ES2828721T3 - Variantes de inmunoglobulina y usos de las mismas - Google Patents

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Abstract

Una IgG variante que comprende una región Fc de IgG1 humana en donde la variante tiene las siguientes sustituciones relativas a la región Fc de IgG1 humana de tipo silvestre, enumeradas de acuerdo con el índice de EU como en Kabat y tiene una semivida aumentada en comparación con la semivida de dicha IgG que tiene la región Fc de IgG1 humana de tipo silvestre: la treonina en el aminoácido 307 de la región Fc se sustituye por glutamina y la asparagina en el aminoácido 434 de la región Fc se sustituye por alanina; o la treonina en el aminoácido 307 de la región Fc se sustituye por glutamina, el ácido glutámico en el aminoácido 380 de la región Fc se sustituye por alanina y la asparagina en el aminoácido 434 de la región Fc se sustituye por serina.

Description

DESCRIPCIÓN
Variantes de inmunoglobulina y usos de las mismas
Solicitudes relacionadas
La presente solicitud es una solicitud no provisional presentada según 37 CFR 1.53(b)(1), que reivindica la prioridad según 35 USC 119(e) hacia la solicitud provisional número 61/105.086 presentada el 14 de octubre de 2008, la solicitud provisional número 61/152.131 presentada el 12 de febrero de 2009, la solicitud provisional número 61/171.768 presentada el 22 de abril de 2009 y la solicitud provisional número 61/220.514 presentada el 25 de junio de 2009.
Campo de la invención
La presente invención se refiere de forma general al campo de la biología molecular. Más específicamente, la presente invención se refiere a variantes de inmunoglobulina IgG con propiedades biológicas alteradas y métodos para utilizarlas.
Antecedentes de la invención
Con el transcurrir de los años, la utilización de inmunoglobulinas como agentes terapéuticos ha aumentado notablemente. Las moléculas de inmunoglobulina (Ig) que constituyen una parte importante del sistema inmunitario son de gran interés, debido a que (1) reaccionan con una familia diversa de ligandos, (2) poseen diferentes funciones efectoras y (3) son de gran importancia biológica. En la actualidad, los usos de fármacos basados en anticuerpos incluyen el tratamiento del cáncer, enfermedades autoinmunes así como de diversas enfermedades sistémicas e infecciosas. También, las inmunoglobulinas son útiles como herramientas de diagnóstico in vivo, por ejemplo, en procedimientos de diagnóstico por imágenes.
La IgG es la clase de inmunoglobulinas más importante en humanos y otros mamíferos y es utilizada en diversos tipos de inmunoterapias y procedimientos de diagnóstico. La IgG1 humana es el anticuerpo utilizado más comúnmente con fines terapéuticos. Actualmente, muchos anticuerpos en estudios clínicos se dirigen contra antígenos asociados a tumores. En particular, los anticuerpos neutralizantes anti-VEGF han demostrado suprimir el crecimiento de varias líneas celulares tumorales humanas en ratones desnudos (Kim et al. Nature 362:841-844 (1993); Warren et al. J. Clin. Invest. 95: 1789-1797 (1995); Borgstrom et al. Cancer Res. 56: 4032-4039 (1996); y Melnyk et al. CancerRes. 56:921-924 (1996)) y también inhiben la angiogénesis intraocular en modelos de trastornos retinales isquémicos (Adamis et al. Arch. Ophthalmol. 114:66-71 (1996)). De hecho, un anticuerpo anti-VEGF humanizado, bevacizumab (AVASTIN®, Genentech, South San Francisco, California) es la primera terapia aprobada por la FDA de Estados Unidos diseñada para inhibir la angiogénesis.
A pesar de su potencial, uno de los problemas de la inmunoterapia con inmunoglobulinas ha sido la persistencia de las inmunoglobulinas en la circulación. La tasa de aclaramiento de las inmunoglobulinas afecta directamente a la cantidad y frecuencia de la dosificación de la inmunoglobulina. Una dosis aumentada y la frecuencia de la dosificación pueden causar efectos adversos en el paciente y aumentar también los costes médicos.
El mecanismo del catabolismo de IgG en la circulación se ha dilucidado mediante estudios relacionados con la transferencia de inmunidad pasiva de la madre al feto/recién nacido a través de la placenta o el saco vitelino o a través del calostro (transferencia maternofetal de IgG por transcitosis) en roedores (Brambell, Lancet, ii: 1087-1093, 1966; Rodewald, J. Cell Biol., 71: 666-670, 1976; Morris et al., En: Antigen Absorption by the Gut, págs. 3-22, 1978, University Park Press, Baltimore; Jones et al., J. Clin. Invest., 51: 2916-2927, 1972). El receptor Fc neonatal (FcRn) juega un papel Importante en la transcitosis y la homeostasis de IgG en mamíferos. El FcRn es estructuralmente homólogo a las moléculas de clase I del complejo principal de histocompatibilidad (MHC; del inglés, major histocompatibility complex) y consiste de una cadena a transmembrana y p2-microglobulina (p2m). Los estudios previos en ratones nuligénicos mostraron que la semivida sérica de IgG en ratones deficientes de FcRn o p2m era muy reducida (Roopenian et al., J Immunol 170(7), 3528-3533, 2003; Israel et al., Immunology 89(4), 573-578, 1996), demostrando el papel protector del FcRn en el nivel de regulación de la IgG circulante. Diversos experimentos de mutagénesis específica de sitio en la región Fc de las IgG de ratón han conducido a la identificación de ciertos restos de aminoácidos críticos que intervienen en la interacción entre IgG y FcRn (Kim ef al., Eur. J. Immunol., 24: 2429-2434, 1994; Medesan et al., Eur. J. Immunol., 26:2533, 1996; Medesan et al., J. Immunol., 158: 2211-2217, 1997). Adicionalmente, diversas publicaciones describen métodos para obtener moléculas fisiológicamente activas cuyas semividas están modificadas por la introducción o la modificación de una región de unión a FcRn de las IgG (documento WO 97/43316; patente de Estados N.° 5.869.046; Patente de Estados N.° 5.747.035; documento WO 96/32478; documento WO2006053301; patente de Estados N.° 7.083.784; patente de Estados Unidos n.° 7.371.826).
A nivel molecular, FcRn se une a la porción Fc de IgG en la región del dominio Ch2-Ch3. La interacción Fc-FcRn es altamente dependiente del pH; las IgG se unen a FcRn con elevada afinidad a pH 6, pero a medida que el pH se eleva a 7,4, la afinidad de unión desciende considerablemente. Esta interacción dependiente del pH es responsable de proteger la IgG de la degradación. Específicamente, la IgG sometida a pinocitosis resulta capturada por FcRn en el endosoma ácido, se recicla de nuevo hacia la superficie celular y a continuación, se libera a la circulación en un pH sérico fisiológico de 7,4 (Ober et al. Proc Nati Acad Sci U S A 101(30), 11076-11081, 2004; Ober et al. J Immunol 172(4), 2021-2029, 2004; Prabhat et al. Proc Natl Acad Sci U S A 104(14), 5889-5894, 2007). La IgG que no está unida a FcRn se dirige al lisosoma y se degradada. Dado que FcRn es importante en la regulación de la homeostasis de la IgG, la modulación de la interacción entre Fc y FcRn mediante ingeniería de proteínas es un método para mejorar la farmacocinética de los anticuerpos terapéuticos (Shields et al. J Biol Chem 276(9), 6591-6604, 2001; Dall'Acqua et al. Nat Biotechnol 15(7), 637-640, 1997; Dall'Acqua et al., J Immunol 169(9), 5171-5180, 2002; Hinton et al. J Biol Chem 279(8), 6213-6216, 2004; Hinton et al. J Immunol 176(1), 346-356, 2006; Datta-Mannan et al. Drug Metab Dispos 35(1), 86-94, 2007; Datta-Mannan et al. J Biol Chem 282(3), 1709-1717, 2007). Numerosos estudios en ratones, monos rhesus y cinomolgos han demostrado que el incremento de la afinidad de unión de las IgG a pH 6 puede prolongar la semivida (Dall'Acqua et al. Nat Biotechnol 15(7), 637-640, 1997; Dall'Acqua et al., J Immunol 169(9), 5171-5180, 2002; Hinton et al. J Biol Chem 279(8), 6213-6216, 2004; Hinton et al. J Immunol 176(1), 346-356, 2006). Adicionalmente, otros estudios demostraron también que la afinidad de unión de FcRn a pH 7,4 es un determinante adicional de la farmacocinética de IgG. Específicamente, ciertas variantes con la afinidad de unión a pH 7,4 aumentada hacia FcRn de ratón exhibieron un aumento de aclaramiento (es decir, semivida disminuida) en ratones (Dall'Acqua et al., J Immunol 169(9), 5171-5180, 2002). No obstante, la relación detallada entre la afinidad de FcRn y la semivida no se ha esclarecido, dado que todos los estudios previos implicaron un pequeño número de variantes, dentro de un intervalo limitado de afinidades de FcRn. Se desconoce la máxima extensión de semivida que se puede lograr mediante modificación por ingeniería de la interacción Fc:FcRn. El documento WO2006/031370 desvela unos polipéptidos que tienen regiones Fc de IgG con modificaciones de aminoácidos que dan como resultado los polipéptidos que muestran funciones efectoras de Fc alteradas.
A pesar de que la adherencia (cumplimiento) al tratamiento farmacológico es importante, se estima que la mitad de aquellos a quienes se prescriben las medicinas no las toman en la forma recomendada. Por ejemplo, una investigación reciente demostró que hasta un tercio de las mujeres que reciben fármacos contra el cáncer de mama desarrollado en los últimos 10 años no completan su transcurso de cinco años recomendado. Algunas de las causas de escaso cumplimiento incluyen olvidos, dificultad física del cumplimiento (por ejemplo viajes o mudanzas del lugar de tratamiento), molestias, efectos secundarios adversos, régimen complicado y coste de los fármacos. La escasa adherencia al tratamiento con fármacos puede conducir a que se obtengan menos de los máximos beneficios que pueden proporcionar las medicinas a los pacientes. Por ejemplo, la falta de cumplimiento del transcurso del tratamiento recomendado del cáncer podría conducir a la recurrencia de la enfermedad y a una reducción de las posibilidades de supervivencia.
Las estrategias para mejorar el cumplimiento de los fármacos incluyen hacer más conveniente para los pacientes finalizar el transcurso recomendado de tratamiento. Una de las maneras para conseguirlo en pacientes en tratamiento de inmunoterapia es incrementar la duración del tiempo que las inmunoglobulinas están en circulación. La tasa de aclaramiento de las inmunoglobulinas afecta directamente a la cantidad y frecuencia de la dosificación de la inmunoglobulina. Por tanto, el desarrollo de una inmunoglobulina que confiere una semivida in vivo aumentada puede reducir la cantidad y/o la frecuencia de la dosis, por tanto, minimizando las molestias, así como cualquier otro coste médico adicional.
Por consiguiente, sería altamente ventajoso tener inmunoglobulinas modificadas que confieran una semivida in vivo aumentada con fines terapéuticos. La presente invención aborda estas y otras necesidades, como será aparente tras la revisión de la siguiente divulgación.
Sumario de la invención
La invención proporciona nuevas variantes de IgG y usos como se describe en las reivindicaciones adjuntas. En el presente documento se describen variantes de IgG adicionales. Por ejemplo, las variantes de IgG que comprenden una región Fc de IgG humana como se ha descrito en el presente documento pueden comprender dos o más sustituciones de aminoácidos relativas a una región Fc de IgG humana de tipo silvestre en dos o más restos de aminoácidos 251, 252, 307, 308, 378, 428, 430, 434 y 436, numerados de acuerdo con el índice de EU como en Kabat, en donde la IgG variante tiene una semivida aumentada comparada con la semivida de una IgG que tiene la región Fc de IgG humana de tipo silvestre y en donde al menos dos de las sustituciones de aminoácidos están en los restos de aminoácidos 251, 252, 307, 308, 378, 428, 430, 434 o 436 y una sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 251 es una sustitución por ácido aspártico o ácido glutámico, una sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 252 es una sustitución por tirosina, una sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 307 es una sustitución por glutamina, una sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 308 es una sustitución por prolina, una sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 378 es una sustitución por valina, una sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 428 es una sustitución por leucina, una sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 430 es una sustitución por lisina, una sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 434 es una sustitución por alanina, serina o tirosina y una sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 436 es una sustitución por isoleucina.
Por ejemplo, la región Fc de IgG humana como se ha descrito en el presente documento puede comprender: una sustitución de aminoácido en el aminoácido 251, en donde la sustitución de aminoácido en el aminoácido 251 es la sustitución por ácido aspártico o ácido glutámico; una sustitución de aminoácido en el aminoácido 307, en donde la sustitución de aminoácido en el aminoácido 307 es la sustitución por glutamina; una sustitución de aminoácido en el aminoácido 308, en donde la sustitución de aminoácido en el aminoácido 308 es la sustitución por prolina, una sustitución de aminoácido en el aminoácido 378, en donde la sustitución de aminoácido en el aminoácido 378 es la sustitución por valina o una sustitución de aminoácido en el aminoácido 436, en donde la sustitución de aminoácido en el aminoácido 436 es la sustitución por isoleucina. Las IgG variantes pueden tener una mayor afinidad de unión por FcRn que la IgG que tiene la región Fc de IgG humana de tipo silvestre.
Como alternativa, la región Fc de IgG humana como se ha descrito en el presente documento puede comprender: la sustitución de aminoácido en el aminoácido 307 por glutamina y la sustitución de aminoácido en el aminoácido 434 por alanina; la sustitución de aminoácido en el aminoácido 307 por glutamina y la sustitución de aminoácido en el aminoácido 434 por serina; la sustitución de aminoácido en el aminoácido 308 por prolina y la sustitución de aminoácido en el aminoácido 434 por alanina; la sustitución de aminoácido en el aminoácido 252 por tirosina y la sustitución de aminoácido en el aminoácido 434 por alanina; la sustitución de aminoácido en el aminoácido 378 por valina y la sustitución de aminoácido en el aminoácido 434 por alanina; la sustitución de aminoácido en el aminoácido 428 por leucina y la sustitución de aminoácido en el aminoácido 434 por alanina; la sustitución de aminoácido en el aminoácido 434 por alanina y la sustitución de aminoácido en el aminoácido 436 por isoleucina, la sustitución de aminoácido en el aminoácido 308 por prolina y la sustitución de aminoácido en el aminoácido 434 por tirosina o la sustitución de aminoácido en el aminoácido 307 por glutamina y la sustitución de aminoácido en el aminoácido 436 por isoleucina.
Las variantes de IgG adicionales como se ha descrito en el presente documento pueden comprender una región Fc de IgG humana que comprende tres o más sustituciones de aminoácidos relativas a una región Fc de IgG humana de tipo silvestre en tres o más restos de aminoácidos 251, 252, 307, 308, 378, 380, 428, 430, 434 y 436, numerados de acuerdo con el índice de EU como en Kabat, en donde la IgG variante tiene una semivida aumentada comparada con la semivida de una IgG que tiene la región Fc de IgG humana de tipo silvestre y en donde al menos tres de las sustituciones de aminoácidos están en los restos de aminoácidos 251, 252, 307, 308, 378, 380, 428, 430, 434 o 436 y una sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 251 es una sustitución por ácido aspártico o ácido glutámico, una sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 252 es una sustitución por tirosina, una sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 307 es una sustitución por glutamina, una sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 308 es una sustitución por prolina, una sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 378 es una sustitución por valina, una sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 380 es una sustitución por alanina, una sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 428 es una sustitución por leucina, una sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 430 es una sustitución por lisina, una sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 434 es una sustitución por alanina, serina, tirosina o histidina y una sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 436 es una sustitución por isoleucina.
Como alternativa, la región Fc de IgG humana como se ha descrito en el presente documento puede comprender: una sustitución de aminoácido en el aminoácido 251, en donde la sustitución de aminoácido en el aminoácido 251 es la sustitución por ácido aspártico o ácido glutámico; una sustitución de aminoácido en el aminoácido 307, en donde la sustitución de aminoácido en el aminoácido 307 es la sustitución por glutamina, una sustitución de aminoácido en el aminoácido 308, en donde la sustitución de aminoácido en el aminoácido 308 es la sustitución por prolina; una sustitución de aminoácido en el aminoácido 378, en donde la sustitución de aminoácido en el aminoácido 378 es la sustitución por valina o una sustitución de aminoácido en el aminoácido 436, en donde la sustitución de aminoácido en el aminoácido 436 es la sustitución por isoleucina. La variante puede tener una mayor afinidad de unión a FcRn comparada con la IgG que tiene la región Fc de IgG humana de tipo silvestre.
Como se desvela en el presente documento, la región Fc de IgG humana puede comprender: la sustitución de aminoácido en el aminoácido 307 por glutamina, la sustitución de aminoácido en el aminoácido 380 por alanina y la sustitución de aminoácido en el aminoácido 434 por serina; la sustitución de aminoácido en el aminoácido 307 por glutamina, la sustitución de aminoácido en el aminoácido 380 por alanina y la sustitución de aminoácido en el aminoácido 434 por alanina; la sustitución de aminoácido en el aminoácido 252 por tirosina, la sustitución de aminoácido en el aminoácido 308 por prolina y la sustitución de aminoácido en el aminoácido 434 por tirosina o la sustitución de aminoácido en el aminoácido 251 por ácido aspártico, la sustitución de aminoácido en el aminoácido 307 por glutamina y la sustitución de aminoácido en el aminoácido 434 por histidina.
Como alternativa, las IgG variantes o fragmentos de las mismas como se ha descrito en el presente documento pueden comprender adicionalmente una sustitución de aminoácido en la posición 297 por alanina.
Las IgG variantes como se ha descrito en el presente documento pueden tener una mayor afinidad de unión por FcRn que la IgG que tiene la región Fc de IgG humana de tipo silvestre. Por ejemplo, una IgG variante puede tener una mayor afinidad de unión por FcRn a pH 6,0 que a pH 7,4. La IgG variante puede ser también una IgG humana o humanizada o puede ser IgG-i, IgG2, IgG3 o IgG4. Por ejemplo, la región Fc de IgG de la IgG variante puede ser una región Fc de IgG-i, IgG2, IgG3 o IgG4. En ciertas realizaciones, la región Fc de IgG de la IgG variante puede ser una región Fc de IgG-i.
En ciertas realizaciones, la IgG variante es un anticuerpo anti-VEGF. En ciertas realizaciones, la IgG variante es una variante de bevacizumab. En ciertas realizaciones, la IgG que tiene la región Fc de IgG humana de tipo silvestre es bevacizumab. En ciertas realizaciones, la región Fc de IgG humana de tipo silvestre es la región Fc de bevacizumab. En ciertas realizaciones, la IgG variante comprende el dominio variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 1) y el dominio variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 2). La IgG variante, como se desvela en el presente documento, puede comprender el dominio variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 3) y el dominio variable de cadena ligera (SEQ ID o como alternativa, puede comprender el dominio variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 7) y el dominio variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 8).
La presente invención también desvela adicionalmente composiciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de las IgG variantes como se ha descrito y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También se proporciona en el presente documento un kit que comprende cualquiera de las IgG variantes descritas en el presente documento, en un envase y las instrucciones de uso.
Como se ha descrito en el presente documento, la semivida de la IgG variante está aumentada en al menos un 50 %, un 100%, un 150 %, un 200 %, un 300 % o más, en comparación con una IgG que tiene la región Fc de IgG humana de tipo silvestre. Por ejemplo, la semivida de la IgG variante está aumentada en al menos 2 veces en comparación con una IgG que tiene la región Fc de IgG humana de tipo silvestre; en al menos 3 veces en comparación con una IgG que tiene la región Fc de IgG humana de tipo silvestre o en al menos 4 veces en comparación con una IgG que tiene la región Fc de IgG humana de tipo silvestre. La región Fc de IgG humana de tipo silvestre puede ser bevacizumab y la semivida de la IgG variante puede ser la semivida promedio de bevacizumab. Por ejemplo, la semivida promedio de bevacizumab puede ser de aproximadamente 10 a 12 días, como se ha medido en monos cinomolgos o de aproximadamente 3 semanas, como se ha medido en seres humanos.
Como se establece en las reivindicaciones adjuntas, IgG variantes comprenden una región Fc de IgG1 humana que tiene sustituciones de aminoácidos relativas a una región Fc de IgG humana de tipo silvestre en los restos de aminoácidos 307 y 434, numerados de acuerdo con el índice de EU como en Kabat, en donde la IgG variante tiene una semivida aumentada en comparación con la semivida de una IgG que tiene la región Fc de IgG humana de tipo silvestre y en donde la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 307 es una sustitución por glutamina y la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 434 es una sustitución por alanina. En una realización, la IgG variante es IgG1 de variante que comprende el dominio variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 1) y el dominio variable de cadena ligera (s Eq ID NO: 2) y que comprende una región Fc de IgG1 humana que comprende sustituciones de aminoácidos relativas a una región Fc de IgG1 humana de tipo silvestre en los restos de aminoácidos 307 y 434, numerados de acuerdo con el índice de EU como en Kabat, en donde la IgG1 variante tiene una semivida aumentada en comparación con la semivida de una IgG1 que tiene la región Fc de IgG1 humana de tipo silvestre y en donde la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 307 es una sustitución por glutamina y la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 434 es una sustitución por alanina.
En otra realización, se proporcionan IgG variantes que comprenden una región Fc de IgG humana, como se establece en las reivindicaciones, en donde la región Fc de IgG humana comprende sustituciones de aminoácidos respecto de una región Fc de IgG humana de tipo silvestre en los restos de aminoácidos 307, 380 y 434, numerados de acuerdo con el índice de EU como en Kabat, en donde la IgG variante tiene una semivida aumentada en comparación con la semivida de una IgG que tiene la región Fc de IgG humana de tipo silvestre y en donde la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 307 es una sustitución por glutamina, la sustitución de aminoácido en el aminoácido 380 es una sustitución por alanina y la sustitución de aminoácido en el aminoácido 434 es una sustitución por serina.
En ciertas realizaciones, la IgG variante que comprende una región Fc de IgG humana como se ha descrito anteriormente tiene una mayor afinidad de unión por FcRn que la IgG que tiene la región Fc de IgG humana de tipo silvestre. En ciertas realizaciones, la IgG variante tiene una mayor afinidad de unión por FcRn a pH 6,0 que a pH 7,4. En ciertas realizaciones, la IgG variante es una IgG humana o humanizada. En ciertas realizaciones, la IgG variante es un anticuerpo anti-VEGF. En ciertas realizaciones, la IgG variante es una variante de bevacizumab. En ciertas realizaciones, la IgG que tiene la región Fc de IgG humana de tipo silvestre es bevacizumab. En ciertas realizaciones, la región Fc de IgG humana de tipo silvestre es la región Fc de bevacizumab. En ciertas realizaciones, la IgG variante comprende el dominio variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 1) y el dominio variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 2). En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica que comprende cualquiera de las IgG variantes que comprenden una región Fc de IgG humana y un vehículo farmacéuticamente aceptable se proporcionan en el presente documento. También se proporciona en el presente documento un kit que comprende cualquiera de las IgG variantes que comprenden una región Fc de IgG humana, en un envase y las instrucciones de uso.
Las IgG variantes adicionales desveladas en el presente documento comprenden la región Fc de IgG1 humana, en donde las IgG variantes comprenden el dominio variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 1) y el dominio variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 2) y en donde la región Fc de lgG1 humana comprende una sustitución de aminoácido relativa a una región Fc de lgG1 humana de tipo silvestre en el resto de aminoácido 434, numerados de acuerdo con el índice de EU como en Kabat, en donde la IgG variante tiene una semivida aumentada en comparación con la semivida de una IgG que tiene la región Fc de lgG1 humana de tipo silvestre y la IgG variante tiene mayor afinidad de unión por FcRn en comparación con la afinidad de unión por FcRn de la IgG que tiene la región Fc de lgG1 humana de tipo silvestre y en donde la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 434 es una sustitución por histidina.
La IgG variante como se ha descrito en el presente documento puede ser IgGi variante.
Como se ha descrito en el presente documento, la semivida de una variante puede estar aumentada en al menos un 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 % en comparación con la semivida de la IgG que tiene la región Fc de IgG humana de tipo silvestre.
La semivida de una IgG variante como se ha descrito en el presente documento, puede ser de al menos aproximadamente 15, 20, 25, 30, 35 o 40 días. la semivida de una IgG variante puede ser la semivida medida en seres humanos o en monos cinomolgos. En ciertas realizaciones, la IgG de tipo silvestre o la IgG que tiene la región Fc de IgG humana de tipo silvestre es bevacizumab. La semivida de bevacizumab puede ser de 10 a 12 días, como se ha medido en monos cinomolgos o de aproximadamente 20 días, como se ha medido en seres humanos.
En la invención se proporcionan numerosos métodos para utilizar las variantes de IgG. Se proporcionan métodos para el tratamiento tumoral en un sujeto. Por ejemplo, los métodos comprenden administrar al sujeto una cantidad efectiva de cualesquiera IgG variantes descritas anteriormente y en el presente documento. En ciertas realizaciones, la IgG variante es un anticuerpo anti-VEGF. En ciertas realizaciones, la IgG variante es una variante de bevacizumab. Estos métodos pueden comprender adicionalmente administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente quimioterapéutico.
En la invención se proporcionan métodos para inhibir la actividad de VEGF en un sujeto. Por ejemplo, los métodos que comprenden administrar al sujeto una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-VEGF de IgG variante como se ha descrito anteriormente y en el presente documento. En ciertas realizaciones, la actividad de VEGF es la angiogénesis.
Se desvelan en el presente documento métodos para modular la permeabilidad vascular en un sujeto. Por ejemplo, los métodos comprenden administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de cualesquiera IgG variantes descrita con anterioridad y en el presente documento.
Se desvelan también en el presente documento métodos para tratar un trastorno no neoplásico en un sujeto. Por ejemplo, los métodos comprenden administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de cualesquiera IgG variantes descrita con anterioridad y en el presente documento. Por ejemplo, el trastorno no neoplásico es una enfermedad autoinmune o es enfermedad de Alzheimer. Como alternativa, se diagnostica al sujeto de degeneración macular relacionada con la edad.
Estos métodos incluyen también tratar un tumor que expresa HER en un sujeto. Por ejemplo, estos métodos comprenden administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de cualquier IgG variante descrita con anterioridad y en el presente documento, tal como la IgG variante que comprende el dominio variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 7) y el dominio variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 8).
Se desvelan también en el presente documento, métodos para inhibir o prevenir el crecimiento de células cancerosas en un sujeto. Por ejemplo, estos métodos comprenden administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de cualquier IgG variante descrita con anterioridad y en el presente documento.
Se desvelan también en el presente documento, métodos de administración a un sujeto una cantidad eficaz de cualquier IgG variante. Estos métodos de administración pueden utilizarse junto con otros métodos (por ejemplo, métodos de tratamientos) descritos en el presente documento. Por ejemplo, los métodos comprenden administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de cualquier IgG variante descrita con anterioridad y en el presente documento y en donde la IgG variante se administra al sujeto cada 4 semanas o en intervalos más largos; cada 5 semanas o más; cada 6 semanas o más; cada 7 semanas o más; cada 8 semanas o más; cada 9 semanas o más; cada 10 semanas o más; cada 11 semanas o más; cada 12 semanas o más. Otros métodos pueden comprender también administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de cualesquiera IgG variantes, en donde la IgG variante se administra con menor frecuencia de la dosificación recomendada o prescrita de la IgG que tiene la región Fc de IgG humana de tipo silvestre, la IgG que tiene la región Fc de IgG humana de tipo silvestre puede ser bevacizumab. La IgG variante, por ejemplo, una variante de bevacizumab, se puede administrar menos frecuentemente que la frecuencia de la dosificación prescrita de bevacizumab.
la IgG variante puede administrarse inicialmente cada 2 semanas y después, administrarse cada 4 semanas o más; cada 3 semanas y después, administrarse cada 6 semanas o más; administrarse inicialmente cada 4 semanas y después, administrarse cada 8 semanas o más; administrarse inicialmente cada 5 semanas y después, administrarse cada 10 semanas o más; administrarse inicialmente cada 6 semanas y después, administrarse cada 12 semanas o la IgG variante, por ejemplo, una variante de bevacizumab, se administra inicialmente con la frecuencia de la dosificación prescrita de bevacizumab y después se administrar menos frecuentemente que la dosificación prescrita de bevacizumab.
De acuerdo con los métodos descritos en el presente documento, la IgG variante es un anticuerpo anti-VEGF; un anticuerpo anti-VEGF que comprende el dominio variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 1) y el dominio variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 2) o el anticuerpo anti-VEGF es una variante de bevacizumab.
las IgG variantes de la invención se pueden administrar al sujeto por vía intravenosa o subcutánea.
En ciertas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el sujeto es un ser humano. En ciertas realizaciones, se diagnostica al sujeto de cáncer. Por ejemplo, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de pulmón no microcítico, carcinoma de células renales, cáncer de ovario, glioblastoma, cáncer de mama y cáncer colorrectal.
También se desvelan en el presente documento métodos para tratar un cáncer benigno, precanceroso o no metastásico en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto una cantidad eficaz de una IgG variante. Por ejemplo, la administración de la IgG variante puede impedir que el cáncer benigno, precanceroso o no metastásico se transforme en un cáncer invasivo o metastásico. El cáncer benigno, precanceroso o no metastásico puede ser un cáncer de estadio 0, estadio I o de estadio II y por ejemplo, la administración de la IgG variante puede impedir que el cáncer benigno precanceroso o no metastásico progrese hacia el(los) siguiente(s) estadio(s), por ejemplo, un cáncer de estadio I, de estadio II, de estadio III o de estadio IV.
Como alternativa, la IgG variante se puede administrar durante un tiempo y en una cantidad suficiente para tratar el tumor benigno, precanceroso o no metastásico en el sujeto o impedir que el tumor benigno, precanceroso o no metastásico se transforme en un cáncer invasivo o metastásico. Como alternativa, la administración de la IgG variante puede reducir el tamaño del tumor, la carga tumoral o el número de tumores del tumor benigno, precanceroso o no metastásico. La IgG variante se puede administrar también en una cantidad y durante un tiempo para disminuir la densidad vascular en el tumor benigno, precanceroso o no metastásico.
Como se describe en el presente documento, los métodos desvelados en el presente documento se pueden utilizar para tratar, por ejemplo, un cáncer de estadio 0 (por ejemplo, un carcinoma in situ), de estadio II o de estadio III. Los métodos de la terapia neoadyuvante y adyuvante ser pueden utilizar para tratar cualquier tipo de cáncer, por ejemplo, benigno o maligno. Por ejemplo, el cáncer puede ser un tumor sólido, incluyendo, aunque no de forma limitativa, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer renal, cáncer de pulmón (por ejemplo cáncer no microcítico de pulmón), melanoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer gastrointestinal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de hígado y cánceres de tejidos blandos (por ejemplo, linfomas de linfocitos B, tales como NHL y mieloma múltiple y leucemias tales como la leucemia linfocítica crónica). Por ejemplo, el tumor benigno, precanceroso o no metastásico es un pólipo, adenoma, fibroma, lipoma, gastrinoma, insulinoma, condroma, osteoma, hemangioma, linfangioma, meningioma, leiomioma, rabdomioma, papiloma de células escamosas, neuromas acústicos, neurofibroma, cistanoma de conductos biliares, leiomiomas, mesoteliomas, teratomas, mixomas, tracomas, granulomas, hamartoma, papiloma de células transicionales, adenoma pleiomórfico de las glándulas salivales, tumor desmoide, cistopapiloma dermoide, cistoadenoma, hiperplasia focal nodular o una hiperplasia nodular regenerativa. Como alternativa, el método se utiliza convenientemente para tratar un adenoma. Entre los ejemplos no limitantes de adenomas se incluyen el adenoma de células hepáticas, adenoma renal, adenoma metanéfrico, adenoma bronquial, adenoma alveolar, adenoma adrenal, adenoma hipofisario, adenoma paratiroideo, adenoma pancreático, adenoma de las glándulas salivales, adenoma hepatocelular, adenoma gastrointestinal, adenoma tubular y adenoma del conducto biliar.
Los métodos desvelados en el presente documento comprenden administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una IgG variante para prevenir la aparición o recurrencia de un cáncer benigno, precanceroso o no metastásico en el sujeto. Por ejemplo, el sujeto puede estar en riesgo de cáncer, pólipos o un síndrome canceroso. Por ejemplo, el sujeto puede tener antecedentes familiares de cáncer, pólipos o un síndrome canceroso hereditario; el sujeto está en riesgo de desarrollar un tumor benigno, precanceroso o no metastásico o el método previene la aparición o recurrencia de dicho cáncer benigno, precanceroso o no metastásico en un sujeto que nunca ha tenido un tumor, un sujeto que nunca ha tenido un cáncer detectable clínicamente o un sujeto que solo ha tenido un tumor benigno.
Como alternativa, estos métodos para prevenir o reducir la probabilidad de recurrencia de un cáncer en un sujeto incluyen administrar al sujeto una IgG variante durante un tiempo y en una cantidad suficiente para prevenir o reducir la probabilidad de recurrencia de cáncer en el sujeto. Estos métodos incluyen también un método para prevenir la recurrencia de un cáncer en un sujeto que tiene un tumor que incluye las etapas de extraer el tumor (por ejemplo, utilizando cirugía definitiva) y posteriormente administrar al sujeto una IgG variante. Como alternativa, se incluyen métodos para prevenir el recrecimiento de un tumor en un sujeto que incluye las etapas de extraer el tumor (por ejemplo, utilizando cirugía definitiva) y posteriormente administrar al sujeto una IgG variante o se incluye un método para prevenir la recurrencia de un cáncer en un sujeto o reducir la probabilidad de recurrencia del cáncer en un sujeto que opcionalmente incluye administrar al sujeto una cantidad eficaz de una IgG variante antes de una cirugía, realizar una cirugía definitiva y administrar una cantidad eficaz de una IgG variante tras la cirugía, en donde la administración de la IgG variante tras la cirugía evita la recurrencia del cáncer o reduce la probabilidad de recurrencia del cáncer. Otra alternativa incluye un método para impedir la recurrencia del cáncer en un sujeto o reducir la probabilidad de recurrencia del cáncer en un sujeto que incluye administrar al sujeto una cantidad eficaz de una IgG variante en ausencia de cualquier otro agente terapéutico anticanceroso adicional, en donde la administración impide la recurrencia de cáncer en un sujeto o reduce la probabilidad de recurrencia de cáncer en un sujeto.
Para cada uno de los métodos descritos anteriormente, el tumor puede ser cualquier tipo de tumor, incluyendo aunque no de forma limitativa, los tumores sólidos y particularmente los tumores y adenomas, descritos en el presente documento. El sujeto puede tener un tumor latente o micrometástasis, los cuales pueden o no ser clínicamente detectables; la IgG variante se administra durante un tiempo y en una cantidad suficiente para reducir la neovascularización de un tumor latente o micrometástasis o la IgG variante se administra durante un tiempo y en una cantidad suficiente para impedir la aparición de un tumor clínicamente detectable o metástasis del mismo o aumentar la duración de la supervivencia del sujeto.
La IgG variante puede ser una monoterapia. El sujeto se puede haber tratado previamente para el tumor, por ejemplo, utilizando una terapia contra el cáncer. En un ejemplo, la terapia contra el cáncer puede ser una cirugía. En otro ejemplo, el sujeto se puede tratar adicionalmente con una terapia contra el cáncer adicional antes, durante (por ejemplo, simultáneamente) o tras la administración de la IgG variante. Entre los ejemplos de terapias anticancerosas se incluyen, sin limitación, cirugía, terapia por radiación (radioterapia), bioterapia, inmunoterapia, quimioterapia o una combinación de estas terapias.
En los ejemplos en donde el sujeto se ha sometido a cirugía definitiva, la IgG variante se puede administrar normalmente tras un periodo de tiempo en el que el sujeto se ha recuperado de la cirugía. Este periodo puede incluir el periodo requerido para la curación de heridas o la curación de la incisión quirúrgica, el periodo requerido para reducir el riesgo de dehiscencia de la herida o el periodo requerido para que el sujeto retorne a un nivel de salud esencialmente similar o mejor que el nivel de salud previo a la cirugía. El periodo entre la finalización de la cirugía definitiva y la primera administración de la IgG variante también puede incluir el periodo necesario para un descanso del fármaco, en donde el sujeto requiere o solicita un periodo de tiempo entre regímenes terapéuticos. Habitualmente, el periodo entre la finalización de la cirugía definitiva y el comienzo de la terapia con IgG variante puede incluir menos de una semana, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas (28 días), 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 1 año, 2 años, 3 años o más. En una realización, el periodo entre la cirugía definitiva y la administración de la IgG variante es mayor de 2 semanas y menor de 1 año. Por ejemplo, el periodo entre la cirugía definitiva y la administración de la IgG variante es mayor de 4 semanas (28 días).
Cada uno de los métodos anteriores puede incluir adicionalmente el control del sujeto para la recurrencia del cáncer.
Los métodos de terapia neoadyuvante antes de la extirpación quirúrgica del cáncer operable en un sujeto, por ejemplo, un paciente humano, que comprenden administrar al paciente una cantidad eficaz de una IgG variante cuando se ha diagnosticado al paciente con un tumor o cáncer también se desvelan. La IgG variante se puede administrar sola o junto con al menos un agente quimioterapéutico.
Otro método incluye un método para tratar un sujeto con cáncer operable que incluye administrar al sujeto una cantidad eficaz de una IgG variante antes de la cirugía y después, realizar cirugía de modo que se extirpa el cáncer. Como alternativa, el método también puede incluir adicionalmente la etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de una IgG variante tras la cirugía para prevenir la recurrencia del cáncer o se ocupa de un método de terapia neoadyuvante que comprende administrar a un sujeto con cáncer operable una cantidad eficaz de una IgG variante y al menos un agente quimioterapéutico antes de la cirugía definitiva.
Por ejemplo, estos métodos incluyen un método para reducir el tamaño del tumor en un sujeto que tiene un tumor no extirpable que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una IgG variante en donde la administración reduce el tamaño del tumor, permitiendo de este modo la completa resección del tumor o como alternativa, el método incluye adicionalmente administrar al sujeto una cantidad eficaz de una IgG variante tras la completa resección del tumor.
Como alternativa, estos métodos se ocupan de un método para tratar cáncer en un sujeto que comprende las siguientes etapas: a) una primera fase que comprende una pluralidad de ciclos de tratamiento, en donde cada ciclo comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una IgG variante y al menos un agente quimioterapéutico en un intervalo predeterminado; b) una cirugía definitiva, de modo que el cáncer se elimina; y c) una segunda fase que comprende una pluralidad de ciclos de mantenimiento, en donde cada ciclo comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una IgG variante sin un agente quimioterapéutico en un intervalo predeterminado. Por ejemplo, la primera fase comprende una primera pluralidad de ciclos de tratamiento, en donde una IgG variante y un primer régimen de quimioterapia se administran seguidos de una segunda pluralidad de ciclos de tratamiento, en donde se administran una IgG variante y un segundo régimen de quimioterapia.
La divulgación proporciona métodos que comprenden administrar a un sujeto con cáncer metastásico o no metastásico, tras la cirugía definitiva, una cantidad eficaz de una IgG variante. Por ejemplo, el método puede incluir también la utilización de al menos un agente quimioterapéutico.
