WO2022034934A1 - 인플루엔자 바이러스 백신 조성물 - Google Patents

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WO2022034934A1
WO2022034934A1 PCT/KR2020/010562 KR2020010562W WO2022034934A1 WO 2022034934 A1 WO2022034934 A1 WO 2022034934A1 KR 2020010562 W KR2020010562 W KR 2020010562W WO 2022034934 A1 WO2022034934 A1 WO 2022034934A1
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WO
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seq
influenza virus
fusion protein
ha2sh
protein trimer
Prior art date
Application number
PCT/KR2020/010562
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English (en)
French (fr)
Inventor
정대균
윤선우
김혜권
송대섭
Original Assignee
한국생명공학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses

Definitions

  • the present invention relates to an influenza virus vaccine composition, and more particularly, a vaccine for preventing influenza virus infection using a fusion protein comprising the short helical domain of hemagglutinin (HA2SH) and the ectodomain of M2 protein (M2e) of influenza virus to the composition.
  • a vaccine for preventing influenza virus infection using a fusion protein comprising the short helical domain of hemagglutinin (HA2SH) and the ectodomain of M2 protein (M2e) of influenza virus to the composition.
  • influenza virus that causes respiratory diseases accompanied by chills, fever, and muscle pain
  • proteins that determine the immunogenicity of the virus such as hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA).
  • HA hemagglutinin
  • NA neuraminidase
  • mini-HA using a hemagglutinin protein having a highly conserved epitope demonstrated its versatility by showing viral efficacy in an experiment performed with an H1 subtype protein as an antigen (Impagliazzo A et al., Science 349.6254 (2015): 1301-1306).
  • Non-Patent Document 1 Impagliazzo, Antonietta, et al. "A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen.” Science 349.6254 (2015): 1301-1306.
  • the present inventors studied HA2SH and M2e, which show high conservation among various influenza viruses, for the development of a universal influenza virus vaccine. As a result, it was found that a fusion protein trimer containing HA2SH and M2e induces a strong immune response against various influenza virus subtypes. confirmed, and the present invention was completed.
  • a fusion protein trimer comprising HA2SH and M2e that can be utilized as a universal vaccine by showing an effect on various influenza virus subtypes.
  • a vaccine composition for preventing influenza virus infection and a pharmaceutical composition for treating influenza virus infection disease, comprising the fusion protein trimer as an active ingredient.
  • the present invention provides a fusion protein trimer comprising the short helical domain of hemagglutinin (HA2SH) of influenza virus and the ecto domain of M2 protein (M2e).
  • HA2SH hemagglutinin
  • M2e M2 protein
  • the present invention provides an expression vector comprising a nucleotide encoding the fusion protein trimer.
  • the present invention provides a vaccine composition for preventing influenza virus infection comprising the fusion protein trimer as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the treatment of influenza virus infection disease comprising the fusion protein trimer as an active ingredient.
  • the fusion protein trimer according to the present invention can be mass-expressed and purified in E. coli, and can effectively produce neutralizing antibodies against influenza viruses having several subtypes.
  • the fusion protein trimer can effectively induce immunity by exhibiting an excellent antibody-inducing effect. Therefore, the fusion protein trimer can be used as a general-purpose vaccine capable of preventing not only influenza subtypes, but also new mutant influenza, and pharmaceutical compositions having excellent therapeutic effects on influenza virus-infected diseases.
  • Figure 2 shows the results of analyzing the HA2 sequence of the influenza virus.
  • FIG. 4 shows a schematic diagram of a fusion protein trimer (3XHA2SH-M2e) comprising HA2SH and M2e.
  • FIG. 5 shows the E. coli expression vector pET28a-3XHA2HS-M2e.
  • 7A is a graph showing 3XH1SH-M2e purified by nickel-affinity chromatography.
  • 7B is a graph showing 3XH3SH-M2e purified by nickel-affinity chromatography.
  • 7c is a graph showing 3XH5SH-M2e purified by nickel-affinity chromatography.
  • 7D is a graph showing H135SH-M2e purified by nickel-affinity chromatography.
  • 10a to 10h show changes in body weight and survival rates after infection with influenza A virus (H1N1, H3N2, H5N1 and H5N8) of mice injected with 3XH1SH-M2e, 3XH3SH-M2e, 3XH5SH-M2e and H135SH-M2e.
  • influenza A virus H1N1, H3N2, H5N1 and H5N8
  • 12a to 12f show changes in body weight and survival rates after infection with influenza A virus (H1N1, H3N2 and H7N9) in mice injected with 3XH1SH-M2e (25% cut-off).
  • One aspect of the present invention provides a fusion protein trimer comprising the short helical domain of hemagglutinin (HA2SH) or a fragment thereof of influenza virus and the ectodomain (M2e) of M2 protein or a fragment thereof.
  • HA2SH hemagglutinin
  • M2e ectodomain
  • short helical domain of hemagglutinin refers to a short helical region among the stem domains (HA2) of hemagglutinin (HA), a surface protein of influenza virus, specifically As such, it refers to a region having an amino acid sequence that is conserved in common among various subtypes of influenza virus.
  • the HA2SH included in the fusion protein is preferably a sequence of 373-404 based on the amino acid sequence of hemagglutinin (HA), which is a surface protein of influenza virus.
  • HA2SH hemagglutinin
  • the term “ectodomain of M2 protein (M2e)” refers to the ectodomain of M2 protein, which is a membrane protein of influenza virus, specifically, a region having a conserved amino acid sequence between influenza virus subtypes in M2 protein.
  • M2e included in the fusion protein is preferably an M2e fragment, and approximately 15 amino acid residues may be used.
  • the ectodomain (M2e) of the M2 protein may preferably be a sequence of 5-19 based on the amino acid sequence of the M2 protein of the influenza virus.
  • residues 17 and 19 in the sequence of 5-19 or all of them may be substituted with, for example, serine.
  • HA2SH and M2e of the influenza virus specifically refer to proteins derived from influenza virus type A, and specifically, the type of influenza virus type A may be H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H5N1 or H5N8. and, specifically, may be H1N1, H3N2 or H5N1.
  • a 1 is represented by HA2SH 1 -(l 1 ) k -M2e 1
  • a 2 is represented by HA2SH 2 -(l 2 ) i -M2e 2
  • a 3 is HA2SH 3 -(l 3 ) j -M2e 3
  • the HA2SH 1 , HA2SH 2 and HA2SH 3 are each independently a short helical domain of hemagglutinin of any one influenza virus selected from the group consisting of H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H5N1 and H5N8, or a fragment thereof,
  • the M2e 1 , M2e 2 and M2e 3 are each independently selected from the group consisting of H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H5N1 and H5N8, an ectodomain of the M2 protein of the influenza virus or a fragment thereof,
  • the L 1 , L 2 , 1 1 , 1 2 and 1 3 are each independently a peptide linker consisting of 1 to 8 amino acids linked by a peptide bond.
  • n, m, k, i, and j are each independently an integer of 0 or 1.
  • the HA2SH 1 , HA2SH 2 And HA2SH 3 may be each independently represented by any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9.
  • SEQ ID NO: 7 may be coated with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10
  • SEQ ID NO: 8 may be coated with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11
  • SEQ ID NO: 9 may be encoded with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12.
  • the HA2SH 1 , HA2SH 2 and HA2SH 3 are equal to each other, or HA2SH 1 , HA2SH 2 and HA2SH 3 Any one or more of them are different from each other, or the HA2SH 1 , HA2SH 2 and HA2SH 3 may all be different from each other.
  • the HA2SH 1 , HA2SH 2 and HA2SH 3 may be all represented by SEQ ID NO: 7, all represented by SEQ ID NO: 8, or all represented by SEQ ID NO: 9.
  • the HA2SH 1 is represented by SEQ ID NO: 7
  • the HA2SH 2 may be represented by SEQ ID NO: 8
  • HA2SH 3 may be represented by SEQ ID NO: 8.
  • HA2SH 1 is represented by SEQ ID NO: 7
  • HA2SH 2 may be represented by SEQ ID NO: 8
  • HA2SH 3 may be represented by SEQ ID NO: 9.
  • SEQ ID NO: 7 is H1N1 influenza virus HA2SH or a fragment thereof
  • SEQ ID NO: 8 is H3N2 influenza virus HA2SH or fragment thereof
  • SEQ ID NO: 9 is H5N1 influenza virus HA2SH or a fragment thereof.
  • the M2e 1 , M2e 2 and M2e 3 may be each independently represented by any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, and SEQ ID NO: 15.
  • SEQ ID NO: 13 may be coated with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16
  • SEQ ID NO: 14 may be coated with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17,
  • SEQ ID NO: 15 may be encoded with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18.
  • the M2e 1 , M2e 2 and M2e 3 are equal to each other, or M2e 1 , M2e 2 and M2e 3 Any one or more of them are different from each other, or the M2e 1 , M2e 2 and M2e 3 may all be different from each other.
  • the M2e 1 , M2e 2 and M2e 3 may be all represented by SEQ ID NO: 13, all represented by SEQ ID NO: 14, or all represented by SEQ ID NO: 15.
  • the M2e 1 is represented by SEQ ID NO: 13
  • M2e 2 may be represented by SEQ ID NO: 14
  • M2e 3 may be represented by SEQ ID NO: 14.
  • M2e 1 is represented by SEQ ID NO: 13
  • M2e 2 may be represented by SEQ ID NO: 14
  • M2e 3 may be represented by SEQ ID NO: 15.
  • SEQ ID NO: 13 is H1N1 influenza virus M2e or a fragment thereof
  • SEQ ID NO: 14 is H3N2 influenza virus M2e or fragment thereof
  • SEQ ID NO: 15 is H5N1 influenza virus M2e or a fragment thereof.
  • fusion protein includes HA2SH and M2e, and specifically refers to a fusion protein monomer represented by A 1 , A 2 and A 3 .
