JP2024509191A - 抗ｖｉｓｔａ構築物およびその使用 - Google Patents
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Abstract
本出願は、ＶＩＳＴＡに結合する抗ＶＩＳＴＡ構築物（例えば、抗ＶＩＳＴＡ抗体）、抗ＶＩＳＴＡのアミノ酸配列をコードする核酸分子、核酸分子を含むベクター、ベクターを含む宿主細胞、抗ＶＩＳＴＡ構築物を調製する方法、抗ＶＩＳＴＡ構築物を含む医薬組成物、および抗ＶＩＳＴＡ構築物または組成物を使用する方法を提供する。例示的な抗ＶＩＳＴＡ構築物には、ＶＩＳＴＡに結合して活性化することができるアゴニスト抗体が含まれる。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年３月５日に出願された米国仮出願第６３／１５７，１８２号に基づく優先権を主張し、その内容は、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
本出願は、２０２１年３月５日に出願された米国仮出願第６３／１５７，１８２号に基づく優先権を主張し、その内容は、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
技術分野
本開示は、抗ＶＩＳＴＡ構築物（抗ＶＩＳＴＡ抗体など）およびその使用に関する。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出物
本開示は、抗ＶＩＳＴＡ構築物（抗ＶＩＳＴＡ抗体など）およびその使用に関する。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出物
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出物の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：配列表（ファイル名：１９３８５２０００４４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０２２年３月２日、サイズ：２４，７３９バイト）のコンピュータ可読形式（ＣＲＦ）。
本出願の背景
ＶＩＳＴＡ（プログラム死－１ホモログ、ＰＤ－１Ｈ、ＶＳＩＲ、Ｄｉｅｓ１、ＤＤ１α、Ｇｉ２４としても公知）は、Ｔ細胞および骨髄細胞上に発現されるＢ７／ＣＤ２８遺伝子ファミリーの細胞表面阻害分子である。ＶＩＳＴＡは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対する阻害リガンドとして機能し、未知の受容体を介してＴ細胞応答を調節することができる。さらに、ＶＩＳＴＡは、Ｔ細胞上の阻害性受容体としても機能し得る。例えば、アゴニストＶＩＳＴＡモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を劇的に調節し、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）および実験的肝炎からマウスを保護する。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドでＶＩＳＴＡを欠損したマウス（Ｂ６ ＰＤ－１Ｈ ＫＯ）は、ループスに罹りやすい株と戻し交配した場合、実験的自己免疫性脳脊髄炎および全身性狼瘡などの自己免疫誘導をより受けやすい。ＶＩＳＴＡは、末梢免疫寛容に関与し、Ｔ細胞活性化を負に調節することが示されている。例えば、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１９ Ｄｅｃ １１；１１（５２２）を参照のこと。
ＶＩＳＴＡ（プログラム死－１ホモログ、ＰＤ－１Ｈ、ＶＳＩＲ、Ｄｉｅｓ１、ＤＤ１α、Ｇｉ２４としても公知）は、Ｔ細胞および骨髄細胞上に発現されるＢ７／ＣＤ２８遺伝子ファミリーの細胞表面阻害分子である。ＶＩＳＴＡは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対する阻害リガンドとして機能し、未知の受容体を介してＴ細胞応答を調節することができる。さらに、ＶＩＳＴＡは、Ｔ細胞上の阻害性受容体としても機能し得る。例えば、アゴニストＶＩＳＴＡモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を劇的に調節し、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）および実験的肝炎からマウスを保護する。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドでＶＩＳＴＡを欠損したマウス（Ｂ６ ＰＤ－１Ｈ ＫＯ）は、ループスに罹りやすい株と戻し交配した場合、実験的自己免疫性脳脊髄炎および全身性狼瘡などの自己免疫誘導をより受けやすい。ＶＩＳＴＡは、末梢免疫寛容に関与し、Ｔ細胞活性化を負に調節することが示されている。例えば、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１９ Ｄｅｃ １１；１１（５２２）を参照のこと。
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、特許出願および公開特許出願の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願の簡潔な要旨
一態様における本出願は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体部分を含む抗ＶＩＳＴＡ構築物を提供し、抗体部分は、第二の重鎖可変領域（ＶＨ－２）および第二の軽鎖可変領域（ＶＬ－２）を含む抗体または抗体断片とＶＩＳＴＡの結合エピトープについて競合し、
ａ）ＶＨ－２は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬ－２は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む；
ｂ）ＶＨ－２は、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬ－２は、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む；
ｃ）ＶＨ－２は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬ－２は、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む；
ｄ）ＶＨ－２は、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬ－２は、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号３０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む；または
ｅ）ＶＨ－２は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬ－２は、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号３８のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む。
一態様における本出願は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体部分を含む抗ＶＩＳＴＡ構築物を提供し、抗体部分は、第二の重鎖可変領域（ＶＨ－２）および第二の軽鎖可変領域（ＶＬ－２）を含む抗体または抗体断片とＶＩＳＴＡの結合エピトープについて競合し、
ａ）ＶＨ－２は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬ－２は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む；
ｂ）ＶＨ－２は、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬ－２は、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む；
ｃ）ＶＨ－２は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬ－２は、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む；
ｄ）ＶＨ－２は、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬ－２は、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号３０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む；または
ｅ）ＶＨ－２は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬ－２は、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号３８のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨは、ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含み；ＶＬは、ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含み；ＶＬは、ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含み；ＶＬは、ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含み；ＶＬは、ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含み；ＶＬは、ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、ｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号４２もしくは５１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み；ＶＬは、ｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、ｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号４４もしくは５２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み；ＶＬは、ｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号５６もしくは５７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、ｉ）配列番号４１もしくは４３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５８のいずれかのアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１１もしくは４５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み；ＶＬは、ｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号５０もしくは５３のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む。
別の態様における本出願は、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体部分を含む抗ＶＩＳＴＡ構築物であって、
ａ）配列番号７に示される配列を有するＶＨ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３、ならびに配列番号８に示される配列を有するＶＬ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３；
ｂ）配列番号１５に示される配列を有するＶＨ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３、ならびに配列番号１６に示される配列を有するＶＬ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３；
ｃ）配列番号２３に示される配列を有するＶＨ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３、ならびに配列番号２４に示される配列を有するＶＬ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３；
ｄ）配列番号３１に示される配列を有するＶＨ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３、ならびに配列番号３２に示される配列を有するＶＬ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３；または
ｅ）配列番号３９に示される配列を有するＶＨ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３、ならびに配列番号４０に示される配列を有するＶＬ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３を含む、抗ＶＩＳＴＡ構築物を提供する。
ａ）配列番号７に示される配列を有するＶＨ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３、ならびに配列番号８に示される配列を有するＶＬ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３；
ｂ）配列番号１５に示される配列を有するＶＨ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３、ならびに配列番号１６に示される配列を有するＶＬ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３；
ｃ）配列番号２３に示される配列を有するＶＨ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３、ならびに配列番号２４に示される配列を有するＶＬ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３；
ｄ）配列番号３１に示される配列を有するＶＨ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３、ならびに配列番号３２に示される配列を有するＶＬ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３；または
ｅ）配列番号３９に示される配列を有するＶＨ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３、ならびに配列番号４０に示される配列を有するＶＬ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３を含む、抗ＶＩＳＴＡ構築物を提供する。
上記の抗ＶＩＳＴＡ構築物のいずれかによるいくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号７、１５、２３、３１および３９のいずれか１つのアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含み；および／または、ＶＬは、配列番号８、１６、２４、３２および４０のいずれか１つのアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含み；ＶＬは、配列番号８のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号１５のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含み；ＶＬは、配列番号１６のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号２３のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含み；ＶＬは、配列番号２４のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３１のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含み；ＶＬは、配列番号３２のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３９のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含み；ＶＬは、配列番号４０のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含む。
上記の抗ＶＩＳＴＡ構築物のいずれかによるいくつかの実施形態では、抗体部分は、全長抗体、二重特異性抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、Ｆｖ－Ｆｃ融合物、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合物、ｓｃＦｖ－Ｆｖ融合物、ダイアボディ、トリボディ、およびテトラボディからなる群から選択される抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、抗体部分は全長抗体である。
上記の抗ＶＩＳＴＡ構築物のいずれかによるいくつかの実施形態では、抗体部分は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来のＦｃ断片、ならびにそれらの組み合わせおよびハイブリッドからなる群から選択されるＦｃ断片を有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、およびそれらの組み合わせおよびハイブリッドからのＦｃ断片からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、対応する野生型Ｆｃ断片と比較して低下したエフェクター機能を有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、対応する野生型Ｆｃ断片と比較して長い半減期を有する。
上記の抗ＶＩＳＴＡ構築物のいずれかによるいくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ構築物の抗体部分は、ＶＩＳＴＡの下流シグナル伝達経路を活性化する。
上記の抗ＶＩＳＴＡ構築物のいずれかによるいくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ構築物は、ＶＩＳＴＡのアゴニスト抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ構築物の抗体部分は、ＶＩＳＴＡの下流シグナル伝達経路を少なくとも約２０％活性化または増加させる。
上記の抗ＶＩＳＴＡ構築物のいずれかによるいくつかの実施形態では、ＶＩＳＴＡはヒトＶＩＳＴＡである。
別の態様における本出願は、上記の抗ＶＩＳＴＡ構築物と、薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物を提供する。
別の態様における本出願は、上記の抗ＶＩＳＴＡ構築物をコードする単離された核酸を提供する。
別の態様における本出願は、上記の単離された核酸配列を含むベクターを提供する。
別の態様における本出願は、上記の単離された核酸配列またはベクターを含む単離された宿主細胞を提供する。
別の態様における本出願は、治療剤または標識に連結された、上記の抗ＶＩＳＴＡ構築物を含む免疫コンジュゲートを提供する。
別の態様における本出願は、抗ＶＩＳＴＡ構築物を産生する方法であって、ａ）上記の単離された宿主細胞を、抗ＶＩＳＴＡ構築物を発現するのに有効な条件下で培養することと、ｂ）発現された抗ＶＩＳＴＡ構築物を宿主細胞から得ることとを含む方法を提供する。
別の態様における本出願は、個体における疾患または症状を処置する方法であって、有効量の上記の抗ＶＩＳＴＡ構築物または医薬組成物を個体に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、症状の疾患は、調節不全の免疫系に関連する。いくつかの実施形態では、疾患または症状は、自己免疫疾患、炎症、感染、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）または移植に関連する症状である。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、皮膚エリテマトーデス、関節リウマチ、乾癬、自己免疫性腸障害、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、円板状エリテマトーデス（ＤＬＥ）から選択される。いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ構築物は、個体に静脈内または皮下投与される。いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ構築物は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。
別の態様における本出願は、上記の抗ＶＩＳＴＡ構築物を含むキットを提供する。
本出願の詳細な説明
本出願は、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する新規な抗ＶＩＳＴＡ構築物、抗ＶＩＳＴＡ構築物を調製する方法、構築物を使用する方法（例えば、疾患または症状を処置する方法）を提供する。例示的な抗ＶＩＳＴＡ構築物には、ＶＩＳＴＡに結合して活性化することができるアゴニスト抗体が含まれる。
本出願は、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する新規な抗ＶＩＳＴＡ構築物、抗ＶＩＳＴＡ構築物を調製する方法、構築物を使用する方法（例えば、疾患または症状を処置する方法）を提供する。例示的な抗ＶＩＳＴＡ構築物には、ＶＩＳＴＡに結合して活性化することができるアゴニスト抗体が含まれる。
Ｉ．定義
「抗体」という用語は、その最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、全長抗体およびその抗原結合フラグメントを含むがこれらに限定されない様々な抗体構造を包含する。「抗体部分」という用語は、全長抗体またはその抗原結合フラグメントを指す。
「抗体」という用語は、その最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、全長抗体およびその抗原結合フラグメントを含むがこれらに限定されない様々な抗体構造を包含する。「抗体部分」という用語は、全長抗体またはその抗原結合フラグメントを指す。
全長抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む。軽鎖および重鎖の可変領域は、抗原結合を担う。重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ「ＶＨ」および「ＶＬ」と呼ばれることがある。両方の鎖の可変領域は、一般に、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの高度に可変なループを含む（ＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ、およびＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ）。本明細書に開示される抗体および抗原結合断片のＣＤＲ境界は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、またはＡｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ １９９７；Ｃｈｏｔｈｉａ １９８５；Ｃｈｏｔｈｉａ １９８７；Ｃｈｏｔｈｉａ １９８９；Ｋａｂａｔ １９８７；Ｋａｂａｔ １９９１）の慣例によって定義または同定され得る。重鎖または軽鎖の３つのＣＤＲは、ＣＤＲよりも高度に保存されており、超可変ループを支持するための足場を形成するフレームワーク領域（ＦＲ）として公知の隣接するストレッチの間に介在する。重鎖および軽鎖の定常領域は抗原結合に関与しないが、様々なエフェクター機能を示す。抗体は、その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づいてクラスに割り当てられる。抗体の５つの主要なクラスまたはアイソタイプは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭであり、それぞれα、δ、ε、γおよびμ重鎖の存在を特徴とする。主要な抗体クラスのいくつかは、ＩｇＧ１（γ１重鎖）、ＩｇＧ２（γ２重鎖）、ＩｇＧ３（γ３重鎖）、ＩｇＧ４（γ４重鎖）、ｌｇＡ１（α１重鎖）、またはｌｇＡ２（α２重鎖）などのサブクラスに分けられる。キメラＦｃ領域（ＩｇＧ２／４混合物など）も本明細書で企図される。
本明細書で使用される「抗原結合フラグメント」という用語は、例えば、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ二量体（二価ダイアボディ）、１またはそれを超えるＣＤＲを含む抗体の一部から形成された多重特異性抗体、ラクダ状単一ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、二価ドメイン抗体、または抗原に結合するが完全な抗体構造を含まない任意の他の抗体フラグメントを含む抗体フラグメントを指す。抗原結合フラグメントは、親抗体または親抗体フラグメント（例えば、親ｓｃＦｖ）が結合する同じ抗原に結合することができる。いくつかの実施形態では、抗原結合フラグメントは、フラグメント異なるヒト抗体由来のフレームワーク領域にグラフトされた特定のヒト抗体由来の１またはそれを超えるＣＤＲを含み得る。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。このフラグメントは、１つの重鎖可変領域ドメインと１つの軽鎖可変領域ドメインとが密接に非共有結合した二量体からなる。これらの２つのドメインのフォールディングから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に対する抗原結合特異性を付与する６つの超可変ループ（それぞれ重鎖および軽鎖からの３つのループ）が生じる。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、抗原を認識して結合する能力を有するが、結合部位全体よりも低い親和性であることが多い。
「単鎖Ｆｖ」（「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略される）は、単一のポリペプチド鎖に連結されたＶＨおよびＶＬ抗体ドメインを含む抗体フラグメントである。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの総説については、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」という用語は、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見られる不連続な抗原結合部位を意味することを意図している。これらの特定の領域は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９－６６１６（１９７７）；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９９１）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）；Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７３：９２７－９４８（１９９７）；ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６）；Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４５：３８３２－３８３９（２００８）；Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７：５５－７７（２００３）；およびＨｏｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３０９：６５７－６７０（２００１）に記載されており、ここで、定義は、互いに比較した場合のアミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。それにもかかわらず、抗体またはグラフト抗体またはその改変体のＣＤＲを指すためのいずれかの定義の適用は、本明細書で定義および使用される用語の範囲内であることが意図される。上記で引用した参考文献のそれぞれによって定義されるＣＤＲを包含するアミノ酸残基を、比較として以下の表１に示す。ＣＤＲ予測アルゴリズムおよびインターフェースは当技術分野で公知であり、例えば、Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４５：３８３２－３８３９（２００８）；Ｅｈｒｅｎｍａｎｎ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３８：Ｄ３０１－Ｄ３０７（２０１０）；およびＡｄｏｌｆ－Ｂｒｙｆｏｇｌｅ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４３：Ｄ４３２－Ｄ４３８（２０１５）。この段落で引用された参考文献の内容は、本出願で使用するため、および本明細書の１またはそれを超える請求項中の包含の可能性のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＣＤＲ配列は、ＩＭＧＴ定義に基づく。例えば、ＣＤＲ配列は、ＶＢＡＳＥ２ツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇ／ｖｂａｓｅ２．ｐｈｐ、組込みＶ遺伝子データベースであるＲｅｔｔｅｒ Ｉ，Ａｌｔｈａｕｓ ＨＨ，Ｍｕｎｃｈ Ｒ，Ｍｕｌｌｅｒ Ｗ：ＶＢＡＳＥ２も参照されたい。Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００５ Ｊａｎ １；３３（データベース発行）：Ｄ６７１－４、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）によって決定され得る。
「Ｋａｂａｔにおける可変ドメイン残基ナンバリング」または「Ｋａｂａｔにおけるアミノ酸位置ナンバリング」という表現およびその変形は、上記のＫａｂａｔらの抗体の編集の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに使用されるナンバリングシステムを指す。このナンバリングシステムを使用して、実際の線状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたは超可変領域（ＨＶＲ）の短縮または挿入に対応するより少ないまたは追加のアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後の単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）および重鎖ＦＲ残基８２の後の挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂおよび８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔナンバリングは、抗体の配列と「標準的な」Ｋａｂａｔナンバリング配列との相同性領域でのアラインメントによって、所与の抗体について決定され得る。
本明細書中で他に示されない限り、免疫グロブリン重鎖における残基のナンバリングは、上記のＫａｂａｔらにおけるＥＵインデックスのナンバリングである。「ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基ナンバリングを指す。
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書で定義されるＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト抗体に由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域（ＨＶＲ）由来の残基が、所望の抗体特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基で置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体には見られない残基を含むことができる。これらの改変は、抗体の性能をさらに改良するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、超可変ループのすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲのすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、必要に応じて、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（典型的にはヒト免疫グロブリンのもの）の少なくとも一部を含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３－３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３－５９６（１９９２）を参照のこと。
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体であり、および／または本明細書に開示されるヒト抗体を作製するための技術のいずれかを使用して作製されている。ヒト抗体のこの定義は、具体的には、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含む当技術分野で公知の様々な技術を使用して産生することができる。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）。また、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能なのは、Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６－９５（１９９１）に記載される方法である。ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５：３６８－７４（２００１）も参照のこと。ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してそのような抗体を産生するように改変されているが、その内因性遺伝子座が無効化されているトランスジェニック動物、例えば免疫化異種に抗原を投与することによって調製することができる（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）に関する米国特許第６，０７５，１８１号および第６，１５０，５８４号を参照のこと）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体に関するＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７－３５６２（２００６）も参照のこと。
本明細書で同定されるポリペプチドおよび抗体配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」または「相同性」は、任意の保存的置換を配列同一性の一部として考慮して配列を整列させた後の、比較されるポリペプチド中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）、またはＭＵＳＣＬＥソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当技術分野の技術の範囲内である様々な方法で達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書の目的のために、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＭＵＳＣＬＥ（Ｅｄｇａｒ，Ｒ．Ｃ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２（５）：１７９２－１７９７，２００４；Ｅｄｇａｒ，Ｒ．Ｃ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ５（１）：１１３，２００４を使用して生成される。
「相同」とは、２つのポリペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性または配列同一性を指す。２つの比較された配列の両方の位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占められている場合、例えば２つのＤＮＡ分子のそれぞれの位置がアデニンによって占められている場合、分子はその位置で相同である。二つの配列間の相同性のパーセントは、比較した位置の数で割った２つの配列が共有する一致または相同位置の数を１００倍した関数である。例えば、２つの配列中の１０個の位置のうち６個が一致または相同である場合、２つの配列は６０％相同である。例として、アミノ酸配列ＴＫＬＥＩＫおよびＴＡＬＧＩＥは、５０％の相同性を共有する。一般に、２つの配列が最大の相同性を得るように並べられた場合に比較が行われる。
「定常ドメイン」という用語は、抗原結合部位を含む免疫グロブリンの他の部分、可変ドメインと比較してより保存されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子の部分を指す。定常ドメインは、重鎖のＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（集合的にＣＨ）ならびに軽鎖のＣＨＬ（またはＣＬ）ドメインを含む。
任意の哺乳動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（「κ」）およびラムダ（「λ」）と呼ばれる２つの明確に異なるタイプのうちの１つに割り当てることができる。
「ＣＨ１ドメイン」（「Ｈ１」ドメインの「Ｃ１」とも呼ばれる）は、通常、約アミノ酸１１８から約アミノ酸２１５に及ぶ（ＥＵナンバリングシステム）。
「ヒンジ領域」は、一般に、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６～Ｐｒｏ２３０に対応するＩｇＧ中の領域として定義される（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１－２０６（１９８５））。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間Ｓ－Ｓ結合を形成する最初および最後のシステイン残基を同じ位置に配置することによってＩｇＧ１配列と整列させることができる。
ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」（「Ｃ２」ドメインとも呼ばれる）は、通常、約アミノ酸２３１から約アミノ酸３４０に及ぶ。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接に対になっていないという点で独特である。むしろ、２つのＮ結合分枝炭水化物鎖が、インタクトな天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に挟まれている。炭水化物は、ドメイン－ドメイン対合の代替物を提供し、ＣＨ２ドメインの安定化を助け得ると推測されている。Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌｅｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１－２０６（１９８５）。
「ＣＨ３ドメイン」（「Ｃ２」ドメインとも呼ばれる）は、Ｆｃ領域中のＣＨ２ドメインに対してＣ末端側の残基のストレッチ（すなわち、約アミノ酸残基３４１から抗体配列のＣ末端、典型的にはＩｇＧのアミノ酸残基４４６または４４７まで）を含む。
本明細書における「Ｆｃ領域」または「断片結晶化可能領域」という用語は、天然配列Ｆｃ領域および改変体Ｆｃ領域を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、位置Ｃｙｓ２２６のアミノ酸残基またはＰｒｏ２３０のアミノ酸残基からそのカルボキシル末端まで伸びるように定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵナンバリングシステムによる残基４４７）は、例えば、抗体の産生もしくは精製中に、または抗体の重鎖をコードする核酸を組換え操作することによって除去され得る。場合によっては、Ｆｃ領域の後続のＣ末端グリシン（ＥＵナンバリングシステムによる残基４４６）も除去され得る。したがって、インタクトな抗体の組成物は、すべてのＫ４４７残基が除去された抗体集団、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体集団、およびＫ４４７残基を有するおよび有しない抗体の混合物を有する抗体集団を含み得る。本明細書中に記載される抗体において使用するための好適な天然配列Ｆｃ領域としては、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２（ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ）、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４が挙げられる。
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載する。好ましいＦｃＲは、天然配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含むものであり、これらの受容体の対立遺伝子改変体および選択的にスプライシングされた形態を含み、ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）を含み、これらは主にその細胞質ドメインが異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する。（Ｍ．Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３－２３４（１９９７）を参照のこと。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７－９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５－３４（１９９４）；およびｄｅ Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０－４１（１９９５）で概説されている。新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲＮ）は、本明細書に包含される。将来同定されるものを含む他のＦｃＲもまた、本明細書において「ＦｃＲ」という用語に包含される。
本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、抗体または抗体部分が結合する抗原上の原子またはアミノ酸の特定の群を指す。２つの抗体または抗体部分は、抗原に対する競合的結合を示す場合、抗原内の同じエピトープに結合し得る。
本明細書で使用される場合、第一の抗体またはそのフラグメントは、第一の抗体またはそのフラグメントが等モル濃度の第一の抗体またはそのフラグメントの存在下で第二の抗体またはそのフラグメントの標的抗原結合を少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％のいずれか１つ）阻害する場合、標的抗原への結合について第二の抗体またはそのフラグメントと「競合」し、またはその逆も同様である。交差競合に基づく抗体の「ビニング」のための高スループットプロセスは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ０３／４８７３１に記載されている。
本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」、「特異的に認識する」および「に特異的である」という用語は、生物学的分子を含む不均一な分子集団の存在下で標的の存在を決定する、標的と抗体または抗体部分との間の結合などの測定可能かつ再現可能な相互作用を指す。例えば、標的（エピトープであり得る）を特異的に認識する抗体または抗体部分は、他の標的への結合よりも高い親和性、アビディティで、より容易に、および／またはより長い持続時間でこの標的に結合する抗体または抗体部分である。いくつかの実施形態では、無関係な標的に対する抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定して、標的に対する抗体の結合の約１０％未満である。いくつかの実施形態では、標的に特異的に結合する抗体は、≦１０－５ Ｍ、≦１０－６ Ｍ、≦１０－７ Ｍ、≦１０－８ Ｍ、≦１０－９ Ｍ、≦１０－１０ Ｍ、≦１０－１１ Ｍ、または≦１０－１２ Ｍの解離定数（ＫＤ）を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、異なる種由来のタンパク質の間で保存されているタンパク質上のエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、特異的結合は、排他的結合を含み得るが、それを必要としない。抗体または抗原結合ドメインの結合特異性は、当技術分野で公知の方法によって実験的に決定することができる。そのような方法は、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ－、ＲＩＡ－、ＥＣＬ－、ＩＲＭＡ－、ＥＩＡ－、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）－試験およびペプチドスキャンを含むが、これらに限定されない。
「単離された」抗体（または構築物）は、その産生環境の構成要素（例えば、天然または組換え）から同定、分離および／または回収されたものである。好ましくは、単離されたポリペプチドは、その産生環境からの他のすべての構成要素と会合していない。
本明細書に記載の構築物、抗体、またはその抗原結合フラグメントをコードする「単離された」核酸分子は、それが産生された環境においてそれが通常会合している少なくとも１つの汚染核酸分子から同定および分離される核酸分子である。好ましくは、単離された核酸は、産生環境に関連するすべての構成要素と会合していない。本明細書中に記載されるポリペプチドおよび抗体をコードする単離された核酸分子は、それが自然界で見出される形態または状況以外の形態である。したがって、単離された核酸分子は、細胞内に天然に存在する本明細書に記載のポリペプチドおよび抗体をコードする核酸とは区別される。単離された核酸は、その核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、その核酸分子は染色体外に、またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
「制御配列」という用語は、特定の宿主生物における作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適した制御配列には、例えば、プロモーター、必要に応じてオペレーター配列、およびリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが公知である。
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれた場合に「作動可能に連結される」。例えば、プレ配列または分泌リーダーのためのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結されており；プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されており；またはリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されている場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結されている」とは、連結されているＤＮＡ配列が連続していることを意味し、分泌リーダーの場合、連続しており、リーディングフレーム内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続している必要はない。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが従来の慣例に従って使用される。
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、ならびにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。
本明細書で使用される「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞に移入または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外因性核酸でトランスフェクト、形質転換または形質導入された細胞である。細胞は、初代対象細胞およびその子孫を含む。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養物」という用語は互換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞には、「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞および継代数を問わずそれに由来する子孫が含まれる。子孫は、親細胞と核酸含有量が完全に同一でなくてもよく、変異を含有してもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫が本明細書に含まれる。
「免疫コンジュゲート」という用語は、本明細書に記載の抗体部分などの抗体に対する治療剤または検出可能な標識の共有結合への言及を含む。連結は、リンカー（ペプチドリンカーなど）を介して直接的または間接的であり得る。
本明細書で使用される場合、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。本出願の目的のために、有益なまたは所望の臨床結果には、それだけに限らないが、以下のうちの１つまたは複数が含まれる：疾患に起因する１またはそれを超える症候の緩和、疾患の程度の縮小、疾患の安定化（例えば、疾患の悪化の予防または遅延）、疾患の拡大（例えば、転移）の予防または遅延、疾患の再発の予防または遅延、疾患の進行の遅延または減速、疾患状態の改善、疾患の寛解（部分的または全体）の提供、疾患を処置するに必要な１またはそれを超える他の医薬の用量の低下、疾患の進行の遅延、生活の質の向上もしくは改善、体重増の増加、および／または生存期間の延長。本出願の方法は、処置のこれらの態様のいずれか１またはそれを超える態様を企図する。
「阻害」または「阻害する」という用語は、任意の表現型特性の減少もしくは停止、またはその特性の発生率、程度もしくは可能性の減少もしくは停止を指す。「低減する」または「阻害する」ことは、基準と比較して活性、機能、および／または量を減少、低減または停止することである。特定の実施形態では、「低減する」または「阻害する」とは、２０％またはそれを超える全体的な減少を引き起こす能力を意味する。別の実施形態では、「低減する」または「阻害する」とは、５０％またはそれを超える全体的な減少を引き起こす能力を意味する。さらに別の実施形態では、「低減する」または「阻害する」とは、７５％、８５％、９０％、９５％、またはそれを超える全体的な減少を引き起こす能力を意味する。
本明細書で使用される「基準」は、比較目的で使用される任意の試料、標準、またはレベルを指す。基準は、健康および／または非疾患の試料から得ることができる。いくつかの例では、基準は、未処理試料から得ることができる。いくつかの例では、基準は、個体の非疾患または非処置の試料から得られる。いくつかの例では、基準は、個体または患者ではない１またはそれを超える健康な個体から得られる。
本明細書で使用される場合、「疾患の発症を遅延させる」とは、疾患の発症を延期、妨害、緩徐、阻止、安定化、抑制および／または延期することを意味する。この遅延は、処置される疾患および／または個体の病歴に応じて、様々な時間長であり得る。当業者に明らかなように、十分なまたは有意な遅延は、事実上、個体が疾患を発症しないという点で予防を包含し得る。
本明細書で使用される「予防する」は、疾患の素因を有し得るが、疾患とまだ診断されていない個体における疾患の発生または再発に関して予防を提供することを含む。
「対象」、「個体」、および「患者」という用語は、ヒト、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、げっ歯類、または霊長類を含むがこれらに限定されない哺乳動物を指すために本明細書では互換的に使用される。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。
薬剤の「有効量」は、所望の治療的または予防的結果を達成するために、必要な投与量および期間で有効な量を指す。具体的な用量は、選択される特定の薬剤、従うべき投薬レジメン、他の化合物と組み合わせて投与されるかどうか、投与のタイミング、画像化される組織、およびそれが担持される物理的送達系のうちの１つまたは複数に応じて変化し得る。
「医薬製剤」および「医薬組成物」という用語は、有効成分（複数可）の生物学的活性が有効であることを可能にするような形態であり、製剤が投与される個体に対して許容できないほど毒性である追加の構成要素を含まない調製物を指す。そのような製剤は無菌であり得る。
「薬学的に許容され得る担体」は、個体への投与のための「医薬組成物」を一緒に含む治療剤と共に使用するための、当技術分野で慣用的な非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料、製剤補助剤または担体を指す。薬学的に許容され得る担体は、使用される投与量および濃度でレシピエントに非毒性であり、製剤の他の成分と適合性である。薬学的に許容され得る担体は、使用される製剤に適している。
「無菌」製剤は、無菌であるか、または生きている微生物およびその胞子を本質的に含まない。
１またはそれを超えるさらなる治療剤と「組み合わせて」投与することは、任意の順序での同時（同時発生の）および連続または逐次投与を含む。
「同時発生的に（concurrently）」という用語は、本明細書では、投与の少なくとも一部が時間的に重複するか、または１つの治療剤の投与が他の治療剤の投与と比較して短期間内に入る２またはそれを超える治療剤の投与を指すために使用される。例えば、２またはそれを超える治療剤は、約６０分以下、例えば約３０、１５、１０、５、または１分のいずれか以下の時間間隔で投与される。
「逐次」という用語は、本明細書では、１またはそれを超える他の薬剤の投与を中止した後に１またはそれを超える薬剤の投与が連続する２またはそれを超える治療剤の投与を指すために使用される。例えば、２またはそれを超える治療剤の投与は、約１５分を超える、例えば約２０、３０、４０、５０もしくは６０分、１日、２日、３日、１週間、２週間もしくは１ヶ月のいずれかまたはそれを超える時間間隔で投与される。
本明細書で使用される場合、「と組み合わせて」とは、別の処置モダリティに加えて１つの処置モダリティを投与することを指す。したがって、「と組み合わせて」は、個体への他の処置モダリティの投与前、投与中または投与後の１つの処置モダリティの投与を指す。
「添付文書」という用語は、治療用製品の市販パッケージに通例含まれる説明書であって、そのような治療用製品の使用に関する適応症、用法、用量、投与、併用療法、禁忌および／または警告に関する情報を含む説明書を指すために使用される。
「製造品」は、少なくとも１つの試薬、例えば疾患または障害（例えば、がん）を処置するための医薬品、または本明細書に記載のバイオマーカーを特異的に検出するためのプローブを含む任意の製造品（例えば、パッケージまたは容器）またはキットである。特定の実施形態では、製造品またはキットは、本明細書に記載の方法を実施するためのユニットとして促進、配布、または販売される。
本明細書で記載される本出願の実施形態は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」および／または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」ことを含むことが理解される。
本明細書における値またはパラメータの「約」への言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする変動を含む（および説明する）。例えば、「約Ｘ」という記載は、「Ｘ」という記載を含む。
本明細書で使用される場合、値またはパラメータ「ではないもの」への言及は、一般に、値またはパラメータ「以外」を意味し、説明する。例えば、本方法がタイプＸの疾患を処置するために使用されないとは、本方法がタイプＸ以外の疾患を処置するために使用されることを意味する。
ここでいう「約Ｘ～Ｙ」は、「約Ｘ～約Ｙ」と同義である。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ｏｒ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の指示対象を含む。
ＩＩ．抗ＶＩＳＴＡ構築物
本出願は、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗ＶＩＳＴＡ抗体部分を含む抗ＶＩＳＴＡ構築物を提供する。
本出願は、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗ＶＩＳＴＡ抗体部分を含む抗ＶＩＳＴＡ構築物を提供する。
ＶＩＳＴＡ
Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）（ＰＤ－１Ｈ、Ｇｉ２４、Ｄｉｅｓ－１、またはＤＤ１αとも呼ばれる）は、ＣＤ２８／Ｂ７遺伝子ファミリーのより最近に同定された細胞表面共抑制分子である。ＶＩＳＴＡは、抗原提示細胞に対する阻害性リガンドとして機能し、Ｔ細胞応答を調節することができ、遺伝子ノックアウトまたはアンタゴニスト抗体のいずれかによるＶＩＳＴＡの除去は、マウスモデルにおいて腫瘍に対するＴ細胞免疫応答を増強することができることが報告されている。ＶＩＳＴＡはまた、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、急性肝炎、脳炎、ループス、喘息、および乾癬のマウスモデルに示されるように、炎症および自己免疫疾患の調節において重要な役割を果たし得る。ＶＩＳＴＡは、Ｔ細胞上の共阻害性受容体としても機能し得る。ＶＩＳＴＡアゴニスト性ｍＡｂは、抗原特異的ＣＤ４ Ｔ細胞応答を劇的に調節し、ＧＶＨＤ、急性肝炎および喘息からマウスを保護する。Ｆｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８７，１５３７－１５４１（２０１１）；Ｆｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２４，１９６６－１９７５（２０１４）；およびＬｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５，８３８－８４５（２０１８）を参照のこと。前立腺癌患者における上方制御ＶＩＳＴＡは、イピリムマブ（ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂ）に対する耐性とも関連することが示された。さらに、ＶＩＳＴＡを標的とすることは、ＰＤ－１遮断などの他の非冗長経路と相乗作用して、実験マウスモデルにおいて最適な腫瘍クリアランス有効性を達成し得ることが示されている。Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１２，６６８２－６６８７（２０１５）を参照のこと。したがって、ＶＩＳＴＡは、免疫応答の調節における重要な分子であり、免疫療法の潜在的な標的であり得る。
Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）（ＰＤ－１Ｈ、Ｇｉ２４、Ｄｉｅｓ－１、またはＤＤ１αとも呼ばれる）は、ＣＤ２８／Ｂ７遺伝子ファミリーのより最近に同定された細胞表面共抑制分子である。ＶＩＳＴＡは、抗原提示細胞に対する阻害性リガンドとして機能し、Ｔ細胞応答を調節することができ、遺伝子ノックアウトまたはアンタゴニスト抗体のいずれかによるＶＩＳＴＡの除去は、マウスモデルにおいて腫瘍に対するＴ細胞免疫応答を増強することができることが報告されている。ＶＩＳＴＡはまた、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、急性肝炎、脳炎、ループス、喘息、および乾癬のマウスモデルに示されるように、炎症および自己免疫疾患の調節において重要な役割を果たし得る。ＶＩＳＴＡは、Ｔ細胞上の共阻害性受容体としても機能し得る。ＶＩＳＴＡアゴニスト性ｍＡｂは、抗原特異的ＣＤ４ Ｔ細胞応答を劇的に調節し、ＧＶＨＤ、急性肝炎および喘息からマウスを保護する。Ｆｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８７，１５３７－１５４１（２０１１）；Ｆｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２４，１９６６－１９７５（２０１４）；およびＬｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５，８３８－８４５（２０１８）を参照のこと。前立腺癌患者における上方制御ＶＩＳＴＡは、イピリムマブ（ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂ）に対する耐性とも関連することが示された。さらに、ＶＩＳＴＡを標的とすることは、ＰＤ－１遮断などの他の非冗長経路と相乗作用して、実験マウスモデルにおいて最適な腫瘍クリアランス有効性を達成し得ることが示されている。Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１２，６６８２－６６８７（２０１５）を参照のこと。したがって、ＶＩＳＴＡは、免疫応答の調節における重要な分子であり、免疫療法の潜在的な標的であり得る。
ＶＩＳＴＡ遺伝子は１０ｑ２２．１に位置する。これは、チンパンジー、ウシ、マウス、ラット、ニワトリ、ゼブラフィッシュおよびカエルで保存されている。ヒトＶＩＳＴＡ配列は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＭ＿０２２１５３で見出すことができる。ヒトＶＩＳＴＡタンパク質は３１１アミノ酸を有する（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿０７１４３６．１、配列番号５９）。
抗ＶＩＳＴＡ抗体部分
いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ構築物は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体部分を含み、抗体部分は、ＶＩＳＴＡの結合エピトープについて、第二の重鎖可変領域（ＶＨ－２）および第二の軽鎖可変領域（ＶＬ－２）を含む抗体または抗体断片と競合し、ＶＨ－２は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬ－２は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ構築物は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体部分を含み、抗体部分は、ＶＩＳＴＡの結合エピトープについて、第二の重鎖可変領域（ＶＨ－２）および第二の軽鎖可変領域（ＶＬ－２）を含む抗体または抗体断片と競合し、ＶＨ－２は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬ－２は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨは、ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に最大５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含み、ＶＬは、ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に最大５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含む。いくつかの実施形態では、上記のアミノ酸置換は、本出願の表２に示される「例示的な置換」に限定される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、本出願の表２に示される「好ましい置換」に限定される。
いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗ＶＩＳＴＡ抗体に由来するヒト化抗体であり、ＶＨは、ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬは、ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、抗体部分は、配列番号７に示される配列を有するＶＨ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３、ならびに配列番号８に示される配列を有するＶＬ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか１つ）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含み；ＶＬは、配列番号８のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか１つ）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含む。
いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ構築物は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体部分を含み、抗体部分は、ＶＩＳＴＡの結合エピトープについて、第二の重鎖可変領域（ＶＨ－２）および第二の軽鎖可変領域（ＶＬ－２）を含む抗体または抗体断片と競合し、ＶＨ－２は、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬ－２は、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨは、ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に最大５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含み、ＶＬは、ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に最大５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含む。いくつかの実施形態では、上記のアミノ酸置換は、本出願の表２に示される「例示的な置換」に限定される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、本出願の表２に示される「好ましい置換」に限定される。
いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗ＶＩＳＴＡ抗体に由来するヒト化抗体であり、ＶＨは、ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬは、ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、抗体部分は、配列番号１５に示される配列を有するＶＨ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３、ならびに配列番号１６に示される配列を有するＶＬ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号１５のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか１つ）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含み；ＶＬは、配列番号１６のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか１つ）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含む。
いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ構築物は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体部分を含み、抗体部分は、ＶＩＳＴＡの結合エピトープについて、第二の重鎖可変領域（ＶＨ－２）および第二の軽鎖可変領域（ＶＬ－２）を含む抗体または抗体断片と競合し、ＶＨ－２は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬ－２は、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨは、ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に最大５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含み、ＶＬは、ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に最大５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含む。いくつかの実施形態では、上記のアミノ酸置換は、本出願の表２に示される「例示的な置換」に限定される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、本出願の表２に示される「好ましい置換」に限定される。
いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗ＶＩＳＴＡ抗体に由来するヒト化抗体であり、ＶＨは、ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬは、ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、抗体部分は、配列番号２３に示される配列を有するＶＨ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３、ならびに配列番号２４に示される配列を有するＶＬ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号２３のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか１つ）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含み；ＶＬは、配列番号２４のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか１つ）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含む。
いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ構築物は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体部分を含み、抗体部分は、ＶＩＳＴＡの結合エピトープについて、第二の重鎖可変領域（ＶＨ－２）および第二の軽鎖可変領域（ＶＬ－２）を含む抗体または抗体断片と競合し、ＶＨ－２は、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬ－２は、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号３０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨは、ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に最大５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含み、ＶＬは、ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に最大５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含む。いくつかの実施形態では、上記のアミノ酸置換は、本出願の表２に示される「例示的な置換」に限定される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、本出願の表２に示される「好ましい置換」に限定される。
いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗ＶＩＳＴＡ抗体に由来するヒト化抗体であり、ＶＨは、ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬは、ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、抗体部分は、配列番号３１に示される配列を有するＶＨ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３、ならびに配列番号３２に示される配列を有するＶＬ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３１のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか１つ）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含み；ＶＬは、配列番号３２のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか１つ）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含む。
いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ構築物は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体部分を含み、抗体部分は、ＶＩＳＴＡの結合エピトープについて、第二の重鎖可変領域（ＶＨ－２）および第二の軽鎖可変領域（ＶＬ－２）を含む抗体または抗体断片と競合し、ＶＨ－２は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬ－２は、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号３８のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨは、ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に最大５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含み、ＶＬは、ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に最大５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含む。いくつかの実施形態では、上記のアミノ酸置換は、本出願の表２に示される「例示的な置換」に限定される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、本出願の表２に示される「好ましい置換」に限定される。
いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗ＶＩＳＴＡ抗体に由来するヒト化抗体であり、ＶＨは、ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬは、ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、抗体部分は、配列番号３９に示される配列を有するＶＨ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３、ならびに配列番号４０に示される配列を有するＶＬ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３９のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか１つ）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含み；ＶＬは、配列番号４０のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか１つ）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨは、ｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬは、ｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗ＶＩＳＴＡ抗体に由来するヒト化抗体であり、ＶＨは、ｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬは、ｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨは、ｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬは、ｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗ＶＩＳＴＡ抗体に由来するヒト化抗体であり、ＶＨは、ｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬは、ｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨは、ｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬは、ｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗ＶＩＳＴＡ抗体に由来するヒト化抗体であり、ＶＨは、ｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬは、ｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨは、ｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬは、ｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗ＶＩＳＴＡ抗体に由来するヒト化抗体であり、ＶＨは、ｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬは、ｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨは、ｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬは、ｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗ＶＩＳＴＡ抗体に由来するヒト化抗体であり、ＶＨは、ｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬは、ｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨは、ｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬは、ｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗ＶＩＳＴＡ抗体に由来するヒト化抗体であり、ＶＨは、ｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬは、ｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、構築物は、抗体部分は、全長抗体、二重特異性抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、ＶＨＨ、Ｆｖ－Ｆｃ融合物、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合物、ｓｃＦｖ－Ｆｖ融合物、ダイアボディ、トリボディ、およびテトラボディからなる群から選択される抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはそれらである。
いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分は全長抗体である。
いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分はｓｃＦｖである。
いくつかの実施形態では、上記の抗ＶＩＳＴＡ抗体部分は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ならびにそれらの組み合わせおよびハイブリッドからなる群から選択される免疫グロブリンのＦｃ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の抗ＶＩＳＴＡ抗体部分または全長抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ならびにそれらの組み合わせおよびハイブリッドからなる群から選択される免疫グロブリンのＦｃ断片を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、対応する野生型Ｆｃ断片と比較して低下したエフェクター機能を有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、対応する野生型Ｆｃ断片と比較して増強されたエフェクター機能を有する。
いくつかの実施形態では、抗体部分は、本明細書に記載の抗体部分のいずれかのヒト化抗体を含む。
いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分は、ヒトＶＩＳＴＡとカニクイザルＶＩＳＴＡの両方に結合する。いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分は、ヒトＶＩＳＴＡとマウスＶＩＳＴＡの両方に結合する。いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分は、ヒトＶＩＳＴＡ、カニクイザルＶＩＳＴＡおよびマウスＶＩＳＴＡに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分は、カニクイザルＶＩＳＴＡおよび／またはマウスＶＩＳＴＡに結合しない。
いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ構築物の抗体部分は、ＶＩＳＴＡの下流シグナル伝達経路を活性化する。いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ構築物は、ＶＩＳＴＡのアゴニスト抗体である。
いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ構築物の抗体部分は、参照構築物（例えば、ＶＩＳＴＡを活性化しない対応する構築物、例えば、１Ｅ８などの参照アゴニスト抗ＶＩＳＴＡ抗体を含む対応する構築物）と比較して、ＶＩＳＴＡの下流シグナル伝達経路を少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％活性化または増加させる。
いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ構築物は、抗ＶＩＳＴＡ融合タンパク質を含むか、または抗ＶＩＳＴＡ融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ構築物は、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分（例えば、抗ＶＩＳＴＡ ｓｃＦｖ）と、第二の部分とを含む。いくつかの実施形態では、第二の部分は、半減期延長部分を含む。いくつかの実施形態では、半減期延長部分は、アルブミン結合部分（例えば、アルブミン結合抗体部分）である。いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分と半減期延長部分とは、リンカー（例えばペプチドリンカー、例えばＧＳリンカー）を介して連結されている。
いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ構築物は、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分（例えば、本明細書に記載のＶＩＳＴＡ抗体部分のいずれか）および第二の薬剤を含む抗ＶＩＳＴＡイムノコンジュゲートを含むか、または抗ＶＩＳＴＡイムノコンジュゲートである。いくつかの実施形態では、第二の薬剤は治療剤である。いくつかの実施形態では、第二の薬剤は標識である。
いくつかの実施形態では、ＶＩＳＴＡはヒトＶＩＳＴＡである。
ａ）抗体親和性
抗体部分の結合特異性は、当技術分野で公知の方法によって実験的に決定することができる。そのような方法は、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ－、ＲＩＡ－、ＥＣＬ－、ＩＲＭＡ－、ＥＩＡ－、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）－試験およびペプチドスキャンを含むが、これらに限定されない。
抗体部分の結合特異性は、当技術分野で公知の方法によって実験的に決定することができる。そのような方法は、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ－、ＲＩＡ－、ＥＣＬ－、ＩＲＭＡ－、ＥＩＡ－、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）－試験およびペプチドスキャンを含むが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、抗体部分とＶＩＳＴＡとの結合のＫＤは、約１０－７ Ｍ～約１０－１２ Ｍ、約１０－７ Ｍ～約１０－８ Ｍ、約１０－８ Ｍ～約１０－９ Ｍ、約１０－９ Ｍ～約１０－１０ Ｍ、約１０－１０ Ｍ～約１０－１１ Ｍ、約１０－１１ Ｍ～約１０－１２ Ｍ、約１０－７ Ｍ～約１０－１２ Ｍ、約１０－８ Ｍ～約１０－１２ Ｍ、約１０－９ Ｍ～約１０－１２ Ｍ、約１０－１０ Ｍ～約１０－１２ Ｍ、約１０－７ Ｍ～約１０－１１ Ｍ、約１０－８ Ｍ～約１０－１１ Ｍ、約１０－９ Ｍ～約１０－１１ Ｍ、約１０－７ Ｍ～約１０－１０ Ｍ、約１０－８ Ｍ～約１０－１０ Ｍ、または約１０－７ Ｍ～約１０－９ Ｍである。いくつかの実施形態では、抗体部分とＶＩＳＴＡとの間の結合のＫＤは、約１０－７ Ｍ、１０－８ Ｍ、１０－９ Ｍ、１０－１０ Ｍ、１０－１１ Ｍ、または１０－１２ Ｍのいずれか１つよりも強い。いくつかの実施形態では、ＶＩＳＴＡはヒトＶＩＳＴＡである。
いくつかの実施形態では、抗体部分とＶＩＳＴＡとの間の結合のＫｏｎは、約１０３ Ｍ－１ｓ－１～約１０８ Ｍ－１ｓ－１、約１０３ Ｍ－１ｓ－１～約１０４ Ｍ－１ｓ－１、約１０４ Ｍ－１ｓ－１～約１０５ Ｍ－１ｓ－１、約１０５ Ｍ－１ｓ－１～約１０６ Ｍ－１ｓ－１、約１０６ Ｍ－１ｓ－１～約１０７ Ｍ－１ｓ－１、または約１０７ Ｍ－１ｓ－１～約１０８ Ｍ－１ｓ－１である。いくつかの実施形態では、抗体部分とＶＩＳＴＡとの間の結合のＫｏｎは、約１０３ Ｍ－１ｓ－１～約１０５ Ｍ－１ｓ－１、約１０４ Ｍ－１ｓ－１～約１０６ Ｍ－１ｓ－１、約１０５ Ｍ－１ｓ－１～約１０７ Ｍ－１ｓ－１、約１０６ Ｍ－１ｓ－１～約１０８ Ｍ－１ｓ－１、約１０４ Ｍ－１ｓ－１～約１０７ Ｍ－１ｓ－１、または約１０５ Ｍ－１ｓ－１～約１０８ Ｍ－１ｓ－１である。いくつかの実施形態では、抗体部分とＶＩＳＴＡとの間の結合のＫｏｎは、約１０３ Ｍ－１ｓ－１、１０４ Ｍ－１ｓ－１、１０５ Ｍ－１ｓ－１、１０６ Ｍ－１ｓ－１、１０７ Ｍ－１ｓ－１または１０８ Ｍ－１ｓ－１のいずれか１つ以下である。いくつかの実施形態では、ＶＩＳＴＡはヒトＶＩＳＴＡである。
いくつかの実施形態では、抗体部分とＶＩＳＴＡとの間の結合のＫｏｆｆは、約１ ｓ－１～約１０－６ ｓ－１、約１ ｓ－１～約１０－２ ｓ－１、約１０－２ ｓ－１～約１０－３ ｓ－１、約１０－３ ｓ－１～約１０－４ ｓ－１、約１０－４ ｓ－１～約１０－５ ｓ－１、約１０－５ ｓ－１～約１０－６ ｓ－１、約１ｓ－１～約１０－５ ｓ－１、約１０－２ ｓ－１～約１０－６ ｓ－１、約１０－３ ｓ－１～約１０－６ ｓ－１、約１０－４ ｓ－１～約１０－６ ｓ－１、約１０－２ ｓ－１～約１０－５ ｓ－１、または約１０－３ ｓ－１～約１０－５ ｓ－１である。いくつかの実施形態では、抗体部分とＶＩＳＴＡとの間の結合のＫｏｆｆは、少なくとも約１ｓ－１、１０－２ ｓ－１、１０－３ ｓ－１、１０－４ ｓ－１、１０－５ ｓ－１または１０－６ ｓ－１のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、ＶＩＳＴＡはヒトＶＩＳＴＡである。
いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分または抗ＶＩＳＴＡ構築物の結合親和性は、既存の抗ＶＩＳＴＡ抗体（例えば、抗ヒトＶＩＳＴＡ抗体、例えば、１Ｅ８）よりも高い（例えば、ＫＤ値がより小さい）。
ｂ）キメラ抗体またはヒト化抗体
いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分はキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス由来の可変領域）およびヒト定常領域を含む。いくつかの実施形態では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変更されている「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体には、その抗原結合断片が含まれる。
いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分はキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス由来の可変領域）およびヒト定常領域を含む。いくつかの実施形態では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変更されている「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体には、その抗原結合断片が含まれる。
いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、親非ヒト抗体の特異性および親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低下させるためにヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えばＣＤＲ（またはその一部）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（またはその一部）がヒト抗体配列に由来する１またはそれを超える可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、必要に応じて、ヒト定常領域の少なくとも一部も含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体中のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体の特異性または親和性を回復または改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基で置換される。
ヒト化抗体およびその作製方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）に概説されており、例えば以下にさらに記載されている：Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９－１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号、第７，５２７，７９１号、第６，９８２，３２１号、および第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５－３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）グラフトを記載）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９－４９８（１９９１）（「リサーフェシング」を記載）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：４３－６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を記載）；ならびにＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６１－６８（２００５）およびＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２－２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングに対する「ガイド選択」アプローチを記載）。
ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：「ベストフィット」法を使用して選択されたフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照）；軽鎖可変領域または重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；およびＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域またはヒト生殖系列フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）を参照）；およびＦＲライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８－１０６８４（１９９７）およびＲｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１－２２６１８（１９９６）を参照）。
マウス由来抗体のヒト化は、一般的かつ日常的に使用されている技術であることが理解される。したがって、配列表に開示される抗ＶＩＳＴＡ抗体のいずれかおよび全てのヒト化フォーマットは、前臨床または臨床の状況で使用することができることが理解される。参照される抗ＶＩＳＴＡ抗体またはその抗原結合領域のいずれかのヒト化フォーマットがそのような前臨床または臨床の状況で使用される場合、ヒト化フォーマットは、元の非ヒト化フォーマットと同一または類似の生物学的活性およびプロファイルを有すると予想される。
ｃ）ヒト抗体
いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分はヒト抗体（ヒトドメイン抗体またはヒトＤＡｂとして知られている）である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を使用して産生することができる。ヒト抗体は、一般に、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８－７４（２００１），Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０－４５９（２００８）、およびＣｈｅｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４７（４）：９１２－２１（２０１０）に記載されている。完全ヒト単一ドメイン抗体（またはＤＡｂ）を産生することができるトランスジェニックマウスまたはラットは、当技術分野で公知である。例えば、ＵＳ２００９０３０７７８７Ａ１、米国特許第８，７５４，２８７号、ＵＳ２０１５０２８９４８９Ａ１、ＵＳ２０１００１２２３５８Ａ１、およびＷＯ２００４０４９７９４を参照のこと。
いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分はヒト抗体（ヒトドメイン抗体またはヒトＤＡｂとして知られている）である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を使用して産生することができる。ヒト抗体は、一般に、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８－７４（２００１），Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０－４５９（２００８）、およびＣｈｅｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４７（４）：９１２－２１（２０１０）に記載されている。完全ヒト単一ドメイン抗体（またはＤＡｂ）を産生することができるトランスジェニックマウスまたはラットは、当技術分野で公知である。例えば、ＵＳ２００９０３０７７８７Ａ１、米国特許第８，７５４，２８７号、ＵＳ２０１５０２８９４８９Ａ１、ＵＳ２０１００１２２３５８Ａ１、およびＷＯ２００４０４９７９４を参照のこと。
ヒト抗体（例えば、ヒトＤＡｂ）は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体またはヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製され得る。そのような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、染色体外に存在するか、または動物の染色体にランダムに組み込まれた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含む。そのようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は一般に不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７－１１２５（２００５）を参照のこと。例えば、米国特許第６，０７５，１８１号および第６，１５０，５８４号（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術を記載）；米国特許第５，７７０，４２９号（ＨｕＭａｂ（登録商標）を記載）；米国特許第７，０４１，８７０号（Ｋ－Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）を記載）、および米国特許出願番号２００７／００６１９００（ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）を記載）を参照のこと。そのような動物によって生成されたインタクトな抗体からのヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによってさらに改変され得る。
ヒト抗体（例えば、ヒトＤＡｂ）もまた、ハイブリドーマに基づく方法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒト骨髄腫およびマウス－ヒトヘテロミエローマ細胞株が記載されている（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）；およびＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）を参照のこと）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体もまた、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７－３５６２（２００６）に記載されている。さらなる方法としては、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載）およびＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５－２６８（２００６）（ヒト－ヒトハイブリドーマを記載）に記載されているものが挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）はまた、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７－９３７（２００５）およびＶｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５－９１（２００５）に記載されている。
ヒト抗体（例えば、ヒトＤＡｂ）はまた、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって作製され得る。次いで、そのような可変ドメイン配列を所望のヒト定常ドメインと組み合わせることができる。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術を以下に記載する。
ｄ）ライブラリー由来抗体
本明細書中に記載される抗ＶＩＳＴＡ抗体部分は、所望の１つまたは複数の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離され得る。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作製し、所望の結合特性を有する抗体についてそのようなライブラリーをスクリーニングするための様々な方法が当技術分野で公知である。そのような方法は、例えば、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍらのＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）に概説されており、さらに例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７（１９９２）；Ｍａｒｋｓ ａｎｄ Ｂｒａｄｂｕｒｙ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８：１６１－１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）；Ｓｉｄｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９－３１０（２００４）；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３－１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１（３４）：１２４６７－１２４７２（２００４）；ａｎｄ Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８４（１－２）：１１９－１３２（２００４）に記載されている。単一ドメイン抗体ライブラリーを構築するための方法が記載されており、例えば米国特許第７３７１８４９号を参照。
本明細書中に記載される抗ＶＩＳＴＡ抗体部分は、所望の１つまたは複数の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離され得る。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作製し、所望の結合特性を有する抗体についてそのようなライブラリーをスクリーニングするための様々な方法が当技術分野で公知である。そのような方法は、例えば、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍらのＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）に概説されており、さらに例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７（１９９２）；Ｍａｒｋｓ ａｎｄ Ｂｒａｄｂｕｒｙ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８：１６１－１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）；Ｓｉｄｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９－３１０（２００４）；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３－１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１（３４）：１２４６７－１２４７２（２００４）；ａｎｄ Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８４（１－２）：１１９－１３２（２００４）に記載されている。単一ドメイン抗体ライブラリーを構築するための方法が記載されており、例えば米国特許第７３７１８４９号を参照。
ある特定のファージディスプレイ法では、ＶＨおよびＶＬ遺伝子のレパートリーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別々にクローニングし、ファージライブラリーにおいてランダムに組み替え、次いでこれを、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３－４５５（１９９４）に記載されるように抗原結合ファージについてスクリーニングできる。ファージは、典型的には、ｓｃＦｖフラグメントまたはＦａｂフラグメントのいずれかとして抗体フラグメントを提示する。免疫化された供給源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なしに免疫原に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，１２：７２５－７３４（１９９３）に記載されているように、免疫化を一切することなく、ナイーブレパートリーをクローニングして（例えば、ヒト由来）、広範囲の非自己抗原および自己抗原に対する単一の抗体供給源を提供することができる。最後に、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１－３８８（１９９２）によって記載されるように、幹細胞から再編成されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを使用して高度に可変性のＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再編成を達成することによって、ナイーブライブラリーを合成的に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載する特許公報としては、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、ならびに米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号および同第２００９／０００２３６０号が挙げられる。
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体フラグメントは、本明細書ではヒト抗体またはヒト抗体フラグメントと見なされる。
ｅ）置換、挿入、欠失および改変体
いくつかの実施形態では、１またはそれを超えるアミノ酸置換を有する抗体改変体が提供される。置換変異誘発のための関心部位としては、ＨＶＲ（またはＣＤＲ）およびＦＲが挙げられる。保存的置換を「好ましい置換」という見出しの下で表２に示す。より実質的な変化は、「例示的な置換」という見出しの下で表２に提供されており、アミノ酸側鎖クラスを参照して以下にさらに記載される。アミノ酸置換を目的の抗体に導入し、その産物を、所望の活性、例えば、保持された／改善された抗原結合、低下した免疫原性、または改善されたＡＤＣＣもしくはＣＤＣについてスクリーニングすることができる。
いくつかの実施形態では、１またはそれを超えるアミノ酸置換を有する抗体改変体が提供される。置換変異誘発のための関心部位としては、ＨＶＲ（またはＣＤＲ）およびＦＲが挙げられる。保存的置換を「好ましい置換」という見出しの下で表２に示す。より実質的な変化は、「例示的な置換」という見出しの下で表２に提供されており、アミノ酸側鎖クラスを参照して以下にさらに記載される。アミノ酸置換を目的の抗体に導入し、その産物を、所望の活性、例えば、保持された／改善された抗原結合、低下した免疫原性、または改善されたＡＤＣＣもしくはＣＤＣについてスクリーニングすることができる。
アミノ酸は、一般的な側鎖特性に従ってグループ分けされ得る：（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。
１つのタイプの置換改変体は、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１またはそれを超える超可変領域残基を置換することを含む。一般に、さらなる研究のために選択された得られた改変体（複数可）は、親抗体と比較して特定の生物学的特性（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）に改変（例えば、改良）を有する、および／または親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持する。例示的な置換改変体は親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるものなどのファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を使用して簡便に生成することができる。簡潔には、１またはそれを超えるＨＶＲ残基を変異させ、改変体抗体をファージ上に提示し、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。
例えば、抗体親和性を改善するために、ＨＶＲに改変（例えば、置換）を行ってもよい。そのような改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」、すなわち体細胞成熟プロセス中に高頻度で突然変異を受けるコドン（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９－１９６（２００８）を参照）および／またはＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）によってコードされる残基において行われ得、得られた改変体ＶＨまたはＶＬは結合親和性について試験される。二次ライブラリーを構築して再選択することによる親和性成熟は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１））に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施形態では、多様性は、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、またはオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発）のいずれかによって成熟のために選択された可変遺伝子に導入される。次に、二次ライブラリーが作成される。次いで、ライブラリーをスクリーニングして、所望の親和性を有する任意の抗体改変体を同定する。多様性を導入する別の方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４～６残基）をランダム化するＨＶＲ指向アプローチを含む。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニン走査突然変異誘発またはモデリングを使用して特異的に同定され得る。特にＣＤＲ－Ｈ３およびＣＤＲ－Ｌ３がしばしば標的とされる。
いくつかの実施形態では、置換、挿入または欠失は、そのような変更が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、１またはそれを超えるＨＶＲ内で起こり得る。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的変更（例えば、本明細書で提供される保存的置換）をＨＶＲにおいて行うことができる。そのような変更は、ＨＶＲ「ホットスポット」またはＣＤＲの外側であり得る。
突然変異誘発の標的となり得る抗体の残基または領域を同定するための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１－１０８５に記載されている「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、ＬｙｓおよびＧｌｕなどの荷電残基）の残基または群が同定され、中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）で置き換えられて、抗体と抗原との相互作用が影響を受けるかどうか決定される。さらなる置換を、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入することができる。あるいは、またはさらに、抗体と抗原との間の接触点を同定するための抗原－抗体複合体の結晶構造である。そのような接触残基および隣接残基は、置換の候補として標的化または排除され得る。改変体をスクリーニングして、それらが所望の特性を含むかどうかを決定することができる。
アミノ酸配列挿入には、１つの残基から１００個またはそれを超える残基を含有するポリペプチドに及ぶ長さのアミノ末端および／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入改変体には、抗体の血清半減期を増加させる酵素（例えば、ＡＤＥＰＴ用）またはポリペプチドに対する抗体のＮ末端またはＣ末端への融合が含まれる。
ｆ）グリコシル化改変体
いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分は、構築物がグリコシル化される程度を増加または減少させるように変更される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、１またはそれを超えるグリコシル化部位が作成または除去されるようにアミノ酸配列を変更することによって都合よく達成され得る。
いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分は、構築物がグリコシル化される程度を増加または減少させるように変更される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、１またはそれを超えるグリコシル化部位が作成または除去されるようにアミノ酸配列を変更することによって都合よく達成され得る。
抗体部分がＦｃ領域を含む場合、それに結合した炭水化物は変更され得る。哺乳動物細胞によって産生されるネイティブ抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ結合によって一般に結合している分岐型の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６－３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトースおよびシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「ステム」においてＧｌｃＮＡｃに結合したフコースを含み得る。いくつかの実施形態では、抗体部分のオリゴ糖の修飾は、特定の改善された特性を有する抗体改変体を作製するために行われ得る。
いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分は、Ｆｃ領域に（直接的または間接的に）結合したフコースを欠く炭水化物構造を有する。例えば、そのような抗体中のフコースの量は、１％～８０％、１％～６５％、５％～６５％または２０％～４０％であり得る。フコースの量は、例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によって測定した場合のＡｓｎ２９７に結合した全ての糖構造の合計（例えば、複合、ハイブリッドおよび高マンノース構造）に対する、Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域の約２９７位に位置するアスパラギン残基を指すが（Ｆｃ領域残基のＥＵナンバリング）；Ａｓｎ２９７はまた、抗体におけるわずかな配列変化に起因して、位置２９７の約±３アミノ酸上流または下流、すなわち、位置２９４と３００との間に位置する場合がある。そのようなフコシル化改変体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開番号ＵＳ ２００３／０１５７１０８（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）；ＵＳ ２００４／００９３６２１（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体改変体に関連する刊行物の例としては以下が挙げられる：ＵＳ ２００３／０１５７１０８；ＷＯ ２０００／６１７３９；ＷＯ ２００１／２９２４６；ＵＳ ２００３／０１１５６１４；ＵＳ ２００２／０１６４３２８；ＵＳ ２００４／００９３６２１；ＵＳ ２００４／０１３２１４０；ＵＳ ２００４／０１１０７０４；ＵＳ ２００４／０１１０２８２；ＵＳ ２００４／０１０９８６５；ＷＯ ２００３／０８５１１９；ＷＯ ２００３／０８４５７０；ＷＯ ２００５／０３５５８６；ＷＯ ２００５／０３５７７８；ＷＯ２００５／０５３７４２；ＷＯ２００２／０３１１４０；Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９－１２４９（２００４）；Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）。脱フコシル化抗体を産生することができる細胞株の例としては、タンパク質フコシル化が欠損したＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３－５４５（１９８６）；米国特許出願番号ＵＳ ２００３／０１５７１０８ Ａ１，Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ；およびＷＯ ２００４／０５６３１２ Ａ１，Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．、特に実施例１１）、およびノックアウト細胞株、例えばアルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０－６８８（２００６）；およびＷＯ２００３／０８５１０７）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分は、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている、二分オリゴ糖を有する。そのような抗体改変体は、フコシル化の減少および／またはＡＤＣＣ機能の改善を有し得る。そのような抗体改変体の例は、例えばＷＯ ２００３／０１１８７８（Ｊｅａｎ－Ｍａｉｒｅｔら）；米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａら）；およびＵＳ ２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａら）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体改変体も提供される。そのような抗体改変体は、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。そのような抗体改変体は、例えばＷＯ １９９７／３００８７（Ｐａｔｅｌら）；ＷＯ １９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）；およびＷＯ １９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
ｇ）Ｆｃ領域改変体
いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分は、Ｆｃフラグメントを含む。
いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分は、Ｆｃフラグメントを含む。
「Ｆｃ領域」、「Ｆｃドメイン」、「Ｆｃフラグメント」または「Ｆｃ」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端非抗原結合領域を指す。この用語は、天然Ｆｃ領域および改変体Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、重鎖のＣｙｓ２２６からカルボキシル末端まで延在する。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、Ｆｃ領域の構造または安定性に影響を及ぼすことなく、存在しても存在しなくてもよい。本明細書において別段の指定がない限り、ＩｇＧまたはＦｃ領域中のアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されているように、ＥＵインデックスとも呼ばれる抗体のＥＵナンバリングシステムに従う。
いくつかの実施形態では、Ｆｃフラグメントは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、およびそれらの組み合わせおよびハイブリッドからなる群より選択される免疫グロブリンに由来する。いくつかの実施形態では、Ｆｃフラグメントは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、およびそれらの組み合わせおよびハイブリッドからなる群より選択される免疫グロブリンに由来する。
いくつかの実施形態では、Ｆｃフラグメントは、対応する野生型Ｆｃフラグメントと比較して減少したエフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）のレベルによって測定して、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％または９５％減少したエフェクター機能）を有する。
いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片はＩｇＧ１ Ｆｃ断片である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１ Ｆｃ断片は、Ｌ２３４Ａ突然変異および／またはＬ２３５Ａ突然変異を含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１ Ｆｃ断片は、Ｌ２３５Ａ突然変異および／またはＧ２３７Ａ突然変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片はＩｇＧ２またはＩｇＧ４ Ｆｃ断片である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａおよび／またはＬ２３５Ａ突然変異を含むＩｇＧ４ Ｆｃ断片である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、Ｎ２９７Ａ突然変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、Ｎ２９７Ｇ突然変異を含む。
いくつかの実施形態では、１またはそれを超えるアミノ酸修飾を抗体部分のＦｃ領域に導入し、それによってＦｃ領域改変体を生成することができる。Ｆｃ領域改変体は、１またはそれを超えるアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含み得る。
いくつかの実施形態では、Ｆｃフラグメントは、すべてではないが一部のエフェクター機能を有し、これにより、インビボでの抗体部分の半減期が重要であるが、特定のエフェクター機能（補体およびＡＤＣＣなど）が不要または有害である適用の望ましい候補となる。ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認するために、インビトロおよび／またはインビボ細胞傷害アッセイを行うことができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施して、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（したがって、おそらくＡＤＣＣ活性を欠く）が、ＦｃＲｎ結合能を保持することを確実にすることができる。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現を、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７－４９２（１９９１）の４６４頁の表２に要約する。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：７０５９－７０６３（１９８６）を参照）およびＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１４９９－１５０２（１９８５）；５，８２１，３３７（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１－１３６１（１９８７）を参照）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を使用してもよい（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ；およびＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩを参照のこと）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代替において、または、加えて、目的とする分子のＡＤＣＣ活性は、インビボにおいて、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されるような動物モデルにおいて評価され得る。抗体がＣ１ｑに結合することができず、したがってＣＤＣ活性を欠くことを確認するために、Ｃ１ｑ結合アッセイを行うこともできる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号および国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施することができる（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１：１０４５－１０５２（２００３）；およびＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ １０３：２７３８－２７４３（２００４）を参照のこと）。ＦｃＲｎ結合およびインビボでのクリアランス／半減期の決定もまた、当該分野で公知の方法を用いて行うことができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）を参照のこと）。
エフェクター機能が低下した抗体には、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７および３２９のうちの１またはそれを超える置換がされたものが含まれる（米国特許第６，７３７，０５６号）。そのようなＦｃ変異体には、残基２６５および２９７がアラニンに置換されたいわゆる 「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体（米国特許第７，３３２，５８１号）を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７および３２７のうちの２つまたはそれを超える置換を有するＦｃ変異体が含まれる。いくつかの実施形態では、Ｆｃフラグメントは、Ｎ２９７Ａ変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃフラグメントは、Ｎ２９７Ｇ変異を含む。
ＦｃＲへの結合が改善または減少した一定の抗体改変体が記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、およびＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１－６６０４（２００１）を参照のこと。）
いくつかの実施形態では、ＦｃフラグメントはＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントである。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントは、Ｌ２３４Ａ変異および／またはＬ２３５Ａ変異を含む。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントは、Ｌ２３５Ａ変異および／またはＧ２３７Ａ変異を含む。いくつかの実施形態では、ＦｃフラグメントはＩｇＧ２またはＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントである。いくつかの実施形態では、Ｆｃフラグメントは、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａおよび／またはＬ２３５Ａ変異を含むＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントである。
いくつかの実施形態では、抗体部分は、ＡＤＣＣを改善する１またはそれを超えるアミノ酸置換、例えばＦｃ領域の２９８、３３３および／または３３４の位置の置換（残基のＥＵナンバリング）を有するＦｃ領域を含む。
いくつかの実施形態では、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ ９９／５１６４２、およびＩｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８－４１８４（２０００）に記載されるように、Ｃ１ｑ結合および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の変更（すなわち、改善または減少のいずれか）をもたらすＦｃ領域に変更が加えられる。
いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、Ｔｈｒ２５０、Ｍｅｔ２５２、Ｓｅｒ２５４、Ｔｈｅ２５６、Ｔｈｒ３０７。Ｇｌｕ ３８０、Ｍｅｔ４２８、Ｈｉｓ４３３、および／またはＡｓｎ ４３４に１またはそれを超える突然変異を有する。
いくつかの実施形態では、抗体部分改変体は、半減期を変更するおよび／または新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合を変化させる１またはそれを超えるアミノ酸置換を含む改変体Ｆｃ領域を含む。半減期が増加し、母体ＩｇＧの胎児への移行（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））を担う新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体は、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載されている。これらの抗体は、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合を変更する１またはそれを超える置換を有するＦｃ領域を含む。そのようなＦｃ改変体には、Ｆｃ領域残基のうちの１またはそれより多くに置換（例えばＦｃ領域残基４３４の置換）を有するものが含まれる（米国特許第７，３７１，８２６号）。
Ｄｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８－４０（１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；およびＦｃ領域改変体の他の例に関するＷＯ ９４／２９３５１も参照のこと。
ｈ）システイン操作抗体改変体
いくつかの実施形態では、抗体の１またはそれを超える残基がシステイン残基で置換されているシステイン操作抗体部分、例えば「チオＭＡｂ」を作製することが望ましい場合がある。特定の実施形態では、置換残基は、抗体のアクセス可能な部位に存在する。それらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基はそれによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書にさらに記載されるように、抗体を薬物部分またはリンカー－薬物部分などの他の部分にコンジュゲートして免疫コンジュゲートを作製するために使用され得る。いくつかの実施形態では、以下のいずれか１またはそれを超える残基がシステインで置換され得る：重鎖のＡ１１８（ＥＵナンバリング）；および重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵナンバリング）。システイン操作された抗体部分は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されているように生成され得る。
いくつかの実施形態では、抗体の１またはそれを超える残基がシステイン残基で置換されているシステイン操作抗体部分、例えば「チオＭＡｂ」を作製することが望ましい場合がある。特定の実施形態では、置換残基は、抗体のアクセス可能な部位に存在する。それらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基はそれによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書にさらに記載されるように、抗体を薬物部分またはリンカー－薬物部分などの他の部分にコンジュゲートして免疫コンジュゲートを作製するために使用され得る。いくつかの実施形態では、以下のいずれか１またはそれを超える残基がシステインで置換され得る：重鎖のＡ１１８（ＥＵナンバリング）；および重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵナンバリング）。システイン操作された抗体部分は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されているように生成され得る。
ｉ）抗体誘導体
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体部分は、当技術分野で公知であり、容易に入手可能なさらなる非タンパク質性部分を含むようにさらに修飾され得る。抗体の誘導体化に適した部分には、水溶性ポリマーが含まれるが、これらに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、およびデキストランまたはポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、およびそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中での安定性のために、製造において利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量であってもよく、分岐していても分岐していなくてもよい。抗体に結合するポリマーの数は様々であり得、１よりも多くのポリマーが結合する場合、それらは同じまたは異なる分子であり得る。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数および／または種類は、改善される抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が定義された条件下で診断に使用されるかどうかなどを含むがこれらに限定されない考慮事項に基づいて決定することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体部分は、当技術分野で公知であり、容易に入手可能なさらなる非タンパク質性部分を含むようにさらに修飾され得る。抗体の誘導体化に適した部分には、水溶性ポリマーが含まれるが、これらに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、およびデキストランまたはポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、およびそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中での安定性のために、製造において利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量であってもよく、分岐していても分岐していなくてもよい。抗体に結合するポリマーの数は様々であり得、１よりも多くのポリマーが結合する場合、それらは同じまたは異なる分子であり得る。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数および／または種類は、改善される抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が定義された条件下で診断に使用されるかどうかなどを含むがこれらに限定されない考慮事項に基づいて決定することができる。
いくつかの実施形態では、抗体部分は、１またはそれを超える生物学的に活性なタンパク質、ポリペプチドまたはそれらのフラグメントを含むようにさらに改変され得る。「生物活性」または「生物学的に活性」は、本明細書で互換的に使用される場合、特定の機能を実行するための体内の生物学的活性を示すことを意味する。例えば、タンパク質、ＤＮＡなどの特定の生体分子との組み合わせ、次いでそのような生体分子の活性の促進または阻害を意味し得る。いくつかの実施形態では、生物活性タンパク質またはそのフラグメントは、疾患または状態の予防または処置のために活性薬物物質として患者に投与されるタンパク質およびポリペプチド、ならびに診断目的に使用されるタンパク質およびポリペプチド、例えば診断試験またはインビトロアッセイで使用される酵素、ならびに疾患を予防するために患者に投与されるタンパク質およびポリペプチド（ワクチンなど）を含む。
ＩＩＩ．調製方法
いくつかの実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗ＶＩＳＴＡ構築物または抗体部分、および抗ＶＩＳＴＡ構築物または抗体部分の調製中に産生されるポリヌクレオチド、核酸構築物、ベクター、宿主細胞、または培養培地などの組成物を調製する方法が提供される。本明細書中に記載される抗ＶＩＳＴＡ構築物または抗体部分または組成物は、下記において、より具体的には実施例において一般的に記載されるようないくつかのプロセスによって調製され得る。
いくつかの実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗ＶＩＳＴＡ構築物または抗体部分、および抗ＶＩＳＴＡ構築物または抗体部分の調製中に産生されるポリヌクレオチド、核酸構築物、ベクター、宿主細胞、または培養培地などの組成物を調製する方法が提供される。本明細書中に記載される抗ＶＩＳＴＡ構築物または抗体部分または組成物は、下記において、より具体的には実施例において一般的に記載されるようないくつかのプロセスによって調製され得る。
抗体の発現および産生
本明細書に記載される抗体は、以下および実施例に記載されるものを含む、当技術分野における任意の公知の方法を使用して調製することができる。
本明細書に記載される抗体は、以下および実施例に記載されるものを含む、当技術分野における任意の公知の方法を使用して調製することができる。
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団から得られ、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る天然に存在する可能性のある変異および／または翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除いて同一である。したがって、修飾語「モノクローナル」は、別々の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示す。例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法を使用して作製され得るか、または組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製され得る。ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適切な宿主動物、例えばハムスターまたはラマを上記のように免疫化して、免疫化に使用したタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生することができるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化することができる。次いで、リンパ球を、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を使用して骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９－１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）。ラクダにおける免疫化については実施例１も参照されたい。
モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団から得られ、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る天然に存在する可能性のある変異および／または翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除いて同一である。したがって、修飾語「モノクローナル」は、別々の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示す。例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法を使用して作製され得るか、または組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製され得る。ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適切な宿主動物、例えばハムスターまたはラマを上記のように免疫化して、免疫化に使用したタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生することができるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化することができる。次いで、リンパ球を、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を使用して骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９－１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）。ラクダにおける免疫化については実施例１も参照されたい。
免疫化剤は、典型的には、抗原タンパク質またはその融合改変体を含む。一般に、ヒト起源の細胞が望まれる場合は末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が使用されるか、または、非ヒト哺乳動物供給源が望まれる場合は脾臓細胞もしくはリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を使用してリンパ球を不死化細胞株と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する。Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８６），ｐｐ．５９－１０３。
不死化細胞株は、通常、形質転換された哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシおよびヒト起源の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウス骨髄腫細胞株が使用される。このようにして調製されたハイブリドーマ細胞は、好ましくは、融合されていない親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１またはそれを超える物質を含有する適切な培養培地に播種されて成長する。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマの培養培地には、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンが含まれる（ＨＡＴ培地）。
好ましい不死化骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高レベル産生を支持し、ＨＡＴ培地などの培地に感受性であるものである。これらの中でも、ネズミ骨髄腫株、例えば、ＭＯＰＣ－２１およびＭＰＣ－１１マウス腫瘍（Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡから入手可能）、およびＳＰ－２細胞（およびその誘導体、例えばＸ６３－Ａｇ８－６５３）（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．ＵＳＡ．から入手可能）に由来するものが好ましい。ヒト骨髄腫およびマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７））。
ハイブリドーマ細胞が成長している培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、またはインビトロ結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定される。
ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地は、所望の抗原に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイすることができる。好ましくは、モノクローナル抗体の結合親和性および特異性は、免疫沈降によって、またはインビトロ結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定することができる。そのような技術およびアッセイは、当技術分野において公知である。例えば、結合親和性は、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｍｕｎｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）によって決定され得る。
所望の特異性、親和性および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、限界希釈手順によってクローンをサブクローニングし、標準的な方法（Ｇｏｄｉｎｇ、上記）によって成長させることができる。この目的に適した培養培地には、例えば、Ｄ－ＭＥＭまたはＲＰＭＩ－１６４０培地が含まれる。細胞分別機を使用してもよい。さらに、ハイブリドーマ細胞を、哺乳動物において腫瘍としてインビボで成長させることができる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ－セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって培養培地、腹水、または血清から適切に分離される。
モノクローナル抗体はまた、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第４，８１６，５６７号に記載されている方法によって、上記のとおりに作製され得る。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として働く。単離されると、ＤＮＡは発現ベクターに入れられてもよく、発現ベクターはその後、免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、ＨＥＫ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトされ、そのような組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体を合成する。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組換え発現に関する総説論文としては、Ｓｋｅｒｒａら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：２５６－２６２（１９９３）およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．１３０：１５１－１８８（１９９２）が挙げられる。
さらなる実施形態では、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２－５５４（１９９０）に記載されている技術を使用して生成された抗体ファージライブラリーから抗体を単離することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１－５９７（１９９１）には、ファージライブラリーを使用したマウス抗体およびヒト抗体の単離がそれぞれ記載されている。その後の刊行物は、鎖シャッフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）のヒト抗体の産生（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９－７８３（１９９２））、ならびにコンビナトリアル感染およびインビボ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１：２２６５－２２６６（１９９３））を、非常に大きなファージライブラリーを構築するための戦略として記載している。したがって、これらの技術は、モノクローナル抗体を単離するための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術の実行可能な代替法である。
ＤＮＡはまた、例えば、相同マウス配列の代わりにヒト重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１（１９８４））、または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部または一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合することによって改変され得る。典型的には、そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインの代わりに使用されるか、または抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに使用されて、抗原に対して特異性を有する１つの抗原結合部位および異なる抗原に対して特異性を有する別の抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作製する。
本明細書に記載のモノクローナル抗体は一価であってもよく、その調製は当技術分野で周知である。例えば、１つの方法は、免疫グロブリン軽鎖および改変重鎖の組換え発現を含む。重鎖は、重鎖架橋を防ぐために、一般にＦｃ領域の任意の点でトランケートされる。あるいは、関連するシステイン残基は、架橋を防ぐために、別のアミノ酸残基で置換されていてもよく、または欠失されていてもよい。インビトロ法はまた、一価抗体を調製するのにも適している。そのフラグメント、特にＦａｂフラグメントを産生するための抗体の消化は、当技術分野で公知の日常的な技術を用いて達成することができる。
キメラ抗体またはハイブリッド抗体はまた、架橋剤を含む方法を含む合成タンパク質化学における公知の方法を使用してインビトロで調製され得る。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使用して、またはチオエーテル結合を形成することによって構築され得る。この目的に適した試薬の例としては、イミノチオラートおよびメチル－４－メルカプトブチルイミデートが挙げられる。
抗体部分をコードする核酸分子
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物または抗体部分のいずれか１つをコードするポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるような方法のいずれか１つを使用して調製されるポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態では、核酸分子は、抗体部分（例えば、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分）の重鎖または軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、抗体部分（例えば、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分）の重鎖をコードするポリヌクレオチドおよび軽鎖をコードするポリヌクレオチドの両方を含む。いくつかの実施形態では、第一の核酸分子は、重鎖をコードする第一のポリヌクレオチドを含み、第二の核酸分子は、軽鎖をコードする第二のポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物または抗体部分のいずれか１つをコードするポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるような方法のいずれか１つを使用して調製されるポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態では、核酸分子は、抗体部分（例えば、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分）の重鎖または軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、抗体部分（例えば、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分）の重鎖をコードするポリヌクレオチドおよび軽鎖をコードするポリヌクレオチドの両方を含む。いくつかの実施形態では、第一の核酸分子は、重鎖をコードする第一のポリヌクレオチドを含み、第二の核酸分子は、軽鎖をコードする第二のポリヌクレオチドを含む。
いくつかのこのような実施形態では、重鎖および軽鎖は、１つの核酸分子から、または２つの別個の核酸分子から、２つの別個のポリペプチドとして発現される。いくつかの実施形態では、例えば抗体がｓｃＦｖである場合、単一ポリヌクレオチドは、共に連結された重鎖と軽鎖の両方を含む単一ポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、抗体部分（例えば、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分）の重鎖または軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、翻訳されると重鎖または軽鎖のＮ末端に位置するリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含む。上述のように、リーダー配列は、天然の重鎖または軽鎖リーダー配列であってもよく、または別の異種リーダー配列であってもよい。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡはｍＲＮＡである。
核酸分子は、当技術分野で従来の組換えＤＮＡ技術を使用して構築され得る。いくつかの実施形態では、核酸分子は、選択された宿主細胞における発現に適した発現ベクターである。
核酸構築物
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドのいずれか１つを含む核酸構築物が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の任意の方法を使用して調製された核酸構築物が提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドのいずれか１つを含む核酸構築物が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の任意の方法を使用して調製された核酸構築物が提供される。
いくつかの実施形態では、核酸構築物は、ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは遺伝子に対応し、プロモーターは遺伝子の野生型プロモーターである。
ベクター
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体部分（例えば、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分）または本明細書に記載の核酸構築物のいずれか１つの重鎖および／または軽鎖をコードする任意のポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の任意の方法を使用して調製されたベクターが提供される。抗体、ｓｃＦｖ、融合タンパク質または本明細書に記載される構築物の他の形態（例えば、抗ＶＩＳＴＡ ｓｃＦｖ）などの抗ＶＩＳＴＡ構築物のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。そのようなベクターとしては、限定されないが、ＤＮＡベクター、ファージベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられる。いくつかの実施形態では、ベクターは、重鎖をコードする第一のポリヌクレオチド配列および軽鎖をコードする第二のポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖および軽鎖は、２つの別個のポリペプチドとしてベクターから発現される。いくつかの実施形態では、重鎖および軽鎖は、例えば抗体がｓｃＦｖである場合など、単一のポリペプチドの一部として発現される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体部分（例えば、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分）または本明細書に記載の核酸構築物のいずれか１つの重鎖および／または軽鎖をコードする任意のポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の任意の方法を使用して調製されたベクターが提供される。抗体、ｓｃＦｖ、融合タンパク質または本明細書に記載される構築物の他の形態（例えば、抗ＶＩＳＴＡ ｓｃＦｖ）などの抗ＶＩＳＴＡ構築物のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。そのようなベクターとしては、限定されないが、ＤＮＡベクター、ファージベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられる。いくつかの実施形態では、ベクターは、重鎖をコードする第一のポリヌクレオチド配列および軽鎖をコードする第二のポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖および軽鎖は、２つの別個のポリペプチドとしてベクターから発現される。いくつかの実施形態では、重鎖および軽鎖は、例えば抗体がｓｃＦｖである場合など、単一のポリペプチドの一部として発現される。
いくつかの実施形態では、第一のベクターは、重鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、第二のベクターは、軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第一のベクターおよび第二のベクターは、同様の量（同様のモル量または同様の質量など）で宿主細胞にトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、５：１～１：５のモル比または質量比の第一のベクターおよび第二のベクターが宿主細胞にトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、重鎖をコードするベクターと軽鎖をコードするベクターについて１：１～１：５の質量比が使用される。いくつかの実施形態では、重鎖をコードするベクターと軽鎖をコードするベクターについて１：２の質量比が使用される。
いくつかの実施形態では、ＣＨＯもしくはＣＨＯ由来細胞またはＮＳＯ細胞におけるポリペプチドの発現に最適化されたベクターが選択される。例示的なそのようなベクターは、例えば、Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｄｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：８８０－８８９（２００４）に記載されている。
宿主細胞
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の任意のポリペプチド、核酸構築物および／またはベクターを含む宿主細胞が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の任意の方法を使用して調製された宿主細胞が提供される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、発酵条件下で、本明細書に記載の抗体部分のいずれかを産生することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の任意のポリペプチド、核酸構築物および／またはベクターを含む宿主細胞が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の任意の方法を使用して調製された宿主細胞が提供される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、発酵条件下で、本明細書に記載の抗体部分のいずれかを産生することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体部分（例えば、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分）は、原核細胞、例えば細菌細胞；または真核細胞、例えば真菌細胞（酵母など）、植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞で発現され得る。そのような発現は、例えば、当技術分野で公知の手順に従って行われ得る。ポリペプチドを発現するために使用され得る例示的な真核細胞には、ＣＯＳ７細胞を含むＣＯＳ細胞；２９３－６Ｅ細胞を含む２９３細胞；ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－ＧＳ、ＤＧ４４。Ｌｅｃ１３ ＣＨＯ細胞、およびＦＵＴ８ ＣＨＯ細胞を含むＣＨＯ細胞；ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（Ｃｒｕｃｅｌｌ）；ＨＥＫ細胞、およびＮＳＯ細胞が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体部分（例えば、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分）は、酵母で発現され得る。例えば、米国特許出願公開第２００６／０２７００４５号を参照されたい。いくつかの実施形態では、特定の真核宿主細胞は、抗体部分の重鎖および／または軽鎖に所望の翻訳後修飾を行う能力に基づいて選択される。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞は、２９３細胞で産生される同じポリペプチドよりも高いレベルのシアリル化を有するポリペプチドを産生する。
所望の宿主細胞への１またはそれを超える核酸の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染などを含むがこれらに限定されない任意の方法によって達成され得る。非限定的な例示的方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）に記載されている。核酸は、任意の適切な方法に従って、所望の宿主細胞に一過性または安定にトランスフェクトされ得る。
本出願はまた、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドまたはベクターのいずれかを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、抗ＶＩＳＴＡ抗体を含む宿主細胞を提供する。目的の抗体、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を単離する目的で、異種ＤＮＡを過剰発現することができる任意の宿主細胞を使用することができる。哺乳動物宿主細胞の非限定的な例には、ＣＯＳ、ＨｅＬａおよびＣＨＯ細胞が含まれるが、これらに限定されない。ＰＣＴ公開番号ＷＯ８７／０４４６２も参照されたい。適切な非哺乳動物宿主細胞には、原核生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＢ．ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）および酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ；またはＫ．ｌａｃｔｉｓ）が含まれる。
いくつかの実施形態では、抗体部分は無細胞系で産生される。非限定的な例示的な無細胞系は、例えば、Ｓｉｔａｒａｍａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４９８：２２９－４４（２００９）；Ｓｐｉｒｉｎ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：５３８－４５（２００４）；Ｅｎｄｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２１：６９５－７１３（２００３）に記載されている。
培養培地
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の任意の抗体部分、ポリヌクレオチド、核酸構築物、ベクター、および／または宿主細胞を含む培養培地が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の任意の方法を使用して調製された培養培地が提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の任意の抗体部分、ポリヌクレオチド、核酸構築物、ベクター、および／または宿主細胞を含む培養培地が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の任意の方法を使用して調製された培養培地が提供される。
いくつかの実施形態では、培地は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよび／またはチミジン（例えば、ＨＡＴ媒体）を含む。いくつかの実施形態では、培地は血清を含まない。いくつかの実施形態では、培地は血清を含む。いくつかの実施形態では、培地はＤ－ＭＥＭまたはＲＰＭＩ－１６４０培地である。
いくつかの実施形態では、培養培地は化学的に定義される。いくつかの実施形態では、培養培地は、特定の細胞株（例えば、ＣＨＯ ＧＳ細胞）に特異的に由来する。
抗体部分の精製
抗ＶＩＳＴＡ構築物は、任意の適切な方法によって精製されてもよい。そのような方法には、アフィニティーマトリックスまたは疎水性相互作用クロマトグラフィの使用が含まれるが、これらに限定されない。適切なアフィニティーリガンドとしては、ＲＯＲ１ ＥＣＤおよび抗体定常領域に結合するリガンドが挙げられる。例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、または抗体アフィニティカラムを使用して定常領域に結合し、Ｆｃ断片を含む抗ＶＩＳＴＡ構築物を精製することができる。疎水性相互作用クロマトグラフィ、例えばブチルまたはフェニルカラムもまた、抗体などのいくつかのポリペプチドの精製に適し得る。イオン交換クロマトグラフィ（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィおよび／または陽イオン交換クロマトグラフィ）もまた、抗体などのいくつかのポリペプチドの精製に適し得る。混合モードクロマトグラフィ（例えば、逆相／陰イオン交換、逆相／陽イオン交換、親水性相互作用／陰イオン交換、親水性相互作用／陽イオン交換など）もまた、抗体などのいくつかのポリペプチドの精製にも適し得る。ポリペプチドを精製する多くの方法が当技術分野で公知である。
抗ＶＩＳＴＡ構築物は、任意の適切な方法によって精製されてもよい。そのような方法には、アフィニティーマトリックスまたは疎水性相互作用クロマトグラフィの使用が含まれるが、これらに限定されない。適切なアフィニティーリガンドとしては、ＲＯＲ１ ＥＣＤおよび抗体定常領域に結合するリガンドが挙げられる。例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、または抗体アフィニティカラムを使用して定常領域に結合し、Ｆｃ断片を含む抗ＶＩＳＴＡ構築物を精製することができる。疎水性相互作用クロマトグラフィ、例えばブチルまたはフェニルカラムもまた、抗体などのいくつかのポリペプチドの精製に適し得る。イオン交換クロマトグラフィ（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィおよび／または陽イオン交換クロマトグラフィ）もまた、抗体などのいくつかのポリペプチドの精製に適し得る。混合モードクロマトグラフィ（例えば、逆相／陰イオン交換、逆相／陽イオン交換、親水性相互作用／陰イオン交換、親水性相互作用／陽イオン交換など）もまた、抗体などのいくつかのポリペプチドの精製にも適し得る。ポリペプチドを精製する多くの方法が当技術分野で公知である。
Ｖ．処置方法
疾患または症状を処置する方法、または個体において免疫応答を調節する（例えば、Ｔ細胞の増殖を阻害する）方法、または個体において免疫応答を調節する（例えば、Ｔ細胞の増殖を阻害する）方法も本明細書で提供される。本方法は、本明細書に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物を個体（例えば、ヒトなどの哺乳動物）に投与することを含む。
疾患または症状を処置する方法、または個体において免疫応答を調節する（例えば、Ｔ細胞の増殖を阻害する）方法、または個体において免疫応答を調節する（例えば、Ｔ細胞の増殖を阻害する）方法も本明細書で提供される。本方法は、本明細書に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物を個体（例えば、ヒトなどの哺乳動物）に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、個体において疾患もしくは症状を処置するかまたは免疫応答を調節する（例えば、Ｔ細胞の増殖を阻害する）方法であって、有効量の本明細書に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物を個体に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、疾患または症状は、調節不全の免疫系に関連する。いくつかの実施形態では、疾患または症状は、自己免疫疾患、炎症、感染、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）または移植に関連する症状である。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、皮膚エリテマトーデス、関節リウマチ、乾癬、自己免疫性腸障害、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、円板状エリテマトーデス（ＤＬＥ）から選択される。
いくつかの実施形態では、個体における疾患または症状を処置する、または免疫応答を調節する（例えば、Ｔ細胞の増殖を阻害する）方法であって、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体部分を含み、抗体部分は、ＶＩＳＴＡの結合エピトープについて、第二の重鎖可変領域（ＶＨ－２）および第二の軽鎖可変領域（ＶＬ－２）を含む抗体または抗体断片と競合し、ＶＨ－２は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬ－２は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む、有効量の抗ＶＩＳＴＡ構築物を個体に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、ＶＨは、ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に最大５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含み、ＶＬは、ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に最大５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗ＶＩＳＴＡ抗体に由来するヒト化抗体であり、ＶＨは、ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬは、ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか１つ）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含み；ＶＬは、配列番号８のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか１つ）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含む。いくつかの実施形態では、疾患または症状は、調節不全の免疫系に関連する。いくつかの実施形態では、疾患または症状は、自己免疫疾患、炎症、感染、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）または移植に関連する症状である。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、皮膚エリテマトーデス、関節リウマチ、乾癬、自己免疫性腸障害、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、円板状エリテマトーデス（ＤＬＥ）から選択される。
いくつかの実施形態では、個体における疾患または症状を処置する、または免疫応答を調節する（例えば、Ｔ細胞の増殖を阻害する）方法であって、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体部分を含み、抗体部分は、ＶＩＳＴＡの結合エピトープについて、第二の重鎖可変領域（ＶＨ－２）および第二の軽鎖可変領域（ＶＬ－２）を含む抗体または抗体断片と競合し、ＶＨ－２は、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬ－２は、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む、有効量の抗ＶＩＳＴＡ構築物を個体に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、ＶＨは、ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に最大５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含み、ＶＬは、ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に最大５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗ＶＩＳＴＡ抗体に由来するヒト化抗体であり、ＶＨは、ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬは、ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号１５のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか１つ）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含み；ＶＬは、配列番号１６のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか１つ）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含む。いくつかの実施形態では、疾患または症状は、調節不全の免疫系に関連する。いくつかの実施形態では、疾患または症状は、自己免疫疾患、炎症、感染、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）または移植に関連する症状である。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、皮膚エリテマトーデス、関節リウマチ、乾癬、自己免疫性腸障害、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、円板状エリテマトーデス（ＤＬＥ）から選択される。
いくつかの実施形態では、個体における疾患または症状を処置する、または免疫応答を調節する（例えば、Ｔ細胞の増殖を阻害する）方法であって、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体部分を含み、抗体部分は、ＶＩＳＴＡの結合エピトープについて、第二の重鎖可変領域（ＶＨ－２）および第二の軽鎖可変領域（ＶＬ－２）を含む抗体または抗体断片と競合し、ＶＨ－２は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬ－２は、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む、有効量の抗ＶＩＳＴＡ構築物を個体に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、ＶＨは、ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に最大５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含み、ＶＬは、ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に最大５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗ＶＩＳＴＡ抗体に由来するヒト化抗体であり、ＶＨは、ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬは、ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号２３のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか１つ）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含み；ＶＬは、配列番号２４のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか１つ）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含む。いくつかの実施形態では、疾患または症状は、調節不全の免疫系に関連する。いくつかの実施形態では、疾患または症状は、自己免疫疾患、炎症、感染、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）または移植に関連する症状である。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、皮膚エリテマトーデス、関節リウマチ、乾癬、自己免疫性腸障害、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、円板状エリテマトーデス（ＤＬＥ）から選択される。
いくつかの実施形態では、個体における疾患または症状を処置する、または免疫応答を調節する（例えば、Ｔ細胞の増殖を阻害する）方法であって、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体部分を含み、抗体部分は、ＶＩＳＴＡの結合エピトープについて、第二の重鎖可変領域（ＶＨ－２）および第二の軽鎖可変領域（ＶＬ－２）を含む抗体または抗体断片と競合し、ＶＨ－２は、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬ－２は、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号３０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む、有効量の抗ＶＩＳＴＡ構築物を個体に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、ＶＨは、ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に最大５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含み、ＶＬは、ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に最大５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗ＶＩＳＴＡ抗体に由来するヒト化抗体であり、ＶＨは、ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬは、ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３１のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか１つ）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含み；ＶＬは、配列番号３２のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか１つ）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含む。いくつかの実施形態では、疾患または症状は、調節不全の免疫系に関連する。いくつかの実施形態では、疾患または症状は、自己免疫疾患、炎症、感染、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）または移植に関連する症状である。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、皮膚エリテマトーデス、関節リウマチ、乾癬、自己免疫性腸障害、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、円板状エリテマトーデス（ＤＬＥ）から選択される。
いくつかの実施形態では、個体における疾患または症状を処置する、または免疫応答を調節する（例えば、Ｔ細胞の増殖を阻害する）方法であって、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体部分を含み、抗体部分は、ＶＩＳＴＡの結合エピトープについて、第二の重鎖可変領域（ＶＨ－２）および第二の軽鎖可変領域（ＶＬ－２）を含む抗体または抗体断片と競合し、ＶＨ－２は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬ－２は、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号３８のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む、有効量の抗ＶＩＳＴＡ構築物を個体に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、ＶＨは、ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に最大５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含み、ＶＬは、ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に最大５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ抗体部分は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗ＶＩＳＴＡ抗体に由来するヒト化抗体であり、ＶＨは、ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬは、ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３９のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか１つ）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含み；ＶＬは、配列番号４０のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか１つ）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含む。いくつかの実施形態では、疾患または症状は、調節不全の免疫系に関連する。いくつかの実施形態では、疾患または症状は、自己免疫疾患、炎症、感染、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）または移植に関連する症状である。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、皮膚エリテマトーデス、関節リウマチ、乾癬、自己免疫性腸障害、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、円板状エリテマトーデス（ＤＬＥ）から選択される。
いくつかの実施形態では、上記のアミノ酸置換は、本出願の表２に示される「例示的な置換」に限定される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、本出願の表２に示される「好ましい置換」に限定される。
いくつかの実施形態では、個体における疾患または症状を処置する、または免疫応答を調節する（例えば、Ｔ細胞の増殖を阻害する）方法であって、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体部分を含み、ＶＨがｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号４２または５１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み；ＶＬがｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む、有効量の抗ＶＩＳＴＡ構築物を個体に投与することを含む方法が提供される。
いくつかの実施形態では、個体における疾患または症状を処置する、または免疫応答を調節する（例えば、Ｔ細胞の増殖を阻害する）方法であって、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体部分を含み、ＶＨがｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号４４または５２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み；ＶＬがｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号５６または５７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む、有効量の抗ＶＩＳＴＡ構築物を個体に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、疾患または症状は、調節不全の免疫系に関連する。いくつかの実施形態では、疾患または症状は、自己免疫疾患、炎症、感染、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）または移植に関連する症状である。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、皮膚エリテマトーデス、関節リウマチ、乾癬、自己免疫性腸障害、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、円板状エリテマトーデス（ＤＬＥ）から選択される。
いくつかの実施形態では、個体における疾患または症状を処置する、または免疫応答を調節する（例えば、Ｔ細胞の増殖を阻害する）方法であって、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体部分を含み、ＶＨがｉ）配列番号４１または４３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５８のいずれかのアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１１または４５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み；ＶＬがｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号５０または５３のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む、有効量の抗ＶＩＳＴＡ構築物を個体に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、疾患または症状は、調節不全の免疫系に関連する。いくつかの実施形態では、疾患または症状は、自己免疫疾患、炎症、感染、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）または移植に関連する症状である。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、皮膚エリテマトーデス、関節リウマチ、乾癬、自己免疫性腸障害、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、円板状エリテマトーデス（ＤＬＥ）から選択される。
いくつかの実施形態では、個体における免疫応答の調節または免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の調節に使用される抗ＶＩＳＴＡ構築物は、ＶＩＳＴＡを活性化しない対応する構築物（例えば、アイソタイプ対照）と比較して、Ｔ細胞の増殖を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％防止する。いくつかの実施形態では、個体における免疫応答の調節または免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の調節に使用される抗ＶＩＳＴＡ構築物は、参照アゴニスト抗ＶＩＳＴＡ抗体（例えば、１Ｅ８）を含む対応する構築物と比較して、Ｔ細胞の増殖を少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、または２５％防止する。
いくつかの実施形態では、細胞（例えば、免疫細胞）を調節する方法であって、免疫細胞を抗ＶＩＳＴＡ構築物（本明細書に記載の任意の抗ＶＩＳＴＡ構築物など）と接触させることを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、細胞はＴ細胞（ＣＤ４および／またはＣＤ８ Ｔ細胞など）である。いくつかの実施形態では、細胞は好中球である。いくつかの実施形態では、細胞は樹状細胞（例えば、形質細胞様樹状細胞）である。いくつかの実施形態では、細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態では、接触はインビトロで行われる。
いくつかの実施形態では、細胞（例えば、免疫細胞）をゲノム編集する方法であって、ａ）本明細書に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物のいずれかをコードする核酸配列を含むドナーテンプレート、およびｂ）ＤＮＡヌクレアーゼ、またはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ））を細胞に導入することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、ゲノム編集細胞を、本明細書に記載の疾患または症状を有する個体に投与することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物（ヒトなど）である。
いくつかの実施形態では、個体は、抗核抗体の血清レベルが上昇している（例えば、健常個体よりも少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、または５００％高い血清レベルの抗核抗体）。いくつかの実施形態では、個体は、抗ｄｓＤＮＡ抗体の血清レベルが上昇している（例えば、健常個体よりも少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、または５００％高い血清レベルの抗ｄｓＤＮＡ抗体）。いくつかの実施形態では、個体は、ＩＦＮαの血清レベルが上昇している（例えば、健常個体よりも少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、または５００％高い血清レベルのＩＦＮα）。いくつかの実施形態では、個体は、尿中タンパク質レベルが上昇している（例えば、健常個体よりも少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、または５００％高い尿中タンパク質レベル）。
抗ＶＩＳＴＡ構築物の投薬および投与方法
個体に投与される本明細書に記載の疾患または障害を処置するために使用される抗ＶＩＳＴＡ構築物の投薬レジメン（特定の投薬量および頻度など）は、特定の抗ＶＩＳＴＡ構築物、投与様式、および処置される疾患または症状の種類によって異なり得る。いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ構築物の有効量は、疾患または症状の少なくとも１つの症候を緩和するのに有効な量である。いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ構築物の有効量は、個体の全生存期間を延長するのに十分な量である。いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ構築物の有効量は、抗ＶＩＳＴＡ構築物で処置された個体の集団の中で、約５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％のいずれかを超える臨床的利益をもたらすのに十分な量である。
個体に投与される本明細書に記載の疾患または障害を処置するために使用される抗ＶＩＳＴＡ構築物の投薬レジメン（特定の投薬量および頻度など）は、特定の抗ＶＩＳＴＡ構築物、投与様式、および処置される疾患または症状の種類によって異なり得る。いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ構築物の有効量は、疾患または症状の少なくとも１つの症候を緩和するのに有効な量である。いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ構築物の有効量は、個体の全生存期間を延長するのに十分な量である。いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ構築物の有効量は、抗ＶＩＳＴＡ構築物で処置された個体の集団の中で、約５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％のいずれかを超える臨床的利益をもたらすのに十分な量である。
いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ構築物の有効量は、処置を受けていない個体と比較して、疾患または症状（例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％）の進行を遅らせるかまたは阻害する量である。いくつかの実施形態では、疾患または症状は自己免疫疾患である。いくつかの実施形態では、疾患または症状は感染症である。
いくつかの実施形態では、有効量の抗ＶＩＳＴＡ構築物は、参照個体（例えば、同じ疾患または症状を有するが抗ＶＩＳＴＡ構築物で処置されていない個体）と比較して、抗核抗体の血清レベルを少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％低下させる。いくつかの実施形態では、有効量の抗ＶＩＳＴＡ構築物は、参照個体（例えば、同じ疾患または症状を有するが抗ＶＩＳＴＡ構築物で処置されていない個体）と比較して、抗ｄｓＤＮＡ抗体の血清レベルを少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％低下させる。いくつかの実施形態では、有効量の抗ＶＩＳＴＡ構築物は、参照個体（例えば、同じ疾患または症状を有するが抗ＶＩＳＴＡ構築物で処置されていない個体）と比較して、ＩＦＮαの血清レベルを少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％低下させる。いくつかの実施形態では、有効量の抗ＶＩＳＴＡ構築物は、参照個体（例えば、同じ疾患または症状を有するが抗ＶＩＳＴＡ構築物で処置されていない個体）と比較して、尿中タンパク質レベルを少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、または９０％低下させる。
いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ構築物の有効量は、処置を受けていない個体と比較して、症状（例えば、移植）の副作用（自己免疫応答）を（例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、または５０％）減少させる量である。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態において、抗ＶＩＳＴＡ構築物の有効量は、総体重の約０．００１μｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．００５μｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１μｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、または約０．０１μｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇの範囲である。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態において、ヒトに対する抗ＶＩＳＴＡ構築物の有効量は、マウスに対する０．５ｍｇに等しい用量である。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態において、抗ＶＩＳＴＡ構築物は毎週投与される。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態において、抗ＶＩＳＴＡ構築物は隔週で投与される。いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ構築物は、少なくとも約２、約４、約６、約８、約１０、約１２、約１４、約１６、約１８、または約２０週間、毎週投与される。
抗ＶＩＳＴＡ構築物は、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、肺内、経口、吸入、小胞内、筋肉内、気管内、皮下、眼内、髄腔内、経粘膜、および経皮を含む様々な経路を介して個体（ヒトなど）に投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ構築物は、個体に投与されている間、医薬組成物に含まれる。いくつかの実施形態では、組成物の持続連続放出製剤を使用することができる。いくつかの実施形態では、組成物は静脈内投与される。いくつかの実施形態では、組成物は腹腔内投与される。いくつかの実施形態では、組成物は静脈内投与される。いくつかの実施形態では、組成物は腹腔内投与される。いくつかの実施形態では、組成物は筋肉内投与される。いくつかの実施形態では、組成物は皮下投与される。いくつかの実施形態では、組成物は静脈内投与される。いくつかの実施形態では、組成物は経口投与される。
併用療法
本出願はまた、疾患または症状を処置するために抗ＶＩＳＴＡ構築物を個体に投与する方法であって、第二の薬剤または治療を投与することをさらに含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、第二の薬剤または治療は、疾患または症状を処置するための標準的なまたは一般的に使用される薬剤または治療である。
本出願はまた、疾患または症状を処置するために抗ＶＩＳＴＡ構築物を個体に投与する方法であって、第二の薬剤または治療を投与することをさらに含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、第二の薬剤または治療は、疾患または症状を処置するための標準的なまたは一般的に使用される薬剤または治療である。
いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ構築物は、第二の薬剤または治療と同時に投与される。いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ構築物は、第二の薬剤または治療と共に投与される。いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ構築物は、第二の薬剤または治療と逐次投与される。いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ構築物は、第二の薬剤または治療の前に投与される。いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ構築物は、第二の薬剤または治療の後に投与される。いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ構築物は、第二の薬剤または治療と同じ単位剤形で投与される。いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ構築物は、第二の薬剤または治療とは異なる単位剤形で投与される。いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ構築物は、第二の薬剤または治療と同じ単位剤形で投与される。いくつかの実施形態では、抗ＶＩＳＴＡ構築物は、第二の薬剤または治療とは異なる単位剤形で投与される。
ＶＩ．組成物、キットおよび製造品
本明細書に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物または抗ＶＩＳＴＡ抗体部分、抗体部分をコードする核酸、抗体部分をコードする核酸を含むベクター、または核酸もしくはベクターを含む宿主細胞のいずれか１つを含む組成物（製剤など）も本明細書で提供される。
本明細書に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物または抗ＶＩＳＴＡ抗体部分、抗体部分をコードする核酸、抗体部分をコードする核酸を含むベクター、または核酸もしくはベクターを含む宿主細胞のいずれか１つを含む組成物（製剤など）も本明細書で提供される。
本明細書に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物の適切な製剤は、所望の純度を有する抗ＶＩＳＴＡ構築物または抗ＶＩＳＴＡ抗体部分を任意の薬学的に許容され得る担体、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で混合することによって得ることができる。許容され得る担体、賦形剤、または安定剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン等のアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖類；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；および／または非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などを含む。皮下投与に適した凍結乾燥製剤は、国際公開第９７／０４８０１号に記載されている。そのような凍結乾燥製剤は、適切な希釈剤を用いて高タンパク質濃度に再構成することができ、再構成製剤は、本明細書で画像化、診断、または処置される個体に皮下投与することができる。
インビボ投与に使用される製剤は滅菌されていなければならない。これは、例えば、滅菌濾過膜による濾過によって容易に達成される。
本明細書に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物または抗ＶＩＳＴＡ抗体部分のいずれか１つを含むキットも提供される。キットは、本明細書に記載の細胞組成物または処置を調節する方法のいずれかに有用であり得る。
いくつかの実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗ＶＩＳＴＡ構築物を含むキットが提供される。
いくつかの実施形態では、キットは、抗ＶＩＳＴＡ構築物を個体に送達することができる装置をさらに含む。非経口送達などの用途のための装置の１つのタイプは、組成物を対象の体内に注射するために使用されるシリンジである。吸入装置は、特定の用途にも使用され得る。
いくつかの実施形態では、キットは、疾患または症状、例えば感染症、自己免疫疾患、または移植を処置するための治療剤をさらに含む。
本出願のキットは適切な包装中にある。適切な包装には、バイアル、ボトル、瓶、可撓性包装（例えば、密封されたマイラーまたはプラスチックバッグ）などが含まれるが、これらに限定されない。キットは、必要に応じて、緩衝液および解釈情報などの追加の成分を提供し得る。
したがって、本出願は製造品も提供する。製造品は、容器と、容器上のまたは容器に関連付けられたラベルまたは添付文書とを含むことができる。適切な容器には、バイアル（密封バイアルなど）、ボトル、瓶、可撓性包装などが含まれる。一般に、容器は組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内溶液バッグであってもよいし、皮下注射針で穿刺可能な栓を有するバイアルであってもよい）。ラベルまたは添付文書は、組成物が個体における特定の状態を画像化、診断または処置するために使用されることを示す。ラベルまたは添付文書は、組成物を個体に投与し、個体を画像化するための指示をさらに含む。ラベルは、再構成および／または使用のための指示を示し得る。組成物を保持する容器は、再構成された製剤の反復投与（例えば、２～６回の投与から）を可能にする複数回使用バイアルであり得る。添付文書は、診断用製品の市販パッケージに通例含まれる指示であって、そのような診断用製品の使用に関する適応症、用法、用量、投与、禁忌および／または警告に関する情報を含む指示を指す。さらに、製造品は、静菌性注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液などの薬学的に許容され得る緩衝液を含む第二の容器をさらに含み得る。さらに、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジを含む、商業的およびユーザーの観点から望ましい他の材料を含んでもよい。
キットまたは製造品は、複数の単位用量の組成物および使用についての指示を含み得、薬局、例えば病院の薬局および調剤薬局での保管および使用に十分な量で包装され得る。
当業者は、本発明の範囲および主旨の範囲内でいくつかの実施形態が可能であることを認識するであろう。以下の非限定的な例を参照して、本発明をより詳細に説明する。以下の実施例は、本発明をさらに例示するが、当然のことながら、その範囲を限定するものとして解釈されるべきでは決してない。
例示的な実施形態
実施形態１．重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体部分を含む抗ＶＩＳＴＡ構築物であって、抗体部分が、第二の重鎖可変領域（ＶＨ－２）および第二の軽鎖可変領域（ＶＬ－２）を含む抗体または抗体断片とＶＩＳＴＡの結合エピトープについて競合し、
ａ）ＶＨ－２が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬ－２が、配列番号４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含むか；
ｂ）ＶＨ－２が、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬ－２が、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含むか；
ｃ）ＶＨ－２が、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬ－２が、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含むか；
ｄ）ＶＨ－２は、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬ－２は、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号３０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む；または
ｅ）ＶＨ－２が、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬ－２が、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号３８のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む、抗ＶＩＳＴＡ構築物。
実施形態１．重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体部分を含む抗ＶＩＳＴＡ構築物であって、抗体部分が、第二の重鎖可変領域（ＶＨ－２）および第二の軽鎖可変領域（ＶＬ－２）を含む抗体または抗体断片とＶＩＳＴＡの結合エピトープについて競合し、
ａ）ＶＨ－２が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬ－２が、配列番号４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含むか；
ｂ）ＶＨ－２が、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬ－２が、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含むか；
ｃ）ＶＨ－２が、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬ－２が、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含むか；
ｄ）ＶＨ－２は、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬ－２は、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号３０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む；または
ｅ）ＶＨ－２が、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬ－２が、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号３８のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む、抗ＶＩＳＴＡ構築物。
実施形態２．実施形態１に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物であって、
ａ）ＶＨが、ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含み；ＶＬが、ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含むか；
ｂ）ＶＨが、ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含み；ＶＬが、ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含むか；
ｃ）ＶＨが、ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含み；ＶＬが、ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含むか；
ｄ）ＶＨが、ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含み；ＶＬが、ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含むか；
ｅ）ＶＨが、ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含み；ＶＬが、ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含むか；
ｆ）ＶＨが、ｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号４２もしくは５１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み；ＶＬが、ｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含むか；
ｈ）ＶＨが、ｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号４４もしくは５２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み；ＶＬが、ｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号５６もしくは５７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含むか；または
ｉ）ＶＨが、ｉ）配列番号４１もしくは４３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５８のいずれかのアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１１もしくは４５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み；ＶＬが、ｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号５０もしくは５３のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む、抗ＶＩＳＴＡ構築物。
ａ）ＶＨが、ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含み；ＶＬが、ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含むか；
ｂ）ＶＨが、ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含み；ＶＬが、ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含むか；
ｃ）ＶＨが、ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含み；ＶＬが、ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含むか；
ｄ）ＶＨが、ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含み；ＶＬが、ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含むか；
ｅ）ＶＨが、ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含み；ＶＬが、ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含むか；
ｆ）ＶＨが、ｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号４２もしくは５１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み；ＶＬが、ｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含むか；
ｈ）ＶＨが、ｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号４４もしくは５２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み；ＶＬが、ｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号５６もしくは５７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含むか；または
ｉ）ＶＨが、ｉ）配列番号４１もしくは４３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５８のいずれかのアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１１もしくは４５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み；ＶＬが、ｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号５０もしくは５３のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む、抗ＶＩＳＴＡ構築物。
実施形態３．ＶＨが、ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み；ＶＬが、ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む、実施形態２に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物。
実施形態４．ＶＨが、ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み；ＶＬが、ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む、実施形態２に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物。
実施形態５．ＶＨが、ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み；ＶＬが、ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む、実施形態３に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物。
実施形態６．ＶＨが、ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み；ＶＬが、ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む、実施形態３に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物。
実施形態７．ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体部分を含む抗ＶＩＳＴＡ構築物であって、
ａ）配列番号７に示される配列を有するＶＨ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３、ならびに配列番号８に示される配列を有するＶＬ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３；
ｂ）配列番号１５に示される配列を有するＶＨ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３、ならびに配列番号１６に示される配列を有するＶＬ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３；
ｃ）配列番号２３に示される配列を有するＶＨ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３、ならびに配列番号２４に示される配列を有するＶＬ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３；
ｄ）配列番号３１に示される配列を有するＶＨ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３、ならびに配列番号３２に示される配列を有するＶＬ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３；または
ｅ）配列番号３９に示される配列を有するＶＨ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３、ならびに配列番号４０に示される配列を有するＶＬ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３を含む、抗ＶＩＳＴＡ構築物。
ａ）配列番号７に示される配列を有するＶＨ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３、ならびに配列番号８に示される配列を有するＶＬ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３；
ｂ）配列番号１５に示される配列を有するＶＨ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３、ならびに配列番号１６に示される配列を有するＶＬ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３；
ｃ）配列番号２３に示される配列を有するＶＨ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３、ならびに配列番号２４に示される配列を有するＶＬ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３；
ｄ）配列番号３１に示される配列を有するＶＨ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３、ならびに配列番号３２に示される配列を有するＶＬ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３；または
ｅ）配列番号３９に示される配列を有するＶＨ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３、ならびに配列番号４０に示される配列を有するＶＬ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３を含む、抗ＶＩＳＴＡ構築物。
実施形態８．ＶＨが、配列番号７、１５、２３、３１および３９のいずれか１つのアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含み；および／または、ＶＬが、配列番号８、１６、２４、３２および４０のいずれか１つのアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含む、実施形態１～７のいずれか一つに記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物。
実施形態９．実施形態８に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物であって、
ａ）ＶＨが、配列番号７のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含み；ＶＬが、配列番号８のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含むか、
ｂ）ＶＨが、配列番号１５のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含み；ＶＬが、配列番号１６のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含むか、
ｃ）ＶＨが、配列番号２３のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含み；ＶＬが、配列番号２４のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含むか、
ｄ）ＶＨが、配列番号３１のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含み；ＶＬが、配列番号３２のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含むか、または
ｅ）ＶＨが、配列番号３９のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含み；ＶＬが、配列番号４０のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含む、抗ＶＩＳＴＡ構築物。
ａ）ＶＨが、配列番号７のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含み；ＶＬが、配列番号８のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含むか、
ｂ）ＶＨが、配列番号１５のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含み；ＶＬが、配列番号１６のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含むか、
ｃ）ＶＨが、配列番号２３のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含み；ＶＬが、配列番号２４のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含むか、
ｄ）ＶＨが、配列番号３１のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含み；ＶＬが、配列番号３２のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含むか、または
ｅ）ＶＨが、配列番号３９のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含み；ＶＬが、配列番号４０のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含む、抗ＶＩＳＴＡ構築物。
実施形態１０．抗体部分が、全長抗体、二重特異性抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、Ｆｖ－Ｆｃ融合物、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合物、ｓｃＦｖ－Ｆｖ融合物、ダイアボディ、トリボディ、およびテトラボディからなる群から選択される抗体またはその抗原結合断片である、実施形態１～９のいずれか一つに記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物。
実施形態１１．抗体部分が全長抗体である、実施形態１０に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物。
実施形態１２．抗体部分が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来のＦｃ断片、ならびにそれらの組み合わせおよびハイブリッドからなる群から選択されるＦｃ断片を有する、実施形態１～１１のいずれか一つに記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物。
実施形態１３．Ｆｃ断片が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、およびそれらの組み合わせおよびハイブリッドからのＦｃ断片からなる群から選択される、実施形態１２に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物。
実施形態１４．Ｆｃ断片が、対応する野生型Ｆｃ断片と比較して低下したエフェクター機能を有する、実施形態１２または実施形態１３に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物。
実施形態１５．Ｆｃ断片が、対応する野生型Ｆｃ断片と比較して長い半減期を有する、実施形態１２～１４のいずれか一つに記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物。
実施形態１６．抗ＶＩＳＴＡ構築物の抗体部分が、ＶＩＳＴＡの下流シグナル伝達経路を活性化する、実施形態１～１５のいずれか一つに記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物。
実施形態１７．抗ＶＩＳＴＡ構築物が、ＶＩＳＴＡのアゴニスト抗体である、実施形態１～１６のいずれか一つに記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物。
実施形態１８．抗ＶＩＳＴＡ構築物の抗体部分が、ＶＩＳＴＡの下流シグナル伝達経路を少なくとも約２０％活性化または増加させる、実施形態１６のいずれか一つに記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物。
実施形態１９．ＶＩＳＴＡがヒトＶＩＳＴＡである、実施形態１～１８のいずれか一つに記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物。
実施形態２０．実施形態１～１９のいずれか一つに記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物と、薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物。
実施形態２１．実施形態１～２０のいずれか一つに記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物をコードする単離された核酸。
実施形態２２．実施形態２１に記載の単離された核酸を含むベクター。
実施形態２３．実施形態２１に記載の単離された核酸または実施形態２２に記載のベクターを含む単離された宿主細胞。
実施形態２４．治療剤または標識に連結された実施形態１～１９のいずれか一つに記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物を含む免疫コンジュゲート。
実施形態２５．抗ＶＩＳＴＡ構築物を製造する方法であって、
ａ）抗ＶＩＳＴＡ構築物を発現するのに有効な条件下で、実施形態２３に記載の単離された宿主細胞を培養すること；および
ｂ）宿主細胞から発現された抗ＶＩＳＴＡ構築物を得ることを含む方法。
ａ）抗ＶＩＳＴＡ構築物を発現するのに有効な条件下で、実施形態２３に記載の単離された宿主細胞を培養すること；および
ｂ）宿主細胞から発現された抗ＶＩＳＴＡ構築物を得ることを含む方法。
実施形態２６．個体における疾患または症状を処置する方法であって、個体に、有効量の実施形態１～１９のいずれか一つに記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物、または実施形態２０に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
実施形態２７．症状の疾患が、調節不全の免疫系に関連する、実施形態２６に記載の方法。
実施形態２８．疾患または症状が、自己免疫疾患、炎症、感染、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）または移植に関連する症状である、実施形態２６または実施形態２７に記載の方法。
実施形態２９．自己免疫疾患が、皮膚エリテマトーデス、関節リウマチ、乾癬、自己免疫性腸障害、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、円板状エリテマトーデス（ＤＬＥ）から選択される、実施形態２８に記載の方法。
実施形態３０．抗ＶＩＳＴＡ構築物が、個体に静脈内または皮下投与される、実施形態２６～２９のいずれか一つに記載の方法。
実施形態３１．抗ＶＩＳＴＡ構築物が、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態のいずれか一つに記載の方法。
実施形態３２．個体がヒトである、実施形態２２～３１のいずれか一つに記載の方法。
実施形態３３．実施形態１～１９のいずれか一つに記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物を含むキット。
実施例
以下の実施例は、本出願の純粋に例示を意図しており、したがって、決して本出願を限定すると見なされるべきではない。以下の実施例および詳細な説明は、限定ではなく例示として提供される。
以下の実施例は、本出願の純粋に例示を意図しており、したがって、決して本出願を限定すると見なされるべきではない。以下の実施例および詳細な説明は、限定ではなく例示として提供される。
実施例１．材料
Ｈｉｓタグ付きヒト、マウスおよびカニクイザルＶＩＳＴＡ細胞外ドメインタンパク質を、標準的なプロトコルを使用して社内で生成した。ｈＶＩＳＴＡ－ｍＦｃは、Ａｄｉｐｏｇｅｎ（カタログ番号ＣＨＩ－ＨＦ－２１１Ｂ７Ｈ５－Ｃ１００）から購入した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識抗ヒトＶＩＳＴＡ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５６６６７０）およびＡＰＣ抗マウスＶＩＳＴＡ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号１５０２０５）を使用して、ヒトおよびマウスＶＩＳＴＡ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞を検出した。
Ｈｉｓタグ付きヒト、マウスおよびカニクイザルＶＩＳＴＡ細胞外ドメインタンパク質を、標準的なプロトコルを使用して社内で生成した。ｈＶＩＳＴＡ－ｍＦｃは、Ａｄｉｐｏｇｅｎ（カタログ番号ＣＨＩ－ＨＦ－２１１Ｂ７Ｈ５－Ｃ１００）から購入した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識抗ヒトＶＩＳＴＡ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５６６６７０）およびＡＰＣ抗マウスＶＩＳＴＡ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号１５０２０５）を使用して、ヒトおよびマウスＶＩＳＴＡ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞を検出した。
Ｊｕｒｋａｔ Ａ６親細胞に、フローサイトメトリーによる結合アッセイのために、ｐＬｅｎｔｉ７．３／ＴＯＰＯ－マウスＶＩＳＴＡまたはヒトＶＩＳＴＡ全長配列を形質導入した。Ｊｕｒｋａｔ－ｎｆｋｂ－ＧＦＰレポーター細胞を、フローサイトメトリーによるレポーター活性化アッセイのために、ＣＤ３ζＣＡＲ－ＥＦ１－ｐｕｒｏと共にＣＭＶ－ヒトＶＩＳＴＡ細胞外膜貫通を有するレンチウイルスによって形質導入した。各構築物について、Ｊｕｒｋａｔ細胞のＶＩＳＴＡ陽性集団を２回選別した。各構築物の細胞はポリクローナルである。
実施例２．免疫化
３匹のＶＩＳＴＡノックアウトＢＡＬＢ／ｃマウス（雌）に、表Ｉに概説したスキームに従って４回の免疫化を行った。マウスをｈＶＩＳＴＡ（ヒトＶＩＳＴＡ－ｍＦｃ）およびｍＶＩＳＴＡ（マウスＶＩＳＴＡ－ｈｉｓ）の両方で免疫した。最初の３回の免疫化には、皮下および腹腔内注射が含まれた。最終ブーストは、腹腔内注射のみであった。免疫応答をＥＬＩＳＡによって分析した：０日目、４２日目および７４日目に収集した血清試料を、９６ウェルプレートに吸着したヒトＶＩＳＴＡ ＥＣＤ（２μｇ／ｍｌ）または陰性対照抗体とインキュベートした。結合したマウスＩｇＧを抗マウスＩｇＧホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号６１５０３５２１４）によって検出した。結果を図１および図２に示す。
３匹のＶＩＳＴＡノックアウトＢＡＬＢ／ｃマウス（雌）に、表Ｉに概説したスキームに従って４回の免疫化を行った。マウスをｈＶＩＳＴＡ（ヒトＶＩＳＴＡ－ｍＦｃ）およびｍＶＩＳＴＡ（マウスＶＩＳＴＡ－ｈｉｓ）の両方で免疫した。最初の３回の免疫化には、皮下および腹腔内注射が含まれた。最終ブーストは、腹腔内注射のみであった。免疫応答をＥＬＩＳＡによって分析した：０日目、４２日目および７４日目に収集した血清試料を、９６ウェルプレートに吸着したヒトＶＩＳＴＡ ＥＣＤ（２μｇ／ｍｌ）または陰性対照抗体とインキュベートした。結合したマウスＩｇＧを抗マウスＩｇＧホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号６１５０３５２１４）によって検出した。結果を図１および図２に示す。
図１および図２に示すように、ｈＶＩＳＴＡまたはｍＶＩＳＴＡを使用すると、各抗原に結合する抗体が産生された。
実施例３．ハイブリドーマ上清産生
マウスから脾臓を採取した。ハイブリドーマ細胞を、周知の手順に従って調製した。ハイブリドーマ細胞をハイブリドーマ－ＳＦＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中、３７°Ｃで７～１０日間培養した。細胞を遠心分離によってペレット化し、上清を以下の実施例に記載されるように分析した。
マウスから脾臓を採取した。ハイブリドーマ細胞を、周知の手順に従って調製した。ハイブリドーマ細胞をハイブリドーマ－ＳＦＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中、３７°Ｃで７～１０日間培養した。細胞を遠心分離によってペレット化し、上清を以下の実施例に記載されるように分析した。
実施例４．一次スクリーニング（ＥＬＩＳＡによるヒトＶＩＳＴＡ、マウスＶＩＳＴＡおよびカニクイザルＶＩＳＴＡへの結合）
５０μｌのハイブリドーマ上清を、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上にコーティングしたヒトＶＩＳＴＡ ＥＣＤ（２μｇ／ｍｌ）、マウスＶＩＳＴＡ ＥＣＤ（２μｇ／ｍＬ）、カニクイザルＶＩＳＴＡ（２μｇ／ｍＬ）、または陰性マウスＩｇＧ１対照と共にインキュベートした。マウス抗ＶＩＳＴＡ抗体を抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号６１５０３５２１４）によって検出した。結果を図３に示す。
５０μｌのハイブリドーマ上清を、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上にコーティングしたヒトＶＩＳＴＡ ＥＣＤ（２μｇ／ｍｌ）、マウスＶＩＳＴＡ ＥＣＤ（２μｇ／ｍＬ）、カニクイザルＶＩＳＴＡ（２μｇ／ｍＬ）、または陰性マウスＩｇＧ１対照と共にインキュベートした。マウス抗ＶＩＳＴＡ抗体を抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号６１５０３５２１４）によって検出した。結果を図３に示す。
図３に示すように、９Ｅ９、１５Ｄ１１、１６Ａ１、１７Ｅ９、および２０Ｅ４ハイブリドーマ上清はすべて、ヒト、カニクイザルおよび／またはマウスＶＩＳＴＡ細胞外ドメインに効果的に結合し、（特にヒトとカニクイザルＶＩＳＴＡタンパク質との間の）交差種反応性を示す。
実施例５．ＦＡＣＳアッセイによるＶＩＳＴＡに結合するハイブリドーマ由来抗体の二次スクリーニング
ヒトおよびマウスのＶＩＳＴＡ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞を、１０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０中で培養した。細胞を９６ウェルプレートに１ｘ１０５細胞／ウェルで播種した。次いで、細胞を抗ＶＩＳＴＡハイブリドーマ上清と共に４℃で３０分間インキュベートした。１Ｅ８（Ｉｍｍｕｎｅｘｔ、国際公開第２０１７／１８１１３９号参照）を参照抗体として使用した。ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、細胞をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲート抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（１μｇ／ｍｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号６１５０５２１４）と共に４℃で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、試料をＮｏｖｏＣｙｔｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）で泳動した。ＮｏｖｏＥｘｐｒｅｓｓソフトウェアを使用してデータを分析した。
ヒトおよびマウスのＶＩＳＴＡ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞を、１０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０中で培養した。細胞を９６ウェルプレートに１ｘ１０５細胞／ウェルで播種した。次いで、細胞を抗ＶＩＳＴＡハイブリドーマ上清と共に４℃で３０分間インキュベートした。１Ｅ８（Ｉｍｍｕｎｅｘｔ、国際公開第２０１７／１８１１３９号参照）を参照抗体として使用した。ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、細胞をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲート抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（１μｇ／ｍｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号６１５０５２１４）と共に４℃で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、試料をＮｏｖｏＣｙｔｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）で泳動した。ＮｏｖｏＥｘｐｒｅｓｓソフトウェアを使用してデータを分析した。
図４Ａ～図４Ｂは、試験したすべての抗ＶＩＳＴＡハイブリドーマ（９Ｆ９、１６Ａ１、１７Ｅ９、および２０Ｅ４）が、Ｊｕｒｋａｔ－ｈＶＩＳＴＡ発現細胞株に対する効果的な結合、およびＪｕｒｋａｔ－ｍＶＩＳＴＡ発現細胞株に対するいくらかの結合親和性を示すことを示す。
実施例６．ハイブリドーマ由来抗体のレポーター活性化アッセイ
９６ウェルプレートに、Ｊｕｒｋａｔ－ｎｆｋｂ－ＧＦＰ／ヒトＶＩＳＴＡ－ｈＣＤ３ｚ細胞を、１０％ ＦＢＳ培地を含む２００μｌのＲＰＭＩ１６４０中に１Ｘ１０５細胞／ウェルで播種した。ハイブリドーマ上清を、増加する抗ＶＩＳＴＡ濃度で培地に添加した（ＥＬＩＳＡに基づき、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、１０および３０μｇ／ｍｌ）。２４時間のインキュベーション後にフローサイトメトリーによってＧＦＰを測定した。結果を図５～図７に示す。細胞活性化に対するＯＫＴ３の効果を試験するために、ＯＫＴ３（３ｎｇ／ｍｌ）を、ハイブリドーマ由来抗体由来の増加する抗ＶＩＳＴＡ濃度の存在下で２４時間インキュベーション、細胞に添加した。結果を図８Ａ～図１０に示す。
９６ウェルプレートに、Ｊｕｒｋａｔ－ｎｆｋｂ－ＧＦＰ／ヒトＶＩＳＴＡ－ｈＣＤ３ｚ細胞を、１０％ ＦＢＳ培地を含む２００μｌのＲＰＭＩ１６４０中に１Ｘ１０５細胞／ウェルで播種した。ハイブリドーマ上清を、増加する抗ＶＩＳＴＡ濃度で培地に添加した（ＥＬＩＳＡに基づき、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、１０および３０μｇ／ｍｌ）。２４時間のインキュベーション後にフローサイトメトリーによってＧＦＰを測定した。結果を図５～図７に示す。細胞活性化に対するＯＫＴ３の効果を試験するために、ＯＫＴ３（３ｎｇ／ｍｌ）を、ハイブリドーマ由来抗体由来の増加する抗ＶＩＳＴＡ濃度の存在下で２４時間インキュベーション、細胞に添加した。結果を図８Ａ～図１０に示す。
図５Ａ～図５Ｂおよび図６Ａ～図６Ｂは、様々な濃度の９Ｆ９または２０Ｅ４ハイブリドーマ上清とのインキュベーション時に、陽性ＧＦＰ染色によって示されるように、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＫｂ－ＧＦＰ／ｈＶＩＳＴＡ－ｈＣＤ３ｚ発現細胞においてＶＩＳＴＡ下流経路が活性化されたことを示す。活性化の程度は濃度依存的である。１６Ａ１、１７Ｅ９、および１Ｅ８はまた、特定の濃度でＪｕｒｋａｔ－ＮＦＫｂ－ＧＦＰ／ｈＶＩＳＴＡ－ｈＣＤ３ｚ細胞を活性化する能力を示す。図７を参照されたい。したがって、９Ｆ９、２０Ｅ４、１Ｅ８、１６Ａ１、および１７Ｅ９はすべて、ヒトＶＩＳＴＡに対するアゴニスト効果を示し、９Ｆ９および２０Ｅ４はこれらの抗体の中で最も高いアゴニスト効果を示す。
図８Ａ～図８Ｂ、図９Ａ～図９Ｂおよび図１０は、ＯＫＴ３が活性化Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＫｂ－ＧＦＰ／ｈＶＩＳＴＡ－ｈＣＤ３ｚ細胞のパーセンテージを有意に増加させたことを示す。活性化細胞のパーセンテージは、１５Ｄ１１を除いて試験したすべての抗体について６０％超に達した。２０Ｅ４および１７Ｅ９、または１６Ａ１と共にインキュベートした細胞では、細胞の８０％超が特定の濃度で活性化された。これらの結果は、これらの抗体の強いアゴニスト効果を示す。
実施例７．配列解析
全ＲＮＡをハイブリドーマ細胞株培養物から単離した。ＲＮＡを処理して異常な転写物を除去し、オリゴ（ｄＴ）プライマーを使用して逆転写した。得られたｃＤＮＡの試料を、フレームワーク１および重鎖または軽鎖のいずれかに特異的な定常領域プライマー対を使用して別々のＰＣＲで増幅した。反応産物をアガロースゲル上で分離し、サイズ評価し、回収した。アンプリコンをｐＵＣ１９ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローニングした。１０個のコロニーを選択し、プラスミドＤＮＡおよびＰＣＲ産物の両方をサンガー配列決定に供した。
全ＲＮＡをハイブリドーマ細胞株培養物から単離した。ＲＮＡを処理して異常な転写物を除去し、オリゴ（ｄＴ）プライマーを使用して逆転写した。得られたｃＤＮＡの試料を、フレームワーク１および重鎖または軽鎖のいずれかに特異的な定常領域プライマー対を使用して別々のＰＣＲで増幅した。反応産物をアガロースゲル上で分離し、サイズ評価し、回収した。アンプリコンをｐＵＣ１９ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローニングした。１０個のコロニーを選択し、プラスミドＤＮＡおよびＰＣＲ産物の両方をサンガー配列決定に供した。
すべての構築物からのＤＮＡ配列データを分析し、重鎖および軽鎖のコンセンサス配列を決定した。以下の表３および表４を参照されたい。
実施例８．ハイブリドーマ細胞からの抗ＶＩＳＴＡ抗体発現および精製
ハイブリドーマ細胞をハイブリドーマ－ＳＦＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中、３７°Ｃで７～１０日間培養した。細胞を遠心分離によってペレット化し、プロテインＧセファロース（ＧＥ）を使用した抗体精製のために上清を回収した。カラムからの溶出液を、遠心分離によるダイアフィルトレーションによって１ＸＰＢＳ（ｐＨ７．４）に緩衝液交換した。精製した抗体をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動によって分析して、純度およびサイズを確認した。抗体の濃度を分光光度計のＡ２８０によって決定した。精製した抗体を貯蔵前に０．２μｍ濾過した。
ハイブリドーマ細胞をハイブリドーマ－ＳＦＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中、３７°Ｃで７～１０日間培養した。細胞を遠心分離によってペレット化し、プロテインＧセファロース（ＧＥ）を使用した抗体精製のために上清を回収した。カラムからの溶出液を、遠心分離によるダイアフィルトレーションによって１ＸＰＢＳ（ｐＨ７．４）に緩衝液交換した。精製した抗体をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動によって分析して、純度およびサイズを確認した。抗体の濃度を分光光度計のＡ２８０によって決定した。精製した抗体を貯蔵前に０．２μｍ濾過した。
実施例９．Ｅｘｐｉ２９３細胞における抗ＶＩＳＴＡ抗体の組換え発現および精製
抗ＶＩＳＴＡ可変ドメインをｍＩｇＧ１定常ドメインでクローニングし、Ｅｘｐｉ２９３細胞で発現させた。簡潔には、マウスＩｇＧ１可変ドメインを、ＩＤＴ由来のヒト好適コドンを使用して遺伝子合成した。次いで、マウス抗体シグナル配列およびｍＩｇＧ１ Ｆｃ断片を含むｐｃＤＮＡ３．４ベクターに遺伝子断片をサブクローニングした。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３トランスフェクションキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用したＥｘｐｉ２９３細胞への一過性トランスフェクションによって抗体を産生した。トランスフェクションの５日後、トランスフェクト細胞からの上清を回収し、プロテインＧセファロース（ＧＥ）を用いて精製した。結合した抗体を０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ２．７）を用いて溶出し、１ＸＰＢＳ（ｐＨ７．４）で一晩透析した。精製した抗体を還元および非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析して、純度およびサイズを確認した。組換えタンパク質濃度を分光光度計のＡ２８０によって決定した。
抗ＶＩＳＴＡ可変ドメインをｍＩｇＧ１定常ドメインでクローニングし、Ｅｘｐｉ２９３細胞で発現させた。簡潔には、マウスＩｇＧ１可変ドメインを、ＩＤＴ由来のヒト好適コドンを使用して遺伝子合成した。次いで、マウス抗体シグナル配列およびｍＩｇＧ１ Ｆｃ断片を含むｐｃＤＮＡ３．４ベクターに遺伝子断片をサブクローニングした。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３トランスフェクションキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用したＥｘｐｉ２９３細胞への一過性トランスフェクションによって抗体を産生した。トランスフェクションの５日後、トランスフェクト細胞からの上清を回収し、プロテインＧセファロース（ＧＥ）を用いて精製した。結合した抗体を０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ２．７）を用いて溶出し、１ＸＰＢＳ（ｐＨ７．４）で一晩透析した。精製した抗体を還元および非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析して、純度およびサイズを確認した。組換えタンパク質濃度を分光光度計のＡ２８０によって決定した。
実施例１０．蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）アッセイによって決定された、ヒトおよびマウスのＶＩＳＴＡ Ｊｕｒｋａｔ細胞を発現する細胞表面への組換え抗ＶＩＳＴＡ抗体の結合
ヒトおよびマウス発現Ｊｕｒｋａｔ細胞を、１０％ ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０中で培養した。細胞を９６ウェルプレートに１ｘ１０５細胞／ウェルで播種した。次いで、細胞を組換え抗ＶＩＳＴＡ抗体９Ｆ９、１６Ａ１、１７Ｅ９、２０Ｅ４またはＶ４（Ｈｕｍｍｉｎｇｂｉｒｄ）（１０μｇ／ｍｌ）と共に４℃で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、細胞をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲート抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（１μｇ／ｍｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号６１５６０５２１４）と共に４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、試料をＮｏｖｏＣｙｔｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）で泳動した。ＮｏｖｏＥｘｐｒｅｓｓソフトウェアを使用してデータを分析した。結果を図１１Ａ～図１１Ｂに示す。
ヒトおよびマウス発現Ｊｕｒｋａｔ細胞を、１０％ ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０中で培養した。細胞を９６ウェルプレートに１ｘ１０５細胞／ウェルで播種した。次いで、細胞を組換え抗ＶＩＳＴＡ抗体９Ｆ９、１６Ａ１、１７Ｅ９、２０Ｅ４またはＶ４（Ｈｕｍｍｉｎｇｂｉｒｄ）（１０μｇ／ｍｌ）と共に４℃で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、細胞をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲート抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（１μｇ／ｍｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号６１５６０５２１４）と共に４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、試料をＮｏｖｏＣｙｔｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）で泳動した。ＮｏｖｏＥｘｐｒｅｓｓソフトウェアを使用してデータを分析した。結果を図１１Ａ～図１１Ｂに示す。
図１１Ａ～図１１Ｂは、組換えｍＩｇＧ１抗ＶＩＳＴＡ抗体（９Ｆ９、１６Ａ１、１７Ｅ９、および２０Ｅ４）がすべて、Ｊｕｒｋａｔ－ｈＶＩＳＴＡ発現細胞株に対する有効な結合を示すことを実証している。さらに、９Ｆ９はＪｕｒｋａｔ－ｍＶＩＳＴＡへの有効な結合も示し、異種間反応性を示している。
実施例１１．組換え抗ＶＩＳＴＡ抗体のレポーター活性化アッセイ
９６ウェルプレートに、Ｊｕｒｋａｔ－ｎｆｋｂ－ＧＦＰ／ヒトＶＩＳＴＡ－ｈＣＤ３ｚ細胞を、１０％ ＦＢＳ培地を含む２００μｌのＲＰＭＩ１６４０中に１ｘ１０５細胞／ウェルで播種した。組換え抗ＶＩＳＴＡ抗体を、増加するＶＩＳＴＡ濃度（０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、１０、３０μｇ／ｍｌ）または（０．０５、０．５、５および５０μｇ／ｍｌ）で培地に添加した。２４時間のインキュベーション後にフローサイトメトリーによってＧＦＰを測定した。細胞活性化に対するＯＫＴ３の効果を試験するために、増加する抗ＶＩＳＴＡ濃度の存在下でＯＫＴ３（３ｎｇ／ｍｌ）を細胞に添加し、２４時間のインキュベーション後にＧＦＰを測定した。
９６ウェルプレートに、Ｊｕｒｋａｔ－ｎｆｋｂ－ＧＦＰ／ヒトＶＩＳＴＡ－ｈＣＤ３ｚ細胞を、１０％ ＦＢＳ培地を含む２００μｌのＲＰＭＩ１６４０中に１ｘ１０５細胞／ウェルで播種した。組換え抗ＶＩＳＴＡ抗体を、増加するＶＩＳＴＡ濃度（０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、１０、３０μｇ／ｍｌ）または（０．０５、０．５、５および５０μｇ／ｍｌ）で培地に添加した。２４時間のインキュベーション後にフローサイトメトリーによってＧＦＰを測定した。細胞活性化に対するＯＫＴ３の効果を試験するために、増加する抗ＶＩＳＴＡ濃度の存在下でＯＫＴ３（３ｎｇ／ｍｌ）を細胞に添加し、２４時間のインキュベーション後にＧＦＰを測定した。
図１２～図１５は、組換えｍＩｇＧ１抗ＶＩＳＴＡ抗体（９Ｆ９、１６Ａ１、１７Ｅ９、および２０Ｅ４）が、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＫｂ－ＧＦＰ／ｈＶＩＳＴＡ－ｈＣＤ３ｚ発現細胞株において有効な活性化を誘導し、１５％～５０％の細胞が５μｇ／ｍＬの濃度で活性化されることを示す。
実施例１２．Ｏｃｔｅｔ競合による抗ＶＩＳＴＡ抗体のエピトープビニングアッセイ
Ｏｃｔｅｔ ＱＫｅ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して抗ＶＩＳＴＡ抗体エピトープのビンを決定した。ヒトＶＩＳＴＡ組換えタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．、カタログ番号１３４８５－Ｈ０８Ｈ）を、ＥＺ－ＬＩＮＫ ＮＨＳ－ＰＥＧ４ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてビオチン化した。ストレプトアビジンバイオセンサチップ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用してビオチン化ＶＩＳＴＡタンパク質を捕捉した（５μｇ／ｍｌで３００秒）。ベースライン測定値を１倍動態緩衝液（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）中で６０秒間安定化した後、一次抗ＶＩＳＴＡ抗体（１０μｇ／ｍｌ）を捕捉タンパク質と３００秒間会合させた。次いで、一連の二次抗ＶＩＳＴＡ抗体（１０μｇ／ｍｌ）を抗原および一次抗体複合体とさらに３００秒間会合させた。各結合事象についてシグナルを記録し、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＨＴ １１．１ソフトウェアでデータ分析を行った。
Ｏｃｔｅｔ ＱＫｅ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して抗ＶＩＳＴＡ抗体エピトープのビンを決定した。ヒトＶＩＳＴＡ組換えタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．、カタログ番号１３４８５－Ｈ０８Ｈ）を、ＥＺ－ＬＩＮＫ ＮＨＳ－ＰＥＧ４ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてビオチン化した。ストレプトアビジンバイオセンサチップ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用してビオチン化ＶＩＳＴＡタンパク質を捕捉した（５μｇ／ｍｌで３００秒）。ベースライン測定値を１倍動態緩衝液（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）中で６０秒間安定化した後、一次抗ＶＩＳＴＡ抗体（１０μｇ／ｍｌ）を捕捉タンパク質と３００秒間会合させた。次いで、一連の二次抗ＶＩＳＴＡ抗体（１０μｇ／ｍｌ）を抗原および一次抗体複合体とさらに３００秒間会合させた。各結合事象についてシグナルを記録し、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＨＴ １１．１ソフトウェアでデータ分析を行った。
リード抗ＶＩＳＴＡ抗体のエピトープビニングアッセイは、このＯｃｔｅｔ分析で３つの基結合エピトープを示した。図１６は、１６Ａ１、１７Ｅ９および２０Ｅ４がＶＩＳＴＡ上の同じエピトープについて競合する一方で、１Ｅ８、９Ｆ９および１５Ｄ１１は異なるエピトープに結合することを示す。結合するこれらすべての抗体由来の結合エピトープは、ベンチマーク対照抗体オンバチリマブおよびＩＥ８（Ｉｍｍｕｎｅｘｔ）の結合エピトープとは異なる。
実施例１３．バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）アッセイによる抗ＶＩＳＴＡ ｍＡｂのヒト、カニクイザルおよびマウスＶＩＳＴＡ抗原交差結合活性を示す
Ｏｃｔｅｔ ＱＫｅ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いたバイオレイヤー干渉法により、抗ＶＩＳＴＡ抗体のヒト、カニクイザルおよびマウスＶＩＳＴＡ抗原交差結合活性を測定した。ヒトＶＩＳＴＡ組換えタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．、カタログ番号１３４８２－Ｈ０８Ｈ）マウスＶＩＳＴＡ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．、カタログ番号５１５５０－Ｍ０８Ｈ）またはカニクイザルＶＩＳＴＡタンパク質（自社製）を、ＥＺ－ＬＩＮＫ ＮＨＳ－ＰＥＧ４ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてビオチン化した。ストレプトアビジンバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用してビオチン化ＶＩＳＴＡタンパク質をロードした（５μｇ／ｍｌで３００秒）。ベースライン測定値を１倍動態緩衝液（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）中で６０秒間安定化した後、５μｇ／ｍｌの抗ＶＩＳＴＡ抗体を捕捉タンパク質と３００秒間会合させた。次いで、センサーを１Ｘ動態緩衝液中で６００秒間解離させた。ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＨＴ １１．１ソフトウェアでデータ分析を行った。
Ｏｃｔｅｔ ＱＫｅ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いたバイオレイヤー干渉法により、抗ＶＩＳＴＡ抗体のヒト、カニクイザルおよびマウスＶＩＳＴＡ抗原交差結合活性を測定した。ヒトＶＩＳＴＡ組換えタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．、カタログ番号１３４８２－Ｈ０８Ｈ）マウスＶＩＳＴＡ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．、カタログ番号５１５５０－Ｍ０８Ｈ）またはカニクイザルＶＩＳＴＡタンパク質（自社製）を、ＥＺ－ＬＩＮＫ ＮＨＳ－ＰＥＧ４ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてビオチン化した。ストレプトアビジンバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用してビオチン化ＶＩＳＴＡタンパク質をロードした（５μｇ／ｍｌで３００秒）。ベースライン測定値を１倍動態緩衝液（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）中で６０秒間安定化した後、５μｇ／ｍｌの抗ＶＩＳＴＡ抗体を捕捉タンパク質と３００秒間会合させた。次いで、センサーを１Ｘ動態緩衝液中で６００秒間解離させた。ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＨＴ １１．１ソフトウェアでデータ分析を行った。
図１７Ａ～図１７Ｃは、試験したすべての抗体が、ヒト、カニクイザルおよびマウスＶＩＳＴＡに対する有効な結合を示すことを示す。比較すると、ベンチマーク対照抗体オンバチリマブはマウスＶＩＳＴＡと交差反応しない。
実施例１４．バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）アッセイによって決定されたヒトおよびカニクイザルＶＩＳＴＡに対する抗ＶＩＳＴＡ抗体の結合親和性
ヒトおよびカニクイザルに対する抗ＶＩＳＴＡ抗体の結合親和性を、Ｏｃｔｅｔ ＱＫｅ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用したバイオレイヤー干渉法で決定した。ヒトＶＩＳＴＡ組換えタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．、カタログ番号１３４８２－Ｈ０８Ｈ）またはカニクイザルＶＩＳＴＡタンパク質（社内で作製）を、ＥＺ－ＬＩＮＫ ＮＨＳ－ＰＥＧ４ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてビオチン化した。ストレプトアビジンバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用してビオチン化ＶＩＳＴＡタンパク質をロードした（５μｇ／ｍｌで３００秒）。ベースライン測定値を１倍動態緩衝液（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）中で６０秒間安定化した後、段階希釈（５０、２５、１２．５、６．２５および３．１２５μｇ／ｍｌ）での抗ＶＩＳＴＡ抗体を捕捉タンパク質と３００秒間会合させた。次いで、センサーを１Ｘ動態緩衝液中で６００秒間解離させた。ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＨＴ １１．１ソフトウェアでデータ分析を行った。
ヒトおよびカニクイザルに対する抗ＶＩＳＴＡ抗体の結合親和性を、Ｏｃｔｅｔ ＱＫｅ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用したバイオレイヤー干渉法で決定した。ヒトＶＩＳＴＡ組換えタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．、カタログ番号１３４８２－Ｈ０８Ｈ）またはカニクイザルＶＩＳＴＡタンパク質（社内で作製）を、ＥＺ－ＬＩＮＫ ＮＨＳ－ＰＥＧ４ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてビオチン化した。ストレプトアビジンバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用してビオチン化ＶＩＳＴＡタンパク質をロードした（５μｇ／ｍｌで３００秒）。ベースライン測定値を１倍動態緩衝液（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）中で６０秒間安定化した後、段階希釈（５０、２５、１２．５、６．２５および３．１２５μｇ／ｍｌ）での抗ＶＩＳＴＡ抗体を捕捉タンパク質と３００秒間会合させた。次いで、センサーを１Ｘ動態緩衝液中で６００秒間解離させた。ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＨＴ １１．１ソフトウェアでデータ分析を行った。
図１８Ａ～図１８Ｅは、ヒトおよびカニクイザルＶＩＳＴＡに対するすべての抗ＶＩＳＴＡ抗体の結合親和性を示す。
実施例１５．Ｔ細胞増殖の阻害に対する抗ＶＩＳＴＡ抗体の能力の分析
Ｔ細胞増殖を阻害する抗ＶＩＳＴＡ抗体の能力をインビトロアッセイで分析した。１：１（２．５μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３：２．５μｇ／ｍｌ）の濃度比の抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）およびＶＩＳＴＡ－Ｉｇを、３７°Ｃで一晩、９６ウェルにコーティングした。ヒトＰＢＭＣを新たに収集したバフィーコートから精製し、ＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｃ３４５５４）で標識した。次いで、９６ウェルプレートウェルを１ＸＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、２００，０００個のＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣ細胞を、ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ Ｔ細胞増殖ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ１０４８５０１）を用いて、抗ＶＩＳＴＡ抗体（５０μｇ／ｍｌ）またはマウスＩｇＧ対照（５０μｇ／ｍｌ）の存在下で各ウェルに添加した。５日間の処理後、細胞を回収し、ＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号３００３１１）で標識し、ＮｏｖｏＣｙｔｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）で泳動した。ＮｏｖｏＥｘｐｒｅｓｓソフトウェアを使用してデータを分析した。結果を図１９に示す。
Ｔ細胞増殖を阻害する抗ＶＩＳＴＡ抗体の能力をインビトロアッセイで分析した。１：１（２．５μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３：２．５μｇ／ｍｌ）の濃度比の抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）およびＶＩＳＴＡ－Ｉｇを、３７°Ｃで一晩、９６ウェルにコーティングした。ヒトＰＢＭＣを新たに収集したバフィーコートから精製し、ＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｃ３４５５４）で標識した。次いで、９６ウェルプレートウェルを１ＸＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、２００，０００個のＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣ細胞を、ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ Ｔ細胞増殖ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ１０４８５０１）を用いて、抗ＶＩＳＴＡ抗体（５０μｇ／ｍｌ）またはマウスＩｇＧ対照（５０μｇ／ｍｌ）の存在下で各ウェルに添加した。５日間の処理後、細胞を回収し、ＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号３００３１１）で標識し、ＮｏｖｏＣｙｔｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）で泳動した。ＮｏｖｏＥｘｐｒｅｓｓソフトウェアを使用してデータを分析した。結果を図１９に示す。
ベンチマーク対照抗体１Ｅ８（Ｉｍｍｕｎｅｘｔ）を陽性対照として使用し、マウスＩｇＧアイソタイプを陰性対照として使用した。示されるように、ＯＫＴ３のみ、ＯＫＴ３＋ＶＩＳＴＡ－Ｉｇ、またはＯＫＴ３＋ＶＩＳＴＡ－Ｉｇ＋ｍＩｇＧと共にインキュベートした約５０％～７０％の細胞が、ＣＦＳＥ染色によって示されるように増殖した。対照的に、抗ＶＩＳＴＡ抗体（１Ｅ８、９Ｆ９、１５Ｄ１１、１６Ａ１、１７Ｅ９、および２０Ｅ４）の存在は、Ｔ細胞増殖を有意に抑制した。これらのうち、９Ｆ９、１５Ｄ１１、１６Ａ１および２０Ｅ４は、１Ｅ８よりも良好な抑制効果を示す。
実施例１６．動物研究
４週齢の雌ＭＲＬ－ｌｐｒマウスをループス処置モデルに使用した。５～１２週の間、異なる群のマウスに、２００μｇのｍＩｇＧ１（対照）または抗ＶＩＳＴＡ構築物（ＭＨ５Ａ、９Ｆ９、または２０Ｅ４）の処置を毎週行った。ほとんどの測定は１２週目以降に行われ、血清抗体レベルのいくつかの測定は１２週目の前に行われた。ループス処置モデルに使用したプロトコルのグラフィック要約を図２０に示す。以下の実験Ａ～Ｆは、本明細書で試験した抗ＶＩＳＴＡ構築物の有効性を調べる際に、ループスの主要な臨床指標を使用して設計した。
４週齢の雌ＭＲＬ－ｌｐｒマウスをループス処置モデルに使用した。５～１２週の間、異なる群のマウスに、２００μｇのｍＩｇＧ１（対照）または抗ＶＩＳＴＡ構築物（ＭＨ５Ａ、９Ｆ９、または２０Ｅ４）の処置を毎週行った。ほとんどの測定は１２週目以降に行われ、血清抗体レベルのいくつかの測定は１２週目の前に行われた。ループス処置モデルに使用したプロトコルのグラフィック要約を図２０に示す。以下の実験Ａ～Ｆは、本明細書で試験した抗ＶＩＳＴＡ構築物の有効性を調べる際に、ループスの主要な臨床指標を使用して設計した。
Ａ．リンパ節拡大の処置における抗ＶＩＳＴＡ構築物
ＭＲＬ－ｌｐｒマウスは、自然突然変異Ｆａｓｌｐｒによって引き起こされる異常なＴ細胞の増殖に関連する大規模なリンパ節症を示す。この自己免疫マウスモデルは皮膚病変を発症し、エリテマトーデスのモデルとして使用される共通項である。１０週齢から、頸部領域周辺を穏やかに押すことによって、リンパ節の肥大を感じることができる。リンパ節の拡大は、ループスの状況を反映する初期の徴候であり得、動物が加齢するにつれて皮膚病変が形成される。
ＭＲＬ－ｌｐｒマウスは、自然突然変異Ｆａｓｌｐｒによって引き起こされる異常なＴ細胞の増殖に関連する大規模なリンパ節症を示す。この自己免疫マウスモデルは皮膚病変を発症し、エリテマトーデスのモデルとして使用される共通項である。１０週齢から、頸部領域周辺を穏やかに押すことによって、リンパ節の肥大を感じることができる。リンパ節の拡大は、ループスの状況を反映する初期の徴候であり得、動物が加齢するにつれて皮膚病変が形成される。
ｍＩｇＧ、ＭＨ５Ａ、９Ｆ９または２０Ｅ４でそれぞれ処置したマウスの４つの群を、それぞれ１２、１４および１５週齢でそれらのリンパ節のサイズについて調べた。結果を図２１Ａに示し、左から右への各週のデータバーは、ｍＩｇＧ処置群、ＭＨ５Ａ処置群、９Ｆ９処置群および２０Ｅ４処置群である。リンパ節のサイズを５つの数値に分類した：０（触知できない）、１（リョクトウサイズ）、２（エンドウ豆サイズ）、３（ピーナッツサイズ）、および４（クルミサイズ）。図２１Ａは、対照群（ｍＩｇＧ１処置）と比較して、ＭＨ５Ａおよび９Ｆ９がマウスにおいてリンパ節のサイズを有意に減少させ、２０Ｅ４がリンパ節のサイズをわずかに減少させたことを示す。図２１Ｂは、実験に使用されたマウスの頸部領域から除去されたリンパ節の例示的なサイズを示す。
Ｂ．抗核免疫グロブリンの血清レベルを低下させる際の抗ＶＩＳＴＡ構築物
ＭＲＬ－ｌｐｒマウスは、細胞核に対する自己抗体（抗核抗体、ＡＮＡ）の自然発生を含む全身性自己免疫症状を発症する。ＡＮＡ試験は、ループスを診断するためにヒトにおいて使用されている；陽性のＡＮＡ試験は、免疫系がヒト自身の組織に対して誤った方向の攻撃を開始したことを示す。
ＭＲＬ－ｌｐｒマウスは、細胞核に対する自己抗体（抗核抗体、ＡＮＡ）の自然発生を含む全身性自己免疫症状を発症する。ＡＮＡ試験は、ループスを診断するためにヒトにおいて使用されている；陽性のＡＮＡ試験は、免疫系がヒト自身の組織に対して誤った方向の攻撃を開始したことを示す。
ｍＩｇＧ１、ＭＨ５Ａ、９Ｆ９、または２０Ｅ４で処置したマウスにおける血清ＡＮＡレベルを、それぞれ５、６、９、１２、および１５週目に測定した。結果を図２２に示す。図２２における左から右への各週のデータバーは、ｍＩｇＧ処置群、ＭＨ５Ａ処置群、９Ｆ９処置群および２０Ｅ４処置群である。ＭＨ５Ａおよび９Ｆ９は、ｍＩｇＧ１と比較して血清中のＡＮＡのレベルを有意に低下させ、２０Ｅ４は、１５週目までにマウスの血清中のＡＮＡのレベルを軽度に低下させた。
Ｃ．抗ｄｓＤＮＡ免疫グロブリンの血清レベルを低下させる際の抗ＶＩＳＴＡ構築物
診療所では、血液中の高レベルの抗ｄｓＤＮＡ抗体がループスと強く関連しており、フレアアップ中またはその直前にしばしば有意に増加する。ループスに関連する他の臨床徴候および症候に関連する陽性抗ｄｓＤＮＡ抗体試験が、ループスの診断のために使用される。
診療所では、血液中の高レベルの抗ｄｓＤＮＡ抗体がループスと強く関連しており、フレアアップ中またはその直前にしばしば有意に増加する。ループスに関連する他の臨床徴候および症候に関連する陽性抗ｄｓＤＮＡ抗体試験が、ループスの診断のために使用される。
ｍＩｇＧ１、ＭＨ５Ａ、９Ｆ９、または２０Ｅ４で処置したマウスにおける抗ｄｓＤＮＡ抗体の血清レベルを、それぞれ９、１２、および１５週目に測定した。結果を図２３に示す。試験したすべての抗ＶＩＳＴＡ構築物（ＭＨ５Ａ、９Ｆ９、および２０Ｅ４）は、１２週目にマウス血清中の抗ｄｓＤＮＡ抗体を減少させることができ、１５週目の処置後３週間でレベルは低いままであった。
Ｄ．ＩＦＮαの血清レベルを低下させる際の抗ＶＩＳＴＡ構築物
ループスの病因および病理発生に関与する重要なサイトカインの例は、インターフェロンアルファである。ＩＦＮαは、免疫調節において重要なタンパク質である。ＩＦＮαは、ループスに関与する複数の細胞型に影響を及ぼし得る多面的サイトカインである。ＩＦＮαの血清レベルの上昇およびインターフェロン経路におけるいくつかの遺伝子の発現の変化は、ループスのリスクと関連しており、病因におけるこの経路の役割を示唆している。
ループスの病因および病理発生に関与する重要なサイトカインの例は、インターフェロンアルファである。ＩＦＮαは、免疫調節において重要なタンパク質である。ＩＦＮαは、ループスに関与する複数の細胞型に影響を及ぼし得る多面的サイトカインである。ＩＦＮαの血清レベルの上昇およびインターフェロン経路におけるいくつかの遺伝子の発現の変化は、ループスのリスクと関連しており、病因におけるこの経路の役割を示唆している。
ｍＩｇＧ１、ＭＨ５Ａ、９Ｆ９、または２０Ｅ４で処置したマウスにおけるＩＦＮαの血清レベルを１２週目および１５週目に測定した。図２４では、３つすべての抗ＶＩＳＴＡ構築物が、ｍＩｇＧ１（対照）と比較して、１２週目にＩＦＮαの血清レベルを有意に低下させ、１５週目に有意に低いままであったことが明らかに示されている。
Ｅ．尿中のタンパク質レベルを低下させる際の抗ＶＩＳＴＡ構築物
本明細書で使用されるＭＲＬ－ｌｐｒマウスは、ループス腎炎を自然発症する。尿中のタンパク質レベルは、腎臓の疾患病理発生を反映し得る。診療所では、血液試験の他に、尿タンパク質レベルを含む尿試験が、腎臓に対するループスの影響を診断およびモニタリングするために使用されている。
本明細書で使用されるＭＲＬ－ｌｐｒマウスは、ループス腎炎を自然発症する。尿中のタンパク質レベルは、腎臓の疾患病理発生を反映し得る。診療所では、血液試験の他に、尿タンパク質レベルを含む尿試験が、腎臓に対するループスの影響を診断およびモニタリングするために使用されている。
尿中のタンパク質レベルを、ｍＩｇＧ１、ＭＨ５Ａ、９Ｆ９または２０Ｅ４で処置したマウスについて１２週目および１５週目に測定した。各群は６匹のマウスを有していた。図２５および図２６中の円グラフは、各処置群における異なる尿タンパク質レベルカテゴリーにおけるマウスの分布を実証している。チャートの下のパーセンテージ値は、≧１００ｍｇ／ｄＬまたは≧３００ｍｇ／ｄＬのタンパク質レベルを有する各処置群におけるマウスのパーセンテージを示す。抗ＶＩＳＴＡ構築物によるすべての処置群は、１２週目のｍＩｇＧ群と比較して、２＋群（１００～３００ｍｇ／ｄＬタンパク質）および３＋群（３００～１０００ｍｇ／ｄＬタンパク質）のマウスが少なかった。ＭＨ５Ａおよび９Ｆ９は、１５週目における低下した尿タンパク質レベルの維持に対して長期の効果を示した。
Ｆ．皮膚ループス病変の軽減における抗ＶＩＳＴＡ構築物
マウスの皮膚ループス病変に対する抗ＶＩＳＴＡ構築物の保護効果を１７週目に調査した。図２７に示すように、ＭＨ５Ａおよび９Ｆ９で処置したマウスは、ｍＩｇＧ１で処置したマウスと比較して皮膚病変が減少していた。
マウスの皮膚ループス病変に対する抗ＶＩＳＴＡ構築物の保護効果を１７週目に調査した。図２７に示すように、ＭＨ５Ａおよび９Ｆ９で処置したマウスは、ｍＩｇＧ１で処置したマウスと比較して皮膚病変が減少していた。
Ｇ．結論
ＭＨ５Ａ、９Ｆ９および２０Ｅ４を、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を含むループスに対するそれらの治療効果についてＭＲＬ－ｌｐｒマウスにおいて試験した。リンパ節拡大、血清中の自己抗体およびサイトカインレベル、尿タンパク質レベル、および皮膚外観を使用して、処置後の各群の疾患の重症度を評価した。９Ｆ９およびＭＨ５Ａは、ＭＲＬ－ｌｐｒマウスモデルにおいて有望な前臨床効果を示し、ＭＲＬ－ｌｐｒマウスにおいてリンパ節拡大、血清抗核および抗ｄｓＤＮＡ自己抗体レベル、血清ＩＦＮαレベルおよび尿タンパク質レベルを有意に低下させた。２０Ｅ４はまた、ｍＩｇＧ１（対照）と比較して、血清抗ｄｓＤＮＡおよびＩＦＮαレベルの減少において保護効果を示した。
ＭＨ５Ａ、９Ｆ９および２０Ｅ４を、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を含むループスに対するそれらの治療効果についてＭＲＬ－ｌｐｒマウスにおいて試験した。リンパ節拡大、血清中の自己抗体およびサイトカインレベル、尿タンパク質レベル、および皮膚外観を使用して、処置後の各群の疾患の重症度を評価した。９Ｆ９およびＭＨ５Ａは、ＭＲＬ－ｌｐｒマウスモデルにおいて有望な前臨床効果を示し、ＭＲＬ－ｌｐｒマウスにおいてリンパ節拡大、血清抗核および抗ｄｓＤＮＡ自己抗体レベル、血清ＩＦＮαレベルおよび尿タンパク質レベルを有意に低下させた。２０Ｅ４はまた、ｍＩｇＧ１（対照）と比較して、血清抗ｄｓＤＮＡおよびＩＦＮαレベルの減少において保護効果を示した。
実施例１７．移植片対宿主（ＧｖＨＤ）マウスモデルにおける抗ＶＩＳＴＡ抗体の有効性研究
この研究の目的は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）のマウスモデルにおける抗ＶＩＳＴＡ抗体９Ｆ９および２０Ｅ４の有効性を評価することである。
この研究の目的は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）のマウスモデルにおける抗ＶＩＳＴＡ抗体９Ｆ９および２０Ｅ４の有効性を評価することである。
研究の有効性を、体重を測定することによって、およびマウスの皮膚の裸出の目視評価によって評価した。試験を通して、マウスの全体的な活性を評価した。血液中のＧｖＨＤ発症のレベルを示すヒトＣＤ４５＋細胞生着のレベルも測定した。例えば、Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１２；７（８）：ｅ４４２１９を参照されたい。
ＮＯＤ－ｓｃｉｄ ＩＬ２ｒｇ ｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウスをこの研究に使用した。０日目に、すべてのマウスに静脈内（ＩＶ）注射によって１０００万個のヒトＰＢＭＣを注射し、３つの群に分けた。群１は、０日目にマウスＩｇＧアイソタイプ対照（０．５ｍｇ／マウス）処置を受けた。群２および群３には、それぞれ９Ｆ９（０．５ｍｇ／マウス）または２０Ｅ４（０．５ｍｇ／マウス）を用いて腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって処置した。体重を毎週収集した。２回目の用量の試験物を２週間で与えた。フローサイトメトリー分析のために、２週目および５週目に血液試料を採取した。マウスを３７日目に屠殺した。
生データとして収集した測定値を、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアＰｒｉｓｍを用いて分析した。Ｐ＜０．０５を統計学的に有意とみなした。
移植片対宿主病は、動物が嗜眠状態になるにつれて体重減少をもたらし、疾患が進行するにつれて活性が低下する。図２８は、抗ＶＩＳＴＡ抗体９Ｆ９および２０Ｅ４でマウスを処置することにより、試験期間中の体重減少が防止されることを示す。体重の変化は、アイソタイプ対照群と比較して、９Ｆ９および２０Ｅ４処置群で統計学的に異なっていた。アイソタイプ対照処置マウスの４匹中３匹で活性の低下が観察された。９Ｆ９抗体または２０Ｅ４抗体で処置した群のいずれについても活性の変化は観察されなかった。
ＧｖＨＤに罹患しているマウスは、病気が進行するにつれて、経時的に皮膚裸出を伴って現れる。３３日目に、マウスを撮影して、異なる群で観察された皮膚裸出のレベルを捕捉した。図３０は、アイソタイプ対照を注射したマウスと抗ＶＩＳＴＡ抗体９Ｆ９または２０Ｅ４で処置したマウスにおける皮膚裸出を示す。
ＰＢＭＣ移植後１４日目および３７日目に血清を採取した。細胞を収集し、フローサイトメトリー分析のためにヒトおよびマウスのＣＤ４５について染色した。図２９は、異なる群におけるヒトＣＤ４５＋細胞のパーセントを示す。各記号は、群内の個々のマウスを表す。対照と比較して、９Ｆ９抗体または２０Ｅ４抗体のいずれかで処置したマウスにおいて、ヒトＣＤ４５＋細胞の統計学的に有意な減少があった。
Claims (33)
- 重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体部分を含む抗ＶＩＳＴＡ構築物であって、前記抗体部分が、第二の重鎖可変領域（ＶＨ－２）および第二の軽鎖可変領域（ＶＬ－２）を含む抗体または抗体断片とＶＩＳＴＡの結合エピトープについて競合し、
ａ）前記ＶＨ－２が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬ－２が、配列番号４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含むか；
ｂ）前記ＶＨ－２が、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬ－２が、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含むか；
ｃ）前記ＶＨ－２が、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬ－２が、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含むか；
ｄ）前記ＶＨ－２が、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬ－２が、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号３０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含むか；または
ｅ）前記ＶＨ－２が、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬ－２が、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号３８のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む、抗ＶＩＳＴＡ構築物。 - 請求項１に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物であって、
ａ）前記ＶＨが、ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含み；前記ＶＬが、ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含むか；
ｂ）前記ＶＨが、ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含み；前記ＶＬが、ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含むか；
ｃ）前記ＶＨが、ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含み；前記ＶＬが、ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含むか；
ｄ）前記ＶＨが、ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含み；前記ＶＬが、ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含むか；
ｅ）前記ＶＨが、ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含み；前記ＶＬが、ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含むその改変体を含むか；
ｆ）前記ＶＨが、ｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号４２もしくは５１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み；前記ＶＬが、ｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含むか；
ｈ）前記ＶＨが、ｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号４４もしくは５２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み；前記ＶＬが、ｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号５６もしくは５７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含むか；または
ｉ）前記ＶＨが、ｉ）配列番号４１もしくは４３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５８のいずれかのアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１１もしくは４５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み；前記ＶＬが、ｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号５０もしくは５３のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む、抗ＶＩＳＴＡ構築物。 - 前記ＶＨが、ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み；前記ＶＬが、ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む、請求項２に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物。
- 前記ＶＨが、ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み；前記ＶＬが、ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む、請求項２に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物。
- 前記ＶＨが、ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み；前記ＶＬが、ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む、請求項３に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物。
- 前記ＶＨが、ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含み；前記ＶＬが、ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む、請求項３に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物。
- ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体部分を含む抗ＶＩＳＴＡ構築物であって、
ａ）配列番号７に示される配列を有するＶＨ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３、ならびに配列番号８に示される配列を有するＶＬ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３；
ｂ）配列番号１５に示される配列を有するＶＨ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３、ならびに配列番号１６に示される配列を有するＶＬ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３；
ｃ）配列番号２３に示される配列を有するＶＨ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３、ならびに配列番号２４に示される配列を有するＶＬ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３；
ｄ）配列番号３１に示される配列を有するＶＨ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３、ならびに配列番号３２に示される配列を有するＶＬ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３；または
ｅ）配列番号３９に示される配列を有するＶＨ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３、ならびに配列番号４０に示される配列を有するＶＬ鎖領域内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３を含む、抗ＶＩＳＴＡ構築物。 - 前記ＶＨが、配列番号７、１５、２３、３１および３９のいずれか１つのアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含み；および／または、前記ＶＬが、配列番号８、１６、２４、３２および４０のいずれか１つのアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物。
- 請求項８に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物であって、
ａ）前記ＶＨが、配列番号７のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含み；前記ＶＬが、配列番号８のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含むか、
ｂ）前記ＶＨが、配列番号１５のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含み；前記ＶＬが、配列番号１６のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含むか、
ｃ）前記ＶＨが、配列番号２３のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含み；前記ＶＬが、配列番号２４のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含むか、
ｄ）前記ＶＨが、配列番号３１のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含み；前記ＶＬが、配列番号３２のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含むか、または
ｅ）前記ＶＨが、配列番号３９のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含み；前記ＶＬが、配列番号４０のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変体を含む、抗ＶＩＳＴＡ構築物。 - 前記抗体部分が、全長抗体、二重特異性抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、Ｆｖ－Ｆｃ融合物、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合物、ｓｃＦｖ－Ｆｖ融合物、ダイアボディ、トリボディ、およびテトラボディからなる群から選択される抗体またはその抗原結合断片である、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物。
- 前記抗体部分が全長抗体である、請求項１０に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物。
- 前記抗体部分が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来のＦｃ断片、ならびにそれらの組み合わせおよびハイブリッドからなる群から選択されるＦｃ断片を有する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物。
- 前記Ｆｃ断片が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、およびそれらの組み合わせおよびハイブリッドからのＦｃ断片からなる群から選択される、請求項１２に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物。
- 前記Ｆｃ断片が、対応する野生型Ｆｃ断片と比較して低下したエフェクター機能を有する、請求項１２または請求項１３に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物。
- 前記Ｆｃ断片が、対応する野生型Ｆｃ断片と比較して長い半減期を有する、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物。
- 前記抗ＶＩＳＴＡ構築物の前記抗体部分が、ＶＩＳＴＡの下流シグナル伝達経路を活性化する、請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物。
- 前記抗ＶＩＳＴＡ構築物が、ＶＩＳＴＡのアゴニスト抗体である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物。
- 前記抗ＶＩＳＴＡ構築物の前記抗体部分が、ＶＩＳＴＡの前記下流シグナル伝達経路を少なくとも約２０％活性化または増加させる、請求項１６のいずれか一項に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物。
- 前記ＶＩＳＴＡがヒトＶＩＳＴＡである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物。
- 請求項１～１９のいずれか一項に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物と、薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物。
- 請求項１～２０のいずれか一項に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物をコードする単離された核酸。
- 請求項２１に記載の単離された核酸を含むベクター。
- 請求項２１に記載の単離された核酸または請求項２２に記載のベクターを含む単離された宿主細胞。
- 治療剤または標識に連結された請求項１～１９のいずれか一項に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物を含む免疫コンジュゲート。
- 抗ＶＩＳＴＡ構築物を製造する方法であって、
ａ）前記抗ＶＩＳＴＡ構築物を発現するのに有効な条件下で、請求項２３に記載の単離された宿主細胞を培養すること；および
ｂ）前記宿主細胞から発現された抗ＶＩＳＴＡ構築物を得ることを含む方法。 - 個体における疾患または症状を処置する方法であって、前記個体に、有効量の請求項１～１９のいずれか一項に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物、または請求項２０に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
- 前記症状の疾患が、調節不全の免疫系に関連する、請求項２６に記載の方法。
- 前記疾患または症状が、自己免疫疾患、炎症、感染、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）または移植に関連する症状である、請求項２６または請求項２７に記載の方法。
- 前記自己免疫疾患が、皮膚エリテマトーデス、関節リウマチ、乾癬、自己免疫性腸障害、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、円板状エリテマトーデス（ＤＬＥ）から選択される、請求項２８に記載の方法。
- 前記抗ＶＩＳＴＡ構築物が、前記個体に静脈内または皮下投与される、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗ＶＩＳＴＡ構築物が、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項２６～３０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記個体がヒトである、請求項２２～３１のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項１～１９のいずれか一項に記載の抗ＶＩＳＴＡ構築物を含むキット。
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