JP2023524054A - ベータコロナウイルスの予防と治療 - Google Patents

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Abstract

ターゲティングユニット、二量体化ユニット、および抗原ユニット（当該抗原ユニットは少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープを含む）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを免疫学的に有効な量で含むワクチンが開示されている。この抗原は抗原提示細胞を標的としているため、体内でこの抗原が産生されることから、本ワクチンは、より低い／少ない用量を用いて迅速で強力な免疫応答を誘導することができるためパンデミックとエピデミックにとって理想的である。

Description

本発明は、ベータコロナウイルスに対する治療と予防のワクチン（コロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）などに対するワクチンなど）に関する。
本発明は、典型的なワクチンに比べて少ない用量を用いて迅速で強力な免疫応答を誘導することができるためパンデミックおよびエピデミックと戦うのに理想的なワクシボディ（ｖａｃｃｉｂｏｄｙ）コンストラクトを含むワクチンに関する。なぜならこの抗原は抗原提示細胞を標的としているため、体内でこの抗原が産生されるからである。このワクシボディコンストラクトは、完全長スパイクタンパク質またはその一部；または選択されたＴ細胞エピトープ（例えば異なるベータコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶとＳＡＲＳ－ＣｏＶ２など）の間で保存されているもの）を通じて；またはこれらの組み合わせを通じて抗原効果を誘導する設計にされている。
体内でこれら抗原性エピトープを例えば抗ｐａｎ ＨＬＡクラスＩＩまたはＭＩＰ－１αを通じて標的とすることにより、免疫応答がＢ細胞および／またはＴ細胞を通じて生じるため、予防設定と治療設定でこのワクチンを使用することができる。
図面の説明
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の完全長スパイクタンパク質（配列番号２３０）
Ａ：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質のＲＢＤの代表的な配列（配列番号２３１）。Ｂ：実施例のＶＢ１０．ＣＯＶ２コンストラクトで使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２武漢株のスパイクタンパク質のＲＢＤ配列（配列番号８０２）。Ｃ：実施例のＶＢ１０．ＣＯＶ２コンストラクトで使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２南アフリカバリアントＢ．１．３５１のスパイクタンパク質のＲＢＤ配列（配列番号８０３）。Ｄ：実施例のＶＢ１０．ＣＯＶ２コンストラクトで使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＵＫバリアントＢ．１．１．７のスパイクタンパク質のＲＢＤ配列（配列番号８０４）。Ｅ：実施例のＶＢ１０．ＣＯＶ２コンストラクトで使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２カリフォルニアバリアントＢ．１．４２７のスパイクタンパク質のＲＢＤ配列（配列番号８０５）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＳＡＲＳ－ＣｏＶのスパイクタンパク質のＨＲ２ドメイン（配列番号２３２）
ｈＭＩＰ１α（ＬＤ７８ｂ）のシグナルペプチドと成熟ペプチド、ＩｇＧ３からのヒトヒンジ領域１、ＩｇＧ３からのヒトヒンジ領域４、グリシン－セリンリンカー、ＩｇＧ３のヒトＣＨ３ドメイン、およびグリシン－ロイシンリンカーのアミノ酸配列（配列番号２３３）。配列を「｜」によって分割し、この配列のさまざまな部分を識別しやすくしてある
：シグナルペプチド（アミノ酸１～２３）と成熟ペプチド（ｈＭＩＰ１α／ＬＤ７８－ベータ、アミノ酸２４～９３）を含むＣ－Ｃモチーフケモカイン３様１前駆体（配列番号２３４）
：シグナルペプチド（配列番号２３５）
シグナルペプチド（配列番号２３６）
ＶＢ２０４０の抗原ユニットのアミノ酸配列（配列番号２３７）
ＶＢ２０４１の抗原ユニットのアミノ酸配列（配列番号２３８）
ＶＢ２０４２の抗原ユニットのアミノ酸配列（配列番号２３９）
ＶＢ２０４３の抗原ユニットのアミノ酸配列（配列番号２４０）
ＶＢ２０４４の抗原ユニットのアミノ酸配列（配列番号２４１）
ＶＢ２０４５の抗原ユニットのアミノ酸配列（配列番号２４２）
ＶＢ２０４６の抗原ユニットのアミノ酸配列（配列番号２４３）
ＶＢ２０４７の抗原ユニットのアミノ酸配列（配列番号２４４）
ＶＢ２０４８の抗原ユニットのアミノ酸配列（配列番号２４５）
ＶＢ２０４９の抗原ユニットのアミノ酸配列（配列番号２４６）
ＶＢ２０５０の抗原ユニットのアミノ酸配列（配列番号２４７）
：ＶＢ２０５１の抗原ユニットのアミノ酸配列（配列番号２４８）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＳＡＲＳ－ＣｏＶのスパイクタンパク質の代替ＨＲ２ドメイン（配列番号２４９）
ＶＢ２０５３の抗原ユニットのアミノ酸配列（配列番号２５０）
ＶＢ２０５４の抗原ユニットのアミノ酸配列（配列番号２５１）
Ａ．ＶＢ２０４９のヌクレオチド配列（配列番号２５２）、Ｂ．ＶＢ２０４９のアミノ酸配列（配列番号２５３）。このヌクレオチド配列は、ターゲティングユニットｈＭＩＰ－１α、ｈＩｇＧ３のｈ１とｈ４とＣＨ３ドメインを含む二量体化ユニット、および短いＲＢＤドメインを有するＶＢ２０４９タンパク質をコードしている。
Ａ．ＶＢ２０６０のヌクレオチド配列（配列番号２５４）、Ｂ．ＶＢ２０６０のアミノ酸配列（配列番号２５５）。このヌクレオチド配列は、ターゲティングユニットｈＭＩＰ－１α、ｈＩｇＧ３のｈ１とｈ４とＣＨ３ドメインを含む二量体化ユニット、および長いＲＢＤドメインを有するＶＢ２０６０タンパク質をコードしている。
Ａ．ＶＢ２０６５のヌクレオチド配列（配列番号２５６）。この大文字のヌクレオチド配列は、ターゲティングユニットｈＭＩＰ－１α、ｈＩｇＧ３のｈ１とｈ４とＣＨ３ドメインを含む二量体化ユニット、およびスパイクドメインを有するＶＢ２０６５タンパク質をコードしている。 Ｂ．ＶＢ２０６５のアミノ酸配列（配列番号２５７）。この大文字のヌクレオチド配列は、ターゲティングユニットｈＭＩＰ－１α、ｈＩｇＧ３のｈ１とｈ４とＣＨ３ドメインを含む二量体化ユニット、およびスパイクドメインを有するＶＢ２０６５タンパク質をコードしている。
Ａ．ＶＢ２０４８のヌクレオチド配列（配列番号２５８）。Ｂ．ＶＢ２０４８のアミノ酸配列（配列番号２５９）。このヌクレオチド配列は、ターゲティングユニットｈＭＩＰ－１α、ｈＩｇＧ３のｈ１とｈ４とＣＨ３ドメインを含む二量体化ユニット、および２０個の予測されるＴ細胞エピトープを有するＶＢ２０４８タンパク質をコードしている。
Ａ．ＶＢ２０５９のヌクレオチド配列（配列番号２６０）。Ｂ．ＶＢ２０５９のアミノ酸配列（配列番号２６１）。このヌクレオチド配列は、ターゲティングユニット抗マウスＭＨＣＩＩ ｓｃＦｖ、ｈＩｇＧ３のｈ１とｈ４とＣＨ３ドメインを含む二量体化ユニット、および長いＲＢＤドメインを有するＶＢ２０５９タンパク質をコードしている。
Ａ．ＶＢ２０７１のヌクレオチド配列（配列番号２６２）。このヌクレオチド配列は、ターゲティングユニット抗マウスＭＨＣＩＩ ｓｃＦｖ、ｈＩｇＧ３のｈ１とｈ４とＣＨ３ドメインを含む二量体化ユニット、およびスパイクタンパク質を有するＶＢ２０７１タンパク質をコードしている。 Ｂ．ＶＢ２０７１のアミノ酸配列（配列番号２６３）。このヌクレオチド配列は、ターゲティングユニット抗マウスＭＨＣＩＩ ｓｃＦｖ、ｈＩｇＧ３のｈ１とｈ４とＣＨ３ドメインを含む二量体化ユニット、およびスパイクタンパク質を有するＶＢ２０７１タンパク質をコードしている。
Ａ．ＶＢ２０８１のヌクレオチド配列（配列番号２６４）。Ｂ．ＶＢ２０８１のアミノ酸配列（配列番号２６５）。このヌクレオチド配列は、ターゲティングユニットｈＭＩＰ－１α、ｈＩｇＧ３のｈ１とｈ４とＣＨ３ドメインを含む二量体化ユニット、および（ＧＧＧＧＳ）２リンカーを用いて連結された１つの予測されるＴ細胞エピトープ（ｐｅｐ０８）と長いＲＢＤドメインを含む抗原ユニットを有するＶＢ２０８１タンパク質をコードしている。
Ａ．ＶＢ２０８２のヌクレオチド配列（配列番号２６６）。Ｂ．ＶＢ２０８２のアミノ酸配列（配列番号２６７）。このヌクレオチド配列は、ターゲティングユニットｈＭＩＰ－１α、ｈＩｇＧ３のｈ１とｈ４とＣＨ３ドメインを含む二量体化ユニット、および（ＧＧＧＧＳ）２リンカーを用いて連結された１つの予測されるＴ細胞エピトープ（ｐｅｐ１８）と長いＲＢＤドメインを含む抗原ユニットを有するＶＢ２０８２タンパク質をコードしている。
Ａ．ＶＢ２０８３のヌクレオチド配列（配列番号２６８）。Ｂ．ＶＢ２０８３のアミノ酸配列（配列番号２６９）。このヌクレオチド配列は、ターゲティングユニットｈＭＩＰ－１α、ｈＩｇＧ３のｈ１とｈ４とＣＨ３ドメインを含む二量体化ユニット、および（ＧＧＧＧＳ）２リンカーを用いて連結された２つの予測されるＴ細胞エピトープ（エピトープ間に（ＧＧＧＧＳ）２リンカーを有するｐｅｐ０８＋ｐｅｐ１８）と長いＲＢＤドメインを含む抗原ユニットを有するＶＢ２０８３タンパク質をコードしている。
Ａ．ＶＢ２０８４のヌクレオチド配列（配列番号２７０）。Ｂ．ＶＢ２０８４のアミノ酸配列（配列番号２７１）。このヌクレオチド配列は、ターゲティングユニットｈＭＩＰ－１α、ｈＩｇＧ３のｈ１とｈ４とＣＨ３ドメインを含む二量体化ユニット、および（ＧＧＧＧＳ）２リンカーを用いて連結された３つの予測されるＴ細胞エピトープ（エピトープ間に（ＧＧＧＧＳ）２リンカーを有するｐｅｐ０８、ｐｅｐ１８、およびｐｅｐ２５）と長いＲＢＤドメインを含む抗原ユニットを有するＶＢ２０８４タンパク質をコードしている。
Ａ．ＶＢ２０８５のヌクレオチド配列（配列番号２７２）。Ｂ．ＶＢ２０８５のアミノ酸配列（配列番号２７３）。このヌクレオチド配列は、ターゲティングユニットｈＭＩＰ－１α、ｈＩｇＧ３のｈ１とｈ４とＣＨ３ドメインを含む二量体化ユニット、およびＧＬＧＧＬリンカーを用いて連結された１つの予測されるＴ細胞エピトープ（ｐｅｐ０８）と長いＲＢＤドメインを含む抗原ユニットを有するＶＢ２０８５タンパク質をコードしている。
Ａ．ＶＢ２０８６のヌクレオチド配列（配列番号２７４）。Ｂ．ＶＢ２０８６のアミノ酸配列（配列番号２７５）。このヌクレオチド配列は、ターゲティングユニットｈＭＩＰ－１α、ｈＩｇＧ３のｈ１とｈ４とＣＨ３ドメインを含む二量体化ユニット、および（ＧＬＧＧＬ）２リンカーを用いて連結された１つの予測されるＴ細胞エピトープ（ｐｅｐ０８）と長いＲＢＤドメインを含む抗原ユニットを有するＶＢ２０８６タンパク質をコードしている。
Ａ．ＶＢ２０８７のヌクレオチド配列（配列番号２７６）。Ｂ．ＶＢ２０８７のアミノ酸配列（配列番号２７７）。このヌクレオチド配列は、ターゲティングユニットｈＭＩＰ－１α、ｈＩｇＧ３のｈ１とｈ４とＣＨ３ドメインを含む二量体化ユニット、およびＧＬＧＧＬリンカーを用いて連結された１つの予測されるＴ細胞エピトープ（ｐｅｐ１８）と長いＲＢＤドメインを含む抗原ユニットを有するＶＢ２０８７タンパク質をコードしている。
Ａ．ＶＢ２０８８のヌクレオチド配列（配列番号２７８）。Ｂ．ＶＢ２０８８のアミノ酸配列（配列番号２７９）。このヌクレオチド配列は、ターゲティングユニットｈＭＩＰ－１α、ｈＩｇＧ３のｈ１とｈ４とＣＨ３ドメインを含む二量体化ユニット、およびＧＬＧＧＬリンカーを用いて連結された２つの予測されるＴ細胞エピトープ（エピトープ間に（ＧＧＧＧＳ）２リンカーを有するｐｅｐ０８＋ｐｅｐ１８）と長いＲＢＤドメインを含む抗原ユニットを有するＶＢ２０８８タンパク質をコードしている。
Ａ．ＶＢ２０８９のヌクレオチド配列（配列番号２８０）。Ｂ．ＶＢ２０８９のアミノ酸配列（配列番号２８１）。このヌクレオチド配列は、ターゲティングユニットｈＭＩＰ－１α、ｈＩｇＧ３のｈ１とｈ４とＣＨ３ドメインを含む二量体化ユニット、およびＧＬＧＧＬリンカーを用いて連結された３つの予測されるＴ細胞エピトープ（エピトープ間に（ＧＧＧＧＳ）２リンカーを有するｐｅｐ０８、ｐｅｐ１８、およびｐｅｐ２５）と長いＲＢＤドメインを含む抗原ユニットを有するＶＢ２０８９タンパク質をコードしている。
Ａ．ＶＢ２０９１のヌクレオチド配列（配列番号２８２）。Ｂ．ＶＢ２０９１のアミノ酸配列（配列番号２８３）。このヌクレオチド配列は、ターゲティングユニットｈＭＩＰ－１α、ｈＩｇＧ３のｈ１とｈ４とＣＨ３ドメインを含む二量体化ユニット、およびＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬリンカーを用いて連結された１つの予測されるＴ細胞エピトープ（ｐｅｐ０８）と長いＲＢＤドメインを含む抗原ユニットを有するＶＢ２０９１タンパク質をコードしている。
Ａ．ＶＢ２０９２のヌクレオチド配列（配列番号２８４）。Ｂ．ＶＢ２０９２のアミノ酸配列（配列番号２８５）。このヌクレオチド配列は、ターゲティングユニットｈＭＩＰ－１α、ｈＩｇＧ３のｈ１とｈ４とＣＨ３ドメインを含む二量体化ユニット、およびＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬリンカーを用いて連結された３つの予測されるＴ細胞エピトープ（エピトープ間に（ＧＧＧＧＳ）２リンカーを有するｐｅｐ０８、ｐｅｐ１８、およびｐｅｐ２５）と長いＲＢＤドメインを含む抗原ユニットを有するＶＢ２０９２タンパク質をコードしている。
Ａ．ＶＢ２０９４のヌクレオチド配列（配列番号２８６）。Ｂ．ＶＢ２０９４のアミノ酸配列（配列番号２８７）。このヌクレオチド配列は、ターゲティングユニットｈＭＩＰ－１α、ｈＩｇＧ３のｈ１とｈ４とＣＨ３ドメインを含む二量体化ユニット、およびＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬリンカーを用いて連結された１つの予測されるＴ細胞エピトープ（ｐｅｐ０８）と長いＲＢＤドメインを含む抗原ユニットを有するＶＢ２０９４タンパク質をコードしている。
Ａ．ＶＢ２０９５のヌクレオチド配列（配列番号２８８）。Ｂ．ＶＢ２０９５のアミノ酸配列（配列番号２８９）。 このヌクレオチド配列は、ターゲティングユニットｈＭＩＰ－１α、ｈＩｇＧ３のｈ１とｈ４とＣＨ３ドメインを含む二量体化ユニット、およびＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬリンカーを用いて連結された３つの予測されるＴ細胞エピトープ（エピトープ間に（ＧＧＧＧＳ）２リンカーを有するｐｅｐ０８、ｐｅｐ１８、およびｐｅｐ２５）と長いＲＢＤドメインを含む抗原ユニットを有するＶＢ２０９５タンパク質をコードしている。
Ａ．ＶＢ２０９７のヌクレオチド配列（配列番号２９０）。Ｂ．ＶＢ２０９７のアミノ酸配列（配列番号２９１）。このヌクレオチド配列は、ターゲティングユニットｈＭＩＰ－１α、ｈＩｇＧ３のｈ１とｈ４とＣＨ３ドメインを含む二量体化ユニット、およびＧＳＡＴリンカーを用いて連結された３つの予測されるＴ細胞エピトープ（エピトープ間に（ＧＧＧＧＳ）２リンカーを有するｐｅｐ０８、ｐｅｐ１８、およびｐｅｐ２５）と長いＲＢＤドメインを含む抗原ユニットを有するＶＢ２０９７タンパク質をコードしている。
Ａ．ＶＢ２０９９のヌクレオチド配列（配列番号２９２）。Ｂ．ＶＢ２０９９のアミノ酸配列（配列番号２９３）。このヌクレオチド配列は、ターゲティングユニットｈＭＩＰ－１α、ｈＩｇＧ３のｈ１とｈ４とＣＨ３ドメインを含む二量体化ユニット、およびＳＥＧリンカーを用いて連結された３つの予測されるＴ細胞エピトープ（エピトープ間に（ＧＧＧＧＳ）２リンカーを有するｐｅｐ０８、ｐｅｐ１８、およびｐｅｐ２５）と長いＲＢＤドメインを含む抗原ユニットを有するＶＢ２０９９タンパク質をコードしている。
Ａ．ＶＢ２１２９のヌクレオチド配列（配列番号２９４）。Ｂ．ＶＢ２１２９のアミノ酸配列（配列番号２９５）。このヌクレオチド配列は、ターゲティングユニットｈＭＩＰ－１α、ｈＩｇＧ３のｈ１とｈ４とＣＨ３ドメインを含む二量体化ユニット、および南アフリカバリアントＢ．１．３５１に特徴的な３つの変異を有する長いＲＢＤドメインを含む抗原ユニットを有するＶＢ２１２９タンパク質をコードしている。
ＶＢ２１３１のアミノ酸配列（配列番号２９６）。ターゲティングユニットｈＭＩＰ－１α、ｈＩｇＧ３のｈ１とｈ４とＣＨ３ドメインを含む二量体化ユニット、およびＳＥＧリンカーを用いて連結された２つの長いＲＢＤドメイン（武漢株と南アフリカバリアントＢ．１．３５１からのＲＢＤ）を含む抗原ユニットを有するＶＢ２１３１タンパク質。
ＶＢ２１３２のアミノ酸配列（配列番号２９７）。ターゲティングユニットｈＭＩＰ－１α、ｈＩｇＧ３のｈ１とｈ４とＣＨ３ドメインを含む二量体化ユニット、およびＧＳＡＴリンカーを用いて連結された２つの長いＲＢＤドメイン（武漢株と南アフリカバリアントＢ．１．３５１からのＲＢＤ）を含む抗原ユニットを有するＶＢ２１３２タンパク質。
ＶＢ２１３３のアミノ酸配列（配列番号２９８）。ターゲティングユニットｈＭＩＰ－１α、ｈＩｇＧ３のｈ１とｈ４とＣＨ３ドメインを含む二量体化ユニット、およびＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬリンカーを用いて連結された２つの長いＲＢＤドメイン（武漢株と南アフリカバリアントＢ．１．３５１からのＲＢＤ）を含む抗原ユニットを有するＶＢ２１３３タンパク質。
ＶＢ２１３４のアミノ酸配列（配列番号２９９）。ターゲティングユニットｈＭＩＰ－１α、ｈＩｇＧ３のｈ１とｈ４とＣＨ３ドメインを含む二量体化ユニット、およびＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬリンカーを用いて連結された２つの長いＲＢＤドメイン（武漢株と南アフリカバリアントＢ．１．３５１からのＲＢＤ）を含む抗原ユニットを有するＶＢ２１３４タンパク質。
ＶＢ２１３５のアミノ酸配列（配列番号３００）。ターゲティングユニットｈＭＩＰ－１α、ｈＩｇＧ３のｈ１とｈ４とＣＨ３ドメインを含む二量体化ユニット、およびＳＥＧリンカーを用いて連結された２つの長いＲＢＤドメイン（南アフリカバリアントＢ．１．３５１とＵＫバリアントＢ．１．１．７からのＲＢＤ）を含む抗原ユニットを有するＶＢ２１３５タンパク質。
ＶＢ２１３６のアミノ酸配列（配列番号３０１）。ターゲティングユニットｈＭＩＰ－１α、ｈＩｇＧ３のｈ１とｈ４とＣＨ３ドメインを含む二量体化ユニット、およびＧＳＡＴリンカーを用いて連結された２つの長いＲＢＤドメイン（南アフリカバリアントＢ．１．３５１とＵＫバリアントＢ．１．１．７からのＲＢＤ）を含む抗原ユニットを有するＶＢ２１３６タンパク質。
ＶＢ２１３７のアミノ酸配列（配列番号３０２）。ターゲティングユニットｈＭＩＰ－１α、ｈＩｇＧ３のｈ１とｈ４とＣＨ３ドメインを含む二量体化ユニット、およびＳＥＧリンカーを用いて連結された２つの長いＲＢＤドメイン（南アフリカバリアントＢ．１．３５１とカリフォルニアバリアントＢ．１．４２７からのＲＢＤ）を含む抗原ユニットを有するＶＢ２１３７タンパク質。
ＶＢ２１３８のアミノ酸配列（配列番号３０３）。ターゲティングユニットｈＭＩＰ－１α、ｈＩｇＧ３のｈ１とｈ４とＣＨ３ドメインを含む二量体化ユニット、およびＧＳＡＴリンカーを用いて連結された２つの長いＲＢＤドメイン（南アフリカバリアントＢ．１．３５１とカリフォルニアバリアントＢ．１．４２７からのＲＢＤ）を含む抗原ユニットを有するＶＢ２１３８タンパク質。
非臨床開発で使用したＶＢ１０．ＣＯＶ２コンストラクトのタンパク質の形式の概要：Ａ：ＶＢ２０４９、ＶＢ２０６０、ＶＢ２０６５、およびＶＢ２０４８。Ｂ：ＶＢ２０５９とＶＢ２０７１。 Ｃ：ＶＢ２０８１－ＶＢ２０９９。Ｄ：ＶＢ２１２９。 Ｅ：ＶＢ２１３１－ＶＢ２１３８。
ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションの３日後にＶＢ１０．ＣＯＶ２ワクシボディタンパク質ＶＢ２０４９、ＶＢ２０６０、およびＶＢ２０６５が機能的ホモ二量体として産生されて分泌された。これらタンパク質の立体配置の完全さは、ＥＬＩＳＡにおいて、ヒトＭＩＰ－１α（ターゲティングユニット）、ヒトＩｇＧ ＣＨ３ドメイン（二量体化ユニット）（捕獲抗体として）、ＲＢＤドメインまたはスパイクタンパク質（抗原ユニット）を検出する抗体への結合によって確認した。
Ａ：ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションの３日後にＶＢ２０４８ワクシボディタンパク質が機能的ホモ二量体として産生されて分泌された。これらタンパク質の立体配置の完全さは、ヒトＭＩＰ－１α（ターゲティングユニット）を検出する抗体と、ヒトＩｇＧ ＣＨ３ドメイン（二量体化ユニット）を捕獲する抗体への結合によって確認した。Ｂ：ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションの３日後にＶＢ１０．ＣＯＶ２ワクシボディタンパク質ＶＢ２０５９とＶＢ２０７１が機能的ホモ二量体として産生されて分泌された。これらタンパク質の立体配置の完全さは、ＥＬＩＳＡにおいて、ヒトＩｇＧ ＣＨ３ドメイン（二量体化ユニット）、ＲＢＤドメイン、またはスパイクタンパク質（抗原ユニット）を検出する抗体への結合によって確認した。 Ｃ：ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションの６日後にＶＢ１０．ＣＯＶ２ワクシボディタンパク質ＶＢ２０８１－ＶＢ２０９９が機能的ホモ二量体として産生されて分泌された。これらタンパク質の立体配置の完全さは、ＥＬＩＳＡ において、ヒトＩｇＧ ＣＨ３ドメイン（二量体化ユニット）を捕獲する抗体と、ＲＢＤドメイン（抗原ユニット）タンパク質を検出する抗体への結合によって確認した。 Ｄ：ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションの３日後にＶＢ１０．ＣＯＶ２ワクシボディタンパク質ＶＢ２１２９とＶＢ２０６０が機能的ホモ二量体として産生されて分泌された。これらタンパク質の立体配置の完全さは、ＥＬＩＳＡにおいて、ヒトＭＩＰ－１α（ターゲティングユニット）、ヒトＩｇＧ ＣＨ３ドメイン（二量体化ユニット、捕獲抗体として）、およびＲＢＤドメインタンパク質（抗原ユニット）を検出する抗体への結合によって確認した。 Ｅ：ＶＢ２０４８とＶＢ２０４９を同時にトランスフェクトされていたＨＥＫ２９３細胞から一過性トランスフェクションの３日後に回収した上清でＥＬＩＳＡを実施した。これらタンパク質の立体配置の完全さは、ＥＬＩＳＡにおいて、ヒトＩｇＧ ＣＨ３ドメイン（二量体化ユニット）（捕獲抗体として）とヒトＭＩＰ－１α（ターゲティングユニット）、またはＲＢＤドメインタンパク質（抗原ユニット）を検出する抗体への結合によって確認した。両方のプラスミドの発現は、これらの結果に、マウスにおいてＶＢ２０４８（Ｔ細胞エピトープに対する応答）とＶＢ２０４９（ＲＢＤドメインに対する応答）に対する生体内免疫応答を示すデータを組み合わせることによって確認する（例えば図７６）。
ＶＢ１０．ＣＯＶ２ワクシボディタンパク質ＶＢ２０６０のＳＤＳ－ＰＡＧＥとウエスタンブロット分析。（Ａ）還元（ＳＤＳ＋還元剤）条件下または非還元（ＳＤＳ）条件下でＶＢ２０６０をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞から上清を回収した。上清を一過性トランスフェクションの６日後に回収し、濃度を約４倍大きくした後にゲルにロードした。矢印は可能なバンドを示す。
Ａ：本発明によるＶＢ２０４９またはＶＢ２０６０のＤＮＡワクチンを接種したマウスにおける抗ＲＢＤ ＩｇＧ免疫応答（棒グラフと線グラフ）。マウスにＤＮＡを筋肉内投与した直後に注射部位に電気穿孔することによって接種した。ワクチン、投与日、投与回数、および用量レベルが示されている。２つの独立な実験の平均値が示されている。 Ｂ：３つのＶＢ１０．ＣＯＶ２ ＤＮＡワクチン（ＶＢ２０４９、ＶＢ２０６０、ＶＢ２０６５、およびＶＢ２０７１）のうちの１つを５０ μｇで２回接種したマウスにおける抗ＲＢＤ ＩｇＧ免疫応答。マウスに０日目と２１日目にＤＮＡを筋肉内投与した直後に注射部位に電気穿孔することによって接種した。ワクチンのタイプと対照（ＰＢＳ）が示されている。最初のワクチン接種の７日後、１４日後、および２８日後に得られた血清を調べてＲＢＤタンパク質に結合する抗ＲＢＤ ＩｇＧ抗体を探した。群ごとに５匹までのマウスの平均値が示されている。Ｃ：３、６、１２．５、または２５ μｇいずれかのＶＢ２０６０ ＤＮＡワクチンを１回または２回接種したマウスにおける抗ＲＢＤ ＩｇＧ免疫応答。マウスに０日目（と２１日目）にＤＮＡを筋肉内投与した直後に注射部位に電気穿孔することによって接種した。最初のワクチン接種の７日後、１４日後、および２１日後、および２８日後と、２１日目のブーストワクチン接種の７日後に得られた血清を調べ、ＲＢＤタンパク質に結合する抗ＲＢＤ ＩｇＧ抗体を探した。群ごとに４～５匹のマウスの平均値が示されている。 Ｄ：３、６．２５、１２．５、または２５ μｇのＶＢ２０６０ ＤＮＡワクチンを１回または２回接種したマウスの気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）で測定された抗ＲＢＤ ＩｇＧ。マウスに０日目に、または０日目と２１日目にＤＮＡを筋肉内投与した直後に注射部位に電気穿孔することによって接種した。最初のワクチン接種の１４日後、２１日後、および２８日後と、２１日目のブーストワクチン接種の７日後に得られたＢＡＬ液を調べて抗ＲＢＤを探した。 Ｅ：本発明によるＶＢ２０５９ ＤＮＡワクチンを接種したマウスにおける抗ＲＢＤ ＩｇＧ免疫応答。マウスにＤＮＡを筋肉内投与した直後に注射部位に電気穿孔することによって接種した。ワクチン、投与日、投与回数、および用量レベルが示されている。２つの独立な実験の平均値が示されている。Ｆ：示されているワクチン候補を２５ μｇで１回接種したマウスにおける抗ＲＢＤ ＩｇＧ免疫応答。マウスに０日目にＤＮＡを筋肉内投与した直後に注射部位に電気穿孔することにより接種した。ワクチン接種の１４日後に得られた血清を調べてＲＢＤタンパク質に結合する抗ＲＢＤ ＩｇＧ抗体を探した。群ごとに２～５匹のマウスの平均値が示されている。 Ｇ：１、６．２５、１２．５、または２５ μｇいずれかのＶＢ２１２９とＶＢ２０６０のＤＮＡワクチンを１回または２回接種したマウスにおける抗ＲＢＤ ＩｇＧ免疫応答。マウスに０日目（と２１日目）にＤＮＡを筋肉内投与した直後に注射部位に電気穿孔することによって接種した。最初のワクチン接種の７日後、１４日後、および２１日後、および２８日後と、２１日目のブーストワクチン接種の７日後に得られた血清を調べ、ＲＢＤタンパク質に結合する抗ＲＢＤ ＩｇＧ抗体を探した。群ごとに４～５匹のマウスの平均値が示されている。Ｈ：ＤＮＡプラスミドＶＢ２０４８とＶＢ２０４９を含むワクチンを接種したマウスにおける抗ＲＢＤ ＩｇＧ免疫応答。薬学的に許容可能な１つの担体の中に１２．５ μｇの各プラスミドを組み合わせて含むものを１回、０日目にマウスに筋肉内投与した直後に注射部位に電気穿孔した。ワクチン接種の７日後と１４日後に得られた血清を調べ、ＲＢＤタンパク質に結合する抗ＲＢＤ ＩｇＧ抗体を探した。群ごとに３～５匹のマウスの平均値が示されている。
Ａ：ＶＢ１０．ＣＯＶ２ ＤＮＡワクチンＶＢ２０４９、ＶＢ２０６０、およびＶＢ２０６５はロバストな中和抗体応答を誘導する。マウスに０日目、２１日目、および８９日目に２．５ μｇ、２５ μｇ、または５０ μｇのＶＢ２０４９、ＶＢ２０６０、またはＶＢ２０６５を筋肉内接種した（調べた群が示されている）。血清を回収し、同型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２生ウイルス株Ａｕｓｔｒａｌｉａ／ＶＩＣ０１／２０２０単離体４４に対する中和抗体を評価した。ＰＢＳを接種したマウスからの血清を陰性対照として使用し、ＮＩＢＳＣ ２０／１３０を陽性対照として使用した。点線はアッセイの検出限界を示す。Ｂ：ＶＢ１０．ＣＯＶ２ ＤＮＡワクチンＶＢ２０６０はロバストな中和抗体応答を誘導する。マウスに ０日目（と２１日目）に３、６、１２．５、または２５ μｇいずれかのＶＢ２０６０を筋肉内接種した（調べた群が示されている）。血清を回収し、同型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２生ウイルス株Ａｕｓｔｒａｌｉａ／ＶＩＣ０１／２０２０単離体４４に対する中和抗体を評価した。ＰＢＳを接種したマウスからの血清を陰性対照として使用し、ＮＩＢＳＣ ２０／１３０を陽性対照として使用した。点線はアッセイの検出限界を示す。
異なる用量と投与回数のＶＢ１０．ＣＯＶ２ ＤＮＡワクチンＶＢ２０４９で誘導されたＴ細胞応答。重複するＲＢＤペプチドプールで再刺激した後に２．５ μｇまたは２５ μｇのＶＢ２０４９ ＤＮＡプラスミドを筋肉内接種したマウス（５匹／群）からのＩＦＮ－γ陽性スポットの総数／１×１０６個の脾臓細胞。脾臓細胞を最初のワクチン接種の１４日後と、２１日目のブーストワクチン接種の７日後に回収した。
マウスに筋肉内ワクチン接種した後のＣＤ４＋ ＲＢＤ特異的免疫応答とＣＤ８＋ ＲＢＤ特異的免疫応答の誘導とＴ細胞エピトープマッピング。ＣＤ４細胞集団とＣＤ８細胞集団を６１個の個々のＲＢＤペプチド（ＳＡＲＳ－ＣＯＶ２ ＲＢＤドメインからの１２個のアミノ酸が重複する１５量体ペプチド）で２４時間刺激し、ＩＦＮ－γ陽性スポットの数／１×１０６個の脾臓細胞をＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて検出した。Ａ．マウス（５匹／群）に２×２５ μｇのＶＢ２０４９を０日目と２１日目（ブーストワクチン接種）に接種し、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを２８日目（ブーストワクチン接種の７日後）に実施した。Ｂ．マウス（２～３匹／群）に３×５０ μｇのＶＢ２０６０を０日目、２１日目、および８９日目に接種し、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを９９日目（最後のブーストワクチン接種の１０日後）に実施した。 Ｃ．ＳＡＲＳ－ＣＯＶ２ ＲＢＤドメインのマップと、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける免疫優性ペプチドの同定。
Ａ．２５ μｇのＶＢ２０６０を接種したマウスにおけるＴ細胞応答の動態。マウスに１回または２回（０日目と７日目）接種し、脾臓細胞を４日目、７日目、１１日目、１４日目、１８日目、および２１日目に回収した（５～６匹／群）が、１回だけの免疫化群の２１日目（２匹／群）は例外である。 Ｂ．誘導されたＴ細胞応答を３つのＶＢ１０．ＣＯＶ２ ＤＮＡワクチンＶＢ２０４９、ＶＢ２０５９、およびＶＢ２０６０で比較。重複するＲＢＤペプチドプールで再刺激した後に２×２．５ μｇの３つのＶＢ１０．ＣＯＶ２ ＤＮＡプラスミドを筋肉内接種したマウス（４～５匹／群）からのＩＦＮ－γ陽性スポットの総数／１×１０６個の脾臓細胞。脾臓細胞を２８日目に回収した（２１日目のブーストワクチン接種の７日後）。
異なる用量と投与回数のＶＢ２０６０を用いて誘導されたＴ細胞応答。重複するＲＢＤペプチドプールで再刺激した後に２５ μｇまたは５０ μｇのＶＢ２０６０ ＤＮＡプラスミドを筋肉内接種したマウス（２～３匹／群）からのＩＦＮ－γ陽性スポットの総数／１×１０６個の脾臓細胞。脾臓細胞を最初のワクチン接種の９０日後、または８９日目のブーストワクチン接種の１０日後のいずれかに回収した。
Ａ：ＶＢ２０６５またはＶＢ２０７１のＤＮＡワクチンによって誘導されるＣＤ４＋スパイク特異的免疫応答とＣＤ８＋スパイク特異的免疫応答の誘導。スパイクペプチドプールで再刺激した後に５０ μｇのＶＢ２０６５ ＤＮＡプラスミドを２回（０日目と２１日目）筋肉内接種したマウス（５～６匹／群）からのＩＦＮ－γ陽性スポットの総数／１×１０６個の脾臓細胞。脾臓細胞を２８日目（２１日目のブーストワクチン接種の７日後）に回収した。Ｂ ＤＮＡワクチンＶＢ２１２９によって誘導されるＴ細胞応答。重複するＲＢＤペプチドプールで再刺激した後に１×１．０、６．２５、１２．５、または２５ μｇを筋肉内接種したマウス（５匹／群）からのＩＦＮ－γ 陽性スポットの総数／１×１０６個の脾臓細胞。脾臓細胞をワクチン接種の７日後と１４日後に回収した。
ＡとＢ：ＲＢＤ特異的Ｔｈ１応答を示すＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインプロファイル。ＶＢ１０．ＣＯＶ２ ＤＮＡワクチン（Ａ）ＶＢ２０６０、ＶＢ２０４９、またはＶＢ２０５９と、 （Ｂ）ＶＢ２０６５またはＶＢ２０７１と、対照群（ＰＢＳ）を筋肉内接種したマウスからの脾臓細胞培養物の上清に含まれるサイトカインの濃度。
Ｔ細胞を同定するためのゲーティングストラテジー：Ａ．全細胞を側方散乱（ＳＳＣ）と前方散乱（ＦＳＣ）のパラメータを用いて調べた。リンパ球ゲートを細胞の相対サイズ（ＦＳＣ）に基づいて設定した。Ｂ．リンパ球を分析してダブレットの存在を探し、ゲートを設定して単一細胞だけが将来の分析に含まれるようにした。Ｃ．死んだ細胞を生死判別染料を用いて同定し、ゲートを設定して生存細胞がさらなる分析に含まれるようにした。Ｄ．生存細胞の集団において、全ＣＤ３＋細胞を将来の分析のためゲーティングした。Ｅ．Ｔ細胞をＣＤ３＋ Ｔ細胞と定義し、γδ ＴＣＲ Ｔ細胞を分析から除外した。Ｆ．全Ｔ細胞を分析してＣＤ４マーカーとＣＤ８マーカーの発現を探した。
最初のワクチン接種の２８日後にＶＢ２０６０（ＡとＢ）またはＶＢ２０４９（ＣとＤ）を接種したマウスにおけるＲＢＤ特異的多機能性Ｔ細胞応答の検出。Ａ／Ｃ．ＲＢＤ刺激に応答したＣＤ４＋ Ｔ細胞とＣＤ８＋ Ｔ細胞の割合。各マーカー（またはマーカーの組み合わせ）を発現している細胞の割合をそれぞれの集団の合計として示す。Ｂ／Ｄ．サイトカインの発現に基づく応答のタイプのグラフ表示。ＣＤ４とＣＤ８のグラフはＳＰＩＣＥソフトウエアを用いて作成した。
ＶＢ２０６０を接種したマウスにおける最初のワクチン接種の９０日後のＲＢＤ特異的多機能性ＣＤ４＋ Ｔ細胞応答の検出。Ａ．ＲＢＤ刺激に応答したＣＤ４＋ Ｔ細胞の割合。グラフは３つの群におけるサイトカインの産生を示す － 中用量（ＶＢ２０６０ ２×２５ μｇ）を２回ワクチン接種、高用量（ＶＢ２０６０ １×５０ μｇ）を１回ワクチン接種、および高用量（ＶＢ２０６０ ２×５０ μｇ）を２回ワクチン接種。Ｂ．サイトカインの発現に基づく応答のタイプのグラフ表示。ＣＤ４とＣＤ８のグラフはＳＰＩＣＥソフトウエアを用いて作成した。
ＶＢ２０６０を接種したマウスにおける最初のワクチン接種の９０日後のＲＢＤ特異的多機能性ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の検出。Ａ．ＲＢＤ刺激に応答したＣＤ８＋ Ｔ細胞の割合。グラフは３つの群におけるサイトカインの産生を示す － 中用量（ＶＢ２０６０ ２×２５ μｇ）を２回ワクチン接種、高用量（ＶＢ２０６０ １×５０ μｇ）を１回ワクチン接種、および高用量（ＶＢ２０６０ ２×５０ μｇ）を２回ワクチン接種。Ｂ．サイトカインの発現に基づく応答のタイプのグラフ表示。円グラフはＳＰＩＣＥソフトウエアを用いて作成した。
ＶＢ２０６０を接種したマウスにおける最初のワクチン接種の１００日後のＲＢＤ特異的多機能性ＣＤ４＋ Ｔ細胞応答の検出。Ａ．ＲＢＤ刺激に応答したＣＤ４＋ Ｔ細胞の割合。グラフは３つの群におけるサイトカインの産生を示す － 中用量（ＶＢ２０６０ ３×２５ μｇ）を３回ワクチン接種、高用量（ＶＢ２０６０ ２×５０ μｇ）を２回ワクチン接種、および高用量（ＶＢ２０６０ ３×５０ μｇ）を３回ワクチン接種。Ｂ．サイトカインの発現に基づく応答のタイプのグラフ表示。円グラフはＳＰＩＣＥソフトウエアを用いて作成した。
ＶＢ２０６０を接種したマウスにおける最初のワクチン接種の１００日後のＲＢＤ特異的多機能性ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の検出。Ａ．ＲＢＤ刺激に応答したＣＤ８＋ Ｔ細胞の割合。グラフは３つの群におけるサイトカインの産生を示す － 中用量（ＶＢ２０６０ ３×２５μｇ）を３回ワクチン接種、高用量（ＶＢ２０６０ ２×５０ μｇ）を２回ワクチン接種、および高用量（ＶＢ２０６０ ３×５０ μｇ）を３回ワクチン接種。Ｂ．サイトカインの発現に基づく応答のタイプのグラフ表示。ＣＤ４とＣＤ８のグラフはＳＰＩＣＥソフトウエアを用いて作成した。
ワクチン接種の７日後とブーストの７日後のリンパ節におけるＴ細胞応答。マウスに０日目と２１日目にＶＢ２０６０ ＤＮＡワクチンを接種し、Ｔ細胞応答を流入領域リンパ節において２８日目に分析した。細胞をＲＢＤペプチドで１６時間刺激し、多パラメータフローサイトメトリーを利用して分析した。Ｔ細胞を図６５に記載されているようにしてゲートした。ＣＤ４＋ Ｔ細胞とＣＤ８＋ Ｔ細胞を調べてＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、およびグランザイムＢの発現を探した。陽性細胞の割合がパネルＡ、Ｂ、Ｄ、およびＥに棒グラフで示されている。図７２に示されているＴｒｍ細胞も調べてＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、およびグランザイムＢの発現を探した。陽性細胞の割合がパネルＣとＦに示されている。
図７１の中のＣＤ８＋陽性Ｔ細胞を分析してＣＤ１０３とＣＤ６９の発現を探し、常在メモリＴ細胞（Ｔｒｍ）を明確にした。
異なる用量と投与回数のＶＢ１０．ＣＯＶ２ ＤＮＡワクチンＶＢ２０４８を用いて誘導されたＴ細胞応答。２０個の予測されるＴ細胞エピトープを用いて刺激した後に０日目（と２１日目）に２．５ μｇまたは２５ μｇのＶＢ２０４８ ＤＮＡプラスミドを筋肉内接種したマウス（５匹／群）からのＩＦＮ－γ陽性スポットの総数／１×１０６個の脾臓細胞。脾臓細胞を最初のワクチン接種の１４日後と、２８日目（２１日目のブーストワクチン接種の７日後）に回収した。
２×２５ μｇのＶＢ２０４８ ＤＮＡプラスミドを０日目と２１日目に筋肉内接種された後のマウス（５匹／群）におけるＣＤ４＋ペプチド特異的免疫応答とＣＤ８＋ペプチド特異的免疫応答の誘導。ＣＤ４細胞集団とＣＤ８細胞集団を２０個の予測されるペプチドで２４時間刺激し、ＩＦＮ－γ陽性スポットの数／１×１０６個の脾臓細胞をＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて２１日目のブーストワクチン接種の７日後に検出した。
予測されるＴ細胞エピトープとＲＢＤドメインの両方を含む抗原ユニットを有するＶＢ１０．ＣＯＶ２コンストラクトによって誘導されるＴ細胞応答。マウス（５匹／群）に０日目に示されているＶＢ１０．ＣＯＶ２ ＤＮＡプラスミドを２５ μｇ、筋肉内接種した。ワクチン接種の１４日後、脾臓を回収し、脾臓細胞を１～３個の予測されるＴ細胞エピトープまたはＲＢＤプールのいずれかを用いて再刺激した。この図はＩＦＮ－γ陽性スポットの総数／１×１０６個の脾臓細胞を表わす。
単一のプラスミドを含むワクチンによって誘導されるＴ細胞応答を２つのプラスミドを含むワクチンと比較。ワクチン接種のため、ＶＢ１０．ＣＯＶ２コンストラクトＶＢ２０４８（２０個のＴ細胞エピトープ）とＶＢ２０４９（ＲＢＤ）を、単独ワクチン、または薬学的に許容可能な担体の中にＶＢ２０４８とＶＢ２０４９の両方を含むワクチン（組み合わせワクチン）のいずれかとして使用した。マウス（５匹／群）に０日目に、単独ワクチンとしての２５ μｇのＶＢ２０４８またはＶＢ２０４９、またはＶＢ２０４８とＶＢ２０４９のそれぞれを１２．５ μｇ含む組み合わせワクチンを筋肉内接種した。ワクチン接種の１４日後、脾臓を回収し、脾臓細胞を２０個の予測されるＴ細胞エピトープおよび／またはＲＢＤプールのいずれかで再刺激した。この図はＩＦＮ－γ陽性スポットの総数／１×１０６個の脾臓細胞を表わす。
