CN110003314B

CN110003314B - H1n1流感病毒血凝素可诱发广谱保护性抗体的表位肽及其应用

Info

Publication number: CN110003314B
Application number: CN201910288826.5A
Authority: CN
Inventors: 李元春; 谢毅; 王健; 戴建锋; 唐海平; 顾少华; 季朝能; 程一航; 连文博; 詹建民; 徐万祥
Original assignee: Shanghai Institute of Planned Parenthood Research
Current assignee: Shanghai Institute of Planned Parenthood Research
Priority date: 2019-04-11
Filing date: 2019-04-11
Publication date: 2023-06-09
Anticipated expiration: 2039-04-11
Also published as: CN110003314A

Abstract

本发明提供了H1N1流感病毒血凝素可诱发广谱保护性抗体的表位肽，其来自于流感A病毒(IAV)H1N1血凝素(HA)切割位点。所述的表位肽除了H14亚型，在包括部分H8的17个IAV‑H亚型HA蛋白中都几乎100％保守地存在。本发明的表位肽可以用于制备抗流感的广谱治疗性抗体药物和检测用抗原，或用于制备人和/或禽类用单价/多价通用预防性流感疫苗。

Description

H1N1流感病毒血凝素可诱发广谱保护性抗体的表位肽及其应用

技术领域

本发明属于免疫学和生物医药技术领域，更具体地，本发明涉及一种流感A病毒(IAV)血凝素(HA)蛋白可诱发阻断HA前体(HA0)切割抗体的表位肽及其应用。

背景技术

流感病毒是归属于正黏病毒科的RHA病毒，存在甲型(A)、乙型(B)、丙型(C)和丁型(D)4个属[Hause BM，et al.Characterization of a novel influenza virus in cattleand swine:proposal for a new genus in the Orthomyxoviridae family.MBio 2014，5:e00014-e00031]，其中宿主范围广和血清亚型多的流感A病毒(influenza A virus，IAV)，依据其暴露于病毒表面的血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)发生抗原转变和抗原漂移带来的抗原性差异，又被进一步细分为不同的亚型，目前已发现18种HA亚型(H1～H18)和11种NA亚型(N1～N11)[Tong S，et al.Newworld bats harbor diverse influenza A viruses.PLoS Pathog 2013，9(10):e1003657]。另外，已确定能在人际间广泛传播的IAV是H1N1、H2N2和H3N2亚型，因此它们又被称为人流感病毒；而目前可感染人的禽流感IAV主要是H5N1、H7N9和H9N2等亚型。

流行性感冒主要是由IAV引发的一种呼吸道传染疾病，全球每年感染人数达10亿人之多，其中有30～50万患者最终死亡，且间隔若干年的周期性流感大爆发还将导致更高的发病率和死亡率[Lambert LC，et al.Influenza vaccines for the future.N Engl JMed 2010，363:2036-2044]。例如，19世纪以来已出现过5次流感大爆发，其中1918年的西班牙流感大流行导致5亿人感染H1N1病毒，约5000万人死亡[Neumann G，et al.Emergenceand pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus.Nature 2009，460:931-939]；之后于1957年和1968年，相继在亚洲和中国香港发生过二次人流感病毒H2N2和H3N2大流行[Peiris JS，et al.Avian influenza virus(H5N1):a threat to humanhealth.Clin Microbiol Rev 2007，20:243-267；Webster RG，et al.Evolution andecology of influenza A viruses.Microbiol Rev 1992，56:152-179]；2009年墨西哥H1N1猪流感也一度蔓延至包括中国和美国在内的200多个国家和地区[Webster RG，etal.Evolution and ecology of influenza A viruses.Microbiol Rev1992，56:152-179]，使全世界将近40万人感染，并引起6700多人死亡；以及2013年的中国H7N9禽流感大爆发。IAV也存在于鸡鸭等动物体内，其流行也往往引起家禽的大量死亡和被大批量捕杀，因而会造成巨大的经济损失。

因此，严重威胁人类健康和阻碍社会经济发展的流感，始终是世界各国高度关注的公共卫生问题，并为此每年投入大量IAV基础病原学、IAV控制和预防对策的研发经费。目前预防IAV流感大流行相对有效的措施，是接种由对人类危害较大的IAV-H1N1、H3N2和一种流感B病毒(influenza B virus，IBV)组成的灭活疫苗、减毒疫苗、亚单位疫苗和病毒样颗粒疫苗等三价疫苗。但由于IAV-HA亚型众多，同时疫苗靶蛋白HA头部区域(HA1)极易发生抗原性漂移而造成同一亚型的众多突变株，导致每年的流感疫苗生产，难以随着IAV流行毒株变异而予以及时匹配更新，再加上每年IAV疫苗株的匹配选育费时费力，生产周期长成本高，因此难以适应满足年年防控流感的社会实际需求。为了能彻底解决上述难题，“通用”流感疫苗的研制迫在眉睫。

“通用”流感疫苗概念的提出和被接受，起始于以病毒表面保守的跨膜离子通道M2基质蛋白的研究，即发现M2抗原可在IAV亚型之间产生免疫交叉反应性[Slepushkin VA，etal.Protection of mice against influenza A virus challenge by vaccination withbaculovirus-expressed M2 protein.Vaccine 1995，13:1399-1402]，之后改用其在亚型间更为保守的M2蛋白N端胞外区肽(M2e)作为免疫原[Deng L，et al.M2e-based Universalinfluenza A vaccine.Vaccine2015，3:105-136]，并证明M2e抗体虽然不能中和IAV病毒，但可通过抗体依赖细胞介导的细胞杀伤产生有效抗IAV流感保护作用[Jegerlehner A，etal.Influenza A vaccine based on the extracellular domain of M2:weekprotection mediated via antibody-dependent NK cell activity.J Immunol 2004，172:5598-5605；Fan J，et al.Preclinical study of influenza virus A M2 peptideconjugate vaccines in mice，ferrets，and rhesus monkeys.Vaccine 2004，22:2993-3003]，或通过控制同源M2四聚体质子通道活性调节病毒内pH值，以影响IAV的复制扩散[Schnell JR，et al.Structure and mechanism of the M2 protein channel ofinfluenza A virus.Nature 2008，451:591-595]。

