TW201736599A - 靶向豬蘭格素(langerin)之抗原 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於豬蘭格素結合蛋白。與該結合蛋白或該結合蛋白之片段連接之抗原將特異性靶向樹突狀細胞，引起抵抗該抗原之免疫反應。本發明亦描述藉由提供有效免疫來治療豬以抵抗疾病之方法。

Description

靶向豬蘭格素(LANGERIN)之抗原
本發明係關於抗豬蘭格素(Langerin)抗體。本發明亦係關於融合或共價連接至抗豬蘭格素抗體之抗原。抗原/抗體嵌合分子用於使抵抗由感染性病原體導致之疾病的豬免疫。亦提供治療抵抗由感染性病原體導致之疾病的豬的方法。
感染性病原體可在豬肉工業中造成極大經濟損害。抵抗病原性病毒及細菌之市售疫苗引起安全問題及/或缺乏全面療效。舉例而言，基於改良活(亦即毒性減弱)病毒(modified live viruses；MLV)之疫苗通常展示良好療效，但存在MLV可突變或重組以恢復至毒性的安全風險。不活化(亦即殺滅)病毒疫苗使用更安全，但很少與MLV疫苗一樣有效。不活化病毒亦可不誘發有效細胞免疫，MLV同樣如此。含有分離或重組病毒抗原之次單位疫苗為最安全替代物，但除非改良抗原且將強佐劑併入至疫苗中，否則該替代物可不有效誘發保護性抗體反應。 提高次單位疫苗之療效的一個方法為提高次單位抗原經由抗原呈遞細胞(antigen presenting cells；APC)吸收之效能，抗原呈遞細胞為諸如巨噬細胞及樹突狀細胞(dendritic cells；DC)。在此方法中，產生改良抗原，其中次單位抗原連接至辨識APC上表現之分子的結合蛋白。一個實例將為使抗原連接至特異性辨識APC上之表面標記物的抗體。已描述辨識豬DC-SIGN之抗體，其中連接至抗體之抗原靶向DC。Subramaniam等人, Vaccine 32: 6768-75 (2014)。另一種此類APC表面標記物可為蘭格素，亦稱作CD (分化簇)207，其由DC表現。然而，未鑑定出對豬蘭格素(pLangerin)之特異性及高親和力。 抗pLangerin抗體對於抵抗豬病原體之安全及有效次單位疫苗的研發將為有價值的。尤其有利的將為單株抗體(mAb)，其可經分子更改以產生對於pLangerin保留特異性及親和力之單鏈(sc)融合蛋白質。來源於豬病原體之抗原(Ag)可以重組方式或化學方式連接至sc融合蛋白質。sc融合蛋白質-Ag錯合物可隨後用於使豬免疫，以保護動物免受傳染病。
因此，本文揭示抗pLangerin單株抗體3B3，其可變(V)區可表現為sc融合蛋白質。3B3 sc融合蛋白質可以重組方式連接至另一域(如免疫球蛋白重鏈恆定片段(Fc))，以有助於嵌合分子之分離且提供一域用於另外修改及連接。嵌合體可藉由添加來自豬病原體之抗原進一步改良。代表性抗原為來自豬流行性下痢病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus；PEDV)之棘抗原(S Ag)。3B3scFv-pIgG2 Fc2-PEDV S Ag嵌合體可用以誘發豬中之免疫反應，諸如病毒中和血清抗體。 本發明提供包含SEQ ID NO：1之序列的核酸，其中核酸編碼抗豬蘭格素抗體重鏈可變區。抗體重鏈可包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列。核酸可進一步包含(不限於)以下中之任一者：信號序列、免疫球蛋白輕鏈之序列、輕鏈可變區之序列、免疫球蛋白重鏈之序列及/或重鏈恆定區(Fc)之序列。 本發明提供包含SEQ ID NO：1之序列且進一步包含SEQ ID NO：3之序列的核酸，其中核酸編碼豬蘭格素結合蛋白。核酸可在各別開放閱讀框架中編碼免疫球蛋白重鏈區及免疫球蛋白輕鏈區。核酸可編碼豬蘭格素結合蛋白中之單鏈可變區片段(scFv)。核酸可進一步包含(不限於)信號序列及/或彈性連接區序列。核酸可包含與SEQ ID NO：5之核苷酸1-894至少95%一致、96%一致、97%一致、98%一致、99%一致或99.5%一致的序列。核酸可包含與SEQ ID NO：5之核苷酸1-894一致的序列。核酸可包含與至少SEQ ID NO：5之核苷酸67-444及514-894一致的序列。 本發明提供包含SEQ ID NO：1之序列且進一步包含SEQ ID NO：3之序列的核酸，其中核酸編碼豬蘭格素結合蛋白之單鏈可變區片段(scFv)。核酸可進一步包含免疫球蛋白重鏈恆定區片段(Fc)序列。Fc序列可為豬免疫球蛋白Fc之序列。包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3之序列及豬免疫球蛋白Fc序列的核酸可包含與SEQ ID NO：5至少95%一致、96%一致、97%一致、98%一致、99%一致或99.5%一致的序列。例如且不受限制，可在信號序列、彈性連接區之序列、短連接區之序列及/或豬免疫球蛋白Fc之序列中存在變異性。此外，不同密碼子在不改變由SEQ ID NO：5編碼之肽的情況下可取代SEQ ID NO：5內所含有之彼等密碼子。 本發明提供包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3之序列及豬免疫球蛋白Fc序列的核酸，其中核酸編碼具有與SEQ ID NO：6至少95%一致、96%一致、97%一致、98%一致、99%一致或99.5%一致的胺基酸序列的肽。例如且不受限制，可在信號序列、彈性連接區之序列、短連接區之序列及/或豬免疫球蛋白Fc之序列中存在變異性。本發明提供包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3之序列及豬免疫球蛋白Fc序列的核酸，其中核酸編碼具有與至少SEQ ID NO：6之胺基酸23-148及172-298一致的胺基酸序列的肽。 