KR102602564B1 - 인터루킨-6의 인간 수용체에 결합가능한 항체 또는 항원 결합성 단편 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 서열 번호 3의 서열과 적어도 75% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함함으로써, 인간 인터루킨-6(IL-6) 수용체에 결합하는 능력이 보장된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.

Description

인터루킨-6의 인간 수용체에 결합가능한 항체 또는 항원 결합성 단편
본 발명은 의약에 관한 것이다. 본 발명은 인터루킨-6 매개 질병을 치료 또는 진단하거나 인터루킨-6 매개 증상을 경감시키는 약제로서 사용될 수 있는, 인간 인터루킨-6 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 단편의 개발에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 항체를 생산하는 방법 및 상기 항체를 사용하여 인간 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다.
인터루킨-6(IL-6)은 B 및 T 세포를 포함하는 광범위한 항원 제시 세포에 의해 생성된 염증 반응의 주요 매개체 중 하나이다. IL-6는 활성화된 단구세포 또는 대식세포, 내피 세포, 섬유 아세포, 활성화된 T 세포뿐만 아니라 면역 세포가 아닌 범위의 세포에 의해서도 생성된다. 이는 많은 다른 사이토카인과 함께 면역 반응, 혈관 신생, 염증, 골 대사와 관련된 프로세스에 관여한다. IL-6의 주요 효과는 B 림프구의 분화, 이의 면역 글로블린을 분비하는 형질 세포로의 성장 및 형질 전환에 있어 보조 인자로서 참여하는 것과 관련이 있다. 나아가, IL-6는 활성화된 면역 세포에서 IL-6 수용체 발현을 촉진하고, Т 세포에 의한 IL-2 생성을 유도한다. 이러한 사이토카인은 T 림프구의 증식과 조혈 반응을 자극한다. 생물학적 효능이 있는 제품 및 표적 세포의 다양성 측면에서 인터루킨-6은 면역 및 염증 반응의 실현에 관여하는 가장 활동적인 사이토카인 중 하나이다. IL-6의 친염증 및 항염증(pro- and anti-inflammatory) 효과 사이의 불균형은 다양한 자가 면역 질환, 만성 염증 및 골다공증, 및 건선을 유발하고, 이의 과도한 생산으로 인해 다양한 형태의 암이 발생한다.
이와 관련하여, IL-6 효과를 차단하는 것은 상기 질환을 조사 및 치료하기 위한 매력적인 목표이다(Pete rC. HeinrichBiochem. J. (2003) 374:1).
세포 내에서의 사이토카인 신호의 전달은 두가지 방법에 의해 가능하다. 첫 번째는 수용체의 막 결합 알파 서브 유닛을 갖는 세포들이 알파 서브 유닛과 gp130 분자로 이미 조립된 수용체로 인터루킨 6에 결합하는 것이다. 두 번째는 멤브레인 상에 gp130만을 갖는 세포가 인터루킨-6과 알파 서브 유닛의 가용성 형태와의 복합체에 결합하는 것이다. 세포막 상에서는, 완전한 복합체가 조립되고 그 후 세포 반응 캐스케이드가 시작된다. 사이토카인의 효과 및 이에 따른 염증 반응을 차단하는 것은 알파-서브 유닛 및 gp130 분자로 이루어진 수용체와 인터루킨-6의 완전한 조립을 방해함으로써 달성될 수 있다. 특정 항체가 분자 중 하나와 결합하면 완전한 복합체 조립이 방해되어 세포 내부의 신호 전달이 차단된다.
IL-6, IL-6R 또는 gp130에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드(러시아 연방 특허 제2550262호 참조)는 IL-6 작동을 유의하게 억제하는 영향을 미친다. IL-6R에 결합하고 IL-6와의 상호 작용을 차단하는 항체(토실리주맙(tocilizumab))를 기반으로 한 의약품은 류마티스성 관절염 및 전신성 청소년 특발성 관절염의 치료에 단일 요법의 형태로, 그리고 메토트렉세이트(methotrexat) 및/또는 기타 기초 항염증 의약품(basic anti-inflammatory drugs)과 조합되어 광범위하게 사용되고 있다.
제공된 데이터를 통해 항-IL-6R 항체를 기반으로 한 제품의 개발이 이러한 질병을 갖는 환자를 완벽히 치료할 것이라고 추측케 한다.
IL-6 수용체(IL-6R, IL6R, CD126)는 분자 복합체로서 활성화되면 세포 반응 케스케이드를 시작하여 추가 염증 반응에 관여하는 단백질의 활성적인 합성을 유발한다. 수용체는 IL-6가 신호 전달을 방해하는 80 kDa의 질량을 갖는 수용체 알파 단위에 결합하는 동안 활성화되고, 130 kDa의 질량을 갖는 2개의 gp130 분자는 세포 내부에서 신호를 변환한다(Simon A. Jones The FASEB Journal 15(1):43-58). 알파 수용체에는 멤브레인-결합 형태(mIL-6R) 및 가용성 형태(sIL-6R 38kDa)의 두 가지 형태가 있다. 가용성 형태는 막관통 단백질 분해(transmembrane proteolysis) 또는 mIL-6R mRNA의 선택적인 스프라이싱(splicing)의 결과로 생성된다. IL-6sR의 가용성 형태는 세포가 mIL-6R이 없는 사이토카인에 반응할 수 있게 한다.
수용체에 결합하는 폴리펩티드로 IL-6 신호를 차단하는 것은 IL-6에 직접 결합하는 것보다 많은 이점을 갖는다. 따라서, IL-6에 대한 항체는 표적 내-관절 리간드(target intra-articular ligand) 및 혈액 순환 중인 IL-6 모두에 결합한다. IL-6R에 결합된 항체는 그 표면에 mIL-6R를 포함하는 세포 및 gp130만을 포함하는 세포 모두에 영향을 준다.
본 발명의 목적은 인터루킨-6이 매개하는 질환의 치료 또는 진단, 증상 완화를 위한 의약품으로 적용될 수 있는, 인간 인터루킨-6 수용체에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 선택적 항체 또는 그 단편을 생성하는 것이다.
본 발명에 따르면, 서열 번호 3의 서열과 적어도 75% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함함으로써, 인간 인터루킨-6(IL-6) 수용체에 결합하는 능력이 보장된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하는 것이다.
도 1은 12% PAGE에서 배양되고 정제된 인간 sIL-6R의 변성 조건 하에서의 겔 전기영동을 나타낸 것이다.
경로 a-d : 페르멘타스(fermentas) 비염색 마커, 10 mcl의 칼럼에 적용 전의 IL6R-H6F 세포 배양액, 10 mcl의 컬럼에 적용한 후 IL6R-H6F 세포 배양액, 5 mcl에서 IL6R-H6F 용출.
도 2는 배양되고 정제된 인간 sIL-6R의 웨스턴 블랏 분석을 나타낸 것이다. 12% PAGE에서 인간 sIL-6R의 변성 조건 하에서 겔 전기영동을 완료하고 이를 막으로 옮긴 후, tocilizumab에 결합시키고, anti-GoatahIgGIgG HRP를 수행하였다. 염색은 DAB로 수행하였다. 경로 a-d : 예비염색(Prestained) 마커, IL6R-flag-his 5mcl.
도 3은 12% PAGE에서 배양되고 정제된 인간 IL6-H6-EPEA (6개의 히스티딘 및 단백질 C-말단 상의 EPEA 서열을 가짐)의 변성 조건 하에서의 겔 전기영동을 나타낸 것이다.
경로 a-d : 페르멘타스(fermentas) 비염색 마커, 5mcl 컬럼에 적용하기 전의 IL6-H6-EPEA ccf, 5mcl 컬럼에 적용 후의 IL6-H6-EPEA ccf, 5mcl 컬럼에서 IL6-H6-EPEA ccf 용출.
도 4는 Fab 파지 디스플레이 라이브러리를 클로닝하기 위한 파지미드 벡터를 도시한다.
도 5는 Fab의 클로닝 및 배양용 발현 플라스미드를 도시한다.
도 6은 ForteBio를 이용한 Fab 단편과 인간 IL-6R 알파 단편과의 결합 및 해리 동역학을 나타낸다.
도 7은 β-머캅토에탄올의 존재하에 12% PAGE에서 인간 IL-6sR의 배양되고 정제된 전장 크기의(full size) 항체의 변성 조건 하에서 겔 전기영동을 나타낸 것이다.
경로 a - f : a - 페르멘타스 비염색 마커, b - f - 항-IL-6sR 항체.
도 8은 β-머캅토에탄올의 존재하에 12% PAGE에서 인간 IL-6sR의 배양되고 정제된 전장 크기의 항체의 변성 조건 하에서 겔 전기영동을 나타낸 것이다.
경로 a - f : a - 페르멘타스 비염색 마커, b - f - 항-IL-6sR 항체.
도 9는 항-IL-6R 항체를 사용한 DS-1 세포 증식에 대한 세포 저해 시험을 나타낸 것이다.
도 10은 토실리주맙(tocilizumab)과 비교하여 BCD089 항체(항 IL-6sR)를 사용한 HEK-BlueTM IL6 세포 배양에서의 STAT3 경로 억제 분석의 세포 시험을 나타낸 것이다.
도 11은 인간, 사이노몰거스(cynomolgus), 래트 및 개의 IL-6R과 BCD089 항체의 상호 작용에 대한 효소 면역측정법을 나타낸 것이다.
도 12는 BCD089 항체와 인간, 토끼 및 기니아 피그의 IL-6R 수용체와의 상호 작용에 대한 효소 면역 측정법을 나타낸다.
도 13은 ForteBio를 사용하여 BCD089의 인간 IL-6R 알파 서브 유닛과의 결합 및 해리 동력학을 나타낸 것이다.
도 14는 ForteBio를 사용하여 BCD089의 사이노몰거스 IL-6R 알파 서브 유닛과의 결합 및 해리 동역학을 나타낸 것이다.
도 15는 인간 및 마우스의 IL-6R에 대한 BCD 089 항체의 BCD089의 결합 및 해리 동역학(association and dissociation kinetics)을 나타낸 것이다(250nM의 마우스 IL-6R - 검정 곡선, 50nM의 인간 IL-6R - 파란 곡선).
도 16은 ForteBio를 사용하여 BCD089의 기니아 피그 IL-6R 알파 서브 유닛과의 결합 및 해리 동역학을 나타낸 것이다.
도 17은 BCD089 분자의 50℃에서 12시간 항온처리(incubation) 전(빨간색)과 후(파란색)의 겔 여과 프로필을 나타낸 것이다.
도 18은 콜라겐 유도된 관절염의 영장류 모델을 이용한 BCD-089 생성물의 항-염증 활성을 평가한 것이다
1. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 기술분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 여기에 기술된 것과 유사한 또는 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시예를 실시 또는 시험하는데 사용될 수 있지만, 하기에 기술된 것은 예시적인 방법 및/또는 물질이다. 본원에 언급된 모든 발행물 및 다른 참고 문헌은 참고문헌으로서 그 전부가 첨부되어 있다. 모순이 있는 경우 정의를 포함한 본 설명이 우선한다. 다수의 선행 기술 문헌이 본원에 언급되었지만, 그러한 문헌은 이들 문헌 중 임의의 것이 당해 분야의 통상적인 지식의 일부를 형성한다고 인정되는 것은 아니다.
나아가, 문맥에 의해 달리 요구되지 않는 한, 단수의 용어는 복수를 포함하고 복수의 용어는 단수를 포함할 수 있다. 전형적으로, 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학, 분석 화학, 유기 합성 화학, 의학 및 약학 화학에 따른 분류 및 방법뿐만 아니라 여기에 기술된 단백질 및 핵산의 혼성화 및 화학의 분류 및 방법은 잘 알려져 있고 통상의 기술자에 의해 널리 사용된다. 효소 반응 및 정제 방법은 당해 기술 분야에서 통상적인 바와 같이 또는 본원에 기재된 바와 같이 제조자의 지시에 따라 수행된다.
본 명세서 및 실시예를 통틀어, "갖는" 및 "포함하는" 또는 그 변형어, 예를 들어 "가지는", "가지고 있는", "포함한" 또는 "포함하고 있는"과 같은 단어는 명시된 정수 또는 정수의 그룹을 포함하는 의미로 이해되어야 할 뿐만 아니라, 다른 정수 또는 정수의 그룹을 제외하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
달리 명시하지 않는 한, 아미노산은 그 단일 문자 코드에 의해 표현된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "인터루킨-6", "IL6" 및 "IL-6"은 상호 교환가능하다.
용어 "IL-6R", "IL6R" 또는 CD126은 인터루킨-6 수용체를 의미한다.
용어 "sIL-6R"은 인터루킨-6의 수용체의 가용성 형태를 나타낸다.
용어 "mIL-6R"은 인터루킨-6의 막-결합 수용체를 나타낸다.
"항체" 및 "면역 글로불린"이라는 용어는 상호 교환가능하며, 면역계 세포 또는 유전적으로 조작된 다른 유기체에 의해 합성되는 형태의 전장 크기(full size)의 항체를 의미한다.
전장 크기의 항체는 4개의 폴리펩티드 사슬를 포함한다:
2개의 중쇄(Н)(전장 약 50-70kD) 및 2개의 경쇄(L)(전장 약 25kD)은 이황화물 브릿지로 서로 결합되어 있다.
각 사슬의 N-말단(아미노 말단부)은 기본적으로 항원 인식을 담당하는 약 100-110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다.
각 사슬의 C-말단(카복시 말단부)은 기본적으로 작동기의 기능을 담당하는 불변 영역을 결정한다.
중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원-결합 중심(또는 영역)을 형성한다.
항체의 경쇄는 카파(kappa) 또는 람다(lambda)로 분류되며, 각각은 특정 불변 영역을 갖는다. 각각의 경쇄는 경쇄의 N 말단부의 가변 영역("LCVR"또는 "VL") 및 하나의 CL 도메인으로 이루어진 경쇄의 불변 영역을 포함한다.
중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류된다. 그들은 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE와 같은 항체 이소타입을 각각 결정하며, 그 중 몇 개는 서브클래스(이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 각 유형의 중쇄는 불변 영역 -Fc를 특징으로 할 수 있다. 각 중쇄는 N 말단 중쇄("HCVR" 또는 "VH)의 가변 영역 및 중쇄 CH의 불변 영역으로 구성된다. 중쇄의 불변 영역은 IgG, IgD 및 IgA에 대한 3개의 도메인(CH1, CH2 및 СН3) 및 IgM 및 IgE에 대한 4개의 도메인(CH1, CH2, СН3 및 СН4)으로 구성된다.
HCVR 및 LCVR 영역은 Rf-초가변 영역(CDR)이라 불리는 초가변성의 영역으로 추가로 세분될 수 있는데, 이는 프레임워크 영역(FR)이라 명명된 보다 보존적 영역으로 산재되어 있다.
각각의 HCVR 및 LCVR은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 아미노 말단으로부터 카르복시 말단에 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다.
CDR은 항원과 특이적으로 상호작용하는 잔기의 대부분을 구성한다.