Por ejemplo, el método puede comprender las siguientes etapas: a) una primera fase que comprende una pluralidad de ciclos de tratamiento, en donde cada ciclo comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una IgG variante y al menos un agente quimioterapéutico en un intervalo predeterminado; y b) una segunda fase que comprende una pluralidad de ciclos de mantenimiento, en donde cada ciclo comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una IgG variante sin un agente quimioterapéutico en un intervalo predeterminado. Como alternativa, la primera fase comprende una primera pluralidad de ciclos de tratamiento en donde se administran una IgG variante y un primer régimen de quimioterapia, seguido de una segunda pluralidad de ciclos de tratamiento en donde se administran una IgG variante y un segundo régimen de quimioterapia.
En ciertas realizaciones, la IgG variante es un anticuerpo anti-VEGF que se une a VEGF o reduce la expresión de VEGF o la actividad biológica. El anticuerpo anti-VEGF o su fragmento de unión a antígeno, puede ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo totalmente humano o un anticuerpo humanizado. Aunque el sujeto puede tratarse de numerosas formas diferentes antes, durante o tras la administración de la IgG variante. El sujeto puede tratarse sin cirugía o quimioterapia. El tratamiento con la IgG variante puede seguir una monoterapia o una monoterapia para la duración del periodo de tratamiento de la IgG variante, como lo han evaluado los médicos o se ha descrito en el presente documento.
El tratamiento con la IgG variante junto con una terapia contra el cáncer adicional, puede incluir aunque no de forma limitativa, cirugía, radioterapia, quimioterapia, terapia de diferenciación, bioterapia, terapia inmunitaria, un inhibidor de angiogénesis y un compuesto antiproliferativo. El tratamiento con la IgG variante también puede incluir cualquier combinación de los tipos anteriores de regímenes terapéuticos. En ciertas realizaciones, pueden utilizarse agentes citotóxicos, antiangiogénicos y agentes antiproliferativos junto con la IgG variante. La terapia anticancerosa puede ser quimioterapia y el agente quimioterapéutico y la IgG variante se pueden administrar concurrentemente.
Como se describe en el presente documento, los métodos desvelados en el presente documento pueden ser ventajosos para el tratamiento y la prevención de los tumores en fases iniciales, evitando de este modo la progresión a los estadios más avanzados que dan como resultado una reducción de la morbilidad y la mortalidad asociada con el cáncer avanzado. Estos métodos también son ventajosos para prevenir la recurrencia de un tumor o el recrecimiento de un tumor, por ejemplo, un tumor latente que persiste tras la extirpación del tumor primario o en la reducción o prevención de la aparición o proliferación de micrometástasis.
Para estos métodos, el cáncer puede ser un tumor sólido, por ejemplo, tal como, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer de pulmón, cáncer de células renales, un glioma (por ejemplo, astrocitoma anaplásico, oligoastrocitoma anaplásico, oligodendroglioma anaplásico, glioblastoma multiforme), cáncer de riñón, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, sarcoma de partes blandas, carcinoma carcinoide, cáncer de cabeza y cuello, melanoma y cáncer de ovario.
Estos métodos también pueden incluir controlar al sujeto para la recurrencia del cáncer o tumor.
Otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la siguiente Descripción detallada, las figuras. La invención se establece en las reivindicaciones.
Breve descripción de las figuras
Fig. 1 Paneles A-B: Unión de anti-VEGF de tipo silvestre (WT) y variantes de anti-VEGF a FcRn humano a pH 6,0. Se realizaron dos ejecuciones experimentales separadas con diferentes niveles de FcRn acoplado en los chips. Para cada ejecución, la unidad de respuesta del estado estacionario se representa en función de las concentraciones variantes para estimar las constantes de disociación.
Fig. 2 : Constantes de disociación del anti-VEGF de tipo silvestre (WT) y variantes de anti-VEGF contra FcRn humano a pH 6,0. Kd se estimó a partir de las dos ejecuciones diferentes mostradas en la Figura 1.
Fig. 3 : Unión de anti-VEGF de tipo silvestre (WT) y variantes de anti-VEGF a FcRn humano a pH 7,4. La unidad de respuesta del estado estacionario se representa en función de las concentraciones de las variantes de anti-VEGF.
Fig. 4 Paneles A-D: Unión de anti-VEGF de tipo silvestre y variantes de anti-VEGF a (A) FcRn humano a pH 6,0, (B) FcRn humano a pH 7,4, (C) FcRn de cino a pH 6.0 y (D) FcRn de cino a pH 7,4.
Fig. 5 : Parámetros cinéticos y constantes de disociación monovalentes (Kd) de diversas variantes de anti-VEGF contra FcRn humano a pH 6,0 y 25 °C. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes.
Fig. 6 : Parámetros cinéticos y constantes de disociación monovalentes (Kd) de diversas variantes de anti-VEGF contra FcRn de cino a pH 6,0 y 25 °C. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes.
Fig. 7 Paneles A-B: Velocidad de disociación (koff) de (A) FcRn humano y (B) FcRn de cino contra diferentes variantes de anti-VEGF a diferentes pH.
Fig. 8 : Sumario de la mejora de afinidad de FcRn humano de las variantes de anti-VEGF sobre el anti-VEGF de tipo silvestre. Los resultados se resumen en las Figuras 4 y 5.
Fig. 9 Paneles A-B: Unión a VEGF de (1) anti-VEGF de tipo silvestre y variantes de anti-VEGF (2) N434H, (3) T307Q/N434A, (4) T307Q/N434S, (5) T307Q/E380A/N434S y (6) V308P/N434A. (A) La unión a VEGF de los anticuerpos determinada por la inyección de anti-VEGF de tipo silvestre y variantes de anti-VEGF sobre un chip sensor recubierto por VEGF-A109 a 37 °C utilizando BIAcore® 3000. (B) Sensogramas para las inyecciones de 50 nM y 100 nM. El valor inicial de cada sensograma se compensó mediante 4UR para una mejor visualización. Fig. 10: Inhibición in vitro de proliferación de HUVEC por AVASTIN®, anti-VEGF de tipo silvestre (bevacizumab) y variantes de anti-VEGF. Se cultivaron células endoteliales vasculares umbilicales humanas (HUVEC) en presencia de VEGF y diversas concentraciones de anticuerpos anti-VEGF. La viabilidad se evaluó tras 4 días de cultivo. Fig. 11: Perfiles farmacocinéticos del tipo silvestre de anti-VEGF y cinco variantes de anti-VEGF en monos cinomolgos tras una única dosis IV de 5 mg/kg. Las concentraciones séricas de los anticuerpos se midieron mediante ELISA. Los datos se representan como la media ± desviación típica (n= 12 animales/grupo excepto para el grupo V308P/N434A que tiene 11 animales).
Fig. 12: Parámetros farmacocinéticos para el tipo silvestre de anti-VEGF y cinco variantes de anti-VEGF tras una única dosis IV de 5 mg/kg a monos cinomolgos.
Fig. 13: Gráfico que muestra la relación entre la semivida terminal en monos cinomolgos y afinidad de FcRn a pH 6,0 por el anti-VEGF de tipo silvestre y cinco variantes de anti-VEGF. Las barras de error representan las desviaciones típicas de 11 o 12 animales por grupo.
Fig. 14 Paneles A-B: Perfiles farmacocinéticos del tipo silvestre de anti-VEGF y la variante de anti-VEGF T307Q/N434A en ratones transgénicos VEGF humanizados tras una única dosis IV de 0,3 o 5 mg/kg. Las concentraciones séricas de los anticuerpos se midieron utilizando (A) ELISA de captura de VEGF o (B) ELISA de captura de Fc humano. Los datos se representan como la media ± desviación típica.
Fig. 15: Parámetros farmacocinéticos para el tipo silvestre de anti-VEGF y la variante de anti-VEGF T307Q/N434A tras una única dosis intravenosa de 0,3 o 5 mg/kg a ratones transgénicos VEGF humanizados.
Fig. 16 Paneles A-B: Perfiles farmacocinéticos de la variante de anti-VEGF T307Q/N434A en ratones transgénicos VEGF humanizados tras una dosis múltiple de 0,3 o 5 mg/kg. El anticuerpo se administró los días 0, 3, 6 y 9. Las concentraciones séricas de los anticuerpos se midieron utilizando (A) ELISA de captura de VEGF o (B) ELISA de captura de Fc humano. Los datos se representan como la media ± desviación típica.
Fig. 17: Parámetros farmacocinéticos para T307Q/N434A tras cuatro dosis intravenosas de 0,3 o 5 mg/kg en los días 0, 3, 6 y 9 a ratones transgénicos VEGF humanizados.
Fig. 18 Paneles A-C: Eficacia de anti-VEGF de tipo silvestre y la variante T307Q/N434A (QA) en el tratamiento de xenoinjertos HM-7 implantados s.c. en RAG2 KO; ratones doble homocigotos KI VEGF hum-X. Se administraron 5 mg/kg y 0,5 mg/kg de tipo silvestre y la variante T307Q/N434A y 5 mg/kg de control anti-ambrosía por vía intraperitoneal dos veces por semana. (A) Curvas de crecimiento de tumores HM-7. Los datos se representan como la media ± error estándar. (B) Curvas de crecimiento de tumores HM-7 para los grupos de tratamiento de 0,5 y 0,05 mg/kg. (C) Concentraciones séricas de anticuerpo anti-VEGF al final del tratamiento (día 18 para anti­ ambrosía y día 21 para los grupos de tratamiento anti-VEGF). Las concentraciones se midieron utilizando ELISA de captura de VEGF. Los datos se representan como la media ± desviación típica.
Fig. 19 Paneles A-D: Estudio de eficacia de repetición del tipo silvestre de anti-VEGF y la variante T307Q/N434A (QA) en el tratamiento de xenoinjertos HM-7 implantados s.c. en ratones RAG2 KO; ratones doble homocigotos KI VEGF hum-X. Se administraron 5, 0,5 y 0,05 mg/kg de tipo silvestre y la variante T307Q/N434A y 5 mg/kg de control anti-ambrosía por vía intraperitoneal dos veces por semana. (A) Curvas de crecimiento de tumores HM-7. Los datos se representan como la media ± error estándar. (B) Curvas de crecimiento de tumores HM-7 para los grupos de tratamiento de 0,5 y 0,05 mg/kg. Los datos se representan como la media ± error estándar. (C) Pesos terminales de los tumores HM-7 determinados al final del tratamiento (día 16 para anti-ambrosía, día 19 para el grupo de 0,05 mg/kg y día 22 de los grupos restantes). Los datos se representan como la media ± error estándar. (D) Concentraciones séricas de anticuerpo anti-VEGF al final del tratamiento. Las concentraciones se midieron utilizando ELISA de captura de Fc humano. Los datos se representan como la media ± desviación típica. (E) Proporción de la concentración de anticuerpos en tumores respecto a la sangre. Las concentraciones de anticuerpos antitumorales se determinaron midiendo la cantidad total de lisados tumorales y la cantidad de anticuerpo anti-VEGF en los lisados tumorales. Los datos se representan como la media ± desviación típica. Fig. 20 Paneles A-D: El tercer estudio de eficacia de anti-VEGF de tipo silvestre y T307Q/N434A (QA) en el tratamiento de xenoinjertos HM-7 implantados s.c. en ratones RAG2 KO; ratones doble homocigotos KI VEGF hum-X. se administraron 5, 0,5 y 0,05 mg/kg de tipo silvestre y T307Q/N434A y 5 mg/kg de control anti-ambrosía vía intraperitoneal dos veces por semana. (A) Volumen medio de tumor para cada grupo al final del tratamiento (día 22). Los datos se representan como la media ± error estándar. (B) Pesos terminales de los tumores HM-7. Los datos se representan como la media ± error estándar. (C) Concentraciones séricas de anticuerpo anti-VEGF al final del tratamiento. Las concentraciones se midieron utilizando de ELISA de captura de Fc humano. Los datos se representan como la media ± desviación típica. (D) Proporción de concentración de anticuerpo en tumores respecto de la sangre.
Las concentraciones de anticuerpos antitumorales se determinaron midiendo la cantidad total de lisados tumorales y la cantidad de anticuerpo anti-VEGF en los lisados tumorales. Los datos se representan como la media ± desviación típica.
Fig. 21 Paneles A-D: Eficacia de anti-VEGF de tipo silvestre y la variante T307Q/N434A (QA) en el tratamiento de xenoinjertos HT-55 implantados s.c. en RAG2 KO; ratones doble homocigotos KI VEGF hum-X. se administraron 5, 0,5 y 0,05 mg/kg de tipo silvestre y T307Q/N434A y 5 mg/kg de control anti-ambrosía vía intraperitoneal dos veces por semana. (A) Curvas de crecimiento de tumores HT-55. Los datos se representan como la media ± error estándar. (B) Pesos terminales de los tumores HT-55 determinados al final del tratamiento (día 35). Los datos se representan como la media ± error estándar. (C) Concentraciones séricas de anticuerpo anti-VEGF al final del tratamiento. Las concentraciones se midieron utilizando ELISA de captura de Fc humano. Los datos se representan como la media ± desviación típica. (D) Proporción de la concentración de anticuerpos en tumores respecto a la sangre. Las concentraciones de anticuerpos antitumorales se determinaron midiendo la cantidad total de lisados tumorales y la cantidad de anticuerpo anti-VEGF en los lisados tumorales. Los datos se representan como la media ± desviación típica.
Fig. 22 Paneles A-D: Eficacia de anti-VEGF de tipo silvestre y la variante T307Q/N434A (QA) en el tratamiento de xenoinjertos Colo-205 implantados s.c. en RAG2 KO; ratones doble homocigotos KI VEGF hum-X. se administraron 5, 0,5 y 0,05 mg/kg de tipo silvestre y T307Q/N434A y 5 mg/kg de control anti-ambrosía vía intraperitoneal dos veces por semana. (A) Curvas de crecimiento de tumores Colo-205. Los datos se representan como la media ± error estándar. (B) Curvas de crecimiento de tumores Colo-205 en los grupos de tratamiento de 0,5 y 0,05 mg/kg. (C) Pesos terminales de los tumores Colo-205 determinados al final del tratamiento (día 38). Los datos se representan como la media ± error estándar. (D) Concentraciones séricas de anticuerpo anti-VEGF al final del tratamiento. Las concentraciones se midieron utilizando ELISA de captura de Fc humano. Los datos se representan como la media ± desviación típica. (E) Proporción de la concentración de anticuerpos en tumores respecto a la sangre. Las concentraciones de anticuerpos antitumorales se determinaron midiendo la cantidad total de lisados tumorales y la cantidad de anticuerpo anti-VEGF en los lisados tumorales. Los datos se representan como la media ± desviación típica.
Fig. 23 Paneles A-D: Estudio de eficacia de repetición del tipo silvestre de anti-VEGF y la variante T307Q/N434A (QA) en el tratamiento de xenoinjertos Colo-205. se administraron 5, 0,5 y 0,05 mg/kg de tipo silvestre y T307Q/N434A y 5 mg/kg de control anti-ambrosía vía intraperitoneal dos veces por semana. (A) Curvas de crecimiento de tumores Colo-205. Los datos se representan como la media ± error estándar. (B) Curvas de crecimiento de tumores Colo-205 en los grupos de tratamiento de 0,5 y 0,05 mg/kg. (C) Pesos terminales de los tumores Colo-205 determinados al final del tratamiento (día 32). Los datos se representan como la media ± error estándar. (D) Concentraciones séricas de anticuerpo anti-VEGF al final del tratamiento. Las concentraciones se midieron utilizando ELISA de captura de Fc humano. Los datos se representan como la media ± desviación típica.
Fig. 24: Constantes de disociación monovalentes (Kd) de variantes de Fc de IgG1 anti-HER2 (traztuzumab) para FcRn humano a pH 6,0 y 25 °C utilizando BIAcore. Los resultados son representativos de dos experimentos independientes.
Fig. 25: Niveles de expresión de FcRn en diferentes líneas celulares de tumores humanos. Se utilizaron cinco millones de células de cada línea celular para el experimento. Se utilizaron células Raji (linfoma de linfocitos B humanos) como control negativo, mientras la proteína soluble FcRn humana, que carece de las regiones 7kDa transmembrana y citoplasmática, se transfirió como un control positivo. Se utilizaron diluciones de proteína soluble FcRn como el estándar para cuantificar el nivel de expresión de FcRn. Los resultados mostrados aquí son representativos de al menos tres experimentos independientes.
Fig. 26: Unión dependiente de pH de las variantes de Fc de IgG1 anti-HER2 (traztuzumab) para FcRn humano. Las variantes se construyeron con mutaciones en L251, L314 y E430. La unión se midió a un pH que varió de 6 a 7,2 utilizando BIAcore a 25 °C. Las proporciones de afinidad de las variantes respecto al tipo silvestre de IgG1 anti-HER2 se determinaron y representaron en función del pH.
Fig. 27 Paneles A-D: Unión del tipo silvestre de IgG1 anti-HER2 (traztuzumab), variante T307Q/N434A, variante L251 D/T307Q/N434H y variante L251D/T307Q/M428L/N434H/Y436I contra FcRn humano a (A) pH 6,0, (B) pH 7,1 y (C) pH 7,4. La unión se midió utilizando de BIAcore a 25 °C. No hubo unión detectable de la variante L251D/T307Q/N434H a FcRn humano a pH 7,4 en la Fig. 27C.
Fig. 28: Velocidad de disociación (koff) del FcRn humano contra diversas variantes de anti-VEGF y anti-HER2 a diferentes pH. Las variantes de anti-VEGF son T307Q/N434A, T307Q/N434S. T307Q/E380A/N434S y V308P/N434A. La variante de anti-HER2 es L251D/T307Q/M428L/N434H/Y436I. Los valores de Koff a los diferentes pH se ajustaron frente al pH para cada variante para producir la pendiente de la línea de mejor ajuste (ecuación: log(koff) = pendiente x pH intersección de y).
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a nuevas variantes de dominios Fc, incluyendo aquellos encontrados en anticuerpos, fusiones de Fc e inmunoadhesinas, que tienen una semivida in vivo aumentada. Estas variantes comprenden una región Fc de IgG humana o fragmentos de la misma que se unen a un FcRn, que contiene una o más modificaciones de aminoácidos relativa(s) a una región Fc de IgG de tipo salvaje humana cuyas modificaciones aumentan la afinidad de la región Fc de IgG o uno de sus fragmentos, por el FcRn.
Las técnicas y procedimientos descritos o referenciados en el presente documento generalmente se comprenden bien y se emplean comúnmente usando metodología convencional por los expertos en la materia, tal como, por ejemplo, las metodologías ampliamente utilizadas descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3a Edición (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (2003)); la serie METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames y G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow y Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL y ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths y D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller y M. P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway y P. Travers, 1997); Anticuerpos (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); "Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd y C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow y D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti y J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); y Cancer: Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita et al., eds., J. B. Lippincott Company, 1993).
A menos que se defina lo contrario, los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2a ed., J. Wiley & Sons (Nueva York, Nueva York. 1994) y March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4a ed., John Wiley & Sons (Nueva York, Nueva York. 1992) proporciona al experto en la materia una guía general para muchos de los términos usados en la presente solicitud.
Definiciones
Con el fin de interpretar la presente memoria descriptiva, se aplicarán las siguientes definiciones y siempre que sea adecuado, los términos usados en singular también incluirán el plural y viceversa. A lo largo de la presente memoria descriptiva y reivindicaciones, la numeración de los restos en una cadena pesada de inmunoglobulina es la del índice EU tal como en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland. (1992). El "índice EU como en Kabat" se refiere a la numeración de restos del anticuerpo EU de lgG1 humano.
La expresión "semivida in vivo" o "la semivida del anticuerpo in vivo" como se utiliza en el presente documento se refiere a la semivida biológica de un tipo particular de molécula de IgG o sus fragmentos que contienen sitios de unión de FcRn en la circulación de un animal dado y se representa por el tiempo requerido para que la concentración circulante de una molécula disminuya en un 50%. En ciertas realizaciones, cuando la concentración de determinada IgG se gráfica en función del tiempo, la curva es bifásica normalmente, con una fase a rápida que representa un equilibrio de las moléculas inyectadas de IgG entre el espacio intra y extravascular y una fase p más larga que representa la eliminación de las moléculas de IgG del espacio intravascular. En ciertas realizaciones, el término "semivida in vivo" corresponde a la semivida de las moléculas de IgG en la fase p. En ciertas realizaciones, la curva de concentración frente al tiempo de una IgG dada es trifásica, con la correspondiente distribución en una fase a y una fase p y la eliminación terminal representada por una fase y. Por tanto, en ciertas realizaciones, la semivida in vivo corresponde a la semivida de la fase de eliminación terminal o la fase y. En ciertas realizaciones, la curva de concentración frente al tiempo de una IgG dada es monofásica, con una fase de eliminación única. Por tanto, en ciertas realizaciones, la semivida in vivo corresponde a la semivida de la fase de eliminación única.
Por "polipéptido parental" o "polipéptido de tipo silvestre" se entiende en el presente documento un polipéptido no modificado, un polipéptido de origen natural o una versión modificada por ingeniería de un polipéptido que carece de una o más de las modificaciones de aminoácidos de la región Fc desvelado en el presente documento y que difiere en la función efectora comparado con la IgG variante desvelada en el presente documento. El polipéptido parental puede comprender una secuencia nativa de la región Fc o una región Fc con modificaciones preexistentes de la secuencia de aminoácidos (tales como adiciones, deleciones y/o sustituciones). El polipéptido original puede comprender también aminoácidos no naturales tales como los descritos más adelante. El polipéptido parental también puede referirse al propio polipéptido, a las composiciones que comprenden el polipéptido parental o a las secuencias aminoácidos que lo codifican. El polipéptido parental incluye, sin limitación, la inmunoglobulina parental, la inmunoglobulina de tipo silvestre, el anticuerpo parental y el anticuerpo de tipo silvestre.
Por consiguiente, por "inmunoglobulina parental", "IgG parental", "inmunoglobulina de tipo silvestre" o "IgG de tipo silvestre" se entiende en el presente documento una inmunoglobulina no modificada, una inmunoglobulina de origen natural o una versión modificada por ingeniería de una inmunoglobulina de origen natural que carece de una o más de las modificaciones de aminoácidos de la región Fc desvelada en el presente documento y que difiere de la función efectora en comparación con la IgG variante tal como se desvela en el presente documento. La inmunoglobulina parental puede comprender una secuencia nativa de la región Fc o una región Fc con modificaciones preexistentes de la secuencia de aminoácidos (tales como adiciones, deleciones y/o sustituciones). La inmunoglobulina parental puede comprender también aminoácidos no naturales tales como los descritos más adelante. La inmunoglobulina parental también puede referirse a la propia inmunoglobulina, a las composiciones que comprenden la inmunoglobulina parental o a las secuencias aminoácidos que la codifican.
Por "anticuerpo parental" o "anticuerpo de tipo silvestre" se entiende en el presente documento un polipéptido no modificado, un anticuerpo de origen natural o una versión modificada por ingeniería de un anticuerpo de origen natural que carece de una o más de las modificaciones de aminoácidos de la región Fc desvelado en el presente documento y que difiere de la función efectora en comparación con la IgG variante tal como se desvela en el presente documento. El anticuerpo parental puede comprender una secuencia nativa de la región Fc o una región Fc con modificaciones preexistentes de la secuencia de aminoácidos (tales como adiciones, deleciones y/o sustituciones). El anticuerpo parental puede comprender también aminoácidos no naturales tales como los descritos más adelante. El anticuerpo parental también puede referirse al propio anticuerpo, a las composiciones que comprenden el anticuerpo parental o a las secuencias aminoácidos que la codifican.
En ciertas realizaciones, "IgG parental", "anticuerpo parental", "IgG tipo silvestre", o "anticuerpo de tipo silvestre" incluye, aunque no de forma limitativa, anticuerpos comerciales conocidos, producidos en forma recombinante como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, la IgG de tipo silvestre es una IgG que tiene la región Fc de IgG humana de tipo silvestre. En ciertas realizaciones, la región Fc de IgG humana de tipo silvestre se refiere a la región Fc que carece de una o más de las modificaciones de aminoácidos de la región Fc desveladas en el presente documento. En ciertas realizaciones, la región Fc de IgG humana de tipo silvestre se refiere a la región Fc con una o más modificaciones de aminoácidos de la región Fc no desveladas en el presente documento. En ciertas realizaciones, la IgG de tipo silvestre es bevacizumab. De acuerdo con la presente divulgación, la IgG variante de dicho anticuerpo de tipo silvestre es una proteína de fusión Fc que comprende fragmentos del dominio Fab del anticuerpo de tipo silvestre o el dominio o dominios de una proteína no de anticuerpo y un fragmento de dominio de Fc que comprende una o más de las modificaciones de la región Fc desveladas en el presente documento. De acuerdo con la presente divulgación, la región Fc de IgG humana de tipo silvestre se refiere a una región Fc de IgG con la mutación L251 D o L251 D/434H de Fc, pero que no tiene otras modificaciones de aminoácidos de la región Fc descritas en el presente documento.
Por "variante", "proteína variante" o "variante de proteína" se entiende en el presente documento una proteína que difiere de una proteína parental en virtud de al menos una modificación de aminoácidos. La variante de proteína se puede referir a la propia proteína, a una composición que comprende la proteína o a la secuencia de aminoácidos que la codifica. La variante de proteína puede tener al menos una modificación de aminoácidos en comparación con el polipéptido parental, por ejemplo, desde aproximadamente una a aproximadamente diez modificaciones de aminoácidos. La variante de proteína tiene al menos dos modificaciones de aminoácidos en la región Fc de IgG o al menos tres modificaciones de aminoácidos en la región Fc de IgG. La secuencia de la variante de proteína en el presente documento puede poseer al menos aproximadamente un 80% de homología con una secuencia de proteína parental; al menos aproximadamente un 90% de homología, más preferentemente al menos aproximadamente un 95% de homología. Las proteínas variantes también pueden comprender aminoácidos no naturales, como se define más adelante. La expresión "variante de proteína" incluye la variante de inmunoglobulina y la variante de anticuerpo como se describe en el presente documento.
La expresión "variante de inmunoglobulina", "inmunoglobulina de variante", "IgG variante" o "variante de IgG " significa en el presente documento una secuencia de inmunoglobulina que difiere de una secuencia de inmunoglobulina parental o de tipo silvestre en virtud de al menos una modificación de aminoácidos. En ciertas realizaciones, la IgG variante es un anticuerpo anti-VEGF. En una realización, la IgG variante es una variante de bevacizumab que comprende una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fc del anticuerpo.
Por "variante de anticuerpo" o "anticuerpo variante" se entiende en el presente documento un anticuerpo que difiere de un anticuerpo parental en virtud de al menos una modificación de aminoácidos. En ciertas realizaciones, el anticuerpo variante tiene una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fc respecto al anticuerpo de tipo silvestre.
Por "posición" se entiende en el presente documento una localización en la secuencia de una proteína. Las posiciones se pueden numerar secuencialmente o de acuerdo con un formato establecido, por ejemplo, el índice EU según Kabat.
El término "polipéptido que contiene la región Fc" o "polipéptido Fc" se refiere a un polipéptido que comprende la totalidad o parte de una región Fc. Por ejemplo, los polipéptidos Fc incluyen anticuerpos, fusiones de Fc, Fc aislados y fragmentos de Fc.
El término "anticuerpo que comprende la región Fc" se refiere a un anticuerpo que comprende una región Fc. La lisina C-terminal (resto 447 de acuerdo con el sistema de numeración EU) de la región Fc puede eliminarse, por ejemplo, durante purificación del anticuerpo o mediante ingeniería recombinante del ácido nucleico que codifica el anticuerpo. Por consiguiente, una composición que comprende un anticuerpo que tiene una región Fc puede comprender un anticuerpo con K447, con la totalidad de K447 eliminada o una mezcla de anticuerpos con y sin el resto k447.
Una "modificación de aminoácidos" se refiere a un cambio de la secuencia de aminoácidos de una secuencia predeterminada de aminoácidos. Los ejemplos de modificaciones incluyen una sustitución, inserción y/o supresión de aminoácidos. En ciertas realizaciones, la modificación de aminoácidos es una sustitución.
Una "modificación de aminoácidos en" una posición especificada, por ejemplo, de la región Fc, se refiere a la sustitución o eliminación del resto especificado o a la inserción de al menos un resto de aminoácido adyacente al resto especificado. Por inserción "adyacente" a un resto específico se entiende la inserción dentro de uno a dos restos correspondientes. La inserción puede ser N-terminal o C-terminal en el resto especificado.
Una "sustitución de aminoácidos" se refiere al reemplazo de al menos un resto existente de aminoácido en una secuencia de aminoácidos predeterminada por otro resto diferente de aminoácido de "reemplazo". El resto o los restos de reemplazo pueden ser "restos de aminoácidos de origen natural" (es decir, codificados en el código genético) y seleccionados del grupo que consiste en: alanina (Ala); arginina (Arg); asparagina (Asn); ácido aspártico (Asp); cisteína (Cys); glutamina (Gln); ácido glutámico (Glu); glicina (Gly); histidina (His); isoleucina (Ile); leucina (Leu); lisina (Lys); metionina (Met); fenilalanina (Phe); prolina (Pro); serina (Ser); treonina (Thr); triptófano (Trp); tirosina (Tyr); y valina (Val). En ciertas realizaciones, el resto de reemplazo no es cisteína. La sustitución por uno o más restos de aminoácidos no naturales también queda abarcada por la definición de una sustitución de aminoácido en el presente documento.
Un "resto de aminoácido no natural" se refiere a un resto, distinto de los restos de aminoácidos de origen natural enumerados con anterioridad, que es capaz de unirse covalentemente a un(os) resto(s) de aminoácidos adyacentes en una cadena de polipéptido. Los ejemplos de restos de aminoácidos no naturales incluyen norleucina, ornitina, norvalina, homoserina y otros restos de aminoácidos análogos, tales como los descritos en Ellman et al. Enzym. 202: 301-336 (1991); patente de Estados Unidos N.° 6.586.207; documento WO 98/48032; documento WO 03/073238; publicación de los Estados Unidos N.° 2004-0214988A1; documento WO 05135727A2; documento WO 05/74524A2; J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124: 9026-9027; J. W. Chin, y P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 11: 1135-1137; y J. W. Chin et al., (2002), PICAS United States of America 99: 11020-11024. Una "inserción de aminoácidos" se refiere a la incorporación de al menos un aminoácido en una secuencia de aminoácidos predeterminada. Si bien la inserción normalmente consistirá en la inserción de uno o dos restos de aminoácidos, la presente solicitud contempla "inserciones peptídicas" más grandes, por ejemplo, la inserción de aproximadamente tres a aproximadamente cinco o incluso hasta aproximadamente diez restos de aminoácidos. El(los) resto(s) insertado(s) puede(n) ser de origen natural o no natural como se ha divulgado anteriormente.
Una "supresión de aminoácidos" se refiere a la eliminación de al menos un resto de aminoácido de una secuencia de aminoácidos predeterminada.
En ciertas realizaciones, la expresión "aumentar", "semivida aumentada" o "semivida in vivo aumentada" se refiere a un aumento global de al menos aproximadamente un 25%, un 30 %, un 40 %, un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 100 %, un 150 %, un 200 %, un 300 % o más, en la semivida in vivo de una IgG variante de la invención detectada por los métodos conocidos en la técnica estándar, tales como los descritos en el presente documento, comparados con una IgG de tipo silvestre o una IgG que tiene la región Fc de IgG humana de tipo silvestre. En ciertas realizaciones, el término aumento se refiere al aumento in vivo de la semivida de la IgG variante, en donde el aumento es de al menos aproximadamente un 1,25X, 1,5X, 1,75X, 2X, 3X, 4X, 5X o 10X o mayor comparado con una IgG de tipo silvestre o una IgG que tiene la región Fc de IgG humana de tipo silvestre. En ciertas realizaciones, la IgG de tipo silvestre o la IgG que tiene la región Fc de IgG humana de tipo silvestre es bevacizumab. En ciertas realizaciones, la semivida media de bevacizumab es de aproximadamente 10 a 12 días, como se ha medido en monos cinomolgos o de aproximadamente 20 semanas, como se ha medido en seres humanos.
La "región bisagra" se define como estirada desde Glu216 hasta Pro230 de la IgG1 humana (Burton, Molec. Immunol.
22: 161-206 (1985)). Las regiones bisagra de otros isotipos de IgG se pueden alinear con la secuencia de IgG1 colocando los restos de cisteína primero y último formando enlaces S-S entre cadenas pesadas en las mismas posiciones.
La "región bisagra inferior" de una región Fc normalmente se define como el tramo de los restos inmediatamente C-terminal en la región bisagra, es decir los restos 233 a 239 de la región Fc. Antes de la presente invención, la unión FcyR se atribuyó normalmente a los restos de aminoácidos en la región bisagra inferior de una región Fc de IgG.
"C1q" es un polipéptido que incluye un sitio de unión para la región Fc de una inmunoglobulina. C1q junto con dos serina proteasas, C1r y C1s, forman el complejo C1, el primer componente de la ruta de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). El C1q humano se puede adquirir comercialmente, por ejemplo, de Quidel, San Diego, California.
El término "dominio de unión" se refiere a la región de un polipéptido que se une a otra molécula. En el caso de un FcR, el dominio de unión puede comprender una porción de una de las cadenas de polipéptido del mismo (por ejemplo, la cadena a del mismo) que es responsable de unirse a una región Fc. Un dominio de unión útil es el dominio extracelular de una cadena a de FcR.
El término "anticuerpo" en el presente documento se utiliza en el sentido más amplio y cubre específicamente los anticuerpos monoclonales (incluidos los anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo, en tanto que muestren la actividad biológica deseada.
Un anticuerpo "aislado" es aquel que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con los usos de investigación, diagnóstico o terapéuticos del anticuerpo y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos o no proteínicos. En algunas realizaciones, un anticuerpo se purifica (1) hasta más de un 95 % en peso de anticuerpo según se determina mediante, por ejemplo, el método de Lowry y en algunas realizaciones, hasta más de un 99 % en peso; (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de, por ejemplo, un secuenciador de taza giratoria o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras utilizando, por ejemplo, tinción azul de Coomassie o plateada. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes, ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Normalmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.
Los "anticuerpos nativos" son generalmente glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 Dalton, compuestas de dos cadenas ligeras idénticas (L) y dos cadenas pesadas idénticas (H). Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada mediante un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera tiene también puentes disulfuro intracatenarios a espacios regulares. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (Vh) seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (Vl) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que restos de aminoácidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada.
El término "dominio constante" se refiere a la porción de una molécula de inmunoglobulina que tiene una secuencia de aminoácidos más conservada con respecto a la otra porción de la inmunoglobulina, el dominio variable, que contiene el sitio de unión al antígeno. El dominio constante contiene los dominios Ch1, Ch2 y Ch3 de la cadena pesada y el dominio CHL de la cadena ligera.
La "región variable" o "dominio variable" de un anticuerpo se refiere a los dominios amino-terminales de la cadena pesada o ligera del anticuerpo. El dominio variable de la cadena pesada puede denominarse "Vh". El dominio variable de la cadena ligera puede denominarse "Vl". Estos dominios generalmente son las partes más variables de un anticuerpo y contienen los sitios de unión al antígeno.
El término "variable" se refiere al hecho de que determinadas porciones de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre los anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo concreto a su antígeno concreto. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida uniformemente en todos los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos llamados regiones hipervariables (HVR), tanto en los dominios variables de cadena ligera como de cadena pesada. Las porciones más conservadas de los dominios variables se denominan regiones marco conservadas (FR). Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan en gran parte una configuración de lámina beta, conectadas por tres HVR, que forman bucles que conectan y en algunos casos, forman parte de la estructura de lámina beta. Las HVR en cada cadena se mantienen juntas muy cerca de las regiones FR y con las HVR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, sino que muestran diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpos.
Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado se pueden asignar a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa (k) y lambda (A), basándose en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.
El término "isotipo" o "subclase" de IgG, como se entiende en el presente documento, significa cualquiera de las subclases de inmunoglobulinas definidas por las características químicas y antigénicas de sus regiones constantes.
En función de la secuencia de aminoácidos de los dominios constantes de sus cadenas pesadas, los anticuerpos se pueden asignar a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y varias de estas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, 8, £, y y M, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas y se han descrito generalmente en, por ejemplo, Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4a ed. (W.B. Saunders, Co., 2000). Un anticuerpo puede ser parte de una molécula de fusión más grande, formada por la asociación covalente o no covalente del anticuerpo con una o más proteínas o péptidos diferentes.
El término "modificación de subclase de IgG" como se entiende en el presente documento significa una modificación de aminoácido que convierte un aminoácido de un isotipo de IgG en el correspondiente aminoácido en un diferente isotipo de IgG alineado. Por ejemplo, dado que IgGi comprende una tirosina e lgG2 una fenilalanina en la posición de EU 296, una sustitución F296Y en lgG2 se considera una modificación de subclase de IgG.
Por "modificación no natural" como se utiliza en el presente documento se entiende una modificación de aminoácido que no es isotípica. Por ejemplo, dado que ninguna de las IgG comprende un ácido glutámico en la posición 332, la sustitución en la posición 332 con ácido glutámico (332E) en IgGi, IgG2, IgG3 o IgG4 se considera una modificación no natural.
Las expresiones "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se utilizan en el presente documento de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo en su forma sustancialmente intacta. Los términos se refieren particularmente a un anticuerpo con cadenas pesadas que contienen una región Fc.
Un "anticuerpo desnudo" para los propósitos del presente documento es un anticuerpo que no está conjugado con una fracción citotóxica o radiomarcador.
Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, que comprende preferentemente la región de unión a antígeno del mismo. En ciertas realizaciones, los fragmentos de anticuerpo comprenden una región Fc o una porción de la región Fc que comprende una o más modificaciones de la región Fc desveladas en el presente documento. Algunos ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y fragmentos Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenario; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un solo sitio de unión a antígeno y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar con facilidad. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación con antígeno y sigue siendo capaz de reticularse con el antígeno.
"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de unión a antígeno completo. En una realización, una especie Fv de dos cadenas consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera en una asociación fuerte no covalente. En una especie de Fv monocatenario (scFv), un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera se puede unir covalentemente mediante un enlazador peptídico flexible, de manera que las cadenas ligera y pesada se puedan asociar en una estructura "dimérica" análoga a la de una especie Fv de dos cadenas. Es en esta configuración que las tres HVR de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero VH-VL. En conjunto, las seis HVR confieren al anticuerpo especificidad de unión al antígeno. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres HVR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad menor que el sitio de unión completo.
El fragmento Fab contiene los dominios variables de cadena ligera y de cadena pesada y también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab en la adición de unos pocos restos en el extremo carboxi del dominio CH1 de cadena pesada incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en el presente documento para Fab' en los que el resto o restos de cisteína de los dominios constantes portan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpos F(ab')2 originalmente se produjeron como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.
Los fragmentos de anticuerpos "Fv monocatenarios" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL de un anticuerpo, en los que estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. Habitualmente, el polipéptido scFv además comprende un enlazador polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión de scFv, véase, por ejemplo, Pluckthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., (Springer-Verlag, Nueva York, 1994), págs. 269-315.
El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión al antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de la cadena pesada (VH) conectado con un dominio variable de la cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Usando un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, se obliga a los dominios a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión al antígeno. Los diacuerpos pueden ser bivalentes o biespecíficos. Se describen diacuerpos de manera más completa en, por ejemplo, documento EP 404.097; documento WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003); y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444­ 6448 (1993). Los triacuerpos y tetracuerpos también se describen en Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003)).
