JP4832719B2 - ＦｃγＲＩＩＩａ多型患者に適応する抗体組成物含有医薬 - Google Patents

ＦｃγＲＩＩＩａ多型患者に適応する抗体組成物含有医薬 Download PDF

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Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞から生産された抗体組成物を有効成分として含有する、ＦｃγＲＩＩＩａ多型患者に適応する医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、高い結合活性、結合特異性および血中での高い安定性を有することから、ヒトの各種疾患の診断、予防および治療薬としての応用が試みられてきた［モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５）］。また、遺伝子組換え技術を利用して、非ヒト動物抗体からヒト型キメラ抗体あるいはヒト型相補性決定領域（以下、ＣＤＲと表記する）移植抗体などのヒト化抗体が作製された［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３１２，６４３（１９８４）、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），８１，６８５１（１９８４）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３２１，５２２（１９８６）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３３２，３２３（１９８８）］。ヒト型キメラ抗体とは、抗体可変領域（以下、Ｖ領域と表記する）がヒト以外の動物の抗体で、定常領域（以下、Ｃ領域と表記する）がヒト抗体である抗体である。ヒト型ＣＤＲ移植抗体とは、ヒト抗体のＣＤＲをヒト以外の動物の抗体のＣＤＲと置換した抗体である。
【０００３】
ヒト化抗体は、マウス抗体などの非ヒト動物抗体の高い免疫原性、低いエフェクター機能、短い血中半減期などの問題を解決し、モノクローナル抗体の医薬品としての応用を可能にした［イムノロジー・トゥデイ（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ），２１，３６４（２０００）、イムノロジー・トゥデイ（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ），２１，４０３（２０００）、アナルズ・オブ・アレルギー・アズマ・アンド・イムノロジー（Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｓｔｈｍａ Ｉｍｍｕｎｏｌ．），８１，１０５（１９９８）、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．），１６，１０１５（１９９８）］。既に米国においては、例えば、癌治療用抗体として５種類のヒト化抗体が認可され、販売されている［ネイチャー・レビューズ・キャンサー（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ），１，１１９（２００１）］。
【０００４】
これらのヒト化抗体は、実際に臨床においてある程度の効果を示しているが、より効果の高い抗体医薬が求められていることも事実である。例えば、ＣＤ２０に対するヒト型キメラ抗体であるＲｉｔｕｘａｎ（ＩＤＥＣ社製）は、単独では、再発性低悪性度の非ホジキンリンパ腫患者に対する第ＩＩＩ相臨床試験における奏効率は４８％（完全寛解６％、部分寛解４２％）に過ぎず、また、平均の効果持続期間は１２ヶ月と報告されている［ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．），１６，２８２５（１９９８）］。Ｒｉｔｕｘａｎと化学療法（ＣＨＯＰ：Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ，Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ，Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）との併用の再発性低悪性度および濾胞性の非ホジキンリンパ腫患者に対する第ＩＩ相臨床試験においては、奏効率は９５％（完全寛解５５％、部分寛解４５％）と報告されているが、ＣＨＯＰに起因する副作用が認められている［ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．），１７，２６８（１９９９）］。ＨＥＲ２に対するヒト型ＣＤＲ移植抗体であるＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社製）は、単独では、転移性乳癌患者に対する第ＩＩＩ相臨床試験における奏効率は僅か１５％であり、平均の効果持続期間は９．１ヶ月と報告されている［ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．），１７，２６３９（１９９９）］。
【０００５】
このような抗原発現細胞を直接標的とする抗体医薬の治療効果を増強するために、様々な方法が検討されている。
一つは、放射性同位元素や毒素を抗体に結合させ、標的細胞を直接障害する方法である［ブラッド（Ｂｌｏｏｄ），９６，２９３４（２０００）、ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．），１７，３７９３（１９９９）］。Ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎを結合させた抗ＣＤ３３抗体であるＭｙｌｏｔａｒｇ（Ｗｙｅｔｈ Ｌａｂｓ社製）は、既に米国において認可、販売されている。また、放射性同位元素を結合させた抗ＣＤ２０抗体であるＺｅｖａｌｉｎ（ＩＤＥＣ社製）やＢｅｘｘａｒ（Ｃｏｒｉｘａ社製）などが開発されている。
【０００６】
また、２種類の抗原結合特異性を有する抗体である２特異性抗体を用いて間接的に標的細胞を障害する方法が検討されている。すなわち、一方の特異性を標的細胞に、他方をエフェクター細胞や放射性同位元素、毒素に対する特異性とした抗体の作製が行われている［カレント・オピニオン・イン・イムノロジー（Ｃｙｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１１，５５８（１９９９）、ジャーナル・オブ・イムノセラピー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），２２，５１４（１９９９）、イムノロジー・トゥデイ（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ），２１，３９１（２０００）］。
さらに、抗体と酵素とを結合させ、抗体の標的細胞への特異的集積後に酵素により活性化される薬剤を投与し、標的細胞を特異的に障害させる方法（ＡＤＥＰＴ：ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｚｙｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｒｏｄｒｕｇ ｔｈｅｒａｐｙ）も検討されている［アンチキャンサー・リサーチ（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．），１９，６０５（１９９９）、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．），５４，２１５１（１９９４）］。
【０００７】
これらの方法は、現在、各種臨床試験においてその効果が検証されているが、放射性同位元素や毒素による副作用［クリニカル・キャンサー・リサーチ（Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．），２，４５７（１９９６）、ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．），１７，４７８（１９９９）］、２特異性抗体については製造方法や費用、ＡＤＥＰＴについては使用する酵素の抗原性［セル・バイオフィジクス（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｐｈｙｓ．），２１，１０９（１９９２）］などの問題がある。
【０００８】
ヒト抗体のＩｇＧ１およびＩｇＧ３サブクラスの抗体は、抗体依存性細胞障害活性（以下、ＡＤＣＣ活性と表記する）や補体依存性細胞障害活性（以下、ＣＤＣ活性と表記する）などのエフェクター機能を有している［ケミカル・イムノロジー（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ），６５，８８（１９９７）、イムノロジー・トゥデイ（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ），２０，５７６（１９９９）］。上記のＲｉｔｕｘａｎは、ＩｇＧ１サブクラスのヒト型キメラ抗体であり、その抗腫瘍効果の作用機序として、抗体によるＣＤ２０のクロスリンクによるアポトーシスの誘導の他、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性などのエフェクター機能の重要性が示唆されている［カレント・オピニオン・イン・イムノロジー（Ｃｙｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１１，５４１（１９９９）］。ＨｅｒｃｅｐｔｉｎもＩｇＧ１サブクラスのヒト型ＣＤＲ移植抗体であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏの実験で細胞障害活性におけるＡＤＣＣ活性の重要性が報告されている［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），３７，２５５（１９９３）］。以上の事実は、エフェクター機能、特に、ＡＤＣＣ活性を増強することにより、抗体の治療効果を高めることが可能であることを示している。
ＡＤＣＣ活性は、標的細胞上の抗原に結合したＩｇＧクラスの抗体のＦｃ領域と、好中球、マクロファージ、ＮＫ細胞などのエフェクター細胞上に存在するＦｃ受容体（以下、ＦｃγＲと表記する）との相互作用を介して発揮される［アニュアル・レビュー・オブ・イムノロジー（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１８，７０９（２０００）、アニュアル・レビュー・オブ・イムノロジー（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１９，２７５（２００１）］。
【０００９】
ＦｃγＲは、３つの異なるクラスが存在することが明らかとなっており、それぞれＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）と呼ばれている。ヒトにおいては、ＦｃγＲＩＩとＦｃγＲＩＩＩは、さらに、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂとＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂに分類されている。ＦｃγＲは、イムノグロブリンスーパーファミリーに属する膜蛋白質であり、ＦｃγＲＩＩとＦｃγＲＩＩＩは、２つのイムノグロブリン様ドメイン、ＦｃγＲＩは、３つのイムノグロブリン様ドメインからなる細胞外領域を持つα鎖を構成成分として持ち、α鎖がＩｇＧ結合活性を担っている。さらに、ＦｃγＲＩとＦｃγＲＩＩＩは、α鎖と会合してシグナル伝達機能を有するγ鎖あるいはζ鎖を構成成分として有している［アニュアル・レビュー・オブ・イムノロジー（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１８，７０９（２０００）、アニュアル・レビュー・オブ・イムノロジー（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１９，２７５（２００１）］。
ＦｃγＲは、その機能から、活性化受容体と抑制性受容体に分けられる［アニュアル・レビュー・オブ・イムノロジー（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１９，２７５（２００１）］。
【００１０】
活性化受容体は、α鎖あるいは会合するγ鎖、ζ鎖の細胞内領域にｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ（以下、ＩＴＡＭと表記する）と呼ばれる１９アミノ酸残基からなる配列が存在する。ＩｇＧ免疫複合体の結合に伴ってＩＴＡＭと相互作用するＳｒｃやＳｙｋなどのチロシンキナーゼが活性化されて、種々の活性化反応が惹起される。
【００１１】
抑制性受容体は、α鎖の細胞内領域にｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｔｉｆ（以下、ＩＴＩＭと表記する）と呼ばれる１３アミノ酸残基からなる配列が存在する。活性化受容体との会合を介してＩＴＩＭがリン酸化されることにより、ＳＨＩＰと呼ばれるホスファターゼの活性化を始めとして種々の反応が惹起され、活性化受容体からの活性化シグナルを抑制する。
【００１２】
ヒトでは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａは、活性化受容体として機能している。ＦｃγＲＩは、会合しているγ鎖の細胞内領域にＩＴＡＭ配列が存在している。ＦｃγＲＩはマクロファージ、単球、樹状細胞、好中球、好酸球などに発現している。ＦｃγＲＩＩａは、単一のα鎖からなり、細胞内領域にＩＴＡＭ様配列が存在している。ＦｃγＲＩＩａは、マクロファージ、マスト細胞、単球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、好中球、好酸球、血小板および一部のＢ細胞に発現している。ＦｃγＲＩＩＩａは、会合しているγ鎖あるいはζ鎖の細胞内領域にＩＴＡＭ配列が存在している。ＦｃγＲＩＩＩａは、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球、マスト細胞、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、好酸球などに発現しているが、好中球、Ｂ細胞およびＴ細胞には発現していない。
【００１３】
一方、ＦｃγＲＩＩｂは、単一のα鎖からなり、細胞外領域のアミノ酸配列はＦｃγＲＩＩａと約９０％の相同性を有するものの、細胞内領域にＩＴＩＭ配列が存在するため、抑制性受容体として機能している。ＦｃγＲＩＩｂは、Ｂ細胞、マクロファージ、マスト細胞、単球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、好塩基球、好中球、好酸球に発現しているが、ＮＫ細胞やＴ細胞には発現していない。
【００１４】
ＦｃγＲＩＩＩｂは、単一のα鎖からなり、細胞外領域のアミノ酸配列はＦｃγＲＩＩＩａと約９５％の相同性を有しているが、グリコシルホスファチジルイノシトール（以下、ＧＰＩと表記する）結合型の膜蛋白質として、好中球に特異的に発現している。ＦｃγＲＩＩＩｂは、ＩｇＧ免疫複合体を結合するが、単独では細胞を活性化できず、ＦｃγＲＩＩａなどのＩＴＡＭ配列を有する受容体との会合を介して機能していると考えられている。
【００１５】
マウスを用いた実験から、ＲｉｔｕｘａｎやＨｅｒｃｅｐｔｉｎなどの抗体の抗腫瘍活性においてＦｃγＲが重要な役割を果たしていることが明らかとなった。すなわち、抑制性受容体であるＦｃγＲＩＩｂを欠損したマウスでは、抗体による抗腫瘍効果は上昇し、一方、活性化受容体であるＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩを欠損したマウスでは、抗体の抗腫瘍効果は低下した［ネイチャー・メディスン（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），６，４４３（２０００）］。さらに、Ｆｃ領域のアミノ酸変異によりＦｃγＲへの結合活性を低下させた抗体では、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＡＤＣＣ活性はほとんど検出されず、また、マウスでの抗腫瘍効果は著しく低下した［ネイチャー・メディスン（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），６，４４３（２０００）］。以上の結果は、抗体の活性化受容体への結合活性を上昇させる、あるいは抑制性受容体への結合活性を低下させることにより、主としてＡＤＣＣ活性を介した抗体の抗腫瘍効果を高めることが可能であることを示している。
【００１６】
実際に、シールズら（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．）は、ヒトＩｇＧ１サブクラスの抗体のＦｃ領域のアミノ酸を変異させることにより、活性化受容体であるＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性を上昇させ、その結果、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＡＤＣＣ活性が約２倍上昇したことを報告した［ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２７６，６５９１（２００１）］。ただし、そのｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍効果の増強については報告されていない。
【００１７】
また、抗体のＡＤＣＣ活性の増強は、Ｆｃ領域に結合している糖鎖を人為的に改変することによっても行われている。ＣＨＯ細胞にβ−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ遺伝子を導入することにより、バイセクティング糖鎖を増加させ、ＡＤＣＣ活性が上昇したことが報告されている［ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．），１７，１７６（１９９９）］。しかし、この場合、ＦｃγＲへの結合活性を含め、そのＡＤＣＣ活性の上昇に関する詳細な機構の解明はなされていない。
【００１８】
最近、Ｒｉｔｕｘａｎの臨床において、その治療効果が患者のＦｃγＲＩＩＩａの多型によって影響されることが報告された［ブラッド（Ｂｌｏｏｄ），１，７５４（２００２）］。ヒトのＦｃγＲＩＩＩａには、１７６番目のアミノ酸残基がＰｈｅ（以下、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）と表記する）とＶａｌ（以下、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）と表記する）の多型がある。ヒトのＩｇＧ１サブクラスの抗体は、Ｐｈｅ／Ｐｈｅのホモ型やＰｈｅ／Ｖａｌのヘテロ型（以下、Ｐｈｅ／Ｐｈｅのホモ型やＰｈｅ／Ｖａｌのヘテロ型はＰｈｅキャリアーと表記する）のＮＫ細胞に比べて、Ｖａｌ／Ｖａｌのホモ型のＮＫ細胞により高い結合活性を示し、さらに高いＡＤＣＣ活性を誘導することが知られている［ブラッド（Ｂｌｏｏｄ），９０，１１０９（１９９７）、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．），１００，１０５９（１９９７）、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２７６，６５９１（２００１）］。Ｒｉｔｕｘａｎの濾胞性非ホジキンリンパ腫の患者に対する治療１年後の奏効率は、Ｐｈｅキャリアーの５１％に対して、Ｖａｌホモ型では、９０％と有意に高いことが示されている［ブラッド（Ｂｌｏｏｄ），１，７５４（２００２）］。
【００１９】
ＦｃγＲＩＩＩａのＰｈｅキャリアーとＶａｌホモ型の割合は、各種民族間でほぼ一定であり、Ｐｈｅキャリアーが８０〜９０％、Ｖａｌホモ型が１０〜２０％と報告されている［ブラッド（Ｂｌｏｏｄ），９０，１１０９（１９９７）、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ），２４２，１２７（２０００）、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ），９４，４２２０（１９９９）］。ヒトＩｇＧ１サブクラスの抗体とＦｃγＲＩＩＩの結合活性については、多数の報告があり、測定方法によって差が認められるが、結合定数（以下、ＫＡと表記する）は、１０５〜１０７Ｍ−１と報告されている［バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍ．），３４，１３３２０（１９９５）、アドバンシズ・イン・イムノロジー（Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ），５７，１（１９９４）、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ），２７，１９２８（１９９７）、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．），１８３，２２２７（１９９６）、アナルズ・オブ・ヘマトロジー（Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．），７６，２３１（１９９８）、アニュアル・レビューズ・オブ・イムノロジー（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），９，４５７（１９９１）］。上記のヒトＩｇＧ１サブクラスの抗体のＦｃ領域のアミノ酸変異により作製された抗体は、天然型のヒトＩｇＧ１（いずれもヒト胚性腎細胞株２９３細胞で生産）に比べ、ＥＬＩＳＡ法において最大でＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）に対して１．１１倍、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）に対して２．１７倍高い結合活性を示している［ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２７６，６５９１（２００１）］。
【発明の開示】
【００２０】
本発明は、以下の（１）〜（２８）に関する。
（１）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞から生産された抗体組成物を有効成分として含有する、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有さない細胞から生産された抗体組成物を有効成分として含有する医薬とヒトＦｃγ受容体ＩＩＩａとの親和性が、該抗体組成物が治療効果を発揮するには十分ではない親和性しか示さない患者に適用することを特徴とする医薬。
（２）治療効果を発揮するには十分ではない親和性が、抗体依存性細胞障害活性を発揮するには十分ではない親和性である、（１）記載の医薬。
（３）治療効果を発揮するには十分ではない親和性が、少なくとも、以下の（ａ）または（ｂ）からなる群から選ばれる親和性より低いことを特徴とする、（１）または（２）に記載の医薬。
（ａ）ＢＩＡｃｏｒｅによるバイオセンサー法で測定した場合、２５℃でのヒトＦｃγ受容体ＩＩＩａに対する結合定数が１×１０７Ｍ−１；
（ｂ）等温滴定型熱量計で測定した場合、２５℃でのヒトＦｃγ受容体ＩＩＩａに対する結合定数が２×１０６Ｍ−１。
（４）ヒトＦｃγ受容体ＩＩＩａが、シグナル配列のＮ末端メチオニンから１７６番目のアミノ酸がフェニルアラニンを有するヒトＦｃγ受容体ＩＩＩａである、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の医薬。
（５）該患者が、シグナル配列のＮ末端メチオニンから１７６番目のアミノ酸がフェニルアラニンであるヒトＦｃγ受容体ＩＩＩａを有する患者である、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の医薬。
（６）該患者が、シグナル配列のＮ末端メチオニンから１７６番目のアミノ酸がフェニルアラニンであるヒトＦｃγ受容体ＩＩＩａのみを有する患者である、（１）〜（５）のいずれか１項に記載の医薬。
（７）レクチンに耐性を有する細胞が、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる群から選ばれる蛋白質の活性が低下または欠失した細胞である、（１）〜（６）のいずれか１項に記載の医薬。
（ａ）細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素蛋白質；
（ｂ）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素蛋白質；
（ｃ）細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質。
（８）レクチンが、少なくとも、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれるレクチンである、（１）〜（７）のいずれか１項に記載の医薬。
（ａ）レンズマメレクチン；
（ｂ）エンドウマメレクチン；
（ｃ）ソラマメレクチン；
（ｄ）ヒイロチャワンタケレクチン。
（９）細胞が、酵母、動物細胞、昆虫細胞および植物細胞からなる群から選ばれる細胞である、（１）〜（８）のいずれか１項に記載の医薬。
（１０）細胞が、以下の（ａ）〜（ｊ）からなる群から選ばれる細胞である、（１）〜（９）のいずれか１項に記載の医薬。
（ａ）チャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞；
（ｂ）ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞；
（ｃ）マウスミエローマ細胞株ＮＳＯ細胞；
（ｄ）マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞；
（ｅ）シリアンハムスター腎臓組織由来ＢＨＫ細胞；
（ｆ）抗体を生産するハイブリドーマ細胞；
（ｇ）ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞；
（ｈ）胚性幹細胞；
（ｉ）受精卵細胞；
（ｊ）植物細胞。
（１１）抗体組成物が、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれる抗体分子を有効成分として含有する抗体組成物である、（１）〜（１０）のいずれか１項に記載の医薬。
（ａ）ヒト抗体；
（ｂ）ヒト化抗体；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を含む抗体の断片；
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を有する融合蛋白質。
（１２）抗体分子のクラスがＩｇＧである、（１１）記載の医薬。
（１３）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞から生産された抗体組成物の抗体依存性細胞障害活性が、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有さない細胞から生産された抗体組成物の抗体依存性細胞障害活性よりも高い、（１）〜（１２）のいずれか１項に記載の医薬。
（１４）抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物における抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有さない細胞から生産された抗体組成物における割合よりも高いことを特徴とする、（１３）に記載の医薬。
（１５）フコースが結合していない糖鎖が、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖である、（１４）に記載の医薬。
（１６）抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が２０％以上である抗体組成物である、（１３）〜（１５）いずれか１項に記載の医薬。
（１７）抗体組成物が、ＣＨＯ細胞が生産する抗体組成物である、（１６）記載の医薬。
（１８）医薬が、腫瘍を伴う疾患、アレルギーを伴う疾患、炎症を伴う疾患、自己免疫疾患、循環器疾患、ウイルス感染を伴う疾患または細菌感染を伴う疾患に対する診断薬、予防薬または治療薬である、（１）〜（１７）のいずれか１項に記載の医薬。
（１９）（１）〜（１８）のいずれか１項に記載の医薬を製造するための、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞から生産された抗体組成物の使用。
（２０）（ｉ）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有さない細胞から生産された抗体組成物を有効成分として含有する医薬または（１）〜（１８）記載のいずれか１項に記載の医薬と、患者から取得したエフェクター細胞とをそれぞれ接触させ、（ｉｉ）該エフェクター細胞と結合した医薬の量をそれぞれ測定し、（ｉｉｉ）得られた測定値を比較し、（ｉｖ）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有さない細胞から生産された抗体組成物を含有する医薬がエフェクター細胞と結合した量が少ない患者を選択することにより、（１）〜（１８）のいずれか１項に記載の医薬が有効な患者をスクリーニングする方法。
（２１）エフェクター細胞と反応した医薬の量を定量する方法が、免疫学的測定方法である、（２０）に記載の方法。
（２２）（ｉ）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有さない細胞から生産された抗体組成物を有効成分として含有する医薬または（１）〜（１８）のいずれか１項に記載の医薬と患者から取得したエフェ・BR>Nター細胞とをそれぞれ接触させ、（ｉｉ）該エフェクター細胞と医薬との接触によって引き起こされる活性をそれぞれ測定し、（ｉｉｉ）得られた測定値を比較し、（ｉｖ）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有さない細胞から生産された抗体組成物の活性が低い患者を選択することにより、（１）〜（１８）のいずれか１項に記載の医薬が有効な患者をスクリーニングする方法。
（２３）エフェクター細胞の抗体医薬との接触によって引き起こされる活性を測定する方法が、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選ばれる方法である、（２２に記載の方法。
（ａ）抗体依存性細胞障害活性測定法；
（ｂ）補体依存性細胞障害活性測定法；
（ｃ）細胞障害性分子の発現を測定する方法；
（ｄ）ヒトＦｃγ受容体ＩＩＩａの細胞内情報伝達シグナルを測定する方法；
（ｅ）ヒトＦｃγ受容体ＩＩＩａを刺激することによって発現が変動する分子を測定する方法。
（２４）エフェクター細胞が、ヒトＦｃγ受容体ＩＩＩａを発現している細胞である、（２０）〜（２３）のいずれか１項に記載の方法。
（２５）スクリーニングする方法が、ヒトＦｃγ受容体ＩＩＩａのシグナル配列のＮ末端のメチオニンから１７６番目のアミノ酸がフェニルアラニンである患者をスクリーニングする方法である（２０）〜（２４）のいずれか１項に記載の方法。
（２６）（２０）〜（２５）のいずれか１項記載の方法によりヒトＦｃγ受容体ＩＩＩａのシグナル配列のＮ末端のメチオニンから１７６番目のアミノ酸がフェニルアラニンである患者をスクリーニングし、該患者に投与するためのＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞から生産された抗体組成物を有効成分として含有する医薬。
（２７）（２０）〜（２６）のいずれか１項記載の方法によりヒトＦｃγ受容体ＩＩＩａのシグナル配列のＮ末端のメチオニンから１７６番目のアミノ酸がフェニルアラニンである患者をスクリーニングし、該患者に投与するための（１）〜（１８）のいずれか１項に記載の医薬。
（２８）（２６）または（２７）記載の医薬を製造するための、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞から生産された抗体組成物の使用。
【００２１】
本発明の医薬に用いる、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチン耐性を有する細胞（以下、α１，６−フコース／レクチン耐性細胞と略記する。）としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など抗体組成物を製造することができる細胞であって、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチン耐性を有する細胞であればいかなる細胞でもよい。
【００２２】
具体的には、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する、ハイブリドーマ細胞、ヒト抗体およびヒト化抗体を製造するための宿主細胞、ヒト抗体を生産するためのトランスジェニック非ヒト動物を製造するための胚性幹細胞および受精卵細胞、ミエローマ細胞、トランスジェニック非ヒト動物由来の細胞などがあげられる。ミエローマ細胞はハイブリドーマ細胞を製造する際に融合細胞として用いることができる。また、トランスジェニック非ヒト動物に抗原を免疫し、該動物の脾臓細胞を取り出し、ハイブリドーマ細胞を製造するために用いることができる。
【００２３】
レクチンに耐性を有する細胞とは、培養培地にレクチンを有効濃度与えて細胞培養を行ったときにも、生育が阻害されない細胞をいう。
本発明において、生育が阻害されないレクチン有効濃度は、細胞株に応じて適宜定めればよいが、通常１０μｇ／ｍｌ〜１０．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜２．０ｍｇ／ｍｌである。親株細胞に変異を導入した場合のレクチンの有効濃度とは、該親株細胞が正常に生育できない濃度以上であり、好ましくは親株細胞が正常に生育できない濃度と同濃度、より好ましくは２〜５倍、さらに好ましくは１０倍、最も好ましくは２０倍以上の濃度をいう。
【００２４】
親株細胞とは、何らかの処理を施す前の細胞、すなわち本発明で用いるα１，６−フコース／レクチン耐性細胞を選択する工程を行う前の細胞、上述した酵素活性を低下または欠失するために遺伝子工学的な処理を行う前の細胞をいう。
親株細胞としては、特に限定はないが、種々の細胞株の親株細胞の具体例として、以下に示す。
【００２５】
ＮＳＯ細胞の親株細胞としては、バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），１０，１６９（１９９２）、バイオテクノロジー・バイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．），７３，２６１，（２００１）等の文献に記載されているＮＳＯ細胞があげられる。また、理化学研究所細胞開発銀行に登録されているＮＳＯ細胞株（ＲＣＢ０２１３）、あるいはこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株などもあげられる。
【００２６】
ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞の親株細胞としては、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１２６，３１７，（１９８１）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２７６，２６９，（１９７８）、ヒューマン・アンチィボディズ・アンド・ハイブリドーマズ（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ），３，１２９，（１９９２）等の文献に記載されているＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞があげられる。また、ＡＴＣＣに登録されているＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８１）あるいはこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８１．１）などもあげられる。
【００２７】
チャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞の親株細胞としては、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１０８，９４５（１９５８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０，１２７５（１９６８）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５５，５１３（１９６８）、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ，４１，１２９（１９７３）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８，１１５（１９９６）、Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４８，２６０（１９９７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，６０，１２７５（１９６８）、Ｃｅｌｌ，６，１２１（１９７５）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ Ｉ，ＩＩ（ｐ８８３−９００）等の文献に記載されているＣＨＯ細胞などがあげられる。また、ＡＴＣＣに登録されているＣＨＯ−Ｋ１株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）、ＤＵＸＢ１１株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９０９６）、Ｐｒｏ−５株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７８１）や、市販のＣＨＯ−Ｓ株（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社Ｃａｔ＃１１６１９）、あるいはこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株などもあげられる。
【００２８】
ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞の親株細胞としては、Ｙ３／Ａｇ１．２．３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６３１）から樹立された株化細胞が包含される。その具体的な例としては、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９３，５７６（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３Ｂ，１（１９８１）等の文献に記載されているＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞があげられる。また、ＡＴＣＣに登録されているＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６６２）あるいはこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株などもあげられる。
【００２９】
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンとしては、該糖鎖構造を認識できるレクチンであれば、いずれのレクチンも包含される。その具体的な例としては、 レンズマメレクチンＬＣＡ（Ｌｅｎｓ Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ Ｌｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）などがあげられる。
【００３０】
本発明において、α１，６−フコース／レクチン耐性細胞としては、一定の有効濃度のレクチン存在下で生育が阻害されない細胞であれば、いずれでもよいが、例えば、以下にあげる少なくとも１種類の蛋白質の活性が親株細胞よりも低下または欠失した細胞などがあげられる。
（ａ）細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素蛋白質（以下、「ＧＤＰ−フコース合成酵素」と表記する）；
（ｂ）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素蛋白質（以下、「α１，６−フコース修飾酵素］と表記する）；
（ｃ）細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質（以下、「ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質」と表記する）。
【００３１】
ＧＤＰ−フコース合成酵素としては、細胞内で糖鎖へのフコースの供給源である糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素であればいかなる酵素も包含され、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に影響を与える酵素などがあげられる。
細胞内の糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースは、ｄｅ ｎｏｖｏの合成経路あるいはＳａｌｖａｇｅ合成経路により供給されている。したがって、これら合成経路に関与する酵素はすべてＧＤＰ−フコース合成酵素に包含される。
【００３２】
ｄｅ ｎｏｖｏの合成経路に関与するＧＤＰ−フコース合成酵素としては、ＧＤＰ−ｍａｎｎｏｓｅ４−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ（ＧＤＰ−マンノース４−デヒドラターゼ；以下、ＧＭＤと表記する）、ＧＤＰ−ｋｅｔｏ−６−ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｓｅ ３，５−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ，４−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＧＤＰ−ケト−デオキシマンノース３，５−エピメラーゼ，４−リダクターゼ；以下、Ｆｘと表記する）などがあげられる。
【００３３】
Ｓａｌｖａｇｅ合成経路に関与するＧＤＰ−フコース合成酵素としては、ＧＤＰ−ｂｅｔａ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ（ＧＤＰ−ベータ−Ｌ−フコース−ピロホスフォリラーゼ；以下、ＧＦＰＰと表記する）、Ｆｕｃｏｋｉｎａｓｅ（フコキナーゼ）などがあげられる。
ＧＤＰ−フコース合成酵素としては、上述の細胞内の糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成経路に関与する酵素の活性に影響を与えたり、該酵素の基質となる物質の構造に影響を与える酵素も包含される。
【００３４】
α１，６−フコース修飾酵素としては、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合する反応に関与する酵素であればいかなる酵素も包含される。Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合する反応に関与する酵素としては、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合する反応に影響を与える酵素であればいかなる酵素も包含される。具体的には、α１，６−フコシルトランスフェラーゼやα−Ｌ−フコシダーゼなどがあげられる。
【００３５】
また、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合する反応に影響を与える酵素としては、上述のＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する反応に関与する酵素の活性に影響を与えたり、該酵素の基質となる物質の構造に影響を与える酵素も包含される。
【００３６】
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質としては、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質であればいかなる蛋白質も包含され、具体的には、ＧＤＰ−フコーストランスポーターなどがあげられる。
また、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースをゴルジ体内へ輸送する反応に影響を与える蛋白質もＧＤＰ−フコース輸送蛋白質に包含され、具体的には上述の細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の活性に影響を与えたり、発現に影響を与える蛋白質などがあげられる。
【００３７】
本発明の医薬の製造に用いられる細胞を取得する方法としては、α１，６−フコース／レクチン耐性細胞を選択することができる手法であればいかなる手法でも用いることができる。具体的には、上述した蛋白質の活性を低下または欠失させる手法などがあげられる。上述の蛋白質の活性を低下または欠失させる手法としては、
（ａ）蛋白質の遺伝子を標的した遺伝子破壊の手法；
（ｂ）蛋白質の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する手法；
（ｃ）蛋白質についての突然変異を導入する手法；
（ｄ）蛋白質の遺伝子の転写または翻訳を抑制する手法；などがあげられる。
【００３８】
本発明は、α１，６−フコース／レクチン耐性細胞から生産された抗体組成物を有効成分として含有する、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有さない細胞から生産された抗体組成物を有効成分として含有する医薬（以下、「従来の抗体医薬」とも称す）とヒトＦｃγ受容体ＩＩＩａとの親和性が、該抗体医薬が治療効果を発揮するには十分ではない親和性しか示さない患者に適応することを特徴とする医薬に関する。
【００３９】
従来の抗体医薬とヒトＦｃγ受容体ＩＩＩａとの親和性が、該抗体医薬が治療効果を発揮するには十分ではない親和性とは、該抗体医薬がＡＤＣＣ活性を発揮するには十分ではない親和性をいう。
具体的には、ＢＩＡｃｏｒｅによるバイオセンサー法で測定した場合に、２５℃でのヒトＦｃγ受容体ＩＩＩａに対する結合定数が１×１０７Ｍ−１より低い値、また等温滴定型熱量計で測定した場合に、２５℃でのヒトＦｃγ受容体ＩＩＩａに対する結合定数が２×１０６Ｍ−１より低い値であるとき、抗体医薬が治療効果を発揮するには十分ではない親和性であるという。
【００４０】
抗体組成物とヒトＦｃγ受容体ＩＩＩａとの親和性を測定する方法としては、表面プラズモン共鳴を利用したバイオセンサー法、等温滴定型熱量計による測定法などがあげられる。表面プラズモン共鳴を利用したバイオセンサー法は、表面プラズモン共鳴現象を利用して生体分子間の相互作用をリアルタイムにモニターする方法である。本方法を用いる場合には、生体分子を標識する必要はない。測定装置としては、Ｂｉａｃｏｒｅ社のＢＩＡｃｏｒｅシリーズなどがあげられる。
【００４１】
ＢＩＡｃｏｒｅでの測定方法としては、添付の使用説明書に従って至適な測定条件下で測定することがあげられる。
至適な測定条件としては、センサーチップへ固定化する物質の量が式１の範囲で、かつ最大結合量が式２以下であることが好ましい。式１および式２において、リガンドとはセンサーチップに固定化する分子を示し、アナライトとは流路系を介して添加する分子を示し、Ｓとはリガンドの結合部位数を示す。
【００４２】
【式１】
Figure 0004832719
【００４３】
測定時に一定の最大結合量が維持できるように流速および洗浄条件を設定することにより、蛋白質の結合様式に則った解析を行うことができる。
【００４４】
等温滴定型熱量計は、蛋白質とリガンドとの結合のストイキオメトリー（量比、以下Ｎと呼ぶ）、結合定数（ＫＡ）、結合のエンタルピー変化量（ΔＨ）を測定することができる装置である。リガンドとしては、蛋白質、ＤＮＡ、低分子化合物等、蛋白質と結合する分子であればいかなるものでもよい。
等温滴定型熱量計は、蛋白質と離岸度を用いて滴定を行い、結合に伴い発生または吸収する熱量を測定する。滴定曲線を解析することにより、ＮとＫＡとΔＨが同時に求められる。等温滴定型熱量計により得られるＮとＫＡとΔＨは、結合を定量的かつ熱力学的に記述するパラメータとして有用である。
【００４５】
ＡＤＣＣ活性は、生体内で腫瘍細胞等の細胞表面抗原などに結合した抗体が、抗体のＦｃ領域とエフェクター細胞表面上に存在するＦｃレセプターとの結合を介してエフェクター細胞を活性化し、腫瘍細胞等を障害する活性をいう［モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｐｔｅｒ ２．１（１９９５）］。エフェクター細胞としては、ナチュラルキラー細胞（以下ＮＫ細胞と呼ぶ）、マクロファージ、単球、樹状細胞、顆粒球等の免疫細胞があげられる。
【００４６】
Ｆｃ受容体としては、Ｆｃα受容体Ｉ、Ｆｃε受容体Ｉ、Ｆｃε受容体ＩＩ、Ｆｃγ受容体Ｉ、Ｆｃγ受容体ＩＩａ、Ｆｃγ受容体ＩＩｂ、Ｆｃγ受容体ＩＩｃ、Ｆｃγ受容体ＩＩＩａ、Ｆｃγ受容体ＩＩＩｂ、Ｆｃ受容体ｎ等のタイプに分類される。
【００４７】
Ｆｃγ受容体ＩＩＩａ（以下ＦｃγＲＩＩＩａと呼ぶ）はＮＫ細胞、マクロファージ、単球、マスト細胞、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、好酸球など細胞上に発現し、ＡＤＣＣ活性に重要なＦｃ受容体の一つである［モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｐｔｅｒ ２．１（１９９５）］。
【００４８】
また、抗体組成物の有する細胞障害活性としてはＡＤＣＣ活性の他に、ＣＤＣ活性［モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｐｔｅｒ ２．１（１９９５）］や、抗原に結合することによる抗原発現細胞の増殖抑制活性などがあげられる。
【００４９】
増殖抑制活性には標的細胞のアポトーシス誘導や分化誘導を促進するものも含まれる［キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）６０，７１７０（２０００）、ネイチャー・メディスン（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）１，６４４（１９９５）、セル・グロース・ディファレンシエーション（Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．）３，４０１（１９９２）］。
【００５０】
抗体医薬がＡＤＣＣ活性を発揮するには十分ではないとは、患者において、該抗体医薬が標的としている細胞を障害できないことを意味する。
【００５１】
ＦｃγＲＩＩＩａは、抗体の結合により、エフェクター細胞である免疫担当細胞を活性化し、細胞障害性分子の産生により抗原陽性の標的細胞を障害するＡＤＣＣ活性を介在する［モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｐｔｅｒ ２．１（１９９５）］。
【００５２】
細胞障害製分子とは、エフェクター細胞上のＦｃγＲＩＩＩａのシグナルにより発現が上昇し、直接または間接的に標的細胞を障害する分子をいう。具体的には、パーフォリン、グランザイム、活性酸素、一酸化窒素、グラニュライシン、ＦａｓＬ等があげられる。
【００５３】
免疫担当細胞とは、生体内に存在し、様々な免疫反応に関与する細胞をいう。
免疫担当細胞としては、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球、マスト細胞、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、好中球、好酸球、好塩基球、Ｂ細胞、Ｔ細胞などを包含する。
【００５４】
ヒトＦｃγＲＩＩＩａには遺伝的多型（ｇｅｎｅｔｉｃ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；以下、単に「多型」と称す）がある。具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａのシグナル配列のＮ末端メチオニンから１７６番目のアミノ酸残基がフェニルアラニンまたはバリンである。
【００５５】
多型とは、同一種内の正常な個体間の同一遺伝子に認められる遺伝子塩基配列上の変異であり、その結果アミノ酸の変異をともなうことがある。
ヒトＦｃγＲＩＩＩａのシグナル配列のＮ末端メチオニンから１７６番目には、対立遺伝子多型の組み合わせにより、Ｐｈｅ／ＰｈｅあるいはＶａｌ／Ｖａｌのホモ型、Ｐｈｅ／Ｖａｌのヘテロ型の３種類の表現系が知られている。
【００５６】
本発明において、ヒトＦｃγＲＩＩＩａとは、いずれの多型も包含する。シグナル配列のＮ末端メチオニンから１７６番目のアミノ酸残基がフェニルアラニンを有するヒトＦｃγＲＩＩＩａは、シグナル配列のＮ末端メチオニンから１７６番目のアミノ酸残基がバリンを有するヒトＦｃγＲＩＩＩａと比較して、従来の抗体医薬との親和性が低い。したがって、シグナル配列のＮ末端メチオニンから１７６番目のアミノ酸残基がフェニルアラニンを有するヒトＦｃγＲＩＩＩａを有する患者に対しては、本発明の医薬が特に効果を奏する。
【００５７】
本発明において、抗体組成物としては、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子を含有してなる組成物であればいかなるものも包含される。
抗体分子とは、重鎖および軽鎖（以下、それぞれＨ鎖およびＬ鎖と表記する）の２種類のポリペプチド鎖がそれぞれ２分子ずつ会合した４量体である。Ｈ鎖のＮ末端側の約４分の１とＬ鎖のＮ末端側の約２分の１（それぞれ１００余アミノ酸）はＶ領域と呼ばれ、多様性に富み、抗原との結合に直接関与する。Ｖ領域以外の部分の大半はＣ領域と呼ばれる。抗体分子はＣ領域の相同性によりＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥの各クラスに分類される。
またＩｇＧクラスはＣ領域の相同性により、さらにＩｇＧ１〜ＩｇＧ４のサブクラスに分類される。
【００５８】
Ｈ鎖はＮ末端側よりＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３の４つのイムノグロブリンドメインに分かれ、ＣＨ１とＣＨ２の間にはヒンジ領域と呼ばれる可動性の高いペプチド領域があり、ＣＨ１とＣＨ２とが区切られる。ヒンジ領域以降のＣＨ２とＣＨ３からなる構造単位はＦｃ領域と呼ばれ、Ｎ−グリコシド結合型糖鎖が結合している。また、この領域は、Ｆｃレセプター、補体などが結合する領域である（免疫学イラストレイテッド原書第５版、２０００年２月１０日発行、南江堂版、抗体工学入門、１９９４年１月２５日初版、地人書館）。
【００５９】
抗体などの糖蛋白質の糖鎖は、蛋白質部分との結合様式により、アスパラギンと結合する糖鎖（Ｎ−グリコシド結合糖鎖）とセリン、スレオニンなどと結合する糖鎖（Ｏ−グリコシル結合糖鎖）の２種類に大別される。Ｎ−グリコシド結合糖鎖は、以下の構造式（Ｉ）に示す基本となる共通のコア構造を有する［生物化学実験法２３−糖蛋白質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９年）］。
【００６０】
【式２】
Figure 0004832719
【００６１】
上記構造式（Ｉ）において、アスパラギンと結合する糖鎖の末端を還元末端、反対側を非還元末端という。
【００６２】
Ｎ−グリコシド結合糖鎖としては、上記構造式（Ｉ）のコア構造を有するものであればいかなるものでもよいが、コア構造の非還元末端にマンノースのみが結合するハイマンノース型、コア構造の非還元末端側にガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃと表記する）の枝を並行して１ないしは複数本有し、更にＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃの非還元末端側にシアル酸、バイセクティングのＮ−アセチルグルコサミンなどの構造を有するコンプレックス型（複合型）、コア構造の非還元末端側にハイマンノース型とコンプレックス型の両方の枝を持つハイブリッド型などがあげられる。
【００６３】
抗体分子のＦｃ領域には、Ｎ−グリコシド結合糖鎖が１カ所ずつ結合する領域を有しているので、抗体１分子あたり２本の糖鎖が結合している。抗体分子に結合するＮ−グルコシド結合糖鎖としては、前記構造式（Ｉ）で示されるコア構造を含むいかなる糖鎖も包含されるので、抗体に結合する２本のＮ−グルコシド結合糖鎖には多数の糖鎖の組み合わせが存在することになる。
【００６４】
したがって、本発明において、α１，６−フコース／レクチン耐性細胞を用いて製造された抗体組成物は、本発明の効果が得られる範囲であれば、単一の糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよいし、複数の異なる糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよい。
