KR102482710B1 - 항-pd-1 항체, 이의 생산 방법 및 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생명공학에 관한 것으로서, 단리된 단클론 항체, 특히 고친화성으로 PD-1에 특이적으로 결합하는 인간 단클론 항체를 포함한다. 본 발명에 따른 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체, 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있고, 다양한 세포 증식 또는 발달 장애와 관련된 질환을 치료하기 위해 종양학 및 면역종양학에서 약제로서 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 상기 항체를 생산하는 방법 및 상기 항체를 이용하여 인간 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

항-PD-1 항체, 이의 생산 방법 및 사용 방법
본 발명은 생명공학에 관한 것으로서, 단리된 단클론 항체, 특히 고친화성 PD-1에 특이적으로 결합하는 인간 단클론 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체, 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있고, 종양학 및 면역종양학에서 약제로서 그리고, 다양한 세포 증식 또는 발달 장애와 관련된 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 상기 항체를 생산하는 방법 및 상기 항체를 이용하여 인간 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
프로그램된 사멸 1(PD-1) 단백질은 또한 CD28, CTLA-4, ICOS 및 BTLA를 포함하는 CD28 수용체 패밀리의 억제 구성원이다. PD-1은 활성화된 B 세포, T 세포, 및 골수 세포 상에서 발현된다(Agata et al., supra; Okazaki et al. (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82; Bennet et al. (2003) J Immunol 170:711-8). 이 패밀리의 초기 구성원인 CD28 및 ICOS는 단클론 항체의 첨가 후 T 세포 증식 증가에 대한 기능적 효과에 의해 검출되었다(Hutloff et al. (1999) Nature 397:263-266; Hansen et al. (1980) Immunogenics 10:247-260). PD-1은 세포자멸 세포에서 차등 발현을 스크리닝하여 검출되었다(Ishida et al. (1992) EMBO J 11:3887-95). 이 패밀리의 다른 구성원인 CTLA-4 및 BTLA는 각각 세포독성 T-림프구 및 TH1 세포에서 차등 발현을 스크리닝하여 검출되었다. CD28, ICOS 및 CTLA-4 모두는 동종이량체화를 가능하게 하는 비쌍(unpaired) 시스테인 잔기를 갖는다. 대조적으로, PD-1은 다른 CD28 패밀리 구성원의 비쌍 시스테인 잔기 특징이 결여된 단량체로서 존재하는 것으로 여겨진다.
PD-1은 Ig 유전자 수퍼패밀리의 일부인 55 kDa I형 막투과 단백질이다(Agata et al. (1996) Int Immunol 8:765-72). PD-1은 막 근위 면역수용체 티로신 억제 모티프(ITIM) 및 막 원위 티로신 기반 스위치 모티프(ITSM)를 포함한다(Thomas, M.L. (1995) J Exp Med 181:1953-6; Vivier, E Ｈ Daeron, M (1997) Immunol Today 18:286-91). PD-1은 CTLA-4과 구조적으로 유사하지만 B7-1 및 B7-2 결합에 중요한 MYPPY 모티프가 결여되어 있다. PD-1은, PD-1에 결합 후 T 세포 활성화를 부정적으로 조절하는 것으로 나타난 2개의 리간드인 PD-L1 및 PD-L2을 갖는 것으로 밝혀졌다(Freeman et al. (2000) J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. (2001) Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. (2002) Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1 및 PD-L2 모두는, PD-1에는 결합하나 CD28 패밀리의 다른 구성원에 결합하지 않는 B7 동족체이다.
하나의 PD-1 리간드인 PD-L1은 다양한 인간 암에서 풍부하다(Dong et al. (2002) Nat. Med. 8:787-9). PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용은 종양 침윤 림프구의 수를 감소시키고, T 세포 수용체 매개 증식을 감소시키며, 암세포의 면역학적 감시에서 벗어난다(Dong et al. (2003) J. Mol. Med. 81:281-7; Blank et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:307-314; Konishi et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:5094-100). 면역억제는 PD-L1과 PD-1의 국부적 상호작용을 억제함으로써 역전될 수 있고, 이 효과는 PD-L2와 PD-1과의 상호작용이 차단될 때 증가한다(Iwai et al. (2002) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 99:12293-7; Brown et al. (2003) J. Immunol. 170:1257-66).
PD-1은 CD28 패밀리의 억제 구성원이며 활성화된 B 세포, T 세포 및 골수 세포 상에서 발현된다(Agata et al., supra; Okazaki et al. (2002) Curr Opin Immunol 14: 391779-82; Bennett et al. (2003) J Immunol 170:711-8). PD-1 결핍 동물은 자가면역 심장병증을 포함하는 다양한 자가면역 질환, 및 관절염 및 신염으로 구성된 루푸스 유사 증후군이 발생하기 쉽다(Nishimura et al. (1999) Immunity 11:141-51; Nishimura et al. (2001) Science 291:319-22). 또한, PD-1은 자가면역 뇌척수염, 전신 홍반성 루프스, 이식편 대 숙주 질환(GVHD), I형 당뇨병 및 류마티스성 관절염에서 역할을 하는 것으로 밝혀졌다(Salama et al. (2003) J Exp Med 198:71-78; Prokunina and Alarcon-Riquelme (2004) Hum Mol Genet 13:R143; Nielsen et al. (2004) Lupus 13:510). 쥣과 B 세포 종양 주에서, PD-1의 ITSM은 BCR 매개 Ca2+ 유동(flux) 및 하류 이펙터 분자의 티로신 인산화를 차단하는데 필수적인 것으로 나타났다(Okazaki et al. (2001) PNAS 98:13866-71).
현재, 니볼루맙(BMS-936558, MDX-1106 또는 ONO-4538; BMS), 펨브롤리주맙(Merck)과 같은 많은 항-PD-1 항체가 있다.
선행 기술은 WO 제2006/121168호에 따른 특정 아미노산 서열을 포함하는 단클론 항-PD-1 항체(니볼루맙, BMS)를 개시하며, 이는 인간 PD-1에 대한 고친화성 결합과 같은 일부 유용한 특성을 나타내지만, 인간 CD28, CTLA-4 또는 ICOS와 유의한 교차 반응성을 나타내지 않는다. 또한, 이들 항체는 면역 반응을 조절하는 것으로 나타났다. 따라서, 본 출원은 또한 항-PD-1 항체를 사용하여 면역 반응을 조절하는 방법을 기술한다. 특히, 본 발명은 항-PD-1 항체를 사용하여 종양 세포의 생체내 성장을 억제하는 방법을 제공한다.
선행 기술은 또한 제1 가변 영역 및 제2 가변 영역을 포함하는 WO제2009/114335호에 기술된 단리된 PD-1 결합 단백질(펨브롤리주맙, Merck)을 개시한다. 제1 가변 영역은 다양한 CDR을 포함하는 중쇄이고, 제2 가변 영역은 또한 다양한 CDR을 포함하는 경쇄이다.
따라서, PD-1을 인식하는 항체, 및 이러한 제제의 사용 방법을 개발하는 것이 중요하다. 본 발명은 PD-1에 특이적으로 결합하고 시험 분석에서 기능적 활성, 친화성, 특이성, 및 안정성의 유리한 특징을 갖는 항체를 제공한다.
본 발명은 PD-1에 특이적으로 결합하는 인간 단클론 항체에 관한 것이다. 이러한 항체는 종양학적 질환 및 전염병의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 단클론 항체는 항체를 이용한 치료를 포함하는 상기 질환의 현재의 치료 방법과 비교하여 최상의 임상 반응을 제공하는 것으로 여겨진다.
일 양태에서, 본 발명은 인간 PD-1 수용체에 결합할 수 있고 서열 번호 3의 서열과 적어도 75% 상동인 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 서열 번호3의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 단편에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항체 또는 이의 단편에 관한 것이다:
- 서열 번호 7의 서열과 적어도 75% 상동인 중쇄 가변 도메인의 서열, 및
- 서열 번호 8의 서열과 적어도 75% 상동인 경쇄 가변 도메인의 서열.
일 구현예에서, 본 발명은 서열 번호 1-3의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 단편에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 결합 단편은 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 결합 도메인과 동일한 에피토프에 대한 결합을 경쟁하거나 그에 결합한다.
일부 구현예에서, 결합 단편은 서열 번호 7의 아미노산 서열과 적어도 90% 상동이다. 본 발명의 일 구현예에서, 결합 도메인은 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 결합 도메인은 인간화될 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 아이소타입과 관련된 것을 특징으로 한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 9의 서열과 적어도 90% 상동인 중쇄 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 10의 서열과 적어도 90% 상동인 경쇄 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 항체 또는 이의 단편의 Fc 불변 영역은 천연 서열과 비교하여 임의의 이펙터 기능(ADCC, ADCP 또는 CDC)을 감소시키거나 제거하는 임의의 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 이의 단편의 Fc 불변 영역은 t1/ 2β(h) 또는 Cmax(μg/ml)와 같은 동물 또는 인간 약동학 파라미터를 증가시키는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기 특성 중 적어도 하나를 갖는다:
a) 응집 안정성: 응집체 함량은 6개월 초과 동안 저장 온도 T = 4℃에서 및 10 mg/ml 초과의 농도의 용액에서 초기 함량의 5% 초과로 증가하지 않음;
b) 응집 안정성: 응집체 함량은 2주 초과 동안 37℃까지 온도의 증가로 및 10 mg/ml 초과의 농도의 용액에서 초기 함량의 5% 초과로 증가하지 않음;
c) 응집 안정성: 응집체 함량은 6시간 초과 동안 50℃까지 온도의 증가로 및 10 mg/ml 초과의 농도에서 초기 함량의 5% 초과로 증가하지 않음;
d) 인간 PD-1에 결합할 때 10-9(M) 이하의 해리 상수 KD;
e) 인간 PD-1에 결합할 때 105(1/Ms) 이상의 동역학 결합 상수 kon(1/Ms);
f) 인간 PD-1에 결합할 때 10-4(1/s) 이하의 동역학 해리 상수 dis(1/s).
일 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 항체의 임의의 항원 결합 단편을 포함하는 이중특이성 항체에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 제1항-제14항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 도메인을 코딩하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 단리된 핵산 분자 중 어느 하나를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 발현 벡터를 이용하여 적합한 줄기 세포를 형질감염시키는 단계를 포함하는, 숙주 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 숙주 세포의 생산, 상기 항체 또는 이의 단편을 생산하기에 충분한 조건 하에 숙주 세포의 배양 후, 수득된 항체 또는 이의 활성 단편의 단리 및 정제를 포함하는, 본원에 기재된 바와 같은 임의의 항체의 제조 방법에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 조합된, 상기 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 약학 조성물은 종양학적 질환 및 전염병의 치료에 사용하도록 의도된다.
일 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 임의의 항체의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, PD-1의 생물학적 활성의 억제를 필요로 하는 대상에서 PD-1의 생물학적 활성을 억제하는 방법에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 항체 또는 항원 결합 단편 또는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 환자의 치료 방법에 관한 것이다.
도 1 인간 나이브(naive) 조합 라이브러리의 합성 계획.
도 2. Fab 파아지 디스플레이 라이브러리의 클로닝을 위한 파아지미드(A) 및 Fab의 생산을 위한 발현 플라스미드(B).
도 3. 환원 조건(3A, 12% SDS-PAGE), 비환원 조건(3B, 8% SDS-PAGE) 하에 BCD-100 전기영동도.
도 4. BCD-100과 PD1 및 다른 항원과의 상호작용의 면역효소 분석.
도 5. Jurkat-NFAT-PD1 리포터 세포주에서 항-PDI 항체에 의한 NFAT-신호전달의 재활성화.
도 6. 스타필로코커스 장독소의 존재하에 인간 전혈에서 항-PD1 항체에 의한 IL-2의 생산의 자극.
도 7. Jurkat-PD1 세포주에서 항-PD1 항체의 항체 의존적 세포 매개　세포독성(ADCC)의 분석.
도 8. Octet RED 96에서 BCD-100 후보와 FcRn 및 Fcγ 수용체와의 상호작용의 분석.
도 9. BCD-100과 상이한 유기체의 PD1 수용체와의 상호작용의 면역효소 분석.
도 10. BCD-100과 CD28 패밀리 수용체와의 상호작용의 면역효소 분석.
도 11. Octet RED 96에서 BCD-100 후보와 인간 및 시노몰구스 원숭이 PD1 수용체와의 상호작용의 분석.
도 12. BCD-100 분자의 열 스트레스(50℃, 12시간)의 결과.
정의 및 일반 방법
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 구현예의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및/또는 물질이 하기에 기술되어 있다. 본원에 언급된 모든 간행물 및 다른 문헌은 그 전체가 참고로 포함된다. 충돌이 있는 경우, 정의를 포함하는 본 설명이 우선할 것이다. 많은 선행 기술이 본원에 언급되지만, 이러한 문헌은 이들 문서 중 어느 하나가 당업계의 통상적인 일반 지식의 일부를 형성한다는 것을 인정하는 것은 아니다.
또한, 문맥에 의해 달리 요구되지 않는 한, 단수의 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수의 용어는 단수를 포함할 것이다. 전형적으로, 세포 및 조직 배양, 분자생물학, 면역학, 미생물학, 유전학, 분석 화학, 유기 합성 화학, 의학 및 약화학의 분류 및 방법뿐만 아니라 본원에 기재된 단백질 및 핵산의 혼성화 및 화학은 널리 알려져 있고 당업자에 의해 광범위하게 사용된다. 효소 반응 및 정제 방법은 당업계에 알려진 바와 같이, 또는 본원에 기재된 바와 같이, 제조사의 지침에 따라 수행된다.
본 개시 및 구현예 전반에서, 단어 "구성되다" 및 "포함하다" 또는 이의 변형, 예컨대 "구성되는", 또는 "포함하는"은 언급된 완전체(integer) 또는 완전체의 그룹을 포함하지만 임의의 다른 완전체 또는 완전체의 그룹을 배제하지 않는다는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
항체와 관련된 정의
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로그램된 사멸 1", "프로그램된 세포 사멸 1", "PD-1 단백질", "PD-1", "CD279", "PDCD1", "hPD-1" 및 "hPD-I"은 상호교환가능하며, 인간 PD-1의 임의의 변이체, 아형(isoform), 종 동족체 및 PD-1과 적어도 하나의 공통된 에피토프를 포함하는 이의 유사체를 지칭한다.
용어 "면역 반응", "자가면역 반응" 및 "자가면역 염증"은, 예를 들어, 림프구, 항원-제시 세포, 식세포, 과립구 및 상기 세포 또는 간 세포에 의해 생산된 가용성 거대분자(침입 병원체, 병원체로 감염된 세포 또는 조직, 암세포 또는, 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우, 인체로부터의 정상 세포 또는 조직의 선택적 손상, 파괴 또는 제거의 결과로서 생산된 항체, 사이토카인 및 보체 포함)의 작용을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "결합 분자"는 항체, 면역글로불린 및 항체의 항원 결합 단편을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "항체"(Ab) 또는 "면역글로불린"(Ig)은 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 중쇄(H)(약 50-70 kDa) 및 2개의 경쇄(L)(약 25 kDa)를 포함하는 사량체를 지칭하는 것으로 의도된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 중쇄 불변 영역(CH)으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 도메인(VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. VH 및 VL 도메인은 "프레임워크 영역"(FR)으로 불리는 보다 보존된 영역 사이에 배치된 "상보성 결정 영역"(CDR)으로 불리는 초가변성의 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 하기의 순서로 아미노 말단부터 카르복시 말단으로 배열된 3개의 CDR(본원에 사용된 H-CDR은 중쇄 CDR을 가리키고, 본원에 사용된 L-CDR은 경쇄 CDR을 가리킴) 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 각 영역에 대한 아미노산의 기여는 IMGT®(Lefranc et al., Dev Comp Immunol 27(1):55-77 (2003); 또는 Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987 and 1991)에 의한 정의); Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); 또는 Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989)에 의한 정의에 따라 이뤄질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 상호교환가능하다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 항체의 "항원 결합 부분"(또는 "항원 부분", "단편")은 항원(예컨대, PD1)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 부분 또는 단편을 지칭하는 것으로 의도된다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 일부 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 용어 "항원 결합 부분" 내에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역의 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab)2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 구성된 단일 도메인 항체 *dAb) 단편; 및 (vi) 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH는 개별 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자(단쇄 Fv(scFv)로 알려짐)를 형성하는 단쇄 단백질로서 제조될 수 있게 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 결합될 수 있다. 본 발명은 또한　 V H 및/또는 VL을 포함하는 항원 결합 분자를 제공한다. VH의 경우, 분자는 또한 CH1, 힌지, CH2 또는 CH3 영역 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 이러한 단쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원 결합 부분"에 포함되는 것으로 의도된다. 디아바디(diabody)와 같은 단쇄 항체의 다른 형태가 또한 포함된다. 디아바디는 도메인 VH 및 도메인 VL이 동일한 폴리펩타이드 사슬(VH-VL) 상에서 발현되는 작은 2가 및 이중특이성 항체이다. 동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이에 쌍을 이루기에 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또 다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 이루어 2개의 항원 결합 부위를 생성한다. Fab- 및 F(ab')2 단편과 같은 항체 영역은 종래의 기술, 예컨대, 전체 항체의 파파인 또는 펩신 가수분해를 사용하여 전체 항체로부터 제조될 수 있다. 더욱이, 항체, 이의 부분 및 면역부착 분자는, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
용어 "재조합 항체"는 항체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 세포 또는 세포주로부터 발현된 항체를 지칭하는 것으로 의도되며, 상기 뉴클레오타이드 서열(들)은 세포와 자연적으로 결합하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "변이체 항체"는 모 항체의 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 잔기를 부가, 결실 및/또는 치환함으로써 이의 "모(parental)" 항체의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 갖는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 바람직한 구현예에서, 변이체 항체는 모 항체와 비교하여 아미노산의 적어도 하나 이상(예컨대, 1 내지 12, 예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9, 10, 11 또는 12; 일부 구현예에서, 변이체 항체는 1 내지 약 10개를 포함함)의 부가, 결실, 및/또는 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 부가, 결실 및/또는 치환은 변이체 항체의 CDR에서 이루어진다. 변이체 항체의 서열에 관한 동일성 또는 상동성은, 서열을 정렬하고, 필요한 경우, 서열 동일성의 최대 백분율을 달성하기 위해 갭을 도입한 후, 모 항체 잔기와 동일한 변이체 항체 서열에서의 아미노산 잔기의 백분율로서 본원에서 정의된다. 변이체 항체는 모 항체가 결합하는 동일한 항원, 및 바람직하게는 에피토프에 결합하는 능력을 보유하며; 일부 구현예에서, 적어도 하나의 특성 또는 생물학적 활성이 모 항체보다 우수하다. 예를 들어, 변이체 항체는 모 항체와 비교하여, 예컨대, 더 강한 결합 친화성, 더 긴 반감기, 더 낮은 IC50, 또는 향상된 항원 생물학적 활성을 억제하는 능력을 가질 수 있다. 본원에서 특히 관심있는 변이체 항체는 모 항체와 비교하여 적어도 2배, (바람직하게는 적어도 5배, 10배 또는 20배)의 생물학적 활성의 향상을 나타내는 항체이다.
광의의 의미에서, 용어 "키메라 항체"는 하나의 항체의 하나 이상의 영역, 및 하나 또는 몇 가지 다른 항체의 하나 이상의 영역을 포함하는 항체, 전형적으로, 부분적으로 인간 및 부분적으로 비인간 항체, 즉 마우스, 랫트, 또는 유사한 해로운 야생동물과 같은 비인간 동물, 또는 라마(llama) 및 알파카(alpaca)와 같은 낙타과로부터 유래된 비인간 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 키메라 항체는 인간 항-항체 면역 반응, 예컨대 쥣과 항체의 경우 인간 항-마우스 항체 면역 반응의 위험을 감소시키기 위해 비인간 항체보다 일반적으로 바람직하다. 전형적인 키메라 항체의 예는 가변 영역 서열이 쥣과 서열인 반면, 불변 영역 서열은 인간인 항체다. 키메라 항체의 경우, 비인간 부분은 항체를 인간화하기 위해 추가로 변경될 수 있다.
용어 "인간화"는 항체가 완전히 또는 부분적으로 비인간 기원을 갖는 경우, 예를 들어, 마우스 또는 라마를 각각 관심 항원으로 각각 면역화함으로써 수득된 마우스 또는 라마 항체인 경우, 또는 항체가 이러한 마우스 또는 라마 항체에 기초한 키메라 항체인 경우, 인간에서 면역 반응을 피하거나 최소화하기 위해, 특히 중쇄 및 경쇄의 프레임워크 영역 및 불변 도메인 내의 특정 아미노산을 치환할 수 있다는 사실을 지칭하는 것으로 의도된다. 항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 CDR에 위치한 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유 때문에, CDR 내의 아미노산 서열은 CDR 외부의 아미노산 서열보다 개별 항체 사이에서 훨씬 더 가변적이다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 예컨대, 상이한 항체의 프레임워크 서열 상에 이식된 특정 항체의 CDR 서열을 발현하는 발현 벡터를 제작함으로써, 특정 자연발생 항체, 또는 보다 일반적으로 상기 아미노산 서열을 갖는 임의의 특정 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현시킬 수 있다. 그 결과, 비인간 항체를 "인간화"하고, 대체로 초기 항체의 결합 특이성 및 친화성을 보존할 수 있다. 특정 항체의 면역원성 및 그에 따른 인간 항-항체 반응을 정확하게 예측할 수 없지만, 비인간 항체는 전형적으로 인간 항체보다 더 면역원성이다. 외래(예컨대, 해로운 야생동물 또는 낙타과) 불변 영역이 인간 기원의 서열로 치환된 키메라 항체가 일반적으로 완전 외래 기원의 항체보다 덜 면역원성인 것으로 나타났고, 치료용 항체의 추세는 인간화 또는 완전 인간 항체로 향하고 있다. 따라서, 키메라 항체 또는 비인간 기원의 다른 항체는 인간 항-항체 반응의 위험을 감소시키기 위해 인간화될 수 있다.
키메라 항체의 경우, 인간화는 전형적으로 가변 영역 서열 중 프레임워크 영역의 변형을 포함한다. 상보성 결정 영역(CDR)의 일부인 아미노산 잔기는 인간화에 의해 대부분 변형되지 않을 것이지만, 일부 경우 CDR의 개별 아미노산 잔기를 변형하기 위해, 예를 들어, 당화 부위, 탈아미드화 부위, 아스파테이트 이성질체화 부위, 또는 원하지 않는 시스테인 또는 메티오닌 잔기를 제거하기 위해, 그것이 바람직할 수 있다. N 연결된 당화는　트리펩타이드 서열 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr(여기서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음) 내의 아스파라긴 잔기에 올리고당 사슬을 부착시킴으로써 이뤄진다. N-당화 부위의 제거는 Asn 또는 Ser/Thr 잔기 중 하나를 상이한 잔기에 의해 돌연변이시킴으로써, 바람직하게는 보존적 치환에 의해, 달성될 수 있다. 아스파라긴 및 글루타민 잔기의 탈아미드화는 pH 및 표면 노출과 같은 인자에 따라 발생할 수 있다. 아스파라긴 잔기는, 주로 서열 Asn Gly에 존재할 때, 그리고 더 적은 정도로 Asn-Ala과 같은 다른 디펩타이드 서열에 존재할 때, 특히 탈아미드화에 민감하다. CDR 서열이 이러한 탈아미드화 부위, 특히 Asn-Gly를 포함한다면, 전형적으로 보존적 치환에 의해 이 부위를 제거하여 연루된　잔기 중 하나를 제거하는 것이 바람직할 수 있다.
항체 서열을 인간화하는 많은 방법이 당업계에 알려져 있으며; 예를 들어, 문헌[Almagro & Fransson, Front Biosci. 13:1619-1633 (2008)]에 의한 검토를 참고한다. 통상적으로 사용되는 한 가지 방법은, 예컨대, 쥣과 키메라 항체가 쥣과 가변 영역 유전자에 대한 인간 생식계열 유전자 대응물의 확인 및 쥣과 CDR 서열의 이 프레임워크 내로의 이식을 포함하는 경우, CDR 이식이다. 최근 판(Magdelaine-Beuzelin et al., Crit Rev.Oncol Hematol. 64:210 225 (2007))이 IMGT®(the international ImMunoGeneTics information system®, www.imgt.org) 정의가 인간화 결과를 개선할 수 있다고 제시하고 있지만(Lefranc et al., Dev. Comp Immunol. 27:55-77 (2003) 참고), CDR 이식은 Kabat에 의한 CDR 정의에 기초할 수 있다. 일부 경우, CDR 이식은 CDR이 수득된 모 항체와 비교하여 CDR 이식된 비인간 항체의 결합 특이성 및 친화성, 및 결과적으로 생물학적 활성을 감소시킬 수 있다. 모 항체의 결합 특이성 및 친화성을 회복시키기 위해, CDR 이식된 항체의 선택된 위치에, 전형적으로 프레임워크 영역 내에 역 돌연변이(back mutation)(때때로 "프레임워크 영역 복구"로도 불림)가 도입될 수 있다. 가능한 역 돌연변이를 위한 위치는 문헌 및 항체 데이터베이스에서 이용가능한 정보를 사용하여 확인할 수 있다. 역 돌연변이를 위한 후보인 아미노산 잔기는 항체 분자의 표면에 위치한 잔기인 반면, 묻혀 있거나 낮은 정도의 표면 노출을 갖는 잔기는 일반적으로 변경되지 않을 것이다. CDR 이식 및 역 돌연변이에 대한 대안적인 인간화 기술은, 비인간 기원의 비표면 노출된 잔기는 유지되는 반면 표면 잔기는 인간 잔기로 변경되는 재표면화(resurfacing)이다.
특정 경우, 표적 에피토프에 대한 결합 친화성을 개선하기 위해 하나 이상의 CDR 아미노산 잔기를 변경시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 이것은 "친화성 성숙"으로 알려져 있으며, 이는, 예를 들어 항체의 인간화가 감소된 결합 특이성 또는 친화성을 초래하고 역 돌연변이 단독에 의해 결합 특이성 또는 친화성을 충분히 개선할 수 없는 상황에서, 인간화와 관련하여 선택적으로 수행될 수 있다. 다양한 친화성 성숙 방법, 예를 들어 문헌[Burks et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94:412-417 (1997)]에 의해 기술된 시험관내 스캐닝 포화 돌연변이유발 방법 및 문헌[Wu et al., Proc Natl Acad Sci USA 95:6037 6042 (1998)]에 의한 단계적 시험관내 친화성 성숙 방법이 당업계에 알려져 있다.
용어　"단리된　단백질", "단리된　폴리펩타이드" 또는 "단리된　항체"는, 이의 유래의 기원 또는 공급원에 의해, (1) 그의 천연 상태에서 이들을 동반하는 자연적으로 결합된 성분과 결합되지 않거나, (2) 동일한 종으로부터의 다른 단백질이 없거나, (3) 상이한 종으로부터의 세포에 의해 발현되거나, 또는 (4) 자연에서 발생하지 않는 단백질,　폴리펩타이드 또는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 따라서, 화학적으로 합성되거나 또는 자연적으로 기원하는 세포와 상이한 세포 시스템에서 합성된 폴리펩타이드는 그의 자연적으로 결합된 성분으로부터 "단리"될 것이다. 단백질은 또한　당업계에 널리 알려진 단백질　정제 기술을 사용한 단리에 의해 자연적으로 결합된 성분이 실질적으로 없을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "생식(germinal)"은 항체 유전자 및 유전자 절편의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열 및 이들이 생식 세포를 통해 부모로부터 자손으로 어떻게 전달되는지를 의미하는 것으로 의도된다. 생식계열 서열은 B 세포의 성숙 동안 재조합 및 수퍼돌연변이의 결과로서 변경된 성숙한 B 세포 내의 항체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 상이하다. 특정 생식계열 서열을 "이용"하는 항체는, 임의의 다른 생식계열 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열보다 더 완전하게 상응하는 생식계열 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열에 정렬된 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 갖는다.
용어 "친화성"은 항원과 결합 분자, 예컨대, 항체 사이의 인력을 측정하는 것을 지칭하는 것으로 의도된다. 결합 분자를 항체로 끌어당기는 고유의 능력은 전형적으로 특정 결합 분자-항원 상호작용의 결합 친화성 평형 상수(KD)로서 표현된다. 결합 분자는 KD가 < 1 mM, 바람직하게는 < 100 nM일 때 항원에 특이적으로 결합한다고 한다. KD　결합 친화성 상수는, 예를 들어 ProteOnTM XPR36 SPR(Bio-Rad) 또는 OctetTM 시스템을 사용하여, 예컨대, 표면 플라스몬 공명(BIAcoreTM) 또는 생물층 간섭법(bio-layer interferometry)에 의해 측정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "Ka"는 특정 항체-항원 상호작용의 결합 속도를 지칭하는 것으로 의도되는 반면, 용어 "Kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭하는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "Kd"는 해리 상수를 지칭하는 것으로 의도되며, 이는 Kd 대 Ka의 비율(즉 Kd/Ka)로부터 수득되고 몰 농도(M)로 표현된다. 항체에 대한 Kd 값은 당업계에 널리 확립된 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
항체의 Kd를 결정하기 위한 바람직한 방법은 BIAcoreTM 시스템과 같은 바이오센서 시스템을 사용하는 표면 플라스몬 공명이다.
본원에 사용된 바와 같이, IgG 항체에 대한 용어 "고친화성"은 표적 항원에 대해 Kd　10-8　M, 더욱 바람직하게는 10-9　M 이하 및 더욱더 바람직하게는 10-10　M 이하를 갖는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 그러나, "고친화성" 결합은 다른 항원 아이소타입마다 다를 수 있다. 예를 들어, IgM 아이소타입에 대한 "고친화성" 결합은 KD　10-7　M 이하, 더욱 바람직하게는 10-8　M 이하, 더욱더 바람직하게는 10-9　M 이하를 갖는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "koff"는 특정 결합 분자-항원 상호작용의 해리 속도 상수를 지칭하는 것으로 의도된다. 해리 속도 상수(koff+)는 생물층 간섭법을 사용하여, 예를 들어, Octet™ 시스템을 사용하여 측정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "에피토프"는 결합 분자(예를 들어, 항체 또는 관련 분자, 예컨대 이중특이성 결합 분자)에 특이적으로 결합하는 항원의 부분(결정기)을 지칭하는 것으로 의도된다. 에피토프 결정기는 일반적으로 아미노산 또는 탄수화물 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹으로 구성되며, 전형적으로 특이적 3차원 구조적 특징뿐만 아니라 특이적 전하 특징을 포함한다. 에피토프는 "선형" 또는 "구조적(conformational)"일 수 있다. 선형 에피토프에서, 단백질(예컨대, 항원) 및 상호작용 분자(예컨대, 항체) 사이의 모든 상호작용점은 단백질의 일차 아미노산 서열을 따라 선형으로 존재한다. 구조적 에피토프에서, 상호작용점은 일차 아미노산 서열에서 서로 분리된 단백질 상의 아미노산 잔기에 걸쳐 존재한다. 항원의 원하는 에피토프가 결정되면, 당업계에 널리 알려진 기술을 사용하여 상기 에피토프에 대한 항체를 생성할 수 있다. 또한, 항체 또는 다른 결합 분자의 생성 및 특성 규명은 바람직한 에피토프에 관한 정보를 설명할 수 있다. 이후, 이 정보로부터, 예컨대, 항원과의 결합에 대해 서로 경쟁하는 결합 분자를 발견하기 위한 경쟁 연구를 수행함으로써, 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 경쟁적으로 스크리닝할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "에피토프"는, 특히, 동물, 바람직하게는 포유동물, 예컨대 마우스 및 인간에서 항원성 및/또는 면역원성 활성을 갖는 폴리펩타이드 단편을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "항원성 에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있고 당업계에 널리 알려진 임의의 기술, 예를 들어, 표준 면역분석에 의해 검출될 수 있는 폴리펩타이드 단편이다. 항원 에피토프는 반드시 면역원성일 필요는 없으나, 이들은 면역원성일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이 "면역원성 에피토프"는, 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 결정된 바와 같이, 동물에서 항체 반응을 일으키는 폴리펩타이드 단편으로서 정의된다. "비선형 에피토프" 또는 "구조적 에피토프"는 에피토프 특이적 항체에 결합하는 항원 단백질 내의 비인접 폴리펩타이드(또는 아미노산)를 포함한다.
당업계에 알려진 방법을 사용하여 항체 또는 다른 결합 분자가 본 발명의 PD-1 결합 분자와 동일한 에피토프에 결합하는지 또는 본 발명의 PD-1 결합 분자와 결합에 대해 교차 경쟁하는지 결정할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 분자를 포화 조건 하에서 PD-1에 결합시킨 다음, 상기 표적 항원에 결합하는 시험 항체의 능력을 측정한다. 시험 항체가 참조 결합 분자와 동시에 표적 항원에 결합할 수 있으면, 시험 항체는 참조 결합 분자와 상이한 에피토프에 결합한다. 그러나, 시험 항체가 동시에 표적 항원에 결합할 수 없으면, 시험 항체는 동일한 에피토프, 중첩 에피토프, 또는 결합 분자가 결합한 에피토프에 매우 근접한 에피토프에 결합한다. 이 실험은 ELISA, RIA, BIACORETM, 생물층 간섭법 또는 유세포 분석법을 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 결합 분자가 또 다른 결합 분자와 교차 경쟁하는지 여부를 시험하기 위해, 상기 기재된 경쟁 방법을 두 가지 방향으로 사용할 수 있고, 즉 공지된 결합 분자가 시험 결합 분자를 차단하는지 또는 반대인지 결정할 수 있다. 이러한 교차 경쟁 실험은, 예컨대, IIBS MX96 SPR 또는 OctetTM 시스템을 사용하여 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 단클론 항체이다. 본원에 사용된 바와 같이, 약어 "mAb"는 단클론 항체, 즉 세포의 개별적인 클론 집단에 의해 합성되고 단리된 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 클론 집단은 불멸화 세포의 클론 집단일 수 있다. 일부 구현예에서, 클론 집단 내의 불멸화 세포는 전형적으로 면역화된 동물로부터의 개별적인 B 림프구와 림프구성 종양으로부터의 개별적인 세포와의 융합에 의해 생산된 하이브리도마인 잡종 세포이다. 하이브리도마는 제작된 세포의 하나의 유형이며 자연계에 존재하지 않는다.
항체의 부류(아이소타입) 및 하위부류는 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 항체의 부류 및 하위부류는 항체의 특정 부류 및 하위부류에 특이적인 항체에 의해 결정될 수 있다. 이러한 항체는 상업적으로 이용가능하다. 부류 및 하위부류는 ELISA, 웨스턴 블롯 분석, 및 다른 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 부류 및 하위부류는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 불변 도메인의 전부 또는 일부를 시퀀싱하고, 이의 아미노산 서열을 면역글로불린의 다양한 부류 및 하위부류의 공지된 아미노산 서열과 비교하고, 항체의 부류 및 하위부류를 결정함으로써 결정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "단클론 항체" 또는 "단클론 항체 조성물"은 단일 분자 조성의 항체 분자의 제제를 지칭한다. 단클론 항체 조성물은 특정 항원 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "인간 항체"는 프레임워크 및 CDR 모두가 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 포함하는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 상기 항체가 불변 영역을 함유하는 경우, 불변 영역은 또한 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된다.
본 발명의 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다(예컨대, 무작위 또는 부위 특이적 시험관내 돌연변이유발에 의해 도입된 돌연변이, 또는 생체내 체세포 돌연변이). 그러나, 본원에 사용된 바와 같이 용어 "인간 항체"는 마우스와 같은 또 다른 포유동물 종의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 이식된 항체를 포함하지 않는 것으로 의도된다.
용어 "인간 단클론 항체"는 프레임워크 및 CDR 모두가 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 일 구현예에서, 인간 단클론 항체는 불멸화 세포에 융합된 인간 중쇄 이식유전자 및 인간 경쇄 이식유전자를 포함하는 게놈을 갖는, 형질전환 비인간 동물, 예컨대, 형질전환 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 조작 또는 단리된 모든 인간 항체, 예컨대 (a) 인간 면역글로불린 유전자에 대해 형질전환(transgenic) 또는 트랜스크로모좀(transchromosomal)인 동물(예컨대, 마우스) 또는 이로부터 제조된 하이브리도마(하기에 추가로 기술됨)로부터 단리된 항체, (b) 인간 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예컨대, 트랜스펙토마(transfectoma)로부터 단리된 항체, (c) 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 인간 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열에 스플라이싱(splicing)하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 조작 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 프레임워크 영역 및 CDR이 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는다. 그러나, 특정 구현예에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발(또는, Ig 서열에 대한 형질전환 동물이 사용되는 경우, 체세포 돌연변이유발)에 적용될 수 있고, 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL　영역의 아미노산 서열은 인간 생식계열 VH 및 VL　서열로부터 유래되거나 관련되지만, 생체내에서 인간 항체 생식계열 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
문구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 본원에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 항체 "변이체"는 그의 아미노산 서열이 모 항체의 서열에서의 하나 이상의 아미노산 잔기의 부가, 결실 및/또는 치환에 의해 모 서열과 상이한 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 바람직한 구현예에서, 변이체 항체는 모 항체의 CDR에서 적어도 하나(예를 들어, 1 내지 약 10, 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8)의 아미노산 부가, 결실 및/또는 치환을 포함한다. 본 출원은 서열을 정렬하고, 필요한 경우 최대 백분율 동일한 서열을 달성하기 위해 절단한 후, 모 항체에서의 잔기와 동일한 변이체 항체 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 변이체 항체의 서열에 관한 동일성 또는 상동성을 정의한다. 변이체 항체는 모 항체가 결합하는 것과 동일한 항원 또는, 바람직하게는, 에피토프에 결합하는 능력을 유지하거나, 바람직하게는, 모 항체의 특성 또는 생물학적 활성을 초과하는 적어도 하나의 특성 또는 생물학적 활성을 나타낸다. 예를 들어, 항체는 바람직하게는 모 항체와 비교하여 더 강한 친화성, 더 긴 반감기, 더 낮은 IC50 또는 향상된 항원 생물학적 활성을 억제하는 능력을 갖는다. 본원에 특히 관심있는 변이체 항체는 모 항체와 비교하여 적어도 약 2배, 바람직하게는 적어도 약 5배, 10배 또는 20배의 생물학적 활성의 향상을 나타내는 항체이다.
핵산 서열의 맥락에서 용어 "동일성" 또는 "상동성"은 최대 대응을 위해 정렬될 때 동일한 2개의 서열 내의 잔기를 지칭하는 것으로 의도된다. 서열 동일성의 비교는 적어도 약 9 뉴클레오타이드, 일반적으로 적어도 약 18 뉴클레오타이드, 더욱 일반적으로 적어도 약 24 뉴클레오타이드, 전형적으로 적어도 약 28 뉴클레오타이드, 더욱 전형적으로 적어도 약 32 뉴클레오타이드, 및 바람직하게는 적어도 약 36, 48 이상의 뉴클레오타이드의 길이로 확장될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열 동일성을 측정하는데 사용될 수 있는 당업계에 알려진 많은 다양한 알고리즘이 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 서열은 Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group(GCG), Madison, Wisconsin의 프로그램인 FASTA, Gap 또는 BESTFIT를 사용하여 비교될 수 있다. 예컨대, FASTA2 및 FASTA3 프로그램을 포함하는 FASTA는 질의 및 서치 서열 간의 최상의 중첩 영역의 정렬 및 백분율 서열 동일성을 제공한다(Pearson, Methods Enzymol. 183:63 98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266: 227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276: 71-84 (1998)). 달리 명시되지 않는 한, 특정 프로그램 또는 알고리즘에 대한 기본 파라미터가 사용된다. 예를 들어, 핵산 서열 간의 백분율 서열 동일성은 기본 파라미터(6의 워드 크기 및 스코어링 매트릭스에 대한 NOPAM 인자)를 갖는 FASTA를 사용하여 또는 GCG 버전 6.1에서 제공된 기본 파라미터를 갖는 Gap을 사용하여 결정될 수 있다.
항체의 폴리펩타이드 서열에 관한 용어 "상동성"은 폴리펩타이드 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 더욱 바람직하게는 90% 및 가장 바람직하게는 95% 서열 동일성을 나타내는 항체로서 해석되어야 한다. 핵산 서열과 관련된 상기 용어는 핵산 서열에 대해 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95% 및 가장 바람직하게는 97% 서열 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드의 서열로서 해석되어야 한다.
본원에 사용된 바와 같이, "모" 항체는 변이체를 수득하기 위해 사용되는 아미노산 서열에 의해 코딩된 항체이다.
본 발명의 항체는 다양한 공급원으로부터 수득된 DNA의 셔플링(shuffling)을 포함하는 재조합 방법을 사용하는 것을 포함하는, 다양한 디자인 기술에 의해 제조될 수 있다.
용어 "인간화 항체"는 마우스와 같은 또 다른 포유동물 종의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 이식된 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 추가의 프레임워크 영역 변형은 이러한 인간 프레임워크 서열 내에서 이뤄질 수 있다.
용어 "키메라 항체"는 가변 영역 서열이 하나의 종으로부터 유래되고 불변 영역 서열이 또 다른 종으로부터 유래된 항체, 예컨대 가변 영역 서열이 쥣과 항체로부터 유래되고 불변 영역 서열이 인간 항체로부터 유래된 항체를 지칭하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "특이적으로 결합하다"는 특정 결합 쌍 중 하나의 구성원이 이의 특이적 결합 파트너(들) 이외의 분자에 유의하게 결합하지 않는 상황을 지칭하는 것으로 의도된다. 상기 용어는 또한 예컨대 본 발명의 항체의 항원 결합 도메인이 많은 항원이 갖는 특정 에피토프에 특이적인 경우에 적용가능하며, 이 경우, 항원 결합 도메인을 포함하는 특이적 항체는 에피토프를 갖는 다양한 항원에 특이적으로 결합할 수 있을 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "인간 PD-1에 특이적으로 결합하는" 항체는 1×10-7　M 이하, 더욱 바람직하게는 5×10-8M 이하, 더욱 바람직하게는 1×10-8M 이하, 더욱 바람직하게는 5×10-9M 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다.
용어 "이중특이성 항체" 또는 "다중특이적 항체"는 둘 이상의 에피토프에 선택적으로 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 이중특이성 항체는, 예컨대, 2개의 상이한 항원 결합 부분을 포함할 수 있고, 상기 항원 결합 부분은 상이한 분자(예컨대, 항원) 상의, 또는 동일한 분자 상의(예컨대, 동일한 항원 상의) 상이한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 이중특이성 항체가 2개의 상이한 에피토프(제1 에피토프 및 제2 에피토프)에 선택적으로 결합할 수 있는 경우, 제1 에피토프에 대한 제1 항원 결합 부분의 친화성은 전형적으로 제2 에피토프에 대한 제1 항원 결합 부분의 친화성보다 적어도 1 내지 2, 또는 3, 또는 4 자리수가 낮거나 그 반대일 것이다. 이중특이성 항체에 의해 인식된 에피토프는 동일하거나 상이한 표적(예컨대, 동일하거나 상이한 단백질 상의)일 수 있다. 이중특이성 항체는, 예를 들어, 동일한 항원 상의 상이한 에피토프를 인식하는 중쇄를 조합함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 상이한 에피토프를 인식하는 가변 중쇄 서열을 코딩하는 핵산 서열은 다양한 중쇄 불변 영역을 코딩하는 핵산 서열에 융합될 수 있고, 이러한 서열은 면역글로불린 경쇄를 발현하는 세포에서 발현될 수 있다. 전형적인 이중특이성 항체는 3개의 중쇄 CDR 다음에(N-말단에서 C-말단으로) CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 각각 포함하는 2개의 중쇄, 및 항원 결합 특이성을 갖지 않지만 각각의 중쇄와 조합될 수 있는 면역글로불린 경쇄, 각각의 중쇄와 조합될 수 있고 항원 결합 중쇄 영역에 의해 제한된 하나 이상의 에피토프에 결합할 수 있는 면역글로불린 경쇄, 또는 각 중쇄와 조합될 수 있고 하나 또는 둘 모두의 에피토프에 대한 하나 또는 둘 모두의 중쇄의 결합을 촉진하는 면역글로불린 경쇄를 포함한다.
본 발명의 항체와 관련하여 문구 "생물학적 특성" 또는 "생물활성," "활성" 또는 "생물학적 활성"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 비제한적으로, 에피토프/항원 친화성 및 특이성, 생체내 또는 시험관내에서 PD-1의 활성을 중화시키거나 길항하는 능력, IC50, 항체의 안정성 및 생체내에서 항체의 면역원성 특성을 포함한다. 항체의 다른 확인가능한 생물학적 특성은, 예를 들어, 교차 반응성, (즉, 일반적으로 표적 펩타이드의 비인간 동족체와의, 또는 다른 단백질 또는 조직과의), 및 포유동물 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 유지하는 능력을 포함한다. 상기 특성 또는 특징은, 비제한적으로 ELISA, 경쟁적 ELISA, BIACORE 또는 KINEXA를 사용한 표면 플라스몬 공명에 의한 항원-항체 상호작용, 또는 ForteBio를 사용한 생물층 간섭법, 비제한적으로 시험관내 또는 생체내 중화 분석, 수용체 결합, 사이토카인 또는 성장 인자의 생산 및/또는 분비, 신호 전달 및 인간, 영장류, 또는 임의의 다른 공급원을 포함하는 다양한 공급원으로부터의 조직 절편의 면역조직화학을 포함하는, 당업계에 인식된 기술을 사용하여 관찰, 측정 또는 평가될 수 있다.
본 발명의 항체의 활성과 관련하여 본원에 사용된 바와 같이 용어 "억제하다" 또는 "중화하다"는, 예컨대 비제한적으로 생물학적 활성(예컨대, PD-1의 활성) 또는 특성, 질환 또는 병태를 포함하는, 억제되는 것의 진행 또는 중증도를 실질적으로 길항하거나, 방지하거나, 억제하거나, 저지하거나, 늦추거나, 파괴하거나, 제거하거나, 중지시키거나, 감소시키거나, 역전시키는 능력을 지칭하는 것으로 의도된다. 본 발명의 항체를 PD-1에 결합시킴으로써 야기되는 PD-1의 활성의 억제 또는 중화는 바람직하게는 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상이다.
PD-1 결합 분자
본 발명은 서열 번호 3의 서열과 적어도 75% 상동인, 예를 들어, 서열 번호 3의 서열과 적어도 91%, 92%, 93% %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 인간 PD-1 수용체에 결합하는 능력을 갖는 결합 분자에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 항-PD1 항체의 중쇄(HC)는 서열 번호 1의 서열과 적어도 60% 동일하며, 예를 들어, 서열 번호 2의 서열과 적어도 60%, 70% 또는 80% 동일하다. 일부 구현예에서, 항-PD1 항체의 중쇄(HC)는 서열 번호 7의 서열과 적어도 90% 동일하며, 예를 들어, 서열 번호 7의 서열과 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다. 특정 구현예에서, HC는 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
일부 구현예에서, 항-PD1 항체의 경쇄는 서열 번호 4의 경쇄 CDR1(L-CDR1) 아미노산 서열, 서열 번호 5의 경쇄 CDR2(L-CDR2) 아미노산 서열, 서열 번호 6의 경쇄 CDR3(L-CDR3) 아미노산 서열, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, PD1 항체의 경쇄는 서열 번호 4, 서열 번호 5 및 서열 번호 6에 나타낸 아미노산 서열 L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-PD1 항체의 경쇄는 서열 번호 8의 서열과 적어도 60% 동일한, 예를 들어, 서열 번호 8의 서열과 적어도 60%, 70%, 또는 80% 동일한 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-PD1 항체의 경쇄는 서열 번호 8의 서열과 적어도 90% 동일한, 예를 들어, 서열 번호 8의 서열과 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 특정 구현예에서, VL 도메인은 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
일부 구현예에서, 항-PD1 항체의 경쇄(LC)는 서열 번호 10의 서열과 적어도 60% 동일하며, 예를 들어, 서열 번호 10의 서열과 적어도 60%, 70%, 또는 80% 동일하다. 일부 구현예에서, PD1 항체의 경쇄(LC)는 서열 번호 10의 서열과 적어도 90% 동일하며, 예를 들어, 서열 번호 10의 서열과 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% 97%, 98%, 또는 99% 동일하다. 특정 구현예에서, VL 도메인은 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
본원에 기재된 기술을 사용하여 수득된 결합 분자의 부류는 또 다른 부류 또는 하위부류로 전환될 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, VL 또는 VH를 코딩하는 핵산 분자는　CL 또는 CH를 코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않도록 당업계에 널리 알려진 방법을 사용하여 단리된다. VL 또는 VH를 코딩하는 핵산 분자는　상이한 부류의 면역글로불린 분자로부터의 CL 또는 CH를 각각 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되었다. 이것은 상기 기재된 바와 같은 CL 또는 CH　사슬을 포함하는 벡터 또는 핵산 분자를 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 원래 IgM이었던 결합 분자는　IgG로 부류 전환될 수 있다. 또한, 부류 전환은 하나의 IgG 하위부류를 또 다른 IgG 하위부류로, 예컨대, IgG1을 IgG2로 변환하는데 사용될 수 있다. 원하는 아이소타입을 갖는 본 발명의 결합 분자를 생산하는 예시적인 방법은 결합 분자의 중쇄를 코딩하는 핵산 분자 및 결합 분자의 경쇄를 코딩하는 핵산 분자를 단리하는 단계, 중쇄의 가변 도메인을 수득하는 단계, 중쇄의 가변 도메인을 원하는 아이소타입의 중쇄의 불변 도메인과 라이게이션하는 단계, 경쇄 및 라이게이션된 중쇄를 세포에서 발현시키는 단계, 및 원하는 아이소타입을 갖는 결합 분자를 수득하는 단계를 포함한다.
본 발명의 결합 분자는 IgG, IgM, IgE, IgA, 또는 IgD 분자일 수 있지만, 전형적으로 IgG 아이소타입, 예컨대, lgG 하위부류의 IgG1, lgG2a 또는 b, IgG3, 또는 IgG4이다. 일 구현예에서, 결합 분자는 lgG 하위부류의 IgG1 항체이다.
일 구현예에서, 결합 분자는 Fc 영역에 적어도 하나의 돌연변이를 포함할 수 있다. 많은 다양한 Fc 돌연변이가 알려져 있으며, 이들 돌연변이는 변경된 이펙터 기능을 제공한다. 예를 들어, 많은 경우에, 예컨대, 리간드-수용체 상호작용이 바람직하지 않은 경우 또는 항체-약물 접합체의 경우, 이펙터 기능을 감소시키거나 제거하는 것이 바람직할 것이다. 이펙터 기능을 감소시키기 위해 유리하게 돌연변이될 수 있는 아미노산 Fc 영역 위치는 위치 228, 233, 234 및 235 중 하나 이상을 포함하며, 아미노산 위치는 카밧 넘버링 방식에 따라 번호가 매겨진다. 일부 구현예에서, 결합 분자는 돌연변이가 없는 동일한 결합 분자와 비교하여, ADCC 및/또는 CDC를 감소시키는 적어도 하나의 돌연변이의 Fc 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 항체 또는 항체 부분과 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩타이드와의 공유 또는 비공유 결합에 의해 형성된 더 큰 면역부착 분자의 부분일 수 있다. 이러한 면역부착 분자의 예는 사량체성 scFv 분자를 만들기 위한 스트렙타비딘 코어 영역의 사용(Kipriyanov et al., Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101 (1995)) 및 2가 및 바이오티닐화된 scFv 분자를 만들기 위한 시스테인 잔기, 마커 펩타이드 및 C-말단 폴리히스티딘 태그의 사용(Kipriyanov et al., Mol. Immunol. 31:1047-1058 (1994))을 포함한다. 다른 예는 항체로부터의 하나 이상의 CDR이 공유적으로 또는 비공유적으로 분자내로 혼입되어 관심 항원에 특이적으로 결합하는 면역부착소를 생산하는 경우를 포함한다. 이러한 구현예에서, CDR은 더 큰 폴리펩타이드 사슬의 일부로서 혼입될 수 있거나, 또 다른 폴리펩타이드 사슬에 공유 결합될 수 있거나, 비공유로 혼입될 수 있다.
추가의 구현예에서, 또 다른 폴리펩타이드에 연결된 본 발명의 결합 분자의 모두 또는 일부를 포함하는 융합 항체 또는 면역부착소가 생산될 수 있다. 일부 구현예에서, 결합 분자의 가변 영역만이 폴리펩타이드에 연결된다. 일부 구현예에서, 결합 분자의 VH 도메인은 제1 폴리펩타이드에 연결되는 반면, 결합 분자의 VL 도메인은 VH 및 VL 도메인이 서로 상호작용하여 항원 결합 부위를 형성하는 방식으로 제1 폴리펩타이드와 결합하는 제2 폴리펩타이드에 연결된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, VH 도메인은 VH 및 VL 도메인이 서로 상호작용할 수 있도록 링커에 의해 VL 도메인으로부터 분리된다(예컨대, 단쇄 항체). 이후, VH-링커-VL 항체는 관심 폴리펩타이드에 연결된다. 또한, 2개(또는 이상)의 단쇄 항체가 서로 연결된 융합 항체가 생성될 수 있다. 이것은 단일 폴리펩타이드 사슬 상에서 2가 또는 다가 항체를 조작하고자 하거나, 또는 다중특이적 항체를 조작하고자 하는 경우 유용하다.
단쇄 항체(scFv)를 조작하기 위해, VH- 및 VL 코딩 DNA 단편은 가요성 링커를 코딩하는 또 다른 단편, 예컨대, VH 및 VL 서열이 가요성 링커에 의해 연결된 VL 및 VH 도메인을 갖는 인접한 단쇄 단백질로서 발현될 수 있도록 아미노산 서열(Gly4 -Ser)3을 코딩하는 또 다른 단편에 작동가능하게 연결된다. 예컨대, 문헌[Bird et al., Science 242:423 426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879 5883 (1988); 및 McCafferty et al., Nature 348:552 554 (1990)]을 참고한다. 단쇄 항체는 단일 VH 및 VL 도메인만이 사용되는 경우 1가일 수 있거나, 2개의 VH 및 VL 도메인이 사용되는 경우 2가일 수 있거나, 또는 2개를 초과하는 VH 및 VL 도메인이 사용되는 경우 다가일 수 있다.
본 발명의 결합 분자는 유도체화되거나 또 다른 분자(예컨대, 또 다른 펩타이드 또는 단백질)에 연결될 수 있다.　일반적으로, 결합 분자(예컨대, 항체 또는 이의 항원 결합 부분)는 PD-1 결합이 유도체화 또는 표지화에 의해 부정적으로 영향을 받지 않도록 유도체화된다. 따라서, 본 발명의 결합 분자는 본원에 기재된 결합 분자의 손상되지 않은(intact) 형태 및 변형된 형태 모두를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 결합 분자는 결합 분자와 또 다른 분자(예컨대, 스트렙타비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그)와의 결합을 매개할 수 있는 하나 이상의 분자 실체, 예컨대 또 다른 항체, 검출제, 약학적 제제, 및/또는 단백질 또는 펩타이드에 기능적으로 연결(화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유 결합 또는 다른 방법에 의해)될 수 있다.
유도체화된 결합 분자의 하나의 유형은 둘 이상의 항체(예컨대, 이중특이성 항체를 조작하기 위해, 동일한 유형 또는 상이한 유형)를 교차결합함으로써 생산된다. 적합한 가교제는 적합한 스페이서(예컨대, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스테르)에 의해 분리된 2개의 상이한 반응성 그룹을 갖는 이종이기능성인 가교제 또는 동종이기능성(예컨대, 디석신이미딜 수베레이트)인 가교제를 포함한다.
본 발명의 결합 분자는 또한 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 메틸 또는 에틸 그룹과 같은 화학적 그룹, 또는 탄수화물 그룹으로 유도체화될 수 있다. 이들 그룹은 결합 분자의 생물학적 특징을 개선하는데, 예컨대, 혈청 반감기를 증가시키는데 유용할 수 있다.
본 발명의 결합 분자는 또한 표지될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "표지" 또는 "표지된"은 결합 분자 내의 또 다른 분자의 혼입을 지칭한다. 일 구현예에서, 표지는 검출가능한 마커, 예컨대, 방사성 아미노산의 혼입 또는 폴리펩타이드에 대한 바이오티닐화된 단편의 부착이며, 이러한 단편은 표지된 아비딘(예컨대, 광학 또는 비색 기술에 의해 검출될 수 있는 형광 마커 또는 효소 활성을 포함하는 스트렙타비딘)에 의해 검출될 수 있다. 추가의 구현예에서, 표지 또는 마커는 치료제, 예컨대, 약물 접합체 또는 독소일 수 있다. 폴리펩타이드 및 당단백질을 표지하는 다양한 방법이 당업계에 알려져 있으며 사용될 수 있다. 폴리펩타이드를 위한 표지의 예는, 특히, 하기를 포함한다: 방사성 동위원소 또는 방사성 핵종(예컨대, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), 형광 표지(예컨대, FITC, 로다민, 란탄족 인광체(lanthanide phosphors)), 효소 표지(예컨대, 호스래디쉬 과산화효소, β-갈락토시다아제, 루시퍼라아제, 알칼리 포스파타아제), 화학발광 마커, 바이오티닐 그룹, 이차 리포터에 의해 인식된 사전 결정된 폴리펩타이드 에피토프(예컨대, 류신 지퍼 쌍 서열, 이차 항체를 위한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그), 자성 제제, 예컨대 가돌리늄 킬레이트, 독소, 예컨대 백일해 독소, 탁솔, 사이토칼라신, 그라미시딘 D, 브롬화 에티듐, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜키신, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 액티노마이신 D, 1-데하이드테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 푸로마이신 및 이의 유사체 또는 동족체를 포함한다. 일부 구현예에서, 표지는 잠재적인 입체 장애를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 아암에 의해 부착된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 중성 형태(양쪽성 형태 포함)로 또는 양 전하 또는 음 전하 종으로서 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 반대이온과 복합체화되어 약학적으로 허용가능한 염을 형성할 수 있다.
용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 하나 이상의 결합 분자 및 하나 이상의 반대이온을 포함하는 복합체를 지칭하는 것으로 의도되며, 여기서 반대이온은 약학적으로 허용가능한 무기 및 유기 산 및 염기로부터 유래된다.
약학적으로 허용가능한 무기 염기는, 특히, 적합한 알칼리 금속 염, 알칼리 토금속 염 및 허용가능한 금속의 다른 생리학적 이온을 포함하는 금속 이온을 포함한다. 무기 염기로부터 유래된 염은 알루미늄, 암모늄, 칼슘, 코발트, 니켈, 몰리브덴, 바나듐, 망간, 크롬, 셀레늄, 주석, 구리, 철, 리튬, 마그네슘, 망간(manganic 또는 manganous), 칼륨, 루비듐, 나트륨, 및 아연 염, 및 이들의 전형적인 원자가를 포함한다.
본 발명의 결합 분자의 약학적으로 허용가능한 산 부가 염은, 특히, 포름산, 아세트산, 아세타미도벤조산, 아디프산, 아스코르브산, 붕산, 프로피온산, 벤조산, 캄포르산, 탄산, 사이클람산, 데하이드로콜산, 말론산, 에데트산(에틸렌디아민테트라아세트산), 에틸황산, 펜디조산(fendizoic), 메타인산, 석신산, 글리콜산, 글루콘산, 젖산, 말산, 타르타르산, 탄닌산, 구연산, 질산, 글루쿠론산, 말레산, 엽산, 푸말산, 피루브산, 아스파트산, 글루탐산, 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 라이신, 이소구연산, 트리플루오로아세트산, 파모산, 안트라닐산, 메실산, 오로트산, 옥살산, 옥살아세트산, 올레산, 스테아르산, 살리실산, 아미노살리실산, 규산, p-하이드록시벤조산, 니코틴산, 페닐아세트산, 만델산, 엠본산, 설폰산, 메탄설폰산, 인산, 포스폰산, 에탄설폰산, 에탄디설폰산, 암모늄, 벤젠설폰산, 판토텐산, 나프탈렌설폰산, 톨루엔설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 설파닐산, 황산, 질산, 아질산, 황산 모노메틸 에스테르, 사이클로헥실아미노설폰산, β-하이드록시부틸산, 글리신, 글리실글리신, 카코딜산, 디아미노헥사노산, 캄포르설폰산, 티오시안산, 옥소글루타르산, 피리독살 5-인산염, 클로로페녹시아세트산, 운데카노산, N-아세틸-L-아스파트산, 갈락타르산 및 갈락투론산을 포함하는, 산으로부터 제조될 수 있다.
약학적으로 허용가능한 유기 염기는 트리메틸아민, 디에틸아민, N,N'-디벤질에틸렌디아민, 클로로프로카인, 콜린, 디벤질아민, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 메글루민(N-메틸글루카민), 프로카인, 사이클릭 아민, 4차 암모늄 양이온, 아르기닌, 베타인, 카페인, 클레미졸, 2-에틸아미노에탄올, 2-디에틸아미노에탄올, 2-디메틸아미노에탄올, 에탄디아민, 부틸아민, 에탄올아민, 에틸렌디아민, N-에틸모르폴린, N-에틸피페리딘, 에틸글루카민, 글루카민, 글루코사민, 히스티딘, 하이드라바민, 이미다졸, 이소프로필아민, 메틸글루카민, 모르폴린, 피페라진, 피리딘, 피리독신, 네오디뮴, 피페리딘, 폴리아민 수지, 프로카인, 퓨린, 테오브로민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 트리에탄올아민, 트로메타민, 메틸아민, 타우린, 콜레이트, 6-아미노-2-메틸-2-헵탄올, 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올, 2-아미노-2-메틸-1-프로판올, 지방족 모노- 및 디카르복실산, 페닐-치환된 알카노산, 하이드록시 알카노산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 설폰산, 스트론튬, 트리신, 하이드라진, 페닐사이클로헥실아민, 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산, 비스(2-하이드록시에틸)아미노-트리스(하이드록시메틸)메탄, N-(2-아세타미도)-2-아미노에탄설폰산, 1,4-피페라진디에탄설폰산, 3-모르폴리노-2-하이드록시프로판설폰산, 1,3-비스[트리스(하이드록시메틸)메틸아미노]프로판, 4-모르폴린프로판설폰산, 4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-에탄설폰산, 2-[(2-하이드록시-1,1-비스(하이드록시메틸)에틸)아미노] 에탄설폰산, N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄설폰산, 4-(N-모르폴리노)부탄설폰산, 3-(N,N-비스[2-하이드록시에틸]아미노)-2-하이드록시 프로판설폰산, 2-하이드록시-3-[트리스(하이드록시메틸)메틸아미노]-1-프로판설폰산, 4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-(2-하이드록시프로판 설폰산), 피페라진-1,4-비스(2-하이드록시프로판설폰산) 이수화물, 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진프로판설폰산, N,N-비스(2-하이드록시에틸) 글리신, N-(2-하이드록시에틸피페라진-N′-(4-부탄설폰산), N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-3-아미노프로판설폰산, N-트리스(하이드록시메틸)메틸-4-아미노부탄설폰산, N-(1,1-디메틸-2-하이드록시에틸)-3-아미노-2-하이드록시 프로판설폰산, 2-(사이클로헥실아미노) 에탄설폰산, 3-(사이클로헥실아미노)-2-하이드록시-1-프로판설폰산, 3-(사이클로헥실아미노)-1-프로판설폰산, N-(2-아세타미도)이미노디아세트 산, 4-(사이클로헥실아미노)-1-부탄설폰산, N-[트리스(하이드록시메틸)메틸] 글리신, 2-아미노-2-(하이드록시메틸)-1,3-프로판디올, 및 트로메타몰을 포함한다.
핵산 분자 및 벡터
본 발명은 또한 핵산 분자, 및 본원에 기재된 본 발명의 결합 분자를 코딩하는 서열에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 다양한 핵산 분자는 결합 분자의 아미노산 서열의 제1 도메인 및 제2 도메인을 코딩한다. 일부 구현예에서, 제1 도메인 및/또는 제2 도메인은 중쇄 및 경쇄를 포함하며, 다양한 핵산은 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 코딩한다. 다른 구현예에서, 동일한 핵산 분자가 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 코딩한다. 특정 구현예에서, 핵산 분자는 제1 및 제2 도메인의 아미노산 서열의 임의의 조합(예컨대, 중쇄 및 경쇄 서열)을 코딩할 수 있다. 특정 구현예에서, 핵산 분자는 제1 결합 도메인의 아미노산 서열 및 제2 결합 도메인의 경쇄 아미노산 서열을 코딩할 수 있고, 선택적으로 이들을 연결하는 펩타이드 링커의 임의의 서열을 포함한다.
뉴클레오타이드 서열에 대한 언급은, 달리 명시되지 않는 한, 이의 보체를 포함한다. 따라서, 특정 서열을 갖는 핵산에 대한 언급은 이의 상보적 서열을 갖는 이의 상보적 가닥을 포함하는 것으로서 이해되어야 한다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 적어도 10 염기 길이인 뉴클레오타이드, 또는 리보뉴클레오타이드, 또는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 어느 유형의 뉴클레오타이드의 변형된 형태의 중합체 형태를 의미한다. 상기 용어는 단일 및 이중 가닥 형태를 포함한다.
본 발명은 또한 상기 뉴클레오타이드 서열 또는 서열 번호 1-10으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 중 하나 이상과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 4-9로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다. 핵산 서열의 맥락에서 용어 "백분율 서열 동일성"은 최대 대응을 위해 정렬될 때 동일한 2개의 서열 내의 잔기를 지칭하는 것으로 의도된다. 서열 동일성의 비교는 적어도 약 9 뉴클레오타이드, 일반적으로 적어도 약 18 뉴클레오타이드, 더욱 일반적으로 적어도 약 24 뉴클레오타이드, 전형적으로 적어도 약 28 뉴클레오타이드, 더욱 전형적으로 적어도 약 32 뉴클레오타이드, 및 바람직하게는 적어도 약 36, 48, 또는 그 이상의 뉴클레오타이드의 길이로 확장될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열 동일성을 측정하는데 사용될 수 있는 당업계에 알려진 많은 다양한 알고리즘이 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 서열은 Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group(GCG), Madison, Wisconsin의 프로그램인 FASTA, Gap 또는 BESTFIT를 사용하여 비교될 수 있다. 예컨대, FASTA2 및 FASTA3 프로그램을 포함하는 FASTA는 질의 및 서치 서열 간의 최상의 중첩 영역의 정렬 및 백분율 서열 동일성을 제공한다(Pearson, Methods Enzymol. 183:63 98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266: 227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276: 71-84 (1998); 본원에 참고로 포함됨). 달리 명시되지 않는 한, 특정 프로그램 또는 알고리즘에 대한 기본 파라미터가 사용된다. 예를 들어, 핵산 서열 간의 백분율 서열 동일성은 기본 파라미터(6의 워드 크기 및 스코어링 매트릭스에 대한 NOPAM 인자)를 갖는 FASTA를 사용하여 또는 본원에 참고로 포함된 GCG 버전 6.1에서 제공된 기본 파라미터를 갖는 Gap을 사용하여 결정될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 서열 번호 1-10으로부터 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 핵산 분자는 또한 상기 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 서열 번호 4를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 추가의 구현예에서, 핵산 분자는 서열 번호 4 및 6을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 추가의 구현예에서, 핵산 분자는 서열 번호 4, 6 및 16을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 추가의 구현예에서, 핵산 분자는 서열 번호 7을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 추가의 구현예에서, 핵산 분자는 서열 번호 5를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
상기 구현예 중 어느 하나에서, 핵산 분자는 단리될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 뉴클레오타이드 서열의 발현에 적합한 벡터에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "벡터"는 연결된 또 다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 일부 구현예에서, 벡터는 플라스미드, 즉, DNA의 고리형 이중 가닥의 조각이며, 여기에 추가의 DNA 절편이 라이게이션될 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터이며, 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈에 라이게이션될 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 도입되는 숙주 세포에서 자동복제될 수 있다(예컨대, 박테리아 복제 원점 부위를 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 추가의 구현예에서, 벡터(예컨대, 비에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입시 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 유전자와 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히, "발현 벡터")로 불린다.
본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 결합 분자 또는 이의 부분의 아미노산 서열 중 어느 하나(예컨대, 제1 및/또는 제2 결합 도메인의 중쇄 및/또는 경쇄 서열)을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 융합 단백질, 변형된 항체, 항체 단편, 및 이의 프로브를 코딩하는 핵산을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 추가로 제공한다.
본 발명의 핵산 분자는 결합 분자 또는 이의 부분을 생산하는 임의의 공급원으로부터 단리될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 단리되기보다는 합성될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는, 임의의 공급원으로부터의 중쇄 불변 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 인프레임(in-frame)으로 연결된, 본 발명의 결합 분자의 제1 또는 제2 도메인으로부터의 VH 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 유사하게, 본 발명의 핵산 분자는 임의의 공급원으로부터의 경쇄 불변 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 인프레임으로 연결된, 본 발명의 결합 분자의 제1 또는 제2 영역으로부터의 VL　도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 추가의 양태에서, 제1 또는 제2 결합 도메인의 중쇄(VH) 및/또는 경쇄(VL)의 가변 도메인을 코딩하는 핵산 분자는 항체 유전자의 길이 전반에서 "전환"될 수 있다. 일 구현예에서, VH 또는 VL　도메인을 코딩하는 핵산 분자는, VH　절편이 벡터 내의 CH 절편(들)에 작동가능하게 연결되고/되거나 VL　절편이 벡터 내의 CL 절편에 작동가능하게 연결되도록 각각 중쇄 불변(CH) 또는 경쇄 불변(CL) 도메인을 이미 코딩하는 발현 벡터 내로 삽입함으로써 전체 길이를 따라 항체 유전자로 전환된다. 또 다른 구현예에서, VH　및/또는 VL　도메인을 코딩하는 핵산 분자는 표준 분자 생물학적 기술을 사용하여 VH　및/또는 VL　도메인을 코딩하는 핵산 분자를 CH　및/또는 CL　도메인을 코딩하는 핵산 분자에 연결, 예컨대 라이게이션함으로써 길이 전반에 걸쳐 항체 유전자로 전환된다. 이후, 길이 전반에 걸쳐 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 핵산 분자는 이들이 도입된 세포로부터 발현될 수 있다.
핵산 분자는 대량의 재조합 결합 분자를 발현하는데 사용될 수 있다. 핵산 분자는 또한 본원에 기재된 바와 같이, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 이중특이성 항체, 단쇄 항체, 면역부착소, 디아바디, 돌연변이된 항체 및 항체 유도체를 생산하는데 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 특정 항체 서열에 대한 프로브 또는 PCR 프라이머로서 사용된다. 예를 들어, 핵산은 진단 기술에서 프로브로서 또는 예컨대, 결합 분자 영역(예컨대, 가변 도메인)을 코딩하는 추가의 핵산 분자를 단리시키는데 사용될 수 있는 DNA의 영역을 증폭시키는 PCR 프라이머로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 올리고뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 결합 분자의 매우 가변적인 도메인으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 결합 분자의 하나 이상의 CDR 중 모두 또는 일부를 코딩한다.
또 다른 구현예에서, 핵산 분자 및 벡터는 돌연변이된 결합 분자를 제조하는데 사용될 수 있다. 항체는, 예컨대, 결합 분자의 결합 특성을 변경하기 위해, 제1 및/또는 제2 결합 도메인의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인에서 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 결합 분자의 KD를 증가시키거나 감소시키기 위해, koff를 증가시키거나 감소시키기 위해, 또는 PD-1에 대한 항체의 결합 특이성을 변경하기 위해 하나 이상의 CDR에서 이뤄질 수 있다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 돌연변이는 본 발명의 결합 분자의 제1 또는 제2 결합 도메인에 상응하는 항체 내의 생식계열과 비교하여 변화되는 것으로 알려진 아미노산 잔기에서 이뤄진다. 이러한 돌연변이는 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 영역에서, 또는 불변 도메인에서 이뤄질 수 있다. 바람직한 구현예에서, 돌연변이는 가변 도메인에서 이뤄진다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 돌연변이는 본 발명의 결합 분자의 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 영역 내의 생식계열과 비교하여 변화되는 것으로 알려진 아미노산 잔기에서 이뤄진다.
또 다른 구현예에서, 프레임워크 영역(들)은 생성된 프레임워크 영역(들)이 상응하는 생식계열 유전자의 아미노산 서열을 갖도록 돌연변이된다. 이러한 돌연변이는 결합 분자의 반감기를 증가시키기 위해 프레임워크 영역 또는 불변 도메인에서 이뤄질 수 있다. 예컨대, WO 제00/09560호를 참고한다. 프레임워크 영역 또는 불변 도메인에서의 돌연변이는 또한 결합 분자의 면역원성을 변경하고/하거나 또 다른 분자에 공유 또는 비공유 결합하기 위한 부위를 제공하도록 이뤄질 수 있다. 본 발명에 따르면, 결합 분자는 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 영역 중 어느 하나 이상에서 또는 불변 도메인에서 돌연변이를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 상기 기재된 바와 같이 수득된, 제1 또는 제2 결합 도메인의 서열(예컨대, 결합 도메인이 경쇄 및 중쇄 서열을 포함하는 경우 경쇄 및 중쇄 서열)을 부분적으로 또는 완전히 코딩하는 DNA를 발현 벡터에 삽입하여 유전자가 전사 및 번역 제어 서열과 같은 필요한 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결되게 함으로써 발현된다. 발현 벡터는 플라스미드, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스(AAV), 식물 바이러스, 예컨대 콜리플라워 모자이크 바이러스, 담배 모자이크 바이러스, 코스미드, YAC, EBV 유래 에피솜 등을 포함한다. DNA 분자는 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 DNA의 전사 및 번역을 조절하는 이들의 의도된 기능을 제공하도록 벡터에 라이게이션될 수 있다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 양립가능하도록 선택될 수 있다. 제1 및 제2 결합 도메인의 서열(예를 들어, 결합 도메인이 중쇄 및 경쇄 서열 포함하는 경우 중쇄 및 경쇄 서열)을 부분적으로 또는 완전히 코딩하는 DNA 분자가 개별 벡터 내로 도입될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 DNA 분자의 임의의 조합이 동일한 발현 벡터 내로 도입된다. DNA 분자는 표준 방법에 의해 발현 벡터 내로 도입될 수 있다(예컨대, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보적 제한 부위의 라이게이션, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우 평활 말단 라이게이션).
적합한 벡터는, 임의의 VH 또는 VL　서열이 상기 기재된 바와 같이 쉽게 삽입되고 발현될 수 있도록 적절한 제한 부위 조작을 갖는, 기능적으로 완전한 인간 CH 또는 CL　면역글로불린 서열을 코딩하는 벡터이다. 이러한 벡터 내의 HC- 및 LC 코딩 유전자는 상응하는 mRNA를 안정화시킴으로써 전체 항체 단백질 수율을 향상시키는 인트론 서열을 함유할 수 있다. 인트론 서열은 스플라이스 공여자 및 스플라이스 수여자 부위에 측접하며, RNA 스플라이싱이 일어날 곳을 결정한다. 인트론 서열의 위치는 항체 사슬의 가변 또는 불변 영역 중 어느 하나에 있을 수 있거나, 또는 다수의 인트론이 사용되는 경우 가변 및 불변 영역 모두에 있을 수 있다.　폴리아데닐화 및 전사 종결은 코딩 영역의 하류에 있는 천연 염색체 부위에서 일어날 수 있다. 재조합 발현 벡터는 또한 숙주 세포로부터 항체 사슬의 분비를 용이하게 하는 신호 펩타이드를 코딩할 수 있다. 항체 사슬 유전자는 신호 펩타이드가 면역글로불린 사슬의 아미노 말단에 인프레임으로 연결되도록 벡터에 클로닝될 수 있다. 신호 펩타이드는 면역글로불린 신호 펩타이드 또는 이종 신호 펩타이드(즉, 비면역글로불린 단백질로부터의 신호 펩타이드)일 수 있다.
항체 사슬 유전자 외에, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 항체 사슬 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열을 가질 수 있다. 조절 서열의 선택을 포함한 발현 벡터의 디자인은 형질전환될 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현의 수준 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다. 포유동물에서 발현 숙주 세포를 위한 바람직한 제어 서열은 레트로바이러스 LTR, 사이토메갈로바이러스(CMV)(예컨대, CMV 프로모터/인핸서), 시미안 바이러스 40(SV40)(예컨대, SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스, (예컨대, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(AdMLP)), 폴리오마바이러스 및 강한 포유동물 프로모터, 예컨대 천연 면역글로불린 및 액틴 프로모터로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서와 같은 포유동물에서 높은 수준의 단백질 발현을 보장하는 바이러스 요소를 포함한다. 바이러스 제어 요소 및 이의 서열의 추가 설명을 위해, 예컨대, 미국 특허 제5,168,062호, 제4,510,245호 및 제4,968,615호를 참고한다. 프로모터 및 벡터의 설명을 포함하는 식물에서의 항체와 같은 결합 분자를 발현시키는 방법뿐만 아니라 식물의 형질전환은 당업계에 알려져 있다. 예컨대, 미국 특허 제6,517,529호를 참고한다. 박테리아 세포 또는 진균 세포, 예컨대, 효모 세포에서 폴리펩타이드를 발현시키는 방법 역시 당업계에 널리 알려져 있다.
항체 사슬 유전자 및 조절 서열 외에, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 추가의 서열, 예컨대 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예컨대, 복제 원점) 및 선별 마커 유전자를 가질 수 있다. 선별 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선별을 용이하게 한다(예컨대, 미국 특허 제4,399,216호, 제4,634,665호 및 제5,179,017호 참고). 예를 들어, 전형적으로 선별 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에 G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약제에 대한 내성을 부여한다. 예를 들어, 선별 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 유전자(메토트렉세이트 선별/증폭 동안 dhfr-숙주 세포에서 사용하기 위함), 네오 유전자(G418 선별을 위함), 및 글루타메이트 합성효소 유전자를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "발현 제어 서열"은 이들이 라이게이션되는 코딩 서열의 발현 및 가공에 영향을 미치는데 필요한 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭하는 것으로 의도된다. 발현 제어 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 효율적인 RNA 가공 신호, 예컨대 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 향상시키는 서열(즉, 코작(Kozak) 공통 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 원하는 경우, 단백질 분비를 향상시키는 서열을 포함한다. 이러한 제어 서열의 특성은 숙주 유기체에 따라 상이하며; 원핵생물에서, 이러한 제어 서열은 일반적으로 리보솜 결합 부위의 프로모터, 및 전사 종결 서열을 포함하고; 진핵생물에서, 전형적으로, 이러한 제어 서열은 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. 용어 "제어 서열"은 이의 존재가 발현 및 가공에 필수적인 적어도 모든 성분을 포함하는 것으로 의도되며, 또한 이의 존재가 유리한 추가의 성분, 예를 들어, 리더 서열 및 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다.
숙주 세포 및 결합 분자의 생산 방법
본 발명의 추가의 양태는 본 발명의 결합 분자를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예는 결합 분자를 발현할 수 있는 재조합 숙주 세포를 도입하는 단계, 상기 숙주 세포를 결합 분자의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 단계, 및 수득된 결합 분자를 단리하는 단계를 포함하는, 본원에 정의된 바와 같은 결합 분자를 생산하는 방법에 관한 것이다. 이러한 재조합 숙주 세포에서 이러한 발현에 의해 생산된 결합 분자는 본원에서 "재조합 결합 분자"로 불린다. 결합 분자가 항체인 경우, 이들은 "재조합 항체"로 불린다. 본 발명은 또한 이러한 숙주 세포로부터 유래된 세포의 자손 및 유사하게 수득된 결합 분자에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "재조합 숙주 세포"(또는 간단하게 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭하는 것으로 의도된다. 본 발명은, 예를 들어 상기 기재된 본 발명에 따른 벡터를 포함할 수 있는, 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 예를 들어, 본 발명의 결합 분자의 제1 결합 도메인 및/또는 제2 결합 도메인의 중쇄를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 항원 결합 부분, 경쇄 코딩 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 항원 결합 부분, 또는 둘 모두를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. "재조합 숙주 세포" 및 "숙주 세포"는 특정 대상 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손을 지칭하는 것으로 의도되는 것으로 이해되어야 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후속 세대에서 변형이 일어날 수 있으므로, 이러한 자손은 사실상 모 세포와 동일하지 않을 수 있으나, 이러한 세포는 본원에 사용된 바와 같은 용어 "숙주 세포"의 범위에 여전히 포함된다.
본 발명의 결합 분자를 코딩하는 핵산 분자 및 이들 핵산 분자를 포함하는 벡터는 적합한 포유동물, 식물, 박테리아 또는 효모 숙주 세포의 형질감염에 사용될 수 있다. 형질전환은 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포 내로 도입하는 임의의 공지된 기술에 의할 수 있다. 이종 폴리뉴클레오타이드를 포유동물 세포에 도입하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있으며, 이는 덱스트란 매개 형질감염, 인산칼슘 침전, 폴리브렌 매개 형질감염, 원형질체 융합, 리포좀 내에 폴리뉴클레오타이드(들)의 캡슐화, 및 핵 내로 DNA의 미세주사를 포함한다. 또한, 핵산 분자는 바이러스 벡터에 의해 포유동물 세포 내로 도입될 수 있다. 세포를 형질전환하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있다. 예컨대, 미국 특허 제4,399,216호, 제4,912,040호, 제4,740,461호 및 제4,959,455호를 참고한다. 식물 세포를 형질전환시키는 방법은 당업계에 널리 알려져 있으며, 이는, 예컨대,　아그로박테리움 매개 형질전환, 바이오리스틱(biolistic) 형질전환, 직접 주사, 전기천공 및 바이러스 형질전환을 포함한다. 박테리아 및 효모 세포를 형질전환시키는 방법 역시 당업계에 널리 알려져 있다.
발현을 위한 숙주로서 이용가능한 포유동물 세포주는 당업계에 널리 알려져 있으며, 이는 미국 생물자원센터(ATCC)로부터 이용가능한 다수의 불멸화 세포주를 포함한다. 이들은, 특히, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, NSO 세포, SP2 세포, HEK-293T 세포, FreeStyle 293 세포(Invitrogen), NIH-3T3 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장(BHK) 세포, 아프리카 그린 원숭이 신장 세포(COS), 인간 간세포 암종 세포(예컨대, Hep G2), A549 세포, 및 많은 다른 세포주를 포함한다. 특히 선호되는 세포주는 어느 세포주가 높은 발현 수준을 갖는지 결정함으로써 선택된다. 사용될 수 있는 다른 세포주는 곤충 세포주, 예컨대 Sf9 또는 Sf21 세포이다. 결합 분자를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포에 도입되는 경우, 결합 분자는 숙주 세포에서 결합 분자를 발현시키기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 발현시키거나 또는, 더욱 바람직하게는, 결합 분자를 숙주 세포가 성장하는 배양 배지 내로 분비시킴으로써 생산된다. 결합 분자는 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 배양 배지로부터 재구성될 수 있다. 식물 숙주 세포는, 예컨대, 담배속(Nicotiana), 애기장대(Arabidopsis), 개구리밥(duckweed), 옥수수, 밀, 감자 등을 포함한다. 박테리아 숙주 세포는 대장균(E. coli) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)　종을 포함한다. 효모 숙주 세포는 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)를 포함한다.
더욱이, 생산 세포주로부터 본 발명의 결합 분자의 발현은 많은 공지된 기술을 사용하여 향상될 수 있다. 예를 들어, 글루타민 합성효소 유전자 발현 시스템(GS 시스템)은 특정 조건 하에 발현을 향상시키기 위한 일반적인 접근법이다. GS 시스템은 유럽 특허 제0 216 846호, 제0 256 055호, 제0 323 997호 및 제0 338 841호와 관련하여 전체적으로 또는 부분적으로 논의된다.
상이한 세포주에 의해 또는 형질전환 동물에서 발현된 결합 분자는 서로와 비교하여 상이한 당화 프로파일을 가질 가능성이 높다. 그러나, 본원에 기재된 핵산 분자에 의해 코딩되거나, 또는 본원에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 모든 결합 분자는 결합 분자의 당화에 관계없이, 그리고, 일반적으로, 번역후 변형의 존재 또는 부재에 관계없이 본 발명의 일부이다.
결합 분자는 복수의 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, PD1-결합 도메인은 개별적으로 제조된 다음(예컨대, 화학적 단백질 합성, 재조합 발현 기술, 하이브리도마 기술 등을 사용하여), 직접 또는 링커를 통해 서로 화학적으로 부착될 수 있다. 분자(예컨대, 항체 또는 이의 항원 결합 부분)의 화학적 접합을 위한 수단은 당업계에 널리 알려져 있다. 폴리펩타이드는 전형적으로 상응하는 폴리펩타이드 또는 링커의 적합한 작용기와 반응할 수 있는 카르복실산(COOH) 또는 유리 아민(-NH2) 그룹과 같은 다양한 작용기를 함유한다. 항체는 또한 추가의 반응성 작용기를 노출시키거나 부착시키기 위해 유도체화될 수 있고, 피어스 화학 회사(Pierce Chemical Company, Rockford, 111)로부터 이용가능한 것과 같은 임의의 많은 링커 분자의 부착을 포함할 수 있다. 본 발명의 결합 분자에서 사용된 링커는 당업계에 알려진 임의의 적합한 링커일 수 있다.
일부 구현예에서, PD1에 대한 도메인의 결합은 숙주 세포에서 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 발현에 의해 생성된다. 결합 도메인의 임의의 조합을 코딩하는 서열은 연결될 수 있다(직접 또는 링커를 통해). PD-1에 결합하는 도메인을 코딩하는 수득된 핵산 분자는 발현 벡터에 삽입되어 숙주 세포에 도입된다. 이후, 수득된 결합 분자는 발현 시스템으로부터 발현, 단리, 및 정제된다.
일부 구현예에서, 결합 분자의 결합 도메인은 결합 분자의 단백질 분해를 방지하기 위한 획기적인 링커 분자에 의해 함께 커플링될 수 있다. 이러한 링커는 전형적으로 단백질분해 절단 부위가 없다.
본원에 사용된 바와 같이, 표현 "세포," "숙주 세포," "세포주," 및 "세포 배양액," "생산자로서 세포주"는 상호교환적으로 사용되며, 본 발명의 임의의 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 본 발명의 HCVR, LCVR 또는 단클론 항체를 코딩하는 서열을 포함하는 임의의 재조합 벡터(임의의 재조합 벡터)의 수용자(recipient)인 세포 또는 세포 배양액을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하며, 자손은 자연적, 우발적, 또는 고의적인 돌연변이 및/또는 변경으로 인해 원래의 모 세포와 반드시 완전히 동일하지 않을 수 있다(형태에서 또는 총 DNA 보체에서). 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 재조합 벡터, 또는 단클론 항체 또는 이의 경쇄 또는 중쇄로 형질전환되거나, 형질도입되거나 또는 감염된 세포를 포함한다. 본 발명의 재조합 벡터(숙주 염색체 내로 안정적으로 혼입되거나 혼입되지 않음)를 포함하는 숙주 세포는 또한 "재조합 숙주 세포"로 지칭될 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 바람직한 숙주 세포는 CHO 세포(예컨대, ATCC CRL-9096), NS0 세포, SP2/0 세포, COS 세포(ATCC, 예컨대, CRL-1650, CRL-1651), 및 HeLa(ATCC CCL-2)이다. 본 발명에서 사용하기 위한 추가의 숙주 세포는 식물 세포, 효모 세포, 다른 포유동물 세포 및 원핵 세포를 포함한다.
약학 조성물
용어 "약학 조성물"은 본 발명의 항체의 치료적 유효량 및 부형제(희석제, 비히클, 용매 및 다른 부형제)를 함유하는 제제 및/또는 조성물을 지칭하는 것으로 의도된다.
용어 "부형제"는 본 발명의 화합물(들) 이외의 임의의 구성성분을 기술하기 위해 본원에 사용된다. 부형제의 선택은 주로 특정 투여 기술, 용해도 및 안정성에 대한 부형제의 효과, 및 투여 형태의 특성과 같은 인자에 좌우된다. 본원에 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용가능한 부형제"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 및 유사한 생리학적으로 양립가능한 물질을 포함한다. 상기 약학적으로 허용가능한 부형제의 예는 물, 생리 식염수, 인산 완충액, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등, 및 이의 조합이다.　조성물에 등장화제, 예컨대, 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨, 또는 염화나트륨을 첨가하는 것이 종종 바람직하다. 약학적으로 허용가능한 부형제의 추가의 예는 항체의 저장 기간 및 효율을 증가시킬 습윤제 또는 소량의 보조 물질, 예컨대 보습제 및 유화제, 보존제 또는 완충액이다.
본 발명의 항체는 환자에 투여하는데 적합한 약학 조성물에 혼입될 수 있다(실시예 17 참고). 본 발명의 항체는 단일 또는 다중 용량으로, 단독으로 또는 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 및/또는 부형제와 조합하여 투여될 수 있다. 투여를 위한 약학 조성물은 선택된 투여 방식에 적절하도록 디자인되며, 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 및/또는 부형제, 예컨대 분산제, 완충액, 계면활성제, 보존제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등이 적절히 사용된다(실시예 17 참고). 상기 조성물은 예컨대, 당업자에게 일반적으로 알려진 조성물을 수득하기 위한 다양한 기술을 제공하는, 문헌[Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995]에 기재된 바와 같은 통상적인 기술에 따라 디자인된다.
본 발명의 항-PD-1 단클론 항체를 포함하는 조성물은 경구, 정맥내, 복강내, 피하, 폐, 경피, 근육내, 비강내, 구강, 설하, 또는 좌제 투여를 포함하는 표준 투여 기술을 사용하여 본원에 기재된 바와 같은 부정적인 발생 또는 병리학의 위험을 보이는 환자에게 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 바람직하게는 본 발명의 항체의 "치료적 유효량"을 포함하거나 본 발명의 항체의 "치료적 유효량"이다. 용어 "치료적 유효량"은 원하는 치료 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량 및 기간 동안 효과적인 양을 지칭하는 것으로 의도된다. 항체의 치료적 유효량은 대상의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 대상에서 원하는 반응을 유발하는 항체 또는 이의 부분의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 치료적 유효량은 또한 항체의 임의의 독성 또는 해로운 효과가 치료적으로 유익한 효과보다 큰 양이다. "예방적 유효량"은 원하는 예방 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량 및 기간 동안 효과적인 양을 지칭하는 것으로 의도된다. 예방적 용량은 질환 전에 또는 질환의 초기 단계에 개체에게 처방되므로, 전형적으로 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 적을 수 있다.
치료적 유효량 또는 예방적 유효량은 활성제의 독성 용량보다 적은 적어도 최소한의 치료적으로 유익한 용량이다. 한편, 본 발명의 항체의 치료적 유효량은 포유동물, 바람직하게는 인간에서 PD-1의 생물학적 활성을 감소시키는 양이다.
본 발명의 항체의 투여 경로는 경구, 비경구, 흡입 또는 국소일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 비경구 투여에 허용가능한 약학 조성물에 포함될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "비경구"는 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질 또는 복강내 투여를 포함한다. 정맥내, 복강내 또는 피하 주사가 바람직한 투여 경로이다. 이러한 주사를 위한 허용가능한 약학적 담체는 선행 기술로부터 널리 알려져 있다.
적절한 지침에 기재된 바와 같이, 약학 조성물은, 예를 들어, 밀폐된 바이알(앰플) 또는 주사기에 의해 제공되는 용기에서의 생산 및 저장 조건 하에 멸균되고 안정해야 한다. 따라서, 약학 조성물은 조성물을 제조한 후 여과 멸균될 수 있거나, 또는 임의의 다른 기술에 의해 미생물학적으로 적합하게 될 수 있다. 정맥내 주입을 위한 전형적인 조성물은 멸균 링거액, 생리 식염수, 덱스트로스 용액 또는 행크스 염 용액과 같은 250-1000 ml의 용액, 및 항체 농축물의 치료적 유효량(예를 들어, 1-100 mg/ml 이상)을 포함할 수 있다. 용량은 질환 유형 및 중증도에 따라 달라질 수 있다. 환자를 위한 용량이 환자의 크기, 체표면적, 연령, 투여될 특정 화합물, 성별, 투여 기간 및 경로, 일반적인 건강 상태 및 다른 동시에 투여된 약물을 포함하는 다수의 인자에 좌우된다는 것이 의료 분야의 기술 수준으로부터 널리 알려져 있다. 전형적인 용량은, 예를 들어, 0.001-1000 μg 범위일 수 있으나, 특히 전술한 파라미터를 고려할 때, 이 예시적인 범위보다 낮거나 높은 용량이 예상된다. 일일 비경구 투여 요법은 전체 체중의 0.1 μg/kg 내지 100 μg/kg, 바람직하게는 1일당 체중의 0.3 μg/kg 내지 10 μg/kg, 및 더욱 바람직하게는 1 μg/kg 내지 1 μg/kg, 더욱더 바람직하게는 0.5 내지 10 μg/kg일 수 있다. 치료 과정은 환자의 건강 상태를 주기적으로 평가하여 모니터링될 수 있다. 수일 이상 반복 투여의 경우, 환자의 병태에 따라, 치료는 원하는 반응 또는 질환의 증상의 억제까지 반복된다. 그러나, 본원에 기재되지 않은 또 다른 요법이 또한 적용될 수 있다. 원하는 용량은 단일 볼루스 또는 다중 볼루스 투여에 의해, 또는 의사가 원하는 약동학적 분해에 따른 항체의 지속적인 주입에 의해 투여될 수 있다.
상기 추정된 항체의 특성은 주로 의사의 결정에 좌우된다. 의도된 효과는 적절한 용량 및 요법을 선택하기 위한 핵심 인자이다. 본원에서 고려되는 인자는 치료될 특정 질환, 치료를 받는 특정 포유동물, 특정 환자의 임상 상태, 장애 원인, 항체 투여 부위, 특정 항체 유형, 투여 경로, 투여 요법 및 의료 분야에서 널리 알려진 다른 인자를 포함한다.
본 발명의 치료제는 동결되거나 동결건조될 수 있고 투여 전에 적절한 멸균 담체에서 재구성될 수 있다. 동결건조 및 재구성은 항체의 활성의 상당한 손실을 초래할 수 있다. 이 손실을 보상하기 위해 복용량이 조정될 수 있다. 일반적으로, 6 내지 8의 약학 조성물 pH 값이 바람직하다.
본 발명의 결합 분자의 치료적 용도
일 양태에서, 본 발명의 결합 분자는 PD1 활성과 관련된 장애의 치료에 유용하다.
"치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 생물학적 장애 및/또는 이에 수반되는 증상 중 적어도 하나를 완화시키거나 폐지하는 방법을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 질환, 장애 또는 병태를 "완화시키는" 것은 질환, 장애, 또는 병태의 증상의 중증도 및/또는 발생 빈도를 감소시키는 것을 의미한다. 또한, 본원에서 "치료"에 대한 언급은 치유적, 완화적 및 예방적 치료에 대한 언급을 포함한다.
일 양태에서, 대상은 포유동물, 바람직하게는 인간 대상이다. 상기 대상은 임의의 연령의 남성 또는 여성일 수 있다.
"치료적 유효량"은 치료되는 장애의 증상 중 하나 이상을 어느 정도 완화시킬 투여되는 치료제의 양을 지칭하는 것으로 의도된다.
본 발명의 결합 분자는 단독으로 하나 이상의 다른 제제 또는 항체(또는 이의 임의의 조합)와 조합하여 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물, 방법 및 용도는 하기 기재된 바와 같이, 다른 활성제와의 조합(공동 투여)의 구현예를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 결합 분자 및 하나 이상의 다른 치료제와 관련된 용어 "공동 투여", "공동 투여된" 및 "조합된"은 하기를 지칭하거나 포함한다:
이러한 성분들이 상기 성분들을 실질적으로 동일한 시간에 상기 환자에게 방출하는 단일 투여 형태로 함께 제제화되는 경우, 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 결합 분자 및 치료제의 이러한 조합의 동시 투여,
이러한 성분들이 상기 환자에 의해 실질적으로 동일한 시간에 복용되는 별도의 투여 형태로 서로 분리되어 제제화되고, 그 결과 상기 성분들이 실질적으로 동일한 시간에 상기 환자에게 방출되는 경우, 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 결합 분자 및 치료제의 이러한 조합의 실질적으로 동시 투여,
이러한 성분들이 각 투여 사이에 유의한 시간 간격으로 상기 환자에 의해 연속적인 시간에 복용되는 별도의 투여 형태로 서로 분리되어 제제화되고, 그 결과 상기 성분들이 실질적으로 상이한 시간에 상기 환자에게 방출되는 경우, 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 결합 분자 및 치료제의 이러한 조합의 순차적 투여; 및
이러한 성분들이 제어된 방식으로 상기 성분들을 방출하는 단일 투여 형태로 함께 제제화되고, 그 결과 이들이 동일하거나 상이한 시간에 상기 환자에게 동시에, 연속적으로 또는 공동으로 방출되고, 여기서 각 부분은 동일하거나 상이한 경로에 의해 투여될 수 있는 경우, 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 결합 분자 및 치료제의 이러한 조합의 순차적 투여.
본 발명의 결합 분자는 추가의 치료적 치료 없이, 즉, 독립적인 요법으로서 투여될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 결합 분자에 의한 치료는 적어도 하나의 추가의 치료적 치료(조합 요법)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 결합 분자는 자가면역 또는 염증 질환의 치료를 위한 또 다른 약물/제제와 공동으로 투여되거나 제제화될 수 있다.
본 발명의 결합 분자 및 적어도 하나의 다른 제제(예컨대, 면역억제제 또는 항염증제)를 포함하는 약학적 제제는 염증 및 자가면역 장애의 치료에서 동시, 독립적 또는 연속적 투여를 위한 조합 요법으로서 사용될 수 있다.
그것은 본 발명의 결합 분자가 상기 기재된 바와 같은 치료 방법에서 사용될 수 있고, 상기 기재된 바와 같은 치료에서 사용될 수 있고/있거나 상기 기재된 바와 같은 치료용 약물의 제조에 사용될 수 있음을 의미한다.
용량 및 투여 경로
당업계에 허용되는 펩타이드, 단백질 또는 항체를 투여하기 위한 임의의 방법이 본 발명의 결합 분자에 적합하게 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 전형적으로 비경구 투여에 적합하다. 본원에 사용된 바와 같이, 약학 조성물의 "비경구 투여"는, 일반적으로 혈류, 근육, 또는 내부 기관 내로의 직접적인 투여를 초래하는, 대상의 조직의 물리적 파괴를 특징으로 하는 임의의 투여 경로 및 조직 내의 파괴를 통한 약학 조성물의 투여를 포함한다. 따라서, 비경구 투여는, 특히, 조성물의 주사에 의한, 외과적 절개를 통한 조성물의 투여에 의한, 조직을 침투하는 비외과적 상처를 통한 조성물의 적용 등에 의한 약학 조성물의 투여를 포함한다. 특히, 비경구 투여는, 특히, 피하, 복강내, 근육내, 흉골내, 정맥내, 동맥내, 척수강내, 심실내, 요도내, 두개내, 활막내 주사 또는 주입; 및 신장 투석 주입 기술을 포함하는 것을 의미한다. 종양내 전달, 예를 들어, 종양내 주사가 또한 유용할 수 있다. 국소 관류가 또한 제공된다. 바람직한 구현예는 정맥내 및 피하 경로를 포함한다.
비경구 투여에 적합한 약학 조성물의 투여 형태는 전형적으로 약학적으로 허용가능한 담체, 예컨대 멸균 물 또는 멸균 등장성 식염수와 조합된 활성 구성성분을 포함한다. 이러한 투여 형태는 볼루스 투여 또는 연속 투여에 적합한 형태로 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 주사가능한 제제는 통상적인 투여 형태, 예컨대, 보존제를 함유하는 앰플 또는 다중 용량 용기로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는, 특히, 현탁액, 용액, 유성 또는 수성 기제 중의 유화액, 페이스트 등을 포함한다. 이러한 투여 형태는, 특히, 현탁제, 안정화제, 또는 분산제를 포함하는 하나 이상의 추가의 구성성분을 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 비경구 투여를 위한 조성물은 재구성된 조성물의 비경구 투여 전에 적합한 기제(예컨대, 멸균 발열원이 없는 물)를 이용하여 재구성하기 위한 건조(즉, 분말 또는 과립) 형태로 제공되는 활성 구성성분을 포함한다. 비경구 투여 형태는 또한 염, 탄수화물 및 완충제(바람직하게는 pH 3 내지 9)와 같은 부형제를 포함할 수 있는 수용액을 포함하지만, 일부 적용의 경우, 이들은 멸균 비수용액으로서 또는 멸균 발열원이 없는 물과 같은 적합한 기제와 함께 사용되는 건조된 형태로 더 적합하게 제제화될 수 있다. 비경구 투여를 위한 예시적인 형태는 멸균 수용액, 예를 들어, 수성 프로필렌 글리콜 또는 덱스트로스 용액 중의 용액 또는 현탁액을 포함한다. 이러한 투여 형태는 필요한 경우 완충될 수 있다. 비경구 투여를 위한 다른 적합한 투여 형태는 미세결정 형태, 또는 리포좀 제제 내에 활성 구성성분을 포함하는 것을 포함할 수 있다. 비경구 투여를 위한 투여 형태는 즉시 및/또는 변형된 방출을 갖도록 제제화될 수 있다. 변형된 방출 투여 형태는 지연, 서방, 펄스형, 제어, 표적화 및 프로그램된 방출을 포함한다.
예를 들어, 일 양태에서, 멸균 주사가능한 용액은 필요에 따라 하나의 구성성분 또는 상기 열거된 하나의 구성성분의 조합을 갖는 적절한 용매 중에 필요한 양으로 적어도 하나의 결합 분자를 혼입시킨 다음, 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 분산액은 전형적으로 활성 화합물을 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터 다른 필요한 구성성분을 함유하는 멸균 용매에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 활성 구성성분의 분말 및 이전에 멸균 여과된 이의 용액으로부터의 임의의 추가의 원하는 구성성분을 생성하는 동결 건조이다. 용액의 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해, 분산액의 경우 원하는 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 조성물에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 모노스테아레이트 및 젤라틴을 혼입시킴으로써, 및/또는 변형된 방출 코팅(예컨대, 서방 코팅)에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 결합 분자는 또한 비강내로 또는 흡입에 의해, 전형적으로 적합한 추진제가 사용되거나 사용되지 않을 수 있는, 가압된 에어로졸 용기, 펌프, 스프레이, 분무기(바람직하게는 미세 입자를 생산하기 위해 전기유체역학을 사용하는 분무기), 또는 네뷸라이저와 같은 건조 분말 흡입기로부터 건조 분말의 형태로(단독으로, 혼합물로서, 또는, 예를 들어, 적합한 약학적으로 허용가능한 부형제와 혼합된 혼합된 성분을 포함하는 입자로서) 또는 점비액(nasal drops)으로서 투여될 수 있다.
가압 용기, 펌프, 스프레이, 분무기, 또는 네뷸라이저는 전형적으로, 예를 들어, 활성 물질의 분산, 재구성, 또는 방출 연장을 위한 적합한 제제, 용매로서 추진제를 포함하는, 본 발명의 결합 분자의 용액 또는 현탁액을 함유한다.
건조 분말 또는 현탁액으로 사용하기 전에, 약학적 제제는 전형적으로 흡입에 의해 전달하기에 적합한 크기(전형적으로 5 마이크론 미만)로 미세화된다. 이것은 나노입자, 고압 균질화, 또는 분무 건조를 형성하기 위해 임의의 적합한 분쇄 기술, 예컨대 나선형 제트 밀링, 유동층 제트 밀링, 초임계 유체 처리에 의해 달성될 수 있다.
흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한 캡슐, 블리스터 및 카트리지는 본 발명의 화합물, 적합한 분말 기제 및 성능 개질제의 분말 혼합물을 함유하도록 제제화될 수 있다.
전기유체역학을 사용하여 미세 입자를 생성하는 분무기에서 사용하기 위한 적합한 용액 제제는 작동당 본 발명의 결합 분자의 적합한 용량을 함유할 수 있고, 작동 부피는, 예컨대, 1 μl 내지 100 μl로 달라질 수 있다.
적합한 향미제, 예컨대 멘톨 및 레보멘톨, 또는 감미제, 예컨대 사카린 또는 사카린 나트륨이 흡입/비강내 투여를 위한 본 발명의 상기 투여 형태에 첨가될 수 있다.
투여를 위한 투여 형태는 즉각적이고/이거나 변형된 방출을 위해 제제화될 수 있다. 변형된 방출 투여 형태는 지연, 서방, 펄스형, 제어, 표적화 및 프로그램된 방출을 포함한다.
건조 분말 흡입기 및 에어로졸의 경우, 투여량 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브에 의해 결정된다. 본 발명에 따른 단위는 전형적으로 본 발명의 결합 분자의 계량된 용량 또는 "퍼프(puff)"를 투여하도록 배열된다. 총 1일 용량은 전형적으로 단일 용량으로 투여되거나, 또는 더 빈번하게는 하루 내내 분할된 용량으로서 투여될 것이다.
본 발명의 결합 분자는 또한 경구 투여를 위한 투여 형태로 제제화될 수 있다. 경구 투여는 화합물이 위장관으로 들어가도록 하는 연하(swallowing), 및/또는 화합물이 구강으로부터 직접 혈류로 들어가는 구강, 혀, 또는 설하 투여를 포함할 수 있다.
경구 투여에 적합한 투여 형태는 고체, 반고체 및 액체 시스템, 예컨대 정제; 다중- 또는 나노-입자를 포함하는 연질 또는 경질 캡슐, 액체, 또는 분말;　로젠지(액체가 충진된 것을 포함함); 츄(chew); 겔; 빠른 분산 투여 형태;　필름; 오불(ovule);　스프레이; 및 구강/점막접착성 패치를 포함한다.
액체 투여 형태는 현탁액, 용액, 시럽 및 엘릭서를 포함한다. 이러한 투여 형태는 연질 또는 경질 캡슐(예를 들어, 젤라틴 또는 하이드록시프로필메틸셀룰로오스로 제조됨)에서 부형제로서 사용될 수 있고, 전형적으로 담체, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 메틸셀룰로오스, 또는 적합한 오일, 및 하나 이상의 유화제 및/또는 현탁화제를 포함한다. 액체 투여 형태는 또한, 예를 들어, 사세트(sachet)로부터 고체 물질을 재구성함으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 결합 분자는 당해 병태의 치료에 효과적인 양으로, 즉 원하는 결과를 달성하는데 필요한 용량 및 시간 동안 투여될 것이다. 치료적 유효량은 치료될 특정 병태, 환자의 연령, 성별, 및 체중, 및 결합 분자가 단독으로 또는 하나 이상의 추가의 항-자가면역 또는 항-염증 치료 기술과 조합하여 투여되는지 여부와 같은 인자에 따라 달라질 수 있다.
투여량 요법은 최적 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 시간 경과에 따라 몇 개의 분할 용량이 투여될 수 있거나, 용량이 치료 상황의 긴급성에 따라 비례적으로 감소하거나 증가할 수 있다. 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 단위 투여 형태로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 단위 투여 형태는 치료될 환자/대상를 위한 단위 투여량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하는 것으로 의도되며; 각 단위는 원하는 약학적 담체와 함께 원하는 치료 효과를 야기하도록 계산된 활성 화합물의 미리 결정된 양을 함유한다. 본 발명의 단위 투여 형태에 대한 설명은 전형적으로 (a) 화학치료제의 독특한 특성 및 달성될 특정 치료 또는 예방 효과, 및 (b) 대상에서 감수성의 치료를 위해 이러한 활성 화합물을 배합하는 당업계의 고유한 한계에 의해 결정되고 이에 직접 의존한다.
따라서, 당업자는, 본원에 제공된 개시에 기초하여, 용량 및 투여량 요법이 치료 분야에서 공지된 방법에 따라 조정된다는 것을 이해할 것이다. 즉, 최대 용인 용량은 쉽게 확립될 수 있고, 환자에게 검출가능한 치료 효과를 제공하는 유효량은 또한 환자에게 검출가능한 치료 효과를 제공하기 위해 각 제제를 투여하기 위한 시간 요구사항과 마찬가지로 결정될 수 있다. 따라서, 특정 용량 및 투여 요법이 본원에 예시되어 있지만, 이들 실시예는 본 발명의 구현예를 실시하는데 있어 환자에게 제공될 수 있는 용량 및 투여 요법을 결코 제한하는 것이 아니다.
투여량 값은 완화될 병태의 유형 및 중증도에 따라 달라질 수 있으며 이는 단일 또는 다중 용량을 포함할 수 있음에 유의해야 한다. 더욱이, 임의의 특정 대상의 경우, 특정 투여량 요법이 개인적 필요성 및 조성물의 투여를 관리 또는 감독하는 의료 전문가의 판단에 따라 시간이 경과하면서 조정되어야 한다는 것과, 본원에 제시된 투여량이 단지 예시적인 것이며 청구된 조성물의 범위 또는 실시를 제한하고자 하는 것은 아닌 것임을 이해해야 한다. 더욱이, 본 발명의 조성물을 사용한 투여량 요법은 질환의 유형, 연령, 체중, 성별, 환자의 건강 상태, 병태의 중증도, 투여 경로 및 사용된 특정 결합 분자를 포함하는 다양한 인자에 기초할 수 있다. 따라서, 투여 요법은 광범위하게 달라질 수 있지만, 표준 기술을 사용하여 정기적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 용량은 독성 효과 및/또는 실험 값과 같은 임상 효과를 포함할 수 있는 약동학 또는 약력학 파라미터에 기초하여 조정될 수 있다. 따라서, 본 발명은 당업자에 의해 결정된 바와 같은 개별 용량 확대를 포함한다. 적절한 투여량 및 요법을 결정하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있으며, 본원에 개시된 아이디어를 제공받은 당업자에 의해 이해될 것이다.
적합한 투여 방법의 예는 상기에 제공되어 있다.
본 발명의 결합 분자의 적합한 용량은 0.1-100 mg/kg의 범위, 예를 들어 약 0.5-50 mg/kg, 예컨대 약 1-20 mg/kg일 것으로 여겨진다. 결합 분자는, 예컨대, 적어도 0.25 mg/kg의 용량, 예컨대 적어도 0.5 mg/kg, 예컨대 적어도 1 mg/kg, 예컨대, 적어도 1.5 mg/kg, 예컨대 적어도 2 mg/kg, 예컨대, 적어도 3 mg/kg, 예컨대 적어도 4 mg/kg, 예컨대, 적어도 5 mg/kg; 및 예를 들어 최대 50 mg/kg, 예컨대 최대 30 mg/kg, 예컨대, 최대 20 mg/kg, 예컨대 최대 15 mg/kg으로 투여될 수 있다. 투여는 전형적으로 적절한 시간 간격으로, 예컨대 1주에 1회, 2주에 1회, 3주에 1회 또는 4주에 1회, 및 일부 경우, 필요한 경우 용량을 증가시키거나 감소시킬 수 있는 책임 있는 의사에 의해 적절한 것으로 간주되는 한 반복될 것이다.
자가면역 또는 염증 장애의 치료를 위한 유효량은 질환의 진행을 안정화시키고/거나 환자에서 증상을 개선하고, 바람직하게는 질환 징후를 역전시키는 이의 능력에 의해 측정될 수 있다. 자가면역 또는 염증 장애를 억제하는 본 발명의 결합 분자의 능력은, 예를 들어 주어진 실시예에 기재된 바와 같은 시험관내 분석에서뿐만 아니라 이러한 장애에서의 효능을 예측하는 적합한 동물 모델에서 평가될 수 있다. 특정 상황에서 최적의 치료 반응을 제공하기 위해 적합한 투여 요법이 선택될 것이고, 예컨대, 각 경우의 긴급성에 따라 가능한 용량이 조절된 단일 볼루스 투여 또는 연속 주입이 선택될 것이다.
진단 용도 및 조성물
본 발명의 결합 분자는 또한 진단 과정(예컨대, 시험관내, 생체외)에서 사용된다. 예를 들어, 이들은 환자로부터 얻은 샘플(예컨대, 조직 샘플 또는 체액의 샘플, 예컨대 염증 삼출물, 혈액, 혈청, 장액, 타액 또는 소변)에서 PD-1의 수준을 검출하거나 측정하는데 사용될 수 있다. 검출 및 측정을 위한 적합한 방법은 면역분석, 예컨대 유세포분석법, 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA), 화학발광 분석, 방사성면역분석, 및 면역조직학을 포함한다.
제조 물품
또 다른 구현예에서, 상기 기재된 장애 및 병태의 치료 또는 예방에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 제공된다.
제조 물품은 라벨을 갖는 항체를 함유하는 약학 조성물, 및 아마도 포장 삽입물을 갖는 용기를 포함한다. 적합한 용기는, 예컨대, 바이알, 앰플, 주사기 및 분석용 튜브를 포함한다. 용기는 유리 또는 중합체 물질과 같은 복수의 물질로 제조될 수 있다. 용기는 PD-1 매개 질환 또는 장애를 치료하는데 효과적인 본 발명의 조성물을 포함하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예컨대, 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 뚫릴 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있음). 본 발명의 항-PD-1-항체는 조성물의 활성제이다. 용기에 위치한 라벨 또는 용기에 부착된 포장 삽입물은 조성물이 원하는 질환을 치료하는데 사용된다는 것을 나타낸다. 제조 물품은 인산 완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액과 같은 약학적으로 허용가능한 완충액을 갖는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 그것은 상업적 및 소비자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 이는 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 주사기 및 포장 삽입물을 포함한다.
하기 실시예는 본 발명을 더 잘 이해하기 위해 제공된다. 이들 실시예는 단지 예시적인 목적을 위해 제시되며, 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 한정하고자 하는 것은 아니다.
실시예
실시예 1
나이브 인간 항체 Fab -라이브러리 MeganLibTM의 조작
제안된 프로토콜(QIAGEN)에 따라 RNeasy 미니 키트를 사용하여 1000명이 넘는 각각의 인간 공여자의 혈액 샘플에서 B 림프구의 총 RNA를 단리하였다. RNA 농도 분석을 Nanovue 키트(GE Healthcare)를 사용하여 수행하였고; 단리된 RNA의 품질을 1.5% 아가로스 젤 전기영동에 의해 시험하였다.
역전사 반응을 MMuLV 역전사효소 및 프라이머로서 무작위 육량체 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 권장된 프로토콜에 따라 MMLV RT 키트(Evrogen)를 사용하여 수행하였다.
역전사 생성물을 2단계 중합효소 연쇄 반응에서 매트릭스로 사용하여 제한 부위에 측접한 가변 도메인의 유전자를 수득하였고; 반응을 문헌[J Biol Chem. 1999 Jun 25; 274(26): 18218-30]에 의한 올리고뉴클레오타이드 키트 및 프로토콜을 사용하여 수행하였다.
수득된 DNA 제제 VL-CK-VH(도 1)를 NheI/Eco91I 제한 엔도뉴클레아제로 처리하고 원래의 파아지미드 pH5(도 2A)에 라이게이션하였다. 라이게이션 생성물을 프로토콜[Methods Enzymol. 2000;328: 333-63.]에 따라 제조된 SS320 전기수용성(electrocompetent) 세포 내로 형질전환시켰다. 조합 파아지 Fab-디스플레이 라이브러리 MeganLibTM의 레퍼토리는 1011 형질전환체였다. 파아지-Fab-라이브러리의 제제를 이전에 기재된 절차[J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3): 581-97]에 따라 제조하였다.
실시예 2
파아지 항체의 fab -라이브러리의 선택
특이적 항-PD-1 파아지 Fab-항체를 MeganLibTM의 조합 라이브러리 파아지 Fab-디스플레이 라이브러리로부터 단리하였다. 이전에 기재된 바와 같은 조건 하에 패닝으로, 재조합 인간 PD-1을 사용하여 선택을 수행하였다(J Biol Chem. 1999 Jun 25; 274(26): 18218-30; Nat Biotechnol. 1996 Mar;14(3):309-14; J Mol Biol.1991 Dec 5;222(3): 581-97). 패닝 방법에 의한 선택 과정을 수행하기 위해, 50 mM 탄산 완충액(pH 9.5) 중의 인간 PD-1을 HighSorb 튜브(Nunc)의 표면 상에 4℃에서 밤새 흡착시켰다. 또한, 튜브를 PBS(pH 7.4)로 세척한 다음 PBS(pH 7.4)-무지방 우유(0.5% 중량/부피)를 함유하는 용액으로 1시간 동안 차단시켰다. 그리고 나서, PBS(pH 7.4)-무지방 우유(0.5% w/vol) 중의 2-4 ml의 파아지 용액(ml당 1013 파아지 입자)을 항원을 가진 튜브로 옮기고, 시스템을 교반하에 1시간 동안 인큐베이션하였다. 결합하지 않은 파아지를 PBS(pH 7.4)-트윈 20(0.1% 부피/부피)을 이용한 일련의 세척 사이클에 의해 제거하였다. 세척 사이클의 횟수를 첫 번째 라운드부터 세 번째 라운드까지 각각 20-30-40회로 증가시켰다. 결합된 상태로 남아있는 파아지 입자를 교반하에 15분 동안 100 mM Gly-HCl 용액(pH 2.5)으로 용리시킨 다음, 1 M 트리스-HCl(pH 7.6)로 중화시켰다. E. coli TG1 박테리아를 수득된 파아지로 감염시키고; 추가로 파아지를 단리시켜 다음 선택 사이클에서 사용하였다. 2번째 및 3번째 선택 라운드 후, DNA(파아지미드)를 단리시키고, 항체 가변 도메인의 유전자를 E. coli 세포에서 Fab의 생산을 위해 발현 벡터(도 2B)에 클로닝하였다.
실시예 3
인간 PD-1에 대한 Fab 특이적 결합의 분석
ELISA를 시험하여 인간 PD-1에 대한 시험 Fab-단편의 결합을 측정하였다. 공개된 니볼루맙 서열(Bristol-Myers Squibb)을 갖는 Fab를 양성 대조군으로 사용하였다. 특이적 결합을 분석하기 위해, ELISA 플레이트 웰(Greiner bio one으로부터의 배지 결합)을 50 μl(1× 코팅 탄산 완충액, pH 9.5 중의 0.5 μg/ml) PD1-H6F로 코팅하고, 밀폐시키고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 모든 추가 단계를 Genetix Qpix2xt(Molecular Devices) 및 Tecan Freedom EVO 200(Tecan)과 같은 로봇 시스템을 기반으로 하는 고성능 자동화 플랫폼을 이용하여 표준 ELISA 프로토콜에 따라 수행하였다. 비특이적 결합을 차단 완충액 BB(PBS 중의 200 μl 0.5% 무지방 우유)를 첨가하여 차단하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 진탕기 상에서 인큐베이션하였다. PBS-트윈으로 세척한 후, 각각의 세포를 동일한 부피의 BB와 혼합된 50 μl의 시험 Fab 함유 세포 상층액으로 코팅하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 진탕기 상에서 인큐베이션하고, 추가로 각 플레이트 웰을 PBS-트윈 완충액으로 3회 세척하였다. 세척 후, 각 웰을 PBS-트윈(1:5000) 중의 항-인간 Fab HRP-접합된 이차 항체(Pierce-ThermoScientific)로 코팅(50 μl/웰)하였다. 플레이트를 회전 진탕기(실온에서 50분)로 옮긴 다음, 상기 기재된 바와 같이 PBS-트윈 완충액으로 3회 세척하였다. 포화될 때까지(평균 3-5분) TMB(50 μl/웰)를 첨가하여 비색 신호를 얻고; 정지 용액(30 μl/웰, 10% 황산)을 첨가하여 추가 발색을 차단하였다. 흡광도를 적절한 Tecan-Sunrise 플레이트 판독기(Tecan)를 사용하여 450 nm에서 측정하였다. 항체 결합은 생성된 신호와 비례하였다.
실시예 4
PDL1 리간드와 PD-1 수용체의 상호작용을 차단하는 경쟁적 ELISA
경쟁적 ELISA 기술을 사용하여 이전에 선택된 항-PD-1 특이적 Fab의 길항 능력을 시험하였다. 공개된 니볼루맙 서열(Bristol-Myers Squibb)을 갖는 Fab를 양성 길항제 대조군으로 사용하였다. ELISA 웰 플레이트(배지 결합, Greiner bio one)를 50 μl/웰 PD1-H6F 수용체(1× 코팅 탄산 완충액 pH 9.5 중의 1 μg/ml 용액)로 덮고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 모든 추가 단계를 Genetix Qpix2xt(Molecular Devices) 및 Tecan Freedom EVO 200(Tecan)과 같은 로봇 시스템을 기반으로 하는 고성능 자동화 플랫폼을 이용하여 표준 ELISA 프로토콜에 따라 수행하였다. 차단 완충액 BB(PBS 중의 200 μl 0.5% 무지방 우유)를 첨가하여 비특이적 결합을 차단하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 진탕기 상에서 인큐베이션하였다.
PD1 수용체를 함유하는 플레이트를 BB 용액으로 세척한 후, 시험 Fab 함유 세포 상층액으로 코팅하고, 실온에서 45분 동안 500 rpm 진탕하에 인큐베이션하였다. 그리고 나서, 이를 1 μg/ml의 최종 농도로 50 μl PDL1-Fc와 혼합하고, 동일한 조건 하에 45분 동안 인큐베이션하고, 추가로 각각의 플레이트 웰을 PBS-트윈 완충액으로 3회 세척하였다. 또한, 50 μl/웰의 염소 항-인간 IgG(Fρ) HRP-접합된 이차 항체(Sigma)를 PBS-트윈(1:5000)에서 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 45분 동안 회전 진탕기 상에서 인큐베이션하고, 상기 언급된 바와 같이 PBS-트윈으로 5회 세척하였다. 포화될 때까지(평균 3-5분) TMB(50 μl/웰)를 첨가하여 비색 신호를 얻고; 정지 용액(30 μl/웰, 10% 황산)을 첨가하여 추가 발색을 차단하였다. 흡광도를 적절한 Tecan-Sunrise 플레이트 판독기(Tecan)를 사용하여 450 nm에서 측정하였다. Fab 결합은 생성된 색상 신호와 반비례하였다.
실시예 5
항-PD1 Fab 인간 후보에 대한 비교 koff -스크리닝
koff 스크리닝을 Pall Forte Bio Octet Red 96을 사용하여 수행하였다. 항-FABCH1 바이오센서를 10 mM PBS(pH 7.2-7.4), 0.1% 트윈-20 및 0.1% BSA를 함유하는 작업 완충액에서 30분 동안 재수화하였다. 10x 작업 완충액을 1x 최종 농도까지 E.coli 상층액의 시험 샘플에 첨가하였다. 그리고 나서, 항-FABCH1 바이오센서를 후보 항체의 Fab-단편을 함유하는 E. coli 상층액에 담그고 4℃의 온도에서 12시간 동안 인큐베이션하였다. 그리고 나서, 센서를 분석물 용액(PD-1, 30 μg/ml)을 갖는 웰로 옮겨 항원-항체 결합을 달성하였다(300초). 이후, 추가 해리를 위해 센서를 작업 완충액을 갖는 웰로 복귀시켰다(300초). 사용한 센서를 각 시험 후 재생시켰고, 이들을 재생 완충액(Gly-HCl, pH 1.7)에 3회 넣은 다음, 추가 실험에서 사용하였다. 수득된 곡선을 1:1 상호작용 모델을 이용하여 표준 절차에 따라 Octet Data 분석(버전 7.0)을 사용하여 분석하였다.
실시예 6
현탁 포유동물 세포 배양에서 재조합 항원 및 항체의 생산
항체 및 항원을 공개된 프로토콜[Biotechnol Bioeng. 2005 Sep 20; 91(6):670-677, Liao Metal., 2004; Biotechnol Lett. 2006 Jun;28(11):843-848; Biotechnol Bioeng. 2003 Nov 5;84(3):332-342]에 따라 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO-K1)로부터 수득된 확립된 세포주에서 생성하였다. EBNA1 단백질(엡스타인-바바이러스 핵 항원 1)의 유전자를 항시적으로 발현하는 세포를 사용하였다. 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)의 무혈청 배지를 사용하여 그리고 제조사의 지침에 따라 궤도 진탕기 상의 플라스크에서 현탁 배양을 수행하였다. 일시적 발현을 위해, 2*106/ml의 농도의 세포를 선형 폴리에틸렌이민(PEI MAX, Polysciences)에 의해 형질감염시켰다. DNA/PEI 비율은 1:3-1:10이었다. 형질감염 후 5-7일에, 세포 배양액을 2000 g하에서 20분 동안 원심분리하고, 0.22 μm 필터를 통해 여과시켰다. 표적 단백질을 아핀(affine) HPLC에 의해 배양액으로부터 단리하였다.
C-말단 영역에 6개의 His 아미노산을 함유하는 재조합 PD-1 단백질을 Profinity IMAC Ni-충전 수지(Bio-Rad) 상에서 배양액으로부터 단리 및 정제하였다. 정제 절차 전, NiCl2를 1mM의 농도로 배양액에 첨가하였다. 그리고 나서, 5 ml의 Profinity IMAC Ni-충전 수지를 배양액에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 진탕기 상에서 혼합하였다. 흡착제를 5 ml Thermo scientific 폴리프로필렌 컬럼으로 옮기고 5 컬럼 부피의 PBS로 세척하여 비특이적으로 결합한 성분을 제거하였다. 결합한 항원을 0.3 M 이미다졸(pH 8) 및 150mM NaCl로 용리시켰다. 그리고 나서, 단백질을 SnakeSkin 투석 튜빙 기술에 의해 PBS(pH 7.4) 내로 투석하고, 여과하고(0.22 μm), 튜브로 옮기고, -70℃에서 보관하였다.
재조합 PD1-Fc 및 PDL1-Fc 단백질을 아핀 HPLC용 단백질 A 컬럼 상에서 세포 배양물로부터 단리하고 정제하였다. 맑은 배양액을 인산 완충 식염수(PBS, pH 7.4)로 평형화된 5 ml HiTrap rProtein A Sepharose FF 컬럼(GE Healthcare)에 통과시켰다. 그리고 나서, 컬럼을 5 부피의 PBS로 세척하여 비특이적으로 결합한 성분을 제거하였다. 결합한 항원을 0.1 M 글리신 완충액(pH 8)을 이용하여 용리시켰다. 주요 단백질 용리 피크를 수집하고, 1 M 트리스-완충액(pH 8)을 이용하여 중성 pH로 조정하였다. 모든 단계를 110 cm/h 유속 하에 수행하였다. 그리고 나서, 단백질을 SnakeSkin 투석 튜빙 기술에 의해 PBS(pH 7.4) 내로 투석하고, 여과하고(0.22 μm), 튜브로 옮기고, -70℃에서 보관하였다.
IgG1 항체를 PD1-Fc 항원에 대한 전술한 절차에 따라 1 ml Hi Trap rProteinA FF 컬럼(GE Healthcare) 상에서 정제하였다. 수득된 단백질의 순도를 SDS-PAGE에 의해 평가하였다(도 3A 및 3B).
실시예 7
Jurkat - NFAT -PD1 리포터 세포주에서 항- PDI 항체에 의한 NFAT -신호전달의 재활성화
Jurkat 기원의 인간 T-세포주의 조작을 2개의 유전적 작제물을 이의 게놈 내로 도입하여 수행하였다. 하나의 작제물은 인간 PD1 수용체 유전자를 코딩한다. 제2 작제물은 NFAT-민감성 유전적 요소의 제어하에 luc2P 루시퍼라아제 유전자를 코딩한다. 결과는 표면 막 상에서 PD1 수용체를 발현하고 luc2P 루시퍼라아제 유전자의 전사를 지시하는 NFAT 의존적 프로모터를 함유하는 리포터 세포주 Jurkat-PD1-NFAT-Luc2였다. 이 세포주에서의 루시퍼라아제 효소의 합성은 NFAT 활성 수준에 비례하며, 이는 결국 세포 활성화의 전체 수준을 반영한다.
PDL1과 PD1과의 상호작용은 TCR 수용체로부터 NFAT-프로모터로의 신호전달을 억제한다. 항-PDI 항체가 PDL1-PD1 상호작용을 분리할 때, 세포내 신호전달의 재활성화가 발생한다.
실험용 플레이트를 하기와 같이 분석 하루 전에 준비하였다: PBS 중의 항-CD3 항체의 용액(5 μg/ml PDL1-Fc를 갖는 1 μg/ml)을 불투명 플라스틱으로 제조된 96-웰 불투명 플레이트에 도입하였다. PDL1이 없는 항-CD3 항체의 용액을 활성화의 양성 대조군으로 사용하였다. 그리고 나서, 이를 +4℃에서 밤새 방치하였다.
그리고 나서, 시험 항체를 3배 희석을 사용하여 세포 성장 배지에서 11 μg/ml로부터 희석하여, 10점 곡선을 피팅하고, 항체 희석을 가진 세포를 실온에서 20분 동안 인큐베이션한 다음, 항체를 가진 세포를 제조된 플레이트에 도입하였다. 성장 배지 중의 항-CD28 항체의 용액을 0.25 μg/ml의 최종 농도로 모든 웰에 첨가하였다. 그리고 나서, 이를 CO2 배양기에서 6시간 동안 방치하였다.
프로토콜에 따라 미리 제조된 Bio-Glo 루시퍼라아제 분석 시스템(Promega)의 루시퍼라아제 기질을 -70℃에서 해동시키고 V 세포/V 기질의 비율로 첨가하였다. 발광을 Fluoroscan Ascent를 사용하여 측정하였다(도 5). 항-PD1 항체는 Jurkat-PD1-NFAT 리포터 주에서 발광 수준을 재활성화시키고, 따라서 수용체에 결합하여 PDL1/PD1 상호작용을 억제한다. BCD-100은 최상의 결과를 나타내었고, 유효 용량(ED50)은 114.6 ng/μL이었다.
실시예 8
스타필로코커스 장독소의 존재하에 인간 전혈에서 항-PD1 항체에 의한 IL- 2 의 생산의 자극
SEB 세포독소(스타필로코커스 장독소)와 같은 수퍼항원은 항원-제시 세포 상의 부류 II MHC 분자를 TCR 수용체 Vβ 요소에 결합시켜 T 세포를 활성화시키고, 이는 IL2 자가분비 성장 인자를 포함하는 사이토카인의 생산을 초래한다.
시험은 진행성 고형 종양을 가진 환자에서의 품목 설명(MK-3475; 항-PD-1 단클론 항체)에 기초한다(Clin Cancer Res Published OnlineFirst May 14, 2015).
간략하게, 전혈을 SEB 또는 SEB 및 항-PD1 항체와 함께 인큐베이션한 다음, IL-2 농도를 측정하였다.
헤파린이 첨가된 공여자의 전혈을 성장 배지(10% 우태아 혈청을 갖는 RPMI)에서 1:5로 희석시켰다. SEB를 1 μg/ml의 최종 농도로 희석된 혈액에 첨가하였다. 항-PD1 항체를 50 μg/ml부터 3씩 증가시켜 성장 배지에서 희석하여, 총 8개의 희석을 수득하였다. 성장 배지 중의 혈액 및 SEB의 용액(부피/부피)을 희석된 항체에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 CO2 배양기에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 또한, IL-2 농도를 상업적으로 이용가능한 키트(R & D Systems의 인간 IL-2 Quantikine ELISA 키트) 프로토콜에 따라, ELISA 기술에 의해 선택된 샘플에서 측정하였다(도 6). BCD-100은 대조군 항체보다 더 큰 기능적 활성으로 인해 최상의 결과를 나타내었다.
실시예 9
Jurkat -PD1 세포주 상의 항-PD1 항체의 항체 의존적 세포 매개　세포독성(ADCC)의 분석
정량 시험에서 사용하기 위한 성장한 Jurkat-PD1 세포 배양액을 바이알로부터 수집하고 200 g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 배수시키고 정량 시험용 배지에서 한번 더 세척하였다.
세포 펠렛을 5 ml의 정량 시험용 배지에 현탁시키고; 생존율 및 세포의 수를 결정하였다. 3×105 세포/ml로 백색 96-웰 배양 플레이트에 시딩하기 위한 세포 현탁액을 제조하였다.
시험 샘플의 희석액을 96-웰 플레이트의 웰에 첨가하였다. Jurkat-PD1 세포 현탁액을 시험 샘플을 포함하는 웰에 첨가하고, 플레이트를 CO2 배양기에서 15-30분 동안 인큐베이션하였다.
7.5 * 106 세포/ml의 농도로 PBMC 세포 현탁액을 제조하고, 시험 샘플을 함유하는 웰에 첨가하였다. 플레이트를 4시간 동안 CO2 배양기에서 37℃에서 인큐베이션하였다.
CytoTox-Glotm 세포독성 분석 키트의 분석 완충액 및 AAF-Glo™Substrate를 혼합하고 시험 샘플을 포함하는 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 발광을 Fluoroscan Ascent FL을 사용하여 측정하였다(도 7). 방법의 원리는 세포내 프로테아제의 활성을 결정하는 것에 기초하며, 생성된 발광 신호는 용해된 세포의 수에 비례한다. 항-PD1 항체는 검출가능한 항체 의존적 세포 매개　세포독성을 가지고 있지 않다.
실시예 10
항-PD1 항체와 PD1 및 다른 항원과의 상호작용의 면역효소 분석
ELISA를 사용하여 PD1 및 다른 항원에 대한 항체의 상대적 친화성을 측정하였다. ELISA 플레이트 웰(Greiner bio one으로부터의 배지 결합)을 사용하여 결합을 측정하였다. ELISA 플레이트 웰을 50 μl의 PD1-Fc, IL6R-Fc, CD38-Fc, HER3-Fc, IGFR-Fc, CD3-Fc, IL23-Fc(1× 코팅 탄산 완충액에서 PD1의 경우 1 μg/ml 및 다른 항원의 경우 5 μg/ml)으로 코팅하고, 밀폐시키고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 모든 추가 단계를 표준 ELISA 프로토콜에 따라 수행하였다. 차단 완충액 BB(PBS 중의 200 μl 0.5% 무지방 우유)를 첨가하여 비특이적 결합을 차단하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 진탕기 상에서 인큐베이션하였다. PBS-트윈으로 세척한 후, 웰당 50 μl의 시험 항체를 PBS-트윈에 5 μg/ml의 농도로 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 진탕하면서 다시 한번 인큐베이션한 후, 각 플레이트 웰을 PBS-Twin 완충액으로 3회 세척하였다. 세척 후, 각 웰을 PBS-트윈(1:5000)에서 항-인간 Fab HRP 접합된 이차 항체(Pierce-ThermoScientific)로 코팅하였다. 플레이트를 회전 진탕기(실온에서 50분)로 옮긴 다음, 상기 기재된 바와 같은 PBS-트윈 완충액으로 3회 세척하였다. 포화될 때까지(평균 3-5분) TMB(50 μl/웰)를 첨가하여 비색 신호를 얻고; 정지 용액(30 μl/웰, 10% 황산)을 첨가하여 추가 발색을 차단하였다. 흡광도를 적절한 Tecan-Sunrise 플레이트 판독기(Tecan)를 사용하여 450 nm에서 측정하였다. 항체 결합은 생성된 신호와 비례하였다(도 4). 항-PD1 항체는 PD1에 특이적으로 결합하며 문제의 다른 항원에 결합하지 않는다.
실시예 11
항-PD1 항체와 상이한 유기체의 PD1 수용체와의 상호작용의 면역효소 분석
ELISA를 사용하여 상이한 유기체의 PD1 수용체에 대한 항체의 상대적 친화성을 측정하였다. ELISA 플레이트 웰(Greiner bio one으로부터의 배지 결합)을 사용하여 결합을 측정하였다. ELISA 플레이트 웰을 50 μl의 인간 및 자바 원숭이(Javanese monkey) PD1-Fc, 마우스, 랫트, 개, 토끼, 기니피그(1× 코팅 탄산 완충액, pH 9.5 중의 0.5 μg/ml)의 PD1로 코팅하고, 밀폐시키고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 모든 추가 단계를 표준 ELISA 프로토콜에 따라 수행하였다. 항-PD1 항체는 인간 및 시노몰구스 원숭이 PD1에 특이적으로 결합하며 다른 시험 수용체에 결합하지 않는다(도 9).
실시예 12
항-PD1 항체와 CD28 패밀리 수용체와의 상호작용의 면역효소 분석
ELISA를 사용하여 CD28 패밀리 수용체에 대한 항체의 상대적 친화성을 측정하였다. ELISA 플레이트 웰(Greiner bio one으로부터의 배지 결합)을 사용하여 결합을 측정하였다. ELISA 플레이트 웰을 50 μl 의 인간 PD1-Fc, CD28, CTLA-4 및 ICOS-Fc(1Х 코팅 탄산 완충액, pH 9.5 중의 0.5 μg/ml)로 코팅하고, 밀폐시키고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 모든 추가 단계를 표준 ELISA 프로토콜에 따라 수행하였다. 항-PD1 항체는 PD1에만 결합하며 다른 CD28 패밀리 구성원에 결합하지 않는다(도 10).
실시예 13
Octet RED 96 상에서 항-PD1 항체와 인간 및 시노몰구스 　원숭이 PD1 수용체와의 상호작용의 분석
인간 및 시노몰구스　원숭이 PD-1에 결합하는 항체의 친화성 상수(Affinity constant)를 OctetRed 96(ForteBio) 상에서 조사하였다. AR2G 센서의 제조 및 고정화와 관련하여 제조사의 매뉴얼에 기재된 표준 프로토콜에 따라, BCD100 항체를 아민 반응성 2세대 센서(ForteBio, Pall)의 표면상에 비특이적으로 고정화시켰다. 작업 완충액으로서 0.1% 트윈-20 및 0.1% BSA를 포함하는 PBS를 사용하여 30℃에서 분석을 수행하였다. 인간 및 시노몰구스　원숭이 PD-1을 작업 완충액을 사용하여 126 nM부터 2 nM의 농도까지 2씩 증가시켜 적정하였다.
참조 신호를 차감한 후, 결합 곡선을 표준 절차에 따라 그리고 1:1 상호작용 모델을 사용하여 Octet Data 분석 소프트웨어(Version 7.0)를 사용하여 분석하였다. 항-PD1 항체는 인간 및 시노몰구스 원숭이 PD1 항원에 특이적으로 결합한다(도 11).
실시예 14
Octet RED 96을 사용한 항-PD1 항체와 FcRn 및 Fcγ 수용체와의 상호작용의 분석
Forte bio Octet RED96 및 스트렙타비딘(SA) 바이오센서를 사용하여 항체와 FcgRIIIaV, FcgRIIaH, FcgRIIb, FcgRIa, FcRn과의 상호작용을 분석하였다.
실험 과정에서, 바이오틴 표지된 수용체를 스트렙타비딘 코팅된 센서의 표면에 동향으로 고정시켰다. 항체를 500 μg/ml의 농도부터 2씩 7점까지 증가시켜 연속 희석하고, 96-웰 플레이트 내의 웰에 넣었다. 그리고 나서, 다양한 농도의 항체 용액에 센서를 침지시켜 결합 단계를 수행하였고, 추가로 작업 완충액에 센서를 침지시켜 해리 단계를 수행하였다.
작업 완충액 PH7.4를 사용하여 FcgRIIIaV, FcgRIIaH, FcgRIIb, FcgRIa에 대한 항체 친화성을 분석하였고, 작업 완충액 PH6.0을 사용하여 FcRn에 대한 친화성을 분석하였다.
참조 신호를 차감한 후, 수득된 곡선을 표준 절차에 따라 2:1 상호작용 모델(이종 리간드)을 사용하여 SteadyState에 의해 분석하였다. 결과가 도 8에 나타나 있다. Fcg 수용체에 대한 친화성의 분석은 변형된 IgG1의 이펙터 기능이 감소되고 IgG4와 거의 대등하다는 것을 보여준다. FcRn 수용체에 대한 친화성의 분석에 기초하여, 항-PD1 항체의 약동학이 니볼루맙 항체의 약동학과 동일하다고 가정할 수 있다.
실시예 15
열 스트레스하에 항-PD1 항체의 응집 안정성의 결정
PBS 완충액 중의 9 mg/ml의 BCD100 항체 제제를 50℃의 온도에서 12시간 동안 가열하였다. 열 스트레스 후 응집을 고성능 젤 여과 크로마토그래피에 의해 결정하였다. 크로마토그래피를 7 μm의 입자 직경을 갖는 프리컬럼 Tosoh TSKgel Guard SWXL, 6.0 mm x 4.0 cm, 주문 번호 08543과 함께 컬럼 Tosoh TSK-Gel G3000SWXL, 7.8 mm x 30 cm, 주문 번호 08541 상에서 HPLC 시스템(Agilent)에서 수행하였다. 용리를 등용매 모드, 이동상: 0.5 ml/분의 유속에서 50 mM NaFb, 0.3 M NaCl, pH 7.0에서 수행하였다. 검출을 214 및 280 nm의 파장에서 수행하였다. 항체의 샘플을 FSB 완충액, pH 7.5를 이용하여 ~1 mg/ml의 농도로 희석하였다. 주사 부피는 10 마이크로리터였다. 보정 혼합물 젤 여과 표준(Bio-Rad), 주문 번호 151- 1901을 미리 크로마토그래피하였다. 도 12는 조합된 크로마토그램을 나타낸다: 적색 - 온전함, 청색 - 50℃에서 12시간 인큐베이션 후. 항-PD-1 항체는 열 스트레스 하에 안정한 상태를 유지한다(열 스트레스 전/후 용액에서의 응집체 함량의 차이가 5% 미만이었음).
실시예 16
항-PD1 항체의 안정한 세포주, 생산 및 정제의 조작
Neon 형질감염 시스템(Life Technologies)을 사용한 전기천공을 이용하여, 최적 비율의 경쇄 및 중쇄 항체 사슬을 포함한 벡터 작제물로 모 현탁 CHO-S 세포주를 형질감염시켜 BCD-100 단클론 항체를 생산하는 안정한 세포주를 수득하였다. ClonePix 로봇 플랫폼(Molecular Devices) 및 상이한 배양 포맷의 항생제를 사용하는 예비 미니풀 선택 단계를 사용하여 고수준 클론 계통(1 g/l 초과)을 수득하였다. 선택된 클론의 생산성을 Biomek FX 로봇 자동화 시스템(Beckman Coulter)에 의해 분석하고, 생산성을 Octet RED96 분석 시스템(Pall Life Sciences)에 의해 분석하였다. 기본 환경 및 배양 계획을 선택하기 위한 DOE를 Biomek FX 로봇 자동화 시스템(Beckman Coulter)을 사용하여 수행하였다. 생산세포를 무혈청 배지 및 동물 유래의 단백질을 함유하지 않는 급식에서 배양하였다.
배양액을 Zeta Plus Maximizer 60M02>>(3M) 깊이 필터를 통해 여과시켰다. 항체의 일차 정제를 단백질 A 친화성 흡착제 상에서 수행하였다.　표적 단백질을 산성 조건 하에 글리신 완충액 pH 3.3-3.8을 이용하여 특이적으로 용리시켰다. 수집된 용리액을 바이러스 불활성화를 위해 30-60분 동안 산성 pH에 노출시킨 다음, 1M 트리스-OH 용액으로 pH 6.8-7.2로 중화시켰다. 잔류 DNA, 생산 세포 단백질, 방출된 아핀 흡착제의 리간드, 응집체 및 항체 단편을 제거하기 위한 최종 크로마토그래피 정제를 플로스로우(flow-through) 모드로 CaptoAdhere 흡착제(GE HealthCare LifeSciences)를 사용하여 수행하였다. 이와 같이, 단백질 용액을 낮은 전도도(<2msec/cm2)하에, 제조된 흡착제 pH 6.8-7.2를 통과시켰다. 이후, 정제된 단백질을 Viresolve PRO 필터 키트(Millipore)를 사용하여 바이러스 제거 여과하고, 농축하고, 히스티딘 완충액(pH 6.0-6.5), 트윈 80 및 트레할로스를 함유하는 최종 완충액에 대해 투석여과(diafiltration)하였다. 단백질 농도는 50 mg/ml 이상이었다.
실시예 17
본 발명의 항-PD-1 항체를 포함하는 약학 조성물의 수득
PD1(BCD-100)에 대한 항체 농도 - 25 mg/ml, 아세트산 나트륨 t/g - 0.436 mg, 만니톨 - 50 mg, Kolliphor(폴록사머) P188 - 0.2 mg, pH 5.0까지 빙초산 pH 5.15 Osm 300 ± 20 mOsm
실시예 18
정상 동결 인간 조직에서 항-PD1 항체의 교차 반응성의 연구
항-PD1 제제의 교차 반응성의 연구를 정상 동결된 인간 조직(부검 물질)에서 수행하였다. 하기 33개의 인간 조직을 분석에 사용하였다: 뇌하수체, 망막, 위, 말초 혈액 세포, 대뇌 피질, 피부, 폐, 림프절, 자궁, 편도선, 소뇌, 유선, 방광, 수뇨관, 부신, 말초 신경, 이하선, 간, 췌장, 횡문근, 신장, 전립선, 비장, 심장, 척수, 대장, 소장, 나팔관, 갑상선 및 부갑상선, 혈관 내피, 고환, 난소. PD1 막 항원을 포함하는 Jurkat-PD1 세포의 동결된 현탁액을 양성 대조군으로 사용하였다.
기관 조직 조각으로부터 제조된 동결된 조직 블록을 Tissue-Tec(Sacura) 조직 충전 및 동결 배지에 포매시키고, 액체 질소 증기에서 동결시키고, -70℃에 보관하였다. PD1을 발현하는 Jurkat-PD1 세포의 침전된 현탁액을 양성 대조군으로 사용하였고, 1*106　세포/ml을 1 ml의 Tissue-Tec(Sacura) 조직 충전 및 동결 배지에 재현탁시키고, 생성된 현탁액을 액체 질소 증기에서 동결시키고, -70℃에 보관하였다.
5 μm 절편을 Thermo HM525U 저온 유지 장치에서 제조하였다. 또한, 절편을 빙냉 아세톤으로 10분 동안 고정시키고, 공기 중에서 실온에서 2-24시간 동안 건조시켰다. 고정된 절편을 -70℃의 암실에 보관하였다.
항-PD1 제제(JSC Biokad, Russia)를 제조사의 지침에 따라 FluoReporter FITC 단백질 표지화 키트(Invitrogen)를 사용하여 FITC로 표지하였다.
내인성 과산화효소를 차단하였다. 절편을 PBS(0.05% 트윈 20)로 2회 세척하고, 내인성 과산화효소를 실온에서 10분 동안 과산화수소 블록(Thermo)을 사용하여 차단하고, PBS로 2회 더 세척하였다.
비특이적 염색을 하기와 같이 염색 절차 전에 차단하였다: 절편을 실온에서 10분 동안 단백질 Block 무혈청(Dako)으로 처리하였다. 일차 항체를 세척 없이 적용하였다.
절편을 0.2 μg/ml의 작업 농도의 일차 항체(FITC로 표지된 항-PD1 항체, 0.2 μg/ml의 농도의 인간 IgG1 아이소타입 항체)로 코팅하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 매회 5분 동안 PBS로 2회 세척하였다.
과산화효소에 접합된 쥣과 단클론 항-FITC 항체의 용액(작업 희석 1/1000)을 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 매회 5분 동안 PBS로 2회 세척하였다. 절편을 DAB 염색 용액으로 10분 동안 처리한 다음, 탈이온수로 2회 세척하였다.
핵을 헤마톡실린으로 10분 동안 가볍게 염색한 다음, 탈이온수로 2회 세척하였다. 절편을 1% HCl 용액으로 1초 동안 처리한 다음, 탈이온수로 3회 세척하였다. 핵을 포화 탄산 리튬 용액(청색)으로 45초 동안 염색하였다. 염색 후, 절편을 탈이온수로 2회 세척하고, 증가하는 알코올 농도(70%, 80%, 96%)를 갖는 알코올 용액에서 탈수시키고, 자일렌 대체물에서 정화시키고, 마운팅 배지에 포매시킨 다음, ClearVue(Thermo)를 사용하여 봉입하였다.
양성 염색의 반정량　세포독성 측정을 수행하였다. 제제의 스크리닝을 Leica DM 6000B 광학 현미경을 사용하여 수행하였고, 디지털 이미지를 Leica DFC 420 비디오 카메라를 통해 컴퓨터 모니터로 전송하고 포함된 Leica Application Suite(버전 2.5.0.R1)를 사용하여 하드 디스크에 기록하였다. 스크리닝을 위해, 특별히 조정된(디지털 설정) 표준 수준의 미세제제 조명과 함께, 40x 렌즈를 사용하였다. 이미지 내의 염색 강도는 표지된 물질(이 경우, 항-PD1)의 상대적 농도와 비례한다. 세포 유형 및 구조체의 면역양성 염색의 시각적 평가 외에도, ImageJ 디지털　이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 선택된 영역에서 면역양성 염색의 수준을 측정하였다. 염색 강도 및 염색된 구조체의 총 수에 따라, 0-3점 척도로 평가하였다. 최종 면역양성 염색을 대조군 아이소타입 항체로 코팅된 조직의 염색의 강도를 고려하여 평가하였다.
실시예 19
항-PD1 항체의 생체내 효능의 평가
인간　흑색종　세포주　A2058가 피하주사된 인간화 PBMC 마우스(The Jackson Laboratory)에 의해 효능을 평가하였다. 그룹 내의 각 동물에게 2.5x106 종양 세포를 투여하였다. 세포를 투여 전에 Matrigel®(1: 1)과 혼합하였다. 수득된 혼합물을 피하 투여하였다. 효능을 BCD-100 제제의 3개의 용량, Keytruda® 참조 제제(양성 대조군) 및 정맥내 투여용 정상 인간 면역글로불린 제제(음성 대조군)를 사용하여 평가하였다(표 1).
표 1. 효능　평가 계획
Figure 112019013563417-pct00001
실험 과정에서, 동물의 체중(주사 전, 및 이후 매주 2회) 및 종양 결절의 부피를 하기 식을 사용하여 평가하였다:
Figure 112019013563417-pct00002
상기 식에서, W - 종양 결절의 폭, L - 종양 결절의 길이.
동물을 실험 37일에 안락사시켰다. 안락사 전에, 동물의 혈액을 샘플링하여 하기 하위집단의 순환성 인간 혈액 림프구의 수준을 평가하였다:
Figure 112019013563417-pct00003
실시예 20
항-PD1 항체 독성동태학 평가
하기 독성동태학 연구를 3개의 BCD-100 투여량 수준을 사용하여 시노몰구스 원숭이에서 수행하였다. 실험 그룹에 대한 계획이 하기 표 2에 나타나 있다.
표 2. 독성동태학 연구 계획
Figure 112019013563417-pct00004
하기 파라미터를 연구 동안 평가하였다:
- 임상 조사의 결과;
- 동물 체중(투여 전 및 실험 4, 8, 22, 42일);
- 체온(투여 전 및 투여 후 1, 2, 4, 6, 24시간, 실험 4, 8, 22, 42일);
- 소변 검사(투여 전 및 실험 4, 8, 22, 42일);
- 하기 파라미터에 대한 일반 혈액 분석: 적혈구의 수, 백혈구의 수, 헤모글로빈 농도(투여 전 및 실험 4, 8, 22, 42일);
- 하기 파라미터에 대한 혈청의 생화학적 분석: 젖산 탈수소효소, 총 빌리루빈, 총 단백질, 글루코스, 아스파테이트 아미노전이효소, 알라닌 아미노전이효소(투여 전 및 실험 4, 8, 22, 42일);
- 영장류의 혈청에서의 제제의 농도의 조사(투여 후 5, 15분 및 0.5, 1, 3, 6, 24, 30, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 264, 336, 408, 576, 888, 984시간).
실시예 21
시노몰구스 원숭이에서 3개월 동안 다중 피하 투여 후 3개월 동안 투여가 없는 기간의 경우의 독성의 평가
3개월 동안 다중 피하 투여 후 3개월의 회복 기간의 경우의 독성의 조사를 관련 동물-시노몰구스 원숭이에서 수행하였다. 3개의 투여량 수준을 실험에 사용하였다. 실험 그룹에 대한 계획이 하기 표 3에 나타나 있다.
표 3. 다중 피하 투여의 경우 독성 평가 계획
Figure 112019013563417-pct00005
하기 파라미터를 연구 동안 평가하였다:
- 임상 조사의 결과;
- 동물 체중(투여 전 및 이후 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13주);
- 체온(투여 전 및 이후 실험 종료까지 매주);
- 폴리스펙트럼 심전계(Poly-Spectrum cardiograph)에 의해 평가된 심장의 생체전기 활성에 기초한 심혈관계에 대한 효과; 평가를 투여 전 및 이후 실험 5, 9, 13, 18, 22, 26주에 수행하였음;
- 소변 검사(투여 전 및 실험 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13주);
- 하기 파라미터에 대한 일반 혈액 분석: 적혈구의 수, 백혈구의 수, 헤모글로빈 농도, 림프구의 수, 단핵구의 수, 호중구의 수, 호산구의 수, 호염기구의 수, 혈소판의 수(투여 전, 및 이후 실험 첫 주부터 시작하여 매주 1회);
- 하기 파라미터에 대한 혈액 응고 시스템에 대한 효과의 평가: - 활성화된 부분적 트롬보플라스틴 시간, 피브리노겐 농도, 프로트롬빈 시간(투여 전, 이후 실험 2주부터 시작하여 투여 기간 동안 2주에 1회, 회복 기간 동안 실험 15, 20 및 25주);
- 하기 파라미터에 대한 혈청의 생화학적 분석: 나트륨, 칼륨, 크레아티닌, 우레아, 알칼리 포스파타아제, 젖산 탈수소효소, 총 빌리루빈, 총 단백질, 글루코스, 트리글리세라이드, 아스파테이트 아미노전이효소, 알라닌 아미노전이효소, 총 콜레스테롤(투여 전 및 실험 4, 8, 12, 15, 20주);
- 투여 기간 말기에, 위성(satellite) 그룹 3*의 동물을 안락사시킨 다음, 이의 병리형태적　조사; 연구 말기에, 그룹 3 및 대조군의 동물을 안락사시킨 다음, 이의 병리형태적 조사;
- 독성 연구의 일부로서, 제제의 국소 자극 효과를 또한 평가하였고, 따라서 주사 영역 근처에 위치한 연조직을 선택하여 조직학적으로 조사하였음.
실시예 22
항-PD1 항체 제제의 면역독성의 평가
3개월 동안 다중 피하 투여 후 3개월의 회복 기간의 경우의 면역독성의 조사를 관련 동물-시노몰구스 원숭이에서 수행하였다. 3개의 투여량 수준을 실험에 사용하였다. 실험 그룹에 대한 계획이 하기 표 4에 나타나 있다.
표 4. 다중 피하 투여의 경우 면역독성 평가 계획
Figure 112019013563417-pct00006
하기 파라미터를 연구 동안 평가하였다:
- 제제 투여 전 및 이후 실험 3, 7, 13, 21 및 26주에 평가된 림프구의 하위집단 조성;
- 면역글로불린 부류의 비율을 투여 전 및 실험 4, 8, 12, 20, 25주에 평가하였음;
- 식균작용(phagocytosis)에 대한 영향을 투여 전 및 실험 3, 7, 13, 21, 26주에 평가하였음;
- 림프구의 모세포 전환(blast-transformation) 반응을 제제의 투여 전 및 이후 실험 5, 13, 21, 26주에 측정하였음.
실시예 23
항-PD-1 항체의 다중 피하 투여의 경우 약동학 및 면역원성의 평가
3개월 동안 다중 피하 투여 후 3개월의 회복 기간의 경우의 약동학 및 면역독성의 조사를 관련 동물-시노몰구스 원숭이에서 수행하였다. 3개의 투여량 수준을 실험에 사용하였다. 실험 그룹에 대한 계획이 하기 표 5에 나타나 있다.
표 5. 다중 피하 투여의 경우 독성 평가 계획
Figure 112019013563417-pct00007
제제 농도의 동역학을 평가하고 이어서 약동학 파라미터를 계산하기 위해, 동물의 혈청을 제제의 투여 전 및 이후 실험 1, 2, 8, 9, 15, 16, 22, 23, 29, 30, 36, 37, 43, 44, 50, 51, 57, 58, 64, 65, 71, 72, 78, 79, 85, 86, 92, 99, 106, 113, 120, 127, 134, 148, 162, 176일에 채취하였다.
면역원성을 결합 항체의 수준에 의해 평가하였고, 이 목적을 위해, 혈액을 채취하고, 혈청을 제제의 투여 전 및 이후 실험 4, 8, 12, 20, 26주에 분리하였다.
SEQUENCE LISTING <110> JSC ≪BIOCAD≫ <120> ANTI-PD-1 ANTIBODIES, A METHOD OF PRODUCTION AND A METHOD OF USE THEREOF <150> RU2016128487 <151> 2016-07-13 <160> 10 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> synthetic <400> 1 Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Met Tyr 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> synthetic <400> 2 Ala Ile Asp Thr Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> synthetic <400> 3 Cys Ala Arg Asp Glu Gly Gly Gly Thr Gly Trp Gly Val Leu Lys Asp 1 5 10 15 Trp Pro Tyr Gly Leu Asp Ala 20 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> synthetic <400> 4 Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val His 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> synthetic <400> 5 Arg Asp Ser Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> synthetic <400> 6 Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Thr Ala Val 1 5 10 <210> 7 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> synthetic <400> 7 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asp Thr Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Val Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Glu Gly Gly Gly Thr Gly Trp Gly Val Leu Lys Asp Trp 100 105 110 Pro Tyr Gly Leu Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> synthetic <400> 8 Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Leu Ser Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Arg Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Ala Gln Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Thr Ala Val 85 90 95 Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gln 100 105 <210> 9 <211> 459 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> synthetic <400> 9 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asp Thr Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Val Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Glu Gly Gly Gly Thr Gly Trp Gly Val Leu Lys Asp Trp 100 105 110 Pro Tyr Gly Leu Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 130 135 140 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 145 150 155 160 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 165 170 175 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 180 185 190 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 195 200 205 Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 210 215 220 Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 225 230 235 240 Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 245 250 255 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 260 265 270 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 275 280 285 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 290 295 300 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 305 310 315 320 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 325 330 335 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 355 360 365 Gln Val Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 370 375 380 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 385 390 395 400 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 405 410 415 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 420 425 430 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 435 440 445 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 10 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> synthetic <400> 10 Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Leu Ser Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Arg Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Ala Gln Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Thr Ala Val 85 90 95 Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gln Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims (24)

  1. 서열번호 1 내지 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및
    서열번호 4의 CDR1 아미노산 서열, 서열번호 5의 CDR2 아미노산 서열 및 서열번호 6의 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
    를 포함하는, 인간 PD-1 수용체에 결합하는 능력을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 중쇄 가변 도메인이 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서,
    서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및
    서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인
    을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 결합 도메인이 인간화된 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항에 있어서 , 인간 아이소타입 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 중 하나와 관련된 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항에 있어서, 중쇄가 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항에 있어서, 경쇄가 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제1항에 있어서, Fc 불변부가, 천연 서열과 비교하여, 이펙터 기능 ADCC, ADCP 또는 CDC 중 어느 하나를 감소시키거나 제거하는, 위치 228, 233, 234 및 235에서의 돌연변이를 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제1항에 있어서, Fc 불변부가 t1/2β(시간) 또는 Cmax(μg/ml)와 같은 동물 또는 인간 약동학 파라미터를 증가시키는 돌연변이를 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  11. 제10항에 따른 단리된 핵산 분자 중 어느 하나를 포함하는 발현 벡터.
  12. 제10항에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 생산하는 방법으로서,
    상기 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 적합한 줄기세포에 감염시키는 단계를 포함하는, 방법.
  14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법으로서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 생산하는 단계, 숙주 세포를 항체 또는 이의 단편을 생산하기에 충분한 조건 하에 배양하는 단계, 및 수득된 항체 또는 이의 활성 단편을 단리 및 정제하는 단계를 포함하는, 방법.
  15. 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 비히클과 조합된, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 종양학적 질환 또는 전염병의 치료에 사용하기 위한 약학 조성물.
  16. PD-1 에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 치료하기 위한, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    상기 질환 또는 장애가 종양학적 질환 또는 전염병인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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SI3661954T1 (sl) 2017-08-03 2022-05-31 Amgen Inc. Muteini interlevkina-21 in postopki zdravljenja
BR112020014121A2 (pt) 2018-01-12 2020-12-01 Amgen Inc. anticorpos anti-pd-1 e métodos de tratamento
US20210261665A1 (en) * 2018-07-19 2021-08-26 Tayu Huaxia Biotech Medical Group Co., Ltd. Anti-pd-1 antibodies, dosages and uses thereof
CN109652453B (zh) * 2018-12-29 2021-04-06 杭州科兴生物科技有限公司 一种基于pd-1/pdl-1阻断功能及生物效应的抗癌药物快速筛选方法
JP2022534889A (ja) 2019-05-24 2022-08-04 ファイザー・インコーポレイテッド Ｃｄｋ阻害剤を使用した組合せ療法
EP3982997A4 (en) * 2019-06-14 2023-09-13 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. ANTIBODIES TO PD-1 AND METHOD OF USE THEREOF
TW202114637A (zh) * 2019-08-22 2021-04-16 俄羅斯聯邦商拜奧卡德聯合股份公司 抗ｐｄ－１抗體ｐｒｏｌｇｏｌｉｍａｂ的水性藥物組合物及其用途
RU2753282C2 (ru) 2019-09-19 2021-08-12 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" ИММУНОЦИТОКИН, ВКЛЮЧАЮЩИЙ ГЕТЕРОДИМЕРНЫЙ БЕЛКОВЫЙ КОМПЛЕКС НА ОСНОВЕ IL-15/IL-15Rα, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
BR112022017136A2 (pt) 2020-02-28 2022-10-11 Tallac Therapeutics Inc Conjugação mediada por transglutaminase
WO2022118197A1 (en) 2020-12-02 2022-06-09 Pfizer Inc. Time to resolution of axitinib-related adverse events
EP4314062A1 (en) * 2021-03-31 2024-02-07 Merus N.V. Novel pd-1 binding domains
TW202327595A (zh) 2021-10-05 2023-07-16 美商輝瑞大藥廠 用於治療癌症之氮雜內醯胺化合物的組合
WO2023079428A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 Pfizer Inc. Combination therapies using tlr7/8 agonist
WO2024077069A1 (en) * 2022-10-05 2024-04-11 Chulalongkorn University Monoclonal antibodies against human programmed cell death protein 1 (pd-1)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013521768A (ja) 2010-03-11 2013-06-13 ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム Ｐｄ−１抗体
US20160068586A1 (en) 2010-03-11 2016-03-10 Ucb Biopharma Sprl Pd-1 antibodies
WO2016068801A1 (en) 2014-10-27 2016-05-06 Agency For Science, Technology And Research Anti-pd-1 antibodies

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105315373B (zh) * 2005-05-09 2018-11-09 小野药品工业株式会社 程序性死亡-1(pd-1)的人单克隆抗体及使用抗pd-1抗体来治疗癌症的方法
KR101562580B1 (ko) * 2007-06-18 2015-10-22 머크 샤프 앤 도메 비.브이. 사람 프로그램된 사멸 수용체 ｐｄ-1에 대한 항체
US8062852B2 (en) * 2007-10-01 2011-11-22 The Children's Hospital And Regional Medical Center Detection and treatment of autoimmune disorders
CA2778714C (en) * 2009-11-24 2018-02-27 Medimmune Limited Targeted binding agents against b7-h1
RS57895B1 (sr) * 2011-03-29 2019-01-31 Roche Glycart Ag Fc varijante antitela
PT2992017T (pt) * 2013-05-02 2021-01-29 Anaptysbio Inc Anticorpos dirigidos contra a morte programada 1 (pd-1)
EP4130044A1 (en) * 2013-09-13 2023-02-08 BeiGene Switzerland GmbH Anti-pd1 antibodies and their use as therapeutics and diagnostics
WO2016022994A2 (en) * 2014-08-08 2016-02-11 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University High affinity pd-1 agents and methods of use
TWI595006B (zh) * 2014-12-09 2017-08-11 禮納特神經系統科學公司 抗ｐｄ－１抗體類和使用彼等之方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013521768A (ja) 2010-03-11 2013-06-13 ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム Ｐｄ−１抗体
US20160068586A1 (en) 2010-03-11 2016-03-10 Ucb Biopharma Sprl Pd-1 antibodies
WO2016068801A1 (en) 2014-10-27 2016-05-06 Agency For Science, Technology And Research Anti-pd-1 antibodies

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