KR20240103030A - 범용 사르베코바이러스 백신 - Google Patents
범용 사르베코바이러스 백신Info
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Abstract
사르베코바이러스 (베타코로나바이러스 속의 B 계통)는 지난 20년 동안 2003년 SARS-CoV, 2019년 SARS-CoV-2라는 2가지 주요 발병을 일으켰다. SARS-CoV-2 백신은 이환율 및 사망률을 감소시키는 데 필수적일 것이다. 따라서, 이러한 부류의 바이러스에 대한 범용 백신은 현재의 팬데믹을 종식시키는 데 중요할 뿐만 아니라, 자연 저장소에서 지속적으로 발견되는 SARS 유사 바이러스의 추가적인 긴급 변이 및 향후 발병을 예방하는 데에도 중요하다. 이제, 본 발명자들은 중쇄가 SAR-CoV-2의 단백질 N 폴리펩티드에 접합되거나, 또는 융합되고, 경쇄가 RBD 폴리펩티드에 융합되는, 항원 제시 세포 (즉, 수지상 세포)의 표면 항원 (즉, CD40)에 대한 항체를 생산하였다. 특히, 본 발명자들은 상기 항체가 사르베코바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있음을 보여주었다.
Description
본 발명의 기술분야:
본 발명은 의학, 특히, 바이러스학 분야에 관한 것이다.
본 발명의 배경:
사르베코바이러스(Sarbecovirus) (베타코로나바이러스 속의 B 계통)는 지난 20년 동안 2003년 SARS-CoV, 2019년 SARS-CoV-2라는 2가지 주요 발병을 일으켰다. 2019년 코로나바이러스 유발 질환 (COVID-19)은 실제로 인수공통 바이러스인 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2)에 유발되고, 이는 2020년 반 동안 급속히 확산되어 1억 명 이상의 인간을 감염시키고, 전 세계적으로 200만 명 이상의 사망자를 초래하였다. 팬데믹을 지속적으로 통제하기 위해서는 대규모 백신접종 전략법(vaccination strategy)이 요구되며, 이를 위해 2020년 말에 첫 번째 백신 후보가 이용가능해졌다. 이전에 인간용으로 허가받은 벡터(vector) 기반 백신의 수가 제한되어 있지만, 그럼에도 불구하고 재조합 DNA 벡터 및 합성 mRNA 백신은 유전 공학과 신속한 확장성을 통해 제공되는 많은 가능성으로 인해 COVID-19 퇴치에서 가장 발전된 기술이 되었다1 ,2,3,4. 인간에게 사용하는 경우 이점이 위험을 능가한다면, mRNA 유래, 벡터 기반 백신 및 바이러스 불활성화 백신을 비롯한 여러 백신은 인간에서의 질환 확산을 퇴치하기 위한 긴급 사용에 대해 허가를 받았다3 ,5,6,7,8,9,10, 11. 더욱 최근에는 CD40 발현 항원 제시 세포(antigen-presenting cell)에 대한 바이러스 항원을 표적화하는 차세대 서브유닛 백신이 보고되었다12. SARS-CoV-2 스파이크의 수용체 결합 도메인 (RBD)은 현 백신의 주요 면역원이다. 그러나, 코로나바이러스 스파이크는 상이한 종과 변종 사이에서 상당한 유전적 다양성을 나타낸다. 더욱이, 회복기의 COVID-19 환자는 SARS-CoV-2에 대한 교차 중화 활성을 거의 보이지 않는 바, 이는 현 면역원이 사르베코바이러스에 대한 광범위한 보호를 유도하지 못할 수도 있다는 것을 시사하는 것이다. 따라서, 상기 부류의 바이러스에 대한 범용 백신이 현재의 팬데믹을 종식시키는 데 중요할 뿐만 아니라, 자연 저장소에서 지속적으로 발견되는 SARS 유사 바이러스의 추가적인 긴급 변이 및 향후 발병을 예방하는 데에도 중요하다.
본 발명의 요약:
본 발명은 청구범위에 의해 정의된다. 특히, 본 발명은 중쇄가 Npep2 폴리펩티드에 접합(conjugating)되거나, 또는 융합(fusing)되고, 경쇄가
- K417N, L452R, T478K, E484K, 및 N501Y 자연적으로 발생하는 돌연변이를 포함하고, C538S 비자연적으로 발생하는 돌연변이를 포함하는 RBD 폴리펩티드, 또는
- K417N, L452R, T478K, E484Q 및 N501Y 자연적으로 발생하는 돌연변이를 포함하고, C538S 비자연적으로 발생하는 돌연변이를 포함하는 RBD 폴리펩티드에 융합되는, 항원 제시 세포의 표면 항원에 대한 항체에 관한 것이다.
본 발명은 또한 범용 사르베코바이러스 백신으로서 상기 항체의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 상세한 설명:
정의:
본원에서 사용되는 바, 용어 "폴리펩티드," "펩티드," 및 "단백질"은 임의 길이의 아미노산 중합체를 지칭하는 것으로 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 본 용어는 또한 예를 들어, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 인산화 또는 표지 성분과의 접합과 같은 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 유전자 요법의 맥락에서 논의되는 경우, 폴리펩티드는 각각의 무손상 폴리펩티드, 또는 무손상 단백질의 원하는 생화학적 기능을 유지하는 이의 임의의 단편 또는 유전자 조작된 유도체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 이의 유사체를 포함하는, 임의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대, 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있고, 비-뉴클레오티드 성분에 의해 중단될 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 어셈블리 전후에 부여될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 폴리뉴클레오티드라는 용어는 이중가닥 및 단일가닥 분자를 상호교환적으로 지칭한다. 달리 명시되거나 요구되지 않는 한, 폴리뉴클레오티드인 본원에 기술된 본 발명의 임의의 실시양태는 이중가닥 형태, 및 이중가닥 형태를 구성하는 것으로 공지되거나, 또는 예측되는 2개의 상보적 단일가닥 형태 각각을 모두 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "~을 코딩하는(encoding)"이라는 용어는 정의된 뉴클레오티드 서열 (예컨대, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 정의된 아미노산 서열을 및 그로부터 생성되는 생물학적 특성을 갖는 생물학적 프로세스에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 작용하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대, 예를 들어, 유전자, cDNA, 또는 mRNA에서 특정 뉴클레오티드 서열의 고유 특성을 지칭한다. 따라서, 유전자, cDNA 또는 RNA는 상기 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생성한다면, 단백질을 코딩하는 것이다. 뉴클레오티드 서열이 mRNA 서열과 동일하고, 일반적으로 서열 목록에 제공되는 코딩 가닥과 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로 사용되는 비-코딩 가닥, 둘 모두 상기 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 생성물을 코딩하는 것으로 지칭될 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 축퇴 버전이고, 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. "단백질 또는 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열"이라는 어구는 또한 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 일부 버전에서 인트론(들)을 함유할 수 있는 정도로 인트론을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "~로부터 유래된"이라는 표현은 제1 성분 (예컨대, 제1 폴리펩티드), 또는 상기 제1 성분으로부터의 정보를 사용하여 상이한 제2 성분 (예컨대, 제1의 것과는 상이한 제2 폴리펩티드)을 단리, 유도 또는 제조하는 프로세스를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 두 서열 사이의 "동일성( % )"은 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입해야 하는 갭의 개수, 및 각 갭의 길이를 고려하여, 서열이 공유하는 동일한 위치의 개수의 함수이다 (즉, 동일성(%) = 동일한 위치의 개수/위치의 총 개수 x 100). 두 서열 사이의 서열의 비교 및 동일성(%) 결정은 하기 기술된 바와 같이 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 두 아미노산 서열 사이의 동일성(%)은 니들맨(Needleman) 및 운쉬(Wunsch) 알고리즘을 사용하여 결정할 수 있다 (문헌 [Needleman, Saul B. & Wunsch, Christian D. (1970). "A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins". Journal of Molecular Biology. 48 (3): 443-53.]). 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 동일성(%) 또한 예를 들어, 알고리즘, 예컨대, EMBOSS 니들(EMBOSS Needle) (쌍별 정렬; www.ebi.ac.uk에서 이용가능)즘을 사용하여 결정할 수 있다. 예를 들어, EMBOSS 니들은 예를 들어, EMBOSS 니들은 BLOSUM62 매트릭스, "갭 개방 페널티" 10, "갭 확장 페널티" 0.5, 거짓 "엔드 갭 페널티," "엔드 갭 개방 페널티" 10 및 "엔드 갭 확장 페널티" 0.5와 함께 사용될 수 있다. 일반적으로, "동일성(%)"은 매칭된 위치의 개수를 비교된 위치의 개수로 나누고, 100을 곱한 함수이다. 예를 들어, 정렬 후의 비교된 두 서열 사이에서 10개의 서열 위치 중 6개가 동일하다면, 이때 동일성은 60%이다. 동일성(%) 은 통상 분석이 수행되는 질의 서열의 전장에 걸쳐 결정된다. 동일한 1차 아미노산 서열 또는 핵산 서열을 갖는 두 분자는 임의의 화학적 및/또는 생물학적 변형에 관계없이 동일하다. 본 발명에 따르면, 제2 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 제1 아미노산 서열은 제1 서열이 제2 아미노산 서열과 적어도 90; 91; 92; 93; 94; 95; 96; 97; 98; 99 또는 100%의 동일성을 갖는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "코로나바이러스"는 당업계에서 그의 일반적 의미를 갖고, 코로나비리다에(Coronaviridae) 과의 임의의 구성원을 지칭한다. 코로나바이러스는 그의 게놈이 특정 바이러스에 따라 약 27 kb로부터 약 33 kb 길이의 플러스-가닥 RNA인 바이러스이다. 비리온 RNA는 5' 단부에 캡이 있고, 3' 단부에 폴리 A 테일이 있다. RNA의 길이로 인해 코로나바이러스는 최대 RNA 바이러스 게놈을 갖는 것이 된다. 특히, 코로나바이러스 RNA는 (1) RNA-의존성 RNA 폴리머라제; (2) N-단백질; (3) 3개의 외피 당단백질; 및 (4) 3개의 비-구조 단백질을 코딩한다. 상기 코로나바이러스는 다양한 포유동물 및 조류를 감염시킨다. 이들은 호흡기 감염 (일반), 장 감염 (대개 >12 mo.인 유아), 및 가능하게는 신경학적 증후군을 유발한다. 코로나바이러스는 호흡기 분비물의 에어로졸에 의해 전파된다.
본원에서 사용되는 바, β-CoV 또는 베타-CoV로도 공지된 "베타코로나바이러 스"라는 용어는 당업계에서 그의 일반적 의미를 갖고, 코로나바이러스의 4가지 속 (알파-, 베타-, 감마-, 및 델타-) 중 하나를 지칭한다. 베타코로나바이러스 속은 4가지 계통: A, B, C, D.를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "사르베코바이러스"는 당업계에서 그의 일반적 의미를 갖고, 베타코로나바이러스 중 계통 B를 지칭한다. 인간에 관하여 임상적으로 가장 중요한 사르베코바이러스는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 (SARS-CoV 또는 SARS-CoV-1) 및 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2)이다. 아속은 또한 박쥐 SC2r-CoV RaTG13, 박쥐 SC2r-CoV RacCS203, 천산갑(Pangolin) SC2r-CoV GX-P4L, 천산갑 SC2r-CoV GX-P5L, 박쥐 SC2r-CoV ZC45, 박쥐 SC2r-CoV ZXC21, 박쥐 SC2r-CoV Rc-o319, 박쥐 SC1r-CoV WIV1, 박쥐 CoV WIV16, 박쥐 CoV Rs3367, 박쥐 CoV LYRa11, 박쥐 SC1r-CoV Cp/Yunnan2011, 박쥐 CoV Rs-YN2018B, 박쥐 CoV Rs7327, 박쥐 CoV RsSHC014, 박쥐 CoV Rs4231, 박쥐 CoV Rs4084, 박쥐 CoV Rs4081, 박쥐 CoV Rs672, 박쥐 CoV Rs4237, 박쥐 SC1r-CoV YNLF_31C, 박쥐 SC1r-CoV Rp3, BtRl-베타CoV/SC2018, 박쥐 SC1r-CoV Rf1, 박쥐 SC1r-CoV HeB2013, 박쥐 SC1r-CoV Rp/Shaanxi2011, 박쥐 SC1r-CoV Rm1, 박쥐 SC1r-CoV HuB2013, 박쥐 SC1r-CoV HKU3-1, 박쥐 SC1r-CoV Longquan-140, 박쥐 SC1r-CoV BM48-31/BGR/2008, 및 박쥐 SC1r-CoV BtKY72를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2" 또는 "SARS- Cov -2"는 당업계에서 그의 일반적 의미를 갖고, 경미한 상기도 질환 (일반적인 감기와 유사한 증상) 및 때로는 중증 하기도 질병 및 다기관 부전 및 사망으로 이어지는 폐외 소견과 유사한 임상 병리의 소견을 보이는 호흡기 증후군인 코로나바이러스 질환 2019 (COVID-19)를 유발하는 코로나바이러스 균주를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "핵단백질" 또는 "단백질 N"은 (+) 가닥 바이러스 게놈 RNA를 나선형 리보뉴클레오캡시드 (RNP)로 팩키징하고, 바이러스 게놈 및 막 단백질 M과 이의 상호작용을 통해 비리온 어셈블리 동안 기본적인 역할을 하는 SARS-CoV-2 단백질을 지칭한다. 전형적으로, 핵단백질은 서열 번호: 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는다.
서열 번호: 1>sp|P0DTC9|NCAP_SARS2 핵단백질 OS=중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 OX=2697049 GN=N PE=1 SV=1. 폴리펩티드 Npep2는 밑줄체로 표시되어 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "Npep2 폴리펩티드"는 SAR-CoV-2의 단백질 N으로부터 유래하고, 범위가 서열 번호: 1에서 위치 276의 잔기(residue)로부터 위치 411의 잔기까지인 아미노산 서열로 구성된 SARS-CoV-2 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "스파이크 단백질" 또는 "단백질 S"는 세포 수용체 (즉, ACE2)에 결합하고, 막 융합 및 바이러스 침입을 매개하는 SARS-CoV-2 스파이크 당단백질을 지칭한다. 삼량체 S 단백질의 각 단량체는 약 180 kDa이며, 각각 부착 및 막 융합을 매개하는 2개의 서브유닛 S1 및 S2를 포함한다. 특히, 스파이크 단백질 S1은 "RBD"로도 명명되는 "수용체 결합 도메인"을 통해 숙주 수용체 (즉, 인간 ACE2 수용체)와 상호작용함으로써 비리온을 세포막에 부착시킨다. 스파이크 단백질 S2는 클래스(class) I 바이러스 융합 단백질로서 작용함으로써 비리온과 세포 막의 융합을 매개한다. 현재 모델에서, 단백질은 적어도 3개의 입체형태 상태: 융합 전의 천연 상태, 헤어핀 전의 중간 상태 및 융합 후의 헤어핀 상태를 갖는다. 바이러스 및 표적 세포막의 융합 동안, 코일드 코일 영역 (헵타드 반복부)은 삼량체-헤어핀 구조 형태를 취하며, 융합 펩티드를 엑토도메인의 C-말단 영역에 매우 근접하게 위치시킨다. 이 구조의 형성은 바이러스 및 표적 세포막의 병치 및 후속 융합을 유도하는 것으로 보인다. 스파이크 단백질 S2'는, 바이러스 세포내이입시에 발생하는 S2 절단에 계속하여 언마스킹되는 바이러스 융합 펩티드로서 작용한다. 전형적으로, 스파이크 단백질은 서열 번호: 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는다.
서열 번호: 2 >sp|P0DTC2|스파이크_SARS2 스파이크 당단백질 OS=중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 OX=2697049 GN=S PE=1 SV=1. RBD는 밑줄체로 표시되어 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "RBD 폴리펩티드"는 범위가 서열 번호: 2에서 위치 319의 아미노산 잔기로부터 위치 541의 아미노산 잔기까지인 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "돌연변이"는 당업계에서 일반적 의미를 갖고, 치환, 결실 또는 삽입을 지칭한다. 특히, "치환"은 특정 위치의 특정 아미노산 잔기가 제거되고, 또 다른 아미노산 잔기가 동일한 위치에 삽입되는 것을 의미한다. 본 명세서 내에서, 돌연변이는 표준 돌연변이 명명법에 따른 참조이다. 특히, "돌연변이"라는 용어는 "자연적으로 발생하는 돌연변이" 및 "비-자연적으로 발생하는 돌연변이"를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "자연적으로 발생하는 돌연변이"는 SARS-CoV-2 폴리펩티드의 자연적으로 발생된 변이체에서 발견될 수 있고, 전형적으로, B.1.1.7 계통 (20I/501Y.V1 우려 변이종 (VOC) 202012/01 또는 알파 VOC), B.1.351 계통 (20H/501Y.V2 또는 베타 VOC로도 공지) 및 P.1 계통 (20J/501Y.V3 또는 감마 VOC로도 공지) 및 B.1.617.2 계통 (델타 VOC로도 공지)을 포함하는 임의의 돌연변이를 지칭한다. 상기 돌연변이는 당업계에 널리 공지되어 있고, 이는 참조로 포함된 하기 참고문헌에 기술되어 있는 것을 포함한다:
예를 들어, 돌연변이 N501Y는 각각 영국 남동부, 브라질/일본 및 남아프리카에서 최초로 확인된 3개의 SARS-CoV-2 계통 B.1.1.7, P.1 (20J/501Y.V3으로도 공지) 및 501Y.V2가 공유하는 S-단백질의 수용체 결합 도메인 (RBD) 내의 비-동의 돌연변이이다. 이는 RBD 내의 주요 접촉 잔기 중 하나이며, 인간 및 뮤린 ACE2에 대한 결합 친화성을 증가시키는 것으로 확인되었다. 각각 남아프리카 및 브라질로부터의 신규 계통 501Y.S2 및 B.1.1.28, 및 인도로부터의 B1.617.1 (관심 카파 변종)에 존재하는 S-단백질의 수용체 결합 도메인 (RBD) 내의 E484K 및 E484Q 돌연변이는 다수의 중화 항체의 결합에 중요한 것으로 밝혀진 RBD 내의 잔기에 영향을 미친다. 따라서, 이 돌연변이는 항체 인식에 영향을 미치고, SARS-CoV-2 면역 회피를 가능하게 한다. 상기 돌연변이를 보유하는 바이러스는 사람들의 회복기의 혈청에서 항체에 의한 인식을 회피하는 것으로 밝혀졌고, 따라서, 백신의 효과를 변경할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Allison J. Greaney, Andrea N. Loes, Katharine H.D. Crawford, Tyler N. Starr, Keara D. Malone, Helen Y. Chu, Jesse D. Bloom, bioRxiv 2020.12.31.425021] 참조). K417N, L452R, T478K, 및 E484K/E484Q 돌연변이를 비롯한 수개의 다른 돌연변이가 발견되었다. 따라서, 본 발명에 따라, 주요 자연적으로 발생하는 돌연변이는 서열 번호: 2에서 위치 417의 아미노산 잔기 (K)가 아미노산 잔기 (N)으로 치환된 K417N 돌연변이, 서열 번호: 2에서 위치 452의 아미노산 잔기 (L)이 아미노산 잔기 (R)로 치환된 L452R 돌연변이, 서열 번호: 2에서 위치 478의 아미노산 잔기 (T)가 아미노산 잔기 (K)로 치환된 T478K 돌연변이, 및 서열 번호: 2에서 위치 484의 아미노산 잔기 (E)가 아미노산 잔기 (K) 또는 (Q)로 치환된 E484K 또는 E484Q 돌연변이, 및 서열 번호: 2에서 위치 501의 아미노산 잔기 (N)이 아미노산 잔기 (Y)로 치환된 N501Y 돌연변이를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "비-자연적으로 발생하는 돌연변이"는 본 발명의 폴리펩티드에 유전적으로 삽입된 임의의 돌연변이를 지칭한다. 특히, 폴리펩티드의 생산을 용이하게 하기 위해 상기 돌연변이가 삽입된다. 예를 들어, 상기 돌연변이는 서열 번호: 2에서 위치 538의 아미노산 잔기 (C)가 아미노산 잔기 (S)로 치환된 서열 번호: 2 중의 돌연변이 C538S를 포함한다. 상기 돌연변이는 본 발명의 폴리펩티드 내에서 디술피드 결합의 생성을 회피하는 데 특히 적합하다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "벡터," "클로닝 벡터" 및 "발현 벡터"는 숙주를 형질전환시키고, 도입된 서열의 발현 (예컨대, 전사 및 번역)을 촉진시키기 위한 DNA 또는 RNA 서열 (예컨대, 외래 유전자)이 숙주 세포 내로 도입시킬 수 있는 비히클을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "프로모터/조절 서열"은 세포의 합성 기구, 또는 도입된 합성 기구에 의해 인식되고, 폴리뉴클레오티드 서열의 특정 전사를 개시하여 프로모터/조절 서열에 작동가능하게 연결된 유전자 생성물이 발현될 수 있도록 하는 데 필요한 핵산 서열 (예컨대, 예를 들어, DNA 서열)을 지칭한다. 일부 경우에, 이 서열은 코어 프로모터 서열일 수 있고, 다른 경우에, 이 서열은 또한 유전자 생성물의 발현에 필요한 인핸서 서열 및 다른 조절 요소를 포함할 수 있다. 프로모터/조절 서열은 예를 들어, 조직 특이적 방식으로 유전자 생성물을 발현하는 서열일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "작동가능하게 연결된" 또는 "전사 제어"라는 용어는 조절 서열과 이종 핵산 서열 사이의 기능적 연결로서, 핵산 서열의 발현을 일으키는 것을 지칭한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계에 배치되어 있을 때, 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 작동가능하게 연결된 것이다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미친다면, 프로모터는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 작동 가능하게 연결된 DNA 서열은 서로 인접할 수 있으며, 예컨대, 2개의 단백질 코딩 영역을 연결하는 데 필요한 경우, 동일한 리딩 프레임 내에 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "형질전환"은 "외래" (즉, 외인성 또는 세포외) 유전자, DNA 또는 RNA 서열을 숙주 세포에 도입하여 숙주 세포가 도입된 유전자 또는 서열을 발현시켜 원하는 물질, 전형적으로, 도입된 유전자 또는 서열에 의해 코딩된 단백질 또는 효소를 생성하는 것을 의미한다. 도입된 DNA 또는 RNA 염기를 수용하고, 발현하는 숙주 세포는 "형질전환"된 것이다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "발현 시스템"은 예컨대, 벡터에 의해 운반되고, 숙주 세포에 도입된 외래 DNA에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 위한, 적합한 조건하에 있는 숙주 세포 및 화합성 벡터를 의미한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "접합체" 또는 상호교환적으로 "접합된 폴리펩티드"는 하나 이상의 폴리펩티드의 공유 부착에 의해 형성된 복합체 또는 키메라 분자를 명시하는 것으로 의도된다. 용어 "공유 부착" 또는 "접합"은 폴리펩티드 및 비-펩티드 모이어티가 서로 직접적으로 공유 결합되거나, 그렇지 않으면 개재 모이어티(intervening moiety) 또는 모이어티들, 예컨대, 브릿지, 스페이서, 또는 결합 모이어티 또는 모이어티들을 통해 서로 간접적으로 공유 결합되는 것을 의미한다. 특정 접합체는 융합 단백질이다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "융합 단백질"은 은 별게의 단백질로부터 유래된 2개 이상의 폴리펩티드의 부착을 통해 생성된 단백질을 의미한다. 특히, 융합 단백질은 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있으며, 전형적으로 생물학적 연구 또는 치료에 사용된다. 융합 단백질의 폴리펩티드 부분 사이에 링커(linker)하에, 또는 링커 없이 화학적 공유 접합을 통해 단백질이 생성될 수도 있다. 융합 단백질에서, 2개 이상의 폴리펩티드는 직접적으로 또는 링커를 통해 융합된다.
본원에서 사용되는 바, "직접적으로"라는 용어는 제1 폴리펩티드의 N-말단 단부에 있는 첫 번째 아미노산이 제2 폴리펩티드의 C-말단 단부에 있는 마지막 아미노산에 융합된다는 것을 의미한다. 이러한 직접적인 융합은 문헌 (Vigneron et al., Science 2004, PMID 15001714), (Warren et al., Science 2006, PMID 16960008), (Berkers et al., J. Immunol. 2015a, PMID 26401000), (Berkers et al., J. Immunol. 2015b, PMID 26401003), (Delong et al., Science 2016, PMID 26912858) (Liepe et al., Science 2016, PMID 27846572), (Babon et al., Nat. Med. 2016, PMID 27798614)에 기술된 바와 같이 자연적으로 발생할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "링커"는 당업계에서 일반적인 의미를 갖고, 단백질이 확실하게 적절한 2차 및 3차 구조를 형성하도록 하는 데 충분한 길이의 아미노산 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 링커는 1개 이상이되, 30개 미만의 아미노산을 포함하는 펩티드 링커, 예컨대, 2-30개의 아미노산, 바람직하게는, 10-30개의 아미노산, 더욱 바람직하게는, 15-30개의 아미노산, 더욱더 바람직하게는, 19-27개의 아미노산, 가장 바람직하게는, 20-26개의 아미노산으로 이루어진 펩티드 링커이다. 일부 실시양태에서, 링커는 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18; 19; 20; 21; 22; 23; 24; 25; 26; 27; 28; 29; 30개의 아미노산 잔기를 갖는다. 전형적으로, 링커는 화합물이 적절한 입체형태 (즉, IL-15R베타/감마 신호전달 경로를 통해 적절한 신호 전달 활성을 허용하는 입체형태)를 취하도록 허용하는 것이다. 가장 적합한 링커 서열은 (1) 유연한 확장 입체형태를 취할 수 있고, (2) 융합 단백질의 기능적 도메인과 상호작용할 수 있는 정렬된 2차 구조를 발생시키는 경향을 나타내지 않으며, (3) 기능성 단백질 도메인과의 상호작용을 촉진할 수 있는 소수성 또는 전하 특성을 최소로 가질 것이다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "항체"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부분, 즉, 항원에 면역특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 지칭한다. 설치류 및 영장류의 자연 항체에서, 2개의 중쇄가 디술피드 결합에 의해 서로 연결되어 있고, 각 중쇄는 디술피드 결합에 의해 경쇄에 연결되어 있다. 경쇄에는 2가지 유형, 람다 (l) 및 카파 (k)가 존재한다. 항체 분자의 기능적 활성을 결정하는 5개의 주요 중쇄 부류 (또는 이소타입)가 있다: IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE. 각 쇄는 상이한 서열 도메인을 포함한다. 전형적인 IgG 항체에서, 경쇄는 가변 도메인 (VL) 및 불변 도메인 (CL)인 두 도메인을 포함한다. 중쇄는 가변 도메인 (VH) 및 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2 및 CH3, 총칭하여 CH)인 4개의 도메인을 포함한다. 경쇄 (VL) 및 중쇄(VH), 둘 모두의 가변 영역이 항원에 대한 결합 인식 및 특이성을 결정한다. 경쇄 (CL) 및 중쇄 (CH)의 불변 영역 도메인은 예컨대, 항체 쇄 회합, 분비, 태반 이동성, 보체 결합 및 Fc 수용체 (FcR)에 대한 결합과 같은 중요한 생물학적 특성을 부여한다. Fv 단편은 면역글로불린의 Fab 단편의 N-말단부이고, 하나의 경쇄와 하나의 중쇄의 가변부로 구성된다. 항체의 특이성은 항체 조합 부위와 항원성 결정기 사이의 구조적 상보성에 존재한다. 항체 조합 부위는 주로 초가변 또는 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터 유래하는 잔기로 구성된다. 경우에 따라, 비-초가변 또는 프레임워크 영역 (FR)으로부터의 잔기는 항체 결합 부위에 참여하거나, 또는 전체 도메인 구조 및 이로써, 조합 부위에 영향을 미칠 수 있다. 상보성 결정 영역 또는 CDR은 천연 면역글로불린 결합 부위의 자연 Fv 영역의 결합 친화성 및 특이성을 함께 정의하는 아미노산 서열을 지칭한다. 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄는 각각 L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3 및 H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3으로 명명되는 3개의 CDR을 갖는다. 따라서, 항원-결합 부위는 전형적으로 각각의 중쇄 및 경쇄 V 영역으로부터의 CDR 세트를 포함하는 6개의 CDR을 포함한다. 프레임워크 영역 (FR)은 CDR 사이에 삽입된 아미노산 서열을 지칭한다. 따라서, 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 전형적으로 하기 순서로 4개의 프레임워크 영역 및 3개의 CDR을 포함한다: FFR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. 항체 가변 도메인의 잔기는 카바트(Kabat) 등에 의해 고안된 체계에 따라 통상적으로 넘버링된다. 상기 체계는 문헌 [Kabat et al., 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (Kabat et al., 1992, 이하 "Kabat et al.")]에 기재되어 있다. 카바트 잔기의 지정은 서열 번호 서열에서 아미노산 잔기의 선형 넘버링과 항상 직접적으로 상응하는 것은 아니다. 실제 선형 아미노산 서열은 기본 가변 도메인 구조의 프레임워크 또는 상보성 결정 영역 (CDR) 여부와 상관없이, 구조적 성분의 단축 또는 그 내부로의 삽입에 상응하는 엄격한 카바트 넘버링보다 더 적거나 또는 추가의 아미노산을 포함할 수 있다. 잔기의 정확한 카바트 넘버링은 "표준" 카바트 넘버링된 서열과 항체 서열에서 상동성 잔기의 정렬에 의해 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다. 중쇄 가변 도메인의 CDR은 카바트 넘버링 체계에 따라 잔기 31-35 (H-CDR1), 잔기 50-65 (H-CDR2) 및 잔기 95-102 (H-CDR3)에 위치한다. 경쇄 가변 도메인의 CDR은 카바트 넘버링 체계에 따라 잔기 24-34 (L-CDR1), 잔기 50-56 (L-CDR2) 및 잔기 89-97 (L-CDR3)에 위치한다. 이후 기술되는 효능제 항체(agonist antibody)의 경우, CDR은 www.bioinf.org.uk로부터의 CDR 검색 알고리즘을 사용하여 결정되었다 - 항체 페이지 내의 표제가 ≪How to identify the CDRs by looking at a sequence≫인 섹션을 참조한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "면역글로불린 도메인"은 항체 쇄의 구상 영역 (예컨대, 중쇄 항체의 쇄 또는 경쇄), 또는 본질적으로 상기 구상 영역으로 이루어진 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함하는, 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는 데 사용된다. 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 위치 C226 또는 P230으로부터 IgG 항체의 카르복실-말단까지의 아미노산 잔기를 포함하는 것으로 정의된다. Fc 영역의 잔기의 넘버링은 카바트의 EU 인덱스의 것이다. Fc 영역의 C-말단 리신 (잔기 K447)은, 예를 들어, 항체의 생산 또는 정제 중에 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체의 조성물은 모든 K447 잔기가 제거된 항체 집단, K447 잔기가 제거되지 않은 항체 집단, 및 K447 잔기가 제거된 항체 및 K447 잔기가 제거되지 않은 항체의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "키메라 항체(chimeric antibody)"는 비-인간 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인, 및 인간 항체의 CH 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, "키메라 항체"는 (a) 불변 영역 (즉, 중쇄 및/또는 경쇄), 또는 이의 일부가, 항원 결합 부위 (가변 영역)가 상이한 또는 변경된 부류, 이펙터 기능 및/또는 종의 불변 영역, 또는 키메라 항체에 신규 특성을 부여하는 완전히 상이한 분자, 예컨대, 효소, 독소, 또는 효능제 분자, 예컨대, CD40 리간드, 호르몬, 성장 인자, 약물 등에 연결되도록 변경, 치환 또는 교환되거나; 또는 (b) 가변 영역, 또는 이의 일부가 상이한 또는 변경된 항원 특이성을 갖는 가변 영역으로 변경, 치환 또는 교환된 항체 분자이다. 키메라 항체는 또한 영장류화 항체, 및 특히 인간화 항체(humanized antibody)를 포함한다. 추가로, 키메라 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 개선하기 위해 수행된다. 추가의 상세한 설명에 대해서는 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다 (미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)]를 참조한다).
본원에서 사용되는 바, 용어 "인간화 항체"는 뮤린 항체의 6개 CDR을 갖지만, 인간화 프레임워크 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 더욱 구체적으로, "인간화 항체"라는 용어는 본원에서 사용되는 바와 같이, 예컨대, 마우스와 같은 또 다른 포유동물 종의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 이식된 항체를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "인간 모노클로날 항체"는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래하는 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예컨대, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 한 실시양태에서, 본원에서 사용되는 바, 용어 "인간 모노클로날 항체"는 예컨대, 마우스와 같은 또 다른 포유동물 종의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 이식된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "면역 반응"은 항원 특이적 항체 및/또는 세포의 세포독성 반응의 생성을 포함하는, 숙주의 체내에서 항원에 대한 면역계의 반응을 지칭한다. 초기 항원 노출에 대한 면역 반응 (1차 면역 반응)은 전형적으로 수일부터 2주까지의 지연기 후에 검출가능하고; 동일한 항원에 의한 후속 자극에 대한 면역 반응 (2차 면역 반응)은 1차 면역 반응의 경우보다 더 빠르다. 트랜스진 생성물에 대한 면역 반응은 트랜스진에 의해 코딩된 면역원성 생성물에 대해 유도될 수 있는 체액성 (예컨대, 항체 반응) 및 세포성 (예컨대, 세포용해성 T 세포 반응) 면역 반응, 둘 모두 포함할 수 있다. 면역 반응의 수준은 당업계에 공지된 방법 (예컨대, 항체 역가 측정)에 의해 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "APC" 또는 "항원 제시 세포"는 T 세포를 활성화할 수 있는 세포를 나타내며, 특정 대식세포, B 세포 및 수지상 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "수지상 세포" 또는 "DC"는 림프 조직 또는 비-림프 조직에서 발견되는 형태학적으로 유사한 세포 유형의 다양한 집단의 임의의 구성원을 지칭한다. 이들 세포는 이들의 독특한 형태, 높은 수준의 표면 MHC-클래스 II 발현을 특징으로 한다 (문헌 [Steinman, et al., Ann. Rev. Immunol. 9:271 (1991)]; 상기 문헌은 상기 세포의 설명에 대해 본원에서 참조로 포함된다).
본원에서 사용되는 바, 용어 "CD40"은 당업계에서 그의 일반적 의미를 갖고, 인간 CD40 폴리펩티드 수용체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, CD40은 UniProtKB-P25942 (인간 TNR5로도 지칭)에 의해 보고된 바와 같은 인간 정규 서열의 이소폼이다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "CD40 효능제 항체"는 세포 기반 검정법, 예컨대, B 세포 증식 검정법에서 CD40L의 부재하에 CD40 매개 신호전달 활성을 증가시키는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 특히, CD40 효능제 항체는 (i) 시험관내에서 유세포 분석에 의해 또는 CFSE-표지된 세포의 복제 희석 분석에 의해 측정된 바와 같이, B 세포의 증식을 유도하고/거나; (ii) 수지상 세포 활성화 검정법으로 시험관내에서 측정된 바와 같이, 시토카인, 예컨대, IL-6, IL-12, 또는 IL-15의 분비를 유도한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "랑게린 ( Langerin )"은 당업계에서 그의 일반적 의미를 갖고, 인간 C형 렉틴 도메인 패밀리 4 구성원 K 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 랑게린은 UniProtKB- Q9UJ71 (인간 CD207로도 지칭)에 의해 보고된 바와 같은 인간 정규 서열의 이소폼이다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "대상체( subject )" 또는 "이를 필요로 하는 대상체"는 인간 또는 비-인간 포유동물에 대한 것으로 의도된다. 전형적으로, 환자는 사르베코바이러스에 의해 이환되었거나, 또는 사르베코바이러스로 감염될 가능성이 있는 것이다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "Covid -19"는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 및 그의 변종에 의해 유발되는 호흡기 질환을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "무증상"은 코로나바이러스 감염에 대해 검출가능한 증상을 경험하지 않는 대상체를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "증후성"은 코로나바이러스 감염의 검출가능한 증상을 경험하는 대상체를 지칭한다. 코로나바이러스 감염의 증상으로는 피로, 후각 상실, 두통, 기침, 발열, 호흡 곤란을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "치료" 또는 "치료하다"라는 용어는 질환에 걸릴 위험이 있거나 질환에 걸린 것으로 의심되는 환자 뿐만 아니라, 질환을 앓거나, 또는 질환 또는 의학적 병태를 앓고 있는 것으로 진단받은 환자의 치료를 포함하여, 예방 또는 예방적 치료 뿐만 아니라, 치유 또는 질환 변형 치료 둘 모두를 지칭하고, 임상적 재발의 억제를 포함한다. 치료는 장애 또는 재발성 장애의 하나 이상의 증상을 예방, 치유, 이의 개시를 지연, 이의 중증도를 감소 또는 호전시키기 위해, 또는 이러한 치료의 부재하에 예상되는 것을 초과하여 환자의 생존을 연장시키기 위해 의학적 장애를 앓는 환자 또는 최종적으로 장애가 후천적으로 발생할 수 있는 환자에게 투여될 수 있다. "치료 섭생(regimen)"은 질환의 치료의 패턴, 예컨대, 요법 중에 사용되는 투여 패턴을 의미한다. 치료 섭생은 유도 섭생 및 유지 섭생을 포함할 수 있다. "유도 섭생" 또는 "유도 기간"이라는 어구는 질환의 초기 치료에 사용되는 치료 섭생 (또는 치료 섭생의 일부)을 지칭한다. 유도 섭생의 일반적인 목표는 치료 섭생의 초기 기간 중에 환자에게 높은 수준의 약물을 제공하는 것이다. 유도 섭생은 (부분적으로 또는 전체적으로) "로딩 섭생"을 사용할 수 있으며, 이는 의사가 유지 섭생 중에 사용하는 것보다 많은 용량의 약물을 투여하는 것, 의사가 유지 섭생 중에 약물을 투여하는 것보다 더욱 빈번하게 약물을 투여하는 것, 또는 이들 둘 모두를 포함할 수 있다. "유지 섭생" 또는 "유지 기간"이라는 어구는 예컨대, 환자를 장기간 (월 또는 년) 동안 관해 상태로 유지하기 위해 질환의 치료 중에 환자의 유지에 사용되는 치료 섭생 (또는 치료 섭생의 일부)을 지칭한다. 유지 섭생은 연속 요법을 사용할 수 있거나 (예컨대, 약물을 일정한 간격, 예컨대, 매주, 매월, 매년 등), 또는 간헐적 요법 (예컨대, 중단된 치료, 간헐적 치료, 재발시의 치료, 또는 특정의 미리 결정된 기준 [예컨대, 통증, 질환 소견 등] 달성시의 치료)을 사용할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "제약 조성물"은 예컨대, 담체 및/또는 부형제 와 같은 다른 작용제와 함께 본원에 기술된 조성물, 또는 이의 제약상 허용되는 염을 지칭한다. 본원에 제공된 제약 조성물은 전형적으로 제약상 허용되는 담체를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "제약상 허용되는 담체"는 원하는 특정 투여 형태에 적합한 바와 같이, 임의의 모든 용매, 희석제 또는 다른 액체 비히클, 분산 또는 현탁 보조제, 표면 활성제, 등장제, 증점제 또는 유화제, 보존제, 고체 결합제, 활택제 등을 포함한다. 문헌 [Remington's Pharmaceutical-Sciences, Sixteenth Edition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980)]은 제약 조성물을 제제화하는 데 사용되는 다양한 담체 및 이의 제조를 위한 공지된 기술을 개시한다.
본원에서 사용되는 바, "백신접종(vaccination)" 또는 "백신접종하는( vaccinating )"이라는 용어는 대상체에서 특정 항원에 대해 면역 반응을 유발하는 프로세스를 의미하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "백신 조성물"은 면역계 반응을 유도하기 위해 인간 또는 동물에게 투여될 수 있는 조성물을 의미하는 것으로 의도되고; 이 면역계 반응은 특정 세포, 특히 APC, T 림프구 및 B 림프구의 활성화를 초래할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "항원"은 MHC 분자에 의해 프로세싱되고, 제시되는 경우, 항체 또는 T 세포 수용체 (TCR)가 특이적으로 결합할 수 있는 분자를 지칭한다. 항원은 추가로 면역계에 의해 인식될 수 있고/거나, 체액성 면역 반응 및/또는 B- 및/또는 T-림프구의 활성화를 유도하는 세포성 면역 반응을 유도할 수 있다. 항원은 하나 이상의 에피토프 또는 항원 부위 (B- 및 T-에피토프)를 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "애주번트"는 대상체 또는 동물에게 투여될 때, 항원에 대한 면역 반응을 유도 및/또는 증강시킬 수 있는 화합물을 지칭한다. 또한, 일반적으로 특정 항원에 대한 특정 면역 반응의 정질을 가속화, 연장 또는 증강시키는 작용을 하는 물질을 의미하는 것으로 의도된다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "애주번트"는 선천성 면역 반응의 일시적 반응에 영향을 미침으로써 선천성 면역 반응을 증강시키고, 항원 제시 세포 (APC), 특히 수지상 세포 (DC)의 활성화 및 성숙에 의해 적응 면역 반응의 보다 장기간 지속되는 효과를 증강시키는 화합물을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "치료 유효량"이라는 표현은 의학적 치료에 적용가능한 합리적 이익/위험 비로 면역 반응을 유도하기에 충분한 본 발명의 활성 성분의 양을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "면역 체크포인트 억제제"는 당업계에서 그의 일반적 의미를 갖고, 면역 억제 체크포인트 단백질의 기능을 억제하는 임의의 화합물을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "면역 체크포인트 단백질"은 당업계에서 그의 일반적 의미를 갖고, 신호를 증가시키거나 (자극 체크포인트 분자), 신호를 감소시킨다는 (억제 체크포인트 분자) 점에서 T 세포에 의해 발현되는 분자를 지칭한다. 면역 체크포인트 분자는 CTLA-4 및 PD-1 의존성 경로와 유사한 면역 체크포인트 경로를 구성하는 것으로 당업계에서 인식된다 (예컨대, 문헌 [Pardoll, 2012. Nature Rev Cancer 12:252-264]; [Mellman et al., 2011. Nature 480:480-489] 참조). 억제 체크포인트 분자의 예로는 A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, CD277, IDO, KIR, PD-1, LAG-3, TIM-3 및 VISTA를 포함한다.
본 발명의 항체
:
본 발명의 제1 목적은
- 중쇄는 Npep2 폴리펩티드에 접합되거나, 또는 융합되고,
- 경쇄는
o K417N, L452R, T478K, E484K, 및 N501Y 자연적으로 발생하는 돌연변이를 포함하고, C538S 비자연적으로 발생하는 돌연변이를 포함하는 RBD 폴리펩티드, 또는
o K417N, L452R, T478K, E484Q, 및 N501Y 자연적으로 발생하는 돌연변이를 포함하고, C538S 비자연적으로 발생하는 돌연변이를 포함하는 RBD 폴리펩티드에 접합되거나, 또는 융합되는, 항원 제시 세포의 표면 항원에 대한 항체에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 중쇄는 범위가 서열 번호: 1에서 위치 276의 잔기로부터 위치 411의 잔기까지인 아미노산 서열로 구성된 Npep2 폴리펩티드에 접합되거나, 또는 융합된다.
일부 실시양태에서, 항체는
- 범위가 서열 번호: 1에서 위치 276의 잔기로부터 위치 411의 잔기까지인 아미노산 서열로 구성된 Npep2 폴리펩티드에 접합되거나, 또는 융합되는 중쇄, 및
- 범위가 서열 번호: 2에서 위치 319의 아미노산 잔기로부터 위치 541의 아미노산 잔기까지인 아미노산으로 구성되고, K417N, L452R, T478K, E484K, 및 N501Y 자연적으로 발생하는 돌연변이 및 C538S 비자연적으로 발생하는 돌연변이를 포함하는 RBD 폴리펩티드에 접합되거나, 또는 융합되는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는
- 범위가 서열 번호: 1에서 위치 276의 잔기로부터 위치 411의 잔기까지인 아미노산 서열로 구성된 Npep2 폴리펩티드에 접합되거나, 또는 융합되는 중쇄, 및
- 범위가 서열 번호: 2에서 위치 319의 아미노산 잔기로부터 위치 541의 아미노산 잔기까지인 아미노산으로 구성되고, K417N, L452R, T478K, E484Q, 및 N501Y 자연적으로 발생하는 돌연변이 및 C538S 비자연적으로 발생하는 돌연변이를 포함하는 RBD 폴리펩티드에 접합되거나, 또는 융합되는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 IgG 항체, 바람직하게는, IgG1 또는 IgG4 항체의 것, 또는 더욱더 바람직하게는, IgG4 항체의 것이다.
일부 실시양태에서, 항체는 키메라 항체, 특히, 키메라 마우스/인간 항체이다.
일부 실시양태에서, 항체는 인간화 항체이다.
키메라 또는 인간화 항체는 상기 기술된 바와 같이 제조된 뮤린 모노클로날 항체의 서열에 기초하여 제조될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 코딩하는 DNA는 관심 뮤린 하이브리도마로부터 수득될 수 있고, 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 비-뮤린 (예컨대, 인간) 면역글로불린 서열을 포함하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체를 생성하기 위해, 뮤린 가변 영역은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 인간 불변 영역에 연결될 수 있다 (예컨대, 미국 특허 번호 4,816,567 (카빌리(Cabilly) 등) 참조). 인간화 항체를 생성하기 위해, 뮤린 CDR 영역은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 인간 프레임워크에 삽입될 수 있다. 예컨대, 미국 특허 번호 5,225,539 (윈터(Winter)), 및 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (퀸(Queen) 등)을 참조한다.
일부 실시양태에서, 항체는 인간 항체이다.
인간 항체는 마우스 시스템이 아닌 인간 면역계의 일부를 보유하는 트랜스제닉 또는 트랜스염색체 마우스를 사용하여 확인할 수 있다. 이러한 트랜스제닉 및 트랜스염색체 마우스는 본원에서 각각 HuMAb 마우스 및 KM 마우스로 지칭되는 마우스를 포함하고, 본원에서 총칭하여 "인간 Ig 마우스"로 지칭된다. HuMAb 마우스® (메다렉스, 인크.(Medarex, Inc.))는 내인성 μ 및 κ 쇄 유전자좌를 불활성화시키는 표적화된 돌연변이와 함께, 재배열되지 않은 인간 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ 경쇄 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 유전자 미니유전자좌를 함유한다 (문헌 [Lonberg, et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859] 참조). 또 다른 실시양태에서, 인간 항-PD-1 항체는 예컨대, 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스염색체를 보유하는 마우스와 같은, 트랜스진 및 트랜스염색체 상에 인간 면역글로불린 서열을 보유하는 마우스를 사용하여 생성될 수 있다. 본원에서 "KM 마우스"로 지칭되는 상기 마우스는 PCT 공개 WO 02/43478 (이시다(Ishida) 등)에 상세히 기술되어 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 전문 APC의 세포 표면 마커에 특이적이다. 항체는 예컨대, B 세포 또는 대식세포와 같은 또 다른 전문 APC의 세포 표면 마커에 특이적일 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 DC 면역수용체 (DCIR), MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, 만노스 수용체, 랑게린, DECTIN-1, B7-1, B7-2, IFN-γ 수용체 및 IL-2 수용체, ICAM-1, Fey 수용체, LOX-1, 및 ASPGR에 특이적으로 결합하는 항체로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 항체는 CD40에 특이적이다.
일부 실시양태에서, 항-CD40 항체는 12E12 항체로부터 유래되고,
- 상보성 결정 영역 CDR1H, CDR2H 및 CDR3H를 포함하는 중쇄로서, CDR1H는 아미노산 서열 GFTFSDYYMY (서열 번호: 3)를 갖고, CDR2H는 아미노산 서열 YINSGGGSTYYPDTVKG (서열 번호: 4)를 갖고, CDR3H는 아미노산 서열 RGLPFHAMDY (서열 번호: 5)를 갖는 것인 중쇄, 및
- 상보성 결정 영역 CDR1L, CDR2L 및 CDR3L을 포함하는 경쇄로서, CDR1L은 아미노산 서열 SASQGISNYLN (서열 번호: 6)을 갖고, CDR2L은 아미노산 서열 YTSILHS (서열 번호: 7)를 갖고, CDR3L은 아미노산 서열 QQFNKLPPT (서열 번호: 8)를 갖는 것인 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-CD40 항체는 11B6 항체로부터 유래되고,
- 상보성 결정 영역 CDR1H, CDR2H 및 CDR3H를 포함하는 중쇄로서, CDR1H는 아미노산 서열 GYSFTGYYMH (서열 번호: 9)를 갖고, CDR2H는 아미노산 서열 RINPYNGATSYNQNFKD (서열 번호: 10)를 갖고, CDR3H는 아미노산 서열 EDYVY (서열 번호: 11)를 갖는 것인 중쇄, 및
- 상보성 결정 영역 CDR1L, CDR2L 및 CDR3L을 포함하는 경쇄로서, CDR1L은 아미노산 서열 RSSQSLVHSNGNTYLH (서열 번호: 12)을 갖고, CDR2L은 아미노산 서열 KVSNRFS (서열 번호: 13)를 갖고, CDR3L은 아미노산 서열 SQSTHVPWT (서열 번호: 14)를 갖는 것인 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-CD40 항체는 12B4 항체로부터 유래되고,
- 상보성 결정 영역 CDR1H, CDR2H 및 CDR3H를 포함하는 중쇄로서, CDR1H는 아미노산 서열 GYTFTDYVLH (서열 번호: 15)를 갖고, CDR2H는 아미노산 서열 YINPYNDGTKYNEKFKG (서열 번호: 16)를 갖고, CDR3H는 아미노산 서열 GYPAYSGYAMDY (서열 번호: 17)를 갖는 것인 중쇄, 및
- 상보성 결정 영역 CDR1L, CDR2L 및 CDR3L을 포함하는 경쇄로서, CDR1L은 아미노산 서열 RASQDISNYLN (서열 번호: 18)을 갖고, CDR2L은 아미노산 서열 YTSRLHS (서열 번호: 19)를 갖고, CDR3L은 아미노산 서열 HHGNTLPWT (서열 번호: 20)를 갖는 것인 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-CD40 항체는 표 A 에 기술된 바와 같은 선택된 mAb1, mAb2, mAb3, mAb4, mAb5 및 mAb6으로 구성된 군으로부터 선택된다.
<표 A>
일부 실시양태에서, 항-CD40 항체는
- 가변 도메인이 서열 번호: 21에 기재된 서열을 갖는 중쇄, 및 가변 도메인이 서열 번호: 22에 기재된 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체,
- 가변 도메인이 서열 번호: 23에 기재된 서열을 갖는 중쇄, 및 가변 도메인이 서열 번호: 22에 기재된 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체,
- 가변 도메인이 서열 번호: 24에 기재된 서열을 갖는 중쇄, 및 가변 도메인이 서열 번호: 25에 기재된 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체,
- 가변 도메인이 서열 번호: 26에 기재된 서열을 갖는 중쇄, 및 가변 도메인이 서열 번호: 27에 기재된 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체,
- 가변 도메인이 서열 번호: 28에 기재된 서열을 갖는 중쇄, 및 가변 도메인이 서열 번호: 29에 기재된 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체, 및
- 가변 도메인이 서열 번호: 30에 기재된 서열을 갖는 중쇄, 및 가변 도메인이 서열 번호: 31에 기재된 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 항-CD40 항체는 CD40 효능제 항체이다. CD40 효능제 항체는 WO2010/009346, WO2010/104747 및 WO2010/104749에 기술되어 있다. 개발된 다른 항-CD40 효능제 항체로는 화이자(Pfizer)에 의해 개발된 완전 인간 IgG2 CD40 효능제 항체인 CP-870,893이다. 이는 3.48Х10-10 M의 KD로 CD40에 결합하지만, CD40L (예컨대, 미국 특허 번호 7,338,660 참조) 및 면역원으로서 인간 방광암종 세포주를 사용하여 생성된 마우스 항체 클론 S2C6으로부터 시애틀 게네틱스(Seattle Genetics)에 의해 개발된 인간화 IgG1 항체인 SGN-40의 결합을 차단하지 않는다. 이는 1.0Х10-9 M의 KD로 CD40에 결합하고, CD40과 CD40L 사이의 상호작용을 증진시켜 부분적인 효능제 효과를 보이는 작용을 한다 (문헌 [Francisco J A, et al., Cancer Res, 60: 3225-31, 2000]). 더욱더 특히, CD40 효능제 항체는 표 A에 기술된 바와 같은 선택된 mAb1, mAb2, mAb3, mAb4, mAb5 및 mAb6으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 항체는 랑게린에 특이적인 것이다. 일부 실시양태에서, 항체는 ATCC 수탁 번호 PTA-9852를 갖는 항체 15B10으로부터 유래된 것이다. 일부 실시양태에서, 항체는 ATCC 수탁 번호 PTA-9853을 갖는 항체 2G3으로부터 유래된 것이다. 일부 실시양태에서, 항체는 WO2011032161에 기술된 바와 같은 항체 91E7, 37C1, 또는 4C7로부터 유래된 것이다.
일부 실시양태에서, 항-랑게린 항체는 15B10 항체의 상보성 결정 영역 CDR1H, CDR2H 및 CDR3H를 포함하는 중쇄 및 15B10 항체의 상보성 결정 영역 CDR1L, CDR2L 및 CDR3L을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-랑게린 항체는 2G3 항체의 상보성 결정 영역 CDR1H, CDR2H 및 CDR3H를 포함하는 중쇄 및 2G3 항체의 상보성 결정 영역 CDR1L, CDR2L 및 CDR3L을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-랑게린 항체는 4C7 항체의 상보성 결정 영역 CDR1H, CDR2H 및 CDR3H를 포함하는 중쇄 및 4C7 항체의 상보성 결정 영역 CDR1L, CDR2L 및 CDR3L을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-랑게린 항체는 표 B 에 기술된 바와 같이 선택된 mAb7, mAb8, mAb9로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 항-랑게린 항체는
- 가변 도메인이 서열 번호: 32에 기재된 서열을 갖는 중쇄, 및 가변 도메인이 서열 번호: 33에 기재된 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체,
- 가변 도메인이 서열 번호: 34에 기재된 서열을 갖는 중쇄, 및 가변 도메인이 서열 번호: 35에 기재된 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체,
- 가변 도메인이 서열 번호: 36에 기재된 서열을 갖는 중쇄, 및 가변 도메인이 서열 번호: 37에 기재된 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 항체는 예컨대, 제한 없이 임의의 화학적, 생물학적, 유전적 또는 효소적 기술과 같은 당업계에 공지된 임의의 기술에 의해 단독으로 또는 조합하여 생산될 수 있다. 원하는 서열의 아미노산 서열을 알면, 당업자는 폴리펩티드 생산을 위한 표준 기술에 의해 상기 폴리펩티드를 쉽게 생산할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 현재 당업계에 널리 공지된 바와 같은 재조합 DNA 기술에 의해 합성될 수 있다. 예를 들어, 이들 단편은 원하는 (폴리)펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 발현 벡터에 도입하고, 상기 벡터를 원하는 폴리펩티드를 발현하는 적합한 진핵성 또는 원핵성 숙주에 도입한 후에 DNA 발현 생성물로서 수득할 수 있고, 이들은 널리 공지된 기술을 사용하여 이후에 단리될 수 있다.
일부 실시양태에서, 경쇄는 RBD 폴리펩티드에 그의 C-말단을 통해 접합되거나, 또는 융합된다. 일부 실시양태에서, 항체의 경쇄는 RBD 폴리펩티드의 N-말단에 융합된다.
일부 실시양태에서, 중쇄는 Npep2 폴리펩티드에 그의 C-말단을 통해 접합되거나, 또는 융합된다. 일부 실시양태에서, 항체의 중쇄는 Npep2 폴리펩티드의 N-말단에 융합된다.
일부 실시양태에서, 항체의 중쇄 및/또는 경쇄는 화학적 커플링을 사용하여 RBD 폴리펩티드에 접합된다. 항체의 그의 접합체 모이어티에의 부착 또는 접합을 위한 여러 방법이 당업계에 공지되어 있다. 모이어티를 항체에 접합시키는 데 사용된 링커 유형의 예로는 히드라존, 티오에테르, 에스테르, 디술피드 및 펩티드-함유 링커, 예컨대, 발린-시트룰린 링커를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들면, 리소좀 구획 내의 낮은 pH에 의해 절단되기 쉬운, 또는 프로테아제, 예컨대, 종양 조직에서 우선적으로 발현되는 프로테아제, 예컨대, 카텝신 (예컨대, 카텝신 B, C, D)에 의해 절단되기 쉬운 링커가 선택될 수 있다. 폴리펩티드를 접합시키는 기술은 특히 당업계에 널리 공지되어 있다 (예컨대, [Reisfeld et al. eds., Alan R. Liss, Inc., 1985)]; [Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery," in Controlled Drug Delivery (Robinson et al. eds., Marcel Deiker, Inc., 2nd ed. 1987)]; [Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (Pinchera et al. eds., 1985)]; ["Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy (Baldwin et al. eds., Academic Press, 1985)]; 및 [Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58] 참조; 또한, 예컨대, PCT 공개 WO 89/12624 참조). 전형적으로, 펩티드는 각각 N-히드록시숙신이미드 에스테르 또는 말레이미드 관능기를 통해 항체 상의 리신 또는 시스테인 잔기에 공유 부착된다. 조작된 시스테인을 사용하는 접합 방법 또는 비자연 아미노산의 도입 방법은 접합체의 균질성을 개선시키는 것으로 보고되었다 (문헌 [Axup, J.Y., Bajjuri, K.M., Ritland, M., Hutchins, B.M., Kim, C.H., Kazane, S.A., Halder, R., Forsyth, J.S., Santidrian, A.F., Stafin, K., et al. (2012). Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109, 16101-16106.]; [Junutula, J.R., Flagella, K.M., Graham, R.A., Parsons, K.L., Ha, E., Raab, H., Bhakta, S., Nguyen, T., Dugger, D.L., Li, G., et al. (2010). Engineered thio-trastuzumab-DM1 conjugate with an improved therapeutic index to target human epidermal growth factor receptor 2-positive breast cancer. Clin. Cancer Res.16, 4769-4778]). 주누툴래트(Junutula) 등 (문헌 [Nat Biotechnol. 2008; 26:925-32])은 "THIOMAB"(TDC)로 불리는 시스테인-기반 부위 특이적 접합을 개발하였고, 이는 종래의 접합 방법과 비교하여 개선된 치료 지수를 나타내는 것으로 주장되고 있다. 항체에 도입된 비자연 아미노산에의 접합도 ADC에 대해 조사되고 있고; 그러나, 이 접근법의 일반성은 아직 확립되지 않았다 (문헌 [Axup et al., 2012]). 특히, 당업자는 또한 아실 공여자 글루타민-함유 태그 (예컨대, Gin-함유 펩티드 태그 또는 Q-태그)로 조작된 Fc-함유 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드 조작 (예컨대, 폴리펩티드 상의 아미노산 결실, 삽입, 치환 또는 돌연변이를 통해)에 의해 활성화된 내인성 글루타민을 구상할 수 있다. 이어서, 트랜스글루타미나제는 아민 공여자 작용제 (예컨대, 반응성 아민을 포함하거나, 또는 반응성 아민에 부착된 소분자)와 공유적으로 가교결합하여 아실 공여자 글루타민-함유 태그 또는 접근가능한/노출된/반응성 내인성 글루타민을 통해 Fc-함유 폴리펩티드에 부위 특이적으로 접합되는 아민 공여자 작용제와의 조작된 Fc-함유 폴리펩티드 접합체의 안정하고, 균일한 집단을 형성할 수 있다 (WO 2012059882).
일부 실시양태에서, 접합은 US20160031988A1 및 US20120039916A1에 기술된 바와 같이 코헤신 융합 단백질에 대한 비공유 커플링을 가능하게 하는 독케린 도메인 또는 다중 도메인에 의해 수행된다.
일부 실시양태에서, 융합은 직접적으로, 또는 링커를 통해 수행된다. 본원에서 사용되는 바, "직접적으로"라는 용어는 제1 폴리펩티드의 N-말단 단부에 있는 첫 번째 아미노산이 제2 폴리펩티드의 C-말단 단부에 있는 마지막 아미노산에 융합된다는 것을 의미한다. 이러한 직접적인 융합은 문헌 (Vigneron et al., Science 2004, PMID 15001714), (Warren et al., Science 2006, PMID 16960008), (Berkers et al., J. Immunol. 2015a, PMID 26401000), (Berkers et al., J. Immunol. 2015b, PMID 26401003), (Delong et al., Science 2016, PMID 26912858) (Liepe et al., Science 2016, PMID 27846572), (Babon et al., Nat. Med. 2016, PMID 27798614)에 기술된 바와 같이 자연적으로 발생할 수 있다.
일부 실시양태에서, 링커는 하기 기술되는 바와 같은 FlexV1, f1, f2, f3, 또는 f4로 구성된 군으로부터 선택된다.
다시 말해, 일부 실시양태에서, 링커는 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 서열 번호: 41 및 서열 번호: 42로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질은 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 존재하는 제한 클로닝 부위(들)로부터 기원하는 하나 이상의 서열을 추가로 포함한다. 전형적으로, 상기 서열은 2개의 아미노산 잔기로 구성될 수 있고, 전형적으로 AP, AS, AR, PR, SA, TR, 및 TS 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 신호 펩티드의 서열을 포함한다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "신호 펩티드"는 당업계에서 일반적 의미를 가지며, 단백질의 전구체 형태로 N-말단 펩티드로서 존재하는 프레-펩티드를 지칭한다. 신호 펩티드의 기능은 소포체에 부착되어 있는 발현된 폴리펩티드의 전좌를 촉진하는 것이다. 신호 펩티드는 일반적으로 이 프로세스에서 절단된다. 신호 펩티드는 폴리펩티드를 생산하는 데 사용되는 유기체에 대해 이종성 또는 상동성일 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 i) RBD 폴리펩티드에 융합되어 서열 번호: 43에 기재된 융합 단백질을 형성하는 경쇄, 및 ii) Npep2 폴리펩티드에 융합되어 서열 번호: 45에 기재된 융합 단백질을 형성하는 중쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 i) RBD 폴리펩티드에 융합되어 서열 번호: 44에 기재된 융합 단백질을 형성하는 경쇄, 및 ii) Npep2 폴리펩티드에 융합되어 서열 번호: 45에 기재된 융합 단백질을 형성하는 중쇄를 포함한다.
본 발명의 핵산, 벡터 및 숙주 세포:
본 발명의 추가 목적은 본 발명의 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
전형적으로, 상기 핵산은 예컨대, 플라스미드, 코스미드, 에피솜, 인공 염색체, 파지 또는 바이러스 벡터와 같은 임의의 적합한 벡터에 포함될 수 있는 DNA 또는 RNA 분자이다.
따라서, 본 발명의 추가 목적은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
상기 벡터는 대상체에게 투여시 상기 항체의 발현을 유발하거나, 또는 지시하기 위한 조절 요소, 예컨대, 프로모터, 인핸서, 터미네이터 등을 포함할 수 있다. 동물 세포용 발현 벡터에 사용되는 프로모터 및 인핸서의 예로는 SV40의 조기 프로모터 및 인핸서, 몰로니 마우스 백혈병 바이러스의 LTR 프로모터 및 인핸서, 면역글로불린 H 쇄의 프로모터 및 인핸서 등을 포함한다. 인간 항체 C 영역을 코딩하는 유전자가 삽입되어 발현될 수 있는 한, 임의의 동물 세포 발현 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 예로는 pAGE107, pAGE103, pHSG274, pKCR, pSG1 베타 d2-4 등을 포함한다. 플라스미드의 다른 예는 복제 기점을 포함하는 복제 플라스미드, 또는 통합 플라스미드, 예컨대, 예로서, pUC, pcDNA, pBR 등을 포함한다. 바이러스 벡터의 다른 예로는 아데노바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스 및 AAV 벡터를 포함한다. 상기 재조합 바이러스는 예컨대, 패키징 세포를 형질감염시키거나, 헬퍼 플라스미드 또는 바이러스를 이용한 일시적 형질감염과 같은 당업계에 공지된 기술에 의해 생산될 수 있다. 바이러스 패키징 세포의 전형적인 예로는 PA317 세포, PsiCRIP 세포, GPenv+ 세포, 293 세포 등을 포함한다. 상기 복제 결함 재조합 바이러스를 생산하기 위한 상세한 프로토콜은 예를 들어, WO 95/14785, WO 96/22378, US 5,882,877, US 6,013,516, US 4,861,719, US 5,278,056 및 WO 94/19478에서 살펴볼 수 있다.
본 발명의 추가 목적은 본 발명에 따른 핵산 및/또는 벡터에 의해 형질감염, 감염 또는 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명의 핵산은 적합한 발현 시스템에서 본 발명의 항체를 생산하는 데 사용될 수 있다. 일반적인 발현 시스템으로는 E. 콜라이(E. coli) 숙주 세포 및 플라스미드 벡터, 곤충 숙주 세포 및 바큘로바이러스 벡터, 및 포유동물 숙주 세포 및 벡터를 포함한다. 숙주 세포의 다른 예로는 제한 없이, 원핵 세포 (예컨대, 박테리아) 및 진핵 세포 (예컨대, 효모 세포, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등)를 포함한다. 구체적인 예로는 E. 콜라이, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 또는 사카로마이세스(Saccharomyces) 효모를 포함한다. 포유동물 숙주 세포로는 DHFR 선택 마커와 함께 사용되는 dhfr-CHO 세포 (문헌 [Urlaub and Chasin, 1980]에 기재)를 포함하는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO 세포), CHOK1 dhfr+ 세포주, NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포, 예를 들어, GS Xceed™ 유전자 발현 시스템 (론자(Lonza))과 함께 GS CHO 세포주, 또는 HEK 세포를 포함한다.
본 발명은 또한 (i) 시험관내 또는 생체외에서 상기 기술된 바와 같은 재조합 핵산 또는 벡터를 적격 숙주 세포에 도입하는 단계, (ii) 수득된 재조합 숙주 세포를 시험관내 또는 생체외에서 배양하는 단계, 및 (iii) 임의적으로, 상기 항체를 발현 및/또는 분비하는 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 발현하는 재조합 숙주 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다. 상기 재조합 숙주 세포는 본 발명의 항체 생산에 사용될 수 있다.
따라서, 본원에 개시된 숙주 세포는 본 발명의 항체를 생산하는 데 특히 적합하다. 실제로, 재조합 발현이 포유동물 숙주 세포에 도입되는 경우, 폴리펩티드는 숙주 세포에서의 항체 발현, 및 임의적으로, 숙주 세포가 성장한 배양 배지로의 항체 분비에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생산된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 분비 후 배양 배지로부터 회수 및 정제될 수 있다.
제약 및 백신 조성물 :
본원에 기술된 항체는 하나 이상의 제약 조성물의 일부로서 투여될 수 있다. 임의의 종래의 담체 매질이, 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 생성하거나, 또는 그렇지 않으면 제약 조성물의 임의의 다른 성분(들)과 유해한 방식으로 상호작용하는 것과 같이 본 발명의 폴리펩티드와 양립할 수 없는 경우를 제외하고는, 이의 용도는 본 발명의 범주 내에서 고려된다. 제약상 허용되는 담체로서 작용할 수 있는 물질의 일부 예로는 당, 예컨대, 락토스, 글루코스 및 수크로스; 전분, 예컨대, 옥수수 전분, 및 감자 전분; 셀룰로스 및 그의 유도체, 예컨대, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 분말화 트라가칸트; 맥아; 젤라틴; 활석; 부형제, 예컨대, 코코아 버터 및 좌제 왁스; 오일, 예컨대, 땅콩유, 면실유; 홍화유, 참깨유; 올리브유; 옥수수유 및 대두유; 글리콜, 예컨대, 프로필렌 글리콜; 에스테르, 예컨대, 에틸 올레이트, 에틸 라우레이트; 아가; 완충화제, 예컨대, 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; 알긴산; 발열원 무함유 물; 등장성 염수; 링거액; 에틸알콜, 및 포스페이트 완충 용액 뿐만 아니라, 다른 비독성 상용성 활택제, 예컨대, 라우릴 황산나트륨, 스테아린산마그네슘을 포함하나, 이에 제한되지 않을 뿐만 아니라, 착색화제, 이형제, 코팅제, 감미제, 향미제 및 방향제, 보존제 및 항산화제도 제제설계자의 판단에 따라 조성물에 존재할 수 있다.
본원에 기술된 항체는 백신 조성물을 제조하는 데 특히 적합하다. 따라서, 본 발명의 추가 목적은 본 발명의 항체를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 백신 조성물은 애주번트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 애주번트는 알룸이다. 일부 실시양태에서, 애주번트는 불완전 프로인트 애주번트 (IFA) 또는 30-70%, 바람직하게는, 40-60%, 더욱 바람직하게는, 45-55% 중량/중량 비율 (w/w)로 존재하는 다른 오일 기반 애주번트이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 백신 조성물은 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, 및 TLR8 효능제로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 톨-유사 수용체 (TLR) 효능제를 포함한다.
치료 방법
:
본원에 기술된 항체 뿐만 아니라, 제약 또는 백신 조성물은 사르베코바이러스, 및 특히 SARS-CoV-2에 대한 면역 반응을 유도하는 데 특히 적합한 바, 백신 목적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 범용 사르베코바이러스 백신으로 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가 목적은 치료 유효량의 본 발명의 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 사르베코바이러스에 대한 백신접종을 필요로 하는 대상체에게 백신접종하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가 목적은 치료 유효량의 본 발명의 항체를 투여하는 단계를 포함하는, SARS-CoV-2에 대한 백신접종을 필요로 하는 대상체에게 백신접종하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 항체 뿐만 아니라, 제약 또는 백신 조성물은 특히 Covid-19 치료에 적합하다.
일부 실시양태에서, 대상체는 인간 또는 코로나바이러스 감염에 취약할 수 있는 임의의 다른 동물 (예컨대, 조류 및 포유동물) (예컨대, 가축, 예컨대, 고양이 및 개; 가축 및 농장 동물, 예컨대, 말, 소, 돼지, 닭 등)일 수 있다. 전형적으로, 상기 대상체는 비영장류 (예컨대, 낙타, 당나귀, 얼룩말, 소, 돼지, 말, 염소, 양, 고양이, 개, 래트 및 마우스) 및 영장류 (예컨대, 원숭이, 침팬지 및 인간)를 비롯한 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 비-인간 동물이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 농장 동물 또는 애완동물이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간 유아이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간 아동이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간 성인이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 노인이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간 미숙아이다.
일부 실시양태에서, 대상체는 증상이 있거나, 또는 무증상일 수 있다.
전형적으로, 본 발명의 활성 성분 (즉, 본원에 기술된 항체 및 제약 또는 백신 조성물)은 대상체에게 치료 유효량으로 투여된다. 본 발명의 화합물 및 조성물의 총 1일 투여량은 건전한 의학적 판단의 범주 내에서 주치의에 의해 결정될 것임을 이해할 것이다. 임의의 특정 대상체에 대한 특정 치료 유효 용량 수준은 치료되는 장애 및 장애의 중증도; 사용된 특정 화합물의 활성; 사용된 특정 조성물, 대상체의 연령, 체중, 일반 건강, 성별 및 식이; 투여 시간, 투여 경로, 및 사용된 특정 화합물의 배설 속도; 치료 기간; 사용된 특정 폴리펩티드와 조합하여 또는 동시에 사용되는 약물; 및 의학 분야에 널리 공지된 유사한 인자를 포함하는 다양한 인자에 의존할 것이다. 예를 들면, 원하는 치료 효과를 달성하는 데 필요한 수준보다 낮은 수준에서 화합물의 용량을 개시하고, 원하는 효과가 달성될 때까지 용량을 점진적으로 증량하는 것은 당업계의 기술 범위 내에 있다. 그러나, 생성물의 1일 투여량은 성인 1인 1일당 0.01 내지 1,000 mg의 광범위한 범위에 걸쳐 다양할 수 있다. 특히, 조성물은 치료하고자 하는 대상체에 대한 투여량의 증상 조정을 위해 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0, 50.0, 100, 250 및 500 mg의 활성 성분을 함유한다. 의약은 전형적으로 약 0.01 mg 내지 약 500 mg의 활성 성분, 특히, 1 mg 내지 약 100 mg의 활성 성분을 함유한다. 약물의 유효량은 통상 0.0002 mg/kg (체중)/일 내지 약 20 mg/kg (체중)/일, 특히 약 0.001 mg/kg (체중)/일 내지 7 mg/kg (체중)/일의 투여량 수준으로 공급된다.
본원에 기술된 항체 및 제약 또는 백신 조성물은 임의의 주어진 경우에 가장 적합한 경로는 치료되는 병태의 성질 및 중증도 및 사용되는 특정 활성제의 성질에 따라 달라질 것이지만, 임의의 투여 경로, 및 특히 경구, 비강, 직장, 국소, 협측 (예컨대, 설하), 비경구 (예컨대, 피하, 근육내, 피내 또는 정맥내) 및 경피 투여에 의해 대상체에게 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 항체 뿐만 아니라, 제약 또는 백신 조성물은 예를 들어, SARS-CoV-2 코로나바이러스에 대한 임의의 공지된 치료제 또는 백신접종 방법과 함께 조합하여 대상체에게 투여될 수 있다. 상기 공지된 치료제의 비제한적 예로는 항바이러스제, 예컨대, 렘데시비르, 로피나비르, 리토나비르, 히드록시클로로퀸 및 클로로퀸을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 항체 및 제약 또는 백신 조성물은 면역 체크포인트 억제제와 함께 조합하여 투여된다. 면역 체크포인트 억제제의 예로는 PD-1 길항제, PD-L1 길항제, PD-L2 길항제 CTLA-4 길항제, VISTA 길항제, TIM-3 길항제, LAG-3 길항제, IDO 길항제, KIR2D 길항제, A2AR 길항제, B7-H3 길항제, B7-H4 길항제, 및 BTLA 길항제를 포함한다. 일부 실시양태에서, PD-1 (프로그램화된 사멸-1) 축 길항제는 PD-1 길항제 (예를 들어 항-PD-1 항체), PD-L1 (프로그램화된 사멸 리간드-1) 길항제 (예를 들어 항-PD-L1 항체) 및 PD-L2 (프로그램화된 사멸 리간드-2) 길항제 (예를 들어 항-PD-L2 항체)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 MDX-1106 (니볼루맙(Nivolumab), MDX-1106-04, ONO-4538, BMS-936558, 및 옵디보(Opdivo)®로도 공지), 머크(Merck) 3475 (펨브롤리주맙(Pembrolizumab), MK-3475, 람브롤리주맙(Lambrolizumab), 키트루다(Keytruda)®, 및 SCH-900475로도 공지), 및 CT-011 (피딜리주맙(Pidilizumab), hBAT, 및 hBAT-1로도 공지)로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, PD-1 결합 길항제는 AMP-224 (also known as B7-DCIg로도 공지)이다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 YW243.55.S70, MPDL3280A, MDX-1105, 및 MEDI4736으로 구성된 군으로부터 선택된다. MDX-1105 (BMS-936559로도 공지)는 WO2007/005874에 기술된 항-PD-L1 항체이다. 항체 YW243.55. S70은 WO 2010/077634 A1에 기술된 항-PD-L1이다. MEDI4736은 WO2011/066389 및 US2013/034559에 기술된 항-PD-L1 항체이다. MDX-1106 (MDX-1106-04, ONO-4538 또는 BMS-936558로도 공지)은 미국 특허 번호 8,008,449 및 WO2006/121168에 기술된 항-PD-1 항체이다. 머크 3745 (MK-3475 또는 SCH-900475로도 공지)는 미국 특허 번호 8,345,509 및 WO2009/114335에 기술된 항-PD-1 항체이다. CT-011 (피디질루맙(Pidizilumab)) (hBAT 또는 hBAT-1로도 공지)은 WO2009/101611에 기술된 항-PD-1 항체이다. AMP-224 (B7-DCIg로도 공지)는 WO2010/027827 및 WO2011/066342에 기술된 PD-L2-Fc 융합 가용성 수용체이다. 아테졸리무맙(Atezolimumab)은 미국 특허 번호 8,217,149에 기술된 항-PD-L1 항체이다. 아벨루맙(Avelumab)은 US 20140341917에 기술된 항-PD-L1 항체이다. CA-170은 WO2015033301 & WO2015033299에 기술된 PD-1 길항제이다. 다른 항-PD-1 항체는 미국 특허 번호 8,609,089, US 2010028330, 및/또는 US 20120114649에 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, PD-1 억제제는 니볼루맙, 펨브롤리주맙 또는 피딜리주맙으로부터 선택된 항-PD-1 항체이다. 일부 실시양태에서, PD-L1 길항제는 아벨루맙, BMS-936559, CA-170, 두르발루맙(Durvalumab), MCLA-145, SP142, STI-A1011, STIA1012, STI-A1010, STI-A1014, A110, KY1003 및 아테졸리무맙으로 구성된 군으로부터 선택되고, 바람직한 것은 아벨루맙, 두르발루맙 또는 아테졸리무맙이다.
본 발명은 하기 도면 및 실시예에 의해 추가로 예시될 것이다. 그러나, 이들 실시예 및 도면은 어떠한 방식으로든 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
도면:
도 1: 범용-
사르베코바이러스
DC
표적화
백신 (
CD40.Pan
.
CoV
) 디자인.
도 2: SARS- CoV -2 감염된 회복기의 공여자 PBMC 배양물에서 사르베코바이러 스 T 세포의 시험관내 확장을 통해 시험된 범용- 사르베코바이러스 DC 표적화 백신. a ) SARS-CoV-2+ 회복기의 공여자 환자 PBMC (n=6)를 D0에 CD40.N2.RBDvSAD 백신 (1 nM)으로 자극하고, 9일 동안 IL-2와 함께 배양한 후, 이어서, 마지막 24 h 동안 하기 서열: i) 백신 RBD (vRBD) of SARS-CoV-2 (우한(Wuhan)), VOC 베타/감마, VOC 델타, SARS-CoV-1, ii) 백신 Npep2 (vN) of SARS-CoV-2 및 SARS-CoV-1 영역에 걸친 상이한 중복 펩티드 (OLP) 풀 (1 ㎍/ml)로 자극한 후, D9에 세포내 시토카인 염색 (ICS)으로 분석하였다. b ) 그래프는 세포내 인터페론 γ (IFNγ+), 세포내 종양 괴사 인자 α (TNFα+) 또는 인터루킨 2 (IL-2+)에 대해 임의적으로 염색된 CD4+ T 및 CD8+ T 세포의 비율(%)에 대한 누적 값을 보여준다.
도 3: 베타코로나바이러스 중 백신 RDB 및 Npep2 (N2) 영역의 상동성을 분석한 결과 사르베코바이러스 내에서 이러한 백신 영역의 상동성이 높은 비율로 나타 났다. 본 발명자들은 SARS-CoV-2, 4개의 SARS-CoV-2 VOC (α, β, γ, δ), SARS-CoV-1, 및 32개의 최근 기술된 SARS-CoV 관련 코로나바이러스 (박쥐 기원의 바이러스 30개 및 천산갑 기원의 바이러스 2개 포함 (이들은 모두 사르베코바이러스 아속으로부터의 것이다))를 포함)로부터의 서열 정렬을 수행하기 위해 코발트(Cobalt) (https://www-ncbi-nlm-nih-gov.proxy.insermbiblio.inist.fr/tools/cobalt/re_cobalt.cgi)를 사용하였다.
도 4: 범용- 사르베코바이러스 DC 표적화 백신 ( CD40.Pan . CoV )은 SARS- CoV -2 감염된 회복기의 공여자 PBMC로부터 B 세포의 시험관내 활성화 및 혈장 세포 분화를 유도하였다. a ) COVID-19 회복기의 개체로부터의 PBMC를 시험관내에서 CD40.CoV2, CD40.Pan.CoV (즉, CD40.N2.RBDvSAD-Q), IgG4.CoV2, CD40.NivG (Nipah 대조군 백신) 또는 비융합 CD40 mAb (1 nM)로 자극하였다. PBMC (5E05)를 10% 인간 AB (SAB)로 보충된 RPMI 300 ㎕ 중에서 인큐베이션시켰다. 48시간 후, 상청액을 폐기하고, 10% 인간 혈청 AB (SAB)로 보충된 신선한 RPMI 1 mL로 대체한다. 배지를 2일마다 절반씩 보충한다. 7일 후, PBMC를 RPMI 10% FCS 중에서 세척하고, 500 ul의 RPMI 10% FCS 중에서 배양한다. b ) 9일 후, CD19 Alexa700 (BD로부터 입수; ref:561031), CD21 PECF594 (BD로부터 입수; ref :563474), CD27 APC (BD로부터 입수; ref 337169), CD38 PercPCy5.5 (바이오레전드(Biolegend)로부터 입수; ref 303522), CD138 PE (BD로부터 입수; ref: 552026), 및 IgD FITC (인비트로겐(Invitrogen)으로부터 입수; ref: H15501) 외에 생존능 마커로 세포를 염색하여 B 세포 계통을 결정하고, LSR II-3 레이저 유세포 분석기 (405, 488 및 640 nm) (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson))를 사용하여 분석하였다. c) 세포 배양물 상청액 중 SARS-CoV-2 RBD에 대한 IgG 항체 측정은 LUMINEX 기술을 이용하여 수행하였다.
도 5: 범용- 사르베코바이러스 DC 표적화 백신 ( CD40.Pan . CoV )은 K18 hACE2tg x hCD40tg 마우스를 SARS- CoV2 감염으로부터 방어하였다. K18 hACE2 tg x hCD40tg 마우스를 0일 및 21일째 CD40.Pan.CoV 백신 (10 ㎍/마우스) + 폴리-ICLC (힐토놀(Hiltonol)®) (애주번트로서) (50 ㎍/마우스)를 이용하여 2회에 걸쳐 복강내로 면역화하였다 (n=6). 모의 마우스는 0일 및 21일째 PBS 또는 폴리-ICLC를 받았다 (n=9/군). 이어서, 마우스를 프라임 후 D28에 비내 점적을 통해 SARS-CoV2 바이러스 (우한 균주 10^4 PFU)로 감염시켰다. a) 마우스를 12일 동안 생존에 대해 모니터하였다. b ) 군당 마우스 3마리씩 무작위로 선택하고, 감염 후 5일째 희생시켜 폐의 바이러스 부하 및 바이러스 감염성을 평가하였다.
도 6: 델타 SARS- CoV -2 균주로 챌린지된 회복기의 NHP에서 범용- 사르베코바 이러스 DC 표적화 백신 ( CD40.Pan . CoV )의 항바이러스 효능. 본 발명자들은 애주번트 없이 백신 200 ㎍을 회복기의 시노몰구스 마카크 5마리에게 피하로 주사하였다. 모든 회복기의 마카크는 이전에 SARS-CoV-2 (1x10^6 PFU; 균주: 베타CoV/France/IDF/0372/2020; 2020년 3-4월 및 2020년 10월)에 노출되고, RT-qPCR 및 혈청학에 의해 감염된 것으로 확인된 것이었다. 사전 약물 치료를 위해 아트로핀 (0.04 mg/kg)을 사용하고, 마취를 위해 메데토미딘 (0.05 mg/kg)과 함께 케타민 (5 mg/kg)을 사용하여 비내 및 기관내 경로 25의 조합을 통해 (각 콧구멍에 0.25 mL 및 기관에 4.5 mL, 즉, 총 5 mL; 0일째) 면역화 후 4주째, 5마리의 CD40.Pan.CoV 면역화된 회복기의 NHP 및 6마리의 SARS-CoV-2-나이브 동물 (대조군)을 총 용량 10e5 TCID50의 SARS-CoV-2 B.1.617.2 변종 바이러스 (델타 균주; SARS-CoV-2, hCoV-19/USA/PHC658/2021; BEI 자원 저장소(BEI Resources Repository) (미국 국립 보건원(National Instituted of Health))에 노출시켰다. 혈액, 비인두 & 기관 스왑 및 기관지폐포 세척액을 정기적으로 수집하였다. a) 나이브 및 CD40.Pan.CoV 백신접종 회복기의 마카크의 기관, 비인두 스왑 및 BAL에서의 게놈 바이러스RNA (gRNA) 정량화. 가로 점선은 검출 한계를 나타낸다. b) 나이브 및 CD40.Pan.CoV 백신접종 회복기의 마카크의 기관, 비인두 스왑 및 BAL에서의 서브게놈 바이러스 RNA (gRNA) RNA (gRNA) 정량화. 가로 점선은 검출 한계를 나타낸다.
도 7: 회복기의 NHP에서의 범용- 사르베코바이러스 DC 표적화 백신 (CD40.Pan.CoV)의 면역원성. a) 항-스파이크 (S), b) 항-뉴클레오캡시드 (N) 및 c) 항-RBD 델타, d) 항-RBD 우한 또는 e) 항-RBD 베타 IgG를 이전에 기술된 바와 같이, 메조스케일 디스커버리(Mesoscale Discovery) (MSD, 미국 MD 로크빌)에 의해 개발된 상업적으로 이용가능한 다중화 면역검정법을 이용하여 적정하였다 (문헌 [Anderson, E. J. et al. Safety and immunogenicity of SARS-CoV-2 mRNA-1273 vaccine in older adults. N. Engl. J. Med. 383, 2427-2438 (2020)]). 스파이크 단백질의 ACE2 수용체에의 결합을 중화시키는 a) 항-스파이크 및 c) 항-RBD 델타, d) 항-RBD 우한 및 e) 항-RBD 베타 항체는 MSD 의사-중화 검정법을 이용하여 적정하였다.
실시예
:
CD40 결합 특이성을 포함한 발현 벡터 및 단백질 정제 생산 및 품질 보증 방법은 기술된 바와 같았다 [1; 2; 3, 4, 5]. 단백질 발현은 TransIT®-CHO 형질감염 키트(TransIT®-CHO Transfection Kit) (미루스(Mirus))를 사용한 일시적 CHO-S (차이니즈 햄스터 난소 세포) 형질감염을 통해 이루어졌다. 클로닝은 CHO 최적화된 코돈을 이용하여 전형적으로 다양한 조합으로 벡터에의 라이게이션에 편리한 제한 부위와 경계를 이루고 있는 다양한 SARS-CoV-2 항원 영역을 코딩하는 합성 DNA 카세트를 사용하였다.