【００６５】
抗体分子としては、抗体のＦｃ領域を含む分子であればいかなる分子も包含される。具体的には、抗体、抗体の断片、Ｆｃ領域を含む融合蛋白質などがあげられる。
【００６６】
抗体としては、動物に抗原を免疫し、免疫動物の脾臓細胞より作製したハイブリドーマ細胞が分泌する抗体、遺伝子組換え技術により作製された抗体、すなわち、抗体遺伝子を挿入した抗体発現ベクターを、宿主細胞へ導入することにより取得された抗体などがあげられる。具体的には、ハイブリドーマが生産する抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体などをあげることができる。
ハイブリドーマは、ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得されたＢ細胞と、マウス、ラット等に由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる、所望の抗原特異性を有したモノクローナル抗体を生産する細胞をいう。
【００６７】
ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体などがあげられる。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体Ｈ鎖Ｖ領域（以下、ＨＶまたはＶＨとも称す）および抗体Ｌ鎖Ｖ領域（以下、ＬＶまたはＶＬとも称す）とヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域（以下、ＣＨとも称す）およびヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域（以下、ＣＬとも称す）とからなる抗体をいう。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ヒト型キメラ抗体は、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、宿主細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
【００６８】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体をいう。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列を任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびヒト抗体のＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入することによりヒト型ＣＤＲ移植抗体を発現させ、製造することができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
【００６９】
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーならびにヒト抗体トランスジェニック動物あるいはヒト抗体トランスジェニック植物から得られる抗体等も含まれる。
ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルス等を感染させ不死化、クローニングすることにより、該抗体を生産するリンパ球を培養でき、培養物中より該抗体を精製することができる。
【００７０】
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、一本鎖抗体等の抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、更に遺伝子工学的手法により、２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
【００７１】
ヒト抗体トランスジェニック非ヒト動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物をいう。具体的には、マウス胚性幹細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該胚性幹細胞を他のマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体トランスジェニック動物を作製することができる。また、動物の受精卵にヒト抗体遺伝子を導入し、該受精卵を発生させることにヒト抗体トランスジェニック動物を作製することもできる。ヒト抗体トランスジェニック動物からのヒト抗体の作製方法は、通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体ハイブリドーマを得、培養することで培養物中にヒト抗体を蓄積させることができる。
トランスジェニック非ヒト動物は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サルまたはウサギ等があげられる。
【００７２】
抗体の断片は、上記抗体の少なくともＦｃ領域の一部を含んだ断片をいう。Ｆｃ領域とは、抗体のＨ鎖のＣ末端側の領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を意味し、天然型およびその変異型を包含する。少なくともＦｃ領域の一部とは、好ましくはＣＨ２領域を含む断片、より好ましくはＣＨ２領域内に存在する１番目のアスパラギン酸を含む領域をいう。ＩｇＧクラスのＦｃ領域は、カバット（Ｋａｂａｔ）らのＥＵ Ｉｎｄｅｘ［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）］のナンバリングで２２６番目のＣｙｓからＣ末端、あるいは２３０番目のＰｒｏからＣ末端までを意味する。抗体の断片としては、Ｈ鎖の単量体、Ｈ鎖の２量体などがあげられる。
【００７３】
Ｆｃ領域の一部を有する融合蛋白質とは、抗体のＦｃ領域の一部を含んだ抗体あるいは抗体の断片と、酵素、サイトカインなどの蛋白質とを融合させた物質（以下、Ｆｃ融合蛋白質と称す）を意味する。
抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合とは、該組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全てのＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の合計数に対して、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の数が占める割合をいう。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖とは、フコースが、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにα結合していない糖鎖をいう。具体的には、フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖があげられる。
【００７４】
また、本発明はα１，６−フコース／レクチン耐性細胞から生産された抗体組成物が、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有さない細胞から生産された抗体組成物を有効成分として含有する医薬にくらべて、ＡＤＣＣ活性が高い抗体組成物である医薬に関する。
レクチンに耐性を有さない細胞から生産された抗体組成物よりもＡＤＣＣ活性が高い抗体組成物は、上記のα１，６−フコース／レクチン耐性細胞を用いて抗体組成物を製造することにより得ることができる。
ＡＤＣＣ活性とは、生体内で、腫瘍細胞等の細胞表面抗原などに結合した抗体が、抗体Ｆｃ領域とエフェクター細胞表面上に存在するＦｃレセプターとの結合を介してエフェクター細胞を活性化し、腫瘍細胞等を障害する活性をいう［モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｐｔｅｒ ２．１（１９９５）］。エフェクター細胞としては、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、活性化されたマクロファージ等があげられる。
【００７５】
抗体分子のＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有さない細胞から生産された抗体組成物よりも高い場合、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有さない細胞が生産する抗体組成物より高いＡＤＣＣ活性を有する。
【００７６】
抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が高いほど、抗体組成物のＡＤＣＣ活性が高くなる。ＡＤＣＣ活性が高い抗体組成物としては、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上、特に好ましくは５０％以上、最も好ましくは１００％の抗体組成物があげられる。
【００７７】
また、ＣＨＯ細胞が生産するＡＤＣＣ活性が高い抗体組成物としては、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上、特に好ましくは５０％以上、最も好ましくは１００％の抗体組成物があげられる。
【００７８】
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子からなる組成物中に含まれる、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合は、抗体分子からヒドラジン分解や酵素消化などの公知の方法［生物化学実験法２３−糖タンパク質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９）］を用い、糖鎖を遊離させ、遊離させた糖鎖を蛍光標識または同位元素標識し、標識した糖鎖をクロマトグラフィー法にて分離することによって決定することができる。また、遊離させた糖鎖をＨＰＡＥＤ−ＰＡＤ法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．），６，１
５７７（１９８３）］によって分析することでも決定することができる。
【００７９】
また、本発明において、抗体が、腫瘍関連抗原を認識する抗体、アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体、またはウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体であることが好ましく、抗体のクラスはＩｇＧが好ましい。
【００８０】
腫瘍関連抗原を認識する抗体としては、抗ＧＤ２抗体（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１３，３３１−３３６，１９９３）、抗ＧＤ３抗体（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，２６０−２６６，１９９３）、抗ＧＭ２抗体（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５４，１５１１−１５１６，１９９４）、抗ＨＥＲ２抗体（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４２８５−４２８９，１９９２）、抗ＣＤ５２抗体（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４２８５−４２８９，１９９２）、抗ＭＡＧＥ抗体（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３，４９３−４９７，２０００）、抗ＨＭ１．２４抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３６，３８７−３９５，１９９９）、抗副甲状腺ホルモン関連蛋白（ＰＴＨｒＰ）抗体（Ｃａｎｃｅｒ，８８，２９０９−２９１１，２０００）、抗塩基性繊維芽細胞増殖因子抗体、抗ＦＧＦ８抗体（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，９９１１−９９１５，１９８９）、抗塩基性繊維芽細胞増殖因子受容体抗体、抗ＦＧＦ８受容体抗体（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１６４５５−１６４６３，１９９０）、抗インスリン様増殖因子抗体（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４０，６４７−６５９，１９９５）、抗インスリン様増殖因子受容体抗体（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４０，６４７−６５９，１９９５）、抗ＰＭＳＡ抗体（Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ，１６０，２３９６−２４０１，１９９８）、抗血管内皮細胞増殖因子抗体（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５７，４５９３−４５９９，１９９７）、抗血管内皮細胞増殖因子受容体抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９，２１３８−２１４６，２０００）などがあげられる。
【００８１】
アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体としては、抗インターロイキン６抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１２７，５−２４，１９９２）、抗インターロイキン６受容体抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３１，３７１−３８１，１９９４）、抗インターロイキン５抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｒｅｖ．，１２７，５−２４，１９９２）、抗インターロイキン５受容体抗体、抗インターロイキン４抗体（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，３，５６２−５６７，１９９１）、抗インターロイキン４受容体抗体（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，２１７，４１−５０，１９９８）、抗腫瘍壊死因子抗体（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１３，１８３−１９０，１９９４）、抗腫瘍壊死因子受容体抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５８，２３７−２４５，２０００）、抗ＣＣＲ４抗体（Ｎａｔｕｒｅ，４００，７７６−７８０，１９９９）、抗ケモカイン抗体（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１７４，２４９−２５７，１９９４）または抗ケモカイン受容体抗体（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６，１３７３−１３８１，１９９７）であり、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体が抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２，２９６８−２９７６，１９９４）、抗血小板由来増殖因子抗体（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３，１１２９−１１３２，１９９１）、抗血小板由来増殖因子受容体抗体（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１７４００−１７４０４，１９９７）、抗血液凝固因子抗体（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０１，１１５８−１１６４，２０００）などがあげられる。
【００８２】
ウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体としては、抗ｇｐ１２０抗体（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，８，３８５−３９５，２０００）、抗ＣＤ４抗体（Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，２５，２０６５−２０７６，１９９８）、抗ＣＣＲ４抗体、抗ベロ毒素抗体（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７，３９６−３９９，１９９９）などがあげられる。
【００８３】
さらに、本発明は、本発明の医薬を患者へ投与前に効果を予測するための判別方法に関する。具体的には、以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）の工程を含む、本発明の医薬が有効な患者をスクリーニングする方法があげられる。
（ｉ）従来の抗体医薬または本発明の医薬と、患者から取得したエフェクター細胞とをそれぞれ接触させ、（ｉｉ）該エフェクター細胞と結合した医薬の量をそれぞれ測定し、（ｉｉｉ）得られた測定値を比較し、（ｉｖ）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有さない細胞から生産された抗体組成物を含有する医薬がエフェクター細胞と結合した量が少ない患者を選択することにより、本発明の医薬が有効な患者をスクリーニングする方法。
【００８４】
または、（ｉ）従来の抗体医薬または本発明の医薬と、患者から取得したエフェクター細胞とをそれぞれ接触させ、（ｉｉ）該エフェクター細胞と医薬との接触によって引き起こされる活性をそれぞれ測定し、（ｉｉｉ）得られた測定値を比較し、（ｉｖ）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有さない細胞から生産された抗体組成物を含有する医薬がエフェクター細胞との活性が低い患者を選択することにより、本発明の医薬が有効な患者をスクリーニングする方法。
【００８５】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．宿主細胞の作製
本発明で用いられる抗体組成物を製造するための宿主細胞は、以下に述べる手法により作製することができる。
（１）酵素の遺伝子を標的とした遺伝子破壊の手法
宿主細胞は、ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を標的とし、遺伝子破壊の方法を用いることにより作製することができる。ＧＤＰ−フコース合成酵素としては、具体的には、ＧＭＤ、Ｆｘ、ＧＦＰＰ、Ｆｕｃｏｋｉｎａｓｅなどがあげられる。α１，６−フコース修飾酵素としては、具体的には、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼなどがあげられる。ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質としては、具体的には、ＧＤＰ−フコーストランスポーターなどがあげられる。
【００８６】
遺伝子破壊の方法としては、標的とする酵素の遺伝子を破壊することができる方法であればいかなる方法も包含される。その例としては、アンチセンス法、リボザイム法、相同組換え法、ＲＮＡ−ＤＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ＲＤＯ）法、ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）法、レトロウイルスを用いた方法、トランスポゾンを用いた方法等があげられる。以下これらを具体的に説明する。
【００８７】
（ａ）アンチセンス法またはリボザイム法による宿主細胞の作製
宿主細胞は、ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を標的とし、細胞工学，１２，２３９，（１９９３）、バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），１７，１０９７，（１９９９）、ヒューマン・モレキュラー・ジェネティクス（Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．），５，１０８３，（１９９５）、細胞工学，１３，２５５，（１９９４）、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），９６，１８８６（１９９９）等に記載されたアンチセンス法またはリボザイム法を用いて、例えば、以下のように作製することができる。
【００８８】
ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードするｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡを調製する。
調製したあるいはゲノムＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したＤＮＡの配列に基づき、ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードするＤＮＡ部分、非翻訳領域の部分あるいはイントロン部分を含む適当な長さのアンチセンス遺伝子またはリボザイムのコンストラクトを設計する。
該アンチセンス遺伝子、またはリボザイムを細胞内で発現させるために、調製したＤＮＡの断片、または全長を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより形質転換体を得る。
【００８９】
ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性を指標として形質転換体を選択することにより、宿主細胞を得ることができる。また、細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造または産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択することにより、宿主細胞を得ることもできる。
【００９０】
宿主細胞を作製するために用いられる宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など、標的とするＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３．に記載の宿主細胞があげられる。
【００９１】
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、設計したアンチセンス遺伝子、またはリボザイムを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、後述の３．に記載の発現ベクターがあげられる。
【００９２】
各種宿主細胞への遺伝子の導入方法としては、後述の３．に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
【００９３】
ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、文献［新生化学実験講座 ３−糖質Ｉ，糖タンパク質（東京化学同人）日本生化学会編（１９８８）］、文献［細胞工学，別冊，実験プロトコールシリーズ，グライコバイオロジー実験プロトコール，糖タンパク質・糖脂質・プロテオグリカン（秀潤社製）谷口直之・鈴木明美・古川清・菅原一幸監修（１９９６）］、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された生化学的な方法あるいは遺伝子工学的な方法などがあげられる。生化学的な方法としては、例えば、酵素特異的な基質を用いて酵素活性を評価する方法があげられる。遺伝子工学的な方法としては、例えば、酵素遺伝子のｍＲＮＡ量を測定するノーザン解析やＲＴ−ＰＣＲ法等があげられる。
【００９４】
細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述の１の（５）に記載の方法があげられる。産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述の５または後述の６に記載の方法があげられる。
【００９５】
ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードするｃＤＮＡを調製する方法としては、例えば、以下に記載の方法があげられる。
【００９６】
ＤＮＡの調製方法
ヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞から全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを調製する。調製した全ＲＮＡまたはｍＲＮＡから以下のようにしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。
ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のアミノ酸配列に基づいて、デジェネレイティブプライマーを作製し、作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ法にてＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードする遺伝子断片を取得する。
取得した遺伝子断片をプローブとして用い、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードするＤＮＡを取得することができる。
【００９７】
ヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞のｍＲＮＡは市販のもの（例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いてもよいし、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１５４，３（１９８７）］、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム（ＡＧＰＣ）法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１６２，１５６（１９８７）；実験医学、９，１９３７（１９９１）］などによりヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞から全ＲＮＡを調製し、得られた得られた全ＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング第２版）等によりｐｏｌｙ（ａ）＋ＲＮＡとしてｍＲＮＡを調製することができる。
または、Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）などのキットを用いることによりｍＲＮＡを調製することもできる。
【００９８】
調製したヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する方法としては、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．（１９８９）等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いる方法などがあげられる。
【００９９】
ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのクローニングベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる。具体的には、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ［ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社、ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１７，９４９４（１９８９）］、Ｌａｍｂｄａ ＺＡＰ ＩＩ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ディーエヌエー・クローニング・ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ），１，４９（１９８５）］、λＴｒｉｐｌＥｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２［モレキュラー・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），３，２８０（１９８３）］およびｐＵＣ１８［ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３（１９８５）］等をあげることができる。
【０１００】
ｃＤＮＡライブラリーを作製するための宿主微生物としては、微生物であればいずれでも用いることができるが、好ましくは大腸菌が用いられる。具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’［ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社、ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，８１（１９９２）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｃ６００［ジェネティクス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｙ１０８８［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｙ１０９０［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＮＭ５２２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６６，１（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ８０２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６，１１８（１９６６）］およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０５ ［ジーン（Ｇｅｎｅ），３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
このｃＤＮＡライブラリーを、そのまま以降の解析に用いてもよいが、不完全長ｃＤＮＡの割合を下げ、なるべく完全長ｃＤＮＡを効率よく取得するために、菅野らが開発したオリゴキャップ法［ジーン（Ｇｅｎｅ），１３８，１７１（１９９４）；ジーン（Ｇｅｎｅ），２００，１４９（１９９７）；蛋白質核酸酵素，４１，６０３（１９９６）；実験医学，１１，２４９１（１９９３）；ｃＤＮＡクローニング（羊土社）（１９９６）；遺伝子ライブラリーの作製法（羊土社）（１９９４）］を用いて調製したｃＤＮＡライブラリーを以下の解析に用いてもよい。
【０１０１】
ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のアミノ酸配列に基づいて、該アミノ酸配列をコードすることが予測される塩基配列の５’端および３’端の塩基配列に特異的なデジェネレイティブプライマーを作製し、作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ法［ピーシーアール・プロトコールズ（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］を用いてＤＮＡの増幅を行うことにより、ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードする遺伝子断片を取得することができる。
【０１０２】
取得した遺伝子断片がＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードするＤＮＡであることは、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシークエンサー（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、確認することができる。
該遺伝子断片をＤＮＡをプローブとして、ヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリー対してコロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーション（モレキュラー・クローニング第２版）を行うことにより、ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のＤＮＡを取得することができる。
【０１０３】
また、ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードする遺伝子断片を取得するために用いたプライマーを用い、ヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法を用いてスクリーニングを行うことにより、ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のＤＮＡを取得することもできる。
【０１０４】
取得したＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列を末端から、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシークエンサー（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定する。
【０１０５】
決定したｃＤＮＡの塩基配列をもとに、ＢＬＡＳＴ等の相同性検索プログラムを用いて、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪなどの塩基配列データベースを検索することにより、データベース中の遺伝子の中でＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードしている遺伝子を決定することもできる。
【０１０６】
決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ ３９２等のＤＮＡ合成機で化学合成することにより、ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のｃＤＮＡを取得することもできる。
【０１０７】
ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のゲノムＤＮＡは、例えば、モレキュラー・クローニング第２版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された公知の方法があげられる。また、ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングシステム（ＧｅｎｏｍｅＳｙｓｔｅｍｓ社製）やＵｎｉｖｅｒｓａｌ ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭＫｉｔｓ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）などを用いることにより、調製することもできる。
【０１０８】
また、発現ベクターを用いず、ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の塩基配列に基づいて設計したアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムを、直接宿主細胞に導入することで、宿主細胞を得ることもできる。
【０１０９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムは、常法またはＤＮＡ合成機を用いることにより調製することができる。具体的には、ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードするｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの塩基配列のうち、連続した５〜１５０塩基、好ましくは５〜６０塩基、より好ましくは１０〜４０塩基に相当する配列を有するオリゴヌクレオチドの配列情報に基づき、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列に相当するオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）または該オリゴヌクレオチドの配列を含むリボザイムを合成することで調製することができる。
【０１１０】
オリゴヌクレオチドとしては、オリゴＲＮＡおよび該オリゴヌクレオチドの誘導体（以下、オリゴヌクレオチド誘導体という）等があげられる。
オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等があげられる［細胞工学，１６，１４６３（１９９７）］。
【０１１１】
（ｂ）相同組換え法による宿主細胞の作製
宿主細胞は、ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を標的とし、染色体上の標的遺伝子を相同組換え法を用い改変することによって作製することができる。
染色体上の標的遺伝子の改変は、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）（以下、「マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル」と略す）、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）（以下、「ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製」と略す）等に記載の方法を用い、例えば以下のように行うことができる。
【０１１２】
ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のゲノムＤＮＡを調製する。
ゲノムＤＮＡの塩基配列にも基づき、改変する標的遺伝子（例えば、ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の構造遺伝子、あるいはプロモーター遺伝子）を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。
作製したターゲットベクターを宿主細胞に導入し、標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、宿主細胞を作製することができる。
【０１１３】
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３．に記載の宿主細胞があげられる。
【０１１４】
ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のゲノムＤＮＡを調製する方法としては、上記１の（１）の（ａ）に記載のゲノムＤＮＡの調製方法などがあげられる。
【０１１５】
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターは、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製（羊土社）（１９９５）等に記載の方法にしたがって作製することができる。ターゲットベクターは、リプレースメント型、インサーション型いずれでも用いることができる。
【０１１６】
各種宿主細胞へのターゲットベクターの導入には、後述の３．に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
【０１１７】
相同組換え体を効率的に選別する方法として、例えば、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製（羊土社）（１９９５）等に記載のポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリＡ選択などの方法を用いることができる。選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）やＰＣＲ法［ピーシーアール・プロトコールズ（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］等があげられる。
【０１１８】
（ｃ）ＲＤＯ方法による細胞の作製
宿主細胞は、ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を標的とし、ＲＤＯ（ＲＮＡ−ＤＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）法を用い、例えば、以下のように作製することができる。
【０１１９】
ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡを調製する。
調製したｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したＤＮＡの配列に基づき、ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードする部分、非翻訳領域の部分あるいはイントロン部分を含む適当な長さのＲＤＯのコンストラクトを設計し合成する。
合成したＲＤＯを宿主細胞に導入し、標的とした酵素、すなわちＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質に変異が生じた形質転換体を選択することにより、宿主細胞を作製することができる。
【０１２０】
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３．に記載の宿主細胞があげられる。
各種宿主細胞へのＲＤＯの導入には、後述の３．に記載の各種宿主細胞に適した組み換えベクターの導入方法を用いることができる。
ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のｃＤＮＡを調製する方法としては、例えば、上記１の（１）の（ａ）に記載の「ＤＮＡの調製方法」などがあげられる。
ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のゲノムＤＮＡを調製する方法としては、例えば、上記１の（１）の（ａ）に記載のゲノムＤＮＡの調製方法などがあげられる。
【０１２１】
ＤＮＡの塩基配列は、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等を用いて解析することで該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
【０１２２】
ＲＤＯは、常法またはＤＮＡ合成機を用いることにより調製することができる。
ＲＤＯを宿主細胞に導入し、標的とした酵素、ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子に変異が生じた形質転換株を選択する方法としては、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された染色体上の遺伝子の変異を直接検出する方法があげられる。
【０１２３】
また、前記１の（１）の（ａ）に記載の、ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性を指標として形質転換体を選択する方法、後述の１の（５）に記載の細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法を選択する方法も用いることができる。
【０１２４】
ＲＤＯのコンストラクトは、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２７３，１３８６，（１９９６）；ネイチャー・メディシン（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），４，２８５，（１９９８）；ヘパトロジー（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ），２５，１４６２，（１９９７）；ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ），５，１９６０，（１９９９）；ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ），５，１９６０，（１９９９）；ジャーナル・オブ・モレキュラー・メディシン（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．），７５，８２９，（１９９７）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，８７７４，（１９９９）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，８７６８，（１９９９）；ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．），２７，１３２３，（１９９９）；インベスティゲーション・オブ・ダーマトロジー（Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｍａｔｏｌ．），１１１，１１７２，（１９９８）；ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．），１６，１３４３，（１９９８）；ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．），１８，４３，（２０００）；ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．），１８，５５５，（２０００）等の記載に従って設計することができる。
【０１２５】
（ｄ）ＲＮＡｉ方法による宿主細胞の作製
宿主細胞は、ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を標的とし、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）法を用い、例えば、以下のように作製することができる。
【０１２６】
ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のｃＤＮＡを調製する。
調製したｃＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したＤＮＡの配列に基づき、ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードする部分あるいは非翻訳領域の部分を含む適当な長さのＲＮＡｉ遺伝子のコンストラクトを設計する。
該ＲＮＡｉ遺伝子を細胞内で発現させるために、調製したＤＮＡの断片、または全長を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより形質転換体を得る。
ＧＤＰ−フコース合成酵素の活性、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性、あるいは産生抗体分子または細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標に形質転換体を選択することで、宿主細胞を得ることができる。
【０１２７】
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３．に記載の宿主細胞があげられる。
【０１２８】
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、設計したＲＮＡｉ遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、後述の３．に記載の発現ベクターがあげられる。
【０１２９】
各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述の３．に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
【０１３０】
ＧＤＰ−フコース合成酵素の活性、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、前記１の（１）の（ａ）に記載の方法があげられる。
【０１３１】
細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述の１の（５）に記載の方法があげられる。産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述の５または後述の６に記載の方法があげられる。
【０１３２】
ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のｃＤＮＡを調製する方法としては、例えば、前記１の（１）の（ａ）に記載されたＤＮＡの調製方法などがあげられる。
【０１３３】
また、発現ベクターを用いず、ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の塩基配列に基づいて設計したＲＮＡｉ遺伝子を、直接宿主細胞に導入することで、宿主細胞を得ることもできる。
ＲＮＡｉ遺伝子は、常法またはＤＮＡ合成機を用いることにより調製することができる。
【０１３４】
ＲＮＡｉ遺伝子のコンストラクトは、［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３９１，８０６，（１９９８）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９５，１５５０２，（１９９８）；ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３９５，８５４，（１９９８）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，５０４９，（１９９９）；セル（Ｃｅｌｌ），９５，１０１７，（１９９８）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，１４５１，（１９９９）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９５，１３９５９，（１９９８）；ネイチャー・セル・バイオオロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．），２，７０，（２０００）］等の記載に従って設計することができる。
【０１３５】
（ｅ）トランスポゾンを用いた方法による、宿主細胞の作製
宿主細胞は、ネイチャー・ジェネティク（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．），２５，３５，（２０００）等に記載のトランスポゾンのシステムを用い、ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性、あるいは産生抗体分子または細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標に突然変異体を選択することで、宿主細胞を作製することができる。
【０１３６】
トランスポゾンのシステムとは、外来遺伝子をランダムに染色体上に挿入させることで突然変異を誘発させるシステムであり、通常、トランスポゾンに挿まれた外来遺伝子を突然変異を誘発させるベクターとして用い、この遺伝子を染色体上にランダムに挿入させるためのトランスポゼースの発現ベクターを同時に細胞の中に導入する。
トランスポゼースは、用いるトランスポゾンの配列に適したものであればいかなるものも用いることができる。
外来遺伝子としては、宿主細胞のＤＮＡに変異を誘起するものであればいかなる遺伝子も用いることができる。
【０１３７】
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３．に記載の宿主細胞があげられる。各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述の３．に記載の各種宿主細胞に適した組み換えベクターの導入方法を用いることができる。
【０１３８】
ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性を指標として突然変異体を選択する方法としては、例えば、前記１の（１）の（ａ）に記載の方法があげられる。
【０１３９】
細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として突然変異体を選択する方法としては、例えば、後述の１の（５）に記載の方法があげられる。産生抗体分子の糖鎖構造を指標として突然変異体を選択する方法としては、例えば、後述の５または後述の６に記載の方法があげられる。
【０１４０】
（２）酵素の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する手法
宿主細胞は、ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を標的とし、該酵素のドミナントネガティブ体を導入する手法を用いることにより作製することができる。ＧＤＰ−フコース合成酵素としては、具体的には、ＧＭＤ、Ｆｘ、ＧＦＰＰ、Ｆｕｃｏｋｉｎａｓｅなどがあげられる。α１，６−フコース修飾酵素としては、具体的には、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼなどがあげられる。ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質としては、具体的には、ＧＤＰ−フコーストランスポーターなどがあげられる。
これらの酵素は、基質特異性を有したある特定の反応を触媒する酵素であり、このような基質特異性を有した触媒作用を有する酵素の活性中心を破壊することで、これらの酵素のドミナントネガティブ体を作製することができる。標的とする酵素のうち、ＧＭＤを例として、そのドミナントネガティブ体に作製について具体的に以下に述べる。
【０１４１】
大腸菌由来のＧＭＤの立体構造を解析した結果、４つのアミノ酸（１３３番目のトレオニン、１３５番目のグルタミン酸、１５７番目のチロシン、１６１番目のリシン）が酵素活性に重要な機能を担っていることが明らかにされている（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，８，２，２０００）。すなわち、立体構造の情報にもとづきこれら４つのアミノ酸を異なる他のアミノ酸に置換した変異体を作製した結果、いずれの変異体においても有意に酵素活性が低下していたことが示されている。
【０１４２】
一方、ＧＭＤの補酵素ＮＡＤＰや基質であるＧＤＰ−マンノースとの結合能に関しては、いずれの変異体においてもほとんど変化が観察されていない。従って、ＧＭＤの酵素活性を担うこれら４つのアミノ酸を置換することによりドミナントネガティブ体を作製することができる。大腸菌由来のＧＭＤの結果に基づき、アミノ酸配列情報をもとにした相同性比較や立体構造予測を行うことによりドミナントネガティブ体を作製することができる。このようなアミノ酸置換を導入した遺伝子の作製は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。
【０１４３】
宿主細胞は、上述のように作製した標的酵素のドミナントネガティブ体遺伝子を用い、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版等に記載された遺伝子導入の方法に従って、例えば、以下のように作製することができる。
【０１４４】
ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のドミナントネガティブ体をコードする遺伝子（以下、ドミナントネガティブ体遺伝子と略記する）を調製する。
調製したドミナントネガティブ体遺伝子の全長ＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
該ＤＮＡ断片、または全長ＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、形質転換体を得る。
【０１４５】
ＧＤＰ−フコース合成酵素の活性、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性、あるいは産生抗体分子または細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標に形質転換体を選択することで、本発明に用いられる宿主細胞を作製することができる。
【０１４６】
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３．に記載の宿主細胞があげられる。
【０１４７】