La expresión "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones, por ejemplo, mutaciones de origen natural, que pueden estar presentes en cantidades menores. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica que el carácter del anticuerpo no es una mezcla de anticuerpos discretos. En ciertas realizaciones, tal anticuerpo monoclonal normalmente incluye un anticuerpo que comprende una secuencia polipeptídica que se une a una diana, en donde la secuencia polipeptídica que se une a la diana se obtuvo mediante un proceso que incluye la selección de una única secuencia polipeptídica de unión a la diana de una pluralidad de secuencias polipeptídicas. Por ejemplo, el proceso de selección puede ser la selección de un clon único de una pluralidad de clones, tal como un conjunto de clones de hibridoma, clones de fago o clones de ADN recombinante. Debe entenderse que una secuencia de unión a la diana seleccionada se puede alterar adicionalmente, por ejemplo, para mejorar la afinidad por la diana, para humanizar la secuencia de unión a la diana, para mejorar su producción en cultivo celular, para reducir su inmunogenicidad in vivo, para crear un anticuerpo multiespecífico, etc. y que un anticuerpo que comprende la secuencia de unión a la diana alterada también es un anticuerpo monoclonal de esta invención. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que incluyen normalmente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales está dirigido contra un solo determinante en un antígeno. Además de su especificidad, las preparaciones de anticuerpo monoclonal son ventajosas en cuando a que normalmente no están contaminadas con otras inmunoglobulinas.
El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo por ningún método concreto. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para su uso de acuerdo con la presente invención pueden producirse mediante diversas técnicas, incluyendo, por ejemplo, el método del hibridoma (por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature, 256: 495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Hammerling et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, Nueva York, 1981)), métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 4.816.567), tecnologías de presentación en fagos (véanse, por ejemplo, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); y Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004) y tecnologías para producir anticuerpos humanos o de tipo humano en animales que tienen partes o todos los loci o genes de inmunoglobulina humana que codifican secuencias de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, documento WO 1998/24893; documento WO 1996/34096; documento WO 1996/33735; documento WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); las Patentes de Estados Unidos N.° 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; y 5.661.016; Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995).
Los anticuerpos monoclonales del presente documento incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo en particular, mientras que el resto de la cadena o cadenas es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que muestren la actividad biológica deseada (véanse, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos incluyen anticuerpos PRIMATTZED® en donde la región de unión al antígeno del anticuerpo se deriva de un anticuerpo producido, por ejemplo, inmunizando monos macacos con el antígeno de interés.
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. En una realización, un anticuerpo humanizado es una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor) en la que los restos de una HVR del receptor se reemplazan por restos de una HVR de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como un ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y/o capacidad deseadas. En algunos casos, los restos FR de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los correspondientes restos no humanos. Adicionalmente, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se pueden efectuar para perfeccionar adicionalmente el funcionamiento de los anticuerpos. En general, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno y normalmente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana o todas o sustancialmente todas las regiones f R son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase, por ejemplo, Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)). Véase también, por ejemplo, Vaswani y Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23: 1035-1038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op. Biotech. 5: 428-433 (1994); y las Patentes de Estados Unidos N.° 6.982.321 y 7.087.409.
Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o que ha sido fabricado usando cualquiera de las técnicas para producir anticuerpos humanos como se divulga en el presente documento. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprenda restos de unión a antígeno no humanos. Los anticuerpos humanos se pueden producir también usando diversas técnicas conocidas en la técnica, incluyendo bibliotecas de presentación en fagos. Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). Para la preparación de anticuerpos monoclonales también se dispone de los métodos descritos en Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991). Véase también van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001). Pueden prepararse anticuerpos humanos administrando el antígeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir dichos anticuerpos en respuesta a la exposición a antígenos, pero cuyos loci endógenos se han desactivado, por ejemplo, ratones xenomouse inmunizados (véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N.° 6.075.181 y 6.150.584 referentes a la tecnología XENOMOUSE™). Véase también, por ejemplo, Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 3557-3562 (2006), que se refiere a anticuerpos humanos generados mediante la tecnología de hibridoma de linfocitos B humanos.
Un "anticuerpo dependiente de la especie" es uno que tiene una afinidad de unión más fuerte por un antígeno de una primera especie de mamífero que la que tiene por un homólogo de ese antígeno de una segunda especie de mamífero. Normalmente, el anticuerpo dependiente de la especie "se une específicamente" a un antígeno humano (es decir, tiene un valor de afinidad de unión (Kd) de no más de aproximadamente 1 x 10-7 M, preferentemente no más de aproximadamente 1 x 10-8 M y preferentemente no más de aproximadamente 1 x 10-9 M), pero tiene una afinidad de unión por un homólogo del antígeno de una segunda especie de mamífero no humano que es al menos aproximadamente 50 veces o al menos aproximadamente 500 veces o al menos aproximadamente 1000 veces, más débil que su afinidad de unión por el antígeno humano. El anticuerpo dependiente de la especie puede ser cualquiera de los diversos tipos de anticuerpos definidos anteriormente, pero preferentemente es un anticuerpo humanizado o humano.
La expresión "región hipervariable", "HVR", o "HV", cuando se utiliza en el presente documento, se refiere a las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos. Habitualmente, los anticuerpos comprenden seis HVR; tres en la VH (HI, H2, H3) y tres en la VL (L1, L2, L3). En anticuerpos nativos, H3 y L3 muestran la mayor diversidad de las seis CDR y se cree que H3 en particular desempeña un papel único en conferir una especificidad delicada a los anticuerpos. Véase, por ejemplo, Xu et al., Immunity 13: 37-45 (2000); Johnson y Wu, en Methods in Molecular Biology 248: 1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, Nueva Jersey, 2003). De hecho, los anticuerpos de camélidos de origen natural que consisten en una cadena pesada únicamente son funcionales y estables en ausencia de cadena ligera. Véase, por ejemplo, Hamers-Casterman et al., Nature 363: 446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3: 733-736 (1996)).
Están en uso varias delimitaciones de HVR y se abarcan en el presente documento. Las Regiones Determinantes de la Complementariedad (CDR; del inglés, Complementarity Determining Regions) de Kabat se basan en la variabilidad de secuencia y son las más utilizadas habitualmente (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland. (1991)). Chothia se refiere, en cambio, a la ubicación de los bucles estructurales (Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Las HVR de AbM representan un compromiso entre las CDR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia y se utilizan en el programa informático de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Las HVR "de contacto" se basan en un análisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles. Los restos de cada una de estas HVR se indican a continuación.
Bucle K<abat------------- A bM ------- Chothia------ - Contacto
L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
H1 H31-H35E H26-H35B H26-H32 H30-H35B
(numeración de Kabat)
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35
(numeración de Chothia)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
Las HVR pueden comprender "HVR extendidas" como sigue: 24-36 o 24-34 (L1), 46-56 o 50-56 (L2) y 89-97 u 89-96 (L3) en la VL y 26-35 (H1), 50-65 o 49-65 (H2) y 93-102, 94-102 o 95-102 (H3) en la VH. Los restos del dominio variable se numeran de acuerdo con Kabat et al., citado anteriormente, para cada una de estas definiciones.
Los restos de "marco" o "FR" son aquellos restos de dominio variable distintos de los restos de HVR como se define en el presente documento.
La expresión "numeración de restos de dominio variable como en Kabat" o "numeración de posición de aminoácidos como en Kabat", y variaciones de los mismos, se refiere al sistema de numeración usado para los dominios variables de cadena pesada o los dominios variables de cadena ligera de la compilación de anticuerpos en Kabat et al., mencionado anteriormente. Utilizando este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales correspondientes a un acortamiento de o inserción en, una FR o HVR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir una única inserción de aminoácido (resto 52a de acuerdo con Kabat) después del resto 52 de H2 y restos insertados (por ejemplo, los restos 82a, 82b y 82c, etc. de acuerdo con Kabat) después del resto 82 de la FR de cadena pesada. La numeración de Kabat de los restos puede determinarse para un anticuerpo dado por alineación en las regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de Kabat "patrón".
El sistema de numeración de Kabat se utiliza habitualmente cuando se hace referencia a un resto en el dominio variable (aproximadamente los restos 1 —107 de la cadena ligera y los restos 1 —113 de la cadena pesada (por ejemplo, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland. (1991)). El "sistema de numeración EU" o "índice EU" se utiliza generalmente cuando se hace referencia a un resto en una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, el índice EU informado en Kabat et al., citado anteriormente). El "índice EU como en Kabat" se refiere a la numeración de restos del anticuerpo EU de lgG1 humano. A menos que se indique otra cosa en el presente documento, las referencias a los números de restos en el dominio variable de los anticuerpos significa una numeración de restos por el sistema de numeración de Kabat. A menos que se indique otra cosa en el presente documento, las referencias a los números de restos en el dominio constante de los anticuerpos significa una numeración de restos por el sistema de numeración de EU (véase, por ejemplo, la publicación PCT N.° WO2006073941).
Un anticuerpo "madurado por afinidad" es uno con una o más alteraciones en uno o más HVR del mismo que da como resultado una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno, en comparación con un anticuerpo parental que no posee dicha(s) alteraciones(s). En una realización, un anticuerpo madurado por afinidad tiene afinidades nanomolares o incluso picomolares por el antígeno diana. Los anticuerpos madurados por afinidad se pueden producir utilizando ciertos procedimientos conocidos en la materia. Por ejemplo, Marks et al. Bio/Technology 10: 779-783 (1992) describen la maduración por afinidad por la mezcla de dominios VH y VL. La mutagénesis aleatoria de los restos HVR y/o marco conservadas está descrita en, por ejemplo, Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91: 3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol.
154(7): 3310-9 (1995); y Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226: 889-896 (1992)).
Un anticuerpo "de bloqueo" o un anticuerpo "antagonista" es uno que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno al que se une. Ciertos anticuerpos de bloqueo o anticuerpos antagonistas inhiben sustancial o completamente la actividad biológica del antígeno.
Un "anticuerpo agonista", como se utiliza en el presente documento, es un anticuerpo que imita parcial o totalmente al menos una de las actividades funcionales de un polipéptido de interés.
Los anticuerpos "inhibidores del crecimiento" son aquellos que evitan o reducen la proliferación de una célula que expresa un antígeno al que se une el anticuerpo.
Las "funciones efectoras" del anticuerpo hacen referencia a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc (una región Fc de la secuencia nativa o una región Fc de la variante de la secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo y varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC); unión al receptor Fc; citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (CCDA; en inglés, ADCC); fagocitosis; regulación negativa de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B); y activación de linfocitos B.
El término "región Fc" en el presente documento se utiliza para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo regiones Fc de secuencia nativa y regiones Fc variantes. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la región Fc de cadena pesada de lgG humana habitualmente se define como que se extiende desde un resto de aminoácido en la posición Cys226 o desde Pro230, al extremo carboxilo de la misma. La lisina C-terminal (resto 447 de acuerdo con el sistema de numeración EU) de la región Fc puede eliminarse, por ejemplo, durante la producción o purificación del anticuerpo o mediante ingeniería recombinante del ácido nucleico que codifica una cadena pesada del anticuerpo. Por consiguiente, una composición de anticuerpos intactos puede comprender poblaciones de anticuerpos con todos los restos de K447 eliminados, poblaciones sin restos de K447 eliminados y poblaciones de anticuerpos que tienen una mezcla de anticuerpos con y sin el resto K447. En ciertas realizaciones, La región Fc de una inmunoglobulina comprende dos dominios constantes, Ch2 y Ch3.
El "dominio Ch2" de una región Fc de IgG humana (también denominada como dominio "Cy2") normalmente se extiende aproximadamente del aminoácido 231 a aproximadamente el aminoácido 340. El dominio Ch2 es único ya que no está emparejado de forma cercana con otro dominio. Más bien, dos cadenas de hidratos de carbono ramificadas unidas a N se interponen entre los dos dominios Ch2 de una molécula de IgG nativa intacta. Se ha especulado que el carbohidrato puede proporcionar un sustitutivo para el emparejamiento dominio-dominio y ayudar a estabilizar el dominio Ch2. Burton, Molec. Immunol. 22: 161-206 (1985)).
El "dominio Ch3" comprende el tramo de restos C-terminal a un dominio Ch2 en una región Fc (es decir, de aproximadamente el resto de aminoácido 341 hasta aproximadamente el resto 447 de una IgG).
Una "región Fc funcional" posee una "función efectora" de una región Fc de secuencia nativa. Las "funciones efectoras" a modo de ejemplo incluyen unión a receptor Fc; unión a C1q; CDC; CCDA; fagocitosis; regulación negativa de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B; BCR), etc. Tales funciones efectoras habitualmente requieren que la región Fc se combine con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo) y se puede evaluar usando diversos ensayos.
Una "región Fc de secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fc encontrada en la naturaleza. Las regiones Fc humanas de secuencias nativas incluyen una región Fc de IgG1 humana de secuencia nativa (alotipos A y no A); región Fc de IgG2 humana de secuencia nativa; región Fc de IgG3 humana de secuencia nativa; y región Fc de IgG4 humana de secuencia nativa así como variantes de las mismas de origen natural (véanse, por ejemplo, el SEQ ID NO: 11 a el SEQ ID NO: 17).
Una "región Fc variante" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de aquella de una región Fc de secuencia nativa en virtud de al menos una modificación de aminoácidos, En ciertas realizaciones, una región Fc variante comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de aquella de una región Fc de secuencia nativa en una o más sustituciones de aminoácidos. En ciertas realizaciones, la región Fc variante tiene al menos una sustitución de aminoácidos en comparación con la región Fc de una IgG de tipo silvestre o un anticuerpo de tipo silvestre. En ciertas realizaciones, la región Fc variante tiene dos o más sustituciones de aminoácidos en la región Fc del anticuerpo de tipo silvestre. En ciertas realizaciones, la región Fc variante tiene tres o más sustituciones de aminoácidos en la región Fc del anticuerpo de tipo silvestre. En ciertas realizaciones, la región Fc variante tiene al menos una, dos o tres o más sustituciones de aminoácidos de la región Fc descritas en el presente documento. En ciertas realizaciones, la región Fc variante en el presente documento posee al menos aproximadamente un 80% de homología con una región Fc de secuencia nativa y/o con una región Fc de un polípéptido parental. En ciertas realizaciones, la región Fc variante en el presente documento posee al menos aproximadamente un 90 % de homología con una región Fc de secuencia nativa y/o con una región Fc de un polípéptido parental. En ciertas realizaciones, la región Fc variante en el presente documento posee al menos aproximadamente un 95 % de homología con una región Fc de secuencia nativa y/o con una región Fc de un polípéptido parental.
Un "receptor Fc" o "FcR" es un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. En algunas realizaciones, un FcR es un FcR humano nativo. En algunas realizaciones, un FcR preferido es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII y FcyRIII, incluyendo las variantes alélicas y las formas de corte y empalme alternativo de esos receptores. Los receptores de FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor activador") y FcyRI IB (un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplasmáticos de los mismos. El receptor activador FcyRIIA contiene un motivo de activación inmunorreceptor basado en tirosina (ITAM; del inglés, immunoreceptor tyrosine-based activation motif) en su dominio citoplasmático. El receptor FcyRIIB inhibidor contiene un motivo de inhibición inmunorreceptor basado en tirosina (ITIM; del inglés, immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif) en su dominio citoplasmático. (véase, por ejemplo, Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). Se revisan FcR, por ejemplo, en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995)). Otros FcR, incluyendo los que se identifiquen en el futuro, están abarcados por el término "FcR" en el presente documento.
La expresión "receptor Fc" o "FcR" también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) y de la regulación de la homeostasis de las inmunoglobulinas. Se conocen métodos para medir la unión a FcRn (véase, por ejemplo, Ghetie y Ward., Immunol. Today 18(12): 592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7): 637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216 (2004); documento WO 2004/92219 (Hinton et al.).
La semivida in vivo o en suero de los polipéptidos de unión de alta afinidad de FcRn humano puede ser evaluada, por ejemplo, en ratones transgénicos, en seres humanos o en primates no humanos a los que se administran los polipéptidos con una región Fc variante. Véase también, por ejemplo, Petkova et al. International Immunology 18(12): 1759-1769 (2006).
Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcR y realizan funciones efectoras. En ciertas realizaciones, las células expresan al menos FcyRIII y realizan la(s) función(ones) efectora(s) de CCDA. Entre los ejemplos de leucocitos humanos que median la CCDA se incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC; del inglés, peripheral blood mononuclear cells), linfocitos citolíticos naturales (NK; del inglés, natural killer), monocitos, linfocitos T citotóxicos y neutrófilos. Las células efectoras pueden aislarse de una fuente nativa, por ejemplo, de la sangre.
La "citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo" o "CCDA" se refiere a una forma de citotoxicidad en donde la Ig secretada unida a receptores Fc (FcR) presentes en determinadas células citotóxicas (por ejemplo, linfocitos citolíticos NK, neutrófilos y macrófagos) permite que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula diana portadora del antígeno y posteriormente destruyan a la célula diana con citotoxinas. Las células primarias para mediar en la CCDA, células n K, expresan FcyRIII solamente, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991). Para evaluar la actividad de CCDA de una molécula de interés, puede realizarse un ensayo de CCDA in vitro, tal como se describe en la patente de Estados Unidos N.° 5.500.362 o 5.821.337 o la patente de Estados Unidos N.° 6.737.056 (Presta). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células PBMC y NK. Como alternativa o adicionalmente, la actividad de CCDA de la molécula de interés puede determinarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el desvelado en Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).
"Citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula diana en presencia del complemento. La activación de la ruta clásica del complemento se inicia por la unión del primer componente del sistema del complemento (C1q) a anticuerpos (de la subclase apropiada), que están unidos a su antígeno afín. Para evaluar la activación de complemento, puede realizarse un ensayo CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996). Las variantes de polipéptidos con secuencias de aminoácidos de la región Fc alterada (polipéptidos con una región Fc variante) y capacidad de unión a C1 q aumentada o reducida se describen, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos N.° 6.194.551 B1 y el documento WO 1999/51642. Véase también, por ejemplo, Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
Una variante de polipéptido con afinidad de unión a FcR o actividad de CCDA "alterada" es una que tiene actividad de unión a FcR y/o actividad de CCDA potenciada o disminuida en comparación con un polipéptido parental o con un polipéptido que comprende una región Fc de secuencia nativa. La variante de polipéptido que "presenta una unión aumentada" a un FcR une al menos un FcR con mejor afinidad que el polipéptido parental. La variante de polipéptido que "presenta una unión reducida" a un FcR, une al menos un FcR con menor afinidad que un polipéptido parental. Tales variantes que presentan una unión disminuida a un FcR pueden poseer poca o ninguna unión apreciable a un FcR, por ejemplo, 0-20% de unión al FcR en comparación con una región Fc de IgG de secuencia nativa.
La variante de polipéptido que "media citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (CCDA) en presencia de células efectoras humanas de manera más efectiva" que un anticuerpo parental es una que, in vitro o in vivo, es sustancialmente más efectiva para mediar la CCDA, cuando las cantidades de variante de polipéptido y anticuerpo parental utilizadas en el ensayo son esencialmente las mismas. Habitualmente, tales variantes se identificarán utilizando el ensayo de CCDA in vitro como se desvela en el presente documento, aunque se contemplan otros ensayos o métodos para determinar la actividad de CCDA, por ejemplo, en un modelo animal, etc.
"Afinidad de unión" se refiere generalmente a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un solo sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique lo contrario, como se utiliza en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su pareja Y se puede representar habitualmente por su constante de disociación (Kd), el recíproco de la constante de asociación (Ka). La afinidad puede medirse mediante métodos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento. Los anticuerpos de baja afinidad habitualmente se unen al antígeno lentamente y/o tienden a disociarse fácilmente, mientras que los anticuerpos de alta afinidad habitualmente se unen al antígeno más rápido y/o tienden a permanecer unidos durante más tiempo. Se conocen diversidad de métodos de medición de la afinidad de unión en la técnica, cualquiera de los cuales puede usarse para los fines de la presente invención. A continuación se describen realizaciones específicas ilustrativas y a modo de ejemplo para medir la afinidad de unión.
En ciertas realizaciones, el "Kd", "Kd", "Kd" o "valor Kd" de acuerdo con esta invención se mide utilizando los ensayos de resonancia de plasmón superficial usando un BIACC)RE®-2000 o a BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, Nueva Jersey) a 25 °C con chips CM5 de antígeno inmovilizados en ~10 unidades de respuesta (UR). En resumen, los chips biosensores de dextrano carboximetilados (CM5, BIACORE, Inc.) se activan con clorhidrato de A/-etil-W-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y A/-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, a 5 pg/ml (~0,2 pM) antes de la inyección en un caudal de 5 pl/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Después de la inyección del antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos que no han reaccionado. Para las mediciones de cinética, se inyectan diluciones seriadas de polipéptido, por ejemplo, anticuerpo de longitud total, en PBS con tensioactivo de Tw Ee N-20™ al 0,05 % (PBST) a 25 °C en un caudal de aproximadamente 25 pl/min. Las tasas de asociación (kon) y las tasas de disociación (koff) se calculan utilizando un modelo de unión Langmuir simple uno a uno (Software de evaluación BIACORE® versión 3.2) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación en el equilibrio (Kd) se calcula como la proporción koff/kon. Véase, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293: 865-881 (1999)). Si la velocidad de asociación supera 106 M' 1 s_1 mediante el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, puede determinarse la velocidad de asociación utilizando una técnica de inactivación fluorescente que mide el aumento o la reducción en la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25 °C de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno medidas en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con flujo de parada (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro s LM-AMINCO™ serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.
Una "velocidad de asociación", "tasa de asociación", "tasa de asociación", o "kon"de acuerdo con esta invención también se puede determinar como se ha descrito anteriormente utilizando un sistema BIACORE®-2000 o BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, Nueva Jersey).
La expresión "sustancialmente similar" o "sustancialmente el mismo", como se utiliza en el presente documento, denota un grado de similitud suficientemente elevado entre dos valores numéricos, de manera que un experto en la materia podría considerar que la diferencia entre los dos valores tendría una significación biológica y/o estadística pequeña o nula en el contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores de Kd). En ciertas realizaciones, la diferencia entre dichos dos valores es, por ejemplo, menor de aproximadamente un 50 %, menor de aproximadamente un 40 %, menor de aproximadamente un 30 %, menor de aproximadamente un 20 % y/o menor de aproximadamente un 10 %, en función del valor de referencia/comparación.
La expresión "sustancialmente reducida", o "sustancialmente diferente", como se utiliza en el presente documento, denota un grado de similitud suficientemente elevado entre dos valores numéricos, de manera que un experto en la materia podría considerar que la diferencia entre los dos valores tendría una significación biológica y/o estadística en el contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores de Kd). En ciertas realizaciones, la diferencia entre dichos dos valores es, por ejemplo, mayor de aproximadamente un 10 %, mayor de aproximadamente un 20 %, mayor de aproximadamente un 30 %, mayor de aproximadamente un 40 % y/o mayor de aproximadamente un 50 %, en función del valor para la molécula de referencia/comparación.
Un "marco aceptor humano", a efectos del presente documento, es un marco que comprende la secuencia de aminoácidos de un marco VL o VH derivado de un marco de inmunoglobulina humana o un marco consenso humano. Un marco aceptor humano "derivado de" un marco de inmunoglobulina humana o de un marco consenso humano pueden comprender la misma secuencia de aminoácidos del mismo o puede contener cambios en la secuencia de aminoácidos preexistente. En algunas realizaciones, el número de cambios de aminoácidos preexistentes es 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos o 2 o menos. En donde los cambios de aminoácidos preexistentes están presentes en una VH, esos cambios suceden preferentemente en solo tres, dos o una posiciones 71H, 73H y 78H; por ejemplo, los restos de aminoácidos en esas posiciones pueden ser 71A, 73T y/o 78A. En una realización, el marco humano aceptor de VL es idéntico en secuencia a la secuencia del marco de VL de inmunoglobulina humana o a la secuencia de marco consenso humana.
Un "marco de consenso humano" es un marco que representa los restos de aminoácidos más comunes en una selección de secuencias marco VL o VH de inmunoglobulina humana. Habitualmente, la selección de secuencias de VL o VH de inmunoglobulina humanas es de un subgrupo de secuencias de dominio variable. Habitualmente, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat et al., mencionado anteriormente. En una realización, para la VL, el subgrupo es el subgrupo kappa I, como en Kabat et al., mencionado anteriormente. En una realización, para la VH, el subgrupo es el subgrupo III, como en Kabat et al., mencionado anteriormente.
Un "marco de consenso del subgrupo III de VH" comprende la secuencia de consenso obtenida a partir de las secuencias de aminoácidos en el subgrupo III de variable pesada de Kabat et al.
Un "marco de consenso del subgrupo I de VL" comprende la secuencia de consenso obtenida a partir de las secuencias de aminoácidos en el subgrupo I de variable ligera kappa de Kabat et al.
"Purificada" significa que una molécula está presente en una muestra en una concentración de al menos un 95% en peso o al menos un 98% en peso de la muestra en la que está contenida.
Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que se separa de al menos una molécula de ácido nucleico con la que normalmente está asociada, por ejemplo, en su ambiente natural. Un ácido nucleico aislado incluye adicionalmente una molécula de ácido nucleico contenida en células que normalmente contienen la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente de forma extracromosómica o en una ubicación cromosómica que es diferente de su ubicación cromosómica natural.
El término "vector", como se utiliza en el presente documento, pretende referirse a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un a Dn bicatenario circular en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector de fago. Otro tipo de vector es un vector vírico, en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales al genoma viral. Determinados vectores son aptos para la replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamífero). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episómicos de mamífero) se pueden integrar en el genoma de una célula huésped tras su introducción en la célula huésped y de este modo se replican junto con el genoma del huésped. Asimismo, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están unidos operativamente. Tales vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión recombinante", o simplemente, "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión útiles en las técnicas de ADN recombinante están con frecuencia en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" se pueden utilizar indistintamente, dado que el plásmido es la forma de vector más comúnmente utilizada.
"Polinucleótido", o "ácido nucleico", como se utiliza en el presente documento, se refiere a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud e incluye ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos o bases modificados y/o sus análogos o cualquier sustrato que pueda incorporarse en un polímero mediante ADN o ARN polimerasa o mediante una reacción de síntesis. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. Si está presente, se pueden impartir modificaciones a la estructura de los nucleótidos antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede estar interrumpida por componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido puede comprender modificaciones hechas tras la síntesis, tales como la conjugación en una etiqueta. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, "casquetes", sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo, modificaciones internucleotídicas tales como, por ejemplo, las que tienen enlaces no cargados (por ejemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), las que contienen fracciones colgantes, tal como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc.), las que tienen intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), las que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidativos, etc.), aquellas que contienen alquilantes, aquellas con enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos, alfa anoméricos, etc.), así como formas no modificadas del(los) polinucleótido(s). Adicionalmente, puede reemplazarse cualquiera de los grupos hidroxilo normalmente presentes en los azúcares, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegerse mediante grupos protectores convencionales o activarse para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales o pueden conjugarse a soportes sólidos o semisólidos. El OH 5' y 3' terminal puede fosforilarse o sustituirse con aminas o fracciones de casquetes de remate orgánicos de 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también pueden derivatizarse en grupos protectores convencionales. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares de ribosa o desoxirribosa que son normalmente conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, 2-O-metil-, 2'-O-alil-, 2'-fluoro- o 2'-azido-ribosa, análogos de azúcares carbocíclicos, azúcares aanoméricos, azúcares epiméricos, tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos de nucleósidos básicos, tales como metil ribósido. Pueden reemplazarse uno o más enlaces fosfodiéster por grupos de enlace alternativos. Estos grupos de unión alternativos incluyen, pero sin limitación, realizaciones en donde el fosfato se reemplaza por P(O)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (O)NR2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OR', CO o CH2 ("formacetal"), en donde cada R o R' son independientemente H o alquilo (1-20 C) sustituido o no sustituido que contiene opcionalmente un enlace éter (-O-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No es necesario que todos los enlaces en un polinucleótido sean idénticos. La descripción anterior se aplica a todos los polinucleótidos citados en el presente documento, incluyendo ADN y ARN.
"Oligonucleótido", como se utiliza en el presente documento, habitualmente se refiere a polinucleótidos cortos, habitualmente monocatenarios, habitualmente sintéticos que habitualmente son, pero no necesariamente, de menos de aproximadamente 200 nucleótidos de longitud. Los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido" no son mutuamente excluyentes. La descripción anterior para los oligonucleótidos es igual y totalmente aplicable a oligonucleótidos.
La expresión "secuencias de control" se refiere a las secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación unida operativamente a un organismo hospedador particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de unión a ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.
El ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se pone en relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o líder de secreción está unido operativamente con ADN de un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido operativamente con una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está unido operativamente con una secuencia codificante si se coloca de manera que facilite la traducción. Habitualmente, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas y en el caso de un líder de secreción, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, no es necesario que los potenciadores sean contiguos. La unión se realiza mediante ligamiento en sitios de restricción convenientes. Si no existen dichos sitios, se usan adaptadores o conectores oligonucleotídicos sintéticos de acuerdo con la práctica habitual.
Como se utiliza en el presente documento, las expresiones "célula", "línea celular", y "cultivo celular" se pueden utilizar indistintamente y todas estas denominaciones incluyen la descendencia. Por tanto, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula objeto primaria y cultivos procedentes de la misma sin tener en cuenta el número de transferencias. Se entiende también que toda la descendencia puede no ser exactamente idéntica en el contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o involuntarias. Se incluyen descendientes mutantes que tienen la misma función o actividad biológica que la usada para cribar la célula transformada originalmente. Cuando se pretendan denominaciones distintas, esto resultará evidente según el contexto.
Como se utiliza en el presente documento, "conjunto de codones" se refiere a un conjunto de diferentes secuencias tripletes de nucleótidos utilizadas para codificar los aminoácidos variantes deseados. Un conjunto de oligonucleótidos puede sintetizarse, por ejemplo, por síntesis en fase sólida, incluyendo secuencias que representan todas las posibles combinaciones de tripletes de nucleótidos proporcionados por el conjunto de codones y que codificarán el grupo deseado de aminoácidos. Una forma estándar de designación de codones es la del código iUb , que se conoce en la técnica y se describe en el presente documento. Un conjunto de codones normalmente se representa por 3 letras en mayúscula y cursiva, por ejemplo, NNK, NNS, XYZ, DVK y similares. Un "conjunto de codones no aleatorios", como se utiliza en el presente documento, se refiere, por tanto, a un conjunto de codones que codifica aminoácidos seleccionados que satisfacen parcialmente, preferentemente completamente, los criterios para la selección de aminoácidos como se describe en el presente documento. La síntesis de oligonucleótidos con "degeneración" de nucleótidos seleccionada en ciertas posiciones se conoce en la técnica, por ejemplo, el enfoque TRIM (Knappek et al. (1999) J. Mol. Biol. Biol. 296: 57-86); Garrard y Henner (1993) Gene 128:103). Tales conjuntos de oligonucleótidos que tienen ciertos conjuntos de codones pueden sintetizarse utilizando sintetizadores de ácido nucleico comerciales (disponibles en, por ejemplo, Applied Biosystems, Foster City, California) o se pueden obtener comercialmente (por ejemplo, de Life Technologies, Rockville, Maryland). Por tanto, un conjunto de oligonucleótidos sintetizados que tiene un conjunto de codones particular incluye normalmente una pluralidad de oligonucleótidos con diferentes secuencias, las diferencias establecidas por el conjunto de codones dentro de la secuencia general. Los oligonucleótidos, como se utiliza de acuerdo con la invención, tienen secuencias que permitan la hibridación con un molde de ácido nucleico de dominio variable y también pueden, aunque no necesariamente, incluir sitios enzimáticos de restricción útiles para, por ejemplo, los fines de clonación.
La expresión "anticuerpos lineales" se refiere a los anticuerpos descritos en Zapata et al. (1995 Protein Eng, 8(10): 1057-1062). En resumen, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos Fd en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que, junto con polipéptidos de cadena ligera complementarios, forman un par de regiones de unión a antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.
Como se utiliza en el presente documento, "biblioteca" se refiere a una pluralidad de secuencias de anticuerpos o de fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, las IgG variantes de la invención) o a los ácidos nucleicos que codifican estas secuencias, siendo las secuencias diferentes en la combinación de aminoácidos variantes que se introducen en estas secuencias de acuerdo con los métodos de la invención.
La "presentación en fagos" es una técnica por la que los polipéptidos se presentan como proteínas de fusión a al menos una porción de la proteína de cobertura sobre la superficie del fago, por ejemplo, fago filamentoso, partículas. Una utilidad de la presentación en fagos recae en el hecho de que pueden elegirse grandes bibliotecas de variantes de proteínas aleatorias rápida y eficientemente en cuanto a aquellas secuencias que se unen a un antígeno diana con alta afinidad. La presentación de las bibliotecas de péptidos y proteínas sobre el fago se ha utilizado para cribar millones de polipéptidos para los que tienen propiedades de unión específicas. Los métodos de presentación en fagos polivalente se han utilizado para visualizar pequeños péptidos aleatorios y pequeñas proteínas a través de fusiones al gen III o al gen VIII del fago filamentoso. Wells y Lowman (1992) Curr. Opin. Struct. Biol. 3: 355 -362) y las referencias citadas en ese documento. En una presentación en fagos monovalentes, una biblioteca de proteínas o péptidos se fusiona a un gen III o una porción del mismo y se expresa a niveles bajos en presencia de una proteína de gen III de tipo silvestre de manera que las partículas de fagos presentan una copia o ninguna de las proteínas de fusión. Los efectos de avidez se reducen relativos al fago polivalente de manera que la clasificación se basa en la afinidad de ligando intrínseca y se utilizan vectores fagémidos, que simplifican las manipulaciones de ADN. Lowman y Wells (1991) Methods: A Companion to Methods in Enzymology 3: 205 -0216.
Un "fagémido" es un vector plasmídico que tiene un origen bacteriano de replicación, por ejemplo, Co1E1 y una copia de una región intergénica de un bacteriófago. El fagémido se puede usar en cualquier bacteriófago conocido, incluyendo el bacteriófago filamentoso y el bacteriófago lambdoide. El plásmido contendrá también habitualmente un marcador seleccionare para la resistencia antibiótica. Los segmentos de ADN clonados en estos vectores se pueden propagar como plásmidos. Cuando las células que albergan estos vectores están provistas con todos los genes necesarios para la producción de partículas de fagos, el modo de replicación del plásmido cambia a replicación en círculo rodante para generar copias de una cadena del ADN plasmídico y empaquetar partículas de fagos. El fagémido puede formar partículas de fagos infecciosas o no infecciosas. Este término incluye fagémidos que contienen un gen proteico de cobertura de fago o fragmento del mismo ligado a un gen polipeptídico heterólogo como una fusión génica de manera que el polipéptido heterólogo se visualice sobre la superficie de la partícula de fago.
El término "vector de fago" hace referencia a una forma replicante bicatenaria de un bacteriófago que contiene un gen heterólogo y capaz de replicación. El vector de fago tiene un origen de replicación de fago que permite la replicación del fago y la formación de partículas del fago. El fago es preferentemente un bacteriófago filamentoso, tal como un fago M13, f1, fd, Pf3 o un derivado de los mismos o un fago lamboide, tal como lambda, 21, phi80, phi81, 82, 424, 434, etc. o un derivado del mismo.
Como se utiliza en el presente documento, "posición accesible del disolvente" se refiere a una posición de un resto de aminoácido en las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de un fragmento de unión a antígeno o anticuerpo fuente que está determinada, basándose en la estructura, ensamblaje de estructuras y/o estructura modelada del fragmento de unión a antígeno o anticuerpo, tal como se encuentra potencialmente disponibles para acceso y/o contacto del disolvente con una molécula, tal como un antígeno específico de anticuerpo. Estas posiciones se encuentran normalmente en las CDRs y sobre el exterior de la proteína. Las posiciones accesibles del disolvente de un fragmento de unión a antígeno o anticuerpo, tal como se definen en el presente documento, se pueden determinar utilizando cualquiera de un número de algoritmos conocidos en la técnica. En una realización, las posiciones accesibles del solvente se determinan utilizando coordenadas de un modelo tridimensional de un anticuerpo, preferentemente usando un programa informático tal como el programa Insightll (Accelrys, San Diego, California). Las posiciones accesibles del disolvente se pueden determinar también utilizando algoritmos conocidos en la técnica (por ejemplo, Lee y Richards (1971) J. Mol. Biol. 55, 379 y Connolly (1983) J. Appl. Cryst. 16, 548). La determinación de las posiciones accesibles del disolvente se puede realizar utilizando un software adecuado para modelar de proteínas y la información estructural tridimensional obtenida a partir de un anticuerpo. El software que puede utilizarse para estos fines incluye SYBYL Biopolymer Module (Tripos Associates). Habitualmente, en donde un algoritmo (programa) requiere un parámetro de tamaño de entrada del usuario, el "tamaño" de una sonda que se usa en el cálculo se establece a alrededor de 1,4 Angstrom o menos en radio. Además, los métodos de determinación de las regiones accesibles del disolvente y del área que utilizan el software para los ordenadores personales se han descrito por Pacios (1994) Comput. Chem. 18(4): 377-386.
El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" respecto a la secuencia de un polipéptido de referencia se define como el porcentaje de restos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los restos de aminoácidos en la secuencia de polipéptido de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede lograrse de diversas maneras que están dentro de la experiencia de la técnica, por ejemplo, usando software disponibles al público, tales como los software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar los parámetros necesarios para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr una alineación máxima en la totalidad de la longitud de las secuencias que se estén comparando. Para los fines del presente documento, sin embargo, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 fue programado por Genentech, Inc. y el código fuente, junto con la documentación para usuarios, se han depositado en la Oficina de Derechos de Autor de los Estados Unidos (U.S. Copyright Office), Washington D.C., 20559, donde está registrada con el n.° de Registro de Derechos de Autor de los Estados Unidos TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible al público a través de Genentech, Inc., South San Francisco, California o puede compilarse a partir de su código fuente. El programa ALIGN-2 debe compilarse para su uso en un sistema operativo UNIX, preferentemente UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencia se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían.
En las situaciones donde se emplea ALIGN-2 para comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A para, con o contra una secuencia de aminoácidos dada B (que puede, como alternativa, citarse como una secuencia de aminoácidos A que tiene o comprende un % determinado de identidad de secuencia para, con o frente a una secuencia de aminoácidos B) se calcula del modo siguiente:
100 veces la fracción X/Y
donde X es el número de restos de aminoácidos puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en la alineación del programa de A y B y donde Y es el número total de restos de aminoácidos en B. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de A respecto de B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B respecto de A. A menos que se afirme específicamente lo contrario, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente usando el programa informático ALIGN-2.
El término "VEGF" o "VEGF-A" tal como se utiliza en el presente documento se refiere al factor de crecimiento de células endoteliales vasculares humanas de 165 aminoácidos y a los factores de crecimiento endotelial vascular humano de 121, 189 y 206 aminoácidos relacionados, como se describe por Leung et al. (1989) Science 246:1306 y Houck et al. (1991) Mol. Endocrin, 5:1806, junto con sus formas alélicas y procesadas del mismo de origen natural. El término "VEGF" también se refiere a VEGF de especies no humanas tales como ratón, rata o primate. A veces, el VEGF de una especie específica se indica mediante términos como hVEGF para VEGF humano, mVEGF para VEGF murino, etc. El término "VEGF" también se usa para referirse a formas truncadas del polipéptido que comprende los aminoácidos 8 a 109 o 1 a 109 del factor de crecimiento de células endoteliales vasculares humanas de 165 aminoácidos. La referencia a cualquiera de tales formas de VEGF se puede identificar en la presente solicitud, por ejemplo, por "VEGF (8-109)", "VEGF (1-109)", "VEGF-A109" o "VEGF 165". Las posiciones de aminoácidos para un VEGF nativo "truncado" se numeran como se indica en la secuencia nativa de VEGF. Por ejemplo, la posición de aminoácido 17 (metionina) en el VEGF nativo truncado es también la posición 17 (metionina) del VEGF nativo. El VEGF nativo truncado tiene afinidad de unión por los receptores KDR y Flt-1 comparable al VEGF nativo.
