JP6909153B2 - 抗ｐｄ−ｌ１抗体 - Google Patents

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関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年８月５日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＣＮ２０１４／０８３７１５の優先権を主張し、あらゆる目的のためその全体が本明細書に参照として組み込まれる。
発明の分野
本発明は、ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体及びその抗原結合断片、並びにかかる抗体及び抗原結合断片の使用方法に関する。
電子的に提出されたテキストファイルの説明
本明細書と共に電子出願されたテキストファイルの内容物は、その全体が本明細書に参照として組み込まれる：配列表のコンピュータで読み取り可能な形式のコピー（ファイル名：ＣＲＢＩ＿００７＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ；記録日：２０１５年８月４日、ファイルサイズ１５３ＫＢ）。
背景
プログラム細胞死受容体リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）は、プログラム細胞死受容体１（ＰＤ−１）のリガンドである。ＰＤ−１はリンパ球で主に発現し、２つのリガンド、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−Ｌ２を有する。ＰＤ−Ｌ２はＰＤ−Ｌ１ほど一般的でない。ＰＤ−Ｌ１は分化クラスター２７４（ＣＤ２７４）またはＢ７ホモログ１（Ｂ７−Ｈ１）としても知られ、ＣＤ２７４遺伝子によりコードされる、４０ｋＤａの１型膜貫通タンパク質である。ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１は共に免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、２つの細胞外Ｉｇドメイン、Ｎ末端Ｖドメイン、及びＣ末端定常ドメインからなる。ＰＤ−Ｌ１の、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）及びＢ７−１（ＣＤ８０）への結合インターフェースは、ＩｇＶ様ドメインにある（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）ＰＮＡＳ １０５：３０１１−３０１６（非特許文献１）。ＰＤ−Ｌ１ドメインは保存された短い細胞内尾部（約３０個のアミノ酸）を含有し、ＰＤ−１は、２つの細胞質チロシン系シグナル伝達モチーフ、１つの免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）、及び免疫受容体スイッチ性チロシンモチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ ｓｗｉｔｃｈ ｍｏｔｉｆ：ＩＴＳＭ）を含有する。Ｔ細胞の刺激の後、ＰＤ−１はチロシンホスファターゼＳＨＰ−２を細胞質尾部内のＩＴＳＭモチーフに動員し、ＣＤ３ Ｔ細胞シグナル伝達カスケードに関与するＣＤ３ζ、ＰＫＣθ及びＺＡＰ７０等のエフェクター分子の脱リン酸化をもたらす（Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９２：１０２７−３４（非特許文献２）；Ｌａｔｃｈｍａｎ，ｅｔ．ａｌ．（２００１）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２：２６１−８（非特許文献３）；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２：６３４−４３（非特許文献４））。
ＰＤ−Ｌ１はリンパ系及び非リンパ系組織内の白血球及び非造血細胞に広範に分布しているだけでなく、種々の癌細胞にも分布している。臨床データは、ＰＤ−Ｌ１の高い腫瘍発現は、腫瘍の攻撃性の増加と、一層の予後不良と関係していることを示唆している。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１複合体が形成されると阻害シグナルを伝達してＴ細胞免疫応答を負に調節し、ＴＣＲが仲立ちするＴ細胞の活性化、サイトカイン産生及びＴ細胞増殖を抑制し（Ｆｉｆｅ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０：１１８５−１１９３（非特許文献５））、コグネイト抗原特異的Ｔ細胞の疲弊またはアネルギーを誘発し（Ｈｏｆｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１１：１−９（非特許文献６））、Ｔｈ１細胞のＦｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞への分化を促進し（Ａｒｍａｎａｔｈ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ＴｒａｎｓＭｅｄ ３：１−１３（非特許文献７）；Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０６：３０１５−３０２９（非特許文献８））、エフェクターＴ細胞のアポトーシスを誘発する。ＰＤ−Ｌ１遺伝子の破壊により、Ｔ細胞応答の上方制御、及び自己反応性Ｔ細胞の生成がもたらされる（Ｌａｔｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）ＰＮＡＳ １０１：１０６９１−１０６９６（非特許文献９））。ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１のいずれかを抗体で遮断することにより、増大した抗腫瘍免疫がもたらされる（Ｉｗａｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＰＮＡＳ ９９：１２２９３−１２２９７（非特許文献１０））。
したがって、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路には、免疫応答を制御するための重要な役割が存在する。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達の機能障害は、癌及びウイルス感染等の疾患の開始及び発症と相関があるように思われる。ノックアウト動物を分析することで、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１は主に、末梢性免疫寛容の誘発及び制御において機能するという認識に到達している。したがって、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路を治療により遮断することは、免疫寛容の克服、並びに癌または感染症の治療、及び（予防用または治療用のいずれかの）ワクチン接種中の追加免疫に有用であろう。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路を遮断するための改良された方法が、当該技術分野において求められている。
Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）ＰＮＡＳ １０５：３０１１−３０１６ Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９２：１０２７−３４ Ｌａｔｃｈｍａｎ，ｅｔ．ａｌ．（２００１）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２：２６１−８ Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２：６３４−４３ Ｆｉｆｅ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０：１１８５−１１９３ Ｈｏｆｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１１：１−９ Ａｒｍａｎａｔｈ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ＴｒａｎｓＭｅｄ ３：１−１３ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０６：３０１５−３０２９ Ｌａｔｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）ＰＮＡＳ １０１：１０６９１−１０６９６ Ｉｗａｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＰＮＡＳ ９９：１２２９３−１２２９７