  • a 1 is represented by HA2SH 1 -(l 1 ) k -M2e 1
  • a 2 is represented by HA2SH 2 -(l 2 ) i -M2e 2
  • a 3 is HA2SH 3 -(l 3 ) can be represented as j -M2e 3 .
  • the A 1 is represented by HA2SH 1 -M2e 1
  • the A 2 is represented by HA2SH 2 -M2e 2
  • the A 3 may be represented as HA2SH 3 -M2e 3
  • a 1 is represented by HA2SH 1 -(l 1 ) 1 -M2e 1
  • a 2 is HA2SH 2 -(l 2 ) 1 -M2e 2
  • a 3 may be represented by HA2SH 3 -(l 3 ) 1 -M2e 3 .
  • k, i, and j may be the same, or at least one of k, i, and j may be different from each other.
  • a 1 , A 2 , and A 3 may be represented as meaning a fusion protein monomer including HA2SH and M2e, as in the structure of HA2SH-M2e.
  • HA2SH 1 of A 1 and M2e 1 may be HA2SH and a fragment thereof of an influenza virus identical to each other, or M2e and a fragment thereof. Specifically, HA2SH 1 and M2e 1 may all be HA2SH and fragments thereof of influenza virus of H1N1, or M2e and fragments thereof. On the other hand, HA2SH 1 of the A 1 and M2e 1 may be HA2SH and fragments thereof of different influenza viruses, or M2e and fragments thereof. Specifically, the HA2SH 1 may be H1N1 influenza virus HA2SH and fragments thereof, and M2e 1 may be H3N2 influenza virus M2e and fragments thereof.
  • the HA2SH 2 of A 2 and M2e 2 may be HA2SH and a fragment thereof of an influenza virus identical to each other, or M2e and a fragment thereof.
  • HA2SH 2 and M2e 2 may all be HA2SH and fragments thereof of influenza virus of H3N2, or M2e and fragments thereof.
  • HA2SH 2 of the A 2 and M2e 2 may be HA2SH and fragments thereof of different influenza viruses, or M2e and fragments thereof.
  • the HA2SH 2 may be H3N2 influenza virus HA2SH and fragments thereof
  • M2e 2 may be H5N1 influenza virus M2e and fragments thereof.
  • HA2SH 3 of A 3 and M2e 3 may be HA2SH and a fragment thereof of an influenza virus identical to each other, or M2e and a fragment thereof. Specifically, HA2SH 3 and M2e 3 may all be HA2SH and fragments thereof of influenza virus of H5N1, or M2e and fragments thereof.
  • HA2SH 3 of the A 3 and M2e 3 may be HA2SH and fragments thereof of different influenza viruses, or M2e and fragments thereof.
  • the HA2SH 3 may be HA2SH and a fragment thereof of the H5N1 influenza virus
  • the M2e 2 may be M2e of the H1N1 influenza virus and a fragment thereof.
  • a 1 , A 2 and A 3 may be the same as each other, at least one of A 1 , A 2 and A 3 may be different from each other, or A 1 , A 2 , and A 3 may all be different from each other.
  • the A 1 , Both A 2 and A 3 may be represented by SEQ ID NO: 19, both may be represented by SEQ ID NO: 20, or both may be represented by SEQ ID NO: 21.
  • the A 1 is represented by SEQ ID NO: 19, and A 2 may be represented by SEQ ID NO: 20, and A 3 may be represented by SEQ ID NO: 20.
  • the A 1 is represented by SEQ ID NO: 19, and A 2 may be represented by SEQ ID NO: 20, and A 3 may be represented by SEQ ID NO: 21.
  • SEQ ID NO: 19 may include H1N1 influenza virus HA2SH and fragments thereof, or M2e and fragments thereof
  • SEQ ID NO: 20 may include H3N2 influenza virus HA2SH and fragments thereof, or M2e and fragments thereof
  • SEQ ID NO: 21 may include H5N1 influenza virus HA2SH and fragments thereof, or M2e and fragments thereof.
  • SEQ ID NO: 19 may be coated with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22
  • SEQ ID NO: 20 may be coated with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23
  • SEQ ID NO: 21 may be encoded with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 24.
  • the fusion proteins A 1 , A 2 and A 3 each independently include a monomer represented by one or more amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21 can do.
  • the fusion protein is identical to the amino acid sequence, or amino acids thereof are substituted by conservative substitution, or 90 to 99% sequence homology, preferably 95 to 99% sequence homology, more preferably 98 to 99% sequence homology. It may include all fusion proteins having % sequence homology.
  • fusion protein trimer refers to a form in which fusion protein monomers including HA2SH and M2e are repeatedly combined three times, specifically, the A 1 -(L 1 ) n -A 2 -(L 2 ) m -A 3 refers to a fusion protein trimer having a structure.
  • a fusion protein trimer formed from HA2SH and M2e having amino acid sequences that are conserved in common among various subtypes of influenza virus can effectively form neutralizing antibodies against various subtypes of influenza virus.
  • the fusion protein trimer can induce an immune response to influenza virus by inducing an antigen-antibody response by acting as an antigen in the individual.
  • the fusion protein trimer may be represented by the structural formula of A 1 -(L 1 ) n -A 2 -(L 2 ) m -A 3 (wherein A 1 , A 2 and A 3 are as defined above), Specifically, when n and m are each an integer of 1, the fusion protein trimer may be represented by A 1 -A 2 -A 3 , and when n and m are each an integer of 1, the fusion protein trimer may be represented as A 1 -(L 1 ) 1 -A 2 -(L 2 ) 1 -A 3 .
  • the fusion protein trimer may be represented by A 1 -A 2 -(L 2 ) 1 -A 3 , wherein n is an integer of 1 and m When this is an integer equal to 0, the fusion protein trimer may also be represented as A 1 -(L 1 ) 1 -A 2 -A 3 .
  • a 1 , A 2 and A 3 may be the same as each other, at least one of A 1 , A 2 and A 3 is different from each other, or A 1 , A 2 and A 3 are all different from each other.
  • the fusion protein trimer may be represented by the structure of 3XHA2SH-M2e, and specifically, it may be represented by 3XH1SH-M2e, 3XH3SH-M2e, 3XH5SH-M2e and H135SH-M2e.
  • the 3XH1SH-M2e (SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33 or SEQ ID NO: 41) is a fusion protein comprising all of A 1 , A 2 and A 3 H1N1 influenza virus HA2SH and fragments thereof, or M2e and fragments thereof refers to a trimer, wherein the 3XH3SH-M2e (SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 34 or SEQ ID NO: 42) is that all of A 1 , A 2 and A 3 are H3N2 influenza virus HA2SH and fragments thereof, or M2e and fragments thereof It means a fusion protein trimer comprising.
  • the 3XH5SH-M2e (SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35 or SEQ ID NO: 43) is a fusion protein comprising all of A 1 , A 2 and A 3 of H5N1 influenza virus HA2SH and fragments thereof, or M2e and fragments thereof means a trimer.
  • the H135SH-M2e (SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 36 or SEQ ID NO: 44) includes HA2SH and fragments thereof of H1N1 influenza virus, or M2e and fragments thereof, and A 2 is H3N2 of influenza virus It includes HA2SH and fragments thereof, or M2e and fragments thereof, and A 3 refers to a fusion protein trimer including HA2SH and fragments thereof of influenza virus of H5N1, or M2e and fragments thereof.
  • the fusion protein trimer is SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 41, It may be represented by one or more amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 and SEQ ID NO: 44.
  • the fusion protein trimer is identical to the amino acid sequence, or an amino acid thereof is substituted by conservative substitution, 90 to 99% sequence homology, preferably 95 to 99% sequence homology, more preferably 98 It may include all of the fusion protein trimers having a sequence homology of from to 99%.
  • the SEQ ID NOs: 25 to 28 indicate a fusion protein trimer that does not contain a linker (wherein n and m each have an integer equal to 0), and SEQ ID NOs: 23 to SEQ ID NO: 36 include a linker (Wherein n and m each have an integer equal to 1) A fusion protein trimer is indicated, and SEQ ID NOs: 41 to 44 indicate a fusion protein trimer including a His-tag.
  • SEQ ID NO: 25 is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29
  • SEQ ID NO: 26 is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 30
  • SEQ ID NO: 27 is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 31
  • SEQ ID NO: 28 is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 32
  • SEQ ID NO: 33 is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 37
  • SEQ ID NO: 34 is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 38
  • SEQ ID NO: 35 is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 39
  • the sequence Number 36 is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 40
  • SEQ ID NO: 41 is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 45
  • SEQ ID NO: 42 is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 46
  • SEQ ID NO: 43 is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 47
  • conservative substitution means that an amino acid of one class is replaced by another amino acid of the same class. Conservative substitutions do not alter the structure or function of the polypeptide.
  • Classes of amino acids for the purpose of conservative substitutions are hydrophobic (eg Met, Ala, Val, Leu), neutral hydrophilic (eg Cys, Ser, Thr), acidic (eg Asp, Glu). , basic (eg Asn, Gin, His, Lys, Arg), conformational disrupters (eg Gly, Pro) and aromatic (eg Trp, Tyr, Phe) can
  • the term “antigen” refers to a component capable of generating an immune function among the components of a virus, preferably a protein expressed by the virus. Specifically, when the fusion protein trimer is administered to a subject, the fusion protein trimer may act as an antigen inducing an immune response.
  • the HA2SH and M2e may be directly coupled or coupled through a linker, and the fusion protein may be coupled directly to each other or coupled through a linker.
  • the linker refers to an amino acid sequence of a certain length that connects HA2SH and M2e, or artificially connects between fusion protein monomers.
  • the linker may be a peptide linker consisting of 1 to 8 amino acids linked by a peptide bond, and the amino acids are glycine, serine, alanine, proline, valine, leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, and threonine.
  • cysteine, asparagine, glutamine, lysine, arginine, histidine may be at least one selected from the group consisting of aspartic acid and glutamic acid. More specifically, the linker may be composed of glycine and serine, lysine and leucine, or leucine and glutamic acid.