IAV在宿主体内的复制还取决于病毒被细胞内吞后内涵体中pH下降而打开M2离子通道，并使IAV发生构象变化，进而导致HA茎部(HA2)N端融合肽(fusion peptide，FP)与宿主细胞膜受体融合的事件发生。同时发现此又一重要靶点的HA2-FP(aa 1-23或1-38)氨基酸序列，不仅在IAV亚型及其突变株间高度保守，且能诱发特异抑制HA与宿主细胞膜受体融合活性的抗体[Vareckova E，et al.A monoclonal antibody specific to the HA2glycoprotein of influenza A virus hemagglutinin that inhibits its fusionactivity reduces replication of the virus.Acta Virol 2003，47:229-236]。因此，随之开始出现同时单独或组合M2e和HA2-FP表位肽的通用流感疫苗研制[StanekováZ，etal.Conserved epitopes of influenza A virus inducing protective immunity andtheir prospects for universal vaccine development.Virol J 2010，7:351；Guo Y，etal.Highly conserved M2e and hemagglutinin epitope-based recombinant proteinsinduce protection against influenza virus infection.Microbes Infect 2017，19(12):641-647；Paules CI，et al.The pathway to a universal influenzavaccine.Immunity 2017，47(4):599-603]。

除了上述M2e和HA2-FP两个高保守性多肽或它们的亚单位外，IAV-HA0切割位点区域也一直是广受关注的研制通用流感疫苗的潜在靶点，因为HA0被蛋白酶切割为由二硫键共价连接的HA1头部和HA2茎部两个亚单位，是病毒宿主体内复制史中获得其感染性的关键性事件。因而，作为预防流感的一个对策，相关研究人员一直在寻找可抑制蛋白酶切割的治疗用化合物，但欲发现一种广谱蛋白酶化合物抑制剂几无可能，因为IAV-HA0的切割涉及众多来源于不同宿主细胞的蛋白酶，具H亚型特异性[江征.流感病毒血凝素蛋白裂解机制的研究进展.微生物学免疫学进展2014，42：75-78]。

虽然目前一些研究提示存在可抑制胰蛋白酶介导HA0切割的抗体，但它们或识别HA1-C端肽[Nagy Z，et al.The intersubunit region of the influenza Virushemagglutinin is recognized by antibodies during infection.Scand J Immunol1994，40:281-291]，或结合HA2-N端可与宿主细胞膜受体融合的FP肽[Vareckova E，etal.A monoclonal antibody specific to the HA2glycoprotein of influenza A virushemagglutinin that inhibits its fusion activity reduces replication of thevirus.Acta Virol 2003，47:229-236]，但都未能通过抗体识别表位基序鉴定，证明体内抑制蛋白酶功效确由封闭HA0切割位点(R↓G)非构象型抗体所产生。即，上述两篇代表性论文中Z38和CF2多克隆抗体(单抗)的抑制功效，可能是源于它们结合HA1-C端肽和/或HA2-FP后形成空间位阻效应而影响宿主特异蛋白酶对HA0的切割，或是CF2单抗的存在直接妨碍了HA2-FP与宿主细胞膜受体的融合。

另外，即便鉴定出位于HA1-C末端的线性表位肽，由于该区域序列在H亚型间相互差异很大，因而也无可能用作研制通用流感疫苗的候选多肽。总之，若能发现直接作用HA0切割位点的抗体且具广谱性，势必是极其重要的新发现，即它有助于大大促进通用流感疫苗研制的进程。

在疫苗发展史中，化学合成肽疫苗曾被寄希望能成为继病毒灭活/减毒疫苗和亚单位蛋白疫苗之后的第三个里程碑。但是，由于过去受非构象型抗体表位鉴定方法学的限制，仅能知晓采用靶蛋白抗原中1或少数几个表位(可见发现靶蛋白上一个新抗原性表位的难度和不易)的合成肽疫苗，因而其预防功效难以达到人用标准，以致50多年来未见一个化学合成肽疫苗被美国FDA批准上市。随着基因工程技术的发展，上世纪就已形成研发同样属于合成肽疫苗范畴的重组多价多表位肽疫苗的理念和趋势，组合疟原虫生活史中9个特异抗原12个B细胞表位的多价疟原虫疫苗设计，就是具代表性的一例[Shi YP.etal.Immunogenicity and in vitro protective efficacy of a recombinantmultistage Plasmodium falciparum candidate vaccine.Proc Natl Acad SciUSA1999，96，1615–1620]，也因此新发现或知晓更多靶抗原上抗体中和性/保护性表位的重要性及其应用意义。

不难理解，一个真正能充分展现重组多表位肽疫苗功效的关键，是尽可能多地知晓多靶点蛋白抗原中的保护性抗体表位，而实现这一目标自然需要在已有表位鉴定方法上的突破。本发明人为此经多年探索建立了多方面优于经典化学合成肽法的生物合成肽法(也叫基因工程法)[Xu WX，et al.Minimal motif mapping of a known epitope onhuman zona pellucida protein-4using a peptide biosynthesis strategy.J ReprodImmunol.2009，81(1):9-16；Xu WX，et al.A simpler and more cost-effective peptidebiosynthetic method using the truncated GST as carrier for epitopemapping.PLoS One 2017，12(10):e0186097]，其最突出的优点就是能用鼠/兔多抗鉴定较长抗原性肽中的抗体识别表位最小基序，从而为解码任一感兴趣靶抗原的IgG-表位组奠定了基础[Xu WX，et al.Epitomics:IgG-epitome decoding of E6，E7 and L1 proteinsfrom oncogenic human papillomavirus type 58.Sci Rep 2016，6:34686]，也因此有助于发现更多有价值的抗体表位，促进有效重组多表位肽免疫原的分子设计和成功构建。

以上简述，即为本发明主要与持久威胁人类健康的IAV、通用流感疫苗研制的靶点选择、发现新目标表位的需求和所发明表位肽的用途、以及本发明采用技术相关的背景介绍，应能充分反映本发明IAV-HA表位肽在本领域中的重要意义及其实际用途和潜在高效益应用价值，因而也毋容置疑，本发明的抗体保护性表位肽及其扩展表位肽用途都具有发明和制备的知识产权。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在IAV-H亚型中广谱存在、诱发抗体能阻断HA0切割为HA1和HA2亚单位的线性表位最小基序肽(一种非构象型抗体的排他性特征)及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种分离的多肽，所述的多肽长度为6～11aa，且包括式(I)所示的氨基酸序列；