각 쌍의 경쇄/중쇄 가변 영역은 항체-항원 결합 부위를 형성한다. 본원에서 사용되는바, "항원-결합부", "항원-결합 영역", "항원-결합 도메인" 또는 "항원-결합 센터"는 항원과 상호작용하고 항원과 관련하여 항체 특이성 및 친화성을 제공하는 아미노산 잔기를 포함하는 항체 분자의 부분과 상호교환적으로 관련되어 있다.
항체의 이러한 부분은 항원-결합 잔기의 적절한 형태를 유지하는데 필요한 "골격" 아미노산 잔기를 포함한다.
본 출원에서 "항체"라는 용어는 반드시 인간 항체를 의미하는 것은 아니며, 설치류 항체, 영장류 또는 낙타과 동물의 항체일 수 있다. 바람직하게는 마우스, 마카크(macaque)의 항체; 낙타 또는 라마(lama)의 항체; 키메릭 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간 항체일 수 있다.
이러한 문맥에서 용어 "항체"는 천연 항체의 구조에 가까운 구조를 갖는 인공 단쇄 항체를 포함한다.
상기 항체는 글리코실화(glycolised) 다당류 잔기가 없을 수 있다.
본 발명의 항체는 모노클로날 항체로 이해될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 균질 또는 실질적으로 균질한 항체 집단(즉, 약 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 바람직하게는 적어도 약 97% 또는 98%, 또는 보다 더 바람직하게는 99% 이상의 항체가 동일한 항원/에피토프에 대해 ELISA에서 경쟁하거나, 또는 심지어 더 바람직하게는 그의 아미노산 서열이 동일하다).
또한, 모노클로날 항체는 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 항체로서 이해될 수 있지만, 이들은 번역후 변형(post-translational modification), 예를 들어 글리코실화 패턴이 다를 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체는, 예를 들어, 본원 기술분야에서 잘 공지된 하이브리도마 기술뿐만 아니라 재조합 기술, 파지 디스플레이 기술, 합성 기술 또는 이러한 기술 또는 본원 기술분야에 널리 공지된 다른 기술과 조합하여 수득할 수 있다.
그러나, "단일 클론 항체"라는 용어는 하이브리도마 기술에 의해서만 얻어진 항체에 국한되지 않는다. 이 용어는 예를 들어 모든 진핵 세포, 원핵 세포 또는 파지 클론을 포함하는 단일 카피 또는 클론으로부터 수득된 항체를 지칭할 수 있다.
본원에서 아미노산 잔기에는 참조 항체에 대한 참조 번호가 붙어 있는데, 이는 항체 중쇄가 서열 번호 10의 서열이고, 경쇄가 서열 번호 9의 서열인 항체를 의미한다. 다른 모든 경우에 있어서, 다른 지시가 없다면, HCVR 및 LCVR 항체 영역의 한계 내의 CDR 아미노산 잔기는 Kabat 일동의 "Sequences of Proteins of Immunological Interest"(5th Ed. Public Health Service, 국립 보건원, Bethesda, 메릴랜드(1991))에 따라 번호 및 위치가 지정된다.
본 발명에 따라, 항원은 상이한 소스로부터 수득된 DNA 셔플링(shuffling)을 포함한 재조합 방법을 포함하는 상이한 디자인 기술을 사용하여 수득될 수 있다.
본 발명의 항체는 단일 특이적, 이중 특이적 및 다중 특이적일 수 있다. 다중 특이적 항체는 하나의 표적 폴리 펩타이드의 다양한 에피토프에 특이적일 수 있거나, 다른 항원 또는 여러 항원과 관련하여, 또는 IL-6R 이외에 다양한 IL-6R 에피토프와 관련하여 특이적인 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다(예: Tuttetal. (1991) J. Immunol. 147: 60-69).
단일 항체, 이중 항체 및 다중 항체의 항원-결합부 간의 결합은 다양하다. 특히, 항원-결합부 간의 결합은 화학적 결합일 수 있고, 또는 상이한 항원-결합부는 공통의 폴리펩티드 사슬을 통해 결합될 수 있고, 또는 서로 다른 사슬의 비공유 결합에 의해 결합될 수 있으며, 또는 항원-결합부는 다른 항체 또는 항체 단편에 의해 서로 결합될 수도 있다.
"항-sIL-6R-항체", "sIL-6R에 대한 항체", "인터루킨-6 수용체에 특이적으로 결합하는 항체" 등의 용어들은 이 출원의 문맥에서 상호 교환가능하고 항체를 지칭하며, 이는 IL-6 수용체에 특이적으로 결합한다. "mIL-6R"는 인터루킨-6의 막 결합 수용체를 나타낸다.
"sIL-6R"은 인터루킨-6의 수용체의 가용성 형태를 나타낸다.
"항체 단편"이란 용어는 중쇄의 3개 CDR 및 경쇄의 3개 CDR를 포함하는 자연적 및 인위적으로 고안된 항체 임의의 단편을 의미한다. 항체 단편은 특히 중쇄의 단축된 프레임워크 영역을 갖는 실질적으로 전장 크기의 항체, 또는 완전한 또는 전장 Fc 영역, 또는 항원 결합부를 포함하는 항체의 부분 또는 단편, 예를 들어, HCVR 및 LCVR을 암호화하는 DNA와 링커 서열을 결합하여 수득될 수 있는 항체의 Fab-단편, Fab'-단편 또는 F(ab')2-단편, scFv, (scFv)2, dsFv, 및 단쇄 Fv-단편으로 볼 수 있다(Pluckthun, Monoclonal Antibodies의 약리학, 113권, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, 269-315페이지, 1994).
"항체 단편"이라는 용어는 전장 항체의 기원을 나타내는 것으로 이해되어서는 안 된다. "항체 단편"은 임의의 공지된 방법에 의해 전장 크기의 항체와 무관하게 절대적으로 수득될 수 있다.
또한, "항체 단편"은, 항체 단편이 중쇄의 3개 이하의 CDRs 및 경쇄의 3개 이하의 CDRs를 포함하고 그 폴리펩타이드 또는 그 생성물이 이들의 표적(예를 들어, 에피토프 또는 항원)에 대한 특이적 또는 우선적 결합 능력을 보유한다면, 인위적으로 고안된 폴리펩타이드 또는 펩타이드 부분과 비-펩타이드 부분을 포함하는 생성물일 수 있다.
글리코실화와 관련된 것을 포함하여 그 밖의 항체와 관련한 상기 모든 사항은 상식적으로 양립할 수 있다면 항체 단편에도 적용 가능하다.
본 출원에서 사용되는 용어 "특이적으로 결합하는"은 특이적으로 결합된 쌍의 한 영역이 그 특이적 결합 파트너(파트너들)와 상이한 큰 수준의 분자들에는 결합하지 않는 상황을 나타낸다. 이 용어는 또한 예를 들어, 본 발명의 항체의 항원-결합 도메인이 다수의 항원에 의해 운반되는 특정 에피토프에 특이적인 경우에도 적용될 수 있다. 이 경우, 항원 결합 도메인을 포함하는 특정 항체는 에피토프를 운반하는 다양한 항원에 특이적으로 결합할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 항체 또는 그 단편은 인간 sIL-6R에 특이적으로 결합하는 반면, 인간 단백질 IL12, IL23, EGFR, CD3, IGFR, CTGF, FGF2, PD1, PSCK9, CD38, GCSF, 인터페론 알파-2b에는 거의 결합할 수 없다.
"에피토프"라는 용어는 항체의 하나 이상의 항원-결합 영역에서 항체에 인식되어 결합될 수 있는 분자의 부분을 의미한다. 에피토프는 종종 아미노산 또는 당류 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹으로 구성되며, 특유의 전하 특성뿐만 아니라 특이한 3차원 구조적 특성을 갖는다. "억제 에피토프(inhibiting epitope)" 및/또는 "상쇄 에피토프(neutralizing epitope)"는 손상되지 않은(intact) 항원 분자와 관련하여, 및 에피토프에 특이적인 항체에 결합될 때 생체 내 또는 시험관 내 분자를 포함하여 분자 또는 세포의 생물학적 활성 손실 또는 감소를 초래하는 에피토프로 볼 수 있다. 본 출원에서 사용되는 "에피토프"라는 용어는 동물, 바람직하게는 마우스 또는 인간과 같은 포유동물에서 항원성 및/또는 면역원 활성을 개시하는 폴리펩티드의 부분에 관한 것이다. 본원에서 사용된 "항원성 에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩티드 단편이며, 예를 들어 표준 면역측정법(standard immunoassay)과 같이 선행 기술에서 잘 공지된 임의의 기술에 의해 검출될 수 있다. 항원성 에피토프는 면역원성일 필요는 없지만 면역원성일 수도 있다. 본원에 사용된 "면역원성 에피토프"는 선행 기술로부터 공지된 임의의 방법에 의해 결정된 바와 같이, 동물에서 항체 반응을 일으키는 폴리펩티드 단편으로 정의된다. "비선형 에피토프(nonlinear epitope)" 또는 "구조적 에피토프(conformational epitope)"는 에피토프-특이적 항체에 결합하는 항원 단백질 내의 비인접 폴리펩타이드(또는 아미노산)를 포함한다.
본 발명의 항체와 관련하여 "생물학적 특성", 또는 "활성" 또는 "생체 활성"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, sIL-6R에 대한 에피토프/항원 친화성 및 특이성, IL-6에 길항하는 능력, 항체의 안정성 및 생체 내 항체의 면역원성을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 항체의 다른 확인가능한 생물학적 성질은 예를 들어, 교차 반응성(즉, 일반적으로 표적 펩타이드의 비-인간 상동체 또는 다른 단백질 또는 표적과의 교차 반응성) 및 포유 동물 세포에서 단백질의 높은 수준의 발현을 보존하는 능력을 들 수 있다. 상기 언급한 성질 및 특성은 ELISA 분석, 경쟁적 ELISA 분석, 또는 KINEXA 표면 플라스몬 공명 분석(KINEXA surface plasmon resonance analysis), 시험관 내 또는 생체 내 중화 분석(neutralization analysis in vitro or in vivo), 수용체 결합, 사이토카인 또는 성장 인자의 생성 및/또는 분비, 인간, 영장류 또는 다른 모든 공급원을 포함하는 상이한 공급원으로부터 수득된 조직 절편의 신호 전달 및 면역조직화학법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 본원 기술분야에서 공지된 기술에 의해 관찰, 측정 또는 평가 될 수 있다.
본 발명의 항체의 활성과 관련하여 본원에서 사용되는 "억제" 또는 "상쇄(neutralize)"라는 용어는 상기에서 언급한 생물학적 활성(예: IL-6 활성) 또는 성질, 질병 또는 상태를 포함하되 이에 국한되지는 않는 것에 대한 실질적 저지(hold back), 억제, 방지, 제한, 감속, 중단, 파괴, 중지, 감소 또는 전환, 예를 들어, 저해된 상태를 진전 또는 심화(severity)시킬 수 있는 능력을 지칭한다. 본 발명의 항체를 sIL-6R에 결합시킨 결과로서 IL-6 활성의 저해 또는 상쇄는 바람직하게는 적어도 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95% 이상이다.
본 출원에서 "환자"라는 용어는 마우스, 원숭이, 사람, 농경 포유동물, 스포츠 포유동물 및 애완동물을 포함하나 이에 한정되지 않는 포유동물에 관한 것이며, 특히 바람직하게 인간에 관련된다. 특정 실시 양태에서, 환자, 바람직하게는 포유동물, 바람직하게는 인간은 IL-6의 생물학적 활성을 감소시킴으로써 개선될 수 있는 IL-6에 의해 매개되는 질병 또는 장애 또는 상태를 추가적 특징으로 할 수 있다.
"벡터"라는 용어는 플라스미드 및 바이러스 벡터를 포함하여, 결합된 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 어떤 벡터는 주입된 숙주 세포에서 자율적으로 복제할 수 있는 반면, 다른 벡터는 숙주 세포 게놈에 통합되어 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 나아가, 특정 벡터는 기능적으로 결합된 유전자 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히 "발현 벡터")로 지칭되고, 그 예시적 벡터들이 본원 기술분야에 잘 공지되어 있다.
본 출원에서 사용된 바와 같이, "세포", "숙주 세포", "세포주" 및 "세포 배양", "생산자로서의 세포주"라는 표현은 상호 교환가능한 용어로 사용되며, 본 발명의 임의의 분리된 폴리펩타이드 또는 본 발명의 HCVR, LCVR 또는 모노클로날 항체를 코딩하는 서열을 포함하는 임의의 재조합 벡터(임의의 재조합 벡터들)의 이식자인 개별 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 개별 세포의 자손을 포함하며 자손은 자연적, 우발적 또는 의도적 돌연변이 및/또는 변화로 인해 원래의 모세포와 완전히 동일(형태학 또는 완전한 DNA 보체에 의해)할 필요는 없다. 숙주 세포는 재조합 벡터 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 경쇄 또는 중쇄를 발현하는 모노클로날 항체로 형질 전환, 형질 감염(transduction) 또는 감염된(infected) 세포를 포함한다. 본 발명의 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포 (숙주 염색체에 일관되게 통합된 것 및 통합되지 않은 것 둘 다)는 또한 "재조합 숙주 세포"로 지칭될 수 있다. 본 발명에 사용하기에 바람직한 숙주 세포는 CHO 세포(예컨대, ATCC CRL-9096), NS0 세포, SP2/0 세포, COS 세포(예를 들어, CRL-1650, CRL-1651과 같은 ATCC) 및 HeLa(ATCC CCL-2)이다. 본 발명에 사용하기 위한 추가 숙주 세포는 식물 세포, 효모 세포, 다른 포유류 세포 및 원핵 세포를 포함한다.
"친화성"이란 용어는 항원과 결합 분자, 예를 들어 항체 간의 인력을 측정하는 것을 의미한다. 항원에 대해 결합 분자를 끌어들이는 본질적인 능력은 전형적으로 특정 결합 분자-항원 상호 작용의 결합 친화도 평형 상수(binding affinity equilibrium constant; KD)로 표현된다. 결합 분자는 KD가 1mM 미만, 바람직하게는 100nM미만일 때, 항원과 특이적으로 결합하는 것으로 말한다. KD 결합 친화도 상수는 예를 들어 ProteOnTMTM XPR36 SPR (Bio-Rad) 또는 OctetTM 시스템을 사용하여 표면 플라스몬 공명(BIAcoretterm) 또는 생물층 간섭계(bio-layer interferometry)에 의해 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "Ka"는 특정 항체-항원 상호 작용의 결합 속도를 지칭하는 것을 의미하는 반면, "Kd"라는 용어는 특정 항체-항원 상호 작용의 해리 속도를 의미하는 것이다. 본원에 사용된 용어 "KD"는 Kd대 Ka의 비(즉, Kd/Ka)로부터 수득되고 몰 농도(M)로서 표현되는 친화성 상수를 의미한다. 항체에 대한 KD 값은 본원 기술분야에서 잘 확립된 방법을 사용하여 결정할 수 있다.
항체의 KD를 결정하는 바람직한 방법은 바람직하게는 Biocore®시스템과 같은 바이오센서 시스템을 사용하는 표면 플라스몬 공명법이다.
