하는 살모넬라 균주.
- 제1항에 있어서, 상기 형질전환된 살모넬라 균주는 살모넬라 티피뮤리움 χ8501(swIFN-α)균주인 것을 특징으로 하는 살모넬라 균주.
- 제 1 항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 살모넬라 균주를 함유하는 것을 특징으로 하는 항바이러스 활성용 또는 면역증강용 조성물.
- 제 6항에 있어서, 상기 항바이러스 활성은 전염성 F낭염(Infectious bursal disease), 전염성 기관지염(Infectious bronchitis), 뉴캐슬병(New Castle disease), 전염성 후두기관지염(Infectious laryngotracheitis) 또는 조류독감(avian influenza) 으로 이루어진 군에서 선택된 질병에 대한 항바이러스 활성인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 6 항에 있어서, 상기 조성물은 경구 투여용 사료첨가제인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 6 항에 있어서, 상기 살모넬라 균주는 배양액 단백질 기준으로 0.1 내지 100 ㎍/ml의 농도로 함유됨을 특징으로 하는 조성물.
- 제6항의 조성물을 이용하여 항생제 저항성 없이 항 바이러스 활성 증진 또는 면역을 증강하는 방법.
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