KR101525180B1 - 인플루엔자 바이러스 항원의 세포표면 발현벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인플루엔자 바이러스의 특이 항원 단백질인 매트릭스 2(M2) 및 헤마글루티닌(HA2)을 미생물의 표면에 발현시키는 벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 폴리감마글루탐산 합성효소 복합체 유전자(pgsA), 콜레라 독소 A1 서브유닛(CTA1), 인플루엔자 바이러스의 특이 항원 단백질인 매트릭스 2(M2) 및 헤마글루티닌(HA2)을 코딩하는 유전자를 포함하는 표면 발현벡터, 상기 벡터로 형질전환된 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물로부터 수득한 항원을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방용 백신에 관한 것이다. 본 본 발명에 따른 콜레라 독소 A1 서브유닛과 결합된 매트릭스 2 및 헤마글루티닌(CTA1-sM2HA2) 항원단백질이 표면 발현된 미생물은 다양한 A형 인플루엔자 바이러스 서브타입에 우수한 면역반응을 유발하며, 상기 인플루엔자 바이러스의 특이 항원단백질인 매트릭스 2 및 헤마글루티닌을 표면 발현하는 미생물은 경구 또는 비강에 직접 적용할 수 있는 점막백신으로 유용하다.

Description

인플루엔자 바이러스 항원의 세포표면 발현벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물 {Cell Surface Expression Vector for Influenza Virus Antigen and Microorganisms Transformed Thereby}

본 발명은 인플루엔자 바이러스의 특이 항원 단백질인 매트릭스 2(M2) 및 헤마글루티닌(HA2)을 미생물의 표면에 발현시키는 벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 폴리감마글루탐산 합성효소 복합체 유전자(pgsA), 콜레라 독소 A1 서브유닛(CTA1), 인플루엔자 바이러스의 특이 항원 단백질인 매트릭스 2(M2) 및 헤마글루티닌(HA2)을 코딩하는 핵산을 포함하는 표면 발현벡터, 상기 벡터로 형질전환된 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물로부터 수득된 항원을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방용 백신에 관한 것이다.

백신접종은 인플루엔자 바이러스에 의한 호흡기 질환 예방의 가장 경제적이고 효과적인 방법이다(Fiore et al., Curren Top Microbiol Immunol 333:43-82, 2009). 유행성 바이러스에 대해 3가 백신이 개발되어 인플루엔자 바이러스에 사용되고 있으며(Kang et al., Virus Res 162:31-38, 2011), 현재 허용되고 있는 가장 보편적인 방법은 계란을 사용하여 생산된 불활성화 백신을 근육에 투여하는 것이다(Beyer et al., Vaccine 20:1340-1353, 2002). 그러나, 이 방법은 전 세계적으로 유행하는 바이러스와 일치하는 백신 균주를 새로 구성해야 하는 어려움이 있으며(Couch et al., Vaccine 26:5-9, 2008), 게다가 불활성화 백신에 의해 유도되는 항체는 8개월 이후에 75% 정도로 감소하는 것으로 나타났다(Kang et al., Virus Res 162:31-38, 2011). 따라서, 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 넓은 교차예방 효과를 나타내면서 안전하고 효과적인 백신의 개발이 매우 중요하다.

매트릭스 2(M2) 단백질, 특히 세포외(extracellular) 도메인(M2e)는 A형 인플루엔자 바이러스 균주들 간에 높은 보존성을 나타내므로, 범용백신 개발에 있어 주요 타겟이다(Eliasson et al., Vaccine 26:1243-1252, 2008). 이전 연구에서, M2 융합단백질을 발현하는 재조합 E.coli, M2 단백질을 발현하는 아데노바이러스 벡터, M2를 코딩하는 플라스미드 DNA(Frace et al., Vaccine 17:2237-2244, 1999; Jimenez et al., Hum Vaccin 3:157-164, 2007; Lalor et al., J Infect Dis 197:1643-1652, 2008) 및 M2e를 코딩하는 펩티드(Wu et al., Vaccine 25:8868-8873, 2007) 등의 여러 가지 M2 백신이 개발되어 마우스에서 면역반응을 유도할 수는 있었으나, 낮은 면역성과 대부분 근육에 투여해야 한다는 문제점을 가지고 있다. 따라서, M2 백신의 면역성을 높이기 위해 여러 가지 캐리어 분자를 M2 단백질과 결합하였고, 다양한 서브타입의 인플루엔자 바이러스에 대한 교차예방 효과를 높이기 위해 여러 가지 항원보강제의 사용 및 다양한 투여 경로에 대한 탐색이 시도되었다. 마우스에 M2 또는 바이러스 유사입자(VLPs)를 콜레라 독소(CT) 보강제와 함께 점막접종 하였을 때 비경구 접종에 비해 우수한 효과를 나타낸바 있다(Mozdzanowska et al., Virol J 4:118, 2007; Quan et al., Viral Immunol 26:385-395, 2013). 그러나, CT의 독성으로 인해 서브유닛 A 또는 서브유닛 B 중 하나를 제거하여 비독성 서브유닛을 확인하는 것이 필요하였고, 황색포도상구균의 D-프레그먼트와 융합한 CTA1(콜레라 독소 서브유닛 A1)을 발현시킨 E.coli 점막백신에서 A1 서브유닛에 의한 이상반응이 나타나지 않았으며 보강제의 효과도 확인되었다(Eliasson et al., Vaccine 26:1243-1252, 2008). M2의 융합단백질은 본래의 테트라머 형태로 존재하지 못하므로, 세포내에서 발현되는 것보다 박테리아 표면 세포외에서 발현되는 것이 훨씬 효과적이다(Lee et al., J Virol 80:4079-4087, 2006). 따라서, 점막백신에서는 전달체의 선택이 중요하다.

인플루엔자 표면의 헤마글루티닌(HA)는 또 다른 강한 항원으로, 75kDa의 동형삼량체(homotrimer) 형태로 존재하는 막당단백질이다(Wilson IA et al., Nature 289:366-373, 1981). 바이러스가 감염되는 동안, HA는 숙주세포의 당단백질과 결합하여 바이러스 침투를 가능하게 하며, 낮은 pH에 의한 구조 변화를 통해 숙주세포와 바이러스를 매개한다(Wilson IA et al., Annual review of immunology 8:737-771,1990; Skehel JJ et al., Annual review of biochemistry 69:531-569, 2000). HA는 높은 면역원성으로, 백신개발의 주요 대상이다(Stevens J et al., Infectious disorders drug targets 7:329-335, 2007).

