CN105142665A

CN105142665A - 增强对艾美球虫的免疫应答或限制艾美球虫感染的组合物和方法

Info

Publication number: CN105142665A
Application number: CN201480021011.6A
Authority: CN
Inventors: J·R·巴尔塔; L·贝里曼; L·比耶尔克; B·哈吉斯; S·施瓦拉迈亚; O·B·福克纳
Original assignee: University of Guelph; Texas A&M University System
Current assignee: University of Guelph; University of Arkansas; Texas A&M University System; Texas A&M University
Priority date: 2013-02-14
Filing date: 2014-02-14
Publication date: 2015-12-09
Also published as: CN111956796A; HUE047484T2; BR112015019283B1; EA201591488A1; EP2956165A4; PL2956165T3; JP2019073554A; HK1218880A1; US20190298815A1; EP2956165B1; PT2956165T; ZA201505638B; EP3610887B8; AR094791A1; JP6874031B2; DK2956165T3; ES2758759T3; US11904005B2; CL2015002273A1; CA2900644C

Abstract

本文提供疫苗载体和使用疫苗载体来增强对顶复门寄生虫的免疫应答以及降低与继发感染相关的发病率或死亡率的方法。所述疫苗载体包括编码菱状体多肽的多核苷酸，以及任选地包括适合表达在疫苗载体表面的免疫刺激性多肽。

Description

增强对艾美球虫的免疫应答或限制艾美球虫感染的组合物和方法

相关申请的交叉参考

本专利申请要求2013年2月14日提交的美国临时专利申请号61/764,681的优先权权益，该临时专利申请的全部内容在此通过引用并入此处。

序列表

本申请是通过EFS-Web电子提交的，并且包含电子提交的txt格式的序列表。该txt文件包含题目为“2014-02-13_5658-00201_ST25.txt”的序列表，其创建于2014年2月13日，大小是40.3千字节。这个txt文件中包含的序列表是说明书的一部分，因此通过引用其全部并入此处。

技术领域

球虫病(coccidiosis)是由顶复门(apicomplexan)原生动物寄生虫(艾美球虫属(Eimeriaspp.)和相关寄生虫)引起的禽、猪和牲畜的传染性疾病，是世界范围的难题。由于球虫病对禽业估计高达每年二十亿美元生产损失的经济影响，球虫病是禽的前十大传染性疾病。其它顶复门寄生虫也引起疾病，包括疟原虫(Plasmodium)、隐孢子虫(Cryptosporidium)和弓形虫(Toxoplasma)，其分别是疟疾、隐孢子虫病和弓形虫病的病原体。

背景技术

球虫病的典型症状包括食欲的迅速丧失、体重减轻、腹泻和急剧的死亡率。当群体暴露于高水平病原体时以及在大多数情况下易感染球虫病的鸟暴露于继发性细菌感染时，在群体中爆发球虫病。传统的疾病控制方法包括施用抗生素和化学治疗试剂。然而，随着持续使用，这引发耐药性问题。使用抗生素也降低社会对禽肉的接受度。因为接种疫苗能够赋予长期保护(通常是商用鸡的整个生命周期)，所以接种疫苗是合理的方法。

针对艾美球虫的大多数商业上可获得的疫苗，基于控制的低剂量的基本上完全毒力的但对药物敏感的艾美球虫寄生虫。使用目前基于艾美球虫的疫苗进行接种疫苗，在接种的群体中产生大量疫苗反应发病率和经济损失。因此，需要针对艾美球虫的有效的低毒力疫苗。基于保守的免疫原性靶标的针对艾美球虫的有效疫苗，也可能被证明可用作针对其它顶复门寄生虫的疫苗。

发明内容

此处提供一种包含编码顶复门菱状体(ApicomplexanRhomboid)多肽的第一多核苷酸序列的疫苗载体，及其使用方法。

在一方面，公开了一种疫苗载体，其含有编码顶复门菱状体多肽或其免疫原性片段的第一多核苷酸和编码免疫刺激性多肽的第二多肽序列。合适地，顶复门菱状体多肽和免疫刺激性多肽表达在疫苗载体的表面。顶复门菱状体多肽可包含SEQIDNO:1，SEQIDNO:2，SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:37，SEQIDNO:38，SEQIDNO:1-4、37-38的至少一个的免疫原性片段，或SEQIDNO:1-4和37-38的组合。免疫刺激性多肽可以是能够结合CD40的CD154多肽或HMGB1多肽。所述CD154多肽包含不多于50个氨基酸，以及包含CD154的氨基酸140-149或其同源物。

在另一方面，疫苗载体包含第一多核苷酸，其编码SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38的顶复门菱状体多肽、SEQIDNO:1-4或37-38的至少一个或SEQIDNO:1-4或37-38的组合的免疫原性片段。顶复门菱状体多肽可表达在疫苗载体的表面。

根据本发明的疫苗载体可以是病毒、酵母、细菌或脂质体载体。药物组合物可包含此处所述的疫苗载体以及药学上可接受的载体。

在另一方面，提供了通过向受试者施用此处所述的疫苗载体来增强受试者中针对顶复门寄生虫的免疫应答的方法。增强的免疫应答可以是增强的抗体应答、增强的T细胞应答或其组合。

在又一方面，提供了通过向受试者施用此处所述的疫苗载体来减少受试者中与顶复门寄生虫感染相关的发病率和死亡率的方法。与对照相比，在施用疫苗载体的受试者中，疫苗载体能够减少与顶复门寄生虫继发感染相关的发病率和死亡率。

附图说明

图1是显示在若干顶复门寄生虫之间的MPP序列同源性的概要图。在顶复门中一致的MPP序列在氨基酸序列上是高度相似的。在一致序列中不相同的位置以X表示，其显示在图顶行并且是SEQIDNO:38。刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)序列(在一致序列之下的头四行)与来自巨型艾美球虫(Eimeriamaxima)的MPP序列SEQIDNO:2具有100％同一性。底部两个序列分别是来自犬新孢子虫(Neosporacaninum)(SEQIDNO:3)和柔嫩艾美球虫(Eimeriatenella)(SEQIDNO:4)的同源物。

图2是在实施例中所述的疫苗载体构建体的概要表示。

图3是柱状图，表示使用表达所述序列的所述疫苗载体接种小鸡后再使用巨型艾美球虫感染后8天的小鸡的体重(克)。通过不同的字母表示在处理组之间的显著差异(p<0.05)。

图4是柱状图，表示使用表达所述序列的所述疫苗载体接种小鸡后再使用巨型艾美球虫挑战感染后29天存活的小鸡的体重(克)。通过实际的p值和星号(*)表示在处理组之间的显著差异(p<0.05)。

图5是柱状图，表示使用表达所述序列的所述疫苗载体接种后，使用巨型艾美球虫挑战感染后8天，与巨型艾美球虫致命性挑战感染相关的死亡率百分比。通过星号(*)表示显著差异(p<0.05)。

具体实施方式

针对球虫病的传统疫苗通常是基于可控数目传代(deliver)的活的/减毒的寄生虫。然而，由于寄生虫是活的以及能够引起疾病，所以感染的风险不能消除。此外，这些类型疫苗的生产成本非常高，因为它涉及到通过活的鸟来传递寄生虫、定期收集和确保从生产到在孵化场或在农场使用的不中断的冷中转链。使用接种疫苗是关键的控制方法，使用重组疫苗可改进基于球虫病疫苗的整体效率同时降低生产成本。