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、目的とするドミナントネガティブ体をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、後述の３．に記載の発現ベクターがあげられる。
【０１４８】
各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述の３．に記載の各種宿主細胞に適した組み換えベクターの導入方法を用いることができる。
【０１４９】
ＧＤＰ−フコース合成酵素の活性、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、前記１の（１）の（ａ）に記載の方法があげられる。
【０１５０】
細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述の１の（５）に記載の方法があげられる。産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述の５または後述の６に記載の方法があげられる。
【０１５１】
（３）酵素に突然変異を導入する手法
宿主細胞は、ＧＤＰ−フコース合成酵素またはのα１，６−フコース修飾酵素遺伝子について突然変異を導入し、該酵素に突然変異を生じた所望の細胞株を選択する手法を用いることにより作製できる。
ＧＤＰ−フコース合成酵素としては、ＧＭＤ、Ｆｘ、ＧＦＰＰ、Ｆｕｃｏｋｉｎａｓｅなどがあげられる。α１，６−フコース修飾酵素としては、具体的には、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼなどがあげられる。ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質としては、具体的には、ＧＤＰ−フコーストランスポーターなどがあげられる。
【０１５２】
酵素に突然変異を導入する方法としては、１）突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、ＧＤＰ−フコース合成酵素の活性、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性を指標として所望の細胞株を選択する方法、２）突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、生産抗体分子の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法、３）突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、該細胞の細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法などがあげられる。
突然変異誘発処理としては、親株の細胞のＤＮＡに点突然変異、欠失あるいはフレームシフト突然変異を誘起するものであればいかなる処理も用いることができる。
【０１５３】
具体的には、エチルニトロソウレア、ニトロソグアニジン、ベンゾピレン、アクリジン色素による処理、放射線の照射などがあげられる。また、種々のアルキル化剤や発癌物質も突然変異誘発物質として用いることができる。突然変異誘発物質を細胞に作用させる方法としては、例えば、組織培養の技術 第三版（朝倉書店）日本組織培養学会編（１９９６）、ネイチャー・ジェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．），２４，３１４，（２０００）等に記載の方法をあげることができる。
【０１５４】
自然発生的に生じた突然変異体としては、特別な突然変異誘発処理を施さないで、通常の細胞培養の条件で継代培養を続けることによって自然発生的に生じる突然変異体をあげることができる。
【０１５５】
ＧＤＰ−フコース合成酵素の活性、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性の活性を測定する方法としては、例えば、前記１の（１）の（ａ）に記載の方法があげられる。細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を識別する方法としては、例えば、後述の１の（５）に記載の方法があげられる。
【０１５６】
（４）酵素の遺伝子の転写または翻訳を抑制する手法
宿主細胞は、ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を標的とし、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術［バイオサイエンスとインダストリー，５０，３２２（１９９２）、化学，４６，６８１（１９９１）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，３５８（１９９２）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，８７（１９９２）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１５２（１９９２）、細胞工学，１６，１４６３（１９９７）］、トリプル・ヘリックス技術［Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１３２（１９９２）］等を用い、標的とする遺伝子の転写または翻訳を抑制することで作製することができる。
ＧＤＰ−フコース合成酵素としては、具体的には、ＧＭＤ、Ｆｘ、ＧＦＰＰ、Ｆｕｃｏｋｉｎａｓｅなどがあげられる。α１，６−フコース修飾酵素としては、具体的には、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼなどがあげられる。
【０１５７】
（５）Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法
宿主細胞は、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法を用いることにより作製することができる。
Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法としては、例えば、ソマティク・セル・アンド・モレキュラー・ジェネティクス（Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．），１２，５１，（１９８６）等に記載のレクチンを用いた方法があげられる。
【０１５８】
レクチンとしては、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンであればいずれのレクチンでも用いることができるが、その具体的な例としては、レンズマメレクチンＬＣＡ（Ｌｅｎｓ Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ Ｌｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）等をあげることができる。
【０１５９】
具体的には、１μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの濃度の上述のレクチンを含む培地で１日〜２週間、好ましくは１日〜１週間培養し、生存している細胞を継代培養あるいはコロニーをピックアップし別の培養器に移し、さらに引き続きレクチンを含む培地で培養を続けることにより、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択することができる。
【０１６０】
レクチン耐性細胞であることを確認する方法としては、ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の発現を確認する方法、直接レクチンを加えた培地に細胞を培養する方法などがあげられる。具体的には、α１，６−フコース修飾酵素の一つであるα１，６−フコシルトランスフェラーゼのｍＲＮＡの発現量を測定し、ｍＲＮＡの発現が低下していればレクチン耐性細胞であるといえる。
２．トランスジェニック非ヒト動物あるいは植物またはそれら子孫の作製
【０１６１】
本発明で用いられる抗体組成物は、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素およびＧＤＰ−フコース輸送蛋白質からなる群から選ばれる蛋白質の少なくとも１つの蛋白質の活性が低下または欠失するようにゲノム遺伝子が改変されたトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物またはそれら子孫を用いて、製造することができる。トランスジェニック非ヒト動物あるいは植物またはそれら子孫は、上述の蛋白質の遺伝子を標的として、１．に記載の手法と同様の手法を用いて作製することができる。
【０１６２】
トランスジェニック非ヒト動物の場合、目的とする非ヒト動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サル、ウサギ等の胚性幹細胞に、１．に記載の手法と同様の手法を用いることにより、ＧＤＰ−フコース合成酵素の活性、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性が低下または欠失された胚性幹細胞を作製することができる。
【０１６３】
具体的は、染色体上のＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードする遺伝子を公知の相同組換えの手法［例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３２６，６１１０，２９５（１９８７）、Ｃｅｌｌ，５１，３，５０３（１９８７）等］により不活化または任意の配列と置換した変異クローンを作製する。作製した該変異クローンを用い、動物の受精卵の胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）への注入キメラ法または集合キメラ法等の手法により、胚性幹細胞クローンと正常細胞からなるキメラ個体を調製することができる。このキメラ個体と正常個体の掛け合わせにより、全身の細胞でＧＤＰ−フコース合成酵素の活性、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性が低下または欠失したトランスジェニック非ヒト動物を得ることができる。
【０１６４】
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターは、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製等に記載の方法にしたがって作製することができる。ターゲットベクターは、リプレースメント型、インサーション型、ジーントラップ型いずれでも用いることができる。
【０１６５】
胚性幹細胞へのターゲットベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８４，７４１３（１９８７）］、インジェクション法（マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（日本特許第２６０６８５６、日本特許第２５１７８１３）、ＤＥＡＥ−デキストラン法［バイオマニュアルシリーズ４−遺伝子導入と発現・解析法（羊土社）横田崇・新井賢一編（１９９４）］、ウイルスベクター法（マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版）等をあげることができる。
【０１６６】
相同組換え体を効率的に選別する方法として、例えば、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製等に記載のポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリＡ選択などの方法を用いることができる。具体的には、ｈｐｒｔ遺伝子を含むターゲットベクターの場合は、ｈｐｒｔ遺伝子を欠損した胚性幹細胞に導入後、胚性幹細胞をアミノプテリン、ヒポキサンチンおよびチミジンを含む培地で培養し、アミノプテリン耐性の株を選別することにより、ｈｐｒｔ遺伝子を含む相同組換え体を選別するポジティブ選択を行なうことができる。ネオマイシン耐性遺伝子を含むターゲットベクターの場合は、ベクターを導入した胚性幹細胞をＧ４１８を含む培地で培養し、Ｇ４１８耐性の株を選別することにより、ネオマイシン耐性遺伝子を含む相同組換え体を選別するポジティブ選択を行なうことができる。ＤＴ遺伝子を含むターゲットベクターの場合は、ベクターを導入した胚性幹細胞を培養し、生育してきた株を選別する（相同組換え以外のランダムに染色体に挿入された組換え体は、ＤＴ遺伝子が染色体に組み込まれて発現するため、ＤＴの毒性により生育できない）ことにより、ＤＴ遺伝子を含まない相同組換え体を選別するネガティブ選択を行なうことができる。選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）やＰＣＲ法［ピーシーアール・プロトコールズ（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］等があげられる。
【０１６７】
胚性幹細胞を集合キメラ法を用いて受精卵に取り込ませる場合には、一般に８細胞期以前の発生段階の受精卵を用いることが好ましい。胚性幹細胞を注入キメラ法を用いて受精卵に取り込ませる場合には、一般に８細胞期から胚盤胞の発生段階の受精卵を用いることが好ましい。
雌マウスへ受精卵を移植する場合には、精管結紮雄非ヒト哺乳動物と交配させることにより、受精能を誘起された偽妊娠雌マウスに得られた受精卵を人工的に移植および着床させる方法が好ましく、偽妊娠雌マウスは自然交配によっても得られるが、黄体形成ホルモン放出ホルモン（以下、ＬＨＲＨと略する）あるいはその類縁体を投与後、雄マウスと交配させることにより、受精能を誘起された偽妊娠雌マウスを得ることもできる。ＬＨＲＨの類縁体としては、例えば［３，５−Ｄｉｌ−Ｔｙｒ５］−ＬＨＲＨ、［Ｇｌｎ８］−ＬＨＲＨ、［Ｄ−Ａｌａ６］−ＬＨＲＨ、ｄｅｓ−Ｇｌｙ１０−［Ｄ−Ｈｉｓ（Ｂｚｌ）６］−ＬＨＲＨ ｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ等があげられる。また、目的とする非ヒト動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サル、ウサギ等の受精卵細胞に、１．に記載の手法と同様の手法を用いることにより、ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性が低下または欠失した受精卵細胞を作製することができる。
作製した受精卵細胞を、マニピューレーティング・マウス・エンブリオ第２版等に記載の胚移植の方法を用いて偽妊娠雌の卵管あるいは子宮に移植し出産させることで、ＧＤＰ−フコース合成酵素の活性またはα１，６−フコース修飾酵素の活性が低下または欠失したトランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。
【０１６８】
トランスジェニック植物の場合、目的とする植物体カルスまたは細胞に、１．に記載の手法と同様の手法を用いることにより、ＧＤＰ−フコース合成酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位あるいは３位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が低下または欠失したカルスを作製することができる。
作製したカルスを、公知の方法［組織培養，２０（１９９４）；組織培養，２１（１９９５）；トレンド・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），１５，４５（１９９７）］に準じてオーキシンおよびサイトカイニンを含む培地で培養することで再分化させ、ＧＤＰ−フコース合成酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位あるいは３位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が低下または欠失したトランスジェニック植物を作製することができる。
【０１６９】
３．抗体組成物の製造方法
抗体組成物は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８（以下、アンチボディズと略す）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，１９９６（以下、モノクローナルアンチボディズと略す）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６（以下、アンチボディエンジニアリングと略す）等に記載された方法を用い、例えば、以下のように宿主細胞中で発現させて取得することができる。
【０１７０】
抗体分子の全長ｃＤＮＡを調製し、該抗体分子をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
該ＤＮＡ断片、または全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、抗体分子を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できる前記１に記載した宿主細胞を用いる。
【０１７１】
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、目的とする抗体分子をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
【０１７２】
ｃＤＮＡは、上記１の（１）の（ａ）に記載のＤＮＡの調製方法に従い、ヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞より、目的とする抗体分子に特異的なプローブプライマー等を用いて調製することができる。
【０１７３】
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）等をあげることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、クリュイベロミセス属、トリコスポロン属、シュワニオミセス属等に属する酵母、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［メソッズ・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ），８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ），１５３，１６３（１９８３）］、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ），７５，１９２９（１９７８）］に記載の方法等をあげることができる。
【０１７４】
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９７９；サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３，（１９９０）］、ｐＡＳ３−３［特開平２−２２７０７５］、ｐＣＤＭ８［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３２９，８４０，（１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＧＥ１０３［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０等をあげることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ラットミエローマ細胞、マウスミエローマ細胞、シリアンハムスター腎臓由来細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法［特開平２−２２７０７５］、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８４，７４１３（１９８７）］、インジェクション法［マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル］、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法［日本特許第２６０６８５６、日本特許第２５１７８１３］、ＤＥＡＥ−デキストラン法［バイオマニュアルシリーズ４−遺伝子導入と発現・解析法（羊土社）横田崇・新井賢一編（１９９４）］、ウイルスベクター法［マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版］等をあげることができる。
【０１７５】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、蛋白質を発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１［カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）］、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８４，７４１３（１９８７）］等をあげることができる。
【０１７６】
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）［特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７］、エレクトロポレーション法［特開昭６０−２５１８８７］、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法［日本特許第２６０６８５６、日本特許第２５１７８１３］等をあげることができる。
【０１７７】
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、Ｆｃ領域と他の蛋白質との融合蛋白質発現等を行うことができる。
糖鎖の合成に関与する遺伝子を導入した酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、導入した遺伝子によって糖あるいは糖鎖が付加された抗体分子を得ることができる。
【０１７８】
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に抗体分子を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、抗体組成物を製造することができる。形質転換体を培地に培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【０１７９】
酵母を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マン癌、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調製は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【０１８０】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した酵母を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した酵母を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した酵母を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【０１８１】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［ザ・ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエイション（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ），１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地邊［ヴュウロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８，３９６（１９５９）］、１９９培地［プロシーディング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォア・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），７３，１（１９５・BR>O）］、Ｗｈｉｔｔｅｎ培地［発生工学実験マニュアル−トランスジェニック・マウスの作り方（講談社）勝木元也編（１９８７）］またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【０１８２】
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、Ｓｆ−９００ＩＩ ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９５，７８８（１９６２）］等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【０１８３】
上記のとおり、抗体分子をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する酵母、動物細胞、昆虫細胞あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、抗体組成物を生成蓄積させ、該培養物より抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を製造することができる。
【０１８４】
抗体遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法に準じて、分泌生産、融合蛋白質発現等を行うことができる。
抗体組成物の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させる抗体分子の構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
【０１８５】
抗体組成物が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８６，８２２７（１９８９）；ジーン・デベロップメント（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．），４，１２８８（１９９０）］、または特開平０５−３３６９６３、特開平０６−８２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該抗体組成物を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、発現ベクターに、抗体分子をコードするＤＮＡ、および抗体分子の発現に適切なシグナルペプチドをコードするＤＮＡを挿入し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入の後に発現させることにより、目的とする抗体組成物を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
【０１８６】
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いて抗体組成物を製造することもできる。
【０１８７】
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、抗体組成物を生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該抗体組成物を採取することにより、該抗体組成物を製造することができる。
【０１８８】
動物個体を用いて抗体組成物を製造する方法としては、例えば公知の方法［アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ），６３，６３９Ｓ（１９９６）；アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ），６３，６２７Ｓ（１９９６）；バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），９，８３０（１９９１）］に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に目的とする抗体組成物を生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、抗体分子をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、抗体組成物を該動物中に生成蓄積させ、該動物中より抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を製造することができる。
該動物中の生成蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭６３−３０９１９２）、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
【０１８９】
植物個体を用いて抗体組成物を製造する方法としては、例えば抗体分子をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法［組織培養，２０（１９９４）；組織培養，２１（１９９５）；トレンド・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），１５，４５（１９９７）］に準じて栽培し、抗体組成物を該植物中に生成蓄積させ、該植物中より該抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を生産する方法があげられる。
【０１９０】
抗体分子をコードする遺伝子を導入した形質転換体により製造された抗体組成物は、例えば抗体組成物が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮＨＰＡ−７５（三菱化学（株）製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、抗体組成物の精製標品を得ることができる。
【０１９１】
また、抗体組成物が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として抗体組成物の不溶体を回収する。回収した抗体組成物の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析することにより、該抗体組成物を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法により該抗体組成物の精製標品を得ることができる。
【０１９２】
抗体組成物が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該抗体組成物あるいはその誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、抗体組成物の精製標品を得ることができる。
【０１９３】
このようにして取得される抗体組成物として、例えば、抗体、抗体の断片、抗体のＦｃ領域を有する融合蛋白質などをあげることができる。
【０１９４】
以下に、抗体組成物の取得のより具体的な例として、ヒト化抗体の組成物およびＦｃ融合蛋白質の製造方法について記すが、他の抗体組成物を当該方法と同様にして取得することもできる。
Ａ．ヒト化抗体の組成物の製造（１）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとは、ヒト抗体のＨ鎖および軽鎖Ｌ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
【０１９５】
ヒト抗体のＣ領域としては、任意のヒト抗体のＣＨおよびＣＬであることができ、例えば、ヒト抗体のＨ鎖のＩｇＧ１サブクラスのＣ領域（以下、ｈＣγ１と表記する）およびヒト抗体のＬ鎖のκクラスのＣ領域（以下、ｈＣκと表記する）等があげられる。
ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンから成る染色体ＤＮＡを用いることができ、また、ｃＤＮＡを用いることもできる。
【０１９６】
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［ジーン（Ｇｅｎｅ），２７，２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７８，１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１ β ｄ２−４［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），４，１７３（１９９０）］等があげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲ［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．），１４９，９６０（１９８７）］、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［セル（Ｃｅｌｌ），４１，４７９（１９８５）］とエンハンサー［セル（Ｃｅｌｌ），３３，７１７（１９８３）］等があげられる。
【０１９７】
ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（以下、タンデム型と表記する）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量のバランスが均衡する等の点からタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい［ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ），１６７，２７１（１９９４）］。
構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体およびヒト型ＣＤＲ移植抗体の動物細胞での発現に使用できる。
【０１９８】
（２）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは以下のようにして取得することができる。
目的のマウス抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージ或いはプラスミド等のベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、既存のマウス抗体のＣ領域部分或いはＶ領域部分をプローブとして用い、ＶＨをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目的のマウス抗体のＶＨおよびＶＬの全塩基配列を決定し、塩基配列よりＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定する。
【０１９９】
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
【０２００】
ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１５４，３（１９８７）］、また全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９］等があげられる。また、ハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製するキットとしては、Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等があげられる。
【０２０１】
ｃＤＮＡの合成およびｃＤＮＡライブラリー作製法としては、常法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １−３４］、或いは市販のキット、例えば、Ｓｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いる方法などがあげられる。
【０２０２】
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１７，９４９４（１９８９）］、λｚａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ディーエヌエー・クローニング：ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ），Ｉ，４９（１９８５）］、Ｌａｍｂｄａ ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３ １８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２［モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），３，２８０（１９８３）］およびｐＵＣ１８［ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３（１９８５）］等が用いられる。
ファージ或いはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現および維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，８１（１９９２）］、Ｃ６００［ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６６，１（１９８３）］、Ｋ８０２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６，１１８（１９６６）］およびＪＭ１０５［ジーン（Ｇｅｎｅ），３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
【０２０３】
ｃＤＮＡライブラリーからのヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択法としては、アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法或いはプラーク・ハイブリダイゼーション法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９］により選択することができる。また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ或いはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ［以下、ＰＣＲ法と表記する；モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １−３４］によりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
上記方法により選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等を用いて解析することで該ｃＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
【０２０４】
決定した塩基配列からＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定し、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。
【０２０５】
（３）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域のアミノ酸配列の解析
分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さおよびＮ末端アミノ酸配列を推定でき、更にはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、ＶＨおよびＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］と比較することによって見出すことができる。
【０２０６】
（４）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
本項３の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを、ヒト以外の動物の抗体ＶＨおよびＶＬの３’末端側の塩基配列とヒト抗体のＣＨおよびＣＬの５’末端側の塩基配列とから成り、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡとそれぞれ連結し、それぞれを本項３の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
【０２０７】
（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。まず、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを移植するヒト抗体のＶＨおよびＶＬのフレームワーク（以下、ＦＲと表記する）のアミノ酸配列を選択する。ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ等のデータベースに登録されているヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列、ヒト抗体のＨ鎖およびＬ鎖のＶ領域のＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］等があげられるが、その中でも、十分な活性を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体を作製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）を有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。
【０２０８】
次に、選択したヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を設計する。設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さから成る数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行う。この場合、ＰＣＲでの反応効率および合成可能なＤＮＡの長さから、Ｈ鎖、Ｌ鎖とも６本の合成ＤＮＡを設計することが好ましい。
【０２０９】
また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項３の（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクローニングすることができる。ＰＣＲ後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、本項３の（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。
【０２１０】
（６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
本項３の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流に、本項３の（５）で構築したヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、本項３の（５）でヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項３の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。
【０２１１】
（７）ヒト化抗体の安定的生産
本項３の（４）および（６）に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な動物細胞に導入することによりヒト型キメラ抗体およびヒト型ＣＤＲ移植抗体（以下、併せてヒト化抗体と称す）を安定に生産する形質転換株を得ることができる。
【０２１２】
動物細胞へのヒト化抗体発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法［特開平２−２５７８９１；サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］等があげられる。
ヒト化抗体発現ベクターを導入する動物細胞としては、ヒト化抗体を生産させることができる上記１で作製された動物細胞を用いることができる。
具体的には、マウスミエローマ細胞であるＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、ＩＲ９８３Ｆ細胞、シリアンハムスター腎臓由来であるＢＨＫ細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ細胞などがあげられるが、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣細胞であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、５に記載の宿主細胞等があげられる。
【０２１３】
ヒト化抗体発現ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に生産する形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８ ｓｕｌｆａｔｅ（以下、Ｇ４１８と表記する；ＳＩＧＭＡ社製）等の薬剤を含む動物細胞培養用培地により選択できる。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、またはこれら培地に牛胎児血清（以下、ＦＢＳと表記する）等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を生産蓄積させることができる。培養上清中のヒト化抗体の生産量および抗原結合活性は酵素免疫抗体法［以下、ＥＬＩＳＡ法と表記する；アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４，１９９８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６］等により測定できる。また、形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系等を利用してヒト化抗体の生産量を上昇させることができる。
【０２１４】
ヒト化抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる［アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ８，１９８８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６］。また、その他に通常、蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動［以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと表記する；ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０（１９７０）］やウエスタンブロッティング法［アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １２，１９８８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６］等で測定することができる。
【０２１５】
Ｂ．Ｆｃ融合蛋白質の製造
（１）Ｆｃ融合蛋白質発現用ベクターの構築
Ｆｃ融合蛋白質発現用ベクターとは、ヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子をクローニングすることにより構築することができる。
ヒト抗体のＦｃ領域としては、ＣＨ２とＣＨ３領域を含む領域のほか、ヒンジ領域、ＣＨ１の一部が含まれるものも包含される。またＣＨ２またはＣＨ３の少なくとも１つのアミノ酸が欠失、置換、付加または挿入され、実質的にＦｃγ受容体への結合活性を有するものであればいかなるものでもよい。
ヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンから成る染色体ＤＮＡを用いることができ、また、ｃＤＮＡを用いることもできる。それら遺伝子とＦｃ領域を連結する方法としては、各遺伝子配列を鋳型として、ＰＣＲ法（レキュラー・クローニング第２版；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １−３４）を行うことがあげられる。
【０２１６】
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［ジーン（Ｇｅｎｅ），２７，２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７８，１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１ β ｄ２−４［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），４，１７３（１９９０）］等があげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲ［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．），１４９，９６０（１９８７）］、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［セル（Ｃｅｌｌ），４１，４７９（１９８５）］とエンハンサー［セル（Ｃｅｌｌ），３３，７１７（１９８３）］等があげられる。
【０２１７】
（２）ヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードするＤＮＡの取得
ヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードするＤＮＡは以下のようにして取得することができる。
目的のＦｃと融合させる蛋白質を発現している細胞や組織よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージ或いはプラスミド等のベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、目的の蛋白質の遺伝子配列部分をプローブとして用い、目的の蛋白質をコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドを単離する。組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目的の蛋白質の全塩基配列を決定し、塩基配列より全アミノ酸配列を推定する。
【０２１８】
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等、細胞や組織を摘出することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
細胞や組織から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１５４，３（１９８７）］、また全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング第２版）等があげられる。また、細胞や組織からｍＲＮＡを調製するキットとしては、Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等があげられる。
【０２１９】
ｃＤＮＡの合成及びｃＤＮＡライブラリー作製法としては、常法（モレキュラー・クローニング第２版；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １−３４）、或いは市販のキット、例えば、Ｓｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いる方法などがあげられる。
【０２２０】
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、細胞や組織から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１７，９４９４（１９８９）］、λｚａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ディーエヌエー・クローニング：ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ），Ｉ，４９（１９８５）］、Ｌａｍｂｄａ ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３ １８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２［モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），３，２８０（１９８３）］及びｐＵＣ１８［ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３（１９８５）］等が用いられる。
【０２２１】
ファージ或いはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現及び維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，８１（１９９２）］、Ｃ６００［ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６６，１（１９８３）］、Ｋ８０２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６，１１８（１９６６）］及びＪＭ１０５［ジーン（Ｇｅｎｅ），３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
【０２２２】
ｃＤＮＡライブラリーからの目的の蛋白質をコードするｃＤＮＡクローンの選択法としては、アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法或いはプラーク・ハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）により選択することができる。また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ或いはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法により目的の蛋白質をコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
【０２２３】
目的の蛋白質をヒト抗体のＦｃ領域と融合させる方法としては、ＰＣＲ法があげられる。例えば、目的の蛋白質の遺伝子配列の５’側と３’側に任意の合成オリゴＤＮＡ（プライマー）を設定し、ＰＣＲ法を行いＰＣＲ産物を取得する。同様に、融合させるヒト抗体のＦｃ領域の遺伝子配列に対しても任意のプライマーを設定し、ＰＣＲ産物を得る。このとき、融合させる蛋白質のＰＣＲ産物の３’側とＦｃ領域のＰＣＲ産物の５’側には同じ制限酵素部位もしくは同じ遺伝子配列が存在するようにプライマーを設定する。この連結部分周辺のアミノ酸改変が必要である場合には、その変異を導入したプライマーを用いることで変異を導入する。得られた２種類のＰＣＲ断片を用いてさらにＰＣＲを行うことで、両遺伝子を連結する。もしくは、同一の制限酵素処理をした後にライゲーションすることでも連結することができる。
【０２２４】
上記方法により連結された遺伝子配列を、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７ＤＮＡシークエンサー（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
決定した塩基配列からＦｃ融合蛋白質の全アミノ酸配列を推定し、目的のアミノ酸配列と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含むＦｃ融合蛋白質の完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。
【０２２５】
（３）Ｆｃ融合蛋白質の安定的生産
前記の（１）項に記載のＦｃ融合蛋白質発現ベクターを適当な動物細胞に導入することによりＦｃ融合蛋白質を安定に生産する形質転換株を得ることができる。
動物細胞へのＦｃ融合蛋白質発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法［特開平２−２５７８９１；サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］等があげられる。
Ｆｃ融合蛋白質発現ベクターを導入する動物細胞としては、Ｆｃ融合蛋白質を生産させることができる動物細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。
具体的には、マウスミエローマ細胞であるＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、ＩＲ９８３Ｆ細胞、シリアンハムスター腎臓由来であるＢＨＫ細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ細胞などがあげられるが、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣細胞であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、前記１項に記載の本発明の方法に用いられる宿主細胞等があげられる。
【０２２６】
Ｆｃ融合蛋白質発現ベクターの導入後、Ｆｃ融合蛋白質を安定に生産する形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８等の薬剤を含む動物細胞培養用培地により選択できる。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、またはこれら培地に牛胎児血清等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にＦｃ融合蛋白質を生産蓄積させることができる。培養上清中のＦｃ融合蛋白質の生産量及び抗原結合活性はＥＬＩＳＡ法等により測定できる。また、形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系等を利用してＦｃ融合蛋白質の生産量を上昇させることができる。
【０２２７】
Ｆｃ融合蛋白質は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムやプロテインＧカラムを用いて精製することができる（アンチボディズ，Ｃｈａｐｔｅｒ８、モノクローナル・アンティボディズ）。また、その他に通常、タンパク質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したＦｃ融合蛋白質分子全体の分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０（１９７０）］やウエスタンブロッティング法（アンチボディズ，Ｃｈａｐｔｅｒ１２、モノクローナル・アンティボディズ）等で測定することができる。
【０２２８】
以上、動物細胞を宿主とした抗体組成物の製造方法を示したが、上述したように、酵母、昆虫細胞、植物細胞または動物個体あるいは植物個体においても動物細胞と同様の方法により抗体組成物を製造することができる。
すでに宿主細胞が抗体分子を発現する能力を有する場合には、前記１．に記載した方法を用いて抗体組成物を発現させる細胞を調製した後に、該細胞を培養し、該培養物から目的とする抗体組成物を精製することにより、本発明の治療剤に有効成分として含有される抗体組成物を製造することができる。
【０２２９】
４．抗体組成物の活性評価
精製した抗体組成物の蛋白量、抗原との結合活性あるいはエフェクター機能はを測定する方法としては、モノクローナルアンチボディズ、あるいはアンチボディエンジニアリング等に記載の公知の方法を用いることができる。
その具体的な例としては、抗体組成物がヒト化抗体の場合、抗原との結合活性、抗原陽性培養細胞株に対する結合活性はＥＬＩＳＡ法および蛍光抗体法［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），３６，３７３（１９９３）］等により測定できる。抗原陽性培養細胞株に対する細胞障害活性は、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性等を測定することにより、評価することができる［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），３６，３７３（１９９３）］。
【０２３０】
異なる薬剤の治療効果の比較は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ブタ、サル等の実験動物を用いた疾患モデルを用いたｉｎ ｖｉｖｏ実験より行うことができる。また疾患に関与する細胞あるいはその株化細胞を標的としたｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞障害活性の測定によっても行うことができる。
ｉｎ ｖｉｖｏ実験は疾患に関与する細胞あるいはその株化細胞等の標的細胞を実験動物の体内に移植し、薬剤を腹腔内、静脈内、皮下等に投与し、実験動物の病態を観察することにより行うことができる。例えば、腫瘍の増殖や実験動物の生存日数、薬剤の血中成分濃度や臓器重量等を測定することにより、薬剤の治療効果を調べることができる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞障害活性は、ＡＤＣＣ活性やＣＤＣ活性等を測定することにより得ることができる。
【０２３１】
５．各種細胞で発現させた抗体分子の糖鎖の分析
各種細胞で発現させた抗体分子の糖鎖構造は、通常の糖蛋白質の糖鎖構造の解析に準じて行うことができる。例えば、ＩｇＧ分子に結合している糖鎖はガラクトース、マンノース、フコースなどの中性糖、Ｎ−アセチルグルコサミンなどのアミノ糖、シアル酸などの酸性糖から構成されており、糖組成分析および二次元糖鎖マップ法などを用いた糖鎖構造解析等の手法を用いて行うことができる。
【０２３２】
（１）中性糖・アミノ糖組成分析
抗体分子の糖鎖の組成分析は、トリフルオロ酢酸等で、糖鎖の酸加水分解を行うことにより、中性糖またはアミノ糖を遊離し、その組成比を分析することができる。
具体的な方法として、Ｄｉｏｎｅｘ社製糖組成分析装置（ＢｉｏＬＣ）を用いる方法があげられる。ＢｉｏＬＣはＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｐｕｌｓｅｄ ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．），６，１５７７（１９８３）］によって糖組成を分析する装置である。
また、２−アミノピリジンによる蛍光標識化法でも組成比を分析することができる。具体的には、公知の方法［アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），５５（１），２８３−２８４（１９９１）］に従って酸加水分解した試料を２−アミノピリジル化で蛍光ラベル化し、ＨＰＬＣ分析して組成比を算出することができる。
【０２３３】
（２）糖鎖構造解析
抗体分子の糖鎖の構造解析は、２次元糖鎖マップ法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１７１，７３（１９８８）、生物化学実験法２３−糖タンパク質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９年）］により行うことができる。２次元糖鎖マップ法は、例えば、Ｘ軸には逆相クロマトグラフィー糖鎖の保持時間または溶出位置を、Ｙ軸には順相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置を、それぞれプロットし、既知糖鎖のそれらの結果と比較することにより、糖鎖構造を推定する方法である。
具体的には、抗体をヒドラジン分解して、抗体から糖鎖を遊離し、２−アミノピリジン（以下、ＰＡと略記する）による糖鎖の蛍光標識［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），９５，１９７（１９８４）］を行った後、ゲルろ過により糖鎖を過剰のＰＡ化試薬などと分離し、逆相クロマトグラフィーを行う。次いで、分取した糖鎖の各ピークについて順相クロマトグラフィーを行う。これらの結果をもとに、２次元糖鎖マップ上にプロットし、糖鎖スタンダード（ＴａＫａＲａ社製）、文献［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１７１，７３（１９８８）］とのスポットの比較より糖鎖構造を推定することができる。
さらに各糖鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳなどの質量分析を行い、２次元糖鎖マップ法により推定される構造を確認することができる。
【０２３４】
６．抗体分子の糖鎖構造を識別する免疫学的定量方法
抗体組成物は、抗体のＦｃ領域に結合する糖鎖構造が異なった抗体分子から構成されている。本発明の治療剤に有効成分として含有される抗体組成物は、Ｆｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合していない糖鎖の割合が２０％以上であり、高いＡＤＣＣ活性を示す特徴を有している。このような抗体組成物は、上記５．に記載の抗体分子の糖鎖構造の分析法を用いることにより識別できる。また、レクチンを用いた免疫学的定量方法を用いることによっても識別できる。
【０２３５】
レクチンを用いた免疫学的定量方法を用いた抗体分子の糖鎖構造の識別は、文献［モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５）；酵素免疫測定法，第３版，医学書院（１９８７）；改訂版，酵素抗体法，学際企画（１９８５）］等に記載のウエスタン染色、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＶＩＡ（Ｖｉｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＦＩＡ（Ｆｌｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＭＩＡ（Ｍｅｔａｌｌｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）などの免疫学的定量方法に準じて、例えば、以下のように行うことができる。
【０２３６】
抗体組成物を構成する抗体分子の糖鎖構造を認識するレクチンを標識し、標識したレクチンと試料である抗体組成物を反応させる。次に、標識したレクチンと抗体分子の複合体の量を測定する。
抗体分子の糖鎖構造を識別に用いられるレクチンとしては、例えば、ＷＧＡ（Ｔ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のｗｈｅａｔ−ｇｅｒｍ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＣｏｎＡ（Ｃ．ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ由来のｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ）、ＲＩＣ（Ｒ．ｃｏｍｍｕｎｉｓ由来の毒素）、Ｌ−ＰＨＡ（Ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のｌｅｕｋｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＬＣＡ（Ｌ．ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のｌｅｎｔｉｌ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＰＳＡ（Ｐ．ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ ｌｅｃｔｉｎ）、ＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＡＣＬ（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｃａｕｄａｔｕｓ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＢＰＬ（Ｂａｕｈｉｎｉａ ｐｕｒｐｕｒｅａ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＤＳＬ（Ｄａｔｕｒａ ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＤＢＡ（Ｄｏｌｉｃｈｏｓ ｂｉｆｌｏｒｕｓ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＥＢＬ（Ｅｌｄｅｒｂｅｒｒｙ Ｂａｌｋ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＥＣＬ（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ ｃｒｉｓｔａｇａｌｌｉ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＥＥＬ（Ｅｕｏｎｙｍｕｓ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＧＮＬ（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＧＳＬ（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＨＰＡ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＨＨＬ（Ｈｉｐｐｅａｓｔｒｕｍ Ｈｙｂｒｉｄ Ｌｅｃｔｉｎ）、Ｊａｃａｌｉｎ、ＬＴＬ（Ｌｏｔｕｓ ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＬＥＬ（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＭＡＬ（Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＭＰＬ（Ｍａｃｌｕｒａ ｐｏｍｉｆｅｒａ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＮＰＬ（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ ｐｓｅｕｄｏｎａｒｃｉｓｓｕｓ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＰＮＡ（Ｐｅａｎｕｔ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、Ｅ−ＰＨＡ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｅｒｙｔｈｒｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＰＴＬ（Ｐｓｏｐｈｏｃａｒｐｕｓ ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＲＣＡ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＳＴＬ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＳＪＡ（Ｓｏｐｈｏｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＳＢＡ（Ｓｏｙｂｅａｎ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＵＥＡ（Ｕｌｅｘ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＶＶＬ（Ｖｉｃｉａ ｖｉｌｌｏｓａ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＷＦＡ（Ｗｉｓｔｅｒｉａ ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）があげられる。
【０２３７】
本発明で用いられる抗体組成物を識別するには、Ｎ−グルコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合している糖鎖構造を特異的に認識するレクチンを用いることが好ましく、その具体的な例としては、レンズマメレクチンＬＣＡ（Ｌｅｎｓ Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ Ｌｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）をあげることができる。
【０２３８】
７．レクチン耐性細胞で製造された抗体医薬が有効な患者をスクリーニングする方法
本発明の医薬が有効な患者をスクリーニングする方法としては、エフェクター細胞を患者の体内より採取し、本発明の医薬あるいは従来の抗体医薬と接触させ、該エフェクター細胞と反応した本発明の医薬あるいは従来の抗体医薬のエフェクター細胞に結合した医薬の量あるいは活性を測定し、従来の抗体医薬の示した結合量あるいは活性と本発明の医薬の結合量あるいは活性とを比較し、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有さない細胞から生産された抗体組成物を含有する医薬がエフェクター細胞と結合した量あるいは活性が少ない患者を選択する方法があげられる。
患者よりエフェクター細胞を採取する方法としては、外科的手法や体液の採取などがあげられる。必要に応じて採取した試料より、免疫学的方法、あるいは比重分離法や吸着法などの方法によりエフェクター細胞を濃縮あるいは精製して用いてもよい。
【０２３９】
エフェクター細胞に結合した医薬の量を測定する方法としては、抗体分子を検出できる方法であればいかなる方法でもよい。具体的には、免疫組識染色法、エンザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、フローサイトメトリー法、スキャッチャードプロット法、イムノブロッティング法、凝集反応、補体結合反応、溶血反応、沈降反応、金コロイド法、クロマトグラフィー法などの免疫学的測定方法があげられる。
【０２４０】
エフェクター細胞に結合した医薬によって引き起こされた活性を測定する方法としては、抗体分子の活性を検出することができる方法であればいかなる方法でもよい。具体的には、ＡＤＣＣ活性測定法、ＣＤＣ活性測定法、細胞障害性分子の発現を測定する方法、ヒトＦｃγ受容体ＩＩＩａの細胞内情報伝達シグナルを測定する方法、ヒトＦｃγ受容体ＩＩＩａを発現するエフェクター細胞での発現が変動する分子を測定する方法などがあげられる。
【０２４１】
ＡＤＣＣ活性測定法は、本発明の抗体医薬が結合したエフェクター細胞と、抗原を発現する標的細胞とを接触させ、標的細胞の障害を検出する方法である。
標的細胞としては株化細胞、抗原を付着させた赤血球、患者から採取した標的細胞などがあげられる。
標的細胞の障害を検出する方法としては、放射性同位元素、色素、蛍光物質等で標的細胞を標識する方法、あるいは未標識の標的細胞が有する酵素の生物活性や色素量を測定する方法などの免疫学的測定方法があげられる。
ＣＤＣ活性測定法は、本発明の抗体医薬が結合した補体と、抗原を発現する標的細胞とを接触させ、標的細胞の障害を検出する方法である。
標的細胞としては株化細胞、抗原を付着させた赤血球、患者から採取した標的細胞などがあげられる。
細胞障害性分子の発現を測定する方法は、本発明の抗体医薬が結合したエフェクター細胞から産生される物質を測定する方法である。
【０２４２】
エフェクター細胞から産生される物質としては、パーフォリン、グランザイム、活性酸素、一酸化窒素、グラニュライシン、ＦａｓＬなどがあげられる。
物質を測定する方法としては、物質に対して特異的に反応する抗体を用いた免疫学的測定方法、細胞外に放出された物質の細胞障害活性を測定するバイオアッセイ法などがあげられる。
ヒトＦｃγ受容体ＩＩＩａのエフェクター細胞内情報伝達シグナルを測定する方法は、本発明の抗体医薬が結合したエフェクター細胞内のシグナル伝達分子のリン酸化を検出する方法である。
エフェクター細胞内のシグナル伝達分子としては、γ鎖、ζ鎖、ＺＡＰ−７０、ＰＬＣ−γなどがあげられる。
ヒトＦｃγ受容体ＩＩＩａの下流のシグナル伝達分子のリン酸化を測定する方法としては、ウェスタンブロット法、免疫沈降法などがあげられる。
ヒトＦｃγ受容体ＩＩＩａを発現するエフェクター細胞での発現が変動する分子を測定する方法は、本発明の抗体医薬が結合したエフェクター細胞上の分子の発現を測定する方法である。
エフェクター細胞での発現が変動する分子としては、活性化されたＮＫ細胞上に発現するＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ７１などがあげられる。
エフェクター細胞上の分子の発現を測定する方法としては、フローサイトメトリー法、免疫組織染色等の免疫染色法などがあげられる。
【０２４３】
本発明のスクリーニング方法は、特に本発明の医薬が最も効力を奏するＦｃγＲＩＩＩａのシグナル配列のＮ末端メチオニンから１７６番目のアミノ酸がフェニルアラニンである患者のスクリーニングに有用である。
また本発明のスクリーニング方法により、患者を選別し本発明の医薬を適用することにより、効果的に患者を治療することができる。特に従来の医薬では治療できない患者に対して有用である。
【０２４４】
本発明の医薬を適用するための患者のスクリーニング方法としては、上記の方法以外にも、以下の（ａ）または（ｂ）の方法により行うことができる。
（ａ）患者のＦｃγＲＩＩＩａのシグナル配列のＮ末端メチオニンから１７６番目のアミノ酸をコードする遺伝子の塩基配列で選別する方法
（ｂ）患者のエフェクター細胞を採取し、ＦｃγＲＩＩＩａのシグナル配列のＮ末端メチオニンから１７６番目のアミノ酸における多型を特異的に認識する抗体を用いて、免疫学的手法によって選択する方法。
上記（ａ）の方法としては、患者の細胞を採取し、市販のゲノムＤＮＡ抽出キットなどにより取得したゲノム中のＦｃγＲＩＩＩａのシグナル配列のＮ末端メチオニンから１７６番目のアミノ酸をコードする遺伝子の塩基配列を解析する方法、まず該多型を含むゲノムの一部の領域のみをＰＣＲ法によって増幅し、増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を解析する方法などがあげられる。後者の方法は、具体的には、塩基配列解析の際、ＦｃγＲＩＩＩａのシグナル配列のＮ末端メチオニンから１７６番目のアミノ酸をコードするコドンの最初の塩基が、Ｔであればフェニルアラニン型のホモ型、Ｇであればバリン型のホモ型、ＴとＧの混合シグナルであればヘテロ型の対立遺伝子を患者が有すると判定することができる。
【０２４５】
また、塩基配列を解析する代わりに、ＰＣＲによって得られた増幅断片を、一方の多型をコードする遺伝子配列のみを認識する制限酵素で処理し、処理後の増幅断片の電気泳動像により多型を判断することもできる。具体的には、１７６番目のアミノ酸がフェニルアラニンである患者は制限酵素ＮｌａＩＩＩで切断されないのに対し、バリンである患者はＮｌａＩＩＩで切断されるため、該増幅断片がＮｌａＩＩＩによって切断、非切断あるいは両者の混合パターンのいずれに該当するかを判定することにより、患者がフェニルアラニン型のホモ型、バリンのホモ型あるいは両者のヘテロ型のいずれかを判別することができる。
【０２４６】
上記（ｂ）の方法としては、ＦｃγＲＩＩＩａのシグナル配列のＮ末端メチオニンから１７６番目のアミノ酸における多型を特異的に認識する抗体を用いて、患者のエフェクター細胞を染色し、フローサイトメトリー法や免疫組織染色等の免疫染色法を用いて判定する方法があげられる。患者のエフェクター細胞の採取法としては、外科的手法や体液からの採取などがあげられる。
【０２４７】
８．レクチン耐性細胞で製造された抗体医薬を用いて患者を治療する方法
本発明の医薬を用いて患者を治療する方法としては、治療薬として該医薬を単独で投与することも可能ではあるが、通常は該医薬を薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
【０２４８】
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができ、抗体製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
【０２４９】
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
【０２５０】
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。または、抗体組成物を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることによって粉末注射剤を調製することもできる。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。
また、噴霧剤は該抗体組成物そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該抗体組成物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該抗体組成物および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。
また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
【０２５１】
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、有効成分の量として、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。
【０２５２】
本発明の医薬を用いて患者を治療する方法としては、上記６に示した方法により本発明の医薬が有効である患者をあらかじめ選抜した後、以下に示す医薬を選抜された患者に投与する方法が好ましい。
特に、シグナル配列のＮ末端メチオニンから１７６番目のアミノ酸残基がフェニルアラニンを有するヒトＦｃγＲＩＩＩａを持つ患者を選抜し、該患者に対して本発明の医薬を投与することにより、高い治療効果を得ることができる。
【０２５３】
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【０２５４】
実施例１．抗ＧＤ３キメラ抗体の活性評価
１．抗ＧＤ３キメラ抗体のＧＤ３に対する結合活性（ＥＬＩＳＡ法）
参考例１の３項で得られた各種動物細胞で生産、精製した２種類の抗ＧＤ３キメラ抗体のＧＤ３に対する結合活性を参考例１の２項に記載のＥＨＳＡ法により測定した。
第１図は、添加する抗ＧＤ３キメラ抗体の濃度を変化させて結合活性を検討した結果である。第１図に示したように、２種類の抗ＧＤ３キメラ抗体は、ほぼ同等のＧＤ３に対する結合活性を示した。この結果は、抗体を生産する動物細胞の種類に依らず、抗体の抗原結合活性は、一定であることを示している。
【０２５５】
２．抗ＧＤ３キメラ抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）
参考例１の３項で得られた各種動物細胞で生産、精製した２種類の抗ＧＤ３キメラ抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害活性を評価するため、以下に示す方法に従い、ＡＤＣＣ活性を測定した。
（１）標的細胞溶液の調製
ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で培養したヒトメラノーマ細胞株Ｇ−３６１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４２４）の１×１０６細胞を調製し、放射性物質であるＮａ２ ５１ＣｒＯ４を３．７ＭＢｑ当量加えて３７℃で１時間反応させ、細胞を放射性物質標識した。反応後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で懸濁および遠心分離操作により３回洗浄し、培地に再懸濁し、４℃で３０分間氷中に放置して放射性物質を自然解離させた。遠心分離後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地を５ｍＬ加え、２×１０５細胞／ｍＬに調製し、標的細胞溶液とした。
【０２５６】
（２）ヒトエフェクター細胞溶液の調製
健常人静脈血５０ｍＬを採取し、ヘパリンナトリウム（清水製薬社製）０．５ｍＬを加え穏やかに混ぜた。これをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｎｙｃｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａ ＡＳ社製）を用いて使用説明書に従い、遠心分離して単核球層を分離した。ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で３回遠心分離して洗浄後、培地を用いて２×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁し、エフェクター細胞溶液とした。
【０２５７】
（３）ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに実施例１の２項（１）で調製した標的細胞溶液の５０μＬ（１×１０４細胞／ウェル）を分注した。次いで、実施例１の２項（２）で調製したヒトエフェクター細胞溶液を１００μＬ（２×１０５細胞／ウェル、エフェクター細胞と標的細胞の比は２０：１となる）添加した。さらに、各種抗ＧＤ３キメラ抗体を各種濃度で加え、３７℃で４時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清中の５１Ｃｒ量をγ−カウンターにて測定した。自然解離５１Ｃｒ量は、エフェクター細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて上記と同様の操作を行い、上清中の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。全解離５１Ｃｒ量は、抗体溶液の代わりに培地のみを、エフェクター細胞溶液の代わりに１ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液を添加し、上記と同様の操作を行い、上清中の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。ＡＤＣＣ活性は下式（１）により求めた。
【０２５８】
【式３】
Figure 0004832719
その結果を第２図に示した。第２図に示したように、ＹＢ２／０−ＧＤ３キメラ抗体は、ＣＨＯ−ＧＤ３キメラ抗体に比べ、１００倍以上高いＡＤＣＣ活性を示した。以上の結果は、α１，６−フコース／レクチン耐性細胞によって生産された抗体のＡＤＣＣ活性は、α１，６−フコース／レクチン不耐性細胞によって生産された抗体のＡＤＣＣ活性よりも大幅に高いことを示す。
【０２５９】
３．抗体分子に結合する糖鎖解析
続いてＷＯ００／６１７３９の実施例５の方法に基づき抗体組成物のＦｃ領域に結合する糖鎖分析を行った。その結果、各種抗体のＦｃ領域に結合する還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位が結合していない糖鎖含量は、ＹＢ２／０−ＧＤ３キメラ抗体が５３％、ＣＨＯ−ＧＤ３キメラ抗体は７％であった。以上の結果は、α１，６−フコース／レクチン耐性細胞によって生産された抗体の高いＡＤＣＣ活性は、抗体のＦｃ領域に結合する還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位が結合していない糖鎖含量が高いことに起因することを示す。
【０２６０】
実施例２．抗ＣＣＲ４キメラ抗体の活性評価
１．抗ＣＣＲ４キメラ抗体のＣＣＲ４部分ペプチドに対する結合活性（ＥＬＩＳＡ法）
参考例２の３項で得られた各種動物細胞で生産、精製した２種類の抗ＣＣＲ４キメラ抗体のＣＣＲ４部分ペプチドに対する結合活性を参考例２の２項に記載のＥＬＩＳＡ法により測定した。
第３図は、添加する抗ＣＣＲ４キメラ抗体の濃度を変化させて結合活性を検討した結果である。第３図に示したように、２種類の抗ＣＣＲ４キメラ抗体は、同等のＣＣＲ４部分ペプチドに対する結合活性を示した。この結果は、抗ＧＤ３キメラ抗体の場合と同様に、抗体を生産する動物細胞の種類に依らず、抗体の抗原結合活性は、一定であることを示している。
【０２６１】
２．抗ＣＣＲ４キメラ抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）
参考例２の３項で得られた各種動物細胞で生産、精製した２種類の抗ＣＣＲ４キメラ抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害活性を評価するため、以下に示す方法に従い、ＡＤＣＣ活性を測定した。
（１）標的細胞溶液の調製
ＷＯ０１／６４７５４に記載のヒトＣＣＲ４を高発現しているＣＣＲ４／ＥＬ−４細胞の１．５×１０６細胞を調製し、放射性物質であるＮａ２ ５１ＣｒＯ４を５．５５ＭＢｑ当量加えて３７℃で１．５時間反応させ、細胞を放射性物質標識した。反応後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で懸濁および遠心分離操作により３回洗浄し、培地に再懸濁し、４℃で３０分間氷中に放置して放射性物質を自然解離させた。遠心分離後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地を７．５ｍＬ加え、２×１０５細胞／ｍＬに調製し、標的細胞溶液とした。
【０２６２】
（２）ヒトエフェクター細胞溶液の調製
健常人末梢血６０ｍＬを採取し、ヘパリンナトリウム（清水製薬社製）を０．６ｍＬを加え穏やかに混ぜた。これをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＡＸＩＳ ＳＨＩＥＬＤ社製）を用いて使用説明書に従い、遠心分離（８００ｇ、２０分間）して単核球層を分離した。ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で３回遠心分離して洗浄後、培地を用いて５×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁し、エフェクター細胞溶液とした。
【０２６３】
（３）ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに実施例２の２項（１）で調製した標的細胞溶液の５０μＬ（１×１０４細胞／ウェル）を分注した。次いで、実施例２の２項（２）で調製したヒトエフェクター細胞溶液を１００μＬ（５×１０５細胞／ウェル、エフェクター細胞と標的細胞の比は５０：１となる）添加した。さらに、各種抗ＣＣＲ４キメラ抗体を各種濃度で加え、３７℃で４時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清中の５１Ｃｒ量をγ−カウンターにて測定した。自然解離５１Ｃｒ量は、エフェクター細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて上記と同様の操作を行い、上清中の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。全解離５１Ｃｒ量は、抗体溶液とヒトエフェクター細胞溶液の代わりに１ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液を添加し、上記と同様の操作を行い、上清中の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。ＡＤＣＣ活性は前記式（１）により求めた。
【０２６４】
その結果を第４図に示した。第４図に示したように、ＫＭ３０６０は、測定抗体濃度の最も高値である１０μｇ／ｍＬにおいても約３０％の細胞障害活性しか認められなかった。一方、ＫＭ２７６０−１においては、その細胞障害活性は、抗体濃度が０．０１μｇ／ｍＬ以上で約８０％と高値でほぼ一定となり、また、ＫＭ３０６０と同等の約３０％の細胞障害活性を与える抗体濃度は、約０．０００３μｇ／ｍＬであり、その濃度差は、３×１０４倍以上であった。以上の結果は、抗ＧＤ３キメラ抗体の結果と同様であり、ＹＢ２／０細胞由来抗体は、高いＡＤＣＣ活性を示した。以上の結果は、α１，６−フコース／レクチン耐性細胞によって生産された抗体のＡＤＣＣ活性は、α１，６−フコース／レクチン不耐性細胞によって生産された抗体のＡＤＣＣ活性よりも大幅に高いことを示す。
【０２６５】
３．抗体分子に結合する糖鎖解析
ＷＯ００／６１７３９の実施例５の方法に基づき抗体組成物のＦｃ領域に結合する糖鎖分析を行った。その結果、各種抗体のＦｃ領域に結合する還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位が結合していない糖鎖含量は、ＹＢ２／０由来抗体が８７％、ＣＨＯ由来抗体は８％であった。以上の結果は、α１，６−フコース／レクチン耐性細胞によって生産された抗体の高いＡＤＣＣ活性は、抗体のＦｃ領域に結合する還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位が結合していない糖鎖含量が高いことに起因することを示す。
【０２６６】
実施例３．抗ＣＤ２０キメラ抗体の活性評価
（１）．抗ＣＤ２０キメラ抗体のＣＤ２０発現細胞に対する結合活性（蛍光抗体法）
参考例４の３項で得られた精製ＣＤ２０キメラ抗体の結合活性をフローサイトメトリーを用いた蛍光抗体法によって評価した。ＣＤ２０陽性細胞であるヒトリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ細胞（ＪＣＲＢ９０１２）を２×１０５個ずつ、９６ウェルＵ字プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）に分注した。抗ＣＤ２０キメラ抗体をＦＡＣＳ用緩衝液（１％ＢＳＡ−ＰＢＳ、０．０２％ＥＤＴＡ、０．０５％ＮａＮ３）にて希釈した抗体溶液（濃度０．０３９〜４０μｇ／ｍＬ）を５０μＬ／ウェルとして加え、氷中で３０分間反応させた。ＦＡＣＳ用緩衝液にて２００μＬ／ウェルで２回洗浄後、ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（コールター社製）をＦＡＣＳ用緩衝液を用いて１００倍希釈したものを５０μＬ／ウェル加えた。遮光し氷中で３０分間反応させた後、２００μＬ／ウェルで３回洗浄し、最終的に５００μＬに懸濁して、フローサイトメーターで蛍光強度を測定した。その結果を第５図に示した。ＫＭ３０６５、ＲｉｔｕｘａｎＴＭともに抗体濃度依存的に蛍光強度の増加が認められ、ほぼ同等の結合活性を示すことが確認された。
【０２６７】
（２）．抗ＣＤ２０キメラ抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）
参考例４の３項で得られた精製抗ＣＤ２０キメラ抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性を評価するため、以下に示す方法に従い、ＡＤＣＣ活性を測定した。
（ａ）標的細胞溶液の調製
ＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地（ＦＣＳを１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製））で培養したヒトＢリンパ球培養細胞株ＷＩＬ２−Ｓ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ８８８５）あるいはＲａｍｏｓ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５９６）、Ｒａｊｉ細胞（ＪＣＲＢ９０１２）を遠心分離操作および懸濁によりＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（５）培地（ＦＣＳを５％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製））で洗浄した後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（５）培地によって、２×１０５細胞／ｍＬに調製し、標的細胞溶液とした。
【０２６８】
（ｂ）エフェクター細胞溶液の調製
健常人静脈血５０ｍＬを採取し、ヘパリンナトリウム（清水製薬社製）０．５ｍＬを加え穏やかに混ぜた。これをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＡＸＩＳ ＳＨＩＥＬＤ社製）を用いて使用説明書に従い、遠心分離（８００ｇ、２０分間）して単核球層を分離した。ＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（５）培地で３回遠心分離して洗浄後、同培地を用いて４×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁し、エフェクター細胞溶液とした。
【０２６９】
（ｃ）ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに上記（ａ）で調製した標的細胞溶液の５０μＬ（１×１０４細胞／ウェル）を分注した。次いで（ｂ）で調製したエフェクター細胞溶液を５０μＬ（２×１０５細胞／ウェル、エフェクター細胞と標的細胞の比は２０：１となる）添加した。更に、各種抗ＣＤ２０キメラ抗体を各最終濃度０．３〜３０００ｎｇ／ｍＬとなるように加えて全量を１５０μＬとし、３７℃で４時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を、ＣｙｔｏＴｏｘ９６ Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、添付の説明書にしたがって吸光度データを取得することで測定した。標的細胞自然遊離の吸光度データは、エフェクター細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて、また、エフェクター細胞自然遊離の吸光度データは、標的細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて、上記と同様の操作を行うことで取得した。標的細胞全遊離の吸光度データは、抗体溶液、エフェクター細胞溶液の代わりに培地を用い、反応終了４５分前に１５μＬの９％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液を添加し、上記と同様の操作を行い、上清のＬＤＨ活性を測定することにより求めた。ＡＤＣＣ活性は次式により求めた。
【０２７０】
【式４】
Figure 0004832719
【０２７１】
第６図には３種類の細胞株を標的とした結果を示した。第６Ａ図はＲａｊｉ細胞（ＪＣＲＢ９０１２）を、第６Ｂ図はＲａｍｏｓ細胞を（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５９６）、第６Ｃ図はＷＩＬ２−Ｓ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ８８８５）を標的とした結果である。第６図に示したように、ＫＭ３０６５はいずれの抗体濃度においてもＲｉｔｕｘａｎＴＭよりも高いＡＤＣＣ活性を示し、最高細胞傷害活性値も高かった。以上の結果は、α１，６−フコース／レクチン耐性細胞によって生産された抗体のＡＤＣＣ活性は、α１，６−フコース／レクチン不耐性細胞によって生産された抗体のＡＤＣＣ活性よりも大幅に高いことを示す。
【０２７２】
５．抗体分子に結合する糖鎖解析
ＷＯ００／６１７３９の実施例５の方法に基づき抗体組成物のＦｃ領域に結合する糖鎖分析を行った。その結果、各種抗体のＦｃ領域に結合する還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位が結合していない糖鎖含量は、ＫＭ３０６５が９６％、ＣＨＯ−ＧＤ３キメラ抗体は６％であった。以上の結果は、α１，６−フコース／レクチン耐性細胞によって生産された抗体の高いＡＤＣＣ活性は、抗体のＦｃ領域に結合する還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位が結合していない糖鎖含量が高いことに起因することを示す。
【０２７３】
実施例４．各種キメラ抗体のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）に対する結合活性の評価（ＥＬＩＳＡ法）
ヒトＦｃγＲＩＩＩａに存在する、Ｎ末端メチオニンから１７６番目のアミノ酸の多型が、α１，６フコース／レクチン耐性細胞で生産された抗体とヒトＦｃγＲＩＩＩａとの結合性に与える影響を、ＥＬＩＳＡ法にて検証した。
１．抗ＧＤ３キメラ抗体の結合活性の評価
参考例１の３項に記載の２種類の抗ＧＤ３キメラ抗体であるＹＢ２／０−ＧＤ３キメラ抗体とＣＨＯ−ＧＤ３キメラ抗体の、参考例６の４項記載のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）に対する結合活性を以下のようにしてＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。
参考例１の２項に記載の方法に従い、９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に、２００ｐｍｏｌ／ウェルでＧＤ３を固定化した。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、各種抗ＧＤ３キメラ抗体の１％ＢＳＡ−ＰＢＳによる希釈溶液を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２．３μｇ／ｍＬに希釈したｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）溶液を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、Ｈｉｓ−ｔａｇに対するマウス抗体Ｔｅｔｒａ・Ｈｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を１％ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて１μｇ／ｍＬに調製した溶液を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ１抗体溶液（ＺＹＭＥＤ社製）を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、１０分後に５％ＳＤＳ溶液を５０μＬ／ウェルで加えて反応を停止させた。その後、ＯＤ４１５を測定した。また、同様にして作製した別のプレートに各種抗ＧＤ３キメラ抗体を添加し、参考例１の２項に記載のＥＬＩＳＡ法を行うことにより、プレートに結合した各種抗ＧＤ３キメラ抗体量に差がないことを確認した。
【０２７４】
第７図には、各種抗ＧＤ３キメラ抗体のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）に対する結合活性を測定した結果を示した。第７図に示したように、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）は、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）よりも高いキメラ抗体に対する結合活性を示した。そして、ＹＢ２／０−ＧＤ３キメラ抗体は、どちらの型のｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対してもＣＨＯ−ＧＤ３キメラ抗体よりも２０−３０倍以上高い結合活性を示し、さらに、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）との結合活性は、ＣＨＯ−ＧＤ３キメラ抗体のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）との結合活性と比べても、５倍以上高かった。また、ＣＨＯ−ＧＤ３キメラ抗体はｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）とはほとんど結合活性を示さなかった。以上の結果は、α１，６−フコース／レクチン不耐性細胞によって生産された抗体は、Ｎ末端から１７６番目のアミノ酸がバリンである多型を有するＦｃγＲＩＩＩａにのみ結合するが、α１，６−フコース／レクチン耐性細胞によって生産された抗体は、いずれの多型を有するＦｃγＲＩＩＩａに対しても高い結合活性を有することを示す。すなわちこれらの結果は、α１，６−フコース／レクチン耐性細胞によって生産された抗体は、いずれのＦｃγＲＩＩＩａの多型を有する患者に対しても、α１，６−フコース／レクチン不耐性細胞によって生産された抗体よりも高い治療効果を発揮するが、特にＦｃγＲＩＩＩａのＮ末端から１７６番目のアミノ酸がフェニルアラニンである多型を有する患者に対して治療効果の面で優位性があることを示す。
【０２７５】
２．抗ＣＣＲ４キメラ抗体の結合活性の評価
参考例２の３項に記載の２種類の抗ＣＣＲ４キメラ抗体であるＫＭ２７６０−１とＫＭ３０６０のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）に対する結合活性を以下のようにしてＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。
参考例２の２項に記載の方法に従い、９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に、１．０μｇ／ｍＬでヒトＣＣＲ４細胞外領域ペプチドコンジュゲートを固定化した。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、各種抗ＣＣＲ４キメラ抗体の１％ＢＳＡ−ＰＢＳによる希釈溶液を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２．３μｇ／ｍＬに希釈したｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）溶液を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、Ｈｉｓ−ｔａｇに対するマウス抗体Ｔｅｔｒａ・Ｈｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を１％ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて１μｇ／ｍＬに調製した溶液を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ１抗体溶液（ＺＹＭＥＤ社製）を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、１０分後に５％ＳＤＳ溶液を５０μＬ／ウェルで加えて反応を停止させた。その後、ＯＤ４１５を測定した。また、同様にして作製した別のプレートに各種抗ＣＣＲ４キメラ抗体を添加し、参考例２の２項に記載のＥＬＩＳＡ法を行うことにより、プレートに結合した各種抗ＣＣＲ４キメラ抗体量に差がないことを確認した。
【０２７６】
第８図には、各種抗ＣＣＲ４キメラ抗体のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）に対する結合活性を測定した結果を示した。第８図に示したように、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）は、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）よりも高いキメラ抗体に対する結合活性を示した。そして、ＫＭ２７６０−１は、どちらの型のｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対してもＫＭ３０６０よりも３０−５０倍以上高い結合活性を示し、さらに、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）との結合活性は、ＫＭ３０６０のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）との結合活性と比べても、１０倍以上高かった。また、ＫＭ３０６０はｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）とはほとんど結合活性を示さなかった。以上の結果は、α１，６−フコース／レクチン不耐性細胞によって生産された抗体は、Ｎ末端から１７６番目のアミノ酸がバリンである多型を有するＦｃγＲＩＩＩａにのみ結合するが、α１，６−フコース／レクチン耐性細胞によって生産された抗体は、いずれの多型を有するＦｃγＲＩＩＩａに対しても高い結合活性を有することを示す。すなわちこれらの結果は、α１，６−フコース／レクチン耐性細胞によって生産された抗体は、いずれのＦｃγＲＩＩＩａの多型を有する患者に対しても、α１，６−フコース／レクチン不耐性細胞によって生産された抗体よりも高い治療効果を発揮するが、特にＦｃγＲＩＩＩａのＮ末端から１７６番目のアミノ酸がフェニルアラニンである多型を有する患者に対して治療効果の面で優位性があることを示す。
【０２７７】
３．抗ＦＧＦ−８キメラ抗体の結合活性の評価
参考例３の３項に記載の２種類の抗ＦＧＦ−８キメラ抗体であるＹＢ２／０−ＦＧＦ８キメラ抗体とＣＨＯ−ＦＧＦ８キメラ抗体のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）に対する結合活性を以下のようにしてＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。
参考例３の２項に記載の方法に従い、９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に、１．０μｇ／ｍＬでヒトＦＧＦ−８ペプチドコンジュゲートを固定化した。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、各種抗ＦＧＦ−８キメラ抗体の１％ＢＳＡ−ＰＢＳによる希釈溶液を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２．３μｇ／ｍＬに希釈したｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）溶液を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、Ｈｉｓ−ｔａｇに対するマウス抗体Ｔｅｔｒａ・Ｈｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を１％ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて１μｇ／ｍＬに調製した溶液を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ１抗体溶液（ＺＹＭＥＤ社製）を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、１０分後に５％ＳＤＳ溶液を５０μＬ／ウェルで加えて反応を停止させた。その後、ＯＤ４１５を測定した。また、同様にして作製した別のプレートに各種抗ＦＧＦ−８キメラ抗体を添加し、参考例３の２項に記載のＥＬＩＳＡ法を行うことにより、プレートに結合した各種抗ＦＧＦ−８キメラ抗体量に差がないことを確認した。
【０２７８】
第９図には、各種抗ＦＧＦ−８キメラ抗体のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）に対する結合活性を測定した結果を示した。第９図に示したように、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）は、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）よりも高いキメラ抗体に対する結合活性を示した。そして、ＹＢ２／０−ＦＧＦ８キメラ抗体は、どちらの型のｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対してもＣＨＯ−ＦＧＦ８キメラ抗体よりも２５−３０倍以上高い結合活性を示し、さらに、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）との結合活性は、ＣＨＯ−ＦＧＦ８キメラ抗体のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）との結合活性と比べても、１０倍以上高かった。また、ＣＨＯ−ＦＧＦ８キメラ抗体はｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）とはほとんど結合活性を示さなかった。以上の結果は、α１，６−フコース／レクチン不耐性細胞によって生産された抗体は、Ｎ末端から１７６番目のアミノ酸がバリンである多型を有するＦｃγＲＩＩＩａにのみ結合するが、α１，６−フコース／レクチン耐性細胞によって生産された抗体は、いずれの多型を有するＦｃγＲＩＩＩａに対しても高い結合活性を有することを示す。すなわちこれらの結果は、α１，６−フコース／レクチン耐性細胞によって生産された抗体は、いずれのＦｃγＲＩＩＩａの多型を有する患者に対しても、α１，６−フコース／レクチン不耐性細胞によって生産された抗体よりも高い治療効果を発揮するが、特にＦｃγＲＩＩＩａのＮ末端から１７６番目のアミノ酸がフェニルアラニンである多型を有する患者に対して治療効果の面で優位性があることを示す。
【０２７９】
４．抗ＣＤ２０キメラ抗体の結合活性の評価
参考例４の３項に記載の２種類の抗ＣＤ２０キメラ抗体ＫＭ３０６５とＲｉｔｕｘａｎＴＭのＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性を以下の様にしてＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。
９６穴のＥＬＩＳＡ用プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に、Ｈｉｓ−ｔａｇに対するマウス抗体Ｔｅｔｒａ・Ｈｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を５μｇ／ｍＬ、５０μｌ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈した実施例７の４項に記載のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）溶液を５０μＬ／ウェルで加え、室温で２時間反応させた。反応後、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄し、各種抗ＣＤ２０キメラ抗体の１％ＢＳＡ−ＰＢＳによる希釈溶液を５０μＬ／ウェルで加え、室温で２時間反応させた。反応後、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで６０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）抗体溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ社製）をそれぞれ５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素を１μｌ／ｍＬで添加した溶液］を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、１０分後に５％ＳＤＳ溶液を５０μＬ／ウェル加えて反応を停止した。その後４１５ｎｍの吸光度を測定した。また、Ｈｉｓ−ｔａｇに対するマウス抗体の代わりにヒトＩｇＧに対するヤギ抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ社製）をコートしたＥＬＩＳＡ用プレートに上記で用いた抗体希釈溶液を添加し、同様にペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）抗体溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ社製）で検出することにより、用いた抗体希釈液中の抗ＣＤ２０キメラ抗体量に差がないことを確認した。
【０２８０】
第１０図には、各種抗ＣＤ２０キメラ抗体のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）および（Ｖ）に対する結合活性を測定した結果を示した。第１０図に示したように、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）は、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）よりも高いキメラ抗体に対する結合活性を示した。そして、ＫＭ３０６５はどちらの型のｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対してもＲｉｔｕｘａｎＴＭよりも５０−７３倍程度高い結合活性を示し、さらに、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）との結合活性は、ＲｉｔｕｘａｎＴＭのｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）との結合活性と比べても数倍高かった。また、ＲｉｔｕｘａｎＴＭはｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）とはほとんど結合活性を示さなかった。以上の結果は、α１，６−フコース／レクチン不耐性細胞によって生産された抗体は、Ｎ末端から１７６番目のアミノ酸がバリンである多型を有するＦｃγＲＩＩＩａにのみ結合するが、α１，６−フコース／レクチン耐性細胞によって生産された抗体は、いずれの多型を有するＦｃγＲＩＩＩａに対しても高い結合活性を有することを示す。すなわちこれらの結果は、α１，６−フコース／レクチン耐性細胞によって生産された抗体は、いずれのＦｃγＲＩＩＩａの多型を有する患者に対しても、α１，６−フコース／レクチン不耐性細胞によって生産された抗体よりも高い治療効果を発揮するが、特にＦｃγＲＩＩＩａのＮ末端から１７６番目のアミノ酸がフェニルアラニンである多型を有する患者に対して治療効果の面で優位性があることを示す。
【０２８１】
５．レクチン耐性ＣＨＯ細胞により産生された各種抗ＣＣＲ４キメラ抗体の結合活性の評価
参考例２の３項（２）に記載のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞によって生産された抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ３０６０と、参考例５の２項に記載のＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株生産抗体の、参考例６の４項に記載のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）に対する結合活性を上記２項に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。
【０２８２】
第１１図には、各種抗ＣＣＲ４キメラ抗体のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）に対する結合活性を測定した結果を示した。第１７図に示したように、ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株生産抗体はｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）に対して高い結合活性を示したのに対し、ＫＭ３０６０はｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）のみに高い結合性を示し、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）に対してはほとんど結合活性を示さなかった。以上の結果は、本発明のＬＣＡレクチン耐性ＣＨＯ細胞が生産するキメラ抗体は、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａの多型に依らず、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）だけでなく、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）に対しても、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞が生産するキメラ抗体よりも高い結合活性を有していることを示すものである。すなわち、ＬＣＡレクチンに耐性を有するＣＨＯ細胞によって生産された抗体は、いずれのＦｃγＲＩＩＩａの多型を有する患者に対しても、ＬＣＡレクチンに耐性を有さないＣＨＯ細胞によって生産された抗体よりも高い治療効果を発揮するが、特にＦｃγＲＩＩＩａのＮ末端から１７６番目のアミノ酸がフェニルアラニンである多型を有する患者に対して治療効果の面で優位性があることを示す。
【０２８３】
６．レクチン耐性ＣＨＯ細胞により産生された各種抗ＧＤ３キメラ抗体の結合活性の評価
参考例１の１項（２）に記載のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞によって生産されたＣＨＯ−ＧＤ３キメラ抗体、参考例５の３項に記載のＣＨＯ／ＧＤ３−ＬＣＡ−１株生産抗体、およびＣＨＯ／ＧＤ３−ＬＣＡ−２株生産抗体の、参考例６の４項に記載のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）に対する結合活性を実施例４の１項に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。
【０２８４】
第１２図には、各種抗ＧＤ３キメラ抗体のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）に対する結合活性を測定した結果を示した。第１２図に示したように、ＣＨＯ／ＧＤ３−ＬＣＡ−１株生産抗体、およびＣＨＯ／ＧＤ３−ＬＣＡ−２株生産抗体はいずれもｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）に対して高い結合活性を示したが、ＫＭ３０６０はｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）のみに高い結合性を示し、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）に対してはほとんど結合活性を示さなかった。以上の結果は、本発明のＬＣＡ耐性ＣＨＯ細胞が生産するキメラ抗体は、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａの多型に依らず、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）だけでなく、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）に対しても、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞が生産するキメラ抗体よりも高い結合活性を有していることを示すものである。すなわち、ＬＣＡレクチンに耐性を有するＣＨＯ細胞によって生産された抗体は、いずれのＦｃγＲＩＩＩａの多型を有する患者に対しても、ＬＣＡレクチンに耐性を有さないＣＨＯ細胞によって生産された抗体よりも高い治療効果を発揮する。特に、ＦｃγＲＩＩＩａのＮ末端から１７６番目のアミノ酸がフェニルアラニンである多型を有する患者に対して治療効果の面で優位性があることを示す。
【０２８５】
実施例５．各種キメラ抗体のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）に対する結合活性の評価（バイオセンサー法）
ヒトＦｃγＲＩＩＩａに存在する、Ｎ末端メチオニンから１７６番目のアミノ酸の多型が、α１，６フコース／レクチン耐性細胞で生産された抗体とヒトＦｃγＲＩＩＩａとの結合性に与える影響を、バイオセンサー法にて検証した。
１．抗ＣＣＲ４キメラ抗体および抗ＦＧＦ−８キメラ抗体の結合活性の評価
参考例２の３項に記載の２種類の抗ＣＣＲ４キメラ抗体であるＫＭ２７６０−１およびＫＭ３０６０、参考例３の３項に記載の２種類の抗ＦＧＦ−８キメラ抗体であるＹＢ２／０−ＦＧＦ８キメラ抗体およびＣＨＯ−ＦＧＦ８キメラ抗体の、参考例６の４項に記載のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）に対する結合活性をＢＩＡｃｏｒｅ２０００（ＢＩＡＣＯＲＥ社製）を用いて以下のようにして測定し、比較した。
【０２８６】
以下、サンプルの希釈および測定中の緩衝液としてはＨＢＳ−ＥＰ（ＢＩＡＣＯＲＥ社製）を使用した。まず、センサーチップＳＡ（ＢＩＡＣＯＲＥ社製）をセットし、１０μＬ／分の流速で０．５μｇ／ｍＬに調製したビオチン化抗原ペプチドを１０μＬ添加した。その後、５μＬの１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ−塩酸溶液（ｐＨ２．０）を添加し、チップ表面を洗浄した。このようにしてフローセル（以下、ＦＣと表記する）１には、ビオチン化化合物１（ヒトＣＣＲ４細胞外領域ペプチド）を４２１．９ＲＵ、ＦＣ２には、ビオチン化化合物２（ヒトＦＧＦ−８ペプチド）を３４９．９ＲＵ固定化した。
５μＬ／分の流速で、ＦＣ１およびＦＣ２に各種キメラ抗体の１０μｇ／ｍＬの溶液を２０μＬ添加し、抗体を結合させた。９０秒後、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）の希釈溶液を１５μＬ添加し、その後、３分間に渡り解離反応をモニターした。解離反応後、５μＬの１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ−塩酸溶液（ｐＨ２．０）を添加し、チップ表面を再生させた。このサイクルを各種濃度（２２．３−７１４．３ｎＭ）のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）溶液について行い、各種濃度におけるセンサーグラムを得た。代表的なセンサーグラム第１３図に示した。各々のキメラ抗体のセンサーグラムは、非特異的抗原ペプチドを固定化したＦＣに対して得られたセンサーグラムを差し引くことにより特異的な反応のセンサーグラムとした。
【０２８７】
第１４図に抗ＣＣＲ４キメラ抗体のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）に対する結合のセンサーグラムを、第１５図に抗ＦＧＦ−８キメラ抗体のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）に対する結合のセンサーグラムを示した。得られた各種濃度におけるセンサーグラムを用いて、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００に付属の解析ソフトウェアであるＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ３．０を用いて非線型解析［ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ），２００，１２１（１９９７）］を行うことにより、第１表に示す抗ＣＣＲ４キメラ抗体のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）に対する結合の結合速度定数（以下、Ｋａと表記する）、解離速度定数（以下、Ｋｄと表記する）、結合定数（以下、ＫＡと表記する）を、第２表に示す抗ＦＧＦ−８キメラ抗体のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）に対する結合のＫａ、Ｋｄ、ＫＡを算出した。ただし、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来のキメラ抗体（ＫＭ３０６０とＣＨＯ−ＦＧＦ８キメラ抗体）とｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）の結合については、解離が極めて速く、上記の解析が困難であったため、結合の平衡値とｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）の濃度からＫＡを算出した［プロテイン−プロテイン・インタラクションズ（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００２］。
【０２８８】
【表１】
Figure 0004832719
【０２８９】
【表２】
Figure 0004832719
【０２９０】
その結果、抗ＣＣＲ４キメラ抗体と抗ＦＧＦ−８キメラ抗体の結果は、ほぼ一致し、ＥＬＩＳＡ法による解析と同様に、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）は、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）よりもキメラ抗体に対し、高い結合活性を示し、ＫＡで２−７倍高かった。そして、ＹＢ２／０細胞が生産するキメラ抗体は、どちらの型のｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対してもＣＨＯ／ＤＧ４４細胞が生産するキメラ抗体よりも９−２７倍以上高い結合活性を示し、さらに、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）との結合活性は、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞が生産するキメラ抗体のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）との結合活性と比べても、４倍以上高かった。以上の結果は、ＹＢ２／０細胞が生産するキメラ抗体は、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａの多型に依らず、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞が生産するキメラ抗体よりも高いｈＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性を有していることを示すものである。
【０２９１】
すなわち、α１，６−フコース／レクチン耐性細胞によって生産された抗体は、いずれのＦｃγＲＩＩＩａの多型を有する患者に対しても、α１，６−フコース／レクチン不耐性細胞によって生産された抗体よりも高い治療効果を発揮する。特に、ＦｃγＲＩＩＩａのＮ末端から１７６番目のアミノ酸がフェニルアラニンである多型を有する患者に対して治療効果の面で優位性があることを示す。
【０２９２】
２．抗ＣＤ２０キメラ抗体の結合活性の評価
参考例４の３項に記載の２種類の抗ＣＤ２０キメラ抗体であるＫＭ３０６５およびＲｉｔｕｘａｎＴＭの、参考例６の４項に記載のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）に対する結合活性をＢＩＡｃｏｒｅ２０００（ＢＩＡＣＯＲＥ社製）を用いて以下の様にして測定し、比較した。
まず、センサーチップＣＭ５（ＢＩＡＣＯＲＥ社製）をセットし、１０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．０）で１０μｇ／ｍＬに希釈したＨｉｓ−ｔａｇに対するマウス抗体Ｔｅｔｒａ・Ｈｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を４５９６．６ＲＵ固定化した。以下、サンプルの希釈および測定中の緩衝液としてはＨＢＳ−ＥＰ（ＢＩＡＣＯＲＥ社製）を使用した。５μＬ／分の流速で、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）を５μｇ／ｍＬに希釈した溶液を２０μＬ添加し、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａを結合させた。６０秒後、抗ＣＤ２０キメラ抗体およびＲｉｔｕｘａｎＴＭの希釈溶液を１５μＬ添加し、その後、４分間に渡り解離反応をモニターした。解離反応後、５μＬの７．５ｍＭ塩酸溶液を添加し、チップ表面を再生させた。このサイクルを各種抗体濃度（２０〜０．６２５μｇ／ｍＬ）の抗ＣＤ２０キメラ抗体について行い、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）への結合のセンサーグラムを得た。各々の抗ＣＤ２０キメラ抗体のセンサーグラムは、抗体の代わりに緩衝液のみ添加して得られたセンサーグラムを差し引くことにより得た。第１６図に抗ＣＤ２０キメラ抗体のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）に対する結合のセンサーグラムを示した。得られた各種濃度におけるセンサーグラムを用いて、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００に付属の解析ソフトウェアであるＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ３．０を用いて非線型解析を行うことにより、第３表に示す抗ＣＤ２０キメラ抗体のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）に対するＫａ、Ｋｄ、ＫＡを算出した。但し、ＲｉｔｕｘａｎＴＭとｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）の結合については、解離が極めて速く、上記の解析が困難であったため、結合の平衡値とｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）の濃度からＫＡを算出した。
【０２９３】
【表３】
Figure 0004832719
【０２９４】
その結果、ＥＬＩＳＡ法による解析と同様に、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）はｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）よりもキメラ抗体に対して高い結合活性を示し、ＫＡで約２〜３倍高かった。そして、ＹＢ２／０細胞が生産するＫＭ３０６５は、どちらの型のｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対してもＲｉｔｕｘａｎＴＭよりも高い結合活性を示し、さらに、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）への結合活性はＲｉｔｕｘａｎのｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）との結合活性と比べても、３倍以上高かった。以上の結果は、ＹＢ２／０細胞が産生するキメラ抗体はｓｈＦｃγＲＩＩＩａの多型に依らず、ＣＨＯ細胞が生産するキメラ抗体よりも高いｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性を有していることを示すものである。すなわち、α１，６−フコース／レクチン耐性細胞によって生産された抗体は、いずれのＦｃγＲＩＩＩａの多型を有する患者に対しても、α１，６−フコース／レクチン不耐性細胞によって生産された抗体よりも高い治療効果を発揮するが、特にＦｃγＲＩＩＩａのＮ末端から１７６番目のアミノ酸がフェニルアラニンである多型を有する患者に対して治療効果の面で優位性があることを示す。
実施例６．ＦｃγＲＩＩＩａの多型とＡＤＣＣ活性の相関の解析
ヒトＦｃγＲＩＩＩａに存在する、配列番号１１あるいは１３のＮ末端メチオニンから１７６番目のアミノ酸の多型（以下１７６番目のアミノ酸の多型と表記する）と、α１，６フコース／レクチン耐性細胞で生産された抗体のＡＤＣＣ活性の関係を解析した。
【０２９５】
１．ヒト末梢血中に含まれるＦｃγＲＩＩＩａ遺伝子の多型解析
（１）ヒト血液からのゲノムＤＮＡの抽出
ランダムに選抜した健常人ドナー２０名の末梢血を３０ｍＬずつ採取し、ヘパリンナトリウム（清水製薬社製）０．３ｍＬずつを加え穏やかに混ぜた。うち２ｍＬずつより、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（キアジェン社製）を用いて各ボランティアのゲノムＤＮＡを抽出した。残りの２８ｍＬは実施例６の３項で行ったＡＤＣＣ活性の測定に用いた。
【０２９６】
（２）ＦｃγＲＩＩＩａ遺伝子の多型解析
解析は公知の方法［ブラッド（Ｂｌｏｏｄ），９０，１１０９（１９９７）］に従い行った。以下に上記実施例６の１項（１）で各ドナーより取得したゲノムＤＮＡを用いて行った方法を示す。
ａ．アレル特異的ＰＣＲによるＦｃγＲＩＩＩａ遺伝子の特異的増幅
ゲノムＤＮＡ５ｎｇを用いて、５００ｎＭ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号２８、２９、ジェンセット社に委託）、２００μＭ各ｄＮＴＰ（宝酒造社製）、２．５Ｕ Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（プロメガ社製）、１ｘＴａｑＢｕｆｆｅｒ（プロメガ社製）よりなる、５０μｌの反応液でホットスタート法によるＰＣＲを行った。使用した機種はＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（アプライド・バイオシステムズ社製）、９５℃１０分間変性した後、９５℃１分間、５６℃１分３０秒間、７２℃１分３０秒間のサイクルを３５回行い、７２℃で８分間保温した。増幅断片が目的のサイズ（約１．７ｋｂｐ）であることを１．５％アガロースゲル電気泳動により確認した。
【０２９７】
ｂ．配列決定
ＦｃγＲＩＩＩａの１７６番目のアミノ酸の多型解析を、上記ａ．で得られた増幅断片を鋳型として用いた塩基配列解析にて行った。配列決定のＰＣＲ反応液（２０μｌ）の組成は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアジェン社製）で精製したＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ７μｌ、１．５μＭ ｐｒｉｍｅｒ（ジェンセット、配列は下記参照）、５倍希釈ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ（アプライド・バイオシステムズ社製、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒキット）である。使用した機種はＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（アプライド・バイオシステムズ社製）。９４℃５分間変性した後、９６℃１０秒間、５０℃５秒間、６０℃４分間のサイクルを２５回行った。反応後、ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔの精製にはＤｙｅ Ｅｘ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ（キアジェン社製）を用いた。解析はＡＢＩ３７７シークエンサー（アプライド・バイオシステムズ社製）を用いて行い、ＦｃγＲＩＩＩａの１７６番目のアミノ酸の多型の判定は、シークエンサーの波形より判定した。解析例を第１７図に示す。１７６番目のアミノ酸をコードする遺伝子型が、フェニルアラニンのホモ型（以下Ｐｈｅ／Ｐｈｅ型と表記）のドナーのサンプルは、１７６番目のアミノ酸をコードするコドンの最初の塩基がＴのシグナルを、フェニルアラニンとバリンのヘテロ型（以下Ｐｈｅ／Ｖａｌ型と表記）のドナーのサンプルは１７６番目のアミノ酸をコードするコドンの最初の塩基がＴとＧの混合シグナル（シークエンサーの解析結果はＮ）を、バリンのホモ型（以下Ｖａｌ／Ｖａｌ型と表記）のドナーのサンプルは、１７６番目のアミノ酸をコードするコドンの最初の塩基がＧのシグナルをそれぞれ示す。２０人のドナー全てについて多型解析を行った結果、Ｐｈｅ／Ｐｈｅ型が１５人、Ｐｈｅ／Ｖａｌ型が４人、Ｖａｌ／Ｖａｌ型が１人であった。
【０２９８】
２．末梢血単核球中のＮＫ細胞比率の測定（蛍光抗体法）
２０人のドナー由来の末梢血単核球中に含まれるＮＫ細胞の存在比率を、蛍光抗体法により測定した。実施例６の１項（１）で得られた末梢血単核球の４×１０５細胞をＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体／ＰＥ標識抗ＣＤ５６抗体の混合溶液（Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）、もしくは陰性対照としてＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１／ＰＥ標識マウスＩｇＧ１の混合溶液（Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用いて、・BR>燒セ書に従い染色した後にフローサイトメーターＥＰＩＣＳ ＸＬ−ＭＣＬ（Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）で解析した。ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体／ＰＥ標識抗ＣＤ５６抗体で染色したヒストグラム中、全細胞中のＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞画分に含まれる細胞の比率をＮＫ細胞比率とみなした。その結果、ＮＫ細胞比率にはドナー間でばらつきが見られたが、ＮＫ細胞比率とＦｃγＲＩＩＩａの１７６番目のアミノ酸の多型の間に明確な相関は見られなかった。
【０２９９】
【表４】
Figure 0004832719
【０３００】
３．抗ＣＤ２０抗体および抗ＧＤ３抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）
ＦｃγＲＩＩＩａの１７６番目のアミノ酸の多型が判別済みの末梢血単核球をエフェクター細胞として用いたＡＤＣＣ活性を測定することにより、多型とＡＤＣＣ活性の関係を解析した。以下に方法を示す。抗体は参考例４の３項に記載の抗ＣＤ２０キメラ抗体ＫＭ３０６５（α−１，６−フコースが結合しない糖鎖含量は９６％）、抗ＣＤ２０キメラ抗体ＲｉｔｕｘａｎＴＭ（α−１，６−フコースが結合しない糖鎖含量は６％）、参考例１の３項（１）に記載の抗ＧＤ３キメラ抗体ＹＢ２／０−ＧＤ３キメラ抗体（α−１，６−フコースが結合しない糖鎖含量は５３％）、参考例１の３項（２）に記載の抗ＧＤ３キメラ抗体ＣＨＯ−ＧＤ３キメラ抗体（α−１，６−フコースが結合しない糖鎖含量は７％）を用いた。
【０３０１】
（１）標的細胞溶液の調製
ＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地（ＦＣＳを１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製））で培養したヒトＢリンパ球培養細胞株Ｒａｊｉ細胞（ＪＣＲＢ９０１２）、あるいはＷＩＬ２−Ｓ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ８８８５）、あるいはＧ−３６１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４２４）に、放射性物質であるＮａ２ ５１ＣｒＯ４を１×１０５細胞あたり３．７ＭＢｑ等量加えて３７℃で１時間反応させ、細胞を放射性物質標識した。反応後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地で懸濁および遠心分離操作により３回洗浄し、培地に再懸濁し、４℃で３０分間静置して放射性物質を自然解離させた。遠心分離後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地によって、１×１０５細胞／ｍＬに調製し、標的細胞溶液とした。
【０３０２】
（２）エフェクター細胞溶液の調製
実施例６の１項（１）で得られた２０人のドナーより２８ｍＬずつ採取した末梢血より、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＡＸＩＳ ＳＨＩＥＬＤ社製）を用いて使用説明書に従い、遠心分離（８００ｇ、２０分間）して単核球層を分離した。ＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地で３回遠心分離して洗浄後、同培地を用いて２×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁し、エフェクター細胞溶液とした。
【０３０３】
（３）ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに上記（１）で調製した標的細胞溶液の５０μＬ（１×１０４細胞／ウェル）を分注した。次いで（２）で調製したエフェクター細胞溶液を１００μＬ（２×１０５細胞／ウェル、エフェクター細胞と標的細胞の比は２０：１となる）添加した。更に、Ｒａｊｉ細胞およびＷＩＬ２−Ｓ細胞を分注した各ウェルには抗ＣＤ２０キメラ抗体ＫＭ３０６５またはＲｉｔｕｘａｎＴＭを、Ｇ−３６１細胞を分注した各ウェルには抗ＧＤ３キメラ抗体ＹＢ２／０−ＧＤ３キメラ抗体またはＣＨＯ−ＧＤ３キメラ抗体を各最終濃度１０ｎｇ／ｍＬとなるように加えて全量を２００μＬとし、３７℃で４時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清中の５１Ｃｒ量をγ−カウンターにて測定した。自然解離５１Ｃｒ量は抗体溶液とエフェクター細胞溶液のかわりに培地を、全解離５１Ｃｒ量は抗体溶液とエフェクター細胞溶液のかわりに１規定の塩酸を、抗体非依存性の細胞障害活性データは抗体溶液のかわりに培地を加えて反応させたウェルより取得した。細胞障害活性は下式により求めた。
【０３０４】
【式５】
Figure 0004832719
【０３０５】
４．ＦｃγＲＩＩＩａの１７６番目のアミノ酸の多型とＮＫ細胞１０４個あたりのＡＤＣＣ活性の相関解析
ＮＫ細胞比率の個人差によるＡＤＣＣ活性のばらつきを押えるため、上記実施例６の３項で得られたＡＤＣＣ活性の値と、上記実施例６の２項で得られたＮＫ細胞比率を用いてＮＫ細胞１０４個あたりのＡＤＣＣ活性の値を以下の式に基づき算出した。
【０３０６】
【式６】
Figure 0004832719
【０３０７】
第１８図、第５表に各ドナーのＦｃγＲＩＩＩａの１７６番目のアミノ酸の多型をＶａｌアレルの有無で分け、それぞれについてのＮＫ細胞１０４個あたりのＡＤＣＣ活性をを示す。
【０３０８】
【表５】
Figure 0004832719
【０３０９】
第１８図、第５表に示したように、いずれの抗原、標的細胞、エフェクター細胞のＦｃγＲＩＩＩａの１７６番目のアミノ酸の多型においても、ＹＢ２／０細胞が産生するキメラ抗体のＡＤＣＣ活性は、同じドナーのエフェクター細胞を用いた場合のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞が産生するキメラ抗体のＡＤＣＣ活性よりも高いＡＤＣＣ活性を示した。また、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞が産生するキメラ抗体は、Ｐｈｅ／Ｐｈｅ型のドナーのエフェクター細胞を用いた場合はほとんどＡＤＣＣ活性を示さなかった。それに対し、ＹＢ２／０細胞が産生するキメラ抗体のＡＤＣＣ活性は、Ｐｈｅ／Ｐｈｅ型に対しても強い活性を示し、ＡＤＣＣ活性の上昇率もＰｈｅ／Ｐｈｅ型のドナーのエフェクター細胞を用いた場合に特に高かった。
【０３１０】
すなわち、α１，６−フコース／レクチン耐性細胞によって生産された抗体は、いずれのＦｃγＲＩＩＩａの多型を有する患者に対しても、α１，６−フコース／レクチン不耐性細胞によって生産された抗体よりも高い治療効果を発揮する。特にＦｃγＲＩＩＩａのＮ末端から１７６番目のアミノ酸がフェニルアラニンである多型を有する患者に対して治療効果の面で優位性があることを示す。さらに本実施例の結果は、患者のエフェクター細胞を用いてＡＤＣＣ活性を測定することにより、本発明のα１，６−フコース／レクチン耐性細胞によって生産された抗体が特に有効な患者を選別することができることも示している。
【０３１１】
実施例７．等温滴定型熱量計を用いた各種抗ＣＣＲ４キメラ抗体のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）に対する結合活性の評価
ヒトＦｃγＲＩＩＩａに存在する、配列番号１１中のＮ末端メチオニンから１７６番目のアミノ酸の多型が、α１，６フコース／レクチン耐性細胞で生産された抗体とヒトＦｃγＲＩＩＩａとの結合性に与える影響を、等温滴定型熱量計を用いて解析した。
ＷＯ０１／６４７５４に記載の抗ＣＣＲ４キメラ抗体のアミノ酸配列情報、および配列番号１１に記載のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）の情報から、下式を用いて各蛋白質のモル吸光係数（２８０ｎｍ）を計算した。
【０３１２】
【式７】
Figure 0004832719
【０３１３】
その結果、抗ＣＣＲ４キメラ抗体（参考例２の３項（１）に記載のＫＭ２７６０−１または参考例２の３項（２）に記載のＫＭ３０６０）のモル吸光係数は２０３０００Ｍ−１ｃｍ−１と算出された。また参考例６の４項に記載のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）のモル吸光係数は３８９００Ｍ−１ｃｍ−１と算出された。
【０３１４】
以下に等温滴定型熱量計ＶＰ−ＩＴＣ（ＭｉｃｒｏＣａｌ社製）を用いた、各種抗ＣＣＲ４キメラ抗体のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）に対する結合活性の評価について記す。抗ＣＣＲ４キメラ抗体とｓｈＦγＲＩＩＩａをそれぞれ緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）に対して透析した。透析した抗体をセル（容量１．４４ｍＬ）に、透析したｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）またはｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）をインジェクターシリンジ（容量約０．３ｍＬ）に充填し、２５℃の条件下でインジェクターシリンジ溶液を１０μＬずつセル溶液に注入して滴定プロファイルを取得した。この測定の直後に、インジェクターシリンジ溶液はそのままにしてセル溶液を緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）におきかえて滴定を行い、希釈熱データを取得した。セルおよびインジェクターシリンジに充填した試料と同じものを吸光度測定のために分取した。紫外可視分光光度計を用いて分取した試料の２８０ｎｍの吸光度をセル長１ｃｍのセルで測定した。上記のモル吸光係数Ｅ（Ｌｍｏｌ−１ｃｍ−１）を用いて、下式よりセルおよびインジェクターシリンジに充填した試料のモル濃度を計算した。
【０３１５】
【式８】
Figure 0004832719
希釈熱データを用いて滴定データの補正を行い、さらに上述の式により計算したモル濃度を用いて、抗体に対するｓｈＦｃγＲＩＩＩａのモル比を横軸とする滴定プロファイルを作成した。Ｎ（結合のストイキオメトリー：抗体１分子あたりに結合するｓｈＦｃ・ＲＩＩＩａの数）とＫＡ（結合定数）とΔＨ（結合のエンタルピー変化量）の３つをパラメータとして持つ理論曲線が滴定データにベストフィットするようなＮとＫＡとΔＨを、最小二乗法により求めた。以上の一連のデータ解析はソフトウェアＯｒｉｇｉｎ（ＭｉｃｒｏＣａｌ社製）を用いて行った。また、ＫＭ２７６０−１とｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）の結合、ＫＭ３０６０とｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）の結合については２回の独立した測定を行った。全ての解析結果を第６表に示す。
【０３１６】
【表６】
Figure 0004832719
【０３１７】
第６表に示したとおり、ＫＭ２７６０−１とｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）との結合定数ＫＡは３．８×１０６Ｌ・ｍｏｌ−１（２回の測定の平均）、ＫＭ２７６０−１とｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）との結合定数ＫＡは１６．８×１０６Ｌ・ｍｏｌ−１（２回の測定の平均）、ＫＭ３０６０とｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）との結合定数ＫＡは０．１４×１０６Ｌ・ｍｏｌ−１、ＫＭ３０６０とｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）との結合定数ＫＡは０．７４×１０６Ｌ・ｍｏｌ−１（２回の測定の平均）であった。以上の結果は、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞が生産するキメラ抗体はＦｃγＲＩＩＩａのいずれの多型に対しても弱い結合活性しか有さず、特にフェニルアラニン型に対して非常に弱い結合活性しか有さないのに対し、ＹＢ２／０細胞が産生するキメラ抗体はＦｃγＲＩＩＩａの１７６番目のアミノ酸の多型に依らず、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞が生産するキメラ抗体よりも高いＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性を有していることを示すものである。すなわち、α１，６−フコース／レクチン耐性細胞によって生産された抗体は、いずれのＦｃγＲＩＩＩａの多型を有する患者に対しても、α１，６−フコース／レクチン不耐性細胞によって生産された抗体よりも高い治療効果を発揮するが、特にＦｃγＲＩＩＩａのＮ末端から１７６番目のアミノ酸がフェニルアラニンである多型を有する患者に対して治療効果の面で優位性があることを示す。
【０３１８】
実施例８．レクチンに耐性を有する細胞によって生産された抗体のエフェクター細胞への結合活性の測定
以下に示したように、磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ）を用いてヒト末梢血単核球よりＮＫ細胞をＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＩｇＥ陰性細胞として精製し、抗体の結合活性をフローサイトメトリーを用いた蛍光抗体法によって評価した。
【０３１９】
１．ヒト末梢血由来ＮＫ細胞の取得
健常人静脈血５０ｍＬを採取し、ヘパリンナトリウム（清水製薬社製）０．５ｍＬを加えて穏やかに混ぜた。これをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＡＸＩＳ ＳＨＩＥＬＤ社製）を用いて使用説明書に従い、遠心分離（８００ｇ、２０分間）して単核球層を分離した。ＭＡＣＳ用緩衝液（０．５％ＢＳＡおよび２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）にて洗浄後、ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて使用説明書に従い、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＩｇＥ陰性細胞を取得した。得られた細胞集団は多くがＮＫ細胞であることを示すＣＤ３陰性、ＣＤ５６陽性であった。そこで神細胞集団を解析に用いた。
【０３２０】
２．抗体のＮＫ細胞に対する結合活性（蛍光抗体法）
上記で得られたヒト末梢血由来ＮＫ細胞１．３×１０５個に、抗ＣＣＲ４キメラ抗体あるいは抗ＣＤ２０キメラ抗体をそれぞれ１０μｇ／ｍｌになるようにＦＡＣＳ用緩衝液（１％ＢＳＡ、０．０２％ＥＤＴＡ、０．０５％ＮａＮ３を含むＰＢＳ）にて希釈して添加し、氷中で３０分間反応させた。ＦＡＣＳ用緩衝液にて洗浄後、ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）をＦＡＣＳ用緩衝液を用いて１００倍希釈した溶液を５０μＬずつ加えた。遮光して氷中で３０分間反応させた後、細胞を洗浄し、最終的に５００μＬに懸濁して、フローサイトメーターで蛍光強度を測定した。抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０とＫＭ３０６０の結果を第１９Ａ図に、抗ＣＤ２０キメラ抗体ＫＭ３０６５とＲｉｔｕｘａｎＴＭの結果を第１９Ｂ図に示した。抗ＣＣＲ４キメラ抗体の場合はＫＭ２７６０の方が、抗ＣＤ２０キメラ抗体の場合はＫＭ３０６５の方が、それぞれ高い結合活性を示した。以上の結果は、本発明のα１，６−フコース／レクチン耐性細胞によって生産された抗体組成物の高いＡＤＣＣ活性は、エフェクター細胞上のＦｃγＲＩＩＩａへの高い結合性によることを示唆している。
【０３２１】
また、本実施例の結果より、本発明のα１，６−フコース／レクチン耐性細胞によって生産された抗体組成物が有効な患者を選別する際には、患者のエフェクター細胞への該抗体組成物の結合活性と、α１，６−フコース／レクチン不耐性細胞によって生産された抗体組成物の結合活性とを比較し、α１，６−フコース／レクチン不耐性細胞によって生産された抗体組成物を含有する医薬との結合活性が低い患者を選択することにより、本発明のα１，６−フコース／レクチン耐性細胞によって生産された抗体組成物を含有する医薬が有効な患者を選択することができることが示された。
【０３２２】
実施例９．レクチンに耐性を有する細胞によって生産された抗体によってエフェクター細胞に誘導されるＣＤ６９分子の発現上昇の測定
上記実施例８の１項と同様の方法によって取得したヒト末梢血由来ＮＫ細胞を用いて、以下に示した方法により、抗ＣＣＲ４キメラ抗体および抗ＣＤ２０キメラ抗体とそれぞれの抗原発現細胞（標的細胞）を反応させた際の、ＮＫ細胞表面上の活性化マーカーＣＤ６９の発現を解析した。
【０３２３】
１．抗ＣＣＲ４キメラ抗体存在下でのＮＫ細胞と標的細胞の共培養
標的細胞としてはＣＣＲ４発現細胞であるＮＡＬＭ−６細胞［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７９，４３８６（１９８２）］を用いた。ＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地（ＦＣＳを１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製））を用いて培養したＮＡＬＭ−６細胞を遠心分離後、同じ培地によって１×１０６細胞／ｍＬに調製し、培養９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに５０μＬずつ（５×１０４細胞／ウェル）分注した。また、実施例８の１項と同様の方法によって取得したヒト末梢血由来ＮＫ細胞をＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地により１×１０６細胞／ｍＬに調製し、５０μＬずつ（５×１０４細胞／ウェル、ＮＫ細胞と標的細胞の比は１：１となる）分注した。更に、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を各最終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように加えて全量を２００μＬとし、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。
【０３２４】
２．抗ＣＤ２０キメラ抗体存在下でのＮＫ細胞と標的細胞の共培養
標的細胞としてはＣＤ２０発現細胞であるＲａｊｉ細胞（ＪＣＲＢ ＣＣＬ８６）を使用した。ＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地を用いて培養したＲａｊｉ細胞を遠心分離後、同じ培地によって２×１０６細胞／ｍＬに調製し、培養９６ウェルＵ字底プレートの各ウェルに５０μＬずつ（１×１０５細胞／ウェル）分注した。また、実施例８の１項と同様の方法によって取得したヒト末梢血由来ＮＫ細胞をＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地により４×１０６細胞／ｍＬに調製し、５０μＬずつ（２×１０５細胞／ウェル、ＮＫ細胞と標的細胞の比は２：１となる）分注した。更に、抗ＣＤ２０キメラ抗体を各最終濃度０．１μｇ／ｍｌとなるように加えて全量を２００μＬとし、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。
【０３２５】
３．ＮＫ細胞表面上のＣＤ６９の発現解析（蛍光抗体法）
上記１．あるいは２．のように培養した細胞を回収し、ＦＡＣＳ用緩衝液にて洗浄した後、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ６９抗体（ファーミンジェン社製）およびＰＥ標識抗ＣＤ５６抗体（Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）をそれぞれ使用説明書に従って添加し、氷中で３０分間反応させた。ＦＡＣＳ用緩衝液にて洗浄後、最終的に５００μＬに懸濁して、フローサイトメーターでＣＤ５６陽性細胞集団中のＣＤ６９の蛍光強度を測定した。
【０３２６】
第２０Ａ図には抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０とＫＭ３０６０をそれぞれ１０μｇ／ｍｌの濃度で４時間反応させた際の、第２０図には７２時間反応させた際の、ＣＤ５６陽性細胞画分中のＣＤ６９の発現強度を示した。また第２０Ｃ図には、抗ＣＤ２０キメラ抗体ＫＭ３０６５とＲｉｔｕｘａｎＴＭをそれぞれ０．１μｇ／ｍｌの濃度で２１時間反応させた際の、ＣＤ５６陽性細胞画分中のＣＤ６９の発現強度を示した。抗ＣＣＲ４キメラ抗体の場合はＫＭ２７６０の方が、抗ＣＤ２０キメラ抗体の場合はＫＭ３０６５の方が、いずれの条件においてもそれぞれＣＤ５６陽性細胞、すなわちＮＫ細胞上のＣＤ６９の発現が高い傾向を示した。以上の結果は、本発明のＬＣＡレクチンに耐性を有する抗体組成物が高いＡＤＣＣ活性を発揮する際に、エフェクター細胞上のＣＤ６９分子の発現が強く誘導されることを示唆している。
【０３２７】
本実施例の結果より、本発明のα１，６−フコース／レクチン耐性細胞によって生産された抗体組成物が有効な患者を選別する際に、患者のエフェクター細胞に該抗体組成物を接触させた場合のエフェクター細胞の活性化マーカー分子と、α１，６−フコース／レクチン不耐性細胞によって生産された抗体組成物を接触させた場合の該分子との差を比較し、エフェクター細胞の活性化マーカー分子の発現が少なく、かつα１，６−フコース／レクチン不耐性細胞によって生産された抗体組成物を含有する医薬との結合活性が低い患者を選択することにより、本発明のα１，６−フコース／レクチン耐性細胞によって生産された抗体組成物を含有する医薬が有効な患者を選択することができることが示された。
【０３２８】
参考例１．抗ガングリオシドＧＤ３ヒト型キメラ抗体の作製１．抗ガングリオシドＧＤ３ヒト型キメラ抗体の安定生産細胞の作製
ＷＯ００／６１７３９に記載の抗ガングリオシドＧＤ３（以下、ＧＤ３と表記する）ヒト型キメラ抗体の発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＬＨＧＭ４を用いて抗ＧＤ３ヒト型キメラ抗体（以下、抗ＧＤ３キメラ抗体）の安定生産細胞を以下のようにして作製した。
【０３２９】
（１）ラットミエローマＹＢ２／０細胞を用いた生産細胞の作製
抗ＧＤ３キメラ抗体発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＬＨＧＭ４の５μｇを４×１０６細胞のラットミエローマＹＢ２／０細胞［ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２、ジャーナル・オブ・セルラー・バイオロジー（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），９３，５７６（１９８２）］へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、４０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）［１０％牛胎児血清（以下、ＦＢＳと表記する；ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）］に懸濁し、９６ウェル培養用プレート（住友ベークライト社製）に２００μＬ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍＬになるように添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ＧＤ３キメラ抗体の抗原結合活性を参考例１の２項に記載のＥＬＩＳＡ法により測定した。
【０３３０】
培養上清中に抗ＧＤ３キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍＬ、ＤＨＦＲの阻害剤であるメソトレキセート（以下、ＭＴＸと表記する；ＳＩＧＭＡ社製）を５０ｎｍｏｌ／Ｌ含むＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地に１〜２×１０５細胞／ｍＬになるように懸濁し、２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に２ｍＬずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎｍｏｌ／Ｌ ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換株の増殖が認められたウェルの培養上清中の抗ＧＤ３キメラ抗体の抗原結合活性を参考例１の２項に記載のＥＬＩＳＡ法により測定した。
【０３３１】
培養上清中に抗ＧＤ３キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を１００ｎｍｏｌ／Ｌ、２００ｎｍｏｌ／Ｌと順次上昇させ、最終的にＧ４１８を０．５ｍｇ／ｍＬ、ＭＴＸを２００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度で含むＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、抗ＧＤ３キメラ抗体を高生産する形質転換株を得た。得られた形質転換株について、２回の限界希釈法による単一細胞化（以下、クローン化と表記する）を行った。尚、ＷＯ００／６１７３９の実施例８に示すα１，６−フコシルトランスフェラーゼの遺伝子の転写物の定量法を用い、該転写物の量が比較的低い株を優良株として選択した。
このようにして得られた抗ＧＤ３キメラ抗体を生産する形質転換細胞クローン７−９−５１は平成１１年４月５日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）（現・独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地 中央第６））にＦＥＲＭ ＢＰ−６６９１として寄託されている。
【０３３２】
（２）ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を用いた生産細胞の作製
抗ＧＤ３キメラ抗体発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＬＨＧＭ４の４μｇを１．６×１０６細胞のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞［プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７７，４２１６（１９８０）］へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、１０ｍＬのＩＭＤＭ−ＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）［ＦＢＳ（ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を１０％、ＨＴｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を１倍濃度で含むＩＭＤＭ培地（ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）］に懸濁し、９６ウェル培養用プレート（岩城硝子社製）に２００μＬ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍＬになるように添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ＧＤ３キメラ抗体の抗原結合活性を参考例１の２項に記載のＥＬＩＳＡ法により測定した。
【０３３３】
培養上清中に抗ＧＤ３キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍＬ、ＭＴＸを１０ｎｍｏｌ／Ｌ含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地［１０％透析牛胎児血清（以下、ｄＦＢＳと表記する；ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を含むＩＭＤＭ培地］に１〜２×１０５細胞／ｍＬになるように懸濁し、２４ウェルプレート（岩城硝子社製）に０．５ｍＬずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、１０ｎｍｏｌ／Ｌ ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。増殖が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を１００ｎｍｏｌ／Ｌに上昇させ、最終的にＧ４１８を０．５ｍｇ／ｍＬ、ＭＴＸを１００ｎｍｏ／Ｌの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、抗ＧＤ３キメラ抗体を高生産する形質転換株を得た。得られた形質転換株について、２回の限界希釈法によるクローン化を行い、得られた形質転換細胞クローンをＤＣＨＩ０１−２０と名付けた。
【０３３４】
２．抗体のＧＤ３に対する結合活性の測定（ＥＬＩＳＡ法）
抗体のＧＤ３に対する結合活性は以下のようにして測定した。
４ｎｍｏｌのＧＤ３（雪印乳業社製）を１０μｇのジパルミトイルフォスファチジルコリン（ＳＩＧＭＡ社製）と５μｇのコレステロール（ＳＩＧＭＡ社製）とを含む２ｍＬのエタノール溶液に溶解した。該溶液の２０μＬを９６ウェルのＥＬＩＳＡ用のプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）の各ウェルにそれぞれ分注し（ＧＤ３濃度は４０ｐｍｏｌ／ウェルとなる）、風乾後、１％牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡと表記する；ＳＩＧＭＡ社製）を含むＰＢＳ（以下、１％ＢＳＡ−ＰＢＳと表記する）を１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、形質転換株の培養上清あるいは精製したキメラ抗体の各種希釈溶液を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬社製）を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと表記する）で洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで３０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ社製）を二次抗体溶液として、５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素を１μＬ／ｍＬで添加した溶液（以下、同様）］を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、５分後に５％ＳＤＳ溶液を５０μＬ／ウェルで加えて反応を停止させた。その後、４１５ｎｍの吸光度（以下、ＯＤ４１５と表記する）を測定した。
【０３３５】
３．抗ＧＤ３キメラ抗体の精製
（１）ＹＢ２／０細胞由来の生産細胞の培養および抗体の精製
参考例１の１項（１）で得られた抗ＧＤ３キメラ抗体を生産する形質転換細胞クローン７−９−５１をＢＳＡを０．２％、ＭＴＸを２００ｎｍｏｌ／Ｌ、トリヨードチロニン（以下、Ｔ３と表記する；ＳＩＧＭＡ社製）を１００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度で含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）に３×１０５細胞／ｍＬとなるように懸濁し、２．０Ｌスピナーボトル（岩城硝子社製）を用いて５０ｒｐｍの速度で攪拌培養した。３７℃の恒温室内で１０日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＧＤ３キメラ抗体を精製した。精製した抗ＧＤ３キメラ抗体は、ＹＢ２／０−ＧＤ３キメラ抗体と名付けた。
【０３３６】
（２）ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来の生産細胞の培養および抗体の精製
参考例１の１項（２）で得られた抗ＧＤ３キメラ抗体を生産する形質転換細胞クローンＤＣＨＩ０１−２０をＬ−Ｇ１ｎを３ｍｍｏｌ／Ｌ、脂肪酸濃縮液（以下、ＣＤＬＣと表記する；ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を０．５％、プルロニックＦ６８（以下、ＰＦ６８と表記する；ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を０．３％の濃度で含むＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に１×１０６細胞／ｍＬとなるように懸濁し、１７５ｍｍ２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に５０ｍＬずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で４日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＧＤ３キメラ抗体を精製した。精製した抗ＧＤ３キメラ抗体は、ＣＨＯ−ＧＤ３キメラ抗体と名付けた。
【０３３７】
４．精製した抗ＧＤ３キメラ抗体の解析
参考例１の３項で得られた各種動物細胞で生産、精製した２種類の抗ＧＤ３キメラ抗体の各４μｇを公知の方法［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０（１９７０）］に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥし、分子量および精製度を解析した。精製した各抗ＧＤ３キメラ抗体は、いずれも非還元条件下では分子量が約１５０キロダルトン（以下、Ｋｄと表記する）の単一のバンドが、還元条件下では約５０Ｋｄと約２５Ｋｄの２本のバンドが認められた。これらの分子量は、抗体のＨ鎖およびＬ鎖のｃＤＮＡの塩基配列から推定される分子量（Ｈ鎖：約４９Ｋｄ、Ｌ鎖：約２３Ｋｄ、分子全体：約１４４Ｋｄ）とほぼ一致し、さらに、ＩｇＧクラスの抗体は、非還元条件下では分子量は約１５０Ｋｄであり、還元条件下では分子内のジスルフィド結合（以下、Ｓ−Ｓ結合と表記する）が切断され、約５０Ｋｄの分子量を持つＨ鎖と約２５Ｋｄの分子量を持つＬ鎖に分解されるという報告［アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６］と一致し、各抗ＧＤ３キメラ抗体が正しい構造の抗体分子として発現され、かつ精製されたことが確認された。
【０３３８】
参考例２．抗ケモカイン受容体ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体の作製１．抗ケモカイン受容体ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体の安定生産細胞の作製
ＷＯ０１／６４７５４に記載の抗ケモカイン受容体ＣＣＲ４（以下、ＣＣＲ４と表記する）ヒト型キメラ抗体の発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２１６０を用いて抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体（以下、抗ＣＣＲ４キメラ抗体）の安定生産細胞を以下のようにして作製した。
【０３３９】
（１）ラットミエローマＹＢ２／０細胞を用いた生産細胞の作製
抗ＣＣＲ４キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２１６０の１０μｇを４×１０６細胞のラットミエローマＹＢ２／０細胞［ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２、ジャーナル・オブ・セルラー・バイオロジー（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），９３，５７６（１９８２）］へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、４０ｍＬのＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ−ＦＢＳ（５）［ＦＢＳ（ＰＡＡ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を５％含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）］に懸濁し、９６ウェル培養用プレート（住友ベークライト社製）に２００μＬ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８を１．０ｍｇ／ｍＬになるように添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の抗原結合活性を参考例２の２項に記載のＥＬＩＳＡ法により測定した。
【０３４０】
培養上清中に抗ＣＣＲ４キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、Ｇ４１８を１．０ｍｇ／ｍＬ、ＤＨＦＲの阻害剤であるＭＴＸ（ＳＩＧＭＡ社製）を５０ｎｍｏｌ／Ｌ含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ−ＦＢＳ（５）培地に１〜２×１０５細胞／ｍＬになるように懸濁し、２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に１ｍＬずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎｍｏｌ／Ｌ ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。
形質転換株の増殖が認められたウェルの培養上清中の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の抗原結合活性を参考例２の２項に記載のＥＬＩＳＡ法により測定した。
培養上清中に抗ＣＣＲ４キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を１００ｎｍｏｌ／Ｌ、２００ｎｍｏｌ／Ｌと順次上昇させ、最終的にＭＴＸを２００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度で含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ−ＦＢＳ（５）培地で増殖可能かつ、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を高生産する形質転換株を得た。得られた形質転換株について、２回の限界希釈法によるクローン化を行い、得られた形質転換細胞クローンをＫＭ２７６０＃５８−３５−１６と名付けた。尚、ＷＯ００／６１７３９の実施例８に示すα１，６−フコシルトランスフェラーゼの遺伝子の転写物の定量法を用い、該転写物の量が比較的低い株を優良株として選択し、用いた。
【０３４１】
（２）ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を用いた生産細胞の作製
抗ＣＣＲ４キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２１６０の４μｇを１．６×１０６細胞のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞［プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７７，４２１６（１９８０）］へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、１０ｍＬのＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）［ｄＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１０％、ＨＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１倍濃度で含むＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）］に懸濁し、９６ウェル培養用プレート（岩城硝子社製）に１００μＬ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、ＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）（ｄＦＢＳを１０％で含むＩＭＤＭ培地）に培地交換し、１〜２週間培養した。ＨＴ非依存的な増殖を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の発現量を参考例２の２項に記載のＥＬＩＳＡ法により測定した。
培養上清中に抗ＣＣＲ４キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、ＭＴＸを５０ｎｍｏｌ／Ｌ含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地に１〜２×１０５細胞／ｍＬになるように懸濁し、２４ウェルプレート（岩城硝子社製）に０．５ｍＬずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎｍｏｌ／Ｌ ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。増殖が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を２００ｎｍｏｌ／Ｌに上昇させ、最終的にＭＴＸを２００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を高生産する形質転換株を得た。得られた形質転換株は５−０３と名付けた。
【０３４２】
２．抗体のＣＣＲ４部分ペプチドに対する結合活性の測定（ＥＬＩＳＡ法）
抗ＣＣＲ４キメラ抗体が反応し得るヒトＣＣＲ４細胞外領域ペプチドとして化合物１（配列番号１）を選択した。ＥＬＩＳＡ法による活性測定に用いるため、以下の方法でＢＳＡ（ナカライテスク社製）とのコンジュゲートを作製し、・BR>R原として用いた。すなわち、１０ｍｇのＢＳＡを含むＰＢＳ９００ｍＬに、１００ｍＬの２５ｍｇ／ｍＬ ＳＭＣＣ［４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシリックアシッドＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステル］（ＳＩＧＭＡ社製）−ＤＭＳＯ溶液を攪拌しながら滴下し、３０分間ゆっくりと攪拌した。２５ｍＬのＰＢＳで平衡化したＮＡＰ−１０カラムに反応液１ｍＬをアプライし、１．５ｍＬのＰＢＳで溶出させた溶出液をＢＳＡ−ＳＭＣＣ溶液とした（ＯＤ２８０測定からＢＳＡ濃度を算出）。次に、０．５ｍｇの化合物１に２５０ｍＬ ＰＢＳを加え、次いで２５０ｍＬ ＤＭＦを加えて完全に溶解させた後、前述のＢＳＡ−ＳＭＣＣ溶液（ＢＳＡ換算１．２５ｍｇ）を攪拌下で添加して３時間ゆっくり攪拌した。反応液をＰＢＳに対して４℃、一晩透析し、最終濃度０．０５％となるようにアジ化ナトリウムを添加して、０．２２μｍフィルターでろ過した後、ＢＳＡ−化合物１溶液とした。
９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に、上述のように調製したコンジュゲートを０．０５μｇ／ｍＬ、５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、形質転換株の培養上清あるいは精製したキメラ抗体の各種希釈液を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで３０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ社製）を二次抗体溶液として、５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、５分後に５％ＳＤＳ溶液を５０μＬ／ウェル加えて反応を停止させた。その後、ＯＤ４１５を測定した。
【０３４３】
３．抗ＣＣＲ４キメラ抗体の精製
（１）ＹＢ２／０細胞由来の生産細胞の培養および抗体の精製
参考例２の１項（１）で得られた抗ＣＣＲ４キメラ抗体を生産する形質転換細胞クローンＫＭ２７６０＃５８−３５−１６を２００ｎｍｏｌ／Ｌ ＭＴＸ、Ｄａｉｇｏ’ｓ ＧＦ２１（和光純薬社製）を５％の濃度で含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に２×１０５細胞／ｍＬとなるように懸濁し、スピナーボトル（岩城硝子社製）を用いて３７℃の恒温室内でＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ攪拌培養した。８−１０日間培養して回収した培養上清より、Ｐｒｏｓｅｐ−Ａ（ミリポア社製）カラムおよびゲルろ過法を用いて、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を精製した。精製した抗ＣＣＲ４キメラ抗体をＫＭ２７６０−１と名付けた。
【０３４４】
（２）ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来の生産細胞の培養および抗体の精製
参考例２の１項（２）で得られた抗ＣＣＲ４キメラ抗体を生産する形質転換細胞株５−０３をＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地中で、１８２ｃｍ２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）にて５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて培養した。数日後、細胞密度がコンフルエントに達した時点で培養上清を除去し、２５ｍＬのＰＢＳにて細胞を洗浄後、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０１培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を３５ｍＬ注入した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて７日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（ミリポア社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を精製した。精製した抗ＣＣＲ４キメラ抗体はＫＭ３０６０と名付けた。
【０３４５】
４．精製した抗ＣＣＲ４キメラ抗体の解析
参考例２の３項で得られた各種動物細胞で生産、精製した２種類の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の各４μｇを公知の方法［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０（１９７０）］に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥし、分子量および製精度を解析した。精製した各抗ＣＣＲ４キメラ抗体は、いずれも非還元条件下では分子量が約１５０Ｋｄの単一のバンドが、還元条件下では約５０Ｋｄと約２５Ｋｄの２本のバンドが認められた。これらの分子量は、抗体のＨ鎖およびＬ鎖のｃＤＮＡの塩基配列から推定される分子量（Ｈ鎖：約４９Ｋｄ、Ｌ鎖：約２４Ｋｄ、分子全体：約１４６Ｋｄ）とほぼ一致し、さらに、ＩｇＧクラスの抗体は、非還元条件下では分子量は約１５０Ｋｄであり、還元条件下では分子内のＳ−Ｓ結合が切断され、約５０Ｋｄの分子量を持つＨ鎖と約２５Ｋｄの分子量を持つＬ鎖に分解されるという報告［アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６］と一致し、抗ＣＣＲ４キメラ抗体が正しい構造の抗体分子として発現され、かつ精製されたことが確認された。
【０３４６】
参考例３．抗線維芽細胞増殖因子−８キメラ抗体の作製１．抗線維芽細胞増殖因子−８（以下、ＦＧＦ−８と表記する）に対するマウス抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの単離、解析
（１）ＦＧＦ−８に対するマウス抗体生産ハイブリドーマ細胞からのｍＲＮＡの調製
ＦＧＦ−８に対するマウス抗体（抗ＦＧＦ−８マウス抗体）を生産するハイブリドーマＫＭ１３３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４５１）の１×１０７細胞より、ｍＲＮＡの調製キットであるＦａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、ｍＲＮＡを約８μｇ調製した。
【０３４７】
（２）抗ＦＧＦ−８マウス抗体のＨ鎖およびＬ鎖ｃＤＮＡライブラリーの作製
参考例３の１項（１）で取得したＫＭ１３３４のｍＲＮＡの５μｇから、Ｔｉｍｅ Ｓａｖｅｒ ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、両端にＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩアダプターを有するｃＤＮＡを合成した。作製したｃＤＮＡ全量を２０μｌの滅菌水に溶解後、アガロースゲル電気泳動にて分画し、ＩｇＧクラスの抗体のＨ鎖に対応する約１．５ｋｂのｃＤＮＡ断片とκクラスのＬ鎖に対応する約１．０ｋｂのｃＤＮＡ断片をそれぞれ約０．１μｇ回収した。次に、各々の約１．５ｋｂのｃＤＮＡ断片０．１μｇおよび約１．０ｋｂのｃＤＮＡ断片０．１μｇと、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化後、Ｃａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅで末端を脱リン酸化したλＺＡＰＩＩベクター１μｇをλＺＡＰＩＩ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、連結した。
【０３４８】
連結後の各々の反応液のうち４μｌをＧｉｇａｐａｃｋ ＩＩ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｔｓ Ｇｏｌｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、λファージにパッケージングし、適当量を大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，５，３７６，１９８７）に感染させて、ＫＭ１３３４のＨ鎖ｃＤＮＡライブラリーおよびＬ鎖ｃＤＮＡライブラリーとしてそれぞれ約８．１×１０４個と、５．５×１０４個のファージクローンを取得した。次に各々のファージを常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）に従い、ナイロンメンブレン上に固定した。
【０３４９】
（３）抗ＦＧＦ−８マウス抗体のＨ鎖およびＬ鎖ｃＤＮＡのクローニング
参考例３の１項（２）で作製したＫＭ１３３４のＨ鎖ｃＤＮＡライブラリーおよびＬ鎖ｃＤＮＡライブリーのナイロンメンブレンを、ＥＣＬ Ｄｉｒｅｃｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ａｎｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、マウス抗体のＣ領域のｃＤＮＡ〔Ｈ鎖はマウスＣγ１ｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４６，２０１０，１９９１）、Ｌ鎖はマウスＣκｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片（Ｃｅｌｌ，２２，１９７，１９８０）〕をプローブとして検出し、プローブに強く結合したファージクローンをＨ鎖、Ｌ鎖各１０クローン取得した。次に、λＺＡＰＩＩ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）の使用説明書に従い、ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｘｃｉｓｉｏｎ法により各ファージクローンをプラスミドに変換した。こうして得られた各プラスミドに含まれるｃＤＮＡの塩基配列をＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（Ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてジデオキシ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）により決定した。その結果、ｃＤＮＡの５’末端に開始コドンと推定されるＡＴＧ配列が存在する完全長の機能的なＨ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ１３３４Ｈ７−１およびＬ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ１３３４Ｌ７−１を得た。
【０３５０】
（４）抗ＦＧＦ−８マウス抗体のＶ領域のアミノ酸配列の解析
配列番号１４にプラスミドｐＫＭ１３３４Ｈ７−１に含まれていたＶＨの全塩基配列を、配列番号１５に推定された全アミノ酸配列を、配列番号１６にプラスミドｐＫＭ１３３４Ｌ７−１に含まれていたＶＬの全塩基配列を、配列番号１７に推定された全アミノ酸配列をそれぞれ示す。既知のマウス抗体の配列データ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）との比較および精製した抗ＦＧＦ−８マウス抗体ＫＭ１３３４のＨ鎖およびＬ鎖のＮ末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサーＰＰＳＱ−１０（島津製作所製）を用いて自動エドマン分解により解析した結果との比較から、単離した各々のｃＤＮＡは分泌シグナル配列を含む抗ＦＧＦ−８マウス抗体ＫＭ１３３４をコードする完全長ｃＤＮＡであり、Ｈ鎖については配列番号１５に記載のアミノ酸配列の１から１９番目が、Ｌ鎖については配列番号１７に記載のアミノ酸配列の１から１９番目が分泌シグナル配列であることが明らかとなった。
【０３５１】
次に、抗ＦＧＦ−８マウス抗体ＫＭ１３３４のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列（分泌シグナル配列を除いた配列）の新規性について検討した。配列解析システムとしてＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ ９．１、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ社製）を用い、既存の蛋白質のアミノ酸配列データベース（ＰＩＲ−Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｒｅｌｅａｓｅ ５６．０））をＢＬＡＳＴ法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３，１９９０）により検索した。その結果、Ｈ鎖、Ｌ鎖ともに完全に一致する配列は認められず、抗ＦＧＦ−８マウス抗体ＫＭ１３３４のＶＨおよびＶＬは新規なアミノ酸配列であることが確認された。
【０３５２】
また、抗ＦＧＦ−８マウス抗体ＫＭ１３３４のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを、既知の抗体のアミノ酸配列と比較することにより同定した。抗ＦＧＦ−８マウス抗体ＫＭ１３３４のＶＨのＣＤＲ１、２および３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１８、１９および２０に、ＶＬのＣＤＲ１、２および３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２１、２２および２３に示した。
【０３５３】
２．抗ＦＧＦ−８キメラ抗体の動物細胞を用いた安定発現
（１）抗ＦＧＦ−８キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ１３３４の構築
ＷＯ９７／１０３５４に記載のヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３と参考例３の１項（３）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４Ｈ７−１およびｐＫＭ１３３４Ｌ７−１を用いて抗ＦＧＦ−８キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ１３３４を以下の様にして構築した。
参考例３の１項（３）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４Ｈ７−１の５０ｎｇを鋳型とし、配列番号２４、２５に記載の塩基配列を有する合成ＤＮＡ（ＧＥＮＳＥＴ社製）をプライマーとして終濃度０．３μＭとなるように加え、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）に添付の取扱説明書に従い、５０μｌの系でまず９４℃で２分間加熱した後、９４℃１５秒間、５５℃３０秒間、６８℃１分間の条件で３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。該反応液をエタノール沈殿した後、滅菌水に溶解し、１０単位の制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）および１０単位の制限酵素ＮｏｔＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．４７ｋｂのＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片を約０．３μｇ回収した。
【０３５４】
次に、ヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３の３μｇを１０単位の制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）および１０単位の制限酵素ＮｏｔＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約１２．７５ｋｂのＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片を約２μｇ回収した。
次に、上記で得られたＰＣＲ産物由来のＮｏｔＩ−ＡｐａＩ断片０．１μｇとプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３由来のＮｏｔＩ−ＡｐａＩ断片０．１μｇを全量１０μｌの滅菌水に加え、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、第２１図に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１３３４Ｈを得た。
【０３５５】
次に、参考例３の１項（３）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４Ｌ７−１の５０ｎｇを鋳型とし、配列番号２６、２７に記載の塩基配列を有する合成ＤＮＡ（ＧＥＮＳＥＴ社製）をプライマーとして終濃度０．３μＭとなるように加え、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）に添付の取扱説明書に従い、５０μｌの系でまず９４℃で２分間加熱した後、９４℃１５秒間、５５℃３０秒間、６８℃１分間の条件で３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。該反応液をエタノール沈殿したのち滅菌水に溶解し、１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）および１０単位の制限酵素ＢｓｉＷＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．４４ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片を約０．３μｇ回収した。
次に、上記で得られたプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１３３４Ｈの３μｇを１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＢｓｉＷＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約１３．２０ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片を約２μｇ回収した。
【０３５６】
次に、上記で得られたＰＣＲ産物由来のＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片０．１μｇとプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１３３４Ｈ由来のＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片０．１μｇを全量１０μｌの滅菌水に加え、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、第２１図に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１３３４を得た。
得られたプラスミドの４００ｎｇを用い、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（Ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてジデオキシ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）による塩基配列の解析を行った結果、目的のＤＮＡがクローニングされたプラスミドが得られたことを確認した。
【０３５７】
３．抗ＦＧＦ−８キメラ抗体の安定生産細胞の作製
参考例３の２項に記載の抗ＦＧＦ−８ヒト型キメラ抗体の発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ１３３４を用いて抗ＦＧＦ−８ヒト型キメラ抗体（以下、抗ＦＧＦ−８キメラ抗体と表記する）の安定生産細胞を以下のようにして作製した。
（１）ラットミエローマＹＢ２／０細胞を用いた生産細胞の作製
抗ＦＧＦ−８キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ１３３４の１０μｇを４×１０６細胞のラットミエローマＹＢ２／０細胞［ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２、ジャーナル・オブ・セルラー・バイオロジー（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），９３，５７６（１９８２）］へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、４０ｍＬのＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ−ＦＢＳ（５）に懸濁し、９６ウェル培養用プレート（住友ベークライト社製）に２００μＬ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍＬになるように添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ＦＧＦ−８キメラ抗体の抗原結合活性を参考例３の４項に記載のＥＬＩＳＡ法により測定した。
【０３５８】
培養上清中に抗ＦＧＦ−８キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍＬ、ＤＨＦＲの阻害剤であるＭＴＸ（ＳＩＧＭＡ社製）を５０ｎｍｏｌ／Ｌ含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ−ＦＢＳ（５）培地に１〜２×１０５細胞／ｍＬになるように懸濁し、２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に１ｍＬずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎｍｏｌ／Ｌ ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換株の増殖が認められたウェルの培養上清中の抗ＦＧＦ−８キメラ抗体の抗原結合活性を参考例３の４項に記載のＥＬＩＳＡ法により測定した。
【０３５９】
培養上清中に抗ＦＧＦ−８キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を１００ｎｍｏｌ／Ｌ、２００ｎｍｏｌ／Ｌと順次上昇させ、最終的にＧ４１８を０．５ｍｇ／ｍＬ、ＭＴＸを２００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度で含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ−ＦＢＳ（５）培地で増殖可能かつ、抗ＦＧＦ−８キメラ抗体を高生産する形質転換株５−Ｄを得た。得られた形質転換株について、限界希釈法によるクローン化を行い、得られた形質転換細胞クローンを５−Ｄ−１０と名付けた。尚、ＷＯ００／６１７３９の実施例８に示すα１，６−フコシルトランスフェラーゼの遺伝子の転写物の定量法を用い、該転写物の量が比較的低い株を優良株として選択し、用いた。
【０３６０】
（２）ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を用いた生産細胞の作製
参考例２の１項（２）に記載した方法に従い、抗ＦＧＦ−８キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ１３３４をＣＨＯ／ＤＧ４４細胞に導入し、薬剤ＭＴＸによる遺伝子増幅を行い、抗ＦＧＦ−８キメラ抗体を高生産する形質転換株を得た。抗体生産量の測定は参考例３の４項に記載したＥＬＩＳＡ法を用いて行った。
得られた形質転換株について、２回の限界希釈法によるクローン化を行い、得られた形質転換細胞クローンを７−Ｄ−１−５と名付けた。
【０３６１】
４．抗体のＦＧＦ−８部分ペプチドに対する結合活性の測定（ＥＬＩＳＡ法）
抗ＦＧＦ−８キメラ抗体が反応し得るヒトＦＧＦ−８ペプチドとして化合物２（配列番号２）を選択した。ＥＬＩＳＡ法による活性測定に用いるため、以下の方法でＢＳＡ（ナカライテスク社製）とのコンジュゲートを作製し、抗原として用いた。すなわち、１０ｍｇのＢＳＡを含むＰＢＳ９００ｍＬに、１００ｍＬの２５ｍｇ／ｍＬ ＳＭＣＣ［４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシリックアシッドＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステル］（シグマ社製）−ＤＭＳＯ溶液を攪拌しながら滴下し、３０分間ゆっくりと攪拌した。２５ｍＬのＰＢＳで平衡化したＮＡＰ−１０カラムに反応液１ｍＬをアプライし、１．５ｍＬのＰＢＳで溶出させた溶出液をＢＳＡ−ＳＭＣＣ溶液とした（ＯＤ２８０測定からＢＳＡ濃度を算出）。次に、０．５ｍｇの化合物２に２５０ｍＬ ＰＢＳを加え、次いで２５０ｍｌ ＤＭＦを加えて完全に溶解させた後、前述のＢＳＡ−ＳＭＣＣ溶液（ＢＳＡ換算１．２５ｍｇ）を攪拌下で添加して３時間ゆっくり攪拌した。反応液をＰＢＳに対して４℃、一晩透析し、最終濃度０．０５％となるようにアジ化ナトリウムを添加して、０．２２μｍフィルターでろ過した後ＢＳＡ−化合物２溶液とした。
【０３６２】
９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に、上述のように調製したコンジュゲートを１μｇ／ｍＬ、５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、形質転換株の培養上清あるいは精製したキメラ抗体の各種希釈液を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで３０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ社製）を二次抗体溶液として、５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、５分後に５％ＳＤＳ溶液を５０μＬ／ウェル加えて反応を停止させた。その後、ＯＤ４１５を測定した。
５．抗ＦＧＦ−８キメラ抗体の精製（１）ＹＢ２／０細胞由来の生産細胞の培養および抗体の精製
【０３６３】
参考例３の３項（１）で得られた抗ＦＧＦ−８キメラ抗体を生産する形質転換株５−Ｄを２００ｎｍｏｌ／Ｌ ＭＴＸ、Ｄａｉｇｏ’ｓ ＧＦ２１（和光純薬社製）を５％の濃度で含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に２×１０５細胞／ｍＬとなるように懸濁し、１８２ｃｍ２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）を用いて５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて培養した。８−１０日間培養して回収した培養上清より、Ｐｒｏｓｅｐ−Ａ（ミリポア社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＦＧＦ−８キメラ抗体を精製した。精製した抗ＦＧＦ−８キメラ抗体をＹＢ２／０−ＦＧＦ８キメラ抗体と名付けた。
【０３６４】
（２）ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来の生産細胞の培養および抗体の精製
参考例３の３項（２）で得られた抗ＦＧＦ−８キメラ抗体を生産する形質転換細胞クローン７−Ｄ−１−５をＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地中で、１８２ｃｍ２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）にて５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて培養した。数日後、細胞密度がコンフルエントに達した時点で培養上清を除去し、２５ｍＬのＰＢＳにて細胞を洗浄後、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０１培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を３５ｍＬ注入した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて７日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（ミリポア社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＦＧＦ−８キメラ抗体を精製した。精製した抗ＦＧＦ−８キメラ抗体はＣＨＯ−ＦＧＦ８キメラ抗体と名付けた。
【０３６５】
６．精製した抗ＦＧＦ−８キメラ抗体の解析
参考例３の５項で得られた各種動物細胞で生産、精製した２種類の抗ＦＧＦ−８キメラ抗体の各４μｇを公知の方法［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０（１９７０）］に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥし、分子量および製精度を解析した。精製した各抗ＦＧＦ−８キメラ抗体は、いずれも非還元条件下では分子量が約１５０Ｋｄの単一のバンドが、還元条件下では約５０Ｋｄと約２５Ｋｄの２本のバンドが認められた。これらの分子量は、抗体のＨ鎖およびＬ鎖のｃＤＮＡの塩基配列から推定される分子量（Ｈ鎖：約５０Ｋｄ、Ｌ鎖：約２４Ｋｄ、分子全体：約１４８Ｋｄ）とほぼ一致し、さらに、ＩｇＧクラスの抗体は、非還元条件下では分子量は約１５０Ｋｄであり、還元条件下では分子内のＳ−Ｓ結合が切断され、約５０Ｋｄの分子量を持つＨ鎖と約２５Ｋｄの分子量を持つＬ鎖に分解されるという報告［アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６］と一致し、抗ＦＧＦ−８キメラ抗体が正しい構造の抗体分子として発現され、かつ精製されたことが確認された。
【０３６６】
７．抗ＦＧＦ−８キメラ抗体のＦＧＦ−８部分ペプチドに対する結合活性（ＥＬＩＳＡ法）
参考例３の５項で得られた各種動物細胞で生産、精製した２種類の抗ＦＧＦ−８キメラ抗体のＦＧＦ−８部分ペプチドに対する結合活性を参考例３の４項に記載のＥＬＩＳＡ法により測定した。
第２２図は、添加する抗ＦＧＦ−８キメラ抗体の濃度を変化させて結合活性を検討した結果である。第２２図に示したように、２種類の抗ＦＧＦ−８キメラ抗体は、同等のＦＧＦ−８部分ペプチドに対する結合活性を示した。この結果は、抗体を生産する動物細胞の種類に依らず、抗体の抗原結合活性は、一定であることを示している。
【０３６７】
参考例４．抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体の作製１．抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体発現ベクターの作製
（１）抗ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体のＶＬをコードするｃＤＮＡの構築
ＷＯ９４／１１０２６に記載されている抗ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体２Ｂ８のＶＬのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ（配列番号３０に記載）をＰＣＲ法を用いて以下の様にして構築した。
まず、ＷＯ９４／１１０２６記載のＶＬの塩基配列の５’末端と３’末端にＰＣＲ反応時の増幅用プライマーの結合塩基配列（ヒト化抗体発現用ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列も含む）を付加した。設計した塩基配列を５’末端側から約１００塩基ずつ計６本の塩基配列に分け（隣り合う塩基配列は、その末端に約２０塩基の重複配列を有する様にする）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順で、実際には、配列番号３１、３２、３３、３４、３５および３６の６本の合成ＤＮＡを作製（ＧＥＮＳＥＴ社製へ委託）した。
【０３６８】
各オリゴヌクレオチドを最終濃度が０．１μＭとなる様に、５０μＬの反応液［ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ＃１（東洋紡績社製）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．５μＭ Ｍ１３ ｐｒｉｍｅｒ Ｍ４（宝酒造社製）、０．５μＭ Ｍ１３ ｐｒｉｍｅｒ ＲＶ（宝酒造社製）］に添加し、ＤＮＡサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて、９４℃にて３分間加熱した後、２．５単位のＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を添加し、９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、７４℃にて１分間のサイクルを２５サイクル行ない、更に７２℃にて１０分間反応させた。該反応液２５μＬをアガロースゲル電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約０．４４ｋｂのＶＬのＰＣＲ産物を回収した。
次に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を制限酵素ＳｍａＩ（宝酒造社製）して得られたＤＮＡ０．１μｇと、上記で得られたＰＣＲ産物約０．１μｇを滅菌水に加えて７．５μＬとし、ＴＡＫＡＲＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．２のｓｏｌｕｔｉｏｎＩ（宝酒造社製）７．５μＬ、制限酵素ＳｍａＩ（宝酒造社製）０．３μＬを加えて２２℃で２時間反応させた。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖ２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７により塩基配列を解析した。こうして目的の塩基配列を有する第２３図に示したプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｌを得た。
【０３６９】
（２）抗ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体のＶＨをコードするｃＤＮＡの構築
ＷＯ９４／１１０２６に記載されている抗ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体２Ｂ８のＶＨのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ（配列番号３７に記載）をＰＣＲ法を用いて以下の様にして構築した。
まず、ＷＯ９４／１１０２６記載のＶＨの塩基配列の５’末端と３’末端にＰＣＲ反応時の増幅用プライマーの結合塩基配列（ヒト化抗体発現用ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列も含む）を付加した。設計した塩基配列を５’末端側から約１００塩基ずつ計６本の塩基配列に分け（隣り合う塩基配列は、その末端に約２０塩基の重複配列を有する様にする）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順で、実際には、配列番号３８、３９、４０、４１、４２および４３の６本の合成ＤＮＡを作製（ＧＥＮＳＥＴ社製へ委託）した。
【０３７０】
各オリゴヌクレオチドを最終濃度が０．１μＭとなる様に、５０μＬの反応液［ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ＃１（東洋紡績社製）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．５μＭ Ｍ１３ ｐｒｉｍｅｒ Ｍ４（宝酒造社製）、０．５μＭ Ｍ１３ ｐｒｉｍｅｒ ＲＶ（宝酒造社製）］に添加し、ＤＮＡサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて、９４℃にて３分間加熱した後、２．５単位のＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を添加し、９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、７４℃にて１分間のサイクルを２５サイクル行い、更に７２℃にて１０分間反応させた。該反応液２５μＬをアガロースゲル電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約０．４９ｋｂのＶＨのＰＣＲ産物を回収した。
【０３７１】
次に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を制限酵素ＳｍａＩ（宝酒造社製）して得られたＤＮＡ０．１μｇと、上記で得られたＰＣＲ産物約０．１μｇを滅菌水に加えて７．５μＬとし、ＴＡＫＡＲＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．２のｓｏｌｕｔｉｏｎＩ（宝酒造社製）７．５μＬ、制限酵素ＳｍａＩ（宝酒造社製）０．３μＬを加えて２２℃で一晩反応させた。
この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖ２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７により塩基配列を解析した。こうして目的の塩基配列を有する第２４図に示したプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｈを得た。
【０３７２】
次に、１４番目のアミノ酸残基をＡｌａからＰｒｏへ置換するために、配列番号４５で示した合成ＤＮＡを設計し、ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ ｆｏｒ ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（宝酒造社製）を用いたＰＣＲ法により、以下の様に塩基の置換を行った。上記のプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｈを１ｎｇ含む５０μＬの反応液［ＬＡ ＰＣＲ ＢｕｆｆｅｒＩＩ（宝酒造社製）、２．５単位のＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ、０．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２．５ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｎＭ Ｔ３ ＢｃａＢＥＳＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造社製）、５０ｎＭ上記の変異導入用プライマー（配列番号４４、ＧＥＮＳＥＴ社製）］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて、９４℃にて３０秒間、５５℃にて２分間、７２℃にて１分３０秒間のサイクルを２５サイクル行なった。該反応液３０μＬをアガロースゲル電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約０．４４ｋｂのＰＣＲ産物を回収し、３０μＬの水溶液とした。また、同様に、上記のプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｈを１ｎｇ含む５０μＬの反応液［ＬＡ ＰＣＲ ＢｕｆｆｅｒＩＩ（宝酒造社製）、２．５単位のＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ、０．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２．５ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｎＭ Ｔ７ ＢｃａＢＥＳＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造社製）、５０ｎＭ ＭＵＴ Ｂ１ ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造社製）］のＰＣＲ反応を行った。該反応液３０μＬをアガロースゲル電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約０．６３ｋｂのＰＣＲ産物を回収し、３０μＬの水溶液とした。続いて、上記で得られた０．４４ｋｂのＰＣＲ産物と０．６３ｋｂのＰＣＲ産物を０．５μＬずつ４７．５μＬの反応液［ＬＡ ＰＣＲ ＢｕｆｆｅｒＩＩ（宝酒造社製）、０．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２．５ｍＭ塩化マグネシウム］に添加し、ＤＮＡサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて、９０℃にて１０分間加熱した後、６０分間かけて３７℃まで冷却した後、３７℃で１５分間保持することによってＤＮＡをアニーリングさせた。２．５単位のＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造社製）を添加して７２℃にて３分間反応させた後、１０ｐｍｏｌずつのＴ３ ＢｃａＢＥＳＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造社製）とＴ７ ＢｃａＢＥＳＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造社製）を添加して反応液を５０μＬとし、９４℃にて３０秒間、５５℃にて２分間、７２℃にて１分３０秒間のサイクルを１０サイクル行った。該反応液２５μＬをＱＩＡ ｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）にて精製した後、半量を１０単位の制限酵素ＫｐｎＩ（宝酒造社製）と１０単位の制限酵素ＳａｃＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．５９ｋｂのＫｐｎＩ−ＳａｃＩ断片を回収した。
【０３７３】
次に、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）１μｇを１０単位の制限酵素ＫｐｎＩ（宝酒造社製）と１０単位のＳａｃＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた後、該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約２．９ｋｂのＫｐｎＩ−ＳａｃＩ断片を回収した。
上記で得られたＰＣＲ産物由来のＫｐｎＩ−ＳａｃＩ断片とプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）由来のＫｐｎＩ−ＳａｃＩ断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）のＳｏｌｕｔｉｏｎＩを用いて添付の説明書に従って連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖ２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７により塩基配列を解析した。
こうして目的の塩基配列を有する第２４図に示したプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｈｍを得た。
【０３７４】
（３）抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３７，１０３５，２０００）と参考例４（Ｅ１）の１項（１）および（２）で得られたプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８ＬおよびｐＢＳ−２Ｂ８Ｈｍを用いて抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体（以下、抗ＣＤ２０キメラ抗体と表記する）の発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８Ｐを以下の様にして構築した。
参考例４（Ｅ１）の１項（１）で得られたプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｌの２μｇを１０単位の制限酵素ＢｓｉＷＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて５５℃で１時間反応させた後、更に１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．４１ｋｂのＢｓｉＷＩ−ＥｃｏＲＩ断片を回収した。
次に、ヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３の２μｇを１０単位の制限酵素ＢｓｉＷＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて５５℃で１時間反応させた後、更に１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約１２．７５ｋｂのＢｓｉＷＩ−ＥｃｏＲＩ断片を回収した。
【０３７５】
次に、上記で得られたプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｌ由来ＢｓｉＷＩ−ＥｃｏＲＩ断片とプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３由来のＢｓｉＷＩ−ＥｃｏＲＩ断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）のＳｏｌｕｔｉｏｎＩを用いて添付の説明書に従って連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、第２５図に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８−Ｌを得た。
次に、参考例４（Ｅ１）の１項（２）で得られたプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｈｍの２μｇを１０単位の制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた後、更に１０単位の制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．４５ｋｂのＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片を回収した。
次に、上記で得られたプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８−Ｌの３μｇを１０単位の制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた後、更に１０単位の制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約１３．１６ｋｂのＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片を回収した。
次に、上記で得られたプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｈｍ由来のＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片とプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８−Ｌ由来のＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）のＳｏｌｕｔｉｏｎＩを用いて、添付の説明書に従って連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製した。
得られたプラスミドを用い、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖ２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を同社のＤＮＡシークエンサー３７７を用いて塩基配列の解析を行った結果、目的のＤＮＡがクローニングされている第２５図に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８Ｐが得られたことを確認した。
【０３７６】
２．抗ＣＤ２０キメラ抗体の動物細胞を用いた安定発現
（１）ラットミエローマＹＢ／０細胞を用いた生産細胞の作製
上記参考例４（Ｅ１）の１項（３）で得られた抗ＣＤ２０キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８Ｐを用いて抗ＣＤ２０キメラ抗体の動物細胞での発現を以下の様にして行った。
プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８Ｐの１０μｇを４×１０６細胞のラットミエローマ細胞株ＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２）へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、４０ｍｌのＨ−ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）培地（牛胎児血清（ＦＣＳ）を５％添加）に懸濁し、９６ウェルマイクロタイタープレート（住友ベークライト社製）に２００μＬ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８を１ｍｇ／ｍｌになる様に添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、コンフルエントになったウェルより培養上清を回収し、培養上清中のヒトＩｇＧ抗体の産生量を参考例４（Ｅ１）の２項（２）に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。
【０３７７】
培養上清中にヒトＩｇＧ抗体の発現が認められたウェルの形質転換株については、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系を利用して抗体発現量を増加させる目的で、Ｇ４１８を１ｍｇ／ｍＬ、ｄｈｆｒ遺伝子産物のジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ＤＨＦＲと表記する）の阻害剤であるメソトレキセート（以下、ＭＴＸと表記する：ＳＩＧＭＡ社製）を５０ｎＭ含むＨ−ＳＦＭ培地に１〜２×１０５細胞／ｍｌになる様に懸濁し、２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に１ｍＬずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎＭ ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換株がウェルにコンフルエントになった時点で培養上清中のヒトＩｇＧ抗体の産生量を参考例４（Ｅ１）の２項（２）に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。培養上清中にヒトＩｇＧ抗体の発現が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を１００ｎＭ、２００ｎＭと順次上昇させ、最終的にＧ４１８を１ｍｇ／ｍＬ、ＭＴＸを２００ｎＭの濃度で含むＨ−ＳＦＭ培地で増殖可能かつ、抗ＣＤ２０キメラ抗体を高発現する形質転換株を得た。得られた形質転換株については、限界希釈法による単一細胞化（クローン化）を行い、抗ＣＤ２０キメラ抗体を発現するクローンＫＭ３０６５を取得した。尚、ＷＯ００／６１７３９の実施例８に示すα１，６−フコシルトランスフェラーゼの遺伝子の転写物の定量法を用い、該転写物の量が比較的低い株を優良株として選択し、用いた。
このようにして得られた抗ＣＤ２０キメラ抗体を生産する形質転換クローンＫＭ３０６５は平成１３年１２月２１日付で、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にＦＥＲＭ ＢＰ−７８３４として寄託されている。
【０３７８】
（２）培養上清中のヒトＩｇＧ抗体濃度の測定（ＥＬＩＳＡ法）
ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ社製）をＰｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（以下、ＰＢＳと表記する）で希釈して１μｇ／ｍＬとし、９６穴のＥＬＩＳＡ用プレート（グライナー社製）に、５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、１％牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡと表記する；ＡＭＰＣ社製）を含むＰＢＳ（以下、１％ＢＳＡ−ＰＢＳと表記する）を１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、形質転換株の培養上清、精製したヒト型キメラ抗体の各種希釈溶液を５０μＬ／ウェルで加え、室温で２時間反応させた。反応後、各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと表記する）で洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで３０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ社製）を二次抗体溶液として、それぞれ５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。
反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素を１μＬ／ｍｌで添加した溶液］を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、４１５ｎｍの吸光度（以下、ＯＤ４１５と表記する）を測定した。
【０３７９】
３．抗ＣＤ２０キメラ抗体の培養上清からの精製
参考例４の２項（１）で得られた抗ＣＤ２０キメラ抗体を発現する形質転換細胞クローンＫＭ３０６５をＭＴＸを２００ｎＭ、Ｄａｉｇｏ’ｓ ＧＦ２１（和光純薬製）を５％の濃度で含むＨ−ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）に１×１０５細胞／ｍｌとなる様に懸濁し、１８２ｃｍ２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に５０ｍｌ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で７日間培養し、コンフルエントになった時点で培養上清を回収した。培養上清よりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（ミリポア社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＣＤ２０キメラ抗体ＫＭ３０６５を精製した。得られた抗ＣＤ２０キメラ抗体ＫＭ３０６５の約３μｇを、公知の方法［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０（１９７０）］に従って電気泳動し、分子量および精製度を調べた。その結果、精製した抗ＣＤ２０キメラ抗体ＫＭ３０６５は、非還元条件下は約１５０キロダルトン（以下、Ｋｄと表記する）であり、還元条件下では約５０Ｋｄと約２５Ｋｄの２本のバンドが認められた。これらの蛋白質の大きさは、ＩｇＧ型の抗体は、非還元条件下では分子量は約１５０Ｋｄであり、還元条件下では分子内のジスルフィド結合（以下、Ｓ−Ｓ結合と表記する）が切断され、約５０Ｋｄの分子量を持つＨ鎖と約２５Ｋｄの分子量を持つＬ鎖に分解されるという報告［アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４，１９８８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６］と一致し、ＲｉｔｕｘａｎＴＭの泳動パターンともほぼ一致することから、抗ＣＤ２０キメラ抗体ＫＭ３０６５が正しい構造の抗体分子として発現されていることが確認された。
【０３８０】
参考例５．レクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の作製と該細胞を用いた抗体の生産
１．レクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４株の取得
ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を、ＩＭＤＭ−ＦＢＳ（１０）培地［ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％、ＨＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を１倍濃度含むＩＭＤＭ培地］にて接着培養用フラスコ７５ｃｍ２（グライナー社製）中で培養し、コンフルエント直前まで増殖させた。５ｍｌのダルベッコＰＢＳ（インビトロジェン社製）にて細胞を洗浄後、ダルベッコＰＢＳで希釈した０．０５％トリプシン（インビトロジェン社製）を１．５ｍｌ添加して３７℃にて５分間放置し、細胞を培養器底面から剥離させた。剥離させた細胞を通常の細胞培養で行われる遠心分離操作により回収し、１（１０５細胞／ｍｌの密度になるようにＩＭＤＭ−ＦＢＳ（１０）培地を添加して懸濁後、未添加または０．１μｇ／ｍｌのアルキル化剤であるＭＮＮＧ（シグマ社製）を添加した。ＣＯ２インキュベータ（ＴＡＢＡＩ製）内で３７℃にて３日間放置後、培養上清を除き、再び上述した操作と同様の操作で細胞を洗浄、剥離、回収し、ＩＭＤＭ−ＦＢＳ（１０）培地に懸濁後、接着培養用９６穴プレート（岩城硝子社製）に１０００細胞／ウエルの密度で播種した。各ウエルには培地中終濃度で１ｍｇ／ｍｌのレンズマメレクチン（Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；以下、ＬＣＡと表記、Ｖｅｃｔｏｒ社製）、あるいは１ｍｇ／ｍｌのヒイロチャワンタケレクチン（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ Ｌｅｃｔｉｎ；以下、ＡＡＬと表記、Ｖｅｃｔｏｒ社製）、あるいは１ｍｇ／ｍｌのインゲンマメレクチン（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｌｅｕｃｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；以下、Ｌ−ＰＨＡと表記、Ｖｅｃｔｏｒ社製）を添加した。ＣＯ２インキュベータ内で３７℃にて２週間培養後、出現したコロニーをレクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４株として取得した。取得したそれぞれのレクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４株については、ＬＣＡ耐性株をＣＨＯ−ＬＣＡ株、ＡＡＬ耐性株をＣＨＯ−ＡＡＬ株、Ｌ−ＰＨＡ耐性株をＣＨＯ−ＰＨＡ株と名付けた。取得したこれら株の各種レクチンに対する耐性を調べたところ、ＣＨＯ−ＬＣＡ株はＡＡＬに対しても耐性であり、ＣＨＯ−ＡＡＬ株はＬＣＡに対しても耐性であることが分かった。さらに、ＣＨＯ−ＬＣＡ株およびＣＨＯ−ＡＡＬ株は、ＬＣＡやＡＡＬが認識する糖鎖構造と同じ糖鎖構造を認識するレクチン、すなわち、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基の６位とフコースの１位がα結合で付加された糖鎖構造を認識するレクチンに対しても耐性を示した。具体的には、終濃度１ｍｇ／ｍｌのエンドウマメレクチン（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；以下、ＰＳＡと表記、Ｖｅｃｔｏｒ社製）が添加された培地でもＣＨＯ−ＬＣＡ株およびＣＨＯ−ＡＡＬ株は耐性を示し生存することが分かった。また、アルキル化剤ＭＮＮＧ無添加の場合でも、レクチン耐性株を取得することが可能であった。
【０３８１】
３．レクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を用いた抗ガングリオシドＧＤ３ヒト型キメラ抗体の生産と該抗体の活性評価
（１）抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体生産細胞の作製
上記１項で得られた３種類のレクチン耐性株に、参考例２の１項（２）に記載した方法で、抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体発現プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２１６０を導入し、薬剤ＭＴＸによる遺伝子増幅を行い、抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体生産株を作製した。抗体発現量の測定は参考例２の２項に記載したＥＬＩＳＡ法を用いて行い、ＣＨＯ−ＬＣＡ株、ＣＨＯ−ＡＡＬ株、ＣＨＯ−ＰＨＡ株、それぞれから抗体を発現した形質転換株を取得した。取得したそれぞれの形質転換株については、ＣＨＯ−ＬＣＡ株由来の形質転換株をＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株、ＣＨＯ−ＡＡＬ株由来の形質転換株をＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＡＡＬ株、ＣＨＯ−ＰＨＡ株由来の形質転換株をＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＰＨＡ株と名付けた。なおＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株はＮｅｇａ−１３の株名で、平成１３年９月２６日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地 中央第６）にＦＥＲＭ ＢＰ−７７５６として寄託されている。
【０３８２】
（２）レクチン耐性ＣＨＯ細胞による抗ＣＣＲ４キメラ抗体の生産と該抗体の活性評価
上記（１）で得られた３種類の形質転換株を用い、参考例１の３項に記載した方法で精製抗体を取得した。各抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体精製標品の抗原結合活性は参考例２の２項に記載したＥＬＩＳＡ法を用いて評価した。いずれの形質転換株が生産する抗体も、参考例２で作製した通常のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を宿主とした組換え細胞株（５−０３株）が生産する抗体と同等の抗原結合活性を示した。それら精製抗体を用い、実施例２の２項に記載した方法にしたがって各抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体精製標品のＡＤＣＣ活性を評価した。その結果を第２６図に示した。５−０３株が生産した抗体と比較して、ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株およびＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＡＡＬ株が生産した抗体では、約１００倍程度のＡＤＣＣ活性の上昇が観察された。一方、ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＰＨＡ株が生産した抗体では有意なＡＤＣＣ活性の上昇は観察されなかった。また、ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株とＹＢ２／０株が生産した抗体のＡＤＣＣ活性を参考例１の７に記載した方法にしたがって比較したところ、ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株が生産した抗体は参考例２で作製したＹＢ２／０細胞株が生産した抗体ＫＭ２７６０−１と同様に、５−０３株が生産した抗体に比べ高いＡＤＣＣ活性を示すことが明らかとなった（第２７図）。
【０３８３】
（３）レクチン耐性ＣＨＯ細胞が生産する抗体の糖鎖解析
参考例５の２項（２）にて精製した抗ＧＤ３キメラ抗体の糖鎖解析をＷＯ００／６１７３９の実施例５に記載の方法に従って行った。その結果得られた、各抗体におけるα−１，６フコースを持たない糖鎖の割合を第７表に示した。
【０３８４】
【表７】
Figure 0004832719
【０３８５】
５−０３株が生産した抗体と比較して、ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株が生産した抗体では、α１，６−フコースを持たない糖鎖の割合が、９％から４８％まで上昇していた。ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＡＡＬ株が生産した抗体では、α１，６−フコースを持たない糖鎖の割合が、９％から２７％まで上昇していた。一方、ＰＨＡ耐性株では５−０３株と比較して、糖鎖パターンおよびα１，６−フコースを持たない糖鎖の割合に殆ど変化は認められなかった。上記（２）の結果と併せて推察すると、レクチンに耐性を有する細胞より生産される、α１，６−フコースを持たない糖鎖の割合が２０％以上の抗体組成物は、レクチンに耐性有さないを細胞より生産される抗体組成物よりも大幅に高いＡＤＣＣ活性を示すことが明らかとなった。
【０３８６】
３．レクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を用いた抗ガングリオシドＧＤ３ヒト型キメラ抗体の生産と該抗体の活性評価
（１）抗ＧＤ３キメラ抗体安定生産細胞の作製
ＷＯ００／６１７３９に記載の抗ＧＤ３キメラ抗体発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＬＨＧＭ４の４μｇを、１．６×１０６細胞のＣＨＯ／ＤＧ４４株、および参考例５の１項で作製したＣＨＯ−ＬＣＡ株へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、体積比１０％の透析牛胎児血清（インビトロジェン社製）を含むＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製、ＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地と表記）１０ｍｌに懸濁し、９６ウェル培養用プレート（岩城硝子社製）に２００μｌ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で２週間培養した。培地中の核酸成分に非依存的な増殖を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ＧＤ３キメラ抗体の抗原結合活性を、参考例１の２項に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。
【０３８７】
培養上清中に抗ＧＤ３キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、メトトレキセート（Ｓｉｇｍａ社製、ＭＴＸと表記）を５０ｎＭ含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地に１×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、２４ウェルプレート（岩城硝子社製）に０．５ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で２週間培養して、５０ｎＭ ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。増殖が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を２００ｎＭに上昇させ、３７℃で２週間培養して、２００ｎＭ ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。増殖が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を５００ｎＭに上昇させ、３７℃で２週間培養して、５００ｎＭ ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。
【０３８８】
最終的にＭＴＸを５００ｎＭの濃度で含むＩＭ ＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、抗ＧＤ３キメラ抗体を高生産する安定な形質転換体を得た。得られた形質転換株については、限界希釈法による単一細胞化（クローン化）を行いクローン化株を取得した。ＣＨＯ−ＬＣＡ株を遺伝子導入の宿主細胞として得られたクローン化株をＣＨＯ／ＧＤ３−ＬＣＡ−１株、ＣＨＯ／ＧＤ３−ＬＣＡ−２株と名付けた。ＣＨＯ／ＤＧ４４株宿主細胞として得られたクローン化株をＣＨＯ／ＧＤ３株と名付けた。ＣＨＯ／ＧＤ３−ＬＣＡ−１株は、平成１４年１１月１１日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地 中央第６）にＦＥＲＭ ＢＰ−８２３６として寄託されている。
【０３８９】
（２）レクチン耐性ＣＨＯ細胞による抗ＧＤ３キメラ抗体の生産と該抗体の活性評価
上記（１）で得られた抗ＧＤ３キメラ抗体を生産する形質転換細胞クローンＣＨＯ／ＧＤ３−ＬＣＡ−１株とＣＨＯ／ＧＤ３−ＬＣＡ−２株について、市販無血清培地ＥＸ−ＣＥＬＬ３０１培地（ＪＲＨ社製）に１×１０６細胞／ｍｌとなるように懸濁し、１７５ｃｍ２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に３５ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で７日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（ミリポア社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＧＤ３キメラ抗体を精製した。精製した抗ＧＤ３キメラ抗体は、ＣＨＯ／ＧＤ３−ＬＣＡ−１株の生産抗体をＣＨＯ／ＧＤ３−ＬＣＡ−１抗体、ＣＨＯ／ＧＤ３−ＬＣＡ−２株の生産抗体をＣＨＯ／ＧＤ３−ＬＣＡ−２抗体と名付けた。なお、比較対照として用いた、通常のＣＨＯ／ＤＧ４４株の生産抗体は、ＣＨＯ／ＧＤ３抗体と名付けた。いずれの形質転換株が生産する抗体も同等の抗原結合活性を示した。それら精製抗体を用い、実施例１の２項に記載した方法にしたがって各抗ＧＤ３ヒト型キメラ抗体精製標品のＡＤＣＣ活性を評価した。その結果を第２８図に示した。第２８図に示したように、３種類の抗ＧＤ３キメラ抗体のうち、ＣＨＯ／ＧＤ３−ＬＣＡ−２抗体が最も高いＡＤＣＣ活性を示し、次いでＣＨＯ／ＧＤ３−ＬＣＡ−１抗体、ＣＨＯ−ＧＤ３抗体の順に高いＡＤＣＣ活性を示した。以上の結果は、ＬＣＡレクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４株では、生産抗体のＡＤＣＣ活性が上昇することを示している。
【０３９０】
（４）抗ＧＤ３キメラ抗体の糖鎖解析
参考例５の３項（２）にて精製した抗ＧＤ３キメラ抗体の糖鎖解析をＷＯ００／６１７３９の実施例５に記載の方法に従って行った。その結果得られた、各抗体におけるα−１，６フコースを持たない糖鎖の割合を第８表に示した。
【０３９１】
【表８】
Figure 0004832719
【０３９２】
第８表に示した通り、ＣＨＯ／ＧＤ３−ＬＣＡ−１抗体では、通常のＣＨＯ／ＧＤ３抗体と比較して、α１，６−フコースを持たない複合二本鎖型糖鎖の割合が、９％から４２％まで上昇した。また、ＣＨＯ／ＧＤ３−ＬＣＡ−２抗体では、α１，６−フコースを持たない複合二本鎖型糖鎖の割合が、９％から８０％まで上昇していた。
【０３９３】
参考例６．可溶性ヒトＦｃγＲＩＩＩａ蛋白質の作製
１．可溶性ヒトＦｃγＲＩＩＩａ蛋白質の発現ベクターの構築
（１）ヒト末梢血単核球ｃＤＮＡの作製
健常人の静脈血３０ｍＬを採取し、ヘパリンナトリウム（清水製薬社製）０．５ｍＬを加えて穏やかに混和した後、生理的食塩水（大塚製薬社製）３０ｍＬと混合した。混合後、各１０ｍＬをそれぞれＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＮＹＣＯＭＥＤ ＰＨＡＲＭＡ ＡＳ社製）４ｍＬ上に穏やかに重層し、室温下２０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離を行った。分離された単核球画分を各遠心管より集めて混合し、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）３０ｍＬに懸濁した。室温下１２００ｒｐｍで１５分の遠心分離を行った後、上清を除去し、該細胞をＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）２０ｍＬに懸濁した。この洗浄操作を２回繰り返した後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）を用いて２×１０６個／ｍＬの末梢血単核球懸濁液を調製した。
上記のようにして調製した末梢血単核球懸濁液の５ｍＬを室温下８００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行った後、上清を除去し、５ｍＬのＰＢＳに懸濁した。室温下８００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行った後、上清を除去し、ＱＩＡａｍｐ ＲＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付の説明書に従い、全ＲＮＡを抽出した。
得られた全ＲＮＡ２μｇに対し、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて添付の説明書に従い、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとした４０μＬの系で逆転写反応を行うことにより、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。
【０３９４】
（２）ヒトＦｃγＲＩＩＩａ蛋白質をコードするｃＤＮＡの取得
ヒトＦｃγＲＩＩＩａ蛋白質（以下、ｈＦｃγＲＩＩＩａと表記する）のｃＤＮＡの取得は、以下の手順で行った。
まず、ｈＦｃγＲＩＩＩａのｃＤＮＡの塩基配列［ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．），１７０，４８１（１９８９）］より、翻訳開始コドンを含む特異的なフォワードプライマー（配列番号３に示す）および翻訳終止コドンを含む特異的なリバースプライマー（配列番号４に示す）を設計した。
次にＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を用いて、参考例６の１項（１）で調製したヒト末梢血単核球由来のｃＤＮＡ溶液の２０倍希釈液５μＬを含む５０μＬの反応液［１倍濃度のＥｘＴａｑ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ、１μｍｏｌ／Ｌ上記遺伝子特異的プライマー（配列番号３および４）］を調製し、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で３０秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で６０秒間からなる反応を１サイクルとして、３５サイクル行った。
ＰＣＲ後、反応液をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、滅菌水２０μＬに溶解した。制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）およびＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、特異的増幅断片約８００ｂｐを回収した。
【０３９５】
一方、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）２．５μｇ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）およびＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、約２．９ｋｂｐの断片を回収した。
【０３９６】
上記で得たヒト末梢血単核球ｃＤＮＡ由来増幅断片とプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）由来の断片を、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２．０（宝酒造社製）を用いて連結反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、得られたアンピシリン耐性コロニーより公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。
【０３９７】
各プラスミドに挿入されたｃＤＮＡの塩基配列は、ＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）およびＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を添付マニュアルに従い使用して決定した。本法により配列決定した全ての挿入ｃＤＮＡが、ｈＦｃγＲＩＩＩａのｃＤＮＡのＯＲＦ全長配列をコードすることを確認した。結果として２種類のｈＦｃγＲＩＩＩａをコードするｃＤＮＡを得た。一つは、配列番号５に示した配列であり、該配列を含むプラスミドとしてｐＢＳＦｃγＲＩＩＩａ５−３を得た。配列番号５の塩基配列に対応するアミノ酸配列を配列番号６に示す。もう一つは、配列番号７に示した配列であり、該配列を含むプラスミドとしてｐＢＳＦｃγＲＩＩＩａ３を得た。配列番号７の塩基配列に対応するアミノ酸配列を配列番号８に示す。配列番号５と配列番号７の違いは、５３８番目の塩基がそれぞれＴとＧであり、その結果、対応するアミノ酸配列は、配列上、１７６番目がそれぞれＰｈｅとＶａｌであった。以下、配列番号６記載のアミノ酸配列のｈＦｃγＲＩＩＩａをｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）、配列番号８記載のアミノ酸配列のｈＦｃγＲＩＩＩａをｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）と称す。
【０３９８】
（３）可溶性ｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）をコードするｃＤＮＡの取得
ｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）の細胞外領域（配列番号６の１〜１９３番目）とＣ末端にＨｉｓ−ｔａｇ配列を持つ可溶性ｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）［以下、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）と表記する］をコードするｃＤＮＡを以下のようにして構築した。
まず、ｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）のｃＤＮＡの塩基配列（配列番号５）より、細胞外領域に特異的なプライマーＦｃｇＲ３−１（配列番号９に示す）を設計した。
次にＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を用いて、参考例６の１項（２）で作製したプラスミドｐＢＳＦｃγＲＩＩＩａ５−３の５ｎｇを含む５０μＬの反応液［１倍濃度のＥｘＴａｑ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ、１μｍｏｌ／ＬプライマーＦｃｇＲ３−１、１μｍｏｌ／ＬプライマーＭ１３Ｍ４（宝酒造社製）］を調製し、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で３０秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で６０秒間からなる反応を１サイクルとして、３５サイクル行った。
【０３９９】
ＰＣＲ後、反応液をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、滅菌水２０μＬに溶解した。制限酵素ＰｓｔＩ（宝酒造社製）およびＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、特異的増幅断片約１１０ｂｐを回収した。
一方、プラスミドｐＢＳＦｃγＲＩＩＩａ５−３の２．５μｇを制限酵素ＰｓｔＩ（宝酒造社製）およびＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、約３．５ｋｂｐの断片を回収した。
上記で得たｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）ｃＤＮＡ由来増幅断片とプラスミドｐＢＳＦｃγＲＩＩＩａ５−３由来の断片を、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２．０（宝酒造社製）を用いて連結反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、得られたアンピシリン耐性コロニーより公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。
【０４００】
各プラスミドに挿入されたｃＤＮＡの塩基配列は、ＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）およびＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を添付マニュアルに従い使用して決定した。本法により配列決定した全ての挿入ｃＤＮＡが、目的のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）のｃＤＮＡのＯＲＦ全長配列をコードすることを確認した。このうちＰＣＲに伴う塩基の読み誤りを該配列内に全く含まないプラスミドＤＮＡを選択した。以下、本プラスミドをｐＢＳＦｃγＲＩＩＩａ＋Ｈｉｓ３と称す。
決定したｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）の全長ｃＤＮＡ配列を配列番号１０、それに対応するシグナル配列を含むアミノ酸配列を配列番号１１に示す。配列番号１１において、Ｎ末端メチオニンから１７６番目のアミノ酸残基はフェニルアラニンであった。
【０４０１】
（４）可溶性ｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）をコードするｃＤＮＡの取得
ｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）の細胞外領域（配列番号８の１〜１９３番目）とＣ末端にＨｉｓ−ｔａｇ配列を持つ可溶性ｈＦｃｙＲＩＩＩａ（Ｖ）［以下、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）と表記する］をコードするｃＤＮＡを以下のようにして構築した。
参考例６の１項（２）で得られたプラスミドｐＢＳＦｃγＲＩＩＩａ３の３．０μｇを制限酵素ＡｌｗＮＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で消化後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、ｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）の５’末端側を含む約２．７ｋｂｐの断片を回収した。
参考例６の１項（３）で得られたプラスミドｐＢＳＦｃγＲＩＩＩａ＋Ｈｉｓ３の３．０μｇを制限酵素ＡｌｗＮＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で消化後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、ｈＦｃγＲＩＩＩａの３’末端側とＨｉｓ−ｔａｇ配列を含む約０．９２ｋｂｐの断片を回収した。
上記で得たｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）の５’末端側を含むＤＮＡ断片とｈＦｃγＲＩＩＩａの３’末端側とＨｉｓ−ｔａｇ配列を含むＤＮＡ断片を、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２．０（宝酒造社製）を用いて連結反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、得られたアンピシリン耐性コロニーより公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。
【０４０２】
各プラスミドに挿入されたｃＤＮＡの塩基配列は、ＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）およびＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を添付マニュアルに従い使用して決定した。本法により配列決定した全ての挿入ｃＤＮＡが、目的のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）のｃＤＮＡのＯＲＦ全長配列をコードすることを確認した。このうちＰＣＲに伴う塩基の読み誤りを該配列内に全く含まないプラスミドＤＮＡを選択した。以下、本プラスミドをｐＢＳＦｃγＲＩＩＩａ＋Ｈｉｓ２と称す。
決定したｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）の全長ｃＤＮＡ配列を配列番号１２、それに対応するシグナル配列を含むアミノ酸配列を配列番号１３に示す。配列番号１３において、Ｎ末端メチオニンから１７６番目のアミノ酸残基はバリンであった。
【０４０３】
（５）ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）の発現ベクターの構築
ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）の発現ベクターは、以下のようにして構築した。
参考例６の１項（３）および（４）で得られたプラスミドｐＢＳＦｃγＲＩＩＩａ＋Ｈｉｓ３およびｐＢＳＦｃγＲＩＩＩａ＋Ｈｉｓ２の各３．０μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）およびＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、約６２０ｂｐの各断片を回収した。
一方、ＷＯ９７／１０３５４に記載のプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３の２．０μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）およびＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、約１０．７ｋｂｐの断片を回収した。
上記で得たｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）ｃＤＮＡおよびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）ｃＤＮＡを含む各ＤＮＡ断片とプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３由来の断片を、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２．０（宝酒造社製）を用いて連結反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、得られたアンピシリン耐性コロニーより公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。
【０４０４】
各プラスミドに挿入されたｃＤＮＡの塩基配列は、ＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）およびＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を添付マニュアルに従い使用して決定した。本法により配列決定したプラスミドが、目的のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）ｃＤＮＡあるいはｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）ｃＤＮＡを含むことを確認した。ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）ｃＤＮＡを含む発現ベクターを以下、ｐＫＡＮＴＥＸＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）−Ｈｉｓ、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）ｃＤＮＡを含む発現ベクターを以下、ｐＫＡＮＴＥＸＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）−Ｈｉｓと称す。
【０４０５】
２．ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）の安定生産細胞の作製
参考例６の１項で構築したｓｈＦｃγＩＩＩａ（Ｆ）の発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）−ＨｉｓおよびｓｈＦｃγＩＩＩａ（Ｖ）の発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）−ＨｉｓをラットミエローマＹＢ２／０細胞［ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６６２、ジャーナル・オブ・セルラー・バイオロジー（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），９３，５７６（１９８２）］に導入し、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）の安定生産細胞を以下のようにして作製した。
制限酵素ＡａｔＩＩで消化し、線状化したｐＫＡＮＴＥＸＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）−ＨｉｓおよびｐＫＡＮＴＥＸＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）−Ｈｉｓの各１０μｇを４×１０６細胞へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、４０ｍＬのＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ−ＦＢＳ（１０）に懸濁し、９６ウェル培養用プレート（住友ベークライト社製）に２００μＬ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８を１．０ｍｇ／ｍＬになるように添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）の生産量を参考例６の３項に記載のＥＬＩＳＡ法・BR>ノより測定した。
【０４０６】
培養上清中にｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）の生産が認められたウェルの形質転換株については、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系を利用して生産量を増加させる目的で、Ｇ４１８を１．０ｍｇ／ｍＬ、ＤＨＦＲの阻害剤であるＭＴＸ（ＳＩＧＭＡ社製）を５０ｎｍｏｌ／Ｌ含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ−ＦＢＳ（１０）培地に１〜２×１０５細胞／ｍＬになるように懸濁し、２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に２ｍＬずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎｍｏｌ／Ｌ ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換株の増殖が認められたウェルの培養上清中のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）の生産量を参考例６の３項に記載のＥＬＩＳＡ法により測定した。
【０４０７】
培養上清中にｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）の生産が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を１００ｎｍｏｌ／Ｌ、２００ｎｍｏｌ／Ｌと順次上昇させ、最終的にＧ４１８を１．０ｍｇ／ｍＬ、ＭＴＸを２００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度で含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ−ＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）を高生産する形質転換株を得た。
【０４０８】
得られた形質転換株について、２回の限界希釈法によるクローン化を行い、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）を生産する形質転換細胞クローンＫＣ１１０７およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）を生産する形質転換細胞クローンＫＣ１１１１を得た。
【０４０９】
３．ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）の検出（ＥＬＩＳＡ法）
培養上清中あるいは精製したｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）の検出、定量は、以下に示すＥＬＩＳＡ法により行った。
Ｈｉｓ−ｔａｇに対するマウス抗体Ｔｅｔｒａ・Ｈｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）をＰＢＳを用いて５μｇ／ｍＬに調製した溶液を９６ウェルのＥＬＩＳＡ用のプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に５０μＬ／ウェルで分注し、４℃、１２時間以上反応させた。反応後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、形質転換株の培養上清あるいは精製したｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）の各種希釈溶液を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで５０倍に希釈したビオチン標識マウス抗ヒトＣＤ１６抗体溶液（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで４０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識Ａｖｉｄｉｎ Ｄ溶液（Ｖｅｃｔｏｒ社製）を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、５分後に５％ＳＤＳ溶液を５０μＬ／ウェルで加えて反応を停止させた。その後、ＯＤ４１５を測定した。
【０４１０】
４．ｓｈＦｃγＲＩＩＩａの精製
参考例６の２項で得られたｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）を生産する形質転換細胞クローンＫＣ１１０７およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）を生産する形質転換細胞クローンＫＣ１１１１をＧ４１８を１．０ｍｇ／ｍＬ、ＭＴＸを２００ｎｍｏｌ／Ｌで含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ−ＧＦ（５）［５％ Ｄａｉｇｏ’ｓ ＧＦ２１（和光純薬社製）を含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）］に３×１０５細胞／ｍＬとなるように懸濁し、１８２ｃｍ２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に５０ｍＬ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で４日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりＮｉ−ＮＴＡ ａｇａｒｏｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）を精製した。
【０４１１】
５．精製したｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）の解析
参考例６の４項で得られた精製ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）の濃度は、以下のようにしてアミノ酸組成分析を行い、算出した。精製ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）の一部を６ｍｏｌ／Ｌ塩酸、１％フェノール溶液に懸濁し、１１０℃で２０時間、気相中で加水分解を行った。加水分解には、Ｗａｔｅｒｓ社製ワークステーションを使用した。加水分解後のアミノ酸をＢｉｄｌｉｎｇｍｅｙｅｒらの方法［ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．），３３６，９３（１９８４）］に従い、ＰＴＣ−アミノ酸誘導体として、ＰｉｃｏＴａｇアミノ酸分析装置（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いて分析した。
次に、精製したｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）の約０．５μｇを公知の方法［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０（１９７０）］に従って還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、分子量および精製度を解析した。その結果を第２８図に示した。第２９図に示したように、精製したｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）は、分子量３６〜３８Ｋｄのブロードなバンドが検出された。ｈＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域には、５箇所のＮ−グリコシド型の糖鎖結合可能部位が存在していることが知られており［ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．），１７０，４８１（１９８９）］、精製したｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）のブロードな分子量の分布は、糖鎖付加の不均一性に起因すると考えられた。一方、精製したｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）のＮ末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサーＰＰＳＱ−１０（島津製作所製）を用いて自動エドマン分解により解析した結果、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）のｃＤＮＡより予想される配列が得られたことより、目的のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）が精製できたことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０４１２】
本発明によって、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞から生産された抗体組成物を有効成分として含有する、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有さない細胞から生産された抗体組成物を有効成分として含有する医薬では治療できないＦｃγＲＩＩＩａ多型患者に適応する医薬が提供される。
【配列表フリーテキスト】
【０４１３】
配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】 SEQUENCE LISTING
<110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD.
<120> Therapeutic agent for patients having human FcgRIIIa
<140> 2003-581809
<141> 2003-04-09
<150> 2002-106951
<151> 2002-04-09
<160> 44
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Asp Glu Ser Ile Tyr Ser Asn Tyr Tyr Leu Tyr Glu Ser Ile Pro Lys
1 5 10 15
Pro Cys
<210> 2
<211> 25
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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20 25
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 3
taaatagaat tcggcatcat gtggcagctg ct 32
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 4
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<211> 788
<212> DNA
<213> Homo sapiens
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Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu
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cta gtt tca gct ggc atg cgg act gaa gat ctc cca aag gct gtg gtg 96
Leu Val Ser Ala Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val
15 20 25
ttc ctg gag cct caa tgg tac agg gtg ctc gag aag gac agt gtg act 144
Phe Leu Glu Pro Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr
30 35 40
ctg aag tgc cag gga gcc tac tcc cct gag gac aat tcc aca cag tgg 192
Leu Lys Cys Gln Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp
45 50 55 60
ttt cac aat gag agc ctc atc tca agc cag gcc tcg agc tac ttc att 240
Phe His Asn Glu Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile
65 70 75
・ gac gct gcc aca gtc gac gac agt gga gag tac agg tgc cag aca aac 288
Asp Ala Ala Thr Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn
80 85 90
ctc tcc acc ctc agt gac ccg gtg cag cta gaa gtc cat atc ggc tgg 336
Leu Ser Thr Leu Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp
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ctg ttg ctc cag gcc cct cgg tgg gtg ttc aag gag gaa gac cct att 384
Leu Leu Leu Gln Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile
110 115 120
cac ctg agg tgt cac agc tgg aag aac act gct ctg cat aag gtc aca 432
His Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr
125 130 135 140
tat tta cag aat ggc aaa ggc agg aag tat ttt cat cat aat tct gac 480
Tyr Leu Gln Asn Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp
145 150 155
ttc tac att cca aaa gcc aca ctc aaa gac agc ggc tcc tac ttc tgc 528
Phe Tyr Ile Pro Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys
160 165 170
agg ggg ctt ttt ggg agt aaa aat gtg tct tca gag act gtg aac atc 576
Arg Gly Leu Phe Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile
175 180 185
acc atc act caa ggt ttg gca gtg tca acc atc tca tca ttc ttt cca 624
Thr Ile Thr Gln Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro
190 195 200
cct ggg tac caa gtc tct ttc tgc ttg gtg atg gta ctc ctt ttt gca 672
Pro Gly Tyr Gln Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala
205 210 215 220
gtg gac aca gga cta tat ttc tct gtg aag aca aac att cga agc tca 720
Val Asp Thr Gly Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser
225 230 235
aca aga gac tgg aag gac cat aaa ttt aaa tgg aga aag gac cct caa 768
Thr Arg Asp Trp Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln
240 245 250
gac aaa tga ccc cag gat cc 788
Asp Lys
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<211> 254
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
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Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
20 25 30
Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
35 40 45
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
50 55 60
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
65 70 75 80
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
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Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
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His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
130 135 140
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
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Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Phe
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Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
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Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
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・ 210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp
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Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
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<220>
<221> CDS
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Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu
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cta gtt tca gct ggc atg cgg act gaa gat ctc cca aag gct gtg gtg 96
Leu Val Ser Ala Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val
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ttc ctg gag cct caa tgg tac agg gtg ctc gag aag gac agt gtg act 144
Phe Leu Glu Pro Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr
30 35 40
ctg aag tgc cag gga gcc tac tcc cct gag gac aat tcc aca cag tgg 192
Leu Lys Cys Gln Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp
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Phe His Asn Glu Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile
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gac gct gcc aca gtc gac gac agt gga gag tac agg tgc cag aca aac 288
Asp Ala Ala Thr Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn
80 85 90
ctc tcc acc ctc agt gac ccg gtg cag cta gaa gtc cat atc ggc tgg 336
Leu Ser Thr Leu Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp
95 100 105
ctg ttg ctc cag gcc cct cgg tgg gtg ttc aag gag gaa gac cct att 384
Leu Leu Leu Gln Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile
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cac ctg agg tgt cac agc tgg aag aac act gct ctg cat aag gtc aca 432
His Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr
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tat tta cag aat ggc aaa ggc agg aag tat ttt cat cat aat tct gac 480
Tyr Leu Gln Asn Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp
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ttc tac att cca aaa gcc aca ctc aaa gac agc ggc tcc tac ttc tgc 528
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agg ggg ctt gtt ggg agt aaa aat gtg tct tca gag act gtg aac atc 576
Arg Gly Leu Val Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile
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acc atc act caa ggt ttg gca gtg tca acc atc tca tca ttc ttt cca 624
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190 195 200
cct ggg tac caa gtc tct ttc tgc ttg gtg atg gta ctc ctt ttt gca 672
Pro Gly Tyr Gln Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala
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aca aga gac tgg aag gac cat aaa ttt aaa tgg aga aag gac cct caa 768
Thr Arg Asp Trp Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln
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gac aaa tga ccc cag gat cc 788
Asp Lys
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<213> Homo sapiens
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<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(420)
<400> 14
atg gaa tgg atc tgg atc ttt ctc ttc ttc ctc tca gga act aca ggt 48
Met Glu Trp Ile Trp Ile Phe Leu Phe Phe Leu Ser Gly Thr Thr Gly
1 5 10 15
gtc tac tcc cag gtt cag ctg cag cag tct gga gct gag gtg gcg agg 96
Val Tyr Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Arg
20 25 30
ccc ggg gct tca gtg aaa ctg tcc tgc aag gct tct ggc tac acc ttc 144
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
act gac tac tat cta aac tgg gtg aag cag agg tct gga cag ggc ctt 192
Thr Asp Tyr Tyr Leu Asn Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu
50 55 60
gag tgg att gga gag att gat cct gga agt gat agt ata tat tat aat 240
Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asp Pro Gly Ser Asp Ser Ile Tyr Tyr Asn
65 70 75 80
gaa aac ttg gag ggc agg gcc aca ctg act gca gac aaa tcc tcc agc 288
Glu Asn Leu Glu Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
aca gcc tac atg cag ctc aac agc ctg aca tct gag gac tct gca gtc 336
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
tat ttc tgt gca aga tat ggg tat tct aga tac gac gta agg ttt gtc 384
Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Gly Tyr Ser Arg Tyr Asp Val Arg Phe Val
115 120 125
tac tgg ggc caa ggg act ctg gtc act gtc tct aca 420
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Thr
130 135 140
<210> 15
<211> 140
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 15
Met Glu Trp Ile Trp Ile Phe Leu Phe Phe Leu Ser Gly Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val Tyr Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Arg
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asp Tyr Tyr Leu Asn Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asp Pro Gly Ser Asp Ser Ile Tyr Tyr Asn
65 70 75 80
Glu Asn Leu Glu Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Gly Tyr Ser Arg Tyr Asp Val Arg Phe Val
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Thr
130 135 140
<210> 16
<211> 393
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(393)
<400> 16
atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct gct 48
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala
1 5 10 15
tcc agg agt gat gtt ttg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc 96
Ser Arg Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
20 25 30
agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag agt ctt 144
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu
35 40 45
gta cat agt aat gga aga acc tat tta gaa tgg tac ctg cag aaa cct 192
Val His Ser Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
50 55 60
ggc cag tca cca aag gtc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga att tct 240
Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser
65 70 75 80
ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca 288
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
ctc aaa atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc 336
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys
100 105 110
ttt cag ggt tca cat gtt ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg 384
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
gaa ata aaa 393
Glu Ile Lys
130
<210> 17
<211> 131
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 17
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala
1 5 10 15
Ser Arg Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
20 25 30
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu
35 40 45
Val His Ser Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys
100 105 110
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys
130
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 18
Asp Tyr Tyr Leu Asn
1 5
<210> 19
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 19
Glu Ile Asp Pro Gly Ser Asp Ser Ile Tyr Tyr Asn Glu Asn Leu Glu
1 5 10 15
Gly
<210> 20
<211> 12
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 20
Tyr Gly Tyr Ser Arg Tyr Asp Val Arg Phe Val Tyr
1 5 10
<210> 21
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 21
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 22
Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser
1 5
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 23
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr
1 5
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA
<400> 24
ctgaattcgc ggccgctagt cc 22
<210> 25
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA
<400> 25
atgggccctt ggtggaggct gtagagacag tgaccagag 39
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA
<400> 26
ctgaattcgc ggccgctgct gt 22
<210> 27
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA
<400> 27
atcgtacgtt ttatttccag cttggtcc 28
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 28
atatttacag aatggcacag g 21
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 29
gacttggtac ccaggttgaa 20
<210> 30
<211> 384
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 30
atg gat ttt cag gtg cag att atc agc ttc ctg cta atc agt gct tca 48
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Ile Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
gtc ata atg tcc aga gga caa att gtt ctc tcc cag tct cca gca atc 96
Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile
20 25 30
ctg tct gca tct cca ggg gag aag gtc aca atg act tgc agg gcc agc 144
Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser
35 40 45
tca agt gta agt tac atc cac tgg ttc cag cag aag cca gga tcc tcc 192
Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser
50 55 60
ccc aaa ccc tgg att tat gcc aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cct 240
Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
gtt cgc ttc agt ggc agt ggg tct ggg act tct tac tct ctc acc atc 288
Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile
85 90 95
agc aga gtg gag gct gaa gat gct gcc act tat tac tgc cag cag tgg 336
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
100 105 110
act agt aac cca ccc acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa atc aaa 384
Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
<210> 31
<211> 91
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 31
caggaaacag ctatgacgaa ttcgcctcct caaaatggat tttcaggtgc agattatcag 60
cttcctgcta atcagtgctt cagtcataat g 91
<210> 32
<211> 91
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 32
gtgaccttct cccctggaga tgcagacagg attgctggag actgggagag aacaatttgt 60
cctctggaca ttatgactga agcactgatt a 91
<210> 33
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 33
ctccagggga gaaggtcaca atgacttgca gggccagctc aagtgtaagt tacatccact 60
ggttccagca gaagccagga tcctccccca 90
<210> 34
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 34
ccagacccac tgccactgaa gcgaacaggg actccagaag ccaggttgga tgtggcataa 60
atccagggtt tgggggagga tcctggctt 89
<210> 35
<211> 91
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 35
tcagtggcag tgggtctggg acttcttact ctctcaccat cagcagagtg gaggctgaag 60
atgctgccac ttattactgc cagcagtgga c 91
<210> 36
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 36
gttttcccag tcacgaccgt acgtttgatt tccagcttgg tcccccctcc gaacgtgggt 60
gggttactag tccactgctg gcagtaataa 90
<210> 37
<211> 420
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 37
atg ggt tgg agc ctc atc ttg ctc ttc ctt gtc gct gtt gct acg cgt 48
Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg
1 5 10 15
gtc ctg tcc cag gta caa ctg cag cag cct ggg gct gag ctg gtg aag 96
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys
20 25 30
cct ggg gcc tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct ggc tac aca ttt 144
Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
acc agt tac aat atg cac tgg gta aaa cag aca cct ggt cgg ggc ctg 192
Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu
50 55 60
gaa tgg att gga gct att tat ccc gga aat ggt gat act tcc tac aat 240
Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn
65 70 75 80
cag aag ttc aaa ggc aag gcc aca ttg act gca gac aaa tcc tcc agc 288
Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
aca gcc tac atg cag ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct gcg gtc 336
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
tat tac tgt gca aga tcg act tac tac ggc ggt gac tgg tac ttc aat 384
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn
115 120 125
gtc tgg ggc gca ggg acc acg gtc acc gtc tct gca 420
Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala
130 135 140
<210> 38
<211> 99
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 38
caggaaacag ctatgacgcg gccgcgaccc ctcaccatgg gttggagcct catcttgctc 60
ttccttgtcg ctgttgctac gcgtgtcctg tcccaggta 99
<210> 39
<211> 98
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 39
atgtgtagcc agaagccttg caggacatct tcactgaggc cccagccttc accagctcag 60
ccccaggctg ctgcagttgt acctgggaca ggacacgc 98
<210> 40
<211> 97
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 40
caaggcttct ggctacacat ttaccagtta caatatgcac tgggtaaaac agacacctgg 60
tcggggcctg gaatggattg gagctattta tcccgga 97
<210> 41
<211> 99
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 41
gtaggctgtg ctggaggatt tgtctgcagt caatgtggcc ttgcctttga acttctgatt 60
gtaggaagta tcaccatttc cgggataaat agctccaat 99
<210> 42
<211> 99
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 42
aatcctccag cacagcctac atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct 60
attactgtgc aagatcgact tactacggcg gtgactggt 99
<210> 43
<211> 98
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 43
gttttcccag tcacgacggg cccttggtgg aggctgcaga gacggtgacc gtggtccctg 60
cgccccagac attgaagtac cagtcaccgc cgtagtaa 98
<210> 44
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 44
gagctggtga agcctggggc ctcag 25
【図面の簡単な説明】
【０４１４】
第１図は、精製した２種類の抗ＧＤ３キメラ抗体のＧＤ３との結合活性を抗体濃度を変化させて測定した図である。縦軸はＧＤ３との結合活性、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。○がＹＢ２／０−ＧＤ３キメラ抗体、●がＣＨＯ−ＧＤ３キメラ抗体の活性をそれぞれ示す。
第２図は、精製した２種類の抗ＧＤ３キメラ抗体のヒトメラノーマ細胞株Ｇ−３６１に対するＡＤＣＣ活性を示した図である。縦軸に細胞障害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。○がＹＢ２／０−ＧＤ３キメラ抗体、●がＣＨＯ−ＧＤ３キメラ抗体の活性をそれぞれ示す。
第３図は、精製した２種類の抗ＣＣＲ４キメラ抗体のヒトＣＣＲ４ペプチドとの結合活性を抗体濃度を変化させて測定した図である。縦軸はヒトＣＣＲ４ペプチドとの結合活性、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。○がＫＭ２７６０−１、●がＫＭ３０６０の活性をそれぞれ示す。
第４図は、精製した２種類の抗ＣＣＲ４キメラ抗体のヒトＣＣＲ４発現細胞ＣＣＲ４／ＥＬ−４に対するＡＤＣＣ活性を示した図である。縦軸に細胞障害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。○がＫＭ２７６０−１、●がＫＭ３０６０の活性をそれぞれ示す。
第５図は、蛍光抗体法を用いて、精製した抗ＣＤ２０キメラ抗体ＫＭ３０６５およびＲｉｔｕｘａｎＴＭのヒトＣＤ２０発現細胞Ｒａｊｉ細胞との結合活性を抗体濃度を変化させて測定した結果である。各濃度における相対蛍光強度を縦軸に、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。■がＲｉｔｕｘａｎＴＭ、○がＫＭ３０６５の活性をそれぞれ示す。
第６図は、精製した抗ＣＤ２０キメラ抗体ＫＭ３０６５およびＲｉｔｕｘａｎＴＭのヒトＣＤ２０発現細胞に対するＡＤＣＣ活性を示した図である。ＡはＲａｊｉ細胞、ＢはＲａｍｏｓ細胞、ＣはＷＩＬ２−Ｓ細胞を標的細胞にしたものである。縦軸に細胞傷害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。■がＲｉｔｕｘａｎＴＭ、○がＫＭ３０６５の活性をそれぞれ示す。
第７図は、各種抗ＧＤ３キメラ抗体のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）に対する結合活性を示した図である。縦軸に結合活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。○がＹＢ２／０−ＧＤ３キメラ抗体とｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）、□がＹＢ２／０−ＧＤ３キメラ抗体とｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）、●がＣＨＯ−ＧＤ３キメラ抗体とｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）、■がＣＨＯ−ＧＤ３キメラ抗体とｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）の活性をそれぞれ示す。
第８図は、各種抗ＣＣＲ４キメラ抗体のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）に対する結合活性を示した図である。縦軸に結合活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。○がＫＭ２７６０−１とｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）、□がＫＭ２７６０−１とｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）、●がＫＭ３０６０とｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）、■がＫＭ３０６０とｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）の活性をそれぞれ示す。
第９図は、各種抗ＦＧＦ−８キメラ抗体のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）に対する結合活性を示した図である。縦軸に結合活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。○がＹＢ２／０−ＦＧＦ８キメラ抗体とｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）、□がＹＢ２／０−ＦＧＦ８キメラ抗体とｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）、●がＣＨＯ−ＦＧＦ８キメラ抗体とｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）、■がＣＨＯ−ＦＧＦ８キメラ抗体とｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）の活性をそれぞれ示す。
第１０図は、各種抗ＣＤ２０キメラ抗体のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）に対する結合活性を示した図である。縦軸に結合活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。第１０Ａ図はｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）との結合性、第１０Ｂ図はｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）との結合性をそれぞれ示す。○がＫＭ３０６５、■がＲｉｔｕｘａｎＴＭの結合活性をそれぞれ示す。
第１１図は、各種抗ＣＣＲ４キメラ抗体のｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性を示した図である。縦軸に結合活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。第１１Ａ図はＬＣＡｒＣＨＯ−ＣＣＲ４キメラ抗体（４８％）の結合性、第１１Ｂ図はＫＭ３０６０の結合性をそれぞれ示す。●がｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）、○がｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）との結合活性をそれぞれ示す。
第１２図は、各種抗ＧＤ３キメラ抗体のｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性を示した図である。縦軸に結合活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。第１２Ａ図はＬＣＡｒＣＨＯ−ＧＤ３キメラ抗体（４２％）の結合性、第１２Ｂ図はＬＣＡｒＣＨＯ−ＧＤ３キメラ抗体（８０％）、第１２Ｃ図はＣＨＯ−ＧＤ３キメラ抗体の結合性をそれぞれ示す。●がｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）、○がｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）との結合活性をそれぞれ示す。
第１３図は、キメラ抗体のｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性をＢＩＡｃｏｒｅ２０００を用いて測定した結果を示した図である。代表例として、抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０−１と１０μｇ／ｍＬのｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）溶液を用いた結果を示した。
第１４図は、各種抗ＣＣＲ４キメラ抗体のｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性をＢＩＡｃｏｒｅ２０００を用いて測定した結果を示した図である。ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）それぞれの結合および解離反応部分を示した。ＡがＫＭ２７６０−１とｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）、ＢがＫＭ２７６０−１とｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）、Ｃが０３０６０とｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）、ＤがＫＭ３０６０とｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）の結果をそれぞれ示す。
第１５図は、各種抗ＦＧＦ−８キメラ抗体のｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性をＢＩＡｃｏｒｅ２０００を用いて測定した結果を示した図である。ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）それぞれの結合および解離反応部分を示した。ＡがＹＢ２／０−ＦＧＦ８キメラ抗体とｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）、ＢがＹＢ２／０−ＦＧＦ８キメラ抗体とｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）、ＣがＣＨＯ−ＦＧＦ８キメラ抗体とｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）、ＤがＣＨＯ−ＦＧＦ８キメラ抗体とｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）の結果をそれぞれ示す。
第１６図は、各種抗ＣＤ２０キメラ抗体のｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性をＢＩＡｃｏｒｅ２０００を用いて測定した結果を示した図である。ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）それぞれの結合および解離反応部分を示した。第１６Ａ図がＫＭ３０６５とｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）、第１６Ｂ図がＫＭ３０６５とｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）、第１６Ｃ図がＲｉｔｕｘａｎＴＭとｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）、第１６Ｄ図がＲｉｔｕｘａｎＴＭとｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）の結果をそれぞれ示す。
第１７図は、健常人ドナーのＦｃγＲＩＩＩａの１７６番目のアミノ酸配列の多型の、ＤＮＡシーケンサーを解析例を示す。上段よりＰｈｅ／Ｐｈｅ型、Ｐｈｅ／Ｖａｌ型、Ｖａｌ／Ｖａｌ型のシグナルをそれぞれ示す。矢印は遺伝子多型を有する、１７６番目のアミノ酸をコードするコドンの最初の塩基の位置を示す。
第１８図は２０人のドナーの末梢血単核球をエフェクター細胞として用いた、ＮＫ細胞１０４個あたりのＡＤＣＣ活性を示した図である。●はＣＨＯ細胞産生キメラ抗体を、○はＹＢ２／０細胞産生抗体を１０ｎｇ／ｍＬで添加したときの活性をそれぞれ示す。点線は同一ドナーの対応を示す。
第１９図は蛍光抗体法を用いて、抗体のヒト末梢血由来ＮＫ細胞に対する結合活性を測定した図である。横軸は蛍光強度を、縦軸は細胞数をそれぞれ示す。第１９Ａ図は抗ＣＣＲ４キメラ抗体を、第１９Ｂ図は抗ＣＤ２０キメラ抗体を反応させた図であり、それぞれの抗体を図中に示す。
第２０図は蛍光抗体法を用いて、ヒト末梢血由来ＮＫ細胞を抗体および抗原発現細胞と反応させた際の、ＣＤ５６陽性細胞すなわちＮＫ細胞表面上のＣＤ６９の発現強度を測定した図である。横軸は蛍光強度を、縦軸は細胞数をそれぞれ示す。第２０Ａ図は抗ＣＣＲ４キメラ抗体を１０μｇ／ｍｌの濃度で４時間、第２０Ｂ図は抗ＣＣＲ４キメラ抗体を１０μｇ／ｍｌの濃度で２４時間、第２０Ｃ図は抗ＣＤ２０キメラ抗体を０．１μｇ／ｍｌの濃度で２１時間反応させた際の図であり、それぞれの抗体および反応時間を図中に示す。
第２１図は、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨおよびプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１３３４の造成工程を示した図である。
第２２図は、精製した２種類の抗ＦＧＦ−８キメラ抗体のヒトＦＧＦ−８ペプチドとの結合活性を抗体濃度を変化させて測定した図である。縦軸はヒトＦＧＦ−８ペプチドとの結合活性、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。○がＹＢ２／０−ＦＧＦ８キメラ抗体、●がＣＨＯ−ＦＧＦ８キメラ抗体の活性をそれぞれ示す。
第２３図は、プラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｌの構築過程を示した図である。
第２４図は、プラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｈｍの構築過程を示した図である。
第２５図は、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８Ｐの構築過程を示した図である。
第２６図は、レクチン耐性株が生産した抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体のＡＤＣＣ活性を示した結果を示した図である。縦軸に細胞傷害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。□は５−０３株、■はＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株、◆はＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＡＡＬ株、▲はＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＰＨＡ株が生産した抗体の活性をそれぞれ示す。
第２７図は、レクチン耐性株が生産した抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体のＡＤＣＣ活性を評価した結果を示したものである。縦軸に細胞傷害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。□はＹＢ２／０株（ＫＭ２７６０＃５８−３５−１６）、△は５−０３株、●はＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株が生産した抗体の活性をそれぞれ示す。
第２８図は、抗ＧＤ３キメラ抗体のＡＤＣＣ活性を評価した結果を示したものである。グラフの縦軸は、標的細胞の細胞傷害の程度を、実施例２の２項に示した式で算出した値、横軸は抗ＧＤ３キメラ抗体の反応液中の濃度を示す。
第２９図は、精製したｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）の還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１５％グラジエントゲルを使用）の電気泳動パターンを示した写真である。レーン１がｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）、レーン２がｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）、レーンＭが分子量マーカーの泳動パターンをそれぞれ示す。

Claims (17)

  1. Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞から生産された抗体組成物を有効成分として含有する、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有さない細胞から生産された抗体組成物を有効成分として含有する医薬とヒトＦｃγ受容体ＩＩＩａとの親和性が、該抗体組成物が少なくとも以下の（ａ）または（ｂ）からなる群から選ばれる親和性より低い患者に適用することを特徴とする医薬。
    （ａ）ＢＩＡｃｏｒｅによるバイオセンサー法で測定した場合、２５℃でのヒトＦｃγ受容体ＩＩＩａに対する結合定数が１×１０ ７ Ｍ −１ ；
    （ｂ）等温滴定型熱量計で測定した場合、２５℃でのヒトＦｃγ受容体ＩＩＩａに対する結合定数が２×１０ ６ Ｍ −１
  2. ヒトＦｃγ受容体ＩＩＩａが、シグナル配列のＮ末端メチオニンから１７６番目のアミノ酸がフェニルアラニンを有するヒトＦｃγ受容体ＩＩＩａである、請求項１に記載の医薬。
  3. 該患者が、シグナル配列のＮ末端メチオニンから１７６番目のアミノ酸がフェニルアラニンであるヒトＦｃγ受容体ＩＩＩａを有する患者である、請求項１または２に記載の医薬。
  4. 該患者が、シグナル配列のＮ末端メチオニンから１７６番目のアミノ酸がフェニルアラニンであるヒトＦｃγ受容体ＩＩＩａのみを有する患者である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬。
  5. レクチンに耐性を有する細胞が、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる群から選ばれる蛋白質の活性が低下または欠失した細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬。
    （ａ）細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素蛋白質；
    （ｂ）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素蛋白質；
    （ｃ）細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質。
  6. レクチンが、少なくとも、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれるレクチンである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬。
    （ａ）レンズマメレクチン；
    （ｂ）エンドウマメレクチン；
    （ｃ）ソラマメレクチン；
    （ｄ）ヒイロチャワンタケレクチン。
  7. 細胞が、酵母、動物細胞、昆虫細胞および植物細胞からなる群から選ばれる細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬。
  8. 細胞が、以下の（ａ）〜（ｊ）からなる群から選ばれる細胞である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬。
    （ａ）チャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞；
    （ｂ）ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞；
    （ｃ）マウスミエローマ細胞株ＮＳＯ細胞；
    （ｄ）マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞；
    （ｅ）シリアンハムスター腎臓組織由来ＢＨＫ細胞；
    （ｆ）抗体を生産するハイブリドーマ細胞；
    （ｇ）ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞；
    （ｈ）胚性幹細胞；
    （ｉ）受精卵細胞；
    （ｊ）植物細胞。
  9. 抗体組成物が、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれる抗体分子を有効成分として含有する抗体組成物である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬。
    （ａ）ヒト抗体；
    （ｂ）ヒト化抗体；
    （ｃ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を含む抗体の断片；
    （ｄ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を有する融合蛋白質。
  10. 抗体分子のクラスがＩｇＧである、請求項９記載の医薬。
  11. Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞から生産された抗体組成物の抗体依存性細胞障害活性が、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有さない細胞から生産された抗体組成物の抗体依存性細胞障害活性よりも高い、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の医薬。
  12. 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物における抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有さない細胞から生産された抗体組成物における割合よりも高いことを特徴とする、請求項１１に記載の医薬。
  13. フコースが結合していない糖鎖が、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖である、請求項１２に記載の医薬。
  14. 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が２０％以上である抗体組成物である、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の医薬。
  15. 抗体組成物が、ＣＨＯ細胞が生産する抗体組成物である、請求項１４に記載の医薬。
  16. 医薬が、腫瘍を伴う疾患、アレルギーを伴う疾患、炎症を伴う疾患、自己免疫疾患、循環器疾患、ウイルス感染を伴う疾患または細菌感染を伴う疾患に対する診断薬、予防薬または治療薬である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の医薬。
  17. 請求項１〜１６のいずれか１項に記載の医薬を製造するための、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞から生産された抗体組成物の使用。
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