CN102811734B - 增强免疫应答的疫苗载体和方法 - Google Patents

增强免疫应答的疫苗载体和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102811734B
CN102811734B CN201180006369.8A CN201180006369A CN102811734B CN 102811734 B CN102811734 B CN 102811734B CN 201180006369 A CN201180006369 A CN 201180006369A CN 102811734 B CN102811734 B CN 102811734B
Authority
CN
China
Prior art keywords
polypeptide
vaccine carrier
seqidno
vaccine
carrier
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201180006369.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102811734A (zh
Inventor
L·贝里曼
W·博蒂杰
B·哈吉斯
S·莱顿
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Guelph
Texas A&M University System
Original Assignee
University of Guelph
Texas A&M University System
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Guelph, Texas A&M University System filed Critical University of Guelph
Publication of CN102811734A publication Critical patent/CN102811734A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102811734B publication Critical patent/CN102811734B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/542—Mucosal route oral/gastrointestinal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/543—Mucosal route intranasal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6006—Cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

此处提供了包括存在于疫苗载体表面的抗原多肽和HMGB1多肽的疫苗载体。还提供了包括疫苗载体的组合物，并包括可药用载体，合适地用于口服或经鼻施用的载体。还提供了通过向受试者施用此处公开的疫苗载体或组合物来增强免疫应答的方法，尤其是抗体免疫应答以及合适地IgA应答。