Un "antagonista de VEGF" se refiere a una molécula capaz de neutralizar, bloquear, inhibir, abrogar, reducir o interferir con las actividades de VEGF incluyendo, aunque no de forma limitativa, su unión con uno o más receptores de VEGF. Los antagonistas de VEGF incluyen, sin limitación, anticuerpos anti-VEGF y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, moléculas receptoras y derivados que se unen específicamente a VEGF, secuestrando de este modo su unión a uno o más receptores, anticuerpos del receptor anti-VEGF, antagonistas del receptor de VEGF, tales como inhibidores de molécula pequeña de las tirosinas quinasas del VEGFR e inmunoadhesinas que se unen a VEGF tal como un Trap de VEGF. El término "antagonista de VEGF", como se utiliza en el presente documento, específicamente incluye moléculas, incluyendo anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, otros polipéptidos de unión, péptidos y moléculas pequeñas no peptídicas, que se unen a VEGF y son capaces de neutralizar, bloquear, inhibir, abrogar, reducir o interferir con las actividades de VEGF. Por tanto, la expresión "actividades de VEGF" incluye específicamente las actividades biológicas mediadas por VEGF de VEGF.
Las expresiones "actividad biológica" y "biológicamente activo" con respecto a un polipéptido de VEGF o "actividad de VEGF" se refieren a las propiedades físicas/químicas y funciones biológicas asociadas con VEGF de longitud completa y/o truncado. En ciertas realizaciones, la actividad de VEGF es inducir y/o estimular y/o promover la angiogénesis. En ciertas realizaciones, la actividad de VEGF es inducir y/o estimular y/o promover la neovascularización. En ciertas realizaciones, la actividad de VEGF es inducir y/o modular la permeabilidad vascular. En ciertas realizaciones, la actividad de VEGF es inducir y/o estimular y/o promover la migración de células endoteliales y/o proliferación de las células endoteliales.
Los anticuerpos neutralizantes anti-VEGF suprimen el crecimiento de varias líneas celulares tumorales humanas en ratones desnudos (Kim et al., Nature 362:841-844 (1993); Warren et al., J. Clin. Invest. 95: 1789-1797 (1995); Borgstrom et al., Cancer Res. 56: 4032-4039 (1996); Melnyk et al., Cancer Res. 56: 921-924 (1996)) y también inhiben la angiogénesis intraocular en modelos de trastornos retinales isquémicos. Adamis et al., Arch. Ophthalmol. 114: 66­ 71 (1996)).
El término "anticuerpo anti-VEGF" o "un anticuerpo que se une a VEGF" se refiere a un anticuerpo que es capaz de unirse a VEGF con suficiente afinidad y especificidad ya que el anticuerpo es útil como agente diagnóstico y/o agente terapéutico para dirigirse al VEGF. Por ejemplo, el anticuerpo anti-VEGF de la invención se puede utilizar como un agente terapéutico para dirigir e interferir en las enfermedades o afecciones en donde la actividad de VEGF está implicada. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos 6.582.959, 6.703.020; documento WO98/45332; documento WO 96/30046; documento WO94/10202, WO2005/044853; ; documento EP 0666868B1; solicitud de patente de Estados Unidos 20030206899, 20030190317, 20030203409, 20050112126, 20050186208 y 20050112126; Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288: 149-164 (2004); y documento WO2005012359. El anticuerpo seleccionado normalmente tendrá una afinidad de unión suficientemente fuerte por VEGF. Por ejemplo, el anticuerpo puede unirse a hVEGF con un valor de Kd de entre 100 nM-1 pM. Las afinidades del anticuerpo se pueden determinar por un ensayo basado en resonancia de plasmón superficial (tal como el ensayo Bl Acore se describe en la publicación de Solicitud PCT N.° WO2005/012359); ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA); y ensayos de competencia (por ejemplo, RIA), por ejemplo. El anticuerpo se puede someter a otros ensayos de actividad biológica, por ejemplo, a fin de evaluar su efectividad como un terapéutico. Tales ensayos son conocidos en la técnica y dependen del antígeno diana y el uso deseado para el anticuerpo. Los ejemplos incluyen el ensayo de inhibición de HUVEC; ensayos de inhibición de crecimiento celular tumoral (como se describe en el documento WO 89/06692, por ejemplo); ensayos de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (CCDA) y citotoxicidad mediada por complemento (CDC) (patente US 5.500.362); y ensayos de actividad agonista o de hematopoyesis (véase el documento WO 95/27062). Un anticuerpo anti-VEGF normalmente no se unirá a otros homólogos de VEGF tales como VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D o VEGF-E, ni a otros factores de crecimiento tales como PIGF, PDGF o bFGF. En una realización, los anticuerpos anti-VEGF incluyen un anticuerpo monoclonal que se une al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonales anti-VEGF A4.6.1 producido por el hibridoma ATCC HB 10709; un anticuerpo monoclonal anti-VEGF humanizado recombinante (véase Presta et al. (1997) Cáncer Res. 57: 4593-4599), que incluye aunque no de forma limitativa el anticuerpo conocido como "bevacizumab (BV)", también conocido como "rhuMAb VEGF" o "AVASTIN®". AVASTIN® en la actualidad está comercialmente disponible. Bevacizumab comprende regiones marco conservadas de IgG1 humana mutada y regiones determinantes de complementariedad de unión a antígeno a partir del anticuerpo murino A.4.6.1 que bloquea la unión del VEGF humano a sus receptores. Aproximadamente un 93% de la secuencia de aminoácidos de bevacizumab, que incluye la mayoría de las regiones marco conservadas, deriva de la lgG1 humana y aproximadamente un 7% de la secuencia se deriva de A4.6.1. Bevacizumab tiene una masa molecular de aproximadamente 149.000 daltons y está glicosilado. Bevacizumab y otros anticuerpos anti-VEGF humanizados se describen adicionalmente en la patente de Estados Unidos N.° 6.884.879, presentada el 26 de febrero de 2005. Los anticuerpos anti- VEGF adicionales incluyen los anticuerpos de la serie G6 o B20 (por ejemplo, G6-23, G6-31, B20-4.1), como se describe en la Publicación de Solicitud PCT N.° WO2005/012359. Para anticuerpos adicionales preferidos véanse las Patentes de Estados Unidos N.° 7.060.269, 6.582.959, 6.703.020; 6.054.297; documento WO98/45332; documento WO 96/30046; documento WO94/10202; documento EP 0666868B1; publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos N.° 2006009360, 20050186208, 20030206899, 20030190317, 20030203409 y 20050112126; y Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288: 149-164 (2004).
El término "polipéptido de la serie B20", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un polipéptido, incluyendo un anticuerpo que se une a VEGF. Los polipéptidos de la serie B20 incluyen, aunque no de forma limitativa, anticuerpos derivados de una secuencia del anticuerpo B20 o un anticuerpo derivado de B20 descrito en la publicación de Estados Unidos N.° 20060280747, publicación de Estados Unidos N.° 20070141065 y/o publicación de Estados Unidos N.° 20070020267. En una realización, el polipéptido de la serie B20 es B20-4.1 como se describe en la publicación de Estados Unidos N.° 20060280747, publicación de Estados Unidos N.° 20070141065 y/o publicación de Estados Unidos N.° 20070020267. En otra realización, el polipéptido de la serie B20 es B20-4.1.1 como se describe en la publicación PCT N.° WO 2009/073160.
El término "polipéptido de la serie G6", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un polipéptido, incluyendo un anticuerpo que se une a VEGF. Los polipéptidos de la serie G6 incluyen, aunque no de forma limitativa, anticuerpos derivados de una secuencia del anticuerpo G6 o un anticuerpo derivado de G6 descrito en la publicación de Estados Unidos N.° 20060280747, publicación de Estados Unidos N.° 20070141065 y/o publicación de Estados Unidos N.° 20070020267. Los polipéptidos de la serie G6, como se describe en la publicación de Estados Unidos N.° 20060280747, publicación de Estados Unidos N.° 20070141065 y/o publicación de Estados Unidos N.° 20070020267 incluyen, aunque no de forma limitativa, G6-8, G6-23 y G6-31.
Un "factor o agente angiogénico" es un factor de crecimiento que estimula el desarrollo de vasos sanguíneos, por ejemplo, promueve la angiogénesis, crecimiento de células endoteliales, estabilidad de los vasos sanguíneos y/o vasculogénesis, etc. Por ejemplo, los factores angiogénicos, incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, VEGF y miembros de la familia VEGF (Ve GF-B, VEGF-C y VEGF-D), PlGF, familia PDGF, familia del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), ligandos de TIE (angiopoyetinas), efrinas, ligando 4 de tipo delta (DLL4), Del-1, factores de crecimiento de fibroblastos: ácido (aFGF) y básico (bFGF), folistatina, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) /factor de dispersión (SF), interleucina-8 (IL-8), leptina, midquina, neuropilinas, factor de crecimiento placentario, factor de crecimiento de células endoteliales (PD-ECGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas, especialmente PDGF-BB o PDGFR-beta, pleiotrofina (PTN), progranulina, proliferina, factor de crecimiento transformante alfa (TGF- alfa), factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa), etc. También incluirían factores que aceleran la cicatrización de heridas, tales como la hormona del crecimiento, factor de crecimiento tipo insulina I (IGF-I), VIGF, factor de crecimiento epidérmico (EGF), CTGF y miembros de su familia y TGF-alfa y TGF-beta. Véanse, por ejemplo, Klagsbrun y D'Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53: 217-39; Streit y Detmar (2003) Oncogene 22:3172-3179; Ferrara y Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12): 1359-1364; Tonini et al. (2003) Oncogene 22: 6549-6556 (por ejemplo, la Tabla 1 que enumera los factores antiangiogénicos conocidos); y Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8: 200-206.
Un "agente anti-angiogénesis" o "inhibidor de la angiogénesis" se refiere a una sustancia de bajo peso molecular, un polinucleótido (que incluye, por ejemplo, un ARN inhibidor (ARNi o ARNsi)), un polipéptido, una proteína aislada, una proteína recombinante, un anticuerpo o sus conjugados o proteínas de fusión del mismo, que inhiben la angiogénesis, vasculogénesis o permeabilidad vascular no deseada, directa o indirectamente. Debe entenderse que el agente antiangiogénesis incluye los agentes que se unen y bloquean la actividad angiogénica del factor angiogénico o su receptor. Por ejemplo, un agente anti-angiogénesis es un anticuerpo u otro antagonista de un agente angiogénico como se ha definido anteriormente, por ejemplo, anticuerpos para v Eg F-A o para el receptor de VEGF-A (por ejemplo, receptor de KDR o receptor de Flt-1), inhibidores de anti-PDGFR tales como GLEEVEC® (mesilato de Imatinib), moléculas pequeñas que bloquean la señalización del receptor de VEGF (por ejemplo, PTK787/ZK2284, SU6668, SUTENT®//SU11248 (malato de sunitinib)), AMG706 o los descritos en, por ejemplo, la solicitud de patente internacional WO 2004/113304). Los agentes antiangiogénesis también incluyen inhibidores de la angiogénesis nativos, por ejemplo, angiostatina, endostatina, etc. Véanse, por ejemplo, Klagsbrun y D'Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53: 217-39; Streit y Detmar (2003) Oncogene 22: 3172-3179 (por ejemplo, la Tabla 3 enumera terapias antiangiogénicas para el melanoma maligno); Ferrara y Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12): 1359-1364; Tonini et al. (2003) Oncogene 22: 6549-6556 (por ejemplo, la Tabla 2 enumera factores antiangiogénicos conocidos); y Sato (2003) Int. J. Clin. dOncol. 8: 200-206 (por ejemplo, la Tabla 1 enumera agentes antiangiogénicos utilizados en ensayos clínicos).
Un "trastorno" es cualquier afección o enfermedad que podría beneficiarse del tratamiento con una composición o método de la invención. Esto incluye trastornos crónicos y agudos o enfermedades que incluyen dichas patologías que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Los ejemplos no limitantes de trastornos que pueden tratarse utilizando los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de la invención incluyen diversas enfermedades y trastornos proporcionados en el presente documento en las "Definiciones".
Las expresiones "trastorno proliferativo celular" y "trastorno proliferativo" se refieren a trastornos que se asocian con algún grado de proliferación celular anormal. En una realización, el trastorno proliferativo celular es cáncer.
"Tumor", como se utiliza en el presente documento, se refiere a todo el crecimiento de células y proliferación neoplásica, ya sea maligno o benigno y a todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos. Los términos "cáncer", "canceroso", "trastorno proliferativo celular", "trastorno proliferativo" y "tumor" no son mutuamente excluyentes, como se cita en el presente documento.
El tumor puede ser un tumor sólido o un tumor de tejidos blandos. Entre los ejemplos de tumores de tejidos blandos se incluyen leucemia (por ejemplo, leucemia mielógena crónica, leucemia mielógena aguda, leucemia linfoblástica aguda de adultos, leucemia mielógena aguda, leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T maduros, leucemia linfocítica crónica, leucemia polilinfocítica o tricoleucemia) o linfoma (por ejemplo, linfoma no Hodgkin, linfoma de linfocitos T cutáneos o enfermedad de Hodgkin). Un tumor sólido incluye cualquier cáncer de los tejidos corporales diferentes de sangre, médula ósea o el sistema linfático. Los tumores sólidos pueden separarse adicionalmente en los de origen de células epiteliales y los de origen de células no epiteliales. Entre los ejemplos de tumores sólidos se incluyen tumores de colon, mama, próstata, pulmón, riñón, hígado, páncreas, ovario, cabeza y cuello, cavidad oral, estómago, duodeno, intestino delgado, intestino grueso, tracto gastrointestinal, ano, vesícula biliar, labio, nasofaringe, piel, útero, órganos genitales masculinos, órganos urinarios, vejiga y piel. Los tumores sólidos de origen no epitelial incluyen sarcomas, tumores cerebrales y tumores óseos.
Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la afección fisiológica en mamíferos que se caracteriza normalmente por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero sin limitación, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia o tumores linfoides malignos. Los ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen, aunque no de forma limitativa, cáncer de células escamosas (por ejemplo, cáncer de células escamosas epiteliales), cáncer de pulmón, incluyendo cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma epidermoide de pulmón, cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago, incluyendo cáncer gastrointestinal y cáncer estromal gastrointestinal, cáncer de páncreas, glioblastoma, cáncer de cuello de útero, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer del tracto urinario, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio o uterino, carcinoma de las glándulas salivales, cáncer de riñón o renal, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma del pene, melanoma, melanoma de diseminación superficial, léntigo, melanoma maligno, melanomas lentigosos acrales, melanomas nodulares, mieloma múltiple y linfoma de linfocitos B (incluyendo el linfoma no Hodgkin de bajo grado/folicular (NHL); NHL linfocítico de células pequeñas (SL); NHL de grado intermedio/folicular; NHL difuso de grado intermedio; NHL inmunoblástico de alto grado; NHL linfoblástico de alto grado; NHL de células no escindidas pequeñas de alto grado; NHL con neoplasia maligna; linfoma de células del manto; linfoma relacionado con SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom); leucemia linfocítica crónica (LLC); leucemia linfoblástica aguda (LLA); tricoleucemia; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo posterior a trasplante (PTLD), así como proliferación vascular anormal asociada con facomatosis, edema (tal como el asociado con tumores cerebrales), síndrome de Meigs, cerebro, así como cáncer de cabeza y cuello y las metástasis asociadas. En ciertas realizaciones, los cánceres que son susceptibles de tratamiento mediante las IgG variantes de la invención incluyen cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer de pulmón no microcítico, glioblastoma, linfoma no Hodgkin (NHL), cáncer de células renales, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, sarcoma de partes blandas, sarcoma de Kaposi, carcinoma carcinoide, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovario, mesotelioma y mieloma múltiple. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de pulmón microcítico, gliblastoma, neuroblastomas, melanoma, carcinoma de mama, cáncer gástrico, cáncer colorrectal (CRC) y carcinoma hepatocelular. Con todo, en algunas realizaciones, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de pulmón no microcítico, cáncer colorrectal, glioblastoma y carcinoma de mama, incluyendo formas metastásicas de estos cánceres.
El término cáncer abarca una colección de trastornos proliferativos, incluyendo, aunque no de forma limitativa, crecimientos precancerosos, tumores benignos, tumores malignos y tumores latentes. Los tumores benignos permanecen localizados en el sitio de origen y no tienen la capacidad de infiltrar, invadir o producir metástasis en sitios distantes. Los tumores malignos invadirán y dañarán otros tejidos alrededor de ellos. También pueden aumentar la capacidad de desprenderse de donde comienzan y extenderse a otras partes del cuerpo (producir metástasis), normalmente a través del torrente sanguíneo o a través del sistema linfático, donde se localizan los nodos. Los tumores latentes son tumores quiescentes en los que las células tumorales están presentes, pero la progresión del tumor no es clínicamente evidente. Los tumores primarios se clasifican por el tipo de tejido del que se originan; los tumores metastásicos se clasifican por el tipo de tejido del que derivan las células cancerosas. Con el paso del tiempo, las células de un tumor maligno se vuelven más anormales y parecen menos como células normales. Este cambio en la apariencia de las células cancerosas se llama grado del tumor y las células cancerosas se describen como bien diferenciadas, moderadamente diferenciadas, escasamente diferenciadas o no diferenciadas. Las bien diferenciadas son de aspecto relativamente normal y se asemejan a las células normales de las que se originan. Las células no diferenciadas son células que se vuelto tan anormales que ya no es posible determinar el origen de las células.
Los cánceres epiteliales generalmente evolucionan de un tumor benigno a un estadio preinvasivo (por ejemplo, carcinoma in situ), a un cáncer maligno, que ha penetrado en la membrana basal e invadido el estroma subepitelial.
Por "displasia" se entiende cualquier crecimiento o desarrollo anormal de tejido, órgano o células. En ciertas realizaciones, la displasia es de alto grado o precancerosa.
Por "metástasis" se entiende la difusión del cáncer desde su sitio primario a otros lugares del cuerpo. Las células cancerosas pueden desprenderse de un tumor primario, penetrar en los vasos linfáticos y sanguíneos, circular a través del torrente sanguíneo y crecer en un foco distante (producir metástasis) en tejidos normales de cualquier otro sitio del cuerpo. La metástasis puede ser local o distante. La metástasis es un proceso secuencial, sujeto al desprendimiento de células tumorales del tumor primario, que viajan a través del torrente sanguíneo y se detienen en un sitio distante. En el nuevo sitio, las células establecen una irrigación sanguínea y pueden crecer para formar una masa potencialmente mortal. Tanto las rutas moleculares estimuladoras como inhibidoras dentro de las células tumorales regulan este comportamiento y las interacciones entre la célula tumoral y las células hospedadoras en el lugar distante también son significativas.
Por "micrometástasis" se entiende un pequeño número de células que se ha propagado a partir del tumor primario a otras partes del cuerpo. La micrometástasis puede detectarse o no en una prueba de cribado o diagnóstico.
Por "no metastásico" se entiende un cáncer que es benigno o que permanece en el sitio primario y no ha penetrado en el sistema vascular linfático o sanguíneo o en los tejidos diferentes del sitio primario. Habitualmente, un cáncer no metastásico es cualquier cáncer que está en estadio 0, I o II del cáncer y ocasionalmente en cáncer de estadio III.
La referencia a un tumor o cáncer como "estadio 0", "estadio I", "estadio II", "estadio III", o "estadio IV" indica la clasificación del tumor o cáncer usando los métodos de agrupación de fases globales o de estadificación con números romanos conocidos en la técnica. Aunque el estadio real del cáncer depende del tipo de cáncer, en general, un cáncer en estadio 0 es una lesión in situ, un cáncer en estadio I es un tumor localizado pequeño, un cáncer en estadio II y III es un tumor local avanzado que exhibe una implicación de los ganglios linfáticos locales y un cáncer en estadio IV representa un cáncer metastásico. los estadios específicos de cada tipo de tumor son conocidos por los médicos expertos.
Por "tumor primario" o "cáncer primario" se entiende el cáncer original y no una lesión metastásica localizada en otro tejido, órgano o localización del cuerpo del sujeto.
Por "tumor benigno" o "cáncer benigno" se entiende un tumor que permanece localizado en el sitio de origen y que no tiene la capacidad de infiltrar, invadir o producir metástasis en un sitio distante.
"Recurrencia del cáncer" en el presente documento se refiere a un retorno del cáncer tras el tratamiento e incluye el retorno del cáncer en el órgano primario, así como la recurrencia distante, cuando el cáncer retorna fuera del órgano primario.
Por "latencia del tumor" se entiende un estado quiescente prolongado en que las células tumorales están presentes pero la progresión del tumor no es evidente clínicamente. Un tumor latente puede detectarse o no en una prueba de cribado o diagnóstico.
Por "carga tumoral" se entiende el número de células cancerosas, el tamaño de un tumor o la cantidad de cáncer en el cuerpo. La carga tumoral también se denomina carga tumoral.
Por "número de tumores" se entiende el número de tumores.
Las enfermedades no neoplásicas que son susceptibles de tratamiento con los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de la invención incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, hipertrofia no deseable o anómala, hipertrofia benigna de próstata, artritis, artritis reumatoide (RA), artritis psoriásica, enfermedades neurodegenerativas (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, demencia relacionada con SIDA, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, retinitis pigmentosa, atrofia muscular espinal y degeneración cerebelosa), enfermedad autoinmunitaria, psoriasis, placas psoriásicas, sarcoidosis, ateroesclerosis, placas ateroscleróticas, tiroiditis de Hashimoto, trastornos angiogénicos, enfermedad ocular tal como el presunto síndrome de histoplasmosis ocular, vascularización retiniana, retinopatía diabética y otras proliferativas incluyendo retinopatía del prematuro, nefropatía diabética, fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, degeneración macular relacionada con la edad, edema macular diabético, neovascularización de la córnea, neovascularización del injerto de córnea, rechazo de injerto de córnea, neovascularización retinal/coroidal, neovascularización del ángulo (rubeosis), enfermedad neovascular ocular, enfermedad vascular, afecciones que implican la proliferación anómala de células epiteliales vasculares, restenosis vascular, síndrome de Guillain-Barre, pólipos tales como pólipos del colon, poliposis adenomatosa familiar, pólipos nasales o pólipos gastrointestinales, úlceras gastrointestinales, estenosis pilórica hipertrófica infantil, síndrome obstructivo urinario, enfermedad de Menetrier, adenomas secretores o síndrome de pérdida de proteínas, fibroadenoma, enfermedad respiratoria, colecistitis, neurofibromatosis, malformaciones arteriovenosas (AVM), meningioma, hemangioma, angiofibroma, hiperplasias tiroideas (incluyendo la enfermedad de Grave), trasplante de córnea y de otros tejidos, enfermedades inflamatorias, inflamación crónica, inflamación pulmonar, lesión pulmonar aguda/ARDS, sepsis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, hipertensión pulmonar primaria, derrames pulmonares malignos, ateroma, edema tras quemaduras, traumatismo, radiación, ictus, hipoxia o isquemia, edema a partir de infarto de miocardio, lesión isquémica, daño tras un evento isquémico cerebral, edema cerebral (por ejemplo, asociado con ictus agudo/ traumatismo craneoencefálico cerrado/ traumatismo), trombos causados por agregación plaquetaria, enfermedades fibróticas o edema, tales como cirrosis hepática, fibrosis pulmonar, carcoidosis, tiroiditis, síndrome de hiperviscosidad sistémica, inflamación sinovial, formación de pannus en la AR, miositis osificante, formación de hueso hipertrófico, patologías asociadas con el hueso tales como artrosis, raquitismo y osteoporosis, ascitis refractaria, inflamación de huesos o articulaciones, síndromes mielodisplásicos, anemia, riñón o hígado aplásicos; enfermedad de hipersensibilidad mediada por linfocitos T, enfermedad de Paget, enfermedad renal poliquística, tercer espaciamiento en enfermedades de fluidos (pancreatitis, síndrome compartimental, quemaduras, enfermedad del intestino), inflamación crónica tal como EII (enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), trastornos renales, rechazo de aloinjerto renal, enfermedad de injerto contra huésped o rechazo de trasplante, enfermedad inflamatoria del intestino, nefropatías agudas y crónicas (incluyendo glomerulonefritis proliferativa y enfermedad renal inducida por diabetes), síndrome nefrótico, crecimiento de masa tisular no deseable o anómala (no cancerosa), obesidad, crecimiento de masa tisular adiposa, articulaciones hemofílicas, cicatrices hipertróficas, inhibición del crecimiento del cabello, Síndrome de Osler Weber-Rendu, fibroplasias retrolentales granuloma piógeno, esclerodermia, tracoma, adhesiones vasculares, sinovitis, reacción de hipersensibilidad de la piel, trastornos cutáneos incluyendo psoriasis y dermatitis, eczema, fotoenvejecimiento (por ejemplo, causada por la radiación UV de la piel humana), formación de cicatriz hipertrófica, afecciones reproductoras tales como endometriosis, síndrome de hiperestimulación ovárica, enfermedad de ovario poliquístico, preeclampsia, hemorragia uterina disfuncional o menometrorragia, fibromas uterinos, parto prematuro, ascitis, derrame pericárdico (tal como el asociado con la pericarditis), derrame pleural, choque endotóxico e infección fúngica, ciertas infecciones microbianas incluyendo patógenos microbianos seleccionados de adenovirus, hantavirus, Borrelia burgdorferi, Yersinia spp., Bordetella pertussis y trastornos psiquiátricos (por ejemplo, esquizofrenia, depresión bipolar, autismo y trastorno por déficit de atención).
Una "enfermedad respiratoria" implica el sistema respiratorio e incluye bronquitis crónica, asma, que incluye asma agudo y asma alérgico, fibrosis quística, bronquiectasia, alergia u otra rinitis o sinusitis, deficiencia de alfa 1 -antitripsina, tos, enfisema pulmonar, fibrosis pulmonar o vías respiratorias hiperreactivas, enfermedad pulmonar obstructiva crónica y trastorno pulmonar obstructivo crónico.
Una "enfermedad autoinmunitaria" en el presente documento es una enfermedad o trastorno no maligno que procede y se dirige contra los propios tejidos propios de un individuo. Los ejemplos de enfermedades o trastornos autoinmunitarios incluyen, pero sin limitación, respuestas inflamatorias tales como enfermedades cutáneas inflamatorias que incluyen psoriasis y dermatitis (por ejemplo, dermatitis atópica y dermatitis por contacto); esclerodermia sistémica y esclerosis; respuestas asociadas con la enfermedad inflamatoria del intestino (tal como enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa); síndrome de dificultad respiratoria (incluyendo el síndrome de dificultad respiratoria del adulto; ARDS); dermatitis; meningitis; encefalitis; uveítis; colitis; glomerulonefritis; afecciones alérgicas, tales como eccema y asma y otras afecciones que implican la infiltración de linfocitos T y respuestas inflamatorias crónicas; aterosclerosis; deficiencia de adhesión de leucocitos; artritis reumatoide; lupus eritematoso sistémico (LES); diabetes mellitus (por ejemplo, diabetes mellitus de tipo I o diabetes mellitus insulinodependiente); esclerosis múltiple; síndrome de Reynaud; tiroiditis autoinmunitaria; encefalomielitis alérgica; síndrome de Sjorgen; diabetes de inicio juvenil; y respuestas inmunitarias asociadas con una hipersensibilidad aguda y retrasada mediada por citocinas y linfocitos T, normalmente encontrados en tuberculosis, sarcoidosis, polimiositis, granulomatosis y vasculitis; anemia perniciosa (enfermedad de Addison); enfermedades que implican la diapedesis leucocitaria; trastorno inflamatorio del sistema nervioso central (SNC); síndrome de lesión multiorgánica; anemia hemolítica (que incluyen, pero no se limitan a, anemia crioglobinemia o anemia de Coombs positiva); miastenia grave; enfermedades mediadas por el complejo antígeno-anticuerpo; enfermedad de la membrana basal antiglomerular; síndrome antifosfolípido; neuritis alérgica; enfermedad de Graves; síndrome miasténico de Lambert-Eaton; penfigoide ampolloso; pénfigo; poliendocrinopatías autoinmunitarias; enfermedad de Reiter; síndrome del hombre rígido; enfermedad de Behcet; arteritis de células gigantes; nefritis del complejo inmunitario; nefropatía de IgA; polineuropatías por IgM; púrpura trombocitopénica inmune (ITP) o trombocitopenia autoinmunitaria, etc.
La expresión "enfermedad o trastorno vascular" en el presente documento se refiere a las diversas enfermedades o trastornos que impactan en el sistema vascular, incluyendo el sistema cardiovascular. Los ejemplos de tales enfermedades incluyen arteriosclerosis, reobstrucción vascular, ateroesclerosis, estenosis vascular posquirúrgica, reestenosis, oclusión vascular o enfermedad obstructiva de la carótida, arteriopatía coronaria, angina, enfermedad de vasos pequeños, hipercolesterolemia, hipertensión y afecciones que implican la proliferación o función anómala de células epiteliales vasculares.
Como se utiliza en el presente documento, "tratamiento" (y las variaciones tales como "tratar" o "tratando") se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar el transcurso natural del individuo o célula que se esté tratando y puede realizarse para profilaxis o durante el transcurso de la patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen prevenir la aparición o recurrencia de la enfermedad, alivio de los síntomas, la disminución de cualesquiera consecuencias patológicas directas o indirectas de la enfermedad, prevenir la metástasis, disminuir la velocidad de progresión de la enfermedad, mejora o paliación de la patología y remisión o pronóstico mejorado. En algunas realizaciones, las IgG variantes de la invención se utilizan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o trastorno o para ralentizar la progresión de una enfermedad o trastorno.
Un "individuo", "sujeto", o "paciente" es un vertebrado. En ciertas realizaciones, el vertebrado es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero sin limitación, animales de granja (tales como vacas), animales para el deporte, mascotas (tales como gatos, perros y caballos), primates, ratones y ratas. En ciertas realizaciones, un mamífero es un ser humano.
La expresión "formulación farmacéutica" o "composición farmacéutica" se refiere a una preparación que se encuentra en una forma que permite que sea eficaz la actividad biológica del principio activo y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se administraría la formulación. Tales formulaciones pueden ser estériles. Véase también la sección titulada Dosificaciones, formulaciones y duración.
Una formulación "estéril" es aséptica o libre de todos los microorganismos vivos y sus esporas.
La expresión "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un fármaco eficaz para tratar una enfermedad o trastorno en un sujeto. En ciertas realizaciones, una cantidad eficaz se refiere a una cantidad eficaz, a las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz de una sustancia/molécula de la invención puede variar de acuerdo con factores tales como el estadio de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo y la capacidad de la sustancia/molécula, para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz abarca una cantidad en la que cualesquiera efectos tóxicos o perjudiciales de la sustancia/molécula se ven superados por los efectos terapéuticamente beneficiosos. En el caso del cáncer, la cantidad eficaz del fármaco puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir, ralentizar hasta cierto punto y normalmente detener) la infiltración de células cancerosas en los órganos periféricos; inhibir (es decir, ralentizar hasta cierto punto y normalmente detener) la metástasis tumoral; inhibir, hasta cierto punto, el crecimiento tumoral; permitir el tratamiento del tumor y/o aliviar hasta cierto punto uno o más de los síntomas asociados con el trastorno. En la medida en que el fármaco puede prevenir el crecimiento y/o destruir las células cancerosas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico.
Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad que es eficaz, a las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Normalmente, pero no necesariamente, dado que se usa una dosis profiláctica en sujetos antes de o en una etapa más temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz puede ser menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.
En el caso de tumores precancerosos, benignos o de fase tardía, la cantidad terapéuticamente eficaz del inhibidor angiogénico puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor primario; inhibir (es decir, ralentizar hasta cierto punto y preferentemente detener) la infiltración de células cancerosas en los órganos periféricos; inhibir (es decir, ralentizar hasta cierto punto y preferentemente detener) la metástasis tumoral; inhibir o retrasar, hasta cierto punto, el crecimiento tumoral o la progresión tumoral; y/o aliviar hasta cierto punto uno o más de los síntomas asociados con el trastorno. En la medida en que el fármaco puede prevenir el crecimiento y/o destruir las células cancerosas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico.
El término "anticuerpo" se utiliza en el presente documento en el sentido más amplio y se refiere a la capacidad de la inmunoglobulina, del anticuerpo o de la proteína de fusión de Fc para producir un efecto deseado. En ciertas realizaciones, la eficacia se refiere al efecto observado máximo de una inmunoglobulina, anticuerpo o proteína de fusión de Fc en niveles de saturación. En ciertas realizaciones, la eficacia se refiere a la EC50 de una inmunoglobulina, anticuerpo o proteína de fusión de Fc. En ciertas realizaciones, la eficacia se refiere a la potencia de una inmunoglobulina, anticuerpo o proteína de fusión de Fc. En ciertas realizaciones, la eficacia se refiere a la capacidad de la inmunoglobulina, del anticuerpo o de la proteína de fusión de Fc para producir efectos beneficiosos sobre el transcurso o duración de una enfermedad, incluyendo el beneficio clínico como se define en el presente documento.
El término "EC50" se refiere a la concentración de una inmunoglobulina, anticuerpo o proteína de fusión de Fc que induce una respuesta intermedia entre la basal y la máxima. En ciertas realizaciones, EC50 representa la concentración de una inmunoglobulina, anticuerpo o proteína de fusión de Fc cuando se observa un 50% de su efecto máximo. En ciertas realizaciones, EC50 representa la concentración plasmática o sérica necesaria para obtener un 50% del efecto máximo in vivo.
La eficacia para el tratamiento del cáncer se puede demostrar por la detección de la capacidad de un anticuerpo, una proteína de fusión, una molécula conjugada o una composición de la invención para inhibir o reducir el crecimiento o metástasis de las células cancerosas o para mejorar o aliviar uno o más síntomas asociados con el cáncer. El tratamiento se considera terapéutico si hay, por ejemplo, una reducción del crecimiento o metástasis de las células cancerosas, mejora de uno o más síntomas asociados con cáncer o una disminución de la mortalidad y/o morbilidad tras la administración de un anticuerpo, una proteína de fusión, una molécula conjugada o una composición de la invención. Los anticuerpos, las proteínas de fusión o las composiciones de la invención se pueden analizar en cuanto a su capacidad para reducir la formación de tumor en ensayos in vitro, ex vivo e in vivo. Para la terapia del cáncer, la eficacia in vivo puede, por ejemplo, medirse evaluando la duración de la supervivencia, el tiempo hasta la progresión de la enfermedad (TPE; en inglés, TTP), las tasas de respuesta (RR; del inglés, response rates), la duración de la respuesta y/o la calidad de vida. Véase también la sección titulada Eficacia del tratamiento.
La eficacia en el tratamiento de trastornos inflamatorios se puede demostrar por la detección de la capacidad de un anticuerpo, una proteína de fusión, una molécula conjugada o una composición de la invención para reducir o inhibir la inflamación en un animal o para mejorar o aliviar uno o más síntomas asociados con un trastorno inflamatorio. El tratamiento se considera terapéutico si hay, por ejemplo, una reducción en la inflamación o mejora de uno o más síntomas tras la administración de un anticuerpo, una proteína de fusión, una molécula conjugada o una composición de la invención.
La eficacia en el tratamiento o prevención de una infección vírica se puede demostrar por la detección de la capacidad de un anticuerpo, una proteína de fusión, una molécula conjugada o una composición de la invención para inhibir la replicación del virus, para inhibir la transmisión o prevenir que el virus se establezca por sí mismo en su hospedador o para prevenir, mejorar o aliviar uno o más síntomas asociados con la infección vírica. El tratamiento se considera terapéutico si hay, por ejemplo, una reducción en la carga vírica, mejora de uno o más síntomas asociados o una disminución de la mortalidad y/o morbilidad tras la administración de un anticuerpo, una proteína de fusión, una molécula conjugada o una composición de la invención. Los anticuerpos, proteínas de fusión, moléculas conjugadas o composiciones de la invención, pueden analizarse también en cuanto a su capacidad para inhibir la replicación vírica o reducir la carga vírica en ensayos in vitro e in vivo.
La eficacia en el tratamiento o prevención de una infección bacteriana se puede demostrar por la detección de la capacidad de un anticuerpo, una proteína de fusión o una composición de la invención para inhibir la replicación bacteriana o para prevenir, mejorar o aliviar uno o más síntomas asociados con la infección bacteriana. El tratamiento se considera terapéutico si hay, por ejemplo, una reducción en el número bacteriano, mejora de uno o más síntomas asociados o una disminución de la mortalidad y/o morbilidad tras la administración de un anticuerpo, una proteína de fusión o una composición de la invención.
El beneficio clínico se puede medir evaluando diversos criterios, por ejemplo, la inhibición, hasta cierto punto, de la progresión de la enfermedad, incluyendo su ralentización y detención completa; reducción en el número de episodios y/o síntomas de la enfermedad; reducción en el tamaño de la lesión; inhibición (es decir, reducción, ralentización o detención completa) de la infiltración de células de la enfermedad en órganos y/o tejidos periféricos adyacentes; inhibición (es decir, reducción, ralentización o detención completa) de la propagación de la enfermedad; disminución de la respuesta autoinmunitaria, que puede, pero no tiene que, dar como resultado la regresión o ablación de la lesión de la enfermedad; alivio, hasta cierto punto, de uno o más síntomas asociados con el trastorno; aumento de la duración de la presentación libre de enfermedad tras el tratamiento, por ejemplo, supervivencia libre de progresión; aumento de la supervivencia global; mayor tasa de respuesta; y/o mortalidad reducida en cualquier punto temporal dado tras el tratamiento.
"Reducir o inhibir" es disminuir o reducir una actividad, función y/o cantidad en comparación con una referencia. En ciertas realizaciones, por "reducir o inhibir" se entiende la capacidad para causar una disminución global de un 20 % o más. En otra realización, por "reducir o inhibir" se entiende la capacidad para causar una disminución global de un 50 % o más. En todavía otra realización, por "reducir o inhibir" se entiende la capacidad para causar una reducción global de un 75 %, un 85 %, un 90 %, un 95 % o más. Reducir o inhibir puede referirse a los síntomas del trastorno que se está tratando, la presencia o tamaño de la metástasis, el tamaño del tumor primario o el tamaño o número de vasos sanguíneos en trastornos angiogénicos.
Cáncer "operable" es cáncer que está confinado en el órgano primario y adecuado para cirugía.
"Supervivencia" se refiere al paciente que permanece vivo e incluye la supervivencia libre de enfermedad (SLE; en inglés, DFS), la supervivencia libre de progresión (SLP; en inglés, PFS) o la supervivencia global (SG; en inglés, OS). La supervivencia se puede estimar por el método de Kaplan-Meier y cualquiera de las diferencias de supervivencia se calculan utilizando la prueba de rango logarítmico estratificado.
"Supervivencia libre de enfermedad (SLE)" se refiere al paciente que sigue con vida, sin retorno del cáncer, durante un periodo de tiempo definido, tal como aproximadamente 1 año, aproximadamente 2 años, aproximadamente 3 años, aproximadamente 4 años, aproximadamente 5 años, aproximadamente 10 años, etc., a partir del inicio del tratamiento a partir del diagnóstico inicial. En un aspecto de la invención, la SLE se analiza de acuerdo con el principio de intención de tratar, es decir, se evalúa a los pacientes basándose en su terapia asignada. Los eventos utilizados en el análisis de la SLE pueden incluir la recurrencia local, regional y distante del cáncer, la aparición de cáncer secundario y la muerte por cualquier causa en pacientes sin un evento previo (por ejemplo, recurrencia del cáncer de mama o segundo cáncer primario).
