KR20220113791A - 이중특이적 항-ccl2 항체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인간 CCL2 상의 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 이중특이적 항-CCL2 항체, 이의 약학적 조성물, 이의 제조, 및 암, 염증성, 자가면역 및 안과 질환들을 치료하기 위한 약제로서의 사용에 관한 것이다.
Description
본 발명은 인간 CCL2 상의 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 이중특이적 항-CCL2 항체, 이의 약학적 조성물, 이의 제조, 및 암, 염증성, 자가면역 및 안과 질환들을 치료하기 위한 약제로서의 사용에 관한 것이다.
CCL2/CCR2 축은 미성숙 골수 세포가 종양으로 동원되는 주요 매개체이다. CCL2는 악성 세포에 의해 과발현되고 세포외 기질(ECM)에 결합하여 화학 유인 물질 구배를 형성한다. 일단 종양에 도달하면, 골수 유래 억제 세포(MDSC)는 항종양 T 세포 반응의 개시를 억제하는 항염증성 사이토카인/수용체를 분비/상향 조절함으로써 전종양 형성 환경에 기여한다. 이러한 방식으로, MDSC는 T 세포 활성화 요법의 효능을 감소시키거나 심지어 손상시킬 수 있다(Meyer et al, 2014). 따라서, 이러한 미성숙 골수 세포의 동원을 특이적으로 억제하면 관문 억제제, T 세포 이중특이적 항체(TCB) 또는 다른 암 면역요법(CIT)의 효능을 높일 수 있다. 또한, CCL2는 혈관신생, 전이 및 종양 성장의 촉진과도 관련이 있으며, 이는 CCL2를 중화하는 것이 여러 방식의 항종양 개입에 기여할 수 있음을 시사한다.
이의 수용체와 대조적으로, CCL2를 표적으로 삼는 것은 Th1 및 NK 세포와 같은 다른 면역 세포 군의 동원에 관여하는 리간드는 상이하지만(예: CCL7, CCL8, CCL13) 동일한 수용체(CCR2)를 통해 신호를 보낼 수 있는 것들을 피하면서 원하지 않는 CCL2 매개 효과를 특이적으로 억제할 것이다.
임상적으로, CCL2는 상이한 염증성 질환들, 예컨대 류마티스 관절염(Haringman et al, Arthritis Rheum. 2006 Aug;54(8):2387-92), 특발성 폐섬유증(Raghu et al, Eur Respir J. 2015 Dec;46(6):1740-50), 당뇨병성 신장병(Menne et al, Nephrol Dial Transplant (2017) 32: 307-315) 및 암(Sandhu et al, Cancer Chemother Pharmacol. 2013 Apr;71(4):1041-50)으로 인해 상승된 수치를 중화시키는 것을 목표로 하는 다양한 연구에서 선호되는 항체 표적이었다. 하지만, 관찰된 높은 생체내 항체-항원 해리 상수(KD)와 함께 이의 높은 합성 속도는 임상적으로 실행 가능한 용량에서 기존 항체에 의한 유리 CCL2 억제를 방해하는 주요 장애물로 입증되었다(Fetterly et al, J Clin Pharmacol. 2013 Oct;53(10):1020-7).
CCL2 중화는 CCL2의 혈청 수준이 상승된 환자에게서 더 분명히 관련이 있는 것으로 보이며, 이는 유방암(BC), 난소암(OvCa), 결장직장암(CRC), 췌장암 및 전립선암과 같은 여러 유형의 암에서 관찰되었다. 하지만, 이러한 혈청학을 나타내지는 않지만 종양이 골수 계통의 면역 세포로 심하게 침윤된 이러한 적응증 내의 환자의 경우라도, 위에서 언급한 바와 같이 종양과 관련하여 CCL2가 수행하는 많은 역할로 인해 이러한 신규 치료법으로부터 많은 도움을 받을 수 있다.
Igawa et al, Immunological Reviews 270 (2016) 132-151은 생성된 항체가 pH 의존적 CDR(산성 엔도솜 내에서 항체-항원 해리를 위해 항원 분해를 유도함) 및 최적화된 등전점(pI) 및 FcγRIIb에 대한 향상된 결합(면역 복합체의 세포 흡수를 촉진함)을 갖는 조작된 Fc 모이어티, 및 신생아 Fc 수용체에 대한 적당한 친화도를 보유함으로써 허용가능한 약동학적 프로필을 유지하는 스위핑(Sweeping) 기술을 기술한다.
본 발명은 인간 CCL2 상의 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 이중특이적 항-CCL2 항체, 이의 약학적 조성물, 이의 제조, 및 암, 염증성, 자가면역 및 안과 질환들을 치료하기 위한 약제로서의 사용에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 상이한 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 상이한 제2 항원 결합 부위를 포함하고, 인간 IgG 동형의 Fc 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체이다.
본 발명의 일 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 상이한 제2 항원 결합 부위를 포함하는, 이중특이적 항체로서,
A) i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
(d) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
B) i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
C) i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
D) i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
E) i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
F) i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
G) i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
H) i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
I) i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체이다.
일 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 인간 IgG 동형의 Fc 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 인간 IgG1 동형의 Fc 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 인간 IgG 동형의 불변 중쇄 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 인간 IgG1 동형의 불변 중쇄 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 20 mg/kg의 각 이중특이적 항체 및 0.1 mg/kg의 인간 CCL2로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 10 ml/kg의 단일 용량으로 FcRn 형질전환 마우스에 투여할 때, 인간 야생형 IgG1 동형의 불변 중쇄 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함하는 이중특이적 항체를 투여한 후 인간 CCL2에 대한 생체내 제거율(ml/day/kg)은 돌연변이 L234A, L235A, P329G(카바트(Kabat) EU 넘버링)를 포함하는 인간 IgG1 동형의 Fc 감마 수용체 침묵형 불변 중쇄 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함하는 이중특이적 항체를 투여한 후 인간 CCL2에 대한 생체내 제거율(ml/day/kg)에 비해 2배 이상(일 구현예에서 5배 이상, 일 구현예에서 10배 이상, 일 구현예에서 20배 이상) 높다.
본 발명의 일 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서,
i) 상기 제1 항원 결합 부위는 CCL2 상의 동일한 에피토프에 항체로서 결합하고, 상기 항체는,
서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하며, (a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 CCL2 상의 동일한 에피토프에 항체로서 결합하고, 상기 항체는,
서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하며, (a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체이다.
일 구현예에서, 20 mg/kg의 각 이중특이적 항체 및 0.1 mg/kg의 인간 CCL2로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 10 ml/kg의 단일 용량으로 FcRn 형질전환 마우스에 투여할 때, 인간 야생형 IgG1 동형의 불변 중쇄 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함하는 이중특이적 항체를 투여한 후 인간 CCL2에 대한 생체내 제거율(ml/day/kg)은 돌연변이 L234A, L235A, P329G(카바트 EU 넘버링)를 포함하는 인간 IgG1 동형의 Fc 감마 수용체 침묵형 불변 중쇄 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함하는 이중특이적 항체를 투여한 후 인간 CCL2에 대한 생체내 제거율(ml/day/kg)에 비해 15배 이상, 특히 20배 이상 높다.
본 발명의 일 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서,
i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
(d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고;
그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
(d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.
본 발명의 일 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서,
i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3, (d) 서열번호 63의 아미노산 서열 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTF를 포함하는 FR-H1, (e) 서열번호 64의 아미노산 서열 WVRQAPGQGLEWMG를 포함하는 FR-H2, (f) 서열번호 65의 아미노산 서열 RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVY YCAR을 포함하는 FR-H3, 및 (g) 서열번호 66의 아미노산 서열 WGQGTLVTVSS를 포함하는 FR-H4를 포함하는 VH 도메인; 및
(h) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (i) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (j) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3, (k) 서열번호 67의 아미노산 서열 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC를 포함하는 FR-H1, (l) 서열번호 68의 아미노산 서열 WYQQKPGQAPRLLIY를 포함하는 FR-H2, (m) 서열번호 69의 아미노산 서열 GVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC를 포함하는 FR-L3, 및 (n) 서열번호 70의 아미노산 서열 GQGTKVEIK를 포함하는 FR-H4를 포함하는 VL 도메인을 포함하고;
그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3, (d) 서열번호 82의 아미노산 서열 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGLTIS를 포함하는 FR-H1, (e) 서열번호 83의 아미노산 서열 WVRQAPGQGLEWMG를 포함하는 FR-H2, 및 (f) 서열번호 84의 아미노산 서열 RVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR을 포함하는 FR-H3, 및 (g) 서열번호 85의 아미노산 서열 WGQGTTVTVSS를 포함하는 FR-H4를 포함하는 VH 도메인; 및
(h) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (i) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (j) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3, (k) 서열번호 86의 아미노산 서열 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC를 포함하는 FR-L1, (l) 서열번호 87의 아미노산 서열 WYQQKPGKAPKLLIH를 포함하는 FR-L2, (m) 서열번호 88의 아미노산 서열 GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYC를 포함하는 FR-L3, 및 (n) 서열번호 89의 아미노산 서열 FGGGTKVEIK를 포함하는 FR-H4를 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.
본 발명의 일 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서,
A) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
B) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
C) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
D) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
E) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
F) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
G) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
H) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
I) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
J) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
K) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
L) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
M) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
N) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
O) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
P) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.
본 발명의 일 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서,
A) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V이고, X2는 P이며, X3은 H인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F이고 X2는 R인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
B) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V이고, X2는 P이며, X3은 H인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 91의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F이고 X2는 R인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
C) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 94의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
D) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 72의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 94의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
E) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 73의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
F) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 73의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 94의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
G) i)상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 73의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 92의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
H) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 73의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 91의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
I) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 72의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
J) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 72의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 92의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
K) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 72의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 91의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
L) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 74의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
M) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 74의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 94의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
N) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 74의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 92의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
O) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 74의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 91의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
P) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 92의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는,
i) 시험관 내에서 CCL2가 이의 수용체 CCR2에 결합하는 것을 차단하고(리포터 분석, IC50=0.5 nM); 및/또는
ii) 시험관 내에서 골수 세포의 CCL2 매개 주화성을 억제하고(IC50=1.5 nM); 및/또는
iii) 시노 및 및 인간 CCL2에 교차 반응한다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 다른 CCL 동족체에 대해 교차 반응성이 아니며, 특히 CCL2에 대한 결합과 비교하여 다른 CCL 동족체(예컨대, CCL8)에 대한 결합이 100배 더 적게 나타낸다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 이온 의존적 방식으로 인간 CCL2 상의 제1 에피토프 및 제2 에피토프에 결합한다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 pH 의존적 방식으로 인간 CCL2에 결합하고, 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위 둘 모두는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화도로 CCL2에 결합한다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 pH 5.8에서보다 pH 7.4에서 10배 더 높은 친화도로 인간 CCL2에 결합한다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 하기 돌연변이(카바트 EU 넘버링)들:
i) Q311R 및/또는 P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합); 및/또는
ii) L234Y, L235W, G236N, P238D, T250V, V264I, H268D, Q295L, T307P, K326T 및/또는 A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합); 및/또는
iii) M428L, N434A 및/또는 Y436T(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및/또는
iv) Q438R 및/또는 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합) 중 하나 이상을 포함하는 IgG1 중쇄 불변 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 하기 돌연변이(카바트 EU 넘버링)들:
i) Q311R, 및/또는 P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합); 및/또는
ii) L235W, G236N, H268D, Q295L, K326T 및/또는 A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합); 및/또는
iii) N434A(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및/또는
iv) Q438R 및/또는 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합) 중 하나 이상을 포함하는 IgG1 중쇄 불변 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 하기 돌연변이(카바트 EU 넘버링)들:
i) Q311R 및 P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합); 및
ii) L235W, G236N, H268D, Q295L, K326T 및 A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합); 및
iii) N434A(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및
iv) Q438R 및 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합)를 포함하는 IgG1 중쇄 불변 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 하기 돌연변이(카바트 EU 넘버링)들:
i) Q311R 및 P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합); 및
ii) N434A(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및
iii) Q438R 및 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합)를 포함하는 IgG1 중쇄 불변 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 하기 돌연변이(카바트 EU 넘버링)들:
Q311R 및 P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합)을 포함하는 IgG1 중쇄 불변 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 하기 돌연변이(카바트 EU 넘버링)들:
i) Q311R 및/또는 P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합); 및/또는
ii) L234Y, P238D, T250V, V264I, T307P 및/또는 A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합); 및/또는
iii) M428L, N434A 및/또는 Y436T(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및/또는
iv) Q438R 및/또는 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합) 중 하나 이상을 포함하는 IgG1 중쇄 불변 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 하기 돌연변이(카바트 EU 넘버링)들:
i) Q311R 및 P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합); 및
ii) L234Y, P238D, T250V, V264I, T307P 및 A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합); 및
iii) M428L, N434A 및 Y436T(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및
iv) Q438R 및 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합) 중 하나 이상을 포함하는 IgG1 중쇄 불변 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 하기 돌연변이(카바트 EU 넘버링)들:
i) Q311R 및 P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합); 및
ii) L234Y, P238D, T250V, V264I, T307P 및 A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합); 및
iii) N434A(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및
iv) Q438R 및 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합) 중 하나 이상을 포함하는 IgG1 중쇄 불변 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 하기 돌연변이(카바트 EU 넘버링)들:
i) 중쇄 불변 도메인 중 하나에서의 S354C 및 T366W
ii) 중쇄 불변 도메인 중 다른 하나에서의 Y349C, T366S, L368A, Y407V를 포함하는 (독립적으로 또는 상기 기재된 돌연변이 이외에) 2개의 IgG1 중쇄 불변 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함한다.
본 발명의 일 구현예는 인간 CCL2에 (특이적으로)결합하는 (단리된)(단일특이적)항체로서,
상기 항체는,
A) (a) X는 I 또는 T인 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
(d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
B) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
(d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)(단일특이적)이중특이적 항체이다.
본 발명의 일 구현예는 인간 CCL2에 (특이적으로)결합하는 (단리된)(단일특이적)항체로서,
상기 항체는,
A) 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
또는
B) 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
또는
C) 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
또는
D) 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
또는
E) 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
또는
F) 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
또는
G) 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
또는
H) 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)(단일특이적)항체이다.
본 발명의 일 구현예는 선행하는 구현예들 중 어느 한 구현예에 따른 (단일특이적 또는 이중특이적)항체를 부호화하는 단리된 핵산이다.
본 발명의 일 구현예는 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포이다.
본 발명의 일 구현예는 상기 항체가 생성되도록 상기 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 항체를 생성하는 방법이다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 숙주 세포로부터 상기 항체를 회수하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 일 구현예는 본원에 기재된 이중특이적 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 제제이다.
본 발명의 일 구현예는 약제로서 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 이중특이적 항체이다.
본 발명의 일 구현예는 약제의 제조에서 본원에 기재된 바와 같은 이중특이체의 사용이다.
일 구현예에서, 상기 약제는 암의 치료를 위한 것이다.
일 구현예에서, 상기 약제는 염증성 또는 자가면역 질환을 치료하기 위한 것이다.
본 발명의 일 구현예는 암을 치료하는 데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 이중특이적 항체이다.
본 발명의 일 구현예는 염증성 또는 자가면역 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 이중특이적 항체이다.
본 발명의 일 구현예는 암이 있는 개체를 치료하는 방법으로서, 본원에 기재된 항체의 유효량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예는 염증성 또는 자가면역 질환이 있는 개체를 치료하는 방법으로서, 본원에 기재된 항체의 유효량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
도 1: 단일특이적 항-CCL2 항체(CNTO888(= CNTO), 1A5, 1G9 및 인간화 11K2(=11k2))의 재조합 CCL2 및 CCL2 동족체에 대한 결합을 도시하는 표면 플라즈몬 공명(비아코어(Biacore)®) 센서그램이다.
도 2a: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 CNTO888-SG1(야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 CNTO888-SG105(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 FcRn 형질전환 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 2b: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 11K2-SG1(야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 11K2-SG105(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 FcRn 형질전환 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 2c: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 ABN912-SG1(야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 ABN912-SG105(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 FcRn 형질전환 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 2d: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 1A4-SG1(야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 1A4-SG105(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 FcRn 형질전환 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 2e: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 1A5-SG1(야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 1A5-SG105(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 FcRn 형질전환 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 2f: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 1G9 -SG1(야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 1G9-SG105(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 FcRn 형질전환 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 2g: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 2F6-SG1(야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 2F6-SG105(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 FcRn 형질전환 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 3: a) 실선: 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 11K2-SG1(야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 11K2-SG105(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)를 마우스에 정맥 주사한 후 혈청 총 마우스 CCL2 농도(도 °3a) 및 항체-시간 곡선(도 °3b)의 시간 경과를 도시한다.
도 4a: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 11K2//1G9-WT IgG1(원형 Fc 수용체가 결합된 야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 11K2//1G9-PGLALA(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 Balb/c 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 4b: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 CNTO888//11K2-WT IgG1(원형 Fc 수용체가 결합된 야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 CNTO888//11K2-PGLALA(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 Balb/c 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 4c: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 CNTO888//1G9-WT IgG1(원형 Fc 수용체가 결합된 야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 11K2//1G9-PGLALA(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 Balb/c 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 4d: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 CNTO888//1A5-WT IgG1(원형 Fc 수용체가 결합된 야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 CNTO888//1A5-PGLALA(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 Balb/c 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 4e: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 1A5//1G9-WT IgG1(원형 Fc 수용체가 결합된 야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 1A5//1G9-PGLALA(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 Balb/c 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 4f: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 11K2//2F6-WT IgG1(원형 Fc 수용체가 결합된 야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 11K2//2F6-PGLALA(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 Balb/c 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 4g: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 ABN912//11K2-WT IgG1(원형 Fc 수용체가 결합된 야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 ABN912//11K2-PGLALA(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 Balb/c 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 4h: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 1A4//2F6-WT IgG1(원형 Fc 수용체가 결합된 야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 1A4//2F6-PGLALA(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 Balb/c 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 4i: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 1A5//2F6-WT IgG1(원형 Fc 수용체가 결합된 야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 1A5//2F6-PGLALA(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 Balb/c 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 5a: 4개의 변형된 11K2 및 4개의 CNTO888 변이체, 및 4개의 변형된 11K2 및 4개의 CNTO888 변이체의 각각의 조합 항원 결합 모이어티의 결과인 16개의 이중특이적 항-CCL2 항체 CKLO01 내지 CKLO16의 pH 7.4(검정색 선) 및 pH 5.8(회색선)에서 단량체 CCL2에 대한 결합 곡선을 도시한 비아코어(Biacore)® 센서그램이다.
도 5b: 4개의 변형된 11K2 및 4개의 CNTO888 변이체, 및 4개의 변형된 11K2 및 4개의 CNTO888 변이체의 각각의 조합 항원 결합 모이어티의 결과인 16개의 이중특이적 항-CCL2 항체 CKLO01 내지 CKLO16의 단량체 CCL2에 대한 결합 곡선을 도시한 비아코어® 센서그램이다. pH 5.8에서의 추가적인 해리 단계는 pH 7.4에서의 해리 단계 직후에 비아코어® 분석에 통합되었다.
도 6: 이중특이적 항-CCL2 항체 CKLO01, CKLO02, CKLO03 및 CKLO04의 pH 7.4(검정색 선) 및 pH 5.8(회색선)에서의 단량체 CCL8에 대한 결합 곡선을 도시한 비아코어® 센서그램이다.
도 7a: hCCL2 및 이중특이적 항-CCL2 항체(모 CNTO//11K2 및 pH 의존적 변이체 CKLO01, CKLO02, CKLO03 및 CKLO04)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 SCID 마우스에 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 7b: hCCL2 및 CKLO03(IgG1 야생형 Fc를 가짐) 또는 CKLO03-SG1099(강화된 pI Fc를 갖는 CKLO03)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 SCID 마우스에 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 8: 주화성 분석: 동일한 CDR 및 가변 영역 VH/VL, 즉 CKLO2-IgG1 야생형 및 CKLO2-SG1095를 갖지만, Fc 모이어티가 상이한 이중특이적 항-CCL2 항체는 동일한 효능으로 THP-1 세포의 이동을 억제할 수 있다(IC50 = 0.2 μg/ml; 도 8, 왼쪽 패널).
유사하게도, pH 비의존적인 CKLO2의 모 비변형 이중특이적 항체 CNTO888/11k2k2 IgG1인 CCL2-0048이 또한 0.2 μg/ml의 IC50을 나타낸다. 이는 pH 의존성이 상기 분석에서는 발생하지 않는 항원 스위핑(sweeping) 현상에 중요하기 때문이다.
상응하는 단일특이적 항체 CNTO888 IgG1 및 인간화 11k2 IgG1은 각각 0.3 및 0.7 μg/ml의 IC50 값을 나타내는 반면, huIgG1 동형 대조군은 억제를 나타내지 않는다(도 8, 오른쪽 패널).
도 9: 유전자 변형 마우스 모델에서의 생체내 항종양 활성. Mab CKLO2-IgG1(Fc 야생형 IgG1) 및 CKLO2-SG1099((= CKLO2 pI 강화)를 사용한 마우스 종양 모델의 치료. 연구 종료 시 종양 부피(왼쪽), 종양 무게(중간) 및 M-MDSC 침윤물(오른쪽). (전달체는 검정색, CKLO2 야생형 IgG1은 회색, 및 CKLO2pI 강화 Fc(CKLO2-SG1099)는 흰색 막대/점선)
도 10: 이중특이적 항-CCL2 항체(전달체는 검정색, CKLO2 야생형 IgG1은 회색, pI 강화 Fc(CKLO2-SG1099)는 흰색 막대/점선)로 치료한 생체내 항종양 활성 연구(도 9의 효능 참조) 동안 혈청 총(왼쪽) 및 유리(오른쪽) CCL2 수준
도 11: 시노몰구스 원숭이에서 CCL2 스위핑 효율에 대한 개념 입증 연구. 시노몰구스 원숭이의 혈청에서 총 항체 농도-시간 곡선; 왼쪽 패널: 4가지 항체의 평균 농도-시간 곡선이 7일에 걸쳐 표시되고; 군 1: 최대 총 CCL2 축적의 대조군으로서 단일특이적 CNTO888-SG1(= IgG1 야생형) 항-CCL2 항체(n=3마리 동물); 군 2: pH 의존적 표적 결합은 갖지만 Fc 변형은 갖지 않는 이중 파라토프 항-CCL2 항체 CKLO2-SG1(IgG1 야생형)(n=3); 군 3: pH 의존적 표적 결합 및 Fc-pI 및 추가 변형을 갖는 이중 파라토프 항-CCL2 항체 CKLO2-SG1100(n=4) 및 군 4: pH 의존적 표적 결합을 갖고 Fc-pI, 강화된 FcγRIIb 친화도 및 추가 변형을 갖는 이중 파라토프 항-CCL2 항체 CKLO2-SG1095(n=4); 오른쪽 패널: PK 연구 기간(70일)에 걸친 개인 4(군 2)의 개별 농도-시간 곡선이 표시된다.
도 12: 시노몰구스 원숭이에서 CCL2 스위핑 효율에 대한 개념 입증 연구. 시노몰구스 원숭이의 혈청에서 총 CCL2 농도-시간 곡선; 왼쪽 패널: 4가지 항체의 평균 총 CCL2 농도-시간 곡선이 7일에 걸쳐 표시되고; 오른쪽 패널: PK 연구 기간(70일)에 걸친 개인 4(군 2)의 개별 총 CCL2 농도-시간 곡선이 표시된다.
도 13: 시노몰구스 원숭이의 혈청에서 유리 CCL2 농도-시간 곡선; 왼쪽 패널: 4가지 항체의 평균 유리 CCL2 농도-시간 곡선이 7일에 걸쳐 표시되고; 오른쪽 패널: PK 연구 기간(70일)에 걸친 개인 4(군 2)의 개별 유리 CCL2 농도-시간 곡선이 표시되며; 검출 한계 미만인 샘플에 대해 0.01 ng/mL(최저 정량 한계) 값을 사용하여 평균 곡선을 계산하였다.
도 14: 시노몰구스 원숭이에서 CCL2 스위핑 효율에 대한 PK/PD 연구. 시노몰구스 원숭이의 혈청에서 총 CKL02-SG1095 농도-시간 곡선(상이한 농도로 CKL02-SG1095 처리(군 1-3)); 왼쪽 패널: 3가지 용량 수준에 대한 평균 농도-시간 곡선(n=4)이 7일에 걸쳐 표시되고; 오른쪽 패널: 2개의 ADA 음성 개별 동물(25 mg/kg 용량 군)의 개별 농도-시간 곡선이 연구 기간(98일)에 걸쳐 표시된다.
도 15: 시노몰구스 원숭이에서 CCL2 스위핑 효율에 대한 PK/PD 연구. CNTO888-SG1 처리(군 4)와 비교하여 상이한 농도로 CKL02-SG1095 처리(군 1-3)한 시노몰구스 원숭이의 혈청에서 총 CCL2 농도-시간 곡선; 왼쪽 패널: 4개의 연구 군의 평균 총 CCL2 농도-시간 곡선(오차 막대는 SD를 나타냄)은 7일에 걸쳐 표시되고; 오른쪽 패널: 군 3(n=2, 오차 막대는 범위를 나타냄) 및 4(n=3, 오차 막대는 SD를 나타냄)의 ADA 음성 동물의 개별 총 CCL2 농도-시간 곡선은 PK 연구 기간(98일)에 걸쳐 표시된다.
도 16: 시노몰구스 원숭이에서 CCL2 스위핑 효율에 대한 PK/PD 연구. 시노몰구스 원숭이의 혈청에서 유리 CCL2 농도-시간 곡선; 왼쪽 패널: 4개의 연구 군의 평균 유리 CCL2 농도-시간 곡선(오차 막대는 SD를 나타냄)이 7일에 걸쳐 표시되고(상이한 농도의 CKL02-SG1095 처리(군 1-3) 및 CNTO888-SG1 처리(군 4)와 비교함); 오른쪽 패널: 군 3(n=2, 오차 막대는 범위를 나타냄) 및 4(n=3, 오차 막대는 SD를 나타냄)의 ADA 음성 동물의 평균 유리 CCL2 농도-시간 곡선이 PK 연구 기간(70일)에 걸쳐 표시되며; 검출 한계 미만인 샘플에 대해 0.01 ng/mL(최저 정량 하한) 값을 사용하여 평균 프로파일을 계산하였다.
도 2a: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 CNTO888-SG1(야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 CNTO888-SG105(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 FcRn 형질전환 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 2b: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 11K2-SG1(야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 11K2-SG105(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 FcRn 형질전환 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 2c: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 ABN912-SG1(야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 ABN912-SG105(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 FcRn 형질전환 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 2d: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 1A4-SG1(야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 1A4-SG105(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 FcRn 형질전환 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 2e: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 1A5-SG1(야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 1A5-SG105(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 FcRn 형질전환 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 2f: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 1G9 -SG1(야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 1G9-SG105(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 FcRn 형질전환 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 2g: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 2F6-SG1(야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 2F6-SG105(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 FcRn 형질전환 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 3: a) 실선: 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 11K2-SG1(야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 11K2-SG105(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)를 마우스에 정맥 주사한 후 혈청 총 마우스 CCL2 농도(도 °3a) 및 항체-시간 곡선(도 °3b)의 시간 경과를 도시한다.
도 4a: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 11K2//1G9-WT IgG1(원형 Fc 수용체가 결합된 야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 11K2//1G9-PGLALA(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 Balb/c 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 4b: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 CNTO888//11K2-WT IgG1(원형 Fc 수용체가 결합된 야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 CNTO888//11K2-PGLALA(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 Balb/c 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 4c: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 CNTO888//1G9-WT IgG1(원형 Fc 수용체가 결합된 야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 11K2//1G9-PGLALA(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 Balb/c 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 4d: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 CNTO888//1A5-WT IgG1(원형 Fc 수용체가 결합된 야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 CNTO888//1A5-PGLALA(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 Balb/c 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 4e: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 1A5//1G9-WT IgG1(원형 Fc 수용체가 결합된 야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 1A5//1G9-PGLALA(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 Balb/c 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 4f: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 11K2//2F6-WT IgG1(원형 Fc 수용체가 결합된 야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 11K2//2F6-PGLALA(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 Balb/c 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 4g: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 ABN912//11K2-WT IgG1(원형 Fc 수용체가 결합된 야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 ABN912//11K2-PGLALA(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 Balb/c 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 4h: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 1A4//2F6-WT IgG1(원형 Fc 수용체가 결합된 야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 1A4//2F6-PGLALA(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 Balb/c 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 4i: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 1A5//2F6-WT IgG1(원형 Fc 수용체가 결합된 야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 1A5//2F6-PGLALA(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 Balb/c 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 5a: 4개의 변형된 11K2 및 4개의 CNTO888 변이체, 및 4개의 변형된 11K2 및 4개의 CNTO888 변이체의 각각의 조합 항원 결합 모이어티의 결과인 16개의 이중특이적 항-CCL2 항체 CKLO01 내지 CKLO16의 pH 7.4(검정색 선) 및 pH 5.8(회색선)에서 단량체 CCL2에 대한 결합 곡선을 도시한 비아코어(Biacore)® 센서그램이다.
도 5b: 4개의 변형된 11K2 및 4개의 CNTO888 변이체, 및 4개의 변형된 11K2 및 4개의 CNTO888 변이체의 각각의 조합 항원 결합 모이어티의 결과인 16개의 이중특이적 항-CCL2 항체 CKLO01 내지 CKLO16의 단량체 CCL2에 대한 결합 곡선을 도시한 비아코어® 센서그램이다. pH 5.8에서의 추가적인 해리 단계는 pH 7.4에서의 해리 단계 직후에 비아코어® 분석에 통합되었다.
도 6: 이중특이적 항-CCL2 항체 CKLO01, CKLO02, CKLO03 및 CKLO04의 pH 7.4(검정색 선) 및 pH 5.8(회색선)에서의 단량체 CCL8에 대한 결합 곡선을 도시한 비아코어® 센서그램이다.
도 7a: hCCL2 및 이중특이적 항-CCL2 항체(모 CNTO//11K2 및 pH 의존적 변이체 CKLO01, CKLO02, CKLO03 및 CKLO04)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 SCID 마우스에 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 7b: hCCL2 및 CKLO03(IgG1 야생형 Fc를 가짐) 또는 CKLO03-SG1099(강화된 pI Fc를 갖는 CKLO03)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 SCID 마우스에 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 8: 주화성 분석: 동일한 CDR 및 가변 영역 VH/VL, 즉 CKLO2-IgG1 야생형 및 CKLO2-SG1095를 갖지만, Fc 모이어티가 상이한 이중특이적 항-CCL2 항체는 동일한 효능으로 THP-1 세포의 이동을 억제할 수 있다(IC50 = 0.2 μg/ml; 도 8, 왼쪽 패널).
유사하게도, pH 비의존적인 CKLO2의 모 비변형 이중특이적 항체 CNTO888/11k2k2 IgG1인 CCL2-0048이 또한 0.2 μg/ml의 IC50을 나타낸다. 이는 pH 의존성이 상기 분석에서는 발생하지 않는 항원 스위핑(sweeping) 현상에 중요하기 때문이다.
상응하는 단일특이적 항체 CNTO888 IgG1 및 인간화 11k2 IgG1은 각각 0.3 및 0.7 μg/ml의 IC50 값을 나타내는 반면, huIgG1 동형 대조군은 억제를 나타내지 않는다(도 8, 오른쪽 패널).
도 9: 유전자 변형 마우스 모델에서의 생체내 항종양 활성. Mab CKLO2-IgG1(Fc 야생형 IgG1) 및 CKLO2-SG1099((= CKLO2 pI 강화)를 사용한 마우스 종양 모델의 치료. 연구 종료 시 종양 부피(왼쪽), 종양 무게(중간) 및 M-MDSC 침윤물(오른쪽). (전달체는 검정색, CKLO2 야생형 IgG1은 회색, 및 CKLO2pI 강화 Fc(CKLO2-SG1099)는 흰색 막대/점선)
도 10: 이중특이적 항-CCL2 항체(전달체는 검정색, CKLO2 야생형 IgG1은 회색, pI 강화 Fc(CKLO2-SG1099)는 흰색 막대/점선)로 치료한 생체내 항종양 활성 연구(도 9의 효능 참조) 동안 혈청 총(왼쪽) 및 유리(오른쪽) CCL2 수준
도 11: 시노몰구스 원숭이에서 CCL2 스위핑 효율에 대한 개념 입증 연구. 시노몰구스 원숭이의 혈청에서 총 항체 농도-시간 곡선; 왼쪽 패널: 4가지 항체의 평균 농도-시간 곡선이 7일에 걸쳐 표시되고; 군 1: 최대 총 CCL2 축적의 대조군으로서 단일특이적 CNTO888-SG1(= IgG1 야생형) 항-CCL2 항체(n=3마리 동물); 군 2: pH 의존적 표적 결합은 갖지만 Fc 변형은 갖지 않는 이중 파라토프 항-CCL2 항체 CKLO2-SG1(IgG1 야생형)(n=3); 군 3: pH 의존적 표적 결합 및 Fc-pI 및 추가 변형을 갖는 이중 파라토프 항-CCL2 항체 CKLO2-SG1100(n=4) 및 군 4: pH 의존적 표적 결합을 갖고 Fc-pI, 강화된 FcγRIIb 친화도 및 추가 변형을 갖는 이중 파라토프 항-CCL2 항체 CKLO2-SG1095(n=4); 오른쪽 패널: PK 연구 기간(70일)에 걸친 개인 4(군 2)의 개별 농도-시간 곡선이 표시된다.
도 12: 시노몰구스 원숭이에서 CCL2 스위핑 효율에 대한 개념 입증 연구. 시노몰구스 원숭이의 혈청에서 총 CCL2 농도-시간 곡선; 왼쪽 패널: 4가지 항체의 평균 총 CCL2 농도-시간 곡선이 7일에 걸쳐 표시되고; 오른쪽 패널: PK 연구 기간(70일)에 걸친 개인 4(군 2)의 개별 총 CCL2 농도-시간 곡선이 표시된다.
도 13: 시노몰구스 원숭이의 혈청에서 유리 CCL2 농도-시간 곡선; 왼쪽 패널: 4가지 항체의 평균 유리 CCL2 농도-시간 곡선이 7일에 걸쳐 표시되고; 오른쪽 패널: PK 연구 기간(70일)에 걸친 개인 4(군 2)의 개별 유리 CCL2 농도-시간 곡선이 표시되며; 검출 한계 미만인 샘플에 대해 0.01 ng/mL(최저 정량 한계) 값을 사용하여 평균 곡선을 계산하였다.
도 14: 시노몰구스 원숭이에서 CCL2 스위핑 효율에 대한 PK/PD 연구. 시노몰구스 원숭이의 혈청에서 총 CKL02-SG1095 농도-시간 곡선(상이한 농도로 CKL02-SG1095 처리(군 1-3)); 왼쪽 패널: 3가지 용량 수준에 대한 평균 농도-시간 곡선(n=4)이 7일에 걸쳐 표시되고; 오른쪽 패널: 2개의 ADA 음성 개별 동물(25 mg/kg 용량 군)의 개별 농도-시간 곡선이 연구 기간(98일)에 걸쳐 표시된다.
도 15: 시노몰구스 원숭이에서 CCL2 스위핑 효율에 대한 PK/PD 연구. CNTO888-SG1 처리(군 4)와 비교하여 상이한 농도로 CKL02-SG1095 처리(군 1-3)한 시노몰구스 원숭이의 혈청에서 총 CCL2 농도-시간 곡선; 왼쪽 패널: 4개의 연구 군의 평균 총 CCL2 농도-시간 곡선(오차 막대는 SD를 나타냄)은 7일에 걸쳐 표시되고; 오른쪽 패널: 군 3(n=2, 오차 막대는 범위를 나타냄) 및 4(n=3, 오차 막대는 SD를 나타냄)의 ADA 음성 동물의 개별 총 CCL2 농도-시간 곡선은 PK 연구 기간(98일)에 걸쳐 표시된다.
도 16: 시노몰구스 원숭이에서 CCL2 스위핑 효율에 대한 PK/PD 연구. 시노몰구스 원숭이의 혈청에서 유리 CCL2 농도-시간 곡선; 왼쪽 패널: 4개의 연구 군의 평균 유리 CCL2 농도-시간 곡선(오차 막대는 SD를 나타냄)이 7일에 걸쳐 표시되고(상이한 농도의 CKL02-SG1095 처리(군 1-3) 및 CNTO888-SG1 처리(군 4)와 비교함); 오른쪽 패널: 군 3(n=2, 오차 막대는 범위를 나타냄) 및 4(n=3, 오차 막대는 SD를 나타냄)의 ADA 음성 동물의 평균 유리 CCL2 농도-시간 곡선이 PK 연구 기간(70일)에 걸쳐 표시되며; 검출 한계 미만인 샘플에 대해 0.01 ng/mL(최저 정량 하한) 값을 사용하여 평균 프로파일을 계산하였다.
본 발명은 인간 CCL2 상의 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 이중특이적 항-CCL2 항체, 이의 약학적 조성물, 이의 제조, 및 암, 염증성, 자가면역 및 안과 질환들을 치료하기 위한 약제로서의 사용에 관한 것이다. 따라서, 항체는 인간 CC2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 상이한 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 상이한 제2 항원 결합 부위를 포함한다.
본 발명은 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, 이중특이적 항체를 포함하고,
i) 상기 제1 항원 결합 부위는 CCL2 상의 동일한 에피토프에 항체로서 결합하고, 상기 항체는,
서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하며, (a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 CCL2 상의 동일한 에피토프에 항체로서 결합하고, 상기 항체는,
서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하며, (a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 20 mg/kg의 각 이중특이적 항체 및 0.1 mg/kg의 인간 CCL2로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 10 ml/kg의 단일 용량으로 FcRn 형질전환 마우스에 투여할 때, 인간 야생형 IgG1 동형의 불변 중쇄 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함하는 이중특이적 항체를 투여한 후 인간 CCL2에 대한 생체내 제거율(ml/day/kg)은 돌연변이 L234A, L235A, P329G(카바트 EU 넘버링)를 포함하는 인간 IgG1 동형의 Fc 감마 수용체 침묵형 불변 중쇄 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함하는 이중특이적 항체를 투여한 후 인간 CCL2에 대한 생체내 제거율(ml/day/kg)에 비해 15배 이상, 특히 20배 이상 높다.
용어 "에피토프"는 항체에 특이하게 결합할 수 있는 임의의 폴리펩티드 결정인자를 포함한다. 특정 구현예들에서, 에피토프 결정인자는 분자, 예컨대 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴, 또는 설포닐의 화학적 활성 표면 그룹화를 포함하고, 특정 구현예들에서, 특정 3차원 구조 특성, 및/또는 특정 전하 특성을 가질 수 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합된 항원의 영역이다. 본 발명은 인간 CCL2 상의 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 이중특이적 항-CCL2 항체에 관한 것이다. 제1 에피토프 및 제2 에피토프는 인간 CCL2의 2개의 상이한 에피토프를 나타낸다. 따라서, 제2 에피토프는 제1 에피토프와 상이하다. 항체가 참조 항-CCL2 항원 결합 부위와 동일한 에피토프에 결합하는지, 또는 이의 결합에 대해 경쟁하는지 여부를 당업계에 공지된 일상적인 방법을 사용하여 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들어, 시험 항체가 본 발명의 참조 항-CCL2 항원 결합 부위와 동일한 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위해, 참조 항체는 포화 조건 하에서 이의 CCL2 도메인에 결합하도록 허용된다. 다음으로, 인간 CCL2에 결합하는 시험 항체의 능력이 평가된다. 시험 항체가 참조 항-CCL2 항원 결합 부위와의 포화 결합 후 인간 CCL2에 결합할 수 있다면, 시험 항체가 참조 항-CCL2 항원 결합 부위와 상이한 에피토프에 결합한다고 결론내릴 수 있다. 반면에, 시험 항체가 참조 항-CCL2 항체와의 포화 결합 후 인간 CCL2에 결합할 수 없다면, 시험 항체는 본 발명의 참조 항-CCL2 항체에 의해 결합된 에피토프와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 그런 다음, 시험 항체의 관찰된 결합의 결핍이 실제로 참조 항체와 동일한 에피토프에 대한 결합 때문인지, 또는 입체 차단(또는 다른 현상)이 관찰된 결합 결핍의 원인인지를 확인하기 위해, 추가적인 일상적인 실험(예컨대, 펩티드 돌연변이 및 결합 분석)을 실시할 수 있다. 상기 종류의 실험은 ELISA, RIA, 표면 플라즈몬 공명(예컨대, 비아코어), 유세포 분석 또는 당업계에서 이용 가능한 임의의 다른 정량적 또는 정성적 항체 결합 분석을 사용하여 실시할 수 있다. 본 발명의 특정 구현예들에 따르면, 예컨대, 1-, 5-, 10-, 20- 또는 100배 과량의 한 항체는, 경쟁 결합 분석에서 측정할 때, 다른 항체의 결합을 적어도 50%, 하지만 바람직하게는 75%, 90% 또는 심지어 99% 만큼 억제하는 경우, 2개의 항체는 동일한(또는 중복되는) 에피토프에 결합한다(예컨대, Junghans et al., Cancer Res. 1990:50:1495-1502를 참조).
대안적으로, 하나의 항체의 결합을 감소하거나 제거하는 항원의 본질적으로 모든 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소하거나 제거하는 경우, 2개의 항체가 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 간주된다. 한 항체의 결합을 감소하거나 제거하는 아미노산 돌연변이의 하위 집합 만이 다른 항체의 결합을 감소하거나 제거하는 경우, 두 항체는 "중복 에피토프"를 갖는 것으로 간주된다.
항체가 참조 항-CCL2 항체와 결합에 대해 경쟁하는지 여부를 결정하기 위해, 상기 기재된 결합 방법론은 두 가지 방향으로 실시한다: 제1 방향에서, 참조 항체는 포화 조건 하에서 CCL2에 결합하도록 허용되고, 이어서 인간 CCL2에 대한 시험 항체의 결합이 평가된다. 제2 방향에서, 시험 항체는 포화 조건 하에서 CCL2 분자에 결합하도록 허용되고, 이어서 인간 CCL2에 대한 참조 항체의 결합이 평가된다. 두 방향 모두에서, 제1 (포화)항체만이 CCL2 분자에 결합할 수 있는 경우, 시험 항체 및 참조 항체가 CCL2에 결합하기 위해 경쟁한다고 결론내릴 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 참조 항체와 결합에 대해 경쟁하는 항체는 참조 항체와 동일한 에피토프에 반드시 결합할 필요는 없지만, 중첩된 또는 인접한 에피토프에 결합함으로써 참조 항체의 결합을 입체적으로 차단할 수 있다.
본원에 사용될 때, "MCP-1"이라고도 하는 "CCL2", "인간 CCL2"라는 용어는 NCBI 기록 등록 번호 NP_002973에서 참조되고, CCL2, MCP-1(단핵구 화학주성 단백질 1), SMC-CF(평활근 세포 화학주성 인자), LDCF(림프구 유래 화학주성 인자), GDCF(신경교종 유래 단핵구 화학주성 인자), TDCF(종양 유래 화학주성 인자), HCl1(인간 사이토카인 11), MCAF(단핵구 화학주성 및 활성화 인자)로서 다양하게 공지된 76 아미노산 서열을 의미한다. 유전자 기호는 인간 염색체 17번의 JE 유전자인 SCYA2이고, 새로운 명칭은 CCL2이다(Zlotnik, Yoshie 2000. Immunity 12: 121-127). JE는 인간 MCP-1/CCL2의 마우스 동족체이다.
Handel 외(Biochemistry. 1996; 35:6569-6584)는 CCL2 이량체의 용매 구조를 결정하였다. 상기 연구는 CCL2의 2차 구조가 4개의 β 시트로 구성되어 있음을 나타낸다. 추가적으로, CCL2의 이량체화 계면을 담당하는 잔기는 Zhang 및 Rollins에 의해 설명되었다(Mol Cell Biol. 1995; 15:4851-4855). 단백질 복합체는 큰 주머니를 형성하는 방식으로 배향된 두 개의 단량체로 길게 나타난다. 두 가지 결정 형태, 소위 I 및 P 형태의 단량체 및 이량체 CCL2의 구조가 또한 결정되었고(Lubkowski et al., Nat Struct Biol. 1997; 4:64-69). Paolini et al, (J Immunol. 1994 Sep 15;153(6):2704-17), MCP1/CCL2는 생리학적으로 적절한 농도에서 단량체로 존재한다고 설명하였다: rec. CCL2 단백질(페프로텍(Peprotech)에서 구입)을 크기 배제 HPLC, 침강 평형 초원심분리 및 화학적 가교로 분석함으로써, MCP-1의 단량체 및 이량체 형태의 중량 분율이 시험관 내 협력에 의존한다는 것을 보여줄 수 있다. 마지막으로, Seo 외(J Am Chem Soc. 2013 Mar 20;135(11):4325-32)는 생리학적 조건 하에서 단량체 및 이량체 형태 둘 모두로 주입된 CCL2의 존재를 이온 이동성 질량 분석법으로 나타낼 수 있다.
따라서, "야생형 CCL-2"(wt CCL2)는 단량체로 존재할 수 있지만, 실제로 생리학적 농도에서 이량체를 형성할 수도 있다. 상기 단량체-이량체 평형은 확실히 상이하며, 이는 상이한 농도가 사용될 수 있는 기재된 모든 시험관 내 실험에 대해 신중하게 고려해야 한다. 불확실성을 피하기 위해, 점 돌연변이된 CCL2 변이체를 생성하였다: CCL2의 "P8A" 변이체는 이량체화 계면에 돌연변이를 수반하여, 정의된 순수한 CCL2 단량체로 이어지는 이량체를 형성할 수 없다. 이와 대조적으로, CCL2의 "T10C"" 변이체는 CCL2의 고정된 이량체를 생성한다(J Am Chem Soc. 2013 Mar 20;135(11):4325-32).
CCL2/CCR2 축은 미성숙 골수 세포가 종양으로 동원되는 주요 매개체이다. CCL2는 악성 세포에 의해 과발현되고 세포외 기질(ECM)에 결합하여 화학 유인 물질 구배를 형성한다. 일단 종양에 도달하면, 골수 유래 억제 세포(MDSC)는 항종양 T 세포 반응의 개시를 억제하는 항염증성 사이토카인/수용체를 분비/상향 조절함으로써 전종양 형성 환경에 기여한다. 이러한 방식으로, MDSC는 T 세포 활성화 요법의 효능을 감소시키거나 심지어 손상시킬 수 있다(Meyer et al, 2014). 따라서, 이러한 미성숙 골수 세포의 동원을 특이적으로 억제하면 관문 억제제, T 세포 이중특이적 및 암 면역요법의 효능을 높일 수 있을 것이다. 또한, CCL2는 혈관신생, 전이 및 종양 성장의 촉진과도 관련이 있으며, 이는 CCL2를 중화하는 것이 여러 방식의 항종양 개입에 기여할 수 있음을 시사한다.
이의 수용체와 대조적으로, CCL2를 표적으로 삼는 것은 Th1 및 NK 세포와 같은 다른 면역 세포 군의 동원에 관여하는, 리간드는 상이하지만(예: CCL7, CCL8, CCL13) 동일한 수용체(CCR2)를 통해 신호를 보낼 수 있는 것들을 피하면서 원하지 않는 CCL2 매개 효과를 특이적으로 억제할 것이다.
임상적으로, CCL2는 상이한 염증성 질환들, 예컨대 류마티스 관절염(Haringman et al, 2006), 특발성 폐섬유증(Raghu et al, 2015), 당뇨병성 신증(Menne et al, 2016) 및 암(Sandhu et al, 2013)에 의해 증가된 수치를 중화하는 것을 목표로 하는 여러 연구에서 선호되는 항체 표적이었다. 하지만, 관찰된 높은 생체내 항체-항원 해리 상수(KD)와 함께 이의 높은 합성 속도는 임상적으로 실행 가능한 용량에서 기존 항체에 의한 유리 CCL2 억제를 방해하는 주요 장애물로 입증되었다(Fetterly et al, 2013).