최근, 유산균(LAB)에서 인플루엔자 바이러스 항원을 발현하는 연구가 진행되고 있으며(Beyer et al., Vaccine 20:1340-1353, 2002; Mannam et al., Infect Immune 72:3444-3450, 2004; Lei et al., Virology 407:319-324, 2010), 점막백신에서 유산균은 shigella, Salmonella 및 Listeria 같은 생백신 벡터보다 훨씬 우수한 전달 시스템으로 보고되었다(Lee et al., Nat Biotechnol 18:645-648, 2000; Shata et al., J Virol 75:9665-9670, 2001). 트랜스멤브레인 단백질 pgsA는 바실러스 서브틸리스의 폴리감마글루탐산 합성효소 복합체 중 하나로(Lee et al., J Virol 80:4079-4087, 2006; Narita et al., Appl Environ Microbiol 72:269-275, 2006: Candela et al., Mol Microbiol 60:1091-1098, 2006), C-말단에 목적단백질을 융합하여 안정화한 후 세포막에서 발현이 가능하다.

이에, 본 발명자들은 높은 보존성을 나타내는 sM2 및 HA2를 범용백신을 위한 목적단백질로 사용하고 CTA1을 점막백신의 보강제로 사용하여 A형 인플루엔자 바이러스 예방용 점막백신을 개발하고자 예의 노력한 결과, 다양한 서브타입의 A형 인플루엔자 바이러스를 분석하여 sM2 보존서열을 재구성하고 HA2 및 CTA1을 융합한 후, pgsA를 발현하는 벡터를 사용하여 목적항원인 sM2 및 HA2를 락토바실러스 카제이(L.casei)의 표면에 발현시켰다. 재조합락토바실러스 카제이(L.casei)를 경구 또는 비강 접종하여, 상기 재조합 락토바실러스 카제이가 다양한 인플루엔자 서브타입에 대해 강력한 면역반응을 유도한다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 폴리감마글루탐산 합성효소 복합체 유전자(pgsA), 콜레라 독소 A1 서브유닛(CTA1)과 인플루엔자 바이러스의 특이 항원 단백질인 매트릭스 2(M2) 및 헤마글루티닌(HA2)을 코딩하는 핵산을 포함하는 표면 발현벡터, 상기 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 미생물 또는 재조합 미생물로부터 수득한 항원을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방용 백신을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 콜레라 독소 서브유닛 A1(CTA1), 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 2(M2) 및 헤마글루티닌(HA2) 항원단백질이 결합되어 있는 융합단백질을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 융합단백질을 코딩하는 핵산을 제공한다.

본 발명은 또한, 폴리감마글루탐산 합성효소 복합체를 코딩하는 유전자 pgsA와 콜레라 독소 서브유닛 A1(CTA1), 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 2(M2) 및 헤마글루티닌(HA2) 항원단백질이 결합되어 있는 융합단백질을 코딩하는 핵산을 함유하는 세포표면 발현벡터을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 상기 형질전환된 미생물을 배양하여 콜레라 독소 서브유닛 A1(CTA1), 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 2(M2) 및 헤마글루티닌(HA2) 항원단백질이 결합되어 있는 융합단백질을 미생물 표면에 발현하는 단계; 및 (b) 상기 융합단백질이 표면 발현된 미생물을 회수하는 단계를 포함하는 콜레라 독소 서브유닛 A1(CTA1), 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 2(M2) 및 헤마글루티닌(HA2) 항원단백질이 결합되어 있는 융합단백질이 표면 발현된 미생물을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방용 백신을 제공한다.

본 발명은 또한, 콜레라 독소 서브유닛 A1(CTA1), 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 2(M2) 및 헤마글루티닌(HA2) 항원단백질이 결합되어 있는 융합단백질을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방용 백신을 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 1로 표시되는 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 2(M2) 항원 단백질을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 항원단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 항원단백질과 M/Korea/W149/06(H5N1) 인플루엔자 바이러스의 아미노산 잔기 15-137 서열을 갖는 헤마글루티닌(HA2) 항원 단백질이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 항원 단백질을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 항원단백질을 코딩하는 핵산를 제공한다.

본 발명에 따른 콜레라 독소 A1 서브유닛과 결합된 매트릭스 2 및 헤마글루티닌(CTA1-sM2HA2) 항원단백질이 표면 발현된 미생물은 다양한 A형 인플루엔자 바이러스 서브타입에 우수한 면역반응을 유발하며, 상기 인플루엔자 바이러스의 특이 항원단백질인 매트릭스 2 및 헤마글루티닌을 표면 발현하는 미생물은 경구 또는 비강에 직접 적용할 수 있는 점막백신으로 유용하다.