본원에 사용된 바와 같이, IgG 항체에 대한 "고친화성"이란 용어는 목표 항원에 대해 KD - E-10 - E-08 M, 보다 바람직하게는 E-10 - E-09 M 이하, 더욱 더 바람직하게는 E-10 M 이하의 KD 값을 갖는 갖는 항원을 지칭한다. 그러나, "고친화성" 결합은 다른 항원 이소타입에 대해 다양할 수 있다. 예를 들어, IgM 이소타입에 대한 "고친화성" 결합은 E-10 - E-07 M 이하, 보다 바람직하게는 E-10 - E-08 M 또는 더욱 바람직하게는 E-10 - E-09 M 이하의 KD 값을 갖는 항원을 언급한다.
본원에 사용된 용어 "koff"는 특정 결합 분자-항원 상호작용의 해리 속도 상수를 지칭한다. 해리 속도 상수(koff+)는 예를 들어 Octet™ 시스템을 사용하여 생체-층 간섭계(bio-layer interferometry)를 사용하여 측정할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "에피토프"는 결합 분자(예를 들어, 항체 또는 이중 특이적 결합 분자와 같은 관련 분자)에 특이적으로 결합하는 항원의 부분(결정인자)을 의미한다. 에피토프 결정인자는 일반적으로 아미노산 또는 탄수화물 또는 당 측쇄와 같은 분자로 이루어지며, 전형적으로 특별한 전하 특성뿐만 아니라 특정한 3차원 구조 특성을 갖는다. 에피토프는 "선형(linear)" 또는 "구조형(conformational)"일 수 있다. 선형 에피토프에서, 단백질(예: 항원)과 상호작용하는 분자(항체) 사이의 모든 상호 작용점은 단백질의 일차 아미노산 서열에 따라 선형적으로 발생한다. 구조형 에피토프에서, 상호 작용점은 일차 아미노산 서열에서 서로 분리된 단백질상의 아미노산 잔기에 걸쳐 발생한다. 항원에서 원하는 항원 결정인자가 결정되면, 본원 기술분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 상기 항원 결정인자에 대한 항체를 생성할 수 있다. 또한, 항체 또는 다른 결합 분자의 생성 및 특성 규명을 통해 바람직한 에피토프에 대한 정보를 설명할 수 있다. 이러한 정보로부터, 예를 들어, 항원에 대한 결합을 위해 서로 경쟁하는 결합 분자를 발견하기 위한 경쟁 연구를 수행함으로써, 동일하거나 일치하는 에피토프에 결합하기 위한 항체를 경쟁적으로 스크리닝하는 것이 가능하다. 본 출원에서 사용되는 "에피토프"라는 용어는 동물, 바람직하게는 마우스 또는 인간과 같은 포유동물에서 항원성 및/또는 면역원 활성을 개시하는 폴리펩티드의 일부분에 관한 것이다. 본원에서 사용된 용어 "항원성 에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩티드 단편이며, 예를 들어 표준 면역측정법(standard immunoassay)과 같이 선행 기술에서 잘 공지된 임의의 기술에 의해 검출될 수 있다.
항체 또는 다른 결합 분자가 본 발명의 IL-6 결합 분자와 결합하기 위한 동일한 에피토프 또는 교차 경쟁체(cross-competes)에 결합하는지 여부를 본원 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 일 구현 예에서, 본 발명의 분자가 포화 조건 하에서 IL-6에 결합할 수 있게 한 후 시험 항체가 상기 표적 항원에 결합하는 능력을 측정한다. 시험 항체가 기준 결합 분자와 동시에 표적 항원에 결합할 수 있다면, 시험 항체는 기준 결합 분자와 다른 에피토프에 결합한다. 그러나, 시험 항체가 표적 항원에 동시에 결합할 수없는 경우, 시험 항체는 동일한 에피토프, 중첩 에피토프 또는 결합 분자에 결합된 에피토프에 매우 근접한 에피토프에 결합한다. 이러한 실험은 ELISA, RIA, BIACORE™, 생물층 간섭계 또는 유동 세포계측법을 사용하여 수행할 수 있다. 본 발명의 결합 분자가 또 다른 결합 분자와 교차경쟁하는지를 시험하기 위해, 상기 기술한 경쟁 방법을 두 가지 방향으로, 즉 공지된 결합 분자가 시험 결합 분자를 차단하는지 및 그 역도 성립하는지를 결정하는데 사용할 수 있다. 이러한 교차 경쟁 실험은 예를 들어 IBIS MX96 SPR 또는 OctetTM 시스템을 사용하여 수행될 수있다.
한 구체 예에서, 본 발명의 결합 분자는 모노클로날 항체이다. 본원에서 사용된 약어 "mAb"는 모노클로날 항체, 즉 세포의 개별 클론 집단에 의해 합성되고 단리된 항체를 의미한다. 클론 집단은 불멸화 세포의 클론 집단일 수 있다. 일부 실시예에서, 클론 개체군 내의 불멸화된 세포는 하이브리드 세포-하이브리도마(hybridomas)이며, 일반적으로 면역화된 동물의 개별 B 림프구와 림프구 종양의 개별 세포가 융합됨으로써 생성된다. 하이브리도마는 생성된 세포의 한 종류이며 자연계에는 존재하지 않는다.
항체의 클래스(이소타입) 및 서브 클래스는 본원 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 항체의 클래스 및 서브 클래스는 항체의 특정 클래스 및 서브 클래스에 특이적인 항체에 의해 결정될 수 있다. 이러한 항체는 상업적으로 이용가능하다. 클래스와 하위 클래스는 ELISA, 웨스턴 블롯 분석 및 기타 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 클래스 및 서브 클래스는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 도메인의 전부 또는 일부를 시퀀싱하고, 그 아미노산 서열을 면역글로불린의 다양한 클래스 및 서브 클래스의 공지된 아미노산 서열과 비교한 후, 항체의 클래스와 하위 클래스를 결정함으로써 결정될 수 있다.
핵산 서열과 관련하여 용어 "동일성(identity)"또는 "상동성(homology)"은 최대한 대응하도록 정렬될 때 동일한 두 서열의 잔기를 의미한다. 서열 동일성의 비교는 적어도 약 9개의 뉴클레오타이드, 일반적으로 약 18개의 뉴클레오티드, 더욱 일반적으로는 약 24개의 뉴클레오티드, 전형적으로 약 28개의 뉴클레오타이드, 보다 전형적으로는 약 32개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 적어도 약 36개, 48개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드의 길이에 걸쳐 확장될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열 동일성을 측정하는데 사용될 수 있는 본원 기술분야에 공지된 다수의 다양한 알고리즘이 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 서열은 Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin FASTA의 프로그램인 FASTA, Gap 또는 BESTFIT를 사용하여 비교될 수 있는데, FASTA는 예를 들어, FASTA2 및 FASTA3 프로그램을 포함하고, FASTA는 조회 서열과 검색 서열 사이의 최상의 중첩 영역에 대해 정렬 및 퍼센트 서열 동일성을 제공한다(Pearson, Methods Enzymol. 183 : 63 98 (1990); Pearson, Methods Mol. Pearson, Methods Enzymol.266 : 227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276 : 71-84 (1998)] 참조). 특별히 지정되지 않는 한, 특정 프로그램 또는 알고리즘의 기본 매개 변수가 사용된다. 예를 들어, 핵산 서열 간의 퍼센트 서열 동일성은 기본 매개 변수 (워드 크기 6 및 스코어 매트릭스의 NOPAM 인자)를 갖는 FASTA를 사용하거나 GCG 버전 6.1에 제공된 기본 매개 변수를 갖는 Gap를 사용하여 결정할 수 있다.
항체의 폴리펩티드 서열에 관한 용어 "상동성(homologous)"은 폴리 펩타이드 서열에 대해 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상 및 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 나타내는 항체로 해석되어야 한다. 핵산 서열과 관련한 이 용어는 핵산 서열에 대해 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상 및 가장 바람직하게는 97% 이상의 서열 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열로 해석되어야 한다.
용어 "이중 특이적 항체" 또는 "다중 특이적 항체"는 2개 이상의 에피토프를 선택적으로 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 이중 특이적 항체는 예를 들어 2개의 상이한 항원-결합 부분을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 항원-결합 부분은 상이한 분자(예: 항원)상의 또는 동일한 분자(예를 들어, 동일한 항원)상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 이중 특이적 항체가 2개의 상이한 에피토프(제 1 에피토프 및 제 2 에피토프)에 선택적으로 결합할 수 있는 경우, 제 1 에피토프에 대한 제 1 항원-결합 부분의 친화성은 제 2 에피토프에 대한 제 1 항원-결합 부분의 친화성보다 전형적으로 1 내지 2 또는 3 또는 4배 더 낮을 수 있고 그 역도 가능하다. 이중 특이적 항체에 의해 인식되는 에피토프는 동일하거나 상이한 표적(예를 들어, 동일하거나 상이한 단백질 상의)일 수 있다. 이중 특이적 항체는 예를 들어, 동일한 항원상의 상이한 에피토프를 인식하는 중쇄를 조합함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 상이한 에피토프를 인식하는 가변 중쇄 서열을 코딩하는 핵산 서열은 다양한 중쇄 불변 영역을 코딩하는 핵산 서열과 융합될 수 있으며, 이러한 서열은 면역글로불린 경쇄를 발현하는 세포에서 발현될 수 있다. 전형적인 이중 특이적 항체는 2개의 중쇄를 포함하고, 이들 각각은 CH1 도메인, 힌지(hinge) 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인, 및 면역글로불린 경쇄에 의해 이어진(N 말단에서 C 말단까지) 3개의 중쇄 CDR을 포함하는데, 이들은 항원-결합 특이성을 갖지 않지만 각각의 중쇄와 결합할 수 있거나, 각각의 중쇄와 결합할 수 있고 항원-결합 중쇄 영역에 의해 제한되는 하나 이상의 에피토프와 결합할 수 있거나, 또는 각각의 중쇄와 결합할 수 있고 하나 또는 두 에피토프에 대한 하나 또는 두 중쇄의 결합을 촉진한다.
2. 목적
본 발명의 목적은 인터루킨-6이 매개하는 질환의 치료 또는 진단, 증상 완화를 위한 의약품으로 적용될 수 있는, 인간 인터루킨-6 수용체에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 선택적 항체 또는 그 단편을 생성하는 것이다.
3. 본 발명의 항체 및 그 단편
본 발명에 따르면, 서열 번호 3의 서열과 적어도 75% 이상 상동인 아미노산 서열을 포함함으로써, 인간 인터루킨-6(IL-6) 수용체에 결합하는 능력이 보장된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하는 것이다.
한 양태에서, 본 발명은 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 그 단편에 관한 것이다.
일부 실시 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항체 또는 그 단편에 관한 것이다:
- 서열 번호 9의 서열과 적어도 75% 상동성을 갖는 중쇄 가변 도메인 서열 및
- 서열 번호 10의 서열과 적어도 75% 상동성을 갖는 경쇄 가변 도메인 서열.
한 실시 양태에서, 본 발명은 서열 번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 그 단편에 관한 것이다.
일부 구체 예에서, 결합 단편은 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 결합 도메인과 동일한 에피토프에 결합하거나 결합하기 위해 경쟁한다.
일부 실시 형태에 있어서, 결합 단편은 서열 번호 7의 아미노산 서열과 적어도 90% 상동이다. 본 발명의 일 구체 예에서, 결합 도메인은 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 이소타입과 관련되어 있음을 특징으로 한다.
일부 실시 형태에 있어서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 9의 서열과 적어도 90% 상동인 중쇄 서열을 갖는다.
일부 실시 형태에 있어서, 항체 또는 그의 단편은 서열 번호 10의 서열과 적어도 90% 상동인 경쇄 서열을 갖는다.
일부 실시 양태에서, IgG1 이소타입의 Fc 불변 영역은 E233P, L234A, L235A, E236P, L237V 및/또는 L238A 돌연변이를 포함한다.
일부 구체 예에서, IgG1 이소타입의 Fc 불변 영역은 t1/2β(h) 또는 Cmax(μg/ml)와 같은 동물 또는 인간의 약동학 파라미터를 증가시키는 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에 있어서, IgG1 이소타입의 Fc 불변 영역은 t1/2β(h) 또는 Cmax(μg/ml)와 같은 동물 또는 인간의 약동학 파라미터를 증가시키는 M255Y, S257T 및/또는 T259E 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음 특성 중 하나 이상을 갖는다:
a) 응집체의 함량이 6개월 이상동안 10 mg/ml 이상의 농도 및 T = 4℃의 보관 온도에서 용액 내 초기 함량의 5% 초과하여 증가하지 않는 응집 안정성;
b) 응집체의 함량이 2주 이상동안 10 mg/ml 이상의 농도 및 37℃로 증가하는 온도에서 용액 내 초기 함량의 5% 초과하여 증가하지 않는 응집 안정성;
c) 응집체의 함량이 24시간 이상동안 10 mg/ml 이상의 농도 및 50℃로 증가하는 온도에서 용액 내 초기 함량의 5% 초과하여 증가하지 않는 응집 안정성;
d) 인간 IL-6 수용체에 결합할 때 10-9 (M) 이하인 해리 상수 KD;
e) 인간 IL-6 수용체에 결합할 때 적어도 105 (l/Ms)의 동역학 상수 (kinetic association constant) kon (l/Ms);
f) 인간 IL-6 수용체에 결합할 때 10-4 (l/s) 이하인 운동 해리 상수(kinetic dissociation constant) dis (l/s);
g) 10-8M을 초과하지 않는 IC50 값으로 인터루킨-6 의존성 DS1 세포의 배양물에 항증식 활성을 나타냄; 및
h) 10-8nM을 초과하지 않는 IC50 값으로 인터루킨-6 의존성 세포의 배양물에 STAT-3 신호 전달에 대한 차단성을 나타냄.
4. 본 발명에 따른 이중 특이적 항체
본 발명에 따라, 상기 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 이중 특이적 항체가 또한 제공된다.
이러한 항체의 예로는 CDR이 서로 상이하고 서로 95% 이상의 총 상동성을 갖는 항원-결합 부분을 포함하는 이중 특이적 항체가 될 수 있다.
5. DNA
본 발명에 따라, 상기 CDR과 일치하는 서열을 포함하는 상기 언급한 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 수득하기 위한 DNA도 제공된다.
6. 발현 벡터
본 발명에 따라, 하나 또는 수 개의 상기 DNA를 포함하는 발현 벡터가 또한 제공된다.
발현을 위해, 국제공개 WO2010/148223의 6.2 "NUCLEIC ACIDS AND EXPRESSION SYSTEMS"(러시아 연방 특허 2567639 참조)에 기술된 시스템이 사용될 수 있다.
7. 세포주
본 발명에 따르면, 상기 벡터 또는 상기 DNA를 세포 내에 포함하는 세포주도 제공된다.
8. 항체를 얻는 방법
본 발명에 따르면, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 수득하기에 충분한 조건하에 상기 배양 배지에서 상기 세포주를 배양하는 단계 및 수득된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 정제하는 단계를 포함하는, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 수득하는 방법도 제공된다.
9. 약학 조성물
본 발명에 따르면, 인터루킨-6(IL-6)의 효과와 관련된 질환 또는 상태 치료용, 또는 IL-6의 바람직하지 않은 효과와 관련된 증상의 제거 또는 경감용 제약 조성물이 제공되며, 이는 청구항 제1항 또는 그 종속항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편 유효량을 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 조합하여 포함한다.
