MX2012008506A - Vectores para vacunas y metodos para potenciar respuestas inmunes. - Google Patents

Abstract

Vectores para vacunas que incluyen un polipéptido antigénico y un polipéptido HMGB1 que están presentes sobre la superficie del vector para vacunas. Composiciones que comprenden los vectores para vacunas e incluyen un vehículo farmacéuticamente aceptable, convenientemente un vehículo para administración oral o nasal. Métodos para potenciar respuestas inmunes, en particular, una respuesta inmune de anticuerpos y convenientemente una respuesta a IgA, mediante la administración a un sujeto de los vectores para vacunas o composiciones que se exponen en la presente.

Description

VECTORES PARA VACUNAS Y MÉTODOS PARA POTENCIAR RESPUESTAS INMUNES CAMPO DE LA INVENCIÓN En la presente se proveen vectores para vacunas y métodos para estimular una respuesta inmune y métodos para reducir la morbilidad asociada con la infección por influenza.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las vacunas se usan para iniciar una respuesta inmune adaptativa contra antígenos, en particular antígenos de patógenos, células tumorales o similares, con el objetivo de mejorar o de prevenir una enfermedad. Las vacunas de péptidos sintéticos o de microorganismos muertos o atenuados con frecuencia son eficaces para estimular una respuesta inmune robusta que es totalmente protectora. En algunos casos estas vacunas no son protectoras o son solo parcialmente protectoras y se deben usar otras estrategias para desarrollar vacunas protectoras. Las vacunas a base de microorganismos atenuados están asociadas con riesgos de transferencia génica y de reparación de mutaciones y pueden poner en riesgo a individuos inmunocomprometidos. Es necesario desarrollar nuevas vacunas que sean seguras y eficaces para estimular respuestas inmunes protectoras duraderas.

La infección por virus de influenza, en particular el H5N1 de influenza aviar, representa una creciente importancia sanitaria y económica. La evidencia indica claramente que el H5N1 continua circulando entre aves y cerdos susceptibles en regiones cada vez extensas. Muchos científicos creen que si no se presta la debida atención, la influenza aviar H5N1 actual mutará para permitir la transmisión de humano a humano y para causar una pandemia mundial. Con una tasa de mortalidad de más del 50%, dicha epidemia sería devastadora. Sin importar la habilidad del virus para causar enfermedad en humanos, la influenza H5N1 aviar ya está amenazando con tener un enorme impacto económico debido a la erradicación de manadas de aves de corral en áreas afectadas. Por lo tanto, se necesita el desarrollo de una vacuna para proteger a los humanos, aves de corral, cerdos y otros animales domésticos contra la influenza H5N1. Una vacuna para influenza que sea capaz de proteger contra H5 1 así como también contra otros virus de influenza, tal como H1 N1 , seria óptima.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En la presente se proveen vectores para vacunas y métodos para estimular una respuesta inmune y métodos para reducir la morbilidad asociada con la infección por influenza. En un aspecto, se provee un vector para vacunas que incluye un polipéptido antigénico y un polipéptido HMGB1 o un fragmento funcional de los mismos. Al menos una porción del polipéptido antigénico y del polipéptido HMGB1 está presente sobre la superficie del vector para vacunas. El vector para vacunas puede incluir un primer polinucleótido que codifica el polipéptido antigénico y un segundo polinucleótido que codifica el polipéptido HMGB1. El polipéptido HMGB1 y el polipéptido antigénico pueden estar unidos, tal como en una proteína de fusión. El polipéptido HMGB1 y el polipéptido antigénico se pueden insertar ambos dentro de un bucle externo de una proteína transmembrana.

En otro aspecto, se provee una composición que comprende el vector para vacunas y un vehículo farmacéuticamente aceptable. El vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser aceptable para uso oral o nasal. El vector para vacunas puede ser incapaz de replicarse.

En aun otro aspecto, se provee un vector para vacunas contra Bacillus spp. El vector para vacunas incluye una primera secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido antigénico que se expresa sobre la superficie del vector para vacunas y una segunda secuencia de poliuncleótidos que codifica un polipéptido inmunoestimulatorio que se expresa sobre la superficie del vector para vacunas. El polipéptido antigénico puede ser un polipéptido M2e de influenza, un polipéptido HA de influenza, o un polipéptido NP de influenza o una combinación de los mismos. El polipéptido inmunoestimulatorio puede ser un polipéptido CD154 o un polipéptido HMGB1 o una combinación de los mismos. El polipéptido inmunoestimulatorio y el polipéptido antigénico pueden estar unidos, tal como en una proteína de fusión y se pueden insertar en un bucle externo de una proteína transmembrana.

En aun otro aspecto, se proveen métodos para potenciar una respuesta inmune en un sujeto. En el método, se administran al sujeto, vectores para vacunas o composiciones provistas en la presente en una cantidad eficaz para potenciar la respuesta inmune del sujeto hacia el polipéptido antigénico. Convenientemente, el vector para vacunas se administra por vía oral o por vía intranasal.

En otro aspecto, se proveen métodos para potenciar la respuesta inmune en un sujeto mediante la administración de un vector para vacunas contra Bacillus spp. como se describe en la presente. El vector para vacunas incluye una primera secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido antigénico que se expresa sobre la superficie del vector para vacunas y una segunda secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido inmunoestimulatorio que se expresa sobre la superficie del vector para vacunas. El polipéptido antigénico puede ser un polipéptido M2e de influenza, un polipéptido HA de influenza, un polipéptido NP de influenza o una combinación de los mismos. El polipéptido inmunoestimulatorio puede ser un polipéptido CD154, un polipéptido H GB1 o una combinación de los mismos.

En aun otro aspecto, se proveen métodos para reducir la morbilidad relacionada con influenza en un sujeto. En los métodos, la administración de los vectores para vacunas o composiciones que se exponen en la presente reduce la morbilidad asociada con una subsiguiente infección por influenza.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 representa un gráfico que muestra las proporciones S/P (muestra a control positivo) del ELISA para producción de anticuerpos específicos contra M2e por parte de pollos después de la administración oral de la dosificación indicada de vector para vacunas a Bacillus subtilis que expresa los epitopes de influenza A y ya sea HMGB1 o CD154, en comparación con pollos vacunados con salina.

La figura 2 representa un gráfico que muestra las proporciones S/P del ELISA para producción de anticuerpos específicos contra HA LB mediante pollos después de la administración oral de la dosificación indicada de vector para vacunas a Bacillus subtilis que expresa los epitopes de influenza A y ya sea HMGB1 o CD154 en comparación con pollos vacunados con salina.

La figura 3 representa un gráfico que muestra las proporciones S/P del ELISA para la producción de anticuerpos específicos contra HA UA mediante pollos después de la administración oral de la dosificación indicada de vector para vacunas a Bacillus subtilis que expresa los epitopes de influenza A y ya sea HMGB1 o CD154 en comparación con pollos vacunados con solución salina.

La figura 4 representa un gráfico que muestra las proporciones S/P del ELISA para producción de anticuerpos específicos contra 2e mediante pollos después de la administración oral de la dosificación indicada de vectores para vacunas a Bacillus subtilis vivos o diversamente inactivados que expresan los epitopes de influenza A y ya sea HMGB1 o CD154 en comparación con pollos vacunados con el vector de Bacillus solo (BSBB).

La figura 5 representa un gráfico que muestra las proporciones S/P del ELISA para producción de anticuerpos específicos contra HA LB mediante pollos después de la administración oral de la dosificación indicada de vectores para vacunas a Bacillus subtilis vivos o diversamente inactivados que expresan los epitopes de influenza A y ya sea HMGB1 o CD154 en comparación con pollos vacunados con el vector de Bacillus solo (BSBB).