一態様において、本発明は、プログラム細胞死１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）に結合する抗体及びその抗原結合断片を提供する。いくつかの実施形態において、抗体及びその抗原結合断片はヒトＰＤ−Ｌ１に結合する。いくつかの実施形態において、抗体及びその抗原結合断片はＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ−１及び／またはＣＤ８０のＰＤ−Ｌ１への結合をブロックする。更なる実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片はＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１／ＣＤ８０経路を阻害する。一実施形態では、抗体またはその断片は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体である。一実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその断片は、モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）断片、二重特異性抗体、免疫複合体、またはこれらの組み合わせである。
一実施形態では、本発明は、配列番号：８１〜１４０からなる群から選択される１つまたは複数のＣＤＲを含む、単離された抗体またはその断片を提供する。
一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号：８１、８７、９３、９９、１０５、１１１、１１７、１２３、１２９、及び１３５からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％の相同性、少なくとも８１％の相同性、少なくとも８２％の相同性、少なくとも８３％の相同性、少なくとも８４％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも８６％の相同性、少なくとも８７％の相同性、少なくとも８８％の相同性、少なくとも８９％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有する重鎖ＣＤＲ１配列を含む。
一実施形態では、 抗体またはその断片は、配列番号：８２、８８、９４、１００、１０６、１１２、１１８、１２４、１３０、及び１３６からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％の相同性、少なくとも８１％の相同性、少なくとも８２％の相同性、少なくとも８３％の相同性、少なくとも８４％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも８６％の相同性、少なくとも８７％の相同性、少なくとも８８％の相同性、少なくとも８９％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有する重鎖ＣＤＲ２配列を含む。
一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号：８３、８９、９５、１０１、１０７、１１３、１１９、１２５、１３１、及び１３７からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％の相同性、少なくとも８１％の相同性、少なくとも８２％の相同性、少なくとも８３％の相同性、少なくとも８４％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも８６％の相同性、少なくとも８７％の相同性、少なくとも８８％の相同性、少なくとも８９％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有する重鎖ＣＤＲ３配列を含む。
一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号：８４、９０、９６、１０２、１０８、１１４、１２０、１２６、１３２、及び１３８からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％の相同性、少なくとも８１％の相同性、少なくとも８２％の相同性、少なくとも８３％の相同性、少なくとも８４％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも８６％の相同性、少なくとも８７％の相同性、少なくとも８８％の相同性、少なくとも８９％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有する軽鎖ＣＤＲ１配列を含む。
一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号：８５、９１、９７、１０３、１０９、１１５、１２１、１２７、１３３、及び１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％の相同性、少なくとも８１％の相同性、少なくとも８２％の相同性、少なくとも８３％の相同性、少なくとも８４％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも８６％の相同性、少なくとも８７％の相同性、少なくとも８８％の相同性、少なくとも８９％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有する軽鎖ＣＤＲ２配列を含む。
一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号：８６、９２、９８、１０４、１１０、１１６、１２２、１２８、１３４、及び１４０からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％の相同性、少なくとも８１％の相同性、少なくとも８２％の相同性、少なくとも８３％の相同性、少なくとも８４％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも８６％の相同性、少なくとも８７％の相同性、少なくとも８８％の相同性、少なくとも８９％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有する軽鎖ＣＤＲ３配列を含む。
一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号：８１、８７、９３、９９、１０５、１１１、１１７、１２３、１２９、及び１３５からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１；配列番号：８２、８８、９４、１００、１０６、１１２、１１８、１２４、１３０、及び１３６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２；配列番号：８３、８９、９５、１０１、１０７、１１３、１１９、１２５、１３１、及び１３７からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３；配列番号：８４、９０、９６、１０２、１０８、１１４、１２０、１２６、１３２、及び１３８からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１；配列番号：８５、９１、９７、１０３、１０９、１１５、１２１、１２７、１３３、及び１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２；並びに配列番号：８６、９２、９８、１０４、１１０、１１６、１２２、１２８、１３４、及び１４０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む。