Description

增强免疫应答的疫苗载体和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2010年1月21日提交的美国临时专利申请No.61/297,098的优先权，其全部并入此处作为参考。
背景技术
疫苗用来引发对抗原，尤其是来自病原体、肿瘤细胞等的抗原的适应性免疫应答，以减轻或防止疾病。合成肽或灭活（killed）或减毒微生物疫苗往往在刺激充分保护性的强大免疫应答方面是有效的。在某些情况下，这些疫苗不是保护性的或只有部分保护性，而其它策略必须用于开发保护性疫苗。基于减毒微生物的疫苗还与基因转移或突变修复的风险有关，并可能给免疫力低下的个体带来风险。需要开发在刺激持久保护性免疫应答方面安全且有效的新疫苗。
流感病毒感染，尤其是禽流感H5N1，呈现出上升的健康及经济关注。证据明确地显示世界越来越多地区，H5N1继续在易感的鸟类及猪之间传播。许多科学家相信，如果不加控制，目前的H5N1禽流感将突变成能够从人到人之间传播而导致世界范围的大流行。由于死亡率（mortalityrate）为50%以上，这样的爆发将是灾难性的。不论禽流感病毒H5N1导致人类疾病的能力如何，由于受累地区对禽畜采取消灭措施，该病毒已经对巨大经济影响造成威胁。因此，需要开发疫苗来保护人类、禽类、猪及其它驯养动物免受H5N1流感。能够保护免受H5N1以及其它流感病毒比如H1N1的流感疫苗将是最好的。
发明内容
此处提供刺激免疫应答的疫苗载体和方法，以及降低与流感感染相关的发病率（morbidity）的方法。在一方面中，提供包括抗原多肽和HMGB1多肽或其功能片段的疫苗载体。至少部分抗原多肽和HMGB1多肽存在于疫苗载体的表面上。疫苗载体可能包括编码抗原多肽的第一多核苷酸以及编码HMGB1多肽的第二多核苷酸。HMGB1多肽和抗原多肽可连接于比如融合蛋白中。HMGB1多肽和抗原多肽均可以插入到跨膜蛋白的外环中。
在另一方面中，提供包括疫苗载体和可药用载体的组合物。可药用载体可能是对于口服或经鼻使用可接受的。疫苗载体可能不能复制。
在另一方面中，提供芽孢杆菌（Bacillusspp.）疫苗载体。疫苗载体包括编码表达于疫苗载体表面上的抗原多肽的第一多核苷酸序列以及编码表达于疫苗载体表面上的免疫刺激多肽的第二多核苷酸序列。抗原多肽可能是流感M2e多肽、流感HA多肽或流感NP多肽或其组合。免疫刺激多肽可能是CD154多肽或HMGB1多肽或其组合。免疫刺激多肽和抗原多肽连接于比如融合蛋白中，并可能插入至跨膜蛋白的外环中。
在另一方面中，提供在受试者中增强免疫应答的方法。在方法中，以有效增强受试者对抗原多肽的免疫应答的量向受试者施用此处提供的疫苗载体或组合物。合适地，口服或鼻内施用疫苗载体。
在另一方面中，提供通过施用此处所述的芽孢杆菌疫苗载体在受试者中增强免疫应答的方法。疫苗载体包括编码表达于疫苗载体表面上的抗原多肽的第一多核苷酸序列以及编码表达于疫苗载体表面上的免疫刺激多肽的第二多核苷酸序列。抗原多肽可能是流感M2e多肽、流感HA多肽或流感NP多肽或其组合。免疫刺激多肽可能是CD154多肽、HMGB1多肽或其组合。
在另一方面中，提供降低受试者中流感相关的发病率的方法。在方法中，施用此处公开的疫苗载体或组合物降低与随后流感感染相关的发病率。
附图说明
图1是一个图表，其显示，和用生理盐水接种的鸡相比，通过将指示剂量的表达A型流感表位和HMGB1或CD154的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）疫苗载体对鸡进行灌胃（oralsavage）后的M2e特异性抗体生产的ELISA的S/P（样品相对于阳性对照）比。
图2是一个图表，其显示，和用生理盐水接种的鸡相比，通过将指示剂量的表达A型流感表位和HMGB1或CD154的枯草芽孢杆菌疫苗载体对鸡进行灌胃后的HALB特异性抗体生产的ELISA的S/P比。
图3是一个图表，其显示，和用生理盐水接种的鸡相比，通过将指示剂量的表达A型流感表位和HMGB1或CD154的枯草芽孢杆菌疫苗载体对鸡进行灌胃后的HAUA特异性抗体生产的ELISA的S/P比。
图4是一个图表，其显示，和用芽孢杆菌载体单独（BSBB）接种的鸡相比，通过将指示剂量的表达A型流感表位和HMGB1或CD154的活或不同程度失活的枯草芽孢杆菌疫苗载体对鸡进行灌胃后的M2e特异性抗体生产的ELISA的S/P比。
图5是一个图表，其显示，和用芽孢杆菌载体单独（BSBB）接种的鸡相比，通过将指示剂量的表达A型流感表位和HMGB1或CD154的活或不同程度失活的枯草芽孢杆菌疫苗载体对鸡进行灌胃后的HALB特异性抗体生产的ELISA的S/P比。
图6是一个图表，其显示，和用芽孢杆菌载体单独（BSBB）接种的鸡相比，通过将指示剂量的表达A型流感表位和HMGB1或CD154的活或不同程度失活的枯草芽孢杆菌疫苗载体对鸡进行灌胃后的HAUA特异性抗体生产的ELISA的S/P比。
图7是一个图表，其显示，和用芽孢杆菌载体单独（BSBB）接种的鸡相比，通过将106活的或各种指示剂量的表达A型流感表位和HMGB1的福尔马林失活的枯草芽孢杆菌疫苗载体对鸡进行灌胃后的M2e特异性IgG抗体生产的ELISA的S/P比。
图8是一个图表，其显示，和用芽孢杆菌载体单独（BSBB）接种的鸡相比，通过口服或皮下接种有106活的、福尔马林失活的或者福尔马林失活且冻干的表达A型流感表位和HMGB1的枯草芽孢杆菌疫苗载体的鸡的M2e特异性IgA抗体生产的ELISA的S/P比。
图9是一个图表，其显示，和用芽孢杆菌载体单独（BSBB）接种的鸡相比，通过口服或皮下接种有106活的、福尔马林失活的或者福尔马林失活且冻干的表达A型流感表位和HMGB1的枯草芽孢杆菌疫苗载体的鸡的M2e特异性IgA抗体生产的ELISA的S/P比。
具体实施方式
重组DNA技术使得能够相对容易地操作许多细菌和病毒物种。一些细菌和病毒天然地或可以经选择或工程化为轻度致病性的或非致病性的，但仍然能够产生强大的免疫应答。这些细菌和病毒制备有吸引力的疫苗载体来引起对异源或外来抗原的免疫应答。细菌或病毒疫苗载体可能会模仿天然感染，并产生强大和持久的免疫力。生产和施用疫苗载体往往是相对低廉的。此外，这种载体往往可以携带一个以上抗原并可提供对多种感染性因子的保护。
活的细菌或病毒疫苗载体仍可能给免疫力低下的个体带来风险，并需要额外的监管审查。因此，使用灭活的或失活的或取得由食品与药品监督管理局（FDA）“通常认为是安全的（GRAS）”资格的生物体的载体是可取的。问题是使用这种载体产生强大的免疫应答。如实施例中所示，通过将HMGB1（高迁移率族1）多肽纳入疫苗载体的表面，我们可以使用芽孢杆菌载体产生针对抗原多肽的强大的免疫应答。事实上，实施例证明使用各种方法可以使这种载体失活从而它不能复制而施用后仍然引发强大的免疫应答。
此处提供包括抗原多肽和HMGB1多肽或其功能片段的疫苗载体。至少部分抗原多肽和至少部分HMGB1多肽或其功能片段存在于疫苗载体的表面上。疫苗载体可能包括编码抗原多肽的第一多核苷酸以及编码HMGB1多肽的第二多核苷酸。HMGB1多肽和抗原多肽可连接于比如融合蛋白中或可分开表达。HMGB1多肽和抗原多肽可均插入到跨膜蛋白的外环中。
疫苗载体可能是基于细菌、病毒或脂质体的载体。潜在的疫苗载体包括，但不限于，芽孢杆菌（Bacillus）（枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis））、沙门氏菌（Salmonella）（肠炎沙门氏菌（Salmonellaenteritidis））、志贺氏菌（Shigella）、大肠埃希氏菌（Escherichia）（大肠杆菌（E.coli））、耶尔森氏菌（Yersinia）、百日咳杆菌（Bordetella）、球菌（Lactococcus）、链球菌（Streptococcus）、弧菌（Vibrio）（霍乱弧菌（Vibriocholerae））、李斯特菌（Listeria）、腺病毒（adenovirus）、痘病毒（poxvirus）、疱疹病毒（herpesvirus）、甲病毒（alphavirus）和腺相关病毒。合适地，疫苗载体是GRAS生物体。疫苗载体可经过失活或灭活从而它不能够复制。使细菌或病毒疫苗载体失活或灭活的方法对于本领域技术人员是已知的，并包括，但不限于，实施例中显示的那些方法，即福尔马林失活、基于抗生素的失活、热处理和乙醇处理。
抗原多肽是一种能够被适应性免疫系统特异性识别的多肽。抗原多肽包括免疫原性的任何多肽。抗原多肽包括但不限于病原体相关、致敏原相关、肿瘤相关或疾病相关的抗原。病原体包括病毒、寄生虫、真菌和细菌病原体以及蛋白质病原体如朊病毒。抗原多肽可能是全长蛋白质或其部分。已经公认的是许多蛋白质的免疫系统识别是基于相对较少数目的氨基酸，通常称为表位。表位可能只有8-10个氨基酸。因此，此处所述的抗原多肽可能是全长的蛋白质、8个氨基酸长的表位或这两种极端之间的任何部分。事实上，抗原多肽可能包括来自单一病原体或蛋白质的一个以上的表位。
来自不同蛋白质的相同表位或多表位的多拷贝可包括在疫苗载体中。可以设想，来自相同或不同的病原体或疾病的几个表位或抗原可在单一疫苗载体中组合施用来产生对多抗原的增强的免疫应答。重组疫苗载体可能编码来自多病原微生物、病毒或肿瘤相关抗原的抗原。能够表达多抗原的疫苗载体的施用具有同时诱导对两种或更多疾病的免疫力的优势。