艾美球虫物种是高度免疫原性的、并且能够刺激强效的宿主免疫应答。这种真核生物部分的广泛抗原库(repertoire)在功能上是高度特异性的，因而适合作为重组疫苗开发的合适靶标。子孢子和裂殖子是寄生虫的最能动(motile)阶段以及负责激活和维持活性感染。这些进入肠上皮细胞的侵入阶段是寄生虫在宿主细胞内继续其生命周期的必要过程。位于寄生虫的前(顶)端的高度特化的细胞器组参与运输这些能动阶段从肠腔易位进入上皮层所需的各种蛋白。这种顶端复合物由包括大量微线体(microneme)的各种分泌细胞器组成，所述微线体将蛋白环境转运至能动的顶复门生殖子(zoite)表面以支持能动性(motility)的基本功能。

在几个详细描述的微线体相关蛋白中，血小板反应相关的黏着蛋白(TRAP)已在作为候选疫苗的重组沙门氏菌属(Salmonella)和芽孢杆菌属(Bacillus)载体系统中用作成功的重组抗原。参见美国公开号2011/0111015，其通过引入全部内容并入此处。许多微线体蛋白具有类似的行为模式，因为当子孢子靠近宿主细胞时，微线体从子孢子的前端的微线体复合物中释放，并且作为寄生虫和其所在基质之间的连接。然后，微线体蛋白穿过寄生虫的表面向后移位，从而将寄生虫移动至接近宿主细胞。这滑行运动形式是所有顶复门寄生虫典型的。当微线体蛋白已被易位到寄生虫的后端，它需要被切割并且从寄生虫的表面释放以便成功地完成入侵过程。在寄生虫细胞膜内或细胞膜上组成型表达的蛋白酶家族来执行此功能。切割过程发生在细胞内并且是用于传播感染所必须的。

重组疫苗设计的新方法包括靶向这种蛋白酶和干扰切割/入侵过程。参与切割过程的蛋白酶家族称为菱状体蛋白酶，并且非常详细地描述在与艾美球虫和其它顶复门同源的弓形虫(Toxoplasma)物种中。菱状体蛋白酶(ROM4和ROM5，MPP)主要参与微线体蛋白的切割，并且在不同的顶复门寄生虫中具有良好的同源性。我们的假说是基于这样前提，如果我们能够免疫地靶向蛋白酶，抗体结合会干扰切割过程从而削弱子孢子/裂殖子运动性(mobility)。为进行成功感染，寄生虫的细胞内发育是关键，而我们的方法可以缩短细胞侵入因此干扰生命周期的建立。靶向MPP的一个优点是，这种蛋白质在许多顶复门物种间的保守性质使其不仅是艾美球虫还是其它顶复门的合适靶标。

对预测的MPP抗原性区(ROM5)进行比对，并检查在六种不同的顶复门之间的同源性(图1)。所比较的七个序列如下：柔嫩艾美球虫ROM4(JN558353)、刚地弓形虫ME49ROM5(XP_002370238)、刚地弓形虫ROM5(AAT84606)、刚地弓形虫ROM5(AY587208)、刚地弓形虫RHROM5(AM055942)、刚地弓形虫(AY634626)和来自SEQIDNO:2的巨型艾美球虫的MPP插入。适当的顶复门寄生虫包括但不限于：艾美球虫物种，包括但不限于柔嫩艾美球虫、巨型艾美球虫、和布氏艾美球虫(Eimeriabrunetti)；刚地弓形虫；犬新孢子虫；隐孢子虫物种；和疟原虫物种，包括但不限于恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)、三日疟原虫(Plasmodiummalariae)、诺氏疟原虫(Plasmodiumknowlesi)、和间日疟原虫(Plasmodiumvivax)。

重组DNA技术能相对容易地操作许多酵母、细菌及病毒物种。一些微生物是轻度致病性或无致病性，却能够产生强烈的免疫应答。对于激发针对在载体中重组表达的抗原的免疫应答而言，这些微生物成为有吸引力的疫苗载体。微生物所承载的疫苗能够模拟自然感染，有助于产生强烈的和持久的粘膜免疫性，并且生产和施用相对廉价。此外，这样的载体可经常携带一个以上的抗原，而且有能力提供保护免受多种传染性试剂。

在一方面，提供了包含编码SEQIDNO:1-4、37-38的顶复门菱状体多肽、其免疫原性片段或其组合的第一多核苷酸序列的疫苗载体。在另一实施方案中，提供可包括编码顶复门菱状体多肽的第一多核苷酸和编码免疫刺激性多肽的第二多核苷酸的疫苗载体。菱状体多肽和任选的免疫刺激性多肽表达在疫苗载体的表面。菱状体多肽可包含全长蛋白(SEQIDNO:39)或免疫原性片段，例如SEQIDNO:1-4和37-38所提供的那些。例如，菱状体多肽可包括、可基本上由或可由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38或这些SEQIDNO中任一个的免疫原性片段组成。这些片段的组合也可用在疫苗载体上。疫苗载体可包括SEQIDNO:1-4或37-38。单一疫苗载体也还可包括单一片段的多个拷贝。

菱状体多肽的免疫原性片段可以是至少5、6、7、8、10、12、14、16，18或20个氨基酸长，并且与此处提供的SEQIDNO：1-4或37-38的片段具有至少85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的百分比同一性的序列。不受理论的限制，此处提供的疫苗载体被认为通过诱导能够阻断寄生虫侵入细胞的抗体应答，从而减少与艾美球虫感染相关的发病率和死亡率。本领域技术人员明白B细胞表位通常性质上是亲水性，从而此信息可以用来产生针对此处提供的SEQIDNO：1-4和37-38多肽的免疫原性片段。SEQIDNO：2的亲水性图谱(plot)表示肽的三个亲水区和三个潜在的B细胞表位，包括SEQIDNO：2的氨基酸1-11、18-27和31-43。这些氨基酸的片段对应于SEQIDNO：3和37的氨基酸7-16以及SEQIDNO:4的氨基酸12-21。如SEQIDNO：1和SEQIDNO：38的两个一致序列所示，与SEQIDNO：2的18-27相对应的氨基酸是在物种间和顶复门寄生虫属中高度保守的。针对这样高度保守表位的免疫应答可以允许从单一疫苗引发跨物种或甚至跨属的免疫。

一种疫苗包含含有编码抗原性多肽的多核苷酸的任何组合物，其中抗原性多肽能够激发对多肽的免疫应答。疫苗载体是可被工程化以携带抗原或免疫刺激性多肽的组合物，并且还可以包含佐剂、或与佐剂一起施用以进一步增强对寄生虫的免疫应答，并提供更好的保护免受继发感染相关的发病率和死亡率。此处公开了载体如细菌载体用于接种疫苗和产生对艾美球虫或其它顶复门寄生虫，如疟原虫(疟疾的病原体)、弓形虫和隐孢子虫的免疫应答的用途。施用疫苗载体后的免疫应答不需要是完全保护性的，但可降低继发感染相关的发病率或百分比死亡率(即，死亡的概率)。