"Supervivencia global" se refiere al paciente que sigue con vida durante un período de tiempo definido, tal como aproximadamente 1 año, aproximadamente 2 años, aproximadamente 3 años, aproximadamente 4 años, aproximadamente 5 años, aproximadamente 10 años, etc., a partir del inicio del tratamiento a partir del diagnóstico inicial.
Por "prolongación de la supervivencia" se entiende el aumento de la SLE y/o SG en un paciente tratado respecto a un paciente no tratado o respecto a un protocolo de tratamiento de control, tal como un tratamiento solo con el agente quimioterapéutico. La supervivencia se controla durante al menos aproximadamente seis meses o al menos aproximadamente 1 año o al menos aproximadamente 2 años o al menos aproximadamente 3 años o al menos aproximadamente 4 años o al menos aproximadamente 5 años o al menos aproximadamente 10 años, etc., tras el inicio del tratamiento o tras el diagnóstico inicial.
El término "concurrentemente" se utiliza en el presente documento para hacer referencia a la administración de dos o más agentes terapéuticos, donde al menos parte de la administración se solapa en el tiempo. Por consiguiente, la administración concurrente incluye una pauta posológica cuando la administración de uno o más agentes continúa después de interrumpir la administración de uno o más agentes distintos.
Por "monoterapia" se entiende un régimen terapéutico que incluye solo un agente terapéutico único para el tratamiento del cáncer o tumor durante el transcurso del período de tratamiento. En ciertas realizaciones, la monoterapia mediante una IgG variante significa que la IgG variante se administra en ausencia de una terapia anticancerosa adicional durante el período de tratamiento.
Por "terapia de mantenimiento" se entiende un régimen terapéutico que se da para reducir la probabilidad de recurrencia o progresión de la enfermedad. La terapia de mantenimiento se puede proporcionar durante cualquier duración de tiempo, incluyendo períodos de tiempo extendidos de hasta la esperanza de vida del sujeto. La terapia de mantenimiento se puede proporcionar tras la terapia inicial o en conjunto con terapias iniciales o adicionales. Las dosificaciones utilizadas para la terapia de mantenimiento pueden variar y pueden incluir dosificaciones disminuidas en comparación con las dosificaciones utilizadas para otros tipos de terapia.
"Terapia neoadyuvante" o "terapia preoperatoria" en el presente documento se refieren a la terapia dada antes de la cirugía. El objetivo de la terapia neoadyuvante es proporcionar tratamiento sistémico inmediato, erradicar potencialmente micrometástasis que de otro modo poliferarían si se siguiera la secuencia estándar de cirugía seguida por la terapia sistémica. La terapia neoadyuvante también puede ayudar a reducir el tamaño del tumor, permitiendo de este modo la resección completa de los tumores inicialmente no resecables o que conservan porciones de los órganos y sus funciones. Adicionalmente, la terapia neoadyuvante permite una evaluación in vivo de la eficacia del fármaco, que puede guiar la elección de los tratamientos posteriores.
"Terapia adyuvante" en el presente documento se refiere a la terapia dada tras la cirugía, donde no se pueden detectar pruebas de enfermedad residual, con objeto de reducir el riesgo de recurrencia de enfermedad. El objetivo de la terapia adyuvante es prevenir la recurrencia del cáncer y por tanto, reducir la posibilidad de muerte relacionada con el cáncer.
En el presente documento, en la "atención médica estándar", quimioterapia se refiere a los agentes quimioterapéuticos utilizados de forma rutinaria para tratar un cáncer particular.
"Cirugía definitiva" se utiliza como el término que se emplea en la comunidad médica. La cirugía definitiva incluye, por ejemplo, procedimientos, quirúrgicos o de otro tipo, que producen la extracción o resección del tumor, incluyendo los que dan como resultado la extracción o resección del total de tumor marcadamente visible. La cirugía definitiva incluye, por ejemplo, resección completa o curativa o resección macroscópica completa del tumor. La cirugía definitiva incluye procedimientos que se producen en una o más fases, e incluye, por ejemplo, procedimientos quirúrgicos de múltiples etapas donde se realizan uno o más procedimientos quirúrgicos u otros antes de la resección del tumor. La cirugía definitiva incluye procedimientos para eliminar o extirpar el tumor, incluyendo órganos implicados, partes de órganos y tejidos, así como órganos vecinos, tales como ganglios linfáticos, partes de órganos o tejidos.
La administración "junto con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.
La administración "crónica" se refiere a la administración del o los agentes en un modo continuo, en oposición a un modo agudo, a fin de mantener el efecto (actividad) terapéutico inicial durante un período de tiempo extendido. La administración "intermitente" es un tratamiento que no se realiza de manera consecutiva sin interrupción, sino que es de naturaleza cíclica.
Los "vehículos" como se utiliza en el presente documento, incluyen los vehículos, excipientes o estabilizantes que no son tóxicos para la célula o mamífero que se exponen a ellos en las dosificaciones y concentraciones empleadas. Con frecuencia, el vehículo fisiológicamente aceptable es una solución acuosa a pH tamponado. Los ejemplos de vehículos fisiológicamente aceptables incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (de menos de aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar, tales como manitol o sorbitol; contra iones formadores de sal tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos, tales como TWEEN™, polietilenglicol (PEG) y PLURONICS™.
Un "liposoma" es una pequeña vesícula compuesta por varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensioactivos que es útil para suministrar un fármaco (tal como una IgG variante) a un mamífero. Los componentes del liposoma habitualmente están dispuestos en una formación de bicapa, similar a la disposición lipídica de las membranas biológicas.
La expresión "composición antineoplásica" se refiere a una composición útil para el tratamiento del cáncer que comprende al menos un agente terapéutico activo, por ejemplo, "agente anticanceroso". Entre los ejemplos de agentes terapéuticos (agentes anticancerosos) se incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, agentes quimioterapéuticos, agentes inhibidores del crecimiento, agentes citotóxicos, agentes utilizados en radioterapia, agentes antiangiogénesis, agentes apoptóticos, agentes antitubulina y otros agentes para tratar el cáncer, tales como anticuerpos anti-HER-2, anticuerpos anti-CD20, un antagonista del receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (por ejemplo, un inhibidor de tirosina cinasa), un inhibidor de HER1/EGFR (por ejemplo, erlotinib (TARCEVA®), inhibidores de factor de crecimiento derivados de plaquetas (por ejemplo, GLEEVEC® (imatinib mesilato)), un inhibidor de COX-2 (por ejemplo, celecoxib), interferones, citocinas, antagonistas (por ejemplo, anticuerpos neutralizantes) que se unen a una o más de las siguientes dianas ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-beta, BlyS, a Pr IL, BCMA o receptor(es) de VEGF, TRAIL/Apo2 y otros agentes químicos bioactivos y orgánicos, etc.
La expresión "agente citotóxico", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una sustancia que inhibe o evita una función celular y/o provoca muerte o destrucción celular. Se pretende que el término incluya isótopos radiactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radiactivos de Lu), agentes quimioterapéuticos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorrubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercalantes, enzimas y fragmentos de las mismas, tales como enzimas nucleolíticas, antibióticos y toxinas tales como toxinas de moléculas pequeñas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de los mismos y los diversos agentes antitumorales o anticancerosos desvelados a continuación. Más adelante, se describen otros agentes citotóxicos. Un agente tumoricida provoca la destrucción de células tumorales. En ciertas realizaciones, la IgG variante puede conjugarse con un agente citotóxico.
Una "toxina" es cualquier sustancia capaz de tener un efecto perjudicial sobre el crecimiento o proliferación de una célula.
Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes, tales como tiotepa y ciclosfosfamida (CITOXAN®); alquilsulfonatos, tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas, tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilmelaminas, incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilomelamina; acetogeninas (especialmente bullatacina y bullatacinona); delta-9-tetrahidrocannabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapachona; lapachol; colchicinas; ácido betulínico; una camptotecina (incluyendo el análogo sintético de topotecán (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecán, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, escopolectina y 9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos, adozelesina, carzelesina y bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; tenipósido; criptoficinas (en particular, criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrógeno, tales como clorambucilo, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas, tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibióticos, tales como los antibióticos de enediina (por ejemplo, calicheamicina, especialmente caliqueamicina gamma1I y caliqueamicina omegaI1 (véase, por ejemplo, Nicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); CDP323, un inhibidor oral de alfa-4 integrina; dinemicina, incluyendo dinemicina A; una esperamicina; así como cromóforo de neocarcinostatina y cromóforos de antibióticos de enediina relacionados con cromoproteína), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (incluyendo ADRIAMYCIN®, morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina, inyección liposómica de doxorrubicina HCl (DOXIL®), doxorrubicina liposomal TLC D-99 (MYOCET®), doxorrubicina liposomal pegilada (CAELYX®) y desoxidoxorrubicina), epirubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos, tales como metotrexato, gemcitabina (GEMZAR®), tegafur (UFTORAL®), capecitabina (XELODA®), una epotilona y 5-fluorouracilo (5-FU); combretastatina; análogos de ácido fólico, tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos, tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenales, tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor del ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides, tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo polisacarídico PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2', 2'- triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); tiotepa; taxoide, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL®), formulación de nanopartículas obtenidas por ingeniería de albúminas de paclitaxel (ABRAXANE™) y docetaxel (TAXOTERE®); clorambucilo; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; agentes de platino, tales como cisplatino, oxaliplatino (por ejemplo, ELOXATIN®) y carboplatino; vincas, que evitan que la polimerización de tubulina forme microtúbulos, incluyendo vinblastina (VELBAN®), vincristina (ONCOVIN®), vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®) y vinorelbina (NAVELBINE®); etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; leucovorina; novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides, tales como ácido retinoico, incluyendo bexaroteno (TARGRETIN®); bisfosfonatos, tales como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® u OSTAC®), etidronato (DIDROc Al®), NE-58095, ácido zoledrónico/zoledronato (ZOMETA®), alendronato (FOSAMAX®), pamidronato (AREDIA®), tiludronato (SKELID®) o risedronato (ACTONEL®); troxacitabina (un análogo nucleosídico de 1,3-dioxolano citosina; oligonucleótidos antisentido, particularmente, los que inhiben la expresión de genes en vías de señalización implicadas en la proliferación celular aberrante, tal como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras y receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) (por ejemplo, erlotinib (TARCEVA®)); y VEGF-A que reducen la proliferación celular; vacunas, tales como la vacuna THERATOPE® y vacunas de terapia génica, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN® y vacuna VAXID®; inhibidor de topoisomerasa 1 (por ejemplo, LURTOTECAN®); rmRH (por ejemplo, ABARELIX®); BAY439006 (sorafenib; Bayer); SU-11248 (sunitinib, SUTENT®, Pfizer); perifosina, inhibidor de COX-2 (por ejemplo, celecoxib o etoricoxib), inhibidor del proteasoma (por ejemplo, PS341); bortezomib (VELCADE®); documento CCI-779; tipifarnib (R11577); orafenib, documento ABT510; inhibidor de Bcl-2, tal como oblimersen sódico (GENASENSE®); pixantrona; inhibidores de EGFR; inhibidores de tirosina cinasa; inhibidores de serina-treonina quinasa, tales como rapamicina (sirolimus, RAPAMUNE®); inhibidores de farnesil transferasa, tales como lonafarnib (SCH 6636, SARASAR™); y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores tales como CHOP, una abreviatura de una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisolona; y FOLFOX, una abreviatura para un régimen de tratamiento con oxiplatino (ELOXATIN™) combinado con 5-FU y leucovorina y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores.
Los agentes quimioterapéuticos como se definen en el presente documento incluyen "agentes antihormonales" o "terapéuticos endocrinos" que actúan para regular, reducir, bloquear o inhibir los efectos de hormonas que pueden promover el crecimiento del cáncer. Pueden ser, en sí, hormonas, incluyendo, aunque no de forma limitativa: antiestrógenos y moduladores selectivos del receptor de estrógenos (SERM), incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno (incluyendo tamoxifeno NOLVADEX®), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno FARESTON; inhibidores de la aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógenos en las glándulas suprarrenales, tales como, por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestanio, fadrozol, vorozol RIVISOR®, letrozol FEMARA® y anastrozol ARIMIDEX®; y antiandrógenos, tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; así como troxacitabina (un análogo nucleosídico de 1,3-dioxolano citosina); oligonucleótidos antisentido, en particular, los que inhiben la expresión de genes en rutas de señalización implicadas en la proliferación celular anómala, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf y H-Ras; ribozimas tales como un inhibidor de la expresión de VEGF (p. ej., ribozima ANGIOZYME®) y un inhibidor de la expresión de HER2; vacunas tales como vacunas para terapia génica, por ejemplo, vacuna AlLOv ECTIN®, vacuna LEUVECTIN® y vacuna VAXID®; PROLEUKIN® rIL-2; inhibidor de la topoisomerasa 1 LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; Vinorelbina y Espiramicinas (véase la Patente de Estados Unidos N.° 4.675.187) y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores.
Un "agente inhibidor del crecimiento", cuando se utiliza en el presente documento, se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula (tal como una célula que expresa VEGF), ya sea in vitro o in vivo. Por tanto, el agente inhibidor de crecimiento puede ser uno que reduce significativamente el porcentaje de células (tal como una célula que expresa VEGF), en fase S. Los ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un punto distinto de la fase S), tales como agentes que inducen la detención en G1 y la detención en la fase M. Los bloqueadores de la fase M clásicos incluyen los agentes de la vinca (vincristina y vinblastina), taxanos e inhibidores de topoisomerasa II, tales como doxorrubicina, epirubicina, daunorrubicina, etopósido y bleomicina. Aquellos agentes que detienen la fase G1 y también se pasan a la detención de la fase S, por ejemplo, agentes alquilantes de ADN, tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo y ara-C. Puede encontrarse información adicional en Mendelsohn e Israel, eds., The Molecular Basis of Cancer, Capítulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" por Murakami et al. (W.B. Saunders, Filadelfia, 1995), por ejemplo, pág. 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son fármacos anticancerosos ambos derivados del tejo. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), procedente del tejo europeo, es un análogo semisintético del paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). El paclitaxel y el docetaxel promueven el ensamblaje de microtúbulos a partir de dímeros de tubulina y estabilizan los microtúbulos impidiendo su despolimerización, lo que da como resultado la inhibición de la mitosis en las células.
Por "radioterapia" se entiende el uso de rayos gamma o rayos beta dirigidos para inducir un daño suficiente a una célula a fin de limitar su capacidad para funcionar normalmente o para destruir por completo la célula. Se apreciará que habrá muchas formas conocidas en la técnica para determinar la dosis y la duración del tratamiento. Los tratamientos típicos se administran como una administración única y las dosis típicas varían de 10 a 200 unidades (Gray) al día.
La "patología" de una enfermedad incluye todos los fenómenos que comprometen el bienestar del paciente. Para el cáncer, esto incluye, sin limitación, el crecimiento celular anómalo o incontrolable, metástasis, interferencia en el funcionamiento normal de las células vecinas, liberación de citocinas u otros productos secretores en niveles anómalos, supresión o agravamiento de la respuesta inflamatoria o inmunológica, etc.
Una "molécula pequeña" o "molécula orgánica pequeña" se define en el presente documento como que tiene un peso molecular por debajo de aproximadamente 500 Dalton.
La expresión "infusión intravenosa" se refiere a la introducción de un fármaco en la vena de un paciente animal o humano durante un período de tiempo mayor de aproximadamente 5 minutos, preferentemente entre aproximadamente 30 a 90 minutos, aunque, de acuerdo con la invención, la infusión intravenosa se administra alternativamente durante 10 horas o menos.
El término "bolo intravenoso" o "empuje intravenoso" se refiere a la administración del fármaco en una vena de un animal o ser humano de manera que el cuerpo recibe el fármaco en aproximadamente 15 minutos o menos, preferentemente 5 minutos o menos.
La expresión "administración subcutánea" se refiere a la introducción de un fármaco bajo la piel de un paciente animal o humano, preferentemente dentro de una bolsa entre la piel y el tejido subyacente, por suministro relativamente lento, sostenido, a partir de un receptáculo de fármaco. La bolsa se puede crear al pellizcar o estirando la piel hacia arriba y lejos del tejido subyacente.
La expresión "infusión subcutánea" se refiere a la introducción de un fármaco bajo la piel de un paciente animal o humano, preferentemente dentro de una bolsa entre la piel y el tejido subyacente, por suministro relativamente lento, sostenido, a partir de un receptáculo de fármaco durante un periodo de tiempo que incluye, aunque no de forma limitativa, 30 minutos o menos o 90 minutos o menos. Opcionalmente, la infusión se puede realizar por la implantación subcutánea de una bomba de suministro de fármaco implantada bajo la piel de un paciente animal o humano, en donde la bomba suministra una cantidad predeterminada de fármaco durante un período predeterminado de tiempo, tal como 30 minutos, 90 minutos o un período de tiempo que abarca la duración del régimen de tratamiento.
La expresión "bolo subcutáneo" se refiere a la administración de fármaco por debajo de la piel de un paciente animal o humano, donde el suministro de fármaco del bolo es de preferentemente menos de aproximadamente 15 minutos, más preferentemente menos de 5 minutos y con más preferentemente menos de 60 segundos. La administración está preferentemente dentro de una bolsa entre la piel y el tejido subyacente, donde se crea la bolsa, por ejemplo, al pellizcar o estirando la piel hacia arriba y lejos del tejido subyacente.
La palabra "marcador" cuando se utiliza en el presente documento, se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente con el polipéptido. El marcador puede ser en sí mismo detectable (por ejemplo, marcadores radioisótopos o marcadores fluorescentes) o en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición sustrato que es detectable.
Anticuerpos
Los anticuerpos son proteínas que muestran especificidad de unión a un antígeno específico. Los anticuerpos nativos son normalmente glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 Dalton, compuestas de dos cadenas ligeras idénticas (L) y dos cadenas pesadas idénticas (H). Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada mediante un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera tiene también puentes disulfuro intracatenarios a espacios regulares. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (Vh) seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (Vl) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que unos restos de aminoácidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada.
Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de la región constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos o inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varios de éstos pueden además dividirse en subclases (isotipos), por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3 e IgG4; IgAi e IgA2. Se ha descrito varios alotipos de IgGi, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas (revisado por M.-P. LeFranc y G. LeFranc en: "The Human IgG Subclasses", F. Shakib (ed.), págs. 43-78, Pergamon Press, Oxford (1990)). Los diferentes isotipos de la clase IgG, incluyendo lgG-i, lgG2s, lgG3 e lgG4, tienen propiedades físicas, biológicas y clínicas únicas. La IgG1 humana es el anticuerpo más comúnmente usado para fines terapéuticos y la mayoría de los estudios de ingeniería genética se han construido en este contexto.
La presente aplicación se dirige a inmunoglobulinas de IgG variantes que incluyen modificaciones de aminoácidos que alteran las propiedades biológicas de la IgG. Las inmunoglobulinas variantes de la presente solicitud incluyen anticuerpos que comprenden una región Fc modificada que muestra semividas más largas in vivo en comparación con los anticuerpos de tipo silvestre.
La semivida de una IgG variante desvelada en el presente documento puede aumentarse en al menos un 50%, en al menos un 75 % o en al menos un 100 % en comparación con la semivida de la IgG que tiene la región Fc de IgG humana de tipo silvestre.
Como alternativa, la semivida de una IgG variante de la presente invención es al menos aproximadamente de 15 días, al menos aproximadamente de 20, al menos aproximadamente de 25 días, al menos aproximadamente 30 días, al menos aproximadamente de 35 días o al menos aproximadamente de 40 días. La IgG variante es la IgG1 variante.
La semivida de la IgG variante de la presente invención puede ser la semivida medida en seres humanos o en monos cinomolgos.
Fragmentos de anticuerpo
La presente invención cubre los fragmentos de anticuerpo. De particular interés son los anticuerpos que comprenden regiones Fc, fusiones de Fc y la región constante de la cadena pesada. En ciertas realizaciones, los fragmentos de anticuerpo son los fragmentos de inmunoglobulinas variantes (IgG) que comprenden regiones Fc. Los fragmentos de anticuerpos se pueden generar por medios tradicionales, tales como digestión enzimática o mediante técnicas recombinantes.
Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaban a través de la digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992); y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos ahora pueden producirse directamente mediante células hospedadoras recombinantes. Los fragmentos de anticuerpos Fab, Fv y ScFv pueden expresarse y secretarse a partir de E. coli, permitiendo por tanto la producción fácil de grandes cantidades de estos fragmentos. Los fragmentos de anticuerpos se pueden aislar a partir de las bibliotecas de fagos de anticuerpos. Pueden recuperarse directamente fragmentos Fab'-SH a partir de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). De acuerdo con otro enfoque, pueden aislarse directamente fragmentos F(ab')2 de cultivo de células hospedadoras recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para los expertos en la técnica. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos N.° 5.641.870, por ejemplo. Dichos anticuerpos lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos.
Anticuerpos humanizados
La invención abarca anticuerpos humanizados que pueden ser unas IgG variantes humanizadas con una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fc respecto a la IgG de tipo silvestre. En la materia se conocen diversos procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado puede tener uno o más restos de aminoácidos introducidos en este a partir de una fuente que no es humana. Estos restos de aminoácidos no humanos se citan a menudo como restos "importados", que se toman normalmente de un dominio variable "importado". La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1534-1536), sustituyendo las secuencias de la región hipervariable por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente de Estados Unidos N.° 4.816.567) en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son normalmente anticuerpos humanos en los que algunos restos de la región hipervariable y posiblemente algunos restos de FR se sustituyen por restos de sitios análogos en anticuerpos de roedor.
La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, para utilizar en la fabricación de los anticuerpos humanizados puede ser muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el método denominado de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se explora frente a la biblioteca completa de secuencias conocidas de dominio variable humano. La secuencia humana que es la más cercana a la del roedor se acepta a continuación como la región marco conservada humana para el anticuerpo humanizado. Véase, por ejemplo, Sims et al. (1993) J. Immunol. 151:2296; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901. Otro procedimiento utiliza un marco particular derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. El mismo marco se puede utilizar para diferentes anticuerpos humanizados. Véase, por ejemplo, Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; Presta et al. (1993) J. Immunol., 151:2623.
Habitualmente, es deseable adicionalmente que los anticuerpos se humanicen con la retención de una afinidad elevada para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para conseguir este objetivo, de acuerdo con un método, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias precursoras y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias precursoras y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulinas están disponibles habitualmente y son familiares para aquellos expertos en la técnica. Se dispone de programas de ordenador que ilustran y exponen posibles estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias seleccionadas de la inmunoglobulina candidata. La inspección de estas presentaciones permite el análisis del papel probable de los restos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los restos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta manera, los restos de Fr pueden seleccionarse y combinarse a partir de las secuencias receptoras e importadas de manera que se logra la característica deseada del anticuerpo, tal como la afinidad aumentada por el(los) antígeno(s) diana. En general, los restos de la región hipervariable están directamente y más sustancialmente, implicados en la influencia de la unión a antígeno.
Anticuerpos humanos
Los anticuerpos humanos desvelados en el presente documento pueden ser IgG variantes humanas con una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fc respecto a la IgG de tipo silvestre. Los anticuerpos humanos pueden construirse combinando secuencia(s) de dominio variable del clon de Fv seleccionadas de bibliotecas de presentación en fagos derivadas de ser humano con secuencia(s) de dominio constante humano conocidas, como se ha descrito anteriormente. Como alternativa, los anticuerpos monoclonales humanos pueden fabricarse mediante el procedimiento de hibridoma. Las líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma humano de ratón para la producción de anticuerpos monoclonales humanos también se han descrito, por ejemplo, en Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987); y Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).
Ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la eliminación homocigótica de la región de unión de cadena pesada (JH) de anticuerpo en ratones quiméricos y mutantes de la línea germinal da como resultado una inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la matriz génica de inmunoglobulina de la línea germinal humana en tales ratones mutantes de la línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras el desafío de antígeno. Véanse, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7: 33 (1993).
La transposición génica puede utilizarse también para derivar anticuerpos humanos a partir de anticuerpos no humanos, por ejemplo, un roedor, donde el anticuerpo humano tiene afinidades y especificidades similares al anticuerpo no humano de partida. De acuerdo con este método, que también se denomina "impresión de epítopo", la región variable de cadena pesada o ligera de un fragmento de anticuerpo no humano obtenido mediante técnicas de presentación en fagos como se describe en el presente documento se reemplaza por un repertorio de genes de dominio V humano, creando una población de quimeras de scFv o Fab de cadena no humana/cadena humana. La selección con antígeno da como resultado el aislamiento de un scFv o Fab quimérico de cadena humana o no humana en el que la cadena humana restaura el sitio de unión al antígeno destruido al eliminar la cadena no humana correspondiente en el clon de presentación en fagos primario, es decir, el epítopo rige (imprime) la selección de la pareja de la cadena humana. Cuando se repite el proceso para reemplazar la cadena no humana restante, se obtiene un anticuerpo humano (véase el documento PCT WO 93/06213 publicado el 1 de abril de 1993). A diferencia de la humanización tradicional de anticuerpos no humanos mediante injerto de CDR, esta técnica proporciona anticuerpos completamente humanos, que no tienen restos de FR o CDR de origen no humano.
Anticuerpos biespecíficos
Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de unión por al menos dos antígenos diferentes. Los anticuerpos biespecíficos pueden ser anticuerpos biespecíficos con una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fc respecto del anticuerpo de tipo silvestre o pueden ser anticuerpos humanos o humanizados. Las especificidades de unión pueden ser para VEGF y la otra es para cualquier otro antígeno. Los anticuerpos biespecíficos se pueden unir a dos epítopos diferentes de VEGF. Los anticuerpos biespecíficos también se pueden utilizar para localizar agentes citotóxicos en las células que expresan VEGF. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión a VEGF y un brazo que se une a un agente citotóxico, tales como, por ejemplo, saporina, anti-interferóna, alcaloide de la vinca, la cadena A de ricina, metotrexato o hapteno de isótopo radiactivo. En ciertos anticuerpos, las especificidades de unión son para IL-4 e IL-13. Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como anticuerpos de longitud completa o como fragmentos de anticuerpo que comprenden la región Fc.
Se conocen en la técnica métodos para fabricar anticuerpos biespecíficos. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la expresión simultánea de dos parejas de cadena pesadacadena ligera de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milsteiny Cuello, Nature, 305:537 (1983)). Debido a la mezcla aleatoria de las cadenas pesada y ligera de la inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 diferentes moléculas de anticuerpos, de las cuales solo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que normalmente se realiza mediante etapas de cromatografía de afinidad, es demasiado complicada y los rendimientos del producto son bajos. Se describen procedimientos similares en el documento WO 93/08829 publicado el 13 de mayo de1993 y en Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655 (1991).
De acuerdo con un enfoque diferente, los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) se fusionan con secuencias de dominio constante de la inmunoglobulina. La fusión, por ejemplo, es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos una parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. En ciertas realizaciones, la primera región constante de la cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera, está presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de la inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de la inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se transfecta simultáneamente en un organismo hospedador adecuado. Esto proporciona gran flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en realizaciones en las que proporciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas usadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes para dos o las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en proporciones iguales da como resultado rendimientos elevados o cuando las proporciones no son de significación particular.
Los anticuerpos biespecíficos pueden estar compuestos por una cadena pesada de la inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo y un par de cadena pesada-cadena ligera de la inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se ha descubierto que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadena de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solo una mitad de la molécula biespecífica proporciona una forma fácil de separación. Este enfoque se divulga en el documento WO/94/04690. Para más detalles acerca de la generación de anticuerpos biespecíficos, véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).
De acuerdo con otro enfoque, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpo se puede modificar por ingeniería para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo de células recombinantes. La interfaz comprende al menos una parte del dominio Ch3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfaz de la primera molécula de anticuerpo son sustituidas por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean "cavidades" compensadoras de tamaño idéntico o similar a las cadenas laterales grandes en la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo reemplazando cadenas laterales grandes de aminoácidos por otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero frente a otros productos finales no deseados, tales como homodímeros.
Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado se puede acoplar a avidina, el otro a biotina. Dichos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir las células del sistema inmune a células no deseadas (patente de Estados Unidos N.° 4,676,980) y para el tratamiento de la infección por VIH (documentos WO 91/00360, WO 92/00373 y EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados pueden fabricarse utilizando cualquier procedimiento de reticulación conveniente. Los agentes de reticulación adecuados son bien conocidos en la materia y se desvelan en la patente de Estados Unidos N.° 4,676,980, junto con una serie de técnicas de reticulación.
La tecnología del "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para fabricar fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) por un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento se fuerzan a emparejarse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, formando así dos sitios de unión a antígeno. También se ha informado de otra estrategia para fabricar fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante el uso de dímeros de Fv monocatenarios (sFv). Véase Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).
Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).
Anticuerpos multivalentes
Un anticuerpo multivalente puede internalizarse (y/o catabolizarse) más rápidamente que un anticuerpo bivalente por una célula que expresa un antígeno al que se unen los anticuerpos. Los anticuerpos como se desvelan en el presente documento pueden ser anticuerpos multivalentes (que son distintos de la clase IgM) con tres o más sitios de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpos tetravalentes), que pueden producirse fácilmente por expresión recombinante del ácido nucleico que codifica las cadenas polipeptídicas del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios de unión a antígeno. En ciertas realizaciones, el dominio de dimerización comprende (o consiste en) una región Fc o una región bisagra. En este escenario, el anticuerpo comprenderá una región Fc y tres o más sitios de unión a antígeno amino-terminal a la región Fc. En ciertas realizaciones, un anticuerpo multivalente comprende (o consiste en) tres a aproximadamente ocho sitios de unión a antígeno. En una de tales realizaciones, un anticuerpo multivalente comprende (o consiste en) cuatro sitios de unión a antígeno. El anticuerpo multivalente comprende al menos una cadena polipeptídica (por ejemplo, dos cadenas polipeptídicas), en donde la(s) cadena(s) polipeptídica(s) comprende(n) dos o más dominios variables. Por ejemplo, la(s) cadena(s) polipeptídica(s) puede(n) comprender VD1-(X1)n -VD2-(X2)n -Fc, en donde VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fc es una cadena polipeptídica de una región Fc, X1 y X2 representan un aminoácido o polipéptido y n es 0 o 1. Por ejemplo, la(s) cadena(s) polipeptídica(s) puede(n) comprender: cadena VH-CH1-enlazador flexible-VH-CH1-región Fc; o cadena VH-CH1-VH-CH1-región Fc. El anticuerpo multivalente en el presente documento puede comprender adicionalmente al menos dos (por ejemplo, cuatro) polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. El anticuerpo multivalente en el presente documento puede, por ejemplo, comprender de aproximadamente dos a aproximadamente ocho polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. Los polipéptidos de dominio variable de cadena ligera contemplados en el presente documento comprenden un dominio variable de cadena ligera y opcionalmente, comprenden adicionalmente un dominio CL.
Anticuerpos de dominio único
Esta divulgación cubre también un anticuerpo de dominio único que comprende la región Fc. Tal anticuerpo de dominio único puede tener una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fc respecto a la IgG de tipo silvestre. Un anticuerpo de dominio único es una cadena polipeptídica única que comprende la totalidad o una porción del dominio variable de la cadena pesada o la totalidad o una porción del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo.
Modificaciones de anticuerpos
Se desvelan la(s) modificación(ones) de secuencia de aminoácidos de las inmunoglobulinas descritas en el presente documento. Tales modificaciones pueden comprender una o más modificaciones de aminoácidos en las IgG variantes de la presente invención. Puede ser deseable también alterar adicionalmente la afinidad de unión, la semivida in vivo y/o otras propiedades biológicas de las IgG variantes de la presente invención. Estas modificaciones de aminoácidos pueden comprender una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fc no descritas en el presente documento. Las secuencias de aminoácidos modificadas de las IgG variantes pueden prepararse introduciendo cambios apropiados en la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo o mediante síntesis peptídica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de y/o inserciones en y/o sustituciones de, restos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Puede hacerse cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar al constructo final, a condición de que la construcción final posea las características deseadas. Las alteraciones de aminoácidos pueden introducirse en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo objeto en el momento en que se realiza la secuencia.
Un procedimiento útil para la identificación de ciertos restos o regiones del anticuerpo que son ubicaciones preferentes para la mutagénesis se denomina "mutagénesis de barrido de alanina" como se describe en Cunningham y Wells (1989) Science, 244: 1081-1085. En este caso, se identifican un resto o grupo de restos diana (por ejemplo, restos cargados tales como arg, asp, his, lys y glu) y se reemplazan por un aminoácido neutro o cargado negativamente (por ejemplo, alanina o polialanina) para afectar a la interacción de los aminoácidos con el antígeno. Esas localizaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones a continuación, se refinan introduciendo variantes adicionales o diferentes en, o para, los sitios de sustitución. Por tanto, aunque el sitio para introducir una modificación de la secuencia de aminoácidos está predeterminado, no es necesario que la naturaleza de la mutación en sí misma esté predeterminada. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutación en un sitio dado, se llevó a cabo un barrido de ala o mutagénesis aleatoria en el codón o región diana y las inmunoglobulinas expresadas se cribaron para la actividad deseada.
Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones en el extremo amino y/o carboxilo terminal que varían en su longitud, desde un resto hasta polipéptidos que contienen cien o más restos, así como inserciones intrasecuencia de restos de aminoácidos individuales o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un resto de metionilo N-terminal. Otras modificaciones de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al extremo N o C-terminal del anticuerpo de una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que aumenta la semivida en suero del anticuerpo.
Una IgG variante desvelada en el presente documento se puede alterar para aumentar o reducir el grado de glucosilación del anticuerpo. Normalmente, la glicosilación de polipéptidos está unida a N o unida a O. Unida a N se refiere a la unión de una fracción de carbohidrato a la cadena lateral de un resto de asparagina. Las secuencias tripeptídicas de asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto de hidrato de carbono con la cadena lateral de asparagina. Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio de glucosilación potencial. La glucosilación unida al átomo de O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa con un hidroxiaminoácido, más frecuentemente serina o treonina, aunque también se pueden usar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.
La adición o deleción de sitios de glicosilación al anticuerpo se lleva a cabo convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que se crean o eliminan una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para sitios de glicosilación unidos a N). La alteración puede realizarse también mediante la adición, deleción o sustitución de uno o más restos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación unidos a O).
El hidrato de carbono unido a la región Fc de las IgG variantes puede alterarse. Los anticuerpos nativos producidos por células de mamífero comprenden normalmente un oligosacárido ramificado, biantenario, que está unido habitualmente mediante un enlace N al Asn297 del dominio CH2 de la región Fc. Véase, por ejemplo, Wright et al. (1997) TIBTECH 15: 26-32. El oligosacárido puede incluir varios carbohidratos, por ejemplo, manosa, N-acetil glucosamina (GlcNAc), galactosa y ácido siálico, así como fucosa unida a un GlcNAc en el "tallo" de la estructura de oligosacárido biantenaria. Se pueden realizar modificaciones del oligosacárido en una IgG variante desvelada en el presente documento para crear IgG variantes con ciertas propiedades mejoradas adicionalmente. Una IgG variante como se desvela en el presente documento pueden comprender adicionalmente una sustitución de aminoácido en la posición 297 por alanina.
Por ejemplo, se contemplan modificaciones de anticuerpos que tienen una estructura de carbohidrato que carece de fucosa unida (directa o indirectamente) a una región Fc. Dichas modificaciones pueden haber mejorado la función de CCDA. Véanse, por ejemplo, las Publicaciones de Patente de los Estados Unidos N.° US 2003/0157108 (Presta, L.); documento US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Ejemplos de publicaciones relacionadas con modificaciones de anticuerpos "defucosilados" o "deficientes en fucosa" incluyen: documento US 2003/0157108; documento WO 2000/61739; documento WO 2001/29246; documento US 2003/0115614; documento US 2002/0164328; documento US 2004/0093621; documento US 2004/0132140; documento US 2004/0110704; documento US 2004/0110282; documento US 2004/0109865; documento WO 2003/085119; documento WO 2003/084570; documento WO 2005/035586; documento WO 2005/035778; documento WO2005/053742; documento WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336: 1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Los ejemplos de líneas celulares capaces de producir anticuerpos desfucosilados incluyen células Lec13 CHO deficientes en la fucosilación de proteínas (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249: 533-545 (1986); Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.° 2003/0157108 A1, Presta, L; y el documento WO 2004/056312 A1, Adams et al., especialmente en el ejemplo 11) y líneas celulares de inactivación, tal como el gen de la alfa-1,6-fucosiltransferasa, FUT8, células CHO de inactivación (véase, por ejemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4): 680-688 (2006); y el documento WO2003/085107).
Se proporcionan adicionalmente modificaciones de anticuerpos con oligosacáridos biseccionados, por ejemplo, en las que se bisecciona un oligosacárido biantenario unido a la región Fc del anticuerpo mediante GlcNAc. Dichas variantes de anticuerpos pueden tener una fucosilación reducida y/o una función de CCDA mejorada. Se describen ejemplos de dichas modificaciones de anticuerpos, por ejemplo, en el documento WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); la patente de Estados Unidos N.° 6.602.684 (Umana et al.); y el documento US 2005/0123546 (Umana et al.). También se proporcionan modificaciones de anticuerpos con al menos un resto de galactosa en el oligosacárido unido a la región Fc. Dichas modificaciones de anticuerpos pueden tener una función CDC mejorada. Dichas modificaciones de anticuerpos se describen, por ejemplo, en el documento WO 1997/30087 (Patel et al.); el documento WO 1998/58964 (Raju, S.); y el documento WO 1999/22764 (Raju, S.).
Las modificaciones de anticuerpos que poseen algunas pero no todas las funciones efectoras, que las hacen un candidato deseable para muchas aplicaciones en las que es importante la semivida del anticuerpo in vivo mientras que se pueden introducir ciertas funciones efectoras (tales como complemento y CCDA) innecesarias o perjudiciales. Las actividades de Fc del anticuerpo se pueden medir para asegurarse de que solo se mantienen las propiedades deseadas. Pueden llevarse a cabo ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo para confirmar la reducción/eliminación de las actividades de CDC y/o CCDA. Por ejemplo, pueden llevarse a cabo ensayos de unión a receptor Fc (FcR) para asegurarse de que el anticuerpo carece de actividad de unión a FcyR (por tanto, careciendo probablemente de actividad CCDA), pero conserva la capacidad de unión a FcRn. Las células primarias para mediar en la CCDA, células NK, expresan Fc (RIII solamente, mientras que los monocitos expresan Fc(RI, Fc(RII y Fc(RIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457­ 92 (1991)). Se describen ejemplos no limitantes de ensayos in vitro para evaluar la actividad CCDA de una molécula de interés en la Patente de Estados Unidos N.° 5.500.362 (véase, por ejemplo, Hellstrom, I., et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83: 7059-7063 (1986)) y Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82: 1499-1502 (1985); 5.821.337 (véase Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166: 1351-1361 (1987)). Como alternativa, pueden emplearse métodos de ensayo no radiactivos (véase, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radiactivo ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, California; y el ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, Wisconsin). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células asesinas naturales (NK). Como alternativa o adicionalmente, la actividad de CCDA de la molécula de interés puede determinarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal, como se divulga en Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95: 652-656 (1998). Pueden llevarse a cabo ensayos de unión a C1q para confirmar que el anticuerpo es incapaz de unirse a C1q y por tanto, carece de actividad CDC. Para evaluar la activación de complemento, puede llevarse a cabo un ensayo de CDC (véase, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101: 1045-1052 (2003); y Cragg, M.S. y M.J. Glennie, Blood 103: 2738-2743 (2004)). También pueden realizarse determinaciones de unión a FcRn y de aclaramiento/semivida in vivo utilizando métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12): 1759-1769 (2006)).