本發明提供包含SEQ ID NO：1之序列的核酸、包含SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：3之序列的核酸，及包含SEQ ID NO：1及3之序列及豬免疫球蛋白Fc序列的核酸，其中各核酸可進一步包含來源於豬病原體之序列。豬病原體可為病毒或細菌株。豬病原體可為選自以下之群的病毒：豬生殖與呼吸症候群(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome；PRRS)病毒、豬流行性下痢病毒(PEDV)、傳染性胃腸炎病毒(Transmissible Gastroenteritis virus；TGEV)、經典豬瘟(Classical Swine Fever；SCF)病毒、豬流感病毒、豬冠狀病毒、豬環狀病毒、豬小病毒、豬痘病毒、豬腺病毒、豬狂犬病病毒、豬疱疹病毒及豬小核糖核酸病毒。本發明提供包含SEQ ID NO：1之序列的核酸、包含SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：3之序列的核酸，及包含SEQ ID NO：1及3之序列及豬免疫球蛋白Fc序列的核酸，其中各核酸可進一步包含來源於豬病原體之序列，其為來源於豬病原體PEDV之棘抗原序列。 本發明提供包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3之序列、豬免疫球蛋白Fc序列及來源於豬病原體之序列的核酸，其中核酸包含與SEQ ID NO：7至少95%一致、96%一致、97%一致、98%一致、99%一致或99.5%一致的序列。例如且不受限制，可在信號序列、彈性連接區之序列、短連接區之序列及/或豬免疫球蛋白Fc之序列中存在變異性。來源於豬病原體之序列可在給定豬病原體之不同株中變化。本發明提供包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3之序列、豬免疫球蛋白Fc序列及來源於豬病原體之序列的核酸，其中核酸包含SEQ ID NO：7之序列。 本發明提供包含SEQ ID NO：3之序列的核酸，其中核酸編碼豬蘭格素結合蛋白。SEQ ID NO：3代表小鼠抗豬蘭格素抗體之輕鏈可變區的核酸序列。抗體可包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列。核酸可進一步包含(不限於)以下中之任一者：信號序列、免疫球蛋白輕鏈之序列、輕鏈可變區之序列、免疫球蛋白重鏈之序列及/或重鏈恆定區(Fc)之序列。 本發明提供包含SEQ ID NO：1之序列的核酸的用途，用於製造治療患有傳染病的豬的藥物。本發明提供包含SEQ ID NO：3之序列的核酸的用途，用於製造治療患有傳染病的豬的藥物。本發明提供包含SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：3之序列的核酸的用途，用於製造治療患有傳染病的豬的藥物。本發明提供包含SEQ ID NO：1及3之序列及豬免疫球蛋白Fc序列的核酸的用途，用於製造治療患有傳染病的豬的藥物。本發明提供包含SEQ ID NO：5之序列的核酸的用途，用於製造治療患有傳染病的豬的藥物。本發明提供包含SEQ ID NO：5之核苷酸1-894之序列的核酸的用途，用於製造治療患有傳染病的豬的藥物。本發明提供包含SEQ ID NO：5之核苷酸67-444及514-894之序列的核酸的用途，用於製造治療患有傳染病的豬的藥物。本發明提供包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3之序列、豬免疫球蛋白Fc序列及來源於豬病原體之序列的核酸的用途，用於製造治療患有傳染病的豬的藥物。本發明提供包含SEQ ID NO：7之序列的核酸的用途，用於製造治療患有傳染病的豬的藥物。 本發明提供包含SEQ ID NO：1之序列的核酸用於治療。本發明提供包含SEQ ID NO：3之序列的核酸用於治療。本發明提供包含SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：3之序列的核酸用於治療。本發明提供包含SEQ ID NO：1及3之序列及豬免疫球蛋白Fc序列的核酸用於治療。本發明提供包含SEQ ID NO：5之序列的核酸用於治療。本發明提供包含SEQ ID NO：5之核苷酸1-894之序列的核酸用於治療。本發明提供包含SEQ ID NO：5之核苷酸67-444及514-894之序列的核酸用於治療。本發明提供包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3之序列、豬免疫球蛋白Fc序列及來源於豬病原體之序列的核酸用於治療。本發明提供包含SEQ ID NO：7之序列的核酸用於治療。 本發明提供包含SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：4之胺基酸序列的豬蘭格素結合蛋白。SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：4之胺基酸序列可存在於各別肽或單個肽上。本發明提供包含SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：4之胺基酸序列的豬蘭格素結合蛋白，其中豬蘭格素結合蛋白為單鏈可變區片段(scFv)融合蛋白質。本發明提供包含SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：4之胺基酸序列的豬蘭格素結合蛋白，或包含SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：4之胺基酸序列的scFv，其中豬蘭格素結合蛋白或scFv進一步包含彈性連接區及免疫球蛋白重鏈恆定區片段(Fc)肽中之至少一者。