  • one aspect of the present invention provides an expression vector comprising a nucleotide encoding a fusion protein trimer.
  • the nucleotide may be any one selected from the group consisting of SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 and SEQ ID NO: 48, and the nucleotide may include a signal peptide or His-tag.
  • one aspect of the present invention provides a vaccine composition for preventing influenza virus infection comprising the fusion protein trimer as an active ingredient.
  • vaccine refers to inducing an antigen-antibody response in an individual for the purpose of preventing or treating a common influenza virus.
  • the vaccine composition can induce the formation of antibodies against various influenza virus subtypes.
  • the antibody thus formed may bind to any one subtype selected from the group consisting of various subtypes of influenza virus, preferably H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H5N1, H5N8, and combinations thereof. More preferably, the antibody formed as described above can bind to influenza virus subtypes of H1N1, H3N2, H5N1 or H5N8.
  • influenza virus subtype refers to a variant of influenza A virus in which hemagglutinin (H) and neuramidase (N) virus surface proteins are combined.
  • the influenza virus subtype may have an influenza virus subtype having a combination of H number and N number (eg, H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H5N1, H5N8, etc.).
  • the vaccine composition may further include one or more selected from the group consisting of a solvent, an adjuvant and an excipient.
  • Physiological saline or distilled water may be used as the solvent, and as the immune enhancing agent, Freund's incomplete or complete adjuvant, aluminum hydroxide gel, and vegetable and mineral oils may be used, and as the excipient can use aluminum phosphate, aluminum hydroxide or aluminum potassium sulfate.
  • it may further include a known substance used in the manufacture of vaccines.
  • the vaccine composition may be prepared as an oral or parenteral formulation, and is preferably prepared as an injection solution, which is a parenteral formulation, intradermally, intramuscularly, intraperitoneally, intravenously, subcutaneously, nasally or epidurally (eidural). ) can be administered by route.
  • Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for the treatment of influenza virus infection disease comprising the fusion protein trimer as an active ingredient.
  • influenza virus infection disease may be any one selected from the group consisting of sinusitis, paroxysmal asthma, otitis media, cystic fibrosis, bronchitis, pneumonia and diarrhea.
  • the pharmaceutical composition may be administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level depends on the type and severity of the subject, age, sex, type of virus infected, and drug. Activity, sensitivity to drug, administration time, administration route and excretion rate, duration of treatment, factors including drugs used concurrently, and other factors well known in the medical field can be determined according to factors.
  • the pharmaceutical composition may be administered as an individual therapeutic agent or may be administered in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. and may be administered single or multiple. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with a minimum amount without side effects, and can be easily determined by those skilled in the art.
  • Another aspect of the present invention may provide a method for inducing immunity against influenza virus comprising administering the fusion protein trimer to an individual.
  • the fusion protein trimer When the fusion protein trimer is administered to an individual, it forms an antibody in the individual and induces an immune response, so it can be usefully used to prevent or treat influenza-infected diseases.
  • Another aspect of the present invention provides a composition comprising the fusion protein trimer for use in inducing immunity against influenza virus.
  • Another aspect of the present invention provides a vaccine composition comprising the fusion protein trimer for use in the prevention of influenza virus infection.
  • fusion protein trimer for the preparation of a vaccine against influenza virus.
  • 'HA' hemagglutinin
  • 'HA' structure-based protein sequencing comparison program
  • the program was used to compare and analyze the sequences of six amino acid sequences of HA proteins having various subtypes, and the short helical domain (HA2SH) of HA2 with a sequence conserved between subtypes among the entire HA sequence was determined.
  • the results of sequence analysis of the entire head domain and stem domain of the structure-based influenza HA and the results of sequence analysis of HA2 are shown in FIGS. 1 and 2 .
  • 1 is a sequence analysis result of the entire head domain and stem domain of HA
  • FIG. 1 is a sequence analysis result of the entire head domain and stem domain of HA
  • the preferred sequence according to the present invention is a 373-404 residue sequence based on the amino acid sequence according to FIG. 1 and a 29-60 residue sequence based on the amino acid sequence according to FIG. 2 .
  • HA2 short helical domain having an amino acid sequence commonly conserved in HA and the M2e domain having an amino acid sequence commonly conserved in M2 protein were identified, which were prepared as antigens as in Example 2 below. did
  • HA protein (567 amino acids) of influenza A virus (A/California/04/2009(H1N1)) used in the experiment, HA protein (588) of influenza A virus (A/canine/Korea/01/2007(H3N2)) Dog amino acids) and HA protein (568 amino acids) genes of influenza A virus (A/chiken/korea/es/2003(H5N1)) were synthesized by Bioneer.
  • Their nucleotide sequences are the same as SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 3, respectively.
  • M2 protein (97 amino acids) of influenza A virus (A/California/04/2009(H1N1)) used in the experiment
  • M2 protein of influenza A virus (A/canine/Korea/01/2007(H3N2)) (97 amino acids)
  • M2 protein (97 amino acids) genes of influenza A virus (A/chiken/korea/es/2003(H5N1)) were synthesized by Bioneer.
  • Their nucleotide sequences are the same as SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, respectively.
  • fragment 1 was HA2 short helical domain, based on the amino acid sequence of hemagglutinin (HA), amino acid residues 373-404 and 15 amino acid residues of the M2e domain (M2 protein) Based on the amino acid sequence of 5-19 (serine substitution is possible for residues 17 and 19)), fragment 2 is an HA2 short helical domain based on the amino acid sequence of hemagglutinin (HA) with amino acid residues 373-404 and 15 amino acid residues of the M2e domain (5-19 (serine substitution possible for residues 17 and 19) based on the amino acid sequence of the M2 protein), and fragment 3 is the HA2 short helical domain and is an amino acid of hemagglutinin (HA) Based on the sequence, NdeI and BamHI, respectively, to have amino acid residues 373-404 and 15 amino acid residues of the M2e domain (5-19 based on the amino acid sequence of the M2 protein (
  • E. coli expression vector pET28a-3XHA2HS-M2e is shown in FIG. 5 .
  • amino acid residues 373-404 are represented by the amino acid sequences of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9, and M2e used
  • amino acid residues of SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 are represented by the amino acid sequences.
  • Each protein was inoculated into E. coli, 0.2 mM IPTG was added at OD600 nm between 0.5 and 0.6, and incubated at 290K for 18 hours.
  • His-tagged 3XHA2SH-M2e was purified by nickel-affinity chromatography, followed by dialysis in a buffer containing 25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.2 M NaCl, and 5% (v/v) glycerol. 3XHA2SH-M2e was obtained.
  • 3XHA2SH-M2e (3XH1SH-M2e, 3XH3SH-M2e, 3XH5SH-M2e and H135SH-M2e) was confirmed on SDS-PAGE, and it was confirmed that it was purified to a purity of 96% or more by nickel-affinity chromatography (Fig. 6 and Fig. 7). In addition, the expression test results of 3XHA2SH-M2e are shown in FIG. 8 .
  • pre-immune serum was collected and used as a negative control.
  • 50 ug of each purified 3XHA2SH-M2e antigen was mixed with emulsion adjuvant (ISA 71 VG) (montinide) and intramuscularly injected (IM), and primary blood was collected 2 weeks later for ELISA Analysis was performed.
  • 50 ug of the protein antigen was mixed with an emulsion adjuvant (ISA 71 VG) (montinide) to perform boosting immunization, and 2 weeks later, the final serum was isolated and a final ELISA analysis was performed.
  • Example 3 it was confirmed that 3XHA2SH-M2e exhibited an excellent antibody-inducing effect, and through this, it was confirmed whether it could be utilized as a universal vaccine capable of inducing protection against various influenza viruses.
  • each purified 3XHA2SH-M2e antigen was mixed with emulsion adjuvant (ISA 71 VG) (montinide) and intramuscularly injected into mice, and after 2 weeks, 50 ug of antigen was administered with emulsion adjuvant (ISA 71 VG) ( montinide) and boosting immunization was performed.
  • ISA 71 VG emulsion adjuvant
  • each of the influenza A viruses H1N1, H3N2, H5N1 and H5N8 was diluted in 1x PBS, and 30 ul of each of the mice was infected through nasal inoculation (IN). Thereafter, the effect of 3XHA2SH-M2e antigen inducing protective immunity was confirmed by measuring the change in body weight and survival rate of mice over 2 weeks ( FIGS. 10 and 11 ).
  • Example 4 it was confirmed that 3XH1SH-M2e exhibited an excellent protective immunity-inducing effect, and through this, it was confirmed whether it could be utilized as a universal vaccine capable of inducing defense against various influenza viruses.
  • each purified 3XH1SH-M2e antigen was mixed with emulsion adjuvant (ISA 71 VG) (montinide) and intramuscularly injected into mice, and after 2 weeks, 50 ug of antigen was mixed with emulsion adjuvant (ISA 71 VG) ( montinide) and boosting immunization was performed.
  • ISA 71 VG emulsion adjuvant
  • each of the influenza A viruses H1N1, H3N2 and H7N9 was diluted in 1x PBS, and 30 ul of each of the mice was infected through nasal inoculation (IN). Thereafter, the effect of the 3XH1SH-M2e antigen on inducing protective immunity was confirmed by measuring the change in body weight and survival rate of mice over 2 weeks.
  • FIGS. 12A to 12F The results are shown in FIGS. 12A to 12F. As can be seen in FIG. 12 , it was confirmed that when the 3XH1SH-M2e antigen according to the present invention was used, it exhibited excellent protective ability against various influenza viruses.
  • emulsion adjuvant emulsion adjuvant
  • IM intramuscular injection
  • Boosting immunization was performed by mixing with (ISA 71 VG) (montinide), and after 2 weeks, the spleen was collected and ELISpot analysis was performed. Individuals that were not immunized were used as negative controls.