Otras modificaciones de anticuerpos que tienen una o más sustituciones de aminoácidos son posibles. Los sitios de interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan alteraciones de FR. En la tabla 1 se muestran sustituciones conservativas bajo el encabezado "sustituciones preferidas". Más cambios sustanciales, denominados "sustituciones a modo de ejemplo" se proporcionan en la Tabla 1 o como se describen adicionalmente más adelante en referencia a clases de aminoácidos. Se pueden introducir sustituciones de aminoácidos en un anticuerpo de interés y los productos cribados, por ejemplo, para una actividad deseada, tal como unión a antígeno mejorada, disminución de la inmunogenicidad, CCDA o CDC mejorados, etc.
TABLA 1
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Se pueden lograr modificaciones en las propiedades biológicas de un anticuerpo mediante la selección de sustituciones que afectan (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, en forma de una conformación de lámina o helicoidal, (b) la carga o la hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana o (c) el volumen de la cadena lateral. Los aminoácidos pueden agruparse de acuerdo con similitudes en las propiedades de sus cadenas laterales (en A. L. Lehninger, en Biochemistry, segunda ed., págs. 73-75, Worth Publishers, Nueva York (1975)):
(1) no polares: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2) polares no cargados: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
(3) ácidos: Asp (D), Glu (E)
(4) básicos: Lys (K), Arg (R), His (H)
Como alternativa, los restos de origen natural pueden dividirse en grupos basándose en las propiedades comunes de la cadena lateral:
(1) hidrófobos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) ácidos: Asp, Glu;
(4) básicos: His, Lys, Arg;
(5) restos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;
(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Las sustituciones no conservativas implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase. Tales restos sustituidos pueden introducirse también en los sitios de sustitución conservativa o en los sitios restantes (no conservados).
Un tipo de modificación de sustitución implica sustituir uno o más restos de la región hipervariable de un anticuerpo parental (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En ciertas realizaciones, el anticuerpo parental es la IgG variante homóloga de tipo silvestre (por ejemplo, una IgG variante de la invención sin ninguna alteración adicional en su secuencia de aminoácidos). Habitualmente, los anticuerpos resultantes seleccionadas para un desarrollo adicional tendrán propiedades biológicas modificadas (por ejemplo, mejoradas) con respecto al anticuerpo parental a partir del cual se generan. Una modificación de sustitución a modo de ejemplo es un anticuerpo madurado por afinidad, que se puede generar convenientemente utilizando técnicas de maduración de la afinidad basadas en presentación en fagos. En resumen, varios sitios en la región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) están mutados para generar todas las posibles sustituciones de aminoácidos en cada sitio. Los anticuerpos generados por tanto, se muestran a partir de partículas de fagos filamentosos como fusiones a al menos parte de una proteína de la cubierta del fago (por ejemplo, el producto del gen III de M13) empaquetado dentro de cada partícula. Los anticuerpos presentados en fagos a continuación se criban por su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión). Con el fin de identificar los sitios de la región hipervariable candidatos para la modificación, se puede llevar a cabo mutagénesis de barrido (por ejemplo, barrido de alanina) para identificar restos de la región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión del antígeno. Como alternativa o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos restos de contacto y restos adyacentes son candidatos para la sustitución de acuerdo con las técnicas conocidas en la materia, incluyendo las elaboradas en el presente documento. Una vez se generan tales anticuerpos modificados, el panel de anticuerpos se somete a cribado utilizando técnicas conocidas en la técnica, incluyendo las descritas en el presente documento y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes pueden seleccionarse para un desarrollo adicional.
Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos del anticuerpo modificado (por ejemplo, IgG variante modificada) se preparan mediante diversos métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero sin limitación, el aislamiento de una fuente natural (en el caso de modificaciones de secuencias de aminoácidos de origen natural) o la preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida al sitio), mutagénesis por RCP y mutagénesis de casete de un anticuerpo modificado preparado anteriormente o una versión no modificada del anticuerpo.
De acuerdo con esta descripción y las enseñanzas de la técnica, se contempla que una modificación de anticuerpo puede comprender una o más alteraciones en comparación en la IgG variante homóloga de tipo silvestre (por ejemplo, una IgG variante de la invención sin ninguna alteración adicional en su secuencia de aminoácidos). Estas modificaciones de anticuerpos que comprenden alteraciones adicionales, sin embargo, retendrían sustancialmente las mismas características requeridas para utilidad terapéutica en comparación con la IgG variante homólogo de tipo silvestre. En ciertas realizaciones, la IgG variante homóloga de tipo silvestre es una variante de bevacizumab.
Las modificaciones de anticuerpos pueden comprender también modificaciones en la interfaz de los polipéptidos de Fc que comprenden la región Fc, en donde las modificaciones facilitan y/o promueven la heterodimerización. Estas modificaciones comprenden la introducción de una protuberancia en un primer polipéptido de Fc y una cavidad en un segundo polipéptido de Fc, en donde la protuberancia es puede colocar en la cavidad para promover la formación de complejos del primer y segundo polipéptidos de Fc. Los métodos para generar anticuerpos con estas modificaciones son conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos N.° 5.731.168.
También puede ser deseable crear anticuerpos modificados por ingeniería con cisteína, por ejemplo, "tioMAb", en los que se sustituyen uno o más restos de un anticuerpo por restos de cisteína. Estas sustituciones pueden producirse en sitios accesibles del anticuerpo. Mediante la sustitución de esos restos con cisteína, se colocan de este modo grupos tiol reactivos en sitios accesibles del anticuerpo y pueden usarse para conjugar el anticuerpo a otros restos, tales como restos de fármacos o enlazadores-restos de fármaco, como se describe adicionalmente en el presente documento. Por ejemplo, puede sustituirse uno cualquiera o más de los siguientes restos por cisteína: V205 (numeración de Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración de EU) de la cadena pesada; y S400 (numeración de EU) de la región Fc de la cadena pesada.
Derivados de anticuerpos
Las IgG variantes de la presente invención se pueden modificar adicionalmente para contener fracciones no proteicas adicionales que son conocidos en la técnica y están fácilmente disponibles. La IgG puede conjugarse con un agente citotóxico. En ciertas realizaciones, la IgG variante a la que se une el agente citotóxico se interioriza por la célula, dando como resultado una eficacia terapéutica aumentada del conjugado en la destrucción de la célula cancerosa a la que se une. El agente citotóxico se dirige o interfiere con el ácido nucleico en la célula cancerosa.
Las fracciones adecuadas para la derivatización del anticuerpo son polímeros solubles en agua. Los ejemplos no limitantes de polímeros hidrosolubles incluyen, pero sin limitación, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de óxido de prolipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), alcohol polivinílico y mezclas de los mismos. El propionaldehído de polietilenglicol puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede tener cualquier peso molecular y puede ser ramificado o no ramificado. La cantidad de polímeros unidos al anticuerpo puede variar y si se une más de un polímero, pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, el número y/o tipo de polímeros usados para la derivatización se puede determinar basándose en consideraciones que incluyen, aunque no de forma limitativa, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo a mejorar, si el derivado de anticuerpo se usará en una terapia en condiciones definidas, etc.
Se pueden construir conjugados de un anticuerpo y una fracción no proteico que pueden calentarse selectivamente por exposición a radiación. La fracción no proteica puede ser es un nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda e incluye, aunque no se limita a, longitudes de onda que no dañan a las células ordinarias, pero que calientan la fracción no proteica a una temperatura a la que mueren las células próximas a la fracción no proteica del anticuerpo.
Fabricación de IgG variantes
Las IgG variantes se pueden fabricar mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, las secuencias de IgG variantes se pueden utilizar para crear ácidos nucleicos que codifican las secuencias miembro y que a continuación, pueden clonarse en células hospedadoras, expresarse y ensayarse, si se desea. Estas prácticas se llevan a cabo utilizando procedimientos bien conocidos y diversos métodos que pueden ser útiles se describen en Molecular Cloning-- A Laboratory Manual, 3a Ed. (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, 2001) y en Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons). Los ácidos nucleicos que codifican las IgG variantes se pueden incorporar en un vector de expresión con el fin de expresar la proteína. Los vectores de expresión normalmente incluyen una proteína ligada operativamente, es decir, situada en una relación funcional, con secuencias de control o reguladoras, marcadores seleccionables, cualesquier compañeros de fusión y/o elementos adicionales. Las IgG variantes se pueden producir cultivando una célula hospedadora transformada con ácido nucleico, preferentemente un vector de expresión, que contiene ácido nucleico que codifica las IgG variantes, bajo las condiciones apropiadas para inducir o provocar la expresión de la proteína. Puede transfectarse una gran variedad de células hospedadoras adecuadas, que incluyen, aunque no de forma limitativa, células de mamíferos, bacterias, células de insectos y levaduras. Por ejemplo, en el catálogo de líneas celulares de ATCC se describe diversas líneas celulares que pueden ser útiles, disponibles a partir de la Colección Americana de Cultivos Tipo (en inglés, American Type Culture Collection). Los métodos para introducir ácido nucleico exógeno en células hospedadoras se conocen bien en la técnica y varían con la célula hospedadora utilizada.
Las IgG variantes se pueden purificar o aislar tras la expresión. Los anticuerpos se pueden purificar o aislar en diversas formas conocidas por los expertos en la materia. Los métodos de purificación estándares incluyen técnicas cromatográficas, electroforéticas, inmunológicas, técnicas de precipitación, diálisis, filtración, concentración y cromatoenfoque. Como se conoce bien en la técnica, diversas proteínas naturales se unen a anticuerpos, por ejemplo, proteínas bacterianas A, G y L y estas proteínas pueden ser útiles en la purificación. A menudo, la purificación se puede permitir mediante un compañero de fusión particular. Por ejemplo, las proteínas se pueden purificar utilizando resina de glutatión, si se emplea una fusión de g St , cromatografía de afinidad de Ni+2, si se emplea una etiqueta de His o un anticuerpo anti-flag inmovilizado, si se utiliza una etiqueta flag. Como guía general en las técnicas de purificación adecuadas, véase Antibody Purífication: Principles and Practice, 3a ed., Scopes, Springer-Verlag, Nueva York, 1994.
Cribado de IgG variantes
Las IgG variantes de la presente divulgación se pueden cribar utilizando varios métodos, incluyendo, aunque no de forma limitativa, los que utilizan ensayos in vitro, ensayos in vivo y basados en células y tecnologías de selección. Las tecnologías de automatización y de cribado de alto rendimiento pueden utilizarse en los procedimientos de cribado. El cribado puede emplear la utilización de un compañero de fusión o etiqueta, por ejemplo, una etiqueta inmunitaria, una etiqueta isotópica o una etiqueta de molécula pequeña tal como un colorante fluorescente o calorimétrico.
Las propiedades funcionales y/o biofísicas de IgG variantes pueden cribarse en un ensayo in vitro. La proteína puede cribarse para la funcionalidad, por ejemplo, su capacidad para catalizar una reacción o su afinidad de unión a su diana.
Un subconjunto de métodos de cribado son los que seleccionan miembros favorables de una biblioteca. En el presente documento los métodos se denominan "métodos de selección" y estos métodos pueden utilizarse para cribar las IgG variantes. Cuando se criban las bibliotecas de proteínas utilizando un método de selección, solo los miembros de una biblioteca que son favorables, es decir, que satisfacen algunos criterios de selección, se propagan, aíslan y/o observan. Se conoce varios métodos de selección en la técnica, que pueden utilizarse para cribar bibliotecas de proteínas. Otros métodos de selección que pueden utilizarse incluyen métodos que no dependen de la visualización, tal como métodos in vivo. Un subconjunto de métodos de selección denominado como métodos de "evolución dirigida" son aquellos que incluyen el emparejamiento o creación de secuencias favorables durante la selección, a veces con la incorporación de nuevas mutaciones.
También se pueden cribar las IgG variantes utilizando uno o más ensayos basados en células o in vivo. Para dichos ensayos, las proteínas purificadas o no purificadas se agregan normalmente exógenamente de manera que las células se exponen a las variantes individuales o agrupamientos de variantes que pertenecen a una biblioteca. Estos ensayos se basan normalmente, pero no siempre, en la función de la IgG variante; es decir, la capacidad de la IgG variante de unirse a su diana y mediar algún evento bioquímico, por ejemplo, una función efectora, inhibición de unión a ligando/receptor, apoptosis y similares. Tales ensayos a menudo implican controlar la respuesta de las células a la IgG, por ejemplo, la proliferación celular, migración celular, angiogénesis, supervivencia celular, muerte celular, cambio en la morfología celular o activación transcripcional tal como la expresión celular de un gen natural o gen indicador. Por ejemplo, tales ensayos pueden medir la capacidad de las IgG variantes para provocar CCDA, ADCP o CDC. Para algunos ensayos puede ser necesario añadir células o componentes adicionales, es decir, además de las células diana, por ejemplo, un complemento sérico o células efectoras tales como células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células NK, macrófagos y similares. Tales células adicionales pueden ser de cualquier organismo, preferentemente, de seres humanos, ratones, rata, conejo y mono. En ciertas realizaciones, los anticuerpos pueden inhibir angiogénesis y los métodos para controlar dicha actividad se conocen bien en la técnica. En todavía otra realización, los anticuerpos pueden provocar apoptosis de ciertas líneas celulares que expresan la diana o pueden mediar el ataque sobre células diana mediante células inmunitarias que se han añadido al ensayo. Los métodos para controlar la muerte o viabilidad celular se conocen en la técnica e incluyen la utilización de colorantes, reactivos inmunoquímicos, citoquímicos y radiactivos. La activación transcripcional también puede servir como un método para evaluar la función en los ensayos basados en células. Como alternativa, se realizan cribados basados en células utilizando células que se han transformado o transfectado con ácidos nucleicos que codifican las variantes. Es decir, las IgG variantes no se añaden exógenamente a las células.
Las propiedades biológicas de las IgG variantes se pueden caracterizar en experimentos celulares, tisulares y del organismo completo. Los fármacos se ensayan, a menudo, en animales, incluyendo, aunque no de forma limitativa, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y monos, con el fin de medir la eficacia de un fármaco para el tratamiento contra una enfermedad o modelo de enfermedad o para medir la farmacocinética, toxicidad y otras propiedades de un fármaco. Los animales pueden denominarse como modelos de enfermedad. Los terapéuticos se ensayan, a menudo, en ratones, incluyendo, aunque no de forma limitativa, ratones atímicos, ratones SCID, ratones injertados y ratones transgénicos (incluyendo ratones con inserciones génicas (en inglés, knockins) y ratones nuligénicos (en inglés, knockouts)). Tal experimentación puede proporcionar datos significativos para la determinación del potencial de la proteína a ser utilizada como un terapéutico. Cualquier organismo, preferentemente mamíferos, puede utilizarse para ensayar. Por ejemplo, dada su similitud genética con los seres humanos, los monos pueden ser modelos terapéuticos adecuados y por tanto pueden utilizarse para ensayar la eficacia, toxicidad, farmacocinética u otra propiedad de las IgG variantes. Las pruebas en seres humanos se requieren por último para la aprobación como fármacos y por tanto, desde luego se contemplan estos experimentos. Por tanto, las IgG variantes se pueden ensayar en seres humanos para determinar su eficacia terapéutica, toxicidad, inmunogenicidad, farmacocinética y/u otras propiedades clínicas.
Usos terapéuticos de IgG variantes
Las IgG variantes pueden utilizarse en un amplio intervalo de productos. Por ejemplo, La IgG variante es un reactivo terapéutico, de diagnóstico o de investigación. La IgG variante puede utilizarse en una composición de anticuerpos que es monoclonal o policlonal. as IgG variantes pueden utilizarse para bloquear, antagonizar o agonizar al antígeno diana, tal como VEGF. En ciertas realizaciones, las IgG variantes se utilizan para bloquear o neutralizar la actividad de VEGF. En una realización, la actividad de VEGF es la angiogénesis.
Las IgG variantes se pueden utilizar para diversos propósitos terapéuticos, incluyendo, aunque no de forma limitativa, el tratamiento de pacientes con enfermedades neoplásicas y/o no-neoplásicas, como se ha definido en el presente documento en las "Definiciones". En ciertas realizaciones, la enfermedad neoplásica es cáncer. En ciertas realizaciones, los pacientes se tratan primero con IgG de tipo silvestre y posteriormente se tratan con IgG variante. Por ejemplo, los pacientes se tratan primero con bevacizumab y a continuación, se tratan con la IgG variante, por ejemplo, una variante de bevacizumab. En ciertas realizaciones, los pacientes se tratan con bevacizumab durante aproximadamente 6 meses y a continuación, se tratan con la IgG variante, por ejemplo, una variante de bevacizumab.
Un número de anticuerpos y fusiones Fc que se han aprobado para usar en ensayos clínicos o en desarrollo, se denominan en el presente documento "productos y candidatos clínicos". Las IgG variantes de la presente invención pueden utilizarse en un intervalo de productos y candidatos clínicos. Entre los ejemplos de anticuerpos que pueden modificarse se incluyen, pero sin limitación, un anticuerpo que puede unirse a un antígeno diana tal como VEGF, EGFR (ErbB-1), Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), CD20, IgE, CD11, lipoproteína de baja densidad (LDL), interleucina 4 (IL-4), interleucina 13 (IL-13), un epítopo de la hepatitis C, A-beta, IL-17A, IL-17F, d R6, DR5, un epítopo del citomegalovirus humano, un epítopo de staph aureus, factor tisular, alpha4beta7 integrina, alpha5beta1 integrina, CTLA4, CD3, un epítopo del RSV, NFalfa, CD147, IL8, MUC18, MUC1, alpha4beta1 (VLA-4) integrina, receptor de linfotoxina alfa, receptor beta de linfotoxina (LTBR), TGF-p2, IL-12, TGFp1, Eotaxinl, BAFF, TRAIL-R1, IL15, Heparanasa I; CD40, CDl54, CD80, CD23, factor de migración de macrófagos (MIF), KDR, flk-1, cadherina VE, antígeno carcinoembrionario (CEA), CD22, CTLA4, CD30, molécula-1 de adhesión intercelular, receptor 3 del factor de crecimiento anti-fibroblasto (FGFR-3), interferón gamma, IL-12, anticuerpo de Ep-CAM e integrina beta2.
Entre los ejemplos de productos y candidatos clínicos que pueden modificarse se incluyen, pero sin limitación, anticuerpo anti-VEGF AVASTIN® (bevacizumab, Genentech) (véase por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 7.169.901; anticuerpo monoclonal anti-HER2 humanizado HERCEPTIN® (trastuzumab, Genentech) (véase por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 6.489.447); anticuerpo anti-CD20 quimérico RITUXAN® (rituximab, iDEC/Genentech/Roche); anticuerpo anti-lgE XOLAIR® (omalizumab, Genentech); otros anticuerpos anti-CD20; anticuerpo anti-CD11a Ra PTIVA® (efalizumab, Genentech/Xoma); anticuerpo anti-Her2 OMNITARG® (pertuzumab, Genentech); un anticuerpo anti-oxLDL (véase por ejemplo, la publicación de Estados Unidos N.° 20040202653 y el documento WO 2004030607; anticuerpo anti-CD4 MTRX101lA (véase, por ejemplo, el documento WO 02/102853); anticuerpos biespecíficos en donde los antígenos diana son IL-4 e IL-13; un anticuerpo anti-HCV; un anticuerpo anti-IL-17A/F; un anticuerpo anti-A-beta; un anticuerpo anti-DR6; anticuerpo anti-citomegalovirus humano (HCMV); anticuerpos de la familia del receptor anti-HER; un anticuerpo del factor antitejido; anticuerpo de MLN-02, un anticuerpo monoclonal IgGi humanizado a a4p7 integrina (anteriormente LDP-02, Genentech/Millennium Pharmaceuticals); anticuerpo anti-CD 18 F(ab')2 humanizado; y un anticuerpo anti-lgE IgGi humanizado rhuMab-E25 (Genentech/Norvartis/Tanox Biosystems).
Entre los ejemplos de productos y candidatos clínicos adicionales que pueden modificarse se incluyen, pero sin limitación, un anticuerpo anti- CD20 quimérico aprobado para tratar linfoma No Hodgkin; un anticuerpo anti- CD20 HuMax-CD20 (Genmab); anticuerpo anti-CD20 AME-133 (véase por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 5.500.362, Applied Molecular Evolution); hA20 (Immunomedics, Inc.), HumaLYM (Intracel) y PRO70769 (PCT/US2003/040426). Un número de anticuerpos que se dirigen a miembros de la familia de los receptores de factor de crecimiento epidérmico, incluyen EGFR (ErbB-1), Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), también se pueden beneficiar de las modificaciones a la región Fc descrita en la presente invención. Por ejemplo, las variantes de IgG pueden utilizarse en un anticuerpo que es sustancialmente similar a ERBITUX® (cetuximab, Imclone) (patente de Estados Unidos N.° 4.943.533; documento WO 96/40210; un anticuerpo anti-EGFR quimérico en ensayos clínicos para diversos cánceres; ABX-EGF (patente de Estados Unidos N.° 6,235,883, Abgenix/Immunex/Amgen); HuMax-EGFr (N.° de serie de Estados Unidos N.° 10/172.317, incorporada a modo de referencia en su totalidad, Genmab); 425, EMD55900, EMD62000 y EMD72000 (Merck KGaA) (patente de Estados Unidos N.° 5.558.864; Murthy et al.
1987, Arch Biochem Biophys. 252(2): 549-60; Rodeck et al., 1987, J Cell Biochem. 35(4): 315-20; Kettleborough et al., 1991, Protein Eng. 4(7): 773-83; ICR62 (Institute of Cancer Research) (documento WO 95/20045; Modjtahedi et al., 1993, J. Cell Biophys. 1993, 22(1-3): 129-46; Modjtahedi et al., 1993, Br J Cancer. 1993, 67(2): 247-53; Modjtahedi et al, 1996, Br J Cancer, 73(2): 228-35; Modjtahedi et al, 2003, Int J Cancer, 105(2): 273-80); TheraCIM hR3 (YM Biosciences, Canadá y Centro de Inmunología Molecular, Cuba (Patentes de Estados Unidos N.° 5.891.996; 6.506.883; Mateo et al., 1997, Immunotechnology, 3(1):71-81); mAb-806 (Ludwig Institute for Cancer Research, Memorial Sloan-Kettering) (Jungbluth et al. 2003, Proc Natl Acad Sci U S A. 100(2): 639-44); KSB-102 (KS Biomedix); MR1-1 (IVAX, National Cancer Institute) (documento WO 0162931A2); y SC100 (Scancell) (documento WO 01/88138). En ciertas realizaciones, las variantes de IgG de la presente invención pueden utilizarse en CAMPATH® (alemtuzumab, Genzyme Corporation), un anticuerpo monoclonal humanizado actualmente aprobado para el tratamiento de leucemia linfocítica crónica de linfocitos B. Las variantes de IgG de la presente invención pueden utilizarse en diversos anticuerpos o fusiones Fc que son sustancialmente similares a otros productos y candidatos clínicos, incluyendo, aunque no de forma limitativa, VEGF-Trap (Regeneron); muromonab-CD3 (Orthoclone OKT3®), un anticuerpo anti-CD3 (Ortho Biotech/Johnson & Johnson); anticuerpo anti-CD20 ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetan, IDEC/Schering AG); anticuerpo anti-CD33 MYLOTARG®, un anticuerpo (proteína p67) gemtuzumab ozogamicina (Celltech/Wyeth); un anticuerpo de fusión de Fc anti-LFA-3 AMEVIVE® (alefacept, Biogen); REOPRO® (abciximab, Centocor/lilly); SIMULECT® (basiliximab, Novartis); SYNAGIS® (palivizumab, MedImmune); anticuerpo anti-TNFalfa REMICADE® (infliximab, Centocor); anticuerpo anti-TNFalfa Hu M iRA®, (adalimumab, Abbott); anticuerpo anti-TNF lgG4 humanizado HUMICADE® (Celltech); anticuerpo de fusión Fc anti- TNFalfa e Nb REL® (etanercept, Immunex/Amgen); anticuerpo anti-CD147 ABX- CBL (Abgenix); anticuerpo anti-IL8 ABX-IL8 (Abgenix); anticuerpo anti-MUC18 ABX-MA1 (Abgenix); anticuerpo anti-MUC1 pemtumomab (R1549, 90Y-muHMFG1) (Antisoma); anticuerpo anti-MUC1 therex (R1550) (Antisoma); AngioMab (AS1405) (Antisoma); HuBC-1 (Antisoma); Tioplatina (AS1407) (Antisoma); TYSa Br I® (anteriormente ANTEGREN®, natalizumab), un anticuerpo anti-alfa-4-beta-1 (VLA-4) y anticuerpo alfa-4-beta-7 (Biogen); anticuerpo anti- VLA-1 integrina VLA-1 mAb (Biogen); anticuerpo del receptor beta anti-linfotoxina (LTBR) LTBR mAb (Biogen); anticuerpo anti-TGF-p2 CAT-152 (Cambridge Antibody Technology); J695, un anticuerpo anti-IL-12 (Cambridge Antibody Technology/Abbott); CAT-192, un anticuerpo anti-TGFp1 (Cambridge Antibody Technology/Genzyme); CAT-213, un anticuerpo anti-Eotaxinl (Cambridge Antibody Technology); LYMPHOSTAT-B®, un anticuerpo anti-Blys (Cambridge Antibody Technology/ Human Genome Sciences Inc.; TRAIL-RlmAb, un anticuerpo anti-TRAIL-Rl (Cambridge Antibody Technology/Human Genome Sciences, Inc.); HUMAX-CD4, un anticuerpo anti-CD4 (Genmab); HuMax-IL15, un anticuerpo anti-IL15 (Genmab/Amgen); HuMax-Inflam (Genmab/ Medarex); HuMax-Cancer, un anticuerpo anti-Heparanasa I (Genmab/Medarex/Oxford GlycoSciences); HuMax-Lymphoma (Genmab/Amgen); HuMax-TAC (Genmab); IDEC-131, un anticuerpo anti-CD40L (IDEC Pharmaceuticals); |De C-151 (clenoliximab), un anticuerpo anti-CD4 (Id Ec Pharmaceuticals); IDEC-114, un anticuerpo anti-CD80 (IDEC Pharmaceuticals); IDEC-152, un anticuerpo anti-CD23 (IDEC Pharmaceuticals); anticuerpos anti-factor de migración de macrófagos (MIF) (IDEC Pharmaceuticals); BEC2, un anticuerpo antiidiotípico (Imclone); IMC-1C11, un anticuerpo anti-KDR (Imclone); DC101, un anticuerpo anti-flk-1 (Imclone); anticuerpos anti-cadherina VE (Imclone); CEA-CIDE® (labetuzumab), un anticuerpo del antígeno anti-carcinoembrionario (CEA) (Immunomedics); LYMPHOCIDE® (Epratuzumab), un anticuerpo anti-CD22 (Immunomedics); AFP-Cide (Immunomedics); MyelomaCide (Immunomedics); LkoCide (Immunomedics); ProstaCide (Immunomedics); MDX-010, un anticuerpo anti-CTLA4 (Medarex); MdX-060, un anticuerpo anti-CD30 (Medarex); MDX-070 (Medarex); MDX-018 (Medarex); OSIDEM® (IDM-1), un anticuerpo anti-Her2 (Medarex /Immuno-Designed Molecules); CNTO 148, un anticuerpo anti-TNFa (Medarex/Centocor/J&J); CNTO 1275, un anticuerpo anti-citocina (Centocor/J&J); MOR101 y MOR102, anticuerpos anti-molécula-1 de adhesión intercelular (ICAM-1, también conocido como CD54) (MorphoSys); MOR201, un anticuerpo anti-receptor 3 del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR-3) (MorphoSys); Nu VIOn® (visilizumab), un anticuerpo anti-CD3 (Protein Design Labs); Hu-ZAF®, un anticuerpo anti-interferón gamma (Protein Design Labs); anticuerpos para integrina a5p1 (Protein Design Labs); anti-IL-12 (Protein Design Labs); ING-1, un anticuerpo anti-Ep-CAM (Xoma); y MLN01, un anticuerpo anti-integrina beta2 (Xoma).
Las IgG variantes con modificaciones en la región Fc de IgG del presente documento se pueden incorporar en los candidatos y productos clínicos anteriormente mencionados o en anticuerpos y fusiones de Fc que son sustancialmente similares a los mismos. Las IgG variantes en el presente documento invención también se pueden incorporar en las versiones de los candidatos y productos clínicos anteriormente mencionados que están humanizados, madurados por afinidad, modificadas por ingeniería genética o modificados de alguna otra manera.
En ciertas realizaciones, las IgG variantes de la presente invención pueden utilizarse en el tratamiento de cánceres benignos, precancerosos o no metastásicos; para el tratamiento de tumores latentes o micrometástasis; para la prevención de la recurrencia de tumores o el recrecimiento; o para el tratamiento o la prevención del cáncer en un sujeto en riesgo de desarrollar cáncer. Por ejemplo, las IgG variantes que comprenden modificaciones de Fc como se describen en el presente documento se pueden utilizar para una terapia adyuvante para el tratamiento de un sujeto con cáncer no metastásico, tras la cirugía definitiva o para terapia neoadyuvante para el tratamiento de un sujeto con un cáncer operable, donde se proporciona la terapia antes de la extracción quirúrgica del cáncer operable en el sujeto. Si bien las aplicaciones terapéuticas se separan bajo prevención, terapia neoadyuvante y terapia adyuvante, se apreciará por el experto que estas categorías no son necesariamente excluyentes mutuamente.
Clasificación de los tumores
Los sistemas de estadificación del cáncer describen hasta qué punto el cáncer se ha diseminado anatómicamente e intentan poner a los pacientes con pronóstico y tratamiento similares dentro del mismo grupo. Se pueden realizar varias pruebas para ayudar a estadificar el cáncer, incluyendo una biopsia y ciertas pruebas de imágenes, tales como radiografía de tórax, mamografía, gammagrafía ósea, tomografía axial computerizada y resonancia magnética nuclear. Los análisis de sangre y una evaluación clínica también se utilizan para evaluar la salud global de un paciente y detectar si el cáncer se ha diseminado a ciertos órganos.
Para estadificar el cáncer, el Comité conjunto estadounidense sobre el cáncer (American Joint Committee on Cáncer) primero localiza el cáncer, particularmente los tumores sólidos, en una categoría de letras que usa el sistema de clasificación de TNM. Los cánceres se designan con la letra T (tamaño del tumor), N (nódulos palpables) y/o M (metástasis). T1, T2, T3 y T4 describen el aumento de tamaño de la lesión primaria; N0, N1, N2, N3 indica progresivamente el avance de la implicación de nódulos; y M0 y M1 reflejan la ausencia o presencia de metástasis distante.
En el segundo método de estadificación, también conocido como Agrupamiento de estadios global (en inglés, Overall Stage Grouping) o Estadificación en números romanos (en inglés, Román Numeral Staging), los cánceres se dividen en los estadios 0 a IV, incorporando el tamaño de lesiones primarias así como la presencia de la diseminación de nódulos y de metástasis distante. En este sistema, los casos se agrupan en cuatro estadios denotadas por los números romanos I a IV o se clasifican como "recurrente". Para algunos cánceres, el estadio 0 se denomina "in situ" o "Tis", tal como el carcinoma ductal in situ o carcinoma lobular in situ para cánceres de mama. Los adenomas de alto grado se pueden clasificar también como estadio 0. En general, los cánceres de estadio I son cánceres localizados pequeños que son curables normalmente, mientras que los de estadio IV normalmente representan un cáncer inoperable o metastásico. Los cánceres de estadio II y III normalmente avanzan localmente y/o muestran la implicación de nódulos linfáticos locales. En general, los números de estadios superiores indican una enfermedad más extensa, incluyendo un mayor tamaño del tumor y/o diseminación del cáncer a nódulos linfáticos cercanos y/u órganos adyacentes al tumor primario. Estos estadios están precisamente definidos, pero la definición es diferente para cada tipo de cáncer y es conocida para el experto en la materia.
Muchos registros del cáncer, tales como la Vigilancia del NCI, Epidemiología y el Programa de resultados finales (SEER; del inglés, End Results Program), utilizan una estadificación resumida. Este sistema se utiliza para todos los tipos de cáncer. Agrupa los casos de cáncer en cinco categorías principales:
In situ es el cáncer temprano que está presente solo en la capa de las células en las cuales comenzó.
Localizado es el cáncer que se limita al órgano en el cual comenzó, sin pruebas de diseminación.
Regional es el cáncer que se ha diseminado más allá del sitio original (primario) a los nódulos linfáticos cercanos u órganos y tejidos.
Distante es el cáncer que se ha diseminado desde el sitio primario a órganos distantes o nódulos linfáticos distantes.
Desconocido se utiliza para describir los casos para los que no existe suficiente información para indicar el estadio.
Además, es común que el cáncer retorne meses o años después de que el tumor primario ha haya eliminado. El cáncer que reaparece después de que todo tumor visible se haya erradicado, se denomina enfermedad recurrente. La enfermedad que reaparece en el área del tumor primario es localmente recurrente y la enfermedad que reaparece como metástasis se denomina recurrencia distante. Un tumor latente es un tumor que existe en un estado quiescente en el que cual las células tumorales están presentes pero la progresión del tumor no es evidente clínicamente. Las micrometástasis son pequeñas metástasis o un número de células que se han diseminado desde el tumor primario hacia otras partes del cuerpo. La micrometástasis puede detectarse o no en una prueba de cribado o diagnóstico. Los métodos de la invención son útiles para prevenir la aparición de tumores latentes o micrometástasis o la recurrencia del tumor, por ejemplo, en un escenario donde un tumor latente o micrometástasis están presentes pero pueden o no detectarse clínicamente.
Los métodos de la invención también son útiles para el tratamiento de cánceres tempranos, pero no se limitan a tumores benignos, pre-cancerosos o no metastásicos. Estos incluyen cualquier tumor de los estadios 0, I o II; cualquier tumor no metastásico de estadio II; cualquier afección que normalmente precede o evoluciona a un cáncer, incluyendo, aunque no de forma limitativa, displasia; y cualquier tumor que permanece localizado en el sitio de origen y no se ha infiltrado, invadido o metastatizado a sitios distantes. Entre los ejemplos de tumores benignos, pre-cancerosos o no metastásicos se incluyen un pólipo, adenoma, fibroma, lipoma, gastrinoma, insulinoma, condroma, osteoma, hemangioma, linfangioma, meningioma, leiomioma, rabdomioma, papiloma de células escamosas, neuromas acústicos, neurofibroma, cistanoma de conductos biliares, leiomiomas, mesoteliomas, teratomas, mixomas, tracomas, granulomas, hamartoma, papiloma de células transicionales, adenoma pleiomórfico de las glándulas salivales, tumor desmoide, cistopapiloma dermoide, cistoadenoma, hiperplasia focal nodular e hiperplasia nodular regenerativa.
Debido a que la angiogénesis está implicada tanto en el crecimiento del tumor primario como en la metástasis, el tratamiento antiangiogénico proporcionado por la invención es capaz de inhibir el crecimiento neoplásico de un tumor en el sitio primario, así como prevenir la metástasis de tumores en los sitios secundarios, permitiendo, por tanto, atacar los tumores por parte de otros terapéuticos.
La información adicional respecto a las terapias adyuvantes y neoadyuvantes y al tratamiento de tumores de estadios tempranos se desvelan en la solicitud de Estados Unidos N.° 12/002.605 y la solicitud PCT, PCT/US2007/088000).
Prevención
En ciertas realizaciones, las IgG variantes se pueden utilizar para el tratamiento de cánceres benignos, precancerosos o de estadios tempranos o para el tratamiento o prevención de la recurrencia del tumor. En ciertas realizaciones, la IgG variante es un anticuerpo anti-VEGF. En una realización, la IgG variante es una variante de bevacizumab. En una realización, la IgG variante comprende las regiones determinantes de complementariedad de bevacizumab. En otra realización, la IgG variante comprende el dominio variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 1) y el dominio variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 2). La IgG variante puede comprender el dominio variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 7) y el dominio variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 8).
Los métodos se pueden utilizar para tratar el cáncer en sí mismo o para prevenir la progresión del cáncer a un estadio invasivo o metastásico o a un grado o estadio mayor. Por ejemplo, los métodos de la invención se pueden utilizar para tratar un sujeto con pólipos o cáncer del Estadio 0, con el fin de prevenir la progresión a un Estadio I o tumor de estadio superior. Análogamente, en un paciente que tiene cáncer de Estadio II, los métodos se pueden utilizar para prevenir la progresión del cáncer a un cáncer de Estadio III o de Estadio IV.
Las IgG variantes también se pueden utilizar para prevenir la recurrencia de un tumor. Por ejemplo, si un tumor se ha identificado y tratado (por ejemplo, con quimioterapia o se ha eliminado quirúrgicamente), se puede utilizar una IgG variante para prevenir la recurrencia del tumor colorrectal localmente o una metástasis del tumor colorrectal. Para la prevención de la recurrencia del tumor, las IgG variantes se pueden utilizar, por ejemplo, para tratar un tumor latente o micrometástasis o para prevenir el crecimiento o recrecimiento de un tumor latente o micrometástasis, que pueden o no ser clínicamente detectables.
Por ejemplo, las IgG variantes se pueden utilizar para la prevención del cáncer en un sujeto que nunca ha tenido cáncer o quien está en riesgo de desarrollar un cáncer. Existe varios factores de riesgo conocidos por estar asociados con el cáncer y muchos de ellos se describen en el presente documento. Además, un sujeto que se sabe que padece un síndrome de cáncer hereditario se considera que está en riesgo de desarrollar cáncer.
Terapia neoadyuvante
Los métodos de terapia neoadyuvante antes de la extirpación quirúrgica del cáncer operable en un sujeto, por ejemplo, un paciente humano, pueden comprender administrar al paciente (por ejemplo, cuando se diagnostica al paciente con un tumor y/o cáncer) una cantidad eficaz de una IgG variante, tal como el anticuerpo IgG variante anti-VEGF o una variante de bevacizumab. La IgG variante puede comprender las regiones determinantes de complementariedad de bevacizumab, el dominio variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 1) y el dominio variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 2) o el dominio variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 7) y el dominio variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 8) .
La IgG variante se puede administrar junto con al menos un agente quimioterapéutico. La etapa adicional de administrar al sujeto una cantidad eficaz de una IgG variante tras la cirugía para prevenir la recurrencia del cáncer también se puede emplear con las terapias neoadyuvantes descritas en el presente documento. Para los métodos que incluyen la etapa adicional de administrar al sujeto una cantidad eficaz de una IgG variante tras la cirugía, puede utilizarse cualquiera de los métodos adyuvantes descritos en el presente documento.
Por ejemplo, un método incluye tratar el cáncer en un sujeto, que comprende los siguientes etapas: a) una primera fase que comprende una pluralidad de ciclos de tratamiento, en donde cada ciclo comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una IgG variante y opcionalmente, al menos un agente quimioterapéutico en un intervalo predeterminado; b) una cirugía definitiva, de modo que el cáncer se elimina; y opcionalmente, c) una segunda fase que comprende una pluralidad de ciclos de mantenimiento, en donde cada ciclo comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una IgG variante con o sin un agente quimioterapéutico en un intervalo predeterminado.
