CN105143265A - 抗CRTh2抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供抗CRTh2抗体及使用该抗体的方法。

Description

抗CRTh2抗体及其用途
相关申请的交叉参考
本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请系列号61/786,370的优先权，该美国临时申请系列号的内容在此以其整体引入作为参考。
ASCII文本文件序列表的提交
以下ASCII文本文件提交的内容在此完整引入作为参考：计算机可读形式(CRF)的序列表(文件名：146392017340SEQLIST.TXT，记录日期：2014年3月6日，大小：115KB)。
技术领域
本发明涉及抗CRTh2抗体及使用该抗体的方法。
背景技术
表达在T辅助2细胞上的化学引诱物受体-同源分子(CRTh2)是G蛋白偶联受体(GPCR)家族的成员。CRTh2介导嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和2型T辅助(Th2)细胞响应前列腺素D2(PGD2)的趋化性。认为这些细胞类型，特别是Th2细胞有助于变应性疾病(如哮喘)的发病。已在动物模型中显示CRTh2抑制导致呼吸道高反应性和炎症的减弱。Lukacs等；Am.J.Phsiol.LungCell.Mol.Physiol.295:L767-779,2008。例如，双重thrombroxaneA2受体和CRTh2受体拮抗剂雷马曲班(ramatroban)在体外和体内抑制嗜酸性粒细胞趋化性，在日本被批准用于治疗变应性鼻炎。Bosnjak,B等,RespiratoryResearch12:114,2011。许多其他CRTh2拮抗剂如4-氨基四氢喹啉衍生物或吲哚乙酸衍生物目前正在研发中。Pettipher；Br.J.Pharmacol.153(增刊1):S191-199,2008；Royer等；Eur.J.Clin.Invest.38:663-671,2008；Stebbins等；Eur.J.Pharmacol.638:142-149,2010。
发明概述
本发明提供抗CRTh2抗体及使用该抗体的方法。
在一方面，本文提供分离的抗体，在对人个体施用治疗有效量时，其结合人CRTh2并排除(deplete)CRTh2表达细胞。在一些实施方案中，该抗CRTh2抗体是改造的抗体。在一些实施方案中，通过重组方法产生该抗CRTh2抗体(例如，通过用编码抗体的一种或多种核酸转染或转化的宿主细胞体外(例如，在细胞培养物中)产生)。在一些实施方案中，该宿主细胞是原核细胞(例如细菌细胞)或真核细胞(例如CHO细胞、淋巴样细胞)。
在一些实施方案中，该抗体排除一种或多种以下类型的CRTh2表达细胞：Th2细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞或先天2型(IT2)细胞。在一些实施方案中，已改造该抗体来改善ADCC和/或CDC活性。在一些实施方案中，已改造该抗体来改善ADCC活性和/或降低CDC活性。在一些实施方案中，该抗体是无岩藻糖基化的(afucosylated)。在一些实施方案中，该抗体在α1,6-岩藻糖基转移酶(Fut8)敲除的细胞系中产生。在一些实施方案中，该抗体在过量表达β1,4-N-乙酰葡糖胺转移酶III(1，4-N-acetylglycosminyltransferaseIII，GnT-III)的细胞系中产生。在一些实施方案中，该细胞系还过量表达高尔基体甘露糖苷酶II(ManII)。在一些实施方案中，该抗体在Fc区中包含至少一个改善ADCC和/或CDC活性的氨基酸取代。在一些实施方案中，该氨基酸取代是S298A/E333A/K334A。
在一些实施方案中，该抗体是裸抗体。在一些实施方案中，该抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，该抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，该抗体是人抗体。在一些实施方案中，该抗体是双特异性抗体。在一些实施方案中，该抗体是IgG1抗体。
在一些实施方案中，该抗体结合非人灵长类的CRTh2。在一些实施方案中，该抗体结合恒河猴(rhesus)和/或食蟹猴(cynomologous)CRTh2。
在一些实施方案中，该抗体竞争性抑制至少一种以下抗体与人CRTh2的结合：19A2、8B1、31A5、3C12和本文所述的任意人源化抗体。在一些实施方案中，用ELISA测定来测定竞争性结合。在一些实施方案中，该抗体结合与至少一种以下抗CRTh2抗体所结合的CRTh2表位相同或重叠的人CRTh2表位：19A2、8B1、31A5、3C12和本文所述的任意人源化抗体。在一些实施方案中，该抗体包含来自以下抗CRTh2抗体之一的六个高变区(HVR)：19A2、8B1、31A5、3C12和本文所述的任意人源化抗体。
在一些实施方案中，该抗体进一步阻断CRTh2信号发放。在一些实施方案中，该抗体阻止CRTh2表达细胞响应前列腺素D2的募集。在一些实施方案中，该抗体阻断CRTh2表达细胞中的Ca2+流动。在一些实施方案中，该抗体以约100nM或更小的Kd值结合人CRTh2。
在一些实施方案中，该抗体包含：含有SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-H3；含有SEQIDNO:3的氨基酸序列的HVR-L3；及含有X1ISNGGSTTX2YPGTVEG(SEQIDNO:5)的HVR-H2，其中X1是Y或R，X2是Y或D。在一些实施方案中，该抗体包含：含有SEQIDNO:35或36的氨基酸序列的HVR-H3；含有SEQIDNO:27的氨基酸序列的HVR-L3；及含有SEQIDNO:32或33的氨基酸序列的HVR-H2。在一些实施方案中，该抗体包含：含有SEQIDNO:37的氨基酸序列的HVR-H3；含有SEQIDNO:28的氨基酸序列的HVR-L3；及含有SEQIDNO:34的氨基酸序列的HVR-H2。
在另一方面，本文提供分离的包含轻链可变区和重链可变区的抗CRTh2抗体，其中该轻链可变区和重链可变区包含六个高变区(HVR)序列：(i)含有RASENIYXNLA(SEQIDNO:1)的HVR-L1，其中X是S、W或Y；(ii)含有AATQLAX(SEQIDNO:2)的HVR-L2，其中X是D、E或S；(iii)含有QHFWITPWT(SEQIDNO:3)的HVR-L3；(iv)含有X1YX2MS(SEQIDNO:4)的HVR-H1，其中X1是S或F，X2是S、L或K；(v)含有X1ISNGGSTTX2YPGTVEG(SEQIDNO:5)的HVR-H2，其中X1是Y或R，X2是Y或D；和(vi)含有HRTNWDFDY(SEQIDNO:6)的HVR-H3。
在另一方面，本文提供分离的包含轻链可变区和重链可变区的抗CRTh2抗体，其中该轻链可变区包含：含有SEQIDNO:7、8或9的氨基酸序列的HVR-L1；含有SEQIDNO:10、11或12的氨基酸序列的HVR-L2；及含有SEQIDNO:3的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，该抗体进一步包含重链可变区，该重链可变区包含：含有SEQIDNO:13、14、15、16或17的氨基酸序列的HVR-H1；含有SEQIDNO:18、19、20或21的氨基酸序列的HVR-H2；及含有SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一方面，本文提供分离的包含轻链可变区和重链可变区的抗CRTh2抗体，其包含重链可变区，该重链可变区包含：含有SEQIDNO:13、14、15、16或17的氨基酸序列的HVR-H1；含有SEQIDNO:18、19、20或21的氨基酸序列的HVR-H2；及含有SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-H3。
在一些实施方案中，该抗体包含：(i)含有SEQIDNO:8的氨基酸序列的HVR-L1；(ii)含有SEQIDNO:10的氨基酸序列的HVR-L2；(iii)含有SEQIDNO:3的氨基酸序列的HVR-L3；(iv)含有SEQIDNO:13的氨基酸序列的HVR-H1；(v)含有SEQIDNO:19的氨基酸序列的HVR-H2；和(vi)含有SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-H3。
在一些实施方案中，该抗体包含：(i)含有SEQIDNO:9的氨基酸序列的HVR-L1；(ii)含有SEQIDNO:11的氨基酸序列的HVR-L2；(iii)含有SEQIDNO:3的氨基酸序列的HVR-L3；(iv)含有SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-H1；(v)含有SEQIDNO:20的氨基酸序列的HVR-H2；和(vi)含有SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一方面，本文提供分离的包含轻链可变区和重链可变区的抗CRTh2抗体，其中该轻链可变区包含：含有SEQIDNO:9的氨基酸序列的HVR-L1；含有SEQIDNO:10的氨基酸序列的HVR-L2；及含有SEQIDNO:3的氨基酸序列的HVR-L3。在另一方面，本文提供分离的包含轻链可变区和重链可变区的抗CRTh2抗体，其包含重链可变区，该重链可变区包含：含有SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-H1；含有SEQIDNO:20的氨基酸序列的HVR-H2；及含有SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-H3。在一些实施方案中，该抗体包含：(i)含有SEQIDNO:9的氨基酸序列的HVR-L1；(ii)含有SEQIDNO:10的氨基酸序列的HVR-L2；(iii)含有SEQIDNO:3的氨基酸序列的HVR-L3；(iv)含有SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-H1；(v)含有SEQIDNO:20的氨基酸序列的HVR-H2；和(vi)含有SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一方面，本文提供分离的包含轻链可变区和重链可变区的抗CRTh2抗体，其中该抗体包含选自SEQIDNO:38-53的VL序列。在一些实施方案中，该抗体进一步包含选自SEQIDNO:54-65的VH序列。在另一方面，本文提供分离的包含轻链可变区和重链可变区的抗CRTh2抗体，其中该抗体包含选自SEQIDNO:54-65的VH序列。在一些实施方案中，本文提供分离的抗CRTh2抗体，其包含含有选自SEQIDNO:38-48的VL序列的轻链可变区和含有选自SEQIDNO:54-60的VH序列的重链可变区。
在一些实施方案中，该抗体包含SEQIDNO:40的VL序列和SEQIDNO:57的VH序列。在一些实施方案中，该抗体包含SEQIDNO:39的VL序列和SEQIDNO:55的VH序列。在一些实施方案中，该抗体包含SEQIDNO:41的VL序列和SEQIDNO:57的VH序列。
在一些实施方案中，该抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，该抗体是人源化抗体或嵌合抗体。在一些实施方案中，该抗体的至少部分构架序列是人共有构架序列。在一些实施方案中，该抗体是选自Fab、Fab’-SH、Fv、scFc或(Fab’)2片段的抗体片段。
在另一方面，本文提供分离的编码本文所述的任意抗体的核酸。在另一方面，本文提供包含本文所述核酸的宿主细胞。在另一方面，本文提供产生抗体的方法，其包括培养该宿主细胞，使得产生该抗体。在一些实施方案中，该方法进一步包括回收由该宿主细胞产生的抗体。
在另一方面，本文提供包含本文所述的任意抗体和细胞毒剂的免疫缀合物。在一些实施方案中，该免疫缀合物在药物组合物中。该免疫缀合物可以用于本文所述的任意方法。
在另一方面，本文提供包含本文所述的任意抗CRTh2抗体和可药用载体的药物组合物。
在另一方面，本文提供用于治疗哮喘的方法，其包括对个体施用有效量的抗CRTh2抗体，其中该抗体排除该个体中CRTh2表达细胞。
在一些实施方案中，该抗体排除一种或多种以下类型的CRTh2表达细胞：Th2细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞或先天2型(IT2)细胞。在一些实施方案中，该抗CRTh2抗体从肺组织排除CRTh2表达细胞。在一些实施方案中，该抗CRTh2抗体从支气管肺泡灌洗液排除CRTh2表达细胞。在一些实施方案中，与施用该抗体之前的基线相比，该抗CRTh2抗体从肺排除了至少一类CRTh2表达细胞的至少50％。在一些实施方案中，与施用该抗体之前的基线相比，该抗CRTh2抗体从肺排除了至少一类CRTh2表达细胞的至少80％。在一些实施方案中，与施用该抗体之前的基线相比，该抗CRTh2抗体从肺排除了至少一类CRTh2表达细胞的至少90％。在一些实施方案中，该个体罹患粒细胞缺乏性哮喘(paucigranulocyticasthma)。在一些实施方案中，施用该抗CRTh2抗体后该个体中一种或多种细胞因子的水平降低。在一些实施方案中，由至少一种以下细胞类型产生的一种或多种细胞因子的水平降低：Th2细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞或先天2型(IT2)细胞。在一些实施方案中，该个体中的IL-4、IL-5、IL-9、IL-13、IL-17、组胺或白三烯中的一种或多种的水平降低。在一些实施方案中，该个体罹患未由吸入型糖皮质激素、短效β2激动剂、长效β2激动剂或其组合完全控制的哮喘。在一些实施方案中，该个体是人。在一些实施方案中，该抗CRTh2抗体是本文所述的抗体。
在另一方面，本文提供用于治疗由CRTh2表达细胞介导的障碍的方法，其包括对个体施用有效量的抗CRTh2抗体，其中该抗体排除该个体中CRTh2表达细胞。
在一些实施方案中，该障碍选自：哮喘、粒细胞缺乏性哮喘、特应性皮炎、变应性鼻炎、急性或慢性呼吸道超敏反应、嗜酸细胞增多综合征、嗜酸性食管炎、Churg-Strauss综合征、特发性肺纤维化、与细胞因子相关的炎症、与CRTh2表达细胞相关的炎症、与CRTh2表达细胞相关的恶性肿瘤、慢性特发性荨麻疹、慢性自发性荨麻疹、物理性荨麻疹、寒冷性荨麻疹、压迫性荨麻疹、大疱性类天疱疮、鼻息肉病、食物过敏和变应性支气管肺曲霉菌病(ABPA)。在一些实施方案中，该抗CRTh2抗体是本文所述的抗体。
在另一方面，本文提供用于降低个体中细胞因子水平的方法，其包括对个体施用有效量的抗CRTh2抗体，其中该抗体排除该个体中CRTh2表达细胞。在一些实施方案中，该个体中的IL-4、IL-5、IL-9、IL-13、IL-17、组胺或白三烯中的一种或多种的水平降低。在一些实施方案中，该抗CRTh2抗体是本文所述的抗体。
应理解，本文所述的多种实施方案的一种、几种或全部特性可以组合形成本发明的其他实施方案。本发明的这些及其他方面对本领域技术人员而言将变得显而易见。通过以下发明详述来进一步描述本发明的这些及其他实施方案。
附图简述
图1显示CRTh2表达在人“Th2”生物细胞上。通过使用抗人CRTh2Ab(BM16)的流式细胞术来评估所示人PBMC群体或培养的人细胞上的CRTh2表达。
图2显示，在与CRTh2-记忆CD4+T细胞相比时，CRTh2+记忆CD4+T细胞产生超过95％的记忆CD4+T细胞Th2细胞因子(Il-4、IL-5、IL13和IL-9)。通过流式细胞术从人PBMC分离CRTh2+CD45RO+和CRTh2-CD45RO+记忆CD4+T细胞，并用抗CD3和抗CD28抗体37℃刺激48小时。收集上清，并按Luminex所示进行细胞因子定量。
图3A-F通过流式细胞术显示小鼠或人源化抗CRTh2抗体与表达在细胞系上的CRTh2或与原代嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞的反应性。图3A通过流式细胞术显示与对照Ab(20ug/ml，着色直方图)比较的小鼠抗CRTh2杂交瘤抗体(克隆19A2、8B1、31A5和3C12)与表达在293细胞上的人、恒河猴或食蟹猴CRTh2，以及与不表达CRTh2的野生型293细胞的反应性。所使用的一抗浓度为20ug/ml(黑色线)、2ug/ml(灰色线)和0.2ug/ml(浅灰色线)。图3B通过流式细胞术显示与同种型对照Ab(着色直方图)比较的小鼠抗CRTh2抗体(以mIgG2a克隆的19A2和8B1)与表达在300.19细胞上的人、恒河猴或食蟹猴氨基端flag标记CRTh2，以及与不表达CRTh2的野生型300.19细胞的反应性。所使用的一抗浓度为1ug/ml(人、食蟹猴；黑色线)或5ug/ml(恒河猴、野生型；黑色线)和0.5ug/ml(恒河猴、野生型；灰色线)。抗FlagAb按0.7ug/ml使用。图3C通过流式细胞术显示小鼠抗人CRTh2抗体(19A2、8B1、31A5、3C12)与人PBMC上的嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞的反应性。用5ug/ml(黑色线)、0.5ug/ml(灰色线)的抗CRTh2抗体或用5ug/ml(浅灰色线)、0.5ug/ml(着色直方图)的同种型对照Ab然后用荧光标记的第二抗小鼠IgG、抗CD16、抗HLADR和抗CD123孵育PBMC。图3D和图3E显示人源化h19A2.v1和改造的人源化h19A2.v12抗CRTh2抗体与分别表达在293细胞(图3D)或300.19细胞(图3E)上的氨基端gD标记或flag标记的人、恒河猴或食蟹猴CRTh2的反应性，与各自的不表达CRTh2的野生型293或300.19细胞相比较。所使用的第一抗CRTh2Ab浓度为：10ug/ml(黑色线)、1ug/ml(灰色线)和0.1ug/ml(浅灰色线)；同种型对照Ab(2H7，着色直方图)按10ug/ml使用，抗gD抗体按2ug/ml使用，抗FlagAb按0.7ug/ml使用。图3F显示10ug/ml的抗CRTh2抗体h19A2.v1和h19A2.v12(黑色线)与原代人、食蟹猴和恒河猴嗜碱性粒细胞，以及与来自外周血的原代人嗜酸性粒细胞的FACS结合，与同种型对照Ab(着色直方图)相比较。
图4A-B显示抗CRTh2抗体(mIgG或hFab)与293细胞或300.19细胞上表面表达的CRTh2的结合亲和力的Scatchard分析。图4A显示小鼠抗CRTh2全抗体19A2和8B1与所示表达在293细胞或300.19细胞上的人CRTh2的放射性配体细胞结合测定。图4B显示人源化h19A2.v12或h19A2.v60Fab片段与表达在293细胞上的人或食蟹猴CRTh2的放射性配体细胞结合测定。图中显示抗CRTh2Ab的解离常数(KD)。结合抗体/总抗体指结合的125I标记抗体和总抗体的浓度比；总抗体指125I标记抗体和未标记抗体的浓度。
图5显示抗CRTh2抗体8B1和3C12阻止PGD2诱导的钙动员(calciummobilization)。在抗CRTh2或同种型对照抗体存在下通过流式细胞术监测来自体外极化的Th2细胞的Th2细胞亚型(CD4+CCR4+CCR6-CXCR3-)响应PGD2刺激的钙流动。包括CRTh2受体拮抗剂CAY10471作为阳性对照。
图6A-B显示人CRTh2BAC转基因小鼠的设计和表征。图6A显示引入C57BL/6小鼠来产生hCRTh2BAC转基因小鼠的包含染色体11上的人CRTh2基因的171kb基因组区。图6B通过流式细胞术显示hCRTh2.Bac.Tg品系85中的血液嗜碱性粒细胞(CD123+FceRI+)、血液嗜酸性粒细胞(CCR3+)、腹膜肥大细胞(FceRI+CD117+)、腘(popiteal)淋巴结CD4+CD44hiT细胞(由Th2极化剂木瓜蛋白酶诱导)和肠系膜淋巴结先天2型T辅助细胞(通过流体动力学尾静脉注射小鼠IL-17E质粒加强的Lin-CD117+)上的人CRTh2表达(抗体BM16)。为了比较，显示人细胞上的人CRTh2表达的流式细胞术分析。染色来自PBMC的嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和IT2细胞、来自人骨髓衍生肥大细胞的肥大细胞，在Th2极化条件下从分离自人PBMC的CD4+T细胞分化的Th2细胞(CCR4+CXCR3-)。
图7A-B显示抗CRTh2抗体在人CRTh2.Bac.Tg小鼠中体内排除血液嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞。在第-4天(图7A)或用抗CRTh2Ab(所示19A2、3C12或8B1)处理前4小时(图7B)通过流式细胞术从血液测定CRTh2+嗜碱性粒细胞(CD123+FceRI+)和嗜酸性粒细胞(CCR3+)的基线数目。按静脉内200ug/小鼠(图7A)或静脉内150ug/小鼠(图7B)用抗CRTh2或同种型对照抗体处理人CRTh2.Bac.Tg小鼠。按所示在第3天、第6天或第7天通过流式细胞术评估血液嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞排除。图7B中显示与抗豚草同种型对照抗体相比较的抗CRTh2的百分比排除。
图8A-B显示抗CRTh2抗体19A2处理在hCRTh2.Bac.Tg小鼠中的TNP-OVA诱发慢性哮喘模型中排除先天免疫细胞并减少Th2支气管肺泡灌洗(BAL)细胞因子产生。图8A显示通过流式细胞术在肺组织中及通过分类细胞计数组合流式细胞术在BAL中评估的嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞数目(图8A)。图中显示与抗豚草同种型对照抗体相比较的抗CRTh2的百分比排除。图8B显示通过ELISA测定的BAL中的IL-4和IL-13的浓度。图中显示与同种型对照抗体相比较的抗CRTh2处理的百分比减少。
图9A-B显示抗CRTh2抗体19A2排除SCID小鼠中的产生人IL-4的Th2细胞或人CRTh2.Bac.Tg小鼠中的先天2型辅助(IT2)细胞。图9A：将体外极化的来自PBMC的人Th2细胞转入SCID小鼠，并通过在无岩藻糖基化的抗CRTh219A2抗体或同种型对照抗体的存在下注射rhIL-4加抗IFN-g和抗IL-12mAb来进一步在体内极化7天。7天后，测定产生IL-4或IFN-g的CD4T细胞的百分比。为此，收集脾细胞，并用PdBu(50ng/mL)和离子霉素(500ng/mL)离体刺激4.5小时，在刺激的最后3小时期间加入布雷菲德菌素A(BFA)。用抗hCD4表面染色细胞，并用抗mCD45、抗mTer119和抗hCD19染色谱系细胞；固定细胞，并用抗hIFNg和抗hIL-4染色，以检测细胞因子阳性细胞。图9B：用50ug小鼠IL-17E编码质粒然后用抗CRTh2或同种型对照抗体注射人CRTh2.Bac.Tg小鼠。在处理后第3天，通过流式细胞术测定肠系膜淋巴结中IT2细胞的百分比和总数。图中显示与抗豚草同种型对照抗体相比较的抗CRTh2的百分比排除。
图10显示鼠抗CRTh2抗体19A2的轻链(SEQIDNO:49)和重链(SEQIDNO:61)可变区的氨基酸序列。提供重链和轻链的KabatCDR、ChothiaCDR和ContactCDR序列。
图11A-B显示衍生自抗体19A2的人源化抗CRTh2抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列比对。图11A显示轻链可变区序列比对。提供每种抗体的轻链KabatCDR、ChothiaCDR和ContactCDR序列(hu19A2.v1(SEQIDNO:38)、hu19A2.v12(SEQIDNO:39)、hu19A2.v46(SEQIDNO:39)、hu19A2.v52(SEQIDNO:40)、hu19A2.v58(SEQIDNO:42)、hu19A2.v60(SEQIDNO:41)、hu19A2.v61(SEQIDNO:42)、hu19A2.v62(SEQIDNO:41)、hu19A2.v63(SEQIDNO:43)、hu19A2.v64(SEQIDNO:42)、hu19A2.v65(SEQIDNO:43)、hu19A2.v66(SEQIDNO:44)、hu19A2.v67(SEQIDNO:45)、hu19A2.v68(SEQIDNO:44)、hu19A2.v69(SEQIDNO:45)、hu19A2.v70(SEQIDNO:46)、hu19A2.v71(SEQIDNO:47)、hu19A2.v72(SEQIDNO:48)).图11B显示重链可变区序列比对。提供每种抗体的重链KabatCDR、ChothiaCDR和ContactCDR序列(hu19A2.v1(SEQIDNO:54)、hu19A2.v12(SEQIDNO:55)、hu19A2.v46(SEQIDNO:57)、hu19A2.v52(SEQIDNO:57)、hu19A2.v58(SEQIDNO:57)、hu19A2.v60(SEQIDNO:57)、hu19A2.v61(SEQIDNO:55)、hu19A2.v62(SEQIDNO:55)、hu19A2.v63(SEQIDNO:55)、hu19A2.v64(SEQIDNO:60)、hu19A2.v65(SEQIDNO:60)、hu19A2.v66(SEQIDNO:55)、hu19A2.v67(SEQIDNO:55)、hu19A2.v68(SEQIDNO:60)、hu19A2.v69(SEQIDNO:60)、hu19A2.v70(SEQIDNO:54)、hu19A2.v71(SEQIDNO:54)、hu19A2.v72(SEQIDNO:54))。
图12显示鼠抗CRTh2抗体8B1和3C12及人源化抗CRTh2hu8B1.v1的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列比对(mu8B1-轻链可变区(SEQIDNO:50)、mu8B1-重链可变区(SEQIDNO:62)；mu3C12-轻链可变区(SEQIDNO:51)、mu3C12-重链可变区(SEQIDNO:63)；hu8B1.v1-轻链可变区(SEQIDNO:52)、hu8B1.v1-重链可变区(SEQIDNO:64))。提供每种抗体的轻链和重链KabatCDR、ChothiaCDR和ContactCDR序列。
图13显示鼠抗CRTh2抗体31A5的氨基酸序列。提供抗体31A5的轻链和重链KabatCDR、ChothiaCDR和ContactCDR序列(mu31A5-轻链可变序列(SEQIDNO:53)、mu31A5-重链可变序列(SEQIDNO:65))。
图14显示人源化抗CRTh2抗体hu19A2.v1和hu19A2.v52的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列比对。图14A显示轻链可变区序列比对(hu19A2.v1-轻链可变区(SEQIDNO:38)；hu19A2.v52-轻链可变区(SEQIDNO:40))。提供每种抗体的轻链KabatCDR、ChothiaCDR和ContactCDR序列。图14B显示重链可变区序列比对(hu19A2.v1-重链可变区(SEQIDNO:54)；hu19A2.v52-重链可变区(SEQIDNO:57))。提供每种抗体的重链KabatCDR、ChothiaCDR和ContactCDR序列。
图15A-C通过流式细胞术显示人源化抗CRTh2抗体和人源化亲和力成熟的抗CRTh2抗体与表达在细胞系上的CRTh2或与原代嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞的反应性。图15A通过流式细胞术显示与对照Ab(1ug/ml，着色直方图)相比较的1ug/ml(黑色线)和0.1ug/ml(灰色线)的19A2人源化抗CRTh2抗体(h19A2.v1)和人源化亲和力成熟(h19A2.v46、h19A2.v52)的抗CRTh2抗体与表达在293细胞上的人CRTh2，以及与不表达CRTh2的野生型293细胞的反应性。图15B通过流式细胞术显示与对照Ab(0.55ug/ml，着色直方图)相比较的人源化和人源化亲和力成熟的19A2抗CRTh2抗体(h19A2.v1、h19A2.v12、h19A2.v46、h19A2.v52)与表达在293细胞上的人、食蟹猴或恒河猴CRTh2，以及与不表达CRTh2的野生型293细胞的反应性。所使用的一抗浓度为0.55ug/ml(黑色线)、0.18ug/ml(非常深的灰色线)、0.06ug/ml(深灰色线)、0.02ug/ml(灰色线)和0.006ug/ml(浅灰色线)。图15C通过流式细胞术显示人源化亲和力成熟的抗人CRTh2抗体h19A2.v52与人、食蟹猴或恒河猴PBMC上的嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞的反应性。按材料和方法中所述用15ug/ml(黑色线)、5ug/ml(非常深的灰色线)、1.7ug/ml(深灰色线)、0.6ug/ml(灰色线)或0.2ug/ml(浅灰色线)的荧光标记抗CRTh2抗体或用15ug/ml的同种型对照Ab(着色直方图)与谱系特异性抗体组合孵育PBMC来检测嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞。
图16显示抗CRTh2抗体(Fab片段)与293细胞上表面表达的CRTh2的结合亲和力的Scatchard分析。图16A-B显示人源化h19A2.v52Fab片段与表达在293细胞上的人或食蟹猴CRTh2的同源竞争放射性配体细胞结合测定。图16C-D显示人源化h19A2.v46Fab片段与表达在293细胞上的人或食蟹猴CRTh2的同源竞争放射性配体细胞结合测定。图中显示抗CRTh2Ab的解离常数(KD)。结合抗体/总抗体指结合的125I标记抗体和每次测定中使用的总125I标记抗体的浓度比。