  • Anti-mouse IFN- ⁇ antibody was diluted 1:200 with 1 ⁇ PBS for ELISpot assay and coated. Antigen was used at 10 ⁇ g per well, and spleen cells obtained from immunized mice were used at 1 X 10 7 cells/ml, and 100 ⁇ l per well. After activation by culturing the cells for 3 days, the biotinylated anti-mouse IFN- ⁇ antibody was diluted 1:250 with 1 X PBS and reacted for 2 hours. Streptavidin-HRP was treated at 100 ⁇ l per well and reacted for 1 hour, and then 100 ⁇ l of AEC substrate was treated per well and reacted for 10 minutes.
  • the universal vaccine candidate activates IFN- ⁇ production from T-cells to produce cellular It was confirmed that it can induce an immune response. After culturing mouse spleen cells with an immune antigen, using an anti-IFN- ⁇ antibody, the generated IFN- ⁇ could be visualized as black spots and detected. From the above results, it was confirmed that the spleen cells of mice inoculated with 3XHA2SH-M2e produced a significantly high level of IFN- ⁇ against the immune antigen 3XHA2SH-M2e.
  • ELISA was performed using its anti-sera. Specifically, the same antigen, GST-H2SH (29-60 based on HA2) and GST-M2e (5-19 based on M2) antigens were prepared and ELISA was performed with the coating antigen.
  • the fusion protein trimer according to the present invention acts as a universal antigen by confirming that it binds well not only to H1 but also to H3 and H5 antisera antibodies with the H1 subtype HA2SH (29-60) antigen. .

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Abstract

본 발명은 인플루엔자 바이러스 백신 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌의 짧은 헬리컬 도메인(HA2SH) 및 M2 단백질의 엑토도메인(M2e)을 포함하는 융합단백질을 이용한 인플루엔자 바이러스 감염 예방용 백신 조성물에 관한 것이다. 상기 융합단백질은 대장균에서 대량 발현 및 정제가 가능하며, 여러 아형을 갖는 인플루엔자 바이러스들에 대한 중화항체를 효과적으로 생산할 수 있다. 또한, 상기 융합단백질은 우수한 항체 유도 효과를 나타내어 면역 유도를 효과적으로 수행할 수 있으며, 이를 통해 인플루엔자 바이러스 아형 및 신종 변이 인플루엔자 바이러스에 대한 방어 유도가 가능한 범용성 백신으로 활용될 수 있다.

Description

인플루엔자 바이러스 백신 조성물
본 발명은 인플루엔자 바이러스 백신 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌의 짧은 헬리컬 도메인(HA2SH) 및 M2 단백질의 엑토도메인(M2e)을 포함하는 융합단백질을 이용한 인플루엔자 바이러스 감염 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.
오한, 발열, 근육통 등이 동반되는 호흡기 질환을 일으키는 인플루엔자 바이러스는 다양한 아형이 존재하며, 이는 바이러스의 면역원성을 결정하는 단백질인 헤마글루티닌(Hemagglutinin; HA) 및 뉴라미니다아제(Neuraminidase; NA)의 다양성에서 기인한다. 예를 들어, A형 인플루엔자에 대해서는 HA 16종 및 NA 9종이 존재하며, 이들의 변이가 빈번히 발생한다. 따라서, 백신을 개발하기 위해서는 유행 균주를 미리 예측하고 백신을 제작해야 하는 부담감이 있으며, 유행 균주의 예측에도 불구하고 새로운 변이체의 발생으로 인해 백신 효능이 현저히 떨어지게 되는 등 여러 문제점이 있다.
이를 해결하기 위한 방법으로 인플루엔자 바이러스 표면 단백질에 존재하는 아미노산 잔기의 보존성이 높은 부위를 이용하는 인플루엔자 바이러스의 범용성 백신의 개발이 연구되고 있다. 예를 들어, 높은 보존성의 항원결정기를 갖는 헤마글루티닌 단백질을 이용한 “mini-HA"가 H1 아형 단백질을 항원으로 수행한 실험에서 바이러스 효능을 나타냄으로써 범용성을 증명하였다(Impagliazzo A et al., Science 349.6254 (2015): 1301-1306).
그럼에도 불구하고, 다양한 변이체에 대해서 광범위한 범용성 백신으로 활용될 수 있는 새로운 백신의 개발이 여전히 요구되고 있으며, 특히 대량생산이 가능하고 제조가 용이한 융합단백질을 이용한 범용성 인플루엔자 바이러스 백신 조성물의 개발이 절실하다.
[선행기술문헌]
[비특허문헌]
(비특허문헌 1) Impagliazzo, Antonietta, et al. "A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen." Science 349.6254 (2015): 1301-1306.
이에 본 발명자들은 다양한 인플루엔자 바이러스간에 높은 보존성을 나타내는 HA2SH 및 M2e를 범용성 인플루엔자 바이러스 백신 개발을 위해 연구한 결과, HA2SH 및 M2e를 포함하는 융합단백질 삼량체가 다양한 인플루엔자 바이러스 아형에 대해 강력한 면역 반응을 유도한다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
이에 따라, 본 발명의 목적은 다양한 인플루엔자 바이러스 아형에 대해 효과를 나타내어 범용성 백신으로 활용될 수 있는 HA2SH 및 M2e를 포함하는 융합단백질 삼량체를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 융합단백질 삼량체를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 예방용 백신 조성물 및 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌의 짧은 헬리컬 도메인(HA2SH) 및 M2 단백질의 엑토도메인(M2e)을 포함하는 융합단백질 삼량체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 융합단백질 삼량체를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 융합단백질 삼량체를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 예방용 백신 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 융합단백질 삼량체를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 융합단백질 삼량체는 대장균에서 대량 발현 및 정제가 가능하며, 여러 아형을 갖는 인플루엔자 바이러스에 대한 중화항체를 효과적으로 생산할 수 있다. 또한, 상기 융합단백질 삼량체는 우수한 항체 유도 효과를 나타내어 효과적으로 면역 유도를 할 수 있다. 따라서, 상기 융합단백질 삼량체는 인플루엔자 아형뿐 아니라, 신종 변이 인플루엔자에 대해서도 예방이 가능한 범용성 백신 및 인플루엔자 바이러스 감염 질환에 대한 우수한 치료 효과를 갖는 약학 조성물로 활용될 수 있다.
도 1은 인플루엔자 바이러스의 HA 전체 헤드 도메인 및 스템 도메인의 서열을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 인플루엔자 바이러스의 HA2 서열을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 인플루엔자 바이러스의 M2 단백질 서열을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 HA2SH 및 M2e를 포함하는 융합단백질 삼량체(3XHA2SH-M2e)의 모식도를 나타낸 것이다.
도 5는 대장균 발현 벡터 pET28a-3XHA2HS-M2e를 나타낸 것이다.
도 6은 제조한 3XH1SH-M2e, 3XH3SH-M2e, 3XH5SH-M2e 및 H135SH-M2e를 SDS-PAGE 상에서 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7a는 니켈-친화성 크로마토그래피로 정제된 3XH1SH-M2e를 나타낸 그래프이다.
도 7b는 니켈-친화성 크로마토그래피로 정제된 3XH3SH-M2e를 나타낸 그래프이다.
도 7c는 니켈-친화성 크로마토그래피로 정제된 3XH5SH-M2e를 나타낸 그래프이다.
도 7d는 니켈-친화성 크로마토그래피로 정제된 H135SH-M2e를 나타낸 그래프이다.
도 8은 3XH1SH-M2e, 3XH3SH-M2e, 3XH5SH-M2e 및 H135SH-M2e의 발현 결과를 확인한 것이다.
도 9는 ELISA 분석을 통한 3XH1SH-M2e, 3XH3SH-M2e, 3XH5SH-M2e 및 H135SH-M2e의 항체 유도 효과를 나타낸 것이다.
도 10a 내지 도 10h는 3XH1SH-M2e, 3XH3SH-M2e, 3XH5SH-M2e 및 H135SH-M2e를 주입한 마우스의 인플루엔자 A 바이러스(H1N1, H3N2, H5N1 및 H5N8) 감염 후 체중 변화 및 생존율을 나타낸 것이다.
도 11a 내지 도 11h는 3XHA2SH-M2e(3XH1SH-M2e, 3XH3SH-M2e, 3XH5SH-M2e 및 H135SH-M2e)를 주입한 마우스의 인플루엔자 A 바이러스(H1N1, H3N2, H5N1 및 H5N8) 감염 후 체중 변화 및 생존율을 나타낸 것이다(H1N1 및 H3N2 감염군 보정; n=8에서 dpi 7일차 체중 증가 최대 개체와 체중 감소 최대 개체를 배제(n=6) 후 체중 감소 20% cut-off).
도 12a 내지 도 12f는 3XH1SH-M2e를 주입한 마우스의 인플루엔자 A 바이러스(H1N1, H3N2 및 H7N9) 감염 후 체중 변화 및 생존율을 나타낸 것이다(25% cut-off).
도 13은 ELISpot 분석을 통한 3XH1SH-M2e의 세포성 면역 유도에 의한 INF-γ 생성을 나타낸 것이다.
도 14는 제조된 항-혈청을 이용하여 항원 단백질에 대한 ELISA를 수행하여 범용성 항원으로 작용을 확인한 결과를 나타내는 것이다.
본 발명의 일 측면은 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌의 짧은 헬리컬 도메인(HA2SH) 또는 이의 단편 및 M2 단백질의 엑토도메인(M2e) 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질 삼량체를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "헤마글루티닌의 짧은 헬리컬 도메인(HA2SH)"이란, 인플루엔자 바이러스의 표면 단백질인 헤마글루티닌(HA)의 스템 도메인(HA2) 중 짧은 헬리컬 부위를 의미하는 것으로, 구체적으로 인플루엔자 바이러스의 다양한 아형 간에 공통적으로 보존된 아미노산 서열을 갖는 부위를 의미한다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 융합단백질에 포함되는 HA2SH는 바람직하게 인플루엔자 바이러스의 표면 단백질인 헤마글루티닌(HA)의 아미노산 서열을 기준으로 하여 373-404의 서열이 사용될 수 있다.