La figura 6 representa un gráfico que muestra las proporciones S/P del ELISA para producción de anticuerpos específicos contra HA UA mediante pollos después de la administración oral de la dosificación indicada de vectores para vacunas a Bacillus subtilis vivos o diversamente inactivados que expresan los epitopes de influenza A y ya sea HMGB1 o CD154 en comparación con pollos vacunados con el vector de Bacillus solo (BSBB).

La figura 7 representa un gráfico que muestra las proporciones S/P del ELISA para la producción de anticuerpos a IgG específicos contra 2e mediante pollos después de la administración oral de 106 vectores para vacunas a Bacillus subtilis, ya sea vivos o bien inactivados por las diferentes dosificaciones de formalina que se indican, que expresan los epitopes de influenza A y HMGB1 en comparación con pollos vacunados con el vector de Bacillus solo (BSBB).

La figura 8 representa un gráfico que muestra las proporciones S/P del ELISA para producción de anticuerpo a IgA específico contra M2e mediante pollos vacunados, ya sea por vía oral o por vía subcutánea, con 106 vectores para vacunas a Bacillus subtilis vivos, inactivados con formalina o inactivados con formalina y liofilizados que expresan los epitopes de influenza A y HMGB1 en comparación con pollos vacunados con el vector de Bacillus solo (BSBB).

La figura 9 representa un gráfico que muestra las proporciones S/P del ELISA para producción de anticuerpo a IgA específico contra 2e mediante pollos vacunados, ya sea por vía oral o por vía subcutánea, con 106 vectores para vacunas a Bacillus subtilis vivos, inactivados con formalina o inactivados con formalina y liofilizados que expresan los epitopes de influenza A y HMGB1 en comparación con pollos vacunados con el vector de Bacillus solo (BSBB).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las tecnologías del ADN recombinante permiten la manipulación relativamente fácil de muchas especies de bacterias y virus. Algunas bacterias y virus son, ya sea naturalmente o por selección o por manipulación, levemente patogénicos o no patogénicos, pero permanecen con la capacidad de generar una respuesta inmune robusta. Estas bacterias y virus hacen atractivos a los vectores para vacunas para producir una respuesta inmune contra antígenos heterólogos o foráneos. Los vectores para vacunas bacterianos o virales pueden imitar la infección natural y producir una inmunidad robusta y de larga duración. Los vectores para vacunas con frecuencia son relativamente no caros para producir y administrar. Además, dichos vectores con frecuencia pueden llevar consigo más de un antígeno y pueden proveer protección contra múltiples agentes infecciosos.

Los vectores de para vacuna de bacterias o virus vivos pueden poseer aun riegos para individuos inmunocomprometidos y pueden requerir observaciones reguladoras adicionales. Por lo tanto, es deseable el uso de vectores que estén muertos o inactivados o que califiquen como organismos generalmente vistos como seguros (GRAS) por la Food and Drug Administration (FDA). El problema es generar una respuesta inmune robusta usando dichos vectores. Como se muestra en los ejemplos, mediante la inclusión de polipéptidos HMGB1 (high mobility group box 1) sobre la superficie del vector para vacunas los inventores pueden generar una respuesta inmune robusta contra los polipéptidos antigénicos usando un vector de Bacillus spp. De hecho, los ejemplos demuestran que este vector se puede inactivar, de modo que el mismo no se pueda replicar, usando una variedad de métodos, y aun producir una respuesta inmune robusta después de su administración.

En la presente se proveen vectores para vacunas que incluyen un polipéptido antigénico y un polipéptido H GB1 o un fragmento funcional de los mismos. Al menos una porción del polipéptido antigénico y al menos una porción del polipéptido HMGB1 o fragmentos funcionales de los mismos están presentes sobre la superficie del vector para vacunas. El vector para vacunas puede incluir un primer polinucleótido que codifica el polipéptido antigénico y un segundo polinucleótido que codifica el polipéptido HMGB1. El polipéptido HMGB1 y el polipéptido antigénico pueden estar unidos, tal como en una proteína de fusión o se pueden expresar en forma separada. El polipéptido HMGB1 y el polipéptido antigénico se pueden insertar ambos dentro de un bucle externo de una proteína transmembrana.

Los vectores para vacunas pueden ser bacterianos, virales o a base de liposomas. Los vectores para vacunas potenciales incluyen, sin carácter limitativo, Bacillus (Bacillus subtilis), Salmonella (Salmonella enteritidis), Shigella, Escherichia (£. coli), Yersinia, Bordetella, Lactococcus, Streptococcus, Vibrio {Vibrio cholerae), Listeria, adenovirus, poxvirus, herpesvirus, alfavirus y virus adenoasociados. Convenientemente, el vector para vacunas es un organismo GRAS. El vector para vacunas puede estar inactivado o muerto de modo que no sea capaz de replicarse. Los métodos para inactivar o matar vectores para vacunas de bacterias o virus son conocidos para las personas con experiencia en el arte e incluyen, sin carácter limitativo, métodos tales como los que se muestran en los ejemplos, a saber inactivación por formalina, inactivación a base de antibióticos, tratamiento con calor y tratamiento con etanol.

Un polipéptido antigénico es un polipéptido capaz de ser reconocido específicamente por el sistema inmune adaptativo. Un polipéptido antigénico incluye cualquier polipéptido inmunogénico. Los polipéptidos antigénicos incluyen, sin carácter limitativo, antígenos relacionados con patógenos, con alérgenos, con tumores o con enfermedades. Los patógenos incluyen patógenos virales, parasíticos, fúngicos y bacterianos así como también patógenos proteicos tales como los priones. Los polipéptidos antigénicos pueden ser proteínas de longitud completa o porciones de las mismas. Está bien establecido que el reconocimiento mediante el sistema inmune de muchas proteínas se basa en un número relativamente pequeño de aminoácidos, con frecuencia denominados epitope. Los epitopes pueden ser de entre solo 8 y 10 aminoácidos. Por lo tanto, los polipéptidos antigénicos que se describen en la presente pueden ser proteínas de longitud completa, epitopes de 8 aminoácidos de longitud o cualquier porción entre estos extremos. De hecho, el polipéptido antigénico puede incluir más de un epitope de un patógeno individual o proteína.

Se pueden incluir en el vector para vacunas múltiples copias del mismo epitope o de múltiples epitopes de diferentes proteínas. Se cree que se pueden administrar varios epitopes o antígenos del mismo o diferentes patógenos o enfermedades en combinación con un vector para vacunas individual para generar una respuesta inmune potenciada contra múltiples antígenos. Los vectores para vacunas recombinantes pueden codificar antígenos de múltiples antígenos asociados a microorganismos patogénicos, virus o tumores. La administración de vectores para vacunas capaces de expresar múltiples antígenos tiene la ventaja de inducir inmunidad contra dos o más enfermedades al mismo tiempo.

El polipéptido antigénico puede ser un polipéptido de influenza, convenientemente es un polipéptido de influenza H5N1 o un polipéptido asociado con múltiples cepas del virus de influenza tal como un polipéptido de la proteína 2 de influenza. El ectodominio de la proteína M2 del virus de influenza A, conocido como M2e, protruye desde la superficie del virus. La porción 2e de la proteína 2 contiene aproximadamente 24 aminoácidos. El polipéptido 2e varía poco entre un aislamiento de influenza y otro. De hecho, se han aislado solo unas pocas mutaciones de origen natural en M2e a partir de humanos infectados desde la epidemia de gripe de 1918. Además, los virus de influenza asilados a partir de huéspedes aviares y porcinos tienen diferentes, aunque conservadas, secuencias de 2e. Para revisiones de las secuencias del polipéptido M2e aislado de huéspedes humanos, aviares y porcinos véase Liu et al., Microbes and Infection 7:171-177 (2005) y Reid et al., J. Virol. 76:10717-10723 (2002) cada uno de los cuales se incorpora a la presente como referencia en su totalidad. Véase también SEQ ID NO: 1-4.