본 발명의 청구범위에 따른 조성물이 비경구 용액인 경우가 바람직하다.
대안적으로, 본 발명의 청구범위에 따른 조성물은 동결 건조된 분말일 수 있다.
본 발명의 청구범위에 따른 조성물은 류마티스성 관절염, 골관절염, 청소년 만성 관절염, 패혈증성 관절염, 라임 관절염, 건선 관절염, 반응성 관절염, 척추 관절병증(spondyloarthropathy), 전신 홍반성 루푸스, 크론병, 궤양성 대장염, 염증성 장 질환, 인슐린 의존성 진성 당뇨병, 갑상선염, 천식, 알레르기성 질환, 건선, 아토피성 피부염, 경피증, 이식편 대 숙주(graft versus host), 장기 이식 거부, 장기 이식과 관련된 급성 또는 만성 면역 질환, 유육종증, 가와사키 병, 그레이브스 병, 신장 증후군, 만성 피로 증후군, 베게너 육아 종증, 헤노크-쉔레인 자반병(Henoch-Schoenlein purpurea), 신장의 미세한 혈관염, 만성 활동성 간염, 포도막염, 복막염 쇼크, 독성 쇼크 증후군, 패혈증 증후군, 악액질, 후천성 면역 결핍 증후군, 급성 횡성 척수염, 헌팅톤 무도병, 파킨슨 병, 알츠하이머 병, 뇌졸중, 원발성 담즙성 경화증, 용혈성 빈혈, 성인(급성) 호흡 곤란 증후군, 탈모증, 탈모증 아레아타(alopecia areata), 혈청음성성 관절병증, 관절병증, 라이타병, 건선성 관절염, 궤양성과 관련된 건선성 관절염, 아토피성 알레르기, 자가 면역성 수포성 장애, 불가리스 천포창(pemphigus vulgaris), 낙엽상 천포창(pemphigus foliaceous), 천포창, 선형 lgA 병, 자가 면역 용혈성 빈혈, 궤양 양성 용혈성 빈혈, 후천성 악성 빈혈, 청소년성 악성 빈혈, 동맥염, 원발성 경화성 간염, 기원성 자가 면역성 간염, 기원성 섬유성 폐포염, 염증후 간질성 폐질환, 간질성 폐렴, 만성 호산구성 폐렴, 감염된 간질성 폐 질환, 통풍성 관절염, 자가 면역 간염, 유형-1 자가 면역 간염(고전적 자가 면역 또는 루푸이드 간염), 유형-2 자가 면역 간염, 골관절염, 원발성 경화성 담관염, 건선 유형 1, 건선 유형 2, 특발성 백혈구 감소증, 자가 면역 중성 백혈병, 신장 질환 NOS, 사구체 신염, 신장의 미세한 혈관염, 원반 모양 홍반성 루푸스, 남성 불임 특발성 또는 남성 불임 NOS, 정자의 자가 면역, 다발성 경화증(모든 아형), 교감 신경 안검, 결합 조직 질환에 이차적인 폐 고혈압, 굿파져 증후군(Goodpasture's syndrome), 결절 다발 동맥염의 폐 증상, 급성 류마티스 열, 류마티스 척추염, 스틸 질병(Still's disease), 전신 경피증, 쇼그렌그 증후군(Sjorgren's syndrome), 타카야스 병/동맥염, 자가 면역 혈소판 감소증, 특발성 혈소판 감소증, 자가 면역 갑상선 질환, 갑상선 기능 항진증, 염증성 자가 면역 갑상선 기능 저하증(하시모토 병), 위축성 자가 면역 갑상선 기능 저하증, 일차성 색소 부종, 수정체성(phacogenic) 포도막염, 원발성 혈관염, 비티리고병(vitiligo), 급성 간 질환, 만성 간 질환, 알레르기 및 천식, 정신 장애(우울증 및 정신분열증 포함), Th2 유형 및 Th1 유형 매개 질병, 결막염, 알레르기성 접촉성 피부염, 알레르기성 비염, 알파-1-항 트립신 결핍증, 근 위축성 측삭 경화증, 빈혈증, 낭포성 섬유증, 사이토킨 요법 관련 장애, 말이집탈락(demyelinating) 질병, 피부염, 홍채 모양체염, 포도막염, 시신경염, 허혈-재관류 손상, 허혈성 뇌졸중, 유년기 류마티스 관절염, 자가 면역 장병증, 자가 면역 청력 상실, 자가 면역 림프 증식 증후군(ALPS), 자가 면역성 심근염, 자가 면역 조기 난소 부전, 및 안염을 포함하는 질환의 치료에 유용 할 수있다.
본 발명의 항체는 개별적으로 또는 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 및/또는 충전제와 함께 단일 투여 또는 다중 투여로서 투여될 수 있다. 투여용 약학 조성물은 선택된 투여 요법을 따르도록 개발되어 왔고, 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 및/또는 충전제, 예컨대 분산제, 완충제, 계면 활성제, 보존제, 용해제, 등장화제, 안정화제, 동결억제제가 조성물에 대한 적절한 투여 형태를 고려하여 선택되어 왔다. 상기 조성물은 예를 들어, Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995에 명시된 통상적인 기술에 따라 개발되었으며, 통상의 기술자에게 일반적으로 알려진 포뮬레이션을 수득하는 상이한 기술들이 기재되어 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 단편을 포함하는 약학 조성물은 경구, 정맥 내, 복강 내, 피하, 폐, 경피, 근육 내, 비강 내, 협측(buccal), 설하(sublinguial) 및 좌약을 포함하는 표준 투여 경로를 사용하여 환자에게 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 항체 유효량을 포함한다. "유효량"은 바람직한 치료 결과를 얻기 위해 필요한 시간 내에서 투여시 효과적인 양이다. 항체의 치료학적 유효량은 질환의 상태, 개체의 연령, 성별 및 무게, 및 개체에서 바람직한 반응을 개시하기 위한 항체 또는 항체 일부의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 또한 유효량은 항체의 치료학적으로 유리한 효과가 독성 또는 악영향을 극복하는 양을 나타낸다. 항체가 예방 목적으로 사용되는 경우, "유효량"은 바람직한 예방 효과를 얻기 위해 필요한 시간 내에서 투여시 유효한 양으로 이해된다. 예방적 투여량은 질병의 초기 단계 또는 전 단계에서 개체에 사용되기때문에, 예방적 유효량은 전형적으로 치료 효과량 미만일 수 있다.
유효량은 적어도 최소 투여량을 나타내지만, 환자에서 치료 또는 예방 효과를 보장하는데 필요한 활성제의 독성 투여량보다 적다. 반면에, 본 발명의 항체의 유효량은 포유류, 바람직하게는 인간에서 IL-6의 생물학적 활성을 감소시키는 양을 나타낸다.
본 발명의 항체의 투여 경로는 경구, 비경구, 흡입 또는 국부 투여일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 비경구 투여가 허용되는 약학 조성물에 포함될 수 있다. 용어 "비경구"는 정맥 내, 근육 내, 피하, 직장, 질 또는 복강 내 투여를 포함한다. 정맥 내, 복강 내 또는 피하 주사가 바람직한 투여 경로이다. 이러한 주사를 위한 허용가능한 약학적 담체는 선행 기술에 잘 알려져 있다.
적절한 가이드라인에서 기술된 바와 같이, 약학적 조성물은 밀폐된 약병(앰풀) 또는 주사기에 의해 제공되는 용기에서의 생산 및 보관 조건 하에서 멸균되고 안정해야 한다. 따라서, 약학적 조성물은 조성물의 제조 후에 여과 및 살균될 수 있거나, 임의의 다른 기술에 의해 미생물학적으로 적합하게 될 수 있다. 정맥 내 주입을 위한 전형적인 조성물은 멸균 링거액, 생리 식염수, 덱스트로스 용액 또는 행크스(Hank's) 염 용액과 같은 250-1000ml의 유체, 및 치료적 유효량 (예를 들어, 1 내지 100 mg/ml 또는 그 이상)의 항체 농축물을 포함할 수 있다. 복용량은 질병 유형 및 심각성에 따라 다를 수 있다. 환자에 대한 투여량은 환자의 크기, 체 표면적, 연령, 투여될 특정 화합물, 성별, 투여 기간 및 투여 경로, 일반적인 건강 상태 및 다른 동시 투여되는 의약품을 포함하는 여러 요인들에 의존한다는 것이 의료 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 전형적인 투여량은 예를 들어, 0.001-1000 ㎍ 범위이나, 특히 상기 언급된 파라미터가 주어지는 경우 상기 설명된 범위보다 낮거나 높은 투여량이 예상된다. 일일 비경구 투여 요법은 전체 체중에 대해 0.1 ㎍/kg 내지 100 ㎍/kg, 바람직하게는 0.3 ㎍/kg 내지 10 ㎍/kg, 보다 바람직하게는 1 ㎍/kg 내지 1 mg/kg, 더욱 더 바람직하게는 0.5 내지 10 mg/kg 체중/일이다. 치료 과정은 환자의 건강 상태를 정기적으로 평가하여 모니터링할 수 있다. 환자의 상태에 따라 며칠 또는 그 이상 반복 투여하는 경우, 치료는 원하는 반응이나 질병의 증상을 억제할 때까지 반복된다. 그러나, 본원에 기술되지 않은 또다른 투여 요법이 또한 적용될 수 있다. 바람직한 투여량은 단일 볼러스(bolus) 또는 다중 볼루스 투약에 의해, 또는 의사가 원하는 약동학적 분해(pharmacokinetic breakdown)에 따라 항체의 연속 주입에 의해 투여될 수 있다.
이와 같이 제안된 항체의 양은 상당량 치료자의 결정에 달려 있다. 의도된 효과는 적절한 용량과 요법을 선택하기 위한 핵심 요소이다. 여기에서 고려되는 인자는 치료할 특정 질병, 치료받을 특정 포유동물, 특정 환자의 임상 상태, 장애 원인, 항체 투여 부위, 특정 항체 유형, 투여 경로, 투여 요법 및 의학 분야에 알려진 기타 요인들이 있다.
항체 또는 그의 단편은 동결되거나 동결건조될 수 있으며, 적절하게 살균된 담체에 적용되기 전에 재구성될 수 있다. 동결 건조 및 재구성으로 인해 항체 활성이 약간 손실될 수도 있다. 이러한 손실을 보상하기 위해 복용량을 조정해야 할 수도 있다. 일반적으로, 6 내지 8의 pH가 약학 조성물에 바람직하다.
10. 제품
본 발명의 또 다른 실시 양태에서, 상기 기술된 장애 또는 상태의 치료 또는 예방에 유용한 물질을 포함하는 제품이 제공된다.
제조 물품은 라벨을 갖는 항체-함유 약학 조성물을 포함하는 용기 및 가능하게는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어, 바이알, 앰풀, 주사기 및 분석 튜브를 포함한다. 용기는 유리 또는 중합체 재료와 같은 복수의 재료로 제조될 수 있다. 상기 용기는 IL-6 매개 질환 또는 장애의 치료에 효과적인 본 발명의 조성물을 포함하며 멸균 접근 포트를 구비할 수 있다(예를 들어, 상기 용기는 정맥 내 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 조성물 중의 활성 성분은 본 발명의 항-IL-6R-항체이다. 용기에 부착된 라벨 또는 그에 부착된 포장 삽입물은 조성물이 원하는 질병을 치료하는데 사용됨을 나타낸다. 제품은 인산염 완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액과 같은 약학적으로 허용가능한 완충액을 갖는 제 2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 그것은 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 주사기 및 포장 삽입물을 포함하여 상업적 및 소비자 관점에서 바람직한 다른 물질을 더 포함할 수 있다.
11. 적용
본 발명에 따르면, 의약 제품의 제조를 위한 상기 항체 또는 그의 단편을 적용하는 것을 제공한다.
상기 의약품이 의약 조성물의 처방으로서 상기 열거된 질병의 치료 및/또는 진단에 사용되도록 의도되는 것이 바람직하다.
실시예
본 발명의 항체를 수득하고 시험하는 방법에 관한 일반적 설명
제 1 단계에서, 인간 인터루킨-6 수용체의 가용성 형태(sIL-6R), 즉 그의 α-서브 유닛에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 선택하였다. 이를 위해, 인간 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 기초로 하여 설계된 파지 라이브러리를 사용하였다. 파아지 라이브러리를 구축하기 위해, 1000명 이상의 공여자의 혈액으로부터 RNA 분자를 분리 및 정제하였으며, 이 중 공여자 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 유전자(분자)를 여러 단계에 걸친 역전사 및 PCR에 의해 합성하였다. 중쇄 및 경쇄의 결합 영역으로부터의 다양한 유전자 조합을 적절한 배향으로 박테리오파지 벡터에 삽입하고 하이브리드 파지 라이브러리를 생성하는데 사용하였다(도 4).
수득된 파지 라이브러리를 일시적인 CHO-T 세포 시스템에서 배양되고 IMAC BIORAD 흡수제 상의 배양 세포 유체로부터 정제한 인간 sIL-6R 단백질에서 선택하였다.
sIL-6R을 생성하는 세포를 pEE의 일시적인 배양을 위한 벡터내로 인간 인터루킨-6 수용체의 α서브 유닛 유전자를 재클로닝하고, 그 후 CHO-T 감염(transfection)을 수행하여 수득하였다.
생산 세포(producer cell)를 배양기에서 7-10일 동안 배양하였다.
단백질을 단일 단계로 정제하였다. 표적 단백질을 특정 항체(Human IL-6sR Detection antibody Part No. 840244 from Human IL-6sR DuoSet ELISA Development Kit 카탈로그 번호 : DY227 R&D System)를 사용한 웨스턴 블롯에 의해 규명하였다. 수득된 파지 라이브러리를 2 이상의 단계를 통해 선택하였다. 플라스틱 상에 고정된 sIL-6R에 특이적으로 결합하는 파지를 선택하였다. 그 결과, 박테리오파지 벡터가 분리된 sIL-6R에 결합하는 많은 파지를 수득하였다. 이들 벡터로부터, 단백질에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 유전자를 E.coli 원핵 세포에서 단백질 분자 합성용 발현 벡터로 증폭 및 재클론하였다. 수득한 세포를 플라스미드로 형질 전환하고 개별 폴리펩티드를 합성한 후, IL-6sR에 특이적으로 결합하고 리간드가 수용체에 결합하는 것을 차단하는 분자를 스크리닝 및 선택하였다. 수득된 단백질의 친화성 상수를 서로 비교하고 이미 전장 크기의 항체 발현을 위한 pEE 발현 벡터의 가장 성공적인 유전자에 삽입하였다. 차이니즈 햄스터 난소(CHO)의 부유 세포 배양액에서 항체를 배양하고 이를 정제한 후, 이들의 친화도를 평가하고 다양한 기능 세포 시험을 통해 인터루킨-6 신호가 차단되었음을 확인하였다. 수행된 연구 및 분석의 결과, sIL-6R에 특이적으로 결합하고 세포 검사에서 IL-6의 활성을 차단하는 하나의 항체 분자가 선택되었다. 이의 중쇄 및 경쇄 뉴클레오타이드 서열을 psX 벡터에서 재클론하여 안정적으로 항체를 생산하는 세포주를 얻었다. 이어서, 수득된 세포주를 이용하여 선택된 항체를 배양하였고, 이를 위한 정제 방법 및 보관 조건도 선택하였다. 우리는 수득한 의약품에 대한 전임상 연구를 설계하고 시작하였다.