シグナルペプチドと抗ｐａｎ ＨＬＡクラスＩＩターゲティングユニットのアミノ酸配列。配列を「｜」によって分割し、この配列の以下の部分、すなわちＩｇ ＶＨシグナルペプチド ｜ 抗ｐａｎ ＨＬＡクラスＩＩ ＶＬ ｜ リンカー ｜ 抗ｐａｎ ＨＬＡクラスＩＩ ＶＨを識別しやすくしてある。
ＶＢ１０．ＣＯＶ２ ＤＮＡワクチンＶＢ２０６０の安定性データ。ＶＢ２０６０を４週間まで３７℃で保管し、スーパーコイルＤＮＡの割合を１週間後（Ｔ１）、２週間後（Ｔ２）、３週間後（Ｔ３）、および４週間後（Ｔ４）に、安定性を示すパラメータとしてＨＰＬＣによって求めた。
詳細な説明
本発明の１つの態様は、免疫学的に有効な量の
（ｉ）ターゲティングユニット、二量体化ユニット、および抗原ユニット（この抗原ユニットは少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープを含む）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；または
（ｉｉ）（ｉ）で規定されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または
（ｉｉｉ）（ｉ）で規定されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド２つからなる二量体タンパク質と；
薬学的に許容可能な担体を含むワクチンに関する。
一般に、ワクシボディコンストラクトは、配列内に、ターゲティングユニット、二量体化ユニット、および抗原ユニットを含む。このワクチンは、例えば非常に少ない用量を用いて迅速で強力な免疫応答を誘導する。そのことが、このワクチンをパンデミックとエピデミックの状況にとって理想的なものにしている。
本明細書では、ワクチンは、それを投与された個人で免疫応答を誘導することができる。一実施形態では、免疫応答は、Ｂ細胞による抗体の生成を通じた液性免疫応答である。別の一実施形態では、免疫応答は、Ｔ細胞による抗体の生成を通じた細胞性免疫応答である。さらに別の一実施形態では、免疫応答は、液性かつ細胞性の免疫応答である。
個人として健康な個人が可能であり、ワクチンを用いてその個人に予防的処置を提供する、すなわちその個人をベータコロナウイルスの感染に対して保護する。あるいは個人として、ベータコロナウイルスに感染したことがある個人が可能であり、ワクチンを用いてその個人に治療的処置を提供する、すなわち症状を緩和したり感染症を治癒させたりする。
ベータコロナウイルスはオルトコロナウイルス亜科の中の１つの属である。ベータコロナウイルスはエンベロープを有するポジティブセンス一本鎖ＲＮＡウイルスである。この属の中に４つの系列、すなわち系列Ａ（エンベコウイルス亜属）、系列Ｂ（サルベコウイルス亜属）、系列Ｃ（メルベコウイルス亜属）、および系列Ｄ（ノベコウイルス亜属）が一般に認められる。ベータコロナウイルスに含まれるのは、ヒトでパンデミック／エピデミックを引き起こした／引き起こすか、ヒトに感染することができる以下のウイルス、すなわち重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）を引き起こすＳＡＲＳ－ＣｏＶ、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）を引き起こすＭＥＲＳ－ＣｏＶ、コロナウイルス疾患２０１９（Ｃｏｖｉｄ－１９）を引き起こすＳＡＲＳ－ＣｏＶ２、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、およびＨＣｏＶ－ＨＫＵ１である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶとＳＡＲＳ－ＣｏＶ２は系列Ｂ（サルベコウイルス亜属）に属し、ＭＥＲＳ－ＣｏＶは系列Ｃ（メルベコウイルス亜属）に属し、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３とＨＣｏＶ－ＨＫＵ１は系列Ａ（エンベコウイルス亜属）に属する。
したがってさらなる一実施形態では、個人として、系列Ｂ（サルベコウイルス亜属）に属するベータコロナウイルスに感染するリスクがあるか、感染したことがある個人が可能である。あるいは個人として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染するリスクがあるか、感染したことがある個人が可能である。
ウイルス感染症はウイルスに対する中和抗体を生じさせることによって回避すべきであると一般に考えられている。しかし本発明の１つの態様は、個人に投与されるとＴ細胞応答だけ、またはＴ細胞応答とＢ細胞応答の両方を誘導するワクチンに関する。本明細書に提示されているポリヌクレオチド／ポリペプチド／二量体タンパク質は細胞傷害性Ｔ細胞を生じさせることができる。生じたＣＤ８＋ Ｔ細胞は、予防的設定と治療的設定の両方においてウイルスに感染した細胞を殺してそのウイルスを排除することで、疾患から治癒させる／保護するか、疾患の重症度を少なくとも緩和する。本発明によるワクチンの抗原ユニットは、Ｔ細胞エピトープだけを含むこと、または本明細書に示されているようにＢ細胞エピトープ（例えばスパイクタンパク質）も含むベータコロナウイルスタンパク質の中に含まれるＴ細胞エピトープを含むことができる。Ｔ細胞エピトープだけを含む抗原ユニットについては、それらエピトープは、本質的に細胞内にあってウイルス表面タンパク質よりも保存されているウイルスタンパク質に由来することができる。そのことにより、同様のベータコロナウイルスによって起こる進行中と将来のパンデミック／エピデミックの両方で使用できるワクチンが得られる。ベータコロナウイルス表面タンパク質の中に含まれるＴ細胞エピトープについては、表面タンパク質は、抗体応答（すなわちウイルスが循環しているときにウイルス表面タンパク質に抗体が結合し、そのウイルスが宿主細胞の中に入るのを阻止することによってウイルスを中和させること）を誘導できるＢ細胞エピトープも含むことができる。上記のワクチンは、治療用ワクチンとして、または予防用ワクチンとして用いることができる。
１つの態様では、個人はベータコロナウイルス感染症に罹患しており、ワクチンは治療用ワクチンである。そこでワクチンを、ベータコロナウイルスに曝露されていて影響を受けている可能性のある個人に投与して感染した細胞を排除し、したがって疾患の重症度を最小にするとともに、さらなる細胞の感染に対する中和抗体を産生させる。
本発明の別の１つの態様では、個人は健康な個人であり、ワクチンは予防用ワクチンである。典型的には、これは、予防設定において例えば感染症を予防するためベータコロナウイルスに対する中和抗体を生じさせることが望ましい人々に免疫を誘導するのに使用される。
本発明の１つの態様は、抗原ユニットが、ベータコロナウイルスの完全長ウイルス表面タンパク質またはそのようなタンパク質の一部である少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープを含むワクチンに関する。そのため一実施形態では、その少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープは完全長タンパク質またはその一部であり、そのタンパク質は、エンベロープタンパク質、スパイクタンパク質、膜タンパク質、およびスパイク様タンパク質であるヘマグルチニンエステラーゼ（ベータコロナウイルスがエンベコウイルスである場合）からなる群から選択される。
一実施形態では、抗原ユニットは、ベータコロナウイルスの完全長ウイルス表面タンパク質に含まれる（例えば上記のタンパク質のいずれかの中に含まれる）少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含み、好ましくはベータコロナウイルスの完全長ウイルス表面タンパク質に含まれる（例えば上記のタンパク質のいずれかの中に含まれる）いくつかのＢ細胞エピトープを含む。
「いくつかの」という用語は、本明細書では、「複数の」と「２つ以上」という用語と交換可能に用いられる。
Ｂ細胞エピトープとして、直線状または立体的Ｂ細胞エピトープが可能である。
したがって１つの態様では、本発明は、免疫学的に有効な量の
（ｉ）ターゲティングユニット、二量体化ユニット、および抗原ユニット（この抗原ユニットはベータコロナウイルスのウイルス表面タンパク質またはその一部、好ましくはエンベロープタンパク質、スパイクタンパク質、膜タンパク質、およびヘマグルチニンエステラーゼからなる群から選択されるタンパク質を含む）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、または
（ｉｉ）（ｉ）で規定されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または
（ｉｉｉ）（ｉ）で規定されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド２つからなる二量体タンパク質二量体タンパク質と、
薬学的に許容可能な担体を含むワクチンに関する。
上記のワクチン、すなわち抗原ユニットを含んでいて、その抗原ユニットがベータコロナウイルスのウイルス表面タンパク質またはその一部を含むワクチンは、投与されると、Ｂ細胞応答とＴ細胞応答を誘導するため、予防用または治療用のワクチンとして使用することができる。一実施形態では、上記のワクチンは予防用ワクチンとして使用される。
本発明の１つの態様は、前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープがベータコロナウイルスの完全長スパイクタンパク質であるワクチンに関する。そのスパイクタンパク質はウイルスの構造タンパク質の１つであり、エンベロープタンパク質および膜タンパク質と合わさってウイルスのエンベロープを形成する。宿主細胞の表面でのウイルススパイクタンパク質とアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）の間の相互作用によりウイルスが宿主細胞の膜に付着するとその膜と融合して細胞の中に入り、したがって感染プロセスを開始することが可能になる。スパイクタンパク質は中和抗体を誘導する主要な抗原であるため、ワクチンを設計するための抗原と見なされる。スパイクタンパク質は変異しやすいため、スパイクタンパク質とスパイクタンパク質に含まれるＲＢＤドメインにはいくつかのバリアントが存在する（図２）。
別の一実施形態では、前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープは、配列番号２３０のアミノ酸配列と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む。
好ましい一実施形態では、前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープは、スパイクタンパク質の一部、すなわちスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）またはＲＢＤの一部である。ＲＢＤは非常に強力な中和抗体を誘導する上で重要な複数の立体配置依存性エピトープを含有することが見いだされている。別の一実施形態では、前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープは、配列番号２３１のアミノ酸配列と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む。
別の一実施形態では、前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープは、配列番号８０２のアミノ酸配列と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープは配列番号８０２のアミノ酸配列を有する。
さらに別の一実施形態では、前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープは、配列番号８０３のアミノ酸配列と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープは配列番号８０３のアミノ酸配列を有する。
さらに別の一実施形態では、前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープは、配列番号８０４のアミノ酸配列と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープは配列番号８０４のアミノ酸配列を有する。
さらに別の一実施形態では、前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープは、配列番号８０５のアミノ酸配列と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープは配列番号８０５のアミノ酸配列を有する。
好ましい一実施形態では、前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープは、配列番号２４６のアミノ酸配列と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープは配列番号２４６のアミノ酸配列を有する。
別の好ましい一実施形態では、前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープは、配列番号２５５のアミノ酸２４３～４６５のアミノ酸配列と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープは配列番号２５５のアミノ酸２４３～４６５のアミノ酸配列を有する。
さらなる一実施形態では、前記抗原ユニットは、ＲＢＤおよび／またはその一部の複数のコピー（例えば２、３、４、または５個のコピー）を含み、それらコピーは同じではなく、変異（例えば１、２、３、４、５個、またはそれよりも多い変異）を含む。
一例として、抗原ユニットは２つのＲＢＤまたはその一部（例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の武漢株のスパイクタンパク質のＲＢＤまたはその一部と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の南アフリカバリアントＢ．１．３５１のスパイクタンパク質のＲＢＤまたはその一部）を含むことができる。さらなる一例として、抗原ユニットは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の南アフリカバリアントＢ．１．３５１のスパイクタンパク質のＲＢＤまたはその一部と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＵＫバリアントＢ．１．１．７のスパイクタンパク質のＲＢＤまたはその一部と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のカリフォルニアバリアントＢ．１．４２７のスパイクタンパク質のＲＢＤまたはその一部を含むことができる。好ましい一実施形態では、コピーはリンカーによって分離されている。
別の一実施形態では、前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープは、患者からのプロトタイプ血清またはワクチンの中和力価を新たなバリアント株と比べて有意に減らすバリアントである。一実施形態では、そのバリアントは中和力価（すなわちプロトタイプ株の血清力価を新たなバリアント株に対する力価で割ることによって計算される）を２～４倍以上減らす。別の一実施形態では、そのバリアントとして、Ｅ４８４（例えばＧｒｅａｎｅｙらの中のＢ．１．３５１、Ｐ．１、Ｂ．１．４２９など）、Ｌ４５２(Cherian et al. 2021)、およびＱ４９８(Zahradnik et al 2021と、PHE, 22 April 2021 VOC Tech briefing)にＲＢＤ変異を有するあらゆるバリアントが可能である。
別の一実施形態では、前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープは、スパイクタンパク質の一部、すなわちスパイクタンパク質のｈｅｐｔａｄ ｒｅｐｅａｔ１（ＨＲ１）またはｈｅｐｔａｄ ｒｅｐｅａｔ２（ＨＲ２）ドメインである。ビリオンの表面のスパイクタンパク質が宿主細胞の表面のＡＣＥ受容体に結合した後、ＨＲ１とＨＲ２は互いに相互作用して６螺旋バンドル（６－ＨＢ）融合コアを形成し、融合と感染のためウイルス膜と細胞膜を近接させる。一実施形態では、前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープは、スパイクタンパク質のＨＲ１ドメインであり、別の一実施形態では、前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープは、スパイクタンパク質のＨＲ２ドメインである。
別の一実施形態では、前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープは、配列番号２３２のアミノ酸配列と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む。
さらに別の一実施形態では、前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープは、配列番号２４９のアミノ酸配列と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む。
別の一実施形態では、前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープは、スパイクタンパク質の少なくとも一部、好ましくはスパイクタンパク質に含まれる少なくともＢ細胞エピトープ、より好ましくはいくつかのそのようなＢ細胞エピトープを含む。
したがって１つの態様では、本発明は、免疫学的に有効な量の
（ｉ）ターゲティングユニット、二量体化ユニット、および抗原ユニット（この抗原ユニットは、ベータコロナウイルスの完全長スパイクタンパク質または完全長スパイクタンパク質の少なくとも一部、またはスパイクタンパク質に含まれる少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含む）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、または
（ｉｉ）（ｉ）で規定されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または
（ｉｉｉ）（ｉ）で規定されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド２つからなる二量体タンパク質と、
薬学的に許容可能な担体を含むワクチンに関する。
好ましい一実施形態では、スパイクタンパク質の前記少なくとも一部は受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）である。別の好ましい一実施形態では、スパイクタンパク質の前記少なくとも一部はＨＲ１ドメインまたはＨＲ２ドメインである。さらに別の好ましい一実施形態では、スパイクタンパク質の前記少なくとも一部はＨＲ２ドメインである。
別の好ましい一実施形態では、抗原ユニットは、ベータコロナウイルスのスパイクタンパク質に含まれる少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含み、好ましくはベータコロナウイルスのスパイクタンパク質またはその一部（例えば受容体結合ドメイン、ＨＲ１ドメイン、またはＨＲ２ドメイン）に含まれるいくつかのＢ細胞エピトープを含む。
抗体応答はウイルスを阻止してそのウイルスが宿主細胞に感染するのを予防するため、治療設定よりも予防設定において重要である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶとＣｏＶ－２では、ヒト細胞への感染は、ウイルスのスパイクタンパク質がヒト肺上皮上のＡＣＥ受容体に結合することを通じて起こることができる。
別のアプローチはワクチンであり、前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープはベータコロナウイルスＴ細胞エピトープである。本開示は、ゲノム中にあってベータコロナウイルスの間で保存されている部分が免疫応答を開始させることのできるＴ細胞エピトープを含むことを明らかにする。したがって本発明の１つの態様は、少なくとも１つのＴ細胞エピトープ、好ましくはいくつかの種または株のベータコロナウイルスの間で保存されている（例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の間で保存されている）少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含むワクチンに関する。
Ｔ細胞エピトープは、ウイルスの任意のタンパク質（すなわちウイルス表面タンパク質）だけでなく、ヌクレオカプシドタンパク質、またはレプリカーゼポリタンパク質、または他の構造タンパク質と非構造タンパク質に含まれていてもよい。
ヒトにおいて反応性があることが見いだされたＴ細胞エピトープのいくつかは、機能がまだ十分に解明されていなくともウイルスにとって極めて重要な機能を持っている可能性がある非構造タンパク質とオープンリーディングフレームの中にも存在する（例えばＴａｒｋｅ他２０２１年の補足情報の中の表に掲載されている遺伝子とエピトープを参照されたい）。
したがって別の１つの態様では、本発明は、免疫学的に有効な量の
（ｉ）ターゲティングユニット、二量体化ユニット、および抗原ユニット（この抗原ユニットは、ベータコロナウイルスの少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、または
（ｉｉ）（ｉ）で規定されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または
（ｉｉｉ）（ｉ）で規定されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド２つからなる二量体タンパク質と、
薬学的に許容可能な担体を含むワクチンに関する。
好ましい一実施形態では、抗原ユニットは、ベータコロナウイルスのいくつかのＴ細胞エピトープ、好ましくはいくつかの種または株のベータコロナウイルスの間で保存されているいくつかのＴ細胞エピトープを含む。一実施形態では、抗原ユニットは、２～５０個のＴ細胞エピトープ、例えば３～４５個のＴ細胞エピトープ、例えば４～４０個のＴ細胞エピトープ、例えば５～３５個のＴ細胞エピトープ、例えば６～３０個のＴ細胞エピトープ、例えば７～２５個のＴ細胞エピトープ、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個のＴ細胞エピトープを含む。
ベータコロナウイルスの保存された領域からのＴ細胞エピトープを含むワクチンは、いくつかの種／株のベータコロナウイルス（例えばいくつかの株のＳＡＲＳ－ＣｏＶ、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対する保護を提供するであろう。このようなワクチンは、ベータコロナウイルスの複数のバリアント（例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶのバリアント、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアント）に対する保護も提供するであろう。それは、将来の変異したウイルスに対するそのようなワクチンの有効性にとって重要である。ウイルスは変異する（例えばウイルス抗原ドリフトまたは抗原シフトをする）ことが知られている。ベータコロナウイルスの属を横断して保存された領域という知見により、これらの保存された領域は不可欠な構造または機能を維持するのに必要とされ、したがって将来の変異がより保存されていない領域で起こるであろう可能性が大きくなる。保存された領域に対する免疫応答を起こさせることにより、ワクチンを接種された個人は将来の変異したい（したがって新規な）株に対しても保護されることになる。
したがって本発明の一実施形態では、ワクチンは、ベータコロナウイルスエピトープに対するＴ細胞の活性化を通じて細胞を媒介とする免疫応答を誘起する設計にされる。Ｔ細胞がエピトープを認識するのは、エピトープが処理されて複合体としてＭＨＣ分子に提示されるときである。
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子の２つの主要なクラスＭＨＣ ＩとＭＨＣ ＩＩが存在する。ＭＨＣ（クラス）ＩとＭＨＣ（クラス）ＩＩという用語は本明細書では、ＨＬＡ（クラス）ＩとＨＬＡ（クラス）ＩＩと交換可能に用いられる。ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）はヒトにおける主要組織適合性複合体である。
Ｔ細胞エピトープだけを含む本発明のワクチンの抗原ユニットの中、またはＴ細胞エピトープを含むが、完全長ウイルス表面タンパク質またはその一部である少なくとも１つのベータコロナウイルスをさらに含む本発明のワクチンの抗原ユニットの中に含まれるＴ細胞エピトープは長さが７～約２００個のアミノ酸を持ち、より長いＴ細胞エピトープは、最小エピトープのホットスポットをおそらく含む。最小エピトープのホットスポットは、世界の人口の広い範囲をカバーする異なるＨＬＡアレルによって提示されることが予測されるいくつかの最小エピトープ（例えば長さが８～１５個のアミノ酸）を含有する領域である。
一実施形態では、このようなワクチンの抗原ユニットは、長さが７～１５０個のアミノ酸、好ましくは７～１００個のアミノ酸、例えば約１０～約１００個のアミノ酸、または約１５～約１００個のアミノ酸、または約２０～約７５個のアミノ酸、または約２５～約５０個のアミノ酸のＴ細胞エピトープを含む。
好ましい一実施形態では、このようなワクチンの抗原ユニットは、ＭＨＣ ＩまたはＭＨＣ ＩＩの表面への特異的提示に適した長さを有するＴ細胞エピトープを含む。一実施形態では、Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣＩ提示のため７～１１個のアミノ酸の長さを有する。別の一実施形態では、Ｔ細胞エピトープの配列は、ＭＨＣＩＩ提示のため９～６０個のアミノ酸、例えば９～３０個のアミノ酸、例えば１５～６０個のアミノ酸、例えば１５～３０個のアミノ酸の長さを有する。好ましい一実施形態では、Ｔ細胞エピトープはＭＨＣＩＩ提示のため１５個のアミノ酸の長さを有する。
別の好ましい一実施形態では、Ｔ細胞エピトープは、ＨＬＡクラスＩ／ＩＩアレルへの結合に関して予測される能力に基づいて選択される。さらに別の好ましい一実施形態では、Ｔ細胞エピトープは免疫原性であることが知られており、例えばその免疫原性は適切な方法によって確認され、結果は例えば学術文献に公開されている。
本発明の別の一実施形態では、抗原ユニットは、免疫原性であることが知られているか、ＨＬＡクラスＩ／ＩＩアレルに結合することが予測される複数のＴ細胞エピトープを含む。後者のＴ細胞エピトープは、予測ＨＬＡ結合アルゴリズムに基づいてインシリコで選択される。すべての関連するエピトープが同定された後、それらエピトープは、ＨＬＡクラスＩ／ＩＩアレルに結合する能力に従ってランク付けされ、最もよく結合することが予測されるエピトープが選択されて抗原ユニットに含められる。
適切な任意のＨＬＡ結合アルゴリズムを使用することができ、それは以下に示すものの１つである。
ペプチド－ＭＨＣ結合の分析に利用できるソフトウエア（ＩＥＤＢ、ＮｅｔＭＨＣｐａｎとＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎ）は、以下のウェブサイト：
http://www.iedb.org/
https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetMHCpan-4.0
https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetMHCIIpan-3.2
からダウンロードすること、またはオンラインで使用することができる。
ワクチンのための最適な配列を予測する市販の高度なソフトウエアは、
http://www.oncoimmunity.com/
https://omictools.com/T細胞エピトープ-category
https://github.com/griffithlab/pVAC-Seq
http://crdd.osdd.net/raghava/cancertope/help.php
http://www.epivax.com/tag/neoantigen/
に見いだされる。
別の一実施形態では、各Ｔ細胞エピトープが、予測される結合親和性および／または抗原性に従ってランク付けされ、最も抗原性があると予測されるエピトープが選択されて、好ましくは抗原ユニットの中に最適に配置される。
本発明の一実施形態では、Ｔ細胞エピトープの配列は、スパイクタンパク質、または膜タンパク質、またはエンベロープタンパク質、またはヌクレオカプシドタンパク質、またはＯＲＦ１ａ／ｂタンパク質、またはＯＲＦ３ａタンパク質の配列の一部である。別の一実施形態では、Ｔ細胞エピトープの配列は、以下の遺伝子／タンパク質、すなわちＮＣＡＰ、ＡＰ３Ａ、スパイク、ＯＲＦ１ａ／ｂ、ＯＲＦ３ａ、ＶＭＥ１、およびＶＥＭＰの一部である。
本発明の一実施形態は、本発明は、ベータコロナウイルスの間（例えば同じ亜属のベータコロナウイルスの間、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＳＡＲＳ－ＣｏＶの間）で保存されているＴ細胞エピトープを同定する方法に関係しており、この方法は、
・特定の人口または特定の民族集団または特定の地理的領域に特異的なＨＬＡクラスＩとＩＩのアレルのセットを同定すること
・ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の保存されたウイルス配列の中で最小エピトープ（すなわち世界の人口の広い範囲をカバーするため異なるＨＬＡクラスＩとＩＩのアレルによって提示されることが予想される最小エピトープ）のホットスポットを含有するゲノム領域を同定すること
・異なるＨＬＡクラスＩとＩＩのアレルの最大数をカバーするホットスポットの中でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｔ細胞エピトープを選択すること
・選択されたＴ細胞エピトープから、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－とＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の間で保存されているものを同定すること
・選択されたＴ細胞エピトープについて正常なヒトのプロテオームに見られる配列との類似性をチェックし、そのような配列との一致が多数あるＴ細胞エピトープを除去すること
・残った選択されたＴ細胞エピトープから、免疫原性であることがすでに記載されている最小エピトープと一致するかそれとの類似性が大きいものを同定することを含む。
本発明の別の一実施形態では、本発明は、ベータコロナウイルスの間（例えば同じ亜属のベータコロナウイルスの間、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＳＡＲＳ－ＣｏＶの間）で保存されているＴ細胞エピトープを同定する方法に関係しており、この方法は、
・特定の人口または特定の民族集団または特定の地理的領域に特異的なＨＬＡクラスＩとＩＩのアレルのセットを同定すること
・ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス配列の中で最小エピトープのホットスポットを含有するゲノム領域を同定すること
・ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－とＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のバリアントのほか、異なるＨＬＡクラスＩとＩＩのアレルを最も多くカバーするホットスポットの最適なセットを選択すること
・選択されたＴ細胞エピトープについて正常なヒトのプロテオームに見られる配列との類似性をチェックし、そのような配列との一致が多数あるＴ細胞エピトープを除去すること
・残った選択されたＴ細胞エピトープから、免疫原性であることがすでに記載されている最小エピトープと一致するかそれとの類似性が大きいものを同定することを含む。
この方法では、ホットスポットの最適なセットの選択は、最適化アルゴリズム（最大セットカバレッジ）として実現されるため、ＨＬＡカバレッジと病原体保存の両方が同時に最適化される。
特異的Ｔ細胞エピトープは、開示されている手続きによって同定されている。本発明の一実施形態では、Ｔ細胞エピトープは、実施例１に掲載されているエピトープから選択される。好ましい一実施形態では、Ｔ細胞エピトープは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２３、配列番号２２４、配列番号２２５、配列番号２２６、配列番号２２７、配列番号２２８、配列番号２２９、および配列番号３２２～４４４からなるリストから選択される。
好ましい一実施形態では、Ｔ細胞エピトープは、配列番号６７、配列番号１９、配列番号７８、配列番号５７、配列番号５０、配列番号５５、配列番号６４、配列番号２２、配列番号８７、配列番号６２、配列番号３９、配列番号５９、配列番号２６、配列番号５３、配列番号３２、配列番号３８、配列番号３０、配列番号４０、配列番号４２、配列番号３５、配列番号７１、配列番号９、配列番号２１、配列番号８５、配列番号７５、配列番号２３、配列番号３４、配列番号３６、配列番号７７、および配列番号２０からなるリストから選択される。
別の一実施形態では、Ｔ細胞エピトープは、配列番号６７、配列番号１９、配列番号７８、配列番号５７、配列番号５０、配列番号５５、配列番号６４、配列番号２２、配列番号８７、および配列番号６２からなるリストから選択される。
さらに別の一実施形態では、Ｔ細胞エピトープは、表１と配列番号７５に開示されているｐｅｐ１～ｐｅｐ２０からなるリストから選択される。さらに別の一実施形態では、Ｔ細胞エピトープは、臨床試験で免疫原性であることが確認されたか、ベータコロナウイルスに感染したことがあるヒト患者で検証されているものである。
さらに別の１つの態様では、本発明は、免疫学的に有効な量の
（ｉ）ターゲティングユニット、二量体化ユニット、および抗原ユニット（この抗原ユニットは、ａ）ベータコロナウイルスの完全長ウイルス表面タンパク質またはその一部と、ｂ）少なくとも１つのベータコロナウイルスＴ細胞エピトープを含む）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、または
（ｉｉ）（ｉ）で規定されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または
（ｉｉｉ）（ｉ）で規定されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド２つからなる二量体タンパク質と、
薬学的に許容可能な担体を含むワクチンに関する。
一実施形態では、前記完全長タンパク質は、エンベロープタンパク質、スパイクタンパク質、膜タンパク質、およびヘマグルチニンエステラーゼからなる群から選択される。
別の一実施形態では、抗原ユニットは、ベータコロナウイルスのそのような完全長ウイルス表面タンパク質に含まれる（例えば上記のタンパク質のいずれか１つに含まれる）少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含み、好ましくはベータコロナウイルスのそのような完全長ウイルス表面タンパク質に含まれる（例えば上記のタンパク質のいずれか１つに含まれる）いくつかのＢ細胞エピトープを含む。
さらに別の一実施形態では、本発明は、免疫学的に有効な量の
（ｉ）ターゲティングユニット、二量体化ユニット、および抗原ユニット（この抗原ユニットは、ａ）ベータコロナウイルスの完全長スパイクタンパク質またはその一部、またはスパイクタンパク質に含まれる少なくとも１つのベータコロナウイルスＢ細胞エピトープと、ｂ）少なくとも１つのベータコロナウイルスＴ細胞エピトープを含む）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、または
（ｉｉ）（ｉ）で規定されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または
（ｉｉｉ）（ｉ）で規定されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド２つからなる二量体タンパク質と、
薬学的に許容可能な担体を含むワクチンに関する。
一実施形態では、抗原ユニットは完全長スパイクタンパク質を含む。そのため抗原ユニットは、配列番号２３０のアミノ酸配列と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、上記ワクチンの抗原ユニットは、ａ）ベータコロナウイルスのスパイクタンパク質の受容体結合ドメインと、ｂ）少なくとも１つのベータコロナウイルスＴ細胞エピトープを含む。
一実施形態では、抗原ユニットは、配列番号２３１のアミノ酸配列と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、抗原ユニットは配列番号２３１のアミノ酸配列を含む。
別の一実施形態では、抗原ユニットは、配列番号８０２のアミノ酸配列と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、抗原ユニットは配列番号８０２のアミノ酸配列を含む。
さらに別の一実施形態では、抗原ユニットは、配列番号８０３のアミノ酸配列と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、抗原ユニットは配列番号８０３のアミノ酸配列を含む。
さらに別の一実施形態では、抗原ユニットは、配列番号８０４のアミノ酸配列と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、抗原ユニットは配列番号８０４のアミノ酸配列を含む。
さらに別の一実施形態では、抗原ユニットは、配列番号８０５のアミノ酸配列と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、抗原ユニットは配列番号８０５のアミノ酸配列を含む。
好ましい一実施形態では、抗原ユニットは、配列番号２４６のアミノ酸配列と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、抗原ユニットは配列番号２４６のアミノ酸配列を含む。
別の好ましい一実施形態では、抗原ユニットは、配列番号２５５のアミノ酸２４３～４５５のアミノ酸配列と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、抗原ユニットは配列番号２５５のアミノ酸２４３～４５５のアミノ酸配列を含む。
さらなる一実施形態では、抗原ユニットは、ＲＢＤおよび／またはその一部の複数のコピー（例えば２、３、４、または５個のコピー）を含み、それらコピーは同じではなく、変異（例えば１、２、３、４、５個、またはそれよりも多い変異）を含む。