상기 헤마글루티닌의 짧은 헬리컬 도메인(HA2SH)에는 체액성 방어면역에서 가장 중요한 역할을 하는 중화 항체의 주요한 에피토프가 위치하며, 이에 따라 위 서열의 사용은 우수한 방어면역 효과를 생성하기에 가장 적합하다.
본 명세서에서 사용된 용어 "M2 단백질의 엑토도메인(M2e)"란, 인플루엔자 바이러스의 막단백질인 M2 단백질의 엑토도메인을 의미하는 것으로, 구체적으로 M2 단백질에서 인플루엔자 바이러스 아형 간의 보존적인 아미노산 서열을 갖는 부위를 의미한다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 융합단백질에 포함되는 M2e는 바람직하게 M2e 단편으로써 대략 15개의 아미노산 잔기가 사용될 수 있다. 상기 M2 단백질의 엑토도메인(M2e)은 바람직하게 인플루엔자 바이러스의 M2 단백질의 아미노산 서열을 기준으로 하여 5-19의 서열이 사용될 수 있다. 또한, 상기 M2 단백질의 아미노산 잔기를 기준으로 하여 5-19의 서열에서 17, 19번째 잔기 또는 이들 모두는 예를 들어 세린으로 치환될 수 있다.
여기서, 상기 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 M2e는 구체적으로 인플루엔자 바이러스 A형에서 유래된 단백질을 의미하는 것으로, 구체적으로 상기 인플루엔자 바이러스 A형의 종류는 H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H5N1 또는 H5N8일 수 있으며, 구체적으로는 H1N1, H3N2 또는 H5N1일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 융합단백질 삼량체는 하기 구조식을 가질 수 있다:
A 1-(L 1) n-A 2-(L 2) m-A 3
여기서, 상기 A 1은 HA2SH 1-(l 1) k-M2e 1로 표시되고, 상기 A 2는 HA2SH 2-(l 2) i-M2e 2로 표시되며, 상기 A 3은 HA2SH 3-(l 3) j-M2e 3으로 표시되고,
상기 HA2SH 1, HA2SH 2 및 HA2SH 3은 각각 독립적으로 H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H5N1 및 H5N8로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌의 짧은 헬리컬 도메인 또는 이의 단편이며,
상기 M2e 1, M2e 2 및 M2e 3은 각각 독립적으로 H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H5N1 및 H5N8로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 인플루엔자 바이러스의 M2 단백질의 엑토도메인 또는 이의 단편이며,
상기 L 1, L 2, l 1, l 2 및 l 3은 각각 독립적으로 펩티드 결합에 의해 연결된 1 내지 8개 아미노산으로 이루어진 펩티드 링커이다. 또한, 상기 n, m, k, i, j는 각각 독립적으로 0 또는 1의 정수이다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 HA2SH 1, HA2SH 2 및 HA2SH 3은 각각 독립적으로 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 표시될 수 있다. 또한, 상기 서열번호 7은 서열번호 10의 염기 서열로 코팅되며, 상기 서열번호 8은 서열번호 11의 염기 서열로 코팅되고, 상기 서열번호 9는 서열번호 12의 염기 서열로 코딩될 수 있다.
이때, 상기 HA2SH 1, HA2SH 2 및 HA2SH 3은 서로 같거나, HA2SH 1, HA2SH 2 및 HA2SH 3 중 어느 하나 이상이 서로 상이하거나, 상기 HA2SH 1, HA2SH 2 및 HA2SH 3이 모두 서로 상이할 수 있다. 예를 들어, 상기 HA2SH 1, HA2SH 2 및 HA2SH 3은 모두 서열번호 7로 표시되거나, 모두 서열번호 8로 표시되거나, 모두 서열번호 9로 표시될 수 있다. 또한, 상기 HA2SH 1는 서열번호 7로 표시되고, 상기 HA2SH 2는 서열번호 8로 표시되며, 상기 HA2SH 3은 서열번호 8로 표시될 수 있다. 또한, 상기 HA2SH 1는 서열번호 7로 표시되고, 상기 HA2SH 2는 서열번호 8로 표시되며, 상기 HA2SH 3은 서열번호 9로 표시될 수 있다. 여기서, 서열번호 7은 H1N1의 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 또는 이의 단편이고, 서열번호 8은 H3N2의 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 또는 이의 단편이며, 서열번호 9는 H5N1의 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 또는 이의 단편일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 M2e 1, M2e 2 및 M2e 3은 각각 독립적으로 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 표시될 수 있다. 또한, 상기 서열번호 13은 서열번호 16의 염기 서열로 코팅되며, 상기 서열번호 14는 서열번호 17의 염기 서열로 코팅되고, 상기 서열번호 15는 서열번호 18의 염기 서열로 코딩될 수 있다.
이때, 상기 M2e 1, M2e 2 및 M2e 3은 서로 같거나, M2e 1, M2e 2 및 M2e 3 중 어느 하나 이상이 서로 상이하거나, 상기 M2e 1, M2e 2 및 M2e 3이 모두 서로 상이할 수 있다. 예를 들어, 상기 M2e 1, M2e 2 및 M2e 3은 모두 서열번호 13으로 표시되거나, 모두 서열번호 14로 표시되거나, 모두 서열번호 15로 표시될 수 있다. 또한, 상기 M2e 1는 서열번호 13으로 표시되고, 상기 M2e 2는 서열번호 14로 표시되며, 상기 M2e 3은 서열번호 14로 표시될 수 있다. 또한, 상기 M2e 1는 서열번호 13으로 표시되고, 상기 M2e 2는 서열번호 14로 표시되며, 상기 M2e 3은 서열번호 15로 표시될 수 있다. 여기서, 서열번호 13은 H1N1의 인플루엔자 바이러스의 M2e 또는 이의 단편이고, 서열번호 14는 H3N2의 인플루엔자 바이러스의 M2e 또는 이의 단편이며, 서열번호 15는 H5N1의 인플루엔자 바이러스의 M2e 또는 이의 단편일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "융합단백질"이란, HA2SH 및 M2e를 포함하는 것으로, 구체적으로 상기 A 1, A 2 및 A 3으로 표시되는 융합단백질 단량체를 의미한다. 구체적으로, 상기 A 1은 HA2SH 1-(l 1) k-M2e 1로 표시되고, 상기 A 2는 HA2SH 2-(l 2) i-M2e 2로 표시되며, 상기 A 3은 HA2SH 3-(l 3) j-M2e 3으로 표시될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 융합단백질은 상기 k, i 및 j가 각각 0인 정수일 때, 상기 A 1은 HA2SH 1-M2e 1로 표시되고, 상기 A 2는 HA2SH 2-M2e 2로 표시되며, 상기 A 3은 HA2SH 3-M2e 3으로 표시될 수 있다. 또한, 상기 k, i 및 j가 각각 1인 정수일 때, 상기 A 1은 HA2SH 1-(l 1) 1-M2e 1로 표시되고, 상기 A 2는 HA2SH 2-(l 2) 1-M2e 2로 표시되며, 상기 A 3은 HA2SH 3-(l 3) 1-M2e 3으로 표시될 수 있다. 이때, 상기 k, i 및 j는 서로 같거나, k, i 및 j 중 어느 하나 이상이 서로 상이할 수 있다. 또한, 상기 A 1, A 2 및 A 3은 HA2SH-M2e의 구조와 같이, HA2SH 및 M2e를 포함하는 융합단백질 단량체를 의미하는 것으로 표시될 수 있다.
이때, 상기 A 1의 HA2SH 1 및 M2e 1는 서로 동일한 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편, 또는 M2e 및 이의 단편일 수 있다. 구체적으로, HA2SH 1 및 M2e 1는 모두 H1N1의 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편, 또는 M2e 및 이의 단편일 수 있다. 한편, 상기 A 1의 HA2SH 1 및 M2e 1는 서로 상이한 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편, 또는 M2e 및 이의 단편일 수 있다. 구체적으로, 상기 HA2SH 1은 H1N1의 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편이며, 상기 M2e 1는 H3N2의 인플루엔자 바이러스의 M2e 및 이의 단편일 수 있다.
또한, 상기 A 2의 HA2SH 2 및 M2e 2는 서로 동일한 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편, 또는 M2e 및 이의 단편일 수 있다. 구체적으로, HA2SH 2 및 M2e 2는 모두 H3N2의 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편, 또는 M2e 및 이의 단편일 수 있다. 한편, 상기 A 2의 HA2SH 2 및 M2e 2는 서로 상이한 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편, 또는 M2e 및 이의 단편일 수 있다. 구체적으로, 상기 HA2SH 2는 H3N2의 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편이며, 상기 M2e 2는 H5N1의 인플루엔자 바이러스의 M2e 및 이의 단편일 수 있다.
또한, 상기 A 3의 HA2SH 3 및 M2e 3은 서로 동일한 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편, 또는 M2e 및 이의 단편일 수 있다. 구체적으로, HA2SH 3 및 M2e 3은 모두 H5N1의 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편, 또는 M2e 및 이의 단편일 수 있다. 한편, 상기 A 3의 HA2SH 3 및 M2e 3은 서로 상이한 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편, 또는 M2e 및 이의 단편일 수 있다. 구체적으로, 상기 HA2SH 3은 H5N1의 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편이며, 상기 M2e 2는 H1N1의 인플루엔자 바이러스의 M2e 및 이의 단편일 수 있다.
이때, 상기 A 1, A 2 및 A 3은 서로 같거나, A 1, A 2 및 A 3 중 어느 하나 이상이 서로 상이하거나, 상기 A 1, A 2 및 A 3이 모두 서로 상이할 수 있다. 예를 들어, 상기 A 1, A 2 및 A 3은 모두 서열번호 19로 표시되거나, 모두 서열번호 20으로 표시되거나, 모두 서열번호 21로 표시될 수 있다. 또한, 상기 A 1는 서열번호 19로 표시되고, 상기 A 2는 서열번호 20으로 표시되며, 상기 A 3은 서열번호 20으로 표시될 수 있다. 또한, 상기 A 1는 서열번호 19로 표시되고, 상기 A 2는 서열번호 20으로 표시되며, 상기 A 3은 서열번호 21로 표시될 수 있다.