一実施形態では、抗体またはその断片はＰＤ−Ｌ１に結合し、それぞれ配列番号：８１、８２、及び８３のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；並びに、それぞれ配列番号：８４、８５、及び８６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。更なる実施形態において、抗体またはその抗体断片は、それぞれ配列番号：８１、８２、及び８３の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、並びに、それぞれ配列番号：８４、８５、及び８６の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。
一実施形態では、抗体またはその断片はＰＤ−Ｌ１に結合し、それぞれ配列番号：８７、８８、及び８９のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；並びに、それぞれ配列番号：９０、９１、及び９２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。更なる実施形態において、抗体またはその抗体断片は、それぞれ配列番号：８７、８８、及び８９の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号：９０、９１、及び９２の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。
一実施形態では、抗体またはその断片はＰＤ−Ｌ１に結合し、それぞれ配列番号：９３、９４、及び９５のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；並びに、それぞれ配列番号：９６、９７、及び９８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。更なる実施形態において、抗体またはその抗体断片は、それぞれ配列番号：９３、９４、及び９５の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号：９６、９７、及び９８の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。
一実施形態では、抗体またはその断片はＰＤ−Ｌ１に結合し、それぞれ配列番号：９９、１００、及び１０１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；並びに、それぞれ配列番号：１０２、１０３、及び１０４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。更なる実施形態において、抗体またはその抗体断片は、それぞれ配列番号：９９、１００、及び１０１の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号：１０２、１０３、及び１０４の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。
一実施形態では、抗体またはその断片はＰＤ−Ｌ１に結合し、それぞれ配列番号：１０５、１０６、及び１０７のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；並びに、それぞれ配列番号：１０８、１０９、及び１１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。更なる実施形態において、抗体またはその抗体断片は、それぞれ配列番号：１０５、１０６、及び１０７の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号：１０８、１０９、及び１１０の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。
一実施形態では、抗体またはその断片はＰＤ−Ｌ１に結合し、それぞれ配列番号：１１１、１１２、及び１１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；並びに、それぞれ配列番号：１１４、１１５、及び１１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。更なる実施形態において、抗体またはその抗体断片は、それぞれ配列番号：１１１、１１２、及び１１３の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号：１１４、１１５、及び１１６の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。
一実施形態では、抗体またはその断片はＰＤ−Ｌ１に結合し、それぞれ配列番号：１１７、１１８、及び１１９のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；並びに、それぞれ配列番号：１２０、１２１、及び１２２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。更なる実施形態において、抗体またはその抗体断片は、それぞれ配列番号：１１７、１１８、及び１１９の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、並びに配列番号：１２０、１２１、及び１２２の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。
一実施形態では、抗体またはその断片はＰＤ−Ｌ１に結合し、それぞれ配列番号：１２３、１２４、及び１２５のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；並びに、それぞれ配列番号：１２６、１２７、及び１２８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。更なる実施形態において、抗体またはその抗体断片は、それぞれ配列番号：１２３、１２４、及び１２５の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号：１２６、１２７、及び１２８の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。
一実施形態では、抗体またはその断片はＰＤ−Ｌ１に結合し、それぞれ配列番号：１２９、１３０、及び１３１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；並びに、配列番号：１３２、１３３、及び１３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。更なる実施形態において、抗体またはその抗体断片は、それぞれ配列番号：１２９、１３０、及び１３１の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号：１３２、１３３、及び１３４の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。
一実施形態では、抗体またはその断片はＰＤ−Ｌ１に結合し、それぞれ配列番号：１３５、１３６、及び１３７のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；並びに、それぞれ配列番号：１３８、１３９、及び１４０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。更なる実施形態において、抗体またはその抗体断片は、それぞれ配列番号：１３５、１３６、及び１３７の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号：１３８、１３９、及び１４０の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。