CCL2 중화는 CCL2의 혈청 수준이 상승된 환자에게서 더 분명히 관련이 있는 것으로 보이며, 이는 유방암(BC), 난소암(OvCa), 결장직장암(CRC), 췌장암 및 전립선암과 같은 여러 유형의 암에서 관찰되었다. 하지만, 이러한 혈청학을 나타내지는 않지만 종양이 골수 계통의 면역 세포로 심하게 침윤된 이러한 적응증 내의 환자의 경우라도, 위에서 언급한 바와 같이 종양 맥락에서 CCL2가 수행하는 많은 역할로 인해 이러한 신규 치료법으로부터 많은 도움을 받을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "인간 CCL2에 결합하는", "인간 CCL2에 특이적으로 결합하는", "인간 CCL2에 결합하는" 항체 또는 "항-CCL2 항체"는 5.0 x 10-8 mol/l 이하의 KD 값, 일 구현예에서는 1.0 x 10-9 mol/l 이하의 KD 값, 일 구현예에서는 5.0 x 10-8 mol/l 내지 1.0 x 10-13 mol/l의 KD 값의 결합 친화도로 인간 CCL2 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다.
결합 친화도는 표준 결합 분석, 예컨대 표면 플라즈몬 공명 기술(비아코어®, GE-헬스케어(Healthcare), 스웨덴 웁살라 소재)을 통해, 예컨대 CCL2 세포외 도메인(예컨대, 자연 발생 3차원 구조의)을 포함하는 구성물을 사용하여 결정한다. 일 구현예에서, 결합 친화도는 예시적인 가용성 CCL2를 사용하는 표준 결합 분석으로 결정한다.
항체 특이성은 항원의 특정 에피토프에 대한 항체의 선택적 인식을 지칭한다. 예를 들어, 천연 항체는 단일특이적이다.
본원에 사용된 용어 "단일특이적" 항체는 각각이 동일한 항원의 동일한 에피토프에 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 갖는 항체를 나타낸다.
본원에서 사용된 용어 "(인간)CCL2에 결합하는 이중특이적 항체", "(인간)CCL2에 결합하는 이중 파라토프 항체", "이중특이적 항-CCL2 항체", "이중 파라토프 항-CCL2 항체"는 항체가 (인간)CCL2 상의 적어도 2개의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있음을 의미한다. 전형적으로, 상기 이중특이적 항체는 2개의 상이한 항원 결합 부위(2개의 상이한 파라토프)를 포함하며, 이의 각각은 (인간)CCL2의 상이한 에피토프에 특이적이다. 특정 구현예들에서, 이중특이적 항체는 CCL2 상의 2개의 상이한 비중첩 에피토프에 결합할 수 있으며, 이는 2개의 상이한 항원 결합 부위가 CCL2에 대한 결합에 대해 경쟁하지 않는다는 것을 의미한다.
본원의 목적으로 “수용체 인간 프레임워크”는, 하기에 정의된 바와 같이, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인(VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크“로부터 유래된” 수용체 인간 프레임워크는 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 구현예들에서, 아미노산 변화의 수는 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 또는 2 이하이다. 일부 구현예들에서, VL 수용체 인간 프레임워크는 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 공통 프레임워크 서열과 동일한 서열을 갖는다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미에서 사용되고, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 다중특이적 항체(예컨대, 이중특이적 항체), 및 항체 단편(이들이 원하는 항원 결합 활성을 나타내기만 하면)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다양한 항체 구조를 수반한다.
“항체 단편”은 원형 항체가 결합하는 항원을 결합하는 상기 원형 항체의 일부를 포함하는 원형 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 비제한적으로 Fv, Fab, Fab', Fab’-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단쇄 항체 분자(예컨대, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 “~가(valent)”는 항체 내에 명시된 수의 항원 결합 부위의 존재를 표시한다. 따라서, 용어 “항원에 일가 결합”은 항체 내에 항원에 대해 특이적인 하나(및 하나보다 많지 않은) 항원 결합 부위의 존재를 표시한다.
용어 “항원 결합 부위”는 항원과의 상호작용을 제공하는, 항체의 부위 또는 영역, 즉 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 지칭한다. 예를 들어, 항체의 항원 결합 부위는 상보성 결정 영역(CDRs)으로부터 아미노산 잔기를 포함한다. 일 구현예에서, 항체의 항원 결합 부위는 VH 및 VL로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. 선천적 면역글로불린 분자는 전형적으로 2개의 항원 결합 부위를 갖고, Fab 분자는 전형적으로 단일 항원 결합 부위를 갖는다. "항원 결합 모이어티"는 항원 결정기에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드 분자를 지칭한다. 항원 결합 모이어티는 본원에서 추가로 정의된 바와 같은 항체 및 이들의 단편을 포함한다. 특정 항원 결합 모이어티는 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체의 항원 결합 도메인을 포함한다. 특정 구현예들에서, 항원 결합 모이어티는 본원에서 추가로 정의되고 당해 분야에서 공지된 바와 같은 항체 불변 영역을 포함할 수 있다. 유용한 중쇄 불변 영역은 5가지 동형: α, δ, ε, γ, 또는 μ 중 임의의 것을 포함한다. 유용한 경쇄 불변 영역은 2가지 동형: κ 및 λ 중 임의의 것을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "항원 결정기" 또는 "항원"은 항원 결합 모이어티/부위가 결합하여 항원 결합 모이어티-항원 복합체를 형성하는 폴리펩티드 거대분자 상의 부위를 지칭한다. 유용한 항원 결정인자는, 예를 들어 종양 세포의 표면 상에서, 바이러스 감염된 세포의 표면 상에서, 다른 병든 세포의 표면 상에서, 면역 세포의 표면 상에서, 혈청에서 자유롭게 및/또는 세포외 기질 (ECM)에서 발견될 수 있다.
용어 “키메라” 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되는 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부분이 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래되는 항체를 지칭한다.
항체의 “부류”는 이의 중쇄에 의해 보유된 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체에는 5가지 주요 부류가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 그리고 이들중 몇몇은 하위부류(동형), 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 더 세분화될 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 해당하는 중쇄 불변 도메인들은 각각 a, d, e, g, 및 m로 불린다. 바람직하게는, 본 발명의 이중특이적 항체는 인간 IgG 동형, 더 바람직하게는 인간 IgG1 동형이다. 본원에 사용된 용어 IgG 동형 및 IgG1 동형은 인간 IgG 동형 및 인간 IgG1 동형을 지칭한다. 일반적으로, 상이한 IgG 동형은 IgG 하위부류 간의 대립유전자 변이에 기초하여 약간 상이한 동종이인자형의 형태로 존재한다(Vidarsson et al.; Front Immunol 5 ( 2014) Article 520, 1-17을 참조). 작용제의 "유효량", 예컨대 약학적 제형은 원하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기 위해 필요한 기간 동안 및 투여량에서 효과적인 양을 지칭한다.
본원에서 용어 “Fc 도메인” 또는 “Fc 영역”은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C 말단 영역을 정의하는 데 이용된다. 상기 용어는 선천적 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 비록 IgG 중쇄의 Fc 영역의 경계가 약간 가변될 수도 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로 Cys226으부터, 또는 Pro230부터 중쇄의 카르복실 말단까지 걸쳐있는 것으로 정의된다. 하지만, 숙주 세포에 의해 생성된 항체는 중쇄의 C 말단으로부터 하나 이상, 특히 1개 또는 2개의 아미노산의 번역후 절단을 당할 수 있다. 따라서, 전장 중쇄를 부호화하는 특이적 핵산 분자의 발현을 통해 숙주 세포에 의해 생성되는 항체는 전장 중쇄를 포함할 수 있거나, 또는 이는 전장 중쇄의 절단된 변이체(본원에서 "절단된 변이체 중쇄"로도 지칭됨)를 포함할 수 있다. 이는 중쇄의 최종 2개의 C 말단 아미노산이 글리신(G446) 및 리신(K447, 카바트 EU 색인에 따른 넘버링)인 경우에 그러할 수 있다. 따라서, Fc 영역의 C 말단 리신(Lys447) 또는 C 말단 글리신(Gly446) 및 리신(Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. Fc 영역(또는 본원에서 정의된 바와 같은 Fc 도메인의 아단위)을 포함한 중쇄의 아미노산 서열은 다르게 지시되지 않는 한, C 말단 글리신-리신 디펩티드가 없이 표시된다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이중특이적 항체에 포함된, 본원에 명시된 바와 같은 Fc 영역의 아단위를 포함하는 중쇄는 추가적인 C 말단 글리신-리신 디펩티드(G446 및 K447, 카바트의 EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이중특이적 항체에 포함된, 본원에 명시된 바와 같은 Fc 영역의 아단위를 포함하는 중쇄는 추가적인 C 말단 글리신 잔기(G446, 카바트의 EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다. 본 발명의 조성물, 예컨대 본원에 기재된 약학적 조성물은 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항체의 군을 포함한다. 항체 또는 이중특이적 항체의 군은 전장 중쇄를 갖는 분자 및 절단된 변이체 중쇄를 갖는 분자를 포함할 수 있다. 항체 또는 이중특이적 항체의 군은 전장 중쇄를 갖는 분자 및 절단된 변이체 중쇄를 갖는 분자의 혼합물로 구성될 수 있으며, 항체 또는 이중특이적 항체의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상이 절단된 변이체 중쇄를 갖는다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항체의 군을 포함하는 조성물은 추가적인 C 말단 글리신-리신 디펩티드(G446 및 K447, 카바트의 EU 색인에 따른 넘버링)와 함께 본원에 명시된 바와 같은 Fc 영역의 아단위를 포함한 중쇄를 포함하는 항체 또는 이중특이적 항체를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항체의 군을 포함하는 조성물은 추가적인 C 말단 글리신 잔기(G446, 카바트의 EU 색인에 따른 넘버링)와 함께 본원에 명시된 바와 같은 Fc 영역의 아단위를 포함한 중쇄를 포함하는 항체 또는 이중특이적 항체를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 조성물은 본원에 명시된 바와 같은 Fc 영역의 아단위를 포함한 중쇄를 포함하는 분자; 추가적인 C 말단 글리신 잔기(G446, 카바트의 EU 색인에 따른 넘버링)와 함께 본원에 명시된 바와 같은 Fc 도메인의 아단위를 포함한 중쇄를 포함하는 분자; 및 추가적인 C 말단 글리신-리신 디펩티드(G446 및 K447, 카바트의 EU 색인에 따른 넘버링)와 함께 본원에 명시된 바와 같은 Fc 도메인의 아단위를 포함한 중쇄를 포함하는 분자로 구성된 항체 또는 이중특이적 항체의 군을 포함한다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991에 기재된 바와 같이 "카바트의 EU 색인에 따른 넘버링" 또는 "카바트 EU 넘버링"라고도 하는 "EU 넘버링 시스템에 따른"다. 본원에서 사용된 Fc 도메인의 “아단위”는 이량체 Fc 도메인을 형성하는 2개의 폴리펩티드 중에서 하나, 즉 안정되게 자가 결합할 수 있는, 면역글로불린 중쇄의 C 말단 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, IgG Fc 도메인의 아단위는 IgG CH2 및 IgG CH3 불변 도메인을 포함한다.
“프레임워크” 또는 “FR”은 초가변 영역(HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인들로 구성된다: FR1, FR2, FR3, 및 FR4. 이에 따라, CDR 및 FR 서열들은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 하기의 서열로 나타난다: FR-H1(L1)-CDR-H1(L1)-FR-H2(L2)-CDR-H2(L2)-FR-H3(L3)-CDR-H3(L3)-FR-H4(L4).
용어 “전장 항체", “원형 항체", 및 “전체 항체”는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 선천적인 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 또는 본원에서 정의된 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
“인간 항체”는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성되거나, 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체 부호화 서열을 활용하는 비인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 것이다. 인간 항체에 대한 상기 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 특이적으로 배제한다.
“인간 공통 프레임워크”는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선별에서 가장 흔히 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 선별된다. 일반적으로, 서열의 하위군은 Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3에서와 같은 하위군이다. 일 구현예에서, VL에 대해, 상기 하위군은 상기 Kabat et al.에서와 같은 하위군 카파 I이다. 일 구현예에서, VH에 대해, 상기 하위군은 상기 Kabat et al.에서와 같은 하위군 카파 III이다.
“인간화” 항체는 비인간 CDR로부터 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 구현예들에서, 인간화 항체는 적어도 1개, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하고, CDR의 전부 또는 실질적으로 전부가 비인간 항체의 것에 상응하고, FR의 전부 또는 실질적으로 전부가 인간 항체의 것에 상응한다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체의 "인간화 형태", 예컨대, 비인간 항체는 인간화를 거친 항체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 “상보성 결정 영역” 또는 “CDR”은 서열에서 초가변적인, 및/또는 구조적으로 정의된 루프(“초가변 루프”)를 형성하고, 및/또는 항원 접촉 잔기들(“항원 접촉부”)을 함유하는 항체 가변 도메인의 각 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개 CDR: VH에서 3개(CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3), 및 VL에서 3개(CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3)를 포함한다. 본원에서 예시적인 CDR은 하기를 포함한다:
(a) 아미노산 잔기 26-32(CDR-L1), 50-52(CDR-L2), 91-96(CDR-L3), 26-32(CDR-H1), 53-55(CDR-H2), 및 96-101(CDR-H3)에서 발생하는 초가변 루프(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) 아미노산 잔기 24-34(CDR-L1), 50-56(CDR-L2), 89-97(CDR-L3), 31-35b(CDR-H1), 50-65(CDR-H2), 및 95-102(CDR-H3)에서 나타나는 CDR(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) 아미노산 잔기 27c-36(CDR-L1), 46-55(CDR-L2), 89-96(CDR-L3), 30-35b(CDR-H1), 47-58(CDR-H2), 및 93-101(CDR-H3)에 발생하는 항원 접촉(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); 및
(d) CDR 아미노산 잔기 24-34 (CDR-L1), 50-56 (CDR-L2), 89-97 (vL3), 31-35 (CDR-H1), 50-63 (CDR-H2), 및 95-102(CDR-H3)를 포함하는 (a), (b), 및/또는 (c)의 조합.
다르게 지시되지 않는 한, CDR 잔기 및 가변 도메인의 다른 잔기(예컨대, FR 잔기)는 본원에서 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991에 따라서 넘버링된다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유류이다. 포유류는 가축(예컨대, 소, 양, 고양이, 개, 및 말), 영장류(예컨대, 인간 및 원숭이와 같은 비인간 영장류), 토끼, 및 설치류(예컨대, 마우스 및 래트)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 특정 구현예들에서, 상기 개체 또는 대상체는 인간이다.
"단리된" 항체는 이의 자연 환경의 구성요소로부터 분리된 것이다. 일부 구현예들에 있어서, 항체는, 예를 들어 전기영동의 (예컨대, SDS-PAGE, 등전초점조절(IEF), 모세관전기이동) 또는 크로마토그래프(예컨대, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정되었을 때 95% 또는 99% 순도를 초과하여 정제된다. 항체 순도를 평가하기 위한 방법을 검토하려면, 예컨대 Flatman, S. et al., J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87을 참조한다.
“단리된" 핵산은 이의 자연 환경의 성분으로부터 분리되어 있는 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 보통 함유하는 세포 안에 있는 핵산 분자를 포함하지만, 상기 핵산 분자는 자연 염색체 위치와는 상이한 염색체 위치에 존재하거나 또는 염색체 외부에 존재한다.
"단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체를 부호화하는 단리된 핵산"은, 단일 벡터 또는 별도의 벡터들에 있는 이러한 핵산 분자를 포함하는, 항체 중쇄 및 경쇄(또는 이의 단편)를 부호화하는 하나 이상의 핵산 분자, 및 숙주 세포의 하나 이상의 위치에 존재하는 이러한 핵산 분자(들)을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 동질성 항체 집단으로부터 획득된 항체를 지칭한다, 즉, 개별 항체는 동일한 집단 및/또는 같은 에피토프에 결합하는 모집단을 포함하는데, 다만, 변이체 항체, 예컨대, 자연 발생적 돌연변이를 함유하거나 또는 단일클론 항체 제제를 만드는 동안 발생되는 변이체 항체 가능성이 있으며, 이러한 변이체들은 일반적으로 소량으로 존재한다. 상이한 결정부위(에피토프)에 대해 지향된 상이한 항체를 통상적으로 포함하는 다중클론 항체 제제와 대조적으로, 단일클론 항체 제제의 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정부위에 대해 지향된다. 따라서, 수식어 "단일클론(monoclonal)"은 실질적으로 동질성 항체 집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체 제조를 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단일클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역 글로불린 좌위의 전부 또는 일부를 함유하는 형질전환 동물을 이용하는 방법들을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있으며, 상기 방법 및 단일클론 항체를 제조하는 다른 예시적인 방법이 본원에 기재되어 있다.
"선천적 항체"는 구조가 가변되는 자연 발생 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 선천적 IgG 항체는 이종사량체 당단백질로써, 약 150,000 달톤이며, 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성되며, 이들은 이황화 결합에 의해 연결되어 있다. N 말단으로부터 C 말단에 이르기까지, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 영역(VH), 이어서 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N 말단으로부터 C 말단에 이르기까지, 각 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로 또한 불리는 가변 영역(VL), 이어서 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 카파(κ) 및 람다(λ)라고 하는 두 가지 유형 중 하나로 지정될 수 있다.
용어 “패키지 삽입물(package insert)”은 이러한 치료제 제품의 사용과 관련된 지시, 용도, 투여량, 투여, 병용 요법, 금기 및/또는 경고에 대한 정보가 포함된 치료제 제품의 시판 포장에 관례적으로 포함되는 지침서를 지칭하기 위해 이용된다.
기준 폴리펩티드 서열에 대하여 “퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성”은 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 필요하면, 갭을 도입한 후에, 그리고 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않고, 기준 폴리펩티드 서열 내에 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열 내에 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈라인(Megalign, DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 해당 업계의 기술 범위에 속하는 다양한 방법으로 구현될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 구현하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열들을 정렬하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 하지만, 본원의 목적으로, 아미노산 서열 동일성 % 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨텍 회사(Genentech, Inc.)에서 제작되었고, 소스 코드는 미국 워싱턴 D.C., 20559에 소재한 미국 저작권청에 사용자 문서와 함께 제출되었으며, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되었다. ALIGN-2 프로그램은 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코에 소재한 제넨텍 회사로부터 공개적으로 입수가능하거나 소스 코드로부터 컴파일될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함한 UNIX 운영 체제에서 사용되도록 컴파일해야 한다. 모든 서열 비교 매개변수는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 변경되지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 경우, 주어진 아미노산 서열 B에, 이와 관련한, 또는 이에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 %는 (다른 방식으로, 주어진 아미노산 서열 B에, 이와 관련한, 또는 이에 대한 특정 아미노산 서열 동일성 %를 가지거나 또는 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 표현될 수 있음) 하기와 같이 계산된다:
100 x 분율 X/Y
이때 X는 A 및 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 매치로 기록되는 아미노산 잔기의 수를 말하며, Y는 B의 전체 아미노산 잔기 수가 된다. 아미노산 서열 A의 길이는 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않는 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %는 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 동일하지 않은 것으로 이해될 것이다. 이와 다르게 특별히 명시되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 % 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 바로 전 단락에서 설명된 바와 같이 수득된다.
용어 “약학적 제제”는 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 허용하는 형태이고, 상기 제제가 투여될 대상체에게 허용 불가능할 정도로 독성인 추가 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
약학적으로 허용가능한 담체는 활성 성분 이외에 약학 제제 안에 있는 성분을 말하며, 대상체에게 비독성이다. 약학적으로 허용되는 담체는 완충액, 부형제, 안정화제, 또는 보존제이다.
본원에서 사용된 "치료"(및 이의 문법적 변형, 예컨대 "치료하다" 또는 "치료하는")는 치료받는 개체의 자연적 과정을 변화시키기 위한 시도에서의 임상적 개입을 말하며, 예방을 위해 또는 임상 병리 과정동안 실시될 수 있다. 치료의 바람직한 효과에는 질환의 발생 또는 재발의 방지, 증상의 완화, 상기 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질환 진행 속도의 감소, 상기 질환 상태의 개선 또는 경감, 그리고 차도 또는 개선된 예후가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예들에서, 본 발명의 항체는 질환의 발병을 지연시키거나 질환의 진행을 늦추기 위해 사용된다.
“가변 영역” 또는 “가변 도메인”은 항체가 항원에 결합하는데 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄 도메인을 말한다. 선천적 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각, VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 갖는데, 각 도메인이 4개의 보존된 프레임워크 영역(FRs) 및 3개의 초가변 영역(CDRs)을 포함한다. (예컨대, Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91을 참조) 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원 결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는 각각 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 선별검사하기 위해, 항원에 결합하는 항체로부터 VH 또는 VL 도메인을 이용하여 단리될 수 있다. 예컨대, Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628)을 참조한다.
본원에서 사용된 용어 "벡터"는 연결되는 다른 핵산을 전파시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자가 복제 핵산 구조의 벡터 뿐만 아니라 이것이 도입되어 있는 숙주 세포의 게놈 내부에 통합된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터를 본원에서 “발현 벡터"라고 한다.
I. 조성물 및 방법들
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 이중특이적 항체가 제1 및 제2 항원 결합 부위/모이어티로서 상이한 항-CCL2 항원 결합 부위를 사용한다는 발견에 부분적으로 기초한다. 이러한 항-CCL2 항체는 CCL2의 특정 에피토프에 높은 특이성으로 결합하고, CCL2가 이의 수용체 CCR2에 결합하는 것을 특이적으로 억제하는 능력이 있다. 이들은 단일특이적 항체와 비교하여 개선된 면역 복합체 형성 및 생체내 개선된 CCL2 폐기를 나타낸다.
이중특이적 항-CCL2 항체
이중특이적 항체
본원에 기재된 바와 같은 이중특이적 항체는 CCL2 상의 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 단일클론 항체이다.
다중특이적 및 이중특이적 항체를 제조하기 위한 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 동시 발현(Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)을 참조), 및 "구멍 내 돌기(knob-in-hole)" 공학(예컨대, 미국 특허 제5,731,168호 및 Atwell et al., J. Mol. Biol. 270:26 (1997)을 참조)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 다중특이적 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위한 정전기 스티어링 효과를 가공하고(예컨대, WO 2009/089004를 참조); 2개 이상의 항체 또는 단편을 가교 결합하고(예컨대, 미국 특허 제 4,676,980호 및 Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)을 참조); 류신 지퍼를 사용하여 이중특이적 항체를 형성하고(예컨대, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992) 및 WO 2011/034605를 참조); 경쇄 쌍형성 오류 문제를 우회하기 위한 일반적인 경쇄 기술 사용하고(예컨대, WO 98/50431을 참조); 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 "디아바디" 기술을 사용하고(예컨대, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)을 참조); 단일 사슬 Fv(sFv) 이량체 사용하며(예컨대, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)을 참조); 및, 예컨대, Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)에서 기재된 바와 같은 삼중특이적 항체를 제조하여 만들 수 있다.
예를 들어, “옥토퍼스 항체” 또는 DVD-Ig를 포함한 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 가공된 항체 또한 본원에 포함된다(예컨대, WO 2001/77342 및 WO 2008/024715를 참조). 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 다중특이적 항체의 다른 예는 WO 2010/115589, WO 2010/112193, WO 2010/136172, WO 2010/145792 및 WO 2013/026831에서 발견될 수 있다. 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 또한 CCL2뿐만 아니라 다른 상이한 항원, 또는 CCL2의 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 “이중 작용 FAb” 또는 “DAF”를 포함한다(예컨대, 미국 2008/0069820 및 WO 2015/095539를 참조).
다중특이적 항체는 또한 동일한 항원 특이성의 하나 이상의 결합 팔에서 도메인 교차로, 즉, VH/VL 도메인(예컨대, WO 2009/080252 및 WO 2015/150447을 참조), CH1/CL 도메인(예컨대, WO 2009/080253을 참조) 또는 크로스맵(CrossMab)이라고도 하는 완전한 Fab 팔(예컨대, WO 2009/080251, WO 2016/016299를 참조, 또한 Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 1187-1191 및 Klein at al., MAbs 8 (2016) 1010-20을 참조)을 교환함으로써 비대칭적 형태로 제공될 수 있다. 비대칭 결합 팔은 또한 올바른 Fab 쌍형성을 지시하기 위해 도메인 계면 내로 하전 또는 비하전 아미노산 돌연변이를 도입함으로써 조작될 수 있다. 예컨대, WO 2016/172485를 참조.
다중특이적 항체에 대한 다양한 추가의 분자 형식은 당해 분야에서 공지되어 있으며, 본원에 포함된다(예컨대, Spiess et al., Mol. Immunol. 67 (2015) 95-106을 참조).
바람직한 이중특이적 항체 형식.
본 발명의 특정 구현예들에 따라서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 동일한 항원 특이성의 하나 이상의 결합 팔에서 도메인 교차로, 즉, VH/VL 도메인(예컨대, WO 2009/080252 및 WO 2015/150447을 참조), CH1/CL 도메인(예컨대, WO 2009/080253을 참조) 또는 완전한 Fab 팔(예컨대, WO 2009/080251, WO 2016/016299를 참조, 또한 Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 1187-1191 및 Klein at al., MAbs 8 (2016) 1010-20을 참조)을 교환함으로써 제공될 수 있다.
이러한 이중특이적 항체, 특히 VH/VL 도메인의 교환을 갖는 항체에서의 전하 변형(WO 2015/150447을 참조): 본 발명의 이중특이적 항체는 그 안에 포함된 Fab 분자 내에 아미노산 치환을 포함할 수 있는데, 이들 치환은 그들의 결합 팔 중 하나(또는 2개 이상의 항원 결합 Fab 분자를 포함하는 분자의 경우에는, 그 이상)에서 VH/VL 교환을 갖는 Fab 기반의 이중/항체의 생산에서 일어날 수 있는, 경쇄의 비정합 중쇄와의 쌍형성 오류(Bence-Jones 유형 부산물)을 감소시키는 데 특히 효율적이다(또한, 본원 전체에 원용된 PCT 공개 번호 WO 2015/150447, 특히 이의 실시예를 참조). 결합 팔 중 하나에서 VH/VL 도메인 교환을 갖는 이중특이적 항체에서 발생하는 바람직하지 않은 부산물, 특히 Bence Jones 유형 부산물과 비교하여 원하는 이중특이적 항체의 비율은 CH1 및 CL 도메인 내에 특이적 아미노산 위치에서 반대 전하를 갖는 하전된 아미노산의 도입(때때로 본원에서 “전하 변형”으로서 지칭됨)에 의해 향상될 수 있다.
이에 따라, 이중특이적 항체의 제1 및 제2 항원 결합 모이어티가 둘 모두 Fab 분자이고, 이들 항원 결합 모이어티 중 하나(특히 제2 항원 결합 모이어티)에서 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되는 일부 구현예들에서,
i) 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 양당처으로 하전된 아미노산에 의해 치환되고(카바트에 따른 넘버링), 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산 또는 위치 213에서 아미노산이 음으로 하전된 아미노산에 의해 치환되거나(카바트 EU 색인에 따른 넘버링); 또는
ii) 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 양으로 하전된 아미노산에 의해 치환되고 (카바트에 따른 넘버링), 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산 또는 위치 213에서 아미노산이 음으로 하전된 아미노산에 의해 치환된다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).
이중특이적 항체는 i) 및 ii) 하에 언급된 변형 둘 모두를 포함하지 않는다. VH/VL 교환을 갖는 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로에 의해 대체되지 않는다 (즉, 교환되지 않은 상태로 남아있다).
더 구체적인 구현예에서,
i) 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카바트에 따른 넘버링), 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산 또는 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)에 의해 독립적으로 치환되거나(카바트 EU 색인에 따른 넘버링); 또는
ii) 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이리신 (K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카바트에 따른 넘버링), 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산 또는 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)에 의해 독립적으로 치환된다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).
상기 일 구현예에서, 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카바트에 따른 넘버링), 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산 또는 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)에 의해 독립적으로 치환된다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).
추가의 구현예서, 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카바트에 따른 넘버링), 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)에 의해 독립적으로 치환된다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).
특정 구현예에서, 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 색인에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 색인에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환된다.
더 특정한 구현예에서, 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)에 의해 치환되고(카바트에 따른 넘버링), 위치 123에서 아미노산이 리신(K)에 의해 치환되며(카바트에 따른 넘버링), 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산 (E)에 의해 치환되고(카바트 EU 색인에 따른 넘버링), 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)에 의해 치환된다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).
보다 더 특정한 구현예에서, 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)에 의해 치환되고(카바트에 따른 넘버링), 위치 123에서 아미노산이 아르기닌(R)에 의해 치환되며(카바트에 따른 넘버링), 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산 (E)에 의해 치환되고(카바트 EU 색인에 따른 넘버링), 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)에 의해 치환된다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).
특정한 구현예들에서, 만약 상기 구현예들에 따른 아미노산 치환이 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1에서 만들어지는 경우, 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL은 카파 동형이다.
대안적으로, 상기 구현예들에 따른 아미노산 치환은 제1 항원 결합 도메인의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1 대신에 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1에서 만들어질 수 있다. 특히, 상기 구현예들에서, 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL은 카파 동형이다.
이에 따라, 일 구현예에서, 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카바트에 따른 넘버링), 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산 또는 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)에 의해 독립적으로 치환된다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).
추가의 구현예서, 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카바트에 따른 넘버링), 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)에 의해 독립적으로 치환된다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).
또 다른 구현예에서, 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 색인에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 색인에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환된다.
일 구현예에서, 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)에 의해 치환되고(카바트에 따른 넘버링), 위치 123에서 아미노산이 리신(K)에 의해 치환되며(카바트에 따른 넘버링), 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E)에 의해 치환되고(카바트 EU 색인에 따른 넘버링), 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)에 의해 치환된다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).
다른 구현예에서, 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)에 의해 치환되고(카바트에 따른 넘버링), 위치 123에서 아미노산이 아르기닌(R)에 의해 치환되며(카바트에 따른 넘버링), 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E)에 의해 치환되고(카바트 EU 색인에 따른 넘버링), 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)에 의해 치환된다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).
상기 비대칭(이종이량체) 단백질의 Fc 도메인의 이종이량체화를 개선하기 위해, 본 발명의 상기 양태들에 따른 일 구현예에서, Fc 도메인의 제1 아단위 내에 위치 366에서 트레오닌 잔기가 트립토판 잔기(T366W)로 대체되고, Fc 도메인의 제2 아단위 내에 위치 407에서 티로신 잔기가 발린 잔기(Y407V)로 대체되며, 임의적으로 위치 366에서 트레오닌 잔기가 세린 잔기(T366S)로 대체되고, 위치 368에서 류신 잔기가 알라닌 잔기(L368A)로 대체된다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).
본 발명의 상기 양태들에 따른 추가의 구현예에서, Fc 도메인의 제1 아단위 내에 추가적으로 위치 354에서 세린 잔기가 시스테인 잔기(S354C)로 대체되거나, 또는 위치 356에서 글루타민산 잔기가 시스테인 잔기(E356C)로 대체되며(특히, 위치 354에서 세린 잔기가 시스테인 잔기로 대체되며), Fc 도메인의 제2 아단위 내에 추가적으로 위치 349에서 티로신 잔기가 시스테인 잔기(Y349C)에 의해 대체된다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).
대안적인 이종이량체화 기술은 하기의 "Fc 도메인" 하에 기재되며, 또한 본 발명의 추가 구현예들로서 고려된다.
본 발명의 상기 양태들에 따른 다른 추가의 구현예에서, Fc 도메인은 인간 IgG1 Fc 도메인이다.
Fc 도메인 및 변형들
특정 구현예들에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함한다. 이중특이적 항체와 관련하여 본원에 기재된 Fc 도메인의 특징은 본 발명의 항체에 포함된 Fc 도메인에 동일하게 적용될 수 있는 것으로 이해된다.
이중특이적 항체의 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 중쇄 도메인을 포함하는 한 쌍의 폴리펩티드 사슬로 구성된다. 예를 들어, 면역글로불린 G(IgG) 분자의 Fc 도메인은 이량체이며, 이의 각 아단위는 CH2 및 CH3 IgG 중쇄 불변 도메인을 포함한다. Fc 도메인의 2개 아단위는 서로 안정되게 결합할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 단지 하나의 Fc 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 이중특이적 항체의 Fc 도메인은 IgG Fc 도메인이다. 특정한 구현예에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 다른 구현예에서 Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인이다. 더 구체적인 구현예에서, Fc 도메인은 위치 S228(카바트 EU 색인 넘버링)에서 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 S228P를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 상기 아미노산 치환은 IgG4 항체의 생체내 Fab 팔 교환을 감소시킨다(Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)을 참조). 더 특정한 구현예에서, Fc 도메인은 인간 Fc 도메인이다. 보다 더 특정한 구현예에서, Fc 도메인은 인간 IgG1 Fc 도메인이다.
IgG 동형의 Fc 도메인은 이의 Fc 감마 수용체 또는 신생아 Fc 수용체(FcRn)와의 상호작용을 기반으로 하는 다양한 특성을 갖는 것을 특징으로 한다(예컨대, Vidarsson et al.; Front Immunol 5 ( 2014) Article 520, 1-17을 참조).
이종이량체화를 촉진하는 Fc 도메인 변형
본 발명에 따른 이중특이적 항체는 Fc 도메인의 2개 아단위 중 하나 또는 다른 하나에 융합될 수 있는 상이한 항원 결합 도메인을 포함하고, 따라서 Fc 도메인의 2개의 아단위는 전형적으로 2개의 비동일한 폴리펩티드 사슬 내에 포함된다. 상기 폴리펩티드의 재조합 공동발현 및 이후의 이량체화는 상기 2개의 폴리펩티드의 여러 가능한 조합을 유발한다. 재조합 생성에서 이중특이적 항체의 수율과 순도를 향상시키기 위해, 원하는 폴리펩티드의 결합을 증진시키는 변형을 이중특이적 항체의 Fc 도메인에 도입하는 것이 유리할 것이다.
이에 따라, 특정 구현예들에서, 본 발명에 따른 이중특이적) 항체의 Fc 도메인은 Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위의 결합을 증진시키는 변형을 포함한다. 인간 IgG Fc 도메인의 2개 아단위 사이에서 가장 광범위한 단백질-단백질 상호작용의 부위는 Fc 도메인의 CH3 도메인 내에 있다. 따라서, 일 구현예에서 상기 변형은 Fc 도메인의 CH3 도메인 내에 있다.
이종이량체화를 실시하기 위한 Fc 도메인의 CH3 도메인에서 변형을 위한 여러 접근법이 존재하는데, 이들은 예컨대, WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012058768, WO 2013157954, WO 2013096291에서 충분히 설명된다. 전형적으로, 이와 같은 모든 접근법에서 Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인 및 Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인은 각 CH3 도메인(또는 이를 포함하는 중쇄)이 그 자체로는 더 이상 동종이량체를 형성할 수 없지만, 상보적으로 가공된 다른 CH3 도메인과 이종이량체를 형성하도록 강제되도록(제1 및 제2 CH3 도메인이 이종이량체를 형성하고, 2개의 제1 또는 2개의 제2 CH3 도메인 사이에 어떤 동종이량체도 형성되지 않도록), 둘 모두 상보성 방식으로 가공된다. 향상된 중쇄 이종이량체화를 위한 상기 상이한 접근법들은 중쇄/경쇄 쌍형성 오류 및 Bence Jones 유형 부산물을 감소시키는, 이중특이적 항체에서 중쇄-경쇄 변형(예컨대, 하나의 결합 팔에서 VH와 VL 교환/대체 및 CH1/CL 인터페이스에서 반대 전하를 갖는 하전된 아미노산의 치환의 도입)과 조합으로 상이한 대안으로서 고려된다.
특정한 구현예에서, Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위의 결합을 증진시키는 상기 변형은 Fc 도메인의 2개 아단위 중 하나에서 “돌기” 변형 및 Fc 도메인의 2개 아단위 중 다른 하나에서 “구멍” 변형을 포함하는, 이른바 “구멍 내 돌기” 변형이다.
구멍 내 돌기 기술은, 예를 들어 US 5,731,168; US 7,695,936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) 및 Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)에서 설명된다. 일반적으로, 상기 방법은 이종이량체 형성을 증진하고 동종이량체 형성을 방해하기 위해 융기가 가공동 내에 배치될 수 있도록, 융기(“돌기”)를 제1 폴리펩티드의 계면에서, 그리고 상응하는 공동(“구멍”)을 제2 폴리펩티드의 계면 내에 도입하는 것을 수반한다. 융기는 제1 폴리펩티드의 계면으로부터 작은 아미노산 측쇄를 더욱 큰 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체함으로써 구축된다. 융기와 동일한 또는 유사한 크기의 보상성 공동은 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 제2 폴리펩티드의 계면 내에 창출된다.
이에 따라, 특정 구현예에서, 이중특이적 항체의 Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기가 더 큰 측쇄 용적을 갖는 아미노산 잔기로 대체됨으로써, 제2 아단위의 CH3 도메인 내에 공동에서 위치가능한 제1 아단위의 CH3 도메인 내에 융기가 형성되고, Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기가 더 작은 측쇄 용적을 갖는 아미노산 잔기로 대체됨으로써, 제1 아단위의 CH3 도메인 내에 융기가 위치가능한 제2 아단위의 CH3 도메인 내에 공동이 형성된다.
바람직하게는, 더 큰 측쇄 용적을 갖는 상기 아미노산 잔기는 아르기닌(R), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 및 트립토판(W)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 더 작은 측쇄 용적을 갖는 상기 아미노산 잔기는 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T) 및 발린(V)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
융기 및 공동은 폴리펩티드를 부호화하는 핵산을, 예컨대 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해, 또는 펩티드 합성에 의해 변경함으로써 만들어질 수 있다.
특정한 구현예에서, Fc 도메인의 제1 아단위(“돌기” 아단위)(이의 CH3 도메인)에서 위치 366에서 트레오닌 잔기가 트립토판 잔기(T366W)로 대체되고, Fc 도메인의 제2 아단위(“구멍" 아단위)(이의 CH3 도메인)에서 위치 407에서 티로신 잔기가 발린 잔기(Y407V)로 대체된다. 일 구현예에서, Fc 도메인의 제2 아단위에서 추가적으로 위치 366에서 트레오닌 잔기가 세린 잔기(T366S)로 대체되고, 위치 368에서 류신 잔기가 알라닌 잔기(L368A)로 대체된다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).
다른 추가의 구현예에서, Fc 도메인의 제1 아단위 내에 추가적으로 위치 354에서 세린 잔기가 시스테인 잔기(S354C)로 대체되거나, 또는 위치 356에서 글루타민산 잔기가 시스테인 잔기(E356C)로 대체되고(특히, 위치 354에서 세린 잔기가 시스테인 잔기로 대체되고), Fc 도메인의 제2 아단위 내에 추가적으로 위치 349에서 티로신 잔기가 시스테인 잔기(Y349C)로 대체된다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링). 상기 2개의 시스테인 잔기의 도입은 Fc 도메인의 2개 아단위 사이에 이황화 다리의 형성을 유발하여, 이량체를 더 안정시킨다(Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).
특정 구현예에서, Fc 도메인의 제1 아단위는 아미노산 치환 S354C 및 T366W를 포함하고, Fc 도메인의 제2 아단위는 아미노산 치환 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V(카바트 EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다.
특정 구현예에서, 제2 항원에 결합하는 항원 결합 모이어티는 Fc 도메인의 제1 아단위 (“돌기” 변형을 포함)에 융합된다(선택적으로, CCL2 및/또는 펩티드 링커에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티를 통해). 이론에 얽매이지 않고, Fc 도메인의 돌기 함유 아단위에, 제2 항원, 예컨대 활성화 T 세포 항원에 결합하는 항원 결합 모이어티의 융합은 활성화 T 세포 항원에 결합하는 2개의 항원 결합 모이어티를 포함하는 항체의 생성(2개의 돌기 함유 폴리펩티드의 입체 충돌)을 (더) 최소화할 것이다.
이종이량체화를 실시하기 위한 CH3 변형의 다른 기술이 본 발명에 따른 대안으로서 고려되고, 예를 들어 WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291에서 설명된다.
일 구현예에서, EP 1870459에서 기재된 이종이량체화 접근법이 대안적으로 이용된다. 상기 접근법은 Fc 도메인의 2개 아단위 사이에서 CH3/CH3 도메인 계면 내에 특정한 아미노산 위치에서 반대 전하를 갖는 하전된 아미노산의 도입에 기초한다. 본 발명의 이중특이적 항체에 대한 바람직한 일 구현예는 아미노산 돌연변이 R409D; 2개의 CH3 도메인(Fc 도메인의) 중 하나에서 K370E 및 아미노산 돌연변이 D399K; Fc 도메인의 CH3 도메인 중 다른 하나에서 E357K이다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).
다른 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 T366W 및 Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 T366S, L368A, Y407V, 그리고 부가적으로 아미노산 돌연변이 R409D; Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인에서 K370E 및 아미노산 돌연변이 D399K; Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인에서 E357K을 포함한다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).
다른 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 S354C, T366W 및 Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 Y349C, T366S, L368A, Y407V를 포함하거나, 또는 상기 이중특이적 항체는 Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 Y349C, T366W 및 Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 S354C, T366S, L368A, Y407V, 그리고 부가적으로 아미노산 돌연변이 R409D; Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인에서 K370E 및 아미노산 돌연변이 D399K; Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인에서 E357K를 포함한다(이들 모두 카바트 EU 색인에 따른 넘버링).
일 구현예에서, WO 2013/157953에 기재된 이종이량체화 접근법이 대안적으로 이용된다. 일 구현예에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366K를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 L351D를 포함한다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링). 추가의 구현예에서, 제1 CH3 도메인은 추가 아미노산 돌연변이 L351K를 포함한다. 추가의 구현예에서, 제2 CH3 도메인은 Y349E, Y349D 및 L368E로부터 선택되는 아미노산 돌연변이(바람직하게는 L368E)를 더 포함한다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).
일 구현예에서, WO 2012/058768에 기재된 이종이량체화 접근법이 대안적으로 이용된다. 일 구현예에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 L351Y, Y407A를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366A, K409F를 포함한다. 추가의 구현예에서, 제2 CH3 도메인은 위치 T411, D399, S400, F405, N390 또는 K392에서, 예컨대 a) T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E 또는 T411W, b) D399R, D399W, D399Y 또는 D399K, c) S400E, S400D, S400R 또는 S400K, d) F405I, F405M, F405T, F405S, F405V 또는 F405W, e) N390R, N390K 또는 N390D, f) K392V, K392M, K392R, K392L, K392F 또는 K392E로부터 선택되는 추가 아미노산 돌연변이를 포함한다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링). 추가의 구현예에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 L351Y, Y407A를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366V, K409F를 포함한다. 추가의 구현예에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 Y407A를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366A, K409F를 포함한다. 추가의 구현예에서, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 K392E, T411E, D399R 및 S400R을 더 포함한다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).
일 구현예에서, WO 2011/143545에 기재된 이종이량체화 접근법이, 예컨대 368 및 409(카바트 EU 색인에 따른 넘버링)로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에서 아미노산 변형으로, 대안적으로 이용된다.
일 구현예에서, 전술한 구멍 내 돌기 기술을 또한 이용하는, WO 2011/090762에 기재된 이종이량체화 접근법이 대안적으로 이용된다. 일 구현예에서, 제 1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366W를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 Y407A를 포함한다. 일 구현예에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366Y를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 Y407T를 포함한다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).
일 구현예에서, 이중특이적 항체 또는 이의 Fc 도메인은 IgG2 하위부류의 것이고, WO 2010/129304에 기재된 이종이량체화 접근법이 대안적으로 이용된다.
대안적 구현예에서, Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위의 결합을 증진시키는 변형은, 예컨대 PCT 공개 WO 2009/089004에 기재된 바와 같이, 정전 스티어링 효과를 매개하는 변형을 포함한다. 일반적으로, 이러한 방법은 동종이량체 형성이 정전기적으로 불리하지만 이종이량체화는 정전기적으로 유리하게 되도록, 하전된 아미노산 잔기에 의한 2개의 Fc 도메인 아단위의 계면에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 대체를 수반한다. 상기 일 구현예에서, 제1 CH3 도메인은 음으로 하전된 아미노산(예컨대, 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D), 바람직하게는 K392D 또는 N392D)으로 K392 또는 N392의 아미노산 치환을 포함하고, 제2 CH3 도메인은 양으로 하전된 아미노산(예컨대, 리신(K) 또는 아르기닌(R), 바람직하게는 D399K, E356K, D356K 또는 E357K, 더 바람직하게는 D399K 및 E356K)으로 D399, E356, D356 또는 E357의 아미노산 치환을 포함한다. 추가의 구현예에서, 제1 CH3 도메인은 음으로 하전된 아미노산(예컨대, 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D), 바람직하게는 K409D 또는 R409D)으로 K409 또는 R409의 아미노산 치환을 더 포함한다. 추가의 구현예에서, 제1 CH3 도메인은 음으로 하전된 아미노산(예컨대, 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D))으로 K439 및/또는 K370의 아미노산 치환(이들 모두 카바트 EU 색인에 따른 넘버링)을 추가적으로 또는 대안적으로 포함한다.
다른 추가의 구현예에서, WO 2007/147901에 기재된 이종이량체화 접근법이 대안적으로 이용된다. 일 구현예에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 K253E, D282K 및 K322D를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 D239K, E240K 및 K292D를 포함한다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).
또 다른 구현예에서, WO 2007/110205에 기재된 이종이량체화 접근법이 대안적으로 이용될 수 있다.
일 구현예에서, Fc 도메인의 제1 아단위는 아미노산 치환 K392D 및 K409D를 포함하고, Fc 도메인의 제2 아단위는 아미노산 치환 D356K 및 D399K를 포함한다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).
이중특이적 항-CCL2 항체에 대해 본원에 사용된 용어 "야생형(WT) IgG 또는 IgG1"은 이종이량체화를 촉진하는 상기 기재된 변형/돌연변이를 포함할 수 있지만 하기 기재된 바와 같이 Fc 수용체 결합 및/또는 작동체 기능을 증가시키거나 감소시키는 추가의 Fc 도메인 변형/돌연변이를 포함하지는 않는 IgG 또는 IgG1 불변 중쇄를 포함하는 이중특이적 항체를 지칭한다.
Fc 수용체 결합 및/또는 작동체 기능을 증가시키거나 감소시키는 Fc 도메인 변형/돌연변이
스위핑 기술을 통한 이중특이적 항-CCL2 항체의 변형
이중특이적 항-CCL2 항체는 이중특이적 항-CCL2 항체가 장기간에 걸쳐 유리 CCl2를 제거하여 생체 내에서 항암 효능과 같은 생물학적 효과를 지속할 수 있도록 하는 스위핑 기술을 사용하여 변형되었다.
스위핑의 개념은, 예컨대 Igawa et al, Immunological Reviews 270 (2016) 132-151, WO2012/122011, WO2016/098357, 및 WO2013/081143에서 기재되며, 이는 본원에 원용된다.
본 발명은 전술한 항체의 산성 pH 범위의 항원 결합 활성(결합능)을 이의 중성 pH 범위의 항원 결합 활성 미만으로 저하시킴으로써 항체 매개 항원의 세포 내로의 흡수를 용이하게 하는 방법을 제공한다; 이는 항원의 세포 내 흡수를 촉진한다. 본 발명은 또한 항원의 세포 내 흡수를 촉진하는 상술한 항체의 항원 결합 도메인 내 적어도 하나의 아미노산을 변경하는 것을 기초로 하는, 항체 매개 항원의 세포 내 흡수를 촉진하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 항원의 세포 내 흡수를 촉진하는 상술한 항체의 항원 결합 도메인 내로 적어도 하나의 아미노산에 대한 히스티딘을 치환하거나 적어도 하나의 히스티딘을 삽입하는 것을 기초로 하는, 항체 매개 항원의 세포 내 흡수를 촉진하는 방법을 제공한다.