Convenientemente se puede insertar el polipéptido M2e completo en el vector para vacunas o se puede usar solamente una porción. En los ejemplos, se incorporó un polipéptido de ocho aminoácidos (LM2 que tiene la secuencia de aminoácidos: EVETPIRN, SEQ ID NO:5 o su variante M2eA que tiene la secuencia de aminoácidos EVETPTRN, SEQ ID NO:6) en el vector para vacunas y se demostró que produce una respuesta con anticuerpos después de su administración a pollos. Convenientemente, la porción del polipéptido M2e que se insertó en el vector para vacunas es inmunogénica. Un fragmento inmunogénico es un péptido o polipéptido que es capaz de producir una respuesta inmune celular o humoral. Convenientemente, un fragmento inmunogénico de M2e puede ser el polipéptido M2e de longitud completa, o convenientemente puede ser de 20 o más aminoácidos, 15 o más aminoácidos, 10 o más aminoácidos u 8 o más aminoácidos de la secuencia de longitud completa.

Otros epitopes apropiados para su inclusión en un vector para vacunas de influenza A incluyen, sin carácter limitativo, polipéptidos de la hemaglutinina (HA) o de la proteína nuclear (NP) de influenza A. Por ejemplo, se pueden incluir los péptidos de SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, o SEQ ID NO: 10 en un vector para vacunas. En los ejemplos, se incorporaron SEQ ID NO: 7 (HAUA) y SEQ ID NO: 8 (HALB) en el vector para vacunas y demostraron producir una respuesta con anticuerpos después de su administración a pollos. Véanse las figuras 2-3 y 5-6. Además, en los ejemplos, se incorporaron en el vector para vacunas los epitopes NPs de SEQ ID NO: 9 (NP54) y SEQ ID NO: 10 (NP147). Una persona con experiencia en el arte apreciará que cualquiera de estas secuencias se puede usar en combinación con cualquier otro epitope que incluya epitopes que derivan de otros patógenos o antígenos.

La proteína H GB1 (High Mobility Group Box-1) se identificó primero como una proteína de unión a ADN que es crítica para la estructura y estabilidad del ADN. Es una proteína nuclear que se expresa en forma ubicua que se une al ADN sin especificidad de secuencia. La proteína está altamente conservada y se la encuentra en plantas hasta en mamíferos. Las secuencias de aminoácidos de HMGB1 de pez zebra, pollo y humano se proveen en SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 29, respectivamente. La secuencia está altamente conservada en mamíferos con 98% de identidad de aminoácidos y los cambios de aminoácidos son conservativos. Por lo tanto, una proteína HMGB1 de una especie probablemente puede sustituir funcionalmente a la de otras especies. La proteína HMGB1 de longitud completa o una porción de la misma, se puede usar como polipéptido HMGB1 en el vector para vacunas como se describe en la presente. HMGB1 tiene dos regiones de unión a ADN denominadas caja A, como se muestra en SEQ ID NO: 23 y 24 y caja B como se muestra en SEQ ID NO: 25 y 26. Véase Andersson and Tracey, Annu. Rev. Immunol. 2011 , 29:139-162, la que se incorpora a la presente como referencia en su totalidad.

H GB1 es un mediador de inflamación y sirve como una señal de daño nuclear, tal como en células necróticas. HMGB1 también se puede secretar activamente en células del linaje monocito/macrófago en un proceso que requiere acetilación de la proteína, traslocación a través del núcleo y secreción. La HMGB1 extracelular actúa como un potente mediador de inflamación mediante la vía de señalización de los receptores para productos finales de glicosilación avanzada (RAGE) y a través de miembros de la familia de receptores tipo Toll (TLR), en particular TLR4. Se ha identificado la actividad de unión a RAGE y la misma requiere del polipéptido de SEQ ID NO: 27. La unión a TLR4 requiere de la cisteína de la posición 106 de SEQ ID NO: 18, que se encuentra en la región de la caja B de HMGB1.

Las actividades inflamatorias de HMGB1 no requieren de la de proteína de longitud completa y se han identificado fragmentos funcionales. La caja B se ha demostrado como suficiente para mediar los efectos proinflamatorios de HMGB1 y por lo tanto las SEQ ID NO: 25 y 26 son polipéptidos HMGB1 o fragmentos funcionales de los mismos dentro del contexto de la presente invención. Además, el sitio de unión a RAGE y la actividad de citoquina proinflamatoria se han mapeado en SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28, respectivamente. Por lo tanto, estos polipéptidos son fragmentos funcionales del polipéptido HMGB1 en el contexto de la presente invención.

Las personas con experiencia en el arte son capaces de identificar polipéptidos HMGB1 y fragmentos de los mismos que sean capaces de estimular actividad de citoquina pro-inflamatoria, usando métodos tales como los de la Publicación Internacional Nro. WO02 092004, la que se incorpora a la presente como referencia en su totalidad. Convenientemente, el polipéptido HMGB1 incluye el dominio de unión a RAGE en los aminoácidos 150 a 183 de SEQ ID NO:18 (SEQ ID NO: 27 o un homólogo de la misma) y el domino de actividad citoquina proinflamatoria entre los aminoácidos 89 y 109 de SEQ ID NO: 18 (SEQ ID NO: 28 o un homólogo de la misma). En particular, los polipéptidos HMGB1 y fragmentos funcionales u homólogos del mismo incluyen a polipéptidos idénticos, o al menos 99% idénticos, al menos 98% idénticos, al menos 95% idénticos, al menos 90% idénticos, al menos 85% idénticos, o al menos 80% idénticos a los polipéptidos HMGB1 de SEQ ID NOs: 18 o 23-30.

Al menos una porción del polipéptido antigénico y al menos una porción del polipéptido HMGB1 están presentes sobre la superficie del vector para vacunas. Presente sobre la superficie del vector para vacunas incluye a polipéptidos que están comprendidos dentro de una proteína transmembrana, que interaccionan con la misma, covalentemente o químicamente entrecruzados con una proteína transmembrana, un lípido de membrana o carbohidrato anclado a membrana. Un polipéptido puede estar comprendido en una proteína transmembrana teniendo los aminoácidos que comprenden el polipéptido unidos a través de un enlace peptídico con el N-terminal, C-terminal o con cualquier parte dentro de la proteína transmembrana (o sea insertado entre dos aminoácidos de la proteína transmembrana o en el lugar de uno o más aminoácidos de la proteína transmembrana (o sea deleción-inserción). Convenientemente, los polipéptidos se pueden insertar en un bucle externo de una proteína transmembrana. Proteínas transmembrana adecuadas son cotB y lamB, pero las personas con experiencia en el arte apreciaran que hay disponibles muchas proteína transmembranas apropiadas.

Alternativamente, los polipéptidos pueden unirse covalentemente o químicamente a proteínas, lípidos o carbohidratos en la membrana, o cápside, si es que se usa un vector viral, a lo largo de los métodos disponibles para las personas con experiencia en el arte. Por ejemplo, se pueden usar enlaces dísulfuro o entrecruzamientos de biotina - avidina para presentar los polipéptidos antigénicos y HMGB1 sobre la superficie de un vector para vacunas. Convenien-temente, el polipéptido antigénico y el polipéptido HMGB1 son parte de una proteína de fusión. Los dos polipéptidos se puede unir directamente a través de un enlace peptídico o puede estar separados por un adaptador o por una sección de una tercera proteína en la cual están insertados.

