KR20220113791A

KR20220113791A - Bispecific anti-CCL2 antibody

Info

Publication number: KR20220113791A
Application number: KR1020227024074A
Authority: KR
Inventors: 슈 펑; 옌스 피셔; 시옥 완 간; 가이 조르주; 미카엘 게르츠; 웨이 시옹 아드리안 호; 안톤 요크너; 그레고르 요르단; 후베르트 케텐베르거; 룬이 애들린 램; 메허 마예티; 외르그 묄레켄; 발레리아 룬자; 마틴 쉐퍼; 틸만 슐로타우어; 게오르크 티펜탈러; 마리아 비에르트
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2019-12-18
Filing date: 2020-12-16
Publication date: 2022-08-16
Also published as: TW202136299A; EP4076663A1; CR20220277A; PE20221661A1; US20210188960A1; BR112022012010A2; CO2022009205A2; US20240117029A1; CA3164818A1; CN114867532A; MX2022007479A; WO2021122733A1; US11739142B2; ZA202206008B; JP7415005B2; JP2023506811A; IL293310A; AR120795A1; AU2020403913A1; JP2024050565A

Abstract

본 발명은 인간 CCL2 상의 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 이중특이적 항-CCL2 항체, 이의 약학적 조성물, 이의 제조, 및 암, 염증성, 자가면역 및 안과 질환들을 치료하기 위한 약제로서의 사용에 관한 것이다.The present invention relates to bispecific anti-CCL2 antibodies that bind to two different epitopes on human CCL2, pharmaceutical compositions thereof, preparation thereof, and use as medicaments for the treatment of cancer, inflammatory, autoimmune and ophthalmic diseases.

Description

Bispecific anti-CCL2 antibody

CCL2/CCR2 축은 미성숙 골수 세포가 종양으로 동원되는 주요 매개체이다. CCL2는 악성 세포에 의해 과발현되고 세포외 기질(ECM)에 결합하여 화학 유인 물질 구배를 형성한다. 일단 종양에 도달하면, 골수 유래 억제 세포(MDSC)는 항종양 T 세포 반응의 개시를 억제하는 항염증성 사이토카인/수용체를 분비/상향 조절함으로써 전종양 형성 환경에 기여한다. 이러한 방식으로, MDSC는 T 세포 활성화 요법의 효능을 감소시키거나 심지어 손상시킬 수 있다(Meyer et al, 2014). 따라서, 이러한 미성숙 골수 세포의 동원을 특이적으로 억제하면 관문 억제제, T 세포 이중특이적 항체(TCB) 또는 다른 암 면역요법(CIT)의 효능을 높일 수 있다. 또한, CCL2는 혈관신생, 전이 및 종양 성장의 촉진과도 관련이 있으며, 이는 CCL2를 중화하는 것이 여러 방식의 항종양 개입에 기여할 수 있음을 시사한다.The CCL2/CCR2 axis is a major mediator by which immature bone marrow cells are recruited into tumors. CCL2 is overexpressed by malignant cells and binds to the extracellular matrix (ECM) to form a chemoattractant gradient. Once reaching the tumor, bone marrow-derived suppressor cells (MDSCs) contribute to the pro-tumorigenic environment by secreting/up-regulating anti-inflammatory cytokines/receptors that inhibit the initiation of anti-tumor T cell responses. In this way, MDSCs can reduce or even impair the efficacy of T cell activation therapies (Meyer et al, 2014). Therefore, specific inhibition of the recruitment of these immature bone marrow cells may enhance the efficacy of checkpoint inhibitors, T cell bispecific antibodies (TCB) or other cancer immunotherapy (CIT). In addition, CCL2 is also associated with promotion of angiogenesis, metastasis and tumor growth, suggesting that neutralizing CCL2 may contribute to multiple modalities of antitumor intervention.

이의 수용체와 대조적으로, CCL2를 표적으로 삼는 것은 Th1 및 NK 세포와 같은 다른 면역 세포 군의 동원에 관여하는 리간드는 상이하지만(예: CCL7, CCL8, CCL13) 동일한 수용체(CCR2)를 통해 신호를 보낼 수 있는 것들을 피하면서 원하지 않는 CCL2 매개 효과를 특이적으로 억제할 것이다.In contrast to its receptor, targeting CCL2 means that the ligands involved in the recruitment of other immune cell populations such as Th1 and NK cells are different (e.g. CCL7, CCL8, CCL13) but send signals through the same receptor (CCR2). It will specifically inhibit unwanted CCL2-mediated effects while avoiding possible

임상적으로, CCL2는 상이한 염증성 질환들, 예컨대 류마티스 관절염(Haringman et al, Arthritis Rheum. 2006 Aug;54(8):2387-92), 특발성 폐섬유증(Raghu et al, Eur Respir J. 2015 Dec;46(6):1740-50), 당뇨병성 신장병(Menne et al, Nephrol Dial Transplant (2017) 32: 307-315) 및 암(Sandhu et al, Cancer Chemother Pharmacol. 2013 Apr;71(4):1041-50)으로 인해 상승된 수치를 중화시키는 것을 목표로 하는 다양한 연구에서 선호되는 항체 표적이었다. 하지만, 관찰된 높은 생체내 항체-항원 해리 상수(KD)와 함께 이의 높은 합성 속도는 임상적으로 실행 가능한 용량에서 기존 항체에 의한 유리 CCL2 억제를 방해하는 주요 장애물로 입증되었다(Fetterly et al, J Clin Pharmacol. 2013 Oct;53(10):1020-7).Clinically, CCL2 is associated with different inflammatory diseases, such as rheumatoid arthritis (Haringman et al, Arthritis Rheum. 2006 Aug;54(8):2387-92), idiopathic pulmonary fibrosis (Raghu et al, Eur Respir J. 2015 Dec; 46(6):1740-50), diabetic nephropathy (Menne et al, Nephrol Dial Transplant (2017) 32:307-315) and cancer (Sandhu et al, Cancer Chemother Pharmacol. 2013 Apr;71(4):1041) -50) and has been the preferred antibody target in various studies aimed at neutralizing elevated levels. However, its high synthesis rate, along with the observed high antibody-antigen dissociation constant (KD) in vivo, has proven to be a major obstacle to inhibition of free CCL2 by conventional antibodies at clinically viable doses (Fetterly et al, J. Clin Pharmacol. 2013 Oct;53(10):1020-7).

CCL2 중화는 CCL2의 혈청 수준이 상승된 환자에게서 더 분명히 관련이 있는 것으로 보이며, 이는 유방암(BC), 난소암(OvCa), 결장직장암(CRC), 췌장암 및 전립선암과 같은 여러 유형의 암에서 관찰되었다. 하지만, 이러한 혈청학을 나타내지는 않지만 종양이 골수 계통의 면역 세포로 심하게 침윤된 이러한 적응증 내의 환자의 경우라도, 위에서 언급한 바와 같이 종양과 관련하여 CCL2가 수행하는 많은 역할로 인해 이러한 신규 치료법으로부터 많은 도움을 받을 수 있다.CCL2 neutralization appears to be more clearly relevant in patients with elevated serum levels of CCL2, observed in several types of cancer, such as breast (BC), ovarian (OvCa), colorectal (CRC), pancreatic, and prostate cancers. became However, even in patients within this indication that do not exhibit such serology but whose tumors have been heavily infiltrated with immune cells of the myeloid lineage, as mentioned above, many of the roles played by CCL2 in relation to tumors will benefit greatly from these novel therapies. can receive

Igawa et al, Immunological Reviews 270 (2016) 132-151은 생성된 항체가 pH 의존적 CDR(산성 엔도솜 내에서 항체-항원 해리를 위해 항원 분해를 유도함) 및 최적화된 등전점(pI) 및 FcγRIIb에 대한 향상된 결합(면역 복합체의 세포 흡수를 촉진함)을 갖는 조작된 Fc 모이어티, 및 신생아 Fc 수용체에 대한 적당한 친화도를 보유함으로써 허용가능한 약동학적 프로필을 유지하는 스위핑(Sweeping) 기술을 기술한다.Igawa et al, Immunological Reviews 270 (2016) 132-151 show that the resulting antibodies have pH-dependent CDRs (inducing antigen degradation for antibody-antigen dissociation within acidic endosomes) and an optimized isoelectric point (pI) and improved FcγRIIb Engineered Fc moieties with binding (facilitating cellular uptake of immune complexes), and sweeping techniques that maintain an acceptable pharmacokinetic profile by retaining adequate affinity for the neonatal Fc receptor are described.

본 발명의 일 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 상이한 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 상이한 제2 항원 결합 부위를 포함하고, 인간 IgG 동형의 Fc 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체이다. One embodiment of the present invention comprises a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a different second antigen binding site that (specifically) binds to a second different epitope on human CCL2 And, it is a bispecific antibody, comprising an Fc domain of the human IgG isotype.

본 발명의 일 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 상이한 제2 항원 결합 부위를 포함하는, 이중특이적 항체로서,One embodiment of the present invention comprises a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a different second antigen binding site that (specifically) binds to a second epitope on human CCL2 , as a bispecific antibody,

A) i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 A) i) said first antigen binding site comprises (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, and (c) SEQ ID NO: 35 a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of and

(d) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고(d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:36; a VL domain comprising (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38; and

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;ii) the second antigen binding site comprises (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, and (c) the amino acid of SEQ ID NO: 43 a VH domain comprising a CDR-H3 comprising sequence; and (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:44; a VL domain comprising (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46;

또는or

B) i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고B) i) said first antigen binding site comprises (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, and (c) SEQ ID NO: 35 a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of and (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:36; a VL domain comprising (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38; and

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;ii) the second antigen binding site comprises (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and (c) the amino acid of SEQ ID NO: 19 a VH domain comprising a CDR-H3 comprising sequence; and (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; a VL domain comprising (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22;

또는or

C) i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고C) i) said first antigen binding site comprises (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, and (c) SEQ ID NO: 35 a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of and (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:36; a VL domain comprising (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38; and

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;ii) the second antigen binding site comprises (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, and (c) an amino acid of SEQ ID NO: 11 a VH domain comprising a CDR-H3 comprising sequence; and (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:12; a VL domain comprising (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14;

또는or

D) i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고D) i) said first antigen binding site comprises (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and (c) SEQ ID NO: 19 a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of and (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; a VL domain comprising (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22; and

또는or

E) i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고E) i) said first antigen binding site comprises (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and (c) SEQ ID NO: 27 a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of and (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:28; a VL domain comprising (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30; and

또는or

F) i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고F) i) said first antigen binding site comprises (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 50, and (c) SEQ ID NO: 51 a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of and (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:52; a VL domain comprising (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:53, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:54; and

또는or

G) i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고G) i) said first antigen binding site comprises (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, and (c) SEQ ID NO: 11 a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of and (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:12; a VL domain comprising (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14; and

또는or

H) i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고H) i) said first antigen binding site comprises (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, and (c) SEQ ID NO: 11 a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of and (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:12; a VL domain comprising (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14; and

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;ii) the second antigen binding site comprises (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and (c) the amino acid of SEQ ID NO: 27 a VH domain comprising a CDR-H3 comprising sequence; and (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:28; a VL domain comprising (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30;

또는or

I) i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고I) i) said first antigen binding site comprises (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and (c) SEQ ID NO: 3 a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of and (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:4; a VL domain comprising (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:5, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:6; and

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체이다.ii) the second antigen binding site comprises (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and (c) the amino acid of SEQ ID NO: 27 a VH domain comprising a CDR-H3 comprising sequence; and (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:28; It is a bispecific antibody comprising a VL domain comprising (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:29, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:30.

일 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 인간 IgG 동형의 Fc 도메인을 포함한다. In one embodiment, the bispecific antibody comprises an Fc domain of the human IgG isotype.

일 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 인간 IgG1 동형의 Fc 도메인을 포함한다. In one embodiment, the bispecific antibody comprises an Fc domain of the human IgG1 isotype.

일 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 인간 IgG 동형의 불변 중쇄 도메인을 포함한다. In one embodiment, the bispecific antibody comprises a constant heavy chain domain of a human IgG isotype.

일 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 인간 IgG1 동형의 불변 중쇄 도메인을 포함한다. In one embodiment, the bispecific antibody comprises a constant heavy chain domain of the human IgG1 isotype.

일 구현예에서, 20 mg/kg의 각 이중특이적 항체 및 0.1 mg/kg의 인간 CCL2로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 10 ml/kg의 단일 용량으로 FcRn 형질전환 마우스에 투여할 때, 인간 야생형 IgG1 동형의 불변 중쇄 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함하는 이중특이적 항체를 투여한 후 인간 CCL2에 대한 생체내 제거율(ml/day/kg)은 돌연변이 L234A, L235A, P329G(카바트(Kabat) EU 넘버링)를 포함하는 인간 IgG1 동형의 Fc 감마 수용체 침묵형 불변 중쇄 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함하는 이중특이적 항체를 투여한 후 인간 CCL2에 대한 생체내 제거율(ml/day/kg)에 비해 2배 이상(일 구현예에서 5배 이상, 일 구현예에서 10배 이상, 일 구현예에서 20배 이상) 높다.In one embodiment, when administered to an FcRn transgenic mouse a preformed immune complex consisting of 20 mg/kg of each bispecific antibody and 0.1 mg/kg of human CCL2 at a single dose of 10 ml/kg, human wild-type IgG1 In vivo clearance (ml/day/kg) for human CCL2 after administration of a bispecific antibody comprising an isotype constant heavy chain domain (or an Fc domain thereof) was determined by the mutations L234A, L235A, P329G (Kabat EU Numbering) compared to the in vivo clearance rate (ml / day / kg) for human CCL2 after administration of a bispecific antibody comprising an Fc gamma receptor silent constant heavy chain domain (or an Fc domain thereof) of the human IgG1 isotype comprising at least 2-fold (in one embodiment at least 5-fold, in one embodiment at least 10-fold, in one embodiment at least 20-fold) higher.

본 발명의 일 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서,One embodiment of the present invention comprises a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a second antigen binding site that (specifically) binds to a second epitope on human CCL2, A (isolated) bispecific antibody comprising:

i) 상기 제1 항원 결합 부위는 CCL2 상의 동일한 에피토프에 항체로서 결합하고, 상기 항체는,i) said first antigen binding site binds as an antibody to the same epitope on CCL2, said antibody comprising:

서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하며, (a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39, (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, and (c) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 a VH domain comprising a CDR-H3 comprising an amino acid sequence; and a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40, and (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36; a VL domain comprising (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38; and

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 CCL2 상의 동일한 에피토프에 항체로서 결합하고, 상기 항체는,ii) said second antigen binding site binds as an antibody to the same epitope on CCL2, said antibody comprising:

서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하며, (a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체이다.a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47, (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, and (c) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43 a VH domain comprising a CDR-H3 comprising an amino acid sequence; and a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48, and (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44; It is a bispecific antibody comprising a VL domain comprising (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:45, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:46.

일 구현예에서, 20 mg/kg의 각 이중특이적 항체 및 0.1 mg/kg의 인간 CCL2로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 10 ml/kg의 단일 용량으로 FcRn 형질전환 마우스에 투여할 때, 인간 야생형 IgG1 동형의 불변 중쇄 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함하는 이중특이적 항체를 투여한 후 인간 CCL2에 대한 생체내 제거율(ml/day/kg)은 돌연변이 L234A, L235A, P329G(카바트 EU 넘버링)를 포함하는 인간 IgG1 동형의 Fc 감마 수용체 침묵형 불변 중쇄 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함하는 이중특이적 항체를 투여한 후 인간 CCL2에 대한 생체내 제거율(ml/day/kg)에 비해 15배 이상, 특히 20배 이상 높다.In one embodiment, when administered to an FcRn transgenic mouse a preformed immune complex consisting of 20 mg/kg of each bispecific antibody and 0.1 mg/kg of human CCL2 at a single dose of 10 ml/kg, human wild-type IgG1 In vivo clearance (ml/day/kg) for human CCL2 after administration of a bispecific antibody comprising an isotype constant heavy chain domain (or an Fc domain thereof) was determined by mutations L234A, L235A, P329G (Kabat EU numbering). After administration of a bispecific antibody comprising an Fc gamma receptor silencing constant heavy chain domain (or an Fc domain thereof) of the human IgG1 isotype including , especially more than 20 times higher.

i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X¹은 V, I, 또는 H이고, X²는 P 또는 H이며, X³은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및i) said first antigen binding site is (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence SHYGXS of SEQ ID NO: 57, wherein X is I or T, (b) X ¹ is V, I, or H, and X ² is A CDR-H2 comprising the amino acid sequence GX ¹ IX ² IFX ³ TANYAQKFQG of SEQ ID NO: 58, wherein X ³ is H or G, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence YDAHYGELDF of SEQ ID NO: 59 VH domain comprising; and

(d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고;(d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence RASQHVSDAYLA of SEQ ID NO:60; a VL domain comprising (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence DASDRAE of SEQ ID NO:61, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence HQYIHLHSFT of SEQ ID NO:62;

그리고and

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및ii) said second antigen binding site comprises (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence HTYMH of SEQ ID NO: 76, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence RIDPXNHNTKFDPKFQG of SEQ ID NO: 77, wherein X is D or E; and (c) a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence GVFGFFXH of SEQ ID NO: 78, wherein X is D or E; and

(d) X¹은 F 또는 T이고 X²는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX¹EDIYNRX²A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다. (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence KAX ¹ EDIYNRX ² A of SEQ ID NO: 79, wherein X ¹ is F or T and X ² is R or L, (e) a CDR comprising the amino acid sequence GATSLEH of SEQ ID NO: 80 -L2, and (f) is a bispecific antibody (isolated) comprising a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence QQFXSAPYT of SEQ ID NO:81, wherein X is W or R.

본 발명의 일 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, One embodiment of the present invention comprises a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a second antigen binding site that (specifically) binds to a second epitope on human CCL2, A (isolated) bispecific antibody comprising:

i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X¹은 V, I, 또는 H이고, X²는 P 또는 H이며, X³은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3, (d) 서열번호 63의 아미노산 서열 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTF를 포함하는 FR-H1, (e) 서열번호 64의 아미노산 서열 WVRQAPGQGLEWMG를 포함하는 FR-H2, (f) 서열번호 65의 아미노산 서열 RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVY YCAR을 포함하는 FR-H3, 및 (g) 서열번호 66의 아미노산 서열 WGQGTLVTVSS를 포함하는 FR-H4를 포함하는 VH 도메인; 및i) said first antigen binding site is (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence SHYGXS of SEQ ID NO: 57, wherein X is I or T, (b) X ¹ is V, I, or H, and X ² is A CDR-H2 comprising the amino acid sequence GX ¹ IX ² IFX ³ TANYAQKFQG of SEQ ID NO: 58, wherein X ³ is H or G, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence YDAHYGELDF of SEQ ID NO: 59 , (d) FR-H1 comprising the amino acid sequence QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTF of SEQ ID NO: 63, (e) FR-H2 comprising the amino acid sequence WVRQAPGQGLEWMG of SEQ ID NO: 64, (f) FR-H2 YCAR comprising the amino acid sequence RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVY YCAR of SEQ ID NO: 65 -H3, and (g) a VH domain comprising FR-H4 comprising the amino acid sequence WGQGTLVTVSS of SEQ ID NO:66; and

(h) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (i) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (j) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3, (k) 서열번호 67의 아미노산 서열 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC를 포함하는 FR-H1, (l) 서열번호 68의 아미노산 서열 WYQQKPGQAPRLLIY를 포함하는 FR-H2, (m) 서열번호 69의 아미노산 서열 GVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC를 포함하는 FR-L3, 및 (n) 서열번호 70의 아미노산 서열 GQGTKVEIK를 포함하는 FR-H4를 포함하는 VL 도메인을 포함하고;(h) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence RASQHVSDAYLA of SEQ ID NO:60; (i) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence DASDRAE of SEQ ID NO: 61, and (j) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence HQYIHLHSFT of SEQ ID NO: 62, (k) a FR- comprising the amino acid sequence EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC of SEQ ID NO: 67 H1, (l) FR-H2 comprising the amino acid sequence WYQQKPGQAPRLLIY of SEQ ID NO: 68, (m) FR-L3 comprising the amino acid sequence GVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC of SEQ ID NO: 69, and (n) GQGTKVEIK comprising the amino acid sequence GQGTKVEIK of SEQ ID NO: 70 a VL domain comprising FR-H4;

그리고and

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3, (d) 서열번호 82의 아미노산 서열 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGLTIS를 포함하는 FR-H1, (e) 서열번호 83의 아미노산 서열 WVRQAPGQGLEWMG를 포함하는 FR-H2, 및 (f) 서열번호 84의 아미노산 서열 RVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR을 포함하는 FR-H3, 및 (g) 서열번호 85의 아미노산 서열 WGQGTTVTVSS를 포함하는 FR-H4를 포함하는 VH 도메인; 및ii) said second antigen binding site comprises (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence HTYMH of SEQ ID NO: 76, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence RIDPXNHNTKFDPKFQG of SEQ ID NO: 77, wherein X is D or E; (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence GVFGFFXH of SEQ ID NO: 78, wherein X is D or E, (d) FR-H1 comprising the amino acid sequence QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGLTIS of SEQ ID NO: 82, (e) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 83 a VH domain comprising FR-H2 comprising WVRQAPGQGLEWMG, and (f) FR-H3 comprising the amino acid sequence RVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR of SEQ ID NO: 84, and (g) FR-H4 comprising the amino acid sequence WGQGTTVTVSS of SEQ ID NO: 85; and

(h) X¹은 F 또는 T이고 X²는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX¹EDIYNRX²A를 포함하는 CDR-L1, (i) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (j) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3, (k) 서열번호 86의 아미노산 서열 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC를 포함하는 FR-L1, (l) 서열번호 87의 아미노산 서열 WYQQKPGKAPKLLIH를 포함하는 FR-L2, (m) 서열번호 88의 아미노산 서열 GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYC를 포함하는 FR-L3, 및 (n) 서열번호 89의 아미노산 서열 FGGGTKVEIK를 포함하는 FR-H4를 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다. (h) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence KAX ¹ EDIYNRX ² A of SEQ ID NO: 79, wherein X ¹ is F or T and X ² is R or L, (i) a CDR comprising the amino acid sequence GATSLEH of SEQ ID NO: 80 -L2, and (j) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence QQFXSAPYT of SEQ ID NO: 81, wherein X is W or R, (k) FR-L1 comprising the amino acid sequence DIQMTQSPSSSLSASVGDRVTITC of SEQ ID NO: 86, (l) SEQ ID NO: A VL comprising FR-L2 comprising the amino acid sequence WYQQKPGKAPKLLIH of 87, (m) FR-L3 comprising the amino acid sequence GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYC of SEQ ID NO: 88, and (n) FR-H4 comprising the amino acid sequence FGGGTKVEIK of SEQ ID NO: 89 It is an (isolated) bispecific antibody comprising a domain.

A) i) 상기 제1 항원 결합 부위는A) i) said first antigen binding site is

서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:75; and

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 90; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:93;

또는or

B) i) 상기 제1 항원 결합 부위는B) i) said first antigen binding site is

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 91; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:93;

또는or

C) i) 상기 제1 항원 결합 부위는C) i) said first antigen binding site is

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 90; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 94;

또는or

D) i) 상기 제1 항원 결합 부위는D) i) said first antigen binding site is

서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 72; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:75; and

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

E) i) 상기 제1 항원 결합 부위는E) i) said first antigen binding site is

서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:73; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:75; and

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

F) i) 상기 제1 항원 결합 부위는F) i) said first antigen binding site is

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

G) i) 상기 제1 항원 결합 부위는G) i) said first antigen binding site is

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 92; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:93;

또는or

H) i) 상기 제1 항원 결합 부위는H) i) said first antigen binding site is

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

I) i) 상기 제1 항원 결합 부위는I) i) the first antigen binding site is

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

J) i) 상기 제1 항원 결합 부위는J) i) said first antigen binding site is

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

K) i) 상기 제1 항원 결합 부위는K) i) said first antigen binding site is

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

L) i) 상기 제1 항원 결합 부위는L) i) said first antigen binding site is

서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 74; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:75; and

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

M) i) 상기 제1 항원 결합 부위는M) i) said first antigen binding site is

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

N) i) 상기 제1 항원 결합 부위는N) i) said first antigen binding site is

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

O) i) 상기 제1 항원 결합 부위는O) i) the first antigen binding site is

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

P) i) 상기 제1 항원 결합 부위는P) i) the first antigen binding site is

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 92; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:93.

A) i) 상기 제1 항원 결합 부위는 A) i) said first antigen binding site is

서열번호 71의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X¹은 V이고, X²는 P이며, X³은 H인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및has at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71; is I, a CDR-H1 comprising the amino acid sequence SHYGXS of SEQ ID NO: 57, (b) X ¹ is V, X ² is P, X ³ is H, amino acid sequence GX ¹ IX ² IFX of SEQ ID NO: 58 ³ a VH domain comprising a CDR-H2 comprising TANYAQKFQG, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence YDAHYGELDF of SEQ ID NO:59; and

서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고(d) has at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75; CDR-L1 comprising the amino acid sequence RASQHVSDAYLA of number 60; a VL domain comprising (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence DASDRAE of SEQ ID NO:61, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence HQYIHLHSFT of SEQ ID NO:62; and

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

서열번호 90의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및has at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 90; CDR-H1 comprising the amino acid sequence HTYMH of number 76, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence RIDPXNHNTKFDPKFQG of SEQ ID NO: 77, wherein X is D, and (c) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 78, wherein X is D a VH domain comprising a CDR-H3 comprising GVFGFFXH; and

서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X¹은 F이고 X²는 R인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX¹EDIYNRX²A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;has at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 93; ¹ is F and X ² is R, a CDR-L1 comprising the amino acid sequence KAX ¹ EDIYNRX ² A of SEQ ID NO: 79, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence GATSLEH of SEQ ID NO: 80, and (f) X comprises a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence QQFXSAPYT of SEQ ID NO: 81, wherein W is;

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

서열번호 91의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및has at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 91; CDR-H1 comprising the amino acid sequence HTYMH of number 76, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence RIDPXNHNTKFDPKFQG of SEQ ID NO: 77, wherein X is D, and (c) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 78, wherein X is E a VH domain comprising a CDR-H3 comprising GVFGFFXH; and

또는or

서열번호 71의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X¹은 V, I, 또는 H이고, X²는 P 또는 H이며, X³은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및has at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71; is ^I or ^T ^; a VH domain comprising a CDR-H2 comprising the amino acid sequence GX ¹ IX ² IFX ³ TANYAQKFQG of SEQ ID NO: 58, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence YDAHYGELDF of SEQ ID NO: 59; and

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

서열번호 90의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및has at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 90; CDR-H1 comprising the amino acid sequence HTYMH of number 76, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence RIDPXNHNTKFDPKFQG of SEQ ID NO: 77, wherein X is D or E, and (c) X is D or E, SEQ ID NO: a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence GVFGFFXH of 78; and

서열번호 94의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X¹은 F 또는 T이고 X²는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX¹EDIYNRX²A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;has at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 94; ¹ is F or T ^and X ² is R or L ^; (f) comprises a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence QQFXSAPYT of SEQ ID NO: 81, wherein X is W or R;

또는or

서열번호 72의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X¹은 V, I, 또는 H이고, X²는 P 또는 H이며, X³은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및has at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 72; is ^I or ^T ^; a VH domain comprising a CDR-H2 comprising the amino acid sequence GX ¹ IX ² IFX ³ TANYAQKFQG of SEQ ID NO: 58, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence YDAHYGELDF of SEQ ID NO: 59; and

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

서열번호 73의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X¹은 V, I, 또는 H이고, X²는 P 또는 H이며, X³은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및has at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 73; is ^I or ^T ^; a VH domain comprising a CDR-H2 comprising the amino acid sequence GX ¹ IX ² IFX ³ TANYAQKFQG of SEQ ID NO: 58, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence YDAHYGELDF of SEQ ID NO: 59; and

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X¹은 F 또는 T이고 X²는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX¹EDIYNRX²A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;has at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 93; ¹ is F or T ^and X ² is R or L ^; (f) comprises a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence QQFXSAPYT of SEQ ID NO: 81, wherein X is W or R;

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

G) i)상기 제1 항원 결합 부위는G) i) the first antigen binding site is

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

서열번호 92의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및has at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 92; CDR-H1 comprising the amino acid sequence HTYMH of number 76, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence RIDPXNHNTKFDPKFQG of SEQ ID NO: 77, wherein X is D or E, and (c) X is D or E, SEQ ID NO: a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence GVFGFFXH of 78; and

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

서열번호 91의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및has at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 91; CDR-H1 comprising the amino acid sequence HTYMH of number 76, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence RIDPXNHNTKFDPKFQG of SEQ ID NO: 77, wherein X is D or E, and (c) X is D or E, SEQ ID NO: a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence GVFGFFXH of 78; and

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

서열번호 92의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및has at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 92; CDR-H1 comprising the amino acid sequence HTYMH of number 76, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence RIDPXNHNTKFDPKFQG of SEQ ID NO: 77, wherein X is D or E, and (c) X is D or E, SEQ ID NO: a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence GVFGFFXH of 78; and

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

서열번호 91의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및has at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 91; CDR-H1 comprising the amino acid sequence HTYMH of number 76, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence RIDPXNHNTKFDPKFQG of SEQ ID NO: 77, wherein X is D or E, and (c) X is D or E, SEQ ID NO: a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence GVFGFFXH of 78; and

또는or

서열번호 74의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) X는 I 또는 T인, 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X¹은 V, I, 또는 H이고, X²는 P 또는 H이며, X³은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및has at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 74; is ^I or ^T ^; a VH domain comprising a CDR-H2 comprising the amino acid sequence GX ¹ IX ² IFX ³ TANYAQKFQG of SEQ ID NO: 58, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence YDAHYGELDF of SEQ ID NO: 59; and

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

서열번호 90의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및has at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 90; CDR-H1 comprising the amino acid sequence HTYMH of number 76, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence RIDPXNHNTKFDPKFQG of SEQ ID NO: 77, wherein X is D or E, and (c) X is D or E, SEQ ID NO: a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence GVFGFFXH of 78; and

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X¹은 F 또는 T이고 X²는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX¹EDIYNRX²A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.has at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 93; ¹ is F or T ^and X ² is R or L ^; (f) is a bispecific antibody (isolated) comprising a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence QQFXSAPYT of SEQ ID NO:81, wherein X is W or R;

일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는,In one embodiment, the bispecific antibody described herein comprises:

i) 시험관 내에서 CCL2가 이의 수용체 CCR2에 결합하는 것을 차단하고(리포터 분석, IC₅₀=0.5 nM); 및/또는i) block the binding of CCL2 to its receptor CCR2 in vitro (reporter assay, IC ₅₀ =0.5 nM); and/or

ii) 시험관 내에서 골수 세포의 CCL2 매개 주화성을 억제하고(IC₅₀=1.5 nM); 및/또는ii) inhibits CCL2-mediated chemotaxis of myeloid cells in vitro (IC ₅₀ =1.5 nM); and/or

iii) 시노 및 및 인간 CCL2에 교차 반응한다.iii) cross-reacts to cyno and and human CCL2.

일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 다른 CCL 동족체에 대해 교차 반응성이 아니며, 특히 CCL2에 대한 결합과 비교하여 다른 CCL 동족체(예컨대, CCL8)에 대한 결합이 100배 더 적게 나타낸다.In one embodiment, the bispecific antibodies described herein are not cross-reactive to other CCL homologues, and particularly exhibit 100-fold less binding to other CCL homologues (eg, CCL8) compared to binding to CCL2.

일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 이온 의존적 방식으로 인간 CCL2 상의 제1 에피토프 및 제2 에피토프에 결합한다.In one embodiment, the bispecific antibodies described herein bind a first epitope and a second epitope on human CCL2 in an ion dependent manner.

일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 pH 의존적 방식으로 인간 CCL2에 결합하고, 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위 둘 모두는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화도로 CCL2에 결합한다.In one embodiment, the bispecific antibody described herein binds to human CCL2 in a pH dependent manner, wherein both the first antigen binding site and the second antigen binding site bind to CCL2 with higher affinity at neutral pH than at acidic pH. combine

일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 pH 5.8에서보다 pH 7.4에서 10배 더 높은 친화도로 인간 CCL2에 결합한다.In one embodiment, the bispecific antibodies described herein bind human CCL2 with a 10-fold higher affinity at pH 7.4 than at pH 5.8.

일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 하기 돌연변이(카바트 EU 넘버링)들:In one embodiment, the bispecific antibodies described herein have the following mutations (Kabat EU numbering):

i) Q311R 및/또는 P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합); 및/또는i) Q311R and/or P343R (suitable for increasing pI to enhance antigen uptake); and/or

ii) L234Y, L235W, G236N, P238D, T250V, V264I, H268D, Q295L, T307P, K326T 및/또는 A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합); 및/또는 ii) L234Y, L235W, G236N, P238D, T250V, V264I, H268D, Q295L, T307P, K326T and/or A330K (suitable for increasing affinity for human FcgRIIb and decreasing affinity for other human FcgRs); and/or

iii) M428L, N434A 및/또는 Y436T(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및/또는iii) M428L, N434A and/or Y436T (suitable for increasing affinity for FcRn for longer plasma half-life); and/or

iv) Q438R 및/또는 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합) 중 하나 이상을 포함하는 IgG1 중쇄 불변 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함한다.iv) an IgG1 heavy chain constant domain (or an Fc domain thereof) comprising at least one of Q438R and/or S440E (suitable for inhibition of rheumatoid factor binding).

i) Q311R, 및/또는 P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합); 및/또는i) Q311R, and/or P343R (suitable for increasing pI to enhance antigen uptake); and/or

ii) L235W, G236N, H268D, Q295L, K326T 및/또는 A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합); 및/또는ii) L235W, G236N, H268D, Q295L, K326T and/or A330K (suitable for increasing affinity for human FcgRIIb and decreasing affinity for other human FcgRs); and/or

iii) N434A(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및/또는iii) N434A (suitable for increasing affinity for FcRn for longer plasma half-life); and/or

i) Q311R 및 P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합); 및i) Q311R and P343R (suitable for increasing pI to enhance antigen uptake); and

ii) L235W, G236N, H268D, Q295L, K326T 및 A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합); 및ii) L235W, G236N, H268D, Q295L, K326T and A330K (suitable for increasing affinity for human FcgRIIb and decreasing affinity for other human FcgRs); and

iii) N434A(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및iii) N434A (suitable for increasing affinity for FcRn for longer plasma half-life); and

iv) Q438R 및 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합)를 포함하는 IgG1 중쇄 불변 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함한다.iv) an IgG1 heavy chain constant domain (or an Fc domain thereof) comprising Q438R and S440E (suitable for inhibition of rheumatoid factor binding).

ii) N434A(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및ii) N434A (suitable for increasing affinity for FcRn for longer plasma half-life); and

iii) Q438R 및 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합)를 포함하는 IgG1 중쇄 불변 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함한다.iii) an IgG1 heavy chain constant domain (or an Fc domain thereof) comprising Q438R and S440E (suitable for inhibition of rheumatoid factor binding).

Q311R 및 P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합)을 포함하는 IgG1 중쇄 불변 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함한다.IgGl heavy chain constant domain (or Fc domain thereof) comprising Q311R and P343R (suitable for increasing pI to enhance antigen uptake).

ii) L234Y, P238D, T250V, V264I, T307P 및/또는 A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합); 및/또는 ii) L234Y, P238D, T250V, V264I, T307P and/or A330K (suitable for increasing affinity for human FcgRIIb and decreasing affinity for other human FcgRs); and/or

ii) L234Y, P238D, T250V, V264I, T307P 및 A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합); 및 ii) L234Y, P238D, T250V, V264I, T307P and A330K (suitable for increasing affinity for human FcgRIIb and decreasing affinity for other human FcgRs); and

iii) M428L, N434A 및 Y436T(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및iii) M428L, N434A and Y436T (suitable for increasing affinity for FcRn for longer plasma half-life); and

iv) Q438R 및 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합) 중 하나 이상을 포함하는 IgG1 중쇄 불변 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함한다.iv) an IgG1 heavy chain constant domain (or an Fc domain thereof) comprising at least one of Q438R and S440E (suitable for inhibition of rheumatic factor binding).

i) 중쇄 불변 도메인 중 하나에서의 S354C 및 T366W i) S354C and T366W in one of the heavy chain constant domains

ii) 중쇄 불변 도메인 중 다른 하나에서의 Y349C, T366S, L368A, Y407V를 포함하는 (독립적으로 또는 상기 기재된 돌연변이 이외에) 2개의 IgG1 중쇄 불변 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함한다. ii) two IgG1 heavy chain constant domains (or Fc domains thereof) (independently or in addition to the mutations described above) comprising Y349C, T366S, L368A, Y407V in the other of the heavy chain constant domains.

본 발명의 일 구현예는 인간 CCL2에 (특이적으로)결합하는 (단리된)(단일특이적)항체로서,One embodiment of the present invention is an (isolated) (monospecific) antibody that (specifically) binds to human CCL2,

상기 항체는,The antibody is

A) (a) X는 I 또는 T인 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X¹은 V, I, 또는 H이고, X²는 P 또는 H이며, X³은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및A) (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence SHYGXS of SEQ ID NO: 57, wherein X is I or T, (b) X ¹ is V, I, or H, X ² is P or H, and X ³ is a VH domain comprising a CDR-H2 comprising the amino acid sequence GX ¹ IX ² IFX ³ TANYAQKFQG of SEQ ID NO: 58, which is H or G, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence YDAHYGELDF of SEQ ID NO: 59; and

(d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나; (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence RASQHVSDAYLA of SEQ ID NO:60; (e) a VL domain comprising a CDR-L2 comprising the amino acid sequence DASDRAE of SEQ ID NO: 61, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence HQYIHLHSFT of SEQ ID NO: 62;

또는or

B) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및B) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence HTYMH of SEQ ID NO: 76, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence RIDPXNHNTKFDPKFQG of SEQ ID NO: 77, wherein X is D or E, and (c) X is D or E a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence GVFGFFXH of SEQ ID NO: 78; and

(d) X¹은 F 또는 T이고 X²는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX¹EDIYNRX²A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)(단일특이적)이중특이적 항체이다. (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence KAX ¹ EDIYNRX ² A of SEQ ID NO: 79, wherein X ¹ is F or T and X ² is R or L, (e) a CDR comprising the amino acid sequence GATSLEH of SEQ ID NO: 80 -L2, and (f) is an (isolated) (monospecific) bispecific antibody comprising a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence QQFXSAPYT of SEQ ID NO: 81, wherein X is W or R .

상기 항체는,The antibody is

A) 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; A) a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75;

또는or

B) 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; B) a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 72; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75;

또는or

C) 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; C) a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:73; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75;

또는or

D) 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; D) a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:74; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75;

또는or

E) 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;E) a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 90; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:93;

또는or

F) 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;F) a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:91; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:93;

또는or

G) 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;G) a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:92; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:93;

또는or

H) 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)(단일특이적)항체이다.H) a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:90; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:94.

본 발명의 일 구현예는 선행하는 구현예들 중 어느 한 구현예에 따른 (단일특이적 또는 이중특이적)항체를 부호화하는 단리된 핵산이다.One embodiment of the present invention is an isolated nucleic acid encoding an antibody (monospecific or bispecific) according to any one of the preceding embodiments.

본 발명의 일 구현예는 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포이다.One embodiment of the present invention is a host cell comprising the nucleic acid.

본 발명의 일 구현예는 상기 항체가 생성되도록 상기 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 항체를 생성하는 방법이다.One embodiment of the present invention is a method for producing an antibody, comprising culturing the host cell to produce the antibody.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 숙주 세포로부터 상기 항체를 회수하는 단계를 더 포함한다.In one embodiment of the present invention, the method further comprises recovering the antibody from the host cell.

본 발명의 일 구현예는 본원에 기재된 이중특이적 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 제제이다. One embodiment of the present invention is a pharmaceutical formulation comprising the bispecific antibody described herein and a pharmaceutically acceptable carrier.

본 발명의 일 구현예는 약제로서 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 이중특이적 항체이다.One embodiment of the invention is a bispecific antibody as described herein for use as a medicament.

본 발명의 일 구현예는 약제의 제조에서 본원에 기재된 바와 같은 이중특이체의 사용이다. One embodiment of the invention is the use of a bispecific as described herein in the manufacture of a medicament.

일 구현예에서, 상기 약제는 암의 치료를 위한 것이다.In one embodiment, the medicament is for the treatment of cancer.

일 구현예에서, 상기 약제는 염증성 또는 자가면역 질환을 치료하기 위한 것이다.In one embodiment, the medicament is for treating an inflammatory or autoimmune disease.

본 발명의 일 구현예는 암을 치료하는 데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 이중특이적 항체이다.One embodiment of the invention is a bispecific antibody as described herein for use in treating cancer.

본 발명의 일 구현예는 염증성 또는 자가면역 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 이중특이적 항체이다.One embodiment of the invention is a bispecific antibody as described herein for use in treating an inflammatory or autoimmune disease.

본 발명의 일 구현예는 암이 있는 개체를 치료하는 방법으로서, 본원에 기재된 항체의 유효량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.One embodiment of the present invention provides a method of treating a subject having cancer, comprising administering to the subject an effective amount of an antibody described herein.

본 발명의 일 구현예는 염증성 또는 자가면역 질환이 있는 개체를 치료하는 방법으로서, 본원에 기재된 항체의 유효량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.One embodiment of the present invention provides a method of treating a subject having an inflammatory or autoimmune disease, comprising administering to the subject an effective amount of an antibody described herein.

도 1: 단일특이적 항-CCL2 항체(CNTO888(= CNTO), 1A5, 1G9 및 인간화 11K2(=11k2))의 재조합 CCL2 및 CCL2 동족체에 대한 결합을 도시하는 표면 플라즈몬 공명(비아코어(Biacore)®) 센서그램이다.
도 2a: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 CNTO888-SG1(야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 CNTO888-SG105(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 FcRn 형질전환 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 2b: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 11K2-SG1(야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 11K2-SG105(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 FcRn 형질전환 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 2c: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 ABN912-SG1(야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 ABN912-SG105(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 FcRn 형질전환 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 2d: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 1A4-SG1(야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 1A4-SG105(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 FcRn 형질전환 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 2e: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 1A5-SG1(야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 1A5-SG105(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 FcRn 형질전환 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 2f: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 1G9 -SG1(야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 1G9-SG105(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 FcRn 형질전환 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 2g: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 2F6-SG1(야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 2F6-SG105(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 FcRn 형질전환 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 3: a) 실선: 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 11K2-SG1(야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 20 mg/kg의 단일특이적 항-CCL2 항체 11K2-SG105(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)를 마우스에 정맥 주사한 후 혈청 총 마우스 CCL2 농도(도 °3a) 및 항체-시간 곡선(도 °3b)의 시간 경과를 도시한다.
도 4a: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 11K2//1G9-WT IgG1(원형 Fc 수용체가 결합된 야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 11K2//1G9-PGLALA(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 Balb/c 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 4b: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 CNTO888//11K2-WT IgG1(원형 Fc 수용체가 결합된 야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 CNTO888//11K2-PGLALA(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 Balb/c 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 4c: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 CNTO888//1G9-WT IgG1(원형 Fc 수용체가 결합된 야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 11K2//1G9-PGLALA(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 Balb/c 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 4d: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 CNTO888//1A5-WT IgG1(원형 Fc 수용체가 결합된 야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 CNTO888//1A5-PGLALA(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 Balb/c 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 4e: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 1A5//1G9-WT IgG1(원형 Fc 수용체가 결합된 야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 1A5//1G9-PGLALA(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 Balb/c 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 4f: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 11K2//2F6-WT IgG1(원형 Fc 수용체가 결합된 야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 11K2//2F6-PGLALA(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 Balb/c 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 4g: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 ABN912//11K2-WT IgG1(원형 Fc 수용체가 결합된 야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 ABN912//11K2-PGLALA(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 Balb/c 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 4h: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 1A4//2F6-WT IgG1(원형 Fc 수용체가 결합된 야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 1A4//2F6-PGLALA(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 Balb/c 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 4i: a) 실선: 0.1 mg/kg의 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 1A5//2F6-WT IgG1(원형 Fc 수용체가 결합된 야생형 IgG1) 또는 b) 점선: 0.1 mg/kg 인간 CCL2(hCCL2) 및 20 mg/kg의 이중특이적 항-CCL2 항체 1A5//2F6-PGLALA(Fc 수용체 결합 침묵형 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 Balb/c 마우스에 정맥 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 5a: 4개의 변형된 11K2 및 4개의 CNTO888 변이체, 및 4개의 변형된 11K2 및 4개의 CNTO888 변이체의 각각의 조합 항원 결합 모이어티의 결과인 16개의 이중특이적 항-CCL2 항체 CKLO01 내지 CKLO16의 pH 7.4(검정색 선) 및 pH 5.8(회색선)에서 단량체 CCL2에 대한 결합 곡선을 도시한 비아코어(Biacore)® 센서그램이다.
도 5b: 4개의 변형된 11K2 및 4개의 CNTO888 변이체, 및 4개의 변형된 11K2 및 4개의 CNTO888 변이체의 각각의 조합 항원 결합 모이어티의 결과인 16개의 이중특이적 항-CCL2 항체 CKLO01 내지 CKLO16의 단량체 CCL2에 대한 결합 곡선을 도시한 비아코어® 센서그램이다. pH 5.8에서의 추가적인 해리 단계는 pH 7.4에서의 해리 단계 직후에 비아코어® 분석에 통합되었다.
도 6: 이중특이적 항-CCL2 항체 CKLO01, CKLO02, CKLO03 및 CKLO04의 pH 7.4(검정색 선) 및 pH 5.8(회색선)에서의 단량체 CCL8에 대한 결합 곡선을 도시한 비아코어® 센서그램이다.
도 7a: hCCL2 및 이중특이적 항-CCL2 항체(모 CNTO//11K2 및 pH 의존적 변이체 CKLO01, CKLO02, CKLO03 및 CKLO04)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 SCID 마우스에 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 7b: hCCL2 및 CKLO03(IgG1 야생형 Fc를 가짐) 또는 CKLO03-SG1099(강화된 pI Fc를 갖는 CKLO03)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 SCID 마우스에 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다.
도 8: 주화성 분석: 동일한 CDR 및 가변 영역 VH/VL, 즉 CKLO2-IgG1 야생형 및 CKLO2-SG1095를 갖지만, Fc 모이어티가 상이한 이중특이적 항-CCL2 항체는 동일한 효능으로 THP-1 세포의 이동을 억제할 수 있다(IC₅₀ = 0.2 μg/ml; 도 8, 왼쪽 패널).
유사하게도, pH 비의존적인 CKLO2의 모 비변형 이중특이적 항체 CNTO888/11k2k2 IgG1인 CCL2-0048이 또한 0.2 μg/ml의 IC₅₀을 나타낸다. 이는 pH 의존성이 상기 분석에서는 발생하지 않는 항원 스위핑(sweeping) 현상에 중요하기 때문이다.
상응하는 단일특이적 항체 CNTO888 IgG1 및 인간화 11k2 IgG1은 각각 0.3 및 0.7 μg/ml의 IC₅₀ 값을 나타내는 반면, huIgG1 동형 대조군은 억제를 나타내지 않는다(도 8, 오른쪽 패널).
도 9: 유전자 변형 마우스 모델에서의 생체내 항종양 활성. Mab CKLO2-IgG1(Fc 야생형 IgG1) 및 CKLO2-SG1099((= CKLO2 pI 강화)를 사용한 마우스 종양 모델의 치료. 연구 종료 시 종양 부피(왼쪽), 종양 무게(중간) 및 M-MDSC 침윤물(오른쪽). (전달체는 검정색, CKLO2 야생형 IgG1은 회색, 및 CKLO2pI 강화 Fc(CKLO2-SG1099)는 흰색 막대/점선)
도 10: 이중특이적 항-CCL2 항체(전달체는 검정색, CKLO2 야생형 IgG1은 회색, pI 강화 Fc(CKLO2-SG1099)는 흰색 막대/점선)로 치료한 생체내 항종양 활성 연구(도 9의 효능 참조) 동안 혈청 총(왼쪽) 및 유리(오른쪽) CCL2 수준
도 11: 시노몰구스 원숭이에서 CCL2 스위핑 효율에 대한 개념 입증 연구. 시노몰구스 원숭이의 혈청에서 총 항체 농도-시간 곡선; 왼쪽 패널: 4가지 항체의 평균 농도-시간 곡선이 7일에 걸쳐 표시되고; 군 1: 최대 총 CCL2 축적의 대조군으로서 단일특이적 CNTO888-SG1(= IgG1 야생형) 항-CCL2 항체(n=3마리 동물); 군 2: pH 의존적 표적 결합은 갖지만 Fc 변형은 갖지 않는 이중 파라토프 항-CCL2 항체 CKLO2-SG1(IgG1 야생형)(n=3); 군 3: pH 의존적 표적 결합 및 Fc-pI 및 추가 변형을 갖는 이중 파라토프 항-CCL2 항체 CKLO2-SG1100(n=4) 및 군 4: pH 의존적 표적 결합을 갖고 Fc-pI, 강화된 FcγRIIb 친화도 및 추가 변형을 갖는 이중 파라토프 항-CCL2 항체 CKLO2-SG1095(n=4); 오른쪽 패널: PK 연구 기간(70일)에 걸친 개인 4(군 2)의 개별 농도-시간 곡선이 표시된다.
도 12: 시노몰구스 원숭이에서 CCL2 스위핑 효율에 대한 개념 입증 연구. 시노몰구스 원숭이의 혈청에서 총 CCL2 농도-시간 곡선; 왼쪽 패널: 4가지 항체의 평균 총 CCL2 농도-시간 곡선이 7일에 걸쳐 표시되고; 오른쪽 패널: PK 연구 기간(70일)에 걸친 개인 4(군 2)의 개별 총 CCL2 농도-시간 곡선이 표시된다.
도 13: 시노몰구스 원숭이의 혈청에서 유리 CCL2 농도-시간 곡선; 왼쪽 패널: 4가지 항체의 평균 유리 CCL2 농도-시간 곡선이 7일에 걸쳐 표시되고; 오른쪽 패널: PK 연구 기간(70일)에 걸친 개인 4(군 2)의 개별 유리 CCL2 농도-시간 곡선이 표시되며; 검출 한계 미만인 샘플에 대해 0.01 ng/mL(최저 정량 한계) 값을 사용하여 평균 곡선을 계산하였다.
도 14: 시노몰구스 원숭이에서 CCL2 스위핑 효율에 대한 PK/PD 연구. 시노몰구스 원숭이의 혈청에서 총 CKL02-SG1095 농도-시간 곡선(상이한 농도로 CKL02-SG1095 처리(군 1-3)); 왼쪽 패널: 3가지 용량 수준에 대한 평균 농도-시간 곡선(n=4)이 7일에 걸쳐 표시되고; 오른쪽 패널: 2개의 ADA 음성 개별 동물(25 mg/kg 용량 군)의 개별 농도-시간 곡선이 연구 기간(98일)에 걸쳐 표시된다.
도 15: 시노몰구스 원숭이에서 CCL2 스위핑 효율에 대한 PK/PD 연구. CNTO888-SG1 처리(군 4)와 비교하여 상이한 농도로 CKL02-SG1095 처리(군 1-3)한 시노몰구스 원숭이의 혈청에서 총 CCL2 농도-시간 곡선; 왼쪽 패널: 4개의 연구 군의 평균 총 CCL2 농도-시간 곡선(오차 막대는 SD를 나타냄)은 7일에 걸쳐 표시되고; 오른쪽 패널: 군 3(n=2, 오차 막대는 범위를 나타냄) 및 4(n=3, 오차 막대는 SD를 나타냄)의 ADA 음성 동물의 개별 총 CCL2 농도-시간 곡선은 PK 연구 기간(98일)에 걸쳐 표시된다.
도 16: 시노몰구스 원숭이에서 CCL2 스위핑 효율에 대한 PK/PD 연구. 시노몰구스 원숭이의 혈청에서 유리 CCL2 농도-시간 곡선; 왼쪽 패널: 4개의 연구 군의 평균 유리 CCL2 농도-시간 곡선(오차 막대는 SD를 나타냄)이 7일에 걸쳐 표시되고(상이한 농도의 CKL02-SG1095 처리(군 1-3) 및 CNTO888-SG1 처리(군 4)와 비교함); 오른쪽 패널: 군 3(n=2, 오차 막대는 범위를 나타냄) 및 4(n=3, 오차 막대는 SD를 나타냄)의 ADA 음성 동물의 평균 유리 CCL2 농도-시간 곡선이 PK 연구 기간(70일)에 걸쳐 표시되며; 검출 한계 미만인 샘플에 대해 0.01 ng/mL(최저 정량 하한) 값을 사용하여 평균 프로파일을 계산하였다.1 : Surface plasmon resonance (Biacore®) depicting the binding of monospecific anti-CCL2 antibodies (CNTO888 (= CNTO), 1A5, 1G9 and humanized 11K2 (= 11k2)) to recombinant CCL2 and CCL2 homologues. ) is a sensorgram.
Figure 2a: a) solid line: 0.1 mg/kg human CCL2 (hCCL2) and 20 mg/kg monospecific anti-CCL2 antibody CNTO888-SG1 (wild-type IgG1) or b) dashed line: 0.1 mg/kg human CCL2 (hCCL2) ) and 20 mg/kg of the monospecific anti-CCL2 antibody CNTO888-SG105 (Fc receptor-binding silencing IgG1) preformed immune complexes were intravenously injected into FcRn transgenic mice. The serum concentrations of hCCL2 over time were measured. show
Figure 2b: a) solid line: 0.1 mg/kg human CCL2 (hCCL2) and 20 mg/kg monospecific anti-CCL2 antibody 11K2-SG1 (wild-type IgG1) or b) dashed line: 0.1 mg/kg human CCL2 (hCCL2) ) and 20 mg/kg of monospecific anti-CCL2 antibody 11K2-SG105 (Fc receptor-binding silencing IgG1) preformed immune complexes were intravenously injected into FcRn transgenic mice and the serum concentrations of hCCL2 over time were measured. show
Figure 2c: a) solid line: 0.1 mg/kg human CCL2 (hCCL2) and 20 mg/kg monospecific anti-CCL2 antibody ABN912-SG1 (wild-type IgG1) or b) dashed line: 0.1 mg/kg human CCL2 (hCCL2) ) and 20 mg/kg of monospecific anti-CCL2 antibody ABN912-SG105 (Fc receptor-binding silencing IgG1) preformed immune complexes were intravenously injected into FcRn transgenic mice, and the serum concentrations of hCCL2 over time were measured show
Figure 2d: a) solid line: human CCL2 (hCCL2) at 0.1 mg/kg and monospecific anti-CCL2 antibody 1A4-SG1 (wild-type IgG1) at 20 mg/kg or b) dashed line: 0.1 mg/kg human CCL2 (hCCL2) ) and 20 mg/kg of monospecific anti-CCL2 antibody 1A4-SG105 (Fc receptor-binding silencing IgG1) preformed immune complexes were intravenously injected into FcRn transgenic mice, and the serum concentrations of hCCL2 over time were measured show
Figure 2e: a) solid line: 0.1 mg/kg human CCL2 (hCCL2) and 20 mg/kg monospecific anti-CCL2 antibody 1A5-SG1 (wild-type IgG1) or b) dashed line: 0.1 mg/kg human CCL2 (hCCL2) ) and 20 mg/kg of monospecific anti-CCL2 antibody 1A5-SG105 (Fc receptor-binding silencing IgG1) preformed immune complexes were intravenously injected into FcRn transgenic mice and the serum concentrations of hCCL2 over time were measured. show
Figure 2f: a) solid line: 0.1 mg/kg human CCL2 (hCCL2) and 20 mg/kg monospecific anti-CCL2 antibody 1G9-SG1 (wild-type IgG1) or b) dashed line: 0.1 mg/kg human CCL2 (hCCL2) ) and 20 mg/kg of a monospecific anti-CCL2 antibody 1G9-SG105 (Fc receptor-binding silencing IgG1) preformed immune complexes were intravenously injected into FcRn transgenic mice. The serum concentrations of hCCL2 over time were measured. show
Figure 2G: a) solid line: 0.1 mg/kg human CCL2 (hCCL2) and 20 mg/kg monospecific anti-CCL2 antibody 2F6-SG1 (wild-type IgG1) or b) dashed line: 0.1 mg/kg human CCL2 (hCCL2) ) and 20 mg/kg of monospecific anti-CCL2 antibody 2F6-SG105 (Fc receptor-binding silencing IgG1) preformed immune complexes were intravenously injected into FcRn transgenic mice, and the serum concentrations of hCCL2 over time were measured show
Figure 3: a) solid line: monospecific anti-CCL2 antibody 11K2-SG1 (wild-type IgG1) at 20 mg/kg or b) dotted line: monospecific anti-CCL2 antibody 11K2-SG105 (Fc receptor binding) at 20 mg/kg The time course of serum total mouse CCL2 concentration (Fig. 3a) and antibody-time curve (Fig. 3b) after intravenous injection of silent IgG1) into mice is shown.
Figure 4a: a) solid line: human CCL2 (hCCL2) at 0.1 mg/kg and bispecific anti-CCL2 antibody 11K2//1G9-WT IgG1 at 20 mg/kg (wild-type IgG1 bound with prototypical Fc receptor) or b) Dashed line: preformed immune complexes consisting of 0.1 mg/kg human CCL2 (hCCL2) and 20 mg/kg of the bispecific anti-CCL2 antibody 11K2//1G9-PGLALA (Fc receptor binding silencing IgG1) were administered to Balb/c mice. Serum concentrations of hCCL2 over time after intravenous injection are shown.
Figure 4b: a) Solid line: human CCL2 (hCCL2) at 0.1 mg/kg and bispecific anti-CCL2 antibody CNTO888//11K2-WT IgG1 at 20 mg/kg (wild-type IgG1 bound with prototypical Fc receptor) or b) Dotted line: preformed immune complexes consisting of 0.1 mg/kg human CCL2 (hCCL2) and 20 mg/kg of the bispecific anti-CCL2 antibody CNTO888//11K2-PGLALA (Fc receptor binding silencing IgG1) were administered to Balb/c mice. Serum concentrations of hCCL2 over time after intravenous injection are shown.
Figure 4c: a) Solid line: human CCL2 (hCCL2) at 0.1 mg/kg and bispecific anti-CCL2 antibody CNTO888//1G9-WT IgG1 at 20 mg/kg (wild-type IgG1 bound to a prototypical Fc receptor) or b) Dashed line: preformed immune complexes consisting of 0.1 mg/kg human CCL2 (hCCL2) and 20 mg/kg of the bispecific anti-CCL2 antibody 11K2//1G9-PGLALA (Fc receptor binding silencing IgG1) were administered to Balb/c mice. Serum concentrations of hCCL2 over time after intravenous injection are shown.
Figure 4d: a) Solid line: human CCL2 (hCCL2) at 0.1 mg/kg and bispecific anti-CCL2 antibody CNTO888//1A5-WT IgG1 at 20 mg/kg (wild-type IgG1 bound to a prototypical Fc receptor) or b) Dotted line: preformed immune complexes consisting of 0.1 mg/kg human CCL2 (hCCL2) and 20 mg/kg of the bispecific anti-CCL2 antibody CNTO888//1A5-PGLALA (Fc receptor binding silencing IgG1) were administered to Balb/c mice. Serum concentrations of hCCL2 over time after intravenous injection are shown.
Figure 4e: a) Solid line: human CCL2 (hCCL2) at 0.1 mg/kg and bispecific anti-CCL2 antibody 1A5//1G9-WT IgG1 at 20 mg/kg (wild-type IgG1 bound with prototypical Fc receptor) or b) Dotted line: preformed immune complexes consisting of 0.1 mg/kg human CCL2 (hCCL2) and 20 mg/kg of the bispecific anti-CCL2 antibody 1A5//1G9-PGLALA (Fc receptor binding silencing IgG1) were administered to Balb/c mice. Serum concentrations of hCCL2 over time after intravenous injection are shown.
Figure 4f: a) solid line: human CCL2 (hCCL2) at 0.1 mg/kg and bispecific anti-CCL2 antibody 11K2//2F6-WT IgG1 at 20 mg/kg (wild-type IgG1 bound to a prototypical Fc receptor) or b) Dotted line: Preformed immune complexes consisting of 0.1 mg/kg human CCL2 (hCCL2) and 20 mg/kg of the bispecific anti-CCL2 antibody 11K2//2F6-PGLALA (Fc receptor binding silencing IgG1) were administered to Balb/c mice. Serum concentrations of hCCL2 over time after intravenous injection are shown.
Figure 4g: a) solid line: human CCL2 (hCCL2) at 0.1 mg/kg and bispecific anti-CCL2 antibody ABN912//11K2-WT IgG1 at 20 mg/kg (wild-type IgG1 bound with prototypical Fc receptor) or b) Dashed line: a preformed immune complex consisting of 0.1 mg/kg human CCL2 (hCCL2) and 20 mg/kg of the bispecific anti-CCL2 antibody ABN912//11K2-PGLALA (Fc receptor-binding silencing IgG1) was administered to Balb/c mice. Serum concentrations of hCCL2 over time after intravenous injection are shown.
Figure 4h: a) Solid line: human CCL2 (hCCL2) at 0.1 mg/kg and bispecific anti-CCL2 antibody 1A4//2F6-WT IgG1 at 20 mg/kg (wild-type IgG1 bound to a prototypical Fc receptor) or b) Dotted line: preformed immune complexes consisting of 0.1 mg/kg human CCL2 (hCCL2) and 20 mg/kg of the bispecific anti-CCL2 antibody 1A4//2F6-PGLALA (Fc receptor binding silencing IgG1) were administered to Balb/c mice. Serum concentrations of hCCL2 over time after intravenous injection are shown.
Figure 4i: a) Solid line: human CCL2 (hCCL2) at 0.1 mg/kg and bispecific anti-CCL2 antibody 1A5//2F6-WT IgG1 at 20 mg/kg (wild-type IgG1 bound to a prototypical Fc receptor) or b) Dotted line: Preformed immune complexes consisting of 0.1 mg/kg human CCL2 (hCCL2) and 20 mg/kg of the bispecific anti-CCL2 antibody 1A5//2F6-PGLALA (Fc receptor binding silencing IgG1) were administered to Balb/c mice. Serum concentrations of hCCL2 over time after intravenous injection are shown.
Figure 5a: pH of 16 bispecific anti-CCL2 antibodies CKLO01 to CKLO16 resulting from the respective combined antigen binding moieties of 4 modified 11K2 and 4 CNTO888 variants, and 4 modified 11K2 and 4 CNTO888 variants. Biacore® sensorgram showing binding curves for monomeric CCL2 at 7.4 (black line) and pH 5.8 (grey line).
Figure 5B: Monomers of 16 bispecific anti-CCL2 antibodies CKLO01 to CKLO16 resulting from the respective combined antigen binding moieties of 4 modified 11K2 and 4 CNTO888 variants, and 4 modified 11K2 and 4 CNTO888 variants. Biacore® sensorgram showing the binding curve for CCL2. An additional dissociation step at pH 5.8 was incorporated into the Biacore® assay immediately after the dissociation step at pH 7.4.
Figure 6: Biacore® sensorgrams depicting the binding curves of the bispecific anti-CCL2 antibodies CKLO01, CKLO02, CKLO03 and CKLO04 to monomeric CCL8 at pH 7.4 (black line) and pH 5.8 (grey line).
Figure 7a: Serum of hCCL2 over time after injection into SCID mice with preformed immune complexes consisting of hCCL2 and bispecific anti-CCL2 antibodies (parental CNTO//11K2 and pH-dependent variants CKLO01, CKLO02, CKLO03 and CKLO04) concentration is shown.
7B: Serum concentrations of hCCL2 over time after injection of preformed immune complexes consisting of hCCL2 and CKLO03 (with IgG1 wild-type Fc) or CKLO03-SG1099 (CKLO03 with enhanced pI Fc) into SCID mice. .
Figure 8: Chemotaxis analysis: bispecific anti-CCL2 antibodies with identical CDRs and variable region VH/VL, i.e. CKLO2-IgG1 wild-type and CKLO2-SG1095, but different Fc moieties, migrate THP-1 cells with the same potency. can be inhibited (IC ₅₀ = 0.2 μg/ml; FIG. 8 , left panel).
Similarly, CCL2-0048, the parent unmodified bispecific antibody CNTO888/11k2k2 IgG1 of CKLO2, which is pH independent, also exhibits an IC ₅₀ of 0.2 μg/ml. This is because pH dependence is important for antigen sweeping events that do not occur in this assay.
The corresponding monospecific antibodies CNTO888 IgG1 and humanized 11k2 IgG1 showed IC ₅₀ values of 0.3 and 0.7 μg/ml, respectively, whereas the huIgG1 isotype control showed no inhibition ( FIG. 8 , right panel).
Figure 9: In vivo antitumor activity in a transgenic mouse model. Treatment of mouse tumor models with Mab CKLO2-IgG1 (Fc wild-type IgG1) and CKLO2-SG1099 ((= CKLO2 pI enhancement). Tumor volume (left), tumor weight (middle) and M-MDSC infiltrate (right) at study end. ).
Figure 10: In vivo antitumor activity study of treatment with bispecific anti-CCL2 antibody (carrier is black, CKLO2 wild-type IgG1 is gray, pI enhanced Fc (CKLO2-SG1099) is white bar/dotted line) (see efficacy in Figure 9) ) serum total (left) and free (right) CCL2 levels during
Figure 11: A proof-of-concept study of CCL2 sweeping efficiency in cynomolgus monkeys. total antibody concentration-time curves in the serum of cynomolgus monkeys; Left panel: mean concentration-time curves of the four antibodies are shown over 7 days; Group 1: monospecific CNTO888-SG1 (=IgG1 wild-type) anti-CCL2 antibody (n=3 animals) as control of maximal total CCL2 accumulation; Group 2: biparatopic anti-CCL2 antibody CKLO2-SG1 (IgG1 wild type) with pH dependent target binding but no Fc modification (n=3); Group 3: biparatopic anti-CCL2 antibody CKLO2-SG1100 (n=4) with pH-dependent target binding and Fc-pI and further modifications and Group 4: Fc-pI, enhanced FcγRIIb affinity with pH-dependent target binding. and the biparatopic anti-CCL2 antibody CKLO2-SG1095 with further modifications (n=4); Right panel: individual concentration-time curves for individual 4 (group 2) over the PK study period (70 days) are shown.
Figure 12: A proof-of-concept study of CCL2 sweeping efficiency in cynomolgus monkeys. Total CCL2 concentration-time curves in the serum of cynomolgus monkeys; Left panel: mean total CCL2 concentration-time curves of the four antibodies are shown over 7 days; Right panel: Individual total CCL2 concentration-time curves for individual 4 (group 2) over the period of the PK study (70 days) are shown.
Figure 13: Free CCL2 concentration-time curve in the serum of cynomolgus monkeys; Left panel: mean free CCL2 concentration-time curves of the four antibodies are shown over 7 days; Right panel: individual free CCL2 concentration-time curves for individual 4 (group 2) over the PK study period (70 days) are shown; A mean curve was calculated using a value of 0.01 ng/mL (lowest limit of quantitation) for samples below the limit of detection.
Figure 14: PK/PD study of CCL2 sweeping efficiency in cynomolgus monkeys. Total CKL02-SG1095 concentration-time curve in the serum of cynomolgus monkeys (CKL02-SG1095 treatment at different concentrations (Groups 1-3)); Left panel: mean concentration-time curves (n=4) for the three dose levels are shown over 7 days; Right panel: individual concentration-time curves of two ADA negative individual animals (25 mg/kg dose group) are shown over the study period (98 days).
Figure 15: PK/PD study of CCL2 sweeping efficiency in cynomolgus monkeys. Total CCL2 concentration-time curves in the serum of cynomolgus monkeys treated with CKL02-SG1095 at different concentrations (groups 1-3) compared to CNTO888-SG1 treatment (group 4); Left panel: mean total CCL2 concentration-time curves (error bars represent SD) for the four study groups are shown over 7 days; Right panel: Individual total CCL2 concentration-time curves from ADA negative animals in groups 3 (n=2, error bars indicate range) and 4 (n=3, error bars indicate SD) were plotted over the duration of the PK study (98 days). ) is displayed over the
Figure 16: PK/PD study of CCL2 sweeping efficiency in cynomolgus monkeys. Free CCL2 concentration-time curves in the serum of cynomolgus monkeys; Left panel: Mean free CCL2 concentration-time curves (error bars indicate SD) for the four study groups are shown over 7 days (different concentrations of CKL02-SG1095 treatment (Groups 1-3) and CNTO888-SG1 treatment (Groups 1-3) ( compared to group 4)); Right panel: Mean free CCL2 concentration-time curves of ADA-negative animals in groups 3 (n=2, error bars indicate ranges) and 4 (n=3, error bars indicate SD) for the duration of the PK study (70 days). ) are shown over; A mean profile was calculated using a value of 0.01 ng/mL (lowest lower limit of quantitation) for samples below the limit of detection.

본 발명은 인간 CCL2 상의 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 이중특이적 항-CCL2 항체, 이의 약학적 조성물, 이의 제조, 및 암, 염증성, 자가면역 및 안과 질환들을 치료하기 위한 약제로서의 사용에 관한 것이다. 따라서, 항체는 인간 CC2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 상이한 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 상이한 제2 항원 결합 부위를 포함한다. The present invention relates to bispecific anti-CCL2 antibodies that bind to two different epitopes on human CCL2, pharmaceutical compositions thereof, preparation thereof, and use as medicaments for the treatment of cancer, inflammatory, autoimmune and ophthalmic diseases. Thus, an antibody comprises a first antigen binding site that (specifically) binds a first epitope on human CC2 and a different second antigen binding site that (specifically) binds a different second epitope.

본 발명은 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, 이중특이적 항체를 포함하고,The present invention relates to a bispecific antibody comprising a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a second antigen binding site that (specifically) binds to a second epitope on human CCL2 including,

i) 상기 제1 항원 결합 부위는 CCL2 상의 동일한 에피토프에 항체로서 결합하고, 상기 항체는, i) said first antigen binding site binds as an antibody to the same epitope on CCL2, said antibody comprising:

서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하며, (a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47, (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, and (c) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43 a VH domain comprising a CDR-H3 comprising an amino acid sequence; and a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:48, and (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:44; and a VL domain comprising (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46.

용어 "에피토프"는 항체에 특이하게 결합할 수 있는 임의의 폴리펩티드 결정인자를 포함한다. 특정 구현예들에서, 에피토프 결정인자는 분자, 예컨대 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴, 또는 설포닐의 화학적 활성 표면 그룹화를 포함하고, 특정 구현예들에서, 특정 3차원 구조 특성, 및/또는 특정 전하 특성을 가질 수 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합된 항원의 영역이다. 본 발명은 인간 CCL2 상의 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 이중특이적 항-CCL2 항체에 관한 것이다. 제1 에피토프 및 제2 에피토프는 인간 CCL2의 2개의 상이한 에피토프를 나타낸다. 따라서, 제2 에피토프는 제1 에피토프와 상이하다. 항체가 참조 항-CCL2 항원 결합 부위와 동일한 에피토프에 결합하는지, 또는 이의 결합에 대해 경쟁하는지 여부를 당업계에 공지된 일상적인 방법을 사용하여 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들어, 시험 항체가 본 발명의 참조 항-CCL2 항원 결합 부위와 동일한 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위해, 참조 항체는 포화 조건 하에서 이의 CCL2 도메인에 결합하도록 허용된다. 다음으로, 인간 CCL2에 결합하는 시험 항체의 능력이 평가된다. 시험 항체가 참조 항-CCL2 항원 결합 부위와의 포화 결합 후 인간 CCL2에 결합할 수 있다면, 시험 항체가 참조 항-CCL2 항원 결합 부위와 상이한 에피토프에 결합한다고 결론내릴 수 있다. 반면에, 시험 항체가 참조 항-CCL2 항체와의 포화 결합 후 인간 CCL2에 결합할 수 없다면, 시험 항체는 본 발명의 참조 항-CCL2 항체에 의해 결합된 에피토프와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 그런 다음, 시험 항체의 관찰된 결합의 결핍이 실제로 참조 항체와 동일한 에피토프에 대한 결합 때문인지, 또는 입체 차단(또는 다른 현상)이 관찰된 결합 결핍의 원인인지를 확인하기 위해, 추가적인 일상적인 실험(예컨대, 펩티드 돌연변이 및 결합 분석)을 실시할 수 있다. 상기 종류의 실험은 ELISA, RIA, 표면 플라즈몬 공명(예컨대, 비아코어), 유세포 분석 또는 당업계에서 이용 가능한 임의의 다른 정량적 또는 정성적 항체 결합 분석을 사용하여 실시할 수 있다. 본 발명의 특정 구현예들에 따르면, 예컨대, 1-, 5-, 10-, 20- 또는 100배 과량의 한 항체는, 경쟁 결합 분석에서 측정할 때, 다른 항체의 결합을 적어도 50%, 하지만 바람직하게는 75%, 90% 또는 심지어 99% 만큼 억제하는 경우, 2개의 항체는 동일한(또는 중복되는) 에피토프에 결합한다(예컨대, Junghans et al., Cancer Res. 1990:50:1495-1502를 참조).The term "epitope" includes any polypeptide determinant capable of specifically binding to an antibody. In certain embodiments, epitope determinants include chemically active surface groupings of molecules, such as amino acids, sugar side chains, phosphoryl, or sulfonyl, in certain embodiments, specific three-dimensional structural properties, and/or specific charges. can have characteristics. An epitope is a region of an antigen bound by an antibody. The present invention relates to bispecific anti-CCL2 antibodies that bind to two different epitopes on human CCL2. The first epitope and the second epitope represent two different epitopes of human CCL2. Thus, the second epitope is different from the first epitope. Whether an antibody binds to, or competes for binding to, the same epitope as a reference anti-CCL2 antigen binding site can be readily determined using routine methods known in the art. For example, to determine whether a test antibody binds to the same epitope as a reference anti-CCL2 antigen binding site of the invention, a reference antibody is allowed to bind to its CCL2 domain under saturating conditions. Next, the ability of the test antibody to bind human CCL2 is assessed. If the test antibody is able to bind human CCL2 after saturating binding with the reference anti-CCL2 antigen binding site, it can be concluded that the test antibody binds to a different epitope than the reference anti-CCL2 antigen binding site. On the other hand, if the test antibody is unable to bind human CCL2 after saturating binding with the reference anti-CCL2 antibody, the test antibody may bind to the same epitope as the epitope bound by the reference anti-CCL2 antibody of the present invention. Then, additional routine experiments ( eg, peptide mutation and binding assays). Experiments of this kind can be performed using ELISA, RIA, surface plasmon resonance (eg, Biacore), flow cytometry, or any other quantitative or qualitative antibody binding assay available in the art. According to certain embodiments of the invention, for example, a 1-, 5-, 10-, 20- or 100-fold excess of one antibody reduces binding of the other antibody by at least 50%, but Preferably, when inhibiting by 75%, 90% or even 99%, the two antibodies bind to the same (or overlapping) epitope (see, e.g., Junghans et al., Cancer Res. 1990:50:1495-1502). Reference).

대안적으로, 하나의 항체의 결합을 감소하거나 제거하는 항원의 본질적으로 모든 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소하거나 제거하는 경우, 2개의 항체가 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 간주된다. 한 항체의 결합을 감소하거나 제거하는 아미노산 돌연변이의 하위 집합 만이 다른 항체의 결합을 감소하거나 제거하는 경우, 두 항체는 "중복 에피토프"를 갖는 것으로 간주된다.Alternatively, two antibodies are considered to bind to the same epitope if essentially all amino acid mutations in the antigen that reduce or eliminate binding of one antibody reduce or eliminate binding of the other antibody. Two antibodies are considered to have "overlapping epitopes" if only a subset of amino acid mutations that reduce or eliminate binding of one antibody reduce or eliminate binding of the other.

항체가 참조 항-CCL2 항체와 결합에 대해 경쟁하는지 여부를 결정하기 위해, 상기 기재된 결합 방법론은 두 가지 방향으로 실시한다: 제1 방향에서, 참조 항체는 포화 조건 하에서 CCL2에 결합하도록 허용되고, 이어서 인간 CCL2에 대한 시험 항체의 결합이 평가된다. 제2 방향에서, 시험 항체는 포화 조건 하에서 CCL2 분자에 결합하도록 허용되고, 이어서 인간 CCL2에 대한 참조 항체의 결합이 평가된다. 두 방향 모두에서, 제1 (포화)항체만이 CCL2 분자에 결합할 수 있는 경우, 시험 항체 및 참조 항체가 CCL2에 결합하기 위해 경쟁한다고 결론내릴 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 참조 항체와 결합에 대해 경쟁하는 항체는 참조 항체와 동일한 에피토프에 반드시 결합할 필요는 없지만, 중첩된 또는 인접한 에피토프에 결합함으로써 참조 항체의 결합을 입체적으로 차단할 수 있다.To determine whether an antibody competes for binding with a reference anti-CCL2 antibody, the binding methodology described above is carried out in two directions: in a first direction, the reference antibody is allowed to bind to CCL2 under saturating conditions, and then Binding of the test antibody to human CCL2 is assessed. In a second orientation, the test antibody is allowed to bind to a CCL2 molecule under saturating conditions, and then binding of the reference antibody to human CCL2 is assessed. If, in both directions, only the first (saturated) antibody is capable of binding the CCL2 molecule, it can be concluded that the test antibody and the reference antibody compete for binding to CCL2. As will be understood by one of ordinary skill in the art, an antibody that competes for binding with a reference antibody does not necessarily bind to the same epitope as the reference antibody, but may sterically block binding of the reference antibody by binding to an overlapping or contiguous epitope.

본원에 사용될 때, "MCP-1"이라고도 하는 "CCL2", "인간 CCL2"라는 용어는 NCBI 기록 등록 번호 NP_002973에서 참조되고, CCL2, MCP-1(단핵구 화학주성 단백질 1), SMC-CF(평활근 세포 화학주성 인자), LDCF(림프구 유래 화학주성 인자), GDCF(신경교종 유래 단핵구 화학주성 인자), TDCF(종양 유래 화학주성 인자), HCl1(인간 사이토카인 11), MCAF(단핵구 화학주성 및 활성화 인자)로서 다양하게 공지된 76 아미노산 서열을 의미한다. 유전자 기호는 인간 염색체 17번의 JE 유전자인 SCYA2이고, 새로운 명칭은 CCL2이다(Zlotnik, Yoshie 2000. Immunity 12: 121-127). JE는 인간 MCP-1/CCL2의 마우스 동족체이다.As used herein, the terms "CCL2", "human CCL2", also referred to as "MCP-1" are referenced in NCBI Record Accession No. NP_002973, and include CCL2, MCP-1 (monocyte chemotactic protein 1), SMC-CF (smooth muscle Cell chemotactic factor), LDCF (lymphocyte-derived chemotactic factor), GDCF (glioma-derived monocyte chemotactic factor), TDCF (tumor-derived chemotactic factor), HCl1 (human cytokine 11), MCAF (monocyte chemotaxis and activation) factor) variously known 76 amino acid sequences. The gene symbol is SCYA2, the JE gene of human chromosome 17, and the new name is CCL2 (Zlotnik, Yoshie 2000. Immunity 12: 121-127). JE is a mouse homologue of human MCP-1/CCL2.

Handel 외(Biochemistry.　1996; 35:6569-6584)는 CCL2 이량체의 용매 구조를 결정하였다. 상기 연구는 CCL2의 2차 구조가 4개의 β 시트로 구성되어 있음을 나타낸다. 추가적으로, CCL2의 이량체화 계면을 담당하는 잔기는 Zhang 및 Rollins에 의해 설명되었다(Mol Cell Biol.　1995; 15:4851-4855). 단백질 복합체는 큰 주머니를 형성하는 방식으로 배향된 두 개의 단량체로 길게 나타난다. 두 가지 결정 형태, 소위 I 및 P 형태의 단량체 및 이량체 CCL2의 구조가 또한 결정되었고(Lubkowski et al., Nat Struct Biol.　1997; 4:64-69). Paolini et al, (J Immunol.　1994 Sep 15;153(6):2704-17), MCP1/CCL2는 생리학적으로 적절한 농도에서 단량체로 존재한다고 설명하였다: rec. CCL2 단백질(페프로텍(Peprotech)에서 구입)을 크기 배제 HPLC, 침강 평형 초원심분리 및 화학적 가교로 분석함으로써, MCP-1의 단량체 및 이량체 형태의 중량 분율이 시험관 내 협력에 의존한다는 것을 보여줄 수 있다. 마지막으로, Seo 외(J Am Chem Soc.　2013 Mar 20;135(11):4325-32)는 생리학적 조건 하에서 단량체 및 이량체 형태 둘 모두로 주입된 CCL2의 존재를 이온 이동성 질량 분석법으로 나타낼 수 있다.Handel et al. (Biochemistry. 1996; 35:6569-6584) determined the solvent structure of CCL2 dimers. This study indicates that the secondary structure of CCL2 consists of four β sheets. Additionally, the residues responsible for the dimerization interface of CCL2 were described by Zhang and Rollins (Mol Cell Biol. 1995; 15:4851-4855). Protein complexes appear elongated as two monomers oriented in such a way as to form large pockets. The structures of monomeric and dimeric CCL2 in two crystal forms, the so-called I and P forms, have also been determined (Lubkowski et al., Nat Struct Biol. 1997; 4:64-69). Paolini et al, (J Immunol. 1994 Sep 15;153(6):2704-17), described that MCP1/CCL2 exists as a monomer at physiologically appropriate concentrations: rec. By analyzing the CCL2 protein (purchased from Peprotech) by size exclusion HPLC, sedimentation equilibrium ultracentrifugation, and chemical crosslinking, we could show that the weight fractions of the monomeric and dimeric forms of MCP-1 depend on collaboration in vitro. have. Finally, Seo et al. (J Am Chem Soc. 2013 Mar 20;135(11):4325-32) reported that the presence of implanted CCL2 in both monomeric and dimeric forms under physiological conditions could be indicated by ion mobility mass spectrometry. have.

따라서, "야생형 CCL-2"(wt CCL2)는 단량체로 존재할 수 있지만, 실제로 생리학적 농도에서 이량체를 형성할 수도 있다. 상기 단량체-이량체 평형은 확실히 상이하며, 이는 상이한 농도가 사용될 수 있는 기재된 모든 시험관 내 실험에 대해 신중하게 고려해야 한다. 불확실성을 피하기 위해, 점 돌연변이된 CCL2 변이체를 생성하였다: CCL2의 "P8A" 변이체는 이량체화 계면에 돌연변이를 수반하여, 정의된 순수한 CCL2 단량체로 이어지는 이량체를 형성할 수 없다. 이와 대조적으로, CCL2의 "T10C"" 변이체는 CCL2의 고정된 이량체를 생성한다(J Am Chem Soc.　2013 Mar 20;135(11):4325-32).Thus, while "wild-type CCL-2" (wt CCL2) can exist as a monomer, it can also actually form dimers at physiological concentrations. The monomer-dimer equilibria are distinctly different, and this should be carefully considered for all in vitro experiments described in which different concentrations may be used. For the avoidance of doubt, point mutated CCL2 variants were generated: the "P8A" variant of CCL2 carries mutations at the dimerization interface, which cannot form dimers leading to the defined pure CCL2 monomer. In contrast, the “T10C”” variant of CCL2 produces an immobilized dimer of CCL2 (J Am Chem Soc. 2013 Mar 20;135(11):4325-32).

CCL2/CCR2 축은 미성숙 골수 세포가 종양으로 동원되는 주요 매개체이다. CCL2는 악성 세포에 의해 과발현되고 세포외 기질(ECM)에 결합하여 화학 유인 물질 구배를 형성한다. 일단 종양에 도달하면, 골수 유래 억제 세포(MDSC)는 항종양 T 세포 반응의 개시를 억제하는 항염증성 사이토카인/수용체를 분비/상향 조절함으로써 전종양 형성 환경에 기여한다. 이러한 방식으로, MDSC는 T 세포 활성화 요법의 효능을 감소시키거나 심지어 손상시킬 수 있다(Meyer et al, 2014). 따라서, 이러한 미성숙 골수 세포의 동원을 특이적으로 억제하면 관문 억제제, T 세포 이중특이적 및 암 면역요법의 효능을 높일 수 있을 것이다. 또한, CCL2는 혈관신생, 전이 및 종양 성장의 촉진과도 관련이 있으며, 이는 CCL2를 중화하는 것이 여러 방식의 항종양 개입에 기여할 수 있음을 시사한다.The CCL2/CCR2 axis is a major mediator by which immature bone marrow cells are recruited into tumors. CCL2 is overexpressed by malignant cells and binds to the extracellular matrix (ECM) to form a chemoattractant gradient. Once reaching the tumor, bone marrow-derived suppressor cells (MDSCs) contribute to the pro-tumorigenic environment by secreting/up-regulating anti-inflammatory cytokines/receptors that inhibit the initiation of anti-tumor T cell responses. In this way, MDSCs can reduce or even impair the efficacy of T cell activating therapies (Meyer et al, 2014). Therefore, specific inhibition of the recruitment of these immature bone marrow cells may enhance the efficacy of checkpoint inhibitors, T cell bispecific and cancer immunotherapy. In addition, CCL2 is also associated with promotion of angiogenesis, metastasis and tumor growth, suggesting that neutralizing CCL2 may contribute to multiple modalities of antitumor intervention.

이의 수용체와 대조적으로, CCL2를 표적으로 삼는 것은 Th1 및 NK 세포와 같은 다른 면역 세포 군의 동원에 관여하는, 리간드는 상이하지만(예: CCL7, CCL8, CCL13) 동일한 수용체(CCR2)를 통해 신호를 보낼 수 있는 것들을 피하면서 원하지 않는 CCL2 매개 효과를 특이적으로 억제할 것이다.In contrast to its receptor, targeting CCL2 signals through the same receptor (CCR2), although different ligands (e.g. CCL7, CCL8, CCL13) are involved in the recruitment of other immune cell populations such as Th1 and NK cells. It will specifically inhibit unwanted CCL2-mediated effects while avoiding those that may send.

임상적으로, CCL2는 상이한 염증성 질환들, 예컨대 류마티스 관절염(Haringman et al, 2006), 특발성 폐섬유증(Raghu et al, 2015), 당뇨병성 신증(Menne et al, 2016) 및 암(Sandhu et al, 2013)에 의해 증가된 수치를 중화하는 것을 목표로 하는 여러 연구에서 선호되는 항체 표적이었다. 하지만, 관찰된 높은 생체내 항체-항원 해리 상수(KD)와 함께 이의 높은 합성 속도는 임상적으로 실행 가능한 용량에서 기존 항체에 의한 유리 CCL2 억제를 방해하는 주요 장애물로 입증되었다(Fetterly et al, 2013).Clinically, CCL2 is associated with different inflammatory diseases, such as rheumatoid arthritis (Haringman et al, 2006), idiopathic pulmonary fibrosis (Raghu et al, 2015), diabetic nephropathy (Menne et al, 2016) and cancer (Sandhu et al, 2013) was the preferred antibody target in several studies aimed at neutralizing levels increased by . However, its high synthesis rate, along with the observed high in vivo antibody-antigen dissociation constant (KD), has proven to be a major obstacle to inhibition of free CCL2 by conventional antibodies at clinically viable doses (Fetterly et al, 2013). ).

CCL2 중화는 CCL2의 혈청 수준이 상승된 환자에게서 더 분명히 관련이 있는 것으로 보이며, 이는 유방암(BC), 난소암(OvCa), 결장직장암(CRC), 췌장암 및 전립선암과 같은 여러 유형의 암에서 관찰되었다. 하지만, 이러한 혈청학을 나타내지는 않지만 종양이 골수 계통의 면역 세포로 심하게 침윤된 이러한 적응증 내의 환자의 경우라도, 위에서 언급한 바와 같이 종양 맥락에서 CCL2가 수행하는 많은 역할로 인해 이러한 신규 치료법으로부터 많은 도움을 받을 수 있다.CCL2 neutralization appears to be more clearly relevant in patients with elevated serum levels of CCL2, observed in several types of cancer, such as breast (BC), ovarian (OvCa), colorectal (CRC), pancreatic, and prostate cancers. became However, even in patients within these indications, who do not exhibit such serology but whose tumors have been heavily infiltrated with immune cells of the myeloid lineage, as mentioned above, many of the roles CCL2 plays in the context of tumors may benefit greatly from these novel therapies. can receive

본원에 사용된 바와 같이, "인간 CCL2에 결합하는", "인간 CCL2에 특이적으로 결합하는", "인간 CCL2에 결합하는" 항체 또는 "항-CCL2 항체"는 5.0 x 10^-8 mol/l 이하의 K_D 값, 일 구현예에서는 1.0 x 10^-9 mol/l 이하의 K_D 값, 일 구현예에서는 5.0 x 10^-8 mol/l 내지 1.0 x 10^-13 mol/l의 K_D 값의 결합 친화도로 인간 CCL2 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다. As used herein, an antibody that “binds to human CCL2”, “binds specifically to human CCL2”, “binds to human CCL2” or “anti-CCL2 antibody” is 5.0×10 ⁻⁸ mol/l a K _D value of less than or equal to, in one embodiment a K _D value of 1.0 x 10 ^-9 mol/l or less, and in an embodiment a K _D value of 5.0 x 10 ^-8 mol/l to 1.0 x 10 ^-13 mol/l Refers to an antibody that specifically binds to human CCL2 antigen with binding affinity.

결합 친화도는 표준 결합 분석, 예컨대 표면 플라즈몬 공명 기술(비아코어®, GE-헬스케어(Healthcare), 스웨덴 웁살라 소재)을 통해, 예컨대 CCL2 세포외 도메인(예컨대, 자연 발생 3차원 구조의)을 포함하는 구성물을 사용하여 결정한다. 일 구현예에서, 결합 친화도는 예시적인 가용성 CCL2를 사용하는 표준 결합 분석으로 결정한다.Binding affinity is measured via standard binding assays, such as surface plasmon resonance technology (BIACORE®, GE-Healthcare, Uppsala, Sweden), such as including the CCL2 extracellular domain (eg, of a naturally occurring three-dimensional structure). It is decided by using the In one embodiment, binding affinity is determined in a standard binding assay using exemplary soluble CCL2.

항체 특이성은 항원의 특정 에피토프에 대한 항체의 선택적 인식을 지칭한다. 예를 들어, 천연 항체는 단일특이적이다.Antibody specificity refers to the selective recognition of an antibody for a specific epitope on an antigen. For example, natural antibodies are monospecific.

본원에 사용된 용어 "단일특이적" 항체는 각각이 동일한 항원의 동일한 에피토프에 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 갖는 항체를 나타낸다.The term "monospecific" antibody, as used herein, refers to an antibody having one or more binding sites, each binding to the same epitope of the same antigen.

본원에서 사용된 용어 "(인간)CCL2에 결합하는 이중특이적 항체", "(인간)CCL2에 결합하는 이중 파라토프 항체", "이중특이적 항-CCL2 항체", "이중 파라토프 항-CCL2 항체"는 항체가 (인간)CCL2 상의 적어도 2개의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있음을 의미한다. 전형적으로, 상기 이중특이적 항체는 2개의 상이한 항원 결합 부위(2개의 상이한 파라토프)를 포함하며, 이의 각각은 (인간)CCL2의 상이한 에피토프에 특이적이다. 특정 구현예들에서, 이중특이적 항체는 CCL2 상의 2개의 상이한 비중첩 에피토프에 결합할 수 있으며, 이는 2개의 상이한 항원 결합 부위가 CCL2에 대한 결합에 대해 경쟁하지 않는다는 것을 의미한다.As used herein, the terms "bispecific antibody that binds (human)CCL2", "biparatopic antibody that binds (human)CCL2", "bispecific anti-CCL2 antibody", "biparatopic anti-CCL2 By "antibody" is meant that the antibody is capable of specifically binding to at least two different epitopes on (human)CCL2. Typically, such bispecific antibodies comprise two different antigen binding sites (two different paratopes), each of which is specific for a different epitope of (human)CCL2. In certain embodiments, a bispecific antibody is capable of binding two different non-overlapping epitopes on CCL2, meaning that the two different antigen binding sites do not compete for binding to CCL2.

본원의 목적으로 “수용체 인간 프레임워크”는, 하기에 정의된 바와 같이, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인(VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크“로부터 유래된” 수용체 인간 프레임워크는 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 구현예들에서, 아미노산 변화의 수는 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 또는 2 이하이다. 일부 구현예들에서, VL 수용체 인간 프레임워크는 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 공통 프레임워크 서열과 동일한 서열을 갖는다. An “acceptor human framework” for the purposes of this application, as defined below, refers to a light chain variable domain (VL) framework or a heavy chain variable domain (VH) framework derived from a human immunoglobulin framework or a human consensus framework. It is a framework comprising an amino acid sequence. An acceptor human framework “derived from” a human immunoglobulin framework or human consensus framework may comprise its identical amino acid sequence, or may contain amino acid sequence changes. In some embodiments, the number of amino acid changes is 10 or less, 9 or less, 8 or less, 7 or less, 6 or less, 5 or less, 4 or less, 3 or less, or 2 or less. In some embodiments, the VL acceptor human framework has a sequence identical to a VL human immunoglobulin framework sequence or a human consensus framework sequence.

본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미에서 사용되고, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 다중특이적 항체(예컨대, 이중특이적 항체), 및 항체 단편(이들이 원하는 항원 결합 활성을 나타내기만 하면)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다양한 항체 구조를 수반한다.The term "antibody" is used herein in its broadest sense and includes monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, multispecific antibodies (eg, bispecific antibodies), and antibody fragments, provided that they exhibit the desired antigen-binding activity. However, it involves a variety of antibody structures, including but not limited to.

“항체 단편”은 원형 항체가 결합하는 항원을 결합하는 상기 원형 항체의 일부를 포함하는 원형 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 비제한적으로 Fv, Fab, Fab', Fab’-SH, F(ab')₂; 디아바디; 선형 항체; 단쇄 항체 분자(예컨대, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. “Antibody fragment” refers to a molecule other than a prototype antibody comprising a portion of the prototype antibody that binds the antigen to which it binds. Examples of antibody fragments include, but are not limited to, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab') ₂ ; diabody; linear antibody; single chain antibody molecules (eg, scFv); and multispecific antibodies formed from antibody fragments.

본원에서 사용된 용어 “~가(valent)”는 항체 내에 명시된 수의 항원 결합 부위의 존재를 표시한다. 따라서, 용어 “항원에 일가 결합”은 항체 내에 항원에 대해 특이적인 하나(및 하나보다 많지 않은) 항원 결합 부위의 존재를 표시한다. As used herein, the term “valent” indicates the presence of a specified number of antigen binding sites in an antibody. Thus, the term “monovalent binding to an antigen” indicates the presence in an antibody of one (and no more than one) antigen binding site specific for the antigen.

용어 “항원 결합 부위”는 항원과의 상호작용을 제공하는, 항체의 부위 또는 영역, 즉 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 지칭한다. 예를 들어, 항체의 항원 결합 부위는 상보성 결정 영역(CDRs)으로부터 아미노산 잔기를 포함한다. 일 구현예에서, 항체의 항원 결합 부위는 VH 및 VL로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. 선천적 면역글로불린 분자는 전형적으로 2개의 항원 결합 부위를 갖고, Fab 분자는 전형적으로 단일 항원 결합 부위를 갖는다. "항원 결합 모이어티"는 항원 결정기에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드 분자를 지칭한다. 항원 결합 모이어티는 본원에서 추가로 정의된 바와 같은 항체 및 이들의 단편을 포함한다. 특정 항원 결합 모이어티는 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체의 항원 결합 도메인을 포함한다. 특정 구현예들에서, 항원 결합 모이어티는 본원에서 추가로 정의되고 당해 분야에서 공지된 바와 같은 항체 불변 영역을 포함할 수 있다. 유용한 중쇄 불변 영역은 5가지 동형: α, δ, ε, γ, 또는 μ 중 임의의 것을 포함한다. 유용한 경쇄 불변 영역은 2가지 동형: κ 및 λ 중 임의의 것을 포함한다.The term “antigen binding site” refers to a site or region of an antibody, ie, one or more amino acid residues, that provides for interaction with an antigen. For example, the antigen binding site of an antibody comprises amino acid residues from complementarity determining regions (CDRs). In one embodiment, the antigen binding site of an antibody comprises amino acid residues from VH and VL. Innate immunoglobulin molecules typically have two antigen binding sites, and Fab molecules typically have a single antigen binding site. "Antigen binding moiety" refers to a polypeptide molecule comprising an antigen binding site that specifically binds to an antigenic determinant. Antigen binding moieties include antibodies and fragments thereof as further defined herein. Particular antigen binding moieties comprise an antigen binding domain of an antibody, comprising an antibody heavy chain variable region and an antibody light chain variable region. In certain embodiments, an antigen binding moiety may comprise an antibody constant region as further defined herein and known in the art. Useful heavy chain constant regions include any of the five isoforms: α, δ, ε, γ, or μ. Useful light chain constant regions include any of two isoforms: κ and λ.

본원에 사용된 용어 "항원 결정기" 또는 "항원"은 항원 결합 모이어티/부위가 결합하여 항원 결합 모이어티-항원 복합체를 형성하는 폴리펩티드 거대분자 상의 부위를 지칭한다. 유용한 항원 결정인자는, 예를 들어 종양 세포의 표면 상에서, 바이러스 감염된 세포의 표면 상에서, 다른 병든 세포의 표면 상에서, 면역 세포의 표면 상에서, 혈청에서 자유롭게 및/또는 세포외 기질 (ECM)에서 발견될 수 있다. As used herein, the term “antigenic determinant” or “antigen” refers to a site on a polypeptide macromolecule to which an antigen binding moiety/site binds to form an antigen binding moiety-antigen complex. Useful antigenic determinants may be found, for example, on the surface of tumor cells, on the surface of virus-infected cells, on the surface of other diseased cells, on the surface of immune cells, freely in serum and/or in the extracellular matrix (ECM). can

용어 “키메라” 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되는 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부분이 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래되는 항체를 지칭한다.The term “chimeric” antibody refers to an antibody in which a portion of the heavy and/or light chain is derived from a particular source or species, while the remainder of the heavy and/or light chain is derived from a different source or species.

항체의 “부류”는 이의 중쇄에 의해 보유된 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체에는 5가지 주요 부류가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 그리고 이들중 몇몇은 하위부류(동형), 예컨대, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁, 및 IgA₂로 더 세분화될 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 해당하는 중쇄 불변 도메인들은 각각 a, d, e, g, 및 m로 불린다. 바람직하게는, 본 발명의 이중특이적 항체는 인간 IgG 동형, 더 바람직하게는 인간 IgG1 동형이다. 본원에 사용된 용어 IgG 동형 및 IgG1 동형은 인간 IgG 동형 및 인간 IgG1 동형을 지칭한다. 일반적으로, 상이한 IgG 동형은 IgG 하위부류 간의 대립유전자 변이에 기초하여 약간 상이한 동종이인자형의 형태로 존재한다(Vidarsson et al.; Front Immunol 5 ( 2014) Article 520, 1-17을 참조). 작용제의 "유효량", 예컨대 약학적 제형은 원하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기 위해 필요한 기간 동안 및 투여량에서 효과적인 양을 지칭한다.A “class” of an antibody refers to the type of constant domain or constant region possessed by its heavy chains. There are five main classes of antibodies: IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, and some of these are subclasses (isotypes), such as IgG ₁ , IgG ₂ , IgG ₃ , IgG ₄ , IgA ₁ , and IgA ₂ can be further subdivided. The heavy chain constant domains corresponding to the different classes of immunoglobulins are called a, d, e, g, and m, respectively. Preferably, the bispecific antibody of the invention is a human IgG isotype, more preferably a human IgG1 isotype. As used herein, the terms IgG isotype and IgG1 isotype refer to human IgG isotype and human IgG1 isotype. In general, different IgG isotypes exist in the form of slightly different allotypes based on allelic variation between IgG subclasses (see Vidarsson et al.; Front Immunol 5 (2014) Article 520, 1-17). An “effective amount” of an agent, such as a pharmaceutical formulation, refers to an amount effective in dosage and for periods of time necessary to achieve the desired therapeutic or prophylactic result.

본원에서 용어 “Fc 도메인” 또는 “Fc 영역”은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C 말단 영역을 정의하는 데 이용된다. 상기 용어는 선천적 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 비록 IgG 중쇄의 Fc 영역의 경계가 약간 가변될 수도 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로 Cys226으부터, 또는 Pro230부터 중쇄의 카르복실 말단까지 걸쳐있는 것으로 정의된다. 하지만, 숙주 세포에 의해 생성된 항체는 중쇄의 C 말단으로부터 하나 이상, 특히 1개 또는 2개의 아미노산의 번역후 절단을 당할 수 있다. 따라서, 전장 중쇄를 부호화하는 특이적 핵산 분자의 발현을 통해 숙주 세포에 의해 생성되는 항체는 전장 중쇄를 포함할 수 있거나, 또는 이는 전장 중쇄의 절단된 변이체(본원에서 "절단된 변이체 중쇄"로도 지칭됨)를 포함할 수 있다. 이는 중쇄의 최종 2개의 C 말단 아미노산이 글리신(G446) 및 리신(K447, 카바트 EU 색인에 따른 넘버링)인 경우에 그러할 수 있다. 따라서, Fc 영역의 C 말단 리신(Lys447) 또는 C 말단 글리신(Gly446) 및 리신(Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. Fc 영역(또는 본원에서 정의된 바와 같은 Fc 도메인의 아단위)을 포함한 중쇄의 아미노산 서열은 다르게 지시되지 않는 한, C 말단 글리신-리신 디펩티드가 없이 표시된다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이중특이적 항체에 포함된, 본원에 명시된 바와 같은 Fc 영역의 아단위를 포함하는 중쇄는 추가적인 C 말단 글리신-리신 디펩티드(G446 및 K447, 카바트의 EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이중특이적 항체에 포함된, 본원에 명시된 바와 같은 Fc 영역의 아단위를 포함하는 중쇄는 추가적인 C 말단 글리신 잔기(G446, 카바트의 EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다. 본 발명의 조성물, 예컨대 본원에 기재된 약학적 조성물은 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항체의 군을 포함한다. 항체 또는 이중특이적 항체의 군은 전장 중쇄를 갖는 분자 및 절단된 변이체 중쇄를 갖는 분자를 포함할 수 있다. 항체 또는 이중특이적 항체의 군은 전장 중쇄를 갖는 분자 및 절단된 변이체 중쇄를 갖는 분자의 혼합물로 구성될 수 있으며, 항체 또는 이중특이적 항체의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상이 절단된 변이체 중쇄를 갖는다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항체의 군을 포함하는 조성물은 추가적인 C 말단 글리신-리신 디펩티드(G446 및 K447, 카바트의 EU 색인에 따른 넘버링)와 함께 본원에 명시된 바와 같은 Fc 영역의 아단위를 포함한 중쇄를 포함하는 항체 또는 이중특이적 항체를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항체의 군을 포함하는 조성물은 추가적인 C 말단 글리신 잔기(G446, 카바트의 EU 색인에 따른 넘버링)와 함께 본원에 명시된 바와 같은 Fc 영역의 아단위를 포함한 중쇄를 포함하는 항체 또는 이중특이적 항체를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 조성물은 본원에 명시된 바와 같은 Fc 영역의 아단위를 포함한 중쇄를 포함하는 분자; 추가적인 C 말단 글리신 잔기(G446, 카바트의 EU 색인에 따른 넘버링)와 함께 본원에 명시된 바와 같은 Fc 도메인의 아단위를 포함한 중쇄를 포함하는 분자; 및 추가적인 C 말단 글리신-리신 디펩티드(G446 및 K447, 카바트의 EU 색인에 따른 넘버링)와 함께 본원에 명시된 바와 같은 Fc 도메인의 아단위를 포함한 중쇄를 포함하는 분자로 구성된 항체 또는 이중특이적 항체의 군을 포함한다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991에 기재된 바와 같이 "카바트의 EU 색인에 따른 넘버링" 또는 "카바트 EU 넘버링"라고도 하는 "EU 넘버링 시스템에 따른"다. 본원에서 사용된 Fc 도메인의 “아단위”는 이량체 Fc 도메인을 형성하는 2개의 폴리펩티드 중에서 하나, 즉 안정되게 자가 결합할 수 있는, 면역글로불린 중쇄의 C 말단 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, IgG Fc 도메인의 아단위는 IgG CH2 및 IgG CH3 불변 도메인을 포함한다.The term “Fc domain” or “Fc region” is used herein to define the C-terminal region of an immunoglobulin heavy chain that contains at least a portion of the constant region. The term includes native sequence Fc regions and variant Fc regions. Although the boundaries of the Fc region of an IgG heavy chain may vary slightly, the human IgG heavy chain Fc region is usually defined as spanning from Cys226, or from Pro230 to the carboxyl terminus of the heavy chain. However, antibodies produced by the host cell may be subject to post-translational cleavage of one or more, in particular one or two amino acids, from the C terminus of the heavy chain. Thus, an antibody produced by a host cell through expression of a specific nucleic acid molecule encoding a full-length heavy chain may comprise a full-length heavy chain, or it may be a truncated variant of a full-length heavy chain (also referred to herein as a "truncated variant heavy chain"). ) may be included. This may be the case if the last two C-terminal amino acids of the heavy chain are glycine (G446) and lysine (K447, numbering according to the Kabat EU index). Thus, C-terminal lysine (Lys447) or C-terminal glycine (Gly446) and lysine (Lys447) of the Fc region may or may not be present. The amino acid sequence of the heavy chain comprising the Fc region (or a subunit of the Fc domain as defined herein) is shown without the C-terminal glycine-lysine dipeptide, unless otherwise indicated. In one embodiment of the invention, the heavy chain comprising a subunit of the Fc region as specified herein, comprised in the antibody or bispecific antibody according to the invention, comprises additional C-terminal glycine-lysine dipeptides (G446 and K447, numbering according to the EU index of Kabat). In one embodiment of the invention, the heavy chain comprising a subunit of the Fc region as specified herein, comprised in the antibody or bispecific antibody according to the invention, has an additional C-terminal glycine residue (G446, EU index of Kabat) numbering according to ). A composition of the invention, such as a pharmaceutical composition described herein, comprises a group of antibodies or bispecific antibodies of the invention. The class of antibodies or bispecific antibodies can include molecules with full-length heavy chains and molecules with truncated variant heavy chains. Antibodies or groups of bispecific antibodies may consist of a mixture of molecules with full-length heavy chains and molecules with truncated variant heavy chains, wherein at least 50%, at least 60%, at least 70%, 80% of the antibody or bispecific antibody At least % or at least 90% have truncated variant heavy chains. In one embodiment of the invention, a composition comprising an antibody or a group of bispecific antibodies of the invention is provided herein together with additional C-terminal glycine-lysine dipeptides (G446 and K447, numbering according to the EU index of Kabat). antibody or bispecific antibody comprising a heavy chain comprising a subunit of the Fc region as specified. In one embodiment of the invention, a composition comprising an antibody or group of bispecific antibodies of the invention comprises an Fc region as specified herein together with an additional C-terminal glycine residue (G446, numbering according to the EU index of Kabat). Includes an antibody or bispecific antibody comprising a heavy chain comprising a subunit of. In one embodiment of the present invention, the composition comprises a molecule comprising a heavy chain comprising a subunit of an Fc region as specified herein; a molecule comprising a heavy chain comprising a subunit of an Fc domain as specified herein together with an additional C-terminal glycine residue (G446, numbering according to the EU index of Kabat); and an antibody or bispecific antibody consisting of a molecule comprising a heavy chain comprising a subunit of an Fc domain as specified herein together with additional C-terminal glycine-lysine dipeptides (G446 and K447, numbering according to the EU index of Kabat). includes the group of Unless otherwise specified herein, the numbering of amino acid residues in the Fc region or constant region is described in Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991 "according to the EU numbering system", also referred to as "numbering according to the EU index of Kabat" or "Kabat EU numbering". As used herein, a “subunit” of an Fc domain refers to a polypeptide comprising the C-terminal constant region of an immunoglobulin heavy chain, capable of stably self-associating one of the two polypeptides forming the dimeric Fc domain. For example, subunits of an IgG Fc domain include IgG CH2 and IgG CH3 constant domains.

“프레임워크” 또는 “FR”은 초가변 영역(HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인들로 구성된다: FR1, FR2, FR3, 및 FR4. 이에 따라, CDR 및 FR 서열들은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 하기의 서열로 나타난다: FR-H1(L1)-CDR-H1(L1)-FR-H2(L2)-CDR-H2(L2)-FR-H3(L3)-CDR-H3(L3)-FR-H4(L4).“Framework” or “FR” refers to variable domain residues other than hypervariable region (HVR) residues. The FRs of a variable domain generally consist of four FR domains: FR1, FR2, FR3, and FR4. Accordingly, the CDR and FR sequences generally appear in the VH (or VL) as: FR-H1(L1)-CDR-H1(L1)-FR-H2(L2)-CDR-H2(L2)- FR-H3(L3)-CDR-H3(L3)-FR-H4(L4).

용어 “전장 항체", “원형 항체", 및 “전체 항체”는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 선천적인 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 또는 본원에서 정의된 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.The terms “full length antibody”, “prototype antibody”, and “whole antibody” are used interchangeably herein and refer to a heavy chain having a structure substantially similar to the native antibody structure or containing an Fc region as defined herein. It refers to an antibody with

“인간 항체”는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성되거나, 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체 부호화 서열을 활용하는 비인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 것이다. 인간 항체에 대한 상기 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 특이적으로 배제한다.A “human antibody” is one having an amino acid sequence that corresponds to the amino acid sequence of an antibody produced by a human or human cell, or derived from a non-human source utilizing a human antibody repertoire or other human antibody coding sequence. This definition of a human antibody specifically excludes a humanized antibody comprising non-human antigen-binding residues.

“인간 공통 프레임워크”는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선별에서 가장 흔히 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 선별된다. 일반적으로, 서열의 하위군은 Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3에서와 같은 하위군이다. 일 구현예에서, VL에 대해, 상기 하위군은 상기 Kabat et al.에서와 같은 하위군 카파 I이다. 일 구현예에서, VH에 대해, 상기 하위군은 상기 Kabat et al.에서와 같은 하위군 카파 III이다. A “human consensus framework” is a framework representing the amino acid residues most commonly occurring in the selection of human immunoglobulin VL or VH framework sequences. In general, human immunoglobulin VL or VH sequences are selected from a subgroup of variable domain sequences. In general, a subgroup of sequences is described in Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. It is a subgroup as in 1-3. In one embodiment, for VL, said subgroup is subgroup kappa I as in Kabat et al., supra. In one embodiment, for VH, said subgroup is subgroup kappa III as in Kabat et al., supra.

“인간화” 항체는 비인간 CDR로부터 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 구현예들에서, 인간화 항체는 적어도 1개, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하고, CDR의 전부 또는 실질적으로 전부가 비인간 항체의 것에 상응하고, FR의 전부 또는 실질적으로 전부가 인간 항체의 것에 상응한다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체의 "인간화 형태", 예컨대, 비인간 항체는 인간화를 거친 항체를 지칭한다. A “humanized” antibody refers to a chimeric antibody comprising amino acid residues from non-human CDRs and amino acid residues from human FRs. In certain embodiments, a humanized antibody comprises substantially all of at least one, and typically two, variable domains, wherein all or substantially all of the CDRs correspond to those of a non-human antibody, and all or substantially all of the FRs It corresponds to that of a human antibody. A humanized antibody may optionally comprise at least a portion of an antibody constant region derived from a human antibody. A “humanized form” of an antibody, such as a non-human antibody, refers to an antibody that has undergone humanization.

본원에서 사용되는 용어 “상보성 결정 영역” 또는 “CDR”은 서열에서 초가변적인, 및/또는 구조적으로 정의된 루프(“초가변 루프”)를 형성하고, 및/또는 항원 접촉 잔기들(“항원 접촉부”)을 함유하는 항체 가변 도메인의 각 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개 CDR: VH에서 3개(CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3), 및 VL에서 3개(CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3)를 포함한다. 본원에서 예시적인 CDR은 하기를 포함한다: As used herein, the term “complementarity determining region” or “CDR” refers to a hypervariable and/or structurally defined loop in sequence (“hypervariable loop”), and/or antigen-contacting residues (“antigen each region of an antibody variable domain containing "contacts"). Generally, an antibody comprises six CDRs: three in the VH (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3), and three in the VL (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3). Exemplary CDRs herein include:

(a) 아미노산 잔기 26-32(CDR-L1), 50-52(CDR-L2), 91-96(CDR-L3), 26-32(CDR-H1), 53-55(CDR-H2), 및 96-101(CDR-H3)에서 발생하는 초가변 루프(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));(a) amino acid residues 26-32 (CDR-L1), 50-52 (CDR-L2), 91-96 (CDR-L3), 26-32 (CDR-H1), 53-55 (CDR-H2), and a hypervariable loop occurring in 96-101 (CDR-H3) (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));

(b) 아미노산 잔기 24-34(CDR-L1), 50-56(CDR-L2), 89-97(CDR-L3), 31-35b(CDR-H1), 50-65(CDR-H2), 및 95-102(CDR-H3)에서 나타나는 CDR(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));(b) amino acid residues 24-34 (CDR-L1), 50-56 (CDR-L2), 89-97 (CDR-L3), 31-35b (CDR-H1), 50-65 (CDR-H2), and the CDR represented by 95-102 (CDR-H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));

(c) 아미노산 잔기 27c-36(CDR-L1), 46-55(CDR-L2), 89-96(CDR-L3), 30-35b(CDR-H1), 47-58(CDR-H2), 및 93-101(CDR-H3)에 발생하는 항원 접촉(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); 및(c) amino acid residues 27c-36 (CDR-L1), 46-55 (CDR-L2), 89-96 (CDR-L3), 30-35b (CDR-H1), 47-58 (CDR-H2), and antigen contact that occurs at 93-101 (CDR-H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); and

(d) CDR 아미노산 잔기 24-34 (CDR-L1), 50-56 (CDR-L2), 89-97 (vL3), 31-35 (CDR-H1), 50-63 (CDR-H2), 및 95-102(CDR-H3)를 포함하는 (a), (b), 및/또는 (c)의 조합. (d) CDR amino acid residues 24-34 (CDR-L1), 50-56 (CDR-L2), 89-97 (vL3), 31-35 (CDR-H1), 50-63 (CDR-H2), and A combination of (a), (b), and/or (c) comprising 95-102 (CDR-H3).

다르게 지시되지 않는 한, CDR 잔기 및 가변 도메인의 다른 잔기(예컨대, FR 잔기)는 본원에서 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991에 따라서 넘버링된다.Unless otherwise indicated, CDR residues and other residues of the variable domain (eg, FR residues) are described herein in Kabat et al ., Sequences of Proteins of Immunological Interest , 5th Ed. Numbered according to Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

"개체" 또는 "대상체"는 포유류이다. 포유류는 가축(예컨대, 소, 양, 고양이, 개, 및 말), 영장류(예컨대, 인간 및 원숭이와 같은 비인간 영장류), 토끼, 및 설치류(예컨대, 마우스 및 래트)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 특정 구현예들에서, 상기 개체 또는 대상체는 인간이다. An “individual” or “subject” is a mammal. Mammals include, but are not limited to, domestic animals (eg, cattle, sheep, cats, dogs, and horses), primates (eg, humans and non-human primates such as monkeys), rabbits, and rodents (eg, mice and rats). . In certain embodiments, the subject or subject is a human.

"단리된" 항체는 이의 자연 환경의 구성요소로부터 분리된 것이다. 일부 구현예들에 있어서, 항체는, 예를 들어 전기영동의 (예컨대, SDS-PAGE, 등전초점조절(IEF), 모세관전기이동) 또는 크로마토그래프(예컨대, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정되었을 때 95% 또는 99% 순도를 초과하여 정제된다. 항체 순도를 평가하기 위한 방법을 검토하려면, 예컨대 Flatman, S. et al., J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87을 참조한다.An “isolated” antibody is one that has been separated from a component of its natural environment. In some embodiments, the antibody may have been measured, for example, by electrophoresis (eg, SDS-PAGE, isoelectric focusing (IEF), capillary electrophoresis) or chromatograph (eg, ion exchange or reverse phase HPLC). when purified to greater than 95% or 99% purity. For a review of methods for assessing antibody purity, see, eg, Flatman, S. et al., J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87.

“단리된" 핵산은 이의 자연 환경의 성분으로부터 분리되어 있는 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 보통 함유하는 세포 안에 있는 핵산 분자를 포함하지만, 상기 핵산 분자는 자연 염색체 위치와는 상이한 염색체 위치에 존재하거나 또는 염색체 외부에 존재한다. An “isolated” nucleic acid refers to a nucleic acid molecule that has been separated from a component of its natural environment. An isolated nucleic acid includes a nucleic acid molecule in a cell that normally contains the nucleic acid molecule, but the nucleic acid molecule is located at a different location than its natural chromosomal location. either at a chromosomal location or extrachromosomal.

"단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체를 부호화하는 단리된 핵산"은, 단일 벡터 또는 별도의 벡터들에 있는 이러한 핵산 분자를 포함하는, 항체 중쇄 및 경쇄(또는 이의 단편)를 부호화하는 하나 이상의 핵산 분자, 및 숙주 세포의 하나 이상의 위치에 존재하는 이러한 핵산 분자(들)을 지칭한다. An "isolated nucleic acid encoding a monospecific or bispecific anti-CCL2 antibody" refers to one encoding antibody heavy and light chains (or fragments thereof) comprising such nucleic acid molecules in a single vector or in separate vectors. to more than one nucleic acid molecule, and to such nucleic acid molecule(s) present at one or more locations in a host cell.

본원에서 사용된 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 동질성 항체 집단으로부터 획득된 항체를 지칭한다, 즉, 개별 항체는 동일한 집단 및/또는 같은 에피토프에 결합하는 모집단을 포함하는데, 다만, 변이체 항체, 예컨대, 자연 발생적 돌연변이를 함유하거나 또는 단일클론 항체 제제를 만드는 동안 발생되는 변이체 항체 가능성이 있으며, 이러한 변이체들은 일반적으로 소량으로 존재한다. 상이한 결정부위(에피토프)에 대해 지향된 상이한 항체를 통상적으로 포함하는 다중클론 항체 제제와 대조적으로, 단일클론 항체 제제의 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정부위에 대해 지향된다. 따라서, 수식어 "단일클론(monoclonal)"은 실질적으로 동질성 항체 집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체 제조를 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단일클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역 글로불린 좌위의 전부 또는 일부를 함유하는 형질전환 동물을 이용하는 방법들을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있으며, 상기 방법 및 단일클론 항체를 제조하는 다른 예시적인 방법이 본원에 기재되어 있다. As used herein, the term "monoclonal antibody" refers to an antibody obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, i.e., individual antibodies include the same population and/or populations that bind the same epitope, provided that variant antibodies, such as , there is the potential for variant antibodies that contain naturally occurring mutations, or that arise during the making of monoclonal antibody preparations, and these variants are usually present in small amounts. In contrast to polyclonal antibody preparations, which typically include different antibodies directed against different determinants (epitopes), each monoclonal antibody of a monoclonal antibody preparation is directed against a single determinant on an antigen. Accordingly, the modifier "monoclonal" indicates the character of the antibody as being obtained from a substantially homogeneous population of antibodies, and is not to be construed as requiring production of the antibody by any particular method. For example, monoclonal antibodies used in accordance with the present invention include hybridoma methods, recombinant DNA methods, phage-display methods, and methods using transgenic animals containing all or part of a human immunoglobulin locus, It can be prepared by a variety of techniques, including, but not limited to, those methods and other exemplary methods of making monoclonal antibodies are described herein.

"선천적 항체"는 구조가 가변되는 자연 발생 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 선천적 IgG 항체는 이종사량체 당단백질로써, 약 150,000 달톤이며, 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성되며, 이들은 이황화 결합에 의해 연결되어 있다. N 말단으로부터 C 말단에 이르기까지, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 영역(VH), 이어서 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N 말단으로부터 C 말단에 이르기까지, 각 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로 또한 불리는 가변 영역(VL), 이어서 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 카파(κ) 및 람다(λ)라고 하는 두 가지 유형 중 하나로 지정될 수 있다. "Native antibody" refers to a naturally occurring immunoglobulin molecule of variable structure. For example, native IgG antibodies are heterotetrameric glycoproteins, about 150,000 daltons, and are composed of two identical light chains and two identical heavy chains, which are linked by disulfide bonds. From N-terminus to C-terminus, each heavy chain has a variable region (VH), also called a variable heavy domain or heavy chain variable domain, followed by three constant domains (CH1, CH2 and CH3). Similarly, from N-terminus to C-terminus, each light chain has a variable region (VL), also called a variable light domain or light chain variable domain, followed by a constant light (CL) domain. The light chain of an antibody can be assigned to one of two types, called kappa (κ) and lambda (λ), depending on the amino acid sequence of its constant domain.

용어 “패키지 삽입물(package insert)”은 이러한 치료제 제품의 사용과 관련된 지시, 용도, 투여량, 투여, 병용 요법, 금기 및/또는 경고에 대한 정보가 포함된 치료제 제품의 시판 포장에 관례적으로 포함되는 지침서를 지칭하기 위해 이용된다. The term “package insert” is customarily included in the commercial packaging of a therapeutic product containing information about the instructions, uses, dosage, administration, combination therapy, contraindications and/or warnings related to the use of such therapeutic product. It is used to refer to a guide to be used.

기준 폴리펩티드 서열에 대하여 “퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성”은 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 필요하면, 갭을 도입한 후에, 그리고 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않고, 기준 폴리펩티드 서열 내에 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열 내에 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈라인(Megalign, DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 해당 업계의 기술 범위에 속하는 다양한 방법으로 구현될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 구현하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열들을 정렬하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 하지만, 본원의 목적으로, 아미노산 서열 동일성 % 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨텍 회사(Genentech, Inc.)에서 제작되었고, 소스 코드는 미국 워싱턴 D.C., 20559에 소재한 미국 저작권청에 사용자 문서와 함께 제출되었으며, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되었다. ALIGN-2 프로그램은 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코에 소재한 제넨텍 회사로부터 공개적으로 입수가능하거나 소스 코드로부터 컴파일될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함한 UNIX 운영 체제에서 사용되도록 컴파일해야 한다. 모든 서열 비교 매개변수는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 변경되지 않는다.“Percent (%) amino acid sequence identity” with respect to a reference polypeptide sequence aligns the sequences to achieve maximum percent sequence identity and, if necessary, introduces gaps, and does not take into account any conservative substitutions as part of sequence identity. It is defined as the percentage of amino acid residues in a candidate sequence that are identical to the amino acid residues in the reference polypeptide sequence. Alignment to determine percent amino acid sequence identity can be accomplished by a variety of methods within the skill of the art using publicly available computer software such as, for example, BLAST, BLAST-2, ALIGN or Megalign (DNASTAR) software. can be implemented as One of ordinary skill in the art can determine appropriate parameters for aligning sequences, including any algorithms necessary to achieve maximal alignment over the entire length of the sequences being compared. However, for purposes herein, % amino acid sequence identity values are generated using the sequence comparison computer program ALIGN-2. The ALIGN-2 sequence comparison computer program was produced by Genentech, Inc., the source code was submitted with user documentation to the United States Copyright Office, Washington D.C., 20559, United States, and registered under the United States Copyright Registration No. TXU510087. The ALIGN-2 program is publicly available from Genentech Corporation of South San Francisco, CA or may be compiled from source code. The ALIGN-2 program must be compiled for use on UNIX operating systems, including digital UNIX V4.0D. All sequence comparison parameters are set by the ALIGN-2 program and are not changed.

ALIGN-2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 경우, 주어진 아미노산 서열 B에, 이와 관련한, 또는 이에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 %는 (다른 방식으로, 주어진 아미노산 서열 B에, 이와 관련한, 또는 이에 대한 특정 아미노산 서열 동일성 %를 가지거나 또는 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 표현될 수 있음) 하기와 같이 계산된다:When ALIGN-2 is used for amino acid sequence comparison, the % amino acid sequence identity of a given amino acid sequence A to, with respect to, or to a given amino acid sequence B (otherwise, to, with respect to, or with a given amino acid sequence B) is (which can be expressed as a given amino acid sequence A having or comprising a specific % amino acid sequence identity to) is calculated as follows:

100 x 분율 X/Y100 x fraction X/Y

이때 X는 A 및 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 매치로 기록되는 아미노산 잔기의 수를 말하며, Y는 B의 전체 아미노산 잔기 수가 된다. 아미노산 서열 A의 길이는 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않는 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %는 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 동일하지 않은 것으로 이해될 것이다. 이와 다르게 특별히 명시되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 % 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 바로 전 단락에서 설명된 바와 같이 수득된다.Here, X refers to the number of amino acid residues recorded as the same match by the sequence alignment program ALIGN-2 in the program alignment of A and B, and Y is the total number of amino acid residues in B. It will be understood that if the length of amino acid sequence A is not equal to the length of amino acid sequence B, then the % amino acid sequence identity of A to B is not equal to the % amino acid sequence identity of B to A. Unless otherwise specified, all amino acid sequence identity % values used herein are obtained as described in the immediately preceding paragraph using the ALIGN-2 computer program.

용어 “약학적 제제”는 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 허용하는 형태이고, 상기 제제가 투여될 대상체에게 허용 불가능할 정도로 독성인 추가 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다. The term “pharmaceutical preparation” refers to a preparation that is in a form that permits the biological activity of the active ingredient contained therein to be effective, and which does not contain additional ingredients that are unacceptably toxic to the subject to which the preparation is to be administered.

약학적으로 허용가능한 담체는 활성 성분 이외에 약학 제제 안에 있는 성분을 말하며, 대상체에게 비독성이다. 약학적으로 허용되는 담체는 완충액, 부형제, 안정화제, 또는 보존제이다. A pharmaceutically acceptable carrier refers to an ingredient in a pharmaceutical formulation other than the active ingredient, and is non-toxic to a subject. Pharmaceutically acceptable carriers are buffers, excipients, stabilizers, or preservatives.

본원에서 사용된 "치료"(및 이의 문법적 변형, 예컨대 "치료하다" 또는 "치료하는")는 치료받는 개체의 자연적 과정을 변화시키기 위한 시도에서의 임상적 개입을 말하며, 예방을 위해 또는 임상 병리 과정동안 실시될 수 있다. 치료의 바람직한 효과에는 질환의 발생 또는 재발의 방지, 증상의 완화, 상기 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질환 진행 속도의 감소, 상기 질환 상태의 개선 또는 경감, 그리고 차도 또는 개선된 예후가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예들에서, 본 발명의 항체는 질환의 발병을 지연시키거나 질환의 진행을 늦추기 위해 사용된다."Treatment" (and grammatical variations thereof, such as "treat" or "treating"), as used herein, refers to clinical intervention in an attempt to alter the natural course of the individual being treated, either for prophylaxis or for clinical pathology. This can be done during the process. Desirable effects of treatment include preventing the occurrence or recurrence of a disease, alleviating symptoms, reducing any direct or indirect pathological consequences of the disease, preventing metastasis, reducing the rate of disease progression, ameliorating or alleviating the disease state, and remission or improved prognosis. In some embodiments, an antibody of the invention is used to delay the onset of a disease or to slow the progression of a disease.

“가변 영역” 또는 “가변 도메인”은 항체가 항원에 결합하는데 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄 도메인을 말한다. 선천적 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각, VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 갖는데, 각 도메인이 4개의 보존된 프레임워크 영역(FRs) 및 3개의 초가변 영역(CDRs)을 포함한다. (예컨대, Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91을 참조) 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원 결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는 각각 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 선별검사하기 위해, 항원에 결합하는 항체로부터 VH 또는 VL 도메인을 이용하여 단리될 수 있다. 예컨대, Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628)을 참조한다. “Variable region” or “variable domain” refers to an antibody heavy or light chain domain that is involved in binding an antibody to an antigen. The variable domains of the heavy and light chains of native antibodies (VH and VL, respectively) generally have a similar structure, with each domain comprising four conserved framework regions (FRs) and three hypervariable regions (CDRs). (See, eg, Kindt, TJ et al. Kuby Immunology, 6th ed., WH Freeman and Co., NY (2007), page 91) A single VH or VL domain may be sufficient to confer antigen binding specificity. Antibodies that bind a particular antigen can also be isolated using a VH or VL domain from an antibody that binds the antigen to screen a library of complementary VL or VH domains, respectively. See, eg, Portolano, S. et al., J. Immunol . 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628).

본원에서 사용된 용어 "벡터"는 연결되는 다른 핵산을 전파시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자가 복제 핵산 구조의 벡터 뿐만 아니라 이것이 도입되어 있는 숙주 세포의 게놈 내부에 통합된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터를 본원에서 “발현 벡터"라고 한다. As used herein, the term “vector” refers to a nucleic acid molecule capable of propagating another nucleic acid to which it has been linked. The term includes vectors of self-replicating nucleic acid constructs as well as vectors integrated within the genome of the host cell into which it has been introduced. Certain vectors are capable of directing the expression of operably linked nucleic acids. Such vectors are referred to herein as “expression vectors”.

I. 조성물 및 방법들I. Compositions and Methods

일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 이중특이적 항체가 제1 및 제2 항원 결합 부위/모이어티로서 상이한 항-CCL2 항원 결합 부위를 사용한다는 발견에 부분적으로 기초한다. 이러한 항-CCL2 항체는 CCL2의 특정 에피토프에 높은 특이성으로 결합하고, CCL2가 이의 수용체 CCR2에 결합하는 것을 특이적으로 억제하는 능력이 있다. 이들은 단일특이적 항체와 비교하여 개선된 면역 복합체 형성 및 생체내 개선된 CCL2 폐기를 나타낸다.In one aspect, the invention is based in part on the discovery that bispecific antibodies as described herein use different anti-CCL2 antigen binding sites as first and second antigen binding sites/moieties. Such anti-CCL2 antibody binds to a specific epitope of CCL2 with high specificity and has the ability to specifically inhibit the binding of CCL2 to its receptor CCR2. They show improved immune complex formation and improved CCL2 clearance in vivo compared to monospecific antibodies.

이중특이적 항-CCL2 항체Bispecific anti-CCL2 antibody

이중특이적 항체bispecific antibody

본원에 기재된 바와 같은 이중특이적 항체는 CCL2 상의 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 단일클론 항체이다. Bispecific antibodies as described herein are monoclonal antibodies with binding specificities for at least two different epitopes on CCL2.

다중특이적 및 이중특이적 항체를 제조하기 위한 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 동시 발현(Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)을 참조), 및 "구멍 내 돌기(knob-in-hole)" 공학(예컨대, 미국 특허 제5,731,168호 및 Atwell et al., J. Mol. Biol. 270:26 (1997)을 참조)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 다중특이적 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위한 정전기 스티어링 효과를 가공하고(예컨대, WO 2009/089004를 참조); 2개 이상의 항체 또는 단편을 가교 결합하고(예컨대, 미국 특허 제 4,676,980호 및 Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)을 참조); 류신 지퍼를 사용하여 이중특이적 항체를 형성하고(예컨대, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992) 및 WO 2011/034605를 참조); 경쇄 쌍형성 오류 문제를 우회하기 위한 일반적인 경쇄 기술 사용하고(예컨대, WO 98/50431을 참조); 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 "디아바디" 기술을 사용하고(예컨대, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)을 참조); 단일 사슬 Fv(sFv) 이량체 사용하며(예컨대, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)을 참조); 및, 예컨대, Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)에서 기재된 바와 같은 삼중특이적 항체를 제조하여 만들 수 있다.Techniques for making multispecific and bispecific antibodies include recombinant co-expression of two immunoglobulin heavy chain-light chain pairs with different specificities (see Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), and "in-pores""knob-in-hole" engineering (see, eg, US Pat. No. 5,731,168 and Atwell et al., J. Mol. Biol. 270:26 (1997)). Multispecific antibodies also engineer electrostatic steering effects to produce antibody Fc-heterodimeric molecules (see, eg, WO 2009/089004); cross-linking two or more antibodies or fragments (see, eg, US Pat. No. 4,676,980 and Brennan et al. , Science , 229: 81 (1985)); Leucine zippers are used to form bispecific antibodies (eg, Kostelny et al., J. Immunol. , 148(5):1547-1553 (1992) and WO 2011/034605); using common light chain techniques to circumvent the problem of light chain pairing errors (see, eg, WO 98/50431); using "diabody" technology for making bispecific antibody fragments (see, eg, Hollinger et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 90:6444-6448 (1993)); using single chain Fv (sFv) dimers (see, eg, Gruber et al. , J. Immunol. , 152:5368 (1994)); and, eg, Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

예를 들어, “옥토퍼스 항체” 또는 DVD-Ig를 포함한 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 가공된 항체 또한 본원에 포함된다(예컨대, WO 2001/77342 및 WO 2008/024715를 참조). 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 다중특이적 항체의 다른 예는 WO 2010/115589, WO 2010/112193, WO 2010/136172, WO 2010/145792 및 WO 2013/026831에서 발견될 수 있다. 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 또한 CCL2뿐만 아니라 다른 상이한 항원, 또는 CCL2의 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 “이중 작용 FAb” 또는 “DAF”를 포함한다(예컨대, 미국 2008/0069820 및 WO 2015/095539를 참조).Engineered antibodies with three or more antigen binding sites, including, for example, “Octopus antibodies” or DVD-Igs are also included herein (see, eg, WO 2001/77342 and WO 2008/024715). Other examples of multispecific antibodies with three or more antigen binding sites can be found in WO 2010/115589, WO 2010/112193, WO 2010/136172, WO 2010/145792 and WO 2013/026831. Bispecific antibodies or antigen binding fragments thereof also include "dual acting FAbs" or "DAFs" comprising antigen binding sites that bind CCL2 as well as other different antigens, or two different epitopes of CCL2 (e.g., US 2008/0069820 and WO 2015/095539).

다중특이적 항체는 또한 동일한 항원 특이성의 하나 이상의 결합 팔에서 도메인 교차로, 즉, VH/VL 도메인(예컨대, WO 2009/080252 및 WO 2015/150447을 참조), CH1/CL 도메인(예컨대, WO 2009/080253을 참조) 또는 크로스맵(CrossMab)이라고도 하는 완전한 Fab 팔(예컨대, WO 2009/080251, WO 2016/016299를 참조, 또한 Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 1187-1191 및 Klein at al., MAbs 8 (2016) 1010-20을 참조)을 교환함으로써 비대칭적 형태로 제공될 수 있다. 비대칭 결합 팔은 또한 올바른 Fab 쌍형성을 지시하기 위해 도메인 계면 내로 하전 또는 비하전 아미노산 돌연변이를 도입함으로써 조작될 수 있다. 예컨대, WO 2016/172485를 참조.Multispecific antibodies also contain domain intersections in one or more binding arms of the same antigenic specificity, ie the VH/VL domain (see, eg, WO 2009/080252 and WO 2015/150447), the CH1/CL domain (eg, WO 2009/ 080253) or the complete Fab arm, also called CrossMab (see, e.g., WO 2009/080251, WO 2016/016299, also Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 1187-1191 and Klein at al., MAbs 8 (2016) 1010-20) can be provided in an asymmetric form. Asymmetric binding arms can also be engineered by introducing charged or uncharged amino acid mutations into the domain interface to direct correct Fab pairing. See, eg, WO 2016/172485.

다중특이적 항체에 대한 다양한 추가의 분자 형식은 당해 분야에서 공지되어 있으며, 본원에 포함된다(예컨대, Spiess et al., Mol. Immunol. 67 (2015) 95-106을 참조).A variety of additional molecular formats for multispecific antibodies are known in the art and are included herein (see, eg, Spiess et al., Mol. Immunol. 67 (2015) 95-106).

바람직한 이중특이적 항체 형식.Preferred bispecific antibody format.

본 발명의 특정 구현예들에 따라서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 동일한 항원 특이성의 하나 이상의 결합 팔에서 도메인 교차로, 즉, VH/VL 도메인(예컨대, WO 2009/080252 및 WO 2015/150447을 참조), CH1/CL 도메인(예컨대, WO 2009/080253을 참조) 또는 완전한 Fab 팔(예컨대, WO 2009/080251, WO 2016/016299를 참조, 또한 Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 1187-1191 및 Klein at al., MAbs 8 (2016) 1010-20을 참조)을 교환함으로써 제공될 수 있다. According to certain embodiments of the invention, the bispecific antibodies described herein have domain intersections in one or more binding arms of the same antigen specificity, i.e. the VH/VL domain (see, e.g., WO 2009/080252 and WO 2015/150447). ), the CH1/CL domain (see, eg, WO 2009/080253) or the complete Fab arm (see, eg, WO 2009/080251, WO 2016/016299, also Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 1187-1191 and Klein at al., MAbs 8 (2016) 1010-20).

이러한 이중특이적 항체, 특히 VH/VL 도메인의 교환을 갖는 항체에서의 전하 변형(WO 2015/150447을 참조): 본 발명의 이중특이적 항체는 그 안에 포함된 Fab 분자 내에 아미노산 치환을 포함할 수 있는데, 이들 치환은 그들의 결합 팔 중 하나(또는 2개 이상의 항원 결합 Fab 분자를 포함하는 분자의 경우에는, 그 이상)에서 VH/VL 교환을 갖는 Fab 기반의 이중/항체의 생산에서 일어날 수 있는, 경쇄의 비정합 중쇄와의 쌍형성 오류(Bence-Jones 유형 부산물)을 감소시키는 데 특히 효율적이다(또한, 본원 전체에 원용된 PCT 공개 번호 WO 2015/150447, 특히 이의 실시예를 참조). 결합 팔 중 하나에서 VH/VL 도메인 교환을 갖는 이중특이적 항체에서 발생하는 바람직하지 않은 부산물, 특히 Bence Jones 유형 부산물과 비교하여 원하는 이중특이적 항체의 비율은 CH1 및 CL 도메인 내에 특이적 아미노산 위치에서 반대 전하를 갖는 하전된 아미노산의 도입(때때로 본원에서 “전하 변형”으로서 지칭됨)에 의해 향상될 수 있다.Charge modification in such bispecific antibodies, in particular antibodies with exchange of VH/VL domains (see WO 2015/150447): The bispecific antibodies of the invention may comprise amino acid substitutions within the Fab molecule contained therein. wherein these substitutions can occur in the production of Fab-based duplexes/antibodies with VH/VL exchange in one of their binding arms (or more, in the case of molecules comprising two or more antigen binding Fab molecules), It is particularly effective in reducing pairing errors (Bence-Jones type by-products) of light chains with mismatched heavy chains (see also PCT Publication No. WO 2015/150447, particularly examples thereof, incorporated throughout this application). The proportion of the desired bispecific antibody compared to the undesirable by-products occurring in bispecific antibodies with VH/VL domain exchange in one of the binding arms, particularly the Bence Jones type by-products, is at specific amino acid positions in the CH1 and CL domains. may be enhanced by the introduction of a charged amino acid having an opposite charge (sometimes referred to herein as “charge modification”).

이에 따라, 이중특이적 항체의 제1 및 제2 항원 결합 모이어티가 둘 모두 Fab 분자이고, 이들 항원 결합 모이어티 중 하나(특히 제2 항원 결합 모이어티)에서 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되는 일부 구현예들에서,Thus, the first and second antigen binding moieties of the bispecific antibody are both Fab molecules, and in one of these antigen binding moieties (particularly the second antigen binding moiety) the variable domains VL of the Fab light chain and the Fab heavy chain. and in some embodiments where VH is substituted for each other,

i) 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 양당처으로 하전된 아미노산에 의해 치환되고(카바트에 따른 넘버링), 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산 또는 위치 213에서 아미노산이 음으로 하전된 아미노산에 의해 치환되거나(카바트 EU 색인에 따른 넘버링); 또는i) the amino acid at position 124 in the constant domain CL of the first antigen binding moiety is substituted by a positively charged amino acid (numbering according to Kabat) and at position 147 in the constant domain CH1 of the first antigen binding moiety the amino acid or the amino acid at position 213 is substituted by a negatively charged amino acid (numbering according to the Kabat EU index); or

ii) 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 양으로 하전된 아미노산에 의해 치환되고 (카바트에 따른 넘버링), 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산 또는 위치 213에서 아미노산이 음으로 하전된 아미노산에 의해 치환된다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).ii) the amino acid at position 124 in the constant domain CL of the second antigen binding moiety is substituted by a positively charged amino acid (numbering according to Kabat) and the amino acid at position 147 in the constant domain CH1 of the second antigen binding moiety or the amino acid at position 213 is substituted by a negatively charged amino acid (numbering according to the Kabat EU index).

이중특이적 항체는 i) 및 ii) 하에 언급된 변형 둘 모두를 포함하지 않는다. VH/VL 교환을 갖는 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로에 의해 대체되지 않는다 (즉, 교환되지 않은 상태로 남아있다).Bispecific antibodies do not contain both the modifications mentioned under i) and ii). The constant domains CL and CH1 of the antigen binding moiety with VH/VL exchange are not replaced by each other (ie, remain unexchanged).

더 구체적인 구현예에서,In a more specific embodiment,

i) 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카바트에 따른 넘버링), 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산 또는 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)에 의해 독립적으로 치환되거나(카바트 EU 색인에 따른 넘버링); 또는i) the amino acid at position 124 in the constant domain CL of the first antigen binding moiety is independently substituted by lysine (K), arginine (R) or histidine (H) (numbering according to Kabat) and binds a first antigen the amino acid at position 147 or the amino acid at position 213 in the constant domain CH1 of the moiety is independently substituted by glutamic acid (E) or aspartic acid (D) (numbering according to the Kabat EU index); or

ii) 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이리신 (K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카바트에 따른 넘버링), 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산 또는 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)에 의해 독립적으로 치환된다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).ii) independently substituted by the amino acid irisine (K), arginine (R) or histidine (H) at position 124 in the constant domain CL of the second antigen binding moiety (numbering according to Kabat) and binds a second antigen In the constant domain CH1 of the moiety the amino acid at position 147 or the amino acid at position 213 is independently substituted by glutamic acid (E) or aspartic acid (D) (numbering according to the Kabat EU index).

상기 일 구현예에서, 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카바트에 따른 넘버링), 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산 또는 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)에 의해 독립적으로 치환된다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).In one such embodiment, the amino acid at position 124 in the constant domain CL of the second antigen binding moiety is independently substituted by lysine (K), arginine (R) or histidine (H) (numbering according to Kabat), In the constant domain CH1 of the second antigen binding moiety the amino acid at position 147 or the amino acid at position 213 is independently substituted by glutamic acid (E) or aspartic acid (D) (numbering according to the Kabat EU index).

추가의 구현예서, 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카바트에 따른 넘버링), 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)에 의해 독립적으로 치환된다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).In a further embodiment, the amino acid at position 124 in the constant domain CL of the first antigen binding moiety is independently substituted by lysine (K), arginine (R) or histidine (H) (numbering according to Kabat), 1 The amino acid at position 147 in the constant domain CH1 of the antigen binding moiety is independently substituted by glutamic acid (E) or aspartic acid (D) (numbering according to the Kabat EU index).

특정 구현예에서, 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 색인에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 색인에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환된다.In certain embodiments, the amino acid at position 124 in the constant domain CL of the first antigen binding moiety is independently substituted by lysine (K), arginine (R) or histidine (H) (numbering according to Kabat), the position the amino acid at 123 is independently substituted by lysine (K), arginine (R) or histidine (H) (numbering according to Kabat) and the amino acid at position 147 within the constant domain CH1 of the first antigen binding moiety is glutamic acid ( E) or aspartic acid (D) (numbering according to the Kabat EU index), the amino acid at position 213 is replaced by glutamic acid (E) or aspartic acid (D) (numbering according to the Kabat EU index) independently substituted.

더 특정한 구현예에서, 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)에 의해 치환되고(카바트에 따른 넘버링), 위치 123에서 아미노산이 리신(K)에 의해 치환되며(카바트에 따른 넘버링), 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산 (E)에 의해 치환되고(카바트 EU 색인에 따른 넘버링), 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)에 의해 치환된다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).In a more specific embodiment, in the constant domain CL of the first antigen binding moiety the amino acid at position 124 is substituted by lysine (K) (numbering according to Kabat) and the amino acid at position 123 is substituted by lysine (K). (numbering according to Kabat), in the constant domain CH1 of the first antigen binding moiety the amino acid at position 147 is substituted by glutamic acid (E) (numbering according to the Kabat EU index) and at position 213 the amino acid is replaced with glutamic acid ( E) is replaced by (numbering according to the Kabat EU index).

보다 더 특정한 구현예에서, 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)에 의해 치환되고(카바트에 따른 넘버링), 위치 123에서 아미노산이 아르기닌(R)에 의해 치환되며(카바트에 따른 넘버링), 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산 (E)에 의해 치환되고(카바트 EU 색인에 따른 넘버링), 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)에 의해 치환된다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).In an even more specific embodiment, in the constant domain CL of the first antigen binding moiety the amino acid at position 124 is substituted by a lysine (K) (numbering according to Kabat) and the amino acid at position 123 is replaced by an arginine (R) is substituted (numbering according to Kabat), wherein in the constant domain CH1 of the first antigen binding moiety the amino acid at position 147 is substituted by glutamic acid (E) (numbering according to Kabat EU index) and at position 213 the amino acid is glutamic acid is replaced by (E) (numbering according to the Kabat EU index).

특정한 구현예들에서, 만약 상기 구현예들에 따른 아미노산 치환이 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1에서 만들어지는 경우, 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL은 카파 동형이다.In certain embodiments, if an amino acid substitution according to the above embodiments is made in the constant domain CL and constant domain CH1 of the first antigen binding moiety, the constant domain CL of the first antigen binding moiety is kappa isoform.

대안적으로, 상기 구현예들에 따른 아미노산 치환은 제1 항원 결합 도메인의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1 대신에 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1에서 만들어질 수 있다. 특히, 상기 구현예들에서, 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL은 카파 동형이다.Alternatively, amino acid substitutions according to the above embodiments may be made in the constant domain CL and constant domain CH1 of the second antigen binding moiety instead of the constant domain CL and constant domain CH1 of the first antigen binding domain. In particular, in the above embodiments, the constant domain CL of the second antigen binding moiety is a kappa isoform.

이에 따라, 일 구현예에서, 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카바트에 따른 넘버링), 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산 또는 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)에 의해 독립적으로 치환된다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).Accordingly, in one embodiment, the amino acid at position 124 in the constant domain CL of the second antigen binding moiety is independently substituted by lysine (K), arginine (R) or histidine (H) (numbering according to Kabat) ), the amino acid at position 147 or the amino acid at position 213 in the constant domain CH1 of the second antigen binding moiety is independently substituted by glutamic acid (E) or aspartic acid (D) (numbering according to the Kabat EU index).

추가의 구현예서, 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카바트에 따른 넘버링), 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)에 의해 독립적으로 치환된다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).In a further embodiment, the amino acid at position 124 in the constant domain CL of the second antigen binding moiety is independently substituted by lysine (K), arginine (R) or histidine (H) (numbering according to Kabat), The amino acids at position 147 in the constant domain CH1 of the 2 antigen binding moieties are independently substituted by glutamic acid (E) or aspartic acid (D) (numbering according to the Kabat EU index).

또 다른 구현예에서, 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 색인에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 색인에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환된다.In another embodiment, the amino acid at position 124 in the constant domain CL of the second antigen binding moiety is independently substituted by lysine (K), arginine (R) or histidine (H) (numbering according to Kabat), the amino acid at position 123 is independently substituted by lysine (K), arginine (R) or histidine (H) (numbering according to Kabat) and the amino acid at position 147 in the constant domain CH1 of the second antigen binding moiety is glutamic acid independently substituted by (E) or aspartic acid (D) (numbering according to the Kabat EU index), the amino acid at position 213 to glutamic acid (E) or aspartic acid (D) (numbering according to the Kabat EU index) independently replaced by

일 구현예에서, 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)에 의해 치환되고(카바트에 따른 넘버링), 위치 123에서 아미노산이 리신(K)에 의해 치환되며(카바트에 따른 넘버링), 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E)에 의해 치환되고(카바트 EU 색인에 따른 넘버링), 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)에 의해 치환된다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).In one embodiment, in the constant domain CL of the second antigen binding moiety the amino acid at position 124 is substituted by lysine (K) (numbering according to Kabat) and the amino acid at position 123 is substituted by lysine (K); (numbering according to Kabat), in the constant domain CH1 of the second antigen binding moiety the amino acid at position 147 is substituted by glutamic acid (E) (numbering according to Kabat EU index) and the amino acid at position 213 is glutamic acid (E) ) (numbering according to the Kabat EU index).

다른 구현예에서, 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)에 의해 치환되고(카바트에 따른 넘버링), 위치 123에서 아미노산이 아르기닌(R)에 의해 치환되며(카바트에 따른 넘버링), 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E)에 의해 치환되고(카바트 EU 색인에 따른 넘버링), 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)에 의해 치환된다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).In another embodiment, in the constant domain CL of the second antigen binding moiety, the amino acid at position 124 is substituted by lysine (K) (numbering according to Kabat), the amino acid at position 123 is substituted by arginine (R), and (numbering according to Kabat), in the constant domain CH1 of the second antigen binding moiety the amino acid at position 147 is substituted by glutamic acid (E) (numbering according to Kabat EU index) and the amino acid at position 213 is glutamic acid (E) ) (numbering according to the Kabat EU index).

상기 비대칭(이종이량체) 단백질의 Fc 도메인의 이종이량체화를 개선하기 위해, 본 발명의 상기 양태들에 따른 일 구현예에서, Fc 도메인의 제1 아단위 내에 위치 366에서 트레오닌 잔기가 트립토판 잔기(T366W)로 대체되고, Fc 도메인의 제2 아단위 내에 위치 407에서 티로신 잔기가 발린 잔기(Y407V)로 대체되며, 임의적으로 위치 366에서 트레오닌 잔기가 세린 잔기(T366S)로 대체되고, 위치 368에서 류신 잔기가 알라닌 잔기(L368A)로 대체된다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링). To improve heterodimerization of the Fc domain of the asymmetric (heterodimer) protein, in one embodiment according to the above aspects of the present invention, a threonine residue at position 366 in the first subunit of the Fc domain is a tryptophan residue (T366W), and in the second subunit of the Fc domain a tyrosine residue at position 407 is replaced with a valine residue (Y407V), optionally a threonine residue at position 366 is replaced with a serine residue (T366S), and at position 368 The leucine residue is replaced with an alanine residue (L368A) (numbering according to the Kabat EU index).

본 발명의 상기 양태들에 따른 추가의 구현예에서, Fc 도메인의 제1 아단위 내에 추가적으로 위치 354에서 세린 잔기가 시스테인 잔기(S354C)로 대체되거나, 또는 위치 356에서 글루타민산 잔기가 시스테인 잔기(E356C)로 대체되며(특히, 위치 354에서 세린 잔기가 시스테인 잔기로 대체되며), Fc 도메인의 제2 아단위 내에 추가적으로 위치 349에서 티로신 잔기가 시스테인 잔기(Y349C)에 의해 대체된다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).In a further embodiment according to the above aspects of the invention, additionally in the first subunit of the Fc domain a serine residue at position 354 is replaced with a cysteine residue (S354C), or a glutamic acid residue at position 356 is replaced with a cysteine residue (E356C) (in particular, the serine residue at position 354 is replaced by a cysteine residue) and additionally within the second subunit of the Fc domain a tyrosine residue at position 349 is replaced by a cysteine residue (Y349C) (according to the Kabat EU index) numbering).

대안적인 이종이량체화 기술은 하기의 "Fc 도메인" 하에 기재되며, 또한 본 발명의 추가 구현예들로서 고려된다.Alternative heterodimerization techniques are described below under “Fc domain” and are also contemplated as further embodiments of the invention.

본 발명의 상기 양태들에 따른 다른 추가의 구현예에서, Fc 도메인은 인간 IgG₁ Fc 도메인이다.In yet a further embodiment according to the above aspects of the invention, the Fc domain is a human IgG ₁ Fc domain.

Fc 도메인 및 변형들Fc domains and modifications

특정 구현예들에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함한다. 이중특이적 항체와 관련하여 본원에 기재된 Fc 도메인의 특징은 본 발명의 항체에 포함된 Fc 도메인에 동일하게 적용될 수 있는 것으로 이해된다.In certain embodiments, a bispecific antibody of the invention comprises an Fc domain consisting of a first and a second subunit. It is understood that the features of the Fc domains described herein with respect to bispecific antibodies are equally applicable to the Fc domains comprised in the antibodies of the invention.

이중특이적 항체의 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 중쇄 도메인을 포함하는 한 쌍의 폴리펩티드 사슬로 구성된다. 예를 들어, 면역글로불린 G(IgG) 분자의 Fc 도메인은 이량체이며, 이의 각 아단위는 CH2 및 CH3 IgG 중쇄 불변 도메인을 포함한다. Fc 도메인의 2개 아단위는 서로 안정되게 결합할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 단지 하나의 Fc 도메인을 포함한다.The Fc domain of a bispecific antibody consists of a pair of polypeptide chains comprising the heavy chain domain of an immunoglobulin molecule. For example, the Fc domain of an immunoglobulin G (IgG) molecule is a dimer, each subunit of which comprises CH2 and CH3 IgG heavy chain constant domains. The two subunits of the Fc domain can stably bind to each other. In one embodiment, a bispecific antibody of the invention comprises only one Fc domain.

일 구현예에서, 이중특이적 항체의 Fc 도메인은 IgG Fc 도메인이다. 특정한 구현예에서, Fc 도메인은 IgG₁ Fc 도메인이다. 다른 구현예에서 Fc 도메인은 IgG₄ Fc 도메인이다. 더 구체적인 구현예에서, Fc 도메인은 위치 S228(카바트 EU 색인 넘버링)에서 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 S228P를 포함하는 IgG₄ Fc 도메인이다. 상기 아미노산 치환은 IgG₄ 항체의 생체내 Fab 팔 교환을 감소시킨다(Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)을 참조). 더 특정한 구현예에서, Fc 도메인은 인간 Fc 도메인이다. 보다 더 특정한 구현예에서, Fc 도메인은 인간 IgG₁ Fc 도메인이다. In one embodiment, the Fc domain of the bispecific antibody is an IgG Fc domain. In certain embodiments, the Fc domain is an IgG ₁ Fc domain. In another embodiment the Fc domain is an IgG ₄ Fc domain. In a more specific embodiment, the Fc domain is an IgG ₄ Fc domain comprising an amino acid substitution at position S228 (Kabat EU index numbering), in particular the amino acid substitution S228P. This amino acid substitution reduces Fab arm exchange in vivo of IgG ₄ antibodies (see Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)). In a more specific embodiment, the Fc domain is a human Fc domain. In an even more specific embodiment, the Fc domain is a human IgG ₁ Fc domain.

IgG 동형의 Fc 도메인은 이의 Fc 감마 수용체 또는 신생아 Fc 수용체(FcRn)와의 상호작용을 기반으로 하는 다양한 특성을 갖는 것을 특징으로 한다(예컨대, Vidarsson et al.; Front Immunol 5 ( 2014) Article 520, 1-17을 참조). The Fc domain of the IgG isotype is characterized by having various properties based on its interaction with the Fc gamma receptor or the neonatal Fc receptor (FcRn) (eg, Vidarsson et al.; Front Immunol 5 ( 2014) Article 520, 1). -17).

이종이량체화를 촉진하는 Fc 도메인 변형Fc domain modifications to promote heterodimerization

본 발명에 따른 이중특이적 항체는 Fc 도메인의 2개 아단위 중 하나 또는 다른 하나에 융합될 수 있는 상이한 항원 결합 도메인을 포함하고, 따라서 Fc 도메인의 2개의 아단위는 전형적으로 2개의 비동일한 폴리펩티드 사슬 내에 포함된다. 상기 폴리펩티드의 재조합 공동발현 및 이후의 이량체화는 상기 2개의 폴리펩티드의 여러 가능한 조합을 유발한다. 재조합 생성에서 이중특이적 항체의 수율과 순도를 향상시키기 위해, 원하는 폴리펩티드의 결합을 증진시키는 변형을 이중특이적 항체의 Fc 도메인에 도입하는 것이 유리할 것이다.Bispecific antibodies according to the invention comprise different antigen binding domains which may be fused to one or the other of the two subunits of the Fc domain, and thus the two subunits of the Fc domain are typically two non-identical polypeptides. included in the chain. Recombinant co-expression of the polypeptides and subsequent dimerization leads to several possible combinations of the two polypeptides. In order to improve the yield and purity of the bispecific antibody in recombinant production, it would be advantageous to introduce modifications to the Fc domain of the bispecific antibody that enhance binding of the desired polypeptide.

이에 따라, 특정 구현예들에서, 본 발명에 따른 이중특이적) 항체의 Fc 도메인은 Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위의 결합을 증진시키는 변형을 포함한다. 인간 IgG Fc 도메인의 2개 아단위 사이에서 가장 광범위한 단백질-단백질 상호작용의 부위는 Fc 도메인의 CH3 도메인 내에 있다. 따라서, 일 구현예에서 상기 변형은 Fc 도메인의 CH3 도메인 내에 있다.Accordingly, in certain embodiments, the Fc domain of a bispecific) antibody according to the invention comprises modifications that enhance binding of the first and second subunits of the Fc domain. The site of the most extensive protein-protein interaction between the two subunits of the human IgG Fc domain is within the CH3 domain of the Fc domain. Thus, in one embodiment said modification is in the CH3 domain of the Fc domain.

이종이량체화를 실시하기 위한 Fc 도메인의 CH3 도메인에서 변형을 위한 여러 접근법이 존재하는데, 이들은 예컨대, WO　96/27011, WO　98/050431, EP　1870459, WO　2007/110205, WO　2007/147901, WO　2009/089004, WO　2010/129304, WO　2011/90754, WO　2011/143545, WO　2012058768, WO　2013157954, WO　2013096291에서 충분히 설명된다. 전형적으로, 이와 같은 모든 접근법에서 Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인 및 Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인은 각 CH3 도메인(또는 이를 포함하는 중쇄)이 그 자체로는 더 이상 동종이량체를 형성할 수 없지만, 상보적으로 가공된 다른 CH3 도메인과 이종이량체를 형성하도록 강제되도록(제1 및 제2 CH3 도메인이 이종이량체를 형성하고, 2개의 제1 또는 2개의 제2 CH3 도메인 사이에 어떤 동종이량체도 형성되지 않도록), 둘 모두 상보성 방식으로 가공된다. 향상된 중쇄 이종이량체화를 위한 상기 상이한 접근법들은 중쇄/경쇄 쌍형성 오류 및 Bence Jones 유형 부산물을 감소시키는, 이중특이적 항체에서 중쇄-경쇄 변형(예컨대, 하나의 결합 팔에서 VH와 VL 교환/대체 및 CH1/CL 인터페이스에서 반대 전하를 갖는 하전된 아미노산의 치환의 도입)과 조합으로 상이한 대안으로서 고려된다.Several approaches exist for modification in the CH3 domain of the Fc domain to effect heterodimerization, these are, for example, WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012058768, WO 2013157954, WO 2013096291. Typically, in all such approaches the CH3 domain of the first subunit of the Fc domain and the CH3 domain of the second subunit of the Fc domain each CH3 domain (or the heavy chain comprising it) is itself no longer a homodimer. to form heterodimers with other complementarily engineered CH3 domains (the first and second CH3 domains form a heterodimer, and the two first or two second CH3 domains so that no homodimers are formed between them), both are processed in a complementary manner. These different approaches for improved heavy chain heterodimerization include heavy chain-light chain modifications in bispecific antibodies (e.g., VH and VL exchange/replacement in one binding arm), reducing heavy chain/light chain pairing errors and Bence Jones type byproducts. and introduction of substitution of charged amino acids with opposite charges at the CH1/CL interface).

특정한 구현예에서, Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위의 결합을 증진시키는 상기 변형은 Fc 도메인의 2개 아단위 중 하나에서 “돌기” 변형 및 Fc 도메인의 2개 아단위 중 다른 하나에서 “구멍” 변형을 포함하는, 이른바 “구멍 내 돌기” 변형이다.In certain embodiments, said modifications that enhance binding of the first and second subunits of the Fc domain include a “protrusion” modification in one of the two subunits of the Fc domain and a “protrusion” modification in the other of the two subunits of the Fc domain. This is the so-called “protrusion in the hole” variant, including the “hole” variant.

구멍 내 돌기 기술은, 예를 들어 US 5,731,168; US 7,695,936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) 및 Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)에서 설명된다. 일반적으로, 상기 방법은 이종이량체 형성을 증진하고 동종이량체 형성을 방해하기 위해 융기가 가공동 내에 배치될 수 있도록, 융기(“돌기”)를 제1 폴리펩티드의 계면에서, 그리고 상응하는 공동(“구멍”)을 제2 폴리펩티드의 계면 내에 도입하는 것을 수반한다. 융기는 제1 폴리펩티드의 계면으로부터 작은 아미노산 측쇄를 더욱 큰 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체함으로써 구축된다. 융기와 동일한 또는 유사한 크기의 보상성 공동은 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 제2 폴리펩티드의 계면 내에 창출된다.In-hole protrusion techniques are described, for example, in US 5,731,168; US 7,695,936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) and Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). In general, the method involves placing a ridge (“protrusion”) at the interface of the first polypeptide, and a corresponding cavity ( "pores") into the interface of the second polypeptide. The elevation is constructed by replacing small amino acid side chains with larger side chains (eg, tyrosine or tryptophan) from the interface of the first polypeptide. Compensatory cavities of the same or similar size as the bumps are created within the interface of the second polypeptide by replacing large amino acid side chains with smaller amino acid side chains (eg, alanine or threonine).

이에 따라, 특정 구현예에서, 이중특이적 항체의 Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기가 더 큰 측쇄 용적을 갖는 아미노산 잔기로 대체됨으로써, 제2 아단위의 CH3 도메인 내에 공동에서 위치가능한 제1 아단위의 CH3 도메인 내에 융기가 형성되고, Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기가 더 작은 측쇄 용적을 갖는 아미노산 잔기로 대체됨으로써, 제1 아단위의 CH3 도메인 내에 융기가 위치가능한 제2 아단위의 CH3 도메인 내에 공동이 형성된다.Accordingly, in certain embodiments, amino acid residues in the CH3 domain of the first subunit of the Fc domain of the bispecific antibody are replaced with amino acid residues having a larger side chain volume, thereby co-located within the CH3 domain of the second subunit. A bump is formed in the CH3 domain of a possible first subunit, and an amino acid residue in the CH3 domain of a second subunit of the Fc domain is replaced by an amino acid residue with a smaller side chain volume, whereby the elevation in the CH3 domain of the first subunit is A cavity is formed in the CH3 domain of the second positionable subunit.

바람직하게는, 더 큰 측쇄 용적을 갖는 상기 아미노산 잔기는 아르기닌(R), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 및 트립토판(W)으로 구성된 군으로부터 선택된다.Preferably, said amino acid residue having a larger side chain volume is selected from the group consisting of arginine (R), phenylalanine (F), tyrosine (Y) and tryptophan (W).

바람직하게는, 더 작은 측쇄 용적을 갖는 상기 아미노산 잔기는 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T) 및 발린(V)으로 구성된 군으로부터 선택된다.Preferably, said amino acid residue having a smaller side chain volume is selected from the group consisting of alanine (A), serine (S), threonine (T) and valine (V).

융기 및 공동은 폴리펩티드를 부호화하는 핵산을, 예컨대 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해, 또는 펩티드 합성에 의해 변경함으로써 만들어질 수 있다.Raises and cavities can be made by altering the nucleic acid encoding the polypeptide, such as by site-directed mutagenesis, or by peptide synthesis.

특정한 구현예에서, Fc 도메인의 제1 아단위(“돌기” 아단위)(이의 CH3 도메인)에서 위치 366에서 트레오닌 잔기가 트립토판 잔기(T366W)로 대체되고, Fc 도메인의 제2 아단위(“구멍" 아단위)(이의 CH3 도메인)에서 위치 407에서 티로신 잔기가 발린 잔기(Y407V)로 대체된다. 일 구현예에서, Fc 도메인의 제2 아단위에서 추가적으로 위치 366에서 트레오닌 잔기가 세린 잔기(T366S)로 대체되고, 위치 368에서 류신 잔기가 알라닌 잔기(L368A)로 대체된다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).In certain embodiments, a threonine residue at position 366 is replaced with a tryptophan residue (T366W) in the first subunit (“protrusion” subunit) of the Fc domain (the CH3 domain thereof) and the second subunit (“hole” of the Fc domain) In the " subunit) (CH3 domain thereof) a tyrosine residue at position 407 is replaced by a valine residue (Y407V). In one embodiment, in the second subunit of the Fc domain additionally, a threonine residue at position 366 is replaced with a serine residue (T366S) , and the leucine residue at position 368 is replaced with an alanine residue (L368A) (numbering according to the Kabat EU index).

다른 추가의 구현예에서, Fc 도메인의 제1 아단위 내에 추가적으로 위치 354에서 세린 잔기가 시스테인 잔기(S354C)로 대체되거나, 또는 위치 356에서 글루타민산 잔기가 시스테인 잔기(E356C)로 대체되고(특히, 위치 354에서 세린 잔기가 시스테인 잔기로 대체되고), Fc 도메인의 제2 아단위 내에 추가적으로 위치 349에서 티로신 잔기가 시스테인 잔기(Y349C)로 대체된다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링). 상기 2개의 시스테인 잔기의 도입은 Fc 도메인의 2개 아단위 사이에 이황화 다리의 형성을 유발하여, 이량체를 더 안정시킨다(Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).In yet a further embodiment, within the first subunit of the Fc domain additionally a serine residue at position 354 is replaced with a cysteine residue (S354C), or a glutamic acid residue at position 356 is replaced with a cysteine residue (E356C) (particularly at position position At 354 a serine residue is replaced with a cysteine residue), and additionally within the second subunit of the Fc domain a tyrosine residue at position 349 is replaced with a cysteine residue (Y349C) (numbering according to the Kabat EU index). The introduction of these two cysteine residues causes the formation of a disulfide bridge between the two subunits of the Fc domain, making the dimer more stable (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).

특정 구현예에서, Fc 도메인의 제1 아단위는 아미노산 치환 S354C 및 T366W를 포함하고, Fc 도메인의 제2 아단위는 아미노산 치환 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V(카바트 EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다.In certain embodiments, the first subunit of the Fc domain comprises the amino acid substitutions S354C and T366W and the second subunit of the Fc domain comprises the amino acid substitutions Y349C, T366S, L368A and Y407V (numbering according to the Kabat EU index) do.

특정 구현예에서, 제2 항원에 결합하는 항원 결합 모이어티는 Fc 도메인의 제1 아단위 (“돌기” 변형을 포함)에 융합된다(선택적으로, CCL2 및/또는 펩티드 링커에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티를 통해). 이론에 얽매이지 않고, Fc 도메인의 돌기 함유 아단위에, 제2 항원, 예컨대 활성화 T 세포 항원에 결합하는 항원 결합 모이어티의 융합은 활성화 T 세포 항원에 결합하는 2개의 항원 결합 모이어티를 포함하는 항체의 생성(2개의 돌기 함유 폴리펩티드의 입체 충돌)을 (더) 최소화할 것이다.In certain embodiments, an antigen binding moiety that binds a second antigen is fused to a first subunit (comprising a “protrusion” modification) of the Fc domain (optionally, a first antigen that binds CCL2 and/or a peptide linker) via a binding moiety). Without wishing to be bound by theory, the fusion of an antigen binding moiety that binds a second antigen, such as an activating T cell antigen, to a dendritic containing subunit of the Fc domain comprises two antigen binding moieties that bind activating T cell antigen. It will (further) minimize the production of antibodies (steric collisions of two protrusion containing polypeptides).