도 1 내지 도 3은 Lactobacillus casei에서 sM2, CTA1-sM2 및 sM2HA2, CTA1-sM2HA2 단백질의 표면발현을 분석한 것이다.
도 1A는 pgsA-sM2, pgsA-CTA1-sM2 및 pgsA-sM2HA2, pgsA-CTA1-sM2HA2 플라스미드 도식도이다. 도 1B는 L. casei(lane1), 재조합 pgsA-L. casei(lane2), pgsA-sM2HA2/L. casei(lane3) 및 pgsA-CTA1-sM2HA2/L. casei(lane4)에서 항-pgsA, CT, sM2 및 HA2 발현을 분석한 것이며, 도 1C는 L. casei(lane1), 재조합 pgsA-L. casei(lane2), pgsA-sM2/L. casei(lane3) 및 pgsA-CTA1-sM2/L. casei(lane4)에서 항-pgsA, sM2 및 CT 발현을 분석한 것이다.
도 2는 sM2, sM2HA2 및 CT 발현을 L. casei과 각각의 재조합 L. casei에서 FACS로 분석하여 비교한 것이다.
도 3은 sM2, sM2HA2 및 CT 발현을 L. casei과 각각의 재조합 L. casei에서 형광현미경으로 분석하여 비교한 것이다.
도 4는 마우스에 백신접종 및 바이러스 감염 실험일정에 대한 프로토콜이다.
도 5는 마우스에 각각의 재조합 L. casei을 비강접종 후 sM2, sM2HA2 및 CTA1 항원단백질에 대한 면역글로불린 G의 양을 측정한 결과이다.
도 6는 마우스에 각각의 재조합 L. casei을 경구접종 후 sM2, sM2HA2 및 CTA1 항원단백질에 대한 면역글로불린 G의 양을 측정한 결과이다.
도 7은 마우스에 각각의 재조합 L. casei을 비강접종 후 폐와 장내 sM2, sM2HA2 및 CTA1 항원단백질에 대한 면역글로불린 A의 양을 측정한 결과이다.
도 8은 마우스에 각각의 재조합 L. casei을 경구접종 후 폐와 장내 sM2, sM2HA2 및 CTA1 항원단백질에 대한 면역글로불린 A의 양을 측정한 결과이다.
도 9는 각각의 재조합 L. casei을 비강접종한 마우스의 비장세포를 sM2, HA2 단백질과 M2, HA2 펩티드로 자극(A) 및 sM2 단백질 및 M2 펩티드로 자극(B)하여 IFN-γ를 측정한 결과이다.
도 10은 각각의 재조합 L. casei을 비강접종한 마우스의 비장세포를 sM2, HA2 단백질과 M2, HA2 펩티드로 자극(A) 및 sM2 단백질 및 M2 펩티드로 자극(B)하여 IL-4를 측정한 결과이다.
도 11은 각각의 재조합 L. casei을 경구접종한 마우스의 비장세포를 sM2, HA2 단백질과 M2, HA2 펩티드로 자극(A) 및 sM2 단백질 및 M2 펩티드로 자극(B)하여 IFN-γ를 측정한 결과이다.
도 12는 각각의 재조합 L. casei을 경구접종한 마우스의 비장세포를 sM2, HA2 단백질과 M2, HA2 펩티드로 자극(A) 및 sM2 단백질 및 M2 펩티드로 자극(B)하여 IL-4를 측정한 결과이다.
도 13은 다양한 인플루엔자 바이러스 서브타입 감염에 대한 재조합 미생물(pgsA, pgsA-sM2HA2, pgsA-CTA1-sM2 및 pgsA-CTA1-sM2HA2)의 방어효과를 나타낸 결과이다. 비강 (A) 및 경구 (B) 접종 후, H5N2 바이러스 감염에 대한 체중변화 및 생존율 분석; 비강 (C) 및 경구 (D) 접종 후, H5N1 바이러스 감염에 대한 체중변화 및 생존율 분석; 비강 (E) 및 경구 (F) 접종 후, H1N1 바이러스 감염에 대한 체중변화 및 생존율 분석; 비강 (G) 및 경구 (H) 접종 후, H9N2 바이러스 감염에 대한 체중변화 및 생존율 분석; 비강 (G) 및 경구 (H) 접종 후, H3N2 바이러스 감염에 대한 체중변화 및 생존율 분석한 결과이다.
도 14는 다양한 인플루엔자 바이러스 서브타입 감염에 대한 재조합 미생물(pgsA, pgsA-sM2 및 pgsA-CTA1-sM2)의 방어효과를 나타낸 결과이다. 비강 (A) 및 경구 (B) 접종 후, H5N2 바이러스 감염에 대한 체중변화 및 생존율 분석; 비강 (C) 및 경구 (D) 접종 후, H1N1 바이러스 감염에 대한 체중변화 및 생존율 분석; 비강 (E) 및 경구 (F) 접종 후, H9N2 바이러스 감염에 대한 체중변화 및 생존율 분석; 비강 (G) 및 경구 (H) 접종 후, H5N1 바이러스 감염에 대한 체중변화 및 생존율 분석; 비강 (I) 및 경구 (J) 접종 후, H7N3 바이러스 감염에 대한 체중변화 및 생존율 분석 결과이다.
도 15는 각각의 재조합 L. casei(pgsA, pgsA-sM2HA2, pgsA-CTA1-sM2 및 pgsA-CTA1-sM2HA2)을 비강 및 경구 접종하여 면역반응 유도 후, 다양한 인플루엔자 바이러스로 감염된 마우스의 폐에서 바이러스 타이터를 분석한 결과이다. (A), (B) H5N2; (C), (D) H5N1; (E), (F) H1N1; (G), (H) H9N2; (I), (J) H3N2.
도 16은 각각의 재조합 L. casei(pgsA, pgsA-sM2 및 pgsA-CTA1-sM2)을 비강 및 경구 접종하여 면역반응 유도 후, 다양한 인플루엔자 바이러스로 감염된 마우스의 폐에서 바이러스 타이터를 분석한 결과이다. (A), (B) H5N2; (C), (D) H1N1; (E), (F) H9N2; (G), (H) H5N1; (I), (J) H7N3.
도 17은 비강 및 경구 접종으로 면역반응 유도 후, 인플루엔자 바이러스로 감염된 마우스의 폐를 면역조직화합법으로 분석한 결과이다.
도 18은 다양한 인플루엔자 바이러스 서브타입에 대한 면역반응의 지속성을 분석한 결과이다. (A) 비강 및 경구 접종으로 면역반응 유도 후, 210일간 폐와 장내에서 sM2 및 HA2 항원단백질 지속 확인; (B) 비강 및 경구 접종으로 180일간 면역력이 지속된 마우스를 H5N2 바이러스로 감염시켜 체중변화 및 생존율 분석한 결과이다.
도 19은 다양한 인플루엔자 바이러스 서브타입에 대한 면역반응의 지속성을 분석한 결과이다. 비강 (A) 및 경구 (C) 접종으로 면역반응 유도 후, 180일간 폐와 장내에서 sM2 항원단백질 지속 확인; 비강 (B) 및 경구 (D) 접종으로 180일간 면역력이 지속된 마우스를 H5N2 바이러스로 감염시켜 체중변화 및 생존율 분석한 결과이다.
도 20은 닭에 백신 접종 및 바이러스 감염 실험 일정에 대한 프로토콜이다.
도 21은 L. casei(pgsA, pgsA-CTA1-sM2)을 비강 및 경구 접종하여 면역반응 유도 후, 0, 16, 30, 51일에 닭 혈청에서 sM2, sM2HA2 항원단백질에 대한 면역글로불린 G의 양을 측정한 결과이다.
도 22는 H5N8 인플루엔자 바이러스에 대한 재조합 미생물(pgsA, pgsA-CTA1-sM2HA2)의 방어효과를 나타낸 결과이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 다양한 유형의 인플루엔자 바이러스 서브타입의 M2 아미노산 서열을 비교 분석한 후, 트랜스멤브레인 도메인을 제거한 세포외 및 세포질 도메인 부분만 포함하는 sM2콘센서스 서열(표1: 서열번호 1)을 합성하고, HA2 유전자는 A/EM/Korea/W149/06(H5N1) 바이러스의 15-137 잔기로부터 얻었으며, CT 전체 게놈 DNA는 국제백신 연구소(Dr. 송만기)에서 제공받았다. sM2, HA2 및 CTA1 유전자는 표 2의 프라이머(서열번호 2 내지 7)로 PCR을 수행하여 제한효소 부위를 삽입한 후, pKV-pgsA 벡터에 라이게이션하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 콜레라 독소 서브유닛 A1(CTA1), 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 2(M2) 및 헤마글루티닌(HA2) 항원단백질이 결합되어 있는 융합 단백질에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 2(M2) 항원 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 인플루엔자 바이러스 매트릭스 (sM2) 단백질의 콘센서스 서열은 H5N1, H5N2, H1N1, H7N3 및 H9N2 인플루엔자 바이러스의 M2 단백질 보존서열을 변형시켜 합성한 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(HA2) 항원단백질은 A/EM/Korea/W149/06(H5N1)의 아미노산 잔기 15-137 서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 다른 관점에서, 콜레라 독소 서브유닛 A1(CTA1), 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 2(M2) 및 헤마글루티닌(HA2) 항원단백질이 결합되어 있는 융합단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

