TWI832013B - 一種抗pd-l1抗原結合蛋白及其應用 - Google Patents

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Abstract

本申請涉及一種PD-L1抗原結合蛋白，其能夠以1×10-8M或更低的KD值結合源自靈長類動物的PD-L1。該抗原結合蛋白能夠阻斷PD-1和CD80與PD-L1的結合，刺激免疫細胞中細胞因子的分泌，能夠抑制腫瘤生長和/或腫瘤細胞增殖。本申請還提供了一種融合蛋白，其包括人TGFBRII或其片段和該抗原結合蛋白。本申請還提供了該抗原結合蛋白和/或該融合蛋白在預防和治療腫瘤或癌症中的應用。

Description

一種抗PD-L1抗原結合蛋白及其應用
本申請涉及生物醫藥領域，具體的涉及一種抗PD-L1抗原結合蛋白及其應用，以及一種抗PD-L1和抗TGFB的融合蛋白及其應用。
程式性死亡受體配體1(PD-L1)，也稱為分化簇274(CD274)或B7同源蛋白1(B7-H1)，是一個40KDa的I型跨膜蛋白，一般在活化的T細胞、B細胞、單核細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞及許多非造血細胞上表達。
PD-L1能與程式性死亡受體1(PD-1)和B7-1(CD80)結合。其中PD-L1/PD-1信號通路是免疫反應中非常重要的共抑制信號途徑，負調節T細胞免疫應答，抑制T細胞活性，減弱細胞因子的分泌。研究發現PD-L1能在許多腫瘤組織中表達，包括胃癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、結腸癌、肥大細胞性腫瘤以及惡性黑色素瘤等，以及在浸潤腫瘤微環境的骨髓細胞中表達，保護腫瘤細胞逃避免疫攻擊。轉化生長因子-B(TGFB)是對免疫系統有顯著影響的強效細胞因子，參與許多增殖性和非增殖性細胞過程，如細胞增殖和分化、胚胎發育、細胞外基質形成、骨骼發育、傷口癒合、造血作用以及免疫和炎症反應。現有治療技術手段無論是化學療法或是腫瘤靶向療法，影響其療效的一個重要 瓶頸是腫瘤細胞產生免疫耐受。腫瘤細胞在腫瘤微環境中利用多種免疫抑制機制來逃避機體免疫系統識別和攻擊，這些免疫抑制機制包括免疫抑制型的細胞因子(如TGFB)、調節性T細胞(Tregs)、共抑制信號通路分子、髓系抑制性細胞等等。
免疫抑制的多種機制可能會阻礙免疫治療具有有效性。在一些情況下，腫瘤對於單藥免疫治療來說是難治的並且只有一小部分的癌症有完全反應。因此，研發具備阻斷PD-L1/PD-1信號通路能力的藥物以及在抑制PD-1/PD-L1通路的基礎上靶向中和腫瘤微環境的免疫抑制型細胞因子TGFB，能為腫瘤及多種免疫系統相關疾病的治療帶來全新的解決方法。
本申請提供了一種PD-L1抗原結合蛋白，其能夠以1×10-8M或更低的KD值結合源自靈長類動物的PD-L1。該抗原結合蛋白能夠阻斷PD-1和CD80與PD-L1的結合，刺激免疫細胞中IFN-γ和/或IL2的分泌，能夠抑制腫瘤生長和/或腫瘤細胞增殖。本申請還提供了一種融合蛋白，其包括人TGFBRII或其片段和該抗原結合蛋白。本申請還提供了該抗原結合蛋白和/或該融合蛋白在預防和治療腫瘤或癌症中的應用。
一方面，本申請提供了一種結合PD-L1的分離的抗原結合蛋白，其包含抗體重鏈可變區VH中的至少一個CDR，該VH包含SEQ ID NO：193所示的胺基酸序列；較佳地，該VH包含SEQ ID NOs：90-93、95和97-104中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含抗體輕鏈可變區VL中的至少一個CDR，該VL包含SEQ ID NO：194所示的胺基酸序列；較佳地，該VL包含SEQ ID NOs：108-114、116和118中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包括抗體或其抗原結合片段；較佳地，其中該抗體選自下組：單株抗體、嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體；較佳地，該抗原結合片段包括Fab、Fab’、Fv片段、F(ab’)2、scFv、di-scFv並且/或者dAb。
在某些實施方式中，輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1包含如SEQ ID NO：181所示的胺基酸序列，該LCDR2包含如SEQ ID NO：182所示的胺基酸序列，該LCDR3包含如SEQ ID NO：191所示的胺基酸序列；其中重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，該HCDR2包含如SEQ ID NO：179所示的胺基酸序列，該HCDR3包含如SEQ ID NO：180所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該LCDR1包含SEQ ID NOs：181、48-51中任一項所示的胺基酸序列；該LCDR2包含SEQ ID NOs：182、63-64中任一項所示的胺基酸序列；該LCDR3包含SEQ ID NOs：191、77-79中任一項所示的胺基酸序列；HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NOs：179、14、16和17中任一項所示的胺基酸序列；HCDR3包含SEQ ID NOs：180、29-33中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該LCDR1包含如SEQ ID NO：48所示的胺基酸序列；該LCDR2包含如SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列；該LCDR3包含如SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列；該HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示 的胺基酸序列；該HCDR2包含如SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列；該HCDR3包含如SEQ ID NO：29所示；或者，
該LCDR1包含如SEQ ID NO：49所示的胺基酸序列、該LCDR2包含如SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列、該LCDR3包含如SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列、該HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列、該HCDR2包含如SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列且該HCDR3包含如SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列；或者，
該LCDR1包含如SEQ ID NO：48所示的胺基酸序列、該LCDR2包含如SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列、該LCDR3包含如SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列、該HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列、該HCDR2包含如SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列且該HCDR3包含如SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列；或者，
該LCDR1包含如SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列、該LCDR2包含如SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列、該LCDR3包含如SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列、該HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列、該HCDR2包含如SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列且該HCDR3包含如SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列；或者，
該LCDR1包含如SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列、該LCDR2包含如SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列、該LCDR3包含如SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列、該HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列、該HCDR2包含如SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列且該HCDR3包含如SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列；或者，
該LCDR1包含如SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列、該LCDR2包含如SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列、該LCDR3包含如SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列、該HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列、該HCDR2包含如SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列且該HCDR3包含如SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列；或者，
該LCDR1包含如SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列、該LCDR2包含如SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列、該LCDR3包含如SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列、該HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列、該HCDR2包含如SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列且該HCDR3包含如SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列；或者，
該LCDR1包含如SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列、該LCDR2包含如SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列、該LCDR3包含如SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列、該HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列、該HCDR2包含如SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列且該HCDR3包含如SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列；或者，
該LCDR1包含如SEQ ID NO：48所示的胺基酸序列、該LCDR2包含如SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列、該LCDR3包含如SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列、該HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列、該HCDR2包含如SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列且該HCDR3包含如SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列；或者，
該LCDR1包含如SEQ ID NO：48所示的胺基酸序列、該LCDR2包含如SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列、該LCDR3包含如SEQ ID NO：78所 示的胺基酸序列、該HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列、該HCDR2包含如SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列且該HCDR3包含如SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列；或者，
該LCDR1包含如SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列、該LCDR2包含如SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列、該LCDR3包含如SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列、該HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列、該HCDR2包含如SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列且該HCDR3包含如SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列；或者，
該LCDR1包含如SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列、該LCDR2包含如SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列、該LCDR3包含如SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列、該HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列、該HCDR2包含如SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列且該HCDR3包含如SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列；或者，
該LCDR1包含如SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列、該LCDR2包含如SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列、該LCDR3包含如SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列、該HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列、該HCDR2包含如SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列且該HCDR3包含如SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列；或者，
該LCDR1包含如SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列、該LCDR2包含如SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列、該LCDR3包含如SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列、該HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列、該HCDR2 包含如SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列且該HCDR3包含如SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列；或者，
該LCDR1包含如SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列、該LCDR2包含如SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列、該LCDR3包含如SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列、該HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列、該HCDR2包含如SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列且該HCDR3包含如SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列；或者，
該LCDR1包含如SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列、該LCDR2包含如SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列、該LCDR3包含如SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列、該HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列、該HCDR2包含如SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列且該HCDR3包含如SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該抗體重鏈可變區VH包括框架區H-FR1，H-FR2，H-FR3，和H-FR4；較佳地，該H-FR1的C末端與該HCDR1的N末端相連，包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列；並且/或者該H-FR2位於該HCDR1與該HCDR2之間，包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列；並且/或者該H-FR3位於該HCDR2與該HCDR3之間，包含SEQ ID NO：192所示的胺基酸序列；並且/或者該H-FR4的N末端與該HCDR3的C末端相連，包含SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列；進一步較佳地，該H-FR3包含SEQ ID NOs：21、22和24中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該抗體輕鏈可變區VL包括框架區L-FR1，L-FR2，L-FR3，和L-FR4；較佳地，該L-FR1的C末端與該LCDR1的N末端 相連，包含SEQ ID NO：185所示的胺基酸序列；並且/或者該L-FR2位於該LCDR1與該LCDR2之間，包含SEQ ID NO：186所示的胺基酸序列；並且/或者該L-FR3位於該LCDR2與該LCDR3之間，包含SEQ ID NO：187所示的胺基酸序列；並且/或者該L-FR4的N末端與該LCDR3的C末端相連，包含SEQ ID NO：188所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該L-FR1包含SEQ ID NOs：41-44中任一項所示的胺基酸序列；並且/或者該L-FR2包含SEQ ID NOs：56-59中任一項所示的胺基酸序列；並且/或者該L-FR3包含SEQ ID NOs：69-72中任一項所示的胺基酸序列；並且/或者該L-FR4包含SEQ ID NOs：85-86中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該抗體重鏈可變區VH包含SEQ ID NO：193所示的胺基酸序列；該抗體輕鏈可變區VL包含SEQ ID NO：194所示的胺基酸序列；
較佳地，該抗體重鏈可變區VH包含SEQ ID NOs：90-93、95和97-104中任一項所示的胺基酸序列；
較佳地，該抗體輕鏈可變區VL包含SEQ ID NOs：108-114、116和118中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該抗體重鏈可變區VH包含SEQ ID NO：90所示的胺基酸序列，該抗體輕鏈可變區VL包括SEQ ID NO：108所示的胺基酸序列；或者，
該抗體重鏈可變區VH包含如SEQ ID NO：90所示的胺基酸序列，該抗體輕鏈可變區VL包含如SEQ ID NO：109所示的胺基酸序列；或者，
該抗體重鏈可變區VH包含如SEQ ID NO：91所示的胺基酸序列，該抗體輕鏈可變區VL包含如SEQ ID NO：110所示的胺基酸序列；或者，
該抗體重鏈可變區VH包含如SEQ ID NO：90所示的胺基酸序列，該抗體輕鏈可變區VL包含如SEQ ID NO：111所示的胺基酸序列；或者，
該抗體重鏈可變區VH包含如SEQ ID NO：92所示的胺基酸序列，該抗體輕鏈可變區VL包含如SEQ ID NO：112所示的胺基酸序列；或者，
該抗體重鏈可變區VH包含如SEQ ID NO：93所示的胺基酸序列，該抗體輕鏈可變區VL包含如SEQ ID NO：113所示的胺基酸序列；或者，
該抗體重鏈可變區VH包含如SEQ ID NO：90所示的胺基酸序列，該抗體輕鏈可變區VL包含如SEQ ID NO：114所示的胺基酸序列；或者，
該抗體重鏈可變區VH包含如SEQ ID NO：95所示的胺基酸序列，該抗體輕鏈可變區VL包含如SEQ ID NO：116所示的胺基酸序列；或者，
該抗體重鏈可變區VH包含如SEQ ID NO：97所示的胺基酸序列，該抗體輕鏈可變區VL包含如SEQ ID NO：118所示的胺基酸序列；或者，
該抗體重鏈可變區VH包含如SEQ ID NO：98所示的胺基酸序列，該抗體輕鏈可變區VL包含如SEQ ID NO：118所示的胺基酸序列；或者，
該抗體重鏈可變區VH包含如SEQ ID NO：99所示的胺基酸序列，該抗體輕鏈可變區VL包含如SEQ ID NO：113所示的胺基酸序列；或者，
該抗體重鏈可變區VH包含如SEQ ID NO：100所示的胺基酸序列，該抗體輕鏈可變區VL包含如SEQ ID NO：113所示的胺基酸序列；或者，
該抗體重鏈可變區VH包含如SEQ ID NO：101所示的胺基酸序列，該抗體輕鏈可變區VL包含如SEQ ID NO：114所示的胺基酸序列；或者，
該抗體重鏈可變區VH包含如SEQ ID NO：102所示的胺基酸序列，該抗體輕鏈可變區VL包含如SEQ ID NO：114所示的胺基酸序列；或者，
該抗體重鏈可變區VH包含如SEQ ID NO：103所示的胺基酸序列，該抗體輕鏈可變區VL包含如SEQ ID NO：116所示的胺基酸序列；或者，
該抗體重鏈可變區VH包含如SEQ ID NO：104所示的胺基酸序列，該抗體輕鏈可變區VL包含如SEQ ID NO：116所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包括抗體重鏈恆定區，且該抗體重鏈恆定區包括人IgG恆定區；較佳地，其中該抗體重鏈恆定區包含如SEQ ID NOs：172-175中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含抗體重鏈HC，且該HC包含如SEQ ID NOs：122-125、127和129-137中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包括抗體輕鏈恆定區，其中該抗體輕鏈恆定區包含如SEQ ID NO：170所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含抗體輕鏈LC，且該LC包含如SEQ ID NOs：150-156、158和160-163中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白具有下述性質中的一種或多種：
1)能夠以1×10-8M或更低的KD值結合源自靈長類動物的PD-L1；
2)能夠阻斷PD-1與PD-L1的結合；
3)能夠阻斷CD80與PD-L1的結合；
4)能夠刺激免疫細胞中IFN-γ並且/或者IL2的分泌；
5)能夠抑制腫瘤生長並且/或者腫瘤細胞增殖；
6)與對照抗體相比，結合與源自靈長類動物的PD-L1的不完全重疊的表位，
其中該對照抗體包含SEQ ID NO：52所示的LCDR1、SEQ ID NO：65所示的LCDR2和SEQ ID NO：81所示的LCDR3，且該對照抗體包含SEQ ID NO：6所示的HCDR1、SEQ ID NO：15所示的HCDR2和SEQ ID NO：34所示的HCDR3；
或者，
其中該對照抗體包含SEQ ID NO：53所示的LCDR1、SEQ ID NO：66所示的LCDR2和SEQ ID NO：82所示的LCDR3，且該對照抗體包含SEQ ID NO：5所示的HCDR1、SEQ ID NO：18所示的HCDR2和SEQ ID NO：35所示的HCDR3；
或者，
該對照抗體包含SEQ ID NO：55所示的LCDR1、SEQ ID NO：68所示的LCDR2和SEQ ID NO：84所示的LCDR3，且該對照抗體包含SEQ ID NO：8所示的HCDR1、SEQ ID NO：20所示的HCDR2和SEQ ID NO：37所示的HCDR3。
在某些實施方式中，該靈長類動物包括人並且/或者猴。
另一方面，本申請提供了一種融合蛋白，其包含：a)人TGFBRII或其片段；以及b)該分離的抗原結合蛋白。
在某些實施方式中，該融合蛋白包含第一多肽和第二多肽，其中該第一多肽包含該分離的抗原結合蛋白的重鏈或其片段以及該人TGFBRII或其片段；且該第二多肽包含該分離的抗原結合蛋白的輕鏈或其片段；較佳地，該抗體重鏈或其片段與該人TGFBRII或其片段框內融合而形成該第一多肽；進一步 較佳地，其中該抗體重鏈或其片段的C端直接或間接與該人TGFBRII或其片段的N端連接。
在某些實施方式中，該第一多肽的該重鏈或其片段包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，HCDR1包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NOs：179、14、16和17中任一項所示的胺基酸序列；HCDR3包含SEQ ID NOs：180、29-33中任一項所示的胺基酸序列；並且/或者該第二多肽包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，LCDR1包含SEQ ID NOs：181、48-51中任一項所示的胺基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NOs：182、63-64中任一項所示的胺基酸序列；LCDR3包含SEQ ID NOs：191、77-79中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，LCDR1包含如SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列，LCDR2包含如SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，LCDR3包含如SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列；HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，HCDR2包含如SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列，HCDR3包含如SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列；或者，
LCDR1包含如SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列，LCDR2包含如SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，LCDR3包含如SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列；HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，HCDR2包含如SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列，HCDR3包含如SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列；或者，
LCDR1包含如SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列，LCDR2包含如SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，LCDR3包含如SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列；HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，HCDR2包含如 SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列，HCDR3包含如SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列；或者，
LCDR1包含如SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列，LCDR2包含如SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，LCDR3包含如SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列；HCDR1包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列，HCDR3包含如SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列；或者，
LCDR1包含如SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列，LCDR2包含如SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，LCDR3包含如SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列；HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，HCDR2包含如SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，HCDR3包含如SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該抗體重鏈或其片段藉由連接子與該人TGFBRII或其片段相連；較佳地，該連接子為肽連接子，且該肽連接子包含SEQ ID NOs：167-169中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該人TGFBRII或其片段包含人TGFBRII的胞外結構域；較佳地，該人TGFBRII或其片段包含SEQ ID NOs：176-178中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該第一多肽的該重鏈或其片段與該第二多肽的該輕鏈或其片段組合後形成特異性結合PD-L1的抗原結合部分。
在某些實施方式中，該第一多肽包含SEQ ID NOs：138、139、142、143和145-148中任一項所示的胺基酸序列；其中該第二多肽包含SEQ ID NOs：162-163中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該第一多肽包含如SEQ ID NO：138所示的胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：162所示的胺基酸序列；或者，
該第一多肽包含SEQ ID NO：139所示的胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：162所示的胺基酸序列；或者，
該第一多肽包含SEQ ID NO：142所示的胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：162所示的胺基酸序列；或者，
該第一多肽包含SEQ ID NO：143所示的胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：162所示的胺基酸序列；或者，
該第一多肽包含SEQ ID NO：145所示的胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：163所示的胺基酸序列；或者，
該第一多肽包含SEQ ID NO：146所示的胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：163所示的胺基酸序列；或者，
該第一多肽包含SEQ ID NO：147所示的胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：162所示的胺基酸序列；或者，
該第一多肽包含SEQ ID NO：148所示的胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：162所示的胺基酸序列。
另一方面，本申請提供了分離的一種或多種核酸分子，其編碼該分離的抗原結合蛋白或該融合蛋白。
另一方面，本申請提供了載體，其包含該核酸分子。
另一方面，本申請提供了細胞，其包含該核酸分子或該載體。
另一方面，本申請提供了製備該分離的抗原結合蛋白或該融合蛋白的方法，所述方法包括在使得該分離的抗原結合蛋白該融合蛋白表達的條件下，培養該細胞。
另一方面，本申請提供了嵌合抗原受體，其包含該分離的抗原結合蛋白。
另一方面，本申請提供了基因修飾的細胞，其包含該嵌合抗原受體。
另一方面，本申請提供了抗體藥物偶聯物，其包含細胞毒性劑，以及該分離的抗原結合蛋白。
另一方面，本申請提供了醫藥組成物，其包含該分離的抗原結合蛋白、該融合蛋白、該核酸分子、該載體、該細胞、該嵌合抗原受體、該基因修飾的細胞和/或該抗體藥物偶聯物，以及視需要地藥學上可接受的載體；較佳地，所述醫藥組成物還含有由激素製劑、靶向小分子製劑、蛋白酶體抑制劑、成像劑、診斷劑、化療劑、溶瘤藥物、細胞毒性劑、細胞因子、共刺激分子的啟動劑、抑制性分子的抑制劑以及疫苗組成的群組中的一種或多種。