실시예 1
포유 동물의 현탁 세포 배양으로 재조합 항원 및 항체의 생산
항체 및 항원을 중국 햄스터 난소 세포(CHO-K1 라인)로부터 수득된 일시적 세포주(transient cell line)의 세포에서 프로토콜에 따라 생성하였다. 현탁 배양은 Life Technologies Corporation사의 현탁 배양을 위한 무혈청 배지를 사용하여 제조사의 지시에 따라 궤도 쉐이커(orbital shaker)상의 플라스크에서 수행하였다. 과도적 발현 세포(transient expression cell)를 선형 폴리에틸렌이민(PEI "MAX" by "Polysciences")으로 형질감염시켰다. DNA/PEI 비율은 1 : 3 내지 1 : 10이었다. 형질감염후 7-10일에, 배양 배지를 2000g에서 20분동안 원심 분리하고 0.22㎛ 공극 크기의 필터를 통해 여과하였다. 아핀(affine) HPLC에 의해 배양액으로부터 표적 단백질을 분리하였다.
실시예 2
포유류의 현탁 세포 배양으로 항원 및 항체의 정제
단백질 C-말단에 6개의 His 아미노산을 포함하는 sil-6R 재조합 단백질을 Profinity IMAC Ni-충전 수지(Bio-Rad사)를 사용하여 배양 배지로부터 분리하고 정제하였다. 정제 전에 NiCl2의 농도가 1 mM이 될 때까지 배양액에 첨가하였다. 그후, Profinity IMAC Ni-충전 흡착제 용량의 1/200 내지 1/500 을 배양 배지에 첨가하고 실온에서 1시간동안 쉐이커에서 혼합했다. 그 다음, 흡착제를 5 또는 10ml 부피의 Thermoscientific Polypropylene 컬럼으로 옮기고 5mM 이미다졸과 0.3M 염화나트륨이 함유된 pH 8의 10mM 인산염 완충액 5 컬럼 부피로 씻어서 비특이적 결합성분을 씻어내었다. 결합된 항원은 0.3M 이미다졸 및 pH 8의 0.3M NaCl을 사용하여 용리하였다. 그 다음, 단백질을 Snake Skin Dialysis Tubing 기술을 사용하여 투석하여 PBS(pH 7.4)로 옮기고 여과(0.22μm)한 후, 튜브에 옮겼다. 튜브를 -70℃에 보관하였다. 수득된 용액의 순도를 SDS 겔 전기영동으로 평가하고, 특정 항-IL-6R 항체 및 접합 염소 항-인간 항체 항체(conjugated goat anti-human antibody antibodies)(도 1 및 2 참조)를 사용하여 웨스턴 블롯 기술로 동정하였다.
연구된 항-IL-6R 항체를 1 ml HiTrap rProteinA FF 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 정제하였다. 정화된 배양액을 인산염 완충 생리 식염수(PBS, pH 7.4)로 평형된 HiTrap rProtein A FF(GE Healthcare) 1 ml에 통과시켰다. 그 후, 컬럼을 5 컬럼 부피의 PBS로 세척하여 비특이적 결합성분을 제거하였다. 결합된 단백질ㅇ을 pH 3의 1M 글리신 완충액을 사용하여 용출하였다. 주요 용출 단백질 피크를 모으고 그 pH를 pH 8 1M Tris 완충액으로 중화시켰다. 모든 단계를 1ml/min의 유속으로 수행하였다. 그 다음, Snake Skin Dialysis Tubing 기술을 사용하여 투석하여 PBS(pH 7.4)로 옮기고 여과(0.22㎛)한 후 튜브에 옮기고, -70℃에 보관하였다. 수득된 단백질의 순도는 SDS 겔 전기 영동으로 평가하였다(도 7 및 도 8 참조).
재조합 IL6-H6-EPEA 리간드(C 말단에 6개의 히스티딘 및 EPEA-태그의 "펩티드 꼬리(peptide tail)"를 갖는 인터루킨-6)를 GE Healthcare C16/20 컬럼에서 5ml의 캡쳐 셀렉트 C-태그 친화성 매트릭스(Capture Select C-tag Affinity Matrix)로 정제하였다. 모든 단계는 5ml/min의 유속으로 수행하였다. 정화된 배양 배지를 인산 완충 식염수(PBS, pH 7.4)로 평형화시킨 칼럼을 통해 처리하였다. 그 다음 칼럼을 크로마토그래피 시스템 분광 광도계 신호가 비특이적 결합성분을 제거하기위한 평편기(plateau)에 도달할 때까지 PBS로 세척하였다. 결합 단백질을 20mM Tris 2M MgCl2 pH 7.1를 사용하여 용리하였다. Snake Skin Dialysis Tubing 기술을 사용하여 투석하여 주요 용리 단백질 피크를 수집하고 PBS(pH 7.4)로 옮겼다. 그 다음, 여과하고(0.22㎛) 튜브로 옮기 후, -70℃에 보관하였다. 수득된 용액의 순도를 SDS 겔 전기영동으로 평가하였다(도 3 참조).
실시예 3
인간 파지 항체의 Fab-라이브러리 선택
수정된 프로토콜(J Biol Chem., 1999. Jun. 25, 274(26): 18218-30)에 따라, sIL-6R에 특이적으로 결합하는 Fab-단편을 갖는 파지를 1011개 이상의 개별 클론을 포함하는 조합 파지 Fab-디스플레이 라이브러리 MeganLibTM(BIOCAD)로부터 분리하고, 인간 면역글로불린 유전자의 가변 도메인에 기초하여 합성하였다(도4). 이 라이브러리를 생성하기 위해 수천 명의 기증자의 림프구가 사용되었다. 상기 기재된 조건(NatBiotechnol.1996 Mar;14(3): 309-14; J Mol Biol.1991 Dec 5; 222(3): 581-97) 하에서 재조합 인간 sIL-6R-H6F에 대한 선택을 수행하였다. 패닝(panning)에 의한 선별을 수행하기 위해 인간 sIL-6R-H6 또는 sIL-6R-Fc를 4℃에서 50mM 탄산염 완충액(pH 9.5)에서 면역 튜브 EIA/RIA 고결합(Greineer bio-one)의 표면상에 밤새 흡착시켰다. PBST(PBS pH 7.4 및 0.1% Tween 20 v/V)로 튜브를 여러 번 세척한 후, 튜브 표면의 비어있는 단백질 결합 부위를 무지방 우유 용액(pH 7.4 PBST 내 0.5% m/V)으로 차단시켰다. 무지방 우유 용액을 1시간동안 튜브에서 배양하였다. 이어서, 튜브를 PBST 용액으로 세척하였다. 그 다음, MeganLibTM 파지 라이브러리를 파지의 최종 농도가 ml당 1013이 될 때까지 0.5%의 무지방 우유로 2 ~ 4 ml의 PBST 용액에서 희석시켰다. 준비된 라이브러리를 그 표면에 결합된 항원을 함유하는 튜브에 넣고 1시간동안 교반하면서 배양하였다. 결합되지 않은 파지는 PBST로 일련의 튜브 세척으로 제거하였다. 세척량을 제 1 라운드에서 제 3 라운드까지 각각 20-30-40 번으로 증가시켰다. 결합되어 남은 파지 입자는 0.1M Gly-HCl 용액(pH 2.2)으로 15분동안 교반하여 플라스크 튜브에서 용리하였다. 그 다음, 용액을 깨끗한 플라스틱 튜브로 옮기고 1M Tris-HCl(pH 8) 5:1로 중화시켰다. 이.콜라이 TG1 균주를 수득된 파지로 감염시키고, 파지를 증폭시켜 다음 선별주기에서 사용하였다.
실시예 4
박테리오파지 증폭
선택 후, 박테리오파지를 E.coli TG1 균주를 사용하여 배양하였다. 숙주 균주를 파지 배양물에 감염시키고 12-15시간동안 성장시킴으로써 증폭 반응을 수행하였다. 선택 후, 파지 용액을 E.coli TG1 성장 세포 배양액(OD600 = 0.3-0.4)과 혼합하고 37℃에서 1.5시간동안 배양하였다. 그 다음, 세포를 3000 ~ 4000 rpm으로 10 내지 15분동안 회전시키고, 2TY 배지 1ml에 재현탁하여 선택용 항생제(암피실린)를 사용하여 페트리 접시에서 부수었다. 콜로니를 30℃의 온도 조절 장치에서 밤새 성장시켰다. 12-15시간 후, 콜로니의 수를 계수하고, 2TY 배지 5 내지 10ml로 접시에서 세척하였다. 이를 위해, 100mcl의 세포 현탁액을 항생제(암피실린)가 포함된 2TY 배지 20ml에 첨가하고 37℃에서 OD600이 0.35-0.5가 될 때까지 쉐이커에서 성장시켰다. κ07 파지 헬퍼를 세포 현탁액에 최종 농도 1010 입자/ml(세포 현탁액 10 ㎖ 당 1mcl κ07 파지 헬퍼)로 첨가하고 가볍게 교반하면서 37℃에서 1.5시간동안 배양하였다. 그 다음, 1회 투여량의 암피실린(100㎍/㎖)과 2회 투여량의 카나마이신(60㎍/㎖) 및 2회 투여량의 IPTG(0.2mM)을 포함하는 균질한 용량의 배지를 세포 배양액에 첨가하였다. 플라스크를 쉐이커에 로딩하고 파지를 30℃에서 3 내지 5시간동안 배양하였다. 세포 배양물을 10,000rpm에서 20-30분간 원심분리하고 상등액을 튜브에 수집하였다. 그 후, 20%의 폴리에틸렌글리콜 및 2.5M의 염화나트륨을 함유하는 용액 부피의 1/6을 상등액에 첨가하고, 강하게 교반 하였다. 용액을 얼음에서 적어도 3시간동안 항온 배양하였다. 이어서, 용액을 8000g에서 10분간 원심분리하고, 파지를 포함하는 형성된 침전물을 1ml의 TBS 완충액으로 희석시켰다.
실시예 5
발현 플라스미드에서 다양한 가변 영역을 지닌 Fab 단편의 유전자 재클론
파생된 M13 파지의 파지 DNA(phagmid)를 세 번째 선택 후 E.coli TG1 세포로부터 분리하였다. 다양한 가변 영역을 갖는 Fab-단편의 유전자를 증폭하고 PCR 및 말단 특이적 프라이머를 사용하여 pll4 플라스미드로 재클론하였다. 유전자는 NheI, NotI 사이트에 의해 재클론되었다. 4개의 무작위 콜로니를 시퀀싱하여 삽입 여부를 검사하였다.
실시예 6
성장 세포 배지내 단백질 발현으로 E.coli BL21Gold 세포에서의 Fab 단편의 성장
수득된 유전자에 기초한 Fab 단편을 E.coli BL21Gold 세포에서 합성하였다. 2 및 3 라운드 선택후 파지 미드로부터 재클론된 Fab-단편의 유전자를 갖는 pLL4 발현 벡터를 E.coli BL21Gold의 발현 균주내로 형질 전환시켰다(표준 프로토콜에 따라 전기천공시킴). 세포를 2TY 배양 배지에서 선택적 항생제(카나마이신 30㎍/㎖, 암피실린 100㎍/㎖ 및 글루코스 0.2%)를 함유하는 진액 배지(agarized medium)(페트리 접시) 상으로 성장시켰다. 세포 역가가 개별 클론을 선택하기에 적합한 방식으로 세포를 성장시켰다. 콜로니를 30℃의 자동온도조절 장치로 14-16시간동안 성장시켰다. 특정 콜로니를 웰 당 100mcl의 2TY 배지(카나마이신 30㎍/ml, 암피실린 100㎍/ml 및 글루코스 0.4%)를 포함하는 96 웰 플레이트(U 형)로 재주입하고, 실온에서 16 내지 18 시간동안 800rpm의 쉐이커 상에서 성장시켰다. 세포 배양액을 2TY 배지(카나마이신 30㎍/ml, 암피실린 100㎍/ml 및 글루코스 0.1%, TX100 0.01% 및 IPTG 0.5mM) 100㎖를 포함하는 멸균된 96 웰 플레이트(V-모양) 상에 96-채널 리플리케이터를 통해 스크리닝하고, 실온에서 밤새 800rpm의 쉐이커 상에서 성장시켰다. 플레이트를 3500rpm에서 20분동안 원심 분리하고 ELISA용 Fab-단편이 있는 배지를 깨끗한 96 웰 플레이트(U 자형)에 수집하고, 플레이트를 -70 ℃에 저장하였다.
실시예 7
인간 IL-6sR-H6에 의한 특이적 결합의 Fab 스크리닝
ELISA를 사용하여 인간 IL-6sR-H6에 특이적으로 결합하는 Fab 단편을 선택 하였다. 재생한 Fab Actemra(tocilizumab)[US20110245473 seq.id 15 및 US20110245473 seq.id 16]을 양성 대조군으로 사용하였다. 특이적 결합을 스크리닝하기 위해, 96 웰 ELISA 플레이트를 사용하였다(NuncImmunoMaxisorp). IL-6sR-H6 항원 결합은 웰 표면에서 수행되었다. 이를 위해, 결합 카보네이트 완충액 내 IL-6sR-H6 용액(0.5㎍/ml) 50㎕를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 덮고 4℃에서 밤새 배양했다. 모든 후속 단계는 로봇 시스템 Genetix Qpix2xt(분자 장치) 및 Tecan Freedom EVO 200(Tecan)을 기반으로한 고효율 자동화 플랫폼을 사용하여 표준 ELISA 프로토콜에 따라 수행되었다. 다음날 플레이트 웰을 PBST로 5회 세척하였다. 비특이적 결합을 방지하기 위해 PBST 내 0.5% 무지방 우유인 웰 당 200㎕의 차단 완충액을 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간동안 쉐이커에서 인큐베이션하였다. PBST로 세척한 후, 시험 Fab를 함유하는 시험 세포 상등액과 블로킹 완충액의 1 : 1 혼합물 50㎕를 각 웰에 첨가하였다. Fab 용액을 함유하는 플레이트를 상온에서 1시간동안 쉐이커 상에서 배양하였다. 1시간 후, 플레이트 웰을 PBST로 5회 세척하였다. 그 다음, PBST 내 퍼옥시다제(Pierce ThermoScientific)(1:5000)를 함유하는 접합 염소(goat) 2차 항체 항-인간 Fab의 용액을 플레이트 웰에 첨가하였다(웰당 50mcl). 플레이트를 회전 쉐이커(실온에서 50분)에서 흔든 후, 상기한 바와 같이 PBST로 5 회 세척하였다. 비색계 신호(colorimetric signal)를 pH 5.5의 아세테이트 완충액 및 H2O2 0.02%(50ml/웰)에 ТМВ 기질 용액을 첨가하여 수득하였고, 포화 신호(평균 3-5분)가 수득될 때까지 항온배양한 후, 10% 황산 용액(30㎕/웰)을 첨가하여 반응을 종료하였다. Tecan-Sunrise 플레이트 판독기(Tecan)를 사용하여 450nm에서 신호를 측정했다. 항원에 결합된 Fab의 수는 등록된 신호에 비례하였다. 따라서 클론이 선택되었으며, 이 클론의 신호는 배경 신호를 5회 이상 초과했다. 이어서 선택된 Fab를 경합(competitive ELISA)에서 검사하여 IL6과 그 수용체 사이의 상호 작용을 차단하는 길항 Fab를 검출하였다. 최대 신호를 갖는 E.coli BL21Gold 세포 현탁액을 깨끗한 플레이트에 옮기고, -70℃에서 15% 글리세롤로 배양하였다.