图17A-B显示抗CRTh2抗体对表达人CRTh2的293细胞中毛喉素诱导的cAMP水平的PGD2介导的抑制的影响，或抗CRTh2抗体对表达人CRTh2的293细胞中毛喉素诱导的cAMP水平的影响。图17A显示抗CRTh2抗体h19A2.v52未影响表达人CRTh2的293细胞中毛喉素诱导的cAMP水平的PGD2介导的抑制。相反，人源化h8B1抗体以剂量依赖性方式阻断毛喉素诱导的cAMP水平的PGD2介导的抑制。图17B显示抗CRTh2抗体h8B1和h19A2.v52未在缺乏PGD2的情况下影响表达人CRTh2的293细胞中毛喉素诱导的cAMP水平。相反，配体PGD2以剂量依赖性方式降低毛喉素诱导的cAMP水平。
图18A-C显示鼠抗CRTh2抗体19A2(mIgG2a)在人CRTh2.Bac.Tg小鼠中体内排除血液、脾和骨髓中的嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞。按所示在用抗CRTh2Ab19A2处理前的第-7天(图18A和图18B)通过流式细胞术从血液测定CRTh2+嗜碱性粒细胞(CD123+FceRI+)和嗜酸性粒细胞(CCR3+)的基线数目。按静脉内20ug/小鼠或100ug/小鼠用抗CRTh2或同种型对照抗体处理人CRTh2.Bac.Tg小鼠。按所示通过流式细胞术在第3天和第7天在血液中(图18A和图18B)或在第7天在脾和骨髓(BM)中(图18C)评估嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞排除。符号代表来自单只小鼠的数据。
图19A-C显示单个剂量的人源化抗CRTh2抗体h19A2.v52(hIgG1)后，人CRTh2.Bac.Tg小鼠中的血液、脾和骨髓中的嗜碱性粒细胞或嗜酸性粒细胞排除的剂量反应和持续时间。在第-3天通过流式细胞术从血液测定CRTh2+嗜酸性粒细胞(CCR3+)的基线数目(图19A)。按静脉内10ug/小鼠或200ug/小鼠用抗CRTh2或同种型对照抗体处理人CRTh2.Bac.Tg小鼠。按所示通过流式细胞术在第2天、第7天和第14天在血液(图19A)、脾(图19B)和骨髓(BM)(图19C)中评估嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞排除。符号代表来自单只小鼠的数据。
图20A-B显示，在hCRTh2.Bac.Tg小鼠中的TNP-OVA诱发慢性哮喘模型中，在先天免疫细胞排除及Th2BAL细胞因子产生的减少上，具有效应子功能的排除性抗CRTh219A2mIgG2a抗体比非排除性抗CRTh219A2mIgG2a_DANAFc突变体抗体更有效。图20A显示通过流式细胞术在肺组织中及通过分类细胞计数组合流式细胞术在BAL中评估的嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞数目(图20A)。图中显示与抗豚草同种型对照抗体相比较的抗CRTh219A2mIgG2a抗体和Fc突变体19A2mIgG2a_DANA抗体的百分比排除。图20B显示通过ELISA测定的BAL中的IL-4的浓度。图中显示与抗豚草同种型对照抗体相比较的抗CRTh219A2mIgG2a抗体和Fc突变体19A2mIgG2a_DANA抗体的百分比减少。
发明详述
I.定义
用于本文目的的“受体人构架”是包含衍生自下文定义的人免疫球蛋白构架或人共有构架的轻链可变结构域(VL)构架或重链可变结构域(VH)构架的氨基酸序列的构架。“衍生自”人免疫球蛋白构架或人共有构架的受体人构架可以包含其相同氨基酸序列，或者它可以包含氨基酸序列改变。在一些实施方案中，氨基酸改变的数目为10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。在一些实施方案中，VL受体人构架在序列上与VL人免疫球蛋白构架序列或人共有构架序列相同。
“亲和力”指分子(例如抗体)的单个结合部位与其结合配偶体(例如抗原)之间非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，本文所用的“结合亲和力”指内在的结合亲和力，其反映结合对(例如抗体和抗原)的成员之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可通过解离常数(Kd)来表示。亲和力可以通过本领域公知的方法来测量，包括本文中所述的那些。用于测量结合亲和力的具体的说明性和示例性实施方案在下文中描述。
“亲和力成熟的”抗体指与不具有这类改变的亲本抗体相比在一个或多个高变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体，这类改变导致抗体对抗原的亲和力的改善。
除非另有说明，本文所用的术语“CRTh2”指来自任意哺乳动物如灵长类(例如人、恒河猴、食蟹猴CRTh2)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任意天然CRTh2。该术语涵盖“全长”、未加工的CRTh2，以及产生于细胞内加工的任意形式的CRTh2。该术语还涵盖天然存在的CRTh2变体，例如剪接变体或等位变体。SEQIDNO：84中显示示例性人CRTh2的氨基酸序列。SEQIDNO：85中显示示例性恒河猴CRTh2的氨基酸序列。SEQIDNO：86中显示示例性食蟹猴CRTh2的氨基酸序列。参见例如L.Cosmi等，Eur.J.Immunol.30(10)：2972-9(2000)；K.Nagat等，FEBSLett.459(2)：195-9(1999)；及K.Nagata等，J.Immunol.162(3)：1278-86(1999)。
人CRTh2序列(SEQIDNO：84)
MSANATLKPLCPILEQMSRLQSHSNTSIRYIDHAAVLLHGLASLLGLVENGVILFVVGCRMRQTVVTTWVLHLALSDLLASASLPFFTYFLAVGHSWELGTTFCKLHSSIFFLNMFASGFLLSAISLDRCLQVVRPVWAQNHRTVAAAHKVCLVLWALAVLNTVPYFVFRDTISRLDGRIMCYYNVLLLNPGPDRDATCNSRQAALAVSKFLLAFLVPLAIIASSHAAVSLRLQHRGRRRPGRFVRLVAAVVAAFALCWGPYHVFSLLEARAHANPGLRPLVWRGLPFVTSLAFFNSVANPVLYVLTCPDMLRKLRRSLRTVLESVLVDDSELGGAGSSRRRRTSSTARSASPLALCSRPEEPRGPARLLGWLLGSCAASPQTGPLNRALSSTSS
恒河猴CRTh2序列(NCBI参考号XM_001084746)(SEQIDNO：85)
MSANATLKPLCPILEEMSHLRSHSNTSIRYIDHATVLLHGLASLLGLVENGVILFVVGCRMRQTVVTTWVLHLALSDLLASASLPFFTYFLAVGHSWELGTTFCKLHSSIFFLNMFASGFLLSAISLDRCLQVVWPVWAQNHRTVAAAHKVCLVLWALAVLNTVPYFVFRDTISRLDGRIMCYYNVLLLNPGPDRDATCNSRQAALAVSKFLLAFLVPLAIIASSHAAVSLRLQHRGRRRPGRFVRLVAAVVAAFALCWGPYHVFSLLEARAHANPGLRPLVWRGLPFVTSLAFFNSVANPVLYVLTCPDMLRKLRRSLRTVLESVLVDDSELGGAGSSRRRRRTPSTARSASSLALSSRPEERRGPARLFGWLLGGCAASPQRGPLNRALSSTSS
食蟹猴CRTh2序列(SEQIDNO：86)
MSANATLKPLCPILEEMSHLRSHSNTSIRYIDHATVLLHGLASLLGLVENGVILFVVGCRMRQTVVTTWVLHLALSDLLASASLPFFTYFLAVGHSWELGTTFCKLHSSIFFLNMFASGFLLSAISLDRCLQVVWPVWAQNHRTVAAAHKVCLVLWALAVLNTVPYFVFRDTISRLDGRIMCYYNVLLLNPGSDRDATCNSRQAALAVSKFLLAFLVPLAIIASSHAAVSLRLQHRGRRRPGRFVRLVAAVVAAFALCWGPYHVFSLLEARAHANRGLRPLVWRGLPFVTSLAFFNSVANPVLYVLTCPDMLRKLRRSLRTVLESVLVDDSELGGAGSSRRRRRTPSTARSASSLALSSHPEERRGPARLFGWLLGGCAASPQRGPLNRALSSTSS
术语“抗CRTh2抗体”和“结合CRTh2的抗体”指这样的抗体，其能够以足够的亲和力结合CRTh2，使得该抗体可以在靶向CRTh2中用作诊断剂和/或治疗剂。在一个实施方案中，如例如通过放射免疫测定(RIA)测量，抗CRTh2抗体与不相关的非CRTh2蛋白结合的程度小于该抗体与CRTh2的结合的约10％。在某些实施方案中，结合CRTh2的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如从10-8M至10-13M，例如从10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗CRTh2抗体结合在来自不同物种的CRTh2间保守的CRTh2表位。
术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用并涵盖多种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示希望的抗原结合活性。
“抗体片段”指除完整抗体以外的包含完整抗体的部分的分子，其结合该完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；及从抗体片段形成的多特异性抗体。
与参考抗体“结合相同表位的抗体”指在竞争测定中将参考抗体与其抗原的结合阻断50％或更多的抗体，相反，参考抗体在竞争测定中将抗体与其抗原的结合阻断50％或更多。本文提供示例性竞争测定。
术语“嵌合”抗体指这样的抗体，其中部分重链和/或轻链衍生自特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分衍生自不同的来源或物种。
抗体的“种类”指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在5个主要的抗体种类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些种类中的几种可以进一步划分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同种类的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
本文所用的术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂或化疗药物(例如氨甲喋呤、阿霉素、长春花生物碱(长春花新碱(vincristine)、长春灭瘟碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、苯丙氨酸氮芥(melphalan)、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，如核溶解酶；抗生素；毒素，如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体；及下文公开的多种抗肿瘤剂或抗癌剂。
“效应子功能”指可归因于抗体的Fc区且随抗体同种型而变的那些生物学活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和依赖补体的细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；依赖抗体的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；及B细胞激活。
本文的术语“Fc区”用来定义免疫球蛋白重链的C端区域，其包含至少部分恒定区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。但是，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文另有说明，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号按照Kabat等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD,1991中所述的EU编号系统，也称为EU指数。
“构架”或“FR”指高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR一般由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列一般按以下顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，指具有基本上类似于天然抗体结构的结构或具有包含本文所定义的Fc区的重链的抗体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，指已将外源核酸引入其中的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括最初转化的细胞及从其衍生的后代，而不考虑传代数。后代的核酸含量可以并非与亲本细胞完全相同，而是可以包含突变。本文包括具有与在最初转化的细胞中筛选或选择的功能或生物学活性相同的功能和生物学活性的突变体后代。
“人抗体”是具有这样的氨基酸序列的抗体，该氨基酸序列对应于由人或人细胞产生或衍生自利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列。人抗体的此定义明确排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有构架”是代表人免疫球蛋白VL或VH构架序列的选择中最常出现的氨基酸残基的构架。通常，该人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列亚组。通常，该序列亚组是Kabat等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,NIHPublication91-3242,BethesdaMD(1991),1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，该亚组是Kabat等,上文中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，该亚组是Kabat等,上文中的亚组III。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一个且通常为两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部HVR(例如CDR)对应于非人抗体的那些，而全部或基本上全部FR对应于人抗体的那些。人源化抗体可以可选地包含源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”指已进行了人源化的抗体。
本文所用的术语“高变区”或“HVR”指抗体可变结构域的在序列上高变和/或形成结构确定的环(“高变环”)的区域中的每一个。通常，天然四链抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR一般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高的序列变异性和/或涉及抗原识别。本文所用的HVR区包含定位在24-36(对于L1)、46-56(对于L2)、89-97(对于L3)、26-35B(对于H1)、47-65(对于H2)和93-102(对于H3)位内的任意数目的残基。因此，HVR包含之前所述位置中的残基：
A)24-34(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；
B)L1的24-34、L2的50-56、L3的89-97、H1的31-35B、H2的50-65和H3的95-102(Kabat等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)；
C)30-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35(H1)、47-58(H2)、93-100a-j(H3)(MacCallum等J.Mol.Biol.262:732-745(1996)。
除VH中的CDR1外，CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”，其是接触抗原的残基。SDR包含在CDR的称为缩短的CDR或a-CDR的区域内。示例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2和a-CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基31-34、L2的氨基酸残基50-55、L3的氨基酸残基89-96、H1的氨基酸残基31-35B、H2的氨基酸残基50-58和H3的氨基酸残基95-102处(参见Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))。除非另有说明，本文按照Kabat等,上文编号可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如FR残基)。
“免疫缀合物”是与一种或多种异源分子(包括但不限于细胞毒剂)缀合的抗体。
“个体(individual)”或“对象(subject)”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于饲养的动物(例如牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类(例如人类和非人灵长类，如猴)、兔和啮齿类(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，该个体或对象是人。
“分离的”抗体是已从其天然环境的成分分开的抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至通过例如电泳(例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如离子交换或反相HPLC)测定的纯度大于95％或99％。用于评估抗体纯度的方法的综述参见例如Flatman等,J.Chromatogr.B848:79-87(2007)。
“分离的”核酸指已从其天然环境的成分分开的核酸分子。分离的核酸包括包含在通常含有该核酸分子的细胞中的核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或不同于其天然染色体位置的染色体位置上。
“分离的编码抗CRTh2的核酸”指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一个或多个核酸分子，包括单个载体或分开的载体中的这种(类)核酸分子，及存在于宿主细胞中的一个或多个位置上的这种(类)核酸分子。
本文所用的术语“单克隆抗体”指获自基本上同质的抗体群体的抗体，即除了例如包含天然存在的突变或在产生单克隆抗体制剂期间出现的可能的变体抗体(这类变体通常以较小的量存在)外，包含该群体的单种抗体相同和/或结合相同的表位。与通常包含抗不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体抗抗原上的单个决定簇。因此，修饰词“单克隆”指抗体获自基本上同质的抗体群体的特征，而不解释为需要通过任意具体的方法来产生该抗体。例如，将要按照本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术来制备，其包括但不限于杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体展示法和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文描述用于制备单克隆抗体的这类方法和其他示例性方法。
“裸抗体”指未与异源部分(例如细胞毒性部分)或放射性标记缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。
“天然抗体”指天然存在的具有不同结构的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是由形成二硫键的两条相同的轻链和两条相同的重链组成的约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白。从N端至C端，每条重链具有可变区(VH)，也称为可变重链结构域或重链可变结构域，随后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N端至C端，每条轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，随后是恒定轻链(CL)结构域。根据其恒定结构域的氨基酸序列，可以将抗体的轻链分配至两个类型之一，称为κ和λ。
术语“包装说明书”用来指通常包含在治疗性产品的商业包装中的说明书，其包含关于适应症、用法、剂量、施用、联合治疗、禁忌症的信息和/或有关这类治疗性产品的用途的警告的信息。
就参考多肽序列而言的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在比对序列并在必要时引入缺口来达到最大百分比序列同一性，而不将任意保守取代视为序列同一性的部分之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。可以以本领域技术之内的多种方式来达到以测定百分比氨基酸序列同一性为目的的比对，例如，使用公开可得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长内达到最大比对所需的任意算法。但是，为了本文的目的，用序列比较计算机程序ALIGN-2来产生％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.编写，源代码已随用户文件提交美国版权办公室,WashingtonD.C.,20559，它在美国版权办公室注册在美国版权注册号TXU510087之下。ALIGN-2程序从Genentech,Inc.,SouthSanFrancisco,California公开可得，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应编译用在UNIX操作系统上，包括数字UNIXV4.0D。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变动。
在利用ALIGN-2来进行氨基酸序列比较的情况下，按以下计算给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(其可以备选地叙述为，具有或包含与给定氨基酸序列B的某％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)：100乘以分数X/Y，其中X是在该程序的A和B的比对中通过序列比对程序ALIGN-2评分为相同的匹配的氨基酸残基的数目，且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。应理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A与B的％氨基酸序列同一性将不等于B与A的％氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值都是用ALIGN-2计算机程序按前一段落中所述获得。
术语“药物制剂”指这样的制备物，其处于这样的形式，使得包含在其中的活性成分的生物学活性有效，且不包含对将要施用该制剂的个体具有不可接受的毒性的附加成分。
“可药用载体”指药物制剂中除活性成分外的成分，其对个体无毒性。可药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
本文所用的术语“处理”指设计用于改变所处理的个体或细胞在临床病理过程中的自然过程的临床干预。希望得到的处理作用包括减慢疾病进展速率、改善或缓和疾病状态及缓解或改善的预后。在一些实施方案中，该处理改善哮喘控制、减少哮喘恶化、改善肺功能和/或改善患者报告的症状。例如，如果与该障碍相关的一种或多种症状缓和或消除，则个体得到成功“处理”。
本文所用的“与…结合”指施用除另一种治疗方式外的一种治疗方式。因此，“与…结合”指在对个体施用其他治疗方式之前、期间或之后施用一种治疗方式。
本文所用的术语“预防”包括在个体中就疾病的发生或复发提供预防。个体可以易患障碍、对障碍敏感或处于发展障碍的风险，但尚未诊断罹患该障碍。在一些实施方案中，用本文所述的抗CRTh2抗体来延迟该障碍的发展。在一些实施方案中，本文所述的抗CRTh2抗体预防哮喘恶化和/或肺功能下降或哮喘状态。
如本文所使用，在本文所述的处理方法之前，“处于发展障碍的风险”的个体可以具有或不具有可检测到的疾病或疾病症状，且可以已显示或未显示可检测到的疾病或疾病症状。“处于…风险”指个体具有本领域已知的一个或多个风险因子，该风险因子是与该障碍的发展相关的可测量的参数。具有一个或多个这些风险因子的个体比不具有一个或多个这些风险因子的个体具有更高的发展该障碍的概率。
“有效量”指至少对在必要的剂量和时期下达到希望的或所示的效应(包括治疗或预防结果)有效的量。有效量可以在一次或多次施用中提供。
“治疗有效量”至少是实现具体障碍的可测量的改善所需的最小浓度。本文的治疗有效量可以根据诸如疾病状态、年龄、性别、患者体重和抗体在个体中引出希望的反应的能力的因素而变。治疗有效量还是这样的量，其中治疗有益作用超过了抗体的任意毒性作用或有害作用。“预防有效量”指对在必要的剂量和时期下达到希望的预防结果有效的量。通常但并非必然，由于在疾病之前或在疾病的更早阶段将预防性剂量用于个体，预防有效量可以小于治疗有效量。
术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链的涉及该抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个高变区(HVR)(参见例如Kindt等KubyImmunology,第6版,W.H.FreemanandCo.,第91页(2007))。单个VH或VL结构域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域筛选互补的VL或VH结构域的文库来分离结合特定抗原的抗体。参见例如Portolano等,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等,Nature352:624-628(1991)。
本文所用的术语“载体”指能够繁殖与它连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自主复制核酸结构的载体，以及掺入它所引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与它们有效连接的核酸的表达。这类载体在本文中称为“表达载体”。
“依赖抗体的细胞毒性”或“ADCC”指这样的细胞毒性形式，其中分泌的Ig结合至存在于某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上的Fc受体(FcR)上，使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合具有抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶细胞。抗体“武装”细胞毒性细胞，且为通过此机制杀死靶细胞所需。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的Fc表达总结在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)的第464页上的表3中。为了评估目的分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，如描述于美国专利号5,500,362或5,821,337中的体外ADCC测定。用于这类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地，或此外，可以在体内，例如在诸如公开于Clynes等,PNASUSA95:652-656(1998)652-656中的动物模型的动物模型中评估目的分子的ADCC活性。
“依赖补体的细胞毒性”或“CDC”指在补体的存在下裂解靶细胞。经典补体途径的激活由补体系统的第一成分(C1q)与结合于其关联抗原的(适当亚类的)抗体的结合起始。为了评估补体激活，可以进行例如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods202:163(1996)中所述的CDC测定。
术语“哮喘”指表征为可变和复发的症状、可逆的气流阻塞(例如通过支气管扩张剂)及可以与潜在炎症相关或不相关的支气管高反应性的复杂障碍。哮喘的实例包括阿司匹林敏感性/恶化哮喘、特应性哮喘、严重哮喘、轻度哮喘、中度至严重哮喘、首次使用糖皮质激素的哮喘、慢性哮喘、糖皮质激素抗性哮喘、糖皮质激素难治性哮喘、新诊断且未经治疗的哮喘、吸烟引起的哮喘、未受糖皮质激素控制的哮喘及JAllergyClinImmunol(2010)126(5):926-938中提到的其他哮喘。哮喘的症状包括呼吸短促、咳嗽(痰产生和/或痰质量和/或咳嗽频率的变化)、喘鸣、胸闷、支气管狭窄及归因于以上症状之一的夜间觉醒或这些症状的组合(Juniper等(2000)Am.J.Respir.Crit.CareMed.,162(4),1330-1334.)。