抗原多肽可能是流感多肽，合适地，它是流感H5N1多肽或与多株流感病毒（如流感M2蛋白的多肽）相关的多肽。A型流感病毒M2蛋白的胞外域，称为M2e，突出病毒表面。M2蛋白的M2e部分含有约24个氨基酸。流感中一个分离体（isolate）与下一个之间M2e多肽变化不大。事实上，自1918年流感流行从感染的人类中已分离出的M2e中仅少数几个天然发生的突变。此外，从禽和猪宿主分离的流感病毒具有不同的，但仍然保守的，M2e序列。为了综述从人、禽和猪宿主分离的M2e多肽序列，见Liu等人，MicrobesandInfection7:171-177(2005)以及Reid等人，J.Virol.76:10717-10723(2002)，其各自全部纳入此处作为参考。还参见SEQIDNO：1-4。
合适地，整个M2e多肽可插入疫苗载体或可以使用仅一部分。实施例中，八个氨基酸多肽（具有氨基酸序列：EVETPIRN，SEQIDNO：5的LM2或具有氨基酸序列EVETPTRN，SEQIDNO：6的其变体M2eA）并入疫苗载体，并向鸡施用后证明产生抗体应答。合适地，插入疫苗载体的M2e多肽的部分是免疫原性。免疫原性片段是能够引发细胞或体液免疫应答的肽或多肽。合适地，M2e的免疫原性片段可能是全长M2e多肽，或者合适地可能是全长序列的20个或更多个氨基酸，15个或更多个氨基酸，10个或更多个氨基酸或者8个或更多个氨基酸。
纳入A型流感疫苗载体的其它合适表位包括，但不限于，A型流感的血凝素（HA）或核蛋白（NP）的多肽。例如SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9或SEQIDNO：10的肽可纳入疫苗载体。实施例中，SEQIDNO：7（HAUA）和SEQIDNO：8（HALB）并入疫苗载体并向鸡施用后表现出产生抗体应答。见图2-3和图5-6。此外，实施例中SEQIDNO：9（NP54）和SEQIDNO：10（NP147）的NP表位并入疫苗载体。本领域技术人员将理解任何这些序列可以和包括源自其它病原体或抗原的表位的任何其它表位组合使用。
HMGB1（高迁移率族-1）蛋白首次被鉴定为对DNA结构和稳定性关键的DNA结合蛋白。它是广泛表达的核蛋白，其无序列特异性地结合DNA。该蛋白是高度保守的并见于植物到哺乳动物中。斑马鱼、鸡和人HMGB1氨基酸序列分别提供于SEQIDNO：30、SEQIDNO：18和SEQIDNO：29中。整个哺乳动物中的序列是高度保守的，具有98％的氨基酸同一性并且氨基酸的变化是保守的。因此，来自一个物种的HMGB1蛋白可以功能上取代来自另一个物种的HMGB1蛋白。全长HMGB1蛋白或其部分可用作此处所述的疫苗载体中的HMGB1多肽。HMGB1有两个DNA结合区，称为如SEQIDNO：23和24所示的A盒（box）以及如SEQIDNO：25和26所示的B盒。见Andersson和Tracey,Annu.Rev.Immunol.2011,29:139-162，其全部并入此处作为参考。
HMGB1是一种炎症介质，并作为比如来自坏死细胞的核损伤信号。在蛋白质乙酰化、跨核转运和分泌所需的过程中，HMGB1还可以由单核细胞/巨噬细胞系的细胞主动分泌。胞外HMGB1作为强效的炎症介质通过经由晚期糖基化终产物受体（RAGE）和经由Toll样受体家族（TLR）的成员（尤其是TLR4）的信号而发挥作用。RAGE结合活性已经得以鉴定，并需要SEQIDNO：27的多肽。TLR4结合需要SEQIDNO：18的位置106的半胱氨酸，其发现于HMGB1的B盒区域中。
HMGB1的炎症活性不需要全长蛋白，并且功能片段已被鉴定。B盒已显示出足以介导HMGB1的促炎作用，因此SEQIDNO：25和26是本发明文中的HMGB1多肽或其功能片段。此外，RAGE结合位点和促炎细胞因子活性已分别被映射到SEQIDNO：27和SEQIDNO：28上。因此，这些多肽是本发明文中HMGB1多肽的功能片段。
本领域技术人员使用比如国际公开号WO02092004中的那些方法能够鉴定能够刺激促炎细胞因子活性的HMGB1多肽及其片段，其全部并入此处作为参考。合适地，HMGB1多肽包括位于SEQIDNO：18的氨基酸150-183（SEQIDNO：27或其同源物）的RAGE结合域以及SEQIDNO：18的氨基酸89-109（SEQIDNO：28或其同源物）之间的促炎细胞因子活性域。尤其是，HMGB1多肽及其功能片段或同源物包括与SEQIDNO：18或23-30的HMGB1多肽同一的、或至少99％同一性、至少98％同一性、至少95％同一性、至少90％同一性、至少85％同一性、或至少80％同一性的多肽。
至少部分抗原多肽和至少部分HMGB1多肽存在于疫苗载体的表面上。存在于疫苗载体表面上包括包含在跨膜蛋白中、与跨膜蛋白、膜脂或膜锚定碳水化合物相互作用、共价或化学交联至跨膜蛋白、膜脂或膜锚定碳水化合物的多肽。可以通过让包括多肽的氨基酸经由肽键连接至跨膜蛋白N-端、C-端或其中任何位置上，使多肽包括在跨膜蛋白中（即插入至跨膜蛋白两个氨基酸之间或取代跨膜蛋白的一个或多个氨基酸（即删除-插入））。合适地，多肽可能插入至跨膜蛋白的外环内。合适的跨膜蛋白是cotB和lamB，但本领域技术人员将理解可获得许多合适的跨膜蛋白。
或者，多肽通过本领域技术人员可获得的方法可共价或化学连接至膜中的蛋白质、脂质或碳水化合物，或衣壳上（如果使用病毒载体的话）。例如，二硫键或生物素-抗生物素蛋白交联可用于将抗原和HMGB1多肽呈现到疫苗载体表面上。合适地，抗原多肽和HMGB1多肽是融合蛋白的一部分。两个多肽通过肽键直接连接或可通过接头或它们所插入的第三蛋白的区段而分开。
编码抗原多肽或HMGB1多肽的多核苷酸可插入疫苗载体，并经表达而产生抗原多肽和HMGB1多肽。多肽可插入至疫苗载体的染色体或编码于质粒或其它染色体外DNA上。合适地，编码抗原多肽和/或HMGB1多肽的多核苷酸可单独表达或插入所表达的疫苗载体多核苷酸中。合适地，疫苗载体多核苷酸编码表达于疫苗载体表面上的多肽如跨膜蛋白。编码抗原多肽和/或HMGB1多肽的多核苷酸可插入疫苗载体多核苷酸序列以允许抗原多肽和/或HMGB1多肽在载体表面上的表达。例如，编码抗原多肽和HMGB1多肽的多核苷酸可在框中插入至细菌多核苷酸的编码跨膜蛋白外环区的区域中，从而细菌多核苷酸序列仍然在框中。见实施例1。
或者，编码抗原多肽和/或HMGB1多肽的多核苷酸，通过结合疫苗载体表面上的蛋白质、脂质或碳水化合物，可插入至展示在或呈现在疫苗载体表面上的分泌多肽中。本领域技术人员将理解编码抗原多肽和/或HMGB1多肽的多核苷酸可以插入至各种疫苗载体多核苷酸中来向用疫苗载体治疗的受试者免疫细胞提供抗原多肽和/或HMGB1多肽的表达和递呈。在实施例中，从枯草芽孢杆菌的营养表达质粒表达包括M2e表位、HA表位和NP表位的几个流感表位。如通过图1-6所示的免疫应答所证明的，获得的重组细菌表达插入的表位。
在实施例中，疫苗载体具有编码于相同多核苷酸上的并且彼此在框中的抗原多肽（M2e、HA和NP多肽）以及免疫刺激多肽（CD154或HMGB1）。在替代的实施方式中，免疫刺激多肽和抗原多肽可通过区别的多核苷酸编码。本领域技术人员将理解各种方法可用于获得抗原多肽和HMGB1多肽在疫苗载体表面上的表达。这种方法是本领域技术人员已知的。
还提供包括疫苗载体和可药用载体的组合物。可药用载体是适合于体内施用的任何载体。合适地，可药用载体对于口服、经鼻或粘膜递送是可以接受的。可药用载体可包括水、缓冲溶液、葡萄糖溶液或细菌培养液。组合物的额外成分可合适地包括赋形剂比如稳定剂、防腐剂、稀释剂、乳化剂和润滑剂。可药用载体或稀释剂的实例包括稳定剂比如碳水化合物（如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖）、蛋白质比如白蛋白或酪蛋白、含蛋白质的制剂比如牛血清或脱脂奶和缓冲液（如，磷酸盐缓冲液）。尤其是当这种稳定剂加入组合物时，组合物适合冷冻干燥或喷雾干燥。组合物中的疫苗载体可能不能复制，合适地在加入组合物之前，疫苗载体经失活或灭活。
此处所述的组合物可用于增强免疫应答比如对抗原多肽的抗体应答。含有流感多肽的组合物也可用于降低与随后的流感感染相关的发病率。组合物可防止流感在施用此处所述的组合物或疫苗载体的受试者中引起疾病或任何相关的发病率。此处所述的组合物和疫苗载体，通过降低疾病的时程（length）、降低与疾病相关的发病率或死亡率或降低染上疾病的可能性，可降低疾病后的严重程度。和未提供疫苗载体的相似受试者相比，施用此处所述的疫苗载体后，与疾病相关的发病率或死亡率可降低25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或甚至100％。
还提供通过施用疫苗载体在受试者中增强免疫应答的方法。疫苗载体可包含能够刺激对疫苗载体及其相关抗原多肽的免疫应答的HMGB1多肽。以可有效增强受试者对疫苗尤其是对抗原多肽的免疫应答的量向受试者施用包括HMGB1的多肽的疫苗载体。合适地，疫苗载体含有编码包括HMGB1多肽的氨基酸150-183和89-109（SEQIDNO：18）或其同源物的多肽的多核苷酸。在实施例中，使用190个氨基酸的HMGB1的多肽。合适地，多核苷酸编码来自与受试者相同的物种的HMGB1多肽。HMGB1多肽和受试者的异源组合（即人HMGB1多肽用在鸡的疫苗中）在本发明的方法中可能是有用的，因为HMGB1在众多物种当中是高度保守的。HMGB1多肽可用于在受试者中增强对出现在疫苗载体之中或之上的任何外来抗原或抗原多肽的免疫应答。本领域技术人员将理解HMGB1多肽可用于增强对出现在疫苗载体之中的一个以上抗原多肽的免疫应答。来自HMGB1的多肽，通过激活树突状细胞和巨噬细胞从而刺激细胞因子（比如IL-1、IL-6、IFN-γ和TNF-α）的产生，刺激至少部分免疫应答。在实施例中，HMGB1的多肽表达在疫苗载体的表面上。