실시예 8
IL-6 리간드와 IL-6R 수용체의 Fab-단편과의 상호 작용을 차단하는 경합 ELISA
경합 ELISA를 사용하여 이전에 선택된 Fab-단편의 인간 IL-6R에 특이적으로 결합하는 길항 능력을 확인하였다. 길항제의 양성 대조군으로서 우리는 항-IL-6R Fab 단편을 사용했다. 리간드 IL-6-EPEA를 탄산염 완충액 내 단백질 용액(1㎕/ml) 50ml 웰에 첨가하여 ELISA 플레이트(Maxisorp)상에 고정시켰다. 용액을 4℃에서 밤새 배양하였다. 모든 후속 단계는 GenetixQ-pix2xt 로봇 시스템 (MolecularDevice사) 및 TecanFreedom EVO 200(Tecan사)을 기반으로 한 고성능 자동화 플랫폼을 사용하여 표준 ELISA 기술에 따라 수행하였다. 비특이적 결합을 차단하기 위해 블로킹 완충액(웰 당 200mcl, PBST 내 비지방 우유 0.5%)을 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간동안 쉐이커 상에서 인큐베이션하였다.
이와 동시에, 조사된 항-IL-6R의 Fab-단편을 포함한 시험된 세포 상등액 각각 50mcl을 50 mcl의 IL-6sR-H6F 수용체 용액(PBST 내 1% 무지방 우유로 0.4㎍/ml)과 비-결합 96 웰플레이트에서 혼합하였다. 이를 37℃에서 1시간동안 쉐이커 상에서 500rpm으로 배양하였다.
블로킹 완충액을 고정화된 리간드 IL6으로 플레이트로부터 세척한 후, 항-IL-6R 및 IL-6sR 수용체의 Fab-단편의 전술한 반응 혼합물을 이들 플레이트에 옮겼다. 플레이트를 실온에서 45분동안 쉐이커에서 다시 배양한 다음, 플레이트를 PBST 완충액으로 5회 세척하였다. PBST 내 항-FLAG(FLAG 펩타이드는 IL-6sR-H6F 단백질상의 C-말단 펩티드임)의 마우스 항체를 첨가하고(50㎕/웰), 동일한 조건 하에서 45분동안 항온 배양하였다. 플레이트를 PBST 완충액으로 5회 세척한 후, PBST에 피어스(Pierce)사의 염소 항-마우스 퍼옥시다아제 접합 항체 제품을 첨가하였다(1:5000의 희석). 전과 같이 플레이트를 실온에서 45분동안 진탕기에서 배양한 다음 PBST 완충액으로 5회 세척하였다. 포화(평균 3-5 분)될 때까지 TMB 용액(50 mcl/웰)으로 비색 신호를 수득하였고, 10% 황산 용액(30mcl/웰)을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 색 신호는 Tecan-Sunrise 플레이트 판독기(Tecan사)를 사용하여 450nm 파장에서 측정하였다. 2차 접합 항체 결합 정도는 색 신호에 비례한다.
항 IL-6R의 조절된 Fab 단편 수준에서 신호 차단을 지시한 클론을 선택하여 추가분석하는 동안 사용하였다. 이 단계 후, 선택된 가변 도메인의 유전자를 AppliedBiosystems 3130 GeneticAnalyzer(AppliedBiosystems)의 표준 프로토콜에 따라 시퀀싱하고 분석했다.
실시예 9
항-IL-6R Fab의 비교 koff (kdis) 스크리닝
IL-6R 수용체에 특이적으로 결합하는 Fab 단편, 및 수용체와 그 리간드와의 상호 작용의 차단 여부를 수용체에 대한 친화성으로 서로 비교하였다. 항-IL-6R 후보 물질의 비교 koff(kdis) 스크리닝은 Octet Red 96 및 항-FABCH1 바이오센서 (Pall-ForteBio)를 사용하여 수행하였다(도 6). 바이오센서는 10 mM PBS 7.2-7.4, 0.1% Tween-20 및 0.1% BSA를 포함하는 러닝 완충액에서 재수화하였다. 10X 러닝 완충액의 1/10 부피를 항-IL-6R Fab-단편을 포함하는 E.coli 세포 성장 배지의 조사된 샘플에 첨가하고 혼합하였다. 그 다음, 항-FABCH1 바이오 센서를 4℃에서 12시간동안 Fab-단편을 포함하는 용액에 침지시켰다. 12시간 후, 표면 고정화된 Fab-단편을 갖는 센서를 러닝 완충액을 포함하는 웰로 옮겼으며, 기준선(60초)이 설정되었다. 그 후 센서를 항원/Fab-단편 복합체 결합(300초)을 달성하기 위해 분석물 용액(IL-6sR-H6F, 30㎍/ml)을 포함하는 웰에 옮겼다. 그 후, 센서를 추가적으로 해리(300초)하기 위해 작동 완충액을 구비한 웰로 복귀시켰다. 사용된 센서는 각 테스트 후에 재생될 수 있다: 재생 버퍼(Gly-HCl, рH 1.7)에 3회 위치시킨 후 추가 실험에 사용했다. 수득한 곡선을 1 : 1 상호 작용 모델을 갖는 표준 절차에 따라 OctetDataAnalysis(버전 7.0)를 사용하여 분석하였다.
항-IL-6R 후보의 koff 스크리닝의 결과를 표 1에 나타내었다. 인간 IL-6R과 모든 Fab-단편의 특이적 결합이 입증되었고, 최소 값을 갖는 후보군은 전장 크기의 항체를 얻기 위해 재클론되었다.
ForteBio에서 인간 인터루킨-6의 알파 서브 유닛과 항 IL-6R Fab 단편의 kdis 확인
번호 클론명 Koff ForteBio
대조군 Fab-단편 7,91E-04
1 > Il6R_CVKSel2_MMP1A4_14 7,63E-04
2 >Il6R_CVKSel2_MMP1A6_16 7,84E-04
3 >Il6R_CVKSel2_MMP1C12_165 1,27E-04
4 >Il6R_CVLSel2_MMP1G11_52 2,64E-04
5 >Il6R_CVLSel2_MMP1H6_113 6,37E-04
6 >Il6R_CVLSel2_MMP1H9_118 6,28E-04
7 >Il6R_CVLSel2_MMP1H10_119 6,50E-04
8 >Il6R_CVLSel2_MMP2A2_129 6,41E-04
9 >Il6R_CVLSel2_MMP2A4_133 1,05E-03
10 >Il6R_CVLSel2_MMP2A5_134 7,00E-04
11 >Il6R_CVLSel2_MMP2A8_143 6,89E-04
12 >Il6R_CVLSel2_MMP2B2_176 3,14E-04
13 >Il6R_CVLSel2_MMP2B3_177 5,81E-04
14 >Il6R_LVLSel2_MMP2C10_367 4,79E-04
실시예 10
Fab-단편으로부터 가변 도메인을 재클론함으로써 전장 IgG1 항체의 제작.
전장 길이의 IgG1 항체는 Fab 단편 배양을 위해 이전에 사용된 발현 플라스미드로부터 가변 도메인 유전자를 재클론함으로써 제작되었다. Clontech사의 In-Fusion®HD EcoDry™ CloningKit가 재클로닝에 사용되었다. 가변 도메인 유전자 삽입은 특정 프라이머를 사용한 PCR에 의해 수득되었고, PRC 내의 매트릭스 플라스미드는 DpnI 제한 효소로 처리하여 제거되었다. pEE 플라스미드 벡터는 경쇄에 대해서는 SalI 및 BsiWI 제한 효소의 제한에 의해 및 중쇄에 대해서는 SalI/NheI의 제한에 의해 선형화되었다. 유전자 삽입 및 선형화된 벡터를 10mcl의 물에서 혼합하고 In-Fusion 시스템의 개별 스트립 바이알에 옮겼다. 피펫팅으로 교반하였다. 스트립을 37℃에서 15분간, 50℃에서 15분간 배양한 후 얼음으로 옮겼다. 수득된 구조물의 반응 용량의 일부를 세포 형질 전환에 사용하였다. 수득한 클론으로부터 플라스미드를 추출하고 삽입물을 서열에 의해 확인하였다.
실시예 11
DS-1 세포 증식에 대한 항-IL-6R 항체로의 세포 억제 시험
DS-1 세포 성장은 세포외(extracellular) 외부 IL6 리간드의 존재에 의존하며, 세포 표면의 수용체에 대한 결합을 차단함으로써 세포 성장을 억제한다. DS-1 세포 배양물을 10% 불활화 태아 소 혈청, 1mM 피루브산 나트륨 및 7.5ng/ml의 IL6이 첨가된 RPMI-1640 배지에서 성장시켰다. 실험 전날 PBS로 세포를 IL6 잔기로부터 2회 세척하고, IL6을 첨가하지 않고 성장 배지에서 1000 세포/웰의 속도로 96 웰 플레이트에 플레이팅하였다. 다음날, 5ng/ml의 IL6을 첨가하여 전체 성장 배지에서 3개의 간격(spacing 3)을 갖는 20㎍/ml 범위의 항체 희석된 용액을 제조하였다. 그 다음, 세포를 고른 부피의 준비된 항체 용액에 첨가하였으며, 웰내 IL6 최종 농도는 2.5ng/ml이었고, 첫 포인트에서 항체의 농도는 10㎍/ml이었다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 3일간 배양하였다. 그 다음, FluoroskanAscent FL 2.5에서 AlamarBlue 생체 염색으로 살아 증식하는 많은 세포를 측정했다(도 9). 연구 결과에 따라, DS-1 세포 증식을 최대한 억제하는 항IL-6R 항체를 선택하였고, 따라서 이는 인터루킨-6의 막 수용체에 결합하여 리간드와 수용체의 결합을 차단한다.
실시예 12
HEK-Blue™ IL6 세포 배양에서의 STAT3 저해 분석
HEK-Blue IL6 세포 현탁액을 10%의 비활성화된 태아 소 혈청(세포 성장 배지)이 보충된 DMEM 배지에서 1 x 106 클론/ml의 농도로 제조하였다. 세포를 100mcl/웰(5 x 104 클론/웰)의 속도로 96 웰 플레이트에 도말하였다.
항체 희석된 용액을 세포 성장 배지에서 200 ㎍/ml의 범위로 3 개의 10 포인트 간격으로 제조하였고, 마지막 포인트는 항체가 없는 대조군이었다. 인간 IL6 용액을 4ng/ml의 농도로 세포 성장 배지에서 제조하였다. 그 다음, 희석된 항체 50mcl을 세포에 첨가하고 CO2 배양기에서 45분동안 배양하였다. 항체가 있는 세포에 50mcl의 IL6 용액을 첨가하고, 세포를 항체 및 IL6와 함께 CO2 배양기에 밤새 두어 항온배양하였다.
다음날 QUANTI-BlueTM 검출 매질을 준비하였다: 건조된 배지 1팩을 50ml의 정제수에 용해시키고 37℃의 수조에서 10분간 가열한 다음 0.22㎛ 필터로 여과하였다.
180mcl의 검출 매질을 갖는 각 웰에 20mcl의 배양 세포액을 첨가하고 2 내지 3시간동안 CO2 배양기에 두었다. 흡광도는 630nm의 파장에서 분광 광도계로 측정하였다(도 10).
실시예 13
인간 인터루킨-6 수용체와 그 오쏠로그(Orthologues)에 대한 BCD89 항체의 결합 친화 상수의 결정
선택된 항 IL-6R과 사이노몰거스(cynomolgus), 기니아 피그, 개 및 마우스의 인터루킨-6 수용체와의 상호 작용을 ELISA로 검사하였다(도 11 및 12). Octet Red 96(ForteBio)로 인간, 사이노몰거스, 기니아 피그, 개 및 마우스의 IL-6sR 알파 서브유닛에 대한 BCD89 항체의 결합 친화도 상수를 수득하였다. AR2G 센서의 제조 및 고정화에 대한 제조자의 지시에 따라 표준 프로토콜을 사용하여, BCD89를 제 2 세대(AR2G)의 아미노 반응성 센서의 표면 상에 비특이적으로 고정시켰다. 0.1% Tween-20 및 0.1% BSA를 포함하는 PBS를 작업 버퍼로 사용하여 30℃에서 분석하였다. 인간, 시노몰거스, 기니아 피그, 개, 토끼 및 마우스의 IL-6R의 적정을 126nM 내지 2nM의 농도에서 간격 2로 러닝 완충액을 사용하여 수행하였다.
기준 신호를 제외한 후, 결합 곡선을 표준 절차 및 1 : 1 상호 작용 모델에 따라 Octet Data 분석 소프트웨어(버전 7.0)를 사용하여 분석하였다. 그 결과를 표 2에 나타낸다.
알 수 있듯이, BCD89는 인간의 재조합 IL-6R 및 사이노몰거스의 IL-6sR에 높은 친화도로 결합한다(도 13, 도 14 참조). 더욱이, 후보군들은 인간과 비교하여 3배(3 order)만큼 더 낮은 상수로 기니아 피그 IL-6R과 상호 작용한다(도 16 참조). 마우스 수용체와의 상호 작용은 기록되지 않았다(도 15 참조).
Octet Red를 이용한 인간 및 다른 생물 수용체의 IL-6sR 수용체와 BCD89 후보군들의 상호 작용 분석
인간 sIL6R KD, M 시노몰거스 sIL6R KD, M 기니 피그 sIL6R KD, M 마우스 sIL6R KD, M
BCD-BCD-089 IgG1 6,63E-10 2,40E-09 3,06E-07 -
실시예 14
열 응력(Thermostress) 조건 하에서 BCD89 응집 안정성의 결정
조사된 시료를 10kDa/0.5ml(Millipore)의 AmiconUltra 원심 분리 필터의 한외 여과에 의해 5 mg/ml까지 농축하였다. 단백질 함량은 UV 분광 광도법에 의해 280nm 파장에서 측정하였다. 수득한 샘플 각각을 150mcl로 여러 부분으로 나누고 분리된 튜브로 옮겼다: 각 화합물 한 튜브를 4℃에서 보관하기 위해 냉장고에 넣고 다른 튜브는 튜브용 온도 조절기에 넣고 설정 시간동안 50℃로 온도 조절하였다.