본 발명에서는 상기 콜레라 독소 서브유닛 A1(CTA1), 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 2(M2) 및 헤마글루티닌(HA2) 항원단백질이 결합되어 있는 융합 단백질을 발현하는 pKV-pgsA 벡터를 락토바실러스 카제이에 형질전화 시켰다.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 폴리감마글루탐산 합성효소 복합체를 코딩하는 유전자 pgsA와 콜레라 독소 서브유닛 A1(CTA1), 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 2(M2) 및 헤마글루티닌(HA2) 항원단백질이 결합되어 있는 융합단백질을 코딩하는 핵산을 함유하는 세포표면 발현벡터에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 폴리감마글루탐산 합성효소 복합체를 코딩하는 유전자는 pgsBCA의 전부 또는 일부만을 사용하여 백신용 벡터를 제작할 수 있고(KR 10-2004-0034511), pgsB, pgsC 및 pgsA인 것이 바람직하며, pgsA인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 벡터로 형질전환된 재조합 미생물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 형질전환 숙주세포로 사용되는 미생물은 생체 적용시 독성이 없거나 약독화된 미생물이라면 그람음성균인 대장균, 살모넬라 타이피, 살모넬라 타이피미리움, 비브리오 콜레라, 마이코박테리움 보비스, 시겔라 등을 사용할 수 있으며, 그람얀성균인 바실러스, 락토바실러스, 락토코커스, 스테필로코커스, 리스테리아 모노싸이토제네스, 스트랩토코커스 등을 어느 것이라도 사용 가능하며, 바람직하게는 식용이 가능한 미생물인 유산균을 사용할 수 있다. 또한 상기 유산균은 락토바실러스 속, 스트랩토코커스 속 및 비피도박테리움 속을 포함 할 수 있으며, 대표적으로 바실러스 속은 락토바실러스 아시도필러스, 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 퍼멘툼, 락토바실러스 델브루엑키, 락토바실러스 존스니, 락토바실러스 료터리, 락코바실러스 불가리커스 및 락토바실러스 카제이; 스트랩토코커스 속은 스트랩토코커스 서모필러스; 비피도박테리움 속은 비피도박테리움 인판티스, 비피도박테리움 비피덤, 비피도박테리움 론검, 비피도박테리움 슈도론검, 비피도박테리움 브레브, 비피도박테리움 락티스 및 비피도박테리움 아돌레센티스 등을 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 락토바실러스 속 락토바실러스 카제이를 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 융합단백질이 미생물 세포표면에서 발현하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환 되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드" 및 "벡터"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 체한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 도는 링커를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션할 수 있다.

라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환 되어야 한다. 형질전환은 Sambrook, et al., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법(Neumann, et al., EMBO J., 1:841, 1982) 또한 이러한 세포들의 형질전환에 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 항원의 세포표면 발현을 위하여 사용되는 벡터는 당업계에 공지된 벡터가 사용될 수 있으며, 바람직하게는 바실러스 서브틸리스의 pgsA 유전자를 함유하는 플라스미드 벡터를 사용할 수 있다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동 가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점을 같이 포함하고 있는 하나의 재조합벡터 내에 포함되게 된다.

상술한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 형질전환은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다.

물론 모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담 없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 형질전환된 미생물을 배양하여 콜레라 독소 서브유닛 A1(CTA1), 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 2(M2) 및 헤마글루티닌(HA2) 항원단백질이 결합되어 있는 융합단백질을 미생물 표면에 발현하는 단계; 및 (b) 상기 융합 단백질이 표면 발현된 미생물을 회수하는 단계를 포함하는 콜레라 독소 서브유닛 A1(CTA1), 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 2(M2) 및 헤마글루티닌(HA2) 항원단백질이 결합되어 있는 융합단백질이 표면발현된 미생물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서는, 상기 제조된 융합단백질 및 융합단백질을 표면발현하는 미생물을 마우스와 닭의 비강 및 경구 접종하여, 면역반을을 유도하였다.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 폴리감마글루탐산 합성효소 복합체를 코딩하는 유전자 pgsA와 콜레라 독소 서브유닛 A1(CTA1), 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 2(M2) 및 헤마글루티닌(HA2) 항원단백질을 코딩하는 핵산을 함유하는 세포표면 발현벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방용 백신에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 바이러스는 A형 인플루엔자 바이러스인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 백신은 경구용 또는 식용으로 섭취가 가능한 것이 바람직하며, 또한 비강 투여용인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 백신은 인체 및 동물 예방용인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 닭, 칠면조, 거위, 오리, 꿩, 메추라기, 비둘기, 타조 등과 같은 야생조류, 가금류, 돼지, 개 및 고양이 등의 예방용인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 콜레라 독소 서브유닛 A1(CTA1), 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 2(M2) 및 헤마글루티닌(HA2) 항원단백질이 결합되어 있는 융합단백질을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방용 백신에 관한 것이다.

본 발명의 용어 "백신"은 질병에 대한 예방의 목적으로 생유기물을 사용하여 면역 시스템을 자극시키는데 사용되는 약제를 의미한다. 면역 활성화는 유기체 내에서 항체 생성, T-림프구의 자극, 또는 다른 면역세포(예: 대식세포)를 자극하여 항원을 효율적으로 제거하기 위한 과정을 의미한다. 상기에 대한 자세한 면역학의 개관은 당업계의 통상의 기술을 가진자들은 쉽게 이해된다 (Barrett, J.T., Textbook of Immunology, 1983). 항원으로서의 목적단백질을 발현하는 형질전환된 미생물 백신의 투여대상은 포유동물일 수 있으며, 보다 바람직하게는 인간일 수 있다.

본 발명에서, 상기 "목적단백질" 또는 "외래단백질"은 상기 단백질을 발현하는 형질전환된 숙주세포에서는 정상적으로는 존재할 수 없는 단백질을 의미한다. 예를 들면, 유산균에서 바이러스 유래 또는 종양 유래 단백질을 인위적으로 발현하도록 조작하였을 경우, 상기 단백질을 외래단백질 또는 목적단백질이라 한다.

상기 백신 조성물의 제법은 표준 기법을 사용하여 실시할 수 있으며, 투여자에게 적합한 투여량은 유전자 생성물의 항원성에 따라 변하며 존재하는 백신의 전형적인 면역 반응을 유도하기에 충분한 양이면 되며 일상적 실험과정을 거쳐 필요량을 쉽게 판단할 수 있다. 전형적인 초기의 백신 용량은 체중 kg당 항원 0.001 내지 1mg이며, 바람직한 수준의 보호를 제공하기에 필요에 따라 양을 증가하거나 다중 용량을 사용한다. 상기의 양은 당해 기술분야에 속하는 전문가에 의해 결정될 수 있고, 제제화 방법, 투여 방식, 투여자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해서도 다양하게 처방될 수 있다.