本發明提供包含SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：4之胺基酸序列的豬蘭格素結合蛋白，或包含SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：4之胺基酸序列的scFv，其中豬蘭格素結合蛋白或scFv進一步包含彈性連接區及免疫球蛋白重鏈恆定區片段(Fc)肽兩者。本發明提供包含SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：4之胺基酸序列的豬蘭格素結合蛋白，或包含SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：4之胺基酸序列的scFv，其中豬蘭格素結合蛋白或scFv進一步包含彈性連接區及免疫球蛋白重鏈恆定區片段(Fc)肽兩者，且其中Fc肽為豬Fc肽。 本發明提供豬蘭格素結合蛋白，其中豬蘭格素結合蛋白包含與SEQ ID NO：6至少95%一致、96%一致、97%一致、98%一致、99%一致或99.5%一致的胺基酸序列。本發明提供豬蘭格素結合蛋白，其中豬蘭格素結合蛋白包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列。本發明提供豬蘭格素結合scFv融合蛋白質，其中融合蛋白質包含與SEQ ID NO：6之殘基23-298至少95%一致、96%一致、97%一致、98%一致、99%一致或99.5%一致的胺基酸序列。本發明提供豬蘭格素結合scFv融合蛋白質，其中融合蛋白質包含SEQ ID NO：6之殘基23-298的胺基酸序列。本發明提供豬蘭格素結合蛋白或豬蘭格素結合scFv融合蛋白質，其進一步包含來自豬病原體之抗原肽，其中豬病原體為病毒或細菌株。豬病原體可為選自以下之群的病毒：豬生殖與呼吸症候群(PRRS)病毒、豬流行性下痢病毒(PEDV)、傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、經典豬瘟(SCF)病毒、豬流感病毒、豬冠狀病毒、豬環狀病毒、豬小病毒、豬痘病毒、豬腺病毒、豬狂犬病病毒、豬疱疹病毒及豬小核糖核酸病毒。本發明提供豬蘭格素結合蛋白或豬蘭格素結合scFv融合蛋白質，其進一步包含來自豬病原體之抗原肽，其中來自豬病原體之抗原肽為PEDV棘抗原肽。 本發明提供免疫性組合物，其包含本文所述之豬蘭格素結合蛋白或豬蘭格素結合scFv融合蛋白質構築體中之任一者。免疫性組合物可進一步包含佐劑、賦形劑、穩定劑、增溶劑及稀釋劑中之至少一者。 本發明提供豬蘭格素結合蛋白或豬蘭格素結合scFv融合蛋白質構築體中之任一者用於治療。本發明提供免疫性組合物，其包含豬蘭格素結合蛋白或豬蘭格素結合scFv融合蛋白質構築體中之任一者用於治療。 本發明提供豬蘭格素結合蛋白或豬蘭格素結合scFv融合蛋白質構築體中任一者的用途，其用於製造治療豬傳染病的藥物。本發明提供包含豬蘭格素結合蛋白或豬蘭格素結合scFv融合蛋白質構築體中任一者的免疫性組合物的用途，其用於製造治療豬傳染病的藥物。豬之傳染病可為由豬病原體(諸如病毒或細菌株)引起之疾病。豬病原體可為選自以下之群的病毒：豬生殖與呼吸症候群(PRRS)病毒、豬流行性下痢病毒(PEDV)、傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、經典豬瘟(SCF)病毒、豬流感病毒、豬冠狀病毒、豬環狀病毒、豬小病毒、豬痘病毒、豬腺病毒、豬狂犬病病毒、豬疱疹病毒及豬小核糖核酸病毒。 本發明提供豬蘭格素結合蛋白或豬蘭格素結合scFv融合蛋白質構築體中之任一者用於治療患有傳染病的豬。本發明提供包含豬蘭格素結合蛋白或豬蘭格素結合scFv融合蛋白質構築體中之任一者的免疫性組合物用於治療患有傳染病的豬。豬之傳染病可為由豬病原體(諸如病毒或細菌株)導致之疾病。豬病原體可為選自以下之群的病毒：豬生殖與呼吸症候群(PRRS)病毒、豬流行性下痢病毒(PEDV)、傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、經典豬瘟(SCF)病毒、豬流感病毒、豬冠狀病毒、豬環狀病毒、豬小病毒、豬痘病毒、豬腺病毒、豬狂犬病病毒、豬疱疹病毒及豬小核糖核酸病毒。 本發明提供治療患有傳染病的豬的方法，該方法包含向豬投與豬蘭格素結合蛋白或豬蘭格素結合scFv融合蛋白質，其進一步包含來自豬病原體之抗原肽。豬之傳染病可為由豬病原體(諸如病毒或細菌株)導致之疾病。豬病原體可為選自以下之群的病毒：豬生殖與呼吸症候群(PRRS)病毒、豬流行性下痢病毒(PEDV)、傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、經典豬瘟(SCF)病毒、豬流感病毒、豬冠狀病毒、豬環狀病毒、豬小病毒、豬痘病毒、豬腺病毒、豬狂犬病病毒、豬疱疹病毒及豬小核糖核酸病毒。來自豬之抗原肽可為PEDV S抗原肽。投與豬蘭格素結合蛋白或豬蘭格素結合scFv融合蛋白質可預防性或治療性地進行。 本發明提供治療患有傳染病的豬的方法，該方法包含向豬投與包含豬蘭格素結合蛋白或豬蘭格素結合scFv融合蛋白質之免疫性組合物，其進一步包含來自豬病原體之抗原肽。豬之傳染病可為由豬病原體(諸如病毒或細菌株)導致之疾病。豬病原體可為選自以下之群的病毒：豬生殖與呼吸症候群(PRRS)病毒、豬流行性下痢病毒(PEDV)、傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、經典豬瘟(SCF)病毒、豬流感病毒、豬冠狀病毒、豬環狀病毒、豬小病毒、豬痘病毒、豬腺病毒、豬狂犬病病毒、豬疱疹病毒及豬小核糖核酸病毒。來自豬之抗原肽可為PEDV S抗原肽。投與包含豬蘭格素結合蛋白或豬蘭格素結合scFv融合蛋白質之免疫性組合物可預防性或治療性地進行。 本發明進一步提供包含如本文所揭示之核酸的載體(諸如表現載體)及宿主細胞。表現載體之非限制性實例論述於說明性實例中。該等載體可包含SEQ ID NO：1之序列及另外SEQ ID NO：3之序列，其中載體可表現豬蘭格素結合蛋白。載體可包含在各別開放閱讀框架中編碼免疫球蛋白重鏈區及免疫球蛋白輕鏈區之核酸序列。