术语“轻度哮喘”指患者通常经历每周不到两次的症状或恶化，每个月不到两次的夜间症状，且在恶化之间无症状。轻度间歇性哮喘通常根据需要用以下治疗：吸入型支气管扩展剂(短效吸入型β2-激动剂)；避开已知的触发物；每年流感接种；每6至10年肺炎球菌接种；在一些情况下，在暴露于已鉴定的触发物之前使用吸入型β2-激动剂、色甘酸钠(cromolyn)或奈多罗米(nedocromil)。如果患者对短效β2-激动剂具有不断增加的需要(例如，由于急性恶化而在1天中使用短效β2-激动剂超过3至4次，或由于症状而在一个月中使用超过一盒)，则患者可以需要治疗升级。
术语“中度哮喘”通常指这样的哮喘，其中患者经历每周超过两次的恶化，且该恶化影响睡眠和活动；患者每个月超过两次由于哮喘而夜间觉醒；患者具有每天或每隔一天需要短效吸入型β2-激动剂的慢性哮喘症状；患者处理前基线呼气流量峰值(PEF)或1秒钟用力呼气量(FEV1)为60％至80％预期，PEF变异性为20％至30％。
术语“严重哮喘”通常指这样的哮喘，其中患者具有几乎持续的症状、频繁恶化、由于哮喘而频繁夜间觉醒、活动受限、PEF或FEV1基线小于60％预期、及20％至30％的PEF变异性。
术语“FEV1”指在用力呼气的第一秒内呼出的空气体积。它是气流阻塞的测量。FEV1可以以其他相似的方式(例如FEVs)记录，应理解，所有这类相似的变通形式具有相同的含义。
术语“糖皮质激素”包括糖皮质素和盐皮质素。例如，糖皮质激素包括但不限于氟地松(fluticasone)(包括丙酸氟地松(fluticasonepropionate(FP)))、倍氯米松(beclometasone)、布地奈德(budesonide)、环索奈德(ciclesonide)、莫米松(mometasone)、氟尼缩松(flunisolide)、倍他米松(betamethasone)、氢化可的松(hydrocortisone)、泼尼松(prednisone)、泼尼松龙(prednisolone)、甲泼尼龙(methylprednisolone)和曲安西龙(triamcinolone)。“吸入型糖皮质激素”指适合用于通过吸入来递送的糖皮质激素。示例性吸入型糖皮质激素是氟地松、倍氯米松双丙酸酯(beclomethasonedipropionate)、budenoside、糠酸莫米松(mometasonefuroate)、环索奈德、氟尼缩松、醋酸曲安西龙(triamcinoloneacetonide)及目前可得或将来可得的任意其他糖皮质激素。
术语“细胞因子”是由一个细胞群体释放的作为胞间介质作用于另一个细胞的蛋白质的通称。这类细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子；白细胞介素(IL)，如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15，包括rIL-2；肿瘤坏死因子，如TNF-α或TNF-β；及其他多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。本文所用的术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质及天然序列细胞因子的生物活性等同物，包括合成产生的小分子实体及其可药用衍生物和盐。
除非文中另有明确说明，本文及所附权利要求中所用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代物。例如，提到“一种抗体”是提到一种至许多种抗体，如摩尔量，且包括本领域技术人员已知的其等同物，等等。
应理解，本文所述的本发明的方面和实施方案包括“包括该方面和实施方案”、“由该方面和实施方案组成”及“基本由该方面和实施方案组成”。
II.组合物和方法
在一方面，本文提供结合CRTh2的抗体。在某些实施方案中，在对个体(例如人个体)施用有效量时，该抗CRTh2结合人CRTh2并排除CRTh2表达细胞。在一些实施方案中，该抗CRTh2抗体还结合非人灵长类的CRTh2(例如恒河猴或食蟹猴CRTh2)。本发明的抗体用于例如诊断或治疗由CRTh2表达细胞介导的障碍。
示例性抗CRTh2抗体
在一方面，本发明提供分离的结合CRTh2的抗体。在某些实施方案中，抗CRTh2抗体具有一个或多个以下特征：(1)在对个体施用有效量时，结合CRTh2(例如人CRTh2)并排除CRTh2表达细胞(例如Th2细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和/或先天2型(IT2)细胞)；(2)已改造，以改善ADCC；(3)是无岩藻糖基化的或具有降低的岩藻糖基化；(4)竞争性抑制至少一种以下抗体与人CRTh2的结合：19A2、8B1、31A5、3C12和本文所述的任意人源化抗体；(5)结合与至少一种以下抗CRTh2抗体所结合的CRTh2表位相同或重叠的人CRTh2表位：19A2、8B1、31A5、3C12和本文所述的任意人源化抗体；(6)结合人和非人灵长类的CRTh2(例如恒河猴和/或食蟹猴CRTh2)；(7)阻断CRTh2信号发放；(8)阻止CRTh2表达细胞响应前列腺素D2的募集；(9)阻断CRTh2表达细胞中的Ca2+流动；(10)不显示激动活性；(11)不降低CRTh2表达细胞(例如表达人CRTh2的293细胞)中毛喉素诱导的cAMP水平；和(12)阻断CRTh2表达细胞(例如表达人CRTh2的293细胞)中毛喉素诱导的cAMP水平的前列腺素D2引起的抑制。
在另一方面，本发明提供分离的抗CRTh2抗体，其包含：(a)含有选自鼠抗体19A2、8B1、31A5和3C12及本文所述人源化抗体(例如hu8B1.v1、hu19A2.v1、v12、v38、v46、v47、v51-v53、v57、v58和v60-v72)中任一个的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的至少一个、两个或三个HVR的轻链可变区；和/或(b)含有选自鼠抗体19A2、8B1、3C12和31A5及本文所述人源化抗体(例如hu8B1.v1、hu19A2.v1、v12、v38、v46、v47、v51-v53、v57、v58和v60-v72)中任一个的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3的至少一个、两个或三个HVR的重链可变区。在一些实施方案中，该HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3包含图10、11A、11B、12、13和14中所示的KabatCDR、ChothiaCDR或ContactCDR序列。
在另一方面，本发明提供抗CRTh2抗体，其包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(i)含有SEQIDNO:22或23的氨基酸序列的HVR-L1；(2)含有SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L2；(iii)含有SEQIDNO:27的氨基酸序列的HVR-L3；(iv)含有SEQIDNO:29或30的氨基酸序列的HVR-H1；(v)含有SEQIDNO:32或33的氨基酸序列的HVR-H2；(vi)含有SEQIDNO:35或36的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一方面，本发明提供抗CRTh2抗体，其包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(i)含有SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L1；(2)含有SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-L2；(iii)含有SEQIDNO:28的氨基酸序列的HVR-L3；(iv)含有SEQIDNO:31的氨基酸序列的HVR-H1；(v)含有SEQIDNO:34的氨基酸序列的HVR-H2；(vi)含有SEQIDNO:37的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一方面，本发明提供抗CRTh2抗体，其包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(i)含有RASENIYXNLA(SEQIDNO:1)的氨基酸序列的HVR-L1，其中X是S、W或Y；(ii)含有AATQLAX(SEQIDNO:2)的氨基酸序列的HVR-L2，其中X是D、E或S；(iii)含有QHFWITPWT(SEQIDNO:3)的氨基酸序列的HVR-L3；(iv)含有X1YX2MS(SEQIDNO:4)的氨基酸序列的HVR-H1，其中X1是S或F，X2是S、L或K；(v)含有X1ISNGGSTTX2YPGTVEG(SEQIDNO:5)的氨基酸序列的HVR-H2，其中X1是Y或R，X2是Y或D；和(vi)含有HRTNWDFDY(SEQIDNO:6)的氨基酸序列的HVR-H3。
在一方面，本发明提供抗体，其包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VHHVR序列：(a)含有SEQIDNO:29或30的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQIDNO:32或33的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)含有SEQIDNO:35或36的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，该抗体包含含有SEQIDNO:35或36的氨基酸序列的HVR-H3。在另一实施方案中，该抗体包含含有SEQIDNO:35或36的氨基酸序列的HVR-H3及含有SEQIDNO:27的氨基酸序列的HVR-L3。在另一实施方案中，该抗体包含含有SEQIDNO:35或36的氨基酸序列的HVR-H3、含有SEQIDNO:27的氨基酸序列的HVR-L3、及含有SEQIDNO:32或33的氨基酸序列的HVR-H2。在另一实施方案中，该抗体包含：(a)含有SEQIDNO:29或30的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQIDNO:32或33的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)含有SEQIDNO:35或36的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一方面，本发明提供抗体，其包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VLHVR序列：(a)含有SEQIDNO:22或23的氨基酸序列的HVR-L1；(b)含有SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)含有SEQIDNO:27的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，该抗体包含：(a)含有SEQIDNO:22或23的氨基酸序列的HVR-L1；(b)含有SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)含有SEQIDNO:27的氨基酸序列的HVR-L3。
在一方面，本发明提供抗体，其包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VHHVR序列：(a)含有SEQIDNO:31的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQIDNO:34的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)含有SEQIDNO:37的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，该抗体包含含有SEQIDNO:37的氨基酸序列的HVR-H3。在另一实施方案中，该抗体包含含有SEQIDNO:37的氨基酸序列的HVR-H3及含有SEQIDNO:28的氨基酸序列的HVR-L3。在另一实施方案中，该抗体包含含有SEQIDNO:37的氨基酸序列的HVR-H3、含有SEQIDNO:28的氨基酸序列的HVR-L3、及含有SEQIDNO:34的氨基酸序列的HVR-H2。在另一实施方案中，该抗体包含：(a)含有SEQIDNO:31的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQIDNO:34的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)含有SEQIDNO:37的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一方面，本发明提供抗体，其包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VLHVR序列：(a)含有SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L1；(b)含有SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)含有SEQIDNO:28的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，该抗体包含：(a)含有SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L1；(b)含有SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)含有SEQIDNO:28的氨基酸序列的HVR-L3。
在一方面，本发明提供抗体，其包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VHHVR序列：(a)含有SEQIDNO:13、14、15、16或17的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQIDNO:18、19、20或21的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)含有SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，该抗体包含含有SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-H3。在另一实施方案中，该抗体包含含有SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-H3及含有SEQIDNO:3的氨基酸序列的HVR-L3。在另一实施方案中，该抗体包含含有SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-H3、含有SEQIDNO:3的氨基酸序列的HVR-L3、及含有SEQIDNO:18、19、20或21的氨基酸序列的HVR-H2。在另一实施方案中，该抗体包含：(a)含有SEQIDNO:13、14、15、16或17的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQIDNO:18、19、20或21的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)含有SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一方面，本发明提供抗体，其包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VLHVR序列：(a)含有SEQIDNO:7、8或9的氨基酸序列的HVR-L1；(b)含有SEQIDNO:10、11或12的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)含有SEQIDNO:3的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，该抗体包含：(a)含有SEQIDNO:7、8或9的氨基酸序列的HVR-L1；(b)含有SEQIDNO:10、11或12的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)含有SEQIDNO:3的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一方面，本发明的抗体包含：(a)含有选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VHHVR序列的VH结构域：(i)含有SEQIDNO:29或30的氨基酸序列的HVR-H1；(ii)含有SEQIDNO:32或33的氨基酸序列的HVR-H2；和(iii)含有SEQIDNO:35或36的氨基酸序列的HVR-H3；(b)含有选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VLHVR序列的VL结构域：(i)含有SEQIDNO:22或23的氨基酸序列的HVR-L1；(ii)含有SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L2；和(iii)含有SEQIDNO:27的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一方面，本发明提供抗体，其包含：(a)含有SEQIDNO:29或30的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQIDNO:32或33的氨基酸序列的HVR-H2；(c)含有SEQIDNO:35或36的氨基酸序列的HVR-H3；(d)含有SEQIDNO:22或23的氨基酸序列的HVR-L1；(e)含有SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)含有SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一方面，本发明的抗体包含：(a)含有选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VHHVR序列的VH结构域：(i)含有SEQIDNO:31的氨基酸序列的HVR-H1；(ii)含有SEQIDNO:34的氨基酸序列的HVR-H2；和(iii)含有SEQIDNO:37的氨基酸序列的HVR-H3；(b)含有选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VLHVR序列的VL结构域：(i)含有SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L1；(ii)含有SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-L2；和(iii)含有SEQIDNO:28的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一方面，本发明提供抗体，其包含：(a)含有SEQIDNO:31的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQIDNO:34的氨基酸序列的HVR-H2；(c)含有SEQIDNO:37的氨基酸序列的HVR-H3；(d)含有SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L1；(e)含有SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)含有SEQIDNO:28的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一方面，本发明的抗体包含：(a)含有选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VHHVR序列的VH结构域：(i)含有SEQIDNO:13、14、15、16或17的氨基酸序列的HVR-H1；(ii)含有SEQIDNO:18、19、20或21的氨基酸序列的HVR-H2；和(iii)含有SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-H3；(b)含有选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VLHVR序列的VL结构域：(i)含有SEQIDNO:7、8或9的氨基酸序列的HVR-L1；(ii)含有SEQIDNO:10、11或12的氨基酸序列的HVR-L2；和(iii)含有SEQIDNO:3的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一方面，本发明提供抗体，其包含：(a)含有SEQIDNO:13、14、15、16或17的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQIDNO:18、19、20或21的氨基酸序列的HVR-H2；(c)含有SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-H3；(d)含有SEQIDNO:7、8或9的氨基酸序列的HVR-L1；(e)含有SEQIDNO:10、11或12的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)含有SEQIDNO:3的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，该抗体包含：(a)含有SEQIDNO:13的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQIDNO:18的氨基酸序列的HVR-H2；(c)含有SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-H3；(d)含有SEQIDNO:7的氨基酸序列的HVR-L1；(e)含有SEQIDNO:10的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)含有SEQIDNO:3的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，该抗体包含：(a)含有SEQIDNO:13的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQIDNO:19的氨基酸序列的HVR-H2；(c)含有SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-H3；(d)含有SEQIDNO:8的氨基酸序列的HVR-L1；(e)含有SEQIDNO:10的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)含有SEQIDNO:3的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，该抗体包含：(a)含有SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQIDNO:20的氨基酸序列的HVR-H2；(c)含有SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-H3；(d)含有SEQIDNO:9的氨基酸序列的HVR-L1；(e)含有SEQIDNO:11的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)含有SEQIDNO:3的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，该抗体包含：(a)含有SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQIDNO:20的氨基酸序列的HVR-H2；(c)含有SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-H3；(d)含有SEQIDNO:9的氨基酸序列的HVR-L1；(e)含有SEQIDNO:10的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)含有SEQIDNO:3的氨基酸序列的HVR-L3。
在任意以上实施方案中，抗CRTh2抗体是分离的抗体。在任意以上实施方案中，抗CRTh2抗体是人源化抗体。在一个实施方案中，抗CRTh2抗体包含任意以上实施方案中的HVR及图10、11、12、13和14中所示的HVR(包括含有KabatCDR、ChothiaCDR或ContactCDR序列的HVR)，且进一步包含受体人构架，例如人免疫球蛋白构架或人共有构架。在另一实施方案中，抗CRTh2抗体包含任意以上实施方案中的HVR，且进一步包含含有图11A、12和14A中所示的FR(例如FR1、FR2、FR3或FR4)序列的VL。在另一实施方案中，抗CRTh2抗体包含任意以上实施方案中的HVR及图10、11、12、13和14中所示的HVR(包括含有KabatCDR、ChothiaCDR或ContactCDR序列的HVR)，且进一步包含含有图11B、12和14B中所示的FR(例如FR1、FR2、FR3或FR4)序列的VH。
在某些实施方案中，本文所述的抗CRTh2抗体包含Kabat所定义的HVR，例如包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的抗CRTh2抗体，其中CDR中的每一个如本文进一步描述地由Kabat定义。在某些实施方案中，本文所述的抗CRTh2抗体包含Chothia所定义的HVR，例如包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的抗CRTh2抗体，其中CDR中的每一个如本文进一步描述地由Chothia定义。在某些实施方案中，本文所述的抗CRTh2抗体包含通过ContactCDR序列定义的HVR，例如包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的抗CRTh2抗体，其中CDR中的每一个如本文进一步描述地通过ContactCDR序列来定义。