Por ejemplo, un esquema de administración de la terapia neoadyuvante puede comprender una primera etapa en donde una IgG variante y uno o más agentes quimioterapéuticos se administran a los pacientes en una pluralidad de ciclos neoadyuvantes, seguido de una cirugía para eliminar definitivamente el tumor. La terapia neoadyuvante puede durar menos de un año, en una realización, menos de seis meses antes de la cirugía.
Terapia adyuvante
Los métodos de terapia adyuvante pueden comprender administrar una IgG variante a un sujeto con cáncer no metastásico, tras la cirugía definitiva. La IgG variante puede ser un anticuerpo anti-VEGF o una variante de IgG de bevacizumab que puede comprender las regiones determinantes de complementariedad de bevacizumab, el dominio variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 1) y el dominio variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 2) o el dominio variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 7) y el dominio variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 8).
Por ejemplo, un método puede incluir las siguientes etapas: a) una primera fase que comprende una pluralidad de ciclos de tratamiento, en donde cada ciclo comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una IgG variante y opcionalmente, al menos un agente quimioterapéutico en un intervalo predeterminado; y b) una segunda fase que comprende una pluralidad de ciclos de mantenimiento, en donde cada ciclo comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una IgG variante sin un agente quimioterapéutico en un intervalo predeterminado; en donde la primera y la segunda fases combinadas duran al menos un año tras el tratamiento postoperatorio inicial. En una realización, la primera fase comprende una primera pluralidad de ciclos de tratamiento en donde se administran una IgG variante y un primer régimen de quimioterapia, seguido de una segunda pluralidad de ciclos de tratamiento en donde se administran una IgG variante y un segundo régimen de quimioterapia.
La IgG variante se puede administrar habitualmente tras un periodo de tiempo en el que el sujeto se ha recuperado de la cirugía. Este periodo puede incluir el periodo requerido para la curación de heridas o la curación de la incisión quirúrgica, el periodo requerido para reducir el riesgo de dehiscencia de la herida o el periodo requerido para que el sujeto retorne a un nivel de salud esencialmente similar o mejor que el nivel de salud previo a la cirugía. El periodo entre la finalización de la cirugía definitiva y la primera administración de la IgG variante también puede incluir el periodo necesario para un descanso del fármaco, en donde el sujeto requiere o solicita un periodo de tiempo entre regímenes terapéuticos. Habitualmente, el periodo entre la finalización de la cirugía definitiva y el comienzo de la terapia con IgG variante puede incluir menos de una semana, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas (28 días), 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 1 año, 2 años, 3 años o más. En una realización, el periodo de tiempo entre la cirugía definitiva y la administración de la IgG variante es mayor de 4 semanas (28 días) y menor de 1 año.
En un esquema de administración, la terapia adyuvante comprende una primera fase, en donde una IgG variante y uno o más agentes quimioterapéuticos se administran a los pacientes en una pluralidad de ciclos de tratamiento; y una segunda fase, en donde una IgG variante se utiliza como un agente único en una pluralidad de ciclo de mantenimiento. Por ejemplo, la IgG variante puede ser una variante de bevacizumab y un ciclo de tratamiento puede ser de ocho semanas, lo que significa que los pacientes reciben una dosis de quimioterapia y una dosis de variante de bevacizumab cada ocho semanas. El ciclo de tratamiento también puede ser de doce semanas, lo que significa que los pacientes reciben una dosis de quimioterapia y una dosis de variante de bevacizumab, cada doce semanas. La terapia adyuvante puede durar al menos un año desde el inicio del tratamiento y se hará seguimiento del progreso del sujeto después de ese tiempo. El progreso de la terapia se controla fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.
Dosificaciones, formulaciones y duración
La composición de IgG variante se formulará, dosificará y administrará de un modo coherente con la buena práctica médica. Entre los factores a considerar en este contexto se incluyen, aunque no de forma limitativa, el trastorno particular que se va a tratar, el mamífero particular que se va a tratar, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio donde se suministra el agente, el método de administración, la pauta de administración y otros factores conocidos por los profesionales sanitarios. Para la prevención o el tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada de una IgG variante, por ejemplo, un anticuerpo, de la invención (cuando se usa solo o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales diferentes) dependerá del tipo de enfermedad que se vaya a tratar, el tipo de anticuerpo, la gravedad y el trascurso de la enfermedad, de si el anticuerpo se administra con fines preventivos o terapéuticos, de la terapia previa, de la historia clínica del paciente y de la respuesta al anticuerpo y del criterio del médico responsable. La IgG variante se administra adecuadamente al paciente una vez o en una serie de tratamientos.
Las formulaciones descritas en el presente documento también pueden contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que se trata, preferentemente los que tienen actividades complementarias que no se afectan negativamente entre sí. Dichas moléculas están presentes de manera adecuada en combinación en cantidades que son eficaces para el fin previsto.
La "cantidad terapéuticamente eficaz" de una IgG variante, por ejemplo, un anticuerpo, a administrar estará gobernada por consideraciones tratadas en el presente documento y es la cantidad mínima necesaria para prevenir, mejorar o tratar una enfermedad o trastorno. Por ejemplo, Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de la IgG variante a administrar es la cantidad mínima necesaria para prevenir, mejorar o tratar o estabilizar, un cáncer benigno, precanceroso o de estadio temprano; o tratar o prevenir la aparición o recurrencia de un tumor, un tumor latente o una micrometástasis, por ejemplo, en el escenario neoadyuvante o adyuvante. La IgG variante no lo necesita, pero opcionalmente se formula con uno o más agentes usados en la actualidad para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de tales otros agentes depende de la cantidad de IgG variante presente en la formulación, del tipo de trastorno o tratamiento y de otros factores tratados anteriormente. Estos se usan generalmente en las mismas dosis y con las vías de administración que se usan en el presente documento antes o aproximadamente del 1 al 99 % de las dosis empleadas hasta ahora. Habitualmente, el alivio o el tratamiento de una enfermedad o trastorno implica la disminución de uno o más síntomas o problemas médicos asociados con la enfermedad o trastorno. En el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco puede lograr uno o una combinación de lo siguiente: reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir, disminuir hasta cierto punto y/o detener) la infiltración de células cancerosas en los órganos periféricos; inhibir la metástasis tumoral; inhibir, hasta cierto punto, el crecimiento tumoral; y/o aliviar hasta cierto punto uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. En la medida en que el fármaco puede prevenir el crecimiento y/o destruir las células cancerosas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. Se puede utilizar una composición de la presente invención para prevenir la aparición o recurrencia de la enfermedad o trastorno en un sujeto o mamífero.
La duración de la terapia continuará durante tanto tiempo como esté médicamente indicado o hasta que se logre un efecto terapéutico deseado (por ejemplo, los descritos en el presente documento). En ciertas realizaciones, la terapia de IgG variante se continúa durante 2 meses, 4 meses, 6 meses, 8 meses, 10 meses, 1 año, 2 años, 3 años, 4 años, 5 años, 10 años o durante un período de años hasta toda la vida del sujeto.
Habitualmente, el alivio o tratamiento de un cáncer benigno, precanceroso o de estado temprano o la terapia adyuvante 0 neoadyuvante de un cáncer (benigno o maligno) implica la disminución de uno o más síntomas o problemas médicos asociados con el cáncer. La cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco puede lograr uno o una combinación de los siguientes para reducir (por ejemplo, en un 20 %, un 30 %, un 40 %, un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 90 %, 100 % o más) el número de células cancerosas en el tumor; reducir el tamaño del tumor; reducir la carga del tumor; inhibir (es decir, reducir hasta un punto y/o detener) la Infiltración de las células cancerosas en órganos periféricos; reducir la densidad vasos en el tumor; inhibir la metástasis tumoral; reducir o inhibir el crecimiento tumoral o la proliferación celular tumoral; reducir o prevenir el crecimiento de un tumor latente; reducir o prevenir el crecimiento o la proliferación de una micrometástasis; reducir o prevenir el recrecimiento de un tumor tras el tratamiento o eliminación (por ejemplo, en terapia adyuvante); aumentar o extender la SLE o la SG de un sujeto susceptible a o diagnosticado de un tumor benigno, precanceroso o no metastásico o un tumor maligno; reducir el tamaño de un tumor para permitir la cirugía (por ejemplo, en terapia neoadyuvante); y/o aliviar hasta cierto punto uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. La IgG variante se puede utilizar para prevenir la aparición o recurrencia de cáncer en el sujeto.
Para la prevención o el tratamiento de una enfermedad, la dosificación apropiada de una IgG variante de la invención (cuando se usa sola o junto con uno o más agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad a ser tratada, el tipo de anticuerpo, la gravedad y el trascurso de la enfermedad, independientemente de si la IgG variante se administra con fines preventivos o terapéuticos, de la terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta a la IgG variante y el criterio del médico a cargo. En ciertas realizaciones, la IgG variante se administra adecuadamente al paciente una vez o en una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y de la gravedad de la enfermedad, aproximadamente 1 pg/kg a 20 mg/kg (por ejemplo, 0,1 mg/kg -15 mg/kg) de la IgG variante puede ser una dosis inicial posible para la administración al paciente, independientemente, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas o mediante una infusión continua. Una dosificación diaria típica estará en el intervalo de aproximadamente 1 pg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas a lo largo de varios días o un periodo mayor, dependiendo de la afección, se continuará generalmente el tratamiento hasta que suceda una supresión deseada de los síntomas de enfermedad. En una realización, dependiendo de la afección, el tratamiento se sostiene hasta que se trata el cáncer, como se ha medido mediante los métodos descritos en el presente documento o conocidos en la técnica. Una dosis a modo de ejemplo de IgG variante estaría en el intervalo de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg. Por tanto, una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg, 7,5 mg/kg, 10 mg/kg o 15 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas) se pueden administrar al paciente. Tales dosis pueden administrarse de manera intermitente, por ejemplo, cada tres, cada ocho o cada doce semanas (por ejemplo, de modo que el paciente recibe de aproximadamente dos a aproximadamente veinte o por ejemplo, aproximadamente seis dosis del anticuerpo). Por ejemplo, una dosis de carga inicial superior, seguida de una o más dosis inferiores. Tal régimen de dosificación puede comprender administrar una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguida de una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 mg/kg del anticuerpo. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación. El progreso de esta terapia se controla fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales. También en el presente documento, puede utilizarse un anticuerpo variante de IgG anti-VEGF, tal como una variante de IgG de bevacizumab.
Por ejemplo, en algunos regímenes de dosificación la frecuencia de administración de la IgG variante se reduce, en comparación con la frecuencia de administración de la IgG de tipo silvestre debido a la semivida aumentada de la IgG variante o, la IgG variante se administra con menos frecuencia que la frecuencia de dosificación recomendada o prescrita de la IgG de tipo silvestre.
Por ejemplo, cuando la IgG variante es una variante de bevacizumab, la IgG variante puede administrarse cada 4 semanas o en intervalos mayores. Como alternativa, la IgG variante puede administrarse cada 6 semanas o más, cada 8 semanas o más, cada 10 semanas o más o cada 12 semanas o más.
La IgG variante puede administrarse inicialmente cada 2 semanas y posteriormente cada 4 semanas o en intervalos más largos o puede administrarse inicialmente cada 2-3 semanas y posteriormente cada 6 semanas o más. Como alternativa, la IgG variante puede administrarse inicialmente cada 2-4 semanas y posteriormente administrarse cada 8 semanas o más, la IgG variante puede administrarse inicialmente cada 2-5 semanas y posteriormente administrarse cada 10 semanas o más. Dentro de otros regímenes alternativos, la IgG variante puede administrarse inicialmente cada 2-6 semanas y posteriormente administrarse cada 12 semanas o más o la IgG variante, por ejemplo, una variante de bevacizumab, puede administrarse inicialmente con la frecuencia de la dosificación prescrita de bevacizumab y posteriormente administrarse menos frecuentemente que la frecuencia de la dosificación prescrita de bevacizumab. Como alternativa, bevacizumab se administra inicialmente con la frecuencia de la dosificación prescrita y posteriormente se administra una variante de bevacizumab menos frecuentemente que la frecuencia de la dosificación prescrita de bevacizumab.
Como alternativa, la IgG variante se administra cada 14 días o en intervalos más largos, cada 21 días o más. En ciertas realizaciones, la IgG variante se administra cada 28 días o más, cada 60 días o más, cada mes o en intervalos más largos, cada dos meses o más o cada tres meses o más.
El paciente puede tratarse también con una combinación de la IgG variante y uno o más agentes quimioterapéuticos. Tal administración combinada incluye la coadministración o administración concurrente, utilizando formulaciones separadas o una única formulación farmacéutica y la administración consecutiva en cualquier orden, en donde opcionalmente hay un período de tiempo en el que ambos (o todos) los agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas. Las cantidades eficaces de agentes terapéuticos administrados junto con una IgG variante dependerán del criterio del médico o veterinario. La administración y ajuste de la dosis se realiza para lograr el máximo manejo de las condiciones a tratar. La dosis dependerá además de factores tales como el tipo de agente terapéutico a utilizar y del paciente específico que se está tratando. Las dosis adecuadas a modo de ejemplo para la IgG variante son las utilizadas en la actualidad para su IgG de tipo silvestre y se pueden reducir debido a la semivida aumentada y/o la acción combinada (sinergia) de la IgG variante y el agente terapéutico adicional utilizado. La combinación de los inhibidores puede potenciar también la eficacia de un inhibidor único. El término "potenciar" se refiere a una mejora en la eficacia de un agente terapéutico en su dosis común o aprobada.
Los regímenes de dosificación tratados en el presente documento se pueden utilizar junto con un régimen quimioterapéutico que puede implicar la administración intermitente de altas dosis tradicionales o utilizar dosis más pequeñas y más frecuentes sin descansos programados ("quimioterapia metronómica").
Los tratamientos pueden incluir también una combinación de la IgG variante y uno o más agentes quimioterapéuticos. Por ejemplo, el agente quimioterapéutico puede administrarse antes o después de la administración de la IgG variante, el tiempo entre al menos una administración del agente quimioterapéutico y al menos una administración de la IgG variante es de aproximadamente 1 mes o menos. Como alternativa, el tiempo entre al menos una administración del agente quimioterapéutico y al menos una administración de la IgG variante es de aproximadamente 2 semanas o menos. Como alternativa, el otro agente quimioterapéutico y la IgG variante se administran concurrentemente al paciente, en una única formulación o en formulaciones separadas. El tratamiento con la combinación del agente quimioterapéutico y la IgG variante puede dar como resultado un beneficio terapéutico sinérgico o mayor que el aditivo, al paciente.
El agente quimioterapéutico, si se administra, normalmente se administra en dosis conocidas o se reduce opcionalmente debido a la acción combinada de los fármacos o los efectos secundarios negativos atribuibles a la administración del agente quimioterapéutico antimetabolito. La preparación y los programas de dosificación para tales agentes quimioterapéuticos pueden utilizarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante o como se determine de forma empírica por el experto en la materia.
Varios agentes quimioterapéuticos que pueden ser combinados se desvelan en el presente documento, por ejemplo, en las Definiciones. Los ejemplos de los agentes quimioterapéuticos a combinar con la IgG variante incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, un taxoide (incluyendo docetaxel y paclitaxel), vinca (tal como vinorelbina o vinblastina), compuesto de platino (tal como carboplatino o cisplatino), inhibidor de aromatasa (tal como letrozol, anastrazol o exemestano), anti-estrógeno (por ejemplo, fulvestrant o tamoxifeno), etopósido, tiotepa, ciclofosfamida, metotrexato, doxorrubicina liposomal, doxorrubicina liposomal pegilada, capecitabina, gemcitabina, inhibidor de COX-2 (por ejemplo, celecoxib) o inhibidor de proteosoma (por ejemplo, PS342). Se pueden administrar "cócteles" de diferentes agentes quimioterapéuticos.
El progreso de estas terapias desvelado en el presente documento se controla fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.
Por ejemplo, el tratamiento o prevención de la aparición o recurrencia de un tumor, un tumor latente o una micrometástasis puede implicar la prevención de la formación tumoral o metástasis, habitualmente tras el tratamiento inicial o extracción de un tumor (por ejemplo, utilizando una terapia contra el cáncer tal como cirugía, quimioterapia o radioterapia). La cirugía puede dejar células tumorales residuales o nódulos micrometastásicos latentes, que tienen el potencial de reactivar el "programa angiogénico" y facilitar el crecimiento tumoral más exponencial. Aunque la presencia de un tumor latente o micrometástasis no es necesariamente detectable utilizando mediciones o cribas clínicos, una cantidad terapéuticamente eficaz es la que es suficiente para prevenir o reducir la detección del tumor latente, micrometástasis, metástasis o recurrencia tumoral utilizando las técnicas conocidas para el médico. En un ejemplo, un sujeto se trata para un tumor al eliminar quirúrgicamente el tumor, a continuación, se trata con una IgG variante y se controla a lo largo del tiempo para la detección de un tumor latente, micrometástasis o recurrencia tumoral. La IgG variante, por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF, puede administrarse junto con otra terapia contra el cáncer (por ejemplo, antes de, junto con o tras la IgG variante) y una o ambas terapias pueden continuar como una terapia de mantenimiento.
Las mediciones adicionales de eficacia terapéutica en el tratamiento de cánceres se describen en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos N.° 20050186208.
Una IgG variante de la invención (y cualquier agente terapéutico adicional) se puede administrar por cualquier medio adecuado, incluyendo la administración parenteral, subcutánea, intraperitoneal, intracerebrospinal, intrapulmonar e intranasal y si se desea para un tratamiento local, intralesional. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. En ciertas realizaciones, la IgG variante, por ejemplo, un anticuerpo, se administra adecuadamente por infusión de pulsos, particularmente con dosis decreciente de la IgG variante. La dosificación puede ser por cualquier vía adecuada, por ejemplo, mediante inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. En ciertas realizaciones, la IgG variante se administra a un sujeto en forma intravenosa, por ejemplo, como un bolo o por infusión continua en un período de tiempo.
La localización de la diana de unión de una IgG variante, por ejemplo, un anticuerpo, de la invención se puede tener en cuenta en la preparación y administración de la IgG variante. Cuando la diana de unión de una IgG variante está localizada en el cerebro, ciertas realizaciones de la invención proporcionan la IgG variante para atravesar la barrera sangre-cerebro. En la técnica existen varios enfoques conocidos para transportar moléculas a través de la barrera sangre-cerebro, incluyendo, aunque no de forma limitativa, métodos físicos, métodos basados en lípidos, métodos basados en células madre y métodos basados en canales y receptores.
Los métodos físicos para transportar una IgG variante, por ejemplo, un anticuerpo, a través de la barrera sangrecerebro incluyen, pero sin limitación, eludir la barrera sangre-cerebro enteramente o crear aperturas en la barrera sangre-cerebro. Los métodos de elusión incluyen, pero sin limitación, inyección directa en el cerebro (véase, por ejemplo, Papanastassiou et al., Gene Therapy 9: 398-406 (2002)), infusión intersticial/administración potenciada por convección (véase, por ejemplo, Bobo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2076-2080 (1994)) e implante de un dispositivo de suministro en el cerebro (véase, por ejemplo, Gill et al., Nature Med. 9: 589-595 (2003); y Gliadel Wafers™, Guildford Pharmaceutical). Los métodos para crear aperturas en la barrera incluyen, pero sin limitación, ultrasonido (véase, por ejemplo, la publicación de patente de Estados Unidos N.° 2002/0038086), presión osmótica (por ejemplo, mediante administración de manitol hipertónico (Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, vol. 1 y 2, Plenum Press, Nueva York. (1989)), permeabilización mediante, por ejemplo, bradiquinina o permeabilizador A-7 (véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N.° 5.112.596, 5.268.164, 5.506.206 y 5.686.416) y transfección de neuronas que atraviesan la barrera sangre-cerebro con vectores que contienen genes que codifican la IgG variante (véase, por ejemplo, la publicación de patente de Estados Unidos N.° 2003/0083299).
Los métodos basados en lípidos para transportar una IgG variante, por ejemplo, un anticuerpo, a través de la barrera sangre-cerebro incluyen, pero sin limitación, encapsular la IgG variante en liposomas que se acoplan a los fragmentos de unión a anticuerpo que se unen a receptores en el endotelio vascular de la barrera sangre-cerebro (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos N.° 20020025313) y revestir la IgG variante de partículas de lipoproteínas de baja densidad (véase, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 20040204354) o apolipoproteína E (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos N.° 20040131692).
Los métodos basados en células madre para transportar una IgG variante, por ejemplo, un anticuerpo, a través de la barrera sangre-cerebro abarcan células progenitoras neurales (NPC, del inglés Neural Progenitor Cells) modificadas por ingeniería genética para expresar el anticuerpo de interés y a continuación, implantar las células madre en el cerebro del individuo a ser tratado. Véase, Behrstock et al. (2005) GeneTher. publicación en línea avanzada de 15 de diciembre de 2005 (que informa de que las NPC genéticamente manipuladas para expresar el factor neurotrófico GDNF redujeron los síntomas de la enfermedad de Parkinson cuando se implantaron en los cerebros de modelos roedores y primates).
Los métodos basados en canales y receptores para transportar una IgG variante, por ejemplo, un anticuerpo, a través de la barrera sangre-cerebro incluyen, pero sin limitación, utilizar bloqueadores glucocorticoides para aumentar la permeabilidad de la barrera sangre-cerebro (véanse, por ejemplo, las publicaciones de solicitud de patente N.° 2002/0065259, 2003/0162695, y 2005/0124533); activar los canales de potasio (véase, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 2005/ 0089473), inhibir los transportadores de fármacos ABC (véase, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 2003/0073713); revestir los anticuerpos con una transferrina y modular la actividad de uno o más de los receptores de transferrina (véase, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 2003/ 0129186), cationizar los anticuerpos (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 5.004.697).
Las formulaciones farmacéuticas que comprenden una IgG variante, por ejemplo, un anticuerpo, de la invención, se prepara mezclando para almacenamiento mezclando la IgG variante que tiene el grado de pureza deseado con vehículos fisiológicamente aceptables opcionales, excipientes o estabilizantes (Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20a edición (2000)), en forma de soluciones acuosas, formulaciones liofilizadas u otras desecadas. Los vehículos, excipientes y/o estabilizantes aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, histidina y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos, tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).
Los principios activos también pueden estar atrapados en una microcápsula preparada, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsula de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsula de poli-(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20a edición (2000).
Las formulaciones que se van a utilizar para su administración in vivo deben ser estériles. Esto se lleva a cabo fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.
Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen la inmunoglobulina de la invención, cuyas matrices están en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) o poli(vinilalcohol)), polilactidas (patente de EE.UU. n.° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y Y-etil-L-glutamato, etilvinilacetato no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables, tales como las LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas por un copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y poli-ácido D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros tales como etilvinilacetato y ácido lácticoácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, determinados hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando las inmunoglobulinas encapsuladas permanecen en el cuerpo durante un tiempo prolongado, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a la humedad a 37 °C, dando como resultado una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden crear estrategias racionales para la estabilización según el mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través del intercambio de tio-disulfuro, se puede lograr estabilización modificando restos de sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, utilizando aditivos adecuados y desarrollando composiciones de matrices poliméricas específicas.
Eficacia del tratamiento
La eficacia de las IgG variantes se puede medir de varias formas, incluyendo, aunque no de forma limitativa, los métodos descritos en el presente documento en las "Definiciones". Por ejemplo, la eficacia para tratar el tumor se puede medir al detectar la capacidad de una IgG variante para inhibir o reducir el crecimiento o metástasis del tumor. Por ejemplo, una IgG variante tiene una mayor eficacia en comparación con una IgG de tipo silvestre si la IgG variante es capaz de reducir la velocidad de crecimiento tumoral en comparación con el crecimiento tumoral logrado con el tratamiento utilizando la IgG de tipo silvestre o una IgG variante tiene mayor eficacia en comparación con la IgG de tipo silvestre si la IgG variante puede lograr una inhibición máxima del crecimiento tumoral a una dosis de IgG inferior que la dosis que se necesita para que la IgG de tipo silvestre logre la misma inhibición máxima del crecimiento tumoral. Como alternativa, una IgG variante tiene mayor eficacia en comparación con la IgG de tipo silvestre si la IgG variante tiene la capacidad de inhibir o reducir el crecimiento o metástasis de células cancerosas a una dosis de IgG inferior que la dosis requerida para la IgG de tipo silvestre. Las IgG variantes como se desvela en el presente documento pueden tener igual o mayor eficacia en comparación con las IgG de tipo silvestre o no tener menor eficacia en comparación con las IgG de tipo silvestre.
La eficacia del tratamiento de la invención también se puede medir mediante varios criterios de valoración utilizados comúnmente para evaluar trastornos neoplásicos o no neoplásicos. Por ejemplo, los tratamientos del cáncer pueden evaluarse mediante, por ejemplo, aunque no de forma limitativa, regresión tumoral, peso del tumor o contracción del tamaño, tiempo hasta la progresión, duración de la supervivencia, supervivencia libre de progresión, tasa de respuesta global, la duración de la respuesta, calidad de vida, expresión y/o actividad proteicas. Debido a que ciertos agentes descritos en el presente documento, tales como los agentes antiangiogénicos, se dirigen a la vasculatura del tumor y no necesariamente a las células neoplásicas en sí mismas, los mismos representan una clase única de fármacos contra el cáncer y por tanto, pueden requerir medidas únicas y definiciones de respuestas clínicas a los fármacos. Por ejemplo, la contracción del tumor más del 50 % en un análisis bidimensional es el punto de corte estándar para declarar una respuesta. Sin embargo, los inhibidores de la invención pueden provocar la inhibición de la diseminación metastásica sin contracción del tumor primario o pueden ejercer simplemente un efecto tumoristático. Por consiguiente, se pueden emplear enfoques para determinar la eficacia de la terapia, que incluyen, por ejemplo, medición de marcadores urinarios o plasmáticos de angiogénesis y medición de respuesta a través de imágenes radiológicas.
Terapias de combinación
Los agentes terapéuticos descritos en el presente documento se pueden administrar con otros agentes terapéuticos concomitantemente, es decir, los agentes terapéuticos desvelados en el presente documento pueden ser coadministrados con otras terapias o agentes terapéuticos, que incluyen, por ejemplo, moléculas pequeñas, otros agentes biológicos, radioterapia, cirugía, etc.
Como alternativa, una variante de IgG puede ser el único agente terapéuticamente activo administrado a un paciente. La variante de IgG se puede administrar junto con uno o más agentes terapéuticos, incluyendo, aunque no de forma limitativa, agentes antiangiogénicos, agentes quimioterapéuticos, citocinas, agentes inhibidores del crecimiento, agentes antihormonales, inhibidores de cinasa, agentes citotóxicos, cardioprotectores u otros agentes terapéuticos. Las variantes de IgG se pueden administrar concomitantemente con uno o más de otros regímenes terapéuticos. Por ejemplo, la variante de IgG se puede administrar en conjunto con uno o más anticuerpos, que pueden o no ser una variante de IgG o alternativamente las variantes de IgG se pueden emplear junto con todavía otras técnicas terapéuticas tales como cirugía.
En ciertas realizaciones, agentes adicionales, por ejemplo, agentes anticancerosos o agentes terapéuticos o agentes antiangiogénesis, pueden administrar junto con una IgG variante para tratar varias condiciones neoplásicas o no neoplásicas. Por ejemplo, la condición neoplásica o no neoplásica se puede caracterizar por un trastorno patológico asociado con angiogénesis anómala o indeseada. Las IgG variantes de la invención pueden administrarse en serie o junto con otro agente que es efectivo para esos fines, en la misma composición o como composiciones separadas utilizando las mismas vías de administración o diferentes.
La terapia antiangiogénica en relación con el cáncer es una estrategia de tratamiento del cáncer que apunta a inhibir el desarrollo de vasos sanguíneos tumorales, requeridos para proporcionar nutrientes para sustentar el crecimiento tumoral. Dado que la angiogénesis está implicada tanto en el crecimiento del tumor primario como en la metástasis, el tratamiento antiangiogénico proporcionado por la invención es capaz de inhibir el crecimiento neoplásico de un tumor en el sitio primario, así como prevenir la metástasis de tumores en los sitios secundarios, permitiendo, por tanto, atacar los tumores por parte de otros terapéuticos. Por ejemplo, el agente anticanceroso o agente terapéutico puede ser un agente antiangiogénico o el agente anticanceroso es un agente quimioterapéutico.
Muchos agentes antiangiogénicos se han identificado y se conocen en la técnica, incluyendo los enumerados en el presente documento, por ejemplo, enumerados en las Definiciones y mediante, por ejemplo, Carmeliet y Jain, Nature 407: 249-257 (2000); Ferrara et al., Nature Reviews:Drug Discovery, 3: 391-400 (2004); y Sato Int. J. Clin. Oncol., 8: 200-206 (2003)). Véase también, la Publicación de Patente de EE.UU. N.° 20030055006. Por ejemplo, dos o más inhibidores de angiogénesis pueden coadministrarse al paciente opcionalmente además de la IgG variante de la invención.
Otros agentes terapéuticos que pueden combinarse con la IgG variante incluyen el antagonista de VEGF o los antagonistas del receptor VEGf . Otros agentes terapéuticos útiles para la terapia tumoral de combinación con la IgG variante incluyen antagonistas de otros factores que están implicados en el crecimiento tumoral, tales como EGFR, ErbB2 (también conocido como Her2) ErbB3, ErbB4 o TNF. Como alternativa, la IgG variante se puede utilizar junto con inhibidores de receptor de tirosina quinasa (RTKI; del inglés, receptor tyrosine kinase inhibitors) de moléculas pequeñas que se dirigen a uno o más receptores de tirosina quinasa, tales como receptores de VEGF, receptores de FGF, receptores de EGF y receptores de PDGF. Muchos RTKI de moléculas pequeñas terapéuticos se conocen en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, vatalanib (PTK787), erlotinib (TARCEVA®), OSI-7904, ZD6474 (ZACTIMA®), ZD6126 (ANG453), ZD1839, sunitinib (SUTENT®), semaxanib (SU5416), AMG706, AG013736, Imatinib (GLEEVEC®), MLN-518, CEP-701, PKC-412, Lapatinib (GSK572016), VELCADE®, AZD2171, sorafenib (NEXAVAR®), XL880 y CHIR-265.
Otra opción puede ser la utilización de una combinación de dos o más IgG variantes de la invención o la combinación de al menos una IgG variante con una o más terapias anticancerosas adicionales. Entre los ejemplos de terapias anticancerosas se incluyen, sin limitación, cirugía, terapia por radiación (radioterapia), bioterapia, inmunoterapia, quimioterapia o una combinación de estas terapias. Por ejemplo, la terapia anticancerosa para el cáncer de próstata, cáncer de ovario y cáncer de mama puede ser una terapia de hormonas. Además, pueden utilizarse agentes citotóxicos, antiangiogénicos y agentes antiproliferativos junto con la IgG variante. Una variante de IgG se puede administrar también al paciente junto con quimioterapia, radioterapia o tanto quimioterapia como radioterapia.
La IgG variante puede utilizarse también como una terapia adyuvante para el tratamiento de cáncer no metastásico o tras la cirugía definitiva. En este ejemplo, la IgG variante puede estar provista con o sin al menos un agente quimioterapéutico adicional.
Como alternativa, la IgG variante puede utilizarse como terapia neoadyuvante para el tratamiento de un cáncer operable antes de la cirugía. En este ejemplo, la IgG variante se puede proporcionar antes de la cirugía con o sin al menos un agente quimioterapéutico adicional.
La IgG variante y dichos uno o más de otros agentes terapéuticos se pueden administrar simultánea o secuencialmente en una cantidad y durante un tiempo suficientes para reducir o eliminar la aparición o recurrencia de un tumor, un tumor latente o una micrometástasis. La IgG variante y dichos uno o más de otros agentes terapéuticos se pueden administrar como terapia de mantenimiento para prevenir o reducir la posibilidad de recurrencia del tumor.
Como alternativa, una IgG variante con uno o más agentes quimioterapéuticos (por ejemplo, un cóctel). Los ejemplos no limitativos de agentes quimioterapéuticos se describen en el presente documento de las Definiciones. Los esquemas de preparación y dosificación para tales agentes quimioterapéuticos se pueden utilizar de acuerdo con las instrucciones del fabricante o se pueden determinar empíricamente por parte del experto en la materia, véase también, la sección titulada Dosificaciones, formulaciones y duración.
Artículos de fabricación
Puede utilizarse un artículo fabricado que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos con anterioridad. El artículo de fabricación puede comprender un envase y una etiqueta o rótulo inserto o asociado con el envase. Los envases adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas, etc. Los envases pueden formarse a partir de diversos materiales, tales como vidrio o plástico. El envase contiene una composición que está sola o combinada con otra composición eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el contenedor puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). La etiqueta o prospecto indica que la composición se usa para tratar la dolencia de elección. Por ejemplo, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer envase con una composición contenida en este, en donde la composición comprende una IgG variante de la invención; y (b) un segundo envase con una composición contenida en el mismo, en donde la composición comprende un agente citotóxico o de otro modo terapéutico adicional. El artículo de fabricación puede comprender adicionalmente un prospecto que indique que las composiciones se pueden utilizar para tratar una afección particular. Como alternativa o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) envase que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI, por sus siglas en inglés), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.
Como alternativa, la IgG variante se puede envasar sola o junto con otros compuestos terapéuticos como un kit. Por ejemplo, el compuesto terapéutico puede ser un agente anticanceroso. El kit puede incluir componentes opcionales que ayudan a la administración de la dosis unitaria a los pacientes, tales como frascos para reconstituir formas en polvo, jeringas para inyección, sistemas de suministro IV a medida, inhaladores, etc. Adicionalmente, el kit de dosis unitaria puede contener instrucciones para la preparación y administración de las composiciones. El kit puede fabricarse como una dosis unitaria para uso único para un paciente, múltiples usos para un paciente particular (a una dosis constante o en la cual los compuestos individuales pueden variar en potencia a medida que progresa la terapia); o el kit puede contener múltiples dosis adecuadas para la administración a múltiples pacientes ("envase a granel"). Los componentes del kit pueden estar integrados en cartones, envases de tipo blíster, frascos, tubos y similares.
Ejemplos
Ejemplo 1: Producción de variantes anti-VEGF (Bevacizumab)
Las regiones Fv de IgG1 anti-VEGF de tipo silvestre (Bevacizumab) pesada y ligera, se clonaron por separado en dos plásmidos de transfección transitoria basados en pRK que contienen dominios constantes de IgG1 humana. La mutagénesis dirigida a sitio basada en Kunkel se utilizó, a continuación, para generar todas las variantes de IgG1 anti-VEGF en las que mutaron los dominios CH2 y CH3. Las variantes de anti-VEGF generadas en este estudio se resumen en la Tabla 2 más adelante. Cada variante contiene mutaciones simples, dobles o triples en los dominios CH2 y CH3. Las variantes se enumeran de acuerdo con el índice EU como en Kabat.
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Los plásmidos que contienen la cadena ligera silvestre y cadena pesada de las variantes se cotransfectaron en la línea celular 293 de riñón embrionario humano transformado con adenovirus mediante FUGENE® (Roche, Basilea, Suiza) de acuerdo con el protocolo de fabricación. Tras 24 horas de incubación con los complejos de transfección, a continuación, las células transfectadas se cultivaron con medio PSO4 libre de suero suplementado con 10 mg/l de insulina y oligoelementos durante 5 días o 1,3X de medio GEM N con glutamina 5 mM. Se recolectó el sobrenadante y se acondicionó con 1M TRIS pH 8,0 y 5M cloruro de sodio (NaCI) para obtener una concentración final de TRIS 30 mM y NaCI 50mM. A continuación, el sobrenadante acondicionado se purificó utilizando cromatografía de Proteína A. La IgG1 unida se eluyó de la columna de Proteína A con tampón de glicina 0,1M pH 3,0. A continuación, la IgG1 purificada se concentró y se inyectó en una columna de cromatografía de exclusión por tamaños Superdex-200 para eliminar cualquier agregado. Las fracciones de IgG1 monoméricas se agruparon y se utilizaron posteriormente para los estudios de unión. Las concentraciones de IgG1 variantes anti-VEGF y anti-VEGF de tipo silvestre se calcularon utilizando la lectura de absorbancia a 280 nM y se estimó una absorbencia de 1,5 para 1 mg/ml de lgG-i.
Ejemplo 2: Producción de FcRn humano y de mono cinomolqo
El FcRn humano es un heterodímero de una cadena alfa y una subunidad de p2-microglobulina. Estas dos subunidades se clonaron por separado en dos plásmidos de transfección transitoria basados en pRK. Los plásmidos que contienen tanto la cadena alfa como la p2-microglobulina se cotransfectaron en 293 células usando FUGENE® (Roche, Basilea, Suiza) de acuerdo con el protocolo de fabricación. Tras 24 horas de incubación con los complejos de transfección, a continuación, la célula transfectada se cambió a medio PSO4 libre de suero suplementado con 10 mg/l de insulina y oligoelementos durante 5 días. El sobrenadante recogido se filtró y se acondicionó con ácido clorhídrico 1M y NaCI 5M para obtener un pH final de 6,0 y una concentración de NaCI 50 mM. El sobrenadante acondicionado se purificó usando cromatografía de IgG-sefarosa. El FcRn unido se eluyó de la columna usando un tampón de pH 8,0 que contenía TRIS 30 mM y NaCI 150 mM. El FcRn eludido se purificó adicionalmente utilizando una columna de cromatografía de exclusión por tamaño Superdex-75 para eliminar cualquier agregado. La concentración de FcRn se calculó utilizando absorbancia de lectura a 280 nM y una absorbancia de 1,9 correspondió a 1 mg/ml de FcRn. El FcRn de mono cinomolgo se produjo y purificó análogamente al FcRn humano, salvo que se utilizaron plásmidos que contienen la cadena alfa de cino y la p2-microglobulina de cino para la transfección.
Ejemplo 3: Estudios de unión a FcRn: Inyección de variantes de IgG1 en FcRn
La unión de variantes anti-VEGF contra FcRn humano se estudió mediante resonancia de plasmón superficial usando un instrumento BIAcore 3000 (GE healthcare, Piscataway, Nueva Jersey). El FcRn humano se acopló al chip sensor usando un kit de acoplamiento de amina. Específicamente, el chip sensor CM5 se activó con EDC/NHS durante 7min a 5 pl/min. Se inyectaron 100 pg/ml de FcRn humano durante 3o s a 2 min en un caudal de 10 pl/min en un chip activado para dar una unidad de respuesta (UR; en inglés, RU) de unión máxima de 50 a 200. Tras la conjugación, el chip acoplado a FcRn se bloqueó mediante una inyección de 35 pl de clorhidrato de etanolamina 1M a 5 pl/min.