본원에서, 항체에 의해 매개되는 "항원의 세포 내 흡수"는 항원이 세포내 이입에 의해 세포내로 흡수되는 것을 의미한다. 한편, 본원에서 "세포 내 흡수를 촉진한다"는 것은 혈장 중 항원에 결합된 항체의 세포 내 흡수율이 증가되거나, 및/또는 흡수된 항원이 혈장으로 재순환되는 양이 감소됨을 의미한다. 이는 중성 pH 범위의 항체의 인간 FcRn 결합 활성을 증가시키기 전에, 또는 인간 FcRn 결합 활성을 증가시키고 산성 pH 범위의 항체의 항원 결합 활성(결합능)을 이의 중성 pH 범위의 항원 결합 활성 미만으로 저하시키기 전에 항체와 비교하여 세포 내 흡수율이 촉진됨을 의미한다. 상기 비율은 바람직하게는 원형 인간 IgG와 비교하여, 더 바람직하게는 원형 인간 IgG와 비교하여 개선된다. 따라서, 본 발명에서는 항체에 의해 항원의 세포 내 흡수가 촉진되는지 여부를 항원의 세포 내 흡수율의 증가를 기초로 평가할 수 있다. 항원의 세포 내 흡수율은, 예를 들어 배지에 항원 및 항체를 첨가한 후 인간 FcRn 발현 세포를 함유하는 배양 배지에서 항원 농도의 경시적 감소를 모니터링함으로써, 또는 시간 경과에 따른 항원의 인간 FcRn 발현 세포 내 흡수량을 모니터링함으로써 계산할 수 있다. 항체 매개 항원의 세포 내 흡수율을 촉진하기 위한 본 발명의 방법을 사용하여, 예를 들어 혈장으로부터 항원 제거율은 항체를 투여함으로써 향상될 수 있다. 따라서, 항체 매개 항원의 세포 내 흡수가 촉진되는지 여부는, 예를 들어 혈장으로부터의 항원 제거율이 가속화되는지 여부 또는 항체를 투여함으로써 혈장 중 총 항원 농도가 감소되는지 여부를 시험함으로써 평가할 수도 있다.
본원에서, "혈장 중 총 항원 농도"는 항체 결합된 항원 및 비결합된 항원 농도의 합 또는 항체 비결합된 항원 농도인 "혈장 중 유리 항원 농도"를 의미한다. "혈장 중 총 항원 농도" 또는 "혈장 중 유리 항원 농도"를 측정하는 다양한 방법이 하기에 기재된 바와 같이 당업계에 일반적으로 공지되어 있다.
본원에서 사용된 "원형 인간 IgG"(또는 "야생형(WT) 인간 IgG)는 비변형된(상기 이종이량체화에 대한 잠재적인 변형에 대해서는 제외) 인간 IgG를 의미하며 특정 부류의 IgG로 제한되지 않는다. 이는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4가 산성 pH 범위의 인간 FcRn에 결합할 수 있는 한 "원형 인간 IgG"로서 사용될 수 있음을 의미한다. 바람직하게는, "원형 인간 IgG"는 인간 IgG1일 수 있다.
본 발명은 또한 단일 항체가 결합할 수 있는 항원의 수를 증가시키는 방법을 제공한다. 더 구체적으로, 본 발명은 중성 pH 범위의 항체의 인간 FcRn 결합 활성을 증가시킴으로써 산성 pH 범위의 인간 FcRn 결합 활성을 갖는 단일 항체가 결합할 수 있는 항원의 수를 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 항체의 인간 FcRn 결합 도메인 내 적어도 하나의 아미노산을 변경함으로써 산성 pH 범위의 인간 FcRn 결합 활성을 갖는 단일 항체가 결합할 수 있는 항원의 수를 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 항체 매개 항원의 세포 내 흡수를 촉진하는 방법을 제공한다. 더 구체적으로, 본 발명은 중성 pH 범위의 항체의 인간 FcRn 결합 활성을 증가시키는 것에 기초하여 산성 pH 범위의 인간 FcRn 결합 활성을 갖는 항체에 의한 항원의 세포 내 흡수를 촉진하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 항체의 인간 FcRn 결합 도메인 내 적어도 하나의 아미노산을 변경하는 것에 기초하여 산성 pH 범위의 인간 FcRn 결합 활성을 갖는 항체에 의한 항원의 세포 내 흡수를 개선하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 모 IgG의 Fc 도메인을 포함한 인간 FcRn 결합 도메인의 모 IgG Fc 도메인 내 존재하는 위치 237, 238, 239, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 270, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 325, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434, 및 436(EU 넘버링)으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산에 대하여 상이한 아미노산의 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 인간 FcRn 결합 도메인을 이용하는 것에 기초하여, 산성 pH 범위의 인간 FcRn 결합 활성을 갖는 항체에 의한 항원의 세포 내 흡수를 촉진하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 전술한 항체의 산성 pH 범위의 항원 결합 활성(결합능)을 이의 중성 pH 범위의 항원 결합 활성 미만으로 저하시킴으로써 항체 매개 항원의 세포 내로의 흡수를 용이하게 하는 방법을 제공한다; 이는 세포로의 항원 흡수를 촉진한다. 본 발명은 또한 세포 내로의 항원 흡수를 촉진하는 상술한 항체의 항원 결합 도메인 내 적어도 하나의 아미노산을 변경하는 것을 기초로 하는, 항체 매개 항원의 세포 내로의 흡수를 촉진하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 세포 내로의 항원 흡수를 촉진하는 상술한 항체의 항원 결합 도메인 내로 적어도 하나의 아미노산에 대한 히스티딘을 치환하거나 적어도 하나의 히스티딘을 삽입하는 것을 기초로 하는, 항체 매개 항원의 세포 내로의 흡수를 촉진하는 방법을 제공한다.
본원에서, 항체에 의해 매개되는 "세포 내로의 항원 흡수"는 항원이 세포내 이입에 의해 세포내로 흡수되는 것을 의미한다. 한편, 본원에서 "세포 내로의 흡수를 촉진한다"는 것은 혈장 중 항원에 결합된 항체의 세포내 흡수율이 증가되거나, 및/또는 흡수된 항원이 혈장으로 재순환되는 양이 감소됨을 의미한다. 이는 중성 pH 범위의 항체의 인간 FcRn 결합 활성을 증가시키기 전에, 또는 인간 FcRn 결합 활성을 증가시키고 산성 pH 범위의 항체의 항원 결합 활성(결합능)을 이의 중성 pH 범위의 항원 결합 활성 미만으로 저하시키기 전에 항체와 비교하여 세포 내로의 흡수율이 촉진됨을 의미한다. 상기 비율은 바람직하게는 원형 인간 IgG와 비교하여, 더 바람직하게는 원형 인간 IgG와 비교하여 개선된다. 따라서, 본 발명에서는 항체에 의해 항원의 세포 내로의 흡수가 촉진되는지 여부를 세포 내로의 항원 흡수율의 증가를 기초로 평가할 수 있다. 항원의 세포 내 흡수율은, 예를 들어 배지에 항원 및 항체를 첨가한 후 인간 FcRn 발현 세포를 함유하는 배양 배지에서 항원 농도의 경시적 감소를 모니터링함으로써, 또는 시간 경과에 따른 항원의 인간 FcRn 발현 세포 내 흡수량을 모니터링함으로써 계산할 수 있다. 항체 매개 항원의 세포 내 흡수율을 촉진하기 위한 본 발명의 방법을 사용하여, 예를 들어 혈장으로부터 항원 제거율은 항체를 투여함으로써 향상될 수 있다. 따라서, 항체 매개 항원의 세포 내 흡수가 촉진되는지 여부는, 예를 들어 혈장으로부터의 항원 제거율이 가속화되는지 여부 또는 항체를 투여함으로써 혈장 중 총 항원 농도가 감소되는지 여부를 시험함으로써 평가할 수도 있다.
본원에서, "혈장 중 총 항원 농도"는 항체 결합된 항원 및 비결합된 항원 농도의 합 또는 항체 비결합된 항원 농도인 "혈장 중 유리 항원 농도"를 의미한다. "혈장 중 총 항원 농도" 또는 "혈장 중 유리 항원 농도"를 측정하는 다양한 방법이 하기에 기재된 바와 같이 당업계에 일반적으로 공지되어 있다.
본원에서 사용된 "원형 인간 IgG"(또는 "야생형 IgG)는 비변형된 인간 IgG(상기 이종이량체화에 대한 잠재적인 변형에 대해서는 제외)를 의미하며 특정 부류의 IgG로 제한되지 않는다. 이는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4가 산성 pH 범위의 인간 FcRn에 결합할 수 있는 한 "원형 인간 IgG"로서 사용될 수 있음을 의미한다. 바람직하게는, "원형 인간 IgG"는 인간 IgG1일 수 있다.
본원에서 사용된 "모 IgG"는 모 IgG의 변형된 변이체가 산성 pH 범위의 인간 FcRn에 결합할 수 있는 한 변이체를 생성하도록 후속적으로 변형되는 비변형된 IgG를 의미한다(따라서, 모 IgG는 산성 조건의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 반드시 필요로 하지는 않는다). 모 IgG는 자연 발생 IgG, 또는 자연 발생 IgG의 변이체 또는 조작된 버전일 수 있다. 모 IgG는 폴리펩티드 자체, 상기 모 IgG를 포함한 조성물, 또는 이를 부호화하는 아미노산 서열을 지칭할 수 있다. "모 IgG"는 하기에 개략된 바와 같이 공지된 상업적이고 재조합적으로 생성된 IgG를 포함한다는 점에 유의해야 한다. "모 IgG"의 기원은 제한되지 않으며 인간이 아닌 동물 또는 인간의 모든 유기체에서 수득할 수 있다. 바람직하게는, 유기체는 마우스, 래트, 기니피그, 햄스터, 저빌쥐, 고양이, 토끼, 개, 염소, 양, 소, 말, 낙타 및 비인간 영장류로부터 선택된다. 다른 구현예에서, "모 IgG"는 또한 시노몰구스, 마모셋, 레서스, 침팬지 또는 인간으로부터 수득될 수 있다. 바람직하게는, "모 IgG"는 인간 IgG1로부터 수득되지만, 특정 부류의 IgG에 제한되지는 않는다. 이는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4가 "모 IgG"로서 적절하게 사용될 수 있음을 의미한다. 유사한 방식으로, 임의의 유기체로부터의 임의의 부류 또는 하위 부류의 IgG는 바람직하게는 "모 IgG"로서 사용될 수 있다. 자연 발생 IgG의 변이체 또는 조작된 버전의 예는 Curr Opin Biotechnol. 2009 Dec; 20(6): 685-91, Curr Opin Immunol. 2008 Aug; 20(4): 460-70, Protein Eng Des Sel. 2010 Apr; 23(4): 195-202, WO 2009/086320, WO 2008/092117, WO 2007/041635 및 WO 2006/105338에 기재되어 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 또한 항체를 투여함으로써 혈장 항원 제거능을 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명에서, "혈장 항원 제거능을 증가시키는 방법"은 "혈장에서 항원을 제거하는 항체의 능력을 증가시키는 방법"과 동의어이다. 더 구체적으로, 본 발명은 중성 pH 범위의 항체의 인간 FcRn 결합 활성을 증가시킴으로써 산성 pH 범위의 인간 FcRn 결합 활성을 갖는 항체에 의해 혈장 항원 제거능을 증가시키는 방법을 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 항체의 인간 FcRn 결합 도메인 내 적어도 하나의 아미노산을 변경하는 것에 기초하여 산성 pH 범위의 인간 FcRn 결합 활성을 갖는 항체에 의한 혈장 항원 제거능을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상이한 아미노산을 갖는 모 IgG의 Fc 도메인을 포함한 인간 FcRn 결합 도메인의 모 IgG Fc 도메인 내 존재하는 위치 237, 238, 239, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 270, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 325, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434, 및 436(EU 넘버링)으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산의 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 인간 FcRn 결합 도메인을 이용함으로써, 산성 pH 범위의 인간 FcRn 결합 활성을 갖는 항체에 의한 혈장 항원 제거능을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 중성 pH 범위의 항원 결합 활성과 비교하여 혈장 항원 제거능이 개선된 상술된 항체의 산성 pH 범위의 항원 결합 활성을 감소시킴으로써, 항체에 의한 혈장 항원 제거능을 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 혈장 항원 제거능이 개선된 상술된 항체의 항원 결합 도메인 내 적어도 하나의 아미노산을 변경함으로써, 항체에 의한 혈장 항원 제거능을 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 혈장 항원 제거능이 개선된 상술된 항체의 항원 결합 도메인 내로 적어도 하나의 히스티딘을 삽입하거나 적어도 하나의 아미노산에 대해 히스티딘을 치환함으로써, 항체를 투여하여 혈장 항원 제거능을 증가시키는 방법을 제공한다.
본원에서, "혈장 항원 제거능"은 항체가 생체 내에서 투여 또는 분비될 때 혈장에서 항원을 제거하는 능력을 의미한다. 따라서, 본원의 “항체의 혈장 항원 제거능의 증가”는 중성 pH 범위의 항체의 인간 FcRn 결합 활성을 증가시키기 전, 또는 인간 FcRn 결합 활성을 증가시킴과 동시에 이의 산성 pH 범위의 항원 결합 활성을 중성 pH 범위의 활성 미만으로 감소시키기 전과 비교하여 항체 투여 시 혈장으로부터의 항원 제거율이 가속화되는 것을 의미한다. 혈장에서 항원을 제거하는 항체의 활성 증가는, 예를 들어 생체 내에서 가용성 항원 및 항체를 투여하고, 투여 후 혈장 중 가용성 항원의 농도를 측정함으로써 평가할 수 있다. 중성 pH 범위의 항체의 인간 FcRn 결합 활성을 증가시키거나, 인간 FcRn 결합 활성을 증가시킴과 동시에 산성 pH 범위의 이의 항원 결합 활성을 중성 pH 범위의 활성 미만으로 감소시킴으로써 가용성 항원 및 항체의 투여 후 혈장 중 가용성 항원의 농도가 감소될 때, 항체의 혈장 항원 제거능이 증가되는 것으로 판단할 수 있다. 가용성 항원의 형태는 이의 농도가 각각 "혈장 중 항체 결합된 항원의 농도" 및 "혈장 중 항체 비결합된 항원의 농도"로 결정될 수 있는 항체 결합된 항원 또는 항체 비결합된 항원일 수 있다(후자는 "혈장 중 유리 항원의 농도". "혈장 중 총 항원 농도"는 항체 결합된 항원 및 비결합된 항원 농도의 합 또는 항체 비결합된 항원 농도인 "혈장 중 유리 항원의 농도"를 의미하므로, 가용성 항원의 농도는 “혈장 중 총 항원 농도”로서 결정할 수 있다. "혈장 중 총 항원 농도" 또는 "혈장 중 유리 항원의 농도"를 측정하는 다양한 방법이 하기에 기재된 바와 같이 당업계에 일반적으로 공지되어 있다.
본 발명은 또한 항체의 약동학을 개선하는 방법을 제공한다. 더 구체적으로, 본 발명은 중성 pH 범위의 항체의 인간 FcRn 결합 활성을 증가시킴으로써 산성 pH 범위의 인간 FcRn 결합 활성을 갖는 항체의 약동학을 개선하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 항체의 인간 FcRn 결합 도메인 내 적어도 하나의 아미노산을 변경함으로써 산성 pH 범위의 인간 FcRn 결합 활성을 갖는 단일 항체의 약동학을 개선하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, IgG의 Fc 도메인을 포함한 인간 FcRn 결합 도메인의 모 IgG Fc 도메인 내 존재하는 위치 237, 238, 239, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 270, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 325, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434, 및 436(EU 넘버링)으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산에 대하여 상이한 아미노산의 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 인간 FcRn 결합 도메인을 이용함으로써, 산성 pH 범위의 인간 FcRn 결합 활성을 갖는 항체의 약동학을 개선하는 방법을 제공한다.
항체에 결합되지 않은 유리 항원의 혈장 농도 또는 총 농도에 대한 유리 항원 농도의 비율은 당업자에게 공지된 방법에 의해, 예를 들어 Pharm Res. 2006 Jan; 23 (1): 95-103에 기재된 방법에 의해 결정할 수 있다. 대안적으로, 항원이 생체 내에서 특정 기능을 나타내는 경우, 상기 항원이 항원 기능을 중화시키는 항체(길항 분자)에 결합되는지 여부는 상기 항원 기능이 중화되는지 여부를 시험함으로써 평가할 수 있다. 항원 기능이 중화되는지 여부는 항원 기능을 반영하는 생체내 마커를 분석하여 평가할 수 있다. 항원이 항원 기능을 활성화하는 항체(작용 분자)에 결합되는지 여부는 항원 기능을 반영하는 생체내 마커를 분석함으로써 평가할 수 있다.
유리 항원의 혈장 농도 및 혈장 중 총 항원의 양에 대한 혈장 중 유리 항원의 양의 비율의 측정, 생체내 마커 분석 및 이러한 측정은 특별히 제한되지 않지만; 분석은 항체 투여 후 일정 기간이 경과한 후에 실시하는 것이 바람직하다. 본 발명에서, 항체 투여 후의 기간은 특별히 제한되지 않으며; 당업자는 투여되는 항체의 성질 등에 따라 적절한 기간을 결정할 수 있다. 상기 기간은, 예를 들어 항체 투여 후 1일, 항체 투여 후 3일, 항체 투여 후 7일, 항체 투여 후 14일, 및 항체 투여 후 28일을 포함한다. 본원에서, “혈장 항원 농도”는 항체 결합된 항원 및 비결합된 항원 농도의 합인 "혈장 중 총 항원 농도” 또는 항체 비결합된 항원 농도인 "혈장 중 유리 항원 농도"를 의미한다.
혈장 중 총 항원 농도는 인간 FcRn 결합 도메인으로서 원형 인간 IgG Fc 도메인을 포함하는 참조 항체의 투여와 비교하거나, 또는 본 발명의 항원 결합 도메인 분자가 투여되지 않은 경우와 비교하여 본 발명의 항체를 투여함으로써 2배, 5배, 10배, 20배, 50배, 100배, 200배, 500배, 1,000배, 또는 그 이상까지 낮출 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 pH 의존적 결합 특성을 나타내는 이중특이적 항-CCL2 항체를 제공한다. 본원에서 사용된 "pH 의존적 결합"이라는 표현은 항체가 "중성 pH에서의 결합과 비교하여 산성 pH에서 CCL2에 대한 감소된 결합"을 나타낸다는 것을 의미한다(본 개시의 목적으로, 두 표현 모두 상호교환적으로 사용할 수 있음). 예를 들어, "pH 의존적 결합 특성을 갖는" 항체는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화도로 CCL2에 결합하는 항체를 포함한다. 특정 구현예들에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 적어도 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000배 이상 높은 친화도로 CCL2에 결합한다. 일부 구현예들에서, 항체는 pH 5.8에서보다 pH 7.4에서 더 높은 친화도로 CCL2에 결합한다. 추가의 구현예들에서, 항체는 pH 5.8에서보다 pH 7.4에서 적어도 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000배 이상 높은 친화도로 CCL2에 결합한다.
항원이 가용성 단백질인 경우, 항원에 대한 항체의 결합은 혈장 내에서 항원의 반감기를 연장시킬 수 있다(즉, 혈장으로부터 항원의 제거 감소). 왜냐하면, 항체가 항원 자체보다 혈장 내에서 더 긴 반감기를 가질 수 있고 항원에 대한 운반체 역할을 할 수 있기 때문이다. 이는 FcRn이 세포 내 엔도솜 경로를 통해 항원-항체 복합체를 재활용하기 때문이다(Roopenian, Nat. Rev. Immunol. 7(9): 715-725 (2007)). 하지만, 중성 세포외 환경에서 이의 항원과 결합하는 pH 의존적 결합 특성을 갖는 항체는 세포 내로 유입된 후 산성 엔도솜 구획으로 항원을 방출하면서 pH 독립적인 방식으로 결합하는 이의 대응물에 비해 상대적으로 항원 중화 및 제거 면에서 우수한 특성을 가질 것으로 기대된다(Igawa et al., Nature Biotechnol. 28(11):1203-1207 (2010); Devanaboyina et al., mAbs 5(6):851-859 (2013); WO 2009/125825).
본 개시의 목적으로, CCL2에 대한 항체의 "친화도"는 항체의 KD로 표현된다. 항체의 KD는 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 지칭한다. 항체가 항원에 결합하는 KD 값이 클수록, 특정 항원에 대한 이의 결합 친화도가 약해진다. 이에 따라, 본원에서 사용된 표현 "산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화도"(또는 동등한 표현인 "pH 의존적 결합")는 산성 pH에서 CCL2에 결합하는 항체의 KD가 중성 pH에서 CCL2에 결합하는 항체의 KD보다 높음을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 맥락에서, 항체는 산성 pH에서 CCL2에 결합하는 항체의 KD가 중성 pH에서 CCL2에 결합하는 항체의 KD보다 적어도 2배 이상 더 클 경우에 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화도로 CCL2에 결합하는 것으로 간주된다. 따라서, 본 발명은 중성 pH에서 CCL2에 결합하는 항체의 KD보다 적어도 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000배 이상 더 큰 KD로 산성 pH에서 CCL2에 결합하는 항체를 포함한다. 다른 구현예에서, 중성 pH에서 항체의 KD 값은 10-7M, 10-8M, 10-9M, 10-10M, 10-11M, 10-12M 이하일 수 있다. 다른 구현예에서, 산성 pH에서 항체의 KD 값은 10-9M, 10-8M, 10-7M, 10-6M 이상일 수 있다.
추가의 구현예들에서, 항체는 pH 5.8에서 CCL2에 결합하는 항체의 KD가 pH 7.4에서 CCL2에 결합하는 항체의 KD보다 적어도 2배 이상 더 클 경우에 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화도로 결합하는 것으로 간주된다. 일부 구현예들에서, 제공된 항체는 pH 7.4에서 CCL2에 결합하는 항체의 KD보다 적어도 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000배 이상 더 큰 KD로 pH 5.8에서 CCL2에 결합한다. 다른 구현예에서, pH 7.4에서 항체의 KD 값은 10-7M, 10-8M, 10-9M, 10-10M, 10-11M, 10-12M 이하일 수 있다. 다른 구현예에서, pH 5.8에서 항체의 KD 값은 10-9M, 10-8M, 10-7M, 10-6M 이상일 수 있다.
특정 항원에 대한 항체의 결합 특성은 또한 항체의 kd로 표시할 수 있다. 항체의 kd는 특정 항원에 대한 항체의 해리 속도 상수를 지칭하며, 초의 역수(즉, sec-1)로 표현된다. kd 값의 증가는 이의 항원에 대한 항체의 더 약한 결합을 의미한다. 따라서, 본 발명은 중성 pH에서보다 산성 pH에서 더 높은 kd 값으로 CCL2에 결합하는 항체를 포함한다. 본 발명은 중성 pH에서 CCL2에 결합하는 항체의 Kd보다 적어도 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000배 이상 더 큰 Kd로 산성 pH에서 CCL2에 결합하는 항체를 포함한다. 다른 구현예에서, 중성 pH에서 항체의 kd 값은 10-2 1/s, 10-3 1/s, 10-4 1/s, 10-5 1/s, 10-6 1/s 이하일 수 있다. 다른 구현예에서, 산성 pH에서 항체의 kd 값은 10-3 1/s, 10-2 1/s, 10-1 1/s 이상일 수 있다. 본 발명은 또한 pH 7.4에서보다 pH 5.8에서 더 높은 kd 값으로 CCL2에 결합하는 항체를 포함한다. 본 발명은 pH 7.4에서 CCL2에 결합하는 항체의 Kd보다 적어도 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000배 이상 더 큰 kd로 pH 5.8에서 CCL2에 결합하는 항체를 포함한다. 다른 구현예에서, pH 7.4에서 항체의 kd 값은 10-2 1/s, 10-3 1/s, 10-4 1/s, 10-5 1/s, 10-6 1/s 이하일 수 있다. 다른 구현예에서, pH 5.8에서 항체의 kd 값은 10-3 1/s, 10-2 1/s, 10-1 1/s 이상일 수 있다.
특정 경우들에서, "중성 pH에서의 이의 결합과 비교하여 산성 pH에서 CCL2에 대한 감소된 결합"은 중성 pH에서 CCL2에 결합하는 항체의 KD 값에 대한 산성 pH에서 CCL2에 결합하는 항체의 KD 값의 비(또는 그 반대로)로 표현된다. 예를 들어, 본 발명을 목적으로 항체가 2 이상의 산성/중성 KD 비를 나타내는 경우, 항체는 "중성 pH에서의 이의 결합과 비교하여 산성 pH에서 CCL2에 대한 감소된 결합"을 나타내는 것으로 간주될 수 있다. 특정 구현예들에서, 본 발명의 항-CCL2 항체에 대한 pH 5.8/pH 7.4 KD 비는 2 이상이다. 특정 예시적인 구현예들에서, 본 발명의 항체에 대한 산성/중성 KD 비는 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 이상일 수 있다. 다른 구현예에서, 중성 pH에서 항체의 KD 값은 10-7M, 10-8M, 10-9M, 10-10M, 10-11M, 10-12M 이하일 수 있다. 다른 구현예에서, 산성 pH에서 항체의 KD 값은 10-9M, 10-8M, 10-7M, 10-6M 이상일 수 있다. 추가의 경우들에서, 항체가 2 이상의 pH 5.8/pH 7.4 KD 비를 나타내는 경우, 항체는 "중성 pH에서의 이의 결합과 비교하여 산성 pH에서 CCL2에 대한 감소된 결합"을 나타내는 것으로 간주될 수 있다. 특정 예시적인 구현예들에서, 항체에 대한 pH 5.8/pH 7.4 KD 비는 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 이상일 수 있다. 다른 구현예에서, pH 7.4에서 항체의 KD 값은 10-7M, 10-8M, 10-9M, 10-10M, 10-11M, 10-12M 이하일 수 있다. 다른 구현예에서, pH 5.8에서 항체의 KD 값은 10-9M, 10-8M, 10-7M, 10-6M 이상일 수 있다.
특정 경우들에서, "중성 pH에서의 이의 결합과 비교하여 산성 pH에서 CCL2에 대한 감소된 결합"은 중성 pH에서 CCL2에 결합하는 항체의 kd 값에 대한 산성 pH에서 CCL2에 결합하는 항체의 kd 값의 비(또는 그 반대로)로 표현된다. 예를 들어, 본 발명을 목적으로 항체가 2 이상의 산성/중성 Kd 비를 나타내는 경우, 항체는 "중성 pH에서의 이의 결합과 비교하여 산성 pH에서 CCL2에 대한 감소된 결합"을 나타내는 것으로 간주될 수 있다. 특정 예시적인 구현예들에서, 본 발명의 항체에 대한 pH 5.8/pH 7.4 kd 비는 2 이상이다. 특정 예시적인 구현예들에서, 본 발명의 항체에 대한 산성/중성 kd 비는 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 이상일 수 있다. 다른 구현예에서, 중성 pH에서 항체의 Kd 값은 10-2 1/s, 10-3 1/s, 10-4 1/s, 10-5 1/s, 10-6 1/s 이하일 수 있다. 다른 구현예에서, 산성 pH에서 항체의 Kd 값은 10-3 1/s, 10-2 1/s, 10-1 1/s 이상일 수 있다. 특정 예시적인 구현예들에서, 본 발명의 항체에 대한 pH 5.8/pH 7.4 kd 비는 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 이상일 수 있다. 다른 구현예에서, pH 7.4에서 항체의 kd 값은 10-2 1/s, 10-3 1/s, 10-4 1/s, 10-5 1/s, 10-6 1/s 이하일 수 있다. 다른 구현예에서, pH 5.8에서 항체의 kd 값은 10-3 1/s, 10-2 1/s, 10-1 1/s 이상일 수 있다.
본원에서 사용된 "산성 pH"라는 표현은 4.0 내지 6.5의 pH를 의미한다. "산성 pH"라는 표현은 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 및 6.5 중 어느 하나의 pH 값을 포함한다. 특정 양태들에서, "산성 pH"는 5.8이다.
본원에서 사용된 "중성 pH"라는 표현은 6.7 내지 약 10.0의 pH를 의미한다. "중성 pH"라는 표현은 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 및 10.0 중 어느 하나의 pH 값을 포함한다. 특정 양태들에서, "중성 pH"는 7.4이다.
본원에서 표현된 KD 값 및 kd 값은 항체-항원 상호작용을 특성화하기 위해 표면 플라즈몬 공명 기반 바이오센서를 사용하여 결정할 수 있다. KD 값 및 kd 값은 섭씨 25도 또는 섭씨 37도에서 결정할 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 CCL2와 면역 복합체(즉, 항원-항체 복합체)를 형성하는 이중특이적 항-CCL2 항체를 제공한다. 특정 구현예들에서, 2개 이상의 이중특이적 항-CCL2 항체는 2개 이상의 CCL2 분자에 결합하여 면역 복합체를 형성한다. 이는 CCL2가 2개의 CCL2 분자를 함유하는 동종이량체로 존재하는 반면, 항체는 2개의 항원 결합 부위를 갖기 때문에 가능한 것이다.
일반적으로 말하면, 2개 이상의 항체가 2개 이상의 항원과 면역 복합체를 형성할 때, 생성된 면역 복합체는 복합체 내의 항체의 Fc 영역을 통한 결합 효과로 인해 세포 표면 상에 존재하는 Fc 수용체에 강하게 결합할 수 있으며, 그런 다음 고효율로 세포 내에 흡수된다. 따라서, 2개 이상의 항-CCL2 항체 및 2개 이상의 CCL2 분자를 함유한 면역 복합체를 형성할 수 있는 전술한 항-CCL2 항체는 결합 효과로 인한 Fc 수용체에 대한 강한 결합을 통해 생체내 혈장으로부터 CCL2의 신속한 제거를 유도할 수 있다.
또한, pH 의존적 결합 특성을 갖는 항체는 pH 비의존적 방식으로 결합하는 이의 대응물에 비해 상대적인 항원 중화 및 제거 면에서 우수한 특성을 갖는 것으로 생각된다(Igawa et al., Nature Biotech. 28(11):1203-1207 (2010); Devanaboyina et al. mAbs 5(6):851-859 (2013); WO 2009/125825). 따라서, 상기 두 가지 성질을 모두 갖는 항체, 즉 pH 의존적 결합 특성을 갖고 2개 이상의 항원 및 2개 이상의 항체를 함유한 면역복합체를 형성하는 항체는 혈장에서 항원을 매우 빠르게 제거함에 있어서 훨씬 더 우수한 특성을 가지는 것으로 기대된다(WO 2013/081143).
일 양태에서, 본 발명은: (a) 위치 236에서 하나의 아미노산 변경, 및 (b) EU 넘버링에 따른 231, 232, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 264, 266, 267, 268, 271, 295, 298, 325, 326, 327, 328, 330, 331, 332, 334, 및 396으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 위치의 적어도 하나의 아미노산 변경을 포함한 적어도 2개의 아미노산 변경을 포함하는 향상된 FcγRIIb 결합 활성을 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 EU 넘버링에 따른 위치 236에서 아미노산 변경을 포함하는 향상된 FcγRIIb 결합 활성을 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은: (a) 위치 236에서 하나의 아미노산 변경, 및 (b) EU 넘버링에 따른 231, 232, 235, 239, 268, 295, 298, 326, 330, 및 396으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 위치의 적어도 하나의 아미노산 변경을 포함한 적어도 2개의 아미노산 변경을 포함하는 향상된 FcγRIIb 결합 활성을 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 추가의 구현예에서, 변이체 Fc 영역은: EU 넘버링에 따른 231, 232, 235, 239, 268, 295, 298, 326, 330, 및 396으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 위치의 아미노산 변경을 포함한다. 추가의 구현예에서, 변이체 Fc 영역은: EU 넘버링에 따른 268, 295, 326, 및 330으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 위치의 아미노산 변경을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 하기의 (1)-(37): EU 넘버링에 따른 (1) 위치 231, 236, 239, 268 및 330; (2) 위치 231, 236, 239, 268, 295 및 330; (3) 위치 231, 236, 268 및 330; (4) 위치 231, 236, 268, 295 및 330; (5) 위치 232, 236, 239, 268, 295 및 330; (6) 위치 232, 236, 268, 295 및 330; (7) 위치 232, 236, 268 및 330; (8) 위치 235, 236, 268, 295, 326 및 330; (9) 위치 235, 236, 268, 295 및 330; (10) 위치 235, 236, 268 및 330; (11) 위치 235, 236, 268, 330 및 396; (12) 위치 235, 236, 268 및 396; (13) 위치 236, 239, 268, 295, 298 및 330; (14) 위치 236, 239, 268, 295, 326 및 330; (15) 위치 236, 239, 268, 295 및 330; (16) 위치 236, 239, 268, 298 및 330; (17) 위치 236, 239, 268, 326 및 330; (18) 위치 236, 239, 268 및 330; (19) 위치 236, 239, 268, 330 및 396; (20) 위치 236, 239, 268 및 396; (21) 위치 236 및 268; (22) 위치 236, 268 및 295; (23) 위치 236, 268, 295, 298 및 330; (24) 위치 236, 268, 295, 326 및 330; (25) 위치 236, 268, 295, 326, 330 및 396; (26) 위치 236, 268, 295 and 330; (27) 위치 236, 268, 295, 330 및 396; (28) 위치 236, 268, 298 및 330; (29) 위치 236, 268, 298 및 396; (30) 위치 236, 268, 326 및 330; (31) 위치 236, 268, 326, 330 및 396; (32) 위치 236, 268 및 330; (33) 위치 236, 268, 330 및 396; (34) 위치 236, 268 및 396; (35) 위치 236 및 295; (36) 위치 236, 330 및 396; 및 (37) 위치 236 및 396 중 어느 하나의 아미노산 변경을 포함하는 향상된 FcγRIIb 결합 활성을 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
추가의 구현예에서, 향상된 FcγRIIb 결합 활성을 갖는 변이체 Fc 영역은: EU 넘버링에 따른 (a) 위치 231에서 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr; (b) 위치 232에서 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr; (c) 위치 233에서 Asp; (d) 위치 234에서 Trp, Tyr; (e) 위치 235에서 Trp; (f) 위치 236에서 Ala, Asp, Glu, His, Ile, Leu, Met, Asn, Gln, Ser, Thr, Val; (g) 위치 237에서 Asp, Tyr; (h) 위치 238에서 Glu, Ile, Met, Gln, Tyr; (i) 위치 239에서 Ile, Leu, Asn, Pro, Val; (j) 위치 265에서 Ile; (k) 위치 266에서 Phe; (l) 위치 267에서 Ala, His, Leu; (m) 위치 268에서 Asp, Glu; (n) 위치 271에서 Asp, Glu, Gly; (o) 위치 295에서 Leu; (p) 위치 298에서 Leu; (q) 위치 325에서 Glu, Phe, Ile, Leu; (r) 위치 326에서 Thr; (s) 위치 327에서 Ile, Asn; (t) 위치 328에서 Thr; (u) 위치 330에서 Lys, Arg; (v) 위치 331에서 Glu; (w) 위치 332에서 Asp; (x) 위치 334에서 Asp, Ile, Met, Val, Tyr; 및 (y) 위치 396에서 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산을 포함한다.
추가의 구현예에서, 향상된 FcγRIIb 결합 활성을 갖는 변이체 Fc 영역은: EU 넘버링에 따른 (a) 위치 231에서 Gly, Thr; (b) 위치 232에서 Asp; (c) 위치 235에서 Trp; (d) 위치 236에서 Asn, Thr; (e) 위치 239에서 Val; (f) 위치 268에서 Asp, Glu; (g) 위치 295에서 Leu; (h) 위치 298에서 Leu; (i) 위치 326에서 Thr; (j) 위치 330에서 Lys, Arg; 및 (k) 위치 396에서 Lys, Met으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 변경(예컨대, 치환)을 포함한다. 추가의 구현예에서, 향상된 FcγRIIb 결합 활성을 갖는 변이체 Fc 영역은: EU 넘버링에 따른 위치 236에서 Asn, 위치 268에서 Glu, 위치 330에서 Lys, 및 위치 396에서 Met의 아미노산 변경(예컨대, 치환)을 포함한다. 추가의 구현예에서, 향상된 FcγRIIb 결합 활성을 갖는 변이체 Fc 영역은: EU 넘버링에 따른 위치 236에서 Asn, 위치 268에서 Asp, 및 위치 330에서 Lys의 아미노산 변경(예컨대, 치환)을 포함한다. 추가의 구현예에서, 향상된 FcγRIIb 결합 활성을 갖는 변이체 Fc 영역은: EU 넘버링에 따른 위치 236에서 Asn, 위치 268에서 Asp, 위치 295에서 Leu, 및 위치 330에서 Lys의 아미노산 변경(예컨대, 치환)을 포함한다. 추가의 구현예에서, 향상된 FcγRIIb 결합 활성을 갖는 변이체 Fc 영역은: EU 넘버링에 따른 위치 236에서 Thr, 위치 268에서 Asp, 및 위치 330에서 Lys의 아미노산 변경(예컨대, 치환)을 포함한다. 추가의 구현예에서, 향상된 FcγRIIb 결합 활성을 갖는 변이체 Fc 영역은: EU 넘버링에 따른 위치 236에서 Asn, 위치 268에서 Asp, 위치 295에서 Leu, 위치 326에서 Thr, 및 위치 330에서 Lys의 아미노산 변경(예컨대, 치환)을 포함한다. 추가의 구현예에서, 향상된 FcγRIIb 결합 활성을 갖는 변이체 Fc 영역은: EU 넘버링에 따른 235에서 Trp, 위치 236에서 Asn, 위치 268에서 Asp, 위치 295에서 Leu, 위치 326에서 Thr, 및 위치 330에서 Lys의 아미노산 변경(예컨대, 치환)을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 등전점(pI)이 증가된 변이체 Fc 영역을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 특정 구현예들에서, 본원에 기재된 변이체 Fc 영역은 모 Fc 영역에서 적어도 2개의 아미노산 변경을 포함한다. 특정 구현예들, 각각의 아미노산 변경은 모 Fc 영역과 비교하여 변이체 Fc 영역의 등전점(pI)을 증가시킨다. 이들은, 예를 들어 항체가 생체내 투여될 때 적어도 2개의 아미노산 잔기의 변형에 의해 이의 pI가 증가된 항체를 사용하여 혈장으로부터의 항원 제거가 촉진될 수 있다는 발견에 기초한다.
본 발명에서, pI는 이론적 또는 실험적으로 결정된 pI일 수 있다. pI의 값은, 예를 들어 당업자에게 공지된 등전위 초점에 의해 결정할 수 있다. 이론적 pI의 값은, 예를 들어 유전자 및 아미노산 서열 분석 소프트웨어(제네틱스(Genetyx) 등)를 사용하여 계산할 수 있다.
일 구현예에서, pI 값은 변형 전과 비교하여, 예를 들어 적어도 0.01, 0.03, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 이상, 적어도 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 이상, 적어도 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5 이상, 또는 적어도 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 3.0 이상 만큼 증가할 수 있다.
특정 구현예들에서, 증가된 pI를 위한 아미노산은 변이체 Fc 영역의 표면 상에 노출될 수 있다. 본 발명에서, 표면 상에 노출될 수 있는 아미노산이란 일반적으로 변이체 Fc영역을 구성하는 폴리펩티드의 표면 상에 위치하는 아미노산 잔기를 지칭한다. 폴리펩티드의 표면 상에 위치한 아미노산 잔기는 이의 측쇄가 용매 분자(일반적으로 대부분이 물 분자임)와 접촉할 수 있는 아미노산 잔기를 지칭한다. 하지만, 상기 측쇄가 반드시 용매 분자와 완전하게 접촉할 필요는 없으며, 측쇄의 일부라도 용매 분자와 접촉하고 있는 경우에 아미노산은 "표면 상에 위치한 아미노산 잔기"로 정의된다. 폴리펩티드의 표면 상에 위치한 아미노산 잔기는 또한 표면에 가깝게 위치한 아미노산 잔기를 포함하고, 이에 따라 이의 측쇄가 부분적으로라도 용매 분자와 접촉하는 다른 아미노산 잔기로부터 전하 영향을 가질 수 있다. 당업자는, 예를 들어 상업적으로 입수가능한 소프트웨어를 사용하여 폴리펩티드의 상동성 모델을 제조할 수 있다. 대안적으로, X선 결정학과 같은 당업자에게 공지된 방법을 사용하는 것이 가능하다. 표면 상에 노출될 수 있는 아미노산 잔기는, 예를 들어 인사이트II(InsightII) 프로그램(엑설리스(Accelrys))과 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여 3차원 모델의 좌표를 사용하여 결정한다. 표면 노출이 가능한 부위는 기술 분야에 공지된 알고리즘을 사용하여 결정할 수 있다(예를 들어, Lee and Richards (J. Mol. Biol. 55:379-400 (1971)); Connolly (J. Appl. Cryst. 16:548-558 (1983)). 표면 노출 가능한 부위는 단백질 모델링 및 3차원 구조 정보에 적합한 소프트웨어를 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 목적으로 입수 가능한 소프트웨어는, 예를 들어 SYBYL 바이오폴리머 모듈(Biopolymer Module) 소프트웨어(트리포스 어쏘시에이츠(Tripos Associates))를 포함한다. 알고리즘에 사용자 입력 크기 매개변수가 필요한 경우, 계산에 사용되는 프로브의 "크기"는 반경이 약 1.4 옹스트롬 이하로 설정될 수 있다. 또한, 개인용 컴퓨터용 소프트웨어를 사용하여 표면 노출 가능한 영역을 결정하는 방법은 파시오스(Pacios Chem. 18(4):377-386 (1994); J. Mol. Model. 1:46-53 (1995))에 의해 설명되었다. 상기 정보에 기초하여, 변이체 Fc영역을 구성하는 폴리펩티드의 표면 상에 위치하는 적절한 아미노산 잔기를 선택할 수 있다.
특정 구현예들에서, 폴리펩티드는 변이체 Fc 영역 및 항원 결합 도메인 둘 다를 포함한다. 추가의 구현예들에서, 항원은 가용성 항원이다. 일 구현예에서, 항원은 대상체의 생물학적 유체(예를 들어, 혈장, 간질액, 림프액, 복수액, 및 흉막액)에 존재한다. 항원은 또한 막 항원일 수 있다.
추가의 구현예들에서, 항원 결합 도메인의 항원 결합 활성은 이온 농도 조건에 따라 가변된다. 일 구현예에서, 이온 농도는 특별히 제한되지 않으며, 수소 이온 농도(pH) 또는 금속 이온 농도를 지칭한다. 본원에서, 금속이온이란 알칼리금속 및 구리족 원소와 같이 수소를 제외한 I족 원소, 알칼리토금속 및 아연족 원소와 같은 II족 원소, 붕소를 제외한 III족 원소, 탄소 및 규소를 제외한 IV족 원소, 철족 및 백금족 원소와 같은 VIII족 원소, V, VI, VII족의 아족 A에 속하는 원소, 및 안티몬, 비스무트 및 폴로늄과 같은 금속 원소의 이온들을 지칭한다. 본 발명에서, 금속 이온은, 예를 들어 WO 2012/073992 및 WO 2013/125667에 기재된 바와 같이 칼슘 이온을 포함한다. 일 구현예에서, "이온 농도 조건"은 저이온 농도 및 고이온 농도 사이의 항원 결합 도메인의 생물학적 거동의 차이에 초점을 맞춘 조건일 수 있다. 또한, “항원 결합 도메인의 항원 결합 활성은 이온 농도 조건에 따라 가변된다”란, 항원 결합 도메인의 항원 결합 활성이 저이온 농도 및 고이온 농도 사이에서 가변된다는 것을 의미한다(상기 항원 결합 도메인은 본원에서 "이온 농도 의존적 항원 결합 도메인"으로 지칭된다). 고이온 농도 조건하에서의 항원 결합 도메인의 항원 결합 활성은 저이온 농도 조건하에서의 항원 결합 활성보다 높거나(강하거나) 낮을(약할) 수 있다. 일 구현예에서, 이온 농도 의존적 항원 결합 도메인(예컨대, pH 의존적 항원 결합 도메인 또는 칼슘 이온 농도 의존적 항원 결합 도메인)은, 예를 들어 WO 2009/125825, WO 2012/073992, 및 WO 2013/046722에 기재된 공지의 방법에 의해 수득할 수 있다.
본 발명에서, 고칼슘 이온 농도 조건하에서의 항원 결합 도메인의 항원 결합 활성은 저칼슘 이온 농도 조건하에서보다 높을 수 있다. 고칼슘 이온 농도는 특별히 제한되지 않지만, 100 μM 내지 10 mM, 200 μM 내지 5 mM, 400 μM 내지 3 mM, 200 μM 내지 2 mM, 400 μM 내지 1 mM, 또는 500 μM 내지 2.5 mM 사이에서 선택되는 농도일 수 있으며, 이는 생체내 칼슘 이온의 혈장(혈액) 농도에 근접하는 것이 바람직하다. 한편, 저칼슘 이온 농도는 특별히 제한되지 않지만, 0.1 μM 내지 30 μM, 0.2 μM 내지 20 μM, 0.5 μM 내지 10 μM, 1 μM 내지 5 μM, 또는 2 μM 내지 4 μM 사이에서 선택되는 농도일 수 있으며, 이는 생체내 초기 엔도솜 내 칼슘 농도에 근접하는 것이 바람직하다.
일 구현예에서, 저칼슘 이온 농도 조건 및 고칼슘 이온 농도 조건하에서의 항원 결합 활성의 비는 특별히 제한되지 않지만, 고칼슘 이온 농도 조건하에서의 KD에 대한 저칼슘 이온 농도 조건하에서의 KD의 비, 즉 KD(저칼슘 이온 농도 조건)/KD(고칼슘 이온 농도 조건)는 2 이상, 10 이상, 또는 40 이상이다. 비율의 상한값은, 이러한 항원 결합 도메인이 당업자에게 공지된 기술에 의해 생성될 수 있는 한, 400, 1000, 10000일 수 있다. 대안적으로, 예를 들어 KD 대신에 해리 속도 상수(kd)를 사용할 수 있다. 이 경우, 고칼슘 이온 농도 조건하에서의 kd에 대한 저칼슘 이온 농도 조건하에서의 kd의 비, 즉 kd(저칼슘 이온 농도 조건)/kd(고칼슘 이온 농도 조건)는 2 이상, 5 이상, 10 이상, 또는 30 이상이다. 비율의 상한값은, 이러한 항원 결합 도메인이 당업자의 일반적인 기술 지식을 바탕으로 생성될 수 있는 한, 50, 100, 200일 수 있다.
본 발명에서, 저수소 이온 농도(중성 pH) 조건하에서의 항원 결합 도메인의 항원 결합 활성은 고수소 이온 농도(산성 pH) 조건하에서보다 높을 수 있다. 산성 pH는, 예를 들어 pH 4.0 내지 pH 6.5, pH 4.5 내지 pH 6.5, pH 5.0 내지 pH 6.5, 또는 pH 5.5 내지 pH 6.5로부터 선택되는 pH일 수 있으며, 초기 엔도솜에서 생체내 pH에 가까운 것이 바람직하다. 산성 pH는 또한, 예를 들어 pH 5.8 또는 pH 6.0일 수 있다. 특정 구현예들에서, 산성 pH는 5.8이다. 한편, 중성 pH는, 예를 들어 pH 6.7 내지 pH 10.0, pH 6.7 내지 pH 9.5, pH 7.0 내지 pH 9.0, 또는 pH 7.0 내지 pH 8.0로부터 선택되는 pH일 수 있으며, 혈장(혈액) 내에서 생체내 pH에 가까운 것이 바람직하다. 중성 pH는 또한, 예를 들어 pH 7.4 또는 pH 7.0일 수 있다. 특정 구현예들에서, 중성 pH는 7.4이다.