RGXFGA(I)；

其中，X选自氨基酸L或I；

并且，所述的多肽来源于流感A病毒(IAV)。

在一个优选例中，所述的多肽来源于：流感A病毒(IAV)H1～H7、H9～H13、H15～H18亚型和/或部分H8亚型的血凝素蛋白(HA)。

在另一优选例中，所述的多肽为在式(I)所示氨基酸序列的多肽基础上延展的多肽，包括式(II)所示的氨基酸序列；

SIQSRGLFGAI(II)。

在本发明的另一方面，提供一种复合多肽，其包括2拷贝或3拷贝的所述的多肽；较佳地，2拷贝或3拷贝的所述的多肽之间，还包括连接肽；更佳地，所述的连接肽包括(但不限于)：GG或AA。

在本发明的另一方面，提供一种偶联物，包括：(a)所述的多肽或所述的复合多肽；以及(b)与(a)可操作性连接的活性蛋白、载体蛋白或固相载体；较佳地，所述的活性蛋白用于提高(a)多肽的稳定性(包括热稳定性、耐酶稳定性和血清稳定性)，提高活性多肽的半衰期，延长活性多肽的作用时间，和/或提高活性多肽的溶解度；较佳地，所述载体蛋白用于附着或连接(a)多肽；较佳地，所述的固相载体用于附着或连接(a)多肽(一般地，其被用于特异性识别或检测流感A病毒产生的抗体，如基于ELISA或蛋白印迹法的检测)。

在本发明的另一方面，还提供一种分离的核酸，其编码所述的多肽，所述的复合多肽，或所述的偶联物。

在本发明的另一方面，还提供一种重组载体，其包括所述的核酸。

在本发明的另一方面，还提供一种宿主细胞，其包括所述的核酸，或包括所述的重组载体。

在本发明的另一方面，还提供所述的多肽、所述的复合多肽或所述的偶联物的用途，用于：

制备抗流感A病毒的免疫原或疫苗；较佳地，所述的免疫原或疫苗用作免疫生物体；

制备特异性结合、阻断或封闭流感A病毒HA0切割位点R-G，进而抑制流感A病毒感染性的抗体；较佳地，所述的抗体为单克隆抗体，多克隆抗体或单链抗体；较佳地，所述的抗体用于制备流感A病毒感染的治疗药物，或用于制备研究流感A病毒宿主体内复制机制的试剂；或

制备特异性识别或检测流感A病毒的试剂；较佳地，所述的识别或检测基于ELISA或蛋白印迹法，用于鉴定流感疫苗所诱发的目标抗体、检测流感A病毒感染者或感染康复者血清或检测血凝素(HA)抗体库中抗体。

在另一优选例中，所述的流感A病毒是H1～H7、H9～H13、H15～H18亚型和/或部分H8亚型。

在另一优选例中，所述的用途为非诊断目的。

在本发明的另一方面，还提供一种制备抗体的方法，所述方法包括：以所述的多肽、所述的复合多肽或所述的偶联物免疫动物，从而获得抗体；较佳地，所述的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

在本发明的另一方面，还提供一种组合物(较佳地为药物组合物，如疫苗)，包括：所述的多肽，所述的复合多肽或所述的偶联物；以及免疫学或药学上可接受的载体或赋形剂。

在本发明的另一方面，还提供一种药盒或试剂盒，其中包含所述的多肽，所述的复合多肽，所述的偶联物，或所述的组合物。

在本发明的另一方面，还提供一种药盒或试剂盒，其中包含所述的疫苗或所述的偶联物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、印迹阳性18聚肽P36和P37中抗体识别表位最小基序的免疫印迹鉴定。Lane1：P36，2：P37，3：8聚短肽SP7；4：SP8；5：SP9；6：SP10；和Lane 7；SP11。方框分别代表印迹阳性P36和P37重叠区氨基酸序列以及确定表位最小基序的3个印迹阳性SP肽中共有序列。抗体识别表位最小基序鉴定使用了16个SP肽，此简明图省略了SP1-SP6和SP11-SP16肽印迹阴性结果。

图2、A/H1N1-HA抗血清与IAV亚型/突变株和IBV株突变SP肽的免疫印迹鉴定。Lane1，阳性对照H1N1/HA-SP5；2，H3N2突变株SP17；3，H8N2亚型突变株SP18；和4，IBV-B/Lee/40株SP19。方框指示各SP肽序列中的突变残基和位点。

图3、兔单价HA表位肽疫苗抗血清识别肽序列的免疫印迹鉴定。Lane 1，SP6；Lane2，SP7；Lane 3，SP8；Lane 4，SP9；Lane 5，SP10；Lane 6，SP11；Lane 7，SP12；和Lane 8，SP13。

图4、小鼠单价HA表位肽疫苗抗血清识别肽序列的免疫印迹鉴定。Lane 1，SP6；Lane 2，SP7；Lane 3，SP8；Lane 4，SP9；Lane 5，SP10；Lane 6，SP11；Lane 7，SP12；Lane 8，SP13。

图5、表1的比对数据。

具体实施方式

本发明人经过深入地研究和反复地筛选，首次定位到一种来自于流感A病毒(IAV)的特定精细表位基序，其由HA1-C末端的“R”和HA2-N端与R相连的“GXFGA”残基组成，即RGXFGA(X选自氨基酸L或I)。所述的精细表位基序在多种IAV亚型中存在(包括：IAV的H1～H7、H9～H13、H15～H18亚型和/或部分H8亚型)。由于该表位肽所处位置正好位于流感A病毒的HA0切割位点，这一发现意义深远。利用含有该表位的多肽，可以制备抗IAV的免疫原(与其它表位组合构建多表位肽免疫原)，或制备特异性抗IAV的抗体，所获得的免疫原或抗体可用于IAV的防治和诊断。

术语

如本文所用，“分离的多肽(短肽)”、“本发明的多肽(短肽)”、“基序肽”、“表位肽”、“表位”、“抗原表位”、“最小基序”或“最小基序表位肽”可互换使用，均是指本发明中以式(I)表示的肽。