此外，公开了增强抗A型流感的免疫应答的方法以及降低与A型流感感染后相关的发病率的方法。简言之，方法包括以有效引发免疫应答的量向受试者施用包括能够引发免疫应答的A型流感表位（流感的抗原多肽）的疫苗载体。A型流感表位可能是M2e多肽、HA多肽或NP多肽或如上讨论的另一流感多肽。抗原多肽在疫苗载体中的插入可通过本领域技术人员已知的各种方式而实现，包括但不限于国际专利公开No.WO2008/036675中所述的无痕（scarless）定点突变系统。细菌也可经工程化而表达结合有如上面所讨论的能够增强免疫应答的多核苷酸的流感多肽。尤其是，CD154或HMGB1的多肽由疫苗载体表达来增强受试者对流感多肽的免疫应答。实施例证明了在鸡当中对接种产生强大的IgA和IgG应答。我们期望这种强大的应答将保护免受或至少降低与感染后相关的发病率或抗原多肽来源（实施例中的流感病毒）的挑战。
可通过各种手段包括但不限于口服、经鼻和黏膜来施用组合物。例如，可通过气溶胶、通过喷雾、通过加入到食物或水中、通过灌胃、或经由滴眼剂来递送组合物或疫苗载体。在一些实施方式中，通过注射比如皮内、肠道外、皮下、腹腔、静脉、颅内、或肌肉内施用组合物。对于鸡或其它禽，可卵内（inovo）施用组合物。
受试者包括但不限于脊椎动物，合适的哺乳动物、合适的人、牛、猫、狗、猪或鸟类，合适的禽比如鸡。也可使用其它感染的动物模型。增强免疫应答包括但不限于诱导受试者免疫系统介导的治疗性或预防性作用。具体来说，增强免疫应答可包括，比如图1-3所证明的增强的抗体生产、图8所示的增强的抗体重链的类别转换比如IgA的生产、抗原递呈细胞的成熟、辅助性T细胞的刺激、细胞毒性T细胞的刺激或T和B细胞记忆的诱导。
待施用的有用剂量将取决于受试者的年龄、体重和物种、施用模式和途径以及所寻求的免疫应答病原体或疾病类型而不同。可以足以唤起免疫应答的剂量的任何疫苗载体施用组合物。可设想，范围从103至1010载体拷贝（即噬菌斑形成或集落形成单位）的剂量，从104至109载体拷贝，或从105至107载体拷贝是合适的。
可施用仅一次或施用两次或更多次组合物来提高免疫应答。例如，可施用两次或更多次组合物，每次隔一周、两周、或三周、一个月、两个月、三个月、六个月或以上。施用前细菌可能是有活力的，但在一些实施方式中施用前细菌可能是灭活的或失活的。在一些实施方式中，细菌可能是能够在受试者中复制的，而在其它实施方式中细菌可能是不能在受试者中复制的。如在实施例中所示的，施用前可使用福尔马林、乙醇、热或抗生素使细菌疫苗载体失活。本领域技术人员将理解也可以使用失活疫苗载体的其它手段。
此处还提供了芽孢杆菌疫苗载体。芽孢杆菌疫苗载体包括编码抗原多肽的第一多核苷酸序列以及编码免疫刺激多肽的第二多核苷酸序列。如上所述抗原多肽和免疫刺激多肽呈现在芽孢杆菌疫苗载体表面上。抗原多肽是如上所述的流感多肽并且免疫刺激多肽是如上所述的HMGB1多肽或CD154多肽。
编码与受试者蛋白质同源的且能够刺激免疫系统响应抗原多肽的免疫刺激多肽的多核苷酸也可以插入疫苗载体。如实施例中更详细所述的，疫苗载体可包括CD154多肽，与上述HMGB1相似，其在受试者中能够结合CD40并刺激受试者响应疫苗载体及其相关抗原多肽。芽孢杆菌疫苗载体可包括HMGB1多肽、CD154多肽或其组合。如上所述，编码这些多肽的多核苷酸可插入疫苗载体的染色体或维持在染色体外。本领域技术人员将理解这些多肽可以插入各种疫苗载体的多肽并表达于疫苗载体的不同部位中或可被分泌。
编码能够增强对抗原多肽的免疫应答的免疫刺激多肽的多核苷酸也可编码抗原多肽。编码免疫刺激多肽的多核苷酸可连接至编码抗原多肽的多核苷酸，从而在疫苗载体中免疫刺激多肽和抗原多肽由相同的多核苷酸编码。在实施例中，编码CD154（能够结合CD40）或HMGB1的多肽的多核苷酸还编码A型流感的M2e表位、HA表位和NP表位。见SEQIDNO：19-22。在实施例中，编码流感表位的多核苷酸和编码免疫刺激多肽的多核苷酸均表达自营养细胞表达的质粒。在一些实施方式中，多核苷酸插入至cotB基因或编码表达于孢子表面的蛋白的另一基因。本领域技术人员将理解也可使用编码其它跨膜蛋白的细菌多核苷酸。
如上面所讨论的，编码能够增强对表位的免疫应答的与受试者蛋白质同源的免疫刺激多肽的多核苷酸可纳入到疫苗载体中。在实施例中，如通过在对接种应答中增加的抗体生产而测量的，包括编码能够结合CD40的CD154多肽或编码HMGB1的多肽的多核苷酸的芽孢杆菌疫苗载体，被证明增强对M2e表位和两个不同HA表位的免疫应答。
合适地，CD154多肽在50个氨基酸长以下，更合适的40个以下、30个以下或20个氨基酸以下的长度。多肽可在10和15个氨基酸之间，10和20个氨基酸之间或10和25个氨基酸的长度。CD154序列和CD40结合区在各种物种之间不是高度保守的。鸡和人的CD154序列分别如SEQIDNO：11和SEQIDNO：12中所提供。
对于一些物种已经确定了CD154的CD40结合区，包括人、鸡、鸭、小鼠和牛，并分别显示在SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：16、SEQIDNO：17中。尽管物种间CD40结合区中在序列上有可变性，如下实施例表明人CD154多肽能够在鸡当中增强免疫应答。因此，人们可能会使用物种特异性CD154多肽或异源CD154多肽来实施本发明。尤其是CD154多肽及其功能片段或同源物包括与SEQIDNO：11-17的CD154多肽同一的、或至少99％同一性、至少98％同一性、至少95％同一性、至少90％同一性、至少85％同一性、或至少80％同一性的多肽。
此处所述的芽孢杆菌疫苗载体可用于如上所述在受试者中增强免疫应答的方法中以及降低流感发病率的方法中。芽孢杆菌疫苗载体还可用来制造向受试者施用的组合物，比如如上所述的那些。
可以使用本领域已知的方法将编码抗原多肽的异源多核苷酸在任何非必要位点处插入细菌基因组中，或者作为替代可插入质粒上。一个适合多核苷酸插入的位点位于跨膜蛋白的外面部分当中，或偶联至靶向分泌途径的异源多核苷酸的序列上。适合多核苷酸插入的跨膜蛋白的实例是芽孢杆菌的cotB基因与沙门氏菌的lamB基因。
异源多核苷酸包括但不限于编码选自病原微生物或疫苗载体以外的病毒的抗原的多核苷酸。这种多核苷酸可衍生自病原性病毒比如流感（如，M2e、血凝素或神经氨酸苷酶）、疱疹病毒（如编码疱疹病毒结构蛋白的基因）、逆转录病毒（如gp160包膜蛋白）、腺病毒、副粘病毒、冠状病毒等。异源多核苷酸还可以获自病原性细菌，如编码细菌蛋白质如毒素和外膜蛋白的基因。此外，来自寄生虫如艾美球虫的异源多核苷酸是用于载体疫苗中的有吸引力的候选者。
参与引发免疫系统的额外免疫刺激多肽也可包括在此处所述的疫苗载体中。多核苷酸可编码以其刺激作用而公知的免疫系统分子，如白细胞介素、肿瘤坏死因子或干扰素、或参与免疫调节的另一多核苷酸。
如下实施例只意图是说明性的，并不意味着作为对本发明或所附权利要求的范围的限制。
实施例
实施例1：HA/NP/M2e/cCD154和HA/NP/M2e/HMGB1芽孢杆菌载体的构建
株和培养条件
除非另有说明，否则首先将所有质粒维持在TOP10大肠杆菌细胞（Invitrogen,Carlsbad,CA,USA）中。芽孢杆菌用来引入突变（Bacillussubtilis,禽类健康实验室株，指定为NP122）。携带质粒pDGIEF和pHT10的细菌在37°C下培养。
Luria-Bertani（LB）培养基用于细胞的常规生长，而SOC培养基（Invitrogen,Carlsbad,CA,USA）用于电穿孔之后表型的表达。在适当时，将以下物质添加到培养基中：
1mM异丙基-beta-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、100μg/ml氨苄西林（Amp）、100μg/ml壮观霉素（SP）和5μg/ml氯霉素（Cm）。
质粒
以前描述过质粒pDGIEF（芽孢杆菌遗传储存中心BacillusGeneticStockCenter,Columbus,OH）和pHT10用于本研究（Zhang等人，Nuc.AcidsResearch2006,34(9):1-8和Nguyen等人，Curr.Micro.2007,55:89-93）。质粒pDGIEF作为mazF基因扩增的模板，mazF基因在芽孢杆菌染色体操作期间用作反选标志物。质粒pHT10用于在芽孢杆菌中编码和生产禽流感的异源表位序列。质粒包含CM抗性基因，通过加入1mMIPTG而诱导并在37°C下维持在芽孢杆菌中。
用于营养细胞表达的异源蛋白质的生产