在另一方面，提供抗CRTh2抗体，其中该抗体包含与选自SEQIDNO:38-53的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列包含取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗CRTh2抗体保留结合CRTh2的能力。在某些实施方案中，在SEQIDNO:38-53的任一个中取代、插入和/或缺失了总计1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在某些实施方案中，该取代、插入或缺失发生在HVR之外的区域(即FR中)。可选地，该抗CRTh2抗体包含选自SEQIDNO:38-53的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体实施方案中，该VL包含选自以下的一个、两个或三个HVR：(a)含有选自SEQIDNO:7-9的氨基酸序列的HVR-L1；(b)含有选自SEQIDNO:10-12的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)含有SEQIDNO:3的氨基酸序列的HVR-L3。在具体实施方案中，该VL包含选自以下的一个、两个或三个HVR：(a)含有SEQIDNO:22或23的氨基酸序列的HVR-L1；(b)含有SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)含有SEQIDNO:27的氨基酸序列的HVR-L3。在具体实施方案中，该VL包含选自以下的一个、两个或三个HVR：(a)含有SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L1；(b)含有SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)含有SEQIDNO:28的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一方面，抗CRTh2抗体包含与选自SEQIDNO:54-65的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列包含取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗CRTh2抗体保留结合CRTh2的能力。在某些实施方案中，在SEQIDNO:54-65的任一个中取代、插入和/或缺失了总计1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在某些实施方案中，该取代、插入或缺失发生在HVR之外的区域(即FR中)。可选地，该抗CRTh2抗体包含SEQIDNO:54-65的任一个中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体实施方案中，该VH包含选自以下的一个、两个或三个HVR：(a)含有选自SEQIDNO:13-17的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有选自SEQIDNO:18-21的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)含有SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-H3。在具体实施方案中，该VH包含选自以下的一个、两个或三个HVR：(a)含有SEQIDNO:29或30的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQIDNO:32或33的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)含有SEQIDNO:35或36的氨基酸序列的HVR-H3。在具体实施方案中，该VH包含选自以下的一个、两个或三个HVR：(a)含有SEQIDNO:31的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQIDNO:34的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)含有SEQIDNO:37的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一方面，提供抗CRTh2抗体，其中该抗体包含上文提供的任意实施方案中的VH，及上文提供的任意实施方案中的VL。在一些实施方案中，该抗体包含鼠抗体8B1、3C12、31A5和19A2及人源化抗体hu19A2(包括v1、v12、v38、v46、v47、v51-v53、v57、v58和v60-v72)中任一个的VH序列。在一些实施方案中，该抗体包含鼠抗体8B1、3C12、31A5和19A2及人源化抗体hu19A2(包括v1、v12、v38、v46、v47、v51-v53、v57、v58和v60-v72)中任一个的VL序列。在一个实施方案中，该抗体包含选自SEQIDNO:54-60的VH序列及选自SEQIDNO:38-48的VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含SEQIDNO:55的VH序列及SEQIDNO:39的VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含SEQIDNO:57的VH序列及SEQIDNO:41的VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含SEQIDNO:61的VH序列及SEQIDNO:49的VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含SEQIDNO:62的VH序列及SEQIDNO:50的VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含SEQIDNO:63的VH序列及SEQIDNO:51的VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含SEQIDNO:64的VH序列及SEQIDNO:52的VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含SEQIDNO:65的VH序列及SEQIDNO:53的VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含SEQIDNO:57的VH序列及SEQIDNO:40的VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
在另一方面，本发明提供结合与本文提供的抗CRTh2抗体相同的表位的抗体。例如，在某些实施方案中，提供结合与鼠抗体8B1、3C12、31A5和19A2及人源化抗体hu19A2(包括v1、v12、v38、v46、v47、v51-v53、v57、v58和v60-v72)相同的表位的抗体。
在另一方面，提供结合人CRTh2和至少一种非人灵长类CRTh2二者的抗CRTh2抗体。在某些实施方案中，抗CRTh2抗体结合人CRTh2和食蟹猴CRTh2。在某些实施方案中，抗CRTh2抗体结合人CRTh2和恒河猴CRTh2。在某些实施方案中，抗CRTh2抗体结合人CRTh2、恒河猴CRTh2和食蟹猴CRTh2。在某些实施方案中，抗CRTh2抗体以小于100nM的KD结合人CRTh2和至少一种非人灵长类CRTh2二者(例如，抗CRTh2抗体以小于100nM的KD结合人CRTh2，且小于100nM的KD结合至少一种非人灵长类CRTh2)。在某些实施方案中，抗CRTh2抗体以小于75nM、50nM、45nM、40nM、35nM、30nM、25nM、20nM、15nM或10nM的KD结合人CRTh2和至少一种非人灵长类CRTh2二者。在某些实施方案中，结合人CRTh2和至少一种非人灵长类CRTh2二者的抗CRTh2抗体是排除性抗体，例如，本文进一步描述的排除CRTh2表达细胞的抗体。
在本发明的另一方面，任意以上实施方案的抗CRTh2抗体是单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗CRTh2抗体是抗体片段，例如Fv,Fab、Fab’、scFv、双抗体或F(ab’)2片段。在另一实施方案中，该抗体是本文定义的全长抗体，例如完整的IgG1抗体或其他抗体种类或同种型(例如IgG2、IgG3或IgG4)。在一些实施方案中，该抗体包含选自SEQIDNO:77-83的重链序列；和/或选自SEQIDNO:66-76的轻链序列。
在另一方面，任意以上实施方案的抗CRTh2抗体可以单独地或组合地掺入以下章节中所述的任意特征：
抗体亲和力
在某些实施方案中，本文提供的抗体具有≤1μM、≤150nM、≤100nM、≤50nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如从10-8M至10-13M，例如从10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。
在一个实施方案中，通过用以下测定所述的Fab形式的目的抗体及其抗原进行的放射性标记抗原结合测定(RIA)来测量Kd。通过在未标记抗原的滴定系列的存在下用最小浓度的(125I)-标记抗原平衡Fab，然后用抗-Fab抗体包被的平板捕获结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(参见例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为了确定用于测定的条件，用50mM碳酸钠(pH9.6)中的5μg/ml的捕获抗-Fab抗体(CappelLabs)过夜包被多孔板(ThermoScientific)，然后用含2％(w/v)牛血清白蛋白的PBS在室温(约23℃)下封闭2至5小时。在非吸附平板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与目的Fab的系列稀释混合(例如，与Presta等,CancerRes.57:4593-4599(1997)中的抗-VEGF抗体Fab-12的评估一致)。然后过夜孵育目的Fab；但是，孵育可以持续更长时期(例如约65小时)，以确保达到平衡。然后，将混合物转移至捕获平板在室温下孵育(例如孵育1小时)。然后去除溶液，用含0.1％聚山梨酸酯20的PBS洗涤平板8次。平板干燥后，加入150μl/孔的闪烁体(MICROSCINT-20TM；Packard)，在TOPCOUNTTMγ计数器(Packard)上计数平板10分钟。选择给出小于或等于最大结合的20％的每种Fab的浓度用于竞争结合测定。在一些实施方案中，还可以测量抗体与表达在细胞表面上的CRTh2的Kd。
根据另一实施方案，用～10个响应单位(RU)的固定化抗原CM5芯片，在25℃下使用或(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)，用表面等离振子共振测定来测量Kd。简言之，按照供应商的说明用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。在按5μl/分钟的流速注入前，用10mM柠檬酸钠pH4.8将抗原稀释至5μg/ml(～0.2μM)，以达到约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺来封闭未反应的基团。对于动力学测量，按约25μl/分钟的流速在25℃下注入两倍系列稀释于含0.05％聚山梨酸酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)的Fab(0.78nM至500nM)。通过同时拟合结合传感图和解离传感图，用简单的1:1Langmuir结合模型(EvaluationSoftwareversion3.2)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(Kd)计算为比值koff/kon。参见例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通过以上表面等离振子共振测定测量的结合速率超过106M-1s-1，则可以通过使用荧光淬灭技术来测定结合速率，如在分光计，如装配停流的分光光度计(AvivInstruments)或具有搅拌杯的8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中测量，该技术在浓度逐渐提高的抗原的存在下测量含20nM抗-抗原的抗体(Fab形式)的PBSpH7.2在25℃下的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的提高或降低。
抗体片段
在某些实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv和scFv片段，及下文所述的其他片段。某些抗体片段的综述参见Hudson等Nat.Med.9:129-134(2003)。scFv片段的综述参见例如Pluckthün,inThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,113卷,Rosenburg和Moore编辑,(Springer-Verlag,NewYork),269-315页(1994)；还参见WO93/16185；及美国专利号5,571,894和5,587,458。包含补救受体结合表位残基且具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论参见美国专利号US5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合部位的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的。参见例如EP404,097；WO1993/01161；Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)；及Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体还描述于Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)中。
单结构域抗体是包含抗体的重链可变结构域的全部或部分或轻链可变结构域的全部或部分的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利号6,248,516B1)。
可以通过包括但不限于本文所述的完整抗体的蛋白酶解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌(E.coli)或噬菌体)产生的多种技术来制备抗体片段。
嵌合抗体和人源化抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如美国专利号4,816,567；和Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)中。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如衍生自小鼠、大鼠、仓鼠、兔、或非人灵长类(如猴)的可变区)和人恒定区。在另一实例中，嵌合抗体是“种类转换”抗体，其中种类或亚类已从亲本抗体的种类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，人源化非人抗体来降低对人类的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR，例如CDR(或其部分)衍生自非人抗体，FR(或其部分)衍生自人抗体序列。人源化抗体还将可选地包含至少部分人恒定区。在一些实施方案中，用对应的来自非人抗体(例如从其衍生HVR残基的抗体)的残基取代人源化抗体中的一些FR残基，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体和制备它们的方法综述于例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中，并进一步描述于例如Riechmann等,Nature332:323-329(1988)；Queen等,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等,Methods36:25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重建”)；Dall’Acqua等,Methods36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；Osbourn等,Methods36:61-68(2005)；及Klimka等,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述FR改组的“指导选择”方法)中。
可以用来进行人源化的人构架区包括但不限于：用“最适”法选择的构架区(参见例如Sims等J.Immunol.151:2296(1993))；衍生自具体亚组的轻链或重链可变区的人抗体的共有序列的构架区(参见例如Carter等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；和Presta等J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)构架区或人种系构架区(参见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和衍生自筛选FR文库的构架区(参见例如Baca等,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
人抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是人抗体。可以用本领域已知的多种技术产生人抗体。人抗体一般地描述于vanDijk和vandeWinkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中。
可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体，该转基因动物已修饰为响应抗原攻击而产生完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体。这类动物通常包含全部或部分人免疫球蛋白基因座，其取代内源免疫球蛋白基因座，或其存在于染色体外，或随机整合入动物的染色体。在这类转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座通常已失活。用于从转基因动物获得人抗体的方法的综述参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见例如描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和US6,150,584；描述技术的美国专利号5,770,429；描述K-M技术的美国专利号7,041,870；描述技术的美国专利申请公开号2007/0061900。可以例如通过与不同的人恒定区组合来进一步修饰来自由这类动物产生的完整抗体的人可变区。
还可以通过基于杂交瘤的方法来制备人抗体。已描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤细胞系(参见例如KozborJ.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等,MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,51-63页(MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987)；和Boerner等,J.Immunol.,147:86(1991))。通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也描述于Li等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)中。其他方法包括描述于例如美国专利号7,189,826(描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,XiandaiMianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)中。人杂交瘤技术(三元杂交瘤技术)也描述于Vollmers和Brandlein,HistologyandHistopathology,20(3):927-937(2005)及Vollmers和Brandlein,MethodsandFindingsinExperimentalandClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)中。
还可以通过分离选自人衍生的噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来产生人抗体。然后可以将这类可变结构域序列与希望的人恒定区组合。下文描述用于从抗体文库选择人抗体的技术。
文库衍生的抗体
可以针对具有一种或多种希望的活性的抗体筛选组合文库来分离本发明的抗体。例如，本领域已知用于产生噬菌体文库并针对具有希望的结合特征的抗体筛选这类文库的多种方法。这类方法综述于例如Hoogenboom等inMethodsinMolecularBiology178:1-37(O’Brien等,编辑,HumanPress,Totowa,NJ,2001)中，并进一步描述于例如McCafferty等,Nature348:552-554；Clackson等,Nature352:624-628(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,inMethodsinMolecularBiology248:161-175(Lo,编辑,HumanPress,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34):12467-12472(2004)；及Lee等,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)中。
在某些噬菌展示方法中，分别通过聚合酶链反应(PCR)克隆VH和VL基因的库，并在噬菌体文库中随机组合，然后按Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述针对结合抗原的噬菌体筛选该文库。噬菌体通常作为单链Fv(scFv)片段或作为Fab片段展示抗体片段。来自免疫的来源的文库提供抗免疫原的高亲和力抗体而无需构建杂交瘤。备选地，可以按Griffiths等,EMBOJ,12:725-734(1993)所述克隆(例如从人)首次用于实验的库来提供抗广范围的非自身以及自身抗原的抗体的单一来源而无需任何免疫。最后，还可以按Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述，通过从干细胞克隆未重排V基因区段，并用包含随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区并实现体外重排来合成制备首次用于实验的文库。描述人抗体噬菌体文库的专利公开包括例如美国专利号5,750,373及美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
本文将分离自人抗体文库的抗体或抗体片段视为人抗体或人抗体片段。
多特异性抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同部位具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，该结合特异性之一针对CRTh2，另一种针对任意其他抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以与CRTh2的两个不同表位结合。还可以用双特异性抗体来将细胞毒剂定位至CRTh2表达细胞。双特异性抗体可以作为全长抗体或抗体片段制备。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello,Nature305:537(1983)；WO93/08829；及Traunecker等,EMBOJ.10:3655(1991))和“杵入臼”改造(参见例如美国专利号5,731,168)。还可以通过以下来制备多特异性抗体：用于制备抗体Fc-异二聚体分子的工程静电引导作用(WO2009/089004A1)；交联两种或多种抗体或片段(参见例如美国专利号4,676,980和Brennan等,Science,229:81(1985))；用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体(参见例如Kostelny等,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用用于制备双特异性抗体片段的“双抗体”技术(参见例如Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等,J.Immunol.,152:5368(1994))；按例如Tutt等J.Immunol.147:60(1991)中所述制备三特异性抗体。
本文还包括具有三个或多个功能性抗原结合部位的改造抗体，包括“章鱼抗体”(参见例如US2006/0025576A1)。
本文的抗体或片段还可以包括含有与CRTh2以及另一不同抗原结合的抗原结合部位的“双重作用FAb”或“DAF”(参见例如US2008/0069820)。
抗体变体
在某些实施方案中，考虑本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可以希望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。可以通过在编码抗体的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。这类修饰包括例如从抗体的氨基酸序列缺失残基和/或在抗体的氨基酸序列内插入残基和/或取代抗体的氨基酸序列内的残基。可以进行缺失、插入和取代的任意组合来达到最终的构建体，只要最终的构建体具有希望的特征，例如抗原结合。
取代、插入和缺失变体
在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。进行取代诱变的目的位点包括HVR和FR。表1中在“保守取代”的表头下显示保守取代。表1中在“示例性取代”的表头下显示更实质性的改变，如下文参考氨基酸侧链种类进一步描述。可以在目的抗体中引入氨基酸取代，并针对希望的活性(例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC)筛选产物。
表1
氨基酸可以按照共同的侧链性质分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代将需要将这些种类之一的成员换为另一种类。
一类取代变体涉及取代亲本抗体(例如人源化抗体或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，所得到的选择用于进一步研究的一种或多种变体将相对于亲本抗体具有某些生物学特性(例如提高的亲和力、降低的免疫原性)的修饰(例如改善)和/或将具有基本上保留的亲本抗体的某些生物学特性。示例性取代变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(如本文所述的那些)方便地产生。简言之，突变一个或多个HVR残基，将变体抗体展示在噬菌体上，并针对具体的生物学活性(例如结合亲和力)进行筛选。
可以在HVR中进行改变(例如取代)，例如以改善抗体亲和力。可以在HVR“热点”(即由在体细胞成熟过程中以高频率发生突变的密码子编码的残基)(参见例如Chowdhury,MethodsMol.Biol.207:179-196(2008))和/或SDR(a-CDR)中进行这类改变，针对结合亲和力测试所得到的变体VH或VL。通过构建二级文库并从二级文库重新选择的亲和力成熟已描述于例如Hoogenboom等inMethodsinMolecularBiology178:1-37(O’Brien等,编辑,HumanPress,Totowa,NJ,(2001))中。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如易错PCR、链改组或寡核苷酸定点诱变)中的任一种来在选择用于成熟的可变基因中引入多样性。然后产生二级文库。然后筛选该文库来鉴定具有希望的亲和力的任意抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR定点途径，其中随机化几个HVR残基(例如每次4-6个残基)。可以例如用丙氨酸扫描诱变或模拟来明确地鉴定出涉及抗原结合的HVR残基。尤其是通常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，取代、插入或缺失可以发生在一个或多个HVR内，只要这类改变不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVR中进行不实质性降低结合亲和力的保守改变(例如本文提供的保守取代)。这类改变可以在HVR“热点”或SDR之外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，各HVR未改变，或包含不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述，用于鉴定可以靶向进行诱变的抗体的残基或区域的方法称为“丙氨酸扫描诱变”。在此方法中，鉴定残基或靶残基组(例如带电荷的残基，如arg、asp、his、lys和glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或多聚丙氨酸)取代，以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在证明对最初的取代的功能敏感性的氨基酸位置引入其他取代。备选地或此外，用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体和抗原之间的接触点。这类接触残基和邻近残基可以作为取代的候选残基来靶向或消除。可以筛选变体来确定它们是否包含希望的特性。
氨基酸序列插入包括长度在一个残基至含有一百或更多个残基的多肽的范围内的氨基端和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N端蛋氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N或C端与酶(例如，对于ADEPT)或增加抗体的血清半衰期的多肽的融合。
糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文提供的抗体来提高或降低该抗体的糖基化程度。通过改变氨基酸序列，使得产生或去除一个或多个糖基化位点，可以方便地实现对抗体进行糖基化位点的加入或缺失。
在抗体包含Fc区时，可以改变附着于Fc区的糖类。哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分枝的双触角寡糖，其一般通过N连接附着于Fc区的CH2结构域的Asn297。参见例如Wright等TIBTECH15:26-32(1997)。寡糖可以包括多种糖类，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及在双触角寡糖结构的“茎”中附着于GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以进行本发明的抗体中的寡糖的修饰来产生具有某些改善的特性的抗体变体。