如本文所用，所述的“扩展肽”、“延展肽”或“扩展(延展)的多肽”可互换使用，是指在所述基序肽基础上两端增加一个或若干个氨基酸残基后形成的肽，例如，其是以式(II)表示的肽。

如本文所用，所述的“复合多肽”是指包含2拷贝或多拷贝的本发明所述的多肽或其扩展肽的肽。

如本文所用，所述的“抗原性肽”是指靶蛋白抗原中未经过抗体识别表位最小基序肽的一段较长抗体反应性肽，如本文提及用于第一轮靶蛋白抗原性肽扫描作图的18聚肽(融合蛋白)。

如本文所用，所述“表位”或“表位肽”是指对较长抗体反应性肽段完成特定抗体所识别最小基序肽鉴定的短肽，具有类似抗原性肽相对完整蛋白抗原的优点，还包括因此可通过同源蛋白序列比对知晓其具有的特异性或广谱性。目前已知道非构象型抗体识别表位肽的长度在3～8个氨基酸残基之间[Hodges RS，et al.Antigen-antibodyinteraction.Synthetic peptides define linear antigenic determinantsrecognized by monoclonal antibodies directed to the cytoplasmic carboxylterminus of rhodopsin.J Biol Chem 1988，263:11768-11775]，但由于以前受方法学的限制，常常将未经抗体识别基序鉴定的大于8聚肽甚至37聚抗原性肽都称之为“表位”[Maier RH，et al.Epitope Mapping of Antibodies Using a Cell Array-BasedPolypeptide Library.J Biomol Screen.2010，15:418-426]。作为常识，免疫学界人士一般不会将抗原“蛋白”称为“抗原性肽”或将“抗原性肽”称为“表位”。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“HA或HA0蛋白”是指存在于IAV的一种血凝素蛋白或其前体，本发明中，IAV亚型/突变株的HA蛋白编码基因序列和蛋白质一级结构序列分别依据它们的代表性亚型，如人H1N1、H2N2和H3N2，禽流感H5N1、H7N9和H9N2以及H8N4和H14N8亚型，它们的GenBank登录号依次分别为：ACP41105、AAA64366、ACF54455(和AAZ32953)、ACZ48514、AGL44438、AB432938、ABK32094和CY133553。

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

如本文所用，抗体的“特异性”是指抗体能结合于本发明所述IAV的HA蛋白或片段，特别指那些能与所述IAV的HA蛋白结合的抗体。

基序表位肽、其扩展肽及复合多肽

本发明人经过大量的研究和筛选，获得了来自流感A病毒的最小基序表位肽，其由HA1-C最末端的“R”和HA2-N端与R相连的“GXFGA(X选自氨基酸L或I)”残基组成(RGXFGA)。本发明中，所述的HA蛋白可以是具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽或其变体。

本发明的最小基序表位肽的发现过程如下：本发明人在揭示A/H1N1-2009亚型株HA的IgG-表位组研究过程中，用兔HA多抗和生物合成60个18聚抗原性肽(P1～P60)进行第一轮扫描作图，产生了能被三只兔以上抗血清识别的28个抗原性肽(最终鉴定出22个表位)。经过序列对比分析，发现其中P36和P37相邻肽的重叠区可能存在1个涉及HA0切割位点的表位，即它们都包含了“R”切割位点之前HA1-C末端的2个残基和之后HA2-N端的最前面6个残基。因为重叠区两端P36-N和P37-C端的九肽，理论上也可能存在1或2个抗体表位。因此，为确定两个抗原性肽中存在的表位数以及抗体识别序列，继而采用独特策略，对相邻P36和P37的全长序列(27肽)开展抗体识别精细表位基序鉴定，最终形成本发明的技术方案。

本发明人的实验结果表明，如图1所示，证明P36和P37代表的全长27肽仅存在一个位于重叠区的表位，且此表位序列(RGLFGA)显示其抗体可封闭HA0切割位点(R↓G)。同时，经过调取GenBank数据库18个IAV-H亚型及其突变株的同源HA蛋白序列进行比对，发现由于仅包含HA1-C端(极易发生突变)最后1个残基“R”，连同在IAV间完全保守的HA2-N端5个残基(表1)，确定了本发明的表位肽在IAV间范围极宽的广谱保守性，即它在18个IAV的16个H亚型和1个部分H8亚型HA中几乎100％保守地存在，唯H14亚型是完全例外。显而易见，此表位广谱性的确定大大提升了本发明的表位肽的未来潜在应用价值。

基于本发明人的新发现，提供了一个线性抗体表位的最小基序肽，它具有覆盖HA0切割位点所示RGLFGA氨基酸序列，并且所述的多肽可来源于全部16个H亚型和部分H8亚型的HA蛋白，唯H14-HA完全例外(HA0切割位点的HA1-C端的最后1个残基“R”突变为“K”残基，并如图2所示，导致对应位置的八肽未被H1N1-HA抗血清识别)。

作为本发明的优选方式，所述的多肽具有SEQ ID NO:1(RGLFGA)所示的氨基酸序列，其扩展肽具有SEQ ID NO:2(SIQSRGLFGAI)所示的氨基酸序列。

本发明的最小基序肽或其延展肽可以以单拷贝存在，也可以以双拷贝或多拷贝的形式存在。当多拷贝(包括双拷贝)的形式存在时，一般将其称为单表位多价(包括双价)的肽，用于制备单表位多价的疫苗。优选地，以多拷贝(包括双拷贝)的形式存在时，每一拷贝之间以连接肽进行连接，所述的连接肽包括(但不限于)：GG或AA。

本发明的最小基序肽或其延展肽可以与其它的基序肽、抗原表位或抗原性肽进行连接，获得多价(包括双价)的肽，用于制备多表位(包括双表位)多价的疫苗。

一旦获得了所述多肽(包括基序表位肽、其扩展肽及复合多肽)的序列，就可以通过化学合成或重组表达的方法来生产所述的多肽。所谓重组表达，就是通常将表位肽的编码DNA片段正负链退火后重组插入克隆载体，再转入感受态细胞，然后通过常规方法从培养增殖后的转化细胞中分离得到序列正确的表位短肽融合蛋白。就本发明的表位肽而言，也可采用化学合成方法，即通过多肽合成仪合成目的序列短肽，从而简便快速地获得所需要的目标表位肽。