另一方面，本申請提供了該分離的抗原結合蛋白、該融合蛋白、該核酸分子、該載體、該細胞、該嵌合抗原受體、該基因修飾的細胞和/或該抗體藥物偶聯物和/或該醫藥組成物在製備藥物中的用途，所述藥物用於預防、緩解並且/或者治療腫瘤或癌症，抑制腫瘤生長並且/或者抑制腫瘤細胞增殖；較佳地，所述腫瘤或癌症為PD-L1表達異常的腫瘤或癌症；較佳地，所述腫瘤或癌症包括結直腸癌。
另一方面，本申請提供了一種預防、緩解或治療腫瘤，抑制腫瘤生長並且/或者抑制腫瘤細胞增殖的方法，所述方法包括向有需要的受試者施用該分離的抗原結合蛋白、該融合蛋白、該核酸分子、該載體、該細胞、該嵌合抗原受體、該基因修飾的細胞和/或該抗體藥物偶聯物和/或該醫藥組成物；較佳地，所述其中所述腫瘤或癌症為PD-L1表達異常的腫瘤或癌症；較佳地，所述腫瘤或癌症包括結直腸癌。
另一方面，本申請提供了一種該分離的抗原結合蛋白、該融合蛋白、該核酸分子、該載體、該細胞、該嵌合抗原受體、該基因修飾的細胞和/或該抗體藥物偶聯物和/或該醫藥組成物，其用於治療癌症，抑制腫瘤生長並且/或者抑制腫瘤細胞增殖。
另一方面，本申請提供了一種抑制PD-L1和或CD80與PD-1結合的方法，所述方法包括施用該分離的抗原結合蛋白、該融合蛋白、該核酸分子、該載體、該細胞、該嵌合抗原受體、該基因修飾的細胞和/或該抗體藥物偶聯物和/或該醫藥組成物。
另一方面，本申請提供了一種試劑盒，其包括該分離的抗原結合蛋白、該融合蛋白、該核酸分子、該載體、該細胞、該嵌合抗原受體、該基因修飾的細胞和/或該抗體藥物偶聯物和/或該醫藥組成物；較佳地，所述試劑盒還包括(i)施用裝置；和/或(ii)使用說明。本領域技術人員能夠從下文的詳細描述中容易地洞察到本申請的其它方面和優勢。下文的詳細描述中僅顯示和描述了本申請的示例性實施方式。如本領域技術人員將認識到的，本申請的內容使得本領域技術人員能夠對所公開的實施方式進行改動而不脫離本申請所涉及發明的精神 和範圍。相應地，本申請的附圖和說明書中的描述僅僅是示例性的，而非為限制性的。
本申請所涉及的發明的具體特徵如所附申請專利範圍所顯示。藉由參考下文中詳細描述的示例性實施方式和圖式能夠更好地理解本申請所涉及發明的特點和優勢。對圖式簡要說明如下：
圖1顯示的是本申請該抗原結合蛋白結合過表達人PD-L1的CHO-K1細胞；
圖2顯示的是本申請所述抗原結合蛋白結合過表達食蟹猴PD-L1的CHO-K1細胞。
圖3顯示的是本申請所述抗原結合蛋白結合人PD-L1蛋白；
圖4顯示的是本申請所述抗原結合蛋白結合食蟹猴PD-L1蛋白；
圖5顯示的是本申請所述抗原結合蛋白阻斷人PD-1與過表達人PD-L1的CHO-K1細胞的結合；
圖6顯示的是本申請所述抗原結合蛋白阻斷人PD-1與過表達人PD-L1的CHO-K1細胞的結合；
圖7顯示的是本申請所述抗原結合蛋白阻斷生物素化的人PD-1蛋白與人PD-L1蛋白的結合；
圖8顯示的是本申請所述抗原結合蛋白阻斷生物素化的人B7-1(CD80)蛋白與人PD-L1蛋白的結合；
圖9顯示的是本申請所述抗原結合蛋白對PD-1信號通路的抑制作用；
圖10顯示的是本申請所述抗原結合蛋白對PD-1信號通路的抑制作用；
圖11顯示的是本申請所述抗原結合蛋白與人PD-L1的親和力：(A)PR000265的單濃度抗原結合解離曲線，(B)PR000266的單濃度抗原結合解離曲線，(C)PR000265的多濃度抗原結合解離曲線，(D)PR000151的多濃度抗原結合解離曲線，(E)PR001598的多濃度抗原結合解離曲線；
圖12顯示的是本申請所述抗原結合蛋白在混合淋巴細胞反應(MLR)中刺激細胞因子分泌：在第一組供體配對的MLR實驗中，(A)120小時後上清中的IFN-γ水準，(B)72小時後上清中的IL-2水準；在第二組供體配對的MLR實驗中，(C)120小時後上清中的IFN-γ水準，(D)72小時後上清中的IL-2水準；
圖13顯示的是本申請所述抗原結合蛋白的抗體依賴的細胞毒性結果：(A-C)三個不同供體的PBMC對腫瘤細胞MDA-MB-231的殺傷；(D-F)三個不同供體的PBMC對腫瘤細胞NCI-H292的殺傷；
圖14顯示的是本申請所述抗原結合蛋白的體內抑制腫瘤活性，分別為腫瘤體積變化(A)和小鼠體重變化(B)；
圖15顯示的是本申請所述融合蛋白結合過表達人PD-L1的CHO-K1細胞：(A)表20-1所列融合蛋白，(B)表20-2所列融合蛋白；
圖16顯示的是本申請所述融合蛋白阻斷人PD-1與過表達人PD-L1的CHO-K1細胞的結合：(A)表21-1所列融合蛋白，(B)表21-2所列融合蛋白；
圖17顯示的是本申請所述融合蛋白對PD-1信號通路的抑制作用；
圖18顯示的是本申請所述融合蛋白結合TGFB1：(A)表23-1所列融合蛋白，(B)表23-2所列融合蛋白，(C)表23-3所列融合蛋白；
圖19顯示的是本申請所述融合蛋白對TGFB1誘導Smad信號通路啟動的抑制作用；
圖20顯示的是本申請所述融合蛋白在混合淋巴細胞反應(MLR)中，在沒有或外加TGFB1的條件下，刺激T淋巴細胞分泌細胞因子的水準：(A)72小時後上清中的IL-2水準，(B)120小時後上清中的IFN-γ水準；
圖21顯示的是本申請所述融合蛋白的抗體依賴的細胞毒性結果：(A-C)三個不同供體的PBMC對腫瘤細胞MDA-MB-231的殺傷；(D-F)三個不同供體的PBMC對腫瘤細胞NCI-H292的殺傷；
圖22顯示的是本申請所述融合蛋白PR001902的藥物代謝動力學結果；
圖23顯示的是本申請所述融合蛋白PR001488的藥物代謝動力學結果；
圖24顯示的是本申請所述融合蛋白對腫瘤動物體內模型的抗腫瘤活性，分別為腫瘤體積變化(A)和小鼠體重變化(B)。
以下由特定的具體實施例說明本申請發明的實施方式，熟悉此技術的人士可由本說明書所公開的內容容易地瞭解本申請發明的其他優點及效果。
在本申請中，術語“抗原結合蛋白”通常是指包含結合抗原的部分的蛋白質，以及視需要地允許結合抗原的部分採用促進抗原結合蛋白與抗原結合的構象的支架或骨架部分。可典型地包含抗體輕鏈可變區(VL)、抗體重鏈可變區(VH)或上述兩者。VH和VL區可進一步被區分為稱為互補決定區(CDR)的高變區，它們散佈在稱為框架區(FR)的更保守的區域中。每個VH 和VL可由三個CDR和四個FR區構成，它們從胺基端至羧基端可按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。抗原結合蛋白的實例包括但不限於抗體、抗原結合片段(Fab，Fab’，F(ab)2，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb)、免疫綴合物、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、抗體片段、抗體衍生物、抗體類似物或融合蛋白等，只要它們顯示出所需的抗原結合活性即可。
在本申請中，術語“融合蛋白”通常是指由兩種或多種多肽構成的蛋白質，在天然狀態下通常不結合，但是各自的胺基和羧基末端可藉由直接或間接結合在一起以形成一個連續多肽。在某些情形中，提及本申請該融合蛋白時，術語“融合蛋白”可與“抗體”互換的使用。在某些情形中，提及本申請該融合蛋白時，術語“融合蛋白”可與“抗原結合蛋白”互換的使用。
在本申請中，術語“Fab”通常是指含有重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域的片段，並且還含有輕鏈的恆定結構域和重鏈的第一恆定結構域(CH1)；術語“Fab’”通常是指在重鏈CH1結構域的羧基端添加少量殘基(包括一個或多個來自抗體鉸鏈區的半胱胺酸)而不同於Fab的片段；術語“F(ab')2”通常是指Fab’的二聚體，包含藉由鉸鏈區上的二硫橋連接的兩個Fab片段的抗體片段。術語“Fv”通常是指含有完整抗原識別與結合位點的最小抗體片段。在某些情形中，該片段可以由一個重鏈可變區和一個輕鏈可變區以緊密非共價結合的二聚體組成；術語“dsFv”通常是指二硫鍵穩定的Fv片段，其單個輕鏈可變區與單個重鏈可變區之間的鍵是二硫鍵。術語“dAb片段”通常是指由VH結構域組成的抗體片段。在本申請中，術語“scFv”通常是指抗體的一個重鏈可變結構域和一個輕鏈可變結構域藉由柔性肽連接子共價連接配對形成的單價分 子；此類scFv分子可具有一般結構：NH2-VL-連接子-VH-COOH或NH2-VH-連接子-VL-COOH。
在本申請中，術語“可變”通常是指這樣的事實，即抗體的可變結構域的序列的某些部分變化強烈，它形成各種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。然而，變異性並非均勻地分佈在抗體的整個可變區中。它集中在輕鏈和重鏈可變區中的三個區段，被稱為互補決定區(CDR)或高變區(HVR)。可變域中更高度保守的部分被稱為框架(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變結構域各自包含四個FR區(H-FR1、H-FR2、H-FR3、H-FR4、L-FR1、L-FR2、L-FR3、L-FR4)，大部分採用β-折疊構型，藉由三個CDR結構環區連接。每條鏈中的CDR藉由FR區緊密靠近在一起，並與來自另一條鏈的CDR一起形成抗體的抗原結合位點，恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是它們表現出不同的效應功能，例如參與抗體依賴的細胞毒性。在本領域中，可以藉由多種方法來定義抗體的CDR，例如基於序列可變性的Kabat定義規則(參見，Kabat等人，免疫學的蛋白質序列，第五版，美國國立衛生研究院，貝塞斯達，馬里蘭州(1991))和基於結構環區域位置的Chothia定義規則(參見，A1-Lazikani等人，JMol Biol 273：927-48,1997)。在本申請中，還使用包含了Kabat定義和Chothia定義的Combined定義規則確定可變結構域序列和全長抗體序列中的胺基酸殘基。抗體CDR定義方法請參見表1。
Figure 109133866-A0101-12-0022-1
其中，Laa-Lbb可以指從抗體輕鏈的N端開始，第aa位元(Chothia編碼規則)至第bb位元(Chothia編碼規則)的胺基酸序列；Haa-Hbb可以指從抗體重鏈的N端開始，第aa位元(Chothia編碼規則)至第bb位元(Chothia編碼規則)的胺基酸序列。例如，L24-L34可以指從抗體輕鏈N端開始，按照Chothia編碼規則的從第24位元至第34位的胺基酸序列；H26-H32可以指從抗體重鏈N端開始，按照Chothia編碼規則的從第26位元至第32位的胺基酸序列。
在本申請中，術語“分離的”抗原結合蛋白通常是指已經從其產生環境(例如，天然的或重組的)的組分中識別，分離和/或回收的抗原結合蛋白。其產生環境的污染組分通常是干擾其研究、診斷或治療用途的物質，可以包括酶、激素和其他蛋白質或非蛋白質溶質。分離的抗原結合蛋白或抗體通常將藉由至少一個純化步驟來製備。
在本申請中，術語“單株抗體”通常是指從一群基本上同質的抗體獲得的抗體，即集群中的個別抗體是相同的，除了可能存在的少量的自然突 變。單株抗體通常針對單個抗原位點具有高度特異性。而且，與常規多株抗體製劑(通常具有針對不同決定簇的不同抗體)不同，各單株抗體是針對抗原上的單個決定簇。除了它們的特異性之外，單株抗體的優點在於它們可以藉由融合瘤培養合成，不受其他免疫球蛋白污染。修飾語“單株”表示從基本上同質的抗體群體獲得的抗體的特徵，並且不被解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。例如，根據本發明使用的單株抗體可以在融合瘤細胞中製備，或者可以藉由重組DNA方法製備。
在本申請中，術語“全人源抗體”通常是指將人類編碼抗體的基因轉移至基因工程改造的抗體基因缺失動物中，使動物表達的抗體。抗體所有部分(包括抗體的可變區和恆定區)均由人類來源的基因所編碼。全人源抗體可以大大減少異源抗體對人體造成的免疫副反應。本領域獲得全人源抗體的方法可以有噬菌體展示技術、轉基因小鼠技術、核糖體展示技術和RNA-多肽技術等。
在本申請中，術語“特異性結合”通常是指抗體藉由其抗原結合域與表位結合，並且該結合需要抗原結合域和表位之間的一些互補性。根據該定義，當抗體相比於其將結合隨機的、不相關的表位而言更容易藉由其抗原結合域與表位結合時，抗體被稱為“特異性結合”該抗原。“表位”是指抗原上與抗原結合蛋白(如抗體)結合的特定的原子基團(例如，糖側鏈、磷醯基、磺醯基)或胺基酸。
在本申請中，術語“KD”、“K D ”可互換地使用，通常是指平衡解離常數，“KD”是解離速率常數(kdis，也稱為“解離率(off-rate)(koff)”或“kd”)與結合速率常數(kon，也稱為“結合率(kon)”或“ka”)的比值。可使用結合速率常數(kon)、解離速率常數(kdis)和平衡解離常數(KD)表 示抗原結合蛋白(例如抗體)對抗原的結合親和力。確定結合和解離速率常數的方法為本領域熟知，包括但不限於生物膜干涉技術(BLI)、放射免疫法(RIA)、平衡透析法、表面等離子共振(SPR)、螢光共振能量遷移(FRET)、免疫共沉澱(Co-IP)以及蛋白質晶片技術。如果在不同的條件(例如鹽濃度、pH)下測量，則所測得的某種特定蛋白-蛋白相互作用的親和力可不同。
在本申請中，術語“PD-L1”通常是指程式性死亡配體1蛋白、其功能變體和/或其功能片段。PD-L1也稱為分化簇274(CD274)或B7同源物1(B7-H1)，並且是由(人類中)CD274基因編碼的蛋白。PD-L1結合其受體，例如程式性死亡1(PD-1)，該PD-1在活化的T細胞、B細胞和巨噬細胞中表達(Ishida et al.,1992 EMBO J,11：3887-3395；Okazaki et al.,Autoimmune dilated cardiomyopathy in PD-1 receptor-deficient mice.Science,2001；291：319-22)。PD-L1和PD-1的絡合藉由抑制T細胞增殖和產生細胞因子IL-2和IFN-γ發揮免疫抑制作用(Freeman et al.,Engagement of PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation,J.Exp.Med.2000,192：1027-1034；Carter et al.,PD-1：PD-L inhibitory pathway affects both CD4(+)and CD8(+)T cells and is overcome by IL-2.Eur.J.Immunol.2002,32：634-643)。術語“PD-L1”涵蓋任何脊椎動物來源的任何天然PD-L1，該任何脊椎動物來源包括哺乳動物，諸如靈長類(例如，人)和齧齒類(例如，小鼠和大鼠)。該術語涵蓋“全長”、未加工的PD-L1以及由細胞中的加工所產生的任何形式的PD-L1。PD-L1可作為跨膜蛋白或作為可溶性蛋白存在。該術語還涵蓋天然存在的PD-L1的變體，例如剪接變體或等位基因變體。PD-L1的基本結構包括4個結構域：胞外Ig樣V型結構域和Ig樣C2型結構域、跨膜結構域以及細胞質結 構域。PD-L1序列是本領域已知的。例如可在NCBI Gene ID No.29126下找到關於人PD-L1基因(包括基因組DNA序列)的資訊。又例如可在NCBI Gene ID No.60533下找到關於小鼠PD-L1基因(包括基因組DNA序列)的資訊。又例如可在NCBI Gene ID No.102145573下找到關於食蟹猴PD-L1基因(包括基因組DNA序列)的資訊。示例性的全長人PD-L1蛋白的胺基酸序列可在NCBI登錄號NP_054862或UniProt登錄號Q9NZQ7下找到。示例性的全長小鼠PD-L1蛋白序列可在NCBI登錄號NP_068693或Uniprot登錄號Q9EP73下找到。示例性的全長食蟹猴PD-L1蛋白序列可在NCBI登錄號XP_005581836或Uniprot登錄號G7PSE7下找到。
在本申請中，術語“PD-1”通常是指程式性死亡1受體(也稱為CD279)、其功能變體和/或其功能片段。PD-1通常在T細胞、B細胞、自然殺傷T細胞、活化的單核細胞和樹突細胞(DC)上表達。PD-1可以結合其配體PD-L1和PD-L2。在PD-1的定義之內還包括與天然存在的PD-1的胺基酸序列不同但保持特異性結合PD-L1的能力的變體。在PD-1的定義之內進一步包括增強PD-L1的生物活性的變體。PD-1序列是本領域已知的。例如，示例性的全長人PD-1蛋白序列可在NCBI登錄號NP_005009下找到，示例性的全長食蟹猴的PD-1蛋白序列可在NCBI登錄號NP_001271065或Uniprot登錄號B0LAJ3下找到。
在本申請中，術語“CD80”通常是指分化簇蛋白80(也稱為B7-1)、其功能變體和/或其功能片段。CD80通常在專職抗原遞呈細胞(APC)上表達。CD80能與PD-L1結合。在CD80的定義之內還包括與天然存在的CD80的胺基酸序列不同但保持特異性結合PD-L1的能力的變體。如本文使用的術語“CD80”包括人CD80(hCD80)、hCD80的變體、異構體和種屬同源體、以及 具有至少一種含hCD80的常見表位的類似物。例如，術語“CD80”還涵蓋來自其他種屬比如其它哺乳動物(例如，大鼠、小鼠、兔、非人靈長類動物、豬或牛)的CD80。完整的人CD80序列可以在Uniprot登錄號P33681中找到。
在本申請中，術語“TGFBRII”通常是指一種轉化生長因子B(TGFB)的受體(也稱為TGFBR2)。細胞表面的TGFBR可以被轉化生長因子(TGFB)結合並啟動，藉由SMAD通路進行信號傳遞，具有調節生長，抗炎和免疫調節的活性。完整的人TGFBRII序列可以在Uniprot登錄號P37173中找到。
在本申請中，術語“特定抗PD-L1抗體”通常是指可以與本申請的抗體競爭結合PD-L1的抗體。本申請的抗原結合蛋白可包括與特定抗PD-L1抗體具有相同胺基酸序列的那些抗體。
在本申請中，術語“對照抗體”通常是指在本申請實施例中以提供相對其來評價實驗結果的標準的PD-L1抗體。在某些情形中，對照抗體可以指本申請實施例中的陽性對照，例如PR000151、PR001598和PR002466。
在本申請中，術語“靈長類動物”通常是指猴和猿物種，並包括猴物種，諸如來自彌猴屬(諸如，和具體地，食蟹猴(食蟹猴(Macaca fascicularis))和或恒河猴(恒河猴(Macaca mulatta)))和狒狒(豚尾狒狒(Papio ursinus))的猴，以及狨猴(來自狨(Callithrix)屬的物種)，松鼠猴(來自松鼠猴(Saimiri)屬的物種)和絹毛猴(來自檉柳猴(Saguinus)屬的物種)，以及猿物種，諸如黑猩猩(黑猩猩(Pan troglodytes))，並且還包括智人。
在本申請中，術語“表位”通常是指抗原結合蛋白(如抗體)特異性結合的抗原的某個區或區域。表位通常由諸如胺基酸或碳水化合物或糖側 鏈分子的化學活性表面群組組成，且通常具有特異性三維結構特徵以及特異性電荷特徵。表位元可為“線性表位元”或“構型表位”。在線性表位元中，蛋白質與相互作用的分子(諸如抗體)之間的所有相互作用點沿蛋白質的一級胺基酸序列線性發生。在構型表位中，相互作用點於彼此分離的蛋白質上的胺基酸上交叉發生。給定抗原結合蛋白(如抗體)結合何種表位的方法(如，表位作圖(Epitope Mapping))是本領域所公知的，包括例如免疫印跡和免疫沉澱測定，例如，測試重疊或鄰接的肽(例如，來自PD-L1)與給定抗原結合蛋白(如抗-PD-L1抗體)的反應性。確定表位空間構象的方法包括本領域技術和本申請的那些技術，例如，X射線晶體學、二維核磁共振和HDX-MS(可參見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,Vol.66,G.E.Morris,Ed.(1996))。術語“不完全重疊”的表位通常是指在提及兩種或多種抗原結合蛋白(如抗體)時，各抗體結合不完全相同或不完全重疊的胺基酸殘基群，如藉由給定方法所測定的。用於確定本申請所述抗原結合蛋白是否與參比抗體結合相同表位的技術包括例如表位作圖方法，諸如，抗原：抗體複合物的晶體的x射線分析，其提供表位的原子解析度，和氫/氘交換質譜法(HDX-MS)。其他方法監測抗體與抗原片段或抗原的突變變化形式的結合，其中由於抗原序列內胺基酸殘基的修飾所致的結合損失經常被視為可指示表位組分(例如，丙胺酸掃描誘變-Cunningham及Wells(1985)Science 244：1081)。另外，亦可使用表位元定位的計算組合方法。
在本申請中，術語“受試者”通常是指哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴化動物(例如奶牛、綿羊、貓、狗和馬)、靈長類(例如人和非人靈長類，諸如猴)、兔以及齧齒類(例如，小鼠和大鼠)。
在本申請中，術語“核酸分子”通常是指從其天然環境中分離的或人工合成的任何長度的分離形式的核苷酸、去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物。
在本申請中，術語“載體”通常是指能夠在合適的宿主中自我複製的核酸分子，其將插入的核酸分子轉移到宿主細胞中和/或宿主細胞之間。該載體可包括主要用於將DNA或RNA插入細胞中的載體、主要用於複製DNA或RNA的載體，以及主要用於DNA或RNA的轉錄和/或翻譯的表達的載體。該載體還包括具有多種上述功能的載體。該載體可以是當引入合適的宿主細胞時能夠轉錄並翻譯成多肽的多核苷酸。通常，藉由培養包含該載體的合適的宿主細胞，該載體可以產生期望的表達產物。
在本申請中，術語“細胞”通常是指可以或已經含有包括本申請的核酸分子的質粒或載體，或者能夠表達本申請的抗體或其抗原結合片段的個體細胞、細胞系或細胞培養物。該細胞可以包括單個宿主細胞的子代。由於天然的、意外的或故意的突變，子代細胞與原始親本細胞在形態上或在基因組上可能不一定完全相同，但能夠表達本申請該抗體或其抗原結合片段即可。該細胞可以藉由使用本申請該載體體外轉染細胞而得到。該細胞可以是原核細胞(例如大腸桿菌)，也可以是真核細胞(例如酵母細胞，例如COS細胞，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，HeLa細胞，HEK293細胞，COS-1細胞，NS0細胞或骨髓瘤細胞)。在某些情形中，該細胞可以是哺乳動物細胞。例如，該哺乳動物細胞可以是CHO-K1細胞。在本申請中，術語“重組細胞”通常是指在其中引入了重組表達載體的細胞。該重組宿主細胞不僅包括某種特定的細胞，還包括這些細胞的後代。
在本申請中，術語“醫藥組成物”通常是指這樣的製劑，其以允許活性成分的生物學活性有效的形式存在，並且不包含對將施用該組成物的物件具有不可接受的毒性的另外的成分。該組成物是無菌的。“無菌”組成物是滅菌的，或不含所有活的微生物及它們的孢子。
在本申請中，術語“治療”通常是指期望改變所治療個體的天然病程，且可為實現防治或在臨床病變過程中進行的臨床介入。合乎需要的治療效果包括但不限於防止疾病發生或復發性、減輕症狀、減弱疾病的任何直接或間接病理學後果、防止轉移、降低疾病進展速率、改善或緩解疾病狀態以及緩和或改善預後。在一些情形中，抗體(例如，抗PD-L1抗體)可用來延遲疾病發展或減緩疾病進展。
在本申請中，術語“施用”通常是指向受試者(例如，患者)給予一定劑量的化合物(例如，抗癌治療劑)或醫藥組成物(例如，包含抗癌治療劑的醫藥組成物)的方法。施用可藉由任何合適的方式進行，包括腸胃外、肺內和鼻內，以及(如果局部治療需要)損傷內施用。胃腸外輸注包括例如肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下施用。部分地根據施用是否為短暫的或長期的，給藥可藉由任何適合的途徑進行，例如藉由注射(諸如靜脈內或皮下注射)進行。本文涵蓋各種給藥過程，包括但不限於單次施用或各種時間點內的多次施用、推注施用和脈衝輸注。
在本申請中，術語“腫瘤”通常是指所有贅生性細胞生長和增殖(無論惡性還是良性)以及所有癌前和癌性細胞和組織。在本申請中，腫瘤可以包括結腸癌。
在本申請中，術語“在……之間”通常是指某種胺基酸片段的C端與第一胺基酸片段的N端直接或間接連接，並且其N端與第二胺基酸片段的C端直接或間接連接。在輕鏈中，例如，該L-FR2的N末端與該LCDR1的C末端直接或間接相連，且該L-FR2的C末端與該LCDR2的N末端直接或間接相連。又例如，該L-FR3的N末端與該LCDR2的C末端直接或間接相連，且該L-FR3的C末端與該LCDR3的N末端直接或間接相連。在重鏈中，例如，該H-FR2的N末端與該HCDR1的C末端直接或間接相連，且該H-FR2的C末端與該HCDR2的N末端直接或間接相連。又例如，該H-FR3的N末端與該HCDR2的C末端直接或間接相連，且該H-FR3的C末端與該HCDR3的N末端直接或間接相連。在本申請中，“第一胺基酸片段”和“第二胺基酸片段”可以為相同或不同的任意一段胺基酸片段。
在本申請中，術語“包括”通常是指包含、總括、含有或包涵的含義。在某些情況下，也表示“為”、“由......組成”的含義。
在本申請中，術語“約”通常是指在指定數值以上或以下0.5%-10%的範圍內變動，例如在指定數值以上或以下0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、或10%的範圍內變動。
抗原結合蛋白
在一個方面，本申請提供了一種抗原結合蛋白，其包含抗體輕鏈可變區VL中的至少一個CDR。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含LCDR1，且該LCDR1可包含SEQ ID NO：181所示的胺基酸序列：
RASQSIX7X8WLA(SEQ ID NO：181)；其中，X7=F，S或Y；X8=I或S。例如，該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
在某些情形中，與SEQ ID NO：48所示抗原結合蛋白的LCDR1相比，該LCDR1可至少包含在選自以下位置處的胺基酸取代：在X7和/或X8處的胺基酸取代。
在某些情形中，與SEQ ID NO：48所示抗原結合蛋白的LCDR1相比，該LCDR1可至少包含在X7和/或X8處的胺基酸取代，其中X7處的胺基酸可被取代為Y或F；X8處的胺基酸可被取代為S。
例如，該LCDR1可包含SEQ ID NOs：48-51中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含LCDR2，且該LCDR2可包含SEQ ID NO：182所示的胺基酸序列：
KASSLEX7(SEQ ID NO：182)；其中，X7=T或S。例如，該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
在某些情形中，與SEQ ID NO：63所示抗原結合蛋白的LCDR2相比，該LCDR2可至少包含在選自以下位置處的胺基酸取代：在X7處的胺基酸取代。
在某些情形中，與SEQ ID NO：63所示抗原結合蛋白的LCDR2相比，該LCDR2可至少包含在X7處的胺基酸取代，其中X7處的胺基酸可被取代為T。
例如，該LCDR2可包含SEQ ID NOs：63-64中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含LCDR3，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：183所示的胺基酸序列：
QQYX4X5X6SRT(SEQ ID NO：183)；其中，X4=Y或H；X5=G，T或S；X6=Y或S。例如，該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
在某些情形中，與SEQ ID NO：77所示抗原結合蛋白的LCDR3相比，該LCDR3可至少包含在選自以下位置處的胺基酸取代：在X4、X5和/或X6處的胺基酸取代。
在某些情形中，與SEQ ID NO：77所示抗原結合蛋白的LCDR3相比，該LCDR3可至少包含在X4、X5和/或X6處的胺基酸取代，其中X4處的胺基酸可被取代為H；X5處的胺基酸可被取代為S或T；X6處的胺基酸可被取代為S。
例如，該LCDR3可包含SEQ ID NOs：77-80中任一項所示的胺基酸序列。
在另一些情形中，該LCDR3可包含SEQ ID NO：191[ZY1]所示的胺基酸序列：
QQYYX5X6SRT(SEQ ID NO：191)；其中，X5=G或S；X6=Y或S。例如，該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
在一些具體的情形中，與SEQ ID NO：77所示抗原結合蛋白的LCDR3相比，該LCDR3可至少包含在選自以下位置處的胺基酸取代：在X5和/或X6處的胺基酸取代。
在一些具體的情形中，與SEQ ID NO：77所示抗原結合蛋白的LCDR3相比，該LCDR3可至少包含在X5和/或X6處的胺基酸取代，其中X5處的胺基酸可被取代為S；X6處的胺基酸可被取代為S。
例如，該LCDR3可包含SEQ ID NOs：77-79中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該的抗原結合蛋白可包含框架區L-FR1。該L-FR1的C末端與該LCDR1的N末端相連，且該的L-FR1可包含SEQ ID NO：185所示的胺基酸序列：
DIQMTQSPSTLSX13SVGX17RVTX21TC(SEQ ID NO：185)；其中，X13=T或A；X17=D或H；X21=I或V。例如，該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
在某些情形中，與SEQ ID NO：41所示的抗原結合蛋白的L-FR1相比，該L-FR1可至少包含在選自以下位置處的胺基酸取代：在X13、X17和/或X21處的胺基酸取代。
在某些情形中，與SEQ ID NO：41所示的抗原結合蛋白的L-FR1相比，該L-FR1可至少包含在X13、X17和/或X21處的胺基酸取代，其中，X13處的胺基酸可被取代為A；X17處的胺基酸可被取代為H；X21處的胺基酸可被取代為V。
例如，該L-FR1可包含SEQ ID NOs：41-44中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含L-FR2。該L-FR2位於該LCDR1與該LCDR2之間，且該L-FR2可包含SEQ ID NO：186所示的胺基酸序列：
WYQQX5PGKAPX11LLIY(SEQ ID NO：186)；其中，X5=K或H；X11=K，N或D。例如，該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
在某些情形中，與SEQ ID NO：56所示的抗原結合蛋白的L-FR2相比，該L-FR2至少包含在選自以下位置處的胺基酸取代：在X5和/或X11處的胺基酸取代。
在某些情形中，與SEQ ID NO：56所示的抗原結合蛋白的L-FR2相比，該L-FR2可至少包含在X5和/或X11處的胺基酸取代，其中，X5處的胺基酸可被取代為H；X11處的胺基酸可被取代為D或N。
例如，該L-FR2可包含SEQ ID NOs：56-59中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含L-FR3，該L-FR3位於該LCDR2與該LCDR3之間，且該L-FR3包含SEQ ID NO：187所示的胺基酸序列：
GVPSRFSGX9GSGTEFTLTISSLQPDDFX28TYX31C(SEQ ID NO：187)；其中，X9=S或N；X28=A或T；X31=Y或F。例如，該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
在某些情形中，與SEQ ID NO：69所示的L-FR3相比，該L-FR3可至少包含在選自以下位置處的胺基酸取代：在X9、X28和/或X31處的胺基酸取代。
在某些情形中，與SEQ ID NO：69所示的抗原結合蛋白的L-FR3相比，該L-FR3可至少包含在X9、X28和/或X31處的胺基酸取代，其中，X9處的胺基酸可被取代為N；X28處的胺基酸可被取代為T；X31處的胺基酸可被取代為F。
例如，該L-FR3可包含SEQ ID NOs：69-72中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含L-FR4，該L-FR4的N末端與該LCDR3的C末端相連，且該L-FR4可包含SEQ ID NO：188所示的胺基酸序列：
FGQGTKVEIX10(SEQ ID NO：188)；其中，X10=K或R。例如，該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
在某些情形中，與SEQ ID NO：85所示的抗原結合蛋白的L-FR4相比，該L-FR4至少包含在選自以下位置處的胺基酸取代：在X10處的胺基酸取代。
在某些情形中，與SEQ ID NO：85所示的L-FR4相比，該L-FR4可至少包含在X10處的胺基酸取代，其中，X10處的胺基酸可被取代為R。
例如，該L-FR4可包含SEQ ID NOs：85-86中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含輕鏈可變區VL，且該VL可包含SEQ ID NO：190所示的胺基酸序列：
DIQMTQSPSTLSX13SVGX17RVTX21TCRASQSIX30X31WLAWYQQX39PGKAPX45LLIYKASSLEX56GVPSRFSGX65GSGTEFTLTISSLQPDDFX84TYX87CQQYX 92X93X94SRTFGQGTKVEIX107(SEQ ID NO：190)；其中，X13=T或A；X17=D或H；X21=I或V；X30=F，S或Y；X31=I或S；X39=K或H；X45=K，N或D；X56=S或T；X65=S或N；X84=A或T；X87=Y或F；X92=Y或H；X93=G，T或S；X94=Y或S；X107=K或R。例如，該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
在某些情形中，與SEQ ID NO：108所示的VL相比，該VL可至少包含在選自以下位置處的胺基酸取代：在X13、X17、X21、X30、X31、X39、X45、X56、X65、X84、X87、X92、X93、X94、X107處的胺基酸取代。
在某些情形中，與SEQ ID NO：108所示的VL相比，該VL可至少包含在X13、X17、X21、X30、X31、X39、X45、X56、X65、X84、X87、X92、X93、X94、X107處的胺基酸取代，其中，X13處的胺基酸可被取代為A，X17處的胺基酸可被取代為H，X21處的胺基酸可被取代為V，X30處的胺基酸可被取代為S或Y，X31處的胺基酸可被取代為S，X39處的胺基酸可被取代為H，X45處的胺基酸可被取代為N或D，X56處的胺基酸可被取代為T，X65處的胺基酸可被取代為N，X84處的胺基酸可被取代為T，X87處的胺基酸可被取代為F，X92處的胺基酸可被取代為H，X93處的胺基酸可被取代為T或S，X94處的胺基酸可被取代為S，X107處的胺基酸可被取代為R。
例如，該VL區可包含SEQ ID NOs：108-116和118中任一項所示的胺基酸序列。
在某些情形中，本申請該VL可包含SEQ ID NO：194[ZY5]所示的胺基酸序列：
DIQMTQSPSTLSX13SVGX17RVTX21TCRASQSIX30X31WLAWYQQX39PGKAPX45LLIYKASSLEX56GVPSRFSGX65GSGTEFTLTISSLQPDDFX84TYX87CQQYY X93X94SRTFGQGTKVEIX107(SEQ ID NO：194)；其中，X13=T或A；X17=D或H；X21=I或V；X30=F，S或Y；X31=I或S；X39=K或H；X45=K，N或D；X56=S或T；X65=S或N；X84=A或T；X87=Y或F；X93=G或S；X94=Y或S；X107=K或R。例如，該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
在某些情形中，與SEQ ID NO：108所示的VL相比，該VL可至少包含在選自以下位置處的胺基酸取代：在X13、X17、X21、X30、X31、X39、X45、X56、X65、X84、X87、X93、X94、X107處的胺基酸取代。