일 구현예에서, 산성 pH 조건 및 중선 pH 조건하에서의 항원 결합 활성의 비는 특별히 제한되지 않지만, 중성 pH 조건하에서의 KD에 대한 산성 pH 조건하에서의 해리 상수(KD)의 비, 즉 KD(산성 pH 조건)/KD(중성 pH 조건)는 2 이상, 10 이상, 또는 40 이상이다. 비율의 상한값은, 이러한 항원 결합 도메인이 당업자에게 공지된 기술에 의해 생성될 수 있는 경우, 400, 1000, 10000일 수 있다. 대안적으로, 예를 들어 KD 대신에 해리 속도 상수(kd)를 사용할 수 있다. 이 경우, 중성 pH 조건하에서의 kd에 대한 산성 pH 조건하에서의 kd의 비, 즉 kd(산성 pH 조건)/kd(중성 pH 조건)는 2 이상, 5 이상, 10 이상, 또는 30 이상이다. 비율의 상한값은, 이러한 항원 결합 도메인이 당업자의 일반적인 기술 지식을 바탕으로 생성될 수 있는 한, 50, 100, 200일 수 있다.
일 구현예에서, 예를 들어, 적어도 하나의 아미노산 잔기는 측쇄 pKa가 4.0~8.0인 아미노산 잔기로 치환되고, 및/또는 측쇄 pKa가 4.0~8.0인 적어도 하나의 아미노산은 WO 2009/125825에 기재된 바와 같이 항원 결합 도메인에 삽입된다. 아미노산은, 치환 또는 삽입 전과 비교하여 중성 pH 조건하에서보다 산성 pH 조건하에서 항원 결합 도메인의 항원 결합 활성이 약해지는 한, 임의의 부위에 치환 및/또는 삽입될 수 있다. 항원 결합 도메인이 가변 영역 또는 CDR을 갖는 경우, 상기 부위는 가변 영역 또는 CDR 내에 있을 수 있다. 치환 또는 삽입되는 아미노산의 수는 당업자에 의해 적절하게 결정할 수 있고; 상기 수는 하나 이상일 수 있다. 측쇄 pKa가 4.0~8.0인 아미노산은 수소 이온 농도 조건에 따라 항원 결합 도메인의 항원 결합 활성을 변화시키는 데 사용할 수 있다. 상기 아미노산은, 예를 들어 His(H) 및 Glu(E)와 같은 천연 아미노산, 및 비천연 아미노산, 예컨대 히스티딘 유사체(US2009/0035836), m-NO2-Tyr(pKa 7.45), 3,5-Br2-Tyr(pKa 7.21) 및 3,5-I2-Tyr(pKa 7.38)을 포함한다(Heyl et al., Bioorg. Med. Chem. 11(17):3761-3768 (2003)). 예컨대, His(H)를 포함하는 측쇄 pKa가 6.0-7.0인 아미노산도 사용할 수 있다.
다른 구현예에서, pI가 증가된 변이체 Fc 영역에 대한 바람직한 항원 결합 도메인이 기재되고 WO2016/125495 및 WO2017/046994에 기재된 방법에 의해 수득될 수 있다.
특정 구현예들에서, 증가된 pI를 갖는 변이체 Fc 영역은: EU 넘버링에 따른 285, 311, 312, 315, 318, 333, 335, 337, 341, 342, 343, 384, 385, 388, 390, 399, 400, 401, 402, 413, 420, 422, 및 431로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 위치에서 적어도 2개의 아미노산 변경을 포함한다.
추가의 구현예들에서, 증가된 pI를 갖는 변이체 Fc 영역은: EU 넘버링에 따른 311, 341, 343, 384, 399, 400, 401, 402, 및 413으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 위치에서 적어도 2개의 아미노산 변경을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 하기의 (1)-(10): EU 넘버링에 따른 (1) 위치 311 및 341; (2) 위치 311 및 343; (3) 위치 311, 343 및 413; (4) 위치 311, 384 및 413; (5) 위치 311 및 399; (6) 위치 311 및 401; (7) 위치 311 및 413; (8) 위치 400 및 413; (9) 위치 401 및 413; 및 (10) 위치 402 및 413 중 어느 하나의 아미노산 변경을 포함한 증가된 pI를 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은: (a) EU 넘버링에 따른 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 264, 266, 267, 268, 271, 295, 298, 325, 326, 327, 328, 330, 331, 332, 334, 및 396으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 위치에서 적어도 하나의 아미노산 변경, 및 (b) EU 넘버링에 따른 285, 311, 312, 315, 318, 333, 335, 337, 341, 342, 343, 384, 385, 388, 390, 399, 400, 401, 402, 413, 420, 422, 및 431로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 위치에서 적어도 2개의 아미노산 변경을 포함한 적어도 3개의 아미노산 변경을 포함하는 증가된 pI 및 향상된 FcγRIIb 결합 활성을 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은: (a) EU 넘버링에 따른 231, 232, 235, 236, 239, 268, 295, 298, 326, 330, 및 396으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 위치에서 적어도 하나의 아미노산 변경, 및 (b) EU 넘버링에 따른 311, 341, 343, 384, 399, 400, 401, 402, 및 413으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 위치에서 적어도 2개의 아미노산 변경을 포함한 적어도 3개의 아미노산 변경을 포함하는 증가된 pI 및 향상된 FcγRIIb 결합 활성을 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 하기의 (1)-(9): EU 넘버링에 따른 (1) 위치 235, 236, 268, 295, 311, 326, 330 및 343; (2) 위치 236, 268, 295, 311, 326, 330 및 343; (3) 위치 236, 268, 295, 311, 330 및 413; (4) 위치 236, 268, 311, 330, 396 및 399; (5) 위치 236, 268, 311, 330 및 343; (6) 위치 236, 268, 311, 330, 343 및 413; (7) 위치 236, 268, 311, 330, 384 및 413; (8) 위치 236, 268, 311, 330 및 413; 및 (9) 위치 236, 268, 330, 396, 400 및 413 중 어느 하나의 아미노산 변경을 포함한 증가된 pI 및 향상된 FcγRIIb 결합 활성을 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은: (a) EU 넘버링에 따른 234, 238, 250, 264, 267, 307, 및 330으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 위치에서 적어도 하나의 아미노산 변경, 및 (b) EU 넘버링에 따른 285, 311, 312, 315, 318, 333, 335, 337, 341, 342, 343, 384, 385, 388, 390, 399, 400, 401, 402, 413, 420, 422, 및 431로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 위치에서 적어도 2개의 아미노산 변경을 포함한 적어도 3개의 아미노산 변경을 포함하는 증가된 pI 및 향상된 FcγRIIb 결합 활성을 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 추가의 구현예들에서, 폴리펩티드는: EU 넘버링에 따른 311, 341, 343, 384, 399, 400, 401, 402, 및 413으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 위치에서 적어도 2개의 아미노산 변경을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 하기의 (1)-(16): EU 넘버링에 따른 (1) 위치 234, 238, 250, 264, 307, 311, 330 및 343; (2) 위치 234, 238, 250, 264, 307, 311, 330 및 413; (3) 위치 234, 238, 250, 264, 267, 307, 311, 330 및 343; (4) 위치 234, 238, 250, 264, 267, 307, 311, 330 및 413; (5) 위치 234, 238, 250, 267, 307, 311, 330 및 343; (6) 위치 234, 238, 250, 267, 307, 311, 330 및 413; (7) 위치 234, 238, 250, 307, 311, 330 및 343; (8) 위치 234, 238, 250, 307, 311, 330 및 413; (9) 위치 238, 250, 264, 267, 307, 311, 330 및 343; (10) 위치 238, 250, 264, 267, 307, 311, 330 및 413; (11) 위치 238, 250, 264, 307, 311, 330 및 343; (12) 위치 238, 250, 264, 307, 311, 330 및 413; (13) 위치 238, 250, 267, 307, 311, 330 및 343; (14) 위치 238, 250, 267, 307, 311, 330 및 413; (15) 위치 238, 250, 307, 311, 330 및 343; 및 (16) 위치 238, 250, 307, 311, 330 및 413 중 어느 하나의 아미노산 변경을 포함한 증가된 pI 및 향상된 FcγRIIb 결합 활성을 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
또한, 다른 목적(들)으로 실시된 아미노산 변경은 본원에 기재된 변이체 Fc 영역에서 조합될 수 있다. 예를 들어, FcRn 결합 활성을 개선시키는 아미노산 치환 (Hinton et al., J. Immunol. 176(1):346-356 (2006); Dall'Acqua et al., J. Biol. Chem. 281(33):23514-23524 (2006); Petkova et al., Intl. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006); Zalevsky et al., Nat. Biotechnol. 28(2):157-159 (2010); WO 2006/019447; WO 2006/053301; 및 WO 2009/086320), 및 항체 이질성 또는 안정성을 개선하기 위한 아미노산 치환(WO 2009/041613)이 추가될 수 있다. 대안적으로, WO 2011/122011, WO 2012/132067, WO 2013/046704 또는 WO 2013/180201에 기재된 항원 제거를 촉진하는 성질을 갖는 폴리펩티드, WO 2013/180200에 기재된 표적 조직에 특이적으로 결합하는 성질을 갖는 폴리펩티드, WO 2009/125825, WO 2012/073992 또는 WO 2013/047752에 기재된 복수의 항원 분자에 대해 반복적으로 결합하는 성질을 갖는 폴리펩티드는 본원에 기재된 변이체 Fc 영역과 조합될 수 있다. 대안적으로, 다른 항원에 대한 결합능을 부여할 목적으로, EP1752471 및 EP1772465에 개시된 아미노산 변경은 본원에 기재된 변이체 Fc 영역의 CH3에서 조합될 수 있다. 대안적으로, 혈장 체류를 증가시키기 위한 목적으로, 불변 영역의 pI를 감소시키는 아미노산 변경(WO 2012/016227)은 본원에 기재된 변이체 Fc 영역에서 조합될 수 있다. 대안적으로, 세포 내 흡수를 촉진시키기 위한 목적으로, 불변 영역의 pI를 증가시키는 아미노산 변경(WO 2014/145159)은 본원에 기재된 변이체 Fc 영역에서 조합될 수 있다. 대안적으로, 혈장에서 표적 분자의 제거를 촉진하기 위한 목적으로, 불변 영역의 pI를 증가시키는 아미노산 변경(WO 2016/125495)은 본원에 기재된 변이체 Fc 영역에서 조합될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 변경은, 예를 들어 EU 넘버링에 따른 311, 343, 384, 399, 400, 및 413으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 위치에서의 치환을 포함할 수 있다. 추가의 구현예에서, 상기 치환은 아미노산을 각 위치에서 Lys 또는 Arg로 치환하는 것일 수 있다.
산성 pH 하에서 인간 FcRn 결합 활성을 향상시키는 아미노산 변경은 또한 본원에 기재된 변이체 Fc 영역에서 조합될 수 있다. 구체적으로, 상기 변경은, 예를 들어 EU 넘버링에 따른 위치 428에서 Met를 Leu로 치환 및 위치 434에서 Asn을 Ser로 치환(Zalevsky et al., Nat. Biotechnol. 28:157-159 (2010)); 위치 434에서 Asn을 Ala로 치환(Deng et al., Metab. Dispos. 38(4):600-605 (2010)); 위치 252에서 Met를 Tyr로 치환, 위치 254에서 Ser를 Thr로 치환 및 위치 256에서 Thr를 Glu로 치환(Dall'Acqua et al., J. Biol. Chem. 281:23514-23524 (2006)); 위치 250에서 Thr을 Gln으로 치환 및 위치 428에서 Met를 Leu로 치환(Hinton et al., J. Immunol.176(1):346-356 (2006)); 위치 434에서 Asn을 His로 치환(Zheng et al., Clin. Pharmacol. Ther. 89(2):283-290 (2011), 및 WO 2010/106180, WO 2010/045193, WO 2009/058492, WO 2008/022152, WO 2006/050166, WO 2006/053301, WO 2006/031370, WO 2005/123780, WO 2005/047327, WO 2005/037867, WO 2004/035752, 또는 WO 2002/060919에 기재된 변경을 포함할 수 있다. 상기 변경은, 예를 들어 위치 428에서 Met를 Leu로 치환, 위치 434에서 Asn을 Ala로 치환 및 위치 436에서 Tyr을 Thr로 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 변경을 포함할 수 있다. 상기 변경은 위치 438에서 Gln을 Arg로 치환 및/또는 위치 440에서 Ser을 Glu로 치환을 더 포함할 수 있다(WO2016/125495).
예시적인 이중특이적 항-CCL2 항체
본 발명의 일 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 상이한 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 상이한 제2 항원 결합 부위를 포함하는, 이중특이적 항체로서,
A) i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
B) i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 22의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
C) i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
D) i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
E) i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
F) i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
G) i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
H) i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
I) i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 인간 IgG1 동형의 Fc 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 인간 IgG1 동형의 불변 중쇄 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 20 mg/kg의 각 이중특이적 항체 및 0.1 mg/kg의 인간 CCL2로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 10 ml/kg의 단일 용량으로 FcRn 형질전환 마우스에 투여할 때, 인간 야생형 IgG1 동형의 불변 중쇄 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함하는 이중특이적 항체를 투여한 후 인간 CCL2에 대한 생체내 제거율(ml/day/kg)은 돌연변이 L234A, L235A, P329G를 포함하는 인간 IgG1 동형의 Fc 감마 수용체 침묵형 불변 중쇄 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함하는 이중특이적 항체를 투여한 후 인간 CCL2에 대한 생체내 제거율(ml/day/kg)에 비해 2배 이상(일 구현예에서 5배 이상, 일 구현예에서 10배 이상, 일 구현예에서 20배 이상) 높다.
본 발명의 일 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 상이한 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서,
i) 상기 제1 항원 결합 부위는 CCL2 상의 동일한 에피토프에 항체로서 결합하고, 상기 항체는,
서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하며, (a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 CCL2 상의 동일한 에피토프에 항체로서 결합하고, 상기 항체는,
서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하며, (a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.
일 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 인간 IgG1 동형의 Fc 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 인간 IgG1 동형의 불변 중쇄 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 20 mg/kg의 각 이중특이적 항체 및 0.1 mg/kg의 인간 CCL2로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 10 ml/kg의 단일 용량으로 FcRn 형질전환 마우스에 투여할 때, 인간 야생형 IgG1 동형의 불변 중쇄 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함하는 이중특이적 항체를 투여한 후 인간 CCL2에 대한 생체내 제거율(ml/day/kg)은 돌연변이 L234A, L235A, P329G를 포함하는 인간 IgG1 동형의 Fc 감마 수용체 침묵형 불변 중쇄 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함하는 이중특이적 항체를 투여한 후 인간 CCL2에 대한 생체내 제거율(ml/day/kg)에 비해 15배 이상, 특히 20배 이상 높다.
본 발명의 일 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 상이한 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서,
i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
(d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고;
그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
(d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.
본 발명의 일 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 상이한 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서,
i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3, (d) 서열번호 63의 아미노산 서열 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTF를 포함하는 FR-H1, (e) 서열번호 64의 아미노산 서열 WVRQAPGQGLEWMG를 포함하는 FR-H2, (f) 서열번호 65의 아미노산 서열 RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVY YCAR을 포함하는 FR-H3, 및 (g) 서열번호 66의 아미노산 서열 WGQGTLVTVSS를 포함하는 FR-H4를 포함하는 VH 도메인; 및
(h) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (i) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (j) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3, (k) 서열번호 67의 아미노산 서열 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC를 포함하는 FR-H1, (l) 서열번호 68의 아미노산 서열 WYQQKPGQAPRLLIY를 포함하는 FR-H2, (m) 서열번호 69의 아미노산 서열 GVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC를 포함하는 FR-L3, 및 (n) 서열번호 70의 아미노산 서열 GQGTKVEIK를 포함하는 FR-H4를 포함하는 VL 도메인을 포함하고;
그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3, (d) 서열번호 82의 아미노산 서열 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGLTIS를 포함하는 FR-H1, (e) 서열번호 83의 아미노산 서열 WVRQAPGQGLEWMG를 포함하는 FR-H2, 및 (f) 서열번호 84의 아미노산 서열 RVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR을 포함하는 FR-H3, 및 (g) 서열번호 85의 아미노산 서열 WGQGTTVTVSS를 포함하는 FR-H4를 포함하는 VH 도메인; 및
(h) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (i) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (j) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3, (k) 서열번호 86의 아미노산 서열 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC를 포함하는 FR-L1, (l) 서열번호 87의 아미노산 서열 WYQQKPGKAPKLLIH를 포함하는 FR-L2, (m) 서열번호 88의 아미노산 서열 GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYC를 포함하는 FR-L3, 및 (n) 서열번호 89의 아미노산 서열 FGGGTKVEIK를 포함하는 FR-H4를 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.
본 발명의 일 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 상이한 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서,
A) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
B) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
C) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
D) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
E) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
F) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
G) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
H) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
I) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
J) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
K) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
L) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
M) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
N) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
O) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
P) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.
일 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 인간 IgG1 동형의 Fc 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 인간 IgG1 동형의 불변 중쇄 도메인을 포함한다.
본 발명의 일 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 상이한 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서,
i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
본 발명의 일 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 상이한 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서,
i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.
본 발명의 일 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 상이한 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서,
i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.
본 발명의 일 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 상이한 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서,
i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.
일 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 인간 IgG1 동형의 Fc 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 인간 IgG1 동형의 불변 중쇄 도메인을 포함한다. 본 발명의 일 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 상이한 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서,
A) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V이고, X2는 P이며, X3은 H인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F이고 X2는 R인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
B) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V이고, X2는 P이며, X3은 H인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 91의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F이고 X2는 R인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
C) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 94의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
D) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 72의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 94의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
E) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 73의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
F) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 73의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 94의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
G) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 73의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 92의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
H) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 73의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 91의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
I) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 72의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
J) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 72의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 92의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
K) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 72의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 91의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
L) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 74의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
M) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 74의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 94의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
N) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 74의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 92의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
O) i)상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 74의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 91의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
P) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 92의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.
일 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 인간 IgG1 동형의 Fc 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 인간 IgG1 동형의 불변 중쇄 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는,
i)시험관 내에서 CCL2가 이의 수용체 CCR2에 결합하는 것을 차단하고(리포터 분석, IC50=0.5 nM); 및/또는
ii) 시험관 내에서 골수 세포의 CCL2 매개 주화성을 억제하고(IC50=1.5 nM); 및/또는
iii) 시노 및 및 인간 CCL2에 교차 반응한다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 다른 인간 CCL 동족체에 대해 교차 반응성이 아니며, 특히 CCL2에 대한 결합과 비교하여 다른 CCL 동족체(CCL8, CCL7 및 CCL13의 군으로부터 선택됨)에 대한 결합이 100배 더 적게 나타낸다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 이온 의존적 방식으로 인간 CCL2 상의 제1 에피토프 및 제2 에피토프에 결합한다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 pH 의존적 방식으로 인간 CCL2에 결합하고, 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위 둘 모두는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화도로 CCL2에 결합한다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 pH 5.8에서보다 pH 7.4에서 10배 더 높은 친화도로 인간 CCL2에 결합한다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 하기 돌연변이(카바트 EU 넘버링)들:
i) 중쇄 불변 도메인 중 하나에서의 S354C 및 T366W
ii) 중쇄 불변 도메인 중 다른 하나에서의 Y349C, T366S, L368A, Y407V를 포함하는 (독립적으로 또는 상기 기재된 돌연변이 이외에) 2개의 IgG1 중쇄 불변 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 인간 IgG1 동형의 Fc 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 인간 IgG1 동형의 불변 중쇄 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 하기 돌연변이(카바트 EU 넘버링)들:
i) Q311R 및/또는 P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합); 및/또는
ii) L234Y, L235W, G236N, P238D, T250V, V264I, H268D, Q295L, T307P, K326T 및/또는 A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합); 및/또는
iii) M428L, N434A 및/또는 Y436T(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및/또는
iv) Q438R 및/또는 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합) 중 하나 이상을 포함하는 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 하기 돌연변이(카바트 EU 넘버링)들:
i) Q311R, 및/또는 P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합); 및/또는
ii) L235W, G236N, H268D, Q295L, K326T 및/또는 A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합); 및/또는
iii) N434A(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및/또는
iv) Q438R 및/또는 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합) 중 하나 이상을 포함하는 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 하기 돌연변이(카바트 EU 넘버링)들:
i) Q311R 및 P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합); 및
ii) L235W, G236N, H268D, Q295L, K326T 및 A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합); 및
iii) N434A(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및
iv) Q438R 및 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합)를 포함하는 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 하기 돌연변이(카바트 EU 넘버링)들:
i) Q311R 및 P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합); 및
ii) N434A(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및
iii) Q438R 및 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합)를 포함하는 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 하기 돌연변이(카바트 EU 넘버링)들:
Q311R 및 P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합)을 포함하는 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 하기 돌연변이(카바트 EU 넘버링)들:
i) Q311R 및/또는 P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합); 및/또는
ii) L234Y, P238D, T250V, V264I, T307P 및/또는 A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합); 및/또는
iii) M428L, N434A 및/또는 Y436T(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및/또는
iv) Q438R 및/또는 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합) 중 하나 이상을 포함하는 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 하기 돌연변이(카바트 EU 넘버링)들:
i) Q311R 및 P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합); 및
ii) L234Y, P238D, T250V, V264I, T307P 및 A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합); 및
iii) M428L, N434A 및 Y436T(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및
iv) Q438R 및 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합) 중 하나 이상을 포함하는 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 하기 돌연변이(카바트 EU 넘버링)들:
i) Q311R 및 P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합); 및
ii) L234Y, P238D, T250V, V264I, T307P 및 A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합); 및
iii) N434A(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및
iv) Q438R 및 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합) 중 하나 이상을 포함하는 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함한다.
본 발명의 일 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 상이한 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서,
A) i)상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
B) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
C) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
D) i)상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고;
상기 이중특이적 항체는 인간 IgG 동형(바람직하게는 인간 IgG1 동형)의 전장 항체로서,
a) 각각의 i) 하에 상기 제1 항원 결합 부위를 포함하는 제1 항체의 제1 경쇄 및 제1 중쇄; 및
b) 각각의 ii) 하에 상기 제2 항원 결합 부위를 포함하는 제2 항체의 제2 경쇄 및 제2 중쇄를 갖고, 제2 항체의 제2 경쇄 및 제2 중쇄 내의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로에 의해 대체되고; 그리고
a) 하의 제1 경쇄의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신(K)에 의해 치환되고(카바트에 따른 넘버링), 위치 123의 아미노산은 리신(K)에 의해 치환되며(카바트에 따른 넘버링),
a) 하의 제1 중쇄의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되고(카바트에 따른 넘버링), 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되는 (카바트에 따른 넘버링), (단리된)이중특이적 항체이다.
본 발명의 일 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 상이한 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서,
i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고;
상기 이중특이적 항체는 (전장)항체로서,
a) i) 하에 상기 제1 항원 결합 부위를 포함하는 IgG1 동형의 제1 중쇄 및 제1 카파 또는 람다 경쇄; 및
b) ii) 하에 상기 제2 항원 결합 부위를 포함하는 제2 IgG1 중쇄 IgG1 동형 및 제2 카파 또는 람다 경쇄를 갖고, 제2 항체의 제2 경쇄 및 제2 중쇄 내의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로에 의해 대체되고; 그리고
a) 하의 제1 경쇄의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신(K)에 의해 치환되고(카바트에 따른 넘버링), 위치 123의 아미노산은 리신(K)에 의해 치환되며(카바트에 따른 넘버링),
a) 하의 제1 중쇄의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되고(카바트에 따른 넘버링), 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되는 (카바트에 따른 넘버링), (단리된)이중특이적 항체이다.
일 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 하기 돌연변이들(카바트 EU 넘버링):
i) 중쇄 불변 도메인 중 하나에서의 S354C 및 T366W
ii) 중쇄 불변 도메인 중 다른 하나에서의 Y349C, T366S, L368A, Y407V를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 하기 돌연변이들(카바트 EU 넘버링):
i) Q311R 및 P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합); 및
ii) L235W, G236N, H268D, Q295L, K326T 및 A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합); 및
iii) N434A(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및
iv) Q438R 및 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합)를 추가로 포함한다.
대안적인 일 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 하기 돌연변이들(카바트 EU 넘버링):
i) Q311R 및 P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합); 및
ii) N434A(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및
iii) Q438R 및 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합)를 추가로 포함한다.
대안적인 일 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 하기 돌연변이들(카바트 EU 넘버링):
Q311R 및 P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합)을 추가로 포함한다.
대안적인 일 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 하기 돌연변이들(카바트 EU 넘버링):
i) Q311R 및 P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합); 및
ii) L234Y, P238D, T250V, V264I, T307P 및 A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합); 및
iii) M428L, N434A 및 Y436T(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및
iv) Q438R 및 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합)를 추가로 포함한다.
대안적인 일 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 하기 돌연변이들(카바트 EU 넘버링):
i) Q311R 및 P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합); 및
ii) L234Y, P238D, T250V, V264I, T307P 및 A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합); 및
iii) N434A(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및
iv) Q438R 및 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합)를 추가로 포함한다.
본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 112의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 113의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 114의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 115의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.
본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.
본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 116의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 117의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 118의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 119의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.
본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.
본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 120의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 121의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 122의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 123의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.
본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.
본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 120의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 121의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 122의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 123의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.
본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.
본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 155의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 156의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 157의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 158의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.
본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 155의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 156의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 157의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호 158의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.
본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 159의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 160의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 161의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 162의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.
본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 159의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 160의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 161의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호 162의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.
본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 163의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 164의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 165의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 166의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.
본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 163의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 164의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 165의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호 166의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.
본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 167의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 168의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 169의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 170의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.
본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 167의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 168의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 169의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호 170의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.
본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 171의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 172의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 173의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 174의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.
본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 172의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 173의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호 174의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.
본 발명의 일 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 상이한 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서,
i)
상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고;
상기 이중특이적 항체는 인간 IgG1의 (전장)항체로서,
a) i) 하에 상기 제1 항원 결합 부위를 포함하는 IgG1 동형의 제1 중쇄 및 제1 카파 또는 람다 경쇄; 및
b) ii) 하에 상기 제2 항원 결합 부위를 포함하는 제2 IgG1 중쇄 IgG1 동형 및 제2 카파 또는 람다 경쇄를 갖고, 제2 항체의 제2 경쇄 및 제2 중쇄 내의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로에 의해 대체되고; 그리고
a) 하의 제1 경쇄의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신(K)에 의해 치환되고(카바트에 따른 넘버링), 위치 123의 아미노산은 리신(K)에 의해 치환되며(카바트에 따른 넘버링),
a) 하의 제1 중쇄의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되고(카바트에 따른 넘버링), 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되는 (카바트에 따른 넘버링), (단리된)이중특이적 항체이다.
일 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 하기 돌연변이들(카바트 EU 넘버링):
i) 중쇄 불변 도메인 중 하나에서의 S354C 및 T366W
ii) 중쇄 불변 도메인 중 다른 하나에서의 Y349C, T366S, L368A, Y407V를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 하기 돌연변이들(카바트 EU 넘버링):
i) Q311R 및 P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합); 및
ii) L235W, G236N, H268D, Q295L, K326T 및 A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합); 및
iii) N434A(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및
iv) Q438R 및 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합)를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 하기 돌연변이(카바트 EU 넘버링)들:
i) Q311R 및 P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합); 및
ii) N434A(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및
iii) Q438R 및 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합)를 포함하는 IgG1 중쇄 불변 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 하기 돌연변이(카바트 EU 넘버링)들:
Q311R 및 P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합)을 추가로 포함한다.
대안적인 일 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 하기 돌연변이들(카바트 EU 넘버링):
i) Q311R 및 P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합); 및
ii) L234Y, P238D, T250V, V264I, T307P 및 A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합); 및
iii) M428L, N434A 및 Y436T(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및
iv) Q438R 및 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합)를 추가로 포함한다.
대안적인 일 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 하기 돌연변이들(카바트 EU 넘버링):
i) Q311R 및 P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합); 및
ii) L234Y, P238D, T250V, V264I, T307P 및 A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합); 및
iii) N434A(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및
iv) Q438R 및 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합)를 추가로 포함한다.
본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 124의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 125의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 126의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 127의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.
본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 126의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호 127의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.
본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 128의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 129의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 130의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 131의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.
본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 128의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호 131의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.
본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 132의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 133의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 134의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 135의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.
본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 132의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 133의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 134의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호 135의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.
재조합 방법 및 조성물
항체는, 예컨대 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 바와 같이 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생성될 수 있다. 일 구현예에서, 본원에서 기재된 항-CCL2 항체(이중특이적 또는 단일특이적)를 부호화하는 단리된 핵산이 제공된다. 상기 핵산은 단일특이적 또는 이중특이적 항체의 하나 또는 모든 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 하나 또는 모든 VH를 포함하는 아미노산 서열(예컨대, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)를 부호화할 수 있다. 추가의 구현예에서, 상기 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예컨대, 발현 벡터)가 제공된다. 추가의 구현예에서, 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 상기 일 구현예에서, 숙주 세포는: (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 부호화하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 부호화하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 부호화하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다(예컨대, 이로 변형된다). 일 구현예에서, 상기 숙주 세포는 진핵, 예컨대 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary: CHO) 세포, HEK293 세포 또는 림프구 세포(예컨대, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 일 구현예에서, 항-CCL2 항체를 제조하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 상기 제공된 바와 같은 항체의 발현에 적합한 조건하에, 상기 항체를 부호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 임의적으로, 상기 항체를 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 회수하는 단계를 포함한다.
항-CCL2 세포의 재조합 생성을 위해, 상기 핵산은 통상적인 절차에 의해(예컨대, 항체의 중쇄 및 경쇄를 부호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리되고 서열분석된다.
항체 부호화 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 항체는 특히 당화 및 Fc 작동체 기능이 요구되지 않는 경우 박테리아에서 생성될 수 있다. 박테리아에서 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현을 위해서, 예컨대 US 5,648,237, US 5,789,199, 및 US 5,840,523을 참조한다. (또한, 대장균에서 항체 단편의 발현을 설명하는 Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254를 참조한다). 발현 이후, 항체는 가용성 분획의 박테리아 세포 덩어리로부터 단리될 수 있고 추가로 정제될 수 있다.
원핵생물에 더하여, 진핵 미생물, 예컨대 이의 글리코실화 경로가 “인간화”되어, 부분적 또는 완전한 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체의 생성을 유발하는 균류 및 효모 균주를 포함한 실모양 균류 또는 효모는 항체 부호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; and Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215를 참조한다.
글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 생물체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 특히, 스포도프테라 푸르기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포들의 형질감염을 위해 곤충 세포들과 병용될 수 있는 많은 베큘로바이러스 균주들이 확인되었다.
식물 세포 배양액 또한 숙주로서 활용될 수 있다. 예컨대, US 특허 제5,959,177호, 6,040,498호, 6,420,548호, 7,125,978호 및 6,417,429호(유전자도입 식물에서 항체를 생성하기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES)TM 기술을 설명)를 참조한다.
척추동물 세포가 또한 숙주로서 이용될 수 있다. 예를 들어, 현탁 상태에서 성장하도록 적응된 포유류 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예에는 SV40(COS-7)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주; 인간 배아 신장 세포주(예컨대, Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74에 기재된 바와 같은 293 또는 293T 세포); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리 세포(예컨대, Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252에 기재된 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK; 버팔로 랫트 간 세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간 세포(Hep G2); 마우스 유방 종양(MMT 060562); TRI 세포(예컨대, Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포가 포함된다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주로는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 예컨대 DHFR- CHO세포(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0이 포함된다. 항체 생성에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 예컨대 Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268을 참조한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 변형된 단일특이적 항체가 개선된 pH 의존적 결합 특성을 나타내고, 따라서 본 발명의 이중특이적 항체의 생성에 특히 유용하다는 발견에 부분적으로 기초한다.
pH 의존적 결합 특성을 갖는 단일특이적 항-CCL2 항체
본 발명의 일 구현예는 인간 CCL2에 (특이적으로)결합하는 (단리된)(단일특이적)항체로서,
상기 항체는,
A) X는 I 또는 T인 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
(d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
B) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
(d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.
본 발명의 일 구현예는 인간 CCL2에 (특이적으로)결합하는 (단리된)(단일특이적)항체로서,
상기 항체는,
A) 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
또는
B) 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
또는
C) 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
또는
D) 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
또는
E) 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
또는
F) 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
또는
G) 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
또는
H) 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)(단일특이적)항체이다.
진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정 구현예들에서, 본원에서 제공된 임의의 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체는 생물학적 샘플에서 CCL2의 존재 검출에 유용하다. 본원에서 사용된 용어 “검출하는”은 정량적 또는 정성적 검출을 수반한다. 특정 구현예들에서, 생물학적 샘플은 면역 세포 또는 T 세포 침윤물 및/또는 종양 세포와 같은 세포 또는 조직을 포함한다.
일 구현예에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체가 제공된다. 추가의 양태에서, 생물학적 샘플 중의 CCL2의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 구현예들에서, 상기 방법은 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체가 CCL2에 결합하는 것을 허용하는 조건하에서 상기 생물학적 샘플을 본원에 기재된 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체와 접촉시키고 복합체가 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체 및 CCL2 간에 형성되는지 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 생체내 또는 시험관내 방법일 수 있다. 일 구현예에서, 예컨대 CCL2이 환자 선택용 바이오마커인 경우, 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체를 사용하여 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체를 이용한 요법에 적격인 대상체를 선택한다.
특정 구현예들에서, 표지된 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체가 제공된다. 표지는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티(예컨대, 형광, 발색, 전자 밀도, 화학발광 및 방사성 표지) 뿐만 아니라, 예컨대 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 모이어티, 예컨대 효소 또는 리간드를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 표지는 염료 전구체를 산화시키는 과산화수소를 이용하는 효소, 예컨대 HRP, 락토페록시다아제 또는 마이크로페록시다아제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지 및 안정된 유리 라디칼 등과 연계된 방사성 동위원소 32P, 14C, 125I, 3H 및 131I, 형광단, 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루시페라아제, 예컨대 개똥벌레 루시페라아제 및 세균 루시페라아제(미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디히드로프타라진디온, 양고추냉이 과산화효소(HRP), 알칼리 인산분해효소, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다아제, 예컨대 글루코오스 옥시다아제, 갈락토오스 옥시다아제 및 글루코오스-6-인산염 탈수소효소, 헤테로환상 옥시다아제, 예컨대 요산분해효소 및 크산틴 옥시다아제를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
E.약학적 제제
본원에 기재된 바와 같은 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체의 약학적 제제는 동결 건조된 제제 또는 수용액의 형태에서 원하는 정도의 순도를 갖는 이런 항체를 하나 이상의 임의적인 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합함으로써 제조된다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)). 약학적으로 허용가능한 담체는 이용되는 투여량 및 농도에서 수용자에 비독성이며, 완충액, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토니움 클로라이드; 벤잘코니움 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 낮은 분자량의(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로블린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리(비닐피롤리돈); 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체(예컨대, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 예시적인 약학적으로 허용가능한 담체는 세포간(insterstitial) 약물 분산제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들어 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대 rhuPH20(하일레넥스(HYLENEX)®, 박스터 인터내셔널(Baxter International, Inc.))을 포함한다. rhuPH20를 포함하는 특정 예시적인 sHASEGPs 및 이를 이용하는 방법은 미국 공개 특허 출원 제 2005/0260186 및 2006/0104968에 기재되어 있다. 일 구현예에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가적인 글리코사미노글리카나제, 예컨대 콘드로이티나제와 조합된다.
예시적인 동결건조된 항체 제제는 미국 특허 제6,267,958호에서 기재된다. 수용액 항체 제제는 미국 특허 제6,171,586 및 WO 2006/044908에서 기재된 것들을 포함하며, 후자의 제제는 히스티딘-아세테이트 완충액을 포함한다.
본원에서 제제는 또한 치료되는 특정 적응증에 대해 필요에 따라 한 가지 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에 부정적으로 영향을 주지 않는 상보성 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 예를 들어, 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 활성 성분들은 의도한 목적에 효과적인 양으로 복합물 내에 적합하게 존재한다.
활성 성분은 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에서 각각 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 의해 준비된 마이크로캡슐 또는 마크로에멀젼 (macroemulsions)안에 포집될 수 있다. 상기 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)에서 개시된다.
서방형 제제가 제조될 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 상기 매트릭스는 성형 제품, 예컨대 필름 또는 미세캡슐 형태이다.
생체내 투여에 사용되는 제제는 일반적으로 무균이다. 무균은, 예컨대 무균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 구현될 수 있다.
F. 치료 방법 및 조성물
본원에서 제공된 임의의 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체는 치료 방법에서 사용할 수 있다.
일 양태에서, 약제로서 사용하기 위한 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체가 제공된다. 추가의 양태에서, 암 치료에 사용하기 위한 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체가 제공된다. 특정 구현예들에서, 치료 방법에서 사용하기 위한 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체가 제공된다. 특정 구현예들에서, 본 발명은 유효량의 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 가진 개체의 치료 방법에 사용하기 위한 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체를 제공한다.
추가의 구현예들에서, 본 발명은 종양에서 면역억제를 억제하여 항 PD1 및 항 PDL-1 길항제 등과 같은 면역 자극제에 대해 종양 감수성을 만드는 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체를 제공한다.
따라서, 본 발명의 일 양태는 본원에 기재된 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체와 항 PD1 및 항 PDL-1 길항제 등과 같은 암 면역요법의 조합이다.
본원에서 사용된 용어 "암"은, 예를 들어 폐암, 비소세포 폐암(NSCL), 세기관지 세포 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 머리 또는 목의 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 부위의 암, 위암, 위암, 결장암, 유방암, 자궁암, 난관의 암종, 자궁내막의 암종, 자궁경부의 암종, 질의 암종, 외음부의 암종, 호지킨병, 식도의 암, 소장의 암, 내분비계의 암, 갑상선의 암, 부갑상선의 암, 부신의 암, 연조직의 육종, 요도의 암, 음경의 암, 전립선암, 방광의 암, 신장 또는 요관의 암, 신장 세포 암종, 신우의 암종, 중피종, 간세포암, 담즙 암, 중추신경계(CNS)의 신생물, 척추 축 종양, 뇌간 신경교종, 다형성 아교모세포종, 성상세포종, 슈반세포종, 상의세포종, 수모세포종, 수막종, 편평상피 세포 암종, 뇌하수체 선종, 림프종, 림프성 백혈병, 예컨대 상기 암 중 임의의 것의 불응성 버전, 또는 상기 암 중 하나 이상의 조합일 수 있다.
상기 구현예들 중 임의의 것에 따른 “개체”는 바람직하게는 인간이다. 추가의 양태에서, 본 발명은 약제의 제조 또는 준비에서 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체의 사용을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 약제는 암의 치료를 위한 것이다. 추가의 구현예에서, 상기 약제는 암을 갖는 개체에게 유효량의 약제를 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 것이다. 추가의 구현예에서, 약제는 암 세포의 세포 매개 용해를 유도하기 위한 것이다. 추가의 구현예에서, 약제는 암 세포에서 세포자멸사를 유도하거나 암 세포 증식을 억제하기 위해 유효량의 약제를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 암을 앓고 있는 개체에게서 암세포의 세포 매개 용해를 유도하는 방법을 사용하기 위한 것이다. 상기 구현예들 중 임의의 것에 따른 “개체”는 인간일 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 암을 가진 개체에게 유효량의 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 상기 구현예들 중 임의의 것에 따른 “개체”는 인간일 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 암을 앓고 있는 개체에게서 암세포의 세포 매개 용해를 유도하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 방법은 개체에게 유효량의 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체를 투여하여 암을 앓고 있는 개체에게서 암세포의 세포 매개 용해를 유도하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, “개체”는 인간이다.
본 발명의 다른 양태에서, 염증성 질환 또는 자가면역 질환을 치료하는데 사용하기 위한 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체가 제공된다. 특정 구현예들에서, 본 발명은 유효량의 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 질환 또는 자가면역 질환을 가진 개체의 치료 방법에 사용하기 위한 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체를 제공한다.
추가의 양태에서, 본 발명은, 예컨대 임의의 상기 치료 방법에서 사용하기 위해, 본원에서 제공된 임의의 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체를 포함하는 약학적 제제를 제공한다. 일 구현예에서, 약학적 제제는 본원에서 제공된 임의의 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
일부 구현예들에서, 염증성 질환 또는 자가면역 질환은 자가면역 장애, 염증성 장애, 섬유성 장애, 과립구(호중구 또는 호산구성) 장애, 단핵구 장애 또는 림프구 장애, 또는 정상 또는 비정상 조직의 상주 세포(예컨대, 비만 세포, 대식세포 또는 림프구) 또는 기질 세포(예컨대, 섬유아세포, 근섬유아세포, 평활근 세포, 상피 또는 내피)의 증가된 수 또는 분포와 관련된 장애이다. 일부 구현예들에서, 상기 장애는 폐질환이다. 일부 구현예들에서, 폐질환은 과립구(호산구성 및/또는 호중구) 폐 염증, 감염 유도된 폐 질환(바이러스(예컨대, 인플루엔자, 파라인플루엔자, 리노바이러스, 인간 메타뉴모바이러스 및 호흡기 세포융합 바이러스)와 관련된 질환을 포함), 세균성 또는 곰팡이(예컨대, 아스페르길루스) 유발 요인과 관련이 있다. 일부 구현예들에서, 장애는 알레르겐 유발성 폐 질환, 독성 환경 오염물질 유발성 폐 상태(예컨대, 석면폐증, 규폐증, 또는 베릴륨증), 위 흡인 유발성 폐 질환이거나, 면역 조절장애 또는 낭포성 섬유증과 같은 유전적 소인으로 인한 염증성 질환과 관련이 있다. 일부 구현예들에서, 장애는 물리적 외상 유발성 폐 질환(예컨대, 인공호흡기 손상), 폐기종, 담배 유발성 폐기종, 기관지염, 유육종증, 조직구증, 림프관근육종증, 급성 폐 손상, 급성 호흡 곤란 증후군, 만성 폐 질환, 기관지폐 이형성증, 폐렴(예컨대, 지역사회 획득 폐렴, 병원 폐렴, 인공호흡기 관련 폐렴, 바이러스성 폐렴, 세균성 폐렴 및 중증 폐렴), 기도 악화 및 급성 호흡곤란 증후군(ARDS))이다. 일부 구현예들에서, 염증성 폐질환은 COPD이다.
일부 구현예들에서, 염증성 폐질환은 천식이다. 일부 구현예들에서, 천식은 치명적일 수 있는 악화되는 증상(악화 또는 발적)의 급성 사건을 동반하는 지속적인 만성 중증 천식이다. 일부 구현예들에서, 천식은 아토피(알레르기로도 공지됨) 천식, 비알레르기성 천식(예컨대, 종종 호흡기 바이러스(예컨대, 인플루엔자, 파라인플루엔자, 리노바이러스, 인간 메타뉴모바이러스 및 호흡기 세포융합 바이러스)로 인한 감염 또는 흡입된 자극제(대기 오염 물질, 스모그, 디젤 입자, 실내 또는 실외의 휘발성 화학물질 및 가스 또는 심지어 차가운 건조 공기)에 의해 촉발됨)이다.
일부 구현예들에서, 천식은 간헐적 또는 운동 유발 천식, “연기”(전형적으로 담배, 권련, 파이프 담배), 흡입 또는 “베이핑(vaping)”(담배, 마리화나 또는 이러한 다른 물질)에 급성 또는 만성의 일차적인 또는 간접적인 노출에 기인한 천식, 또는 아스피린 또는 관련된 NSAIDS의 최근 섭취에 의해 촉발된 천식이다. 일부 구체예에서, 천식은 경등도 천식, 또는 코르티코스테로이드 미경험 천식, 새로이 진단되고 치료되지 않은 천식, 또는 증상 (기침, 천명, 숨가쁨/헐떡임, 또는 흉통)을 제어하기 위해 흡입된 국소 또는 전신 스테로이드의 장기적인 이용을 이전에 필요로 하지 않은 천식이다. 일부 구현예들에서, 천식은 만성 천식, 코르티코스테로이드 저항성 천식, 코르티코스테로이드 난치성 천식, 코르티코스테로이드 또는 다른 만성 천식 조절제 복용 중 통제되지 않는 천식이다. 일부 구현예들에서, 자가면역 질환, 염증성 질환, 섬유성 질환, 호중구 질환, 또는 호산구성 질환은 폐 섬유증이다. 일부 구현예들에서, 폐 섬유증은 특발성 폐 섬유증(IPF)이다. 일부 구현예들에서, 자가면역 질환, 염증성 질환, 섬유성 질환, 과립구(호중구 또는 호산구성) 질환, 단핵구 질환, 또는 림프구 질환은 식도염, 알레르기성 비염, 비알레르기성 비염, 폴립을 동반한 비부비동염, 비용종증, 기관지염, 만성 폐렴, 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증, 기도 염증, 알레르기성 비염, 기관지 확장증 및/또는 만성 기관지염이다.
일부 구현예들에서, 자가면역 질환, 염증성 질환, 섬유성 질환, 과립구(호중구 또는 호산구성) 질환, 단핵구 질환, 또는 림프구 질환은 관절염이다. 일부 구현예들에서, 관절염은 류마티스 관절염이다. 일부 구현예들에서, 관절염은 골관절염, 류마티스 관절염, 소아 관절염, 소아 류마티스 관절염, 초기 관절염, 다관절 류마티스 관절염, 전신 발병 류마티스 관절염, 장병증 관절염, 반응성 관절염, 건선 관절염, 및/또는 손상의 결과로서의 관절염이다.
일부 구현예들에서, 자가면역 질환, 염증성 질환, 섬유성 질환, 과립구(호중구 또는 호산구성) 질환, 단핵구 질환, 또는 림프구 질환은 위장 염증 질환이다. 일부 구현예들에서, 위장 염증 질환은 IBD(염증성 장 질환), 궤양성 대장염(UC), 크론병(CD), 대장염(예컨대, 환경적 손상에 의해 유발된 대장염(예컨대, 치료 요법, 예컨대 화학 요법, 방사선 요법 등에 의해 유발되거나 관련됨), 감염성 대장염, 허혈성 대장염, 교원성 또는 림프구성 대장염, 괴사성 장염, 만성 육아종 질환 또는 복강 질환과 같은 병태의 대장염, 음식 알레르기, 위염, 위장염, 감염성 위염 또는 장염(예컨대, 헬리코박터 파일로리 감염 만성 활동성 위염), 감염원으로 인한 기타 형태의 위장관 염증 또는 불확실한 대장염이다.
일부 구현예들에서, 자가면역 질환, 염증성 질환, 섬유성 질환, 과립구(호중구 또는 호산구성) 질환, 단핵구 질환, 또는 림프구 질환, 또는 정상 또는 비정상 조직 상주 세포(예컨대, 비만 세포, 대식세포 또는 림프구) 또는 기질 세포(예컨대, 섬유아세포, 근섬유아세포, 평활근 세포, 상피 또는 내피)의 증가된 수 또는 분포와 관련된 질환은 루푸스 또는 전신 홍반성 루푸스(SLE), 또는 루푸스의 하나 이상의 기관 특이적 징후(예컨대, 신장에 영향을 미치는 루푸스 신염(LN) 또는 혈액 및/또는 림프 기관(림프절, 비장, 흉선 및 관련 림프관) 및/또는 관절 및/또는 기타 기관에 영향을 미치지만 반드시 그렇지는 않은 신외 루푸스(ERL)이다. 일부 구현예들에서, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 섬유성 질환은 패혈증 및/또는 외상, HIV 감염, 또는 특발성 질환(병인이 공지되지 않음), 예컨대 ANCA 관련 혈관염(AAV), 다발혈관염을 동반한 육아종증(이전에는 베게너 육아종증으로 공지됨), 베체트병, 심혈관 질환, 호산구성 기관지염, 라이터 증후군, SEA 증후군(혈청음성, 골근부착부질병, 관절병증 증후군), 강직성 척추염, 피부근염, 경피증, 예컨대 전신 경화증이라고도 하는 전신 경피증, 혈관염(예컨대, 거대 세포 동맥염(GCA), 측두 동맥염, 두개동맥염 또는 호튼병이라고도 함), 근염, 다발성근염, 피부근염, 결절성 다발동맥염, 동맥염, 류마티스성 다발성 근육통, 유육종증, 원발성 담즙 경화증, 경화성 담관염, 쇼그렌 증후군, 건선, 물방울 건선, 부위바뀜건선, 고름물집건선, 홍색피부건선, 피부염, 아토피 피부염, 천포창, 예컨대 심상성 천포창, 죽상경화증, 루푸스, 스틸병, 중증 근무력증, 복강 질병, 재발 경감(RRMS) 또는 원발성 진행성(PPMS) 또는 이차 진행성(SPMS) 하위유형의 다발성 경화증(MS), 길랭-바레병, 제1형 진성 당뇨병(T1DM) 또는 인슐린 의존성(IDDM) 또는 소아 발병 DM 유형, 갑상선염(예컨대, 그레이브스병), 만성 소화 장애증, 처그-스트라우스 증후군, 근육통 증후군, 호산구과다 증후군, 일시적인 혈관 부종을 포함한 부종 반응, 기생충 감염, 사상충성 피부염, 호산구성 식도염, 호산구성 장염, 호산구성 대장염, 폐쇄성 수면 무호흡증, 심근내막 섬유증, 애디슨병, 레이노병 또는 현상, 자가면역 간염, 이식편대숙주질환(GVHD) 또는 장기 이식 거부반응과 관련이 있다.