Los polinucleótidos que codifican el polipéptido antigénico o el polipéptido H GB1 se pueden insertar en el vector para vacunas y expresar para generar el polipéptido antigénico y el polipéptido HMGB1. Los polinucleótidos se pueden insertar en el cromosoma del vector para vacunas o pueden estar codificados en plásmidos u otro ADN extracromosómico. Convenientemente, los polinucleótidos que codifican el polipéptido antigénico y/o el polipéptido HMGB1 se pueden expresar en forma independiente o se insertan en un polinucleótido del vector para vacunas que se expresa. Convenientemente, el polinucleótido del vector para vacunas codifica un polipéptido que se expresa sobre la superficie del vector para vacunas tal como una proteína transmembrana. El polinucleótido que codifica el polipéptido antigénico y/o el polipéptido HMGB1 se puede insertar en la secuencia de polinucleótidos del vector para vacunas para permitir la expresión del polipéptido antigénico y/o el polipéptido HMGB1 sobre la superficie del vector. Por ejemplo, el polinucleótido que codifica el polipéptido antigénico y el polipéptido HMGB1 se puede insertar en fase dentro de un polinucleótido bacteriano en una región que codifica una región externa en bucle de una proteína transmembrana, de modo que la secuencia de polinucleótidos bacteriana permanezca en fase. Véase el Ejemplo 1.

De forma alternativa, el polinucleótido que codifica el polipéptido antigénico y/o el polipéptido HMGB1 se puede insertar en un polipéptido' secretado que se expone o presenta sobre la superficie del vector para vacunas a través de la asociación con una proteína, lípido o carbohidrato sobre la superficie del vector para vacunas. Las personas con experiencia en el arte apreciarán que el polinucleótido que codifica el polipéptido antigénico y/o el polipéptido H GB1 se puede insertar en una amplia variedad de polinucleótidos del vector para vacunas para proveer la expresión y presentación del polipéptido antigénico y/o el polipéptido HMGB1 a las células inmunes del sujeto que se trata con el vector para vacunas. En los ejemplos, se expresaron varios epitopes de influenza, que incluyen un epitope M2e, un epitope HA y un epitope NP, a partir de un plásmido para expresión vegetativa en Bacillus subtilis. La bacteria recombinante resultante expresa los epitopes insertados según se demuestra mediante la respuesta inmune que se muestra en las figuras 1 a 6.

En los ejemplos, los vectores para vacunas tienen los polipéptidos antigónicos (polipéptidos M2e, HA y NP) y el polipéptido inmunoestimulatorio (ya sea CD154 o bien H GB1 ) codificados por el mismo polinucleótido y en fase uno con el otro. En formas de realización alternativas, el polipéptido inmunoestimulatorio y el polipéptido antigénico pueden estar codificados por polinucleótidos diferentes. Las personas con experiencia en el arte apreciarán que se puede usar una variedad de métodos para obtener la expresión del polipéptido antigénico y el polipéptido HMGB1 sobre la superficie del vector para vacunas. Dichos métodos son conocidos por las personas con experiencia en el arte.

También se proveen composiciones que comprenden el vector para vacunas y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo farmacéuticamente aceptable es cualquier vehículo apropiado para administración in vivo. Convenientemente, el vehículo farmacéuticamente aceptable es aceptable para administración oral, nasal o a través de mucosa. El vehículo farmacéuticamente aceptable puede incluir agua, soluciones amortiguadas, soluciones de glucosa o fluidos de cultivo bacteria Nro. Otros componentes de las composiciones convenientemente pueden incluir excipientes tales como estabilizantes, preservantes, diluyentes, emulsionantes y lubricantes. Entre los ejemplos de vehículos o diluyentes aceptables para el uso farmacéutico se incluye a estabilizantes tales como carbohidratos (por ejemplo, sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, glucosa, dextrano), proteínas tales como albúmina o caseína, agentes que contienen proteínas tales como suero bovino o leche descremada y soluciones amortiguadoras (p.ej., solución amortiguadora de fosfatos). En especial cuando se agregan dichos estabilizantes a las composiciones, la composición es apropiada para secado por congelación o secado por atomizado. El vector para vacunas en las composiciones puede no ser capaz de replicarse, convenientemente el vector para vacunas se inactiva o mata antes de su agregado a la composición.

Las composiciones que se describen en la presente se pueden usar para potenciar una respuesta inmune tal como una respuesta con anticuerpos hacia el polipéptido antigénico. Las composiciones que contienen polipéptidos de influenza también se pueden usar para disminuir la morbilidad asociada con la subsiguiente infección por influenza. Las composiciones pueden prevenir que la influenza cause enfermedad o cualquier morbilidad asociada en un sujeto al cual se administraron las composiciones o el vector para vacunas como se describe en la presente. Las composiciones y el vector para vacunas como se describen en la presente pueden reducir la severidad de la enfermedad subsiguiente mediante la disminución de la longitud de la enfermedad, disminuyendo la morbilidad o mortalidad asociadas con la enfermedad o reduciendo la posibilidad de contraer la enfermedad. La morbilidad o mortalidad asociadas con la enfermedad después de la administración del vector para vacunas como se describe en la presente se pueden reducir en 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o incluso 100% en comparación con sujetos similares que no recibieron el vector para vacunas.

También se proveen métodos para potenciar las respuestas inmunes en un sujeto mediante la administración de un vector para vacunas. El vector para vacunas puede contener un polipéptido HMGB1 capaz de estimular la respuesta inmune contra el vector para vacunas y su polipéptido antigénico asociado. El vector para vacunas que comprende un polipéptido de HMGB1 se administra a un sujeto en una cantidad eficaz para potenciar la respuesta inmune del sujeto contra la vacuna y en particular hacia el polipéptido antigénico. Convenientemente, el vector para vacunas contiene un polinucleótido que codifica un polipéptido que incluye los aminoácidos 150 a 183 y 89 a 109 del polipéptido HMGB1 (SEQ ID NO: 18) o un homólogo del mismo. En los ejemplos, se usó un polipéptido de 190 aminoácidos de H GB1. Convenientemente, el polinucleótido codifica un polipéptido HMGB1 de la misma especie que el sujeto. Las combinaciones heterólogas de polipéptidos HMGB1 y sujetos (o sea un polipéptido HMGB1 humano para usar en una vacuna para pollos) pueden ser útiles en los métodos de la invención debido a que H GB1 está altamente conservado a través de un amplio número de especies. El polipéptido HMGB1 se puede usar para potenciar la respuesta inmune en el sujeto hacia cualquier antígeno o polipéptido antigénico foráneo que esté presente en, o sobre el vector para vacunas. Una persona con experiencia en el arte apreciará que el polipéptido H GB1 se puede usar para potenciar la respuesta inmune hacia más de un polipéptido antigénico presente en un vector para vacunas. El polipéptido de HMGB1 estimula una respuesta inmune al menos en parte mediante la activación de células dendríticas y macrófagos y por lo tanto estimulando la producción de citoquinas tales como IL-1 , IL-6, IFN-? y TNF-a. En los ejemplos, se expresó un polipéptido de HMGB1 sobre la superficie del vector para vacunas.

Además, se exponen métodos para potenciar una respuesta inmune contra influenza A y métodos para reducir la morbilidad asociada con la subsiguiente infección por influenza A. Brevemente, los métodos comprenden administrar a un sujeto un vector para vacunas que comprende un epitope de influenza A (un polipéptido antigénico de influenza) que sea capaz de producir una respuesta inmune en una cantidad eficaz para producir la respuesta inmune. El epitope de influenza A puede ser un polipéptido M2e, un HA polipéptido o un NP polipéptido u otro polipéptido de influenza como se expuso previamente. La inserción de los polipéptidos antigénicos en el vector para vacunas se puede llevar a cabo en una variedad de formas que son conocidas para las personas con experiencia en el arte, que incluyen, sin carácter limitativo, el sistema de mutagénesis sin cicatrices dirigida a sitio, que se describe en la Publicación de Patente Internacional Nro. WO 2008/036675. Las bacterias también se pueden manipular por ingeniería para que expresen polipéptidos de influenza junto con polinucleótidos capaces de potenciar la respuesta inmune como se expuso previamente. En particular, se puede expresar un polipéptido de CD154 o HMGB1 mediante el vector para vacunas para potenciar la respuesta inmune del sujeto contra los polipéptidos de influenza. Los ejemplos demuestran la producción de una respuesta robusta a IgA e IgG ante la vacunación en pollos. Los inventores esperan que dicha respuesta robusta sea protectora, o que al menos reduzca la morbilidad asociada con la subsiguiente infección o desafío con la fuente del polipéptido antigénico (virus de influenza en los ejemplos).