购自MoBioTec/BocaScientific,BocaRaton,FL的质粒pHT10（Nguyen等人，2007）通过加入枯草芽孢杆菌密码子优化的插入序列在多克隆位点进行转化。进行DNA测序来证实正确的序列插入。新改造的质粒然后转化至芽孢杆菌中。简言之，芽孢杆菌培养物在HS培养基（Spizizen培养基，补充有0.5%葡萄糖、50μg/mlDL-色氨酸、50μg/ml尿嘧啶、0.02%酪蛋白水解物、0.1%酵母提取物、8μg/ml精氨酸、0.4μg/ml组蛋白、1mMMgSO4）中在37oC下过夜生长。过夜培养物（1ml）用于接种20mlLS培养基（Spizizen培养基，补充有0.5%葡萄糖、5μg/mlDL-色氨酸、5μg/ml尿嘧啶、0.01%酪蛋白水解物、0.1%酵母提取物、1mMMgSO4、2.5mMMgCl2、0.5mMCaCl2）并在30oC下振荡孵育3-4小时。向1ml获得的LS培养物中加入10μl的0.1MEGTA并在室温下孵育5分钟。然后加入1-2μg质粒DNA，37oC下振荡2小时，并涂覆在带有选择性抗生素的LB板上。当用1mMIPTG诱导时，这些转化的芽孢杆菌现在从AI生产异源表位序列。
PCR
用于PCR的所有引物在表1中列出。典型的PCR条件由如下组成：在50μL总体积中，大约0.1μg纯化的基因组、质粒或PCR产生的DNA（Qiagen,Valencia,CA,USA）、1×Pfu聚合酶缓冲液、5UPfu聚合酶（StratageneLaJolla,CA,USA）、1mMdNTP（GEHealthcareBio-SciencesCorp.,Piscataway，NJ）、每个引物1.2μM。使用DNA工程热循环仪（Bio-Rad,Hercules,CA,USA）在以下扩增条件下进行扩增：94°C，2分钟；30个循环的94°C持续30秒、58°C持续60秒、72°C持续90秒每1kb；和72°C持续10分钟以进行最后的延伸。每个PCR产物经过凝胶纯化（Qiagen,Valencia,CA,USA），并以25μL的EB缓冲液洗脱用于制备重叠延伸PCR反应所用的模板，或者以50μL的EB缓冲液洗脱，乙醇沉淀，并在5μL的ddH2O中悬浮用于将其电穿孔至芽孢杆菌中。
表1：用于产生疫苗载体的引物序列
表1中，斜体核苷酸是互补于枯草芽孢杆菌CotB基因插入位点各侧的那些。
电穿孔
简言之，将细胞接种至10mlLB肉汤培养基（broth）中，并在37°C生长过夜。然后将100μL过夜培养物重新接种至10mL新鲜的LB肉汤培养基中，并在37°C培养3-4小时。将细胞在ddH2O水中冲洗五次，然后将其重悬于60μL的10%甘油中。接着将细胞以2.4-2.45kV的脉冲处理1-6ms，于37°C在0.5ml的SOC中孵育2-3小时，并将其涂覆于含适当抗生素的LB培养基上。
用于芽孢外被表达的异源DNA的染色体整合
使用最近发表的方法加以改造来构建含有所选M2e、HA和NP表位稳定整合拷贝的重组芽孢杆菌株。简言之，芽孢杆菌株转化有MazF盒（cassette）（Zhang等人，2006），其产生IPTG敏感的且spectomycin（无中文译文）抗性的株。两侧有每侧大约300bp同源DNA的MazF盒通过电穿孔引入芽孢杆菌载体的CotB基因（Isticato等人，2001），随后在含有spectomycin的培养基中生长，现在含有MazF盒的阳性克隆是spectomycin抗性的。
在CotB中证实MazF突变后，这一区域用编码AI抗原表位的密码子优化的DNA序列（同样两侧有300bp同源DNA）替换。通过使用重叠延伸PCR来产生两侧有每侧大约300bp和芽孢杆菌染色体同源的抗原序列来创建PCR产物而得以实现（Cox等人，2007）。再次通过电穿孔和MazF盒替换将PCR产物引入芽孢杆菌。在含有IPTG的板上选择转化体，阳性克隆应当现在对IPTG不响应而对spectomycin敏感。通过DNA测序证实正确的染色体序列插入。
实施例2接种研究1和2
从当地商业性孵化场获得孵化日（第0日）鸡，并将其随机地分配到处理组中（实验1，n=15/处理组，和实验2，n=20/处理组）。为每个处理组的所有鸡加标签并编号。如研究1的表2和研究2的表3中所示，通过用0.25ml的生理盐水或106-108cfu/ml各种芽孢杆菌处理进行灌胃使鸡口服感染。
表2接种研究1中各处理组的挑战剂量
处理组 挑战剂量
仅生理盐水
BS/AI/HMGB1 106cfu/ml
BS/AI/HMGB1 108cfu/ml
BS/AI/CD154 106cfu/ml
BS/AI/CD154 108cfu/ml
表3接种研究2中各处理组的挑战剂量
处理组 挑战剂量
BSBB(芽孢杆菌) 106cfu/ml
BS/AI/HMGB1 106cfu/ml
BS/AI/CD154 106cfu/ml
BS/AI/HMGB1热失活的 106cfu/ml
BS/AI/HMGB1福尔马林失活的 106cfu/ml
BS/AI/HMGB1抗生素失活的 106cfu/ml
BS/AI/HMGB1乙醇失活的 106cfu/ml
在研究2中，以各种不同途径使细菌失活来评估复制对于针对抗原流感肽的抗体应答的产生是否是必要的。使用几种失活手段，因为失活的手段可导致表位的破坏并导致数据的误解，并且支持需要芽孢杆菌载体的复制或活力。通过在0.022%福尔马林中孵育10分钟（福尔马林失活的）；在70℃下孵育10分钟（热失活的）；在5μg/ml庆大霉素中孵育（抗生素失活的）；或在70%乙醇中孵育10分钟（乙醇失活的）使细菌失活。
各处理组饲养在单独的地面鸡圈（floorpen）中铺以新鲜的松砂（pinelitter）并随意（adlibitum）提供水和饲料。在孵化后第11和21天，给予鸟与它们在第0天所接受的相同处理的加强接种。还在第21和31/32天，从各个带标签的鸟中采集血液并移除血清。
采集自各处理组中带标签的鸟的血清然后用于抗体捕获ELISA以确定特异性M2e、HAUA和HALB抗体应答。简言之，用缀合有BSA的10g/ml的M2e表位、HAUA表位或HALB表位包被96孔板的每个孔。于4°C过夜使抗原得以粘附。用PBS+0.05%Tween20冲洗板，用PBSSuperblock（PierceChemicalCo.）封闭至少2小时，并用以前从上述各处理组的鸟采集的血清孵育2小时。用PBS+0.05%Tween20冲洗板，然后用过氧化酶缀合的羊抗鸡IgY二抗（1:7,500稀释度）（获自JacksonImmunoResearchLaboratories（WestGrove,PA））再孵育1小时。在随后的冲洗后，使用过氧化酶底物试剂盒（获自FisherScientific）使板显色，并在分光光度计上在450nm和405nm读取吸光度。
将来自接受载体疫苗的组的血清样本合并用作阳性对照，将来自未接种的组的血清样本合并用作阴性对照，在每个平板上替换来自处理组的血清。采用如下计算，针对阳性对照、阴性对照和实验样本获得的吸光度用于计算样本相对于阳性对照的比（S/P比）：
S/P比计算：
各研究计算的S/P比如图1-6所示。图1-3显示，对于研究1，M2e、HALB和HAUA分别在孵化后第21天和31天的总抗体滴度。结果证明，表达各表位以及作为免疫刺激肽的CD154或HMGB1的芽孢杆菌口服施用后，对于这些抗原的每种产生强大的免疫应答。图4-6显示，对于研究2，M2e、HALB和HAUA分别在孵化后第21天和32天的总抗体滴度。结果证明，表达表位以及免疫刺激肽的活芽孢杆菌口服施用后，对于各表位产生强大的免疫应答。图4-6还证明当施用前使载体（芽孢杆菌）失活时，产生相似水平的特异性抗体。
实施例3接种研究3
从当地商业性孵化场获得孵化日（第0日）鸡，并将其随机地分配到处理组中（n=20/处理组）。为每个处理组的所有鸡加标签并编号。通过用0.25ml的生理盐水或105-108cfu/ml的芽孢杆菌载体（BSBB）、表达禽流感表位和HMGB1的芽孢杆菌载体（BS/AI/HMGB1）、或福尔马林失活后各种量的BS/AI/HMGB1载体（如上所述）进行灌胃使鸡口服感染。在孵化后第10天，给予鸟与它们在第0天所接受的相同处理的加强接种。还在第21和32天，从各个带标签的鸟中采集血液并移除血清。使用上述方法用过氧化物酶标记的抗鸡IgG特异性二抗（JacksonImmunoResearchLaboratories，WestGrove,PA）确定血清IgGM2e特异性抗体水平。图7中的结果显示福尔马林失活的细菌以及活细菌能够刺激M2e特异性抗体的产生。这一结果是出乎意料的，因为通常认为只有活细菌在口服施用后可以刺激强大的免疫应答。
实施例4接种研究4
从当地商业性孵化场获得孵化日（第0日）鸡，并将其随机地分配到处理组中（n=20-35/处理组）。为每个处理组的所有鸡加标签并编号。通过用0.25ml的106cfu/ml的芽孢杆菌载体（BSBB）、表达禽流感表位和HMGB1的芽孢杆菌载体（BSAI）、或福尔马林失活后（如上所述）或福尔马林失活后接着冻干（施用前直接用生理盐水重新配制）的BSAI载体通过灌胃使鸡口服感染或对鸡进行皮下注射。在孵化后第10天，给予鸟一些与它们在第0天所接受的相同处理的加强接种。在第11、14和21天，从各个带标签的鸟中采集血液并移除血清。使用上述方法用过氧化物酶标记的抗鸡IgA（GenTex）或过氧化物酶标记的抗鸡IgG特异性二抗（JacksonImmunoResearchLaboratories，WestGrove,PA）确定血清IgA和IgGM2e特异性抗体水平。图8中的结果显示当口服给予时，福尔马林失活的细菌以及活细菌能够刺激M2e特异性IgA抗体的产生。相反，当皮下给予时，失活的BSAI载体在刺激IgA抗体应答方面不那么有效，并且冻干的细菌不刺激IgA应答。图9中的结果显示各BSAI施用操作支持强大的IgG形成。