在某些情形中，與SEQ ID NO：108所示的VL相比，該VL可至少包含在X13、X17、X21、X30、X31、X39、X45、X56、X65、X84、X87、X93、X94、X107處的胺基酸取代，其中，X13處的胺基酸可被取代為A，X17處的胺基酸可被取代為H，X21處的胺基酸可被取代為V，X30處的胺基酸可被取代為S或Y，X31處的胺基酸可被取代為S，X39處的胺基酸可被取代為H，X45處的胺基酸可被取代為N或D，X56處的胺基酸可被取代為T，X65處的胺基酸可被取代為N，X84處的胺基酸可被取代為T，X87處的胺基酸可被取代為F，X93處的胺基酸可被取代為S，X94處的胺基酸可被取代為S，X107處的胺基酸可被取代為R。
例如，該VL區可包含SEQ ID NOs：108-114、116和118中任一項所示的胺基酸序列。
本申請該抗原結合蛋白可包含輕鏈恆定區CL，且該抗體輕鏈恆定區可包括人Igκ恆定區。例如，該CL區可包含下述所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：170。
本申請該抗原結合蛋白可包含抗體輕鏈LC，該抗體輕鏈可包含SEQ ID NOs：150-158和160-163中任一項所示的胺基酸序列。或者，本申請該 抗原結合蛋白的抗體輕鏈可包含SEQ ID NO：150-156、158和160-163中任一項所示的胺基酸序列。
本申請該抗原結合蛋白可包含抗體重鏈可變區VH中的至少一個CDR。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1，且該HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列：
GFTFSSY(SEQ ID NO：5)。例如，該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR2，且該HCDR2可包含SEQ ID NO：179所示的胺基酸序列：
KQX3X4SE(SEQ ID NO：179)；其中，X3=D或E；X4=G或A。例如，該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
在某些情形中，與SEQ ID NO：14所示抗原結合蛋白的HCDR2相比，該HCDR2可至少包含在選自以下位置處的胺基酸取代：在X3和/或X4處的胺基酸取代。
在某些情形中，與SEQ ID NO：14所示抗原結合蛋白的HCDR2相比，該HCDR2可至少包含在X3和/或X4處的胺基酸取代，其中，X3處的胺基酸可被取代為E，X4處的胺基酸可被取代為A。
例如，該HCDR2可包含SEQ ID NOs：14、16和17中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR3，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：180所示的胺基酸序列：
DRX3VAGAX8X9X10(SEQ ID NO：180)；其中，X3=A或P；X8=F或S；X9=D或A；X10=I或F。例如，該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
在某些情形中，與SEQ ID NO：29所示抗原結合蛋白的HCDR3相比，該HCDR3可至少包含在選自以下位置處的胺基酸取代：在X3、X8、X9和/或X10處的胺基酸取代。
在某些情形中，與SEQ ID NO：29所示抗原結合蛋白的HCDR3相比，該HCDR3可至少包含在X3、X8、X9和/或X10處的胺基酸取代，其中X3處的胺基酸可被取代為P；X8處的胺基酸可被取代為S；X9處的胺基酸可被取代為A；X10處的胺基酸可被取代為F。
例如，該HCDR3可包含SEQ ID NOs：29-33中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含框架區H-FR1。該H-FR1的C末端與該HCDR1的N末端相連，且該H-FR1可包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO：1)。例如，該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含H-FR2，該H-FR2位於該HCDR1與該HCDR2之間，且該H-FR2可包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列：
WMSWVRQAPGKGLEWVANI(SEQ ID NO：9)。例如，該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含H-FR3，該H-FR3位於該HCDR2與該HCDR3之間，且該H-FR3可包含SEQ ID NO：184[YH3]所示的胺基酸序列：
KYYX4DSVKGRFTISRDNAKNSX22YLQMNSLRAEX33TAVX37YCAR(SEQ ID NO：184)；其中，X4=V或G；X22=L或Q；X33=D或E；X37=Y或F。例如，該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
在某些情形中，與SEQ ID NO：21所示的H-FR3相比，該H-FR3可至少包含在選自以下位置處的胺基酸取代：在X4、X22、X33和/或X37處的胺基酸取代。
在某些情形中，與SEQ ID NO：21所示的抗體的H-FR3相比，該H-FR3可至少包含在X4、X22、X33和/或X37處的胺基酸取代，其中，X4處的胺基酸可被取代為G；X22處的胺基酸可被取代為Q；X33處的胺基酸可被取代為E；X37處的胺基酸可被取代為F。
例如，該H-FR3可包含SEQ ID NOs：21-24中任一項所示的胺基酸序列。
或者，本申請該H-FR3可包含SEQ ID NO：192所示的胺基酸序列：
KYYX4DSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEX33TAVX37YCAR(SEQ ID NO：192)；其中，X4=V或G；X33=D或E；X37=Y或F。例如，該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
在某些情形中，與SEQ ID NO：21所示的H-FR3相比，該H-FR3可至少包含在選自以下位置處的胺基酸取代：在X4、X33和/或X37處的胺基酸取代。
在某些情形中，與SEQ ID NO：21所示的抗體的H-FR3相比，該H-FR3可至少包含在X4、X33和/或X37處的胺基酸取代，其中，X4處的胺基酸可被取代為G；X33處的胺基酸可被取代為E；X37處的胺基酸可被取代為F。
例如，該H-FR3可包含SEQ ID NOs：21-22和24中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含H-FR4，該H-FR4的N末端與該HCDR3的C末端相連，且該H-FR4可包含SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列：
WGQGTMVTVSS(SEQ ID NO：38)。例如，該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含重鏈可變區VH，且該VH可包含SEQ ID NO：189所示的胺基酸序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQX54X55SEKYYX61DSVKGRFTISRDNAKNSX79YLQMNSLRAEX90TAVX94YCARDRX101VAGAX106X107X108WGQGTMVTVSS(SEQ ID NO：189)；其中，X54=D或E；X55=G或A；X61=V或G；X79=L或Q；X90=D或E，X94=Y或F；X101=A或P；X106=F或S；X107=D或A；X108=I或F。例如，該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
在某些情形中，與SEQ ID NO：90所示的VH相比，該VH可至少包含在選自以下位置處的胺基酸取代：在X54、X55、X61、X79、X90、X94、X101、X106、X107和/或X108處的胺基酸取代。
在某些情形中，與SEQ ID NO：90所示的VH相比，該VH可至少包含在X54、X55、X61、X79、X90、X94、X101、X106、X107和/或X108處的胺基酸取代，其中，X54處的胺基酸可被取代為E，X55處的胺基酸可被取代為A，X61處的胺基酸可被取代為G，X79處的胺基酸可被取代為Q，X90處的胺基酸可被取代為E，X94處的胺基酸可被取代為F，X101處的胺基酸可被取代為P，X106處的胺基酸可被取代為S，X107處的胺基酸可被取代為A，X108處的胺基酸可被取代為F。
例如，該VH區可包含SEQ ID NOs：90-95和97-104中任一項所示的胺基酸序列。
在某些情形中，本申請該VH可包含SEQ ID NO：193[ZY9]所示的胺基酸序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQX54X55SEKYYX61DSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEX90TAVX94YCARDRX101VAGAX106X107X108WGQGTMVTVSS(SEQ ID NO：193)；其中，X54=D或E；X55=G或A；X61=V或G；X90=D或E，X94=Y或F；X101=A或P；X106=F或S；X107=D或A；X108=I或F。例如，該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
在某些情形中，與SEQ ID NO：90所示的VH相比，該VH可至少包含在選自以下位置處的胺基酸取代：在X54、X55、X61、X90、X94、X101、X106、X107和/或X108處的胺基酸取代。
在某些情形中，與SEQ ID NO：90所示的VH相比，該VH可至少包含在X54、X55、X61、X90、X94、X101、X106、X107和/或X108處的胺基酸取代，其中，X54處的胺基酸可被取代為E，X55處的胺基酸可被取代為A，X61處的胺基酸可被取代為G，X90處的胺基酸可被取代為E，X94處的胺基酸可被取代為F，X101處的胺基酸可被取代為P，X106處的胺基酸可被取代為S，X107處的胺基酸可被取代為A，X108處的胺基酸可被取代為F。
例如，該VH區可包含SEQ ID NOs：90-93、95和97-104中任一項所示的胺基酸序列。
本申請該抗原結合蛋白可包含重鏈恆定區CH，且該抗體重鏈恆定區可以包含人IgG恆定區。在某些情形中，該人IgG恆定區可包含人IgG1恆定區。該人IgG1恆定區可包括天然和人工合成的IgG1恆定區或其突變體。該突變可包含以下一個或多個位置的突變：L234，L235，N297或K447。例如，可包含一個、兩個或更多位置處的突變。突變可包括胺基酸的缺失、插入或置換。例如，該人IgG1恆定區可包括的突變如下：1)N297A，2)K447缺失，3)N297A和K447缺失，4)L234A，L235A和K447缺失。例如，該融合蛋白的人IgG1恆定區可包含SEQ ID NOs：172-175中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含LCDR1-3。其中，該LCDR1可包含SEQ ID NO：181所示的胺基酸序列；該LCDR2可包含SEQ ID NO：182所示的胺基酸序列；且該LCDR3可包含SEQ ID NO：183所示的胺基酸 序列。或者，本申請該抗原結合蛋白的LCDR1可包含SEQ ID NO：181所示的胺基酸序列；該LCDR2可包含SEQ ID NO：182所示的胺基酸序列；且該LCDR3可包含SEQ ID NO：191所示的胺基酸序列。
在某些情形中，本申請該抗原結合蛋白的該LCDR1可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：48-51：該LCDR2可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：63-64；且該LCDR3可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：77-80。在另一些情形中，本申請該抗原結合蛋白的該LCDR1可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：48-51；該LCDR2可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：63-64；且該LCDR3可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：77-79。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000064相同的LCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：48所示的胺基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列，且LCDR3可包含SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000065相同的LCDR1-3，其中LCDR1可包含SEQ ID NO：49所示的胺基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，LCDR3可包含SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000066、PR000261、PR000262相同的LCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：48所示的胺基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，且LCDR3可包含SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000067相同的LCDR1-3，其中LCDR1可包含SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列，LCDR3可包含SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000068相同的LCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列，且LCDR3可包含SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000069、PR000263、PR000264相同的LCDR1-3，其中LCDR1可包含SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列，LCDR3可包含SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000070、PR000265、PR000266相同的LCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，且LCDR3可包含SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000071相同的LCDR1-3，其中LCDR1可包含SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列，LCDR3可包含SEQ ID NO：80所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000072、PR000267、PR000268相同的LCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：50所示的胺基酸 序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，LCDR3可包含SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含L-FR1-4。其中，該L-FR1可包含SEQ ID NO：185所示的胺基酸序列；該L-FR2可包含SEQ ID NO：186所示的胺基酸序列；該L-FR3可包含SEQ ID NO：187所示的胺基酸序列；且該L-FR4可包含SEQ ID NO：188所示的胺基酸序列。
在某些情形中，本申請該抗原結合蛋白的該L-FR1可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：41-44；該L-FR2可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：56-59；該L-FR3可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：69-72；且該L-FR4可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：85-86。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000064相同的L-FR1-4。其中L-FR1可包含SEQ ID NO：41所示的胺基酸序列，L-FR2可包含SEQ ID NO：56所示的胺基酸序列，L-FR3可包含SEQ ID NO：69所示的胺基酸序列，且L-FR4可包含SEQ ID NO：85所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000065相同的L-FR1-4。其中L-FR1可包含SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列，L-FR2可包含SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列，L-FR3可包含SEQ ID NO：69所示的胺基酸序列，且L-FR4可包含SEQ ID NO：85所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000066相同的L-FR1-4。其中L-FR1可包含SEQ ID NO：43所示的胺基酸序列，L-FR2可包含SEQ ID NO：58所示的胺基酸序列，L-FR3可包含SEQ ID NO：70所示的胺基酸序列，且L-FR4可包含SEQ ID NO：85所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000067相同的L-FR1-4。其中L-FR1可包含SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列，L-FR2可包含SEQ ID NO：56所示的胺基酸序列，L-FR3可包含SEQ ID NO：69所示的胺基酸序列，且L-FR4可包含SEQ ID NO：85所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000068相同的L-FR1-4。其中L-FR1可包含SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列，L-FR2可包含SEQ ID NO：56所示的胺基酸序列，L-FR3可包含SEQ ID NO：71所示的胺基酸序列，且L-FR4可包含SEQ ID NO：85所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000071相同的L-FR1-4。其中L-FR1可包含SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列，L-FR2可包含SEQ ID NO：56所示的胺基酸序列，L-FR3可包含SEQ ID NO：69所示的胺基酸序列，且L-FR4可包含SEQ ID NO：85所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000069、PR000263、PR000264相同的L-FR1-4。其中L-FR1可包含SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列，L-FR2可包含SEQ ID NO：59所示的胺基酸序列，L-FR3可包含SEQ ID NO：72所示的胺基酸序列，且L-FR4可包含SEQ ID NO：86所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000070、PR000265、PR000266相同的L-FR1-4。其中L-FR1可包含SEQ ID NO：44所示的胺基酸序列，L-FR2可包含SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列，L-FR3可包含SEQ ID NO：69所示的胺基酸序列，且L-FR4可包含SEQ ID NO：85所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000072、PR000267、PR000268相同的L-FR1-4。其中L-FR1可包含SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列，L-FR2可包含SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列，L-FR3可包含SEQ ID NO：69所示的胺基酸序列，且L-FR4可包含SEQ ID NO：85所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000261、PR000262相同的L-FR1-4。其中L-FR1可包含SEQ ID NO：43所示的胺基酸序列，L-FR2可包含SEQ ID NO：58所示的胺基酸序列，L-FR3可包含SEQ ID NO：69所示的胺基酸序列，且L-FR4可包含SEQ ID NO：85所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR1-3。其中，該HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列；該HCDR2可包含SEQ ID NO：179所示的胺基酸序列；且該HCDR3可包含SEQ ID NO：180所示的胺基酸序列。
在某些情形中，本申請該抗原結合蛋白的該HCDR1可包含下述所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：5；該HCDR2可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：14、16和17；且該HCDR3可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：29-33。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000064、PR000065、PR000067、PR000070相同的HCDR1-3。其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000066相同的HCDR1-3。其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000068相同的HCDR1-3。其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000069相同的HCDR1-3。其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000071、PR000072相同的HCDR1-3。其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000261相同的HCDR1-3。其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000262同的HCDR1-3。其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000263相同的HCDR1-3。其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000264同的HCDR1-3。其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000265相同的HCDR1-3。其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000266相同的HCDR1-3。其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000267相同的HCDR1-3。其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000268相同的HCDR1-3。其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含H-FR1-4。其中，該H-FR1可包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列；該H-FR2可包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列；該H-FR3可包含SEQ ID NO：184所示的胺基酸序列；且該H-FR4可包含SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列。或者，該H-FR1可包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列；該H-FR2可包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列；該H-FR3可包含SEQ ID NO：192所示的胺基酸序列；且該H-FR4可包含SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列。
在某些情形中，本申請該抗原結合蛋白的該H-FR1可包含下述所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：1；該H-FR2可包含下述所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：9；該H-FR3可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：21-24；且該H-FR4可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：38。在另一些情形中，本申請該抗原結合蛋白的該H-FR1可包含下述所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：1；該H-FR2可包含下述所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：9；該H-FR3可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：21-22和24；且該H-FR4可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：38。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含H-FR1-4，其中該H-FR1可包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，該H-FR2可包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，該H-FR3可包含SEQ ID NO：21所示的胺基酸序列，且該H-FR4可包含SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含H-FR1-4，其中該H-FR1可包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，該H-FR2可包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，該H-FR3可包含SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列，且該H-FR4可包含SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含H-FR1-4，其中該H-FR1可包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，該H-FR2可包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，該H-FR3可包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列，且該H-FR4可包含SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含H-FR1-4，其中該H-FR1可包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，該H-FR2可包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，該H-FR3可包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列，且該H-FR4可包含SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含LCDR1-3和HCDR1-3。其中，該LCDR1可包含SEQ ID NO：181所示的胺基酸序列；該LCDR2可包含SEQ ID NO：182所示的胺基酸序列；且該LCDR3可包含SEQ ID NO：183所示的胺基酸序列；該HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列；該HCDR2可包含SEQ ID NO：179所示的胺基酸序列；且該HCDR3可包含SEQ ID NO：180所示的胺基酸序列。或者，該LCDR1可包含SEQ ID NO：181所示的胺基酸序列；該LCDR2可包含SEQ ID NO：182所示的胺基酸序列；且該LCDR3可包含SEQ ID NO：191所示的胺基酸序列；該HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列；該HCDR2可包含SEQ ID NO：179所示的胺基酸序列；且該HCDR3可包含SEQ ID NO：180所示的胺基酸序列。