載體可包括編碼豬蘭格素結合蛋白之單鏈可變區片段(scFv)的核酸。載體可包括進一步包含(不限於)信號序列及/或彈性連接區序列之核酸序列。載體可包括核酸序列，其包含與SEQ ID NO：5之核苷酸1-894至少95%一致、96%一致、97%一致、98%一致、99%一致或99.5%一致的序列；與SEQ ID NO：5之核苷酸1-894一致的序列；或與至少SEQ ID NO：5之核苷酸67-444及514-894一致的序列。 宿主細胞可藉由本文揭示之表現載體及核酸序列轉換，且可為原核細胞或真核細胞。該等宿主細胞之實例為此項技術中已知的且可包括細菌細胞，諸如大腸桿菌(E . coli )；動物細胞，諸如哺乳動物宿主細胞CHO及COS；植物細胞；酵母細胞，諸如釀酒酵母(S . cerevisiae )；或真菌細胞。因此，本發明提供包含本文所述之載體及/或核酸的宿主細胞。
本文揭示對豬蘭格素具有高親和力之單株抗體3B3。編碼mAb 3B3 mAb之重鏈可變區的核苷酸序列為：(SEQ ID NO：1)。 mAB 3B3之重鏈可變區的胺基酸序列為：(SEQ ID NO：2)。 mAb 3B3之輕鏈可變域的核苷酸序列包含以下序列：(SEQ ID NO：3)。mAb 3B3之輕鏈可變區的胺基酸序列為：(SEQ ID NO：4)。 抗體單元可具有兩個重鏈及兩個輕鏈，各含有可變及恆定域。抗原結合域及片段可基於重鏈及輕鏈可變域序列之部分設計及產生。舉例而言，F(ab')2 片段可含有輕鏈及兩個重鏈之可變域、第一恆定域及鉸鏈區。Fab片段可含有單個輕鏈，及單個重鏈之可變域及第一恆定域。亦可形成含有與可變重鏈域成序列之可變輕鏈域的單鏈，結果為「scFv」融合肽。因此，本發明提供豬蘭格素結合蛋白或其蘭格素結合部分，其包含本文揭示之豬蘭格素抗體的一或多個抗原結合域。蘭格素結合活性之測定可使用可偵測、測定及/或定量蘭格素(例如，豬蘭格素)與蘭格素結合蛋白或其結合部分之間結合的量的任何常見結合分析來評估。 3B3重鏈及輕鏈可變域可在scFv構築體中連接。連接域必須為彈性且足夠長的，以使得可變肽域在功能性構形中成對，但此外連接子及/或連接域之胺基酸序列可變化。本文揭示之蘭格素結合蛋白的連接子序列可視其是否被鑑定為「短連接子」或更長之序列而在長度上有變化，且提供更「彈性連接子」序列。短連接子序列之非限制性實例提供於說明性序列中且通常為1至不大於10 (例如，10、9、8、7、6、5、4、3、2或1)個胺基酸殘基長度。較短連接子可用於在分子已組裝之後接合接近彼此定位之域及/或區，其中域相對於其他域之三級相互作用及定向對於所需功能而言不為必要的。在一些實施例中短連接子為1至5個胺基酸長度(例如，1、2、3、4或5個胺基酸殘基)。包括彈性連接子之其他較長連接區通常包含至少8個胺基酸殘基且可包含至多約50個胺基酸殘基(例如，8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或約50個殘基)長度。該等連接子之部分可為彈性、親水性的且具有極少或無其自身之二級結構(連接子部分或彈性連接子部分)。如本文所說明，當使用多個連接子以使蘭格素結合蛋白之不同域/部分互相連接時，連接子可相同或不同(例如，相同或不同的長度及/或胺基酸序列)。連接子可有助於形成蘭格素結合蛋白之三級結構且幫助賦予或改良蘭格素結合活性或親和力。連接子之非限制性實例可包含(Gly-Ser)n 殘基，其中n為正整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)，具有分散遍及之一些麩胺酸或離胺酸以提高溶解度。其他連接子基元及序列可結合本文揭示之蘭格素結合蛋白使用。 3B3 scFv融合蛋白質亦可含有前導序列，諸如引導融合蛋白質之胞外分泌的前導序列。如熟習此項技術者將理解，多種不同前導序列(例如，信號序列)可併入至3B3 scFv融合蛋白質中。前導序列通常裂解自融合蛋白質之殘餘成熟形式。 3B3 scFv融合蛋白質可進一步含有額外域。額外域可適用於融合蛋白質之純化或分離，或可提供殘基用於化學修飾或連接。舉例而言，重鏈恆定區片段(Fc)可添加至3B3 scFv融合蛋白質以准許使用抗體結合細菌蛋白A及/或蛋白G之融合蛋白質的分離。若3B3 scFv融合蛋白質欲用於使豬免疫，則可使用豬Fc，其降低抵抗3B3 scFv-Fc嵌合蛋白質之宿主免疫反應的風險。 3B3 scFv融合蛋白質可進一步含有來自豬病原體之抗原。病原體可為病毒或細菌。舉例而言，抗原可為豬流行性下痢病毒(PEDV)之棘(「S」)蛋白。多個抗原或T細胞抗原決定基可包括於單個3B3 scFv融合蛋白質中。抗原可化學連接至3B3 scFv融合蛋白質。可替代地，抗原之核苷酸序列可連接至3B3 scFv融合構築體之核苷酸序列，使得3B3 scFv融合蛋白質及抗原存在於單個多肽中。 含有至少一個抗原或抗原決定基之3B3 scFv融合蛋白質可用以使豬免疫。構築體之3B3 scFv部分將結合由豬樹突狀細胞(DC)表現之豬蘭格素。此結合應有助於嵌合蛋白質經由DC吸收。在DC表面上之主要組織相容複合體(major histocompatibility complex；MHC)1類蛋白質的情形下嵌合蛋白質將被處理且肽呈遞至T淋巴細胞。含有3B3 scFv融合蛋白質(其具有至少一個抗原或抗原決定基)之免疫性組合物亦可含有佐劑，使得佐劑活化DC且增強T細胞經由DC之刺激。 「抗原」為能夠經由生物體之免疫系統特異性偵測的任何分子。通常病毒抗原為由病毒基因組編碼之病毒蛋白或來源於病毒基因組之產物。病毒抗原之存在可經由宿主T淋巴細胞及宿主B淋巴細胞兩者之表面抗原受體特異性偵測，且經由宿主細胞合成之抗體分子特異性偵測。「抗原決定基」為由經淋巴細胞表現之抗原特異性受體辨識的肽或肽構形。 「融合」或「嵌合」蛋白質為在單個序列中含有不天然連接之兩個或更多個胺基酸序列的肽。 「免疫原性」係指抗原誘發免疫反應的能力，該免疫反應包含抗原特異性反應及非抗原特異性反應兩者或先天性免疫反應。