编码SEQIDNO:1-4、37-38的菱状体多肽抗原或其片段的多核苷酸、以及编码来自任何数目的致病性生物的其它抗原的多核苷酸可插入到载体中并在载体中表达。载体表达这些多核苷酸将允许在免疫受试者之后产生抗原性多肽。多核苷酸可以插入到载体的染色体中或者在质粒或其它染色体外DNA上编码。本领域技术人员将理解，存在多种用于在载体(如沙门氏菌属或芽孢杆菌属)中获得多核苷酸表达的方法。通过本领域技术人员已知的方法，多核苷酸可以可操作地连接到启动子(例如，组成型启动子、诱导型启动子等)。适当地，编码菱状体抗原的多核苷酸被插入到载体(如细菌载体)中从而表达该多核苷酸。

编码菱状体抗原的多核苷酸可以符合读码框地插入至编码跨膜蛋白的多核苷酸中。编码菱状体抗原的多核苷酸插入到载体多核苷酸序列中，以允许在载体的表面上表达菱状体抗原。例如，编码菱状体抗原的多核苷酸可以符合读码框地被插入在载体多核苷酸的编码跨膜蛋白外环区的区域中，以使得载体的多核苷酸序列保持在读码框中。在一个实施方式中，编码菱状体多肽的第一多核苷酸可插入到沙门氏菌lamB基因的环9中。

在另一个实施方式中，第一多核苷酸插入或者在蛋白的表面露出端，所述蛋白附着至细胞壁但不是跨膜蛋白。所述蛋白可以是通过蛋白或脂质锚而锚定或附着至细胞壁的分泌蛋白。在实施例中，MPP(SEQIDNO:2)多肽插入枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)纤连蛋白结合蛋白(FbpB)的3'端。或者，编码菱状体抗原的第一多核苷酸可插入编码分泌多肽的多核苷酸。

本领域技术人员将理解，编码菱状体抗原的多核苷酸可插入各种载体多核苷酸中，以提供菱状体抗原的表达并递呈至使用疫苗治疗的受试者的免疫细胞。可包含单拷贝或一个以上拷贝的编码菱状体抗原的多核苷酸。多个拷贝可插入在单个位置或一个以上位置。或者，多表位例如菱状体抗原的组合(在此处提供为SEQIDNO:1-4和37-38)、或这种表位与其它顶复门表位(如TRAP)或来自其它病原体的表位的组合，可插入在载体的相同位置或一个以上位置。

适当地，第一多核苷酸编码菱状体多肽的部分、完整的菱状体多肽或来自菱状体多肽的一个以上的表位。尤其考虑来自单一寄生虫或病原体的一个以上多肽的表位的组合、或者来自相关病原体的表位的组合。多核苷酸可以插入到载体中，以及可作为包含一个以上表位的融合蛋白插入。在实施例中，SEQIDNO:2和15(MPP-HMGB1)或SEQIDNO:2、40和15(MPP-TRAP-HMGB1)并入芽孢杆菌属的载体。适当地，插入至载体的菱状体多肽的部分是抗原性片段。抗原性片段是能够激发细胞或体液免疫应答或者能够降低寄生虫继发感染相关的发病率或死亡率的肽或多肽。

抗原性多肽或表位包含任何免疫原性的多肽。抗原性多肽包括但不限于病原体相关、过敏原相关、肿瘤相关或疾病相关的抗原。病原体包括病毒、寄生虫、真菌和细菌病原体以及蛋白病原体如朊病毒。抗原性多肽可以是全长蛋白或其部分。已知许多蛋白的免疫系统识别是基于通常称为表位的相对少量的氨基酸。表位可以是仅4-8个氨基酸长。因此，此处所述的抗原多肽可以是全长蛋白、4个氨基酸长的表位或这些端之间的任何部分。事实上，抗原性多肽可包含来自单一病原体或蛋白的一个以上的表位。抗原性多肽与此处所提供的SEQIDNO具有至少85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的百分比同一性。适当地，菱状体抗原或多肽的抗原性片段可以是全长蛋白序列的四、五、六、七、八、九、10个或更多个氨基酸、15个或更多个氨基酸、或者20个或更多个氨基酸。

相同表位的多个拷贝或来自相同或不同蛋白的多个表位可以包括在疫苗载体中。疫苗载体中的表位可以是相关且同源的，从而允许用单一疫苗载体靶向多个相关病原体。可以想象，来自相同或不同病原体或疾病的几个表位或抗原可以以单一疫苗载体组合进行施用以产生针对多种抗原的增强的免疫应答。重组疫苗载体可以编码来自多个病原性微生物、病毒或肿瘤相关抗原的抗原。施用能够表达多种抗原的疫苗载体具有以下优点：同时诱导针对两种或更多种疾病的免疫、提供针对单一病原体多个株的更广泛保护或者针对单一病原体更强烈的免疫应答。

在实施例中，MPP抗原(SEQIDNO:2)与第二抗原性多肽共表达在若干载体中。来自巨型艾美球虫高分子量、无性阶段抗原(EmTFP250)被证明是通过饲养这种原生寄生虫感染的母鸡所产生的母源抗体的靶。分析这种抗原的氨基酸序列揭示TRAP(血小板反应蛋白相关的匿名蛋白)家族的新成员，含有16个血小板反应蛋白1型重复和31个表皮生长因子样钙结合结构域。见美国专利公开号2011/0111015。EmTFP250或TRAP还包含两个低复杂度(complex)、富含谷氨酸及甘氨酸残基的亲水区，以及与寄生虫滑行运动相关的跨膜结构域/胞质的尾，其在顶复门微线体蛋白中是高度保守的。选择几个潜在的表位并鉴定为美国专利公开号2011/0111015的SEQIDNO：1-3和11，其在此再现为SEQIDNO：5-8。在此处所提供的实施例中使用SEQIDNO：40，其也称为TRAP抗原。SEQIDNO：40和SEQIDNO：6之间有单个氨基酸变化。在SEQIDNO：6的位置6的脯氨酸变为在SEQIDNO：40的相同位置6的精氨酸。进行这种改变是为了使表位更具柔性(flexible)和亲水性以实现将其制备成更好抗原的目标。本领域的技术人员可进行其它单氨基酸改变以在本发明的范围内改善抗原性。由于这种抗原的保守性，通过载体表达这些表位可诱导免受多个顶复门寄生虫的保护性免疫，并且施用包含两个不同抗原性多肽的疫苗载体可诱导更强烈的免疫反应。

本领域技术人员将理解，来自其它病原体的抗原性多肽可用在疫苗载体中以便通过单一疫苗来增强对一种以上病原体的免疫应答。施用针对多种病原体的单一疫苗将是有利的。考虑能够激发对顶复门寄生虫(如艾美球虫)以及与流感、沙门氏菌属、弯曲杆菌属或其它病原体的组合的免疫应答的疫苗。