在某些情形中，本申請該抗原結合蛋白的該LCDR1可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NOs：48-51；該LCDR2可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NOs：63-64；且該LCDR3可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NOs：77-80；該HCDR1可包含下述所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：5；該HCDR2可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NOs：14、16和17；且該HCDR3可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NOs：29-33。在另一些情形中，本申請該抗原結合蛋白的該LCDR1可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NOs：48-51；該LCDR2可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NOs：63-64；且該LCDR3可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NOs：77-79；該HCDR1可包含下述所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：5：該HCDR2可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NOs：14、16和17；且該HCDR3可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NOs：29-33。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000064相同的LCDR1-3和HCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：48所示的胺基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列，且LCDR3可包含SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列，其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000065相同的LCDR1-3和HCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：49所示的胺基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，LCDR3可包含SEQ ID NO：78所示 的胺基酸序列，其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000066相同的LCDR1-3和HCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：48所示的胺基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，且LCDR3可包含SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列，其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000067相同的LCDR1-3和HCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列；LCDR2可包含SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列；LCDR3可包含SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列，其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000068相同的LCDR1-3和HCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列，且LCDR3可包含SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列，其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000069相同的LCDR1-3和HCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列；LCDR2可包含SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列；LCDR3可包含SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列，其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000070相同的LCDR1-3和HCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，且LCDR3可包含SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列，其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000071相同的LCDR1-3和HCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列，且LCDR3可包含SEQ ID NO：80所示的胺基酸序列，其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000072相同的LCDR1-3和HCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，LCDR3可包含SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列，其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，HCDR2 可包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000261相同的LCDR1-3和HCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：48所示的胺基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，且LCDR3可包含SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列，其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000262相同的LCDR1-3和HCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：48所示的胺基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，且LCDR3可包含SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列，其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000263相同的LCDR1-3和HCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列，LCDR3可包含SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列，其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000264相同的LCDR1-3和HCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列，LCDR2 可包含SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列，LCDR3可包含SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列，其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000265和PR000416相同的LCDR1-3和HCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，且LCDR3可包含SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列，其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000266相同的LCDR1-3和HCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，且LCDR3可包含SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列，其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000267相同的LCDR1-3和HCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，LCDR3可包含SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列，其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000268相同的LCDR1-3和HCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，LCDR3可包含SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列，其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含輕鏈可變區VL和重鏈可變區VH。該VL可包含SEQ ID NO：194所示的胺基酸序列，且該VH可包含SEQ ID NO：193所示的胺基酸序列。或者，該VL可包含SEQ ID NO：190所示的胺基酸序列，且該VH可包含SEQ ID NO：189所示的胺基酸序列。
在某些情形中，該抗原結合蛋白的該VL可包含SEQ ID NOs：108-116和118中任一項所示的胺基酸序列，且該VH可包含SEQ ID NOs：90-95、97-104中任一項所示的胺基酸序列。在另一些情形中，該抗原結合蛋白的該VL可包含SEQ ID NOs：108-114、116和118中任一項所示的胺基酸序列，且該VH可包含SEQ ID NOs：90-93、95和97-104中任一項所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000064相同的VL和VH，其中，該VL可包含SEQ ID NO：108所示的胺基酸序列，且該VH可包含SEQ ID NO：90所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000065相同的VL和VH，其中，該VL可包含SEQ ID NO：109所示的胺基酸序列，且該VH可包含SEQ ID NO：90所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000066相同的VL和VH，其中，該VL可包含SEQ ID NO：110所示的胺基酸序列，且該VH可包含SEQ ID NO：91所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000067相同的VL和VH，其中，該VL可包含SEQ ID NO：111所示的胺基酸序列，且該VH可包含SEQ ID NO：90所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000068相同的VL和VH，其中，該VL可包含SEQ ID NO：112所示的胺基酸序列，且該VH可包含SEQ ID NO：92所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000069相同的VL和VH，其中，該VL可包含SEQ ID NO：113所示的胺基酸序列，且該VH可包含SEQ ID NO：93所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000070相同的VL和VH，其中，該VL可包含SEQ ID NO：114所示的胺基酸序列，且該VH可包含SEQ ID NO：90所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000071相同的VL和VH，其中，該VL可包含SEQ ID NO：115所示的胺基酸序列，且該VH可包含SEQ ID NO：94所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000072相同的VL和VH，其中，該VL可包含SEQ ID NO：116所示的胺基酸序列，且該VH可包含SEQ ID NO：95所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000261相同的VL和VH，其中，該VL可包含SEQ ID NO：118所示的胺基酸序列，且該VH可包含SEQ ID NO：97所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000262相同的VL和VH，其中，該VL可包含SEQ ID NO：118所示的胺基酸序列，且該VH可包含SEQ ID NO：98所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000263相同的VL和VH，其中，該VL可包含SEQ ID NO：113所示的胺基酸序列，且該VH可包含SEQ ID NO：99所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000264相同的VL和VH，其中，該VL可包含SEQ ID NO：113所示的胺基酸序列，且該VH可包含SEQ ID NO：100所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000265或PR000416相同的VL和VH，其中，該VL可包含SEQ ID NO：114所示的胺基酸序列，且該VH可包含SEQ ID NO：101所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000266相同的VL和VH，其中，該VL可包含SEQ ID NO：114所示的胺基酸序列，且該VH可包含SEQ ID NO：102所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000267相同的VL和VH，其中，該VL可包含SEQ ID NO：116所示的胺基酸序列，且該VH可包含SEQ ID NO：103所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000268相同的VL和VH，其中，該VL可包含SEQ ID NO：116所示的胺基酸序列，且該VH可包含SEQ ID NO：104所示的胺基酸序列。
在某些情形中，該抗原結合蛋白可包含輕鏈恆定區和重鏈恆定區，其中，該輕鏈恆定區可包含SEQ ID NO：170所示的胺基酸序列，且該重鏈恆定區可包含SEQ ID NOs：172-175中任一項所示的胺基酸序列。
在某些情形中，該抗原結合蛋白可包含抗體輕鏈LC和抗體重鏈HC，其中，該抗體輕鏈LC可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：150-158和160-163，且該抗體重鏈HC可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：122-127和129-137。
在某些情形中，該抗原結合蛋白可包含抗體輕鏈LC和抗體重鏈HC，其中，該抗體輕鏈LC可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：150-156、158和160-163，且該抗體重鏈HC可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：122-125、127和129-137。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000064相同的LC和HC，其中，該LC可包含SEQ ID NO：150所示的胺基酸序列，且該HC可包含SEQ ID NO：122所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000065相同的LC和HC，其中，該LC可包含SEQ ID NO：151所示的胺基酸序列，且該HC可包含SEQ ID NO：122所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000066相同的LC和HC，其中，該LC可包含SEQ ID NO：152所示的胺基酸序列，且該HC可包含SEQ ID NO：123所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000067相同的LC和HC，其中，該LC可包含SEQ ID NO：153所示的胺基酸序列，且該HC可包含SEQ ID NO：122所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000068相同的LC和HC，其中，該LC可包含SEQ ID NO：154所示的胺基酸序列，且該HC可包含SEQ ID NO：124所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000069相同的LC和HC，其中，該LC可包含SEQ ID NO：155所示的胺基酸序列，且該HC可包含SEQ ID NO：125所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000070相同的LC和HC，其中，該LC可包含SEQ ID NO：156所示的胺基酸序列，且該HC可包含SEQ ID NO：122所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000071相同的LC和HC，其中，該LC可包含SEQ ID NO：157所示的胺基酸序列，且該HC可包含SEQ ID NO：126所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000072相同的LC和HC，其中，該LC可包含SEQ ID NO：158所示的胺基酸序列，且該HC可包含SEQ ID NO：127所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000261相同的LC和HC，其中，該LC可包含SEQ ID NO：160所示的胺基酸序列，且該HC可包含SEQ ID NO：129所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000262相同的LC和HC，其中，該LC可包含SEQ ID NO：160所示的胺基酸序列，且該HC可包含SEQ ID NO：130所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000263相同的LC和HC，其中，該LC可包含SEQ ID NO：161所示的胺基酸序列，且該HC可包含SEQ ID NO：131所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000264相同的LC和HC，其中，該LC可包含SEQ ID NO：161所示的胺基酸序列，且該HC可包含SEQ ID NO：132所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000265相同的LC和HC，其中，該LC可包含SEQ ID NO：162所示的胺基酸序列，且該HC可包含SEQ ID NO：133所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000266相同的LC和HC，其中，該LC可包含SEQ ID NO：162所示的胺基酸序列，且該HC可包含SEQ ID NO：134所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000267相同的LC和HC，其中，該LC可包含SEQ ID NO：163所示的胺基酸序列，且該HC可包含SEQ ID NO：135所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000268相同的LC和HC，其中，該LC可包含SEQ ID NO：163所示的胺基酸序列，且該HC可包含SEQ ID NO：136所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含與PR000416相同的LC和HC，其中，該LC可包含SEQ ID NO：162所示的胺基酸序列，且該HC可包含SEQ ID NO：137所示的胺基酸序列。
特定抗PD-L1抗體
本申請的分離的抗原結合蛋白，其可與特定抗PD-L1抗體競爭結合PD-L1。在本申請中，該特定抗PD-L1抗體可包含LCDR1-3。其中，該LCDR1可包含SEQ ID NO：181所示的胺基酸序列；該LCDR2可包含SEQ ID NO：182所示的胺基酸序列；且該LCDR3可包含SEQ ID NO：191所示的胺基酸序列。在某些情形中，本申請該特定抗PD-L1抗體的該LCDR1可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NOs：48-51；該LCDR2可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NOs：63-64；且該LCDR3可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NOs：77-79。
在本申請中，該特定抗PD-L1抗體可包含HCDR1-3。其中，該HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列；該HCDR2可包含SEQ ID NO：179所示的胺基酸序列；且該HCDR3可包含SEQ ID NO：180所示的胺基酸序列。在某些情形中，本申請該特定抗PD-L1抗體的該HCDR1可包含下述所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：5；該HCDR2可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NOs：14、16和17；且該HCDR3可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NOs：29-33。
在本申請中，該特定抗PD-L1抗體可包含LCDR1-3和HCDR1-3。其中，該LCDR1可包含SEQ ID NO：181所示的胺基酸序列；該LCDR2可包含SEQ ID NO：182所示的胺基酸序列；且該LCDR3可包含SEQ ID NO：191所示的胺基酸序列；該HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列；該HCDR2可包含SEQ ID NO：179所示的胺基酸序列；且該HCDR3可包含SEQ ID NO：180所示的胺基酸序列。在某些情形中，本申請該特定抗PD-L1抗體的該LCDR1可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NOs：48-51；該LCDR2可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NOs：63-64；且該LCDR3可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NOs：77-79；該HCDR1可包含下述所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：5；該HCDR2可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NOs：14、16和17；且該HCDR3可包含下述任一項中所示的胺基酸序列：SEQ ID NOs：29-33。
在本申請中，該特定抗PD-L1抗體可包含輕鏈可變區VL和重鏈可變區VH。該VL可包含SEQ ID NO：194所示的胺基酸序列，且該VH可包含SEQ ID NO：193所示的胺基酸序列。在某些情形中，該特定抗PD-L1抗體的該VL可包含SEQ ID NOs：108-114、116和118中任一項所示的胺基酸序列，且該VH可包含SEQ ID NOs：90-93、95、97-104中任一項所示的胺基酸序列。
檢測方法
可藉由本領域已知的各種測定鑒別、篩選或表徵本申請的PD-L1抗原結合蛋白或融合蛋白的物理/化學特性和/或生物活性。
在一個方面，例如可藉由已知方法諸如酶聯免疫吸附測定(ELISA)、免疫印跡(例如，蛋白質印跡)、流式細胞術(例如，FACS)、免疫組織化學、免疫螢光等來測試本申請抗原結合蛋白或融合蛋白的抗原結合活性。
本申請中，該分離的抗原結合蛋白能夠以1×10-8M或更低的KD值結合源自靈長類動物的PD-L1。該靈長類動物PD-L1抗原結合蛋白對PD-L1的結合親和力可藉由本領域已知的任何方法測定。在某些情形中，結合親和力可藉由表面等離子共振法(SPR)、酶聯免疫法(ELISA)、結合抗原沉澱法、平衡透析法、生物膜干涉(BLI)測定。在某些情形中，PD-L1抗原結合蛋白對PD-L1的結合親和力和KD值可藉由生物膜干涉(BLI)測定。例如，可使用ForteBio Octet分子相互作用分析儀，來進行抗原抗體之間的結合動力學分析。
本申請中，該分離的抗原結合蛋白能夠以1×10-8M或更低的KD值結合源自靈長類動物的PD-L1。例如，該KD的值可以以約1×10-8M或以下、約9×10-9M或以下、約8×10-9M或以下、約7×10-9M或以下、約6×10-9M或以下、約5×10-9M或以下、約4×10-9M或以下、約3×10-9M或以下、約2×10-9M或以下、約1×10-9M或以下的值結合源自人的PD-L1，例如，使用使用FortieBio Octet分子相互作用分析儀所檢測的。
在另一情形中，本申請該PD-L1抗原結合蛋白與PD-L1的結合活性可使用流式細胞術或酶聯免疫法測定進行檢測。例如，在FACS檢測中，使用穩定表達人PD-L1的宿主細胞(如CHOK1細胞)，該PD-L1抗原結合蛋白與PD-L1的EC50值在約0.0001nM至約100nM之間，例如，約0.001nM至約10nM之間，約0.01nM至約10nM之間，約0.05nM至約5nM之間，約0.05nM至約 1nM之間。又例如，在ELISA中，使用人PD-L1抗原蛋白，該PD-L1抗原結合蛋白與PD-L1的EC50值在約0.0001nM至約100nM之間，例如，約0.001nM至約10nM之間，約0.001nM至約5nM之間，約0.001nM至約1nM之間，約0.01nM至約0.5nM之間，約0.01nM至約0.1nM之間。
在另一個方面，競爭測定可用來鑒別與本申請的任一種抗原結合蛋白競爭結合到PD-L1的抗體。在某些情形中，這種競爭性抗體結合到與由本申請的任一種抗原結合蛋白所結合的重疊表位元(例如，線性或構象表位元)。用於對抗原結合蛋白所結合到的表位進行作圖的示例性方法包括但不限於X射線共晶體和低溫電子顯微鏡法(cryo-EM)、基於陣列的寡肽掃描法、定點誘變作圖、交聯耦合質譜法和生物膜干涉法。
在另一個方面，本申請的抗原結合蛋白能夠阻斷PD-1與PD-L1的結合。在某些情形中，該抗原結合蛋白阻斷PD-1與PD-L1的結合可藉由流式細胞技術FACS、酶聯免疫法ELISA測定。例如，首先將穩定表達PD-L1的宿主細胞(如CHOK1細胞)與遞減量的未標記的該抗原結合蛋白孵育，隨後用生物素標記的PD-1蛋白孵育。然後，使用FACS分析細胞，以證實該抗原結合蛋白阻斷PD-1與PD-L1結合。又例如，首先將PD-L1抗原蛋白包被在板上，將遞減量的未標記的該抗原結合蛋白和生物素標記的PD-1蛋白混合後，共同孵育。然後，使用ELISA分析細胞，以證實該抗原結合蛋白可以阻斷PD-1和PD-L1的結合。
在另一個方面，本申請的抗原結合蛋白能夠阻斷CD80與PD-L1的結合。在某些情形中，該抗原結合蛋白阻斷CD80與PD-L1的結合可藉由流式細胞技術FACS、酶聯免疫法ELISA測定。例如，首先將穩定表達PD-L1的 宿主細胞(如CHOK1細胞)與遞減量的未標記的該抗原結合蛋白孵育，隨後用生物素標記的CD80蛋白孵育。然後，使用FACS分析細胞，以證實該抗原結合蛋白阻斷CD80與PD-L1結合。又例如，首先將PD-L1抗原蛋白包被在板上，將遞減量的未標記的該抗原結合蛋白和生物素標記的CD80蛋白混合後，共同孵育。然後，使用ELISA分析細胞，以證實該抗原結合蛋白可以阻斷CD80和PD-L1的結合。
本申請該抗原結合蛋白能夠刺激免疫細胞中IFN-γ和/或IL2的分泌。該免疫細胞可包括淋巴細胞，例如B細胞、T細胞，天然殺傷細胞，髓樣細胞，例如單核細胞、巨噬細胞、肥大細胞、嗜堿細胞和粒細胞。可用本領域任何技術人員已知的方法測定免疫細胞中細胞因子的分泌，例如，藉由酶聯免疫法(ELISA)定量測定免疫細胞(例如T細胞)增殖情況或由免疫細胞產生的細胞因子(例如由T細胞產生的IFN-γ或IL-2)。
對照抗體
本申請該抗原結合蛋白與對照抗體相比，能夠結合與源自靈長類動物的PD-L1的不完全重疊的表位。在某些情形中，該對照抗體可以是抗PD-L1抗體avelumab，即，本申請該抗體PR001598。PR001598可包含輕鏈可變區和重鏈可變區，該對照抗體的輕鏈可變區可包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1包含SEQ ID NO：53所示的胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：66所示的胺基酸序列，該LCDR3包含SEQ ID NO：82所示的胺基酸序列；該對照抗體的重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列，該HCDR3包含SEQ ID NO：35所示的胺基酸序列；該對照抗體的輕鏈可變區包含SEQ ID NO：119所示的胺基酸序列，該對照抗體的重鏈可變區包含SEQ ID NO：105所示的胺基酸序列。
在另一些情形中，該對照抗體可以是抗PD-L1抗體atezolizumab，即，本申請該抗體PR000151。PR000151可包含輕鏈可變區和重鏈可變區，該對照抗體的輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1包含SEQ ID NO：52所示的胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：65所示的胺基酸序列，該LCDR3包含SEQ ID NO：81所示的胺基酸序列；該對照抗體的重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列，該HCDR3包含SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列；該對照抗體的輕鏈可變區包含SEQ ID NO：117所示的胺基酸序列，該對照抗體的重鏈可變區包含SEQ ID NO：96所示的胺基酸序列。
在另一些情形中，該對照抗體可以是Hengrui融合蛋白9，即，本申請該抗體PR002466。PR002466可包含輕鏈可變區和重鏈可變區，該對照抗體的輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1包含SEQ ID NO：55所示的胺基酸序列；該LCDR2包含SEQ ID NO：68所示的胺基酸序列；該LCDR3包含SEQ ID NO：84所示的胺基酸序列，該對照抗體的重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1包含SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列；該HCDR2包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列；該HCDR3包含SEQ ID NO：37所示的胺基酸序列；該對照抗體的輕鏈可變區包含SEQ ID NO：121所示的胺基酸序列，該對照抗體的重鏈可變區包含SEQ ID NO：107所示的胺基酸序列。
本領域測定表位的方法包括但不限於合成肽法，免疫資訊學預測法，多肽活性測定，表位元肽掃描技術，蛋白質切割法，噬菌體展示技術，X射線衍射與核磁共振分析，以及利用電腦軟體進行表位元預測。在某些實施方式中，可以使用基於生物膜干涉法(BLI)Octet分子相互作用分析平臺進行本申請該抗原結合蛋白與該對照抗體對抗原表位的競爭性結合。例如，將第一種抗體與抗原混合，再加入第二種抗體，利用ForteBio Octet測定第二種抗體對第一種抗體的競爭性抑制率，當競爭性抑制率低於85%時(例如，低於84%、低於83%、低於80%或更低)，可以說第一抗體與第二種抗體結合抗原的表位不完全重疊。
融合蛋白
另一方面，本申請提供了一種融合蛋白，其可包含：a)人TGFBRII或其片段；以及b)本申請上文的抗原結合蛋白。
本申請該融合蛋白的該人TGFBRII或其片段可包含人TGFBRII的胞外結構域。在某些情形中，該人TGFBRII或其片段可包含SEQ ID NOs：176-178中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該融合蛋白可包含本申請的分離的抗原結合蛋白。該分離的抗原結合蛋白可包含輕鏈可變區VL和重鏈可變區VH。在某些情形中，該VL可包含SEQ ID NO：190所示的胺基酸序列，且該VH可包含SEQ ID NO：189所示的胺基酸序列。
該分離的抗原結合蛋白還可包含抗體重鏈恆定區，且該重鏈恆定區可以包含人IgG恆定區。在某些情形中，該人IgG恆定區可包含人IgG1恆定區。該人IgG1恆定區可包括天然和人工合成的IgG1恆定區或其突變體。該突變可包含以下一個或多個位置的突變：L234，L235，N297或K447。例如，可包 含一個、兩個或更多位置處的突變。突變可包括胺基酸的缺失、插入或置換。例如，該人IgG1恆定區可包括的突變如下：1)N297A，2)K447缺失，3)N297A和K447缺失，4)L234A，L235A和K447缺失。例如，該融合蛋白的人IgG1恆定區可包含SEQ ID NOs：172-175中任一項所示的胺基酸序列。
本申請該融合蛋白的分離的抗原結合蛋白可包含抗體重鏈或其片段。在某些情形中，該抗體重鏈或其片段可包含下述任一項中所示的胺基酸序列或其一部分：SEQ ID NOs：122-127和129-137。例如，該抗體重鏈或其片段可包含下述任一項中所示的胺基酸序列或其一部分：SEQ ID NOs：122和133-137。本申請該融合蛋白的分離的抗原結合蛋白可包含抗體輕鏈或其片段。在某些情形中，該抗體輕鏈或其片段可包含下述任一項中所示的胺基酸序列或其一部分：SEQ ID NOs：150-158和160-163。例如，該抗體輕鏈或其片段可包含下述任一項中所示的胺基酸序列或其一部分：SEQ ID NOs：156和162-163。該融合蛋白的該重鏈或其片段與該輕鏈或其片段組合後可形成特異性結合PD-L1的抗原結合部分。
本申請該融合蛋白包含的該抗原結合蛋白的該抗體重鏈或其片段與該人TGFBRII或其片段框內融合而形成融合多肽。在某些情形中，該抗體重鏈或其片段的N端可以直接或間接與該人TGFBRII或其片段的C端連接。在某些情形中，該抗體重鏈或其片段的C端可以直接或間接與該人TGFBRII或其片段的N端連接。例如，該抗體重鏈或其片段的C端可以直接與該人TGFBRII或其片段的N端連接。在另一些情形中，該抗體重鏈或其片段可以藉由連接子與該人TGFBRII或其片段相連，例如，該肽連接子可包含SEQ ID NOs：167-169中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該融合蛋白可包含第一多肽和第二多肽。該第一多肽可包含該分離的抗原結合蛋白的重鏈或其片段以及該人TGFBRII或其片段。在某些情形中，該第一多肽從N端至C端可以包括該抗原結合片段的重鏈或其片段，該肽連接子，以及該人TGFBRII或其片段。例如，該第一多肽可包含SEQ ID NOs：138-139、142-143和145-148中任一項所示的胺基酸序列。該第二多肽可包含該分離的抗原結合蛋白的輕鏈或其片段，例如，該第二多肽可包含SEQ ID NOs：162-163中任一項所示的胺基酸序列。
例如，該融合蛋白的該第一多肽可包含SEQ ID NO：138所示的胺基酸序列，且該第二多肽可包含SEQ ID NO：162所示的胺基酸序列，例如，該融合蛋白可包含與PR001487相同的第一多肽和第二多肽；
該第一多肽可包含SEQ ID NO：139所示的胺基酸序列，且該第二多肽可包含SEQ ID NO：162所示的胺基酸序列，例如，該融合蛋白可包含與PR001488相同的第一多肽和第二多肽；
該第一多肽可包含SEQ ID NO：142所示的胺基酸序列，且該第二多肽可包含SEQ ID NO：162所示的胺基酸序列，例如，該融合蛋白可包含與PR001901相同的第一多肽和第二多肽；
該第一多肽可包含SEQ ID NO：143所示的胺基酸序列，且該第二多肽可包含SEQ ID NO：162所示的胺基酸序列，例如，該融合蛋白可包含與PR001902相同的第一多肽和第二多肽；
該第一多肽可包含SEQ ID NO：145所示的胺基酸序列，且該第二多肽可包含SEQ ID NO：163所示的胺基酸序列，例如，該融合蛋白可包含與PR002247相同的第一多肽和第二多肽；
該第一多肽可包含SEQ ID NO：146所示的胺基酸序列，且該第二多肽可包含SEQ ID NO：163所示的胺基酸序列，例如，該融合蛋白可包含與PR002248相同的第一多肽和第二多肽；
該第一多肽可包含SEQ ID NO：147所示的胺基酸序列，且該第二多肽可包含SEQ ID NO：162所示的胺基酸序列，例如，該融合蛋白可包含與PR002249相同的第一多肽和第二多肽；
該第一多肽可包含SEQ ID NO：148所示的胺基酸序列，且該第二多肽可包含SEQ ID NO：162所示的胺基酸序列，例如，該融合蛋白可包含與PR002251相同的第一多肽和第二多肽。
本申請的該融合蛋白可包含兩條該第一多肽以及兩條該第二多肽。
在本申請中，該抗體結合蛋白每個重鏈或輕鏈胺基酸序列的一部分與來自特定物種的抗體中相應胺基酸序列同源，或者屬於特定的類別。例如，輕鏈和重鏈的可變區及恆定部分均來自一個動物物種(如人)的抗體的可變區及恆定區。在本申請中，該同源物可以為，與該蛋白質和/或該多肽(例如，特異性結合PD-L1蛋白的抗體或其片段)的胺基酸序列具有至少約85%(例如，具有至少約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高的)序列同源性的蛋白質或多肽。
在本申請中，該同源性通常是指兩個或多個序列之間的相似性、類似或關聯。可以藉由以下方式計算“序列同源性百分比”：將兩條待比對的序列在比較窗中進行比較，確定兩條序列中存在相同核酸堿基(例如，A、T、C、G)或相同胺基酸殘基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、 Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的數目以得到匹配位置的數目，將匹配位置的數目除以比較窗中的總位置數(即，窗大小)，並且將結果乘以100，以產生序列同源性百分比。為了確定序列同源性百分數而進行的比對，可以按本領域已知的多種方式實現，例如，使用可公開獲得的電腦軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。本領域技術人員可以確定用於比對序列的適宜參數，包括為實現正在比較的全長序列範圍內或目標序列區域內最大比對所需要的任何演算法。該同源性也可以藉由以下的方法測定：FASTA和BLAST。對FASTA演算法的描述可以參見W．R．Pearson和D．J．Lipman的“用於生物學序列比較的改進的工具”，美國國家科學院院刊(Proc．Natl．Acad．Sci．)，85：2444-2448，1988；和D．J．Lipman和W．R．Pearson的“快速靈敏的蛋白質相似性搜索”，Science，227：1435-1441，1989。對BLAST演算法的描述可參見S．Altschul、W．Gish、W．Miller、E．W．Myers和D．Lipman的“一種基本的局部對比(alignment)搜索工具”，分子生物學雜誌，215：403-410，1990。