「保護性免疫」為當經免疫動物受病原性病毒株刺激或暴露於病原性病毒株時可減少或防止臨床症狀的免疫反應。如熟習此項技術者將理解，保護性免疫可隨時間或隨經免疫動物的年齡增加而衰退。如本文所使用之保護性免疫應自免疫接種之最遲日期持續至少4個月有效，但較佳至少6個月。保護性免疫可藉由疫苗之單次劑量誘發。二次或另外劑量可用於提高或延長保護性免疫反應。舉例而言，提高育種母豬中之保護性免疫反應可導致豬崽中源自母本之抗體的含量增加。 與抗原成對比，「佐劑」為免疫反應之非特異性刺激劑。佐劑可藉由結合及活化模式辨識受體(pattern recognition receptor；PRR)來刺激先天性免疫反應。舉例而言，該等PRR刺激劑可為病毒或細菌核酸、來自細菌或寄生蟲之脂質，或細菌蛋白質或毒素，或該等分子之任何人工構築模擬物。佐劑亦包括(不限於)：聚集抗原以促進B淋巴細胞辨識或吞噬細胞吸收之無機化合物，諸如明礬、氫氧化鋁、磷酸鋁、磷酸鈣氫氧化物或硫酸銨；油劑；及洗滌劑。佐劑亦可為免疫傳信之宿主介質，諸如(不限於)細胞介素、淋巴介質、趨化激素、干擾素、過敏毒素、生長因子、分化因子及黏附分子。 如本文所使用，「免疫性組合物」為當投與動物時引發免疫反應的組合物。免疫性組合物包含至少一種抗原及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑、穩定劑、增溶劑或稀釋劑。醫藥學上可接受之賦形劑、穩定劑、增溶劑或稀釋劑之描述可發現於例如「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」, Lloyd V. Allen, ed., Pharmaceutical Press,英國倫敦,第22版, 2012中。抗原可為活的或不活化完整病毒、細菌或其他病原體。抗原亦可為自病毒、細菌或其他病原體分離、純化或部分純化之抗原分子。抗原可為多肽、多醣、核酸或脂質。 如本文所使用，「疫苗」為當投與動物時賦予防護、抵抗、預防或治療疾病症狀之免疫性組合物，其中該症狀由病原性生物體(例如病毒)引起。疫苗可包括(不限於)活的或不活化病毒抗原或完整病毒粒子與醫藥學上可接受之佐劑、賦形劑、穩定劑、增溶劑或稀釋劑組合。 如本文中所使用，術語「治療(treating/to treat/treatment)」包括限制、減緩、停止、減少、改善或逆轉現有症狀、病症、病狀或疾病之進展或嚴重程度。 如本文所使用，術語「預防(preventing/to prevent/prevention)」包括(不限於)減少、降低或改善症狀、病症、病狀或疾病之風險，及保護動物免於症狀、病症、病狀或疾病。預防可預防性地施加或投與。 「一致性百分比」可藉由計算在核酸或蛋白質中同一相對位置處一致核苷酸或胺基酸的數目來測定。兩個或更多個序列可在一個序列之全長或序列之片段上比較。一致性百分比之計算包括測定兩個或更多個序列之間的理想對準。對準可考慮諸如(不限於)在核酸之非編碼區及多肽序列之截斷或延伸中待測試之序列中之每一者中的插入及缺失(亦即「間隙」)。諸如鹼基局部比對檢索工具(Basic Local Alignment Search Tool；BLAST)之電腦程式及算法可用於測定一致性百分比。BLAST係由美國國家生物技術資訊中心(U.S. National Center for Biotechnology Information)提供之多種資源中之一者。因為基因密碼為簡併的，且多於一種密碼子可編碼給定胺基酸，所以若核酸編碼一致多肽，則認為核酸之編碼區一致。因此，一致性百分比亦可基於由核酸編碼之多肽計算。 如本文及隨附申請專利範圍中所用，除非上下文另外明確規定，否則單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數個參考物。因此，舉例而言，「V區」或「抗原」及各種加連字符及不加連字符形式之參考為一或多個該等蛋白質之參考且包括一般技術者已知的該等蛋白質的等效物。 以下實驗實例為抗豬蘭格素抗體及使用該等抗體以將抗原靶向豬樹突狀細胞之說明。應瞭解，其他實施例及用途對於熟習此項技術者將顯而易見，且本發明不限於此等特定說明性實例或較佳實施例。 實例1 豬蘭格素細胞外域選殖為小鼠Fc融合蛋白質，自短暫轉染293T細胞培養基之上清液表現及純化，且用於生成如下之小鼠抗pLangerin抗體。 編碼豬蘭格素細胞外域之核酸序列(228-1011核苷酸，GenBank寄存編號NM_001129957)經PCR擴增且在pFUSE-mIgG2a Fc2及pFUSE-hIgG1 Fc2表現載體(InvivoGen)中選殖。pLangerin細胞外域藉由短暫轉染使用LIPOFECTAMINE ® LTX (Thermo Fisher Scientific)在293T細胞中表現為小鼠Fc 融合蛋白質。293T細胞維持於以4% FBS補充之Pro293aCDM (條件界定培養基(Conditioned Defined Media)) (Lonza)中。短暫轉染293T細胞維持於以2%超低IgG FBS (胎牛血清) (Gibco)補充之Iscove改良Dulbecco培養基(Iscove's modified Dulbecco's Medium；IMDM)中。表現之蛋白質藉由蛋白A順磁珠粒(Millipore)自培養基上清液純化。BALB/c小鼠經皮下免疫接種純化之pLangerin-mIgG2a Fc 蛋白質以及Freund佐劑(Sigma)。融合瘤細胞株之面板藉由使用CLONACELL®-HY融合瘤套組(Stemcell Technologies)建立。藉由使融合瘤經由其中pLangerin-hIgG1 Fc 及抗小鼠IgG-HRP (辣根過氧化酶) (Kirkegaard & Perry Laboratories)分別用作包被抗原及二級抗體的間接ELISA篩分來製備單株抗體。來自融合瘤培養基上清液之單株抗體藉由蛋白A順磁珠粒(Millipore)純化且使用快速抗體同型套組(Pierce)同型。 