例如，第二抗原性多肽可以是流感多肽，适当地它是流感H5N1多肽或与流感病毒的多个株相关的多肽，如流感M2蛋白的多肽。A型流感病毒M2蛋白的胞外域称为M2e，突出于病毒的表面上。M2蛋白的M2e部分包含大约24个氨基酸。在流感中M2e多肽在一种分离株和另一种之间变化很小。事实上，自1918年流感爆发以来，从受感染的人当中仅分离出M2e中的几个自然发生的突变。此外，从禽和猪宿主分离出来的流感病毒含有不同却依然保守的M2e序列。分离自人类、禽和猪宿主的M2e多肽序列的综述，参见Liu等人MicrobesandInfection7:171-177(2005)和Reid等人J.Virol.76:10717-10723(2002)，其中每个通过引用全部内容并入此处。适当地，可将整个M2e多肽插入疫苗载体，或仅使用部分。将8氨基酸多肽(具有氨基酸序列EVETPIRN的LM2(SEQIDNO:9)，或具有氨基酸序列EVETPTRN的其变体M2eA(SEQIDNO:10))并入疫苗载体，并证明将其施用到鸡之后产生抗体应答。参见美国公开号2011/0027309，通过引用其全部并入此处。

并入A型流感疫苗载体内的其它适当表位包括但不限于A型流感的血凝素(HA)或核蛋白(NP)的多肽。例如，SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13或SEQIDNO：14的肽可包含在疫苗载体中。本领域技术人员将理解，任何这些序列可以和任何其它表位(包括源自其它病原体或抗原的表位)组合使用。

作为疫苗载体一部分而包含的免疫刺激分子能够潜在地激活免疫系统的一部分，这对持久保护或提供佐剂效用是关键的。免疫刺激性多肽可以是能够刺激初始或适应性免疫应答的多肽。免疫刺激性多肽不是与疫苗载体天然相关的多肽，而是和脊椎动物的免疫系统(如待施用疫苗的受试者的免疫系统)天然相关的多肽。此处描述两种免疫刺激性多肽，即CD154和高迁移率族蛋白B1(HighMobilityGroupBox1)(HMGB1)多肽，但是本领域技术人员将理解可以使用其它免疫刺激性多肽、或者可选择地将其它免疫刺激性多肽与此处所述那些组合使用。

编码参与触发免疫系统的多肽的其它多核苷酸也可包含在疫苗载体中。多核苷酸可以编码已知其刺激效应的免疫系统分子，如参与免疫调节的白细胞介素、肿瘤坏死因子、干扰素、补体、或另一多核苷酸。疫苗也可包括编码已知刺激免疫应答的肽(如此处所述的CD154或HMGB1多肽)的多核苷酸。

HMGB1由激活的巨噬细胞和受损细胞分泌，以及作为炎症细胞因子介导因子影响固有免疫应答。部分HMGB1序列已被包含在实施例所述的疫苗载体中。HMGB1(高迁移率族蛋白B-1)蛋白是首先鉴定为对DNA结构和稳定性至关重要的DNA结合蛋白。它是非序列特异性结合DNA的广泛表达的核蛋白。所述蛋白是高度保守的，以及见于植物至哺乳动物中。斑马鱼、鸡和人HMGB1的氨基酸序列分别见于SEQIDNO：23、SEQIDNO：15和SEQIDNO：22中。在整个哺乳动物中所述序列是高度保守的，具有98％的氨基酸同一性，并且氨基酸改变是保守的。因此，来自一个物种的HMGB1蛋白可能在功能上取代来自另一个物种的HMGB1蛋白。全长HMGB1蛋白或其一部分可以用作此处所述疫苗载体中的HMGB1多肽。HMGB1具有两个DNA结合区，称为A盒(SEQIDNO：16和17所示)和B盒(SEQIDNO：18和19所示)。参见Andersson和Tracey，Annu.Rev.Immunol.2011,29:139-162，通过引用其全部并入此处。

HMGB1是炎症的介导因子以及作为核损伤，如来自坏死细胞的核损伤的信号。在需要蛋白乙酰化、跨核易位以及分泌的过程中，HMGB1也可以由单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞主动分泌。通过经由晚期糖基化终产物受体(RAGE)以及经由Toll样受体家族(TLR)的成员(尤其是TLR4)的信号传导，细胞外HMGB1作为炎症的强效介导因子发挥作用。RAGE结合活性已被鉴定，并且需要SEQIDNO：20的多肽。TLR4结合需要SEQIDNO：15的位置106的半胱氨酸，其见于HMGB1的B盒区。

HMGB1的炎症活性不需要全长蛋白，并且已经鉴定出功能性片段。B盒已被证明足以介导HMGB1的促炎效应，因而在本发明的上下文中SEQIDNO：18和19是HMGB1多肽或其功能性片段。此外，RAGE结合位点和促炎细胞因子活性已经被分别描绘(map)至SEQIDNO：20和SEQIDNO：21。因此，在本发明上下文中这些多肽是HMGB1多肽的功能性片段。

本领域技术人员使用方法，如以参考其全部并入此处的国际公开号WO02/092004中的那些，能够鉴定HMGB1多肽及其能够刺激促炎细胞因子活性的片段。适当地，HMGB1多肽包括SEQIDNO：15的氨基酸150-183的RAGE结合结构域(SEQIDNO：20或其同源物)和SEQIDNO：15的氨基酸89-109之间的促炎细胞因子活性结构域(SEQIDNO：21或其同源物)。特别地，HMGB1多肽及其功能性片段或其同源物包括和SEQIDNO：15或16-23的HMGB1多肽相同的、或者至少99％相同、至少98％相同、至少97％相同、至少96％相同、至少95％相同、至少90％相同、至少85％相同、或至少80％相同的多肽。

如下面更详细描述的，疫苗载体可以包含CD154多肽，其能够在受试者中结合CD40并刺激受试者对载体及其相关抗原产生应答。树突细胞(DC)的参与对启动强大的免疫应答是必要的，因为树突细胞具有独特的激活初始T细胞的能力，引起T细胞扩增并分化为效应细胞。DC的作用是捕获抗原，将它们递送到相关的淋巴组织，然后将它们递呈给初始T细胞，其中DC是一种在身体几乎所有组织中发现的抗原递呈细胞(APC)。一旦被DC激活，T细胞便扩增、分化为效应细胞，离开次级免疫器官，再进入外周组织。激活的细胞毒性T细胞(CTL)能破坏病毒感染的细胞、肿瘤细胞或者甚至感染有细胞内寄生虫(例如，沙门氏菌属)的APC，并且已被证明在保护免受病毒感染中是关键的。CD40是TNF-受体分子家族的成员，并且表达于多种细胞类型中，包括专职抗原递呈细胞(APC)，例如DC和B细胞。CD40与其配体CD154的相互作用是极其重要的，并且刺激体液和细胞免疫两者。由在DC表面表达的CD40对DC的刺激可以通过抗CD40的抗体进行模拟。然而，在体内，这是通过在激活的T细胞表面表达的CD40天然配体(即CD154)相互作用而发生的。有趣的是，CD154的CD40结合区也得以鉴定。如此处提供的实施例中以及美国专利公开号2011/0027309所示，CD154的CD40结合区可表达在载体如沙门氏菌或芽孢杆菌载体的表面上，并且导致针对共提呈的肽序列增强的免疫应答，美国专利公开号2011/0027309通过引用全部并入此处。CD154多肽可以是CD154全长蛋白的一部分或整个CD154蛋白。适当地，CD154多肽能够与CD40结合。