Claims (37)

1.一种疫苗载体，其包括抗原多肽和HMGB1多肽，所述抗原多肽和HMGB1多肽包括在跨膜蛋白内，其中至少部分抗原多肽和至少部分HMGB1多肽出现于疫苗载体的表面上，并且其中所述抗原多肽包含选自M2e、HA和NP的至少两种多肽。
2.根据权利要求1所述的疫苗载体，其中抗原多肽是M2e、HA和NP流感多肽。
3.根据权利要求2所述的疫苗载体，其中抗原多肽选自SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、以及SEQIDNO：10。
4.根据权利要求1-3任一项所述的疫苗载体，其中HMGB1多肽选自SEQIDNO：18、SEQIDNO：29和SEQIDNO：30。
5.根据权利要求1-3任一项所述的疫苗载体，其中疫苗载体是细菌。
6.根据权利要求5所述的疫苗载体，其中所述疫苗载体是不能复制的。
7.根据权利要求5所述的疫苗载体，其中所述疫苗载体是失活的。
8.根据权利要求5所述的疫苗载体，其中所述疫苗载体是灭活的。
9.根据权利要求5所述的疫苗载体，其中细菌是芽孢杆菌Bacillusspp.。
10.根据权利要求1所述的疫苗载体，其中抗原多肽和/或HMGB1多肽在跨膜蛋白的外环中。
11.根据权利要求1所述的疫苗载体，其中跨膜蛋白是cotB。
12.一种组合物，其包括权利要求1-3任一项所述的疫苗载体和可药用载体。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中可药用载体是口服或经鼻施用可接受的。
14.根据权利要求12所述的组合物，其中所述疫苗载体是不能复制的。
15.根据权利要求12所述的组合物，其中所述疫苗载体是失活的。
16.根据权利要求12所述的组合物，其中所述疫苗载体是灭活的。
17.权利要求1-3任一项所述的疫苗载体用于制造增强受试者对抗原多肽的免疫应答的药物的用途。
18.根据权利要求17所述的用途，其中疫苗载体制剂成口服或鼻内施用。
19.根据权利要求18所述的用途，其中免疫应答是对抗原多肽的IgA抗体应答。
20.根据权利要求17所述的用途，其中疫苗载体不能在受试者中复制。
21.根据权利要求17所述的用途，其中疫苗载体在向受试者施用之前被失活。
22.根据权利要求17所述的用途，其中疫苗载体在向受试者施用之前被灭活。
23.根据权利要求17所述的用途，其中抗原多肽和/或HMGB1多肽在跨膜蛋白的外环中。
24.一种芽孢杆菌疫苗载体，其包括编码出现于疫苗载体表面上的抗原多肽的第一多核苷酸序列以及编码免疫刺激多肽的第二多核苷酸序列，其中抗原多肽和免疫刺激多肽包括在跨膜蛋白内并且出现于疫苗载体表面上的，其中所述抗原多肽包含选自M2e、HA和NP的至少两种多肽以及其中免疫刺激多肽是HMGB1多肽。
25.根据权利要求24所述的芽孢杆菌疫苗载体，其中第一多核苷酸和第二多核苷酸插入编码跨膜蛋白外面部分的第三多核苷酸序列中。
26.根据权利要求25所述的芽孢杆菌疫苗载体，其中跨膜蛋白是cotB。
27.根据权利要求24所述的芽孢杆菌疫苗载体，其中抗原多肽是流感M2e多肽、流感HA多肽和流感NP多肽。
28.根据权利要求27所述的芽孢杆菌疫苗载体，其中抗原多肽选自SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9和SEQIDNO：10。
29.根据权利要求24-28任一项所述的芽孢杆菌疫苗载体，其中HMGB1多肽选自SEQIDNO：18、SEQIDNO：29和SEQIDNO：30。
30.根据权利要求24所述的芽孢杆菌疫苗载体，其中所述疫苗载体不能复制。
31.根据权利要求24所述的芽孢杆菌疫苗载体，其中所述疫苗载体是失活的。
32.根据权利要求24所述的芽孢杆菌疫苗载体，其中所述疫苗载体是灭活的。
33.权利要求24-28任一项所述的芽孢杆菌疫苗载体用于制造增强受试者对抗原多肽的免疫应答的药物的用途。
34.根据权利要求33所述的用途，其中疫苗载体制剂成口服或鼻内施用。
35.根据权利要求33所述的用途，其中免疫应答是对抗原多肽的IgA抗体应答。
36.权利要求1-4或24-26任一项所述的疫苗载体在制造在受试者中降低A型流感相关发病率的药物中的用途。
37.权利要求12-13任一项所述的组合物用于制造在受试者中降低A型流感相关发病率的药物的用途。
CN201180006369.8A 2010-01-21 2011-01-21 增强免疫应答的疫苗载体和方法 Active CN102811734B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US29709810P 2010-01-21 2010-01-21
US61/297,098 2010-01-21
PCT/US2011/022062 WO2011091255A1 (en) 2010-01-21 2011-01-21 Vaccine vectors and methods of enhancing immune responses

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102811734A CN102811734A (zh) 2012-12-05
CN102811734B true CN102811734B (zh) 2016-02-10

Family

ID=44307229

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180006369.8A Active CN102811734B (zh) 2010-01-21 2011-01-21 增强免疫应答的疫苗载体和方法

Country Status (21)

Country Link
US (2) US8956618B2 (zh)
EP (1) EP2525817B8 (zh)
JP (3) JP6242050B2 (zh)
KR (1) KR101638661B1 (zh)
CN (1) CN102811734B (zh)
AU (1) AU2011207331C1 (zh)
CA (1) CA2787661C (zh)
CL (1) CL2012002016A1 (zh)
CO (1) CO6561819A2 (zh)
DK (1) DK2525817T3 (zh)
EA (1) EA023058B1 (zh)
ES (1) ES2643646T3 (zh)
HU (1) HUE037157T2 (zh)
MX (1) MX341775B (zh)
NO (1) NO2525817T3 (zh)
NZ (1) NZ601609A (zh)
PL (1) PL2525817T3 (zh)
PT (1) PT2525817T (zh)
UA (1) UA110024C2 (zh)
WO (1) WO2011091255A1 (zh)
ZA (1) ZA201205824B (zh)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT3097926T (pt) * 2007-11-01 2020-01-08 Univ Guelph Composições e métodos de potenciação das respostas imunitárias frente a eimeria
WO2011091255A1 (en) 2010-01-21 2011-07-28 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Vaccine vectors and methods of enhancing immune responses
WO2011156619A2 (en) 2010-06-09 2011-12-15 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Vaccine and methods to reduce campylobacter infection
WO2012072788A1 (en) 2010-12-02 2012-06-07 Mab-Factory Gmbh Vaccine against influenza h5n1 viruses, medicament and treatment of h5n1 viral infections
CN105142665A (zh) 2013-02-14 2015-12-09 阿肯色大学评议会 增强对艾美球虫的免疫应答或限制艾美球虫感染的组合物和方法
US10376571B2 (en) * 2013-03-15 2019-08-13 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Compositions and methods of enhancing immune responses to enteric pathogens
CN105399808B (zh) * 2015-11-23 2019-05-10 青岛农业大学 一种许氏平鮋免疫增强蛋白hmgb1基因及编码蛋白和应用
KR20230070521A (ko) 2016-05-03 2023-05-23 더 보드 오브 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 아칸소 면역자극 및 항원 폴리펩티드를 포함하는 효모 백신 벡터, 및 그를 이용하는 방법
EP3996731A4 (en) * 2019-07-12 2023-07-12 Op-T Llc PEPTIDES AND METHODS OF TREATING DISEASES
US10973908B1 (en) 2020-05-14 2021-04-13 David Gordon Bermudes Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine

Family Cites Families (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2131069T3 (es) 1991-03-05 1999-07-16 Wellcome Found Expresion de proteinas recombinantes en bacterias atenuadas.
US5962406A (en) 1991-10-25 1999-10-05 Immunex Corporation Recombinant soluble CD40 ligand polypeptide and pharmaceutical composition containing the same
US5981724A (en) 1991-10-25 1999-11-09 Immunex Corporation DNA encoding CD40 ligand, a cytokine that binds CD40
DE69233402T3 (de) 1991-10-25 2009-06-25 Immunex Corp., Seattle Neue cytokine
US7405270B2 (en) 1991-10-25 2008-07-29 Immunex Corporation CD40-Ligand lacking native-pattern glycosylation
ATE173166T1 (de) 1992-09-04 1998-11-15 Univ Saskatchewan Neue bakterielle impfstoffe unter verwendung von impfstämmen von pathogenen bakterien
AU1059095A (en) 1993-11-24 1995-06-13 Australian National University, The Treatment of viral disease with cd40l peptide
ATE220331T1 (de) 1995-03-01 2002-07-15 Immunex Corp Cd40 bindendes protein zur stimulierung der immunantwort
ATE257858T1 (de) 1995-06-07 2004-01-15 Immunex Corp Cd40l mutein
US6479258B1 (en) 1995-12-07 2002-11-12 Diversa Corporation Non-stochastic generation of genetic vaccines
US6713279B1 (en) 1995-12-07 2004-03-30 Diversa Corporation Non-stochastic generation of genetic vaccines and enzymes
US6306387B1 (en) 1997-05-29 2001-10-23 The Research Foundation Of State University Of New York Antigen delivery system
US20030045492A1 (en) 1997-08-13 2003-03-06 Tang De-Chu C. Vaccination by topical application of recombinant vectors
US6969609B1 (en) 1998-12-09 2005-11-29 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Serivces Recombinant vector expressing multiple costimulatory molecules and uses thereof
CA2223225A1 (en) 1997-11-28 1999-05-28 Canadian Red Cross Society Method for inhibiting in vivo immune response
CA2313805A1 (en) 1997-12-19 1999-07-01 Immunex Corporation Method for reducing susceptibility to hiv infection
GB9806449D0 (en) 1998-03-25 1998-05-27 Peptide Therapeutics Ltd Attenuated bacteria useful in vaccines
US6190669B1 (en) 1998-05-13 2001-02-20 University Of Maryland, Baltimore Attenuated mutants of salmonella which constitutively express the Vi antigen
IT1299583B1 (it) 1998-05-19 2000-03-16 Vander Way Limited Uso di proteine hmg-i per la preparazione di medicamenti ad attivita' citotossica
CA2341349C (en) 1998-09-04 2013-12-10 Creatogen Aktiengesellschaft Attenuated cells comprising sp12 mutants, carriers and compositions containing same, methods of production and uses thereof
US7300774B1 (en) 1999-12-09 2007-11-27 The Regents Of The University Of California Multimeric fusion proteins of the TNF superfamily ligands
CA2369820A1 (en) 1999-04-16 2000-10-26 Frank Dicker Nucleic acids encoding cd40/cd40l chimeric polypeptides, methods for their production and uses thereof
EP1067194A1 (en) 1999-04-16 2001-01-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Vectors containing a gene coding for CD40 and/or CD40L under the control of a cytokine-inducible promoter which is a human acute phase amyloid A gene promoter. Methods for their production and uses thereof
US7118751B1 (en) 1999-10-14 2006-10-10 Trubion Pharmaceuticals, Inc. DNA vaccines encoding antigen linked to a domain that binds CD40
EP1112747B1 (en) 1999-12-28 2004-06-16 Akzo Nobel N.V. Salmonella vaccine not inducing antibodies against flagellin or flagella
EP1255560B1 (en) 2000-02-02 2008-10-29 UNITED STATES GOVERNMENT as represented by THE SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES, CENTERS FOR DISEASE Cd40 ligand adjuvant for respiratory syncytial virus vaccine
WO2001070247A2 (en) 2000-03-17 2001-09-27 Pharmacia & Upjohn Company Salmonella vaccine materials and methods
GB0015426D0 (en) 2000-06-24 2000-08-16 Univ Southampton Method for generating soluble highly multimeric proteins
US20030165538A1 (en) * 2000-06-26 2003-09-04 Maxygen Incorporated Methods and compositions for developing spore display systems for medicinal and industrial applications
WO2002036769A2 (en) 2000-10-31 2002-05-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Nucleic acids encoding cd40/cd40l chimeric polypeptides, methods for their production and uses thereof
PL367132A1 (en) 2001-05-15 2005-02-21 North Shore-Long Island Jewish Research Institute Use of hmg fragments as anti-inflammatory agents
US7220723B2 (en) 2001-05-15 2007-05-22 The Feinstein Institute For Medical Research Inhibitors of the interaction between HMGB polypeptides and toll-like receptor 2 as anti-inflammatory agents
EP1407004B1 (en) 2001-05-15 2009-08-05 Ortho-McNeil-Janssen Pharmaceuticals, Inc. Ex-vivo priming for generating cd40-ligand specific cytotoxic t lymphocytes to treat autoimmune and allergic disease
ITMI20011986A1 (it) 2001-09-25 2003-03-25 San Raffaele Centro Fond Metodo e composizione per l'attivazione di cellule presentanti l'antigene
DE50212280D1 (de) 2001-12-19 2008-06-26 Alcedo Biotech Gmbh Verwendung von hmgb-proteinen und dafür codierenden nukleinsäuren
US6923958B2 (en) 2002-03-02 2005-08-02 The Scripps Research Institute DNA vaccines encoding CEA and a CD40 ligand and methods of use thereof
EP2380440B1 (en) 2002-04-15 2016-03-09 Washington University Regulated attenuation of live vaccines to enhance cross protective immunogenicity
US7495090B2 (en) 2002-05-23 2009-02-24 The Regents Of The University Of California Nucleic acids encoding chimeric CD154 polypeptides
AU2003294488B2 (en) 2002-11-20 2007-05-24 Critical Therapeutics, Inc. Use of HMGB fragments as anti-inflammatory agents
US20040141948A1 (en) 2002-11-20 2004-07-22 Critical Therapeutics, Inc. Use of HMGB fragments as anti-inflammatory agents
US20040156851A1 (en) 2002-11-20 2004-08-12 Critical Therapeutics, Inc. HMGB1 combination therapies
EP1567544A4 (en) 2002-11-20 2009-07-22 Long Island Jewish Res Inst USE OF HMGB POLYPEPTIDES TO INCREASE IMMUNE RESPONSES
US20060014248A1 (en) 2003-01-06 2006-01-19 Xencor, Inc. TNF super family members with altered immunogenicity
US20050181994A1 (en) 2003-01-06 2005-08-18 Xencor, Inc. Novel variants of CD40L protein
US7696169B2 (en) 2003-06-06 2010-04-13 The Feinstein Institute For Medical Research Inhibitors of the interaction between HMGB polypeptides and toll-like receptor 2 as anti-inflammatory agents
US7754209B2 (en) 2003-07-26 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals Binding constructs and methods for use thereof
WO2005025604A2 (en) 2003-09-10 2005-03-24 The General Hospital Corporation Use of hmgb and hmgb fragments to decrease specific immune response
EP1673389A2 (en) 2003-10-10 2006-06-28 Xencor Inc. Novel variants of cd40l protein
CA2548347A1 (en) 2003-12-11 2005-06-30 Sidney Kimmel Cancer Center Methods for generating immunity to antigen
US8828957B2 (en) 2003-12-11 2014-09-09 Microvax, Llc Methods for generating immunity to antigen
JP2008508855A (ja) 2004-04-27 2008-03-27 インターツェル・アクチェンゲゼルシャフト Ｔｄ抗原
WO2005113598A2 (en) 2004-05-21 2005-12-01 Xencor, Inc. Tnf super family members with altered immunogenicity
EP1768698A4 (en) * 2004-06-17 2009-01-28 Medimmune Inc IMMUNOGENIC COMPOSITIONS COMPRISING HMGB1 POLYPEPTIDES
US20080075728A1 (en) 2004-07-20 2008-03-27 Walter Newman Combination Therapies Of Hmgb And Complement Inhibitors Against Inflammation
CN101080487B (zh) 2004-10-07 2012-11-14 阿戈斯治疗公司 成熟树突细胞组合物及其培养方法
US8513008B2 (en) 2004-10-07 2013-08-20 Argos Therapeutics, Inc. Mature dendritic cell compositions and methods for culturing same
GB0423681D0 (en) 2004-10-26 2004-11-24 Sec Dep For Environment Food & Vaccine and nucleic acids
NZ556004A (en) 2004-12-21 2010-05-28 Vaxinnate Corp Compositions of influenza viral proteins comprising at least one flagellin and at least one influenza M2 protein
WO2006105972A1 (en) 2005-04-07 2006-10-12 Universite Libre De Bruxelles Transgenic organism expressing cd40l and uses thereof
US20060286074A1 (en) 2005-05-31 2006-12-21 Yucheng Tang Methods for immunotherapy of cancer
WO2007011606A2 (en) 2005-07-18 2007-01-25 Critical Therapeutics, Inc. USE OF HMGBl ANTAGONISTS FOR THE TREATMENT OF INFLAMMATORY SKIN CONDITIONS
PT1949913E (pt) 2005-10-07 2010-08-24 Proyecto Biomedicina Cima Sl Associação imunoestimuladora para a profilaxia e o tratamento da hepatite c
US9533036B2 (en) 2005-11-07 2017-01-03 Microvax, Llc Methods for generating immune responses to influenza antigens with a secretable CD40L fusion protein
WO2007054658A1 (en) 2005-11-14 2007-05-18 King's College London Control of immune responses
WO2007130725A2 (en) * 2006-02-06 2007-11-15 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Use of hmgb1 for protection against ischemia reperfusion injury
WO2007103048A2 (en) 2006-03-01 2007-09-13 Regents Of The University Of Colorado Tlr agonist (flagellin)/cd40 agonist/antigen protein and dna conjugates and use thereof for inducing synergistic enhancement in immunity
WO2007106073A2 (en) 2006-03-02 2007-09-20 University Of Massachusetts Modified pathogens for use as vaccines
CA2659275C (en) * 2006-07-27 2017-01-10 Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. Chimeric influenza virus-like particles
US8564612B2 (en) * 2006-08-04 2013-10-22 Apple Inc. Deep pixel pipeline
WO2008021959A2 (en) * 2006-08-09 2008-02-21 Medimmune Vaccines, Inc. Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants
EP2066339B1 (en) * 2006-09-18 2014-08-13 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Compositions and methods of enhancing immune responses
EP2139913A4 (en) 2007-03-08 2011-09-21 Mayo Foundation INDUCTION OF TUMOR CELL DEATH THROUGH IMMUNE
WO2009009215A2 (en) * 2007-05-02 2009-01-15 Emory University Enhancement of glycoprotein incorporation into virus-like particles
AU2008318615A1 (en) 2007-10-30 2009-05-07 Texas A&M University System Compositions and methods of enhancing immune responses to flagellated bacterium
PT3097926T (pt) 2007-11-01 2020-01-08 Univ Guelph Composições e métodos de potenciação das respostas imunitárias frente a eimeria
WO2011091255A1 (en) 2010-01-21 2011-07-28 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Vaccine vectors and methods of enhancing immune responses
WO2013071298A1 (en) 2011-11-11 2013-05-16 Nutrition Physiology Company, Llc Lactic acid bacteria and their use as dietary supplementals for poultry
WO2011156619A2 (en) 2010-06-09 2011-12-15 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Vaccine and methods to reduce campylobacter infection