如藉由以上ELISA所量測對豬蘭格素具有特異性之兩種融合瘤細胞株已建立，且稱為3B3及5G7。如藉由在野生型蘭格素轉染293T細胞上之免疫螢光法分析所量測，抗體亦對豬蘭格素具有特異性。編碼野生型蘭格素之核酸(核苷酸25-1014，GenBank寄存編號NM_001129957)經PCR擴增且在pFUSE-hIgG1-Fc2 (Invivogen)中選殖。CHO-K1細胞藉由表現豬蘭格素或CD137 (不相關的基因對照)之pFUSE載體使用LIPOFECTAMINE ® LTX (Thermo Fisher Scientific)轉染。CHO-K1細胞(ATCC)維持於以10% FBS補充之達爾伯克氏改良伊格爾培養基(Dulbecco's modified eagle medium；DMEM)中。在轉染後48小時，細胞藉由3.2%多聚甲醛固定，藉由Triton X-100滲透，且藉由3%牛血清白蛋白(BSA)阻斷。細胞隨後藉由阻斷緩衝液中之蘭格素特異性抗體(於100 μL中1 μg)染色，隨後與螢光染料共軛二級抗體一起培育。使用DAPI (4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚)以使細胞核染色，且細胞在Nikon Eclipse TE 300螢光顯微鏡中成像。 兩種單株抗體(mAb)之親和力藉由硫氰酸鹽溶離測定。mAb在ELISA中結合至pLangerin-hIgG1 Fc 在離液硫氰酸銨(Sigma-Aldrich)離子自0 M至3.5 M的漸升濃度存在下評估，其干擾抗體結合至抗原。對硫氰酸鹽溶離之抗性為親和力之量測值，藉此親和力指數代表在無硫氰酸鹽存在下結合的50%降低。已發現3B3 mAb之相對親和力(親和力指數＞3.5)比5G7 mAb之相對親和力(親和力指數≈0.4)高得多。 3B3抗體之同型已藉由免疫球蛋白同型套組(ThermoFisher Scientific)測定且為具有κ輕鏈之小鼠IgG1。 實例2 mAb 3B3之可變(V)域自由融合瘤細胞中提取出之DNA擴增。用於擴增之引子已獲自小鼠Ig引子集合(EMD Millipore)。mAb 3B3可變域之PCR產物在pCR-Blunt載體(Invitrogen)中選殖，且編碼DNA序列藉由Sanger DNA定序(Genomics Research Laboratory, Biocomplexity Institute, Virginia Tech)驗證。 3B3 mAb重鏈可變(HCV)之聚核苷酸序列為：(SEQ ID NO：1)。3B3重鏈可變區之胺基酸序列為：(SEQ ID NO：2)。 聚核苷酸序列3B3 mAb輕鏈可變(LCV)域為：(SEQ ID NO：3)。3B3輕鏈可變區之胺基酸序列為：(SEQ ID NO：4)。 實例3 mAb 3B3之輕鏈V區域及重鏈V區域藉由彈性連接子基因連接以製得單鏈可變片段(scFv)。人類介白素-2 (IL-2)信號序列亦添加至輕鏈區之5'端。 豬Fc cDNA (802-1495核苷酸，參見例如NCBI: AK405797.1)自豬脾總RNA使用特定引子製備，在pFUSE-hIgG1 Fc2中藉由替換人類Fc 且在其c端引入XhoI 位點來選殖，以獲得命名為pFUSE-pIgG2 Fc2之載體。 3B3scFv在pFUSE-pIgG2 Fc2及pFUSE-hIgG1 Fc2 (Invivogen)中選殖以分別製得豬及人類Fc 融合抗體。3B3scFv-pIgG2 Fc2之核苷酸序列如下： (SEQ ID NO：5)。3B3scFv部分(包括前導序列)代表SEQ ID NO：5之核苷酸1-894，其之後為對豬Fc之連接區。此嵌合肽之胺基酸序列如下：(SEQ ID NO：6)。第一298胺基酸殘基代表3B3scFv肽，包括人類IL-2前導肽，其導致第一22胺基酸殘基。SEQ ID NO：6之胺基酸23-148來源於3B3 LCV域，其在此構築體中缺失LCV域之前三個胺基酸。在彈性連接區之後，胺基酸172-298來源於3B3 HCV域。另一短連接區藉由在胺基酸313-543處發現之豬免疫球蛋白恆定區(Fc)的胺基酸接合以上序列。 實例4 PEDV-CO/13病毒株藉由以0.02%酵母提取物、0.3%胰蛋白磷酸酯培養液及2 μg/mL胰蛋白酶補充之伊格爾最低必需培養基(Eagle minimum essential medium；MEM)在Vero細胞中傳播。未感染Vero細胞(ATCC)維持在以10%胎牛血清(FBS)補充之MEM中。PEDV MN病毒株(GenBank寄存編號KF468752.1)之S蛋白(胺基酸21-737)的N端域(NTD)及S1域在pFUSE載體中與豬Fc 或3B3scFv-豬Fc 之羧基端基因組合。豬Fc之UGA終止密碼子已轉換成絲胺酸之UCA密碼子，且插入Gly-Leu-Glu-Gln之短連接區(參看圖1)。欲用作疫苗抗原之融合蛋白質及嵌合體在293T細胞中藉由大規模短暫轉染使用Polyethyleneimine-Max (Polysciences, Inc)生產。抗原藉由CAPTIVA PRIMAB蛋白A瓊脂糖珠粒(Repligen)自培養基上清液純化，用0.2 M甘胺酸緩衝液(pH 2.5)溶離且pH藉由1 M三羥甲基胺基甲烷緩衝液中和至約7.5。疫苗抗原之分子尺寸藉由SDS-PAGE及BIOSAFE庫馬斯藍(Biorad)染色分析。經染色凝膠藉由ODYSSEY CLx紅外成像系統(LI-COR)掃描。疫苗抗原藉由QUICK START Bradford分析(Bio-rad)定量。標準曲線使用QUICK START Gamma Globulin Standard Set (Biorad)製備。疫苗抗原在液氮中急凍且隨後存儲在-80℃下。 實例5 可使用3B3scFv-pIgG2 Fc2-PEDV S Ag嵌合多肽以藉由將S抗原(Ag)靶向樹突狀細胞來刺激豬中之PEDV特異性免疫反應。