여기서, 서열번호 19는 H1N1의 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편, 또는 M2e 및 이의 단편을 포함할 수 있고, 서열번호 20은 H3N2의 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편, 또는 M2e 및 이의 단편을 포함할 수 있으며, 서열번호 21은 H5N1의 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편, 또는 M2e 및 이의 단편을 포함할 수 있다. 또한, 상기 서열번호 19는 서열번호 22의 염기 서열로 코팅되며, 상기 서열번호 20은 서열번호 23의 염기 서열로 코팅되고, 상기 서열번호 21은 서열번호 24의 염기 서열로 코딩될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 융합단백질 A 1, A 2 및 A 3은 각각 독립적으로 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 21로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열로 표시되는 단량체를 포함할 수 있다. 상기 융합단백질은 상기 아미노산 서열과 동일하거나, 이의 아미노산이 보존적 치환에 의해 치환되거나, 90 내지 99%의 서열상동성, 바람직하게는 95 내지 99%의 서열상동성, 더욱 바람직하게는 98 내지 99%의 서열상동성을 갖는 융합단백질을 모두 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "융합단백질 삼량체"란, HA2SH 및 M2e를 포함하는 융합단백질 단량체가 3번 반복적으로 결합된 형태를 의미하는 것으로, 구체적으로 상기 A 1-(L 1) n-A 2-(L 2) m-A 3의 구조를 갖는 융합단백질 삼량체를 의미한다. 인플루엔자 바이러스의 다양한 아형 간에 공통적으로 보존된 아미노산 서열을 갖는 HA2SH 및 M2e로부터 형성된 융합단백질 삼량체는 인플루엔자 바이러스의 다양한 아형에 대하여 효과적으로 중화항체를 형성할 수 있다. 상기 융합단백질 삼량체는 개체 내에서 항원으로 작용하여 항원-항체 반응을 유도함으로써 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다.
상기 융합단백질 삼량체는 A 1-(L 1) n-A 2-(L 2) m-A 3의 구조식(상기 A 1, A 2 및 A 3은 상기 정의한 바와 같다)으로 표시될 수 있으며, 구체적으로, 상기 n 및 m가 각각 1인 정수일 때, 상기 융합단백질 삼량체는 A 1-A 2-A 3으로 표시될 수 있고, 상기 n 및 m가 각각 1인 정수일 때, 상기 융합단백질 삼량체는 A 1-(L 1) 1-A 2-(L 2) 1-A 3으로 표시될 수 있다. 또한, 상기 n이 0인 정수이고 m이 1인 정수일 때, 상기 융합단백질 삼량체는 A 1-A 2-(L 2) 1-A 3으로 표시될 수 있고, 상기 n이 1인 정수이고 m이 0인 정수일 때, 상기 융합단백질 삼량체는 A 1-(L 1) 1-A 2-A 3으로도 표시될 수 있다. 상술한 바와 같이, 상기 A 1, A 2 및 A 3은 서로 같거나, A 1, A 2 및 A 3 중 어느 하나 이상이 서로 상이하거나, 상기 A 1, A 2 및 A 3이 모두 서로 상이할 수 있다.
또한, 상기 융합단백질 삼량체는 3XHA2SH-M2e의 구조로도 표시될 수 있으며, 구체적으로 3XH1SH-M2e, 3XH3SH-M2e, 3XH5SH-M2e 및 H135SH-M2e로 표시될 수 있다. 여기서, 상기 3XH1SH-M2e(서열번호 25, 서열번호 33 또는 서열번호 41)는 A 1, A 2 및 A 3 모두가 H1N1의 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편, 또는 M2e 및 이의 단편을 포함하는 융합단백질 삼량체를 의미하고, 상기 3XH3SH-M2e(서열번호 26, 서열번호 34 또는 서열번호 42)는 A 1, A 2 및 A 3 모두가 H3N2의 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편, 또는 M2e 및 이의 단편을 포함하는 융합단백질 삼량체를 의미한다. 또한, 상기 3XH5SH-M2e(서열번호 27, 서열번호 35 또는 서열번호 43)는 A 1, A 2 및 A 3 모두가 H5N1의 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편, 또는 M2e 및 이의 단편을 포함하는 융합단백질 삼량체를 의미한다. 한편, 상기 H135SH-M2e(서열번호 28, 서열번호 36 또는 서열번호 44)는 A 1이 H1N1의 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편, 또는 M2e 및 이의 단편을 포함하고, A 2가 H3N2의 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편, 또는 M2e 및 이의 단편을 포함하며, A 3이 H5N1의 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편, 또는 M2e 및 이의 단편을 포함하는 융합단백질 삼량체를 의미한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 융합단백질 삼량체는 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43 및 서열번호 44로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열로 표시될 수 있다. 상기 융합단백질 삼량체는 상기 아미노산 서열과 동일하거나, 이의 아미노산이 보존적 치환에 의해 치환되거나, 90 내지 99%의 서열상동성, 바람직하게는 95 내지 99%의 서열상동성, 더욱 바람직하게는 98 내지 99%의 서열상동성을 갖는 융합단백질 삼량체를 모두 포함할 수 있다.
이때, 상기 서열번호 25 내지 서열번호 28은 링커를 포함하지 않는(상기 n 및 m가 각각 0인 정수를 가짐) 융합단백질 삼량체를 표시하고, 상기 서열번호 23 내지 서열번호 36은 링커를 포함하는(상기 n 및 m가 각각 1인 정수를 가짐) 융합단백질 삼량체를 표시하며, 상기 서열번호 41 내지 서열번호 44는 His-tag를 포함하는 융합단백질 삼량체를 표시한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 서열번호 25는 서열번호 29의 염기 서열로, 상기 서열번호 26은 서열번호 30의 염기 서열로, 상기 서열번호 27은 서열번호 31의 염기 서열로, 상기 서열번호 28은 서열번호 32의 염기서열로, 서열번호 33은 서열번호 37의 염기 서열로, 상기 서열번호 34는 서열번호 38의 염기 서열로, 상기 서열번호 35는 서열번호 39의 염기 서열로, 상기 서열번호 36은 서열번호 40의 염기서열로, 서열번호 41은 서열번호 45의 염기 서열로, 상기 서열번호 42는 서열번호 46의 염기 서열로, 상기 서열번호 43은 서열번호 47의 염기 서열로, 상기 서열번호 44는 서열번호 48의 염기서열로 코딩될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "보존적 치환"이란, 한 부류의 아미노산이 동일한 부류의 다른 아미노산으로 대체되는 것을 의미한다. 보존적 치환은 폴리펩티드의 구조 또는 기능을 변경시키지 않는다. 보존적 치환의 목적을 위한 아미노산의 부류는 소수성(예를 들어, Met, Ala, Val, Leu), 중성 친수성(예를 들어, Cys, Ser, Thr), 산성(예를 들어, Asp, Glu), 염기성(예를 들어, Asn, Gln, His, Lys, Arg), 입체형태 파괴물질(disrupter)(예를 들어, Gly, Pro) 및 방향족(예를 들어, Trp, Tyr, Phe)을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "항원"이란, 바이러스의 구성성분 중 면역기능을 일으킬 수 있는 성분으로, 바람직하게는 바이러스가 발현하는 단백질을 의미한다. 구체적으로, 상기 융합단백질 삼량체가 개체에 투여되었을 때, 상기 융합단백질 삼량체는 면역 반응을 유도하는 항원으로 작용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 HA2SH 및 M2e는 직접적으로 결합되거나, 링커를 통해 결합될 수 있으며, 상기 융합단백질은 서로 직접적으로 결합되거나, 링커를 통해 결합될 수 있다.
상기 링커는 HA2SH 및 M2e를 연결하거나, 융합단백질 단량체 사이를 인위적으로 연결하는 작용을 하는 일정 길이의 아미노산 서열을 의미한다. 구체적으로 상기 링커는 펩티드 결합에 의해 연결된 1 내지 8개 아미노산으로 이루어진 펩티드 링커를 사용할 수 있으며, 상기 아미노산은 글리신, 세린, 알라닌, 프롤린, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르트산 및 글루탐산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 링커는 글리신 및 세린, 라이신 및 류신 또는 류신 및 글루탐산으로 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명의 일 측면은 융합단백질 삼량체를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
상기 뉴클레오티드는 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47 및 서열번호 48로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 뉴클레오티드는 시그널 펩타이드 또는 His-tag를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 측면은 상기 융합단백질 삼량체를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 예방용 백신 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "백신"이란, 일반적인 인플루엔자 바이러스에 대한 예방 또는 치료를 목적으로 개체에서 항원-항체 반응을 유도하는 것을 의미한다.
상기 백신 조성물은 다양한 인플루엔자 바이러스 아형에 대하여 항체의 형성을 유도할 수 있다. 이와 같이 형성된 항체는 인플루엔자 바이러스의 다양한 아형, 바람직하게는 H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H5N1, H5N8 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아형에 결합할 수 있다. 더욱 바람직하게 상기와 같이 형성된 항체는 H1N1, H3N2, H5N1 또는 H5N8의 인플루엔자 바이러스 아형에 결합할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "인플루엔자 바이러스 아형"은 헤마글루티닌(H) 및 뉴라미다제(N) 바이러스 표면 단백질이 조합된 인플루엔자 A 바이러스 변이체를 의미한다. 상기 인플루엔자 바이러스 아형은 H 번호 및 N 번호의 조합(예를 들어, H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H5N1, H5N8 등)을 갖는 인플루엔자 바이러스 아형을 가질 수 있다.