核酸、載體、宿主細胞和製備方法
在另一個方面，本申請還提供了分離的一種或多種核酸分子。該一種或多種核酸分子可編碼本申請的抗原結合蛋白。例如，該一種或多種核酸分子中的每一個核酸分子可以編碼完整的該抗原結合蛋白，也可以編碼其中的一部分(例如，HCDR1-3、LCDR1-3、VL、VH、輕鏈或重鏈中的一種或多種)。
本申請的核酸分子可以為分離的。例如，其可以是藉由以下方法產生或合成的：(i)在體外擴增的，例如藉由聚合酶鏈式反應(PCR)擴增產生的，(ii)藉由選植重組產生的，(iii)純化的，例如藉由酶切和凝膠電泳分級 分離，或者(iv)合成的，例如藉由化學合成。在某些實施方式中，該分離的核酸是藉由重組DNA技術製備的核酸分子。
在本申請中，可以藉由本領域已知的多種方法來製備編碼該抗體、其抗原結合片段的核酸，這些方法包括但不限於，採用限制性片段操作或採用合成性寡核苷酸的重疊延伸PCR，具體操作可參見Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；和Ausube等人Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York N.Y.，1993。
在另一個方面，本申請提供了一種或多種載體，其包含本申請的一種或多種核酸分子。每種載體中可包含一種或多種該核酸分子。此外，該載體中還可包含其他基因，例如允許在適當的宿主細胞中和在適當的條件下選擇該載體的標記基因。此外，該載體還可包含允許編碼區在適當宿主中正確表達的表達控制元件。這樣的控制元件為本領域技術人員所熟知的，例如，可包括啟動子、核糖體結合位點、增強子和調節基因轉錄或mRNA翻譯的其他控制元件等。在某些實施方式中，該表達控制序列為可調的元件。該表達控制序列的具體結構可根據物種或細胞類型的功能而變化，但通常包含分別參與轉錄和翻譯起始的5’非轉錄序列和5’及3’非翻譯序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。例如，5’非轉錄表達控制序列可包含啟動子區，啟動子區可包含用於轉錄控制功能性連接核酸的啟動子序列。該表達控制序列還可包括增強子序列或上游活化子序列。在本申請中，適當的啟動子可包括，例如用於SP6、T3和T7聚合酶的啟動子、人U6RNA啟動子、CMV啟動子及其人工雜合啟動子(如CMV)，其中啟動子的某部分可與其他細胞蛋白(如人GAPDH，甘油醛-3-磷酸脫氫酶)基因 啟動子的某部分融合，其可包含或不包含另外的內含子。本申請的一種或多種核酸分子可以與該表達控制元件可操作地連接。
該載體可以包括，例如質粒、黏粒、病毒、噬菌體或者在例如遺傳工程中通常使用的其他載體。例如，該載體為表達載體。
在另一個方面，本申請提供了宿主細胞，該宿主細胞可包含本申請的一種或多種核酸分子和/或本申請的一種或多種載體。在某些實施方式中，每種或每個宿主細胞可包含一個或一種本申請的核酸分子或載體。在某些實施方式中，每種或每個宿主細胞可包含多個(例如，2個或以上)或多種(例如，2種或以上)本申請的核酸分子或載體。例如，可將本申請的載體引入該宿主細胞中，例如真核細胞，如來自植物的細胞、真菌或酵母細胞等。可藉由本領域已知的方法將本申請的載體引入該宿主細胞中，例如電穿孔、lipofectine轉染、lipofectamin轉染等。
在另一個方面，本申請提供了製備的抗體或其抗原結合片段的方法。該方法可包括，在使得該抗體或其抗原結合片段表達的條件下，培養該宿主細胞。例如，可藉由使用適當的培養基、適當的溫度和培養時間等，這些方法是本領域普通技術人員所瞭解的。
在某些情形中，該方法還可包括分離和/或純化該抗體或其抗原結合片段的步驟。例如，可以採用蛋白G-瓊脂糖或蛋白A-瓊脂糖進行親和層析，還可藉由凝膠電泳和/或高效液相色譜等來純化和分離本申請的抗體或其抗原結合片段。
醫藥組成物、方法、用途
在另一個方面，本申請提供了一種醫藥組成物，其可包含本申請的抗原結合蛋白和/或該融合蛋白，該核酸分子，該載體，該宿主細胞，以及視需要地藥學上可接受的佐劑。
該藥學上可接受的佐劑在所採用的劑量和濃度下對接受者無毒性，並且可包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苄基氯化銨、氯化六烴季銨(hexamethonium chloride)、氯化苯二甲羥銨(benzalkonium chloride)、氯化苄甲乙氧銨(benzethonium chloride)、苯酚、丁醇或苄醇；對羥苯甲酸烷酯，諸如對羥苯甲酸甲酯或丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇和間-甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、凝膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯基吡咯烷酮；胺基酸，諸如甘胺酸、穀醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或賴胺酸；單糖、雙糖以及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽反離子，諸如鈉離子；金屬絡合物(例如，Zn-蛋白質絡合物)；和/或非離子表面活性劑，諸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。本申請中的醫藥組成物還可含有多於一種活性化合物，通常為不會不利地影響彼此的具有互補活性的那些活性化合物。此類醫藥的類型和有效量取決於例如製劑中存在的拮抗劑的量和類型，以及受試者的臨床參數。
該醫藥組成物可以用於抑制腫瘤生長。例如，本申請的醫藥組成物可以抑制或延緩疾病的發展或進展，可以減小腫瘤大小(甚至基本消除腫瘤)，和/或可以減輕和/或穩定疾病狀態。
本申請的醫藥組成物可以包含預防和/或治療有效量的該抗體、其抗原結合片段。該預防和/或治療有效量是能夠預防和/或治療(至少部分治療)患有或具有發展風險的受試者中的疾病或病症和/或其任何併發症而所需的劑量。
另一方面，本申請提供了該抗原結合蛋白和/或該融合蛋白在製備醫藥中的用途。該醫藥用於治療癌症，抑制腫瘤生長和/或抑制腫瘤細胞增殖。在某些實施方式中，該腫瘤或癌症包含結直腸腫瘤或癌症。在某些實施方式中，該腫瘤或癌症為PD-L1表達異常的腫瘤或癌症。本申請還提供了以下描述的檢測生物樣品中PD-L1表達的方法。在某些情形中，該方法包括使生物樣品與本申請的抗原結合蛋白和/或融合蛋白在容許該抗原結合蛋白和/或融合蛋白結合PD-L1的條件下接觸，和檢測在該抗原結合蛋白和/或融合蛋白與PD-L1之間是否形成複合物。例如，該腫瘤或癌症為與非腫瘤或癌症樣品相比，PD-L1表達升高的腫瘤或癌症。此類方法可以是體外或體內方法。本申請該抗原結合蛋白和/或融合蛋白可用於例如免疫測定中，該免疫測定包括例如免疫組織化學(IHC)、免疫螢光(IF)、免疫印跡(例如，蛋白質印跡)、流式細胞術(例如，FAGS)和酶聯免疫吸附測定(ELISA)。在某些情形中，例如當PD-L1為用於選擇患者的生物標記時，該抗原結合蛋白和/或融合蛋白用來選擇適於用本申請該抗原結合蛋白和/或融合蛋白進行的療法的受試者。本申請還提供了該抗原結合蛋白和/或融合蛋白在診斷患有病症(例如，癌症或免疫功能失調)的受試者的方法中的用途，該方法包括：藉由使樣品與本發明的該抗原結合蛋白和/或融合蛋白接觸並檢測結合的該抗原結合蛋白和/或融合蛋白的存在來確定獲自受試者的樣品中PD-L1的存在或表達水準。
另一方面，本申請提供了抑制PD-L1與PD-1結合的方法，包括施用本申請的抗原結合蛋白。該方法可以是離體或體外方法。在某些情形中，該方法可包括使生物樣品與本申請的抗原結合蛋白和/或PD-1在容許該抗原結合蛋白和/或PD-1結合PD-L1的條件下接觸，檢測在該抗原結合蛋白與PD-L1之間是否形成複合物，和檢測PD-1與PD-L1之間是否形成複合物。
另一方面，本申請提供了抑制PD-L1與CD80結合的方法，包括施用本申請的抗原結合蛋白。該方法可以是離體或體外方法。在某些情形中，該方法包括使生物樣品與本申請的抗原結合蛋白和/或CD80在容許該抗原結合蛋白和/或CD80結合PD-L1的條件下接觸，檢測在該抗原結合蛋白與PD-L1之間是否形成複合物，和檢測CD80與PD-L1之間是否形成複合物。
另一方面，本申請提供了抑制TGFB與TGFBRII結合的方法，包括施用本申請的融合蛋白。該方法可以是離體或體外方法。在某些情形中，該方法包括使生物樣品與本申請的融合蛋白和/或表達TGFBRII的報告基因細胞在容許該融合蛋白和/或表達TGFBRII的報告基因細胞結合TGFB的條件下接觸，檢測在該融合蛋白是否抑制了TGFB結合TGFBRII誘導的Smad信號通路。
在一些情況下，生物樣品包括組織或細胞樣品。例如，生物樣品可包括來自正常或癌症患者的細胞或組織。在某些情況下，組織或細胞樣品的來源可為如來自新鮮、冷凍和/或防腐器官或組織樣品或活檢物或吸出物的固體組織；血液或任何血液成分；體液，諸如腦脊髓液、羊水、腹膜液或間質液；來自受試者妊娠或發育的任何時間的細胞。在另一些情形中，該生物樣品獲自體外組織或細胞培養物。本申請中的生物樣品的實例包括但不限於腫瘤活檢、迴圈腫瘤細胞、血清或血漿、迴圈血漿蛋白、腹水、來源於腫瘤的或展現出腫瘤樣特性的 原代細胞培養物或細胞系，以及保存的腫瘤樣品，諸如福馬林固定石蠟包埋的腫瘤樣品或冷凍的腫瘤樣品。
本申請還提供了抗原結合蛋白在診斷患有腫瘤或癌症的受試者的方法中的用途，該方法包括：藉由使樣品與本申請的抗原結合蛋白接觸並檢測結合的抗體的存在來確定獲自受試者的樣品中PD-L1的存在或表達水準。在一些情況下，該樣品可選自由以下組成的組：組織樣品、全血樣品、血清樣品和血漿樣品。在一些情況下，該組織樣品可以為腫瘤樣品。在一些情況下，該腫瘤樣品可包含腫瘤浸潤性免疫細胞、腫瘤細胞、基質細胞及其任何組合。
另一方面，本申請提供了治療受試者中的癌症、抑制受試者中腫瘤生長和/或抑制腫瘤細胞增殖的方法，包括向有需要的受試者或該腫瘤細胞施用本申請的抗原結合片段和/或該融合蛋白、該分子核酸、該載體、該宿主細胞和/或該醫藥組成物。可藉由任何合適的方法來施用，該合適的方法包括例如：以靜脈內方式、以肌內方式、以皮下方式、以皮內方式、以經皮方式、以動脈內方式、以腹膜內方式、以損傷內方式、以顱內方式、以關節內方式、以前列腺內方式、以胸膜內方式、以氣管內方式、以鞘內方式、以鼻內方式、以陰道內方式、以直腸內方式、以局部方式、以腫瘤內方式、以腹膜方式、以結膜下方式、以囊內方式、以黏膜方式、以心包內方式、以臍內方式、以眼內方式、以眶內方式、以口服方式、以局部方式、以透皮方式、以玻璃體內方式(例如，藉由玻璃體內注射)、藉由滴眼劑、藉由吸入、藉由注射、藉由植入、藉由輸注、藉由連續輸注、藉由直接沐浴靶細胞的局部灌注、藉由導管、藉由灌洗、以乳膏形式或以脂質組成物形式。用於本文描述的方法中的組成物還可以全身方式或以局部方式施用。施用方法可以根據各種因素(例如，所施用的化合物或組成物以及所治療 的病狀、疾病或病症的嚴重性)而變化。在某些實施方案中，以靜脈內方式、以肌內方式、以皮下方式、以局部方式、以口服方式、以透皮方式、以腹膜內方式、以眶內方式、藉由植入、藉由吸入、以鞘內方式、以心室內方式或以鼻內方式施用抗癌療法(例如，抗PD-L1抗體)。部分地根據施用是否為短暫的或長期的，給藥可藉由任何適合的途徑進行，例如藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射。本文涵蓋各種給藥排程，包括但不限於單次施用或各種時間點內的多次施用、推注施用和脈衝輸注。
本文該抗原結合蛋白或醫藥組成物可以符合良好醫療實踐的方式配製、給藥和施用。在此情形下的考慮因素包括所治療的特定病症、所治療的特定哺乳動物、單個患者的臨床病狀、病症的病因、藥劑遞送部位、施用方法、施用排程和醫學從業者已知的其他因素。治療劑(例如，抗PD-L1抗體)無需但視需要地與一種或多種當前用來預防或治療所考慮的病症的藥劑一起配製和/或同時施用。此類其他藥劑的有效量取決於製劑中存在的治療劑(例如，抗PD-L1抗體)的量、病症或治療的類型以及以上論述的其他因素。這些藥劑通常可以憑經驗/臨床上確定為適當的任何劑量且藉由憑經驗/臨床上確定為適當的任何途徑加以使用。與單個治療相比，可減少組合治療中施用的抗體的劑量。藉由常規技術易於監測此療法的進展。
嵌合抗原受體
另一方面，本申請提供了一種嵌合抗原受體(CAR)，其可以包含本申請的核酸分子或本申請的抗原結合蛋白。在某些實施方式中，其可以包含能夠結合抗原的胞外域(胞外結合結構域)、鉸鏈結構域、跨膜結構域(跨膜區)和使胞質信號傳到結構域的多肽(即胞內信號域)。鉸鏈結構域可以被認為是用於向細胞外 抗原結合區提供柔性的一部分。胞內信號域指經由確定的信號傳導途徑藉由產生第二信使而將資訊傳遞到細胞內以調節細胞活性的蛋白質、或藉由相應於此類信使而作為效應子發揮作用的蛋白質，產生可以促進CAR的細胞(例如CAR-T細胞))的免疫效應子功能的信號。胞內信號域可以包含信號傳導結構域，還可以包括源自共刺激分子的共刺激胞內結構域。例如，共刺激分子可以選自4-1BB，CD27，ICOS和/或CD28。另一方面，本申請提供了基因修飾的細胞，其可包含該嵌合抗原受體。在某些實施方式中，該基因修飾的細胞可包括真核細胞。在某些實施方式中，該基因修飾的細胞可包括分離的人細胞。在某些實施方式中，該基因修飾的細胞可包括免疫細胞如T細胞，或NK細胞。
抗體藥物偶聯物
另一方面，本申請提供了一種抗體藥物偶聯物，其可以包含細胞毒性劑，以及本申請的抗原結合片段。抗體藥物偶聯物通常是指採用特定的連接子將抗體和小分子細胞毒藥物連接起來，其主要組成成分可以包括抗體、連接子和小分子細胞毒藥物。抗體藥物偶聯物的靶向性可以來自其中抗體部分(antibody)，毒性大部分可以來自小分子化藥毒物部分(payload)，抗體部分也可以自帶毒性(ADCC與CDC)。
試劑盒
另一方面，本申請提供了一種試劑盒，其可以包含本申請的抗原結合蛋白，嵌合抗原受體，基因修飾的細胞，抗體藥物偶聯物，和/或本申請的醫藥組成物。其可在單一常用容器中包括本申請的抗原結合蛋白，嵌合抗原受體，基因修飾的細胞，和/或抗體藥物偶聯物，也可視需要地與一種或多種治療劑組合，視需要地一起配製於醫藥組成物中。
在某些情形中，該試劑盒還可以包括施用本申請該抗原結合蛋白，嵌合抗原受體，基因修飾的細胞，抗體藥物偶聯物或醫藥組成物的裝置；例如，該裝置取決於內容物的施用方式。在某些情形中，該試劑盒可包括包裝插頁，其包括關於試劑盒中的抗原結合蛋白、醫藥組成物和劑型的資訊。通常，此類資訊說明患者和醫師有效且安全地使用封裝的抗原結合蛋白、醫藥組成物和劑型。用於此類試劑盒中的容器通常可包含至少一個小瓶、試管、燒瓶、瓶、注射器或其它適合容器，檢測和/或治療組成物中的一種或多種可置於其中，且較佳適當等分。在還提供第二治療劑的情況下，試劑盒也可含有第二不同容器，其中可放置該第二檢測和/或治療組成物。或者，多種化合物可製備成單一醫藥組成物，且可包裝在單一容器裝置諸如小瓶、燒瓶、注射器、瓶或其它適合單一容器中。
給藥裝置
另一方面，本申請提供了一種給藥裝置(例如塑膠或小瓶，例如空心銷或注射器圓筒)，它可以用來施用本申請的抗原結合蛋白或其醫藥組成物。該設備可以藉由腸胃外途徑(例如肌肉內部，皮下或靜脈內)將一種物質引入患者體內。例如，注射設備可以是注射器(例如預先填充的具有本申請該抗原結合蛋白或其醫藥組成物的注射器，例如自動注射器)，其可以包括用於容納要注射的流體(例如本申請該抗原結合蛋白或其醫藥組成物)的針筒和針(可以用於刺穿皮膚和/或血管)。給藥方式可改變。給藥途徑可以包括口服，肌肉注射，皮下注射，經直腸給藥等。
另一方面，本申請提供了以下實施方案：
1.分離的抗原結合蛋白，其包含抗體重鏈可變區VH中的至少一個CDR，該VH包含SEQ ID NO：193所示的胺基酸序列。
2.根據實施方案1所述的分離的抗原結合蛋白，其中該VH包含SEQ ID NOs：90-93、95和97-104中任一項所示的胺基酸序列。
3.根據實施方案1-2中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包含抗體輕鏈可變區VL中的至少一個CDR，該VL包含SEQ ID NO：194所示的胺基酸序列。
4.根據實施方案3所述的分離的抗原結合蛋白，其中該VL包含SEQ ID NOs：108-114、116和118中任一項所示的胺基酸序列。
5.根據實施方案1-4中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包括抗體或其抗原結合片段。
6.根據實施方案5所述的分離的抗原結合蛋白，其中該抗原結合片段包括Fab，Fab’，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb。
7.根據實施方案5-6中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該抗體選自下組：單株抗體、嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體。
8.根據實施方案1-7中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其與特定抗PD-L1抗體競爭結合PD-L1，其中該特定抗PD-L1抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區[YH40]，該特定抗PD-L1抗體的輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1包含SEQ ID NO：181所示的胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：182所示的胺基酸序列，該LCDR3包含SEQ ID NO：191所示的胺基酸序列；該特定抗PD-L1抗體的重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：179所示的胺基酸序列，該HCDR3包含SEQ ID NO：180所示的胺基酸序列。
9.根據實施方案8所述的分離的抗原結合蛋白，其中該特定抗PD-L1抗體的輕鏈可變區包含SEQ ID NO：194所示的胺基酸序列，該特定抗PD-L1抗體的重鏈可變區包含SEQ ID NO：193所示的胺基酸序列。
10.根據實施方案1-9中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其中該HCDR1包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列。
11.根據實施方案10所述的分離的抗原結合蛋白，其中該HCDR2包含SEQ ID NO：179所示的胺基酸序列。
12.根據實施方案10-11所述的分離的抗原結合蛋白，其中該HCDR2包含SEQ ID NOs：14、16和17中任一項所示的胺基酸序列。
13.根據實施方案10-12中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該HCDR3包含SEQ ID NO：180所示的胺基酸序列。
14.根據實施方案10-13所述的分離的抗原結合蛋白，其中該HCDR3包含SEQ ID NOs：29-33中任一項所示的胺基酸序列。
15.根據實施方案1-14中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該VH包括框架區H-FR1，H-FR2，H-FR3，和H-FR4。
16.根據實施方案15所述的分離的抗原結合蛋白，其中該H-FR1的C末端與該HCDR1的N末端相連，且該H-FR1包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。
17.根據實施方案15-16中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該H-FR2位於該HCDR1與該HCDR2之間，且該H-FR2包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列。
18.根據實施方案15-17中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該H-FR3位於該HCDR2與該HCDR3之間，且該H-FR3包含SEQ ID NO：192所示的胺基酸序列。
19.根據實施方案15-18中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該H-FR3包含SEQ ID NOs：21、22和24中任一項所示的胺基酸序列。
20.根據實施方案15-19中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該H-FR4的N末端與該HCDR3的C末端相連，且該H-FR4包含SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列。
21.根據實施方案1-20中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包含抗體重鏈可變區VH，其中該VH包含SEQ ID NO：193所示的胺基酸序列。
22.根據實施方案21所述的分離的抗原結合蛋白，其中該VH包含SEQ ID NOs：90-93、95和97-104中任一項所示的胺基酸序列。
23.根據實施方案1-22中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包括抗體重鏈恆定區，且該抗體重鏈恆定區包括人IgG恆定區。
24.根據實施方案23所述的分離的抗原結合蛋白，其中該抗體重鏈恆定區包含SEQ ID NOs：172-175中任一項所示的胺基酸序列。
25.根據實施方案1-24中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包含抗體重鏈HC，且該HC包含SEQ ID NOS：122-125、127和129-137中任一項所示的胺基酸序列。
26.根據實施方案3-25中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該VL包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，其中該LCDR1包含SEQ ID NO：181所示的胺基酸序列。
27.根據實施方案26所述的分離的抗原結合蛋白，其中該LCDR1包含SEQ ID NOs：48-51中任一項所示的胺基酸序列。
28.根據實施方案26-27中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該LCDR2包含SEQ ID NO：182所示的胺基酸序列。
29.根據實施方案26-28中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該LCDR2包含SEQ ID NOs：63-64中任一項所示的胺基酸序列。
30.根據實施方案26-29中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該LCDR3包含SEQ ID NO：191所示的胺基酸序列。
31.根據實施方案26-30中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該LCDR3包含SEQ ID NOs：77-79中任一項所示的胺基酸序列。
32.根據實施方案3-31中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該VL包括框架區L-FR1，L-FR2，L-FR3，和L-FR4。
33.根據實施方案32所述的分離的抗原結合蛋白，其中該L-FR1的C末端與該LCDR1的N末端相連，且該L-FR1包含SEQ ID NO：185所示的胺基酸序列。
34.根據實施方案32-33中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該L-FR1包含SEQ ID NOs：41-44中任一項所示的胺基酸序列。
35.根據實施方案32-34中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該L-FR2位於該LCDR1與該LCDR2之間，且該L-FR2包含SEQ ID NO：186所示的胺基酸序列。
36.根據實施方案32-35中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該L-FR2包含SEQ ID NOs：56-59中任一項所示的胺基酸序列。
37.根據實施方案32-36中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該L-FR3位於該LCDR2與該LCDR3之間，且該L-FR3包含SEQ ID NO：187所示的胺基酸序列。
38.根據實施方案32-37中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該L-FR3包含SEQ ID NOs：69-72中任一項所示的胺基酸序列。
39.根據實施方案32-38中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該L-FR4的N末端與該LCDR3的C末端相連，且該L-FR4包含SEQ ID NO：188所示的胺基酸序列。
40.根據實施方案32-39中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該L-FR4包含SEQ ID NOs：85-86中任一項所示的胺基酸序列。
41.根據實施方案1-40中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包含抗體輕鏈可變區VL，其中該VL包含SEQ ID NO：194所示的胺基酸序列。
42.根據實施方案41所述的分離的抗原結合蛋白，其中該VL包含SEQ ID NOs：108-114、116和118中任一項所示的胺基酸序列。
43.根據實施方案1-42中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包括抗體輕鏈恆定區，其中該抗體輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：170所示的胺基酸序列。
44.根據實施方案1-43中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包含抗體輕鏈LC，且該LC包含SEQ ID NOs：150-156、158和160-163中任一項所示的胺基酸序列。
45.根據實施方案1-44中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其具有下述性質中的一種或多種：
1)能夠以1×10-8M或更低的KD值結合源自靈長類動物的PD-L1；
2)能夠阻斷PD-1與PD-L1的結合；
3)能夠阻斷CD80與PD-L1的結合；
4)能夠刺激免疫細胞中IFN-γ和/或IL2的分泌；
5)能夠抑制腫瘤生長和/或腫瘤細胞增殖；
6)與對照抗體相比，結合與源自靈長類動物的PD-L1的不完全重疊的表位，
其中該對照抗體包[ZY41]含SEQ ID NO：52所示的LCDR1、SEQ ID NO：65所示的LCDR2和SEQ ID NO：81所示的LCDR3，且該對照抗體包含SEQ ID NO：6所示的HCDR1、SEQ ID NO：15所示的HCDR2和SEQ ID NO：34所示的HCDR3；
或者，
其中該對照抗體[ZY42]包含SEQ ID NO：53所示的LCDR1、SEQ ID NO：66所示的LCDR2和SEQ ID NO：82所示的LCDR3，且該對照抗體包含SEQ ID NO：5所示的HCDR1、SEQ ID NO：18所示的HCDR2和SEQ ID NO：35所示的HCDR3；
或者，
該對照抗體[ZY43]包含SEQ ID NO：55所示的LCDR1、SEQ ID NO：68所示的LCDR2和SEQ ID NO：84所示的LCDR3，且該對照抗體包含SEQ ID NO：8所示的HCDR1、SEQ ID NO：20所示的HCDR2和SEQ ID NO：37所示的HCDR3。
46.根據實施方案45所述的分離的抗原結合蛋白，其中該靈長類動物包括人和/或猴。
47.一種融合蛋白，其包含：a)人TGFBRII或其片段；以及b)實施方案1-46中任一項該分離的抗原結合蛋白。
48.根據實施方案47所述的融合蛋白，其中該分離的抗原結合蛋白包含抗體重鏈或其片段，且該抗體重鏈或其片段與該人TGFBRII或其片段框內融合而形成該融合多肽。
49.根據實施方案48所述的融合蛋白，其中該抗體重鏈或其片段的C端直接或間接與該人TGFBRII或其片段的N端連接。
50.根據實施方案48-49中任一項所述的融合蛋白，其中該抗體重鏈或其片段藉由連接子與該人TGFBRII或其片段相連。
51.根據實施方案50所述的融合蛋白，其中該連接子為肽連接子，且該肽連接子包含SEQ ID NOs：167-169中任一項所示的胺基酸序列。
52.根據實施方案47-51中任一項所述的融合蛋白，其中該人TGFBRII或其片段包含人TGFBRII的胞外結構域。
53.根據實施方案47-52中任一項所述的融合蛋白，其中該人TGFBRII或其片段包含SEQ ID NOs：176-178中任一項所示的胺基酸序列。
54/根據實施方案47-53中任一項所述的融合蛋白，其包含第一多肽和第二多肽，
其中該第一多肽包含該分離的抗原結合蛋白的重鏈或其片段以及該人TGFBRII或其片段；且
該第二多肽包含該分離的抗原結合蛋白的輕鏈或其片段。
55.根據實施方案54所述的融合蛋白，其中該第一多肽的該重鏈或其片段與該第二多肽的該輕鏈或其片段組合後形成特異性結合PD-L1的抗原結合部分。
56.根據實施方案54-55中任一項所述的融合蛋白，其中該第一多肽[ZY44]包含SEQ ID NOs：138、139、142、143和145-148中任一項所示的胺基酸序列。
57.根據實施方案54-56中任一項所述的融合蛋白，其中該第二多肽[ZY45]包含SEQ ID NOs：162-163中任一項所示的胺基酸序列。
58.根據實施方案54-57中任一項所述的融合蛋白，其中，
該第一多肽包含SEQ ID NO：138所示的胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：162所示的胺基酸序列；或者，
該第一多肽包含SEQ ID NO：139所示的胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：162所示的胺基酸序列；或者，
該第一多肽包含SEQ ID NO：142所示的胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：162所示的胺基酸序列；或者，
該第一多肽包含SEQ ID NO：143所示的胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：162所示的胺基酸序列；或者，
該第一多肽包含SEQ ID NO：145所示的胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：163所示的胺基酸序列；或者，
該第一多肽包含SEQ ID NO：146所示的胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：163所示的胺基酸序列；或者，
該第一多肽包含SEQ ID NO：147所示的胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：162所示的胺基酸序列；或者，
該第一多肽包含SEQ ID NO：148所示的胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：162所示的胺基酸序列。
59.根據實施方案54-58中任一項所述的融合蛋白，其包含兩條該第一多肽以及兩條該第二多肽。
60.分離的一種或多種核酸分子，其編碼實施方案1-46中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，和/或實施方案47-59中任一項所述的融合蛋白。
61.載體，其包含根據實施方案60所述的核酸分子。
62.細胞，其包含根據實施方案60所述的核酸分子或根據實施方案61所述的載體。
63.製備實施方案1-46中任一項所述的分離的抗原結合蛋白和/或實施方案47-59中任一項所述的融合蛋白的方法，該方法包括在使得實施方案1-46中任一項所述的分離的抗原結合蛋白實施方案47-59中任一項所述的融合蛋白表達的條件下，培養根據實施方案49所述的細胞。
64.嵌合抗原受體，其包含實施方案1-46中任一項所述的分離的抗原結合蛋白。
65.基因修飾的細胞，其包含實施方案64所述的嵌合抗原受體。
66.抗體藥物偶聯物，其包含細胞毒性劑，以及實施方案1-46中任一項所述的分離的抗原結合蛋白。
67.醫藥組成物，其包含實施方案1-46中任一項所述的分離的抗原結合蛋白、實施方案47-59中任一項所述的融合蛋白、實施方案60所述的核酸分子、實施方案61所述的載體、實施方案62所述的細胞、實施方案64所述的嵌合抗原受體、實施方案65所述的基因修飾的細胞和/或實施方案66所述的抗體藥物偶聯物，以及視需要地藥學上可接受的載體。
68.實施方案1-46中任一項所述的分離的抗原結合蛋白、實施方案60所述的核酸分子、實施方案61所述的載體、實施方案62所述的細胞、實施方案64所述的嵌合抗原受體、實施方案65所述的基因修飾的細胞、實施方案66所述的抗體藥物偶聯物和/或實施方案67所述的醫藥組成物在製備藥物中的用途，該藥物用於預防、緩解和/或治療腫瘤或癌症，抑制腫瘤生長和/或抑制腫瘤細胞增殖。
69.實施方案68所述的用途，其中該腫瘤或癌症為PD-L1表達異常的腫瘤或癌症。
70.根據實施方案68-69中任一項所述的用途，其中該腫瘤或癌症包括結直腸癌。
71.預防、緩解或治療腫瘤，抑制腫瘤生長和/或抑制腫瘤細胞增殖的方法，該方法包括向有需要的受試者施用實施方案1-46中任一項所述的分離的抗原結合蛋白、實施方案60所述的核酸分子、實施方案61所述的載體、實施方案62所述的細胞、實施方案64所述的嵌合抗原受體、實施方案65所述的基因修飾的細胞、實施方案66所述的抗體藥物偶聯物和/或實施方案67所述的醫藥組成物。
72.實施方案71所述的方法，其中該腫瘤或癌症為PD-L1表達異常的腫瘤或癌症。
73.根據實施方案71-72中任一項所述的方法，其中該腫瘤或癌症包括結直腸癌。
74.實施方案1-46中任一項所述的分離的抗原結合蛋白、實施方案60所述的核酸分子、實施方案61所述的載體、實施方案62所述的細胞、實施方案64所述的嵌合抗原受體、實施方案65所述的基因修飾的細胞、實施方案66所述的 抗體藥物偶聯物和/或實施方案67所述的醫藥組成物，其用於治療癌症，抑制腫瘤生長和/或抑制腫瘤細胞增殖。
75.抑制PD-L1與PD-1結合的方法，該方法包括施用實施方案1-46中任一項所述的分離的抗原結合蛋白、實施方案60所述的核酸分子、實施方案61所述的載體、實施方案62所述的細胞、實施方案64所述的嵌合抗原受體、實施方案65所述的基因修飾的細胞、實施方案66所述的抗體藥物偶聯物和/或實施方案67所述的醫藥組成物。
76.抑制CD80與PD-L1結合的方法，該方法包括施用實施方案1-46中任一項所述的分離的抗原結合蛋白、實施方案60所述的核酸分子、實施方案61所述的載體、實施方案62所述的細胞、實施方案64所述的嵌合抗原受體、實施方案65所述的基因修飾的細胞、實施方案66所述的抗體藥物偶聯物和/或實施方案67所述的醫藥組成物。