가열 후, 튜브를 온도조절기에서 꺼내어 실온까지 냉각시키고, 13,000g에서 10분동안 원심분리하여 용액을 정제하고, 상등액을 UV 검출기로 겔 여과하여 제공하였다. 크로마토그램에서 전장 크기의 단백질 피크를 가열 전후에 분석하고, 크로마토그래피를 Agilent USA 1100 시리즈 M 크로마토그래프에서 수행했다. 컬럼Tosoh TSK-Gel G3000SWXL 7.8mm ID X 30cm 및 예비 컬럼 Tosoh TSK-Gel GuardSWXL 6mm ID X 4cm, 7mcm를 사용하였다. 유속은 0.7 ml/min, 시료 부피는 시료 농도 5 mg/ml에서 10mcl이었다. 검출기 파장은 220 및 280nm이었고, 용출 시간은 25분이었다(도 17).
내부 정규화 방법으로 계산을 수행하였다. 단량체 함량(Х)은 다음 공식에 의해 계산된다:
여기서 S1 - 단량체 피크 면적
ΣS - 모든 피크 영역의 합계.
계산하는 동안, 이동상 크로마토그램 및 처방된 완충 용액에 존재하는 피크는 무시하였다.
실시예 15
콜라겐 유도 관절염을 갖는 영장류 모델을 이용한 BCD-089 제품의 항-염증 활성 측정
이 연구는 콜라겐 유도성 관절염의 영장류 모델을 사용하여 시노몰거스 원숭이(Mnacaca fascicularis) 수컷에서 수행하였다. 실험에 참여한 동물의 총 수는 20마리였고, 각 그룹에는 4마리의 원숭이가 포함되었다. 실험에서 제품은 4개 투여량으로 사용되었다: 1.0mg/kg; 4.0mg/kg; 10.0㎎/㎏; 20.0㎎/㎏. 대조군의 동물에게는 위약을 투여하였다. 제품 및 위약의 투여는 콜라겐으로 예비 감작(preliminary sensitization)한 후에 시작하였다. 실험 도중, 모든 그룹의 동물을 측정하여 관절 표면 및 염증 영역의 백분율(PIA)을 계산하였고, 연구의 마지막에는 중수 지골과 중족 지간 관절을 사용하여 파괴적인 변화의 심각성을 평가했다. 동물을 5그룹으로 나누었다. 그룹의 이름은 표 3에 나와 있다.
항 염증 활성 연구 동물 그룹
그룹
번호		 동물
수량		 물질 투여 경로 투여량
1 4(♂) MAb against IL-6R s/c 1.0 mg/kg
2 4 (♂) 4.0 mg/kg
3 4 (♂) 10.0 mg/kg
4 4 (♂) 20.0 mg/kg
5 4 (♂) 위약 -
관절염 유도를 위해, 소 유형 II 콜라겐(Sigma)의 에멀전을 동물에게 3회 투여했다.
콜라겐의 첫 투여: 총 콜라겐 양은 실험 동물 한 마리당 2mg이었다. 이를 위해, 2mg의 콜라겐을 0.1M 아세트산 0.7ml에 용해시켰다. Freund의 불완전 보조제 0.7ml를 이 용액에 첨가하였다.
콜라겐을 처음 투여한 후 28일동안 동물을 유지하였다.
콜라겐의 두 번째 투여: 총 콜라겐 양은 실험 동물 한 마리 당 3mg이었다. 이를 위해 콜라겐 3mg을 0.1M 아세트산 1.0ml에 용해시켰다. 이 용액에 Freund의 불완전 보조제(incomplete adjuvant) 1.0ml를 첨가하였다.
콜라겐의 두 번째 투여 후 동물을 21일동안 유지하였다.
콜라겐 3 차 투여: 총 콜라겐 양은 실험 동물 한 마리 당 3mg이었다. 이를 위해 콜라겐 3mg을 0.1M 아세트산 1.0ml에 용해시켰다. Freund의 불완전 보조제 1.0ml를 이 용액에 첨가하였다.
관절의 크기를 측정하는 것은 다음과 같은 시점에서 캘리퍼와 함께 수행되었다:
- 콜라겐의 첫 투여 전
- 콜라겐 2차 투여시
- 매주 콜라겐 2차 투여 후 7 주간 콜라겐 투여 직전
측정 과정에서 관절의 종축과 횡축의 양이 측정되었다. 엄지를 제외한 모든 중수 지간 관절과 중족 지간 관절에 대해 이 절차를 시행하였다. 공식에 따라 면적 계산을 수행되었다.
JA = 종 방향 축의 값 × 횡축의 값 × 3.14 × 0.25.
각 동물의 16개 관절에 대한 데이터는 염증 부위의 백분율(PIA) 값을 계산하는데 사용되었다. 다음 공식에 따라 계산을 수행하였다.
PIA = (실험 당일의 JA 값 × 100)/(관절염 유도 전의 JA 평균값)(도 18).
실시예 16
붉은털 원숭이(Rhesus Monkeys)에서 단일 피하 투여 후 BCD-089 제품의 독성 및 약물 동태 학(Toxicokinetics) 연구
이 연구는 붉은털 원숭이 12 마리에게서 수행되었다. 동물을 4그룹으로 나누었다. 그룹의 이름은 표 4에 나와 있다.
독물 동력학 연구에 사용된 동물 그룹
그룹
번호		 동물
수량		 물질 투여 경로 투여량
1 3 (♂) MAb against IL-6R s/c 2.0 ㎎/㎏
2 3 (♂) MAb against IL-6R 10.0 ㎎/㎏
3 3 (♂) MAb against IL-6R 50.0 mg/kg
4 3 (♂) 위약 -
실험 중 다음 매개 변수를 평가했다.
- 임상 시험의 결과
- 동물 무게 (투여 전 및 실험 8, 15, 22, 29, 36, 43일차);
- 체온 (투여 전, 투여 후 1, 2, 4, 6, 24시간 후, 실험 8, 15, 22, 29, 36, 43일차);
- 소변 검사 (투여 전 및 실험 8, 15, 22, 29, 36, 43일차);
- 적혈구 수, 백혈구 수, 헤모글로빈 농도 (투여 전 및 실험 8, 15, 22, 29, 36, 43일차)에 대한 완전한 혈액 분석
- 하기 요소에 대한 혈청의 생화학적 분석: 락테이트 탈수소효소, 총 빌리루빈(total bilirubin), 총 단백질, 글루코스, 아스파테이트, 아미노전이효소, 알라닌 아미노전이효소 (투여 전 및 실험 8, 15, 22, 29, 36, 43일차)
- 영장류의 혈청에서의 조제 농도 검사 (투여 전, 및 투여 후 0.5, 1, 3, 6, 24, 30, 48, 72, 96, 120, 192, 264, 408, 504, 720, 912 및 1032시간).
실시예 17
시노몰거스 원숭이에서 1개월동안 다중 피하 투여 후 2주간의 비투여시에 대한 독성 연구
1달동안 여러 번 피하 투여한 후 2주동안 회복 기간을 거친 독성에 대한 연구가 관련동물종인 cynomolgus monkeys에서 수행되었다. 이 실험에서는 3회 투용량 수준을 사용하였다. 실험 그룹에 대한 계획은 표 5에 나와 있다.
다중 투여 후 독성 연구 동물 그룹
그룹 번호 동물 수 물질 투여 경로 투여량
1 3 (♂) MAb against IL-6R s/c 4.0 mg/kg
3 (♀)
2 3 (♂) MAb against IL-6R 15.0 mg/kg
3 (♀)
3 3 (♂) * MAb against IL-6R 40.0 mg/kg
3 (♀) *
3 (♂)
3 (♀)
4 3 (♂) 위약 -
3 (♀)
실험 중 다음 매개 변수를 평가했다.
- 임상 시험의 결과
- 동물 무게 (투여 전 및 매주)
- 체온 (투여 전, 실험 종료까지 매주);
- 폴리-스펙트럼 심전도에 의해 평가된 심장의 생체전기 활성에 기초한 심혈관 시스템에 대한 효과: 투여 전과 3, 5, 7주에 평가하였다.
- 소변 검사 (투여 전 및 실험 3, 5, 7주);
- 하기 파라미터에 대한 완전한 혈액 분석 실험: 적혈구 수, 백혈구 수, 헤모글로빈 농도, 림프구 수, 단구 수, 호중구 수, 호산구 수, 호염기구 수, 혈소판 수 (투여 전, 및 실험의 첫 주를 시작으로 매주 1 회);
- 하기 파라미터에 대한 혈액 응고 시스템에 대한 효과 평가: 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간, 피브리노겐 농도, 프로트롬빈 시간 : 제품 투여 전, 및 다음 실험 3, 5, 7주차에 수행;
- 하기 파라미터에 대한 혈청의 생화학적 분석: 나트륨, 칼륨, 크레아티닌, 요소, 알칼리성 인산가수분해효소(phosphotase), 락테이트 탈수소효소, 총 빌리루빈, 총 단백질, 포도당, 트리글리세리드, 아스파테이트 아미노전이효소, 알라닌 아미노전이효소, 총 콜레스테롤 (투여 전 및 실험 3, 5, 7주);
- 투여 기간의 마지막에, 최대 투여량의 동물 위성군을 안락사시키고, 그 병형을 조사하였다. 최대 투여량 및 대조군 그룹의 동물에 대한 연구를 종료하였다.
- 독성 연구의 일환으로 제품의 국소 자극 효과도 평가되었으며, 주사 부위 근처의 연조직을 선택하여 조직학적 검사를 실시했다.
실시예 18
시노몰거스 원숭이에서 4주 내에 BCD-089 제품의 다중 피하 투여 후 면역원성에 관한 연구
1개월동안 여러 번 피하 투여한 후 2주간 회복 기간을 가진 경우의 면역원성을 적절한 동물-시노몰거스 원숭이에서 수행했다. 이 실험에서 3회 투여량 수준을 사용하였다. 실험 그룹에 대한 계획은 아래 표에 나와 있다.
면역원성 연구의 동물 그룹
그룹 넘버 동물 수 물질 투여 경로 투여량
1 3 (♂) MAb against IL-6R s/c 4.0 mg/kg
3 (♀)
2 3 (♂) MAb against IL-6R 15.0 mg/kg
3 (♀)
3 3 (♂) MAb against IL-6R 40.0 mg/kg
3 (♀)
면역원성의 평가는 결합 항체 수준에 기초하여 수행되었고, 이를 위해 제품 투여 전 및 실험 3, 5, 7주차에 혈액 샘플을 하기 혈청 분리를 통해 수집하였다.
실시예 19
시노몰거스 원숭이에서 1개월 내 BCD-089 제품의 다중 피하투여 후 약물동태학에 관한 연구
1 달동안 다중 피하 투여한 후 2주동안 회복 기간을 가진 경우의 약물동태학에 대한 연구를 관련 동물종인 시노몰거스 원숭이에서 수행하였다. 이 실험에서 3 회 투여량 수준을 사용하였다. 실험 그룹에 대한 계획은 표 7에 나와 있다.
다중 투여 후 약물동태학 연구에 사용된 동물 그룹
그룹 번호 동물 수 물질 투여 경로 투여량
1 3 (♂) MAb against IL-6R s/c 4.0 mg/kg
3 (♀)
2 3 (♂) MAb against IL-6R 15.0 mg/kg
3 (♀)
3 3 (♂) MAb against IL-6R 40.0 mg/kg
3 (♀)
영장류의 혈청에서의 제품 수준의 변화를 평가하기 위해, 실험 시작 전, 및 실험 1, 2, 8, 9, 15, 16, 22, 23, 29, 36 및 43일에 혈액 샘플을 수집했다.
실시예 20
1달간 다중 피하투여 후 2주간 회복 기간을 가진 경우 BCD-089 제품 면역 독성에 대한 연구
1 달동안 다중 피하 투여한 후 2주동안 회복 기간을 가진 경우의 면역독성에 대한 연구를 관련 동물종인 시노몰거스 원숭이에서 수행하였다. 이 실험에서 3 회 투여량 수준을 사용하였다. 실험 그룹에 대한 계획은 표 에 나와 있다.
면역 독성 연구 동물 그룹
그룹 번호 동물 수 물질 투여 경로 투여량
1 3 (♂) MAb against IL-6R s/c 4.0 mg/kg
3 (♀)
2 3 (♂) MAb against IL-6R 15.0 mg/kg
3 (♀)
3 3 (♂) MAb against IL-6R 40.0 mg/kg
3 (♀)
4 3 (♂) 위약 -
3 (♀)
실험 중 다음 매개 변수를 평가했다.
- 림프구의 부분집단(subspopulation) 조성을 제제 투여 전, 및 실험 2, 4, 6주차에 평가하였다.
- 면역글로불린 클래스의 비율을 투여 전과 2, 4, 6주에 평가하였다.
- 식균 작용에 대한 효과를 투여 전과 2, 4, 6에 평가하였다.
실시예 21
약학 조성물의 수득.
BCD089 항체를 농도가 180mg/ml가 될 때까지 적절한 완충액으로 옮기고, 수득된 용액을 여과하고(멸균 여과), 주사기 내로 흡입하였다.
SEQUENCE LISTING <110> JSC BIOCAD <120> ANTIBODY OR AN ANTIGEN-BINDING FRAGMENT THEREOF CAPABLE OF BINDING TO A HUMAN RECEPTOR OF INTERLEUKIN-6 <150> RU2016133720 <151> 2016-08-17 <160> 10 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gly Ile Tyr Ser Asp Gly Thr Thr His Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gly Ala Gly Pro Thr Trp Trp Tyr Ala Leu Asp Ala 1 5 10 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Ser Ala Ser Asn Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Tyr Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gln Gln Ala Tyr Arg Ala Pro Val Thr 1 5 <210> 7 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Tyr Ser Asp Gly Thr Thr His Tyr Gly Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Gly Ala Gly Pro Thr Trp Trp Tyr Ala Leu Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Ile Asp Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Ser Ala 20 25 30 Ser Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Gln Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr 85 90 95 Arg Ala Pro Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 9 <211> 450 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Tyr Ser Asp Gly Thr Thr His Tyr Gly Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Gly Ala Gly Pro Thr Trp Trp Tyr Ala Leu Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile 245 250 255 Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 10 <211> 218 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Ile Asp Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Ser Ala 20 25 30 Ser Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Gln Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr 85 90 95 Arg Ala Pro Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

Claims (25)

  1. 결합 도메인을 포함하는, 인간 인터루킨-6(IL-6) 수용체에 결합하는 능력을 갖는 항체 또는 그 항원-결합 단편으로서,
    상기 결합 도메인은
    서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 각각 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로서 포함하는 중쇄 서열; 및
    서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열을 각각 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로서 포함하는 경쇄 서열
    을 포함하는, 항체 또는 그 항원-결합 단편.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 결합 도메인이 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 또는 그 항원-결합 단편.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 서열 번호 9의 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 또는 그 항원-결합 단편.
  8. 제1항에 있어서, 서열 번호 10의 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 또는 그 항원-결합 단편.
  9. 제1항에 있어서,
    서열 번호 9의 서열을 갖는 중쇄, 및
    서열 번호 10의 서열을 갖는 경쇄
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 또는 그 항원-결합 단편.
  10. 제1항에 있어서, 하기 인간 이소타입: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 중 하나와 관련되어 있는 것을 특징으로 하는, 항체 또는 그 항원-결합 단편.
  11. 제1항에 있어서, IgG1 이소타입의 Fc 불변 영역이 E233P, L234A, L235A, E236P, L237V 및/또는 L238A 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 또는 그 항원-결합 단편.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 제1항, 제5항, 및 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그 항원-결합 단편을 코딩하는 분리된 핵산 분자.
  17. 제16항에 따른 분리된 핵산 분자를 하나 이상 포함하는 발현 벡터.
  18. 제1항, 제5항, 및 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그 항원-결합 단편을 코딩하는 분리된 핵산 분자; 또는
    제1항, 제5항, 및 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그 항원-결합 단편을 코딩하는 분리된 핵산 분자를 하나 이상 포함하는 발현 벡터
    를 세포 내에 포함하는 세포주.
  19. i) 제1항, 제5항, 및 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그 항원-결합 단편을 코딩하는 분리된 핵산 분자; 또는 제1항, 제5항, 및 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그 항원-결합 단편을 코딩하는 분리된 핵산 분자를 하나 이상 포함하는 발현 벡터를 세포 내에 포함하는 세포주
    를 상기 항체 또는 그 항원-결합 단편을 생산하기에 충분한 조건하에 배양 배지에서 배양하는 단계; 및
    ii) 수득된 항체 또는 그 항원-결합 단편을 분리 및 정제하는 단계
    를 포함하는, 제1항, 제5항, 및 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그 항원-결합 단편의 제조 방법.
  20. 제1항, 제5항, 및 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그 항원-결합 단편의 유효량, 및
    하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체
    를 포함하는, 약학 조성물로서,
    상기 약학 조성물은 인터루킨-6(IL-6)의 효과와 관련된 질환 또는 상태 치료용 또는 IL-6의 바람직하지 않은 효과와 관련된 증상의 제거 또는 완화용 조성물이고,
    상기 질환 또는 상태 또는 증상이
    류마티스성 관절염, 골관절염, 청소년 만성 관절염, 패혈증성 관절염, 라임 관절염, 건선 관절염, 반응성 관절염, 척추 관절병증(spondyloarthropathy), 전신 홍반성 루푸스, 크론병, 궤양성 대장염, 염증성 장 질환, 인슐린 의존성 진성 당뇨병, 갑상선염, 천식, 알레르기성 질환, 건선, 아토피성 피부염, 경피증, 이식편 대 숙주(graft versus host), 장기 이식 거부, 장기 이식과 관련된 급성 또는 만성 면역 질환, 유육종증, 가와사키 병, 그레이브스 병, 신장 증후군, 만성 피로 증후군, 베게너 육아 종증, 헤노크-쉔레인 자반병(Henoch-Schoenlein purpurea), 신장의 미세한 혈관염, 만성 활동성 간염, 포도막염, 복막염 쇼크, 독성 쇼크 증후군, 패혈증 증후군, 악액질, 후천성 면역 결핍 증후군, 급성 횡성 척수염, 헌팅톤 무도병, 파킨슨 병, 알츠하이머 병, 뇌졸중, 원발성 담즙성 경화증, 용혈성 빈혈, 성인(급성) 호흡 곤란 증후군, 탈모증, 탈모증 아레아타(alopecia areata), 혈청음성성 관절병증, 관절병증, 라이타병, 건선성 관절염, 궤양성과 관련된 건선성 관절염, 아토피성 알레르기, 자가 면역성 수포성 장애, 불가리스 천포창(pemphigus vulgaris), 낙엽상 천포창(pemphigus foliaceous), 천포창, 선형 lgA 병, 자가 면역 용혈성 빈혈, 궤양 양성 용혈성 빈혈, 후천성 악성 빈혈, 청소년성 악성 빈혈, 동맥염, 원발성 경화성 간염, 기원성 자가 면역성 간염, 기원성 섬유성 폐포염, 염증후 간질성 폐질환, 간질성 폐렴, 만성 호산구성 폐렴, 감염된 간질성 폐 질환, 통풍성 관절염, 자가 면역 간염, 유형-1 자가 면역 간염(고전적 자가 면역 또는 루푸이드 간염), 유형-2 자가 면역 간염, 골관절염, 원발성 경화성 담관염, 건선 유형 1, 건선 유형 2, 특발성 백혈구 감소증, 자가 면역 중성 백혈병, 신장 질환 NOS, 사구체 신염, 신장의 미세한 혈관염, 원반 모양 홍반성 루푸스, 남성 불임 특발성 또는 남성 불임 NOS, 정자의 자가 면역, 다발성 경화증(모든 아형), 교감 신경 안검, 결합 조직 질환에 이차적인 폐 고혈압, 굿파져 증후군(Goodpasture's syndrome), 결절 다발 동맥염의 폐 증상, 급성 류마티스 열, 류마티스 척추염, 스틸 질병(Still's disease), 전신 경피증, 쇼그렌그 증후군(Sjorgren's syndrome), 타카야스 병/동맥염, 자가 면역 혈소판 감소증, 특발성 혈소판 감소증, 자가 면역 갑상선 질환, 갑상선 기능 항진증, 염증성 자가 면역 갑상선 기능 저하증(하시모토 병), 위축성 자가 면역 갑상선 기능 저하증, 일차성 색소 부종, 수정체성(phacogenic) 포도막염, 원발성 혈관염, 비티리고병(vitiligo), 급성 간 질환, 만성 간 질환, 알레르기 및 천식, 정신 장애(우울증 및 정신분열증 포함), Th2 유형 및 Th1 유형 매개 질병, 결막염, 알레르기성 접촉성 피부염, 알레르기성 비염, 알파-1-항 트립신 결핍증, 근 위축성 측삭 경화증, 빈혈증, 낭포성 섬유증, 사이토킨 요법 관련 장애, 말이집탈락(demyelinating) 질병, 피부염, 홍채 모양체염, 포도막염, 시신경염, 허혈-재관류 손상, 허혈성 뇌졸중, 유년기 류마티스 관절염, 자가 면역 장병증, 자가 면역 청력 상실, 자가 면역 림프 증식 증후군, 자가 면역성 심근염, 자가 면역 조기 난소 부전, 및 안염
    으로 이루어진 군에서 선택되는 질병 또는 질환으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는,
    약학 조성물.
  21. 삭제
  22. 제20항에 있어서, 비경구 투여용 용액인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  23. 제20항에 있어서, 동결 건조된 분말인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  24. 제1항, 제5항, 및 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    인터루킨-6(IL-6)의 효과와 관련된 질환 또는 상태 치료용 약제의 제조에 사용하기 위한 것으로서,
    상기 질환 또는 상태는
    류마티스성 관절염, 골관절염, 청소년 만성 관절염, 패혈증성 관절염, 라임 관절염, 건선 관절염, 반응성 관절염, 척추 관절병증(spondyloarthropathy), 전신 홍반성 루푸스, 크론병, 궤양성 대장염, 염증성 장 질환, 인슐린 의존성 진성 당뇨병, 갑상선염, 천식, 알레르기성 질환, 건선, 아토피성 피부염, 경피증, 이식편 대 숙주(graft versus host), 장기 이식 거부, 장기 이식과 관련된 급성 또는 만성 면역 질환, 유육종증, 가와사키 병, 그레이브스 병, 신장 증후군, 만성 피로 증후군, 베게너 육아 종증, 헤노크-쉔레인 자반병(Henoch-Schoenlein purpurea), 신장의 미세한 혈관염, 만성 활동성 간염, 포도막염, 복막염 쇼크, 독성 쇼크 증후군, 패혈증 증후군, 악액질, 후천성 면역 결핍 증후군, 급성 횡성 척수염, 헌팅톤 무도병, 파킨슨 병, 알츠하이머 병, 뇌졸중, 원발성 담즙성 경화증, 용혈성 빈혈, 성인(급성) 호흡 곤란 증후군, 탈모증, 탈모증 아레아타(alopecia areata), 혈청음성성 관절병증, 관절병증, 라이타병, 건선성 관절염, 궤양성과 관련된 건선성 관절염, 아토피성 알레르기, 자가 면역성 수포성 장애, 불가리스 천포창(pemphigus vulgaris), 낙엽상 천포창(pemphigus foliaceous), 천포창, 선형 lgA 병, 자가 면역 용혈성 빈혈, 궤양 양성 용혈성 빈혈, 후천성 악성 빈혈, 청소년성 악성 빈혈, 동맥염, 원발성 경화성 간염, 기원성 자가 면역성 간염, 기원성 섬유성 폐포염, 염증후 간질성 폐질환, 간질성 폐렴, 만성 호산구성 폐렴, 감염된 간질성 폐 질환, 통풍성 관절염, 자가 면역 간염, 유형-1 자가 면역 간염(고전적 자가 면역 또는 루푸이드 간염), 유형-2 자가 면역 간염, 골관절염, 원발성 경화성 담관염, 건선 유형 1, 건선 유형 2, 특발성 백혈구 감소증, 자가 면역 중성 백혈병, 신장 질환 NOS, 사구체 신염, 신장의 미세한 혈관염, 원반 모양 홍반성 루푸스, 남성 불임 특발성 또는 남성 불임 NOS, 정자의 자가 면역, 다발성 경화증(모든 아형), 교감 신경 안검, 결합 조직 질환에 이차적인 폐 고혈압, 굿파져 증후군(Goodpasture's syndrome), 결절 다발 동맥염의 폐 증상, 급성 류마티스 열, 류마티스 척추염, 스틸 질병(Still's disease), 전신 경피증, 쇼그렌그 증후군(Sjorgren's syndrome), 타카야스 병/동맥염, 자가 면역 혈소판 감소증, 특발성 혈소판 감소증, 자가 면역 갑상선 질환, 갑상선 기능 항진증, 염증성 자가 면역 갑상선 기능 저하증(하시모토 병), 위축성 자가 면역 갑상선 기능 저하증, 일차성 색소 부종, 수정체성(phacogenic) 포도막염, 원발성 혈관염, 비티리고병(vitiligo), 급성 간 질환, 만성 간 질환, 알레르기 및 천식, 정신 장애(우울증 및 정신분열증 포함), Th2 유형 및 Th1 유형 매개 질병, 결막염, 알레르기성 접촉성 피부염, 알레르기성 비염, 알파-1-항 트립신 결핍증, 근 위축성 측삭 경화증, 빈혈증, 낭포성 섬유증, 사이토킨 요법 관련 장애, 말이집탈락(demyelinating) 질병, 피부염, 홍채 모양체염, 포도막염, 시신경염, 허혈-재관류 손상, 허혈성 뇌졸중, 유년기 류마티스 관절염, 자가 면역 장병증, 자가 면역 청력 상실, 자가 면역 림프 증식 증후군, 자가 면역성 심근염, 자가 면역 조기 난소 부전, 및 안염
    으로 이루어진 질병 또는 질환으로부터 선택되는,
    항체 또는 그 항원-결합 단편.
  25. 제20항에 있어서, 인터루킨-6(IL-6)의 효과와 관련된 질환 또는 상태 치료용 약제의 제조에 사용하기 위한 것으로서,
    상기 질환 또는 상태는
    류마티스성 관절염, 골관절염, 청소년 만성 관절염, 패혈증성 관절염, 라임 관절염, 건선 관절염, 반응성 관절염, 척추 관절병증(spondyloarthropathy), 전신 홍반성 루푸스, 크론병, 궤양성 대장염, 염증성 장 질환, 인슐린 의존성 진성 당뇨병, 갑상선염, 천식, 알레르기성 질환, 건선, 아토피성 피부염, 경피증, 이식편 대 숙주(graft versus host), 장기 이식 거부, 장기 이식과 관련된 급성 또는 만성 면역 질환, 유육종증, 가와사키 병, 그레이브스 병, 신장 증후군, 만성 피로 증후군, 베게너 육아 종증, 헤노크-쉔레인 자반병(Henoch-Schoenlein purpurea), 신장의 미세한 혈관염, 만성 활동성 간염, 포도막염, 복막염 쇼크, 독성 쇼크 증후군, 패혈증 증후군, 악액질, 후천성 면역 결핍 증후군, 급성 횡성 척수염, 헌팅톤 무도병, 파킨슨 병, 알츠하이머 병, 뇌졸중, 원발성 담즙성 경화증, 용혈성 빈혈, 성인(급성) 호흡 곤란 증후군, 탈모증, 탈모증 아레아타(alopecia areata), 혈청음성성 관절병증, 관절병증, 라이타병, 건선성 관절염, 궤양성과 관련된 건선성 관절염, 아토피성 알레르기, 자가 면역성 수포성 장애, 불가리스 천포창(pemphigus vulgaris), 낙엽상 천포창(pemphigus foliaceous), 천포창, 선형 lgA 병, 자가 면역 용혈성 빈혈, 궤양 양성 용혈성 빈혈, 후천성 악성 빈혈, 청소년성 악성 빈혈, 동맥염, 원발성 경화성 간염, 기원성 자가 면역성 간염, 기원성 섬유성 폐포염, 염증후 간질성 폐질환, 간질성 폐렴, 만성 호산구성 폐렴, 감염된 간질성 폐 질환, 통풍성 관절염, 자가 면역 간염, 유형-1 자가 면역 간염(고전적 자가 면역 또는 루푸이드 간염), 유형-2 자가 면역 간염, 골관절염, 원발성 경화성 담관염, 건선 유형 1, 건선 유형 2, 특발성 백혈구 감소증, 자가 면역 중성 백혈병, 신장 질환 NOS, 사구체 신염, 신장의 미세한 혈관염, 원반 모양 홍반성 루푸스, 남성 불임 특발성 또는 남성 불임 NOS, 정자의 자가 면역, 다발성 경화증(모든 아형), 교감 신경 안검, 결합 조직 질환에 이차적인 폐 고혈압, 굿파져 증후군(Goodpasture's syndrome), 결절 다발 동맥염의 폐 증상, 급성 류마티스 열, 류마티스 척추염, 스틸 질병(Still's disease), 전신 경피증, 쇼그렌그 증후군(Sjorgren's syndrome), 타카야스 병/동맥염, 자가 면역 혈소판 감소증, 특발성 혈소판 감소증, 자가 면역 갑상선 질환, 갑상선 기능 항진증, 염증성 자가 면역 갑상선 기능 저하증(하시모토 병), 위축성 자가 면역 갑상선 기능 저하증, 일차성 색소 부종, 수정체성(phacogenic) 포도막염, 원발성 혈관염, 비티리고병(vitiligo), 급성 간 질환, 만성 간 질환, 알레르기 및 천식, 정신 장애(우울증 및 정신분열증 포함), Th2 유형 및 Th1 유형 매개 질병, 결막염, 알레르기성 접촉성 피부염, 알레르기성 비염, 알파-1-항 트립신 결핍증, 근 위축성 측삭 경화증, 빈혈증, 낭포성 섬유증, 사이토킨 요법 관련 장애, 말이집탈락(demyelinating) 질병, 피부염, 홍채 모양체염, 포도막염, 시신경염, 허혈-재관류 손상, 허혈성 뇌졸중, 유년기 류마티스 관절염, 자가 면역 장병증, 자가 면역 청력 상실, 자가 면역 림프 증식 증후군, 자가 면역성 심근염, 자가 면역 조기 난소 부전, 및 안염
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