偶联物

本发明的最小基序肽、其延展肽或复合多肽适用于与多种多样的活性蛋白或多肽进行化学偶联。所述的活性蛋白或多肽用于提高本发明的最小基序肽、其延展肽或复合多肽的稳定性(包括热稳定性、耐酶稳定性和血清稳定性)，延长半衰期，延长生物活性作用时间和/或提高溶解度等。

本发明的最小基序肽、其延展肽或复合多肽还能够与一些载体蛋白连接，或附着倒载体蛋白上。本领域公知，当免疫原序列较短或为小分子时，在体内可能会存在免疫原性较弱的情形，因此，可以将此类免疫原连接(偶联或附着)到载体蛋白上，制备免疫原性更强的抗原。所述的载体蛋白是本身没有或具有很低的免疫原性的一类生物大分子，例如所述的载体蛋白选自：牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、血蓝蛋白(KLH)。

应理解，当本发明的最小基序肽、其延展肽或复合多肽与一些载体蛋白连接或附着于其上后，发挥免疫原性作用并促进抗体产生的主体仍然是本发明的最小基序肽、其延展肽或复合多肽。

本发明的最小基序肽、其延展肽或复合多肽还能够与一些固相载体连接，用于进行流感A病毒或病毒疫苗所诱导产生的抗体的识别和检测。本发明对所采用的固相载体没有特别的限制，可以如多孔板，玻片，微球，金属片，试纸等。

用途

本发明还提供了所述最小基序肽、其扩展肽、复合多肽或偶联物在制备“通用”预防性/治疗性HPV重组多表位肽疫苗中的应用。

在本发明的具体实施例中，为验证本发明的表位肽在不同动物中的免疫原性，用化学合成并与钥孔血蓝蛋白(KLH)载体偶联的扩展表位肽作为疫苗，结果在免疫兔和小鼠中都产生了可识别同样六肽表位的抗体，提示兔和小鼠免疫系统确实可识别H1N1-HA此相同抗原性位点。因此，化学合成或重组表达含此表位基序的多肽，可用作验证流感疫苗特定抗体生成的检测抗原，或作为免疫原制备小鼠单抗、基因工程抗体或鼠/兔多抗，用作抑制人IAV感染性的治疗用广谱抗体药物，或用此表位肽研制人/禽类用’通用’单价/多价预防性重组多表位肽流感疫苗。

本发明同时提供所鉴定的表位最小基序肽及其扩展肽，在制备用于ELISA和蛋白印迹法检测目标抗体的肽抗原、以及制备用于流感治疗用单抗或基因工程抗体、或作为单/多抗抑制剂研究确定不同IAV亚型HA0切割对应特异蛋白酶中的应用。

抗体药物或作为研究试剂，可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备(见Kohler G，et al.Continuous cultures of fused cells secreting antibody ofpredefined specificity.Nature 1975，256:495-497；Wrammert J，et al.Broadlycross-reactive antibodies dominate the human B cell response against2009pandemic H1N1 influenza virus infection.J Exp Med 2011，208:181-193)。例如，纯化的本发明扩展肽(或与其它载体串联表达的融合肽)可作为免疫原用于制备动物抗血清(多抗)或制备鼠源单抗、嵌合、人源化、全人单抗，或通过PCR扩增免疫动物或IAV感染者体内浆细胞内抗体基因片段获得基因工程目的抗体。此类单抗可以利用成熟的杂交瘤技术来制备。特定多抗可用本发明的扩展肽免疫家兔和小鼠等动物后获得。

本发明的表位肽的最大价值，还在于提供其扩展肽在制备人用单价/多价“通用”预防性重组肽疫苗，和/或制备单价/多价“通用”预防性禽流感疫苗中的应用。

药物组合物

本发明还提供了一种组合物(药物组合物)，含有所述最小基序肽、其扩展肽、复合多肽或偶联物，以及药学上可接受的载体。所述的组合物可以是预防性或治疗性疫苗。

“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质；如本领域常用的药物载体或赋形剂。该术语可以是这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s PharmaceuticalSciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和山梨醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂，如白蛋白等。

本发明所述的最小基序肽、其扩展肽、复合多肽或偶联物通常是“有效量”的，“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

可将所述的组合物(疫苗)制成各种适合于哺乳动物给药的剂型，所述剂型包括但不限于：注射剂、胶囊剂、片剂、乳剂、栓剂。

在使用时，是将安全有效的本发明所述的组合物施用于哺乳动物(如人)。具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明还提供了一种药盒或试剂盒，所述的药盒或试剂盒中含有所述最小基序肽、其扩展肽、复合多肽、偶联物或组合物。较佳地，所述的药盒或试剂盒中还可包含说明使用方法的使用说明书。

当用于检测目的时，所述的药盒或试剂盒中还可含有可检测标记物、显色剂或抗抗体等，这是本领域技术人员易于理解和运用的。

本发明可进一步通过下列实例描述。列举实例并不意味限制本发明所涉及的范围，该范围在之前的描述中已被充分陈述阐明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可按照常规条件以及[美]J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔编著、黄培堂等翻译的第三版“分子克隆：实验室手册”(科学出版社，2002)和[美]E.哈洛和D.莱恩编著沈关心等翻译的“抗体技术实验指南”(科学出版社，2002)中所述的步骤，或按照生产销售商建议的条件进行。

材料和方法

1.依据GenBank No.FJ966082公开信息的A/California/2009(H1N1)毒株HA编码基因由上海捷瑞生物技术公司合成。本发明使用的靶蛋白HA重组表达原核质粒pET28b，和专门用于表达相互重叠9残基的系列18聚抗原性肽(P1～P60)和相互重叠7残基系列8聚肽(SP)以及个别亚型/突变株SP短肽(SP1～SP19)的原核质粒pXXGST-3，参见Xu WX，etal.PLoS One 2017，12(10):e0186097。

2.新西兰白兔和Balb/c小鼠分别购自上海市松江区松联实验动物场和上海吉辉实验动物饲料有限公司。

3.H1N1-HA的原核重组表达、兔抗HA抗血清制备、抗血清滴度ELISA测定(ELISA测定四只免疫家兔抗血清的抗体滴度均达到1:200000或以上)和H1N1-HA表位组扫描作图的第一轮抗原性肽筛选鉴定由本发明人完成。结果，确定含P36和P37的28个印迹阳性抗原性肽。