77.試劑盒，其包括實施方案1-46中任一項所述的分離的抗原結合蛋白、實施方案60所述的核酸分子、實施方案61所述的載體、實施方案62所述的細胞、實施方案64所述的嵌合抗原受體、實施方案65所述的基因修飾的細胞、實施方案66所述的抗體藥物偶聯物、實施方案67所述的醫藥組成物，和/或(i)施用裝置。
不欲被任何理論所限，下文中的實施例僅僅是為了闡釋本申請的融合蛋白、製備方法和用途等，而不用於限制本申請發明的範圍。
[實施例]
下面顯示的實施例意在說明本發明的具體實施方案，並且不意在以任何方式限制本說明書或權利要求書的範圍。實施例不包括對傳統方法的詳 細描述，如那些用於構建載體和質粒的方法，將編碼蛋白的基因插入到這樣的載體和質粒的方法或將質粒引入宿主細胞的方法．這樣的方法對於本領域中具有普通技術的人員是眾所周知的，並且在許多出版物中都有所描述，包括Sambrook，J.，Fritsch，E．F．and Maniais，T．(1989)MolecuLar Cloning：A Laboratory Manual，2nd edition，Cold spring Harbor Laboratory Press。
實施例1抗原結合蛋白或融合蛋白的製備和表徵分析
可以利用PD-L1抗原對實驗動物進行免疫以獲得針對PD-L1特異性結合的抗體分子，該實驗動物可以是小鼠、大鼠、兔、羊、駱駝等。通常，其得到的抗體分子是非人源的。在獲得非人源抗體後，需要對這些分子利用抗體工程技術進行人源化改造，以降低免疫原性並提高成藥性。然而，抗體的人源化過程有其技術複雜性，經過人源化改造的分子往往會降低對抗原的親和力。另一方面，轉基因技術的進步使得可以培育出基因工程化小鼠，其攜帶人免疫球蛋白免疫庫並使其內源的鼠的免疫庫缺失。這種轉基因小鼠產生的抗體具有全人源的序列，因而無需再進一步做人源化改造，大大提高了治療性抗體開發的效率。Harbour H2L2小鼠(Harbour Antibodies BV)是一種攜帶人免疫球蛋白免疫庫的轉基因小鼠，其產生的抗體具有完整的人的抗體可變結構域和大鼠恆定結構域。
1.1 用PD-L1抗原免疫小鼠
用可溶的重組人PD-L1-mFc融合蛋白(Novo Protein Inc.貨號CM06，批號0330837)對Harbour H2L2小鼠進行多輪免疫。抗原蛋白與免疫佐劑混合成免疫原試劑，然後藉由皮下經腹股溝注射或藉由腹腔注射。在每一輪免疫中，每隻小鼠接受的總注射劑量是100微升。在首輪免疫中，每隻小鼠接受用50μg抗原蛋白(人PD-L1-mFc)與完全弗氏佐劑(Sigma，貨號F5881)以體積比1：1混合 配製的免疫原試劑的免疫。在隨後的每輪增強免疫中，每隻小鼠接受用25μg抗原蛋白與Sigma Adjuvant System佐劑(Sigma，貨號S6322)混合配製的免疫原試劑的免疫。每輪增強免疫的間隔時間至少為兩週，通常不超過五輪增強免疫。免疫時間為第0、14、28、42、56、70天；並且在第49、77天，檢測小鼠血清抗體滴度。在進行細胞融合前3天，以每隻小鼠25μg抗原蛋白的劑量進行最後一次增強免疫。
1.2 獲得融合瘤單株抗體序列
當檢測小鼠血清中PD-L1特異的抗體滴度達到一定的水準後，將小鼠的脾細胞取出並與骨髓瘤細胞系融合得到融合瘤細胞；對融合瘤細胞經過多輪篩選和選植之後，分離出數個表達抗-PD-L1單株抗體分子的融合瘤細胞，分離的融合瘤細胞及其表達的單株抗體都使用對應的株號來表示，例如：63G11H3G9、91G3H5H3等等。分離的融合瘤細胞表達具有完整的人可變結構域和大鼠恆定結構域的重鏈和輕鏈的抗體分子。對上述單株抗體進行進一步的鑒定，根據其對人PD-L1的結合能力、食蟹猴PD-L1的結合能力、抑制PD-L1與PD-1結合能力等參數，選出若干個融合瘤株進行測序。利用常規的融合瘤測序手段獲得編碼抗體分子可變結構域的核苷酸序列以及對應的胺基酸序列。在本實施例中，從免疫的Harbour H2L2小鼠得到的抗PD-L1單株抗體分子可變結構域的序列是人源抗體序列。抗體可變結構域的CDR序列可以藉由Kabat或者Chothia或者其他CDR定義規則(如Combined定義規則)進行分析(見表1關於CDR定義)。表2列出了融合瘤細胞及重組抗體的可變區序列以及CDR序列所對應的SEQ ID NO編號，其中CDR使用Chothia定義規則。
1.3 製備全人重組抗體
在得到編碼抗體分子的輕、重鏈可變結構域序列以後，可以採用常規的重組DNA技術，將輕、重鏈可變結構域序列和相應的人的抗體輕、重鏈恆定結構域序列進行融合表達，得到重組抗體分子。在本實施例中，抗體重鏈可變結構域序列(VH)藉由基因合成並選植到編碼人IgG1抗體重鏈恆定結構域序列(SEQ ID NO：172)或者其含有胺基酸突變的變體序列(SEQ ID NO：173-175)的哺乳動物細胞表達質粒載體中，以編碼產生人IgG抗體的全長重鏈(或其變體)；抗體輕鏈可變結構域序列(VL)藉由基因合成並選植到編碼人抗體κ輕鏈恆定結構域序列(SEQ ID NO：170)的哺乳動物細胞表達質粒載體中，以編碼產生抗體的全長κ輕鏈；或者將VL藉由基因合成並選植到編碼人抗體λ輕鏈恆定結構域序列(SEQ ID NO：171)的哺乳動物細胞表達質粒載體中，以編碼產生抗體的全長λ輕鏈。表2列出了本實施例中PD-L1抗體的輕、重鏈可變結構域胺基酸序列，輕鏈全長胺基酸序列，重鏈(人IgG1)全長胺基酸序列和根據Chothia定義規則定義的CDR的胺基酸序列。
將編碼抗體重鏈的質粒和編碼抗體輕鏈的質粒同時轉染哺乳動物宿主細胞(如人胚腎細胞HEK293)，利用常規的重組蛋白表達和純化技術，可以得到具有輕重鏈正確配對組裝的純化的PD-L1重組抗體。具體說來，將HEK293細胞在FreeStyleTM F17 Expression Medium培養基(Thermo,A1383504)中擴培。暫態轉染開始之前，調節細胞濃度至6~8 x 105細胞/ml，於37℃ 8% CO2搖床中培養24小時，細胞濃度在1.2 x 106細胞/ml。準備30ml培養的細胞。將上述編碼抗體重鏈的質粒和編碼抗體輕鏈的質粒以2：3的比例混合共計30μg質粒溶解於1.5ml Opti-MEM減血清培養基(Thermo,31985088)，並用0.22μm濾膜過濾除菌。再取1.5ml Opti-MEM溶入1mg/ml PEI(Polysciences,23966-2) 120μl，靜置5分鐘。把PEI緩慢加入質粒中，室溫孵育10分鐘，邊搖晃培養瓶邊緩慢滴入質粒PEI混合溶液，於37℃ 8% CO2搖床中培養5天。5天後觀測細胞活率。收集培養物，以3300g轉速離心10分鐘後取上清；然後將上清高速離心去除雜質。用PBS(pH7.4)緩衝液平衡含有MabSelectTM(GE Healthcare Life Science,71-5020-91 AE)的重力管柱(Bio-Rad,7311550)，2-5倍管柱體積沖洗。將上清樣品過管柱；用5-10倍管柱體積的PBS沖洗管管柱，再用pH3.5的0.1M甘胺酸洗脫目的蛋白，後用pH 8.0的Tris-HCl調節至中性，最後用超濾管(Millipore,UFC901024)濃縮換液至PBS緩衝液，得到純化的重組蛋白溶液。最後用NanoDrop(Thermo ScientificTM NanoDropTM One)測定濃度，分裝、存儲備用。
Figure 109133866-A0101-12-0099-2
1.4 PD-L1抗體的序列分析和表達純化
抗體的重鏈可變結構域序列來源於染色體上重鏈基因群的胚系基因V、D、J基因片段的基因重排和體細胞高頻突變等事件；輕鏈可變結構域序列來源於輕鏈基因群的胚系基因V、J基因片段的基因重排和體細胞高頻突變等事件。基因重排和體細胞高頻突變是增加抗體多樣性的主要因素。來源於相同胚系V基因片段的抗體也可能產生不同的序列，但總體上相似性較高。利用一些演算法，例如IMGT/DomainGapAlign(http：//imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi)或者NCBI/IgBLAST(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)可以從抗體的可變結構域序列推測出其發生基因重排時可能的胚系基因片段。 將實施例1.3和表2中的抗體序列進行分析，其重鏈可變結構域(VH)和輕鏈可變結構域(VL)的胚系基因V基因片段列於表3。
蛋白質或多肽胺基酸鏈在細胞中翻譯合成後有時會引入化學修飾，稱為翻譯後修飾(PTM)。對於抗體而言，一些PTM的位點是非常保守的，例如，在人的IgG1抗體的恆定結構域的第297位元(EU編號)的保守的胺基酸天冬醯胺Asn通常會發生糖基化修飾形成糖鏈，而該糖鏈結構對於抗體結構和相關的效應子功能是至關重要的。但是，如果在抗體的可變結構域尤其是抗原結合區域(如CDR)中存在PTM，那麼這些PTM的存在有可能會對抗原的結合有較大的影響，也可能對抗體的物理化學性質帶來變化。例如，糖基化、脫醯胺、異構化、氧化等都可能增加抗體分子的不穩定性或異質性，從而增加抗體開發的難度和風險。因而避免一些潛在的PTM對於治療性抗體的開發是非常重要的。隨著經驗的積累，人們發現一些PTM是和胺基酸序列的組成尤其是相鄰胺基酸組成的“模式”是高度相關的，這樣使得可以從蛋白質的一級胺基酸序列預測出潛在的PTM。例如，N-x-S/T(第一位是天冬醯胺，第二位是非脯胺酸以外的任意胺基酸，第三位是絲胺酸或者蘇胺酸)的序列模式預測出N-連接糖基化位點。引起PTM的胺基酸序列模式有可能來源於胚系基因序列，例如人胚系基因片段IGHV3-33天然地在FR3區域存在糖基化模式NST；也可能來源於體細胞高頻突變。表3列出了實施例1.3的抗體的可變結構域VH和VL的預測的PTM。具體說來，NGS或NLT可能是糖基化位點，DG可能引起天冬胺酸的異構化。
可以藉由胺基酸突變來破壞PTM的胺基酸序列模式，從而降低或者去除特定PTM的形成。根據抗體序列和PTM序列模式的不同，有不同的突變設計方法。一種方法是將“熱點”胺基酸(如NS模式中的N或S)替換成 物理化學性質相似的胺基酸(如把N突變為Q)。如果PTM序列模式來源於體細胞高頻突變，而並不存在於胚系基因序列中，那麼另一種方法可以是把該序列模式替換成對應的胚系基因序列。實際操作中，對同一個PTM序列模式可能採用多種突變設計方法。
表4列出了對六個來自實施例1.3的具有潛在PTM位點的抗體的序列進行胺基酸突變得到的新的抗體分子(稱為PTM變體)。表5-1列出了本實施例中這些PTM變體的輕、重鏈可變結構域胺基酸序列，輕鏈全長胺基酸序列，重鏈(人IgG1(N297A))全長胺基酸序列，和根據Chothia定義規則定義的CDR的胺基酸序列。所有設計出來的PTM變體按照實施例1.3中描述的方法得到純化的重組抗體，並在後續的功能實驗中進一步驗證。
Figure 109133866-A0101-12-0101-3
表4 PD-L1抗原結合蛋白序列的突變位點設計
Figure 109133866-A0101-12-0102-4
Figure 109133866-A0101-12-0102-5
表5-2列出了本申請的實施例中出現的對照抗體PR000151、PR001598和PR000265的Fc類型的轉換抗體PR000416的分子的序號，其中， PR000151是Roche的抗PD-L1抗體阿特利珠單抗(atezolizumab)類似物，在本文中，PR000151與阿特利珠單抗(atezolizumab)可互換地使用；PR001598是Merck KGaA的抗PD-L1抗體阿維魯單抗(avelumab)類似物，在本文中，PR001598與阿維魯單抗(avelumab)可互換地使用。上述抗體藉由實施例1.3的方法製備純化。
Figure 109133866-A0101-12-0103-6
實施例2 抗原結合蛋白與過表達人/食蟹猴PD-L1的細胞的結合(FACS)
本實施例為了研究PD-L1抗原結合蛋白體外結合人/食蟹猴PD-L1的活性，採用過表達人PD-L1的CHOK1細胞株(CHO-K1/hPD-L1，南京金斯瑞，M00543)或過表達食蟹猴PD-L1的CHOK1細胞株(CHOK1/cynoPD-L1，南京金斯瑞，M00573)進行細胞水準的結合實驗。簡言之，消化PD-L1細胞，並用F-12K完全培養基重懸，將細胞密度調整為1x106細胞/mL。以100μL細胞/孔接種於96孔V底板(Corning,3894)，隨後加入100μL/孔，2倍於終濃度的5倍濃度梯度稀釋的待測抗原結合蛋白，混合均勻，其中抗原結合蛋白最高終濃度為100nM，共8個濃度，同型抗體hIgG1 iso作為對照。將細胞放置於4℃，避光孵育1小時。之後，加入100μL/孔預冷PBS漂洗細胞兩次，於500g，4℃ 下離心5分鐘，棄上清。再加入100μL/孔螢光二抗(山羊抗人IgG(H+L)第二抗體Alexa Fluor 488 conjugate,Invitrogen,A11013,1：1000稀釋)，4℃，避光孵育30分鐘。用200μL/孔預冷PBS洗滌細胞兩次，於500g，4℃下離心5分鐘，棄上清。最後，200μL/孔預冷PBS重懸細胞。使用BD FACS CANTOII讀取螢光發光信號值。使用流式細胞儀BD FACS CANTOII讀取螢光發光信號值，並用軟體FlowJo v10(FlowJo,LLC)處理和分析資料。應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析，藉由四參數非線性擬合，得到結合曲線及EC50值等參數。
圖1和表6的結果顯示了本申請該PD-L1抗原結合蛋白均能結合人PD-L1；圖2和表7的結果顯示了該PD-L1抗原結合蛋白均能結合食蟹猴PD-L1；並且呈現濃度依賴效應。
Figure 109133866-A0101-12-0105-7
Figure 109133866-A0101-12-0105-8
實施例3 抗原結合蛋白與人/食蟹猴PD-L1蛋白的結合
本實施例利用酶聯免疫吸附測定法(ELISA)研究PD-L1抗原結合蛋白體外結合人/食蟹猴PD-L1蛋白的活性。
3.1 抗原結合蛋白與人PD-L1蛋白的結合(ELISA)
將人PD-L1(Acrobiosystems,PD1-H5229)用PBS稀釋為2μg/ml，加至96孔板(Corning,9018)中，每孔100μl，4℃下孵育過夜。棄去液體後用PBST緩衝液(pH 7.4，含0.05% tween-20)洗板3次，加入250μl 2% BSA封閉液，37℃條件下孵育1小時。棄去封閉液，並用PBST緩衝液(pH7.4，含0.05%吐溫-20)洗板3次，將待測抗原結合蛋白，自100nM濃度起，依次進行5倍濃度稀釋，共8個濃度梯度，每個孔加入100μl，37℃孵育1小時，同型抗體hIgG1 iso作為對照。PBST緩衝液(pH7.4，含0.05%吐溫-20)清洗3次後，加入稀釋4000倍的羊抗人HRP二抗(Invitrogen,A18805)，37℃條件下，避光孵育1小時。PBST緩衝液(pH7.4，含0.05% tween-20)清洗3次後，添加100μl/孔TMB(Biopanda,TMB-S-003)，室溫避光放置約5分鐘；每孔加入50μl/孔終止液(BBI life sciences,E661006-0200)終止反應。用酶標儀Enspire(PerkinElemer)檢測450nm吸收值(OD450)。應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析，藉由四參數非線性擬合，得到結合曲線及EC50值等參數。
圖3和表8顯示了本申請該PD-L1抗原結合蛋白均能與人PD-L1蛋白結合，且PTM變體仍保留了親本抗體的結合活性。
Figure 109133866-A0101-12-0107-9
3.2 抗原結合蛋白與食蟹猴PD-L1蛋白的結合(ELISA)
將食蟹猴(Cynomolgus)的PD-L1蛋白(Acrobiosystems,PD1-C52H4)用PBS稀釋為2μg/ml，加至96孔板(Corning,9018)中，每孔100μl，4℃下孵育過夜。棄去液體後用PBST洗板3次，加入250μl的2%BSA封閉，室溫條件下孵育1小時。棄去封閉液，並用PBST緩衝液(pH7.4，含0.05% tween-20)洗板3次，將待測抗原結合蛋白濃度稀釋至5μg/ml，加入100μl/孔，37℃孵育1小時。 PBST緩衝液(pH7.4，含0.05% tween-20)清洗3次後，加入稀釋4000倍稀釋的羊抗入HRP二抗(Invitrogen,A18805)，37℃孵育1小時。清洗後添加100μl/孔TMB(Biopanda,TMB-S-003)，室溫避光放置5分鐘；每孔加入50μl/孔終止液(BBI life sciences,E661006-0200)終止反應。用酶標儀Enspire(PerkinElemer)檢測450nm吸收值(OD450)。
結果如圖4所示，本申請所述PD-L1抗原結合蛋白均能結合食蟹猴PD-L1蛋白。
實施例4抗原結合蛋白阻斷人PD-1與過表達人PD-L1的CHO-K1細胞的結合
為了研究人PD-L1結合蛋白體外阻斷人PD-1與人PD-L1結合的活性，採用過表達人PD-L1的CHOK1細胞株(CHO-K1/hPD-L1，南京金斯瑞，M00543)進行細胞水準的人PD-1/人PD-L1結合阻斷實驗。簡言之，消化CHO-K1/hPD-L1細胞，並用F-12K完全培養基重懸，將細胞密度調整為1x106細胞/mL。以100μL細胞/孔接種於96孔V底板(Corning,3894)，隨後加入100μL/孔，2倍於終濃度的3倍濃度梯度稀釋的待測抗原結合蛋白，混合均勻，其中抗原結合蛋白最高終濃度為100nM，共8個濃度，同型抗體hIgG1 iso作為對照。將細胞放置於4℃，避光孵育1小時。之後，4℃下離心5分鐘，棄上清，隨後加入50μL/孔，1μg/mL濃度的生物素標記的人PD-1蛋白(Acrobiosystems，PD1-H82F2)，4℃，避光孵育30分鐘。加入100μL/孔預冷PBS漂洗細胞兩次，於500g，4℃下離心5分鐘，棄上清。加入100μL/孔螢光二抗PE Streptavidin(BD Pharmingen,554061,1：200稀釋)，4℃，避光孵育30分鐘。用200μL/孔預冷PBS洗滌細胞兩次，於500g，4℃下離心5分鐘，棄上清。最後，200μL/孔預冷PBS重懸細 胞。使用BD FACS CANTOII讀取螢光發光信號值。應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析，藉由四參數非線性擬合，得到結合曲線及IC50值等參數。
圖5和表9顯示本申請該PTM突變前的抗原結合蛋白均能阻斷人PD-1與細胞表面的人PD-L1結合；圖6和表10顯示本申請該PTM變體的抗原結合蛋白均能阻斷人PD-1與細胞表面的人PD-L1結合；阻斷能力與atezolizumab類似物的相當。
Figure 109133866-A0101-12-0109-10
Figure 109133866-A0101-12-0110-11
實施例5 抗原結合蛋白阻斷人PD-L1蛋白與其配體蛋白的結合
本實施例利用酶聯免疫吸附測定法(ELISA)研究PD-L1抗原結合蛋白體外阻斷人PD-L1蛋白與其配體蛋白PD-1或CD80的結合的能力。
5.1 抗原結合蛋白阻斷人PD-L1與人PD-1的結合(ELISA)
將人PD-L1(Acrobiosystems,EP-101-96tests,A001-214)用PBS稀釋成2μg/ml加入到96孔板(Corning,9018)中，每孔100μl，4℃包被過夜。棄去液體後用PBST緩衝液(pH7.4，含0.05% tween-20)洗板3次，加入250μl 2% BSA封閉液，37℃條件下孵育1小時。棄去封閉液，並用PBST緩衝液(pH7.4，含0.05% tween-20)洗板3次，將待測抗原結合蛋白，用PBST with 0.5%(w/v)BSA稀釋成不同濃度梯度，與0.6μg/ml人PD-1-Biotin蛋白(Acrobiosystems,EP-101-96tests,A002-214)混合後，加入孔板，同型抗體hIgG1 iso作為對照，37℃條件下孵育1小時。洗滌3次後每孔加入100μl Streptavidin-HRP(Acrobiosystems,EP-101- 96tests,A003-214)，37℃條件下，避光反應1小時。洗滌3次後加入100μl TMB顯色液，室溫下避光顯色5分鐘。加入終止液終止反應。用酶標儀Enspire(PerkinElemer)檢測450nm吸收值(OD450)。應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析，藉由四參數非線性擬合，得到結合曲線及IC50值等參數。
圖7和表11顯示了本申請該抗原結合蛋白能阻斷人PD-1與人PD-L1蛋白結合；阻斷能力與阿特利珠單抗(atezolizumab)類似物的相當。
Figure 109133866-A0101-12-0111-12
5.2 抗原結合蛋白阻斷人PD-L1與人B7-1(CD80)的結合(ELISA)
將人PD-L1-hFc蛋白(Acrobiosystems,PD1-H5258)用PBS稀釋成1μg/ml加入到96孔板(Corning,9018)中，每孔100μl，4℃包被過夜。棄去液體後用PBST緩衝液(pH7.4，含0.05% tween-20)洗板3次，加入250μl 2% BSA封閉液，37℃條件下孵育1.5小時。棄去封閉液，並用PBST緩衝液(pH7.4，含0.05% tween-20)洗板3次，將待測抗原結合蛋白，用PBST with 0.5%(w/v)BSA稀釋成不同濃度梯度，與10μg/ml人B7-1-Biotin蛋白(Acrobiosystems,B71-H82F2)混合後，加入孔板，同型抗體hIgG1 iso作為對照，37℃條件下孵育1.5小時。洗滌3次後每孔加入100μl Streptavidin-HRP(SIGMA,S2438)，37℃條件下，避光反應1小時。洗滌3次後加入100μl TMB顯色液，室溫下避光顯色5分鐘。加入終止液終止反應。用酶標儀Enspire(PerkinElemer)檢測450nm吸收值(OD450)。應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析，藉由四參數非線性擬合，得到結合曲線及IC50值等參數。
圖8和表12顯示了本申請該抗原結合蛋白均能阻斷人B7-1(CD80)與人PD-L1蛋白結合。
Figure 109133866-A0101-12-0113-13
實施例6 利用報告基因細胞系檢測抗原結合蛋白對PD-1信號通路的抑制作用
將共表達人PD-L1和OS8(CD3單鏈抗體跨膜蛋白)的Hep3B(睿智化學(上海)構建)細胞接種到96孔板上，細胞量為1.25×104/孔，100μL/孔。37℃在5% CO2環境下孵育過夜。去除上清液，加入50μL/孔的待測抗原結合蛋白稀釋液，起始濃度為100nM，5倍濃度稀釋，同型抗體hlgG1 iso為對照組。加入5×104/孔的可持續表達PD-1和NFAT-螢光素酶報告基因的Jurkat報告細胞(睿 智化學(上海)構建)50μL/孔。37℃在5% CO2環境下培養6小時。加入ONE-GloTM螢光素酶試劑(Promega，貨號E6110)，室溫孵育5分鐘，酶標儀檢測發光值。
圖9和表13以及圖10和表14顯示了本申請該抗原結合蛋白對PD-1信號通路有抑制作用；除PR000071以外，其餘分子對PD-1信號通路的抑制作用與阿特利珠單抗(atezolizumab)類似物的相當。
Figure 109133866-A0101-12-0114-14
Figure 109133866-A0101-12-0115-15
實施例7. 利用BLI方法測定抗原結合蛋白與人PD-L1的親和力
7.1 測定抗原結合蛋白與人PD-L1的解離常數，單濃度抗原解離速率的比較
帶有組胺酸標籤的人PD-L1蛋白購自廠家NovoProtein(貨號C315)；測試緩衝液為1x動力學緩衝液(從10x動力學緩衝液(ForteBio，貨號18-1105)稀釋)，用於親和力測試以及抗原、抗體的稀釋；藉由生物膜干涉(BLI)技術，使用Octet分子相互作用分析儀(ForteBio，型號Octet Red96e)，來進行抗原抗體之間的結合動力學分析。
測定抗原和抗體的親和力時，感測器轉動速度為1000轉/分鐘。先將置於一列的2個AHC感測器在測試緩衝液中平衡10分鐘，然後用AHC感測器捕獲待測抗原結合蛋白，捕獲高度0.9-1.1nm，然後將AHC感測器在測試緩衝液中平衡2分鐘，然後將AHC感測器與抗原(60nM以及0nM)結合3分 鐘，最後解離15分鐘。將AHC感測器浸入10mM甘胺酸(pH1.5)溶液進行再生，以洗脫結合在感測器上的蛋白。
使用Octet Data Analysis軟體(Fortebio，版本11.0)進行資料分析時，選擇單扣除模式(reference well)扣除參照信號，選擇“1：1 Local/full fitting”方法進行資料擬合，計算出抗原與抗體結合的動力學參數，得到kon(1/Ms)值、kdis(1/s)值和KD(M)值。
結果如圖11(A-B)和表15-1所示，PR000265和PR000266與PD-L1均具有較高的親和力。
Figure 109133866-A0101-12-0116-16
7.2 測定抗原結合蛋白與人PD-L1的結合常數和親和力(多濃度抗原)
按照實施例7.1的方法，測定抗原(多濃度)和抗體的親和力。測定抗原(多濃度)和抗體的親和力時，感測器轉動速度為1000轉/分鐘。先將兩列AHC感測器(每列放置8個感測器；第一列稱為參照AHC感測器，第二列稱為測試AHC感測器)在測試緩衝液中平衡10分鐘。然後，用8個測試AHC感測器捕獲待測抗原結合蛋白(濃度40nM)，捕獲時間30秒，捕獲高度約0.7nm；8個測試AHC感測器在測試緩衝液中平衡2分鐘後與梯度稀釋的抗原蛋白(例 如，抗原濃度可以為50-1.56nM的兩倍梯度稀釋以及0nM)結合，8個感測器可以分別浸入到最多8個不同濃度的抗原中；與抗原結合5分鐘，然後解離15分鐘；最後將AHC感測器浸入10mM甘胺酸(pH 1.5)溶液進行再生，以洗脫結合在感測器上的蛋白。參照AHC感測器的實驗步驟與測試AHC感測器相同，唯一的區別是在第一步將8個參照AHC感測器浸入不含待測分子的測試緩衝液中30秒。
使用Octet Data Analysis軟體(Fortebio，版本11.0)進行資料分析時，選擇雙扣除模式(double reference)扣除參照信號，選擇“1：1 Global fitting”方法進行資料擬合，計算出抗原與抗原結合蛋白結合的動力學參數，得到kon(1/Ms)值、kdis(1/s)值和KD(M)值。
結果如圖11(C-E)和表15-2所示，PR000265與PD-L1的親和力比PR000151(atezolizumab類似物)和PR001598(avelumab類似物)更高。
Figure 109133866-A0101-12-0117-18
實施例8 利用BLI方法測定抗原結合蛋白結合PD-L1的表位競爭
首先將人PD-L1蛋白(NovoProtein,C315)先利用生物素化試劑盒(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin,ThermoFisher,A39257)按照說明書要求進行生物素化。然 後使用ForteBio Octet平臺對得到的抗原結合蛋白和PR000151(atezolizumab類似物)以及PR001598(avelumab類似物)進行表位競爭實驗。第一步，獲取抗體的100%信號：用SA感測器捕獲生物素化的PD-L1蛋白，捕獲高度為0.25nm。將感測器浸入抗體中(50nM)，時間500秒，將該抗體與PD-L1結合的最終信號記錄為該抗體的100%信號。第二步，表位競爭實驗：用SA感測器捕獲生物素化的PD-L1蛋白，捕獲高度為0.25nm。將感測器浸入第一抗體中(50nM)，時間500秒，再將SA感測器浸入第一抗體和第二抗體的混合物中(兩種抗體的終濃度均為50nM)，時間500秒，將最終信號記錄為該第二抗體的信號。抑制率藉由下式計算，
抑制率(%)=(A-B)/A * 100
A：某抗體的100%信號(從第一步中獲得)，B：該抗體作為第二抗體的信號(從第二步獲得)。
若得到的抑制率大於85(%)，則意味著兩種抗體的表位完全重疊；若抑制率小於85(%)，則意味著兩種抗體結合的表位不完全重疊。
其中，抗體PR000416是將本申請該抗原結合蛋白PR000265的重鏈恆定區更換為無突變的人IgG1恆定區得到的抗體。
結果顯示PR000265(或PR000416)與對照抗體PR000151或PR001598的表位不完全重疊，見表16-1和表16-2。
Figure 109133866-A0101-12-0119-19
Figure 109133866-A0101-12-0119-20
實施例9 抗原結合蛋白在混合淋巴細胞反應(MLR)中刺激細胞因子分泌
用Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare,17144002)從第一供體全血中分離PBMC細胞，加入重組人源IL-4(R&D Systems,204-GMP)和重組人源GM-CSF(R&D Systems,215-GM/CF)誘導6天後，獲得未成熟的人CD14+樹突狀細胞(iDC細胞)；繼續加入1μg/ml的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS；Sigma,L2630)，誘導24小時，獲得成熟的樹突狀細胞(mDC細胞)。採用T細胞分離試劑盒(StemCell,17951)從第二供體的PBMC細胞中分離得到T淋巴細胞。將1×105/孔的T淋巴細胞和1×104/孔的mDC細胞按10：1比例接種至96孔板，加入10μg/ml各抗原結合蛋白和及對照抗體，並做10倍或者對應倍數的稀釋。於37℃，5% CO2培養箱孵育5天。分別收集72小時後和120小時後的上清液。採用IL2ELISA試劑盒(Thermo,88-7025-88)檢測72小時後上清液中的IL-2的水準； 採用IFN-γ ELISA試劑盒(Thermo,88-7316-88)檢測120小時後上清液中的IFN-γ的水準；具體操作參考試劑說明書。
本實施例使用了四個供體的PBMC分成了兩組供體配對進行混合淋巴細胞反應(MLR)。結果如圖12(A-D)所示，在兩次獨立的MLR實驗中，抗原結合蛋白都能增強啟動的T淋巴細胞分泌細胞因子IL-2和IFN-γ。
實施例10抗體依賴的細胞毒性實驗
本實施例測定抗體依賴的細胞毒性(ADCC)。本實施例使用PBMC作為效應細胞，使用多種PD-L1高表達的腫瘤細胞系作為靶細胞(如MDA-MB-231細胞(ATCC，HTB-26)，NCI-H292細胞(ATCC，CRL-1848))。具體說來，將新鮮的PBMC離心棄去上清，重懸到10%FBS-RPMI1640培養基中，37°培養箱培養過夜。然後收集PBMC細胞，離心棄上清，重懸到2%FBS-RPMI1640培養基中，計數，調整細胞密度至1×107/ml，將PBMC加入到U型底96孔板中，50μl/孔。收集靶細胞，離心棄去上清，重懸到2%FBS-RPMI1640培養基中，計數，調整細胞密度至4×105/ml，將靶細胞加入到U型底96孔板中，25μl/孔。效應細胞與靶細胞比例為50：1。稀釋抗體至中間濃度，起始濃度為1.6nM，5倍梯度稀釋，共3個濃度。將樣品加入到U型底96孔板中，25μl/孔，樣品最終起始濃度為0.4nM。將細胞板放入培養箱中孵育3.5小時，向靶細胞最大釋放孔和體積參照孔加入10μl裂解液，繼續孵育30分鐘，細胞和樣品共同孵育總時間為4小時。取出50μl/孔上清至透明平底96孔板中，加入Promega LDH試劑盒(Promega LDH-GloTM,J2380)檢測試劑50μl/孔。室溫孵育20分鐘，加入50μl反應終止液，終止反應。酶標儀讀取OD450nm吸光值。根據下面計算公式計算細胞毒性。細胞毒性(%)=((ER-CMB)-(ESR-CMB)-(TSR-CMB))/(TMR-VCC)×100% 其中：
ER=實驗孔，樣品+效應細胞+靶細胞
ESR=效應細胞自然釋放孔，效應細胞+培養基
TSR=靶細胞自然釋放孔，靶細胞+培養基
TMR=靶細胞最大釋放空，靶細胞+培養基+裂解液
VCC=體積參照孔，培養基+裂解液
CMB=培養基參照孔，培養基
本實施例使用了三個供體的PBMC和兩個腫瘤細胞系，共六個獨立ADCC實驗。結果如圖13(A-F)所示，PR000416(PR000416是將PR000265更換為無突變的人IgG1恆定區得到的抗體)比PR001598(avelumab類似物)有更強的ADCC作用。
實施例11抗原結合蛋白的體內抑制腫瘤活性
將MC38-hPD-L1(過表達人PD-L1的MC38細胞)結腸癌細胞5×105個/0.1mL接種於雌性B-hPD-1人源化小鼠(百奧賽圖)右側皮下，待腫瘤生長到約118mm3時按腫瘤體積隨機分組，每組10隻，共5組，分別為：Human IgG1(3mg/kg，人IgG1同型對照組)、PR000151(3mg/kg，Atezolizumab低劑量組)、PR000151(10mg/kg，Atezolizumab高劑量組)、PR000265(3mg/kg，本申請抗體低劑量組)和PR000265(10mg/kg，本申請抗體高劑量組)。給藥途徑為腹腔注射，每2天給藥1次，總計給藥13次(q2dx13)。每週測量腫瘤體積及體重2次，記錄小鼠體重和腫瘤體積。
在分組給藥第20天時，hIgG1對照組腫瘤體積為1359±171mm3。抗PD-L1抗體PR000151在3mg/kg和10mg/kg劑量下腫瘤體積分別為898±233 mm3和741±203mm3，TGI分別為33.9%和45.5%。抗PD-L1抗體PR000265在3mg/kg和10mg/kg劑量下腫瘤體積分別為881±169mm3和1035±472mm3，TGI分別為35.1%和23.8%。在分組給藥第24天時，human IgG1對照組腫瘤體積為1876±203mm3。抗PD-L1抗體PR000151在3mg/kg和10mg/kg劑量下腫瘤體積分別為1349±306mm3和949±266mm3，TGI分別為28.1%和49.4%。抗PD-L1抗體PR000265在3mg/kg和10mg/kg劑量下腫瘤體積分別為1228±187mm3和937±225mm3，TGI分別為34.5%和50.1%。PR000151和PR000265在3mg/kg，10mg/kg劑量下都有明顯的腫瘤抑制效果，且與hIgG1相比，有統計學差異(P<0.05)。PR000151和PR000265藥效相似，組間比較未見統計學差異(P>0.05)。
結果如圖14所示，PR000151和PR000265有明顯腫瘤抑制效果，在實驗過程中，各組動物體重均出現增長，表明動物對受試品耐受良好。未對動物產生明顯毒性作用，安全性較好。
實施例12抗PD-L1和抗TGFB的雙功能融合蛋白的製備和表徵分析
12.1 構建融合蛋白分子
在實施例1得到的抗原結合蛋白的C末端藉由長度合適的柔性肽段(Linker)融合人TGFB受體(TGFBRII)胞外區的序列構建雙功能融合蛋白分子。將編碼多肽序列的質粒轉染哺乳動物宿主細胞(如HEK293或者ExpiCHO)，利用實施例1.3該方法進行融合蛋白的重組表達和純化，得到本申請該融合蛋白PR001487、PR001488、PR001901、PR001902、PR002247、PR002248、PR002249和PR002251，各部分結構見表17，抗體輕鏈、重鏈和各結構域的序號見表18。 另外，製備蛋白分子M7824(也稱為PR001599，其為bintrafusp alfa類似物)，蛋白分子Hengrui融合蛋白9(也稱為PR002466，其序列來源於專利WO2018205985A1)，以及TGFBRII Trap(也稱為PR002040，其利用抗雞溶菌酶的抗體克隆TEL16的序列與TGFBRII胞外區截短序列融合得到)作為實施例中的對照，其各部分結構和序號見表17和表18。
Figure 109133866-A0101-12-0123-21
Figure 109133866-A0101-12-0124-22
12.2 利用HPLC-SEC分析蛋白純度和多聚體
使用分析型分子尺寸排阻層析色譜法(SEC)來分析蛋白樣品的純度和聚體形式。將分析型色譜管柱TSKgel G3000SWxl(Tosoh Bioscience,08541,5μm,7.8mm x 30cm)連接到高壓液相色譜儀(HPLC)(型號Agilent Technologies,Agilent 1260 Infinity II)，用PBS緩衝液室溫下平衡至少1小時。適量蛋白樣品(至少10μg，樣品濃度調整到1mg/ml)用0.22μm濾膜過濾後注射入系統，並設定HPLC程式：用PBS(pH 7.4)緩衝液將樣品以1.0ml/min的流速流過色譜管柱，最長時間為20分鐘；檢測波長280nm。採集後用ChemStation軟體對色譜圖進 行積分並計算相關資料，生成分析報告，報告出樣品內不同分子尺寸組份的滯留時間。
