WO2023020637A1 - Antigenos quimericos para el control de coronavirus y composiciones que los comprenden - Google Patents
Antigenos quimericos para el control de coronavirus y composiciones que los comprenden Download PDFInfo
- Publication number
- WO2023020637A1 WO2023020637A1 PCT/CU2022/050009 CU2022050009W WO2023020637A1 WO 2023020637 A1 WO2023020637 A1 WO 2023020637A1 CU 2022050009 W CU2022050009 W CU 2022050009W WO 2023020637 A1 WO2023020637 A1 WO 2023020637A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- protein
- rbd
- chimeric antigen
- chimeric
- sars
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 91
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 91
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 91
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 23
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 title claims description 21
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 40
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 33
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims abstract description 16
- 101001028244 Onchocerca volvulus Fatty-acid and retinol-binding protein 1 Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 13
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 10
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 32
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 25
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 24
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 15
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 claims description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 3
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- -1 aluminum compound Chemical class 0.000 claims description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 6
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 abstract description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 41
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 41
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 39
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 35
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 102000008873 Angiotensin II receptor Human genes 0.000 description 21
- 108050000824 Angiotensin II receptor Proteins 0.000 description 21
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 20
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 20
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 15
- 230000004044 response Effects 0.000 description 12
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 11
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 11
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 11
- 210000001280 germinal center Anatomy 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 10
- 108091005634 SARS-CoV-2 receptor-binding domains Proteins 0.000 description 9
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 9
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 6
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 5
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 5
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 5
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 5
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 5
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 4
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 4
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 4
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 4
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 3
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 3
- 229930189065 blasticidin Natural products 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N (2s)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-aminoacetyl)amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000004176 Alphacoronavirus Species 0.000 description 2
- 241000008904 Betacoronavirus Species 0.000 description 2
- 102100021935 C-C motif chemokine 26 Human genes 0.000 description 2
- 241000288673 Chiroptera Species 0.000 description 2
- 241001461743 Deltacoronavirus Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000008920 Gammacoronavirus Species 0.000 description 2
- 101710114810 Glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 101000897493 Homo sapiens C-C motif chemokine 26 Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 208000025370 Middle East respiratory syndrome Diseases 0.000 description 2
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 2
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 description 2
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 2
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 101710167605 Spike glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 108700012920 TNF Proteins 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 229940022962 COVID-19 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 101100352418 Caenorhabditis elegans plp-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 244000084296 Hernandia moerenhoutiana Species 0.000 description 1
- 235000010044 Hernandia moerenhoutiana Nutrition 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 101150048279 KMS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 241001292005 Nidovirales Species 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 206010033307 Overweight Diseases 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 101000933967 Pseudomonas phage KPP25 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 108091006197 SARS-CoV-2 Nucleocapsid Protein Proteins 0.000 description 1
- 208000037847 SARS-CoV-2-infection Diseases 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 238000010162 Tukey test Methods 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 1
- 229940021704 adenovirus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N brefeldin A Chemical compound O[C@@H]1\C=C\C(=O)O[C@@H](C)CCC\C=C\[C@@H]2C[C@H](O)C[C@H]21 KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N 0.000 description 1
- JUMGSHROWPPKFX-UHFFFAOYSA-N brefeldin-A Natural products CC1CCCC=CC2(C)CC(O)CC2(C)C(O)C=CC(=O)O1 JUMGSHROWPPKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000010370 cell cloning Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001102 germinal center b cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 1
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000002809 long lived plasma cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229940038694 mRNA-based vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000002516 postimmunization Effects 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 229940126583 recombinant protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 210000005212 secondary lymphoid organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55516—Proteins; Peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Abstract
Antígenos quiméricos que comprenden un segmento que consiste en el dominio de unión al receptor de la proteína S1 o en la proteína N de dicho virus y el segmento extracelular de la proteína CD154 humana, así como composiciones vacunales contra el coronavirus SARS-CoV2 que comprenden al menos uno de esos antígenos y un adyuvante. Uso de los antígenos quiméricos para la fabricación de una composición vacunal contra SARS-CoV2. Método para la inducción de respuesta inmune contra el SARS-CoV2 en un individuo que lo necesita donde se administra una cantidad farmacéuticamente efectiva de al menos un antígeno quimérico que comprende el dominio de unión al receptor de la proteína S1 o la proteína N de dicho virus y el segmento extracelular de la proteína CD154 humana.
Description
ANTIGENOS QUIMERICOS PARA EL CONTROL DE CORONAVIRUS Y COMPOSICIONES QUE LOS COMPRENDEN
Campo de la técnica
La presente invención se encuadra dentro del campo de las vacunas para humanos, en particular para la protección contra el virus SARS-CoV2. La protección se logra mediante proteínas quiméricas que comprenden proteínas de dicho virus, como la nucleoproteína (N) o el dominio de unión al receptor de angiotensina II (ACE2) de la glicoproteína de la espícula (S), conocido como dominio RBD (del inglés, receptor binding domain). Estas proteínas se fusionaron al dominio extracelular del CD154 humano. Los antígenos quiméricos se emplean en la fabricación de composiciones vacunales que confieren protección temprana contra el virus SARS-CoV2.
Estado de la técnica anterior
Los coronavirus (CoVs) pertenecen a la subfamilia Othocoronavirinae, en la familia Coronaviridae del orden Nidovirales, según el décimo informe sobre taxonomía de virus del Comité International de Taxonomía de Virus. Los Othocoronavirinae se componen de cuatro géneros, incluidos alfacoronavirus (alfa-CoV), betacoronavirus (beta-CoV), gammacoronavirus (gamma-CoV) y deltacoronavirus (delta-CoV) (King, A. M. Q., et al. Arch. Virol. (2018), 163: 2601-2631). Los CoVs Alpha y Beta tienen la capacidad de infectar a los mamíferos; por ejemplo: murciélagos, cerdos, gatos y ratones (Kudelova, M., et al. Microb. Ecol. (2015), 70: 785-794.; Cui, J., et al. Nat. Rev. Microbiol. (2019), 17: 181-192). Los CoVs Gamma y Delta infestan preferiblemente a las aves, aunque se ha demostrado también su capacidad para infestar a algunos mamíferos (Ma, Y., et al. mBio (2015), 6:e00064).
Vahos CoVs afectan a los humanos, causando infecciones respiratorias leves y resfriados. No obstante, los brotes pandémicos de infecciones más severas causadas por estos virus han aumentado su prevalencia en los últimos años. El CoV conocido como SARS (del inglés, Severe Acute Respiratory Syndrome), CoV beta Linaje B, causó la primera pandemia del siglo XXI en los años 2002-2003. Esta pandemia tuvo su epicentro en China. El CoV conocido como MERS (del inglés, Middle East Respiratory Syndrome), CoV beta Linaje C, emergió una década después y las infecciones continúan en el Medio Oriente. En el año 2019, solo 7 años después del brote de MERS, el virus SARS-CoV2 (CoV beta Linaje B) que produce la enfermedad conocida como Covid-19 emergió en China causando una pandemia de proporciones
devastadoras (Saif, L.J., EMJ. 2020; D0l/10.33590/emj/200324). Su ocurrencia no constituyó un hecho inesperado, debido a que los científicos previamente identificaron el SARS-like CoV en murciélagos, al igual que el SARS (Li , W et al. (2005). Science 310, 676-679. doi: 10.1126/science.1118391 ; Ng OW, Tan YJ. Hum Vaccine Immunother. 2017; 13(1):186-9). En febrero del 2020, la Organización Mundial de la Salud (OMS) convocó a investigadores a nivel mundial para definir la agenda de investigación de medicamentos y vacunas contra el SARS-CoV2, a través de un proyecto de investigación y desarrollo conocido como R&D Blueprint.
SARS-CoV2 tiene un genoma de ácido ribonucleico (ARN), simple cadena y orientación positiva. Este genoma tiene 29,88 Kb y contiene aproximadamente 12 marcos de lectura abiertos. Como todos los CoV, estos genes codifican 4 proteínas estructurales mayoritarias: la nucleocápside (N) asociada al genoma de ARN y 3 proteínas de membrana: que son la glicoproteína de la espícula (S), la glicoproteína integral de membrana (M) y la proteína de la envoltura (E). Se conoce que en personas convalecientes de COVID-19 la mayor parte de la respuesta de anticuerpos neutralizantes, y una parte importante de la respuesta celular contra SARS-CoV2, se dirige contra la proteína S (Brouwer PJM, et al. Science 2020, 369(6504): 643-50). Sin embargo, investigaciones previas con otros CoV han implicado a la proteína S en fenómenos patológicos de inmunoamplificación, tanto en modelos animales como en la clínica (Lambert P, et al. Vaccine. 2020, 38(31):4783-91). La proteína S es una molécula de considerable tamaño (141 kDa), cuya forma activa es un trímero, está muy glicosilada (entre 17-22 sitios de N-glicosilación y un número variable de sitios de O-glicosilación) (Shajahan A, et al. Glycobiology 2020, 30(12): 981-988) y su conformación es mantenida por 13 puentes disulfuro (Kumar S, et al. Virus Disease. 2020, 31 (1): 13-21). Por ello, su expresión en sistemas heterólogos es compleja.
La proteína S contiene un dominio de unión al receptor (RBD), el cual comprende aproximadamente desde la cisteína 336 hasta la cisteína 525, y tiene una masa molecular aproximada de 25 kDa. Este dominio está involucrado en la unión viral y la fusión a la membrana celular, e induce anticuerpos neutralizantes que bloquean la unión al receptor de angiotensina II (ACE2) presente en las células del huésped. Hasta la fecha, el dominio RBD constituye el blanco fundamental para el desarrollo de las vacunas de subunidades contra SARS-CoV2 (Cheng et al. Current Tropical Medicine Reports (2020), 7:61-64). La reciente aparición de nuevas vahantes circulantes del virus, debido a mutaciones en el dominio RBD, ha suscitado
importantes preocupaciones sobre la eficacia geográfica y temporal de las vacunas (Garcia-Beltran, W.F., et al. Cell (2021), 184: 2372-2383). Por otra parte, la proteína N es la proteína más abundante del virus, es altamente conservada e inmunogénica (Gong, Y., et al., J. Virol. (2020), 94: e01925-19).
El 10 de mayo del 2021 se contabilizaban 97 candidatos vacunales en ensayos clínicos, y 183 en ensayos preclínicos, según el sitio oficial de la QMS. En el desarrollo de las vacunas contra SARS-CoV2 se están utilizando diversas tecnologías y plataformas, tales como ácidos nucleicos (ácido desoxirribonucleico (ADN) y ARN), vectores virales (replícateos y no replícateos), virus inactivado, virus vivo atenuado, vacunas de subunidades proteicas, partículas semejantes a virus y vectores virales replícateos o no replícateos, conjuntamente con células presentadoras de antígenos. Algunas de estas tecnologías se habían utilizado para desarrollar vacunas para otros CoVs (como el SARS y el MERS) y se habían probado en animales. Las rutas de administración de las vacunas han sido en su mayoría: oral, nasal o parenteral (subcutánea, intramuscular o intradérmica), siguiendo diferentes dosis y esquemas de vacunación. Cada tipo de vacuna tiene ventajas y desventajas con respecto a la inmunogenicidad, seguridad, facilidad de uso y eficacia.
A diferencia de las vacunas vivas atenuadas o inactivadas, que involucran a todo el patógeno, las vacunas de subunidades basadas en proteínas virales recombinantes individuales reducen la posibilidad de reacciones adversas. Sin embargo, estas vacunas presentan desafíos potenciales, como una inmunogenicidad débil y la necesidad de adyuvantes de refuerzo inmunológico y dosis múltiples (Hansson M., et al. Biotechnol. Appl. Biochem. (2000), 32: 95). Por otra parte, investigaciones previas demostraron que las modificaciones post-traduccionales en determinadas proteínas virales son cruciales para la inmunogenicidad de los antígenos en humanos, enfatizando la necesidad de sistemas confiables y efectivos para expresar antígenos recombinantes en células humanas (Lorenzo, E. et al., AMB Express 2019, 9: 139). CD154 tiene una función importante en la interacción de las células T con otras células del sistema inmune y en la diferenciación de células T (van Kooten C Y Banchereau J. J Leukoc Biol (2000), 67: 2-17; Ma DY y Clark EA. Semin Immunol (2009), 21 :265- 72). El uso de CD154 como adyuvante molecular ha sido explorado por varios grupos de investigación, empleando múltiples estrategias. En su mayoría, estas estrategias están basadas en adenovirus o vacunas de ADN (Cao J,et al. Vaccine (2010),
28:7514-22; Gómez, C.E., et al. Vaccine (2009), 27:3165-74; Yao, Q., et al. Vaccine 2010; 28:8147-56).
Un número significativo de estrategias de desarrollo de candidatos vacunales están basadas en RBD, la mayoría de los candidatos vacunales se basa en proteínas monoméricas (aunque algunos de los candidatos se sustentan también en proteínas multiméricas). Se han empleado estrategias de conjugación química a proteínas portadoras y/o nanopartículas basadas en polímeros con propiedades inmunoestimuladoras. Sin embargo, sigue siendo de interés el diseño y obtención de nuevos antígenos vacunales contra coronavirus, que prevengan o disminuyan en impacto de la infección desde tiempos tempranos post - inmunización, con el menor número de dosis posible, y que proporcionen protección a largo plazo mediante la activación de la respuesta de memoria, así como protección contra las nuevas cepas que se generan debido a mutaciones en el dominio RBD.
Explicación de la invención
La presente invención resuelve el problema antes mencionado al proveer antígenos quiméricos contra el coronavirus SARS-CoV2 que comprenden a) un segmento que consiste en el dominio de unión al receptor (RBD) de la proteína S1 o en la proteína N de dicho virus y b) el segmento extracelular de la proteína CD154 humana. Los antígenos quiméricos de la invención comprenden en su secuencia de aminoácidos una molécula estimuladora del sistema inmune, lo que propicia el desarrollo de una respuesta temprana, que protege a los humanos frente a la infección por el SARS- CoV2.
En una materialización de la invención, el dominio RBD de la proteína S1 del virus SARS-CoV2 presente en los antígenos quiméricos consiste en los aminoácidos 324 al 533 de dicha proteína. En una realización de la invención, adicionalmente, los antígenos quiméricos comprenden un segmento de seis residuos histidina y un espaciador entre el segmento que consiste en RBD o en la proteína N de dicho virus y el segmento extracelular de la proteína CD154.
En una realización particular, los antígenos quiméricos poseen una estructura modular, donde se disponen i) un segmento del dominio RBD de la proteína S de SARS-CoV2, ¡i) un segmento que comprende una secuencia de 6 histidinas, iii) un espaciador que consiste en 4 repeticiones de los aminoácidos Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, y iv) el dominio extracelular del CD154 humano, dispuestos en ese mismo orden.
En una materialización de la invención, el antígeno quimérico se caracteriza porque el segmento que consiste en el RBD de la proteína S1 posee una secuencia de aminoácidos que se identifica como SEQ ID NO: 1 y el segmento extracelular de la proteína CD154 posee una secuencia de aminoácidos que se identifica como SEQ ID NO: 3 (GeneBank Accesión NM_000074; aminoácidos 51-260). En una realización particular, dicho antígeno quimérico posee una secuencia de aminoácidos que se identifica como SEQ ID NO: 4 en el Listado de Secuencias. En la invención a este antígeno quimérico se le denomina RBD-CD154.
En otra materialización de esta invención el antígeno quimérico comprende: i) un segmento correspondiente a la proteína N de SARS-CoV2, ¡i) un segmento que comprende una secuencia de 6 histidinas, iii) un espaciador de 4 repeticiones de los aminoácidos Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, y iv) el dominio extracelular del CD154 humano, dispuestos en ese mismo orden. En una realización de la invención, el antígeno quimérico se caracteriza porque el segmento que consiste en la proteína N posee una secuencia de aminoácidos que se identifica como SEQ ID NO: 2 y el segmento extracelular de la proteína CD154 posee una secuencia de aminoácidos que se identifica como SEQ ID NO: 3. En una realización particular, dicho antígeno quimérico posee una secuencia de aminoácidos que se identifica como SEQ ID NO: 5. En la invención a este antígeno quimérico se le denomina N-CD154.
La secuencia de seis residuos histidina permite la purificación de los antígenos quiméricos mediante cromatografía de afinidad a quelatos metálicos. La incorporación del espaciador tiene la función de aportar un determinado grado de relajamiento a la cadena polipeptídica, que garantiza el plegamiento tridimensional de la estructura proteica. En la obtención de las proteínas quiméricas de la invención se pretende que la conformación tridimensional de los segmentos correspondientes a los antígenos de SARS-CoV2 presentes en los antígenos quiméricos sea similar a la nativa.
Los antígenos quiméricos se pueden producir por vía del ADN recombinante, como se ha demostrado en los ejemplos de la invención. En una materialización de la misma, sin que se limite su alcance, los antígenos quiméricos se obtienen en el sobrenadante de cultivo de células de mamíferos transformadas.
En una materialización de la invención, los antígenos vacunales quiméricos son obtenidos mediante la tecnología del ADN recombinante. En la invención, se generaron las vahantes RBD-CD154 y N-CD154 en células embrionarias de riñón HEK-293, empleando vectores lentivirales para la transformación celular. El sistema
de expresión empleado permitió que las proteínas quiméricas se produjeran en su forma glicosilada, lo que favorece la obtención de las moléculas con la estructura tridimensional adecuada.
Es objeto de la invención una composición vacunal contra el virus SARS-CoV2 que comprende al menos un antígeno quimérico que comprende a) un segmento que consiste en el RBD de la proteína S1 o en la proteína N de dicho virus y b) el segmento extracelular de la proteína CD154 humana, y un adyuvante farmacéuticamente aceptable. En una realización de la invención, el adyuvante farmacéuticamente aceptable es un compuesto de aluminio. En una materialización, la composición vacunal se formula para ser administrada a los humanos por una ruta sistémica.
En una realización particular, la composición vacunal comprende un primer antígeno quimérico que comprende un segmento que consiste en el RBD de la proteína S1 y un segundo antígeno quimérico que comprende la proteína N. Esta combinación de antígenos tiene el propósito de incrementar la eficacia de la vacunación respecto a nuevas vahantes del virus, debido a mutaciones en el dominio RBD. Dichas composiciones vacunales pueden ser administradas a los humanos de manera simultánea o secuencial en el curso de un esquema de inmunización.
Las composiciones vacunales que comprenden estas proteínas quiméricas confieren protección temprana contra el SARS-CoV2. Dicha protección está mediada por una respuesta inmune de tipo humoral y celular. También se observa un acortamiento en el tiempo en el que se inducen los anticuerpos neutralizantes. La respuesta generada permite la neutralización rápida y eficaz del virus.
A pesar de la inclusión de vahos segmentos en las construcciones genéticas, sorprendentemente, los antígenos vacunales contra SARS-CoV2 de la presente invención conservan las propiedades antigénicas e inmunogénicas similares al dominio RBD o a la proteína N del virus nativo. La inmunización con las moléculas quiméricas, producidas en sistemas de expresión como las células HEK-293, conduce a una repuesta inmune potente y temprana. El segmento proveniente de CD154 mantiene su actividad biológica y, aun dentro de los antígenos quiméricos, actúa como adyuvante molecular que estimula el sistema inmune de los animales vacunados, produciendo una respuesta inmune protectora después de dos dosis de vacuna.
En otro aspecto, la invención revela el uso de los antígenos quiméricos mencionados para la fabricación de una composición vacunal contra el virus SARS-CoV2. Además,
es objeto de la presente invención un método para la inducción de respuesta inmune contra el virus SARS-CoV2 en un individuo que lo necesita donde se administra una cantidad farmacéuticamente efectiva de al menos un antígeno quimérico que comprende a) un segmento que consiste en el RBD de la proteína S1 o en la proteína N de dicho virus y b) el segmento extracelular de la proteína CD154 humana, y un adyuvante farmacéuticamente aceptable. En una realización de la invención, en el método para la inducción de respuesta inmune contra el SARS-CoV2 se administra un antígeno quimérico que comprende un segmento que consiste en RBD de la proteína S1 y un antígeno quimérico que comprende la proteína N en el mismo esquema de inmunización. En una realización particular, ambos antígenos se administran simultáneamente en el individuo que lo necesita.
En otro aspecto, la invención revela un método para la inducción de respuesta inmune contra el SARS-CoV2 que se caracteriza porque se administra a un individuo que lo necesita una cantidad farmacéuticamente efectiva de una composición vacunal que comprende la(s) proteína(s) quimérica(s) antes descritas y excipientes o diluentes farmacéuticamente aceptables.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Análisis mediante western blotting de la proteína quimérica RBD-CD154 obtenida en el sobrenadante de cultivo de células HEK-293. A) western blotting empleando un anticuerpo monoclonal (AcM) anti His conjugado a peroxidasa (Sigma), donde las proteínas se separaron en condiciones reductoras en la electroforesis. B) western blotting empleando IgG purificadas, a partir de un suero de paciente convaleciente al SARS-CoV-2, y anti-lgG humana conjugado a peroxidasa como anticuerpo secundario, donde las proteínas se separaron en condiciones no reductoras en la electroforesis. Carril 1 : Patrón de peso molecular, carriles 2-4: Células transfectadas con el plasmidio pL6twBlast-RBD-CD154, carril 5: Células transfectadas con pCMV-GFP (Addgene) como control negativo. Las flechas indican la proteína de interés a la talla esperada y agregados de proteína de mayor peso molecular en condiciones no reductoras.
Figura 2. Análisis mediante western blotting de la proteína quimérica N-CD154 obtenida en el sobrenadante de cultivo de células HEK-293 A) western blotting empleando un AcM anti - proteína N conjugado a peroxidasa (CIGB Santi Spiritus, Cuba), B) western blotting empleando IgG purificadas a partir de un suero de paciente
convaleciente al SARS-CoV-2 y anti-lgG humana conjugado a peroxidasa como anticuerpo secundario. Carril 1 : Patrón de peso molecular. Carril 2: Células transfectadas con el plasmidio pL6twBlast-N-CD154, y condiciones reductoras en la electroforesis, carril 3: Células transfectadas con el plasmidio pL6twBlast-N-CD154, y condiciones no reductoras en la electroforesis. Las flechas indican la proteína de interés a la talla esperada y agregados de proteína de mayor peso molecular en condiciones no reductoras.
Figura 3. Respuesta de IgG en ratones determinada dos semanas después de la reinmunización con diferentes antígenos. Las inmunizaciones se realizaron en los días 0 y 21. (A) Respuesta generada contra el dominio RBD, (B) Respuesta generada contra la proteína N. Se realizó un test de comparación múltiple de Dunn. Diferentes letras representan diferencias estadísticamente significativas. Se representan las medias geométricas y el intervalo de confianza del 95%.
Figura 4. Inhibición de la unión al receptor ACE2 por los sueros de ratón obtenidos dos semanas después de la re-inmunización con los antígenos quiméricos. Las inmunizaciones se realizaron en los días 0 y 21 . Se realizó un test de comparaciones múltiples de Dunn. Diferentes letras representan diferencias estadísticamente significativas.
Figura 5. Porciento de células B en los centros germinales en muestras tomadas 7 días después de la inmunización de ratones. El porciento de células B se determinó mediante citometría de flujo. Se realizó un ANOVA seguido de un test de comparación múltiple de Tukey. Diferentes letras representan diferencias estadísticamente significativas. CG: centros germinales.
Figura 6. Respuesta de IgG generada contra la proteína N (A) y contra RBD (B) en los días 21 , 28, 35, 42 y 63 en Macaca fascicularís inmunizados con los antígenos quiméricos. Se realizó un test de comparación múltiple de Dunn. Diferentes letras representan diferencias estadísticamente significativas.
Figura 7. Inhibición de la unión de RBD al receptor ACE2 por los sueros obtenidos de los primates Macaca fascicularís inmunizados con proteína quimérica RBD-CD154, las proteínas quiméricas RBD-CD154 y N-CD154 administradas de forma simultánea (RBD+N), y proteína RBD, obtenidas en HEK-293. La línea discontinua representa el 60% de inhibición de la unión de RBD a ACE2.
Figura 8. Respuesta celular en Macaca fascicularís determinada como porciento de linfocitos T CD8+IFNy+ (A), TCD8+TNFa+ (B), T CD4+IFNy+ (C) y TCD4+TNFa+ (D). Se
realizó un test de comparación múltiple de Dunn. Diferentes letras representan diferencias estadísticamente significativas. Las determinaciones se realizaron mediante citometría de flujo.
Exposición detallada de modos de realización / Ejemplos de realización Ejemplo 1. Obtención de los segmentos génicos que codifican para el dominio RBD de la proteína S, la proteína N y el dominio extracelular del CD154 humano y clonación en el plasmidio pDisplay.
Con el objetivo de obtener la proteína quimérica RBD-CD154, se amplificó el fragmento de 631 pb que codifica para el dominio RBD de la proteína S del virus SARS-CoV2 (codifica para los aminoácidos 324-533 de dicha proteína, identificado como SEQ ID NO: 1). Por separado, con el objetivo de obtener la proteína quimérica N-CD154, se amplificó el gen de 1257 pb que codifica para la nucleoproteína N del mismo virus (la proteína N se identifica como SEQ ID NO: 2). En ambos casos la amplificación se realizó mediante la técnica de transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR, del inglés Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction). Se empleó como templado ARN total purificado a partir del suero de un paciente positivo al SARS-CoV2. Los oligonucleótidos se diseñaron a partir de la secuencia del genoma viral del aislamiento SARS-CoV2/human/CHN/KMS1/2020, anotado en la base de datos del Centro Nacional de Información en Biotecnología de Estados Unidos (en inglés “National Center for Biotechnology Information", abreviado NCBI), número de acceso MT226610. El fragmento de 630 pb que codifica para el dominio extracelular del CD154 humano (SEQ ID NO: 3) se obtuvo mediante PCR, a partir del plasmidio pCMV3-CD40LG-His (Sino Biological).
Para construir los genes quiméricos RBD-CD154 y N-CD154, se insertaron primeramente los nucleótidos que codifican para la cola de 6 residuos de histidina y el espaciador en los sitios de restricción Sma \-Sac II del sitio de clonación múltiple del plasmidio pDisplay (Invitrogen), mediante el empleo de oligonucleótidos sintéticos. Posteriormente, se insertó el fragmento que codifica para el dominio extracelular del CD154 humano, obtenido por PCR, en los sitios Sac W-Sal I. Los genes que codifican para la proteína N y el dominio RBD se insertaron en los sitios Bgl ll-Sma I, y se obtuvieron los vectores pDisplay-N-CD154 y pDisplay-RBD-CD154, respectivamente. Se verificó la funcionalidad de las unidades transcripcionales mediante transfección transitoria en células de la línea HEK-293 (del inglés, human embryonic kidney, ATCC
CRL-1573), con el empleo de polietileneimina (PEI) como agente de transfección. Se demostró, mediante electroforesis unidimensional en gel de poliacrilamida (SDS- PAGE) y western blotting, que las proteínas quiméricas RBD-CD154 y N-CD154 se producen en el sobrenadante de cultivo y que son reconocidas por un anticuerpo monoclonal (AcM) anti His (A7058, Sigma).
Ejemplo 2. Construcción de los vectores lentivirales y obtención de los lentivirus.
Con el objetivo de obtener líneas celulares de HEK-293 establemente transfectadas, que produzcan de forma constitutiva las proteínas quiméricas RBD-CD154 (SEQ ID NO: 4) y N-CD154 (SEQ ID NO: 5) en el sobrenadante de cultivo, se generaron vectores lentivirales que contenían los genes de interés. Estos vectores se utilizaron, posteriormente, para construir lentivirus quiméricos, que constituyen los agentes de transducción. Se emplearon vectores lentivirales de tercera generación: el vector pL6twBlast (que contiene el gen que confiere resistencia a blasticidina) como vector de transferencia y los plásmidos auxiliadores: pLP1 , pLP2 y pVSVG. Debido a que el vector de transferencia pL6twBlast no contiene promotor, se amplificó por PCR, a partir de las construcciones intermedias generadas en pDisplay, la unidad transcripcional que comprende el promotor/potenciador del citomegalovirus humano (CMV) y los genes RBD o N fusionados al dominio extracelular del CD154 humano mediante un segmento de histidinas y el espaciador. Para amplificar la unidad transcripcional que contiene la proteína N, se emplearon oligonucleótidos específicos y se incorporó el sitio Xma I en el oligonucleótido 3’. Posteriormente, se digirió el producto de PCR con esta enzima, y se clonó en el vector pL6twBlast en los sitios Xma I y EcoR \/. En el caso de la unidad transcripcional que contiene RBD, se siguió una estrategia similar pero incorporando el sitio Pst I en el oligonucleótido 3’. Posteriormente, se digirió el producto de PCR con esta enzima, y se clonó en el vector pL6twBlast en los sitios Pst \ y EcoR M. Como resultado, se obtuvieron los plasmidios pL6twBlast-N-CD154 y pL6twBlast-RBD-CD154. Las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos mencionados se resumen en la Tabla 1.
Tabla 1. Resumen de los polipéptidos mencionados.
Los plasmidios obtenidos se purificaron, secuenciaron y se verificó la producción de las proteínas quiméricas mediante transfección transitoria, con el empleo de PEI como agente de transfección. A las 72 horas se colectó el sobrenadante, y se realizó el análisis mediante SDS-PAGE y western blotting, empleando: a) un AcM antiHis (Sigma), b) IgG purificadas a partir de un suero humano positivo al SARS-CoV2 (CIGB Santi Spiritus, Cuba) o c) un AcM generado contra la proteína N recombinante obtenida en Escherichia coli (CIGB Santi Spiritus, Cuba). Como resultado de este ensayo, se corroboró la obtención de las proteínas quiméricas en el sobrenadante de cultivo y la funcionalidad de las unidades transcripcionales (Figuras 1 y 2). Además, se demostró que las proteínas RBD-CD154 y N-CD154 son reconocidas por las IgG purificadas a partir de un suero de paciente convaleciente al virus SARS-CoV2, lo que sugiere que la conformación de los segmentos de RBD y de proteína N en los polipéptidos quiméricos es similar a la conformación que tienen en las proteínas nativas del virus. Este resultado fue sorprendente, dado que la fusión de las proteínas virales al CD154 pudo cambiar la conformación de las mismas y, por tanto, afectar su reconocimiento por los anticuerpos de un paciente, inducidos tras la infección con el virus. Además, se observó la formación de agregados moleculares de alto peso en
condiciones no reductores (Figuras 1 y 2), que podrían incrementar la inmunogenicidad de las mismas.
Teniendo en cuenta estos resultados, se procedió a la obtención de las partículas lentivirales. Para esto, se sembraron 5 frascos T 75 cm2 de células HEK-293T (ATCC, CRL-3216) por cada construcción, en medio DMEM F-12 (del inglés, Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) suplementado con 10% de Suero Fetal Bovino (SFB), 48 horas antes, con el objetivo de tener 70-80% de confluencia celular en el momento de la transfección. Para transfectar y obtener las partículas lentivirales, se empleó una proporción pL6twBlast-N-CD154 (o pL6twBlast-RBD-CD154): pipi : plp2: pVSV-G de 2: 1 : 1 : 1 (m: m: m: m) y una proporción 1 :1 de PEI 160 000 y ADN. Esta mezcla de PEI-ADN se añadió a las células en medio DMEM F-12 sin SFB. Posteriormente, las células se incubaron por 6 horas a 37°C y 5% de CO2. Pasado ese tiempo, se añadió al medio de cultivo de las células transfectadas el SFB a una concentración final del 10%, y se incubaron las mismas durante 72 horas a 37°C y 5% de CO2. A las 72 horas, se colectó el sobrenadante de cultivo de las células transfectadas, y se precipitaron los lentivirus contenidos en este, mediante el empleo del reactivo LentiX concentrator (Invitrogen) y centrifugación. Las partículas lentivirales se cuantificaron con el empleo del juego de reactivos DAVIH-Ag P24 (Cuba), y se almacenaron a -80 °C hasta su uso.
Ejemplo 3. Transducción lentiviral, clonaje celular y purificación de proteínas.
La transducción lentiviral se efectuó en placas de 24 pozos, sembradas con células HEK-293 (ATCC CRL-1573) a una densidad celular de 2 x 104 células por pozo, en 2 mL de medio DMEM con 10% SFB. Los lentivirus se añadieron a diferentes multiplicidades de infección (50 y 100), empleando dos réplicas por condición. Posteriormente, las células se incubaron por 16 horas a 37 °C en 5% de CO2. Pasado ese tiempo, el medio de transducción fue reemplazado por 2 mL de medio fresco que contenía blasticidina, a una concentración final de 6 ug/mL. Las colonias resistentes a blasticidina se transfirieron a placas de 12 pozos, a los 14 días. En este momento todas las células controles (células que no fueron transducidas con el lentivirus quimérico y que se cultivaron en medio de cultivo con antibiótico a la misma concentración que las células transducidas) tuvieron 100% de mortalidad. Tres semanas después, se realizó el clonaje mediante el método de dilución limitante en placas de 96 pocilios (Costar), con el objetivo de obtener una célula por pocilio. Como resultado de este procedimiento, se seleccionaron 14-16 clones, en los cuales se
verificó la producción de la proteína de interés (RBD-CD154 o N-CD154), mediante un ensayo inmunoenzimático (ELISA, del inglés Enzyme-linked immunosorbent assay). Teniendo en cuenta el resultado del ELISA, se escogieron 6 clones de células productoras de cada proteína quimérica para su expansión, congelación y adaptación a medio libre de suero y proteínas CDM4 (HyClone CDM4HEK293, Cytiva), que se realizó gradualmente. Primero, se redujo el porciento de SFB del medio DMEM F-12 de 10% a 2,5%. Luego, se realizaron de 3 a 4 cambios del medio de cultivo con diferentes proporciones de los medios CDM4/DMEM-F12 (25/75, 50/50, 75/25 y 100/0), cada 72 horas.
Con el objetivo de purificar las proteínas quiméricas RBD-CD154 y N-CD154, a partir del sobrenadante de cultivo de los clones transformados, este se centrifugó y se mezcló con tampón fosfato salino (TFS: 137 mM NaCI; 2,7 mM KCI, 10 mM Na2HPÜ4, y 1 ,8 mM KH2PO4), en una proporción 1 :1 , y se filtró empleando filtros de 0,2 pm. Se aplicó la muestra en una columna de purificación XK16, empaquetada con una matriz de agarosa Ni-NTA (Qiagen). Se realizó un paso de lavado con TFS que contenía 20 mM de imidazol, y la elución con TFS con 250 mM de imidazol. Las diferentes fracciones se chequearon por SDS-PAGE y Western blotting. Las proteínas quiméricas RBD-CD154 y N-CD154 se obtuvieron con más de 85% de pureza. Además, se verificó la identidad de las proteínas purificadas, mediante espectrometría de masas, y en el caso de la proteína quimérica RBD-CD154 también se verificó la unión al receptor ACE2, mediante ELISA y Biacore.
Ejemplo 4. Ensayos de unión de la proteína quimérica RBD-CD154 al receptor ACE2.
Los análisis se realizaron en un biosensor BIACORE X (General Electric). Como tampón de corrida se utilizó TFS. El procedimiento de inmovilización se realizó a 25 °C, a un flujo de 5 pL/min. La superficie de un chip CM5 se activó con la aplicación de 35 pL de una solución de 1-etil-3-(3 dimetilaminopropil) carbodiimida (Sigma- Aldrich) a 0,2 mol/L y N-hidroxisuccinimida (Sigma-Aldrich) a 50 mmol/L, en agua. Seguidamente, se aplicó una solución de ACE2-Fc murino (30 pg/mL) en acetato de sodio a 10 mmol/L; pH 5,0. Al finalizar ese paso, se realizó una inyección de 35 pL de etanolamina 1 mol/L; pH 8,0; para bloquear los grupos NH2 que permanecían activados. En el canal que se empleó como control negativo, se realizaron solamente las inyecciones de activación y el bloqueo con etanolamina, empleando el mismo flujo
y volumen de inyección. Cada muestra se aplicó a un flujo de 10 pL/min por 120 s, luego se sustituyó por tampón de corrida y se registró la disociación durante otros 120 s. Para la regeneración de la superficie, se aplicaron 5 pL de NaOH 10 mM en agua. Para el análisis cinético, cada muestra se aplicó en diluciones seriadas desde 2 pM a 0,015 pM. Cada experimento se repitió tres veces con resultados similares. El análisis de los resultados se realizó mediante el programa BIAevaluation V4.1 (General Electric™). Se determinaron las velocidades de asociación (ka) y disociación (kd), así como la constante de afinidad (KD) de la interacción estudiada, a partir de un ajuste de Langmuir 1 :1. Esto se realizó en correspondencia con estudios de BIACORE previamente reportados para este par ligando-receptor, en formatos similares de experimento (Wang Q, et al. Cell (2020), 181 : 894-904; Jun Lan, et al. Nature (2020), 581 : 215-220.).
Se calculó la velocidad de asociación (ka=1 ,51 E+04 1/Ms), la velocidad de disociación (kd=4,63E 07 1/s), las unidades de resonancia magnética (Rmax=4,12E+01 RU) y la constante de disociación o afinidad (KD=3,63E-11 M). Los resultados demuestran que la proteína quimérica RBD-CD154 se une al receptor ACE2 inmovilizado, por lo que se mantiene su conformación en TFS a pH fisiológico. Otro aspecto importante es que la fusión al dominio extracelular del CD154 humano, por el extremo carboxilo, no afecta su capacidad de unión a ACE2. Este resultado fue sorprendente, esta proteína de fusión no existe en la naturaleza, y la incorporación de aminoácidos en uno de sus extremos pudiera afectar la conformación del segmento RBD, y por tanto la capacidad neutralizante de los anticuerpos que se generan mediante la inmunización con este antígeno quimérico.
Ejemplo 5. Evaluación de la respuesta inmune inducida en ratones por las proteínas quiméricas RBD-CD154 o N-CD154.
Con el objetivo de evaluar la inmunogenicidad de las proteínas quiméricas obtenidas, se inmunizaron ratones Balb/C hembras, de 6-8 semanas, de entre 15-18 gramos de peso. Como adyuvante se empleó Alhydrogel (Hidróxido de aluminio, Branntag Biosector), a una concentración final de 1 ,44 mg/mL. La adyuvación se realizó durante 16 horas a 4 °C. La inmunización se realizó por vía subcutánea, en un volumen de 0,1 mL con una dosis de 10 ug de antígeno/animal.
Se establecieron 5 grupos experimentales, de 15 animales cada uno: Grupo 1 : Se administró RBD-CD154, Grupo 2: Se administró N-CD154, Grupo 3: Se co-administró
RBD-CD154 y N-CD154 (N+RBD) en sitios diferentes de manera simultánea, Grupo 4: Placebo (TFS y adyuvante), Grupo 5: Se administró RBD. Para este y otros ensayos, la proteína RBD se obtuvo en el sobrenadante de cultivo de células HEK- 293, mediante transfección transitoria, y se purificó mediante cromatografía de afinidad a quelatos metálicos (IMAC), debido a que está fusionada a un segmento de 6 histidinas en el C-terminal.
Las inmunizaciones se realizaron en los días 0 y 21. Las extracciones de sangre se realizaron los días 0 y 35. A partir de la sangre, se realizó la extracción del suero, mediante centrifugación a 10 000 x g por 10 min a 4 °C. Los títulos de IgG específicos generados se determinaron mediante ELISA, recubriendo placas High binding (Costar) con la proteína RBD (obtenida en células HEK-293) a una concentración de 10 pg/mL, o con proteína N (obtenida en E. coli) a una concentración de 5 pg/mL, respectivamente. Estas placas se bloquearon con 3% de leche descremada en TFS- Tween 0,05% durante 1h a 37°C. A continuación, se realizaron 4 lavados con TFS- Tween 0,05% y se aplicaron en la placa 100 pL de diluciones del suero desde 1 :500 hasta 1 :32 000. Se incubó a 37°C durante 2 h. Se realizaron 4 lavados con TFS- Tween 0,05% y se adicionaron 100 pL de un AcM anti-lgG de ratón conjugado a peroxidasa (Sigma) diluido en solución de bloqueo, a una dilución de trabajo 1 :10000. Se incubó durante 1 h a 37°C. Después de 4 lavados, las reacciones se revelaron empleando una solución sustrato con tetrametilbencidina (TMB) y peróxido de hidrógeno, durante 10 min, a temperatura ambiente. Después de detener la reacción, las absorbancias de los pocilios se midieron a una longitud de onda de 450 nm en un lector de placas (SUMA, Centro de Inmunoensayo, Cuba). Se definió como título, la dilución del suero donde la absorbancia fue mayor o igual que el doble de la absorbancia del suero pre-inmune.
Los resultados de los títulos de IgG específicos para RBD mostraron que en los animales inmunizados con la proteína quimérica RBD-CD154 (Grupo 1), y en los que recibieron las proteínas RBD-CD154 y N-CD154 en co-administración simultánea (Grupo 3), se obtuvieron títulos promedio superiores a 1 : 27 000. En estos grupos todos los ratones tuvieron títulos de anticuerpos. En el caso del grupo inmunizado con la proteína RBD no se obtuvieron títulos de IgG estadísticamente significativos en el día 35 (2 semanas después de la re-inmunización), lo que demuestra una mayor inmunogenicidad de la proteína quimérica RBD-CD154, en comparación con la
proteína RBD sin el adyuvante molecular y obtenida en las mismas células (Figura 3A).
En los grupos inmunizados con la proteína quimérica N-CD154 (Grupo 2) y con las proteínas quiméricas RBD-CD154 y N-CD154 (Grupo 3) se obtuvieron títulos promedio contra la proteína N superiores a 1 :26 000. Este experimento demostró que las proteínas quiméricas RBD-CD154 y N-CD154, que comprenden el adyuvante molecular CD154, son capaces de inducir altos títulos de anticuerpos, tanto cuando se co-administran como cuando son administradas individualmente (Figura 3B).
También se midió la capacidad de estos sueros de inhibir la unión de la proteína RBD al receptor ACE2. Con este objetivo, se recubrió una placa de 96 pocilios (Costar) con la proteína de fusión ACE2-Fc murino (CIM, Habana) a una concentración de 5 ug/mL, durante 16 horas a 4°C, empleando un volumen de 50 pL por pocilio. En otra placa de 96 pocilios de cultivo, se añadieron 60 pL de una dilución 1 :50 de los sueros a evaluar, en tampón TFS-Tween 20 al 0,05% con leche descremada al 0,2% y se preincubó con el conjugado RBD-Fc humano - peroxidasa de rábano picante, a una dilución 1 :12 500 (dilución final del suero 1 :100). Se incubó la mezcla durante 1 h a 37 °C. Se lavó la placa de ELISA recubierta con ACE2-Fc murino 3 veces con TFS- Tween 20 al 0,1%. Se bloqueó con leche al 2% en TFS-Tween 20 al 0,05% con un volumen de 150 uL por pozo, por 1 hora a 37 °C. Pasado ese tiempo, se lavó la placa y se añadieron 50 pL de la mezcla de muestras y conjugado. Se incubó 1 h a 37 °C. Después de lavar 4 veces, las reacciones se revelaron empleando una solución sustrato con TMB y peróxido de hidrógeno, durante 10 min a temperatura ambiente. Después de detener la reacción, las absorbancias de los pocilios se midieron a una longitud de onda de 450 nm en un lector de placas (SUMA, Centro de Inmunoensayo, Cuba). El porciento de inhibición de la unión a ACE2 se determinó en comparación con la U máxima, donde se encontraban todos los componentes de la reacción excepto el suero. Es importante señalar que hay una correlación entre la capacidad de inhibición de la unión al receptor ACE2 de los sueros policlonales y el ensayo de neutralización viral in vitro (Zang J, et al. Cell Discov 2020, 6:61). Por lo tanto, el ensayo de inhibición se puede considerar un “marcador surrogado” de la capacidad neutralizante de los sueros.
Los resultados mostraron porcientos de inhibición de la unión a ACE2 superiores al 60% en el suero del 73-80% de los ratones co-inmunizados con las dos proteínas quiméricas o con la proteína quimérica RBD-CD154 sola, respectivamente (Figura 4).
Estos porcientos de inhibición fueron superiores a los obtenidos en el grupo inmunizado con RBD. En este grupo solo se detectaron títulos de IgG específicos para RBD en el suero de 5 animales, y solo el suero de un animal mostró un porciento de inhibición de la unión a ACE2 mayor del 60% (Figura 4). Estos resultados demuestran que al inmunizar con la proteína quimérica RBD-CD154 obtenida en células HEK-293 o co-inmunizar con las proteínas quiméricas N-CD154 y RBD- CD154, obtenidas en esa misma línea celular, se genera una respuesta de anticuerpos de mayor capacidad neutralizante. También se observó una mayor homogeneidad de la respuesta inmune evaluada en estos dos grupos que la observada al inmunizar con la proteína RBD sola.
Ejemplo 6. Evaluación del porciento de células B presente en los centros germinales de los ratones inmunizados.
Los centros germinales son estructuras microanatómicas en los órganos linfoides secundarios. En general, las reacciones que ocurren en los centros germinales son fundamentales para la inducción de respuestas de células B duraderas y de alta calidad. Recientemente, se demostró que una inmunización con ARN mensajero (ARNm) que codifica para RBD del SARS-CoV2 provocó una respuesta de células auxiliares foliculares en los centros germinales, específicas del SARS-CoV2, así como células plasmáticas de larga duración y células B de memoria (Lederer, K., et al. Immunity (2020), 53:1281-1295). Sin embargo, esta respuesta muy deseada para una vacuna eficiente no se logró con la vacuna de proteína recombinante en ese mismo estudio.
Para evaluar el porciento de células B presente en los centros germinales de los ratones inmunizados con las proteínas quiméricas de la invención, se inmunizaron ratones Balb/C hembras, de 6-8 semanas, de entre 15 y 18 gramos de peso. Se empleó como adyuvante Alhydrogel, a una concentración final de 1 ,44 mg/mL. La adyuvación se realizó durante 16 horas a 4 °C. La inmunización se realizó por vía intramuscular, en un volumen de 0,1 mL, empleando una dosis de 10 ug de antígeno/animal. Se establecieron 6 grupos experimentales, de 10 animales cada uno: Grupo 1 : Placebo (TFS y adyuvante), Grupo 2: antígeno quimérico N-CD154, Grupo 3: antígeno quimérico RBD-CD154, Grupo 4: co-administración de los antígenos quiméricos RBD-CD154 y N-CD154 (N+RBD) simultáneamente, Grupo 5: RBD, y Grupo 6: N (proteína obtenida en el sobrenadante de cultivo de células HEK-
293 mediante transfección transitoria y purificada mediante IMAC debido a que tiene una secuencia de 6 histidinas en el extremo C-terminal).
Las células B de los centros germinales se obtuvieron y cuantificaron de forma similar a lo descrito por Lederer et al. (Immunity (2020), 53: 1281-1295)). Los resultados que se grafican en la Figura 5 muestran que, después de una sola inmunización, no hay células B Fas+GL7+ detectadles en los centros germinales de los animales de los grupos placebo, RBD y N. En contraste, una población de células B de los centros germinales se detectó en los animales de los grupos inmunizados con una dosis de las proteínas quiméricas N-CD154 (4,46 ± 0,53), RBD-CD154 (5,02 ± 0,18) y del grupo que se inmunizó con una dosis de ambos antígenos quiméricos RBD-CD154 y N-CD154 (7,49 ± 0,39) simultáneamente, siendo superior en este último grupo. Estos resultados demuestran que las proteínas quiméricas tienen una capacidad superior de potenciar una respuesta de células B en los centros germinales, después de la administración de una dosis. Anteriormente, esto solo se había demostrado para vacunas basadas en ARNm de RBD, donde se observó que este mayor porciento de células B específicas en los centros germinales correlaciona de forma positiva con una producción mayor de anticuerpos neutralizantes (Lederer etal., Immunity (2020), 53: 1281-1295).
Ejemplo 7. Ensayo de inmunización con los antígenos quiméricos en primates no humanos.
Se realizó un ensayo de inmunización en monos de la especie Macaca fascicularís, del sexo masculino, de 3-4 años de edad y más de 2,5 Kg de peso. Este constituye el modelo animal apropiado para la respuesta funcional que se quería evaluar, debido a la identidad de secuencia entre la proteína CD154 del humano y la de los primates no humanos. Se emplearon 3 monos por grupo, y seis grupos experimentales. Los animales del Grupo 1 recibieron Placebo, los animales del Grupo 2 recibieron el antígeno quimérico N-CD154, los animales del Grupo 3 recibieron el antígeno quimérico RBD-CD154. En los animales del Grupo 4 se realizó la co-administración de los antígenos quiméricos N-CD154 y RBD-CD154 (N+RBD) simultáneamente, mientras que el Grupo 5 recibió el antígeno RBD y el Grupo 6 recibió el antígeno N. Las inmunizaciones se realizaron los días 0 y 21 del esquema, por vía intramuscular, con 25 pg de antígeno por dosis, en un volumen de 0,5 mL. Las extracciones de sangre para la obtención de suero se realizaron dos días antes de la primera inmunización y 21 , 28, 35, 42 y 63 días después de la primera dosis.
Los títulos de IgG específica para el dominio RBD o la proteína N se determinaron mediante un ELISA similar al descrito en el Ejemplo 5, pero empleando diluciones de los sueros desde 1 :400 hasta 1 :409 600 y un AcM anti-lgG humana conjugado (Jackson Immunology Research) diluido en solución de bloqueo, a una dilución de trabajo de 1 :80000. Se definió como título de anticuerpos a la dilución del suero donde la absorbancia fue mayor o igual que el doble de la absorbancia del suero pre-inmune. Se asignó un título de IgG de 200 para todas aquellas muestras cuya absorbancia no superó el doble de la absorbancia del suero preinmune a la dilución del suero de 1 :400.
Los resultados, que se reflejan en la Figura 6A, muestran que desde los 21 días después de la primera inmunización se produjeron títulos de anticuerpos específicos contra la proteína N, en el grupo inmunizado con el antígeno quimérico N-CD154 y en el que recibió los dos antígenos, N-CD154 y RBD-CD154, administrados simultáneamente (RBD+N). Además, los títulos de IgG específica contra la proteína N fueron superiores, con significación estadística, en el grupo inmunizado con el antígeno quimérico N-CD154 y con las dos proteínas quiméricas N-CD154 y RBD- CD154 a la vez, respecto a los títulos encontrados en el grupo inmunizado con el antígeno N solo (Figura 6A).
Por su parte, los títulos de IgG específica contra RBD fueron superiores, con significación estadística, en el grupo inmunizado con el antígeno quimérico RBD- CD154 y en los animales inmunizados con los dos antígenos quiméricos administrados simultáneamente (RBD+N), en comparación con el grupo inmunizado con el antígeno RBD solo (Figura 6B). Se observó un incremento significativo de los títulos contra RBD en los grupos inmunizados con las proteínas quiméricas una semana después de la re-inmunización. Estos resultados demuestran que la incorporación del segmento de CD154 en los antígenos quiméricos aumentó la inmunogenicidad de los mismos.
La evaluación de la inhibición de la unión de RBD a su receptor ACE2, por los sueros de los animales inmunizados, se realizó siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 5. Este análisis mostró que a partir del día 35 del esquema de inmunización y hasta el día 63, todos los monos inmunizados con el antígeno quimérico RBD- CD154 y los que recibieron los dos antígenos quiméricos N-CD154 y RBD-CD154 (RBD+N) simultáneamente mostraron porcientos de inhibición de la unión a ACE2 superiores al 65% (Figura 7). Los sueros de los monos inmunizados con el antígeno
RBD mostraron porcientos de inhibición de la unión a ACE2 inferiores, entre 35-65%. También se observó una menor dispersión de los valores en los grupos inmunizados con RBD-CD154 y con RBD+N.
Además del ensayo de inhibición de la unión RBD-ACE2, se llevó a cabo un ensayo de neutralización del virus, donde se evaluaron los sueros del día 35 del esquema de inmunización. Para el ensayo de neutralización viral, se emplearon dos vahantes del virus SARS-CoV2 (cepa Wuhan y cepa con la mutación D614G en el dominio RBD). Se sembraron un total de 20 000 células Vero E6 (ATCC) por pozo, en placas de 96 pocilios (COSTAR) en medio de cultivo MEM (del inglés, Eagle’s Minimal Essential Medium) suplementado con 2% de SFB (v/v). Los sueros a evaluar se inactivaron a 56 °C por 30 min. Posteriormente, se prepararon diluciones seriadas 1 :2 de los sueros en medio MEM suplementado con SFB 2%. La cepa de SARS-CoV2 a 100 TCIDso (carga viral que induce el 50% de ruptura de la monocapa de células Vero) fue incubada en presencia o ausencia del suero por 1 hora a 37 °C. Después, se añadieron las suspensiones virales a las células Vero. A las 96 horas, las células se inspeccionaron en un microscopio óptico, para evaluar los efectos citopáticos y se adicionó Rojo Neutro (Sigma). Después de tres lavados, el Rojo Neutro se disolvió con buffer de lisis (50% etanol, 1 % ácido acético) por 15 min a 25 °C. Por último, se realizó la lectura de la absorbancia a 540 nm. Se consideró título de neutralización la mayor dilución del suero evaluado que mostró un valor de absorbancia mayor que el valor de corte. El valor de corte se calculó como el promedio de los valores de la absorbancia de los pozos del control celular dividido entre dos. Los títulos de neutralización viral obtenidos frente a dos vahantes de SARS-CoV2 se muestran en las Tablas 2 y 3.
Tabla 2. Título de neutralización viral frente al virus SARS-CoV2 (vahante Wuhan) encontrado en los sueros obtenidos 14 días después de segunda dosis.
Tabla 3. Título de neutralización viral frente al virus SARS-CoV2 (vahante D614G) encontrado en los sueros obtenidos 14 días después de segunda dosis.
Como se esperaba, y en correspondencia con lo obtenido en el ensayo de inhibición de la unión de RBD al receptor ACE2 por los sueros de los animales inmunizados, los títulos de neutralización viral fueron mayores en los grupos inoculados con el antígeno quimérico RBD-CD154 y con los dos antígenos quiméricos N-CD154 y RBD-CD154 administrados simultáneamente (RBD+N), en comparación con los otros grupos donde los animales recibieron la formulación placebo o el antígeno RBD solo.
En resumen, los resultados indican que con la presencia del segmento de CD154 en el antígeno quimérico se genera en los primates una respuesta de anticuerpos no solo más vigorosa, si no de mejor calidad, que con el mismo antígeno recombinante sin ese segmento de CD154. Esto se reflejó en: 1) Mayores títulos de IgG específicos contra la proteína N y contra RBD, 2) Mayor porciento de inhibición de la unión de RBD al receptor ACE2 y 3) Mayores títulos de neutralización viral contra diferentes vahantes del virus.
Ejemplo 8. Respuesta celular específica en primates no humanos inmunizados con los antígenos quiméricos RBD-CD154 y N-CD154.
Este estudio se realizó en primates no humanos de la especie Macaca fascicularís. La inducción de células T que producen IFN-y y TNF-a, después de la inmunización, se determinó mediante citometría de flujo. Se aislaron los linfocitos de sangre periférica de los animales, en el día 35 del esquema de inmunización descrito en el Ejemplo 7, mediante un gradiente de Ficoll. Se sembraron 0,5-1 x 106 linfocitos por pocilio a una placa de 96 pozos de fondo redondo, por triplicado, y se cultivaron en medio de cultivo RPMI 1640 (del inglés, Roswell Park Memorial Institute) (Gibco) suplementado con 10% SFB, 100 U/rnL de penicilina-estreptomicina (Gibco), 1 mM piruvato de sodio (Gibco) y 50 pM p-mercaptoetanol (Sigma-Aldhch), en presencia de virus SARS-CoV2 (cepa CUT2010-2025/Cuba/2020) inactivado, durante 16-18 h. Se
usó Concanavalina A (5 pg/ml, Sigma-Aldrich) para estimular las células del control positivo. Se añadió brefeldina A (10 pg/ml, BD Biosciences) al cultivo, 1 hora después de la adición de los estímulos. Después del cultivo, las células se recolectaron y se tiñeron primero con el colorante fluorescente IR (Jive/dead near-IR fluorescent dye, Invitrogen) durante 20 min, y luego con los anticuerpos monoclonales anti-CD3 PEcy7 (Clon SK7) (BD Biosciences) y anti-CD4 PEcy5 (Clon RPA-T4) (BD Pharmingen), durante 30 min. Posteriormente, las células se fijaron y se permeabilizaron para teñir con los anticuerpos monoclonales anti-IFN-y conjugado a PE (Clon 4S.B3) (BD Biosciences 561056) y anti-TNF-a conjugado a FITC (Clon mAb11) (Invitrogen), durante 40-50 min. Se adquirió un total de 2x105 linfocitos en un citómetro Gallios (Beckam Coulter), y los datos se analizaron utilizando el software Kaluza versión 1.2. Se ha demostrado que las células T CD4+ y CD8+ desempeñan una función importante en la protección contra el SARS-CoV2. Los resultados, que se resumen en la Figura 8, demuestran que la administración de la proteína quimérica N-CD54 y de las proteínas quiméricas N-CD154 y RBD-CD154 simultáneamente (N+RBD) produce un incremento significativo del porciento de células T productoras de IFN-y y TNF-a, al estimular con el virus, lo que indica una activación de la respuesta inmune de memoria. Estos resultados, junto a los mostrados para la respuesta de anticuerpos específicos con capacidad neutralizante (Ejemplo 7), evidencian una mayor respuesta en los individuos inmunizados con las dos proteínas quiméricas.
Claims
1. Antígeno quimérico contra el coronavirus SARS-CoV2 que comprende a) un segmento que consiste en el dominio de unión al receptor de la proteína S1 o en la proteína N de dicho virus y b) el segmento extracelular de la proteína CD154 humana.
2. El antígeno quimérico según la reivindicación 1 donde el dominio de unión al receptor de la proteína S1 se caracteriza porque consiste en los aminoácidos 324 al 533 de dicha proteína.
3. El antígeno quimérico según la reivindicación 1 que adicionalmente comprende un un segmento de seis residuos histidina entre el segmento que consiste en el dominio de unión al receptor de la proteína S1 o en la proteína N de dicho virus y el segmento extracelular de la proteína CD154.
4. El antígeno quimérico según la reivindicación 1 que se caracteriza porque el segmento que consiste en el dominio de unión al receptor de la proteína S1 posee una secuencia de aminoácidos que se identifica como SEQ ID NO: 1 y el segmento extracelular de la proteína CD154 posee una secuencia de aminoácidos que se identifica como SEQ ID NO: 3.
5. El antígeno quimérico según la reivindicación 4 que se caracteriza porque posee una secuencia de aminoácidos que se identifica como SEQ ID NO: 4.
6. El antígeno quimérico según la reivindicación 1 que se caracteriza porque el segmento que consiste en la proteína N posee una secuencia de aminoácidos que se identifica como SEQ ID NO: 2 y el segmento extracelular de la proteína CD154 posee una secuencia de aminoácidos que se identifica como SEQ ID NO: 3.
7. El antígeno quimérico según la reivindicación 6 que se caracteriza porque posee una secuencia de aminoácidos que se identifica como SEQ ID NO: 5.
8. El antígeno quimérico según la reivindicación 1 que se caracteriza porque se obtiene en el sobrenadante de cultivo de células de mamíferos.
9. Composición vacunal contra el virus SARS-CoV2 caracterizada porque comprende al menos un antígeno quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 y un adyuvante farmacéuticamente aceptable.
La composición vacunal según la reivindicación 9 que se caracteriza porque el adyuvante farmacéuticamente aceptable es un compuesto de aluminio. La composición vacunal según la reivindicación 9 que se caracteriza porque se formula para ser administrada por ruta sistémica. La composición vacunal según la reivindicación 9 que se caracteriza porque comprende un antígeno quimérico que comprende un segmento que consiste en el dominio de unión al receptor de la proteína S1 y un antígeno quimérico que comprende la proteína N. Uso del antígeno quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para la fabricación de una composición vacunal contra el virus SARS-CoV2. Método para la inducción de respuesta inmune contra el virus SARS-CoV2 en un individuo que lo necesita donde se administra una cantidad farmacéuticamente efectiva de al menos un antígeno quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 y un adyuvante farmacéuticamente aceptable. El método de la reivindicación 14 donde se administra un antígeno quimérico que comprende un segmento que consiste en el dominio de unión al receptor de la proteína S1 y un antígeno quimérico que comprende la proteína N en el mismo esquema de inmunización. El método de la reivindicación 15 donde ambos antígenos se administran simultáneamente en el individuo que lo necesita.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CU2021000070A CU20210070A7 (es) | 2021-08-20 | 2021-08-20 | Antígenos quiméricos para el control de coronavirus y composiciones que los comprenden |
| CU2021-0070 | 2021-08-20 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2023020637A1 true WO2023020637A1 (es) | 2023-02-23 |
Family
ID=83690216
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/CU2022/050009 WO2023020637A1 (es) | 2021-08-20 | 2022-08-18 | Antigenos quimericos para el control de coronavirus y composiciones que los comprenden |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CU (1) | CU20210070A7 (es) |
| WO (1) | WO2023020637A1 (es) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007056266A2 (en) * | 2005-11-07 | 2007-05-18 | Sidney Kimmel Cancer Center | Cd40 ligand fusion protein vaccine |
| EP1994943A2 (en) * | 2006-02-28 | 2008-11-26 | Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia (Cigb) | Chimeric vaccine antigens against classical swine fever virus |
| WO2022101302A1 (en) * | 2020-11-12 | 2022-05-19 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Antibodies conjugated or fused to the receptor-binding domain of the sars-cov-2 spike protein and uses thereof for vaccine purposes |
-
2021
- 2021-08-20 CU CU2021000070A patent/CU20210070A7/es unknown
-
2022
- 2022-08-18 WO PCT/CU2022/050009 patent/WO2023020637A1/es unknown
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007056266A2 (en) * | 2005-11-07 | 2007-05-18 | Sidney Kimmel Cancer Center | Cd40 ligand fusion protein vaccine |
| EP1994943A2 (en) * | 2006-02-28 | 2008-11-26 | Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia (Cigb) | Chimeric vaccine antigens against classical swine fever virus |
| WO2022101302A1 (en) * | 2020-11-12 | 2022-05-19 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Antibodies conjugated or fused to the receptor-binding domain of the sars-cov-2 spike protein and uses thereof for vaccine purposes |
Non-Patent Citations (36)
| Title |
|---|
| ALAN GONZLEZ POSE ET AL: "Subunit influenza vaccine candidate based on CD154 fused to HAH5 increases the antibody titers and cellular immune response in chickens", VETERINARY MICROBIOLOGY, ELSEVIER BV, NL, vol. 152, no. 3, 17 May 2011 (2011-05-17), pages 328 - 337, XP028270707, ISSN: 0378-1135, [retrieved on 20110525], DOI: 10.1016/J.VETMIC.2011.05.033 * |
| ÁVALOS ILEANET ET AL: "Chimeric Antigen by the Fusion of SARS-CoV-2 Receptor Binding Domain with the Extracellular Domain of Human CD154: A Promising Improved Vaccine Candidate", VACCINES, vol. 10, no. 6, 3 June 2022 (2022-06-03), pages 897, XP055979511, DOI: 10.3390/vaccines10060897 * |
| BROUWER PJM ET AL., SCIENCE, vol. 369, no. 6504, 2020, pages 643 - 50 |
| CHENG ET AL., CURRENT TROPICAL MEDICINE REPORTS, vol. 7, 2020, pages 61 - 64 |
| CONG, Y. ET AL., J. VIROL., vol. 94, 2020, pages e01925 - 19 |
| CUI, J. ET AL., NAT. REV. MICROBIOL., vol. 17, 2019, pages 181 - 192 |
| GARCIA-BELTRAN, W.F. ET AL., CELL, vol. 184, 2021, pages 2372 - 2383 |
| GÓMEZ, C.E. ET AL., VACCINE, vol. 27, 2009, pages 3165 - 74 |
| GONZÁLEZ ALAÍN ET AL: "New antigen against avian influenza virus based on the fusion of the exposed domains of the H5 subtype hemagglutinin and the Gallus gallus CD154 protein", BIOTECNOLOGIA APLICADA, 1 January 2012 (2012-01-01), pages 275 - 278, XP055979707, Retrieved from the Internet <URL:http://scielo.sld.cu/pdf/bta/v29n4/bta09412.pdf> [retrieved on 20221109] * |
| GUPTA SACHIN ET AL: "Vaccination with a fusion protein that introduces HIV-1 gag antigen into a multitrimer CD40L construct results in enhanced CD8+ T cell responses and protection from viral challenge by vaccinia-gag", JOURNAL OF VIROLOGY (ONLINE), AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 88, no. 3, 1 February 2014 (2014-02-01), pages 1492 - 1501, XP009179457, ISSN: 1098-5514, DOI: 10.1128/JVI.02229-13 * |
| HANSSON M. ET AL., BIOTECHNOL. APPL. BIOCHEM., vol. 32, 2000, pages 95 |
| HASHEM ANWAR M ET AL: "A highly immunogenic, protective, and safe adenovirus-based vaccine expressing Middle East respiratory syndrome coronavirus S1-CD40L fusion protein in a transgenic human dipeptidyl peptidase 4 mouse model", JOURNAL OF INFECTIOUS DISEASES, vol. 220, no. 10, 4 July 2019 (2019-07-04), US, pages 1558 - 1567, XP055855073, ISSN: 0022-1899, Retrieved from the Internet <URL:http://academic.oup.com/jid/article-pdf/220/10/1558/30120825/jiz137.pdf> DOI: 10.1093/infdis/jiz137 * |
| JUN LAN ET AL., NATURE, vol. 581, 2020, pages 215 - 220 |
| KING, A. M. Q. ET AL., ARCH. VIROL., vol. 163, 2018, pages 2601 - 2631 |
| KUDELOVA, M. ET AL., MICROB. ECO!., vol. 70, 2015, pages 785 - 794 |
| KUMAR S ET AL., VIRUS DISEASE, vol. 31, no. 1, 2020, pages 13 - 21 |
| LAMBERT P ET AL., VACCINE, vol. 38, no. 31, 2020, pages 4783 - 91 |
| LEDERER, K. ET AL., IMMUNITY, vol. 53, 2020, pages 1281 - 1295 |
| LEI LEI ET AL: "CD40L-adjuvanted DNA vaccine carrying EBV-LMP2 antigen enhances anti-tumor effect in NPC transplantation tumor animal", CENTRAL EUROPEAN JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 43, no. 2, 1 January 2018 (2018-01-01), pages 117 - 122, XP055979575, ISSN: 1426-3912, DOI: 10.5114/ceji.2018.77379 * |
| LI, W ET AL., SCIENCE, vol. 310, 2005, pages 676 - 679 |
| LORENZO, E. ET AL., AMB EXPRESS, vol. 9, 2019, pages 139 |
| MA DYCLARK EA, SEMIN IMMUNOL, vol. 21, 2009, pages 265 - 72 |
| MA, Y. ET AL., MBIO, vol. 6, 2015, pages e00064 |
| MARLIN ROMAIN ET AL: "Targeting SARS-CoV-2 receptor-binding domain to cells expressing CD40 improves protection to infection in convalescent macaques", NATURE COMMUNICATIONS, 19 February 2021 (2021-02-19), pages 1 - 29, XP055879416, Retrieved from the Internet <URL:https://assets.researchsquare.com/files/rs-244682/v1/7becd25e-ba60-47bd-ac7a-8ecca60d16b1.pdf?c=1637595522> [retrieved on 20220114], DOI: 10.1038/s41467-021-25382-0 * |
| NG OWTAN YJ, HUM VACCINE IMMUNOTHER, vol. 13, no. 1, 2017, pages 186 - 9 |
| SHAJAHAN A ET AL., GLYCOBIOLOGY, vol. 30, no. 12, 2020, pages 981 - 988 |
| SIELING PETER ET AL: "Th1 Dominant Nucleocapsid and Spike Antigen-Specific CD4+ and CD8+ Memory T Cell Recall Induced by hAd5 S-Fusion + N-ETSD Infection of Autologous Dendritic Cells from Patients Previously Infected with SARS-CoV-2", MEDRXIV, 6 November 2020 (2020-11-06), pages 1 - 44, XP055845509, Retrieved from the Internet <URL:https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.11.04.20225417v1.full.pdf> [retrieved on 20210928], DOI: 10.1101/2020.11.04.20225417 * |
| STONE G W ET AL: "Multimeric soluble CD40 ligand and GITR ligand as adjuvants for human immunodeficiency virus DNA vaccines", JOURNAL OF VIROLOGY, THE AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 80, no. 4, 1 February 2006 (2006-02-01), pages 1762 - 1772, XP002711225, ISSN: 0022-538X, DOI: 10.1128/JVI.80.4.1762-1772.2006 * |
| SUÁREZ MARISELA ET AL: "A single dose of the novel chimeric subunit vaccine E2-CD154 confers early full protection against classical swine fever virus", VACCINE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 35, no. 34, 5 July 2017 (2017-07-05), pages 4437 - 4443, XP085133832, ISSN: 0264-410X, DOI: 10.1016/J.VACCINE.2017.05.028 * |
| TAMMING LEVI A. ET AL: "DNA Based Vaccine Expressing SARS-CoV-2 Spike-CD40L Fusion Protein Confers Protection Against Challenge in a Syrian Hamster Model", FRONTIERS IN IMMUNOLOGY, vol. 12, 12 January 2022 (2022-01-12), XP055979509, DOI: 10.3389/fimmu.2021.785349 * |
| VAN KOOTEN C YBANCHEREAU J, J LEUKOC BIOL, vol. 67, 2000, pages 2 - 17 |
| WANG NING ET AL: "Subunit Vaccines Against Emerging Pathogenic Human Coronaviruses", FRONTIERS IN MICROBIOLOGY, vol. 11, 28 February 2020 (2020-02-28), XP055843968, DOI: 10.3389/fmicb.2020.00298 * |
| WANG Q ET AL., CELL, vol. 181, 2020, pages 894 - 904 |
| WEI LI: "Synergistic antibody induction by antigen-CD40 ligand fusion protein as improved immunogen", CANCER RESEARCH, WILEY-BLACKWELL PUBLISHING LTD, GB, vol. 115, no. 2, 31 March 2005 (2005-03-31), pages 215 - 222, XP071275201, ISSN: 0019-2805, DOI: 10.1111/J.1365-2567.2005.02141.X * |
| YAO, Q. ET AL., VACCINE, vol. 28, 2010, pages 8147 - 56 |
| ZANG J ET AL., CELL DISCOV, vol. 6, 2020, pages 61 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CU20210070A7 (es) | 2023-03-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6294828B2 (ja) | インフルエンザウイルスワクチンおよびその使用 | |
| TWI486359B (zh) | 可用作誘發抗原專一性ｔ細胞反應之免疫原性增強劑之融合蛋白 | |
| CN113164586B (zh) | 免疫组合物及其制备方法与应用 | |
| JP5942296B2 (ja) | 少なくとも１つのｃｘｘｃモチーフを含むポリペプチドと異種抗原とを含む医薬組成物、及びその使用 | |
| JP2023524054A (ja) | ベータコロナウイルスの予防と治療 | |
| US11352416B2 (en) | Mosaic chimeric viral vaccine particle | |
| US6432679B1 (en) | Enhancement of B cell activation and immunoglobulin secretion by co-stimulation of receptors for antigen and EBV Gp350/220 | |
| KR20190056382A (ko) | 안정화된 그룹 2 인플루엔자 헤마글루티닌 줄기 영역 삼량체 및 그의 용도 | |
| WO2021254270A1 (zh) | 基于细胞膜展示冠状病毒免疫原以诱导中和抗体的方法 | |
| KR20220010478A (ko) | 기도 감염의 치료 또는 예방용 서브유닛 백신 | |
| JP2021511077A (ja) | インフルエンザウイルスワクチン及びその使用 | |
| CA2900318C (en) | Induction of cross-reactive cellular response against rhinovirus antigens | |
| CN113151184A (zh) | 基于细胞膜展示冠状病毒免疫原以诱导中和抗体的方法 | |
| WO2022135563A1 (zh) | 同时诱导抗多种病毒的免疫应答的方法 | |
| KR20230084478A (ko) | 면역원성 코로나 바이러스 융합 단백질 및 관련 방법 | |
| TW202206598A (zh) | 對抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２之疫苗及其製品 | |
| JP4382163B2 (ja) | ターゲッティング分子を用いた免疫応答の増強 | |
| Corigliano et al. | Plant heat shock protein 90 as carrier-adjuvant for immunization against a reporter antigen | |
| Liu et al. | A bacterially expressed SARS-CoV-2 receptor binding domain fused with cross-reacting material 197 a-domain elicits high level of neutralizing antibodies in mice | |
| Tong et al. | C3d enhanced DNA vaccination induced humoral immune response to glycoprotein C of pseudorabies virus | |
| WO2023020637A1 (es) | Antigenos quimericos para el control de coronavirus y composiciones que los comprenden | |
| WO2023018817A1 (en) | Truncated influenza neuraminidase and methods of using the same | |
| JP2018052953A (ja) | インフルエンザウイルスワクチンおよびその使用 | |
| TW201736599A (zh) | 靶向豬蘭格素(langerin)之抗原 | |
| CN113801206A (zh) | 利用受体识别域诱导抗新冠病毒中和抗体的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 22789152 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
| NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |