TW201916890A

TW201916890A - 抗ｐｄ－１抗體和抗ｌａｇ－３抗體聯合在製備治療腫瘤的藥物中的用途

Info

Publication number: TW201916890A
Application number: TW107136365A
Authority: TW
Inventors: 黃曉輝; 曹國慶; 楊昌永; 張連山
Original assignee: 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司; 大陸商上海恆瑞醫藥有限公司; 大陸商蘇州盛迪亞生物醫藥有限公司
Priority date: 2017-10-17
Filing date: 2018-10-16
Publication date: 2019-05-01
Also published as: CN111094339B; CN111094339A; WO2019076277A1

Abstract

本發明涉及抗PD-1抗體和抗LAG-3抗體聯合在製備治療腫瘤的藥物中的用途。具體而言，本發明涉及抗PD-1抗體或其抗原結合片段和抗LAG-3抗體或其抗原結合片段聯合在製備治療腫瘤和/或增強T細胞活性的藥物中的用途。

Description

抗PD-1抗體和抗LAG-3抗體聯合在製備治療腫瘤的藥物中的用途

本發明涉及抗PD-1抗體或其抗原結合片段和LAG-3抗體或其抗原結合片段聯合在製備治療腫瘤和/或增強T細胞活性的藥物中的用途。

LAG-3(淋巴細胞活化基因-3)也稱CD223，是免疫球蛋白超家族成員的一種膜蛋白，目前研究顯示其與免疫性疾病、腫瘤、瘧原蟲感染、超敏反應等多種疾病有關([J].現代生物醫學進展，2014,15：047)；而PD-1(程序性死亡受體-1)抗體可以特異性識別並結合淋巴細胞表面PD-1，阻斷PD-1/PD-L1信號通路，進而激活T細胞對腫瘤的免疫殺傷作用，調動機體免疫系統而清除體內腫瘤細胞。在一些疾病中，LAG-3表達均會升高，並且會出現相應的免疫抑制。Gandhi等發現霍奇金淋巴瘤患者血液和腫瘤組織中，淋巴細胞高表達LAG-3；腫瘤組織中特異性CD8⁺T細胞的功能明顯受損，如果去除LAG-3陽性的T細胞，其抗腫瘤功能可以恢復，細胞因子分泌增加。據此推測，LAG-3的表達與特異性T細胞的免疫負調節功能相關，抑制LAG-3分子功能可以增強T細胞的抗腫瘤作用，該分子有可能是一個潛在的腫瘤免疫治療靶點(Blood,2006,108(7)：2280-9)。

Woo等人發現抗LGA-3和抗PD-1聯合可抑制腫瘤生長，編碼LAG-3和PD-1基因的小鼠發展為致命的全身性免疫性疾病([J].Cancer research,2012,72(4)：917-927)；Matsuzaki等人發現在人類卵巢癌中，LAG-3分子在降低PD-1⁺CD8⁺T細胞的效應功能中發揮著重要作用，雙重阻斷LAG-3和PD-1通路有利於恢復T細胞的效應功能([J].The Journal of Immunology,2010,184(11)：6545-6551)。

專利申請WO2015042246、WO2015048312、WO2016196560公開了一種抗LAG抗體和抗PD-1或抗PD-L1抗體聯合治療黑素瘤、非小細胞肺癌、血液腫瘤等惡性腫瘤以及給藥方法等；WO2016110593公開了一種包含選自BMS-936559、MED14736等的LAG-3蛋白和PD-1通路抑制劑的組合物治療多種腫瘤；WO2017025498公開了一種LGA-3與PD-1的雙特異性融合多肽能夠共刺激T細胞應答。

目前已有抗PD-1抗體與抗LAG-3抗體聯用治療惡性腫瘤的臨床研究公開了相應結果，P.A.Ascierto等人報道Relatlimab與Nivolumab聯用治療既往接受免疫治療後復發進展的黑色素瘤患者，在可評價的61名受試者中，1名受試者徹底緩解，6名受試者部分緩解，但總緩解率和疾病總控制率僅分別為11.5%和49%，受試者不良反應可耐受([J].Annals of Oncology,2017,28(suppl_5))；此外，還有LAG-525與PDR001(抗PD-1抗體)聯用治療高級惡性腫瘤(NCT02460224)以及MK-4280與Pembrolizumab聯用治療晚期實體瘤正在進行中(NCT02720068)。

雖然已有多項有關抗PD-1抗體與抗LAG-3抗體的臨床研究正在開展，但仍不能達到令人滿意的治療效果；另外對於常見瘤腫如肺癌、乳腺癌或結直腸癌等對抗LAG-3抗體和抗PD-1抗體聯用的敏感度和協同效果仍是未知的，因此如何選擇合適的抗LAG-3抗體和抗PD-1抗體聯用以及如何給藥能夠延長患者生存期並降低不良反應依舊是臨床研究尚未攻克的難題。

在本發明中，專利申請PCT/CN2017/089492提供的抗LAG-3抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：29的重鏈可變區和SEQ ID NO：30的輕鏈可變區或SEQ ID NO：24的重鏈可變區和SEQ ID NO：26的輕鏈可變區，具體序列如下：SEQ ID NO：29

SEQ ID NO：30 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGSRLNWYQQKPGK

SEQ ID NO：24

SEQ ID NO：26

WO2015085847及WO2017054646公開了一種新的PD-1抗體及其製劑。本發明提供的抗PD-1抗體正處於國內臨床I期，安全性良好，已報到的臨床研究結果已經顯示出其具有一定的抗腫瘤作用([J].Journal of Clinical Oncology 35(2017)：e15572-e15572)

本發明提供抗PD-1抗體或其抗原結合片段和抗LAG-3抗體或其抗原結合片段聯合在製備治療腫瘤和/或增強T細胞活性的藥物中的用途，該抗LAG-3抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區和輕鏈可變區包含以下(i)或(ii)的CDR區序列：(i)SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或(ii)SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示的所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

其中，前述的各CDR序列如下表所示：

在本發明中，該增強T細胞活性包括但不限於恢復T細胞功能或刺激T細胞增殖。

在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為LAG-3人源化抗體或其抗原結合片段。

在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體重鏈可變區上的重鏈FR區序列來源於人種系重鏈，IGHV7-4-1*02和hjh6.1的組合序列或其突變序列；其包含人種系重鏈IGHV7-4-1*02的FR1、FR2、FR3區和hjh6.1的FR4區或其突變序列；較佳的，其中該人源化抗體重鏈FR區序列有0-10個胺基酸的回復突變，更佳為一個或多個選自E46K、R38K、V93T和Y95F的胺基酸回復突變。

在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的人源化LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體重鏈可變區序列為SEQ ID NO：21所示的序列，或與其具有至少85%(較佳95%)序列同一性的胺基酸序列；較佳在重鏈可變區有1至10的胺基酸變化；這種胺基酸變化可基於本領域親和力成熟的技術進行改變。

在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的人源化LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體重鏈可變區包含SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25所示的序列，或與其具有至少 85%(較佳95%)序列同一性的胺基酸序列。

在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的人源化LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體重鏈可變區上的重鏈FR區序列來源於人種系重鏈IGHV1-3*01和hjh6.1的組合序列及其突變序列；其包含人種系重鏈IGHV1-3*01的FR1、FR2、FR3區和hjh6.1的FR4區或其突變序列；其中該人源化抗體重鏈FR區序列有0至10個胺基酸的回復突變，更較佳為一個或多個選自F29L、A97T、M48I、V68A、I70L、R72V和T74K的胺基酸回復突變。

在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的人源化LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體重鏈可變區序列為SEQ ID NO：29所示的序列，或與其具有至少85%(較佳95%)序列同一性的胺基酸序列；較佳在重鏈可變區有1至10的胺基酸變化；這種胺基酸變化可基於本領域親和力成熟的技術進行改變。

在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的人源化LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體重鏈可變區序列選自SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33所示的序列，或與其具有至少85%(較佳95%)序列同一性的胺基酸序列。

在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的人源化LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體輕鏈可變區上的輕鏈FR區序列來源於人種系輕鏈模板IGKV1-39*01和hjk4.1的組合序列及其突變序列；其包含人種系輕鏈IGKV1-39*01的FR1、FR2、FR3區和hjk4.1的FR4區及其突變序列。

在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的人源化LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體可變區輕鏈序列為SEQ ID NO：22所示的序列，或與其具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；較佳在輕鏈可變區有1至10的胺基酸變化；這種胺基酸變化可基於本領域親和力成熟的技術進行改變。

在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的人源化LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體輕鏈FR區序列有0至10個胺基酸的回復突變，較佳為一個或多個選自D70Q、F71Y、I48V和A43S的胺基酸回復突變。

在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的人源化LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體輕鏈可變區序列選自SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28所示的序列，或與其具有至少85%(較佳95%)序列同一性的胺基酸序列。

在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的人源化LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體可變區輕鏈序列為SEQ ID NO：30所示的序列，或與其具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；較佳在輕鏈可變區有0至10的胺基酸變化；這種胺基酸變化可基於本領域親和力成熟的技術進行改變。

在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的人源化LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體輕鏈FR區序列有0-10個胺基酸的回復突變，較佳為一個或多個選自L46R、G66R、S60K、P44F、Y36L、K42G、I21L和T85D的胺基酸回復突變。

在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的人源化LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體輕鏈可變區序列選自SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：37所示的序列，或與其具有至少85%(較佳95%)序列同一性的胺基酸序列。

在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的人源化LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體包含(a)重鏈可變區序列，該重鏈可變區序列與SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列具有至少85%(較佳95%)序列同一性；和(b)輕鏈可變區序列，該輕鏈可變區序列與SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性。

在本發明另一個較佳的實施方案中，本發明所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體包含(a)重鏈可變區序列，該重鏈可變區序列與SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、或SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列具有至少85%(較佳95%)序列同一性；和(b)輕鏈可變區序列，該輕鏈可變區序列與SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：37所示的胺基酸序列具有至少85%(較佳95%)序列同一性。

在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含選自以下的重鏈可變區和輕鏈可變區的組合：1)SEQ ID NO：21的重鏈可變區和SEQ ID NO：22的輕鏈可變區；2)SEQ ID NO：21的重鏈可變區和SEQ ID NO：26的輕鏈可變區；3)SEQ ID NO：21的重鏈可變區和SEQ ID NO：27的輕鏈可變區；4)SEQ ID NO：21的重鏈可變區和SEQ ID NO：28的輕鏈可變區；5)SEQ ID NO：23的重鏈可變區和SEQ ID NO：22的輕鏈可變區；6)SEQ ID NO：23的重鏈可變區和SEQ ID NO：26的輕鏈可變區；7)SEQ ID NO：23的重鏈可變區和SEQ ID NO：27的輕鏈可變區；8)SEQ ID NO：23的重鏈可變區和SEQ ID NO：28的輕鏈可變區； 9)SEQ ID NO：24的重鏈可變區和SEQ ID NO：22的輕鏈可變區；10)SEQ ID NO：24的重鏈可變區和SEQ ID NO：26的輕鏈可變區；11)SEQ ID NO：24的重鏈可變區和SEQ ID NO：27的輕鏈可變區；12)SEQ ID NO：24的重鏈可變區和SEQ ID NO：28的輕鏈可變區；13)SEQ ID NO：25的重鏈可變區和SEQ ID NO：22的輕鏈可變區；14)SEQ ID NO：25的重鏈可變區和SEQ ID NO：26的輕鏈可變區；15)SEQ ID NO：25的重鏈可變區和SEQ ID NO：27的輕鏈可變區；和16)SEQ ID NO：25的重鏈可變區和SEQ ID NO：28的輕鏈可變區；更佳10)SEQ ID NO：24的重鏈可變區和SEQ ID NO：26的輕鏈可變區。

在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含選自以下的重鏈可變區和輕鏈可變區的組合：1)SEQ ID NO：29的重鏈可變區和SEQ ID NO：30的輕鏈可變區；2)SEQ ID NO：29的重鏈可變區和SEQ ID NO：34的輕鏈可變區；3)SEQ ID NO：29的重鏈可變區和SEQ ID NO：35的輕鏈可變區；4)SEQ ID NO：29的重鏈可變區和SEQ ID NO：36的輕鏈可變區；5)SEQ ID NO：29的重鏈可變區和SEQ ID NO：37的輕鏈可變區；6)SEQ ID NO：31的重鏈可變區和SEQ ID NO：30的輕鏈可變區；7)SEQ ID NO：31的重鏈可變區和SEQ ID NO：34的輕鏈可變區；8)SEQ ID NO：31的重鏈可變區和SEQ ID NO：35的輕鏈可變區；9)SEQ ID NO：31的重鏈可變區和SEQ ID NO：36的輕鏈可變區；10)SEQ ID NO：31的重鏈可變區和SEQ ID NO：37的輕鏈可變區；11)SEQ ID NO：32的重鏈可變區和SEQ ID NO：30的輕鏈可變區；12)SEQ ID NO：32的重鏈可變區和SEQ ID NO：34的輕鏈可變區；13)SEQ ID NO：32的重鏈可變區和SEQ ID NO：35的輕鏈可變區；14)SEQ ID NO：32的重鏈可變區和SEQ ID NO：36的輕鏈可變區；15)SEQ ID NO：32的重鏈可變區和SEQ ID NO：37的輕鏈可變區；16)SEQ ID NO：33的重鏈可變區和SEQ ID NO：30的輕鏈可變區；17)SEQ ID NO：33的重鏈可變區和SEQ ID NO：34的輕鏈可變區；18)SEQ ID NO：33的重鏈可變區和SEQ ID NO：35的輕鏈可變區；19)SEQ ID NO：33的重鏈可變區和SEQ ID NO：36的輕鏈可變區；和20)SEQ ID NO：33的重鏈可變區和SEQ ID NO：37的輕鏈可變區；更佳2)SEQ ID NO：29的重鏈可變區和SEQ ID NO：34的輕鏈可變區。

在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的嵌合或人源化LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該嵌合抗體或人源化抗體重鏈進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恒定區，較佳包含人源IgG4或其變體的重鏈恒定區，最較佳如SEQ ID NO：38所示的重鏈恒定區；該嵌合抗體或人源化抗體輕鏈進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恒定區，最佳如SEQ ID NO：39所示的輕鏈恒定區。

重鏈恒定區： SEQ ID NO：38

輕鏈恒定區： SEQ ID NO：39

本發明較佳的實施例方案中，該抗PD-1抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；該PD-1抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；其中，前面所述的各CDR序列如下表所示：

較佳的，該PD-1抗體為人源化抗體。

較佳的人源化抗體輕鏈序列為如SEQ ID NO：47所示的序列或其變體；該變體較佳在輕鏈可變區有0至10的胺基酸變化；更佳為A43S的胺基酸變化。

該人源化抗體重鏈序列為如SEQ ID NO：46所示的序列或其變體；該變體較佳在重鏈可變區有0至10的胺基酸變化；更佳為G44R的胺基酸變化。

特別較佳的該人源化抗體輕鏈序列為如SEQ ID NO：47所示的序列，重鏈序列為如SEQ ID NO：46所示的序列。

前述的人源化抗體重、輕鏈的序列如下所示：重鏈 SEQID NO：46

輕鏈 SEQID NO：47

本發明另外較佳的實施例方案中，該抗PD-1抗體或其抗原結合片段還可選自匹地利珠單抗(Pidilizumab)、MEDI-0680、AMP-224、PF-06801591、TSR-042、JS-001、GLS-010、PDR-001、杰諾單抗(Genolimzumab)、卡瑞利珠單抗(Camrelizumab)、BGB-A317、IBI-308、REGN-2810、帕博利珠單抗(Pembrolizumab)、納武單抗(Nivolumab)和其組合。

在本發明較佳的實施例方案中，該腫瘤選自惡性腫瘤、良性腫瘤；該惡性腫瘤選自惡性上皮腫瘤、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、頭頸部腫瘤、腦部腫瘤、腹膜癌、混合型腫瘤、兒童惡性腫瘤；該惡性上皮腫瘤選自肺癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、結直腸癌、胃癌、胃食管腺癌、食管癌、小腸癌、賁門癌、子宮內膜癌、卵巢癌、輸卵管癌、外陰癌、睾丸癌、前列腺癌、陰莖癌、腎癌、膀胱癌、肛門癌、膽囊癌、膽管癌、畸胎瘤、心臟腫瘤；該頭頸部腫瘤選自鼻咽癌、喉癌、甲狀腺癌、舌癌、口腔癌；該肉瘤選自Askin瘤、軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤、惡性血管內皮瘤、惡性神經鞘瘤、骨肉瘤、軟組織肉瘤；該骨髓瘤選自孤立型骨髓瘤、多髮型骨髓瘤、彌漫型骨髓瘤、白血病型骨髓瘤、髓外型骨髓瘤；該白血病選自急性淋巴性白血病、慢性淋巴性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、多毛細胞性白血病、T細胞淋巴細胞白血病、大顆粒淋巴細胞性白血病、成人T細胞白血病；該淋巴瘤選自非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤；該腦部腫瘤選自神經上皮組織腫瘤、顱神經和脊髓神經腫瘤、腦膜組織腫瘤；該兒童惡性腫瘤選自腎母細胞瘤、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、兒童生殖細胞腫瘤。

在本發明另外一個較佳的實施例方案中，該肺癌選自所述肺癌選自非小細胞肺癌、小細胞肺癌；該乳腺癌選自乳腺癌選自激素受體(HR)陽性乳腺癌、人表皮生長因子受體-2(HER2)陽性乳腺癌、三陰乳腺癌；該腎癌選自透明腎細胞癌、乳頭狀腎細胞癌、嫌色細胞性腎細胞癌、集合管癌；該神經上皮組織腫瘤選自較佳星形細胞瘤、間變性星形細胞瘤、膠質母細胞瘤；該肝癌選自原發性肝癌、繼發性肝癌，該原發性肝癌選自肝細胞癌、膽管細胞癌、混合性肝癌；該結直腸癌選自結腸癌、直腸癌。

在本發明另外一個較佳的實施例方案中，該腫瘤選自微衛星不穩定高MSI-H或錯配修復缺失的實體瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、食管癌、肝癌、膽管癌、乳腺癌、結直腸癌、胃癌、腎癌、急性髓性淋巴細胞白血病、骨髓增生異常綜合征、膠質瘤、基底細胞癌、鱗狀細胞癌和人乳頭瘤病毒相關腫瘤，較佳選自微衛星不穩定高MSI-H或錯配修復缺失的實體瘤。

在本發明較佳的實施例方案中，該腫瘤由PD-1介導和/或表達PD-L1。

在本發明較佳的實施例方案中，該腫瘤還表達LAG-3。

在本發明較佳的實施例方案中，該腫瘤選自RAS突變型腫瘤、RAF突變型腫瘤。

在本發明較佳的實施例方案中，該腫瘤選自不伴有RAS突變型腫瘤、不伴有RAF突變型腫瘤。

在本發明較佳的實施例方案中，該RAS突變型選自HRas突變型、KRas突變型、NRas突變型；該RAF突變型選自A-RAF突變型、B-RAF突變型。其中B-RAF突變型較佳選自B-RAF V600E突變型、B-RAF V600K突變型、B-RAF V600D突變型、B-RAF V600R突變型。

在本發明中，上述突變為陽性突變。

在本發明中，上述腫瘤表達PD-L1和/或LAG-3為過表達或正常表達。

在本發明較佳的實施例方案中，該腫瘤選自中晚期腫瘤、復發難治性腫瘤、經化療藥物治療失敗和/或復發腫瘤、經放療失敗和/或復發腫瘤、經靶向藥物治療失敗和/或復發腫瘤、經免疫治療失敗和/或復發腫瘤。

在本發明較佳的實施例方案中，該腫瘤對免疫治療劑或免疫療法或表現為抵抗或耐藥，較佳的，該免疫治療劑是以PD-1和/或PD-L1或CTLA-4(細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4)為靶點；該免疫療法選自免疫檢查點阻斷(ICB)療法、嵌合抗原受體T細胞免疫療法(CAR-T療法)、自體細胞免疫療法(CIK療法)。

在本發明較佳的實施例方案中，較佳的，該免疫治療劑選自PD-1抗體、PD-L1抗體、CTLA-4抗體，該PD-1抗體包括但不限於匹地利珠單抗(Pidilizumab)、MEDI-0680、AMP-224、PF-06801591、TSR-042、JS-001、GLS-010、PDR-001、杰諾單抗(Genolimzumab)、卡瑞利珠單抗(Camrelizumab)、BGB-A317、IBI-308、REGN-2810、帕博利珠單抗(Pembrolizumab)、納武單抗(Nivolumab)；該PD-L1抗體包括但不限於MSB-0011359-C、CA-170、LY-3300054、BMS-936559、度伐魯單抗(Durvalumab)、阿維魯單抗(Avelumab)、阿特珠單抗(Atezolizumab)；該CTLA-4抗體包括但不限於伊匹單抗(ipilimumab)、AK-104、JHL-1155、ATOR-1015、AGEN-1884、PRS-010、曲美木單抗 (tremelimumab)、IBI-310、MK-1308、BMS-986218、SN-CA21、FPT-155、KN-044、CG-0161、ONC-392、AGEN-2041、PBI-5D3H5。

在本發明較佳的實施例方案中，該抗LAG-3抗體或其抗原結合片段的劑量選自0.01至1000mg，較佳選自0.1mg、0.25mg、0.5mg、0.75mg、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、12.5mg、15mg、17.5mg、20mg、22.5mg、25mg、30mg、40mg、45mg、50mg、60mg、70mg、75mg、80mg、90mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、275mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg、850mg、900mg、1000mg，更佳選自50mg、60mg、70mg、75mg、80mg、90mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、275mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1000mg。

在本發明較佳的另外一個實施例方案中，該抗LAG-3抗體或其抗原結合片段劑量選自1至20mg/kg，較佳選自1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、12mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、18mg/kg、20mg/kg，更佳選自3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg。

在本發明較佳的實施例方案中，該抗PD-1抗體或其抗原結合片段劑量選自50至600mg，較佳選自50mg、60mg、70mg、75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、 250mg、375mg、400mg、425mg、450mg、475mg、500mg、600mg，更佳選自100mg、200mg、400mg。

在本發明另外較佳的實施例方案中，該抗PD-1抗體或其抗原結合片段劑量選自1至10mg/kg，較佳選自1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg，更佳選自3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg。

在本發明中，抗PD-1抗體或其抗原結合片段與抗LAG-3抗體或其抗原結合片段聯合用於腫瘤治療，二者的給藥次序為抗LAG-3抗體或其抗原結合片段在PD-1抗體或其抗原結合片段給藥之前，或二者同時給藥，或抗LAG-3抗體或其抗原結合片段給藥在PD-1抗體或其抗原結合片段給藥之後。

在本發明中，抗PD-1抗體或其抗原結合片段與抗LAG-3抗體或其抗原結合片段聯合用於腫瘤治療，二者可在同一個給藥週期給藥，也可以在不同的給藥週期給藥。

在本發明中，該治療週期可為1天、3天、1週、2週、3週(21天)、3-4週(21至28天)、4週(28天)，較佳3週或3至4週或4週。

在本發明中，該治療週期包括但不限於化療週期或放療週期或其他相關靶向藥物治療週期或免疫治療週期。

在本發明中，抗LAG-3抗體或其抗原結合片段與抗PD-1抗體或其抗原結合片段可在在相同或不同的治療週期內聯合用於治療腫瘤，在治療腫瘤的過程中，抗LAG-3抗體或其抗原結合片段與抗PD-1抗體或其抗原結合片段聯合給藥的同時或之前或之後還可聯合依據不同腫瘤類型較佳的化療方案或放療治療方案或靶向小分子藥物治療方案或免疫治療方案治療腫瘤，該免疫治療方案包括但不限於細胞免疫療法(如CAR-T療法，腫瘤疫苗、CIK療法等)；此外抗LAG-3抗體或其抗原結合片段與抗PD-1抗體或其抗原結合片段的聯合給藥也可不聯合其他治療方案單獨進行。

在本發明中，抗LAG-3抗體或其抗原結合片段與抗PD-1抗體或其抗原結合片段在聯用的同時，或之前、或之後可進行按照各種腫瘤診療規範或指導原則依據的不同病理分型和腫瘤進展階段所規定的治療方案，該腫瘤診療規範或指導原則包括但不限於NCCN(美國國立綜合癌症網絡發佈各種惡性腫瘤臨床實踐指南)或中國衛生部頒佈的惡性腫瘤診療規範。

在本發明中，抗LAG-3抗體或其抗原結合片段與抗PD-1抗體或其抗原結合片段在相同的治療週期內(如28天為一個治療週期或21天為一個治療週期)聯合用於治療腫瘤，抗LAG-3抗體或其抗原結合片段與抗PD-1抗體或其抗原結合片段同步給藥或在抗PD-1抗體或其抗原結合片段之前或在抗PD-1抗體或其抗原結合片段之後給藥；在相同的給藥週期內，抗LAG-3抗體或其抗原結合片段在治療週期的第1天給藥，或在一個治療週期的第1天和第15天給藥，該治療週期可以是21天或28天；抗PD-1抗體或其抗原結合片段與抗LAG-3抗體或其抗原結合片段在同一個給藥週期內(如28天為一個治療週期或21天為一個治療週期)給藥時，抗PD-1抗體或其抗原結合片段給藥頻率可為2週/次或3週/次或4週/次，也可以在一個治療週期的第1天和第15天給藥。

在本發明中，所謂“聯合”是一種給藥方式，是指在一定時間期限內給予至少一種劑量的抗PD-1抗體或其抗原結合片段和至少一種劑量的抗LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中兩種物質都顯示藥理學作用。該時間期限可以是一個給藥週期內，較佳4週內、3週內、2週內、1週內、或24小時以內、12小時以內。可以同時或依次給予PD-1抗體或其抗原結合片段和抗LAG-3抗體或其抗原結合片段。這種期限包括這樣的治療，其中藉由相同給藥途徑或不同給藥途徑給予PD-1抗體或其抗原結合片段和抗LAG-3抗體或其抗原結合片段。本發明所述聯合的給藥方式選自同時給藥、獨立地配製並共給藥或獨立地配製並相繼給藥。

在本發明中，本發明進一步涉及的藥物中的用途，其中該抗PD-1抗體或其抗原結合片段的給藥頻次為一日一次、一日二次、一日三次、一週一次、二週一次、三週一次、一月一次；該抗LAG-3抗體或其抗原結合片段的給藥頻次為一日一次、一日二次、一日三次、一週一次、二週一次、三週一次、一月一次。

在本發明較佳的實施方案中，該抗LAG-3抗體或其抗原結合片段以注射的方式給藥，例如皮下或靜脈注射，注射前需將抗LAG-3抗體或其抗原結合片段配製成可注射的形式；該抗PD-1抗體或其抗原結合片段以注射的方式給藥，例如皮下或靜脈注射，注射前需將抗PD-1抗體或其抗原結合片段配製成可注射的形式。特別較佳的抗PD-1抗體或其抗原結合片段的可注射形式是注射液或凍乾粉針，其包含抗PD-1抗體或其抗原結合片段、緩衝劑、穩定劑，視需要地還含有表面活性劑。緩衝劑可選自醋酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、以及磷酸鹽中的一種或幾種。穩定劑可選自糖或胺基酸，較佳二糖，例如蔗糖、乳糖、海藻糖、麥芽糖。表面活性劑選自聚氧乙烯氫化蓖麻油、甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯，較佳該聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯為聚山梨酯20、40、60或80，最佳為聚山梨酯20。最佳為抗PD-1抗體或其抗原結合片段的可注射形式包含抗PD-1抗體或其抗原結合片段、醋酸鹽緩衝劑、海藻糖和聚山梨酯20。

本發明所述聯合的給藥方式選自同時給藥、獨立地配製並共給藥或獨立地配製並相繼給藥。

本發明所述聯合的給藥途徑選自經口給藥、胃腸外給藥、經皮給藥，該胃腸外給藥包括但不限於靜脈注射、皮下注射、肌肉注射。

本發明提供上述抗PD-1抗體或其抗原結合片段聯合上述抗LAG-3抗體或其抗原結合片段作為治療腫瘤和/或增強T細胞活性的藥物。

在本發明中，提供了一種治療腫瘤和/或增強T細胞活性的辦法，包括向患者施用上述抗PD-1抗體或其抗原結合片段聯合上述抗LAG-3抗體或其抗原結合片段。

本發明還提供了一種藥物套組，或者一種藥物包裝盒，其中含有上述的抗PD-1抗體或其抗原結合片段聯合上述抗LAG-3抗體或其抗原結合片段。

本發明還提供了一種醫藥組成物，包含前述的有效量的抗PD-1抗體或其抗原結合片段聯合上述抗LAG-3抗體或其抗原結合片段，以及一種或多種可藥用的賦型劑、稀釋劑或載體。

第1圖為抗體C和抗體B對SEB激活的T淋巴細胞的分泌IL-2細胞因子的增強作用；第2圖為抗體A和抗體B對SEB激活的T淋巴細胞的分泌IL-2細胞因子的增強作用；第3圖為抗體A和抗體B對人惡性膠質瘤U-87MG小鼠移植瘤的療效，其中*p<0.05，**p<0.01 vs FC對照-6mpk；*p<0.05 vs抗體B-3mpk by student T檢驗；第4圖為抗體A和抗體B聯用對人惡性膠質瘤U-87MG小鼠體重的影響；第5圖為抗體A和抗體B聯用及抗體C和抗體B聯用對人惡性膠質瘤U-87MG小鼠移植瘤的療效，其中*p<0.05，**p<0.01 vs FC對照-6mpk by student T檢驗。

一.術語

為了更容易理解本發明，以下具體定義了某些技術和科學術語。除非在本文中另有明確定義，本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本發明所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。

本發明所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。

術語“LAG-3”是指淋巴細胞活化基因3。術語“LAG-3”包含變體、同等型(isoform)、同源物、直系同源體(ortholog)及旁系同源體(paralog)。術語“人LAG-3”指人序列LAG-3，例如具有Uniprot號：P18627的人LAG-3的完整胺基酸序列。本領域中亦已知LAG-3，例如CD223。人LAG-3序列與Uniprot號：P18627的人LAG-3的不同之處可在於具有例如保守突變或在非保守區中的突變，且LAG-3與Uniprot號：P18627的人LAG-3具有實質上相同的生物功能。舉例而言，人LAG-3的生物功能是在LAG-3的胞外域中具有表位，該表位被本公開的抗體特異性結合，或人LAG-3的生物功能是結合MHCII類分子。

特定人LAG-3序列在胺基酸序列中通常與Uniprot號：P18627的人LAG-3至少90%相同，且含有在與其他物種(例如鼠類)的LAG-3胺基酸序列相比時鑒別為人胺基酸序列的胺基酸殘基。在某些情形下，人LAG-3在胺基酸序列中可與Uniprot號：P18627的LAG-3至少85%或甚至至少95%、96%、97%、98%或99%相同。在某些實施方案中，人LAG-3序列較Uniprot號：P18627的LAG-3序列顯示不超過10個胺基酸差異。在某些實施方案中，人LAG-3可較Uniprot號：P18627的LAG-3序列顯示不超過5或甚至不超過4、3、2或1個胺基酸差異。可如本文所闡述的測定百分比同一性。

本發明所述的“序列同一性”表示當具有適當的替換、插入或缺失等突變的情況下最佳比對和比較時，兩個核酸或兩個胺基酸序列之間的同一性程度。本發明中所述的序列和其具有同一性的序列之間的序列同一性可以至少為85%、90%或95%，較佳至少為95%。非限制性實施例包括85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%。

兩條序列之間的同一性百分比是由序列共享的相同位置數目的函數(即%同一性=相同位置數目/位總數目乘以100)，考慮到缺口數目和每個缺口的長度，其需要被引入用於兩條序列的最佳比對。在兩個序列之間的序列比較和同一性百分比測定可以藉由National Center For Biotechnology Institute網站上可得的BLASTN/BLASTP算法的默認設置來進行。本發明所述的“抗體”指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恒定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈、和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恒定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。

在本發明中，本發明所述的抗體輕鏈可變區可進一步包含輕鏈恒定區，該輕鏈恒定區包含人源或鼠源的κ、λ鏈或其變體。

在本發明中，本發明所述的抗體重鏈可進一步包含重鏈恒定區，該重鏈恒定區包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體。

抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(Fv區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恒定區。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(LCVR)和重鏈可變區(HCVR)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本發明所述的抗體或抗原結合片段的LCVR區和HCVR區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號規則(LCDR1-3，HCDE2-3)，或者符合kabat和chothia的編號規則(HCDR1)。

本發明的抗體包括鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體，較佳為人源化抗體。

術語“鼠源抗體”在本發明中為根據本領域知識和技能製備的抗人LAG-3的單株抗體。製備時用LAG-3抗原注射試驗對象，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的融合瘤。在本發明一個較佳的實施方案中，該鼠源LAG-3抗體或其抗原結合片段，可進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恒定區，或進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其變體的重鏈恒定區。

術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”，是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恒定區融合而成的抗體，可以減輕鼠源性抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體，要先建立分泌鼠源性特異性單抗的融合瘤，然後從鼠融合瘤細胞中選殖可變區基因，再根據需要選殖人抗體的恒定區基因，將鼠可變區基因與人恒定區基因連接成嵌合基因後插入表達載體中，最後在真核系統或原核系統中表達嵌合抗體分子。在本發明一個較佳的實施方案中，該LAG-3嵌合抗體的抗體輕鏈進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恒定區。該LAG-3嵌合抗體的抗體重鏈進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恒定區，較佳包含人源IgG1、IgG2或IgG4重鏈恒定區，或者使用胺基酸突變(如YTE突變)的IgG1、IgG2或IgG4變體。

術語“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架，即不同類型的人種系抗體構架序列中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量鼠蛋白成分，從而誘導的異源性反應。此類構架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數據庫或公開的參考文獻獲得。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列數據庫(在因特網www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可獲得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對該人抗體可變區框架序列進行最少反向突變或回復突變，以保持活性。本發明的人源化抗體也包括進一步由噬菌體展示對CDR進行親和力成熟後的人源化抗體。在本發明一個較佳的實施方案中，該LAG-3人源化抗體中鼠的CDR序列選自SEQ ID NO：9-20；人的抗體可變區框架經過設計選擇，其中該抗體重鏈可變區上的重鏈FR區序列，來源於人種系重鏈IGKV1-39*01和hjk4.1的組合序列；其中該抗體輕鏈可變區上的輕鏈FR區序列，來源於人種系重鏈IGHV3-23*04和hjh6.1的組合序列。為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對該人抗體可變區可進行最少反向突變，以保持活性。

CDR的移植可由於與抗原接觸的構架殘基而導致產生的LAG-3抗體或其抗原結合片段對抗原的親和力減弱。此類相互作用可以是體細胞高度突變的結果。因此，可能仍然需要將此類供體構架胺基酸移植至人源化抗體的構架。來自非人LAG-3抗體或其抗原結合片段的參與抗原結合的胺基酸殘基可藉由檢查鼠單株抗體可變區序列和結構來鑒定。CDR供體構架中與種系不同的的各殘基可被認為是相關的。如果不能確定最接近的種系，那麼可將序列與亞型共有序列或具有高相似性百分數的鼠序列的共有序列相比較。稀有構架殘基被認為可能是體細胞高度突變的結果，從而在結合中起著重要作用。

術語抗體的“抗原結合片段”(或簡稱“抗體片段”)是指抗體的保持特異性結合抗原(例如，LAG-3)的能力的一個或多個片段。已顯示可利用全長抗體的片段來進行抗體的抗原結合功能。術語抗體的“抗原結合片段”中包含的結合片段的實例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab')₂片段，包含藉由鉸鏈區上的二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段，(iii)由VH和CH1結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體的單臂的VH和VL結構域組成的Fv片段；(v)單結構域或dAb片段(Ward等人，(1989)Nature341：544-546)，其由VH結構域組成；和(vi)分離的互補決定區(CDR)或(vii)可視需要地藉由合成的接頭連接的兩個或更多個分離的CDR的組合。此外，雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH由分開的基因編碼，但可使用重組方法，藉由合成的接頭連接它們，從而使得其能夠產生為其中VL和VH區配對形成單價分子的單個蛋白質鏈(稱為單鏈Fv(scFv)；參見，例如，Bird等人(1988)Science 242：423-426和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA 85：5879-5883)。此類單鏈抗體也意欲包括在術語抗體的“抗原結合片段”中。使用本領域技術人員已知的一般技術獲得此類抗體片段，並且以與對於完整抗體的方式相同的方式就功用性篩選片段。可藉由重組DNA技術或藉由酶促或化學斷裂完整免疫球蛋白來產生抗原結合部分。抗體可以是不同同種型的抗體，例如，IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗體。

術語“單鏈抗體”、“單鏈Fv”或“scFv”意指包含藉由接頭連接的抗體重鏈可變結構域(或區域；VH)和抗體輕鏈可變結構域(或區域；VL)的分子。此類scFv分子可具有一般結構：NH₂-VL-接頭-VH-COOH或NH₂-VH-接頭-VL-COOH。合適的現有技術接頭由重複的GGGGS胺基酸序列或其變體組成，例如使用1至4個重複的變體(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448)。可用於本發明的其他接頭由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immuno 1.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。

術語“CDR”是指抗體的可變結構域內主要促成抗原結合的6個高變區之一。該6個CDR的最常用的定義之一由Kabat E.A.等人，(1991)Sequences of proteins of immunological interest.NIH Publication91-3242)提供。如本文中使用的，CDR的Kabat定義只應用於輕鏈可變結構域的CDR1、CDR2和CDR3(LCDR1、LCDR2、LCDR3或L1、L2、L3)，以及重鏈可變結構域的CDR2和CDR3(HCDR2、HCDR3或H2、H3)。

本文中使用的術語“抗體構架”，是指可變結構域VL或VH的一部分，其用作該可變結構域的抗原結合環(CDR)的支架。從本質上講，其是不具有CDR的可變結構域。

術語“表位”或“抗原決定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗體特異性結合的部位(例如，LAG-3分子上的特定部位)。表位通常以獨特的空間構象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個連續或非連續的胺基酸。參見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular B iology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。

術語“特異性結合”、“選擇性結合”、“選擇性地結合”和“特異性地結合”是指抗體對預先確定的抗原上的表位的結合。通常，抗體以大約小於10^-7M，例如大約小於10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的親和力(KD)結合。

術語“競爭結合”是指與本發明的單株抗體識別人LAG-3的胞外區上的相同表位(也稱為抗原決定簇)或相同表位的一部分並與該抗原結合的抗體。與本發明的單株抗體結合相同表位的抗體是指識別並結合於本發明的單株抗體所識別的人LAG-3的胺基酸序列的抗體。

術語"KD"或“Kd”是指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數。通常，本發明的抗體以小於大約10^-7M，例如小於大約10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的解離平衡常數 (KD)結合LAG-3，例如，如使用表面等離子體共振(SPR)技術在BIACORE儀中測定的。

本文中使用的術語“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但較佳是雙鏈DNA。當將核酸與另一個核酸序列置於功能關係中時，核酸是“有效連接的”。例如，如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，那麼啟動子或增強子有效地連接至該編碼序列。

術語“載體”是指能夠運輸已與其連接的另一個核酸的核酸分子。在一個實施方案中，載體是“質粒”，其是指可將另外的DNA區段連接至其中的環狀雙鏈DNA環。在另一個實施方案中，載體是病毒載體，其中可將另外的DNA區段連接至病毒基因組中。本文中公開的載體能夠在已引入它們的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌的複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)或可在引入宿主細胞後整合入宿主細胞的基因組，從而隨宿主基因組一起複製(例如，非附加型哺乳動物載體)。

現有技術中熟知生產和純化抗體和抗原結合片段的方法，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。例如，鼠可以用人LAG-3或其片段免疫，所得到的抗體能被覆性、純化，並且可以用一般的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用一般方法製備。發明所述的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人源FR區。人FR種系序列可以藉由比對IMGT 人類抗體可變區種系基因數據庫和MOE軟件，從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站http：//imgt.cines.fr得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。

術語“宿主細胞”是指已向其中引入了表達載體的細胞。宿主細胞可包括細菌、微生物、植物或動物細胞。易於轉化的細菌包括腸桿菌科(enterobacteriaceae)的成員，例如大腸桿菌(Escherichia coli)或沙門氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢桿菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；鏈球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。適當的微生物包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和畢赤酵母(Pichia pastoris)。適當的動物宿主細胞系包括CHO(中國倉鼠卵巢細胞系)和NS0細胞。

本發明工程化的抗體或抗原結合片段可用一般方法製備和純化。比如，編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以選殖並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端位點。藉由表達與人LAG-3特異性結合的抗體得到穩定的純株。陽性的純株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用一般技術純化。比如，用含調整過的緩衝液的A或G Sepharose FF管柱進行純化。洗去非特異性結合的組分。再用PH梯度法沖提結合的抗體，用SDS-PAGE檢測抗體片段，收集。抗體可用一般方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用一般方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。

“給予”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“給予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“給予”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組合物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。

“治療”意指給予患者內用或外用治療劑，例如包含本發明的任一種結合化合物的組合物，該患者具有一種或多種疾病症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，以誘導這類症狀退化或抑制這類症狀發展到任何臨床右測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在患者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本發明的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的患者中應當減輕目標疾病症狀。

“保守修飾”或“保守置換或取代”是指具有類似特徵(例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構象和剛性等)的其它胺基酸置換蛋白中的胺基酸，使得可頻繁進行改變而不改變蛋白的生物學活性。本領域技術人員知曉，一般而言，多肽的非必需區域中的單個胺基酸置換基本上不改變生物學活性(參見例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224頁，(第4版))。另外，結構或功能類似的胺基酸的置換不大可能破壞生物學活性。

“有效量”包含足以改善或預防醫學疾病的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：例如，待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。

“外源性”指根據情況在生物、細胞或人體外產生的物質。“內源性”指根據情況在細胞、生物或人體內產生的物質。

“同源性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同堿基或胺基酸單體亞基佔據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時，那麼該分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源；如果兩個序列中的100個位置有95個匹配或同源，那麼兩個序列為95%同源。一般而言，當比對兩個序列而得到最大的同源性百分率時進行比較。

本文使用的表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類名稱都包括後代。因此，單詞“轉化體”和“轉化細胞”包括原代受試細胞和由其衍生的培養物，而不考慮轉移數目。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。在意指不同名稱的情況下，其由上下文清楚可見。

本文使用的“聚合酶鏈式反應”或“PCR”是指其中微量的特定部分的核酸、RNA和/或DNA如在例如美國專利號4,683,195中所述擴增的程序或技術。一般來說，需要獲得來自目標區域末端或之外的序列信息，使得可以設計寡核苷酸引子；這些引子在序列方面與待擴增模板的對應鏈相同或相似。2個引子的5’末端核苷酸可以與待擴增材料的末端一致。PCR可用於擴增特定的RNA序列、來自總基因組DNA的特定DNA序列和由總細胞RNA轉錄的cDNA、噬菌體或質粒序列等。一般參見Mullis等(1987)Cold Spring Harbor Symp.Ouant.Biol.51：263；Erlich編輯，(1989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press,N.Y.)。本文使用的PCR被視為用於擴增核酸測試樣品的核酸聚合酶反應法的一個實例，但不是唯一的實例，該方法包括使用作為引子的已知核酸和核酸聚合酶，以擴增或產生核酸的特定部分。

“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。例如，“視需要包含1-3個抗體重鏈可變區”意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。

“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，該其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。

“免疫療法”指免疫療法是利用免疫系統來治療疾病，在本發明中主要指藉由提高腫瘤細胞的免疫原性和對效應細胞殺傷的敏感性，激發和增強機體抗腫瘤免疫應答，並應用免疫細胞和效應分子輸注宿主體內，協同機體免疫系統殺傷腫瘤、抑制腫瘤生長。

“增強T細胞活性”在本發明中不僅指增強已有T細胞活性，還指恢復T細胞的功能，使失活的T細胞重新激活或刺激T細胞增殖，產生抑瘤活性。

二、實施例

以下結合實施例進一步描述本發明，但這些實施例並非限制著本發明的範圍。本發明實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照一般條件，如冷泉港的抗體技術實驗手冊，分子選殖手冊；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未注明具體來源的試劑，為市場購買的一般試劑。

實施例1、LAG-3抗原抗體的製備 1、蛋白設計及表達

以UniProt Lymphocyte activation gene 3 protein(人LAG-3，Uniprot號：P18627)作為本發明LAG-3的模板，設計本發明涉及的抗原及檢測用蛋白的胺基酸序列，可選的在LAG-3蛋白基礎上融合不同的標簽，分別選殖到pHr載體上(自產)或pTT5載體上(Biovector，Cat#：102762)或pTargeT載體上(promega,A1410)，在293細胞瞬轉表達或CHO-S穩定表達純化，獲得編碼本發明抗原及檢測用蛋白。以下LAG-3抗原未特殊說明的均指人LAG-3帶Flag標簽的LAG-3胞外區：LAG-3-Flag，用於免疫小鼠 SEQ ID NO：1註釋：下劃橫線部分為信號肽，斜體部分為Flag-tag標簽。

全長LAG-3：用於構建LAG-3過表達細胞株，免疫小鼠和檢測 SEQ ID NO：2註釋：信號肽+胞外區++胞內區

LAG-3胞外區和hIgG1 Fc的融合蛋白：LAG-3-Fc，用於檢測 SEQ ID NO：3註釋：下劃橫線部分為信號肽，雙劃線部分為接頭，斜體部分為Fc。

LAG-3胞外區和mIgG2a Fc的融合蛋白：LAG-3-mFc，用於檢測 SEQ ID NO：4 註釋：下劃橫線部分為信號肽，雙劃線部分為接頭，斜體部分為mFc。

2、LAG-3相關重組蛋白的純化，以及融合瘤抗體、重組抗體的純化

1)帶Flag標簽的LAG-3-Flag重組蛋白的純化步驟：將樣品高速離心去除雜質，並濃縮至適當體積。利用0.5×PBS平衡flag親和管柱，沖洗2至5倍管柱體積。將除雜後的細胞表達上清樣品上管柱。用0.5×PBS沖洗管柱，至A280讀數降至基線。用PBS沖洗管柱，沖洗雜蛋白，並收集。用100mM甘胺酸，pH 3.0.沖提目的蛋白，並收集，以備後續體外激活和進一步純化。

2)融合瘤，重組抗體，Fc融合蛋白的純化

將細胞表達上清樣品高速離心去除雜質，融合瘤表達上清用Protein G管柱，重組抗體、Fc融合蛋白表達上清用Protein A管柱進行純化。用PBS沖洗管柱，至A280讀數降至基線。用100mM乙酸pH3.0沖提目的蛋白，用1M Tris-HCl，pH8.0中和。沖提樣品適當濃縮後利用PBS平衡好的凝膠層析Superdex200(GE)進一步純化，去聚體的峰收集好後分裝備用。

實施例2、抗人LAG-3融合瘤單株抗體的製備

1．免疫

抗人LAG-3單株抗體藉由免疫小鼠產生。實驗用SJL 白小鼠，雌性，6週齡(北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK(京)2012-0001)。飼養環境：SPF級。小鼠購進後，實驗室環境飼養1週，12/12小時光/暗週期調節，溫度20至25℃；濕度40至60%。將已適應環境的小鼠按以下方案免疫。免疫抗原為帶Flag標簽的人LAG-3胞外區(SEQ ID NO：1)。

免疫方案A：用TiterMax® Gold Adjuvant(Sigma Cat No.T2684)與Thermo Imject® Alum(Thermo Cat No.77161)交叉免疫。抗原與佐劑(TiterMax® Gold Adjuvant)比例為1：1，抗原與佐劑(Thermo Imject® Alum)比例為3：1，50μg/隻/次(首次免疫)，25μg/隻/次(追加免疫)。抗原乳化後進行接種，時間為第0、7、14、21、28、35、42天。第0天皮下(SC)多點注射50μg/隻的乳化後抗原。第7天腹膜內(IP)注射25μg/隻。第14、28、35、42天根據背部結塊和腹部腫脹情況，選擇背部或腹膜內注射抗原。於第21，35，49天取血，用ELISA方法確定小鼠血清中的抗體滴度。在7次免疫以後，選擇血清中抗體滴度高並且滴度趨於平臺的小鼠進行脾細胞融合。在進行脾細胞融合前3天追加免疫，腹膜內(IP)注射50μg/隻的生理鹽水配製的抗原溶液。

免疫方案B：用QuickAntibody-Mouse5W(KX0210041)對小鼠進行免疫。抗原與佐劑比例為1：1，25μg/隻/次(首次免疫/追加免疫)。抗原與佐劑迅速充分混勻後接種，時間為第0、21、35天。第0天小鼠後小腿肌肉(IM)注射25 μg/隻的抗原。第21，35天按同樣方式注射25μg/隻(根據滴度決定第3免是否進行)。於第28，42天取血，用ELISA方法確定小鼠血清中的抗體滴度。選擇血清中抗體滴度高並且滴度趨於平臺的小鼠進行脾細胞融合。在進行脾細胞融合前3天加強免疫，腹膜內(IP)注射50μg/只的生理鹽水配製的抗原溶液。

2.脾細胞融合

採用優化的PEG介導的融合步驟將脾淋巴細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0細胞(ATCC® CRL-8287^TM)進行融合得到融合瘤細胞。融合好的融合瘤細胞以0.5-1×10⁶/ml的密度用完全培養基(含20% FBS、1×HAT、1×OPI的DMEM培養基)重懸，100μl/孔種於96孔板中，37℃，5%CO₂孵育3至4天後，補充HAT完全培養基100μl/孔，繼續培養3至4天至形成針尖般純株。去除上清，加入200μl/well的HT完全培養基(含20%FBS、1×HT和1×OPI的RPMI-1640培養基)，37℃，5%CO₂培養3天後進行ELISA檢測。

3.融合瘤細胞篩選

根據融合瘤細胞生長密度，用結合ELISA方法進行融合瘤培養上清檢測(見測試例1)。並將結合ELISA檢測的陽性孔細胞上清進行細胞阻斷實驗(見測試例3)。結合和阻斷均為陽性的孔細胞及時進行擴增凍存保種和二到三次亞選殖直至獲得單細胞純株。

每次亞選殖細胞均需進行LAG-3結合ELISA、細胞阻斷實驗檢測(見測試例1和測試例3)。藉由以上實驗篩選得到融合瘤純株，用無血清細胞培養法進一步製備抗體，按純化實例純化抗體，供在檢測例中使用。

4.融合瘤陽性純株序列測定

從陽性融合瘤中選殖序列過程如下。收集對數生長期融合瘤細胞，用Trizol(Invitrogen,Cat No.15596-018)按照試劑盒說明書步驟提取RNA，用PrimeScript^TM Reverse Transcriptase試劑盒反轉錄(Takara,Cat No.2680A)。將反轉錄得到的cDNA採用mouse Ig-Primer Set(Novagen,TB326 Rev.B 0503)進行PCR擴增後送測序公司測序。得到的融合瘤純株mAb229和mAb303的重鏈、輕鏈的DNA序列對應的胺基酸序列SEQ ID NO：5、6和SEQ ID NO：7、8所示： mAb229-VH SEQ ID NO：5

mAb229-VL SEQ ID NO：6

mAb303-VH EVQLQQSGPVLVKPGASVKMSCKASGYTLTDYYMNWVKQS SEQ ID NO：7

mAb303-VL SEQ ID NO：8

對得到的陽性純株進行結合人LAG-3的ELISA實驗(測試例1，結果見表2中蛋白水平結合活性EC50值)、結合人LAG-3過表達CHO-s細胞的ELISA實驗(測試例2，結果見表2中細胞水平結合活性EC50值)和阻斷LAG-3抗原與Daudi細胞結合實驗(測試例3，結果見表2中阻斷活性EC50值)，並檢測其與人LAG-3蛋白的親和力(見測試例4，結果見表3)。

表2數據顯示LAG-3抗體mAb229和mAb303與人LAG-3蛋白均有很好的結合活性。LAG-3抗體mAb229和mAb303與過表達人LAG-3全長蛋白的CHO-S細胞均有很好的結合活性。LAG-3抗體mAb229和mAb303均可顯著阻斷人LAG-3抗原與Daudi細胞的結合。

表3數據表明，本發明LAG-3抗體mAb229和mAb303對人LAG-3蛋白有較強的結合活性和親和力。

實施例3. 抗人LAG-3鼠融合瘤單株抗體mAb229的人源化

藉由比對IMGT人類抗體重輕鏈可變區種系基因數據庫和MOE軟件，分別挑選與mAb229同源性高的重鏈和輕鏈可變區種系基因作為模板，將鼠源抗體的CDR分別移植到相應的人源模板中，形成次序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可變區序列。其中胺基酸殘基由Kabat編號系統確定並註釋。

1、融合瘤純株mAb229人源化構架選擇

鼠源抗體mAb229的人源化輕鏈模板為IGKV1-39*01和hjk4.1，人源化重鏈模板為IGHV7-4-1*02和hjh6.1，人源化可變區序列如下：Hu229VH-CDR graft SEQ ID NO：21

Hu229VL-CDR graft DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASENIYSNLA WYQQKPGK SEQ ID NO：22

註：順序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜體為FR序列，下劃線為CDR序列。

2、融合瘤純株mAb229的模板選擇和回復突變設計，見下表4：

注：如I48V表示依照Kabat編號系統，將48位I突變回V。Grafted代表鼠抗體CDR植入人種系FR區序列。

註：該表表示各種突變組合所得的序列。如Hu229-005表示，在人源化的鼠抗體Hu229-005上的有輕鏈HumAb229_VL.1A、重鏈HumAb229_VH.1兩種突變。其它類推。

mAb229人源化具體序列如下：Hu229VH.1(同Hu229VH-CDR graft) SEQ ID NO：21

Hu229VH.1A SEQ ID NO：23

Hu229VH.1B SEQ ID NO：24

Hu229VH.1C SEQ ID NO：25

Hu229VL.1(同Hu229VL-CDR graft) SEQ ID NO：22

Hu229VL.1A SEQ ID NO：26

Hu229VL.1B SEQ ID NO：27

Hu229VL.1C SEQ ID NO：28

實施例4. 抗人LAG-3鼠融合瘤單株抗體mAb303的人源化

藉由比對IMGT人類抗體重輕鏈可變區種系基因數據庫和MOE軟體，分別挑選與mAb303同源性高的重鏈和輕鏈可變區種系基因作為模板，將鼠源抗體的CDR分別移植到相應的人源模板中，形成次序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可變區序列。其中胺基酸殘基由Kabat編號系統確定並註釋。

1、融合瘤純株mAb303人源化構架選擇

鼠源抗體mAb303的人源化輕鏈模板為IGKV1-39*01和hjk4.1，人源化重鏈模板為IGHV1-3*01和hjh6.1，人源化可變區序列如下：Hu303VH-CDR graft SEQ ID NO：29

Hu303VL-CDR graft SEQ ID NO：30註：順序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜體為FR序列，下劃線為CDR序列。

2、融合瘤純株mAb303的模板選擇和回復突變設計，見下表6：

註：如L46R表示依照Kabat編號系統，將46位L突變回R。Grafted代表鼠抗體CDR植入人種系FR區序列。

各突變序列組合如下：註：該表表示各種突變組合所得的序列。如Hu303-005表示，在人源化的鼠抗體Hu303-005上的有輕鏈HumAb303_VL.1A、重鏈HumAb303_VH.1兩種突變。其它類推。

mAb303人源化具體序列如下：Hu303_VH.1(同Hu303VH-CDR graft) SEQ ID NO：29

Hu303_VH.1A QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQA SEQ ID NO：31

Hu303_VH.1B SEQ ID NO：32

Hu303_VH.1C SEQ ID NO：33

Hu303_VL.1(同Hu303VL-CDR graft) SEQ ID NO：30

Hu303_VL.1A SEQ ID NO：34

Hu303_VL.1B SEQ ID NO：35

Hu303_VL.1C SEQ ID NO：36

Hu303_VL.1D SEQ ID NO：37

實施例5. 重組以及人源化抗體的製備

抗體選用人重鏈IgG4/輕鏈kappa的恒定區與各可變區組合，在Fc段做了S228P突變來增加IgG4抗體的穩定性，也可選用本領域其它已知的突變來增加其性能。

重鏈恒定區： SEQ ID NO：38

輕鏈恒定區： SEQ ID NO：39

1.重組抗體的分子選殖

融合瘤篩選所獲得的陽性抗體分子經過測序後，得到可變區編碼基因序列。以測序所得序列設計首尾引子，以測序基因為模板，經過PCR搭建各抗體VH/VK基因片段，再與表達載體pHr(帶信號肽及hIgG4/hkappa恒定區基因(CH1-FC/CL)片段)進行同源重組，構建重組抗體全長表達質粒VH-CH1-FC-pHr/VL-CL-pHr。

2.人源化抗體的分子選殖

人源設計之後的抗體序列，經過密碼子優化後產生人密碼子偏好的編碼基因序列，設計引子PCR搭建各抗體VH/VK基因片段，再與表達載體pHr(帶信號肽及hIgG4/hkappa恒定區基因(CH1-FC/CL)片段)進行同源重組，構建人源化抗體全長表達質粒 VH-CH1-FC-pHr/VL-CL-pHr。

3.重組以及人源化抗體的表達與純化

分別表達抗體輕重鏈的質粒以1：1.2的比例轉染HEK293E細胞，6天後收集表達上清，高速離心去除雜質，用Protein A管柱進行純化。用PBS沖洗管柱，至A280讀數降至基線。用pH3.0-pH3.5的酸性沖提液沖提目的蛋白，用1M Tris-HCl,pH8.0-9.0中和。沖提樣品適當濃縮後，利用PBS平衡好的凝膠層析Superdex200(GE)進一步純化，以去除聚體，收集單體峰，分裝備用。

實施例6. LAG-3抗體單用及聯合PD-1抗體對T淋巴細胞激活的實驗 1．實驗材料和實驗方法 1.1．實驗材料

LAG-3抗體(上述實施例4表7中Hu303-005，為SEQ ID NO：29所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：34所示的輕鏈可變區及其所對應的重鏈恒定區SEQ ID NO：38和輕鏈恒定區SEQ ID NO：39組成的序列，以下稱為抗體A；上述實施例3表5中Hu229-013，為SEQ ID NO：24所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：26所示的輕鏈可變區及其所對應的重鏈恒定區SEQ ID NO：38和輕鏈恒定區SEQ ID NO：39組成的序列，以下稱為-抗體C)，製備方案參照上述實施例1-5，LAG3抗體溶解於PBS緩衝液，存儲濃度均大於2mg/ml。

PD-1抗體(重鏈和輕鏈序列分別為SEQ ID NO：46和 SEQ ID NO：47，以下稱為抗體B)，PD-1抗體溶解於PBS緩衝液，存儲濃度為40mg/ml。

超抗原金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB凍乾粉溶解於去離子水，完全溶解後過0.22μM濾膜過濾除菌，分裝保存，存儲濃度為500μg/ml；配製工作濃度時，用PBS緩衝液稀釋。)

1.2．PBMCs(人外周血單核細胞)提取

本實驗所使用PBMCs由2名志願者新鮮血液中提取，提取方法如下：

a)將用肝素抗凝處理的靜脈血與同體積含2%FBS的PBS混合

b)無菌轉移15ml分離液1077到50ml分離管中(之前輕輕顛倒瓶子使1077充分混合)

c)仔細的將稀釋血液25ml加入離心管中的1077(室溫，緩慢加入，在血液和1077中形成一個明顯的分層，不要將稀釋血液混合入1077中)；

d)室溫下1200g離心10分鐘，離心可以沉澱紅細胞和多核白細胞同時可以在1077上形成一層單核淋巴細胞。吸出淋巴細胞上方4-6cm的血漿；

e)吸取淋巴細胞層以及它下面一半的1077轉移到另外的一個離心管。加入等體積的PBS，室溫下300g離心8分鐘；

f)用PBS或RPMI-1640培養基清洗細胞，用含血清的RPMI-1640培養基重懸細胞。

1.3.實驗設計

新鮮分離純化的PBMC，接種至96孔細胞培養板，細胞密度約為1x10^5/孔，加入80ng/mL SEB超抗原刺激；PD1抗體和LAG-3抗體樣品分別梯度稀釋，同時加入至各濃度點對應的細胞培養孔內；背景對照孔為只加SEB刺激孔。37℃，5% CO2培養箱培養72h後，收集細胞培養上清。採用ELISA(BD,CAT# 550611)方法檢測細胞培養上清內IL-2分泌水平。具體操作參考試劑說明書。結果如第1圖所示，LAG-3抗體樣品聯合PD1抗體能夠增強激活的T淋巴細胞分泌細胞因子IL-2，並且有藥物濃度劑量效應。

2.試驗結果

與抗體A、抗體B和抗體C單獨刺激PBMCs相比，抗體A與抗體B聯用或抗體C與抗體B聯用對提高IL-2細胞因子分泌水平有明顯增強作用(見第1圖、第2圖)。

實施例7. LAG-3抗體(抗體A)與PD-1抗體聯用對人惡性膠質瘤U-87MG小鼠皮下移植瘤的療效 1．實驗材料和實驗方法 1.1．實驗動物和飼養條件

NOD/SCID雌性小鼠4至6週齡，體重約19g，5隻/籠飼養，12/12小時光/暗週期調節，溫度23±1℃恒溫，濕度40至60%，自由進食進水。

1.2．實驗材料

FC對照抗體，濃度：13.3mg/ml，批號：20151126，來自上海恒瑞醫藥有限公司。給藥前在無菌條件下用PBS稀釋成給藥濃度，置於4℃保存。

LAG-3抗體(上述實施例4表7中Hu303-005，為SEQ ID NO：29所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：34所示的輕鏈可變區及其所對應的重鏈恒定區SEQ ID NO：38和輕鏈恒定區SEQ ID NO：39組成的序列，以下稱為抗體A)，製備方案參照上述實施例1-5；濃度：1.9mg/ml，給藥前在無菌條件下用PBS稀釋成給藥濃度，置於4℃保存。

PD-1抗體(重鏈和輕鏈序列分別為SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47，以下稱為抗體B)，按照專利申請WO201508584該方法製備；濃度：50mg/ml，給藥前在無菌條件下用PBS稀釋成給藥濃度，置於4℃保存。

Human CD3 Antibodies OKT3，購自Miltenyi Biotec(Cat.No.130-093-387)。

1.3．PBMCs提取

參照實施例6。

1.4.CD3抗體包被及PBMCs激活

a)將用PBS稀釋的CD3 mAb(40ng/ml)加入6孔細胞培養板，1ml/well，37℃包被一小時；b)在加PBMCs之前，倒掉抗體，每孔加入2ml PBS洗滌兩遍；c)分別加入2名志願者的PBMCs(1640培養基培養)：每孔約2×10⁶Cells，2ml/well；d)置於37℃培養箱中培養4天。

2.實驗設計

將U-87MG細胞(3.6×10⁶cells/mouse)100μl接種於NOD/SCID小鼠右肋部皮下，10天後去除腫瘤體積過大過小的動物，按平均腫瘤體積約40mm³將小鼠隨機分為：FC對照-6mpk、抗體A-6mpk組、抗體B-3mpk組及抗體A-6mpk與抗體B-3mpk聯用組，共4組，每組8隻(Day0)，分組後開始注射PBMCs和抗體。整個試驗週期共注射2次PBMCs，在Day0將經CD3抗體刺激4天的兩名志願者的PBMCs以1：1比例混合，以5×10⁵cells/mouse注射到荷瘤小鼠的腫瘤組織中，剩餘的PBMCs停止刺激並繼續培養，於Day7以5×10⁶cells/mouse腹腔注射到荷瘤鼠體內。給藥是從Day0開始腹腔注射(I.P.)抗體B和抗體A，每週3次(TIW)，共給藥6次(表1)。每週2次監測腫瘤體積、動物重量並記錄數據。

3．數據處理

所有數據使用Excel和GraphPad Prism 5軟體進行作圖及統計分析。

腫瘤體積(V)計算公式為：V=1/2×a×b²其中a、b分別表示長、寬。

相對腫瘤增殖率T/C(%)=(T-T₀)/(C-C₀)×100其中T、C為實驗結束時治療組和對照組的腫瘤體積；T₀、C₀為實驗開始時的腫瘤體積。

抑瘤率TGI(%)=1-T/C(%)。

4．結果

抗體A及抗體B單用能一定程度抑制人惡性膠質瘤U-87MG小鼠皮下移植瘤的生長。抗體A單用組(6mpk,I.P.,TIW×6)抑瘤率為27.25%(p=0.1489 vs FC對照)；抗體B單用組(3mpk,I.P.,TIW×6)抑瘤率為14.05%(p=0.4623 vs FC對照)。

抗體A與抗體B聯用能顯著抑制人惡性膠質瘤U-87MG小鼠皮下移植瘤的生長。抗體A+抗體B(6mpk+3mpk,I.P.,TIW×6)抑瘤率為46.27%(p=0.0042 vs FC對照)，且與抗體B單用組有統計學差異(p=0.0441)，但與抗體A單用組無統計學差異(p=0.1765)，(表8及第3圖)。

荷瘤小鼠對抗體A和抗體B單用或聯用均能很好耐受，在整個給藥過程中體重平穩上升，無明顯藥物致體重減輕等症狀發生(第4圖)。

綜上所述，抗體A和抗體B聯合用藥(6mpk+3mpk,I.P.,TIW×6)能顯著抑制人惡性膠質瘤U-87MG小鼠皮下移植瘤的生長，且較單用組具有一定優勢。荷瘤小鼠對以上藥物均能很好耐受。

實施例8. LAG-3抗體(抗體A、抗體C)單用及分別與聯合PD-1抗體對U-87MG皮下移植瘤抑制實驗 1．實驗材料和實驗方法 1.1．實驗動物和飼養條件

參照實施例7。

1.2．實驗材料

LAG-3抗體(上述實施例4表7中Hu303-005，為SEQ ID NO：29所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：34所示的輕鏈可變區及其所對應的重鏈恒定區SEO ID NO：38和輕鏈恒定區 SEQ ID NO：39組成的序列，以下稱為抗體A；上述實施例3表5中Hu229-013，為SEQ ID NO：24所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：26所示的輕鏈可變區及其所對應的重鏈恒定區SEQ ID NO：38和輕鏈恒定區SEQ ID NO：39組成的序列，以下稱為抗體C)，製備方案參照上述實施例1-5；濃度：1.9mg/ml，給藥前在無菌條件下用PBS稀釋成給藥濃度，置於4℃保存。

PD-1抗體(重鏈和輕鏈序列分別為SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47，以下稱為抗體B)，按照專利申請WO201508584所述方法製備；濃度：50mg/ml，給藥前在無菌條件下用PBS稀釋成給藥濃度，置於4℃保存。

Human CD3 Antibodies OKT3，購自Miltenyi Biotec(Cat.No.130-093-387)。

1.3．PBMCs提取

參照實施例6。

1.4.CD3抗體包被及PBMCs激活

參照實施例7。

2.實驗設計

將U-87MG細胞(3.6×10⁶cells/mouse)100μl接種於NOD/SCID小鼠右肋部皮下，10天後去除腫瘤體積過大過小的動物，按平均腫瘤體積約40mm³將小鼠隨機分為：FC對照-6mpk、抗體A-6mpk組、抗體C-6mpk組、抗體B-3mpk組及抗體A-6mpk與抗體B-3mpk聯用組、抗體C-6mpk與抗體B-3mpk聯用組，共6組，每組8隻(Day0)，分組後開始注射PBMCs和抗體。整個試驗週期共注射2次PBMCs，在Day0將經CD3抗體刺激4天的兩名志願者的PBMCs以1：1比例混合，以5×10⁵cells/mouse注射到荷瘤小鼠的腫瘤組織中，剩餘的PBMCs停止刺激並繼續培養，於Day7以5×10⁶cells/mouse腹腔注射到荷瘤鼠體內。給藥是從Day0開始腹腔注射(I.P.)抗體B、抗體A、抗體C，每週3次(TIW)，共給藥6次(表1)。每週2次監測腫瘤體積、動物重量並記錄數據。

3．數據處理

參照實施例7。

4．結果

實驗結果如表9及第5圖所示，給藥14天後，LAG-3抗體，即抗體C-6mpk，抗體A-6mpk均有一定的抑瘤效果，抑瘤率分別為27.25%(p<0.05)及34.94%(p<0.01)；兩者分別與PD-1抗體，即與抗體B-3mpk聯用，抑瘤效果有顯著提升，抑瘤率分別為47.27%及49.09%，與FC對照組及抗體B-3mpk單獨用藥組均有顯著差異(p<0.001 vs FC對照，p<0.01 vs抗體B-3mpk)。

D0：第一次給藥時間；* p<0.05,** p<0.01,***p<0.001 vs FC對照by two way ANOVA。

<110> 江蘇恆瑞醫藥股份有限公司、上海恆瑞醫藥有限公司、蘇州盛迪亞生物醫藥有限公司

<120> 抗PD-1抗體和抗LAG-3抗體聯合在製備治療腫瘤的藥物中的用途

<130> 2017

<160> 47

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 442

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<221> 肽

<223> LAG-3-Flag

<400> 1

<210> 2

<211> 525

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<221> 肽

<400> 2

<210> 3

<211> 675

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<221> 肽

<223> LAG-3胞外區和hIgG1 Fc的融合蛋白

<400> 3

<210> 4

<211> 677

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<221> 肽

<223> LAG-3胞外區和mIgG2a Fc的融合蛋白

<400> 4

<210> 5

<211> 124

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<221> 域

<400> 5

<210> 6

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<221> 域

<400> 6

<210> 7

<211> 120

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<221> 域

<400> 7

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<221> 域

<400> 8

<210> 9

<211> 5

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<221> 域

<400> 9

<210> 10

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<221> 域

<400> 10

<210> 11

<211> 15

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<221> 域

<400> 11

<210> 12

<211> 5

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<221> 域

<400> 12

<210> 13

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<221> 域

<400> 13

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<221> 域

<400> 14

<210> 15

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<221> 域

<400> 15

<210> 16

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<221> 域

<400> 16

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<221> 域

<400> 17

<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<221> 域

<400> 18

<210> 19

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<221> 域

<400> 19

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<221> 域

<400> 20

<210> 21

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<221> 域

<223> Hu229VH.1

<400> 21

<210> 22

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<221> 域

<223> Hu229VL.1

<400> 22

<210> 23

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<221> 域

<223> Hu229VH.1A

<400> 23

<210> 24

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<221> 域

<223> Hu229VH.1B

<400> 24

<210> 25

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<221> 域

<223> Hu229VH.1C

<400> 25

<210> 26

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<221> 域

<223> Hu229VL.1A

<400> 26

<210> 27

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<221> 域

<223> Hu229VL.1B

<400> 27

<210> 28

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<221> 域

<223> Hu229VL.1C

<400> 28

<210> 29

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<221> 域

<223> Hu303_VH.1

<400> 29

<210> 30

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<221> 域

<223> Hu303_VL.1

<400> 30

<210> 31

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<221> 域

<223> Hu303_VH.1A

<400> 31

<210> 32

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<221> 域

<223> Hu303_VH.1B

<400> 32

<210> 33

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<221> 域

<223> Hu303_VH.1C

<400> 33

<210> 34

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<221> 域

<223> Hu303_VL.1A

<400> 34

<210> 35

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<221> 域

<223> Hu303_VL.1B

<400> 35

<210> 36

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<221> 域

<223> Hu303_VL.1C

<400> 36

<210> 37

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<221> 域

<223> Hu303_VL.1D

<400> 37

<210> 38

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<221> 域

<223> 重鏈恆定區，S228P突變.