Also Published As

Publication number Publication date
CL2012002016A1 (es) 2014-06-20
WO2011091255A1 (en) 2011-07-28
EP2525817A1 (en) 2012-11-28
JP2016117757A (ja) 2016-06-30
AU2011207331A2 (en) 2012-08-23
EP2525817B1 (en) 2017-08-09
JP2018039843A (ja) 2018-03-15
CA2787661A1 (en) 2011-07-28
CN102811734A (zh) 2012-12-05
EP2525817B8 (en) 2017-09-20
HUE037157T2 (hu) 2018-08-28
US8956618B2 (en) 2015-02-17
AU2011207331A1 (en) 2012-08-23
AU2011207331C1 (en) 2016-05-12
US20150190500A1 (en) 2015-07-09
US9913893B2 (en) 2018-03-13
KR101638661B1 (ko) 2016-07-11
US20120282291A1 (en) 2012-11-08
UA110024C2 (uk) 2015-11-10
CA2787661C (en) 2021-10-12
ES2643646T3 (es) 2017-11-23
JP2013518052A (ja) 2013-05-20
EA023058B1 (ru) 2016-04-29
AU2011207331B2 (en) 2014-12-18
CO6561819A2 (es) 2012-11-15
DK2525817T3 (en) 2017-10-02
JP6242050B2 (ja) 2017-12-06
JP6687585B2 (ja) 2020-04-22
KR20120117886A (ko) 2012-10-24
NO2525817T3 (zh) 2018-01-06
MX341775B (es) 2016-09-02
PT2525817T (pt) 2017-10-24
EA201290675A1 (ru) 2013-04-30
PL2525817T3 (pl) 2018-01-31
NZ601609A (en) 2014-08-29
MX2012008506A (es) 2012-11-21
EP2525817A4 (en) 2013-10-23
ZA201205824B (en) 2016-01-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102811734B (zh) 增强免疫应答的疫苗载体和方法
JP6874031B2 (ja) アイメリアに対する免疫応答を強化するか又はアイメリア感染症を制限する組成物及び方法
CN102971008B (zh) 降低弯曲菌属感染的疫苗和方法
CN101522210A (zh) 增强免疫应答的组合物和方法
Tizard Vaccines for Veterinarians E-Book
CN105142653B (zh) 增强对肠病原体免疫应答的组合物和方法
JP6802813B2 (ja) アヒル腸炎ウイルス及びその使用
ES2684556T3 (es) Vacunas de mannheimia haemolytica atenuadas y procedimientos de fabricación y uso
Kim et al. Live attenuated Salmonella enterica serovar Typhimurium expressing swine interferon-α has antiviral activity and alleviates clinical signs induced by infection with transmissible gastroenteritis virus in piglets
KR101525180B1 (ko) 인플루엔자 바이러스 항원의 세포표면 발현벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물
RU2776479C1 (ru) Живая пробиотическая вакцина, содержащая консервативные эпитопы вируса гриппа А (LAH+4M2e), для профилактики гриппозной инфекции
BR112012018027B1 (pt) Vetores de vacina e métodos de aperfeiçoamento de respostas imunes

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C53 Correction of patent of invention or patent application
CB02 Change of applicant information

Address after: American Arkansas

Applicant after: Texas A. & M. Univ Sys

Applicant after: Univ Guelph

Address before: Arizona, USA

Applicant before: Texas A. & M. Univ Sys

Applicant before: Univ Guelph

C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant