KR20220071264A - 항-pd-l1 항원 결합 단백질 및 이의 응용 - Google Patents

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Abstract

1 Х 10-8 M 이하의 KD 값으로 영장류 유래 PD-L1에 결합할 수 있는 항-PD-L1 항원 결합 단백질이 제공된다. 상기 항원 결합 단백질은 PD-L1에의 PD-1 및 CD80의 결합을 차단하고, 면역 세포에서 사이토카인의 분비를 자극하고, 종양 성장 및/또는 종양 세포 증식을 억제할 수 있다. 또한, 인간 TGFBRII 또는 이의 단편 및 상기 항원 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질이 제공된다. 게다가, 종양 또는 암의 예방 및 치료에서 상기 항원 결합 단백질 및/또는 상기 융합 단백질의 응용이 제공된다.

Description

항-PD-L1 항원 결합 단백질 및 이의 응용
본 출원은 생물의약 분야에 관한 것으로, 구체적으로는 항-PD-L1 항원 결합 단백질 및 이의 용도, 및 PD-L1 및 TGFB 둘 모두에 대한 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.
프로그래밍된 사멸 수용체 리간드 1(PD-L1)은 분화 클러스터 274(CD274) 또는 B7 상동 단백질 1(B7-H1)로도 알려져 있으며, 활성화된 T 세포, B 세포, 단핵구, 수지상 세포, 대식세포, 및 다수 비조혈 세포에서 일반적으로 발현되는 40kDa의 I형 막관통 단백질이다.
PD-L1은 프로그래밍된 사멸 수용체 1(PD-1) 및 B7-1(CD80)에 결합할 수 있다. PD-L1/PD-1 신호전달 경로는 T 세포의 면역 반응을 음성 조절하고 T 세포의 활성을 억제하며 사이토카인의 분비를 감소시키는 면역 반응에서 매우 중요한 공동-억제 신호전달 경로이다. 연구에 따르면 PD-L1은 위암, 폐암, 유방암, 췌장암, 난소암, 결장암, 비만세포 종양, 악성 흑색종 등을 포함하는 다양한 종양 조직에서 발현될 수 있으며 골수 세포에서 발현될 수 있고, 종양 미세환경에 침투하는 골수 세포에서 발현되어, 면역계 공격으로부터 종양 세포를 보호하는 것으로 밝혀졌다. TGFB(Transforming growth factor-B)는 면역계에 상당한 영향을 미치는 강력한 사이토카인이고, 다수 증식성 및 비증식성 세포 과정, 예컨대, 세포 증식 및 분화, 배아 발달, 세포외 기질 형성, 골 형성, 상처 치유, 조혈, 및 면역 및 염증 반응(immune and inflammatory response)에 참여한다. 선행 치료 기술들 중에서, 화학요법이든 종양 표적 요법이든 그 효능에 영향을 미치는 중요한 장애물(bottleneck)은 종양 세포에 의해 발달된 면역 내성이다. 종양 세포는 면역억제 사이토카인(예컨대, TGFB), 조절 T 세포(Treg), 공동 억제 신호전달 경로 분자 및 골수 억제 세포 등을 포함하는 종양 미세환경의 다양한 면역억제 메커니즘을 사용하여 신체의 면역계에 의한 인지 및 공격으로부터 회피한다.
다양한 면역억제 메커니즘은 면역요법의 효과를 방해할 수 있다. 일부 경우에서, 종양은 단일 약물 면역요법에 불응성이고, 오직 극히 일부의 암만이 완전한 반응을 보인다. 따라서, PD-1/PD-L1 신호전달 경로를 차단하는 것뿐만 아니라, PD-1/PD-L1 경로를 억제하는 것을 기반으로 종양 미세환경에서 면역 억제성 사이토카인 TGFB의 중화를 표적으로 하는 약제의 연구 및 개발은 종양 및 다양한 면역계 관련 질병을 치료하기 위한 새로운 해결책을 제공할 수 있다.
본 출원은 1×10-8 M 이하의 KD 값으로 영장류 유래 PD-L1에 결합할 수 있는 PD-L1 항원 결합 단백질을 제공한다. 상기 항원 결합 단백질은 PD-1 및 CD80이 PD-L1과 결합하는 것을 차단할 수 있고, 면역 세포에서 IFN-γ 및/또는 IL2의 분비를 자극할 수 있으며, 종양 성장 및/또는 종양 세포 증식을 억제할 수 있다. 본 출원은 또한 인간 TGFBRII 또는 이의 단편 및 항원 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 본 출원은 또한 종양 또는 암의 예방 및 치료에 있어 상기 항원 결합 단백질 및/또는 상기 융합 단백질의 용도를 제공한다.
일 측면에서, 본 출원은 PD-L1에 결합하는 분리된 항원 결합 단백질을 제공하는데, 상기 분리된 항원 결합 단백질은 항체 결쇄 가변 부위 VH의 적어도 하나의 CDR을 포함하고, 상기 VH는 서열 번호 193에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 바람직하게는, 상기 VH는 서열 번호 90 내지 93, 95 및 97 내지 104 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 분리된 항원 결합 단백질은 항체 경쇄 가변 부위 VH의 적어도 하나의 CDR을 포함하고, 상기 VL은 서열 번호 194에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 바람직하게는, 상기 VL은 서열 번호 108 내지 114, 116 및 118 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 분리된 항원 결합 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고; 바람직하게는, 상기 항체는 단일클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 완전 인간 항체로 이루어진 군으로부터 선택되고; 바람직하게는, 상기 항원 결합 단편은 Fab, Fab', Fv 단편, F(ab')2, scFv, di-scFv 및/또는 dAb를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 분리된 항원 결합 단백질은 경쇄 가변 부위 VL 및 중쇄 가변 부위 VH를 포함하는데, 상기 경쇄 가변 부위 VL은 서열 번호 181에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열 번호 182에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열 번호 191에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하고; 상기 중쇄 가변 부위 VH는 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열 번호 179에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열 번호 180에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 LCDR1은 서열 번호 181, 및 48 내지 51 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 LCDR2는 서열 번호 182, 63 및 64 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 LCDR3은 서열 번호 191, 및 77 내지 79 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR2는 서열 번호 179, 14, 16 및 17 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR3은 서열 번호 180, 및 29 내지 33 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 LCDR1은 서열 번호 48에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 LCDR2는 서열 번호 63에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 LCDR3은 서열 번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR2는 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 상기 HCDR3은 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 LCDR1은 서열 번호 49에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR3은 서열 번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR2는 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 HCDR3은 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 LCDR1은 서열 번호 48에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR3은 서열 번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR2는 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 HCDR3은 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 LCDR1은 서열 번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR2는 서열 번호 63에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR3은 서열 번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR2는 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 HCDR3은 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 LCDR1은 서열 번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR2는 서열 번호 63에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR3은 서열 번호 79에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR2는 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 HCDR3은 서열 번호 31에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 LCDR1은 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR2는 서열 번호 63에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR3은 서열 번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR2는 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 HCDR3은 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 LCDR1은 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR3은 서열 번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR2는 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 HCDR3은 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 LCDR1은 서열 번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR3은 서열 번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR2는 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 HCDR3은 서열 번호 33에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 LCDR1은 서열 번호 48에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR3은 서열 번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR2는 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 HCDR3은 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 LCDR1은 서열 번호 48에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR3은 서열 번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR2는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 HCDR3은 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 LCDR1은 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR2는 서열 번호 63에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR3은 서열 번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR2는 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 HCDR3은 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 LCDR1은 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR2는 서열 번호 63에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR3은 서열 번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR2는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 HCDR3은 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 LCDR1은 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR3은 서열 번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR2는 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 HCDR3은 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 LCDR1은 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR3은 서열 번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR2는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 HCDR3은 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 LCDR1은 서열 번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR3은 서열 번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR2는 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 HCDR3은 서열 번호 33에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
상기 LCDR1은 서열 번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR3은 서열 번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR2는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 HCDR3은 서열 번호 33에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 항체 중쇄 가변 부위 VH는 프레임워크 부위 H-FR1, H-FR2, H-FR3 및 H-FR4를 포함하고; 바람직하게는, 상기 H-FR1은 C-말단에서 상기 HCDR1의 N-말단에 연결되고, 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는 상기 H-FR2는 상기 HCDR1 및 상기 HCDR2 사이에 위치하고, 서열 번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는 상기 H-FR3은 상기 HCDR2 및 상기 HCDR3 사이에 위치하고, 서열 번호 192에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는 상기 H-FR4는 N-말단에서 상기 HCDR3의 C-말단에 연결되고, 서열 번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 더 바람직하게는, 상기 H-FR3은 서열 번호 21, 22 및 24 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 항체 경쇄 가변 부위 VL는 프레임워크 부위 L-FR1, L-FR2, L-FR3 및 H-FR4를 포함하고; 바람직하게는, 상기 L-FR1은 C-말단에서 상기 LCDR1의 N-말단에 연결되고, 서열 번호 185에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는 상기 L-FR2는 상기 LCDR1 및 상기 LCDR2 사이에 위치하고, 서열 번호 186에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는 상기 L-FR3은 상기 LCDR2 및 상기 LCDR3 사이에 위치하고, 서열 번호 187에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는 상기 L-FR4는 N-말단에서 상기 LCDR3의 C-말단에 연결되고, 서열 번호 188에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 L-FR1은 서열 번호 41 내지 44 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는 상기 L-FR2는 서열 번호 56 내지 59 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는 상기 L-FR3은 서열 번호 69 내지 72 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는 상기 L-FR4는 서열 번호 85 및 86 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 항체 중쇄 가변 부위 VH는 서열 번호 193에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 항체 경쇄 가변 부위 VL는 서열 번호 194를 포함하고; 바람직하게는, 상기 항체 중쇄 가변 부위 VH는 서열 번호 90 내지 93, 95 및 97 내지 104 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 바람직하게는, 상기 항체 경쇄 가변 부위 VL은 서열 번호 108 내지 114, 116 및 118 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 중쇄 가변 부위 VH는 서열 번호 90에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 부위 VL은 서열 번호 108에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 중쇄 가변 부위 VH는 서열 번호 90에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 부위 VL은 서열 번호 109에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 중쇄 가변 부위 VH는 서열 번호 91에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 부위 VL은 서열 번호 110에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 중쇄 가변 부위 VH는 서열 번호 90에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 부위 VL은 서열 번호 111에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 중쇄 가변 부위 VH는 서열 번호 92에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 부위 VL은 서열 번호 112에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 중쇄 가변 부위 VH는 서열 번호 93에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 부위 VL은 서열 번호 113에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 중쇄 가변 부위 VH는 서열 번호 90에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 부위 VL은 서열 번호 114에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 중쇄 가변 부위 VH는 서열 번호 95에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 부위 VL은 서열 번호 116에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 중쇄 가변 부위 VH는 서열 번호 97에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 부위 VL은 서열 번호 118에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 중쇄 가변 부위 VH는 서열 번호 98에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 부위 VL은 서열 번호 118에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 중쇄 가변 부위 VH는 서열 번호 99에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 부위 VL은 서열 번호 113에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 중쇄 가변 부위 VH는 서열 번호 100에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 부위 VL은 서열 번호 113에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 중쇄 가변 부위 VH는 서열 번호 101에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 부위 VL은 서열 번호 114에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 중쇄 가변 부위 VH는 서열 번호 102에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 부위 VL은 서열 번호 114에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 중쇄 가변 부위 VH는 서열 번호 103에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 부위 VL은 서열 번호 116에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
상기 중쇄 가변 부위 VH는 서열 번호 104에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 부위 VL은 서열 번호 116에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 분리된 항원 결합 단백질은 항체 중쇄 불변 부위를 포함하고, 상기 항체 중쇄 분변 부위는 인간 IgG 불변 부위를 포함하고; 바람직하게는, 상기 항체 중쇄 불변 부위는 서열 번호 172 내지 175 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 분리된 항원 결합 단백질은 항체 중쇄 HC를 포함하고, 상기 HC는 서열 번호 122 내지 125, 127 및 129 내지 137 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 분리된 항원 결합 단백질은 항체 경쇄 불변 부위를 포함하되, 상기 항체 경쇄 불변 부위는 서열 번호 170에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 분리된 항원 결합 단백질은 항체 경쇄 LC를 포함하고, 상기 LC는 서열 번호 150 내지 156, 158 및 160 내지 163 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 분리된 항원 결합 단백질은 하기 특성들 중 하나 이상을 갖는다:
1) 1 x 10-8 M 이하의 KD 값으로 영장류 유래 PD-L1에 결합할 수 있음;
2) PD-L1에의 PD-1 결합을 차단할 수 있음;
3) PD-L1에의 CD80 결합을 차단할 수 있음;
4) 면역 세포에서 IFN-γ 및/또는 IL2의 분비를 자극할 수 있음;
5) 종양 성장 및/또는 종양 세포 증식을 억제할 수 있음;
6) 대조군 항체의 에피토프와 완전히 중첩되지 않는 영장류 유래 PD-L1의 에피토프에의 결합함,
이때, 상기 대조군 항체는 서열 번호 52에 제시된 LCDR1, 서열 번호 65에 제시된 LCDR2, 및 서열 번호 81에 제시된 LCDR3을 포함하고, 상기 대조군 항체는 서열 번호 6에 제시된 HCDR1, 서열 번호 15에 제시된 HCDR2 및 서열 번호 34에 제시된 HCDR3을 포함하거나;
상기 대조군 항체는 서열 번호 53에 제시된 LCDR1, 서열 번호 66에 제시된 LCDR2 및 서열 번호 82에 제시된 LCDR3을 포함하고, 상기 대조군 항체는 서열 번호 5에 제시된 HCDR1, 서열 번호 18에 제시된 HCDR2 및 서열 번호 35에 제시된 HCDR3을 포함하거나; 또는
상기 대조군 항체는 서열 번호 55에 제시된 LCDR1, 서열 번호 68에 제시된 LCDR2 및 서열 번호 84에 제시된 LCDR3을 포함하고, 상기 대조군 항체는 서열 번호 8 에 제시된 HCDR1, 서열 번호 20에 제시된 HCDR2 및 서열 번호 37에 제시된 HCDR3을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 영장류는 인간 및/또는 원숭이를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 a) 인간 TGFBRII 또는 이의 단편; 및 b) 상기 분리된 항원 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 융합 단백질은 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는데, 상기 제1 폴리펩티드는 상기 분리된 항원 결합 단백질의 중쇄 또는 이의 단편, 및 인간 TGFBRII 또는 이의 단편을 포함하고; 제2 폴리펩티드는 상기 분리된 항원 결합 단백질의 경쇄 또는 이의 단편을 포함하고; 바람직하게는, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 상기 인간 TGFBRII 또는 이의 단편과 프레임 내 융합되어 제1 폴리펩티드를 형성하고; 더욱 바람직하게는, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 C-말단에서 인간 TGFBRII 또는 이의 단편의 N-말단에 직접 또는 간접적으로 연결된다.
일부 구현예에서, 상기 제1 폴리펩티드의 중쇄 또는 이의 단편은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR2는 서열 번호 179, 14, 16 및 17 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR3은 서열 번호 180, 및 29 내지 33 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는 상기 제2 폴리펩티드는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, 상기 LCDR1은 서열 번호 181, 및 48 내지 51에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 LCDR2는 서열 번호 182, 63 및 64 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 LCDR3은 서열 번호 191, 및 77 내지 79 중 어느 하나에 제시된 아미노산을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 LCDR1은 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR3은 서열 번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR2는 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR3은 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 LCDR1은 서열 번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR3은 서열 번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR3은 서열 번호 33에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 LCDR1은 서열 번호 50에 제시된 아미노산 서열으 포함하고, 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR3은 서열 번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR2는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR3은 서열 번호 33에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 LCDR1은 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR3은 서열 번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR1은 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR2는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR3은 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
상기 LCDR1은 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR3은 서열 번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR2는 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR3은 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함한다..
일부 구현예에서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 링커를 통해 인간 TGFBRII 또는 이의 단편에 연결되고; 바람직하게는, 상기 링커는 펩티드 링커이고, 상기 펩티드 링커는 서열 번호 167 내지 169 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 인간 TGFBRII 및 이의 단편은 인간 TGFBRII의 세포외 도메인을 포함하고; 바람직하게는, 상기 인간 TGFBRII 및 이의 단편은 서열 번호 176 내지 178 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제1 폴리펩티드의 중쇄 또는 이의 단편은 상기 제2 폴리펩티드의 경쇄 또는 이의 단편과 결합되어 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부분을 형성한다.
일부 구현예에서, 상기 제1 폴리펩티드는 서열 번호 138, 139, 142, 143 및 145 내지 148 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 제2 폴리펩티드는 서열 번호 162 및 163 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제1 폴리펩티드는 서열 번호 138에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 제2 폴리펩티드는 서열 번호 162에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 제1 폴리펩티드는 서열 번호 139에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 제2 폴리펩티드는 서열 번호 162에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 제1 폴리펩티드는 서열 번호 142에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 제2 폴리펩티드는 서열 번호 162에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 제1 폴리펩티드는 서열 번호 143에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 제2 폴리펩티드는 서열 번호 162에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 제1 폴리펩티드는 서열 번호 145에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 제2 폴리펩티드는 서열 번호 163에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 제1 폴리펩티드는 서열 번호 146에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 제2 폴리펩티드는 서열 번호 163에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 제1 폴리펩티드는 서열 번호 147에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 제2 폴리펩티드는 서열 번호 162에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
상기 제1 폴리펩티드는 서열 번호 148에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 제2 폴리펩티드는 서열 번호 162에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 상기 분리된 항원 결합 단백질 또는 상기 융합 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 상기 핵산 분자 또는 상기 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 상기 분리된 항원 결합 단백질 또는 상기 융합 단백질을 제조하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 상기 분리된 항원 결합 단백질 또는 상기 융합 단백질이 발현되는 조건 하에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 상기 분리된 항원 결합 단백질을 포함하는 키메라 항원 수용체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 상기 키메라 항원 수용체를 포함하는 유전자 변형 세포를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 세포독성제(cytotoxic agent) 및 상기 분리된 항원 결합 단백질을 포함하는 항체-약물 접합체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 상기 분리된 항원 결합 단백질, 상기 융합 단백질, 상기 핵산 분자, 상기 벡터, 상기 세포, 상기 키메라 항원 수용체, 상기 유전자 변형 세포 및/또는 상기 항체-약물 접합체, 및 선택적으로는, 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하며; 보다 바람직하게는, 상기 약제학적 조성물은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함한다: 호르몬 제제, 표적화된 저분자 제제, 프로테아좀 억제제, 영상화제, 진단제, 화학요법제, 종양 용해제(oncolytic medicament), 세포독성제, 사이토카인, 공동 자극 분자의 활성화제, 억제 분자의 억제제 및 백신.
또 다른 측면에서, 본 출원은 종양 또는 암을 예방, 완화 및/또는 치료하고, 종양 성장을 억제하고/하거나 종양 세포 증식을 억제하는데 사용되는 약제의 제조에서 상기 분리된 항원 결합 단백질, 상기 융합 단백질, 상기 핵산 분자, 상기 벡터, 상기 세포, 상기 키메라 항원 수용체, 상기 유전자 변형 세포 및/또는 상기 항체-약물 접합체 및/또는 약제학적 조성물의 용도를 제공하고; 바람직하게는, 상기 종양 또는 암은 PD-L1의 비정상적 발현을 갖는 종양 또는 암이고; 바람직하게는, 상기 종양 또는 암은 결장직장암을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 종양을 예방, 경감 또는 치료하고, 종양 성장을 억제 및/또는 종양 세포 증식을 억제하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 상기 분리된 항원 결합 단백질, 상기 융합 단백질, 상기 핵산 분자, 상기 벡터, 상기 세포, 상기 키메라 항원 수용체, 상기 유전자 변형 세포 및/또는 상기 항체-약물 접합체 및/또는 상기 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하고; 바람직하게는, 상기 종양 또는 암은 PD-L1의 비정상적인 발현을 갖는 종양 또는 암이고; 바람직하게는, 상기 종양 또는 암은 결장직장암을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 암을 치료하고, 종양 성장을 억제하고/하거나 종양 세포 증식을 억제하는데 사용하기 위한, 상기 분리된 항원 결합 단백질, 상기 융합 단백질, 상기 핵산 분자, 상기 벡터, 상기 세포, 상기 키메라 항원 수용체, 상기 유전자 변형 세포 및/또는 상기 항체-약물 접합체 및/또는 상기 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 PD-1에의 PD-L1 및/또는 CD80의 결합을 억제하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 상기 분리된 항원 결합 단백질, 상기 융합 단백질, 상기 핵산 분자, 상기 벡터, 상기 세포, 상기 키메라 항원 수용체, 상기 유전자 변형 세포 및/또는 상기 항체-약물 접합체 및/또는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 상기 분리된 항원 결합 단백질, 상기 융합 단백질, 상기 핵산 분자, 상기 벡터, 상기 세포, 상기 키메라 항원 수용체, 상기 유전자 변형 세포 및/또는 상기 항체-약물 접합체, 및/또는 상기 약제학적 조성물을 포함하는 키트를 제공하며; 바람직하게는, 상기 키트는 (i) 전달 장치; 및/또는 (ii) 지침을 더 포함한다. 당업자는 하기 상세한 설명으로부터 본 출원의 다른 측면 및 이점을 쉽게 알 수 있다. 하기 상세한 설명은 단지 본 출원의 예시적인 구현예들을 보여주고 설명한다. 당업자가 인식하는 바와 같이, 본 출원의 내용은 당업자가 본 출원과 관련된 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 개시된 특정 구현예를 수정할 수 있게 한다. 따라서, 본 출원 명세서의 도면 및 설명은 예시적일 뿐이며 제한적이지 않다.
본 출원과 관련된 본 발명의 구체적인 특징은 첨부된 청구범위에 제시되어 있다. 본 출원과 관련된 본 발명의 특징 및 이점은 이하에서 상세하게 설명되는 예시적인 구현예 및 도면을 참조함으로써 더 잘 이해될 것이다. 도면의 간략한 설명은 하기와 같다:
도 1은 본 출원의 항원 결합 단백질이 인간 PD-L1을 과발현하는 CHO-K1 세포에 결합하는 것을 보여준다;
도 2는 본 출원의 항원 결합 단백질이 시노몰구스 PD-L1(cynomolgus PD-L1)을 과발현하는 CHO-K1 세포에 결합하는 것을 보여준다;
도 3은 본 출원의 항원 결합 단백질이 인간 PD-L1 단백질에 결합하는 것을 보여준다;
도 4는 본 출원의 항원 결합 단백질이 시노몰구스 PD-L1 단백질에 결합하는 것을 보여준다;
도 5는 본 출원의 항원 결합 단백질이 인간 PD-L1을 과발현하는 CHO-K1 세포에의 인간 PD-1의 결합을 차단하는 것을 보여준다;
도 6은 본 출원의 항원 결합 단백질이 인간 PD-L1을 과발현하는 CHO-K1 세포에의 인간 PD-1의 결합을 차단하는 것을 보여준다;
도 7은 본 출원의 항원 결합 단백질이 인간 PD-L1 단백질에의 비오틴화된 인간 PD-1 단백질의 결합을 차단하는 것을 보여준다;
도 8은 본 출원의 항원 결합 단백질이 인간 PD-L1 단백질에의 비오틴화된 인간 B7-1(CD80) 단백질의 결합을 차단하는 것을 보여준다;
도 9는 본 출원의 항원 결합 단백질에 의한 PD-1 신호전달 경로의 억제를 보여준다;
도 10은 본 출원의 항원 결합 단백질에 의한 PD-1 신호전달 경로의 억제를 보여준다;
도 11은 인간 PD-L1에 대한 본 출원의 항원 결합 단백질의 친화도를 나타낸다; (A) 단일 농도에서 PR000265의 항원 결합 및 해리 곡선, (B) 단일 농도에서 PR000266의 항원 결합 및 해리 곡선, (C) 다중 농도에서 PR000265의 항원 결합 및 해리 곡선, (D) 다중 농도에서 PR000151의 항원 결합 및 해리 곡선, (E) 다중 농도에서 PR001598의 항원 결합 및 해리 곡선;
도 12는 본 출원의 항원 결합 단백질이 혼합 림프구 반응(mixed lymphocyte reaction; MLR)에서 사이토카인의 분비를 자극하는 것을 보여준다: 공여자와 쌍을 이룬 MLR 실험의 제1 그룹에서, (A) 120시간 후 상층액의 IFN-γ의 수준, (B) 72시간 후 상층액의 IL-2 수준; 공여자와 쌍을 이룬 MLR 실험의 제2 그룹에서, (C) 120시간 후 상층액의 IFN-γ 수준, (D) 72시간 후 상층액의 IL-2 수준;
도 13은 본 출원의 항원 결합 단백질의 항체-의존성 세포독성의 결과를 보여준다: (A 내지 C) 세 상이한 공여자로부터의 PBMC에 의한 종양 세포 MDA-MB-231의 사멸; (D 내지 F) 세 상이한 공여자로부터의 PBMC에 의한 종양 세포 NCI-H292의 사멸;
도 14는 본 출원의 항원 결합 단백질의 생체 내(in vivo) 종양 억제 활성으로서, 각각 종양 부피 변화(A) 및 마우스 체중 변화(B)를 보여준다.
도 15는 본 출원의 융합 단백질이 인간 PD-L1을 과발현하는 CHO-K1 세포에 결합하는 것을 보여준다: (A) 표 20-1에 나열된 융합 단백질, (B) 표 20-2에 나열된 융합 단백질;
도 16은 본 출원의 융합 단백질이 인간 PD-L1을 과발현하는 CHO-K1 세포에의 인간 PD-1의 결합을 차단하는 것을 보여준다: (A) 표 21-1에 나열된 융합 단백질, (B) 표 21-2에 나열된 융합 단백질;
도 17은 본 출원의 융합 단백질에 의한 PD-1 신호전달 경로의 억제를 보여준다;
도 18은 본 출원의 융합 단백질이 TGFB1에 결합하는 것을 보여준다: (A) 표 23-1에 나열된 융합 단백질, (B) 표 23-2에 나열된 융합 단백질, (C) 표 23-3에 나열된 융합 단백질;
도 19는 본 출원의 융합 단백질에 의한 Smad 신호전달 경로의 TGFB1-유도 활성화의 억제를 보여준다;
도 20은 TGFB1이 존재하거나 존재하지 않는 조건 하에서, 혼합 림프구 반응(MLR)에서 본 출원의 융합 단백질에 의해 자극된 T 림프구에 의한 사이토카인 분비 수준을 보여준다: (A) 72시간 후 상층액의 IL-2 수준, (B) 120시간 후 상층액의 IFN-γ 수준;
도 21은 본 출원의 융합 단백질의 항체-의존성 세포독성의 결과를 보여준다: (A 내지 C) 세 상이한 공여자로부터의 PBMC에 의한 종양 세포 MDA-MB-231의 사멸; (D 내지 F) 세 상이한 공여자로부터의 PBMC에 의한 종양 세포 NCI-H292의 사멸;
도 22는 본 출원의 융합 단백질 PR001902의 약동학적 결과를 보여준다;
도 23은 본 출원의 융합 단백질 PR001488의 약동학적 결과를 보여준다;
도 24는 종양 동물 생체 내 모델에서 본 출원의 융합 단백질의 항종양 활성으로서, 각각 종양 부피의 변화(A) 및 마우스 체중의 변화(B)를 보여준다.
이하에서, 본원 발명의 구현예를 특정 구체적인 실시예로 예시한다. 이 기술에 정통한 사람은 본 명세서에 개시된 내용으로부터 본원 발명의 다른 이점 및 효과를 쉽게 이해할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "항원 결합 단백질"은 일반적으로 항원 결합 부분을 포함하는 단백질을 지칭하고, 선택적으로는 항원 결합 단백질은 항원 결합 부분이 항원 결합 단백질이 항원에 결합하는 입체형태(conformation)를 촉진하는 스캐폴드 또는 프레임워크 부분을 채택하도록 한다. 이는 통상적으로 항체 경쇄 가변 부위(VL), 항체 중쇄 가변 부위(VH) 또는 상기 둘 모두를 포함한다. VH 및 VL 부위는 상보성 결정 부위(CDR)로 불리는 초가변 부위로 더 나눌 수 있으며, 이는 프레임워크 부위(FR)로 불리는 보다 보존된 영부위에 산재되어 있다. VH 및 VL 각각은 3개의 CDR 및 4개의 FR 부위로 구성될 수 있으며, 아미노 말단에서 카르복시 말단까지 하기 순서로 배열될 수 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 그리고 FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 부위는 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항원 결합 단백질의 예시는, 원하는 항원 결합 활성을 나타내는 조건하에, 항체, 항원 결합 단편(Fab, Fab', F(ab)2, Fv 단편, F(ab')2, scFv, di-scFv 및/또는 dAb), 면역접합체, 다중 특이적 항체(예컨대, 이중특이적 항체), 항체 단편, 항체 유도체, 항체 유사체 또는 융합 단백질 등(단, 원하는 항원 결합 활성을 나타내는 경우)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서, 용어 "융합 단백질"은 일반적으로는 2개 이상의 폴리펩티드들로 구성된 단백질을 지칭하고, 자연 상태에서는 일반적으로 연결되지 않지만, 각각의 아미노 말단 및 카르복실 말단이 직접 또는 간접적으로 함께 결합되어 1개의 연속적인 폴리펩티드를 형성한다. 일부 경우에, 용어 "융합 단백질" 및 "항체"는 본 출원의 융합 단백질을 언급할 때 상호교환적으로 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 용어 "융합 단백질" 및 "항원 결합 단백질"은 본 출원의 융합 단백질을 언급할 때 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "Fab"는 일반적으로 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 포함하는 단편을 지칭하고; 용어 "Fab'"은 일반적으로 소수의 잔기(항체 힌지 부위의 하나 이상의 시스테인 포함)가 중쇄의 CH1 도메인의 카르복실 말단에 추가되어 Fab와 상이하게 되는 단편을 일반적으로 지칭하고; 용어 "F(ab')2"는 일반적으로 힌지 부위 상의 이황화 다리에 의해 연결된 2개의 Fab 단편의 항체 단편을 포함하는, Fab'의 이량체를 지칭한다. 용어 "Fv"는 일반적으로 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 함유하는 가장 작은 항체 단편을 지칭한다. 일부 경우에서, 상기 단편은 하나의 중쇄 가변 부위 및 하나의 경쇄 가변 부위가 단단히 비공유결합으로 결합된 이량체로 이루어질 수 있고; 용어 "dsFv"는 일반적으로 단일 경쇄 가변 부위 및 단일 중쇄 가변 부위 사이의 결합이 이황화 결합인, 이황화 결합 안정화 Fv 단편을 지칭한다. 용어 "dAb 단편"은 일반적으로 VH 도메인으로 이루어진 항체 단편을 지칭한다. 본 출원에서, 용어 "scFv"는 일반적으로 항체의 하나의 중쇄 가변 도메인 및 하나의 경쇄 가변 도메인을 플렉서블 펩티드 링커를 통해 공유결합으로 연결 및 쌍을 이뤄 형성되는 1가 분자를 지칭하고; 이러한 scFv 분자는 하기와 같은 일반 구조를 가질 수 있다. NH2-VL-링커-VH-COOH 또는 NH2-VH-링커-VL-COOH.
본 출원에서, 용어 "가변"은 일반적으로 항체의 가변 도메인 서열의 특정 부분이 강력히 변화하여, 이의 특정 항원들에의 다양한 특정 항체들의 결합 및 특이성을 형성한다는 사실을 의미한다. 하지만, 가변성은 항체 가변 부위 전체에 균일하게 분포되지는 않는다. 이는 상보성 결정 부위(CDR) 또는 초가변 부위(HVR)로 불리는, 경쇄 및 중쇄의 가변 부위의 3개의 분절에 집중되어 있다. 가변 도메인에서 고도로 보존된 부분을 프레임워크 부위(FR)라고 한다. 천연 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은 4개의 FR 부위(H-FR1, H-FR2, H-FR3, H-FR4, L-FR1, L-FR2, L-FR3, L-FR4)를 포함하며, 이들 대부분은 β-시트 구성을 채택하고 3개의 CDR 구조 루프 부위로 연결된다. 각 사슬의 CDR은 FR 부위를 통해 서로 가까이 있고, 다른 사슬의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 위치를 형성한다. 불변부위들은 항체와 항원의 결합에 직접적으로 관여하지 않지만, 다양한 이펙터 기능, 예를 들면, 항체-의존성 세포독성을 나타낸다. 당업계에서, 항체의 CDR은 다양한 방법, 예를 들면, 서열 가변성에 기초한 Kabat 정의 규칙(Kabat et al., Protein Sequences of Immunology, Fifth Edition, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland (1991) 참조) 및 구조적인 루프 부위의 위치에 기초한 Chothia 정의 규칙(A1-Lazikani et al., J Mol Biol 273:927-48, 1997 참조)에 의해 정의될 수 있다. 본 출원에서, Kabat 정의 및 Chothia 정의를 포함하는 조합된 정의 규칙 또한 가변 도메인 서열 및 전장 항체 서열의 아미노산 잔기를 결정하는데 사용된다. 항체 CDR의 정의법은 표 1에서 확인할 수 있다.
[표 1] 항체 CDR의 정의법
Figure pct00001
여기서, Laa-Lbb는 항체 경쇄의 N-말단에서 시작하여 위치 aa(Chothia 넘버링 규칙)에서 위치 bb(Chothia 넘버링 규칙)까지의 아미노산 서열을 지칭할 수 있고; Haa-Hbb는 항체 중쇄의 N-말단에서 시작하여 위치 aa(Chothia 넘버링 규칙)에서 위치 bb(Chothia 넘버링 규칙)까지의 아미노산 서열을 지칭할 수 있다. 예를 들면, L24-L34는 항체의 경쇄의 N-말단에서 시작하여 Chothia 넘버링 규칙에 따른 위치 24부터 위치 34까지의 아미노산 서열을 지칭할 수 있고; H26-H32는 항체 중쇄의 N-말단에서 Chothia 넘버링 규칙에 따른 위치 26에서 위치 32까지의 아미노산 서열을 지칭할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "분리된(isolated)" 항원 결합 단백질은 일반적으로 이의 생산 환경(예를 들면, 천연 또는 재조합)의 성분들로부터 이미 식별되고, 분리 및/또는 회수된 항원 결합 단백질을 의미한다. 이의 생산 환경의 오염 성분들은 이의 연구, 진단 및 치료 용도를 방해하는 물질이며, 효소, 호르몬 및 기타 단백질 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 상기 분리된 항원 결합 단백질 및 항체는 일반적으로 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조된다.
본 출원에서, 용어 "단일클론 항체"는 일반적으로 본질적으로 균질한 항체의 그룹으로부터 얻은 항체를 의미하고, 즉, 존재할 수 있는 소수의 자연적 돌연변이를 제외하고 그룹 내 개별 항체들은 동일하다. 단일클론 항체는 일반적으로 단일 항원 위치에 매우 특이적이다. 또한, 각각의 단일클론 항체는 항원상의 단일 결정인자로 향하고, 기존 다중클론 항원 제제(일반적으로 상이한 결정인자로 향하는 상이한 항체들을 포함함)와 상이하다. 특이성 외에도, 단일클론 항체의 이점은 하이브리도마 배양에 의해 합성할 수 있어 다른 면역글로빈에 의해 오염되지 않는데에 있다. 수식어 "단일클론성"은 본질적으로 균질한 항체 집단에서 얻은 항체의 특징을 나타내고, 항체를 생산하는 데 어떤 특정 방법이 필요한 것으로 해석되지 않는다. 예를 들면, 본 출원에 따라 사용되는 단일클론 항체는 하이브리도마 세포에서 제조될 수 있거나, DNA 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "완전 인간 항체"는 일반적으로 인간 항체를 인코딩하는 유전자를 항체 유전자가 결핍된 유전적으로 조작된 동물에 전달하여 얻어진 동물에의해 발현된 항체를 의미한다. 항체의 모든 부분(항체의 가변 부위 및 불변 부위 포함)은 인간 유래 유전자에 의해 인코딩된다. 완전 인간 항체는 이종성 항체로 유발된 인체에 대한 면역 부작용을 크게 감소시킬 수 있다. 당업계에서 완전 인간 항체를 얻는 방법은 파지 디스플레이 기술, 형질전환 마우스 기술, 리보솜 디스플레이 기술, RNA-폴리펩티드 기술 등을 포함할 수 있다.
본 출원에서 용어 "특이적으로 결합"은 일반적으로 항체가 이의 항원 결합 도메인을 통해 에피토프에 결합하는 것을 의미하며, 항원 결합 도메인 및 에피토프 사이의 일부 상보성이 결합을 위해 필요하다. 이 정의에 따르면, 항체는 무작위로 관련 없는 에피토프에 결합하는 것보다 이의 항원 결합 도메인을 통해 에피토프에 더 쉽게 결합할 때 항원에 "특이적으로 결합"하는 것으로 지된다. "에피토프"는 항원 결합 단백질 (예컨대, 항체)에 결합하는 항원 상의 특정 원자 라디칼(예를 들면, 당 측쇄, 포스포릴, 설포닐) 또는 아미노산을 의미한다.
본 출원에서, 용어 "KD", "K D "는 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 일반적으로 평형 해리 상수를 나타내고, "KD"는 결합 속도 상수 (kon, “결합 속도 (kon)” 또는 “ka”로도 알려짐)에 대한 해리 속도 상수(kdis, "해리 속도(오프 속도(off-rate)) (koff)" 또는 “kd”로도 알려짐)의 비이다. 결합 속도 상수(kon), 해리 속도 상수(kdis) 및 평형 해리 상수(KD)는 항원에 대한 항원 결합 단백질(예컨대, 항체)의 결합 친화성을 나타내기 위해 사용될 수 있다. 결합 및 해리 속도 상수를 결정하는 방법은 당업계에 익히 공지되어 있고, 바이오필름 간섭 기술(biofilm interference technology; BLI), 방사선면역분석(radioimmunoassay; RIA), 평형 투석, 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance; SPR), 형광 공명 에너지 전달(fluorescence resonance energy transfer; FRET), 공동 면역 침전 (co-immunoprecipitation; Co-IP) 및 단백질 칩 기술을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 단백질-단백질 상호작용의 측정된 친화도는 상이한 조건(예를 들면, 염 농도, pH)에서 측정되는 경우 상이할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "PD-L1"은 일반적으로 프로그래밍된 사멸 리간드 1 단백질, 이의 기능적 변이체 및/또는 이의 기능적 단편을 지칭한다. PD-L1은 분화 클러스터 274(CD274) 또는 B7 상동체 1(B7-H1)로도 알려져 있으며, (인간에서) CD274 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다. PD-L1은 그의 리간드, 예를 들면, 활성화된 T 세포, B 세포 및 대식세포에서 발현되는 프로그래밍된 사멸 1(PD-1)에 결합한다(Ishida et al., 1992 EMBO J, 11:3887-3395; Okazaki et al., Autoimmune dilated cardiomyopathy in PD-1 receptor-deficient mice Science. 319-22). PD-L1과 PD-1의 복합체화는 T 세포의 증식을 억제하고 사이토카인 IL-1 및 IFN-γ를 생산함으로써 면역억제 효과를 발휘한다(Freeman et al., Engagement of PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation, J. Exp.Med. 2000, 192:1027-1034; Carter et al., PD-1: PD-L inhibitory pathway affects both CD4(+) and CD8(+) T cells and is overcome by IL-2. Eur. J. Immunol. 2002, 32:634-643). 용어 "PD-L1"은 영장류(예를 들어, 인간) 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 랫트)와 같은 포유동물을 포함하는 임의의 척추동물 공급원의 임의의 천연 PD-L1을 포함한다. 상기 용어는 "전장(full-length)"은, 가공되지 않은 PD-L1 및 세포에서 가공에 의해 생산된 임의의 형태의 PD-L1을 포함한다. PD-L1은 막관통 단백질 또는 가용성 단백질로서 존재할 수 있습니다. 상기 용어는 또한 PD-L1의 자연적으로 존재하는 변이체, 예를 들면, 스플라이싱 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. PD-L1의 기본 구조는 하기 4개의 도메인들을 포함한다: 세포외 Ig 유사 V형 도메인 및 Ig 유사 C2형 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 도메인의 4개 도메인. PD-L1의 서열은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 인간 PD-L1 유전자(게놈 DNA 서열 포함)에 관한 정보는 NCBI Gene ID No.29126에서 찾을 수 있다. 예를 들면, 마우스 PD-L1 유전자(게놈 DNA 서열 포함)에 관한 정보는 NCBI Gene ID No.60533에서 찾을 수 있다. 예를 들면, 시노몰구스 PD-L1 유전자(게놈 DNA 서열 포함)에 관한 정보는 NCBI Gene ID No. 102145573에서 찾을 수 있다 예시적인 전장 인간 PD-L1 단백질의 아미노산 서열은 NCBI 등록 번호 NP_054862 또는 Uniprot 등록 번호 Q9NZQ7에서 찾을 수 있다. 예시적인 전장 마우스 PD-L1의 단백질 서열은 NCBI 등록 번호 NP_068693 또는 Uniprot 등록 번호 Q9EP73에서 찾을 수 있다. 예시적인 전장 시노몰구스 PD-L1의 단백질 서열은 NCBI 등록 번호 XP_005581836 또는 Uniprot 등록 번호 G7PSE7에서 찾을 수 있다.
본 출원에서, 용어 "PD-1"은 일반적으로 프로그래밍된 사멸 1 수용체(CD279로도 알려짐), 이의 기능적 변이체 및/또는 이의 기능적 단편을 지칭한다. PD-1은 일반적으로 T 세포, B 세포, 자연 살해 세포, 활성화된 단핵구 및 수지상 세포(DC) 상에서 발현된다. PD-1은 이의 리간드인 PD-L1 및 PD-L2에 결합할 수 있다. 자연적으로 존재하는 PD-1와 상이한 아미노산 서열을 갖지만 PD-L1에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하는 변이체 또한 PD-1의 정의 내에 포함된다. PD-1의 정의 내에 PD-L1의 생물학적 활성을 향상시키는 변이체가 추가로 포함된다. PD-1의 서열은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 예시적인 전장 인간 PD-1의 단백질 서열은 NCBI 등록 번호 NP_005009에서 찾을 수 있고, 예시적인 전장 시노몰구스 PD-1의 단백질 서열은 NCBI 등록 번호 NP_001271065 또는 Uniprot 등록 번호 B0LAJ3에서 찾을 수 있다.
본 출원에서, 용어 "CD80"은 일반적으로 분화 단백질 80(B7-1로도 알려짐), 이의 기능적 변이체 및/또는 이의 기능적 단편의 클러스터를 지칭한다. CD80은 일반적으로 절대(obligate) 항원제시세포(APC) 상에서 발현된다. CD80은 PD-L1에 결합할 수 있다. 자연적으로 존재하는 CD80과 상이한 아미노산 서열을 갖지만 PD-L1에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하는 변이체 또한 CD80의 정의 내에 포함된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "CD80"은 인간 CD80(hCD80), hCD80의 변이체, 이성질체 및 종 상동체, 및 hCD80의 하나 이상의 공통 에피토프를 함유하는 유사체를 포함한다. 예를 들면, 용어 "CD80"은 또한 다른 포유동물(예를 들어, 랫트, 마우스, 토끼, 인간이 아닌 영장류, 돼지 또는 소)과 같은 다른 종으로부터 유래된 CD80을 포함한다. 온전한 인간 CD80 서열은 Uniprot 등록 번호 P33681에서 찾을 수 있다.
본 출원에서, 용어 "TGFBRII"는 일반적으로 형질전환 성장 인자 B(TGFBR2로도 알려짐)의 수용체를 지칭한다. 세포 표면 상의 TGFBR은 형질전환 성장 인자 (TGFB)에 의해 결합 및 활성화될 수 있으며, 성장 조절, 항염증성 및 면역 조절 활성을 갖는 SMAD 경로를 통해 신호 전달을 수행할 수 있다. 온전한 인간 TGFBRII 서열은 Uniprot 등록 번호 P37173에서 찾을 수 있다.
본 출원에서, 용어 "특이적 항-PD-L1 항체"는 일반적으로 PD-L1에의 결합에 대해 본 출원의 항체와 경쟁할 수 있는 항체를 의미한다. 본 출원의 항원 결합 단백질은 특정 항-PD-L1 항체와 동일한 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "대조군 항체"는 표준 PD-L1 항체를 지칭하는데, 이때, 본 출원의 실시예에서 표준 PD-L1 항체를 기준으로 실험 결과가 평가된다. 일부 경우에서, 상기 대조군 항체는 본 출원의 실시예에서 양성 대조군, 예를 들면, PR000151, PR001598 및 PR002466을 지칭할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "영장류"는 일반적으로 원숭이 및 유인원 종을 의미하고, 원숭이 종, 예컨대, 마카카(Macaca) (예컨대, 구체적으로는, 시노몰구스(Macaca fascicularis) 및/또는 붉은털 원숭이(Macaca mulatta)), 개코원숭이(Papio ursinus), 마모셋(Callithrix의 한 종), 다람쥐원숭이(Saimiri의 한 종), 및 타마린(Saguinus의 한 종) 원숭이, 침팬지(Pan troglodytes)와 같은 유인원 종, 및 호모 사피엔스 또한 포함된다.
본 출원에서, 용어 "에피토프"는 일반적으로 항원 결합 단백질(예컨대, 항체)에 의해 특이적으로 결합되는 항원의 특정 영역 또는 부위를 의미한다. 에피토프는 일반적으로 아미노산이나 탄수화물 또는 당 측쇄 분자와 같은 화학적 활성 표면 그룹으로 이루어지며, 일반적으로 특정 3차원 구조적 특징 및 특정 전하 특징을 가지고 있다. 에피토프는 "선형 에피토프" 또는 "입체형태적 에피토프"일 수 있다. 선형 에피토프에서, 단백질 및 상호 작용 분자(예컨대, 항체) 사이의 모든 상호작용 위치는 단백질의 1차 아미노산 서열을 따라 선형으로 발생한다. 입체형태적 에피토프에서, 상호 작용 위치는 서로 분리된 단백질의 아미노산들에서 교차하여 발생한다. 어떤 유형의 에피토프가 제공된 항원 결합 단백질(예컨대, 항체)에 의해 결합되는지를 결정하는 방법(예컨대, 에피토프 매핑(Epitope Mapping)은 당업계에 익히 공지되어 있고, 예를 들면, 웨스턴 블롯팅 및 면역침전 분석을 포함하며, 예를 들면, 제공된 항원 결합 단백질(예컨대, 항-PD-L1 항체)과 중첩되거나 인접한 펩티드(예를 들면, PD-L1로부터)의 반응성을 테스트한다. 에피토프의 공간적 입체형태를 결정하는 방법은 당업계의 기술 및 본 출원에 기재된 기술, 예를 들면, X선 결정학, 2차원 NMR 및 HDX-MS를 포함한다(예를 들면, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed.(1996) 참조). 용어 "완전히 중첩되지 않는" 에피토프는 일반적으로 2개 이상의 항원 결합 단백질(예컨대, 항체)을 언급할 때, 소정의 방법에 의해 결정되는 바와 같이, 각각의 항체들이 완전히 동일하지 않거나 완전히 중첩되지 않는 아미노산 잔기의 집단에 결합하는 것을 의미한다. 본 출원의 항원 결합 단백질이 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위한 기술은 예를 들면, 에피토프의 원자 분해능(atomic resolution)을 제공하는 에피토프 매핑 방법, 예컨대 항원: 항체 복합체 결정의 X-선 분석, 및 수소/중수소 교환 질량 분석법 (HDX-MS)을 포함한다. 다른 방법은 항원 단편 또는 항원의 돌연변이 변이체 형태에 대한 항체의 결합을 모니터링하는데, 이때, 항원 서열에서 아미노산 잔기의 변형으로 인한 결합의 손실은 흔히 에피토프 성분을 나타내는 것으로 간주된다(예를 들면, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발-Cunningham and Wells (1985) Science 244:1081). 또한, 에피토프 위치를 결정(positioning)하는 컴퓨터 조합 방법(computational combination method) 또한 사용될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "대상체(subject)"는 일반적으로 포유동물을 지칭한다. 포유동물은 길들여진 동물(예를 들면, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들면, 인간 및 비인간 영장류, 예컨대, 원숭이), 토끼 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 랫트)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서, 용어 "핵산 분자"는 일반적으로 자연 환경으로부터 분리되거나 인공적으로 합성된 임의의 길이의 뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 또는 이들의 유사체의 분리된 형태를 지칭한다.
본 출원에서, 용어 "벡터"는 일반적으로 적합한 숙주에서 자가-복제할 수 있는 핵산 분자를 지칭하며, 이는 삽입된 핵산 분자를 숙주 세포 내에 및/또는 숙주 세포 간에 전달한다. 벡터는 DNA 또는 RNA를 세포에 삽입하는데 주로 사용되는 벡터, DNA 또는 RNA를 복제하는 데 주로 사용되는 벡터, DNA 또는 RNA 전사 및/또는 번역에 주로 사용되는 발현 벡터를 포함할 수 있다. 벡터는 또한 상기의 다양한 기능을 갖는 벡터를 포함한다. 벡터는 적합한 숙주 세포에 도입될 때 폴리펩티드로 전사 및 번역할 수 있는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 일반적으로, 벡터는 벡터를 포함하는 적합한 숙주 세포를 배양하여 원하는 발현 생성물을 생성할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "세포"는 일반적으로 본 출원의 핵산 분자를 포함하는 플라스미드 또는 벡터를 함유하거나 이미 함유할 수 있는 개별 세포, 세포주 또는 세포 배양물, 또는 본 출원의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현할 수 있는 개별 세포, 세포주 또는 세포 배양물을 지칭한다. 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함할 수 있다. 자연적, 우발적 또는 의도적 돌연변이로 인해, 자손 세포는 본 출원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현할 수 있다면 형태 또는 게놈에 있어 원래의 모 세포와 반드시 동일할 필요는 없을 수 있다. 상기 세포는 본 출원에 기재된 벡터를 사용하여 시험관 내(in vitro) 형질감염에 의해 얻어질 수 있다. 상기 세포는 원핵생물 세포(예를 들면, 대장균(Escherichia coli)), 또는 진핵생물 세포(예를 들면, 효모 세포, 예를 들면, COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, HeLa 세포, HEK293 세포, COS-1 세포, NS0 세포 또는 골수종 세포)일 수 있다. 일부 경우에서, 상기 세포는 포유동물 세포일 수 있다. 예를 들면, 포유동물 세포는 CHO-K1 세포일 수 있다. 본 출원에서, 용어 "재조합 세포"는 일반적으로 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 의미한다. 재조합 숙주 세포는 특정 종류의 세포뿐만 아니라 이들 세포의 자손도 포함한다.
본 출원에서, 용어 "약제학적 조성물"은 일반적으로 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 하는 형태로 존재하고 상기 조성물이 투여되는 대상체에게 허용할 수 없을 정도로 독성이 있는 추가 성분을 포함하지 않는, 제형을 의미한다. 상기 조성물은 무균성(aseptic)이다. 상기 "무균성" 조성물은 멸균되거나, 모든 살아있는 미생물 또는 이의 포자가 없다.
본 출원에서, 용어 "치료"는 일반적으로 치료를 받는 개체에서 질병의 자연적 경과를 변경하려는 욕구를 의미하며, 예방을 달성하기 위한 또는 임상적 질병의 과정 동안의 임상적 개입일 수 있다. 바람직한 치료 효과에는 질병의 발생 또는 재발의 방지, 증상의 감소, 질병의 직간접적 병리학적 결과의 약화, 전이 예방, 질병 진행 속도 감소, 질병 상태(disease state)의 개선 또는 완화, 및 예후의 완화 또는 개선을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에서, 항체(예를 들면, 항-PD-L1 항체)가 사용되어 질병 진행을 지연시키거나 질병 진행을 늦출 수 있다.
본 출원에서, 용어 "투여"는 일반적으로 특정 용량의 화합물(예를 들면, 항종양 치료제) 또는 약제학적 조성물(예를 들면, 항종양 치료제를 포함하는 약제학적 조성물)을 대상체(예를 들면, 환자)에 제공하는 방법을 의미한다. 상기 투여는 비경구, 폐내 및 비강내 및 (국소 치료가 필요한 경우) 병변내 투여를 포함하는, 임의의 적합한 수단을 통해 수행될 수 있다. 비경구 주입은 예를 들면, 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 상기 투여는 부분적으로 투여가 일시적인지 또는 장기적인지에 따라 임의의 적합한 경로, 예를 들면, 주사(예컨대, 정맥내 또는 피하 주사)에 의해 수행될 수 있다. 다양한 투여 절차가 본 명세서에 포함되는데, 상기 투여 절차는 단일 투여 또는 다양한 시점에 걸친 다중 투여, 일시 투여(bolus administration) 및 펄스 주입을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서, 용어 "종양"은 (악성이든 양성이든) 일반적으로 모든 신생물 세포 성장 및 증식, 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다. 본 출원에서, 상기 종양은 결장암을 포함할 수 있다.
본 출원에서 용어 "사이에"는 일반적으로 특정 아미노산 단편이 C-말단에서 제1 아미노산 단편의 N-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, N-말단에서 제2 아미노산 단편의 C-말단에 직접 또는 간접적으로 연결된 것을 지칭한다. 예를 들면, 경쇄에서 L-FR2의 N-말단은 LCDR1의 C-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고 L-FR2의 C-말단은 LCDR2의 N-말단에 직접 또는 간접적으로 연결된다. 추가로 예를 들면, L-FR3의 N-말단은 LCDR2의 C-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, L-FR3의 C-말단은 LCDR3의 N-말단에 직접 또는 간접적으로 연결된다. 예를 들면, 중쇄에서 H-FR2의 N-말단은 HCDR1의 C-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, H-FR2의 C-말단은 HCDR2의 N-말단에 직접 또는 간접적으로 연결된다. 또한 예를 들면, H-FR3의 N-말단은 HCDR2의 C-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, H-FR3의 C-말단은 HCDR3의 N-말단에 직접 또는 간접적으로 연결된다. 본 출원에서, "제1 아미노산 단편" 및 "제2 아미노산 단편"은 동일하거나 상이할 수 있는 임의의 아미노산 단편일 수 있다.
본 출원에서, 용어 "포함하다"는 일반적으로 "포함하다", "포괄하다", "함유하다" 또는 "아우르다"의 의미를 나타낸다. 일부 경우에서, 이는 "~이다", "~로 이루어지다"의 의미를 나타내기도 한다.
본 출원에서, 용어 "약"은 일반적으로 특정 값 이상 또는 이하의 0.5% 내지 10%의 변동 범위를 지칭하는데, 예를 들면, 특정 값 이상 또는 이하의 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5%, 또는 10%의 변동 범위이다.
항원 결합 단백질
제1 측면에서, 본 출원은 항체 경쇄 가변 부위 VL의 적어도 하나의 CDR을 포함하는 항원 결합 단백질을 제공한다.
본 출원에서, 상기 항원 결합 단백질은 LCDR1을 포함할 수 있고, 상기 LCDR1은 서열 번호 181에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
RASQSIX7X8WLA (서열 번호 181); 여기서, X7=F, S 또는 Y; X8=I 또는 S. 예를 들면, 이 서열은 Chothia 정의 규칙에 따라 결정된 서열일 수 있다.
일부 경우에서, 서열 번호 48에 제시된 항원 결합 단백질의 LCDR1과 비교할 때, 상기 LCDR1은 하기 위치들로부터 선택된 아미노산 치환을 적어도 포함할 수 있다: X7 및/또는 X8에서 아미노산 치환.
일부 경우에서, 서열 번호 48에 제시된 항원 결합 단백질의 LCDR1과 비교할 때, 상기 LCDR1은 X7 및/또는 X8에서 아미노산 치환을 적어도 포함할 수 있는데, 여기서 X7의 아미노산은 Y 또는 F로 치환될 수 있고; X8의 아미노산은 S로 치환될 수 있다.
예를 들면, 상기 LCDR1은 서열 번호 48 내지 51 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 항원 결합 단백질은 LCDR2를 포함할 수 있고, 상기 LCDR2는 서열 번호 182에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
KASSLEX7 (서열 번호 182); 여기서, X7=T 또는 S. 예를 들면, 이 서열은 Chothia 정의 규칙에 따라 결정된 서열일 수 있다.
일부 경우에서, 서열 번호 63에 제시된 항원 결합 단백질의 LCDR2와 비교할 때, 상기 LCDR2는 하기 위치로부터 선택된 아미노산 치환을 적어도 포함할 수 있다: X7에서 아미노산 치환.
일부 경우에서, 서열 번호 63에 제시된 항원 결합 단백질의 LCDR2와 비교할 때, 상기 LCDR2는 X7에서 아미노산 치환을 적어도 포함할 수 있는데, 여기서 X7의 아미노산은 T로 치환될 수 있다.
예를 들면, 상기 LCDR2는 서열 번호 63 또는 64에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 항원 결합 단백질은 LCDR3을 포함할 수 있고, 상기 LCDR3은 서열 번호 183에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
QQYX4X5X6SRT (서열 번호 183); 여기서, X4=Y 또는 H, X5=G, T 또는 S, X6=Y 또는 S. 예를 들면, 이 서열은 Chothia 정의 규칙에 따라 결정된 서열일 수 있다.
일부 경우에서, 서열 번호 77에 제시된 항원 결합 단백질의 LCDR3과 비교할 때, 상기 LCDR3은 하기 위치들로부터 선택되는 아미노산 치환을 적어도 포함할 수 있다: X4, X5 및/또는 X6에서 아미노산 치환.
일부 경우에서, 서열 번호 77에 제시된 항원 결합 단백질의 LCDR3과 비교할 때, 상기 LCDR3은 X4, X5 및/또는 X6에서 아미노산 치환을 적어도 포함할 수 있는데, 여기서 X4의 아미노산은 H로 치환될 수 있고; X5의 아미노산은 S 또는 T로 치환될 수 있고; X6의 아미노산은 S로 치환될 수 있다.
예를 들면, 상기 LCDR3은 서열 번호 77 내지 80 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 다른 경우에서, 상기 LCDR3은 서열 번호 191에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
QQYYX5X6SRT (서열 번호 191); 여기서, X5=G 또는 S, X6=Y 또는 S. 예를 들면, 이 서열은 Chothia 정의 규칙에 따라 결정된 서열일 수 있다.
일부 특정 경우에서, 서열 번호 77의 항원 결합 단백질의 LCDR3과 비교할 때, 상기 LCDR3은 하기 위치들로부터 선택되는 아미노산 치환을 적어도 포함할 수 있다: X5 및/또는 X6에서 아미노산 치환.
일부 특정 경우에서, 서열 번호 77의 항원 결합 단백질의 LCDR3과 비교할 때, 상기 LCDR3은 X5 및/또는 X6에서 아미노산 치환을 적어도 포함할 수 있는데, 여기서 상기 X5의 아미노산은 S로 치환될 수 있고; X6의 아미노산은 S로 치환될 수 있다.
예를 들면, 상기 LCDR3은 서열 번호 77 내지 79 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 항원 결합 단백질은 프레임워크 부위 L-FR1을 포함할 수 있다. 상기 L-FR1의 C-말단은 상기 LCDR1의 N-말단에 연결되고, 상기 L-FR1은 서열 번호 185에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
DIQMTQSPSTLSX13SVGX17RVTX21TC (서열 번호 185); 여기서, X13=T 또는 A; X17=D 또는 H; X21=I 또는 V. 예를 들면, 이 서열은 Chothia 정의 규칙에 따라 결정된 서열일 수 있다.
일부 경우에서, 서열 번호 41에 제시된 항원 결합 단백질의 L-FR1과 비교할 때, 상기 L-FR1은 하기 위치들로부터 선택되는 아미노산 치환을 적어도 포함할 수 있다: X13, X17 및/또는 X21에서 아미노산 치환.
일부 경우에서, 서열 번호 41에 제시된 항원 결합 단백질의 L-FR1과 비교할 때, 상기 L-FR1은 X13, X17 및/또는 X21에서 아미노산 치환을 적어도 포함할 수 있는데, 여기서 X13의 아미노산은 A로 치환될 수 있고 A; X17의 아미노산은 H로 치환될 수 있고; X21의 아미노산은 V로 치환될 수 있다.
예를 들면, 상기 L-FR1은 서열 번호 41 내지 44 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 항원 결합 단백질은 L-FR2를 포함할 수 있다. 상기 L-FR2는 상기 LCDR1 및 상기 LCDR2 사이에 위치하고, 상기 L-FR2는 서열 번호 186에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
WYQQX5PGKAPX11LLIY (서열 번호 186); 여기서, X5=K 또는 H; X11=K, N 또는 D. 예를 들면, 이 서열은 Chothia 정의 규칙에 따라 결정된 서열일 수 있다.
일부 경우에서, 서열 번호 56에 제시된 항원 결합 단백질의 L-FR2와 비교할 때, 상기 L-FR2는 하기 위치들로부터 선택되는 아미노산 치환을 적어도 포함할 수 있다: X5 및/또는 X11에서 아미노산 치환.
일부 경우에서, 서열 번호 56에 제시된 항원 결합 단백질의 L-FR2와 비교할 때, 상기 L-FR2는 X5 및/또는 X11에서 아미노산 치환을 적어도 포함할 수 있는데, 여기서 X5의 아미노산은 H로 치환될 수 있고; X11의 아미노산은 D 또는 N으로 치환될 수 있다.
예를 들면, 상기 L-FR2는 서열 번호 56 내지 59 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 항원 결합 단백질은 L-FR3을 포함할 수 있다. 상기 L-FR3은 상기 LCDR2 및 상기 LCDR3 사이에 위치하고, 상기 L-FR3은 서열 번호 187에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
GVPSRFSGX9GSGTEFTLTISSLQPDDFX28TYX31C (서열 번호 187); 여기서, X9=S 또는 N; X28=A 또는 T; X31=Y 또는 F. 예를 들면, 이 서열은 Chothia 정의 규칙에 따라 결정된 서열일 수 있다.
일부 경우에서, 서열 번호 69에 제시된 항원 결합 단백질의 L-FR3과 비교할 때, 상기 L-FR3은 하기 위치들로부터 선택되는 아미노산 치환을 적어도 포함할 수 있다: X9, X28 및/또는 X31에서 아미노산 치환.
일부 경우에서, 서열 번호 69에 제시된 항원 결합 단백질의 L-FR3과 비교할 때, 상기 L-FR3은 X9, X28 및/또는 X31에서 아미노산 치환을 포함할 수 있는데, 여기서 X9의 아미노산은 N으로 치환될 수 있고; X28의 아미노산은 T로 치환될 수 있고; X31의 아미노산은 F로 치환될 수 있다.
예를 들면, 상기 L-FR3은 서열 번호 69 내지 72 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 항원 결합 단백질은 L-FR4를 포함할 수 있는데, 상기 L-FR4의 N-말단은 상기 LCDR3의 C-말단에 연결되고, 상기 L-FR4는 서열 번호 188에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
FGQGTKVEIX10 (서열 번호 188); 여기서, X10=K 또는 R. 예를 들면, 이 서열은 Chothia 정의 규칙에 따라 결정된 서열일 수 있다.
일부 경우에서, 서열 번호 85에 제시된 항원 결합 단백질의 L-FR4와 비교할 때, 상기 L-FR4는 하기 위치로부터 선택되는 아미노산 치환을 적어도 포함할 수 있다: X10에서 아미노산 치환.
일부 경우에서, 서열 번호 85에 제시된 항원 결합 단백질의 L-FR4와 비교할 때, 상기 L-FR4는 X10에서 아미노산 치환을 적어도 포함할 수 있는데, 여기서 X10의 아미노산은 R로 치환될 수 있다.
예를 들면, 상기 L-FR4는 서열 번호 85 또는 86에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 항원 결합 단백질은 경쇄 가변 부위 VL을 포함할 수 있고, 상기 VL은 서열 번호 190에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
DIQMTQSPSTLSX13SVGX17RVTX21TCRASQSIX30X31WLAWYQQX39PGKAPX45LLIYKASSLEX56GVPSRFSGX65GSGTEFTLTISSLQPDDFX84TYX87CQQYX92X93X94SRTFGQGTKVEIX107 (서열 번호 190); 여기서, X13=T 또는 A; X17=D 또는 H; X21=I 또는 V; X30=F, S 또는 Y; X31=I 또는 S; X39=K 또는 H; X45=K, N 또는 D; X56=S 또는 T; X65=S 또는 N; X84=A 또는 T; X87=Y 또는 F; X92=Y 또는 H; X93=G, T 또는 S; X94=Y 또는 S; X107=K 또는 R. 예를 들면, 이 서열은 Chothia 정의 규칙에 따라 결정된 서열일 수 있다.
일부 경우에서, 서열 번호 108에 제시된 VL과 비교할 때, 상기 VL은 하기 위치들로부터 선택되는 아미노산 치환을 적어도 포함할 수 있다: X13, X17, X21, X30, X31, X39, X45, X56, X65, X84, X87, X92, X93, X94, X107에서 아미노산 치환.
일부 경우에서, 서열 번호 108에 제시된 VL과 비교할 때, 상기 VL은 X13, X17, X21, X30, X31, X39, X45, X56, X65, X84, X87, X92, X93, X94, 및 X107에서 아미노산 치환을 적어도 포함할 수 있는데, 여기서, X13의 아미노산은 A로 치환될 수 있고, X17의 아미노산은 H로 치환될 수 있고, X21의 아미노산은V로 치환될 수 있고, X30의 아미노산은로 S 또는 Y로 치환될 수 있고, X31의 아미노산은 S로 치환될 수 있고, X39의아미노산은 H로 치환될 수 있고, X45아미노산은 N 또는 D로 치환될 수 있고, X56의 아미노산은 T로 치환될 수 있고, X65의 아미노산은 N으로 치환될 수 있고, X84의 아미노산은 T로 치환될 수 있고, X87의 아미노산은 F로 치환될 수 있고, X92의 아미노산은 H로 치환될 수 있고, X93의 아미노산은 T 또는 S로 치환될 수 있고, X94의 아미노산은 S로 치환될 수 있고, X107의 아미노산은 R로 치환될 수 있다.
예를 들면, 상기 VL 부위는 서열 번호 108 내지 116 및 118 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 경우에서, 본 출원의 VL은 서열 번호 194에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
DIQMTQSPSTLSX13SVGX17RVTX21TCRASQSIX30X31WLAWYQQX39PGKAPX45LLIYKASSLEX56GVPSRFSGX65GSGTEFTLTISSLQPDDFX84TYX87CQQYYX93X94SRTFGQGTKVEIX107 (서열 번호 194); 여기서, X13=T 또는 A; X17=D 또는 H; X21=I 또는 V; X30=F, S 또는 Y; X31=I 또는 S; X39=K 또는 H; X45=K, N 또는 D; X56=S 또는 T; X65=S 또는 N; X84=A 또는 T; X87=Y 또는 F; X93=G 또는 S; X94=Y 또는 S; X107=K 또는 R. 예를 들면, 이 서열은 Chothia 정의 규칙에 따라 결정된 서열일 수 있다.
일부 경우에서, 서열 번호 108에 제시된 VL과 비교할 때, 상기VL은 하기 위치들로부터 선택되는 아미노산 치환을 적어도 포함할 수 있다: X13, X17, X21, X30, X31, X39, X45, X56, X65, X84, X87, X93, X94, 및 X107에서 아미노산 치환.
일부 경우에서, 서열 번호 108에 제시된 VL과 비교할 때, 상기VL은 X13, X17, X21, X30, X31, X39, X45, X56, X65, X84, X87, X93, X94, 및 X107에서 아미노산 치환을 적어도 포함할 수 있는데, 여기서, X13의 아미노산은 A로 치환될 수 있고, X17의 아미노산은 H로 치환될 수 있고, X21의 아미노산은 V로 치환될 수 있고, X30 의 아미노산은 S 또는 Y로 치환될 수 있고, X31의아미노산은 S로 치환될 수 있고, X39아미노산은 H로 치환될 수 있고, X45의 아미노산은 N 또는 D로 치환될 수 있고, X56의 아미노산은 T로 치환될 수 있고, X65의 아미노산은 N으로 치환될 수 있고, X84의 아미노산은 T로 치환될 수 있고, X87의 아미노산은 F로 치환될 수 있고, X93의 아미노산은 S로 치환될 수 있고, X94의- 아미노산은 S로 치환될 수 있고, X107의 아미노산은 R로 치환될 수 있다.
예를 들면, 상기 VL 부위는 서열 번호 108 내지 114, 116 및 118 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원의 항원 결합 단백질은 경쇄 불변 부위 CL을 포함할 수 있고, 상기 항체 경쇄 불변 부위는 인간 Igκ 불변 부위를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 CL 부위는 하기에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다: 서열 번호 170.
본 출원의 항원 결합 단백질은 항체 경쇄 LC를 포함할 수 있고, 상기 항체 경쇄는 서열 번호 150 내지 158 및 160 내지 163 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로는, 본 출원의 항원 결합 단백질의 항체 경쇄는 서열 번호 150 내지 156, 158 및 160 내지 163 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원의 항원 결합 단백질은 항체 중쇄 가변 부위 VH의 적어도 하나의 CDR을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 항원 결합 단백질은 HCDR1을 포함할 수 있고, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
GFTFSSY (서열 번호 5). 예를 들면, 이 서열은 Chothia 정의 규칙에 따라 결정된 서열일 수 있다.
본 출원에서, 상기 항원 결합 단백질은 HCDR2를 포함할 수 있고, 상기 HCDR2는 서열 번호 179에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
KQX3X4SE (서열 번호 179); 여기서, X3=D 또는 E; X4=G 또는 A. 예를 들면, 이 서열은 Chothia 정의 규칙에 따라 결정된 서열일 수 있다.
일부 경우에서, 서열 번호 14에 제시된 항원 결합 단백질의 HCDR2와 비교할 때, 상기 HCDR2는 하기 위치들로부터 선택되는 아미노산 치환을 적어도 포함할 수 있다: X3 및/또는 X4에서 아미노산 치환.
일부 경우에서, 서열 번호 14에 제시된 항원 결합 단백질의 HCDR2와 비교할 때, 상기 HCDR2는 X3 및/또는 X4에서 아미노산 치환을 적어도 포함할 수 있는데, 여기서 X3의 아미노산은 E로 치환될 수 있고, X4의 아미노산은 A로 치환될 수 있다.
예를 들면, 상기 HCDR2는 서열 번호 14, 16 및 17 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 항원 결합 단백질은 HCDR3을 포함할 수 있고, 상기 HCDR3은 서열 번호 180에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
DRX3VAGAX8X9X10 (서열 번호 180); 여기서, X3=A 또는 P; X8=F 또는 S; X9=D 또는 A; X10=I 또는 F. 예를 들면, 이 서열은 Chothia 정의 규칙에 따라 결정된 서열일 수 있다.
일부 경우에서, 서열 번호 29에 제시된 항원 결합 단백질의 HCDR3과 비교할 때, 상기 HCDR3은 하기 위치들로부터 선택되는 아미노산 치환을 적어도 포함할 수 있다: X3, X8, X9 및/또는 X10에서 아미노산 치환.
일부 경우에서, 서열 번호 29에 제시된 항원 결합 단백질의 HCDR3과 비교할 때, 상기 HCDR3은 X3, X8, X9 및/또는 X10에서 아미노산 치환을 적어도 포함할 수 있는데, 여기서 X3 의 아미노산은 P로 치환될 수 있고; X8의 아미노산은 S로 치환될 수 있고; X9의 아미노산은 A로 치환될 수 있고; X10의 아미노산은 F로 치환될 수 있다.
예를 들면, 상기 HCDR3은 서열 번호 29 내지 33 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 항원 결합 단백질은 프레임워크 부위 H-FR1을 포함할 수 있다. 상기 H-FR1의 C-말단은 상기 HCDR1의 N-말단에 연결되고, 상기 H-FR1은 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (서열 번호 1). 예를 들면, 이 서열은 Chothia 정의 규칙에 따라 결정된 서열일 수 있다.
본 출원에서, 상기 항원 결합 단백질은 H-FR2를 포함할 수 있는데, 상기 H-FR2는 상기 HCDR1 및 상기 HCDR2 사이에 위치하고 상기 H-FR2는 서열 번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
WMSWVRQAPGKGLEWVANI (서열 번호 9). 예를 들면, 이 서열은 Chothia 정의 규칙에 따라 결정된 서열일 수 있다.
본 출원에서, 상기 항원 결합 단백질은 H-FR3을 포함할 수 있는데, 상기 H-FR3은 상기 HCDR2 및 상기 HCDR3 사이에 위치하고, 상기 H-FR3은 서열 번호 184에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
KYYX4DSVKGRFTISRDNAKNSX22YLQMNSLRAEX33TAVX37YCAR (서열 번호 184); 여기서, X4=V 또는 G; X22=L 또는 Q; X33=D 또는 E; X37=Y 또는 F. 예를 들면, 이 서열은 Chothia 정의 규칙에 따라 결정된 서열일 수 있다.
일부 경우에서, 서열 번호 21에 제시된 H-FR3과 비교할 때, 상기 H-FR3은 하기 위치들로부터 선택되는 아미노산 치환을 적어도 포함할 수 있다: X4, X22, X33 및/또는 X37에서 아미노산 치환.
일부 경우에서, 서열 번호 21에 제시된 H-FR3과 비교할 때, 상기 H-FR3은 X4, X22, X33 및/또는 X37에서 아미노산 치환을 적어도 포함할 수 있고, 여기서, X4의 아미노산은 G로 치환될 수 있고, X22의 아미노산은 Q로 치환될 수 있고, X33의 아미노산은 E로 치환될 수 있고, X37의 아미노산은 F로 치환될 수 있다.
예를 들면, 상기 H-FR3은 서열 번호 21 내지 24 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
대안적으로는, 본 출원의 H-FR3은 서열 번호 192에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
KYYX4DSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEX33TAVX37YCAR (서열 번호 192); 여기서, X4=V 또는 G; X33=D 또는 E; X37=Y 또는 F. 예를 들면, 이 서열은 Chothia 정의 규칙에 따라 결정된 서열일 수 있다.
일부 경우에서, 서열 번호 21에 제시된 H-FR3과 비교할 때, 상기 H-FR3은 하기 위치들로부터 선택되는 아미노산 치환을 적어도 포함할 수 있다: X4, X33 및/또는 X37에서 아미노산 치환.
일부 경우에서, 서열 번호 21에 제시된 H-FR3과 비교할 때, 상기 H-FR3은 X4, X33 및/또는 X37에서 아미노산 치환을 적어도 포함할 수 있는데, 여기서, X4의 아미노산은 G로 치환될 수 있고, X33의 아미노산은 E로 치환될 수 있고, X37의 아미노산은 F로 치환될 수 있다.
예를 들면, 상기 H-FR3은 서열 번호 12, 22 및 24 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 항원 결합 단백질은 H-FR4를 포함할 수 있는데, 상기 H-FR4의 N-말단은 상기 HCDR3의 C-말단에 연결되고, 상기 H-FR4는 서열 번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
WGQGTMVTVSS (서열 번호 38). 예를 들면, 이 서열은 Chothia 정의 규칙에 따라 결정된 서열일 수 있다.
본 출원에서, 상기 항원 결합 단백질 중쇄 가변 부위 VH를 포함할 수 있고, 상기 VH는 서열 번호 189에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQX54X55SEKYYX61DSVKGRFTISRDNAKNSX79YLQMNSLRAEX90TAVX94YCARDRX101VAGAX106X107X108WGQGTMVTVSS (서열 번호 189); 여기서, X54=D 또는 E; X55=G 또는 A; X61=V 또는 G; X79=L 또는 Q; X90=D 또는 E; X94=Y 또는 F; X101=A 또는 P; X106=F 또는 S; X107=D 또는 A; X108=I 또는 F. 예를 들면, 이 서열은 Chothia 정의 규칙에 따라 결정된 서열일 수 있다.
일부 경우에서, 서열 번호 90에 제시된 VH와 비교할 때, 상기 VH는 하기 위치들로부터 선택되는 아미노산 치환을 적어도 포함할 수 있다: X54, X55, X61, X79, X90, X94, X101, X106, X107 및/또는 X108에서 아미노산 치환.
일부 경우에서, 서열 번호 90에 제시된 VH와 비교할 때, 상기 VH는 X54, X55, X61, X79, X90, X94, X101, X106, X107 및/또는 X108에서 아미노산 치환을 적어도 포함할 수 있는데, 여기서, X5의 아미노산은 E로 치환될 수 있고, X55의 아미노산은 A로 치환될 수 있고, X61의 아미노산은 G로 치환될 수 있고, X79의 아미노산은 Q로 치환될 수 있고, X90의- 아미노산은 E로 치환될 수 있고, X94의 아미노산은 F로 치환될 수 있고, X101 의 아미노산은 P로 치환될 수 있고, X106의 아미노산은 S로 치환될 수 있고, X107의 아미노산은 A로 치환될 수 있고, X108의 아미노산은 F로 치환될 수 있다.
예를 들면, 상기 VH 부위는 서열 번호 90 내지 95 및 97 내지 104 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 경우에서, 본 출원의 VH는 서열 번호 193에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQX54X55SEKYYX61DSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEX90TAVX94YCARDRX101VAGAX106X107X108WGQGTMVTVSS (서열 번호 193); 여기서, X54=D 또는 E; X55=G 또는 A; X61=V 또는 G; X90=D 또는 E; X94=Y 또는 F; X101=A 또는 P; X106=F 또는 S; X107=D 또는 A; X108=I 또는 F. 예를 들면, 이 서열은 Chothia 정의 규칙에 따라 결정된 서열일 수 있다.
일부 경우에서, 서열 번호 90에 제시된 VH와 비교할 때, 상기 VH는 하기 위치들로부터 선택되는 아미노산 치환을 적어도 포함할 수 있다: X54, X55, X61, X90, X94, X101, X106, X107 및/또는 X108에서 아미노산 치환.
일부 경우에서 서열 번호 90에 제시된 VH와 비교할 때, 상기 VH는 X54, X55, X61, X90, X94, X101, X106, X107 및/또는 X108에서 아미노산 치환을 적어도 포함할 수 있는데, 여기서, X54의 아미노산은 E로 치환될 수 있고, X55의 아미노산은 A로 치환될 수 있고, X61의- 아미노산은 G로 치환될 수 있고, X90의 -아미노산은 E로 치환될 수 있고, X94의 아미노산은 F로 치환될 수 있고, X101의 아미노산은 P로 치환될 수 있고, X106의 아미노산은 S로 치환될 수 있고, X107의 아미노산은 A로 치환될 수 있고, X108의 -아미노산은 F로 치환될 수 있다.
예를 들면, 상기 VH 부위는 서열 번호 90 내지 93, 95 및 97 내지 104 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원의 항원 결합 단백질은 중쇄 불변 부위 CH를 포함할 수 있고, 상기 항체 중쇄 불변 부위는 인간 IgG 불변 부위를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 인간 IgG 불변 부위는 인간 IgG1 불변 부위를 포함할 수 있다. 상기 인간 IgG1 불변 부위는 자연적 또는 인공적으로 합성된 IgG1 불변 부위 또는 이의 돌연변이체들을 포함할 수 있다. 상기 돌연변이는 하기 하나 이상의 위치에서의 돌연변이를 포함할 수 있다: L234, L235, N297 또는 K447. 예를 들면, 이는 하나, 둘 또는 그 이상의 위치들에서의 돌연변이를 포함할 수 있다. 상기 돌연변이는 아미노산의 삭제, 삽입 또는 치환을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 인간 IgG1 불변 부위는 하기 돌연변이들을 포함할 수 있다: 1) N297A, 2) K447 삭제, 3) N297A 및 K447 삭제, 4) L234A, L235A 및 K447 삭제. 예를 들면, 상기 융합 단백질의 인간 IgG1 불변 부위는 서열 번호 172 내지 175 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 분리된 항원 결합 단백질은 LCDR1 내지 3을 포함할 수 있다. 여기서, 상기 LCDR1은 서열 번호 181에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 LCDR2는 서열 번호 182에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 LCDR3은 서열 번호 183에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로는, 본 출원의 항원 결합 단백질의 LCDR1은 서열 번호 181에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 LCDR2 서열 번호 182에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 LCDR3은 서열 번호 191에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 경우에서, 본 출원의 항원 결합 단백질의 LCDR1은 서열 번호 48 내지 51 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 LCDR2는 서열 번호 63 또는 64에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 LCDR3은 서열 번호 77 내지 80 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 다른 경우에서, 본 출원의 항원 결합 단백질의 LCDR1은 서열 번호 48 내지 51 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 LCDR2는 서열 번호 63 또는 64에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 LCDR3은 서열 번호 77 내지 79 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000064와 동일한 LCDR1 내지 LCDR3을 포함할 수 있다. 여기서 상기 LCDR1은 서열 번호 48에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR2는 서열 번호 63에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR3은 서열 번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000065과 동일한 LCDR1 내지 LCDR3을 포함할 수 있는데, 상기 LCDR1은 서열 번호 49에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR3은 서열 번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000066, PR000261, PR000262과 동일한 LCDR1 내지 LCDR3을 포함할 수 있다. 여기서 상기 LCDR1은 서열 번호 48에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR3 서열 번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000067과 동일한 LCDR1 내지 LCDR3을 포함할 수 있는데, 상기 LCDR1은 서열 번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR2는 서열 번호 63에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기LCDR3은 서열 번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000068과 동일한 LCDR1 내지 LCDR3을 포함할 수 있다. 여기서 상기 LCDR1은 서열 번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR2는 서열 번호 63에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR3은 서열 번호 79에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000069, PR000263, PR000264와 동일한 LCDR1 내지 LCDR3을 포함할 수 있는데, 상기 LCDR1은 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR2는 서열 번호 63에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR3은 서열 번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000070, PR000265, PR000266과 동일한 LCDR1 내지 LCDR3을 포함할 수 있다. 여기서 상기 LCDR1은 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR3은 서열 번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000071과 동일한 LCDR1 내지 LCDR3을 포함할 수 있는데, 상기 LCDR1은 서열 번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR2는 서열 번호 63에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR3은 서열 번호 80에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000072, PR000267, PR000268과 동일한 LCDR1 내지 LCDR3을 포함할 수 있다. 여기서 상기 LCDR1은 서열 번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR3은 서열 번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 분리된 항원 결합 단백질은 L-FR1 내지 L-FR4를 포함할 수 있다. 여기서, 상기 L-FR1은 서열 번호 185에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 L-FR2는 서열 번호 186에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 L-FR3은 서열 번호 187에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 L-FR4는 서열 번호 188에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 경우에서, 본 출원의 항원 결합 단백질의 L-FR1은 서열 번호 41 내지 44 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 L-FR2는 서열 번호 56 내지 59 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 L-FR3은 서열 번호 69 내지 72 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 L-FR4는 서열 번호 85 또는 86에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000064과 동일한 L-FR1 내지 L-FR4를 포함할 수 있다. 여기서 상기 L-FR1은 서열 번호 41에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 L-FR2는 서열 번호 56에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 L-FR3은 서열 번호 69에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 L-FR4는 서열 번호 85에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000065과 동일한 L-FR1 내지 L-FR4를 포함할 수 있다. 여기서 상기 L-FR1은 서열 번호 42에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 L-FR2는 서열 번호 57에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 L-FR3은 서열 번호 69에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 L-FR4는 서열 번호 85에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000066과 동일한 L-FR1 내지 L-FR4를 포함할 수 있다. 여기서 상기 L-FR1은 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 L-FR2는 서열 번호 58에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 L-FR3은 서열 번호 70에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 L-FR4는 서열 번호 85에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000067과 동일한 L-FR1 내지 L-FR4를 포함할 수 있다. 여기서 상기 L-FR1은 서열 번호 42에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 L-FR2는 서열 번호 56에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 L-FR3은 서열 번호 69에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 L-FR4는 서열 번호 85에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000068과 동일한 L-FR1 내지 L-FR4를 포함할 수 있다. 여기서 상기 L-FR1은 서열 번호 42에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 L-FR2는 서열 번호 56에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 L-FR3은 서열 번호 71에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 L-FR4는 서열 번호 85에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000071과 동일한 L-FR1 내지 L-FR4를 포함할 수 있다. 여기서 상기 L-FR1은 서열 번호 42에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 L-FR2는 서열 번호 56에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 L-FR3은 서열 번호 69에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 L-FR4는 서열 번호 85에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000069, PR000263, PR000264과 동일한 L-FR1 내지 L-FR4를 포함할 수 있다. 여기서 상기 L-FR1은 서열 번호 42에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 L-FR2는 서열 번호 59에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 L-FR3은 서열 번호 72에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 L-FR4는 서열 번호 86에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000070, PR000265, PR000266과 동일한 L-FR1 내지 L-FR4를 포함할 수 있다. 여기서 상기 L-FR1은 서열 번호 44에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 L-FR2는 서열 번호 57에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 L-FR3은 서열 번호 69에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 L-FR4는 서열 번호 85에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000072, PR000267, PR000268과 동일한 L-FR1 내지 L-FR4를 포함할 수 있다. 여기서 상기 L-FR1은 서열 번호 42에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 L-FR2는 서열 번호 57에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 L-FR3은 서열 번호 69에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 L-FR4는 서열 번호 85에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000261, PR000262과 동일한 L-FR1 내지 L-FR4를 포함할 수 있다. 여기서 상기 L-FR1은 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 L-FR2는 서열 번호 58에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 L-FR3은 서열 번호 69에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 L-FR4는 서열 번호 85에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 분리된 항원 결합 단백질은 HCDR1 내지 HCDR3을 포함할 수 있다. 여기서, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR2는 서열 번호 179에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR3은 서열 번호 180에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 경우에서, 본 출원의 항원 결합 단백질의 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR2는 서열 번호 14, 16 및 17 중 어느 하나에 제시된 아미노산을 포함할 수 있고; 상기HCDR3은 서열 번호 29 내지 33 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000064, PR000065, PR000067, PR000070과 동일한 HCDR1 내지 HCDR3을 포함할 수 있다. 여기서 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR2는 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR3은 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000066과 동일한 HCDR1 내지 HCDR3을 포함할 수 있다. 여기서 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR2는 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR3은 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000068과 동일한 HCDR1 내지 HCDR3을 포함할 수 있다. 여기서 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR2는 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR3은 서열 번호 31에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000069과 동일한 HCDR1 내지 HCDR3을 포함할 수 있다. 여기서 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR2는 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR3은 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000071, PR000072과 동일한 HCDR1 내지 HCDR3을 포함할 수 있다. 여기서 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR2는 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR3은 서열 번호 33에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000261과 동일한 HCDR1 내지 HCDR3을 포함할 수 있다. 여기서 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR2는 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR3은 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000262과 동일한 HCDR1 내지 HCDR3을 포함할 수 있다. 여기서 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR2는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR3은 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000263과 동일한 HCDR1 내지 HCDR3을 포함할 수 있다. 여기서 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR2는 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR3은 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000264과 동일한 HCDR1 내지 HCDR3을 포함할 수 있다. 여기서 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR2는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR3은 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000265과 동일한 HCDR1 내지 HCDR3을 포함할 수 있다. 여기서 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR2는 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR3은 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000266과 동일한 HCDR1 내지 HCDR3을 포함할 수 있다. 여기서 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR2는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR3은 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000267과 동일한 HCDR1 내지 HCDR3을 포함할 수 있다. 여기서 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR2는 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR3은 서열 번호 33에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000268과 동일한 HCDR1 내지 HCDR3을 포함할 수 있다. 여기서 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR2는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR3은 서열 번호 33에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 분리된 항원 결합 단백질은 H-FR1 내지 H-FR4를 포함할 수 있다. 여기서, 상기 H-FR1은 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 H-FR2는 서열 번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 H-FR3은 서열 번호 184에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 H-FR4는 서열 번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로는, 상기 H-FR1은 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 H-FR2는 서열 번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 H-FR3은 서열 번호 192에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 H-FR4는 서열 번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 경우에서, 본 출원의 항원 결합 단백질의 H-FR1은 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 H-FR2는 서열 번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 H-FR3은 서열 번호 21 내지 24 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 H-FR4는 서열 번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 다른 경우에서, 본 출원의 항원 결합 단백질의 H-FR1은 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 H-FR2는 서열 번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 H-FR3은 서열 번호 21, 22 및 24 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 H-FR4는 서열 번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 H-FR1 내지 H-FR4를 포함할 수 있는데, 여기서 상기 H-FR1은 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 H-FR2는 서열 번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 H-FR3은 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 H-FR4는 서열 번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 H-FR1 내지 H-FR4를 포함할 수 있는데, 여기서 상기 H-FR1은 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 H-FR2는 서열 번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 H-FR3은 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 H-FR4는 서열 번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 H-FR1 내지 H-FR4를 포함할 수 있는데, 여기서 상기 H-FR1은 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 H-FR2는 서열 번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 H-FR3은 서열 번호 23에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 H-FR4는 서열 번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 H-FR1 내지 H-FR4를 포함할 수 있는데, 여기서 상기 H-FR1은 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 H-FR2는 서열 번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 H-FR3은 서열 번호 24에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 H-FR4는 서열 번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 분리된 항원 결합 단백질은 LCDR1 내지 LCDR3 및 HCDR1 내지 HCDR3을 포함할 수 있다. 여기서, 상기 LCDR1은 서열 번호 181에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 LCDR2는 서열 번호 182에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 및 상기 LCDR3은 서열 번호 183에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR2는 서열 번호 179에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 및 상기 HCDR3은 서열 번호 180에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로는, 상기 LCDR1은 서열 번호 181에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 LCDR2는 서열 번호 182에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 및 상기 LCDR3은 서열 번호 191에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR2는 서열 번호 179에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 및 상기 HCDR3은 서열 번호 180에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 경우에서, 본 출원의 항원 결합 단백질의 LCDR1은 서열 번호 48 내지 51 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 LCDR2는 서열 번호 63 또는 64에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 및 상기 LCDR3은 서열 번호 77 내지 80 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR2는 서열 번호 14, 16 및 17 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 및 상기 HCDR3은 서열 번호 29 내지 33 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 다른 경우에서, 본 출원의 항원 결합 단백질의 LCDR1은 서열 번호 48 내지 51 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 LCDR2는 서열 번호 63 또는 64에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 및 상기 LCDR3은 서열 번호 77 내지 79 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR2는 서열 번호 14, 16 및 17 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 및 상기 HCDR3은 서열 번호 29 내지 33 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000064와 동일한 LCDR1 내지 LCDR3 및 HCDR1 내지 HCDR3을 포함할 수 있다. 여기서 상기 LCDR1은 서열 번호 48에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR2는 서열 번호 63에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및 상기 LCDR3은 서열 번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR2는 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및 상기 HCDR3은 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000065와 동일한 LCDR1 내지 LCDR3 및 HCDR1 내지 HCDR3을 포함할 수 있다. 여기서 상기 LCDR1은 서열 번호 49에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및 상기 LCDR3은 서열 번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR2는 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및 상기 HCDR3은 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000066과 동일한 LCDR1 내지 LCDR3 및 HCDR1 내지 HCDR3을 포함할 수 있다. 여기서 상기 LCDR1은 서열 번호 48에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및 상기 LCDR3은 서열 번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR2는 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및 상기 HCDR3은 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000067과 동일한 LCDR1 내지 LCDR3 및 HCDR1 내지 HCDR3을 포함할 수 있다. 여기서 상기 LCDR1은 서열 번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR2는 서열 번호 63에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및 상기 LCDR3은 서열 번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR2는 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및 상기 HCDR3은 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000068과 동일한 LCDR1 내지 LCDR3 및 HCDR1 내지 HCDR3을 포함할 수 있다. 여기서 상기 LCDR1은 서열 번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR2는 서열 번호 63에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및 상기 LCDR3은 서열 번호 79에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR2는 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및 상기 HCDR3은 서열 번호 31에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000069와 동일한 LCDR1 내지 LCDR3 및 HCDR1 내지 HCDR3을 포함할 수 있다. 여기서 상기 LCDR1은 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR2는 서열 번호 63에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및 상기 LCDR3은 서열 번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR2는 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및 상기 HCDR3은 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000070과 동일한 LCDR1 내지 LCDR3 및 HCDR1 내지 HCDR3을 포함할 수 있다. 여기서 상기 LCDR1은 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및 상기 LCDR3은 서열 번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR2는 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및 상기 HCDR3은 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000071과 동일한 LCDR1 내지 LCDR3 및 HCDR1 내지 HCDR3을 포함할 수 있다. 여기서 상기 LCDR1은 서열 번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR2는 서열 번호 63에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및 상기 LCDR3은 서열 번호 80에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR2는 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및 상기 HCDR3은 서열 번호 33에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000072와 동일한 LCDR1 내지 LCDR3 및 HCDR1 내지 HCDR3을 포함할 수 있다. 여기서 상기 LCDR1은 서열 번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및 상기 LCDR3은 서열 번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR2는 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및 상기 HCDR3은 서열 번호 33에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000261과 동일한 LCDR1 내지 LCDR3 및 HCDR1 내지 HCDR3을 포함할 수 있다. 여기서 상기 LCDR1은 서열 번호 48에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및 상기 LCDR3은 서열 번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR2는 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및 상기 HCDR3은 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000262와 동일한 LCDR1 내지 LCDR3 및 HCDR1 내지 HCDR3을 포함할 수 있다. 여기서 상기 LCDR1은 서열 번호 48에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및 상기 LCDR3은 서열 번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR2는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및 상기 HCDR3은 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000263과 동일한 LCDR1 내지 LCDR3 및 HCDR1 내지 HCDR3을 포함할 수 있다. 여기서 상기 LCDR1은 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR2는 서열 번호 63에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및 상기 LCDR3은 서열 번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR2는 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및 상기 HCDR3은 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000264와 동일한 LCDR1 내지 LCDR3 및 HCDR1 내지 HCDR3을 포함할 수 있다. 여기서 상기 LCDR1은 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR2는 서열 번호 63에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및 상기 LCDR3은 서열 번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR2는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및 상기 HCDR3은 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000265 및 PR000416과 동일한 LCDR1 내지 LCDR3 및 HCDR1 내지 HCDR3을 포함할 수 있다. 여기서 상기 LCDR1은 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및 상기 LCDR3은 서열 번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR2는 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및 상기 HCDR3은 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000266과 동일한 LCDR1 내지 LCDR3 및 HCDR1 내지 HCDR3을 포함할 수 있다. 여기서 상기 LCDR1은 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및 상기 LCDR3은 서열 번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR2는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및 상기 HCDR3은 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000267과 동일한 LCDR1 내지 LCDR3 및 HCDR1 내지 HCDR3을 포함할 수 있다. 여기서 상기 LCDR1은 서열 번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및 상기 LCDR3은 서열 번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR2는 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및 상기 HCDR3은 서열 번호 33에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000268과 동일한 LCDR1 내지 LCDR3 및 HCDR1 내지 HCDR3을 포함할 수 있다. 여기서 상기 LCDR1은 서열 번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및 상기 LCDR3은 서열 번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR2는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및 상기 HCDR3은 서열 번호 33에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 항원 결합 단백질은 경쇄 가변 부위 VL 및 중쇄 가변 부위 VH를 포함할 수 있다. 상기 VL은 서열 번호 194에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 VH는 서열 번호 193에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로는, 상기 VL은 서열 번호 190에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 VH는 서열 번호 189에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 경우에서, 상기 항원 결합 단백질의 VL은 서열 번호 108 내지 116 및 118 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 VH는 서열 번호 90 내지 95, 및 97 내지 104 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 다른 경우에서, 상기 항원 결합 단백질의 VL은 서열 번호 108 내지 114, 116 및 118 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 VH는 서열 번호 90 내지 93, 95, 및 97 내지 104 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000064와 동일한 VL 및 VH를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 VL은 서열 번호 108에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 VH는 서열 번호 90에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000065와 동일한 VL 및 VH를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 VL은 서열 번호 109에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 VH는 서열 번호 90에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000066과 동일한 VL 및 VH를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 VL은 서열 번호 110에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 VH는 서열 번호 91에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000067과 동일한 VL 및 VH를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 VL은 서열 번호 111에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 VH는 서열 번호 90에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000068과 동일한 VL 및 VH를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 VL은 서열 번호 112에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 VH는 서열 번호 92에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000069와 동일한 VL 및 VH를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 VL은 서열 번호 113에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 VH는 서열 번호 92에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000070과 동일한 VL 및 VH를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 VL은 서열 번호 114에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 VH는 서열 번호 90에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000071과 동일한 VL 및 VH를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 VL은 서열 번호 115에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 VH는 서열 번호 94에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000072과 동일한 VL 및 VH를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 VL은 서열 번호 116에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 VH는 서열 번호 95에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000261과 동일한 VL 및 VH를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 VL은 서열 번호 118에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 VH는 서열 번호 97에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000262과 동일한 VL 및 VH를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 VL은 서열 번호 118에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 VH는 서열 번호 98에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000263과 동일한 VL 및 VH를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 VL은 서열 번호 113에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 VH는 서열 번호 99에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000264와 동일한 VL 및 VH를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 VL은 서열 번호 113에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 VH는 서열 번호 100에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000265와 동일한 VL 및 VH를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 VL은 서열 번호 114에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 VH는 서열 번호 101에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000266과 동일한 VL 및 VH를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 VL은 서열 번호 114에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 VH는 서열 번호 102에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000267과 동일한 VL 및 VH를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 VL은 서열 번호 116에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 VH는 서열 번호 103에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000268과 동일한 VL 및 VH를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 VL은 서열 번호 116에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 VH는 서열 번호 104에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 경우에서, 상기 항원 결합 단백질은 경쇄 불변 부위 및 중쇄 불변 부위를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 경쇄 불변 부위는 서열 번호 170에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 중쇄 불변 부위는 서열 번호 172 내지 175 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 경우에서, 상기 항원 결합 단백질은 항체 경쇄 LC 및 항체 중쇄 HC를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 항체 경쇄 LC는 서열 번호 150 내지 158 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 항체 중쇄 HC는 서열 번호 122 내지 127 및 129 내지 137 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 경우에서, 상기 항원 결합 단백질은 항체 경쇄 LC 및 항체 중쇄 HC를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 항체 경쇄 LC는 서열 번호 150 내지 156, 158 및 160 내지 163 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 항체 중쇄 HC는 서열 번호 122 내지 125, 127 및 129 내지 137 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000064와 동일한 LC 및 HC를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 LC는 서열 번호 150에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HC는 서열 번호 122에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000065와 동일한 LC 및 HC를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 LC는 서열 번호 151에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HC는 서열 번호 122에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000066과 동일한 LC 및 HC를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 LC는 서열 번호 152에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HC는 서열 번호 123에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000067과 동일한 LC 및 HC를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 LC는 서열 번호 153에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HC는 서열 번호 122에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000068과 동일한 LC 및 HC를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 LC는 서열 번호 154에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HC는 서열 번호 124에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000069와 동일한 LC 및 HC를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 LC는 서열 번호 155에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HC는 서열 번호 125에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000070과 동일한 LC 및 HC를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 LC는 서열 번호 156에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HC는 서열 번호 122에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000071과 동일한 LC 및 HC를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 LC는 서열 번호 157에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HC는 서열 번호 126에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000072과 동일한 LC 및 HC를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 LC는 서열 번호 158에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HC는 서열 번호 127에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000261과 동일한 LC 및 HC를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 LC는 서열 번호 160에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HC는 서열 번호 129에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000262와 동일한 LC 및 HC를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 LC는 서열 번호 160에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HC는 서열 번호 130에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000263과 동일한 LC 및 HC를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 LC는 서열 번호 161에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HC는 서열 번호 131에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000264와 동일한 LC 및 HC를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 LC는 서열 번호 161에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HC는 서열 번호 132에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000265와 동일한 LC 및 HC를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 LC는 서열 번호 162에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HC는 서열 번호 133에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000266과 동일한 LC 및 HC를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 LC는 서열 번호 162에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HC는 서열 번호 134에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000267과 동일한 LC 및 HC를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 LC는 서열 번호 163에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HC는 서열 번호 135에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000268과 동일한 LC 및 HC를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 LC는 서열 번호 163에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HC는 서열 번호 136에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PR000416과 동일한 LC 및 HC를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 LC는 서열 번호 162에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HC는 서열 번호 137에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
특정 항-PD-L1 항체
본 출원의 분리된 항원 결합 단백질은 특정 항-PD-L1 항체와 경쟁적으로 PD-L1에 결합할 수 있다. 본 출원에서, 상기 특정 항-PD-L1 항체는 LCDR1 내지 LCDR3을 포함할 수 있다. 여기서, 상기 LCDR1은 서열 번호 181에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 LCDR2는 서열 번호 182에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 LCDR3은 서열 번호 191에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 본 출원의 항-PD-L1 항체의 LCDR1은 서열 번호 48 내지 51 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 LCDR2는 서열 번호 63 또는 64에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR3은 서열 번호 77 내지 79 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 본 출원에서, 상기 특정 항-PD-L1 항체는 HCDR1 내지 HCDR3을 포함할 수 있다. 여기서, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR2는 서열 번호 179에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR3은 서열 번호 180에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 본 출원의 항-PD-L1 항체의 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR2는 서열 번호 14, 16 및 17 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR3은 서열 번호 29 내지 33 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 특정 항-PD-L1 항체는 LCDR1 내지 LCDR3 및 HCDR1 내지 HCDR3을 포함할 수 있다. 여기서, 상기 LCDR1은 서열 번호 181에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 LCDR2는 서열 번호 182에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 및 상기 LCDR3은 서열 번호 191에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR2는 서열 번호 179에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 및 상기 HCDR3은 서열 번호 180에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 특정 항-PD-L1 항체의 LCDR1은 서열 번호 48 내지 51 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 LCDR2는 서열 번호 63 또는 64에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 및 상기 LCDR3은 서열 번호 77 내지 79 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 특정 항-PD-L1 항체의 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR2는 서열 번호 14, 16 및 17 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 및 상기 HCDR3은 서열 번호 29 내지 33 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 특정 항-PD-L1 항체는 경쇄 가변 부위 VL 및 중쇄 가변 부위 VH를 포함할 수 있다. 상기 VL은 서열 번호 194에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 VH는 서열 번호 193에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 특정 항-PD-L1 항체의 VL은 서열 번호 108 내지 114, 116 및 118 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 VH는 서열 번호 90 내지 93, 95, 및 97 내지 104 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
결정 방법(Determination method)
본 출원의 PD-L1 항원 결합 단백질 또는 융합 단백질의 물리적/화학적 성질 및/또는 생물학적 활성은 당업계에 공지된 다양한 분석에 의해 결정, 스크리닝 또는 특성화될 수 있다.
제1 측면에서, 예를 들면, 본 출원의 PD-L1 항원 결합 단백질 또는 융합 단백질의 항원 결합 활성은 공지된 방법, 예컨대, 효소 결합 면역 흡착법 (Enzyme-Linked Immunosorbent assay; ELISA), 면역블롯팅(예를 들면, 웨스턴 블롯팅), 유세포 분석(예를 들면, FACS), 면역조직화학(Immunohistochemistry), 및 면역형광(Immunofluorescence) 등으로 테스트될 수 있다.
본 출원에서, 상기 분리된 항원 결합 단백질은 1 Х 10-8 M 이하의 KD값으로 영장류 유래 PD-L1에 결합할 수 있다. PD-L1에의 영장류 PD-L1 항원 결합 단백질의 결합 친화도는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 일부 경우에서, 상기 결합 친화도는 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance; SPR), 효소 결합 면역 흡착법(ELISA), 결합 항원 침전(Binding Antigen Precipitation), 평형 투석(Equilibrium Dialysis), 생물층 간섭계(BLI)에 의해 결정될 수 있다. 일부 경우에서, PD-L1에의 PD-L1 항원 결합 단백질의 결합 친화도 및 KD 값은 생물층 간섭계(BLI)에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, ForteBio 옥텟 분자 상호작용 분석측정기를 사용하여 항원 및 항체 사이의 결합 역학 분석을 수행하는데 사용할 수 있다.
본 출원에서, 상기 분리된 항원 결합 단백질은 1 Х 10-8 M 이하의 KD값으로 영장류 유래 PD-L1에 결합할 수 있다. 예를 들면, 인간 유래 PD-L1은, 예컨대 ForteBio 옥텟 분자 상호작용 분석측정기로 검출시, 약 1 Х 10-8 M 이하, 약 9 Х 10-9 M 이하, 약 8 Х 10-9 M 이하, 약 7 Х 10-9 M, 약 6 Х 10-9 M 이하, 약 5 Х 10-9 M 이하, 약 4 Х 10-9 M 이하, 약 3 Х 10-9 M 이하, 약 2 Х 10-9 M 이하, 약 1 Х 10-9 M 이하의 KD값으로 결합될 수 있다.
또 다른 경우에서, PD-L1에 대한 본 출원의 PD-L1 항원 결합 단백질의 결합 활성은 유세포 분석 또는 효소 결합 면역 흡착 분석에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, FACS 분석에서, 인간 PD-L1을 안정적으로 발현하는 숙주 세포(예컨대, CHOK1 세포)가 사용되고, 상기 PD-L1 항원 결합 단백질 및 상기 PD-L1의 EC50 값은 약 0.0001 nM 내지 약 100 nM, 예를 들면, 약 0.001 nM 내지 약 10 nM, 약 0.01 nM 내지 약 10 nM, 약 0.05 nM 내지 약 5 nM, 약 0.05 nM 내지 약 1 nM이다. 다른 예를 들면, ELISA에서, 인간 PD-L1 항원 단백질이 사용되고, 상기 PD-L1 항원 결합 단백질 및 상기 PD-L1의 EC50은 약 0.0001 nM 내지 약 100 nM, 예를 들면, 약 0.001 nM 내지 약 10 nM, 약 0.001 nM 내지 약 5 nM, 약 0.001 nM 내지 약 1 nM, 약 0.01 nM 내지 약 0.5 nM, 약 0.01 nM 내지 약 0.1 nM이다.
또 다른 측면에서, 경쟁 분석(competition assay)을 사용하여 PD-L1에의 결합에 대한 본 출원의 항원 결합 단백질들 중 어느 하나와 경쟁하는 항체들을 식별할 수 있다. 일부 경우에서, 이러한 경쟁적 항체는 본 출원의 항원 결합 단백질들 중 어느 하나에 의해 결합되는 중첩 에피토프(예를 들면, 선형 또는 입체형태적 에피토프)에 결합한다. 항원 결합 단백질이 결합하는 에피토프를 매핑하는 예시적인 방법은 X-선 공결정 및 저온 전자 현미경 검사(Cryo-electron Microscopy; cryo-EM), 어레이-기반 올리고펩티드 스캐닝(Array-based Oligopeptide Scanning), 위치-지정 돌연변이 유발 매핑, 가교 결합 질량 분석법(Cross-linking Coupled Mass Spectrometry), 생물층 간섭계를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 측면에서, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PD-L1에의 PD-1의 결합을 차단할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 항원 결합 단백질에 의한 PD-L1에의 PD-1의 결합 차단은 유세포 분석 FACS, 효소 결합 면역 흡착 분석 ELISA에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 먼저 PD-L1을 안정적으로 발현하는 숙주 세포(예컨대, CHOK1 세포)를 표지되지 않은 항원 결합 단백질의 양을 점점 감소시키면서 함께 인큐베이팅한 다음, 비오틴화된 PD-1 단백질과 인큐베이팅한다. 이어서, FACS가 사용하여 항원 결합 단백질에 의해 PD-L1에의 PD-1의 결합을 차단하는지 확인하기 위해 세포를 분석한다. 다른 예를 들면, 먼저 PD-L1 항원 단백질을 플레이트 상에 코팅하고, 표지되지 않은 항원 결합 단백질의 양을 점점 감소시키면서 표지되지 않은 항원 결합 단백질 및 비오틴화된 PD-1 단백질을 함께 혼합 및 인큐베이팅한다. 이어서, ELISA를 사용하여 항원 결합 단백질에 의해 PD-L1에의 PD-1의 결합을 차단하는지 확인하기 위해 세포를 분석한다.
또 다른 측면에서, 본 출원의 항원 결합 단백질은 PD-L1에의 CD80을 차단할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 항원 결합 단백질에 의한 PD-L1에의 CD80의 결합을 차단하는 것은 유세포 분석 FACS, 효소 결합 면역 흡착 분석 ELISA에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 먼저 PD-L1을 안정적으로 발현하는 숙주 세포(예컨대, CHOK1 세포)를 표지되지 않은 항원 결합 단백질의 양을 점점 감소시키면서 함께 인큐베이팅한 다음, 비오틴화된 CD80 단백질과 인큐베이팅한다. 이어서, FACS가 사용하여 항원 결합 단백질에 의해 PD-L1에의 CD80의 결합을 차단하는지 확인하기 위해 세포를 분석한다. 다른 예를 들면, 먼저 PD-L1 항원 단백질을 플레이트 상에 코팅하고, 표지되지 않은 항원 결합 단백질의 양을 점점 감소시키면서 표지되지 않은 항원 결합 단백질 및 비오틴화된 CD80 단백질을 함께 혼합 및 인큐베이팅한다. 이어서, ELISA를 사용하여 항원 결합 단백질에 의해 PD-L1에의 CD80의 결합을 차단하는지 확인하기 위해 세포를 분석한다.
본 출원의 항원 결합 단백질은 면역 세포에서 IFN-γ 및/또는 IL2의 분비를 자극할 수 있다. 상기 면역 세포는 림프구, 예를 들면, B 세포, T 세포, 자연 살해 세포, 골수 세포, 예를 들면, 단핵구, 대식세포, 비만 세포, 호염기구 및 과립구를 포함할 수 있다. 당업자에게 공지된 임의의 방법은 면역 세포에서 사이토카인의 분비를 결정하는데 사용될 수 있는데. 예를 들면, 면역 세포(예를 들면, T 세포)의 증식 또는 면역 세포에 의해 생산된 사이토카인(예를 들면, T 세포에 의해 생산된 IFN-γ 또는 IL2)은 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA)를 통해 정량적으로 측정될 수 있다.
대조군 항체
본 출원의 항원 결합 단백질은 대조군 항체의 에피토프와 완전히 중첩되지 않는 영장류 유래 PD-L1의 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 대조군 항체는 항-PD-L1 항체 아벨루맙(avelumab), 즉, 본 출원의 항체 PR001598일 수 있다. PR001598은 경쇄 가변 부위 및 중쇄 가변 부위를 포함할 수 있는데, 상기 대조군 항체의 경쇄 가변 부위는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함할 수 있고, 상기LCDR1 서열 번호 53에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR2는 서열 번호 66에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR3은 서열 번호 82에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 대조군 항체의 중쇄 가변 부위는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함할 수 있는데, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR2는 서열 번호 18에 제시된 아미노산을 포함할 수 있고, 상기 HCDR3은 서열 번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 대조군 항체의 경쇄 가변 부위는 서열 번호 119에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 대조군 항체의 중쇄 가변 부위는 서열 번호 105에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 다른 경우에서, 상기 대조군 항체는 항-PD-L1 항체 아테졸리주맙(atezolizumab), 즉, 본 출원의 항체 PR000151일 수 있다. PR000151 은 경쇄 가변 부위 및 중쇄 가변 부위를 포함할 수 있는데, 상기 대조군 항체의 경쇄 가변 부위는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함할 수 있고, 상기LCDR1 서열 번호 52에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR2는 서열 번호 65에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR3은 서열 번호 81에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 대조군 항체의 중쇄 가변 부위는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함할 수 있는데, 상기 HCDR1은 서열 번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR2는 서열 번호 15에 제시된 아미노산을 포함할 수 있고, 상기 HCDR3은 서열 번호 34에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 대조군 항체의 경쇄 가변 부위는 서열 번호 117에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 대조군 항체의 중쇄 가변 부위는 서열 번호 96에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 다른 경우에서, 상기 대조군 항체는 Hengrui 융합 단백질 9, 즉, 본 출원의 항체 PR002466일 수 있다. PR002466은 경쇄 가변 부위 및 중쇄 가변 부위를 포함할 수 있는데, 상기 대조군 항체의 경쇄 가변 부위는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함할 수 있고, 상기LCDR1 서열 번호 55에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR2는 서열 번호 68에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR3은 서열 번호 84에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 대조군 항체의 중쇄 가변 부위는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함할 수 있는데, 상기 HCDR1은 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR2는 서열 번호 20에 제시된 아미노산을 포함할 수 있고, 상기 HCDR3은 서열 번호 37에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 대조군 항체의 경쇄 가변 부위는 서열 번호 121에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 대조군 항체의 중쇄 가변 부위는 서열 번호 107에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
당업계에서 에피토프를 결정하는 방법은 합성 펩티드 방법, 면역정보학 예측 방법, 폴리펩티드 활성 분석, 에피토프 펩티드 스캐닝 기술, 단백질 절단 방법, 파지 디스플레이 기술, X-선 회절 및 핵 자기 공명 분석, 및 컴퓨터 소프트웨어를 사용한 에피토프 예측을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 생물층 간섭계(Biolayer Interferometry (BLI))-기반 옥텟 분자 상호작용 분석 플랫폼은 항원 에피토프에 대한 본 출원의 항원 결합 단백질 및 대조군 항체의 경쟁적 결합을 수행하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 제1 항체와 항원을 혼합한 후, 제2 항체를 첨가하고, ForteBio Octet를 사용하여 제1 항체에 대한 제2 항체의 경쟁적 억제율을 결정하는데, 경쟁적 억제율이 85% 미만(예를 들면, 84% 미만, 83% 미만, 80% 미만, 또는 더 낮음)인 경우, 제1 항체 및 제2 항체가 각각 결합하는 항원의 에피토프가 완전히 중첩되지 않는 것으로 여겨진다.
융합 단백질
또 다른 측면에서, 본 출원은 하기를 포함할 수 있는 융합 단백질을 제공한다: a) 인간 TGFBRII 또는 이의 단편; 및 b) 본 출원에서 앞서 기재된 항원 결합 단백질.
본 출원의 융합 단백질의 인간 TGFBRII 또는 이의 단편은 인간 TGFBRII의 세포외 도메인을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 인간 TGFBRII 또는 이의 단편은 서열 번호 176 내지 178 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 융합 단백질은 본 출원의 분리된 항원 결합 단백질을 포함할 수 있다. 상기 분리된 항원 결합 단백질은 경쇄 가변 부위 VL 및 중쇄 가변 부위 VH를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 VL은 서열 번호 190에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 VH는 서열 번호 189에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 분리된 항원 결합 단백질은 또한 중쇄 불변 부위를 포함할 수 있고, 상기 중쇄 불변 부위는 인간 IgG 분변 부위를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 인간 IgG 불변 부위는 인간 IgG1 불변 부위를 포함할 수 있다. 상기 인간 IgG 불변 부위는 자연적 및 인공적으로 합성된 IgG1 불변 부위 또는 이의 돌연변이체를 포함할 수 있다. 상기 돌연변이는 하기 위치들에서 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다: L234, L235, N297 또는 K447. 예를 들면, 이는 하나, 둘 또는 그 이상의 위치들에서의 돌연변이를 포함할 수 있다. 상기 돌연변이는 아미노산의 삭제, 삽입 또는 치환을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 인간 IgG1 불변 부위는 하기 돌연변이들을 포함할 수 있다: 1) N297A, 2) K447 삭제, 3) N297A 및 K447 삭제, 4) L234A, L235A 및 K447 삭제. 예를 들면, 상기 융합 단백질의 인간 IgG1 불변 부위는 서열 번호 172 내지 175 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원의 융합 단백질의 분리된 항원 결합 단백질은 항체 중쇄 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 서열 번호 122 내지 127 및 129 내지 137 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 얘를 들면, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 서열 번호 122 및 133 내지 137 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 출원의 융합 단백질의 분리된 항원 결합 단백질은 항체 경쇄 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 서열 번호 150 내지 158 및 160 내지 163 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 서열 번호 156, 162 및 163 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 융합 단백질의 중쇄 또는 이의 단편은 상기 경쇄 또는 이의 단편과 결합하여 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부분을 형성한다.
본 출원의 융합 단백질에 포함되는 상기 항원 결합 단백질의 항체 중쇄 또는 이의 단편은 상기 인간 TGFBRII 또는 이의 단편과 프레임 내 융합되어 융합 폴리펩티드를 형성한다. 일부 경우에서, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 N-말단에서 상기 인간 TGFBRII 또는 이의 단편의 C-말단에 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 일부 경우에서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 C-말단에서 상기 인간 TGFBRII 또는 이의 단편의 N-말단에 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 예를 들면, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 C-말단에서 상기 인간 TGFBRII 또는 이의 단편의 N-말단에 직접적으로 연결될 수 있다. 일부 다른 경우에서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 링커를 통해 인간 TGFBRII 또는 이의 단편에 연결될 수 있는데, 예를 들면, 상기 펩티드 링커는 서열 번호 167 내지 169 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 융합 단백질은 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 상기 제1 폴리펩티드는 상기 분리된 항원 결합 단백질의 중쇄 또는 이의 단편 및 인간 TGFBRII 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 제1 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단까지 상기 항원 결합 단백질의 중쇄 또는 이의 단편, 상기 펩티드 링커, 및 상기 인간 TGFBRII 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 제1 폴리펩티드는 서열 번호 138, 139, 142, 143 및 145 내지 148 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 제2 폴리펩티드는 상기 분리된 항원 결합 단백질의 경쇄 또는 이의 단편을 포함할 수 있다, 예를 들면, 제2 폴리펩티드는 서열 번호 162 및 163 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 상기 융합 단백질의 제1 폴리펩티드는 서열 번호 138에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 제2 폴리펩티드는 서열 번호 162에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 예를 들면 상기 융합 단백질은 PR001487과 동일한 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있고;
상기 제1 폴리펩티드는 서열 번호 139에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 제2 폴리펩티드는 서열 번호 162에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 예를 들면 상기 융합 단백질은 PR001488과 동일한 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있고;
상기 제1 폴리펩티드는 서열 번호 142에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 제2 폴리펩티드는 서열 번호 162에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 예를 들면 상기 융합 단백질은 PR001901과 동일한 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있고;
상기 제1 폴리펩티드는 서열 번호 143에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 제2 폴리펩티드는 서열 번호 162에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 예를 들면 상기 융합 단백질은 PR001902와 동일한 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있고;
상기 제1 폴리펩티드는 서열 번호 145에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 제2 폴리펩티드는 서열 번호 163에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 상기 융합 단백질은 PR002247과 동일한 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있고;
상기 제1 폴리펩티드는 서열 번호 146에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 제2 폴리펩티드는 서열 번호 163에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 예를 들면 상기 융합 단백질은 PR002248과 동일한 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있고;
상기 제1 폴리펩티드는 서열 번호 147에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 제2 폴리펩티드는 서열 번호 162에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 상기 융합 단백질은 PR002249과 동일한 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있고;
상기 제1 폴리펩티드는 서열 번호 148에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 제2 폴리펩티드는 서열 번호 162에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 예를 들면 상기 융합 단백질은 PR002251과 동일한 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
본 출원의 융합 단백질은2개의 제1 폴리펩티드들 및 2개의 제2 폴리펩티드들을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 항원 결합 단백질의 각각의 중쇄 또는 경쇄의 아미노산 서열의 일 부분은 대응하는 특정 종으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열과 상동성이거나, 특정 클래스(class)에 속한다. 예를 들면, 경쇄 및 중쇄의 가변 부위 및 불변 부분은 모두 한 동물 종(예컨대, 인간)의 항체의 가변 부위 및 불변 부위로부터 유래된다. 본 출원에서, 상기 상동체는 단백질 및/또는 폴리펩티드 (예를 들면, PD-L1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편)의 아미노산 서열과 적어도 약 85%(예를 들면, 적어도 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 그 이상)의 서열 상동성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다.
본 출원에서, 상동성은 일반적으로 2개 이상의 서열들 사이의 유사성, 상사성 또는 관련성을 의미한다. "서열 상동성 퍼센트"는 하기 방식으로 계산된다: 비교 창에서 정렬된 2개의 서열을 비교하고, 2개의 서열에서 동일한 핵산 염기(예를 들면, A, T, C, G) 또는 동일한 아미노산 잔기(예를 들면, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys, 및 Met)가 있는 위치의 개수를 결정하여 매칭되는 위치의 개수를 얻고, 매칭되는 위치의 개수를 비교 창에서의 총 위치의 개수(즉, 창의 크기)로 나눈 다음 100을 곱해 서열 상동성 퍼센트를 얻는다. 서열 상동성 퍼센트를 결정하기 위해 수행되는 상기 정렬은 당업계에 공지된 다양한 방식에 따라 달성될 수 있는데, 예를 들면, 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용함으로써 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 전장 서열의 범위 내 또는 목적하는 서열의 부위 내에서 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적합한 매개변수들을 결정할 수 있다. 상동성은 또한 하기 방법들에 의해 결정될 수 있다: FASTA 및 BLAST. FASTA 알고리즘에 대한 설명은 W. R. Pearson and D. J. Lipman, Improved tools for biological sequence comparison, Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 2444-2448, 1988; 및 D. J. Lipman and W. R. Pearson, Rapid and sensitive protein similarity searches, Science, 227: 1435-1441, 1989에서 찾을 수 있다. BLAST 알고리즘에 대한 설명은 S. Altschul, W. Gish, W. Miller, E. W. Myers and D. Lipman, A basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990에서 찾을 수 있다.
핵산, 벡터, 숙주 세포 및 제조 방법
또 다른 측면에서, 본 출원은 또한 하나 이상의 분리된 핵산 분자를 제공한다. 상기 하나 이상의 핵산 분자는 본 출원의 항원 결합 단백질을 인코딩한다. 예를 들면, 하나 이상의 핵산 분자의 핵산 분자 각각은 온전한 항원 결합 단백질을 인코딩할 수 있고, 이의 일부(예를 들면, HCDR1 내지 HCDR3, LCDR1 내지 LCDR3, VH, 경쇄 또는 중쇄 중 하나 이상)를 인코딩할 수도 있다.
본 출원의 핵산 분자는 분리될 수 있다. 예를 들면, 이는 하기 방법들에 의해 생산 또는 합성될 수 있다: (i) 시험관 내(in vitro) 증폭, 예를 들면, 중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)을 통한 증폭에 의한 생산, (ii) 클로날 재조합(clonal recombination)에 의한 생산, (iii) 예를 들면, 효소 절단 및 겔 전기 영동을 통한 분별(fraction separation)에 의한 정제, 또는 (iv) 예를 들면, 화학적 합성에 의한 합성. 일부 구현예에서, 상기 분리된 핵산은 DNA 재조합 기술에 의해 제조된 핵산 분자이다.
본 출원에서, 상기 항체 및 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산은, 제한 단편(restriction fragment) 조작을 사용하거나 합성 올리고뉴클레오티드에 의한 중첩 확장 PCR(overlapping extension PCR)을 사용하는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계 공지된 다양한 방법으로 제조될 수 있고, 구체적인 작업은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; 및 Ausube et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York N.Y., 1993에서 찾을 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 본 출원에 기재된 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 벡터를 제공한다. 각 벡터는 하나 이상의 핵산 분자를 포함할 수 있다. 게다가, 상기 벡터는 또한 다른 유전자를 포함할 수 있는데, 예를 들면, 적절한 숙주 세포 및 적절한 조건 하에서 벡터가 선택되도록 하는 마커 유전자를 포함할 수 있다. 게다가, 상기 벡터는 적절한 숙주 세포에서 코딩 부위가 정확하게 발현되도록 하는 발현 조절 요소를 포함할 수 있다. 이러한 조절 요소는 당업계에 공지되어 있는데, 예를 들면, 조절 요소는 프로모터, 리보솜 결합 부위, 인핸서, 및 유전자 전사 또는 mRNA 번역 등을 조절하는 기타 조절 요소를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 조절을 위한 서열은 조절 가능한 요소일 수 있다. 발현 조절 서열의 특정 구조는 세포 유형의 종 또는 기능에 따라 변화할 수 있지만, 일반적으로 5' 비-전사 서열 및 5' 및 3' 비번역 서열, 예를 들면, TATA 박스, 캡핑 서열, CAAT 서열 등을 포함한다. 예를 들면, 5' 비-번역 발현 조절 서열은 기능적으로 연결된 핵산의 전사 조절을 위한 프로모터 서열을 포함할 수 있는 프로모터 부위를 포함할 수 있다. 상기 발현 조절 서열은 또한 인핸서 서열 또는 상류 활성화 서열(upstream activator sequence)을 포함할 수 있다. 본 출원에서, 적절한 프로모터는 예를 들면, SP6, T3 및 T7 폴리머라제에 대한 프로모터, 인간 U6TNA 프로모터, CMV 프로모터 및 인공 이종 프로모터(artificially heterozygous promoters) (예컨대, CMV)를 포함할 수 있는데, 프로모터의 특정 부분은 다른 세포 단백질(예컨대, 인간 GAPDH, 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소)에 대한 유전자 프로모터의 특정 부분과 융합될 수 있고, 다른 인트론을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 본 출원의 하나 이상의 핵산 분자는 발현 조절 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
상기 벡터는, 예를 들면, 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 파지 또는 유전 공학에서 흔히 사용되는 기타 벡터를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 벡터는 발현 벡터이다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 본 출원의 하나 이상의 핵산 분자 및/또는 본 출원의 하나 이상의 벡터를 포함할 수 있는 숙주 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 각 유형 또는 각각의 숙주 세포는 또는 본 출원의 하나 이상의 핵산 분자 또는 벡터를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 각 유형 또는 각각의 숙주 세포는 다수(예를 들면, 2개 이상) 또는 다수 유형의(예를 들면, 2개 이상의 유형의) 본 출원의 핵산 분자 또는 벡터를 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 출원의 벡터는 숙주 세포, 예를 들면, 진핵생물 세포, 예컨대, 식물로부터 유래한 세포, 진균 또는 효모 세포 등에 도입될 수 있다. 본 출원의 벡터는 당업계에 공지된 방법, 예를 들면, 전기천공법, 리포펙틴 형질감염, 리포펙타민 형질감염 등에 의해 숙주 세포에 도입될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 발현되는 조건 하에서 본 출원의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들면, 이는 적절한 배지, 적절한 온도 및 배양 시간 등을 사용하여 달성될 수 있고, 이 방법들은 당업자에게 공지되어 있다.
일부 경우에서, 상기 방법은 또한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 분리 및/또는 정제하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들면, 단백질 G-아가로스 또는 단백질 A-아가로스를 사용하여 친화성 크로마토그래피를 수행할 수 있고, 본 출원의 항체 또는 항원 결합 단편은 또한 겔 전기영동 및/또는 고성능 액체 크로마토그래피 등에 의해 분리될 수 있다.
약제학적 조성물, 방법, 및 용도
또 다른 측면에서, 본 출원은 본 출원의 항원 결합 단백질 및/또는 융합 단백질, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포, 및 선택적으로는 약제학적으로 허용 가능한 아쥬반트(adjuvant)를 포함할 수 있는 약제학적 조성물을 제공한다.
상기 약제학적으로 허용 가능한 아쥬반트는 사용되는 용량 및 농도에서 수용자에게 비-독성이고, 하기를 포함할 수 있다: 인산, 시트레이트 및 기타 유기산과 같은, 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌산을 포함하는, 항산화제; 보존제(예컨대, 옥타데실 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 페놀, 부탄올 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올 및 m-크레졸); (약 10개 미만의 잔기를 갖는) 저분자량의 폴리펩티드; 혈청 알부민, 겔 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은, 친수성 폴리머; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신과 같은, 아미노산; 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는, 단당류, 이당류, 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은, 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스, 또는 소르비톨과 같은, 당; 나트륨 이온과 같은, 염-형성 반대이온; 및/또는 TWEENTM, PLURONICSTM, 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은, 비이온성 계면활성제. 본 출원의 약제학적 조성물은 또한 1개 초과의 유효 화합물을 포함할 수 있는데, 상기 유효 화합물은 서로에게 악영향을 미치지 않으면서 상보적인 활성을 갖는다. 이러한 약제의 유형 및 유효량은 예를 들면, 제형에 존재하는 길항제의 양 및 유형, 및 대상체의 임상 매개변수에 따라 달라진다.
상기 약제학적 조성물은 종양 성장을 억제하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 출원의 약제학적 조성물은 질병의 발달 또는 진행을 억제하거나 지연시킬 수 있고, 종양 크기를 감소시킬 수 있고 (심지어 실질적으로 종양을 제거할 수 있고), 및/또는 질병 상태를 완화 및/또는 안정화할 수 있다.
본 출원의 약제학적 조성물은 상기 항체, 이의 항원 결합 단편의 예방학적 및/또는 치료학적 유효량을 포함할 수 있다. 상기 예방학적 및/또는 치료학적 유효량은 질병 또는 질환이 발생할 위험이 있는 대상체에서 질병 또는 질환 및/또는 이들의 임의의 합병증을 예방 및/또는 치료(적어도 부분적으로 치료)하는데 필요한 투여량이다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 약제의 제조에서 상기 항원 결합 단백질 및/또는 융합 단백질의 용도를 제공한다. 상기 약제는 암을 치료하고, 종양 성장을 억제하고 /하거나 종양 세포 증식을 억제하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 상기 종양 또는 암은 결장직장 종양 또는 암을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 종양 또는 암은 PD-L1을 비정상적으로 발현하는 종양 또는 암이다. 본 출원은 또한 하기 기재된 생물학적 샘플에서 PD-L1의 발현을 검출하는 방법을 제공한다. 일부 경우에서, 상기 방법은 상기 항원 결합 단백질 및/또는 융합 단백질이 PD-L1에 결합하도록 하는 조건 하에서 생물학적 샘플을 본 출원의 항원 결합 단백질 및/또는 융합 단백질과 접촉시키는 단계, 및 상기 항원 결합 단백질 및/또는 융합 단백질과 PD-L1 사이에서 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 예를 들면, 상기 종양 또는 암은 비-종양 또는 비-암 샘플에 비해 PD-L1의 발현이 증가된 종양 또는 암이다. 이러한 방법은 시험관 내(in vitro) 또는 생체 내(in vivo) 방법일 수 있다. 본 출원의 항원 결합 단백질 및/또는 융합 단백질은 면역 검정, 예를 들면, 면역조직화학(IHC), 면역형광(IF), 면역블롯팅(예를 들면, 웨스턴 블롯팅), 유세포 분석(예를 들면, FACS), 및 효소 결합 면역 흡착법(ELISA)에 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 예를 들면, PD-L1이 환자를 선택하기 위한 생물학적 마커로 사용되는 경우, 항원 결합 단백질 및/또는 융합 단백질은 본 출원의 항원 결합 단백질 및/또는 융합 단백질을 사용한 요법을 수행하기에 적합한 대상체를 선택하기 위해 사용된다. 본 출원은 또한 질환 (예를 들면, 암 또는 면역 장애)를 앓고 있는 대상체를 진단하는 방법에서 상기 항원 결합 단백질 및/또는 융합 단백질의 용도를 제공하는데, 상기 방법은: 샘플을 본 출원의 항원 결합 단백질 및/또는 융합 단백질과 접촉시키고 결합된 항원 결합 단백질 및/또는 융합 단백질의 존재를 검출함으로써 대상체로부터 얻은 샘플에서 PD-L1의 존재 또는 발현 수준을 결정하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 본 출원의 항원 결합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는 PD-1에의 PD-L1의 결합을 억제하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 생체 외(ex vivo) 또는 시험관 내(in vitro) 방법일 수 있다. 일부 경우에서, 상기 방법은 PD-L1에 항원 결합 단백질 및/또는 PD-1이 결합하도록 하는 조건 하에서 생물학적 샘플을 본 출원의 항원 결합 단백질 및/또는 PD-L1과 접촉시키는 단계, 상기 항원 결합 단백질 및 PD-L1 사이에서 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 단계, 및 PD-1 및 PD-L1 사이에서 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 CD80에의 PD-L1의 결합을 억제하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 본 출원의 항원 결합 단백질을 투여하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 생체 외 또는 시험관 내 방법일 수 있다. 일부 경우에서, 상기 방법은 PD-L1에 항원 결합 단백질 및/또는 CD80이 결합하도록 하는 조건 하에서 생물학적 샘플을 본 출원의 항원 결합 단백질 및/또는 CD80과 접촉시키는 단계, 상기 항원 결합 단백질 및 PD-L1 사이에서 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 단계, 및 CD80 및 PD-L1 사이에서 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 TGFBRII에의 TGFB의 결합을 억제하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 본 출원의 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 생체 외 또는 시험관 내 방법일 수 있다. 일부 경우에서, 상기 방법은 TGFB에 융합 단백질 및/또는 TGFBRII 보고 유전자 발현 세포가 결합하도록 하는 조건 하에서 생물학적 샘플을 본 출원의 융합 단백질 및/또는 TGFBRII 보고 유전자 발현 세포와 접촉시키는 단계, 및 상기 융합 단백질이 TGFBRII에의 TGFB의 결합에 의해 유도되는 Smad 신호전달 경로를 억제하는지 여부를 검출하는 단계를 포함한다.
일부 경우에서, 상기 생물학적 샘플은 조직 또는 세포 샘플일 수 있다. 예를 들면, 생물학적 샘플은 정상 대상체 또는 암 환자로부터 유래한 세포 또는 조직을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 조직 또는 세포 샘플의 출처는 고형 조직, 예컨대, 신선하고, 동결 및/또는 보존된 기관 또는 조직 샘플 또는 생검물(biopsies) 또는 흡인물(aspirates)로부터 유래한 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 성분; 체액, 예컨대, 뇌척수액, 양수, 복강액 또는 간질액; 대상체의 임신 또는 발달(development) 중 어느 시점의 세포일 수 있다. 일부 다른 경우에서, 상기 생물학적 샘플은 시험관 내 조직 또는 세포 배양물로부터 얻어진다. 본 출원의 생물학적 샘플의 예시는 종양 생검, 순환하는 종양 세포, 혈청 또는 혈장, 순환하는 혈장 단백질, 복수, 종양으로부터 유래하거나 종양과 유사한 성질을 나타내는 1차 세포 배양물 또는 세포주, 및 보존된 종양 샘플, 예컨대, 포르말린-고정 파라핀-포매 종양 샘플 또는 동결된 종양 샘플을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원은 또한 종양 또는 암을 앓고 있는 대상체를 진단하는 방법에서 항원 결합 단백질의 용도를 제공하는데, 상기 방법은: 샘플을 본 출원의 항원 결합 단백질과 접촉시키고 결합된 항체의 존재를 검출함으로써 대상체로부터 얻은 샘플에서 PD-L1의 존재 또는 발현 수준을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 경우에서, 상기 샘플은 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다: 조직 샘플, 전혈(whole blood) 샘플, 혈청 샘플 및 혈장 샘플. 일부 경우에서, 상기 조직 샘플은 종양 샘플일 수 있다. 일부 경우에서, 상기 종양 샘플은 종양-침윤 면역 세포, 종양 세포, 기질 세포, 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 대상체에서 암을 치료하고, 대상체에서 종양 성장을 억제하고/하거나 종양 세포 증식을 억제하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 본 출원의 항원 결합 단편 및/또는 융합 단백질, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포 및/또는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체 또는 종양 세포에 투여하는 단계를 포함한다. 이는 임의의 적합한 방법에 의해 투여될 수 있는데, 상기 적합한 방법은 예를 들면, 하기를 포함한다: 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하(subcutaneously) 투여, 피내(intradermally) 투여, 경피(percutaneously) 투여, 동맥내 투여, 복강내 투여, 병변내 투여, 두개내 투여, 관절내 투여, 전립선내 투여, 흉막내 투여, 기관내 투여, 척수강내(intrathecally) 투여, 비강내 투여, 질내 투여, 직장내 투여, 국소 투여, 종양내 투여, 복강내 투여, 결막하(subconjunctivally) 투여, 피막내(intracapsularly) 투여, 점막내 투여, 심낭내(intrapericardially) 투여, 탯줄내(intraumbilically) 투여, 안구내(intraocularly) 투여, 안와내(intraorbitally) 투여, 구강 투여, 국소 투여, 경피(transdermally) 투여, 유리체내(intravitreally) 투여(예를 들면, 유리체내 주사에 의함), 점안액에 의한 투여, 흡입에 의한 투여, 주사에 의한 투여, 이식에 의한 투여, 주입에 의한 투여, 연속 주입에 의한 투여, 표적 세포의 직접적 배씽(bathing)을 통한 국소 주입에 의한 투여, 카테터에 의한 투여, 세정(lavage)에 의한 투여, 크림 또는 액체 조성물의 형태로 투여. 본 명세서에 기재된 방법에서 사용되는 조성물은 또한 전신으로 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 투여 방법은 다양한 요인(예를 들면, 투여될 화합물 또는 조성물 및 치료될 병태, 질병 또는 질환의 중증도)에 따라 변경될 수 있다. 특정 구현예에서, 항암 요법제 (예를 들면, 항-PD-L1 항체)는 정맥내, 근육내, 피하, 국소, 구강, 경피, 복강내, 안구내, 이식에 의해, 흡입에 의해, 척수강내, 뇌실내, 또는 비강내 투여될 수 있다. 부분적으로 투여가 일시적인지 장기적인지에 따라, 투여는 임의의 적합한 경로, 예를 들면, 주사에 의해, 예컨대, 정맥내 주사에 의해, 피하 주사에 의해 수행될 수 있다. 다양한 투여 스케줄이 본 명세서에 포함되고, 단일 투여 또는 다양한 시점에 걸친 다중 투여, 일시 투여(bolus administrations), 및 펄스 주입을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 기재된 항원 결합 단백질 또는 약제학적 조성물은 우수한 의료 행위와 일치하는 방식으로 제형화, 투약 또는 투여될 수 있다. 이 경우 고려 사항은 치료 중인 특정 질환, 치료 중인 특정 포유 동물, 개별 환자의 임상적 상태, 질환의 원인, 약물 전달의 위치, 투여 방법, 투여 스케쥴, 및 의료 종사자에게 공지된 기타 요인을 포함한다. 치료제(예를 들면, 항-PD-L1 항체)는 고려 중인 질환을 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 제제와 동시에 제형화 및/또는 투여될 필요는 없지만 선택적으로 이와 동시에 제형화 및/또는 투여된다. 이러한 다른 제제의 유효량은 제형에 존재하는 치료제(예를 들면, 항-PD-L1 항체)의 양, 질환 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 기타 요인에 따라 달라진다. 이 제제들은 일반적으로 임의의 적절한 용량으로 투여되도록 경험적으로/임상적으로 결정되고 임의의 적절한 경로로 투여되도록 경험적으로/임상적으로 결정된다. 병용 요법에서 투여되는 항체의 용량은 단일 요법에 비해 감소될 수 있다. 이 요법의 진행 상황은 기존의 기술에 의해 쉽게 모니터링될 수 있다.
키메라 항원 수용체
또 다른 측면에서, 본 출원은 본 출원의 핵산 분자 또는 본 출원의 항원 결합 단백질을 포함할 수 있는 키메라 항원 수용체(CAR)을 제공한다. 일부 구현예에서, 이는 항원에 결합할 수 있는 세포외 도메인(세포외 결합 도메인), 힌지 도메인, 막관통 도메인(막관통 부위) 및 세포질 신호를 상기 도메인에 전달(transduce)하는 폴리펩티드(즉, 세포내 신호전달 도메인)를 포함할 수 있다. 상기 힌지 도메인은 세포외 항원 결합 부위에 유연성(flexibility)을 제공하는 부분으로 여겨질 수 있다. 세포내 신호전달 도메인은 정의된 신호전달 경로를 통해 2차 메신저를 생성함으로써 세포 활성을 조절하기 위해 세포 내에 정보를 전송하는 단백질, 또는 CAR 세포 (예를 들면, CAR-T 세포)의 이펙터 기능 촉진할 수 있는 신호를 생산하기 위해 이러한 메신저 상응하여 이펙터(effector)로서 역할하는 단백질을 의미한다. 세포내 신호전달 도메인은 신호전달 도메인을 포함할 수 있고, 또한 공동-자극 분자로부터 유래한 공동-자극 세포내 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 공동-자극 분자는 4-1BB, CD27, ICOS 및/또는 CD28로부터 선택될 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 출원은 상기 키메라 항원 수용체를 포함할 수 있는 유전자 변형 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 유전자 변형 세포는 진핵생물 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 유전자 변형 세포는 분리된 인간 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 유전자-변형 세포는 면역 세포, 예컨대, T 세포, 또는 NK 세포를 포함할 수 있다.
항체-약물 접합체
또 다른 측면에서, 본 출원은 세포독성제 및 본 출원의 항원 결합 단편을 포함할 수 있는 항체-약물 접합체를 제공한다. 항체-약물 접합체는 일반적으로 특정 링커를 사용하여 저분자량 세포독성 약물에 연결된 항체를 의미하며, 이의 주요 성분은 항체, 링커 및 저분자량 세포독성 약물을 포함할 수 있다. 항체-약물 접합체의 표적화는 이의 항체 부분에서 비롯될 수 있고, 독성은 대부분 저분자량 화학적 약물의 독성 부분(payload)에서 비롯될 수 있지만, 항체 부분 또한 독성(ADCC 및 CDC)을 가질 수 있다.
키트
또 다른 측면에서, 본 출원은 본 출원의 항원 결합 단백질, 키메라 항원 수용체, 유전자 변형 세포, 항체-약물 접합체, 및/또는 본 출원의 약제학적 조성물을 포함할 수 있는 키트를 제공한다. 이는 단일의 통상적인 용기에 본 출원의 항원 결합 단백질, 키메라 항원 수용체, 유전자 변형 세포, 및/또는 항체 약물 접합체를 포함할 수 있고, 또한 선택적으로는 하나 이상의 치료제와 조합(combine)될 수 있으며, 이들은 약제학적 조성물로 함께 제형화될 수 있다.
일부 경우에서, 상기 키트는 또한 본 출원의 항원 결합 단백질, 키메라 항원 수용체, 유전자 조작 세포, 항체-약물 접합체 또는 약제학적 조성물의 투여를 위한 장치를 포함할 수 있고; 예를 들면, 상기 장치는 내용물의 투여 경로에 따라 달라진다. 일부 경우에서, 상기 키트는 패키지 삽입물(package insert)을 포함할 수 있는데, 상기 패키지 삽입물은 키트 내의 항원 결합 단백질, 약제학적 조성물 및 투여 형태에 대한 정보를 포함한다. 일반적으로는, 이러한 정보는 환자 및 의사가 캡슐화된 항원 결합 단백질, 약제학적 조성물 및 투여 형태를 효과적이고 안전하게 사용하는데 도움을 준다. 이러한 키트에서 사용되는 용기는 일반적으로 적어도 하나의 바이알, 튜브, 플라스크, 병, 주사기, 또는 기타 적합한 용기를 포함할 수 있으며, 하나 이상의 검출 및/또는 치료 조성물이 상기 용기에 배치될 수 있고, 바람직하게는 적절하게 등분된다. 제2 치료제 또한 제공되는 경우, 키트는 또한 제2 검출 및/또는 치료 조성물이 배치될 수 있는 제2의 상이한 용기 또한 함유할 수 있다. 대안적으로는, 다수의 화합물들이 단일 약제학적 조성물로서 제조될 수 있고 단일 용기 장치, 예컨대, 바이알, 플라스크, 주사기, 병 또는 기타 적합한 단일 용기에 패키징될 수 있다.
약물 전달 장치
또 다른 측면에서, 본 출원은 약물 전달 장치 (예를 들면, 플라스틱 병 또는 바이알, 예를 들면, 중공 핀(hollow pin) 또는 주사기 배럴(syringe barrel))을 제공하는데, 이는 본 출원에 기재된 항원 결합 단백질 또는 이의 약제학적 조성물의 투여하는데 사용될 수 있다. 이 장치는 비경구 경로(예컨대, 근육내, 피하, 또는 정맥내)를 통해 환자에게 물질을 도입할 수 있다. 예를 들면, 상기 주사 장치는 주사기(예를 들면, 본 출원에 기재된 항원 결합 단백질 또는 약제학적 조성물로 사전-충전된 주사기, 예컨대, 자동-주사기)일 수 있고, 주사될 유체(예를 들면, 본 출원에 기재된 항원 결합 단백질 또는 이의 약제학적 조성물)를 함유하기 위한 주사기 배럴 및 니들(피부 및/또는 혈관을 관통하는데 사용될 수 있음)을 포함할 수 있다. 투여 방식은 변경될 수 있다. 투여 경로는 구강 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 직장 투여 등을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 하기 구현예들을 제공한다:
1. 항체 중쇄 가변 부위 VH의 적어도 하나의 CDR을 포함하는 분리된 항원 결합 단백질로서, 상기 VH는 서열 번호 193에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
2. 제1 구현예에 있어서, 상기 VH는 서열 번호 90 내지 93, 95 및 97 내지 104 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
3. 제1 구현예 또는 제2 구현예에 있어서, 상기 분리된 항원 결합 단백질은 항체 경쇄 가변 부위 VL의 적어도 하나의 CDR을 포함하는데, 상기 VL은 서열 번호 194에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
4. 제3 구현예에 있어서, 상기 VL은 서열 번호 108 내지 114, 116 및 118 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
5. 제1 구현예 내지 제4 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 분리된 항원 결합 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 분리된 항원 결합 단백질.
6. 제5 구현예에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 Fab, Fab', Fv 단편, F(ab')2, scFv, di-scFv 및/또는 dAb를 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
7. 제5 구현예 또는 제6 구현예에 있어서, 상기 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 분리된 항원 결합 단백질: 단일클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 완전 인간 항체.
8. 제1 구현예 내지 제7 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 분리된 항원 결합 단백질은 PD-L1에 결합하는데 특정 항-PD-L1 항체와 경쟁하고, 상기 특정 항-PD-L1 항체는 경쇄 가변 부위 및 중쇄 가변 부위를 포함하는데, 상기 특정 항-PD-L1 항체의 경쇄 가변 부위는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 LCDR1은 서열 번호 181에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR2는 서열 번호 182에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR3은 서열 번호 191에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 특정 항-PD-L1 항체의 중쇄 가변 부위는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하며, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR2는 서열 번호 179에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR3은 서열 번호 180에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
9. 제8 구현예에 있어서, 상기 특정 항-PD-L1 항체의 경쇄 가변 부위는 서열 번호 194에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 특정 항-PD-L1 항체의 중쇄 가변 부위는 서열 번호 193에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
10. 제1 구현예 내지 제9 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 VH는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는데, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
11. 제10 구현예에 있어서, 상기 HCDR2는 서열 번호 179에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
12. 제10 구현예 또는 제11 구현예에 있어서, 상기 HCDR2는 서열 번호 14, 16 및 17 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
13. 제10 구현예 내지 제12 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 HCDR3은 서열 번호 180에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
14. 제10 구현예 내지 제13구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 HCDR3은 서열 번호 29 내지 33 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
15. 제1 구현예 내지 제14 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 VH는 프레임워크 부위 H-FR1, H-FR2, H-FR3 및 H-FR4를 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
16. 제15 구현예에 있어서, 상기 H-FR1의 C-말단은 상기 HCDR1의 N-말단에 연결되고, 상기 H-FR1은 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
17. 제15 구현예 또는 제16 구현예에 있어서, 상기 H-FR2는 상기 HCDR1 및 상기 HCDR2 사이에 위치하고, 상기 H-FR2는 서열 번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
18. 제15 구현예 내지 제17 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 H-FR3은 상기 HCDR2 및 상기 HCDR3 사이에 위치하고, 상기 H-FR3은 서열 번호 192에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
19. 제15 구현예 내지 제18 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 H-FR3은 서열 번호 21, 22 및 24 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
20. 제15 구현예 내지 제19 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 H-FR4의 N-말단은 상기 HCDR3의 C-말단에 연결되고, 상기 H-FR4는 서열 번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
21. 제1 구현예 내지 제20 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 분리된 항원 결합 단백질은 중쇄 가변 부위 VH를 포함하는데, 상기 VH는 서열 번호 193에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
22. 제21 구현예에 있어서, 상기 VH는 서열 번호 90 내지 93, 95 및 97 내지 104 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
23. 제1 구현예 내지 제22 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 분리된 항원 결합 단백질은 항체 중쇄 불변 부위를 포함하고, 상기 항체 중쇄 불변 부위는 인간 IgG 불변 부위를 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
24. 제23 구현예에 있어서, 상기 항체 중쇄 불변 부위는 서열 번호 172 내지 175 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
25. 제1 구현예 내지 제24 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 분리된 항원 결합 단백질은 항체 중쇄 HC를 포함하고, 상기 HC는 서열 번호 122 내지 125, 127 및 129 내지 137 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
26. 제3 구현예 내지 제25 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 VL은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는데, 상기 LCDR1은 서열 번호 181에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
27. 제26 구현예에 있어서, 상기 LCDR1은 서열 번호 48 내지 51 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
28. 제26 구현예 또는 제27 구현예에 있어서, 상기 LCDR2는 서열 번호 182에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
29. 제26 구현예 내지 제28 구현예에 있어서, 상기 LCDR2는 서열 번호 63 또는 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
30. 제26 구현예 내지 제29 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 LCDR3은 서열 번호 191에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
31. 제26 구현예 내지 제30 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 LCDR3은 서열 번호 77 내지 79 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
32. 제3 구현예 내지 제31 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 VL은 프레임워크 부위 L-FR1, L-FR2, L-FR3 및 L-FR4를 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
33. 제32 구현예에 있어서, 상기 L-FR1의 C-말단은 상기 LCDR1의 N-말단에 연결되고, 상기 L-FR1은 서열 번호 185에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
34. 제32 구현예 또는 제33 구현예에 있어서, 상기 L-FR1은 서열 번호 41 내지 44 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
35. 제32 구현예 내지 제34 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 L-FR2는 상기 LCDR1 및 상기 LCDR2 사이에 위치하고, 상기 L-FR2는 서열 번호 186에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
36. 제32 구현예 내지 제35 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 L-FR2는 서열 번호 56 내지 59 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
37. 제32 구현예 내지 제36 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 L-FR3은 상기 LCDR2 및 상기 LCDR3 사이에 위치하고, 상기 L-FR3은 서열 번호 187에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
38. 제32 구현예 내지 제37 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 L-FR3은 서열 번호 69 내지 72 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
39. 제32 구현예 내지 제38 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 L-FR4의 N-말단은 상기 LCDR3의 C-말단에 연결되고, 상기 L-FR4는 서열 번호 188에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
40. 제32 구현예 내지 제39 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 L-FR4는 서열 번호 85 또는 86에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
41. 제1 구현예 내지 제40 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 분리된 항원 결합 단백질은 항체 경쇄 가변 부위 VL을 포함하는데, 상기 VL은 서열 번호 194에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
42. 제41 구현예에 있어서, 상기 VL은 서열 번호 108 내지 114, 116 및 118 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
43. 제1 구현예 내지 제42 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 분리된 항원 결합 단백질은 항체 경쇄 불변 부위를 포함하는데, 상기 항체 경쇄 불변 부위는 서열 번호 170에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
44. 제1 구현예 내지 제43 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 분리된 항원 결합 단백질은 항체 경쇄 LC를 포함하는데, 상기 LC는 서열 번호 150 내지 156, 158 및 160 내지 163 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
45. 제1 구현예 내지 제44 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 분리된 항원 결합 단백질은 하기 특성들 중 하나 이상을 갖는, 분리된 항원 결합 단백질:
1) 1 Х 10-8 M 이하의 KD 값으로 영장류 유래 PD-L1에 결합할 수 있음;
2) PD-1과 PD-L1의 결합을 차단할 수 있음;
3) CD80과 PD-L1의 결합을 차단할 수 있음;
4) 면역 세포에서 IFN-γ 및/또는 IL2의 분비를 자극할 수 있음;
5) 종양 성장 및/또는 종양 세포 증식을 억제할 수 있음; 및
6) 대조군 항체의 에피토프와 완전히 중첩되지 않는 영장류 유래 PD-L1의 에피토프에 결합함,
이때, 상기 대조군 항체는 서열 번호 52에 제시된 LCDR1, 서열 번호 65에 제시된 LCDR2, 및 서열 번호 81에 제시된 LCDR3을 포함하고, 상기 대조군 항체는 서열 번호 6에 제시된 HCR1, 서열 번호 15에 제시된 HCDR2 및 서열 번호 34에 제시된 HCDR3을 포함하거나;
상기 대조군 항체는 서열 번호 53에 제시된 LCDR1, 서열 번호 66에 제시된 LCDR2, 및 서열 번호 82에 제시된 LCDR3을 포함하고, 상기 대조군 항체는 서열 번호 5에 제시된 HCR1, 서열 번호 18에 제시된 HCDR2 및 서열 번호 35에 제시된 HCDR3을 포함하거나; 또는
상기 대조군 항체는 서열 번호 55에 제시된 LCDR1, 서열 번호 68에 제시된 LCDR2, 및 서열 번호 84에 제시된 LCDR3을 포함하고, 상기 대조군 항체는 서열 번호 8에 제시된 HCR1, 서열 번호 20에 제시된 HCDR2 및 서열 번호 37에 제시된 HCDR3을 포함한다.
46. 제45 구현예에 있어서, 상기 영장류는 인간 및/또는 원숭이를 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
47. 융합 단백질로서, 상기 융합 단백질은: a) 인간 TGFBRII 또는 이의 단편; 및 b) 제1 구현예 내지 제46 구현예 중 어느 한 구현예의 분리된 항원 결합 단백질을 포함하는, 융합 단백질.
48. 제47 구현예에 있어서, 상기 분리된 항원 결합 단백질은 항체 중쇄 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 상기 인간 TGFBRII 또는 이의 단편과 프레임 내 융합되어 융합 폴리펩티드를 형성하는 것인, 융합 단백질.
49. 제48 구현예에 있어서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편의 C-말단은 상기 인간 TGFBRII 또는 이의 단편의 N-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되는 것인, 융합 단백질.
50. 제48 구현예 또는 제49 구현예에 있어서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 링커를 통해 상기 인간 TGFBRII 또는 이의 단편에 연결되는 것인, 융합 단백질.
51. 제50 구현예에 있어서, 상기 링커는 펩티드 링커이고, 상기 펩티드 링커는 서열 번호 167 내지 169 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합 단백질.
52. 제47 구현예 내지 제51 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 인간 TGFBRII 또는 이의 단편은 상기 인간 TGFBRII의 세포외 도메인을 포함하는 것인, 융합 단백질.
53. 제47 구현예 내지 제52 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 인간 TGFBRII 또는 이의 단편은 서열 번호 176 내지 178 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합 단백질.
54. 제47 구현예 내지 제53 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 융합 단백질은 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는데,
상기 제1 폴리펩티드는 상기 분리된 항원 결합 단백질의 중쇄 또는 이의 단편 및 상기 인간 TGFBRII 또는 이의 단편을 포함하고; 및
상기 제2 폴리펩티드는 상기 분리된 항원 결합 단백질의 중쇄 또는 이의 단편을 포함하는 것인, 융합 단백질.
55. 제54 구현예에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드의 중쇄 또는 이의 단편 제2 폴리펩티드의 경쇄 또는 이의 단편과 결합하여 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부분을 형성하는 것인, 융합 단백질.
56. 제54 구현예 또는 제55 구현예에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드는 서열 번호 138, 139, 142, 143 및 145 내지 148 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합 단백질.
57. 제54 구현예 내지 제56 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 제2 폴리펩티드는 서열 번호 162 또는 163에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합 단백질.
58. 제54 구현예 내지 제57 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 제1 폴리펩티드는 서열 번호 138에 제시된 아미노사 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드는 서열 번호 162에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 제1 폴리펩티드는 서열 번호 139에 제시된 아미노사 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드는 서열 번호 162에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 제1 폴리펩티드는 서열 번호 142에 제시된 아미노사 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드는 서열 번호 162에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 제1 폴리펩티드는 서열 번호 143에 제시된 아미노사 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드는 서열 번호 162에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 제1 폴리펩티드는 서열 번호 145에 제시된 아미노사 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드는 서열 번호 163에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 제1 폴리펩티드는 서열 번호 146에 제시된 아미노사 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드는 서열 번호 163에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 제1 폴리펩티드는 서열 번호 147에 제시된 아미노사 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드는 서열 번호 162에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
상기 제1 폴리펩티드는 서열 번호 148에 제시된 아미노사 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드는 서열 번호 162에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합 단백질.
59. 제54 구현예 내지 제58 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 융합 단백질은 2개의 제1 폴리펩티드들 및 2개의 제2 폴리펩티드들을 포함하는 것인, 융합 단백질.
60. 제1 구현예 내지 제46 구현예 중 어느 한 구현예의 분리된 항원 결합 단백질, 및/또는 제47 구현예 내지 제59 구현예 중 어느 한 구현예의 융합 단백질을 인코딩하는 분리된 하나 이상의 핵산.
61. 제60 구현예의 핵산을 포함하는 벡터.
62. 제60 구현예의 핵산 또는 제61 구현예의 벡터를 포함하는 세포
63. 제1 구현예 내지 제46 구현예 중 어느 한 구현예의 분리된 항원 결합 단백질 및/또는 제47 구현예 내지 제59 구현예 중 어느 한 구현예의 융합 단백질을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 제1 구현예 내지 제46 구현예 중 어느 한 구현예의 분리된 항원 결합 단백질 또는 제47 구현예 내지 제59 구현예 중 어느 한 구현예의 융합 단백질이 발현되는 조건 하에서 제49 구현예의 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
64. 제1 구현예 내지 제46 구현예의 분리된 항원 결합 단백질을 포함하는 키메라 항원 수용체.
65. 제64 구현예의 키메라 항원 수용체를 포함하는 유전자 변형 세포.
66. 세포독성제 및 제1 구현예 내지 제46 구현예 중 어느 한 구현예의 분리된 항원 결합 단백질을 포함하는 항체-약물 접합체.
67. 제1 구현예 내지 제46 구현예 중 어느 한 구현예의 분리된 항원 결합 단백질, 제47 구현예 내지 제59 구현예 중 어느 한 구현예의 융합 단백질, 제60 구현예의 핵산 분자, 제61 구현예의 벡터, 제62 구현예의 세포, 제64 구현예의 키메라 항원 수용체, 제65 구현예의 유전자 변형 세포 및/또는 제66 구현예의 항체-약물 접합체, 및 선택적으로, 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
68. 종양 또는 암을 예방, 완화 및/또는 치료하고, 종양 성장을 억제하고/하거나 종양 세포 증식을 억제하기 위한 약제의 제조에서 제1 구현예 내지 제46 구현예 중 어느 한 구현예의 분리된 항원 결합 단백질, 제60 구현예의 핵산 분자, 제61 구현예의 벡터, 제62 구현예의 세포, 제64 구현예의 키메라 항원 수용체, 제65 구현예의 유전자 변형 세포, 제66 구현예의 항체-약물 접합체 및/또는 제67 구현예의 약제학적 조성물의 용도
69. 제68 구현예에 있어서, 상기 종양 또는 암은 PD-L1을 비정상적으로 발현하는 종양 또는 암인 것인, 용도.
70. 제68 구현예 또는 제69 구현예에 있어서, 상기 종양 또는 암은 결장직장암을 포함하는 것인, 용도.
71. 종양을 예방, 완화 또는 치료하고, 종양 성장을 억제하고/하거나 종양 세포 증식을 억제하는 방법으로서, 상기 방법은 제1 구현예 내지 제46 구현예 중 어느 한 구현예의 분리된 항원 결합 단백질, 제60 구현예의 핵산 분자, 제61 구현예의 벡터, 제62 구현예의 세포, 제64 구현예의 키메라 항원 수용체, 제65 구현예의 유전자 변형 세포, 제66 구현예의 항체-약물 접합체 및/또는 제67 구현예의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
72. 제71 구현예에 있어서, 상기 종양 또는 암은 PD-L1을 비정상적으로 발현하는 종양 또는 암인 것인, 방법.
73. 제71 구현예 또는 제72 구현예에 있어서, 상기 종양 또는 암은 결장직장암을 포함하는 것인, 방법.
74. 암을 치료하고, 종양 성장을 억제하고/하거나 종양 성장 증식을 억제하는데 사용하기 위한 제1 구현예 내지 제46 구현예 중 어느 한 구현예의 분리된 항원 결합 단백질, 제60 구현예의 핵산 분자, 제61 구현예의 벡터, 제62 구현예의 세포, 제64 구현예의 키메라 항원 수용체, 제65 구현예의 유전자 변형 세포, 제66 구현예의 항체-약물 접합체 및/또는 제67 구현예의 약제학적 조성물.
75. PD-L1과 PD-1의 결합을 억제하는 방법으로서, 상기 방법은 제1 구현예 내지 제46 구현예 중 어느 한 구현예의 분리된 항원 결합 단백질, 제60 구현예의 핵산 분자, 제61 구현예의 벡터, 제62 구현예의 세포, 제64 구현예의 키메라 항원 수용체, 제65 구현예의 유전자 변형 세포, 제66 구현예의 항체-약물 접합체 및/또는 제67 구현예의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
76. CD80과 PD-1의 결합을 억제하는 방법으로서, 상기 방법은 제1 구현예 내지 제46 구현예 중 어느 한 구현예의 분리된 항원 결합 단백질, 제60 구현예의 핵산 분자, 제61 구현예의 벡터, 제62 구현예의 세포, 제64 구현예의 키메라 항원 수용체, 제65 구현예의 유전자 변형 세포, 제66 구현예의 항체-약물 접합체 및/또는 제67 구현예의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
77. 제1 구현예 내지 제46 구현예 중 어느 한 구현예의 분리된 항원 결합 단백질, 제60 구현예의 핵산 분자, 제61 구현예의 벡터, 제62 구현예의 세포, 제64 구현예의 키메라 항원 수용체, 제65 구현예의 유전자 변형 세포, 제66 구현예의 항체-약물 접합체 및/또는 제67 구현예의 약제학적 조성물, 및/또는 (i) 투여 장치를 포함하는 키트
임의의 이론에 의해 제한되는 것을 의도하지 않고, 하기 실시예는 단지 본 출원의 융합 단백질, 제조 방법, 및 용도 등을 예시하는데 사용되고, 본 출원의 범위를 제한하는데 사용되지 않는다.
실시예
하기 나타낸 실시예들은 본 출원의 특정 구현예들을 예시하는데 사용되고, 어떠한 방식으로든 본 발명의 설명 또는 청구범위를 제한하려는 의도를 갖지 않는다. 본 실시예들은 기존 방법들, 예컨대, 벡터 및 플라스미드를 작제하는 방법, 이러한 벡터 및 플라스미드로 단백질을 인코딩하는 유전자를 삽입하는 방법, 또는 플라스미드를 숙주 세포에 도입하는 방법의 상세한 설명을 포함하지 않는다. 이러한 방법들은 당업자에게 익히 공지되어 있고, Sambrook J., Fritsch, E. F. and Maniais, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold spring Harbor Laboratory Press을 포함하는 수많은 공개문헌에 기재되어 있다.
PD-L1에 특이적으로 결합하는 항체 분자를 얻기 위해 PD-L1 항원을 사용하여 실험 동물들을 면역화할 수 있으며, 상기 실험 동물들은 마우스, 랫트, 토끼, 양, 낙타 등일 수 있다. 일반적으로는, 얻어진 항체 분자는 비-인간 기원이다. 비-인간 항체를 얻은 후에, 이 분자들은 면역원성을 감소시키고 약물성(druggability)을 개선하기 위해 항체 조작 기술을 사용하여 인간화될 필요가 있다. 하지만, 항체의 인간화 과정은 기술적 복잡함을 가지고 있고, 인간화 변형된 분자들은 흔히 항원에 대한 친화도를 감소시킨다. 또 다른 측면에서, 형질전환 기술의 진전은 인간 면역글로불린 라이브러리를 보유하고 내인성 마우스 면역 라이브러리가 결실된 유전자 조작 마우스를 기르는 것을 가능하게 했다. 이러한 유형의 형질전환 마우스에 의해 생산된 항체는 완전 인간 서열을 가지고 있어, 추가 인간화 변형을 할 필요가 없고, 치료학적 항체의 개발의 효율을 굉장히 개선시킨다. Harbour H2L2 마우스 (Harbour Antibodies BV)는 인간 면역글로불린 라이브러리를 보유한 형질전환 마우스이고, 이 마우스에 의해 생산된 항체는 온전한 인간 항체 가변 도메인 및 랫트 불변 도메인을 가지고 있다.
1.1 PD-L1 항원으로 마우스 면역화
가용성 재조합 인간 PD-L1-mFc 융합 단백질(Novo Protein Inc. Cat. No. CM06, lot number 0330837)로 Harbor H2L2 마우스를 여러 라운드(round) 동안 면역화하였다. 상기 항원 단백질을 면역 아쥬반트(immunologic adjuvant)와 함께 혼합하여 면역원성 시약(immunogen reagent)을 형성한 다음, 사타구니 또는 복강을 통해 피하 주사하였다. 각 라운드의 면역화에서, 각 마우스에 제공된 총 주사 용량은 100 μL이다. 제1 라운드의 면역화에서, 50 μg의 항원 단백질 (인간 PD-L1-mFc) 및 완전 프로인트 아쥬반트(Complete Freund's Adjuvant) (Sigma, Cat. No. F5881)를 1:1의 부피비로 혼합하여 제조된 면역원성 시약으로 각 마우스를 면역화하였다. 이후의 각 라운드의 부스터 면역화에서, 25 μg의 항원 단백질 및 Sigma Adjuvant System 아쥬반트(Sigma, Cat. No. S6322)를 혼합하여 제조된 면역원성 시약으로 각 마우스를 면역화하였다. 각 라운드의 부스터 면역화 사이의 시간 간격은 적어도 2주였고, 일반적으로 5 라운드를 초과하는 부스터 면역화는 없었다. 면역화 시간은 0, 14, 28, 42, 56, 및 70일차이고; 49 및 77일차에 마우스 혈청 역가를 검출했다. 세포 융합 3일 전에 마우스 당 25 μg의 항원 단백질의 용량으로 최종 부스터 면역화를 수행했다.
1.2 단일클론성 하이브리도마 및 항체 서열의 획득
마우스 혈청에서 검출되는 PD-L1에 특이적인 항체 역가가 특정 수준에 도달하면, 마우스의 비장 세포를 취하여 골수종 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 얻었고; 여러 라운드 동안 하이브리도마 세포를 스크리닝 및 클로닝한 후에, 항-PD-L1 단일클론 항체 분자를 발현하는 여러 하이브리도마 세포가 분리되었다. 분리된 하이브리도마 세포들 및 이 세포들에 의해 발현된 단일클론 항체들 모두는 대응하는 클론 번호, 예를 들면: 63G11H3G9, 91G3H5H3 등으로 나타난다. 분리된 하이브리도마 세포는 중쇄 및 경쇄로 온전한 인간 가변 도메인 및 랫트 불변 도메인을 갖는 항체 분자를 발현한다. 앞서 언급된 단일클론 항체를 추가로 동정(identify)하고, 매개변수, 즉, 인간 PD-L1에의 결합 능력, 시노몰구스(cynomolgus) PD-L1에의 결합 능력, PD-1에의 PD-L1의 결합 능력의 억제 등에 따라 여러 하이브리도마 클론을 스크리닝하여 시퀀싱했다. 기존의 하이브리도마 시퀀싱 기술을 사용하여 항체 분자의 가변 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 이와 대응하는 아미노산 서열을 얻었다. 본 실시예에서, 면역화된 Harbour H2L2 마우스로부터 얻은 항-PD-L1 단일클론 항체 분자의 가변 도메인의 서열은 인간 항체 서열이다. 이 항체 가변 도메인의 CDR 서열들은 Kabat 또는 Chothia 또는 기타 CDR 정의 규칙(예컨대, 조합된(combined) 정의 규칙)에 의해 분석될 수 있다(CDR 정의에 대해 표 1 참조). 표 2는 하이브리도마 세포 및 재조합 항체의 가변 도메인 서열 및 CDR 서열을 나열하며, 여기서 CDR은 Chothia 정의 규칙을 사용하여 정의된다.
1.3 완전 인간 재조합 항체의 제조
항체 분자의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 서열을 인코딩하는 서열을 얻은 후에, 기존 DNA 재조합 기술을 사용하여 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 서열을 대응하는 인간 항체의 경쇄 및 중쇄 불변 도메인의 서열과 융합시키고 발현시켜 재조합 항체 분자를 얻을 수 있다. 본 실시예에서, 항체 중쇄 가변 도메인의 서열(VH)은 유전적으로 합성되고 인간 IgG1 항체 중쇄 불변 도메인의 서열(서열 번호 172) 또는 아미노산 돌연변이를 포함하는 이의 변이체 서열(서열 번호 173 내지 175)을 인코딩하는 포유동물 세포 발현 플라스미드 벡터 내에 클로닝되어, 인간 IgG 항체의 전장 중쇄 (또는 이의 변이체)를 인코딩 및 생산하고; 항체 경쇄 가변 도메인의 서열(VL)은 유전적으로 합성되고 인간 항체 κ 경쇄 불변 도메인 (서열 번호 170)의 서열을 인코딩하는 포유동물 세포 발현 플라스미드 벡터 내에 클로닝되어, 항체의 전장 κ 경쇄를 인코딩 및 생산하고; 또는 상기 VL은 유전적으로 합성되고 인간 항체 λ 경쇄 불변 도메인 (서열 번호 171)의 서열을 인코딩하는 포유동물 세포 발현 플라스미드 내에 클로닝되어, 항체의 전장 λ 경쇄를 인코딩 및 생산한다. 표 2는 본 실시예에서 PD-L1 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열, 경쇄의 전장 아미노산 서열, 중쇄(인간 IgG1)의 전장 아미노산 서열 및 Chothia 정의 규칙에 따라 정의된 CDR의 아미노산 서열을 나열한다.
항체의 중쇄를 인코딩하는 플라스미드 및 항체의 경쇄를 인코딩하는 플라스미드를 포유동물 숙주 세포(예컨대, 인간 배아 신장 세포 HEK293)에 동시에 형질감염시켰다. 기존의 재조합 단백질 발현 및 정제 기술을 사용하여 경쇄 및 중쇄가 정확하게 쌍을 이루고 조립된, 정제된 PD-L1 재조합 항체를 얻었다. 구체적으로는, HEK293 세포를 FreeStyleTM F17 발현 배지(Thermo, A1383504)에서 확대배양하였다. 일시적 형질감염을 시작하기 전에, 세포 농도를 6-8 Х 105 세포/mL로 조정하고, 24시간 동안 37℃ 및 8% CO2 하에 진탕기에서 1.2 Х 106 세포/mL로 배양하였다. 30 mL의 배양된 세포를 준비했다. 상기 항체 중쇄를 인코딩하는 플라스미드 및 상기 항체 경쇄를 인코딩하는 플라스미드를 2:3의 비로 혼합하여 총 30μg의 플라스미드를 만들고, 1.5 mL Opti-MEM 환원 혈청 배지 (Thermo, 31985088) 중 용해시키고, 0.22 μm 필터를 통해 여과 멸균시켰다. 이어서, 1.5 mL의 Opti-MEM을 취하여 120 μL의 1 mg/mL PEI (Polysciences, 23966-2) 중 용해시키고, 5분 동안 방치하였다. PEI를 플라스미드에 천천히 첨가하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이팅했다. 플라스미드 및 PEI의 혼합 용액을 배양 플라스크를 진탕시키면서 배양 플라스크에 천천히 떨어뜨리고, 5일 동안 37℃ 및 8% CO2 진탕기에서 배양하였다. 5일 후에 세포의 생존을 관찰하였다. 배양물을 수집하고 10분 동안 3300g으로 원심분리하고, 상층액을 취하였다. 이어서, 상층액을 고속 원심분리하여 불순물을 제거했다. MabSelectTM (GE Healthcare Life Science, 71-5020-91 AE)를 함유하는 중력 컬럼 (Bio-Rad, 7311550)을 PBS (pH 7.4) 완충액으로 평형화하고 2-5배의 컬럼 부피로 세척했다. 상층액 샘플을 컬럼에 통과시키고; 5-10배의 컬럼 부피의 PBS를 사용하여 컬럼을 세척하고, pH 3.5의 0.1 M 글리신을 사용하여 목적하는 단백질을 용출시킨 다음, pH 8.0의 Tris-HCl을 사용하여 중성으로 조절한 후, 한외여과 튜브 (Millipore, UFC901024)를 사용하여 농축시키고 PBS 완충액으로 교환시켜 정제된 재조합 단백질 용액을 얻었다. 최종적으로, NanoDrop (Thermo ScientificTM NanoDropTM One)을 농도를 결정하는데 사용하고, 추후 사용을 위해 정제된 재조합 단백질 용액을 분취하고 저장했다.
[표 2] 스크리닝된 항-PD-L1 단일클론성 하이브리도마 및 이의 재조합 항체의 서열 번호
Figure pct00002
1.4 PD-L1 항체의 서열 분석 및 발현 정제
항체의 중쇄 가변 도메인의 서열은 염색체 상의 중쇄 유전자 그룹의 생식계열 유전자 V, D, J 유전자 단편의 유전자 재배열 및 체세포 과돌연변이(somatic high frequency mutations) 등과 같은 사건으로부터 유래되고; 경쇄 가변 도메인의 서열은 경쇄 유전자 그룹의 V, J 유전자 단편의 유전자 재배열 및 체세포 과돌연변이 등과 같은 사건으로부터 유래된다. 유전자 재배열 및 체세포 과돌연변이는 항체의 다양성을 증가시키는 주요 요인이다. 동일한 생식계열 V 유전자 단편으로부터 유래된 항체 또한 상이한 서열을 생산할 수 있지만, 전반적으로 유사성이 높다. 예컨대, IMGT/DomainGapAlign (http://imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi) 또는 NCBI/IgBLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)와 같은 일부 알고리즘을 사용하여, 항체의 가변 도메인의 서열로부터 유전자 재배열이 일어날 때 가능한 생식계열 유전자 단편을 추측할 수 있다. 실시예 1.3 및 표 2의 항체 서열을 분석하였고, 이의 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)의 생식계열 유전자 V의 유전자 단편을 표 3에 나열하였다.
때때로, 화학적 변형이 세포에서 번역 및 합성 후 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노산 사슬 내에 도입되는데, 이를 번역후 변형(PTM)으로 부른다. 항체의 경우, 일부 PTM 위치는 매우 보존되어 있다. 예를 들면, 인간 IgG1 항체의 불변 도메인에서 위치 297(EU 넘버링)에 있는 보존된 아미노산 아스파라긴 Asn은 글리코실화 변형을 겪어 당 사슬을 형성하는데, 당 사슬의 구조는 항체의 구조 및 이와 관련된 이펙터 기능에 필수적이다. 하지만, 항체의 가변 도메인, 특히 항원 결합 부위(예컨대, CDR)에 PTM이 있는 경우, PTM의 존재는 항원에의 결합에 굉장한 효과를 가질 수 있고, 항체의 물리화학적 성질 또한 변화시킬 수 있다. 예를 들면, 글리코실화, 탈아미드화, 이성질체화, 산화 등은 항체 분자의 불안정성 또는 이종성을 증가시킬 수 있어, 항체 개발의 어려움 및 위험을 증가시킨다. 그러므로, 일부 잠재적인 PTM들을 방지하는 것은 치료학적 항체의 개발에 매우 중요하다. 경험의 축적에 따라, 일부 PTM들이 아미노산 서열의 조성, 특히 인접 아미노산의 조성의 “패턴”과 매우 높은 상관관계가 있음이 발견되었으므로, 잠재적인 PTM들은 단백질의 1차 아미노산 서열로부터 예측될 수 있다. 예를 들면, N-x-S/T (첫 번째 위치는 아스파라긴, 두 번째 위치는 프롤린 이외의 아미노산, 세 번째 위치는 세린 또는 트레오닌)으로부터 N-연결 글리코실화 위치를 예측할 수 있다. PTM을 유발하는 아미노산 서열의 패턴은 생식계열 유전자의 서열로부터 유래할 수 있고(예를 들면, 인간 생식계열 유전자 단편 IGHV3-33은 FR3 부위에 글리코실화 패턴 NST를 자연적으로 가짐); 이는 또한 체세포 과돌여변이로부터 유래할 수 있다. 표 3은 실시예 1.3의 항체 VH 및 VL의 가변 도메인의 예측된 PTM을 나열한다. 특히, NGS 또는 NLT는 글리코실화 위치일 수 있고, DG는 아스파르트산의 이성질체화를 유발할 수 있다.
아미노산 돌연변이에 의해 PTM의 아미노산 서열 패턴이 파괴됨으로써, 특정 PTM의 형성을 감소시키거나 제거될 수 있다. 항체 서열 및 PTM 서열 패턴에 따라, 상이한 돌연변이 설계 방법이 존재한다. 한 방법은 “핫 스팟(hot spot)”아미노산 (예컨대, NS 패턴에서 N 또는 S)을 유사한 물리화학적 성질을 갖는 아미노산으로 대체하는 것이다(예를 들면, N을Q로 대체함). PTM 서열 패턴이 체세포 과돌연변이로부터 유래하고 생식계열 유전자 서열이 존재하지 않는 경우, 또 다른 방법은 서열 패턴을 대응하는 생식계열 유전자 서열로 대체하는 것일 수 있다. 실제 작업시, 동일한 PTM 서열 패턴에 대해 다양한 돌연변이 설계 방법을 사용할 수 있다.
표 4는 실시예 1.3의 잠재적인 PTM 위치를 갖는 6개의 항체들의 서열에서 아미노산 돌연변이에 의해 얻어진 새로운 항체 분자(PTM 변이체라고 함)들을 나열한다. 표 5-1은 본 실시예에서 이러한 PTM 변이체들의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인, 경쇄의 전장 아미노산 서열, 중쇄(인간 IgG1s(N297A))의 전장 아미노산 서열, 및 Chothia 정의 규칙에 따라 정의된 CDR의 아미노산 서열을 나열한다. 모든 설계된 PTM 변이체에 대해, 실시예 1.3에 기재된 방법에 따라 정제된 재조합 항체를 얻었고, 이는 후속 기능 실험에서 추가로 검증되었다.
[표 3] PD-L1 항원 결합 단백질 서열의 생식계열 유전자 분석 및 번역후 변형(PTM) 위치의 분석
Figure pct00003
[표 4] PD-L1 항원 결합 단백질 서열의 돌연변이 위치 설계
Figure pct00004
[표 5-1] PTM 돌연변이 후 얻어진 항체의 서열 번호
Figure pct00005
표 5-2는 본 출원의 실시예들에서 나타난 대조군 항체 PR000151, PR001598 및 PR000265의 Fc-유형 전환 항체(Fc-type switching antibody), 즉 PR000416 분자의 서열 번호를 나열하는데, 여기서, PR000151 은 Roche의 항-PD-L1 항체 아테졸리주맙(atezolizumab)의 유사체이고, PR000151 및 아테졸리주맙은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용될 수 있고; PR001598은 Merck KGaA의 항-PD-L1 항체 아벨루맙(avelumab)의 유사체이고, PR001598 및 아벨루맙은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 항체들을 실시예 1.3의 방법으로 제조 및 정제했다.
[표 5-2] PR000265의 Fc-유형 전환 및 대조군 항체
Figure pct00006
실시예 2 인간/시노몰구스 PD-L1을 과발현하는 세포에의 항원 결합 단백질의 결합 (FACS)
시험관 내(in vitro)에서 인간/시노몰구스 PD-L1에 대한 PD-L1 항원 결합 단백질의 결합 활성을 연구하기 위해, 본 실시예에서 인간 PD-L1을 과발현하는 CHOK1 세포주 (CHO-K1/hPD-L1, Nanjing Genscript, M00543) 또는 시노몰구스 PD-L1을 과발현하는 CHOK1 세포주 (CHO-K1/cynoPD-L1, Nanjing Genscript, M00573)를 사용하여 세포 수준에서 결합 실험을 수행했다. 간략히 말하자면, PD-L1 세포를 분해시키고, F-12K 완전 배지에 재현탁시키고, 세포 밀도를 1 Х 106 세포/ml로 조정하였다. 세포를 100 μL 세포/웰로 96-웰 바닥 플레이트 (Corning, 3894)에 시딩(seeding)한 다음, 최종 농도의 2배 농도인 테스트하고자 하는 항원 결합 단백질의 5배 농도 구배 연속 희석액을 100 μL/웰로 첨가하고, 잘 혼합했으며, 이때, 항원 결합 단백질의 가장 높은 최종 농도는 100 nM이었고, 총 8개의 농도들이 있었다. 동형 항체 hIgG1 iso를 대조군으로 사용했다. 세포를 4℃에 배치하고, 1시간 동안 암흑에서 인큐베이팅했다. 이어서, 100 μL/웰의 사전-냉각한 PBS를 첨가하여 세포를 2회 세척했다. 세포를 5분 동안 4℃에서 500g로 원심분리하고, 상층액을 제거했다. 형광 2차 항체 (염소 항-인간 IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor 488 접합체, Invitrogen, A11013, 1:1000 희석)을 100 μL/웰로 첨가하고, 30분 동안 4℃에서 암흑에서 인큐베이팅했다. 200 μL/웰의 사전-냉각된 PBS를 첨가하여 세포를 2회 세척하고, 세포를 5분 동안 4℃에서 500g로 원심분리하고, 상층액을 제거했다. 최종적으로, 세포를 200 μL/웰의 사전-냉각된 PBS로 재현탁시켰다. BD FACS MAYTOII를 사용하여 형광 발광의 신호값을 판독하고, 소프트웨어 FlowJo v10 (FlowJo, LLC)을 사용하여 데이터를 처리 및 분석했다. 소프트웨어 GraphPad Prism 8을 적용하여 데이터 처리 및 플롯팅 분석을 수행하고, 결합 곡선 및 EC50 값과 같은 매개변수들을 4개의 매개변수 비선형 피팅(fitting)으로 얻었다.
도 1 및 표 6의 결과는 본 출원에 기재된 모든 PD-L1 항원 결합 단백질이 인간 PD-L1에 결합 할 수 있음을 나타내고; 도 2 및 표 7의 결과는 모든 PD-L1 항원 결합 단백질이 시노몰구스 PD-L1에 결합할 수 있음을 나타내며; 상기 결과들은 농도 의존적 효과를 나타냈다.
[표 6] 세포 표면상에 있는 인간 PD-L1에의 결합
Figure pct00007
[표 7] 세포 표면상에 있는 시노몰구스 PD-L1에의 결합
Figure pct00008
실시예 3 인간/시노몰구스 PD-L1 단백질에의 항원 결합 단백질의 결합
본 실시예에서, 효소 결합 면역 흡착법(ELISA)을 통해 단백질에의 PD-L1 항원 결합 단백질의 시험관 내 결합 활성을 연구한다.
3.1 인간 PD-L1 단백질에의 항원 결합 단백질의 결합 (ELISA)
인간 PD-L1 (Acrobiosystems, PD1-H5229)을 2 μg/ml로 PBS 중 희석하고, 웰당 100 μL로 96-웰 플레이트 (Corning 9018)에 첨가하고, 밤새 4℃에서 인큐베이팅했다. 액체를 제거한 후, PBST 완충액 (pH 7.4, 0.05% tween-20 함유)을 사용하여 플레이트를 3회 세척했다. 250 μL의 2% BSA 차단 완충액을 첨가하고, 1시간 동안 37℃의 조건에서 인큐베이팅했다. 차단 완충액을 제거하고, PBST 완충액 (pH 7.4, 0.05% tween-20 함유)을 사용하여 플레이트를 3회 세척했다. 테스트하고자 하는 항원 결합 단백질을 100 nM의 최종 농도에서 시작하여 5배 연속 희석하여, 총 8개의 농도 구배물들을 웰당 100 μL로 첨가하고, 1시간 동안 37℃에서 인큐베이팅했다. 동형 항체 hIgG1 iso를 대조군으로 사용했다. PBST 완충액 (pH 7.4, 0.05% tween-20 함유)으로 3회 세척한 후, 4000배로 희석된 염소 항-인간 HRP 2차 항체 (Invitrogen, A18805)를 첨가하고, 1시간 동안 37℃의 조건에서 암흑에서 인큐베이팅했다. PBST 완충액 (pH 7.4, 0.05% tween-20 함유)으로 3회 세척한 후, 100 μL/웰의 TMB (Biopanda, TMB-S-003)를 첨가하고, 약 5분 동안 실온에서 암흑에 배치하고; 정지 용액(BBI life sciences, E661006-0200)을 각 웰에 50 μL/웰로 첨가하여 반응을 정지시켰다. Microplate Reader Enspire (PerkinElemer)를 사용하여 450 nm에서 흡광도 값(OD450)을 검출했다. 소프트웨어 GraphPad Prism 8을 적용하여 데이터 처리 및 플롯팅 분석을 수행하고, 결합 곡선 및 EC50 값과 같은 매개변수들을 4개의 매개변수 비선형 피팅으로 얻었다.
도 3 및 표 8은 본 출원의 모든 PD-L1 항원 결합 단백질이 인간 PD-L1 단백질에 결합할 수 있고, PTM 변이체들은 여전히 모 항체의 결합 활성을 보유하는 것을 나타낸다.
[표 8] 인간 PD-L1 단백질에의 결합
Figure pct00009
3.2 시노몰구스 PD-L1 단백질에의 항원 결합 단백질의 결합 (ELISA)
시노몰구스 PD-L1 (Acrobiosystems, PD1-C52H4)을 2 μg/ml로 PBS 중 희석하고, 웰당 100 μL로96-웰 플레이트 (Corning 9018)에 첨가하고, 밤새 4℃에서 인큐베이팅했다. 액체를 제거한 후, PBST 완충액으로 플레이트를 3회 세척했다. 250 μL의 2% BSA를 차단을 위해 첨가하고, 1시간 동안 실온의 조건에서 인큐베이팅했다. 차단 완충액을 제거하고, PBST 완충액 (pH 7.4, 0.05% tween-20 함유)을 사용하여 플레이트를 3회 세척했다. 테스트하고자 하는 항원 결합 단백질의 농도를 5 μg/mL로 희석하고, 웰당 100 μL로 첨가하고, 1시간 동안 37℃에서 인큐베이팅했다. PBST 완충액 (pH 7.4, 0.05% tween-20 함유)으로 3회 세척한 후, 4000배로 희석된 염소 항-인간 HRP 2차 항체 (Invitrogen, A18805)를 첨가하고, 1시간 동안 37℃에서 인큐베이팅했다. 세척 후, TMB (Biopanda, TMB-S-003)를 100 μL/웰로 첨가하고, 5분 동안 실온에서 암흑에 배치하고; 정지 용액 (BBI life sciences, E661006-0200)을 각 웰에 50 μL/웰로 첨가하여 반응을 정지시켰다. Microplate Reader Enspire (PerkinElemer)를 사용하여 450 nm에서 흡광도 값(OD450)을 검출했다.
상기 결과는 도 4에 나타나고, 본 출원의 모든 PD-L1 항원 결합 단백질이 시노몰구스 PD-L1 단백질에 결합할 수 있음을 나타낸다.
실시예 4 본 항원 결합 단백질은 인간 PD-L1을 과발현하는 CHO-K1 세포에의 인간 PD-1의 결합을 차단한다.
시험관 내에서 인간 PD-L1에의 PD-1의 결합을 차단하는 인간 PD-L1 결합 단백질의 활성을 연구하기 위해, 인간 PD-L1을 과발현하는 CHOK1 세포주 (CHO-K1/hPD-L1, Nanjing Genscript, M00543)를 사용하여 세포 수준에서 인간 PD-1/인간 PD-L1 결합을 차단하는 실험을 수행했다. 간략히 말하자면, CHO-K1/hPD-L1 세포를 분해시키고, F-12K 완전 배지에 재현탁시켰다. 세포 밀도를 1 Х 106 세포/ml로 조정하였다. 세포를 100 μL 세포/웰로 96-웰 V 바닥 플레이트 (Corning, 3894)에 시딩한 다음, 최종 농도의 2배 농도인 테스트하고자 하는 항원 결합 단백질의 3배 농도 구배 연속 희석액을 첨가하고, 잘 혼합했으며, 이때, 항원 결합 단백질의 가장 높은 최종 농도는 100 nM이었고, 총 8개의 농도들이 있었다. 동형 항체 hIgG1 iso를 대조군으로 사용했다. 세포를 4℃에 배치하고, 1시간 동안 암흑에서 인큐베이팅했다. 이어서, 세포를 5분 동안 4℃에서 원심분리하고, 상층액을 제거했다. 이어서, 1 μg/mL의 비오틴-표지된 인간 PD-1 단백질 (Acrobiosystems, PD1-H82F2)을 50 μL/웰로 첨가하고, 30분 동안 4℃에서 암흑에서 인큐베이팅했다. 100 μL/웰의 사전-냉각한 PBS 로 세포를 2회 세척하고, 5분 동안 4℃에서 500g로 원심분리하고, 상층액을 제거했다. 100 μL/웰의 형광 2차 항체 PE 스트렙트아비딘 (BD Pharmingen, 554061, 1:200 희석)을 첨가하고, 30분 동안 4℃에서 암흑에서 인큐베이팅했다. 200 μL/웰의 사전-냉각된 PBS를 첨가하여 세포를 2회 세척하고, 세포를 5분 동안 4℃에서 500g로 원심분리하고, 상층액을 제거했다. 최종적으로, 200 μL/웰의 사전-냉각된 PBS를 사용하여 세포를 재현탁시켰다. BD FACS MAYTOII를 사용하여 형광 발광의 신호값을 판독했다. 소프트웨어 GraphPad Prism 8을 적용하여 데이터 처리 및 플롯팅 분석을 수행하고, 결합 곡선 및 IC50 값과 같은 매개변수들을 4개의 매개변수 비선형 피팅으로 얻었다.
도 5 및 표 9는 본 출원에 기재된 PTM 돌연변이 전의 모든 항원 결합 단백질이 세포 표면 상의 인간 PD-L1에 대한 인간 PD-1의 결합을 차단할 수 있음을 나타내고; 도 6 및 표 10은 본 출원에 기재된 모든 PTM 변이체의 항원 결합 단백질이 세포 표면상의 인간 PD-L1에 대한 인간 PD-1의 결합을 차단할 수 있음을 나타내고; 상기 차단 능력은 아테졸리주맙 유사체와 필적한다.
[표 9] 세포 표면상의 인간 PD-L1에 대한 인간 PD-1 결합 차단
Figure pct00010
[표 10] 세포 표면상의 인간 PD-L1에 대한 인간 PD-1 결합 차단
Figure pct00011
실시예 5 본 항원 결합 단백질은 리간드 단백질에의 인간 PD-L1 단백질의 결합을 차단한다
본 실시예는 효소 결합 면역 흡착법 (ELISA)을 사용하여 PD-L1 항원 결합 단백질이 시험관 내에서 리간드 단백질 PD-1 또는 CD80에의 인간 PD-L1 단백질의 결합을 차단하는 능력을 연구한다.
5.1 본 항원 결합 단백질은 인간 PD-1에의 인간 PD-L1의 결합을 차단한다 (ELISA)
인간 PD-L1 (Acrobiosystems, PD1-H5229)을 2 μg/ml로 PBS 중 희석하고, 웰당 100 μL로96-웰 플레이트 (Corning 9018)에 첨가했다. 플레이트를 밤새 4℃에서 코팅했다. 액체를 제거한 후, PBST 완충액 (pH 7.4, 0.05% tween-20 함유)을 사용하여 플레이트를 3회 세척하고, 250 μL의 2% BSA 차단 완충액을 첨가하고, 1시간 동안 37℃의 조건에서 인큐베이팅했다. 차단 완충액을 제거하고, PBST 완충액 (pH 7.4, 0.05% tween-20 함유)을 사용하여 플레이트를 3회 세척했다. 테스트하고자 하는 항원 결합 단백질을 상이한 농도 구배로 0.5% (w/v) BSA 함유 PBST 중 희석시키고, 0.6 μg/mL의 인간 PD-1-Biotin 단백질 (Acrobiosystems, EP-101-96tests, A002-214)과 혼합한 후에, 웰 플레이트에 첨가했다. 동형 항체 hIgG1 iso를 대조군으로 사용했다. 이들을 1시간 동안 37℃의 조건 하에서 인큐베이팅했다. 3회 세척 후, 100 μL의 스트렙트아비딘-HRP (Acrobiosystems, EP-101-96tests, A003-214)를 각 웰에 첨가하고, 37℃의 조건 하에서, 1시간 동안 암흑에서 반응시켰다. 3회 세척 후, 100 μL의 TMB 발색-기질 용액을 첨가하고, 5분 동안 실온에서 발색 반응을 위해 암흑에 두었다. 정지 용액을 첨가하여 반응을 정지시켰다. Microplate Reader Enspire (PerkinElemer)를 사용하여 450 nm에서 흡광도 값(OD450)을 검출했다. 소프트웨어 GraphPad Prism 8을 적용하여 데이터 처리 및 플롯팅 분석을 수행하고, 결합 곡선 및 IC50 값과 같은 매개변수들을 4개의 매개변수 비선형 피팅으로 얻었다.
도 7 및 표 11은 본 출원에 기재된 항원 결합 단백질이 인간 PD-L1 단백질에의 인간 PD-1의 결합을 차단할 수 있음을 나타내고; 상기 차단 능력은 아테졸리주맙 유사체와 필적한다.
[표 11] 인간 PD-L1 단백질에의 인간 PD-1의 결합 차단
Figure pct00012
5.2 본 항원 결합 단백질은 인간 B7-1(CD80)에의 인간 PD-L1의 결합을 차단한다 (ELISA)
인간 PD-L1-hFc 단백질 (Acrobiosystems, PD1-H5258)을 1 μg/ml로 PBS 중 희석하고, 웰당 100 μL로96-웰 플레이트 (Corning 9018)에 첨가했다. 플레이트를 밤새 4℃에서 코팅했다. 액체를 제거한 후, PBST 완충액 (pH 7.4, 0.05% tween-20 함유)을 사용하여 플레이트를 3회 세척하고, 250 μL의 2% BSA 차단 완충액을 첨가하고, 1.5시간 동안 37℃의 조건 하에서 인큐베이팅했다. 차단 완충액을 제거하고, PBST 완충액 (pH 7.4, 0.05% tween-20 함유)을 사용하여 플레이트를 3회 세척했다. 테스트하고자 하는 항원 결합 단백질을 상이한 농도 구배로 0.5% (w/v) BSA 함유 PBST 중 희석시키고, 10 μg/mL의 인간 B7-1-비오틴 단백질 (Acrobiosystems, B71-H82F2)과 혼합한 후에, 웰 플레이트에 첨가했다. 동형 항체 hIgG1 iso를 대조군으로 사용했다. 이들을 1.5시간 동안 37℃의 조건 하에서 인큐베이팅했다. 3회 세척 후, 100 μL의 스트렙트아비딘-HRP (SIGMA, S2438)를 각 웰에 첨가하고, 1시간 동안 37℃의 조건 하에서 암흑에서 반응시켰다. 3회 세척 후, 100 μL의 TMB 발색-기질 용액을 첨가하고, 실온에서 5분 동안 발색 반응을 위해 암흑에 두었다. 정지 용액을 첨가하여 반응을 정지시켰다. Microplate Reader Enspire (PerkinElemer)를 사용하여 450 nm에서 흡광도 값(OD450)을 검출했다. 소프트웨어 GraphPad Prism 8을 적용하여 데이터 처리 및 플롯팅 분석을 수행하고, 결합 곡선 및 IC50 값과 같은 매개변수들을 4개의 매개변수 비선형 피팅으로 얻었다.
도 8 및 표 12는 본 출원에 기재된 모든 항원 결합 단백질이 인간 PD-L1 단백질에의 인간 B7-1 (CD80)의 결합을 차단할 수 있음을 나타낸다.
[표 12] 인간 PD-L1에의 인간 B7-1 (CD80) 결합 차단
Figure pct00013
실시예 6 보고 유전자 세포주를 사용한, PD-1 신호전달 경로에 대한 본 항원 결합 단백질의 억제 효과 검출
인간 PD-L1 및 OS8 (CD3 단일 사슬 항체 막관통 단백질)을 공동-발현하는 Hep3B 세포 (ChemPartner (Shanghai)에 의해 제작)을 100 μL/웰 및 1.25Х104/웰의 세포양으로 96-웰 플레이트에 시딩했다. 세포를 밤새 5% CO2의 조건 하에서 37℃에서 인큐베이팅했다. 상층액을 제거하고, 100 nM의 초기 농도에서 시작하여 5배 희석한, 테스트하고자 하는 항원 결합 단백질의 희석액 50 μL/웰을 첨가했다. 동형 항체 hIgG1 iso를 대조군으로 사용했다. PD-1 및 NFAT 루시퍼라제 보고 유전자를 계속적으로 발현할 수 있는 5Х104/웰의 Jurkat보고 유전자(ChemPartner (Shanghai)에 의해 제작)을 50 μL/웰로 첨가했다. 6시간 동안 5% CO2 조건 하에서 37℃에서 플레이트를 인큐베이팅했다. ONE-GloTM 루시퍼라제 시약 (Promega, Cat. No. E6110)을 첨가하고, 5분 동안 실온에서 인큐베이팅한 다음, Microplate Reader를 사용하여 발광값을 검출했다.
도 9 및 표 13, 및 도 10 및 표 14는 본 출원에 기재된 항원 결합 단백질이 PD-1 신호전달 경로에 억제 효과를 가지고 있고; PR000071를 제외하고, 다른 분자들의 PD-1 신호전달 경로에 대한 억제는 아테졸리주맙 유사체와 필적한다.
[표 13] PD-1 신호전달 경로에 대한 억제 효과
Figure pct00014
[표 14] PD-1 신호전달 경로에 대한 억제 효과
Figure pct00015
실시예 7 BLI 방법을 사용한 본 항원 결합 단백질 및 인간 PD-L1의 친화도 결정
7.1 본 항원 결합 단백질 및 인간 PD-L1의 해리 상수의 결정, 및 단일 농도에서 항원의 해리율 비교
히스티딘 태그를 갖는 인간 PD-L1 단백질을 제조업체 Novo Protein로부터 구입했고(Cat. No. C315); 테스트 완충액은 항원 및 항체의 친화도 및 희석을 테스트하기 위한 1Х역학 완충액(kinetic buffer) (10 Х 역학 완충액 (ForteBio, Cat. No. 18-1105)으로부터 희석함)이었고; 생물층 간섭계(BLI) 기술 및 옥텟 분자 상호작용 분석측정기 (ForteBio, Octet Red96e)를 사용하여 항원 및 항체 사이의 결합 역학을 분석했다.
항원 및 항체의 친화도를 결정할 때, 센서의 회전 속도는 1000 rpm이었다. 먼저, 컬럼에 배치된 2개의 AHC 센서들을 10분 동안 테스트 완충액에서 평형화한 다음, AHC 센서들을 사용하여 테스트하고자 하는 항원 결합 단백질을 0.9-1.1 nm의 포획 높이로 포획했다. 이어서, AHC 센서들을 2분 동안 테스트 완충엑에서 평형화했다. 이후, AHC 센서들을 3분 동안 항원(60 nM 및 0 nM)에 결합시키고, 최종적으로 15분 동안 해리시켰다. 센서들에 결합된 단백질을 용출시켜 재생하기 위해 AHC 센서들을 10mM 글리신 (pH 1.5) 용액에 담갔다.
데이터 분석을 위한 옥텟 데이터 분석 소프트웨어 (Fortebio, 버전 11.0)를 사용할 때, 단일 공제 모드 (참조 웰)를 선택하여 참조 신호를 공제하고, 데이터 피팅을 위해 "1:1 Local/full fitting" 방법을 선택하고, 항원 및 항체 결합의 역학 매개변수들을 계산하였고, kon (1/Ms) 값, kdis (1/s) 값 및 KD (M) 값을 얻었다.
결과는 도 11ab 및 표 15-1에 나타나고, PR000265 및 PR000266 둘 모두 PD-L1과 높은 친화도를 갖는다.
[표 15-1] 본 항원 결합 단백질과 인간 PD-L1의 친화도
Figure pct00016
7.2 본 항원 결합 단백질 및 인간 PD-L1 (다중-농도 항원)의 결합 상수 및 친화도 결정
실시예 7.1의 방법에 따라, 항원 (다중-농도) 및 항체의 친화도를 결정하였다. 항원 (다중-농도) 및 항체의 친화도를 결정할 때, 센서의 회전 속도는 1000rpm이었다. 먼저, 2개의 컬럼의 AHC 센서들 (8개의 센서들을 각 컬럼에 배치하였고; 제1 컬럼의 센서들을 참조 AHC 센서라고 하고, 제2 컬럼의 센서들을 테스트 AHC 센서라고 함)을 10분 동안 테스트 완충액에서 평형화했다. 이어서, 8개의 테스트 AHC 센서들을 사용하여 30s의 포획시간, 약 0.7 nm의 포획 높이로 테스트하고자 하는 항원 결합 단백질(40nM의 농도)을 포획하고; 2분 동안 테스트 완충액에서 8개의 테스트 AHC 센서들을 평형화한 후, 이들을 연속 희석한 항원 단백질에 결합시켰고(예를 들면, 항원 농도는 50-1.56 nM에서 시작하여 2배로 구배 희석되거나 0 nM일 수 있음) - 여기서 8개의 센서들은 최대 8개의 상이한 농도의 항원에 담글 수 있음 - ; 5분 동안 항원에 결합시킨 다음, 15분 동안 해리시켰고; 최종적으로, 센서들에 결합된 단백질을 용출시켜 재생하기 위해 AHC 센서들을 10mM 글리신 (pH 1.5) 용액에 담갔다. 참조 AHC 센서의 실험 절차는 테스트 AHC 센서의 실험 절차와 동일하고, 첫 번째 단계에서만 차이가 있는데, 이는 8개의 참조 AHC 센서를 테스트하고자 하는 분자 없이 테스트 완충액에 30초 동안 담그는 것이다.
데이터 분석을 위해 옥텟 데이터 분석 소프트웨어 (Fortebio, version 11.0)를 사용할 때, 이중 공제 모드(이중 참조)를 선택하여 참조 신호를 공제하고, 데이터 피팅을 위해 "1:1 Global fitting" 방법을 선택하고, 항원 및 항원 결합 단백질 결합의 역학 매개변수들을 계산하였고, kon (1/Ms) 값, kdis (1/s) 값 및 KD (M) 값을 얻었다.
결과는 도 11cde 및 표 15-2에 나타나고, PR000265 및 PD-L1의 친화도는 PR000151 (아테졸리주맙 유사체) 및 PROO1598 (아벨루맙 유사체)보다 높았다.
[표 15-2] 본 항원 결합 단백질 및 인간 PD-L1의 친화도
Figure pct00017
실시예 8 BLI 방법을 사용한 PD-L1에의 본 항원 결합 단백질 결합의 에피토프 경쟁 결정
먼저, 비오틴화 키트(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, ThermoFisher, A39257)를 사용하여 인간 PD-L1 단백질 (NovoProtein, C315)을 지침의 요구사항에 따라 비오틴화했다. 이어서, ForteBio Octet 플랫폼을 사용하여 얻어진 항원 결합 단백질과 PR000151 (아테졸리주맙 유사체) 및 PR001598 (아벨루맙 유사체)에 대한 에피토프 경쟁 실험을 수행했다. 단계 1, 항체의 100% 신호를 얻는다: SA 센서를 사용하여 비오틴화된 PD-L1 단백질을 0.25 nm의 포획 높이로 포획한다. 센서를 500s 동안 항체 (50 nM) 중 담그고, PD-L1에의 항체 결합의 최종 신호를 이 항체의 100% 신호로 기록했다. 단계 2, 에피토프 경쟁 실험: SA 센서를 사용하여 비오틴화된 PD-L1 단백질을 0.25 nm의 포획 높이로 포획한다. 센서를 500s 동안 제1 항체 (50 nM) 중 담근 다음, Sa 센서를 500s 동안 제1 항체 및 제2 항체의 혼합물(두 항체의 최종 농도는 50 nM이었음)에 담그고, 최종 신호를 제2 항체의 신호로 기록했다. 하기 공식으로 억제율을 계산했다,
억제율 (%) = (A - B) / A * 100
A: 특정 항체의 100% 신호 (단계 1에서 얻음), B: 2차 항체로서 항체의 신호 (단계 2에서 얻음).
얻어진 억제율이 85 (%) 초과인 경우, 이는 2개의 항체들에 의해 결합되는 에피토프들이 완전히 중첩되는 것을 의미하고; 억제율이 85 (%) 미만인 경우, 이는 2개의 항체들에 의해 결합되는 에피토프들이 완전히 중첩되지 않음을 의미한다.
이 중에서, 항체 PR000416은 본 출원에 기재된 항원 결합 단백질 PR000265의 중쇄 불변 부위를 돌연변이를 가지지 않는 인간 IgG1 불변 부위로 대체하여 얻은 것이다.
결과는 PR000265 (또는 PR000416)의 에피토프 및 대조군 항체 PR000151 또는 PR001598의 에피토프가 완전히 중첩되지 않음을 나타냈고, 표 16-1 및 표 16-2을 참조한다.
[표 16-1] 본 항원 결합 단백질의 에피토프 경쟁
Figure pct00018
[표 16-2] 본 항원 결합 단백질의 에피토프 경쟁
Figure pct00019
실시예 9 본 항원 결합 단백질은 혼합 림프구 반응(MLR)에서 사이토카인의 분비를 자극한다
Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare, 17144002)를 사용하여 제1 공여자의 전혈로부터 PBMC 세포를 분리하였고, 재조합 인간 IL-4(R&D Systems, 204-GMP) 및 재조합 인간 GM-CSF(R&D Systems, 215)를 첨가하여 6일 동안 유도한 후,. 미성숙 인간 CD14+ 수지상 세포(iDC 세포)를 얻었고; 이어서, 1㎍/ml 리포다당류(리포다당류, LPS; Sigma, L2630)를 첨가하고, 24시간 동안 유도를 수행하고, 성숙 수지상 세포 (mDC 세포)를 얻었다. 계속 첨가 세포). T 세포 분리 키트(StemCell, 17951)를 사용하여 제2 공여자의 PBMC 세포로부터T 림프구를 분리하여 얻었다. 1Х105/웰의 T 림프구 및 1Х104/웰의 mDC 세포를 10:1의 비로 96웰 플레이트에 시딩하고, 각 항원 결합 단백질 및 대조군 항체 10㎍/ml를 첨가하고, 10배 또는 상응하는 배수로 희석하였다. 이들을 5일 동안 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 인큐베이팅하였다. 상층액을 각각 72시간 후 및 120시간 후에 수집하였다. 72시간 후의 상층액의 IL-2 수준은 IL2 ELISA 키트(Thermo, 88-7025-88)를 사용하여 검출하고, 120시간 후의 상층액의 IFN-γ 수준은 IFN-γ ELISA 키트(Thermo, 88-7316-88)를 사용하여 검출했다. 특정 작업에 대해 시약 지침을 참조했다.
본 실시예에서, 4 공여자들의 PBMC를 혼합 림프구 반응 (MLR)을 위해 2개의 그룹의 공여자 쌍으로 나누었다. 결과는 도 12ab 및 도12cd에 나타난다. 2개의 독립적인 MLR 실험에서, 모든 항원 결합 단백질은 활성화된 T 림프구에 의해 사이토카인 IL-2 및 IFN-γ의 분비를 향상시킬 수 있었다.
실시예 10 항체-의존성 세포독성 실험
본 실시예는 항체 의존성 세포독성(ADCC)을 측정한다. 본 실시예에서, PBMC를 이펙터 세포로 사용하고, PD-L1의 높은 발현을 갖는 다양한 유형의 종양 세포주를 표적 세포로 사용했다(예컨대, MDA-MB-231 세포(ATCC, HTB-26), NCI-H292 세포(ATCC), CRL-1848)). 구체적으로, 신선한 PBMC를 원심분리하여 상층액을 제거하고, 10% FBS-RPMI1640 배지에 재현탁시키고, 37℃ 인큐베이터에서 밤새 인큐베이팅했다. 이어서, PBMC 세포를 수집하고, 원심분리하여 상청액을 제거하고, 2% FBS-RPMI1640 배지에 재현탁시키고, 계수하고, 세포 밀도를 1 x 107/ml로 조정하고, PBMC를 50μl/웰로 U-모양 바닥 96-웰 플레이트에 첨가했다. 표적 세포를 수집하고, 원심분리하여 상층액을 제거하고, 2% FBS-RPMI1640 배지에 재현탁시키고, 계수한 다음, 세포 밀도를 4Х105 /ml로 조정하고, 표적 세포를25μl/ ml로 U-모양 바닥 96-웰 플레이트에 첨가했다. 이펙터 세포 및 표적 세포의 비는 50:1이었다. 항체를 중간 농도로 희석하였는데, 1.6 nM의 초기 농도에서 5배 연속 희석하여 총 3개의 농도들을 얻었다. 샘플을 25μl/웰로 U-모양 바닥 96-웰 플레이트에 첨가하고, 샘플의 최종 출발 농도는 0.4nM이었다. 세포 플레이트를 인큐베이터에 배치하여 3.5시간 동안 인큐베이팅했다. 10μl의 용해 완충액을 표적 세포 최대 방출 웰 및 부피 참조 웰에 첨가하고, 30분 동안 계속 인큐베이팅하였는데, 세포 및 샘플을 함께 인큐베이팅하는 총 시간은 4시간이었다. 50 μl/웰의 상층액을 투명한 평평한 바닥의 96-웰 플레이트에서 꺼내고 Promega LDH 키트(Promega LDH-Glo TM, J2380)의 검출 시약을50 μl/웰로 첨가하였다. 이들을 20분 동안 실온에서 인큐베이팅한 후, 반응 정지 용액 50μl를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 OD450nm에서 흡광도값을 판독했다. 하기 공식에 따라 세포독성을 계산했다.
세포독성 (%) = ( ( ER - CMB ) - ( ESR - CMB ) - ( TSR - CMB ) ) / ( TMR -VCC ) Х 100%
여기서:
ER = 실험 웰, 샘플 + 이펙터 세포 + target cells
ESR = 이펙터 세포 자발적 방출 웰, 이펙터 세포 + 배양 배지
TSR = 표적 세포 자발적 방출 웰, 표적 세포 + 배양 배지
TMR = 표적 세포 최대 방출 웰, 표적 세포 + 배양 배지 + 용해 완충액
VCC = 부피 참조 웰, 배양 배지 + 용해 완충액
CMB = 배양 배지 참조 웰, 배양 배지
본 실시예에서 3 공여자 및 2개의 종양 세포주들을 총 6개의 독립적인 ADCC 실험들에 사용했다. 상기 결과는 도 13 (A-F)에 나타난다. PR000416 (PR000416은 PR000265를 돌연변이를 가지지 않는 인간 IgG1 불변 부위로 대체하여 얻은 항체임)은 PR001598 (아벨루맙 유사체)보다 강력한 ADCC 효과를 갖는다.
실시예 11 본 항원 결합 단백질의 생체 내 종양 억제 활성
MC38-hPD-L1(인간 PD-L1을 과발현하는 MC38 세포) 결장암 세포 5Х105 세포 /0.1 mL를 암컷 B-hPD-1 인간화된 마우스(Biocytometer)의 우측에 피하 접종하였다. 종양이 약 118mm3까지 성장했을 때, 마우스를 종양 부피에 따라 무작위로 그룹으로 나누었다. 총 5개의 그룹이고, 각 그룹에 10마리의 마우스가 있으며, 즉 하기와 같다: 인간 IgG1(3 mg/kg, 인간 IgG1 동형 대조군), PR000151(3 mg/kg, 아테졸리주맙 저용량 투여군), PR000151(10mg/kg, 아테졸리주맙 고용량 투여군), PR000265(3mg/kg, 본 출원의 항체 저용량 투여군) 및 PR000265(10mg/kg, 본 출원의 항체 고용량 투여군). 투여 경로는 2일에 1회 복강내 주사하여 총 13회 투여(q2dx13)하였다. 종양 부피 및 체중은 주 2회 측정하였고, 마우스의 체중 및 종양 부피를 기록하였다.
그룹 내 투여 20일차에, hIgG1 대조군의 종양 부피는 1359±171 mm3이었다. 3 mg/kg 및 10 mg/kg의 용량에서 항-PD-L1 항체 PR000151의 종양 부피는 각각 898 ± 233 mm3 및 741 ± 203 mm3이었고, TGI는 각각 33.9% 및 45.5%이었다. 3 mg/kg 및 10 mg/kg의 용량에서 항-PD-L1 항체 PR000265의 종양 부피는 각각 881 ± 169 mm3 및 1035 ± 472 mm3이었고, TGI는 각각 35.1% 및 23.8%이었다. 그룹 내 투여 24일차에, 인간 IgG1 대조군의 종양 부피는 1876 ± 203 mm3이었다. 3 mg/kg 및 10 mg/kg의 용량에서 항-PD-L1 항체 PR000151의 종양 부피는 각각 1349 ± 306 mm3 및 949 ± 266 mm3이었고, TGI는 각각 28.1% 및 49.4%이었다. 3 mg/kg 및 10 mg/kg의 용량에서 항-PD-L1 항체 PR000265의 종양 부피는 각각 1228 ± 187 mm3 및 937 ± 225 mm3이었고, TGI는 각각 34.5% 및 50.1%이었다. PR000151및 PR000265 둘 모두 3mg/kg 및 10mg/kg의 용량에서 유의한 종양 억제 효과를 가졌고, hIgG1과 비교하여 통계적 차이가 있었다(P<0.05). PR000151 및 PR000265의 효능은 유사하였고, 이들 그룹 간에 통계적 차이는 없었다(P>0.05).
결과는 도 14에 나타난다. PR000151 및 PR000265 둘 모두 종양 억제 효과를 가지고 있다. 실험 동안, 각 그룹의 동물 모두의 체중은 증가하여, 이는 동물들이 테스트 제품을 잘 견딘 것을 나타냈다. 동물에서 유의한 독성 효과는 없었고 우수한 안정성을 가졌다.
실시예 12 항-PD-L1 및 항-TGFB 이기능성 융합 단백질의 제조 및 특성화
12.1 융합 단백질 분자의 제작
실시예 1에서 얻은 항원 결합 단백질의 C-말단에 인간 TGFB 수용체(TGFBRII)의 세포외 부위 서열을 적절한 길이의 플렉서블 펩티드 절편 (링커)를 통해 융합시켜 이기능성 융합 단백질 분자를 제작하였다. 폴리펩티드 서열을 코딩하는 플라스미드로 포유동물 숙주 세포(예컨대, HEK293 또는 ExpiCHO)를 형질감염시켰다. 실시예 1.3에 기재된 방법을 사용하여 융합 단백질의 재조합적 발현 및 정제를 수행했다. 본 출원의 융합 단백질 PR001487, PR001488, PR001901, PR001902, PR002247, PR002248, PR002249 및 PR002251을 얻었고, 각 부분의 구조를 표 17에 나타냈다. 항체 경쇄, 항체 중쇄 및 각 도메인의 서열 번호를 표 18에 나타내었다. 또한, 단백질 분자 M7824(bintrafusp alfa 유사체인 PR001599로도 지칭됨), 단백질 분자 Hengrui 융합 단백질 9(PR002466으로도 지칭됨, 이의 서열은 특허 WO2018205985A1에서 유래), 및 TGFBRII Trap(PR002040으로도 지칭됨, 항-닭 라이소자임 항체 클론 TEL16 서열을 및 TGFBRII 세포외 부위의 절단된 서열과 융합하여 얻음)을 본 실시예에서 대조군으로 사용했고, 이들 각 부분의 구조 및 서열 번호를 표 17 및 표 18에 나타냈다.
[표 17] 본 출원의 융합 단백질 각 부분의 구조
Figure pct00020
[표 18] 본 출원의 융합 단백질의 서열 번호
Figure pct00021
12.2 HPLC-SEC을 사용한 단백질 순도 및 폴리머 분석
분석용 분자 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 단백질 샘플의 순도 및 응집체 형태를 분석했다. 분석 컬럼 TSKgel G3000SWxl(Tosoh Bioscience, 08541, 5μm, 7.8mm x 30cm)을 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)(모델명: Agilent Technologies, Agilent 1260 Infinity II)에 연결하고 적어도 1시간 동안 실온에서 PBS 완충액으로 평형화했다. 실온에서 1시간. 적절한 양의 단백질 샘플(적어도 10μg, 샘플 농도는 1mg/ml로 조정)을 0.22μm 여과막으로 여과한 다음 시스템에 주입하고, HPLC 프로그램을 하기와 같이 설정하였다: PBS (pH 7.4 ) 완충액 중 샘플을1.0ml/min의 유속으로 크로마토그래피 컬럼에 흘려보내고, 최장 시간은 20분이고, 검출 파장은 280nm이었다. 수집 후, ChemStation 소프트웨어를 사용하여 크로마토그램을 통합하고 관련 데이터를 계산하여, 샘플에서 다양한 분자 크기의 성분의 체류 시간(retention time)을 보고하는 분석 보고서를 생성했다.
12.3 HPLC-HIC를 사용한 단백질 순도 및 소수성 분석
분석용 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)를 사용하여 단백질 샘플의 순도 및 소수성을 분석했다. 분석 컬럼 TSKge1Buty1-NPR(Tosoh Bioscience, 14947, 4.6mm x 3.5cm)을 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)(모델명: Agilent Technologies, Agilent 1260 Infinity II)에 연결하고 적어도 1시간 동안 실온에서 PBS 완충액으로 평형화했다. 설정 방법을 16분 내에 100% 이동상 A(20mM 히스티딘, 1.8M 황산 암모늄, pH 6.0)에서 100% 이동상 B(20mM 히스티딘, pH 6.0)까지의 선형 구배로 설정하고, 유속을 0.7ml/분으로 설정하고, 단백질 샘플 농도는 1mg/ml, 주사 부피는 20μl, 검출 파장을 280nm이었다. 수집 후, ChemStation 소프트웨어를 사용하여 크로마토그램을 통합하고 관련 데이터를 계산하고 샘플에서 다양한 분자 크기의 성분의 체류 시간을 보고하는 분석 보고서를 생성했다.
12.4 DSF를 사용한 단백질 분자의 열안정성 결정
시차 주사 형광측정법(Differential Scanning Fluorimetry; DSF)은 단백질 열 안정성을 결정하기 위해 일반적으로 사용되는 고처리량 방법이다. 이는 Real-Time 형광 정량 PCR 기기를 사용하여 접혀지지 않은(unfolded) 단백질 분자에 결합된 염료의 형광 강도의 변화를 모니터링함으로써 단백질 변성 과정을 반영하여, 단백질 분자의 열적 안정성을 반영한다. 본 실시예에서 DSF 방법은 단백질 분자의 열 변성 온도(Tm)를 결정하는 데 사용되었다. 10㎍의 단백질을 96-웰 PCR 플레이트(Thermo, AB-0700/W)에 첨가한 다음, 2μl의 100X 희석된 염료 SYPROTM(Invitrogen, 2008138)을 첨가하고, 이어서 완충액을 첨가하여 웰당 최종 부피 40μl로 만들었다. PCR 플레이트를 밀봉하고, real-time 형광 정량 PCR 기기(Bio-Rad CFX96 PCR System)에 배치하고, 5분 동안 25°C에서 인큐베이팅한 다음, 0.2°C/0.2분의 기울기로 25°C에서 95°C로 온도를 점진적으로 높였고, 테스트 종료시 온도를 25°C로 낮추었다. FRET 스캐닝 모드를 사용하고 Bio-Rad CFX Maestro 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 샘플의 Tm을 계산했다.
12.5 융합 단백질의 발현 및 특성화 분석
실시예 12.1에서 얻은 융합단백질의 발현 및 물리화학적 성질을 표 19에 나타냈다. 결과는 PR001488 및 PR001902가 대조군 단백질 PR002466 및 PR001599보다 높은 수율을 갖고, PR001488 및 PR001902가 대조군 단백질 PR001599보다 우수한 친수성을 가지는 것을 나타냈다 (HPLC-HIC에서 더 짧은 체류 시간으로 나타남). 일반적으로, PR001488 및 PR001902는 PR001599보다 더 안정적인 물리화학적 성질을 나타냈다.
[표 19] 융합 단백질의 발현 및 물리화학적 성질
Figure pct00022
실시예 13 인간 PD-L1을 과발현하는 CHO-K1 세포에의 융합 단백질의 결합
실시예 2의 방법에 따라, 인간 PD-L1에의 본 출원에 기재된 융합 단백질의 시험관 내 결합 활성을 테스트하였다.
도 15 (A) 및 표20-1, 및 도 15 (B) 및 표 20-2는 본 출원에 기재된 모든 융합 단백질이 인간 PD-L1을 과발현하는 CHO-K1 세포에 결합할 수 있음을 나타낸다.
[표 20-1] 세포 표면상에 있는 인간 PD-L1에의 결합
Figure pct00023
[표 20-2] 세포 표면상에 있는 인간 PD-L1에의 결합
Figure pct00024
실시예 14 본 융합 단백질은 인간 PD-L1을 과발현하는 CHO-K1 세포에의 인간 PD-1의 결합을 차단한다
실시예 4의 방법에 따라, 인간 PD-L1에의 인간 PD-1의 결합을 차단하는데 본 출원에 기재된 융합 단백질의 시험관 내 활성을 테스트하였다.
도 16 (A) 및 표 21-1, 및 도 16 (B) 및 표 21-2는 본 출원에 기재된 모든 융합 단백질이 인간 PD-L1을 과발현하는 CHO-K1 세포에의 인간 PD-L1의 결합을 차단할 수 있음을 나타낸다.
[표 21-1] 세포 표면상에 있는 인간 PD-L1에의 인간 PD-1 결합 차단
Figure pct00025
[표 21-2] 세포 표면상에 있는 인간 PD-L1에의 인간 PD-1 결합 차단
Figure pct00026
실시예 15 보고 유전자 세포주를 사용한 PD-1 신호전달 경로에 대한 융합 단백질의 억제 효과 검출
실시예 6의 방법에 따라, 보고 유전자 세포주를 사용하여 PD-1 신호전달 경로에 대한 본 출원에 기재된 융합 단백질의 억제 효과를 검출했다. 도 17 및 표 22는 본 출원에 기재된 융합 단백질이 PD-1 신호전달 경로에 억제 효과를 갖는 것을 나타낸다.
[표 22] PD-1 신호전달 경로에 대한 억제 효과
Figure pct00027
실시예 16 효소 결합 면역 흡착법에 의한 TGFB1에의 본 융합 단백질의 시험관 내 결합 효과 검출
1μg/ml 농도의 인간 TGFB1(Novoprotein, CA59)을 항원으로 사용하였고, 밤새 4℃에서 96-웰 플레이트를 100μl/웰로 코팅하는데 사용했다. 200㎕/웰의 1x PBST로 3회 세척하고, 200㎕/웰의 2% BSA를 첨가하고, 플레이트를 2시간 동안 37℃에서 차단시켰다. 200 μl/웰의 1x PBST를 첨가하여 3회 세척하고, 5배 농도 구배로 희석된 항체를 첨가하였는데, 항체의 가장 높은 최종 농도는 100nM이고, 1시간 동안 37°C에서 인큐베이팅했다. 200 ㎕/웰의 1x PBST로 플레이트를 3회 세척하고, 100 ㎕/웰의 항-인간 FC-HRP 2차 항체(Sigma-Aldrich, A0170, 1:4000 희석)를 각 웰에 첨가하고, 1시간 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 200μl/웰의 1×PBST 로 플레이트를 3회 세척한 다음, 각 웰에 TMB 100μl/웰을 첨가하였다. 실온에서 10분 동안 배양한 후, 1M ELISA 정지 용액 50μl/웰을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 450nm 및 570nm에서 흡광도 값을 검출했다. 소프트웨어 GraphPad Prism 8을 적용하여 데이터 처리 및 플롯팅 분석을 수행했고, 결합 곡선 및 EC50 값과 같은 매개변수들을 4개의 매개변수 비선형 피팅으로 얻었다. 이중에서, TGFBRII-Fc는 TGFBRII 세포외 부위 융합 단백질(Novoprotein, CC10)이고, PR001599 및 PR002040은 전술한 대조군 융합 단백질 분자이다.
도 18 (A) 및 표 23-1, 도 18 (B) 및 표 23-2, 및 도 18 (C) 및 표 23-3은 본 출원에 기재된 모든 융합 단백질이 TGFB1에 효과적으로 결합할 수 있고, 약물 농도 용량-의존적 효과를 가지고 있음을 나타낸다.
[표 23-1] TGFB1에의 시험관 내 결합
Figure pct00028
[표 23-2] TGFB1에의 시험관 내 결합
Figure pct00029
[표 23-3] TGFB1에의 시험관 내 결합
Figure pct00030
실시예 17 TGFB1에 의해 유도된 Smad 신호전달 경로의 활성화에 대한 본 융합 단백질의 억제 효과
이 실험에서, 인간 TGFBRI 및 SEAP 보고 유전자와 융합된 Smad3/4 유전자를 고발현하는 HEK-BlueTM TGFB 세포(Invivogen, hkb-tgfb,)를 사용하여 세포 수준에서 TGFB1에 의해 유도된 Smad 신호전달 경로의 활성화에 대한 본 융합 단백질의 억제 효과를 연구했다. 테스트하고자 하는 융합 단백질의 5배 농도 구배 희석액 10μl/웰을 96-웰 플레이트에 첨가하였는데, 가장 높은 최종 농도는 50nM이었다. 이어서, 최종 농도가 1ng/ml인 인간 TGFB1 단백질(R&D Systems, 240-B/F) 10μl/웰을 96-웰 플레이트에 첨가하였다. TGFB1 항체(Biointron, B5484) 및 TGFBRII-Fc 융합 단백질(Novoprotein, CC10)을 대조군 분자로 사용하였다. 180 μl의 2.5Х104 세포/웰을 96-웰 플레이트에 시딩하고 이산화탄소 인큐베이터에서 밤새 인큐베이팅했다. 이어서, 각 웰로부터 20μl의 세포 상층액을 또 다른 96-웰 플레이트에 옮기고, 180μl의 Quanti-Blue 작업 용액(Invivogen, rep-qb1)을 각 웰에 첨가하고, 1시간 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 마이크로플레이트 판독기에서 655 nm에서의 흡광도값을 검출했다. GraphPad Prism 8을 사용하여 데이터 처리 및 그래프 분석을 하였고, 결합 곡선 및 IC50 값과 같은 매개변수들을 4개의 매개변수 비선형 피팅을 통해 얻었다.
결과는 도 19 및 표 24에 나타난다. 본 융합 단백질은 용량-의존적 방식으로 TGFB1에 의해 유도된 pSMAD3 리포터의 활성을 억제하고, PR001902는 양성 대조군 PR001599(M7824)과 필적하는 효능 및 IC50을 가지며; 억제 활성 및 IC50은 양성 대조군 PR002466(Hengrui 융합 단백질 9) 및 TGFB 항체보다 8배 더 강력하다.
[표 24] TGFB1에 의해 유도된 Smad 신호전달 경로의 활성화에 대한 억제 효과
Figure pct00031
실시예 18 BLI를 사용한 본 융합 단백질 및 인간 PD-L1의 친화도 결정의 결과
실시예 7.2에 기재된 방법을 사용하여 본 융합 단백질 및 인간 PD-L1 단백질의 친화도를 테스트하였다.
결과는 표 25에 나타나고, 본 출원의 융합 단백질 및 인간 PD-L1 사이의 친화도의 KD 값은 모두 1Х10-8 M 미만이다.
[표 25] 본 융합 단백질 및 인간 PD-L1의 친화도
Figure pct00032
실시예 19 BLI 방법을 사용한 본 융합 단백질 및 인간 TGFB1의 친화도 결정
먼저, 비오틴화 키트(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, ThermoFisher, A39257)를 사용하여 인간 TGFB1 단백질 (NovoProtein, CA59)을 지침의 요구사항에 따라 비오틴화했다. 이어서, 실시예 7.2에 기재된 것과 유사한 방법에 따라 본 융합 단백질 및 인간 TGFB1의 친화도를 결정했다. 특히, 먼저 2개의 컬럼의 SA 센서들(8개의 센서들을 갈 컬럼에 배치하였고; 제1 컬럼의 센서들을 참조 SA 센서라고 하고, 제2 컬럼의 센서를 테스트 SA 센서라고 함)을 10분 동안 0.02% Tween 함유 1 Х PBS 테스트 완충액에서 평형화했다. 이어서, 테스트 SA 센서들로 비오틴화된 인간 TGFB1을 포획하고, 포획 높이는 0.3 nm로 설정한 반면에, 참조 SA 센서는 30초 동안 완충액에 담갔다. 이후, 2개의 컬럼의 센서들은 구배 희석된 테스트하고자 하는 융합 단백질에 결합시켰고(예를 들면, 테스트하고자 하는 융합 단백질의 농도는 6.25 - 0.39 nM로 2배 희석, 및 0nM일 수 있음); 3분 동안 결합이 지속된 다음, 10분 동안 해리하였다.
데이터 분석을 위해 옥텟 데이터 분석 소프트웨어 (Fortebio, version 11.0)를 사용할 때, 이중 공제 모드 (이중 참조)를 선택하여 참조 신호를 공제하고, 데이터 피팅을 위해 "1:1 Global fitting" 방법을 선택하고, 항원 및 항원 결합 단백질 결합의 역학 매개변수들을 계산하였고, kon (1/Ms) 값, kdis (1/s) 값 및 KD (M) 값을 얻었다.
결과는 표 26에 나타난다. 본 출원의 융합 단백질은 인간 TGFB1과 1Х109 M 미만의 KD 값을 가지고, 대조군 분자 PR001599 및 PR002466 보다 높은 친화도를 가지는 것을 보여준다.
[표 26] 인간 TGFB1과의 친화도
Figure pct00033
실시예 20 BLI 방법을 사용한 PD-L1에의 본 융합 단백질 결합의 에피토프 경쟁의 결정
실시예 8의 방법에 따라 에피토프 경쟁 실험을 융합 단백질 및 대조군 분자에 수행하였다. 그 결과는 표 27-1 및 표 27-2에 나타난다. PR001488 및 PR001902의 에피토프는 대조군 분자 PR001599 또는 PR002466과 완전히 중첩되지 않았다.
[표 27-1] 융합 단백질의 에피토프 경쟁
Figure pct00034
[표 27-2] 융합 단백질의 에피토프 경쟁
Figure pct00035
실시예 21 MLR 방법을 사용한 T 세포에 대한 본 융합 단백질의 활성화 효과의 시험관 내 검출
T 세포에 대한 PD-L1/TGFB 융합 단백질의 상승적 활성화 효과를 연구하기 위해 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 수집 및 정제하고 단핵구 세포 (Meltenyi, 130-050-201)를 분리하고, 완전한 배지(50ng/mL IL-4, 100ng/mL GM-CSF 함유 RPI1640)를 사용하여 6일 동안 배양한 다음, 1μg/mL LPS를 첨가하여 24시간 동안 유도하여 성숙한 DC 세포를 생성하였다. 상기 언급한 배양된 세포를 원심분리하여 수집하고, 2% FBS 함유 PBS로 4회 세척하고, 신선한 배지에 재현탁시키고, 밀도를 2Х105 세포/mL로 조정하고, 96-웰 세포 배양 플레이트에 100 μl/웰로 시딩했다. 동시에 Pan T 세포(Meltenyi, 130-096-535)를 동종(allogenic)의 신선한 PBMC로부터 분리하고 신선한 배지에 재현탁시키고, 세포 밀도를 1Х106 세포/ml로 조정하고 96-웰 세포 배양 플레이트에 100 μl/웰로 시딩했다. 50μl/웰의 상이한 농도의 항체 및 50μl/웰의 0.3ng/ml의 최종 농도를 갖는 인간 TGFB1 단백질(R&D Systems, 240-B/F)을 상기 96-웰 세포 배양 플레이트의 대응하는 웰에 첨가하였고, 세포 배양 플레이트를 5일 동안 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 인큐베이팅했다. 상층액을 각각 72시간 후 및 120시간 후 수집하였다. 72시간 후의 상층액의 IL-2 수준은 IL2 ELISA 키트 (Thermo, 88-7025-88)를 사용하여 검출하고; 120시간 후의 상층액의 IFN-γ 수준은 IFN-γ ELISA 키트 (Thermo, 88-7316-88)를 사용하여 검출했고; 특정 작업은 시약 지침에 따를 수 있다.
결과는 도 20에 나타난다. TGFB1을 첨가하는 경우, 본 융합 단백질은 활성화된 T 림프구에 의해 사이토카인 IL-2(도 20 (A)) 및 IFN-γ도 20 (B))의 분비를 향상시킬 수 있고, PD-L1 단일클론 항체 PR000416 및 양성 대조군 PR001599 및 PR002446보다 더 강력한 활성화를 갖는다.
실시예 22 세포-매개 항체-의존성 세포독성 실험의 결과
본 출원에 기재된 융합 단백질의 종양 세포-매개 항체-의존성 세포독성을 실시예 10의 방법에 따라 검출하였다. 본 실시예에서, 총 6개의 독립적인 ADCC 실험으로, 3 공여자 및 2개의 종양 세포주의 PBMC를 사용했다. 결과는 도 21(A-F)에 나타나고, PR001488은 양성 대조군 PR001599보다 더 강력한 ADCC 효과를 가집니다.
실시예 23 융합 단백질의 약동학 연구
본 실시예에서 본 융합 단백질의 약동학적 성질을 테스트했다. 방법은 하기와 같다. 체중 18-22g의 암컷 C57BL/6 마우스 3마리를 선택하고, 융합단백질 약제를 PR001902의 경우 9.53mg/kg 및 PR001488의 경우 10mg/kg의 용량으로 정맥내 주사하여 투여했다. 투여 전 및 투여 후 0.5시간, 24시간(1일), 2일, 4일, 7일, 10일, 및 14일 후에 전혈을 수집하고, 전혈을 30분 동안 방치하여 응고시킨 후, 5분 동안 4°C에서 2,000rpm으로 원심분리하고, 분리된 혈청 샘플을 분석할 때까지 -80°C에서 동결시켰다. 본 실시예에서 2개의 ELISA 방법을 사용하여 마우스 혈청의 약물 농도를 정량적으로 결정했다. ELISA 방법 I, 즉 , Fc-말단 검출 방법에서, 96-웰 플레이트 상의 염소 항-인간 Fc 다중클로날 항체 코팅에 의해 마우스 혈청 내 인간 Fc 함유 융합 단백질을 포획한 다음, HRP-표지된 염소 항-인간 Fc 2차 항체를 첨가하여 검출했다; ELISA 방법 2, 즉, TGFBRII-말단 검출 방법에서, 96-웰 플레이트 상의 인간 TGFB1 단백질 코팅에 의해 마우스 혈청 내 인간 TGFBRII 도메인 함유 융합 단백질을 포획한 다음, HRP-표지된 염소 항-인간 Fc 2차 항체를 첨가하여 검출했다. Phoenix WinNonlin 소프트웨어 버전 6.4를 사용하고, 비구획 모델(Noncompartmental Model;NCA)을 선택하여 혈액 약물 농도 데이터를 분석하여 약동학을 평가했다.
도 22 및 표 28은 융합 단백질 PR001902의 약동학 데이터를 나타낸다. 상기 결과는 마우스 내 PR001902의 반감기는 Fc-말단 검출 방법 하에서 약 11일인 것을 나타내고, TGFBRII-말단 검출 방법은 마우스 내 PR001902의 반감기가 약 8.5일인 것을 나타낸다.
[표 28] PR001902의 약동학
Figure pct00036
도 23 및 표 29는 융합 단백질 PR001488의 약동학 데이터를 나타낸다. 결과는 마우스 내 PR001488의 반감기는 Fc-말단 검출 방법 하에서 약 10일인 것을 나타내고, TGFBRII-말단 검출 방법은 마우스 내 PR001488이 반감기가 약 5일인 것을 나타낸다.
[표 29] PR001488의 약동학
Figure pct00037
실시예 24 결장암 CT26-인간 PD-1/PD-L1 형질전환 마우스의 동물 생체 내 모델에서 융합 단백질의 항종양 활성
본 실시예에서, 면역 체크포인트 이식된 인간화된 마우스 BALB/c-인간 PD-1/PD-L1 (외인성 인간 PD-1 전이유전자(transgene) 및 인간 PD-L1 전이유전자가 동시에 BALB/c 마우스에 도입됨, Jicui Yaokang Biotechnology) 및 마우스 결장암 세포 CT26-인간 PDL1(tg)-마우스 PDL1(KO) (마우스 결장암 CT26의 외인성 마우스 PD-L1 유전자가 녹아웃되고 외인성 인간 PD-L1 전이유전자가 도입됨, Jicui Yaokang Biotechnology)에 대한 테스트 약제의 항-종양 효과를 평가했다. 대수기(log phase)의 CT26-인간 PDL1(tg)-mPDL1(KO) 세포를 인간화된 마우스 BALB/c-인간 PD-1/PD-L1의 겨드랑이 뒤의 오른쪽에 피하 접종하였다. 평균 종양 부피가 80 - 120 mm3에 도달했을 때, 종양 부피가 너무 큰 개별 마우스를 제거한 후, 마우스를 종양 부피에 따라 3개의 그룹으로 무작위로 나누었으며, 각 그룹당 6마리의 마우스가 있었다. 총 3개의 테스트 그룹이 있었는데, 즉: 인간 IgG1 (10.4 mg/kg, 인간 IgG1 동형 대조군), M7824 (12.3 mg/kg, 양성 대조군) 및 PR001902 (12.2 mg/kg, 본 출원의 융합 단백질). 그룹화 당일에 복강내 투여를 시작했고, 3일에 1회, 총 6회(q3d Х 6)를 투여했다. 투여 시작 후, 체중 및 종양 부피를 주 2회 칭량했다. 종양 부피의 계산 방법은 하기와 같다: 종양 부피 (mm3) = 0.5 Х 종양 장직경(long diameter) Х 종양 단직경(short diameter)2. 실험이 끝난 후, 종양을 가지고 있는 마우스를 안락사 시키고 종얄을 제거하여 무게를 쟀다. 각 그룹의 동물의 종양 부피 및 체중과 같은 실험 결과는 평균값 ± 표준 오차 (평균값 ± SEM)로 계산되었다. 다양한 처리군 및 대조군 사이에 유의한 차이가 있는지 비교하기 위해 일원 분산 분석(one way ANOVA) 테스트 방법을 사용하여 다중 그룹 비교를 수행했다. SPSS 18.0을 사용하여 데이터를 분석하였다. P <0.05는 유의한 차이가 있는 것으로 간주하였다.
결과는 도 24에 나타난다. Both 융합 단백질 PR001902 및 양성 대조군 M7824 둘 모두 CT26-인간 PD-1/PD-L1 마우스의 피하 이식된 종양의 성장을 유의하게 억제할 수 있고; 실험 동안, 각 그룹의 동물 모두의 체중은 증가하여, 모든 동물들이 테스트 제품을 잘 견딘 것을 나타낸다. 동물에 대한 유의한 독성 효과는 없었고 우수한 안정성을 가졌다.
전술한 상세한 설명은 설명 및 예시로서 제공되고, 첨부된 청구범위를 제한하는 것을 의도하지 않는다. 본 출원에 나열된 구현예들의 다양한 변경은 당업자에게 명백하고, 첨부된 청구범위 및 이와 균등한 해결책의 범위 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> HARBOUR BIOMED (SHANGHAI) CO., LTD. <120> ANTI-PD-L1 ANTIGEN BINDING PROTEIN AND APPLICATION THEREOF <130> 0113-PA-016 <160> 194 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HFWR1 <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 2 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HFWR1 <400> 2 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 3 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HFWR1 <400> 3 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ala 20 25 <210> 4 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HFWR1 <400> 4 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 20 25 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> 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Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile 100 105 110 Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys 115 120 125 Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn 130 135 140 Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu 145 150 155 160 Leu Leu Val Ile Phe Gln Val Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu 165 170 175 Gly Val Ala Ile Ser Val Ile Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val Asn 180 185 190 Arg Gln Gln Lys Leu Ser Ser Thr Trp Glu Thr Gly Lys Thr Arg Lys 195 200 205 Leu Met Glu Phe Ser Glu His Cys Ala Ile Ile Leu Glu Asp Asp Arg 210 215 220 Ser Asp Ile Ser Ser Thr Cys Ala Asn Asn Ile Asn His Asn Thr Glu 225 230 235 240 Leu Leu Pro Ile Glu Leu Asp Thr Leu Val Gly Lys Gly Arg Phe Ala 245 250 255 Glu Val Tyr Lys Ala Lys Leu Lys Gln Asn Thr Ser Glu Gln Phe Glu 260 265 270 Thr Val Ala Val Lys Ile Phe Pro Tyr Glu Glu Tyr Ala Ser Trp Lys 275 280 285 Thr Glu Lys Asp Ile Phe Ser Asp Ile Asn Leu Lys His Glu Asn Ile 290 295 300 Leu Gln Phe Leu Thr Ala Glu Glu Arg Lys Thr Glu Leu Gly Lys Gln 305 310 315 320 Tyr Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Ala Lys Gly Asn Leu Gln Glu Tyr 325 330 335 Leu Thr Arg His Val Ile Ser Trp Glu Asp Leu Arg Lys Leu Gly Ser 340 345 350 Ser Leu Ala Arg Gly Ile Ala His Leu His Ser Asp His Thr Pro Cys 355 360 365 Gly Arg Pro Lys Met Pro Ile Val His Arg Asp Leu Lys Ser Ser Asn 370 375 380 Ile Leu Val Lys Asn Asp Leu Thr Cys Cys Leu Cys Asp Phe Gly Leu 385 390 395 400 Ser Leu Arg Leu Asp Pro Thr Leu Ser Val Asp Asp Leu Ala Asn Ser 405 410 415 Gly Gln Val Gly Thr Ala Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Glu Ser 420 425 430 Arg Met Asn Leu Glu Asn Val Glu Ser Phe Lys Gln Thr Asp Val Tyr 435 440 445 Ser Met Ala Leu Val Leu Trp Glu Met Thr Ser Arg Cys Asn Ala Val 450 455 460 Gly Glu Val Lys Asp Tyr Glu Pro Pro Phe Gly Ser Lys Val Arg Glu 465 470 475 480 His Pro Cys Val Glu Ser Met Lys Asp Asn Val Leu Arg Asp Arg Gly 485 490 495 Arg Pro Glu Ile Pro Ser Phe Trp Leu Asn His Gln Gly Ile Gln Met 500 505 510 Val Cys Glu Thr Leu Thr Glu Cys Trp Asp His Asp Pro Glu Ala Arg 515 520 525 Leu Thr Ala Gln Cys Val Ala Glu Arg Phe Ser Glu Leu Glu His Leu 530 535 540 Asp Arg Leu Ser Gly Arg Ser Cys Ser Glu Glu Lys Ile Pro Glu Asp 545 550 555 560 Gly Ser Leu Asn Thr Thr Lys 565 <210> 177 <211> 136 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TGFBR2 <400> 177 Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr 1 5 10 15 Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp 20 25 30 Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys 35 40 45 Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val 50 55 60 Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp 65 70 75 80 Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro 85 90 95 Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met 100 105 110 Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu 115 120 125 Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp 130 135 <210> 178 <211> 137 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TGFBR2 <400> 178 Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val 1 5 10 15 Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys 20 25 30 Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn 35 40 45 Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala 50 55 60 Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His 65 70 75 80 Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser 85 90 95 Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe 100 105 110 Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser 115 120 125 Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp 130 135 <210> 179 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 Formula 1 <220> <221> X <222> (3)..(3) <223> X=D or E <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> X=G or A <400> 179 Lys Gln Xaa Xaa Ser Glu 1 5 <210> 180 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 Formula 1 <220> <221> X <222> (3)..(3) <223> X=A or P <220> <221> X <222> (8)..(8) <223> X=F or S <220> <221> X <222> (9)..(9) <223> X=D or A <220> <221> X <222> (10)..(10) <223> X=I或F <400> 180 Asp Arg Xaa Val Ala Gly Ala Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 181 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 Formula 1 <220> <221> X <222> (7)..(7) <223> X=F，S or Y <220> <221> X <222> (8)..(8) <223> X=I or S <400> 181 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Xaa Xaa Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 182 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2 Formula 1 <220> <221> X <222> (7)..(7) <223> X=S or T <400> 182 Lys Ala Ser Ser Leu Glu Xaa 1 5 <210> 183 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 Formula 1 <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> X=Y or H <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> X=G，T or S <220> <221> X <222> (6)..(6) <223> X=Y or S <400> 183 Gln Gln Tyr Xaa Xaa Xaa Ser Arg Thr 1 5 <210> 184 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-FR3 Formula 1 <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> X=V or G <220> <221> X <222> (22)..(22) <223> X=L or Q <220> <221> X <222> (33)..(33) <223> X=D or E <220> <221> X <222> (37)..(37) <223> X=Y or F <400> 184 Lys Tyr Tyr Xaa Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 1 5 10 15 Asn Ala Lys Asn Ser Xaa Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu 20 25 30 Xaa Thr Ala Val Xaa Tyr Cys Ala Arg 35 40 <210> 185 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L-FR1 <220> <221> X <222> (13)..(13) <223> X=T or A <220> <221> X <222> (17)..(17) <223> X=D or H <220> <221> X <222> (21)..(21) <223> X=I or V <400> 185 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Xaa Ser Val Gly 1 5 10 15 Xaa Arg Val Thr Xaa Thr Cys 20 <210> 186 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L-FR2 Formula 1 <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> X=K or H <220> <221> X <222> (11)..(11) <223> X=K，N or D <400> 186 Trp Tyr Gln Gln Xaa Pro Gly Lys Ala Pro Xaa Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 187 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L-FR3 Formula 1 <220> <221> X <222> (9)..(9) <223> X=S or N <220> <221> X <222> (28)..(28) <223> X=A or T <220> <221> X <222> (31)..(31) <223> X=Y or F <400> 187 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Xaa Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Xaa Thr Tyr Xaa Cys 20 25 30 <210> 188 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L-FR4 Formula 1 <220> <221> X <222> (10)..(10) <223> X=K or R <400> 188 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Xaa 1 5 10 <210> 189 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH Formula 1 <220> <221> X <222> (54)..(54) <223> X=D or E <220> <221> X <222> (55)..(55) <223> X=G or A <220> <221> X <222> (61)..(61) <223> X=V or G <220> <221> X <222> (79)..(79) <223> X=L or Q <220> <221> X <222> (90)..(90) <223> X=D or E <220> <221> X <222> (94)..(94) <223> X=Y or F <220> <221> X <222> (101)..(101) <223> X=A or P <220> <221> X <222> (106)..(106) <223> X=F or S <220> <221> X <222> (107)..(107) <223> X=D or A <220> <221> X <222> (108)..(108) <223> X=I or F <400> 189 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Lys Gln Xaa Xaa Ser Glu Lys Tyr Tyr Xaa Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Xaa Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Xaa Thr Ala Val Xaa Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Xaa Val Ala Gly Ala Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 190 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL Formula 1 <220> <221> X <222> (13)..(13) <223> X13=T or A <220> <221> X <222> (17)..(17) <223> X=D or H <220> <221> X <222> (21)..(21) <223> X=I or V <220> <221> X <222> (30)..(30) <223> X=F，S or Y <220> <221> X <222> (31)..(31) <223> X=I or S <220> <221> X <222> (39)..(39) <223> X=K or H <220> <221> X <222> (45)..(45) <223> X=K，N or D <220> <221> X <222> (56)..(56) <223> X=S or T <220> <221> X <222> (65)..(65) <223> X=S or N <220> <221> X <222> (84)..(84) <223> X=A or T <220> <221> X <222> (87)..(87) <223> X=Y or F <220> <221> X <222> (92)..(92) <223> X=Y or H <220> <221> X <222> (93)..(93) <223> X=G，T or S <220> <221> X <222> (94)..(94) <223> X=Y or S <220> <221> X <222> (107)..(107) <223> X=K or R <400> 190 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Xaa Ser Val Gly 1 5 10 15 Xaa Arg Val Thr Xaa Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Xaa Xaa Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Xaa Pro Gly Lys Ala Pro Xaa Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Xaa Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Xaa Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Xaa Thr Tyr Xaa Cys Gln Gln Tyr Xaa Xaa Xaa Ser Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Xaa 100 105 <210> 191 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 Formula 2 <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> X=G or S <220> <221> X <222> (6)..(6) <223> X=Y or S <400> 191 Gln Gln Tyr Tyr Xaa Xaa Ser Arg Thr 1 5 <210> 192 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-FR3 Formula 2 <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> X=V or G <220> <221> X <222> (33)..(33) <223> X=D or E <220> <221> X <222> (37)..(37) <223> X=Y or F <400> 192 Lys Tyr Tyr Xaa Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 1 5 10 15 Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu 20 25 30 Xaa Thr Ala Val Xaa Tyr Cys Ala Arg 35 40 <210> 193 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH Formula 2 <220> <221> X <222> (54)..(54) <223> X=D or E <220> <221> X <222> (55)..(55) <223> X=G or A <220> <221> X <222> (61)..(61) <223> X=V or G <220> <221> X <222> (90)..(90) <223> X=D or E <220> <221> X <222> (94)..(94) <223> X=Y or F <220> <221> X <222> (101)..(101) <223> X=A or P <220> <221> X <222> (106)..(106) <223> X=F or S <220> <221> X <222> (107)..(107) <223> X=D or A <220> <221> X <222> (108)..(108) <223> X=I or F <400> 193 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Lys Gln Xaa Xaa Ser Glu Lys Tyr Tyr Xaa Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Xaa Thr Ala Val Xaa Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Xaa Val Ala Gly Ala Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 194 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL Formula 2 <220> <221> X <222> (13)..(13) <223> X=T or A <220> <221> X <222> (17)..(17) <223> X=D or H <220> <221> X <222> (21)..(21) <223> X=I or V <220> <221> X <222> (30)..(30) <223> X=F，S or Y <220> <221> X <222> (31)..(31) <223> X=I or S <220> <221> X <222> (39)..(39) <223> X=K or H <220> <221> X <222> (45)..(45) <223> X=K，N or D <220> <221> X <222> (56)..(56) <223> X=S or T <220> <221> X <222> (65)..(65) <223> X=S or N <220> <221> X <222> (84)..(84) <223> X=A or T <220> <221> X <222> (87)..(87) <223> X=Y or F <220> <221> X <222> (93)..(93) <223> X=G or S <220> <221> X <222> (94)..(94) <223> X=Y or S <220> <221> X <222> (107)..(107) <223> X=K or R <400> 194 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Xaa Ser Val Gly 1 5 10 15 Xaa Arg Val Thr Xaa Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Xaa Xaa Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Xaa Pro Gly Lys Ala Pro Xaa Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Xaa Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Xaa Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Xaa Thr Tyr Xaa Cys Gln Gln Tyr Tyr Xaa Xaa Ser Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Xaa 100 105

Claims (39)

  1. PD-L1에 결합하는 분리된 항원 결합 단백질로서, 항체 중쇄 가변 부위 VH의 적어도 하나의 CDR을 포함하고, 상기 VH는 서열 번호 193에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 바람직하게는, 상기 VH는 서열 번호 90 내지 93, 95 및 97 내지 104 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 분리된 항원 결합 단백질은 항체 경쇄 가변 부위 VL 의 적어도 하나의 CDR을 포함하고, 상기 VL은 서열 번호 194에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 바람직하게는, 상기 VL은 서열 번호 108 내지 114, 116, 및 118 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 분리된 항원 결합 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는데; 바람직하게는, 상기 항체는 단일클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 완전 인간 항체로 이루어진 군으로부터 선택되고; 바람직하게는, 상기 항원 결합 단편은 Fab, Fab', Fv 단편, F(ab')2, scFv, di-scFv 및/또는 dAb를 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리된 항원 결합 단백질은 경쇄 가변 부위 VL 및 중쇄 가변 부위 VH을 포함하는데, 상기 경쇄 가변 부위 VL은 서열 번호 181에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열 번호 182에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열 번호 191에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하고; 상기 중쇄 가변 부위 VH는 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열 번호 179에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열 번호 180에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
  5. 제4항에 있어서, 상기 LCDR1은 서열 번호 181, 및 48 내지 51 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 LCDR2는 서열 번호 182, 63 및 64 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 상기 LCDR3은 서열 번호 191, 및 77 내지 79 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR2는 서열 번호 179, 14, 16 및 17 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 상기 HCDR3은 서열 번호 180, 및 29 내지 33 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
  6. 제5항에 있어서, 상기 LCDR1은 서열 번호 48에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 LCDR2는 서열 번호 63에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 사이 LCDR3은 서열 번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR2는 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 상기 HCDR3은 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    상기 LCDR1은 서열 번호 49에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 사이 LCDR3은 서열 번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR2는 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 상기 HCDR3은 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    상기 LCDR1은 서열 번호 48에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 사이 LCDR3은 서열 번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR2는 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 상기 HCDR3은 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    상기 LCDR1은 서열 번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 LCDR2는 서열 번호 63에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 사이 LCDR3은 서열 번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR2는 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 상기 HCDR3은 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    상기 LCDR1은 서열 번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 LCDR2는 서열 번호 63에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 사이 LCDR3은 서열 번호 79에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR2는 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 상기 HCDR3은 서열 번호 31에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    상기 LCDR1은 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 LCDR2는 서열 번호 63에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 사이 LCDR3은 서열 번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR2는 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 상기 HCDR3은 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    상기 LCDR1은 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 사이 LCDR3은 서열 번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR2는 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 상기 HCDR3은 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    상기 LCDR1은 서열 번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 사이 LCDR3은 서열 번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR2는 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 상기 HCDR3은 서열 번호 33에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    상기 LCDR1은 서열 번호 48에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 사이 LCDR3은 서열 번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR2는 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 상기 HCDR3은 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    상기 LCDR1은 서열 번호 48에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 사이 LCDR3은 서열 번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR2는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 상기 HCDR3은 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    상기 LCDR1은 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 LCDR2는 서열 번호 63에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 사이 LCDR3은 서열 번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR2는 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 상기 HCDR3은 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    상기 LCDR1은 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 LCDR2는 서열 번호 63에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 사이 LCDR3은 서열 번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR2는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 상기 HCDR3은 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    상기 LCDR1은 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 사이 LCDR3은 서열 번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR2는 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 상기 HCDR3은 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    상기 LCDR1은 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 사이 LCDR3은 서열 번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR2는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 상기 HCDR3은 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    상기 LCDR1은 서열 번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 사이 LCDR3은 서열 번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR2는 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 상기 HCDR3은 서열 번호 33에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    상기 LCDR1은 서열 번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 사이 LCDR3은 서열 번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR2는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 상기 HCDR3은 서열 번호 33에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것이, 분리된 항원 결합 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 중쇄 가변 부위 VH는 프레임워크 부위 H-FR1, H-FR2, H-FR3 및 H-FR4를 포함하고; 바람직하게는, 상기 H-FR1은 C-말단에서 상기 HCDR1의 N-말단에 연결되고, 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는 상기 H-FR2는 상기 HCDR1 및 상기 HCDR2 사이에 위치하고, 서열 번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는 상기 H-FR3은 상기 HCDR2 및 상기 HCDR3 사이에 위치하고, 서열 번호 192에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는 상기 H-FR4는 N-말단에서 상기 HCDR3의 C-말단에 연결되고, 서열 번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 더욱 바람직하게는, 상기 H-FR3은 서열 번호 21, 22, 및 24 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 경쇄 가변 부위 VL은 프레임워크 부위 L-FR1, L-FR2, L-FR3 및 L-FR4를 포함하고; 바람직하게는, 상기 L-FR1은 C-말단에서 상기 LCDR1의 N-말단에 연결되고 서열 번호 185에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는 상기 L-FR2는 상기 LCDR1 및 상기 LCDR2 사이에 위치하고, 서열 번호 186에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는 상기 L-FR3은 상기 LCDR2 및 상기 LCDR3 사이에 위치하고, 서열 번호 187에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는 상기 L-FR4는 N-말단에서 상기 LCDR3의 C-말단에 연결되고, 서열 번호 188에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
  9. 제8항에 있어서, 상기 L-FR1은 서열 번호 41 내지 44 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는 상기 L-FR2는 서열 번호 56 내지 59 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는 상기 L-FR3은 서열 번호 69 내지 72 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는 상기 L-FR4는 서열 번호 85 또는 86에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 중쇄 가변 부위 VH는 서열 번호 193에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 항체 경쇄 가변 부위 VL은 서열 번호 194에 제시된 아미노산 서열을 포함하고;
    바람직하게는, 상기 항체 중쇄 가변 부위 VH는 서열 번호 90 내지 93, 95, 및 97 내지 104 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고;
    바람직하게는, 상기 항체 경쇄 가변 부위 VL은 서열 번호 108 내지 114, 116, 및 118 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 중쇄 가변 부위 VH는 서열 번호 90에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체 경쇄 가변 부위 VL은 서열 번호 108에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    상기 항체 중쇄 가변 부위 VH는 서열 번호 90에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체 경쇄 가변 부위 VL은 서열 번호 109에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    상기 항체 중쇄 가변 부위 VH는 서열 번호 91에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체 경쇄 가변 부위 VL은 서열 번호 110에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    상기 항체 중쇄 가변 부위 VH는 서열 번호 90에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체 경쇄 가변 부위 VL은 서열 번호 111에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    상기 항체 중쇄 가변 부위 VH는 서열 번호 92에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체 경쇄 가변 부위 VL은 서열 번호 112에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    상기 항체 중쇄 가변 부위 VH는 서열 번호 93에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체 경쇄 가변 부위 VL은 서열 번호 113에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    상기 항체 중쇄 가변 부위 VH는 서열 번호 90에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체 경쇄 가변 부위 VL은 서열 번호 114에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    상기 항체 중쇄 가변 부위 VH는 서열 번호 95에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체 경쇄 가변 부위 VL은 서열 번호 116에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    상기 항체 중쇄 가변 부위 VH는 서열 번호 97에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체 경쇄 가변 부위 VL은 서열 번호 118에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    상기 항체 중쇄 가변 부위 VH는 서열 번호 98에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체 경쇄 가변 부위 VL은 서열 번호 118에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    상기 항체 중쇄 가변 부위 VH는 서열 번호 99에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체 경쇄 가변 부위 VL은 서열 번호 113에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    상기 항체 중쇄 가변 부위 VH는 서열 번호 100에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체 경쇄 가변 부위 VL은 서열 번호 113에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    상기 항체 중쇄 가변 부위 VH는 서열 번호 101에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체 경쇄 가변 부위 VL은 서열 번호 114에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    상기 항체 중쇄 가변 부위 VH는 서열 번호 102에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체 경쇄 가변 부위 VL은 서열 번호 114에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    상기 항체 중쇄 가변 부위 VH는 서열 번호 103에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체 경쇄 가변 부위 VL은 서열 번호 116에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    상기 항체 중쇄 가변 부위 VH는 서열 번호 104에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체 경쇄 가변 부위 VL은 서열 번호 116에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리된 항원 결합 단백질은 항체 중쇄 불변 부위를 포함하고, 상기 항체 중쇄 불변 부위는 인간 IgG 불변 부위를 포함하고; 바람직하게는, 상기 항체 중쇄 불변 부위는 서열 번호 172 내지 175 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
  13. 제1항 내지 제12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리된 항원 결합 단백질은 항체 중쇄 HC를 포함하고, 상기 HC는 서열 번호 122 내지 125, 127, 및 129 내지 137 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리된 항원 결합 단백질은 항체 경쇄 불변 부위를 포함하는데, 상기 항체 경쇄 불변 부위는 서열 번호 170에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리된 항원 결합 단백질은 항체 경쇄 LC를 포함하고 ,상기 LC는 서열 번호 150 내지 156, 158, 및 160 내지 163 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리된 항원 결합 단백질은 하기 특성들 중 하나 이상을 갖는, 분리된 항원 결합 단백질:
    1) 1 Х 10-8 M 이하의 KD 값으로 영장류 유래 PD-L1에 결합할 수 있음;
    2) PD-L1에의 PD-1의 결합을 차단할 수 있음;
    3) PD-L1에의 CD80의 결합을 차단할 수 있음;
    4) 면역 세포에서 IFN-γ 및/또는 IL2의 분비를 자극할 수 있음;
    5) 종양 성장 및/또는 종양 세포 증식을 억제할 수 있음; 및
    6) 대조군 항체의 에피토프와 완전히 중첩되지 않는 영장류 유래 PD-L1의 에피토프에 결합함,
    이때, 상기 대조군 항체는 서열 번호 52에 제시된 LCDR1, 서열 번호 65에 제시된 LCDR2, 및 서열 번호 81에 제시된 LCDR3을 포함하고, 상기 대조군 항체는 서열 번호 6에 제시된 HCR1, 서열 번호 15에 제시된 HCDR2 및 서열 번호 34에 제시된 HCDR3을 포함하거나;
    상기 대조군 항체는 서열 번호 53에 제시된 LCDR1, 서열 번호 66에 제시된 LCDR2, 및 서열 번호 82에 제시된 LCDR3을 포함하고, 상기 대조군 항체는 서열 번호 5에 제시된 HCR1, 서열 번호 18에 제시된 HCDR2 및 서열 번호 35에 제시된 HCDR3을 포함하거나; 또는
    상기 대조군 항체는 서열 번호 55에 제시된 LCDR1, 서열 번호 68에 제시된 LCDR2, 및 서열 번호 84에 제시된 LCDR3을 포함하고, 상기 대조군 항체는 서열 번호 8에 제시된 HCR1, 서열 번호 20에 제시된 HCDR2 및 서열 번호 37에 제시된 HCDR3을 포함한다.
  17. 제16항에 있어서, 상기 영장류는 인간 및/또는 원숭이를 포함하는 것인, 분리된 항원 결합 단백질.
  18. 융합 단백질로서, 상기 융합 단백질은: a) 인간 TGFBRII 또는 이의 단편; 및 b) 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 분리된 항원 결합 단백질을 포함하는, 융합 단백질.
  19. 제18항에 있어서, 상기 융합 단백질은 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는데, 상기 제1 폴리펩티드는 상기 분리된 항원 결합 단백질의 중쇄, 또는 이의 단편, 및 인간 TGFBRII 또는 이의 단편을 포함하고; 상기 제2 폴리펩티드는 상기 분리된 항원 결합 단백질의 경쇄, 또는 이의 단편을 포함하고; 바람직하게는, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 상기 인간 TGFBRII 또는 이의 단편과 프레임 내 융합되어 제1 폴리펩티드를 형성하고, 더욱 바람직하게는, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 C-말단에서 상기 인간 TGFBRII 또는 이의 단편의 N-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되는 것인, 융합 단백질.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드의 중쇄 또는 이의 단편은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산을 포함하고; 상기 HCDR2는 서열 번호 179, 14, 16, 및 17 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 상기 HCDR3은 서열 번호 180, 및 29 내지 33 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는 상기 제2 폴리펩티드는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, 상기 LCDR1은 서열 번호 181, 및 48 내지 51 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 LCDR2는 서열 번호 182, 63 및 64 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 LCDR3은 서열 번호 191, 및 77 내지 79 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합 단백질.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 LCDR1은 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 LCDR3은 서열 번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR2는 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 HCDR3은 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    상기 LCDR1은 서열 번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 LCDR3은 서열 번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR2는 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 HCDR3은 서열 번호 33에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    상기 LCDR1은 서열 번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 LCDR3은 서열 번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR2는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 HCDR3은 서열 번호 33에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    상기 LCDR1은 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 LCDR3은 서열 번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR2는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 HCDR3은 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    상기 LCDR1은 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR2는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 LCDR3은 서열 번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR2는 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 HCDR3은 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합 단백질.
  22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 링커를 통해 상기 인간 TGFBRII 또는 이의 단편에 연결되고; 바람직하게는, 상기 링커는 펩티드 링커이고, 상기 펩티드 링커는 서열 번호 167 내지 169 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합 단백질.
  23. 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 TGFBRII 또는 이의 단편은 인간 TGFBRII의 세포외 도메인을 포함하고; 바람직하게는, 상기 인간 TGFBRII 또는 이의 단편은 서열 번호 176 내지 178 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합 단백질.
  24. 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드의 중쇄 또는 이의 단편은 상기 제2 폴리펩티드의 경쇄 또는 이의 단편과 결합하여 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부분(antigen binding portion)을 형성하는 것인, 융합 단백질.
  25. 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드는 서열 번호 138, 139, 142, 143, 및 145 내지 148 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 제2 폴리펩티드는 서열 번호 162 또는 163에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합 단백질.
  26. 제18항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 폴리펩티드는 서열 번호 138에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드는 서열 번호 162에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    상기 제1 폴리펩티드는 서열 번호 139에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드는 서열 번호 162에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    상기 제1 폴리펩티드는 서열 번호 142에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드는 서열 번호 162에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    상기 제1 폴리펩티드는 서열 번호 143에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드는 서열 번호 162에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    상기 제1 폴리펩티드는 서열 번호 145에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드는 서열 번호 163에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    상기 제1 폴리펩티드는 서열 번호 146에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드는 서열 번호 163에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    상기 제1 폴리펩티드는 서열 번호 147에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드는 서열 번호 162에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    상기 제1 폴리펩티드는 서열 번호 148에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드는 서열 번호 162에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합 단백질.
  27. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 분리된 항원 결합 단백질 또는 제18항 내지 제26항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 분리된 핵산 분자.
  28. 제27항의 핵산 분자를 포함하는, 벡터.
  29. 제27항의 핵산 분자 또는 제28항의 벡터를 포함하는 세포.
  30. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 분리된 항원 결합 단백질 또는 제18항 내지 제26항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 분리된 항원 결합 단백질 또는 제18항 내지 제26항 중 어느 한 항의 융합 단백질이 발현되는 조건 하에서 제29항의 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  31. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 분리된 항원 결합 단백질을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  32. 제31항의 키메라 항원 수용체를 포함하는, 유전자 변형 세포.
  33. 세포독성제(cytotoxic agent) 및 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 분리된 항원 결합 단백질을 포함하는, 항체-약물 접합체.
  34. 약제학적 조성물로서, 상기 약제학적 조성물은 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 분리된 항원 결합 단백질, 제18항 내지 제26항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제27항의 핵산 분자, 제28항의 벡터, 제29항의 세포, 제31항의 키메라 항원 수용체, 제32항의 유전자 변형 세포 및/또는 제33항의 항체-약물 접합체, 및 선택적으로, 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하고; 바람직하게는, 상기 약제학적 조성물은 호르몬 제제, 표적화된 저분자 제제, 프로테아좀 억제제, 영상화제, 진단제, 화학요법제, 종양 용해제(oncolytic medicament), 세포독성제, 사이토카인, 공동-자극 분자의 활성화제, 억제 분자의 억제제 및 백신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 더 포함하는, 약제학적 조성물.
  35. 종양 또는 암을 예방, 완화 및/또는 치료하고, 종양 성장을 억제하고/하거나 종양 세포 증식을 억제하기 위한 약제의 제조에서 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 분리된 항원 결합 단백질, 제18항 내지 제26항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제27항의 핵산 분자, 제28항의 벡터, 제29항의 세포, 제31항의 키메라 항원 수용체, 제32항의 유전자 변형 세포 및/또는 제33항의 항체-약물 접합체 및/또는 제34항의 약제학적 조성물의 용도로서; 바람직하게는, 상기 종양 또는 암은 PD-L1의 비정상적인 발현을 갖는 종양 또는 암이고; 바람직하게는, 상기 종양 또는 암은 결장직장암을 포함하는 것인, 용도.
  36. 종양을 예방, 완화 또는 치료하고, 종양 성장을 억제하고/하거나 종양 세포 증식을 억제하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 분리된 항원 결합 단백질, 제18항 내지 제26항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제27항의 핵산 분자, 제28항의 벡터, 제29항의 세포, 제31항의 키메라 항원 수용체, 제32항의 유전자 변형 세포 및/또는 제33항의 항체-약물 접합체 및/또는 제34항의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하고; 바람직하게는, 상기 종양 또는 암은 PD-L1의 비정상적인 발현을 갖는 종양 또는 암이고; 바람직하게는, 상기 종양 또는 암은 결장직장암을 포함하는 것인, 방법.
  37. 암을 치료하고, 종양 성장을 억제하고/하거나 종양 세포 증식을 억제하는데 사용하기 위한 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 분리된 항원 결합 단백질, 제18항 내지 제26항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제27항의 핵산 분자, 제28항의 벡터, 제29항의 세포, 제31항의 키메라 항원 수용체, 제32항의 유전자 변형 세포 및/또는 제33항의 항체-약물 접합체 및/또는 제34항의 약제학적 조성물.
  38. PD-L1 및/또는 CD80과 PD-1의 결합을 억제하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 분리된 항원 결합 단백질, 제18항 내지 제26항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제27항의 핵산 분자, 제28항의 벡터, 제29항의 세포, 제31항의 키메라 항원 수용체, 제32항의 유전자 변형 세포 및/또는 제33항의 항체-약물 접합체 및/또는 제34항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  39. 키트로서, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 분리된 항원 결합 단백질, 제18항 내지 제26항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제27항의 핵산 분자, 제28항의 벡터, 제29항의 세포, 제31항의 키메라 항원 수용체, 제32항의 유전자 변형 세포 및/또는 제33항의 항체-약물 접합체 및/또는 제34항의 약제학적 조성물을 포함하고; 바람직하게는, 상기 키트는 (i) 전달 장치; 및/또는 (ii) 사용을 위한 지침을 더 포함하는, 키트.
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