Se determinó la unión de las variantes anti-VEGF de tipo silvestre (TS; en inglés, WT) y anti-VEGF a FcRn humano a pH 6,0 o pH 7,4. El tampón de ejecución para el experimento de unión es PBS pH 6,0 o pH 7,4 que contiene P20 al 0,01 % y azida de sodio al 0,02 %. Las variantes anti-VEGF (Bevacizumab) TS y anti-VEGF se intercambiaron por tampón en tampón de ejecución de pH 6,0 o pH 7,4. Todos los experimentos se realizaron a 25 °C. Para la ejecución de pH 6,0, las variantes, con concentraciones que varían entre 15 pM y 0,7 nM, fluyeron sobre un chip cubierto de FcRn a 30 pl/min durante varias veces para lograr un estado estacionario y a continuación, se permitió que se disociaran del chip durante 5 min. Para la ejecución de pH 7,4, las variantes, con concentraciones que varían entre 30 pM y 30 nM, se inyectaron en el chip cubierto de FcRn a 20 pl/min durante varias veces para alcanzar un estado estacionario y a continuación, se liberaron durante 2 min. Las variantes también fluyeron sobre una mancha no conjugada sobre el chip sensor para permitir la sustracción de la unión no específica de fondo a partir de la unión al chip acoplado a FcRn. El chip se regeneró con pulsos de 30 s de TRIS 0,1M pH 8,3 entre inyecciones. La UR de estado estacionario para cada inyección se registró al final de cada fase de inyección y se estimaron las constantes de disociación aparentes (Kd aparente) como las concentraciones de IgG que lograron un 50 % de la UR máxima.
Los resultados en la Figura 1A y 1B, generados a partir de dos ejecuciones diferentes, muestran que todas las variantes tienen afinidad de FcRn mejorada sobre el tipo silvestre a pH de 6. Las estimaciones de las constantes de disociación aparentes (Kd) se muestran en la Figura 2. Como la densidad de acoplamiento de FcRn difirió para las dos ejecuciones, el nivel de avidez fue diferente, lo que generó valores Kd aparentes ligeramente diferentes para la misma variante. Sin embargo, la clasificación de afinidad de estas variantes permaneció igual para las diferentes ejecuciones. La Figura 3 muestra que todas las variantes de anti-VEGF analizadas mostraron mayor unión a pH neutro al FcRn humano en comparación con el tipo silvestre. La clasificación de afinidad de las variantes basado en la unión a pH 7,4 se correspondió con la clasificación de afinidad determinada usando la unión a pH 6.
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La unión de FcRn de cino y de humano de las variantes de anti-VEGF de tipo silvestre (TS) y anti-VEGF mostrada en la Tabla 3 se evaluó adicionalmente utilizando este formato de ensayo. Con el FcRn de cino y humano se revistieron chips sensores. Las variantes de anti-VEGF de tipo silvestre y anti-VEGF se inyectaron en los chips revestidos de FcRn a 25 °C en tampón pH 6,0 o en tampón pH 7,4. Las unidades de respuesta del estado estacionario se registraron y representaron en función de las concentraciones de las inyecciones. Todas las variantes de anti-VEGF mostraron una unión mejorada a FcRn de cino y humano sobre el anti-VEGF de tipo silvestre a pH 6,0 y a pH 7,4 (véase la Fig.
4A-4D). La clasificación de afinidad para las variantes de anti-VEGF determinada en este ensayo fue la misma que la clasificación determinada usando la Kd monovalente.
La unión a FcRn humano de las variantes de anti-HER2 de tipo silvestre (TS) y anti-HER2 mostradas en la Figura 26 también se evaluaron usando este formato de ensayo. Las variantes estudiadas en la Figura 26 son L251A, L314A, L314D, L314K, E430A, E430K, L251D/N434H y L314D/N434H. Con FcRn humano se revistieron chips sensores. Las variantes de anti-HER2 de tipo silvestre y anti-HER2 se inyectaron en los chips revestidos con FcRn a 25 °C en tampones con pH que varía de 6,0 a 7,2. Las unidades de respuesta del estado estacionario se registraron y representaron en función de las concentraciones de las inyecciones para cada pH. Las afinidades del tipo silvestre y de cada variante se estimaron a continuación para cada pH de inyección y la proporción de afinidad de la variante con respecto al tipo silvestre se representó en función del pH en la Figura 26. Las proporciones de afinidad para las variantes E430A, E430K y L251 D/N434H disminuyen con pH creciente; si bien las proporciones de afinidad para todas las otras variantes aumentan con pH creciente.
Las uniones del tipo silvestre de IgG1 anti-HER2 (traztuzumab), variante T307Q/N434A, variante L251 D/T307Q/N434H y variante L251 D/T307Q/M428L/N434H/Y436I con FcRn humano a pH 6,0 (Fig. 27A), pH 7,1 (Fig.
27B) y pH 7,4 (Fig. 27C) se evaluaron también usando un formato de ensayo similar. Las variantes de anti-HER2 de tipo silvestre y anti-HER2 se inyectaron en los chips revestidos de FcRn a 25 °C en tampón de pH 6,0, pH 7,1 o pH 7,4. Las unidades de respuesta del estado estacionario se registraron y representaron en función de las concentraciones de las inyecciones para cada variante. Los resultados muestran que a pH 6,0 (Fig. 27A), la variante L251 D/T307Q/N434H tiene afinidad de FcRn similar a la del tipo silvestre y la variante L251 D/T307Q/M428L/N434H/Y436I tiene afinidad de FcRn similar a la variante T307Q/N434A. A pH 7,1 (Fig. 27B), la variante L251D/T307Q/N434H tiene afinidad de FcRn mucho más baja que el tipo silvestre; y la variante L251 D/T307Q/M428L/N434H Y436I tiene afinidad de FcRn similar al silvestre y afinidad de FcRn mucho más baja que la variante T307Q/N434A. A pH 7,4 (Fig. 27C), la variante L251D/T307Q/M428L/N434H/Y436l tiene afinidad de FcRn menor que el tipo silvestre y la variante T307Q/N434A.
Ejemplo 4: Estudios de unión a FcRn: Inyección de FcRn de cino o humano en variantes de IgG1
En el formato de unión que usa un instrumento BIAcore 3000 (GE healthcare, Piscataway, Nueva Jersey), se conjugaron las variantes de anti-VEGF de tipo silvestre (Bevacizumab) y anti-VEGF con diferentes células de flujo del chip sensor usando un kit de acoplamiento de amina. Específicamente, el chip sensor CM5 se activó con EDC/NHS durante 7 min a 5 pl/min. Se inyectaron 10 a 50 pg/ml de anticuerpos durante 30 s a 2 min en un caudal de 10 pl/min en el chip activado para obtener una unidad de respuesta (UR) de unión máxima de 50 a 200. Tras la conjugación, el chip acoplado a FcRn se bloqueó mediante una inyección de 35 pl de clorhidrato de etanolamina 1M a 5 pl/min.
El tampón para los experimentos de unión fue PBS de pH 6,0/P20 al 0,01 %/azida de sodio al 0,02 % (NaN3). Las diluciones de FcRn humano o de cino solubles de 20 pM a 0,15 nM se inyectaron en un caudal de 30 pl/min durante 10 min en el chip sensor revestido de anticuerpos a 25 °C. Las UR del estado estacionario se registraron al final de la inyección. El chip se regeneró con pulsos de 30 s de TRIS 0,1 M pH 8,5/NaCI 0,15 M. También se inyectó FcRn en una superficie no conjugada para la sustracción de fondo. Los parámetros cinéticos y las constantes de unión de equilibrio monovalente (Kd) se calcularon usando el programa informático BIAevaluation (GE healthcare, Piscataway, Nueva Jersey).
Los resultados en la Figura 5 y Figura 6 muestran que todas las variantes de anti-VEGF tienen una afinidad de FcRn mejorada sobre el tipo silvestre, tanto para el FcRn humano como con el de cino a pH 6,0. Las mejoras en la afinidad se deben tanto a los aumentos en las constantes de velocidad de asociación como a los descensos en las constantes de velocidad de disociación. Globalmente, las mejoras de la afinidad de FcRn de las variantes de anti-VEGF sobre el tipo silvestre utilizando diferentes ensayos de unión se resumen en la Figura 8. La Figura 8 muestra que la variante V308P/N434A tiene la mayor afinidad de FcRn entre las variantes enumeradas en la Tabla 3, seguida por T307Q/E380A/N434S, T307Q/N434S y T307Q/N434A. La variante N434H tiene la menor cantidad de afinidad de FcRn sobre el tipo silvestre.
Ejemplo 5: Velocidades de disociación de las variantes de anti-VEGF y anti-HER2 a diferentes pH
Para medir las velocidades de disociación a varios pH, se inyectaron primero 200 nM a 2 pM de FcRn humano o de cino en célula de flujo conjugada con anticuerpos a 30 pl/min en PBS pH 6,0/P20 al 0,01 %/NaN3 al 0,02 % durante 5 min para alcanzar un estado estacionario. A continuación, se inyectó tampón PBS a pH que varían de 6 a 7,4 a 30 pl/min en la célula de flujo durante 8min para dejar que el complejo se disociara. También se inyectó FcRn en una superficie no conjugada para la sustracción de fondo. Las constantes de velocidad de disociación se determinaron ajustando la fase de disociación del sensograma usando el software BIAevaluation (GE healthcare, Piscataway, Nueva Jersey). Los resultados en la Figura 7 muestran que las koff de las variantes contra tanto el FcRn humano (Fig. 7A) como el FcRn de cino (Fig. 7B) aumentan con pH creciente y que la velocidad de la koff aumenta para cada variante fue similar.
La velocidad de disociación (koff) de la variante de anti-HER2 L251 D/T307Q/M428L/N434H/Y436I contra el FcRn humano a diferentes pH se midió de forma similar. La koff de la variante de anti-HER2 L251D/T307Q/M428L/N434H/Y436I contra el FcRn humano se representó en función del pH en la Figura 28. La koff de las variantes de anti-VEGF T307Q/N434A, T307Q/N434S. T307Q/E380A/N434S y V308P/N434A contra el FcRn humano de la Figura 7 también se representaron en la Figura 28 para su comparación. Los valores de Koff a diferentes pH se ajustaron respecto al pH para cada variante para producir la pendiente de la línea de mejor ajuste (ecuación: log(koff) =pendiente x pH intersección de y). Las pendientes de las variantes de anti-VEGF varían de 0,75 a 0,84; mientras que la pendiente de la variante de anti-HER2 L251D/T307Q/ 428L/N434H/Y436I es de aproximadamente 1,2.
Ejemplo 6: Unión contra VEGF humano
Se conjugó una forma recombinante de VEGF-A109 sobre un chip CM5 usando un kit de acoplamiento de amina. Específicamente, el chip sensor CM5 se activó con EDC/NHS durante 7 min a 5 pl/min. Se inyectaron 1 a 2 pg/ml de VEGF-A109 durante 30 s en un caudal de 10 pl/min sobre el chip activado para obtener una unidad de respuesta (UR) de unión máxima de 100 a 400. Tras la conjugación, el chip acoplado a FcRn se bloqueó mediante una inyección de 35 pl de clorhidrato de etanolamina 1M a 5 pl/min. Las diluciones dos veces de anticuerpos de 100 nM a 6 nM se inyectaron en el chip conjugado con VEGF durante 4 min en PBS/Tween al 0,05%/NaN3 al 0,02% a 37 °C. Los complejos se dejaron disociar durante 18 min. El chip se regeneró con pulsos de 30 s de ácido clorhídrico 20 mM. También se inyectaron anticuerpos en una superficie no conjugada para la sustracción de fondo. Los resultados en la Figura 9 muestran que las mutaciones de Fc no alteran la unión a VEGF y que todas las variantes tienen la misma respuesta de unión que el tipo silvestre.
Ejemplo 7: Inhibición in-vitro de la proliferación celular
Se preincubaron varias concentraciones de variantes de anti-VEGF de tipo silvestre (bevacizumab) y anti-VEGF con VEGF humano recombinante a temperatura ambiente durante 1 h. Las concentraciones de las variantes de anti-VEGF de tipo silvestre (bevacizumab) y anti-VEGF variaron de 33 nM a 0,05 nM. La concentración de VEGF humano recombinante fue de 0,26 nM. A continuación, los complejos se presentaron a las células endoteliales vasculares umbilicales humanas (HUVEC) en cultivo a 37 °C y CO2 al 5 %. La viabilidad de las HUVEC (del inglés, Human umbilical vascular endothelial cells) tras 4 días de cultivo se evaluó mediante la incubación de las células con un 20% de colorante ALAMAR BLUE® (Trek Diagnostic Systems, Cleveland, Ohio) durante 6 h a 37 °C y CO2 al 5%. A continuación, se detectó la fluorescencia de ALAMAR BLUE® con un lector de microplacas de Molecular Devices (Sunnyvale, California). Como se muestra en la Figura 10, todas las variantes tienen el mismo nivel de inhibición de la proliferación que el tipo silvestre y AVASTIN®, de nuevo confirmando que las mutaciones de Fc no afectan a la capacidad de la variante para neutralizar el VEGF.
Ejemplo 8: Estudios farmacocinéticos en monos cinomolgos
Treinta y cinco machos y treinta y seis hembras de monos cinomolgos machos, de peso 2 - 5 kg y de 2 a 7 años en el examen físico pre-estudio, se asignaron a seis grupos de tratamiento, cada uno consistiendo en seis machos y seis hembras. Se asignó a los animales a los grupos de tratamiento usando un procedimiento de bloqueo computarizado diseñado para lograr un equilibrio en el peso corporal con respecto a los grupos de tratamiento. Solamente los animales que parecían estar sanos y libres de anomalías obvias se utilizaron en el estudio. Todos los animales recibieron una dosis de bolo intravenoso única por vena safenosa, seguido de un lavado de solución salina al 0,9 % el día 1. El nivel de dosis para todos los grupos fue de 5 mg/kg. Las muestras sanguíneas (aproximadamente 1,0 ml) de la vena femoral se recogieron antes y tras las dosis a 0,5, 2, 4, 8 horas, 1, 2, 4, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56 y 70 días. Las curvas de concentración de suero-tiempo para todos los grupos se formaron usando la concentración de suero media de n=11 a 12 animales por grupo. Las muestras de suero recogidas en este experimento se analizaron usando un protocolo ELISA descrito en el Ejemplo 9.
Ejemplo 9: Detección de concentración de anticuerpos en suero de monos cinomolgos mediante ELISA
Las placas de ELISA de Maxisorp (Thermo Fisher Scientific, Rochester, Nueva York) se revistieron con 0,5 pg/ml de VEGF humano recombinante en tampón de carbonato 50 mM, pH 9,6, a 4 °C durante la noche. Las placas se bloquearon con PBS, BSA al 0,5 %, Proclina 10 ppm, pH 7,2 durante 1 h a temperatura ambiente y a continuación, se lavaron con tampón de lavado (PBS/Tween 20 al 0,05%/pH 7,2). Los estándares diluidas en series de dos veces (IgG1 anti-VEGF de tipo silvestre (Bevacizumab)) así como las muestras de suero de cino diluidas en series de 3 veces (comenzando a 1:10) en tampón de PBS que contiene albúmina de suero bovino al 0,5 %, Tween 20 al 0,05 %, EDTA 5 mM pH 8,0, CHAPS al 0,25 %, gamma globulina bovina al 0,2%, Proclina 10 ppm y NaCI 0,35M se añadieron a las placas bloqueadas y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación. Las placas se lavaron 6 veces y el fármaco unido fue detectado con anti-IgG humana de oveja (Fc específico)-HRP (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pensilvania) diluida 1:10K en un tampón de ensayo (PBS, pH 7,4, BSA al 0,5%, Tween 20 al 0,05 %, Proclina 10 ppm) durante 1 h a temperatura ambiente con agitación. A continuación, las placas se lavaron de nuevo 6 veces, seguido por la adición de sustrato de benzidina de tetrametilo (Moss, Pasadena, Maryland) para el desarrollo de color. La reacción se detuvo tras 20 minutos por adición de ácido fosfórico 1 M (H3PO4). Las placas se leyeron en un lector de microplacas Molecular Devices a una longitud de onda de 450-620 nm. Los perfiles séricos del tipo silvestre y de cinco variantes de anti-VEGF en monos cinomolgos tras una dosis IV simple de 5 mg/kg se muestran en la Figura 11. Las cinco variantes mostraron aclaramiento reducido y semivida prolongada en comparación con el tipo silvestre.
Ejemplo 10: Análisis de datos farmacocinéticos
Los parámetros PK (farmacocinéticos) se estimaron usando WinNonLin- Enterprise, versión 5.1.1 (Pharsight Corporation; Mountain View, California). Un modelo de dos compartimentos con entrada de bolo IV, eliminación de primer orden y constantes de microvelocidades (Modelo 7), se utilizó para describir los datos observados. Las concentraciones se ponderaron utilizando reponderación iterativa (predicho a potencia n=-1) y el algoritmo de minimización de Gauss-Newton con modificación de Levenberg y Hartley. Los siguientes parámetros PK se indicaron utilizando un WinNonLin Modelo 7: AUC» = exposición al fármaco total definida como el área bajo la curva de concentración-tiempo extrapolada hacia infinito; fi/2,a = semivida de la fase alfa (semivida alfa); fi/2, p = semivida de la fase beta (semivida beta); Cmáx= concentración máxima observada; CL = aclaramiento; V1 = volumen del compartimento central; Vss= Volumen de distribución en estado estacionario.
Para todos los grupos de dosis, la selección del modelo se basó en la bondad del ajuste mediante inspección visual del perfil de concentración sérica predicho frente al observado para cada animal, examen de la suma de cuadrados de los residuos ponderados y examen del error estándar y el coeficiente de variación para cada parámetro. Los parámetros PK se presentaron como la media ± desviación típica (DT) de cada grupo.
La Figura 12 muestra los parámetros farmacocinéticos tabulados para el anti-VEGF de tipo silvestre y las cinco variantes, N434H, T307Q/N434A, T307Q/N434S, T307Q/E380A/N434S y V308P/N434A, tras una sola dosis IV de 5 mg/kg a monos cinomolgos. Las semividas p (terminal) de las variantes son aproximadamente 1,6- a 2,2 veces más largas que la semivida del tipo silvestre, siendo la variante T307Q/N434A la que tiene la semivida más larga, de 24,9 días. Según el conocimiento de los inventores, la semivida de la variante T307Q/434A, aproximadamente 25 días, representa la semivida más larga de una IgG humana en mono cinomolgo informada hasta el momento.
La relación entre la semivida y la afinidad de FcRn se muestra en la Figura 13. El aumento modesto en los resultados de afinidad de FcRn pH 6.0 da como resultado una semivida terminal prolongada, como se evidencia por las variantes N434H y T307Q/n 434A. Sin embargo, el aumento adicional en la afinidad de FcRn pH 6,0 (T307Q/N434S, T307Q/E380A/N434A y V308P/N434A) no mejora adicionalmente la semivida, dado que una velocidad de disociación más lenta y una afinidad aumentada a pH neutro pueden compensar el beneficio producido a partir del aumento de afinidad a pH ácido. En cambio, existe una tendencia hacia la semivida reducida en afinidades altas de FcRn a pH 6,0.
Ejemplo 11: Estudios farmacocinéticos en ratones transgénicos
La cepa de ratones utilizada en el estudio es Mu.VEGFhuX.KI.R1.B6.129. Los ratones MuVEGFhuMUTX (+/+) knockin, rAG2 (-/-) knock-out contienen dos alelos de formas humanizadas de VEGF, que se pueden neutralizar por el anticuerpo anti-VEGF de tipo silvestre (Bevacizumab). Los ratones RAG2 (-/-) son inmunodeficientes y no generan linfocitos T y B funcionales. Los tumores humanos se pueden cultivar en estos ratones, que expresan formas humanizadas de VEGF en ausencia de una respuesta inmune manifiesta hacia las células tumorales. Por tanto, el VEGF derivado del tumor humano y células estromales de ratón se neutralizará por el anticuerpo anti-VEGF de tipo silvestre (Bevacizumab), que no neutraliza el VEGF murino. La PK del tipo silvestre de anti-VEGF y la variante de anti-VEGF T307Q/N434A se evaluaron en estos ratones transgénicos que no portan tumores.
Se realizaron dos estudios PK diferentes. El primer estudio es un estudio PK de dosis única. Hay 4 grupos con 8-9 animales por grupo, cada uno de ellos recibe una dosis única intravenosa de 0,3 o 5 mg/kg del tipo silvestre y de variante T307Q/N434A en PBS. El volumen de dosis a ser administrada varió de 5 a 15 ml/kg dependiendo de la concentración de la solución de dosificación y el peso de cada animal. La dosificación IV se realizó por medio de la vena de la cola. Las muestras de 3 ratones se sangraron en cada punto temporal y se recogieron aproximadamente 125uL de muestras de sangre para los análisis PK en 15 minutos, 8 horas, 24 horas, 2, 4, 7, 10, 14, 21 y 28 días tras la dosis. Las muestras de sangre se recogieron bajo anestesia por el seno periorbital. En los puntos temporales del saco, los ratones se sangraron por punción cardíaca bajo anestesia de isoflurano.
El segundo estudio es un estudio PK de dosis múltiples. Existen 9 animales por grupo. Cada animal recibió 0,3 o 5 mg/kg de variante T307Q/N434A en PBS en los días 0, 3, 6 y 9. Los métodos de inyección y recolección de muestras fueron similares al estudio PK de dosis única. Sin embargo, las muestras de sangre se recogieron 15 min después de la primera dosis, día 3 (antes de la dosis), día 6 (antes de la dosis), día 9 (antes de la dosis), 15 min tras la dosis del día 9, día 11, día 14, día 21, día 28 y día 35.
Las muestras de suero recogidas de los estudios PK se analizaron utilizando ELISA como se describió en el Ejemplo 13. Las Figuras 14A y 14B muestran los perfiles farmacocinéticos del tipo silvestre y variante T307Q/N434A determinados usando ya sea ELISA de captura de VEGF (Fig. 14A) o de captura de Fc humano (Fig. 14B), respectivamente. La variante T307Q/N434A tiene perfiles PK similares son de tipo silvestre tras una dosis IV única de 0,3 o 5 mg/kg. La Figura 15 confirma que las semividas del tipo silvestre y variante de T307Q/N434A en ratones transgénicos son comparables. Sin embargo, se observaron respuestas PK no lineales, dado que los anticuerpos dosificados a 0,3 mg/kg tienen semividas más cortas que los dosificados a 5 mg/kg, posiblemente debido al aclaramiento dependiente de antígeno. La Figura 16 muestra los perfiles farmacocinéticos de la variante T307Q/N434A en ratones transgénicos de VEGF humanizado tras una dosis múltiple de 0,3 o 5 mg/kg y los parámetros PK se resumen en la Figura 17. Los resultados muestran que las concentraciones de suero medidas experimentalmente se correspondieron bien con las concentraciones predichas por una simulación usando los parámetros PK de dosis única.
Ejemplo 12: Estudios de eficacia in vivo
Las células HT-55 humanas, Colo-205 (carcinoma colorrectal) y Calu-6 (carcinoma de pulmón) se obtuvieron de American Type Culture Collection (Manassas, Virginia). La línea celular HM-7 de carcinoma colorrectal humano es un derivado de Ls 174T. Las células Calu-6 y HM-7 se cultivaron en medio F12 de Ham, DMEM de baja glucosa 1:1. Las células Colo-205 y HT-55 se cultivaron en medio RPMI 1640. Ambos medios se complementaron con FBS 10% v/v, penicilina/estreptomicina 1 % v/v (Invitrogen, Carlsbad, California), L-glutamina 2 mM (Invitrogen, Carlsbad, California) y 1 |jg/ml FUNGIZONE™ (Invitrogen, Carlsbad, California). Se cultivaron las células a 37 °C en CO2 al 5 % hasta confluirse, se cosecharon y resuspendieron en Matrigel estéril a 50 x 106 células por ml. Los xenoinjertos se establecieron en ratones doble homocigotos RAG2 KO de 6 - 8 semanas de vida; ratones doble homocigotos KI VEGF hum-X (Genentech, South San Francisco, California) por inyección s.c. dorsal de 5 x106 células por ratón y se permitió que crecieran. El tratamiento con anticuerpo i.p. en la dosis de 5, 0,5 y 0,05 mg/kg dos veces por semana se inició 24 h tras inoculación de células tumorales. Los tumores transplantados se midieron dos veces por semana en el eje más largo y el eje perpendicular, como se describe. Para cada día en los que se midieron tumores, se calculó el volumen del tumor para cada ratón y los volúmenes medios de los tumores del grupo de anticuerpos de control (antiambrosía) y cada grupo anti-VEGF se compararon mediante la prueba t de Student, a un nivel de p < 0,05. Los animales se sacrificaron cuando el volumen del tumor alcanzó 2.000 mm3.
Los resultados de los primeros estudios de los xenoinjertos HM-7 se ilustran en la Figura 18. Las Figuras 18A y 18B muestran que la variante T307Q/N434A pudo lograr la máxima inhibición del crecimiento tumoral en grupos de tratamiento tanto de 0,5 mg/kg como de 5 mg/kg. Aunque el tipo silvestre no inhibió el crecimiento tumoral en ambas dosis, no logró la máxima inhibición de crecimiento tumoral en 0,5 mg/kg. Estos resultados sugieren que la variante T307Q/N434A es más eficaz que el tipo silvestre a 0,5 mg/kg para tratar xenoinjertos HM-7, a pesar de los niveles similares de concentración de IgG sérica (Fig. 18C). Un estudio de eficacia de repetición de xenoinjertos HM-7 mostrado en la Figura 19 confirma que la variante T307Q/N434A es más eficaz que el tipo silvestre en grupos de tratamiento de 0,5 y de 0,05 mg/kg. De hecho, la variante T307Q/N434A mostró mayor inhibición del crecimiento tumoral en todos los grupos de tratamiento comparados con el tipo silvestre (Fig. 19A y 19B). La eficacia aumentada puede deberse a la concentración superior de anticuerpos normalizados en sangre en tumores para el grupo tratado T307Q/N434A en comparación con el tipo silvestre (Fig. 19E). El tercer estudio de eficacia de xenoinjertos HM-7 mostrado en la Figura 20 valida adicionalmente la eficacia superior de T307Q/N434A sobre el tipo silvestre a 0,5 y 0,05 mg/kg de los grupos de tratamiento.
Para el estudio de xenoinjertos HT-55, la variante T307Q/N434A mostró mayor inhibición de crecimiento tumoral en comparación con el tipo silvestre en 0,05 mg/kg de los grupos de tratamiento (Fig. 21), lo que sugirió que la T307Q/N434A es más eficaz que el tipo silvestre en grupos de tratamiento de 0,05 mg/kg. Para el estudio de Colo-205, la Figura 22B muestra una diferencia significativa en las curvas de crecimiento entre el tipo silvestre de 0,5 mg/kg y la variante T307Q/N434A de 0,5 mg/kg. Las Figuras 22A y 22B también muestran un aumento en la inhibición del crecimiento tumoral por T307Q/N434A en los grupos de tratamiento de 0,5 y 0,05 mg/kg, lo que sugiere una eficacia ligeramente superior para la T307Q/N434A en los grupos de 0,5 y 0,05 mg/kg. Un estudio de Colo-205 de repetición ilustrado en la Figura 23 indica que la T307Q/N434A es ligeramente más eficaz que el tipo silvestre para tratar xenoinjertos de Colo-205. Finalmente, las eficacias de la variante T307Q/N434A y del tipo silvestre en el estudio de xenoinjertos de Calu-6 fueron similares.
Pueden existir varias razones posibles para la eficacia aumentada de las variantes Fc. Por ejemplo, la potencia aumentada de una variante podría deberse a la retención y/o reciclado aumentados del anticuerpo variante mediado por el FcRn humano expresado en ciertos tumores (por ejemplo, HM-7). Esto puede generar un efecto masa-acción aumentado de bloqueo del VEGF producido localmente o puede proporcionar un mecanismo para la degradación potenciada del VEGF en el tumor. Sin embargo, los presentes inventores encontraron que la concentración de variante aumentada detectada en los tumores HM-7 relativa a los tumores de HT-55 y de Calu-6 no se correlaciona directamente con el nivel de expresión de FcRn celular, dado que las células HM-7 expresan cantidades menores de FcRn que las células HT-55 o las células Calu-6 (Figura 25). Otros factores en el microambiente tumoral tal como el pH del tumor, velocidad de crecimiento y otros constituyentes tumorales, pueden jugar también papeles de colaboración con el FcRn en la determinación de la distribución de las IgG. Por ejemplo, el microambiente del tumor es mayormente ácido, con un pH que varía de 6,0 a 7,6 (media=7,1), mientras que el de los tejidos normales varía de 7,3 a 7,8 (media=7,55), véase Song, C.W. et al., "Influence of Tumor pH on Therapeutic Response " in Cancer Drug Resistance, 21-42 (2007). Adicionalmente, los diferentes tipos de tumores pueden tener un amplio intervalo de pH debido al suministro vascular heterogéneo y la perfusión sanguínea, véase Song, C.W. et al., Cancer Drug Resistance, 21-42 (2007); anteriormente citado; Gillies, R.J. et al., J Magn Reson Imaging 16, 430-450 (2002). Los estudios in-vitro múltiples indican que la cantidad de Fc/lgG asociados a células aumenta cuando las células se incuban a pH ácido, véase Praetor, A. et al., Journal of cell science 112 (Pt 14), 2291-2299 (1999); McCarthy, K.M., Yoong, Y. y Simister, N. E. Bidirectional transcytosis of IgG by the rat neonatal Fc receptor expressed in a rat kidney cell line: a system to study protein transport across epithelia. Journal of cell science 113 (Pt 7), 1277-1285 (2000); Tesar, D.B. et al., Traffic 7, 1127-1142 (2006). Por tanto, es concebible que las diferencias en el pH entre las líneas tumorales evaluadas puedan afectar al nivel de acumulación del anticuerpo en cada tumor. Adicionalmente, el microambiente del tumor ácido también activa la expresión del VEGF (véase, Song, C.W. et al., Cancer Drug Resistance, 21-42 (2007), anteriormente citado), que podría mediar la retención de estos anticuerpos anti-VEGF específicamente. Adicionalmente, los tumores de HM-7 en ratones mostraron previamente que tenían un estroma escaso (véase Liang, W. C. et al., J Biol Chem 281, 951-961 (2006)), mientras que los tumores de Calu-6 indujeron una respuesta estromal hospedadora más fuerte y fueron relativamente ricos en estroma (véase Tejada, M. L. et al., Clin Cancer Res 12, 2676-2688 (2006)). La presencia de las células estromales de ratón, que expresan FcRn murino, pueden enmascarar el reciclaje mejorado de una variante de IgG por células tumorales humanas. Esto puede conducir al efecto de concentración menor en xenoinjertos humanos que tienen un componente mayor de estroma murino, por ejemplo, Calu-6.
Ejemplo 13: Detección de concentraciones de anticuerpos en sueros y tumores de ratones transgénicos mediante ELISA
Se utilizaron dos formatos de ensayos de ELISA diferentes con dos reactivos de captura de anticuerpos diferentes (VEGF o Fc de anti-IgG1 humana) revestidos en placas para detectar concentraciones de anticuerpos en ratones transgénicos. Las placas de ELISA de Maxisorp (Thermo Fisher Scientific, Rochester, Nueva York) se cubrieron con O, 5 |jg/ml de VEGF recombinante humano o bien con 0,25 jg/m l (Fab'2) de Fc de anti-IgG1 humana de conejo (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pensilvania) en tampón de carbonato 50 mM, pH 9,6, a 4 °C durante la noche. Las placas se bloquearon con PBS, BSA al 0,5%, Proclina 10 ppm, pH 7,2 durante 1 h a temperatura ambiente y a continuación, se lavaron con tampón de lavado (PBS/Tween 20 al 0,05%/pH 7,2). Se añadieron estándares diluidos en serie dos veces (Bevacizumab para formato de VEGF o IgG1 humana para formato de Fc) bajando a 12,5 ng/ml así como muestras séricas de cino diluidas en serie de tres veces (comenzando a 1:10) en tampón de PBS con un contenido de albúmina de suero bovino 0,5%, Tween 20 al 0,05 %, EDTA 5 mM pH 8,0, CHAp S al 0,25 %, gamma globulina bovina al 0,2%, Proclina 10 ppm y NaCI 0,35M se añadieron a las placas bloqueadas y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación. Las placas se lavaron 6 veces y el fármaco unido se detectó con conjugado de (Fab'2) anti-IgG de cabra (específica de Fc)-HRP (Jackson) diluido 1:20K a 1:60K en tampón de ensayo (PBS, pH 7,4, BSA al 0,5 %, Tween 20 al 0,05 %, Proclina 10 ppm) durante 1 h a temperatura ambiente con agitación. A continuación, las placas se lavaron de nuevo 6 veces, seguido por la adición de sustrato de benzidina de tetrametilo (Moss, Pasadena, Maryland) para el desarrollo de color. La reacción se detuvo tras 20 minutos por adición de ácido fosfórico 1 M (H3PO4). Las placas se leyeron en un lector de microplacas Molecular Devices a una longitud de onda de 450-620 nm.
Ejemplo 14: Variantes Fc de IgG1 con diversas mejoras de afinidad sobre el tipo silvestre y sus comportamientos farmacocinéticos in-vivo
Las combinaciones adicionales de las mutaciones Fc, mostradas en la Figura 24, se incorporaron en anti-HER2 humano (tratuzumab) para construir variantes de IgG. Las variantes de IgG1 se expresaron utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 1. Las constantes de disociación de la IgG1 anti-HER2 de tipo silvestre y las variantes de IgG1 anti-HER2 se midieron como se describe en el Ejemplo 4 y los resultados se muestran en la Fig. 24. Los resultados muestran que al combinar diferentes mutaciones, podemos construir una variante de IgG tal como M252Y/V308P/N434Y que es capaz de unirse al FcRn humano con afinidad nanomolar de un solo dígito, representando una mejora de aproximadamente 450 veces sobre a la IgG1 de tipo silvestre.
Sin embargo, las variantes de alta afinidad no necesariamente tienen comportamientos farmacocinéticos mejorados in vivo. Por ejemplo, dos mutaciones de Fc, N434A y N434W, se incorporaron en un anticuerpo humano diferente para construir dos variantes de IgG-i. Las dos variantes de IgG-i, variante N434A y variante N434W, generaron una afinidad de FcRn superior de aproximadamente 3 a 40 veces a pH 6,0 en comparación con el anticuerpo silvestre, respectivamente, como se muestra en la Fig.24. Su comportamiento farmacocinético se evaluó en monos cinomolgos, como se describe en los Ejemplos 8 y 9 y se comparó con el del tipo silvestre (aproximadamente 6 a 9 días). La semivida de N434W (aproximadamente 9,7 /-2,4 días) mejoró menos que la de la variante de afinidad modestamente mejorada, N434A (alrededor de 14,5 /-2,2 días). Estos resultados sugieren que demasiado aumento en la afinidad de FcRn puede tener un efecto perjudicial sobre la semivida de una variante de Fc y es difícil predecir a priori si una variante de Fc con afinidad de FcRn mejorada tendrá o no una semivida mejorada.
Ejemplo 15: Inmunoprecipitación de FcRn utilizando una variante de IgG1 de alta afinidad.
Cinco millones de células/cada una de las líneas HM-7, HT-55, Calu-6 Raji (linfoma de linfocitos B) se lisaron mediante la incubación en de tampón fosfato sódico 25 mM pH 6,0 conteniendo Nonidet P-40 al 1%, desoxicolato sódico al 0,5%, SDS al 0,1 %, Ed Ta 2 mM, NaCI 150 mM e de inhibidor de proteasa IX (Pierce, Rockland, Illinois) durante 1 h a 4 °C. Las células lisadas se centrifugaron a 12.000 g durante 30 min a 4 °C y a continuación, se agregó la variante de Fc de trastuzumab M252Y/V308P/N434Y 50 nM (Yeung et al., enviado) al sobrenadante para capturar el FcRn. Tras la incubación durante la noche a 4 °C, se agregó resina Protein-L (Pierce) y se permitió que se uniera al complejo durante 4 h a 4 °C. A continuación, la resina se lavó cinco veces con el tampón de lisis y las proteínas unidas se eluyeron con un tampón de carga 2X (Invitrogen, Carlsbad, California). Las proteínas se separaron en un gel BIS-TRIS (Invitrogen) al 4-12 % y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Invitrogen). La membrana se bloqueó con 3 % de leche desnatada en PBS y se sondeó con 1ng/ml de anticuerpo anti-FcRn humano de conejo (Santa Cruz, California) a temperatura ambiente durante 1 h, a continuación, con conjugado de anti-IgG de conejo-peroxidasa de cabra a 1:104 de dilución (Pierce) durante 1 h a temperatura ambiente. La membrana se lavó con PBS/Tween al 0,05% entre las etapas de bloqueo e incubación de anticuerpos. La proteína de FcRn se visualizó mediante el kit detección de ECL (GE Healthcare, Piscataway, Nueva Jersey). Véase la Figura 25.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se realizaron dos experimentos de unión separados con diferentes variantes de anti-VEGF a cada pH, pH 6,0 y pH 7,4. La unidad de respuesta de unión del estado estacionario (UR) en función de la concentración para pH 6,0 y pH 7,4 se representó en la Figura 1 y la Figura 2 , respectivamente. Las constantes de disociación (Kd) a pH 6,0 se estimaron a partir de la Figura 1 y se resumieron en la Figura 2. Las constantes de disociación de la misma variante calculada a partir de dos ejecuciones diferentes fueron ligeramente diferentes. Por ejemplo, la variante N434A tuvo una Kd de 550 nM en la primera ejecución, pero su Kd de la segunda tanda fue de 250 nM. La diferencia se debió al efecto de avidez en el formato del ensayo que implicó deslizamiento de un anticuerpo bivalente sobre un chip acoplado a FcRn. El nivel de contribución de la avidez a la constante de disociación depende del nivel de FcRn acoplado en los chips, con un mayor nivel de acoplamiento de FcRn que da como resultado más avidez. Esto podría explicar la mayor afinidad observada en la segunda ejecución, que tuvo UR aproximadamente dos veces más altas que la primera ejecución. Aunque hubo un efecto de avidez en la configuración del ensayo, este formato se pareció más al proceso

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Una IgG variante que comprende una región Fc de IgGi humana en donde la variante tiene las siguientes sustituciones relativas a la región Fc de IgG1 humana de tipo silvestre, enumeradas de acuerdo con el índice de EU como en Kabat y tiene una semivida aumentada en comparación con la semivida de dicha IgG que tiene la región Fc de IgG1 humana de tipo silvestre:
la treonina en el aminoácido 307 de la región Fc se sustituye por glutamina y la asparagina en el aminoácido 434 de la región Fc se sustituye por alanina; o
la treonina en el aminoácido 307 de la región Fc se sustituye por glutamina, el ácido glutámico en el aminoácido 380 de la región Fc se sustituye por alanina y la asparagina en el aminoácido 434 de la región Fc se sustituye por serina.
2. La IgG variante de la reivindicación 1, en donde la IgG variante es un anticuerpo anti-VEGF.
3. La IgG variante de las reivindicaciones 1 o 2 que comprende el dominio variable de cadena pesada que comprende el SEQ ID NO: 1 y el dominio variable de cadena ligera que comprende el SEQ ID NO: 2.
4. Una composición farmacéutica que comprende la IgG variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
5. Un kit que comprende la IgG variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en un envase que comprende un puerto de acceso estéril, un vehículo farmacéuticamente aceptable e instrucciones de uso.
6. Una IgG variante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2-4, para utilizar en un método de tratamiento de un tumor en un sujeto, comprendiendo dicho método administrar al sujeto una cantidad eficaz de la IgG variante.
7. Una IgG variante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2-4 para utilizar en un método de inhibición de la actividad de VEGF, en donde la actividad de VEGF es angiogénesis, en un sujeto con una enfermedad o una afección en donde la angiogénesis está implicada, comprendiendo dicho método administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de la IgG variante.
8. Una IgG variante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2-4, para utilizar en un método para inhibir o impedir el crecimiento de células cancerosas en un sujeto, comprendiendo dicho método administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de la IgG variante.
9. Una IgG variante para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en donde el método comprende administrar la IgG variante al sujeto cada 4 semanas o más.
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