상기 백신 조성물은 추가적으로 용매, 면역증강제(adjuvant) 및 부형제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 상기 용매로는 생리식염수 또는 증류수를 사용할 수 있으며, 상기 면역증강제로는 프로인트(Freund's) 불완전체 또는 완전체 어쥬번트, 알루미늄 하이드록사이드 겔, 및 식물성 및 광물성 오일 등을 사용할 수 있고, 상기 부형제로는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포타슘 설페이트를 사용할 수 있다. 또한, 백신 제조에 사용되는 공지의 물질을 더 포함할 수 있다.
상기 백신 조성물은 경구형 또는 비경구형 제제로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 비경구형 제제인 주사 액제로 제조하며, 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내, 비강 또는 경막외(eidural) 경로로 투여할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 상기 융합단백질 삼량체를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 인플루엔자 바이러스 감염 질환은 부비강염, 발작성 천식, 중이염, 낭성 섬유종, 기관지염, 폐렴 및 설사로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 융합단백질 삼량체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역유도 방법을 제공할 수 있다. 상기 융합단백질 삼량체가 개체에 투여되는 경우 개체 내에서 항체를 형성하여 면역 반응을 유도하므로, 인플루엔자 감염 질환을 예방하거나 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 인플루엔자 바이러스에 대한 면역유도에 사용하기 위한 상기 융합단백질 삼량체를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 인플루엔자 바이러스 감염 예방에 사용하기 위한 상기 융합단백질 삼량체를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에서 인플루엔자 바이러스에 대한 백신의 제조를 위한 상기 융합단백질 삼량체의 용도를 제공한다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 인플루엔자 헤마글루티닌 HA2 및 M2e의 서열 동정
범용성 항원으로 사용될 수 있는 인플루엔자 헤마글루티닌(이하 'HA'로 표기)의 서열을 동정하기 위하여, 구조를 기반에 둔 단백질 서열분석 비교 프로그램(Clustal W & ESPript 3.0)을 이용하였다. 상기 프로그램을 이용하여 다양한 아형을 갖는 HA 단백질의 아미노산 서열 중 6종의 서열을 비교 분석하고, HA 전체 서열 중에서 아형 간의 보존된 서열을 가진 HA2의 짧은 헬리컬 도메인(HA2SH)을 결정하였다. 이와 같은 구조 기반 인플루엔자 HA의 전체 헤드 도메인 및 스템 도메인의 서열 분석 결과 및 HA2의 서열 분석 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다. 도 1은 HA의 전체 헤드 도메인 및 스템 도메인의 서열 분석 결과이며, 도 2는 HA2의 서열 분석 결과를 나타낸다. 본 발명에 따른 바람직한 서열은 도 1에 따른 아미노산 서열을 기초로 하였을 때, 373-404 잔기 서열이며, 도 2에 따른 아미노산 서열을 기초로 하였을 때 29-60 잔기 서열임을 확인하였다.
동일한 방법으로 M2 단백질(matrix-2 protein)의 아미노산 서열 중 6종의 서열을 비교 분석하고, M2 단백질에서 아형 간의 보존적인 서열을 가진 M2 단백질의 엑토도메인(이하 'M2e'로 표기)을 결정하였다. 이와 같은 구조 기반 인플루엔자 M2 단백질의 서열 분석 결과를 도 3에 나타내었다. 본 발명에 따른 바람직한 서열은 도 3에 따른 아미노산 서열을 기초로 하였을 때 5-19 번째 아미노산 서열임을 확인하였다. 또한, 위 서열에 있어서 17 및 19 번째 서열이 세린으로 치환 가능함을 확인하였다.
상기와 같은 서열 분석을 통해 HA에 공통적으로 보존된 아미노산 서열을 갖는 HA2 짧은 헬리컬 도메인과 M2 단백질에 공통적으로 보존된 아미노산 서열을 갖는 M2e 도메인을 확인하였으며, 이를 하기 실시예 2에서와 같이 항원으로 제조하였다.
실시예 2. 인플루엔자 헤마글루티닌 HA2 짧은 헬리컬 도메인 및 M2e 융합단백질 삼량체(3XHA2SH-M2e)의 제조
실시예 2.1. HA 단백질 및 M2 단백질의 합성
실험에 사용된 인플루엔자 A 바이러스(A/California/04/2009(H1N1))의 HA 단백질(567개 아미노산), 인플루엔자 A 바이러스(A/canine/Korea/01/2007(H3N2))의 HA 단백질(588개 아미노산) 및 인플루엔자 A 바이러스(A/chiken/korea/es/2003(H5N1))의 HA 단백질(568개 아미노산) 유전자들을 ㈜바이오니아에서 합성하였다. 이들의 염기 서열은 각각 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3과 같다.
또한, 실험에 사용된 인플루엔자 A 바이러스(A/California/04/2009(H1N1))의 M2 단백질(97개 아미노산), 인플루엔자 A 바이러스(A/canine/Korea/01/2007(H3N2))의 M2 단백질(97개 아미노산) 및 인플루엔자 A 바이러스(A/chiken/korea/es/2003(H5N1))의 M2 단백질(97개 아미노산) 유전자들을 ㈜바이오니아에서 합성하였다. 이들의 염기 서열은 각각 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6과 같다.
실시예 2.2. 3XHA2SH-M2e의 제조
3XHA2SH-M2e(도 4)를 제조하기 위하여, 절편 1은 HA2 짧은 헬리컬 도메인으로써 헤마글루티닌(HA)의 아미노산 서열을 기준으로 하여 아미노산 잔기 373-404 및 M2e 도메인의 15개의 아미노산 잔기(M2 단백질의 아미노산 서열을 기준으로 5-19(17, 19 잔기의 경우 세린 치환 가능)), 절편 2는 HA2 짧은 헬리컬 도메인으로써 헤마글루티닌(HA)의 아미노산 서열을 기준으로 하여 아미노산 잔기 373-404 및 M2e 도메인의 15개의 아미노산 잔기(M2 단백질의 아미노산 서열을 기준으로 5-19(17, 19 잔기의 경우 세린 치환 가능)), 및 절편 3은 HA2 짧은 헬리컬 도메인으로써 헤마글루티닌(HA)의 아미노산 서열을 기준으로 하여 아미노산 잔기 373-404 및 M2e 도메인의 15개의 아미노산 잔기(M2 단백질의 아미노산 서열을 기준으로 5-19(17, 19 잔기의 경우 세린 치환 가능))를 가질 수 있도록 각각 NdeI과 BamHI, BamHI과 HindIII, 및 HindIII과 XhoI을 사용하였고, 단백질의 양 말단(N-말단 및 C-말단)에 6개의 히스티딘이 붙도록 디자인하여 pET28a에 서브클론하였다. 그리고 나서, 대장균( Escherichia coli) BL21(DE3) RIL 균주(strain)를 사용하여 과발현시켰다. 사용된 대장균 발현 벡터 pET28a-3XHA2HS-M2e를 도 5에 나타내었다. 또한, 사용된 HA2 짧은 헬리컬 도메인으로써 헤마글루티닌(HA)의 아미노산 서열을 기준으로 하여 아미노산 잔기 373-404은 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되며, 사용된 M2e의 아미노산 잔기는 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시된다.
각각의 단백질을 대장균에 접종하고 OD600 nm에서 0.5 내지 0.6 사이에 0.2 mM IPTG를 넣고 18시간 동안 290K에서 배양하였다. His-태그된 3XHA2SH-M2e를 니켈-친화성 크로마토그래피로 정제하였고, 25 mM Tris-HCl(pH 7.5), 0.2 M NaCl, 5%(v/v) 글리세롤을 포함하는 완충용액에서 투석하여, 정제된 3XHA2SH-M2e를 수득하였다. 3XHA2SH-M2e(3XH1SH-M2e, 3XH3SH-M2e, 3XH5SH-M2e 및 H135SH-M2e)를 SDS-PAGE 상에서 확인하였으며, 니켈-친화성 크로마토그래피에 의하여 순도 96%이상으로 정제된 것을 확인하였다(도 6 및 도 7). 또한, 3XHA2SH-M2e의 발현 테스트 결과를 도 8에 나타내었다.
실시예 3. 3XHA2SH-M2e의 항체 생성 효과 확인
상기 실시예 2에서 제조한 3XHA2SH-M2e(3XH1SH-M2e, 3XH3SH-M2e, 3XH5SH-M2e 및 H135SH-M2e)가 효과적으로 항체를 유도하는지 확인하기 위하여, 이들의 항체 생성 효과를 확인하였다.
항원을 마우스에 주사하기 전에 전-면역 혈청(pre-immune serum)을 채취하여 음성 대조군으로 사용하였다. 일차적 면역화(Primary immunize)를 위하여, 각각 정제된 3XHA2SH-M2e 항원 50 ug을 에멀젼 어쥬번트(ISA 71 VG)(montinide)와 혼합하여 근육 주사(IM)하고, 2주 후 1차 혈액을 채취하여 ELISA 분석을 수행하였다. 이어서, 단백질 항원 50 ug을 에멀젼 어쥬번트(ISA 71 VG)(montinide)와 혼합하여 부스팅 면역화(boosting immunize)를 진행하였고, 2주 후 최종 혈청을 분리하여 최종 ELISA 분석을 수행하였다.
ELISA 분석에서 항원은 웰 당 100 ng을 사용하였다. 또한, 면역 혈청은 1x PBS로 1 : 100 내지 1 : 100,000 비율로 희석하여 사용하였고, 2차 확인을 위해서는 항-마우스 IgG-HRP(ABC5001)를 1 : 5,000 희석하여 사용하였다. 광학 밀도 405 nm에서 발색을 검출하여 최종적으로 면역 항체의 생성 여부를 확인하였다. 그 결과, 마우스 내에서 3XHA2SH-M2e가 우수한 항체 생성 효과를 갖는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과를 통해 3XHA2SH-M2e가 항체를 효과적으로 유도할 수 있다는 것을 확인하였다(도 9).
실시예 4. 범용성 백신으로서 3XHA2SH-M2e의 이용성 확인
상기 실시예 3에서 3XHA2SH-M2e가 우수한 항체 유도 효과를 나타냄을 확인하였으며, 이를 통해 다양한 인플루엔자 바이러스에 대한 방어 유도가 가능한 범용성 백신으로 활용할 수 있는지 여부를 확인하였다.