12.3 利用HPLC-HIC分析蛋白純度和疏水性
使用分析型疏水相互作用層析色譜法(HIC)來分析蛋白樣品的純度和疏水性。將分析型色譜管柱TSKge1 Buty1-NPR(Tosoh Bioscience,14947,4.6mm x 3.5cm)連接到高壓液相色譜儀(HPLC)(型號Agilent Technologies,Agilent 1260 Infinity II)，用PBS緩衝液室溫下平衡至少1小時。設定方法由16分鐘內從100%流動相A(20mM組胺酸，1.8M硫酸銨，pH 6.0)至100%流動相B(20mM組胺酸，pH 6.0)的線性梯度，流速設定為0.7ml/min，蛋白樣品濃度1mg/ml，進樣體積20μl，檢測波長280nm。採集後用ChemStation軟體對色譜圖進行積分並計算相關資料，生成分析報告，報告出樣品內不同分子尺寸組份的滯留時間。
12.4 利用DSF測定蛋白分子的熱穩定性
差示掃描螢光法(Differential Scanning Fluorimetry,DSF)是一種常用的高通量的用來測定蛋白質熱穩定性的方法。它使用即時螢光定量PCR儀器藉由監測與去折疊的蛋白分子結合的染料的螢光強度的變化，來反映蛋白質的變性的過程，從而反映出蛋白分子的熱穩定性。本實施例利用DSF方法來測定蛋白分子熱變性溫度(Tm)。10μg蛋白加入96-孔PCR板(Thermo,AB-0700/W)，接著加入2μl 100X稀釋的染料SYPROTM(Invitrogen,2008138)，然後加入緩衝液使得終體積為40μl每孔。將PCR板密封，放置於即時螢光定量PCR儀器(Bio-Rad CFX96 PCR System)，先於25℃孵育5分鐘，然後以0.2℃/0.2分鐘的梯度逐漸從25℃升溫至95℃，在測試結束時將溫度降至25℃。使用FRET掃描模式並使用Bio-Rad CFX Maestro軟體進行資料分析並計算出樣品的Tm。
12.5 融合蛋白的表達和表徵分析
實施例12.1所得的融合蛋白的表達和物理化學性質見表19。結果顯示，PR001488和PR001902比對照蛋白PR002466、PR001599有更高的產量，PR001488和PR001902比對照蛋白PR001599有更好的親水性(體現為在HPLC-HIC上更短的滯留時間)。總體上，PR001488和PR001902表現出比PR001599更穩定的物理化學物質。
Figure 109133866-A0101-12-0126-23
實施例13 融合蛋白結合過表達人PD-L1的CHO-K1細胞
按照實施例2的方法檢測本申請該融合蛋白在體外結合人PD-L1的活性。
圖15(A)和表20-1以及圖15(B)和表20-2顯示了本申請該融合蛋白均能結合過表達人PD-L1的CHO-K1細胞。
Figure 109133866-A0101-12-0127-24
Figure 109133866-A0101-12-0127-25
實施例14 融合蛋白阻斷人PD-1與過表達人PD-L1的CHO-K1細胞的結合
按照實施例4的方法檢測本申請該融合蛋白體外阻斷人PD-1與人PD-L1結合的活性。
圖16(A)和表21-1以及圖16(B)和表21-2顯示了本申請該融合蛋白均能阻斷人PD-1與過表達人PD-L1的CHO-K1細胞的結合。
Figure 109133866-A0101-12-0128-26
Figure 109133866-A0101-12-0129-27
實施例15 利用報告基因細胞系檢測融合蛋白對PD-1信號通路的抑制作用
按照實施例6的方法利用報告基因細胞系檢測本申請該的融合蛋白對PD-1信號通路的抑制作用。圖17和表22顯示了本申請該融合蛋白對PD-1信號通路有抑制作用。
Figure 109133866-A0101-12-0129-28
實施例16 酶聯免疫吸附實驗法檢測融合蛋白體外結合TGFB1的作用
以1μg/ml濃度的人源TGFB1(Novoprotein,CA59)為抗原，按100μl/孔包被96孔板，4℃過夜。200μl/孔1×PBST洗滌3次，加入200μl/孔2%BSA，37℃封閉2小時。加入200μl/孔1xPBST洗滌3次，加入5倍濃度梯度稀釋的抗體，其中抗體的最高終濃度為100nM，37℃孵育1小時。200μl/孔1×PBST洗滌3次，每孔加入100μl/孔抗人FC-HRP二抗(Sigma-Aldrich,A0170,1：4000稀釋)，37℃孵育1小時。200μl/孔1×PBST洗滌3次，每孔再加入100μl/孔TMB，室溫孵育10分鐘後加入50μl/孔1M ELISA終止液停止反應。酶標儀上檢測450nm及570nm測吸收值。應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析，藉由四參數非線性擬合，得到結合曲線及EC50值等參數。其中，TGFBRII-Fc是TGFBRII胞外區融合蛋白(Novoprotein,CC10)，PR001599，PR002040為前述對照融合蛋白分子。
圖18(A)和表23-1以及圖18(B)和表23-2以及圖18(C)和表23-3顯示了本申請該融合蛋白均能夠有效地與TGFB1結合，並且有藥物濃度劑量依賴效應。
Figure 109133866-A0101-12-0131-29
Figure 109133866-A0101-12-0131-30
Figure 109133866-A0101-12-0131-31
實施例17 融合蛋白對TGFB1誘導Smad信號通路啟動的抑制作用
該實驗使用高表達人源TGFBRI及融合SEAP報告基因的Smad3/4基因的HEK-BlueTM TGFB細胞(Invivogen，hkb-tgfb,)，在細胞水準上研究了融合蛋白對TGFB1誘導的Smad信號通路的啟動的抑制作用。加入10μl/孔，5倍濃度梯度稀釋的待測融合蛋白於96孔板中，最高終濃度為50nM。隨後，加入10μl/孔，終濃度為1ng/ml的人TGFB1蛋白(R&D Systems，240-B/F)於96孔板中。以TGFB1抗體(Biointron，B5484)和TGFBRII-Fc融合蛋白(Novoprotein，CC10)為對照分子。將180μl，2.5×104細胞/孔接種於96孔板中，在二氧化碳培養箱中繼續孵育過夜。然後每孔移取20μl細胞上清入另一塊96孔板中，然後每孔加入180μl Quanti-Blue工作液(Invivogen，rep-qb1)，37℃下孵育1小時。酶標儀上檢測655nm測吸收值。應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析，藉由四參數非線性擬合，得到結合曲線及IC50值等參數。
結果如圖19和表24所示，融合蛋白以劑量依賴性形式抑制TGFB1誘導的pSMAD3報告物活性。PR001902與陽性對照PR001599(M7824)具有相當的功效和IC50；其抑制活性和IC50較陽性對照PR002466(Hengrui融合蛋白9)及TGFB抗體強8倍。
Figure 109133866-A0101-12-0133-32
實施例18 利用BLI測定融合蛋白與人PD-L1的親和力的結果
使用實施例7.2該方法測試融合蛋白與人PD-L1蛋白的親和力。
結果如表25顯示，本申請的融合蛋白與人PD-L1的親和力KD值都小於1×10-8M。
Figure 109133866-A0101-12-0133-33
實施例19 利用BLI方法測定融合蛋白與人TGFB1的親和力
首先將人TGFB1蛋白(NovoProtein，CA59)先利用生物素化試劑盒(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin，ThermoFisher，A39257)按照說明書要求進行生物素化。然後按照類似實施例7.2的該方法，測定融合蛋白與人TGFB1的親和力。特別地，先將兩列SA感測器(每列放置8個感測器；第一列稱為參照SA感測器，第二列稱為測試SA感測器)在含有0.02%吐溫的1×PBS的測試緩衝液中平衡10分鐘。然後，測試SA感測器捕獲生物素化的人TGFB1，設置捕獲高度為0.3nm，而參照SA感測器浸入緩衝液中30秒。兩列感測器再與梯度稀釋的待測融合蛋白(例如，待測融合蛋白濃度可以為6.25-0.39nM的兩倍梯度稀釋以及0nM)結合；結合3分鐘，然後解離10分鐘。
使用Octet Data Analysis軟體(Fortebio，版本11.0)進行資料分析時，選擇雙扣除模式(double reference)扣除參照信號，選擇“1：1 Global fitting”方法進行資料擬合，計算出抗原與抗原結合蛋白結合的動力學參數，得到kon(1/Ms)值、kdis(1/s)值和KD(M)值。
結果如表26顯示，本申請融合蛋白與人TGFB1的KD值小於1×109M，且比對照分子PR001599和PR002466顯示出更高的親和力。
Figure 109133866-A0101-12-0134-34
實施例20 利用BLI方法測定融合蛋白結合PD-L1的表位競爭
按照實施例8的方法對融合蛋白和對照分子進行表位競爭實驗。結果如表27-1和表27-2所示，PR001488和PR001902與對照分子PR001599或PR002466的表位不完全重疊。
Figure 109133866-A0101-12-0135-35
Figure 109133866-A0101-12-0135-36
實施例21 MLR法體外檢測融合蛋白對T細胞的啟動作用
為了研究PD-L1/TGFB融合蛋白對T細胞的協同啟動作用，收集和純化人外周血單核細胞(PBMC)，分離單核細胞(Meltenyi，130-050-201)，採用完全培養基(RPI1640含50ng/mL IL-4,100ng/mL GM-CSF)培養6天，再加入1μg/ml LPS誘導24h，生成成熟的DC細胞。收集上述培養的細胞離心，用含2%FBS的PBS洗4次，重懸至新鮮的培養基中，調整密度為2x105細胞/mL，100μl/孔接種至96孔細胞培養板。同時，自異體新鮮PBMC中分離Pan T細胞(Meltenyi，130-096-535)新鮮培養基重懸，調整細胞密度為1×106細胞/ml， 100μl/孔接種至96孔細胞培養板。將不同濃度的抗體50μl/孔，及終濃度為0.3ng/ml的人TGFB1蛋白(R&D Systems，240-B/F)以50μl/孔分別加入上述96孔細胞培養板的對應孔中，並將細胞培養板於37℃，5% CO2培養箱孵育5天。分別收集72小時後和120小時後的上清液。採用IL2 ELISA試劑盒(Thermo,88-7025-88)檢測72小時後上清液中的IL-2的水準；採用IFN-γ ELISA試劑盒(Thermo,88-7316-88)檢測120小時後上清液中的IFN-γ的水準；具體操作參考試劑說明書。
結果如圖20所示，在外加TGFB1的條件下，融合蛋白能夠增強啟動的T淋巴細胞分泌細胞因子IL-2(圖20(A))和IFN-γ(圖20(B))，並且具有比PD-L1單抗PR000416和陽性對照PR001599和PR002446更強的啟動作用。
實施例22腫瘤細胞介導的抗體依賴的細胞毒性實驗的結果
按照實施例10的方法檢測本申請該融合蛋白的腫瘤細胞介導的抗體依賴的細胞毒性。本實施例使用了三個供體的PBMC和兩個腫瘤細胞系，共六個獨立ADCC實驗。結果如圖21(A-F)所示，PR001488比陽性對照PR001599有更強的ADCC作用。
實施例23融合蛋白的藥物代謝動力學研究
本實施例測試融合蛋白的藥物代謝動力學性能。其方法如下，選取體重18~22克的雌性C57BL/6小鼠3隻，按9.53mg/kg PR001902和10mg/kg PR001488的劑量藉由靜脈注射給與融合蛋白藥物；於給藥前以及給藥後0.5小時、24小時(1天)、第2天、第4天、第7天、第10天和第14天採集全血，將全血靜置30分鐘使其凝固，隨後在4℃下以2,000rpm離心5分鐘並將分離的血清樣品在 -80℃下凍存直至分析。本實施例採用兩種ELISA方法來定量測定小鼠血清中的藥物濃度。ELISA方法一，即Fc端檢測方法，藉由包被於96孔板的山羊抗人Fc多克隆抗體來捕獲小鼠血清中的含有人Fc的融合蛋白，然後加入HRP標記的山羊抗人Fc第二抗體來檢測；ELISA方法二，即TGFBRII端檢測方法，藉由包被於96孔板的人TGFB1蛋白來捕獲小鼠血清中的含有人TGFBRII結構域的融合蛋白，然後加入HRP標記的的山羊抗人Fc第二抗體來檢測。使用Phoenix WinNonlin軟體6.4版，選用非房室模型(NCA)對血藥濃度資料進行分析以評價其藥物代謝動力學。
圖22和表28顯示的是融合蛋白PR001902的藥物代謝動力學資料，結果表明，Fc端檢測方法下，PR001902在小鼠體內的半衰期約為11天；TGFBRII端檢測方法顯示，PR001902在小鼠體內的半衰期約為8.5天。
Figure 109133866-A0101-12-0137-37
圖23和表29顯示的是融合蛋白PR001488的藥物代謝動力學資料，結果表明，Fc端檢測方法下，PR001488在小鼠體內的半衰期約為10天；TGFBRII端檢測方法顯示，PR001488在小鼠體內的半衰期約為5天。
Figure 109133866-A0101-12-0138-38
實施例24 融合蛋白對結腸癌CT26-人PD-1/PD-L1轉基因小鼠的動物體內模型的抗腫瘤活性
本實施例評價測試藥物在小鼠結腸癌細胞CT26-人PDL1(tg)-小鼠PDL1(KO)(將小鼠結腸癌細胞CT26的內源性鼠PD-L1基因剔除並引入外源人PD-L1轉基因，集萃藥康生物科技)移植免疫檢查點人源化小鼠BALB/c-人PD-1/PD-L1(將BALB/c小鼠同時引入外源人PD-1轉基因和人PD-L1轉基因，集萃藥康生物科技)中的抗腫瘤作用。接種對數生長期的CT26-人PDL1(tg)-mPDL1(KO)細胞於人源化小鼠BALB/c-人PD-1/PD-L1腋右側背部皮下，當平均腫瘤體積達到80-120mm3時，去除腫瘤體積過大的小鼠個體後，小鼠根據腫瘤體積隨機分成3組，每組6隻。共3個測試組，分別為：人IgG1(10.4 mg/kg，人IgG1同型對照組)、M7824(12.3mg/kg，陽性對照)和PR001902(12.2mg/kg，本申請融合蛋白)。分組當天開始腹腔給藥，每三天給一次藥，共給藥6次(q3d×6)。開始給藥後，每週稱量體重及瘤體積兩次，瘤體積計算方式為：腫瘤體積(mm3)=0.5×腫瘤長徑×腫瘤短徑2。實驗結束後將荷瘤小鼠安樂死並剝瘤稱 重。計算各組動物的腫瘤體積、小鼠體重等實驗結果以平均值±標準誤差(Mean±SEM)表示。多組比較採用單因素方差分析(one way ANOVA)檢驗方法比較不同治療組與對照組相比有無顯著性差異。資料使用SPSS 18.0進行分析。P<0.05為具有顯著性差異。
結果如圖24顯示，融合蛋白PR001902與陽性對照M7824均能顯著抑制CT26-人PD-1/PD-L1小鼠皮下移植瘤的生長；且在實驗過程中，各組動物體重均出現增長，表明動物對受試品耐受良好，未對動物產生明顯毒性作用，安全性較好。
前述詳細說明是以解釋和舉例的方式提供的，並非要限制所附申請專利範圍。目前本申請所列舉的實施方式的多種變化對本領域普通技術人員來說是顯而易見的，且保留在所附的申請專利範圍和其等同方案的範圍內。
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<400> 72
Figure 109133866-A0101-12-0160-406
<210> 73
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LFWR3
<400> 73
Figure 109133866-A0101-12-0160-407
<210> 74
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LFWR3
<400> 74
Figure 109133866-A0101-12-0161-411
<210> 75
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LFWR3
<400> 75
Figure 109133866-A0101-12-0161-410
<210> 76
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LFWR3
<400> 76
Figure 109133866-A0101-12-0161-409
<210> 77
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LCDR3
<400> 77
Figure 109133866-A0101-12-0161-408
<210> 78
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LCDR3
<400> 78
Figure 109133866-A0101-12-0162-412
<210> 79
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LCDR3
<400> 79
Figure 109133866-A0101-12-0162-413
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LCDR3
<400> 80
Figure 109133866-A0101-12-0162-414
<210> 81
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LCDR3
<400> 81
Figure 109133866-A0101-12-0162-415
<210> 82
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LCDR3
<400> 82
Figure 109133866-A0101-12-0163-419
<210> 83
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LCDR3
<400> 83
Figure 109133866-A0101-12-0163-418
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LCDR3
<400> 84
Figure 109133866-A0101-12-0163-417
<210> 85
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LFWR4
<400> 85
Figure 109133866-A0101-12-0163-416
Figure 109133866-A0101-12-0164-420
<210> 86
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LFWR4
<400> 86
Figure 109133866-A0101-12-0164-421
<210> 87
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LFWR4
<400> 87
Figure 109133866-A0101-12-0164-422
<210> 88
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LFWR4
<400> 88
Figure 109133866-A0101-12-0164-423
<210> 89
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LFWR4
<400> 89
Figure 109133866-A0101-12-0165-426
<210> 90
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH
<400> 90
Figure 109133866-A0101-12-0165-425
<210> 91
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH
<400> 91
Figure 109133866-A0101-12-0165-424
Figure 109133866-A0101-12-0166-427
<210> 92
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH
<400> 92
Figure 109133866-A0101-12-0166-428
<210> 93
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH
<400> 93
Figure 109133866-A0101-12-0167-429
<210> 94
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH
<400> 94
Figure 109133866-A0101-12-0167-430
Figure 109133866-A0101-12-0168-431
<210> 95
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH
<400> 95
Figure 109133866-A0101-12-0168-432
<210> 96
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH
<400> 96
Figure 109133866-A0101-12-0169-434
<210> 97
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH
<400> 97
Figure 109133866-A0101-12-0169-433
Figure 109133866-A0101-12-0170-435
<210> 98
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH
<400> 98
Figure 109133866-A0101-12-0170-436
<210> 99
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH
<400> 99
Figure 109133866-A0101-12-0170-437
Figure 109133866-A0101-12-0171-439
<210> 100
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH
<400> 100
Figure 109133866-A0101-12-0171-438
Figure 109133866-A0101-12-0172-440
<210> 101
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH
<400> 101
Figure 109133866-A0101-12-0172-441
<210> 102
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH
<400> 102
Figure 109133866-A0101-12-0172-442
Figure 109133866-A0101-12-0173-444
<210> 103
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH
<400> 103
Figure 109133866-A0101-12-0173-443
<210> 104
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH
<400> 104
Figure 109133866-A0101-12-0174-445
<210> 105
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH
<400> 105
Figure 109133866-A0101-12-0174-446
Figure 109133866-A0101-12-0175-448
<210> 106
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH
<400> 106
Figure 109133866-A0101-12-0175-447
<210> 107
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH
<400> 107
Figure 109133866-A0101-12-0176-449
<210> 108
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL
<400> 108
Figure 109133866-A0101-12-0176-450
Figure 109133866-A0101-12-0177-453
<210> 109
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL
<400> 109
Figure 109133866-A0101-12-0177-452
<210> 110
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL
<400> 110
Figure 109133866-A0101-12-0177-451
Figure 109133866-A0101-12-0178-455
<210> 111
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL
<400> 111
Figure 109133866-A0101-12-0178-454
<210> 112
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL
<400> 112
Figure 109133866-A0101-12-0179-456
<210> 113
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL
<400> 113
Figure 109133866-A0101-12-0179-457
<210> 114
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL
<400> 114
Figure 109133866-A0101-12-0180-459
<210> 115
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL
<400> 115
Figure 109133866-A0101-12-0180-458
Figure 109133866-A0101-12-0181-460
<210> 116
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL
<400> 116
Figure 109133866-A0101-12-0181-461
<210> 117
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL
<400> 117
Figure 109133866-A0101-12-0181-462
Figure 109133866-A0101-12-0182-464
<210> 118
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL
<400> 118
Figure 109133866-A0101-12-0182-463
<210> 119
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL
<400> 119
Figure 109133866-A0101-12-0183-465
<210> 120
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL
<400> 120
Figure 109133866-A0101-12-0183-466
Figure 109133866-A0101-12-0184-469
<210> 121
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL
<400> 121
Figure 109133866-A0101-12-0184-468
<210> 122
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
<400> 122
Figure 109133866-A0101-12-0184-467
Figure 109133866-A0101-12-0185-470
Figure 109133866-A0101-12-0186-471
<210> 123
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
<400> 123
Figure 109133866-A0101-12-0186-472
Figure 109133866-A0101-12-0187-473
Figure 109133866-A0101-12-0188-474
<210> 124
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
<400> 124
Figure 109133866-A0101-12-0188-475
Figure 109133866-A0101-12-0189-476
<210> 125
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
<400> 125
Figure 109133866-A0101-12-0190-477
Figure 109133866-A0101-12-0191-478
<210> 126
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
<400> 126
Figure 109133866-A0101-12-0191-479
Figure 109133866-A0101-12-0192-480
Figure 109133866-A0101-12-0193-481
<210> 127
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
<400> 127
Figure 109133866-A0101-12-0193-482
Figure 109133866-A0101-12-0194-483
Figure 109133866-A0101-12-0195-484
<210> 128
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
<400> 128
Figure 109133866-A0101-12-0195-485
Figure 109133866-A0101-12-0196-486
Figure 109133866-A0101-12-0197-487
<210> 129
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
<400> 129
Figure 109133866-A0101-12-0197-488
Figure 109133866-A0101-12-0198-489
<210> 130
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
<400> 130
Figure 109133866-A0101-12-0199-490
Figure 109133866-A0101-12-0200-491
<210> 131
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
<400> 131
Figure 109133866-A0101-12-0200-492
Figure 109133866-A0101-12-0201-493
Figure 109133866-A0101-12-0202-494
<210> 132
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
<400> 132
Figure 109133866-A0101-12-0202-495
Figure 109133866-A0101-12-0203-496
Figure 109133866-A0101-12-0204-497
<210> 133
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
<400> 133
Figure 109133866-A0101-12-0204-498
Figure 109133866-A0101-12-0205-499
<210> 134
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
<400> 134
Figure 109133866-A0101-12-0206-500
Figure 109133866-A0101-12-0207-501
<210> 135
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
<400> 135
Figure 109133866-A0101-12-0208-502
Figure 109133866-A0101-12-0209-503
<210> 136
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
<400> 136
Figure 109133866-A0101-12-0209-504
Figure 109133866-A0101-12-0210-505
Figure 109133866-A0101-12-0211-506
<210> 137
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
<400> 137
Figure 109133866-A0101-12-0211-507
Figure 109133866-A0101-12-0212-508
Figure 109133866-A0101-12-0213-509
<210> 138
<211> 600
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
<400> 138
Figure 109133866-A0101-12-0213-510
Figure 109133866-A0101-12-0214-511
Figure 109133866-A0101-12-0215-512
<210> 139
<211> 605
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
<400> 139
Figure 109133866-A0101-12-0215-513
Figure 109133866-A0101-12-0216-514
Figure 109133866-A0101-12-0217-515
<210> 140
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
<400> 140
Figure 109133866-A0101-12-0217-516
Figure 109133866-A0101-12-0218-517
Figure 109133866-A0101-12-0219-518
<210> 141
<211> 607
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