본 발명의 항체(및 임의의 추가 치료제)는 비경구, 폐내 및 비내를 포함한 임의의 적절한 수단에 의해, 그리고 국소 치료를 위해 원하는 경우에, 병소내 투여에 의해 투여할 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복막내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투약은 임의의 적합한 경로에 의할 수 있다. 예를 들어, 부분적으로 투여가 단기 또는 장기인지에 따라서, 주사, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의할 수 있다. 다양한 시점에 걸쳐 단일 또는 다중 투여, 볼루스(bolus) 투여, 및 펄스 주입을 포함하는 다양한 투여 일정이 고려된다.
본 발명의 항체는 모범 의료행위 지침과 일치하는 방식으로 조제되고, 투약되고, 투여될 것이다. 상기 문맥에서 고려되는 인자들은 치료되는 특정 질병, 치료되는 특정 포유류, 개별 환자의 임상적 상태, 질병의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의료 전문인에게 공지된 다른 인자들을 포함한다. 항체는 반드시 그러할 필요는 없지만, 문제되는 장애를 예방하거나 치료하는 데 현재 이용되는 한 가지 또는 그 이상의 작용제와 함께 임의적으로 조제된다. 이런 다른 작용제의 유효량은 제제 내에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 인자에 의존한다. 이들은 일반적으로 본원에 기재된 바와 같은 투여 경로로 동일한 투여량으로 사용되거나, 또는 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99%, 또는 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 판단된 임의의 투여량 및 임의의 경로로 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위한, 본 발명의 항체의 적절한 용량(단독으로 또는 한 가지 이상의 다른 추가 치료제와 조합으로 이용될 때)은 치료되는 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 심각도 및 과정, 항체가 예방적 또는 치료적 목적으로 투여되는지 여부, 이전 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 그리고 주치의의 재량에 의존할 것이다. 상기 항체는 적합하게는, 한꺼번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 투여된다. 질환의 유형과 중증도에 따라서, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg(예컨대, 0.5 mg/kg 내지 10 mg/kg)의 항체가, 예를 들어 1회 이상의 별개 투여에 의한, 또는 연속 주입에 의한 것인지에 상관없이, 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 용량일 수 있다. 한 가지 전형적인 일일 투여량은 상술한 인자에 따라서, 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 수일 또는 그 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 병태에 따라서, 치료는 일반적으로 질환 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 지속된다. 항체의 한 가지 예시적인 용량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위 내에 있을 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg(또는 이들의 임의의 조합) 중에서 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 상기 용량은 간헐적으로, 예컨대 1주 1회 또는 3주 1회(예컨대, 상기 환자가 약 2 내지 약 20, 또는 예컨대 약 6 용량의 항체를 투여받도록 하는) 투여할 수 있다. 초기의 더 높은 부하 용량, 그 이후에 1회 또는 그 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 예시적인 투여 요법은 약 4 mg/kg의 초기 부하 용량에 이어서 항체의 약 2 mg/kg의 매주 유지 용량을 투여하는 것을 포함한다. 하지만, 다른 투여량 요법이 유용할 수 있다. 상기 치료의 진행은 통상적인 기술 및 분석법에 의해 용이하게 모니터링된다.
II. 제조 물품
본 발명의 다른 양태에서, 상술한 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기 및 상기 용기 위의 또는 상기 용기와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기로는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기, IV 용액 주머니 등이 포함된다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 상기 용기는 단독으로, 또는 병태를 치료하고, 예방하고 및/또는 진단하는 데 효과적인 다른 조성물과 병용되는 조성물을 보유하고, 무균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 상기 용기는 정맥내 용액 백, 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통가능한 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 적어도 한 가지 활성 제제는 본 발명의 항체이다. 표지 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택된 병태를 치료하는 데 이용된다는 것을 지시한다. 또한, 제조 물품은 (a) 본 발명의 항체를 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제1 용기; 및 (b) 추가의 세포독성제 또는 그렇지 않으면 치료제를 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 구현예에서 제조 물품은 조성물이 특정 병태를 치료하는 데 이용될 수 있다는 것을 지시하는 포장 삽입물을 더 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 제조 물품은 약학적으로 허용가능한 완충액, 예컨대 정균성 주사용수(BWFI), 인산염 완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2(또는 제3) 용기를 더 포함할 수 있다. 이는 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하여 상업적 관점 및 이용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 구현예들이 하기에 열거된다:
1. 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 상이한 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 상이한 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체로서,
상기 이중특이적 항체는 인간 IgG 동형, 바람직하게는 인간 IgG1 동형의 Fc 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체.
2. 구현예 1에 있어서,
A) i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
B) i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
C) i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
D) i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
E) i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
F) i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
G) i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
H) i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
I) i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체.
3. 구현예 2에 있어서,
A) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하며, (a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하며, (a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
B) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하며, (a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하며, (a) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
C) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하며, (a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하며, (a) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
D) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하며, (a) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하며, (a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
E) i)상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하며, (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하며, (a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
F) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하며, (a) 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하며, (a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
G) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하며, (a) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하며, (a) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
H) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하며, (a) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하며, (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
I) i)상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하며, (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하며, (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체.
4.제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 IgG 동형의 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항체는 인간 IgG1 동형의 불변 중쇄 도메인을 포함하는 이중특이적 항체인, 이중특이적 항체.
5.구현예 4에 있어서,
20 mg/kg의 각 이중특이적 항체 및 0.1 mg/kg의 인간 CCL2로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 10 ml/kg의 단일 용량으로 FcRn 형질전환 마우스에 투여할 때, 인간 야생형 IgG1 동형의 불변 중쇄 도메인을 포함하는 이중특이적 항체를 투여한 후 인간 CCL2에 대한 생체내 제거율(ml/day/kg)은 돌연변이 L234A, L235A, P329G(카바트 EU 넘버링)를 포함하는 인간 IgG1 동형의 Fc 감마 수용체 침묵형 불변 중쇄 도메인을 포함하는 이중특이적 항체를 투여한 후 인간 CCL2에 대한 생체내 제거율(ml/day/kg)에 비해 2배 이상(일 구현예에서 5배 이상, 일 구현예에서 10배 이상, 일 구현예에서 20배 이상) 높은, 이중특이적 항체.
6. 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서,
상기 이중특이적 항체는 인간 IgG 동형의 Fc 도메인을 포함하고,
i) 상기 제1 항원 결합 부위는 CCL2 상의 동일한 에피토프에 항체로서 결합하고, 상기 항체는,
서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하며, (a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 CCL2 상의 동일한 에피토프에 항체로서 결합하고, 상기 항체는,
서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하며, (a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)이중특이적 항체.
7. 구현예 6에 있어서,
20 mg/kg의 각 이중특이적 항체 및 0.1 mg/kg의 인간 CCL2로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 10 ml/kg의 단일 용량으로 FcRn 형질전환 마우스에 투여할 때, 인간 야생형 IgG1 동형의 불변 중쇄 도메인을 포함하는 이중특이적 항체를 투여한 후 인간 CCL2에 대한 생체내 제거율(ml/day/kg)은 돌연변이 L234A, L235A, P329G(카바트(Kabat) EU 넘버링)를 포함하는 인간 IgG1 동형의 Fc 감마 수용체 침묵형 불변 중쇄 도메인을 포함하는 이중특이적 항체를 투여한 후 인간 CCL2에 대한 생체내 제거율(ml/day/kg)에 비해 15배 이상, 특히 20배 이상 더 높은, 이중특이적 항체.
8. 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서,
i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
(d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고;
그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
(d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)이중특이적 항체.
9. 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서,
i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3, (d) 서열번호 63의 아미노산 서열 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTF를 포함하는 FR-H1, (e) 서열번호 64의 아미노산 서열 WVRQAPGQGLEWMG를 포함하는 FR-H2, (f) 서열번호 65의 아미노산 서열 RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVY YCAR을 포함하는 FR-H3, 및 (g) 서열번호 66의 아미노산 서열 WGQGTLVTVSS를 포함하는 FR-H4를 포함하는 VH 도메인; 및
(h) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (i) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (j) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3, (k) 서열번호 67의 아미노산 서열 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC를 포함하는 FR-H1, (l) 서열번호 68의 아미노산 서열 WYQQKPGQAPRLLIY를 포함하는 FR-H2, (m) 서열번호 69의 아미노산 서열 GVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC를 포함하는 FR-L3, 및 (n) 서열번호 70의 아미노산 서열 GQGTKVEIK를 포함하는 FR-H4를 포함하는 VL 도메인을 포함하고;
그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3, (d) 서열번호 82의 아미노산 서열 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGLTIS를 포함하는 FR-H1, (e) 서열번호 83의 아미노산 서열 WVRQAPGQGLEWMG를 포함하는 FR-H2, 및 (f) 서열번호 84의 아미노산 서열 RVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR을 포함하는 FR-H3, 및 (g) 서열번호 85의 아미노산 서열 WGQGTTVTVSS를 포함하는 FR-H4를 포함하는 VH 도메인; 및
(h) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (i) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (j) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3, (k) 서열번호 86의 아미노산 서열 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC를 포함하는 FR-L1, (l) 서열번호 87의 아미노산 서열 WYQQKPGKAPKLLIH를 포함하는 FR-L2, (m) 서열번호 88의 아미노산 서열 GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYC를 포함하는 FR-L3, 및 (n) 서열번호 89의 아미노산 서열 FGGGTKVEIK를 포함하는 FR-H4를 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)이중특이적 항체.
10. 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서,
A) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
B) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
C) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
D) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
E) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
F) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
G) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
H) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
I) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
J) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
K) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
L) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
M) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
N) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
O) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
P) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)이중특이적 항체.
11. 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서,
A) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V이고, X2는 P이며, X3은 H인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F이고 X2는 R인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
B) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V이고, X2는 P이며, X3은 H인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 91의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F이고 X2는 R인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
C) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 94의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
D) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 72의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 94의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
E) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 73의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
F) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 73의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 94의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
G) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 73의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 92의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
H) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 73의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 91의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
I) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 72의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
J) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 72의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 92의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
K) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 72의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 91의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
L) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 74의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
M) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 74의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 94의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
N) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 74의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 92의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
O) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 74의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 91의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
P) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 92의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)이중특이적 항체.
12.
구현예 8 내지 구현예 11 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 이중특이적 항체는 인간 IgG 동형, 바람직하게는 인간 IgG1 동형의 Fc 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체.
13.
구현예 8 내지 구현예 11 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 이중특이적 항체는 인간 IgG 동형, 바람직하게는 인간 IgG1 동형의 불변 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체.
14.
구현예 1 내지 구현예 13 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 이중특이적 항체는
i) 시험관 내에서 CCL2가 이의 수용체 CCR2에 결합하는 것을 차단하고(리포터 분석, IC50=0.5 nM); 및/또는
ii) 시험관 내에서 골수 세포의 CCL2 매개 주화성을 억제하고(IC50=1.5 nM); 및/또는
iii) 시노 및 및 인간 CCL2에 교차 반응하는, 이중특이적 항체.
15.
구현예 1 내지 구현예 14 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 이중특이적 항체는 CCL2에 대한 결합과 비교하여 다른 CCL 동족체에 교차 반응하지 않는 (다른 CCL 동족체(CCL8, CCL7 및 CCL13의 군으로부터 선택됨)에 대한 결합이 100배 더 적게 나타나는), 이중특이적 항체.
16.
구현예 1 내지 구현예 15 중 어느 한 구현예에 있어서,
이중특이적 항체는 이온 의존적 방식으로 인간 CCL2 상의 제1 에피토프 및 제2 에피토프에 결합하는, 이중특이적 항체.
17.
구현예 1 내지 구현예 16 중 어느 한 구현예에 있어서,
이중특이적 항체는 pH 의존적 방식으로 인간 CCL2에 결합하고, 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위 둘 모두는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화도로 CCL2에 결합하는, 이중특이적 항체.
18.
구현예 1 내지 구현예 17 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 이중특이적 항체는 pH 5.8에서보다 pH 7.4에서 10배 더 높은 친화도로 인간 CCL2에 결합하는, 이중특이적 항체.
19.
구현예 1 내지 구현예 18 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 이중특이적 항체는 하기의 돌연변이들(카바트 넘버링):
i) Q311R 및/또는 P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합); 및/또는
ii) L234Y, L235W, G236N, P238D, T250V, V264I, T307PH268D, Q295L, K326T 및/또는 A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합); 및/또는
iii) M428L, N434A 및/또는 Y436T(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및/또는
iv) Q438R 및/또는 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합) 중 하나 이상을 포함하는 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체.
20.
구현예 1 내지 구현예 19 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 이중특이적 항체는 하기의 돌연변이들(카바트 넘버링):
i) Q311R, 및/또는 P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합); 및/또는
ii) L235W, G236N, H268D, Q295L, K326T 및/또는 A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합); 및/또는
iii) N434A(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및/또는
iv) Q438R 및/또는 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합) 중 하나 이상을 포함하는 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체.
21.
구현예 1 내지 구현예 20 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 이중특이적 항체는 하기의 돌연변이들(카바트 넘버링):
i) Q311R 및 P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합); 및
ii) L235W, G236N, H268D, Q295L, K326T 및 A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합); 및
iii) N434A(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및
iv) Q438R 및 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합)를 포함하는 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체.
22.
구현예 1 내지 구현예 21 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 이중특이적 항체는 하기의 돌연변이들(카바트 넘버링):
i) Q311R 및/또는 P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합); 및/또는
ii) L234Y, P238D, T250V, V264I, T307V 및/또는 A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합); 및/또는
iii) M428L, N434A 및/또는 Y436T(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및/또는
iv) Q438R 및/또는 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합) 중 하나 이상을 포함하는 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체.
23.
구현예 1 내지 구현예 22 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 이중특이적 항체는 하기의 돌연변이들(카바트 넘버링):
i) Q311R 및 P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합); 및
ii) L234Y, P238D, T250V, V264I, T307V 및 A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합); 및
iii) M428L, N434A 및 Y436T(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및
iv) Q438R 및 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합) 중 하나 이상을 포함하는 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체.
24.
구현예 1 내지 구현예 23 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 이중특이적 항체는 하기의 돌연변이들(카바트 넘버링):
i) Q311R 및 P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합); 및
ii) L234Y, P238D, T250V, V264I, T307V 및 A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합); 및
iii) N434A(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및
iv) Q438R 및 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합) 중 하나 이상을 포함하는 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체.
25.
구현예 1 내지 구현예 24 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 이중특이적 항체는 하기의 돌연변이들(카바트 넘버링):
i) 중쇄 불변 도메인 중 하나에서의 S354C 및 T366W
ii) 중쇄 불변 도메인 중 다른 하나에서의 Y349C, T366S, L368A, Y407V를 포함하는 2개의 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체.
26.
인간 CCL2에 (특이적으로)결합하는, (단리된) 항체로서,
상기 항체는,
A) X는 I 또는 T인 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
(d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
B) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
(d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)이중특이적 항체.
27.
인간 CCL2에 (특이적으로)결합하는, (단리된) 항체로서,
상기 항체는,
A) 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
또는
B) 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
또는
C) 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
또는
D) 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
또는
E) 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
또는
F) 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
또는
G) 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
또는
H) 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)(단일특이적)항체.
28. 구현예 1 내지 구현예 27 중 어느 한 구현예에 따른 항체를 부호화하는, 단리된 핵산.
29. 구현예 28에 따른 핵산을 포함하는, 숙주 세포.
30. 항체를 생성하는 방법으로서,
상기 항체가 생성되도록 구현예 29에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
31. 구현예 30에 있어서,
상기 숙주 세포로부터 항체를 회수하는 단계를 더 포함하는, 방법.
32. 구현예 1 내지 구현예 25 중 어느 한 구현예에 따른 이중특이적 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 약학적 제제.
33. 구현예 1 내지 구현예 25 중 어느 한 구현예에 있어서,
약제로서 사용하기 위한, 이중특이적 항체.
34. 구현예 1 내지 구현예 25 중 어느 한 구현예에 있어서,
암을 치료하는 데 사용하기 위한, 이중특이적 항체.
35. 구현예 1 내지 구현예 25 중 어느 한 구현예에 있어서,
염증성 또는 자가면역 질환을 치료하는 데 사용하기 위한, 이중특이적 항체.
36. 약제의 제조에서 구현예 1 내지 구현예 25 중 어느 한 구현예에 따른 이중특이적 항체의 사용.
37. 구현예 36에 있어서,
상기 약제는 암을 치료하기 위한, 사용.
38. 구현예 36에 있어서,
상기 약제는 염증성 또는 자가면역 질환을 치료하기 위한, 사용.
39. 암이 있는 개체를 치료하는 방법으로서,
구현예 1 내지 구현예 25 중 어느 한 구현예에 따른 이중특이적 항체의 유효량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
40. 염증성 또는 자가면역 질환이 있는 개체를 치료하는 방법으로서,
구현예 1 내지 구현예 25 중 어느 한 구현예에 따른 이중특이적 항체의 유효량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
하기의 실시예 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 그 진정한 범위는 첨부된 청구범위에 제시되어 있다. 발명의 사상으로부터 벗어나지 않으면서, 진술된 절차에서 변형이 만들어질 수 있는 것으로 이해된다.
아미노산 서열들의 설명
상이한 에피토프에 결합하는 항-CCL2 항원 결합 모이어티(가변 영역 및 초가변 영역(CDR)):
CDR 변형된 항-CCL2 항원 결합 모이어티(가변 영역 및 초가변 영역(CDR)):
변형된 CNTO888
변형된 인간화 11K2
예시적인 불변 경쇄 영역:
서열번호 95
예시적인 인간 카파 경쇄 불변 영역
서열번호 96
예시적인 인간 람다 경쇄 불변 영역
예시적인 불변 중쇄 영역:
서열 번호: 97 IgG1로부터 유래된 예시적인 인간 중쇄 불변 영역
서열 번호: 98 L234A, L235A 및 P329G의 돌연변이가 있는 IgG1로부터 유래된 예시적인 인간 중쇄 불변 영역(Fc감마 수용체 침묵형)
서열번호 99 IgG1(SG1-IgG1 동종이인자형)로부터 유래된 예시적인 인간 중쇄 불변 영역 서열번호 100 돌연변이가 있는 IgG1(SG105-IgG1 동종이인자형 - Fc감마 수용체 침묵형)로부터 유래된 예시적인 인간 중쇄 불변 영역
서열번호 101 SG1095-돌연변이를 포함한 IgG1로부터 유래된 예시적인 인간 중쇄 영역(카바트 EU 넘버링):
-L235W/G236N/H268D/Q295L/A330K/K326T(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합);
-Q311R/P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 등전점(pI) 증가에 적합);
-N434A(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및
-Q438R/S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합)
서열번호 102 SG1099-돌연변이를 포함한 IgG1로부터 유래된 예시적인 인간 중쇄 영역(카바트 EU 넘버링):
Q311R/P343R
(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합)
서열번호 103 SG1100-돌연변이를 포함한 IgG1로부터 유래된 예시적인 인간 중쇄 영역(카바트 EU 넘버링):
Q311R/P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합);
-N434A(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및
-Q438R/S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합)
CNTO888//11K2-WT IgG1(예시적인 이중특이적 CNTO888//11K2-WT IgG1 크로스맵)
서열번호 104 중쇄 1- CNTO888//11K2-WT IgG1
서열번호 105 중쇄 2- CNTO888//11K2-WT IgG1
서열번호 106 경쇄 1- CNTO888//11K2-WT IgG1
서열번호 107 경쇄 2- CNTO888//11K2-WT IgG1
CKLO2 - IgG1(예시적인 이중특이적 CKLO2 IgG1 크로스맵(Crossmab))
서열번호 108 중쇄 1- CKLO2 IgG1
서열번호 109 중쇄 2- CKLO2 IgG1
서열번호 110 경쇄 1- CKLO2 IgG1
서열번호 111 경쇄 2- CKLO2 IgG1
CKLO2 - SG1095(SG1095 Fc 돌연변이를 포함한 예시적인 이중특이적 CLOK2 크로스맵)
서열번호 112 중쇄 1- CKLO2 - SG1095
서열번호 113 중쇄 2- CKLO2 - SG1095
서열번호 114 경쇄 1- CKLO2 - SG1095
서열번호 115 경쇄 2- CKLO2 - SG1095
CKLO2 - SG1099(SG1099 Fc 돌연변이를 포함한 예시적인 이중특이적 CKLO2 크로스맵)
서열번호 116 중쇄 1- CKLO2 - SG1099
서열번호 117 중쇄 2- CKLO2 - SG1099
서열번호 118 경쇄 1- CKLO2 - SG1099
서열번호 119 경쇄 2- CKLO2 - SG1099
CKLO2 - SG1100(SG1100 Fc 돌연변이를 포함한 예시적인 이중특이적 CKLO2 크로스맵)
서열번호 120 중쇄 1- CKLO2 - SG1100
서열번호 121 중쇄 2- CKLO2 - SG1100
서열번호 122 경쇄 1- CKLO2 - SG1100
서열번호 123 경쇄 2- CKLO2 - SG1100
CKLO3 - SG1095(SG1095 Fc 돌연변이를 포함한 예시적인 이중특이적 CLOK3 크로스맵)
서열번호 124 중쇄 1- CKLO3 - SG1095
서열번호 125 중쇄 2- CKLO3 - SG1095
서열번호 126 경쇄 1- CKLO3 - SG1095
서열번호 127 경쇄 2- CKLO3 - SG1095
CKLO3 - SG1099(SG1099 Fc 돌연변이를 포함한 예시적인 이중특이적 CKLO3 크로스맵)
서열번호 128 중쇄 1- CKLO3 - SG1099
서열번호 129 중쇄 2- CKLO3 - SG1099
서열번호 130 경쇄 1- CKLO3 - SG1099
서열번호 131 경쇄 2- CKLO3 - SG1099
CKLO3 - SG1100(SG1100 Fc 돌연변이를 포함한 예시적인 이중특이적 CKLO3 크로스맵)
서열번호 132 중쇄 1- CKLO3 - SG1100
서열번호 133 중쇄 2- CKLO3 - SG1100
서열번호 134 경쇄 1- CKLO3- SG1100
서열번호 135 경쇄 2- CKLO3 - SG1100
추가의 항-CCL2 항원 결합 모이어티들:
서열번호 136 중쇄 가변 도메인 VH
2F2
서열 번호: 137 경쇄 가변 도메인 VL
2F2
서열번호 138 중쇄 가변 도메인 VH
쥐 11K2 (=11K2m)
서열번호 139 경쇄 가변 도메인 VL
쥐 11K2 (=11K2m)
서열번호 140 중쇄 가변 도메인 VH
1H11
서열번호 141 경쇄 가변 도메인 VL
1H11
예시적인 CCL2 및 동족체(신호 펩티드 없음):
서열번호 142 예시적인 인간 CCL2 (MCP1) - 야생형(wt)
서열번호 143 예시적인 인간 CCL2 (MCP1) - P8A 변이체
서열번호 144 예시적인 인간 CCL2 (MCP1) - T10C 변이체
서열번호 145 예시적인 인간 CCL8 (MCP2) - 야생형(wt)
서열번호 146 예시적인 인간 CCL8 (MCP2) - P8A 변이체
서열번호 147 예시적인 인간 CCL7 (MCP3) - 야생형(wt)
서열번호 148 예시적인 인간 CCL13 (MCP4)- 야생형(wt)
서열번호 149 예시적인 시노몰구스 CCL2 - 야생형(wt)
서열번호 150 예시적인 마우스 CCL2- 야생형(wt)
추가의 예시적인 불변 중쇄 영역:
서열번호 151 GG01 - 돌연변이를 포함한 IgG1로부터 유래된 예시적인 인간 중쇄 영역(카바트 EU 넘버링):
-L234Y/P238D/ T250V/V264I/T307P/A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합);
-Q311R/P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 등전점(pI) 증가에 적합);
-N434A(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및
-Q438R/S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합)
서열번호 152 GG02 - 돌연변이를 포함한 IgG1로부터 유래된 예시적인 인간 중쇄 영역(카바트 EU 넘버링):
-L234Y/P238D/T250V/V264I/T307P/A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합);
-Q311R/P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 등전점(pI) 증가에 적합);
-M428L/N434A/Y436T(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및
-Q438R/S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합)
서열번호 153 GG03 - 돌연변이를 포함한 IgG1(-IgG1 동종이인자형 서열을 포함)로부터 유래된 예시적인 인간 중쇄 영역(카바트 EU 넘버링):
-L234Y/P238D/T250V/V264I/T307P/A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합);
-Q311R/P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 등전점(pI) 증가에 적합);
-N434A(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및
-Q438R/S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합)
서열번호 154 GG04 - 돌연변이를 포함한 IgG1(-IgG1 동종이인자형 서열을 포함)로부터 유래된 예시적인 인간 중쇄 영역(카바트 EU 넘버링):
-L234Y/P238D/T250V/V264I/T307P/A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합);
-Q311R/P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 등전점(pI) 증가에 적합);
-M428L/N434A/Y436T(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및
-Q438R/S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합)
CKLO2 - GG01(GG01 Fc 돌연변이를 포함한 예시적인 이중특이적 CLOK2 크로스맵)
서열번호 155 중쇄 1- CKLO2 - GG01
서열번호 156 중쇄 2- CKLO2 - GG01
서열번호 157 경쇄 1- CKLO2 - GG01
서열번호 158 경쇄 2- CKLO2 - GG01
CKLO2 - GG02(GG02 Fc 돌연변이를 포함한 예시적인 이중특이적 CLOK2 크로스맵)
서열번호 159 중쇄 1- CKLO2 GG02
서열번호 160 중쇄 2- CKLO2 GG02
서열번호 161 경쇄 1- CKLO2 GG02
서열번호 162 경쇄 2- CKLO2 GG02
CKLO2 - GG03(GG03 Fc 돌연변이를 포함한 예시적인 이중특이적 CLOK2 크로스맵)
서열번호 163 중쇄 1- CKLO2 - GG03
서열번호 164 중쇄 2- CKLO2 - GG03
서열번호 165 경쇄 1- CKLO2 - GG03
서열번호 166 경쇄 2- CKLO2 - GG03
CKLO2 - GG04(GG04 Fc 돌연변이를 포함한 예시적인 이중특이적 CKLO2 크로스맵)
서열번호 167 중쇄 1- CKLO2 - GG04
서열번호 168 중쇄 2- CKLO2 - GG04
서열번호 169 경쇄 1- CKLO2 - GG04
서열번호 170 경쇄 2- CKLO2 - GG04
CKLO2 - GG03/GG04(돌기 사슬에 GG03 Fc 돌연변이를 포함하고 구멍 사슬에 GG04 Fc 돌연변이를 포함하는 예시적인 이중특이적 CKLO2 크로스맵)
서열번호 171 중쇄 1- CKLO2 - GG03/GG04
서열번호 172 중쇄 2- CKLO2 - GG03/GG04
서열번호 173 경쇄 1- CKLO2 - GG03/GG04
서열번호 174 경쇄 2- CKLO2 - GG03/GG04
명칭 본원에 기재된 항-CCL2 이중특이적 항체에 사용된 단일특이적 비변형 항-CCL2 항체/항원 결합 모이어티
명칭 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(PGLALA)를 포함하는 IgG1 또는 IgG1을 갖는 크로스맵(WO 2016/016299 참조)으로서
변형된 VH/VL
을 갖는 이중특이적 항-CCL2
명칭 크로스맵으로서 변형된 VH/VL을 갖는 이중특이적 항체(WO 2016/016299 참조). 사용된 중쇄 불변 도메인(예컨대, IgG1 야생형, PGLALA, SG1095, SG1099, 1100)에 따라, 접미사 IgG1 야생형, PGLALA, SG1095, SG1099, 1100이 추가된다.
실시예:
실시예 A-1 단일특이적 항-CCL2 항체
단일특이적 항-CCL2 항체 및 CCL2 항원의 생성
재조합 DNA 기술
표준 방법을 사용하여 Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989에 기재된 바에 따라 DNA를 조작하였다. 분자 생물학적 시약은 제조업체의 사용설명서에 따라서 사용하였다.
유전자 및 올리고뉴클레오티드 합성
제네아트(Geneart) GmbH(독일 레겐스부르크 소재)에서 화학 합성에 의해 원하는 유전자 단편을 제조하였다. 합성된 유전자 단편들은 증식/증폭을 위해 대장균 플라스미드에 클로닝되었다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 서열분석으로 확인하였다. 대안적으로, 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드들을 어닐링함으로써 또는 PCR을 통해 짧은 합성 DNA 단편들을 조립하였다. 각각의 올리고뉴클레오티드는 메타비온(metabion) GmbH(독일 플라네그 마틴스리드 소재)에 의해 제조하였다.
기본/표준 포유류 발현 플라스미드에 대한 설명
원하는 유전자/단백질(예컨대, 전장 항체 중쇄, 전장 항체 경쇄 또는 CCL-2 분자)의 발현을 위해, 하기의 기능적 요소들:
- 인트론 A를 포함하는 인간 사이토메갈로바이러스(P-CMV)로부터의 즉각적인 초기 증폭자 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-비번역 영역(5'UTR),
- 뮤린 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 발현될 유전자/단백질(예컨대, 전장 항체 중쇄 또는 항체 경쇄 또는 CCL-2 분자), 및
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGH pA)을 포함하는 전사 단위가 사용된다.
발현하고자 하는 유전자를 포함하는 발현 유닛/카세트 이외에, 기본/표준 포유류 발현 플라스미드는:
대장균에서 상기 플라스미드의 복제를 가능하게 하는 벡터 pUC18로부터의 복제 기점, 및
대장균에서 암피실린 내성을 부여하는 베타 락타마아제 유전자를 함유한다.
재조합 단일클론 항체 및 CCL-2 분자용 발현 플라스미드의 생성
단일클론 항체 및 CCL-2 항원의 일시적인 발현을 위한 발현 플라스미드는 각각의 발현 카세트 외에 대장균에서 상기 플라스미드의 복제를 허용하는 벡터 pUC18 및 대장균에서 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마제 유전자로부터의 복제 기점을 포함하였다.
각각의 면역글로불린 HC 또는 LC 또는 CCL-2 분자의 전사 단위는 하기의 기능적 요소들:
- 인트론 A를 포함하는 인간 사이토메갈로바이러스(P-CMV)로부터의 즉각적인 초기 증폭자 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-비번역 영역(5'UTR),
- 뮤린 면역글로불린 중쇄 신호 서열, 및
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGH pA)을 포함하였다.
이의 VH 및 VL을 기반으로 한 각각의 항체 1A4, 1A5, 1G9, 2F6, CNTO888, 뮤린 및 인간화 11K2, ABN912가 카파 경쇄를 가진 IgG1 PGLALA/작동체 침묵형 Fc 및 IgG1 야생형으로서 생성되었다.
일시적인 발현 및 정제
F17 배지(인비트로젠(Invitrogen Corp.))에서 배양된 HEK293 세포(인간 배아 신장 세포주 293 유래)의 일시적 형질감염에 의해 재조합 생성을 실시하였다. 단일클론 항체의 생성을 위해, 세포를 각각의 면역글로불린 중쇄 및 경쇄를 함유하는 플라스미드로 공동 형질감염시켰다. 형질감염을 위해, "293-펙틴" 형질감염 시약(인비트로젠)을 사용하였다. 제조업체의 지침에 명시된 바와 같이 형질감염을 실시하였다. 세포 배양 상청액을 형질감염 3 내지 7(3-7)일에 회수하였다. 상층액은 감소된 온도(예컨대, -80°C)에서 보관하였다.
예컨대, HEK293 세포에서 인간 면역글로불린의 재조합 발현에 관한 일반 정보는: Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203에 제시되었다.
항체는 맙셀렉트슈어-세파로스(MabSelectSure-Sepharose)TM(GE 헬스케어(Healthcare), 스웨덴 소재) 및 수퍼덱스(Superdex) 200 크기 배제(GE 헬스케어, 스웨덴 소재) 크로마토그래피를 사용한 친화성 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 간단히 말해서, 무균 여과된 세포 배양 상층액을 PBS 완충액(10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl 및 2.7 mM KCl, pH 7.4)으로 평형화된 맙셀렉트슈어 수지 상에서 포획하고, 평형화 완충액으로 세척한 후, 25 mM의 구연산염, pH 3.0으로 용출하였다. 용출된 단백질 분획을 취합하고, 2M 트리스(Tris), pH 9.0으로 중화하고, 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0으로 평형화된 수퍼덱스 200 26/60 GL(GE 헬스케어, 스웨덴 소재) 컬럼을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 크기 배제 크로마토그래피 분획을 CE-SDS(캘리퍼 라이프 사이언스(Caliper Life Science), USA 소재)로 분석하고, 항체 함유 분획을 취합하여 -80°C에서 보관하였다.
재조합 CCL2의 생성
"야생형 CCL-2"는 단량체로 존재할 수 있지만, 실제로 생리학적 농도에서 이량체를 형성할 수도 있다. 상기 단량체-이량체 평형은 상이할 수 있으며, 상이한 농도가 사용될 수 있는 기재된 모든 시험관 내 실험에 대해 신중하게 고려해야 한다. 불확실성을 피하기 위해, 점 돌연변이된 CCL2 변이체를 생성하였다: CCL2의 P8A 변이체는 이량체화 계면에 돌연변이를 수반하여, 정의된 순수한 CCL2 단량체로 이어지는 이량체를 형성할 수 없다. 이와 대조적으로, CCL2의 T10C 변이체는 CCL2의 고정된 이량체를 생성한다(J Am Chem Soc. 2013 Mar 20;135(11):4325-32).
각각의 가용성 CCL2 단백질(야생형, P8A 또는 T10C 변이체)을 SP-세파로스 HP(GE 헬스케어, 스웨덴 소재) 및 수퍼덱스 200 크기 배제(GE 헬스케어, 스웨덴 소재) 크로마토그래피를 사용하는 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 간단히 말해서, 멸균 여과된 세포 배양 상청액을 10 mM KH2PO4, pH 5.0으로 희석하여 전도도를 < 4 mS/cm으로 조정하였다. 희석된 상청액을 10 mM KH2PO4, pH 5.0으로 평형화된 SP-세파로스 수지에 로딩하고, 평형화 완충액으로 세척하고, 10 mM KH2PO4, 1M NaCl, pH 5.0으로의 구배를 사용하여 용출하였다. 용출된 단백질 분획을 취합하고, 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0으로 평형화된 수퍼덱스 200 16/60 GL(GE 헬스케어, 스웨덴 소재) 컬럼을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 크기 배제 크로마토그래피 분획을 SDS-PAGE 및 분석용 고성능 크기 배제 크로마토그래피로 분석하였다. CCL2 함유 분획을 취합하여 -80°C에서 보관하였다.
기능적 특성화(결합)
T200 기기에는 비아코어 시리즈 S 센서 칩(Biacore Series S Sensor Chip) CM5가 장착되었다. 시스템 완충액은 HBS-ET(10 mM HEPES(pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.05 %(w/v) 트윈(Tween)® 20)였다. 시스템은 37°C로 설정하였다. 각 측정에 대해, 샘플 완충액은 1 mg/ml CMD(카르복시메틸덱스트란(Carboxymethyldextran), 플루카(Fluka))가 추가로 보충된 시스템 버퍼를 사용하였다.
항체 포획 시스템이 구축되었다. 14000 GARFcγ(염소 항토끼 Fcγ), 111-005-046, 잭슨 면역연구소(Jackson ImmunoResearch))을 제조업체가 설명한 바와 같이 EDC/NHS 커플링에 의해 10 mM 아세트산나트륨 완충액 pH 5.0에서 25 μg/ml, 25°C에서 고정화하였다. HBS 완충액(100 mM HEPES pH 7.4, 1.5 M NaCl, 0.05%(w/v) 트윈 20)을 20 μl/분으로 15초간 주입, 10 mM 글리신 완충액 pH 2.0을 1분간 주입에 이어서, 10 mM 글리신 완충액 pH 2.25를 1분간 2회 주입하여 포획 시스템을 재생시켰다. 다른 구현예에서, 뮤린 단일클론 항체는 12700 RU 다중클론 토끼 항 마우스(RAMIgG, GE 헬스케어) 항체를 상술한 바와 같은 비아코어 시리즈 CM5 센서 상에 고정화함으로써 바이오센서 상에 포획하였다. 센서는 10 mM 글리신 완충액 pH 1.7의 3분간 주입하여 재생시켰다.
항체 클론 상층액을 시스템 완충액에서 1:2로 희석하고 5 μl/분으로 1분 동안 포획하였다. 항체 포획 후, 시스템을 2.5배 농축된 시스템 완충액으로 80 μl/분으로 30초 동안 세척한 후, 2분 간의 기준선 안정화를 실시하였다. 분석물 동역학을 30 μl/분으로 실시하였다. 인간 CCL2 또는 단량체 CCL2 P8A 변이체 CCL2를 포함하는 용액 내 분석물을 사용하였다. 분석물은 90 nM 최고 농도로 주입하였다. 분석물 접촉 시간은 3분이었고 해리 시간은 10분이었다. 비아이밸류에이션(Biaevaluation) 소프트웨어 V.3.0은 제조업체 GEHC의 지침에 따라 사용하였다. RMAX 로컬을 사용하는 1:1 결합 모델을 적용하여 운동 속도를 분명하게 추정하였다.
야생형(wt) 인간 CCL2 및 인간 CCL2 P8A 변이체(단량체)에 대한 항체의 결합
SPR 분석 I로부터 수득한 pH 의존적 CCL2 결합 동역학의 요약
T200 기기에는 비아코어 시리즈 S 센서 칩(Biacore Series S Sensor Chip) CM5가 장착되었다. 시스템 완충액은 HBS-ET(10 mM HEPES(pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.05 %(w/v) 트윈(Tween)® 20)였다. 다른 구현예들에서, 시스템 완충액의 pH는 pH 8.3, pH 7.9, pH 7.4, pH 7.1, pH 6.7, pH 6.3, pH 5.9, pH 5.5로 설정하였다. 시스템은 25°C로 설정하였다. 각 측정에 대해, 샘플 완충액은 1 mg/ml CMD(카르복시메틸덱스트란(Carboxymethyldextran), 플루카(Fluka))가 추가로 보충된 시스템 버퍼를 사용하였다.
항체 포획 시스템이 구축되었다. 13000 MAb<h-Fc-pan>M-R10Z8E9-IgG(로슈(Roche))를 제조업체가 설명한 바와 같이 EDC/NHS 커플링에 의해 10 mM 아세트산나트륨 완충액 pH 5.0에서 18 μg/ml로 25℃에서 고정화시켰다. HBS 완충액(100 mM HEPES pH 7.4, 1.5 M NaCl, 0.05%(w/v) 트윈 20)을 20 μl/분으로 주입, 10 mM NaOH를 1분 15초간 주입 및 10 mM 글리신 완충액 pH 2.5를 1분간 주입하여 포획 시스템을 재생시켰다. 항체는 각각의 시스템 완충액에 희석된 80 nM 농도에서 10 μl/분으로 30초 동안 주입하였다. 항체 포획 후, 시스템을 2.5배 농축된 시스템 완충액으로 50 μl/분으로 30초 동안 세척한 후, 2분 간의 기준선 안정화를 실시하였다. 농도 의존적 분석물 시리즈는 0 nM(완충액 대조군)에서부터 0.4 nM, 1.1 nM, 2회 주입의 3.3 nM, 30 nM에 이르기까지 1:3 희석 단계로 주입하였다. 분석물 접촉 시간은 3분이었고 해리 시간은 10분이었다. 분석물 동역학은 50 μl/min에서 실시하였다.
인간 항체는 센서 표면에 리간드로서 포착되었다:
· 양성 대조군으로서의 인간 정상 IgG(H-N-IgG, Id.: 11717570, 로슈),
· 항 인간 CCL2 mAb(인간화 11k2: CCL2-0002),
· 항 인간 CCL2 mAb(AB912, CCL2-0003), 및
· 항 인간 CCL2 mAb(CNTO888, CCL2-0004);
· 음성 대조군으로서의 시스템 완충액.
비아이밸류에이션 소프트웨어 V.3.0은 제조업체 GEHC의 지침에 따라 사용하였다. RMAX 로컬을 사용하는 1:1 결합 모델을 적용하여 운동 속도를 결정하였다.
교차 반응성 CCL 동족체
CCL2(MCP-1)는 CCL7(MCP-3), CCL8(MCP-2), CCL13(MCP-4)과 높은 상동성을 갖고, 이들 CCL 케모카인은 CCR2에 결합할 수 있으며, 이러한 상동체에 대한 항-CCL2 항체의 결합을 평가하였다. 결과는 도 1에서 도시된다. CCL2에 대한 선택성을 갖는 것으로 기재된 CNTO888을 제외하고(Mol Immunol. 2012 Jun;51(2):227-33), 시험된 다른 항체들은 CCL7 또는 CCL8에 결합하였다(CCL7 또는 CCL8에 대해 교차 반응성을 나타냄).
비아코어 분석 방법: CCL 동족체, 예컨대 CCL2(MCP-1), CCL8(MCP-2), CCL7(MCP-3) 및 CCL13(MCP-4)에 대한 항-CCL2 항체의 결합은 비아코어 T200 기기(GE 헬스케어)를 사용하여 25°C에서 평가하였다. 마우스 항 인간 IgG(Fc)(GE 헬스케어)를 제조사의 권장된 설정에 따라 아민 커플링 키트(GE 헬스케어)를 사용하여 CM4 센서 칩의 각 플로우 셀에 고정시켰다. 항체 및 분석물을 ACES pH 7.4 완충액(20 mM ACES, 150 mM NaCl, 1 mg/ml BSA, 0.05% 트윈 20, 0.005% NaN3)으로 희석하였다. 항체를 항 Fc 센서 표면 상에 포획한 다음, 재조합 인간 CCL 동족체 단백질을 5 nM 및 20 nM의 유동 세포에 걸쳐 주입하였다. 야생형 CCL2(MCP-1), CCL8(MCP-2), CCL7(MCP-3) 및 CCL13(MCP-4)은 R&D 시스템즈(Systems) 사에서 상업적으로 입수 가능한 반면, 단량체 CCL2(P8A 변이체)는 자체적으로 생성된 항원이었다. 센서 표면은 3M MgCl2로 각 주기마다 재생시켰다. 결합 센서그램은 비아코어 T200 평가 소프트웨어 버전 2.0(GE 헬스케어)을 사용하여 처리하였다.
기능적 특성화(생물학적)
CCR2 신호전달 I - 칼슘 흐름 분석
THP-1(인간 급성 단핵구 백혈병 세포주; ATCC TIB-202) 세포를 RPMI 1640, 10% FBS, 1 mM 피루브산나트륨, 10 mM HEPES, 50 μM ß-메르캅토에탄올(공급업체 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))에서 배양하였다. 분석 당일에 세포 밀도를 25.8 ml 분석 배지(RPMI 1640 w/o FBS)에서 8.33 x 105개 세포/ml로 조정하였다. FLIPR® 칼슘 칼슘 4 분석 키트, Cat# R8142,
제조업체 몰레큘라 디바이스의 지침에 따라 성분 A의 2개 바이알을 20 mM의 성분 B(HBSS 완충액 + 20 mM HEPES, pH 7.4)와 혼합하여 염료 로딩 용액을 제조하였다. 516 μl 1M 헤페스(Hepes, 최종 분석 농도: 10 mM)를 첨가한 다음, 516 μl 250 mM 프로베네시드(최종 분석 농도: 2.5 mM)를 첨가하였다. 스톡 솔루션의 경우 65.4mg 프로베네시드(시그마(Sigma) P8761)를 465 μl 1N NaOH에 용해하고 465 μl 1x HBSS(써모 피셔 사이언티픽)를 첨가하였다. 25.8 ml 로딩 완충액을, 예컨대 4개의 미세역가 플레이트(52.6 ml의 부피 필요, 106 THP-1/ml)에 충분한 세포를 갖는 25.8 ml 분석 배지에 혼합하였다. 로딩 완충액 내 120 μl 세포 현탁액을 흑색 F-바닥 96-웰 세포 배양 플레이트의 각 웰로 옮겼다. 플레이트를 실온에서 3~4시간 동안 항온처리하였다.
그 동안에, 항체 및 리간드 용액을 준비하였다. 30 μg/ml 내지 0.025 μg/ml(연속 희석 없음, 웰의 최종 농도)의 8가지 농도의 각 항체를 시험하였다. 각 농도를 2개의 플레이트에서 시험하였다. 모든 희석액은 10배 농축 용액으로서 분석 배지에서 제조하였다. 참조 항체로서 인간 CCL2/JE/MCP-1 항체(R&D 시스템즈 Cat# MAB279)를 사용하였다. 리간드 CCL2(R&D 시스템즈 Cat#279-MC-10)는 500 μl RPMI 1640(100 μg/ml)에 50 μg CCL2 동결건조물을 용해하고, 400 μl를 10 ml 분석 배지(4 μg/ml 모액)에 옮겨서 준비하였다. 자극 대조군으로서 이오노마이신(시그마 Cat# I-0634)을 사용하였다(1340 μl DMSO(시그마 Cat# D-8779), 1 mM에 용해된 1 mg 이오노마이신). 10 μl의 1 mM 모액을 1990 μl 분석 배지(5 μM, 최종 분석 농도 500 nM)에 희석하였다. 100 μl를 폴리프로필렌 MTP의 해당 대조 웰에 피펫팅하였다.
항체 희석액 및 CCL2를 2개의 V자형 폴리프로필렌 96웰 플레이트에서 사전 배양하였다. 50 μl의 4 μg/ml 모액 CCL2(최종 400 ng/ml CCL2) 및 50 μl의 10배 농축된 항체 희석액을 웰에 피펫팅하였다. 플레이트를 실온에서 30~60분 동안 항온처리하였다.
항온 처리 후, 세포 플레이트 및 화합물 플레이트를 플렉스스테이션(FlexStation)® 3(몰레큘라 디바이스) 판독 위치로 직접 옮기고, 시스템 설명서(여기 485 nm, 방출 525 nm)에 기재된 바와 같이 칼슘 분석을 실시하였다. 판독은 몇 초 간격으로 실시하였다.
결과:
표 1: 40 ng/ml PMA 및 4 μM 이오노마이신을 양성 대조군으로서 사용하였다. 표는 n=2의 EC50의 평균을 포함한다.