백신 조성물을 투여자에게 경구 투여하기 위해서는 친액성 형태, 예를 들면 캡슐 형태로 제공되는 것이 유용하다. 상기 캡슐은 Eudragate S, Eudragate L, 셀룰로오즈 아세테이트, 셀룰로오즈 프탈레이트 또는 히드록시 프로필메틸 셀룰로오즈를 포함하는 장용피복으로 제공된다. 상기 캡슐류는 그 자체로 사용하거나 투여하기 전에 현탁액과 같이 친액성 물질을 재조성하여 사용할 수도 있다. 재조성은 형질전환된 재조합 미생물의 생존에 적합한 pH의 완충액에서 수행하는 것이 효과적이다. 위산으로부터 상기 형질전환된 재조합 미생물 및 백신을 보호하기 위하여 매회 백신 투여 이전에 중탄산나트륨 제제를 투여하는 것이 유용할 수 있다. 선택적으로 백신은 비경구투여, 비내투여 또는 유선내 투여용으로 제조될 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 1로 표시되는 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 2(M2) 항원단백질에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 항원단백질을 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 1로 표시되는 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 2(M2)과 A/EM/Korea/W149/06(H5N1) 인플루엔자 바이러스의 아미노산 잔기 15-137 서열을 갖는 헤마글루티닌(HA2) 항원 단백질이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 항원 단백질에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 항원단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

[실시예]

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명 할 것이다.

마우스

마우스는 5주령의 female BALB/c를 샘타코(한국)에서 구입하여 사용하였다. 실험은 6개의 실험군 마우스로 실시하였으며, 각각의 실험군은 비강 및 경구 접종군 2그룹으로 분류하였다. 6개의 실험군 중 4개는 14마리의 마우스(IgA용:3마리, lung virus titer용:6마리, 생존 분석용:5마리)로 구성된 실험군이며, 나머지 2개는 17마리 마우스(CTL 측정용 3마리가 추가 포함)의 실험군과 11마리 마우스(CTL 측정용 3마리와 lymphocyte 증식 분석용)의 실험군이다. 재조합 락토바실러스 카제이(L.casei)의 접종 농도는 경구 접종시 10¹⁰CFU, 비강 접종시 10⁹CFU로 실시하였으며, 0~3일간, 7~9일간 및 21일째에 접종하였다. 분석을 위한 혈청은 접종 1일전, 접종 후 14일째 및 28일째 분리하여 -20℃에서 보관하고, 폐와 장내에서 얻은 IgA는 접종후 28일째 분리하여 -70℃에서 보관하였으며, CTL(cytotoxic T lymphocyte) 분석을 위한 비장세포 또한 28일째 분리하였다(도 4). 면역반응의 지속효과를 분석하기 위한 마우스 그룹은 6개월 후 분석용 샘플을 분리하였다.

닭

2주령 SPF를 구입하여 사용하였으며, 4개의 실험군으로 나누고 각각의 실험군은 비강 및 경구 접종군의 2 그룹으로 나누어서 실험을 진행하였다. 2종 재조합 락토바실러스 카제이(L. casei)의 접종 농도는 경구 접종시 10¹¹CFU, 비강 접종시 10¹⁰CFU로 실시하였으며, 0~3일간, 7~9일간(1차 boosting) 및 21~23(2차 boosting)일째에 접종하였다. 3차 boosting에서는 1회 접종 후 효능 평가를 위해 모든 실험군에 CTA1-sM2HA2 재조합 유산균만을 접종하였고, 경구 접종시 10¹¹CFU, 비강 접종시 10¹⁰CFU 으로 동일하게 접종하였다. 분석을 위해 혈청은 접종 1일전, 접종 후 16일째, 30일째, 51일째 분리하여 -20℃에서 보관하였다.

바이러스

조류독감 바이러스인 A/EM/Korea/W149/06(H5N1), A/Puerto Rico/8/34(H1N1), A/Aquatic bird/Korea/W81/2005(H5N2), A/Aquatic bird/Korea/W44/2005(H7N3) 및 A/Chicken/Korea/116/2004(H9N2)는 충북대(Dr. 최영기)에서 제공받았으며(표 1: 백신과 바이러스 균주간의 sM2 서열 비교), 10일령 계태아 요막에 주입하여 배양한 후 마우스에 10 MLD₅₀ 최소치사량으로 감염시켰다. 감염 후 3 및 5dpi(day post infection)에 폐의 바이러스 타이터를 측정하였으며, 이후 체중감소 및 생존율을 관찰하였다. 마지막 접종 180일이 지난 마우스에 H5N2 바이러스에 감염시켜 면역반응 지속성을 분석하였다(도 4).

박테리아 균주

클로닝을 위해 E.coli JM83을 사용하였으며, 목적단백질의 표면 발현을 위해 락토바실러스 카제이(L.casei) L525를 사용하였다. 표면 발현벡터 제조를 위해 바실러스 서브틸리스의 pgsA 유전자를 함유하는 pKV-Pald-PgsA 플라스미드는 바이오리더스에서 제공받아 사용하였다.

실시예 1: CTA1-sM2HA2 및 sM2HA2의 표면 발현용 벡터

다양한 유형의 인플루엔자 바이러스 서브타입의 M2 아미노산 서열을 비교 분석한 후(표 1), 트랜스멤브레인 도메인을 제거한 세포외 및 세포질 도메인 부분만 포함하는 sM2 콘센서스(consensus) 서열(표 1: 서열번호 1)을 합성하였다. HA2 유전자는 A/EM/Korea/W149/06(H5N1) 바이러스의 15-137 잔기로부터 얻었으며, CT 전체 게놈 DNA는 국제백신 연구소(Dr. 송만기)에 제공받았다.

[서열번호 1]

MSLLTEVETPTRNGWECKCSDSSDPDRLFFKCIYRRLKYGLKRGPSTEGV

sM2, HA2 및 CTA1 유전자는 표 2의 프라이머(서열번호 2~7)로 PCR을 수행하여, 제한효소 부위를 삽입하였다.

sM2HA2 및 sM2HA2CTA1 유전자의 프라이머

Gene	Primers
	Forward	Reverse
sM2	5'-GGGGTACCTCATTATTAACA-3' (서열번호 2)	5'-ACG TCG ACT CAT TAT TCA AGT TCA ATA ATG AC-3' (서열번호 3)
HA 2	5'-GAG GAT CCC AGG GAA TGG TAG ATG GTT GG-3' (서열번호 4)	5'-GTG CTC GAG TTA TTA ACA ACC GTT ACC AAG CTC CTT TGC-3' (서열번호 5)
CTA1	5'-CGGGATCCAATGATGATAAGTTATAT-3' (서열번호 6)	5'-GGGTACCCGATGATCTTGGAGCATT-3' (서열번호 7)

sM2 유전자는 5 말단에 kpnI과 3' 말단에 SacI 부위를 삽입하였고, CTA1(콜레라 독소 A1 서브유닛) 유전자는 5 말단에 BamHI과 3' 말단에 kpnI 부위를 삽입하여 변형시켰다. 변형된 유전자는 T Easy Vector(Invitrogen, Korea)에 라이게이션 후, 5과 3에 삽입된 제한효소로 절단하여, pKV-pgsA 벡터에 다시 라이게이션 하였다. 제작된 pKV-pgsA-sM2, pKV-pgsA-CTA1-sM2 및 pKV-pgsA-CTA1-sM2HA2는 E.coli JM83에 형진전환시키고, 그 플라스미드를 락토바실러스 카제이(L.casei) L525에 형질전환시켜 pgsA-sM2/L.casei, pgsA-CTA1-sM2/L.casei 및 pgsA-CTA1-sM2HA2/L.casei 를 제작하였다(도 1A).