如上所讨论的，在疫苗中可包含编码CD154多肽的CD154多核苷酸，所述CD154多肽能够增强对抗原的免疫应答。适当地，CD154多肽是少于50个氨基酸长，更适当地长度少于40，少于30或少于20个氨基酸长。多肽可以是在10个和15个氨基酸之间，10和20个氨基酸之间或10和25个氨基酸之间的长度。在各种物种间，CD154序列和CD40结合区不是高度保守的。鸡和人的CD154序列分别提供于SEQIDNO：24和SEQIDNO：25。

对于若干物种，包括人、鸡、鸭、小鼠和牛，已经确定了CD154的CD40结合区，并分别显示在SEQIDNO：26、SEQIDNO：27、SEQIDNO：28、SEQIDNO：29和SEQIDNO：30中。虽然在物种之间CD40结合区的序列有变异，人CD154多肽能够增强鸡的免疫应答。因此，人们可以使用物种特异性CD154多肽或异源CD154多肽来实施本发明。因而，在疫苗载体中可包含SEQIDNO：24-30的CD154多肽，或在疫苗载体中可包含与SEQIDNO：24-30的序列至少99、98、97、96、95、93、90或85％相同的多肽。

来自CD154的多肽通过与其受体CD40结合至少部分地刺激免疫应答。多肽与在受试者免疫细胞上表达的、并且能够与巨噬细胞和其它抗原递呈细胞上的CD40受体结合的CD154多肽同源。这种配体-受体复合物的结合刺激巨噬细胞(和巨噬细胞谱系细胞，如树突细胞)以增强吞噬作用和抗原递呈，并同时促进已知能够激活其它局部免疫细胞(如B淋巴细胞)的细胞因子的分泌。因此，和CD154肽相关的分子是免疫应答及扩大的抗体生产的优选靶标。

抗原性多肽和免疫刺激性多肽经由疫苗载体递送。疫苗载体可以是细菌、酵母、病毒或基于脂质体的载体。潜在的疫苗载体包括但不限于芽孢杆菌属(枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis))、沙门氏菌属(肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis))、志贺氏菌属(Shigella)、埃希氏菌属(Escherichia)(大肠杆菌(E.coli))、耶尔森氏菌属(Yersinia)、博德特氏菌属(Bordetella)、乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)、弧菌属(Vibrio)(霍乱弧菌(Vibriocholerae))、李斯特菌属(Listeria)、酵母如酵母属(Saccharomyces)、或毕赤酵母属(Pichia)、腺病毒、痘病毒、疱疹病毒、甲病毒和腺相关病毒。活的细菌、酵母或病毒疫苗载体可能仍然对免疫力低下个体构成风险，并需要额外的监管审查。因而，希望使用失活的、或灭活的载体、或被食品和药品监督管理局(FDA)认为有资格作为公认安全(GRAS)的生物。问题是使用这种载体产生强烈的免疫应答。使细菌、酵母或病毒疫苗载体失活或灭活的方法是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于例如福尔马林失活、基于抗生素的失活、热处理和乙醇处理的方法。通过将免疫刺激性多肽如HMGB1(高迁移率族蛋白B1)多肽包含在疫苗载体表面上，使用芽孢杆菌种属载体，我们能够产生针对顶复门寄生虫的强烈免疫应答。事实上，实施例证明这样的载体可被失活使其不能复制并且施用后仍然激发强烈的免疫应答。疫苗载体可以是非致病性的野生型细菌、酵母或病毒。或者，载体可以是减毒的，使得载体在宿主中具有有限的复制能力或在缺乏补充介质的情况下不能生长超过数代。本领域技术人员将理解，有多种方式使载体减毒以及这样做的装置(means)。

至少部分抗原性多肽和至少部分免疫刺激性多肽呈现于或表达在疫苗载体的表面上。呈现于疫苗载体表面上，包括包含在跨膜蛋白外环之内的多肽，所述多肽和跨膜蛋白、膜脂或膜锚定的碳水化合物或多肽相互作用，例如共价或化学交联到跨膜蛋白、膜脂或膜锚定的碳水化合物或多肽。经由将包含多肽的氨基酸通过肽键连接至跨膜蛋白内的N端、C端或任何位置(即插入跨膜蛋白的两个氨基酸之间或取代跨膜蛋白的一个或更多个氨基酸(即缺失-插入))，多肽可被包含在跨膜蛋白之内。适当地，多肽可插入跨膜蛋白的外环。适当地，跨膜蛋白是srtA、cotB和lamB，但本领域的技术人员将了解许多适当的跨膜蛋白是可用的。多肽可连接到膜或细胞壁锚定蛋白或脂质，使得抗原性多肽和免疫刺激性多肽表达在疫苗载体的表面上。

如上所述，编码抗原性或免疫刺激性多肽的多核苷酸可插入载体的染色体中或保持在染色体外(例如，在质粒、BAC或YAC上)。本领域技术人员将理解，这些多核苷酸可以符合读码框地插入各种多核苷酸中，并表达在载体的不同部分，或者可以被分泌。编码能够增强对抗原性多肽免疫应答的免疫刺激性多肽的多核苷酸，也可编码抗原性多肽。编码抗原性多肽的多核苷酸可连接至编码免疫刺激性多肽的多核苷酸，从而在载体中两个多肽是同一多肽的部分，如在融合蛋白中。在实施例中，编码抗原性多肽的多核苷酸还编码免疫刺激性多肽。在一个实施方式中，两个编码多肽的多核苷酸都以符合读码框地插入肠炎沙门氏菌lamB基因环9或其它疫苗载体中。本领域技术人员将理解，也可以使用编码其它跨膜蛋白和lamB基因其它环的细菌多核苷酸。

或者，编码抗原性多肽和/或免疫刺激性多肽的多核苷酸可插入分泌多肽，分泌多肽通过和疫苗载体表面上的蛋白、脂质或碳水化合物相关联而展示或呈现于疫苗载体的表面上。本领域技术人员将理解，编码抗原性多肽和/或免疫刺激性多肽的多核苷酸可插入各种疫苗载体的多核苷酸中，以便通过在疫苗载体的表面表达来提供抗原性多肽和/或免疫刺激性多肽的表达并递呈给疫苗载体治疗的受试者的免疫细胞。顶复门菱状体多肽和免疫刺激性多肽的编码区可以融合到含有来自李斯特菌属的分选酶分选基序的金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)纤连蛋白结合蛋白的C端。这允许将分泌蛋白锚定于革兰氏阳性细菌如芽孢杆菌属的细胞壁。见Nguyen和Schumann,JBiotechnol(2006)122:473-482，通过引用全部并入此处。在实施例中使用这种系统以允许将连接至HMGB1的菱状体多肽表达在芽孢杆菌属的表面。也可以使用其它类似的方法。

或者，如果通过本领域技术人员可用的方法使用病毒载体，多肽可以共价或化学连接到膜、细胞壁、或衣壳中的蛋白、脂质或碳水化合物。例如，二硫键或生物素-抗生物素蛋白的交联可以用来在疫苗载体的表面上呈现抗原性和免疫刺激性多肽。适当地，抗原性多肽和免疫刺激性多肽是融合蛋白的部分。两个多肽可以通过肽键直接连接，或者可以通过接头、间隔物(spacer)、或第三蛋白的区段(section)隔开，其中两个多肽符合读码框地插入至第三蛋白中。在实施例中，氨基酸间隔物用在多肽之间。间隔物可以是2至20个氨基酸之间，适当地4至10个氨基酸之间，适当地6至8个氨基酸之间。适当地，间隔物中的氨基酸具有小侧链且不带电荷，例如甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸。在实施例中，使用包含两个甘氨酸残基、两个丝氨酸残基和精氨酸、以及又两个丝氨酸残基的间隔物。本领域技术人员将明白可使用其它间隔物。