단핵구에서 발현되는 CCR2 수용체의 CCL2 유도 내재화를 억제하는 항-CCL2 항체의 효능
골수 세포에서 리간드 유도 CCR2 내재화를 방지하기 위해, 시험관내 분석을 설정하고 항-CCL2 항체를 특성화하였다. 상용 키트(스템셀(Stemcell), cat no. #15068)를 사용하여 자기 분리에 의해 건강한 기증자의 말초 혈액으로부터 단핵구를 분리하였다. FcRs 차단을 위해, 단핵구를 FACS 완충액(PBS + 0.2%BSA) 내 얼음 위에서 정상 인간 IgG(프리비겐(Privigen), CSL 베링(Behring))와 함께 최종 농도 500 μg/ml로 50분 동안 사전 배양하였다. 그런 다음, 세포를 10분 동안 원심분리하고(300xg, 4°C), FACS 완충액으로 한 번 더 세척한 후 얼음 위에 보관하였다. 항-CCL2 항체 희석액(각각 50 μl)을 96개의 U 바닥 웰(BD)에서 제조하였다(4°C 및 37°C에서 병렬 접근). 단핵구를 분할하고, 배지(RPMI 1640; 10%FCS; 2 mM L-글루타민)에 재현탁한 후, 추가 사용 때까지 각각 4°C 및 37°C에서 배양하였다. 재조합 CCL2(50 μl; 100 ng/ml의 최종 농도에서)를 4°C 및 37°C 모두에서 준비된 항체 희석액(가변 농도에서)에 첨가하였다. 100 μl 단핵구 현탁액(2x105 세포/웰)을 200 μl의 총 부피로 CCL2/항-CCL2 혼합물에 첨가하고 세포를 4°C 및 37°C에서 1시간 30분 동안 배양한 후, 300xg, 4°C에서 원심분리하였다. 이제부터 모든 단계는 미리 냉각된 완충액으로 실시하였다. 세포를 250 μl FACS 완충액으로 세척하고, 추가로 세포를 CCR2 수용체에 대해 염색하였다(상용 CCR2-APC 접합체 또는 표준 FACS 프로토콜에 따른 적절한 동형 ctrl-APC를 사용: 분취량을 CD192(CCR2) APC(바이오레전드(BioLegend), #357208, 클론 K036C2/mIgG2a) 및 적절한 동형 ctrl 항체를 사용하여 5 μl/106 세포로 염색하였다: 20 μl/106세포 mIgG2a k APC BD 바이오사이언스, #400222, 클론 MOPC-173).
그런 다음, FACS 칸토(Canto) II에서 수용체 발현을 분석하고 CCR2 내재화를 하기와 같이 계산하였다:
· 내재화 없음: 리간드 배양 없이 분석된 세포(rec. CCL2).
· 100% 내재화: 이전에 rec. CCL2와 함께 배양된 세포에서 최대 감소된 CCR2 발현 수준
인간 THP-1 세포에 대한 CCL2 매개 주화성의 억제
CCL2 구배를 향한 CCR2+ THP1 세포의 이동은 하기와 같이 시험하였다. 단핵구 THP1 세포(ATCCⓒ TIB-202™)를 FCS 및 L-글루타민이 보충된 RPM1 1640 배지(PAN, cat. no. P04-17500)에서 배양하였다. 세포를 이동 분석에 사용하기 전에 일반적으로 2 내지 3회 계대 배양하였고, FSC 함량이 감소된 배지에서 밤새 기아 상태를 유지하였다(10% FCS 대신 1.5%). 세포를 계수하고 10 μg/ml의 정상 인간 IgG(인비트로젠, cat.no.# 12000; FcgR 차단용)와 함께 실온에서 15분 동안 배양하였다.
한편, 항-CCL2 항체(및/또는 대조군)는 25 ng/ml의 rhCCL-2(R&D 시스템즈, cat. no. #279-MC)를 갖는 무혈청 배지를 함유한 HTS 트랜스웰(Transwell) 96웰 플레이트 시스템(코닝(Corning), cat.no. #3386; 3 μm 기공 크기)의 하부 챔버에 첨가하였다. 그런 다음, 삽입 플레이트를 하부 챔버 플레이트에 붙이고, 상기 언급한 세포 현탁액(IgG 블록을 포함) 75 μl(1.5x105개 세포)를 5 μg/ml의 항체/동형의 유무에 관계없이 각 삽입물에 첨가하였다. 플레이트를 덮고 CO2 배양기(5% CO2)에서 37°C에서 밤새 배양하였다.
삽입 플레이트를 제거하고 세포-타이터-글로(Cell-titer-glo) 기질(프로메가(Promega), cat.no. # G758)을 하부 챔버 플레이트의 각 웰에 첨가하여 이동된 세포의 생존력을 측정하였다. 300 rpm의 쉐이커(shaker)에서 1시간 동안 배양한 후(커버 플레이트 밀봉), 각 웰 200 μl를 마이크로플루오르(Microfluor) 블랙 96웰 플레이트(VWR, cat.no.# 735-0527)로 옮기고 발광성을 측정하였다(발광- 리더, 예컨대 바이오-테크(Bio-Tek), 테칸(Tecan)). 배수 변화는 IgG 대조군 항체 및 항-CCL2 항체를 갖는 이동된 세포(세포 타이터-글로, RLU)의 수 사이의 비율로서 계산하였다. 하기의 표 2에는 조건당 5~10회 반복한 결과를 도시한다:
표 2
마우스에서 단일특이적(단일 파라토프) 항-CCL2 항체를 사용한 인간 CCL2 면역 복합체 스위핑에 대한 평가
단일 파라토프 항체가 야생형 인간 CCL2와 함께 면역 복합체를 형성하는 능력을 평가하기 위해, 항-CCL2 단일 파라토프 항체(20 mg/kg) 및 야생형 인간 CCL2(0.1 mg/kg)로 구성된 미리 형성된 면역 복합체를 10 ml/kg의 단일 용량으로 인간 FcRn 형질전환 마우스(B6.Cg-Fcgrt tm1DcrTg(FCGRT)32Dcr/DcrJ, 잭슨 연구소(Jackson Laboratory))의 꼬리 정맥에 투여하였다. 혈액은 투여 후 5분, 7시간, 1일, 2일, 3일 및 7일에 수집하였다. 혈청은 즉시 혈액을 4℃에서 14,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 제조하였다. 혈청은 측정할 때까지 -80℃ 이하에서 보관하였다. 시험한 단일 파라토프 항체는 하기의 표 3에 나열되어 있다. SG1 Fc를 갖는 항체는 야생형과 유사한 Fc 감마 수용체 결합을 갖는 반면, SG105 Fc를 갖는 항체는 Fc 감마 수용체 결합 침묵형이다.
생체내 hCCL2 제거율에 대한 각 항-CCL2 단일 파라토프 항체의 면역 복합체 스위핑 효과는 도 2에 도시된 바와 같이 Fc 감마 수용체 결합을 갖는 항-CCL2 항체(SG1, = 원형 Fc 감마 수용체 결합을 갖는 IgG1 야생형; 실선) 및 Fc 감마 수용체 결합 침묵형(SG105, = Fc 감마 수용체 결합이 없는 IgG1; 점선)을 갖는 항-CCL2 항체를 비교함으로써 평가하였다. 각각의 도 2a 내지 도 2g는 hCCL2 및 각각의 항-CCL2 항체(2개의 상이한 Fc 부분을 포함: SG1 = 원형 Fc 감마 수용체 결합을 갖는 IgG1 야생형 및 SG105 = Fc 감마 수용체 결합이 없는 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 FcRn 형질전환 마우스에 주입한 후 시간에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다. 항체 곡선은 피닉스(Phoenix) 64(파사이트(Pharsight)/체르타라(Certara))를 사용하여 비구획 분석에 의해 분석하였다. AUCinf는 무한대로 외삽된 선형 로그 사다리꼴 규칙에 의해 추정하였다. 제거율 값음 용량/AUCinf로 정의한다. 상기 제거율의 차이는 또한 배수 변화로 표현되었으며, 이는 Fc 감마 수용체 결합(SG1)을 갖는 항체의 hCCL2 제거율을 Fc 감마 수용체 결합 침묵형(SG105)을 갖는 항체의 hCCL2 제거율로 나눔으로써 계산한다(하기 표 3). 하기의 표 3의 데이터는 Fc 감마 수용체 결합 항체(SG1 = 원형 Fc 감마 수용체 결합을 갖는 IgG1 야생형)에 의한 인간 CCL2의 제거율이 시험된 모든 단일 파라토프 항체에 대해 Fc 감마 수용체 결합 침묵형 항체(Fc 감마 수용체 결합이 없는SG105)의 것과 유사함을 나타낸다. 이는 시험된 단일 파라토프 항체에 의한 CCL2의 면역 복합체 매개 스위핑이 효율적이지 않았음을 시사한다.
표 3: 항-CCL2 단일특이적 항체(20 mg/kg) 및 야생형 인간 CCL2(0.1 mg/kg)(IgG1 야생형(SG1) 또는 IgG1 Fc 수용체 침묵형)의 미리 형성된 면역 복합체를 투여한 후의 야생형 CCL2의 제거율 값( SG105)
전기화학발광(ECL)에 의한 혈청 내 총 인간 CCL2 농도의 측정
마우스 혈청에서 총 인간 CCL2의 농도는 ECL에 의해 측정하였다. 3 ug/mL의 항-CCL2 항체(F7(바이오레전드) 또는 클론 MAB679(R&D 시스템즈))를 멀티-어레이 96웰 플레이트(메소 스케일 디스커버리)에 밤새 고정화시킨 후, 차단 완충액에서 30oC에서 2시간 동안 배양하였다. 항-CCL2 MAB679는 인간화 11K2, 1A4 또는 1A5 항체를 함유하는 샘플에 대한 포획 항체로서 사용하였다. 항-CCL2 클론 5D3-F7은 ABN912, CNTO888, 1G9, 2F6H 항체를 함우하는 샘플에 사용하였다. 인간 CCL2 검량선 샘플, 품질 대조군 샘플 및 마우스 혈청 샘플은 희석 완충액에 희석하고 37oC에서 30분 동안 과량의 약물과 함께 배양하여 준비하였다. 이 후, 샘플을 항-CCL2 고정 플레이트에 첨가하고, 30℃에서 1시간 동안 결합시킨 후 세척하였다. 다음으로, SULFO TAG NHS-에스테르(메소 스케일 디스커버리) 표지된 항 인간 Fc(클론: JDC-10, 서던바이오텍(SouthernBiotech))를 첨가하고 플레이트를 세척하기 전에 30oC에서 1시간 동안 항온처리하였다. 판독 버퍼 T(x4)(메소 스케일 디스커버리)를 즉시 플레이트에 추가하고 SECTOR 이미저(Imager) 2400(메소 스케일 디스커버리)으로 신호를 검출하였다. 분석 소프트웨어 소프트맥스 PRO(몰레큘라 디바이스)를 사용하여 검량선에 대한 반응을 기초로 인간 CCL2 농도를 계산하였다.
효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)에 의한 혈청 내 항-CCL2 항체 농도의 측정
마우스 혈청에서 항-CCL2 항체의 농도는 ECL에 의해 측정하였다. 눈크 맥시소프(Nunc MaxiSorp) 플레이트(써모피셔(Thermofisher))에 항인간 IgG 카파 사슬(앤티바디 솔루션(Antibody Solutions))를 분주하고, 4℃에서 밤새 방치하여 항인간 IgG 고정 플레이트를 제작하였다. 검량선 및 샘플은 1% 풀링된 마우스 혈청으로 준비하였다. 그런 다음, 항인간 IgG 고정 플레이트에 샘플을 분주하고, 30℃에서 1시간 방치하였다. 이어서, HRP 접합체(서던바이오텍)를 갖는 염소 항인간 IgG(감마-사슬 특이적)를 첨가하여 30℃에서 1시간 동안 반응시켰다. TMB 기질(라이프 테크놀로지(Life Technologies))을 기질로 사용하여 발색 반응을 실시하였다. 1 N 황산(와코(Wako))으로 반응을 정지시킨 후, 마이크로플레이트 판독기로 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 분석 소프트웨어 소프트맥스 PRO(몰레큘라 디바이스)를 사용하여 검량선의 흡광도로부터 마우스 혈장 중 농도를 계산하였다.
마우스에서 단일 파라토프 항체를 사용한 내인성 마우스 CCL2 면역 복합체 스위핑에 대한 평가
상기 결과(시험된 단일 파라토프 항체에 의한 CCL2의 면역 복합체 매개 스위핑이 효율적이지 않음을 시사함)에 더하여, 추가 평가를 실시하였다.
단일 파라토프 항체가 내인성 마우스 CCL2와 함께 면역 복합체를 형성하고 제거하는 능력을 평가하기 위해, 마우스 교차 반응성 11K2 항-CCL2 단일 파라토프 항체를 마우스에 투여하였다. 인간화 11K2H2-SG1(IgG1 야생형 = Fc 감마 수용체 결합) 또는 인간화 11K2-SG105(Fc 감마 수용체 결합 침묵형) 항체를 Balb/c 마우스의 정맥 꼬리에 20 mg/kg의 단일 용량 및 10 ml/kg의 단일 용량으로 정맥내 투여하였다. 혈액은 투여 전, 투여 후 5분, 7시간, 1일, 2일, 3일 및 7일에 수집하였다. 혈청은 즉시 혈액을 4℃에서 14,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 제조하였다. 혈청은 측정할 때까지 -80℃ 이하에서 보관하였다.
도 3은 마우스에서 인간화 11K2-SG1 및 11K2-SG105에 대한 혈청 총 마우스 CCL2 농도 및 항체-시간 곡선의 시간 경과를 도시한다.
도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 축적된 마우스 CCL2의 수준은 11K2-SG105(Fc 감마 수용체 결합 침묵형 Fc) 및 11K2-SG1(IgG1 야생형 =Fc 감마 수용체 결합 Fc) 사이에 차이가 없었다. 이는 주입된 항체에 의한 내인성 마우스 CCL2의 Fc 감마 수용체 매개 제거가 전혀 또는 거의 없었다는 것을 나타낸다. 면역 복합체의 항원이 Fc 감마 수용체의 다량체 결합을 통해 비복합 항원보다 더 빠르게 제거되기 때문에, 이는 11K2 항체가 내인성 마우스 CCL2와 함께 면역 복합체를 형성할 수 없음을 시사한다.
효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)에 의한 마우스 혈청 내 마우스 항-CCL2 농도의 측정
마우스 혈청에서 마우스 CCL2의 농도는 상업적으로 입수 가능한 마우스 CCL2 ELISA 키트(R&D 시스템즈)의 시약을 적용하여 측정하였다. 검량선 샘플 준비를 제외하고 제조업체의 프로토콜을 따랐다. 정제된 재조합 마우스 CCL2는 제조사의 단백질 대신 표준물질로 대체하였다. 항체 주입 후 채취한 샘플은 2.5% 마우스 혈청 주입 항체를 40 μg/ml 농도로 첨가하여 검량선 샘플 및 샘플을 준비하고 37℃에서 30분간 배양하였다. 항인간 CCL2 고정 플레이트를 30℃에서 2시간 동안 항온처리하였다. 마우스 MCP-1 접합체를 첨가하고 30℃에서 2시간 동안 배양한 후, 기질 및 정지 용액으로 검출하였다.
항체 주입 전에 채취한 샘플의 경우, 제조사의 지침에 따라 마우스(Mouse) MCP-1 울트라-센서티브 키트(Ultra-Sensitive Kit)(메소 스케일 디스커버리)를 사용하였다. 플레이트에 첨가하기 전에, 그 어떤 항체도 샘플에 첨가하지 않았다.
효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)에 의한 혈청 내 항-CCL2 항체 농도의 측정
마우스 혈청에서 항-CCL2 항체의 농도는 ECL에 의해 측정하였다. 눈크 맥시소프(Nunc MaxiSorp) 플레이트(써모피셔(Thermofisher))에 항인간 IgG 카파 사슬(앤티바디 솔루션(Antibody Solutions))를 분주하고, 4℃에서 밤새 방치하여 항인간 IgG 고정 플레이트를 제작하였다. 검량선 및 샘플은 1% 풀링된 마우스 혈청으로 준비하였다. 그런 다음, 항인간 IgG 고정 플레이트에 샘플을 분주하여 상온에서 1시간 동안 방치하였다. 이어서, 마우스 항인간 IgG HRP(클론 JDC-10, 서던바이오텍)를 첨가하여 상온에서 30분간 반응시켰다. ABTS 기질(KPL)을 기질로서 사용하여 발색 반응을 실시하였고, 마이크로플레이트 판독기로 405 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 분석 소프트웨어 소프트맥스 PRO(몰레큘라 디바이스)를 사용하여 검량선의 흡광도로부터 마우스 혈장 중 농도를 계산하였다.
단일특이적(단일 파라토프) 항-CCL2 항체를 사용한 다양한 마우스 PK 연구의 결론
마우스 PK 연구의 결과를 요약하자면, 시험된 단일 파라토프 항체 중 어느 것도 순환계로부터 CCL2의 효율적인 제거를 나타내지 않았다. 이러한 데이터는 단일 파라토프 항체가 순환계로부터 CCL2를 효율적으로 제거하기 위해 CCL2와 면역 복합체를 형성할 수 없음을 시사한다.
이와 대조적으로, 하기에 기재된 바와 같이, 2개의 상이한 항원 결합 모이어티/부위를 갖는 이중특이적 항-CCL2 항체(이중 파라토프 항-CCL2 항체)는 CCL2와 면역 복합체를 효율적으로 형성하고 순환계로부터 이를 제거할 수 있었다.
실시예 B-1
이중특이적(이중 파라토프) 항-CCL2 항체
인간 CCL2 상의 2개의 상이한 특이적 에피토프에 결합하는 2개의 상이한 항원 결합 모이어티(파라토프)를 갖는 여러 이중특이적 항-CCL2 항체가 생성되었다
도입
항원의 단일 결합 또는 교차 결합이 생체내 CCL2 제거에 유의적인 영향을 미치는지 여부를 시험하기 위하여, 이중특이적 크로스맵 기술(예컨대, WO 2009/080252, WO 2015/150447), WO 2009/080253,WO 2009/080251, WO 2016/016299, Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 1187-1191, 및 Klein at al., MAbs 8 (2016) 1010-20)(이중특이적(=이중 파라토프) 크로스맵을 참조)을 사용하여 CCL2 상의 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 2개의 상이한 항원 결합 모이어티/부위를 갖는 이중특이적 항-CCL2 항원을 생성하였다. 이러한 분자는 생화학적 및 기능적 특성에 대해 시험관 내에서 처음 특성화되었지만, 마우스 공동 주입 연구에서 생체내 CCL2 제거율 평가를 위한 도구로도 사용되었다. Fcγ 수용체(FcgR) 결합 매개 스위핑을 기반으로 한 제거 가능성을 평가하기 위하여(예컨대, Igawa et al, Immunological Reviews 270 (2016) 132-151, WO2012/122011 및 WO2016/098357 및 WO2013/081143), FcgR에 결합하고 FcgR 작동체 침묵형 분자(예컨대, 돌연변이 L234A, L235A, P329G를 갖는 IgG1(카바트 EU 넘버링))에 대한 결합이 감소/폐기된 변형된 인간 IgG1 불변쇄를 갖는 야생형 huIgG1로서 모든 크로스맵을 생성하였다.
적합한 항-CCL2 항체 쌍의 확인-샌드위치 ELISA에 의한 이중 파라토프 항체 팔의 선택.
샌드위치 ELISA를 실시하여 인간 CCL2에 대한 결합에 대해 경쟁하지 않는 항체 쌍을 확인하였다. 384-웰 MAXISORP(NUNC) 플레이트를 7개의 표시된 포획 항체(팔 1)의 1 μg/mL로 코팅하고 2% BSA로 차단하였다. 비오틴화된(NHS-PEO4-비오틴, 피어스(Pierce)) WT 인간 CCL2(20 ng/mL)를 1 μg/mL의 과량의 동일한 7개 항체(팔 2)의 또는 섭씨 37도에서 1시간 동안 차단 완충액과 함께 배양하였다. 배양 후, 혼합물을 차단된 ELISA 플레이트에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트 결합된 CCL2의 검출은 스트렙타비딘 HRP에 이어 TMB 원 컴포넌트(One Component) 기질(라이프테크(Lifetech))을 사용하여 실시하였다. 신호 발생은 1N HCl 산(와코)에 의해 중단하였다. 경쟁 항체가 없는 웰의 O.D.는 각 포획 항체에 대해 100% 신호로 설정하였다. CCL2가 첨가되지 않은 블랭크 웰의 O.D.는 0% 신호로 설정하였다. 양방향에서 CCL2 결합에 대해 강한 경쟁을 나타내지 않은 9개의 항체 쌍을 이중특이적 크로스맙 항체의 생성을 위한 후보로 선택하였다.
이중 파라토프 항-CCL2 항체 및 면역 복합체의 생성 및 특성화
이중특이적 크로스맵 형식의 재조합 DNA 기술의 이중 파라토프 항-CCL2 항체 생성
표준 방법을 사용하여 Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989에 기재된 바에 따라 DNA를 조작하였다. 분자 생물학적 시약은 제조업체의 사용설명서에 따라서 이용되었다.
유전자 및 올리고뉴클레오티드 합성
Geneart GmbH (Regensburg, 독일) 사에서 화학 합성을 통해 원하는 유전자 절편들을 제조하였다. 합성된 유전자 단편들은 증식/증폭을 위해 대장균 플라스미드에 클로닝되었다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 시퀀싱으로 확인하였다. 대안적으로, 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드들을 어닐링함에 의해 또는 PCR을 통해 짧은 합성 DNA 단편들을 조립하였다. 각각의 올리고뉴클레오티드는 메타비온(metabion) GmbH(독일 플라네그 마틴스리드 소재)에 의해 제조하였다.
기본/표준 포유류 발현 플라스미드에 대한 설명
원하는 유전자/단백질(예컨대, 항체 중쇄 또는 항체 경쇄)의 발현을 위해, 하기의 기능적 요소들:
· 인트론 A를 포함하는 인간 사이토메갈로바이러스(P-CMV)로부터의 즉각적인 초기 증폭자 및 프로모터,
· 인간 중쇄 면역글로불린 5'-비번역 영역(5'UTR),
· 뮤린 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
· 발현될 유전자/단백질(예컨대, 전장 항체 중쇄 또는 MHC클래스Ⅰ분자), 및
· 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGH pA)을 포함한 전사 단위가 사용된다.
· 발현하고자 하는 유전자를 포함하는 발현 단위/카세트 이외에 기본/표준 포유류 발현 플라스미드는:
· 대장균에서 상기 플라스미드의 복제를 가능하게 하는 벡터 pUC18로부터의 복제 기점, 및
· 대장균에서 암피실린 내성을 부여하는 베타 락타마아제 유전자를 함유한다.
재조합 단일클론 항체용 발현 플라스미드의 생성
재조합 단일클론 항체 유전자는 각각의 면역글로불린 중쇄 및 경쇄를 부호화한다.
일시적인 발현 단일클론 항체 분자를 위한 발현 플라스미드는 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 발현 카세트 외에 대장균에서 상기 플라스미드의 복제를 허용하는 벡터 pUC18 및 대장균에서 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마제 유전자로부터의 복제 기점을 포함하였다.
각각의 항체 중쇄 또는 경쇄의 전사 단위는 하기의 기능적 요소들:
· 인트론 A를 포함하는 인간 사이토메갈로바이러스(P-CMV)로부터의 즉각적인 초기 증폭자 및 프로모터,
· 인간 중쇄 면역글로불린 5'-비번역 영역(5'UTR),
· 뮤린 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
· 각각의 항체 중쇄 또는 경쇄 cDNA 서열 및
· 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGH pA)을 포함하였다.
일시적인 발현 및 분석적 특성화
F17 배지(인비트로젠(Invitrogen Corp.))에서 배양된 HEK293 세포(인간 배아 신장 세포주 293 유래)의 일시적 형질감염에 의해 재조합 생성을 실시하였다. 단일클론 항체의 생성을 위해, 세포를 각각의 면역글로불린 중쇄 및 경쇄를 함유하는 플라스미드로 공동 형질감염시켰다. 형질감염을 위해, "293-펙틴" 형질감염 시약(인비트로젠)을 사용하였다. 제조업체의 지침에 명시된 바와 같이 형질감염을 실시하였다. 세포 배양 상청액을 형질감염 3 내지 7(3-7)일에 회수하였다. 상층액은 감소된 온도(예컨대, -80°C)에서 보관하였다.
예컨대, HEK293 세포에서 인간 면역글로불린의 재조합 발현에 관한 일반 정보는: Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203를 참조한다. 하기의 이중특이적 항체를 생성하기 위하여, WO 2016/016299에 기재된 크로스맵 기술이 사용되었고, VH/VL은 하나의 항체 팔에서 교환되고, 다른 항체 팔의 CH1/CL 계면은 이종이량체화를 촉진하기 위해 CH3/CH3 계면에서 구멍 내 돌기 기술과 함께 전하 변형에 의해 수정되었다. 상기 기술이 적용된 모든 4개의 항체 사슬에 대한 예시적인 서열이 CNTO888//11K2-WT IgG1에 대해 제시된다(서열번호 104 내지 서열번호 107).
야생형 IgG1(WT IgG1)을 사용하여 생성된 이중특이적(이중 파라토프) 항-CCL2 크로스맵 항체의 목록(야생형 IgG1은 Fc 수용체 결합에 영향을 미치는 변형/돌연변이가 없는 것을 의미하지만, 구멍 내 돌기와 같은 이종이량체화 기술이 포함됨)
Fc 감마 수용체 침묵형 돌연변이 L234A, L235A, P329G(카바트 EU 넘버링)(IgG1-PGLALA)를 포함한 IgG1을 갖는 이중특이적(이중 파라토프) 항-CCL2 크로스맵 항체의 목록
이중 파라토프 항-CCL2 항체의 정제
세포 배양 상층액을 함유하는 이중 파라토프 항-CCL2 항체를 최대 3개의 크로마토그래피 단계로 여과하고 정제하였다. 포획 단계 용리액의 순도에 따라 이온 교환 크로마토그래피 단계는 포획 및 연마 단계 사이에 선택적으로 실시하였다.
이중 파라토프 항-CCL2 항체는 맙셀렉트슈어-세파로스TM(GE 헬스케어, 스웨덴 소재), POROS 50 HS(써모 피셔 사이언티픽) 및 수퍼덱스 200 크기 배제(GE 헬스케어, 스웨덴 소재) 크로마토그래피를 사용한 친화성 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 간단히 말해서, 무균 여과된 세포 배양 상층액을 PBS 완충액(10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl 및 2.7 mM KCl, pH 7.4)으로 평형화된 맙셀렉트슈어 수지 상에서 포획하고, 평형화 완충액으로 세척한 후, 25 mM의 구연산염, pH 3.0으로 용출하였다. 용출된 단백질 분획물을 취합하고 2M 트리스(Tris), pH 9.0으로 중화시켰다.
선택적인 제2 정제 단계로서 이온 교환 크로마토그래피는 POROS 50 HS(써모 피셔 사이언티픽)로 실시하고 평형화한 후, 20 mM 히스티딘 pH 5.6으로 세척하고, 희석된 포획 단계 용리액의 부하를 pH 5.6에서 20 mM 히스티딘, 0.5 M NaCl로 실시하였다. 이온 교환 크로마토그래피 분획을 CE-SDS LabChip GX II(퍼킨엘머(PerkinElmer))로 분석하고 크로스맵 함유 분획을 취합하였다.
수퍼덱스 200(GE 헬스케어)의 크기 배제 크로마토그래피를 제2 또는 제3 단계로서 사용하였다. 크기 배제 크로마토그래피는 20 mM 히스티딘 완충액, 0.14 M NaCl, pH 6.0에서 실시하였다. 크기 배제 크로마토그래피 분획을 CE-SDS LabChip GX II(퍼킨엘머)로 분석하고 크로스맵 함유 분획을 취합하여 -80°C에서 보관하였다.수퍼덱스 200(GE 헬스케어)의 POROS 50 HS(써모피셔 사이언티픽) 크기 배제 크로마토그래피 후 만족스러운 생성물 품질의 경우, 20 mM 히스티딘 완충액, 0.14 M NaCl, pH 6.0에서 HiPrep 26/10 디솔팅(Desalting, GE 헬스케어)의 탈염 크로마토그래피로 대체하였다.
항체 제조의 단백질 농도는 아미노산 서열을 기반으로 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정함으로써 결정하였다.
항체의 순도 및 무결성은 단백질 익스프레스 칩 및 HT 단백질 익스프레스 시약 키트(Protein Express Chip and HT Protein Express Reagents Kit)가 포함된 LabChip GX II(퍼킨엘머)를 사용하여 CE-SDS로 분석하였다. 항체 제제의 응집체 함량은 실행 완충액으로 200 mM K2HPO4/KH2PO4, 250 mM KCl, pH 7.0을 사용하는 바이오스위트(Biosuite) 고분해능 SEC, 250
, 5 μm 분석 크기 배제 컬럼(워터스(Waters) GmbH)을 사용하는 고성능 SEC에 의해 결정하였다. CE-SDS로 분석한 평균 순도는 94~100%였으며 단량체 함량은 >95%(SEC)였다.
이중특이적(이중 파라토프) 항-CCL2 항체의 기능적 특성화
친화도 측정(결합)
포획 시스템의 약 1200 공명 단위(RU)(20 μg/ml 염소 항 인간 IgG Fc, 주문 코드: 109-005-098; 잭슨 면역연구소)를 GE 헬스케어에서 공급하는 아민 커플링 키트를 사용하여 pH 5.0에서 C1 칩(GE 헬스케어 BR-1005-35)에 커플링하였다. 표본 및 시스템 완충액은 PBS-T(0.05% 트윈20을 포함하는 10 mM 인산염 완충된 식염수) pH 7.4이었다. 유세포는 25°C로 설정되었고 샘플 블록은 12°C로 설정되었으며 러닝 완충액으로 두 번 프라이밍되었다. 10 μl/분의 유속에서 2 μg/ml 용액을 60초 동안 주입함으로써 이중특이적 항체를 포획하였다. 1:10 희석에서 30 nM로 시작하여 30 μl/분의 유속에서 150 초 동안 용해 상태에서 다양한 농도의 인간 CCL2(wt)를 주입하여 결합을 측정하였다. 해리 단계는 최대 1200초 동안 모니터링되었으며 샘플 용액으로부터 실행 완충액으로 전환하여 유발하였다. 표면은 10 μl/분의 유속에서 0.85% H3PO4 용액으로 60 초 세척에 의해 재생시켰다. 벌크 굴절률 차이가 염소 항인간 IgG Fc 표면으로부터 수득한 반응을 차감함으로써 교정하였다. 블랭크 주입을 또한 차감하였다(= 이중 참조). 동역학 매개변수의 계산을 위해, 랭뮤어(Langmuir) 1:1 모델을 사용하였다.
야생형 항원의 존재하에 천연 면역 복합체의 형성.
모든 단백질 샘플(이중특이적 항-CCL2 크로스맵 항체 및 항원)은 투석 또는 원심 한외여과 장치를 사용하여 1x PBS, pH 7.4에서 재완충시켰다.
2.0 내지 0.1 mg/mL의 크로스맵 샘플 희석 시리즈를 준비하였다. 마찬가지로, PBS 중의 항원 용액은 0.012 내지 0.23 mg/mL 범위의 농도로 제조하였다. 등가 체적의 혼합이 가능하도록 농도를 선택하여, 1:1(항체:CCL2 복합체)의 일정한 몰비를 달성하였다. 하기의 항원: 야생형 CCL2를 본 연구에 사용하였다.
등가 체적의 미리 희석된 크로스맵 및 CCL2 제제를 혼합하고 37°C에서 1시간 동안 배양한 후, 샘플을 수퍼로즈(Superose)6(GE 헬스케어 #2039) 컬럼에 적용하고 PBS로 미리 평형화한 후 0.5 mL/분의 유속으로 용출하였다. 총 100 μg 또는 최대 250 μL의 가능한 부피를 적용하고 항체 및 항원만을 대조군으로 사용하였다.
SEC-MALLS 데이터는 옵티랩(OptiLab) rEX 굴절률 검출기 및 미니(mini)DAWN 트레오스(Treos) MALLS 검출기(둘 모두 와이어트(Wyatt) Inc.)로 기록하였다. SEC-MALLS 신호는 아스트라(Astra) V5 소프트웨어(와이어트)를 사용하여 처리하였다.
범례
+++ 다량의 다중/올리고머
++ 중간 양의 다중/올리고머
+ 소량의 다중/올리고머
0 단지 이량체 이하
항-CCL2 항체의 중화 특성을 연구하기 위한 CCR2 리포터 분석
탕고(Tango)™ CCR2-bla U2OS 세포는 CCL2 중화 항체 구성물의 영향을 연구하기 위해 독일 인비트로젠(Invitrogen)에서 구입하였다. 상기 리포터 세포는 TEV 프로테아제 부위에 연결된 인간 케모카인(C-C 모티프) 수용체 2(CCR2) 및 탕고™ GPCR-bla U2OS 모 세포주에 안정적으로 통합된 Gal4-VP16 전사 인자를 함유한다. 상기 모 세포주는 UAS 반응 요소의 제어 하에 베타-아레스틴/TEV 프로테아제 융합 단백질 및 베타-락타마제(bla) 리포터 유전자를 안정적으로 발현한다. 천연 리간드 MCP1 = CCL2를 추가하면 리포터 유전자의 활성이 표시되며, 이는 FRET 활성화 기질의 절단으로 측정할 수 있다.
원칙적으로, 분석 및 세포 처리 절차는 제공자 설명서에 따랐다. 간단히 말해서, CCR2-U2OS 세포는 2x104 세포/웰(96er 검은색 투명 바닥 플레이트, cat.no. # 655090, 그라이너 바이오원(Greiner Bio-one))로 50 μl 분석 배지(프리스타일(Freestyle) 293 발현 배지(Expression Medium), cat.no. #12338-018, 인비트로젠)에서 분주하였다. 동시에, CCL2 항원 용액 뿐만 아니라 상이한 시험 항체의 연속 희석물을 c = 4x 최종 농도에서 제조하였다. 그런 다음, CCL2 항원/항체 혼합물을 준비하고 실온에서 2 내지 3시간 동안 사전 배양하였다. 표시된 CCL2/항체 용액 50 μl를 U2OS 세포를 발현하는 CCR2로 옮기고 37°C 및 5% CO2의 가습 배양기에서 18시간 동안 배양하였다. 대조군으로서 검정 배지만을 사용하였다.
다음날, CCF4 기질(cat. no. #K1089, 인비트로젠)을 락타마제 로딩 용액(cat. No.# K1085, 인비트로젠)으로 준비하고 이의 20 μl/웰을 세포에 첨가하였다. 기질 용액을 암실 내 실온에서 2시간 동안 배양하였다.
마지막으로, 형광 파장은 하기의 파장(Ex/Em = 409 nm/460 nm = 파랑*, Ex/Em = 409 nm/530 nm = 녹색**)에서 스펙트라(Spectra) Max(M4) 판독기(몰레큘라 디바이스)로 결정하였고, 분석 배지 대조군을 차감한 후 청색/녹색 형광의 비율은 하기의 방정식에 따라 계산하였다: 비율 = (샘플-청색* - 대조군-청색*)/(샘플-녹색** - 대조군-녹색**).
pH 조작 후, CCL2 유도 CCR2 신호 전달을 억제하는 능력에 대해 최종 LO 후보(CKLO1-4)를 특성화하였다. 이 경우, 중화 특성은 rec. CCL2 단백질의 단량체 변이체에 의해서만 평가하였으며, 약 15 ng/ml의 최종 농도에서 사용하였다.
마우스에서 이중 파라토프 항체를 사용한 인간 CCL2 면역 복합체 스위핑에 대한 평가
이중 파라토프 항체가 야생형 인간 CCL2와 함께 면역 복합체를 형성하는 능력을 평가하기 위해, 항-CCL2 이중 파라토프 항체(20 mg/kg) 및 야생형 인간 CCL2(0.1 mg/kg)로 구성된 미리 형성된 면역 복합체를 10 ml/kg의 단일 용량으로 Balb/c 마우스의 꼬리 정맥에 투여하였다. 혈액은 투여 후 5분, 7시간, 1일, 3일 및 7일에 수집하였다. 혈청은 즉시 혈액을 4℃에서 14,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 제조하였다. 혈청은 측정할 때까지 -80℃ 이하에서 보관하였다. 시험한 이중 파라토프 항체는 하기의 표 4에 나열되어 있다. WT IgG1 Fc를 갖는 항체는 야생형과 유사한 Fc 감마 수용체 결합을 갖는 반면, PGLALA Fc를 갖는 항체는 Fc 감마 수용체 결합 침묵형이다. 결과는 도 4a 내지 도 4i에서 도시된다.
생체내 hCCL2 제거에 미치는 각 항-CCL2 이중 파라토프 항체의 면역 복합체 스위핑 효과는 도 4a 내지 도 4i에 도시된 바와 같이 Fc 감마 수용체 결합을 갖는 항-CCL2 항체(실선) 및 Fc 감마 수용체 결합 침묵형을 갖는 항-CCL2 항체(PGLALA, 점선)를 비교함으로써 평가하였다. 항체 곡선은 피닉스(Phoenix) 64(파사이트(Pharsight)/체르타라(Certara))를 사용하여 비구획 분석에 의해 분석하였다. AUCinf는 무한대로 외삽된 선형 로그 사다리꼴 규칙에 의해 추정하였다. 제거율 값음 용량/AUCinf로 정의한다. 상기 제거율의 차이는 또한 배수 변화로 표현되었으며, 이는 Fc 감마 수용체 결합(SG1)을 갖는 항체의 hCCL2 제거율을 Fc 감마 수용체 결합 침묵형(PGLALA)을 갖는 항체의 hCCL2 제거율로 나눔으로써 계산한다(하기 표 4). 하기 표 4의 데이터는 Fc 감마 수용체(FcgR) 결합 항체(WT IgG1)에 의한 인간 CCL2의 제거가 시험된 모든 이중 파라토프 항체에 대하여 Fc 감마 수용체 결합 침묵형 항체(L234A, L235A, P329G 돌연변이(카바트 EU 넘버링)를 포함한 IgG1 Fc 도메인을 갖는 PGLALA)의 것보다 우수함을 나타낸다. 이는 시험된 이중 파라토프 항체에 의해 달성된 CCL2의 면역 복합체 매개 스위핑이 더 효율적임을 시사한다. 또한, 몇몇 이중 파라토프 항체, 예를 들어 CNTO//인간화 11K2(CNTO//11K2)는 제거 값에서 큰 배수 변화를 보였다.
배수 변화는 WT FcγR(FcgR) 결합을 갖는 항체의 hCCL2 제거율을 PGLALA를 갖는 항체의 hCCL2 제거율로 나누어 계산한다. 도 4a 내지 도 4i 및 하기의 표 4에 도시된 바와 같이, CNTO//11k2는 FcgR 결합을 갖는 IgG1 야생형(WT)의 항체 및 FcgR 결합 침묵형인 항체(PGLALA) 사이에서 21.5의 가장 큰 배수 변화를 나타낸다. 이는 CNTO//11k2-WT IgG1에 의한 면역 복합체 매개 스위핑이 모든 변이체 중에서 가장 효율적임을 시사한다.
표 4: 항-CCL2 이중 파라토프 항체(20 mg/kg) 및 야생형 인간 CCL2(0.1mg/kg)의 미리 형성된 면역 복합체 투여 후 야생형 CCL2의 제거율 값
전기화학발광(ECL)에 의한 혈청 내 총 인간 CCL2 농도의 측정
마우스 혈청에서 총 인간 CCL2의 농도는 ECL에 의해 측정하였다. 3 ug/mL의 항-CCL2 항체 2F2-SG1을 멀티-어레이(MULTI-ARRAY) 96웰 플레이트(메소 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery))에 밤새 고정화시킨 후, 차단 완충액에서 30oC에서 2시간 동안 배양하였다. 인간 CCL2 검량선 샘플, 품질 관리 샘플 및 희석된 마우스 혈청 샘플을 37oC에서 30분 동안 9% SDS로 구성된 변성 완충액 또는 37oC에서 10분 동안 pH2.0~2.5 글리신 HCl 완충액과 함께 배양하였다. 변성 완충액의 목적은 이중 파라토프 항체로부터 인간 CCL2를 분리하는 것이다. 이 후, 샘플을 10배 희석하여 항-CCL2 고정 플레이트에 첨가하고, 30℃에서 1시간 동안 결합시킨 후 세척하였다. 다음으로, SULFO TAG 표지된 MCP-1 항체를 첨가하고 플레이트를 세척하기 전에 30oC에서 1시간 동안 항온처리하였다. 판독 버퍼 T(x4)(메소 스케일 디스커버리)를 즉시 플레이트에 추가하고 SECTOR 이미저(Imager) 2400(메소 스케일 디스커버리)으로 신호를 검출하였다. 분석 소프트웨어 소프트맥스 PRO(몰레큘라 디바이스)를 사용하여 검량선에 대한 반응을 기초로 인간 CCL2 농도를 계산하였다.
효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)에 의한 혈청 내 항-CCL2 항체 농도의 측정
마우스 혈청에서 항-CCL2 항체의 농도는 ECL에 의해 측정하였다. 눈크 맥시소프(Nunc MaxiSorp) 플레이트(써모피셔(Thermofisher))에 항인간 IgG 카파 사슬(앤티바디 솔루션(Antibody Solutions))를 분주하고, 4℃에서 밤새 방치하여 항인간 IgG 고정 플레이트를 제작하였다. 검량선 및 샘플은 1% 풀링된 마우스 혈청으로 준비하였다. 그런 다음, 항인간 IgG 고정 플레이트에 샘플을 분주하고, 30℃에서 1시간 방치하였다. 이어서, HRP 접합체(서던바이오텍)를 갖는 염소 항인간 IgG(감마-사슬 특이적)를 첨가하여 30℃에서 1시간 동안 반응시켰다. ABTS 기질(KPL)을 기질로 사용하여 발색 반응을 실시하고 450 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기로 측정하였다. 분석 소프트웨어 소프트맥스(SOFTmax) PRO(몰레큘라 디바이스(Molecular Devices))를 사용하여 검량선의 흡광도로부터 마우스 혈장 중 농도를 계산하였다.
연구의 요약
마우스 PK 연구 데이터를 요약하면, 시험된 이중 파라토프 항체에 의한 인간 CCL2의 스위핑은 동일한 용량의 단일 파라토프 항체에 비해 더 효율적이었다. 단일 파라토프 항체의 경우, WT FcgR 결합을 갖는 항체 및 FcgR 결합 침묵형 항체 사이의 항원 제거에 최소한의 차이가 있었다(표 3). 이와 대조적으로, WT FcgR 결합 및 FcgR 결합 침묵형을 갖는 이중 파라토프 항체들 사이에 큰 항원 제거율 차이가 수득되었고(표 4), 이는 시험된 이중 파라토프 항체가 인간 CCL2를 효율적으로 스위핑할 수 있음을 시사한다. CNTO888//11K2의 조합은 제거율에서 가장 큰 배수 기회를 보여주었기 때문에 추가적인 항체 조작을 위해 선택하였다.
실시예 B-2 변형된 가변 도메인 및 CDR을 갖는 항-CCL2 항체(이온 의존적/pH 의존적 결합)
이온 의존적/pH 의존적 결합을 유발하는 변형
pH 의존적 항-CCL2 항체를 생성하기 위해, mAb CNTO888 및 인간화 11K2의 모든 CDR에 대해 히스티딘 선별검사 돌연변이유발을 실시하였다. CDR의 각 아미노산은 제조업체의 지침에 따라 인퓨전(In-Fusion) HD 클로닝 키트(클론테크(Clontech Inc.) 또는 타카라 바이오사(Takara Bio company))를 사용하여 개별적으로 히스티딘으로 돌연변이되었다. 각 변이체가 올바르게 변이되었음을 서열분석을 통해 확인한 후, 사히의 방법으로 변이체를 일시적으로 발현시키고 정제하였다: 재조합 항체는 제조사의 지침에 따라 프리스타일(Freestyle) FS293-F 세포 및 293펙틴(라이프 테크놀로지)을 사용하여 일시적으로 발현시켰다. 재조합 항체를 단백질 A(GE 헬스케어)로 정제하고 D-PBS 또는 His 완충액(20 mM 히스티딘, 150 mM NaCl, pH6.0)에서 용출하였다. 필요한 경우, 고분자량 및/또는 저분자량 성분을 제거하기 위해 크기 배제 크로마토그래피를 추가로 실시하였다. 모든 히스티딘 치환 변이체는 상술된 것과 비교하여 변형된 비아코어® 분석에 의해 평가하였다. 간단히 말해서, pH 5.8에서의 추가적인 해리 단계는 pH 7.4에서의 해리 단계 직후에 비아코어® 분석에 통합되었다. 이는 pH 5.8에서 상응하는 해리와 대조적으로 pH 7.4에서 형성된 복합체로부터 항체(Ab) 및 항원(Ag) 사이의 pH 의존적 해리를 평가하기 위한 것이다. pH 5.8 완충액에서의 해리 속도는 스크루버(Scrubber) 2.0(바이오로직 소프트웨어(BioLogic Software)) 곡선 맞춤 소프트웨어를 사용하여 데이터를 처리하고 맞춤으로써 결정하였다.
pH 7.4 해리 단계와 비교하여 pH 5.8에서 결합 반응의 감소를 초래하는 단일 히스티딘 치환을 선택하고 조합하였다. pH 7.4에서 친화도를 개선시키는 돌연변이를 확인하기 위해, 히스티딘 치환 단계 동안 생성된 적어도 하나의 변이체를 사용하여 각각 중쇄 및 경쇄에 대해 500개 초과의 변이체를 생성하였다. 상기 변이체는 원래 아미노산 및 시스테인을 제외하고 18개의 다른 아미노산으로 치환된 CDR의 각 아미노산을 가졌다. 인간 CCL2에 대한 변이체의 결합능은 비아코어® 4000 기기(GE 헬스케어)를 사용하여 pH 7.4 하의 37℃에서 평가하였다. 상기와 같이, pH 5.8에서의 추가적인 해리 단계는 pH 7.4에서의 해리 단계 직후에 비아코어® 분석에 통합되었다. pH 5.8 완충액에서의 해리 속도는 스크루버(Scrubber) 2.0(바이오로직 소프트웨어(BioLogic Software)) 곡선 맞춤 소프트웨어를 사용하여 데이터를 처리하고 맞춤으로써 결정하였다.
pH 7.4에서 친화도를 개선하고 pH 의존성을 개선한 변이체를 선택하고 이러한 돌연변이를 조합하였다. 이는 하기의 표에서 4개의 11K2 변이체 및 4개의 CNTO888 변이체로 예시된다.
표: pH 의존적 결합을 위해 조작된 4개의 변형된 11K2 및 4개의 CNTO888 변이체
변형된 11K2 및 CNTO888 변이체의 조합 효과를 평가하기 위해, 각각의 11K2 변이체를 4개의 변형된 CNTO888 변이체와 조합하고, 크로스맵 형식의 이중 파라토프 CCL2 항체로 발현시켰다. 이는 하기의 표에 예시되어 있으며, 4 x 4 조합은 CKLO01 내지 CKLO16으로 지정된 16개의 2중 파라토프 항체를 생성한다.
표: 16개의 이중특이적(이중 파라토프) 항체를 생성하기 위한 4개의 변형된 11K2 및 4개의 변형된 CNTO888 변이체의 조합
이중특이적 항체를 생성하기 위하여, WO 2016/016299에 기재된 크로스맵 기술이 사용되었고, VH/VL은 하나의 항체 팔에서 교환되고, 다른 항체 팔의 CH1/CL 계면은 이종이량체화를 촉진하기 위해 CH3/CH3 계면에서 구멍 내 돌기 기술과 함께 전하 변형에 의해 수정되었다. 상기 기술이 적용된 모든 4개의 항체 사슬에 대한 예시적인 서열이 CKLO2 IgG1에 대해 제시된다(서열번호 108 내지 서열번호 111을 참조). 사용된 중쇄 불변 도메인(예컨대, IgG1 야생형(Fc 수용체 결합 침묵형 돌연변이 없음), PGLALA, SG1095, SG1099, 1100 - SG1095, SG1099, 1100의 경우 하기의 설명 또는 서열 설명을 참조)에 따라, 접미사 IgG1, PGLALA, SG1095, SG1099, 1100을 추가하였다.
변형된 가변 도메인 및 CDR을 갖는 항-CCL2 항체의 기능적 특성화(이온 의존적/pH 의존적 결합)
친화도 측정(상기의 방법 참조)
IgG1 야생형으로서 생성된 16개의 이중특이적 항-CCL2 항체 모두에 대해, 이들의 pH 의존적 결합 인간 CCL2를 측정하였다.