<400> 38

<210> 39

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<221> 域

<223> kappa輕鏈恆定區

<400> 39

<210> 40

<211> 5

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<221> 域

<400> 40

<210> 41

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<221> 域

<400> 41

<210> 42

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<221> 域

<400> 42

<210> 43

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 43

<210> 44

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<221> 域

<400> 44

<210> 45

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<221> 域

<400> 45

<210> 46

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<221> 鏈

<223> 人源化PD-1抗體重鏈

<400> 46

<210> 47

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<221> 鏈

<223> 人源化PD-1抗體輕鏈

<400> 47

Claims

一種抗PD-1抗體或其抗原結合片段和抗LAG-3抗體或其抗原結合片段聯合在製備治療腫瘤和/或增強T細胞活性的藥物中的用途，其特徵在於，該抗LAG-3抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區和輕鏈可變區選自以下(i)或(ii)所示的CDR區序列：(i)SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或(ii)SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示的所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
如申請專利範圍第1項所述的用途，其中，該抗LAG-3抗體或其抗原結合片段為LAG-3人源化抗體。
如申請專利範圍第1或2項所述的用途，其中，該LAG-3抗體或其抗原結合片段，包含選自以下的重鏈可變區和輕鏈可變區的組合：1)SEQ ID NO：21的重鏈可變區和SEQ ID NO：22的輕鏈可變區；2)SEQ ID NO：21的重鏈可變區和SEQ ID NO：26的輕鏈可變區；3)SEQ ID NO：21的重鏈可變區和SEQ ID NO：27 的輕鏈可變區；4)SEQ ID NO：21的重鏈可變區和SEQ ID NO：28的輕鏈可變區；5)SEQ ID NO：23的重鏈可變區和SEQ ID NO：22的輕鏈可變區；6)SEQ ID NO：23的重鏈可變區和SEQ ID NO：26的輕鏈可變區；7)SEQ ID NO：23的重鏈可變區和SEQ ID NO：27的輕鏈可變區；8)SEQ ID NO：23的重鏈可變區和SEQ ID NO：28的輕鏈可變區；9)SEQ ID NO：24的重鏈可變區和SEQ ID NO：22的輕鏈可變區；10)SEQ ID NO：24的重鏈可變區和SEQ ID NO：26的輕鏈可變區；11)SEQ ID NO：24的重鏈可變區和SEQ ID NO：27的輕鏈可變區；12)SEQ ID NO：24的重鏈可變區和SEQ ID NO：28的輕鏈可變區；13)SEQ ID NO：25的重鏈可變區和SEQ ID NO：22的輕鏈可變區；14)SEQ ID NO：25的重鏈可變區和SEQ ID NO：26的輕鏈可變區；15)SEQ ID NO：25的重鏈可變區和SEQ ID NO：27 的輕鏈可變區；16)SEQ ID NO：25的重鏈可變區和SEQ ID NO：28的輕鏈可變區；17)SEQ ID NO：29的重鏈可變區和SEQ ID NO：30的輕鏈可變區；18)SEQ ID NO：29的重鏈可變區和SEQ ID NO：34的輕鏈可變區；19)SEQ ID NO：29的重鏈可變區和SEQ ID NO：35的輕鏈可變區；20)SEQ ID NO：29的重鏈可變區和SEQ ID NO：36的輕鏈可變區；21)SEQ ID NO：29的重鏈可變區和SEQ ID NO：37的輕鏈可變區；22)SEQ ID NO：31的重鏈可變區和SEQ ID NO：30的輕鏈可變區；23)SEQ ID NO：31的重鏈可變區和SEQ ID NO：34的輕鏈可變區；24)SEQ ID NO：31的重鏈可變區和SEQ ID NO：35的輕鏈可變區；25)SEQ ID NO：31的重鏈可變區和SEQ ID NO：36的輕鏈可變區；26)SEQ ID NO：31的重鏈可變區和SEQ ID NO：37的輕鏈可變區；27)SEQ ID NO：32的重鏈可變區和SEQ ID NO：30 的輕鏈可變區；28)SEQ ID NO：32的重鏈可變區和SEQ ID NO：34的輕鏈可變區；29)SEQ ID NO：32的重鏈可變區和SEQ ID NO：35的輕鏈可變區；30)SEQ ID NO：32的重鏈可變區和SEQ ID NO：36的輕鏈可變區；31)SEQ ID NO：32的重鏈可變區和SEQ ID NO：37的輕鏈可變區；32)SEQ ID NO：33的重鏈可變區和SEQ ID NO：30的輕鏈可變區；33)SEQ ID NO：33的重鏈可變區和SEQ ID NO：34的輕鏈可變區；34)SEQ ID NO：33的重鏈可變區和SEQ ID NO：35的輕鏈可變區；35)SEQ ID NO：33的重鏈可變區和SEQ ID NO：36的輕鏈可變區；或36)SEQ ID NO：33的重鏈可變區和SEQ ID NO：37的輕鏈可變區。
如申請專利範圍第3項所述的用途，其中，該LAG-3抗體或其抗原結合片段，包含選自以下的重鏈可變區和輕鏈可變區的組合：10)SEQ ID NO：24的重鏈可變區和SEQ ID NO：26的輕鏈可變區； 18)SEQ ID NO：29的重鏈可變區和SEQ ID NO：34的輕鏈可變區。
如申請專利範圍第1至4項中任一項所述的用途，其中，該LAG-3人源化抗體重鏈進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恒定區；該LAG-3人源化抗體輕鏈進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恒定區。
如申請專利範圍第5項所述的用途，其中，該LAG-3人源化抗體重鏈進一步包含人源IgG4或其變體的重鏈恒定區。
如申請專利範圍第6項所述的用途，其中，該LAG-3人源化抗體重鏈進一步包含如SEQ ID NO：38所示的重鏈恒定區。
如申請專利範圍第5項所述的用途，其中，該LAG-3人源化抗體輕鏈進一步包含如SEQ ID NO：39所示的輕鏈恒定區。
如申請專利範圍第1至8任一項所述的用途，其中，該抗PD-1抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；該PD-1抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
如申請專利範圍第9項所述的用途，其中，該PD-1抗體或其抗原結合片段為PD-1人源化抗體。
如申請專利範圍第10項所述的用途，其中，該PD-1人源化抗體輕鏈序列為如SEQ ID NO：47所示的序列或其變體；該變體在輕鏈可變區有0至10的胺基酸變化。
如申請專利範圍第11項所述的用途，其中，該變體在輕鏈可變區為A43S的胺基酸變化。
如申請專利範圍第10項所述的用途，其中，該PD-1人源化抗體重鏈序列為如SEQ ID NO：46所示的序列或其變體；該變體優選在重鏈可變區有0至10的胺基酸變化。
如申請專利範圍第13項所述的用途，其中，該變體在重鏈可變區為G44R的胺基酸變化。
如申請專利範圍第9至14項中任一項所述的用途，其中，該PD-1人源化抗體輕鏈序列為如SEQ ID NO：47所示的序列，重鏈序列為如SEQ ID NO：46所示的序列。
如申請專利範圍第1項所述的用途，其中，該抗PD-1抗體或其抗原結合片段選自匹地利珠單抗(Pidilizumab)、MEDI-0680、AMP-224、PF-06801591、TSR-042、JS-001、GLS-010、PDR-001、杰諾單抗(Genolimzumab)、卡瑞利珠單抗(Camrelizumab)、BGB-A317、IBI-308、REGN-2810、帕博利珠單抗(Pembrolizumab)、納武單抗(Nivolumab)和其組合。
如申請專利範圍第1至16項中任一項所述的用途，其中，該腫瘤選自惡性腫瘤、良性腫瘤；該惡性腫瘤選自惡性上皮腫瘤、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、頭頸部腫瘤、腦部腫瘤、腹膜癌、混合型腫瘤、兒童惡性腫瘤。
如申請專利範圍第1至16項中任一項所述的用途，其中，該腫瘤選自微衛星不穩定高MSI-H或錯配修復缺失的實體瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、食管癌、肝癌、膽管癌、乳腺癌、結直腸癌、胃癌、腎癌、急性髓性淋巴細胞白血病、骨髓增生異常綜合征、膠質瘤、基底細胞癌、鱗狀細胞癌和人乳頭瘤病毒相關腫瘤。
如申請專利範圍第18項所述的用途，其中，該腫瘤選自微衛星不穩定高MSI-H或錯配修復缺失的實體瘤。
如申請專利範圍第1至19項中任一項所述的用途，其中，該腫瘤由PD-1介導和/或表達PD-L1。
如申請專利範圍第1至20項中任一項所述的用途，其中，該腫瘤表達LAG-3。
如申請專利範圍第1至21項中任一項所述的用途，其中，該腫瘤選自RAS突變型腫瘤、RAF突變型腫瘤。
如申請專利範圍第1至22項中任一項所述的用途，其中，該腫瘤選自中晚期腫瘤、復發難治性腫瘤、經化療藥物治療失敗和/或復發腫瘤、經放療失敗和/或復發腫瘤、經靶向藥物治療失敗和/或復發腫瘤、經免疫治療失敗和/或復發腫瘤。
如申請專利範圍第1至23項中任一項所述的用途，其中，該抗LAG-3抗體或其抗原結合片段的劑量選自0.01至1000mg。
如申請專利範圍第24項所述的用途，其中，該抗LAG-3抗體或其抗原結合片段的劑量選自50mg、60mg、70mg、75mg、80mg、90mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、275mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1000mg。
如申請專利範圍第1至23項中任一項所述的用途，其中，該抗LAG-3抗體或其抗原結合片段劑量選自1至20mg/kg。
如申請專利範圍第26項所述的用途，其中，該抗LAG-3抗體或其抗原結合片段劑量選自1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、12mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、18mg/kg、20mg/kg。
如申請專利範圍第27項所述的用途，其中，該抗LAG-3抗體或其抗原結合片段劑量選自3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg。
如申請專利範圍第1至28項中任一項所述的用途，其中，該抗PD-1抗體或其抗原結合片段劑量選自50至600mg。
如申請專利範圍第29項所述的用途，其中，該抗PD-1抗體或其抗原結合片段劑量選自50mg、60mg、70mg、75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、 250mg、375mg、400mg、425mg、450mg、475mg、500mg、600mg。
如申請專利範圍第30項所述的用途，其中，該抗PD-1抗體或其抗原結合片段劑量選自100mg、200mg、400mg。
如申請專利範圍第1至28項中任一項所述的用途，其中，該抗PD-1抗體或其抗原結合片段劑量選自1至10mg/kg。
如申請專利範圍第32項所述的用途，其中，該抗PD-1抗體或其抗原結合片段劑量選自1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg。
如申請專利範圍第33項所述的用途，其中，該抗PD-1抗體或其抗原結合片段劑量選自3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg。
一種藥物包裝盒，其特徵在於，包含有申請專利範圍第1至34項中任一項所述的抗LAG-3抗體或其抗原結合片段和抗PD-1抗體或其抗原結合片段。
一種醫藥組成物，其特徵在於，包含有申請專利範圍第1至34項中任一項所述的有效量的抗LAG-3抗體或其抗原結合片段和抗PD-1抗體或其抗原結合片段，以及一種或多種可藥用的賦型劑、稀釋劑或載體。