<400> 141
Figure 109133866-A0101-12-0219-519
Figure 109133866-A0101-12-0220-520
Figure 109133866-A0101-12-0221-521
<210> 142
<211> 590
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
<400> 142
Figure 109133866-A0101-12-0221-522
Figure 109133866-A0101-12-0222-523
Figure 109133866-A0101-12-0223-524
<210> 143
<211> 584
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
<400> 143
Figure 109133866-A0101-12-0224-525
Figure 109133866-A0101-12-0225-526
Figure 109133866-A0101-12-0226-527
<210> 144
<211> 603
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
<400> 144
Figure 109133866-A0101-12-0226-528
Figure 109133866-A0101-12-0227-529
Figure 109133866-A0101-12-0228-530
<210> 145
<211> 605
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
<400> 145
Figure 109133866-A0101-12-0228-531
Figure 109133866-A0101-12-0229-532
Figure 109133866-A0101-12-0230-533
<210> 146
<211> 605
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
<400> 146
Figure 109133866-A0101-12-0231-534
Figure 109133866-A0101-12-0232-535
Figure 109133866-A0101-12-0233-536
<210> 147
<211> 605
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
<400> 147
Figure 109133866-A0101-12-0233-537
Figure 109133866-A0101-12-0234-538
Figure 109133866-A0101-12-0235-539
<210> 148
<211> 605
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
<400> 148
Figure 109133866-A0101-12-0235-540
Figure 109133866-A0101-12-0236-541
Figure 109133866-A0101-12-0237-542
<210> 149
<211> 584
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
<400> 149
Figure 109133866-A0101-12-0237-543
Figure 109133866-A0101-12-0238-544
Figure 109133866-A0101-12-0239-545
<210> 150
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LC
<400> 150
Figure 109133866-A0101-12-0240-546
<210> 151
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LC
<400> 151
Figure 109133866-A0101-12-0241-547
<210> 152
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LC
<400> 152
Figure 109133866-A0101-12-0242-548
<210> 153
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LC
<400> 153
Figure 109133866-A0101-12-0242-549
Figure 109133866-A0101-12-0243-550
<210> 154
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LC
<400> 154
Figure 109133866-A0101-12-0243-551
Figure 109133866-A0101-12-0244-552
<210> 155
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LC
<400> 155
Figure 109133866-A0101-12-0244-553
Figure 109133866-A0101-12-0245-554
<210> 156
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LC
<400> 156
Figure 109133866-A0101-12-0245-555
Figure 109133866-A0101-12-0246-556
<210> 157
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LC
<400> 157
Figure 109133866-A0101-12-0246-557
Figure 109133866-A0101-12-0247-558
<210> 158
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LC
<400> 158
Figure 109133866-A0101-12-0247-559
Figure 109133866-A0101-12-0248-560
<210> 159
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LC
<400> 159
Figure 109133866-A0101-12-0248-561
Figure 109133866-A0101-12-0249-563
<210> 160
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LC
<400> 160
Figure 109133866-A0101-12-0249-562
Figure 109133866-A0101-12-0250-564
<210> 161
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LC
<400> 161
Figure 109133866-A0101-12-0250-565
Figure 109133866-A0101-12-0251-567
<210> 162
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LC
<400> 162
Figure 109133866-A0101-12-0251-566
Figure 109133866-A0101-12-0252-568
<210> 163
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LC
<400> 163
Figure 109133866-A0101-12-0252-569
Figure 109133866-A0101-12-0253-570
<210> 164
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LC
<400> 164
Figure 109133866-A0101-12-0253-571
Figure 109133866-A0101-12-0254-572
<210> 165
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LC
<400> 165
Figure 109133866-A0101-12-0254-573
Figure 109133866-A0101-12-0255-574
<210> 166
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LC
<400> 166
Figure 109133866-A0101-12-0255-575
Figure 109133866-A0101-12-0256-576
<210> 167
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> linker
<400> 167
Figure 109133866-A0101-12-0256-577
<210> 168
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> linker
<400> 168
Figure 109133866-A0101-12-0256-578
<210> 169
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> linker
<400> 169
Figure 109133866-A0101-12-0257-580
<210> 170
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CK
<400> 170
Figure 109133866-A0101-12-0257-579
<210> 171
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CL
<400> 171
Figure 109133866-A0101-12-0257-581
Figure 109133866-A0101-12-0258-582
<210> 172
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CH
<400> 172
Figure 109133866-A0101-12-0258-583
Figure 109133866-A0101-12-0259-584
<210> 173
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CH
<400> 173
Figure 109133866-A0101-12-0259-585
Figure 109133866-A0101-12-0260-586
<210> 174
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CH
<400> 174
Figure 109133866-A0101-12-0261-587
Figure 109133866-A0101-12-0262-588
<210> 175
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CH
<400> 175
Figure 109133866-A0101-12-0262-589
Figure 109133866-A0101-12-0263-590
<210> 176
<211> 567
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TGFBR2
<400> 176
Figure 109133866-A0101-12-0263-591
Figure 109133866-A0101-12-0264-592
Figure 109133866-A0101-12-0265-593
<210> 177
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TGFBR2
<400> 177
Figure 109133866-A0101-12-0266-595
<210> 178
<211> 137
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TGFBR2
<400> 178
Figure 109133866-A0101-12-0266-594
Figure 109133866-A0101-12-0267-596
<210> 179
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HCDR2通式1
<220>
<221> X
<222> (3)..(3)
<223> X=D或E
<220>
<221> X
<222> (4)..(4)
<223> X=G或A
<400> 179
Figure 109133866-A0101-12-0267-597
<210> 180
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HCDR3通式1
<220>
<221> X
<222> (3)..(3)
<223> X=A或P
<220>
<221> X
<222> (8)..(8)
<223> X=F或S
<220>
<221> X
<222> (9)..(9)
<223> X=D或A
<220>
<221> X
<222> (10)..(10)
<223> X=I或F
<400> 180
Figure 109133866-A0101-12-0268-599
<210> 181
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LCDR1通式1
<220>
<221> X
<222> (7)..(7)
<223> X--F,S或Y
<220>
<221> X
<222> (8)..(8)
<223> X=I或S
<400> 181
Figure 109133866-A0101-12-0268-598
<210> 182
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LCDR2通式1
<220>
<221> X
<222> (7)..(7)
<223> X=S或T
<400> 182
Figure 109133866-A0101-12-0269-600
<210> 183
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LCDR3通式1
<220>
<221> X
<222> (4)..(4)
<223> X=Y或H
<220>
<221> X
<222> (5)..(5)
<223> X--G,T或S
<220>
<221> X
<222> (6)..(6)
<223> X=Y或S
<400> 183
Figure 109133866-A0101-12-0269-601
<210> 184
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H-FR3通式1
<220>
<221> X
<222> (4)..(4)
<223> X=V或G
<220>
<221> X
<222> (22)..(22)
<223> X=L或Q
<220>
<221> X
<222> (33)..(33)
<223> X=D或E
<220>
<221> X
<222> (37)..(37)
<223> X-Y或F
<400> 1840
Figure 109133866-A0101-12-0270-603
<210> 185
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> L-FR1
<220>
<221> X
<222> (13)..(13)
<223> X=T或A
<220>
<221> X
<222> (17)..(17)
<223> X=D或H
<220>
<221> X
<222> (21)..(21)
<223> X-I或V
<400> 185
Figure 109133866-A0101-12-0270-602
Figure 109133866-A0101-12-0271-604
<210> 186
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> L-FR2通式1
<220>
<221> X
<222> (5)..(5)
<223> X=K或H
<220>
<221> X
<222> (11)..(11)
<223> X=K,N或D
<400> 186
Figure 109133866-A0101-12-0271-605
<210> 187
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> L-FR3通式1
<220>
<221> X
<222> (9)..(9)
<223> X=S或N
<220>
<221> X
<222> (28)..(28)
<223> X=A或T
<220>
<221> X
<222> (31)..(31)
<223> X=Y或F
<400> 187
Figure 109133866-A0101-12-0272-607
<210> 188
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> L-FR4通式1
<220>
<221> X
<222> (10)..(10)
<223> X=K或R
<400> 188
Figure 109133866-A0101-12-0272-606
<210> 189
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH通式1
<220>
<221> X
<222> (54)..(54)
<223> X=D或E
<220>
<221> X
<222> (55)..(55)
<223> X=G或A
<220>
<221> X
<222> (61)..(61)
<223> X=V或G
<220>
<221> X
<222> (79)..(79)
<223> X=L或Q
<220>
<221> X
<222> (90)..(90)
<223> X=D或E
<220>
<221> X
<222> (94)..(94)
<223> X=Y或F
<220>
<221> X
<222> (101)..(101)
<223> X=A或P
<220>
<221> X
<222> (106)..(106)
<223> X=F或S
<220>
<221> X
<222> (107)..(107)
<223> X-D或A
<220>
<221> X
<222> (108)..(108)
<223> X-I或F
<400> 189
Figure 109133866-A0101-12-0273-608
Figure 109133866-A0101-12-0274-609
<210> 190
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL通式1
<220>
<221> X
<222> (13)..(13)
<223> X13=T或A
<220>
<221> X
<222> (17)..(17)
<223> X=D或H
<220>
<221> X
<222> (21)..(21)
<223> X=I或V
<220>
<221> X
<222> (30)..(30)
<223> X=F,S或Y
<220>
<221> X
<222> (31)..(31)
<223> X=I或S
<220>
<221> X
<222> (39)..(39)
<223> X=K或H
<220>
<221> X
<222> (45)..(45)
<223> X=K,N或D
<220>
<221> X
<222> (56)..(56)
<223> X=S或T
<220>
<221> X
<222> (65)..(65)
<223> X=S或N
<220>
<221> X
<222> (84)..(84)
<223> X=A或T
<220>
<221> X
<222> (87)..(87)
<223> X=Y或F
<220>
<221> X
<222> (92)..(92)
<223> X=Y或H
<220>
<221> X
<222> (93)..(93)
<223> X=G,T或S
<220>
<221> X
<222> (94)..(94)
<223> X=Y或S
<220>
<221> X
<222> (107)..(107)
<223> X=K或R
<400> 190
Figure 109133866-A0101-12-0275-610
<210> 191
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LCDR3通式2
<220>
<221> X
<222> (5)..(5)
<223> X=G或S
<220>
<221> X
<222> (6)..(6)
<223> X=Y或S
<400> 191
Figure 109133866-A0101-12-0276-612
<210> 192
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H-FR3通式2
<220>
<221> X
<222> (4)..(4)
<223> X=V或G
<220>
<221> X
<222> (33)..(33)
<223> X=D或E
<220>
<221> X
<222> (37)..(37)
<223> X=Y或F
<400> 192
Figure 109133866-A0101-12-0276-611
Figure 109133866-A0101-12-0277-613
<210> 193
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH通式2
<220>
<221> X
<222> (54)..(54)
<223> X=D或E
<220>
<221> X
<222> (55)..(55)
<223> X=G或A
<220>
<221> X
<222> (61)..(61)
<223> X=V或G
<220>
<221> X
<222> (90)..(90)
<223> X=D或E
<220>
<221> X
<222> (94)..(94)
<223> X=Y或F
<220>
<221> X
<222> (101)..(101)
<223> X=A或P
<220>
<221> X
<222> (106)..(106)
<223> X=F或S
<220>
<221> X
<222> (107)..(107)
<223> X=D或A
<220>
<221> X
<222> (108)..(108)
<223> X=I或F
<400> 193
Figure 109133866-A0101-12-0278-614
<210> 194
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL通式2
<220>
<221> X
<222> (13)..(13)
<223> X=T或A
<220>
<221> X
<222> (17)..(17)
<223> X=D或H
<220>
<221> X
<222> (21)..(21)
<223> X=I或V
<220>
<221> X
<222> (30)..(30)
<223> X-F,S或Y
<220>
<221> X
<222> (31)..(31)
<223> X=I或S
<220>
<221> X
<222> (39)..(39)
<223> X=K或H
<220>
<221> X
<222> (45)..(45)
<223> X=K,N或D
<220>
<221> X
<222> (56)..(56)
<223> X=S或T
<220>
<221> X
<222> (65)..(65)
<223> X=S或N
<220>
<221> X
<222> (84)..(84)
<223> X=A或T
<220>
<221> X
<222> (87)..(87)
<223> X=Y或F
<220>
<221> X
<222> (93)..(93)
<223> X=G或S
<220>
<221> X
<222> (94)..(94)
<223> X=Y或S
<220>
<221> X
<222> (107)..(107)
<223> X=K或R
<400> 194
Figure 109133866-A0101-12-0280-615

Claims (38)

  1. 一種結合PD-L1的分離的抗原結合蛋白，其包含抗體輕鏈可變區VL和抗體重鏈可變區VH，其中輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中，該LCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：51所示，該LCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO：64所示，該LCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：78所示；該HCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：5所示，該HCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO：16所示，該HCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：29所示。
  2. 如請求項1所述的分離的抗原結合蛋白，其包括抗體或其抗原結合片段。
  3. 如請求項2所述的分離的抗原結合蛋白，其中該抗體選自以下群組：嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體。
  4. 如請求項2所述的分離的抗原結合蛋白，其中該抗原結合片段包括Fab、Fab’、Fv片段、F(ab’)2、scFv或者di-scFv。
  5. 如請求項1至4中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該抗體重鏈可變區VH包括框架區H-FR1、H-FR2、H-FR3、和H-FR4；該H-FR1的C末端與該HCDR1的N末端相連，包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列；並且該H-FR2位於該HCDR1與該HCDR2之間，包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列；並且該H-FR3位於該HCDR2與該HCDR3之間，包含SEQ ID NO：21所示的胺基酸序列；並且該H-FR4的N末端與該HCDR3的C末端相連，包含SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列。
  6. 如請求項1至4中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該抗體輕鏈可變區VL包括框架區L-FR1、L-FR2、L-FR3、和L-FR4；該L-FR1的C末端與該LCDR1的N末端相連，包含SEQ ID NO：44所示的胺基酸序列；並且該L-FR2位於該LCDR1與該LCDR2之間，包含SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列；並且該L-FR3位於該LCDR2與該LCDR3之間，包含SEQ ID NO：69所示的胺基酸序列；並且該L-FR4的N末端與該LCDR3的C末端相連，包含SEQ ID NO：85所示的胺基酸序列。
  7. 如請求項1至4任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該抗體重鏈可變區VH包含SEQ ID NOs：101所示的胺基酸序列；該抗體輕鏈可變區VL包含SEQ ID NOs：114所示的胺基酸序列。
  8. 如請求項1至4中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包括抗體重鏈恆定區，且該抗體重鏈恆定區包括人IgG恆定區。
  9. 如請求項8所述的分離的抗原結合蛋白，其中該抗體重鏈恆定區包含如SEQ ID NOs：172-175中任一項所示的胺基酸序列。
  10. 如請求項1至4中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包含抗體重鏈HC，且該HC包含如SEQ ID NOs：133和137中任一項所示的胺基酸序列。
  11. 如請求項1至4中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包括抗體輕鏈恆定區，其中該抗體輕鏈恆定區包含如SEQ ID NO：170所示的胺基酸序列。
  12. 如請求項1至4中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包含抗體輕鏈LC，且該LC包含如SEQ ID NOs：162所示的胺基酸序列。
  13. 一種融合蛋白，其包含：a)人TGFBRII或其片段；以及b)如請求項1至12中任一項所述的分離的抗原結合蛋白。
  14. 如請求項13所述的融合蛋白，其包含第一多肽和第二多肽，其中該第一多肽包含該分離的抗原結合蛋白的重鏈或其片段以及該人TGFBRII或其片段；且該第二多肽包含該分離的抗原結合蛋白的輕鏈或其片段。
  15. 如請求項14所述的融合蛋白，其中該抗體重鏈或其片段與該人TGFBRII或其片段框內融合而形成該第一多肽。
  16. 如請求項15所述的融合蛋白，其中該抗體重鏈或其片段的C端直接或間接與該人TGFBRII或其片段的N端連接。
  17. 如請求項16所述的融合蛋白，其中第一多肽的該重鏈或其片段包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，HCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：5所示；HCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NOs：16所示；HCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：29所示；並且/或者該第二多肽包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，LCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：51所示；LCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO：64所示；LCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：78所示。
  18. 如請求項14至17中任一項所述的融合蛋白，其中該抗體重鏈或其片段藉由連接子與該人TGFBRII或其片段相連。
  19. 如請求項18所述的融合蛋白，其中該連接子為肽連接子，且該肽連接子包含SEQ ID NOs：167-169中任一項所示的胺基酸序列。
  20. 如請求項14至17中任一項所述的融合蛋白，其中該人TGFBRII或其片段包含人TGFBRII的胞外結構域。
  21. 如請求項20所述的融合蛋白，其中該人TGFBRII或其片段包含SEQ ID NOs：176-178中任一項所示的胺基酸序列。
  22. 如請求項14至17中任一項所述的融合蛋白，其中該第一多肽的該重鏈或其片段與該第二多肽的該輕鏈或其片段組合後形成特異性結合PD-L1的抗原結合部分。
  23. 如請求項14至17中任一項所述的融合蛋白，其中該第一多肽包含SEQ ID NOs：138、139、142和143中任一項所示的胺基酸序列；其中該第二多肽包含SEQ ID NO：162所示的胺基酸序列。
  24. 如請求項14至17中任一項所述的融合蛋白，其中，該第一多肽包含如SEQ ID NO：138所示的胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：162所示的胺基酸序列；或者，該第一多肽包含SEQ ID NO：139所示的胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：162所示的胺基酸序列；或者，該第一多肽包含SEQ ID NO：142所示的胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：162所示的胺基酸序列；或者，該第一多肽包含SEQ ID NO：143所示的胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：162所示的胺基酸序列。
  25. 一種分離的核酸分子，其編碼如請求項1至12中任一項所述的分離的抗原結合蛋白或請求項13至24中任一項所述的融合蛋白。
  26. 一種載體，其包含如請求項25所述的核酸分子。
  27. 一種細胞，其包含如請求項25所述的核酸分子或如請求項26所述的載體。
  28. 一種製備如請求項1至12中任一項所述的分離的抗原結合蛋白或如請求項13至24中任一項所述的融合蛋白的方法，該方法包括在使得如請求項1至12中任一項所述的分離的抗原結合蛋白或如請求項13至24中任一項所述的融合蛋白表達的條件下，培養如請求項27所述的細胞。
  29. 一種嵌合抗原受體，其包含如請求項1至12中任一項所述的分離的抗原結合蛋白。
  30. 一種基因修飾的細胞，其包含如請求項29所述的嵌合抗原受體。
  31. 一種抗體藥物偶聯物，其包含細胞毒性劑，以及如請求項1至12中任一項所述的分離的抗原結合蛋白。
  32. 一種醫藥組成物，其包含請求項1至12中任一項所述的分離的抗原結合蛋白、請求項13至24中任一項所述的融合蛋白、請求項25所述的核酸分子、請求項26所述的載體、請求項27所述的細胞、請求項29所述的嵌合抗原受體、請求項30所述的基因修飾的細胞和/或請求項31所述的抗體藥物偶聯物，以及視需要地藥學上可接受的載體。
  33. 如請求項32所述的醫藥組成物，其中該醫藥組成物還含有由激素製劑、靶向小分子製劑、蛋白酶體抑制劑、成像劑、診斷劑、化療劑、溶瘤藥物、細胞毒性劑、細胞因子、共刺激分子的啟動劑、抑制性分子的抑制劑以及疫苗組成的群組中的一種或多種。
  34. 一種請求項1至12中任一項所述的分離的抗原結合蛋白、請求項13至24中任一項所述的融合蛋白、請求項25所述的核酸分子、請求項26所述的載體、請求項27所述的細胞、請求項29所述的嵌合抗原受體、請求項30 所述的基因修飾的細胞、請求項31所述的抗體藥物偶聯物和/或請求項32所述的醫藥組成物在製備藥物中的用途，該藥物用於緩解並且/或者治療腫瘤或癌症，抑制腫瘤生長並且/或者抑制腫瘤細胞增殖。
  35. 如請求項34所述的用途，其中該腫瘤或癌症為PD-L1表達異常的腫瘤或癌症。
  36. 如請求項35所述的用途，其中該腫瘤或癌症包括結直腸癌。
  37. 一種試劑盒，其包括請求項1至12中任一項所述的分離的抗原結合蛋白、請求項13至24中任一項所述的融合蛋白、請求項25所述的核酸分子、請求項26所述的載體、請求項27所述的細胞、請求項29所述的嵌合抗原受體、請求項30所述的基因修飾的細胞、請求項31所述的抗體藥物偶聯物和/或請求項32所述的醫藥組成物。
  38. 如請求項37所述的試劑盒，還包括(i)施用裝置；和/或(ii)使用說明。
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