도 5a는 4개의 변형된 11K2 및 4개의 CNTO888 변이체 및 조합 후 16개의 크로스맵의 pH 7.4(검정색 선) 및 pH 5.8(회색선)에서 단량체 CCL2에 대한 결합 곡선을 나타내는 비아코어® 센서그램을 도시한다.
도 5b는 pH 5.8의 추가적인 해리 단계가 pH 7.4의 해리 단계 직후 비아코어® 분석에 통합된 단량체 CCL2에 대하여 4개의 변형된 11K2 및 4개의 CNTO888 변이체 및 조합 후 16개의 크로스맵의 결합 곡선을 나타내는 비아코어® 센서그램을 도시한다.
CCL8에 대한 교차 반응성 결합
재조합 단량체 인간 CCL2 및 재조합 단량체 인간 CCL8에 대한 pH 의존성 결합은 비아코어 T200 기기(GE 헬스케어)를 사용하여 37°C에서 평가하였다. 항인간 Fc(GE 헬스케어)를 제조사의 권장된 설정에 따라 아민 커플링 키트(GE 헬스케어)를 사용하여 CM4 센서 칩의 각 플로우 셀에 고정화시켰다. 항체 및 분석물을 ACES pH 7.4 또는 pH 5.8 완충액(20 mM ACES, 150 mM NaCl, 1 mg/ml BSA, 0.05% 트윈 20, 0.005% NaN3)으로 희석하였다. 항체를 항 Fc 센서 표면 상에 포획한 다음, 재조합 인간 CCL2를 8 nM 농도에서 유동 세포에 걸쳐 주입하였다. 항체에 대한 분석물의 결합 단계를 120초 동안 모니터링한 다음, 180초의 해리 단계를 모니터링하였다. 센서 표면은 3M MgCl2로 각 주기마다 재생시켰다. 결합 센서그램은 포획 수준에 대한 결합 응답의 정규화에 의해 TIBCO 스포트파이어(Spofire)에 의해 처리하였다.
pH 7.4에서 형성된 항체/항원 복합체에 대한 pH 의존적 해리의 평가는 변형된 비아코어 분석에 의해 확인하였다. 간단히 말해서, pH 5.8에서의 추가적인 해리 단계는 pH 7.4에서의 해리 단계 직후에 비아코어® 분석에 통합되었다. 결합 센서그램은 포획 수준에 대한 결합 응답의 정규화에 의해 TIBCO 스포트파이어(Spofire)에 의해 처리하였다.
재조합 인간 CCL8 P8A 단량체의 발현 및 정제: 야생형 인간 CCL8에 대한 서열은 젠뱅크(Genbank)에서 입수하였다(NCBI: NP_005614.2). 단량체 CCL8을 만들기 위해, 성숙한 CCL8 단백질의 8번 위치에 있는 프롤린을 알라닌으로 돌연변이시켰다. Expi 293 세포(라이프테크)를 제조사의 지침에 따라 형질감염시켰다. CCL8 야생형 및 P8A 단량체 단백질은 SP-세파로즈 HP(GE 헬스케어) 및 수퍼로즈 200 크기 배제(GE 헬스케어) 크로마토그래피를 사용하는 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 동일한 방법을 사용하여 정제하였다. 간단히 말해서, 세포 배양 상청액을 MilliQ 물(밀리포어(Millipore))로 2.5배 희석하고, PBS로 평형화된 Hi-Trap SP-HP 컬럼에 로딩하고, 평형화 완충액으로 세척하고, 0~2M NaCl의 구배를 사용하여 용출하였다. 용출된 단백질 분획을 취합하고, 20 mM 히스티딘, 150 mM NaCl, pH 6.0으로 평형화된 하이로드(HiLoad) 16/600 수퍼로즈 200(GE 헬스케어) 컬럼을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 분획은 크기 배제 크로마토그래피 및 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. CCL8 단백질을 함유한 분획을 취함하고, 농축하여 -80°C에서 보관하였다.
인간 CCL8은 CCL2와 높은 수준의 상동성을 공유하며 CCR2에도 결합할 수 있다. 11K2 팔이 CCL8에 결합할 수 있음에 따라(도 1을 참조), CCL8을 중화시키는 표적외 효과를 피하기 위해 상기 결합을 줄이기 위한 돌연변이를 확인하는 것이 필요하였다. 또한, 11K2 팔에서 CCL8 결합을 제거하는 것은 CCL2와 면역 복합체를 효율적으로 형성하는 데 중요하다. CNTO 팔은 CCL8에 결합하지 않기 때문에, 11K2 팔에 대한 CCL8의 결합은 CCL2와의 면역 복합체 형성을 방해하여 혈장으로부터 CCL2의 제거율을 감소시킬 수 있다.
인간 CCL8에 대한 11K2의 결합을 감소시키고 인간 CCL2에 선택성을 부여하는 돌연변이를 확인하기 위해, 일부 CDR 위치는, 예컨대 CKLO02의 11K2 VH에 있는 D101E 또는 CKLO03의 11K2 VL에 있는 W92R과 같이 huCCL8에 대한 교차 반응성을 제거하기 위해 치환하였다. 도 6에 도시된 바와 같이, 이중 파라토프 크로스맵에서 CCL8 결합은 11K2를 조작함으로써 현저하게 감소할 수 있다. CKLO01 변이체는 CCL8 결합을 감소시키도록 최적화되지 않은 반면, CKLO04, CKLO03 및 CKLO02는 CCL8 결합을 감소시키는 돌연변이를 함유한다. 4개의 크로스맵은 모두 CCL8에 대한 pH 의존적 결합을 가진다.
pH 7.4 및 pH 5.8에서 재조합 CCL2 및 CCL8에 대한 항-CCL2 항체의 결합 친화도
인간 CCL2 및 CCL8에 대한 모 CNTO888H/11K2H2, CKLO1, CKLO2 및 CKLO3의 친화도 및 pH 의존적 결합을 결정하기 위해, 비아코어 T200 기기(GE 헬스케어)를 사용하여 37°C에서 평가하였다. 항인간 Fc(GE 헬스케어)를 제조사의 권장된 설정에 따라 아민 커플링 키트(GE 헬스케어)를 사용하여 CM4 센서 칩의 각 플로우 셀에 고정화시켰다. 항체 및 분석물을 ACES pH 7.4 또는 pH 5.8 완충액(20 mM ACES, 150 mM NaCl, 1 mg/ml BSA, 0.05% 트윈 20, 0.005% NaN3)으로 희석하였다. 항체를 항 Fc 센서 표면에 포획한 다음, 재조합 인간 CCL2 P8A 변이체(단량체) 또는 CCL8 P8A 변이체(단량체)를 2배 연속 희석에 의해 제조한 1.25 nM 내지 20 nM에서 유동 세포에 걸쳐 주입하였다. 센서 표면은 3M MgCl2로 각 주기마다 재생시켰다. 결합 친화도는 비아코어 T200 평가 소프트웨어 버전 2.0(GE 헬스케어)을 사용하여 데이터를 1:1 결합 모델로 처리하고 맞춤으로서 결정하였다. pH 7.4 및 pH 5.8에서 재조합 CCL2 및 CCL8에 대한 항-CCL2 항체의 결합 친화도를 하기의 표 5에 도시하였다.
표 5: pH 7.4 및 pH 5.8에서 재조합 CCL2 및 CCL8에 대한 항-CCL2 항체의 결합 친화도
참고: n.d. 낮은 결합 반응으로 인해 KD를 결정할 수 없다.
표 5의 데이터는 pH 7.4에서 CCL8에 대한 결합이 CKLO2 및 CKLO3에 대해 제거된 반면, pH 7.4에서 강한 친화도 및 CCL2에 대한 pH 의존적 결합을 유지함을 도시한다. 결과는 CNTO888 및 11K2에 기반한 모 이중특이적 항체의 가변 영역 및 CDR에 도입된 상이한 변형이 pH 7.4에서 모 Ab와 비교하여 CCL2에 대한 결합 친화도가 향상된 친화도 성숙 변이체, CKLO1, CKLO2, CKLO3을 성공적으로 생성했음을 나타낸다. 동시에, CKLO1, CKLO2, CKLO3은 CCL2에 강한 pH 의존적 결합을 보였다. pH 7.4에서의 KD 값과 비교하여 pH 5.8에서는 CCL2에 대한 결합 친화도의 1000배를 초과하여 약한 KD가 관찰되었다.
야생형 인간 CCL2의 제거율
pH 의존적 이중특이적 항체가 야생형 인간 CCL2의 제거율을 향상시키는 능력을 평가하기 위해, 항-CCL2 단일 파라토프 항체(20 mg/kg) 및 야생형 인간 CCL2(0.1 mg/kg)로 구성된 미리 형성된 면역 복합체를 10 ml/kg의 단일 용량으로 SCID 마우스의 꼬리 정맥에 투여하였다. 혈액은 투여 후 5분, 1시간, 4시간, 7시간, 1일 및 7일에 수집하였다. 혈청은 측정할 때까지 -80℃ 이하에서 보관하였다. 시험한 크로스맵 항체는 모 CNTO//11K2 및 4개의 pH 조작된 변이체, CKLO01, CKLO02, CKLO03 및 CKLO04였다. 모든 항체는 IgG1 야생형 Fc 부분을 가졌다(Fc(감마) 수용체 결합을 침묵화/소멸하는 돌연변이 없음). 마우스 혈청에서 총 인간 CCL2 및 항-CCL2 항체 농도의 측정은 상술한 바와 같이 실시하였다(표 4에 따른 "마우스에서 이중 파라토프 항체를 사용한 인간 CCL2 면역 복합체 스위핑에 대한 평가").
결과는 도 7a에서 도시된다. hCCL2 및 이중특이적 항-CCL2 항체(모 CNTO//11K2 및 pH 의존적 변이체 CKLO01, CKLO02, CKLO03 및 CKLO04)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 SCID 마우스에 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다. 4가지 모든 pH 조작된 변이체는 인간 CCL2의 빠른 제거율을 보여주었다. CKLO02, CKLO03의 경우, 인간 CCL2는 1일차까지 검출 한계 미만이었다. 모 CNTO//11K2의 경우, 인간 CCL2의 빠른 제거가 처음에 1일까지 관찰되었지만, 이후에는 인간 CCL2의 제거가 느려졌다.
실시예 B-3 변형된 가변 도메인 및 CDR을 갖는 항-CCL2 항체(이온 의존적/pH 의존적 결합) 및 Fc 매개 스위핑
스위핑 기술을 통한 이중특이적 항-CCL2 항체의 변형
이중특이적 항-CCL2 항체는 이중특이적 항-CCL2 항체가 장기간에 걸쳐 유리 CCl2를 제거하여 생체 내에서 항암 효능 또는 생체내 항염증 효능과 같은 생물학적 효과를 지속할 수 있도록 하는 스위핑 기술을 사용하여 변형되었다.
스위핑의 개념은, 예컨대 Igawa et al, Immunological Reviews 270 (2016) 132-151, WO2012/122011, WO2016/098357, 및 WO2013/081143에서 기재되며, 이는 본원에 원용된다.
pI Fc 매개 스위핑
pH 조작된 이중 파라토프 항체가 생체내 CCL2 제거를 가속화할 수 있음을 입증한 후, 다음으로 야생형 인간 CCL2의 제거를 향상시키는 pI 상승 치환을 갖는 항체의 능력을 평가하였다. 항-CCL2 단일 파라토프 항체(20 mg/kg) 및 야생형 인간 CCL2(0.1 mg/kg)로 구성된 미리 형성된 면역 복합체를 SCID 마우스의 꼬리 정맥에 10 ml/kg의 단일 용량으로 투여하였다. 혈액은 투여 후 5분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간 및 7일에 수집하였다. 혈청은 측정할 때까지 -80℃ 이하에서 보관하였다. 시험한 크로스맵 항체는 IgG1을 갖는 모 CKLO03 및 pI가 강화된 Fc, CKLO03-SG1099가 있는 CKLO03이었다. 마우스 혈청에서 총 인간 CCL2 및 항-CCL2 항체 농도의 측정은 상술한 바와 같이 실시하였다(표 4 아래의 "마우스에서 이중 파라토프 항체를 사용한 인간 CCL2 면역 복합체 스위핑에 대한 평가").
결과는 도 7b에서 도시된다. hCCL2 및 CKLO03(IgG1 야생형 Fc를 가짐) 또는 CKLO03-SG1099(강화된 pI Fc를 갖는 CKLO03)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 SCID 마우스에 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다. Fc 치환 Q311R/P343R(EU 카바트 넘버링)을 함유하는 CKLO03-SG1099는 IgG1을 갖는 CKLO03과 비교하여 인간 CCL2의 더 빠른 제거/감소를 나타내었다. 이는 pI 상승 돌연변이를 갖는 pH 의존적 이중 파라토프 항체가 CCL2의 제거를 가속화할 수 있음을 보여준다.
FcγRIIb 강화 Fc 변이체 및 추가 Fc 변형을 갖는 이중 파라토프 항-CCL2 항체의 생성
이러한 예에서, CCL2 제거를 향상시키기 위한 Fc 조작이 설명되어 있다.
WO 2013/125667에서는 FcγRIIb에 대해 증가된 친화도를 나타내는 Fc 도메인을 포함한 항원 결합 분자(예컨대, 항체)의 투여에 의해 가용성 항원의 제거율이 향상될 수 있다는 것이 입증되었다. 또한, 인간 FcγRIIb에 대한 향상된 결합을 나타낼 수 있는 Fc 변이체가 WO 2012/115241 및 WO 2014/030728에 설명되어 있다. 또한, 이들 Fc 변이체는 인간 FcγRIIb에 대한 결합이 선택적으로 향상되고 다른 활성 Fc 감마 수용체(Fc 감마 Rs)에 대한 결합이 감소될 수 있다는 것이 설명되어 있다. FcγRIIb 결합의 이러한 선택적 향상은 가용성 항원의 제거에 유리할 뿐만 아니라 바람직하지 않은 작동체 기능 및 면역 반응의 위험을 감소시키는 데에도 유리할 수 있다.
항체 약물의 개발을 위해서는, 약물이 약리학적으로 활성인 비인간 동물에서 유효성, 약동학 및 안전성을 평가해야 한다. 사람에게만 활성인 경우, 대리항체를 사용하는 등의 대안적 접근법을 고려해야 한다(Int. J. Tox. 28: 230-253 (2009)). 하지만, 인간이 아닌 동물에서 Fc 감마 R의 발현 양상 및/또는 기능이 항상 인간에서와 같지 않기 때문에 대리항체를 이용하여 인간에서 Fc영역과 Fc 감마 R 사이의 상호작용 효과를 정확하게 예측하는 것은 쉽지 않을 것이다. 항체 약물의 Fc 영역은 인간 이외의 동물, 특히 인간에 대한 Fc 감마 R의 발현 패턴 및 기능이 유사한 시노몰구스 원숭이에 대해 교차 반응성을 갖는 것이 바람직할 것이고, 따라서 비인간 동물에게서 수득한 결론은 인간에 대한 결론으로 추정할 수 있다.
이중특이적 항-CCL2 항체의 하기의 IgG1 불변 도메인/Fc 변이체는 Fc 부분의 위치에서 돌연변이로 생성되었다(EU 카바트 넘버링).
SG1095 - 돌연변이를 포함한 IgG1로부터 유래됨(카바트 EU 넘버링):
-L235W/G236N/H268D/Q295L/A330K/K326T(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합);
-Q311R/P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 등전점(pI) 증가에 적합);
-N434A(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및
-Q438R/S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합)
SG1099 - 돌연변이를 포함한 IgG1로부터 유래됨(카바트 EU 넘버링):
Q311R/P343R (항원의 흡수를 증진하기 위한 등전점(pI) 증가에 적합)
SG1100 - 돌연변이를 포함한 IgG1로부터 유래됨(카바트 EU 넘버링):
Q311R/P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 등전점(pI) 증가에 적합);
-N434A(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및
-Q438R/S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합)
GG01 - 돌연변이를 포함한 IgG1로부터 유래됨(카바트 EU 넘버링):
-L234Y/P238D/T250V/V264I/T307P/A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합);
-Q311R/P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 등전점(pI) 증가에 적합);
-N434A(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및
-Q438R/S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합)
GG02 - 돌연변이를 포함한 IgG1로부터 유래됨(카바트 EU 넘버링):
-L234Y/P238D/T250V/V264I/T307P/A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합);
-Q311R/P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 등전점(pI) 증가에 적합);
-M428L/N434A/Y436T(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및
-Q438R/S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합)
GG03 - 돌연변이를 포함한 IgG1(SG1-IgG1 동종이인자형)로부터 유래됨(카바트 EU 넘버링):
-L234Y/P238D/T250V/V264I/T307P/A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합);
-Q311R/P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 등전점(pI) 증가에 적합);
-N434A(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및
-Q438R/S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합)
GG04 - 돌연변이를 포함한 IgG1(SG1-IgG1 동종이인자형)로부터 유래됨(카바트 EU 넘버링):
-L234Y/P238D/T250V/V264I/T307P/A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합);
-Q311R/P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 등전점(pI) 증가에 적합);
-M428L/N434A/Y436T(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및
-Q438R/S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합)
변형된 가변 도메인 및 CDR을 갖는 이중특이적 항-CCL2 항체의 기능적 특성화(이온 의존적/pH 의존적 결합) 및 Fc 매개 스위핑 포함 여부
CKLO2의 Fc 변이체 SG1095, GG01, GG02, GG03/04의 SPR 결합
비아코어 8K 기기의 SPR 분석에서, pH 7.4 및 5.8에서 4가지 상이한 항체 P1AD8325, P1AF8137, P1AF8139 및 P1AF8140에 대한 단량체 인간 및 시노 CCL2의 결합을 조사하였다.
이러한 설정에서 캡쳐셀렉트(CaptureSelect)™ 휴먼(Human) Fab-카파(써모 피셔 사이언티픽)를 아민 커플링 방법을 사용하여 CM3 센서 칩에 고정하고, 다양한 항체를 리간드로 포획한 후, 2개의 상이한 pH 값에서 0, 10, 100 및 1000 nM 단량체 인간 또는 시노 CCL2를 분석물로 사용하여 측정을 실시하였다.
CKLO2-SG1095, CKLO2-GG01, CKLO2-GG02, CKLO2-GG03/04는 10, 100 및 1000 nM에서 결합하고 pH 7.4에서 동등하게 빠르게 해리되는 단량체 인간 및 시노 CCL2에 대해 거의 동일한 결합 곡선을 나타내는 반면, pH 5.8에서는 안정한 결합은 관찰되지 않았다. 결과는 하기의 표에 도시되었다.
표: CKLO2-SG1095, CKLO2-GG01, CKLO2-GG02, CKLO2-GG03/04의 단량체 인간 및 시노 CCL2에 대한 결합은 단량체 인간 및 시노 CCL2에 대한 거의 동일한 결합 곡선을 나타낸다.
주화성 분석
방법의 설명
THP-1 세포를 8x10E5 세포/ml까지 3일 동안 배양하였다. 5000개 세포/웰의 총 세포 수를 미세역가 플레이트의 상부 챔버에 분주하고 37°C에서 정착시켰다. 재조합 huCCL2는 항-CCL2 항체의 존재 여부에 상관없이 최종 농도 50 ng/ml로 하부 챔버에서 피펫팅하였다(대리 항체를 시험하기 위해 분석을 실시할 경우, 100 ng/ml에서 재조합 muCCL2를 대신 사용하였다). 상부 및 하부 챔버는 기포의 형성을 피하기 위해 함께 취합한 다음, 플레이트를 37°C에서 24시간 동안 항온처리하였다. 이동된 세포는 제조업체의 권고에 따라 세포-타이터-글로 방법으로 정량화하였고, 발광성은 테칸 인피티트(Tecan Infinite) 200 판독기로 측정하였다.
결과는 도 8에 도시되었다. 주화성 분석: 동일한 CDR 및 가변 영역 VH/VL, 즉 CKLO2-IgG1 야생형 및 CKLO2-SG1095를 갖지만, Fc 모이어티가 상이한 이중특이적 항-CCL2 항체는 동일한 효능으로 THP-1 세포의 이동을 억제할 수 있다(IC50 = 0.2 μg/ml; 도 8, 왼쪽 패널).
유사하게도, pH 비의존적인 CKLO2의 모 VH/VL 비변형 이중특이적 항체 CNTO888/11k2인 CCL2-0048이 또한 0.2 μg/ml의 IC50을 나타낸다. 이는 pH 의존성이 상기 분석에서는 발생하지 않는 항원 스위핑 현상에 중요하기 때문이다.
상응하는 단일 파라토프 항체 CNTO888 IgG1 및 인간화 11k2 IgG1은 각각 0.3 및 0.7 μg/ml의 IC50 값을 나타내는 반면, huIgG1 동형 대조군은 억제를 나타내지 않는다(도 8, 오른쪽 패널).
추가적인 유사한 실험에서, CKLO2-GG01(0.2 μg/ml), CKLO2-GG02(0.2 μg/ml) 및 GG03/GG04(0.3 μg/ml)의 IC50 값을 결정하였다.
유전자 변형 마우스 모델에서의 생체내 생물학적 활성
물질 및 방법
B16-huCCL2/CCL2 무효 모델
본 모델은, 그렇지 않으면 면역 적격 종양 보유 마우스에서, 마우스 CCL2의 간섭 없이 항인간 CCL2 항체를 시험할 목적으로 생성하였다. 이를 위해, 마우스 종양 세포주 B16-F10은 mCCL2를 분비하지 않고 CCL2 녹아웃 마우스의 유전적 배경인 C57/Bl6 균주의 마우스에서 생체 내에서 성장하는 것으로 공지되어 있기 때문에 선택하였다.
huCCL2를 발현하는 B16F10 종양 세포의 안정한 풀을 생성하기 위해, huCCL2를 부호화하는 플라스미드 DNA 및 하이그로마이신-B 선택 카세트로 형질감염시켰다. 따라서, 세포를 성장 배지(DMEM + 10% FCS + 2 mM L-글루타민) 중 2.0E+05 세포/웰로 6웰 플레이트에 분주하였다. 24시간 후, 옵티(Opti)-MEM 배지에서 웰당 1 μg DNA 및 리포텍타민(Lipofectamine) 2000으로 구성된 형질감염 혼합물을 세포에 첨가하였다. 이어서, 세포를 하이그로마이신-B(0.5 mg/ml)를 함유하는 배지로 선별하였다. 20일 간의 배양 후, 살아있는 단일 세포를 BD FACS 아리아(Aria) III를 사용하여 FSC/SSC 산란을 기반으로 분류하였다. 12일 후, 단일 세포 클론의 세포 배양 상청액을 야생형 B16F10 세포(데이터 미도시)와 비교하여 이바이오사이언스(ebioscience)의 ELISA 레디-셋-고(Ready-SET-Go)(Cat# 88-7399-86)를 사용하여 인간 CCL2의 발현에 대해 선별검사하였다.
선택된 B16-F10_HOMSA_CCL2 종양 세포 클론 1A5, 2A3 및 2B2는 10% FCS 및 2 mM L-글루타민(PAN 바이오테크(Biotech) GmbH, 독일 소재)을 함유한 DMEM에서 37°C, 5% CO2의 수분 포화 분위기에서 일상적으로 배양하였다. 계대 배양은 트립신/EDTA 1x(PAN 바이오테크 GmbH, 독일 소재)를 사용하여 주 2회 분할하여 실시하였다.
도착 시 7~10주령의 암컷 B6.129S4-Ccl2tm1Rol/J 마우스(잭슨 연구소)에 B16-F10_HOMSA_CCL2 종양 세포 클론을 접종하였고: 당일에(연구 0일), 종양 세포를 배양 플라스크로부터 회수한 후, 배양 배지로 옮기고, 1회 세척하고 PBS에 재현탁시켰다. 세포 수는 세포 계수기 및 분석기 시스템(Vi-CELL, 벡크만 쿨터(Beckman Coulter))을 사용하여 결정하였다. SC를 위해, 주사 세포 역가를 1 x 10E7 세포/ml로 조정하고 100 μl를 냉각된
1.0 ml 투베르쿨린 주사기(디스포메드(Dispomed), 독일 소재) 및 작은 바늘(0.45x12 mm)을 사용하여 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다. 세포 접종은 작은 동물용 흡입 장치에서 이소플루란(CP 파마(Pharma), 독일 소재)에 의한 전신 마취하에 실시하였다.
B16-F10_HOMSA_CCL2 종양 세포 클론 1A5 및 2A3에 대해 종양이 약 1000 mm3에 도달한 연구 15일째에 종양 성장을 매일 모니터링하고 마우스를 희생시켰다(이 시점에서 2B2 종양은 느려진 성장 속도로 인해 약 600 mm3였다). 종점에서, CCL2 측정을 위해 혈액 샘플을 채취하고, 상술한 바와 같이 종양을 외식하고 유세포 분석에 의해 분석하였다.
마우스 면역 세포가 모든 종양에 침투하는 것으로 밝혀져, 인간 CCL2가 마우스 CCR2+ 세포를 유인할 수 있다는 개념을 확인하였다. B16-F10_HOMSA_CCL2 종양 세포 클론 1A5는 가장 높은 상대 mMDSC(단핵구 골수 유래 억제 세포) 조성물로 가장 높은 CD45+ 총 침윤물을 나타내었다(도 2). 2A3 세포가 1A5 세포와 같이 유사한 수준의 혈청 총 CCL2를 유도한 반면, 2B2 클론은 유의하게 더 낮은 CCL2 혈청 농도를 나타내었음에도 불구하고, 클론 2A3 및 2B2는 종양 내 면역 세포의 더 낮은 빈도를 가졌다(데이터 미도시).
암컷 B6.129S4-Ccl2tm1Rol/J 마우스에 상술한 바와 같이 B16-F10_HOMSA_CCL2 종양 세포 클론 1A5를 접종하였다.
연구 군의 치료는 세포 접종 5일 후에 시작하였다. 군 1은 인간 IgG 전달체 대조군 치료를 받은 반면, 군 2 및 군 3은 Mab CKLO2-IgG1(Fc 야생형 IgG1) 및 CKLO2-SG1099(돌연변이 Q311R/P343R(카바트 EU 넘버링)이 있는 IgG1 기반 CKLO2 pI 강화 Fc)를 각각 3,7 mg/kg으로 9일 동안 매일 사용하여 복강 내 치료를 받았다. 연구 14일째에, 마우스를 희생시키고 종양을 외식하였다. 효소 분해 및 세포 여과기를 사용하여 각 종양 덩어리로부터 단일 세포 현탁액을 생성하여 유세포 분석에 의해 취합되지 않은 분석을 실시하였다. 관심 면역 세포군의 검출을 위해, 하기의 마커 및 형광색소를 사용하였다: CD45-BUV395, CD11b-BUV737, F4/80-BV421, CD11c-BV605, Ly6C-AF488, Ly6G-PerCP-Cy5.5, CD206-BV711, CD4-BV510, CD8a-APC-H7, NK1.1-PE-Cy7, CD279-APC 및 CD274-PE. BD LSR-포르테사(Fortessa) 유세포 분석기로 샘플을 수집하고 BD 디바(Diva) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
혈청 샘플을 연구 6일, 8일 11일 및 14일에 회수하여 총 및 유리 huCCL2를 측정하였다.
유리 CCL2를 검출하는 방법은 하기의 "시노몰구스 원숭이에서 CCL2 스위핑 효율에 대한 개념 입증 연구"에 자세히 기재되어 있다. 상기 연구에서 유리 인간 CCL2의 분석을 위해, 재조합 시노몰구스 CCL2를 재조합 인간 CCL2로 대체하여 교정기 및 QC를 준비하였다.
총 CCL2 혈청 샘플은 검증되지는 않았지만 적격한 특정 샌드위치 ELISA로 분석하였다. 간단히 말해서, 비오틴화된 항-CCL2 포획 항체(CNTO888 CCL2-0004), 차단 완충액, 전처리된 시험 샘플 및 검출 시약(디곡시게닐화된 항-CCL2 항체(M-1H11-IgG))을 384웰 스트렙타비딘 코팅된 미세역가 플레이트에 단계적으로 첨가하고 각 단계에서 1시간 동안 비강력 진탕기에서 배양하였다. 전처리 단계 샘플에서 CCL2-약물 복합체를 분리하기 위해, 교정기 또는 QC를 37°C에서 pH 5.5로 10분 동안 산성화하였다. 산성화된 샘플을 SA-MTP에 첨가하였다. 고정된 면역 복합체의 검출을 위해, 다중클론 항 디곡시제닌-POD 접합체를 첨가하고 플레이트를 60분 동안 항온처리하였다. 플레이트는 결합되지 않은 물질을 제거하기 위해 각 단계 후에 3회 세척하였다.
ABTS를 플레이트에 첨가하고 실온에서 진탕하면서 항온처리하였다. 405/490 nm 파장에서 흡수를 측정하였다. 분석 소프트웨어 엑스엘피트(XLFit, IDBS)를 사용하여 검량선에 대한 반응을 기초로 인간 CCL2 농도를 계산하였다.
통계적으로 분석되는 데이터 세트에 따라, 다중 비교를 위한 터키(Tukey) 검정 또는 t 검정을 사용한 일원 분산 분석을 적용하였다.
결과
연구 종료 시, CKLO2-SG1099(CKLO2 pI 강화 Fc)를 투여받은 마우스에서 종양 부피 및 종양 중량이 유의하게 감소하였다(도 9). 종양 침윤물을 자세히 살펴보면, CCL2 차단 시 예상한 바와 같이 단핵구 골수 유래 억제 세포(M-MDSC)의 종양 침윤물이 감소한 것으로 나타났다(도 9).
또한, 혈청 분석은 요법의 효능을 확인하였다: pI 최적화는 실제로 IgG1 야생형 Fc CKLO2 분자와 비교하여 총 CCL2의 축적을 감소시키는 반면, 유리 CCL2(항체에 결합되지 않음)는 검출 한계 하에서 완전히 억제된다(도 10). 따라서, 본 모델은 항 huCCL2 이중 파라토프 스위핑 항체 CKLO2-SG1099(CKLO2 pI 강화 Fc)를 사용하여 종양 상황에서 CCL2 차단의 효과를 조사하는 데 적합하다. 후속 연구에서, CKLO2-SG1099(CKLO2 pI 강화 Fc)는 주당 1 또는 2회 더 낮은 용량으로 제공되며 유리 CCL2 억제의 연장은 몇 주에 걸쳐 모니터링한다. 또한, T 세포 활성화 요법(즉, T 세포 이중특이성, PD-L1 차단)과의 조합도 상기 모델에서 탐구한다.
추가적인 유사한 실험에서, CKLO2-SG1095, CKLO2-GG01, GG02 및 GG03/GG04와 같은 다른 변이체를 분석한다.
시노몰구스 원숭이에서 CCL2 스위핑 효율에 대한 개념 입증(POC) 연구
방법.
본 연구의 주요 목적은 시노몰구스 원숭이에서 CCL2 억제의 범위 및 4개의 항-CCL2(MCP-1) 항체의 스위핑 효율을 평가하는 것이었다. 2차 목적은 상기 항체들의 약동학적(PK) 특성을 평가하는 것이었다. 모든 항체는 3~4세 수컷 동물에게 25 mg/kg의 단일 IV 주입으로서 30분 동안 투여하였고 총 CCL2 및 항체 농도는 70일에 걸쳐 혈청에서 측정하였다. 연구된 항-CCL2 항체는 대조군 항체(군 1 및 군 2) 뿐만 아니라 CCL2-약물 복합체의 향상된 제거율을 제공하도록 특별히 조작된 항체(이하 항원 스윕 또는 단순히 스윕이라고 함)로 구성되었다. 군 1: 최대 총 CCL2 축적의 대조군으로서 CNTO888-SG1(= IgG1 야생형) 항-CCL2 항체(n=3 동물); 군 2: pH 의존성 표적 결합은 있지만 Fc 변형은 없는 이중 파라토프 항-CCL2 항체 CKLO2-SG1(IgG1 야생형)(n=3); 군 3: pH 의존적 표적 결합 및 Fc-pI 및 추가 변형을 갖는 이중 파라토프 항-CCL2 항체 CKLO2-SG1100(n=4), 및 군 4: pH 의존적 표적 결합을 갖는 2중 파라토프 항-CCL2 항체 CKLO2-SG1095, Fc-pI 및 FcγRII 및 추가 변형(n=4).
상기 연구에서, 항체의 총 혈청 농도, 총(유리 및 항체 결합 CCL2) 및 유리 표적을 정량화하였다. 또한, 항약물 항체(ADA)의 존재를 평가하였다. 항체, 총 및 유리 CCL2 곡선은 항체 곡선은 피닉스 64(파사이트/체르타라)를 사용하여 비구획 분석에 의해 분석하였다; 데이터는 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) v. 6.07(그래프패드 소프트웨어)을 사용하여 설명되었다.
항체의 경우, 일반 인간 샌드위치 ELISA 방법을 사용하여 혈청 샘플을 분석하였다. 원숭이 혈청에서 총 항체의 농도는 ELISA에 의해 측정하였다. 2 μg/mL의 항인간 카파 사슬 항체를 맥시소프(maxisorp) 96웰 플레이트에 밤새 고정시킨 후, 차단 완충액에서 30oC에서 2시간 동안 배양하였다. 항체 검량선 샘플, 품질 관리 샘플 및 원숭이 혈청 샘플을 세척하기 전에 30oC에서 1시간 동안 플레이트에서 배양하였다. 다음으로, 항인간 IgG-HRP를 첨가하고 30oC에서 1시간 동안 배양한 후 세척하였다. ABTS 기질은 405 nm에서 마이크로플레이트 판독기로 검출하기 전에 10, 20 및 30분 동안 배양하였다. 분석 소프트웨어 소프트맥스 PRO(몰레큘라 디바이스)를 사용하여 검량선에 대한 반응을 기초로 항체 농도를 계산하였다.
총 CCL2 혈청 샘플은 검증되지는 않았지만 적격한 특정 샌드위치 ECL 방법 분석으로 분석하였다. 3 ug/mL의 항-CCL2 항체(r2F2-SG1)를 멀티-어레이 96웰 플레이트(메소 스케일 디스커버리)에 밤새 고정화시킨 후, 차단 완충액에서 30oC에서 2시간 동안 배양하였다. 시노몰구스 원숭이 CCL2 검량선 샘플, 품질 관리 샘플 및 희석된 시노몰구스 원숭이 혈청 샘플을 37oC에서 10분 동안 pH 5.5 산 완충액과 함께 배양하였다. 이 후, 샘플을 항-CCL2 고정 플레이트 상에서 30℃에서 1시간 동안 배양한 후 세척하였다. 다음으로, SULFO TAG 표지된 MCP-1 항체를 첨가하고 30oC에서 1시간 동안 배양한 후, 세척하였다. 판독 버퍼 T(x4)(메소 스케일 디스커버리)를 즉시 플레이트에 추가하고 SECTOR 이미저(Imager) 2400(메소 스케일 디스커버리)으로 신호를 검출하였다. 분석 소프트웨어 소프트맥스 PRO(몰레큘라 디바이스)를 사용하여 검량선에 대한 반응을 기초로 시노몰구스 원숭이 CCL2 농도를 계산하였다.
유리 CCL2 혈청 샘플은 자이로랩 익스플로어(Gyrolab Xplore)에서 실행된 검증되지는 않았지만 적격한 자이로랩TM 면역분석으로 분석하였다. 비오틴화된 항-CCL2 항체(M-2F6-IgG)를 포획 시약으로서 사용하고, 검출을 위해 알렉사(Alexa)647 표지된 항-CCL2 항체(M-1H11-IgG)를 선택하였다. 두 시약 모두 PBS, 0.1%트윈(Tween), 1%BSA에서 1 μg/mL로 희석하고 96웰 PCR 플레이트(피셔 사이언티픽(Fisher Scientific))로 옮겼다. 시노몰구스 원숭이 CCL2 검량선 샘플, QC 및 희석되지 않은 혈청 샘플을 또한 96웰 PCR 플레이트로 옮겼다. 두 플레이트 모두 자이로랩 바이오애피(Bioaffy) 200 nl 디스크(기로스 프로테인 테크놀로지스(Gyros Protein Technologies) AB)와 함께 기기에 로링하였다. 3단계 분석 프로토콜(200-3W-001)을 선택하였다. 간단히 말해서, 프로토콜은 캡처 시약, 샘플 및 검출 시약을 자이로랩 바이오애피 200 디스크의 지정된 스트렙타비딘 컬럼에 순차적으로 첨가하는 것을 간략하게 설명한다. 각 시약은 디스크에 짧은 회전 단계가 적용됨과 동시에 컬럼에 도달한다. 각 단계 후에, 컬럼을 PBS 0.05% 트윈으로 세척하고, 마지막으로 레이저 유도 형광 값을 기기 내에서 기록하였다. 유리 시노몰구스 원숭이 CCL2 농도는 XL Fit 소프트웨어(IDBS)를 사용한 검량선에 대한 반응을 기초로 계산하였다.
ADA는 이외 다른 곳에서 설명된 방법을 사용하여 분석하였다(Stubenrauch et al., 2010). 요약하면, 비오틴화된 mAb 항인간 Fcγ-pan R10Z8E9는 0.5 μg/mL 농도에서 스트렙타비딘 코팅된 고결합 플레이트에 결합되었고 1시간 동안 배양하였다. 샘플 및 표준을 분석 완충액으로 5% 시노몰구스 원숭이 혈청으로 희석하고, 세척 후 코팅된 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 1시간 동안 진탕하면서 배양하였다. 세척 후, 디곡시게닐화된 항 시노몰구스(시노) IgG를 0.1 μg/mL으로 첨가하고, 진탕하면서 1시간 동안 배양하였다. 세척 후, 다중클론 항 디곡시게닌-HRP 접합체를 25 mU/mL으로 첨가하고, 진탕하면서 1시간 동안 배양하였다. ABTS를 플레이트에 첨가하고, 진탕하면서 실온에서 10분 동안 배양하였다. 405/490 nm 파장에서 마이크로플레이트 판독기로 흡수를 측정하였다. 분석 소프트웨어 소프트맥스 PRO(몰레큘라 디바이스)를 사용하여 검량선에 대한 반응을 기초로 ADA 농도를 계산하였다.
결과. PK 거동은 동물에게 ADA가 없는 시간 동안(즉, 14일 이전) 평가하였다. 상기 기간 동안 모든 항-CCL2 항체의 혈청 농도-시간 곡선은 유사했으며(도 11의 왼쪽 패널을 참조), 부분 평균 AUC 값(AUC0-7d)은 군 1, 군 2, 군 3 및 군 4에 대하여 상이한 군들 사이에 각각 1490, 1810, 1210 및 1320 일.μg/mL로 비슷하였다. 유사하게, 평균 Cmax 값은 군 1, 군 2, 군 4 및 군 4에 대하여 각각 620, 764, 616 및 664 μg/mL의 값과 비슷하였다. ADA 발달의 정도는 동물 및 군들 사이에 매우 가변적이었고, 7일 이후에 고도로 가변적인 PK 곡선을 초래하였다(데이터는 미도시). 군 2의 한 동물은 70일의 전체 관찰 기간 동안 ADA 음성이었다(도 11의 오른쪽 패널을 참조). 상기 동물에서 항-CCL2 항체의 제거율, 분포 용적 및 최종 반감기는 각각 7.34 mL/(일.kg), 76.2 mL/kg 및 10.9일에서 비구획 분석에 의해 추정하였다.
혈청 내 CCL2의 기준선 수준은 항체 치료가 시작되기 전에 각 동물에 대해 평가하였다. 기초 CCL2 수준의 범위는 0.126 내지 0.357 ng/mL(기하학적 평균(%CV): 0.199 ng/mL(32.2%, N=14))이었다. CCL2의 유리 형태는 항체 결합 형태의 CCL2보다 제거율이 더 높기 때문에, 항체 치료 후 총 CCL2 혈청 농도의 증가가 예상되었다. 이는 모든 군에서 실제로 관찰되었으며(도 12의 왼쪽 패널), 모든 항체에 의한 표적의 결합을 보여준다. 치료 중, 총 CCL2의 Cmax 값은 군 1, 군 2, 군 3 및 군 4에 대하여 각각 824, 575, 106, 32.7 ng/mL로 증가하였다. AUC0-7d 값은 군 1, 군 2, 군 3 및 군 4에 대하여 각각 3060, 2970, 522 및 181 일.ng/mL였다. 상기 동물이 ADA 음성인 시간 동안, 몰 약물 농도는 총 CCL2 농도를 초과하여 유지되었다. 2개의 스위핑 항-CCL2 항체(군 3 및 군 4)는 총 CCL2 혈청 농도가 기존 항체(군 1)에 비해 혈청 Cmax 값에 기초하여 각각 약 8배 및 25배, 그리고 총 CCL2의 AUC0-7d 값에 기초하여 약 6배 내지 17배 만큼의 상당한 감소를 나타내었다. 군 2의 ADA 음성 동물은 총 CCL2 농도의 지속적인 표적 결합(안정기로 인해 명백해보임)을 나타내었다(도 12의 오른쪽 패널).
모든 항체를 사용한 치료는 혈청 내 유리 CCL2 수준의 실질적인 감소를 가져왔지만(도 13의 왼쪽 패널), 상기 감소는 초기에 부분적으로만 나타났다. 군 1에서, 모든 개체는 하루 후에 다시 정량화 가능한 수준의 유리 CCL2를 가졌다. 군 2에서, 모든 개체는 이틀 후에 다시 정량화 가능한 수준의 유리 CCL2를 가졌다. 군 3 및 군 4에서, 각 군의 두 개체는 유리 CCL2의 억제를 7일 동안 보였다. 군 3에서, 충분한 항체 농도를 유지하면서 중간 정도의 ADA 반응을 보인 2마리의 동물은 21일 동안 검출 한계 미만의 유리 CCL2 억제를 보였다. ADA 양성 동물에서, 항체 제거가 유의하게 증가하였으며, 표적 결합 손실의 결과로 CCL2 수준이 원래 기준선(본원에서는 미도시)으로 빠르게 복귀하였다.
추가적인 유사한 실험에서, CKLO2-SG1099, CKLO2-GG01, GG02 및 GG03/GG04와 같은 다른 변이체를 분석한다.
시노몰구스 원숭이에서 CCL2 스위핑 효율에 대한 PK/PD 연구
연구 개요 및 목표. PK/PD 연구는 항-CCL2 항체 CKL02-SG1095를 사용한 POC 연구의 결과를 기반으로 설계하였다. POC 연구에서 높은 정도의 항약물 항체(ADA) 형성이 입증되었기 때문에, ADA 반응을 줄이기 위한 의도로서 가싸이바(Gazyva)®(오비누투주맙) 치료가 PK/PD 연구에 포함되었다. 이러한 목적으로, 30 mg/kg 용량의 가싸이바를 연구 전반에 걸친 14일, 7일, 8일 및 36일에 4회 정맥 주입을 통해 투여하였다. CKL02-SG1095는 용량 군당 4마리의 동물(수컷 및 암컷 2/2)에게 2.5, 10 및 25 mg/kg의 용량 수준으로 1일(군 1~3)에 30분에 걸쳐 IV 주입하여 투여하였다. 비교를 위해, 기존의 항-CCL2 항체(CNTO888-IgG1)를 25 mg/kg으로 1일에 30분에 걸쳐 IV 주입하여 투여하였다(군 4; 상술한 POC 연구의 군 1과 동일한 대조군). 총 PK(CKL02-SG1095), 총 및 유리 CCL2 농도를 99일(즉, 투여 후 14주)까지 평가하였다.
PK/PD 연구의 목적은 비인간 영장류에서 기존의 항-CCL2 항체(야생형 IgG1 Fc 부분이 있는 CNTO888)와 비교하여 CKL02-SG1095의 유리 CCL2 억제의 연장된 기간을 입증하는 것이었다.
방법. 상기 연구에서 총 PK 뿐만 아니라 총 및 유리 CCL2를 정량화하였다. 하지만, 혈청 샘플에 가싸이바가 존재하기 때문에 본원에 기재된 POC 연구와 비교하여 총 PK 분석, 총 CCL2 분석 및 ADA 분석에 일부 수정이 이루어졌다. CNTO888 IgG1의 경우, PK 분석이 개발되지 않았다.
원숭이 혈청에서 총 항체 CKL02-SG1095의 농도는 ELISA에 의해 측정하였다. ELISA 비오틴화된 재조합 인간 CCL2(항원)의 경우, 전처리된 시험 샘플, 양성 대조군 표준(교정기) 또는 QC(품질 대조군) 및 디곡시게닐화된 항인간 IgG(M-1.19.31-IgG)를 384웰 스트렙타비딘 코팅된 미세역가 플레이트(SA-MTP)에 연속적으로 첨가하였다. CCL2-약물 복합체를 분리하기 위해, 시험 샘플의 전처리를 pH 5.5에서 20분 동안 실시하였다. SA-MTP에 첨가하기 전에, 산성화된 샘플을 중화시켰다. 고정된 면역 복합체는 다중클론 항 디곡시게닌-POD 접합체로 검출하였다. 플레이트는 결합되지 않은 물질을 제거하기 위해 각 단계 후에 3회 세척하였다. ABTS를 기질로서 플레이트에 첨가하고 실온에서 배양하였다. 405/490 nm 파장에서 흡수를 측정하였다. 분석 소프트웨어 XLFit(IDBS)를 사용하여 검량선에 대한 반응을 기초로 항체 농도를 계산하였다.
총 CCL2 혈청 샘플은 검증되지는 않았지만 적격한 특정 샌드위치 ELISA로 분석하였다. 간단히 말해서, 비오티닐화된 항-CCL2 포획 항체*, 전처리된 시험 샘플 및 검출 시약(디곡시게닐화된 항-CCL2 항체(1H11-IgG1))을 384-웰 스트렙타비딘 코팅된 미세역가 플레이트에 단계적으로 첨가하고, 포획 및 샘플 단계의 경우 1시간 동안, 검출 시약의 경우 각각 50분 동안 각각 비강력 진탕기에서 배양하였다. 전처리 단계 샘플에서 CCL2-약물 복합체를 분리하기 위해, 교정기 또는 QC를 pH 5.5에서 20분 동안 산성화하였다. 산성화된 샘플을 SA-MTP에 첨가하였다. 고정된 면역 복합체의 검출을 위해, 다중클론 항 디곡시제닌-POD 접합체를 첨가하고 플레이트를 50분 동안 항온처리하였다. 플레이트는 결합되지 않은 물질을 제거하기 위해 각 단계 후에 3회 세척하였다.
ABTS를 플레이트에 첨가하고 실온에서 진탕하면서 항온처리하였다. 405/490 nm 파장에서 흡수를 측정하였다. 분석 소프트웨어 XLFit(IDBS)를 사용하여 검량선에 대한 반응을 기초로 시노몰구스 원숭이의 CCL2 농도를 계산하였다. *군 1~군 3의 분석을 위한 포획 항체: 항-CCL2 CNTO8888 IgG1, 군 4의 분석을 위한 포획 항체: 항-CCL2 2F2 IgG1.
ADA는 384-웰 플레이트에서 브리징 샌드위치(bridging sandwich) ELISA로 선별검사하였다. 군 1, 군 2 및 군 3의 동물들에 대한 시험 샘플, 품질 대조군 샘플 및 양성 대조군을 2개의 추가적인 항-CCL2 항체(2F6-IgG1 및 1H11-IgG1)와 함께 비오틴화된 포획 항체 CKL02-SG1095 및 디곡시게닐화된 검출 항체 CKL02-SG1095와 함께 실온에서 MTP 진탕기에서 500 rpm으로 밤새 배양하였다; 이들 항체를 첨가하여 CCL2를 중화시켰다. 군 4의 동물 샘플에 대해, 비오틴 표지된 CNTO888-SG1 및 디곡시게닐화된 CNTO888-SG1을 각각 사용하였다. 형성된 면역 복합체를 스트렙타비딘(SA) 코팅된 MTP로 옮겨 비오틴 표지된(Bi) 포획 항체를 통해 면역 복합체를 고정화시켰다. 상층액을 흡인한 후, 결합되지 않은 물질을 반복 세척하여 제거하였다. 항 디곡시게닌 POD(p) 접합 항체 및 ABTS 기질 용액을 첨가하여 검출을 실시하였다. 반응의 색상 강도를 광도계로 측정하였다(405 nm ~ 490 nm 기준 파장에서의 흡수). 신호가 플레이트 특정 절단점(cut-point)을 초과하는 경우, 샘플은 ADA 양성으로서 정의하였다. 상기 절단점은 분석의 적격성 평가 중에 정의하였다.