실시예 2: 재조합 미생물에서의 단백질 발현 확인

pgsA, pgsA-sM2, pgsA-sM2HA2, pgsA-CTA1-sM2 및 pgsA-CTA1-sM2HA2를 함유하는 재조합 락토바실러스 카제이(L.casei)을 30에서 48시간 동안 배양하여, 소니케이션으로 단백질을 추출하고 웨스턴 블롯을 실시하였다.

CTA1, sM2 및 HA2 단백질의 발현을 세포막 및 세포질에서 CTA1(1:1000), sM2(1:1000) 및 HA2(1:1000) 항체로 웨스턴 블롯을 통해 분석한 결과, 66kDa의 pgsA-sM2HA2 및 88kDa의 pgsA-CTA1-sM2HA2 융합단백질이 세포막에서 관찰되었으며, 세포질에서는 발현이 관찰되지 않았다(도 1B). 약 44kDa의 밴드가 항-pgsA에서 나타났으나, 다른 3가지 항체에서는 나타나지 않았으며, 이는 재조합 단백질의 degradation에 의한 것으로 추정된다. 또한, sM2와 CTA1 단백질의 발현을 세포막 및 세포질에서 M2(1:1000) 및 CTA1(1:1000) 항체로 웨스턴 블롯을 통해 분석한 결과, 42kDa의 pgsA, 52kDa의 pgsA-M2 및 74kDa의 pgsA-CTA1-M2가 관찰되었으며, 세포질에서는 발현이 관찰되지 않았다(도 1C).

락토바실러스 카제이(L.casei) 세포와 비교하여, pgsA-sM2HA2/L.casei, pgsA-CTA1-sM2HA2/L.casei 세포에서 sM2, HA2 및 CTA1의 발현을 분석하였으며, pgsA-sM2/L.casei, pgsA-CTA1-sM2/L.casei 세포에서 sM2 및 CTA1의 발현을 분석하였다.

FACS(Becton Dickinson, USA) 및 형광현미경(Carl Zeiss Axioskop 2 fluorescence microscope)을 사용한 형광염색법으로 비교하여 분석한 결과, 락토바실러스 카제이(L.casei) 세포 자체는 pgsA를 이용한 CTA1-sM2HA2 및 CTA1-sM2 융합단백질의 표면발현에 영향을 주지 않는 것을 확인하였다(도 2, 도 3).

실시예 3: 재조합 미생물 접종 후 면역반응 유도 분석

CTA1-sM2HA2 및 CTA1-sM2 융합 단백질을 표면 발현하는 재조합 락토바실러스 카제이(L.casei) 생균을 BALB/c 마우스의 비강(10⁹cell/20l 용량) 및 경구(10¹⁰cell/20l 용량)에 도 4에 표시된 스케줄로 접종하였다. 이후, 0, 14, 28일째의 혈청 샘플과 28일째 폐 및 장내 샘플을 ELISA(Molecular devices)를 사용하여 OD 450_nm에서 항체 타이터를 분석하였다.

그 결과, CTA1이 융합된 sM2 또는 sM2HA2에 의해 비강 및 경구 접종 모두 혈청 내 IgG 수준이 현저하게 증가하였으며, CTA1-sM2에 비해 CTA1-sM2HA2의 혈청 내 IgG 수준이 높았다(도 5, 도 6). 또한, 비강접종 그룹에서 좀 더 우수한 효과를 나타냈다.

점막 면역반응 확인을 위하여, 접종 28일째 폐와 장내 IgA 수준을 측정하였다. 그 결과, CTA1이 융합된 sM2 또는 sM2HA2에 의해 비강 및 경구 접종 모두 혈청 내 IgA 수준이 현저하게 증가하였으며, CTA1-sM2에 비해 CTA1-sM2HA2의 혈청 내 IgA 수준이 높았다(도 7, 도 8). 또한, 직접적인 접종 부위, 즉 비강접종에서는 폐에서 좀 더 우수한 효과를 나타냈으며, 경구접종에서는 장내에서 좀 더 우수한 효과를 나타냈다.

실시예 4: 비장세포에서의 사이토카인 생산 분석

본 실시예에서는 CTA1이 융합된 sM2HA2 및 CTA1이 융합된 sM2이 표면 발현된 재조합 락토바실러스 카제이(L.casei)에 의해 유도되는 세포성 면역반응을 ELISPOT(Enzyme Linked ImmunoSpot)을 통해 분석하였다(Oran et al., J Immunol 171:1999-2005, 2003; Moon et al., Vet Microbiol 160:277-289, 2012).

IFN-γ 및 IL-4 특이항체(5g/ml)를 ELISPOT 96-웰 플레이트에 4에서 하룻밤 동안 코팅하고, 마지막 접종후 7일이 지난 마우스에서 분리한 비장세포(5x10⁴ cell/well)와 sM2(10g/ml) 단백질 또는 M2 펩티드(SLLTEVETPTRNGWECKCSD, 1g/ml) 및 HA2(10g/ml) 단백질 또는 HA2 펩티드(1g/ml)를 각 웰에 분주하여 37에서 24시간 동안 반응시켰다. 양성대조군은 5g/ml의 피토헤마글루티닌(Invitrogen, USA)을 사용하였다. 반응 후, IFN-γ 및 IL-4에 대한 2차 항체 및 발색반응을 통해 나타난 스팟의 수를 ImmunoScan Entry 분석기(Cellular Technology, USA)로 판독하였다.

CTL(cytokine T lymphocyte) 반응 분석 결과, 비강 접종 마우스의 비장세포는 sM2 단백질, M2 펩티드, HA2 단백질, HA2 펩티드 모두에 의해 IFN-γ의 분비가 증가하였으며(도 9), IL-4의 분비 또한 증가하였다(도 10). 경구 접종 그룹도 IFN-γ 및 IL-4의 분비가 증가하였으며, 비강 접종 그룹에 비해서는 그 증가율이 조금 낮게 나타났다(도 11, 도 12).

실시예 5: 다양한 인플루엔자 서브타입에 대한 예방 효과

본 실시예에서는, 본 발명에서 사용한 HA2 및 sM2 서열의 다양한 인플루엔자 서브타입에 대한 효과를 확인하였다. 본 발명에서 사용한 HA2는 A/EM/Korea/W149/06(H5N1) 인플루엔자 바이러스의 아미노산 잔기 15-137 서열이며, 합성한 sM2 서열은 표 1의 인플루엔자 바이러스들의 서열에서 0-8개의 아미노산이 변형되었다.