특히, 본 발명자들은 도 1 에 도시된 바와 같은 2개의 구축물을 생성하였다. 본 발명자들은 구축물이 인간 CD40에 결합하는 것을 확인하였다 ( 데이터는 제시되 지 않음 ). 이어서, 구축물을 상이한 사르베코바이러스의 RBD 및 Npep2 영역에 특이적인 상이한 중복 펩티드 (OLP) 풀을 이용하여 SARS-CoV-2 감염된 회복기의 공여자 PBMC 배양물 중에서의 T 세포의 시험관내 확장을 통해 시험하였다 ( 도 2 ). RBD 영역과 Npep2 영역 사이의 상동성이 매우 높기 때문에 ( 도 3 ), 본원에 개시된 구축물을 범용 사르베코바이러스 백신으로 사용할 수 있다. 특히, Npep2에 대한 상기 38개의 사르베코바이러스 사이의 평균 [최소-최대] 상동성(%)은 93.5% [89.7% 내지 100%]였다 ( 도 3 ). 사르베코바이러스 간의 서열 상동성 이외에도, 본 발명자들은 백신 T 세포 에피토프가 SARS-CoV-2 및 SARS-CoV-1 및 32개의 사르베코바이러스 사이에 고도로 보존되며, 상동성은 75 내지 100%에 이르는 것을 관찰하였다. 추가의 심층 분석 결과, 모든 CD8+ T 세포 에피토프 중 62% (n = 57)가 SARS-CoV-2와 CoV-1 사이에 적어도 하나의 돌연변이가 다르지만, 이러한 돌연변이는 NetMHC4에 의해 예측된 바와 같이, 이들 중 대다수 (81%)의 경우, HLA-클래스 I 결합에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 더욱이, Npep2에 포함된 2개의 CD4+ T 세포 에피토프 (N301-315, 및 N306-320) 및 Npep2로부터의 6개의 CD8+ T 세포 에피토프 (N305-314; N306-315; N307-315; 308-317; 310-319; 311-319)는 모든 사르베코바이러스 간에 100% 상동성이었다. 더욱이, 본 발명자들은 장기 면역에 매우 중요한, Npep2에 대한 매우 강력한 CD8+ T 세포 반응을 관찰하였다 (문헌 [Coleon , Severin, et al. "Design, immunogenicity , and efficacy of a pan- sarbecovirus dendritic-cell targeting vaccine." EBioMedicine 80 (2022): 104062.]의 도 6c 참조). 포괄하면, 결과를 통해 Npep2 서열이 광범위한 교차 반응성 T 세포 반응을 유도하는 것을 목표로 하는 범용-사르베코바이러스 백신 디자인에 적합하다는 것을 확인할 수 있다. SARS-CoV-2 감염된 회복기의 공여자 PBMC 배양물의 범용-사르베코바이러스 DC 표적화 백신 (CD40.Pan.CoV, 즉, CD40.N2.RBDvSAD-Q 백신) 자극 후 (도 4a) , 본 발명자들은 시험관내에서 B 세포 활성화 및 형질 세포 분화를 유도하여 (도 4b) 항-RBD IgG를 생산할 수 있었다 (도 4c) . 본 발명자들은 폴리-ICLC 애주번트가 첨가된 CD40.Pan.CoV 백신으로 2회 면역화된 K18 hACE2 tg x hCD40tg 마우스가 대조군 동물 (PBS 또는 폴리-ICLC)과 비교하여 치명적인 SARS-CoV-2 우한 챌린지로부터 방어되었다는 것을 입증하였다 (도 5a) . 따라서, 백신접종된 마우스의 폐 중 SARS-CoV-2 바이러스 복제 (게놈 등가물/㎍ (RNA)) 및 뇌내 바이러스 감염성 입자 (PFU/mg (조직))는 대조군보다 낮거나 감지할 수 없는 수준이었다 (도 5b) . 이어서, 본 발명자들은 5마리의 회복기의 시노몰구스 마카크에게 애주번트 없이 200 ㎍의 CD40.Pan.CoV 백신을 피하 주사하였다. 면역화 후 4주째, 5마리의 CD40.Pan.CoV 면역화된 회복기의 NHP, 및 6마리의 SARS-CoV-2-나이브 동물 (대조군)을 총 용량 10e5 TCID50의 SARS-CoV-2 B.1.617.2 변종 바이러스 (델타 균주)에 노출시켰다. 기관 및 비인두 스왑 및 기관지폐포 세척액 (BAL) 중 바이러스 게놈 RNA (gRNA, 도 6a) 및 서브게놈 RNA (sgRNA, 도 6b) 검출에 의해 제시된 바와 같이, 모든 나이브 동물은 감염되었다. 본 발명자들은 델타 균주에 의한 챌린지 후 CD40.Pan.CoV로 면역화된 모든 회복기의 시노몰구스 마카크가 대조군 동물보다 유의적으로 더 낮은 바이러스 게놈 RNA 수준 (도 6a) 및 바이러스 서브게놈 RNA 수준 (도 6b)을 보였다는 것을 입증하였다. 본 발명자들은 또한 CD40.Pan.CoV에 의한 면역화가 스파이크에 대한 결합 및 중화 Ab 반응 (도 7a), 뉴클레오캡시드에 대한 결합 Ab 반응 (도 7b) 뿐만 아니라, 우한, 델타 및 베타 RBD에 대한 교차 반응성 결합 및 중화 Ab 반응 (도 7c-e)을 유도할 수 있다는 것을 입증하였다.
참고문헌:
본 출원 전체에 걸쳐, 다양한 참고문헌이 본 발명과 관련된 최신 기술을 설명한다. 이들 참고문헌의 개시내용은 본원에서 본 개시내용에 참조로 포함된다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (18)
- - 중쇄는 범위가 서열 번호: 1에서 위치 276의 잔기(residue)로부터 위치 411의 잔기까지인 Npep2 폴리펩티드에 접합(conjugating)되거나, 또는 융합(fusing)되고,
- 경쇄는
o 범위가 서열 번호: 2에서 위치 319의 아미노산 잔기로부터 위치 541의 아미노산 잔기까지이고, K417N, L452R, T478K, E484K, 및 N501Y 자연적으로 발생하는 돌연변이를 포함하고, C538S 비자연적으로 발생하는 돌연변이를 포함하는 RBD 폴리펩티드, 또는
o 범위가 서열 번호: 2에서 위치 319의 아미노산 잔기로부터 위치 541의 아미노산 잔기까지이고, K417N, L452R, T478K, E484Q, 및 N501Y 자연적으로 발생하는 돌연변이를 포함하고, C538S 비자연적으로 발생하는 돌연변이를 포함하는 RBD 폴리펩티드에 접합되거나, 또는 융합되는,
항원 제시 세포(antigen presenting cell)의 표면 항원에 대한 항체. - 제1항에 있어서, IgG 항체, 바람직하게는, IgG1 또는 IgG4 항체, 또는 더욱더 바람직하게는, IgG4 항체인 항체.
- 제1항에 있어서, 키메라 항체(chimeric antibody), 특히, 키메라 마우스/인간 항체 또는 인간화 항체(humanized antibody)인 항체.
- 제1항에 있어서, DC 면역수용체 (DCIR), MHC 클래스(class) I, MHC 클래스 II, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, 만노스 수용체, 랑게린(Langerin), DECTIN-1, B7-1, B7-2, IFN-γ 수용체 및 IL-2 수용체, ICAM-1, Fey 수용체, LOX-1, 및 ASPGR에 특이적으로 결합하는 항체로부터 선택되는 항체.
- 제1항에 있어서, CD40에 특이적인 항체.
- 제5항에 있어서,
- 12E12 항체로부터 유래되고,
o 상보성 결정 영역 CDR1H, CDR2H 및 CDR3H를 포함하는 중쇄로서, CDR1H는 아미노산 서열 GFTFSDYYMY (서열 번호: 3)를 갖고, CDR2H는 아미노산 서열 YINSGGGSTYYPDTVKG (서열 번호: 4)를 갖고, CDR3H는 아미노산 서열 RGLPFHAMDY (서열 번호: 5)를 갖는 것인 중쇄, 및
o 상보성 결정 영역 CDR1L, CDR2L 및 CDR3L을 포함하는 경쇄로서, CDR1L은 아미노산 서열 SASQGISNYLN (서열 번호: 6)을 갖고, CDR2L은 아미노산 서열 YTSILHS (서열 번호: 7)를 갖고, CDR3L은 아미노산 서열 QQFNKLPPT (서열 번호: 8)를 갖는 것인 경쇄를 포함하거나,
- 11B6 항체로부터 유래되고,
o 상보성 결정 영역 CDR1H, CDR2H 및 CDR3H를 포함하는 중쇄로서, CDR1H는 아미노산 서열 GYSFTGYYMH (서열 번호: 9)를 갖고, CDR2H는 아미노산 서열 RINPYNGATSYNQNFKD (서열 번호: 10)를 갖고, CDR3H는 EDYVY (서열 번호: 11)를 갖는 것인 중쇄, 및
o 상보성 결정 영역 CDR1L, CDR2L 및 CDR3L을 포함하는 경쇄로서, CDR1L은 아미노산 서열 RSSQSLVHSNGNTYLH (서열 번호: 12)를 갖고, CDR2L은 아미노산 서열 KVSNRFS (서열 번호: 13)를 갖고, CDR3L은 아미노산 서열 SQSTHVPWT (서열 번호: 14)를 갖는 것인 경쇄를 포함하거나,
- 12B4 항체로부터 유래되고,
o 상보성 결정 영역 CDR1H, CDR2H 및 CDR3H를 포함하는 중쇄로서, CDR1H는 아미노산 서열 GYTFTDYVLH (서열 번호: 15)를 갖고, CDR2H는 아미노산 서열 YINPYNDGTKYNEKFKG (서열 번호: 16)를 갖고, CDR3H는 GYPAYSGYAMDY (서열 번호: 17)를 갖는 것인 중쇄, 및
o 상보성 결정 영역 CDR1L, CDR2L 및 CDR3L을 포함하는 경쇄로서, CDR1L은 아미노산 서열 RASQDISNYLN (서열 번호: 18)을 갖고, CDR2L은 아미노산 서열 YTSRLHS (서열 번호: 19)를 갖고, CDR3L은 아미노산 서열 HHGNTLPWT (서열 번호: 20)를 갖는 것인 경쇄를 포함하는 항체. - 제6항에 있어서, 항-CD40 항체가 표 A에 기술된 바와 같은 선택된 mAb1, mAb2, mAb3, mAb4, mAb5 및 mAb6으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 항체.
- 제1항에 있어서, 랑게린에 특이적인 항체.
- 제8항에 있어서,
- 15B10 항체의 상보성 결정 영역 CDR1H, CDR2H 및 CDR3H를 포함하는 중쇄 및 15B10 항체의 상보성 결정 영역 CDR1L, CDR2L 및 CDR3L을 포함하는 경쇄, 또는
- 2G3 항체의 상보성 결정 영역 CDR1H, CDR2H 및 CDR3H를 포함하는 중쇄 및 2G3 항체의 상보성 결정 영역 CDR1L, CDR2L 및 CDR3L을 포함하는 경쇄, 또는
- 4C7 항체의 상보성 결정 영역 CDR1H, CDR2H 및 CDR3H를 포함하는 중쇄 및 4C7 항체의 상보성 결정 영역 CDR1L, CDR2L 및 CDR3L을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체. - 제9항에 있어서, 표 B에 기술된 바와 같은 선택된 mAb7, mAb8 및 mAb9로 구성된 군으로부터 선택되는 항체.
- 제1항에 있어서, 중쇄 및/또는 경쇄가 서열 번호: 38 (FlexV1), 서열 번호: 39 (f1), 서열 번호: 40 (f2), 서열 번호: 41 (f3) 및 서열 번호: 42 (f4)로 구성된 군으로부터 선택되는 링커(linker)를 통해 RBD 폴리펩티드 또는 Npep2 폴리펩티드에 융합되는 것인 항체.
- 제1항에 있어서, i) RBD 폴리펩티드에 융합되어 서열 번호: 43에 기재된 융합 단백질을 형성하는 경쇄, 및 ii) Npep2 폴리펩티드에 융합되어 서열 번호: 45에 기재된 융합 단백질을 형성하는 중쇄를 포함하는 항체.
- 제1항에 있어서, i) RBD 폴리펩티드에 융합되어 서열 번호: 44에 기재된 융합 단백질을 형성하는 경쇄, 및 ii) Npep2 폴리펩티드에 융합되어 서열 번호: 45에 기재된 융합 단백질을 형성하는 중쇄를 포함하는 항체.
- 제1항의 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는(encoding) 핵산.
- 제14항의 핵산을 포함하는 벡터(vector).
- 제14항의 핵산 및/또는 제15항의 벡터에 의해 형질감염, 감염 또는 형질전환된 숙주 세포.
- 제1항의 항체를 포함하는 백신 조성물.
- 치료 유효량의 제1항의 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 사르베코바이러스(Sarbecovirus)에 대한 백신접종(vaccinating)을 필요로 하는 대상체(subject)를 사르베코바이러스에 대해 백신접종하는 방법.
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