Las composiciones se pueden administrar mediante una variedad de medios que incluyen, sin carácter limitativo, por vía oral, por vía intranasal, y a través de mucosa. Por ejemplo, las composiciones o vectores para vacunas se pueden administrar mediante aerosol, mediante atomizado, mediante su agregado a comida o agua, mediante alimentación oral, o a través de gotas oculares. En algunas formas de realización, las composiciones se administran mediante inyección tal como intradérmica, parenteral, subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intracraneal, o intramuscular. Para los pollos u otras aves de corral, las composiciones se pueden administrar ¡n ovo.

Los sujetos incluyen, sin carácter limitativo, un vertebrado, convenientemente un mamífero, convenientemente un humano, vacas, gatos, perros, cerdos, o aves, convenientemente aves de corral tal como pollos. También se pueden usar otros modelos animales de infección. La potenciación de la respuesta inmune incluye, sin carácter limitativo, inducir un efecto profiláctico o terapéutico que está mediado por el sistema inmune del sujeto. Específicamente, la potenciación de una respuesta inmune puede incluir la producción aumentada de anticuerpos, tal como se demuestra en las figuras 1 a 3, aumento de cambio de clase de las cadenas pesadas de anticuerpo tal como la producción de IgA como se muestra en la figura 8, maduración de células presentadoras de antígenos, estimulación de células T helper, estimulación de células T citotóxicas o inducción de memoria de células T y B.

La dosificación útil a administrar vanará dependiendo de la edad, peso y especie del sujeto, el modo y la ruta de administración y el tipo de patógeno o enfermedad contra la que se busca una respuesta inmune. La composición se puede administrar en cualquier dosis de vector de vacuna que sea suficiente para producir una respuesta inmune. Se cree que las dosis que están en el rango entre 103 y 1010 copias de vector (o sea unidades formadoras de placas o unidades formadoras de colonias), entre 104 y 109 copias de vector, o entre 10s y 107 copias de vector son apropiadas.

La composición se puede administrar solo una vez o se pueden administrar dos o más veces para incrementar la respuesta inmune. Por ejemplo, la composición se puede administrar dos o más veces, separadas por una semana, dos semanas, o por tres semanas, un mes, dos meses, tres meses, seis meses o más. La bacteria puede ser viable antes de la administración, pero en algunas formas de realización la bacteria se puede matar o inactivar antes de la administración. En algunas formas de realización, la bacteria puede ser capaz de replicarse en el sujeto, mientras que en otras formas de realización la bacteria puede no ser capaz de replicarse en el sujeto. Como se muestra en los ejemplos, los vectores para vacunas bacterianas se pueden inactivar antes de la administración usando formalina, etanol, calor o antibióticos. Una persona con experiencia en el arte apreciará que también se pueden usar otros métodos para inactivar vectores para vacunas.

En la presente también se provee un vector para vacunas contra Bacillus spp. El vector para vacunas a Bacillus incluye una primera secuencia de polinucleótidos que codifican un polipéptido antigénico y una segunda secuencia de polinucleótidos que codifican para un polipéptido inmunoestimulatorio. El polipéptido antigénico y el polipéptido inmunoestimulatorio están presentes sobre la superficie del vector para vacunas a Bacillus como se describió previamente. El polipéptido antigénico es un polipéptido de influenza como se describió previamente y el polipéptido inmunoestimulatorio es un polipéptido H GB1 como se describió previamente o un polipéptido CD154.

También se pueden insertar dentro del polinucleótido del vector para vacunas que codifica polipéptidos inmunoestimulatorios homólogos a proteínas del sujeto y que son capaces de estimular al sistema inmune para responder al polipéptido antigénico. Como se describe en más detalle en los ejemplos, un vector para vacunas puede incluir un polipéptido CD154 capaz de unirse a CD40 en el sujeto y estimular al sujeto para responder contra el vector para vacunas y su polipéptido antigénico asociado, similar a HMGB1 descrito previamente. El vector para vacunas a Bacillus puede incluir un polipéptido HMGB1, un polipéptido CD154 o una combinación de los mismos. Como se describió previamente, los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos se pueden insertar en el cromosoma del vector para vacunas o se pueden mantener extracromosómicamente. Una per-sona con experiencia en el arte apreciará que estos polipéptidos se pueden insertar en una variedad de polipéptidos del vector para vacunas y expresarse en diferentes partes del vector para vacunas, o que se pueden secretar.

El polinucleótido que codifica un polipéptido inmunoestimulatorio capaz de potenciar la respuesta inmune hacia un polipéptido antigénico puede también codificar para el polipéptido antigénico. El polinucleótido que codifica un polipéptido inmunoestimulatorio puede estar unido al polinucleótido que codifica el polipéptido antigénico, de forma que en el vector para vacunas, el polipéptido inmunoestimulatorio y el polipéptido antigénico están codificados por el mismo polinucleótido. En los ejemplos, un polinucleótido que codifica para un polipéptido de CD154, que es capaz de unirse a CD40, o HMGB1 , también codifica para un epitope 2e, un epitope HA y un epitope NP de influenza A. Véanse las SEQ ID NOs: 19 a 22. En los ejemplos, el polinucleótido que codifica los epitopes de influenza y el polinucleótido que codifica el polipéptido inmunoestimulatorio se expresan ambos a partir de un plásmido para expresión en células vegetativas. En algunas formas de realización, los polinucleótidos se insertan en el gen corS u otro gen que codifique para una proteína que se expresa sobre la superficie de los esporos. Las personas con experiencia en el arte apreciarán que también se pueden usar polinucleótidos bacterianos que codifican otras proteínas transmembrana.

Como se expuso previamente, se puede incluir un polinucleótido que codifica un polipéptido inmunoestimulatorio homólogo a una proteína del sujeto que es capaz de potenciar la respuesta inmune hacia el epitope en el vector para vacunas. En los ejemplos, se demostró que un vector para vacunas a Bacillus que incluye un polinucleótido que codifica ya sea un polipéptido CD154 capaz de unirse a CD40 o un polipéptido que codifica HMGB1 , potencia la respuesta inmune contra el epitope M2e y contra los dos diferentes epitopes HA, según medida de incremento de la producción de anticuerpos en respuesta a la vacunación.

Convenientemente, el polipéptido CD154 tiene menos de 50 aminoácidos de longitud, más convenientemente menos de 40, menos de 30 o menos de 20 aminoácidos de longitud. El polipéptido puede ser de entre 10 y 15 aminoácidos, entre 10 y 20 aminoácidos o entre 10 y 25 aminoácidos de longitud. La secuencia de CD154 y la región de unión de CD40 no están altamente conservadas entre las diferentes especies. Las secuencias de CD154 de pollo y humana se proveen en SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, respectivamente.

Se han determinado las regiones de unión a CD40 de CD154 para varias especies, incluyendo humano, pollo, pato, ratón y bovino, y se las muestra en SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, respectivamente. A pesar de que hay una variabilidad en las secuencias de la región de unión a CD40 entre las especies, los ejemplos siguientes indican que el polipéptido CD154 humano fue capaz de potenciar la respuesta inmune en pollos. Por lo tanto, uno puede practicar la invención usando polipéptidos CD154 específicos de especie o un polipéptido CD154 heterólogo. En particular, los polipéptidos CD154 y fragmentos funcionales u homólogos de los mismos incluyen a polipéptidos idénticos, o al menos 99% idénticos, al menos 98% idénticos, al menos 95% idénticos, al menos 90% idénticos, al menos 85% idénticos, o al menos 80% idénticos a los polipéptidos CD154 de SEQ ID NOs: 11 a 17.