3B3scFv-pIgG2 Fc2-PEDV S Ag嵌合多肽由SEQ ID NO：7編碼。 總共31個4週年齡的PEDV陰性豬崽劃分成4個處理組：佐劑對照組(第1組)、接受pIgG2 Fc2-PEDV S Ag嵌合多肽之非靶向組(第2組)、兩個接受3B3scFv-pIgG2 Fc2-PEDV S Ag嵌合多肽之DC靶向組：一個組提供經皮初次免疫接種(第3組)，且第二個組提供肌內初次免疫接種(第4組)。第2-4組中之動物接受200 μg與50 μg霍亂毒素(CT)混合之重組抗原，而第1組中之豬僅接受50 μg CT。在第28天，所有組接受二次或強化肌內注射。在第0、7、21、28、35及42天收集血液用於量測免疫反應。 抗原特異性T細胞反應藉由自外周血液分離之單核細胞的活體外抗原刺激、隨後IFN-γ之胞內染色及隨後流式細胞測量術分析在T細胞群中分析。外周血液單核細胞(PBMC)自第0、7、28及35天採集之血液分離。PBMC藉由20 μg/mL重組pIgG2 Fc2-PEDV S Ag活體外刺激17小時，且胞內IFN-γ染色。流式細胞測量術分析展示CD4+ CD8+ T細胞子集為展示對PEDV抗原起反應之IFN-γ生產細胞之增加的平均頻率的唯一子集。早在豬中初次疫苗接種7天之後，第3組中之抗原特異性CD4 T細胞頻率(0.969 ± 0.201，p ≤ 0.025)顯著高於非靶向組(0.395 ± 0.158)及第4組(0.483 ± 0.067)中之彼等頻率。在第3組中之一部分豬(2/8)中持續CD4 T細胞激活(p = 0.027)，直至初次疫苗接種28天之後。在二次接種疫苗之後第7天時(亦即在第35天)，與非靶向組(0.108 ± 0.052)相比，第3組中之IFN-γ特異性CD4 T細胞反應顯著增加(0.391 ± 0.107，p = 0.016)。然而，在第3組與第4組之間觀測到之CD4 T細胞反應中不存在顯著差異。IFN-γ反應在任何組中之CD4- CD8+ T細胞當中未發現顯著升高。 量測體液性免疫反應以偵測在第21、28、35、及42天之血清IgG及IgA含量。抗體含量藉由ELISA測定。ELISA板(96孔)在4℃下藉由100 μL之PEDV S Ag小鼠IgG2a Fc 抗原(2 μg/mL，於0.2 M碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液中稀釋，pH 9.4)塗佈隔夜。孔用PBS/吐溫-20 (0.1%)洗滌三次，且用150 μL PBS/吐溫中之5%無脂乳在37℃下阻斷2小時。測試血清，將陽性及陰性血清樣品在阻斷緩衝液中稀釋(1:400)。將稀釋之血清(100 μL)一式兩份添加至各孔。板在37℃下保溫1小時。孔用PBS/吐溫洗滌三次且隨後用100 μL二次共軛物37℃保溫1小時：辣根過氧化酶(HRP)共軛山羊抗豬IgG (H+L)、人類/小鼠血清預吸附抗血清(Santa Cruz Biotech) (1 μg：16000 μL)或HRP共軛山羊抗豬IgA抗血清(Bethyl) (1μg：2000μL)。孔用PBS/吐溫洗滌三次且與100 μL之Sure Blue基質(KPL)一起培育5分鐘。反應藉由每孔添加100 μL之1 N HCl即時中止。吸光度在450 nm下在微板讀取器(Tecon或Promega GLOMAX)中量測。樣品比陽性(S/P)比率藉由方程式：(樣品平均值-陰性對照平均值)/(陽性對照平均值-陰性對照平均值)計算，其中「平均值」為重複樣品在450 nm下之光學密度(OD)的平均值。 第一疫苗劑量在所有疫苗接種組中在第21天誘發抗原特異性血清IgG之可偵測含量，但IgA並非如此，但對照組中並非如此。然而，在第二疫苗劑量之後，對PEDV抗原具有特異性之血清IgG含量即顯著增加。特定言之，在第二次投與之後第7天時(亦即第35天)，第4組中之平均IgG S/P比率(1.372 ± 0.039，p = 0.037)顯著高於第3組(1.230 ± 0.059)。與第3組(平均S/P比率：1.048±0.076)相比，在同一時間點第4組中之更高血清IgG含量(平均S/P比率：1.337 ± 0.052，p = 0.005)持續直至強化之後第35天。相比之下，在所有疫苗接種組中僅在第35天偵測到大致IgA含量，但對照組中並非如此；且第4組中之平均IgA S/P比率(0.346 ± 0.118，p = 0.001)比第3組(0.053 ± 0.007)高得多。在第42天觀測到血清IgA反應，儘管處於低層級。有趣的是，在經非靶向PEDV抗原疫苗接種之豬(第2組)中亦觀測到血清IgG反應處於顯著層級，但在第2組與DC靶向第3組之間未注意到抗體含量之顯著差異。 上文所量測之血清抗體在活體外感染分析中測試中和PED病毒之能力。Vero細胞在實際測試前一天接種於96孔細胞培養板中。豬血清樣品在56℃下加熱滅活30分鐘且用MEM連續稀釋兩倍。在MEM中製備濃度為2,000 TCID50 /mL之PEDV且以1:1比率添加至稀釋之血清。病毒-血清混合物在37℃下保溫1小時，且隨後轉移至預先用MEM洗滌一次之96孔細胞培養板上之Vero細胞單層(100微升/孔)。細胞在37℃下保溫1小時且隨後用MEM洗滌三次。將含有胰蛋白酶(2 μg/mL)之維持培養基添加至細胞且在37℃下進一步保溫5天。血清病毒中和(SVN)效價以導致PEDV誘發細胞病變效應完全抑制的最高血清稀釋的倒數計算。對一式三份以及組計算幾何平均值。 在第35天在所有疫苗接種組(第2-4組)中偵測到強中和抗體(NAb)反應，在此等組之間NAb含量無顯著差異，而佐劑對照組未展示血清中和活性。疫苗接種組中平均PEDV特異性NAb效價在32與64之間的範圍內，與DC靶向無關。在PEDV特異性病毒中和抗體含量與血清中IgG含量之間有強正相關(r = 0.88，p ＜ 0.0001)，但在病毒中和抗體含量與血清中IgA含量之間無相關之跡象(r = 0.34，p = 0.062)。