一例として、抗原ユニットはＲＢＤまたはその一部を２つ（例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の武漢株のスパイクタンパク質のＲＢＤまたはその一部と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の南アフリカバリアントＢ．１．３５１のスパイクタンパク質のＲＢＤまたはその一部）含むことができる。さらなる一例として、抗原ユニットは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の南アフリカバリアントＢ．１．３５１のスパイクタンパク質のＲＢＤまたはその一部と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＵＫバリアントＢ．１．１．７のスパイクタンパク質のＲＢＤまたはその一部と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のカリフォルニアバリアントＢ．１．４２７のスパイクタンパク質のＲＢＤまたはその一部を含むことができる。
別の一実施形態では、上記のワクチンの抗原ユニットは、ａ）ベータコロナウイルスのスパイクタンパク質のＨＲ１ドメインまたはＨＲ２ドメインと、ｂ）少なくとも１つのベータコロナウイルスＴ細胞エピトープを含む。さらに別の一実施形態では、上記のワクチンの抗原ユニットは、ａ）ベータコロナウイルスのスパイクタンパク質のＨＲ２ドメインと、ｂ）少なくとも１つのベータコロナウイルスＴ細胞エピトープを含む。
好ましい一実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞エピトープは、配列番号１～配列番号４４４からなるリストから選択され、好ましくは少なくとも１つのＴ細胞エピトープは、配列番号６７、配列番号１９、配列番号７８、配列番号５７、配列番号５０、配列番号５５、配列番号６４、配列番号２２、配列番号８７、配列番号６２、配列番号３９、配列番号５９、配列番号２６、配列番号５３、配列番号３２、配列番号３８、配列番号３０、配列番号４０、配列番号４２、配列番号３５、配列番号７１、配列番号９、配列番号２１、配列番号８５、配列番号７５、配列番号２３、配列番号３４、配列番号３６、配列番号７７、および配列番号２０からなるリストから選択され、より好ましくは少なくとも１つのＴ細胞エピトープは、配列番号６７、配列番号１９、配列番号７８、配列番号５７、配列番号５０、配列番号５５、配列番号６４、配列番号２２、配列番号８７、および配列番号６２からなるリストから選択される。
抗原ユニットの長さは、主に、その中に含まれるエピトープ配列の長さのほか、エピトープ配列の数によって決まる。一実施形態では、エピトープはリンカーによって互いに分離されており、そのことも抗原ユニットの長さに寄与する。
一実施形態では、抗原ユニットは３５００個までのアミノ酸、例えば２１～３５００個のアミノ酸、好ましくは約３０個のアミノ酸～約２０００個のアミノ酸、例えば約５０～約１５００個のアミノ酸、より好ましくは約１００～約１５００個のアミノ酸、例えば約１００～約１０００個のアミノ酸、または約１００～約５００個のアミノ酸、または約１００～約３００個のアミノ酸を含む。
ベータコロナウイルスエピトープが抗原ユニットの中にランダムに配置されている場合、関連する免疫応答を得ることは可能だが、免疫応答を増強するため抗原ユニットの中にＴ細胞エピトープおよび／またはＢ細胞エピトープ、好ましくは直線状Ｂ細胞エピトープ（今後は「エピトープ」と表記する）を配置するのに以下の方法の少なくとも１つに従うことが好ましい。
抗原ユニットは、Ｎ末端開始部とＣ末端終止部を有するポリペプチドとして記述することができる。抗原ユニットは、好ましくはユニットリンカーを介して二量体化ユニットに接続される。抗原ユニットは、ポリペプチド／二量体化タンパク質のＣＯＯＨ末端またはＮＨ２末端のいずれかに位置する。抗原ユニットはポリペプチド／二量体化タンパク質のＣＯＯＨ末端にあることが好ましい。
一実施形態では、エピトープは、二量体化ユニットから抗原ユニットの末端（すなわち末端エピトープ）に向かう方向に、抗原性が最高のものから最低のものへの順番で配置される。
別の一実施形態では、特に親水性／疎水性がエピトープ間で大きく変動する場合には、疎水性が最高のエピトープを抗原ユニットの実質的に中央に位置させ、親水性が最高のエピトープを抗原ユニットの先端および／または末端に位置させる。
抗原ユニットをちょうど中央部に位置させることは、抗原ユニットが奇数のエピトープを含む場合にだけ可能である。この文脈における「実質的に」という用語は偶数のエピトープを含む抗原ユニットを意味し、疎水性が最高のエピトープはできるだけ中央に近く位置させる。
例として、抗原ユニットは、１－２－３＊－４－５のように配置された５つのエピトープを含む。ここに１、２、３＊、４、および５はそれぞれが１つのエピトープであり、＊は疎水性が最高のエピトープを示しており、抗原ユニットの中央に位置している。
別の一例では、抗原ユニットは、１－２－３＊－４－５－６、あるいは１－２－４－３＊－５－６のように配置された６つのエピトープを含む。ここに１、２、３＊、４、５、および６はそれぞれが１つのエピトープであり、＊は疎水性が最高のエピトープを示しており、抗原ユニットの実質的に中央に位置している。
あるいはエピトープは、親水性抗原配列と疎水性抗原配列の間に交互に配置することができる。
さらに、ＧＣが豊富なエピトープは、ＧＣクラスターを回避するため互いに近接して配置してはならない。好ましい一実施形態では、ＧＣが豊富な１つのエピトープの後にＧＣが豊富でない少なくとも１つのエピトープが続き、その後にＧＣが豊富な第２のエピトープが続く。
一実施形態では、本発明のワクチンは、１～５０個のエピトープを含む抗原ユニットを含む。好ましい一実施形態では、前記エピトープはＴ細胞エピトープである。
一実施形態では、３～５０個のエピトープが抗原ユニットに含まれる（例えば３～３０個のエピトープ、例えば３～２０個のエピトープ、例えば３～１５個のエピトープ、または例えば３～１０個のエピトープ）。好ましい一実施形態では、前記エピトープはＴ細胞エピトープである。
別の一実施形態では、５～５０個のエピトープが抗原ユニットに含まれる（例えば５～３０個のエピトープ、例えば５～２５個のエピトープ、例えば５～２０個のエピトープ、例えば５～１５個のエピトープ、または例えば５～１０個のエピトープ）。好ましい一実施形態では、前記エピトープはＴ細胞エピトープである。
さらなる一実施形態では、１０～５０個のエピトープが抗原ユニットに含まれる（例えば１０～４０個のエピトープ、例えば１０～３０個のエピトープ、例えば１０～２５個のエピトープ、例えば１０～２０個のエピトープ、または例えば１０～１５個のエピトープ）。好ましい一実施形態では、前記エピトープはＴ細胞エピトープである。
好ましい一実施形態では、抗原ユニットは、１０、２０、３０、または５０個のエピトープからなる。好ましい一実施形態では、前記エピトープはＴ細胞エピトープである。
抗原ユニットは、１つのエピトープまたはいくつかのエピトープを他の１つのエピトープまたは他のいくつかのエピトープから分離する１つ以上のリンカーと、抗原ユニットを二量体化ユニットに接続する１つのリンカー（今後はユニットリンかーと呼ぶ）をさらに含むことができる。前記１つ以上のリンカーはエピトープが最適なやり方で免疫系に提示されることを保証するため、ワクチンの有効性が向上する。抗原ユニットがベータコロナウイルスの完全長タンパク質またはそのようなタンパク質の一部を含むワクチンでは、リンカーが存在しているとタンパク質が正しく折り畳まれることも保証することができる。
前記１つ以上のリンカーは、非免疫原性であって好ましくは可撓性でもあるように設計することが好ましい。完全長ウイルス表面タンパク質またはその一部（例えばスパイクタンパク質またはその一部）を含むワクチンでは、リンカーによりタンパク質を正しく折り畳むことが可能になり、したがって含まれるＢ細胞エピトープをＢ細胞に提示することが最適化される。それに加え、リンカーは、抗原提示細胞に効果的に送達される機能的ワクチンタンパク質の効果的な分泌を可能にするため、抗原ユニットが多数のエピトープを含む場合でさえ、Ｔ細胞へのＴ細胞エピトープの提示が増加する。前記１つ以上のリンカーの長さは、可撓性を保証するため４～２０個のアミノ酸であることが好ましい。別の好ましい一実施形態では、前記１つ以上のリンカーの長さは８～２０個のアミノ酸、例えば８～１５個のアミノ酸、例えば８～１２個のアミノ酸、または、例えば１０～１５個のアミノ酸である。特別な一実施形態では、前記１つ以上のリンカーの長さは１０個のアミノ酸である。
前記１つ以上のリンカーは、すべてが同じヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を有することが好ましい。しかし１つ以上のエピトープがリンカーと似たアミノ酸モチーフを含む場合には、そのエピトープの近傍のリンカーを異なる配列のリンカーで置き換えることが有利である可能性がある。さらに、エピトープ／リンカーの接合がエピトープそのものを構成することが予測される場合には、異なる配列のリンカーを使用できる可能性がある。
前記１つ以上のリンカーは、いくつかのセリン残基および／またはいくつかのグリシン残基を含むセリン（Ｓ）－グリシン（Ｇ）リンカーであることが好ましい。好ましい例は、ＧＧＧＧＳ（配列番号８０６）、ＧＧＧＳＳ（配列番号８０７）、ＧＧＧＳＧ（配列番号８０８）、ＧＧＧＧＳ、またはこれらの複数のバリアント（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８０９）または（ＧＧＧＧＳ）ｍ、（ＧＧＧＳＳ）ｍ、（ＧＧＧＳＧ）ｍ（ただしｍは、１～５、１～４、または１～３の整数である）など）である。好ましい一実施形態では、ｍは２である。
好ましい一実施形態では、セリン－グリシンリンカーは、少なくとも１個のロイシン（Ｌ）残基（少なくとも２個、または少なくとも３個のロイシンなど）をさらに含む。セリン－グリシンリンカーは、例えば１、２、３、４個のロイシンを含むことができる。セリン－グリシンリンカーは１個のロイシンまたは２個のロイシンを含むことが好ましい。
一実施形態では、前記１つ以上のリンカーは、ＬＧＧＧＳ（配列番号８１０）、ＧＬＧＧＳ（配列番号８１１）、ＧＧＬＧＳ（配列番号８１２）、ＧＧＧＬＳ（配列番号８１３）、またはＧＧＧＧＬ（配列番号８１４）という配列を含むか、その配列からなる。別の一実施形態では、１つ以上のリンカーは、ＬＧＧＳＧ（配列番号８１５）、ＧＬＧＳＧ（配列番号８１６）、ＧＧＬＳＧ（配列番号８１７）、ＧＧＧＬＧ（配列番号８１８）、またはＧＧＧＳＬという配列を含むか、その配列からなる。さらに別の一実施形態では、１つ以上のリンカーは、ＬＧＧＳＳ（配列番号８１９）、ＧＬＧＳＳ（配列番号８２０）、ＧＧＬＳＳ（配列番号８２１）、ＧＧＧＬＳ、またはＧＧＧＳＬ（配列番号８２２）という配列を含むか、その配列からなる。
さらに別の一実施形態では、前記１つ以上のリンカーは、ＬＧＬＧＳ（配列番号８２３）、ＧＬＧＬＳ（配列番号８２４）、ＧＬＬＧＳ（配列番号８２５）、ＬＧＧＬＳ（配列番号８２６）、またはＧＬＧＧＬ（配列番号８２７）という配列を含むか、その配列からなる。さらに別の一実施形態では、前記１つ以上のリンカーは、ＬＧＬＳＧ（配列番号８２８）、ＧＬＬＳＧ（配列番号８２９）、ＧＧＬＳＬ（配列番号８３０）、ＧＧＬＬＧ（配列番号８３１）、またはＧＬＧＳＬ（配列番号８３２）という配列を含むか、その配列からなる。さらに別の一実施形態では、前記１つ以上のリンカーは、ＬＧＬＳＳ（配列番号８３３）、ＧＬＧＬＳ、ＧＧＬＬＳ（配列番号８３４）、ＧＬＧＳＬ、またはＧＬＧＳＬという配列を含むか、その配列からなる。
別の一実施形態では、前記１つ以上のリンカーは長さが１０個のアミノ酸を有するセリン－グリシンリンカーであり、１個のロイシンまたは２個のロイシンを含む。
一実施形態では、前記１つ以上のリンカーは、ＬＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８３５）、ＧＬＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８３６）、ＧＧＬＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８３７）、ＧＧＧＬＳＧＧＧＧＳ（配列番号８３８）、またはＧＧＧＧＬＧＧＧＧＳ（配列番号８３９）という配列を含むか、その配列からなる。別の一実施形態では、前記１つ以上のリンカーは、ＬＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号８４０）、ＧＬＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号８４１）、ＧＧＬＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号８４２）、ＧＧＧＬＧＧＧＧＳＧ（配列番号８４３）、またはＧＧＧＳＬＧＧＧＳＧ（配列番号８４４）という配列を含むか、その配列からなる。さらに別の一実施形態では、前記１つ以上のリンカーは、ＬＧＧＳＳＧＧＧＳＳ（配列番号８４５）、ＧＬＧＳＳＧＧＧＳＳ（配列番号８４６）、ＧＧＬＳＳＧＧＧＳＳ（配列番号８４７）、ＧＧＧＬＳＧＧＧＳＳ（配列番号８４８）、またはＧＧＧＳＬＧＧＧＳＳ（配列番号８４９）という配列を含むか、その配列からなる。
さらなる一実施形態では、前記１つ以上のリンカーは、ＬＧＧＧＳＬＧＧＧＳ（配列番号８５０）、ＧＬＧＧＳＧＬＧＧＳ（配列番号８５１）、ＧＧＬＧＳＧＧＬＧＳ（配列番号８５２）、ＧＧＧＬＳＧＧＧＬＳ（配列番号８５３）、またはＧＧＧＧＬＧＧＧＧＬ（配列番号８５４）という配列を含むか、その配列からなる。別の一実施形態では、前記１つ以上のリンカーは、ＬＧＧＳＧＬＧＧＳＧ（配列番号８５５）、ＧＬＧＳＧＧＬＧＳＧ（配列番号８５６）、ＧＧＬＳＧＧＧＬＳＧ（配列番号８５７）、ＧＧＧＬＧＧＧＧＬＧ（配列番号８５８）、またはＧＧＧＳＬＧＧＧＳＬ（配列番号８５９）という配列を含むか、その配列からなる。さらに別の一実施形態では、前記１つ以上のリンカーは、ＬＧＧＳＳＬＧＧＳＳ（配列番号８６０）、ＧＬＧＳＳＧＬＧＳＳ（配列番号８６１）、ＧＧＬＳＳＧＧＬＳＳ（配列番号８６２）、ＧＧＧＬＳＧＧＧＬＳ、またはＧＧＧＳＬＧＧＧＳＬという配列を含むか、その配列からなる。
さらなる実施形態では、前記１つ以上のリンカーは、ＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬ（配列番号８６３）という配列を含むか、その配列からなる。別の一実施形態では、前記１つ以上のリンカーは、ＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬ（配列番号８６４）という配列を含むか、その配列からなる。
ベータコロナウイルスの完全長タンパク質またはそのようなタンパク質の一部と１つ以上のＴ細胞エピトープを含む抗原ユニットを含むワクチンのため、一実施形態では、Ｔ細胞エピトープとそのタンパク質を分離するリンカーは、１０～６０個のアミノ酸、例えば１１～５０個のアミノ酸、または１２～４５個のアミノ酸、または１３～４０個のアミノ酸の長さを有する。
このようなリンカーは非免疫原性でもあることが好ましい。このようなリンカーの例は、上記のようなグリシン－セリンが豊富なリンカー、またはグリシン－セリン－ロイシンが豊富なリンカー、ＧＧＳＡＧＧＳＧＳＧＳＳＧＧＳＳＧＡＳＧＴＧＴＡＧＧＴＧＳＧＳＧＴＧＳＧ（配列番号８６６）という配列を含むか、その配列からなるＧＳＡＴ（配列番号８６５）リンカーである。別の一実施形態では、このようなリンカーはＳＥＧリンカーであり、ＧＧＳＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号８６７）という配列を含むか、その配列からなる。さらに、タンパク質モデリングを利用してリンカーに接続されたタンパク質の３Ｄ構造／立体配置をモデル化し、どのような長さとアミノ酸配列が正しい折り畳みを促進するかを明らかにすることができる。
一実施形態では、抗原ユニットは、１０～２０個または１０～２５個のエピトープと複数のリンカーを含み、それらリンカーは、それらエピトープのそれぞれを分離するか、いくつかのエピトープを他のいくつかのエピトープから分離している。前記リンカーは１０個のアミノ酸の長さを有することが好ましい。リンカーは上に規定した任意の長さ（例えば５～１２個のアミノ酸など）を有することもできる。
あるいは前記１つ以上のリンカーは、ＧＳＡＴリンカー（すなわち１つ以上のグリシン、セリン、アラニン、およびトレオニンという残基を含むリンカー）と、ＳＥＧリンカー（すなわち１つ以上のセリン、グルタミン酸、およびグリシンという残基を含むリンカー）、またはこれらの複数のバリアントから選択することができる。
抗原ユニットと二量体化ユニットはユニットリンカーによって接続されることが好ましい。ユニットリンカーは、ポリヌクレオチドの構築を容易にするため制限部位を含むことができる。ユニットリンカーはＧＬＧＧＬリンカーまたはＧＬＳＧＬ（配列番号８６８）リンカーであることが好ましい。
リンカーのさらなる配列の例は、ＷＯ ２０２０／１７６７９７Ａ１の段落［００９８］～［００９９］および記載されている配列（本明細書に参照によって組み込まれている）と、ＵＳ ２０１９／００２２２０２Ａ１の参考文献および段落［０１３５］～［０１３９］（本明細書に参照によって組み込まれている）に開示されている。
「ターゲティングユニット」という用語は、本明細書では、抗原ユニットを有するワクチンに含まれる（ポリヌクレオチドによってコードされる）ポリペプチド／二量体タンパク質を抗原提示細胞に送達するユニットを意味する。
ターゲティングユニットにより、本発明のワクチンに含まれるポリペプチド／二量体タンパク質は樹状細胞（ＤＣ）、好中球、および他の免疫細胞を引き付ける。したがってターゲティングユニットを含むポリペプチド／二量体タンパク質／ワクチンは、その中に含まれる抗原ユニットを特定の細胞に向けるだけでなく、それに加え、特定の免疫細胞をワクチンの投与部位にリクルートすることによって応答増幅効果（アジュバント効果）を容易にするであろう。この独自の機構は、患者がいかなる追加アジュバントもなしで本発明のワクチン接種を受ける臨床設定において非常に重要である。なぜならワクチンそのものがアジュバント効果を提供するからである。
ターゲティングユニットは、ポリペプチド／二量体タンパク質のＣＯＯＨ末端またはＮＨ２末端のいずれかに位置する抗原ユニットに二量体化ユニットを介して接続される。抗原ユニットは、ポリペプチド／二量体タンパク質のＣＯＯＨ末端にあることが好ましい。
ターゲティングユニットは、本発明のポリペプチド／二量体タンパク質／ワクチンをＡＰＣ上に発現している表面分子（ＤＣのサブセットの表面にだけ発現している分子など）に向かわせるように設計されている。
ＡＰＣ上のそのような表面分子の例は、ＨＬＡ、分化のクラスター１４（ＣＤ１４）、分化のクラスター４０（ＣＤ４０）、ケモカイン受容体、およびＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）である。ケモカイン受容体に含まれるのは、Ｃ－Ｃモチーフケモカイン受容体１（ＣＣＲ１）、Ｃ－Ｃモチーフケモカイン受容体３（ＣＣＲ３）、およびＣ－Ｃモチーフケモカイン受容体５（ＣＣＲ５）と、ＸＣＲ１である。Ｔｏｌｌ様受容体に含まれるのはＴＬＲ－２、ＴＬＲ－４、およびＴＬＲ－５である。
ターゲティングユニットは、表面分子と相互作用する部分であるか、その部分を含む。したがってターゲティングユニットは、ＨＬＡ、ＣＤ１４、ＣＤ４０、またはＴｏｌｌ様受容体に対する特異性を有する抗体結合領域を含むか、その抗体結合領域からなる。別の一実施形態では、ターゲティングユニットは合成リガンドまたは天然リガンドを含むか、それからなる。例に含まれるのは、可溶性ＣＤ４０リガンド、ケモカインなどの天然リガンド（例えばケモカインリガンド５（Ｃ－Ｃモチーフリガンド５（ＣＣＬ５またはＲＡＮＴＥＳ）とも呼ばれる）、マクロファージ炎症性タンパク質アルファ（ＣＣＬ３またはＭＩＰ－１α）、ケモカインモチーフリガンド１または２（ＸＣＬ１またはＸＣＬ２）、および細菌抗原（例えばフラジェリンなど）である。
本発明の１つの態様では、ターゲティングユニットは、抗原提示細胞上の表面受容体（ＣＤ１４、ＣＤ４０、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ－２、ＴＬＲ－４、および／またはＴＬＲ－５など）、ケモカイン受容体（ＣＣＲ１、ＣＣＲ３、ＣＣＲ５、またはＭＨＣクラスＩとＩＩタンパク質など）など）に対する特異性を有する抗体結合領域を含む。
別の一実施形態では、ターゲティングユニットは、ＣＤ４０、ＴＬＲ－２、ＴＬＲ－４、およびＴＬＲ－５からなる群から選択される表面分子に対する親和性を有する。したがって一実施形態では、ターゲティングユニットは、抗ＣＤ４０、抗ＴＬＲ－２、抗ＴＬＲ－４、または抗ＴＬＲ－５に対する特異性を有する抗体可変ドメイン（ＶＬとＶＨ）を含むか、それからなる。さらに別の一実施形態では、ターゲティングユニットは、ＴＬＲ－５に対する親和性を有するフラジェリンを含むか、それからなる。
一実施形態では、ターゲティングユニットは、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質に対する親和性を有する。したがって一実施形態では、ターゲティングユニットは、抗ＨＬＡ－ＤＰ、抗ＨＬＡ－ＤＲ、および抗ｐａｎ ＨＬＡクラスＩＩからなる群から選択されるＭＨＣクラスＩＩタンパク質に対する特異性を有する抗体可変ドメイン（ＶＬとＶＨ）を含むか、それからなる。
本発明の好ましい一実施形態では、ターゲティングユニットは、ＣＣＲ１、ＣＣＲ３、およびＣＣＲ５から選択されるケモカイン受容体に対する親和性、好ましくはＣＣＲ１とＣＣＲ５から選択されるケモカイン受容体に対する親和性を有する。本発明の別の好ましい実施形態では、ターゲティングユニットは、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質に対する親和性、好ましくは抗ＨＬＡ－ＤＰ、抗ＨＬＡ－ＤＲ、および抗ｐａｎ ＨＬＡクラスＩＩからなる群から選択されるＭＨＣクラスＩＩタンパク質に対する親和性を有する。より具体的には、一実施形態では、ターゲティングユニットは抗ｐａｎ ＨＬＡクラスＩＩとＭＩＰ－１αを含む。
一実施形態では、ターゲティングユニットがそのコグネイト受容体に結合すると、ポリペプチド／二量体タンパク質／ワクチンがＡＰＣにおいて内部化され、それが分解されて小さなペプチドになり、ＭＨＣ分子にロードされてＣＤ４＋ Ｔ細胞とＣＤ８＋ Ｔ細胞に提示され、特異的免疫応答が誘導される。ＭＨＣ ＩＩ分子にロードされたペプチドは抗原特異的ＣＤ４＋ Ｔヘルパー細胞が認識することができるのに対し、ＭＨＣ Ｉ分子にロードされたペプチドは抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞が認識することができ、細胞傷害機能の増殖と活性化へとつながる。ＭＨＣ Ｉ分子の表面への内部化された抗原の提示は、交差提示と呼ばれるプロセスである。ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、刺激されると、活性化されたＣＤ４＋ Ｔ細胞の助けを借りて、同じ抗原を発現している細胞に向かい、その細胞を殺す。
本発明の１つの態様では、ターゲティングユニットはＭＩＰ－１αを含むかＭＩＰ－１αであり、そのＭＩＰ－１αはヒトＭＩＰ－１α（ｈＭＩＰ－１α、ＬＤ７８βとも呼ばれる）であることが好ましい。ＭＩＰ－１αはその走化性能力を通じてＡＰＣをワクチンに引き付けるだけでなく、古典経路と交差提示経路の両方を通じてポリペプチド／二量体タンパク質ワクチンコンストラクトの内部化を引き起こし、そのことによってエピトープが酵素によって処理され、細胞表面に提示されてＴ細胞応答、特にＴｈ１ ＣＤ４＋応答とＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を生じさせる。ＭＩＰ－１αはベータコロナウイルス感染症に対する保護にとって重要な抗体応答（特にＩｇＧ２ａ）の誘導も支援することができる。
本発明の一実施形態では、ターゲティングユニットは、配列番号２３４のアミノ酸配列２４～９３と少なくとも８０％配列が一致するアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態では、ターゲティングユニットは、配列番号２３４のアミノ酸配列２４～９３と少なくとも８５％一致する配列、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む。さらに別の好ましい一実施形態では、ターゲティングユニットは配列番号２３４のアミノ酸配列２４～９３を含む。
より好ましい一実施形態では、ターゲティングユニットは、配列番号１のアミノ酸配列２４～９３と少なくとも８０％一致する配列、配列番号２３４のアミノ酸配列２４～９３と例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば少なくとも１００％一致する配列を有するアミノ酸配列からなる。
一実施形態では、ターゲティングユニットは抗ｐａｎ ＨＬＡクラスＩＩを含むか抗ｐａｎ ＨＬＡクラスＩＩである。このターゲティングユニットは、混合されたＩｇＧ１抗体とＩｇＧ２ａ抗体を用いて迅速かつ強力な抗体応答を誘導する。さらに、このターゲティングユニットは有意な細胞性応答（ＣＤ４ ＋とＣＤ８＋タイプのＴ細胞）を誘導する。
本発明の１つの態様は、免疫学的に有効な量の
（ｉ）抗ｐａｎ ＨＬＡクラスＩＩを含むターゲティングユニット、二量体化ユニット、および抗原ユニット（この抗原ユニットは、ベータコロナウイルスの完全長ウイルス表面タンパク質またはその一部、好ましくはエンベロープタンパク質、スパイクタンパク質、膜タンパク質、およびヘマグルチニンエステラーゼからなる群から選択されるタンパク質を含む）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、または
（ｉｉ）（ｉ）で規定されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または
（ｉｉｉ）（ｉ）で規定されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド２つのからなる二量体タンパク質と、
薬学的に許容可能な担体を含むワクチンに関する。
一実施形態では、上記ワクチンの抗原ユニットは、ベータコロナウイルスの完全長ウイルス表面タンパク質に含まれる（例えば上記のタンパク質のいずれかに含まれる）少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含み、好ましくはベータコロナウイルスの完全長ウイルス表面タンパク質に含まれる（例えば上記のタンパク質のいずれかに含まれる）いくつかのＢ細胞エピトープを含む。
本発明の別の１つの態様は、免疫学的に有効な量の
（ｉ）抗ｐａｎ ＨＬＡクラスＩＩを含むターゲティングユニット、二量体化ユニット、および抗原ユニット（この抗原ユニットは、ベータコロナウイルスの完全長スパイクタンパク質またはその一部、またはそのスパイクタンパク質またはその一部に含まれる少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含む）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、または
（ｉｉ）（ｉ）で規定されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または
（ｉｉｉ）（ｉ）で規定されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド２つのからなる二量体タンパク質と、
薬学的に許容可能な担体を含むワクチンに関する。
本発明のさらなる１つの態様は、免疫学的に有効な量の
（ｉ）ｈＭＩＰ－１αを含むターゲティングユニット、二量体化ユニット、および抗原ユニット（この抗原ユニットは、ベータコロナウイルスの完全長スパイクタンパク質またはその一部、またはそのスパイクタンパク質またはその一部に含まれる少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含む）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、または
（ｉｉ）（ｉ）で規定されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または
（ｉｉｉ）（ｉ）で規定されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド２つからなる二量体タンパク質と、
薬学的に許容可能な担体を含むワクチンに関する。
一実施形態では、上記ワクチンの抗原ユニットは、スパイクタンパク質またはその一部の受容体結合ドメイン、またはその中に含まれる少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含む。別の一実施形態では、上記ワクチンの抗原ユニットは、スパイクタンパク質またはその一部のＨＲ１ドメインまたはＨＲ２ドメイン、またはその中に含まれる少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含む。さらに別の一実施形態では、上記ワクチンの抗原ユニットは、スパイクタンパク質またはその一部のＨＲ２ドメイン、またはその中に含まれる少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含む。
このワクチンは投与されると強力な液性応答を誘導し、潜在的には細胞応答も誘導する。
本発明の別の１つの態様は、免疫学的に有効な量の
（ｉ）ｈＭＩＰ－１αを含むターゲティングユニット、二量体化ユニット、および抗原ユニット（この抗原ユニットは、少なくとも１つのベータコロナウイルスＴ細胞エピトープ、好ましくはベータコロナウイルスの間で保存されているいくつかのＴ細胞エピトープを含む）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、または
（ｉｉ）（ｉ）で規定されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または
（ｉｉｉ）（ｉ）で規定されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド２つからなる二量体タンパク質と、
薬学的に許容可能な担体を含むワクチンに関する。
このワクチンは、投与されるとＴ細胞応答、すなわち強力な細胞性応答を誘導する。これは治療設定において特に重要である。というのもＣＤ８＋ Ｔ細胞がウイルスに感染した細胞を殺し、したがってウイルスを除去することができるからである。ワクチンがベータコロナウイルスの間で保存されたＴ細胞エピトープを含む場合、ベータコロナウイルスの複数のバリアント（例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルスの複数のバリアント）に対する保護を提供することができよう。これは、保存されていない領域に変異が起こる将来のベータコロナウイルスバリアントに対しても潜在的に有効であるため重要である。
特別な１つの態様は、免疫学的に有効な量の
（ｉ）ターゲティングユニット、二量体化ユニット、および抗原ユニット（この抗原ユニットは、ａ）ベータコロナウイルスの完全長スパイクタンパク質またはその一部、またはそのスパイクタンパク質またはその一部に含まれる少なくとも１つのＢ細胞エピトープと、ｂ）少なくとも１つのベータコロナウイルスＴ細胞エピトープを含む）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、または
（ｉｉ）（ｉ）で規定されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または
（ｉｉｉ）（ｉ）で規定されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド２つからなる二量体タンパク質と、
薬学的に許容可能な担体を含むワクチンに関する。
一実施形態では、上記ワクチンの抗原ユニットは、スパイクタンパク質またはその一部の受容体結合ドメイン、またはその中に含まれる少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含む。別の一実施形態では、上記ワクチンの抗原ユニットは、スパイクタンパク質またはその一部のＨＲ１ドメインまたはＨＲ２ドメイン、またはその中に含まれる少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含む。さらに別の一実施形態では、上記ワクチンの抗原ユニットは、スパイクタンパク質またはその一部のＨＲ２ドメイン、またはその中に含まれる少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含む。
このようなワクチンは、投与されるとＴ細胞応答とＢ細胞応答を誘導する。エピデミックとパンデミックの状況では、最初に個人を診断し、必要とされるのが主にＢ細胞応答であるかＴ細胞応答であるかや、医学的に最も必要とされるのが予防的処置であるか治療的処置であるかを判断するのは時間効率がよくない。個人が感染しているかいないかの判断は（十分な）適用可能な試験が欠けていて困難である可能性があるため、ますますそうである。したがって保護と治癒が同時に可能であることが重要である。スパイクタンパク質の完全長または一部、またはそのスパイクタンパク質の中に存在するいくつかのＢ細胞エピトープに保存されたＴ細胞エピトープを組み合わせることにより、ワクチンが投与されると強力な液性応答と細胞性応答の両方が誘導される。応答は、選択したターゲティングユニットに応じてより液性になること、またはより細胞性になることができる。
上記のワクチンは、ＭＩＰ－１αまたは抗ｐａｎ ＨＬＡクラスＩＩを含むターゲティングユニットを含むことが好ましい。
したがって本発明の１つの態様は、免疫学的に有効な量の
（ｉ）ｈＭＩＰ－１αを含むターゲティングユニット、二量体化ユニット、および抗原ユニット（この抗原ユニットは、ａ）ベータコロナウイルスの完全長スパイクタンパク質またはその一部、またはそのスパイクタンパク質またはその一部に含まれる少なくとも１つのＢ細胞エピトープと、ｂ）少なくとも１つのベータコロナウイルスＴ細胞エピトープを含む）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、または
（ｉｉ）（ｉ）で規定されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または
（ｉｉｉ）（ｉ）で規定されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド２つからなる二量体タンパク質と、
薬学的に許容可能な担体を含むワクチンに関する。
一実施形態では、上記ワクチンの抗原ユニットは、スパイクタンパク質またはその一部の受容体結合ドメイン、またはその中に含まれる少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含む。別の一実施形態では、上記ワクチンの抗原ユニットは、スパイクタンパク質またはその一部のＨＲ１ドメインまたはＨＲ２ドメイン、またはその中に含まれる少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含む。さらに別の一実施形態では、上記ワクチンの抗原ユニットは、スパイクタンパク質またはその一部のＨＲ２ドメイン、またはその中に含まれる少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含む。
別の一実施形態では、抗原ユニットは抗ｐａｎ ＨＬＡクラスＩＩを含む。このターゲティングユニットは、混合されたＩｇＧ１抗体とＩｇＧ２ａ抗体を用いて迅速かつ強力な抗体応答を誘導する。さらに、このターゲティングユニットは有意な細胞性応答（ＣＤ４＋とＣＤ８＋タイプのＴ細胞）を誘導する。
したがって本発明の一実施形態は、免疫学的に有効な量の
（ｉ）抗ｐａｎ ＨＬＡクラスＩＩを含むターゲティングユニット、二量体化ユニット、および抗原ユニット（この抗原ユニットは、ａ）ベータコロナウイルスの完全長スパイクタンパク質またはその一部、またはそのスパイクタンパク質またはその一部に含まれる少なくとも１つのＢ細胞エピトープと、ｂ）少なくとも１つのベータコロナウイルスＴ細胞エピトープを含む）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、または
（ｉｉ）（ｉ）で規定されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または
（ｉｉｉ）（ｉ）で規定されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド２つからなる二量体タンパク質と、
薬学的に許容可能な担体を含むワクチンに関する。
一実施形態では、上記ワクチンの抗原ユニットは、スパイクタンパク質またはその一部の受容体結合ドメイン、またはその中に含まれる少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含む。別の一実施形態では、上記ワクチンの抗原ユニットは、スパイクタンパク質またはその一部のＨＲ１ドメインまたはＨＲ２ドメイン、またはその中に含まれる少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含む。さらに別の一実施形態では、上記ワクチンの抗原ユニットは、スパイクタンパク質またはその一部のＨＲ２ドメイン、またはその中に含まれる少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含む。
本発明のさらなる実施形態では、抗原ユニットは、１０、１４、２０、２４、および３０個のＴ細胞エピトープと、ＲＢＤと、エピトープ間のリンカーのセットを含む。一実施形態では、抗原ユニットは、１０個のＴ細胞エピトープと、ＲＢＤと、１０個のＴ細胞エピトープを含む。別の一実施形態では、抗原ユニットは、ＲＢＤと２０個のエピトープを含む。さらなる一実施形態では、抗原ユニットは２０個のＴ細胞エピトープとＲＢＤを含み、リンカーは存在しない。別の一実施形態では、抗原ユニットは２０個のＴ細胞エピトープを含む。
本発明のさらなる実施形態では、抗原ユニットは、１０、１４、２０、２４、および３０個のＴ細胞エピトープと、ＨＲ１ドメインまたはＨＲ２ドメイン（好ましくはＨＲ２ドメイン）と、エピトープ間のリンカーのセットを含む。一実施形態では、抗原ユニットは、１０個のＴ細胞エピトープと、ＨＲ１ドメインまたはＨＲ２ドメイン（好ましくはＨＲ２ドメイン）と、１０個のＴ細胞エピトープを含む。別の一実施形態では、抗原ユニットは、ＨＲ１ドメインまたはＨＲ２ドメイン（好ましくはＨＲ２ドメイン）と２０個のエピトープを含む。さらなる一実施形態では、抗原ユニットは、２０個のＴ細胞エピトープとＨＲ１ドメインまたはＨＲ２ドメイン（好ましくはＨＲ２ドメイン）を含み、リンカーは存在しない。
さらに別の一実施形態では、抗原ユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個のＴ細胞エピトープと、完全長のスパイクタンパク質またはその一部（好ましくはＲＢＤまたはその一部）を含む。さらに別の一実施形態では、２～１０個のＴ細胞エピトープはリンカーによって互いに分離されており、完全長のスパイクタンパク質またはその一部（好ましくはＲＢＤまたはその一部）は最終Ｔ細胞エピトープからリンカーによって分離されている。さらに別の一実施形態では、抗原ユニットは、１～３個のＴ細胞エピトープと、完全長のスパイクタンパク質またはその一部（好ましくはＲＢＤまたはその一部）を含む。さらに別の一実施形態では、前記２または３個のＴ細胞エピトープはリンカーによって互いに分離されており、完全長のスパイクタンパク質またはその一部（好ましくはＲＢＤまたはその一部）は１つのまたは最後のＴ細胞エピトープからリンカーによって分離されている。
一実施形態では、抗原ユニットは、配列番号２６５または配列番号２６７または配列番号２６９または配列番号２７１または配列番号２７３または配列番号２７５または配列番号２７７または配列番号２７９または配列番号２８１または配列番号２８３または配列番号２８５または配列番号２８７または配列番号２８９または配列番号２９１または配列番号２９３のアミノ酸配列と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、抗原ユニットは、配列番号２６５または配列番号２６７または配列番号２６９または配列番号２７１または配列番号２７３または配列番号２７５または配列番号２７７または配列番号２７９または配列番号２８１または配列番号２８３または配列番号２８５または配列番号２８７または配列番号２８９または配列番号２９１または配列番号２９３のアミノ酸配列を含む。
好ましい一実施形態では、前記１０、１４、２０、２４、および３０個のＴ細胞エピトープは、配列番号６７、配列番号１９、配列番号７８、配列番号５７、配列番号５０、配列番号５５、配列番号６４、配列番号２２、配列番号８７、配列番号６２、配列番号３９、配列番号５９、配列番号２６、配列番号５３、配列番号３２、配列番号３８、配列番号３０、配列番号４０、配列番号４２、配列番号３５、配列番号７１、配列番号９、配列番号２１、配列番号８５、配列番号７５、配列番号２３、配列番号３４、配列番号３６、配列番号７７、および配列番号２０からなる群から選択される。
本発明の好ましい一実施形態では、抗原ユニットは、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９、配列番号２４０、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８。配列番号２４９、配列番号２５０、および配列番号２５１からなる群から選択される。
本発明のワクチンは二量体化ユニットを含む。「二量体化ユニット」という用語は、本明細書では、抗原ユニットとターゲティングユニットの間のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列を意味する。したがって二量体化ユニットは抗原ユニットとターゲティングユニットを接続するのに役立ち、２つの単量体ペプチドを二量体化して二量体タンパク質にするのを容易にする。さらに、二量体化ユニットはポリペプチド／二量体タンパク質に可撓性を提供し、ターゲティングユニットがＡＰＣ上の表面分子に、それら表面分子がさまざまな距離に位置する場合でさえ、最適に結合できるようにする。二量体化ユニットとして、これらの条件を満たす任意のユニットが可能である。
したがって一実施形態では、二量体化ユニットはヒンジ領域を含む。別の一実施形態では、二量体化ユニットは、ヒンジ領域と、二量体化を容易にする別のドメインを含む。一実施形態では、ヒンジ領域とその別のドメインはリンカー（すなわち二量体化ユニットリンカー）を介して接続される。さらに別の一実施形態では、二量体化ユニットは、ヒンジ領域、二量体化ユニットリンカー、および二量体化を容易にする別のドメインを含み、二量体化ユニットリンカーはヒンジ領域と二量体化を容易にするその別のドメインの間に位置する。
「ヒンジ領域」という用語は、二量体タンパク質に含まれていて２つのポリペプチドの接合に寄与する（すなわち二量体タンパク質の形成に寄与する）アミノ酸配列を意味する。さらに、ヒンジ領域はポリペプチド間の可動性リンカーとして機能し、二量体タンパク質の２つのターゲティングユニットがＡＰＣ上の２つの表面分子に同時に結合することを、それら表面分子がさまざまな距離で発現している場合でさえ可能にする。ヒンジ領域はＩｇに由来すること（例えばＩｇＧ３に由来すること）が可能である。ヒンジ領域は共有結合（例えばシステイン間のジスルフィド架橋）の形成を通じて二量体化に寄与する可能性がある。したがって一実施形態では、ヒンジ領域は１つ以上の共有結合を形成する能力を有する。共有結合はジスルフィド架橋であることが好ましい。
一実施形態では、二量体化ユニットは、配列番号２３３のアミノ酸配列９４～１２０と少なくとも８０％一致する配列を有するアミノ酸配列を有するヒンジエキソンｈ１とヒンジエキソンｈ４（ヒトヒンジ領域１とヒトヒンジ領域４）を含む。
好ましい一実施形態では、二量体化ユニットは、配列番号２３３のアミノ酸配列９４～１２０と少なくとも８５％一致する配列、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列を有するアミノ酸配列を有するヒンジエキソンｈ１とヒンジエキソンｈ４を含む。
好ましい一実施形態では、二量体化ユニットは、配列番号２３３のアミノ酸配列９４～１２０を有するヒンジエキソンｈ１とヒンジエキソンｈ４を含む。
一実施形態では、二量体化ユニットは二量体化を容易にする別のドメインを含み、前記別のドメインは、免疫グロブリンドメイン、例えば免疫グロブリン定常ドメイン（Ｃドメイン）であり、それは、カルボキシ末端Ｃドメイン（すなわちＣＨ３ドメイン）、ＣＨ１ドメイン、またはＣＨ２ドメイン、またはＣドメインと実質的に一致する配列、またはそのバリアントである。二量体化を容易にする前記別のドメインはＩｇＧに由来するカルボキシ末端Ｃドメインであることが好ましい。二量体化を容易にする前記別のドメインはＩｇＧ３に由来するカルボキシ末端Ｃドメインであることがより好ましい。
免疫グロブリンドメインは非共有結合相互作用（例えば疎水性相互作用）を通じて二量体化に寄与する。例えば免疫グロブリンドメインは非共有結合相互作用を通じて二量体を形成する能力を有する。したがって一実施形態では、免疫グロブリンドメインは非共有結合相互作用を通じて二量体を形成する能力を有する。非共有結合相互作用は疎水性相互作用であることが好ましい。
二量体化ユニットがＣＨ３ドメインを含む場合には、ＣＨ２ドメインを含まないことが好ましい。さらに、二量体化ユニットＣＨ２ドメインを含む場合にはＣＨ３ドメインを含まないことが好ましい。
一実施形態では、二量体化ユニットは、配列番号２３３のアミノ酸配列１３１～２３７と少なくとも８０％一致する配列を有するアミノ酸配列を有するＩｇＧ３由来のカルボキシ末端Ｃドメインを含む。
好ましい一実施形態では、二量体化ユニットは、配列番号２３３のアミノ酸配列１３１～２３７と少なくとも８５％一致する配列、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列を有するアミノ酸配列を有するＩｇＧ３由来のカルボキシ末端Ｃドメインを含む。
好ましい一実施形態では、二量体化ユニットは、配列番号２３３のアミノ酸配列１３１～２３７を有するアミノ酸配列を有するＩｇＧ３由来のカルボキシ末端Ｃドメインを含む。
好ましい一実施形態では、二量体化ユニットは、ヒンジエキソンｈ１、ヒンジエキソンｈ４、二量体化ユニットリンカー、およびヒトＩｇＧ３のＣＨ３ドメインを含む。さらなる好ましい一実施形態では、二量体化ユニットは、ヒンジエキソンｈ１、ヒンジエキソンｈ４、二量体化ユニットリンカー、およびヒトＩｇＧ３のＣＨ３ドメインからなるポリペプチドを含む。
別の好ましい一実施形態では、二量体化ユニットは、ヒトＩｇＧ３のＣＨ３ドメインへの二量体化ユニットリンカーを通じて接続されたヒンジエキソンｈ１とヒンジエキソンｈ４からなる。
本発明の一実施形態では、二量体化ユニットは、配列番号２３３のアミノ酸配列９４～２３７と少なくとも８０％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態では、二量体化ユニットは、配列番号２３３のアミノ酸配列９４～２３７と少なくとも８５％一致する配列、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む。
本発明の一実施形態では、二量体化ユニットは配列番号２３３のアミノ酸配列９４～２３７を含む。
より好ましい一実施形態では、二量体化ユニットは、配列番号２３３のアミノ酸配列９４～２３７と少なくとも８０％一致する配列、例えば配列番号２３３のアミノ酸配列９４～２３７と少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む。より一層好ましい実施形態では、二量体化ユニットは、配列番号２３３のアミノ酸配列９４～２３７からなる。
一実施形態では、二量体化ユニットリンカー、すなわちヒンジ領域を他のドメインに接続するリンカーは、二量体化ユニットの中に存在する。別の一実施形態ではリンカーが存在し、それはグリシン－セリンが豊富なリンカー、好ましくはＧ３Ｓ２Ｇ３ＳＧリンカー（ＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧ）である。
二量体化ユニットは、抗原ユニットおよびターゲティングユニットに対して任意の向きを有する。一実施形態では、抗原ユニットは二量体化ユニットのＣＯＯＨ末端にあり、ターゲティングユニットは二量体化ユニットのＮ末端にある。そのため抗原ユニットは（例えばユニットリンカーを介して）二量体化ユニットのＣ末端に接続され、ターゲティングユニットは二量体化ユニットのＮ末端に接続される。別の一実施形態では、抗原ユニットは二量体化ユニットのＮ末端にあり、ターゲティングユニットは二量体化ユニットのＣＯＯＨ末端にある。そのため抗原ユニットは（例えばユニットリンカーを介して）二量体化ユニットのＮ末端に接続され、ターゲティングユニットは二量体化ユニットのＣ末端に接続される。抗原ユニットは二量体化ユニットのＣＯＯＨ末端にあること、すなわち抗原ユニットは好ましくはユニットリンカーを介して二量体化ユニットのＣ末端に接続され、ターゲティングユニットは二量体化ユニットのＮ末端に接続されることが好ましい。
好ましい一実施形態では、抗原ユニットは二量体化ユニットにリンカーによって接続される。したがって一実施形態では、ポリヌクレオチド／ポリペプチド／二量体タンパク質は、ユニットリンカーをコードするヌクレオチド配列、または抗原ユニットを二量体化ユニットに接続するそのユニットリンカーであるアミノ酸配列を含む。
ユニットリンカーは、ポリヌクレオチドの構築を容易にするため制限部位を含むことができる。好ましい一実施形態では、ユニットリンカーはＧＬＧＧＬまたはＧＬＳＧＬである。
好ましい一実施形態では、本発明のワクチンは、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含むポリヌクレオチドを含む。シグナルペプチドは、ポリペプチドの中でのターゲティングユニットの向きに応じてターゲティングユニットのＮ末端またはターゲティングユニットのＣ末端のいずれかに位置する。シグナルペプチドは、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドを、前記ポリヌクレオチドをトランスフェクトされた細胞の中で分泌できるように設計されて構築される。
適切な任意のシグナルペプチドを使用することができる。適切なペプチドの例は、ヒトＩｇ ＶＨシグナルペプチド（配列番号２３５のアミノ酸配列と少なくとも８０％一致する配列を有するアミノ酸配列を含むシグナルペプチドなど）、ヒトＴＰＡシグナルペプチド（配列番号２３６など）、および配列番号２３４のアミノ酸配列１～２３と少なくとも８０％一致する配列を有するアミノ酸配列を含むシグナルペプチド、すなわちヒトＭＩＰ１－αシグナルペプチドである。
好ましい一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｈＭＩＰ１－αであるターゲティングユニットと、ヒトＭＩＰ１－αシグナルペプチドをコードする核酸配列を含む。
別の好ましい一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ヒト抗ｐａｎ ＨＬＡクラスＩＩであるターゲティングユニットと、Ｉｇ ＶＨシグナルペプチドをコードする核酸配列を含む。
好ましい一実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号２３５のアミノ酸配列と少なくとも８５％一致する配列、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む。
より好ましい一実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号２３５のアミノ酸配列と少なくとも８０％一致する配列、好ましくは少なくとも８５％（例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％一致する配列を有するアミノ酸配列からなる。
好ましい一実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号２３４のアミノ酸配列１～２３と少なくとも８５％一致する配列、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む。
より好ましい一実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号２３４のアミノ酸配列１～２３と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％一致する配列、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％一致する配列を有するアミノ酸配列からなる。
配列一致は以下のようにして判断することができる。高レベルの配列一致は、第２の配列が第１の配列に由来することを示している可能性が大きい。アミノ酸配列の一致は、アラインメントさせた２つの配列の間のアミノ酸配列が同じであることを必要とする。したがって参照配列と７０％のアミノ酸の一致を共有する候補配列は、アラインメントの後、候補配列のアミノ酸の７０％が参照配列の中の対応するアミノ酸と一致することを必要とする。一致は、コンピュータ分析（その非限定的な例は、ＣｌｕｓｔａｌＷコンピュータアラインメントプログラム(Higgins D., Thompson J., Gibson T., Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J., 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22:4673-4680)とその中で推奨されているデフォルトパラメータである）の助けを借りて判断することができる。このプログラムをそのデフォルト設定で使用し、質問と参照ポリペプチドの成熟した（生物活性な）部分をアラインメントさせる。完全に保存された残基の数をカウントし、参照ポリペプチドの長さで割る。そうすることで、質問配列の一部を形成するあらゆるタグまたは融合タンパク質配列がアラインメントの中で無視され、その後に配列一致が判断される。
ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムはヌクレオチド配列のアラインメントでも同様に用いることができる。配列一致はアミノ酸配列について示したのと同様のやり方で計算することができる。
配列の比較に用いられる別の好ましい数学的アルゴリズムはＭｙｅｒｓとＭｉｌｌｅｒ、ＣＡＢＩＯＳ（１９８９年）のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＦＡＳＴＡ配列アラインメントソフトウエアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている(Pearson WR, Methods Mol Biol, 2000, 132:185-219)。Ａｌｉｇｎは全体的なアラインメントに基づいて配列一致を計算する。Ａｌｉｇｎ０は配列の端部にあるギャップにペナルティを課さない。ＡＬＩＧＮとＡｌｉｇｎ０プログラムを用いてアミノ酸配列を比較するとき、ギャップの開き／延長のペナルティが－１２／－２であるＢＬＯＳＵＭ５０置換マトリックスを用いることが好ましい。
配列の比較に用いられる別の好ましい数学的アルゴリズムは、「Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム」と呼ばれるＢｉｏＰｙｔｈｏｎの局所的ペア式アラインメントアルゴリズムの実装である。
本発明の１つの態様は、配列番号２５３のアミノ酸配列を有するポリペプチドであるコンストラクトＶＢ２０４９またはそれをコードするポリヌクレオチドに関係しており、その中には、ヒトＭＩＰ－１αターゲティングユニットと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤの短い形態（「ＲＢＤ短い」、アミノ酸３３１～５２４、すなわち１９３個のアミノ酸）を含む抗原ユニットが含まれる。このコンストラクトは中和効果を有する抗ＲＢＤ ＩｇＧ抗体を生じさせることができる。このコンストラクトは、ＲＢＤに含まれるエピトープに対して強力なＴ細胞応答を誘導することもできる。
本発明の１つの態様は、配列番号２５５のアミノ酸配列を有するポリペプチドであるコンストラクトＶＢ２０６０またはそれをコードするポリヌクレオチドに関係しており、その中には、ターゲティングユニットとしてのヒトＭＩＰ－１αと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのより長いバージョン（「ＲＢＤ長い」、アミノ酸３１９～５４２、すなわち２２３個のアミノ酸）を含む抗原ユニットが含まれる。このコンストラクトは中和抗ＲＢＤ ＩｇＧ抗体を生じさせることができ、その抗体は肺にさえ見いだされる。このコンストラクトは、ワクチン接種から７日以内にＲＢＤに対して強力なＴ細胞応答を誘導することができ、それが長く持続する。
本発明の１つの態様は、配列番号２５７のアミノ酸配列を有するポリペプチドであるコンストラクトＶＢ２０６５、またはそれをコードするポリヌクレオチドに関係しており、その中には、ヒトＭＩＰ－１αターゲティングユニットと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２株Ｗｕｈａｎ Ｈｕ－１からの完全長スパイクタンパク質を含む抗原ユニットが含まれる。このコンストラクトは中和抗ＲＢＤ ＩｇＧ抗体を生じさせることができる。このコンストラクトは広くて強力なＴ細胞応答を誘導することができる。
本発明の１つの態様は、配列番号２５９のアミノ酸配列を有するポリペプチドであるコンストラクトＶＢ２０４８、またはそれをコードするポリヌクレオチドに関係しており、その中には、ヒトＭＩＰ－１αターゲティングユニットと、複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２株からの２０個の免疫原性Ｔ細胞エピトープ（表１参照）を含む抗原ユニットが含まれる。このコンストラクトは、強力なＴ細胞応答を、他のコンストラクト（例えばＶＢ２０４９）と同時に投与したときでさえ誘導することができる。
本発明の１つの態様は、ポリペプチド、またはそれをコードしていて、ヒト抗ｐａｎ ＨＬＡクラスＩＩターゲティングユニットと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのより長いバージョン（「ＲＢＤ長い」アミノ酸３１９～５４２、すなわち２２３個のアミノ酸）を含む抗原ユニットを含むポリヌクレオチドに関する。ターゲティングユニットとして抗マウスＭＨＣＩＩ ｓｃＦｖを含む対応するマウスコンストラクト（コンストラクトＶＢ２０５９）は、ＲＢＤに対する抗体を生じさせることと、ＲＢＤに対するＴ細胞応答を誘導することができる。
本発明の１つの態様は、ポリペプチド、またはそれをコードしていて、ヒト抗ｐａｎ ＨＬＡクラスＩＩターゲティングユニットと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２株Ｗｕｈａｎ Ｈｕ－１からの完全長スパイクタンパク質を含む抗原ユニットを含むポリヌクレオチドに関する。ターゲティングユニットとして抗マウスＭＨＣＩＩ ｓｃＦｖを含む対応するマウスコンストラクトであるコンストラクトＶＢ２０７１は抗ＲＢＤ ＩｇＧ抗体を誘導することができ、広くて強力なＴ細胞応答を誘導する。
本発明の１つの態様は、配列番号２６５のアミノ酸配列を有するポリペプチドであるコンストラクトＶＢ２０８１、またはそれをコードしていて、ヒトＭＩＰ－１αターゲティングユニットを含むとともに、１つの予測されるＴ細胞エピトープ（ｐｅｐ０８）と、（ＧＧＧＧＳ）２リンカーを用いてそのＴ細胞エピトープに連結されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのより長いバージョンとを含む抗原ユニットを含むポリヌクレオチドに関する。このコンストラクトはＲＢＤに対するＩｇＧ抗体を生じさせ、ＲＢＤと含まれている１つのＴ細胞エピトープに対するＴ細胞応答を誘導する。
本発明の１つの態様は、配列番号２６７のアミノ酸配列を有するポリペプチドであるコンストラクトＶＢ２０８２、またはそれをコードしていて、ヒトＭＩＰ－１αターゲティングユニットを含むとともに、１つの予測されるＴ細胞エピトープ（ｐｅｐ１８）と、（ＧＧＧＧＳ）２リンカーを用いてそのＴ細胞エピトープに連結されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのより長いバージョンとを含む抗原ユニットを含むポリヌクレオチドに関する。このコンストラクトはＲＢＤに対するＩｇＧ応答を生じさせ、含まれているその１つのＴ細胞エピトープに対してＴ細胞応答を誘導することができる。
本発明の１つの態様は、配列番号２７１のアミノ酸配列を有するポリペプチドであるコンストラクトＶＢ２０８４、またはそれをコードしていてヒトＭＩＰ－１αターゲティングユニットを含むポリヌクレオチドに関する。このポリヌクレオチドは、３つの予測されるＴ細胞エピトープ（ｐｅｐ０８、ｐｅｐ１８、ｐｅｐ２５）と、それらすべてが（ＧＧＧＧＳ）２リンカーを用いて連結されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのより長いバージョンを含む抗原ユニットを有する。このコンストラクトは、ＲＢＤ内のエピトープに対してのほか、含まれている３つのＴ細胞エピトープに対してＴ細胞応答を誘導することができる。
本発明の１つの態様は、配列番号２９３のアミノ酸配列を有するポリペプチドであるコンストラクトＶＢ２０９７、またはそれをコードしていてヒトＭＩＰ－１αターゲティングユニットを含むポリヌクレオチドに関する。抗原ユニットは、 （ＧＧＧＧＳ）２リンカーを用いて互いに分離された３つの予測されるＴ細胞エピトープ（ｐｅｐ０８、ｐｅｐ１８、およびｐｅｐ２５）と、ＧＳＡＴリンカーによってＴ細胞エピトープから分離された「ＲＢＤ長い」を含む。このコンストラクトはＲＢＤに対するＩｇＧ抗体を生じさせただけでなく、ＲＢＤと含まれているＴ細胞エピトープに対する顕著で強力なＴ細胞応答も示した。
本発明の１つの態様は、配列番号２９７のアミノ酸配列を有するポリペプチドであるコンストラクトＶＢ２０９９、またはそれをコードしていてヒトＭＩＰ－１αターゲティングユニットを含むポリヌクレオチドに関する。抗原ユニットは、 （ＧＧＧＧＳ）２リンカーを用いて互いに分離された３つの予測されるＴ細胞エピトープ（ｐｅｐ０８、ｐｅｐ１８、およびｐｅｐ２５）と、ＳＥＧリンカーによってＴ細胞エピトープに連結されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのより長いバージョン（「ＲＢＤ長い」、２２３個のアミノ酸）を含む。このコンストラクトは、ＲＢＤに対するＩｇＧ抗体を生じさせることができる。それに加え、このコンストラクトは、ＲＢＤに対してと含まれているＴ細胞エピトープに対してＴ細胞応答を誘導することができる。
本発明の１つの態様は、配列番号２９５のアミノ酸配列を有するポリペプチドであるコンストラクトＶＢ２１２９、またはそれをコードしていて、ヒトＭＩＰ－１αターゲティングユニットと、南アフリカＲＢＤ（南アフリカバリアントＢ．１．３５１において特徴的な３つの変異を有する）を中に含む抗原ユニットを含むポリペプチドに関する。このコンストラクトは、ＲＢＤに対するＩｇＧ応答を生じさせ、Ｔ細胞応答を誘導することができる。
本発明の一実施形態では、前記ポリペプチドまたは二量体タンパク質の中のターゲティングユニット、二量体化ユニット、および抗原ユニットは、Ｎ末端からＣ末端に向かい、ターゲティングユニット、二量体化ユニット、および抗原ユニットの順番で存在する。
本発明のワクチンは薬学的に許容可能な担体を含み、その非限定的な例に含まれるのは、生理食塩水、緩衝化生理食塩水（ＰＢＳなど）、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、減菌等張水性バッファ、およびこれらの組み合わせである。
ワクチンはアジュバントをさらに含むことができる。特に、ポリペプチド／タンパク質を含むワクチンに関し、薬学的に許容可能なアジュバントの非限定的な例に含まれるのは、ポリ－ＩＣＬＣ、１０１８ ＩＳＳ、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ、ＡＳ １５、ＢＣＧ、ＣＰ－８７０、８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド、ＩｍｕＦａｃｔ ＥＶ１ Ｐ３２１、ＩＳパッチ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、Ｊｕｖｌｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＦ５９、モノホスホリル脂質Ａ、モンタニドＩＭＳ １３１２、モンタニドＩＳＡ ２０６、モンタニドＩＳＡ ５０Ｖ、モンタニドＩＳＡ－５１、ＯＫ－４３２、ＯＭ－１７４、ＯＭ－１９７－ＭＰ－ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰＬＧＡ微粒子、レシキモド、ＳＲＬ１７２、ウイロソーム、および他のウイルス様粒子、ＹＦ－１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、ベータ－グルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、ＡｑｕｉｌａのＱＳ２１ ｓｔｉｍｕｌｏｎ、バジメザン、および／またはＡｓＡ４０４（ＤＭＸＡＡ）である。
ポリヌクレオチドを含むワクチンでは、ワクチンは、細胞および／またはアジュバントのトランスフェクションを容易にするため、ケモカインまたはサイトカインをコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドの形態の分子を含むことができる。
ワクチンは、対象（例えば個人）に適切な任意のやり方で投与するための製剤にすること、例えば注射（例えば皮内注射または筋肉内注射）のための液体製剤などにすることができる。
本発明のワクチンは、ポリペプチド／タンパク質ワクチンまたはポリヌクレオチドワクチンのいずれかを適切な任意のやり方で対象（例えば個人）に投与すること、例えば皮内、筋肉内、節内、または皮下への注射によって投与すること、または粘膜または表皮への塗布によって投与すること（鼻腔内、経口、経腸、または（膀胱への）膀胱内投与）ができる。
好ましい一実施形態では、ワクチンはポリヌクレオチドを含み、筋肉内注射または皮内注射によって投与される。
ワクチンは、１つのポリヌクレオチド（例えばＤＮＡプラスミドの形態のもの）を含むこと、または２つ以上のポリヌクレオチド（例えば２つ以上のＤＮＡプラスミドの形態のもの）を含むことができる。一実施形態では、ワクチンは２つのＤＮＡプラスミドを含み、一方は、ベータコロナウイルスの完全長表面タンパク質またはその一部（例えばＲＢＤ）を含む抗原ユニットをコードするヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含み、他方は、Ｔ細胞エピトープ、好ましくは保存されたＴ細胞エピトープを含む抗原ユニットをコードするヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む。ワクチンは、「Ｔ細胞エピトーププラスミド」があるためにベータコロナウイルスのいくつかの種／株に対する（例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶのいくつかの株に対する、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する）保護を提供することになる。このようなワクチンは、ベータコロナウイルスの複数のバリアント、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルスのバリアント、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのバリアントに対する保護も提供することになる。それは、将来変異するウイルスに対するそのようなワクチンの効果にとって重要である。
一実施形態では、ウイルスが変異するとき、ベータコロナウイルスの完全長表面タンパク質またはその一部（例えばＲＢＤ）を含む抗原ユニットをコードするヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含むプラスミドを操作してその変異が含まれるようにする一方で、Ｔ細胞エピトープを含む抗原ユニットをコードするヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含むプラスミドはそのままにしておくことができる。
本発明のワクチンは、免疫学的に有効な量のポリヌクレオチド／ポリペプチドまたは二量体タンパク質を含む。「免疫学的に有効な量」という表現は、ワクチンを接種された個人で（保護用ワクチンに関しては）免疫保護応答または（治療用ワクチンに関しては）免疫治療応答を誘導する量を意味し、そのような応答は、１回だけのワクチン接種または数回のワクチン接種（例えば初回のワクチン接種と、十分に時間間隔を空けた１回または数回のブースターワクチン接種）によって誘導される。そのような量は、どの特定のポリヌクレオチド／ポリペプチド／二量体タンパク質を使用するかに応じて変わる可能性がある。そのような量は、ワクチンが予防のために投与されるか治療のために投与されるか、ベータコロナウイルスに感染した個人の疾患の重症度、年齢、体重、病歴、およびあらかじめ存在している状態に応じて変化する可能性もある。
免疫学的に有効な量として、徴候／症状の発生を減らすか阻止する、発生した徴候／症状の重症度を低下させる、徴候／症状の発生をなくす、発生した徴候／症状の進行を遅延させる、発生した徴候／症状の進行を阻止する、および／または徴候／症状の発生を予防するのに有効な量が可能である。
予防のための免疫学的に有効な量は、ベータコロナウイルスによって起こる疾患の予防、またはそのような疾患の再発の予防に有効な量が可能であり、その疾患または再発をそのように予防するのに十分である。それは、ベータコロナウイルス感染症の徴候および／または症状の発生を阻止するのに有効な量が可能である。
治療のための免疫学的に有効な量として、ベータコロナウイルスによって起こる疾患またはその臨床症状の進行を停止または低下させ、および／またはその疾患を緩和し、または和らげ、その疾患またはその臨床症状の後退を引き起こすのに有効な量が可能である。
本発明のワクチンは、典型的には、０．１～１０ ｍｇの範囲、例えば約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１ ｍｇ、または例えば２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ ｍｇのポリヌクレオチドを含む。本発明のワクチンは、典型的には、５ μｇ～５ ｍｇの範囲のポリペプチド／二量体タンパク質を含む。
本発明は、上記のポリヌクレオチドにも関する。そのポリヌクレオチドは、二本鎖または一本鎖いずれかのＤＮＡヌクレオチド配列またはＲＮＡヌクレオチド配列（ゲノムＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列、およびＲＮＡ配列など）を含むことができる。
前記ポリヌクレオチドは、それが投与される対象の種に最適化されていることが好ましい。ヒトに投与するには、ポリヌクレオチド配列がヒトコドンに最適化されていることが好ましい。
好ましい一実施形態では、ワクチンはＤＮＡワクチンである。すなわちポリヌクレオチドはＤＮＡである。
本発明はさらに、上に規定したポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドに関する。このポリペプチドは本発明によるワクチンを製造するためインビトロで発現させること、または対象（個人など）にポリヌクレオチドを投与した結果として生体内で発現させることが可能である。
二量体化ユニットが存在するため、ポリペプチドが発現するとき二量体タンパク質が形成される。二量体タンパク質としてホモ二量体が可能である。すなわち２つのポリペプチド鎖が同じであり、その帰結として同じベータコロナウイルスエピトープを含む。あるいは二量体タンパク質として、抗原ユニットの中にコードされている２つの異なる単量体ポリペプチドを含むヘテロ二量体が可能である。後者は、例えばベータコロナウイルスエピトープの数、したがってアミノ酸の数が抗原ユニットに含められる上限を超える場合に重要になる可能性がある。しかし二量体タンパク質はホモ二量体であることが好ましい。
さらに、本発明は、ターゲティングユニット、二量体化ユニット、および抗原ユニット（この抗原ユニットは少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープを含む）をコードするヌクレオチド配列を含む（例えばＤＮＡの形態の）ポリヌクレオチド配列を含むベクターに関する。
ベクターは、宿主細胞にトランスフェクトして上記のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド／二量体タンパク質を発現させることを目的とする。すなわち発現ベクター、好ましくはＤＮＡプラスミドである。
ベクターによって上記のさまざまなユニット（特に抗原ユニット）の容易な交換が可能になることが好ましい。一実施形態では、発現ベクターとしてｐＵＭＶＣ４ａベクター、またはＮＴＣ９３８５Ｒベクター骨格を含むベクターが可能である。抗原ユニットは、Ｓｆｉｌ制限酵素カセットによって制限される抗原ユニットカセットと交換することができる。５’部位はＧＬＧＧＬ／ＧＬＳＧＬリンカーに組み込まれており、３’部位はベクター内の終止コドンの後に含まれている。
本発明は、ターゲティングユニット、二量体化ユニット、および抗原ユニット（この抗原ユニットは少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープを含む）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む宿主細胞、またはターゲティングユニット、二量体化ユニット、および抗原ユニット（この抗原ユニットは少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープを含む）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列を含むベクターを含む宿主細胞にも関する。
適切な宿主細胞に含まれるのは、原核生物、酵母、昆虫、またはより高等な真核生物である。好ましい一実施形態では、宿主細胞はヒト細胞、好ましくは本発明のワクチンを必要とする個人の細胞である。
１つの態様では、本発明は、上記のポリヌクレオチド、ポリペプチド、または二量体タンパク質の薬としての利用に関する。
本発明の特別な一実施形態では、上記のポリヌクレオチド、またはポリペプチド、または二量体タンパク質は、ベータコロナウイルスの感染症の治療に使用することを目的とする。好ましい一実施形態では、ベータコロナウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。
本発明によるワクチンを調製するための適切な方法は、ＷＯ ２００４／０７６４８９Ａ１、ＷＯ ２０１１／１６１２４４Ａ１、ＷＯ ２０１３／０９２８７５Ａ１、およびＷＯ ２０１７／１１８６９５Ａ１に開示されており、これらは参照によって本明細書に組み込まれている。
１つの態様では、本発明は、上に規定した二量体タンパク質またはポリペプチドを免疫学的に有効な量で含むワクチンを、そのポリペプチドをインビトロで生成させることによって調製する方法に関する。そのポリペプチドとタンパク質のインビトロでの合成は、当業者に知られている適切な任意の方法によって（例えばペプチド合成を通じて、または多彩な発現系のいずれかにおいてそのポリペプチドを発現させた後に精製することを通じて）実施することができる。したがって一実施形態では、本発明により、
（ｉ）ターゲティングユニット、二量体化ユニット、および抗原ユニット（この抗原ユニットは少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープを含む）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド２つからなる二量体タンパク質；または
（ｉｉ）ターゲティングユニット、二量体化ユニット、および抗原ユニット（この抗原ユニットは少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープを含む）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを、前記二量体タンパク質またはポリペプチドをインビトロで生成させることにより含むワクチンを調製する方法として、
ａ）前記ポリヌクレオチドを細胞にトランスフェクトする工程；
ｂ）前記細胞を培養する工程；
ｃ）前記細胞から発現した前記二量体タンパク質または前記ポリペプチドを回収して精製する工程；および
ｄ）工程ｃ）から得られた前記二量体タンパク質またはポリペプチドを薬学的に許容可能な前記担体と混合する工程を含む方法が提供される。
好ましい一実施形態では、工程ｃ）から得られた二量体タンパク質またはポリペプチドは、薬学的に許容可能な前記担体に溶かされる。
薬学的に許容可能な担体は、薬学的に許容可能な前記担体（例えば薬学的に許容可能な水性担体である水やバッファなど）の１つである。一実施形態では、ワクチンはさらにアジュバントを含む。
精製は適切な任意の方法（クロマトグラフィ、遠心分離、または較差溶解度など）に従って実施することができる。
別の１つの態様では、本発明は、上に規定したポリヌクレオチドを免疫学的に有効な量で含む本発明によるワクチンを調製する方法に関する。
したがって一実施形態では、本発明により、ターゲティングユニット、二量体化ユニット、および抗原ユニット（この抗原ユニットは少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープを含む）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを免疫学的に有効な量で含むワクチンを調製する方法として、
ａ）前記ポリヌクレオチドを調製する工程；
ｂ）場合により、前記ポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングする工程；および
ｃ）工程ａ）から得られたポリヌクレオチド、または工程ｂ）から得られたベクターを薬学的に許容可能な担体と混合する工程を含む方法が提供される。
前記ポリヌクレオチドは当業者に知られている適切な任意の方法によって調製することができる。例えば前記ポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチド合成装置を用いて化学合成によって調製することができる。
特に、より小さいヌクレオチド配列（例えばターゲティングユニット、二量体化ユニット、および／または抗原ユニットのサブユニットをコードするヌクレオチド配列）は、個別に合成した後、連結させて最終ポリヌクレオチドを作製し、ベクター骨格の中に入れることができる。
実施例１：Ｔ細胞エピトープの選択：
ＳＡＲＳ ＣｏＶウイルスの保存された領域から予測される免疫原性エピトープを以下のようにして同定した：
第１の工程では、世界中の人口のＨＬＡクラスＩとＩＩのアレルを同定した。ＨＬＡクラスＩについては、http://www.allelefrequencies.netで入手できるアレル頻度データベースを使用し、最頻のＨＬＡアレルを以下のやり方で同定した：各遺伝子座Ａ、Ｂ、およびＣに関する別々の検索と、以下の地域、すなわち欧州、東南アジア（中国に焦点）、および北アメリカ（アメリカ合衆国に焦点）に関する別々の検索を実施した。人口の基準を「金」に設定して高品質の研究だけを得た。解像度のレベルは少なくとも４桁に設定した（例えばＨＬＡ－Ａ＊０１：０１）。サンプリングする年は２００５年以降に設定した。各研究で頻出する上位４つのアレルを回収した。全研究でのあらゆる上位４つのうちで、各地域（欧州／東南アジア／北アメリカ）で頻出する上位４～５つのアレルを選択した。地域間の重複が原因で、最終的に選択されたアレルの数は、Ａ、Ｂ、Ｃについてそれぞれ１０、１０、１１であった。これら３１個のＨＬＡクラスＩアレルは、ＩＥＤＢ人口カバレッジ評価ツール(http://tools.iedb.org/population/)によって評価すると、世界人口の９９．４％をカバーする。詳細なカバレッジは以下の通りである。すなわち、欧州：９９．９％；北アメリカ：９９．２％；南アメリカ：９２．７％；東アジア：９８．５％；東南アジア：９８．１％；北東アジア：９７．４％；南アジア：９３．１％；西南アジア：９３．３％；中央アフリカ：９４．３％；東アフリカ：９２．３％；北アフリカ：９６．２％；南アフリカ：９１．２％、および西アフリカ：９４．３％。
ＨＬＡクラスＩＩについてはこの実施例１で実施しなかったが、アレル頻度をＨＬＡクラスＩと同様にして回収することができる。
次の工程は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に関するＴ細胞エピトープを同定することであった。これは、高品質のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２参照アミノ酸配列を得ることによってなされた。注釈付き（注釈スコア５／５）Ｕｎｉｐｒｏｔ武漢株をＵｎｉｐｒｏｔから質問ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２でダウンロードした（https://www.uniprot.org/uniprot/?query=sars-cov-2&fil=organism%3A%22Severe%20acute%20respiratory%20syndrome%20coronavirus%202%20(2019-nCoV)%20(SARS-CoV-2)%20%5B2697049%5D%22&columns=id%2Centry%20name%2Creviewed%2Cprotein%20names%2Cgenes%2Corganism%2Clength&sort=score）。６つのタンパク質が選択された。すなわちスパイクタンパク質、エンベロープタンパク質、膜タンパク質、およびヌクレオカプシドタンパク質という４つの構造タンパク質と、ＯＲＦ１ａ／ｂとＯＲＦ３ａという２つの非構造タンパク質である。６つのタンパク質配列の中でＨＬＡクラスＩアレルに結合することが予測されるエピトープのホットスポットゲノム領域を探す検索を、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ ４．０（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetMHCpan-4.0）と最初の工程で規定されたＨＬＡクラスＩアレルを用いて実施した。少なくとも１つのＨＬＡクラスＩアレルに結合することが予測される合計で１３２３６個のエピトープが見いだされた。ホットスポット領域を同定するため、フィルタリングを適用し、１０個超の異なるＨＬＡクラスＩアレルと、各遺伝子座（Ａ／Ｂ／Ｃ）からの少なくとも１つのアレルに結合するエピトープだけを残した。残った高品質の６０４個のエピトープを、重複するか隣接するエピトープ（アミノ酸３個以内離れている）を統合することによってさらに処理し、ホットスポットエピトープ領域を得た。アミノ酸１５個よりも短いエピトープをアミノ酸１５個まで伸長させた。統合されたエピトープの最終リストについて、ＨＬＡ ＩアレルとＨＬＡ ＩＩアレルへの結合を、それぞれＮｅｔＭＨＣｐａｎ ４．０とＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎ ３．２（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetMHCIIpan-3.2）を用いて予測した。
次いで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２とＳＡＲＳ－ＣｏＶに関するＮＣＢＩウイルスデータベースから最新の高品質注釈付き配列を取得した。全体的アラインメントによりこれら配列との相同性（株とエピトープ配列の間の％一致）を明らかにした。最新の高品質注釈付きヒト参照タンパク質配列はhttps://www.uniprot.org/proteomes/UP000005640から取得した。６、７、８、および９個のアミノ酸という短い配列を用いて前記エピトープとヒトプロテオームの間のあらゆる一致のまとめを作成し、前記エピトープと、Ｔ／Ｂ細胞応答またはＭＨＣクラスＩへの結合を誘導することが示されている免疫エピトープデータベース（ＩＥＤＢ）に寄託されたあらゆるエピトープの間のサブストリング一致を検索した。エピトープの最終的な優先度は、回収された情報に基づいて以下のようにつけた：
・異なるＭＨＣクラスＩとＩＩのアレルの大きなセットをカバーするエピトープを優先することにより、全体集団のカバレッジを最大にすること
・最新のＮＣＢＩウイルスデータベースからの世界中の２００超の異なるＳＡＲＳ ＣｏＶ－２株の中で保存されていること
・一般に、異なるＳＡＲＳ ＣｏＶ株とベータコロナウイルスの中で保存保存されていること
・ヒトプロテオームの任意のタンパク質と６個のアミノ酸の正確な一致が不在／最小数であること
・免疫エピトープデータベース（ＩＥＤＢ）に寄託された免疫優性ＳＡＲＳ－ＣｏＶエピトープと一致すること。
配列番号１～２２９を有するエピトープが同定された。
Figure 2023524054000002
Figure 2023524054000003
Figure 2023524054000004
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Figure 2023524054000011
Figure 2023524054000012
他のT細胞エピトープは、上記の方法に基づく（似ているか同じ）方法によって予測した。以下のT細胞エピトープが同定された。
Figure 2023524054000013
Figure 2023524054000014
SPIKE 8_110：（配列番号386）PLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTL
SPIKE_286_395（配列番号387）DAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNV
SPIKE_483_552（配列番号388）EGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVL
NCAP_288_387（配列番号389）QELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQK
SPIKE_671_750（配列番号390）ASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECS
SPIKE_1036_1090（配列番号391）SKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFP
SPIKE_252_295（配列番号392）DSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDP
SPIKE_805_853（配列番号393）LPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQ
SPIKE_1180_1232（配列番号394）KEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTI
NCAP_49_129（配列番号395）ASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDG
SPIKE_438_479（配列番号396）NNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTP
VME1_153_212（配列番号397）HHLGRCDIKDLPKEITVATSRTLSYYKLGASQRVAGDSGFAAYSRYRIGNYKLNTDHSS
AP3A_164_233（配列番号398）SSIVITSGDGTTSPISEHDYQIGGYTEKWESGVKDCVVLHSYFTSDYYQLYSTQLSTDTGVEHVTFFIY
AP3A_84_132（配列番号399）LLFVTVYSHLLLVAAGLEAPFLYLYALVYFLQSINFVRIIMRLWLCWK
SPIKE_126_185（配列番号400）VIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGN
SPIKE_880_941（配列番号401）TITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSST
VEMP_18_67（配列番号402）LFLAFVVFLLVTLAILTALRLCAYCCNIVNVSLVKPSFYVYSRVKNLNS
AP3A_0_33（配列番号403）MDLFMRIFTIGTVTLKQGEIKDATPSDFVRATA
Figure 2023524054000015
Figure 2023524054000016
実施例２：ワクチンの構築と発現
試験したコンストラクト（ＶＢ１０．ＣＯＶ２）の全遺伝子配列はＧｅｎｓｃｒｉｐｔ（８６０センテンニアル・アヴェニュー、ピスカタウェイ、ＮＪ ０８８５４、アメリカ合衆国）から注文され、発現ベクターｐＵＭＶＣ４ａにクローニングされた。
すべてのコンストラクトをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、完全なワクシボディタンパク質の発現の確認を上清のサンドイッチＥＬＩＳＡによって実施した。それに加え、ウエスタンブロット分析をいくつかのコンストラクトで実施してワクシボディタンパク質の立体配置とサイズを確認した。
実施例３ａ：さまざまなタンパク質ワクシボディＤＮＡワクチン（ＶＢ１０．ＣＯＶ２と呼ぶ）の設計、製造、および特徴づけ
複数のＶＢ１０．ＣＯＶ２ ＤＮＡワクチンを設計した（図５３）：
ＶＢ２０４９（配列番号２５２、図２３Ａ）は、ＭＩＰ－１αターゲティングユニット、二量体化ユニット、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤの短い形態（「ＲＢＤ短」、アミノ酸 ３３１～５２４、すなわち１９３個のアミノ酸）を含む抗原ユニットをコードしている。
ＶＢ２０６０（配列番号２５４、図２４Ａ）は、ＭＩＰ－１αターゲティングユニット、二量体化ユニット、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのより長いバージョン（「ＲＢＤ長い」、アミノ酸３１９～５４２、すなわち２２３個のアミノ酸）を含む抗原ユニットをコードしている。
ＶＢ２０６５（配列番号２５６、図２５Ａ）は、ＭＩＰ－１αターゲティングユニット、二量体化ユニット、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ２株武漢Ｈｕ－１からのスパイクタンパク質（完全長融合前安定化スパイクタンパク質の発現が可能になるようコドンが最適化され、フーリンによって認識される多塩基切断部位が除去され、安定化変異が付加されている、Wrapp et al., Science 367, (2020), 1260-1263を参照されたい）を含む抗原ユニットをコードしている。
ＶＢ２０４８（配列番号２５８、図２６Ａ）は、ＭＩＰ－１αターゲティングユニット、二量体化ユニット、および実施例１に記載されているように保護免疫を誘導する設計にされた複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２株からの２０個の予測される免疫原性Ｔ細胞エピトープ（下記の表１参照）を含む抗原ユニットをコードしている。
Figure 2023524054000017
ＶＢ２０５９（配列番号２６０、図２７）は、抗マウスＭＨＣＩＩ ｓｃＦｖターゲティングユニット、二量体化ユニット、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのより長いバージョン（「ＲＢＤ長い」、アミノ酸３１９～５４２、すなわち２２３個のアミノ酸）を含む抗原ユニットをコードしている。
ＶＢ２０７１（配列番号２６２、図２８）は、抗マウスＭＨＣＩＩ ｓｃＦｖターゲティングユニット、二量体化ユニット、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ２株Ｗｕｈａｎ Ｈｕ－１からのスパイクタンパク質（完全長融合前安定化スパイクタンパク質の発現が可能になるようコドンが最適化され、フーリンによって認識される多塩基切断部位が除去され、安定化変異が付加されている、Wrapp et al., Science 367, (2020), 1260-1263を参照されたい）を含む抗原ユニットをコードしている。
下記のコンストラクトＶＢ２０８１～ＶＢ２０９９に含まれる予測されるＴ細胞エピトープ ｐｅｐ０８とｐｅｐ１８は、表１の中の対応するエピトープと同じである。ｐｅｐ２５は実施例１で同定された配列番号７５のアミノ酸配列を有する。
ＶＢ２０８１（配列番号２６４、図２９）は、ＭＩＰ－１αターゲティングユニット、二量体化ユニット、および（ＧＧＧＧＳ）２リンカーを用いて連結された１つの予測されるＴ細胞エピトープ（ｐｅｐ０８）とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのより長いバージョン（「ＲＢＤ長い」、アミノ酸３１９～５４２、すなわち２２３個のアミノ酸）からなる抗原ユニットをコードしている。
ＶＢ２０８２（配列番号２６６、図３０）は、ＭＩＰ－１αターゲティングユニット、二量体化ユニット、および（ＧＧＧＧＳ）２リンカーを用いて連結された１つの予測されるＴ細胞エピトープ（ｐｅｐ１８）とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのより長いバージョン（「ＲＢＤ長い」、アミノ酸３１９～５４２、すなわち２２３個のアミノ酸）からなる抗原ユニットをコードしている。
ＶＢ２０８３（配列番号２６８、図３１）は、ＭＩＰ－１αターゲティングユニット、二量体化ユニット、および（ＧＧＧＧＳ）２リンカーを用いて連結された２つの予測されるＴ細胞エピトープ（ｐｅｐ０８＋ｐｅｐ１８であり、エピトープ間に（ＧＧＧＧＳ）２リンカーを有する）とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのより長いバージョン（「ＲＢＤ長い」、アミノ酸３１９～５４２、すなわち２２３個のアミノ酸）からなる抗原ユニットをコードしている。
ＶＢ２０８４（配列番号２７０、図３２）は、ＭＩＰ－１αターゲティングユニット、二量体化ユニット、および（ＧＧＧＧＳ）２リンカーを用いて連結された３つの予測されるＴ細胞エピトープ（ｐｅｐ０８、ｐｅｐ１８、およびｐｅｐ２５であり、エピトープ間に（ＧＧＧＧＳ）２リンカーを有する）とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのより長いバージョン（「ＲＢＤ長い」、アミノ酸３１９～５４２、すなわち２２３個のアミノ酸）からなる抗原ユニットをコードしている。
ＶＢ２０８５（配列番号２７２、図３３）は、ＭＩＰ－１αターゲティングユニット、二量体化ユニット、およびＧＬＧＧＬリンカーを用いて連結された１つの予測されるＴ細胞エピトープ（ｐｅｐ０８）とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのより長いバージョン（「ＲＢＤ長い」、アミノ酸３１９～５４２、すなわち２２３個のアミノ酸）からなる抗原ユニットをコードしている。
ＶＢ２０８６（配列番号２７４、図３４）は、ＭＩＰ－１αターゲティングユニット、二量体化ユニット、および（ＧＬＧＧＬ）２リンカーを用いて連結された１つの予測されるＴ細胞エピトープ（ｐｅｐ０８）とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのより長いバージョン（「ＲＢＤ長い」、アミノ酸３１９～５４２、すなわち２２３個のアミノ酸）からなる抗原ユニットをコードしている。
ＶＢ２０８７（配列番号２７６、図３５）は、ＭＩＰ－１αターゲティングユニット、二量体化ユニット、およびＧＬＧＧＬリンカーを用いて連結された１つの予測されるＴ細胞エピトープ（ｐｅｐ１８）とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのより長いバージョン（「ＲＢＤ長い」、アミノ酸３１９～５４２、すなわち２２３個のアミノ酸）からなる抗原ユニットをコードしている。
ＶＢ２０８８（配列番号２７８、図３６）は、ＭＩＰ－１αターゲティングユニット、二量体化ユニット、およびＧＬＧＧＬリンカーを用いて連結された２つの予測されるＴ細胞エピトープ（ｐｅｐ０８＋ｐｅｐ１８であり、エピトープ間に（ＧＧＧＧＳ）２リンカーを有する）とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのより長いバージョン（「ＲＢＤ長い」、アミノ酸３１９～５４２、すなわち２２３個のアミノ酸）からなる抗原ユニットをコードしている。
ＶＢ２０８９（配列番号２８０、図３７）は、ＭＩＰ－１αターゲティングユニット、二量体化ユニット、およびＧＬＧＧＬリンカーを用いて連結された３つの予測されるＴ細胞エピトープ（ｐｅｐ０８、ｐｅｐ１８、およびｐｅｐ２５であり、エピトープ間に（ＧＧＧＧＳ）２リンカーを有する）とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのより長いバージョン（「ＲＢＤ長い」、アミノ酸３１９～５４２、すなわち２２３個のアミノ酸）からなる抗原ユニットをコードしている。
ＶＢ２０９１（配列番号２８２、図３８）は、ＭＩＰ－１αターゲティングユニット、二量体化ユニット、およびＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬリンカーを用いて連結された１つの予測されるＴ細胞エピトープ（ｐｅｐ０８）とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのより長いバージョン（「ＲＢＤ長い」、アミノ酸３１９～５４２、すなわち２２３個のアミノ酸）からなる抗原ユニットをコードしている。
ＶＢ２０９２（配列番号２８４、図３９）は、ＭＩＰ－１αターゲティングユニット、二量体化ユニット、およびＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬリンカーを用いて連結された３つの予測されるＴ細胞エピトープ（ｐｅｐ０８、ｐｅｐ１８、およびｐｅｐ２５であり、エピトープ間に（ＧＧＧＧＳ）２リンカーを有する）とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのより長いバージョン（「ＲＢＤ長い」、アミノ酸３１９～５４２、すなわち２２３個のアミノ酸）からなる抗原ユニットをコードしている。
ＶＢ２０９４（配列番号２８６、図４０）は、ＭＩＰ－１αターゲティングユニット、二量体化ユニット、およびＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬリンカーを用いて連結された１つの予測されるＴ細胞エピトープ（ｐｅｐ０８）とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのより長いバージョン（「ＲＢＤ長い」、アミノ酸３１９～５４２、すなわち２２３個のアミノ酸）からなる抗原ユニットをコードしている。
ＶＢ２０９５（配列番号２８８、図４１）は、ＭＩＰ－１αターゲティングユニット、二量体化ユニット、およびＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬリンカーを用いて連結された３つの予測されるＴ細胞エピトープ（ｐｅｐ０８、ｐｅｐ１８、およびｐｅｐ２５であり、エピトープ間に（ＧＧＧＧＳ）２リンカーを有する）とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのより長いバージョン（「ＲＢＤ長い」、アミノ酸３１９～５４２、すなわち２２３個のアミノ酸）からなる抗原ユニットをコードしている。
ＶＢ２０９７（配列番号２９０、図４２）は、ＭＩＰ－１αターゲティングユニット、二量体化ユニット、およびＧＳＡＴリンカーを用いて連結された３つの予測されるＴ細胞エピトープ（ｐｅｐ０８、ｐｅｐ１８、およびｐｅｐ２５であり、エピトープ間に（ＧＧＧＧＳ）２リンカーを有する）とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのより長いバージョン（「ＲＢＤ長い」、アミノ酸３１９～５４２、すなわち２２３個のアミノ酸）からなる抗原ユニットをコードしている。
ＶＢ２０９９（配列番号２９２、図４３）は、ＭＩＰ－１αターゲティングユニット、二量体化ユニット、およびＳＥＧリンカーを用いて連結された３つの予測されるＴ細胞エピトープ（ｐｅｐ０８、ｐｅｐ１８、およびｐｅｐ２５であり、エピトープ間に（ＧＧＧＧＳ）２リンカーを有する）とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのより長いバージョン（「ＲＢＤ長い」、アミノ酸３１９～５４２、すなわち２２３個のアミノ酸）からなる抗原ユニットをコードしている。
ＶＢ２１２９（配列番号２９４、図４４）は、ＭＩＰ－１αターゲティングユニット、二量体化ユニット、および南アフリカバリアントＢ．１．３５１において特徴的な３つの変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのより長いバージョン（「ＲＢＤ長い」、アミノ酸３１９～５４２、すなわち２２３個のアミノ酸）を含む抗原ユニットをコードしている。
ＶＢ２１３１は、ＭＩＰ－１αターゲティングユニット、二量体化ユニット、およびＳＥＧリンカー（アミノ酸配列：配列番号２９６、図４５）を用いて連結された武漢株と南アフリカバリアントＢ．１．３５１からのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤの２つの長いバージョン（「ＲＢＤ長い」、アミノ酸３１９－５４２、すなわち２２３個のアミノ酸）からなる抗原ユニットをコードしている。
ＶＢ２１３２は、ＭＩＰ－１αターゲティングユニット、二量体化ユニット、およびＧＳＡＴリンカー（アミノ酸配列：配列番号２９７、図４６）を用いて連結された武漢株と南アフリカバリアントＢ．１．３５１からのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤの２つの長いバージョン（「ＲＢＤ長い」、アミノ酸３１９～５４２、すなわち２２３個のアミノ酸）からなる抗原ユニットをコードしている。
ＶＢ２１３３は、ＭＩＰ－１αターゲティングユニット、二量体化ユニット、およびＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬリンカー（アミノ酸配列：配列番号２９８、図４７）を用いて連結された武漢株と南アフリカバリアントＢ．１．３５１からのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤの２つの長いバージョン（「ＲＢＤ長い」、アミノ酸３１９～５４２、すなわち２２３個のアミノ酸）からなる抗原ユニットをコードしている。
ＶＢ２１３４は、ＭＩＰ－１αターゲティングユニット、二量体化ユニット、およびＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬリンカー（アミノ酸配列：配列番号２９９、図４８）を用いて連結された武漢株と南アフリカバリアントＢ．１．３５１からのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤの２つの長いバージョン（「ＲＢＤ長い」、アミノ酸３１９～５４２、すなわち２２３個のアミノ酸）からなる抗原ユニットをコードしている。
ＶＢ２１３５は、ＭＩＰ－１αターゲティングユニット、二量体化ユニット、およびＳＥＧリンカー（アミノ酸配列：配列番号３００、図４９）を用いて連結された南アフリカバリアントＢ．１．３５１とＵＫバリアントＢ．１．１．７からのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤの２つの長いバージョン（「ＲＢＤ長い」、アミノ酸３１９～５４２、すなわち２２３個のアミノ酸）からなる抗原ユニットをコードしている。
ＶＢ２１３６は、ＭＩＰ－１αターゲティングユニット、二量体化ユニット、およびＧＳＡＴリンカー（アミノ酸配列：配列番号３０１、図５０）を用いて連結された南アフリカバリアントＢ．１．３５１とＵＫバリアントＢ．１．１．７からのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤの２つの長いバージョン（「ＲＢＤ長い」、アミノ酸３１９～５４２、すなわち２２３個のアミノ酸）からなる抗原ユニットをコードしている。
ＶＢ２１３７は、ＭＩＰ－１αターゲティングユニット、二量体化ユニット、およびＳＥＧリンカー（アミノ酸配列：配列番号３０２、図５１）を用いて連結された南アフリカバリアントＢ．１．３５１とカリフォルニアバリアントＢ．１．４２７からのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤの２つの長いバージョン（「ＲＢＤ長い」、アミノ酸３１９～５４２、すなわち２２３個のアミノ酸）からなる抗原ユニットをコードしている。
ＶＢ２１３８は、ＭＩＰ－１αターゲティングユニット、二量体化ユニット、およびＧＳＡＴリンカー（アミノ酸配列：配列番号３０３、図５２）を用いて連結された南アフリカバリアントＢ．１．３５１とカリフォルニアバリアントＢ．１．４２７からのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤの２つの長いバージョン（「ＲＢＤ長い」、アミノ酸３１９～５４２、すなわち２２３個のアミノ酸）からなる抗原ユニットをコードしている。
実施例３ｂ：哺乳類の細胞にＶＢ１０．ＣＯＶ２ ＤＮＡプラスミドを一過性にトランスフェクトした後のＶＢ１０．ＣＯＶ２タンパク質発現レベルのインビトロでの特徴づけ
この研究の目的は、哺乳類細胞にＶＢ１０．ＣＯＶ２ ＤＮＡプラスミドを一過性にトランスフェクトした後のＶＢ１０．ＣＯＶ２タンパク質の発現レベルをインビトロで特徴づけることであり、それは、細胞上清の中の機能的ＶＢ１０．ＣＯＶ２タンパク質の存在をＥＬＩＳＡアッセイによりそのタンパク質のターゲティングユニット、二量体化ユニット、および抗原ユニットへの特異的抗体の結合を利用して測定することによりなされた。それに加え、ウエスタンブロット分析を実施し、ＶＢ２０６０によってコードされるタンパク質の立体配置とサイズを確認した。
ＶＢ１０．ＣＯＶ２ ＤＮＡコンストラクトはＧｅｎｓｃｒｉｐｔによって合成され、クローニングされ、作製された。得られたコンストラクトは、ＭＩＰ－１αおよび他のターゲティングユニットと、抗原ユニットとしてのＲＢＤ／スパイクおよび／またはＴ細胞エピトープを持ち、それらユニットがヒトヒンジエキソンｈ１およびｈ４とＩｇＧ３のＣＨ３ドメインからなる二量体化ユニットによって接続されたホモ二量体タンパク質をコードしていた。ＧｅｎｓｃｒｉｐｔはＤＮＡプラスミドの調製（０．５～１．０ ｍｇ）も実施した。
ＨＥＫ２９３細胞をＡＴＣＣから取得した。ＨＥＫ２９３細胞にＶＢ１０．ＣＯＶ２ ＤＮＡプラスミドを一過性にトランスフェクトした。簡単に述べると、１０％のＦＢＳ増殖培地を含む２４ウエルの組織培養プレートに２×１０５個の細胞／ウエルを播種し、リポフェクタミン（登録商標）２０００試薬を製造者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が推奨する条件で使用して１ μｇのＶＢ１０．ＣＯＶ２ ＤＮＡプラスミドをトランスフェクトした。次いでトランスフェクトされた細胞を６日間まで５％ＣＯ２で３７℃に維持し、ＶＢ１０．ＣＯＶ２タンパク質を特徴づけるため細胞上清を回収した。
ＥＬＩＳＡを実施し、ＨＥＫ２９３細胞によって産生されて細胞上清の中に分泌されるＶＢ１０．ＣＯＶ２タンパク質の量を確認した。簡単に述べると、ＭａｘｉＳｏｒｐ Ｎｕｎｃ－ｉｍｍｕｎｏプレートを、１ μｇ／ｍｌの抗ＣＨ３（ＭＣＡ８７８Ｇ、ＢｉｏＲａｄ）を含む１×ＰＢＳを１００ μｌ／ウエルで用いて被覆し、プレートを４℃で一晩インキュベートした。その微量滴定ウエルを、４％のＢＳＡを含む１×ＰＢＳを２００ μｌ／ウエルで添加することによってブロックした。ＶＢ１０．ＣＯＶ２ タンパク質を含有するトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からの細胞上清１００ μｌをプレートに添加した。検出抗体については、ビオチニル化された抗ヒトＭＩＰ－１α（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ビオチニル化された抗ヒトＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／２０１９－ｎＣｏＶスパイク／ＲＢＤ抗体（１：１０００）（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ）のいずれかを添加してインキュベートした。その後、ｓｔｒｅｐ－ＨＲＰ（１：３０００）または抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰ（１：５０００）を添加してインキュベートした。特に断わらない限り、すべてのインキュベーションを３７℃で１時間実施した後、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。その後、ＴＭＢ溶液を１００ μｌ／ウエルで添加し、５～１５分後に１ ＭのＨＣｌを１００ μｌ／ウエルで添加して発色を停止させた。４５０ ｎｍでの光学密度を自動化されたプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ ＧＯ）で求めた。
それに加えてウエスタンブロット分析を実施し、ＨＥＫ２９３細胞によって産生されて細胞上清の中に分泌されるＶＢ１０．ＣＯＶ２タンパク質の量を確認した。簡単に述べると、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からの上清２４ μｌを、３ μｌの還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の添加あり、またはなしの８ μｌのＮｏｖｅｘ Ｂｏｌｔ ＬＤＳサンプルバッファ４×（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合することによってサンプルを調製した。（還元された、または還元されていない）サンプルを９５℃で４～５分間沸騰させた後、４％～１２％のＮｏｖｅｘトリス－グリシンプレキャストゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に添加した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを、ＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２であらかじめ染色した基準（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＮｏｖｅｘ Ｂｏｌｔ ＳＤＳランニングバッファの中で実施した。Ｔｒａｎ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用い、ＥｔＯＨで活性化させたＰＶＤＦ膜にタンパク質を移した。ＰＶＤＦ膜を３％ＢＳＡ ＰＢＳＴでブロックし、タンパク質をスパイク－ＲＢＤウサギｐＡｂ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）－ヤギ抗ウサギＡＰ（Ｓｉｇｍａ）で検出した。発色するまで、膜のためのＢＣＩＰ／ＮＢＴ－Ｐｕｒｐｌｅ Ｌｉｑｕｉｄ基質系を用いてバンドを現像した。
図５４、５５、および５６は、以下の機能的ＶＢ１０．ＣＯＶ２タンパク質の発現と分泌がうまくいったことを示す：ＶＢ２０４９（配列番号２５３、図２３Ｂ）、ＶＢ２０６０（配列番号２５５、図２４Ｂ）、ＶＢ２０６５（配列番号２５７、図２５Ｂ）、ＶＢ２０４８（配列番号２５９、図２６Ｂ）、ＶＢ２０５９（配列番号２６１、図２７Ｂ）、ＶＢ２０７１（配列番号２６３、図２８Ｂ）、ＶＢ２０８１（配列番号２６５、図２９Ｂ）、ＶＢ２０８２（配列番号２６７、図３０Ｂ）、ＶＢ２０８３（配列番号２６９、図３１Ｂ）、ＶＢ２０８４（配列番号２７１、図３２Ｂ）、ＶＢ２０８５（配列番号２７３、図３３Ｂ）、ＶＢ２０８６（配列番号２７５、図３４Ｂ）、ＶＢ２０８７（配列番号２７７、図３５Ｂ）、ＶＢ２０８８（配列番号２７９、図３６Ｂ）、ＶＢ２０８９（配列番号２８１、図３７Ｂ）、ＶＢ２０９１（配列番号２８３、図３８Ｂ）、ＶＢ２０９２（配列番号２８５、図３９Ｂ）、ＶＢ２０９４（配列番号２８７、図４０Ｂ）、ＶＢ２０９５（配列番号２８９、図４１Ｂ）、ＶＢ２０９７（配列番号２９１、図４２Ｂ）、ＶＢ２０９９（配列番号２９３、図４３Ｂ）、ＶＢ２１２９（配列番号２９５、図４４Ｂ）、ＶＢ２１３１（配列番号２９６、図４５）、ＶＢ２１３２（配列番号２９７、図４６）、ＶＢ２１３３（配列番号２９８、図４７）、ＶＢ２１３４（配列番号２９９、図４８）、ＶＢ２１３５（配列番号３００、図４９）、ＶＢ２１３６（配列番号３０１、図５０）、ＶＢ２１３７（配列番号３０２、図５１）、およびＶＢ２１３８（配列番号３０３、図５２）。
ＶＢ１０．ＣＯＶ２タンパク質の立体配置の完全さを、ＥＬＩＳＡとウエスタンブロット分析において、抗ｈＩｇＧ（ＣＨ３ドメイン）（捕獲抗体として）、ｈＭＩＰ－１α、ＲＢＤドメイン、またはスパイクタンパク質に対して特異的な抗体への結合によって確認した。
ＥＬＩＳＡでは、発現レベルがさまざまなＶＢ１０．ＣＯＶ２コンストラクトの間で分子構造に応じて高発現、中発現、低発現の間で変化することが見いだされた。
より長いＲＢＤドメインを含有するコンストラクト（ＶＢ２０５９とＶＢ２０６０）は、短いＲＢＤドメインを有するコンストラクト（ＶＢ２０４９）と比べて最高レベルで発現した（図５４と図５５Ｂ）。より長いＲＢＤドメインに変異を導入すると、ＶＢ２０６０をＶＢ２１２９と比べたときに観察されるように、発現レベルがわずかに変化した（図５５Ｄ）。スパイクタンパク質を含有するコンストラクト（ＶＢ２０６５とＶＢ２０７１）はＲＢＤコンストラクトよりも低いレベルで発現した（図５４と図５５Ｂ）。同じ抗原ユニット（長いＲＢＤまたはスパイクタンパク質のいずれか）を含有するがターゲティングユニット（ヒトＭＩＰ１αまたは抗マウスＭＨＣＩＩ ｓｃＦｖ）は異なるコンストラクトは発現レベルに有意差がなかった（図５４と図５５Ｂ）。
抗原ユニットの中に予測されるＴ細胞エピトープと長いＲＢＤドメインの組み合わせを含有するコンストラクトでは、発現レベルの差が、含まれるＴ細胞エピトープとリンカーに応じて観察された。発現レベルは、ｐｅｐ０８を含有するコンストラクト（ＶＢ２０８１）と比べてｐｅｐ１８を含有するコンストラクト（ＶＢ２０８２とＶＢ２０８７）で最高であった。コンストラクトが３つのＴ細胞エピトープ（ｐｅｐ０８、ｐｅｐ１８、およびｐｅｐ２５）を含んでいるとき、ＳＥＧリンカーまたはＧＳＡＴリンカーを有するコンストラクトは、それら３つのＴ細胞エピトープの最後と長いＲＢＤドメインの間に他のリンカーを有するコンストラクトと比べて有意により多く発現した（図５５Ｃ）。
ＨＥＫ２９３細胞に２つのプラスミドＶＢ２０４８とＶＢ２０４９を同時にトランスフェクトするとき、発現レベルは、それらプラスミドの一方だけをトランスフェクトしたときと同様であった（図５５Ｅと図５４／５５Ｂ）。
ウエスタンブロット分析（図５６）では、非還元条件下で強いバンドがＶＢ２０６０に関して約９５ ｋＤａの位置に検出された。これは、ＶＢ２０６０ホモ二量体タンパク質の存在を示す。非還元条件ではほぼ半分のサイズの位置のバンドは検出されなかった。これは、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞から発現したコードされたＶＢ２０６０ポリペプチドが上清の中でホモ二量体を形成していることを示唆する。還元条件下で約５０ ｋＤａの位置にバンドが観察された。これは、ＶＢ２０６０のヒンジ領域で共有ジスルフィド架橋が還元され、単量体分子が形成されたことを示す。リポフェクタミン対照レーンに観察されるバンドがないのは、検出抗体の高い特異性と低い交差反応性を示す（図５６Ａ）。
結論として、実施例３はコンストラクトがＨＥＫ２９３細胞の中で発現することを示しており、これは、コンストラクトが筋肉内ワクチン接種後に生体内で、すなわち筋細胞からより高いレベルで分泌されうることを示している可能性がある。
実施例４：ＶＢ１０．ＣＯＶ２ワクシボディ ＤＮＡワクチンで免疫化したマウスにおける抗ＲＢＤ免疫応答
マウスを用いたすべての実験（実施例４～８）に以下の研究設計を適用した：
雌の６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスをＪａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓ（フランス国）から取得した。すべてのマウスをＲａｄｉｕｍ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（オスロ、ノルウェー国）またはオスロ大学（ノルウェー国）の動物施設に収容した。すべての動物プロトコルがＮｏｒｗｅｇｉａｎ Ｆｏｏｄ Ｓａｆｅｔｙ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ（オスロ、ノルウェイ国）によって承認された。研究のため、下記の表２に記載されているようにしてマウスにＤＮＡワクチンを接種した。ワクチンは、（無菌ＰＢＳの中にワクシボディＤＮＡプラスミドを含む２５ μｌの溶液をそれぞれの脚の）それぞれの前脛骨（ＴＡ）筋への針注射と、それに続くＡｇｉｌｅＰｕｌｓｅ生体内電気穿孔（ＥＰ）（ＢＴＸ、アメリカ合衆国）によって投与した。ＡｇｉｌｅＰｕｌｓｅ ＥＰによる送達は、１１０～４５０ボルトの３セットのパルスからなる。第１のセットには０．２ミリ秒の遅延がある１つの５０マイクロ秒のパルスが存在し；第２のセットは５０ミリ秒の遅延がある１つの５０マイクロ秒のパルスであり、第３のセットは、１０ミリ秒のパルスと２０ミリ秒の遅延がある８つのパルスである。血清サンプル（気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）によって肺から回収したサンプル）と脾臓を下記の表２に記載されているようにして回収した。
Figure 2023524054000018
実施例４の研究の目的は、ＶＢ１０．ＣＯＶ２ワクシボディＤＮＡワクチンを接種したときにマウスでＲＢＤに対して誘導される液性免疫応答を、投与されるＤＮＡワクチンの用量と投与回数の関数として評価することであった。
液性免疫応答を、ワクチンを接種したマウスから回収した血清の中で、血清中にあってＳＡＲＳ－ＣｏＶ２からのＲＢＤに結合する全ＩｇＧを検出するＥＬＩＳＡアッセイによって評価した。Ｎｕｎｃ ＥＬＩＳＡプレートを、１ μｇ／ｍｌの組み換えタンパク質抗原を含むＤ－ＰＢＳを用いて４℃で一晩被覆した。プレートを、４％のＢＳＡを含むＤ－ＰＢＳを用いて室温で１時間ブロックした。次いでプレートをマウス血清の段階希釈液とともにインキュベートした後、３７℃で２時間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、ＨＲＰ－抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）の１：５０ ０００希釈液とともにインキュベートし、３７℃で１時間インキュベートした。最終洗浄の後、プレートを、ＴＭＢ基質（Ｍｅｒｃｋ、カタログ番号ＣＬ０７－１０００）を用いて現像した。プレートを３０分以内にＭｕｌｔｉｓｃａｎ ＧＯ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて４５０ ｎｍの波長で読んだ。結合抗体のエンドポイント力価を計算した。調べた結合抗原にはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原であるＲＢＤ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ４０５９２－Ｖ０８Ｈ）が含まれていた。
４つのＤＮＡワクチン（ＶＢ２０４９、ＶＢ２０６０、ＶＢ２０６５、およびＶＢ２０７１）について抗ＲＢＤ ＩｇＧを誘導する能力を比較すると、ＶＢ２０６０がＶＢ２０４９よりも優れていた（図５７Ａ／Ｂ、図５７Ａの中の２つのグラフは同じデータを異なるやり方で示している）。
ＶＢ２０６０は、ワクチンを１回接種してから早くも７日目に；最少用量でさえ、特異的抗ＲＢＤ ＩｇＧと整合する用量－応答を示した（図５７Ａと５７Ｃ）。抗体レベルは１回投与してから２８日目にピークに達し（１０５エンドポイント力価）、少なくとも９０日間持続した（図５７Ａと５７Ｂ）。ＶＢ２０６０については、応答のピークと持続性は、１回投与群と比べて２回投与計画（０日目と２１日目）の後にさらに増大した（１０６超のエンドポイント力価）。限定された追加の利益が、８９日目にブーストワクチン接種を受けたマウスで９９日目に観察された（図５７Ａと５７Ｂ）。
第２の実験により、３．０、６．２５、１２．５、および２５ μｇの範囲のＶＢ２０６０で用量に依存した応答が特に７日目に確認された（図５７Ｃ）が、すでに１４日目にレベルがすべての用量で約１０５エンドポイント力価に到達した。
さらに、ＲＢＤ特異的ＩｇＧの動態を、異なる用量のＶＢ２０６０を１回または２回接種したマウスからの気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）で調べた（図５７Ｄ）。肺におけるＲＢＤ特異的ＩｇＧは、呼吸管感染症に対する最前線の保護としての局所的ウイルス中和に寄与する可能性がある。ＲＢＤ特異的ＩｇＧは、最低用量でさえ、調べた最も早い時点（１４日目）でＢＡＬの中に見いだされた。レベルは用量および時間経過とともに上昇した。
ＶＢ２０６５とＶＢ２０７１（スパイクタンパク質）もＲＢＤに対して強力なＩｇＧ応答を誘導したが、ＲＢＤに基づくコンストラクトＶＢ２０６０よりも弱いように見えた（図５７Ｂ）。この知見は、ワクチンタンパク質の分泌がより少ないことでおそらく説明することができる（図５４参照）。抗マウスＭＨＣＩＩ ｓｃＦｖターゲティングを有するＶＢ２０５９（長いＲＢＤ）とＶＢ２０７１（スパイクタンパク質）もＲＢＤに対する強力なＩｇＧ応答を誘導した。しかしこれらは、ＭＩＰ１αが標的とするＲＢＤに基づくコンストラクトＶＢ２０６０よりも弱いより弱いように見えた（図５７Ｂと５７Ｅ）。ＶＢ２０５９は、１回だけのワクチン接種から早くも７日目に；最低用量でさえ、特異的抗ＲＢＤ ＩｇＧを伴う一貫性のある用量－応答を示した（図５７Ｅ）。しかし抗体レベルはＶＢ２０６０と比べてより遅い時点でピークに達し、より低い応答であった（５６日目、１０５エンドポイント力価）（図５７Ａと５７Ｅ）。この知見は、ＭＩＰ１αターゲティングユニットが、そのようなターゲティングユニットを含むＶＢ１０．ＣＯＶ２ワクチンを用いて迅速で長く続く高レベルの抗ＲＢＤ抗体を誘導することに関して抗マウスＭＨＣＩＩ ｓｃＦｖターゲティングよりも優れていることを明らかに示している。
予測されるＴ細胞エピトープと長いＲＢＤドメインの組み合わせを抗原ユニットに含有するコンストラクトについては、コンストラクトＶＢ２０９７（３つのエピトープ＋ＧＳＡＴリンカー）とＶＢ２０９９（３つのエピトープ＋ＳＥＧリンカー）が、他のリンカーを持っていて３つのエピトープを含むコンストラクトよりもＲＢＤに対してより強いＩｇＧ応答を誘導した（図５７Ｆ）。１つのエピトープを有するコンストラクトについては、ＶＢ２０８２とＶＢ２０８７（ｐｅｐ１８を含む）が、ｐｅｐ０８エピトープを含むコンストラクト（ＶＢ２０８１）と比べてより強い抗ＲＢＤ ＩｇＧ応答を誘導した（図５７Ｆ）。これらの知見は、ワクチンタンパク質の分泌がより少ないことでおそらく説明することができる（図５５Ｃ参照）。予測されるＴ細胞エピトープと長いＲＢＤの組み合わせを含有する最良のコンストラクトＶＢ２０９７とＶＢ２０８７は、長いＲＢＤだけを含むＶＢ２０６０（図５７Ａと５７Ｂ）と比べて同様の免疫応答を誘導する。
３つの南アフリカバリアント変異を有する長いＲＢＤドメインを含有するＶＢ１０．ＣＯＶ２ ＤＮＡワクチンであるＶＢ２１２９は、１回だけの接種から早くも７日目に；低い用量でさえ、特異的抗ＲＢＤ ＩｇＧを示した（図５７Ｇ）。抗体のレベルは、すべての用量で１４日目までにさらに上昇した（１０４エンドポイント力価）。
２つのプラスミドＶＢ２０４８とＶＢ２０４９を、１２．５ μｇの各プラスミドを１つに組み合わせたＤＮＡワクチン溶液にしてマウスに同時に接種したとき、データは、強力な抗ＲＢＤ ＩｇＧ応答がすでに１４日目に誘導されることを示している（図５７Ｈ）。
実施例５：ＶＢ１０．ＣＯＶ２ワクシボディＤＮＡワクチンはマウスで強力な中和抗体応答を誘導する
この研究の目的は、ＶＢ１０．ＣＯＶ２ワクシボディＤＮＡコンストラクトＶＢ２０４９、ＶＢ２０６０、およびＶＢ２０６５を接種したとき、生きているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対してマウスの中で誘導される中和抗体応答の程度を、マウスに与えるＤＮＡワクチンの用量と投与回数の関数として評価することであった。
生存ウイルスマイクロ中和アッセイ（ＭＮＡ）を、Ｆｏｌｅｇａｔｔｉ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ ３９６ （１０２４９）， ２０２０， ４６７－４７８に記載されているようにしてＰｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｎｇｌａｎｄ（ポートン・ダウン、連合王国）で実施した。中和ウイルス力価を、熱で不活化した（５６℃で３０分間）血清サンプルの中で測定した。希釈したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ａｕｓｔｒａｌｉａ／ＶＩＣ０１／２０２０２）を９６ウエルのＶ底プレートの中の１％ＦＣＳ／ＭＥＭの中で２倍血清希釈液と５０：５０で混合し、湿潤な箱の中で３７℃にて１時間インキュベートした。次いでこのウイルス／血清混合物を９６ウエルの平底プレートの中の洗浄したＶｅｒｏ Ｅ６（ＥＣＡＣＣ ８５０２０２０６）細胞単層に移し、３７℃でさらに１時間吸着できるようにした後、ウイルス接種源を除去し、オーバーレイ（１％ｗ／ｖ ＣＭＣを含む完全培地）で置換した。箱を再度密封し、２４時間インキュベートした後、ＰＢＳの中の８％（ｗ／ｖ）ホルムアルデヒド溶液で固定した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤスパイクタンパク質に対して特異的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体とウサギＨＲＰ複合体を用いてマイクロプラークを検出し、ＴｒｕｅＢｌｕｅＴＭ基質を用いて感染した病巣を検出した。染色されたマイクロプラークをＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）Ｓ６ Ｕｌｔｒａ－Ｖ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いてカウントし、得られたカウント数をＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ｖ７．０ソフトウエアで分析した。国際基準２０／１３０（回復したヒト血漿からのヒト抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体、ＮＩＢＳＣ、連合王国）を比較のため陽性対照として使用した。
ＶＢ１０．ＣＯＶ２ワクシボディＤＮＡコンストラクトＶＢ２０４９、ＶＢ２０６０、およびＶＢ２０６５を接種したマウスからの血清は評価された生存ウイルス中和アッセイであり、中和抗体応答がすべてのコンストラクトで見られた。
用量に依存した応答が観察され、２８日目に顕著な中和活性を誘導するのに低用量のＶＢ２０６０（２．５ μｇ）で十分であった。また、１回だけの高用量のＶＢ２０６０（５０ μｇ）は７日目にすでに中和活性を誘導することができて２８日目にピークに達し、９０日目の時点で減衰する兆候がなく、回復したＣＯＶＩＤ－１９患者からの回復血漿（ＮＩＢＳＣ基準２０／１３０）で観察されたのと同等かより高いレベルであった。用量とは独立に、最強の応答が（８９日目のブーストの後である）９９日目に観察された。これは、ＶＢ２０６０を用いた長く持続する中和抗体応答の誘導を示す。
２５または５０ μｇのＶＢ２０４９の２回と３回の投与は９０日目と９９日目に中レベルの中和抗体応答を誘導し、５０ μｇのＶＢ２０６５の２回の投与は同様に２８日目に中レベルの中和抗体応答を誘導した。
第２の実験により、３．０、６．２５、１２．５、および２５ μｇの範囲のＶＢ２０６０で用量に依存した応答が特に７日目に確認された（図５８Ｂ）が、すでに１４日目にレベルがすべての用量で約１０３エンドポイント力価に到達した。この実験では、最高用量のＶＢ２０６０（２５ μｇ）での１回のワクチン接種によりすでに７日目に強力な中和活性を誘導することができ、２８日目（ブーストなし）にピークに達し、回復したＣＯＶＩＤ－１９患者からの回復血漿（ＮＩＢＳＣ基準２０／１３０）で観察されたレベルと同等かより高いレベルであった。
上記の結果から、ＶＢ２０６０は、わずか１回の投与でさえ迅速で高レベルの中和抗体を誘導する点でＶＢ２０６５およびＶＢ２０４９よりも優れているように見える。結果は、ＶＢ２０６０が、ワクチン接種後の７日目にすでにウイルス中和活性を誘導できる強力なＤＮＡワクチンであることを示している（図５８）。
実施例６：ＶＢ１０．ＣＯＶ２ワクシボディＤＮＡワクチンを用いたワクチン接種後のＴ細胞応答の大きさと特異性の評価
この研究の目的は、ＶＢ１０．ＣＯＶ２ワクシボディＤＮＡコンストラクトを接種したマウスからの脾臓細胞の中のＲＢＤ／スパイクに対する細胞性免疫応答を、用量と投与回数の関数として評価することであった。ワクチンを接種したマウスからの脾臓細胞を、ＲＢＤ／スパイク特異的細胞応答を検出するＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで分析した。簡単に述べると、マウスを表２に示されている日に安楽死させ、脾臓を無菌で回収した。脾臓をすりつぶし、細胞懸濁液を１×ＡＣＫバッファとともにインキュベートし、洗浄し、６×１０６個の細胞という細胞濃度で再懸濁させた。いくつかの実験において、Ｄｙｎａｂｅａｄ（カタログ番号１１４４７Ｄまたは１１４４５Ｄ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）磁性ビーズシステムを製造者が推奨する手続きに従って用い、ＣＤ４＋ Ｔ細胞またはＣＤ８＋ Ｔ細胞の集団を全脾臓細胞集団から枯渇させた。次いでＥＬＩＳｐｏｔアッセイのため細胞を完全培地の中に６×１０６個の細胞／ｍｌの割合で再懸濁させた。枯渇はフローサイトメトリー分析によって確認した。さらに、細胞を三連で播種し（６×１０５個の細胞／ウエル）、２ μｇ／ｍｌのＲＢＤ／スパイクプール（下記の表３と４）または個々のペプチド（ＲＢＤ全体にわたって１２個のアミノ酸が重複した１５量体ペプチド（合計で６１個のペプチド）、またはスパイクタンパク質全体にわたって１２個のアミノ酸が重複した１５量体ペプチド（合計で２９６個のペプチド））で２４時間刺激した。ペプチド刺激なしを陰性対照として使用した。刺激された脾臓細胞をＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔ Ｐｌｕｓキット（Ｍａｂｔｅｃｈ ＡＢ、スウェーデン国）を用いて分析してＩＦＮ－γ応答を探した。スポット形成細胞をＣｅｌｌｕｌａｒ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙからのＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ ５．０．３というＣＴＬ ＥＬＩＳｐｏｔリーダーで測定した。結果は、ｓＩＦＮ－γ＋スポットの平均数／１０６個の脾臓細胞として示される。
Figure 2023524054000019
Figure 2023524054000020
Figure 2023524054000021
Figure 2023524054000022
Figure 2023524054000023
Figure 2023524054000024
Figure 2023524054000025
結局、ＶＢ１０．ＣＯＶ２コンストラクトはすべて、ワクチン接種後に用量に依存する強力なＴ細胞応答を誘導し、それが時間経過とともに増大した。応答はＣＤ８＋ Ｔ細胞に支配されており、有意だがより弱いＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を伴っていた。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤドメインに対する強力なＴ細胞応答が、２．５ μｇまたは２５ μｇのＶＢ２０４９の両方について、１回または２回接種したマウスからの脾臓で検出された（図５９）。用量レベルと投与回数に応じ、応答は、１回目の投与の２週間後、または２１日目のブーストワクチン接種後の最初の週に採取してＲＢＤに広がる６つのペプチドプールで別々に刺激した脾臓細胞において、１０６個の細胞につき約１８００～６０００ ＳＦＵの範囲であった。応答は、低用量（２．５ μｇのＤＮＡ）でさえ１回目のワクチン接種の１４日後にすでに強力であり、２１日目に２回目のワクチン接種を受けた群では２８日目までに（用量に依存して）増強された（図５９）。
ＣＤ４ Ｔ細胞集団またはＣＤ８ Ｔ細胞集団のいずれかが枯渇した脾臓細胞の中で１２個のアミノ酸が重複する個々の１５量体を用いて刺激することにより、Ｔ細胞によって認識されるエピトープを特徴づけた。９つのペプチドに対する強力な（約４０００ ＳＦＵまで／１０６個の細胞）ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答が観察された。ＲＢＤ特異的ＣＤ４＋応答も７つのペプチドに対して検出されたが、大きさがより小さく、より少数のエピトープであった（約１０００ ＳＦＵまで／１０６個の細胞）（図６０Ａと６０Ｂ）。重複するペプチドのアミノ酸配列は、ＲＢＤの中の４つの異なるＭＨＣクラスＩ制限エピトープと３つのＭＨＣクラスＩＩ制限エピトープに対する反応性を示した（図６０Ｃ）。
ＶＢ２０６０の１回の投与（０日目）または２回の迅速な投与（０日目＋７日目）によって誘導される初期Ｔ細胞応答の動態を調べた。１×２５ μｇのＶＢ２０６０を用いたワクチン接種は７日目という初期にＴ細胞応答を誘導し（１０６個の脾臓細胞につき約５５０スポット）、１４日目に応答がピークに達した（１０６個の脾臓細胞につき約２７５０スポット。７日目の追加のブーストワクチン接種は、１回だけ投与するワクチン計画と比べてＴ細胞応答を増大させなかった（図６１Ａ）。別の１つの実験では、Ｔ細胞応答が５０ μｇのＶＢ２０６０を接種した後の少なくとも９０日間にわたって持続することが相変わらず見いだされ（約５０００ ＳＦＵ／１０６個の脾臓細胞）、８９日目のブースタ投与の１０日後である９９日目に強力なブースト効果があった（約２００００ ＳＦＵ／１０６個の脾臓細胞）（図６２）。２１日目にＶＢ２０６０、ＶＢ２０４９、またはＶＢ２０５９のいずれかをブーストワクチン接種した７日後に２．５ μｇを２回投与することによるＴ細胞応答を比較したとき、ＶＢ２０４９はＶＢ２０６０よりも強い応答を誘導し、ＶＢ２０５９よりも有意に強い応答を誘導した（それぞれ、約３８００対 約２６００ ＳＦＵ／１０６個の細胞 対 約１０００ ＳＦＵ／１０６個の細胞）（図６１Ｂ）。この知見は、ＭＩＰ１αターゲティングユニット（ＶＢ２０４９とＶＢ２０６０）が、そのようなターゲティングユニットを含むＶＢ１０．ＣＯＶ２ワクチンを用いて高レベルのＲＢＤ特異的Ｔ細胞応答を誘導することに関して抗マウスＭＨＣＩＩ ｓｃＦｖターゲティングユニット（ＶＢ２０５９）よりも優れていることを明らかに示している。
ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを、スパイクタンパク質を含有するＤＮＡワクチンＶＢ２０６５とＶＢ２０７１を接種したマウスからの新鮮な脾臓細胞で実施し、ワクチン投与Ｔ細胞応答効果を評価した。予想通り、ＶＢ２０６５とＶＢ２０７１の両方が、抗原がより大きいという理由で、ＶＢ２０４９、ＶＢ２０６０、およびＶＢ２０５９よりも広くて強い全Ｔ細胞応答を誘導した（図６３）。マウスを２８日目、すなわち２１日目のブーストワクチン接種の７日後に安楽死させた。脾臓を回収し、脾臓細胞を単離した後にスパイクペプチドプールで刺激した。ビーズを用いて全脾臓細胞集団の中でＣＤ４細胞とＣＤ８細胞の集団を枯渇させ、特異的な ＣＤ８＋ ＲＢＤ特異的免疫応答とＣＤ４＋ ＲＢＤ特異的免疫応答を評価した。ＶＢ２０６５とＶＢ２０７１の両方ともＣＤ８＋が優位な強力なＴ細胞応答を誘導し、広くてより弱いＣＤ４＋応答が付随していた。
南アフリカウイルスバリアントからの３つの変異を有する長いＲＢＤドメインを含有するＶＢ２１２９の単回のワクチン接種によって誘導される用量に依存した初期Ｔ細胞応答の動態を調べた。１×１．０、６．２５、１２．５、または２５ μｇのＶＢ２１２９の接種によってＴ細胞応答が低用量で早くも７日目に誘導され（６．２５ μｇの用量で１０６個の脾臓細胞につき約５００スポット）、１４日目までに応答が有意に増加した（２５ μｇの用量で１０６個の脾臓細胞につき約２７５０スポット）（図６３Ｂ）。この実験におけるデータは、同様の実験におけるＶＢ２０６０のデータと同等である（図６１）。
実施例７：ＶＢ１０．ＣＯＶ２ ＤＮＡワクチンはマウスにおいてＲＢＤ／スパイクタンパク質に対するＴｈ１応答を優位に誘導する
この研究の目的は、ＶＢ１０．ＣＯＶ２ ＤＮＡワクチンを２回投与した後にマウスで誘導される細胞応答のＴｈ１／２プロファイルを分析することであった。
マウスに２．５ μｇのＶＢ１０．ＣＯＶ２ワクシボディＤＮＡコンストラクトＶＢ２０４９、ＶＢ２０５９、およびＶＢ２０６０を２回、または５０ μｇのＶＢ２０６５とＶＢ２０７１を２回、０日目と２１日目に接種し、初回のワクチン接種の２８日後に安楽死させた。脾臓を無菌で取り出し、すりつぶして脾臓細胞を含む細胞上清を取得した後、１×ＡＣＫバッファを用いて赤血球を除去した。次いで脾臓細胞を洗浄し、播種し（２４ウエルのプレートに１．５×１０６個の細胞／ウエル）、２ μｇ／ｍｌのＲＢＤペプチドプールまたは選択されたスパイクペプチドプールで２４時間刺激した（表３と４）。細胞培養物の上清を回収し、分析してサイトカインの存在を探した。簡単に述べると、ＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘイムノアッセイを供給者（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）のプロトコルに記載されているようにして使用する際に５０μｌの細胞培養物上清を用いた。上清の中にＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、およびＩＬ－１２ｐ７０が存在することが、Ｔｈ１応答であることを明確にした。Ｔｈ２応答は、ＩＬ－４およびＩＬ－５の産生と、部分的にはＩＬ－６の存在を通じて明確にされた。
ワクチンを接種され、ＲＢＤまたはスパイクペプチドのプールで再刺激されたマウスからの脾臓細胞の細胞培養物の上清に含まれるＴｈ１（ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１２）サイトカインとＴｈ２（ＩＬ－４、ＩＬ－５）サイトカインの特徴づけから、ＶＢ２０６０については応答はＩＦＮ－γとＴＮＦ－αが優位であり、微量のＩＬ－６、ＩＬ－１２ ｐ７０、ＩＬ－４、またはＩＬ－５が検出されることがわかった。これは、ワクチン接種の１ヵ月後に特徴づけたときにＴ細胞応答が強力なＴｈ１バイアスを示したのに対し、Ｔｈ２応答はごくわずかであったことを示す。ＶＢ２０４９とＶＢ２０５９については、わずかなＩＬ－６応答が観察され、ＩＬ－１２ ｐ７０、ＩＬ－４、またはＩＬ－５の有意な応答はなかった（図６４Ａ）。
同じパターンがＶＢ２０６５とＶＢ２０７１（スパイク）で観察され、ＩＬ－６が、プールされたペプチド（ペプチド５と６）の１つについてある程度検出された（図６４Ｂ）。
結局、これは、ワクチンによって誘導されるＴｈ１優位の応答と整合する。Ｔｈ１優位の応答は、ワクチンに関連して疾患が増強される可能性を回避する上で好ましい（疾患の増強がいくつかのＳＡＲＳ－ＣｏＶワクチンで観察されたことがあり、Ｔｈ２優位の応答が関与している可能性が大きい）。実施例８：ＶＢ１０．ＣＯＶ２ ＤＮＡワクチンに対するＲＢＤ特異的細胞を媒介とした免疫応答
実施例８：ＶＢ１０．ＣＯＶ２ ＤＮＡワクチンに対するＲＢＤ特異的細胞を媒介とした免疫応答
この研究の目的は、ＶＢ１０．ＣＯＶ２ワクシボディＤＮＡコンストラクトを２回接種したマウスにおけるＴ細胞応答を単一細胞のレベルで評価することであった。マルチフローサイトメトリーを開発し、ＶＢ２０４９またはＶＢ２０６０ ＤＮＡワクチンを接種したマウスにおけるＴ細胞サブセットを評価した。Ｔ細胞は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およびγδ ＴＣＲ細胞系マーカーを用いて明確にした。ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１７、およびＦｏｘＰ３の発現を詳細に分析することで、Tヘルパー（Ｔｈ）１型と２型の応答、Ｔｈ１７、および制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の評価が可能になった。
ＢＡＬＢ／ｃマウスに低用量（２．５ μｇ）、中用量（２５ μｇ）、または高用量（５０ μｇ）いずれかのＶＢ２０４９またはＶＢ２０６０ ＤＮＡワクチンを１回、２回、または３回、表２に記載されているようにして接種した。ワクチンを接種したマウスからの脾臓細胞を以前に記載されているようにして単離した。脾臓細胞をよりも洗浄し、播種し（２４ウエルのプレートに２×１０６個の細胞／ウエル）、２ μｇ／ｍｌのＲＢＤペプチドで１６時間刺激した。フローサイトメトリーでサイトカインを検出するため、インキュベーションの間に１×モネシンと１×ブレフェルジンをウエルに添加した。ＲＢＤペプチドプールで刺激した後、細胞を回収し、洗浄し、生死判別染料で染色した後、細胞外抗体（抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、およびｇｄＴＣＲ）で染色し、固定し、透過処理した後、染色してＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２（評価する場合）、ＩＬ－４、ＩＬ－１７、およびＦｏｘＰ３を検出した。染色した細胞をＢＤ ＦＡＣＳｙｍｐｈｏｎｙ Ａ５の中で走らせ、ＦｌｏｗＪｏソフトウエアを用いて分析した。
ＲＢＤで刺激したマウスの脾臓細胞Ｔ細胞を、死んだ細胞、ダブレット、およびＣＤ３－非Ｔ細胞を除外することによって明確にした（図６５Ａ～Ｄ）。次いでＣＤ３＋ Ｔ細胞を分析してγδＴＣＲ Ｔ細胞の存在を探し、これらの細胞を分析からさらに除外した（図６５Ｅ）。次いでＴ細胞の残りを調べてＣＤ４マーカーとＣＤ８マーカーを探すことで、ＣＤ４＋ Ｔ細胞とＣＤ８＋ Ｔ細胞を明確にした（図６５Ｆ）。両方の集団でＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１７、またはＦｏｘＰ３の個別の発現を調べ、ゲートを設定して陽性細胞を明確にした。これら陽性細胞をＦｌｏｗＪｏソフトウエアの中のブーリアン・ゲーティングアルゴリズムを用いてさらに分析し、各細胞によって産生されるサイトカインの可能なあらゆる組み合わせを計算することで、多機能性Ｔ細胞を単一細胞のレベルで分析できるようにした。
ＶＢ２０６０を接種したマウス（低用量）におけるＴ細胞のフローサイトメトリー分析は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞とＣＤ８＋ Ｔ細胞によるＲＢＤ刺激に対する応答を示した（図６６Ａと６６Ｂ）。ＣＤ４＋ ＲＢＤ特異的Ｔ細胞は、Ｔｈ１応答に典型的なサイトカインプロファイルであるＩＦＮ－γ、ＴＮＦα、またはこれらサイトカインの組み合わせを産生した。他のマーカー（ＩＬ－４（Ｔｈ２分化）、ＩＬ－１７（Ｔｈ１７）、およびＦｏｘＰ３（Ｔｒｅｇ）など）の存在もＣＤ４＋ Ｔ細胞の集団で見られた。ＣＤ８＋ Ｔ細胞の分析から、応答が、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦα、またはこれら２つの組み合わせによって支配されていることがわかった。ＣＤ８＋ Ｔ細胞の小さな集団はＩＬ－１７とＦｏｘＰ３も発現した。ＩＬ－２の発現は調べなかった。
ＶＢ２０４９を接種したマウス（低用量）におけるＲＢＤ特異的Ｔ細胞の同じ分析から、ＣＤ４＋ Ｔ細胞とＣＤ８＋ Ｔ細胞の応答がわかった（図６６Ｃと６６Ｄ）。ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、またはこれら２つのサイトカインの組み合わせを発現した。ＣＤ４＋ Ｔ細胞の一部は、Ｔｈ２細胞サイトカインであるＩＬ－４と、Ｔｈ１７サイトカインであるＩＬ－１７も発現したため、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、およびＴｒｅｇ応答が混合していることが明らかになった。しかしＣＤ８＋ Ｔ細胞応答はＩＦＮ－γとＴＮＦ－αの組み合わせ産生によって支配されていた一方で、ＲＢＤ特異的細胞の残りはこれらサイトカインの１つを産生した。
したがってＶＢ１０．ＣＯＶ２を接種したマウス（低用量）におけるＲＢＤ特異的ＣＤ４＋ Ｔ細胞の分析から、Ｔｈ１応答（組み合わされたＩＦＮ－γ／ＴＮＦα産生によって定義される）と、Ｔｈ２応答、Ｔｈ１７応答、およびＴｒｅｇ応答の混合がわかった。ＣＤ８＋ Ｔ細胞はＩＦＮ－γとＴＮＦαの存在に支配されていた。これは、ＶＢ１０．ＣＯＶ２がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導することを示す。
ＶＢ２０６０（中用量と高用量）を接種したマウスにおけるＴ細胞応答の持続性を調べるため、脾臓細胞を９０日目に分析した。用量に依存した応答が観察され、それは、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦα、ＩＬ－２、またはこれらサイトカインの組み合わせを産生する多機能性ＣＤ４＋ Ｔ細胞によって支配されていた（図６７）。ＣＤ４＋ Ｔ細胞の小さな集団だけがＩＬ－１７を産生した。同様に、ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答も用量依存性であり、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦαによって支配されていた（図６８）。これらの結果から、低用量のＶＢ２０６０を接種したマウスにおける最初の知見、すなわちＶＢ２０６０ ＤＮＡワクチンの接種が、Ｔｈ１とＴｈ１７ Ｔ細胞応答の組み合わせと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導することが確認された。これらの結果は、Ｔ細胞に対する用量に依存した効果が最初のワクチン接種後の９０日間にわたって持続することを示している。
マウスに８９日目にブーストワクチンを接種した後、Ｔ細胞応答を９９日目に分析した。ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、以前に観察されたようにＩＦＮ－γとＴＮＦαを産生した。これらの細胞はＩＬ－２の産生量も増加させたため、Ｔ細胞の生存と増殖を示している。ＣＤ４＋ Ｔ細胞の一部はＩＬ－１７も産生する（図６９）。ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答は、以前の知見と同様、ＩＦＮ－γと、ある程度ＴＮＦαによって支配されていた（図７０）。結論として、これらのデータは、ＶＢ２０６０ ＤＮＡワクチンが持続可能なＴｈ１、Ｔｈ１７、および細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導し、それが少なくとも１００日間継続することを示している。
それに加え、流入領域リンパ節における初期Ｔ細胞応答を最初にワクチンを接種してから７日目と２８日目に、すなわちワクチン接種の７日後とブーストワクチン接種の７日後に評価した。流入領域リンパ節からの細胞をＲＢＤペプチドで刺激した後、多色フローサイトメトリーを利用して分析した。ＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞と、常在メモリＴ細胞（Ｔｒｍ）と呼ばれるＣＤ８＋ Ｔ細胞のサブセットを評価した。活性化状態と応答のタイプを評価するため、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、およびグランザイムＢの発現を分析した（図７１と図７２）。
ワクチン接種の７日後、２５ μｇのＶＢ２０６０を接種したマウスを分析し、対照群（ＰＢＳ）と比較した。グランザイムＢの存在によって明確にされる強力なＣＤ８ Ｔ細胞応答が観察された。ＣＤ８ Ｔ細胞のＴｒｍサブセットはＩＦＮ－γだけ、またはグランザイムＢとの組み合わせを主に発現したため、ＲＢＤペプチドに対する細胞傷害性応答を示している（図７１Ａ～Ｃ）。同じ時点で、ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、またはこれら２つのサイトカインの組み合わせを産生した。
ブーストワクチン接種の７日後、３．０ μｇ、６．２５ μｇ、１２．５ μｇ、および２５ μｇのＶＢ２０６０を接種したマウスにおけるＴ細胞応答を評価した。この分析から、用量に依存した強力なＣＤ８＋ Ｔ細胞応答に、グランザイムＢ、ＴＮＦ－α ＩＦＮ－γ、またはこれらの組み合わせの産生が伴うことが明らかになった。同様の結果が常在メモリＴ細胞で観察された（図７１ＥとＦ）；それに加え、このサブセットはブーストワクチン接種の後にリンパ節の中で増加した（図７２Ｂ）。ブーストワクチン接種の後、ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、またはこれらサイトカインの組み合わせを用量に依存して産生した。
これらのデータは、合わせて考えると、細胞傷害性Ｔ細胞に支配される強力な用量依存性のＴ細胞応答と、それに付随するＴｈ１分化ＣＤ４＋ Ｔ細胞を示している。
実施例９：予測されるＴ細胞エピトープに対してＶＢ２０４８ ＤＮＡワクチン接種によって誘導される特異的細胞応答
この研究の目的は、ＶＢ２０４８ ＤＮＡワクチンを接種したマウスからの脾臓細胞において、予測されるＴ細胞エピトープに対する細胞性免疫応答を、用量と投与回数の関数として評価することであった。
ワクチンを接種したマウスからの脾臓細胞を、予測されるエピトープ特異的細胞応答を検出するＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで分析した。簡単に述べると、マウスを１４日目または２８日目に安楽死させ、脾臓を無菌で回収した。脾臓をすりつぶし、細胞懸濁液を１×ＡＣＫバッファとともにインキュベートし、洗浄し、再懸濁させて６×１０５個の細胞という細胞濃度にした。さらに、細胞を三連で播種し（６×１０５個の細胞／ウエル）、２ μｇ／ｍｌの個々のペプチド（ＶＢ２０４８に含まれるＴ細胞エピトープ）で２４時間刺激した。ペプチド刺激なしを陰性対照として使用した。刺激された脾臓細胞を、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔ Ｐｌｕｓキット（Ｍａｂｔｅｃｈ ＡＢ、スウェーデン国）を用いて分析してＩＦＮ－γ応答を探した。スポットを形成する細胞は、Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙからのＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ ５．０．３というＣＴＬ ＥＬＩＳｐｏｔリーダーで測定した。結果は、ＩＦＮ－γ＋スポットの平均数／１０６個の脾臓細胞として示される。
複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株からの予測されるエピトープに対する強力なＴ細胞応答を、２．５ μｇまたは２５ μｇのＶＢ２０４８ ＤＮＡワクチンのいずれかを１回または２回接種したマウスからの脾臓で検出した。応答は、用量レベルと投与回数に応じ、最初の投与から２週間後、または２１日目のブースト－ワクチン接種から１週間後に採取した脾臓細胞において１０６個の細胞につき約１５００～２２００ ＳＦＣの範囲であった。応答は低用量（２．５μｇのＤＮＡ）でさえ最初の投与から１４日後にすでに強力であり、２１日目に高用量（２５ μｇ）で第２のワクチンを接種した後の２８日目に増強された（図７３）。
ＣＤ４細胞またはＣＤ８細胞の集団のいずれかが枯渇した脾臓細胞において、１つの優位なペプチド（ｐｅｐ０８）に対する強力で（約２２００ ＳＦＵまで／１０６個の細胞）ＣＤ８＋が優位なＴ細胞応答が観察される（図７４）。Ｔ細胞エピトープ特異的ＣＤ４＋応答も２つの予測されるペプチド（ｐｅｐ０２とｐｅｐ１８）に対して検出されたが、大きさはより小さかった（約４６０ ＳＦＵまで／１０６個の細胞）。
実施例１０：Ｔ細胞エピトープと長いＲＢＤドメインの両方を含有するコンストラクトを用いたＤＮＡワクチン接種による、予測されるＴ細胞エピトープとＲＢＤの両方に対する特異的細胞応答の誘導
この研究の目的は、Ｔ細胞エピトープと長いＲＢＤドメインの両方を含有するＶＢ１０．ＣＯＶ２ ＤＮＡワクチンを接種したマウスからの脾臓細胞において予測されるＴ細胞エピトープとＲＢＤドメインの両方に対する細胞性免疫応答を評価することであった。
ワクチンを接種したマウスからの脾臓細胞を、予測されるエピトープとＲＢＤ特異的細胞応答を検出するＩＦＮ－γ ＬＩＳｐｏｔアッセイで分析した。簡単に述べると、マウスを１４日目に安楽死させ、脾臓を無菌で回収した。脾臓をすりつぶし、細胞懸濁液を１×ＡＣＫバッファとともにインキュベートし、洗浄し、再懸濁させて６×１０５個の細胞という細胞濃度にした。さらに、細胞を三連で播種し（６×１０５個の細胞／ウエル）、２ μｇ／ｍｌの個々のペプチド（各コンストラクトに含まれるＴ細胞エピトープ）と２ μｇ／ｍｌのＲＢＤペプチドプール（表３）で２４時間刺激した。ペプチド刺激なしを陰性対照として使用した。刺激された脾臓細胞を、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔ Ｐｌｕｓキット（Ｍａｂｔｅｃｈ ＡＢ、スウェーデン国）を用いて分析してＩＦＮ－γ応答を探した。スポット形成細胞をＣｅｌｌｕｌａｒ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙからのＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ ５．０．３というＣＴＬ ＥＬＩＳｐｏｔリーダーで測定した。結果は、ＩＦＮ－γ＋スポットの平均数／１０６個の脾臓細胞として示される。
複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株からの予測されるエピトープに対する強力なＴ細胞応答が、１つまたは３つの予測されるＴ細胞エピトープのいずれかを含有する２５ μｇのコンストラクトを１回接種したマウスからの脾臓で１４日目に検出された。ＶＢ２０９７（３つのエピトープ＋ＧＳＡＴリンカー）は、他のリンカーを持っていて３つのエピトープを含む他のコンストラクトよりも強いＴ細胞特異的応答（１０６個の細胞につき約１２５０ ＳＦＣ）を誘導した。それに加え、すべてのコンストラクトが強力なＲＢＤ特異的細胞応答も誘導することができた。ＶＢ２０９７とＶＢ２０８７はＲＢＤに対する最強の応答を誘導し、ＶＢ２０６０に対するのと同様のレベルであった（図７５）。
実施例１１：２つのＶＢ１０．ＣＯＶ２コンストラクトを含有するワクチンを用いたワクチン接種による、予測されるＴ細胞エピトープとＲＢＤの両方に対する特異的細胞応答の誘導
この研究の目的は、２つのプラスミドＶＢ２０４８（２０個のＴ細胞エピトープ）とＶＢ２０４９（短いＲＢＤドメイン）をそれぞれ１２．５ μｇ含むＶＢ１０．ＣＯＶ２ ＤＮＡワクチンを接種したマウスからの脾臓細胞において、予測されるＴ細胞エピトープとＲＢＤドメインの両方に対する細胞性免疫応答を評価することであった。
ワクチンを接種したマウスからの脾臓細胞を、予測されるエピトープとＲＢＤ特異的細胞応答を検出するＩＦＮ－γ ＬＩＳｐｏｔアッセイで分析した。簡単に述べると、マウスを１４日目に安楽死させ、脾臓を無菌で回収した。脾臓をすりつぶし、細胞懸濁液を１×ＡＣＫバッファとともにインキュベートし、洗浄し、再懸濁させて６×１０５個の細胞という細胞濃度にした。さらに、細胞を三連で播種し（６×１０５個の細胞／ウエル）、２ μｇ／ｍｌの２０個の個別のペプチドと、２ μｇ／ｍｌのＲＢＤペプチドプール（表３）で２４時間刺激した。ペプチド刺激なしを陰性対照として使用した。刺激された脾臓細胞を、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔ Ｐｌｕｓキット（Ｍａｂｔｅｃｈ ＡＢ、スウェーデン国）を用いて分析してＩＦＮ－γ応答を探した。スポット形成細胞をＣｅｌｌｕｌａｒ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙからのＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ ５．０．３というＣＴＬ ＥＬＩＳｐｏｔリーダーで測定した。結果は、ＩＦＮ－γ ＋スポットの平均数／１０６個の脾臓細胞として示される。
複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株からの予測されるエピトープに対する強力なＴ細胞応答が、薬学的に許容可能な担体と１２．５ μｇの各プラスミド（ＶＢ２０４８とＶＢ２０４９）を含むワクチンを１回接種したマウスからの脾臓において１４日目に検出された。それに加え、このワクチンは強力なＲＢＤ特異的細胞応答も誘導することができた。マウスに上記のワクチンを接種したとき、予測されるＴ細胞エピトープとＲＢＤドメインの両方に対する全免疫応答は、用量を考慮すると、マウスにいずれかのコンストラクト（すなわちＶＢ２０４８またはＶＣＢ２０４９）を含有するワクチンを接種したときと同様であった（図７６）。
実施例１２：ＶＢ１０．ＣＯＶ２ ＤＮＡワクチンＶＢ２０６０の安定性データ
この研究の目的は、ＶＢ１０．ＣＯＶ２ ＤＮＡワクチンＶＢ２０６０を上昇した温度（３７℃）で４週間まで保管した後、安定性を示すパラメータとしての％超螺旋ＤＮＡ含量を求めることであった。
ＶＢ２０６０プラスミドの殺菌溶液（Ｄ－ＰＢＳの中に３ ｍｇ／ｍｌの製剤）０．５ ｍｌを２ ｍｌの透明なタイプＩガラス製バイアル（Ａｄｅｌｐｈｉ／Ｓｃｈｏｔｔ、ＶＣＤＩＮ２Ｒ）に満たし、１３ ｍｍ ＦｌｕｒｏＴｅｃ（登録商標）注入ストッパ（Ａｄｅｌｐｈｉ／Ｗｅｓｔ、７００１－８０２１／ＩＮＪ１３ＴＢ３ＷＲＳ）で封止し、１３ｍｍの白色のＦｌｉｐ－ｏｆｆオーバーシール（Ａｄｅｌｐｈｉ／Ｗｅｓｔ、５９２１－９８２６／ＦＯＴ１３Ｗ５１１７）を被せた。バイアルを直立でインキュベータの中に３７℃で４週間保管した。研究開始時と研究中の毎週、バイアルでＨＰＬＣによってプラスミドの立体形態を調べた。ＨＰＬＣ法は、カラムＴＳＫゲルＤＮＡ－ＮＰＲ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ／Ｙ００６４）を用い、移動相Ａ；２．４ ＴＲＩＳ－Ｂａｓを含む１０００ ｍｌの水（ＨＣｌによってｐＨを調節してｐＨ ９にした）と、移動相Ｂ；２９．２２ ｇのＮａＣｌを含む５００ ｍｌの移動相Ａを０．７５ ｍｌ／分の流速にして実施した。カラムの温度は５℃であり、サンプル注入体積は１．５ μｌであった。立体形態は、プラスミドＤＮＡの安定性を示す最も敏感なパラメータであることが知られている。
研究開始時のプラスミドＶＢ２０６０の超螺旋化度は約９０％であることが判明した。１週間後、超螺旋化度は約８０％まで低下していた。その後の数週間でプラスミドの立体形態は実質的に変化せず、さらにわずかに分解しただけであった。これは、ＶＢ１０．ＣＯＶ２ ＤＮＡワクチンＶＢ２０６０が上昇した温度で保管するときでさえ、非常に安定であることを示す。
実施例のまとめ：
一例としてＶＢ２０６０を使用し、二量体分子が形成されることを示してある（実施例３ｂ）。例としてＶＢ２０６０、ＶＢ２１２９、およびＶＢ２１３２を使用し、単量体タンパク質は、いくつかのＲＢＤユニットをそのタンパク質に付加することから出発しているため、それら単量体タンパク質コンストラクトのサイズから予測される分子量を有することも示してある（実施例３ｂ）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤの短い形態（ＶＢ２０４９）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのより長いバージョン（ＶＢ２０６０）、南アフリカバリアントＢ．１．３５１に見られる３つの変異（ＶＢ２１２９）とスパイクタンパク質（ＶＢ２０６５とＶＢ２０７１）を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのより長いバージョンを含む抗原ユニットを含むワクシボディを用いて抗ＲＢＤ ＩｇＧの形成を誘導することを示してある（実施例４）。予測されるＴ細胞エピトープをコンストラクト（ＶＢ２０８１、ＶＢ２０８２、ＶＢ２０８７、ＶＢ２０９７、およびＶＢ２０９９）に付加するときにこの応答が変化しないことを示してある。したがってＲＢＤタンパク質に対する翻訳後修飾（グリコシル化や、液性応答を誘導するのに必要なその正しい折り畳みなどは、さらなるアミノ酸の付加による影響を受けない（実施例４）。ワクシボディによって生じた抗体が生存ウイルスマイクロ中和アッセイで有効であることを示してある（実施例５）。
生じた抗体に加え、細胞傷害性Ｔ細胞応答が、ＲＢＤユニットを含有するコンストラクトと、南アフリカＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスバリアントからの３つの変異を有するＲＢＤユニットとを含有するコンストラクトにより、ＲＢＤタンパク質に対して誘導されることを示してある。この応答は迅速であり（わずか７日後）、長く持続する（実施例６）。スパイクタンパク質に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答も生じさせている（実施例６）。大半のＴ細胞応答はＴｈ１を媒介とする（実施例７）。
したがって１回だけのワクチンで、ベータコロナウイルスの感染症に対する免疫を得るのに必要とされるＢ細胞応答を得ることができるだけでなく、既存の感染症を攻撃して患者の回復を助けるＴ細胞も得られる。
われわれはベータコロナウイルスからＴ細胞エピトープを予測する方法を開発したため、それを実施例１に示してある。それらＴ細胞エピトープが強力なＴ細胞応答を誘導することを示してある（実施例９）。予測されるＴ細胞エピトープを含むコンストラクトのプラスミドを、ＲＢＤユニットを含むコンストラクトのプラスミドと同時に投与するとき、Ｔ細胞応答はそれぞれのプラスミドだけによって誘導される応答と同様であることがわかる（実施例１１）。これらの予測されるＴ細胞エピトープは、同じコンストラクトの中でＲＢＤユニットと組み合わせるとき、Ｔ細胞特異的応答を相変わらず生じさせつつ、ＲＢＤユニットのＴ細胞特異的応答が維持される（実施例１０）。
実施した実験からの結論
実施例３～１２からの１つの結論として、ＥＬＩＳＡによって検出されたように、発現レベルは、さまざまなＶＢ１０．ＣＯＶ２コンストラクトの間で分子構造に応じて高発現、中発現、および低発現というように異なることが見いだされた。
ＶＢ１０．ＣＯＶ２ワクチンは、マウスにおいて１回だけのワクチン投与により迅速で用量に依存したＲＢＤ ＩｇＧ抗体応答を誘導し、それが少なくとも３ヶ月後まで持続した。ＶＢ２０６０では、生きているウイルスに対する中和抗体の力価が、１回投与した７日後から検出された。調べたすべての投与計画で、ヒトＣＯＶＩＤ－１９回復患者からの血清よりも大きいか同等な力価に２８日目から到達した。強力なＴ細胞応答がＶＢ２０６０とＶＢ２１２９では７日目にすでに確立されて検出され、その後、ＶＢ２０４９とＶＢ２０６０は多機能性のＣＤ８＋ Ｔ細胞とＴｈ１が優位なＣＤ４＋ Ｔ細胞であると特徴づけられた。応答は１回だけワクチンを接種してから少なくとも３ヶ月後まで高レベルに維持され、８９日目の第２のワクチン接種によってさらに強く増強された。
ＭＩＰ１αターゲティングは、ＶＢ１０．ＣＯＶ２ワクチンを用いてより強い抗ＲＢＤ ＩｇＧ応答とより高いレベルのＲＢＤ特異的Ｔ細胞応答の両方を誘導することに関して抗マウスＭＨＣＩＩ ｓｃＦｖターゲティングよりも優れていた。
ＳＡＲＳ－ＣＯＶ２ゲノムから予測されるＴ細胞エピトープに対する特異的Ｔ細胞応答に加えて強力なＲＢＤ特異的抗体応答とＴ細胞応答の両方を誘導することが、２つの異なる戦略で実現可能であることも示された。１つの成功する戦略は、１つのＶＢ１０．ＣＯＶ２コンストラクトに含まれる抗原ユニットの中で、予測されるＴ細胞エピトープをＲＢＤドメインと組み合わせることであり、別のうまくいく戦略は、２つの別々のプラスミドの組み合わせ（一方のプラスミドは予測されたＴ細胞エピトープを含有し、もう一方のプラスミドは抗原ユニットの中にＲＢＤドメインを含有する）を含む１つのワクチン溶液を接種するというものである。
これらの知見は、上昇した温度でさえ投与が簡単で安定に保管されることと合わせて考えると、ＶＢ１０．ＣＯＶ２ ＤＮＡワクチンがＣｏｖｉｄ－１９の予防と治療のための有望な将来の候補であることを示唆する。
実施形態Ａ
１．免疫学的に有効な量の
（ｉ）ターゲティングユニット、二量体化ユニット、および抗原ユニット（この抗原ユニットは少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープを含む）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；または
（ｉｉ）（ｉ）で規定されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または
（ｉｉｉ）（ｉ）で規定されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド２つからなる二量体タンパク質と；
薬学的に許容可能な担体を含むワクチン。
２．個人に投与されるとＢ細胞による抗体の生成を通じて液性応答を誘導する、実施形態Ａ１によるワクチン。
３．個人に投与されるとＴ細胞による抗体の生成を通じて液性応答を誘導する、実施形態Ａ１によるワクチン。
４．個人に投与されると液性かつ細胞性の免疫応答を誘導する、実施形態Ａ１によるワクチン。
５．前記個人がベータコロナウイルス感染症に罹患しており、前記ワクチンが治療用ワクチンである、実施形態Ａ２～Ａ４のいずれか１つによるワクチン。
６．前記個人が健康な個人であり、前記ワクチンが予防用ワクチンである、実施形態Ａ２～Ａ４のいずれか１つによるワクチン。
７．前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープがベータコロナウイルスの完全長ウイルス表面タンパク質またはその一部である、実施形態Ａ１～Ａ６のいずれか１つによるワクチン。
８．前記ウイルス表面タンパク質が、エンベロープタンパク質、スパイクタンパク質、膜タンパク質、およびヘマグルチニンエステラーゼからなる群から選択される、実施形態Ａ７によるワクチン。
９．前記ウイルス表面タンパク質が前記スパイクタンパク質である、実施形態Ａ７～Ａ８のいずれか１つによるワクチン。
１０．前記ウイルス表面タンパク質が前記完全長スパイクタンパク質である、実施形態Ａ７～Ａ９のいずれか１つによるワクチン。
１１．前記ウイルス表面タンパク質が前記スパイクタンパク質の一部である、実施形態Ａ７～Ａ１０のいずれか１つによるワクチン。
１２．前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、ｈｅｐｔａｄ ｒｅｐｅａｔ１（ＨＲ１）ドメイン、およびｈｅｐｔａｄ ｒｅｐｅａｔ２（ＨＲ２）ドメインからなる群から選択される前記スパイクタンパク質の一部である、実施形態Ａ７～Ａ１１のいずれか１つによるワクチン。
１３．前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが前記ＲＢＤである、実施形態Ａ７～Ａ１２のいずれか１つによるワクチン。
１４．前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが前記ＨＲ１ドメインまたは前記ＨＲ２ドメインであり、前記ＨＲ２ドメインであることが好ましい、実施形態Ａ７～Ａ１２のいずれか１つによるワクチン。
１５．前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが、前記ウイルス表面タンパク質またはその一部に含まれるＢ細胞エピトープである、実施形態Ａ７～Ａ１４のいずれか１つによるワクチン。
１６．前記抗原ユニットが、前記ウイルス表面タンパク質またはその一部に含まれる複数のＢ細胞エピトープを含む、実施形態Ａ７～Ａ１５のいずれか１つによるワクチン。
１７．前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープがＴ細胞エピトープである、実施形態Ａ１～Ａ６のいずれか１つによるワクチン。
１８．前記Ｔ細胞エピトープが異なる種および／または異なる株のベータコロナウイルスの間で保存されている、実施形態Ａ１７によるワクチン。
１９．前記Ｔ細胞エピトープがＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２とＳＡＲＳ－ＣｏＶの間で保存されている、実施形態Ａ１７またはＡ１８によるワクチン。
２０．前記Ｔ細胞エピトープがＨＬＡクラスＩ／ＩＩアレルによる提示に適した長さを持ち、好ましくは７～３０個のアミノ酸の長さを有する、実施形態Ａ１７～Ａ１９のいずれか１つによるワクチン。
２１．前記Ｔ細胞エピトープが、ＨＬＡクラスＩ／ＩＩアレルへの結合に関して予測される能力に基づいて選択される、実施形態Ａ１７～Ａ２０のいずれか１つによるワクチン。
２２．前記抗原ユニットが、複数のＴ細胞エピトープ、好ましくはＨＬＡクラスＩ／ＩＩアレルに結合することが予測される複数のＴ細胞エピトープを含む、実施形態Ａ１７～Ａ２１のいずれか１つによるワクチン。
２３．前記Ｔ細胞エピトープが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２３からなるリストから選択される、実施形態Ａ１７～Ａ２２のいずれか１つによるワクチン。
２４．前記Ｔ細胞エピトープが、配列番号６７、配列番号１９、配列番号７８、配列番号５７、配列番号５０、配列番号５５、配列番号６４、配列番号２２、配列番号８７、配列番号６２、配列番号３９、配列番号５９、配列番号２６、配列番号５３、配列番号３２、配列番号３８、配列番号３０、配列番号４０、配列番号４２、配列番号３５、配列番号７１、配列番号９、配列番号２１、配列番号８５、配列番号７５、配列番号２３、配列番号３４、配列番号３６、配列番号７７、および配列番号２０からなるリストから選択される、実施形態Ａ１７～Ａ２３のいずれか１つによるワクチン。
２５．前記Ｔ細胞エピトープが、配列番号６７、配列番号１９、配列番号７８、配列番号５７、配列番号５０、配列番号５５、配列番号６４、配列番号２２、配列番号８７、および配列番号６２からなるリストから選択される、実施形態Ａ１７～Ａ２４のいずれか１つによるワクチン。
２６．前記抗原ユニットが複数のＴ細胞エピトープを含む、実施形態Ａ１７～Ａ２５のいずれか１つによるワクチン。
２７．前記抗原ユニットがベータコロナウイルスの完全長ウイルス表面タンパク質またはその一部を含む、実施形態Ａ１７～Ａ２６のいずれか１つによるワクチン。
２８．前記ウイルス表面タンパク質が、エンベロープタンパク質、スパイクタンパク質、膜タンパク質、およびヘマグルチニンエステラーゼからなる群から選択される、実施形態Ａ２７によるワクチン。
２９．前記ウイルス表面タンパク質が前記スパイクタンパク質である、実施形態Ａ２７またはＡ２８によるワクチン。
３０．前記ウイルス表面タンパク質が前記完全長スパイクタンパク質である、実施形態Ａ２７～Ａ２９のいずれか１つによるワクチン。
３１．前記ウイルス表面タンパク質が前記スパイクタンパク質の一部である、実施形態Ａ２７～Ａ３０のいずれか１つによるワクチン。
３２．前記抗原ユニットが、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、ｈｅｐｔａｄ ｒｅｐｅａｔ１（ＨＲ１）ドメイン、およびｈｅｐｔａｄ ｒｅｐｅａｔ２（ＨＲ２）ドメインからなる群から選択される前記スパイクタンパク質の一部をさらに含む、実施形態Ａ２７～Ａ３１のいずれか１つによるワクチン。
３３．前記抗原ユニットが前記ＲＢＤをさらに含む、実施形態Ａ２７～Ａ３２のいずれか１つによるワクチン。
３４．前記抗原ユニットが、前記ＨＲ１ドメインまたは前記ＨＲ２ドメイン、好ましくは前記ＨＲ２ドメインをさらに含む、実施形態Ａ２７～Ａ３３のいずれか１つによるワクチン。
３５．前記抗原ユニットが、前記ウイルス表面タンパク質またはその一部に含まれるＢ細胞エピトープをさらに含む、実施形態Ａ２７～Ａ３４のいずれか１つによるワクチン。
３６．前記抗原ユニットが、前記ウイルス表面タンパク質またはその一部に含まれる複数のＢ細胞エピトープをさらに含む、実施形態Ａ２７～Ａ３５のいずれか１つによるワクチン。
３７．前記抗原ユニットが、２１～２０００個のアミノ酸、好ましくは約３０個のアミノ酸～約１５００個のアミノ酸、より好ましくは約５０～約１０００個のアミノ酸、例えば約１００～約５００個のアミノ酸、または約１００～約４００個のアミノ酸、または約１００～約３００個のアミノ酸を含む、実施形態Ａ１～Ａ３６のいずれか１つによるワクチン。
３８．前記抗原ユニットが、１つ以上のリンカー、好ましくは１つ以上の非免疫原性および／または可動性リンカーを含む、実施形態Ａ１～Ａ３７のいずれか１つによるワクチン。
３９．前記抗原ユニットが１０、２０、３０、または５０個のエピトープ、好ましくはＴ細胞エピトープを含む、実施形態Ａ１～Ａ３８のいずれか１つによるワクチン。
４０．前記ターゲティングユニットが、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の表面受容体、好ましくはＣＤ１４、ＣＤ４０、Ｔｏｌｌ様受容体、ＣＣＲ１、ＣＣＲ３、ＣＣＲ５、ＭＨＣクラスＩタンパク質、またはＭＨＣクラスＩＩタンパク質に対する特異性を有する抗体結合領域を含む、実施形態Ａ１～Ａ３９のいずれか１つによるワクチン。
４１．前記ターゲティングユニットが、ＣＣＲ１、ＣＣＲ３、およびＣＣＲ５から選択されるケモカイン受容体に対する親和性を有する、実施形態Ａ１～Ａ４０のいずれか１つによるワクチン。
４２．前記ターゲティングユニットが、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質、好ましくは抗ＨＬＡ－ＤＰ、抗ＨＬＡ－ＤＲ、および抗ｐａｎ ＨＬＡクラスＩＩからなる群から選択されるＭＨＣクラスＩＩタンパク質に対する親和性、実施形態Ａ１～Ａ４１のいずれか１つによるワクチン。
４３．前記ターゲティングユニットが抗ｐａｎ ＨＬＡクラスＩＩとＭＩＰ－１αから選択される、実施形態Ａ１～Ａ４２のいずれか１つによるワクチン。
４４．前記ターゲティングユニットがＭＩＰ－１αである、実施形態Ａ１～Ａ４３のいずれか１つによるワクチン。
４５．前記ターゲティングユニットが抗ｐａｎ ＨＬＡクラスＩＩである、実施形態Ａ１～Ａ４４のいずれか１つによるワクチン。
４６．前記二量体化ユニットが、ヒンジ領域と、場合により、二量体化を容易にする別のドメインを含み、両者が場合によりリンカーを介して接続されている、実施形態Ａ１～Ａ４５のいずれか１つによるワクチン。
４７．前記ポリヌクレオチドがシグナルペプチドをさらにコードする、実施形態Ａ１～Ａ４６のいずれか１つによるワクチン。
４８．前記ペプチドの中の前記ターゲティングユニット、前記二量体化ユニット、および前記抗原ユニットが、Ｎ末端からＣ末端に向かい、ターゲティングユニット、二量体化ユニット、および抗原ユニットの順番である、実施形態Ａ１～Ａ４７のいずれか１つによるワクチン。
４９．前記ベータコロナウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、およびＨＣｏＶ－ＨＫＵ１からなる群から選択される１つ、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶとＳＡＲＳ－ＣｏＶ２からなる群から選択される１つである、実施形態Ａ１～Ａ４８のいずれか１つによるワクチン。
５０．実施形態Ａ１～Ａ４９のいずれか１つに規定されているポリヌクレオチド。
５１．実施形態Ａ５０によるポリヌクレオチドを含むベクター。
５２．実施形態Ａ５０によるポリヌクレオチドを含むか、実施形態Ａ５１によるベクターを含む宿主細胞。
５３．個人に投与するために製剤化された、実施形態Ａ５０によるポリヌクレオチド。
５４．実施形態Ａ５０によるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド。
５５．実施形態Ａ５４によるポリペプチド２つからなる二量体タンパク質。
５６．ホモ二量体タンパク質である、実施形態Ａ５５による二量体タンパク質。
５７．薬として使用するための、実施形態Ａ５０によるポリヌクレオチド、または実施形態５３によるポリペプチド、または実施形態Ａ５５またはＡ５６のいずれか１つによる二量体タンパク質。
５８．ベータコロナウイルスの感染症の治療に使用するための、またはベータコロナウイルス感染症の予防に使用するための、実施形態Ａ５０によるポリヌクレオチド、または実施形態Ａ５４によるポリペプチド、または実施形態Ａ５５またはＡ５６のいずれか１つによる二量体タンパク質。
５９．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、またはＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の感染症の治療に使用するための、または予防に使用するための、実施形態Ａ５０によるポリヌクレオチド、または実施形態Ａ５４によるポリペプチド、または実施形態Ａ５５またはＡ５６のいずれか１つによる二量体タンパク質。
６０．実施形態Ａ１～Ａ４９のいずれか１つによるワクチンを調製する方法であって、
ａ）実施形態Ａ１～Ａ４９のいずれか１つに規定されたポリヌクレオチドを細胞にトランスフェクトする工程；
ｂ）前記細胞を培養する工程；
ｃ）前記細胞から発現した前記二量体タンパク質または前記ポリペプチドを回収して精製する工程；および
ｄ）工程ｃ）から得られた前記二量体タンパク質または前記ポリペプチドを薬学的に許容可能な前記担体と混合する工程を含む方法。
６１．配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２３からなるリストからのアミノ酸配列を含むポリペプチド。
６２．配列番号６７、配列番号１９、配列番号７８、配列番号５７、配列番号５０、配列番号５５、配列番号６４、配列番号２２、配列番号８７、配列番号６２、配列番号３９、配列番号５９、配列番号２６、配列番号５３、配列番号３２、配列番号３８、配列番号３０、配列番号４０、配列番号４２、配列番号３５、配列番号７１、配列番号９、配列番号２１、配列番号８５、配列番号７５、配列番号２３、配列番号３４、配列番号３６、配列番号７７、および配列番号２０からなるリストからのアミノ酸配列を含むポリペプチド。
６３．配列番号６７、配列番号１９、配列番号７８、配列番号５７、配列番号５０、配列番号５５、配列番号６４、配列番号２２、配列番号８７、および配列番号６２からなるリストからのアミノ酸配列を含むポリペプチド。
実施形態Ｂ
１．免疫学的に有効な量の
（ｉ）ターゲティングユニット、二量体化ユニット、および抗原ユニット（この抗原ユニットは少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープを含む）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；または
（ｉｉ）（ｉ）で規定されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または
（ｉｉｉ）（ｉ）で規定されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド２つからなる二量体タンパク質と；
薬学的に許容可能な担体を含むワクチン。
２．前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが、ベータコロナウイルスの完全長ウイルス表面タンパク質またはその一部である、実施形態Ｂ１によるワクチン。
３．前記ウイルス表面タンパク質が、エンベロープタンパク質、スパイクタンパク質、膜タンパク質、およびヘマグルチニンエステラーゼからなる群から選択される、実施形態Ｂ２によるワクチン。
４．前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが前記スパイクタンパク質を含むか前記スパイクタンパク質である、実施形態Ｂ２～Ｂ３のいずれか１つによるワクチン。
５．前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが前記完全長スパイクタンパク質を含むか前記完全長スパイクタンパク質である、実施形態Ｂ２～Ｂ４のいずれか１つによるワクチン。
６．前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが、配列番号２３０のアミノ酸配列と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列、または例えば１００％一致する配列を有するアミノ酸配列を含むかそのアミノ酸配列からなる、実施形態Ｂ５によるワクチン。
７．前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが、配列番号２７５のアミノ酸配列２４３～１４３７と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列、または例えば１００％一致する配列を有するアミノ酸配列を含むかそのアミノ酸配列からなる、実施形態Ｂ５によるワクチン。
８．前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが前記スパイクタンパク質の一部を含むか前記スパイクタンパク質の一部である、実施形態Ｂ２～Ｂ４のいずれか１つによるワクチン。
９．前記スパイクタンパク質の前記一部が、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、ｈｅｐｔａｄ ｒｅｐｅａｔ１（ＨＲ１）ドメイン、およびｈｅｐｔａｄ ｒｅｐｅａｔ２（ＨＲ２）ドメインからなる群から選択される１つである、実施形態Ｂ８によるワクチン。
１０．前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが前記ＲＢＤまたは前記ＲＢＤの一部を含むか、前記ＲＢＤまたは前記ＲＢＤの一部である、実施形態Ｂ９によるワクチン。
１１．前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが、配列番号２３１または配列番号８０２、または配列番号８０３または配列番号８０４または配列番号８０５のアミノ酸配列と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列、または例えば１００％一致する配列を有するアミノ酸配列を含むかそのアミノ酸配列からなる、実施形態Ｂ１０によるワクチン。
１２．前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが、配列番号２５５のアミノ酸配列２４３～４６５と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列、または例えば１００％一致する配列を有するアミノ酸配列を含むかそのアミノ酸配列からなる、実施形態Ｂ１０によるワクチン。
１３．前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが、配列番号２４６のアミノ酸配列と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列、または例えば１００％一致する配列を有するアミノ酸配列を含むかそのアミノ酸配列からなる、実施形態Ｂ１０によるワクチン。
１４．前記抗原ユニットが前記ＲＢＤまたはその一部の複数のコピーを含み、それらコピーはアミノ酸配列が同じであるか異なっている、実施形態Ｂ１０～Ｂ１３のいずれか１つによるワクチン。
１５．前記抗原ユニットが１～５個のコピーからなる、実施形態Ｂ１４によるワクチン。
１６．前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが前記ＨＲ１ドメインまたは前記ＨＲ２ドメイン、好ましくは前記ＨＲ２ドメインを含むか、前記ＨＲ１ドメインまたは前記ＨＲ２ドメイン、好ましくは前記ＨＲ２ドメインである、実施形態Ｂ８によるワクチン。
１７．前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが、前記ウイルス表面タンパク質またはその一部に含まれるＢ細胞エピトープである、実施形態Ｂ２～Ｂ１６のいずれか１つによるワクチン。
１８．前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが、前記ウイルス表面タンパク質またはその一部に含まれる複数のＢ細胞エピトープである、実施形態Ｂ２～Ｂ１７のいずれか１つによるワクチン。
１９．前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープがＴ細胞エピトープである、実施形態Ｂ１によるワクチン。
２０．前記抗原ユニットが複数のＴ細胞エピトープを含む、実施形態Ｂ１９によるワクチン。
２１．前記Ｔ細胞エピトープが構造タンパク質または非構造タンパク質に含まれる、実施形態Ｂ１９～Ｂ２０のいずれか１つによるワクチン。
２２．前記Ｔ細胞エピトープが、表面タンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質、またはレプリカーゼポリタンパク質に含まれる、実施形態Ｂ１９～Ｂ２１のいずれか１つによるワクチン。
２３．前記Ｔ細胞エピトープが、異なる属および／または種および／または株のベータコロナウイルスの間で保存されている、実施形態Ｂ１９～Ｂ２２のいずれか１つによるワクチン。
２４．前記Ｔ細胞エピトープがＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２とＳＡＲＳ－ＣｏＶの間で保存されている、実施形態Ｂ１９～Ｂ２３のいずれか１つによるワクチン。
２５．前記Ｔ細胞エピトープが、長さ７～約２００個のアミノ酸、好ましくは７～１００個のアミノ酸を有するか、ＨＬＡクラスＩ／ＩＩアレルによって提示されるのに適した長さ、好ましくは長さ７～３０個のアミノ酸、より好ましくは長さ８～１５個のアミノ酸を有する、実施形態Ｂ１９～Ｂ２４のいずれか１つによるワクチン。
２６．前記Ｔ細胞エピトープが免疫原性であることが知られているか、ＨＬＡクラスＩ／ＩＩアレルへの結合に関して予測される能力に基づいて選択される、実施形態Ｂ１９～Ｂ２５のいずれか１つによるワクチン。
２７．前記抗原ユニットが、免疫原性であることが知られているかＨＬＡクラスＩ／ＩＩアレルに結合すると予測される複数のＴ細胞エピトープを含む、実施形態Ｂ１９～Ｂ２６のいずれか１つによるワクチン。
２８．前記Ｔ細胞エピトープが、配列番号１～配列番号４４４のいずれかのアミノ酸配列を有するエピトープから選択される、実施形態Ｂ１９～Ｂ２７のいずれか１つによるワクチン。
２９．前記Ｔ細胞エピトープが、配列番号６７、配列番号１９、配列番号７８、配列番号５７、配列番号５０、配列番号５５、配列番号６４、配列番号２２、配列番号８７、配列番号６２、配列番号３９、配列番号５９、配列番号２６、配列番号５３、配列番号３２、配列番号３８、配列番号３０、配列番号４０、配列番号４２、配列番号３５、配列番号７１、配列番号９、配列番号２１、配列番号８５、配列番号７５、配列番号２３、配列番号３４、配列番号３６、配列番号７７、および配列番号２０からなるリストから選択される、実施形態Ｂ２８によるワクチン。
３０．前記Ｔ細胞エピトープが、配列番号６７、配列番号１９、配列番号７８、配列番号５７、配列番号５０、配列番号５５、配列番号６４、配列番号２２、配列番号８７、および配列番号６２からなるリストから選択される、実施形態Ｂ２８によるワクチン。
３１．前記Ｔ細胞エピトープが、配列番号２４５のアミノ酸配列を有する抗原ユニットに含まれるＴ細胞エピトープから選択され、その中の配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳはリンカーであり、Ｔ細胞エピトープではない、実施形態Ｂ１９～Ｂ２７のいずれか１つによるワクチン。
３２．前記Ｔ細胞エピトープが、ＲＳＦＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬＡ、ＭＴＹＲＲＬＩＳＭＭＧＦＫＭＮＹＱＶＮＧＹＰＮＭＦ、ＬＭＩＥＲＦＶＳＬＡＩＤＡＹＰ、ＲＡＭＰＮＭＬＲＩＭＡＳＬＶＬ、ＭＶＹＭＰＡＳＷＶＭＲＩＭＴＷ、ＦＬＮＲＦＴＴＴＬＮＤＦＮＬＶＡＭ、ＳＳＶＥＬＫＨＦＦＦＡＱＤＧＮＡＡＩ、ＨＦＡＩＧＬＡＬＹＹＰＳＡＲＩＶＹＴＡＣＳＨＡＡＶ、ＹＦＩＫＧＬＮＮＬＮＲＧＭＶＬ、ＹＬＮＴＬＴＬＡＶＰＹＮＭＲＶ、ＡＱＦＡＰＳＡＳＡＦＦＧＭＳＲＩ、ＥＩＶＤＴＶＳＡＬＶＹＤＮＫＬ、ＳＳＧＤＡＴＴＡＹＡＮＳＶＦＮＩＣＱＡＶＴＡＮＶＮＡＬＬ、ＨＶＩＳＴＳＨＫＬＶＬＳＶＮＰＹＶ、ＭＬＳＤＴＬＫＮＬＳＤＲＶＶＦＶＬＷＡＨＧＦＥＬ、ＴＡＮＰＫＴＰＫＹＫＦＶＲＩＱＰＧＱＴＦ、ＡＳＩＫＮＦＫＳＶＬＹＹＱＮＮＶＦＭ、ＦＶＮＥＦＹＡＹＬＲＫＨＦＳＭＭ、ＲＶＷＴＬＭＮＶＬＴＬＶＹＫＶ、ＦＡＹＡＮＲＮＲＦＬＹＩＩＫＬ、およびＬＶＫＰＳＦＹＶＹＳＲＶＫＮＬからなるリストから選択される、実施形態Ｂ１９～Ｂ２７のいずれか１つによるワクチン。
３３．前記Ｔ細胞エピトープが、ＲＡＭＰＮＭＬＲＩＭＡＳＬＶＬ、ＨＶＩＳＴＳＨＫＬＶＬＳＶＮＰＹＶ、およびＬＶＫＰＳＦＹＶＹＳＲＶＫＮＬからなるリストから選択される１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、実施形態Ｂ１９～Ｂ２７のいずれか１つによるワクチン。
３４．前記抗原ユニットが、ベータコロナウイルスの完全長ウイルス表面タンパク質またはその一部である少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープをさらに含む、実施形態Ｂ１９～Ｂ３３のいずれか１つによるワクチン。
３５．前記ウイルス表面タンパク質が、エンベロープタンパク質、スパイクタンパク質、膜タンパク質、およびヘマグルチニンエステラーゼからなる群から選択される、実施形態Ｂ３４によるワクチン。
３６．前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが前記スパイクタンパク質を含むか前記スパイクタンパク質である、実施形態Ｂ３４～Ｂ３５のいずれか１つによるワクチン。
３７．前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが前記完全長スパイクタンパク質を含むか前記完全長スパイクタンパク質である、実施形態Ｂ３４～Ｂ３６のいずれか１つによるワクチン。
３８．前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが、配列番号２３０のアミノ酸配列と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列、または例えば１００％一致する配列を有するアミノ酸配列を含むかそのアミノ酸配列からなる、実施形態Ｂ３７によるワクチン。
３９．前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが、配列番号２７５のアミノ酸配列２４３～１４３７と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列、または例えば１００％一致する配列を有するアミノ酸配列を含むかそのアミノ酸配列からなる、実施形態Ｂ３７によるワクチン。
４０．前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが前記スパイクタンパク質の一部を含むか前記スパイクタンパク質の一部である、実施形態Ｂ３４～Ｂ３６のいずれか１つによるワクチン。
４１．前記スパイクタンパク質の前記一部が、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、ｈｅｐｔａｄ ｒｅｐｅａｔ１（ＨＲ１）ドメイン、およびｈｅｐｔａｄ ｒｅｐｅａｔ２（ＨＲ２）ドメインからなる群から選択される１つである、実施形態Ｂ４０によるワクチン。
４２．前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが前記ＲＢＤを含むか、前記ＲＢＤである、実施形態Ｂ４１によるワクチン。
４３．前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが、配列番号２３１または配列番号８０２、または配列番号８０３または配列番号８０４または配列番号８０５のアミノ酸配列と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列、または例えば１００％一致する配列を有するアミノ酸配列を含むかそのアミノ酸配列からなる、実施形態Ｂ４２によるワクチン。
４４．前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが、配列番号２５５のアミノ酸配列２４３～４６５と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列、または例えば１００％一致する配列を有するアミノ酸配列を含むかそのアミノ酸配列からなる、実施形態Ｂ４２によるワクチン。
４５．前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが、配列番号２４６のアミノ酸配列と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列、または例えば１００％一致する配列を有するアミノ酸配列を含むかそのアミノ酸配列からなる、実施形態Ｂ４２によるワクチン。
４６．前記抗原ユニットが前記ＲＢＤまたはその一部の複数のコピーを含み、それらコピーはアミノ酸配列が同じであるか異なっている、実施形態Ｂ４２～Ｂ４５のいずれか１つによるワクチン。
４７．前記抗原ユニットが１～５個のコピーを含む、実施形態Ｂ４６によるワクチン。
４８．前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが前記ＨＲ１ドメインまたは前記ＨＲ２ドメイン、好ましくは前記ＨＲ２ドメインを含むか、前記ＨＲ１ドメインまたは前記ＨＲ２ドメイン、好ましくは前記ＨＲ２ドメインである、実施形態Ｂ４０によるワクチン。
４９．前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが、前記ウイルス表面タンパク質またはその一部に含まれるＢ細胞エピトープである、実施形態Ｂ３４～Ｂ４８のいずれか１つによるワクチン。
５０．前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが、前記ウイルス表面タンパク質またはその一部に含まれる複数のＢ細胞エピトープである、実施形態Ｂ３４～Ｂ４９のいずれか１つによるワクチン。
５１．前記抗原ユニットが、ＲＳＦＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬＡ、ＭＴＹＲＲＬＩＳＭＭＧＦＫＭＮＹＱＶＮＧＹＰＮＭＦ、ＬＭＩＥＲＦＶＳＬＡＩＤＡＹＰ、ＲＡＭＰＮＭＬＲＩＭＡＳＬＶＬ、ＭＶＹＭＰＡＳＷＶＭＲＩＭＴＷ、ＦＬＮＲＦＴＴＴＬＮＤＦＮＬＶＡＭ、ＳＳＶＥＬＫＨＦＦＦＡＱＤＧＮＡＡＩ、ＨＦＡＩＧＬＡＬＹＹＰＳＡＲＩＶＹＴＡＣＳＨＡＡＶ、ＹＦＩＫＧＬＮＮＬＮＲＧＭＶＬ、ＹＬＮＴＬＴＬＡＶＰＹＮＭＲＶ、ＡＱＦＡＰＳＡＳＡＦＦＧＭＳＲＩ、ＥＩＶＤＴＶＳＡＬＶＹＤＮＫＬ、ＳＳＧＤＡＴＴＡＹＡＮＳＶＦＮＩＣＱＡＶＴＡＮＶＮＡＬＬ、ＨＶＩＳＴＳＨＫＬＶＬＳＶＮＰＹＶ、ＭＬＳＤＴＬＫＮＬＳＤＲＶＶＦＶＬＷＡＨＧＦＥＬ、ＴＡＮＰＫＴＰＫＹＫＦＶＲＩＱＰＧＱＴＦ、ＡＳＩＫＮＦＫＳＶＬＹＹＱＮＮＶＦＭ、ＦＶＮＥＦＹＡＹＬＲＫＨＦＳＭＭ、ＲＶＷＴＬＭＮＶＬＴＬＶＹＫＶ、ＦＡＹＡＮＲＮＲＦＬＹＩＩＫＬ、およびＬＶＫＰＳＦＹＶＹＳＲＶＫＮからなるリストから選択されるＴ細胞エピトープを含み、さらに、配列番号２３１または配列番号８０２、または配列番号８０３または配列番号８０４または配列番号８０５のアミノ酸配列と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列、または例えば１００％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ｂ３４によるワクチン。
５２．前記抗原ユニットが、ＲＳＦＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬＡ、ＭＴＹＲＲＬＩＳＭＭＧＦＫＭＮＹＱＶＮＧＹＰＮＭＦ、ＬＭＩＥＲＦＶＳＬＡＩＤＡＹＰ、ＲＡＭＰＮＭＬＲＩＭＡＳＬＶＬ、ＭＶＹＭＰＡＳＷＶＭＲＩＭＴＷ、ＦＬＮＲＦＴＴＴＬＮＤＦＮＬＶＡＭ、ＳＳＶＥＬＫＨＦＦＦＡＱＤＧＮＡＡＩ、ＨＦＡＩＧＬＡＬＹＹＰＳＡＲＩＶＹＴＡＣＳＨＡＡＶ、ＹＦＩＫＧＬＮＮＬＮＲＧＭＶＬ、ＹＬＮＴＬＴＬＡＶＰＹＮＭＲＶ、ＡＱＦＡＰＳＡＳＡＦＦＧＭＳＲＩ、ＥＩＶＤＴＶＳＡＬＶＹＤＮＫＬ、ＳＳＧＤＡＴＴＡＹＡＮＳＶＦＮＩＣＱＡＶＴＡＮＶＮＡＬＬ、ＨＶＩＳＴＳＨＫＬＶＬＳＶＮＰＹＶ、ＭＬＳＤＴＬＫＮＬＳＤＲＶＶＦＶＬＷＡＨＧＦＥＬ、ＴＡＮＰＫＴＰＫＹＫＦＶＲＩＱＰＧＱＴＦ、ＡＳＩＫＮＦＫＳＶＬＹＹＱＮＮＶＦＭ、ＦＶＮＥＦＹＡＹＬＲＫＨＦＳＭＭ、ＲＶＷＴＬＭＮＶＬＴＬＶＹＫＶ、ＦＡＹＡＮＲＮＲＦＬＹＩＩＫＬ、およびＬＶＫＰＳＦＹＶＹＳＲＶＫＮからなるリストから選択されるＴ細胞エピトープを含み、さらに、配列番号２５５のアミノ酸配列２４３～４６５と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列、または例えば１００％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ｂ３４によるワクチン。
５３．前記抗原ユニットが、ＲＳＦＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬＡ、ＭＴＹＲＲＬＩＳＭＭＧＦＫＭＮＹＱＶＮＧＹＰＮＭＦ、ＬＭＩＥＲＦＶＳＬＡＩＤＡＹＰ、ＲＡＭＰＮＭＬＲＩＭＡＳＬＶＬ、ＭＶＹＭＰＡＳＷＶＭＲＩＭＴＷ、ＦＬＮＲＦＴＴＴＬＮＤＦＮＬＶＡＭ、ＳＳＶＥＬＫＨＦＦＦＡＱＤＧＮＡＡＩ、ＨＦＡＩＧＬＡＬＹＹＰＳＡＲＩＶＹＴＡＣＳＨＡＡＶ、ＹＦＩＫＧＬＮＮＬＮＲＧＭＶＬ、ＹＬＮＴＬＴＬＡＶＰＹＮＭＲＶ、ＡＱＦＡＰＳＡＳＡＦＦＧＭＳＲＩ、ＥＩＶＤＴＶＳＡＬＶＹＤＮＫＬ、ＳＳＧＤＡＴＴＡＹＡＮＳＶＦＮＩＣＱＡＶＴＡＮＶＮＡＬＬ、ＨＶＩＳＴＳＨＫＬＶＬＳＶＮＰＹＶ、ＭＬＳＤＴＬＫＮＬＳＤＲＶＶＦＶＬＷＡＨＧＦＥＬ、ＴＡＮＰＫＴＰＫＹＫＦＶＲＩＱＰＧＱＴＦ、ＡＳＩＫＮＦＫＳＶＬＹＹＱＮＮＶＦＭ、ＦＶＮＥＦＹＡＹＬＲＫＨＦＳＭＭ、ＲＶＷＴＬＭＮＶＬＴＬＶＹＫＶ、ＦＡＹＡＮＲＮＲＦＬＹＩＩＫＬ、およびＬＶＫＰＳＦＹＶＹＳＲＶＫＮからなるリストから選択されるＴ細胞エピトープを含み、さらに、配列番号２４６のアミノ酸配列と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列、または例えば１００％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ｂ３４によるワクチン。
５４．前記抗原ユニットが、ＲＳＦＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬＡ、ＭＴＹＲＲＬＩＳＭＭＧＦＫＭＮＹＱＶＮＧＹＰＮＭＦ、ＬＭＩＥＲＦＶＳＬＡＩＤＡＹＰ、ＲＡＭＰＮＭＬＲＩＭＡＳＬＶＬ、ＭＶＹＭＰＡＳＷＶＭＲＩＭＴＷ、ＦＬＮＲＦＴＴＴＬＮＤＦＮＬＶＡＭ、ＳＳＶＥＬＫＨＦＦＦＡＱＤＧＮＡＡＩ、ＨＦＡＩＧＬＡＬＹＹＰＳＡＲＩＶＹＴＡＣＳＨＡＡＶ、ＹＦＩＫＧＬＮＮＬＮＲＧＭＶＬ、ＹＬＮＴＬＴＬＡＶＰＹＮＭＲＶ、ＡＱＦＡＰＳＡＳＡＦＦＧＭＳＲＩ、ＥＩＶＤＴＶＳＡＬＶＹＤＮＫＬ、ＳＳＧＤＡＴＴＡＹＡＮＳＶＦＮＩＣＱＡＶＴＡＮＶＮＡＬＬ、ＨＶＩＳＴＳＨＫＬＶＬＳＶＮＰＹＶ、ＭＬＳＤＴＬＫＮＬＳＤＲＶＶＦＶＬＷＡＨＧＦＥＬ、ＴＡＮＰＫＴＰＫＹＫＦＶＲＩＱＰＧＱＴＦ、ＡＳＩＫＮＦＫＳＶＬＹＹＱＮＮＶＦＭ、ＦＶＮＥＦＹＡＹＬＲＫＨＦＳＭＭ、ＲＶＷＴＬＭＮＶＬＴＬＶＹＫＶ、ＦＡＹＡＮＲＮＲＦＬＹＩＩＫＬ、およびＬＶＫＰＳＦＹＶＹＳＲＶＫＮからなるリストから選択されるＴ細胞エピトープを含み、さらに、配列番号２４６のアミノ酸配列と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列、または例えば１００％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ｂ３４によるワクチン。
５５．前記抗原ユニットが、ＲＡＭＰＮＭＬＲＩＭＡＳＬＶＬ、ＨＶＩＳＴＳＨＫＬＶＬＳＶＮＰＹＶ、およびＬＶＫＰＳＦＹＶＹＳＲＶＫＮＬからなるリストから選択される１つ以上のＴ細胞エピトープを含み、さらに、配列番号２５５のアミノ酸配列２４３～４６５と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列、または例えば１００％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ｂ３４によるワクチン。
５６．前記抗原ユニットが、ＲＡＭＰＮＭＬＲＩＭＡＳＬＶＬ、ＨＶＩＳＴＳＨＫＬＶＬＳＶＮＰＹＶ、およびＬＶＫＰＳＦＹＶＹＳＲＶＫＮＬからなるリストから選択される１つ以上のＴ細胞エピトープを含み、さらに、配列番号２４６のアミノ酸配列と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列、または例えば１００％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ｂ３４によるワクチン。
５７．前記抗原ユニットが、３５００個までのアミノ酸、例えば２１～３５００個のアミノ酸、好ましくは約３０個のアミノ酸～約２０００個のアミノ酸、例えば約５０～約１５００個のアミノ酸、より好ましくは約１００～約１５００個のアミノ酸、例えば約１００～約１０００個のアミノ酸、または約１００～約５００個のアミノ酸、または約１００～約３００個のアミノ酸を含む、実施形態Ｂ１～Ｂ５６のいずれか１つによるワクチン。
５８．前記抗原ユニットが、１つ以上のリンカー、好ましくは１つ以上の非免疫原性および／または可動性リンカーを含む、実施形態Ｂ１～Ｂ５７のいずれか１つによるワクチン。
５９．前記抗原ユニットが、非免疫原性および／または可動性リンカーによって、好ましくは４～２０個のアミノ酸、例えば５～２０個のアミノ酸、または５～１５個のアミノ酸、または８～２０個のアミノ酸、または８～１５個のアミノ酸１０～１５個のアミノ酸、または８～１２個のアミノ酸からなるリンカー、より好ましくはセリンおよび／またはグリシンが豊富で場合により少なくとも１個のロイシン残基を含むリンカー、ＧＳＡＴリンカー、およびＳＥＧリンカーからなる群から選択されるリンカーによって分離された複数のＴ細胞エピトープを含む、実施形態Ｂ５８によるワクチン。
６０．前記抗原ユニットが、ベータコロナウイルスの少なくとも１つのＴ細胞エピトープと完全長タンパク質またはその一部を含み、ベータコロナウイルスの前記少なくとも１つのＴ細胞エピトープと前記完全長タンパク質または前記その一部は、非免疫原性および／または可動性リンカーによって、好ましくは１０～６０個のアミノ酸、例えば１１～５０個のアミノ酸、または２０～５０個のアミノ酸、または２５～４５個のアミノ酸、または１２～４５個のアミノ酸、または１３～４０個のアミノ酸、または３０～４０個のアミノ酸からなるリンカー、より好ましくはセリンおよび／またはグリシンが豊富で場合により少なくとも１個のロイシン残基を含むリンカー（ＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬ、ＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬ）、ＧＳＡＴリンカー（ＧＧＳＡＧＧＳＧＳＧＳＳＧＧＳＳＧＡＳＧＴＧＴＡＧＧＴＧＳＧＳＧＴＧＳＧなど）、およびＳＥＧリンカー（ＧＧＳＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＧＧＧＳなど）からなる群から選択されるリンカーによって分離された複数のＴ細胞エピトープを含む、実施形態Ｂ５８によるワクチン。
６１．前記抗原ユニットが、１０、２０、３０、４０、または５０個のエピトープ、好ましくはＴ細胞エピトープを含む、実施形態Ｂ１～Ｂ６０のいずれか１つによるワクチン。
６２．前記ターゲティングユニットが、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の分子または受容体に対する特異性、好ましくはＣＤ１４、ＣＤ４０、Ｔｏｌｌ様受容体、ＣＣＲ１、ＣＣＲ３、ＣＣＲ５、ＭＨＣクラスＩタンパク質、またはＭＨＣクラスＩＩタンパク質に対する特異性を有する抗体結合領域を含む、実施形態Ｂ１～Ｂ６１のいずれか１つによるワクチン。
６３．前記ターゲティングユニットが、ＣＣＲ１、ＣＣＲ３、およびＣＣＲ５から選択されるケモカイン受容体に対する親和性を有する、実施形態Ｂ１～Ｂ６２のいずれか１つによるワクチン。
６４．前記ターゲティングユニットが、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質、好ましくは抗ＨＬＡ－ＤＰ、抗ＨＬＡ－ＤＲ、および抗ｐａｎ ＨＬＡクラスＩＩからなる群から選択されるＭＨＣクラスＩＩタンパク質に対する親和性を有する、実施形態Ｂ６２～Ｂ６３のいずれか１つによるワクチン。
６５．前記ターゲティングユニットが、抗ｐａｎ ＨＬＡクラスＩＩとＭＩＰ－１αから選択され、好ましくは抗ｐａｎ ＨＬＡクラスＩＩとヒトＭＩＰ－１αから選択される、実施形態Ｂ１～Ｂ６４のいずれか１つによるワクチン。
６６．前記ターゲティングユニットがＭＩＰ－１αであり、好ましくはヒトＭＩＰ－１αである、実施形態Ｂ６５によるワクチン。
６７．前記ターゲティングユニットが、配列番号２３３のアミノ酸配列２４～９３と少なくとも８５％一致するアミノ酸配列、例えば少なくとも８６％、または少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、少なくとも９９％、または１００％一致するアミノ酸配列を含むかそのアミノ酸配列からなる、実施形態Ｂ６６によるワクチン。
６８．前記ターゲティングユニットが抗ｐａｎ ＨＬＡクラスＩＩである、実施形態Ｂ６５によるワクチン。
６９．前記ターゲティングユニットが、配列番号３２１のアミノ酸配列２０～２６０と少なくとも８５％一致するアミノ酸配列、例えば少なくとも８６％、または少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、少なくとも９９％、または１００％一致するアミノ酸配列を含むかそのアミノ酸配列からなる、実施形態Ｂ６８によるワクチン。
７０．前記二量体化ユニットがヒンジ領域を含む、実施形態Ｂ１～Ｂ６９のいずれか１つによるワクチン。
７１．前記ヒンジ領域が１つ以上の共有結合を形成する能力を有する、実施形態Ｂ７０によるワクチン。
７２．前記ヒンジ領域がＩｇ由来である、実施形態Ｂ７０～Ｂ７１のいずれか１つによるワクチン。
７３．前記二量体化ユニットが、二量体化を容易にする別のドメインをさらに含む、実施形態Ｂ７０～Ｂ７２のいずれか１つによるワクチン。
７４．前記別のドメインが、免疫グロブリンドメイン、好ましくは免疫グロブリン定常ドメインである、実施形態Ｂ７３によるワクチン。
７５．前記別のドメインが、ＩｇＧ、好ましくはＩｇＧ３に由来するカルボキシ末端Ｃドメインである、実施形態Ｂ７３とＢ７４のいずれか１つによるワクチン。
７６．前記二量体化ユニットが二量体化ユニットリンカーをさらに含む、実施形態Ｂ７０～Ｂ７５のいずれか１つによるワクチン。
７７．前記二量体化ユニットリンカーが、前記ヒンジ領域と、二量体化を容易にする前記別のドメインを接続する、実施形態Ｂ７６によるワクチン。
７８．前記二量体化ユニットが、ヒンジエキソンｈ１とヒンジエキソンｈ４、二量体化ユニットリンカー、およびヒトＩｇＧ３のＣＨ３ドメインを含む、実施形態Ｂ７０～Ｂ７７のいずれか１つによるワクチン。
７９．前記二量体化ユニットが、配列番号２３３のアミノ酸配列９４～２３７と少なくとも８５％一致するアミノ酸配列、例えば少なくとも８６％、または少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、少なくとも９９％、または１００％一致するアミノ酸配列を含むかそのアミノ酸配列からなる、実施形態Ｂ７８によるワクチン。
８０．前記ポリヌクレオチド（ｉ）を含む、実施形態Ｂ１～Ｂ７９のいずれか１つによるワクチン。
８１．前記ポリヌクレオチドがＲＮＡまたはＤＮＡであり、好ましくはＤＮＡである、実施形態Ｂ８０によるワクチン。
８２．前記ポリヌクレオチドが、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態Ｂ８０～Ｂ８１のいずれか１つによるワクチン。
８３．前記シグナルペプチドが、Ｉｇ ＶＨシグナルペプチド、ヒトＴＰＡシグナルペプチド、またはヒトＭＩＰ１－αシグナルペプチドである、実施形態Ｂ８２によるワクチン。
８４．前記シグナルペプチドが、配列番号２３３のアミノ酸配列１～２３と少なくとも８５％一致するアミノ酸配列、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、または１００％一致するアミノ酸配列を含むかそのアミノ酸配列からなる、実施形態Ｂ８３によるワクチン。
８５．前記ターゲティングユニットがヒトＭＩＰ－１αである、実施形態Ｂ８４によるワクチン。
８６．前記シグナルペプチドが、配列番号３２１のアミノ酸配列１～１９と少なくとも８５％一致するアミノ酸配列、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、または１００％一致するアミノ酸配列を含むかそのアミノ酸配列からなる、実施形態Ｂ８３によるワクチン。
８７．前記ターゲティングユニットが抗ｐａｎ ＨＬＡクラスＩＩである、実施形態Ｂ８６によるワクチン。
８８．前記ポリペプチドまたは前記二量体化ユニットを含み、前記ペプチドまたは前記二量体タンパク質の中の前記ターゲティングユニット、前記二量体化ユニット、および前記抗原ユニットが、Ｎ末端からＣ末端に向かい、ターゲティングユニット、二量体化ユニット、および抗原ユニットの順番である、実施形態Ｂ１～Ｂ８７のいずれか１つによるワクチン。
８９．前記ベータコロナウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、およびＨＣｏＶ－ＨＫＵ１からなる群から選択される１つ、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶとＳＡＲＳ－ＣｏＶからなる群から選択される１つである、実施形態Ｂ１～Ｂ８８のいずれか１つによるワクチン。
９０．前記ベータコロナウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ２である、実施形態Ｂ８９によるワクチン。
９１．薬学的に許容可能な前記担体が、生理食塩水、緩衝化生理食塩水（ＰＢＳなど）、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、減菌等張水性バッファ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態Ｂ１～Ｂ９０のいずれか１つによるワクチン。
９２．実施形態Ｂ１～Ｂ９０のいずれか１つに規定されたポリヌクレオチド。
９３．実施形態Ｂ９２によるポリヌクレオチドを含むベクター。
９４．実施形態Ｂ１～Ｂ９０のいずれか１つに規定されたポリヌクレオチドを含むか、実施形態Ｂ９３によるベクターを含む宿主細胞。
９５．実施形態Ｂ９２に規定されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。
９６．実施形態Ｂ９５に規定されたポリペプチド２つからなる二量体タンパク質。
９７．前記二量体タンパク質がホモ二量体タンパク質である、実施形態Ｂ９６による二量体タンパク質。
９８．薬として使用するための、実施形態Ｂ９２によるポリヌクレオチド、または実施形態Ｂ９５によるポリペプチド、または実施形態Ｂ９６またはＢ９７のいずれか１つによる二量体タンパク質。
９９．ベータコロナウイルスの感染症の治療に使用するための、またはベータコロナウイルス感染症の予防に使用するための、実施形態Ｂ９２によるポリヌクレオチド、または実施形態Ｂ９５によるポリペプチド、または実施形態Ｂ９６またはＢ９７のいずれか１つによる二量体タンパク質。
１００．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、またはＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ、より好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の感染症の治療に使用するための、または予防に使用するための、実施形態Ｂ９２によるポリヌクレオチド、または実施形態Ｂ９５によるポリペプチド、または実施形態Ｂ９６またはＢ９７のいずれか１つによる二量体タンパク質。
１０１．実施形態Ｂ１～Ｂ７９とＢ８８～Ｂ９１のいずれか１つによるワクチンを調製する方法であって、
ａ）実施形態Ｂ１～Ｂ９０のいずれか１つに規定されたポリヌクレオチドを細胞にトランスフェクトする工程；
ｂ）前記細胞を培養する工程；
ｃ）前記細胞から発現した前記二量体タンパク質または前記ポリペプチドを回収して精製する工程；および
ｄ）工程ｃ）から得られた前記二量体タンパク質または前記ポリペプチドを薬学的に許容可能な前記担体と混合する工程を含む方法。
１０２．実施形態Ｂ１～Ｂ８７とＢ８９～Ｂ９１のいずれか１つによるワクチンを調製する方法であって、前記ワクチンが前記ポリペプチドを含み、前記方法が、
ａ）前記ポリヌクレオチドを調製する工程；
ｂ）場合により、前記ポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングする工程；および
ｃ）工程ａ）から得られた前記ポリヌクレオチド、または工程ｂ）から得られた前記ベクターを薬学的に許容可能な前記担体と混合する工程を含む方法。
１０３．ベータコロナウイルス感染症に罹患しているか、その予防を必要とする対象を治療する方法であって、実施形態Ｂ１～Ｂ９１のいずれか１つに規定されたワクチンを前記対象に投与することを含む方法。
１０４．ベータコロナウイルスの感染の治療、またはベータコロナウイルス感染症の予防に使用するための、実施形態Ｂ１～Ｂ９１のいずれか１つに規定されたワクチン。

Claims (66)

  1. 免疫学的に有効な量の
    （ｉ）ターゲティングユニット、二量体化ユニット、および抗原ユニットをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、ここで前記抗原ユニットは少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープを含む；または
    （ｉｉ）（ｉ）に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または
    （ｉｉｉ）（ｉ）に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド２つからなる二量体タンパク質；および
    薬学的に許容可能な担体を含む、ワクチン。
  2. 前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが、ベータコロナウイルスの完全長ウイルス表面タンパク質またはその一部である、請求項１に記載のワクチン。
  3. 前記ウイルス表面タンパク質が、エンベロープタンパク質、スパイクタンパク質、膜タンパク質、およびヘマグルチニンエステラーゼから選択される、請求項２に記載のワクチン。
  4. 前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが前記スパイクタンパク質を含む、または前記スパイクタンパク質である、請求項２～３のいずれか１項に記載のワクチン。
  5. 前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが前記完全長スパイクタンパク質を含む、または前記完全長スパイクタンパク質である、請求項２～４のいずれか１項に記載のワクチン。
  6. 前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが、配列番号２７５のアミノ酸配列２４３～１４３７と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列、または例えば１００％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む、またはそのアミノ酸配列からなる、請求項５に記載のワクチン。
  7. 前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが、前記スパイクタンパク質の一部を含む、または前記スパイクタンパク質の一部である、請求項２～４のいずれか１項に記載のワクチン。
  8. 前記スパイクタンパク質の前記一部が、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、ｈｅｐｔａｄ ｒｅｐｅａｔ１（ＨＲ１）ドメイン、およびｈｅｐｔａｄ ｒｅｐｅａｔ２（ＨＲ２）ドメインからなる群から選択される１つである、請求項７に記載のワクチン。
  9. 前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが、前記ＲＢＤまたは前記ＲＢＤの一部を含むか、前記ＲＢＤまたは前記ＲＢＤの一部である、請求項８に記載のワクチン。
  10. 前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが、配列番号２３１または配列番号８０２、または配列番号８０３または配列番号８０４または配列番号８０５のアミノ酸配列と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列、または例えば１００％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む、またはそのアミノ酸配列からなる、請求項９に記載のワクチン。
  11. 前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが、配列番号２５５のアミノ酸配列２４３～４６５と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列、または例えば１００％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む、またはそのアミノ酸配列からなる、請求項９に記載のワクチン。
  12. 前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが、配列番号２４６のアミノ酸配列と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％一致する配列、または例えば１００％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む、またはそのアミノ酸配列からなる、請求項９に記載のワクチン。
  13. 前記抗原ユニットが前記ＲＢＤまたはその一部の複数のコピーを含み、それらコピーはアミノ酸配列が同じである、または異なっている、請求項９～１２のいずれか１項に記載のワクチン。
  14. 前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが、前記ウイルス表面タンパク質またはその一部に含まれるＢ細胞エピトープである、請求項２～１３のいずれか１項に記載のワクチン。
  15. 前記抗原ユニットが、前記ウイルス表面タンパク質またはその一部に含まれる複数のＢ細胞エピトープを含む、請求項２～１４のいずれか１項に記載のワクチン。
  16. 前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープがＴ細胞エピトープである、請求項１に記載のワクチン。
  17. 前記抗原ユニットが複数のＴ細胞エピトープを含む、請求項１６に記載のワクチン。
  18. 前記Ｔ細胞エピトープが、ベータコロナウイルスの異なる属および／または種および／または株の間、好ましくはＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２とＳＡＲＳ－ＣｏＶの間で保存されている、請求項１６～１７のいずれか１項に記載のワクチン。
  19. 前記Ｔ細胞エピトープが、７～約２００個のアミノ酸の長さ、好ましくは７～１００個のアミノ酸を有するか、またはＨＬＡクラスＩ／ＩＩアレルによって提示されるのに適した長さ、好ましくは７～３０個のアミノ酸の長さ、より好ましくは長さ８～１５個のアミノ酸を有する、請求項１６～１８のいずれか１項に記載のワクチン。
  20. 前記Ｔ細胞エピトープが免疫原性であることが知られているか、またはＨＬＡクラスＩ／ＩＩアレルへの結合に関して予測される能力に基づいて選択される、請求項１６～１９のいずれか１項に記載のワクチン。
  21. 前記Ｔ細胞エピトープが、配列番号１～配列番号４４４のいずれか１つのアミノ酸配列を有するエピトープから選択される、請求項１６～２０のいずれか１項に記載のワクチン。
  22. 前記Ｔ細胞エピトープが、ＲＳＦＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬＡ、ＭＴＹＲＲＬＩＳＭＭＧＦＫＭＮＹＱＶＮＧＹＰＮＭＦ、ＬＭＩＥＲＦＶＳＬＡＩＤＡＹＰ、ＲＡＭＰＮＭＬＲＩＭＡＳＬＶＬ、ＭＶＹＭＰＡＳＷＶＭＲＩＭＴＷ、ＦＬＮＲＦＴＴＴＬＮＤＦＮＬＶＡＭ、ＳＳＶＥＬＫＨＦＦＦＡＱＤＧＮＡＡＩ、ＨＦＡＩＧＬＡＬＹＹＰＳＡＲＩＶＹＴＡＣＳＨＡＡＶ、ＹＦＩＫＧＬＮＮＬＮＲＧＭＶＬ、ＹＬＮＴＬＴＬＡＶＰＹＮＭＲＶ、ＡＱＦＡＰＳＡＳＡＦＦＧＭＳＲＩ、ＥＩＶＤＴＶＳＡＬＶＹＤＮＫＬ、ＳＳＧＤＡＴＴＡＹＡＮＳＶＦＮＩＣＱＡＶＴＡＮＶＮＡＬＬ、ＨＶＩＳＴＳＨＫＬＶＬＳＶＮＰＹＶ、ＭＬＳＤＴＬＫＮＬＳＤＲＶＶＦＶＬＷＡＨＧＦＥＬ、ＴＡＮＰＫＴＰＫＹＫＦＶＲＩＱＰＧＱＴＦ、ＡＳＩＫＮＦＫＳＶＬＹＹＱＮＮＶＦＭ、ＦＶＮＥＦＹＡＹＬＲＫＨＦＳＭＭ、ＲＶＷＴＬＭＮＶＬＴＬＶＹＫＶ、ＦＡＹＡＮＲＮＲＦＬＹＩＩＫＬ、およびＬＶＫＰＳＦＹＶＹＳＲＶＫＮＬからなるリストから選択される、請求項１６～２０のいずれか１項に記載のワクチン。
  23. 前記Ｔ細胞エピトープが、ＲＡＭＰＮＭＬＲＩＭＡＳＬＶＬ、ＨＶＩＳＴＳＨＫＬＶＬＳＶＮＰＹＶ、およびＬＶＫＰＳＦＹＶＹＳＲＶＫＮＬからなるリストから選択される、請求項１６～２０のいずれか１項に記載のワクチン。
  24. 前記抗原ユニットが、ベータコロナウイルスの完全長ウイルス表面タンパク質またはその一部である少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープをさらに含む、請求項１６～２３のいずれか１項に記載のワクチン。
  25. 前記ウイルス表面タンパク質が、エンベロープタンパク質、スパイクタンパク質、膜タンパク質、およびヘマグルチニンエステラーゼからなる群から選択される、請求項２４に記載のワクチン。
  26. 前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが、前記スパイクタンパク質を含む、または前記スパイクタンパク質である、請求項２４～２５のいずれか１項に記載のワクチン。
  27. 前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが、前記完全長スパイクタンパク質を含む、または前記完全長スパイクタンパク質である、請求項２４～２６のいずれか１項に記載のワクチン。
  28. 前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが、配列番号２７５のアミノ酸配列２４３～１４３７と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列、または例えば１００％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む、またはそのアミノ酸配列からなる、請求項２７に記載のワクチン。
  29. 前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが、前記スパイクタンパク質の一部を含む、または前記スパイクタンパク質の一部である、請求項２４～２６のいずれか１項に記載のワクチン。
  30. 前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが、前記ＲＢＤまたは前記ＲＢＤの一部を含むか、前記ＲＢＤまたは前記ＲＢＤの一部である、請求項２９に記載のワクチン。
  31. 前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが、配列番号２３１または配列番号８０２、または配列番号８０３または配列番号８０４または配列番号８０５のアミノ酸配列と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列、または例えば１００％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む、またはそのアミノ酸配列からなる、請求項３０に記載のワクチン。
  32. 前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが、配列番号２５５のアミノ酸配列２４３～４６５と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列、または例えば１００％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む、またはそのアミノ酸配列からなる、請求項３０に記載のワクチン。
  33. 前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが、配列番号２４６のアミノ酸配列と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列、または例えば１００％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む、またはそのアミノ酸配列からなる、請求項３０に記載のワクチン。
  34. 前記抗原ユニットが前記ＲＢＤまたはその一部の複数のコピーを含み、それらコピーはアミノ酸配列が同じである、または異なっている、請求項３０～３３のいずれか１項に記載のワクチン。
  35. 前記少なくとも１つのベータコロナウイルスエピトープが、前記ウイルス表面タンパク質またはその一部に含まれるＢ細胞エピトープである、請求項２４～３４のいずれか１項に記載のワクチン。
  36. 前記抗原ユニットが、前記ウイルス表面タンパク質またはその一部に含まれる複数のＢ細胞エピトープを含む、請求項２４～３５のいずれか１項に記載のワクチン。
  37. 前記抗原ユニットが、ＲＳＦＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬＡ、ＭＴＹＲＲＬＩＳＭＭＧＦＫＭＮＹＱＶＮＧＹＰＮＭＦ、ＬＭＩＥＲＦＶＳＬＡＩＤＡＹＰ、ＲＡＭＰＮＭＬＲＩＭＡＳＬＶＬ、ＭＶＹＭＰＡＳＷＶＭＲＩＭＴＷ、ＦＬＮＲＦＴＴＴＬＮＤＦＮＬＶＡＭ、ＳＳＶＥＬＫＨＦＦＦＡＱＤＧＮＡＡＩ、ＨＦＡＩＧＬＡＬＹＹＰＳＡＲＩＶＹＴＡＣＳＨＡＡＶ、ＹＦＩＫＧＬＮＮＬＮＲＧＭＶＬ、ＹＬＮＴＬＴＬＡＶＰＹＮＭＲＶ、ＡＱＦＡＰＳＡＳＡＦＦＧＭＳＲＩ、ＥＩＶＤＴＶＳＡＬＶＹＤＮＫＬ、ＳＳＧＤＡＴＴＡＹＡＮＳＶＦＮＩＣＱＡＶＴＡＮＶＮＡＬＬ、ＨＶＩＳＴＳＨＫＬＶＬＳＶＮＰＹＶ、ＭＬＳＤＴＬＫＮＬＳＤＲＶＶＦＶＬＷＡＨＧＦＥＬ、ＴＡＮＰＫＴＰＫＹＫＦＶＲＩＱＰＧＱＴＦ、ＡＳＩＫＮＦＫＳＶＬＹＹＱＮＮＶＦＭ、ＦＶＮＥＦＹＡＹＬＲＫＨＦＳＭＭ、ＲＶＷＴＬＭＮＶＬＴＬＶＹＫＶ、ＦＡＹＡＮＲＮＲＦＬＹＩＩＫＬ、およびＬＶＫＰＳＦＹＶＹＳＲＶＫＮからなるリストから選択されるＴ細胞エピトープを含み、さらに、配列番号２３１または配列番号８０２、または配列番号８０３または配列番号８０４または配列番号８０５のアミノ酸配列と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列、または例えば１００％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載のワクチン。
  38. 前記抗原ユニットが、ＲＡＭＰＮＭＬＲＩＭＡＳＬＶＬ、ＨＶＩＳＴＳＨＫＬＶＬＳＶＮＰＹＶ、およびＬＶＫＰＳＦＹＶＹＳＲＶＫＮＬからなるリストから選択される１つ以上のＴ細胞エピトープを含み、さらに、配列番号２５５のアミノ酸配列２４３～４６５と少なくとも７０％一致する配列、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または例えば少なくとも９９％一致する配列、または例えば１００％一致する配列を有するアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載のワクチン。
  39. 前記抗原ユニットが、３５００個までのアミノ酸、例えば２１～３５００個のアミノ酸、好ましくは約３０個のアミノ酸～約２０００個のアミノ酸、例えば約５０～約１５００個のアミノ酸、より好ましくは約１００～約１５００個のアミノ酸、例えば約１００～約１０００個のアミノ酸、または約１００～約５００個のアミノ酸、または約１００～約３００個のアミノ酸を含む、請求項１～３８のいずれか１項に記載のワクチン。
  40. 前記抗原ユニットが、１つ以上のリンカー、好ましくは１つ以上の非免疫原性および／または可動性リンカーを含む、請求項１～３９のいずれか１項に記載のワクチン。
  41. 前記抗原ユニットが、１０、２０、３０、４０、または５０個のエピトープ、好ましくはＴ細胞エピトープを含む、請求項１～４０のいずれか１項に記載のワクチン。
  42. 前記ターゲティングユニットが、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の分子または受容体に対する特異性、好ましくはＣＤ１４、ＣＤ４０、Ｔｏｌｌ様受容体、ＣＣＲ１、ＣＣＲ３、ＣＣＲ５、ＭＨＣクラスＩタンパク質、またはＭＨＣクラスＩＩタンパク質に対する特異性を有する抗体結合領域を含む、請求項１～４１のいずれか１項に記載のワクチン。
  43. 前記ターゲティングユニットが、ＣＣＲ１、ＣＣＲ３、およびＣＣＲ５から選択されるケモカイン受容体に対する親和性を有する、請求項１～４２のいずれか１項に記載のワクチン。
  44. 前記ターゲティングユニットが、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質、好ましくは抗ＨＬＡ－ＤＰ、抗ＨＬＡ－ＤＲ、および抗ｐａｎ ＨＬＡクラスＩＩからなる群から選択されるＭＨＣクラスＩＩタンパク質に対する親和性を有する、請求項４２～４３のいずれか１項に記載のワクチン。
  45. 前記ターゲティングユニットが抗ｐａｎ ＨＬＡクラスＩＩとＭＩＰ－１αから選択され、好ましくは抗ｐａｎ ＨＬＡクラスＩＩおよびヒトＭＩＰ－１αから選択される、請求項１～４４のいずれか１項に記載のワクチン。
  46. 前記ターゲティングユニットがＭＩＰ－１αであり、好ましくはヒトＭＩＰ－１αである、請求項４５によるワクチン。
  47. 前記ターゲティングユニットが抗ｐａｎ ＨＬＡクラスＩＩである、請求項４５に記載のワクチン。
  48. 前記二量体化ユニットがヒンジ領域を含む、請求項１～４７のいずれか１項に記載のワクチン。
  49. 前記二量体化ユニットが、二量体化を容易にする別のドメインをさらに含む、請求項４８に記載のワクチン。
  50. 前記別のドメインが免疫グロブリンドメインであり、好ましくは免疫グロブリン定常ドメインである、請求項４９に記載のワクチン。
  51. 前記二量体化ユニットが二量体化ユニットリンカーをさらに含み、そのリンカーが、前記ヒンジ領域と、二量体化を容易にする前記別のドメインを接続する、請求項４８～４９のいずれか１項に記載のワクチン。
  52. 前記ポリヌクレオチドを含む、請求項１～５１のいずれか１項に記載のワクチン。
  53. 前記ポリヌクレオチドがシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項５２に記載のワクチン。
  54. 前記ポリペプチドまたは前記二量体化ユニットを含み、前記ペプチドまたは前記二量体タンパク質における前記ターゲティングユニット、前記二量体化ユニット、および前記抗原ユニットが、Ｎ末端からＣ末端に向かい、ターゲティングユニット、二量体化ユニット、および抗原ユニットの順番である、請求項１～５３のいずれか１項に記載のワクチン。
  55. 前記ベータコロナウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、およびＨＣｏＶ－ＨＫＵ１からなる群から選択される１つ、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶとＳＡＲＳ－ＣｏＶからなる群から選択される１つである、請求項１～５４のいずれか１項に記載のワクチン。
  56. 請求項１～５３のいずれか１項に記載のワクチンとしてのポリヌクレオチド。
  57. 請求項５６に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  58. 請求項１～５３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、または請求項５７によるベクターを含む、宿主細胞。
  59. 請求項１～５３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。
  60. 請求項５９に記載のポリペプチド２つからなる二量体タンパク質。
  61. ホモ二量体タンパク質である、請求項６０に記載の二量体タンパク質。
  62. 薬剤として使用するための、請求項５６に記載のポリヌクレオチド、または請求項５９に記載のポリペプチド、または請求項６０または６１のいずれかに記載の二量体タンパク質。
  63. 請求項１～５１と５４～５５のいずれか１項に記載のワクチンを調製する方法であって、前記ワクチンが前記ポリペプチドまたは前記二量体タンパク質を含み、前記方法が、
    ａ）請求項１～５３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを細胞にトランスフェクトする工程；
    ｂ）前記細胞を培養する工程；
    ｃ）前記細胞から発現した前記二量体タンパク質または前記ポリペプチドを回収して精製する工程；および
    ｄ）工程ｃ）から得られた前記二量体タンパク質または前記ポリペプチドを薬学的に許容可能な前記担体と混合する工程、
    を含む、方法。
  64. 請求項１～５３と５５のいずれか１項に記載のワクチンを調製する方法であって、前記ワクチンが前記ポリペプチドまたは前記二量体タンパク質を含み、および前記方法が、
    ａ）前記ポリヌクレオチドを調製する工程；
    ｂ）場合により、前記ポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングする工程；および
    ｃ）工程ａ）から得られた前記ポリヌクレオチド、または工程ｂ）から得られた前記ベクターを薬学的に許容可能な前記担体と混合する工程、
    を含む、方法。
  65. ベータコロナウイルス感染症に罹患しているか、その予防を必要とする対象を治療する方法であって、請求項１～５５のいずれか１項に記載のワクチンを前記対象に投与することを含む、方法。
  66. ベータコロナウイルスの感染症の治療に使用するための、またはベータコロナウイルス感染症の予防に使用するための、請求項１～５５のいずれか１項に記載のワクチン。
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