在实施例中，疫苗载体具有编码在同一多核苷酸上的并且彼此符合读码框的抗原性多肽(MPP和/或TRAP多肽)和免疫刺激性多肽(CD154或HMGB1或两者)。在替代实施方案中，免疫刺激性多肽和抗原性多肽可由不同的多核苷酸编码。本领域技术人员将理解，有多种方法可以被用于获得抗原性多肽和HMGB1多肽在疫苗载体表面上的表达。这样的方法是本领域技术人员所熟知的。

还提供了包含疫苗载体和药学上可接受载体的组合物。药学上可接受的载体是适合于体内施用的任何载体。适当地，药学上可接受的载体是口服、经鼻或粘膜递送可以接受的。药学上可接受的载体可包括水、缓冲溶液、葡萄糖溶液或细菌培养液。组合物的附加组分可以适当地包含赋形剂，如稳定剂、防腐剂、稀释剂、乳化剂和润滑剂。药学上可接受的载体或稀释剂的示例包括稳定剂，如碳水化合物(例如，山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖)，蛋白如白蛋白或酪蛋白，含蛋白试剂例如牛血清或脱脂乳和缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)。特别是当这样的稳定剂加入到组合物中时，组合物适合冷冻干燥或喷雾干燥。在组合物中的疫苗载体可能不能够复制，适当地，疫苗载体在加入组合物之前是失活或灭活的。

还提供了通过施用疫苗载体增强受试者免疫应答的方法。疫苗载体可以含有编码顶复门菱状体多肽的第一多核苷酸以及编码免疫刺激性多肽的第二多核苷酸。适当地，免疫刺激性多肽是与脊椎动物免疫系统天然相关的并参与刺激免疫应答的多肽。免疫刺激性多肽可刺激受试者的固有或适应性免疫应答。适当的，以上更充分地描述的HMGB1多肽或CD154多肽可以用作免疫刺激性多肽。在此处提供的方法中，将含有顶复门菱状体多肽和免疫刺激性多肽的疫苗载体以有效增强或影响受试者对疫苗载体免疫应答的量施用至受试者，特别是对抗原性菱状体多肽的免疫应答，以及适当地对顶复门寄生虫的免疫应答。增强的免疫应答可包括抗体或T细胞应答。适当地，免疫应答是保护性免疫应答，但免疫应答可以不是完全的保护，但可以能够降低与感染相关的发病率或死亡率。免疫刺激性多肽可以用于增强受试者对除了菱状体多肽以外的任何外源抗原或呈现于疫苗载体上的抗原性多肽的免疫应答。本领域技术人员将理解，免疫刺激性多肽可用于增强对呈现于疫苗载体的一个以上的抗原性多肽的免疫应答。增强免疫应答包括但不限于诱导由受试者的免疫系统介导的治疗或预防效果。尤其是，增强免疫应答可包括但不限于增强的抗体产生、增强的抗体重链的类别转换、抗原递呈细胞的成熟、刺激辅助性T细胞、刺激细胞毒性T细胞或诱导T和B细胞记忆。

适当地，所述疫苗载体包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包括HMGB1多肽(SEQIDNO：15)的氨基酸150-183和89-109或其同源物。在实施例中，使用HMGB1的190个氨基酸的多肽。适当地，多核苷酸编码和受试者相同物种的HMGB1多肽。因为HMGB1在许多物种之间是高度保守的，可在本发明的方法中使用HMGB1多肽和受试者的异源组合(例如，人HMGB1多肽用于鸡疫苗)。HMGB1多肽可用于增强疫苗载体上呈现的一个以上抗原性多肽的免疫应答。来自HMGB1的多肽至少部分地通过激活树突细胞和巨噬细胞来刺激免疫应答，从而刺激产生细胞因子如IL-1、IL-6、IFN-γ和TNF-α。在实施例中，HMGB1的多肽表达在疫苗载体的表面上。

适当地，疫苗载体可以含有能够结合CD40并激活CD40的CD154多肽。将包含编码能够结合CD40的CD154多肽的多核苷酸的疫苗以有效量施用至受试者以增强或影响受试者对疫苗免疫应答。适当地，疫苗包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含人CD154多肽(SEQIDNO：25)的氨基酸140-149或其同源物。如上所述，源自一个物种的氨基酸140-149的同源物可用于刺激不同物种中的免疫应答。适当地，多核苷酸编码来自和受试者相同物种的CD154多肽。适当地，编码SEQIDNO：26的多肽的多核苷酸用在人受试者中，编码SEQIDNO：27的多肽的多核苷酸用在鸡中，编码SEQIDNO：28的多肽的多核苷酸用在鸭中，编码SEQIDNO：29的多肽的多核苷酸用在小鼠中，以及编码SEQIDNO：30的多肽的多核苷酸用在牛中。人CD154多肽(SEQIDNO：26)已用在鸡疫苗中并证明增强对外源抗原的免疫应答。因而，CD154多肽和受试者的其它异源组合可用于本发明的方法中。

此外，公开了增强针对顶复门寄生虫免疫应答的方法以及降低与顶复门寄生虫继发感染相关的发病率的方法。简单地说，方法包括向受试者施用有效量的疫苗载体，所述疫苗载体包含编码顶复门菱状体多肽的第一多核苷酸序列。疫苗载体还可包含编码有效量的免疫刺激性多肽的第二多核苷酸。菱状体多肽可包含SEQIDNO:1-4、37、38或其组合或片段。可以通过本领域技术人员已知的多种方式来实现将菱状体多肽插入到载体中，包括但不限于通过引用全部并入此处的BMCBiotechnol.2007九月17:7(1):59，ScarlessandSite-directedMutagenesisinSalmonellaEnteritidischromosome中所述的无痕(scarless)定点突变系统，以及如通过引用全部并入此处的Nguyen和SchumannJBiotechnol2006122:473-482中所述此处所用的方法。载体也可经工程化以表达菱状体多肽以及来自顶复门寄生虫的其它抗原性多肽(如TRAP)或来自其它病原体(包括病毒如流感M2e，或细菌如沙门氏菌属、或大肠杆菌)的其它抗原性多肽。特别是，能与CD40结合的CD154或HMGB1的多肽可由载体表达，以增强受试者对菱状体多肽的免疫应答。

也可以使用含抗原性多肽的组合物以降低与顶复门寄生虫继发感染相关的发病率。在施用此处所述的组合物或疫苗载体的受试者中，组合物可预防寄生虫所导致的疾病、或可限制或降低任何相关的发病率。此处所述的组合物和疫苗载体，可以通过降低疾病的时间长短、体重减少、疾病症状的严重程度、降低疾病相关的发病率或死亡率或者降低感染疾病的可能性，而降低继发疾病的严重程度。组合物还可以通过抑制传递而减少寄生虫的扩散。与没有给予疫苗载体的相似受试者相比，施用此处描述的疫苗载体后，疾病相关的发病率或死亡率可以降低25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或甚至100％。

为了施用至动物或人，组合物可以通过各种方式施用，包括但不限于经鼻、粘膜、通过喷雾、皮内、肠胃外、皮下、腹腔内、静脉内、颅内、口服、通过气雾或肌内。此外，适当地，滴眼施用、口服灌胃或添加至饮用水或食物中。对于禽，组合物可以卵内施用。

本发明的一些实施方式提供增强受试者中免疫应答的方法。适当的受试者包括但不限于脊椎动物，适当地哺乳动物，适当地人，以及鸟，适当地禽如鸡或火鸡。也可以使用其它动物如牛、猫、狗或猪。适当地，受试者是非人以及也可以是农业动物。

待施用的疫苗的有用剂量将根据受试者年龄、体重和物种、施用方式和途径以及免疫应答所针对的病原体类型的不同而不同。可按照足以引起免疫应答的任何剂量施用组合物。可以考虑，适当的是剂量范围从10³至10¹⁰载体拷贝(即，菌落形成单位或噬斑形成单位)，从10⁴至10⁹载体拷贝，或从10⁵至10⁷载体拷贝。

组合物可以仅仅施用一次或可以施用两次或更多次以增强免疫应答。例如，组合物可以隔1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、6个月、1年或更长施用两次或更多次。疫苗载体在施用之前可以包含活的微生物，但在一些实施方式中载体可在施用前灭活。在一些实施方式中，载体能在受试者中复制，而在另一些实施方式中，载体不能在受试者中复制。使用作载体的微生物失活的方法是技术人员已知的。例如，可以使用福尔马林、乙醇、热暴露、或抗生素使细菌疫苗载体失活。本领域的技术人员也可以使用其它方法。

可以考虑，来自相同或不同病原体的几个表位或抗原可组合在单一疫苗中施用以产生针对多个抗原的增强的免疫应答。重组疫苗可以编码来自多个致病性微生物、病毒或肿瘤相关抗原的抗原。施用能够表达多个抗原的疫苗具有同时诱导对两种或更多种疾病的免疫的优点。例如，活的减毒细菌提供适当的载体用于激发针对来自单一病原体的多个抗原(如，来自艾美球虫的TRAP(SEQIDNO:6)和MPP(SEQIDNO:2))的免疫应答，或针对来自不同病原体(如，艾美球虫和流感或沙门氏菌属)的多个抗原的免疫应答。

使用本领域公知的方法，可以使用编码抗原的外源多核苷酸构建疫苗载体，所述抗原可插入疫苗载体的任何非必需位点，或者可携带在质粒上或其它染色体外运载体上(如BAC或YAC)。一个适于多核苷酸插入的位点在跨膜蛋白外部部分内，或者偶联至靶向外源多核苷酸的序列，以便分泌途径和/或允许附着到细胞壁。用于插入多核苷酸的一个合适跨膜蛋白的示例是lamB基因。在实施例中提供细胞壁附着的一种合适方法。

外源多核苷酸包括但不限于编码选自致病性微生物或病毒的抗原的多核苷酸，以及包括以产生有效免疫应答的方式而得以表达的多核苷酸。这种多核苷酸可源自致病性病毒，如流感(例如，M2e、血凝素、或神经氨酸苷酶)、疱疹病毒(例如，编码疱疹病毒结构蛋白的基因)、逆转录病毒(例如，gp160包膜蛋白)、腺病毒、副粘病毒、冠状病毒等。外源多核苷酸也可以获自致病性细菌，例如编码细菌蛋白(如毒素、外膜蛋白或其它高度保守蛋白)的基因。此外，来自寄生虫如其它顶复门寄生虫的外源多核苷酸是用于载体疫苗的有吸引力的候选者。

本公开不限于此处所述的结构、组分的安排、或方法步骤的具体细节。本文此处的组合物和方法能够以各种方式得以制造、操作、使用、实施和/或形成，根据以下的公开这对于本领域技术人员将是显而易见的。此处所使用的措辞和术语仅是为了描述的目的，而不应被认为是限制权利要求的范围。在说明书和权利要求书中所用的顺序指代如第一、第二和第三，是指各种结构或方法步骤，并不意图解释为表明任何特定的结构或步骤，或这种结构或步骤的任何特定顺序或构造。除非此处另有指明或与上下文明显矛盾，否则此处所描述的所有方法可以按照任何适当的顺序进行。除非另有声明，否则本文所提供的任何和全部示例或示例性语言(例如“如”)的使用，仅仅是为了便于公开，并不表示对公开范围的任何限制。说明书中的语言以及附图中所示的结构，不应解释为表示任何未要求的元素对实施所公开的主题是必不可少的。此处术语“包括”、“包含”或“具有”及其变体的使用，是指包括其后所列出的元素及其等同物，以及其它元素。记载为“包括”、“包含”或“具有”某些元素的实施方式也被认为是“基本上由这些特定元素组成”和“由这些特定元素组成”。除非明确指明，否则术语“一”、“一个”和“该”可表示一个或一个以上。

除非此处另有指明，否则此处对值范围的描述仅仅旨在作为单独指代落在范围之内各独立值的速记方法，并且各个独立值并入说明书中就好比在此文独立记载。例如，如果浓度范围表示为1％至50％，这意味着如2％至40％、10％至30％、或1％至3％等的值在本说明书中得以明确列举。这些仅仅是具体所指的实施例，在最低值和最高值之间的并包括最低值和最高值的数值的所有可能组合视为在本公开中明确表述。用来描述具体记载的量或量的范围的词语“约”其意欲表示非常接近所记载的量的值包括在所述量范围内，例如由于制造公差(manufacturingtolerance)、形成测量中仪器和人为的误差等，而可能地或天然地将考虑在内的值。除非另有指明，否则所有百分数是指按重量计的量。

以下实施例仅用于说明并且不意图对本发明或所附权利要求的范围进行限制。此处引用的所有参考文献，包括专利、专利公开和非专利文献，通过引用其全部并入此处。参考文献中的陈述和此处所做那些陈述之间的任何冲突，应当以有利于此处所含陈述的方式来解决。

实施例

实施例1.疫苗载体的构建

出于测试效应目的，构建多个疫苗的组合，并且确定每一个疫苗的组合对于保护免受巨型艾美球虫挑战的影响。在图2中示出表示在实施例中所用构建体的图(cartoon)。合成TRAPMPPHMGB1和MPPHMGB1序列并将其插入pNDH10质粒以用于表达在细胞表面。合成的每个序列在5'端具有BamHI限制位点以及在紧邻纤连蛋白结合蛋白B(fbpB)的3'端具有AatII限制性位点。疫苗序列与fbpB的表达是通过预先插入pNDH10质粒的xyl操纵子进行调节[1]。fbpB包括由分选酶A识别的分选基序，所述分选基序将fbpB锚定至表达分选酶A的细菌的细胞表面[1]。因此，疫苗序列放置在fbpB序列的上游并符合fbpB序列的读码框，以使得当fbpB锚定在细胞壁上的分选酶A时，疫苗载体序列将被表达在细菌表面上。含有疫苗序列、fbpB和xyl操纵子的质粒pNDH10转化到表达分选酶A的枯草芽孢杆菌1A857中[2]。通过将0.6μg的插入/质粒加入至含有0.1M乙二醇四乙酸(EGTA)的感受态的1A857培养物中，以便将每种质粒转化至1A857。转化后，表达pNDH10的1A857在含有5μg/mL氯霉素的LB琼脂进行选择，以便仅仅选择携带抗生素抗性的细胞，所述抗生素抗性是质粒通过编码氯霉素乙酰转移酶的cat序列而赋予的。通过质粒提取、接着通过PCR来验证转化有MPPHMGB1(SEQIDNO：33)、或TRAPMPPHMGB1(SEQIDNO：31)pNDH10质粒的枯草芽孢杆菌1A857。培养每个1A857/pNDH10/插入构建体，并在LB肉汤+0.1％葡萄糖和5μg/mL氯霉素中在37℃下用0.6％木糖诱导9小时，同时摇动。通过用兔抗HMGB1抗体进行Western印迹和间接荧光显微镜来验证MPP-HMGB1(SEQIDNO：34)和TRAP-MPP-HMGB1(SEQIDNO：32)蛋白表达。

实施例2.降低艾美球虫感染后小鸡的发病率和死亡率

当通过饮用水连同修饰的壳聚糖佐剂一并施用时，测试载体疫苗MPPHMGB1和TRAPMPPHMGB1提供保护免受巨型艾美球虫挑战的能力。在肉鸡4和14日龄时，使用在饮用水中稀释度为1：128(5×10⁵cfu/小鸡)的各个疫苗对肉鸡进行持续24小时的疫苗接种。在21日龄时，对各组进行称重，并使用巨型艾美球虫的4×10⁴孢子化卵囊通过口服灌胃来挑战各组。在28日龄，记录存活者的体重(BW)以及在挑战期间存活者的体重增加(BWG)。此外，记录死亡率来确定候选疫苗的效应。与未接种疫苗的小鸡相比，使用TRAP-MPP-HMGB1和MPP-HMGB1进行疫苗接种的小鸡在挑战后8天的BW显著更高(图3)。挑战后8天，与对照组相比，所有接种疫苗组的BWG显著更高(图4)。与未接种疫苗的组相比，在TRAP-MPP-HMGB1和MPP-HMGB1接种疫苗组中死亡率也显著更低(图5)。

[1]KimL,MogkA,SchumannW.Axylose-inducibleBacillussubtilisintegrationvectoranditsapplication.Gene1996Nov28；181(1-2):71-6。

[2]NguyenHD,SchumannW.EstablishmentofanexperimentalsystemallowingimmobilizationofproteinsonthesurfaceofBacillussubtiliscells.Journalofbiotechnology2006Apr20；122(4):473-82。

Claims

1.一种疫苗载体，其包含编码任选在疫苗载体表面表达的顶复门菱状体多肽的第一多核苷酸序列，其中所述菱状体多肽是下列中的至少一个或与下列中的至少一个具有90％以上的序列同一性：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:1的免疫原性片段、SEQIDNO:2的免疫原性片段、SEQIDNO:3的免疫原性片段、SEQIDNO:4的免疫原性片段、SEQIDNO:37的免疫原性片段、SEQIDNO:38的免疫原性片段或其组合。

2.根据权利要求1所述的疫苗载体，其还包括编码免疫刺激性多肽的第二多核苷酸序列，其中所述免疫刺激性多肽表达在疫苗载体的表面。

3.根据权利要求2所述的疫苗载体，其中所述免疫刺激性多肽是HMGB1多肽。

4.根据权利要求3所述的疫苗载体，其中所述HMGB1多肽包含选自SEQIDNO:15-23的至少一个的多肽、SEQIDNO:15-23的至少一个的片段、与SEQIDNO:15-23具有至少95％序列同一性的多肽及其组合。

5.根据权利要求2-4中任一项所述的疫苗载体，其中所述免疫刺激性多肽是能够结合CD40的CD154多肽，所述CD154多肽具有不多于50个氨基酸以及包含SEQIDNO:24、SEQIDNO:25的氨基酸140-149或其同源物。

6.根据权利要求5所述的疫苗载体，其中所述CD154多肽是SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30或与SEQIDNO:26-30的至少一个具有至少90％序列同一性。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的疫苗载体，其中所述载体包含一个拷贝以上的所述第一多核苷酸和/或一个拷贝以上的所述第二多核苷酸序列。

8.根据权利要求2-7中任一项所述的疫苗载体，其中所述第一多核苷酸序列符合读码框地连接至所述第二多核苷酸序列。

9.根据权利要求8所述的疫苗载体，其中所述第一多核苷酸通过间隔核苷酸与所述第二多核苷酸连接。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的疫苗载体，其中所述载体选自病毒、细菌、酵母和脂质体。

11.根据权利要求10所述的疫苗载体，其中所述疫苗载体是枯草杆菌属Bacillusspp.。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的疫苗载体，其还包含编码TRAP多肽的第三多核苷酸。

13.根据权利要求12所述的疫苗载体，其中所述TRAP多肽与SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:40、SEQIDNO:5的免疫原性片段、SEQIDNO:6的免疫原性片段、SEQIDNO:7的免疫原性片段或SEQIDNO:40的免疫原性片段至少95％相同。

14.根据权利要求1所述的疫苗载体，其中所述疫苗载体包含SEQIDNO:32、SEQIDNO:34的多肽、或者与SEQIDNO:32或SEQIDNO:34具有95％序列同一性的多肽。

15.一种药物组合物，其包含权利要求1-14中任一项所述的疫苗载体以及药学上可接受的载体。

16.一种增强受试者中针对顶复门寄生虫的免疫应答的方法，其包括以增强受试者对顶复门寄生虫的免疫应答的有效量向受试者施用权利要求1-14中任一项所述的疫苗载体、或权利要求15所述的药物组合物。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述增强的免疫应答包括增强的抗体应答、增强的T细胞应答或两者。

18.一种降低与受试者中顶复门寄生虫感染相关的发病率的方法，所述方法包括，与未施用疫苗载体的对照受试者相比，以降低受试者与顶复门寄生虫继发感染相关的发病率的有效量向受试者施用权利要求1-14中任一项所述的疫苗载体、或权利要求15所述的药物组合物。

19.根据权利要求16-18中任一项所述的方法，其中通过选自口服、粘膜、肠胃外、皮下、肌肉内、眼内和卵内的途径施用所述疫苗载体。

20.根据权利要求16-19中任一项所述的方法，其中所述受试者是禽物种的成员。

21.根据权利要求18所述的方法，其中所述禽物种是鸡或火鸡。

22.根据权利要求16-21中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述受试者是人、猪或牛。

24.根据权利要求16-23中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用约10⁴至约10⁹载体拷贝的所述疫苗。

25.根据权利要求16-23中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用约10⁵至约10⁷载体拷贝的所述疫苗。

26.根据权利要求16-25中任一项所述的方法，其中所述疫苗载体在施用至受试者之前是灭活的或者不能在受试者中复制。

27.根据权利要求16-26中任一项所述的方法，其中所述顶复门寄生虫选自艾美球虫Eimeria、疟原虫Plasmodium、弓形虫Toxoplasma、新孢子虫Neospora和隐孢子虫Cryptosporidium。