5-1: H5N2

최종 면역접종 1주일 후, 마우스를 10MLD₅₀ H5N2 인플루엔자 바이러스로 비강 감염시켰다. 그 결과, pgsA-sM2HA2/L.casei 및 pgsA-CTA1-sM2HA2/L.casei로 경구 면역접종 그룹에서는 40%~80%, 비강 면역접종 그룹에서는 60~100%의 생존율을 나타냈으며(도 13C, D), pgsA-sM2/L.casei 및 pgsA-CTA1-sM2/L.casei로 경구 면역접종 그룹에서는 40~60%, 비강 면역접종 그룹에서는 40~80%의 생존율을 나타냈다(도 14A, B). 사망률 역시 비강 접종 그룹이 낮았으며, 비강 접종 그룹에서는 감염 9일 후(dpi) 초기 체중에 비해 체중이 20% 이하 감소하였으나, 13일 후 완전히 회복되는 것을 확인하였다(도 13C, D, 14A, B).

5-2: H1N1

다음으로, sM2와 8개의 아미노산이 일치하지 않는 H1N1 인플루엔자 바이러스로 마우스를 감염(10MLD₅₀)시켰다. 그 결과, pgsA-sM2HA2/L.casei 및 pgsA-CTA1-sM2HA2/L.casei로 면역접종 그룹과 pgsA-sM2/L.casei 및 pgsA-CTA1-sM2/L.casei로 면역접종 그룹 모두 비강 접종 그룹이 경구 접종 그룹에 비해 현저히 높은 예방효과를 나타냈다(도 13A, B, 도 14C, D). 또한, 비접종 그룹은 9dpi에 40% 이하의 체중 감소를 나타내고 사망하는데 비해, pgsA-CTA1-sM2/L.casei 접종 그룹은 9dpi에 10% 정도의 체중 감소를 나타냈고, pgsA-sM2/L.casei 접종 그룹은 9dpi에 20% 이상 체중 감소를 보인 후, 좀 더 서서히 체중이 회복되는 것을 확인하였다(도 14C, D).

5-3: H9N2

H9N2는 sM2와 2개의 아미노산이 불일치하는 인플루엔자 바이러스로, pgsA-CTA1-sM2HA2/L.casei 및 pgsA-CTA1-sM2/L.casei 접종 그룹은 체중 감소가 거의 나타나지 않았으며, 비강접종 그룹에서는 80~100%, 경구접종 그룹에서는 60~80%의 높은 생존율을 나타냈다(도 13G, H, 도 14 E, F).

5-4: H5N1

고병원성 조류독감 인플루엔자(HPAI) 바이러스인 H5N1 및 H7N3로 마우스를 감염시켰다. H5N1은 sM2와 2개의 아미노산, H7N3은 sM2와 1개의 아미노산이 일치하지 않는다. pgsA-CTA1-sM2HA2/L.casei 및 pgsA-CTA1-sM2/L.casei를 비강 또는 경구 접종한 마우스는 H5N1 감염에 대해 각각 80~100% 및 60~80%의 높은 생존율을 나타냈으며, pgsA-sM2HA2/L.casei 및 pgsA-sM2/L.casei를 접종한 마우스는 각각 40~60% 및 20~60%의 생존율은 나타냈다(도 13E, F, 도 14G, H).

5-5: H7N3 및 H3N2

H5N1 감염에 대해서는 pgsA-CTA1-sM2/L.casei를 비강 및 경구 접종한 마우스 모두 체중 감소가 30%까지 나타났으며, pgsA-CTA1-sM2/L.casei를 비강 접종한 그룹에서 가장 예방효과가 높게 나타났다(도 14I, J). 또한, H3N2 감염에 대해서는 비접종 그룹에서는 체중 감소가 25%까지 나타났으나, pgsA-CTA1-sM2HA2/L.casei 비강접종 그룹에서 예방효과가 현저히 높게 나타났다. 이로써, pgsA-CTA1-sM2HA2/L.casei의 비강접종이 다양한 인플루엔자 바이러스 서브타입에 대해 가장 방어효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6: 폐내 바이러스 타이터 분석

본 실시예에서는 면역유도된 마우스를 인플루엔자 바이러스로 감염시킨 후, 3~5dpi에 폐내 바이러스 타이터를 TCID₅₀(50% 조직배양감염가)로 측정하였다(Quan et al., J Virol 81:3514-3524, 2007). 폐 조직을 페니실린, 스트렙토마이신 및 안티마이코틱스(Gibco, USA)가 포함된 PBS에서 균질화하여 수득한 샘플을 MDCK 세포와 37에서 1시간 동안 배양하였다. 그 후, 배양액을 제거하고 TPCK(L-1-토실아미드-2-페닐에틸클로로메틸케톤) 트립신(Thermo Fisher Scientific, USA)을 감염된 세포에 첨가하여 72시간 동안 반응시켰다. 바이러스에 의한 세포변성 효과는 매일 관찰하였으며, 바이러스 타이터는 HA 테스트로 측정한 후, Reed-Muench 방법(Zhao et al., Virol J 7:2-8, 2010)으로 TCID₅₀(50% 조직배양감염가)를 계산하였다.

그 결과, pgsA-CTA1-sM2HA2/L.casei 및 pgsA-CTA1-sM2/L.casei로 면역유도된 그룹의 바이러스 타이터가 3dpi에서 낮게 나타났으며, 5dpi에서는 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 15, 도 16). 비강 및 경구접종 그룹간의 효과는 특히 3dpi에서 확연히 차이가 나는 것을 알 수 있었다(도 15, 도 16). 이상으로, sM2 및 HA2는 단독보다는 CTA1과 융합되어 다양한 인플루엔자 서브타입에 대해 훨씬 강한 면역반응을 유도할 수 있으며, 경구접종에 비해 비강접종이 강한 면역반응을 유도할 수 있다는 것을 확인하였다.

실시예 7: 폐 조직의 면역조직화학염색법을 통한 조직병리학적 분석

조직병리학적 분석을 위해, 5dpi의 폐 조직을 10% 포르말린 버퍼로 고정하고 에오신으로 염색한 후, 광학현미경으로 분석하였다(Sui et al., Arch Virol 155:535-544,2010; Shm et al., Plos ONE 6:e27953, 2011). 또한, M2 항체(1:500) 및 IgG HRP(1:2000, Sigma, USA)를 이용한 면역퍼옥시다제 방법으로 분석하였다(Bodewes et al., Plos ONE 4:e5538, 2009).