4.转化宿主菌BL21(DE3)、BamH I、Sal I等限制性内切酶和T4 DNA连接酶，购自大连酶宝生物工程有限公司。KLH偶联载体蛋白、氨苄青霉素(Amp)、预染蛋白分子量标准、辣根过氧化酶标记的羊抗兔/鼠二抗(IgG/HRP)和0.2μm硝酸纤维素膜，购自上海生工生物技术服务公司。免疫印迹用化学发光ECL检测试剂盒购自上海GE公司。ELISA试剂购自上海冠泰生物科技有限公司。

5.覆盖A/H1N1-HA全长序列相互重叠9个残基的P1～P6018聚肽编码互补正负链DNA片段(两端分别为BamH I和Sal I-TAA粘性末端)，以及覆盖P36和P37全长27肽相互重叠7个残基的SP1～SP19八肽编码互补正负链DNA片段，由上海赛百盛生物技术公司合成。免疫用双拷贝表位扩展肽(SIQSRGLFGAI-GG-SIQSRGLFGAI)的化学合成，之后与钥孔血蓝蛋白(KLH)载体的偶联由上海博尚生物技术有限公司完成。

6.用于本发明的表位肽比对同源蛋白保守性分析的全部18个IAV-H亚型/突变株以及代表性IBV株HA序列，依据GenBank的公开信息。表1(图5)仅选择性提供了它们中代表性IAV亚型/突变株和1个IBV株的GenBank登录号；表中，方框指示对应本发明的表位肽的其它IAV亚型/突变株和IBV株的突变残基和位置。黑体+下划线指示对应本发明的表位肽的其它亚型100％保守性肽序列。

表1代表性IAV亚型HA0切割位点两端的HA1-C和HA2-N端肽序列比对

实施例1、用兔抗A/H1N1-HA多抗的覆盖HA0切割位点精细表位鉴定

IAV-HA0被胰蛋白酶(trypsin)、菠萝蛋白酶(bromelain)，嗜热菌蛋白酶(thermolysin)、弹性蛋白酶(elastase)、血纤维蛋白溶酶(plasmin)、和胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)等宿主细胞特异性蛋白酶切割成HA1和HA2亚单位，是决定IAV亚型在宿主体内形成感染性的关键事件。本发明人经过深入研究，推测印迹阳性P36和P37肽重叠区可能存在一个涉及HA0切割的非构象型抗体表位。继而，为证实这一可能具有重大发现意义的推断，本发明人通过构建表达一组覆盖P36和P37全长序列相互重叠7个残基的16个SP短肽(融合蛋白)，在完成它们的SDS-PAGE电泳和转印至硝酸纤维素膜后，使用兔抗A/H1N1-HA抗血清进行特定抗体识别表位最小基序肽的印迹鉴定。

具体实验步骤简述如下：

用ddH₂O双蒸水将1或2个OD化学合成的各SP编码互补正负链片段溶解成20μmol/μl储存液(根据DNA合成报告单数据)；各取10μl储存液和20μl ddH₂O于1.5ml Eppendorf管中，94℃水浴加热5min，自然降至室温后，在15μl反应体积中吸入2μl退火片段(约200ng/μl)、经BamH I和Sal I双酶切的pXXGST-3质粒(自带GST188载体蛋白编码序列)、1μl T4 DNA连接酶和其1.5μl缓冲液，连接过夜；连接液转化感受态BL21(DE3)宿主菌，涂布含Amp的LB平板上，于37℃培养过夜；第二天挑取在添加Amp的LB平板上生长的单克隆细胞转接3ml LB培养液中进行诱导表达，各表达的GST188-SP(SP1～SP16)融合蛋白经15％SDS-PAGE分析确认(非重组子克隆不出现约23.5kDa表达条带，18聚肽融合蛋白通常显示接近25kDa的条带，两者相差约1kDa的表达条带可通过延长电泳时间充分展现)，挑取重组克隆外送进行DNA测序验证。

将目的插入片段测序结果正确的克隆接种加入Amp的3ml LB培养液中，于30℃振荡培养过夜，翌日晨按1/50比例转接新鲜含Amp的LB培养液中，30℃振荡培养2～3h至菌体浓度达到0.6～0.8OD值后，调高温度至42℃热诱导4h，离心收集菌体，加入电泳上样裂解液煮沸5min后置于-20℃储存备用。

将诱导的细菌总蛋白样品同时走15％SDS-PAGE凝胶电泳，结束后一块凝胶用考马斯亮蓝染色用作必要时确认目的条带表达的对照，另一块进行将凝胶中蛋白转印至硝酸纤维素膜上的电转移(100mA，2h)，用丽春红染色转印膜2min，在浅红色显示的目的SP融合蛋白条带处用针头打孔标记，洗掉丽春红染色。

转印膜用PBS缓冲液反复洗涤四次，用5％脱脂奶粉封闭过夜，PBS缓冲液洗涤四次，于10ml反应液中加入1μl兔抗H1N1-HA抗血清作为一抗(1:10000稀释)，室温反应2h，PBS缓冲液洗涤后加入5μl羊抗兔IgG/HRP二抗(1：2000稀释)，室温反应1h，用PBS缓冲液洗涤后进行ECL化学发光显色，依据免疫印迹显色确认印迹反应性SP(融合蛋白)。

最终免疫印迹鉴定结果如图1所示，除阳性对照反应性P36和P37条带外，另外3个SP8～SP10条带也呈现免疫印迹阳性反应(注：在另一用全部SP1～SP16短肽的印迹实验中SP1～SP6和SP12～SP16也都为阴性反应结果)。因此，最终依据图1中方框显示的它们之间共有序列RGLFGA，确定兔H1N1-HA多抗中的一种抗体识别的表位最小基序为六肽，后文中称为“本发明的表位肽”。

上述鉴定结果指示，本发明的表位肽存在于P36和P37肽的九肽重叠区，排除了相邻P36和P37肽中其它抗体表位的存在，且显而易见，此表位诱发的抗体确实靶向并能封闭HA0切割位点R-G。