在一个实施方案中，提供包含Fc区的抗体变体，其中附着于Fc区的糖类结构具有减少的岩藻糖或缺乏岩藻糖，这可以改善ADCC功能。特别是，本文考虑相对于在野生型CHO细胞中产生的同一抗体上岩藻糖的量具有减少的岩藻糖的抗体。这就是说，它们的特征在于，具有比通过天然CHO细胞(例如，产生天然糖基化模式的CHO细胞，如包含天然FUT8基因的CHO细胞)产生时它们本该具有的岩藻糖量低的岩藻糖量。在某些实施方案中，该抗体是这样的抗体，其中其上N连接聚糖中的不到约50％、40％、30％、20％、10％或5％包含岩藻糖。例如，这种抗体中的岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。在某些实施方案中，该抗体是这样的抗体，其中其上N连接聚糖中没有一个包含岩藻糖，即其中该抗体完全不含岩藻糖、或无岩藻糖或是无岩藻糖基化的。相对于通过例如WO2008/077546中所述的MALDI-TOF质谱法测量的附着于Asn297的所有糖结构(例如复合、杂合和高甘露糖结构)的总和，通过计算Asn297处的糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖的量。Asn297指定位在Fc区中的约297位(Fc区残基的EU编号)的天冬酰胺残基；但是，由于抗体中小的序列变异，Asn297也可以定位在297位上游或下游约±3氨基酸，即在294位和300位之间。这类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。参见例如美国专利公开号US2003/0157108(Presta,L.)；US2004/0093621(KyowaHakkoKogyoCo.,Ltd)。涉及“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺乏”的抗体变体的出版物的实例包括：US2003/0157108；WO2000/61739；WO2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去岩藻糖基化的抗体的细胞系的实例包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka等Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US2003/0157108A1,Presta,L；及WO2004/056312A1,Adams等，尤其是在实施例11中)和敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；及WO2003/085107)。
还提供具有二等分寡糖的抗体变体，例如，其中附着于抗体Fc区的双触角寡糖被GlcNAc二等分。这类抗体变体可以具有减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。这类抗体变体的实例描述于例如WO2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利号6,602,684(Umana等.)；US2005/0123546(Umana等)；及Ferrara等,BiotechnologyandBioengineering,93(5):851-861(2006)中。还提供在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这类抗体变体可以具有改善的CDC功能。这类抗体变体描述于例如WO1997/30087(Patel等)；WO1998/58964(Raju,S.)；及WO1999/22764(Raju,S.)中。
在某些实施方案中，包含本文所述Fc区的抗体变体能够结合FcγRIII。在某些实施方案中，与包含人野生型IgG1Fc区的同一抗体相比，包含本文所述Fc区的抗体变体在人效应细胞存在下具有ADCC活性，或在人效应细胞存在下具有提高的ADCC活性。
Fc区变体
在某些实施方案中，可以向本文提供的抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，从而产生Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置处含有氨基酸修饰(例如取代)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。
在某些实施方案中，本发明考虑具有一些但不是全部效应子功能的抗体变体，这使得它成为其中抗体的体内半衰期重要但某些效应子功能(如补体和ADCC)不必要或有害的应用所希望的候选者。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定来确认CDC和/或ADCC活性的降低/减损。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定来确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达Fc(RIII，而单核细胞表达Fc(RI、Fc(RI和Fc(RIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页上的表3中。评估目的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362(参见例如Hellstrom,I.等Proc.Nat’lAcad.Sci.USA83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))中。备选地，可以利用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.MountainView,CA)；和CytoTox非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI))。用于这类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地或此外，可以在体内，例如在诸如公开于Clynes等Proc.Nat’lAcad.Sci.USA95:652-656(1998)中的动物模型的动物模型中评估目的分子的ADCC活性。还可以进行C1q结合测定来确认抗体不能结合C1q，并因此缺乏CDC活性。参见例如WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可以进行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods202:163(1996)；Cragg,M.S.等,Blood101:1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood103:2738-2743(2004))。还可以用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见例如Petkova,S.B.等,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有减少的效应子功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个的取代的那些(美国专利号6,737,056)。这类Fc变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或多个处具有取代的Fc突变体，包括具有残基265和297至丙氨酸的取代的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
描述了某些具有改善或减少的FcR结合的抗体变体(参见例如美国专利号6,737,056；WO2004/056312；及Shields等,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
在某些实施方案中，抗体变体包含具有一个或多个改善ADCC的氨基酸取代(例如Fc区的298、333和/或334位(残基的EU编号)的取代)的Fc区。在示例性实施方案中，抗CRTh2抗体在其Fc区中包含以下氨基酸取代：S298A、E333A和K334A。
在一些实施方案中，例如，如美国专利号6,194,551、WO99/51642和Idusogie等J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述，在Fc区中进行改变，该改变导致改变(即改善或减少)的C1q结合和/或依赖补体的细胞毒性(CDC)。
具有增加的半衰期和改善的新生儿Fc受体(FcRn)(其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等,J.Immunol.24:249(1994)))结合的抗体描述于US2005/0014934A1(Hinton等))中。那些抗体包含其中具有一个或多个取代的Fc区，该取代改善Fc区与FcRn的结合。这类Fc变体包括在Fc区残基238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中的一个或多个处具有取代的那些，例如，Fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826)。
关于Fc区变体的其他实例，还参见Duncan&Winter,Nature322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；及WO94/29351。
半胱氨酸改造的抗体变体
在某些实施方案中，可以希望产生半胱氨酸改造的抗体，例如“thioMAb”，其中用半胱氨酸残基取代抗体的一个或多个残基。在具体实施方案中，取代的残基存在于抗体的可接近部位。通过用半胱氨酸取代那些残基，从而将反应性巯基放置在抗体的可接近部位，并可以用于将抗体缀合至其他部分，如药物部分或接头-药物部分，以产生本文进一步描述的免疫缀合物。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸取代以下残基中的任意一个或多个：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；及重链Fc区的S400(EU编号)。半胱氨酸改造的抗体可以按例如美国专利号7,521,541中所述产生。
抗体衍生物
在某些实施方案中，可以进一步修饰本文提供的抗体来包含本领域已知且易于得到的附加的非蛋白质部分。适合用于衍生化抗体的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯比咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(同聚物或随机共聚物)、葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、propropyleneglycol同聚物、prolypropyleneoxide/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛可以在制备中具有优势。聚合物可以具有任意分子量，且可以分枝或不分枝。附着于抗体的聚合物的数目可以不同，且如果附着超过一个聚合物，则它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可以根据包括但不限于抗体要改善的具体特性或功能、抗体衍生物是否将在确定的条件下用于治疗等的考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型。
在另一实施方案中，提供抗体和可通过暴露于照射来选择性加热的非蛋白质部分的缀合物。在一个实施方案中，该非蛋白质部分是碳纳米管(Kam等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:11600-11605(2005))。照射可以具有任意波长，且包括但不限于不损害普通细胞但加热非蛋白质部分至杀死靠近抗体-非蛋白质部分的细胞的温度的波长。
重组方法和组合物
抗体可以用例如美国专利号4,816,567中所述的方法和组合物产生。在一个实施方案中，提供分离的编码本文所述的抗CRTh2抗体的核酸。这种核酸可以编码含有抗体的VL的氨基酸序列和/或含有抗体的VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。在另一实施方案中，提供一个或多个包含这种核酸的载体(例如表达载体)。在另一实施方案中，提供包含这种核酸的宿主细胞。在一个这种实施方案中，宿主细胞包含以下(例如已用以下转化)：(1)包含编码含有抗体的VL的氨基酸序列和含有抗体的VH的氨基酸序列的核酸的载体；或(2)包含编码含有抗体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码含有抗体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，该宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供制备抗CRTh2抗体的方法，其中该方法包括在适于表达抗体的条件下培养上文提供的含有编码抗体的核酸的宿主细胞，并可选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。
对于抗CRTh2抗体的重组产生，分离例如上文所述的编码抗体的核酸，并插入一个或多个载体用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。这种核酸可以用常规方法(例如通过使用能够特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序。
适合用于克隆或表达编码抗体的载体的宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，尤其是在不需要糖基化和Fc效应子功能时，可以在细菌中产生抗体。抗体片段和多肽在细菌中的表达参见例如美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。(还参见Charlton,MethodsinMolecularBiology,248卷(B.K.C.Lo,编辑,HumanaPress,Totowa,NJ,2003),245-254页，其描述抗体片段在大肠杆菌中的表达)。表达后，可以从可溶性级分中的细菌细胞糊分离抗体，并可以进一步纯化。
除原核生物外，诸如丝状真菌或酵母的真核微生物也是编码抗体的载体的适宜的克隆或表达宿主，包括糖基化途径已“人源化”，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)和Li等,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
适合用于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定了许多可以与昆虫细胞结合使用，尤其是用于转染草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞的杆状病毒毒株。
植物细胞培养物也可以用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，可以使用适应悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7)；人胚肾细胞系(描述于例如Graham等,J.GenVirol.36:59(1977)中的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(描述于例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；buffalo大鼠肝细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(HepG2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562)；描述于例如Mather等,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中的TRI细胞；MRC5细胞；及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980))；及骨髓瘤细胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。适合用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述参见例如Yazaki和Wu,MethodsinMolecularBiology,248卷(B.K.C.Lo,编辑,HumanaPress,Totowa,NJ),255-268页(2003)。
测定
可以通过本领域已知的多种测定针对其物理/化学性质和/或生物学活性鉴定、筛选或表征本文提供的抗CRTh2抗体。
结合测定和其他测定
在一方面，例如通过已知的方法(如ELISA、Western印迹等)针对其抗原结合活性测试本发明的抗体。
在另一方面，可以用竞争测定来鉴定与鼠抗体8B1、3C12、31A5和19A2及人源化抗体hu19A2(包括v1、v12、v38、v46、v47、v51-v53、v57、v58和v60-v72)竞争结合CRTh2的抗体。在某些实施方案中，这种竞争性抗体结合与鼠抗体8B1、3C12、31A5和19A2及人源化抗体hu19A2(包括v1、v12、v38、v46、v47、v51-v53、v57、v58和v60-v72)所结合的表位相同的表位(例如线性表位或构象表位)。用于定位抗体所结合的表位的详细的示例性方法在Morris(1996)“EpitopeMappingProtocols,”inMethodsinMolecularBiology66卷(HumanaPress,Totowa,NJ)中提供。
在示例性竞争测定中，在溶液中孵育固定的CRTh2或在细胞表面CRTh2表达细胞，该溶液包含结合CRTh2(例如人或非人灵长类)的第一标记抗体和针对其与该第一抗体竞争结合CRTh2的能力进行测试的第二未标记抗体。该第二抗体可以存在于杂交瘤上清中。作为对照，在溶液中孵育固定的CRTh2或CRTh2表达细胞，该溶液包含该第一标记抗体但不包含该第二未标记抗体。在允许该第一抗体与CRTh2结合的条件下孵育后，去除过量的未结合抗体，并测量与固定的CRTh2或CRTh2表达细胞结合的标记的量。如果测试样品中与固定的CRTh2或CRTh2表达细胞结合的标记的量相对于对照样品实质性减少，则表明该第二抗体与该第一抗体竞争结合CRTh2。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:ALaboratoryManual第14章(ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY)。
活性测定
可以用本领域已知和本文所述(例如实施例1)的测定来鉴定和测试抗CRTh2抗体的生物学活性。在一些实施方案中，提供用于针对排除CRTh2表达细胞(例如，Th2细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和/或先天2型(IT2)细胞)测试抗CRTh2抗体的测定。生物学活性的示例性测试包括，例如，提供在免疫细胞(如嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞)上表达人CRTh2的转基因小鼠，对该转基因小鼠施用抗CRTh2抗体，测量小鼠血液或组织中人CRTh2阳性细胞的水平(例如数目或百分比)，或小鼠血液或组织中已知CRTh2表达细胞类型的水平(例如数目或百分比)。另一种示例性测试可以包括，例如，提供表达人CRTh2的小鼠，用已知方法用TNP-OVA致敏/攻击小鼠，然后施用抗CRTh2抗体。针对CRTh2阳性细胞的存在或已知CRTh2表达细胞类型的存在评估TNP-OVA攻击的小鼠肺组织、血液、BAL和BALF。在一些实施方案中，提供用于检测抗CRTh2抗体对Th2细胞因子产生细胞的排除的测定。例如，可以将体外极化的人Th2细胞腹膜内注入SCID小鼠，对小鼠施用抗CRTh2抗体。可以在用PMA和离子霉素离体刺激后评估产生细胞因子的细胞的水平。在一些实施方案中，抗CRTh2抗体可以在任意这些测定中排除至少约50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％中任一个的CRTh2表达细胞。
还提供用于针对阻断CRTh2信号发放测试抗CRTh2抗体的测定。用于评估CRTh2信号发放的示例性方法可以包括提供CRTh2阳性细胞，用抗CRTh2抗体孵育细胞，然后用配体如PGD2(在存在或缺乏毛喉素的情况下)刺激，最后通过本领域已知的任意方法测量胞内cAMP或Ca2+含量的变化。
还提供用于针对阻止CRTh2表达细胞响应TNP-OVA、木瓜蛋白酶或前列腺素D2的募集测试抗CRTh2抗体的测定。用于CRTh2表达细胞响应PGD2的募集的示例性测试可以包括在存在或缺乏抗CRTh2抗体的情况下将PGD2施用入在免疫细胞(如嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞)上表达人CRTh2的转基因小鼠的呼吸道，并评估随后CRTh2阳性细胞向肺组织和支气管肺泡灌洗液的内流。评估可以以许多方式达到，包括对切下的组织进行CRTh2染色，及通过流式细胞术或本领域已知的任意其他方法测定细胞内流。
还提供用于针对阻断CRTh2表达细胞中的Ca2+流动测试抗CRTh2抗体的测定。示例性测试可以包括用流式细胞术监测细胞响应配体如PGD2的Ca2+流动，然后用indo-1/AM染料和抗CRTh2单克隆抗体孵育。
免疫缀合物
本发明还提供包含与一种或多种细胞毒剂(如化疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的蛋白质毒素、酶活性毒素、或其片段))或放射性同位素缀合的本文的抗CRTh2抗体的免疫缀合物。
在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，该药物包括但不限于美登木素生物碱(参见美国专利号5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP0425235B1)；auristatin，如monomethylauristatin药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见美国专利号5,635,483和5,780,588和7,498,298)；多拉司他汀；棘孢霉素或其衍生物(参见美国专利号5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和5,877,296；Hinman等,CancerRes.53:3336-3342(1993)；及Lode等,CancerRes.58:2925-2928(1998))；蒽环类抗生素，如柔红霉素或阿霉素(参见Kratz等,CurrentMed.Chem.13:477-523(2006)；Jeffrey等,Bioorganic&Med.Chem.Letters16:358-362(2006)；Torgov等,Bioconj.Chem.16:717-721(2005)；Nagy等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:829-834(2000)；Dubowchik等,Bioorg.&Med.Chem.Letters12:1529-1532(2002)；King等,J.Med.Chem.45:4336-4343(2002)；及美国专利号6,630,579)；氨甲喋呤；脱乙酰长春花碱；紫杉烷，如紫杉萜、紫杉醇、larotaxel、tesetaxel和ortataxel；单端孢霉烯；及CC1065。
在另一实施方案中，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的本文所述抗体，该酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、塑莲根毒蛋白A链、α-帚曲霉素、油桐(Aleuritesfordii)蛋白质、香石竹毒蛋白蛋白质、美洲商陆(Phytolacaamericana)蛋白质(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、sapaonariaofficinalis抑制剂、多花白树毒蛋白、米托洁林、局限曲霉素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯。
在另一实施方案中，免疫缀合物包含与放射性原子缀合形成放射性缀合物的本文所述抗体。可用多种放射性同位素来产生放射性缀合物。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu的放射性同位素。在放射性缀合物用于检测时，它可以包含用于闪烁照相研究的放射性原子，例如tc99m或I123，或者用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)的自旋标记物，如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以用多种双功能蛋白质偶联剂来产生抗体和细胞毒剂的缀合物，如3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸-琥珀酰亚胺酯(SMCC)、亚胺基硫烷(IT)、亚胺酯的双功能衍生物(如己二酰亚氨酸二甲酯HCl)、活性酯(如如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、二-叠氮基化合物(如二(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、二-重氮基衍生物(如二-(对-重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2,6-二异氰酸甲苯酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以按照Vitetta等,Science238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳14标记的3-甲基二乙烯三胺五乙酸1-异硫氰基苄酯(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可以使用酸敏感接头、肽酶敏感接头、光敏感接头、二甲基接头或包含二硫化物的接头(Chari等,CancerRes.52:127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
本文的免疫缀合物或ADC明确考虑但不限于用包括但不限于BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、磺基-SMPB和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸盐)的市售交联剂(例如来自PierceBiotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)制备的这类缀合物。
用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文提供的任意抗CRTh2抗体都可用于检测CRTh2在生物样品中的存在。本文所用的术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施方案中，生物样品包含细胞或组织，如Th2细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞或先天2型(IT2)细胞。
在一个实施方案中，提供用于诊断或检测的方法的抗CRTh2抗体。在另一方面，提供检测CRTh2在生物样品中的存在的方法。在某些实施方案中，该方法包括使该生物样品在允许抗CRTh2抗体与CRTh2结合的条件下与本文所述的抗CRTh2抗体接触，并检测是否在抗CRTh2抗体和CRTh2之间形成复合物。这种方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，用抗CRTh2抗体来选择适于进行抗CRTh2抗体治疗的个体，例如，其中CRTh2是用于选择患者的生物标志。
可以用本发明的抗体诊断的示例性障碍包括哮喘、粒细胞缺乏性哮喘、特应性皮炎、变应性鼻炎、急性或慢性呼吸道超敏反应、嗜酸细胞增多综合征、嗜酸性食管炎、Churg-Strauss综合征、特发性肺纤维化、与细胞因子相关的炎症、与CRTh2表达细胞相关的炎症或恶性肿瘤、慢性特发性荨麻疹、慢性自发性荨麻疹、物理性荨麻疹(包括寒冷性荨麻疹和压迫性荨麻疹)、大疱性类天疱疮、鼻息肉病、食物过敏及伴随或不伴随囊性纤维化的变应性支气管肺曲霉菌病(ABPA)。
在某些实施方案中，提供标记的抗CRTh2抗体。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(如荧光标记、生色标记、电子密度标记、化学发光标记和放射性标记)，以及例如通过酶促反应或分子相互作用间接检测的部分(如酶或配体)。示例性标记包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I，荧光团如稀土螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰、伞形酮、萤光素酶(例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利号4,737,456))、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶(例如葡糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡糖-6-磷酸脱氢酶)，杂环氧化酶(如尿酸氧化酶和黄嘌呤氧化酶)，与利用过氧化氢来氧化染料前体的酶(如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶)偶联，生物素/抗生物素蛋白，自旋标记，噬菌体标记，稳定自由基等。
药物制剂
通过将具有希望的纯度的这种抗体与一种或多种可选的可药用载体(Remington'sPharmaceuticalSciences第16版,Osol,A.编辑(1980))混合，以冻干制剂或水溶液的形式制备本文所述的抗CRTh2抗体的药物制剂。可药用载体一般在所利用的剂量和浓度下对受体无毒性，且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯己双铵；氯苄烷铵；苄索氯铵；苯酚；丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性可药用载体进一步包括间质药物分散剂，如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20(BaxterInternational,Inc.)。包括rhuPH20的某些示例性sHASEGP和使用方法描述于美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中。在一方面，将sHASEGP与诸如软骨素酶的一种或多种附加的糖胺聚糖酶组合。
示例性冻干抗体制剂描述于美国专利号6,267,958中。水性抗体制剂包括描述于美国专利号6,171,586和WO2006/044908中的那些，后一种制剂包括组氨酸-乙酸缓冲液。
本文的制剂还可以根据所治疗的具体适应症的需要包含一种以上活性成分，优选相互无不利影响的具有互补活性的那些。例如，可以希望进一步提供以下但不限于以下：IL4抑制剂(例如AER-001、IL4/IL13陷阱或抗IL4抗体)、IL5抑制剂(例如Mepolizumab,CASNo.196078-29-2；resilizumab或另一抗IL5抗体)、IL9抑制剂(例如MEDI-528或另一抗IL9抗体)、IL13抑制剂(例如IMA-026、IMA-638(也称为anrukinzumab,INNNo.910649-32-0；QAX-576；IL4/IL1陷阱)、tralokinumab(也称为CAT-354,CASNo.1044515-88-9)、AER-001、ABT-308(也称为人源化13C5.5抗体)或另一抗IL13抗体)、抗IL17抗体、抗IL25抗体、抗IL33抗体、抗TSLP抗体、抗OX40L抗体、抗OX40抗体、IL-4受体α抑制剂(例如AMG-317、AIR-645或另一抗IL4Ra抗体)、抗IL5Ra抗体、抗17RA抗体或抗-CCR4抗体。这类活性成分以对预期目的有效的量适宜地组合存在。
活性成分可以包载在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微囊(例如，分别为羟甲基纤维素微囊或明胶微囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊)中、胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒和纳米囊(nanocapsule))中或粗滴乳状液中。这类技术公开于Remington’sPharmaceuticalSciences第16版,Osol,A.编辑(1980)中。
可以制备缓释制剂。缓释制剂的适宜的实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质是成形物品的形式，例如膜或微囊。
待用于体内施用的制剂通常是无菌的。无菌可以容易地例如通过滤过无菌滤膜来达到。
治疗方法和组合物
本文提供的任意抗CRTh2抗体都可以用于治疗方法。
在一方面，提供用作药物的抗CRTh2抗体。在另一方面，提供用于治疗由CRTh2介导的障碍的抗CRTh2抗体。在某些实施方案中，提供用于治疗方法的抗CRTh2抗体。在某些实施方案中，本发明提供用于治疗罹患CRTh2介导的障碍的个体的方法的抗CRTh2抗体，该方法包括对该个体施用有效量的抗CRTh2抗体。在一个这种实施方案中，该方法进一步包括对该个体施用有效量的至少一种例如下文所述的附加治疗剂。在一些实施方案中，该障碍选自哮喘、粒细胞缺乏性哮喘、特应性皮炎、变应性鼻炎、急性或慢性呼吸道超敏反应、嗜酸细胞增多综合征、嗜酸性食管炎、Churg-Strauss综合征、特发性肺纤维化、与细胞因子相关的炎症、与CRTh2表达细胞相关的炎症或恶性肿瘤、慢性特发性荨麻疹、慢性自发性荨麻疹、物理性荨麻疹(包括寒冷性荨麻疹和压迫性荨麻疹)、大疱性类天疱疮、鼻息肉病、食物过敏及伴随或不伴随囊性纤维化的变应性支气管肺曲霉菌病(ABPA)。在其他实施方案中，本发明提供用于排除个体中CRTh2表达细胞(例如，Th2细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和/或先天2型(IT2)细胞)或降低个体中一种或多种细胞因子、酶或其他炎症介质(例如，IL-4、IL-5、IL-9、IL-13、IL-17、组胺、类胰蛋白酶和/或白三烯)的水平的抗CRTh2抗体。在一些实施方案中，由至少一种以下细胞类型产生的一种或多种细胞因子减少：Th2细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞或先天2型(IT2)细胞。在某些实施方案中，本发明提供用于在个体中排除CRTh2表达细胞(例如，Th2细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和/或先天2型(IT2)细胞)或在个体中降低一种或多种细胞因子、酶或其他炎症介质(例如，IL-4、IL-5、IL-9、IL-13、IL-17、组胺、类胰蛋白酶和/或白三烯)的水平的方法的抗CRTh2抗体，该方法包括对该个体施用有效量的抗CRTh2抗体来排除CRTh2表达细胞和/或减少一种或多种细胞因子。任意以上实施方案的“个体”优选是人。
在另一方面，本发明提供抗CRTh2抗体在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗由CRTh2介导的障碍。在另一实施方案中，该药物用于治疗由CRTh2介导的障碍的方法，该方法包括对罹患该障碍的个体施用有效量的药物。在一个这种实施方案中，该方法进一步包括对该个体施用有效量的至少一种例如下文所述的附加治疗剂。在一些实施方案中，该障碍选自哮喘、粒细胞缺乏性哮喘、特应性皮炎、变应性鼻炎、急性或慢性呼吸道超敏反应、嗜酸细胞增多综合征、嗜酸性食管炎、Churg-Strauss综合征、特发性肺纤维化、与细胞因子相关的炎症、与CRTh2表达细胞相关的炎症或恶性肿瘤、慢性特发性荨麻疹、慢性自发性荨麻疹、物理性荨麻疹(包括寒冷性荨麻疹和压迫性荨麻疹)、大疱性类天疱疮、鼻息肉病、食物过敏及伴随或不伴随囊性纤维化的变应性支气管肺曲霉菌病(ABPA)。在另一实施方案中，该药物用于排除个体中CRTh2表达细胞(例如，Th2细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和/或先天2型(IT2)细胞)或降低个体中一种或多种细胞因子、酶或其他炎症介质(例如，IL-4、IL-5、IL-9、IL-13、IL-17、组胺、类胰蛋白酶和/或白三烯)的水平。在另一实施方案中，该药物用于在个体中排除CRTh2表达细胞(例如，Th2细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和/或先天2型(IT2)细胞)或在个体中降低一种或多种细胞因子、酶或其他炎症介质(例如，IL-4、IL-5、IL-9、IL-13、IL-17、组胺、类胰蛋白酶和/或白三烯)的水平的方法，该方法包括对该个体施用有效量的药物来排除CRTh2表达细胞和/或减少一种或多种细胞因子。任意以上实施方案的“个体”可以是人。
在另一方面，本发明提供用于治疗由CRTh2介导的障碍的方法。在一个实施方案中，该方法包括对罹患这种障碍的个体施用有效量的抗CRTh2抗体。在一个这种实施方案中，该方法进一步包括对该个体施用有效量的至少一种例如下文所述的附加治疗剂。在一些实施方案中，该障碍选自哮喘、粒细胞缺乏性哮喘、特应性皮炎、变应性鼻炎、急性或慢性呼吸道超敏反应、嗜酸细胞增多综合征、嗜酸性食管炎、Churg-Strauss综合征、特发性肺纤维化、与细胞因子相关的炎症、与CRTh2表达细胞相关的炎症或恶性肿瘤、慢性特发性荨麻疹、慢性自发性荨麻疹、物理性荨麻疹(包括寒冷性荨麻疹和压迫性荨麻疹)、大疱性类天疱疮、鼻息肉病、食物过敏及伴随或不伴随囊性纤维化的变应性支气管肺曲霉菌病(ABPA)。任意以上实施方案的“个体”可以是人。
在另一方面，本发明提供用于在个体中排除CRTh2表达细胞(例如，Th2细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和/或先天2型(IT2)细胞)和/或在个体中降低一种或多种细胞因子、酶或其他炎症介质(例如，IL-4、IL-5、IL-9、IL-13、IL-17、组胺、类胰蛋白酶和/或白三烯)的水平的方法。在一个实施方案中，该方法包括对该个体施用有效量的抗CRTh2抗体来排除CRTh2表达细胞和/或减少一种或多种细胞因子。在一个实施方案中，“个体”是人。在一些实施方案中，该个体罹患选自以下的障碍：哮喘、粒细胞缺乏性哮喘、特应性皮炎、变应性鼻炎、急性或慢性呼吸道超敏反应、嗜酸细胞增多综合征、嗜酸性食管炎、Churg-Strauss综合征、特发性肺纤维化、与细胞因子相关的炎症、与CRTh2表达细胞相关的炎症或恶性肿瘤、慢性特发性荨麻疹、慢性自发性荨麻疹、物理性荨麻疹(包括寒冷性荨麻疹和压迫性荨麻疹)、大疱性类天疱疮、鼻息肉病、食物过敏及伴随或不伴随囊性纤维化的变应性支气管肺曲霉菌病(ABPA)。
在某些实施方案中，本文所述的方法可以用来治疗罹患哮喘的个体，其中该个体是US2012/0156194中所定义的嗜酸细胞性炎症阳性(EIP)。在某些实施方案中，本文所述的方法可以用来治疗罹患哮喘的个体，其中该个体是US2012/0156194中所定义的嗜酸细胞性炎症阴性(EIN)。还参见DFChoy等,JImmunol.186(3):1861-9(2011)；Arron等(2013)AdvPharmacol66:1-49；及G.Jia等,JAllergyClinImmunol.130(3):647-654(2012)。
在某些实施方案中，罹患哮喘的患者显示高水平的总血清或血浆骨膜蛋白(periostin)。在某些实施方案中，EIP患者指已测试了血清或血浆骨膜蛋白水平的患者，其中该血清或血浆骨膜蛋白水平等于或超过患者群体的中间或平均血清或血浆骨膜蛋白水平(也可以称为高骨膜蛋白)。在某些实施方案中，已用例如本文所述的ELISA或夹心法免疫测定测试了血清或血浆骨膜蛋白水平的患者将具有20ng/ml或更高的总骨膜蛋白水平(嗜酸细胞性阳性)。根据某些实施方案，EIP患者中的总骨膜蛋白水平可以选自血清或血浆中为21ng/ml或更高、22ng/ml或更高、23ng/ml或更高、24ng/ml或更高、25ng/ml或更高、26ng/ml或更高、27ng/ml或更高、28ng/ml或更高、29ng/ml或更高、30ng/ml或更高、31ng/ml或更高、32ng/ml或更高、33ng/ml或更高、34ng/ml或更高、35ng/ml或更高、36ng/ml或更高、37ng/ml或更高、38ng/ml或更高、39ng/ml或更高、40ng/ml或更高、41ng/ml或更高、42ng/ml或更高、43ng/ml或更高、44ng/ml或更高、45ng/ml或更高、46ng/ml或更高、47ng/ml或更高、48ng/ml或更高、49ng/ml或更高、50ng/ml或更高、51ng/ml或更高、52ng/ml或更高、53ng/ml或更高、54ng/ml或更高、55ng/ml或更高、56ng/ml或更高、57ng/ml或更高、58ng/ml或更高、59ng/ml或更高、60ng/ml或更高、61ng/ml或更高、62ng/ml或更高、63ng/ml或更高、64ng/ml或更高、65ng/ml或更高、66ng/ml或更高、67ng/ml或更高、68ng/ml或更高、69ng/ml或更高和70ng/ml或更高。
在某些实施方案中，罹患哮喘的患者显示低水平的总血清或血浆骨膜蛋白。在某些实施方案中，EIN患者指已测试了血清或血浆骨膜蛋白水平的患者，其中该血清或血浆骨膜蛋白水平低于20ng/ml。
应理解，EIP状态代表患者的状态，且不依赖于用来测定该状态的测定的类型。因此，可以使用或发展其他嗜酸细胞性炎症诊断测定，包括其他骨膜蛋白测定如ELISA测定和US2012/0156194中所示的骨膜蛋白测定，以用来测试嗜酸细胞性炎症状态和测量总骨膜蛋白水平。还参见Jia等,2012,J.AllergyClin.Immunol.130:647-654和US2012/0156194，其在此以其整体引入作为参考。
本文所用的术语“总骨膜蛋白”至少指骨膜蛋白的同种型1、2、3和4。本领域已知人骨膜蛋白同种型1、2、3和4分别包含以下氨基酸序列：根据NCBI数据库的NP_006466(SEQIDNO:87)、NP_001129406(SEQIDNO:88)、NP_001129407(SEQIDNO:89)和NP_001129408(SEQIDNO:90)，同种型5已进行了部分测序。同种型5包含SEQIDNO:91的氨基酸序列。在一个实施方案中，骨膜蛋白的同种型是人骨膜蛋白。在另一实施方案中，除同种型1-4外，术语总骨膜蛋白还包括人骨膜蛋白的同种型5。在另一实施方案中，总骨膜蛋白是总血清骨膜蛋白或总血浆骨膜蛋白(即来自从全血获得的血清样品或从全血获得的血浆样品的总骨膜蛋白，该全血获自患者)。
在一些实施方案中，对该个体施用的抗CRTh2抗体排除该个体中CRTh2表达细胞。在一些实施方案中，该抗体从肺组织和/或从支气管肺泡灌洗液排除CRTh2表达细胞。在一些实施方案中，与施用该抗体之前的基线相比，该个体中的至少一类CRTh2表达细胞(如从肺)排除了至少约50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％中的任一个。在一些实施方案中，与施用该抗体之前的基线相比，该个体中的至少一类产生细胞因子Th2的细胞(如从肺)排除了至少约50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％中的任一个。本文所用的“基线”指对个体施用本文所述的抗CRTh2抗体之前的水平。可以用本领域已知和本文所述的方法测试施用抗体之前和之后CRTh2表达细胞的水平。
在另一方面，本发明提供包含本文提供的任意抗CRTh2抗体的药物制剂，例如用于任意以上治疗方法。在一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任意抗CRTh2抗体和可药用载体。在另一实施方案中，药物制剂包含本文提供的任意抗CRTh2抗体和至少一种例如下文所述的附加治疗剂。
本发明的抗体可以在治疗中单独或与其他活性剂组合使用。例如，本发明的抗体可以与至少一种附加的治疗剂共同施用。在某些实施方案中，附加治疗剂是吸入型糖皮质激素、短效β2激动剂、长效β2激动剂、长效毒蕈碱性激动剂、白三烯受体拮抗剂、肥大细胞抑制剂(例如色甘酸钠)、CRTh2小分子抑制剂、或其组合。
上文指出的这类联合治疗涵盖组合施用(其中两种或多种治疗剂包含在相同或分开的制剂中)和分开施用，在这种情况下，本发明的抗体的施用可以在施用附加治疗剂和/或佐剂之前发生、与施用附加治疗剂和/或佐剂同时发生和/或在施用附加治疗剂和/或佐剂之后发生。
可以通过任意适宜的手段来施用本发明的抗体(和任意附加治疗剂)，其包括胃肠外、肺内和鼻内，如果希望进行局部处理，则可以病灶内施用。胃肠外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。部分取决于施用是短暂的还是长期的，可以通过任意适宜的途径来给药，例如通过注射，如静脉内或皮下注射。本文考虑多种给药方案，包括但不限于在多种时间点单次或多次施用、快速注射施用和脉冲输注。
将以符合良好医疗实践的方式配制、给药和施用本发明的抗体。此背景中考虑的因素包括待治疗的具体障碍、待治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床病症、障碍的病因、递送活性剂的部位、施用方法、施用日程及医疗从业者已知的其他因素。无需但可选地用目前用来预防或治疗所讨论的障碍的一种或多种活性剂配制抗体。这类其他活性剂的有效量取决于存在于制剂中的抗体的量、障碍或处理的类型及上文讨论的其他因素。这些通常以相同的剂量并用本文所述的给药途径施用，或者本文所述剂量的1％至99％，或以任意剂量，并通过经验/临床上确定为适当的任意途径施用。
对于疾病的预防或治疗，本发明的抗体(在单独使用或与一种或多种其他附加治疗剂组合使用时)的适当剂量将取决于待治疗的疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重度和过程、为了预防性还是治疗性目的而施用抗体、之前的治疗、患者的临床病史和对抗体的反应及主治医师的判断。在一次或一系列的治疗中适宜地对患者施用抗体。取决于疾病的类型和严重度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体可以是例如通过一次或多次分开的施用或通过连续输注来对患者施用的初始候选剂量。取决于上述因素，一个典型的日剂量可以从约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于在几天或更长时间内反复施用，取决于病症，治疗通常将持续直至出现希望的疾病症状抑制。抗体的一个示例性剂量将在从约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此，可以对患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)的一个或多个剂量。这类剂量可以间歇施用，例如每周或每三周(例如，使得患者接受约2至约20或例如约6个剂量的抗体)。可以施用最初较高的负荷剂量，然后施用一个或多个较低的剂量。但是，可以使用其他剂量方案。通过常规技术和测定容易地监测此治疗的进展。
应理解，可以用本发明的免疫缀合物取代或附加至抗CRTh2抗体来进行任意以上制剂或治疗方法的。
制成品和试剂盒
在本发明的另一方面，提供包含用于治疗、预防和/或诊断上述障碍的一种或多种抗CRTh2抗体的制成品或试剂盒。制成品或试剂盒可以进一步包含容器及容器上或伴随容器的标签或包装说明书。适宜的容器包括例如瓶、小管、注射器、IV溶液袋等。容器可以形成自多种材料，如玻璃或塑料。容器容纳本身或与另一组合物组合时对治疗、预防和/或诊断病症有效的组合物，且可以具有无菌接口(例如容器可以是具有可通过皮下注射针头穿孔的塞子的静脉内溶液袋或小管)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装说明书指示该组合物用于治疗所选择的病症。此外，制成品或试剂盒可以包含：(a)组合物包含在其中的第一容器，其中该组合物包含本发明的抗体；和(b)组合物包含在其中的第二容器，其中该组合物包含其他细胞毒性剂或其他治疗剂。本发明的此实施方案中的制成品或试剂盒可以进一步包含指示该组合物可以用来治疗特定病症的包装说明书。备选地或此外，制成品或试剂盒可以进一步包含第二(或第三)容器，该容器包含可药用缓冲液，如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸缓冲盐溶液、林格溶液和葡萄糖溶液。它可以进一步包含商业和用户角度希望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释液、滤器、针头和注射器。
应理解，任意以上制成品或试剂盒可以包含本发明的免疫缀合物来取代或附加至抗CRTh2抗体。
实施例
以下是本发明的方法和组合物的实例。应理解，由于上文所提供的一般描述，可以实施多种其他实施方案。
实施例1.鼠抗人CRTh2抗体的产生
材料和方法
克隆和细胞系
通过RT-PCR从提取自恒河猴和食蟹猴血液的总RNA获得恒河猴和食蟹猴CRTh2cDNA，并克隆入含有氨基端Flag标记、gD标记或无标记的哺乳动物表达载体pRK5载体。将来自Origene的人全长cDNA(GeneBankNM_004778)克隆入含有氨基端Flag标记、gD标记或无标记的载体pRK5。通过序列确认，CRTh2克隆在204位包含丙氨酸，而不是GeneBankNM_004778中所示的缬氨酸(例如SEQIDNO:84，其相对于GeneBank参考序列，具有V204A取代)。
用Fugene6(Roche)将包含CRTh2的质粒转染入293细胞，并用单克隆抗Flag抗体(克隆M2,Sigma)、抗gDAb(克隆952,Genentech)或用特异性抗CRTh2Ab(包括抗人CRTh2的大鼠抗CRTh2抗体BM16(BDPharmingen))确认标记或未标记的CRTh2的表面表达。还通过电穿孔将包含CRTh2的质粒引入小鼠前B细胞系300.19细胞，并用Flag标记表达来确认表面CRTh2表达。还通过抗CRTh2单克隆抗体(包括抗人CRTh2的克隆BM16(BDPharmingen))测定了300.19细胞表面上的CRTh2表达。
抗人CRTh2抗体的产生
为了产生抗人CRTh2抗体，用以下两种方法之一免疫Balb/c小鼠(CharlesRiver)：DNA免疫和细胞免疫。对于DNA免疫，通过每周用50ug含人CRTh2DNA的pRK5载体加上小鼠Flt3-L和GM-CSF作为佐剂进行流体动力学尾静脉注射来免疫Balb/c小鼠。对于细胞免疫，经腹膜内注射每周两次用稀释在PBS中的5x106个用人CRTh2稳定转染的300.19细胞来腹膜内免疫Balb/c小鼠(CharlesRiver,Hollister,CA)。小鼠接受10个剂量，然后在融合前三天进行静脉内20x106个细胞连同腹膜内40x106个细胞的融合前加强。
通过标准方法产生杂交瘤。通过电融合(BTX,Hawthorne,NY)使脾细胞与X63-Ag8.653小鼠骨髓瘤细胞(AmericanTypeCultureCollection,Rockville,MD)融合，并在补充10％胎牛血清(FBS)、4.5g/L葡萄糖、25mMHEPES、0.15mg/ml草酰乙酸、100μg/ml丙酮酸、0.2U/ml胰岛素、2mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素(青霉素-链霉素,Invitrogen,Carlsbad,CA)、NCTC-109(Lonza)、NEAA(Invitrogen)的Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium(DMEM；Lonza,Basel,瑞士)中37℃、7％CO2过夜孵育，然后在补充5.7μM重氮丝氨酸和100μM次黄嘌呤(HA,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的所述培养基中接种入96孔板。培养细胞10天，然后进行ELISA和FACS分析。将来自显示鼠IgG的表达并通过FACS显示强特异性结合的孔的细胞扩大，并通过有限稀释进行亚克隆。将在第二轮亚克隆后显示最高FACS结合的最终克隆扩大用于在生物反应器(IntegraBiosciences,Chur,瑞士)中大规模生产。然后通过之前所述的蛋白A亲和层析(Hongo等,Hybridoma19:303,2000)纯化上清。通过流式细胞术针对结合表达在293细胞或300.19细胞上的人CRTh2的能力筛选纯化的来自杂交瘤的抗体。还在来自人外周血的嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞上测试了结合反应性。将克隆19A2、8B1、31A5和3C12的轻链和重链亚克隆入pRK5载体。所有重链克隆为包含小鼠IgG2aFc区。用标准方法在CHO细胞中产生抗CRTh2抗体。从FUT8-/-CHO细胞系产生无岩藻糖基化的19A2和8B1抗体。
流式细胞术
从健康供体获得人全血，用EL缓冲液(Qiagen)裂解红细胞后用外周血单核细胞(PBMC)进行染色流程。用多种浓度的A467缀合抗CRTh2抗体或用抗CRTh2抗体加第二抗小鼠IgG-PE抗体(JacksonImmunoResearchLaboratory)孵育血细胞。用于染色白细胞群体的抗体如下：FITC-抗人CD15、CD16，PerCP-抗人HLADR和CD4,APC-抗人CD123、CXCR3、CD14、BDCA1，生物素-抗人CCR6，及PE-抗人CCR4。Ab购自BDPharmingen。为了测定调节T细胞上的CRTh2表达，通过MACS分离(MiltenyiBiotec)从人PBMC富集CD4+CD25+T细胞，用抗CRTh2(抗体BM16)进行表面染色，然后用抗FoxP3(BDBioscience)进行胞内染色。为了评估人肥大细胞上的CRTh2表达，通过在含200ng/mLrhIL-6、100ng/mLrhSCF(PeproTech)和30ng/mLrhIL-3(R&Dsystem)的StemPro-34SFM完全培养基(Gibco)中培养新鲜人骨髓CD34+细胞(AllCells)3-4周来产生肥大细胞。用抗CD117、抗CD123和抗FceRI(BDBioscience)染色肥大细胞。为了测定人CRTh2在人CRTh2.Bac.Tg小鼠中的Th2细胞上的表达，将50ul含50ug木瓜蛋白酶的PBS注入小鼠右后爪垫，三天后收集腘淋巴结细胞，并用抗mCD4-PerCP、抗mCD44-FITC和BM16-A647染色。为了检查人CRTh2在人CRTh2.Bac.Tg小鼠中的先天2型T辅助(IT)细胞上的表达，将50ug含小鼠IL-17E的pRK载体通过流体动力学注入尾静脉。三天后，收集肠系膜淋巴结细胞，并用抗mCD117-PE、BM16-A647、碘化丙啶和谱系标记(FITC-标记：CD3、CD4、CD8、B220、FceRI、CD11c、Gr1、NK1.1、F4/80、DX5，及PerCP-标记：CCR3)染色。FITC-抗人CD15、CD16，PerCP-抗人HLADR和CD4，APC-抗人CD123、CXCR3、CD14、BDCA1，生物素-抗人CCR6，及PE-抗人CCR4购自BDPharmingen。从健康猴获得食蟹猴和恒河猴血液，用EL缓冲液(Qiagen)裂解红细胞后用外周血单核细胞(PBMC)进行染色流程。用多种浓度的A467缀合抗CRTh2抗体孵育血细胞。用于染色白细胞群体的抗体如下：FITC-抗人CD123(BDPharmingen)、PE-抗人CD125(BDPharmingen)和PerCP-eFluor710抗人FceRI(eBioscience)。用CellQuestPro软件(BDBiociences)在FACSCalibur流式细胞仪上获取样本，并用Flowjo(TreeStar,Inc)进行数据分析。
CRTh2+记忆CD4+T分离及细胞因子产生的定量
通过MACS分离(MiltenyiBiotec)从来自特应性供体的人PBMC分离未接触的记忆CD4+T细胞，然后用CD45RO-FITC、CD4-PerCP(BDPharmingen)和BM16-PE(MiltenyiBiotec)抗体37℃染色20分钟。通过FacsAria分选仪(BD)分选CRTh2+CD45RO+CD4+和CRTh2-CD45RO+CD4+记忆T细胞。CRTh2+和CRTh2-记忆CD4+T细胞的纯度高于98％。用10ug/mL结合于平板的抗hCD3mAb和1ug/mL可溶性抗hCD28在37℃刺激相同数量的分选细胞48小时。收集上清，用人Bio-Plex(Bio-Rad)抗体固定化小球分析IL-4、IL-5、IL-9、IL-13、IL-17A、TNFα、IFNγ和GM-CSF，按照厂家的流程用Luminex100仪器(Luminex)读板。
放射性配体细胞结合测定(Scatchard分析)
用放射性配体细胞结合测定测定了抗CRTH2抗体与表达重组CRTh2受体的细胞结合的平衡解离常数(KD)。用Iodogen法碘化抗CRTh2抗体，该放射性标记抗体对Fab抗体而言具有19-22μCI/μg的比活性范围，对IgG抗体而言具有10-14μCI/μg的比活性范围。用固定浓度的碘化抗CRTh2抗体与递增浓度的未标记抗CRTh2抗体组合室温孵育表达CRTh2受体的细胞2小时，且包括零添加、仅缓冲液的样品。2小时孵育后，将竞争反应转移至MilliporeMultiscreen滤板，并用结合缓冲液洗涤4次，以将游离的碘化抗体从结合的碘化抗体分开。在WallacWizard1470γ计数器上计数滤板。用NewLigand软件(Genentech)评价结合数据，该软件用Munson和Rodbard的拟合算法来确定抗CRTh2抗体的结合亲和力(Munson和Rodbard,Anal.Biochem,1980；107:220-239)。
表位定位
用EZ-LinkSulfo-NHS-Biotin试剂盒(Pierce/Thermo-Fisher,Rockford,IL)生物素化纯化的小鼠抗-CRTh2单克隆抗体19A2和大鼠抗CRTh2单克隆抗体BM16。通过稳定转染人CRTh2或恒河猴CRTh2的293细胞上的FACS滴定来确认活性。将按10x106细胞/ml的浓度重悬在含1％FBS的PBS中的50ul转染的293细胞加至96孔U形底平板(BDFalcon,FranklinLakes,NJ)，然后加入50μl浓度为20ug/ml的未标记抗体，4℃孵育平板30分钟。将生物素化抗体按通过之前的FACS滴定实验测定的2ug/ml(19A2和BM16)的浓度加至平板，并在4℃孵育平板30分钟。使用离心沉淀细胞后加入200μl含1％FBS的PBS，洗涤细胞两次。然后用藻红蛋白缀合的链霉抗生物素蛋白(Zymed/LifeTechnologies,GrandIsland,NY)4℃孵育细胞30分钟。洗涤细胞，在含1％甲醛的PBS中固定，并在FACSCalibur流式细胞仪(BDBiosciences,SanJose,CA)上通过流式细胞术分析。
人T细胞极化
通过MACS分离(MiltenyiBiotec)从来自健康供体的PBMC分离未接触的幼稚CD4+T细胞。在10ug/mL平板结合的抗CD3mAb和1ug/mL可溶性抗CD28mAb(BDBiociences)的存在下在补充了10％FBS、2mML-谷氨酰胺、50uM2-ME、1mM丙酮酸钠、100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素和1mM非必需氨基酸的完全DMEM培养基中培养细胞。人Th亚型极化条件如下：Th1：10ng/mLrhIL12和2ug/mL抗hIL-4；Th2：20ng/mLrhIL-4(R&DSystem)、2ug/mL抗hIL-12和5ug/mL抗hIFNγ(BDBiosciences)。进行两轮极化，每轮极化由激活期及随后的静息期组成，第二轮再刺激在1ug/mL平板结合的抗CD3mAb和1ug/ml可溶性抗CD28mAb的存在下进行。
钙动员测定
用5μMindo-1/AM和0.2％pluronicF127(MolecularProbe)37℃孵育体外极化的Th2细胞30分钟，洗涤，然后用抗CCR6、抗CCR4、抗CD4和抗CXCR3mAb37℃染色15分钟；洗涤后，用1uM抗CRTh2mAb或同种型对照抗体37℃孵育细胞30分钟，然后用100nMPGD2(Sigma)刺激。通过流式细胞术监测钙释放。
CRTh2功能性cAMP阻断测定
通过测量在毛喉素和PGD2(Sigma；St.Louis,MO)存在下用抗CRTh2孵育重组细胞系cAMPHunterTMCHO-K1CRTh2Gi(DiscoveRx；Fremont,CA)后的细胞cAMP水平来分析抗CRTh2抗体在PGD2-CRTh2信号发放中的阻断活性。简言之，在384孔组织培养板(Corning目录号3707；Corning,NY)中按10,000细胞/孔过夜培养细胞。去除培养基后，每孔加入10μL测试抗体(系列稀释在PBS中)，并在37℃孵育30分钟。然后向每孔加入毛喉素和PGD2，以分别达到12.5μM和4nM的终浓度。37℃再孵育30分钟后，用Envison(PerkinElmer；Waltham,MA)作为化学发光读板器，按厂家的流程用cAMPXS+试剂盒(DiscoveRx)对平板进行cAMP分析。然后用Prism(GraphPadSoftware；LaJolla,CA)分析数据并作图。
人CRTh2BAC转基因小鼠的产生
在BAC载体主链中包含人CRTh2基因的171Kb片段(RPCI人BAC文库11；克隆IDRP11-68H20)购自Invitrogen。通过重组获得28Kb的较短形式。将171Kb或28KbBAC构建体显微注射入从C57BL/6小鼠收集的受精卵母细胞。通过从小鼠尾DNA进行RT-PCR来确定人CRTh2转基因的存在。在所鉴定出的9个建立者中，有7个在通过流式细胞术测试的免疫细胞类型上产生相似的人CRTh2表达模式。在这些品系中，在与来自人PBMC的原代人嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞上的人CRTh2水平相比时，品系85通过流式细胞术证明小鼠嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞上相似的人CRTh2表达水平。
人CRTh2BAC转基因小鼠中抗CRTh2抗体排除血液嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞的测量
在第0天按所示剂量将小鼠或人源化抗人CRTh2抗体或同种型对照抗体(mIgG1：抗gp120抗体；mIgG2a：抗豚草抗体；hIgG1：抗gD抗体)静脉内注入6-8周龄人CRTh2BACtg小鼠。3、6或7天后采集眼血来通过所示流式细胞术分析嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞数目。备选地，在第2、3、7或14天处死一组小鼠，收集血液、脾和骨髓，处理用于通过流式细胞术计数嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。用EL缓冲液(Qiagen)裂解红细胞。用抗CD123-FITC、抗FcεRI-PE和抗CCR3-PerCP染色白细胞、脾细胞或骨髓细胞来检测嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞。用CaliBRITEFITC小球(BDBiosciences)通过流式细胞术来测定绝对细胞数。
人CRTh2BAC转基因小鼠中TNP-OVA诱发的肺炎
在第0天通过腹膜内注射含2mg氢氧化铝的100ul无菌PBS中的50ugTNP-OVA(BiosearchTechnologies)来致敏人CRTh2BACtg小鼠。从致敏后第35天开始，连续7天经喷雾器用雾化的含1％TNP-OVA的PBS攻击小鼠30分钟。在第38至41天，每天一次用100uL含200ug抗人CRTh2抗体克隆19A2mIgG2a(无岩藻糖基化的或野生型)、Fc突变体Ab19A2mIgG2a_DANA或抗豚草对照抗体(mIgG2a)的盐水腹膜内处理小鼠。所有小鼠都在第42天实施安乐死。用20mlPBS通过右心室灌注小鼠来清除肺外周血，取下整个肺用于流式细胞术。通过心脏穿刺采血用于流式细胞术评价。收集BAL用于细胞计数和细胞因子分析。按照厂家的流程通过ELISA(R&D)测定BAL液IL-4和IL-13细胞因子浓度。通过突变2个残基(D265A、N297A)(其废除了Fcγ受体结合)来产生19A2抗体的效应子功能缺陷形式19A2_DANA。
评估抗人CRTh2Ab排除Th2细胞的潜能的人SCID模型
在第-7天，通过白细胞去除术和Ficoll密度梯度离心(GEHealthcare)从血清IgE水平为315ng/mL的特应性供体分离人PBMC。将来自同一供体的PBMC的整分试样冷冻，用于随后转移入小鼠。通过用幼稚CD4+T细胞分离试剂盒II(MiltenyiBiotec130-094-131)排除非CD4+T细胞和记忆T细胞来进一步从PBMC分离未接触的幼稚CD4+T辅助细胞。在偏向Th2的条件下用10ug/mL平板结合的抗CD3(BD555329)和1ug/mL可溶性抗CD28(BD555725)刺激纯化的幼稚CD4+T细胞三天：5ug/mL抗人IFNg(BD554698)、2ug/mL抗IL12(BD554659)和20ng/mL重组人IL-4(R&DSystem204-IL)。将在Th2条件下刺激的CD4+T细胞用于转移入SCID-beige小鼠的实验。
在第0天，用来自铯137源的3.5Gy亚致死剂量照射SCID-beige小鼠(CharlesRiver)。将100ulPBS中的人T细胞按以下混合物经腹膜内注射转入小鼠：6x107极化T细胞(如上文所述)和4x107来自同一供体的活的之前冷冻的PBMC。在第0天和第3天将含100ug抗人IFNg和100ug抗人IL-12抗体的100ulPBS腹膜内注入小鼠。在第1、2天和第3天将100ng重组人IL-4腹膜内注入小鼠。在细胞转移前的第0天及在第3天用含200ug抗人CRTh2抗体(克隆19A2，无岩藻糖基化的)或抗豚草同种型对照抗体的100uLPBS处理小鼠。在第7天对所有小鼠实施安乐死，并收集脾。用PdBu(50ng/mL)和离子霉素(500ng/mL)37℃离体刺激脾细胞4.5小时，用于通过FACS评估胞内细胞因子水平。用抗hCD4对细胞进行表面染色，并在同一通道中用抗mCD45、抗mTer119和抗hCD19染色，以排除这些谱系阳性细胞。固定细胞，并用抗hIFNg和抗hIL-4染色。
排除IT2细胞的模型
为了增加人CRTh2.Bac.Tg小鼠中先天2型T辅助(IT)细胞的数目，将含50ug/小鼠IL-17E的pRK5载体在1.6ml林格液中通过流体动力学注入尾静脉。三天后，收集肠系膜淋巴结细胞，通过用抗mCD117-PE、BM16-A647染色，排除谱系阳性细胞以及死细胞(谱系：CD3、CD4、CD8、B220、FceRI、CD11c、Gr1、NK1.1、F4/80、DX5和CCR3)，通过流式细胞术来测定IT2细胞百分比和数目。
结果
CRTh2在哮喘相关细胞上表达
用抗人CRTh2抗体(克隆BM16)通过流式细胞术评估了来自人PBMC的细胞或培养的人细胞上的CRTh2表达(图1)。如最近所报道(Mjosberg,Nat.Imm.12(11):1055-62(2011))，CRTh2选择性表达在人血液嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、极化Th2细胞、骨髓衍生肥大细胞上，以及先天2型T辅助(IT2)细胞上。CRTh2不表达在极化Th1细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、单核细胞和调节T细胞上。在B细胞、NK细胞、NKT细胞和血小板上未检测到CRTh2表达(数据未显示)。
CRTh2细胞与Th2细胞因子产生相关
为了评估CRTh2表达在与Th2细胞因子产生相关的T细胞亚型上，FACS分选CRTh2+和CRTh2-记忆CD4T细胞，并用抗CD3和抗CD28抗体刺激来评估Th2细胞因子产生。在与CRTh2-记忆CD4T细胞群体相比时，CRTh2+记忆CD4T细胞产生超过95％的记忆T细胞Th2细胞因子(图2)。所测试的其他供体显示相似的结果。
抗人CRTh2抗体的产生和体外表征
从用不含佐剂的过量表达人CRTh2的300.19细胞免疫的Balb/c小鼠产生抗人CRTh2抗体。
按本文所述产生的抗CRTh2抗体以剂量依赖性方式结合过量表达人CRTh2的293细胞或300.19细胞，但不结合293或300.19野生型细胞(图3A和3B)。还测试了抗人CRTh2Ab与在293或300.19细胞中过量表达的食蟹猴(cyno)或恒河猴CRTh2的交叉反应性。除克隆19A2外，这些Ab中没有一种显示与食蟹猴或恒河猴CRTh2的交叉反应性，克隆19A2显示与表达在293细胞上的食蟹猴CRTh2的弱交叉反应性。抗人CRTh2抗体还以剂量依赖性方式与来自人全血的原代人嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞反应。根据其结合过量表达在293细胞或300.19细胞表面上的人CRTh2的能力，以及其与来自人外周血单核细胞(PBMC)的原代嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞的相对反应性，选择候选抗人CRTh2抗体(图3)。从上述免疫产生的所有其他抗体都结合人CRTh2，但不与食蟹猴或恒河猴CRTh2交叉反应(数据未显示)。还测试了人源化克隆h19A2.v1和克隆h19A2.v12与表达在293细胞或300.19细胞上的CRTh以及与原代血液嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞上的CRTh2的交叉反应性。类似于19A2，人源化h19A2.v1与表达在293细胞(图3D)、300.19细胞(图3E)上的人CRTh2及原代血液嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞(图3F)上的CRTh2反应，与过量表达在293或300.19细胞上的食蟹猴CRTh2具有弱交叉反应性。人源化h19A2.v1不与过量表达的293或300.19细胞系及原代恒河猴血液嗜碱性粒细胞上的恒河猴CRTh2反应。相反，人源化和改造的抗体h19A2.v12以剂量依赖性方式与表达在293细胞(图3D)或300.19细胞(图3E)上的人、食蟹猴和恒河猴CRTh2以及与原代血液嗜碱性粒细胞(图3F)上的人、食蟹猴和恒河猴CRTh2反应。此外，抗体h19A2.v12还在原代人血液嗜酸性粒细胞上检测到CRTh2。
进行了同源竞争放射性标记配体分析来评估抗CRTh2抗体与293细胞和300.19细胞上表面表达的人CRTh2的解离常数(KD)。小鼠抗人CRTh2克隆19A2和8B1(整个IgG)与表达人CRTh2的293细胞的KD值分别为2nM和2.6nM。抗体19A2与300.19细胞的KD值为10.2nM(图4A)。为了获得人源化抗体h19A2.v12和h19A2.v60的KD值的直接测量结果(measurement)，产生这些抗体的Fab片段，并进行放射性配体细胞结合测定(图4B)。h19A2.v12和h19A2.v60(IgG的Fab片段)与表达人CRTh2的293细胞的KD值分别为51nM和56nM。h19A2.v12和h19A2.v60(IgG的Fab片段)与表达食蟹猴CRTh2的293细胞的KD值分别为152nM和39nM。根据这些测量结果，h19A2.12对人和食蟹猴CRTh2的相对结合亲和力在3倍之内，而h19A2.v60对人和食蟹猴CRTh2的相对结合亲和力似乎等效(图4B)。
为了获得人源化抗体h19A2.v52和h19A2.v46的KD值的直接测量结果，产生这些抗体的Fab片段，并进行放射性配体细胞结合测定(图15)。h19A2.v52和h19A2.v46(IgG的Fab片段)与表达人CRTh2的293细胞的KD值分别为13.7nM和6.4nM。h19A2.v52和h19A2.v46(IgG的Fab片段)与表达食蟹猴CRTh2的293细胞的KD值分别为21.3nM和8.6nM。
为了评估抗CRTh2抗体的阻断功能，在抗CRTh2或同种型对照抗体的存在下检查了体外极化的Th2细胞响应配体前列腺素(PGD2)的钙动员。8B1和3C12预孵育细胞完全阻止了响应PGD2的钙流动，而31A5显示部分效应。用抗CRTh219A2抗体孵育未显著影响CA2+流动(图5)，表明19A2是CRTh2的非阻断性抗体，这与可阻断CRTh2功能的8B1和3C12不同。
人CRTh2的转基因小鼠模型的产生
为了在体内表征抗CRTh2抗体的排除能力，通过将BAC载体上的人CRTh2基因引入C57BL/6受精卵母细胞来产生转基因小鼠模型(人CRTh2.Bac.Tg小鼠)(图6A)。虽然在7个建立者中确认了血液嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞上的人CRTh2表达，但未能检测到hCRTh2在hCRTh2.Bac.tg品系中的小鼠Th2细胞上的表达。对三个代表性建立者品系进行了更详细的分析(数据未显示)。在分别与原代人血液嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞以及骨髓衍生的人肥大细胞(图6B)相比时，人CRTh2.Bac.Tg小鼠的建立者品系85显示小鼠血液嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞以及腹膜肥大细胞上相似的人CRTh2表达水平。因此，将建立者85hCRTh2.Bac.Tg小鼠用于所有随后的体内排除研究。此外，建立者品系85在小鼠先天2型T辅助(IT)细胞上表达人CRTh2，但在与来自PBMC的人IT2细胞上的表达相比时，表达水平似乎更低。
抗CRTh2抗体排除人CRTh2.Bac.Tg小鼠中的血液嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞
为了测试抗CRTh2抗体是否可以在体内排除CRTh2+嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞，按所示对CRTh2.Bac.Tg小鼠施用一个剂量的19A2或3C12抗体(图7A)。如通过流式细胞术所测定，处理后第3天，单个剂量的19A2或3C12完全排除了人CRTh2.Bac.Tg小鼠中的外周血中的嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞(图7A)。在处理后第7天仍然观察到嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞的显著排除。如在处理后第6天所评估，8B1和19A2抗体也在单个剂量的抗体之后从血液排除嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞(图7B)。
抗CRTh2抗体在人CRTh2.Bac.Tg小鼠中的TNP-OVA诱发慢性哮喘模型中排除肺中的嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞
为了评估抗CRTh2抗体是否可以排除组织内的CRTh2+细胞，在TNP-OVA诱发慢性哮喘模型中检查了抗CRTh2抗体处理的效应。腹膜内200ug/小鼠的治疗方案中的4个剂量的抗体19A2彻底排除了肺嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞，还排除了80％的肺肥大细胞(图8)。此外，支气管肺泡灌洗液(BALF)中的Th2细胞因子IL-4和IL-13分别减少100％和48％(图8B)。
抗CRTh2抗体排除SCID小鼠中Th2细胞因子产生细胞
由于未在人CRTh2.Tg小鼠中的Th2细胞(CD4+CD44hi)上检测到人CRTh2表达，未能在人CRTh2.Bac.Tg小鼠中评估Th2细胞排除。为了评价抗CRTh2抗体是否可以在体内排除Th2细胞因子产生细胞，将体外极化的人Th2细胞转入SCID小鼠，每周用抗CRTh2或同种型对照Ab处理两次，并在给药开始后第7天用PMA和离子霉素离体刺激后评估产生IL-4的细胞。胞内IL-4染色表明，19A2抗CRTh2抗体处理排除了92％的产生IL-4的细胞，而产生IFNg的细胞未减少(图9A)。
抗CRTh2排除人CRTh2.Bac.Tg小鼠中的先天2型细胞
为了评估抗CRTh2抗体排除先天2型(IT2)细胞(也称为先天2型淋巴样细胞或ILC2细胞)，通过将含有IL-17E的质粒注入hCRTh2.Bac.Tg小鼠来增加IT2细胞数目。用单个剂量的抗hCRTh2或同种型对照抗体静脉内处理小鼠，并在处理后第3天通过流式细胞术检测肠系膜淋巴结中的IT2细胞百分比和数目。抗hCRTh2处理使hCRTh2.Bac.Tg小鼠中肠系膜淋巴结IT2细胞的百分比和数目显著减少超过50％。
实施例2.抗体人源化和亲和力成熟
生物素化CRTh2在哺乳动细胞中的表达
将人、食蟹猴和恒河猴CRTh2cDNA及具有Q16E或R19H突变的人CRTh2克隆入哺乳动物表达载体pRK5，符合读框地在3’端与编码序列和接头和Avitag序列(GSGGLNDIFEAQKIEWH)融合。还将来自大肠杆菌的BirA生物素连接酶基因克隆入哺乳动物表达载体pRK5。将编码来自各物种的CRTh2的质粒与BirA表达质粒按9:1的比例混合，并在含10％胎牛血清并补充10μM生物素的Dulbecco’sModifiedEagle’s培养基中用Lipofectamine2000试剂(Invitrogen)共转染入293T细胞。转染后24小时收集细胞，并纯化包含生物素化CRTh2的质膜级分。
质膜级分的纯化
在含蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的PBS(150mMNaCl、10mM磷酸钠、pH7.4)中洗涤转染细胞(2.5×108)两次，将细胞沉淀冷冻在-80℃。融化细胞，重悬在4ml裂解缓冲液(1mMEDTA、50mMHEPES缓冲液、pH7.4，含蛋白酶抑制剂混合物)中，在Dounce匀浆器中用紧合杵击打8次来裂解。初始裂解之后，加入4ml含500mM蔗糖的裂解缓冲液，并用紧合杵击打8次来进一步匀浆。通过770×g离心10分钟来去除细胞碎片，并通过17,000×g离心来沉淀上清中的膜物质。将沉淀的膜重悬在6ml含250mM蔗糖的裂解缓冲液中，在Dounce匀浆器中用宽松杵击打8次。通过770×g离心10分钟来去除大的碎片。小心地将上清放在半透明SW40离心管中的4ml含1.12M蔗糖的裂解缓冲液上，并在SW40Ti转头(Beckman)中4℃、25,000转/分钟旋转1小时。用移液管收集高浓度和低浓度蔗糖级分之间界面处的物质，与等体积不含蔗糖的裂解缓冲液混合，并通过4℃、16,000×g离心10分钟来沉淀。将沉淀的质膜重悬在1ml裂解缓冲液中，并保存在-80℃。所有匀浆步骤都在冰上进行。
从昆虫细胞表达和纯化CRTh2
蛋白质表达：将编码人(Homosapiens)和食蟹猴(Macacafascicularis)CRTh2的Ala3-Asp330的DNA克隆入改进的含有C端Avi标记和His8标记的pAcGP67杆状病毒转移载体(BDBiosciences)。使用BaculoGold表达系统(BDBiosciences)，通过在ESF921培养基(ExpressionSystems)中用pAcGP67构建体和线性化杆状病毒DNA共转染Sf9细胞来产生重组杆状病毒。通过三轮扩增产生病毒。类似地产生表达未标记的大肠杆菌BirA(Met1-Lys321)的重组杆状病毒。用40mL两种病毒(CRTh2和BirA)来共感染10L密度为2x106细胞/mL的Tni.PRO细胞。27℃进一步培养细胞48小时，并通过离心来从培养基取出细胞。
蛋白质纯化：通过三次穿过microfluidizer来在含有完全无EDTA蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的50mMTrispH8、200mMNaCl(TBS)中重悬和裂解所收获的细胞沉淀。澄清裂解物后，通过在Ti超速离心机转子(Beckman)中4℃、40K离心2小时来收集膜。将30g膜沉淀重悬在TBS中(10g/L)，并用1％(重量/体积)十二烷基麦芽糖新戊二醇(LMNG,Affymetrix)4℃溶解2小时。澄清后，将样品分批结合在Ni-NTA树脂(Qiagen)上，并用含15mM咪唑的含0.12％(重量/体积)毛地黄皂苷(EMDBiosciences)的TBS洗涤。用含300mM咪唑的相同缓冲液洗脱蛋白质，用100MWKO离心浓缩器(Vivaspin,GEHealthcare)4℃浓缩，并在不含咪唑的TBS-毛地黄皂苷(0.12％)中稀释5倍。通过与蛋白质标准品比较来估计生物素化CRTh2蛋白质浓度；分装样品，并在液氮中速冻。
使用溶解的CRTh2的ELISA
将Neutravidin(Pierce)4℃过夜包被在96孔MaxisorpELISA平板上(2μg/ml于10mM碳酸盐缓冲液、pH9.6中，100μl/孔)，并用含0.5％牛血清白蛋白的PBS(封闭缓冲液)封闭。将含有CRTh2或对照膜蛋白的质膜或纯化的CRTh2稀释在封闭缓冲液中，在1％十二烷基麦芽糖苷(DDM)中冰上裂解15分钟，通过4℃、16,000×g离心30分钟来去除不溶性物质。将溶解的CRTh2或对照膜蛋白稀释在含0.2％DDM的封闭缓冲液中，并加至neutravidin包被的平板。孵育蛋白质10分钟，并用含0.05％DDM的PBS洗涤平板。将抗体系列稀释在含0.2％DDM的封闭缓冲液中，并与所捕获的抗原4℃孵育1小时。按上文所述洗涤平板，并向平板加入稀释在含0.2％DDM的封闭缓冲液中的与过氧化物酶缀合的抗人或抗小鼠IgG。4℃孵育30分钟后，按上文所述洗涤平板，并向平板加入TMB底物。用等体积的1M磷酸终止过氧化物酶反应，并在450nm读取吸光度。所使用的CRTh2蛋白的量足以获得用结合重组人、食蟹猴和恒河猴CRTh2的抗CRTh2Mab通过ELISA测定的孔的饱和。
抗体人源化
通过寡核苷酸定点诱变来将Mab19A2的CDR序列(图10)移植在共有κ1(共有K1)和共有VH3(共有H3)构架(Dennis,M.S.(2010).CDRrepair:Anovelapproachtoantibodyhumanization.InCurrentTrendsinMonoclonalAntibodyDevelopmentandManufacturing,S.J.Shire,W.Gombotz,K.Bechtold-Peters和J.Andya编辑(Springer,NewYork),9–28页)上。还将存在于亲本鼠19A2抗体中的轻链71位(Kabat编号系统)和重链49位的构架残基掺入人源化抗体hu19A2.v1的构架位置(图11A和11B)。通过寡核苷酸定点诱变来将Mab8B1(图12)的CDR序列移植在共有K1和共有VH1(共有H1)构架上。还将存在于亲本鼠8B1抗体中的轻链46、66、69和71位及重链37、67、69、71和91位的构架残基掺入人源化抗体hu8B1.v1的构架位置(图12)。所有抗体都克隆在pRK5载体中。在293T细胞中将人源化抗体表达为人IgG1，并通过蛋白A-琼脂糖上的亲和层析来纯化。通过使用人、食蟹猴和恒河猴CRTh2的ELISA来测定Mab的结合。
亲和力成熟
将hu19A2.v1的重链和轻链可变区克隆在展示与噬菌体M13的p3蛋白融合的Fab片段的噬菌体展示载体中。制备两组“终止”模板载体，其中去除了轻链或重链的全部3个CDR，并用编码终止密码子的序列替换。通过寡核苷酸定点诱变来产生具有随机化的重链或轻链CDR的文库。合成每个CDR的寡核苷酸，其中每个寡核苷酸具有一个随机化为NNK(N＝A、T、C或G；K＝T或G)的密码子。用一组24个寡核苷酸随机化轻链的Kabat位置27至34、50至56和89至97，用一组28个寡核酸随机化Kabat位置26至35、49至58和95至100a。将随机化的文库电穿孔入大肠杆菌XL1-Blue细胞(Agilenttechnologies)，按每个细胞10个颗粒形成单位的感染复数用突变体辅助噬菌体KO7+(Lamboy等,ChemBioChem9:2846–2852(2008))感染，并使其在37℃在含50μg/ml羧苄青霉素和100μg/ml卡那霉素的2YT培养基中过夜恢复和生长。通过离心去除细胞，并通过PEG沉淀(参考文献)来浓缩和纯化上清中展示Fab的噬菌体。对噬菌体进行四轮选择。在每一轮中，使含0.2％DDM的封闭缓冲液中的噬菌体与结合于neutravidin包被的ELISA平板的DDM溶解的具有野生型序列或具有Q16E或R19H突变的人CRTh2在4℃孵育1小时。用含0.05％DDM的PBS洗涤平板，并用100μl的0.1NHCl洗脱噬菌体10分钟。收集噬菌体，通过加入1/8体积的1MTris碱来中和pH。用噬菌体感染大肠杆菌XL1-Blue，并按上文所述繁殖。用来自第四轮的噬菌体感染大肠杆菌XL1-Blue，并平板接种在含50μg/ml羧苄青霉素的LB上，以获得分离的克隆。通过双脱氧链终止法测序克隆，并将每个位置的突变列表。将有利的突变引入人源化hu19A2.v1人IgG1克隆，在人293T细胞中表达IgG，并通过亲和层析纯化。通过ELISA来测试IgG与人、恒河猴和食蟹猴CRTh2的结合。基于包括轻链突变S31W和重链突变Y58D的hu19A2.v12产生第二代文库。除在选择中使用纯化的在Sf9细胞中表达的人和食蟹猴CRTh2抗原及0.12％毛地黄皂苷替代DDM外，按上文所述选择此第二代文库。此外，用在该位置具有简并密码子NHK和VNK的两个寡核苷酸随机化重链的31位，该位置组合编码除色氨酸和半胱氨酸之外的所有氨基酸。在人源化19A2.v58、19A2.v60和19A2.v52中将轻链31位的色氨酸变为酪氨酸。除它在31位包含色氨酸而不是酪氨酸外，19A2.v46在序列上与19A2.52相同。在19A2.v60和其他克隆中将56位天冬氨酸变为谷氨酸，以去除异构化位点。
小鼠和人源化抗人CRTh2抗体的产生和体外表征
测试了人源化克隆h19A2.v1、h19A2.v46和h19A2.v52与表达在293细胞上的人CRTh2的反应性。类似于19A2，人源化抗CRTh2抗体以剂量依赖性方式与表达在293细胞上的人CRTh2反应(图15A)。此外，人源化亲和力成熟克隆h19A2.v12、h19A2.v46和h19A2.v52还显示与表达在293细胞上的食蟹猴和恒河猴CRTh2的剂量依赖性反应性，而人源化抗体h19A2.v1未显示与表达在293细胞上的食蟹猴和恒河猴CRTh2的反应性(图15B)。此外，人源化和亲和力成熟的抗体h19A2.v52以剂量依赖性方式与来自全血的原代人、食蟹猴和恒河猴嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞反应(图15C)。
进行了同源竞争放射性标记配体分析来评估抗CRTh2抗体与293细胞上表面表达的人和食蟹猴CRTh2的解离常数(KD)。为了获得人源化抗体h19A2.v52和h19A2.v46的KD值的直接测量，产生这些抗体的Fab片段(图16)。人源化抗CRTh2克隆19A2.v52和19A2.v46(IgG的Fab片段)与表达人CRTh2的293细胞的KD值分别为13.7nM和6.4nM。19A2.v52和19A2.v46(IgG的Fab片段)与表达食蟹猴CRTh2的293细胞的KD值分别为21.3nM和8.6nM。根据这些测量结果，h19A2.52对人和食蟹猴CRTh2的相对结合亲和力在2倍之内(图16A和B)，而h19A2.v46对人和食蟹猴CRTh2的相对结合亲和力似乎接近等效(图16C和D)。
为了评估人源化和亲和力成熟的抗CRTh2抗体的阻断功能，测试了抗CRTh2抗体对表达人CRTh2的293细胞中毛喉素诱导的cAMP水平的PGD2介导的抑制的影响。用8B1抗体处理毛喉素加PGD2刺激的表达hCRTh2的293细胞以剂量依赖性方式提高cAMP水平(图17A)。因此，8B1抗体以剂量依赖性方式阻断毛喉素诱导的cAMP水平的PGD2介导的降低，表明8B1具有类似于其抑制Th2细胞中响应PGD2的钙流动的能力的PGD2功能阻断能力。相反，h19A2.v52未在毛喉素诱导的cAMP人CRTh2293细胞测定中显示PGD2功能阻断能力。还在缺乏PGD2的情况下测试了抗CRTh2抗体对毛喉素诱导的cAMP水平是否具有直接影响。如图17B中所示，多种浓度的抗CRTh2抗体显示对人CRTh2293细胞中毛喉素诱导的cAMP水平无影响，表明这些抗体在此测定中不显示激动活性。相反，PGD2降低毛喉素诱导的cAMP水平。