圖 1 . 3B3scFv-pIgG2 Fc2-PEDV S Ag融合蛋白質構築體之核苷酸序列。構築體包括來自人類介白素-2 (IL-2)基因之信號序列、3B3輕鏈可變(V)區(加雙下劃線)、彈性連接區、3B3重鏈V區(加下劃線)、連接區、豬Fc (加粗體下劃線)、短連接區及PEDV棘(S)抗原(加虛下劃線)。豬Fc部分中之加框核苷酸代表根據GenBank寄存編號AK405797.1之鹼基變化。

Claims (36)

  1. 一種核酸，其包含SEQ ID NO：1之序列，其中該核酸編碼豬蘭格素(Langerin)結合蛋白或其蘭格素結合部分。
  2. 如請求項1之核酸，其中該核酸編碼包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的結合蛋白。
  3. 如請求項1之核酸，其進一步包含SEQ ID NO：3之序列。
  4. 如請求項3之核酸，其中該核酸編碼單鏈可變區片段(scFv)融合蛋白質。
  5. 如請求項3之核酸，其進一步包含信號序列及/或彈性連接區序列。
  6. 如請求項5之核酸，其中該核酸包含與SEQ ID NO：5之核苷酸1-894至少95%一致的序列。
  7. 如請求項5之核酸，其進一步包含免疫球蛋白重鏈恆定區片段(Fc)序列。
  8. 如請求項7之核酸，其中該Fc序列為豬免疫球蛋白Fc之序列。
  9. 如請求項7之核酸，其包含與SEQ ID NO：5至少95%一致的序列。
  10. 如請求項7之核酸，其中該核酸編碼具有與SEQ ID NO：6至少95%一致的胺基酸序列的肽。
  11. 如前述請求項中任一項之核酸，其進一步包含來源於豬病原體之序列；其中該豬病原體為病毒或細菌株。
  12. 如請求項10之核酸；其中該豬病原體為選自以下之群的病毒：豬生殖與呼吸症候群(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome；PRRS)病毒、豬流行性下痢病毒(Porcine Epidemic Diarrhea virus；PEDV)、傳染性胃腸炎病毒(Transmissible Gastroenteritis virus；TGEV)、經典豬瘟(Classical Swine Fever；SCF)病毒、豬流感病毒、豬冠狀病毒、豬環狀病毒、豬小病毒、豬痘病毒、豬腺病毒、豬狂犬病病毒、豬疱疹病毒及豬小核糖核酸病毒。
  13. 如請求項10之核酸，其中該來源於豬病原體之序列為PEDV棘(spike)抗原序列。
  14. 如請求項10之核酸，其中該核酸包含與SEQ ID NO：7至少95%一致的序列。
  15. 一種核酸，其包含SEQ ID NO：3之序列，其中該核酸編碼豬蘭格素結合蛋白或其蘭格素結合部分。
  16. 如請求項15之核酸，其中該核酸編碼包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的結合蛋白。
  17. 一種如請求項1至16中任一項之核酸的用途，其用於製造治療豬傳染病的藥物。
  18. 一種蛋白質，其包含SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：4之胺基酸序列。
  19. 如請求項18之蛋白質，其中該蛋白質為單鏈可變區片段(scFv)融合蛋白質。
  20. 如請求項18或19中任一項之蛋白質，其進一步包含彈性連接區。
  21. 如請求項18至20中任一項之蛋白質，其進一步包含免疫球蛋白重鏈恆定區片段(Fc)肽。
  22. 如請求項21之蛋白質，其中該Fc肽為豬Fc肽。
  23. 如請求項18至22中任一項之蛋白質，其中該蛋白質包含與SEQ ID NO：6至少95%一致的胺基酸序列；或與SEQ ID NO：6之殘基23-298至少95%一致的胺基酸序列。
  24. 如請求項18至23中任一項之蛋白質，其進一步包含來自豬病原體之抗原肽；其中該豬病原體為病毒或細菌株。
  25. 如請求項24之蛋白質；其中該豬病原體為選自以下之群的病毒：豬生殖與呼吸症候群(PRRS)病毒、豬流行性下痢病毒(PEDV)、傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、經典豬瘟(SCF)病毒、豬流感病毒、豬冠狀病毒、豬環狀病毒、豬小病毒、豬痘病毒、豬腺病毒、豬狂犬病病毒、豬疱疹病毒及豬小核糖核酸病毒。
  26. 如請求項24之蛋白質，其中該來自豬病原體之抗原肽為PEDV棘抗原肽。
  27. 一種免疫性組合物，其包含如請求項18至26中任一項之蛋白質。
  28. 如請求項27之免疫性組合物，其進一步包含佐劑、賦形劑、穩定劑、增溶劑及稀釋劑中之至少一者。
  29. 如請求項18至26中任一項之蛋白質或如請求項27至28中任一項之免疫性組合物，其用於治療。
  30. 一種如請求項18至26中任一項之蛋白質或如請求項27至28中任一項之免疫性組合物的用途，其用於製造用以治療豬傳染病的藥物。
  31. 一種誘發豬免疫反應之方法，其包含向個體投與以下中之至少一者， a.  如請求項18至26中任一項之蛋白質； b.  如請求項27至28中任一項之免疫性組合物；或 c.  如請求項1至16中任一項之核酸， 其量可有效誘發豬抵抗豬病原體之免疫反應。
  32. 如請求項31之方法，其中該方法誘發抵抗該豬病原體之保護性免疫反應，且該豬具有暴露於豬病原體之風險或具有發生該豬病原體引起之傳染病的風險。
  33. 如請求項31之方法，其中該方法誘發已暴露於該豬病原體或已發生該豬病原體引起之傳染病的豬的免疫反應。
  34. 如請求項31至33中任一項之方法，其中該豬病原體為豬流行性下痢病毒(PEDV)。
  35. 一種表現載體，其包含如請求項1至16中任一項之核酸。
  36. 一種宿主細胞，其包含如請求項1至16中任一項之核酸，或如請求項35之表現載體。
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