实施例2、A/H1N1-HA表位肽在IAV/IBV同源蛋白中的广谱性分析

鉴定出该IAV靶蛋白抗原表位后，本发明人进一步研究其在同源蛋白中的特异性和保守性特征，前一特征可用于制备IAV亚型/突变株的特异检测抗原，后一特征则能被用作研制单价/多价广谱重组肽流感疫苗的免疫原(表位)。

因此，为了展现本发明的表位肽的更多更有价值的用途，本发明人基于获得的精细表位基序的优势和GenBank数据库中18个IAV-H亚型/突变株HA信息，进行基于精细表位基序的同源蛋白序列比对，获得了以往难以企及且结果更为明晰可信的结果。也就是，本发明人发现这一表位肽在16个H亚型和1个部分H8亚型HA几乎100％保守性地存在，除了检索的全部H14亚型(其HA1-C端的最后1个残基都由“R”突变为“K”，部分H8亚型也发生同样的突变)。

这一结果表明，本发明的表位是一可覆盖几乎全部IAV-H亚型的广谱保守性表位，是研制人/禽通用流感疫苗的一个新理想候选表位。

表1中，展示了本发明表位基序与若干具代表性意义的人IAV和部分感染人禽类IAV亚型株/突变株HA0切割位点两端序列比对的结果。有一点十分清楚，若本发明不对具抗原性的相邻P36和P37肽或其重叠区进行抗体识别表位基序精细鉴定，就认定重叠区九肽，甚至认定P36或P37长肽为表位/表位肽，显然就无法通过同源蛋白序列比对而确定其在IAV亚型之间确切可信的广谱性范围。仅凭表1所显示各亚型/突变株HA重叠区切割位点R残基之前HA1-C末端2个残基的差异性，就使得其广谱范围无法断定或大为缩小收窄，除非不可想象地用H1N1-HA抗血清对那些显示残基差异的亚型/突变株逐一开展费时费力的IAV病毒或HA蛋白中和实验。总之，本发明中表位肽的发现过程充分表明了在确定了一个抗原性肽后，继续对其进行抗体识别表位最小基序肽鉴定的重要性。

实施例3、A/H1N1-HA抗血清与IAV-HA切割位点突变肽的交叉反应性鉴定

尽管已知IAV亚型间HA切割位点R↓G和HA2-FP具有高度保守性，但通过检索大量IAV亚型/突变株HA同源HA蛋白序列并进行比对，可发现本发明的表位肽中存在三个残基的突变位点。此处将本发明的表位肽N端的第一个残基确定为位点+1，往后依次类推分别表述为+3和+4。表1提示的三个突变点中尤以+3“L”突变为“I”残基的为多，且涉及若干IAV亚型。例如：H3N2突变株的A/Dunedin/73(AF201842)、A/Moscow/2003(AAZ32953)、A/Brisbane/2007(ABW23353)和A/Kenya/2017(ASV62056)，以及仅为个例的H6N1亚型的A/chicken/Taiwan/05(ABD35556)和H9N1的A/laughing gull/Delaware Bay/2003(ABB19481)株。由此会产生一个问题，即本发明的表位肽抗体与它们是否具有交叉反应性或抗病毒感染性保护作用？

为给出对上述问题的解答，于是本发明人构建表达了表1中H3N2突变株于+3位点发生“I”残基突变的H3N2-SP17、以及于+1和+4位点突变的H8N2-SP18和IBV-B/Lee/40株-SP19，合计3个SP肽(融合蛋白)，并用兔A/H1N1-HA抗血清进行了免疫印迹鉴定。

结果如图2所示，H1N1-HA抗血清仅与H3N2-SP17产生交叉反应，进而提示，本发明的表位肽诱发的抗体对发生上述突变的人H3N2突变株以及禽流感H6N1和H9N2突变株的感染，同样具有抗体保护作用。相反，由于与发生+1位“K”和+4位“F”突变的H14、部分H8亚型和IBV株SP无交叉反应性，因而提示H1N1-HA抗血清对它们的感染无交叉保护功效。

实施例4、本发明的表位肽疫苗在兔和小鼠中的免疫原性鉴定

兔和小鼠免疫系统之间能对靶蛋白特定位点肽段产生同样的免疫应答，也存在一定的识别差异性，如小鼠抗人乳头瘤病毒(HPV)58型L1-假病毒样蛋白抗血清，仅能识别用兔抗重组HPV58-L1蛋白抗血清解码由18个表位组成的表位组中13个表位，与剩余下5个抗原性位点无交叉反应性(Xu WX，et al.Sci Rep 2016，6:34686)。另外，众所周知，有关IAV表位和抗体的研究，通常用小鼠进行抗IAV致命攻击实验作为动物模型。因此，有必要了解本发明的表位肽能否在作为流感病毒研究常用动物模型的小鼠体内产生相应抗体。众所周知，人和小鼠基因组高度同源性，因而本领域中人用治疗性药物研制，特别是抗流感病毒抗体药物研究基本上都以小鼠为动物模型。

虽然如表1所示，本发明的表位肽在A/H7N9-HA中100％保守，但在本发明人同时完成解码的A/H7N9-HA表位组中，却并未发现这一抗体表位的存在，提示在IAV/HA2-FP完全保守的情况下，本发明的表位肽第一个“R”残基之前H7N9/HA1-C末端若干残基的差异性，可能是影响H7N9-HA未能产生相同切割位点抗体的一个原因。因此，为确保至少对照实验兔能生成目的抗体，设计了本发明式II所含六肽表位基序的扩展肽(SIQSRGLFGAI)，并为增强其免疫原性，采用化学合成方法构建了以2个甘氨酸(GG)残基相连接，并与KLH偶联的单表位双价免疫原(SIQSRGLFGAI-GG-SIQSRGLFGAI)。

动物免疫使用完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂，按常规的初次兔免疫采用1毫克与KLH偶联双价合成肽抗原，小鼠免疫剂量则为100微克偶联物抗原；间隔二周的二次加强免疫，抗原注射剂量分别减半(0.5毫克/次和50微克/次)；最后一次加强免疫后，抽取免疫动物抗血清，进行ELISA抗体滴度测定(抗体滴度非常高，免疫兔的抗体滴度为1:200000和免疫小鼠的抗体滴度为1:10000)后放于-20℃冰箱储存备用。