El vector para vacunas a Bacillus que se describe en la presente se puede usar en los métodos para potenciar una respuesta inmune y los métodos para reducir la morbilidad por influenza en un sujeto como se describió previamente. El vector para vacunas a Bacillus se puede usar para hacer composiciones para administración a sujetos tales como los que también se describen previamente.

Se pueden insertar polinucleótidos heterologos que codifican polipéptidos antigénicos en el genoma bacteriano en cualquier sitio no esencial o, de forma alternativa, se lo puede colocar sobre un plásmido usando métodos bien conocidos en el arte. Un sitio apropiado para la inserción de los polinucleótidos es dentro de las porciones externas de las proteínas transmembrana o acoplados a las secuencias que dirigen al polinucleótido heterólogo hacia vías secretorias. Entre los ejemplos de una proteíná transmembrana apropiada para insertar los polinucleótidos son el gen cotB de Bacillus y el gen lamB de Salmonella.

Los polinucleótidos heterologos incluyen, sin carácter limitativo, polinucleótidos que codifican antígenos que se seleccionan de microorganismos o virus patógenos distintos al vector para vacunas. Dichos polinucleótidos pueden derivar de virus patogénicos tales como influenza (por ejemplo, M2e, hemaglutinina, o neuraminidasa), herpesvirus (p.ej., los genes que codifican las proteínas estructurales de herpesvirus), retrovirus (p.ej., la proteína de cubierta gp160), adenovirus, paramixovirus, coronavirus y similares. Los polinucleótidos heterologos también se pueden obtener a partir de bacterias patogénicas, por ejemplo, genes que codifican proteínas bacterianas tales como toxinas, y proteínas de membrana externa. Además, los polinucleótidos heterologos de parásitos, tales como Eimeria son candidatos atractivos para usar en una vacuna a base de vector.

También se pueden incluir polipéptidos inmunoestimulatorios adicionales involucrados en el disparo del sistema inmune en el vector para vacunas como se describe en la presente. Los polinucleótidos pueden codificar moléculas del sistema inmune que sean conocidas por sus efectos estimulatorios, tales como una interleuquina, factor de necrosis tumoral o un interferón, u otro polinucleótido involucrado en la regulación inmune.

Los siguientes ejemplos tienen solamente un propósito ilustrativo y no representan limitaciones al alcance de la invención o a las reivindicaciones adjuntas.

EJEMPLOS Ejemplo 1. Construcción de HA/NP/M2e/cCD154 y HA/NP/M2e/HMGB1 Vectores de Bacillus.

Cepas y condiciones de cultivo Todos los plásmidos se mantuvieron primero en células E. coli TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) a menos que se describa de otra manera. Se usó Bacillus spp. para la introducción de mutaciones (Bacillus subtilis, cepa Poultry Health Laboratory designada como NP 22). Las bacterias portando los plásmidos pDGIEF y pHT10 se crecieron a 37°C.

Se usó el medio de Luria-Bertani (LB) para el crecimiento celular de rutina, y se usó medio SOC (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) para la expresión fenotípica después de la electroporación. En los casos apropiados, el medio se adicionó con los siguientes: Isopropil-fc-D-tiogalactopiranósido (IPTG) a 1 mM, ampicilina (Amp) a 100 pg/ml, espectinomicina (SP) a 100 pg/ml, y cloramfenicol (Cm) a 5 pg/ml.

Plásmidos Los plásmidos pDGIEF (Bacillus Genetic Stock Center, Columbus, OH) y pHT10 que se usaron para el presente estudio se describieron previamente (Zhang et al., Nuc. Acids Research 2006, 34 (9): 1-8 y Nguyen et al., Curr. Micro. 2007, 55:89-93). El plásmido pDGIEF sirvió como molde para la amplificación del gen mazF que se usó como marcador de contra selección durante la manipulación del cromosoma de Bacillus. El plásmido pHT10 se usó para codificar y producir las secuencias de epitopes heterólogos para influenza aviar dentro de Bacillus spp. Este plásmido contiene un gen de resistencia a CM, se induce mediante el agregado de IPTG 1 mM, y se mantiene dentro de Bacillus a 37°C.

Producción de proteínas heterólogas para expresión en células vegetativas: Se transformó el plásmido pHT10 adquirido de MoBioTec/Boca Scientific, Boca Ratón, FL (Nguyen et al., 2007) en el sitio de clonado múltiple mediante el agregado de una secuencia de inserción optimizada por codón para Bacillus subtilis. Se hizo secuenciación de ADN para confirmar la inserción correcta de la secuencia. El plásmido recién modificado se transformó entonces en Bacillus. Brevemente, se desarrolaron cultivos de Bacillus durante una noche a 37°C en medio HS (medio de Spizizen suplementado con glucosa al 0,5%, DL-triptofano 50 pg/ml, uracilo 50 pg/ml, hidrolizado de caseína al 0,02%, extracto de levadura al 0,1%, arginina 8 pg/ml, histidina 0,4 pg/ml, MgS04 1 mM). Se usó el cultivo de una noche (1 mi) para inocular 20 mi de medio LS (Medio de Spizizen suplementado con glucosa al 0,5%, DL-triptofano 5 pg/ml, uracilo 5 pg/ml, hidrolizado de caseína al 0,01 %, extracto de levadura al 0,1%, MgS04 1 mM, MgCI2 2,5 mM, CaCI20,5 mM) y se incubó con agitación entre 3 y 4 horas a 30 °C. A 1 mi del cultivo de LS resultante se agregó 10 µ? de EGTA 0,1 M y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego se agregó entre 1 y 2 pg de ADN plasmídico, se agitó durante 2 horas a 37°C, y se plaqueó en placas de LB con antibióticos de selección. Estos Bacillus spp. transformados ahora producen secuencias de epitopes heterólogos a partir de Al cuando se los induce con IPTG 1 mM.

PCR Todos los cebadores que se usaron para PCR se listan en la tabla 1. Las condiciones típicas de PCR consisten en aproximadamente 0, 1 µ9 de ADN genómico purificado, plasmídico o generado por PCR (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.), solución amortiguadora para Pfu polimerasa 1x, 5 U de Pfu polimerasa (Stratagene La Jolla, CA, EE.UU.), dNTPs 1 t??? (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ), 1 ,2 µ? de cada cebador en un volumen total de 50 µ?. Se usó el DNA engine thermal cycler (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.) con las siguientes condiciones de amplificación: 94°C durante 2 minutos; 30 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 58°C durante 60 segundos, 72°C durante 90 segundos por cada 1 kb; y 72°C durante 10 minutos para la extensión final. Cada producto de PCR se purificó por gel (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.) y se eluyó o bien con 25 µL· de solución amortiguadora EB para la preparación de los moldes que se usan en la PCR de extensión solapada, o con 50 µ? de solución amortiguadora EB, se precipitó con etanol y se resuspendió en 5 µL· de ddH20 para electroporación en Bacillus spp.

Tabla 1 : secuencias de cebadores que se usaron para generar el vector para vacunas En la tabla 1 , los nucleótidos en itálica son los que son complementarios a cada lado del sitio de la inserción del gen CotB de Bacillus subtilis.

Electroporación Brevemente, se inocularon las células en 10 mL de caldo LB y se crecieron a 37°C durante una noche. Luego, se reinocularon 100 µL· del cultivo obtenido durante una noche en 10 mL de caldo LB fresco a 37°C entre 3 y 4 horas. Se lavaron las células cinco veces con agua ddH20 y se resuspendieron en 60 µ? de glicerol al 10%. Luego se sometió a las células a pulsos de entre 2,4 y 2,45 kV entre 1 y 6 ms, se incubaron en 0,5 mi de SOC entre 2 y 3 horas a 37°C y se plaquearon en medio LB con antibióticos apropiados.