일차적 면역화를 위하여, 각각 정제된 3XHA2SH-M2e 항원 50 ug을 에멀젼 어쥬번트(ISA 71 VG)(montinide)와 혼합하여 마우스에 근육 주사하고, 2주 후 항원 50ug을 에멀젼 어쥬번트(ISA 71 VG)(montinide)와 혼합하여 부스팅 면역화를 진행하였다. 2주 후 인플루엔자 A 바이러스 H1N1, H3N2, H5N1 및 H5N8을 각각 1x PBS에 희석하여 비강 접종(IN)을 통해 30 ul씩 마우스 감염을 진행하였다. 이후, 2주에 걸쳐 마우스의 체중 변화와 생존율을 측정하여 3XHA2SH-M2e 항원의 방어 면역 유도 효과를 확인하였다(도 10 및 도 11).
실시예 5. 범용성 백신으로서 3XH1SH-M2e의 이용성 확인
상기 실시예 4에서 3XH1SH-M2e가 우수한 방어 면역 유도효과를 나타냄을 확인하였으며, 이를 통해 다양한 인플루엔자 바이러스에 대한 방어 유도가 가능한 범용성 백신으로 활용할 수 있는지 여부를 확인하였다.
일차적 면역화를 위하여, 각각 정제된 3XH1SH-M2e 항원 50 ug을 에멀젼 어쥬번트(ISA 71 VG)(montinide)와 혼합하여 마우스에 근육 주사하고, 2주 후 항원 50ug을 에멀젼 어쥬번트(ISA 71 VG)(montinide)와 혼합하여 부스팅 면역화를 진행하였다. 2주 후 인플루엔자 A 바이러스 H1N1, H3N2 및 H7N9을 각각 1x PBS에 희석하여 비강 접종(IN)을 통해 30 ul씩 마우스 감염을 진행하였다. 이후, 2주에 걸쳐 마우스의 체중 변화와 생존율을 측정하여 3XH1SH-M2e 항원의 방어 면역 유도효과를 확인하였다.
그 결과를 도 12 a 내지 12 f에 나타내었다. 도 12에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 3XH1SH-M2e 항원을 이용하는 경우 다양한 인플루엔자 바이러스에 대해 우수한 방어 능력을 나타냄을 확인하였다.
실시예 6. 범용성 백신으로서 3XH1SH-M2e의 세포성 면역 유도 확인
상기 실시예 2에서 제조한 3XH1SH-M2e가 효과적으로 세포성 면역을 유도하는지 확인하기 위하여, 이들에 의해 INF-γ의 생성이 유도되는지 여부를 확인하였다.
일차적 면역화(Primary immunize)를 위하여, 정제된 3XH1SH-M2e 항원 50 ug을 에멀젼 어쥬번트(ISA 71 VG)(montinide)와 혼합하여 근육 주사(IM)하고, 2주 후 단백질 항원 50 ug을 에멀젼 어쥬번트(ISA 71 VG)(montinide)와 혼합하여 부스팅 면역화(boosting immunize)를 진행하였고, 2주 후 비장을 채취하여 ELISpot 분석을 진행하였다. 면역화를 진행하지 않은 개체들을 음성대조군으로 사용하였다.
ELISpot 분석에 항-마우스 IFN-γ 항체를 1 X PBS로 1:200으로 희석하여 코팅하였다. 항원을 웰 당 10 μg 씩 사용하였고, 면역화한 마우스로부터 확보한 비장 세포를 1 X 10 7 cells/ml로 웰 당 100 μl씩 사용하였다. 3일간 세포를 배양하여 활성화 시킨 뒤, Biotinylated 항-마우스 IFN-γ 항체를 1 X PBS로 1:250 희석하여 2시간 반응시켰다. streptavidin-HRP를 웰 당 100 μl씩 처리하여 반응 1시간 반응 시킨 뒤, AEC substrate를 웰 당 100 μl씩 처리하여 10분 반응시켰다. Spot 리더기로 반응 결과를 확인하여 면역화한 마우스의 비장 세포에서 IFN-γ 생성이 활성화되는 것을 확인하였으며 이로부터 3XH1SH-M2e에 의한 세포성 면역 유도를 확인하였다(도 13).
도 13에서 확인할 수 있는 바와 같이, 범용백신 후보물질 3XHA2SH-M2e를 접종한 마우스의 비장(spleen)세포를 이용한 ELISpot 실험을 통해 범용백신 후보물질이 T-세포로부터 IFN-γ 생성을 활성화하여 세포성 면역 반응을 유도할 수 있음을 확인하였다. 마우스의 비장 세포를 면역 항원과 함께 배양한 후 항- IFN-γ 항체를 이용하면 생성된 IFN-γ를 검은 반점으로 시각화하여 검출할 수 있었다. 상기 결과들을 통해 3XHA2SH-M2e를 접종한 마우스의 비장 세포에서 면역 항원인 3XHA2SH-M2e에 대해 상당히 높은 수준의 IFN-γ 생성이 확인되었다.
실시예 7. 제조된 항혈청을 이용한 항원 확인
실시예 2에 의해 제조된 3종 항원을 이용하여 마우스의 면역 유도를 진행한 후, 이의 항 혈청을 이용하여 ELISA를 수행하였다. 구체적으로, 동일 항원, GST-H2SH(HA2 기준 29-60) 그리고 GST-M2e(M2 기준 5-19) 항원을 제작하여 코팅항원으로 ELISA를 진행하였다.
그 결과를 도 14에 나타내었다.(-:면역 전, 기호: 마우스별 항혈청(총 5마리))
도 14에서 확인할 수 있는 바와 같이, 항혈청으로부터의 항체는 모두 우수한 결합능을 나타내는 것을 보였다. 특히, H1 아형의 HA2SH(29-60)항원으로도 H1 뿐만 아니라, H3 와 H5의 항혈청의 항체와도 잘 결합하는 것을 확인함으로써, 본 발명에 따른 융합단백질 삼량체가 범용성 항원으로 작용하는 것을 확인하였다.

Claims (20)

  1. 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌의 짧은 헬리컬 도메인(HA2SH) 또는 이의 단편 및 M2 단백질의 엑토도메인(M2e) 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질 삼량체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 융합단백질 삼량체는 하기 구조식을 갖는 것인, 융합단백질 삼량체:
    A 1-(L 1) n-A 2-(L 2) m-A 3
    여기서, 상기 A 1은 HA2SH 1-(l 1) k-M2e 1로 표시되고, 상기 A 2는 HA2SH 2-(l 2) i-M2e 2로 표시되며, 상기 A 3은 HA2SH 3-(l 3) j-M2e 3으로 표시되고,
    상기 HA2SH 1, HA2SH 2 및 HA2SH 3은 각각 독립적으로 H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H5N1 및 H5N8로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌의 짧은 헬리컬 도메인 또는 이의 단편이며,
    상기 M2e 1, M2e 2 및 M2e 3은 각각 독립적으로 H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H5N1 및 H5N8로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 인플루엔자 바이러스의 M2 단백질의 엑토도메인 또는 이의 단편이며,
    상기 L 1, L 2, l 1, l 2 및 l 3은 각각 독립적으로 펩티드 결합에 의해 연결된 1 내지 8개 아미노산으로 이루어진 펩티드 링커이며,
    상기 n, m, k, i, j는 각각 독립적으로 0 또는 1의 정수이다.
  3. 제2항에 있어서,
    인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌의 짧은 헬리컬 도메인 또는 이의 단편은 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 아미노산 서열을 기준으로 하여 373-404의 서열인, 융합단백질 삼량체.
  4. 제2항에 있어서,
    M2 단백질의 엑토도메인 또는 이의 단편은 인플루엔자 바이러스의 M2 단백질의 아미노산 서열을 기준으로 하여 5-19의 서열인, 융합단백질 삼량체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스의 M2 단백질의 아미노산 서열을 기준으로 하여 5-19서열의 17 잔기, 19 잔기 또는 이들 모두가 세린으로 치환된 것인, 융합단백질 삼량체.
  6. 제2항에 있어서,
    상기 HA2SH 1, HA2SH 2 및 HA2SH 3은 각각 독립적으로 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는, 융합단백질 삼량체.
  7. 제2항에 있어서,
    상기 M2e 1, M2e 2 및 M2e 3은 각각 독립적으로 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는, 융합단백질 삼량체.
  8. 제2항에 있어서,
    상기 A 1, A 2 및 A 3은 각각 독립적으로 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 21로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는, 융합단백질 삼량체.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 융합단백질 삼량체는 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43 및 서열번호 44로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는, 융합단백질 삼량체.
  10. 제2항에 있어서,
    상기 펩티드 링커는 글리신, 세린, 알라닌, 프롤린, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르트산 및 글루탐산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 포함하는, 융합단백질 삼량체.
  11. 제1항에 따른 융합단백질 삼량체를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 뉴클레오티드는 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47 및 서열번호 48로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 발현 벡터.
  13. 제1항에 따른 융합단백질 삼량체를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 예방용 백신 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 인플루엔자 바이러스는 H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H5N1 및 H5N8로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아형인, 백신 조성물.
  15. 제1항에 따른 융합단백질 삼량체를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 치료용 약학 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 인플루엔자 바이러스 감염 질환은 부비강염, 발작성 천식, 중이염, 낭성 섬유종, 기관지염, 폐렴 및 설사로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물.
  17. 제1항에 따른 융합단백질 삼량체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역유도 방법.
  18. 인플루엔자 바이러스에 대한 면역유도에 사용하기 위한 제1항에 따른 융합단백질 삼량체를 포함하는 조성물.
  19. 인플루엔자 바이러스 감염 예방에 사용하기 위한 제1항에 따른 융합단백질 삼량체를 포함하는 백신 조성물.
  20. 인플루엔자 바이러스에 대한 백신의 제조를 위한 제1항에 따른 융합단백질 삼량체의 용도.
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