用兔和小鼠抗双价表位肽抗血清的表位基序识别鉴定实验操作，见前述实施例1。结果如图3和图4所示，兔和小鼠免疫血清都产生了识别是可体现抗体最主要特征的同样基序的六肽。

这些结果显示，本发明表位的扩展肽具有良好免疫原性的同时，也为其用作单价或多价通用流感肽疫苗免疫原的小鼠抗IAV攻击抗体保护性实验研究奠定了基础。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。需要说明的是，有一点对于相关领域研究技术人员来说是显而易见的，即在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对本发明的最小表位肽和其融合蛋白作各种变化改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。

序列表

<110> 上海市计划生育科学研究所

<120> H1N1流感病毒血凝素可诱发广谱保护性抗体的表位肽及其应用

<130> 192875

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 流感A病毒(Influenza A virus)

<400> 1

Arg Gly Leu Phe Gly Ala

1 5

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> 流感A病毒(Influenza A virus)

<400> 2

Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile

1 5 10

<210> 3

<211> 566

<212> PRT

<213> 流感A病毒(Influenza A virus)

<400> 3

Met Lys Ala Ile Leu Val Val Leu Leu Tyr Thr Phe Ala Thr Ala Asn

1 5 10 15

Ala Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr

20 25 30

Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn

35 40 45

Leu Leu Glu Asp Lys His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Arg Gly Val

50 55 60

Ala Pro Leu His Leu Gly Lys Cys Asn Ile Ala Gly Trp Ile Leu Gly

65 70 75 80

Asn Pro Glu Cys Glu Ser Leu Ser Thr Ala Ser Ser Trp Ser Tyr Ile

85 90 95

Val Glu Thr Pro Ser Ser Asp Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Asp Phe

100 105 110

Ile Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe

115 120 125

Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Thr Ser Ser Trp Pro Asn His Asp

130 135 140

Ser Asn Lys Gly Val Thr Ala Ala Cys Pro His Ala Gly Ala Lys Ser

145 150 155 160

Phe Tyr Lys Asn Leu Ile Trp Leu Val Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro

165 170 175

Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Ile Asn Asp Lys Gly Lys Glu Val Leu Val

180 185 190

Leu Trp Gly Ile His His Pro Ser Thr Ser Ala Asp Gln Gln Ser Leu

195 200 205

Tyr Gln Asn Ala Asp Thr Tyr Val Phe Val Gly Ser Ser Arg Tyr Ser

210 215 220

Lys Lys Phe Lys Pro Glu Ile Ala Ile Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln

225 230 235 240

Glu Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Val Glu Pro Gly Asp Lys

245 250 255

Ile Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Val Val Pro Arg Tyr Ala Phe

260 265 270

Ala Met Glu Arg Asn Ala Gly Ser Gly Ile Ile Ile Ser Asp Thr Pro

275 280 285

Val His Asp Cys Asn Thr Thr Cys Gln Thr Pro Lys Gly Ala Ile Asn

290 295 300

Thr Ser Leu Pro Phe Gln Asn Ile His Pro Ile Thr Ile Gly Lys Cys

305 310 315 320

Pro Lys Tyr Val Lys Ser Thr Lys Leu Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg

325 330 335

Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly

340 345 350

Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr

355 360 365

His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Leu Lys Ser

370 375 380

Thr Gln Asn Ala Ile Asp Glu Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile

385 390 395 400

Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn His

405 410 415

Leu Glu Lys Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe

420 425 430

Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn

435 440 445

Glu Arg Thr Leu Asp Tyr His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu

450 455 460

Lys Val Arg Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly

465 470 475 480

Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Thr Cys Met Glu Ser Val

485 490 495

Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu

500 505 510

Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Thr Arg Ile Tyr

515 520 525

Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Val

530 535 540

Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu

545 550 555 560

Gln Cys Arg Ile Cys Ile

565

Claims

1.一种分离的最小基序表位多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为式(I)或式(II)所示；

RGLFGA (I)；

SIQSRGLFGAI (II)；

并且，所述的多肽来源于流感A病毒。

2.一种复合多肽，其为SIQSRGLFGAI-GG-SIQSRGLFGAI所示的多肽。

3. 一种偶联物，其特征在于，包括：

(a) 权利要求1所述的多肽或权利要求2所述的复合多肽；以及

(b) 与(a)可操作性连接的活性蛋白、载体蛋白或固相载体。

4.如权利要求3所述的偶联物，其特征在于，所述的活性蛋白用于提高所述多肽的稳定性，提高所述多肽的半衰期，延长所述多肽的作用时间，和/或提高所述多肽的溶解度。

5.如权利要求3所述的偶联物，其特征在于，所述载体蛋白用于附着或连接所述多肽。

6.如权利要求3所述的偶联物，其特征在于，所述的固相载体用于附着或连接所述多肽。

7.权利要求2所述的复合多肽或权利要求3所述的偶联物的用途；其特征在于，用于：

制备抗流感A病毒的免疫原或疫苗；

制备特异性结合、阻断或封闭流感A病毒HA0切割位点R-G，进而抑制流感A病毒感染的抗体；或

制备特异性识别或检测流感A病毒的试剂；

其中，所述的流感A病毒是流感A病毒H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H7N9、H8N4或H9N2亚型。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的免疫原或疫苗用作免疫生物体。

9.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体；并且，所述的抗体用于制备流感A病毒感染的治疗药物，或用于制备研究流感A病毒宿主体内复制机制的试剂。

10.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的识别或检测基于ELISA或蛋白印迹法，用于鉴定流感疫苗所诱发的目标抗体、检测流感A病毒感染者或感染康复者血清或检测血凝素抗体库中抗体。

11.一种制备抗体的方法，其特征在于，所述方法包括：以权利要求2所述的复合多肽或权利要求3～6任一所述的偶联物免疫动物，从而获得抗体。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

13.一种组合物，其特征在于，包括：权利要求2所述的复合多肽或权利要求3～6任一所述的偶联物；以及免疫学或药学上可接受的载体或赋形剂。

14.一种试剂盒，其中包含权利要求1所述的多肽，权利要求2所述的复合多肽，权利要求3～6任一所述的偶联物，或权利要求13所述的组合物。