그 결과, pgsA/L.casei 그룹은 심각한 폐 염증이 관찰되었으나, pgsA-CTA1-sM2/L.casei로 면역유도된 그룹 폐 염증이 거의 관찰되지 않았다(도 7). 면역퍼옥시다제 방법에 의해 확인되는 바이러스 항원은 브라운 컬러로 염색된다. pgsA-CTA1-sM2/L.casei로 비강 및 경구 접종된 그룹은 현저하게 양성항원의 수가 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 17). 이는 pgsA-CTA1-sM2/L.casei에 의해 유도되는 면역반응은 바이러스의 복제를 억제하여, 인플루엔자 바이러스 치사량에 감염된 후에도 생존율을 높일 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 8: 다양한 인플루엔자 서브타입 바이러스에 대한 면역 지속성 분석

sM2와 CTA1의 융합단백질에 의해 유도되는 면역반응의 지속력을 확인하기 위하여, 접종 180일 후에 H5N2 바이러스로 감염시켰다. 이후, 마우스 혈청의 IgG 및 폐와 장내 IgA를 실시예 3의 ELISA 방법으로 분석하였으며, 13dpi까지 체중감소 및 생존률을 모니터하였다.

그 결과, 면역유도 되지 않은 비접종 그룹은 30% 이상 체중감소가 나타나고 9dpi에 사망하였으나(도 19B, D), pgsA-CTA1-sM2/L.casei에 의해 면역유도된 그룹은 체중감소가 거의 나타나지 않고 생존율도 비강접종 그룹 80%(도 19B), 경구접종 그룹 60%(도 19D)로 높게 나타났다. 따라서, sM2와 CTA1의 융합단백질 점막백신은, 최종 접종 6개월 후의 바이러스 감염에 대해서도 면역방어 효과를 나타낼 수 있다는 것을 확인하였다.

실시예 9: 재조합미생물 접종 후 닭에서의 면역반응 유도 분석

CTA1-sM2HA2 융합 단백질을 표면 발현하는 재조합 락토바실러스 카제이(L.casei) 생균을 SPF 닭의 비강(10¹⁰cell/50l 용량) 및 경구(10¹¹cell/100l 용량)에 도 20에 표시된 스케줄로 접종하였다. 이후, 0, 16, 30, 51 일째의 혈청 샘플을 ELISA(Molecular devices)를 사용하여 OD 450_nm에서 항체 타이터를 분석하였다.

그 결과, CTA1-sM2HA2이 융합된 재조합 락토바실러스 카제이(L.casei)에 의해 비강(도 21A) 및 경구(도 21B) 접종 후 모두 혈청내 IgG 수준이 1차, 2차, 3차 boosting 이후에 증가한 것을 확인하였다.

실시예 10: 재조합미생물 접종 후 닭에서의 면역반응 유도 분석

최종 면역접종 2주일 후, SPF 닭을 100MLD₅₀ H5N8 인플루엔자 바이러스를 비강으로 감염시켰다. 바이러스 감염 후 13일까지 관찰한 결과 후, pgsA-CTA1-sM2HA2/L.casei 로 비강 면역 접종 그룹에서는 40% 의 생존율을 보였으며(도 22A), 경구 면역 접종 그룹에서는 30%의 생존율을 나타냈다(도 22B).

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

<110> Bioleaders Corporation <120> Cell Surface Expression Vector for Influenza Virus Antigen and Microorganisms Transformed Thereby <130> P14-B134 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 50 <212> PRT <213> Influenza A Virus <400> 1 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Gly Trp Glu 1 5 10 15 Cys Lys Cys Ser Asp Ser Ser Asp Pro Asp Arg Leu Phe Phe Lys Cys 20 25 30 Ile Tyr Arg Arg Leu Lys Tyr Gly Leu Lys Arg Gly Pro Ser Thr Glu 35 40 45 Gly Val 50 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sM2-f <400> 2 ggggtacctc attattaaca 20 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sM2-r <400> 3 acgtcgactc attattcaag ttcaataatg ac 32 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HA-f <400> 4 gaggatccca gggaatggta gatggttgg 29 <210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HA-r <400> 5 gtgctcgagt tattaacaac cgttaccaag ctcctttgc 39 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTA1-f <400> 6 cgggatccaa tgatgataag ttatat 26 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTA1-r <400> 7 gggtacccga tgatcttgga gcatt 25

Claims (20)

1. 콜레라 독소 서브유닛 A1(CTA1), 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 2(M2) 및 헤마글루티닌(HA2) 항원 단백질이 결합되어 있는 융합 단백질.
   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(HA2) 항원 단백질은 A/EM/Korea/W149/06(H5N1)의 아미노산 잔기 15-137 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
   
4. 제1항 또는 제3항의 융합 단백질을 코딩하는 핵산.
   
5. 폴리감마글루탐산 합성효소 복합체를 코딩하는 유전자 pgsB, pgsC 및 pgsA 중 어느 하나 이상과 제4항의 핵산을 함유하는 세포표면 발현벡터.
   
6. 제5항의 발현벡터로 형질전환된 재조합 미생물.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 미생물은 유산균인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
   
8. 제6항에 있어서, 융합 단백질이 미생물 세포 표면에서 발현하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
   
9. 다음 단계를 포함하는 콜레라 독소 서브유닛 A1(CTA1), 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 2(M2) 및 헤마글루티닌(HA2) 항원 단백질이 결합되어 있는 융합 단백질이 표면발현된 미생물을 제조하는 방법:
   (a) 제6항의 형질전환된 미생물을 배양하여 콜레라 독소 서브유닛 A1(CTA1), 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 2(M2) 및 헤마글루티닌(HA2) 항원 단백질이 결합되어 있는 융합 단백질을 미생물 표면에 발현하는 단계; 및
   (b) 상기 융합 단백질이 표면 발현된 미생물을 회수하는 단계.
   
10. 제6항의 재조합 미생물을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방용 백신.
    
11. 제10항에 있어서, 상기 바이러스는 A형 인플루엔자 바이러스인 것을 특징으로 하는 백신.
    
12. 제10항에 있어서, 상기 백신은 경구용 또는 식용으로 섭취가 가능한 것을 특징으로 하는 백신.
    
13. 제10항에 있어서, 상기 백신은 비강 투여용인 것을 특징으로 하는 백신.
    
14. 제10항에 있어서, 상기 백신은 인체 및 동물 예방용인 것을 특징으로 하는 백신.
    
15. 제14항에 있어서, 상기 동물은 닭, 칠면조, 거위, 오리, 꿩, 메추라기, 비둘기, 타조 등과 같은 야생조류, 가금류, 돼지, 개 및 고양이로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 백신.
    
16. 제1항의 융합단백질을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방용 백신.
    
17. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인플루엔자 바이러스 매트릭스 2(sM2) 항원 단백질.
    
18. 제17항의 항원 단백질을 코딩하는 유전자.
    
19. 제17항의 항원 단백질과 A/EM/Korea/W149/06(H5N1) 인플루엔자 바이러스의 아미노산 잔기 15-137 서열을 갖는 헤마글루티닌(HA2) 항원 단백질이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 항원 단백질.
    
20. 제19항의 항원 단백질을 코딩하는 핵산.
    

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