이종이량체화를 실시하기 위한 CH3 변형의 다른 기술이 본 발명에 따른 대안으로서 고려되고, 예를 들어 WO　96/27011, WO　98/050431, EP　1870459, WO　2007/110205, WO　2007/147901, WO　2009/089004, WO　2010/129304, WO　2011/90754, WO　2011/143545, WO　2012/058768, WO　2013/157954, WO　2013/096291에서 설명된다.Other techniques of CH3 modification to effect heterodimerization are considered as alternatives according to the invention, for example WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO2010/129304, WO2011/90754, WO2011/143545, WO2012/058768, WO2013/157954, WO2013/096291.

일 구현예에서, EP 1870459에서 기재된 이종이량체화 접근법이 대안적으로 이용된다. 상기 접근법은 Fc 도메인의 2개 아단위 사이에서 CH3/CH3 도메인 계면 내에 특정한 아미노산 위치에서 반대 전하를 갖는 하전된 아미노산의 도입에 기초한다. 본 발명의 이중특이적 항체에 대한 바람직한 일 구현예는 아미노산 돌연변이 R409D; 2개의 CH3 도메인(Fc 도메인의) 중 하나에서 K370E 및 아미노산 돌연변이 D399K; Fc 도메인의 CH3 도메인 중 다른 하나에서 E357K이다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).In one embodiment, the heterodimerization approach described in EP 1870459 is used alternatively. This approach is based on the introduction of charged amino acids with opposite charges at specific amino acid positions within the CH3/CH3 domain interface between the two subunits of the Fc domain. One preferred embodiment for the bispecific antibody of the present invention is amino acid mutation R409D; K370E and amino acid mutation D399K in one of the two CH3 domains (of the Fc domain); E357K in the other of the CH3 domains of the Fc domain (numbering according to the Kabat EU index).

다른 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 T366W 및 Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 T366S, L368A, Y407V, 그리고 부가적으로 아미노산 돌연변이 R409D; Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인에서 K370E 및 아미노산 돌연변이 D399K; Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인에서 E357K을 포함한다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).In another embodiment, the bispecific antibody of the invention comprises an amino acid mutation T366W in the CH3 domain of the first subunit of the Fc domain and amino acid mutations T366S, L368A, Y407V, and additional amino acid mutations in the CH3 domain of the second subunit of the Fc domain. by amino acid mutation R409D; K370E and amino acid mutation D399K in the CH3 domain of the first subunit of the Fc domain; contains E357K in the CH3 domain of the second subunit of the Fc domain (numbering according to the Kabat EU index).

다른 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 S354C, T366W 및 Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 Y349C, T366S, L368A, Y407V를 포함하거나, 또는 상기 이중특이적 항체는 Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 Y349C, T366W 및 Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 S354C, T366S, L368A, Y407V, 그리고 부가적으로 아미노산 돌연변이 R409D; Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인에서 K370E 및 아미노산 돌연변이 D399K; Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인에서 E357K를 포함한다(이들 모두 카바트 EU 색인에 따른 넘버링).In another embodiment, the bispecific antibody of the invention comprises amino acid mutations S354C, T366W in the CH3 domain of the first subunit of the Fc domain and amino acid mutations Y349C, T366S, L368A, Y407V in the CH3 domain of the second subunit of the Fc domain. or the bispecific antibody comprises amino acid mutations Y349C, T366W in the CH3 domain of the first subunit of the Fc domain and amino acid mutations S354C, T366S, L368A, Y407V, and in the CH3 domain of the second subunit of the Fc domain, and additionally amino acid mutation R409D; K370E and amino acid mutation D399K in the CH3 domain of the first subunit of the Fc domain; contains E357K in the CH3 domain of the second subunit of the Fc domain (all numbered according to the Kabat EU index).

일 구현예에서, WO 2013/157953에 기재된 이종이량체화 접근법이 대안적으로 이용된다. 일 구현예에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366K를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 L351D를 포함한다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링). 추가의 구현예에서, 제1 CH3 도메인은 추가 아미노산 돌연변이 L351K를 포함한다. 추가의 구현예에서, 제2 CH3 도메인은 Y349E, Y349D 및 L368E로부터 선택되는 아미노산 돌연변이(바람직하게는 L368E)를 더 포함한다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).In one embodiment, the heterodimerization approach described in WO 2013/157953 is used alternatively. In one embodiment, the first CH3 domain comprises the amino acid mutation T366K and the second CH3 domain comprises the amino acid mutation L351D (numbering according to the Kabat EU index). In a further embodiment, the first CH3 domain comprises an additional amino acid mutation L351K. In a further embodiment, the second CH3 domain further comprises an amino acid mutation selected from Y349E, Y349D and L368E (preferably L368E) (numbering according to the Kabat EU index).

일 구현예에서, WO 2012/058768에 기재된 이종이량체화 접근법이 대안적으로 이용된다. 일 구현예에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 L351Y, Y407A를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366A, K409F를 포함한다. 추가의 구현예에서, 제2 CH3 도메인은 위치 T411, D399, S400, F405, N390 또는 K392에서, 예컨대 a) T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E 또는 T411W, b) D399R, D399W, D399Y 또는 D399K, c) S400E, S400D, S400R 또는 S400K, d) F405I, F405M, F405T, F405S, F405V 또는 F405W, e) N390R, N390K 또는 N390D, f) K392V, K392M, K392R, K392L, K392F 또는 K392E로부터 선택되는 추가 아미노산 돌연변이를 포함한다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링). 추가의 구현예에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 L351Y, Y407A를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366V, K409F를 포함한다. 추가의 구현예에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 Y407A를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366A, K409F를 포함한다. 추가의 구현예에서, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 K392E, T411E, D399R 및 S400R을 더 포함한다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).In one embodiment, the heterodimerization approach described in WO 2012/058768 is used alternatively. In one embodiment, the first CH3 domain comprises amino acid mutations L351Y, Y407A and the second CH3 domain comprises amino acid mutations T366A, K409F. In a further embodiment, the second CH3 domain is at position T411, D399, S400, F405, N390 or K392, such as a) T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E or T411W, b) D399R, D399W, D399Y or D399K, c) S400E, S400D, S400R or S400K, d) F405I, F405M, F405T, F405S, F405V or F405W, e) N390R, N390K or N390D, f) K392V, K392M, K392R, K392L, K392F or K392E Contains additional amino acid mutations (numbering according to the Kabat EU index). In a further embodiment, the first CH3 domain comprises the amino acid mutations L351Y, Y407A and the second CH3 domain comprises the amino acid mutations T366V, K409F. In a further embodiment, the first CH3 domain comprises the amino acid mutation Y407A and the second CH3 domain comprises the amino acid mutations T366A, K409F. In a further embodiment, the second CH3 domain further comprises amino acid mutations K392E, T411E, D399R and S400R (numbering according to the Kabat EU index).

일 구현예에서, WO 2011/143545에 기재된 이종이량체화 접근법이, 예컨대 368 및 409(카바트 EU 색인에 따른 넘버링)로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에서 아미노산 변형으로, 대안적으로 이용된다.In one embodiment, the heterodimerization approach described in WO 2011/143545 is alternatively used, such as with amino acid modifications at positions selected from the group consisting of 368 and 409 (numbering according to the Kabat EU index).

일 구현예에서, 전술한 구멍 내 돌기 기술을 또한 이용하는, WO 2011/090762에 기재된 이종이량체화 접근법이 대안적으로 이용된다. 일 구현예에서, 제 1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366W를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 Y407A를 포함한다. 일 구현예에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366Y를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 Y407T를 포함한다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).In one embodiment, the heterodimerization approach described in WO 2011/090762, which also uses the aforementioned in-pore protrusion technique, is alternatively used. In one embodiment, the first CH3 domain comprises the amino acid mutation T366W and the second CH3 domain comprises the amino acid mutation Y407A. In one embodiment, the first CH3 domain comprises the amino acid mutation T366Y and the second CH3 domain comprises the amino acid mutation Y407T (numbering according to the Kabat EU index).

일 구현예에서, 이중특이적 항체 또는 이의 Fc 도메인은 IgG₂ 하위부류의 것이고, WO 2010/129304에 기재된 이종이량체화 접근법이 대안적으로 이용된다.In one embodiment, the bispecific antibody or Fc domain thereof is of the IgG ₂ subclass and the heterodimerization approach described in WO 2010/129304 is used alternatively.

대안적 구현예에서, Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위의 결합을 증진시키는 변형은, 예컨대 PCT 공개 WO 2009/089004에 기재된 바와 같이, 정전 스티어링 효과를 매개하는 변형을 포함한다. 일반적으로, 이러한 방법은 동종이량체 형성이 정전기적으로 불리하지만 이종이량체화는 정전기적으로 유리하게 되도록, 하전된 아미노산 잔기에 의한 2개의 Fc 도메인 아단위의 계면에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 대체를 수반한다. 상기 일 구현예에서, 제1 CH3 도메인은 음으로 하전된 아미노산(예컨대, 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D), 바람직하게는 K392D 또는 N392D)으로 K392 또는 N392의 아미노산 치환을 포함하고, 제2 CH3 도메인은 양으로 하전된 아미노산(예컨대, 리신(K) 또는 아르기닌(R), 바람직하게는 D399K, E356K, D356K 또는 E357K, 더 바람직하게는 D399K 및 E356K)으로 D399, E356, D356 또는 E357의 아미노산 치환을 포함한다. 추가의 구현예에서, 제1 CH3 도메인은 음으로 하전된 아미노산(예컨대, 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D), 바람직하게는 K409D 또는 R409D)으로 K409 또는 R409의 아미노산 치환을 더 포함한다. 추가의 구현예에서, 제1 CH3 도메인은 음으로 하전된 아미노산(예컨대, 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D))으로 K439 및/또는 K370의 아미노산 치환(이들 모두 카바트 EU 색인에 따른 넘버링)을 추가적으로 또는 대안적으로 포함한다.In an alternative embodiment, modifications that enhance binding of the first and second subunits of the Fc domain include modifications that mediate electrostatic steering effects, eg, as described in PCT Publication WO 2009/089004. In general, these methods involve the replacement of one or more amino acid residues at the interface of two Fc domain subunits by charged amino acid residues, such that homodimer formation is electrostatically unfavorable but heterodimerization is electrostatically favored. accompanying In one such embodiment, the first CH3 domain comprises an amino acid substitution of K392 or N392 with a negatively charged amino acid (eg glutamic acid (E) or aspartic acid (D), preferably K392D or N392D), and the second The CH3 domain is an amino acid of D399, E356, D356 or E357 with a positively charged amino acid (such as lysine (K) or arginine (R), preferably D399K, E356K, D356K or E357K, more preferably D399K and E356K). includes substitution. In a further embodiment, the first CH3 domain further comprises an amino acid substitution of K409 or R409 with a negatively charged amino acid (eg glutamic acid (E) or aspartic acid (D), preferably K409D or R409D). In a further embodiment, the first CH3 domain is an amino acid substitution of K439 and/or K370 with a negatively charged amino acid (eg, glutamic acid (E) or aspartic acid (D)), all numbering according to the Kabat EU index. additionally or alternatively.

다른 추가의 구현예에서, WO 2007/147901에 기재된 이종이량체화 접근법이 대안적으로 이용된다. 일 구현예에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 K253E, D282K 및 K322D를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 D239K, E240K 및 K292D를 포함한다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).In yet a further embodiment, the heterodimerization approach described in WO 2007/147901 is used alternatively. In one embodiment, the first CH3 domain comprises the amino acid mutations K253E, D282K and K322D and the second CH3 domain comprises the amino acid mutations D239K, E240K and K292D (numbering according to the Kabat EU index).

또 다른 구현예에서, WO 2007/110205에 기재된 이종이량체화 접근법이 대안적으로 이용될 수 있다.In another embodiment, the heterodimerization approach described in WO 2007/110205 may alternatively be used.

일 구현예에서, Fc 도메인의 제1 아단위는 아미노산 치환 K392D 및 K409D를 포함하고, Fc 도메인의 제2 아단위는 아미노산 치환 D356K 및 D399K를 포함한다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).In one embodiment, the first subunit of the Fc domain comprises the amino acid substitutions K392D and K409D and the second subunit of the Fc domain comprises the amino acid substitutions D356K and D399K (numbering according to the Kabat EU index).

이중특이적 항-CCL2 항체에 대해 본원에 사용된 용어 "야생형(WT) IgG 또는 IgG1"은 이종이량체화를 촉진하는 상기 기재된 변형/돌연변이를 포함할 수 있지만 하기 기재된 바와 같이 Fc 수용체 결합 및/또는 작동체 기능을 증가시키거나 감소시키는 추가의 Fc 도메인 변형/돌연변이를 포함하지는 않는 IgG 또는 IgG1 불변 중쇄를 포함하는 이중특이적 항체를 지칭한다. The term "wild-type (WT) IgG or IgGl" as used herein for a bispecific anti-CCL2 antibody may include the modifications/mutations described above that promote heterodimerization but not Fc receptor binding and/or as described below. or a bispecific antibody comprising an IgG or IgGl constant heavy chain which does not comprise additional Fc domain modifications/mutations that increase or decrease effector function.

Fc 수용체 결합 및/또는 작동체 기능을 증가시키거나 감소시키는 Fc 도메인 변형/돌연변이Fc domain modifications/mutations that increase or decrease Fc receptor binding and/or effector function

스위핑 기술을 통한 이중특이적 항-CCL2 항체의 변형Modification of bispecific anti-CCL2 antibodies via sweeping technique

이중특이적 항-CCL2 항체는 이중특이적 항-CCL2 항체가 장기간에 걸쳐 유리 CCl2를 제거하여 생체 내에서 항암 효능과 같은 생물학적 효과를 지속할 수 있도록 하는 스위핑 기술을 사용하여 변형되었다.The bispecific anti-CCL2 antibody was modified using a sweeping technique that allows the bispecific anti-CCL2 antibody to scavenge free CCl2 over an extended period of time, thereby sustaining biological effects such as anti-cancer efficacy in vivo.

스위핑의 개념은, 예컨대 Igawa et al, Immunological Reviews 270 (2016) 132-151, WO2012/122011, WO2016/098357, 및 WO2013/081143에서 기재되며, 이는 본원에 원용된다.The concept of sweeping is described, for example, in Igawa et al, Immunological Reviews 270 (2016) 132-151, WO2012/122011, WO2016/098357, and WO2013/081143, which are incorporated herein by reference.

본 발명은 전술한 항체의 산성 pH 범위의 항원 결합 활성(결합능)을 이의 중성 pH 범위의 항원 결합 활성 미만으로 저하시킴으로써 항체 매개 항원의 세포 내로의 흡수를 용이하게 하는 방법을 제공한다; 이는 항원의 세포 내 흡수를 촉진한다. 본 발명은 또한 항원의 세포 내 흡수를 촉진하는 상술한 항체의 항원 결합 도메인 내 적어도 하나의 아미노산을 변경하는 것을 기초로 하는, 항체 매개 항원의 세포 내 흡수를 촉진하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 항원의 세포 내 흡수를 촉진하는 상술한 항체의 항원 결합 도메인 내로 적어도 하나의 아미노산에 대한 히스티딘을 치환하거나 적어도 하나의 히스티딘을 삽입하는 것을 기초로 하는, 항체 매개 항원의 세포 내 흡수를 촉진하는 방법을 제공한다.The present invention provides a method for facilitating the uptake of an antibody-mediated antigen into cells by lowering the antigen-binding activity (binding capacity) of the aforementioned antibody in an acidic pH range to less than its neutral pH range antigen-binding activity; This promotes intracellular uptake of antigen. The present invention also provides a method for promoting cellular uptake of an antibody mediated antigen, which is based on altering at least one amino acid in the antigen binding domain of an antibody as described above which promotes cellular uptake of the antigen. The present invention also provides antibody-mediated uptake into cells of an antigen, which is based on substituting histidine for at least one amino acid or inserting at least one histidine into the antigen binding domain of an antibody as described above which promotes intracellular uptake of the antigen. provide a way to promote

본원에서, 항체에 의해 매개되는 "항원의 세포 내 흡수"는 항원이 세포내 이입에 의해 세포내로 흡수되는 것을 의미한다. 한편, 본원에서 "세포 내 흡수를 촉진한다"는 것은 혈장 중 항원에 결합된 항체의 세포 내 흡수율이 증가되거나, 및/또는 흡수된 항원이 혈장으로 재순환되는 양이 감소됨을 의미한다. 이는 중성 pH 범위의 항체의 인간 FcRn 결합 활성을 증가시키기 전에, 또는 인간 FcRn 결합 활성을 증가시키고 산성 pH 범위의 항체의 항원 결합 활성(결합능)을 이의 중성 pH 범위의 항원 결합 활성 미만으로 저하시키기 전에 항체와 비교하여 세포 내 흡수율이 촉진됨을 의미한다. 상기 비율은 바람직하게는 원형 인간 IgG와 비교하여, 더 바람직하게는 원형 인간 IgG와 비교하여 개선된다. 따라서, 본 발명에서는 항체에 의해 항원의 세포 내 흡수가 촉진되는지 여부를 항원의 세포 내 흡수율의 증가를 기초로 평가할 수 있다. 항원의 세포 내 흡수율은, 예를 들어 배지에 항원 및 항체를 첨가한 후 인간 FcRn 발현 세포를 함유하는 배양 배지에서 항원 농도의 경시적 감소를 모니터링함으로써, 또는 시간 경과에 따른 항원의 인간 FcRn 발현 세포 내 흡수량을 모니터링함으로써 계산할 수 있다. 항체 매개 항원의 세포 내 흡수율을 촉진하기 위한 본 발명의 방법을 사용하여, 예를 들어 혈장으로부터 항원 제거율은 항체를 투여함으로써 향상될 수 있다. 따라서, 항체 매개 항원의 세포 내 흡수가 촉진되는지 여부는, 예를 들어 혈장으로부터의 항원 제거율이 가속화되는지 여부 또는 항체를 투여함으로써 혈장 중 총 항원 농도가 감소되는지 여부를 시험함으로써 평가할 수도 있다.As used herein, "intracellular uptake of an antigen" mediated by an antibody means that the antigen is taken up into a cell by endocytosis. Meanwhile, as used herein, "promoting intracellular uptake" means that the intracellular uptake rate of an antibody bound to an antigen in plasma is increased, and/or the amount of the absorbed antigen is recycled into plasma is reduced. This is before increasing the human FcRn binding activity of the antibody in the neutral pH range, or before increasing the human FcRn binding activity and lowering the antigen binding activity (binding capacity) of the antibody in the acidic pH range to less than its neutral pH range antigen binding activity. Compared to the antibody, it means that the rate of uptake into cells is promoted. This ratio is preferably improved compared to native human IgG, more preferably compared to native human IgG. Therefore, in the present invention, whether or not the antigen uptake is promoted by the antibody can be evaluated based on the increase in the antigen uptake rate into the cell. The rate of intracellular uptake of an antigen can be measured, for example, by monitoring the decrease in antigen concentration over time in a culture medium containing human FcRn expressing cells after addition of the antigen and antibody to the medium, or by monitoring the antigen concentration over time in human FcRn expressing cells of the antigen. It can be calculated by monitoring my absorption. Using the methods of the invention to promote cellular uptake of antibody-mediated antigen, for example, antigen clearance from plasma can be enhanced by administering the antibody. Thus, whether antibody-mediated uptake into cells of antigen is promoted may be assessed, for example, by testing whether antigen clearance from plasma is accelerated or whether administration of the antibody reduces the total antigen concentration in plasma.

본원에서, "혈장 중 총 항원 농도"는 항체 결합된 항원 및 비결합된 항원 농도의 합 또는 항체 비결합된 항원 농도인 "혈장 중 유리 항원 농도"를 의미한다. "혈장 중 총 항원 농도" 또는 "혈장 중 유리 항원 농도"를 측정하는 다양한 방법이 하기에 기재된 바와 같이 당업계에 일반적으로 공지되어 있다.As used herein, "total antigen concentration in plasma" means "free antigen concentration in plasma" which is the sum of antibody-bound and unbound antigen concentrations or antibody-unbound antigen concentration. Various methods of determining "total antigen concentration in plasma" or "free antigen concentration in plasma" are generally known in the art, as described below.

본원에서 사용된 "원형 인간 IgG"(또는 "야생형(WT) 인간 IgG)는 비변형된(상기 이종이량체화에 대한 잠재적인 변형에 대해서는 제외) 인간 IgG를 의미하며 특정 부류의 IgG로 제한되지 않는다. 이는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4가 산성 pH 범위의 인간 FcRn에 결합할 수 있는 한 "원형 인간 IgG"로서 사용될 수 있음을 의미한다. 바람직하게는, "원형 인간 IgG"는 인간 IgG1일 수 있다.As used herein, "prototypical human IgG" (or "wild-type (WT) human IgG)" refers to unmodified (except for potential modifications to the above heterodimerization) human IgG and is not limited to a specific class of IgG. This means that human IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 can be used as "prototypical human IgG" as long as it can bind to human FcRn in the acidic pH range. Preferably, "prototypical human IgG" is human IgG1 can

본 발명은 또한 단일 항체가 결합할 수 있는 항원의 수를 증가시키는 방법을 제공한다. 더 구체적으로, 본 발명은 중성 pH 범위의 항체의 인간 FcRn 결합 활성을 증가시킴으로써 산성 pH 범위의 인간 FcRn 결합 활성을 갖는 단일 항체가 결합할 수 있는 항원의 수를 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 항체의 인간 FcRn 결합 도메인 내 적어도 하나의 아미노산을 변경함으로써 산성 pH 범위의 인간 FcRn 결합 활성을 갖는 단일 항체가 결합할 수 있는 항원의 수를 증가시키는 방법을 제공한다.The invention also provides methods of increasing the number of antigens to which a single antibody can bind. More specifically, the present invention provides a method for increasing the number of antigens to which a single antibody having human FcRn-binding activity in an acidic pH range can bind by increasing the human FcRn-binding activity of the antibody in the neutral pH range. The present invention also provides a method of increasing the number of antigens to which a single antibody having human FcRn binding activity in an acidic pH range can bind by altering at least one amino acid in the human FcRn binding domain of the antibody.

본 발명은 항체 매개 항원의 세포 내 흡수를 촉진하는 방법을 제공한다. 더 구체적으로, 본 발명은 중성 pH 범위의 항체의 인간 FcRn 결합 활성을 증가시키는 것에 기초하여 산성 pH 범위의 인간 FcRn 결합 활성을 갖는 항체에 의한 항원의 세포 내 흡수를 촉진하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 항체의 인간 FcRn 결합 도메인 내 적어도 하나의 아미노산을 변경하는 것에 기초하여 산성 pH 범위의 인간 FcRn 결합 활성을 갖는 항체에 의한 항원의 세포 내 흡수를 개선하는 방법을 제공한다.The present invention provides methods for promoting cellular uptake of antibody-mediated antigens. More specifically, the present invention provides a method for promoting intracellular uptake of an antigen by an antibody having human FcRn-binding activity in an acidic pH range based on increasing the human FcRn-binding activity of the antibody in a neutral pH range. The present invention also provides a method for improving the intracellular uptake of an antigen by an antibody having human FcRn binding activity in an acidic pH range based on altering at least one amino acid in the human FcRn binding domain of the antibody.

본 발명은 또한, 모 IgG의 Fc 도메인을 포함한 인간 FcRn 결합 도메인의 모 IgG Fc 도메인 내 존재하는 위치 237, 238, 239, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 270, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 325, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434, 및 436(EU 넘버링)으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산에 대하여 상이한 아미노산의 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 인간 FcRn 결합 도메인을 이용하는 것에 기초하여, 산성 pH 범위의 인간 FcRn 결합 활성을 갖는 항체에 의한 항원의 세포 내 흡수를 촉진하는 방법을 제공한다.The present invention also relates to positions 237, 238, 239, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 270 in the parent IgG Fc domain of a human FcRn binding domain, including the Fc domain of the parent IgG. , 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 325, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387 , 389, 424, 428, 433, 434, and 436 (EU numbering) based on the use of a human FcRn binding domain comprising an amino acid sequence having a substitution of a different amino acid for at least one amino acid selected from the acid pH range. Provided is a method for promoting antigen uptake into cells by an antibody having human FcRn-binding activity.

본 발명은 또한 전술한 항체의 산성 pH 범위의 항원 결합 활성(결합능)을 이의 중성 pH 범위의 항원 결합 활성 미만으로 저하시킴으로써 항체 매개 항원의 세포 내로의 흡수를 용이하게 하는 방법을 제공한다; 이는 세포로의 항원 흡수를 촉진한다. 본 발명은 또한 세포 내로의 항원 흡수를 촉진하는 상술한 항체의 항원 결합 도메인 내 적어도 하나의 아미노산을 변경하는 것을 기초로 하는, 항체 매개 항원의 세포 내로의 흡수를 촉진하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 세포 내로의 항원 흡수를 촉진하는 상술한 항체의 항원 결합 도메인 내로 적어도 하나의 아미노산에 대한 히스티딘을 치환하거나 적어도 하나의 히스티딘을 삽입하는 것을 기초로 하는, 항체 매개 항원의 세포 내로의 흡수를 촉진하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for facilitating antibody-mediated uptake into cells of an antigen by lowering the antigen-binding activity (binding capacity) of the aforementioned antibody in an acidic pH range to less than its neutral pH range antigen-binding activity; This promotes antigen uptake into cells. The present invention also provides a method for promoting uptake of an antibody mediated antigen into a cell, which is based on altering at least one amino acid in the antigen binding domain of an antibody as described above that promotes uptake of the antigen into the cell. The present invention also relates to antibody-mediated uptake of antigen into cells, which is based on substituting histidine for at least one amino acid or inserting at least one histidine into the antigen binding domain of an antibody as described above which promotes antigen uptake into cells. provides a way to promote

본원에서, 항체에 의해 매개되는 "세포 내로의 항원 흡수"는 항원이 세포내 이입에 의해 세포내로 흡수되는 것을 의미한다. 한편, 본원에서 "세포 내로의 흡수를 촉진한다"는 것은 혈장 중 항원에 결합된 항체의 세포내 흡수율이 증가되거나, 및/또는 흡수된 항원이 혈장으로 재순환되는 양이 감소됨을 의미한다. 이는 중성 pH 범위의 항체의 인간 FcRn 결합 활성을 증가시키기 전에, 또는 인간 FcRn 결합 활성을 증가시키고 산성 pH 범위의 항체의 항원 결합 활성(결합능)을 이의 중성 pH 범위의 항원 결합 활성 미만으로 저하시키기 전에 항체와 비교하여 세포 내로의 흡수율이 촉진됨을 의미한다. 상기 비율은 바람직하게는 원형 인간 IgG와 비교하여, 더 바람직하게는 원형 인간 IgG와 비교하여 개선된다. 따라서, 본 발명에서는 항체에 의해 항원의 세포 내로의 흡수가 촉진되는지 여부를 세포 내로의 항원 흡수율의 증가를 기초로 평가할 수 있다. 항원의 세포 내 흡수율은, 예를 들어 배지에 항원 및 항체를 첨가한 후 인간 FcRn 발현 세포를 함유하는 배양 배지에서 항원 농도의 경시적 감소를 모니터링함으로써, 또는 시간 경과에 따른 항원의 인간 FcRn 발현 세포 내 흡수량을 모니터링함으로써 계산할 수 있다. 항체 매개 항원의 세포 내 흡수율을 촉진하기 위한 본 발명의 방법을 사용하여, 예를 들어 혈장으로부터 항원 제거율은 항체를 투여함으로써 향상될 수 있다. 따라서, 항체 매개 항원의 세포 내 흡수가 촉진되는지 여부는, 예를 들어 혈장으로부터의 항원 제거율이 가속화되는지 여부 또는 항체를 투여함으로써 혈장 중 총 항원 농도가 감소되는지 여부를 시험함으로써 평가할 수도 있다.As used herein, "antigen uptake into a cell" mediated by an antibody means that an antigen is taken up into a cell by endocytosis. On the other hand, as used herein, "promoting uptake into cells" means that the intracellular uptake rate of an antibody bound to an antigen in plasma is increased, and/or the amount of the absorbed antigen is recycled into plasma is reduced. This is before increasing the human FcRn binding activity of the antibody in the neutral pH range, or before increasing the human FcRn binding activity and lowering the antigen binding activity (binding capacity) of the antibody in the acidic pH range to less than its neutral pH range antigen binding activity. Compared to the antibody, it means that the absorption rate into the cell is promoted. This ratio is preferably improved compared to native human IgG, more preferably compared to native human IgG. Therefore, in the present invention, whether or not the antigen uptake is promoted by the antibody can be evaluated based on the increase in the antigen uptake rate into the cell. The rate of intracellular uptake of an antigen can be measured, for example, by monitoring the decrease in antigen concentration over time in a culture medium containing human FcRn expressing cells after addition of the antigen and antibody to the medium, or by monitoring the antigen concentration over time in human FcRn expressing cells of the antigen. It can be calculated by monitoring my absorption. Using the methods of the invention to promote cellular uptake of antibody-mediated antigen, for example, antigen clearance from plasma can be enhanced by administering the antibody. Thus, whether antibody-mediated uptake into cells of antigen is promoted may be assessed, for example, by testing whether antigen clearance from plasma is accelerated or whether administration of the antibody reduces the total antigen concentration in plasma.

본원에서 사용된 "원형 인간 IgG"(또는 "야생형 IgG)는 비변형된 인간 IgG(상기 이종이량체화에 대한 잠재적인 변형에 대해서는 제외)를 의미하며 특정 부류의 IgG로 제한되지 않는다. 이는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4가 산성 pH 범위의 인간 FcRn에 결합할 수 있는 한 "원형 인간 IgG"로서 사용될 수 있음을 의미한다. 바람직하게는, "원형 인간 IgG"는 인간 IgG1일 수 있다.As used herein, "prototypical human IgG" (or "wild-type IgG") refers to unmodified human IgG (except for potential modifications to the above heterodimerization) and is not limited to a particular class of IgG. It means that IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 can be used as “prototypical human IgG” as long as it is capable of binding to human FcRn in an acidic pH range, Preferably, “prototypical human IgG” may be human IgG1.

본원에서 사용된 "모 IgG"는 모 IgG의 변형된 변이체가 산성 pH 범위의 인간 FcRn에 결합할 수 있는 한 변이체를 생성하도록 후속적으로 변형되는 비변형된 IgG를 의미한다(따라서, 모 IgG는 산성 조건의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 반드시 필요로 하지는 않는다). 모 IgG는 자연 발생 IgG, 또는 자연 발생 IgG의 변이체 또는 조작된 버전일 수 있다. 모 IgG는 폴리펩티드 자체, 상기 모 IgG를 포함한 조성물, 또는 이를 부호화하는 아미노산 서열을 지칭할 수 있다. "모 IgG"는 하기에 개략된 바와 같이 공지된 상업적이고 재조합적으로 생성된 IgG를 포함한다는 점에 유의해야 한다. "모 IgG"의 기원은 제한되지 않으며 인간이 아닌 동물 또는 인간의 모든 유기체에서 수득할 수 있다. 바람직하게는, 유기체는 마우스, 래트, 기니피그, 햄스터, 저빌쥐, 고양이, 토끼, 개, 염소, 양, 소, 말, 낙타 및 비인간 영장류로부터 선택된다. 다른 구현예에서, "모 IgG"는 또한 시노몰구스, 마모셋, 레서스, 침팬지 또는 인간으로부터 수득될 수 있다. 바람직하게는, "모 IgG"는 인간 IgG1로부터 수득되지만, 특정 부류의 IgG에 제한되지는 않는다. 이는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4가 "모 IgG"로서 적절하게 사용될 수 있음을 의미한다. 유사한 방식으로, 임의의 유기체로부터의 임의의 부류 또는 하위 부류의 IgG는 바람직하게는 "모 IgG"로서 사용될 수 있다. 자연 발생 IgG의 변이체 또는 조작된 버전의 예는 Curr Opin Biotechnol. 2009 Dec; 20(6): 685-91, Curr Opin Immunol. 2008 Aug; 20(4): 460-70, Protein Eng Des Sel. 2010 Apr; 23(4): 195-202, WO 2009/086320, WO 2008/092117, WO 2007/041635 및 WO 2006/105338에 기재되어 있지만, 이에 제한되지는 않는다."Parent IgG" as used herein means an unmodified IgG that is subsequently modified to produce a variant as long as the modified variant of the parent IgG is capable of binding to human FcRn in an acidic pH range (hence the parent IgG is binding activity to human FcRn under acidic conditions). The parent IgG may be a naturally occurring IgG, or a variant or engineered version of a naturally occurring IgG. Parent IgG may refer to a polypeptide itself, a composition comprising the parent IgG, or an amino acid sequence encoding the same. It should be noted that "parent IgG" includes known commercial and recombinantly produced IgG as outlined below. The origin of the "parent IgG" is not limited and can be obtained from any organism, either a non-human animal or a human. Preferably, the organism is selected from mice, rats, guinea pigs, hamsters, gerbils, cats, rabbits, dogs, goats, sheep, cattle, horses, camels and non-human primates. In other embodiments, a “parent IgG” can also be obtained from a cynomolgus, marmoset, rhesus, chimpanzee or human. Preferably, the "parent IgG" is obtained from human IgG1, but is not limited to a particular class of IgG. This means that human IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 can be used as "parent IgG" as appropriate. In a similar manner, any class or subclass of IgG from any organism may preferably be used as "parent IgG". An example of a variant or engineered version of a naturally occurring IgG is Curr Opin Biotechnol. 2009 Dec; 20(6): 685-91, Curr Opin Immunol. 2008 Aug; 20(4): 460-70, Protein Eng Des Sel. 2010 Apr; 23(4): 195-202, WO 2009/086320, WO 2008/092117, WO 2007/041635 and WO 2006/105338.

본 발명은 또한 항체를 투여함으로써 혈장 항원 제거능을 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명에서, "혈장 항원 제거능을 증가시키는 방법"은 "혈장에서 항원을 제거하는 항체의 능력을 증가시키는 방법"과 동의어이다. 더 구체적으로, 본 발명은 중성 pH 범위의 항체의 인간 FcRn 결합 활성을 증가시킴으로써 산성 pH 범위의 인간 FcRn 결합 활성을 갖는 항체에 의해 혈장 항원 제거능을 증가시키는 방법을 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 항체의 인간 FcRn 결합 도메인 내 적어도 하나의 아미노산을 변경하는 것에 기초하여 산성 pH 범위의 인간 FcRn 결합 활성을 갖는 항체에 의한 혈장 항원 제거능을 증가시키는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method of increasing plasma antigen clearance by administering an antibody. In the present invention, "a method of increasing plasma antigen clearance" is synonymous with "a method of increasing the ability of an antibody to remove an antigen from plasma". More specifically, the present invention provides a method of increasing plasma antigen clearance by an antibody having human FcRn-binding activity in an acidic pH range by increasing the human FcRn-binding activity of the antibody in a neutral pH range. The present invention also provides a method of increasing plasma antigen clearance by an antibody having human FcRn binding activity in an acidic pH range based on altering at least one amino acid in the human FcRn binding domain of the antibody.

본 발명은 또한 상이한 아미노산을 갖는 모 IgG의 Fc 도메인을 포함한 인간 FcRn 결합 도메인의 모 IgG Fc 도메인 내 존재하는 위치 237, 238, 239, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 270, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 325, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434, 및 436(EU 넘버링)으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산의 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 인간 FcRn 결합 도메인을 이용함으로써, 산성 pH 범위의 인간 FcRn 결합 활성을 갖는 항체에 의한 혈장 항원 제거능을 증가시키는 방법을 제공한다.The present invention also relates to positions 237, 238, 239, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, present in the parent IgG Fc domain of a human FcRn binding domain, including the Fc domain of a parent IgG having different amino acids; 265, 270, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 325, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, Human FcRn binding in an acidic pH range by using a human FcRn binding domain comprising an amino acid sequence having a substitution of at least one amino acid selected from 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434, and 436 (EU numbering). A method for increasing plasma antigen clearance by an active antibody is provided.

본 발명은 또한 중성 pH 범위의 항원 결합 활성과 비교하여 혈장 항원 제거능이 개선된 상술된 항체의 산성 pH 범위의 항원 결합 활성을 감소시킴으로써, 항체에 의한 혈장 항원 제거능을 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 혈장 항원 제거능이 개선된 상술된 항체의 항원 결합 도메인 내 적어도 하나의 아미노산을 변경함으로써, 항체에 의한 혈장 항원 제거능을 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 혈장 항원 제거능이 개선된 상술된 항체의 항원 결합 도메인 내로 적어도 하나의 히스티딘을 삽입하거나 적어도 하나의 아미노산에 대해 히스티딘을 치환함으로써, 항체를 투여하여 혈장 항원 제거능을 증가시키는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for increasing plasma antigen clearance by an antibody by reducing the antigen-binding activity in the acidic pH range of the above-described antibody, which has improved plasma antigen clearance compared to the antigen-binding activity in the neutral pH range. The present invention also provides a method for increasing plasma antigen clearance by an antibody by altering at least one amino acid in the antigen binding domain of the above-described antibody having improved plasma antigen clearance. The present invention also provides a method of increasing plasma antigen clearance by administering the antibody by inserting at least one histidine into the antigen binding domain of the above-described antibody having improved plasma antigen clearance or substituting histidine for at least one amino acid. .

본원에서, "혈장 항원 제거능"은 항체가 생체 내에서 투여 또는 분비될 때 혈장에서 항원을 제거하는 능력을 의미한다. 따라서, 본원의 “항체의 혈장 항원 제거능의 증가”는 중성 pH 범위의 항체의 인간 FcRn 결합 활성을 증가시키기 전, 또는 인간 FcRn 결합 활성을 증가시킴과 동시에 이의 산성 pH 범위의 항원 결합 활성을 중성 pH 범위의 활성 미만으로 감소시키기 전과 비교하여 항체 투여 시 혈장으로부터의 항원 제거율이 가속화되는 것을 의미한다. 혈장에서 항원을 제거하는 항체의 활성 증가는, 예를 들어 생체 내에서 가용성 항원 및 항체를 투여하고, 투여 후 혈장 중 가용성 항원의 농도를 측정함으로써 평가할 수 있다. 중성 pH 범위의 항체의 인간 FcRn 결합 활성을 증가시키거나, 인간 FcRn 결합 활성을 증가시킴과 동시에 산성 pH 범위의 이의 항원 결합 활성을 중성 pH 범위의 활성 미만으로 감소시킴으로써 가용성 항원 및 항체의 투여 후 혈장 중 가용성 항원의 농도가 감소될 때, 항체의 혈장 항원 제거능이 증가되는 것으로 판단할 수 있다. 가용성 항원의 형태는 이의 농도가 각각 "혈장 중 항체 결합된 항원의 농도" 및 "혈장 중 항체 비결합된 항원의 농도"로 결정될 수 있는 항체 결합된 항원 또는 항체 비결합된 항원일 수 있다(후자는 "혈장 중 유리 항원의 농도". "혈장 중 총 항원 농도"는 항체 결합된 항원 및 비결합된 항원 농도의 합 또는 항체 비결합된 항원 농도인 "혈장 중 유리 항원의 농도"를 의미하므로, 가용성 항원의 농도는 “혈장 중 총 항원 농도”로서 결정할 수 있다. "혈장 중 총 항원 농도" 또는 "혈장 중 유리 항원의 농도"를 측정하는 다양한 방법이 하기에 기재된 바와 같이 당업계에 일반적으로 공지되어 있다.As used herein, "plasma antigen clearance" refers to the ability of an antibody to remove antigen from plasma when administered or secreted in vivo. Therefore, "increasing plasma antigen clearance of an antibody" herein refers to either before increasing the human FcRn-binding activity of the antibody in the neutral pH range, or at the same time as increasing the human FcRn-binding activity and reducing its antigen-binding activity in the acidic pH range to neutral pH. It means that the rate of antigen clearance from plasma is accelerated upon administration of the antibody as compared to before reduction below the range of activity. The increase in the activity of the antibody to remove the antigen from plasma can be evaluated, for example, by administering the soluble antigen and the antibody in vivo, and measuring the concentration of the soluble antigen in plasma after administration. Plasma after administration of a soluble antigen and antibody by increasing the human FcRn-binding activity of the antibody in the neutral pH range, or by increasing the human FcRn-binding activity while simultaneously decreasing its antigen-binding activity in the acidic pH range to less than the neutral pH range. When the concentration of the soluble antigen in the medium is decreased, it can be determined that the plasma antigen clearance of the antibody is increased. The form of the soluble antigen may be antibody bound antigen or antibody unbound antigen whose concentration can be determined as "concentration of antibody bound antigen in plasma" and "concentration of antibody unbound antigen in plasma", respectively (the latter is the "concentration of free antigen in plasma." "Total antigen concentration in plasma" refers to the "concentration of free antigen in plasma" which is the sum of antibody-bound and unbound antigen concentrations or the antibody-unbound antigen concentration; The concentration of soluble antigen can be determined as “total antigen concentration in plasma.” Various methods for determining “total antigen concentration in plasma” or “concentration of free antigen in plasma” are generally known in the art, as described below. has been

본 발명은 또한 항체의 약동학을 개선하는 방법을 제공한다. 더 구체적으로, 본 발명은 중성 pH 범위의 항체의 인간 FcRn 결합 활성을 증가시킴으로써 산성 pH 범위의 인간 FcRn 결합 활성을 갖는 항체의 약동학을 개선하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 항체의 인간 FcRn 결합 도메인 내 적어도 하나의 아미노산을 변경함으로써 산성 pH 범위의 인간 FcRn 결합 활성을 갖는 단일 항체의 약동학을 개선하는 방법을 제공한다.The invention also provides methods for improving the pharmacokinetics of an antibody. More specifically, the present invention provides a method for improving the pharmacokinetics of an antibody having human FcRn-binding activity in an acidic pH range by increasing the human FcRn-binding activity of the antibody in the neutral pH range. The present invention also provides a method for improving the pharmacokinetics of a single antibody having human FcRn binding activity in an acidic pH range by altering at least one amino acid in the human FcRn binding domain of the antibody.

본 발명은 또한, IgG의 Fc 도메인을 포함한 인간 FcRn 결합 도메인의 모 IgG Fc 도메인 내 존재하는 위치 237, 238, 239, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 270, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 325, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434, 및 436(EU 넘버링)으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산에 대하여 상이한 아미노산의 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 인간 FcRn 결합 도메인을 이용함으로써, 산성 pH 범위의 인간 FcRn 결합 활성을 갖는 항체의 약동학을 개선하는 방법을 제공한다.The present invention also relates to positions 237, 238, 239, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 270, in the parent IgG Fc domain of a human FcRn binding domain, including the Fc domain of an IgG; 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 325, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, Human FcRn binding in an acidic pH range by using a human FcRn binding domain comprising an amino acid sequence having a substitution of a different amino acid for at least one amino acid selected from 389, 424, 428, 433, 434, and 436 (EU numbering). Methods for improving the pharmacokinetics of an antibody with activity are provided.

항체에 결합되지 않은 유리 항원의 혈장 농도 또는 총 농도에 대한 유리 항원 농도의 비율은 당업자에게 공지된 방법에 의해, 예를 들어 Pharm Res. 2006 Jan; 23 (1): 95-103에 기재된 방법에 의해 결정할 수 있다. 대안적으로, 항원이 생체 내에서 특정 기능을 나타내는 경우, 상기 항원이 항원 기능을 중화시키는 항체(길항 분자)에 결합되는지 여부는 상기 항원 기능이 중화되는지 여부를 시험함으로써 평가할 수 있다. 항원 기능이 중화되는지 여부는 항원 기능을 반영하는 생체내 마커를 분석하여 평가할 수 있다. 항원이 항원 기능을 활성화하는 항체(작용 분자)에 결합되는지 여부는 항원 기능을 반영하는 생체내 마커를 분석함으로써 평가할 수 있다.The plasma concentration or the ratio of the free antigen concentration to the total concentration of free antigen not bound to the antibody is determined by methods known to those skilled in the art, for example, in Pharm Res. 2006 Jan; 23 (1): It can be determined by the method described in 95-103. Alternatively, when an antigen exhibits a specific function in vivo, whether the antigen binds to an antibody (antagonist molecule) that neutralizes the antigen function can be evaluated by testing whether the antigen function is neutralized. Whether antigenic function is neutralized can be assessed by assaying in vivo markers that reflect antigenic function. Whether an antigen binds to an antibody (action molecule) that activates the antigen function can be assessed by assaying an in vivo marker that reflects the antigen function.

유리 항원의 혈장 농도 및 혈장 중 총 항원의 양에 대한 혈장 중 유리 항원의 양의 비율의 측정, 생체내 마커 분석 및 이러한 측정은 특별히 제한되지 않지만; 분석은 항체 투여 후 일정 기간이 경과한 후에 실시하는 것이 바람직하다. 본 발명에서, 항체 투여 후의 기간은 특별히 제한되지 않으며; 당업자는 투여되는 항체의 성질 등에 따라 적절한 기간을 결정할 수 있다. 상기 기간은, 예를 들어 항체 투여 후 1일, 항체 투여 후 3일, 항체 투여 후 7일, 항체 투여 후 14일, 및 항체 투여 후 28일을 포함한다. 본원에서, “혈장 항원 농도”는 항체 결합된 항원 및 비결합된 항원 농도의 합인 "혈장 중 총 항원 농도” 또는 항체 비결합된 항원 농도인 "혈장 중 유리 항원 농도"를 의미한다.Measurement of the plasma concentration of free antigen and the ratio of the amount of free antigen in plasma to the amount of total antigen in plasma, in vivo marker analysis and such measurement are not particularly limited; The analysis is preferably performed after a certain period of time has elapsed after administration of the antibody. In the present invention, the period after administration of the antibody is not particularly limited; A person skilled in the art can determine an appropriate period according to the nature of the administered antibody and the like. The period includes, for example, 1 day after administration of the antibody, 3 days after administration of the antibody, 7 days after administration of the antibody, 14 days after administration of the antibody, and 28 days after administration of the antibody. As used herein, “plasma antigen concentration” means “total antigen concentration in plasma” which is the sum of antibody-bound and unbound antigen concentrations, or “free antigen concentration in plasma” which is antibody-unbound antigen concentration.

혈장 중 총 항원 농도는 인간 FcRn 결합 도메인으로서 원형 인간 IgG Fc 도메인을 포함하는 참조 항체의 투여와 비교하거나, 또는 본 발명의 항원 결합 도메인 분자가 투여되지 않은 경우와 비교하여 본 발명의 항체를 투여함으로써 2배, 5배, 10배, 20배, 50배, 100배, 200배, 500배, 1,000배, 또는 그 이상까지 낮출 수 있다.The total antigen concentration in plasma can be obtained by administering the antibody of the present invention as compared to administration of a reference antibody comprising a native human IgG Fc domain as a human FcRn-binding domain, or compared to the case in which the antigen-binding domain molecule of the present invention is not administered. You can lower it by 2x, 5x, 10x, 20x, 50x, 100x, 200x, 500x, 1,000x, or more.

다른 양태에서, 본 발명은 pH 의존적 결합 특성을 나타내는 이중특이적 항-CCL2 항체를 제공한다. 본원에서 사용된 "pH 의존적 결합"이라는 표현은 항체가 "중성 pH에서의 결합과 비교하여 산성 pH에서 CCL2에 대한 감소된 결합"을 나타낸다는 것을 의미한다(본 개시의 목적으로, 두 표현 모두 상호교환적으로 사용할 수 있음). 예를 들어, "pH 의존적 결합 특성을 갖는" 항체는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화도로 CCL2에 결합하는 항체를 포함한다. 특정 구현예들에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 적어도 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000배 이상 높은 친화도로 CCL2에 결합한다. 일부 구현예들에서, 항체는 pH 5.8에서보다 pH 7.4에서 더 높은 친화도로 CCL2에 결합한다. 추가의 구현예들에서, 항체는 pH 5.8에서보다 pH 7.4에서 적어도 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000배 이상 높은 친화도로 CCL2에 결합한다.In another aspect, the present invention provides a bispecific anti-CCL2 antibody that exhibits pH dependent binding properties. As used herein, the expression "pH dependent binding" means that the antibody exhibits "reduced binding to CCL2 at acidic pH compared to binding at neutral pH" (for purposes of this disclosure, both expressions are mutually exclusive). can be used interchangeably). For example, an antibody “having pH dependent binding properties” includes an antibody that binds CCL2 with higher affinity at neutral pH than at acidic pH. In certain embodiments, a bispecific antibody of the invention is at least 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, Binds to CCL2 with at least 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000-fold higher affinity. In some embodiments, the antibody binds CCL2 with higher affinity at pH 7.4 than at pH 5.8. In further embodiments, the antibody is at least 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 at pH 7.4 than at pH 5.8. , 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000-fold or more binds to CCL2 with a higher affinity.

항원이 가용성 단백질인 경우, 항원에 대한 항체의 결합은 혈장 내에서 항원의 반감기를 연장시킬 수 있다(즉, 혈장으로부터 항원의 제거 감소). 왜냐하면, 항체가 항원 자체보다 혈장 내에서 더 긴 반감기를 가질 수 있고 항원에 대한 운반체 역할을 할 수 있기 때문이다. 이는 FcRn이 세포 내 엔도솜 경로를 통해 항원-항체 복합체를 재활용하기 때문이다(Roopenian, Nat. Rev. Immunol. 7(9): 715-725 (2007)). 하지만, 중성 세포외 환경에서 이의 항원과 결합하는 pH 의존적 결합 특성을 갖는 항체는 세포 내로 유입된 후 산성 엔도솜 구획으로 항원을 방출하면서 pH 독립적인 방식으로 결합하는 이의 대응물에 비해 상대적으로 항원 중화 및 제거 면에서 우수한 특성을 가질 것으로 기대된다(Igawa et al., Nature Biotechnol. 28(11):1203-1207 (2010); Devanaboyina et al., mAbs 5(6):851-859 (2013); WO 2009/125825).When the antigen is a soluble protein, binding of the antibody to the antigen may prolong the half-life of the antigen in plasma (ie, decrease clearance of the antigen from plasma). This is because an antibody may have a longer half-life in plasma than the antigen itself and may serve as a carrier for the antigen. This is because FcRn recycles the antigen-antibody complex through the intracellular endosomal pathway (Roopenian, Nat. Rev. Immunol. 7(9): 715-725 (2007)). However, an antibody having a pH-dependent binding property that binds its antigen in a neutral extracellular environment neutralizes the antigen relatively compared to its counterpart that binds in a pH-independent manner while releasing the antigen into the acidic endosomal compartment after entering the cell. and removal (Igawa et al., Nature Biotechnol. 28(11):1203-1207 (2010); Devanaboyina et al., mAbs 5(6):851-859 (2013); WO 2009/125825).

본 개시의 목적으로, CCL2에 대한 항체의 "친화도"는 항체의 KD로 표현된다. 항체의 KD는 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 지칭한다. 항체가 항원에 결합하는 KD 값이 클수록, 특정 항원에 대한 이의 결합 친화도가 약해진다. 이에 따라, 본원에서 사용된 표현 "산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화도"(또는 동등한 표현인 "pH 의존적 결합")는 산성 pH에서 CCL2에 결합하는 항체의 KD가 중성 pH에서 CCL2에 결합하는 항체의 KD보다 높음을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 맥락에서, 항체는 산성 pH에서 CCL2에 결합하는 항체의 KD가 중성 pH에서 CCL2에 결합하는 항체의 KD보다 적어도 2배 이상 더 클 경우에 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화도로 CCL2에 결합하는 것으로 간주된다. 따라서, 본 발명은 중성 pH에서 CCL2에 결합하는 항체의 KD보다 적어도 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000배 이상 더 큰 KD로 산성 pH에서 CCL2에 결합하는 항체를 포함한다. 다른 구현예에서, 중성 pH에서 항체의 KD 값은 10-7M, 10-8M, 10-9M, 10-10M, 10-11M, 10-12M 이하일 수 있다. 다른 구현예에서, 산성 pH에서 항체의 KD 값은 10-9M, 10-8M, 10-7M, 10-6M 이상일 수 있다.For the purposes of this disclosure, the "affinity" of an antibody for CCL2 is expressed as the antibody's KD. The KD of an antibody refers to the equilibrium dissociation constant of the antibody-antigen interaction. The higher the KD value at which an antibody binds to an antigen, the weaker its binding affinity for a particular antigen. Accordingly, as used herein, the expression "higher affinity at neutral pH than at acidic pH" (or equivalent expression "pH dependent binding") means that the KD of an antibody that binds CCL2 at acidic pH binds to CCL2 at neutral pH. means higher than the KD of the antibody. For example, in the context of the present invention, an antibody is more at neutral pH than at acidic pH if the KD of the antibody that binds CCL2 at acidic pH is at least 2-fold greater than the KD of the antibody that binds CCL2 at neutral pH. It is considered to bind CCL2 with high affinity. Thus, the present invention is at least 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 greater than the KD of an antibody that binds to CCL2 at neutral pH. , 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000-fold or greater, and antibodies that bind to CCL2 at acidic pH. In other embodiments, the KD value of the antibody at neutral pH may be less than or equal to 10-7M, 10-8M, 10-9M, 10-10M, 10-11M, 10-12M. In other embodiments, the KD value of the antibody at acidic pH may be at least 10-9M, 10-8M, 10-7M, 10-6M.

추가의 구현예들에서, 항체는 pH 5.8에서 CCL2에 결합하는 항체의 KD가 pH 7.4에서 CCL2에 결합하는 항체의 KD보다 적어도 2배 이상 더 클 경우에 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화도로 결합하는 것으로 간주된다. 일부 구현예들에서, 제공된 항체는 pH 7.4에서 CCL2에 결합하는 항체의 KD보다 적어도 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000배 이상 더 큰 KD로 pH 5.8에서 CCL2에 결합한다. 다른 구현예에서, pH 7.4에서 항체의 KD 값은 10-7M, 10-8M, 10-9M, 10-10M, 10-11M, 10-12M 이하일 수 있다. 다른 구현예에서, pH 5.8에서 항체의 KD 값은 10-9M, 10-8M, 10-7M, 10-6M 이상일 수 있다.In further embodiments, the antibody has a higher affinity at neutral pH than at acidic pH if the KD of the antibody that binds CCL2 at pH 5.8 is at least 2-fold greater than the KD of the antibody that binds CCL2 at pH 7.4. considered to be combined. In some embodiments, a provided antibody has a KD of at least 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 that binds to CCL2 at pH 7.4. Binds to CCL2 at pH 5.8 with a KD greater than , 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 times greater. In other embodiments, the KD value of the antibody at pH 7.4 may be less than or equal to 10-7M, 10-8M, 10-9M, 10-10M, 10-11M, 10-12M. In other embodiments, the KD value of the antibody at pH 5.8 may be at least 10-9M, 10-8M, 10-7M, 10-6M.

특정 항원에 대한 항체의 결합 특성은 또한 항체의 kd로 표시할 수 있다. 항체의 kd는 특정 항원에 대한 항체의 해리 속도 상수를 지칭하며, 초의 역수(즉, sec-1)로 표현된다. kd 값의 증가는 이의 항원에 대한 항체의 더 약한 결합을 의미한다. 따라서, 본 발명은 중성 pH에서보다 산성 pH에서 더 높은 kd 값으로 CCL2에 결합하는 항체를 포함한다. 본 발명은 중성 pH에서 CCL2에 결합하는 항체의 Kd보다 적어도 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000배 이상 더 큰 Kd로 산성 pH에서 CCL2에 결합하는 항체를 포함한다. 다른 구현예에서, 중성 pH에서 항체의 kd 값은 10-2　1/s, 10-3　1/s, 10-4　1/s, 10-5　1/s, 10-6　1/s 이하일 수 있다. 다른 구현예에서, 산성 pH에서 항체의 kd 값은 10-3　1/s, 10-2　1/s, 10-1　1/s 이상일 수 있다. 본 발명은 또한 pH 7.4에서보다 pH 5.8에서 더 높은 kd 값으로 CCL2에 결합하는 항체를 포함한다. 본 발명은 pH 7.4에서 CCL2에 결합하는 항체의 Kd보다 적어도 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000배 이상 더 큰 kd로 pH 5.8에서 CCL2에 결합하는 항체를 포함한다. 다른 구현예에서, pH 7.4에서 항체의 kd 값은 10-2　1/s, 10-3　1/s, 10-4　1/s, 10-5　1/s, 10-6　1/s 이하일 수 있다. 다른 구현예에서, pH 5.8에서 항체의 kd 값은 10-3　1/s, 10-2　1/s, 10-1　1/s 이상일 수 있다.The binding properties of an antibody to a particular antigen can also be expressed by the antibody's kd. The kd of an antibody refers to the dissociation rate constant of the antibody for a specific antigen and is expressed as the reciprocal of seconds (ie, sec-1). An increase in the kd value indicates a weaker binding of the antibody to its antigen. Accordingly, the present invention includes antibodies that bind to CCL2 with a higher kd value at acidic pH than at neutral pH. The present invention provides a Kd of an antibody that binds to CCL2 at neutral pH is at least 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 , 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 fold or greater, and an antibody that binds to CCL2 at acidic pH. In other embodiments, the kd value of the antibody at neutral pH may be 10-2 　1/s, 10-3 　1/s, 10-4 　1/s, 10-5 　1/s, 10-6 　1/s or less. . In other embodiments, the kd value of the antibody at acidic pH may be greater than or equal to 10 -3 1/s, 10-2 1/s, or 10-1 1/s. The present invention also includes antibodies that bind to CCL2 with a higher kd value at pH 5.8 than at pH 7.4. The present invention provides a Kd of at least 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 of an antibody that binds to CCL2 at pH 7.4. , 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 fold or greater kd, which binds to CCL2 at pH 5.8. In other embodiments, the kd value of the antibody at pH 7.4 may be less than or equal to 10-2　1/s, 10-3　1/s, 10-4　1/s, 10-5　1/s, 10-6　1/s . In other embodiments, the kd value of the antibody at pH 5.8 may be greater than or equal to 10-3 　1/s, 10-2 　1/s, 10-1 　1/s.

특정 경우들에서, "중성 pH에서의 이의 결합과 비교하여 산성 pH에서 CCL2에 대한 감소된 결합"은 중성 pH에서 CCL2에 결합하는 항체의 KD 값에 대한 산성 pH에서 CCL2에 결합하는 항체의 KD 값의 비(또는 그 반대로)로 표현된다. 예를 들어, 본 발명을 목적으로 항체가 2 이상의 산성/중성 KD 비를 나타내는 경우, 항체는 "중성 pH에서의 이의 결합과 비교하여 산성 pH에서 CCL2에 대한 감소된 결합"을 나타내는 것으로 간주될 수 있다. 특정 구현예들에서, 본 발명의 항-CCL2 항체에 대한 pH 5.8/pH 7.4 KD 비는 2 이상이다. 특정 예시적인 구현예들에서, 본 발명의 항체에 대한 산성/중성 KD 비는 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 이상일 수 있다. 다른 구현예에서, 중성 pH에서 항체의 KD 값은 10-7M, 10-8M, 10-9M, 10-10M, 10-11M, 10-12M 이하일 수 있다. 다른 구현예에서, 산성 pH에서 항체의 KD 값은 10-9M, 10-8M, 10-7M, 10-6M 이상일 수 있다. 추가의 경우들에서, 항체가 2 이상의 pH 5.8/pH 7.4 KD 비를 나타내는 경우, 항체는 "중성 pH에서의 이의 결합과 비교하여 산성 pH에서 CCL2에 대한 감소된 결합"을 나타내는 것으로 간주될 수 있다. 특정 예시적인 구현예들에서, 항체에 대한 pH 5.8/pH 7.4 KD 비는 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 이상일 수 있다. 다른 구현예에서, pH 7.4에서 항체의 KD 값은 10-7M, 10-8M, 10-9M, 10-10M, 10-11M, 10-12M 이하일 수 있다. 다른 구현예에서, pH 5.8에서 항체의 KD 값은 10-9M, 10-8M, 10-7M, 10-6M 이상일 수 있다.In certain cases, "reduced binding to CCL2 at acidic pH compared to its binding at neutral pH" refers to the KD value of an antibody that binds CCL2 at acidic pH to the KD value of the antibody that binds CCL2 at neutral pH. is expressed as the ratio of (or vice versa) of For example, if for the purposes of the present invention an antibody exhibits an acidic/neutral KD ratio of 2 or greater, the antibody may be considered to exhibit "reduced binding to CCL2 at acidic pH compared to its binding at neutral pH" have. In certain embodiments, the pH 5.8/pH 7.4 KD ratio for an anti-CCL2 antibody of the invention is 2 or greater. In certain exemplary embodiments, the acid/neutral KD ratio for an antibody of the invention is 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 or more. In other embodiments, the KD value of the antibody at neutral pH may be less than or equal to 10-7M, 10-8M, 10-9M, 10-10M, 10-11M, 10-12M. In other embodiments, the KD value of the antibody at acidic pH may be at least 10-9M, 10-8M, 10-7M, 10-6M. In further instances, an antibody may be considered to exhibit "reduced binding to CCL2 at acidic pH compared to its binding at neutral pH" if the antibody exhibits a pH 5.8/pH 7.4 KD ratio of 2 or greater. . In certain exemplary embodiments, the pH 5.8/pH 7.4 KD ratio for the antibody is 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 , 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 or more. In other embodiments, the KD value of the antibody at pH 7.4 may be less than or equal to 10-7M, 10-8M, 10-9M, 10-10M, 10-11M, 10-12M. In other embodiments, the KD value of the antibody at pH 5.8 may be at least 10-9M, 10-8M, 10-7M, 10-6M.

특정 경우들에서, "중성 pH에서의 이의 결합과 비교하여 산성 pH에서 CCL2에 대한 감소된 결합"은 중성 pH에서 CCL2에 결합하는 항체의 kd 값에 대한 산성 pH에서 CCL2에 결합하는 항체의 kd 값의 비(또는 그 반대로)로 표현된다. 예를 들어, 본 발명을 목적으로 항체가 2 이상의 산성/중성 Kd 비를 나타내는 경우, 항체는 "중성 pH에서의 이의 결합과 비교하여 산성 pH에서 CCL2에 대한 감소된 결합"을 나타내는 것으로 간주될 수 있다. 특정 예시적인 구현예들에서, 본 발명의 항체에 대한 pH 5.8/pH 7.4 kd 비는 2 이상이다. 특정 예시적인 구현예들에서, 본 발명의 항체에 대한 산성/중성 kd 비는 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 이상일 수 있다. 다른 구현예에서, 중성 pH에서 항체의 Kd 값은 10-2　1/s, 10-3　1/s, 10-4　1/s, 10-5　1/s, 10-6　1/s 이하일 수 있다. 다른 구현예에서, 산성 pH에서 항체의 Kd 값은 10-3　1/s, 10-2　1/s, 10-1　1/s 이상일 수 있다. 특정 예시적인 구현예들에서, 본 발명의 항체에 대한 pH 5.8/pH 7.4 kd 비는 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 이상일 수 있다. 다른 구현예에서, pH 7.4에서 항체의 kd 값은 10-2　1/s, 10-3　1/s, 10-4　1/s, 10-5　1/s, 10-6　1/s 이하일 수 있다. 다른 구현예에서, pH 5.8에서 항체의 kd 값은 10-3　1/s, 10-2　1/s, 10-1　1/s 이상일 수 있다.In certain cases, "reduced binding to CCL2 at acidic pH compared to its binding at neutral pH" refers to the kd value of an antibody that binds CCL2 at acidic pH to the kd value of the antibody that binds CCL2 at neutral pH. is expressed as the ratio of (or vice versa) of For example, if for the purposes of the present invention an antibody exhibits an acidic/neutral Kd ratio of 2 or greater, the antibody may be considered to exhibit "reduced binding to CCL2 at acidic pH compared to its binding at neutral pH" have. In certain exemplary embodiments, the pH 5.8/pH 7.4 kd ratio for an antibody of the invention is 2 or greater. In certain exemplary embodiments, the acid/neutral kd ratio for an antibody of the invention is 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 or more. In other embodiments, the Kd value of the antibody at neutral pH may be less than or equal to 10-2 1/s, 10-3 1/s, 10-4 1/s, 10-5 1/s, 10-6 1/s . In other embodiments, the Kd value of the antibody at acidic pH may be greater than or equal to 10 -3 1/s, 10-2 1/s, or 10-1 1/s. In certain exemplary embodiments, the pH 5.8/pH 7.4 kd ratio for an antibody of the invention is 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 or more. In other embodiments, the kd value of the antibody at pH 7.4 may be less than or equal to 10-2　1/s, 10-3　1/s, 10-4　1/s, 10-5　1/s, 10-6　1/s . In other embodiments, the kd value of the antibody at pH 5.8 may be greater than or equal to 10-3 　1/s, 10-2 　1/s, 10-1 　1/s.

본원에서 사용된 "산성 pH"라는 표현은 4.0 내지 6.5의 pH를 의미한다. "산성 pH"라는 표현은 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 및 6.5 중 어느 하나의 pH 값을 포함한다. 특정 양태들에서, "산성 pH"는 5.8이다.As used herein, the expression “acidic pH” means a pH between 4.0 and 6.5. The expression "acidic pH" means 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1 , a pH value of any one of 6.2, 6.3, 6.4, and 6.5. In certain embodiments, the “acidic pH” is 5.8.

본원에서 사용된 "중성 pH"라는 표현은 6.7 내지 약 10.0의 pH를 의미한다. "중성 pH"라는 표현은 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 및 10.0 중 어느 하나의 pH 값을 포함한다. 특정 양태들에서, "중성 pH"는 7.4이다.As used herein, the expression "neutral pH" means a pH of 6.7 to about 10.0. The expression "neutral pH" means 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8. , 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, and 10.0. In certain embodiments, the “neutral pH” is 7.4.

본원에서 표현된 KD 값 및 kd 값은 항체-항원 상호작용을 특성화하기 위해 표면 플라즈몬 공명 기반 바이오센서를 사용하여 결정할 수 있다. KD 값 및 kd 값은 섭씨 25도 또는 섭씨 37도에서 결정할 수 있다.The KD values and kd values expressed herein can be determined using surface plasmon resonance based biosensors to characterize antibody-antigen interactions. The KD value and the kd value may be determined at 25 degrees Celsius or 37 degrees Celsius.

추가의 양태에서, 본 발명은 CCL2와 면역 복합체(즉, 항원-항체 복합체)를 형성하는 이중특이적 항-CCL2 항체를 제공한다. 특정 구현예들에서, 2개 이상의 이중특이적 항-CCL2 항체는 2개 이상의 CCL2 분자에 결합하여 면역 복합체를 형성한다. 이는 CCL2가 2개의 CCL2 분자를 함유하는 동종이량체로 존재하는 반면, 항체는 2개의 항원 결합 부위를 갖기 때문에 가능한 것이다. In a further aspect, the invention provides a bispecific anti-CCL2 antibody that forms an immune complex with CCL2 (ie, an antigen-antibody complex). In certain embodiments, two or more bispecific anti-CCL2 antibodies bind to two or more CCL2 molecules to form an immune complex. This is possible because CCL2 exists as a homodimer containing two CCL2 molecules, whereas an antibody has two antigen binding sites.

일반적으로 말하면, 2개 이상의 항체가 2개 이상의 항원과 면역 복합체를 형성할 때, 생성된 면역 복합체는 복합체 내의 항체의 Fc 영역을 통한 결합 효과로 인해 세포 표면 상에 존재하는 Fc 수용체에 강하게 결합할 수 있으며, 그런 다음 고효율로 세포 내에 흡수된다. 따라서, 2개 이상의 항-CCL2 항체 및 2개 이상의 CCL2 분자를 함유한 면역 복합체를 형성할 수 있는 전술한 항-CCL2 항체는 결합 효과로 인한 Fc 수용체에 대한 강한 결합을 통해 생체내 혈장으로부터 CCL2의 신속한 제거를 유도할 수 있다.Generally speaking, when two or more antibodies form an immune complex with two or more antigens, the resulting immune complex will strongly bind to the Fc receptor present on the cell surface due to the binding effect through the Fc region of the antibody in the complex. can then be absorbed into cells with high efficiency. Therefore, the aforementioned anti-CCL2 antibody capable of forming an immune complex containing two or more anti-CCL2 antibodies and two or more CCL2 molecules is capable of producing CCL2 from plasma in vivo through strong binding to Fc receptors due to its binding effect. It can lead to rapid removal.

또한, pH 의존적 결합 특성을 갖는 항체는 pH 비의존적 방식으로 결합하는 이의 대응물에 비해 상대적인 항원 중화 및 제거 면에서 우수한 특성을 갖는 것으로 생각된다(Igawa et al., Nature Biotech. 28(11):1203-1207 (2010); Devanaboyina et al. mAbs 5(6):851-859 (2013); WO 2009/125825). 따라서, 상기 두 가지 성질을 모두 갖는 항체, 즉 pH 의존적 결합 특성을 갖고 2개 이상의 항원 및 2개 이상의 항체를 함유한 면역복합체를 형성하는 항체는 혈장에서 항원을 매우 빠르게 제거함에 있어서 훨씬 더 우수한 특성을 가지는 것으로 기대된다(WO 2013/081143).In addition, antibodies with pH-dependent binding properties are thought to have superior properties in terms of antigen neutralization and clearance relative to their counterparts that bind in a pH-independent manner (Igawa et al., Nature Biotech. 28(11): 1203-1207 (2010); Devanaboyina et al. mAbs 5(6):851-859 (2013); WO 2009/125825). Therefore, an antibody having both of the above properties, that is, an antibody having pH-dependent binding properties and forming an immunocomplex containing two or more antigens and two or more antibodies, has much superior properties in removing antigens from plasma very quickly. is expected to have (WO 2013/081143).

일 양태에서, 본 발명은: (a) 위치 236에서 하나의 아미노산 변경, 및 (b) EU 넘버링에 따른 231, 232, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 264, 266, 267, 268, 271, 295, 298, 325, 326, 327, 328, 330, 331, 332, 334, 및 396으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 위치의 적어도 하나의 아미노산 변경을 포함한 적어도 2개의 아미노산 변경을 포함하는 향상된 FcγRIIb 결합 활성을 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. In one aspect, the invention provides: (a) one amino acid change at position 236, and (b) 231, 232, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 264, 266, 267, 268 according to EU numbering. , 271, 295, 298, 325, 326, 327, 328, 330, 331, 332, 334, and 396 comprising at least two amino acid changes comprising at least one amino acid change at at least one position selected from the group consisting of Provided is a polypeptide comprising a variant Fc region having improved FcγRIIb binding activity.

일 양태에서, 본 발명은 EU 넘버링에 따른 위치 236에서 아미노산 변경을 포함하는 향상된 FcγRIIb 결합 활성을 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.In one aspect, the present invention provides a polypeptide comprising a variant Fc region having improved FcγRIIb binding activity comprising an amino acid change at position 236 according to EU numbering.

일 양태에서, 본 발명은: (a) 위치 236에서 하나의 아미노산 변경, 및 (b) EU 넘버링에 따른 231, 232, 235, 239, 268, 295, 298, 326, 330, 및 396으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 위치의 적어도 하나의 아미노산 변경을 포함한 적어도 2개의 아미노산 변경을 포함하는 향상된 FcγRIIb 결합 활성을 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 추가의 구현예에서, 변이체 Fc 영역은: EU 넘버링에 따른 231, 232, 235, 239, 268, 295, 298, 326, 330, 및 396으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 위치의 아미노산 변경을 포함한다. 추가의 구현예에서, 변이체 Fc 영역은: EU 넘버링에 따른 268, 295, 326, 및 330으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 위치의 아미노산 변경을 포함한다. In one aspect, the invention provides a group consisting of: (a) one amino acid change at position 236, and (b) 231, 232, 235, 239, 268, 295, 298, 326, 330, and 396 according to EU numbering. It provides a polypeptide comprising a variant Fc region having improved FcγRIIb binding activity comprising at least two amino acid changes comprising at least one amino acid change at at least one position selected from. In a further embodiment, the variant Fc region comprises an amino acid alteration at at least one position selected from the group consisting of: 231, 232, 235, 239, 268, 295, 298, 326, 330, and 396 according to EU numbering. . In a further embodiment, the variant Fc region comprises an amino acid alteration at at least one position selected from the group consisting of: 268, 295, 326, and 330 according to EU numbering.

다른 양태에서, 본 발명은 하기의 (1)-(37): EU 넘버링에 따른 (1) 위치 231, 236, 239, 268 및 330; (2) 위치 231, 236, 239, 268, 295 및 330; (3) 위치 231, 236, 268 및 330; (4) 위치 231, 236, 268, 295 및 330; (5) 위치 232, 236, 239, 268, 295 및 330; (6) 위치 232, 236, 268, 295 및 330; (7) 위치 232, 236, 268 및 330; (8) 위치 235, 236, 268, 295, 326 및 330; (9) 위치 235, 236, 268, 295 및 330; (10) 위치 235, 236, 268 및 330; (11) 위치 235, 236, 268, 330 및 396; (12) 위치 235, 236, 268 및 396; (13) 위치 236, 239, 268, 295, 298 및 330; (14) 위치 236, 239, 268, 295, 326 및 330; (15) 위치 236, 239, 268, 295 및 330; (16) 위치 236, 239, 268, 298 및 330; (17) 위치 236, 239, 268, 326 및 330; (18) 위치 236, 239, 268 및 330; (19) 위치 236, 239, 268, 330 및 396; (20) 위치 236, 239, 268 및 396; (21) 위치 236 및 268; (22) 위치 236, 268 및 295; (23) 위치 236, 268, 295, 298 및 330; (24) 위치 236, 268, 295, 326 및 330; (25) 위치 236, 268, 295, 326, 330 및 396; (26) 위치 236, 268, 295 and 330; (27) 위치 236, 268, 295, 330 및 396; (28) 위치 236, 268, 298 및 330; (29) 위치 236, 268, 298 및 396; (30) 위치 236, 268, 326 및 330; (31) 위치 236, 268, 326, 330 및 396; (32) 위치 236, 268 및 330; (33) 위치 236, 268, 330 및 396; (34) 위치 236, 268 및 396; (35) 위치 236 및 295; (36) 위치 236, 330 및 396; 및 (37) 위치 236 및 396 중 어느 하나의 아미노산 변경을 포함하는 향상된 FcγRIIb 결합 활성을 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. In another aspect, the present invention provides the following (1)-(37): (1) positions 231, 236, 239, 268 and 330 according to EU numbering; (2) positions 231, 236, 239, 268, 295 and 330; (3) positions 231, 236, 268 and 330; (4) positions 231, 236, 268, 295 and 330; (5) positions 232, 236, 239, 268, 295 and 330; (6) positions 232, 236, 268, 295 and 330; (7) positions 232, 236, 268 and 330; (8) positions 235, 236, 268, 295, 326 and 330; (9) positions 235, 236, 268, 295 and 330; (10) positions 235, 236, 268 and 330; (11) positions 235, 236, 268, 330 and 396; (12) positions 235, 236, 268 and 396; (13) positions 236, 239, 268, 295, 298 and 330; (14) positions 236, 239, 268, 295, 326 and 330; (15) positions 236, 239, 268, 295 and 330; (16) positions 236, 239, 268, 298 and 330; (17) positions 236, 239, 268, 326 and 330; (18) positions 236, 239, 268 and 330; (19) positions 236, 239, 268, 330 and 396; (20) positions 236, 239, 268 and 396; (21) positions 236 and 268; (22) positions 236, 268 and 295; (23) positions 236, 268, 295, 298 and 330; (24) positions 236, 268, 295, 326 and 330; (25) positions 236, 268, 295, 326, 330 and 396; (26) positions 236, 268, 295 and 330; (27) positions 236, 268, 295, 330 and 396; (28) positions 236, 268, 298 and 330; (29) positions 236, 268, 298 and 396; (30) positions 236, 268, 326 and 330; (31) positions 236, 268, 326, 330 and 396; (32) positions 236, 268 and 330; (33) positions 236, 268, 330 and 396; (34) positions 236, 268 and 396; (35) positions 236 and 295; (36) positions 236, 330 and 396; and (37) a variant Fc region having improved FcγRIIb binding activity comprising an amino acid alteration at any one of positions 236 and 396.

추가의 구현예에서, 향상된 FcγRIIb 결합 활성을 갖는 변이체 Fc 영역은: EU 넘버링에 따른 (a) 위치 231에서 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr; (b) 위치 232에서 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr; (c) 위치 233에서 Asp; (d) 위치 234에서 Trp, Tyr; (e) 위치 235에서 Trp; (f) 위치 236에서 Ala, Asp, Glu, His, Ile, Leu, Met, Asn, Gln, Ser, Thr, Val; (g) 위치 237에서 Asp, Tyr; (h) 위치 238에서 Glu, Ile, Met, Gln, Tyr; (i) 위치 239에서 Ile, Leu, Asn, Pro, Val; (j) 위치 265에서 Ile; (k) 위치 266에서 Phe; (l) 위치 267에서 Ala, His, Leu; (m) 위치 268에서 Asp, Glu; (n) 위치 271에서 Asp, Glu, Gly; (o) 위치 295에서 Leu; (p) 위치 298에서 Leu; (q) 위치 325에서 Glu, Phe, Ile, Leu; (r) 위치 326에서 Thr; (s) 위치 327에서 Ile, Asn; (t) 위치 328에서 Thr; (u) 위치 330에서 Lys, Arg; (v) 위치 331에서 Glu; (w) 위치 332에서 Asp; (x) 위치 334에서 Asp, Ile, Met, Val, Tyr; 및 (y) 위치 396에서 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산을 포함한다. In a further embodiment, the variant Fc region with enhanced FcγRIIb binding activity comprises: (a) Asp, Glu, Phe, Gly, His, He, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln at position 231 according to EU numbering. , Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr; (b) Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, He, Lys, Leu, Met, Asn, Gin, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr at position 232; (c) Asp at position 233; (d) Trp, Tyr at position 234; (e) Trp at position 235; (f) Ala, Asp, Glu, His, He, Leu, Met, Asn, Gin, Ser, Thr, Val at position 236; (g) Asp, Tyr at position 237; (h) Glu, He, Met, Gin, Tyr at position 238; (i) He, Leu, Asn, Pro, Val at position 239; (j) Ile at position 265; (k) Phe at position 266; (l) Ala, His, Leu at position 267; (m) Asp, Glu at position 268; (n) Asp, Glu, Gly at position 271; (o) Leu at position 295; (p) Leu at position 298; (q) Glu, Phe, Ile, Leu at position 325; (r) Thr at position 326; (s) Ile, Asn at position 327; (t) Thr at position 328; (u) Lys, Arg at position 330; (v) Glu at position 331; (w) Asp at position 332; (x) Asp, Ile, Met, Val, Tyr at position 334; and (y) at least one selected from the group consisting of Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, He, Lys, Leu, Met, Asn, Gin, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr at position 396 contains amino acids.

추가의 구현예에서, 향상된 FcγRIIb 결합 활성을 갖는 변이체 Fc 영역은: EU 넘버링에 따른 (a) 위치 231에서 Gly, Thr; (b) 위치 232에서 Asp; (c) 위치 235에서 Trp; (d) 위치 236에서 Asn, Thr; (e) 위치 239에서 Val; (f) 위치 268에서 Asp, Glu; (g) 위치 295에서 Leu; (h) 위치 298에서 Leu; (i) 위치 326에서 Thr; (j) 위치 330에서 Lys, Arg; 및 (k) 위치 396에서 Lys, Met으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 변경(예컨대, 치환)을 포함한다. 추가의 구현예에서, 향상된 FcγRIIb 결합 활성을 갖는 변이체 Fc 영역은: EU 넘버링에 따른 위치 236에서 Asn, 위치 268에서 Glu, 위치 330에서 Lys, 및 위치 396에서 Met의 아미노산 변경(예컨대, 치환)을 포함한다. 추가의 구현예에서, 향상된 FcγRIIb 결합 활성을 갖는 변이체 Fc 영역은: EU 넘버링에 따른 위치 236에서 Asn, 위치 268에서 Asp, 및 위치 330에서 Lys의 아미노산 변경(예컨대, 치환)을 포함한다. 추가의 구현예에서, 향상된 FcγRIIb 결합 활성을 갖는 변이체 Fc 영역은: EU 넘버링에 따른 위치 236에서 Asn, 위치 268에서 Asp, 위치 295에서 Leu, 및 위치 330에서 Lys의 아미노산 변경(예컨대, 치환)을 포함한다. 추가의 구현예에서, 향상된 FcγRIIb 결합 활성을 갖는 변이체 Fc 영역은: EU 넘버링에 따른 위치 236에서 Thr, 위치 268에서 Asp, 및 위치 330에서 Lys의 아미노산 변경(예컨대, 치환)을 포함한다. 추가의 구현예에서, 향상된 FcγRIIb 결합 활성을 갖는 변이체 Fc 영역은: EU 넘버링에 따른 위치 236에서 Asn, 위치 268에서 Asp, 위치 295에서 Leu, 위치 326에서 Thr, 및 위치 330에서 Lys의 아미노산 변경(예컨대, 치환)을 포함한다. 추가의 구현예에서, 향상된 FcγRIIb 결합 활성을 갖는 변이체 Fc 영역은: EU 넘버링에 따른 235에서 Trp, 위치 236에서 Asn, 위치 268에서 Asp, 위치 295에서 Leu, 위치 326에서 Thr, 및 위치 330에서 Lys의 아미노산 변경(예컨대, 치환)을 포함한다.In a further embodiment, the variant Fc region with enhanced FcγRIIb binding activity comprises: (a) Gly, Thr at position 231 according to EU numbering; (b) Asp at position 232; (c) Trp at position 235; (d) Asn, Thr at position 236; (e) Val at position 239; (f) Asp, Glu at position 268; (g) Leu at position 295; (h) Leu at position 298; (i) Thr at position 326; (j) Lys, Arg at position 330; and (k) at least one amino acid alteration (eg, substitution) at position 396 selected from the group consisting of Lys, Met. In a further embodiment, the variant Fc region with enhanced FcγRIIb binding activity comprises: amino acid alterations (eg, substitutions) of Asn at position 236, Glu at position 268, Lys at position 330, and Met at position 396 according to EU numbering. include In a further embodiment, the variant Fc region with enhanced FcγRIIb binding activity comprises amino acid alterations (eg, substitutions) of: Asn at position 236, Asp at position 268, and Lys at position 330 according to EU numbering. In a further embodiment, the variant Fc region with enhanced FcγRIIb binding activity comprises: amino acid alterations (eg, substitutions) of Asn at position 236, Asp at position 268, Leu at position 295, and Lys at position 330 according to EU numbering. include In a further embodiment, the variant Fc region with enhanced FcγRIIb binding activity comprises amino acid alterations (eg, substitutions) of: Thr at position 236, Asp at position 268, and Lys at position 330 according to EU numbering. In a further embodiment, the variant Fc region with enhanced FcγRIIb binding activity comprises: amino acid alterations at Asn at position 236, Asp at position 268, Leu at position 295, Thr at position 326, and Lys at position 330 according to EU numbering ( eg substitution). In a further embodiment, the variant Fc region with enhanced FcγRIIb binding activity comprises: Trp at 235, Asn at position 236, Asp at position 268, Leu at position 295, Thr at position 326, and Lys at position 330 according to EU numbering. amino acid changes (eg, substitutions) of

다른 양태에서, 본 발명은 등전점(pI)이 증가된 변이체 Fc 영역을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 특정 구현예들에서, 본원에 기재된 변이체 Fc 영역은 모 Fc 영역에서 적어도 2개의 아미노산 변경을 포함한다. 특정 구현예들, 각각의 아미노산 변경은 모 Fc 영역과 비교하여 변이체 Fc 영역의 등전점(pI)을 증가시킨다. 이들은, 예를 들어 항체가 생체내 투여될 때 적어도 2개의 아미노산 잔기의 변형에 의해 이의 pI가 증가된 항체를 사용하여 혈장으로부터의 항원 제거가 촉진될 수 있다는 발견에 기초한다.In another aspect, the invention provides an isolated polypeptide comprising a variant Fc region with an increased isoelectric point (pI). In certain embodiments, a variant Fc region described herein comprises at least two amino acid alterations in a parent Fc region. In certain embodiments, each amino acid alteration increases the isoelectric point (pI) of the variant Fc region compared to the parent Fc region. They are based on the discovery that antigen clearance from plasma can be facilitated using, for example, antibodies whose pI is increased by modification of at least two amino acid residues when the antibody is administered in vivo.

본 발명에서, pI는 이론적 또는 실험적으로 결정된 pI일 수 있다. pI의 값은, 예를 들어 당업자에게 공지된 등전위 초점에 의해 결정할 수 있다. 이론적 pI의 값은, 예를 들어 유전자 및 아미노산 서열 분석 소프트웨어(제네틱스(Genetyx) 등)를 사용하여 계산할 수 있다.In the present invention, pI may be a pI determined theoretically or experimentally. The value of pI can be determined, for example, by equipotential foci known to the person skilled in the art. The value of the theoretical pI can be calculated using, for example, gene and amino acid sequencing software (such as Genetyx).

일 구현예에서, pI 값은 변형 전과 비교하여, 예를 들어 적어도 0.01, 0.03, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 이상, 적어도 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 이상, 적어도 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5 이상, 또는 적어도 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 3.0 이상 만큼 증가할 수 있다.In one embodiment, the pI value is at least 0.01, 0.03, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 or more, at least 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 or more, at least 1.0, 1.1, 1.2 as compared to before modification. , 1.3, 1.4, 1.5 or more, or by at least 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 3.0 or more.

특정 구현예들에서, 증가된 pI를 위한 아미노산은 변이체 Fc 영역의 표면 상에 노출될 수 있다. 본 발명에서, 표면 상에 노출될 수 있는 아미노산이란 일반적으로 변이체 Fc영역을 구성하는 폴리펩티드의 표면 상에 위치하는 아미노산 잔기를 지칭한다. 폴리펩티드의 표면 상에 위치한 아미노산 잔기는 이의 측쇄가 용매 분자(일반적으로 대부분이 물 분자임)와 접촉할 수 있는 아미노산 잔기를 지칭한다. 하지만, 상기 측쇄가 반드시 용매 분자와 완전하게 접촉할 필요는 없으며, 측쇄의 일부라도 용매 분자와 접촉하고 있는 경우에 아미노산은 "표면 상에 위치한 아미노산 잔기"로 정의된다. 폴리펩티드의 표면 상에 위치한 아미노산 잔기는 또한 표면에 가깝게 위치한 아미노산 잔기를 포함하고, 이에 따라 이의 측쇄가 부분적으로라도 용매 분자와 접촉하는 다른 아미노산 잔기로부터 전하 영향을 가질 수 있다. 당업자는, 예를 들어 상업적으로 입수가능한 소프트웨어를 사용하여 폴리펩티드의 상동성 모델을 제조할 수 있다. 대안적으로, X선 결정학과 같은 당업자에게 공지된 방법을 사용하는 것이 가능하다. 표면 상에 노출될 수 있는 아미노산 잔기는, 예를 들어 인사이트II(InsightII) 프로그램(엑설리스(Accelrys))과 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여 3차원 모델의 좌표를 사용하여 결정한다. 표면 노출이 가능한 부위는 기술 분야에 공지된 알고리즘을 사용하여 결정할 수 있다(예를 들어, Lee and Richards (J. Mol. Biol. 55:379-400 (1971)); Connolly (J. Appl. Cryst. 16:548-558 (1983)). 표면 노출 가능한 부위는 단백질 모델링 및 3차원 구조 정보에 적합한 소프트웨어를 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 목적으로 입수 가능한 소프트웨어는, 예를 들어 SYBYL 바이오폴리머 모듈(Biopolymer Module) 소프트웨어(트리포스 어쏘시에이츠(Tripos Associates))를 포함한다. 알고리즘에 사용자 입력 크기 매개변수가 필요한 경우, 계산에 사용되는 프로브의 "크기"는 반경이 약 1.4 옹스트롬 이하로 설정될 수 있다. 또한, 개인용 컴퓨터용 소프트웨어를 사용하여 표면 노출 가능한 영역을 결정하는 방법은 파시오스(Pacios Chem. 18(4):377-386 (1994); J. Mol. Model. 1:46-53 (1995))에 의해 설명되었다. 상기 정보에 기초하여, 변이체 Fc영역을 구성하는 폴리펩티드의 표면 상에 위치하는 적절한 아미노산 잔기를 선택할 수 있다.In certain embodiments, amino acids for increased pI may be exposed on the surface of the variant Fc region. In the present invention, the amino acid that can be exposed on the surface generally refers to an amino acid residue located on the surface of the polypeptide constituting the variant Fc region. Amino acid residues located on the surface of a polypeptide refer to amino acid residues whose side chains are capable of contacting solvent molecules (generally mostly water molecules). However, the side chain does not necessarily have to be in complete contact with the solvent molecule, and an amino acid is defined as an "amino acid residue located on the surface" when even a part of the side chain is in contact with the solvent molecule. Amino acid residues located on the surface of a polypeptide also include amino acid residues located close to the surface, so that its side chains may, at least in part, have a charge influence from other amino acid residues in contact with the solvent molecule. One skilled in the art can prepare homology models of polypeptides using, for example, commercially available software. Alternatively, it is possible to use methods known to the person skilled in the art, such as X-ray crystallography. Amino acid residues that may be exposed on the surface are determined using the coordinates of the three-dimensional model using, for example, a computer program such as the InsightII program (Accelrys). Areas capable of surface exposure can be determined using algorithms known in the art (eg, Lee and Richards (J. Mol. Biol. 55:379-400 (1971)); Connolly (J. Appl. Cryst); 16:548-558 (1983)).The surface exposable sites can be determined using software suitable for protein modeling and three-dimensional structural information.Software available for this purpose is, for example, the SYBYL Biopolymer Module Module) software (Tripos Associates) If the algorithm requires a user input size parameter, the "size" of the probe used in the calculation can be set to a radius of about 1.4 angstroms or less. Also, a method for determining the surface exposable area using software for a personal computer is described in Pacios Chem. 18(4):377-386 (1994); J. Mol. Model. 1:46-53 (1995). )) Based on the above information, it is possible to select an appropriate amino acid residue located on the surface of the polypeptide constituting the mutant Fc region.

특정 구현예들에서, 폴리펩티드는 변이체 Fc 영역 및 항원 결합 도메인 둘 다를 포함한다. 추가의 구현예들에서, 항원은 가용성 항원이다. 일 구현예에서, 항원은 대상체의 생물학적 유체(예를 들어, 혈장, 간질액, 림프액, 복수액, 및 흉막액)에 존재한다. 항원은 또한 막 항원일 수 있다.In certain embodiments, the polypeptide comprises both a variant Fc region and an antigen binding domain. In further embodiments, the antigen is a soluble antigen. In one embodiment, the antigen is present in the subject's biological fluid (eg, plasma, interstitial fluid, lymphatic fluid, ascites fluid, and pleural fluid). The antigen may also be a membrane antigen.

추가의 구현예들에서, 항원 결합 도메인의 항원 결합 활성은 이온 농도 조건에 따라 가변된다. 일 구현예에서, 이온 농도는 특별히 제한되지 않으며, 수소 이온 농도(pH) 또는 금속 이온 농도를 지칭한다. 본원에서, 금속이온이란 알칼리금속 및 구리족 원소와 같이 수소를 제외한 I족 원소, 알칼리토금속 및 아연족 원소와 같은 II족 원소, 붕소를 제외한 III족 원소, 탄소 및 규소를 제외한 IV족 원소, 철족 및 백금족 원소와 같은 VIII족 원소, V, VI, VII족의 아족 A에 속하는 원소, 및 안티몬, 비스무트 및 폴로늄과 같은 금속 원소의 이온들을 지칭한다. 본 발명에서, 금속 이온은, 예를 들어 WO 2012/073992 및 WO 2013/125667에 기재된 바와 같이 칼슘 이온을 포함한다. 일 구현예에서, "이온 농도 조건"은 저이온 농도 및 고이온 농도 사이의 항원 결합 도메인의 생물학적 거동의 차이에 초점을 맞춘 조건일 수 있다. 또한, “항원 결합 도메인의 항원 결합 활성은 이온 농도 조건에 따라 가변된다”란, 항원 결합 도메인의 항원 결합 활성이 저이온 농도 및 고이온 농도 사이에서 가변된다는 것을 의미한다(상기 항원 결합 도메인은 본원에서 "이온 농도 의존적 항원 결합 도메인"으로 지칭된다). 고이온 농도 조건하에서의 항원 결합 도메인의 항원 결합 활성은 저이온 농도 조건하에서의 항원 결합 활성보다 높거나(강하거나) 낮을(약할) 수 있다. 일 구현예에서, 이온 농도 의존적 항원 결합 도메인(예컨대, pH 의존적 항원 결합 도메인 또는 칼슘 이온 농도 의존적 항원 결합 도메인)은, 예를 들어 WO 2009/125825, WO 2012/073992, 및 WO 2013/046722에 기재된 공지의 방법에 의해 수득할 수 있다.In further embodiments, the antigen binding activity of the antigen binding domain is variable depending on ion concentration conditions. In one embodiment, the ion concentration is not particularly limited and refers to a hydrogen ion concentration (pH) or a metal ion concentration. As used herein, the metal ion is a group I element other than hydrogen such as alkali metals and copper group elements, a group II element such as alkaline earth metals and zinc group elements, a group III element other than boron, a group IV element except carbon and silicon, and an iron group and Group VIII elements such as platinum group elements, elements belonging to subgroup A of groups V, VI, VII, and ions of metal elements such as antimony, bismuth and polonium. In the present invention, metal ions include calcium ions, for example as described in WO 2012/073992 and WO 2013/125667. In one embodiment, the "ion concentration condition" may be a condition focusing on the difference in the biological behavior of the antigen binding domain between the low ionic concentration and the high ionic concentration. In addition, "the antigen-binding activity of the antigen-binding domain varies depending on ion concentration conditions" means that the antigen-binding activity of the antigen-binding domain varies between low and high ionic concentrations (the antigen-binding domain is referred to as "ion concentration dependent antigen binding domain"). The antigen-binding activity of the antigen-binding domain under the high ionic concentration condition may be higher (strong) or lower (weaker) than the antigen-binding activity under the low ionic concentration condition. In one embodiment, an ion concentration dependent antigen binding domain (eg, a pH dependent antigen binding domain or a calcium ion concentration dependent antigen binding domain) is described, for example, in WO 2009/125825, WO 2012/073992, and WO 2013/046722. It can be obtained by a known method.

본 발명에서, 고칼슘 이온 농도 조건하에서의 항원 결합 도메인의 항원 결합 활성은 저칼슘 이온 농도 조건하에서보다 높을 수 있다. 고칼슘 이온 농도는 특별히 제한되지 않지만, 100 μM 내지 10 mM, 200 μM 내지 5 mM, 400 μM 내지 3 mM, 200 μM 내지 2 mM, 400 μM 내지 1 mM, 또는 500 μM 내지 2.5 mM 사이에서 선택되는 농도일 수 있으며, 이는 생체내 칼슘 이온의 혈장(혈액) 농도에 근접하는 것이 바람직하다. 한편, 저칼슘 이온 농도는 특별히 제한되지 않지만, 0.1 μM 내지 30 μM, 0.2 μM 내지 20 μM, 0.5 μM 내지 10 μM, 1 μM 내지 5 μM, 또는 2 μM 내지 4 μM 사이에서 선택되는 농도일 수 있으며, 이는 생체내 초기 엔도솜 내 칼슘 농도에 근접하는 것이 바람직하다.In the present invention, the antigen-binding activity of the antigen-binding domain under a high calcium ion concentration condition may be higher than under a low calcium ion concentration condition. The high calcium ion concentration is not particularly limited, but a concentration selected from 100 μM to 10 mM, 200 μM to 5 mM, 400 μM to 3 mM, 200 μM to 2 mM, 400 μM to 1 mM, or 500 μM to 2.5 mM , which is preferably close to the plasma (blood) concentration of calcium ions in vivo. On the other hand, the low calcium ion concentration is not particularly limited, but may be a concentration selected from 0.1 μM to 30 μM, 0.2 μM to 20 μM, 0.5 μM to 10 μM, 1 μM to 5 μM, or 2 μM to 4 μM. , which is preferably close to the initial endosome calcium concentration in vivo.

일 구현예에서, 저칼슘 이온 농도 조건 및 고칼슘 이온 농도 조건하에서의 항원 결합 활성의 비는 특별히 제한되지 않지만, 고칼슘 이온 농도 조건하에서의 KD에 대한 저칼슘 이온 농도 조건하에서의 KD의 비, 즉 KD(저칼슘 이온 농도 조건)/KD(고칼슘 이온 농도 조건)는 2 이상, 10 이상, 또는 40 이상이다. 비율의 상한값은, 이러한 항원 결합 도메인이 당업자에게 공지된 기술에 의해 생성될 수 있는 한, 400, 1000, 10000일 수 있다. 대안적으로, 예를 들어 KD 대신에 해리 속도 상수(kd)를 사용할 수 있다. 이 경우, 고칼슘 이온 농도 조건하에서의 kd에 대한 저칼슘 이온 농도 조건하에서의 kd의 비, 즉 kd(저칼슘 이온 농도 조건)/kd(고칼슘 이온 농도 조건)는 2 이상, 5 이상, 10 이상, 또는 30 이상이다. 비율의 상한값은, 이러한 항원 결합 도메인이 당업자의 일반적인 기술 지식을 바탕으로 생성될 수 있는 한, 50, 100, 200일 수 있다.In one embodiment, the ratio of antigen-binding activity under the low calcium ion concentration condition and the high calcium ion concentration condition is not particularly limited, but the ratio of KD under the low calcium ion concentration condition to the KD under the high calcium ion concentration condition, that is, KD (low calcium Ion concentration condition)/KD (high calcium ion concentration condition) is 2 or more, 10 or more, or 40 or more. The upper limit of the ratio may be 400, 1000, 10000 as long as such antigen binding domains can be generated by techniques known to those skilled in the art. Alternatively, for example, the dissociation rate constant (kd) may be used instead of KD. In this case, the ratio of kd under the low calcium ion concentration condition to kd under the high calcium ion concentration condition, that is, kd (low calcium ion concentration condition)/kd (high calcium ion concentration condition) is 2 or more, 5 or more, 10 or more, or 30 More than that. The upper limit of the ratio may be 50, 100, 200, so long as such antigen binding domains can be generated based on the general technical knowledge of those skilled in the art.

본 발명에서, 저수소 이온 농도(중성 pH) 조건하에서의 항원 결합 도메인의 항원 결합 활성은 고수소 이온 농도(산성 pH) 조건하에서보다 높을 수 있다. 산성 pH는, 예를 들어 pH 4.0 내지 pH 6.5, pH 4.5 내지 pH 6.5, pH 5.0 내지 pH 6.5, 또는 pH 5.5 내지 pH 6.5로부터 선택되는 pH일 수 있으며, 초기 엔도솜에서 생체내 pH에 가까운 것이 바람직하다. 산성 pH는 또한, 예를 들어 pH 5.8 또는 pH 6.0일 수 있다. 특정 구현예들에서, 산성 pH는 5.8이다. 한편, 중성 pH는, 예를 들어 pH 6.7 내지 pH 10.0, pH 6.7 내지 pH 9.5, pH 7.0 내지 pH 9.0, 또는 pH 7.0 내지 pH 8.0로부터 선택되는 pH일 수 있으며, 혈장(혈액) 내에서 생체내 pH에 가까운 것이 바람직하다. 중성 pH는 또한, 예를 들어 pH 7.4 또는 pH 7.0일 수 있다. 특정 구현예들에서, 중성 pH는 7.4이다.In the present invention, the antigen-binding activity of the antigen-binding domain under a low hydrogen ion concentration (neutral pH) condition may be higher than under a high hydrogen ion concentration (acidic pH) condition. The acidic pH may be, for example, a pH selected from pH 4.0 to pH 6.5, pH 4.5 to pH 6.5, pH 5.0 to pH 6.5, or pH 5.5 to pH 6.5, preferably close to the in vivo pH in the initial endosome. do. The acidic pH may also be, for example, pH 5.8 or pH 6.0. In certain embodiments, the acidic pH is 5.8. Meanwhile, the neutral pH may be, for example, a pH selected from pH 6.7 to pH 10.0, pH 6.7 to pH 9.5, pH 7.0 to pH 9.0, or pH 7.0 to pH 8.0, and the in vivo pH in plasma (blood). It is preferable to be close to The neutral pH may also be, for example, pH 7.4 or pH 7.0. In certain embodiments, the neutral pH is 7.4.

일 구현예에서, 산성 pH 조건 및 중선 pH 조건하에서의 항원 결합 활성의 비는 특별히 제한되지 않지만, 중성 pH 조건하에서의 KD에 대한 산성 pH 조건하에서의 해리 상수(KD)의 비, 즉 KD(산성 pH 조건)/KD(중성 pH 조건)는 2 이상, 10 이상, 또는 40 이상이다. 비율의 상한값은, 이러한 항원 결합 도메인이 당업자에게 공지된 기술에 의해 생성될 수 있는 경우, 400, 1000, 10000일 수 있다. 대안적으로, 예를 들어 KD 대신에 해리 속도 상수(kd)를 사용할 수 있다. 이 경우, 중성 pH 조건하에서의 kd에 대한 산성 pH 조건하에서의 kd의 비, 즉 kd(산성 pH 조건)/kd(중성 pH 조건)는 2 이상, 5 이상, 10 이상, 또는 30 이상이다. 비율의 상한값은, 이러한 항원 결합 도메인이 당업자의 일반적인 기술 지식을 바탕으로 생성될 수 있는 한, 50, 100, 200일 수 있다.In one embodiment, the ratio of the antigen-binding activity under the acidic pH condition and the neutral pH condition is not particularly limited, but the ratio of the dissociation constant (KD) under the acidic pH condition to the KD under the neutral pH condition, i.e., KD (acidic pH condition) /KD (neutral pH conditions) is 2 or more, 10 or more, or 40 or more. The upper limit of the ratio may be 400, 1000, 10000, if such antigen binding domains can be generated by techniques known to those skilled in the art. Alternatively, for example, the dissociation rate constant (kd) may be used instead of KD. In this case, the ratio of kd under acidic pH conditions to kd under neutral pH conditions, that is, kd (acid pH conditions)/kd (neutral pH conditions) is 2 or more, 5 or more, 10 or more, or 30 or more. The upper limit of the ratio may be 50, 100, 200, so long as such antigen binding domains can be generated based on the general technical knowledge of those skilled in the art.

일 구현예에서, 예를 들어, 적어도 하나의 아미노산 잔기는 측쇄 pKa가 4.0~8.0인 아미노산 잔기로 치환되고, 및/또는 측쇄 pKa가 4.0~8.0인 적어도 하나의 아미노산은 WO 2009/125825에 기재된 바와 같이 항원 결합 도메인에 삽입된다. 아미노산은, 치환 또는 삽입 전과 비교하여 중성 pH 조건하에서보다 산성 pH 조건하에서 항원 결합 도메인의 항원 결합 활성이 약해지는 한, 임의의 부위에 치환 및/또는 삽입될 수 있다. 항원 결합 도메인이 가변 영역 또는 CDR을 갖는 경우, 상기 부위는 가변 영역 또는 CDR 내에 있을 수 있다. 치환 또는 삽입되는 아미노산의 수는 당업자에 의해 적절하게 결정할 수 있고; 상기 수는 하나 이상일 수 있다. 측쇄 pKa가 4.0~8.0인 아미노산은 수소 이온 농도 조건에 따라 항원 결합 도메인의 항원 결합 활성을 변화시키는 데 사용할 수 있다. 상기 아미노산은, 예를 들어 His(H) 및 Glu(E)와 같은 천연 아미노산, 및 비천연 아미노산, 예컨대 히스티딘 유사체(US2009/0035836), m-NO2-Tyr(pKa 7.45), 3,5-Br2-Tyr(pKa 7.21) 및 3,5-I2-Tyr(pKa 7.38)을 포함한다(Heyl et al., Bioorg. Med. Chem. 11(17):3761-3768 (2003)). 예컨대, His(H)를 포함하는 측쇄 pKa가 6.0-7.0인 아미노산도 사용할 수 있다.In one embodiment, for example, at least one amino acid residue is substituted with an amino acid residue having a side chain pKa of 4.0-8.0, and/or at least one amino acid having a side chain pKa of 4.0-8.0 is as described in WO 2009/125825 is inserted into the antigen-binding domain. Amino acids may be substituted and/or inserted at any site as long as the antigen-binding activity of the antigen-binding domain is weakened under acidic pH conditions than under neutral pH conditions compared to before substitution or insertion. Where the antigen binding domain has a variable region or CDR, said region may be within a variable region or CDR. The number of amino acids to be substituted or inserted can be appropriately determined by those skilled in the art; The number may be one or more. Amino acids having a side chain pKa of 4.0 to 8.0 can be used to change the antigen-binding activity of the antigen-binding domain depending on hydrogen ion concentration conditions. Such amino acids include, for example, natural amino acids such as His(H) and Glu(E), and non-natural amino acids such as histidine analogs (US2009/0035836), m-NO2-Tyr (pKa 7.45), 3,5-Br2 -Tyr (pKa 7.21) and 3,5-I2-Tyr (pKa 7.38) (Heyl et al., Bioorg. Med. Chem. 11(17):3761-3768 (2003)). For example, amino acids having a side chain pKa of 6.0-7.0 including His(H) can also be used.

다른 구현예에서, pI가 증가된 변이체 Fc 영역에 대한 바람직한 항원 결합 도메인이 기재되고 WO2016/125495 및 WO2017/046994에 기재된 방법에 의해 수득될 수 있다.In another embodiment, preferred antigen binding domains for variant Fc regions with increased pI are described and can be obtained by the methods described in WO2016/125495 and WO2017/046994.

특정 구현예들에서, 증가된 pI를 갖는 변이체 Fc 영역은: EU 넘버링에 따른 285, 311, 312, 315, 318, 333, 335, 337, 341, 342, 343, 384, 385, 388, 390, 399, 400, 401, 402, 413, 420, 422, 및 431로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 위치에서 적어도 2개의 아미노산 변경을 포함한다.In certain embodiments, the variant Fc region with increased pI is: 285, 311, 312, 315, 318, 333, 335, 337, 341, 342, 343, 384, 385, 388, 390, according to EU numbering. at least two amino acid alterations at at least two positions selected from the group consisting of 399, 400, 401, 402, 413, 420, 422, and 431.

추가의 구현예들에서, 증가된 pI를 갖는 변이체 Fc 영역은: EU 넘버링에 따른 311, 341, 343, 384, 399, 400, 401, 402, 및 413으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 위치에서 적어도 2개의 아미노산 변경을 포함한다.In further embodiments, the variant Fc region with increased pI is at least in at least two positions selected from the group consisting of: 311, 341, 343, 384, 399, 400, 401, 402, and 413 according to EU numbering. It contains two amino acid changes.

다른 양태에서, 본 발명은 하기의 (1)-(10): EU 넘버링에 따른 (1) 위치 311 및 341; (2) 위치 311 및 343; (3) 위치 311, 343 및 413; (4) 위치 311, 384 및 413; (5) 위치 311 및 399; (6) 위치 311 및 401; (7) 위치 311 및 413; (8) 위치 400 및 413; (9) 위치 401 및 413; 및 (10) 위치 402 및 413 중 어느 하나의 아미노산 변경을 포함한 증가된 pI를 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.In another aspect, the present invention relates to the following (1)-(10): (1) positions 311 and 341 according to EU numbering; (2) positions 311 and 343; (3) positions 311, 343 and 413; (4) positions 311, 384 and 413; (5) positions 311 and 399; (6) positions 311 and 401; (7) positions 311 and 413; (8) positions 400 and 413; (9) positions 401 and 413; and (10) a variant Fc region having an increased pI comprising an amino acid alteration at any one of positions 402 and 413.

일 양태에서, 본 발명은: (a) EU 넘버링에 따른 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 264, 266, 267, 268, 271, 295, 298, 325, 326, 327, 328, 330, 331, 332, 334, 및 396으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 위치에서 적어도 하나의 아미노산 변경, 및 (b) EU 넘버링에 따른 285, 311, 312, 315, 318, 333, 335, 337, 341, 342, 343, 384, 385, 388, 390, 399, 400, 401, 402, 413, 420, 422, 및 431로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 위치에서 적어도 2개의 아미노산 변경을 포함한 적어도 3개의 아미노산 변경을 포함하는 증가된 pI 및 향상된 FcγRIIb 결합 활성을 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.In one aspect, the present invention provides: (a) 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 264, 266, 267, 268, 271, 295, 298, 325, 326 according to EU numbering , 327, 328, 330, 331, 332, 334, and at least one amino acid change at at least one position selected from the group consisting of 396, and (b) 285, 311, 312, 315, 318, 333 according to EU numbering. , 335, 337, 341, 342, 343, 384, 385, 388, 390, 399, 400, 401, 402, 413, 420, 422, and 431 at least two amino acid changes at at least two positions selected from the group consisting of: It provides a polypeptide comprising a variant Fc region having increased pI and improved FcγRIIb binding activity comprising at least three amino acid alterations, including:

일 양태에서, 본 발명은: (a) EU 넘버링에 따른 231, 232, 235, 236, 239, 268, 295, 298, 326, 330, 및 396으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 위치에서 적어도 하나의 아미노산 변경, 및 (b) EU 넘버링에 따른 311, 341, 343, 384, 399, 400, 401, 402, 및 413으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 위치에서 적어도 2개의 아미노산 변경을 포함한 적어도 3개의 아미노산 변경을 포함하는 증가된 pI 및 향상된 FcγRIIb 결합 활성을 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.In one aspect, the present invention provides: (a) at least one at least one position selected from the group consisting of 231, 232, 235, 236, 239, 268, 295, 298, 326, 330, and 396 according to EU numbering. at least three amino acids comprising an amino acid alteration, and (b) at least two amino acid alterations at at least two positions selected from the group consisting of 311, 341, 343, 384, 399, 400, 401, 402, and 413 according to EU numbering. Polypeptides comprising a variant Fc region having increased pI and enhanced FcγRIIb binding activity comprising alterations are provided.

다른 양태에서, 본 발명은 하기의 (1)-(9): EU 넘버링에 따른 (1) 위치 235, 236, 268, 295, 311, 326, 330 및 343; (2) 위치 236, 268, 295, 311, 326, 330 및 343; (3) 위치 236, 268, 295, 311, 330 및 413; (4) 위치 236, 268, 311, 330, 396 및 399; (5) 위치 236, 268, 311, 330 및 343; (6) 위치 236, 268, 311, 330, 343 및 413; (7) 위치 236, 268, 311, 330, 384 및 413; (8) 위치 236, 268, 311, 330 및 413; 및 (9) 위치 236, 268, 330, 396, 400 및 413 중 어느 하나의 아미노산 변경을 포함한 증가된 pI 및 향상된 FcγRIIb 결합 활성을 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. In another aspect, the present invention relates to the following (1)-(9): (1) positions 235, 236, 268, 295, 311, 326, 330 and 343 according to EU numbering; (2) positions 236, 268, 295, 311, 326, 330 and 343; (3) positions 236, 268, 295, 311, 330 and 413; (4) positions 236, 268, 311, 330, 396 and 399; (5) positions 236, 268, 311, 330 and 343; (6) positions 236, 268, 311, 330, 343 and 413; (7) positions 236, 268, 311, 330, 384 and 413; (8) positions 236, 268, 311, 330 and 413; and (9) an increased pI comprising an amino acid alteration of any one of positions 236, 268, 330, 396, 400 and 413 and a variant Fc region having improved FcγRIIb binding activity.

일 양태에서, 본 발명은: (a) EU 넘버링에 따른 234, 238, 250, 264, 267, 307, 및 330으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 위치에서 적어도 하나의 아미노산 변경, 및 (b) EU 넘버링에 따른 285, 311, 312, 315, 318, 333, 335, 337, 341, 342, 343, 384, 385, 388, 390, 399, 400, 401, 402, 413, 420, 422, 및 431로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 위치에서 적어도 2개의 아미노산 변경을 포함한 적어도 3개의 아미노산 변경을 포함하는 증가된 pI 및 향상된 FcγRIIb 결합 활성을 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 추가의 구현예들에서, 폴리펩티드는: EU 넘버링에 따른 311, 341, 343, 384, 399, 400, 401, 402, 및 413으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 위치에서 적어도 2개의 아미노산 변경을 포함한다. In one aspect, the present invention provides: (a) at least one amino acid alteration at at least one position selected from the group consisting of 234, 238, 250, 264, 267, 307, and 330 according to EU numbering, and (b) EU 285, 311, 312, 315, 318, 333, 335, 337, 341, 342, 343, 384, 385, 388, 390, 399, 400, 401, 402, 413, 420, 422, and 431 according to numbering Provided is a polypeptide comprising a variant Fc region having increased pI and improved FcγRIIb binding activity comprising at least three amino acid alterations comprising at least two amino acid alterations at at least two positions selected from the group consisting of. In further embodiments, the polypeptide comprises at least two amino acid alterations at at least two positions selected from the group consisting of: 311, 341, 343, 384, 399, 400, 401, 402, and 413 according to EU numbering. .

다른 양태에서, 본 발명은 하기의 (1)-(16): EU 넘버링에 따른 (1) 위치 234, 238, 250, 264, 307, 311, 330 및 343; (2) 위치 234, 238, 250, 264, 307, 311, 330 및 413; (3) 위치 234, 238, 250, 264, 267, 307, 311, 330 및 343; (4) 위치 234, 238, 250, 264, 267, 307, 311, 330 및 413; (5) 위치 234, 238, 250, 267, 307, 311, 330 및 343; (6) 위치 234, 238, 250, 267, 307, 311, 330 및 413; (7) 위치 234, 238, 250, 307, 311, 330 및 343; (8) 위치 234, 238, 250, 307, 311, 330 및 413; (9) 위치 238, 250, 264, 267, 307, 311, 330 및 343; (10) 위치 238, 250, 264, 267, 307, 311, 330 및 413; (11) 위치 238, 250, 264, 307, 311, 330 및 343; (12) 위치 238, 250, 264, 307, 311, 330 및 413; (13) 위치 238, 250, 267, 307, 311, 330 및 343; (14) 위치 238, 250, 267, 307, 311, 330 및 413; (15) 위치 238, 250, 307, 311, 330 및 343; 및 (16) 위치 238, 250, 307, 311, 330 및 413 중 어느 하나의 아미노산 변경을 포함한 증가된 pI 및 향상된 FcγRIIb 결합 활성을 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.In another aspect, the present invention relates to the following (1)-(16): (1) positions 234, 238, 250, 264, 307, 311, 330 and 343 according to EU numbering; (2) positions 234, 238, 250, 264, 307, 311, 330 and 413; (3) positions 234, 238, 250, 264, 267, 307, 311, 330 and 343; (4) positions 234, 238, 250, 264, 267, 307, 311, 330 and 413; (5) positions 234, 238, 250, 267, 307, 311, 330 and 343; (6) positions 234, 238, 250, 267, 307, 311, 330 and 413; (7) positions 234, 238, 250, 307, 311, 330 and 343; (8) positions 234, 238, 250, 307, 311, 330 and 413; (9) positions 238, 250, 264, 267, 307, 311, 330 and 343; (10) positions 238, 250, 264, 267, 307, 311, 330 and 413; (11) positions 238, 250, 264, 307, 311, 330 and 343; (12) positions 238, 250, 264, 307, 311, 330 and 413; (13) positions 238, 250, 267, 307, 311, 330 and 343; (14) positions 238, 250, 267, 307, 311, 330 and 413; (15) positions 238, 250, 307, 311, 330 and 343; and (16) an increased pI comprising an amino acid alteration at any one of positions 238, 250, 307, 311, 330 and 413 and a variant Fc region having improved FcγRIIb binding activity.

또한, 다른 목적(들)으로 실시된 아미노산 변경은 본원에 기재된 변이체 Fc 영역에서 조합될 수 있다. 예를 들어, FcRn 결합 활성을 개선시키는 아미노산 치환 (Hinton et al., J. Immunol. 176(1):346-356 (2006); Dall'Acqua et al., J. Biol. Chem. 281(33):23514-23524 (2006); Petkova et al., Intl. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006); Zalevsky et al., Nat. Biotechnol. 28(2):157-159 (2010); WO 2006/019447; WO 2006/053301; 및 WO 2009/086320), 및 항체 이질성 또는 안정성을 개선하기 위한 아미노산 치환(WO 2009/041613)이 추가될 수 있다. 대안적으로, WO 2011/122011, WO 2012/132067, WO 2013/046704 또는 WO 2013/180201에 기재된 항원 제거를 촉진하는 성질을 갖는 폴리펩티드, WO 2013/180200에 기재된 표적 조직에 특이적으로 결합하는 성질을 갖는 폴리펩티드, WO 2009/125825, WO 2012/073992 또는 WO 2013/047752에 기재된 복수의 항원 분자에 대해 반복적으로 결합하는 성질을 갖는 폴리펩티드는 본원에 기재된 변이체 Fc 영역과 조합될 수 있다. 대안적으로, 다른 항원에 대한 결합능을 부여할 목적으로, EP1752471 및 EP1772465에 개시된 아미노산 변경은 본원에 기재된 변이체 Fc 영역의 CH3에서 조합될 수 있다. 대안적으로, 혈장 체류를 증가시키기 위한 목적으로, 불변 영역의 pI를 감소시키는 아미노산 변경(WO 2012/016227)은 본원에 기재된 변이체 Fc 영역에서 조합될 수 있다. 대안적으로, 세포 내 흡수를 촉진시키기 위한 목적으로, 불변 영역의 pI를 증가시키는 아미노산 변경(WO 2014/145159)은 본원에 기재된 변이체 Fc 영역에서 조합될 수 있다. 대안적으로, 혈장에서 표적 분자의 제거를 촉진하기 위한 목적으로, 불변 영역의 pI를 증가시키는 아미노산 변경(WO 2016/125495)은 본원에 기재된 변이체 Fc 영역에서 조합될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 변경은, 예를 들어 EU 넘버링에 따른 311, 343, 384, 399, 400, 및 413으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 위치에서의 치환을 포함할 수 있다. 추가의 구현예에서, 상기 치환은 아미노산을 각 위치에서 Lys 또는 Arg로 치환하는 것일 수 있다.In addition, amino acid alterations made for other purpose(s) may be combined in the variant Fc regions described herein. For example, amino acid substitutions that improve FcRn binding activity (Hinton et al., J. Immunol. 176(1):346-356 (2006); Dall'Acqua et al., J. Biol. Chem. 281(33) ):23514-23524 (2006); Petkova et al., Intl. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006); Zalevsky et al., Nat. Biotechnol. 28(2):157-159 (2010) ; WO 2006/019447; WO 2006/053301; and WO 2009/086320), and amino acid substitutions to improve antibody heterogeneity or stability (WO 2009/041613) may be added. Alternatively, a polypeptide having the property of promoting antigen clearance as described in WO 2011/122011, WO 2012/132067, WO 2013/046704 or WO 2013/180201, the property of specifically binding to a target tissue as described in WO 2013/180200 A polypeptide having a property of repeatedly binding to a plurality of antigen molecules described in WO 2009/125825, WO 2012/073992 or WO 2013/047752 can be combined with the variant Fc region described herein. Alternatively, for the purpose of conferring binding ability to other antigens, the amino acid alterations disclosed in EP1752471 and EP1772465 may be combined at CH3 of the variant Fc region described herein. Alternatively, for the purpose of increasing plasma retention, amino acid alterations that decrease the pI of the constant region (WO 2012/016227) may be combined in the variant Fc region described herein. Alternatively, for the purpose of promoting intracellular uptake, amino acid alterations that increase the pI of the constant region (WO 2014/145159) may be combined in the variant Fc region described herein. Alternatively, for the purpose of promoting clearance of the target molecule from plasma, amino acid alterations that increase the pI of the constant region (WO 2016/125495) can be combined in the variant Fc region described herein. In one embodiment, the alteration may comprise, for example, a substitution at at least one position selected from the group consisting of 311, 343, 384, 399, 400, and 413 according to EU numbering. In a further embodiment, the substitution may be to replace the amino acid with Lys or Arg at each position.

산성 pH 하에서 인간 FcRn 결합 활성을 향상시키는 아미노산 변경은 또한 본원에 기재된 변이체 Fc 영역에서 조합될 수 있다. 구체적으로, 상기 변경은, 예를 들어 EU 넘버링에 따른 위치 428에서 Met를 Leu로 치환 및 위치 434에서 Asn을 Ser로 치환(Zalevsky et al., Nat. Biotechnol. 28:157-159 (2010)); 위치 434에서 Asn을 Ala로 치환(Deng et al., Metab. Dispos. 38(4):600-605 (2010)); 위치 252에서 Met를 Tyr로 치환, 위치 254에서 Ser를 Thr로 치환 및 위치 256에서 Thr를 Glu로 치환(Dall'Acqua et al., J. Biol. Chem. 281:23514-23524 (2006)); 위치 250에서 Thr을 Gln으로 치환 및 위치 428에서 Met를 Leu로 치환(Hinton et al., J. Immunol.176(1):346-356 (2006)); 위치 434에서 Asn을 His로 치환(Zheng et al., Clin. Pharmacol. Ther. 89(2):283-290 (2011), 및 WO 2010/106180, WO 2010/045193, WO 2009/058492, WO 2008/022152, WO 2006/050166, WO 2006/053301, WO 2006/031370, WO 2005/123780, WO 2005/047327, WO 2005/037867, WO 2004/035752, 또는 WO 2002/060919에 기재된 변경을 포함할 수 있다. 상기 변경은, 예를 들어 위치 428에서 Met를 Leu로 치환, 위치 434에서 Asn을 Ala로 치환 및 위치 436에서 Tyr을 Thr로 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 변경을 포함할 수 있다. 상기 변경은 위치 438에서 Gln을 Arg로 치환 및/또는 위치 440에서 Ser을 Glu로 치환을 더 포함할 수 있다(WO2016/125495).Amino acid alterations that enhance human FcRn binding activity under acidic pH can also be combined in the variant Fc regions described herein. Specifically, the alterations include, for example, the substitution of Leu for Met at position 428 and the substitution of Ser for Asn at position 434 according to EU numbering (Zalevsky et al., Nat. Biotechnol. 28:157-159 (2010)). ; substitution of Asn with Ala at position 434 (Deng et al., Metab. Dispos. 38(4):600-605 (2010)); Tyr for Met at position 252, Ser for Thr at position 254 and Thr with Glu at position 256 (Dall'Acqua et al., J. Biol. Chem. 281:23514-23524 (2006)); Thr for Gin at position 250 and Met with Leu at position 428 (Hinton et al., J. Immunol. 176(1):346-356 (2006)); Substitution of Asn with His at position 434 (Zheng et al., Clin. Pharmacol. Ther. 89(2):283-290 (2011), and WO 2010/106180, WO 2010/045193, WO 2009/058492, WO 2008 /022152, WO 2006/050166, WO 2006/053301, WO 2006/031370, WO 2005/123780, WO 2005/047327, WO 2005/037867, WO 2004/035752, or WO 2002/060919. The alteration may comprise, for example, at least one alteration selected from the group consisting of Met at position 428 with Leu, Asn at position 434 with Ala, and Tyr at position 436 with Thr. Said alteration may further comprise a substitution of Arg for Gin at position 438 and/or a substitution of Ser with Glu at position 440 (WO2016/125495).

예시적인 이중특이적 항-CCL2 항체Exemplary bispecific anti-CCL2 antibodies

본 발명의 일 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 상이한 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 상이한 제2 항원 결합 부위를 포함하는, 이중특이적 항체로서,One embodiment of the present invention comprises a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a different second antigen binding site that (specifically) binds to a second different epitope on human CCL2 As a bispecific antibody,

A) i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고 A) i) said first antigen binding site comprises (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, and (c) SEQ ID NO: 35 a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of and (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:36; a VL domain comprising (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38; and

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;ii) the second antigen binding site comprises (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, and (c) the amino acid of SEQ ID NO: 43 a VH domain comprising a CDR-H3 comprising sequence; and (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:44; a VL domain comprising (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence HQYIHLHSFT of SEQ ID NO: 46;

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 22의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;ii) the second antigen binding site comprises (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and (c) the amino acid of SEQ ID NO: 19 a VH domain comprising a CDR-H3 comprising sequence; and (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; a VL domain comprising (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence HQYIHLHSFT of SEQ ID NO: 22;

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.ii) the second antigen binding site comprises (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and (c) the amino acid of SEQ ID NO: 27 a VH domain comprising a CDR-H3 comprising sequence; and (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:28; and a VL domain comprising (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:29, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:30.

일 구현예에서, 20 mg/kg의 각 이중특이적 항체 및 0.1 mg/kg의 인간 CCL2로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 10 ml/kg의 단일 용량으로 FcRn 형질전환 마우스에 투여할 때, 인간 야생형 IgG1 동형의 불변 중쇄 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함하는 이중특이적 항체를 투여한 후 인간 CCL2에 대한 생체내 제거율(ml/day/kg)은 돌연변이 L234A, L235A, P329G를 포함하는 인간 IgG1 동형의 Fc 감마 수용체 침묵형 불변 중쇄 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함하는 이중특이적 항체를 투여한 후 인간 CCL2에 대한 생체내 제거율(ml/day/kg)에 비해 2배 이상(일 구현예에서 5배 이상, 일 구현예에서 10배 이상, 일 구현예에서 20배 이상) 높다.In one embodiment, when administered to an FcRn transgenic mouse a preformed immune complex consisting of 20 mg/kg of each bispecific antibody and 0.1 mg/kg of human CCL2 at a single dose of 10 ml/kg, human wild-type IgG1 In vivo clearance (ml/day/kg) for human CCL2 after administration of a bispecific antibody comprising an isotype constant heavy chain domain (or an Fc domain thereof) is that of a human IgG1 isotype comprising the mutations L234A, L235A, and P329G. After administration of a bispecific antibody comprising an Fc gamma receptor silencing constant heavy chain domain (or an Fc domain thereof), at least 2 times (in one embodiment, 5 at least twice, in one embodiment at least 10 times, and in one embodiment at least 20 times) higher.

본 발명의 일 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 상이한 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서,One embodiment of the present invention comprises a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a second antigen binding site that (specifically) binds to a second different epitope on human CCL2 , (isolated) bispecific antibody,

서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하며, (a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47, (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, and (c) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43 a VH domain comprising a CDR-H3 comprising an amino acid sequence; and a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48, and (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44; is a bispecific antibody (isolated) comprising (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, and (f) a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46 .

일 구현예에서, 20 mg/kg의 각 이중특이적 항체 및 0.1 mg/kg의 인간 CCL2로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 10 ml/kg의 단일 용량으로 FcRn 형질전환 마우스에 투여할 때, 인간 야생형 IgG1 동형의 불변 중쇄 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함하는 이중특이적 항체를 투여한 후 인간 CCL2에 대한 생체내 제거율(ml/day/kg)은 돌연변이 L234A, L235A, P329G를 포함하는 인간 IgG1 동형의 Fc 감마 수용체 침묵형 불변 중쇄 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함하는 이중특이적 항체를 투여한 후 인간 CCL2에 대한 생체내 제거율(ml/day/kg)에 비해 15배 이상, 특히 20배 이상 높다.In one embodiment, when administered to an FcRn transgenic mouse a preformed immune complex consisting of 20 mg/kg of each bispecific antibody and 0.1 mg/kg of human CCL2 at a single dose of 10 ml/kg, human wild-type IgG1 In vivo clearance (ml/day/kg) for human CCL2 after administration of a bispecific antibody comprising an isotype constant heavy chain domain (or an Fc domain thereof) is that of a human IgG1 isotype comprising the mutations L234A, L235A, and P329G. After administration of a bispecific antibody comprising an Fc gamma receptor silencing constant heavy chain domain (or an Fc domain thereof), the in vivo clearance rate for human CCL2 (ml/day/kg) is at least 15-fold, particularly at least 20-fold higher .

그리고and

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및ii) said second antigen binding site comprises (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence HTYMH of SEQ ID NO: 76, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence RIDPXNHNTKFDPKFQG of SEQ ID NO: 77, wherein X is D or E; and (c) a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence GVFGFFXH of SEQ ID NO: 78, wherein X is D or E; and

(h) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (i) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (j) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3, (k) 서열번호 67의 아미노산 서열 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC를 포함하는 FR-H1, (l) 서열번호 68의 아미노산 서열 WYQQKPGQAPRLLIY를 포함하는 FR-H2, (m) 서열번호 69의 아미노산 서열 GVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC를 포함하는 FR-L3, 및 (n) 서열번호 70의 아미노산 서열 GQGTKVEIK를 포함하는 FR-H4를 포함하는 VL 도메인을 포함하고;(h) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence RASQHVSDAYLA of SEQ ID NO:60; (i) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence DASDRAE of SEQ ID NO: 61, and (j) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence HQYIHLHSFT of SEQ ID NO: 62, (k) a FR- comprising the amino acid sequence EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC of SEQ ID NO: 67 H1, (l) FR-H2 comprising the amino acid sequence WYQQKPGQAPRLLIY of SEQ ID NO: 68, (m) FR-L3 comprising the amino acid sequence GVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC of SEQ ID NO: 69, and (n) the amino acid sequence GQGTKVEIK of SEQ ID NO: 70 a VL domain comprising FR-H4;

그리고and

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

i) 상기 제1 항원 결합 부위는 i) the first antigen binding site is

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

i) 상기 제1 항원 결합 부위는 i) the first antigen binding site is

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 91; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:93.

i) 상기 제1 항원 결합 부위는 i) the first antigen binding site is

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 90; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:94.

i) 상기 제1 항원 결합 부위는 i) the first antigen binding site is

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

일 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 인간 IgG1 동형의 불변 중쇄 도메인을 포함한다. 본 발명의 일 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 상이한 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서,In one embodiment, the bispecific antibody comprises a constant heavy chain domain of the human IgG1 isotype. One embodiment of the present invention comprises a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a second antigen binding site that (specifically) binds to a second different epitope on human CCL2 , (isolated) bispecific antibody,

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

O) i)상기 제1 항원 결합 부위는O) i) the first antigen binding site is

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

i)시험관 내에서 CCL2가 이의 수용체 CCR2에 결합하는 것을 차단하고(리포터 분석, IC₅₀=0.5 nM); 및/또는i) block the binding of CCL2 to its receptor CCR2 in vitro (reporter assay, IC ₅₀ =0.5 nM); and/or

일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 다른 인간 CCL 동족체에 대해 교차 반응성이 아니며, 특히 CCL2에 대한 결합과 비교하여 다른 CCL 동족체(CCL8, CCL7 및 CCL13의 군으로부터 선택됨)에 대한 결합이 100배 더 적게 나타낸다.In one embodiment, the bispecific antibodies described herein are not cross-reactive to other human CCL homologues, in particular binding to other CCL homologs (selected from the group of CCL8, CCL7 and CCL13) as compared to binding to CCL2. 100 times less.

일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 pH 5.8에서보다 pH 7.4에서 10배 더 높은 친화도로 인간 CCL2에 결합한다. In one embodiment, the bispecific antibodies described herein bind human CCL2 with a 10-fold higher affinity at pH 7.4 than at pH 5.8.

일 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 인간 IgG1 동형의 불변 중쇄 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 하기 돌연변이(카바트 EU 넘버링)들:In one embodiment, the bispecific antibody comprises a constant heavy chain domain of the human IgG1 isotype. In one embodiment, the bispecific antibodies described herein have the following mutations (Kabat EU numbering):

iv) Q438R 및/또는 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합) 중 하나 이상을 포함하는 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함한다.iv) a human IgG1 heavy chain constant domain (or an Fc domain thereof) comprising at least one of Q438R and/or S440E (suitable for inhibition of rheumatic factor binding).

iv) Q438R 및 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합)를 포함하는 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함한다.iv) a human IgG1 heavy chain constant domain (or an Fc domain thereof) comprising Q438R and S440E (suitable for inhibition of rheumatoid factor binding).

iii) Q438R 및 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합)를 포함하는 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함한다.iii) a human IgG1 heavy chain constant domain (or an Fc domain thereof) comprising Q438R and S440E (suitable for inhibition of rheumatoid factor binding).

Q311R 및 P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합)을 포함하는 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함한다.human IgG1 heavy chain constant domain (or Fc domain thereof) comprising Q311R and P343R (suitable for increasing pI to enhance antigen uptake).

iv) Q438R 및 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합) 중 하나 이상을 포함하는 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함한다.iv) a human IgG1 heavy chain constant domain (or an Fc domain thereof) comprising at least one of Q438R and S440E (suitable for inhibition of rheumatic factor binding).

iv) Q438R 및 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합) 중 하나 이상을 포함하는 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인(또는 이의 Fc 도메인)을 포함한다.iv) a human IgG1 heavy chain constant domain (or an Fc domain thereof) comprising at least one of Q438R and S440E (suitable for inhibition of rheumatoid factor binding).

A) i)상기 제1 항원 결합 부위는A) i) the first antigen binding site is

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

D) i)상기 제1 항원 결합 부위는D) i) the first antigen binding site is

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고;a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 90; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:94;

상기 이중특이적 항체는 인간 IgG 동형(바람직하게는 인간 IgG1 동형)의 전장 항체로서,The bispecific antibody is a full-length antibody of human IgG isotype (preferably human IgG1 isotype),

a) 각각의 i) 하에 상기 제1 항원 결합 부위를 포함하는 제1 항체의 제1 경쇄 및 제1 중쇄; 및a) a first light chain and a first heavy chain of a first antibody comprising said first antigen binding site under each i); and

b) 각각의 ii) 하에 상기 제2 항원 결합 부위를 포함하는 제2 항체의 제2 경쇄 및 제2 중쇄를 갖고, 제2 항체의 제2 경쇄 및 제2 중쇄 내의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로에 의해 대체되고; 그리고 b) a second light chain and a second heavy chain of a second antibody comprising said second antigen binding site under each ii), wherein the variable domains VL and VH in the second light chain and the second heavy chain of the second antibody are to each other replaced by; and

a) 하의 제1 경쇄의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신(K)에 의해 치환되고(카바트에 따른 넘버링), 위치 123의 아미노산은 리신(K)에 의해 치환되며(카바트에 따른 넘버링), In the constant domain CL of the first light chain under a) the amino acid at position 124 is substituted by lysine (K) (numbering according to Kabat), and the amino acid at position 123 is substituted by lysine (K) according to Kabat (according to Kabat) numbering),

a) 하의 제1 중쇄의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되고(카바트에 따른 넘버링), 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되는 (카바트에 따른 넘버링), (단리된)이중특이적 항체이다.In the constant domain CH1 of the first heavy chain under a) the amino acid at position 147 is substituted by glutamic acid (E) (numbering according to Kabat) and the amino acid at position 213 is replaced by glutamic acid (E) according to Kabat (according to Kabat) numbering), (isolated) bispecific antibody.

i) 상기 제1 항원 결합 부위는i) the first antigen binding site is

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고;a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 91; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:93;

상기 이중특이적 항체는 (전장)항체로서,The bispecific antibody is a (full length) antibody,

a) i) 하에 상기 제1 항원 결합 부위를 포함하는 IgG1 동형의 제1 중쇄 및 제1 카파 또는 람다 경쇄; 및a) a first heavy chain and a first kappa or lambda light chain of an IgG1 isotype comprising said first antigen binding site under i); and

b) ii) 하에 상기 제2 항원 결합 부위를 포함하는 제2 IgG1 중쇄 IgG1 동형 및 제2 카파 또는 람다 경쇄를 갖고, 제2 항체의 제2 경쇄 및 제2 중쇄 내의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로에 의해 대체되고; 그리고 b) having a second IgG1 heavy chain IgG1 isotype comprising said second antigen binding site under ii) and a second kappa or lambda light chain, wherein the variable domains VL and VH in the second light chain and the second heavy chain of the second antibody are to each other replaced by; and

일 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 하기 돌연변이들(카바트 EU 넘버링):In one embodiment, the bispecific antibody has the following mutations (Kabat EU numbering):

ii) 중쇄 불변 도메인 중 다른 하나에서의 Y349C, T366S, L368A, Y407V를 포함한다. ii) Y349C, T366S, L368A, Y407V in the other of the heavy chain constant domains.

iv) Q438R 및 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합)를 추가로 포함한다.iv) Q438R and S440E (suitable for inhibition of rheumatoid factor binding).

대안적인 일 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 하기 돌연변이들(카바트 EU 넘버링):In an alternative embodiment, the bispecific antibody has the following mutations (Kabat EU numbering):

iii) Q438R 및 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합)를 추가로 포함한다.iii) Q438R and S440E (suitable for inhibition of rheumatoid factor binding).

Q311R 및 P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합)을 추가로 포함한다.Q311R and P343R (suitable for increasing pI to enhance antigen uptake).

본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 112의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 113의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 114의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 115의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.Certain embodiments of the present invention comprise a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a second antigen binding site that (specifically) binds to a second epitope on human CCL2, A (isolated) bispecific antibody, wherein the bispecific antibody comprises a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 112, amino acids that are at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 113 a polypeptide comprising the sequence, a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 114, and a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 115, It is an (isolated) bispecific antibody.

본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다. Certain embodiments of the present invention comprise a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a second antigen binding site that (specifically) binds to a second epitope on human CCL2, An (isolated) bispecific antibody, wherein the bispecific antibody comprises a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 112, a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 113, a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 114, and An (isolated) bispecific antibody comprising a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:115.

본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 116의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 117의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 118의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 119의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.Certain embodiments of the present invention comprise a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a second antigen binding site that (specifically) binds to a second epitope on human CCL2, A (isolated) bispecific antibody, wherein the bispecific antibody comprises a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 116, amino acids that are at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 117 a polypeptide comprising the sequence, a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 118, and a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 119, It is an (isolated) bispecific antibody.

본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다. Certain embodiments of the present invention comprise a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a second antigen binding site that (specifically) binds to a second epitope on human CCL2, An (isolated) bispecific antibody, wherein the bispecific antibody comprises a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 116, a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117, a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 118, and An (isolated) bispecific antibody comprising a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:119.

본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 120의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 121의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 122의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 123의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.Certain embodiments of the present invention comprise a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a second antigen binding site that (specifically) binds to a second epitope on human CCL2, An (isolated) bispecific antibody, wherein the bispecific antibody comprises a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 120, amino acids that are at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 121 a polypeptide comprising the sequence, a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 122, and a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 123; It is an (isolated) bispecific antibody.

본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다. Certain embodiments of the present invention comprise a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a second antigen binding site that (specifically) binds to a second epitope on human CCL2, A (isolated) bispecific antibody, wherein the bispecific antibody comprises a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 120, a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 121, a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 122, and An (isolated) bispecific antibody comprising a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:123.

본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 155의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 156의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 157의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 158의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.Certain embodiments of the present invention comprise a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a second antigen binding site that (specifically) binds to a second epitope on human CCL2, A (isolated) bispecific antibody, wherein the bispecific antibody comprises a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 155, an amino acid that is at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 156 a polypeptide comprising the sequence, a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 157, and a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 158; It is an (isolated) bispecific antibody.

본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 155의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 156의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 157의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호 158의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다. Certain embodiments of the present invention comprise a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a second antigen binding site that (specifically) binds to a second epitope on human CCL2, A (isolated) bispecific antibody, wherein the bispecific antibody comprises a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 155, a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 156, a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 157, and An (isolated) bispecific antibody comprising a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:158.

본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 159의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 160의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 161의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 162의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.Certain embodiments of the present invention comprise a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a second antigen binding site that (specifically) binds to a second epitope on human CCL2, An (isolated) bispecific antibody, wherein the bispecific antibody comprises a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 159, an amino acid that is at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 160 a polypeptide comprising the sequence, a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 161, and a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 162, It is an (isolated) bispecific antibody.

본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 159의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 160의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 161의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호 162의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다. Certain embodiments of the present invention comprise a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a second antigen binding site that (specifically) binds to a second epitope on human CCL2, An (isolated) bispecific antibody, wherein the bispecific antibody comprises a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 159, a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 160, a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 161, and An (isolated) bispecific antibody comprising a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:162.

본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 163의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 164의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 165의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 166의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.Certain embodiments of the present invention comprise a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a second antigen binding site that (specifically) binds to a second epitope on human CCL2, An (isolated) bispecific antibody, wherein the bispecific antibody comprises a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 163, amino acids that are at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 164 a polypeptide comprising the sequence, a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 165, and a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 166, It is an (isolated) bispecific antibody.

본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 163의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 164의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 165의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호 166의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다. Certain embodiments of the present invention comprise a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a second antigen binding site that (specifically) binds to a second epitope on human CCL2, A (isolated) bispecific antibody, wherein the bispecific antibody comprises a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 163, a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 164, a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 165, and An (isolated) bispecific antibody comprising a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 166.

본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 167의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 168의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 169의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 170의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.Certain embodiments of the present invention comprise a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a second antigen binding site that (specifically) binds to a second epitope on human CCL2, An (isolated) bispecific antibody, wherein the bispecific antibody comprises a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 167, amino acids that are at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 168 a polypeptide comprising the sequence, a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 169, and a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 170; It is an (isolated) bispecific antibody.

본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 167의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 168의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 169의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호 170의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다. Certain embodiments of the present invention comprise a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a second antigen binding site that (specifically) binds to a second epitope on human CCL2, A (isolated) bispecific antibody, wherein the bispecific antibody comprises a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 167, a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 168, a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 169, and A (isolated) bispecific antibody comprising a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 170.

본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 171의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 172의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 173의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 174의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.Certain embodiments of the present invention comprise a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a second antigen binding site that (specifically) binds to a second epitope on human CCL2, An (isolated) bispecific antibody, wherein the bispecific antibody comprises a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 171, amino acids that are at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 172 a polypeptide comprising a sequence, a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 173, and a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 174; It is an (isolated) bispecific antibody.

본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 172의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 173의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호 174의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다. Certain embodiments of the present invention comprise a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a second antigen binding site that (specifically) binds to a second epitope on human CCL2, An (isolated) bispecific antibody, wherein the bispecific antibody comprises a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 171, a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 172, a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 173, and An (isolated) bispecific antibody comprising a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:174.

i) 상기 제1 항원 결합 부위는i) The first antigen binding site is

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

상기 이중특이적 항체는 인간 IgG1의 (전장)항체로서,The bispecific antibody is a (full-length) antibody of human IgG1,

본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 124의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 125의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 126의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 127의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.Certain embodiments of the present invention comprise a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a second antigen binding site that (specifically) binds to a second epitope on human CCL2, An (isolated) bispecific antibody, wherein the bispecific antibody comprises a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 124, an amino acid that is at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 125 a polypeptide comprising the sequence, a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 126, and a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 127, It is an (isolated) bispecific antibody.

본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 126의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호 127의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다. Certain embodiments of the present invention comprise a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a second antigen binding site that (specifically) binds to a second epitope on human CCL2, A (isolated) bispecific antibody, wherein the bispecific antibody comprises a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 124, a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 125, a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 126, and An (isolated) bispecific antibody comprising a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:127.

본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 128의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 129의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 130의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 131의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.Certain embodiments of the present invention comprise a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a second antigen binding site that (specifically) binds to a second epitope on human CCL2, A (isolated) bispecific antibody, wherein the bispecific antibody comprises a polypeptide comprising an amino acid sequence at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 128, amino acids at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 129 a polypeptide comprising the sequence, a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 130, and a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 131, It is an (isolated) bispecific antibody.

본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 128의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호 131의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다. Certain embodiments of the present invention comprise a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a second antigen binding site that (specifically) binds to a second epitope on human CCL2, A (isolated) bispecific antibody, wherein the bispecific antibody comprises a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 128, a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 129, a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 130, and It is an (isolated) bispecific antibody comprising a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:131.

본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 132의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 133의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 134의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 135의 서열과 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다.Certain embodiments of the present invention comprise a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a second antigen binding site that (specifically) binds to a second epitope on human CCL2, An (isolated) bispecific antibody, wherein the bispecific antibody comprises a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 132, amino acids that are at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 133 a polypeptide comprising the sequence, a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 134, and a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 98% or 99% identical to the sequence of SEQ ID NO: 135, It is an (isolated) bispecific antibody.

본 발명의 특정 구현예는 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 132의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 133의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 134의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호 135의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체이다. Certain embodiments of the present invention comprise a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a second antigen binding site that (specifically) binds to a second epitope on human CCL2, A (isolated) bispecific antibody, wherein the bispecific antibody comprises a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 132, a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 133, a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 134, and A (isolated) bispecific antibody comprising a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:135.

재조합 방법 및 조성물Recombinant Methods and Compositions

항체는, 예컨대 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 바와 같이 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생성될 수 있다. 일 구현예에서, 본원에서 기재된 항-CCL2 항체(이중특이적 또는 단일특이적)를 부호화하는 단리된 핵산이 제공된다. 상기 핵산은 단일특이적 또는 이중특이적 항체의 하나 또는 모든 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 하나 또는 모든 VH를 포함하는 아미노산 서열(예컨대, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)를 부호화할 수 있다. 추가의 구현예에서, 상기 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예컨대, 발현 벡터)가 제공된다. 추가의 구현예에서, 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 상기 일 구현예에서, 숙주 세포는: (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 부호화하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 부호화하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 부호화하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다(예컨대, 이로 변형된다). 일 구현예에서, 상기 숙주 세포는 진핵, 예컨대 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary: CHO) 세포, HEK293 세포 또는 림프구 세포(예컨대, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 일 구현예에서, 항-CCL2 항체를 제조하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 상기 제공된 바와 같은 항체의 발현에 적합한 조건하에, 상기 항체를 부호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 임의적으로, 상기 항체를 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 회수하는 단계를 포함한다.Antibodies can be generated using recombinant methods and compositions, eg, as described in US Pat. No. 4,816,567. In one embodiment, an isolated nucleic acid encoding an anti-CCL2 antibody (bispecific or monospecific) described herein is provided. The nucleic acid may encode an amino acid sequence comprising one or all VLs of a monospecific or bispecific antibody and/or an amino acid sequence comprising one or all VHs (eg, light and/or heavy chains of an antibody). In a further embodiment, one or more vectors (eg, expression vectors) comprising the nucleic acid are provided. In a further embodiment, a host cell comprising said nucleic acid is provided. In one such embodiment, the host cell comprises: (1) a vector comprising a nucleic acid encoding an amino acid sequence comprising the VL of the antibody and an amino acid sequence comprising the VH of the antibody, or (2) an amino acid comprising the VL of the antibody. a first vector comprising a nucleic acid encoding the sequence and a second vector comprising a nucleic acid encoding an amino acid sequence comprising the VH of an antibody. In one embodiment, the host cell is a eukaryotic, such as a Chinese Hamster Ovary (CHO) cell, a HEK293 cell or a lymphocyte cell (eg, Y0, NS0, Sp20 cell). In one embodiment, a method of making an anti-CCL2 antibody is provided, the method comprising culturing a host cell comprising a nucleic acid encoding the antibody under conditions suitable for expression of the antibody as provided above, optionally comprising: and recovering the antibody from the host cell (or host cell culture medium).

항-CCL2 세포의 재조합 생성을 위해, 상기 핵산은 통상적인 절차에 의해(예컨대, 항체의 중쇄 및 경쇄를 부호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리되고 서열분석된다. For recombinant production of anti-CCL2 cells, the nucleic acids are readily isolated and sequenced by conventional procedures (eg, by using oligonucleotide probes capable of binding specifically to genes encoding the heavy and light chains of the antibody). analyzed.

항체 부호화 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 항체는 특히 당화 및 Fc 작동체 기능이 요구되지 않는 경우 박테리아에서 생성될 수 있다. 박테리아에서 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현을 위해서, 예컨대 US 5,648,237, US 5,789,199, 및 US 5,840,523을 참조한다. (또한, 대장균에서 항체 단편의 발현을 설명하는 Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254를 참조한다). 발현 이후, 항체는 가용성 분획의 박테리아 세포 덩어리로부터 단리될 수 있고 추가로 정제될 수 있다. Suitable host cells for cloning or expression of antibody encoding vectors include prokaryotic or eukaryotic cells described herein. For example, antibodies may be produced in bacteria, particularly when glycosylation and Fc effector function are not required. For expression of antibody fragments and polypeptides in bacteria see, eg, US 5,648,237, US 5,789,199, and US 5,840,523. (See also Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), which describes the expression of antibody fragments in E. coli, Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254. see). After expression, the antibody can be isolated from the bacterial cell mass in a soluble fraction and can be further purified.

원핵생물에 더하여, 진핵 미생물, 예컨대 이의 글리코실화 경로가 “인간화”되어, 부분적 또는 완전한 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체의 생성을 유발하는 균류 및 효모 균주를 포함한 실모양 균류 또는 효모는 항체 부호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; and Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215를 참조한다.In addition to prokaryotes, eukaryotic microorganisms, such as filamentous fungi or yeast, including strains of fungi and yeast, in which their glycosylation pathways have been "humanized", resulting in the production of antibodies with partial or fully human glycosylation patterns, are expressed in antibody encoding vectors. suitable cloning or expression hosts. Gerngross, T. U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; and Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215.

글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 생물체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 특히, 스포도프테라 푸르기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포들의 형질감염을 위해 곤충 세포들과 병용될 수 있는 많은 베큘로바이러스 균주들이 확인되었다. Suitable host cells for expression of glycosylated antibodies are also derived from multicellular organisms (invertebrates and vertebrates). Examples of invertebrate cells include plant and insect cells. In particular, many baculovirus strains that can be combined with insect cells for transfection of Spodoptera frugiperda cells have been identified.

식물 세포 배양액 또한 숙주로서 활용될 수 있다. 예컨대, US 특허 제5,959,177호, 6,040,498호, 6,420,548호, 7,125,978호 및 6,417,429호(유전자도입 식물에서 항체를 생성하기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES)^TM 기술을 설명)를 참조한다.Plant cell cultures can also be utilized as hosts. See, e.g., US Pat. Nos. 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 and 6,417,429 (describing PLANTIBODIES ^™ technology for producing antibodies in transgenic plants).

척추동물 세포가 또한 숙주로서 이용될 수 있다. 예를 들어, 현탁 상태에서 성장하도록 적응된 포유류 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예에는 SV40(COS-7)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주; 인간 배아 신장 세포주(예컨대, Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74에 기재된 바와 같은 293 또는 293T 세포); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리 세포(예컨대, Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252에 기재된 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK; 버팔로 랫트 간 세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간 세포(Hep G2); 마우스 유방 종양(MMT 060562); TRI 세포(예컨대, Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포가 포함된다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주로는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 예컨대 DHFR- CHO세포(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0이 포함된다. 항체 생성에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 예컨대 Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268을 참조한다.Vertebrate cells can also be used as hosts. For example, mammalian cell lines adapted to grow in suspension may be useful. Other examples of useful mammalian host cell lines include monkey kidney CV1 strain transformed with SV40 (COS-7); human embryonic kidney cell lines (eg, 293 or 293T cells as described in Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74); baby hamster kidney cells (BHK); mouse Sertoli cells (eg, TM4 cells described in Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252); monkey kidney cells (CV1); African green monkey kidney cells (VERO-76); human cervical carcinoma cells (HELA); canine kidney cells (MDCK; buffalo rat liver cells (BRL 3A); human lung cells (W138); human liver cells (Hep G2); mouse mammary tumors (MMT 060562); TRI cells (e.g., Mather, J.P. et al., TRI cells as described in Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68; MRC 5 cells; and FS4 cells Other useful mammalian host cell lines include Chinese Hamster Ovary (CHO) cells, such as DHFR- CHO cells (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); and myeloma cell lines such as Y0, NS0 and Sp2/0. Certain mammalian hosts suitable for antibody production For a review of cell lines, see, e.g., Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268. do.

다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 변형된 단일특이적 항체가 개선된 pH 의존적 결합 특성을 나타내고, 따라서 본 발명의 이중특이적 항체의 생성에 특히 유용하다는 발견에 부분적으로 기초한다. In another aspect, the present invention is based in part on the discovery that the modified monospecific antibodies as described herein exhibit improved pH dependent binding properties and are therefore particularly useful for the production of bispecific antibodies of the present invention.

pH 의존적 결합 특성을 갖는 단일특이적 항-CCL2 항체Monospecific anti-CCL2 antibody with pH-dependent binding properties

상기 항체는,The antibody is

A) X는 I 또는 T인 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X¹은 V, I, 또는 H이고, X²는 P 또는 H이며, X³은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및A) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence SHYGXS of SEQ ID NO: 57, wherein X is I or T, (b) X ¹ is V, I, or H, X ² is P or H, and X ³ is H or G a VH domain comprising phosphorus, a CDR-H2 comprising the amino acid sequence GX ¹ IX ² IFX ³ TANYAQKFQG of SEQ ID NO: 58, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence YDAHYGELDF of SEQ ID NO: 59; and

(d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;(d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence RASQHVSDAYLA of SEQ ID NO:60; (e) a VL domain comprising a CDR-L2 comprising the amino acid sequence DASDRAE of SEQ ID NO: 61, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence HQYIHLHSFT of SEQ ID NO: 62;

또는or

B) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D 또는 E인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및B) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence HTYMH of SEQ ID NO: 76, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence RIDPXNHNTKFDPKFQG of SEQ ID NO: 77, wherein X is D or E, and (c) X is D or E , a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence GVFGFFXH of SEQ ID NO: 78; and

상기 항체는,The antibody is

또는or

진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물Methods and compositions for diagnosis and detection

특정 구현예들에서, 본원에서 제공된 임의의 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체는 생물학적 샘플에서 CCL2의 존재 검출에 유용하다. 본원에서 사용된 용어 “검출하는”은 정량적 또는 정성적 검출을 수반한다. 특정 구현예들에서, 생물학적 샘플은 면역 세포 또는 T 세포 침윤물 및/또는 종양 세포와 같은 세포 또는 조직을 포함한다. In certain embodiments, any monospecific or bispecific anti-CCL2 antibody provided herein is useful for detecting the presence of CCL2 in a biological sample. As used herein, the term “detecting” involves quantitative or qualitative detection. In certain embodiments, the biological sample comprises a cell or tissue, such as an immune cell or T cell infiltrate and/or a tumor cell.

일 구현예에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체가 제공된다. 추가의 양태에서, 생물학적 샘플 중의 CCL2의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 구현예들에서, 상기 방법은 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체가 CCL2에 결합하는 것을 허용하는 조건하에서 상기 생물학적 샘플을 본원에 기재된 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체와 접촉시키고 복합체가 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체 및 CCL2 간에 형성되는지 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 생체내 또는 시험관내 방법일 수 있다. 일 구현예에서, 예컨대 CCL2이 환자 선택용 바이오마커인 경우, 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체를 사용하여 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체를 이용한 요법에 적격인 대상체를 선택한다. In one embodiment, a monospecific or bispecific anti-CCL2 antibody for use in a method of diagnosis or detection is provided. In a further aspect, a method of detecting the presence of CCL2 in a biological sample is provided. In certain embodiments, the method comprises contacting the biological sample with a monospecific or bispecific anti-CCL2 antibody described herein under conditions that allow the monospecific or bispecific anti-CCL2 antibody to bind to CCL2. and detecting whether a complex is formed between the monospecific or bispecific anti-CCL2 antibody and CCL2. The method may be an in vivo or in vitro method. In one embodiment, such as when CCL2 is a biomarker for patient selection, monospecific or bispecific anti-CCL2 antibodies are used to select subjects eligible for therapy with monospecific or bispecific anti-CCL2 antibodies. do.

특정 구현예들에서, 표지된 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체가 제공된다. 표지는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티(예컨대, 형광, 발색, 전자 밀도, 화학발광 및 방사성 표지) 뿐만 아니라, 예컨대 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 모이어티, 예컨대 효소 또는 리간드를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 표지는 염료 전구체를 산화시키는 과산화수소를 이용하는 효소, 예컨대 HRP, 락토페록시다아제 또는 마이크로페록시다아제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지 및 안정된 유리 라디칼 등과 연계된 방사성 동위원소 ³²P, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H 및 ¹³¹I, 형광단, 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루시페라아제, 예컨대 개똥벌레 루시페라아제 및 세균 루시페라아제(미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디히드로프타라진디온, 양고추냉이 과산화효소(HRP), 알칼리 인산분해효소, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다아제, 예컨대 글루코오스 옥시다아제, 갈락토오스 옥시다아제 및 글루코오스-6-인산염 탈수소효소, 헤테로환상 옥시다아제, 예컨대 요산분해효소 및 크산틴 옥시다아제를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.In certain embodiments, labeled monospecific or bispecific anti-CCL2 antibodies are provided. Labels include labels or moieties that are detected directly (e.g., fluorescent, chromogenic, electron density, chemiluminescent and radioactive labels) as well as moieties that are detected indirectly, e.g., through enzymatic reactions or molecular interactions, such as enzymes or ligands. including but not limited to. Exemplary labels include enzymes using hydrogen peroxide to oxidize dye precursors, such as HRP, lactoperoxidase or microperoxidase, biotin/avidin, spin labels, bacteriophage labels and radioactive isotopes linked to stable free radicals, etc. ³² P , ¹⁴ C, ¹²⁵ I, ³ H and ¹³¹ I, fluorophores such as rare earth chelates or fluorescein and derivatives thereof, rhodamine and derivatives thereof, dancil, umbelliferone, luciferases such as firefly luciferase and bacterial luciferase (USA 4,737,456), luciferin, 2,3-dihydrophthalazinedione, horseradish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase, β-galactosidase, glucoamylase, lysozyme, saccharide oxidase such as glucose oxidases, galactose oxidase and glucose-6-phosphate dehydrogenase, heterocyclic oxidases such as uric acidase and xanthine oxidase.

E.약학적 제제E. Pharmaceutical preparations

본원에 기재된 바와 같은 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체의 약학적 제제는 동결 건조된 제제 또는 수용액의 형태에서 원하는 정도의 순도를 갖는 이런 항체를 하나 이상의 임의적인 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합함으로써 제조된다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)). 약학적으로 허용가능한 담체는 이용되는 투여량 및 농도에서 수용자에 비독성이며, 완충액, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토니움 클로라이드; 벤잘코니움 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 낮은 분자량의(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로블린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리(비닐피롤리돈); 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체(예컨대, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 예시적인 약학적으로 허용가능한 담체는 세포간(insterstitial) 약물 분산제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들어 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대 rhuPH20(하일레넥스(HYLENEX)^®, 박스터 인터내셔널(Baxter International, Inc.))을 포함한다. rhuPH20를 포함하는 특정 예시적인 sHASEGPs 및 이를 이용하는 방법은 미국 공개 특허 출원 제 2005/0260186 및 2006/0104968에 기재되어 있다. 일 구현예에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가적인 글리코사미노글리카나제, 예컨대 콘드로이티나제와 조합된다. Pharmaceutical formulations of monospecific or bispecific anti-CCL2 antibodies as described herein include, in the form of lyophilized formulations or aqueous solutions, such antibodies having the desired degree of purity in combination with one or more optional pharmaceutically acceptable carriers. prepared by mixing (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)). Pharmaceutically acceptable carriers are nontoxic to recipients at the dosages and concentrations employed and include buffers such as phosphate, citrate and other organic acids; antioxidants including ascorbic acid and methionine; preservatives (such as octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride; hexamethonium chloride; benzalkonium chloride; benzethonium chloride; phenol, butyl or benzyl alcohol; alkyl parabens such as methyl or propyl paraben; catechol; resorcinol; cyclo hexanol; 3-pentanol; and m-cresol); low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptides; proteins such as serum albumin, gelatin, or immunoglobulins; hydrophilic polymers such as poly(vinylpyrrolidone); amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine, or lysine; monosaccharides, disaccharides, and other carbohydrates including glucose, mannose, or dextrins; chelating agents such as EDTA; sugars such as sucrose, mannitol, trehalose or sorbitol; salt forming counterions such as sodium; metal complexes (eg, Zn-protein complexes); and/or nonionic surfactants such as polyethylene glycol (PEG). Exemplary pharmaceutically acceptable carriers herein are interstitial drug dispersants, such as soluble neutral-active hyaluronidase glycoprotein (sHASEGP), eg, human soluble PH-20 hyaluronidase glycoprotein, such as rhuPH20 (HYLENEX ^® , Baxter International, Inc.). Certain exemplary sHASEGPs comprising rhuPH20 and methods of using the same are described in US Published Patent Applications 2005/0260186 and 2006/0104968. In one embodiment, the sHASEGP is combined with one or more additional glycosaminoglycanases, such as chondroitinases.

예시적인 동결건조된 항체 제제는 미국 특허 제6,267,958호에서 기재된다. 수용액 항체 제제는 미국 특허 제6,171,586 및 WO 2006/044908에서 기재된 것들을 포함하며, 후자의 제제는 히스티딘-아세테이트 완충액을 포함한다.Exemplary lyophilized antibody formulations are described in US Pat. No. 6,267,958. Aqueous antibody formulations include those described in US Pat. No. 6,171,586 and WO 2006/044908, the latter formulations comprising a histidine-acetate buffer.

본원에서 제제는 또한 치료되는 특정 적응증에 대해 필요에 따라 한 가지 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에 부정적으로 영향을 주지 않는 상보성 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 예를 들어, 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 활성 성분들은 의도한 목적에 효과적인 양으로 복합물 내에 적합하게 존재한다.The formulations herein may also contain more than one active compound as required for the particular indication being treated, preferably those with complementary activities that do not adversely affect each other. For example, it may be desirable to further provide. The active ingredients are suitably present in the complex in amounts effective for their intended purpose.

활성 성분은 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에서 각각 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 의해 준비된 마이크로캡슐 또는 마크로에멀젼 (macroemulsions)안에 포집될 수 있다. 상기 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)에서 개시된다.The active ingredient can be administered in colloidal drug delivery systems (e.g., liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles and nanocapsules), respectively, by coacervation techniques or by interfacial polymerization, e.g. hydroxymethylcellulose or gelatin- Microcapsules and poly-(methylmethacrylate) microcapsules can be encapsulated in prepared microcapsules or macroemulsions. This technique is disclosed in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980).

서방형 제제가 제조될 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 상기 매트릭스는 성형 제품, 예컨대 필름 또는 미세캡슐 형태이다. Sustained release formulations may be prepared. Suitable examples of sustained release formulations include semipermeable matrices of solid hydrophobic polymers containing the antibody, which matrices are in the form of shaped articles, such as films or microcapsules.

생체내 투여에 사용되는 제제는 일반적으로 무균이다. 무균은, 예컨대 무균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 구현될 수 있다.Formulations used for in vivo administration are generally sterile. Sterility can be readily achieved, for example, by filtration through a sterile filtration membrane.

F. 치료 방법 및 조성물F. Treatment Methods and Compositions

본원에서 제공된 임의의 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체는 치료 방법에서 사용할 수 있다. Any monospecific or bispecific anti-CCL2 antibody provided herein can be used in a method of treatment.

일 양태에서, 약제로서 사용하기 위한 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체가 제공된다. 추가의 양태에서, 암 치료에 사용하기 위한 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체가 제공된다. 특정 구현예들에서, 치료 방법에서 사용하기 위한 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체가 제공된다. 특정 구현예들에서, 본 발명은 유효량의 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 가진 개체의 치료 방법에 사용하기 위한 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체를 제공한다. In one aspect, a monospecific or bispecific anti-CCL2 antibody for use as a medicament is provided. In a further aspect, a monospecific or bispecific anti-CCL2 antibody for use in the treatment of cancer is provided. In certain embodiments, a monospecific or bispecific anti-CCL2 antibody for use in a method of treatment is provided. In certain embodiments, the present invention provides a monospecific or bispecific for use in a method of treating a subject having cancer comprising administering to the subject an effective amount of a monospecific or bispecific anti-CCL2 antibody. Anti-CCL2 antibodies are provided.

추가의 구현예들에서, 본 발명은 종양에서 면역억제를 억제하여 항 PD1 및 항 PDL-1 길항제 등과 같은 면역 자극제에 대해 종양 감수성을 만드는 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체를 제공한다.In further embodiments, the present invention provides a monospecific or bispecific anti-CCL2 antibody that inhibits immunosuppression in a tumor, making it tumor sensitive to immune stimulating agents such as anti-PD1 and anti-PDL-1 antagonists.

따라서, 본 발명의 일 양태는 본원에 기재된 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체와 항 PD1 및 항 PDL-1 길항제 등과 같은 암 면역요법의 조합이다. Accordingly, one aspect of the present invention is a combination of a monospecific or bispecific anti-CCL2 antibody described herein with cancer immunotherapy, such as anti-PD1 and anti-PDL-1 antagonists.

본원에서 사용된 용어 "암"은, 예를 들어 폐암, 비소세포 폐암(NSCL), 세기관지 세포 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 머리 또는 목의 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 부위의 암, 위암, 위암, 결장암, 유방암, 자궁암, 난관의 암종, 자궁내막의 암종, 자궁경부의 암종, 질의 암종, 외음부의 암종, 호지킨병, 식도의 암, 소장의 암, 내분비계의 암, 갑상선의 암, 부갑상선의 암, 부신의 암, 연조직의 육종, 요도의 암, 음경의 암, 전립선암, 방광의 암, 신장 또는 요관의 암, 신장 세포 암종, 신우의 암종, 중피종, 간세포암, 담즙 암, 중추신경계(CNS)의 신생물, 척추 축 종양, 뇌간 신경교종, 다형성 아교모세포종, 성상세포종, 슈반세포종, 상의세포종, 수모세포종, 수막종, 편평상피 세포 암종, 뇌하수체 선종, 림프종, 림프성 백혈병, 예컨대 상기 암 중 임의의 것의 불응성 버전, 또는 상기 암 중 하나 이상의 조합일 수 있다. The term "cancer" as used herein includes, for example, lung cancer, non-small cell lung cancer (NSCL), bronchial cell lung cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, cancer of the head or neck, skin or intraocular melanoma, uterine cancer, ovarian cancer, Rectal cancer, anal area cancer, stomach cancer, stomach cancer, colon cancer, breast cancer, uterine cancer, fallopian tube carcinoma, endometrium carcinoma, cervix carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, cancer of the esophagus, cancer of the small intestine, Cancer of the endocrine system, cancer of the thyroid gland, cancer of the parathyroid gland, cancer of the adrenal gland, sarcoma of the soft tissue, cancer of the urethra, cancer of the penis, prostate cancer, cancer of the bladder, cancer of the kidney or ureter, renal cell carcinoma, carcinoma of the renal pelvis, Mesothelioma, hepatocellular carcinoma, biliary cancer, neoplasm of central nervous system (CNS), spinal axis tumor, brainstem glioma, glioblastoma multiforme, astrocytoma, schwanncytoma, ependymoma, medulloblastoma, meningioma, squamous cell carcinoma, pituitary adenoma , lymphoma, lymphocytic leukemia, such as a refractory version of any of the above cancers, or a combination of one or more of the above cancers.

상기 구현예들 중 임의의 것에 따른 “개체”는 바람직하게는 인간이다. 추가의 양태에서, 본 발명은 약제의 제조 또는 준비에서 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체의 사용을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 약제는 암의 치료를 위한 것이다. 추가의 구현예에서, 상기 약제는 암을 갖는 개체에게 유효량의 약제를 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 것이다. 추가의 구현예에서, 약제는 암 세포의 세포 매개 용해를 유도하기 위한 것이다. 추가의 구현예에서, 약제는 암 세포에서 세포자멸사를 유도하거나 암 세포 증식을 억제하기 위해 유효량의 약제를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 암을 앓고 있는 개체에게서 암세포의 세포 매개 용해를 유도하는 방법을 사용하기 위한 것이다. 상기 구현예들 중 임의의 것에 따른 “개체”는 인간일 수 있다. An “individual” according to any of the above embodiments is preferably a human. In a further aspect, the invention provides for the use of a monospecific or bispecific anti-CCL2 antibody in the manufacture or preparation of a medicament. In one embodiment, the medicament is for the treatment of cancer. In a further embodiment, the medicament is for use in a method of treating cancer comprising administering to an individual having cancer an effective amount of the medicament. In a further embodiment, the medicament is for inducing cell mediated lysis of cancer cells. In a further embodiment, the medicament is a method of inducing cell-mediated lysis of cancer cells in a subject suffering from cancer comprising administering to the subject an effective amount of the medicament to induce apoptosis in the cancer cells or inhibit cancer cell proliferation. is for using An “individual” according to any of the above embodiments may be a human.

추가의 양태에서, 본 발명은 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 암을 가진 개체에게 유효량의 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 상기 구현예들 중 임의의 것에 따른 “개체”는 인간일 수 있다. In a further aspect, the present invention provides a method of treating cancer. In one embodiment, the method comprises administering to an individual having cancer an effective amount of a monospecific or bispecific anti-CCL2 antibody. An “individual” according to any of the above embodiments may be a human.

추가 양태에서, 본 발명은 암을 앓고 있는 개체에게서 암세포의 세포 매개 용해를 유도하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 방법은 개체에게 유효량의 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체를 투여하여 암을 앓고 있는 개체에게서 암세포의 세포 매개 용해를 유도하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, “개체”는 인간이다. In a further aspect, the invention provides a method of inducing cell mediated lysis of cancer cells in a subject suffering from cancer. In one embodiment, the method comprises administering to the individual an effective amount of a monospecific or bispecific anti-CCL2 antibody to induce cell mediated lysis of cancer cells in the individual suffering from cancer. In one embodiment, an “individual” is a human.

본 발명의 다른 양태에서, 염증성 질환 또는 자가면역 질환을 치료하는데 사용하기 위한 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체가 제공된다. 특정 구현예들에서, 본 발명은 유효량의 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 질환 또는 자가면역 질환을 가진 개체의 치료 방법에 사용하기 위한 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체를 제공한다.In another aspect of the invention there is provided a monospecific or bispecific anti-CCL2 antibody for use in treating an inflammatory disease or an autoimmune disease. In certain embodiments, the invention provides a monospecific or bispecific anti-CCL2 antibody for use in a method of treating an individual having an inflammatory or autoimmune disease comprising administering to the individual an effective amount of a monospecific or bispecific anti-CCL2 antibody. Anti- or bispecific anti-CCL2 antibodies are provided.

추가의 양태에서, 본 발명은, 예컨대 임의의 상기 치료 방법에서 사용하기 위해, 본원에서 제공된 임의의 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체를 포함하는 약학적 제제를 제공한다. 일 구현예에서, 약학적 제제는 본원에서 제공된 임의의 단일특이적 또는 이중특이적 항-CCL2 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.In a further aspect, the present invention provides a pharmaceutical formulation comprising any monospecific or bispecific anti-CCL2 antibody provided herein, such as for use in any of the above methods of treatment. In one embodiment, the pharmaceutical formulation comprises any monospecific or bispecific anti-CCL2 antibody provided herein and a pharmaceutically acceptable carrier.

일부 구현예들에서, 염증성 질환 또는 자가면역 질환은 자가면역 장애, 염증성 장애, 섬유성 장애, 과립구(호중구 또는 호산구성) 장애, 단핵구 장애 또는 림프구 장애, 또는 정상 또는 비정상 조직의 상주 세포(예컨대, 비만 세포, 대식세포 또는 림프구) 또는 기질 세포(예컨대, 섬유아세포, 근섬유아세포, 평활근 세포, 상피 또는 내피)의 증가된 수 또는 분포와 관련된 장애이다. 일부 구현예들에서, 상기 장애는 폐질환이다. 일부 구현예들에서, 폐질환은 과립구(호산구성 및/또는 호중구) 폐 염증, 감염 유도된 폐 질환(바이러스(예컨대, 인플루엔자, 파라인플루엔자, 리노바이러스, 인간 메타뉴모바이러스 및 호흡기 세포융합 바이러스)와 관련된 질환을 포함), 세균성 또는 곰팡이(예컨대, 아스페르길루스) 유발 요인과 관련이 있다. 일부 구현예들에서, 장애는 알레르겐 유발성 폐 질환, 독성 환경 오염물질 유발성 폐 상태(예컨대, 석면폐증, 규폐증, 또는 베릴륨증), 위 흡인 유발성 폐 질환이거나, 면역 조절장애 또는 낭포성 섬유증과 같은 유전적 소인으로 인한 염증성 질환과 관련이 있다. 일부 구현예들에서, 장애는 물리적 외상 유발성 폐 질환(예컨대, 인공호흡기 손상), 폐기종, 담배 유발성 폐기종, 기관지염, 유육종증, 조직구증, 림프관근육종증, 급성 폐 손상, 급성 호흡 곤란 증후군, 만성 폐 질환, 기관지폐 이형성증, 폐렴(예컨대, 지역사회 획득 폐렴, 병원 폐렴, 인공호흡기 관련 폐렴, 바이러스성 폐렴, 세균성 폐렴 및 중증 폐렴), 기도 악화 및 급성 호흡곤란 증후군(ARDS))이다. 일부 구현예들에서, 염증성 폐질환은 COPD이다. In some embodiments, the inflammatory disease or autoimmune disease is an autoimmune disorder, an inflammatory disorder, a fibrotic disorder, a granulocyte (neutrophil or eosinophilic) disorder, a monocyte disorder or a lymphocyte disorder, or a resident cell of normal or abnormal tissue (e.g., a disorder associated with an increased number or distribution of mast cells, macrophages or lymphocytes) or stromal cells (eg, fibroblasts, myofibroblasts, smooth muscle cells, epithelial or endothelial cells). In some embodiments, the disorder is a lung disease. In some embodiments, the lung disease is associated with granulocyte (eosinophilic and/or neutrophil) lung inflammation, infection-induced lung disease (viruses (eg, influenza, parainfluenza, rhinovirus, human metapneumovirus, and respiratory syncytial virus) and related diseases), bacterial or fungal (eg, Aspergillus) triggers. In some embodiments, the disorder is an allergen-induced lung disease, a toxic environmental pollutant-induced lung condition (eg, asbestosis, silicosis, or beryllium), gastric aspiration-induced lung disease, immune dysregulation, or cystic fibrosis. It is associated with inflammatory diseases due to the same genetic predisposition. In some embodiments, the disorder is physical trauma induced lung disease (eg, ventilator injury), emphysema, tobacco induced emphysema, bronchitis, sarcoidosis, histiocytosis, lymphangiosarcoma, acute lung injury, acute respiratory distress syndrome, chronic lung disease, bronchopulmonary dysplasia, pneumonia (eg, community acquired pneumonia, hospital pneumonia, ventilator-associated pneumonia, viral pneumonia, bacterial pneumonia and severe pneumonia), airway deterioration and acute respiratory distress syndrome (ARDS). In some embodiments, the inflammatory lung disease is COPD.

일부 구현예들에서, 염증성 폐질환은 천식이다. 일부 구현예들에서, 천식은 치명적일 수 있는 악화되는 증상(악화 또는 발적)의 급성 사건을 동반하는 지속적인 만성 중증 천식이다. 일부 구현예들에서, 천식은 아토피(알레르기로도 공지됨) 천식, 비알레르기성 천식(예컨대, 종종 호흡기 바이러스(예컨대, 인플루엔자, 파라인플루엔자, 리노바이러스, 인간 메타뉴모바이러스 및 호흡기 세포융합 바이러스)로 인한 감염 또는 흡입된 자극제(대기 오염 물질, 스모그, 디젤 입자, 실내 또는 실외의 휘발성 화학물질 및 가스 또는 심지어 차가운 건조 공기)에 의해 촉발됨)이다. In some embodiments, the inflammatory lung disease is asthma. In some embodiments, asthma is persistent chronic severe asthma with acute events of worsening symptoms (exacerbations or flares) that can be fatal. In some embodiments, the asthma is caused by atopic (also known as allergic) asthma, non-allergic asthma (eg, often respiratory viruses (eg, influenza, parainfluenza, rhinovirus, human metapneumovirus, and respiratory syncytial virus). infection caused by or inhaled irritants (triggered by air pollutants, smog, diesel particles, volatile chemicals and gases indoors or outdoors, or even cold dry air).

일부 구현예들에서, 천식은 간헐적 또는 운동 유발 천식, “연기”(전형적으로 담배, 권련, 파이프 담배), 흡입 또는 “베이핑(vaping)”(담배, 마리화나 또는 이러한 다른 물질)에 급성 또는 만성의 일차적인 또는 간접적인 노출에 기인한 천식, 또는 아스피린 또는 관련된 NSAIDS의 최근 섭취에 의해 촉발된 천식이다. 일부 구체예에서, 천식은 경등도 천식, 또는 코르티코스테로이드 미경험 천식, 새로이 진단되고 치료되지 않은 천식, 또는 증상 (기침, 천명, 숨가쁨/헐떡임, 또는 흉통)을 제어하기 위해 흡입된 국소 또는 전신 스테로이드의 장기적인 이용을 이전에 필요로 하지 않은 천식이다. 일부 구현예들에서, 천식은 만성 천식, 코르티코스테로이드 저항성 천식, 코르티코스테로이드 난치성 천식, 코르티코스테로이드 또는 다른 만성 천식 조절제 복용 중 통제되지 않는 천식이다. 일부 구현예들에서, 자가면역 질환, 염증성 질환, 섬유성 질환, 호중구 질환, 또는 호산구성 질환은 폐 섬유증이다. 일부 구현예들에서, 폐 섬유증은 특발성 폐 섬유증(IPF)이다. 일부 구현예들에서, 자가면역 질환, 염증성 질환, 섬유성 질환, 과립구(호중구 또는 호산구성) 질환, 단핵구 질환, 또는 림프구 질환은 식도염, 알레르기성 비염, 비알레르기성 비염, 폴립을 동반한 비부비동염, 비용종증, 기관지염, 만성 폐렴, 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증, 기도 염증, 알레르기성 비염, 기관지 확장증 및/또는 만성 기관지염이다. In some embodiments, asthma is intermittent or exercise-induced asthma, acute or chronic by “smoke” (typically tobacco, tobacco, pipe tobacco), inhalation, or “vaping” (tobacco, marijuana or other such substances). asthma due to primary or indirect exposure to or asthma triggered by recent intake of aspirin or related NSAIDS. In some embodiments, the asthma is mild asthma, or corticosteroid naive asthma, newly diagnosed and untreated asthma, or the use of inhaled topical or systemic steroids to control symptoms (cough, wheezing, shortness of breath/panting, or chest pain). Asthma that has not previously required long-term use. In some embodiments, the asthma is chronic asthma, corticosteroid resistant asthma, corticosteroid refractory asthma, uncontrolled asthma while taking corticosteroids or other chronic asthma modulators. In some embodiments, the autoimmune disease, inflammatory disease, fibrotic disease, neutrophil disease, or eosinophilic disease is pulmonary fibrosis. In some embodiments, the pulmonary fibrosis is idiopathic pulmonary fibrosis (IPF). In some embodiments, the autoimmune disease, inflammatory disease, fibrotic disease, granulocyte (neutrophil or eosinophil) disease, monocyte disease, or lymphocyte disease is esophagitis, allergic rhinitis, nonallergic rhinitis, rhinosinusitis with polyps , nasal polyposis, bronchitis, chronic pneumonia, allergic bronchopulmonary aspergillosis, airway inflammation, allergic rhinitis, bronchiectasis and/or chronic bronchitis.

일부 구현예들에서, 자가면역 질환, 염증성 질환, 섬유성 질환, 과립구(호중구 또는 호산구성) 질환, 단핵구 질환, 또는 림프구 질환은 관절염이다. 일부 구현예들에서, 관절염은 류마티스 관절염이다. 일부 구현예들에서, 관절염은 골관절염, 류마티스 관절염, 소아 관절염, 소아 류마티스 관절염, 초기 관절염, 다관절 류마티스 관절염, 전신 발병 류마티스 관절염, 장병증 관절염, 반응성 관절염, 건선 관절염, 및/또는 손상의 결과로서의 관절염이다. In some embodiments, the autoimmune disease, inflammatory disease, fibrotic disease, granulocyte (neutrophil or eosinophil) disease, monocyte disease, or lymphocyte disease is arthritis. In some embodiments, the arthritis is rheumatoid arthritis. In some embodiments, the arthritis is osteoarthritis, rheumatoid arthritis, juvenile arthritis, juvenile rheumatoid arthritis, early arthritis, polyarticular rheumatoid arthritis, systemic onset rheumatoid arthritis, enteropathic arthritis, reactive arthritis, psoriatic arthritis, and/or as a result of injury It is arthritis.

일부 구현예들에서, 자가면역 질환, 염증성 질환, 섬유성 질환, 과립구(호중구 또는 호산구성) 질환, 단핵구 질환, 또는 림프구 질환은 위장 염증 질환이다. 일부 구현예들에서, 위장 염증 질환은 IBD(염증성 장 질환), 궤양성 대장염(UC), 크론병(CD), 대장염(예컨대, 환경적 손상에 의해 유발된 대장염(예컨대, 치료 요법, 예컨대 화학 요법, 방사선 요법 등에 의해 유발되거나 관련됨), 감염성 대장염, 허혈성 대장염, 교원성 또는 림프구성 대장염, 괴사성 장염, 만성 육아종 질환 또는 복강 질환과 같은 병태의 대장염, 음식 알레르기, 위염, 위장염, 감염성 위염 또는 장염(예컨대, 헬리코박터 파일로리 감염 만성 활동성 위염), 감염원으로 인한 기타 형태의 위장관 염증 또는 불확실한 대장염이다. In some embodiments, the autoimmune disease, inflammatory disease, fibrotic disease, granulocyte (neutrophil or eosinophil) disease, monocyte disease, or lymphocyte disease is a gastrointestinal inflammatory disease. In some embodiments, the gastrointestinal inflammatory disease is IBD (inflammatory bowel disease), ulcerative colitis (UC), Crohn's disease (CD), colitis (eg, colitis caused by environmental damage (eg, treatment regimens such as chemo caused by or related to therapy, radiation therapy, etc.), colitis, food allergy, gastritis, gastroenteritis, infectious gastritis, or enteritis (eg chronic active gastritis infected with Helicobacter pylori), other forms of inflammation of the gastrointestinal tract due to an infectious agent or colitis of uncertain colitis.

일부 구현예들에서, 자가면역 질환, 염증성 질환, 섬유성 질환, 과립구(호중구 또는 호산구성) 질환, 단핵구 질환, 또는 림프구 질환, 또는 정상 또는 비정상 조직 상주 세포(예컨대, 비만 세포, 대식세포 또는 림프구) 또는 기질 세포(예컨대, 섬유아세포, 근섬유아세포, 평활근 세포, 상피 또는 내피)의 증가된 수 또는 분포와 관련된 질환은 루푸스 또는 전신 홍반성 루푸스(SLE), 또는 루푸스의 하나 이상의 기관 특이적 징후(예컨대, 신장에 영향을 미치는 루푸스 신염(LN) 또는 혈액 및/또는 림프 기관(림프절, 비장, 흉선 및 관련 림프관) 및/또는 관절 및/또는 기타 기관에 영향을 미치지만 반드시 그렇지는 않은 신외 루푸스(ERL)이다. 일부 구현예들에서, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 섬유성 질환은 패혈증 및/또는 외상, HIV 감염, 또는 특발성 질환(병인이 공지되지 않음), 예컨대 ANCA 관련 혈관염(AAV), 다발혈관염을 동반한 육아종증(이전에는 베게너 육아종증으로 공지됨), 베체트병, 심혈관 질환, 호산구성 기관지염, 라이터 증후군, SEA 증후군(혈청음성, 골근부착부질병, 관절병증 증후군), 강직성 척추염, 피부근염, 경피증, 예컨대 전신 경화증이라고도 하는 전신 경피증, 혈관염(예컨대, 거대 세포 동맥염(GCA), 측두 동맥염, 두개동맥염 또는 호튼병이라고도 함), 근염, 다발성근염, 피부근염, 결절성 다발동맥염, 동맥염, 류마티스성 다발성 근육통, 유육종증, 원발성 담즙 경화증, 경화성 담관염, 쇼그렌 증후군, 건선, 물방울 건선, 부위바뀜건선, 고름물집건선, 홍색피부건선, 피부염, 아토피 피부염, 천포창, 예컨대 심상성 천포창, 죽상경화증, 루푸스, 스틸병, 중증 근무력증, 복강 질병, 재발 경감(RRMS) 또는 원발성 진행성(PPMS) 또는 이차 진행성(SPMS) 하위유형의 다발성 경화증(MS), 길랭-바레병, 제1형 진성 당뇨병(T1DM) 또는 인슐린 의존성(IDDM) 또는 소아 발병 DM 유형, 갑상선염(예컨대, 그레이브스병), 만성 소화 장애증, 처그-스트라우스 증후군, 근육통 증후군, 호산구과다 증후군, 일시적인 혈관 부종을 포함한 부종 반응, 기생충 감염, 사상충성 피부염, 호산구성 식도염, 호산구성 장염, 호산구성 대장염, 폐쇄성 수면 무호흡증, 심근내막 섬유증, 애디슨병, 레이노병 또는 현상, 자가면역 간염, 이식편대숙주질환(GVHD) 또는 장기 이식 거부반응과 관련이 있다. In some embodiments, autoimmune disease, inflammatory disease, fibrotic disease, granulocyte (neutrophil or eosinophil) disease, monocyte disease, or lymphocyte disease, or normal or abnormal tissue resident cells (eg, mast cells, macrophages or lymphocytes) ) or an increased number or distribution of stromal cells (e.g., fibroblasts, myofibroblasts, smooth muscle cells, epithelial or endothelium) are lupus or systemic lupus erythematosus (SLE), or one or more organ-specific signs of lupus ( For example, lupus nephritis (LN) that affects the kidneys or extrarenal lupus that affects but not necessarily the blood and/or lymphatic organs (lymph nodes, spleen, thymus and related lymphatic vessels) and/or joints and/or other organs ( ERL) In some embodiments, the autoimmune disease, inflammatory disease, or fibrotic disease is sepsis and/or trauma, HIV infection, or an idiopathic disease (of unknown etiology), such as ANCA-associated vasculitis (AAV), multiple Granulomatosis with vasculitis (previously known as Wegener's granulomatosis), Behcet's disease, cardiovascular disease, eosinophilic bronchitis, Reiter's syndrome, SEA syndrome (seronegative, osteomyelitis, arthropathy syndrome), ankylosing spondylitis, skin Myositis, scleroderma, such as systemic scleroderma, also called systemic sclerosis, vasculitis (also called giant cell arteritis (GCA), temporal arteritis, cranial arteritis or Horton's disease), myositis, polymyositis, dermatomyositis, polyarteritis nodosa, arteritis, rheumatism polymyalgia polymyalgia, sarcoidosis, primary cholangiosclerosis, sclerosing cholangitis, Sjogren's syndrome, psoriasis, waterdrop psoriasis, site-shifted psoriasis, pustular psoriasis, erythematosus psoriasis, dermatitis, atopic dermatitis, pemphigus such as pemphigus vulgaris, atherosclerosis, lupus, Still's disease, myasthenia gravis, celiac disease, relapse remission (RRMS) or primary progressive (PPMS) or secondary progressive (SPMS) subtypes multiple sclerosis (MS), Guillain-Barré disease, type 1 diabetes mellitus (T1DM) or insulin Dependent (IDDM) or childhood-onset DM type, thyroiditis (eg, Graves' disease); Chronic digestive disorders, Chug-Strauss syndrome, myalgia syndrome, eosinophilia syndrome, edema reactions including transient angioedema, parasitic infections, filamentous dermatitis, eosinophilic esophagitis, eosinophilic enteritis, eosinophilic colitis, obstructive sleep apnea, endocardial lining It is associated with fibrosis, Addison's disease, Raynaud's disease or symptoms, autoimmune hepatitis, graft-versus-host disease (GVHD), or organ transplant rejection.

본 발명의 항체(및 임의의 추가 치료제)는 비경구, 폐내 및 비내를 포함한 임의의 적절한 수단에 의해, 그리고 국소 치료를 위해 원하는 경우에, 병소내 투여에 의해 투여할 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복막내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투약은 임의의 적합한 경로에 의할 수 있다. 예를 들어, 부분적으로 투여가 단기 또는 장기인지에 따라서, 주사, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의할 수 있다. 다양한 시점에 걸쳐 단일 또는 다중 투여, 볼루스(bolus) 투여, 및 펄스 주입을 포함하는 다양한 투여 일정이 고려된다.Antibodies of the invention (and any additional therapeutic agents) may be administered by any suitable means, including parenteral, intrapulmonary and intranasal, and, if desired for topical treatment, by intralesional administration. Parenteral infusions include intramuscular, intravenous, intraarterial, intraperitoneal, or subcutaneous administration. Dosing may be by any suitable route. For example, it may be by injection, such as intravenous or subcutaneous injection, depending in part on whether the administration is short-term or long-term. Various dosing schedules are contemplated, including single or multiple administrations, bolus administrations, and pulse infusions over various time points.

본 발명의 항체는 모범 의료행위 지침과 일치하는 방식으로 조제되고, 투약되고, 투여될 것이다. 상기 문맥에서 고려되는 인자들은 치료되는 특정 질병, 치료되는 특정 포유류, 개별 환자의 임상적 상태, 질병의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의료 전문인에게 공지된 다른 인자들을 포함한다. 항체는 반드시 그러할 필요는 없지만, 문제되는 장애를 예방하거나 치료하는 데 현재 이용되는 한 가지 또는 그 이상의 작용제와 함께 임의적으로 조제된다. 이런 다른 작용제의 유효량은 제제 내에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 인자에 의존한다. 이들은 일반적으로 본원에 기재된 바와 같은 투여 경로로 동일한 투여량으로 사용되거나, 또는 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99%, 또는 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 판단된 임의의 투여량 및 임의의 경로로 사용된다. Antibodies of the invention will be formulated, dosed, and administered in a manner consistent with best practice guidelines. Factors contemplated in this context include the particular disease being treated, the particular mammal being treated, the clinical condition of the individual patient, the cause of the disease, the site of delivery of the agent, the method of administration, the schedule of administration, and other factors known to the healthcare professional. . The antibody need not be, but is optionally formulated with one or more agents currently used to prevent or treat the disorder in question. The effective amount of such other agents depends on the amount of antibody present in the formulation, the type of disorder or treatment, and other factors discussed above. They are generally used in the same dosages by the route of administration as described herein, or from about 1-99% of the dosages described herein, or any dosage and any route determined experimentally/clinically appropriate. is used as

질환의 예방 또는 치료를 위한, 본 발명의 항체의 적절한 용량(단독으로 또는 한 가지 이상의 다른 추가 치료제와 조합으로 이용될 때)은 치료되는 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 심각도 및 과정, 항체가 예방적 또는 치료적 목적으로 투여되는지 여부, 이전 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 그리고 주치의의 재량에 의존할 것이다. 상기 항체는 적합하게는, 한꺼번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 투여된다. 질환의 유형과 중증도에 따라서, 약 1 μg/kg 내지 15　mg/kg(예컨대, 0.5 mg/kg 내지 10　mg/kg)의 항체가, 예를 들어 1회 이상의 별개 투여에 의한, 또는 연속 주입에 의한 것인지에 상관없이, 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 용량일 수 있다. 한 가지 전형적인 일일 투여량은 상술한 인자에 따라서, 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 수일 또는 그 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 병태에 따라서, 치료는 일반적으로 질환 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 지속된다. 항체의 한 가지 예시적인 용량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위 내에 있을 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg(또는 이들의 임의의 조합) 중에서 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 상기 용량은 간헐적으로, 예컨대 1주 1회 또는 3주 1회(예컨대, 상기 환자가 약 2 내지 약 20, 또는 예컨대 약 6 용량의 항체를 투여받도록 하는) 투여할 수 있다. 초기의 더 높은 부하 용량, 그 이후에 1회 또는 그 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 예시적인 투여 요법은 약 4 mg/kg의 초기 부하 용량에 이어서 항체의 약 2 mg/kg의 매주 유지 용량을 투여하는 것을 포함한다. 하지만, 다른 투여량 요법이 유용할 수 있다. 상기 치료의 진행은 통상적인 기술 및 분석법에 의해 용이하게 모니터링된다.For the prevention or treatment of a disease, an appropriate dose of the antibody of the invention (when used alone or in combination with one or more other additional therapeutic agents) will depend on the type of disease being treated, the type of antibody, the severity and course of the disease, the antibody Whether the drug is administered for prophylactic or therapeutic purposes will depend on the previous therapy, the patient's clinical history and response to the antibody, and the discretion of the attending physician. The antibody is suitably administered to the patient at one time or over a series of treatments. Depending on the type and severity of the disease, about 1 μg/kg to 15 mg/kg (eg, 0.5 mg/kg to 10 mg/kg) of antibody is administered, for example, by one or more separate administrations, or in continuous infusion. It may be an initial candidate dose for administration to a patient, whether or not by One typical daily dosage may range from about 1 μg/kg to 100 mg/kg or more, depending on the factors described above. For repeated administrations over several days or longer, depending on the condition, treatment is generally continued until a desired suppression of disease symptoms occurs. One exemplary dose of the antibody would be in the range of about 0.05 mg/kg to about 10 mg/kg. Accordingly, one or more doses of about 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg, or 10 mg/kg (or any combination thereof) may be administered to the patient. The dose may be administered intermittently, such as once a week or once every three weeks (eg, such that the patient receives from about 2 to about 20, or such as about 6 doses of the antibody). An initial higher loading dose followed by one or more lower doses may be administered. An exemplary dosing regimen comprises administering an initial loading dose of about 4 mg/kg followed by a weekly maintenance dose of about 2 mg/kg of antibody. However, other dosage regimens may be useful. The progress of the treatment is readily monitored by conventional techniques and assays.

II. 제조 물품II. manufactured goods

본 발명의 다른 양태에서, 상술한 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기 및 상기 용기 위의 또는 상기 용기와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기로는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기, IV 용액 주머니 등이 포함된다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 상기 용기는 단독으로, 또는 병태를 치료하고, 예방하고 및/또는 진단하는 데 효과적인 다른 조성물과 병용되는 조성물을 보유하고, 무균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 상기 용기는 정맥내 용액 백, 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통가능한 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 적어도 한 가지 활성 제제는 본 발명의 항체이다. 표지 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택된 병태를 치료하는 데 이용된다는 것을 지시한다. 또한, 제조 물품은 (a) 본 발명의 항체를 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제1 용기; 및 (b) 추가의 세포독성제 또는 그렇지 않으면 치료제를 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 구현예에서 제조 물품은 조성물이 특정 병태를 치료하는 데 이용될 수 있다는 것을 지시하는 포장 삽입물을 더 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 제조 물품은 약학적으로 허용가능한 완충액, 예컨대 정균성 주사용수(BWFI), 인산염 완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2(또는 제3) 용기를 더 포함할 수 있다. 이는 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하여 상업적 관점 및 이용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 더 포함할 수 있다.In another aspect of the present invention, an article of manufacture containing substances useful for the treatment, prevention and/or diagnosis of the disorders described above is provided. An article of manufacture includes a container and a label or package insert on or associated with the container. Suitable containers include, for example, bottles, vials, syringes, IV solution bags, and the like. The container may be formed from a variety of materials such as glass or plastic. The container holds a composition alone or in combination with another composition effective to treat, prevent, and/or diagnose a condition, and may have a sterile access port (eg, the container may have an intravenous solution bag , or a vial having a stopper pierceable by a hypodermic injection needle). At least one active agent in the composition is an antibody of the invention. The label or package insert indicates that the composition is used to treat the selected condition. The article of manufacture may also comprise (a) a first container having therein a composition comprising an antibody of the invention; and (b) a second container containing therein a composition comprising an additional cytotoxic or otherwise therapeutic agent. The article of manufacture in this embodiment of the invention may further comprise a package insert indicating that the composition may be used to treat a particular condition. Alternatively or additionally, the article of manufacture may further comprise a second (or third) container comprising a pharmaceutically acceptable buffer, such as bacteriostatic water for injection (BWFI), phosphate buffered saline, Ringer's solution and dextrose solution. have. It may further include other materials desirable from a commercial and user standpoint, including other buffers, diluents, filters, needles and syringes.

본 발명의 특정 구현예들이 하기에 열거된다:Specific embodiments of the invention are listed below:

1. 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 상이한 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 상이한 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체로서,1. A bispecific antibody comprising a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a different second antigen binding site that (specifically) binds to a second different epitope on human CCL2 as,

상기 이중특이적 항체는 인간 IgG 동형, 바람직하게는 인간 IgG1 동형의 Fc 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체.The bispecific antibody comprises an Fc domain of a human IgG isotype, preferably of a human IgG1 isotype.

2. 구현예 1에 있어서,2. The method of embodiment 1,

또는or

F) i) 상기 제1 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고F) i) said first antigen binding site comprises (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 50, and (c) SEQ ID NO: 51 a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of and (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:52; a VL domain comprising (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 54; and

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (d) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체.ii) the second antigen binding site comprises (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and (c) the amino acid of SEQ ID NO: 27 a VH domain comprising a CDR-H3 comprising sequence; and (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:28; A bispecific antibody comprising a VL domain comprising (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:29, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:30.

3. 구현예 2에 있어서,3. The method of embodiment 2,

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하며, (a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47, (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, and (c) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43 a VH domain comprising a CDR-H3 comprising an amino acid sequence; and a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:48, and (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:44; a VL domain comprising (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46;

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하며, (a) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and (c) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 a VH domain comprising a CDR-H3 comprising an amino acid sequence; and a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; a VL domain comprising (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22;

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하며, (a) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, and (c) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 a VH domain comprising a CDR-H3 comprising an amino acid sequence; and a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, and (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12; a VL domain comprising (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14;

또는or

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하며, (a) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and (c) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 a VH domain comprising a CDR-H3 comprising an amino acid sequence; and a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; a VL domain comprising (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22; and

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

E) i)상기 제1 항원 결합 부위는E) i) the first antigen binding site is

서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하며, (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31, (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and (c) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 a VH domain comprising a CDR-H3 comprising an amino acid sequence; and a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32, and (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; a VL domain comprising (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30; and

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하며, (a) 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 55; (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 50, and (c) ) a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:51; and a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 56; (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52; a VL domain comprising (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:53, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:54; and

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하며, (a) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, and (c) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 a VH domain comprising a CDR-H3 comprising an amino acid sequence; and a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, and (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12; a VL domain comprising (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14; and

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하며, (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나;a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31, (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and (c) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 a VH domain comprising a CDR-H3 comprising an amino acid sequence; and a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32, and (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; a VL domain comprising (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30;

또는or

I) i)상기 제1 항원 결합 부위는I) i) the first antigen binding site is

서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하며, (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and (c) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 a VH domain comprising a CDR-H3 comprising an amino acid sequence; and a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, and (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; a VL domain comprising (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:5, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:6; and

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하며, (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체.a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31, (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and (c) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 a VH domain comprising a CDR-H3 comprising an amino acid sequence; and a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32, and (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; A bispecific antibody comprising a VL domain comprising (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:29, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:30.

4.제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,4. according to any one of items 1 to 33,

인간 IgG 동형의 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항체는 인간 IgG1 동형의 불변 중쇄 도메인을 포함하는 이중특이적 항체인, 이중특이적 항체. A bispecific antibody comprising an Fc domain of a human IgG isotype is a bispecific antibody comprising a constant heavy chain domain of a human IgG1 isotype.

5.구현예 4에 있어서,5. In embodiment 4,

20 mg/kg의 각 이중특이적 항체 및 0.1 mg/kg의 인간 CCL2로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 10 ml/kg의 단일 용량으로 FcRn 형질전환 마우스에 투여할 때, 인간 야생형 IgG1 동형의 불변 중쇄 도메인을 포함하는 이중특이적 항체를 투여한 후 인간 CCL2에 대한 생체내 제거율(ml/day/kg)은 돌연변이 L234A, L235A, P329G(카바트 EU 넘버링)를 포함하는 인간 IgG1 동형의 Fc 감마 수용체 침묵형 불변 중쇄 도메인을 포함하는 이중특이적 항체를 투여한 후 인간 CCL2에 대한 생체내 제거율(ml/day/kg)에 비해 2배 이상(일 구현예에서 5배 이상, 일 구현예에서 10배 이상, 일 구현예에서 20배 이상) 높은, 이중특이적 항체.Constant heavy chain domain of human wild-type IgG1 isotype when preformed immune complexes consisting of 20 mg/kg of each bispecific antibody and 0.1 mg/kg of human CCL2 are administered to FcRn transgenic mice at a single dose of 10 ml/kg. The in vivo clearance (ml/day/kg) for human CCL2 after administration of a bispecific antibody comprising After administration of a bispecific antibody comprising a constant heavy chain domain, compared to the in vivo clearance rate (ml / day / kg) for human CCL2 at least 2 fold (in one embodiment at least 5 fold, in one embodiment at least 10 fold, in one embodiment at least 20-fold) high, bispecific antibody.

6. 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서,6. Dual (isolated) comprising a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a second antigen binding site that (specifically) binds to a second epitope on human CCL2 As a specific antibody,

상기 이중특이적 항체는 인간 IgG 동형의 Fc 도메인을 포함하고, wherein said bispecific antibody comprises an Fc domain of a human IgG isotype;

서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하며, (a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하며, (d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)이중특이적 항체.a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47, (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, and (c) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43 a VH domain comprising a CDR-H3 comprising an amino acid sequence; and a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:48, and (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:44; A bispecific antibody (isolated) comprising a VL domain comprising (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:45, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:46.

7. 구현예 6에 있어서,7. The method of embodiment 6,

20 mg/kg의 각 이중특이적 항체 및 0.1 mg/kg의 인간 CCL2로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 10 ml/kg의 단일 용량으로 FcRn 형질전환 마우스에 투여할 때, 인간 야생형 IgG1 동형의 불변 중쇄 도메인을 포함하는 이중특이적 항체를 투여한 후 인간 CCL2에 대한 생체내 제거율(ml/day/kg)은 돌연변이 L234A, L235A, P329G(카바트(Kabat) EU 넘버링)를 포함하는 인간 IgG1 동형의 Fc 감마 수용체 침묵형 불변 중쇄 도메인을 포함하는 이중특이적 항체를 투여한 후 인간 CCL2에 대한 생체내 제거율(ml/day/kg)에 비해 15배 이상, 특히 20배 이상 더 높은, 이중특이적 항체.Constant heavy chain domain of human wild-type IgG1 isotype when preformed immune complexes consisting of 20 mg/kg of each bispecific antibody and 0.1 mg/kg of human CCL2 are administered to FcRn transgenic mice at a single dose of 10 ml/kg. The in vivo clearance (ml/day/kg) for human CCL2 after administration of a bispecific antibody comprising A bispecific antibody comprising at least 15-fold, in particular at least 20-fold higher clearance in vivo (ml/day/kg) for human CCL2 after administration of the bispecific antibody comprising a receptor silencing constant heavy chain domain.

8. 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서,8. Dual (isolated) comprising a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a second antigen binding site that (specifically) binds to a second epitope on human CCL2 As a specific antibody,

그리고and

(d) X¹은 F 또는 T이고 X²는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX¹EDIYNRX²A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)이중특이적 항체. (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence KAX ¹ EDIYNRX ² A of SEQ ID NO: 79, wherein X ¹ is F or T and X ² is R or L, (e) a CDR comprising the amino acid sequence GATSLEH of SEQ ID NO: 80 -L2, and (f) a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence QQFXSAPYT of SEQ ID NO:81, wherein X is W or R.

9. 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서,9. Dual (isolated) comprising a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a second antigen binding site that (specifically) binds to a second epitope on human CCL2 As a specific antibody,

그리고and

(h) X¹은 F 또는 T이고 X²는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX¹EDIYNRX²A를 포함하는 CDR-L1, (i) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (j) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3, (k) 서열번호 86의 아미노산 서열 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC를 포함하는 FR-L1, (l) 서열번호 87의 아미노산 서열 WYQQKPGKAPKLLIH를 포함하는 FR-L2, (m) 서열번호 88의 아미노산 서열 GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYC를 포함하는 FR-L3, 및 (n) 서열번호 89의 아미노산 서열 FGGGTKVEIK를 포함하는 FR-H4를 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)이중특이적 항체. (h) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence KAX ¹ EDIYNRX ² A of SEQ ID NO: 79, wherein X ¹ is F or T and X ² is R or L, (i) a CDR comprising the amino acid sequence GATSLEH of SEQ ID NO: 80 -L2, and (j) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence QQFXSAPYT of SEQ ID NO: 81, wherein X is W or R, (k) FR-L1 comprising the amino acid sequence DIQMTQSPSSSLSASVGDRVTITC of SEQ ID NO: 86, (l) SEQ ID NO: A VL comprising FR-L2 comprising the amino acid sequence WYQQKPGKAPKLLIH of 87, (m) FR-L3 comprising the amino acid sequence GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYC of SEQ ID NO: 88, and (n) FR-H4 comprising the amino acid sequence FGGGTKVEIK of SEQ ID NO: 89 An (isolated) bispecific antibody comprising a domain.

10. 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서,10. Dual (isolated) comprising a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a second antigen binding site that (specifically) binds to a second epitope on human CCL2 As a specific antibody,

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)이중특이적 항체.a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 92; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:93.

11. 인간 CCL2 상의 제1 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 CCL2 상의 제2 에피토프에 (특이적으로)결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, (단리된)이중특이적 항체로서,11. Dual (isolated) comprising a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a second antigen binding site that (specifically) binds to a second epitope on human CCL2 As a specific antibody,

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

서열번호 90의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및has at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 90; CDR-H1 comprising the amino acid sequence HTYMH of number 76, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence RIDPXNHNTKFDPKFQG of SEQ ID NO: 77, wherein X is D, and (c) X is D or E; a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence GVFGFFXH; and

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

서열번호 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) 서열번호 60의 아미노산 서열 RASQHVSDAYLA를 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 61의 아미노산 서열 DASDRAE를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열번호 62의 아미노산 서열 HQYIHLHSFT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고(d) has at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO:75; CDR-L1 comprising the amino acid sequence RASQHVSDAYLA of number 60; a VL domain comprising (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence DASDRAE of SEQ ID NO:61, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence HQYIHLHSFT of SEQ ID NO:62; and

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

서열번호 92의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및has at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 92; CDR-H1 comprising the amino acid sequence HTYMH of number 76, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence RIDPXNHNTKFDPKFQG of SEQ ID NO: 77, wherein X is D, and (c) X is D or E; a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence GVFGFFXH; and

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

서열번호 91의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (a) 서열번호 76의 아미노산 서열 HTYMH를 포함하는 CDR-H1, (b) X는 D인, 서열번호 77의 아미노산 서열 RIDPXNHNTKFDPKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) X는 D 또는 E인, 서열번호 78의 아미노산 서열 GVFGFFXH를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및has at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 91; CDR-H1 comprising the amino acid sequence HTYMH of number 76, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence RIDPXNHNTKFDPKFQG of SEQ ID NO: 77, wherein X is D, and (c) X is D or E; a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence GVFGFFXH; and

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

또는or

ii) 상기 제2 항원 결합 부위는ii) the second antigen binding site is

서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, (d) X¹은 F 또는 T이고 X²는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX¹EDIYNRX²A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)이중특이적 항체.has at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 93; ¹ is F or T ^and X ² is R or L ^; (f) a bispecific antibody (isolated) comprising a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence QQFXSAPYT of SEQ ID NO:81, wherein X is W or R.

12. 구현예 8 내지 구현예 11 중 어느 한 구현예에 있어서,12. According to any one of embodiments 8 to 11,

13. 구현예 8 내지 구현예 11 중 어느 한 구현예에 있어서,13. According to any one of embodiments 8 to 11,

상기 이중특이적 항체는 인간 IgG 동형, 바람직하게는 인간 IgG1 동형의 불변 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체.The bispecific antibody comprises a constant domain of a human IgG isotype, preferably of a human IgG1 isotype.

14. 구현예 1 내지 구현예 13 중 어느 한 구현예에 있어서,14. According to any one of embodiments 1 to 13,

상기 이중특이적 항체는 The bispecific antibody is

iii) 시노 및 및 인간 CCL2에 교차 반응하는, 이중특이적 항체.iii) a bispecific antibody that cross-reacts to cyno and human CCL2.

15. 구현예 1 내지 구현예 14 중 어느 한 구현예에 있어서,15. According to any one of embodiments 1 to 14,

상기 이중특이적 항체는 CCL2에 대한 결합과 비교하여 다른 CCL 동족체에 교차 반응하지 않는 (다른 CCL 동족체(CCL8, CCL7 및 CCL13의 군으로부터 선택됨)에 대한 결합이 100배 더 적게 나타나는), 이중특이적 항체.The bispecific antibody does not cross-react to other CCL homologues (showing 100-fold less binding to other CCL homologues (selected from the group of CCL8, CCL7 and CCL13) compared to binding to CCL2), bispecific antibody.

16. 구현예 1 내지 구현예 15 중 어느 한 구현예에 있어서,16. According to any one of embodiments 1 to 15,

이중특이적 항체는 이온 의존적 방식으로 인간 CCL2 상의 제1 에피토프 및 제2 에피토프에 결합하는, 이중특이적 항체.The bispecific antibody binds to a first epitope and a second epitope on human CCL2 in an ion dependent manner.

17. 구현예 1 내지 구현예 16 중 어느 한 구현예에 있어서,17. According to any one of embodiments 1 to 16,

이중특이적 항체는 pH 의존적 방식으로 인간 CCL2에 결합하고, 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위 둘 모두는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화도로 CCL2에 결합하는, 이중특이적 항체.The bispecific antibody binds human CCL2 in a pH dependent manner, and wherein both the first antigen binding site and the second antigen binding site bind CCL2 with higher affinity at neutral pH than at acidic pH.

18. 구현예 1 내지 구현예 17 중 어느 한 구현예에 있어서,18. According to any one of embodiments 1 to 17,

상기 이중특이적 항체는 pH 5.8에서보다 pH 7.4에서 10배 더 높은 친화도로 인간 CCL2에 결합하는, 이중특이적 항체.The bispecific antibody binds to human CCL2 with a 10-fold higher affinity at pH 7.4 than at pH 5.8.

19. 구현예 1 내지 구현예 18 중 어느 한 구현예에 있어서,19. According to any one of embodiments 1 to 18,

상기 이중특이적 항체는 하기의 돌연변이들(카바트 넘버링):The bispecific antibody has the following mutations (Kabat numbering):

ii) L234Y, L235W, G236N, P238D, T250V, V264I, T307PH268D, Q295L, K326T 및/또는 A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합); 및/또는 ii) L234Y, L235W, G236N, P238D, T250V, V264I, T307PH268D, Q295L, K326T and/or A330K (suitable for increasing affinity for human FcgRIIb and decreasing affinity for other human FcgRs); and/or

iv) Q438R 및/또는 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합) 중 하나 이상을 포함하는 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체.iv) a bispecific antibody comprising a human IgGl heavy chain constant domain comprising at least one of Q438R and/or S440E (suitable for inhibition of rheumatoid factor binding).

20. 구현예 1 내지 구현예 19 중 어느 한 구현예에 있어서,20. According to any one of embodiments 1 to 19,

21. 구현예 1 내지 구현예 20 중 어느 한 구현예에 있어서,21. According to any one of embodiments 1 to 20,

iv) Q438R 및 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합)를 포함하는 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체.iv) a bispecific antibody comprising a human IgGl heavy chain constant domain comprising Q438R and S440E (suitable for inhibition of rheumatoid factor binding).

22. 구현예 1 내지 구현예 21 중 어느 한 구현예에 있어서,22. According to any one of embodiments 1 to 21,

ii) L234Y, P238D, T250V, V264I, T307V 및/또는 A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합); 및/또는 ii) L234Y, P238D, T250V, V264I, T307V and/or A330K (suitable for increasing affinity for human FcgRIIb and decreasing affinity for other human FcgRs); and/or

23. 구현예 1 내지 구현예 22 중 어느 한 구현예에 있어서,23. According to any one of embodiments 1-22,

ii) L234Y, P238D, T250V, V264I, T307V 및 A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합); 및 ii) L234Y, P238D, T250V, V264I, T307V and A330K (suitable for increasing affinity for human FcgRIIb and decreasing affinity for other human FcgRs); and

iv) Q438R 및 S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합) 중 하나 이상을 포함하는 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체.iv) a bispecific antibody comprising a human IgGl heavy chain constant domain comprising at least one of Q438R and S440E (suitable for inhibition of rheumatoid factor binding).

24. 구현예 1 내지 구현예 23 중 어느 한 구현예에 있어서,24. According to any one of embodiments 1 to 23,

25. 구현예 1 내지 구현예 24 중 어느 한 구현예에 있어서,25. According to any one of embodiments 1 to 24,

ii) 중쇄 불변 도메인 중 다른 하나에서의 Y349C, T366S, L368A, Y407V를 포함하는 2개의 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체. ii) a bispecific antibody comprising two human IgG1 heavy chain constant domains comprising Y349C, T366S, L368A, Y407V in the other of the heavy chain constant domains.

26. 인간 CCL2에 (특이적으로)결합하는, (단리된) 항체로서,26. An (isolated) antibody that (specifically) binds to human CCL2,

상기 항체는,The antibody is

A) X는 I 또는 T인 서열번호 57의 아미노산 서열 SHYGXS를 포함하는 CDR-H1, (b) X¹은 V, I, 또는 H이고, X²는 P 또는 H이며, X³은 H 또는 G인, 서열번호 58의 아미노산 서열 GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열 YDAHYGELDF를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및A) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence SHYGXS of SEQ ID NO: 57, wherein X is I or T, (b) X ¹ is V, I, or H, X ² is P or H, and X ³ is H or G phosphorus, a VH domain comprising a CDR-H2 comprising the amino acid sequence GX ¹ IX ² IFX ³ TANYAQKFQG of SEQ ID NO: 58, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence YDAHYGELDF of SEQ ID NO: 59; and

또는or

(d) X¹은 F 또는 T이고 X²는 R 또는 L인, 서열번호 79의 아미노산 서열 KAX¹EDIYNRX²A를 포함하는 CDR-L1, (e) 서열번호 80의 아미노산 서열 GATSLEH를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) X는 W 또는 R인, 서열번호 81의 아미노산 서열 QQFXSAPYT를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)이중특이적 항체. (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence KAX ¹ EDIYNRX ² A of SEQ ID NO: 79, wherein X ¹ is F or T and X ² is R or L, (e) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence GATSLEH of SEQ ID NO: 80 -L2, and (f) a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence QQFXSAPYT of SEQ ID NO:81, wherein X is W or R.

27. 인간 CCL2에 (특이적으로)결합하는, (단리된) 항체로서,27. An (isolated) antibody that (specifically) binds to human CCL2,

상기 항체는,The antibody is

또는or

H) 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, (단리된)(단일특이적)항체.H) a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:90; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:94.

28. 구현예 1 내지 구현예 27 중 어느 한 구현예에 따른 항체를 부호화하는, 단리된 핵산.28. An isolated nucleic acid encoding the antibody according to any one of embodiments 1 to 27.

29. 구현예 28에 따른 핵산을 포함하는, 숙주 세포.29. A host cell comprising a nucleic acid according to embodiment 28.

30. 항체를 생성하는 방법으로서,30. A method of generating an antibody, comprising:

상기 항체가 생성되도록 구현예 29에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.A method comprising culturing a host cell according to embodiment 29 such that said antibody is produced.

31. 구현예 30에 있어서,31. The method of embodiment 30,

상기 숙주 세포로부터 항체를 회수하는 단계를 더 포함하는, 방법.The method further comprising recovering the antibody from the host cell.

32. 구현예 1 내지 구현예 25 중 어느 한 구현예에 따른 이중특이적 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 약학적 제제. 32. A pharmaceutical formulation comprising the bispecific antibody according to any one of embodiments 1 to 25 and a pharmaceutically acceptable carrier.

33. 구현예 1 내지 구현예 25 중 어느 한 구현예에 있어서,33. The method according to any one of embodiments 1 to 25,

약제로서 사용하기 위한, 이중특이적 항체.A bispecific antibody for use as a medicament.

34. 구현예 1 내지 구현예 25 중 어느 한 구현예에 있어서,34. The method according to any one of embodiments 1 to 25,

암을 치료하는 데 사용하기 위한, 이중특이적 항체.A bispecific antibody for use in treating cancer.

35. 구현예 1 내지 구현예 25 중 어느 한 구현예에 있어서,35. The method according to any one of embodiments 1 to 25,

염증성 또는 자가면역 질환을 치료하는 데 사용하기 위한, 이중특이적 항체.A bispecific antibody for use in treating an inflammatory or autoimmune disease.

36. 약제의 제조에서 구현예 1 내지 구현예 25 중 어느 한 구현예에 따른 이중특이적 항체의 사용. 36. Use of the bispecific antibody according to any one of embodiments 1 to 25 in the manufacture of a medicament.

37. 구현예 36에 있어서,37. The method of embodiment 36,

상기 약제는 암을 치료하기 위한, 사용.The medicament is used for treating cancer.

38. 구현예 36에 있어서,38. The method of embodiment 36,

상기 약제는 염증성 또는 자가면역 질환을 치료하기 위한, 사용.The medicament is used for treating an inflammatory or autoimmune disease.

39. 암이 있는 개체를 치료하는 방법으로서,39. A method of treating a subject having cancer, comprising:

구현예 1 내지 구현예 25 중 어느 한 구현예에 따른 이중특이적 항체의 유효량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법. A method comprising administering to said subject an effective amount of a bispecific antibody according to any one of embodiments 1-25.

40. 염증성 또는 자가면역 질환이 있는 개체를 치료하는 방법으로서,40. A method of treating a subject having an inflammatory or autoimmune disease, comprising:

하기의 실시예 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 그 진정한 범위는 첨부된 청구범위에 제시되어 있다. 발명의 사상으로부터 벗어나지 않으면서, 진술된 절차에서 변형이 만들어질 수 있는 것으로 이해된다.The following examples and drawings are provided to aid the understanding of the present invention, the true scope of which is set forth in the appended claims. It is understood that modifications may be made in the stated procedure without departing from the spirit of the invention.

아미노산 서열들의 설명 Description of amino acid sequences

상이한 에피토프에 결합하는 항-CCL2 항원 결합 모이어티(가변 영역 및 초가변 영역(CDR)):Anti-CCL2 antigen binding moieties (variable regions and hypervariable regions (CDRs)) that bind different epitopes:

CDR 변형된 항-CCL2 항원 결합 모이어티(가변 영역 및 초가변 영역(CDR)): CDR modified anti-CCL2 antigen binding moieties (variable region and hypervariable region (CDR)):

변형된 CNTO888Modified CNTO888

변형된 인간화 11K2Modified Humanization 11K2

예시적인 불변 경쇄 영역: Exemplary constant light chain regions:

서열번호 95 예시적인 인간 카파 경쇄 불변 영역SEQ ID NO: 95 Exemplary human kappa light chain constant region

서열번호 96 예시적인 인간 람다 경쇄 불변 영역SEQ ID NO: 96 Exemplary human lambda light chain constant region

예시적인 불변 중쇄 영역: Exemplary constant heavy chain regions:

서열 번호: 97 IgG1로부터 유래된 예시적인 인간 중쇄 불변 영역SEQ ID NO: 97 Exemplary human heavy chain constant region derived from IgG1

서열 번호: 98 L234A, L235A 및 P329G의 돌연변이가 있는 IgG1로부터 유래된 예시적인 인간 중쇄 불변 영역(Fc감마 수용체 침묵형)SEQ ID NO: 98 Exemplary human heavy chain constant region derived from IgG1 with mutations of L234A, L235A and P329G (Fcgamma receptor silencing type)

서열번호 99 IgG1(SG1-IgG1 동종이인자형)로부터 유래된 예시적인 인간 중쇄 불변 영역 서열번호 100 돌연변이가 있는 IgG1(SG105-IgG1 동종이인자형 - Fc감마 수용체 침묵형)로부터 유래된 예시적인 인간 중쇄 불변 영역Exemplary human heavy chain constant region derived from SEQ ID NO: 99 IgG1 (SG1-IgG1 allotype) Exemplary human heavy chain constant derived from IgG1 (SG105-IgG1 allotype - Fcgamma receptor silencing type) with SEQ ID NO: 100 mutation area

서열번호 101 SG1095-돌연변이를 포함한 IgG1로부터 유래된 예시적인 인간 중쇄 영역(카바트 EU 넘버링):Exemplary human heavy chain region derived from IgG1 containing SEQ ID NO: 101 SG1095-mutation (Kabat EU numbering):

-L235W/G236N/H268D/Q295L/A330K/K326T(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합);-L235W/G236N/H268D/Q295L/A330K/K326T (suitable for increasing affinity for human FcgRIIb and decreasing affinity for other human FcgRs);

-Q311R/P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 등전점(pI) 증가에 적합);-Q311R/P343R (suitable for increasing isoelectric point (pI) to enhance antigen uptake);

-N434A(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및-N434A (suitable for increasing affinity for FcRn for longer plasma half-life); and

-Q438R/S440E(류마티스 인자 결합의 억제에 적합)-Q438R/S440E (suitable for inhibition of rheumatoid factor binding)

서열번호 102 SG1099-돌연변이를 포함한 IgG1로부터 유래된 예시적인 인간 중쇄 영역(카바트 EU 넘버링):Exemplary human heavy chain region derived from IgG1 containing SEQ ID NO: 102 SG1099-mutation (Kabat EU numbering):

Q311R/P343R (항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합) Q311R/P343R (suitable for increasing pI to enhance antigen uptake)

서열번호 103 SG1100-돌연변이를 포함한 IgG1로부터 유래된 예시적인 인간 중쇄 영역(카바트 EU 넘버링):Exemplary human heavy chain region derived from IgG1 comprising SEQ ID NO: 103 SG1100-mutation (Kabat EU numbering):

Q311R/P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 pI 증가에 적합);Q311R/P343R (suitable for increasing pI to enhance antigen uptake);

CNTO888//11K2-WT IgG1(예시적인 이중특이적 CNTO888//11K2-WT IgG1 크로스맵)CNTO888//11K2-WT IgG1 (Exemplary bispecific CNTO888//11K2-WT IgG1 crossmap)

서열번호 104 중쇄 1- CNTO888//11K2-WT IgG1SEQ ID NO: 104 heavy chain 1- CNTO888//11K2-WT IgG1

서열번호 105 중쇄 2- CNTO888//11K2-WT IgG1SEQ ID NO: 105 heavy chain 2- CNTO888//11K2-WT IgG1

서열번호 106 경쇄 1- CNTO888//11K2-WT IgG1SEQ ID NO: 106 light chain 1- CNTO888//11K2-WT IgG1

서열번호 107 경쇄 2- CNTO888//11K2-WT IgG1SEQ ID NO: 107 light chain 2- CNTO888//11K2-WT IgG1

CKLO2 - IgG1(예시적인 이중특이적 CKLO2 IgG1 크로스맵(Crossmab))CKLO2 - IgG1 (Exemplary Bispecific CKLO2 IgG1 Crossmap (Crossmab))

서열번호 108 중쇄 1- CKLO2 IgG1SEQ ID NO: 108 heavy chain 1- CKLO2 IgG1

서열번호 109 중쇄 2- CKLO2 IgG1SEQ ID NO: 109 heavy chain 2- CKLO2 IgG1

서열번호 110 경쇄 1- CKLO2 IgG1SEQ ID NO: 110 light chain 1- CKLO2 IgG1

서열번호 111 경쇄 2- CKLO2 IgG1SEQ ID NO: 111 light chain 2- CKLO2 IgG1

CKLO2 - SG1095(SG1095 Fc 돌연변이를 포함한 예시적인 이중특이적 CLOK2 크로스맵)CKLO2 - SG1095 (Exemplary bispecific CLOK2 crossmap with SG1095 Fc mutation)

서열번호 112 중쇄 1- CKLO2 - SG1095SEQ ID NO: 112 heavy chain 1- CKLO2 - SG1095

서열번호 113 중쇄 2- CKLO2 - SG1095SEQ ID NO: 113 heavy chain 2- CKLO2 - SG1095

서열번호 114 경쇄 1- CKLO2 - SG1095SEQ ID NO: 114 light chain 1- CKLO2 - SG1095

서열번호 115 경쇄 2- CKLO2 - SG1095SEQ ID NO: 115 light chain 2- CKLO2 - SG1095

CKLO2 - SG1099(SG1099 Fc 돌연변이를 포함한 예시적인 이중특이적 CKLO2 크로스맵)CKLO2 - SG1099 (Exemplary bispecific CKLO2 crossmap with SG1099 Fc mutation)

서열번호 116 중쇄 1- CKLO2 - SG1099SEQ ID NO: 116 heavy chain 1- CKLO2 - SG1099

서열번호 117 중쇄 2- CKLO2 - SG1099SEQ ID NO: 117 heavy chain 2- CKLO2 - SG1099

서열번호 118 경쇄 1- CKLO2 - SG1099SEQ ID NO: 118 light chain 1- CKLO2 - SG1099

서열번호 119 경쇄 2- CKLO2 - SG1099SEQ ID NO: 119 light chain 2- CKLO2 - SG1099

CKLO2 - SG1100(SG1100 Fc 돌연변이를 포함한 예시적인 이중특이적 CKLO2 크로스맵)CKLO2 - SG1100 (Exemplary bispecific CKLO2 crossmap with SG1100 Fc mutation)

서열번호 120 중쇄 1- CKLO2 - SG1100SEQ ID NO: 120 heavy chain 1- CKLO2 - SG1100

서열번호 121 중쇄 2- CKLO2 - SG1100SEQ ID NO: 121 heavy chain 2- CKLO2 - SG1100

서열번호 122 경쇄 1- CKLO2 - SG1100SEQ ID NO: 122 light chain 1- CKLO2 - SG1100

서열번호 123 경쇄 2- CKLO2 - SG1100SEQ ID NO: 123 light chain 2- CKLO2 - SG1100

CKLO3 - SG1095(SG1095 Fc 돌연변이를 포함한 예시적인 이중특이적 CLOK3 크로스맵)CKLO3 - SG1095 (Exemplary bispecific CLOK3 crossmap with SG1095 Fc mutation)

서열번호 124 중쇄 1- CKLO3 - SG1095SEQ ID NO: 124 heavy chain 1- CKLO3 - SG1095

서열번호 125 중쇄 2- CKLO3 - SG1095SEQ ID NO: 125 heavy chain 2- CKLO3 - SG1095

서열번호 126 경쇄 1- CKLO3 - SG1095SEQ ID NO: 126 light chain 1- CKLO3 - SG1095

서열번호 127 경쇄 2- CKLO3 - SG1095SEQ ID NO: 127 light chain 2- CKLO3 - SG1095

CKLO3 - SG1099(SG1099 Fc 돌연변이를 포함한 예시적인 이중특이적 CKLO3 크로스맵)CKLO3 - SG1099 (Exemplary bispecific CKLO3 crossmap with SG1099 Fc mutation)

서열번호 128 중쇄 1- CKLO3 - SG1099SEQ ID NO: 128 heavy chain 1- CKLO3 - SG1099

서열번호 129 중쇄 2- CKLO3 - SG1099SEQ ID NO: 129 heavy chain 2- CKLO3 - SG1099

서열번호 130 경쇄 1- CKLO3 - SG1099SEQ ID NO: 130 light chain 1- CKLO3 - SG1099

서열번호 131 경쇄 2- CKLO3 - SG1099SEQ ID NO: 131 light chain 2- CKLO3 - SG1099

CKLO3 - SG1100(SG1100 Fc 돌연변이를 포함한 예시적인 이중특이적 CKLO3 크로스맵)CKLO3 - SG1100 (Exemplary bispecific CKLO3 crossmap with SG1100 Fc mutation)

서열번호 132 중쇄 1- CKLO3 - SG1100SEQ ID NO: 132 heavy chain 1- CKLO3 - SG1100

서열번호 133 중쇄 2- CKLO3 - SG1100SEQ ID NO: 133 heavy chain 2- CKLO3 - SG1100

서열번호 134 경쇄 1- CKLO3- SG1100SEQ ID NO: 134 light chain 1- CKLO3- SG1100

서열번호 135 경쇄 2- CKLO3 - SG1100SEQ ID NO: 135 light chain 2- CKLO3 - SG1100

추가의 항-CCL2 항원 결합 모이어티들: Additional anti-CCL2 antigen binding moieties:

서열번호 136 중쇄 가변 도메인 VH 2F2 SEQ ID NO: 136 heavy chain variable domain VH 2F2

서열 번호: 137 경쇄 가변 도메인 VL 2F2 SEQ ID NO: 137 light chain variable domain VL 2F2

서열번호 138 중쇄 가변 도메인 VH 쥐 11K2 (=11K2m)SEQ ID NO: 138 heavy chain variable domain VH Rat 11K2 (=11K2m)

서열번호 139 경쇄 가변 도메인 VL 쥐 11K2 (=11K2m)SEQ ID NO: 139 light chain variable domain VL Rat 11K2 (=11K2m)

서열번호 140 중쇄 가변 도메인 VH 1H11SEQ ID NO: 140 heavy chain variable domain VH 1H11

서열번호 141 경쇄 가변 도메인 VL 1H11SEQ ID NO: 141 light chain variable domain VL 1H11

예시적인 CCL2 및 동족체(신호 펩티드 없음): Exemplary CCL2 and homologues (no signal peptide):

서열번호 142 예시적인 인간 CCL2 (MCP1) - 야생형(wt)SEQ ID NO: 142 Exemplary human CCL2 (MCP1) - wild type (wt)

서열번호 143 예시적인 인간 CCL2 (MCP1) - P8A 변이체SEQ ID NO: 143 Exemplary human CCL2 (MCP1)-P8A variant

서열번호 144 예시적인 인간 CCL2 (MCP1) - T10C 변이체SEQ ID NO: 144 Exemplary human CCL2 (MCP1) - T10C variant

서열번호 145 예시적인 인간 CCL8 (MCP2) - 야생형(wt)SEQ ID NO: 145 Exemplary human CCL8 (MCP2) - wild type (wt)

서열번호 146 예시적인 인간 CCL8 (MCP2) - P8A 변이체SEQ ID NO: 146 Exemplary human CCL8 (MCP2) - P8A variant

서열번호 147 예시적인 인간 CCL7 (MCP3) - 야생형(wt)SEQ ID NO: 147 Exemplary human CCL7 (MCP3) - wild type (wt)

서열번호 148 예시적인 인간 CCL13 (MCP4)- 야생형(wt)SEQ ID NO: 148 Exemplary human CCL13 (MCP4)-wild type (wt)

서열번호 149 예시적인 시노몰구스 CCL2 - 야생형(wt)SEQ ID NO: 149 Exemplary cynomolgus CCL2 - wild type (wt)

서열번호 150 예시적인 마우스 CCL2- 야생형(wt) SEQ ID NO: 150 Exemplary mouse CCL2- wild type (wt)

추가의 예시적인 불변 중쇄 영역: Additional exemplary constant heavy chain regions:

서열번호 151 GG01 - 돌연변이를 포함한 IgG1로부터 유래된 예시적인 인간 중쇄 영역(카바트 EU 넘버링):SEQ ID NO: 151 GG01 - Exemplary human heavy chain region derived from IgG1 with mutation (Kabat EU numbering):

-L234Y/P238D/ T250V/V264I/T307P/A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합);-L234Y/P238D/T250V/V264I/T307P/A330K (suitable for increasing affinity for human FcgRIIb and decreasing affinity for other human FcgRs);

서열번호 152 GG02 - 돌연변이를 포함한 IgG1로부터 유래된 예시적인 인간 중쇄 영역(카바트 EU 넘버링):SEQ ID NO: 152 GG02 - Exemplary human heavy chain region derived from IgG1 with mutation (Kabat EU numbering):

-L234Y/P238D/T250V/V264I/T307P/A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합); -L234Y/P238D/T250V/V264I/T307P/A330K (suitable for increasing affinity for human FcgRIIb and decreasing affinity for other human FcgRs);

-M428L/N434A/Y436T(더 긴 혈장 반감기를 위해 FcRn에 대한 친화도 증가에 적합); 및-M428L/N434A/Y436T (suitable for increasing affinity for FcRn for longer plasma half-life); and

서열번호 153 GG03 - 돌연변이를 포함한 IgG1(-IgG1 동종이인자형 서열을 포함)로부터 유래된 예시적인 인간 중쇄 영역(카바트 EU 넘버링):SEQ ID NO: 153 GG03 - Exemplary human heavy chain region derived from IgG1 (including -IgG1 allotype sequence) with mutation (Kabat EU numbering):

-L234Y/P238D/T250V/V264I/T307P/A330K(인간 FcgRIIb에 대한 친화도를 증가시키고 다른 인간 FcgR에 대한 친화도를 감소시키는 데 적합);-L234Y/P238D/T250V/V264I/T307P/A330K (suitable for increasing affinity for human FcgRIIb and decreasing affinity for other human FcgRs);

서열번호 154 GG04 - 돌연변이를 포함한 IgG1(-IgG1 동종이인자형 서열을 포함)로부터 유래된 예시적인 인간 중쇄 영역(카바트 EU 넘버링):SEQ ID NO: 154 GG04 - Exemplary human heavy chain region derived from IgG1 (including -IgG1 allotype sequence) with mutation (Kabat EU numbering):

CKLO2 - GG01(GG01 Fc 돌연변이를 포함한 예시적인 이중특이적 CLOK2 크로스맵)CKLO2 - GG01 (Exemplary bispecific CLOK2 crossmap with GG01 Fc mutation)

서열번호 155 중쇄 1- CKLO2 - GG01SEQ ID NO: 155 heavy chain 1- CKLO2 - GG01

서열번호 156 중쇄 2- CKLO2 - GG01SEQ ID NO: 156 heavy chain 2- CKLO2 - GG01

서열번호 157 경쇄 1- CKLO2 - GG01SEQ ID NO: 157 light chain 1- CKLO2 - GG01

서열번호 158 경쇄 2- CKLO2 - GG01SEQ ID NO: 158 light chain 2- CKLO2 - GG01

CKLO2 - GG02(GG02 Fc 돌연변이를 포함한 예시적인 이중특이적 CLOK2 크로스맵)CKLO2 - GG02 (Exemplary bispecific CLOK2 crossmap with GG02 Fc mutation)

서열번호 159 중쇄 1- CKLO2 GG02SEQ ID NO: 159 heavy chain 1- CKLO2 GG02

서열번호 160 중쇄 2- CKLO2 GG02SEQ ID NO: 160 heavy chain 2- CKLO2 GG02

서열번호 161 경쇄 1- CKLO2 GG02SEQ ID NO: 161 light chain 1- CKLO2 GG02

서열번호 162 경쇄 2- CKLO2 GG02SEQ ID NO: 162 light chain 2- CKLO2 GG02

CKLO2 - GG03(GG03 Fc 돌연변이를 포함한 예시적인 이중특이적 CLOK2 크로스맵)CKLO2 - GG03 (Exemplary bispecific CLOK2 crossmap with GG03 Fc mutation)

서열번호 163 중쇄 1- CKLO2 - GG03SEQ ID NO: 163 heavy chain 1- CKLO2 - GG03

서열번호 164 중쇄 2- CKLO2 - GG03SEQ ID NO: 164 heavy chain 2- CKLO2 - GG03

서열번호 165 경쇄 1- CKLO2 - GG03SEQ ID NO: 165 light chain 1- CKLO2 - GG03

서열번호 166 경쇄 2- CKLO2 - GG03SEQ ID NO: 166 light chain 2- CKLO2 - GG03

CKLO2 - GG04(GG04 Fc 돌연변이를 포함한 예시적인 이중특이적 CKLO2 크로스맵)CKLO2 - GG04 (Exemplary bispecific CKLO2 crossmap with GG04 Fc mutation)

서열번호 167 중쇄 1- CKLO2 - GG04SEQ ID NO: 167 heavy chain 1- CKLO2 - GG04

서열번호 168 중쇄 2- CKLO2 - GG04SEQ ID NO: 168 heavy chain 2- CKLO2 - GG04

서열번호 169 경쇄 1- CKLO2 - GG04SEQ ID NO: 169 light chain 1- CKLO2 - GG04

서열번호 170 경쇄 2- CKLO2 - GG04SEQ ID NO: 170 light chain 2- CKLO2 - GG04

CKLO2 - GG03/GG04(돌기 사슬에 GG03 Fc 돌연변이를 포함하고 구멍 사슬에 GG04 Fc 돌연변이를 포함하는 예시적인 이중특이적 CKLO2 크로스맵)CKLO2 - GG03/GG04 (Exemplary bispecific CKLO2 crossmap comprising a GG03 Fc mutation in the dendritic chain and a GG04 Fc mutation in the pore chain)

서열번호 171 중쇄 1- CKLO2 - GG03/GG04SEQ ID NO: 171 heavy chain 1- CKLO2 - GG03/GG04

서열번호 172 중쇄 2- CKLO2 - GG03/GG04SEQ ID NO: 172 heavy chain 2- CKLO2 - GG03/GG04

서열번호 173 경쇄 1- CKLO2 - GG03/GG04SEQ ID NO: 173 light chain 1- CKLO2 - GG03/GG04

서열번호 174 경쇄 2- CKLO2 - GG03/GG04SEQ ID NO: 174 light chain 2- CKLO2 - GG03/GG04

명칭 본원에 기재된 항-CCL2 이중특이적 항체에 사용된 단일특이적 비변형 항-CCL2 항체/항원 결합 모이어티Name Monospecific unmodified anti-CCL2 antibody/antigen binding moiety used in the anti-CCL2 bispecific antibodies described herein

명칭 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(PGLALA)를 포함하는 IgG1 또는 IgG1을 갖는 크로스맵(WO 2016/016299 참조)으로서 As a crossmap (see WO 2016/016299) with IgG1 or IgG1 comprising the name mutations L234A, L235A and P329G (PGLALA) 변형된 VH/VLModified VH/VL 을 갖는 이중특이적 항-CCL2Bispecific anti-CCL2 with

명칭 크로스맵으로서 변형된 VH/VL을 갖는 이중특이적 항체(WO 2016/016299 참조). 사용된 중쇄 불변 도메인(예컨대, IgG1 야생형, PGLALA, SG1095, SG1099, 1100)에 따라, 접미사 IgG1 야생형, PGLALA, SG1095, SG1099, 1100이 추가된다.Bispecific antibody with modified VH/VL as name crossmap (see WO 2016/016299). Depending on the heavy chain constant domain used (eg, IgG1 wildtype, PGLALA, SG1095, SG1099, 1100), the suffixes IgG1 wildtype, PGLALA, SG1095, SG1099, 1100 are added.

실시예:Example:

실시예 A-1 단일특이적 항-CCL2 항체Example A-1 Monospecific Anti-CCL2 Antibody

단일특이적 항-CCL2 항체 및 CCL2 항원의 생성 Generation of monospecific anti-CCL2 antibodies and CCL2 antigens

재조합 DNA 기술Recombinant DNA technology

표준 방법을 사용하여 Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989에 기재된 바에 따라 DNA를 조작하였다. 분자 생물학적 시약은 제조업체의 사용설명서에 따라서 사용하였다.Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; DNA was engineered as described in Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Molecular biological reagents were used according to the manufacturer's instructions.

유전자 및 올리고뉴클레오티드 합성 Gene and Oligonucleotide Synthesis

제네아트(Geneart) GmbH(독일 레겐스부르크 소재)에서 화학 합성에 의해 원하는 유전자 단편을 제조하였다. 합성된 유전자 단편들은 증식/증폭을 위해 대장균 플라스미드에 클로닝되었다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 서열분석으로 확인하였다. 대안적으로, 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드들을 어닐링함으로써 또는 PCR을 통해 짧은 합성 DNA 단편들을 조립하였다. 각각의 올리고뉴클레오티드는 메타비온(metabion) GmbH(독일 플라네그 마틴스리드 소재)에 의해 제조하였다.The desired gene fragment was prepared by chemical synthesis at Geneart GmbH (Regensburg, Germany). The synthesized gene fragments were cloned into E. coli plasmids for propagation/amplification. The DNA sequence of the subcloned gene fragment was confirmed by DNA sequencing. Alternatively, short synthetic DNA fragments were assembled by annealing chemically synthesized oligonucleotides or via PCR. Each oligonucleotide was prepared by metabion GmbH (Planeg Martinsrid, Germany).

기본/표준 포유류 발현 플라스미드에 대한 설명Description of Basic/Standard Mammalian Expression Plasmids

원하는 유전자/단백질(예컨대, 전장 항체 중쇄, 전장 항체 경쇄 또는 CCL-2 분자)의 발현을 위해, 하기의 기능적 요소들:For expression of a desired gene/protein (eg, full length antibody heavy chain, full length antibody light chain or CCL-2 molecule), the following functional elements:

- 인트론 A를 포함하는 인간 사이토메갈로바이러스(P-CMV)로부터의 즉각적인 초기 증폭자 및 프로모터,- immediate early amplifiers and promoters from human cytomegalovirus (P-CMV) comprising intron A;

- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-비번역 영역(5'UTR),- human heavy chain immunoglobulin 5'-untranslated region (5'UTR),

- 뮤린 면역글로불린 중쇄 신호 서열, - a murine immunoglobulin heavy chain signal sequence,

- 발현될 유전자/단백질(예컨대, 전장 항체 중쇄 또는 항체 경쇄 또는 CCL-2 분자), 및- the gene/protein to be expressed (eg full length antibody heavy chain or antibody light chain or CCL-2 molecule), and

- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGH pA)을 포함하는 전사 단위가 사용된다.- a transcription unit comprising the bovine growth hormone polyadenylation sequence (BGH pA) is used.

발현하고자 하는 유전자를 포함하는 발현 유닛/카세트 이외에, 기본/표준 포유류 발현 플라스미드는:In addition to the expression unit/cassette containing the gene to be expressed, the basic/standard mammalian expression plasmid is:

대장균에서 상기 플라스미드의 복제를 가능하게 하는 벡터 pUC18로부터의 복제 기점, 및an origin of replication from vector pUC18 that enables replication of said plasmid in E. coli, and

대장균에서 암피실린 내성을 부여하는 베타 락타마아제 유전자를 함유한다.It contains the beta-lactamase gene that confers ampicillin resistance in E. coli.

재조합 단일클론 항체 및 CCL-2 분자용 발현 플라스미드의 생성Generation of Expression Plasmids for Recombinant Monoclonal Antibodies and CCL-2 Molecules

단일클론 항체 및 CCL-2 항원의 일시적인 발현을 위한 발현 플라스미드는 각각의 발현 카세트 외에 대장균에서 상기 플라스미드의 복제를 허용하는 벡터 pUC18 및 대장균에서 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마제 유전자로부터의 복제 기점을 포함하였다.Expression plasmids for transient expression of monoclonal antibodies and CCL-2 antigens are, in addition to their respective expression cassettes, the vector pUC18 allowing replication of the plasmid in E. coli and the beta-lactamase gene conferring ampicillin resistance in E. coli origin of replication. included.

각각의 면역글로불린 HC 또는 LC 또는 CCL-2 분자의 전사 단위는 하기의 기능적 요소들:The transcription unit of each immunoglobulin HC or LC or CCL-2 molecule has the following functional elements:

- 뮤린 면역글로불린 중쇄 신호 서열, 및- a murine immunoglobulin heavy chain signal sequence, and

- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGH pA)을 포함하였다.- contained bovine growth hormone polyadenylation sequence (BGH pA).

이의 VH 및 VL을 기반으로 한 각각의 항체 1A4, 1A5, 1G9, 2F6, CNTO888, 뮤린 및 인간화 11K2, ABN912가 카파 경쇄를 가진 IgG1 PGLALA/작동체 침묵형 Fc 및 IgG1 야생형으로서 생성되었다.Antibodies 1A4, 1A5, 1G9, 2F6, CNTO888, murine and humanized 11K2, ABN912, respectively, based on their VH and VL were generated as IgG1 PGLALA/effector silenced Fc and IgG1 wildtype with kappa light chain.

일시적인 발현 및 정제Transient expression and purification

F17 배지(인비트로젠(Invitrogen Corp.))에서 배양된 HEK293 세포(인간 배아 신장 세포주 293 유래)의 일시적 형질감염에 의해 재조합 생성을 실시하였다. 단일클론 항체의 생성을 위해, 세포를 각각의 면역글로불린 중쇄 및 경쇄를 함유하는 플라스미드로 공동 형질감염시켰다. 형질감염을 위해, "293-펙틴" 형질감염 시약(인비트로젠)을 사용하였다. 제조업체의 지침에 명시된 바와 같이 형질감염을 실시하였다. 세포 배양 상청액을 형질감염 3 내지 7(3-7)일에 회수하였다. 상층액은 감소된 온도(예컨대, -80°C)에서 보관하였다.Recombinant production was performed by transient transfection of HEK293 cells (derived from human embryonic kidney cell line 293) cultured in F17 medium (Invitrogen Corp.). For production of monoclonal antibodies, cells were co-transfected with plasmids containing the respective immunoglobulin heavy and light chains. For transfection, "293-Pectin" transfection reagent (Invitrogen) was used. Transfection was performed as specified in the manufacturer's instructions. Cell culture supernatants were harvested 3-7 (3-7) days of transfection. The supernatant was stored at a reduced temperature (eg -80 °C).

예컨대, HEK293 세포에서 인간 면역글로불린의 재조합 발현에 관한 일반 정보는: Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203에 제시되었다.For general information regarding recombinant expression of human immunoglobulins in, eg, HEK293 cells, see: Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203.

항체는 맙셀렉트슈어-세파로스(MabSelectSure-Sepharose)TM(GE 헬스케어(Healthcare), 스웨덴 소재) 및 수퍼덱스(Superdex) 200 크기 배제(GE 헬스케어, 스웨덴 소재) 크로마토그래피를 사용한 친화성 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 간단히 말해서, 무균 여과된 세포 배양 상층액을 PBS 완충액(10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl 및 2.7 mM KCl, pH 7.4)으로 평형화된 맙셀렉트슈어 수지 상에서 포획하고, 평형화 완충액으로 세척한 후, 25 mM의 구연산염, pH 3.0으로 용출하였다. 용출된 단백질 분획을 취합하고, 2M 트리스(Tris), pH 9.0으로 중화하고, 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0으로 평형화된 수퍼덱스 200 26/60 GL(GE 헬스케어, 스웨덴 소재) 컬럼을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 크기 배제 크로마토그래피 분획을 CE-SDS(캘리퍼 라이프 사이언스(Caliper Life Science), USA 소재)로 분석하고, 항체 함유 분획을 취합하여 -80°C에서 보관하였다. Antibodies were subjected to affinity chromatography using MabSelectSure-Sepharose™ (GE Healthcare, Sweden) and Superdex 200 size exclusion (GE Healthcare, Sweden) chromatography was purified from the cell culture supernatant by Briefly, sterile filtered cell culture supernatants were captured on MabSelectSure resin equilibrated with PBS buffer (10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl and 2.7 mM KCl, pH 7.4), washed with equilibration buffer, and then , eluted with 25 mM citrate, pH 3.0. The eluted protein fractions were pooled, neutralized with 2M Tris, pH 9.0, and equilibrated with 20 mM histidine, 140 mM NaCl, pH 6.0 on a Superdex 200 26/60 GL (GE Healthcare, Sweden) column. was used for further purification by size exclusion chromatography. Size exclusion chromatography fractions were analyzed by CE-SDS (Caliper Life Science, USA), and antibody-containing fractions were pooled and stored at -80 °C.

재조합 CCL2의 생성Generation of recombinant CCL2

"야생형 CCL-2"는 단량체로 존재할 수 있지만, 실제로 생리학적 농도에서 이량체를 형성할 수도 있다. 상기 단량체-이량체 평형은 상이할 수 있으며, 상이한 농도가 사용될 수 있는 기재된 모든 시험관 내 실험에 대해 신중하게 고려해야 한다. 불확실성을 피하기 위해, 점 돌연변이된 CCL2 변이체를 생성하였다: CCL2의 P8A 변이체는 이량체화 계면에 돌연변이를 수반하여, 정의된 순수한 CCL2 단량체로 이어지는 이량체를 형성할 수 없다. 이와 대조적으로, CCL2의 T10C 변이체는 CCL2의 고정된 이량체를 생성한다(J Am Chem Soc.　2013 Mar 20;135(11):4325-32)."Wild-type CCL-2" may exist as a monomer, but may actually form dimers at physiological concentrations. The above monomer-dimer equilibria may be different and should be carefully considered for all in vitro experiments described, in which different concentrations may be used. For the avoidance of doubt, point mutated CCL2 variants were generated: the P8A variant of CCL2 carries mutations at the dimerization interface, which cannot form dimers leading to the defined pure CCL2 monomer. In contrast, the T10C variant of CCL2 produces an immobilized dimer of CCL2 (J Am Chem Soc. 2013 Mar 20;135(11):4325-32).

각각의 가용성 CCL2 단백질(야생형, P8A 또는 T10C 변이체)을 SP-세파로스 HP(GE 헬스케어, 스웨덴 소재) 및 수퍼덱스 200 크기 배제(GE 헬스케어, 스웨덴 소재) 크로마토그래피를 사용하는 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 간단히 말해서, 멸균 여과된 세포 배양 상청액을 10 mM KH2PO4, pH 5.0으로 희석하여 전도도를 < 4 mS/cm으로 조정하였다. 희석된 상청액을 10 mM KH2PO4, pH 5.0으로 평형화된 SP-세파로스 수지에 로딩하고, 평형화 완충액으로 세척하고, 10 mM KH2PO4, 1M NaCl, pH 5.0으로의 구배를 사용하여 용출하였다. 용출된 단백질 분획을 취합하고, 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0으로 평형화된 수퍼덱스 200 16/60 GL(GE 헬스케어, 스웨덴 소재) 컬럼을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 크기 배제 크로마토그래피 분획을 SDS-PAGE 및 분석용 고성능 크기 배제 크로마토그래피로 분석하였다. CCL2 함유 분획을 취합하여 -80°C에서 보관하였다. Cation exchange chromatography of each soluble CCL2 protein (wild-type, P8A or T10C variant) using SP-Sepharose HP (GE Healthcare, Sweden) and Superdex 200 size exclusion (GE Healthcare, Sweden) chromatography was purified from the cell culture supernatant by Briefly, the conductivity was adjusted to <4 mS/cm by diluting the sterile filtered cell culture supernatant with 10 mM KH2PO4, pH 5.0. The diluted supernatant was loaded onto SP-Sepharose resin equilibrated with 10 mM KH2PO4, pH 5.0, washed with equilibration buffer and eluted using a gradient to 10 mM KH2PO4, 1M NaCl, pH 5.0. Eluted protein fractions were pooled and further purified by size exclusion chromatography using a Superdex 200 16/60 GL (GE Healthcare, Sweden) column equilibrated with 20 mM histidine, 140 mM NaCl, pH 6.0. . Size Exclusion Chromatography Fractions were analyzed by SDS-PAGE and analytical high performance size exclusion chromatography. CCL2-containing fractions were pooled and stored at -80 °C.

기능적 특성화(결합)Functional characterization (combination)

T200 기기에는 비아코어 시리즈 S 센서 칩(Biacore Series S Sensor Chip) CM5가 장착되었다. 시스템 완충액은 HBS-ET(10 mM HEPES(pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.05 %(w/v) 트윈(Tween)® 20)였다. 시스템은 37°C로 설정하였다. 각 측정에 대해, 샘플 완충액은 1 mg/ml CMD(카르복시메틸덱스트란(Carboxymethyldextran), 플루카(Fluka))가 추가로 보충된 시스템 버퍼를 사용하였다. The T200 device is equipped with the Biacore Series S Sensor Chip CM5. The system buffer was HBS-ET (10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.05% (w/v) Tween® 20). The system was set to 37 °C. For each measurement, the sample buffer was a system buffer supplemented with 1 mg/ml CMD (Carboxymethyldextran, Fluka).

항체 포획 시스템이 구축되었다. 14000 GARFcγ(염소 항토끼 Fcγ), 111-005-046, 잭슨 면역연구소(Jackson ImmunoResearch))을 제조업체가 설명한 바와 같이 EDC/NHS 커플링에 의해 10 mM 아세트산나트륨 완충액 pH 5.0에서 25 μg/ml, 25°C에서 고정화하였다. HBS 완충액(100 mM HEPES pH 7.4, 1.5 M NaCl, 0.05%(w/v) 트윈 20)을 20 μl/분으로 15초간 주입, 10 mM 글리신 완충액 pH 2.0을 1분간 주입에 이어서, 10 mM 글리신 완충액 pH 2.25를 1분간 2회 주입하여 포획 시스템을 재생시켰다. 다른 구현예에서, 뮤린 단일클론 항체는 12700 RU 다중클론 토끼 항 마우스(RAMIgG, GE 헬스케어) 항체를 상술한 바와 같은 비아코어 시리즈 CM5 센서 상에 고정화함으로써 바이오센서 상에 포획하였다. 센서는 10 mM 글리신 완충액 pH 1.7의 3분간 주입하여 재생시켰다.An antibody capture system was constructed. 14000 GARFcγ (goat anti-rabbit Fcγ), 111-005-046, 25 μg/ml, 25 μg/ml in 10 mM sodium acetate buffer pH 5.0 by EDC/NHS coupling as described by the manufacturer. It was immobilized at °C. HBS buffer (100 mM HEPES pH 7.4, 1.5 M NaCl, 0.05% (w/v) Tween 20) was injected at 20 μl/min for 15 s, 10 mM glycine buffer pH 2.0 was injected for 1 min, followed by 10 mM glycine buffer The capture system was regenerated by two injections of pH 2.25 for 1 minute. In another embodiment, a murine monoclonal antibody was captured on a biosensor by immobilizing a 12700 RU polyclonal rabbit anti-mouse (RAMIgG, GE Healthcare) antibody onto a Biacore series CM5 sensor as described above. The sensor was regenerated by injection of 10 mM glycine buffer pH 1.7 for 3 min.

항체 클론 상층액을 시스템 완충액에서 1:2로 희석하고 5 μl/분으로 1분 동안 포획하였다. 항체 포획 후, 시스템을 2.5배 농축된 시스템 완충액으로 80 μl/분으로 30초 동안 세척한 후, 2분 간의 기준선 안정화를 실시하였다. 분석물 동역학을 30 μl/분으로 실시하였다. 인간 CCL2 또는 단량체 CCL2 P8A 변이체 CCL2를 포함하는 용액 내 분석물을 사용하였다. 분석물은 90 nM 최고 농도로 주입하였다. 분석물 접촉 시간은 3분이었고 해리 시간은 10분이었다. 비아이밸류에이션(Biaevaluation) 소프트웨어 V.3.0은 제조업체 GEHC의 지침에 따라 사용하였다. RMAX 로컬을 사용하는 1:1 결합 모델을 적용하여 운동 속도를 분명하게 추정하였다. Antibody clone supernatants were diluted 1:2 in system buffer and captured at 5 μl/min for 1 min. After antibody capture, the system was washed with 2.5-fold concentrated system buffer at 80 μl/min for 30 sec, followed by baseline stabilization for 2 min. Analyte kinetics were run at 30 μl/min. Analytes in solution containing human CCL2 or monomeric CCL2 P8A variant CCL2 were used. The analyte was injected at the highest concentration of 90 nM. The analyte contact time was 3 minutes and the dissociation time was 10 minutes. Biaevaluation software V.3.0 was used according to manufacturer GEHC's guidelines. A 1:1 coupled model using the RMAX local was applied to unambiguously estimate the kinetic velocity.

야생형(wt) 인간 CCL2 및 인간 CCL2 P8A 변이체(단량체)에 대한 항체의 결합Binding of antibodies to wild-type (wt) human CCL2 and human CCL2 P8A variants (monomers)

SPR 분석 I로부터 수득한 pH 의존적 CCL2 결합 동역학의 요약Summary of pH-dependent CCL2 binding kinetics obtained from SPR assay I

T200 기기에는 비아코어 시리즈 S 센서 칩(Biacore Series S Sensor Chip) CM5가 장착되었다. 시스템 완충액은 HBS-ET(10 mM HEPES(pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.05 %(w/v) 트윈(Tween)® 20)였다. 다른 구현예들에서, 시스템 완충액의 pH는 pH 8.3, pH 7.9, pH 7.4, pH 7.1, pH 6.7, pH 6.3, pH 5.9, pH 5.5로 설정하였다. 시스템은 25°C로 설정하였다. 각 측정에 대해, 샘플 완충액은 1 mg/ml CMD(카르복시메틸덱스트란(Carboxymethyldextran), 플루카(Fluka))가 추가로 보충된 시스템 버퍼를 사용하였다. The T200 device is equipped with the Biacore Series S Sensor Chip CM5. The system buffer was HBS-ET (10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.05% (w/v) Tween® 20). In other embodiments, the pH of the system buffer is set to pH 8.3, pH 7.9, pH 7.4, pH 7.1, pH 6.7, pH 6.3, pH 5.9, pH 5.5. The system was set at 25 °C. For each measurement, the sample buffer was a system buffer supplemented with 1 mg/ml CMD (Carboxymethyldextran, Fluka).

항체 포획 시스템이 구축되었다. 13000 MAb<h-Fc-pan>M-R10Z8E9-IgG(로슈(Roche))를 제조업체가 설명한 바와 같이 EDC/NHS 커플링에 의해 10 mM 아세트산나트륨 완충액 pH 5.0에서 18 μg/ml로 25℃에서 고정화시켰다. HBS 완충액(100 mM HEPES pH 7.4, 1.5 M NaCl, 0.05%(w/v) 트윈 20)을 20 μl/분으로 주입, 10 mM NaOH를 1분 15초간 주입 및 10 mM 글리신 완충액 pH 2.5를 1분간 주입하여 포획 시스템을 재생시켰다. 항체는 각각의 시스템 완충액에 희석된 80 nM 농도에서 10 μl/분으로 30초 동안 주입하였다. 항체 포획 후, 시스템을 2.5배 농축된 시스템 완충액으로 50 μl/분으로 30초 동안 세척한 후, 2분 간의 기준선 안정화를 실시하였다. 농도 의존적 분석물 시리즈는 0 nM(완충액 대조군)에서부터 0.4 nM, 1.1 nM, 2회 주입의 3.3 nM, 30 nM에 이르기까지 1:3 희석 단계로 주입하였다. 분석물 접촉 시간은 3분이었고 해리 시간은 10분이었다. 분석물 동역학은 50 μl/min에서 실시하였다. An antibody capture system was constructed. 13000 MAb<h-Fc-pan>M-R10Z8E9-IgG (Roche) was immobilized at 25 °C at 18 µg/ml in 10 mM sodium acetate buffer pH 5.0 by EDC/NHS coupling as described by the manufacturer. did it Inject HBS buffer (100 mM HEPES pH 7.4, 1.5 M NaCl, 0.05% (w/v) Tween 20) at 20 μl/min, 10 mM NaOH for 1 min 15 s, and 10 mM glycine buffer pH 2.5 for 1 min. The capture system was regenerated by injection. Antibodies were injected at a concentration of 80 nM diluted in each system buffer at 10 μl/min for 30 seconds. After antibody capture, the system was washed with 2.5-fold concentrated system buffer at 50 μl/min for 30 sec, followed by baseline stabilization for 2 min. The concentration-dependent analyte series was injected in 1:3 dilution steps ranging from 0 nM (buffer control) to 0.4 nM, 1.1 nM, 3.3 nM in 2 injections, 30 nM. The analyte contact time was 3 minutes and the dissociation time was 10 minutes. Analyte kinetics was performed at 50 μl/min.

인간 항체는 센서 표면에 리간드로서 포착되었다: Human antibodies were captured as ligands on the sensor surface:

· 양성 대조군으로서의 인간 정상 IgG(H-N-IgG, Id.: 11717570, 로슈),Human normal IgG (H-N-IgG, Id.: 11717570, Roche) as positive control,

· 항 인간 CCL2 mAb(인간화 11k2: CCL2-0002),Anti-human CCL2 mAb (humanized 11k2: CCL2-0002),

· 항 인간 CCL2 mAb(AB912, CCL2-0003), 및 Anti-human CCL2 mAb (AB912, CCL2-0003), and

· 항 인간 CCL2 mAb(CNTO888, CCL2-0004);• anti human CCL2 mAb (CNTO888, CCL2-0004);

· 음성 대조군으로서의 시스템 완충액.· System buffer as negative control.

비아이밸류에이션 소프트웨어 V.3.0은 제조업체 GEHC의 지침에 따라 사용하였다. R_MAX 로컬을 사용하는 1:1 결합 모델을 적용하여 운동 속도를 결정하였다.BI Valuation software V.3.0 was used according to the manufacturer's GEHC guidelines. A 1:1 binding model using R _MAX local was applied to determine the kinetic velocity.

교차 반응성 CCL 동족체 Cross-reactive CCL homologs CCL2(MCP-1)는 CCL7(MCP-3), CCL8(MCP-2), CCL13(MCP-4)과 높은 상동성을 갖고, 이들 CCL 케모카인은 CCR2에 결합할 수 있으며, 이러한 상동체에 대한 항-CCL2 항체의 결합을 평가하였다. 결과는 도 1에서 도시된다. CCL2에 대한 선택성을 갖는 것으로 기재된 CNTO888을 제외하고(Mol Immunol. 2012 Jun;51(2):227-33), 시험된 다른 항체들은 CCL7 또는 CCL8에 결합하였다(CCL7 또는 CCL8에 대해 교차 반응성을 나타냄).CCL2 (MCP-1) has high homology with CCL7 (MCP-3), CCL8 (MCP-2), and CCL13 (MCP-4), and these CCL chemokines can bind to CCR2, Binding of anti-CCL2 antibodies was assessed. The results are shown in FIG. 1 . With the exception of CNTO888, which was described as having selectivity for CCL2 (Mol Immunol. 2012 Jun; 51(2):227-33), the other antibodies tested bound to CCL7 or CCL8 (which showed cross-reactivity to CCL7 or CCL8). ).

비아코어 분석 방법: CCL 동족체, 예컨대 CCL2(MCP-1), CCL8(MCP-2), CCL7(MCP-3) 및 CCL13(MCP-4)에 대한 항-CCL2 항체의 결합은 비아코어 T200 기기(GE 헬스케어)를 사용하여 25°C에서 평가하였다. 마우스 항 인간 IgG(Fc)(GE 헬스케어)를 제조사의 권장된 설정에 따라 아민 커플링 키트(GE 헬스케어)를 사용하여 CM4 센서 칩의 각 플로우 셀에 고정시켰다. 항체 및 분석물을 ACES pH 7.4 완충액(20 mM ACES, 150 mM NaCl, 1 mg/ml BSA, 0.05% 트윈 20, 0.005% NaN3)으로 희석하였다. 항체를 항 Fc 센서 표면 상에 포획한 다음, 재조합 인간 CCL 동족체 단백질을 5 nM 및 20 nM의 유동 세포에 걸쳐 주입하였다. 야생형 CCL2(MCP-1), CCL8(MCP-2), CCL7(MCP-3) 및 CCL13(MCP-4)은 R&D 시스템즈(Systems) 사에서 상업적으로 입수 가능한 반면, 단량체 CCL2(P8A 변이체)는 자체적으로 생성된 항원이었다. 센서 표면은 3M MgCl2로 각 주기마다 재생시켰다. 결합 센서그램은 비아코어 T200 평가 소프트웨어 버전 2.0(GE 헬스케어)을 사용하여 처리하였다.Biacore Assay Method: Binding of anti-CCL2 antibodies to CCL homologues such as CCL2 (MCP-1), CCL8 (MCP-2), CCL7 (MCP-3) and CCL13 (MCP-4) is performed on the Biacore T200 instrument ( GE Healthcare) at 25 °C. Mouse anti-human IgG (Fc) (GE Healthcare) was immobilized in each flow cell of a CM4 sensor chip using an amine coupling kit (GE Healthcare) according to the manufacturer's recommended settings. Antibodies and analytes were diluted with ACES pH 7.4 buffer (20 mM ACES, 150 mM NaCl, 1 mg/ml BSA, 0.05% Tween 20, 0.005% NaN3). Antibodies were captured on the anti-Fc sensor surface and then recombinant human CCL homolog protein was injected over 5 nM and 20 nM flow cells. Wild-type CCL2 (MCP-1), CCL8 (MCP-2), CCL7 (MCP-3) and CCL13 (MCP-4) are commercially available from R&D Systems, whereas monomeric CCL2 (P8A variant) is It was an antigen produced by The sensor surface was regenerated at each cycle with 3M MgCl2. Binding sensorgrams were processed using Biacore T200 evaluation software version 2.0 (GE Healthcare).

기능적 특성화(생물학적)Functional characterization (biological)

CCR2 신호전달 I - 칼슘 흐름 분석 CCR2 Signaling I - Calcium Flow Assay

THP-1(인간 급성 단핵구 백혈병 세포주; ATCC TIB-202) 세포를 RPMI 1640, 10% FBS, 1 mM 피루브산나트륨, 10 mM HEPES, 50 μM ß-메르캅토에탄올(공급업체 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))에서 배양하였다. 분석 당일에 세포 밀도를 25.8 ml 분석 배지(RPMI 1640 w/o FBS)에서 8.33 x 10⁵개 세포/ml로 조정하였다. FLIPR® 칼슘 칼슘 4 분석 키트, Cat# R8142, THP-1 (human acute monocytic leukemia cell line; ATCC TIB-202) cells were transfected with RPMI 1640, 10% FBS, 1 mM sodium pyruvate, 10 mM HEPES, 50 μM β-mercaptoethanol (supplier Thermo Fisher Scientific). Scientific)). On the day of the assay, the cell density was adjusted to 8.33×10 ⁵ cells/ml in 25.8 ml assay medium (RPMI 1640 w/o FBS). FLIPR® Calcium Calcium 4 Assay Kit, Cat# R8142,

제조업체 몰레큘라 디바이스의 지침에 따라 성분 A의 2개 바이알을 20 mM의 성분 B(HBSS 완충액 + 20 mM HEPES, pH 7.4)와 혼합하여 염료 로딩 용액을 제조하였다. 516 μl 1M 헤페스(Hepes, 최종 분석 농도: 10 mM)를 첨가한 다음, 516 μl 250 mM 프로베네시드(최종 분석 농도: 2.5 mM)를 첨가하였다. 스톡 솔루션의 경우 65.4mg 프로베네시드(시그마(Sigma) P8761)를 465 μl 1N NaOH에 용해하고 465 μl 1x HBSS(써모 피셔 사이언티픽)를 첨가하였다. 25.8 ml 로딩 완충액을, 예컨대 4개의 미세역가 플레이트(52.6 ml의 부피 필요, 10⁶ THP-1/ml)에 충분한 세포를 갖는 25.8 ml 분석 배지에 혼합하였다. 로딩 완충액 내 120 μl 세포 현탁액을 흑색 F-바닥 96-웰 세포 배양 플레이트의 각 웰로 옮겼다. 플레이트를 실온에서 3~4시간 동안 항온처리하였다. The dye loading solution was prepared by mixing two vials of component A with 20 mM component B (HBSS buffer + 20 mM HEPES, pH 7.4) according to the manufacturer's Molecular Devices instructions. 516 μl 1M Hepes (final assay concentration: 10 mM) was added followed by addition of 516 μl 250 mM probenecid (final assay concentration: 2.5 mM). For stock solution 65.4 mg probenecid (Sigma P8761) was dissolved in 465 μl 1N NaOH and 465 μl 1x HBSS (Thermo Fisher Scientific) was added. 25.8 ml loading buffer is mixed into 25.8 ml assay medium with enough cells for eg 4 microtiter plates (requires volume of 52.6 ml, 10 ⁶ THP-1/ml). 120 μl cell suspension in loading buffer was transferred to each well of a black F-bottom 96-well cell culture plate. Plates were incubated at room temperature for 3-4 hours.

그 동안에, 항체 및 리간드 용액을 준비하였다. 30 μg/ml 내지 0.025 μg/ml(연속 희석 없음, 웰의 최종 농도)의 8가지 농도의 각 항체를 시험하였다. 각 농도를 2개의 플레이트에서 시험하였다. 모든 희석액은 10배 농축 용액으로서 분석 배지에서 제조하였다. 참조 항체로서 인간 CCL2/JE/MCP-1 항체(R&D 시스템즈 Cat# MAB279)를 사용하였다. 리간드 CCL2(R&D 시스템즈 Cat#279-MC-10)는 500 μl RPMI 1640(100 μg/ml)에 50 μg CCL2 동결건조물을 용해하고, 400 μl를 10 ml 분석 배지(4 μg/ml 모액)에 옮겨서 준비하였다. 자극 대조군으로서 이오노마이신(시그마 Cat# I-0634)을 사용하였다(1340 μl DMSO(시그마 Cat# D-8779), 1 mM에 용해된 1 mg 이오노마이신). 10 μl의 1 mM 모액을 1990 μl 분석 배지(5 μM, 최종 분석 농도 500 nM)에 희석하였다. 100 μl를 폴리프로필렌 MTP의 해당 대조 웰에 피펫팅하였다.In the meantime, antibody and ligand solutions were prepared. Eight concentrations of each antibody were tested from 30 μg/ml to 0.025 μg/ml (no serial dilutions, final concentration in wells). Each concentration was tested on two plates. All dilutions were prepared in assay medium as 10-fold concentrated solutions. Human CCL2/JE/MCP-1 antibody (R&D Systems Cat# MAB279) was used as a reference antibody. Ligand CCL2 (R&D Systems Cat#279-MC-10) was dissolved in 50 μg CCL2 lyophilisate in 500 μl RPMI 1640 (100 μg/ml), and 400 μl was transferred to 10 ml assay medium (4 μg/ml stock solution). prepared. Ionomycin (Sigma Cat# I-0634) was used as stimulation control (1340 μl DMSO (Sigma Cat# D-8779), 1 mg ionomycin dissolved in 1 mM). 10 μl of 1 mM stock solution was diluted in 1990 μl assay medium (5 μM, final assay concentration 500 nM). 100 μl was pipetted into the corresponding control wells of polypropylene MTP.

항체 희석액 및 CCL2를 2개의 V자형 폴리프로필렌 96웰 플레이트에서 사전 배양하였다. 50 μl의 4 μg/ml 모액 CCL2(최종 400 ng/ml CCL2) 및 50 μl의 10배 농축된 항체 희석액을 웰에 피펫팅하였다. 플레이트를 실온에서 30~60분 동안 항온처리하였다.Antibody dilutions and CCL2 were pre-incubated in two V-shaped polypropylene 96-well plates. 50 μl of 4 μg/ml stock CCL2 (final 400 ng/ml CCL2) and 50 μl of 10-fold concentrated antibody dilution were pipetted into the wells. Plates were incubated at room temperature for 30-60 minutes.

항온 처리 후, 세포 플레이트 및 화합물 플레이트를 플렉스스테이션(FlexStation)® 3(몰레큘라 디바이스) 판독 위치로 직접 옮기고, 시스템 설명서(여기 485 nm, 방출 525 nm)에 기재된 바와 같이 칼슘 분석을 실시하였다. 판독은 몇 초 간격으로 실시하였다.After incubation, the cell plate and compound plate were transferred directly to the FlexStation® 3 (Molecular Device) reading position and calcium assays were performed as described in the system instructions (excitation 485 nm, emission 525 nm). Readings were made every few seconds.

결과:result:

표 1: 40 ng/ml PMA 및 4 μM 이오노마이신을 양성 대조군으로서 사용하였다. 표는 n=2의 EC₅₀의 평균을 포함한다. Table 1: 40 ng/ml PMA and 4 μM ionomycin were used as positive controls. The table contains the mean of EC ₅₀ for n=2.

단핵구에서 발현되는 CCR2 수용체의 CCL2 유도 내재화를 억제하는 항-CCL2 항체의 효능 Efficacy of anti-CCL2 antibodies to inhibit CCL2-induced internalization of CCR2 receptors expressed in monocytes

골수 세포에서 리간드 유도 CCR2 내재화를 방지하기 위해, 시험관내 분석을 설정하고 항-CCL2 항체를 특성화하였다. 상용 키트(스템셀(Stemcell), cat no. #15068)를 사용하여 자기 분리에 의해 건강한 기증자의 말초 혈액으로부터 단핵구를 분리하였다. FcRs 차단을 위해, 단핵구를 FACS 완충액(PBS + 0.2%BSA) 내 얼음 위에서 정상 인간 IgG(프리비겐(Privigen), CSL 베링(Behring))와 함께 최종 농도 500 μg/ml로 50분 동안 사전 배양하였다. 그런 다음, 세포를 10분 동안 원심분리하고(300xg, 4°C), FACS 완충액으로 한 번 더 세척한 후 얼음 위에 보관하였다. 항-CCL2 항체 희석액(각각 50 μl)을 96개의 U 바닥 웰(BD)에서 제조하였다(4°C 및 37°C에서 병렬 접근). 단핵구를 분할하고, 배지(RPMI 1640; 10%FCS; 2 mM L-글루타민)에 재현탁한 후, 추가 사용 때까지 각각 4°C 및 37°C에서 배양하였다. 재조합 CCL2(50 μl; 100 ng/ml의 최종 농도에서)를 4°C 및 37°C 모두에서 준비된 항체 희석액(가변 농도에서)에 첨가하였다. 100 μl 단핵구 현탁액(2x10⁵ 세포/웰)을 200 μl의 총 부피로 CCL2/항-CCL2 혼합물에 첨가하고 세포를 4°C 및 37°C에서 1시간 30분 동안 배양한 후, 300xg, 4°C에서 원심분리하였다. 이제부터 모든 단계는 미리 냉각된 완충액으로 실시하였다. 세포를 250 μl FACS 완충액으로 세척하고, 추가로 세포를 CCR2 수용체에 대해 염색하였다(상용 CCR2-APC 접합체 또는 표준 FACS 프로토콜에 따른 적절한 동형 ctrl-APC를 사용: 분취량을 CD192(CCR2) APC(바이오레전드(BioLegend), #357208, 클론 K036C2/mIgG2a) 및 적절한 동형 ctrl 항체를 사용하여 5 μl/10⁶세포로 염색하였다: 20 μl/10⁶세포 mIgG2a k APC BD 바이오사이언스, #400222, 클론 MOPC-173).To prevent ligand-induced CCR2 internalization in bone marrow cells, an in vitro assay was set up and anti-CCL2 antibodies were characterized. Monocytes were isolated from peripheral blood of healthy donors by magnetic separation using a commercial kit (Stemcell, cat no. #15068). For FcRs blocking, monocytes were pre-incubated with normal human IgG (Privigen , CSL Behring) on ice in FACS buffer (PBS + 0.2%BSA) to a final concentration of 500 μg/ml for 50 min. . The cells were then centrifuged (300xg, 4 °C) for 10 min, washed once more with FACS buffer and stored on ice. Anti-CCL2 antibody dilutions (50 µl each) were prepared in 96 U bottom wells (BD) (parallel access at 4 °C and 37 °C). Monocytes were split, resuspended in medium (RPMI 1640; 10% FCS; 2 mM L-glutamine), and then incubated at 4 °C and 37 °C, respectively, until further use. Recombinant CCL2 (50 μl; at a final concentration of 100 ng/ml) was added to prepared antibody dilutions (at variable concentrations) at both 4 °C and 37 °C. Add 100 µl monocyte suspension (2x10 ⁵ cells/well) to the CCL2/anti-CCL2 mixture in a total volume of 200 µl and incubate the cells at 4 °C and 37 °C for 1.5 h, 300xg, 4 °C. C was centrifuged. All steps from now on were performed with pre-chilled buffer. Cells were washed with 250 μl FACS buffer and further cells were stained for CCR2 receptor (using a commercial CCR2-APC conjugate or the appropriate isoform ctrl-APC according to standard FACS protocol: aliquots were aliquoted with CD192(CCR2) APC (bio Legend (BioLegend, #357208, clone K036C2/mIgG2a) and stained with 5 μl/10 ⁶ cells using the appropriate isotype ctrl antibody: 20 μl/10 ⁶ cells mIgG2a k APC BD Bioscience, #400222, clone MOPC- 173).

그런 다음, FACS 칸토(Canto) II에서 수용체 발현을 분석하고 CCR2 내재화를 하기와 같이 계산하였다:Then, receptor expression was analyzed in a FACS Canto II and CCR2 internalization was calculated as follows:

· 내재화 없음: 리간드 배양 없이 분석된 세포(rec. CCL2).· No internalization: cells assayed without ligand culture (rec. CCL2).

· 100% 내재화: 이전에 rec. CCL2와 함께 배양된 세포에서 최대 감소된 CCR2 발현 수준· 100% internalization: previously rec. Maximum reduced CCR2 expression level in cells incubated with CCL2

인간 THP-1 세포에 대한 CCL2 매개 주화성의 억제Inhibition of CCL2-mediated chemotaxis on human THP-1 cells

CCL2 구배를 향한 CCR2⁺ THP1 세포의 이동은 하기와 같이 시험하였다. 단핵구 THP1 세포(ATCCⓒ TIB-202™)를 FCS 및 L-글루타민이 보충된 RPM1 1640 배지(PAN, cat. no. P04-17500)에서 배양하였다. 세포를 이동 분석에 사용하기 전에 일반적으로 2 내지 3회 계대 배양하였고, FSC 함량이 감소된 배지에서 밤새 기아 상태를 유지하였다(10% FCS 대신 1.5%). 세포를 계수하고 10 μg/ml의 정상 인간 IgG(인비트로젠, cat.no.# 12000; FcgR 차단용)와 함께 실온에서 15분 동안 배양하였다.Migration of CCR2 ⁺ THP1 cells towards the CCL2 gradient was tested as follows. Monocyte THP1 cells (ATCC© TIB-202™) were cultured in RPM1 1640 medium (PAN, cat. no. P04-17500) supplemented with FCS and L-glutamine. Cells were typically passaged 2-3 times prior to use in migration assays and were starved overnight in medium with reduced FSC content (1.5% instead of 10% FCS). Cells were counted and incubated with 10 μg/ml normal human IgG (Invitrogen, cat.no.#12000; for FcgR blocking) for 15 min at room temperature.

한편, 항-CCL2 항체(및/또는 대조군)는 25 ng/ml의 rhCCL-2(R&D 시스템즈, cat. no. #279-MC)를 갖는 무혈청 배지를 함유한 HTS 트랜스웰(Transwell) 96웰 플레이트 시스템(코닝(Corning), cat.no. #3386; 3 μm 기공 크기)의 하부 챔버에 첨가하였다. 그런 다음, 삽입 플레이트를 하부 챔버 플레이트에 붙이고, 상기 언급한 세포 현탁액(IgG 블록을 포함) 75 μl(1.5x10⁵개 세포)를 5 μg/ml의 항체/동형의 유무에 관계없이 각 삽입물에 첨가하였다. 플레이트를 덮고 CO2 배양기(5% CO2)에서 37°C에서 밤새 배양하였다. On the other hand, anti-CCL2 antibody (and/or control) was administered to 96-well HTS Transwells containing serum-free medium with 25 ng/ml of rhCCL-2 (R&D Systems, cat. no. #279-MC). was added to the lower chamber of the plate system (Corning, cat.no. #3386; 3 μm pore size). Then, attach the insert plate to the lower chamber plate and add 75 µl (1.5x10 ⁵ cells) of the above-mentioned cell suspension (containing IgG block) to each insert with or without 5 µg/ml antibody/isotype did. Cover the plate and incubate overnight at 37 °C in a CO incubator (5% CO).

삽입 플레이트를 제거하고 세포-타이터-글로(Cell-titer-glo) 기질(프로메가(Promega), cat.no. # G758)을 하부 챔버 플레이트의 각 웰에 첨가하여 이동된 세포의 생존력을 측정하였다. 300 rpm의 쉐이커(shaker)에서 1시간 동안 배양한 후(커버 플레이트 밀봉), 각 웰 200 μl를 마이크로플루오르(Microfluor) 블랙 96웰 플레이트(VWR, cat.no.# 735-0527)로 옮기고 발광성을 측정하였다(발광- 리더, 예컨대 바이오-테크(Bio-Tek), 테칸(Tecan)). 배수 변화는 IgG 대조군 항체 및 항-CCL2 항체를 갖는 이동된 세포(세포 타이터-글로, RLU)의 수 사이의 비율로서 계산하였다. 하기의 표 2에는 조건당 5~10회 반복한 결과를 도시한다:The viability of the migrated cells was measured by removing the insert plate and adding Cell-Titer-glo substrate (Promega, cat.no. # G758) to each well of the lower chamber plate. did. After incubation for 1 h in a shaker at 300 rpm (cover plate sealed), 200 μl of each well was transferred to a Microfluor black 96-well plate (VWR, cat.no.#735-0527) and luminescence was measured. were measured (luminescence-readers such as Bio-Tek, Tecan). Fold change was calculated as the ratio between the number of migrated cells (Cell Titer-Glo, RLU) with IgG control antibody and anti-CCL2 antibody. Table 2 below shows the results of 5 to 10 repetitions per condition:

표 2Table 2

마우스에서 단일특이적(단일 파라토프) 항-CCL2 항체를 사용한 인간 CCL2 면역 복합체 스위핑에 대한 평가Evaluation of Human CCL2 Immune Complex Sweeps Using Monospecific (Single Paratope) Anti-CCL2 Antibodies in Mice

단일 파라토프 항체가 야생형 인간 CCL2와 함께 면역 복합체를 형성하는 능력을 평가하기 위해, 항-CCL2 단일 파라토프 항체(20 mg/kg) 및 야생형 인간 CCL2(0.1 mg/kg)로 구성된 미리 형성된 면역 복합체를 10 ml/kg의 단일 용량으로 인간 FcRn 형질전환 마우스(B6.Cg-Fcgrt ^tm1DcrTg(FCGRT)32Dcr/DcrJ, 잭슨 연구소(Jackson Laboratory))의 꼬리 정맥에 투여하였다. 혈액은 투여 후 5분, 7시간, 1일, 2일, 3일 및 7일에 수집하였다. 혈청은 즉시 혈액을 4℃에서 14,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 제조하였다. 혈청은 측정할 때까지 -80℃ 이하에서 보관하였다. 시험한 단일 파라토프 항체는 하기의 표 3에 나열되어 있다. SG1 Fc를 갖는 항체는 야생형과 유사한 Fc 감마 수용체 결합을 갖는 반면, SG105 Fc를 갖는 항체는 Fc 감마 수용체 결합 침묵형이다.To evaluate the ability of monoparatopic antibodies to form immune complexes with wild-type human CCL2, preformed immune complexes consisting of anti-CCL2 monoparatopic antibody (20 mg/kg) and wild-type human CCL2 (0.1 mg/kg) was administered to the tail vein of human FcRn transgenic mice (B6.Cg- Fcgrt ^tm1Dcr Tg(FCGRT)32Dcr/DcrJ, Jackson Laboratory) at a single dose of 10 ml/kg. Blood was collected at 5 minutes, 7 hours, 1 day, 2 days, 3 days and 7 days post-dose. Serum was prepared by immediately centrifuging blood at 14,000 rpm at 4° C. for 10 minutes. Serum was stored at -80°C or lower until measurement. The monoparatopic antibodies tested are listed in Table 3 below. Antibodies with SG1 Fc have Fc gamma receptor binding similar to wild-type, whereas antibodies with SG105 Fc are Fc gamma receptor binding silencing.

생체내 hCCL2 제거율에 대한 각 항-CCL2 단일 파라토프 항체의 면역 복합체 스위핑 효과는 도 2에 도시된 바와 같이 Fc 감마 수용체 결합을 갖는 항-CCL2 항체(SG1, = 원형 Fc 감마 수용체 결합을 갖는 IgG1 야생형; 실선) 및 Fc 감마 수용체 결합 침묵형(SG105, = Fc 감마 수용체 결합이 없는 IgG1; 점선)을 갖는 항-CCL2 항체를 비교함으로써 평가하였다. 각각의 도 2a 내지 도 2g는 hCCL2 및 각각의 항-CCL2 항체(2개의 상이한 Fc 부분을 포함: SG1 = 원형 Fc 감마 수용체 결합을 갖는 IgG1 야생형 및 SG105 = Fc 감마 수용체 결합이 없는 IgG1)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 FcRn 형질전환 마우스에 주입한 후 시간에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다. 항체 곡선은 피닉스(Phoenix) 64(파사이트(Pharsight)/체르타라(Certara))를 사용하여 비구획 분석에 의해 분석하였다. AUCinf는 무한대로 외삽된 선형 로그 사다리꼴 규칙에 의해 추정하였다. 제거율 값음 용량/AUCinf로 정의한다. 상기 제거율의 차이는 또한 배수 변화로 표현되었으며, 이는 Fc 감마 수용체 결합(SG1)을 갖는 항체의 hCCL2 제거율을 Fc 감마 수용체 결합 침묵형(SG105)을 갖는 항체의 hCCL2 제거율로 나눔으로써 계산한다(하기 표 3). 하기의 표 3의 데이터는 Fc 감마 수용체 결합 항체(SG1 = 원형 Fc 감마 수용체 결합을 갖는 IgG1 야생형)에 의한 인간 CCL2의 제거율이 시험된 모든 단일 파라토프 항체에 대해 Fc 감마 수용체 결합 침묵형 항체(Fc 감마 수용체 결합이 없는SG105)의 것과 유사함을 나타낸다. 이는 시험된 단일 파라토프 항체에 의한 CCL2의 면역 복합체 매개 스위핑이 효율적이지 않았음을 시사한다.The effect of immune complex sweeping of each anti-CCL2 monoparatopic antibody on hCCL2 clearance in vivo was determined as shown in FIG. 2 , as shown in FIG. ; solid line) and Fc gamma receptor binding silencing type (SG105, = IgG1 without Fc gamma receptor binding; dotted line) was evaluated by comparing anti-CCL2 antibodies. Each of Figures 2a-2g is a pre-constructed diagram of hCCL2 and each anti-CCL2 antibody (comprising two different Fc regions: SG1 = IgG1 wild-type with prototypical Fc gamma receptor binding and SG105 = IgG1 without Fc gamma receptor binding). Serum concentrations of hCCL2 over time after injection of the formed immune complexes into FcRn transgenic mice are shown. Antibody curves were analyzed by non-compartmental analysis using a Phoenix 64 (Pharsight/Certara). AUCinf was estimated by the linear log trapezoidal rule extrapolated to infinity. The removal rate value is defined as negative capacity/AUCinf. The difference in clearance was also expressed as fold change, which is calculated by dividing the hCCL2 clearance of antibodies with Fc gamma receptor binding (SG1) by the hCCL2 clearance of antibodies with Fc gamma receptor binding silencing (SG105) (Table below). 3). The data in Table 3 below shows that for all monoparatopic antibodies tested for clearance of human CCL2 by Fc gamma receptor binding antibody (SG1 = IgG1 wild type with circular Fc gamma receptor binding), Fc gamma receptor binding silencing antibody (Fc SG105) without gamma receptor binding. This suggests that immune complex mediated sweeping of CCL2 by the monoparatopic antibodies tested was not efficient.

표 3: 항-CCL2 단일특이적 항체(20 mg/kg) 및 야생형 인간 CCL2(0.1 mg/kg)(IgG1 야생형(SG1) 또는 IgG1 Fc 수용체 침묵형)의 미리 형성된 면역 복합체를 투여한 후의 야생형 CCL2의 제거율 값( SG105)Table 3: Wild-type CCL2 after administration of preformed immune complexes of anti-CCL2 monospecific antibody (20 mg/kg) and wild-type human CCL2 (0.1 mg/kg) (IgG1 wild-type (SG1) or IgG1 Fc receptor silencing) Removal rate value of (SG105)

전기화학발광(ECL)에 의한 혈청 내 총 인간 CCL2 농도의 측정Determination of Total Human CCL2 Concentration in Serum by Electrochemiluminescence (ECL)

마우스 혈청에서 총 인간 CCL2의 농도는 ECL에 의해 측정하였다. 3 ug/mL의 항-CCL2 항체(F7(바이오레전드) 또는 클론 MAB679(R&D 시스템즈))를 멀티-어레이 96웰 플레이트(메소 스케일 디스커버리)에 밤새 고정화시킨 후, 차단 완충액에서 30^oC에서 2시간 동안 배양하였다. 항-CCL2 MAB679는 인간화 11K2, 1A4 또는 1A5 항체를 함유하는 샘플에 대한 포획 항체로서 사용하였다. 항-CCL2 클론 5D3-F7은 ABN912, CNTO888, 1G9, 2F6H 항체를 함우하는 샘플에 사용하였다. 인간 CCL2 검량선 샘플, 품질 대조군 샘플 및 마우스 혈청 샘플은 희석 완충액에 희석하고 37^oC에서 30분 동안 과량의 약물과 함께 배양하여 준비하였다. 이 후, 샘플을 항-CCL2 고정 플레이트에 첨가하고, 30℃에서 1시간 동안 결합시킨 후 세척하였다. 다음으로, SULFO TAG NHS-에스테르(메소 스케일 디스커버리) 표지된 항 인간 Fc(클론: JDC-10, 서던바이오텍(SouthernBiotech))를 첨가하고 플레이트를 세척하기 전에 30^oC에서 1시간 동안 항온처리하였다. 판독 버퍼 T(x4)(메소 스케일 디스커버리)를 즉시 플레이트에 추가하고 SECTOR 이미저(Imager) 2400(메소 스케일 디스커버리)으로 신호를 검출하였다. 분석 소프트웨어 소프트맥스 PRO(몰레큘라 디바이스)를 사용하여 검량선에 대한 반응을 기초로 인간 CCL2 농도를 계산하였다. The concentration of total human CCL2 in mouse serum was determined by ECL. 3 ug/mL of anti-CCL2 antibody (F7 (Biolegend) or clone MAB679 (R&D Systems)) were immobilized overnight in multi-array 96-well plates (Meso Scale Discovery), followed by 2 h at 30 ^° C in blocking buffer. incubated during Anti-CCL2 MAB679 was used as capture antibody for samples containing humanized 11K2, 1A4 or 1A5 antibodies. Anti-CCL2 clone 5D3-F7 was used for samples containing ABN912, CNTO888, 1G9, 2F6H antibodies. Human CCL2 calibration curve samples, quality control samples and mouse serum samples were prepared by diluting in dilution buffer and incubating with an excess of drug at 37 ^° C for 30 minutes. Thereafter, the samples were added to anti-CCL2 fixed plates, allowed to bind at 30° C. for 1 hour, and then washed. Next, SULFO TAG NHS-ester (Meso Scale Discovery) labeled anti-human Fc (clone: JDC-10, SouthernBiotech) was added and the plates were incubated for 1 hour at 30 ^° C before washing. Read buffer T(x4) (Meso Scale Discovery) was immediately added to the plate and the signal was detected with a SECTOR Imager 2400 (Meso Scale Discovery). Analytical software Softmax PRO (Molecular Devices) was used to calculate human CCL2 concentrations based on the response to the calibration curve.

효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)에 의한 혈청 내 항-CCL2 항체 농도의 측정Determination of Anti-CCL2 Antibody Concentrations in Serum by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

마우스 혈청에서 항-CCL2 항체의 농도는 ECL에 의해 측정하였다. 눈크 맥시소프(Nunc MaxiSorp) 플레이트(써모피셔(Thermofisher))에 항인간 IgG 카파 사슬(앤티바디 솔루션(Antibody Solutions))를 분주하고, 4℃에서 밤새 방치하여 항인간 IgG 고정 플레이트를 제작하였다. 검량선 및 샘플은 1% 풀링된 마우스 혈청으로 준비하였다. 그런 다음, 항인간 IgG 고정 플레이트에 샘플을 분주하고, 30℃에서 1시간 방치하였다. 이어서, HRP 접합체(서던바이오텍)를 갖는 염소 항인간 IgG(감마-사슬 특이적)를 첨가하여 30℃에서 1시간 동안 반응시켰다. TMB 기질(라이프 테크놀로지(Life Technologies))을 기질로 사용하여 발색 반응을 실시하였다. 1 N 황산(와코(Wako))으로 반응을 정지시킨 후, 마이크로플레이트 판독기로 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 분석 소프트웨어 소프트맥스 PRO(몰레큘라 디바이스)를 사용하여 검량선의 흡광도로부터 마우스 혈장 중 농도를 계산하였다.The concentration of anti-CCL2 antibody in mouse serum was determined by ECL. Anti-human IgG kappa chains (Antibody Solutions) were dispensed on Nunc MaxiSorp plates (Thermofisher), and left at 4° C. overnight to prepare anti-human IgG immobilized plates. Calibration curves and samples were prepared with 1% pooled mouse serum. Then, the sample was aliquoted on an anti-human IgG fixed plate, and left at 30°C for 1 hour. Then, goat anti-human IgG (gamma-chain specific) having an HRP conjugate (Southern Biotech) was added and reacted at 30° C. for 1 hour. The color reaction was carried out using a TMB substrate (Life Technologies) as a substrate. After stopping the reaction with 1 N sulfuric acid (Wako), the absorbance at 450 nm was measured with a microplate reader. The concentration in mouse plasma was calculated from the absorbance of the calibration curve using the analysis software Softmax PRO (Molecular Device).

마우스에서 단일 파라토프 항체를 사용한 내인성 마우스 CCL2 면역 복합체 스위핑에 대한 평가Evaluation of Endogenous Mouse CCL2 Immune Complex Sweeps Using Monoparatopic Antibodies in Mice

상기 결과(시험된 단일 파라토프 항체에 의한 CCL2의 면역 복합체 매개 스위핑이 효율적이지 않음을 시사함)에 더하여, 추가 평가를 실시하였다. In addition to the above results (suggesting that immune complex-mediated sweeping of CCL2 by monoparatopic antibodies tested is not efficient), further evaluations were performed.

단일 파라토프 항체가 내인성 마우스 CCL2와 함께 면역 복합체를 형성하고 제거하는 능력을 평가하기 위해, 마우스 교차 반응성 11K2 항-CCL2 단일 파라토프 항체를 마우스에 투여하였다. 인간화 11K2H2-SG1(IgG1 야생형 = Fc 감마 수용체 결합) 또는 인간화 11K2-SG105(Fc 감마 수용체 결합 침묵형) 항체를 Balb/c 마우스의 정맥 꼬리에 20 mg/kg의 단일 용량 및 10 ml/kg의 단일 용량으로 정맥내 투여하였다. 혈액은 투여 전, 투여 후 5분, 7시간, 1일, 2일, 3일 및 7일에 수집하였다. 혈청은 즉시 혈액을 4℃에서 14,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 제조하였다. 혈청은 측정할 때까지 -80℃ 이하에서 보관하였다. To evaluate the ability of monoparatopic antibodies to form and clear immune complexes with endogenous mouse CCL2, mice were administered a mouse cross-reactive 11K2 anti-CCL2 monoparatopic antibody. Humanized 11K2H2-SG1 (IgG1 wild-type = Fc gamma receptor binding) or humanized 11K2-SG105 (Fc gamma receptor binding silencing) antibody was administered to the venous tail of Balb/c mice at a single dose of 20 mg/kg and a single dose of 10 ml/kg. The dose was administered intravenously. Blood was collected before dosing, 5 minutes, 7 hours, 1 day, 2 days, 3 days and 7 days after dosing. Serum was prepared by immediately centrifuging blood at 14,000 rpm at 4° C. for 10 minutes. Serum was stored at -80°C or lower until measurement.

도 3은 마우스에서 인간화 11K2-SG1 및 11K2-SG105에 대한 혈청 총 마우스 CCL2 농도 및 항체-시간 곡선의 시간 경과를 도시한다. 3 depicts time course of serum total mouse CCL2 concentration and antibody-time curves for humanized 11K2-SG1 and 11K2-SG105 in mice.

도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 축적된 마우스 CCL2의 수준은 11K2-SG105(Fc 감마 수용체 결합 침묵형 Fc) 및 11K2-SG1(IgG1 야생형 =Fc 감마 수용체 결합 Fc) 사이에 차이가 없었다. 이는 주입된 항체에 의한 내인성 마우스 CCL2의 Fc 감마 수용체 매개 제거가 전혀 또는 거의 없었다는 것을 나타낸다. 면역 복합체의 항원이 Fc 감마 수용체의 다량체 결합을 통해 비복합 항원보다 더 빠르게 제거되기 때문에, 이는 11K2 항체가 내인성 마우스 CCL2와 함께 면역 복합체를 형성할 수 없음을 시사한다. As can be seen from FIG. 3 , the level of accumulated mouse CCL2 did not differ between 11K2-SG105 (Fc gamma receptor binding silent Fc) and 11K2-SG1 (IgG1 wild type = Fc gamma receptor binding Fc). This indicates that there was little or no Fc gamma receptor mediated clearance of endogenous mouse CCL2 by the injected antibody. Since antigens in the immune complex are cleared more rapidly than uncomplexed antigens through multimeric binding of Fc gamma receptors, this suggests that the 11K2 antibody is unable to form immune complexes with endogenous mouse CCL2.

효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)에 의한 마우스 혈청 내 마우스 항-CCL2 농도의 측정Determination of mouse anti-CCL2 concentration in mouse serum by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

마우스 혈청에서 마우스 CCL2의 농도는 상업적으로 입수 가능한 마우스 CCL2 ELISA 키트(R&D 시스템즈)의 시약을 적용하여 측정하였다. 검량선 샘플 준비를 제외하고 제조업체의 프로토콜을 따랐다. 정제된 재조합 마우스 CCL2는 제조사의 단백질 대신 표준물질로 대체하였다. 항체 주입 후 채취한 샘플은 2.5% 마우스 혈청 주입 항체를 40 μg/ml 농도로 첨가하여 검량선 샘플 및 샘플을 준비하고 37℃에서 30분간 배양하였다. 항인간 CCL2 고정 플레이트를 30℃에서 2시간 동안 항온처리하였다. 마우스 MCP-1 접합체를 첨가하고 30℃에서 2시간 동안 배양한 후, 기질 및 정지 용액으로 검출하였다.The concentration of mouse CCL2 in mouse serum was measured by applying a reagent of a commercially available mouse CCL2 ELISA kit (R&D Systems). The manufacturer's protocol was followed with the exception of the calibration curve sample preparation. Purified recombinant mouse CCL2 was replaced with a standard material instead of the manufacturer's protein. The samples collected after the antibody injection were prepared by adding 2.5% mouse serum-injected antibody at a concentration of 40 μg/ml to prepare a calibration curve sample and sample, and incubated at 37° C. for 30 minutes. Anti-human CCL2 fixed plates were incubated at 30° C. for 2 h. The mouse MCP-1 conjugate was added and incubated at 30° C. for 2 hours, followed by detection with a substrate and a stop solution.

항체 주입 전에 채취한 샘플의 경우, 제조사의 지침에 따라 마우스(Mouse) MCP-1 울트라-센서티브 키트(Ultra-Sensitive Kit)(메소 스케일 디스커버리)를 사용하였다. 플레이트에 첨가하기 전에, 그 어떤 항체도 샘플에 첨가하지 않았다.For samples taken before antibody injection, the Mouse MCP-1 Ultra-Sensitive Kit (Meso Scale Discovery) was used according to the manufacturer's instructions. Prior to addition to the plate, no antibody was added to the sample.

마우스 혈청에서 항-CCL2 항체의 농도는 ECL에 의해 측정하였다. 눈크 맥시소프(Nunc MaxiSorp) 플레이트(써모피셔(Thermofisher))에 항인간 IgG 카파 사슬(앤티바디 솔루션(Antibody Solutions))를 분주하고, 4℃에서 밤새 방치하여 항인간 IgG 고정 플레이트를 제작하였다. 검량선 및 샘플은 1% 풀링된 마우스 혈청으로 준비하였다. 그런 다음, 항인간 IgG 고정 플레이트에 샘플을 분주하여 상온에서 1시간 동안 방치하였다. 이어서, 마우스 항인간 IgG HRP(클론 JDC-10, 서던바이오텍)를 첨가하여 상온에서 30분간 반응시켰다. ABTS 기질(KPL)을 기질로서 사용하여 발색 반응을 실시하였고, 마이크로플레이트 판독기로 405 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 분석 소프트웨어 소프트맥스 PRO(몰레큘라 디바이스)를 사용하여 검량선의 흡광도로부터 마우스 혈장 중 농도를 계산하였다.The concentration of anti-CCL2 antibody in mouse serum was determined by ECL. Anti-human IgG kappa chains (Antibody Solutions) were dispensed on Nunc MaxiSorp plates (Thermofisher), and left at 4° C. overnight to prepare anti-human IgG immobilized plates. Calibration curves and samples were prepared with 1% pooled mouse serum. Then, the sample was dispensed on an anti-human IgG fixed plate and left at room temperature for 1 hour. Then, mouse anti-human IgG HRP (clone JDC-10, Southern Biotech) was added and reacted at room temperature for 30 minutes. A chromogenic reaction was performed using ABTS substrate (KPL) as a substrate, and absorbance at 405 nm was measured with a microplate reader. The concentration in mouse plasma was calculated from the absorbance of the calibration curve using the analysis software Softmax PRO (Molecular Device).

단일특이적(단일 파라토프) 항-CCL2 항체를 사용한 다양한 마우스 PK 연구의 결론Conclusions of various mouse PK studies using monospecific (monoparatopic) anti-CCL2 antibodies

마우스 PK 연구의 결과를 요약하자면, 시험된 단일 파라토프 항체 중 어느 것도 순환계로부터 CCL2의 효율적인 제거를 나타내지 않았다. 이러한 데이터는 단일 파라토프 항체가 순환계로부터 CCL2를 효율적으로 제거하기 위해 CCL2와 면역 복합체를 형성할 수 없음을 시사한다. To summarize the results of the mouse PK study, none of the monoparatopic antibodies tested showed efficient clearance of CCL2 from circulation. These data suggest that monoparatopic antibodies are unable to form immune complexes with CCL2 to efficiently clear CCL2 from circulation.

이와 대조적으로, 하기에 기재된 바와 같이, 2개의 상이한 항원 결합 모이어티/부위를 갖는 이중특이적 항-CCL2 항체(이중 파라토프 항-CCL2 항체)는 CCL2와 면역 복합체를 효율적으로 형성하고 순환계로부터 이를 제거할 수 있었다. In contrast, as described below, bispecific anti-CCL2 antibodies with two different antigen binding moieties/sites (biparatopic anti-CCL2 antibodies) efficiently form immune complexes with CCL2 and remove them from circulation. could be removed

실시예 B-1 Example B-1

이중특이적(이중 파라토프) 항-CCL2 항체Bispecific (biparatopic) anti-CCL2 antibody

인간 CCL2 상의 2개의 상이한 특이적 에피토프에 결합하는 2개의 상이한 항원 결합 모이어티(파라토프)를 갖는 여러 이중특이적 항-CCL2 항체가 생성되었다Several bispecific anti-CCL2 antibodies have been generated with two different antigen binding moieties (paratopes) that bind two different specific epitopes on human CCL2

도입introduction

항원의 단일 결합 또는 교차 결합이 생체내 CCL2 제거에 유의적인 영향을 미치는지 여부를 시험하기 위하여, 이중특이적 크로스맵 기술(예컨대, WO 2009/080252, WO 2015/150447), WO 2009/080253,WO 2009/080251, WO 2016/016299, Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 1187-1191, 및 Klein at al., MAbs 8 (2016) 1010-20)(이중특이적(=이중 파라토프) 크로스맵을 참조)을 사용하여 CCL2 상의 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 2개의 상이한 항원 결합 모이어티/부위를 갖는 이중특이적 항-CCL2 항원을 생성하였다. 이러한 분자는 생화학적 및 기능적 특성에 대해 시험관 내에서 처음 특성화되었지만, 마우스 공동 주입 연구에서 생체내 CCL2 제거율 평가를 위한 도구로도 사용되었다. Fcγ 수용체(FcgR) 결합 매개 스위핑을 기반으로 한 제거 가능성을 평가하기 위하여(예컨대, Igawa et al, Immunological Reviews 270 (2016) 132-151, WO2012/122011 및 WO2016/098357 및 WO2013/081143), FcgR에 결합하고 FcgR 작동체 침묵형 분자(예컨대, 돌연변이 L234A, L235A, P329G를 갖는 IgG1(카바트 EU 넘버링))에 대한 결합이 감소/폐기된 변형된 인간 IgG1 불변쇄를 갖는 야생형 huIgG1로서 모든 크로스맵을 생성하였다.To test whether single binding or cross-linking of antigens significantly affects CCL2 clearance in vivo, bispecific crossmap techniques (eg WO 2009/080252, WO 2015/150447), WO 2009/080253, WO 2009/080251, WO 2016/016299, Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 1187-1191, and Klein at al., MAbs 8 (2016) 1010-20) (bispecific (=biparatope) crossmap ) was used to generate bispecific anti-CCL2 antigens with two different antigen binding moieties/sites that bind two different epitopes on CCL2. Although these molecules were first characterized in vitro for their biochemical and functional properties, they were also used as tools for the assessment of in vivo CCL2 clearance in mouse co-injection studies. To evaluate clearance potential based on Fcγ receptor (FcgR) binding-mediated sweeping (e.g., Igawa et al, Immunological Reviews 270 (2016) 132-151, WO2012/122011 and WO2016/098357 and WO2013/081143), FcgR All crossmaps as wild-type huIgG1 with a modified human IgG1 constant chain that binds and has reduced/abolished binding to FcgR effector silencing molecules (eg, IgG1 with mutations L234A, L235A, P329G (Kabat EU numbering)). generated.

적합한 항-CCL2 항체 쌍의 확인-샌드위치 ELISA에 의한 이중 파라토프 항체 팔의 선택. Identification of suitable anti-CCL2 antibody pairs - selection of biparatopic antibody arms by sandwich ELISA.

샌드위치 ELISA를 실시하여 인간 CCL2에 대한 결합에 대해 경쟁하지 않는 항체 쌍을 확인하였다. 384-웰 MAXISORP(NUNC) 플레이트를 7개의 표시된 포획 항체(팔 1)의 1 μg/mL로 코팅하고 2% BSA로 차단하였다. 비오틴화된(NHS-PEO₄-비오틴, 피어스(Pierce)) WT 인간 CCL2(20 ng/mL)를 1 μg/mL의 과량의 동일한 7개 항체(팔 2)의 또는 섭씨 37도에서 1시간 동안 차단 완충액과 함께 배양하였다. 배양 후, 혼합물을 차단된 ELISA 플레이트에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트 결합된 CCL2의 검출은 스트렙타비딘 HRP에 이어 TMB 원 컴포넌트(One Component) 기질(라이프테크(Lifetech))을 사용하여 실시하였다. 신호 발생은 1N HCl 산(와코)에 의해 중단하였다. 경쟁 항체가 없는 웰의 O.D.는 각 포획 항체에 대해 100% 신호로 설정하였다. CCL2가 첨가되지 않은 블랭크 웰의 O.D.는 0% 신호로 설정하였다. 양방향에서 CCL2 결합에 대해 강한 경쟁을 나타내지 않은 9개의 항체 쌍을 이중특이적 크로스맙 항체의 생성을 위한 후보로 선택하였다.Sandwich ELISA was performed to identify antibody pairs that did not compete for binding to human CCL2. 384-well MAXISORP (NUNC) plates were coated with 1 μg/mL of the 7 indicated capture antibodies (arm 1) and blocked with 2% BSA. Biotinylated (NHS-PEO ₄ -biotin, Pierce) WT human CCL2 (20 ng/mL) was mixed with 1 μg/mL of the same 7 antibodies (arm 2) in excess or for 1 h at 37°C Incubated with blocking buffer. After incubation, the mixture was added to a blocked ELISA plate and incubated for 1 hour at room temperature. Detection of plate-bound CCL2 was performed using streptavidin HRP followed by TMB One Component substrate (Lifetech). Signal generation was stopped by 1N HCl acid (Wako). The OD of wells without competing antibody was set at 100% signal for each capture antibody. The OD of blank wells to which CCL2 was not added was set to 0% signal. Nine antibody pairs that did not show strong competition for CCL2 binding in both directions were selected as candidates for generation of bispecific crossmab antibodies.

이중 파라토프 항-CCL2 항체 및 면역 복합체의 생성 및 특성화 Generation and Characterization of Biparatopic Anti-CCL2 Antibodies and Immune Complexes

이중특이적 크로스맵 형식의 재조합 DNA 기술의 이중 파라토프 항-CCL2 항체 생성Generation of biparatopic anti-CCL2 antibodies by recombinant DNA technology in a bispecific crossmap format

표준 방법을 사용하여 Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989에 기재된 바에 따라 DNA를 조작하였다. 분자 생물학적 시약은 제조업체의 사용설명서에 따라서 이용되었다.Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; DNA was engineered as described in Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Molecular biological reagents were used according to the manufacturer's instructions.

유전자 및 올리고뉴클레오티드 합성 Gene and Oligonucleotide Synthesis

Geneart GmbH (Regensburg, 독일) 사에서 화학 합성을 통해 원하는 유전자 절편들을 제조하였다. 합성된 유전자 단편들은 증식/증폭을 위해 대장균 플라스미드에 클로닝되었다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 시퀀싱으로 확인하였다. 대안적으로, 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드들을 어닐링함에 의해 또는 PCR을 통해 짧은 합성 DNA 단편들을 조립하였다. 각각의 올리고뉴클레오티드는 메타비온(metabion) GmbH(독일 플라네그 마틴스리드 소재)에 의해 제조하였다.Geneart GmbH (Regensburg, Germany) prepared the desired gene fragments through chemical synthesis. The synthesized gene fragments were cloned into E. coli plasmids for propagation/amplification. The DNA sequence of the subcloned gene fragment was confirmed by DNA sequencing. Alternatively, short synthetic DNA fragments were assembled by annealing chemically synthesized oligonucleotides or via PCR. Each oligonucleotide was prepared by metabion GmbH (Planeg Martinsrid, Germany).

기본/표준 포유류 발현 플라스미드에 대한 설명Description of Basic/Standard Mammalian Expression Plasmids

원하는 유전자/단백질(예컨대, 항체 중쇄 또는 항체 경쇄)의 발현을 위해, 하기의 기능적 요소들:For expression of a desired gene/protein (eg, antibody heavy chain or antibody light chain), the following functional elements:

· 인트론 A를 포함하는 인간 사이토메갈로바이러스(P-CMV)로부터의 즉각적인 초기 증폭자 및 프로모터,Immediate early amplifiers and promoters from human cytomegalovirus (P-CMV) comprising intron A;

· 인간 중쇄 면역글로불린 5'-비번역 영역(5'UTR),Human heavy chain immunoglobulin 5'-untranslated region (5'UTR),

· 뮤린 면역글로불린 중쇄 신호 서열, · murine immunoglobulin heavy chain signal sequence,

· 발현될 유전자/단백질(예컨대, 전장 항체 중쇄 또는 MHC클래스Ⅰ분자), 및the gene/protein to be expressed (eg full length antibody heavy chain or MHC class I molecule), and

· 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGH pA)을 포함한 전사 단위가 사용된다.A transcription unit containing the bovine growth hormone polyadenylation sequence (BGH pA) is used.

· 발현하고자 하는 유전자를 포함하는 발현 단위/카세트 이외에 기본/표준 포유류 발현 플라스미드는:In addition to the expression unit/cassette containing the gene to be expressed, the basic/standard mammalian expression plasmid is:

· 대장균에서 상기 플라스미드의 복제를 가능하게 하는 벡터 pUC18로부터의 복제 기점, 및an origin of replication from the vector pUC18 that enables replication of the plasmid in E. coli, and

· 대장균에서 암피실린 내성을 부여하는 베타 락타마아제 유전자를 함유한다.Contains the beta-lactamase gene that confers ampicillin resistance in E. coli.

재조합 단일클론 항체용 발현 플라스미드의 생성Generation of expression plasmids for recombinant monoclonal antibodies

재조합 단일클론 항체 유전자는 각각의 면역글로불린 중쇄 및 경쇄를 부호화한다.Recombinant monoclonal antibody genes encode the respective immunoglobulin heavy and light chains.

일시적인 발현 단일클론 항체 분자를 위한 발현 플라스미드는 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 발현 카세트 외에 대장균에서 상기 플라스미드의 복제를 허용하는 벡터 pUC18 및 대장균에서 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마제 유전자로부터의 복제 기점을 포함하였다.Expression plasmids for transient expression monoclonal antibody molecules contained, in addition to immunoglobulin heavy or light chain expression cassettes, an origin of replication from the vector pUC18 allowing replication of the plasmid in E. coli and the beta-lactamase gene conferring ampicillin resistance in E. coli. .

각각의 항체 중쇄 또는 경쇄의 전사 단위는 하기의 기능적 요소들:The transcription unit of each antibody heavy or light chain has the following functional elements:

· 뮤린 면역글로불린 중쇄 신호 서열,· murine immunoglobulin heavy chain signal sequence,

· 각각의 항체 중쇄 또는 경쇄 cDNA 서열 및each antibody heavy or light chain cDNA sequence and

· 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGH pA)을 포함하였다. Contains bovine growth hormone polyadenylation sequence (BGH pA).

일시적인 발현 및 분석적 특성화Transient expression and analytical characterization

예컨대, HEK293 세포에서 인간 면역글로불린의 재조합 발현에 관한 일반 정보는: Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203를 참조한다. 하기의 이중특이적 항체를 생성하기 위하여, WO 2016/016299에 기재된 크로스맵 기술이 사용되었고, VH/VL은 하나의 항체 팔에서 교환되고, 다른 항체 팔의 CH1/CL 계면은 이종이량체화를 촉진하기 위해 CH3/CH3 계면에서 구멍 내 돌기 기술과 함께 전하 변형에 의해 수정되었다. 상기 기술이 적용된 모든 4개의 항체 사슬에 대한 예시적인 서열이 CNTO888//11K2-WT IgG1에 대해 제시된다(서열번호 104 내지 서열번호 107).For general information regarding recombinant expression of human immunoglobulins in, eg, HEK293 cells, see: Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203. To generate the following bispecific antibodies, the crossmap technique described in WO 2016/016299 was used, where VH/VL is exchanged in one antibody arm and the CH1/CL interface of the other antibody arm undergoes heterodimerization. To facilitate it, it was modified by charge modification with an in-hole technique at the CH3/CH3 interface. Exemplary sequences for all four antibody chains to which the above techniques have been applied are shown for CNTO888//11K2-WT IgG1 (SEQ ID NOs: 104 to 107).

야생형 IgG1(WT IgG1)을 사용하여 생성된 이중특이적(이중 파라토프) 항-CCL2 크로스맵 항체의 목록(야생형 IgG1은 Fc 수용체 결합에 영향을 미치는 변형/돌연변이가 없는 것을 의미하지만, 구멍 내 돌기와 같은 이종이량체화 기술이 포함됨)List of bispecific (biparatopic) anti-CCL2 crossmap antibodies generated using wild-type IgG1 (WT IgG1) (wild-type IgG1 means no modifications/mutations affecting Fc receptor binding, but with intrapore protrusions and (the same heterodimerization techniques are included)

Fc 감마 수용체 침묵형 돌연변이 L234A, L235A, P329G(카바트 EU 넘버링)(IgG1-PGLALA)를 포함한 IgG1을 갖는 이중특이적(이중 파라토프) 항-CCL2 크로스맵 항체의 목록List of bispecific (biparatopic) anti-CCL2 crossmap antibodies with IgG1 including Fc gamma receptor silencing mutations L234A, L235A, P329G (Kabat EU numbering) (IgG1-PGLALA)

이중 파라토프 항-CCL2 항체의 정제Purification of biparatopic anti-CCL2 antibody

세포 배양 상층액을 함유하는 이중 파라토프 항-CCL2 항체를 최대 3개의 크로마토그래피 단계로 여과하고 정제하였다. 포획 단계 용리액의 순도에 따라 이온 교환 크로마토그래피 단계는 포획 및 연마 단계 사이에 선택적으로 실시하였다. The biparatopic anti-CCL2 antibody containing the cell culture supernatant was filtered and purified in up to 3 chromatography steps. Depending on the purity of the capture step eluent, an ion exchange chromatography step was optionally performed between capture and polishing steps.

이중 파라토프 항-CCL2 항체는 맙셀렉트슈어-세파로스TM(GE 헬스케어, 스웨덴 소재), POROS 50 HS(써모 피셔 사이언티픽) 및 수퍼덱스 200 크기 배제(GE 헬스케어, 스웨덴 소재) 크로마토그래피를 사용한 친화성 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 간단히 말해서, 무균 여과된 세포 배양 상층액을 PBS 완충액(10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl 및 2.7 mM KCl, pH 7.4)으로 평형화된 맙셀렉트슈어 수지 상에서 포획하고, 평형화 완충액으로 세척한 후, 25 mM의 구연산염, pH 3.0으로 용출하였다. 용출된 단백질 분획물을 취합하고 2M 트리스(Tris), pH 9.0으로 중화시켰다. The biparatopic anti-CCL2 antibody was subjected to MabSelectSure-Sepharose™ (GE Healthcare, Sweden), POROS 50 HS (Thermo Fisher Scientific) and Superdex 200 size exclusion (GE Healthcare, Sweden) chromatography. Purification from the cell culture supernatant by affinity chromatography used. Briefly, sterile filtered cell culture supernatants were captured on MabSelectSure resin equilibrated with PBS buffer (10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl and 2.7 mM KCl, pH 7.4), washed with equilibration buffer, and then , eluted with 25 mM citrate, pH 3.0. The eluted protein fractions were pooled and neutralized with 2M Tris, pH 9.0.

선택적인 제2 정제 단계로서 이온 교환 크로마토그래피는 POROS 50 HS(써모 피셔 사이언티픽)로 실시하고 평형화한 후, 20 mM 히스티딘 pH 5.6으로 세척하고, 희석된 포획 단계 용리액의 부하를 pH 5.6에서 20 mM 히스티딘, 0.5 M NaCl로 실시하였다. 이온 교환 크로마토그래피 분획을 CE-SDS LabChip GX II(퍼킨엘머(PerkinElmer))로 분석하고 크로스맵 함유 분획을 취합하였다. As an optional second purification step, ion exchange chromatography was performed with a POROS 50 HS (Thermo Fisher Scientific) and equilibrated, followed by washing with 20 mM histidine pH 5.6 and a load of diluted capture step eluent from pH 5.6 to 20 mM. Histidine, 0.5 M NaCl. Ion exchange chromatography fractions were analyzed with CE-SDS LabChip GX II (PerkinElmer) and crossmap containing fractions were pooled.

수퍼덱스 200(GE 헬스케어)의 크기 배제 크로마토그래피를 제2 또는 제3 단계로서 사용하였다. 크기 배제 크로마토그래피는 20 mM 히스티딘 완충액, 0.14 M NaCl, pH 6.0에서 실시하였다. 크기 배제 크로마토그래피 분획을 CE-SDS LabChip GX II(퍼킨엘머)로 분석하고 크로스맵 함유 분획을 취합하여 -80°C에서 보관하였다.수퍼덱스 200(GE 헬스케어)의 POROS 50 HS(써모피셔 사이언티픽) 크기 배제 크로마토그래피 후 만족스러운 생성물 품질의 경우, 20 mM 히스티딘 완충액, 0.14 M NaCl, pH 6.0에서 HiPrep 26/10 디솔팅(Desalting, GE 헬스케어)의 탈염 크로마토그래피로 대체하였다.Size exclusion chromatography of Superdex 200 (GE Healthcare) was used as the second or third step. Size exclusion chromatography was performed in 20 mM histidine buffer, 0.14 M NaCl, pH 6.0. Size exclusion chromatography fractions were analyzed with CE-SDS LabChip GX II (PerkinElmer) and crossmap-containing fractions were pooled and stored at -80°C. POROS 50 HS (Thermo Fisher Scientific) on Superdex 200 (GE Healthcare) For satisfactory product quality after size exclusion chromatography, it was replaced by desalting chromatography of HiPrep 26/10 desalting (Desalting, GE Healthcare) in 20 mM histidine buffer, 0.14 M NaCl, pH 6.0.

항체 제조의 단백질 농도는 아미노산 서열을 기반으로 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정함으로써 결정하였다. The protein concentration of the antibody preparation was determined by measuring the optical density (OD) at 280 nm using the molar extinction coefficient calculated based on the amino acid sequence.

항체의 순도 및 무결성은 단백질 익스프레스 칩 및 HT 단백질 익스프레스 시약 키트(Protein Express Chip and HT Protein Express Reagents Kit)가 포함된 LabChip GX II(퍼킨엘머)를 사용하여 CE-SDS로 분석하였다. 항체 제제의 응집체 함량은 실행 완충액으로 200 mM K2HPO4/KH2PO4, 250 mM KCl, pH 7.0을 사용하는 바이오스위트(Biosuite) 고분해능 SEC, 250

, 5 μm 분석 크기 배제 컬럼(워터스(Waters) GmbH)을 사용하는 고성능 SEC에 의해 결정하였다. CE-SDS로 분석한 평균 순도는 94~100%였으며 단량체 함량은 >95%(SEC)였다.The purity and integrity of the antibodies were analyzed by CE-SDS using LabChip GX II (PerkinElmer) with Protein Express Chip and HT Protein Express Reagents Kit. The aggregate content of the antibody formulation was determined by Biosuite High Resolution SEC, 250 using 200 mM K2HPO4/KH2PO4, 250 mM KCl, pH 7.0 as running buffer.

, determined by high performance SEC using a 5 μm analytical size exclusion column (Waters GmbH). The mean purity, analyzed by CE-SDS, was 94-100% and the monomer content was >95% (SEC).

이중특이적(이중 파라토프) 항-CCL2 항체의 기능적 특성화 Functional characterization of bispecific (biparatopic) anti-CCL2 antibodies

친화도 측정(결합)Affinity measurement (binding)

포획 시스템의 약 1200 공명 단위(RU)(20 μg/ml 염소 항 인간 IgG Fc, 주문 코드: 109-005-098; 잭슨 면역연구소)를 GE 헬스케어에서 공급하는 아민 커플링 키트를 사용하여 pH 5.0에서 C1 칩(GE 헬스케어 BR-1005-35)에 커플링하였다. 표본 및 시스템 완충액은 PBS-T(0.05% 트윈20을 포함하는 10 mM 인산염 완충된 식염수) pH 7.4이었다. 유세포는 25°C로 설정되었고 샘플 블록은 12°C로 설정되었으며 러닝 완충액으로 두 번 프라이밍되었다. 10 μl/분의 유속에서 2 μg/ml 용액을 60초 동안 주입함으로써 이중특이적 항체를 포획하였다. 1:10 희석에서 30 nM로 시작하여 30 μl/분의 유속에서 150 초 동안 용해 상태에서 다양한 농도의 인간 CCL2(wt)를 주입하여 결합을 측정하였다. 해리 단계는 최대 1200초 동안 모니터링되었으며 샘플 용액으로부터 실행 완충액으로 전환하여 유발하였다. 표면은 10 μl/분의 유속에서 0.85% H₃PO₄ 용액으로 60 초 세척에 의해 재생시켰다. 벌크 굴절률 차이가 염소 항인간 IgG Fc 표면으로부터 수득한 반응을 차감함으로써 교정하였다. 블랭크 주입을 또한 차감하였다(= 이중 참조). 동역학 매개변수의 계산을 위해, 랭뮤어(Langmuir) 1:1 모델을 사용하였다.Approximately 1200 resonance units (RU) of the capture system (20 μg/ml goat anti-human IgG Fc, order code: 109-005-098; Jackson Immunology Lab) were supplied at pH 5.0 using an amine coupling kit supplied by GE Healthcare. was coupled to a C1 chip (GE Healthcare BR-1005-35). The sample and system buffer were PBS-T (10 mM phosphate buffered saline with 0.05% Tween20) pH 7.4. The flow cytometer was set to 25 °C and the sample block was set to 12 °C and primed twice with running buffer. The bispecific antibody was captured by injecting a 2 μg/ml solution for 60 seconds at a flow rate of 10 μl/min. Binding was measured by injecting various concentrations of human CCL2 (wt) in solution for 150 s at a flow rate of 30 μl/min, starting with 30 nM at a 1:10 dilution. The dissociation phase was monitored for up to 1200 seconds and was triggered by switching from sample solution to running buffer. The surface was regenerated by washing for 60 seconds with 0.85% H ₃ PO ₄ solution at a flow rate of 10 μl/min. The bulk refractive index difference was corrected by subtracting the response obtained from the goat anti-human IgG Fc surface. The blank injection was also subtracted (= double reference). For the calculation of kinetic parameters, a Langmuir 1:1 model was used.

야생형 항원의 존재하에 천연 면역 복합체의 형성. Formation of natural immune complexes in the presence of wild-type antigen.

모든 단백질 샘플(이중특이적 항-CCL2 크로스맵 항체 및 항원)은 투석 또는 원심 한외여과 장치를 사용하여 1x PBS, pH 7.4에서 재완충시켰다.All protein samples (bispecific anti-CCL2 crossmap antibody and antigen) were rebuffered in 1x PBS, pH 7.4 using dialysis or centrifugal ultrafiltration.

2.0 내지 0.1 mg/mL의 크로스맵 샘플 희석 시리즈를 준비하였다. 마찬가지로, PBS 중의 항원 용액은 0.012 내지 0.23 mg/mL 범위의 농도로 제조하였다. 등가 체적의 혼합이 가능하도록 농도를 선택하여, 1:1(항체:CCL2 복합체)의 일정한 몰비를 달성하였다. 하기의 항원: 야생형 CCL2를 본 연구에 사용하였다. A crossmap sample dilution series of 2.0 to 0.1 mg/mL was prepared. Likewise, antigen solutions in PBS were prepared at concentrations ranging from 0.012 to 0.23 mg/mL. A constant molar ratio of 1:1 (antibody:CCL2 complex) was achieved by choosing the concentration to allow mixing of equivalent volumes. The following antigens: wild-type CCL2 were used in this study.

등가 체적의 미리 희석된 크로스맵 및 CCL2 제제를 혼합하고 37°C에서 1시간 동안 배양한 후, 샘플을 수퍼로즈(Superose)6(GE 헬스케어 #2039) 컬럼에 적용하고 PBS로 미리 평형화한 후 0.5 mL/분의 유속으로 용출하였다. 총 100 μg 또는 최대 250 μL의 가능한 부피를 적용하고 항체 및 항원만을 대조군으로 사용하였다.After mixing equivalent volumes of pre-diluted Crossmap and CCL2 preparations and incubating at 37 °C for 1 h, the samples were applied to a Superose6 (GE Healthcare #2039) column and pre-equilibrated with PBS. Eluted at a flow rate of 0.5 mL/min. A total of 100 μg or a possible volume of up to 250 μL was applied and only antibodies and antigens were used as controls.

SEC-MALLS 데이터는 옵티랩(OptiLab) rEX 굴절률 검출기 및 미니(mini)DAWN 트레오스(Treos) MALLS 검출기(둘 모두 와이어트(Wyatt) Inc.)로 기록하였다. SEC-MALLS 신호는 아스트라(Astra) V5 소프트웨어(와이어트)를 사용하여 처리하였다. SEC-MALLS data were recorded with an OptiLab rEX refractive index detector and a miniDAWN Treos MALLS detector (both Wyatt Inc.). SEC-MALLS signals were processed using Astra V5 software (Wyatt).

범례legend

+++ 다량의 다중/올리고머+++ Lots of multi/oligomers

++ 중간 양의 다중/올리고머++ Medium amount of multi/oligomer

+ 소량의 다중/올리고머+ Small amount of multi/oligomer

0 단지 이량체 이하0 only dimer or less

항-CCL2 항체의 중화 특성을 연구하기 위한 CCR2 리포터 분석 CCR2 reporter assay to study the neutralizing properties of anti-CCL2 antibodies

탕고(Tango)™ CCR2-bla U2OS 세포는 CCL2 중화 항체 구성물의 영향을 연구하기 위해 독일 인비트로젠(Invitrogen)에서 구입하였다. 상기 리포터 세포는 TEV 프로테아제 부위에 연결된 인간 케모카인(C-C 모티프) 수용체 2(CCR2) 및 탕고™ GPCR-bla U2OS 모 세포주에 안정적으로 통합된 Gal4-VP16 전사 인자를 함유한다. 상기 모 세포주는 UAS 반응 요소의 제어 하에 베타-아레스틴/TEV 프로테아제 융합 단백질 및 베타-락타마제(bla) 리포터 유전자를 안정적으로 발현한다. 천연 리간드 MCP1 = CCL2를 추가하면 리포터 유전자의 활성이 표시되며, 이는 FRET 활성화 기질의 절단으로 측정할 수 있다.Tango™ CCR2-bla U2OS cells were purchased from Invitrogen, Germany to study the effect of CCL2 neutralizing antibody constructs. The reporter cell contains a human chemokine (CC motif) receptor 2 (CCR2) linked to a TEV protease site and a Gal4-VP16 transcription factor stably integrated into the Tango™ GPCR-bla U2OS parental cell line. The parental cell line stably expresses a beta-arrestin/TEV protease fusion protein and a beta-lactamase ( bla ) reporter gene under the control of a UAS response element. Addition of the natural ligand MCP1 = CCL2 displays the activity of the reporter gene, which can be measured by cleavage of the FRET activating substrate.

원칙적으로, 분석 및 세포 처리 절차는 제공자 설명서에 따랐다. 간단히 말해서, CCR2-U2OS 세포는 2x10⁴ 세포/웰(96er 검은색 투명 바닥 플레이트, cat.no. # 655090, 그라이너 바이오원(Greiner Bio-one))로 50 μl 분석 배지(프리스타일(Freestyle) 293 발현 배지(Expression Medium), cat.no. #12338-018, 인비트로젠)에서 분주하였다. 동시에, CCL2 항원 용액 뿐만 아니라 상이한 시험 항체의 연속 희석물을 c = 4x 최종 농도에서 제조하였다. 그런 다음, CCL2 항원/항체 혼합물을 준비하고 실온에서 2 내지 3시간 동안 사전 배양하였다. 표시된 CCL2/항체 용액 50 μl를 U2OS 세포를 발현하는 CCR2로 옮기고 37°C 및 5% CO₂의 가습 배양기에서 18시간 동안 배양하였다. 대조군으로서 검정 배지만을 사용하였다.In principle, assay and cell handling procedures followed the provider's instructions. Briefly, CCR2-U2OS cells were treated with 2x10 ⁴ cells/well (96er black clear bottom plate, cat.no. # 655090, Greiner Bio-one) with 50 μl assay medium (Freestyle). 293 expression medium (Expression Medium), cat.no. #12338-018, Invitrogen). Simultaneously, CCL2 antigen solutions as well as serial dilutions of different test antibodies were prepared at c = 4x final concentration. Then, the CCL2 antigen/antibody mixture was prepared and pre-incubated at room temperature for 2-3 hours. Transfer 50 μl of the indicated CCL2/antibody solution to CCR2 expressing U2OS cells and incubate for 18 h in a humidified incubator at 37 °C and 5% CO ₂ . As a control, only assay medium was used.

다음날, CCF4 기질(cat. no. #K1089, 인비트로젠)을 락타마제 로딩 용액(cat. No.# K1085, 인비트로젠)으로 준비하고 이의 20 μl/웰을 세포에 첨가하였다. 기질 용액을 암실 내 실온에서 2시간 동안 배양하였다.The next day, CCF4 substrate (cat. no. #K1089, Invitrogen) was prepared as a lactamase loading solution (cat. No. # K1085, Invitrogen) and 20 μl/well thereof was added to the cells. The substrate solution was incubated for 2 hours at room temperature in the dark.

마지막으로, 형광 파장은 하기의 파장(Ex/Em = 409 nm/460 nm = 파랑*, Ex/Em = 409 nm/530 nm = 녹색**)에서 스펙트라(Spectra) Max(M4) 판독기(몰레큘라 디바이스)로 결정하였고, 분석 배지 대조군을 차감한 후 청색/녹색 형광의 비율은 하기의 방정식에 따라 계산하였다: 비율 = (샘플-청색* - 대조군-청색*)/(샘플-녹색** - 대조군-녹색**).Finally, the fluorescence wavelength is measured with a Spectra Max(M4) reader (Molecular) at the following wavelengths (Ex/Em = 409 nm/460 nm = blue*, Ex/Em = 409 nm/530 nm = green**) device), and the ratio of blue/green fluorescence after subtracting the assay medium control was calculated according to the following equation: Ratio = (Sample-Blue*-Control-Blue*)/(Sample-Green**-Control -green**).

pH 조작 후, CCL2 유도 CCR2 신호 전달을 억제하는 능력에 대해 최종 LO 후보(CKLO1-4)를 특성화하였다. 이 경우, 중화 특성은 rec. CCL2 단백질의 단량체 변이체에 의해서만 평가하였으며, 약 15 ng/ml의 최종 농도에서 사용하였다. After pH manipulation, the final LO candidates (CKLO1-4) were characterized for their ability to inhibit CCL2-induced CCR2 signaling. In this case, the neutralizing properties are rec. It was evaluated only with the monomeric variant of the CCL2 protein and used at a final concentration of about 15 ng/ml.

마우스에서 이중 파라토프 항체를 사용한 인간 CCL2 면역 복합체 스위핑에 대한 평가Evaluation of Human CCL2 Immune Complex Sweeping Using Biparatopic Antibodies in Mice

이중 파라토프 항체가 야생형 인간 CCL2와 함께 면역 복합체를 형성하는 능력을 평가하기 위해, 항-CCL2 이중 파라토프 항체(20 mg/kg) 및 야생형 인간 CCL2(0.1 mg/kg)로 구성된 미리 형성된 면역 복합체를 10 ml/kg의 단일 용량으로 Balb/c 마우스의 꼬리 정맥에 투여하였다. 혈액은 투여 후 5분, 7시간, 1일, 3일 및 7일에 수집하였다. 혈청은 즉시 혈액을 4℃에서 14,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 제조하였다. 혈청은 측정할 때까지 -80℃ 이하에서 보관하였다. 시험한 이중 파라토프 항체는 하기의 표 4에 나열되어 있다. WT IgG1 Fc를 갖는 항체는 야생형과 유사한 Fc 감마 수용체 결합을 갖는 반면, PGLALA Fc를 갖는 항체는 Fc 감마 수용체 결합 침묵형이다. 결과는 도 4a 내지 도 4i에서 도시된다.To evaluate the ability of a biparatopic antibody to form an immune complex with wild-type human CCL2, a preformed immune complex consisting of an anti-CCL2 biparatopic antibody (20 mg/kg) and wild-type human CCL2 (0.1 mg/kg) was administered to the tail vein of Balb/c mice at a single dose of 10 ml/kg. Blood was collected at 5 minutes, 7 hours, 1 day, 3 days and 7 days post-dose. Serum was prepared by immediately centrifuging blood at 14,000 rpm at 4° C. for 10 minutes. Serum was stored at -80°C or lower until measurement. The biparatopic antibodies tested are listed in Table 4 below. Antibodies with WT IgG1 Fc have Fc gamma receptor binding similar to wild-type, whereas antibodies with PGLALA Fc are Fc gamma receptor binding silencing. The results are shown in FIGS. 4A-4I .

생체내 hCCL2 제거에 미치는 각 항-CCL2 이중 파라토프 항체의 면역 복합체 스위핑 효과는 도 4a 내지 도 4i에 도시된 바와 같이 Fc 감마 수용체 결합을 갖는 항-CCL2 항체(실선) 및 Fc 감마 수용체 결합 침묵형을 갖는 항-CCL2 항체(PGLALA, 점선)를 비교함으로써 평가하였다. 항체 곡선은 피닉스(Phoenix) 64(파사이트(Pharsight)/체르타라(Certara))를 사용하여 비구획 분석에 의해 분석하였다. AUCinf는 무한대로 외삽된 선형 로그 사다리꼴 규칙에 의해 추정하였다. 제거율 값음 용량/AUCinf로 정의한다. 상기 제거율의 차이는 또한 배수 변화로 표현되었으며, 이는 Fc 감마 수용체 결합(SG1)을 갖는 항체의 hCCL2 제거율을 Fc 감마 수용체 결합 침묵형(PGLALA)을 갖는 항체의 hCCL2 제거율로 나눔으로써 계산한다(하기 표 4). 하기 표 4의 데이터는 Fc 감마 수용체(FcgR) 결합 항체(WT IgG1)에 의한 인간 CCL2의 제거가 시험된 모든 이중 파라토프 항체에 대하여 Fc 감마 수용체 결합 침묵형 항체(L234A, L235A, P329G 돌연변이(카바트 EU 넘버링)를 포함한 IgG1 Fc 도메인을 갖는 PGLALA)의 것보다 우수함을 나타낸다. 이는 시험된 이중 파라토프 항체에 의해 달성된 CCL2의 면역 복합체 매개 스위핑이 더 효율적임을 시사한다. 또한, 몇몇 이중 파라토프 항체, 예를 들어 CNTO//인간화 11K2(CNTO//11K2)는 제거 값에서 큰 배수 변화를 보였다.The immune complex sweeping effect of each anti-CCL2 biparatopic antibody on hCCL2 clearance in vivo was as shown in FIGS. 4A to 4I , an anti-CCL2 antibody with Fc gamma receptor binding (solid line) and Fc gamma receptor binding silencing type. was evaluated by comparing the anti-CCL2 antibody (PGLALA, dashed line) with Antibody curves were analyzed by non-compartmental analysis using a Phoenix 64 (Pharsight/Certara). AUCinf was estimated by the linear log trapezoidal rule extrapolated to infinity. Removal rate value defined as sound capacity/AUCinf. The difference in clearance was also expressed as fold change, which was calculated by dividing the hCCL2 clearance of antibodies with Fc gamma receptor binding (SG1) by the hCCL2 clearance of antibodies with Fc gamma receptor binding silencing (PGLALA) (Table below). 4). The data in Table 4 below are the Fc gamma receptor binding silencing antibodies (L234A, L235A, P329G mutations (Ka) for all biparatopic antibodies tested for removal of human CCL2 by Fc gamma receptor (FcgR) binding antibody (WT IgG1) PGLALA) with an IgG1 Fc domain including bart EU numbering). This suggests that the immune complex mediated sweep of CCL2 achieved by the tested biparatopic antibody is more efficient. In addition, some biparatopic antibodies, such as CNTO//humanized 11K2 (CNTO//11K2), showed large fold changes in clearance values.

배수 변화는 WT FcγR(FcgR) 결합을 갖는 항체의 hCCL2 제거율을 PGLALA를 갖는 항체의 hCCL2 제거율로 나누어 계산한다. 도 4a 내지 도 4i 및 하기의 표 4에 도시된 바와 같이, CNTO//11k2는 FcgR 결합을 갖는 IgG1 야생형(WT)의 항체 및 FcgR 결합 침묵형인 항체(PGLALA) 사이에서 21.5의 가장 큰 배수 변화를 나타낸다. 이는 CNTO//11k2-WT IgG1에 의한 면역 복합체 매개 스위핑이 모든 변이체 중에서 가장 효율적임을 시사한다.Fold change is calculated by dividing the hCCL2 clearance of the antibody with WT FcγR (FcgR) binding by the hCCL2 clearance of the antibody with PGLALA. As shown in Figures 4a to 4i and Table 4 below, CNTO//11k2 exhibited the largest fold change of 21.5 between the IgG1 wild-type (WT) antibody with FcgR binding and the FcgR-binding silent antibody (PGLALA). indicates. This suggests that immune complex-mediated sweeping by CNTO//11k2-WT IgG1 is the most efficient among all variants.

표 4: 항-CCL2 이중 파라토프 항체(20 mg/kg) 및 야생형 인간 CCL2(0.1mg/kg)의 미리 형성된 면역 복합체 투여 후 야생형 CCL2의 제거율 값Table 4: Clearance values of wild-type CCL2 after administration of preformed immune complexes of anti-CCL2 biparatopic antibody (20 mg/kg) and wild-type human CCL2 (0.1 mg/kg)

마우스 혈청에서 총 인간 CCL2의 농도는 ECL에 의해 측정하였다. 3 ug/mL의 항-CCL2 항체 2F2-SG1을 멀티-어레이(MULTI-ARRAY) 96웰 플레이트(메소 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery))에 밤새 고정화시킨 후, 차단 완충액에서 30^oC에서 2시간 동안 배양하였다. 인간 CCL2 검량선 샘플, 품질 관리 샘플 및 희석된 마우스 혈청 샘플을 37^oC에서 30분 동안 9% SDS로 구성된 변성 완충액 또는 37^oC에서 10분 동안 pH2.0~2.5 글리신 HCl 완충액과 함께 배양하였다. 변성 완충액의 목적은 이중 파라토프 항체로부터 인간 CCL2를 분리하는 것이다. 이 후, 샘플을 10배 희석하여 항-CCL2 고정 플레이트에 첨가하고, 30℃에서 1시간 동안 결합시킨 후 세척하였다. 다음으로, SULFO TAG 표지된 MCP-1 항체를 첨가하고 플레이트를 세척하기 전에 30^oC에서 1시간 동안 항온처리하였다. 판독 버퍼 T(x4)(메소 스케일 디스커버리)를 즉시 플레이트에 추가하고 SECTOR 이미저(Imager) 2400(메소 스케일 디스커버리)으로 신호를 검출하였다. 분석 소프트웨어 소프트맥스 PRO(몰레큘라 디바이스)를 사용하여 검량선에 대한 반응을 기초로 인간 CCL2 농도를 계산하였다. The concentration of total human CCL2 in mouse serum was determined by ECL. 3 ug/mL of anti-CCL2 antibody 2F2-SG1 was immobilized overnight in a multi-array (MULTI-ARRAY) 96-well plate (Meso Scale Discovery), followed by 2 h at 30 ^o C in blocking buffer. cultured. Human CCL2 calibration curve samples, quality control samples and diluted mouse serum samples were incubated with either denaturing buffer consisting of 9% SDS at 37 ^o C for 30 min or pH2.0-2.5 glycine HCl buffer at 37 ^o C for 10 min. The purpose of the denaturing buffer is to separate human CCL2 from the biparatopic antibody. Thereafter, the sample was diluted 10-fold and added to an anti-CCL2 fixed plate, bound at 30° C. for 1 hour, and then washed. Next, SULFO TAG labeled MCP-1 antibody was added and the plates were incubated for 1 hour at 30 ^° C before washing. Read buffer T(x4) (Meso Scale Discovery) was immediately added to the plate and the signal was detected with a SECTOR Imager 2400 (Meso Scale Discovery). Analytical software Softmax PRO (Molecular Devices) was used to calculate human CCL2 concentrations based on the response to the calibration curve.

마우스 혈청에서 항-CCL2 항체의 농도는 ECL에 의해 측정하였다. 눈크 맥시소프(Nunc MaxiSorp) 플레이트(써모피셔(Thermofisher))에 항인간 IgG 카파 사슬(앤티바디 솔루션(Antibody Solutions))를 분주하고, 4℃에서 밤새 방치하여 항인간 IgG 고정 플레이트를 제작하였다. 검량선 및 샘플은 1% 풀링된 마우스 혈청으로 준비하였다. 그런 다음, 항인간 IgG 고정 플레이트에 샘플을 분주하고, 30℃에서 1시간 방치하였다. 이어서, HRP 접합체(서던바이오텍)를 갖는 염소 항인간 IgG(감마-사슬 특이적)를 첨가하여 30℃에서 1시간 동안 반응시켰다. ABTS 기질(KPL)을 기질로 사용하여 발색 반응을 실시하고 450 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기로 측정하였다. 분석 소프트웨어 소프트맥스(SOFTmax) PRO(몰레큘라 디바이스(Molecular Devices))를 사용하여 검량선의 흡광도로부터 마우스 혈장 중 농도를 계산하였다.The concentration of anti-CCL2 antibody in mouse serum was determined by ECL. Anti-human IgG kappa chains (Antibody Solutions) were dispensed on Nunc MaxiSorp plates (Thermofisher), and left at 4° C. overnight to prepare anti-human IgG immobilized plates. Calibration curves and samples were prepared with 1% pooled mouse serum. Then, the sample was aliquoted on an anti-human IgG fixed plate, and left at 30°C for 1 hour. Then, goat anti-human IgG (gamma-chain specific) having an HRP conjugate (Southern Biotech) was added and reacted at 30° C. for 1 hour. A chromogenic reaction was performed using ABTS substrate (KPL) as a substrate, and the absorbance at 450 nm was measured with a microplate reader. The concentration in mouse plasma was calculated from the absorbance of the calibration curve using the analysis software SOFTmax PRO (Molecular Devices).

연구의 요약Summary of the study

마우스 PK 연구 데이터를 요약하면, 시험된 이중 파라토프 항체에 의한 인간 CCL2의 스위핑은 동일한 용량의 단일 파라토프 항체에 비해 더 효율적이었다. 단일 파라토프 항체의 경우, WT FcgR 결합을 갖는 항체 및 FcgR 결합 침묵형 항체 사이의 항원 제거에 최소한의 차이가 있었다(표 3). 이와 대조적으로, WT FcgR 결합 및 FcgR 결합 침묵형을 갖는 이중 파라토프 항체들 사이에 큰 항원 제거율 차이가 수득되었고(표 4), 이는 시험된 이중 파라토프 항체가 인간 CCL2를 효율적으로 스위핑할 수 있음을 시사한다. CNTO888//11K2의 조합은 제거율에서 가장 큰 배수 기회를 보여주었기 때문에 추가적인 항체 조작을 위해 선택하였다.Summarizing the mouse PK study data, sweeping of human CCL2 by the tested biparatopic antibody was more efficient compared to the same dose of monoparatopic antibody. For monoparatopic antibodies, there was minimal difference in antigen clearance between antibodies with WT FcgR binding and FcgR binding silent antibodies (Table 3). In contrast, a large difference in antigen clearance was obtained between biparatopic antibodies with WT FcgR binding and FcgR binding silencing (Table 4), indicating that the tested biparatopic antibody was able to efficiently sweep human CCL2 suggests The combination of CNTO888//11K2 was chosen for further antibody engineering as it showed the greatest fold chance in clearance.

실시예 B-2 변형된 가변 도메인 및 CDR을 갖는 항-CCL2 항체(이온 의존적/pH 의존적 결합)Example B-2 Anti-CCL2 Antibody with Modified Variable Domains and CDRs (Ion Dependent/pH Dependent Binding)

이온 의존적/pH 의존적 결합을 유발하는 변형Modifications that cause ion-dependent/pH-dependent binding

pH 의존적 항-CCL2 항체를 생성하기 위해, mAb CNTO888 및 인간화 11K2의 모든 CDR에 대해 히스티딘 선별검사 돌연변이유발을 실시하였다. CDR의 각 아미노산은 제조업체의 지침에 따라 인퓨전(In-Fusion) HD 클로닝 키트(클론테크(Clontech Inc.) 또는 타카라 바이오사(Takara Bio company))를 사용하여 개별적으로 히스티딘으로 돌연변이되었다. 각 변이체가 올바르게 변이되었음을 서열분석을 통해 확인한 후, 사히의 방법으로 변이체를 일시적으로 발현시키고 정제하였다: 재조합 항체는 제조사의 지침에 따라 프리스타일(Freestyle) FS293-F 세포 및 293펙틴(라이프 테크놀로지)을 사용하여 일시적으로 발현시켰다. 재조합 항체를 단백질 A(GE 헬스케어)로 정제하고 D-PBS 또는 His 완충액(20 mM 히스티딘, 150 mM NaCl, pH6.0)에서 용출하였다. 필요한 경우, 고분자량 및/또는 저분자량 성분을 제거하기 위해 크기 배제 크로마토그래피를 추가로 실시하였다. 모든 히스티딘 치환 변이체는 상술된 것과 비교하여 변형된 비아코어® 분석에 의해 평가하였다. 간단히 말해서, pH 5.8에서의 추가적인 해리 단계는 pH 7.4에서의 해리 단계 직후에 비아코어® 분석에 통합되었다. 이는 pH 5.8에서 상응하는 해리와 대조적으로 pH 7.4에서 형성된 복합체로부터 항체(Ab) 및 항원(Ag) 사이의 pH 의존적 해리를 평가하기 위한 것이다. pH 5.8 완충액에서의 해리 속도는 스크루버(Scrubber) 2.0(바이오로직 소프트웨어(BioLogic Software)) 곡선 맞춤 소프트웨어를 사용하여 데이터를 처리하고 맞춤으로써 결정하였다.To generate pH dependent anti-CCL2 antibodies, all CDRs of mAb CNTO888 and humanized 11K2 were subjected to histidine screening mutagenesis. Each amino acid of the CDR was individually mutated to histidine using the In-Fusion HD cloning kit (Clontech Inc. or Takara Bio company) according to the manufacturer's instructions. After confirming that each mutant was mutated correctly through sequencing, the mutant was transiently expressed and purified by Sahi's method: Recombinant antibody was prepared from Freestyle FS293-F cells and 293pectin (Life Technology) according to the manufacturer's instructions. was used for transient expression. Recombinant antibody was purified with Protein A (GE Healthcare) and eluted in D-PBS or His buffer (20 mM histidine, 150 mM NaCl, pH6.0). If necessary, size exclusion chromatography was further performed to remove high molecular weight and/or low molecular weight components. All histidine substitution variants were evaluated by the modified Biacore® assay compared to those described above. Briefly, an additional dissociation step at pH 5.8 was incorporated into the Biacore® assay immediately after the dissociation step at pH 7.4. This was to evaluate the pH-dependent dissociation between the antibody (Ab) and antigen (Ag) from the complex formed at pH 7.4 as opposed to the corresponding dissociation at pH 5.8. Dissociation rates in pH 5.8 buffer were determined by processing and fitting the data using Scrubber 2.0 (BioLogic Software) curve fitting software.

pH 7.4 해리 단계와 비교하여 pH 5.8에서 결합 반응의 감소를 초래하는 단일 히스티딘 치환을 선택하고 조합하였다. pH 7.4에서 친화도를 개선시키는 돌연변이를 확인하기 위해, 히스티딘 치환 단계 동안 생성된 적어도 하나의 변이체를 사용하여 각각 중쇄 및 경쇄에 대해 500개 초과의 변이체를 생성하였다. 상기 변이체는 원래 아미노산 및 시스테인을 제외하고 18개의 다른 아미노산으로 치환된 CDR의 각 아미노산을 가졌다. 인간 CCL2에 대한 변이체의 결합능은 비아코어® 4000 기기(GE 헬스케어)를 사용하여 pH 7.4 하의 37℃에서 평가하였다. 상기와 같이, pH 5.8에서의 추가적인 해리 단계는 pH 7.4에서의 해리 단계 직후에 비아코어® 분석에 통합되었다. pH 5.8 완충액에서의 해리 속도는 스크루버(Scrubber) 2.0(바이오로직 소프트웨어(BioLogic Software)) 곡선 맞춤 소프트웨어를 사용하여 데이터를 처리하고 맞춤으로써 결정하였다. A single histidine substitution was selected and combined that resulted in a decrease in the binding response at pH 5.8 compared to the pH 7.4 dissociation step. To identify mutations that improve affinity at pH 7.4, at least one variant generated during the histidine substitution step was used to generate more than 500 variants for the heavy and light chains, respectively. This variant had each amino acid in the CDR substituted with 18 other amino acids except for the original amino acid and cysteine. The binding capacity of the variants to human CCL2 was evaluated at 37°C at pH 7.4 using a Biacore® 4000 instrument (GE Healthcare). As above, an additional dissociation step at pH 5.8 was incorporated into the Biacore® assay immediately after the dissociation step at pH 7.4. Dissociation rates in pH 5.8 buffer were determined by processing and fitting the data using Scrubber 2.0 (BioLogic Software) curve fitting software.

pH 7.4에서 친화도를 개선하고 pH 의존성을 개선한 변이체를 선택하고 이러한 돌연변이를 조합하였다. 이는 하기의 표에서 4개의 11K2 변이체 및 4개의 CNTO888 변이체로 예시된다. Variants with improved affinity and pH dependence at pH 7.4 were selected and these mutations were combined. This is exemplified by the four 11K2 variants and the four CNTO888 variants in the table below.

표: pH 의존적 결합을 위해 조작된 4개의 변형된 11K2 및 4개의 CNTO888 변이체Table: Four modified 11K2 and four CNTO888 variants engineered for pH-dependent binding

변형된 11K2 및 CNTO888 변이체의 조합 효과를 평가하기 위해, 각각의 11K2 변이체를 4개의 변형된 CNTO888 변이체와 조합하고, 크로스맵 형식의 이중 파라토프 CCL2 항체로 발현시켰다. 이는 하기의 표에 예시되어 있으며, 4 x 4 조합은 CKLO01 내지 CKLO16으로 지정된 16개의 2중 파라토프 항체를 생성한다.To evaluate the combined effect of the modified 11K2 and CNTO888 variants, each 11K2 variant was combined with four modified CNTO888 variants and expressed as a crossmap format biparatopic CCL2 antibody. This is illustrated in the table below, where the 4×4 combination produces 16 biparatopic antibodies designated CKLO01 through CKLO16.

표: 16개의 이중특이적(이중 파라토프) 항체를 생성하기 위한 4개의 변형된 11K2 및 4개의 변형된 CNTO888 변이체의 조합Table: Combinations of 4 modified 11K2 and 4 modified CNTO888 variants to generate 16 bispecific (biparatopic) antibodies

이중특이적 항체를 생성하기 위하여, WO 2016/016299에 기재된 크로스맵 기술이 사용되었고, VH/VL은 하나의 항체 팔에서 교환되고, 다른 항체 팔의 CH1/CL 계면은 이종이량체화를 촉진하기 위해 CH3/CH3 계면에서 구멍 내 돌기 기술과 함께 전하 변형에 의해 수정되었다. 상기 기술이 적용된 모든 4개의 항체 사슬에 대한 예시적인 서열이 CKLO2 IgG1에 대해 제시된다(서열번호 108 내지 서열번호 111을 참조). 사용된 중쇄 불변 도메인(예컨대, IgG1 야생형(Fc 수용체 결합 침묵형 돌연변이 없음), PGLALA, SG1095, SG1099, 1100 - SG1095, SG1099, 1100의 경우 하기의 설명 또는 서열 설명을 참조)에 따라, 접미사 IgG1, PGLALA, SG1095, SG1099, 1100을 추가하였다.To generate the bispecific antibody, the crossmap technique described in WO 2016/016299 was used, where VH/VL is exchanged in one antibody arm and the CH1/CL interface of the other antibody arm is used to promote heterodimerization. For this purpose, it was modified by charge modification with the in-hole technique at the CH3/CH3 interface. Exemplary sequences for all four antibody chains to which the above techniques have been applied are shown for CKLO2 IgG1 (see SEQ ID NOs: 108-111). Depending on the heavy chain constant domain used (eg, IgG1 wild type (no Fc receptor binding silencing mutation), PGLALA, SG1095, SG1099, 1100 - SG1095, SG1099, 1100 see the description below or sequence description), the suffix IgG1, PGLALA, SG1095, SG1099, and 1100 were added.

변형된 가변 도메인 및 CDR을 갖는 항-CCL2 항체의 기능적 특성화(이온 의존적/pH 의존적 결합) Functional characterization of anti-CCL2 antibodies with modified variable domains and CDRs (ion-dependent/pH-dependent binding)

친화도 측정(상기의 방법 참조)Affinity measurement (see method above)

IgG1 야생형으로서 생성된 16개의 이중특이적 항-CCL2 항체 모두에 대해, 이들의 pH 의존적 결합 인간 CCL2를 측정하였다.For all 16 bispecific anti-CCL2 antibodies generated as IgG1 wild-type, their pH dependent binding human CCL2 was determined.

도 5a는 4개의 변형된 11K2 및 4개의 CNTO888 변이체 및 조합 후 16개의 크로스맵의 pH 7.4(검정색 선) 및 pH 5.8(회색선)에서 단량체 CCL2에 대한 결합 곡선을 나타내는 비아코어® 센서그램을 도시한다. 5A depicts a Biacore® sensorgram showing the binding curves for monomeric CCL2 at pH 7.4 (black line) and pH 5.8 (grey line) of 4 modified 11K2 and 4 CNTO888 variants and 16 crossmaps after combination. do.

도 5b는 pH 5.8의 추가적인 해리 단계가 pH 7.4의 해리 단계 직후 비아코어® 분석에 통합된 단량체 CCL2에 대하여 4개의 변형된 11K2 및 4개의 CNTO888 변이체 및 조합 후 16개의 크로스맵의 결합 곡선을 나타내는 비아코어® 센서그램을 도시한다. Figure 5b is a via showing binding curves of four modified 11K2 and four CNTO888 variants and 16 crossmaps after combination for monomeric CCL2, where an additional dissociation step at pH 5.8 was incorporated into the Biacore® assay immediately after the dissociation step at pH 7.4. The Core® sensorgram is shown.

CCL8에 대한 교차 반응성 결합 Cross-reactive binding to CCL8

재조합 단량체 인간 CCL2 및 재조합 단량체 인간 CCL8에 대한 pH 의존성 결합은 비아코어 T200 기기(GE 헬스케어)를 사용하여 37°C에서 평가하였다. 항인간 Fc(GE 헬스케어)를 제조사의 권장된 설정에 따라 아민 커플링 키트(GE 헬스케어)를 사용하여 CM4 센서 칩의 각 플로우 셀에 고정화시켰다. 항체 및 분석물을 ACES pH 7.4 또는 pH 5.8 완충액(20 mM ACES, 150 mM NaCl, 1 mg/ml BSA, 0.05% 트윈 20, 0.005% NaN3)으로 희석하였다. 항체를 항 Fc 센서 표면 상에 포획한 다음, 재조합 인간 CCL2를 8 nM 농도에서 유동 세포에 걸쳐 주입하였다. 항체에 대한 분석물의 결합 단계를 120초 동안 모니터링한 다음, 180초의 해리 단계를 모니터링하였다. 센서 표면은 3M MgCl₂로 각 주기마다 재생시켰다. 결합 센서그램은 포획 수준에 대한 결합 응답의 정규화에 의해 TIBCO 스포트파이어(Spofire)에 의해 처리하였다. The pH-dependent binding to recombinant monomeric human CCL2 and recombinant monomeric human CCL8 was assessed at 37 °C using a Biacore T200 instrument (GE Healthcare). Anti-human Fc (GE Healthcare) was immobilized in each flow cell of a CM4 sensor chip using an amine coupling kit (GE Healthcare) according to the manufacturer's recommended settings. Antibodies and analytes were diluted with ACES pH 7.4 or pH 5.8 buffer (20 mM ACES, 150 mM NaCl, 1 mg/ml BSA, 0.05% Tween 20, 0.005% NaN3). Antibodies were captured on the anti-Fc sensor surface and then recombinant human CCL2 was injected across the flow cell at a concentration of 8 nM. The phase of binding of the analyte to the antibody was monitored for 120 seconds followed by a dissociation phase of 180 seconds. The sensor surface was regenerated at each cycle with 3M MgCl ₂ . Binding sensorgrams were processed by TIBCO Spofire by normalization of binding response to capture level.

pH 7.4에서 형성된 항체/항원 복합체에 대한 pH 의존적 해리의 평가는 변형된 비아코어 분석에 의해 확인하였다. 간단히 말해서, pH 5.8에서의 추가적인 해리 단계는 pH 7.4에서의 해리 단계 직후에 비아코어® 분석에 통합되었다. 결합 센서그램은 포획 수준에 대한 결합 응답의 정규화에 의해 TIBCO 스포트파이어(Spofire)에 의해 처리하였다. Assessment of pH-dependent dissociation for antibody/antigen complexes formed at pH 7.4 was confirmed by a modified Biacore assay. Briefly, an additional dissociation step at pH 5.8 was incorporated into the Biacore® assay immediately after the dissociation step at pH 7.4. Binding sensorgrams were processed by TIBCO Spofire by normalization of binding response to capture level.

재조합 인간 CCL8 P8A 단량체의 발현 및 정제: 야생형 인간 CCL8에 대한 서열은 젠뱅크(Genbank)에서 입수하였다(NCBI: NP_005614.2). 단량체 CCL8을 만들기 위해, 성숙한 CCL8 단백질의 8번 위치에 있는 프롤린을 알라닌으로 돌연변이시켰다. Expi 293 세포(라이프테크)를 제조사의 지침에 따라 형질감염시켰다. CCL8 야생형 및 P8A 단량체 단백질은 SP-세파로즈 HP(GE 헬스케어) 및 수퍼로즈 200 크기 배제(GE 헬스케어) 크로마토그래피를 사용하는 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 동일한 방법을 사용하여 정제하였다. 간단히 말해서, 세포 배양 상청액을 MilliQ 물(밀리포어(Millipore))로 2.5배 희석하고, PBS로 평형화된 Hi-Trap SP-HP 컬럼에 로딩하고, 평형화 완충액으로 세척하고, 0~2M NaCl의 구배를 사용하여 용출하였다. 용출된 단백질 분획을 취합하고, 20 mM 히스티딘, 150 mM NaCl, pH 6.0으로 평형화된 하이로드(HiLoad) 16/600 수퍼로즈 200(GE 헬스케어) 컬럼을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 분획은 크기 배제 크로마토그래피 및 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. CCL8 단백질을 함유한 분획을 취함하고, 농축하여 -80°C에서 보관하였다.Expression and Purification of Recombinant Human CCL8 P8A Monomer: The sequence for wild-type human CCL8 was obtained from Genbank (NCBI: NP_005614.2). To make the monomeric CCL8, the proline at position 8 of the mature CCL8 protein was mutated to an alanine. Expi 293 cells (Lifetech) were transfected according to the manufacturer's instructions. CCL8 wild-type and P8A monomer proteins were purified using the same method from cell culture supernatants by cation exchange chromatography using SP-Sepharose HP (GE Healthcare) and Superrose 200 size exclusion (GE Healthcare) chromatography . Briefly, the cell culture supernatant was diluted 2.5-fold with MilliQ water (Millipore), loaded onto a Hi-Trap SP-HP column equilibrated with PBS, washed with equilibration buffer, and a gradient of 0–2 M NaCl was applied. was used to elute. The eluted protein fractions were pooled and further purified by size exclusion chromatography using a HiLoad 16/600 Superrose 200 (GE Healthcare) column equilibrated with 20 mM histidine, 150 mM NaCl, pH 6.0. did. Fractions were analyzed by size exclusion chromatography and SDS-PAGE. Fractions containing CCL8 protein were collected, concentrated and stored at -80 °C.

인간 CCL8은 CCL2와 높은 수준의 상동성을 공유하며 CCR2에도 결합할 수 있다. 11K2 팔이 CCL8에 결합할 수 있음에 따라(도 1을 참조), CCL8을 중화시키는 표적외 효과를 피하기 위해 상기 결합을 줄이기 위한 돌연변이를 확인하는 것이 필요하였다. 또한, 11K2 팔에서 CCL8 결합을 제거하는 것은 CCL2와 면역 복합체를 효율적으로 형성하는 데 중요하다. CNTO 팔은 CCL8에 결합하지 않기 때문에, 11K2 팔에 대한 CCL8의 결합은 CCL2와의 면역 복합체 형성을 방해하여 혈장으로부터 CCL2의 제거율을 감소시킬 수 있다.Human CCL8 shares a high degree of homology with CCL2 and can also bind to CCR2. As the 11K2 arm is capable of binding CCL8 (see FIG. 1 ), it was necessary to identify mutations to reduce this binding to avoid off-target effects that neutralize CCL8. In addition, abolition of CCL8 binding in the 11K2 arm is important for efficient formation of immune complexes with CCL2. Since the CNTO arm does not bind to CCL8, binding of CCL8 to the 11K2 arm may interfere with immune complex formation with CCL2, reducing the clearance of CCL2 from plasma.

인간 CCL8에 대한 11K2의 결합을 감소시키고 인간 CCL2에 선택성을 부여하는 돌연변이를 확인하기 위해, 일부 CDR 위치는, 예컨대 CKLO02의 11K2 VH에 있는 D101E 또는 CKLO03의 11K2 VL에 있는 W92R과 같이 huCCL8에 대한 교차 반응성을 제거하기 위해 치환하였다. 도 6에 도시된 바와 같이, 이중 파라토프 크로스맵에서 CCL8 결합은 11K2를 조작함으로써 현저하게 감소할 수 있다. CKLO01 변이체는 CCL8 결합을 감소시키도록 최적화되지 않은 반면, CKLO04, CKLO03 및 CKLO02는 CCL8 결합을 감소시키는 돌연변이를 함유한다. 4개의 크로스맵은 모두 CCL8에 대한 pH 의존적 결합을 가진다.To identify mutations that reduce binding of 11K2 to human CCL8 and confer selectivity to human CCL2, some CDR positions are crossed over to huCCL8, such as D101E in the 11K2 VH of CKLO02 or W92R in the 11K2 VL of CKLO03. Substituted to eliminate reactivity. As shown in Figure 6, CCL8 binding in the biparatopic crossmap can be significantly reduced by engineering 11K2. The CKLO01 variant was not optimized to reduce CCL8 binding, whereas CKLO04, CKLO03 and CKLO02 contain mutations that reduce CCL8 binding. All four crossmaps have pH-dependent binding to CCL8.

pH 7.4 및 pH 5.8에서 재조합 CCL2 및 CCL8에 대한 항-CCL2 항체의 결합 친화도 Binding Affinity of Anti-CCL2 Antibodies to Recombinant CCL2 and CCL8 at pH 7.4 and pH 5.8

인간 CCL2 및 CCL8에 대한 모 CNTO888H/11K2H2, CKLO1, CKLO2 및 CKLO3의 친화도 및 pH 의존적 결합을 결정하기 위해, 비아코어 T200 기기(GE 헬스케어)를 사용하여 37°C에서 평가하였다. 항인간 Fc(GE 헬스케어)를 제조사의 권장된 설정에 따라 아민 커플링 키트(GE 헬스케어)를 사용하여 CM4 센서 칩의 각 플로우 셀에 고정화시켰다. 항체 및 분석물을 ACES pH 7.4 또는 pH 5.8 완충액(20 mM ACES, 150 mM NaCl, 1 mg/ml BSA, 0.05% 트윈 20, 0.005% NaN3)으로 희석하였다. 항체를 항 Fc 센서 표면에 포획한 다음, 재조합 인간 CCL2 P8A 변이체(단량체) 또는 CCL8 P8A 변이체(단량체)를 2배 연속 희석에 의해 제조한 1.25 nM 내지 20 nM에서 유동 세포에 걸쳐 주입하였다. 센서 표면은 3M MgCl2로 각 주기마다 재생시켰다. 결합 친화도는 비아코어 T200 평가 소프트웨어 버전 2.0(GE 헬스케어)을 사용하여 데이터를 1:1 결합 모델로 처리하고 맞춤으로서 결정하였다. pH 7.4 및 pH 5.8에서 재조합 CCL2 및 CCL8에 대한 항-CCL2 항체의 결합 친화도를 하기의 표 5에 도시하였다. To determine the affinity and pH-dependent binding of parental CNTO888H/11K2H2, CKLO1, CKLO2 and CKLO3 to human CCL2 and CCL8, they were evaluated at 37 °C using a Biacore T200 instrument (GE Healthcare). Anti-human Fc (GE Healthcare) was immobilized in each flow cell of a CM4 sensor chip using an amine coupling kit (GE Healthcare) according to the manufacturer's recommended settings. Antibodies and analytes were diluted with ACES pH 7.4 or pH 5.8 buffer (20 mM ACES, 150 mM NaCl, 1 mg/ml BSA, 0.05% Tween 20, 0.005% NaN3). Antibodies were captured on the anti-Fc sensor surface and then either recombinant human CCL2 P8A variant (monomer) or CCL8 P8A variant (monomer) was injected across the flow cell at 1.25 nM to 20 nM prepared by 2-fold serial dilutions. The sensor surface was regenerated at each cycle with 3M MgCl2. Binding affinity was determined as fit and processing the data into a 1:1 binding model using Biacore T200 evaluation software version 2.0 (GE Healthcare). The binding affinities of anti-CCL2 antibodies to recombinant CCL2 and CCL8 at pH 7.4 and pH 5.8 are shown in Table 5 below.

표 5: pH 7.4 및 pH 5.8에서 재조합 CCL2 및 CCL8에 대한 항-CCL2 항체의 결합 친화도Table 5: Binding Affinities of Anti-CCL2 Antibodies to Recombinant CCL2 and CCL8 at pH 7.4 and pH 5.8

참고: n.d. 낮은 결합 반응으로 인해 KD를 결정할 수 없다.Note: n.d. The KD cannot be determined due to the low binding reaction.

표 5의 데이터는 pH 7.4에서 CCL8에 대한 결합이 CKLO2 및 CKLO3에 대해 제거된 반면, pH 7.4에서 강한 친화도 및 CCL2에 대한 pH 의존적 결합을 유지함을 도시한다. 결과는 CNTO888 및 11K2에 기반한 모 이중특이적 항체의 가변 영역 및 CDR에 도입된 상이한 변형이 pH 7.4에서 모 Ab와 비교하여 CCL2에 대한 결합 친화도가 향상된 친화도 성숙 변이체, CKLO1, CKLO2, CKLO3을 성공적으로 생성했음을 나타낸다. 동시에, CKLO1, CKLO2, CKLO3은 CCL2에 강한 pH 의존적 결합을 보였다. pH 7.4에서의 KD 값과 비교하여 pH 5.8에서는 CCL2에 대한 결합 친화도의 1000배를 초과하여 약한 KD가 관찰되었다.The data in Table 5 show that binding to CCL8 at pH 7.4 was abolished to CKLO2 and CKLO3, while maintaining strong affinity and pH dependent binding to CCL2 at pH 7.4. The results show that different modifications introduced in the variable regions and CDRs of the parent bispecific antibodies based on CNTO888 and 11K2 produced affinity matured variants, CKLO1, CKLO2, CKLO3, with improved binding affinity for CCL2 compared to the parent Ab at pH 7.4. Indicates that it was created successfully. At the same time, CKLO1, CKLO2, and CKLO3 showed strong pH-dependent binding to CCL2. A weak KD of over 1000 times the binding affinity for CCL2 was observed at pH 5.8 compared to the KD value at pH 7.4.

야생형 인간 CCL2의 제거율Removal rate of wild-type human CCL2

pH 의존적 이중특이적 항체가 야생형 인간 CCL2의 제거율을 향상시키는 능력을 평가하기 위해, 항-CCL2 단일 파라토프 항체(20 mg/kg) 및 야생형 인간 CCL2(0.1 mg/kg)로 구성된 미리 형성된 면역 복합체를 10 ml/kg의 단일 용량으로 SCID 마우스의 꼬리 정맥에 투여하였다. 혈액은 투여 후 5분, 1시간, 4시간, 7시간, 1일 및 7일에 수집하였다. 혈청은 측정할 때까지 -80℃ 이하에서 보관하였다. 시험한 크로스맵 항체는 모 CNTO//11K2 및 4개의 pH 조작된 변이체, CKLO01, CKLO02, CKLO03 및 CKLO04였다. 모든 항체는 IgG1 야생형 Fc 부분을 가졌다(Fc(감마) 수용체 결합을 침묵화/소멸하는 돌연변이 없음). 마우스 혈청에서 총 인간 CCL2 및 항-CCL2 항체 농도의 측정은 상술한 바와 같이 실시하였다(표 4에 따른 "마우스에서 이중 파라토프 항체를 사용한 인간 CCL2 면역 복합체 스위핑에 대한 평가"). To evaluate the ability of a pH-dependent bispecific antibody to enhance clearance of wild-type human CCL2, a preformed immune complex consisting of an anti-CCL2 monoparatopic antibody (20 mg/kg) and wild-type human CCL2 (0.1 mg/kg) was administered to the tail vein of SCID mice at a single dose of 10 ml/kg. Blood was collected at 5 minutes, 1 hour, 4 hours, 7 hours, 1 day and 7 days post-dose. Serum was stored at -80°C or lower until measurement. The crossmap antibodies tested were the parental CNTO//11K2 and four pH engineered variants, CKLO01, CKLO02, CKLO03 and CKLO04. All antibodies had an IgG1 wild-type Fc portion (no mutations that silence/abolish Fc (gamma) receptor binding). Determination of total human CCL2 and anti-CCL2 antibody concentrations in mouse serum was performed as described above (“Evaluation of human CCL2 immune complex sweeps using biparatopic antibodies in mice” according to Table 4).

결과는 도 7a에서 도시된다. hCCL2 및 이중특이적 항-CCL2 항체(모 CNTO//11K2 및 pH 의존적 변이체 CKLO01, CKLO02, CKLO03 및 CKLO04)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 SCID 마우스에 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다. 4가지 모든 pH 조작된 변이체는 인간 CCL2의 빠른 제거율을 보여주었다. CKLO02, CKLO03의 경우, 인간 CCL2는 1일차까지 검출 한계 미만이었다. 모 CNTO//11K2의 경우, 인간 CCL2의 빠른 제거가 처음에 1일까지 관찰되었지만, 이후에는 인간 CCL2의 제거가 느려졌다. The results are shown in Figure 7a. Serum concentrations of hCCL2 over time after injection of preformed immune complexes consisting of hCCL2 and bispecific anti-CCL2 antibodies (parental CNTO//11K2 and pH-dependent variants CKLO01, CKLO02, CKLO03 and CKLO04) into SCID mice. do. All four pH engineered variants showed rapid clearance of human CCL2. For CKLO02 and CKLO03, human CCL2 was below the limit of detection by day 1. For parental CNTO//11K2, rapid clearance of human CCL2 was initially observed up to day 1, but thereafter the clearance of human CCL2 was slow.

실시예 B-3 변형된 가변 도메인 및 CDR을 갖는 항-CCL2 항체(이온 의존적/pH 의존적 결합) 및 Fc 매개 스위핑Example B-3 Anti-CCL2 Antibody with Modified Variable Domains and CDRs (Ion Dependent/pH Dependent Binding) and Fc-Mediated Sweeping

스위핑 기술을 통한 이중특이적 항-CCL2 항체의 변형Modification of bispecific anti-CCL2 antibodies via sweeping technique

이중특이적 항-CCL2 항체는 이중특이적 항-CCL2 항체가 장기간에 걸쳐 유리 CCl2를 제거하여 생체 내에서 항암 효능 또는 생체내 항염증 효능과 같은 생물학적 효과를 지속할 수 있도록 하는 스위핑 기술을 사용하여 변형되었다.Bispecific anti-CCL2 antibodies are produced using sweeping technology that allows bispecific anti-CCL2 antibodies to remove free CCl2 over a long period of time, thereby sustaining biological effects such as anti-cancer efficacy or in vivo anti-inflammatory efficacy in vivo. has been transformed

pI Fc 매개 스위핑 pI Fc-mediated sweeping

pH 조작된 이중 파라토프 항체가 생체내 CCL2 제거를 가속화할 수 있음을 입증한 후, 다음으로 야생형 인간 CCL2의 제거를 향상시키는 pI 상승 치환을 갖는 항체의 능력을 평가하였다. 항-CCL2 단일 파라토프 항체(20 mg/kg) 및 야생형 인간 CCL2(0.1 mg/kg)로 구성된 미리 형성된 면역 복합체를 SCID 마우스의 꼬리 정맥에 10 ml/kg의 단일 용량으로 투여하였다. 혈액은 투여 후 5분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간 및 7일에 수집하였다. 혈청은 측정할 때까지 -80℃ 이하에서 보관하였다. 시험한 크로스맵 항체는 IgG1을 갖는 모 CKLO03 및 pI가 강화된 Fc, CKLO03-SG1099가 있는 CKLO03이었다. 마우스 혈청에서 총 인간 CCL2 및 항-CCL2 항체 농도의 측정은 상술한 바와 같이 실시하였다(표 4 아래의 "마우스에서 이중 파라토프 항체를 사용한 인간 CCL2 면역 복합체 스위핑에 대한 평가"). After demonstrating that pH engineered biparatopic antibodies can accelerate CCL2 clearance in vivo, the ability of antibodies with pi synergistic substitutions to enhance clearance of wild-type human CCL2 was next evaluated. A preformed immune complex consisting of anti-CCL2 monoparatopic antibody (20 mg/kg) and wild-type human CCL2 (0.1 mg/kg) was administered to the tail vein of SCID mice at a single dose of 10 ml/kg. Blood was collected at 5 minutes, 30 minutes, 1 hour, 2 hours, 4 hours and 7 days post-dose. Serum was stored at -80°C or lower until measurement. The crossmap antibodies tested were parental CKLO03 with IgG1 and CKLO03 with pI-enriched Fc, CKLO03-SG1099. Determination of total human CCL2 and anti-CCL2 antibody concentrations in mouse serum was performed as described above (“Evaluation of human CCL2 immune complex sweeps using biparatopic antibodies in mice” below Table 4).

결과는 도 7b에서 도시된다. hCCL2 및 CKLO03(IgG1 야생형 Fc를 가짐) 또는 CKLO03-SG1099(강화된 pI Fc를 갖는 CKLO03)로 이루어진 미리 형성된 면역 복합체를 SCID 마우스에 주사한 후 시간 경과에 따른 hCCL2의 혈청 농도를 도시한다. Fc 치환 Q311R/P343R(EU 카바트 넘버링)을 함유하는 CKLO03-SG1099는 IgG1을 갖는 CKLO03과 비교하여 인간 CCL2의 더 빠른 제거/감소를 나타내었다. 이는 pI 상승 돌연변이를 갖는 pH 의존적 이중 파라토프 항체가 CCL2의 제거를 가속화할 수 있음을 보여준다.The results are shown in Figure 7b. Serum concentrations of hCCL2 over time after injection of preformed immune complexes consisting of hCCL2 and CKLO03 (with IgG1 wild-type Fc) or CKLO03-SG1099 (CKLO03 with enhanced pI Fc) into SCID mice are shown. CKLO03-SG1099 containing the Fc substitution Q311R/P343R (EU Kabat numbering) showed a faster clearance/reduction of human CCL2 compared to CKLO03 with IgG1. This shows that a pH-dependent biparatopic antibody with a pI raising mutation can accelerate the clearance of CCL2.

FcγRIIb 강화 Fc 변이체 및 추가 Fc 변형을 갖는 이중 파라토프 항-CCL2 항체의 생성 Generation of biparatopic anti-CCL2 antibodies with FcγRIIb enhancing Fc variants and additional Fc modifications

이러한 예에서, CCL2 제거를 향상시키기 위한 Fc 조작이 설명되어 있다.In this example, Fc engineering to enhance CCL2 clearance is described.

WO 2013/125667에서는 FcγRIIb에 대해 증가된 친화도를 나타내는 Fc 도메인을 포함한 항원 결합 분자(예컨대, 항체)의 투여에 의해 가용성 항원의 제거율이 향상될 수 있다는 것이 입증되었다. 또한, 인간 FcγRIIb에 대한 향상된 결합을 나타낼 수 있는 Fc 변이체가 WO 2012/115241 및 WO 2014/030728에 설명되어 있다. 또한, 이들 Fc 변이체는 인간 FcγRIIb에 대한 결합이 선택적으로 향상되고 다른 활성 Fc 감마 수용체(Fc 감마 Rs)에 대한 결합이 감소될 수 있다는 것이 설명되어 있다. FcγRIIb 결합의 이러한 선택적 향상은 가용성 항원의 제거에 유리할 뿐만 아니라 바람직하지 않은 작동체 기능 및 면역 반응의 위험을 감소시키는 데에도 유리할 수 있다.WO 2013/125667 demonstrated that the clearance rate of soluble antigens can be improved by administration of an antigen-binding molecule (eg, an antibody) comprising an Fc domain exhibiting increased affinity for FcγRIIb. In addition, Fc variants capable of exhibiting enhanced binding to human FcγRIIb are described in WO 2012/115241 and WO 2014/030728. It has also been demonstrated that these Fc variants may selectively enhance binding to human FcγRIIb and may decrease binding to other active Fc gamma receptors (Fc gamma Rs). This selective enhancement of FcγRIIb binding may be beneficial not only for clearance of soluble antigens, but also for reducing the risk of undesirable effector function and immune responses.

항체 약물의 개발을 위해서는, 약물이 약리학적으로 활성인 비인간 동물에서 유효성, 약동학 및 안전성을 평가해야 한다. 사람에게만 활성인 경우, 대리항체를 사용하는 등의 대안적 접근법을 고려해야 한다(Int. J. Tox. 28: 230-253 (2009)). 하지만, 인간이 아닌 동물에서 Fc 감마 R의 발현 양상 및/또는 기능이 항상 인간에서와 같지 않기 때문에 대리항체를 이용하여 인간에서 Fc영역과 Fc 감마 R 사이의 상호작용 효과를 정확하게 예측하는 것은 쉽지 않을 것이다. 항체 약물의 Fc 영역은 인간 이외의 동물, 특히 인간에 대한 Fc 감마 R의 발현 패턴 및 기능이 유사한 시노몰구스 원숭이에 대해 교차 반응성을 갖는 것이 바람직할 것이고, 따라서 비인간 동물에게서 수득한 결론은 인간에 대한 결론으로 추정할 수 있다.For the development of antibody drugs, efficacy, pharmacokinetics and safety should be evaluated in non-human animals in which the drug is pharmacologically active. If active only in humans, alternative approaches such as the use of surrogate antibodies should be considered (Int. J. Tox. 28: 230-253 (2009)). However, since the expression pattern and/or function of Fc gamma R in non-human animals is not always the same as in humans, it is not easy to accurately predict the interaction effect between the Fc region and Fc gamma R in humans using a surrogate antibody. will be. It would be desirable for the Fc region of the antibody drug to have cross-reactivity to non-human animals, particularly cynomolgus monkeys, which have similar expression patterns and functions of Fc gamma R to humans, and therefore the conclusions obtained in non-human animals are for humans. can be inferred from the conclusion.

이중특이적 항-CCL2 항체의 하기의 IgG1 불변 도메인/Fc 변이체는 Fc 부분의 위치에서 돌연변이로 생성되었다(EU 카바트 넘버링).The following IgG1 constant domain/Fc variants of the bispecific anti-CCL2 antibody were generated by mutations in the position of the Fc region (EU Kabat numbering).

SG1095 - 돌연변이를 포함한 IgG1로부터 유래됨(카바트 EU 넘버링):SG1095 - derived from IgG1 with mutation (Kabat EU numbering):

SG1099 - 돌연변이를 포함한 IgG1로부터 유래됨(카바트 EU 넘버링):SG1099 - derived from IgG1 with mutations (Kabat EU numbering):

Q311R/P343R (항원의 흡수를 증진하기 위한 등전점(pI) 증가에 적합)Q311R/P343R (suitable for increasing isoelectric point (pI) to enhance antigen uptake)

SG1100 - 돌연변이를 포함한 IgG1로부터 유래됨(카바트 EU 넘버링):SG1100 - derived from IgG1 with mutations (Kabat EU numbering):

Q311R/P343R(항원의 흡수를 증진하기 위한 등전점(pI) 증가에 적합);Q311R/P343R (suitable for increasing isoelectric point (pI) to enhance antigen uptake);

GG01 - 돌연변이를 포함한 IgG1로부터 유래됨(카바트 EU 넘버링):GG01 - derived from IgG1 with mutation (Kabat EU numbering):

GG02 - 돌연변이를 포함한 IgG1로부터 유래됨(카바트 EU 넘버링):GG02 - derived from IgG1 with mutation (Kabat EU numbering):

GG03 - 돌연변이를 포함한 IgG1(SG1-IgG1 동종이인자형)로부터 유래됨(카바트 EU 넘버링):GG03 - derived from IgG1 (SG1-IgG1 allotype) with mutations (Kabat EU numbering):

GG04 - 돌연변이를 포함한 IgG1(SG1-IgG1 동종이인자형)로부터 유래됨(카바트 EU 넘버링):GG04 - derived from IgG1 (SG1-IgG1 allotype) with mutations (Kabat EU numbering):

변형된 가변 도메인 및 CDR을 갖는 이중특이적 항-CCL2 항체의 기능적 특성화(이온 의존적/pH 의존적 결합) 및 Fc 매개 스위핑 포함 여부Functional characterization of bispecific anti-CCL2 antibodies with modified variable domains and CDRs (ion-dependent/pH-dependent binding) and with or without Fc-mediated sweeping

CKLO2의 Fc 변이체 SG1095, GG01, GG02, GG03/04의 SPR 결합SPR binding of Fc variants SG1095, GG01, GG02, GG03/04 of CKLO2

비아코어 8K 기기의 SPR 분석에서, pH 7.4 및 5.8에서 4가지 상이한 항체 P1AD8325, P1AF8137, P1AF8139 및 P1AF8140에 대한 단량체 인간 및 시노 CCL2의 결합을 조사하였다. In the SPR analysis of the Biacore 8K instrument, the binding of monomeric human and cyno CCL2 to four different antibodies P1AD8325, P1AF8137, P1AF8139 and P1AF8140 at pH 7.4 and 5.8 was investigated.

이러한 설정에서 캡쳐셀렉트(CaptureSelect)™ 휴먼(Human) Fab-카파(써모 피셔 사이언티픽)를 아민 커플링 방법을 사용하여 CM3 센서 칩에 고정하고, 다양한 항체를 리간드로 포획한 후, 2개의 상이한 pH 값에서 0, 10, 100 및 1000 nM 단량체 인간 또는 시노 CCL2를 분석물로 사용하여 측정을 실시하였다.In this setup, CaptureSelect™ Human Fab-kappa (Thermo Fisher Scientific) was immobilized to a CM3 sensor chip using an amine coupling method, and various antibodies were captured with ligands, followed by two different pH values. Measurements were made using 0, 10, 100 and 1000 nM monomeric human or cyno CCL2 as analytes at values.

CKLO2-SG1095, CKLO2-GG01, CKLO2-GG02, CKLO2-GG03/04는 10, 100 및 1000 nM에서 결합하고 pH 7.4에서 동등하게 빠르게 해리되는 단량체 인간 및 시노 CCL2에 대해 거의 동일한 결합 곡선을 나타내는 반면, pH 5.8에서는 안정한 결합은 관찰되지 않았다. 결과는 하기의 표에 도시되었다.CKLO2-SG1095, CKLO2-GG01, CKLO2-GG02, CKLO2-GG03/04 show nearly identical binding curves for the monomeric human and cyno CCL2, which bind at 10, 100 and 1000 nM and dissociate equally rapidly at pH 7.4, whereas No stable binding was observed at pH 5.8. The results are shown in the table below.

표: CKLO2-SG1095, CKLO2-GG01, CKLO2-GG02, CKLO2-GG03/04의 단량체 인간 및 시노 CCL2에 대한 결합은 단량체 인간 및 시노 CCL2에 대한 거의 동일한 결합 곡선을 나타낸다.Table: Binding of CKLO2-SG1095, CKLO2-GG01, CKLO2-GG02, CKLO2-GG03/04 to monomeric human and cyno CCL2 shows almost identical binding curves to monomeric human and cyno CCL2.

주화성 분석chemotaxis analysis

방법의 설명description of the method

THP-1 세포를 8x10E5 세포/ml까지 3일 동안 배양하였다. 5000개 세포/웰의 총 세포 수를 미세역가 플레이트의 상부 챔버에 분주하고 37°C에서 정착시켰다. 재조합 huCCL2는 항-CCL2 항체의 존재 여부에 상관없이 최종 농도 50 ng/ml로 하부 챔버에서 피펫팅하였다(대리 항체를 시험하기 위해 분석을 실시할 경우, 100 ng/ml에서 재조합 muCCL2를 대신 사용하였다). 상부 및 하부 챔버는 기포의 형성을 피하기 위해 함께 취합한 다음, 플레이트를 37°C에서 24시간 동안 항온처리하였다. 이동된 세포는 제조업체의 권고에 따라 세포-타이터-글로 방법으로 정량화하였고, 발광성은 테칸 인피티트(Tecan Infinite) 200 판독기로 측정하였다.THP-1 cells were cultured for 3 days up to 8x10E5 cells/ml. A total cell number of 5000 cells/well was aliquoted into the upper chamber of the microtiter plate and settling at 37 °C. Recombinant huCCL2 was pipetted in the lower chamber to a final concentration of 50 ng/ml with or without anti-CCL2 antibody (if assays were performed to test surrogate antibodies, recombinant muCCL2 at 100 ng/ml was used instead ). The upper and lower chambers were brought together to avoid the formation of air bubbles, and then the plates were incubated at 37 °C for 24 h. Migrated cells were quantified by the Cell-Titer-Glo method according to the manufacturer's recommendations, and luminescence was measured with a Tecan Infinite 200 reader.

결과는 도 8에 도시되었다. 주화성 분석: 동일한 CDR 및 가변 영역 VH/VL, 즉 CKLO2-IgG1 야생형 및 CKLO2-SG1095를 갖지만, Fc 모이어티가 상이한 이중특이적 항-CCL2 항체는 동일한 효능으로 THP-1 세포의 이동을 억제할 수 있다(IC₅₀ = 0.2 μg/ml; 도 8, 왼쪽 패널). The results are shown in FIG. 8 . Chemotaxis assay: Bispecific anti-CCL2 antibodies with identical CDRs and variable region VH/VL, ie CKLO2-IgG1 wild-type and CKLO2-SG1095, but different Fc moieties, would inhibit migration of THP-1 cells with the same potency. (IC ₅₀ = 0.2 μg/ml; Figure 8, left panel).

유사하게도, pH 비의존적인 CKLO2의 모 VH/VL 비변형 이중특이적 항체 CNTO888/11k2인 CCL2-0048이 또한 0.2 μg/ml의 IC₅₀을 나타낸다. 이는 pH 의존성이 상기 분석에서는 발생하지 않는 항원 스위핑 현상에 중요하기 때문이다.Similarly, CCL2-0048, the parental VH/VL unmodified bispecific antibody CNTO888/11k2 of CKLO2, which is pH independent, also exhibits an IC ₅₀ of 0.2 μg/ml. This is because pH dependence is important for antigen sweeping events that do not occur in this assay.

상응하는 단일 파라토프 항체 CNTO888 IgG1 및 인간화 11k2 IgG1은 각각 0.3 및 0.7 μg/ml의 IC₅₀ 값을 나타내는 반면, huIgG1 동형 대조군은 억제를 나타내지 않는다(도 8, 오른쪽 패널).The corresponding monoparatopic antibodies CNTO888 IgG1 and humanized 11k2 IgG1 showed IC ₅₀ values of 0.3 and 0.7 μg/ml, respectively, whereas the huIgG1 isotype control showed no inhibition ( FIG. 8 , right panel).

추가적인 유사한 실험에서, CKLO2-GG01(0.2 μg/ml), CKLO2-GG02(0.2 μg/ml) 및 GG03/GG04(0.3 μg/ml)의 IC₅₀ 값을 결정하였다.In a further similar experiment, the IC ₅₀ values of CKLO2-GG01 (0.2 μg/ml), CKLO2-GG02 (0.2 μg/ml) and GG03/GG04 (0.3 μg/ml) were determined.

유전자 변형 마우스 모델에서의 생체내 생물학적 활성In Vivo Biological Activity in Genetically Modified Mouse Models

물질 및 방법Substances and methods

B16-huCCL2/CCL2 무효 모델 B16-huCCL2/CCL2 invalid model

본 모델은, 그렇지 않으면 면역 적격 종양 보유 마우스에서, 마우스 CCL2의 간섭 없이 항인간 CCL2 항체를 시험할 목적으로 생성하였다. 이를 위해, 마우스 종양 세포주 B16-F10은 mCCL2를 분비하지 않고 CCL2 녹아웃 마우스의 유전적 배경인 C57/Bl6 균주의 마우스에서 생체 내에서 성장하는 것으로 공지되어 있기 때문에 선택하였다. This model was created for the purpose of testing anti-human CCL2 antibodies without interference of mouse CCL2 in otherwise immune-competent tumor-bearing mice. For this purpose, the mouse tumor cell line B16-F10 was selected because it does not secrete mCCL2 and is known to grow in vivo in mice of the C57/B16 strain, which is the genetic background of CCL2 knockout mice.

huCCL2를 발현하는 B16F10 종양 세포의 안정한 풀을 생성하기 위해, huCCL2를 부호화하는 플라스미드 DNA 및 하이그로마이신-B 선택 카세트로 형질감염시켰다. 따라서, 세포를 성장 배지(DMEM + 10% FCS + 2 mM L-글루타민) 중 2.0E+05 세포/웰로 6웰 플레이트에 분주하였다. 24시간 후, 옵티(Opti)-MEM 배지에서 웰당 1 μg DNA 및 리포텍타민(Lipofectamine) 2000으로 구성된 형질감염 혼합물을 세포에 첨가하였다. 이어서, 세포를 하이그로마이신-B(0.5 mg/ml)를 함유하는 배지로 선별하였다. 20일 간의 배양 후, 살아있는 단일 세포를 BD FACS 아리아(Aria) III를 사용하여 FSC/SSC 산란을 기반으로 분류하였다. 12일 후, 단일 세포 클론의 세포 배양 상청액을 야생형 B16F10 세포(데이터 미도시)와 비교하여 이바이오사이언스(ebioscience)의 ELISA 레디-셋-고(Ready-SET-Go)(Cat# 88-7399-86)를 사용하여 인간 CCL2의 발현에 대해 선별검사하였다.To generate a stable pool of B16F10 tumor cells expressing huCCL2, they were transfected with plasmid DNA encoding huCCL2 and a hygromycin-B selection cassette. Therefore, cells were seeded in 6-well plates at 2.0E+05 cells/well in growth medium (DMEM + 10% FCS + 2 mM L-glutamine). After 24 hours, a transfection mixture consisting of 1 μg DNA and Lipofectamine 2000 per well in Opti-MEM medium was added to the cells. Cells were then selected with medium containing hygromycin-B (0.5 mg/ml). After 20 days of culture, live single cells were sorted based on FSC/SSC scattering using a BD FACS Aria III. After 12 days, ELISA Ready-SET-Go from ebioscience (Cat# 88-7399-) comparing cell culture supernatants of single cell clones to wild-type B16F10 cells (data not shown). 86) was used to screen for expression of human CCL2.

선택된 B16-F10_HOMSA_CCL2 종양 세포 클론 1A5, 2A3 및 2B2는 10% FCS 및 2 mM L-글루타민(PAN 바이오테크(Biotech) GmbH, 독일 소재)을 함유한 DMEM에서 37°C, 5% CO2의 수분 포화 분위기에서 일상적으로 배양하였다. 계대 배양은 트립신/EDTA 1x(PAN 바이오테크 GmbH, 독일 소재)를 사용하여 주 2회 분할하여 실시하였다. Selected B16-F10_HOMSA_CCL2 tumor cell clones 1A5, 2A3 and 2B2 were placed in DMEM containing 10% FCS and 2 mM L-glutamine (PAN Biotech GmbH, Germany) at 37 °C, 5% CO2 in a water saturated atmosphere. were routinely cultured in Subculture was performed by dividing twice a week using trypsin/EDTA 1x (PAN Biotech GmbH, Germany).

도착 시 7~10주령의 암컷 B6.129S4-Ccl2tm1Rol/J 마우스(잭슨 연구소)에 B16-F10_HOMSA_CCL2 종양 세포 클론을 접종하였고: 당일에(연구 0일), 종양 세포를 배양 플라스크로부터 회수한 후, 배양 배지로 옮기고, 1회 세척하고 PBS에 재현탁시켰다. 세포 수는 세포 계수기 및 분석기 시스템(Vi-CELL, 벡크만 쿨터(Beckman Coulter))을 사용하여 결정하였다. SC를 위해, 주사 세포 역가를 1 x 10E7 세포/ml로 조정하고 100 μl를 냉각된 Upon arrival, 7-10 week old female B6.129S4-Ccl2tm1Rol/J mice (Jackson Laboratories) were inoculated with the B16-F10_HOMSA_CCL2 tumor cell clone: on the same day (study day 0), tumor cells were recovered from the culture flasks and cultured. Transferred to medium, washed once and resuspended in PBS. Cell counts were determined using a cell counter and analyzer system (Vi-CELL, Beckman Coulter). For SC, adjust the injected cell titer to 1 x 10E7 cells/ml and pour 100 μl into the cooled

1.0 ml 투베르쿨린 주사기(디스포메드(Dispomed), 독일 소재) 및 작은 바늘(0.45x12 mm)을 사용하여 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다. 세포 접종은 작은 동물용 흡입 장치에서 이소플루란(CP 파마(Pharma), 독일 소재)에 의한 전신 마취하에 실시하였다. A 1.0 ml tuberculin syringe (Dispomed, Germany) and a small needle (0.45x12 mm) were used to subcutaneously injected into the right flank of mice. Cell inoculation was performed under general anesthesia with isoflurane (CP Pharma, Germany) in an inhalation device for small animals.

B16-F10_HOMSA_CCL2 종양 세포 클론 1A5 및 2A3에 대해 종양이 약 1000 mm3에 도달한 연구 15일째에 종양 성장을 매일 모니터링하고 마우스를 희생시켰다(이 시점에서 2B2 종양은 느려진 성장 속도로 인해 약 600 mm3였다). 종점에서, CCL2 측정을 위해 혈액 샘플을 채취하고, 상술한 바와 같이 종양을 외식하고 유세포 분석에 의해 분석하였다. For the B16-F10_HOMSA_CCL2 tumor cell clones 1A5 and 2A3, tumor growth was monitored daily and mice were sacrificed on day 15 of the study when the tumors reached approximately 1000 mm3 (at this point the 2B2 tumor was approximately 600 mm3 due to the slowed growth rate) . At the endpoint, blood samples were taken for CCL2 determination and tumors were explanted and analyzed by flow cytometry as described above.

마우스 면역 세포가 모든 종양에 침투하는 것으로 밝혀져, 인간 CCL2가 마우스 CCR2+ 세포를 유인할 수 있다는 개념을 확인하였다. B16-F10_HOMSA_CCL2 종양 세포 클론 1A5는 가장 높은 상대 mMDSC(단핵구 골수 유래 억제 세포) 조성물로 가장 높은 CD45+ 총 침윤물을 나타내었다(도 2). 2A3 세포가 1A5 세포와 같이 유사한 수준의 혈청 총 CCL2를 유도한 반면, 2B2 클론은 유의하게 더 낮은 CCL2 혈청 농도를 나타내었음에도 불구하고, 클론 2A3 및 2B2는 종양 내 면역 세포의 더 낮은 빈도를 가졌다(데이터 미도시).Mouse immune cells were found to infiltrate all tumors, confirming the concept that human CCL2 can attract mouse CCR2+ cells. B16-F10_HOMSA_CCL2 tumor cell clone 1A5 exhibited the highest total CD45+ infiltration with the highest relative mMDSC (monocyte bone marrow derived suppressor cell) composition ( FIG. 2 ). Although 2A3 cells induced similar levels of serum total CCL2 as 1A5 cells, clones 2A3 and 2B2 had a lower frequency of intratumoral immune cells, although the 2B2 clone exhibited significantly lower CCL2 serum concentrations. (data not shown).

암컷 B6.129S4-Ccl2tm1Rol/J 마우스에 상술한 바와 같이 B16-F10_HOMSA_CCL2 종양 세포 클론 1A5를 접종하였다.Female B6.129S4-Ccl2tm1Rol/J mice were inoculated with B16-F10_HOMSA_CCL2 tumor cell clone 1A5 as described above.

연구 군의 치료는 세포 접종 5일 후에 시작하였다. 군 1은 인간 IgG 전달체 대조군 치료를 받은 반면, 군 2 및 군 3은 Mab CKLO2-IgG1(Fc 야생형 IgG1) 및 CKLO2-SG1099(돌연변이 Q311R/P343R(카바트 EU 넘버링)이 있는 IgG1 기반 CKLO2 pI 강화 Fc)를 각각 3,7 mg/kg으로 9일 동안 매일 사용하여 복강 내 치료를 받았다. 연구 14일째에, 마우스를 희생시키고 종양을 외식하였다. 효소 분해 및 세포 여과기를 사용하여 각 종양 덩어리로부터 단일 세포 현탁액을 생성하여 유세포 분석에 의해 취합되지 않은 분석을 실시하였다. 관심 면역 세포군의 검출을 위해, 하기의 마커 및 형광색소를 사용하였다: CD45-BUV395, CD11b-BUV737, F4/80-BV421, CD11c-BV605, Ly6C-AF488, Ly6G-PerCP-Cy5.5, CD206-BV711, CD4-BV510, CD8a-APC-H7, NK1.1-PE-Cy7, CD279-APC 및 CD274-PE. BD LSR-포르테사(Fortessa) 유세포 분석기로 샘플을 수집하고 BD 디바(Diva) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. Treatment in the study group was started 5 days after cell inoculation. Group 1 received human IgG transporter control treatment, whereas Groups 2 and 3 were IgG1-based CKLO2 pI enhanced Fc with Mab CKLO2-IgG1 (Fc wild-type IgG1) and CKLO2-SG1099 (mutation Q311R/P343R (Kabat EU numbering) ) was administered intraperitoneally for 9 days at 3,7 mg/kg, respectively. On study day 14, mice were sacrificed and tumors explanted. Uncollected analysis by flow cytometry was performed by generating single cell suspensions from each tumor mass using enzymatic digestion and cell strainers. For the detection of the immune cell population of interest, the following markers and fluorochromes were used: CD45-BUV395, CD11b-BUV737, F4/80-BV421, CD11c-BV605, Ly6C-AF488, Ly6G-PerCP-Cy5.5, CD206- BV711, CD4-BV510, CD8a-APC-H7, NK1.1-PE-Cy7, CD279-APC and CD274-PE. Samples were collected on a BD LSR-Fortessa flow cytometer and analyzed using BD Diva software.

혈청 샘플을 연구 6일, 8일 11일 및 14일에 회수하여 총 및 유리 huCCL2를 측정하였다.Serum samples were withdrawn on days 6, 8, 11 and 14 of the study to measure total and free huCCL2.

유리 CCL2를 검출하는 방법은 하기의 "시노몰구스 원숭이에서 CCL2 스위핑 효율에 대한 개념 입증 연구"에 자세히 기재되어 있다. 상기 연구에서 유리 인간 CCL2의 분석을 위해, 재조합 시노몰구스 CCL2를 재조합 인간 CCL2로 대체하여 교정기 및 QC를 준비하였다.Methods for detecting free CCL2 are described in detail in "Proof of Concept Study for CCL2 Sweeping Efficiency in Cynomolgus Monkeys" below. For the analysis of free human CCL2 in this study, a calibrator and QC were prepared by replacing recombinant cynomolgus CCL2 with recombinant human CCL2.

총 CCL2 혈청 샘플은 검증되지는 않았지만 적격한 특정 샌드위치 ELISA로 분석하였다. 간단히 말해서, 비오틴화된 항-CCL2 포획 항체(CNTO888 CCL2-0004), 차단 완충액, 전처리된 시험 샘플 및 검출 시약(디곡시게닐화된 항-CCL2 항체(M-1H11-IgG))을 384웰 스트렙타비딘 코팅된 미세역가 플레이트에 단계적으로 첨가하고 각 단계에서 1시간 동안 비강력 진탕기에서 배양하였다. 전처리 단계 샘플에서 CCL2-약물 복합체를 분리하기 위해, 교정기 또는 QC를 37°C에서 pH 5.5로 10분 동안 산성화하였다. 산성화된 샘플을 SA-MTP에 첨가하였다. 고정된 면역 복합체의 검출을 위해, 다중클론 항 디곡시제닌-POD 접합체를 첨가하고 플레이트를 60분 동안 항온처리하였다. 플레이트는 결합되지 않은 물질을 제거하기 위해 각 단계 후에 3회 세척하였다. Total CCL2 serum samples were analyzed by a qualified, but not validated, specific sandwich ELISA. Briefly, biotinylated anti-CCL2 capture antibody (CNTO888 CCL2-0004), blocking buffer, pretreated test sample and detection reagent (digoxigenylated anti-CCL2 antibody (M-1H11-IgG)) were mixed with 384-well streptavir. It was added stepwise to Dean-coated microtiter plates and incubated on a non-vigorous shaker for 1 hour at each step. To isolate the CCL2-drug complex from the pretreatment step samples, the calibrator or QC was acidified to pH 5.5 at 37 °C for 10 min. The acidified sample was added to the SA-MTP. For detection of immobilized immune complexes, polyclonal anti-digoxigenin-POD conjugates were added and plates were incubated for 60 min. Plates were washed 3 times after each step to remove unbound material.

ABTS를 플레이트에 첨가하고 실온에서 진탕하면서 항온처리하였다. 405/490 nm 파장에서 흡수를 측정하였다. 분석 소프트웨어 엑스엘피트(XLFit, IDBS)를 사용하여 검량선에 대한 반응을 기초로 인간 CCL2 농도를 계산하였다.ABTS was added to the plate and incubated at room temperature with shaking. Absorption was measured at 405/490 nm wavelength. Analysis software XLFit (IDBS) was used to calculate human CCL2 concentrations based on the response to the calibration curve.

통계적으로 분석되는 데이터 세트에 따라, 다중 비교를 위한 터키(Tukey) 검정 또는 t 검정을 사용한 일원 분산 분석을 적용하였다.Depending on the data set to be analyzed statistically, one-way ANOVA with Tukey's test or t-test for multiple comparisons was applied.

결과result

연구 종료 시, CKLO2-SG1099(CKLO2 pI 강화 Fc)를 투여받은 마우스에서 종양 부피 및 종양 중량이 유의하게 감소하였다(도 9). 종양 침윤물을 자세히 살펴보면, CCL2 차단 시 예상한 바와 같이 단핵구 골수 유래 억제 세포(M-MDSC)의 종양 침윤물이 감소한 것으로 나타났다(도 9).At the end of the study, tumor volume and tumor weight were significantly reduced in mice receiving CKLO2-SG1099 (CKLO2 pI-enhanced Fc) ( FIG. 9 ). A closer look at the tumor infiltrates showed that the tumor infiltrates of monocyte bone marrow-derived suppressor cells (M-MDSCs) were reduced, as expected when CCL2 was blocked ( FIG. 9 ).

또한, 혈청 분석은 요법의 효능을 확인하였다: pI 최적화는 실제로 IgG1 야생형 Fc CKLO2 분자와 비교하여 총 CCL2의 축적을 감소시키는 반면, 유리 CCL2(항체에 결합되지 않음)는 검출 한계 하에서 완전히 억제된다(도 10). 따라서, 본 모델은 항 huCCL2 이중 파라토프 스위핑 항체 CKLO2-SG1099(CKLO2 pI 강화 Fc)를 사용하여 종양 상황에서 CCL2 차단의 효과를 조사하는 데 적합하다. 후속 연구에서, CKLO2-SG1099(CKLO2 pI 강화 Fc)는 주당 1 또는 2회 더 낮은 용량으로 제공되며 유리 CCL2 억제의 연장은 몇 주에 걸쳐 모니터링한다. 또한, T 세포 활성화 요법(즉, T 세포 이중특이성, PD-L1 차단)과의 조합도 상기 모델에서 탐구한다. Serum analysis also confirmed the efficacy of the therapy: pI optimization actually reduced the accumulation of total CCL2 compared to IgG1 wild-type Fc CKLO2 molecules, whereas free CCL2 (not bound to antibody) was completely inhibited below the detection limit ( Fig. 10). Therefore, this model is suitable to investigate the effect of CCL2 blockade in the tumor context using the anti-huCCL2 biparatopic sweeping antibody CKLO2-SG1099 (CKLO2 pI-enhancing Fc). In a follow-up study, CKLO2-SG1099 (CKLO2 pI enhancing Fc) is given at lower doses 1 or 2 times per week and prolongation of free CCL2 inhibition is monitored over several weeks. Combinations with T cell activating therapies (ie, T cell bispecific, PD-L1 blockade) are also explored in this model.

추가적인 유사한 실험에서, CKLO2-SG1095, CKLO2-GG01, GG02 및 GG03/GG04와 같은 다른 변이체를 분석한다.In additional similar experiments, other variants such as CKLO2-SG1095, CKLO2-GG01, GG02 and GG03/GG04 are analyzed.

시노몰구스 원숭이에서 CCL2 스위핑 효율에 대한 개념 입증(POC) 연구A proof-of-concept (POC) study of CCL2 sweeping efficiency in cynomolgus monkeys.

방법.Way.

본 연구의 주요 목적은 시노몰구스 원숭이에서 CCL2 억제의 범위 및 4개의 항-CCL2(MCP-1) 항체의 스위핑 효율을 평가하는 것이었다. 2차 목적은 상기 항체들의 약동학적(PK) 특성을 평가하는 것이었다. 모든 항체는 3~4세 수컷 동물에게 25 mg/kg의 단일 IV 주입으로서 30분 동안 투여하였고 총 CCL2 및 항체 농도는 70일에 걸쳐 혈청에서 측정하였다. 연구된 항-CCL2 항체는 대조군 항체(군 1 및 군 2) 뿐만 아니라 CCL2-약물 복합체의 향상된 제거율을 제공하도록 특별히 조작된 항체(이하 항원 스윕 또는 단순히 스윕이라고 함)로 구성되었다. 군 1: 최대 총 CCL2 축적의 대조군으로서 CNTO888-SG1(= IgG1 야생형) 항-CCL2 항체(n=3 동물); 군 2: pH 의존성 표적 결합은 있지만 Fc 변형은 없는 이중 파라토프 항-CCL2 항체 CKLO2-SG1(IgG1 야생형)(n=3); 군 3: pH 의존적 표적 결합 및 Fc-pI 및 추가 변형을 갖는 이중 파라토프 항-CCL2 항체 CKLO2-SG1100(n=4), 및 군 4: pH 의존적 표적 결합을 갖는 2중 파라토프 항-CCL2 항체 CKLO2-SG1095, Fc-pI 및 FcγRII 및 추가 변형(n=4). The main objective of this study was to evaluate the extent of CCL2 inhibition and the sweeping efficiency of four anti-CCL2 (MCP-1) antibodies in cynomolgus monkeys. The secondary objective was to evaluate the pharmacokinetic (PK) properties of the antibodies. All antibodies were administered as a single IV infusion of 25 mg/kg to male animals aged 3-4 years for 30 minutes and total CCL2 and antibody concentrations were measured in serum over 70 days. The anti-CCL2 antibodies studied consisted of control antibodies (Groups 1 and 2) as well as antibodies specifically engineered to provide improved clearance of the CCL2-drug complex (hereinafter referred to as antigen sweeps or simply sweeps). Group 1: CNTO888-SG1 (= IgG1 wild-type) anti-CCL2 antibody (n=3 animals) as control of maximal total CCL2 accumulation; Group 2: biparatopic anti-CCL2 antibody CKLO2-SG1 (IgG1 wild type) with pH dependent target binding but no Fc modification (n=3); Group 3: biparatopic anti-CCL2 antibody CKLO2-SG1100 (n=4) with pH-dependent target binding and Fc-pi and further modifications, and Group 4: biparatopic anti-CCL2 antibody with pH-dependent target binding. CKLO2-SG1095, Fc-pI and FcγRII and further modifications (n=4).

상기 연구에서, 항체의 총 혈청 농도, 총(유리 및 항체 결합 CCL2) 및 유리 표적을 정량화하였다. 또한, 항약물 항체(ADA)의 존재를 평가하였다. 항체, 총 및 유리 CCL2 곡선은 항체 곡선은 피닉스 64(파사이트/체르타라)를 사용하여 비구획 분석에 의해 분석하였다; 데이터는 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) v. 6.07(그래프패드 소프트웨어)을 사용하여 설명되었다.In this study, total serum concentration of antibody, total (free and antibody bound CCL2) and free target were quantified. In addition, the presence of anti-drug antibodies (ADA) was assessed. Antibody, total and free CCL2 curves were analyzed by non-compartmental analysis using a Phoenix 64 (Facite/Certara) antibody curve; Data is from GraphPad Prism v. 6.07 (GraphPad software) was used.

항체의 경우, 일반 인간 샌드위치 ELISA 방법을 사용하여 혈청 샘플을 분석하였다. 원숭이 혈청에서 총 항체의 농도는 ELISA에 의해 측정하였다. 2 μg/mL의 항인간 카파 사슬 항체를 맥시소프(maxisorp) 96웰 플레이트에 밤새 고정시킨 후, 차단 완충액에서 30^oC에서 2시간 동안 배양하였다. 항체 검량선 샘플, 품질 관리 샘플 및 원숭이 혈청 샘플을 세척하기 전에 30^oC에서 1시간 동안 플레이트에서 배양하였다. 다음으로, 항인간 IgG-HRP를 첨가하고 30^oC에서 1시간 동안 배양한 후 세척하였다. ABTS 기질은 405 nm에서 마이크로플레이트 판독기로 검출하기 전에 10, 20 및 30분 동안 배양하였다. 분석 소프트웨어 소프트맥스 PRO(몰레큘라 디바이스)를 사용하여 검량선에 대한 반응을 기초로 항체 농도를 계산하였다. For antibodies, serum samples were analyzed using a normal human sandwich ELISA method. The concentration of total antibody in monkey serum was determined by ELISA. Anti-human kappa chain antibody at 2 μg/mL was immobilized in a maxisorp 96-well plate overnight and then incubated in blocking buffer at 30 ^° C for 2 hours. Antibody calibration curve samples, quality control samples and monkey serum samples were incubated on the plate for 1 hour at 30 ^° C before washing. Next, anti-human IgG-HRP was added and incubated at 30 ^o C for 1 hour, followed by washing. ABTS substrate was incubated for 10, 20 and 30 minutes before detection with a microplate reader at 405 nm. Antibody concentrations were calculated based on the response to the calibration curve using the assay software Softmax PRO (Molecular Devices).

총 CCL2 혈청 샘플은 검증되지는 않았지만 적격한 특정 샌드위치 ECL 방법 분석으로 분석하였다. 3 ug/mL의 항-CCL2 항체(r2F2-SG1)를 멀티-어레이 96웰 플레이트(메소 스케일 디스커버리)에 밤새 고정화시킨 후, 차단 완충액에서 30^oC에서 2시간 동안 배양하였다. 시노몰구스 원숭이 CCL2 검량선 샘플, 품질 관리 샘플 및 희석된 시노몰구스 원숭이 혈청 샘플을 37^oC에서 10분 동안 pH 5.5 산 완충액과 함께 배양하였다. 이 후, 샘플을 항-CCL2 고정 플레이트 상에서 30℃에서 1시간 동안 배양한 후 세척하였다. 다음으로, SULFO TAG 표지된 MCP-1 항체를 첨가하고 30^oC에서 1시간 동안 배양한 후, 세척하였다. 판독 버퍼 T(x4)(메소 스케일 디스커버리)를 즉시 플레이트에 추가하고 SECTOR 이미저(Imager) 2400(메소 스케일 디스커버리)으로 신호를 검출하였다. 분석 소프트웨어 소프트맥스 PRO(몰레큘라 디바이스)를 사용하여 검량선에 대한 반응을 기초로 시노몰구스 원숭이 CCL2 농도를 계산하였다. Total CCL2 serum samples were analyzed by specific, but not validated, qualified sandwich ECL method assays. 3 ug/mL of anti-CCL2 antibody (r2F2-SG1) was immobilized overnight in multi-array 96-well plates (Meso Scale Discovery) and then incubated in blocking buffer at 30 ^° C for 2 hours. Cynomolgus monkey CCL2 calibration curve samples, quality control samples and diluted cynomolgus monkey serum samples were incubated with pH 5.5 acid buffer for 10 minutes at 37 ^° C. Thereafter, the samples were incubated for 1 hour at 30° C. on an anti-CCL2 fixed plate and then washed. Next, SULFO TAG-labeled MCP-1 antibody was added and incubated at 30 ^° C for 1 hour, followed by washing. Read buffer T(x4) (Meso Scale Discovery) was immediately added to the plate and the signal was detected with a SECTOR Imager 2400 (Meso Scale Discovery). The analysis software Softmax PRO (Molecular Devices) was used to calculate the cynomolgus monkey CCL2 concentration based on the response to the calibration curve.

유리 CCL2 혈청 샘플은 자이로랩 익스플로어(Gyrolab Xplore)에서 실행된 검증되지는 않았지만 적격한 자이로랩TM 면역분석으로 분석하였다. 비오틴화된 항-CCL2 항체(M-2F6-IgG)를 포획 시약으로서 사용하고, 검출을 위해 알렉사(Alexa)647 표지된 항-CCL2 항체(M-1H11-IgG)를 선택하였다. 두 시약 모두 PBS, 0.1%트윈(Tween), 1%BSA에서 1 μg/mL로 희석하고 96웰 PCR 플레이트(피셔 사이언티픽(Fisher Scientific))로 옮겼다. 시노몰구스 원숭이 CCL2 검량선 샘플, QC 및 희석되지 않은 혈청 샘플을 또한 96웰 PCR 플레이트로 옮겼다. 두 플레이트 모두 자이로랩 바이오애피(Bioaffy) 200 nl 디스크(기로스 프로테인 테크놀로지스(Gyros Protein Technologies) AB)와 함께 기기에 로링하였다. 3단계 분석 프로토콜(200-3W-001)을 선택하였다. 간단히 말해서, 프로토콜은 캡처 시약, 샘플 및 검출 시약을 자이로랩 바이오애피 200 디스크의 지정된 스트렙타비딘 컬럼에 순차적으로 첨가하는 것을 간략하게 설명한다. 각 시약은 디스크에 짧은 회전 단계가 적용됨과 동시에 컬럼에 도달한다. 각 단계 후에, 컬럼을 PBS 0.05% 트윈으로 세척하고, 마지막으로 레이저 유도 형광 값을 기기 내에서 기록하였다. 유리 시노몰구스 원숭이 CCL2 농도는 XL Fit 소프트웨어(IDBS)를 사용한 검량선에 대한 반응을 기초로 계산하였다.Free CCL2 serum samples were analyzed in an unvalidated but qualified Gyrolab™ immunoassay run on a Gyrolab Xplore. Biotinylated anti-CCL2 antibody (M-2F6-IgG) was used as capture reagent and Alexa647 labeled anti-CCL2 antibody (M-1H11-IgG) was selected for detection. Both reagents were diluted to 1 μg/mL in PBS, 0.1% Tween, 1% BSA and transferred to 96-well PCR plates (Fisher Scientific). Cynomolgus monkey CCL2 calibration curve samples, QC and undiluted serum samples were also transferred to 96 well PCR plates. Both plates were loaded into the instrument with a Gyrolab Bioaffy 200 nl disc (Gyros Protein Technologies AB). A three-step assay protocol (200-3W-001) was chosen. Briefly, the protocol outlines the sequential addition of capture reagents, samples, and detection reagents to the designated streptavidin column of the Gyrolab BioAppy 200 disc. Each reagent arrives at the column as soon as a short rotation step is applied to the disk. After each step, the column was washed with PBS 0.05% Tween, and finally the laser induced fluorescence values were recorded in the instrument. Free cynomolgus monkey CCL2 concentrations were calculated based on the response to a calibration curve using the XL Fit software (IDBS).

ADA는 이외 다른 곳에서 설명된 방법을 사용하여 분석하였다(Stubenrauch et al., 2010). 요약하면, 비오틴화된 mAb 항인간 Fcγ-pan R10Z8E9는 0.5 μg/mL 농도에서 스트렙타비딘 코팅된 고결합 플레이트에 결합되었고 1시간 동안 배양하였다. 샘플 및 표준을 분석 완충액으로 5% 시노몰구스 원숭이 혈청으로 희석하고, 세척 후 코팅된 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 1시간 동안 진탕하면서 배양하였다. 세척 후, 디곡시게닐화된 항 시노몰구스(시노) IgG를 0.1 μg/mL으로 첨가하고, 진탕하면서 1시간 동안 배양하였다. 세척 후, 다중클론 항 디곡시게닌-HRP 접합체를 25 mU/mL으로 첨가하고, 진탕하면서 1시간 동안 배양하였다. ABTS를 플레이트에 첨가하고, 진탕하면서 실온에서 10분 동안 배양하였다. 405/490 nm 파장에서 마이크로플레이트 판독기로 흡수를 측정하였다. 분석 소프트웨어 소프트맥스 PRO(몰레큘라 디바이스)를 사용하여 검량선에 대한 반응을 기초로 ADA 농도를 계산하였다. ADA was analyzed using methods described elsewhere (Stubenrauch et al., 2010). Briefly, the biotinylated mAb anti-human Fcγ-pan R10Z8E9 was bound to streptavidin-coated high binding plates at a concentration of 0.5 μg/mL and incubated for 1 h. Samples and standards were diluted with 5% cynomolgus monkey serum in assay buffer, added to each well of coated plates after washing, and incubated with shaking for 1 hour. After washing, digoxigenylated anti-cynomolgus (cyno) IgG was added at 0.1 μg/mL and incubated for 1 hour with shaking. After washing, polyclonal anti-digoxigenin-HRP conjugate was added at 25 mU/mL and incubated for 1 hour with shaking. ABTS was added to the plate and incubated for 10 minutes at room temperature with shaking. Absorption was measured with a microplate reader at 405/490 nm wavelength. The ADA concentration was calculated based on the response to the calibration curve using the analysis software Softmax PRO (Molecular Device).

결과. PK 거동은 동물에게 ADA가 없는 시간 동안(즉, 14일 이전) 평가하였다. 상기 기간 동안 모든 항-CCL2 항체의 혈청 농도-시간 곡선은 유사했으며(도 11의 왼쪽 패널을 참조), 부분 평균 AUC 값(AUC_0-7d)은 군 1, 군 2, 군 3 및 군 4에 대하여 상이한 군들 사이에 각각 1490, 1810, 1210 및 1320 일.μg/mL로 비슷하였다. 유사하게, 평균 C_max 값은 군 1, 군 2, 군 4 및 군 4에 대하여 각각 620, 764, 616 및 664 μg/mL의 값과 비슷하였다. ADA 발달의 정도는 동물 및 군들 사이에 매우 가변적이었고, 7일 이후에 고도로 가변적인 PK 곡선을 초래하였다(데이터는 미도시). 군 2의 한 동물은 70일의 전체 관찰 기간 동안 ADA 음성이었다(도 11의 오른쪽 패널을 참조). 상기 동물에서 항-CCL2 항체의 제거율, 분포 용적 및 최종 반감기는 각각 7.34 mL/(일.kg), 76.2 mL/kg 및 10.9일에서 비구획 분석에 의해 추정하였다. result. PK behavior was assessed during the time the animals were free of ADA (ie, prior to 14 days). The serum concentration-time curves of all anti-CCL2 antibodies during this period were similar (see left panel of FIG. 11 ), and the partial mean AUC values (AUC _0-7d ) were in Group 1, Group 2, Group 3 and Group 4 1490, 1810, 1210, and 1320 days. μg/mL, respectively, between the different groups. Similarly, mean C _max values were comparable to values of 620, 764, 616 and 664 μg/mL for Group 1, Group 2, Group 4 and Group 4, respectively. The extent of ADA development was highly variable between animals and groups, resulting in highly variable PK curves after 7 days (data not shown). One animal in group 2 was ADA negative for a total observation period of 70 days (see right panel in FIG. 11 ). The clearance, volume of distribution and terminal half-life of anti-CCL2 antibody in these animals were estimated by noncompartmental analysis at 7.34 mL/(day.kg), 76.2 mL/kg and 10.9 days, respectively.

혈청 내 CCL2의 기준선 수준은 항체 치료가 시작되기 전에 각 동물에 대해 평가하였다. 기초 CCL2 수준의 범위는 0.126 내지 0.357 ng/mL(기하학적 평균(%CV): 0.199 ng/mL(32.2%, N=14))이었다. CCL2의 유리 형태는 항체 결합 형태의 CCL2보다 제거율이 더 높기 때문에, 항체 치료 후 총 CCL2 혈청 농도의 증가가 예상되었다. 이는 모든 군에서 실제로 관찰되었으며(도 12의 왼쪽 패널), 모든 항체에 의한 표적의 결합을 보여준다. 치료 중, 총 CCL2의 C_max 값은 군 1, 군 2, 군 3 및 군 4에 대하여 각각 824, 575, 106, 32.7 ng/mL로 증가하였다. AUC_0-7d 값은 군 1, 군 2, 군 3 및 군 4에 대하여 각각 3060, 2970, 522 및 181 일.ng/mL였다. 상기 동물이 ADA 음성인 시간 동안, 몰 약물 농도는 총 CCL2 농도를 초과하여 유지되었다. 2개의 스위핑 항-CCL2 항체(군 3 및 군 4)는 총 CCL2 혈청 농도가 기존 항체(군 1)에 비해 혈청 C_max 값에 기초하여 각각 약 8배 및 25배, 그리고 총 CCL2의 AUC_0-7d 값에 기초하여 약 6배 내지 17배 만큼의 상당한 감소를 나타내었다. 군 2의 ADA 음성 동물은 총 CCL2 농도의 지속적인 표적 결합(안정기로 인해 명백해보임)을 나타내었다(도 12의 오른쪽 패널).Baseline levels of CCL2 in serum were assessed for each animal prior to initiation of antibody treatment. Basal CCL2 levels ranged from 0.126 to 0.357 ng/mL (geometric mean (%CV): 0.199 ng/mL (32.2%, N=14)). Since the free form of CCL2 has a higher clearance than the antibody-bound form of CCL2, an increase in total CCL2 serum concentration was expected after antibody treatment. This was actually observed in all groups (left panel of Fig. 12), showing the binding of the target by all antibodies. During treatment, the C _max values of total CCL2 increased to 824, 575, 106 and 32.7 ng/mL for Group 1, Group 2, Group 3 and Group 4, respectively. AUC _0-7d values were 3060, 2970, 522 and 181 days.ng/mL for Group 1, Group 2, Group 3 and Group 4, respectively. During the time the animals were ADA negative, the molar drug concentration remained above the total CCL2 concentration. The two sweeping anti-CCL2 antibodies (Group 3 and Group 4) showed that the total CCL2 serum concentration was approximately 8- and 25-fold, respectively, based on serum C _max values, compared to the conventional antibody (Group 1), and the AUC _0- of total CCL2 Based on the _7d value, a significant reduction of about 6 to 17 fold was shown. ADA-negative animals in group 2 showed sustained target binding (obvious due to plateau) of total CCL2 concentration (right panel of FIG. 12 ).

모든 항체를 사용한 치료는 혈청 내 유리 CCL2 수준의 실질적인 감소를 가져왔지만(도 13의 왼쪽 패널), 상기 감소는 초기에 부분적으로만 나타났다. 군 1에서, 모든 개체는 하루 후에 다시 정량화 가능한 수준의 유리 CCL2를 가졌다. 군 2에서, 모든 개체는 이틀 후에 다시 정량화 가능한 수준의 유리 CCL2를 가졌다. 군 3 및 군 4에서, 각 군의 두 개체는 유리 CCL2의 억제를 7일 동안 보였다. 군 3에서, 충분한 항체 농도를 유지하면서 중간 정도의 ADA 반응을 보인 2마리의 동물은 21일 동안 검출 한계 미만의 유리 CCL2 억제를 보였다. ADA 양성 동물에서, 항체 제거가 유의하게 증가하였으며, 표적 결합 손실의 결과로 CCL2 수준이 원래 기준선(본원에서는 미도시)으로 빠르게 복귀하였다.Treatment with all antibodies resulted in a substantial decrease in free CCL2 levels in serum (left panel of FIG. 13 ), although this decrease was only partially initially visible. In group 1, all subjects had quantifiable levels of free CCL2 again after one day. In group 2, all subjects had quantifiable levels of free CCL2 again after two days. In group 3 and group 4, two subjects in each group showed inhibition of free CCL2 for 7 days. In group 3, two animals with a moderate ADA response while maintaining sufficient antibody concentrations showed free CCL2 inhibition below the limit of detection for 21 days. In ADA positive animals, antibody clearance was significantly increased and CCL2 levels rapidly returned to the original baseline (not shown here) as a result of loss of target binding.

추가적인 유사한 실험에서, CKLO2-SG1099, CKLO2-GG01, GG02 및 GG03/GG04와 같은 다른 변이체를 분석한다.In additional similar experiments, other variants such as CKLO2-SG1099, CKLO2-GG01, GG02 and GG03/GG04 are analyzed.

시노몰구스 원숭이에서 CCL2 스위핑 효율에 대한 PK/PD 연구PK/PD Study of CCL2 Sweeping Efficiency in Cynomolgus Monkeys

연구 개요 및 목표. PK/PD 연구는 항-CCL2 항체 CKL02-SG1095를 사용한 POC 연구의 결과를 기반으로 설계하였다. POC 연구에서 높은 정도의 항약물 항체(ADA) 형성이 입증되었기 때문에, ADA 반응을 줄이기 위한 의도로서 가싸이바(Gazyva)®(오비누투주맙) 치료가 PK/PD 연구에 포함되었다. 이러한 목적으로, 30 mg/kg 용량의 가싸이바를 연구 전반에 걸친 14일, 7일, 8일 및 36일에 4회 정맥 주입을 통해 투여하였다. CKL02-SG1095는 용량 군당 4마리의 동물(수컷 및 암컷 2/2)에게 2.5, 10 및 25 mg/kg의 용량 수준으로 1일(군 1~3)에 30분에 걸쳐 IV 주입하여 투여하였다. 비교를 위해, 기존의 항-CCL2 항체(CNTO888-IgG1)를 25 mg/kg으로 1일에 30분에 걸쳐 IV 주입하여 투여하였다(군 4; 상술한 POC 연구의 군 1과 동일한 대조군). 총 PK(CKL02-SG1095), 총 및 유리 CCL2 농도를 99일(즉, 투여 후 14주)까지 평가하였다. Study outline and goals. The PK/PD study was designed based on the results of the POC study using the anti-CCL2 antibody CKL02-SG1095. Because a high degree of antidrug antibody (ADA) formation was demonstrated in the POC study, Gazyva® (obinutuzumab) treatment was included in the PK/PD study with the intention to reduce the ADA response. For this purpose, gasiba at a dose of 30 mg/kg was administered via intravenous infusions in 4 doses on days 14, 7, 8 and 36 throughout the study. CKL02-SG1095 was administered by IV infusion over 30 minutes on day 1 (groups 1-3) at dose levels of 2.5, 10 and 25 mg/kg to 4 animals (male and female 2/2) per dose group. For comparison, the conventional anti-CCL2 antibody (CNTO888-IgG1) was administered by IV infusion over 30 minutes per day at 25 mg/kg (Group 4; the same control group as in Group 1 of the POC study described above). Total PK (CKL02-SG1095), total and free CCL2 concentrations were assessed up to day 99 (ie, 14 weeks post-dose).

PK/PD 연구의 목적은 비인간 영장류에서 기존의 항-CCL2 항체(야생형 IgG1 Fc 부분이 있는 CNTO888)와 비교하여 CKL02-SG1095의 유리 CCL2 억제의 연장된 기간을 입증하는 것이었다.The objective of the PK/PD study was to demonstrate an extended duration of free CCL2 inhibition of CKL02-SG1095 compared to conventional anti-CCL2 antibody (CNTO888 with wild-type IgG1 Fc portion) in non-human primates.

방법. 상기 연구에서 총 PK 뿐만 아니라 총 및 유리 CCL2를 정량화하였다. 하지만, 혈청 샘플에 가싸이바가 존재하기 때문에 본원에 기재된 POC 연구와 비교하여 총 PK 분석, 총 CCL2 분석 및 ADA 분석에 일부 수정이 이루어졌다. CNTO888 IgG1의 경우, PK 분석이 개발되지 않았다. Way. Total PK as well as total and free CCL2 were quantified in this study. However, some modifications were made to the total PK analysis, the total CCL2 analysis and the ADA analysis compared to the POC studies described herein because of the presence of gasiba in the serum samples. For CNTO888 IgG1, no PK assay was developed.

원숭이 혈청에서 총 항체 CKL02-SG1095의 농도는 ELISA에 의해 측정하였다. ELISA 비오틴화된 재조합 인간 CCL2(항원)의 경우, 전처리된 시험 샘플, 양성 대조군 표준(교정기) 또는 QC(품질 대조군) 및 디곡시게닐화된 항인간 IgG(M-1.19.31-IgG)를 384웰 스트렙타비딘 코팅된 미세역가 플레이트(SA-MTP)에 연속적으로 첨가하였다. CCL2-약물 복합체를 분리하기 위해, 시험 샘플의 전처리를 pH 5.5에서 20분 동안 실시하였다. SA-MTP에 첨가하기 전에, 산성화된 샘플을 중화시켰다. 고정된 면역 복합체는 다중클론 항 디곡시게닌-POD 접합체로 검출하였다. 플레이트는 결합되지 않은 물질을 제거하기 위해 각 단계 후에 3회 세척하였다. ABTS를 기질로서 플레이트에 첨가하고 실온에서 배양하였다. 405/490 nm 파장에서 흡수를 측정하였다. 분석 소프트웨어 XLFit(IDBS)를 사용하여 검량선에 대한 반응을 기초로 항체 농도를 계산하였다.The concentration of total antibody CKL02-SG1095 in monkey serum was determined by ELISA. For ELISA biotinylated recombinant human CCL2 (antigen), pretreated test sample, positive control standard (calibrator) or QC (quality control) and digoxigenylated anti-human IgG (M-1.19.31-IgG) were added to 384 wells. Streptavidin coated microtiter plates (SA-MTP) were added sequentially. In order to separate the CCL2-drug complex, pretreatment of the test sample was carried out at pH 5.5 for 20 minutes. Prior to addition to SA-MTP, the acidified sample was neutralized. Immobilized immune complexes were detected with polyclonal anti-digoxigenin-POD conjugates. Plates were washed 3 times after each step to remove unbound material. ABTS was added to the plate as a substrate and incubated at room temperature. Absorption was measured at 405/490 nm wavelength. Antibody concentrations were calculated based on the response to the calibration curve using the assay software XLFit (IDBS).

총 CCL2 혈청 샘플은 검증되지는 않았지만 적격한 특정 샌드위치 ELISA로 분석하였다. 간단히 말해서, 비오티닐화된 항-CCL2 포획 항체*, 전처리된 시험 샘플 및 검출 시약(디곡시게닐화된 항-CCL2 항체(1H11-IgG1))을 384-웰 스트렙타비딘 코팅된 미세역가 플레이트에 단계적으로 첨가하고, 포획 및 샘플 단계의 경우 1시간 동안, 검출 시약의 경우 각각 50분 동안 각각 비강력 진탕기에서 배양하였다. 전처리 단계 샘플에서 CCL2-약물 복합체를 분리하기 위해, 교정기 또는 QC를 pH 5.5에서 20분 동안 산성화하였다. 산성화된 샘플을 SA-MTP에 첨가하였다. 고정된 면역 복합체의 검출을 위해, 다중클론 항 디곡시제닌-POD 접합체를 첨가하고 플레이트를 50분 동안 항온처리하였다. 플레이트는 결합되지 않은 물질을 제거하기 위해 각 단계 후에 3회 세척하였다.Total CCL2 serum samples were analyzed by a qualified, but not validated, specific sandwich ELISA. Briefly, biotinylated anti-CCL2 capture antibody*, pretreated test samples and detection reagents (digoxigenylated anti-CCL2 antibody (1H11-IgG1)) were stepwise loaded into 384-well streptavidin-coated microtiter plates. was added, and incubated on a non-vigorous shaker for 1 hour for capture and sample steps and 50 minutes each for detection reagents. To separate the CCL2-drug complex from the pretreatment step samples, the calibrator or QC was acidified at pH 5.5 for 20 minutes. The acidified sample was added to the SA-MTP. For detection of immobilized immune complexes, polyclonal anti-digoxigenin-POD conjugates were added and plates were incubated for 50 min. Plates were washed 3 times after each step to remove unbound material.

ABTS를 플레이트에 첨가하고 실온에서 진탕하면서 항온처리하였다. 405/490 nm 파장에서 흡수를 측정하였다. 분석 소프트웨어 XLFit(IDBS)를 사용하여 검량선에 대한 반응을 기초로 시노몰구스 원숭이의 CCL2 농도를 계산하였다. *군 1~군 3의 분석을 위한 포획 항체: 항-CCL2 CNTO8888 IgG1, 군 4의 분석을 위한 포획 항체: 항-CCL2 2F2 IgG1.ABTS was added to the plate and incubated at room temperature with shaking. Absorption was measured at 405/490 nm wavelength. The analysis software XLFit (IDBS) was used to calculate CCL2 concentrations in cynomolgus monkeys based on the response to the calibration curve. *Capture antibody for analysis of group 1-3: anti-CCL2 CNTO8888 IgG1, capture antibody for analysis of group 4: anti-CCL2 2F2 IgG1.

ADA는 384-웰 플레이트에서 브리징 샌드위치(bridging sandwich) ELISA로 선별검사하였다. 군 1, 군 2 및 군 3의 동물들에 대한 시험 샘플, 품질 대조군 샘플 및 양성 대조군을 2개의 추가적인 항-CCL2 항체(2F6-IgG1 및 1H11-IgG1)와 함께 비오틴화된 포획 항체 CKL02-SG1095 및 디곡시게닐화된 검출 항체 CKL02-SG1095와 함께 실온에서 MTP 진탕기에서 500 rpm으로 밤새 배양하였다; 이들 항체를 첨가하여 CCL2를 중화시켰다. 군 4의 동물 샘플에 대해, 비오틴 표지된 CNTO888-SG1 및 디곡시게닐화된 CNTO888-SG1을 각각 사용하였다. 형성된 면역 복합체를 스트렙타비딘(SA) 코팅된 MTP로 옮겨 비오틴 표지된(Bi) 포획 항체를 통해 면역 복합체를 고정화시켰다. 상층액을 흡인한 후, 결합되지 않은 물질을 반복 세척하여 제거하였다. 항 디곡시게닌 POD(p) 접합 항체 및 ABTS 기질 용액을 첨가하여 검출을 실시하였다. 반응의 색상 강도를 광도계로 측정하였다(405 nm ~ 490 nm 기준 파장에서의 흡수). 신호가 플레이트 특정 절단점(cut-point)을 초과하는 경우, 샘플은 ADA 양성으로서 정의하였다. 상기 절단점은 분석의 적격성 평가 중에 정의하였다.ADA was screened by bridging sandwich ELISA in 384-well plates. Test samples, quality control samples and positive controls for animals in Group 1, Group 2 and Group 3 were combined with two additional anti-CCL2 antibodies (2F6-IgG1 and 1H11-IgG1) with biotinylated capture antibody CKL02-SG1095 and Incubated with digoxigenylated detection antibody CKL02-SG1095 overnight at room temperature on an MTP shaker at 500 rpm; These antibodies were added to neutralize CCL2. For animal samples in group 4, biotin-labeled CNTO888-SG1 and digoxigenylated CNTO888-SG1 were used, respectively. The formed immune complex was transferred to streptavidin (SA)-coated MTP to immobilize the immune complex through a biotin-labeled (Bi) capture antibody. After aspirating the supernatant, the unbound material was removed by repeated washing. Detection was performed by adding an anti-digoxigenin POD(p) conjugated antibody and ABTS substrate solution. The color intensity of the reaction was measured photometrically (absorption at reference wavelengths from 405 nm to 490 nm). A sample was defined as ADA positive if the signal exceeded the plate specific cut-point. The cut-off point was defined during the qualification of the assay.

결과. 가싸이바®(오비니투주맙) 전처리에도 불구하고, CKL02-SG1095 처리한 동물 12마리 중 10마리 및 CNTO888 처리한 동물 4마리 중 1마리에서 약물 및 바이오마커 농도에 영향을 미치는 ADA가 발견되었다. 하지만, CKL02-SG1095에 대한 2개의 ADA 음성 동물은 25 mg/kg 용량군에서 CNTO888 군의 ADA 음성 동물과 직접 비교할 수 있었다. PK 거동은 동물에게 ADA가 없는 시간 동안(즉, 10일 이전) 평가하였다. CKL02-SG1095에 대한 3개의 상이한 용량 군의 PK 곡선은 도 14의 왼쪽 패널에 도시된다. 부분 평균 AUC 값(AUC_0-7d)은 용량 수준 2.5, 10 및 25 mg/kg에 대해 각각 229/191(남성/여성), 696/813 및 1492/1346 일.μg/mL였다. C_max 값은 용량 수준 2.5, 10 및 25 mg/kg에 대해 각각 115/122(남성/여성), 369/491 및 869/941 μg/mL였다. 최고 용량 수준에서, 상기 결과는 POC 연구와 일치한다. 2마리의 ADA 음성 동물에 대해, CKL02-SG1095의 제거율, 분포 용적 및 최종 반감기는 각각 10.5~17.4 mL/(일.kg), 116~118 mL/kg 및 5.8-11.6일로 비구획 분석에 의해 추정하였다(도 14의 오른쪽 패널을 참조). result. ADA affecting drug and biomarker concentrations was found in 10 of 12 animals treated with CKL02-SG1095 and 1 of 4 animals treated with CNTO888 despite Gasaiba® (obinituzumab) pretreatment . However, the two ADA-negative animals for CKL02-SG1095 were directly comparable to ADA-negative animals in the CNTO888 group in the 25 mg/kg dose group. PK behavior was assessed during the time the animals were free of ADA (ie, prior to 10 days). The PK curves of the three different dose groups for CKL02-SG1095 are shown in the left panel of FIG. 14 . Partial mean AUC values (AUC _0-7d ) were 229/191 (male/female), 696/813 and 1492/1346 days. μg/mL for dose levels 2.5, 10 and 25 mg/kg, respectively. C _max values were 115/122 (male/female), 369/491 and 869/941 μg/mL for the dose levels 2.5, 10 and 25 mg/kg, respectively. At the highest dose level, the results are consistent with the POC study. For two ADA-negative animals, the clearance, volume of distribution and terminal half-life of CKL02-SG1095 were estimated by noncompartmental analysis to be 10.5-17.4 mL/(day.kg), 116-118 mL/kg and 5.8-11.6 days, respectively. (see the right panel of FIG. 14).

상술한 POC 연구에 대해, 총 CCL2의 축적은 항-CCL2 항체 처리 시 관찰하였다(도 15의 왼쪽 패널을 참조). CCL2의 기준선 수준은 약물 투여 전에 5회 평가하였다(가싸이바®(오비니투주맙) 치료 전 1회를 포함); 평균 CCL2 기준선 값은 0.742 ng/mL이었고 가싸이바®(오비니투주맙) 치료는 기초 CCL2 수준에 영향을 미치지 않았다. 총 CCL2 축적의 정도(괄호 안의 값은 개별 기준선에서 중간 배수 변화를 나타냄)는 용량 및 구성물에 따라 가변된다. CKL02-SG1095의 경우, 총 CCL2 수준은 2.5, 10 및 25 mg/kg의 용량 수준에 대해 22.4(22), 67.2(105) 및 54.9(76) ng/mL(4마리 동물의 중앙값)로 증가하였다. CNTO888 IgG1의 경우, 총 CCL2 수준은 1490(3160) ng/mL(4마리 동물의 중앙값)로 증가하였다. 군 3 및 군 4의 ADA 음성 동물의 비교는 CNTO888에 비해 CKL02-SG1095에 대해 상당히 더 낮은 수준의 축적을 보여주었다(도 15의 오른쪽 패널).For the POC studies described above, accumulation of total CCL2 was observed upon treatment with anti-CCL2 antibody (see left panel of Figure 15). Baseline levels of CCL2 were assessed 5 times prior to drug administration (including 1 time prior to gasiba® (obinituzumab) treatment); The mean CCL2 baseline value was 0.742 ng/mL and gasiba® (obinituzumab) treatment had no effect on basal CCL2 levels. The extent of total CCL2 accumulation (values in parentheses represent median fold change from individual baselines) varies with dose and composition. For CKL02-SG1095, total CCL2 levels increased to 22.4 (22), 67.2 (105) and 54.9 (76) ng/mL (median of 4 animals) for dose levels of 2.5, 10 and 25 mg/kg. . For CNTO888 IgG1, total CCL2 levels increased to 1490 (3160) ng/mL (median of 4 animals). Comparison of ADA negative animals in Groups 3 and 4 showed significantly lower levels of accumulation for CKL02-SG1095 compared to CNTO888 ( FIG. 15 , right panel).

모든 연구 군의 치료는 혈청 내 유리 CCL2 수준의 실질적이고 일시적인 감소로 이어진다(도 16의 왼쪽 패널을 참조; 일반적으로 검출 한계(0.01 ng/mL) 미만). 모든 ADA 양성 동물의 경우, 유리 CCL2 수준은 ADA가 발생한 후 기준선 값으로 빠르게 복귀하였다(약물 노출 손실 및 빠른 표적 회전율과 일치). ADA 음성 동물(군 3에서 2/4) 및 (군 4에서 3/4)의 경우, 유리 CCL2의 억제 기간은 연구 기간 전체에 걸쳐 평가할 수 있었다. 기존 항체 CNTO888(군 4)의 경우, CCL2 억제 기간이 짧았는데, 이는 아마도 전체 표적의 광범위한 축적으로 인한 것으로 추정된다(도 15). 약물 농도는 정량화되지 않았지만(CNTO888에 대해 입수 가능한 특정 분석 없음), POC 연구는 CNTO888 및 CKL02-SG1095 사이에 유사한 PK 특성을 시사한다. 반면에 군 3의 2마리의 ADA 음성 동물의 경우, 오래 지속되는 유리 CCL2 억제가 관찰되었다. 한 동물의 경우, 유리 CCL2 수준이 29일 동안 검출 한계 미만으로 유지되었다(도 16의 오른쪽 패널).Treatment in all study groups resulted in a substantial and transient decrease in serum free CCL2 levels (see left panel of Figure 16; generally below the limit of detection (0.01 ng/mL)). For all ADA-positive animals, free CCL2 levels returned rapidly to baseline values after the onset of ADA (consistent with drug exposure loss and rapid target turnover). For ADA negative animals (2/4 in group 3) and (3/4 in group 4), the duration of inhibition of free CCL2 could be assessed throughout the study period. For the conventional antibody CNTO888 (group 4), the duration of CCL2 inhibition was short, presumably due to the extensive accumulation of the total target ( FIG. 15 ). Although drug concentration was not quantified (no specific assay available for CNTO888), POC studies suggest similar PK properties between CNTO888 and CKL02-SG1095. On the other hand, for the two ADA negative animals in group 3, long-lasting free CCL2 inhibition was observed. For one animal, free CCL2 levels remained below the detection limit for 29 days ( FIG. 16 , right panel).

상이한 종양 유형에서 CCL2의 유병률 연구Prevalence study of CCL2 in different tumor types

CD163/CD68 및 CD14를 사용한 대식세포 분석을 포함하여 CCL2 및 이의 수용체 CCR2에 대한 하기의 IHC 유병률 연구는 6가지 상이한 적응증의 121개 인간 일치 종양 및 혈청 샘플에서 실시하였다: The following IHC prevalence studies for CCL2 and its receptor CCR2, including macrophage analysis using CD163/CD68 and CD14, were conducted in 121 human matched tumor and serum samples in 6 different indications:

췌장암(PaC) Pancreatic Cancer (PaC)

결장직장암(CRC)colorectal cancer (CRC)

유방암(BC)breast cancer (BC)

전립선암(PrC)Prostate Cancer (PrC)

난소암(OvC)Ovarian Cancer (OvC)

위암(GC)stomach cancer (GC)

하기의 질문들이 다루어졌다:The following questions were addressed:

· 이 종양은 CCL2를 (과)발현하는가?· Does this tumor overexpress CCL2?

· 이 종양 환자에게서 혈액 CCL2 수치가 상승하는가?· Are blood CCL2 levels elevated in patients with this tumor?

· 혈액 및 종양 CCL2 수준 사이에 상관관계가 있는가?· Is there a correlation between blood and tumor CCL2 levels?

· 종양 CCL2 및 침윤성 CCR2⁺ 면역 세포 사이에 상관관계가 있는가?· Is there a correlation between tumor CCL2 and infiltrating CCR2 ⁺ immune cells?

· 종양 CCL2 및 침윤성 골수 세포 사이에 상관 관계가 있는가?· Is there a correlation between tumor CCL2 and infiltrating myeloid cells?

물질 및 방법Substances and methods

조직병리학적 스코어링을 반정량적으로 실시하였다. 또한, 자동 다중 이미지 분석이 CD163/CD68 IHC에 사용되었으며, 면역 세포 정량화 및 CCL2 정량화를 위해 CD14 및 CCR2에 대해 시험하였다. Histopathological scoring was performed semi-quantitatively. In addition, automated multiple image analysis was used for CD163/CD68 IHC and tested for CD14 and CCR2 for immune cell quantification and CCL2 quantification.

면역조직학적 조사는 6가지 상이한 적응증의 121개 인간 종양의 절제 표본 세트에 대해 실시하였다: 인디뷰메드(Indivumed, 함부르크) 및 아스테란드(Asterand)(로이스턴(Royston)/허츠(Herts), 영국)가 제공하는 31 췌장암(PaC), 30 대장암(CRC), 30 유방암(BC), 29 전립선암(PrC), 20 난소암(OvC), 및 10 위암(GC). 종양을 4% 완충 포름알데히드에 고정하고, 파라핀 포매 후, 2.5 μm의 두께로 절단하고, 수퍼프로스트 플러스(Superfrost Plus 슬라이드)에 장착하였다. CCL2에 대한 마우스 단일클론 항체(클론 2D8, 노버스바이오(Novusbio) NBP2-22115)를 표준 염색 프로토콜(32'에 대한 CC1, VBX에서 1 μg/mL 농도, 옵티뷰(Optiview) DAB 검출 시스템)에 따라 벤타나(Ventana) BXT에 사용하였다. CCR2에 대한 토끼 단일클론 항체(E68, 애브캠(Abcam) ab32144)를 표준 염색 프로토콜(32'에 대한 CC1, DS2에서 농도 0.8 ug/ml, 옴니-울트라맵(Omni-UltraMap) HRP DAB 검출 시스템)에 따라 벤타나 디스커버리(Ventana Discovery) XT에 사용하였다. 단핵구 마커 CD14(셀 마크(Cell Marque) EPR3653, RTU)에 대한 마우스 단일클론 항체를 표준 염색 프로토콜(64’에 대한 CC1, 옴니-울트라맵 HRP DAB 검출 시스템 검출 시스템)에 따라 벤타나 디스커버리 울트라에 사용하였다. 대식세포 및 M2 유사 TAM(종양 관련 대식세포) CD163/CD68(DAB CD163 마우스 MRQ-26 셀 마크(Cell Marque) RTU//붉은 CD68 마우스 PG-M1 다코(Dako))에 대한 이중 염색은 표준 염색 프로토콜에 따라 벤타나 BXT에 사용하였다(32'에 대한 CC1, DS2에서 CD163 RTU//CD68 농도 0.6 μg/ml, DAB 및 적색 검출 시스템을 사용한 검출). 모든 이미지는 벤타나 아이스캔(iScan) HT®를 사용하여 스캔하였다. 조직 절편을 반정량적으로 분석하였다.Immunohistological investigations were performed on a set of resected specimens of 121 human tumors in 6 different indications: Indivumed (Hamburg) and Asterand (Royston/Herts); UK), 31 pancreatic cancer (PaC), 30 colorectal cancer (CRC), 30 breast cancer (BC), 29 prostate cancer (PrC), 20 ovarian cancer (OvC), and 10 gastric cancer (GC). Tumors were fixed in 4% buffered formaldehyde, paraffin embedded, cut to a thickness of 2.5 μm, and mounted on Superfrost Plus slides. A mouse monoclonal antibody against CCL2 (clone 2D8, Novusbio NBP2-22115) was mixed with a standard staining protocol (CC1 for 32', 1 µg/mL concentration in VBX, Optiview DAB detection system) was used for Ventana BXT. Rabbit monoclonal antibody against CCR2 (E68, Abcam ab32144) was mixed with standard staining protocol (CC1 for 32', concentration 0.8 ug/ml at DS2, Omni-UltraMap HRP DAB detection system) was used in the Ventana Discovery XT. A mouse monoclonal antibody against the monocyte marker CD14 (Cell Marque EPR3653, RTU) was used in the Ventana Discovery Ultra following a standard staining protocol (CC1 for 64', Omni-Ultramap HRP DAB Detection System Detection System) did. Double staining for macrophages and M2-like TAM (tumor-associated macrophages) CD163/CD68 (DAB CD163 mouse MRQ-26 Cell Marque RTU//red CD68 mouse PG-M1 Dako) is a standard staining protocol (CD163 RTU//CD68 concentration 0.6 μg/ml at CC1 for 32', DS2 for 32', detection using DAB and red detection system). All images were scanned using a Ventana iScan HT®. Tissue sections were analyzed semi-quantitatively.

1. 결과1. Results

CCL2 및 CCR2 유병률CCL2 and CCR2 prevalence

모든 분석된 종양 적응증은 가변 수준에서 CCL2이 상향 조절되고 가변량에서 TAM에 대한 CCR2이 존재하는 일부 종양을 보여주었다(하기의 표 6). CCL2 및 CCR2 모두, 난소암에서 가장 높은 발현이 관찰되었고, PDAC 및 GC가 그 뒤를 이었다. All analyzed tumor indications showed some tumors in which CCL2 was upregulated at variable levels and CCR2 to TAM was present at variable levels (Table 6 below). For both CCL2 and CCR2, the highest expression was observed in ovarian cancer, followed by PDAC and GC.

종양 유형별 특성Characteristics by tumor type

높은 MDSC 유인 및 M2 분극의 종양 성장을 강화하는 면역학적 상태와 관련하여 CCL2-CCR2의 높은 활성을 갖는 종양은 CCL2 차단 요법을 위한 종양의 선호를 나타낸다. CCR2 IHC는 이의 생물학적 역할을 확인하는 MDSC 및 M2 유사 대식세포와 양호한 상관관계를 보였고, CCL2 IHC 측정보다 상기 경로에 대한 바이오마커로서 더 높은 관련성을 입증하였다. 현재 연구에서 결론적으로, CCL2 요법에 대한 권장 사항을 하기와 같이 요약할 수 있다: Tumors with high activity of CCL2-CCR2 with respect to immunological status enhancing tumor growth of high MDSC attraction and M2 polarization indicate tumor preference for CCL2 blockade therapy. CCR2 IHC showed good correlation with MDSC and M2-like macrophages confirming their biological role and demonstrated a higher relevance as a biomarker for this pathway than CCL2 IHC measurement. In conclusion from the current study, recommendations for CCL2 therapy can be summarized as follows:

· OvC는 가장 높은 CCL2과 CCR2의 유병률 및 M2 분극 때문에, CCL2 표적 치료에 권장할 수 있다.· OvC may be recommended for CCL2 targeted therapy because of the highest prevalence of CCL2 and CCR2 and M2 polarization.

· PDAC는 다른 분석된 종양 유형에 비해 MDSC의 양이 가장 많고 CCR2 및 M2가 상당히 높은 수준 및 양으로 존재하기 때문에 CCL2 표적 치료에 권장할 수 있다. CCL2는 PDAC에서도 높았고 다른 종양 유형과 대조적으로 종양 세포에서보다 면역 세포에서 훨씬 더 높은 존재를 나타내었다. PaC는 CCL2/CCR2 및 MDSC 유인/M2 분극 사이에 매우 양호한 상관관계를 보여주었다. 이러한 결과는 분석된 PDAC에서 CCL2-CCR2의 역할이 면역 세포 유인에 고도로 집중되어 있음을 뒷받침한다. PDAC may be recommended for CCL2-targeted therapy as it has the highest amount of MDSCs compared to other analyzed tumor types and CCR2 and M2 are present at significantly higher levels and amounts. CCL2 was also high in PDAC and showed a much higher presence in immune cells than in tumor cells in contrast to other tumor types. PaC showed a very good correlation between CCL2/CCR2 and MDSC attraction/M2 polarization. These results support that the role of CCL2-CCR2 in the analyzed PDACs is highly focused on immune cell attraction.

· BC, 특히 TNBC는 CCL2 표적 치료에 권장할 수 있다. BC는 상당히 높은 수준 및 양으로 CCL2, CCR2, MDSC 및 M2를 보여주었다. 특히, TNBC 사례는 비 TNBC가 다른 종양 적응증에 비해 종양 세포에서 가장 높은 CCL2 생성을 나타내긴 했지만 비 TNBC보다 더 많은 양의 M2 및 MDSC를 특징으로 하였다. · BC, particularly TNBC, may be recommended for CCL2 targeted therapy. BC showed CCL2, CCR2, MDSC and M2 at significantly higher levels and amounts. Notably, TNBC cases were characterized by higher amounts of M2 and MDSCs than non-TNBCs, although non-TNBCs exhibited the highest CCL2 production in tumor cells compared to other tumor indications.

하기의 종양 적응증은 CCL2-CCR2-축에 덜 의존적인 것으로 보였으므로, CCL2 표적 치료에 덜 권장할 수 있다.The following tumor indications appeared to be less dependent on the CCL2-CCR2-axis and therefore may be less recommended for CCL2-targeted therapy.

· CRC: CCL2는 특히 PaC와 비교할 때 다른 종양 유형에 비해 낮았다. 또한, 본원에서 다른 종양 유형에 비해 M2 유사 대식세포는 가장 낮은 양으로 측정되었다. CCR2 및 MDSC는 가변적인 양으로 존재하였다. 흥미롭게도, 상기 적응증에서만 CCL2 및 CCR2 사이에 양의 상관관계를 보이는 경향이 감지되었다. 하지만, 전반적인 결과는 CRC에서 CCL2-CCR2의 역할이 면역 세포 유인이 아닌 종양 세포 생존에 초점을 맞추고 있음을 뒷받침한다. · CRC: CCL2 was lower compared to other tumor types, especially when compared to PaC. In addition, M2-like macrophages were measured in the lowest amount compared to other tumor types herein. CCR2 and MDSC were present in variable amounts. Interestingly, a trend toward positive correlation between CCL2 and CCR2 was detected only in this indication. However, the overall results support that the role of CCL2-CCR2 in CRC is focused on tumor cell survival and not immune cell attraction.

· CCL2는 높지만, GC는 CCR2가 낮고 MDSC의 양이 가장 적은 것으로 관찰되었다. M2 유사 대식세포는 가변적인 양으로 존재하였다. · CCL2 was high, but GC was observed to have low CCR2 and the least amount of MDSC. M2-like macrophages were present in variable amounts.

표 6: 본 연구에서 분석된 상이한 종양 유형의 종양 세포(TC) 및 면역 세포(IC)에서의 CCL2 및 CCR2 양성 발현. Table 6: CCL2 and CCR2 positive expression in tumor cells (TC) and immune cells (IC) of different tumor types analyzed in this study.

· PrC에서, CCR2는 가변적으로 수준으로 존재하였다. (M2 및 MDSC는 측정되지 않음)In PrC, CCR2 was present at variable levels. (M2 and MDSC not measured)

상관관계 분석Correlation analysis

연구 결과는 하기와 같이 요약할 수 있다: The study results can be summarized as follows:

· 종양 CCL2 및 CCR2(IHC) 사이에, 유일한 양의 상관관계는 CRC에 존재하였다. • Between tumors CCL2 and CCR2 (IHC), the only positive correlation was in CRC.

· 혈청 CCL2(ELISA)는 CCL2, CCR2, 대식세포 및 MDSC를 포함하여 종양에서 측정된 매개변수들 중 임의의 것과 상관관계가 없었다. 종양 CCL2에 대해 양의 상관관계를 보이는 경향은 PrC에서만 발견되었으며, 두 방법 모두 매우 낮은 값을 나타낸다. Serum CCL2 (ELISA) did not correlate with any of the parameters measured in tumors, including CCL2, CCR2, macrophages and MDSC. A positive correlation trend for tumor CCL2 was found only in PrC, with both methods showing very low values.

· CCR2 발현은 M2 유사 대식세포 및 CD14⁺ 세포의 존재와 양의 상관관계가 있고, M1/M2 비율과 음의 상관관계가 있으며, CCR2의 생물학적 역할을 확인한다. CCR2의 수준은 MDSC 유인보다 M2 분극과 더 양호한 상관관계가 있다. · CCR2 expression positively correlated with the presence of M2-like macrophages and CD14 ⁺ cells and negatively correlated with the M1/M2 ratio, confirming the biological role of CCR2. Levels of CCR2 correlate better with M2 polarization than with MDSC attraction.

· CCL2는 MDSC 유인 및 M2 분극과 양의 상관관계를 보이는 경향을 나타내었다. 따라서, CCL2 수준 단독으로는 MDSC 및 M2 유사 분극의 존재에 대한 주요 요인이 아닌 것으로 보인다.· CCL2 showed a positive correlation with MDSC attraction and M2 polarization. Thus, CCL2 levels alone do not appear to be a major factor for the presence of MDSCs and M2-like polarization.

SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Bispecific anti-CCL2 antibodies <130> P35823-WO <140> PCT/EP2020/086403 <141> 2020-12-16 <150> EP19217665 <151> 2019-12-18 <160> 174 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain CDR-H1 1A4 <400> 1 Trp Ile Cys 1 <210> 2 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain CDR-H2 1A4 <400> 2 Cys Ile Gly Ala Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala 1 5 10 15 Lys Gly <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain CDR-H3 1A4 <400> 3 Thr Gly Thr Glu Phe Thr Tyr Tyr Ser Leu 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain CDR-L1 1A4 <400> 4 Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn Asn Met Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain CDR-L2 1A4 <400> 5 Thr Ala Ser Ser Leu Ala Ser 1 5 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain CDR-L3 1A4 <400> 6 Ala Gly Tyr Lys Ser Tyr Ser Asn Asp Glu Tyr Gly 1 5 10 <210> 7 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Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln His Val Ser Asp Ala 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Ala Ser Asp Arg Ala Glu Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Ile His Leu His 85 90 95 Ser Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys 115 120 125 Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 130 135 140 Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn 145 150 155 160 Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 165 170 175 Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 180 185 190 Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 195 200 205 Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 171 <211> 437 <212> PRT <213> <220> <223> heavy chain 1- CKLO2 - GG03/GG04 <400> 171 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Phe Glu Asp Ile Tyr Asn Arg 20 25 30 Arg Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 His Gly Ala Thr Ser Leu Glu His Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Trp Ser Ala Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr 100 105 110 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 115 120 125 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 130 135 140 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 145 150 155 160 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 180 185 190 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 195 200 205 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 210 215 220 Glu Tyr Leu Gly Gly Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Lys Pro Lys 225 230 235 240 Asp Val Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Ile 245 250 255 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 260 265 270 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 275 280 285 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Val Leu His Arg Asp 290 295 300 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 305 310 315 320 Pro Lys Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Arg Arg 325 330 335 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys 340 345 350 Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 355 360 365 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 370 375 380 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 385 390 395 400 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 405 410 415 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr Arg Lys Glu 420 425 430 Leu Ser Leu Ser Pro 435 <210> 172 <211> 447 <212> PRT <213> <220> <223> heavy chain 2- CKLO2 - GG03/GG04 <400> 172 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser His Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Val Ile Pro Ile Phe His Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Asp Ala His Tyr Gly Glu Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Tyr Leu Gly Gly Asp 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Ile Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Pro Val Leu His Arg Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Lys Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Arg Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser 355 360 365 Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu 420 425 430 Ala Leu His Ala His Thr Thr Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 <210> 173 <211> 224 <212> PRT <213> <220> <223> light chain 1- CKLO2 - GG03/GG04 <400> 173 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Leu Thr Ile Ser His Thr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Asp Asn His Asn Thr Lys Phe Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Val Phe Gly Phe Phe Glu His Trp Gly Gin Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe 115 120 125 Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys 130 135 140 Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val 145 150 155 160 Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln 165 170 175 Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser 180 185 190 Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His 195 200 205 Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 174 <211> 216 <212> PRT <213> <220> <223> light chain 2- CKLO2 - GG03/GG04 <400> 174 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln His Val Ser Asp Ala 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Ala Ser Asp Arg Ala Glu Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Ile His Leu His 85 90 95 Ser Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys 115 120 125 Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 130 135 140 Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn 145 150 155 160 Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 165 170 175 Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 180 185 190 Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 195 200 205 Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

Claims

A bispecific antibody comprising a first antigen binding site that binds a first epitope on human CCL2 and a different second antigen binding site that binds a different second epitope on human CCL2, comprising:
The bispecific antibody comprises an Fc domain of a human IgG isotype.

According to claim 1,
A) i) said first antigen binding site is
(a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 a VH domain; and
(d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38 a VL domain that is; and
ii) the second antigen binding site is
(a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43 a VH domain; and
(d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44 (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46 comprises a VL domain;
or
B) i) said first antigen binding site is
(a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 a VH domain; and
(d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38 a VL domain that is; and
ii) the second antigen binding site is
(a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 a VH domain; and
(d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 or a VL domain that is;
or
C) i) said first antigen binding site is
(a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 a VH domain; and
(d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38 a VL domain that is; and
ii) the second antigen binding site is
(a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 a VH domain; and
(d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 or a VL domain that is;
or
D) i) said first antigen binding site is
(a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 a VH domain; and
(d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 a VL domain that is; and
ii) the second antigen binding site is
(a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43 a VH domain; and
(d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46 or a VL domain that is;
or
E) i) said first antigen binding site is
(a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 a VH domain; and
(d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 a VL domain that is; and
ii) the second antigen binding site is
(a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43 a VH domain; and
(d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46 or a VL domain that is;
or
F) i) said first antigen binding site is
(a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 50, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51 a VH domain; and
(d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 54 a VL domain that is; and
ii) the second antigen binding site is
(a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43 a VH domain; and
(d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46 or a VL domain that is;
or
G) i) said first antigen binding site is
(a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 a VH domain; and
(d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 a VL domain that is; and
ii) the second antigen binding site is
(a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 a VH domain; and
(d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 or a VL domain that is;
or
H) i) said first antigen binding site is
(a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 a VH domain; and
(d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 a VL domain that is; and
ii) the second antigen binding site is
(a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 a VH domain; and
(d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 or a VL domain that is;
or
I) i) the first antigen binding site is
(a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 a VH domain; and
(d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. a VL domain comprising: and
ii) the second antigen binding site is
(a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 a VH domain; and
(d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 A bispecific antibody comprising a VL domain comprising:

3. The method of claim 2,
A) i) said first antigen binding site is
A VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39, wherein (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, and (c) the sequence a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of number 35; and
A VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40, wherein (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37, and (f) the sequence a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of number 38; and
ii) the second antigen binding site is
A VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47, wherein (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, and (c) the sequence a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of number 43; and
A VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48, wherein (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, and (f) the sequence a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of number 46;
or
B) i) said first antigen binding site is
A VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39, wherein (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, and (c) the sequence a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of number 35; and
A VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40, wherein (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37, and (f) the sequence a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of number 38; and
ii) the second antigen binding site is
A VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, wherein (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and (c) the sequence a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of number 19; and
A VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, wherein (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, and (f) the sequence a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of number 22;
or
C) i) said first antigen binding site is
A VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39, wherein (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, and (c) the sequence a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of number 35; and
A VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40, wherein (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37, and (f) the sequence a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of number 38; and
ii) the second antigen binding site is
A VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, wherein (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, and (c) the sequence a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of number 11; and
A VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, and (f) the sequence a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of number 14;
or
D) i) said first antigen binding site is
A VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, wherein (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and (c) the sequence a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of number 19; and
A VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, wherein (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, and (f) the sequence a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of number 22; and
ii) the second antigen binding site is
A VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47, wherein (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, and (c) the sequence a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of number 43; and
A VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48, wherein (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, and (f) the sequence a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of number 46;
or
E) i) said first antigen binding site is
A VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31, wherein (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and (c) the sequence a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of number 27; and
A VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32, wherein (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, and (f) the sequence a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of number 30; and
ii) the second antigen binding site is
A VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47, wherein (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, and (c) the sequence a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of number 43; and
A VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48, wherein (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, and (f) the sequence a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of number 46;
or
F) i) said first antigen binding site is
A VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 55, wherein (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 50, and (c) the sequence a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of number 51; and
A VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 56, wherein (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53, and (f) the sequence a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of number 54; and
ii) the second antigen binding site is
A VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47, wherein (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, and (c) the sequence a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of number 43; and
A VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48, wherein (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, and (f) the sequence a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of number 46;
or
G) i) said first antigen binding site is
A VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, wherein (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, and (c) the sequence a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of number 11; and
A VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, and (f) the sequence a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of number 14; and
ii) the second antigen binding site is
A VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, wherein (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and (c) the sequence a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of number 19; and
A VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, wherein (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, and (f) the sequence a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of number 22;
or
H) i) said first antigen binding site is
A VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, wherein (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, and (c) the sequence a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of number 11; and
A VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, and (f) the sequence a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of number 14; and
ii) the second antigen binding site is
A VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31, wherein (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and (c) the sequence a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of number 27; and
A VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32, wherein (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, and (f) the sequence a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of number 30;
or
I) i) the first antigen binding site is
A VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, wherein (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and (c) the sequence a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of number 3; and
A VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, wherein (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and (f) the sequence a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of number 6; and
ii) the second antigen binding site is
A VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31, wherein (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and (c) the sequence a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of number 27; and
A VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32, wherein (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, and (f) the sequence A bispecific antibody comprising a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of number 30.

4. The method according to any one of claims 1 to 3,
A bispecific antibody comprising an Fc domain of a human IgG isotype is a bispecific antibody comprising a constant heavy chain domain of a human IgG1 isotype.

5. The method of claim 4,
Constant heavy chain domain of human wild-type IgG1 isotype when preformed immune complexes consisting of 20 mg/kg of each bispecific antibody and 0.1 mg/kg of human CCL2 were administered to FcRn transgenic mice at a single dose of 10 ml/kg. The in vivo clearance (ml/day/kg) for human CCL2 after administration of a bispecific antibody comprising A bispecific antibody, which is at least 2-fold higher than the in vivo clearance rate for human CCL2 (ml/day/kg) after administration of the bispecific antibody comprising a receptor silencing constant heavy chain domain.

Bispecific (isolated) comprising a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a second antigen binding site that (specifically) binds to a second epitope on human CCL2 As an antibody,
i) said first antigen binding site binds as an antibody to the same epitope on CCL2, said antibody comprising:
A VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39, wherein (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, and (c) the sequence a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of number 35; and
A VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40, wherein (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37, and (f) the sequence a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of number 38; and
ii) said second antigen binding site binds as an antibody to the same epitope on CCL2, said antibody comprising:
A VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47, wherein (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, and (c) the sequence a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence of number 43; and
A VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48, wherein (d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, and (f) the sequence A bispecific antibody comprising a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence of number 46.

7. The method of claim 6,
Constant heavy chain domain of human wild-type IgG1 isotype when preformed immune complexes consisting of 20 mg/kg of each bispecific antibody and 0.1 mg/kg of human CCL2 are administered to FcRn transgenic mice at a single dose of 10 ml/kg. The in vivo clearance (ml/day/kg) for human CCL2 after administration of a bispecific antibody comprising A bispecific antibody comprising at least 15-fold, in particular at least 20-fold higher clearance in vivo (ml/day/kg) for human CCL2 after administration of the bispecific antibody comprising a receptor silencing constant heavy chain domain.

Bispecific (isolated) comprising a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a second antigen binding site that (specifically) binds to a second epitope on human CCL2 As an antibody,
i) the first antigen binding site is
(a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence SHYGXS of SEQ ID NO: 57, wherein X is I or T, (b) X ¹ is V, I, or H, X ² is P or H, and X ³ is H or a VH domain comprising a CDR-H2 comprising the amino acid sequence GX ¹ IX ² IFX ³ TANYAQKFQG of SEQ ID NO: 58, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence YDAHYGELDF of SEQ ID NO: 59; and
(d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence RASQHVSDAYLA of SEQ ID NO: 60, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence DASDRAE of SEQ ID NO: 61, and (f) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence HQYIHLHSFT of SEQ ID NO: 62 a VL domain comprising L3;
and
ii) the second antigen binding site is
(a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence HTYMH of SEQ ID NO: 76, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence RIDPXNHNTKFDPKFQG of SEQ ID NO: 77, wherein X is D or E, and (c) X is D or E a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence GVFGFFXH of SEQ ID NO: 78; and
(d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence KAX ¹ EDIYNRX ² A of SEQ ID NO: 79, wherein X ¹ is F or T and X ² is R or L, (e) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence GATSLEH of SEQ ID NO: 80 -L2, and (f) a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence QQFXSAPYT of SEQ ID NO:81, wherein X is W or R.

Bispecific (isolated) comprising a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a second antigen binding site that (specifically) binds to a second epitope on human CCL2 As an antibody,
i) the first antigen binding site is
(a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence SHYGXS of SEQ ID NO: 57, wherein X is I or T, (b) X ¹ is V, I, or H, X ² is P or H, and X ³ is H or G, a CDR-H2 comprising the amino acid sequence GX ¹ IX ² IFX ³ TANYAQKFQG of SEQ ID NO: 58, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence YDAHYGELDF of SEQ ID NO: 59, (d) the amino acid of SEQ ID NO: 63 FR-H1 comprising the sequence QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTF, (e) FR-H2 comprising the amino acid sequence WVRQAPGQGLEWMG of SEQ ID NO: 64, (f) FR-H3 comprising the amino acid sequence RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVY YCAR of SEQ ID NO: 65, and (g) SEQ ID NO: a VH domain comprising FR-H4 comprising the amino acid sequence WGQGTLVTVSS of 66; and
(h) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence RASQHVSDAYLA of SEQ ID NO: 60, (i) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence DASDRAE of SEQ ID NO: 61, and (j) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence HQYIHLHSFT of SEQ ID NO: 62 L3, (k) FR-H1 comprising the amino acid sequence EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC of SEQ ID NO: 67, (l) FR-H2 comprising the amino acid sequence WYQQKPGQAPRLLIY of SEQ ID NO: 68, (m) FR-H2 comprising the amino acid sequence GVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC of SEQ ID NO: 69 -L3, and (n) a VL domain comprising FR-H4 comprising the amino acid sequence GQGTKVEIK of SEQ ID NO:70;
and
ii) the second antigen binding site is
(a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence HTYMH of SEQ ID NO: 76, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence RIDPXNHNTKFDPKFQG of SEQ ID NO: 77, wherein X is D or E, (c) X is D or E , a CDR-H3 comprising the amino acid sequence GVFGFFXH of SEQ ID NO: 78, (d) a FR-H1 comprising the amino acid sequence QVQLVQSGAEVKKKPGSSVKVSCKASGLTIS of SEQ ID NO: 82, (e) a FR-H2 comprising the amino acid sequence WVRQAPGQGLEWMG of SEQ ID NO: 83, and (f) a VH domain comprising (f) FR-H3 comprising the amino acid sequence RVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR of SEQ ID NO: 84, and (g) FR-H4 comprising the amino acid sequence WGQGTTVTVSS of SEQ ID NO: 85; and
(h) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence KAX ¹ EDIYNRX ² A of SEQ ID NO: 79, wherein X ¹ is F or T and X ² is R or L, (i) a CDR comprising the amino acid sequence GATSLEH of SEQ ID NO: 80 -L2, and (j) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence QQFXSAPYT of SEQ ID NO: 81, wherein X is W or R, (k) FR-L1 comprising the amino acid sequence DIQMTQSPSSLSSASVGDRVTITC of SEQ ID NO: 86, (l) SEQ ID NO: A VL comprising FR-L2 comprising the amino acid sequence WYQQKPGKAPKLLIH of 87, (m) FR-L3 comprising the amino acid sequence GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYC of SEQ ID NO: 88, and (n) FR-H4 comprising the amino acid sequence FGGGTKVEIK of SEQ ID NO: 89 A (isolated) bispecific antibody comprising a domain.

Bispecific (isolated) comprising a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a second antigen binding site that (specifically) binds to a second epitope on human CCL2 As an antibody,
A) i) said first antigen binding site is
a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:75; and
ii) the second antigen binding site is
a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 90; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:93;
or
B) i) said first antigen binding site is
a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:75; and
ii) the second antigen binding site is
a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 91; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:93;
or
C) i) said first antigen binding site is
a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:75; and
ii) the second antigen binding site is
a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 90; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 94;
or
D) i) said first antigen binding site is
a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 72; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:75; and
ii) the second antigen binding site is
a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 90; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 94;
or
E) i) said first antigen binding site is
a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:73; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:75; and
ii) the second antigen binding site is
a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 90; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:93;
or
F) i) said first antigen binding site is
a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:73; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:75; and
ii) the second antigen binding site is
a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 90; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 94;
or
G) i) said first antigen binding site is
a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:73; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:75; and
ii) the second antigen binding site is
a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 92; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:93;
or
H) i) said first antigen binding site is
a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:73; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:75; and
ii) the second antigen binding site is
a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 91; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:93;
or
I) i) the first antigen binding site is
a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 72; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:75; and
ii) the second antigen binding site is
a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 90; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:93;
or
J) i) said first antigen binding site is
a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 72; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:75; and
ii) the second antigen binding site is
a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 92; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:93;
or
K) i) said first antigen binding site is
a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 72; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:75; and
ii) the second antigen binding site is
a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 91; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:93;
or
L) i) said first antigen binding site is
a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 74; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:75; and
ii) the second antigen binding site is
a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 90; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:93;
or
M) i) said first antigen binding site is
a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 74; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:75; and
ii) the second antigen binding site is
a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 90; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 94;
or
N) i) said first antigen binding site is
a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 74; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:75; and
ii) the second antigen binding site is
a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 92; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:93;
or
O) i) the first antigen binding site is
a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 74; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:75; and
ii) the second antigen binding site is
a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 91; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:93;
or
P) i) the first antigen binding site is
a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:75; and
ii) the second antigen binding site is
a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 92; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:93.

Bispecific (isolated) comprising a first antigen binding site that (specifically) binds to a first epitope on human CCL2 and a second antigen binding site that (specifically) binds to a second epitope on human CCL2 As an antibody,
A) i) said first antigen binding site is
A VH domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71, comprising: a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence SHYGXS of SEQ ID NO: 57, wherein X is I, (b) the amino acid sequence GX ¹ of SEQ ID NO: 58, wherein X ¹ is V, X ² is P and X ³ is H IX ² IFX ³ a VH domain comprising a CDR-H2 comprising TANYAQKFQG, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence YDAHYGELDF of SEQ ID NO:59; and
A VL domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75, comprising: d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence RASQHVSDAYLA of SEQ ID NO: 60, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence DASDRAE of SEQ ID NO: 61, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence HQYIHLHSFT of SEQ ID NO: 62 a VL domain comprising; and
ii) the second antigen binding site is
A VH domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 90, comprising: a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence HTYMH of SEQ ID NO: 76, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence RIDPXNHNTKFDPKFQG of SEQ ID NO: 77, wherein X is D, and (c) SEQ ID NO: 78, wherein X is D a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence GVFGFFXH of; and
A VL domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 93, comprising: d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence KAX ¹ EDIYNRX ² A of SEQ ID NO: 79, wherein X ¹ is F and X ² is R, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence GATSLEH of SEQ ID NO: 80, and ( f) comprises a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence QQFXSAPYT of SEQ ID NO:81, wherein X is W;
or
B) i) said first antigen binding site is
A VH domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71, comprising: a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence SHYGXS of SEQ ID NO: 57, wherein X is I, (b) the amino acid sequence GX ¹ of SEQ ID NO: 58, wherein X ¹ is V, X ² is P and X ³ is H IX ² IFX ³ a VH domain comprising a CDR-H2 comprising TANYAQKFQG, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence YDAHYGELDF of SEQ ID NO:59; and
A VL domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75, comprising: d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence RASQHVSDAYLA of SEQ ID NO: 60, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence DASDRAE of SEQ ID NO: 61, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence HQYIHLHSFT of SEQ ID NO: 62 a VL domain comprising; and
ii) the second antigen binding site is
A VH domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 91, comprising: a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence HTYMH of SEQ ID NO: 76, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence RIDPXNHNTKFDPKFQG of SEQ ID NO: 77, wherein X is D, and (c) SEQ ID NO: 78, wherein X is E a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence GVFGFFXH of; and
A VL domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 93, comprising: d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence KAX ¹ EDIYNRX ² A of SEQ ID NO: 79, wherein X ¹ is F and X ² is R, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence GATSLEH of SEQ ID NO: 80, and ( f) comprises a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence QQFXSAPYT of SEQ ID NO:81, wherein X is W;
or
C) i) said first antigen binding site is
A VH domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71, comprising: a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence SHYGXS of SEQ ID NO: 57, wherein X is I or T, (b) X ¹ is V, I, or H, X ² is P or H, and X ³ is H or a VH domain comprising a CDR-H2 comprising the amino acid sequence GX ¹ IX ² IFX ³ TANYAQKFQG of SEQ ID NO: 58, which is G, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence YDAHYGELDF of SEQ ID NO: 59; and
A VL domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75, comprising: d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence RASQHVSDAYLA of SEQ ID NO: 60, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence DASDRAE of SEQ ID NO: 61, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence HQYIHLHSFT of SEQ ID NO: 62 a VL domain comprising; and
ii) the second antigen binding site is
A VH domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 90, comprising: a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence HTYMH of SEQ ID NO: 76, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence RIDPXNHNTKFDPKFQG of SEQ ID NO: 77, wherein X is D or E, and (c) X is D or E , a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence GVFGFFXH of SEQ ID NO: 78; and
A VL domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 94, comprising: d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence KAX ¹ EDIYNRX ² A of SEQ ID NO: 79, wherein X ¹ is F or T and X ² is R or L, (e) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence GATSLEH of SEQ ID NO: 80- L2, and (f) a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence QQFXSAPYT of SEQ ID NO: 81, wherein X is W or R;
or
D) i) said first antigen binding site is
A VH domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 72, comprising: a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence SHYGXS of SEQ ID NO: 57, wherein X is I or T, (b) X ¹ is V, I, or H, X ² is P or H, and X ³ is H or a VH domain comprising a CDR-H2 comprising the amino acid sequence GX ¹ IX ² IFX ³ TANYAQKFQG of SEQ ID NO: 58, which is G, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence YDAHYGELDF of SEQ ID NO: 59; and
A VL domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75, comprising: d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence RASQHVSDAYLA of SEQ ID NO: 60, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence DASDRAE of SEQ ID NO: 61, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence HQYIHLHSFT of SEQ ID NO: 62 a VL domain comprising; and
ii) the second antigen binding site is
A VH domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 90, comprising: a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence HTYMH of SEQ ID NO: 76, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence RIDPXNHNTKFDPKFQG of SEQ ID NO: 77, wherein X is D or E, and (c) X is D or E , a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence GVFGFFXH of SEQ ID NO: 78; and
A VL domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 94, comprising: d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence KAX ¹ EDIYNRX ² A of SEQ ID NO: 79, wherein X ¹ is F or T and X ² is R or L, (e) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence GATSLEH of SEQ ID NO: 80- L2, and (f) a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence QQFXSAPYT of SEQ ID NO: 81, wherein X is W or R;
or
E) i) said first antigen binding site is
A VH domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 73, comprising: a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence SHYGXS of SEQ ID NO: 57, wherein X is I or T, (b) X ¹ is V, I, or H, X ² is P or H, and X ³ is H or a VH domain comprising a CDR-H2 comprising the amino acid sequence GX ¹ IX ² IFX ³ TANYAQKFQG of SEQ ID NO: 58, which is G, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence YDAHYGELDF of SEQ ID NO: 59; and
A VL domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75, comprising: d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence RASQHVSDAYLA of SEQ ID NO: 60, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence DASDRAE of SEQ ID NO: 61, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence HQYIHLHSFT of SEQ ID NO: 62 a VL domain comprising; and
ii) the second antigen binding site is
A VH domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 90, comprising: a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence HTYMH of SEQ ID NO: 76, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence RIDPXNHNTKFDPKFQG of SEQ ID NO: 77, wherein X is D or E, and (c) X is D or E , a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence GVFGFFXH of SEQ ID NO: 78; and
A VL domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 93, comprising: d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence KAX ¹ EDIYNRX ² A of SEQ ID NO: 79, wherein X ¹ is F or T and X ² is R or L, (e) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence GATSLEH of SEQ ID NO: 80- L2, and (f) a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence QQFXSAPYT of SEQ ID NO: 81, wherein X is W or R;
or
F) i) said first antigen binding site is
A VH domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 73, comprising: a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence SHYGXS of SEQ ID NO: 57, wherein X is I or T, (b) X ¹ is V, I, or H, X ² is P or H, and X ³ is H or a VH domain comprising a CDR-H2 comprising the amino acid sequence GX ¹ IX ² IFX ³ TANYAQKFQG of SEQ ID NO: 58, which is G, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence YDAHYGELDF of SEQ ID NO: 59; and
A VL domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75, comprising: d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence RASQHVSDAYLA of SEQ ID NO: 60, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence DASDRAE of SEQ ID NO: 61, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence HQYIHLHSFT of SEQ ID NO: 62 a VL domain comprising; and
ii) the second antigen binding site is
A VH domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 90, comprising: a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence HTYMH of SEQ ID NO: 76, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence RIDPXNHNTKFDPKFQG of SEQ ID NO: 77, wherein X is D or E, and (c) X is D or E , a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence GVFGFFXH of SEQ ID NO: 78; and
A VL domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 94, comprising: d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence KAX ¹ EDIYNRX ² A of SEQ ID NO: 79, wherein X ¹ is F or T and X ² is R or L, (e) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence GATSLEH of SEQ ID NO: 80- L2, and (f) a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence QQFXSAPYT of SEQ ID NO: 81, wherein X is W or R;
or
G) i) said first antigen binding site is
A VH domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 73, comprising: a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence SHYGXS of SEQ ID NO: 57, wherein X is I or T, (b) X ¹ is V, I, or H, X ² is P or H, and X ³ is H or a VH domain comprising a CDR-H2 comprising the amino acid sequence GX ¹ IX ² IFX ³ TANYAQKFQG of SEQ ID NO: 58, which is G, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence YDAHYGELDF of SEQ ID NO: 59; and
A VL domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75, comprising: d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence RASQHVSDAYLA of SEQ ID NO: 60, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence DASDRAE of SEQ ID NO: 61, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence HQYIHLHSFT of SEQ ID NO: 62 a VL domain comprising; and
ii) the second antigen binding site is
A VH domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 92, comprising: a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence HTYMH of SEQ ID NO: 76, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence RIDPXNHNTKFDPKFQG of SEQ ID NO: 77, wherein X is D or E, and (c) X is D or E , a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence GVFGFFXH of SEQ ID NO: 78; and
A VL domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 93, comprising: d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence KAX ¹ EDIYNRX ² A of SEQ ID NO: 79, wherein X ¹ is F or T and X ² is R or L, (e) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence GATSLEH of SEQ ID NO: 80- L2, and (f) a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence QQFXSAPYT of SEQ ID NO: 81, wherein X is W or R;
or
H) i) said first antigen binding site is
A VH domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 73, comprising: a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence SHYGXS of SEQ ID NO: 57, wherein X is I or T, (b) X ¹ is V, I, or H, X ² is P or H, and X ³ is H or a VH domain comprising a CDR-H2 comprising the amino acid sequence GX ¹ IX ² IFX ³ TANYAQKFQG of SEQ ID NO: 58, which is G, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence YDAHYGELDF of SEQ ID NO: 59; and
A VL domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75, comprising: d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence RASQHVSDAYLA of SEQ ID NO: 60, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence DASDRAE of SEQ ID NO: 61, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence HQYIHLHSFT of SEQ ID NO: 62 a VL domain comprising; and
ii) the second antigen binding site is
A VH domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 91, comprising: a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence HTYMH of SEQ ID NO: 76, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence RIDPXNHNTKFDPKFQG of SEQ ID NO: 77, wherein X is D or E, and (c) X is D or E , a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence GVFGFFXH of SEQ ID NO: 78; and
A VL domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 93, comprising: d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence KAX ¹ EDIYNRX ² A of SEQ ID NO: 79, wherein X ¹ is F or T and X ² is R or L, (e) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence GATSLEH of SEQ ID NO: 80- L2, and (f) a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence QQFXSAPYT of SEQ ID NO: 81, wherein X is W or R;
or
I) i) the first antigen binding site is
A VH domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 72, comprising: a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence SHYGXS of SEQ ID NO: 57, wherein X is I or T, (b) X ¹ is V, I, or H, X ² is P or H, and X ³ is H or a VH domain comprising a CDR-H2 comprising the amino acid sequence GX ¹ IX ² IFX ³ TANYAQKFQG of SEQ ID NO: 58, which is G, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence YDAHYGELDF of SEQ ID NO: 59; and
A VL domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75, comprising: d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence RASQHVSDAYLA of SEQ ID NO: 60, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence DASDRAE of SEQ ID NO: 61, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence HQYIHLHSFT of SEQ ID NO: 62 a VL domain comprising; and
ii) the second antigen binding site is
A VH domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 90, comprising: a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence HTYMH of SEQ ID NO: 76, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence RIDPXNHNTKFDPKFQG of SEQ ID NO: 77, wherein X is D or E, and (c) X is D or E , a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence GVFGFFXH of SEQ ID NO: 78; and
A VL domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 93, comprising: d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence KAX ¹ EDIYNRX ² A of SEQ ID NO: 79, wherein X ¹ is F or T and X ² is R or L, (e) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence GATSLEH of SEQ ID NO: 80- L2, and (f) a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence QQFXSAPYT of SEQ ID NO: 81, wherein X is W or R;
or
J) i) said first antigen binding site is
A VH domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 72, comprising: a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence SHYGXS of SEQ ID NO: 57, wherein X is I or T, (b) X ¹ is V, I, or H, X ² is P or H, and X ³ is H or a VH domain comprising a CDR-H2 comprising the amino acid sequence GX ¹ IX ² IFX ³ TANYAQKFQG of SEQ ID NO: 58, which is G, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence YDAHYGELDF of SEQ ID NO: 59; and
A VL domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75, comprising: d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence RASQHVSDAYLA of SEQ ID NO: 60, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence DASDRAE of SEQ ID NO: 61, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence HQYIHLHSFT of SEQ ID NO: 62 a VL domain comprising; and
ii) the second antigen binding site is
A VH domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 92, comprising: a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence HTYMH of SEQ ID NO: 76, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence RIDPXNHNTKFDPKFQG of SEQ ID NO: 77, wherein X is D or E, and (c) X is D or E , a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence GVFGFFXH of SEQ ID NO: 78; and
A VL domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 93, comprising: d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence KAX ¹ EDIYNRX ² A of SEQ ID NO: 79, wherein X ¹ is F or T and X ² is R or L, (e) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence GATSLEH of SEQ ID NO: 80- L2, and (f) a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence QQFXSAPYT of SEQ ID NO: 81, wherein X is W or R;
or
K) i) said first antigen binding site is
A VH domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 72, comprising: a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence SHYGXS of SEQ ID NO: 57, wherein X is I or T, (b) X ¹ is V, I, or H, X ² is P or H, and X ³ is H or a VH domain comprising a CDR-H2 comprising the amino acid sequence GX ¹ IX ² IFX ³ TANYAQKFQG of SEQ ID NO: 58, which is G, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence YDAHYGELDF of SEQ ID NO: 59; and
A VL domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75, comprising: d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence RASQHVSDAYLA of SEQ ID NO: 60, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence DASDRAE of SEQ ID NO: 61, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence HQYIHLHSFT of SEQ ID NO: 62 a VL domain comprising; and
ii) the second antigen binding site is
A VH domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 91, comprising: a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence HTYMH of SEQ ID NO: 76, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence RIDPXNHNTKFDPKFQG of SEQ ID NO: 77, wherein X is D or E, and (c) X is D or E , a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence GVFGFFXH of SEQ ID NO: 78; and
A VL domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 93, comprising: d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence KAX ¹ EDIYNRX ² A of SEQ ID NO: 79, wherein X ¹ is F or T and X ² is R or L, (e) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence GATSLEH of SEQ ID NO: 80- L2, and (f) a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence QQFXSAPYT of SEQ ID NO: 81, wherein X is W or R;
or
L) i) said first antigen binding site is
A VH domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 74, comprising: a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence SHYGXS of SEQ ID NO: 57, wherein X is I or T, (b) X ¹ is V, I, or H, X ² is P or H, and X ³ is H or a VH domain comprising a CDR-H2 comprising the amino acid sequence GX ¹ IX ² IFX ³ TANYAQKFQG of SEQ ID NO: 58, which is G, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence YDAHYGELDF of SEQ ID NO: 59; and
A VL domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75, comprising: d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence RASQHVSDAYLA of SEQ ID NO: 60, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence DASDRAE of SEQ ID NO: 61, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence HQYIHLHSFT of SEQ ID NO: 62 a VL domain comprising; and
ii) the second antigen binding site is
A VH domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 90, comprising: a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence HTYMH of SEQ ID NO: 76, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence RIDPXNHNTKFDPKFQG of SEQ ID NO: 77, wherein X is D or E, and (c) X is D or E , a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence GVFGFFXH of SEQ ID NO: 78; and
A VL domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 93, comprising: d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence KAX ¹ EDIYNRX ² A of SEQ ID NO: 79, wherein X ¹ is F or T and X ² is R or L, (e) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence GATSLEH of SEQ ID NO: 80- L2, and (f) a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence QQFXSAPYT of SEQ ID NO: 81, wherein X is W or R;
or
M) i) said first antigen binding site is
A VH domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 74, comprising: a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence SHYGXS of SEQ ID NO: 57, wherein X is I or T, (b) X ¹ is V, I, or H, X ² is P or H, and X ³ is H or a VH domain comprising a CDR-H2 comprising the amino acid sequence GX ¹ IX ² IFX ³ TANYAQKFQG of SEQ ID NO: 58, which is G, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence YDAHYGELDF of SEQ ID NO: 59; and
A VL domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75, comprising: d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence RASQHVSDAYLA of SEQ ID NO: 60, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence DASDRAE of SEQ ID NO: 61, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence HQYIHLHSFT of SEQ ID NO: 62 a VL domain comprising; and
ii) the second antigen binding site is
A VH domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 90, comprising: a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence HTYMH of SEQ ID NO: 76, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence RIDPXNHNTKFDPKFQG of SEQ ID NO: 77, wherein X is D or E, and (c) X is D or E , a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence GVFGFFXH of SEQ ID NO: 78; and
A VL domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 94, comprising: d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence KAX ¹ EDIYNRX ² A of SEQ ID NO: 79, wherein X ¹ is F or T and X ² is R or L, (e) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence GATSLEH of SEQ ID NO: 80- L2, and (f) a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence QQFXSAPYT of SEQ ID NO: 81, wherein X is W or R;
or
N) i) said first antigen binding site is
A VH domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 74, comprising: a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence SHYGXS of SEQ ID NO: 57, wherein X is I or T, (b) X ¹ is V, I, or H, X ² is P or H, and X ³ is H or a VH domain comprising a CDR-H2 comprising the amino acid sequence GX ¹ IX ² IFX ³ TANYAQKFQG of SEQ ID NO: 58, which is G, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence YDAHYGELDF of SEQ ID NO: 59; and
A VL domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75, comprising: d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence RASQHVSDAYLA of SEQ ID NO: 60, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence DASDRAE of SEQ ID NO: 61, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence HQYIHLHSFT of SEQ ID NO: 62 a VL domain comprising; and
ii) the second antigen binding site is
A VH domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 92, comprising: a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence HTYMH of SEQ ID NO: 76, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence RIDPXNHNTKFDPKFQG of SEQ ID NO: 77, wherein X is D or E, and (c) X is D or E , a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence GVFGFFXH of SEQ ID NO: 78; and
A VL domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 93, comprising: d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence KAX ¹ EDIYNRX ² A of SEQ ID NO: 79, wherein X ¹ is F or T and X ² is R or L, (e) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence GATSLEH of SEQ ID NO: 80- L2, and (f) a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence QQFXSAPYT of SEQ ID NO: 81, wherein X is W or R;
or
O) i) the first antigen binding site is
A VH domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 74, comprising: a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence SHYGXS of SEQ ID NO: 57, wherein X is I or T, (b) X ¹ is V, I, or H, X ² is P or H, and X ³ is H or a VH domain comprising a CDR-H2 comprising the amino acid sequence GX ¹ IX ² IFX ³ TANYAQKFQG of SEQ ID NO: 58, which is G, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence YDAHYGELDF of SEQ ID NO: 59; and
A VL domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75, comprising: d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence RASQHVSDAYLA of SEQ ID NO: 60, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence DASDRAE of SEQ ID NO: 61, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence HQYIHLHSFT of SEQ ID NO: 62 a VL domain comprising; and
ii) the second antigen binding site is
A VH domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 91, comprising: a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence HTYMH of SEQ ID NO: 76, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence RIDPXNHNTKFDPKFQG of SEQ ID NO: 77, wherein X is D or E, and (c) X is D or E , a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence GVFGFFXH of SEQ ID NO: 78; and
A VL domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 93, comprising: d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence KAX ¹ EDIYNRX ² A of SEQ ID NO: 79, wherein X ¹ is F or T and X ² is R or L, (e) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence GATSLEH of SEQ ID NO: 80- L2, and (f) a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence QQFXSAPYT of SEQ ID NO: 81, wherein X is W or R;
or
P) i) the first antigen binding site is
A VH domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71, comprising: a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence SHYGXS of SEQ ID NO: 57, wherein X is I or T, (b) X ¹ is V, I, or H, X ² is P or H, and X ³ is H or a VH domain comprising a CDR-H2 comprising the amino acid sequence GX ¹ IX ² IFX ³ TANYAQKFQG of SEQ ID NO: 58, which is G, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence YDAHYGELDF of SEQ ID NO: 59; and
A VL domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75, comprising: d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence RASQHVSDAYLA of SEQ ID NO: 60, (e) a CDR-L2 comprising the amino acid sequence DASDRAE of SEQ ID NO: 61, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence HQYIHLHSFT of SEQ ID NO: 62 a VL domain comprising; and
ii) the second antigen binding site is
A VH domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 92, comprising: a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence HTYMH of SEQ ID NO: 76, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence RIDPXNHNTKFDPKFQG of SEQ ID NO: 77, wherein X is D or E, and (c) X is D or E , a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence GVFGFFXH of SEQ ID NO: 78; and
A VL domain having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 93, comprising: d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence KAX ¹ EDIYNRX ² A of SEQ ID NO: 79, wherein X ¹ is F or T and X ² is R or L, (e) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence GATSLEH of SEQ ID NO: 80- L2, and (f) a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence QQFXSAPYT of SEQ ID NO:81, wherein X is W or R.

12. The method according to any one of claims 8 to 11,
The bispecific antibody comprises an Fc domain of a human IgG isotype, preferably of a human IgG1 isotype.

12. The method according to any one of claims 8 to 11,
The bispecific antibody comprises a constant domain of a human IgG isotype, preferably of a human IgG1 isotype.

14. The method according to any one of claims 1 to 13,
The bispecific antibody is
i) block the binding of CCL2 to its receptor CCR2 in vitro (reporter assay, IC ₅₀ =0.5 nM); and/or
ii) inhibits CCL2-mediated chemotaxis of myeloid cells in vitro (IC ₅₀ =1.5 nM); and/or
iii) a bispecific antibody that cross-reacts to cyno and human CCL2.

15. The method according to any one of claims 1 to 14,
wherein said bispecific antibody does not cross-react with other CCL homologs.

16. The method according to any one of claims 1 to 15,
The bispecific antibody binds to human CCL2 with a 10-fold higher affinity at pH 7.4 than at pH 5.8.

17. The method according to any one of claims 1 to 16,
The bispecific antibody has the following mutations (Kabat numbering)
i) Q311R and/or P343R; and/or
ii) L234Y, L235W, G236N, P238D, T250V, V264I, H268D, Q295L, T307P, K326T and/or A330K; and/or
iii) M428L, N434A and/or Y436T; and/or
iv) a human IgG1 heavy chain constant domain comprising at least one of Q438R and/or S440E
comprising, a bispecific antibody.

An (isolated) antibody that (specifically) binds to human CCL2,
the antibody is
A) (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence SHYGXS of SEQ ID NO: 57, wherein X is I or T, (b) X ¹ is V, I, or H, X ² is P or H, and X ³ a VH domain comprising a CDR-H2 comprising the amino acid sequence GX ¹ IX ² IFX ³ TANYAQKFQG of SEQ ID NO: 58, and (c) a CDR-H3 comprising the amino acid sequence YDAHYGELDF of SEQ ID NO: 59; and
(d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence RASQHVSDAYLA of SEQ ID NO:60; (e) a VL domain comprising a CDR-L2 comprising the amino acid sequence DASDRAE of SEQ ID NO: 61, and (f) a CDR-L3 comprising the amino acid sequence HQYIHLHSFT of SEQ ID NO: 62;
or
B) (a) a CDR-H1 comprising the amino acid sequence HTYMH of SEQ ID NO: 76, (b) a CDR-H2 comprising the amino acid sequence RIDPXNHNTKFDPKFQG of SEQ ID NO: 77, wherein X is D or E, and (c) X is D or a VH domain comprising a CDR-H3 comprising the amino acid sequence GVFGFFXH of SEQ ID NO: 78, which is E; and
(d) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence KAX ¹ EDIYNRX ² A of SEQ ID NO: 79, wherein X ¹ is F or T and X ² is R or L, (e) a CDR-L1 comprising the amino acid sequence GATSLEH of SEQ ID NO: 80 -L2, and (f) a VL domain comprising a CDR-L3 comprising the amino acid sequence QQFXSAPYT of SEQ ID NO:81, wherein X is W or R.

An (isolated) antibody that (specifically) binds to human CCL2,
the antibody is
A) a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75;
or
B) a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 72; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75;
or
C) a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:73; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75;
or
D) a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:74; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75;
or
E) a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 90; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:93;
or
F) a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:91; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:93;
or
G) a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:92; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:93;
or
H) a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:90; and a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 94.
An (isolated) antibody comprising:

20. An isolated nucleic acid encoding an antibody according to any one of claims 1 to 19.

A host cell comprising a nucleic acid according to claim 20 .

A method of generating an antibody comprising:
A method comprising culturing the host cell according to claim 21 to produce said antibody.

24. The method of claim 23,
The method further comprising recovering the antibody from the host cell.

A pharmaceutical formulation comprising the bispecific antibody according to any one of claims 1 to 17 and a pharmaceutically acceptable carrier.

18. The method according to any one of claims 1 to 17,
A bispecific antibody for use as a medicament.

18. The method according to any one of claims 1 to 17,
A bispecific antibody for use in treating cancer.

18. The method according to any one of claims 1 to 17,
A bispecific antibody for use in treating an inflammatory or autoimmune disease.

Use of a bispecific antibody according to any one of claims 1 to 17 in the manufacture of a medicament.

29. The method of claim 28,
The medicament is used for treating cancer.

29. The method of claim 28,
The use of the medicament for treating an inflammatory or autoimmune disease.

A method of treating a subject having cancer, comprising:
A method comprising administering to said subject an effective amount of a bispecific antibody according to any one of embodiments 1-17.

A method of treating a subject having an inflammatory or autoimmune disease, comprising:
A method comprising administering to said subject an effective amount of a bispecific antibody according to any one of embodiments 1-17.