为了测试抗CRTh2抗体19A2是否可以在体内排除血液、脾和骨髓中的CRTh2+嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞，按所示对CRTh2.Bac.Tg小鼠施用单个剂量的19A2抗体(图18A和B)。如通过流式细胞术所测定，单个剂量的20ug/小鼠或100ug/小鼠的19A2在处理后第3天完全排除了人CRTh2.Bac.Tg小鼠中的外周血和脾中的嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞，在处理后第7天完全排除了血液、脾和骨髓中的嗜酸性粒细胞(图18A、B和C)。还在处理后第7天在两种剂量水平下观察到脾中嗜碱性粒细胞的显著排除，而骨髓中的嗜碱性粒细胞排除在100ug/小鼠剂量下更显著。血液中嗜碱性粒细胞的排除在处理后第7天可变。
为了测试人源化和亲和力成熟的抗CRTh2抗体h19A2.v52是否可以在体内排除血液、脾和骨髓中的CRTh2+嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞，对人CRTh2.Bac.Tg小鼠施用单个剂量的0.5mg/kg或10mg/kg19A2.v52hIgG1抗体(图19A)。如通过流式细胞术所测定，单个剂量的0.5mg/kg或10mg/kgh19A2.v52在第2天完全排除了人CRTh2.Bac.Tg小鼠中的外周血、脾或骨髓中的嗜酸性粒细胞。在第7天和第14天，嗜酸性粒细胞在10mg/kg剂量下在脾(图19B)和骨髓(图19C)中以及很大程度上在血液(图19A)中保持排除。相反，在0.5mg/kg剂量下，嗜酸性粒细胞在第7天部分及在第14天完全回到血液、脾和骨髓中的基线。此外，在两种剂量水平下在第2天及在10mg/kg剂量下在第7天观察到脾中嗜碱性粒细胞的显著排除，而骨髓中的嗜碱性粒细胞排除在两种剂量下在第2天和第7天都较不显著。嗜碱性粒细胞水平在0.5mg/kg剂量下在第7天回到脾中的基线，在两种剂量下在第14天回到脾和骨髓中的基线。
为了评估抗CRTh2抗体的效应子功能是否为组织内CRTh2+细胞的有效排除所需，在hCRTh2.Bac.Tg小鼠中的TNP-OVA诱发慢性哮喘模型中将Fc突变体抗CRTh219A2_DANA抗体与抗CRTh219A2对先天免疫细胞排除和Th2BAL细胞因子产生的减少的影响相比较。腹膜内200ug/小鼠的治疗方案中4个剂量的抗体19A2使肺嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞分别排除96％、86％和72％(图20A)；相反，19A2_DANA处理仅使肺中的嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞分别部分减少26％、34％和31％(图20A)。此外，19A2处理使支气管肺泡灌洗(BAL)液中的嗜酸性粒细胞排除99％，但19A2_DANA处理仅排除16％。此外，19A处理后BAL液中的Th2细胞因子IL-4减少100％，而19A2_DANA处理仅导致BALIL-4减少20％(图20B)。
表3.抗体mu8B1、hu8B1.v1、mu3C12和mu31A5的KabatCDR序列
鼠抗体可变序列
mu19A2-轻链可变区(SEQIDNO：49)
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mu19A2-重链可变区(SEQIDNO：61)
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mu8B1-轻链可变区(SEQIDNO：50)
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mu8B1-重链可变区(SEQIDNO：62)
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mu3C12-轻链可变区(SEQIDNO：51)
DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQEIGGYLSWLQQKPDGTFKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCLQYANYPYTFGGGTKLEIK
mu3C12-重链可变区(SEQIDNO：63)
QVQLQQSGADLVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIDWVKQRPGQGLEWIGAIHPGSGRTHYNEKFKGKATLTADKSSSAAYMQISSLTSDDSAVFFCARSGGSSFDYYAMDYWGQGTSVTVSS
mu31A5-轻链可变序列(SEQIDNO：53)
DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASVNIYSNLAWYQQRQGKSPQLLVYAATNLAEGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDFGSYYCQHFWVTPYTFGGGTKLEIK
mu31A5-重链可变序列(SEQIDNO：65)
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人源化8B1可变区序列
hu8B1.v1-轻链可变区(SEQIDNO：52)
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hu8B1.v1-重链可变区(SEQIDNO：64)
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人源化19A2可变区序列
hu19A2.v1-轻链可变区(SEQIDNO：38)
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hu19A2.v12-轻链可变区(SEQIDNO：39)
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hu19A2.v38-轻链可变区(SEQIDNO：39)
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hu19A2.v46-轻链可变区(SEQIDNO：39)
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hu19A2.v47-轻链可变区(SEQIDNO：39)
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hu19A2.v51-轻链可变区(SEQIDNO：39)
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hu19A2.v52-轻链可变区(SEQIDNO：40)
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hu19A2.v53-轻链可变区(SEQIDNO：40)
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hu19A2.v57-轻链可变区(SEQIDNO：41)
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hu19A2.v58-轻链可变区(SEQIDNO：42)
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hu19A2.v60-轻链可变区(SEQIDNO：41)
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hu19A2.v61-轻链可变区(SEQIDNO：42)
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hu19A2.v62-轻链可变区(SEQIDNO：41)
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hu19A2.v63-轻链可变区(SEQIDNO：43)
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hu19A2.v64-轻链可变区(SEQIDNO：42)
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hu19A2.v65-轻链可变区(SEQIDNO：43)
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hu19A2.v66-轻链可变区(SEQIDNO：44)
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hu19A2.v67-轻链可变区(SEQIDNO：45)
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hu19A2.v68-轻链可变区(SEQIDNO：44)
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hu19A2.v69-轻链可变区(SEQIDNO：45)
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hu19A2.v70-轻链可变区(SEQIDNO：46)
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hu19A2.v71-轻链可变区(SEQIDNO：47)
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hu19A2.v72-轻链可变区(SEQIDNO：48)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYAATQLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWITPWTFGQGTKVEIK
hu19A2.v1-重链可变区(SEQIDNO：54)
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hu19A2.v12-重链可变区(SEQIDNO：55)
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hu19A2.v38-重链可变区(SEQIDNO：56)
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hu19A2.v46-重链可变区(SEQIDNO：57)
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hu19A2.v47-重链可变区(SEQIDNO：58)
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hu19A2.v51-重链可变区(SEQIDNO：59)
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hu19A2.v52-重链可变区(SEQIDNO：57)
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hu19A2.v53-重链可变区(SEQIDNO：59)
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hu19A2.v57-重链可变区(SEQIDNO：59)
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hu19A2.v58-重链可变区(SEQIDNO：57)
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hu19A2.v60-重链可变区(SEQIDNO：57)
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hu19A2.v61-重链可变区(SEQIDNO：55)
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hu19A2.v62-重链可变区(SEQIDNO：55)
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hu19A2.v63-重链可变区(SEQIDNO：55)
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hu19A2.v64-重链可变区(SEQIDNO：60)
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hu19A2.v65-重链可变区(SEQIDNO：60)
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hu19A2.v66-重链可变区(SEQIDNO：55)
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hu19A2.v67-重链可变区(SEQIDNO：55)
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hu19A2.V68(SEQIDNO：60)
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hu19A2.V69(SEQIDNO：60)
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hu19A2.v70-重链可变区(SEQIDNO：54)
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hu19A2.v71-重链可变区(SEQIDNO：54)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMSWVRQAPGKGLEWVAYISNGGSTTYYPGTVEGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHRTNWDFDYWGQGTLVTVSS
hu19A2.v72-重链可变区(SEQIDNO：54)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMSWVRQAPGKGLEWVAYISNGGSTTYYPGTVEGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHRTNWDFDYWGQGTLVTVSS
人源化19A2全长序列
hu19A2.v1-轻链(SEQIDNO：66)
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hu19A2.v12-轻链(SEQIDNO：67)
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hu19A2.v38-轻链(SEQIDNO：67)
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hu19A2.v46-轻链(SEQIDNO：67)
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hu19A2.v47-轻链(SEQIDNO：67)
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hu19A2.v51-轻链(SEQIDNO：67)
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hu19A2.v53-轻链(SEQIDNO：68)
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hu19A2.v58-轻链(SEQIDNO：70)
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hu19A2.v60-轻链(SEQIDNO：69)
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hu19A2.v61-轻链(SEQIDNO：70)
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骨膜蛋白序列
人骨膜蛋白同种型1NP_006466(SEQIDNO：87)
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人骨膜蛋白同种型2NP_001129406(SEQIDNO：88)
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人骨膜蛋白同种型3NP_001129407(SEQIDNO：89)
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人骨膜蛋白同种型4NP_001129408(SEQIDNO：90)
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人骨膜蛋白同种型5(SEQIDNO：91)
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虽然已为了理解的清晰性的目的以说明和实例的方式较为详细地描述了前述发明，但该描述和实例不应解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容明确以其整体引入作为参考。

Claims (72)

1.分离的抗体，在对人个体施用治疗有效量时，其结合人CRTh2并排除CRTh2表达细胞。
2.权利要求1的抗体，其中抗体排除一种或多种以下类型的CRTh2表达细胞：Th2细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞或先天2型(IT2)细胞。
3.权利要求1或2的抗体，其中已改造抗体来改善ADCC和/或CDC活性。
4.权利要求1或2的抗体，其中已改造抗体来改善ADCC活性和/或降低CDC活性。
5.权利要求1-4中任一项的抗体，其中抗体是无岩藻糖基化的。
6.权利要求5的抗体，其中抗体在α1,6-岩藻糖基转移酶(Fut8)敲除的细胞系中产生。
7.权利要求5的抗体，其中抗体在过量表达β1,4-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnT-III)的细胞系中产生。
8.权利要求7的抗体，其中细胞系还过量表达高尔基体甘露糖苷酶II(ManII)。
9.权利要求3的抗体，其中抗体在Fc区中包含至少一个改善ADCC和/或CDC活性的氨基酸取代。
10.权利要求9的抗体，其中氨基酸取代是S298A/E333A/K334A。
11.权利要求1-10中任一项的抗体，其中抗体是裸抗体。
12.权利要求1-11中任一项的抗体，其中抗体是嵌合抗体。
13.权利要求1-11中任一项的抗体，其中抗体是人源化抗体。
14.权利要求1-11中任一项的抗体，其中抗体是人抗体。
15.权利要求1-14中任一项的抗体，其中抗体是双特异性抗体。
16.权利要求1-14中任一项的抗体，其中抗体是IgG1抗体。
17.权利要求1-16中任一项的抗体，其中抗体竞争性抑制至少一种以下抗体与人CRTh2的结合：19A2、8B1、31A5和3C12。
18.权利要求17的抗体，其中用ELISA测定来测定竞争性结合。
19.权利要求1-18中任一项的抗体，其中抗体结合与至少一种以下抗CRTh2抗体所结合的CRTh2表位相同或重叠的人CRTh2表位：19A2、8B1、31A5和3C12。
20.权利要求1-19中任一项的抗体，其中抗体包含来自以下抗CRTh2抗体之一的六个高变区(HVR)：19A2、8B1、31A5和3C12。
21.权利要求1-16中任一项的抗体，其中抗体结合非人灵长类的CRTh2。
22.权利要求21的抗体，其中抗体结合恒河猴和/或食蟹猴CRTh2。
23.权利要求1-22中任一项的抗体，其中抗体进一步阻断CRTh2信号发放。
24.权利要求1-22中任一项的抗体，其中抗体阻止CRTh2表达细胞响应前列腺素D2的募集。
25.权利要求1-22中任一项的抗体，其中抗体阻断CRTh2表达细胞中的Ca2+流动。
26.权利要求1-25中任一项的抗体，其中抗体以约100nM或更小的Kd值结合人CRTh2。
27.权利要求1的抗体，其中抗体包含：含有SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-H3；含有SEQIDNO:3的氨基酸序列的HVR-L3；及含有X1ISNGGSTTX2YPGTVEG(SEQIDNO:5)的HVR-H2，其中X1是Y或R，X2是Y或D。
28.权利要求1的抗体，其中抗体包含：含有SEQIDNO:35或36的氨基酸序列的HVR-H3；含有SEQIDNO:27的氨基酸序列的HVR-L3；及含有SEQIDNO:32或33的氨基酸序列的HVR-H2。
29.分离的包含轻链可变区和重链可变区的抗CRTh2抗体，其中轻链可变区和重链可变区包含六个高变区(HVR)序列：
(i)含有RASENIYXNLA(SEQIDNO:1)的HVR-L1，其中X是S、W或Y；
(ii)含有AATQLAX(SEQIDNO:2)的HVR-L2，其中X是D、E或S；
(iii)含有QHFWITPWT(SEQIDNO:3)的HVR-L3；
(iv)含有X1YX2MS(SEQIDNO:4)的HVR-H1，其中X1是S或F，X2是S、L或K；
(v)含有X1ISNGGSTTX2YPGTVEG(SEQIDNO:5)的HVR-H2，其中X1是Y或R，X2是Y或D；和
(vi)含有HRTNWDFDY(SEQIDNO:6)的HVR-H3。
30.分离的包含轻链可变区和重链可变区的抗CRTh2抗体，其中轻链可变区包含：含有SEQIDNO:7、8或9的氨基酸序列的HVR-L1；含有SEQIDNO:10、11或12的氨基酸序列的HVR-L2；及含有SEQIDNO:3的氨基酸序列的HVR-L3。
31.权利要求29的抗体，其进一步包含重链可变区，重链可变区包含：含有SEQIDNO:13、14、15、16或17的氨基酸序列的HVR-H1；含有SEQIDNO:18、19、20或21的氨基酸序列的HVR-H2；及含有SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-H3。
32.分离的包含轻链可变区和重链可变区的抗CRTh2抗体，其包含重链可变区，重链可变区包含：含有SEQIDNO:13、14、15、16或17的氨基酸序列的HVR-H1；含有SEQIDNO:18、19、20或21的氨基酸序列的HVR-H2；及含有SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-H3。
33.权利要求29-32中任一项的抗体，其中抗体包含：
(i)含有SEQIDNO:9的氨基酸序列的HVR-L1；
(ii)含有SEQIDNO:10的氨基酸序列的HVR-L2；
(iii)含有SEQIDNO:3的氨基酸序列的HVR-L3；
(iv)含有SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-H1；
(v)含有SEQIDNO:20的氨基酸序列的HVR-H2；和
(vi)含有SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-H3。
34.权利要求29-32中任一项的抗体，其中抗体包含：
(i)含有SEQIDNO:8的氨基酸序列的HVR-L1；
(ii)含有SEQIDNO:10的氨基酸序列的HVR-L2；
(iii)含有SEQIDNO:3的氨基酸序列的HVR-L3；
(iv)含有SEQIDNO:13的氨基酸序列的HVR-H1；
(v)含有SEQIDNO:19的氨基酸序列的HVR-H2；和
(vi)含有SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-H3。
35.权利要求29-32中任一项的抗体，其中抗体包含：
(i)含有SEQIDNO:9的氨基酸序列的HVR-L1；
(ii)含有SEQIDNO:11的氨基酸序列的HVR-L2；
(iii)含有SEQIDNO:3的氨基酸序列的HVR-L3；
(iv)含有SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-H1；
(v)含有SEQIDNO:20的氨基酸序列的HVR-H2；和
(vi)含有SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-H3。
36.分离的包含轻链可变区和重链可变区的抗CRTh2抗体，其中抗体包含选自SEQIDNO:38-53的VL序列。
37.权利要求36的抗体，其中抗体进一步包含选自SEQIDNO:54-65的VH序列。
38.分离的包含轻链可变区和重链可变区的抗CRTh2抗体，其中抗体包含选自SEQIDNO:54-65的VH序列。
39.权利要求36-38中任一项的抗体，抗体包含SEQIDNO:40的VL序列和SEQIDNO:57的VH序列。
40.权利要求36-38中任一项的抗体，抗体包含SEQIDNO:39的VL序列和SEQIDNO:55的VH序列。
41.权利要求36-38中任一项的抗体，其中抗体包含SEQIDNO:41的VL序列和SEQIDNO:57的VH序列。
42.权利要求29-41中任一项的抗体，其中抗体是单克隆抗体。
43.权利要求29-41中任一项的抗体，其中抗体是人源化抗体或嵌合抗体。
44.权利要求29-41中任一项的抗体，其中至少部分构架序列是人共有构架序列。
45.权利要求29-44中任一项的抗体，其中抗体是选自Fab、Fab’-SH、Fv、scFc或(Fab’)2片段的抗体片段。
46.权利要求1-44中任一项的抗体的抗原结合片段。
47.分离的核酸，其编码权利要求1-45中任一项的抗体和权利要求46的抗原结合片段。
48.宿主细胞，其包含权利要求47的核酸。
49.产生抗体的方法，其包括培养权利要求48的宿主细胞，使得产生抗体。
50.权利要求49的方法，其进一步包括回收由宿主细胞产生的抗体。
51.免疫缀合物，其包含权利要求1-45中任一项的抗体或权利要求46的抗原结合片段，以及细胞毒剂。
52.药物组合物，其包含权利要求1-45中任一项的抗体或权利要求46的抗原结合片段，以及可药用载体。
53.用于治疗哮喘的方法，其包括对个体施用有效量的抗CRTh2抗体，其中在个体中，抗体排除CRTh2表达细胞。
54.权利要求53的方法，其中抗体排除一种或多种以下类型的CRTh2表达细胞：Th2细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞或先天2型(IT2)细胞。
55.权利要求53或54的方法，其中抗CRTh2抗体从肺组织排除CRTh2表达细胞。
56.权利要求53-55中任一项的方法，其中抗CRTh2抗体从支气管肺泡灌洗液排除CRTh2表达细胞。
57.权利要求53-55中任一项的方法，其中与施用抗体之前的基线相比，抗CRTh2抗体从肺排除了至少一类CRTh2表达细胞的至少50％。
58.权利要求57的方法，其中与施用抗体之前的基线相比，抗CRTh2抗体从肺排除了至少一类CRTh2表达细胞的至少80％。
59.权利要求57的方法，其中与施用抗体之前的基线相比，抗CRTh2抗体从肺排除了至少一类CRTh2表达细胞的至少90％。
60.权利要求53-59中任一项的方法，其中个体罹患粒细胞缺乏性哮喘。
61.权利要求53-60中任一项的方法，其中施用抗CRTh2抗体后，个体中一种或多种细胞因子的水平降低。
62.权利要求61的方法，其中由至少一种以下细胞类型产生的一种或多种细胞因子的水平降低：Th2细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞或先天2型(IT2)细胞。
63.权利要求61的方法，其中个体中以下一种或多种的水平降低：IL-4、IL-5、IL-9、IL-13、IL-17、组胺或白三烯。
64.权利要求53-59中任一项的方法，其中个体罹患未由吸入型糖皮质激素、短效β2激动剂、长效β2激动剂或其组合完全控制的哮喘。
65.权利要求53-64中任一项的方法，其中个体是人。
66.权利要求53-65中任一项的方法，其中抗CRTh2抗体是权利要求1-45中任一项的抗体或权利要求46的抗原结合片段。
67.用于治疗由CRTh2表达细胞介导的障碍的方法，其包括对个体施用有效量的抗CRTh2抗体，其中在个体中，抗体排除CRTh2表达细胞。
68.权利要求67的方法，其中障碍选自：哮喘、粒细胞缺乏性哮喘、特应性皮炎、变应性鼻炎、急性或慢性呼吸道超敏反应、嗜酸细胞增多综合征、嗜酸性食管炎、Churg-Strauss综合征、特发性肺纤维化、与细胞因子相关的炎症、与CRTh2表达细胞相关的炎症、与CRTh2表达细胞相关的恶性肿瘤、慢性特发性荨麻疹、慢性自发性荨麻疹、物理性荨麻疹、寒冷性荨麻疹、压迫性荨麻疹、大疱性类天疱疮、鼻息肉病、食物过敏和变应性支气管肺曲霉菌病(ABPA)。
69.权利要求67或68的方法，其中抗CRTh2抗体是权利要求1-45中任一项的抗体或权利要求46的抗原结合片段。
70.用于降低个体中细胞因子水平的方法，其包括对个体施用有效量的抗CRTh2抗体，其中在个体中，抗体排除CRTh2表达细胞。
71.权利要求70的方法，其中个体中以下一种或多种的水平降低：IL-4、IL-5、IL-9、IL-13、IL-17、组胺或白三烯。
72.权利要求70或71的方法，其中抗CRTh2抗体是权利要求1-45中任一项的抗体或权利要求46的抗原结合片段。
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