Integración cromosomai de ADN heterólogo para expresión de cubierta de esporo: Se construyeron cepas recombinantes de Bacillus conteniendo copias integradas estables de epitopes 2e, HA y NP seleccionados usando métodos publicados recientemente con modificación. Brevemente, se transformaron cepas de Bacillus con el cásete MazF (Zhang et al., 2006) que generó una cepa que era sensible a IPTG y resistente a espectomicina. El cásete MazF flanqueado por aproximadamente 300 pb de ADN homólogo a cada lado se introdujo en el gen CoíB (Isticato et al., 2001 ) del vector de Bacillus mediante electroporación seguida por crecimiento en medio con espectomicina para clones positivos que ahora contienen el cásete MazF que es resistente a espectomicina.

Después de que se confirmó la mutación de MazF en CorB, se reemplazó esta región por una secuencia de ADN optimizada por codón que codifica los epitopes antigénicos de Al otra vez flaqueada por 300 pb de ADN homólogo. Esto se hizo mediante la creación de un producto de PCR usando PCR por solapamiento y extensión para producir las secuencias antigénicas flanqueadas por aproximadamente 300 bp a cada lado homólogo al cromosoma de Bacillus (Cox et al., 2007). El producto de PCR se introdujo en Bacillus otra vez mediante electroporación y en reemplazo del cásete MazF. Se seleccionaron los transformantes en placas con IPTG, los clones positivos ahora no deberían responder a IPTG y deberían ser sensibles a espectomicina. La inserción de la secuencia cromosómica correcta se confirmó mediante secuenciación de ADN.

Ejemplo 2. Estudio de vacunación 1 y 2.

Se obtuvieron polluelos recién nacidos (día 0) de un granja comercial local y se distribuyeron al azar en los grupos de tratamiento (n=15/grupo de tratamiento, exp. 1 y n=20/grupo de tratamiento, exp. 2). Se marcaron y numeraron todos los polluelos de cada grupo de tratamiento. Se infectaron los polluelos por vía oral mediante alimentación con 0,25 mi de solución salina o entre 106 y 108 ufc/ml de los diferentes tratamientos con Bacillus según se indica en la tabla 2 para el estudio 1 y en la tabla 3 para el estudio 2.

Tabla 2. Dosis de desafío para cada grupo de tratamiento en el estudio de vacunación 1.

Tabla 3. Dosis de desafío para cada grupo de tratamiento en el estudio de vacunación 2.

En el estudio 2, se inactivaron las bacterias de varias maneras diferentes para evaluar si la replicación era necesaria para la producción de una respuesta con anticuerpos dirigida a los péptidos antigénicos de influenza. Se usaron varias formas de inactivación debido a que los medios de inactivación pueden resultar en la destrucción de un epitope y resultar en una mala interpretación de los resultados y apoyar la necesidad de replicación o viabilidad del vector de Bacillus. Las bacterias se inactivaron mediante incubación durante 10 minutos en formalina al 0,022% (inactivados con formalina); incubación durante 10 minutos a 70°C (inactivados por calor); incubación en gentamicina 5 pg/ml (inactivados por antibiótico); o incubación durante 10 minutos en etanol al 70% (inactivados por etanol).

Cada grupo de tratamiento se alojó en un piso de gallinero individual sobre lecho de pino fresco y se proveyó con agua y alimento ad libitum. En los días 11 y 21 después de la eclosión, las aves recibieron una vacuna de refuerzo del mismo tratamiento que habían recibido en el día 0. También en los días 21 y 31/32, se colectó sangre de cada una de las aves marcadas y se separó el suero.

El suero que se colectó a partir de las aves marcadas de cada grupo de tratamiento se usó entonces en un ELISA de captura de anticuerpo para determinar la respuesta específica de anticuerpos contra M2e, HAUA y HALB. Brevemente, se recubrieron los pocilios individuales de una placa de 96 pocilios con 10 g/ml de epitope 2e, epitope HAUA o epitope HALB conjugado a BSA. Se dejó que los antígenos procedan a adherirse durante una noche a 4°C. Se lavaron las placas con PBS + Tween 20 al 0,05%, se bloquearon con PBS Superblock (Pierce Chemical Co.) durante un mínimo de 2 horas y se incubaron durante 2 horas con el suero previamente colectado de las aves de cada uno de los grupos de tratamiento que se describió previamente. Se lavaron las placas con PBS + Tween 20 al 0,05% seguido por incubación con anticuerpo secundario de cabra anti IgY de pollo (dilución 1 :7.500) conjugado con peroxidasa, obtenido de Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA) durante una hora adicional. Después del subsiguiente lavado, se desarrollaron las placas usando un conjunto de componentes con sustrato para peroxidasa que se obtuvo de Fisher Scientific y se leyeron las absorbancias en un espectrofotómetro a 450 nm y 405 nm.

Se usaron las muestras de suero agrupadas de los grupos que recibieron los vectores de vacuna como controles positivos y se usaron muestras de suero agrupadas de los grupos sin vacunar como controles negativos sobre cada placa para reemplazar al suero de los grupos de tratamientos. Las absorbancias que se obtuvieron de las muestras de control positivo, control negativo y experimentales se usaron para calcular las relaciones de muestra a control positivo (relaciones S/P) usando el siguiente cálculo: cálculo de relación S/P: media de muestras - media de control negativo media de control positivo - media de control negativo Las relaciones S/P que se calcularon para cada estudio se muestran en las figuras 1 a 6. Las figuras 1 a 3 muestran los títulos de anticuerpos totales contra M2e, HALB y HAUA para el estudio 1 , respectivamente, en los días 21 y 31 después de la eclosión. Los resultados demuestran que se generaron respuestas inmunes robustas contra cada uno de estos antígenos después de la administración con un Bacillus que expresa cada uno de los epitopes ya sea con CD154 o bien con HMGB1 como péptido inmunoestimulatorio. Las figuras 4 a 6 muestran los títulos de anticuerpo total contra 2e, HALB y HAUA para el estudio 2, respectivamente, en los días 21 y 32 después de la eclosión. Los resultados demuestran que se generaron respuestas inmunes robustas hacia cada uno de los epitopes después de la administración oral de un Bacillus vivo que expresa el epitope y un péptido inmunoestimulatorio. Las figuras 4 a 6 también demuestran que se generaron niveles similares de anticuerpos específicos cuando el vector (el Bacillus) se inactivo antes de la administración.

Ejemplo 3. Estudio de vacunación 3 Se obtuvieron polluelos recién nacidos (día 0) de una granja comercial local y se distribuyeron al azar en grupos de tratamientos (n=20/grupo de tratamiento). Se marcaron y numeraron todos los polluelos de cada grupo de tratamiento. Se infectaron los polluelos por vía oral mediante alimentación con 0,25 mi de solución salina o entre 105 y 108 ufc/ml del vector de Bacillus (BSBB), el vector de Bacillus que expresa los epitopes de influenza aviar y HMGB1 (BS/AI/H GB1 ), o diferentes cantidades del vector BS/AI/HMGB1 después de inactivación por formalina (como se describió previamente). En el día 10 después de la eclosión, las aves recibieron una vacuna de refuerzo del mismo tratamiento que habían recibido en el día 0. También en los días 21 y 32, se colectó sangre de cada una de las aves marcadas y se separó el suero. Se determinaron los niveles séricos de anticuerpo IgG especifico contra M2e usando el método que se describió previamente con un anticuerpo secundario específico anti IgG de pollo marcado con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Los resultados de la figura 7 muestran que las bacterias inactivadas con formalina fueron capaces de estimular la producción de anticuerpos IgG específicos contra M2e así como también las bacterias vivas. Este resultado fue sorprendente debido a que en general se cree que solamente las bacterias vivas pueden estimular una respuesta inmune robusta después de administración oral.