결과. 가싸이바®(오비니투주맙) 전처리에도 불구하고, CKL02-SG1095 처리한 동물 12마리 중 10마리 및 CNTO888 처리한 동물 4마리 중 1마리에서 약물 및 바이오마커 농도에 영향을 미치는 ADA가 발견되었다. 하지만, CKL02-SG1095에 대한 2개의 ADA 음성 동물은 25 mg/kg 용량군에서 CNTO888 군의 ADA 음성 동물과 직접 비교할 수 있었다. PK 거동은 동물에게 ADA가 없는 시간 동안(즉, 10일 이전) 평가하였다. CKL02-SG1095에 대한 3개의 상이한 용량 군의 PK 곡선은 도 14의 왼쪽 패널에 도시된다. 부분 평균 AUC 값(AUC0-7d)은 용량 수준 2.5, 10 및 25 mg/kg에 대해 각각 229/191(남성/여성), 696/813 및 1492/1346 일.μg/mL였다. Cmax 값은 용량 수준 2.5, 10 및 25 mg/kg에 대해 각각 115/122(남성/여성), 369/491 및 869/941 μg/mL였다. 최고 용량 수준에서, 상기 결과는 POC 연구와 일치한다. 2마리의 ADA 음성 동물에 대해, CKL02-SG1095의 제거율, 분포 용적 및 최종 반감기는 각각 10.5~17.4 mL/(일.kg), 116~118 mL/kg 및 5.8-11.6일로 비구획 분석에 의해 추정하였다(도 14의 오른쪽 패널을 참조).
상술한 POC 연구에 대해, 총 CCL2의 축적은 항-CCL2 항체 처리 시 관찰하였다(도 15의 왼쪽 패널을 참조). CCL2의 기준선 수준은 약물 투여 전에 5회 평가하였다(가싸이바®(오비니투주맙) 치료 전 1회를 포함); 평균 CCL2 기준선 값은 0.742 ng/mL이었고 가싸이바®(오비니투주맙) 치료는 기초 CCL2 수준에 영향을 미치지 않았다. 총 CCL2 축적의 정도(괄호 안의 값은 개별 기준선에서 중간 배수 변화를 나타냄)는 용량 및 구성물에 따라 가변된다. CKL02-SG1095의 경우, 총 CCL2 수준은 2.5, 10 및 25 mg/kg의 용량 수준에 대해 22.4(22), 67.2(105) 및 54.9(76) ng/mL(4마리 동물의 중앙값)로 증가하였다. CNTO888 IgG1의 경우, 총 CCL2 수준은 1490(3160) ng/mL(4마리 동물의 중앙값)로 증가하였다. 군 3 및 군 4의 ADA 음성 동물의 비교는 CNTO888에 비해 CKL02-SG1095에 대해 상당히 더 낮은 수준의 축적을 보여주었다(도 15의 오른쪽 패널).
모든 연구 군의 치료는 혈청 내 유리 CCL2 수준의 실질적이고 일시적인 감소로 이어진다(도 16의 왼쪽 패널을 참조; 일반적으로 검출 한계(0.01 ng/mL) 미만). 모든 ADA 양성 동물의 경우, 유리 CCL2 수준은 ADA가 발생한 후 기준선 값으로 빠르게 복귀하였다(약물 노출 손실 및 빠른 표적 회전율과 일치). ADA 음성 동물(군 3에서 2/4) 및 (군 4에서 3/4)의 경우, 유리 CCL2의 억제 기간은 연구 기간 전체에 걸쳐 평가할 수 있었다. 기존 항체 CNTO888(군 4)의 경우, CCL2 억제 기간이 짧았는데, 이는 아마도 전체 표적의 광범위한 축적으로 인한 것으로 추정된다(도 15). 약물 농도는 정량화되지 않았지만(CNTO888에 대해 입수 가능한 특정 분석 없음), POC 연구는 CNTO888 및 CKL02-SG1095 사이에 유사한 PK 특성을 시사한다. 반면에 군 3의 2마리의 ADA 음성 동물의 경우, 오래 지속되는 유리 CCL2 억제가 관찰되었다. 한 동물의 경우, 유리 CCL2 수준이 29일 동안 검출 한계 미만으로 유지되었다(도 16의 오른쪽 패널).
추가적인 유사한 실험에서, CKLO2-SG1099, CKLO2-GG01, GG02 및 GG03/GG04와 같은 다른 변이체를 분석한다.
상이한 종양 유형에서 CCL2의 유병률 연구
CD163/CD68 및 CD14를 사용한 대식세포 분석을 포함하여 CCL2 및 이의 수용체 CCR2에 대한 하기의 IHC 유병률 연구는 6가지 상이한 적응증의 121개 인간 일치 종양 및 혈청 샘플에서 실시하였다:
췌장암(PaC)
결장직장암(CRC)
유방암(BC)
전립선암(PrC)
난소암(OvC)
위암(GC)
하기의 질문들이 다루어졌다:
· 이 종양은 CCL2를 (과)발현하는가?
· 이 종양 환자에게서 혈액 CCL2 수치가 상승하는가?
· 혈액 및 종양 CCL2 수준 사이에 상관관계가 있는가?
· 종양 CCL2 및 침윤성 CCR2+ 면역 세포 사이에 상관관계가 있는가?
· 종양 CCL2 및 침윤성 골수 세포 사이에 상관 관계가 있는가?
물질 및 방법
조직병리학적 스코어링을 반정량적으로 실시하였다. 또한, 자동 다중 이미지 분석이 CD163/CD68 IHC에 사용되었으며, 면역 세포 정량화 및 CCL2 정량화를 위해 CD14 및 CCR2에 대해 시험하였다.
면역조직학적 조사는 6가지 상이한 적응증의 121개 인간 종양의 절제 표본 세트에 대해 실시하였다: 인디뷰메드(Indivumed, 함부르크) 및 아스테란드(Asterand)(로이스턴(Royston)/허츠(Herts), 영국)가 제공하는 31 췌장암(PaC), 30 대장암(CRC), 30 유방암(BC), 29 전립선암(PrC), 20 난소암(OvC), 및 10 위암(GC). 종양을 4% 완충 포름알데히드에 고정하고, 파라핀 포매 후, 2.5 μm의 두께로 절단하고, 수퍼프로스트 플러스(Superfrost Plus 슬라이드)에 장착하였다. CCL2에 대한 마우스 단일클론 항체(클론 2D8, 노버스바이오(Novusbio) NBP2-22115)를 표준 염색 프로토콜(32'에 대한 CC1, VBX에서 1 μg/mL 농도, 옵티뷰(Optiview) DAB 검출 시스템)에 따라 벤타나(Ventana) BXT에 사용하였다. CCR2에 대한 토끼 단일클론 항체(E68, 애브캠(Abcam) ab32144)를 표준 염색 프로토콜(32'에 대한 CC1, DS2에서 농도 0.8 ug/ml, 옴니-울트라맵(Omni-UltraMap) HRP DAB 검출 시스템)에 따라 벤타나 디스커버리(Ventana Discovery) XT에 사용하였다. 단핵구 마커 CD14(셀 마크(Cell Marque) EPR3653, RTU)에 대한 마우스 단일클론 항체를 표준 염색 프로토콜(64’에 대한 CC1, 옴니-울트라맵 HRP DAB 검출 시스템 검출 시스템)에 따라 벤타나 디스커버리 울트라에 사용하였다. 대식세포 및 M2 유사 TAM(종양 관련 대식세포) CD163/CD68(DAB CD163 마우스 MRQ-26 셀 마크(Cell Marque) RTU//붉은 CD68 마우스 PG-M1 다코(Dako))에 대한 이중 염색은 표준 염색 프로토콜에 따라 벤타나 BXT에 사용하였다(32'에 대한 CC1, DS2에서 CD163 RTU//CD68 농도 0.6 μg/ml, DAB 및 적색 검출 시스템을 사용한 검출). 모든 이미지는 벤타나 아이스캔(iScan) HT®를 사용하여 스캔하였다. 조직 절편을 반정량적으로 분석하였다.
1. 결과
CCL2 및 CCR2 유병률
모든 분석된 종양 적응증은 가변 수준에서 CCL2이 상향 조절되고 가변량에서 TAM에 대한 CCR2이 존재하는 일부 종양을 보여주었다(하기의 표 6). CCL2 및 CCR2 모두, 난소암에서 가장 높은 발현이 관찰되었고, PDAC 및 GC가 그 뒤를 이었다.
종양 유형별 특성
높은 MDSC 유인 및 M2 분극의 종양 성장을 강화하는 면역학적 상태와 관련하여 CCL2-CCR2의 높은 활성을 갖는 종양은 CCL2 차단 요법을 위한 종양의 선호를 나타낸다. CCR2 IHC는 이의 생물학적 역할을 확인하는 MDSC 및 M2 유사 대식세포와 양호한 상관관계를 보였고, CCL2 IHC 측정보다 상기 경로에 대한 바이오마커로서 더 높은 관련성을 입증하였다. 현재 연구에서 결론적으로, CCL2 요법에 대한 권장 사항을 하기와 같이 요약할 수 있다:
· OvC는 가장 높은 CCL2과 CCR2의 유병률 및 M2 분극 때문에, CCL2 표적 치료에 권장할 수 있다.
· PDAC는 다른 분석된 종양 유형에 비해 MDSC의 양이 가장 많고 CCR2 및 M2가 상당히 높은 수준 및 양으로 존재하기 때문에 CCL2 표적 치료에 권장할 수 있다. CCL2는 PDAC에서도 높았고 다른 종양 유형과 대조적으로 종양 세포에서보다 면역 세포에서 훨씬 더 높은 존재를 나타내었다. PaC는 CCL2/CCR2 및 MDSC 유인/M2 분극 사이에 매우 양호한 상관관계를 보여주었다. 이러한 결과는 분석된 PDAC에서 CCL2-CCR2의 역할이 면역 세포 유인에 고도로 집중되어 있음을 뒷받침한다.
· BC, 특히 TNBC는 CCL2 표적 치료에 권장할 수 있다. BC는 상당히 높은 수준 및 양으로 CCL2, CCR2, MDSC 및 M2를 보여주었다. 특히, TNBC 사례는 비 TNBC가 다른 종양 적응증에 비해 종양 세포에서 가장 높은 CCL2 생성을 나타내긴 했지만 비 TNBC보다 더 많은 양의 M2 및 MDSC를 특징으로 하였다.
하기의 종양 적응증은 CCL2-CCR2-축에 덜 의존적인 것으로 보였으므로, CCL2 표적 치료에 덜 권장할 수 있다.
· CRC: CCL2는 특히 PaC와 비교할 때 다른 종양 유형에 비해 낮았다. 또한, 본원에서 다른 종양 유형에 비해 M2 유사 대식세포는 가장 낮은 양으로 측정되었다. CCR2 및 MDSC는 가변적인 양으로 존재하였다. 흥미롭게도, 상기 적응증에서만 CCL2 및 CCR2 사이에 양의 상관관계를 보이는 경향이 감지되었다. 하지만, 전반적인 결과는 CRC에서 CCL2-CCR2의 역할이 면역 세포 유인이 아닌 종양 세포 생존에 초점을 맞추고 있음을 뒷받침한다.
· CCL2는 높지만, GC는 CCR2가 낮고 MDSC의 양이 가장 적은 것으로 관찰되었다. M2 유사 대식세포는 가변적인 양으로 존재하였다.
표 6: 본 연구에서 분석된 상이한 종양 유형의 종양 세포(TC) 및 면역 세포(IC)에서의 CCL2 및 CCR2 양성 발현.
· PrC에서, CCR2는 가변적으로 수준으로 존재하였다. (M2 및 MDSC는 측정되지 않음)
상관관계 분석
연구 결과는 하기와 같이 요약할 수 있다:
· 종양 CCL2 및 CCR2(IHC) 사이에, 유일한 양의 상관관계는 CRC에 존재하였다.
· 혈청 CCL2(ELISA)는 CCL2, CCR2, 대식세포 및 MDSC를 포함하여 종양에서 측정된 매개변수들 중 임의의 것과 상관관계가 없었다. 종양 CCL2에 대해 양의 상관관계를 보이는 경향은 PrC에서만 발견되었으며, 두 방법 모두 매우 낮은 값을 나타낸다.
· CCR2 발현은 M2 유사 대식세포 및 CD14+ 세포의 존재와 양의 상관관계가 있고, M1/M2 비율과 음의 상관관계가 있으며, CCR2의 생물학적 역할을 확인한다. CCR2의 수준은 MDSC 유인보다 M2 분극과 더 양호한 상관관계가 있다.
· CCL2는 MDSC 유인 및 M2 분극과 양의 상관관계를 보이는 경향을 나타내었다. 따라서, CCL2 수준 단독으로는 MDSC 및 M2 유사 분극의 존재에 대한 주요 요인이 아닌 것으로 보인다.
SEQUENCE LISTING
<110> F. Hoffmann-La Roche AG
<120> Bispecific anti-CCL2 antibodies
<130> P35823-WO
<140> PCT/EP2020/086403
<141> 2020-12-16
<150> EP19217665
<151> 2019-12-18
<160> 174
<170> PatentIn version 3.5
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<213> Artificial
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1
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<212> PRT
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<220>
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<400> 7
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Glu Leu Asp Phe Tyr Trp Ile Cys
20 25 30
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ala Cys Ile
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Val Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu Gln Met
65 70 75 80
Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Thr
85 90 95
Gly Thr Glu Phe Thr Tyr Tyr Ser Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> light chain variable domain VL 1A4
<400> 8
Ala Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn
20 25 30
Asn Met Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Thr Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser His Phe Arg
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu
65 70 75 80
Ser Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Tyr Lys Ser Tyr Ser
85 90 95
Asn Asp Glu Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
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Gly
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
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<400> 23
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
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<400> 39
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Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
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115
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> light chain variable domain VL CNTO888
<400> 40
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asp Ala
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Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
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50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
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Ser Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 41
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> heavy chain CDR-H1 Humanized 11K2 (= 11K2)
<400> 41
Asp Thr Tyr Met His
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> heavy chain CDR-H2 Humanized 11K2 (= 11K2)
<400> 42
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Phe Asp Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 43
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> heavy chain CDR-H3 Humanized 11K2 (= 11K2)
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Gly Val Phe Gly Phe Phe Asp Tyr
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<400> 44
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1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<400> 45
Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr
1 5
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> light chain CDR-L3 Humanized 11K2 (= 11K2)
<400> 46
Gln Gln Phe Trp Ser Ala Pro Tyr Thr
1 5
<210> 47
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> heavy chain variable domain VH Humanized 11K2 (= 11K2)
<400> 47
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<210> 48
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> light chain variable domain VL Humanized 11K2 (= 11K2)
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<400> 53
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210> 54
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<213> Artificial
<220>
<223> light chain CDR-L3 ABN912
<400> 54
Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 55
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> heavy chain variable domain VH ABN912
<400> 55
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Ala Asn Ile Glu Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Glu Gly Leu His Gly Asp Gly Tyr Phe Asp Leu Trp
100 105 110
Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 56
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> light chain variable domain VL ABN912
<400> 56
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ile Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Pro Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 57
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> heavy chain CDR-H1 mutated variant CNTO888
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X is I or T
<400> 57
Ser His Tyr Gly Xaa Ser
1 5
<210> 58
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> heavy chain CDR-H2 mutated variant CNTO888
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X is V or I or H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X is P or H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X is H or G
<400> 58
Gly Xaa Ile Xaa Ile Phe Xaa Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 59
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> heavy chain CDR-H3 mutated variant CNTO888
<400> 59
Tyr Asp Ala His Tyr Gly Glu Leu Asp Phe
1 5 10
<210> 60
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> light chain CDR-L1 mutated variant CNTO888
<400> 60
Arg Ala Ser Gln His Val Ser Asp Ala Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 61
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> light chain CDR-L2 mutated variant CNTO888
<400> 61
Asp Ala Ser Asp Arg Ala Glu
1 5
<210> 62
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> light chain CDR-L3 mutated variant CNTO888
<400> 62
His Gln Tyr Ile His Leu His Ser Phe Thr
1 5 10
<210> 63
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> heavy chain FR-H1 mutated variant CNTO888
<400> 63
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe
20 25
<210> 64
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> heavy chain FR-H2 mutated variant CNTO888
<400> 64
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10
<210> 65
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> heavy chain FR-H3 mutated variant CNTO888
<400> 65
Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 66
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> heavy chain FR-H4 mutated variant CNTO888
<400> 66
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 67
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> light chain FR-L1 mutated variant CNTO888
<400> 67
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys
20
<210> 68
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> light chain FR-L2 mutated variant CNTO888
<400> 68
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 69
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> light chain FR-L3 mutated variant CNTO888
<400> 69
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> light chain FR-L4 mutated variant CNTO888
<400> 70
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5
<210> 71
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> heavy chain variable domain VH mutated variant CNTO888 H0695
<400> 71
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser His Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Val Ile Pro Ile Phe His Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Asp Ala His Tyr Gly Glu Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 72
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> heavy chain variable domain VH mutated variant CNTO888 H0625
<400> 72
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser His Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile His Ile Phe His Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Asp Ala His Tyr Gly Glu Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 73
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> heavy chain variable domain VH mutated variant CNTO888 H0634
<400> 73
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser His Tyr
20 25 30
Gly Thr Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile His Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Asp Ala His Tyr Gly Glu Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 74
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> heavy chain variable domain VH mutated variant CNTO888 H0635
<400> 74
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser His Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly His Ile His Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Asp Ala His Tyr Gly Glu Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 75
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> light chain variable domain VL mutated variant CNTO888 L0616
<400> 75
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln His Val Ser Asp Ala
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Ala Ser Asp Arg Ala Glu Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Ile His Leu His
85 90 95
Ser Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 76
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> heavy chain CDR-H1 mutated variant humanized 11K2
<400> 76
His Thr Tyr Met His
1 5
<210> 77
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> heavy chain CDR-H2 mutated variant humanized 11K2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X is D or E
<400> 77
Arg Ile Asp Pro Xaa Asn His Asn Thr Lys Phe Asp Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 78
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> heavy chain CDR-H3 mutated variant humanized 11K2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X is D or E
<400> 78
Gly Val Phe Gly Phe Phe Xaa His
1 5
<210> 79
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> light chain CDR-L1 mutated variant humanized 11K2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X is F or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> X is R or L
<400> 79
Lys Ala Xaa Glu Asp Ile Tyr Asn Arg Xaa Ala
1 5 10
<210> 80
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> light chain CDR-L2 mutated variant humanized 11K2
<400> 80
Gly Ala Thr Ser Leu Glu His
1 5
<210> 81
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> light chain CDR-L3 mutated variant humanized 11K2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X is W or R
<400> 81
Gln Gln Phe Xaa Ser Ala Pro Tyr Thr
1 5
<210> 82
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> heavy chain FR-H1 mutated variant humanized 11K2
<400> 82
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Leu Thr Ile Ser
20 25 30
<210> 83
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> heavy chain FR-H2 mutated variant humanized 11K2
<400> 83
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10
<210> 84
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> heavy chain FR-H3 mutated variant humanized 11K2
<400> 84
Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 85
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> heavy chain FR-H4 mutated variant humanized 11K2
<400> 85
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 86
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> light chain FR-L1 mutated variant 11K2
<400> 86
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 87
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> light chain FR-L2 mutated variant humanized 11K2
<400> 87
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile His
1 5 10 15
<210> 88
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> light chain FR-L3 mutated variant humanized 11K2
<400> 88
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 89
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> light chain FR-L4 mutated variant humanized 11K2
<400> 89
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 90
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> heavy chain variable domain VH mutated variant humanized 11K2
H1503
<400> 90
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Leu Thr Ile Ser His Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asp Asn His Asn Thr Lys Phe Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Val Phe Gly Phe Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 91
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> heavy chain variable domain VH mutated variant humanized 11K2
H1510
<400> 91
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Leu Thr Ile Ser His Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asp Asn His Asn Thr Lys Phe Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Val Phe Gly Phe Phe Glu His Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 92
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> heavy chain variable domain VH mutated variant humanized 11K2
H1514
<400> 92
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Leu Thr Ile Ser His Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn His Asn Thr Lys Phe Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Val Phe Gly Phe Phe Glu His Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 93
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> light chain variable domain VL mutated variant humanized 11K2
L1338
<400> 93
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Phe Glu Asp Ile Tyr Asn Arg
20 25 30
Arg Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Gly Ala Thr Ser Leu Glu His Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Trp Ser Ala Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 94
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> light chain variable domain VL mutated variant humanized 11K2
L1201
<400> 94
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Thr Glu Asp Ile Tyr Asn Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Gly Ala Thr Ser Leu Glu His Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Arg Ser Ala Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 95
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 95
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 96
<211> 105
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 96
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
35 40 45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
65 70 75 80
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
85 90 95
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 97
<211> 328
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 97
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 98
<211> 328
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> exemplary human heavy chain constant region derived from IgG1
with mutations L234A, L235A and P329G (Fcgamma receptor silenced)
<400> 98
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 99
<211> 328
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 99
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 100
<211> 328
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> exemplary human heavy chain constant region derived from IgG1
with mutations (SG105-IgG1 allotype - Fcgamma receptor silenced)
<400> 100
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Lys Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 101
<211> 328
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> SG1095-exemplary human heavy chain constant region derived from
IgG1 including the mutations (Kabat EU numbering)
L235W/G236N/H268D/Q295L/A330K/K326T, Q311R/P343R, N434A,
Q438R/S440E
<400> 101
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Trp Asn Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Asp Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Leu Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Arg Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Thr Ala Leu Pro Lys Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Arg Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr
305 310 315 320
Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 102
<211> 328
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> SG1099-exemplary human heavy chain constant region derived from
IgG1 including mutations (Kabat EU numbering) Q311R/P343R
<400> 102
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Arg Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Arg Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 103
<211> 328
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> SG1100-exemplary human heavy chain constant region derived from
IgG1 including the mutations (Kabat EU numbering) Q311R/P343R,
N434A, Q438R/S440E
<400> 103
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Arg Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Arg Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr
305 310 315 320
Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 104
<211> 437
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> heavy chain 1- CNTO888//11K2-WT IgG1
<400> 104
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Thr Glu Asp Ile Tyr Asn Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Trp Ser Ala Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr
100 105 110
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
115 120 125
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
130 135 140
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
145 150 155 160
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
180 185 190
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
195 200 205
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
210 215 220
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
225 230 235 240
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
245 250 255
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
260 265 270
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
275 280 285
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
290 295 300
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
305 310 315 320
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
325 330 335
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys
340 345 350
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
355 360 365
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
370 375 380
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
385 390 395 400
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
405 410 415
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
420 425 430
Leu Ser Leu Ser Pro
435
<210> 105
<211> 447
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> heavy chain 2- CNTO888//11K2-WT IgG1
<400> 105
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Asp Gly Ile Tyr Gly Glu Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser
355 360 365
Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 106
<211> 224
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> light chain 1- CNTO888//11K2-WT IgG1
<400> 106
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Leu Thr Ile Ser Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Phe Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Val Phe Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
115 120 125
Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
130 135 140
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
145 150 155 160
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
165 170 175
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
180 185 190
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
195 200 205
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 107
<211> 216
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> light chain 2- CNTO888//11K2-WT IgG1
<400> 107
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asp Ala
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Ile Gln Leu His
85 90 95
Ser Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 108
<211> 437
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> heavy chain 1- CKLO2 IgG1
<400> 108
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Phe Glu Asp Ile Tyr Asn Arg
20 25 30
Arg Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Gly Ala Thr Ser Leu Glu His Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Trp Ser Ala Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr
100 105 110
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
115 120 125
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
130 135 140
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
145 150 155 160
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
180 185 190
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
195 200 205
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
210 215 220
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
225 230 235 240
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
245 250 255
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
260 265 270
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
275 280 285
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
290 295 300
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
305 310 315 320
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
325 330 335
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys
340 345 350
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
355 360 365
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
370 375 380
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
385 390 395 400
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
405 410 415
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
420 425 430
Leu Ser Leu Ser Pro
435
<210> 109
<211> 447
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> heavy chain 2- CKLO2 IgG1
<400> 109
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser His Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Val Ile Pro Ile Phe His Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Asp Ala His Tyr Gly Glu Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser
355 360 365
Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 110
<211> 224
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> light chain 1- CKLO2 IgG1
<400> 110
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Leu Thr Ile Ser His Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asp Asn His Asn Thr Lys Phe Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
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260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
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340 345 350
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
355 360 365
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
370 375 380
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
385 390 395 400
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
405 410 415
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr Arg Lys Glu
420 425 430
Leu Ser Leu Ser Pro
435
<210> 133
<211> 447
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> heavy chain 2- CKLO3 - SG1100
<400> 133
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser His Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Val Ile Pro Ile Phe His Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Asp Ala His Tyr Gly Glu Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Arg Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Arg Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser
355 360 365
Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Ala His Tyr Thr Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 134
<211> 224
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> light chain 1- CKLO3- SG1100
<400> 134
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Leu Thr Ile Ser His Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asp Asn His Asn Thr Lys Phe Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Val Phe Gly Phe Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
115 120 125
Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
130 135 140
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
145 150 155 160
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
165 170 175
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
180 185 190
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
195 200 205
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 135
<211> 216
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> light chain 2- CKLO3 - SG1100
<400> 135
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln His Val Ser Asp Ala
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Ala Ser Asp Arg Ala Glu Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Ile His Leu His
85 90 95
Ser Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 136
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> heavy chain variable domain VH 2F2
<400> 136
Gln Glu Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ile Asp His
20 25 30
Tyr Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Tyr Ile Gly Gly Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asn Arg Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu Gln
65 70 75 80
Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg
85 90 95
Asn Leu Asp Val Ser Ala Ser Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 137
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> light chain variable domain VL 2F2
<400> 137
Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn Asn
20 25 30
Leu Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Ser Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln
65 70 75 80
Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Glu Gly Ala Phe Leu Cys Thr
85 90 95
Thr Tyr Asp Cys Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 138
<211> 117
<212> PRT
<213> mus musculus
<400> 138
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Ala Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Pro Ala Ser Gly Leu Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Phe Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Val Phe Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 139
<211> 107
<212> PRT
<213> mus musculus
<400> 139
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Ser Phe Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Thr Glu Asp Ile Tyr Asn Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Ser Leu Gln Thr
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Trp Ser Ala Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 140
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> heavy chain variable domain VH 1H11
<400> 140
Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Glu Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Thr Ser
20 25 30
Tyr Trp Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu
35 40 45
Ile Ala Cys Ile Ser Ser Ser Ile Gly Val Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
50 55 60
Ala Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Val Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Thr Asp Asp Asn Trp Asn Val Gly Phe Asn Leu Trp Gly
100 105 110
Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 141
<211> 110
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> light chain variable domain VL 1H11
<400> 141
Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Gly Val Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asn Arg Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ala Thr Ile Ser Tyr
85 90 95
Leu Asp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 142
<211> 76
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 142
Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr
1 5 10 15
Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile Thr
20 25 30
Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val Ala
35 40 45
Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser Met
50 55 60
Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr
65 70 75
<210> 143
<211> 76
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> exemplary human CCL2 (MCP1) - P8A variant
<400> 143
Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Ala Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr
1 5 10 15
Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile Thr
20 25 30
Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val Ala
35 40 45
Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser Met
50 55 60
Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr
65 70 75
<210> 144
<211> 76
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> exemplary human CCL2 (MCP1) - T10C variant
<400> 144
Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Cys Cys Cys Tyr Asn Phe Thr
1 5 10 15
Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile Thr
20 25 30
Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val Ala
35 40 45
Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser Met
50 55 60
Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr
65 70 75
<210> 145
<211> 76
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 145
Gln Pro Asp Ser Val Ser Ile Pro Ile Thr Cys Cys Phe Asn Val Ile
1 5 10 15
Asn Arg Lys Ile Pro Ile Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Thr Arg Ile Thr
20 25 30
Asn Ile Gln Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Arg Gly
35 40 45
Lys Glu Val Cys Ala Asp Pro Lys Glu Arg Trp Val Arg Asp Ser Met
50 55 60
Lys His Leu Asp Gln Ile Phe Gln Asn Leu Lys Pro
65 70 75
<210> 146
<211> 76
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> SEQ ID NO: 146 exemplary human CCL8 (MCP2) - P8A variant
<400> 146
Gln Pro Asp Ser Val Ser Ile Ala Ile Thr Cys Cys Phe Asn Val Ile
1 5 10 15
Asn Arg Lys Ile Pro Ile Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Thr Arg Ile Thr
20 25 30
Asn Ile Gln Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Arg Gly
35 40 45
Lys Glu Val Cys Ala Asp Pro Lys Glu Arg Trp Val Arg Asp Ser Met
50 55 60
Lys His Leu Asp Gln Ile Phe Gln Asn Leu Lys Pro
65 70 75
<210> 147
<211> 76
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 147
Gln Pro Val Gly Ile Asn Thr Ser Thr Thr Cys Cys Tyr Arg Phe Ile
1 5 10 15
Asn Lys Lys Ile Pro Lys Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Thr Thr
20 25 30
Ser Ser His Cys Pro Arg Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Leu Asp
35 40 45
Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Thr Gln Lys Trp Val Gln Asp Phe Met
50 55 60
Lys His Leu Asp Lys Lys Thr Gln Thr Pro Lys Leu
65 70 75
<210> 148
<211> 82
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 148
Phe Asn Pro Gln Gly Leu Ala Gln Pro Asp Ala Leu Asn Val Pro Ser
1 5 10 15
Thr Cys Cys Phe Thr Phe Ser Ser Lys Lys Ile Ser Leu Gln Arg Leu
20 25 30
Lys Ser Tyr Val Ile Thr Thr Ser Arg Cys Pro Gln Lys Ala Val Ile
35 40 45
Phe Arg Thr Lys Leu Gly Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Glu Lys
50 55 60
Trp Val Gln Asn Tyr Met Lys His Leu Gly Arg Lys Ala His Thr Leu
65 70 75 80
Lys Thr
<210> 149
<211> 76
<212> PRT
<213> macaca fascicularis
<400> 149
Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr
1 5 10 15
Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile Thr
20 25 30
Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val Ala
35 40 45
Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser Met
50 55 60
Asp His Leu Asp Lys Gln Ile Gln Thr Pro Lys Pro
65 70 75
<210> 150
<211> 125
<212> PRT
<213> mus musculus
<400> 150
Gln Pro Asp Ala Val Asn Ala Pro Leu Thr Cys Cys Tyr Ser Phe Thr
1 5 10 15
Ser Lys Met Ile Pro Met Ser Arg Leu Glu Ser Tyr Lys Arg Ile Thr
20 25 30
Ser Ser Arg Cys Pro Lys Glu Ala Val Val Phe Val Thr Lys Leu Lys
35 40 45
Arg Glu Val Cys Ala Asp Pro Lys Lys Glu Trp Val Gln Thr Tyr Ile
50 55 60
Lys Asn Leu Asp Arg Asn Gln Met Arg Ser Glu Pro Thr Thr Leu Phe
65 70 75 80
Lys Thr Ala Ser Ala Leu Arg Ser Ser Ala Pro Leu Asn Val Lys Leu
85 90 95
Thr Arg Lys Ser Glu Ala Asn Ala Ser Thr Thr Phe Ser Thr Thr Thr
100 105 110
Ser Ser Thr Ser Val Gly Val Thr Ser Val Thr Val Asn
115 120 125
<210> 151
<211> 328
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> GG01 - exemplary human heavy chain constant region derived from
IgG1 including the mutations (Kabat EU numbering)
L234Y/P238D/T250V/V264I/T307P/A330K, Q311R/P343R, N434A,
Q438R/S440E
<400> 151
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Tyr Leu Gly Gly Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Ile Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Val Leu
180 185 190
His Arg Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Lys Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Arg Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr
305 310 315 320
Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 152
<211> 328
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> GG02 - exemplary human heavy chain constant region derived from
IgG1 including mutations (Kabat EU numbering)
L234Y/P238D/T250V/V264I/T307P/A330K, Q311R/P343R,
M428L/N434A/Y436T,Q438R/S440E
<400> 152
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Tyr Leu Gly Gly Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Ile Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Val Leu
180 185 190
His Arg Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Lys Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Arg Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ala His Thr Thr
305 310 315 320
Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 153
<211> 328
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> GG03 -exemplary human heavy chain constant region derived from
IgG1 (comprising-IgG1 allotype sequences) including the mutations
(Kabat EU numbering) L234Y/P238D/T250V/V264I/T307P/A330K,
Q311R/P343R, N434A,Q438R/S440E
<400> 153
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Tyr Leu Gly Gly Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Ile Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Val Leu
180 185 190
His Arg Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Lys Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Arg Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
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<220>
<223> GG04 -exemplary human heavy chain constant region derived from
IgG1 (comprising-IgG1 allotype sequences) including mutations
(Kabat EU numbering) L234Y/P238D/T250V/V264I/T307P/A330K,
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275 280 285
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290 295 300
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145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Tyr Leu Gly Gly Asp
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Ile Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Pro Val Leu His Arg Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Lys Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Arg Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser
355 360 365
Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Ala His Tyr Thr Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 165
<211> 224
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> light chain 1- CKLO2 - GG03
<400> 165
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Leu Thr Ile Ser His Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asp Asn His Asn Thr Lys Phe Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Val Phe Gly Phe Phe Glu His Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
115 120 125
Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
130 135 140
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
145 150 155 160
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
165 170 175
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
180 185 190
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
195 200 205
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
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<211> 216
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln His Val Ser Asp Ala
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Ala Ser Asp Arg Ala Glu Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Ile His Leu His
85 90 95
Ser Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<213> Artificial
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Phe Glu Asp Ile Tyr Asn Arg
20 25 30
Arg Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Gly Ala Thr Ser Leu Glu His Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Trp Ser Ala Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr
100 105 110
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
115 120 125
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
130 135 140
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
145 150 155 160
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
180 185 190
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
195 200 205
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
210 215 220
Glu Tyr Leu Gly Gly Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
225 230 235 240
Asp Val Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Ile
245 250 255
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
260 265 270
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
275 280 285
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Val Leu His Arg Asp
290 295 300
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
305 310 315 320
Pro Lys Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Arg Arg
325 330 335
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys
340 345 350
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
355 360 365
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
370 375 380
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
385 390 395 400
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
405 410 415
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420 425 430
Leu Ser Leu Ser Pro
435
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<213> Artificial
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser His Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Gly Val Ile Pro Ile Phe His Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
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Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Tyr Leu Gly Gly Asp
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Ile Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Pro Val Leu His Arg Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Lys Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Arg Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser
355 360 365
Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu
420 425 430
Ala Leu His Ala His Thr Thr Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
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<211> 224
<212> PRT
<213> Artificial
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<223> light chain 1- CKLO2 - GG04
<400> 169
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Leu Thr Ile Ser His Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asp Asn His Asn Thr Lys Phe Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Val Phe Gly Phe Phe Glu His Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
115 120 125
Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
130 135 140
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
145 150 155 160
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
165 170 175
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
180 185 190
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
195 200 205
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 170
<211> 216
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> light chain 2- CKLO2 - GG04
<400> 170
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln His Val Ser Asp Ala
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Ala Ser Asp Arg Ala Glu Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Ile His Leu His
85 90 95
Ser Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 171
<211> 437
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> heavy chain 1- CKLO2 - GG03/GG04
<400> 171
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Phe Glu Asp Ile Tyr Asn Arg
20 25 30
Arg Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Gly Ala Thr Ser Leu Glu His Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Trp Ser Ala Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr
100 105 110
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
115 120 125
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
130 135 140
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
145 150 155 160
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
180 185 190
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
195 200 205
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
210 215 220
Glu Tyr Leu Gly Gly Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
225 230 235 240
Asp Val Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Ile
245 250 255
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
260 265 270
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
275 280 285
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Val Leu His Arg Asp
290 295 300
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
305 310 315 320
Pro Lys Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Arg Arg
325 330 335
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys
340 345 350
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
355 360 365
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
370 375 380
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
385 390 395 400
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
405 410 415
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr Arg Lys Glu
420 425 430
Leu Ser Leu Ser Pro
435
<210> 172
<211> 447
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> heavy chain 2- CKLO2 - GG03/GG04
<400> 172
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser His Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Val Ile Pro Ile Phe His Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Asp Ala His Tyr Gly Glu Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Tyr Leu Gly Gly Asp
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Ile Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Pro Val Leu His Arg Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Lys Pro Ile Glu Lys
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu
420 425 430
Ala Leu His Ala His Thr Thr Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 173
<211> 224
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> light chain 1- CKLO2 - GG03/GG04
<400> 173
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Leu Thr Ile Ser His Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asp Asn His Asn Thr Lys Phe Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
130 135 140
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
145 150 155 160
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
165 170 175
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
180 185 190
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
195 200 205
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 174
<211> 216
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<213> Artificial
<220>
<223> light chain 2- CKLO2 - GG03/GG04
<400> 174
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln His Val Ser Asp Ala
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Ala Ser Asp Arg Ala Glu Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Ile His Leu His
85 90 95
Ser Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
Claims (32)
- 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 상이한 제2 에피토프에 결합하는 상이한 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체로서,
상기 이중특이적 항체는 인간 IgG 동형의 Fc 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체. - 제1항에 있어서,
A) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
(a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
(d) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
(a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
(d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
B) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
(a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
(d) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
(a) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
(d) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
C) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
(a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
(d) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
(a) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
(d) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
D) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
(a) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
(d) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
(a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
(d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
E) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
(a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
(d) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
(a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
(d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
F) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
(a) 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
(d) 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
(a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
(d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
G) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
(a) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
(d) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
(a) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
(d) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
H) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
(a) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
(d) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
(a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
(d) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
I) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
(a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
(d) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
(a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
(d) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체. - 제2항에 있어서,
A) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인으로서, (a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인으로서, (d) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인으로서, (a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인으로서, (d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
B) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인으로서, (a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인으로서, (d) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인으로서, (a) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인으로서, (d) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
C) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인으로서, (a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인으로서, (d) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인으로서, (a) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인으로서, (d) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
D) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인으로서, (a) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인으로서, (d) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인으로서, (a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인으로서, (d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
E) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인으로서, (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인으로서, (d) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인으로서, (a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인으로서, (d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
F) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인으로서, (a) 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인으로서, (d) 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인으로서, (a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인으로서, (d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
G) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인으로서, (a) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인으로서, (d) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인으로서, (a) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인으로서, (d) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
H) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인으로서, (a) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인으로서, (d) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인으로서, (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인으로서, (d) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
I) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인으로서, (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인으로서, (d) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인으로서, (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인으로서, (d) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 IgG 동형의 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항체는 인간 IgG1 동형의 불변 중쇄 도메인을 포함하는 이중특이적 항체인, 이중특이적 항체. - 제4항에 있어서,
20 mg/kg의 각 이중특이적 항체 및 0.1 mg/kg의 인간 CCL2로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 10 ml/kg의 단일 용량으로 FcRn 형질전환 마우스에 투여할 경우, 인간 야생형 IgG1 동형의 불변 중쇄 도메인을 포함하는 이중특이적 항체를 투여한 후 인간 CCL2에 대한 생체내 제거율(ml/day/kg)은 돌연변이 L234A, L235A, P329G(카바트(Kabat) EU 넘버링)를 포함하는 인간 IgG1 동형의 Fc 감마 수용체 침묵형 불변 중쇄 도메인을 포함하는 이중특이적 항체를 투여한 후 인간 CCL2에 대한 생체내 제거율(ml/day/kg)에 비해 2배 이상 높은, 이중특이적 항체. - 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서,
i) 상기 제1 항원 결합 부위는 CCL2 상의 동일한 에피토프에 항체로서 결합하고, 상기 항체는,
서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인으로서, (a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인으로서, (d) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 CCL2 상의 동일한 에피토프에 항체로서 결합하고, 상기 항체는,
서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인으로서, (a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인으로서, (d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체. - 제6항에 있어서,
20 mg/kg의 각 이중특이적 항체 및 0.1 mg/kg의 인간 CCL2로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 10 ml/kg의 단일 용량으로 FcRn 형질전환 마우스에 투여할 때, 인간 야생형 IgG1 동형의 불변 중쇄 도메인을 포함하는 이중특이적 항체를 투여한 후 인간 CCL2에 대한 생체내 제거율(ml/day/kg)은 돌연변이 L234A, L235A, P329G(카바트(Kabat) EU 넘버링)를 포함하는 인간 IgG1 동형의 Fc 감마 수용체 침묵형 불변 중쇄 도메인을 포함하는 이중특이적 항체를 투여한 후 인간 CCL2에 대한 생체내 제거율(ml/day/kg)에 비해 15배 이상, 특히 20배 이상 높은, 이중특이적 항체. - 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서,
i) 상기 제1 항원 결합 부위는
(a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
(d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고;
그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
(a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
(d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)이중특이적 항체. - 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로) 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로) 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서,
i) 상기 제1 항원 결합 부위는
(a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3, (d) 서열번호 63의 아미노산 서열 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTF를 포함하는 FR-H1, (e) 서열번호 64의 아미노산 서열 WVRQAPGQGLEWMG를 포함하는 FR-H2, (f) 서열번호 65의 아미노산 서열 RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVY YCAR을 포함하는 FR-H3, 및 (g) 서열번호 66의 아미노산 서열 WGQGTLVTVSS를 포함하는 FR-H4를 포함하는 VH 도메인; 및
(h) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1, (i) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (j) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3, (k) 서열번호 67의 아미노산 서열 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC를 포함하는 FR-H1, (l) 서열번호 68의 아미노산 서열 WYQQKPGQAPRLLIY를 포함하는 FR-H2, (m) 서열번호 69의 아미노산 서열 GVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC를 포함하는 FR-L3, 및 (n) 서열번호 70의 아미노산 서열 GQGTKVEIK를 포함하는 FR-H4를 포함하는 VL 도메인을 포함하고;
그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
(a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3, (d) 서열번호 82의 아미노산 서열 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGLTIS를 포함하는 FR-H1, (e) 서열번호 83의 아미노산 서열 WVRQAPGQGLEWMG를 포함하는 FR-H2, 및 (f) 서열번호 84의 아미노산 서열 RVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR을 포함하는 FR-H3, 및 (g) 서열번호 85의 아미노산 서열 WGQGTTVTVSS를 포함하는 FR-H4를 포함하는 VH 도메인; 및
(h) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (i) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (j) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3, (k) 서열번호 86의 아미노산 서열 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC를 포함하는 FR-L1, (l) 서열번호 87의 아미노산 서열 WYQQKPGKAPKLLIH를 포함하는 FR-L2, (m) 서열번호 88의 아미노산 서열 GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYC를 포함하는 FR-L3, 및 (n) 서열번호 89의 아미노산 서열 FGGGTKVEIK를 포함하는 FR-H4를 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)이중특이적 항체. - 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로) 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로) 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서,
A) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
B) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
C) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
D) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
E) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
F) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
G) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
H) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
I) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
J) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
K) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
L) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
M) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
N) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
O) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
P) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)이중특이적 항체. - 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로) 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로) 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서,
A) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인으로서, (a) X는 I인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V이고, X2는 P이며, X3은 H인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인으로서, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인으로서, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인으로서, (d) X1은 F이고 X2는 R인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
B) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인으로서, (a) X는 I인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V이고, X2는 P이며, X3은 H인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인으로서, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 91의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인으로서, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인으로서, (d) X1은 F이고 X2는 R인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
C) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인으로서, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인으로서, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인으로서, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 94의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인으로서, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
D) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 72의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인으로서, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인으로서, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인으로서, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 94의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인으로서, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
E) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 73의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인으로서, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인으로서, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인으로서, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인으로서, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
F) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 73의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인으로서, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인으로서, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인으로서, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 94의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인으로서, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
G) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 73의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인으로서, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인으로서, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 92의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인으로서, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인으로서, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
H) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 73의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인으로서, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인으로서, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 91의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인으로서, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인으로서, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
I) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 72의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인으로서, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인으로서, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인으로서, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인으로서, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
J) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 72의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인으로서, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인으로서, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 92의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인으로서, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인으로서, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
K) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 72의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인으로서, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인으로서, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 91의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인으로서, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인으로서, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
L) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 74의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인으로서, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인으로서, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인으로서, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인으로서, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
M) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 74의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인으로서, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인으로서, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 90의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인으로서, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 94의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인으로서, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
N) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 74의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인으로서, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인으로서, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 92의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인으로서, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인으로서, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
O) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 74의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인으로서, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인으로서, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 91의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인으로서, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인으로서, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
P) i) 상기 제1 항원 결합 부위는
서열번호 71의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인으로서, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인으로서, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고
ii) 상기 제2 항원 결합 부위는
서열번호 92의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인으로서, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인으로서, (d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된) 이중특이적 항체. - 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 이중특이적 항체는 인간 IgG 동형, 바람직하게는 인간 IgG1 동형의 Fc 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체. - 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 이중특이적 항체는 인간 IgG 동형, 바람직하게는 인간 IgG1 동형의 불변 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체. - 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 이중특이적 항체는
i) 시험관 내에서 CCL2가 이의 수용체 CCR2에 결합하는 것을 차단하고(리포터 분석, IC50=0.5 nM); 및/또는
ii) 시험관 내에서 골수 세포의 CCL2 매개 주화성을 억제하고(IC50=1.5 nM); 및/또는
iii) 시노 및 및 인간 CCL2에 교차 반응하는, 이중특이적 항체. - 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 이중특이적 항체는 다른 CCL 동족체에 교차 반응하지 않는, 이중특이적 항체. - 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 이중특이적 항체는 pH 5.8에서보다 pH 7.4에서 10배 높은 친화도로 인간 CCL2에 결합하는, 이중특이적 항체. - 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 이중특이적 항체는 하기의 돌연변이들(카바트 넘버링)
i) Q311R 및/또는 P343R; 및/또는
ii) L234Y, L235W, G236N, P238D, T250V, V264I, H268D, Q295L, T307P, K326T 및/또는 A330K; 및/또는
iii) M428L, N434A 및/또는 Y436T; 및/또는
iv) Q438R 및/또는 S440E 중 하나 이상을 포함하는 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인
을 포함하는, 이중특이적 항체. - 인간 CCL2에 (특이적으로) 결합하는, (단리된) 항체로서,
상기 항체는
A) (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X1은 V, I, 또는 H이고, X2는 P 또는 H이며, X3은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX1IX2IFX3TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
(d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;
또는
B) (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및
(d) X1은 F 또는 T이고 X2는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX1EDIYNRX2A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된) 항체. - 인간 CCL2에 (특이적으로)결합하는, (단리된) 항체로서,
상기 항체는
A) 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
또는
B) 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
또는
C) 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
또는
D) 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
또는
E) 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
또는
F) 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
또는
G) 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
또는
H) 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인
을 포함하는, (단리된) 항체. - 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 항체를 부호화(encoding)하는, 단리된 핵산.
- 제20항에 따른 핵산을 포함하는 숙주 세포.
- 항체를 생성하는 방법으로서,
상기 항체가 생성되도록 제21항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법. - 제23항에 있어서,
상기 숙주 세포로부터 항체를 회수하는 단계를 더 포함하는 방법. - 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 제형.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
약제로서 사용하기 위한 이중특이적 항체. - 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
암을 치료하는 데 사용하기 위한 이중특이적 항체. - 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
염증성 또는 자가면역 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 이중특이적 항체. - 약제의 제조에서 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체의 용도.
- 제28항에 있어서,
상기 약제는 암을 치료하기 위한, 용도. - 제28항에 있어서,
상기 약제는 염증성 또는 자가면역 질환을 치료하기 위한, 용도. - 암이 있는 개체를 치료하는 방법으로서,
구현예 1 내지 구현예 17 중 어느 한 구현예에 따른 이중특이적 항체의 유효량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법. - 염증성 또는 자가면역 질환이 있는 개체를 치료하는 방법으로서,
구현예 1 내지 구현예 17 중 어느 한 구현예에 따른 이중특이적 항체의 유효량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
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