Ejemplo 4. Estudio de vacunación 4 Se obtuvieron polluelos recién nacidos (día 0) de una granja comercial local y se distribuyeron al azar en los grupos de tratamiento (n=20-35/grupo de tratamiento). Se marcaron y numeraron todos los polluelos de cada grupo de tratamiento. Se infectaron los polluelos por vía oral mediante alimentación o se inyectaron por vía subcutánea con 0,25 mi de 106 ufc/ml del vector de Bacillus (BSBB), el vector de Bacillus que expresa los epitopes influenza aviar y HMGB1 (BSAI), o el vector de BSAI después de inactivación por formalina (como se describió previamente) o después de inactivación por formalina seguido por liofilización (reconstituido con solución salina inmediatamente antes de la administración). En el día 10 después de la eclosión, algunas de las aves recibieron una vacuna de refuerzo del mismo tratamiento que habían recibido en el día 0. En los días 11 , 14 y 21 , se colectó sangre de cada una de las aves marcadas y se separó el suero. Se determinaron los niveles de anticuerpos séricos de IgA y IgG específicos contra 2e usando el método que se describió previamente con un anticuerpo secundario específico anti-lgA de pollo marcado con peroxidasa (GenTex) o anti-lgG de pollo marcado con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Los resultados de la figura 8 muestran que las bacterias inactivadas con formalina fueron capaces de estimular la producción de anticuerpos IgA específicos contra M2e aproximadamente tan bien como las bacterias vivas cuando se administran por vía oral. Por el contrario, cuando se da por vía subcutánea, el vector BSAI inactivado no fue eficaz para estimular una respuesta con anticuerpos IgA y las bacterias liofilizadas no estimularon una respuesta IgA. Los resultados de la figura 9 muestran que cada uno de los protocolos de administración de BSAI apoya una formación robusta de IgG.

Claims (34)

REIVINDICACIONES

1 . Un vector para vacunas que comprende un polipéptido antigénico y un polipéptido HMGB1 o un fragmento funcional de los mismos, en donde al menos una porción del polipéptido antigénico y al menos una porción del polipéptido H GB1 están presentes sobre la superficie del vector para vacunas.

2. El vector para vacunas de la reivindicación 1 , en donde el polipéptido antigénico es un polipéptido específico de influenza.

3. El vector para vacunas de la reivindicación 2, en donde el polipéptido antigénico es un polipéptido de influenza M2e, HA o NP.

4. El vector para vacunas de la reivindicación 3, en donde el polipéptido antigénico se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, un fragmento inmunogénico de SEQ ID NO:1 , un fragmento inmunogénico de SEQ ID NO:2, un fragmento inmunogénico de SEQ ID NO:3, un fragmento inmunogénico de SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 y un fragmento inmunogénico SEQ ID NO:7, un fragmento inmunogénico SEQ ID NO:8, un fragmento inmunogénico SEQ ID NO:9 o un fragmento inmunogénico SEQ ID 10.

5. El vector para vacunas de la reivindicación 1 , en donde el polipéptido H GB1 se selecciona entre SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, un fragmento funcional de SEQ ID NO: 18, un fragmento funcional de SEQ ID NO: 29, un fragmento funcional de SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27 y SEQ ID NO:28 y un homólogo del mismo.

6. El vector para vacunas de la reivindicación 1 , en donde el vector para vacunas es una bacteria.

7. El vector para vacunas de la reivindicación 6, en donde la bacteria es Bacillus spp.

8. El vector para vacunas de la reivindicación 1 , en donde el polipéptido antigénico y/o el polipéptido HMGB1 está comprendido dentro de una proteína transmembrana.

9. El vector para vacunas de la reivindicación 10, en donde el polipéptido antigénico y/o el polipéptido H GB1 está dentro de un bucle externo de una proteína transmembrana.

10. El vector para vacunas de cualquiera de la reivindicación 1 , en donde la proteína transmembrana es cotB.

1 1. El vector para vacunas de la reivindicación 1 , en donde el polipéptido antigénico y el polipéptido HMGB1 son parte de una proteína de fusión.

12. Una composición que comprende el vector para vacunas de la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

13. La composición de la reivindicación 12, en donde el vehículo farmacéuticamente aceptable es aceptable para administración oral o nasal.

14. La composición de la reivindicación 12, en donde el vector para vacunas no es capaz de replicación, se inactiva o elimina.

15. Uso del vector para vacunas de cualquiera de la reivindicación 1 para la preparación de un medicamento para potenciar la respuesta inmune del sujeto contra el polipéptido antigénico.

16. El uso de la reivindicación 15, en donde el vector para vacunas está formulado para ser administrado por vía oral o por vía intranasal.

17. El uso de la reivindicación 16, en donde la respuesta inmune es una respuesta con anticuerpos IgA contra el polipéptido antigénico.

18. El uso de la reivindicación 15, en donde el vector para vacunas no es capaz de replicarse en el sujeto, se inactiva o se elimina antes de la administración al sujeto..

19. El uso de la reivindicación 15, en donde el polipéptido antigénico y/o el polipéptido HMGB1 está comprendido dentro de una proteína transmembrana.

20. El uso de la reivindicación 19, en donde el polipéptido antigénico y/o el polipéptido HMGB1 está dentro de un bucle externo de una proteína transmembrana.

21. Un vector para vacunas contra Bacillus spp. que comprende una primera secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido antigénico que está presente sobre la superficie del vector para vacunas y una segunda secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido inmunoestimulatorio, en donde el polipéptido antigénico y el polipéptido inmunoestimulatorio están presentes sobre la superficie del vector para vacunas, en donde el polipéptido antigénico es un polipéptido de influenza y en donde el polipéptido inmunoestimulatorio es un polipéptido CD154 o un polipéptido H GB1.

22. El vector para vacunas de la reivindicación 21 , en donde el primer polinucleótido y el segundo polinucleótido se insertan dentro de una tercera secuencia de poliuncleótidos que codifica una porción externa de una proteína transmembrana.

23. El vector para vacunas de la reivindicación 21 , en donde la proteína transmembrana es cofS.

24. El vector para vacunas de la reivindicación 21 , en donde el polipéptido antigénico es un polipéptido 2e de influenza, un polipéptido HA de influenza, o un polipéptido NP de influenza.

25. El vector para vacunas de la reivindicación 24, en donde el polipéptido M2e de influenza se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, un fragmento inmunogénico de SEQ ID NO:1 , un fragmento inmunogénico de SEQ ID NO:2, un fragmento inmunogénico de SEQ ID NO:3, un fragmento inmunogénico de SEQ ID NO:4, SEQ ID N0.7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 y SEQ ID NO:10.

26. El vector para vacunas de la reivindicación 21 , en donde el polipéptido HMGB1 se selecciona entre SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, un fragmento funcional de SEQ ID NO: 18. un fragmento funcional de SEQ ID NO: 29, un fragmento funcional de SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:28 y un homólogo del mismo.

27. Uso del vector para vacunas contra Bacillus spp. de la reivindicación 21 para la preparación de un medicamento para potenciar la respuesta inmune del sujeto.

28. El uso de la reivindicación 27, en donde el vector para vacunas es formulado para ser administrado por vía oral o por vía intranasal.

29. El uso de la reivindicación 28, en donde la respuesta inmune es una respuesta con anticuerpos IgA hacia el polipéptido antigénico.

30. El uso de la reivindicación 27, en donde el vector para vacunas no es capaz de replicarse en el sujeto, se inactiva o sé elimina antes de la administración al sujeto.

31. Uso el vector para vacunas de la reivindicación 1 para la preparación de un medicamento para reducir la morbilidad relacionada con influenza A.

32. Uso de la composición de la reivindicación 12 para la preparación de un medicamento para potenciar la respuesta inmune de un sujeto contra un polipéptido antigénico.

33. Uso de la composición de la reivindicación 12 para la preparación de un medicamento para reducir la morbilidad relacionada con influenza A en un sujeto.

34. Uso del vector para vacunas de la reivindicación 21 para la preparación de un medicamento para reducir la morbilidad relacionada con influenza A en un sujeto.