一実施形態では、抗体またはその断片はＰＤ−Ｌ１に結合し、配列番号：２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、及び４６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；並びに、配列番号：４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、及び４８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。更なる実施形態において、単離された抗体またはその断片はＰＤ−Ｌ１に結合し、配列番号：２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、及び４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる重鎖可変領域；並びに、配列番号：４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、及び４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、１３Ｃ５、５Ｇ９、５Ｇ１１、８Ｃ６、７Ｂ４、４Ｄ１、４Ａ８、８Ｈ４、８Ｈ３、及び１５Ｆ１からなる群から選択される抗体の可変重鎖、並びに、１３Ｃ５、５Ｇ９、５Ｇ１１、８Ｃ６、７Ｂ４、４Ｄ１、４Ａ８、８Ｈ４、８Ｈ３、及び１５Ｆ１からなる群から選択される抗体の可変軽鎖を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体を提供する。したがって、一実施形態において、本発明は、配列番号：２を含む重鎖可変領域及び配列番号：４を含む軽鎖可変領域；配列番号：６を含む重鎖可変領域及び配列番号：８を含む軽鎖可変領域；配列番号：１０を含む重鎖可変領域及び配列番号：１２を含む軽鎖可変領域；配列番号：１４を含む重鎖可変領域及び配列番号：１６を含む軽鎖可変領域；配列番号：１８を含む重鎖可変領域及び配列番号：２０を含む軽鎖可変領域；配列番号：２２を含む重鎖可変領域及び配列番号：２４を含む軽鎖可変領域；配列番号：２６を含む重鎖可変領域及び配列番号：２８を含む軽鎖可変領域；配列番号：３０を含む重鎖可変領域及び配列番号：３２を含む軽鎖可変領域；配列番号：３４含む重鎖可変領域及び配列番号：３６を含む軽鎖可変領域；または配列番号：３８を含む重鎖可変領域及び配列番号：４０を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその断片を提供する。
一実施形態では、本発明はキメラ抗ＰＤ−Ｌ１抗体を提供し、この抗体は、配列番号：５０、５４、５８、６０、６４、及び６６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有する重鎖；並びに、配列番号：５２、５６、６２、及び６８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
一実施形態では、本発明はヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体を提供し、この抗体は、配列番号：４２及び４６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。別の実施形態において、本発明はヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体を提供し、この抗体は、配列番号：４４及び４８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
別の実施形態において、本発明はヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体を提供し、この抗体は、配列番号：４２に少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有する重鎖可変領域、並びに、配列番号：４４に少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有する軽鎖可変領域を含む。別の実施形態において、本発明はヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体を提供し、この抗体は、配列番号：４６に少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有する重鎖可変領域、並びに、配列番号：４８に少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有する軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明はヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体を提供し、この抗体は、配列番号：７０、７２、７６、及び７８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有する完全重鎖を含む。別の実施形態において、本発明はヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体を提供し、この抗体は、配列番号：７４及び８０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有する完全軽鎖を含む。
一実施形態では、本発明はヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体を提供し、この抗体は、配列番号：７０の重鎖及び配列番号：７４の軽鎖を含む。別の実施形態において、本発明はヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体を提供し、この抗体は、配列番号：７２の重鎖及び配列番号：７４の軽鎖を含む。別の実施形態において、本発明はヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体を提供し、この抗体は、配列番号：７６の重鎖及び配列番号：８０の軽鎖を含む。別の実施形態において、本発明はヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体を提供し、この抗体は、配列番号：７８の重鎖及び配列番号：８０の軽鎖を含む。
一実施形態では、本発明は、本明細書において提供する例示的抗体のいずれかと、ＰＤ−Ｌ１上の同じエピトープに結合する抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその断片を提供する。一実施形態では、抗体またはその断片は、ＰＤ−Ｌ１への結合に関して、本明細書において提供する例示的抗体のいずれかと競合する。ＰＤ−Ｌ１への結合は、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ、または当該技術分野において公知の任意の他の方法により測定してよい。
一実施形態では、本発明は、約１０ｎＭ〜約０．０１ｎＭの結合親和性ｋＤでＰＤ−Ｌ１に結合する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片を提供する。更なる実施形態において、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、約１０ｎＭ〜約０．０５ｎＭの結合親和性ｋＤでＰＤ−Ｌ１に結合する。更なる実施形態において、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、約８ｎＭ〜約０．１ｎＭの結合親和性ｋＤでＰＤ−Ｌ１に結合する。更なる実施形態において、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、約５ｎＭ〜約０．２ｎＭの結合親和性ｋＤでＰＤ−Ｌ１に結合する。別の実施形態において、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、約１０ｎＭ以下の結合親和性ｋＤでＰＤ−Ｌ１に結合する。更なる実施形態において、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、約６ｎＭ以下の結合親和性ｋＤでＰＤ−Ｌ１に結合する。更なる実施形態において、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、約４ｎＭ以下の結合親和性ｋＤでＰＤ−Ｌ１に結合する。更なる実施形態において、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、約２ｎＭ以下の結合親和性ｋＤでＰＤ−Ｌ１に結合する。更なる実施形態において、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、約１ｎＭ以下の結合親和性ｋＤでＰＤ−Ｌ１に結合する。更なる実施形態において、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、約０．７５ｎＭ以下の結合親和性ｋＤでＰＤ−Ｌ１に結合する。更なる実施形態において、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、約０．５ｎＭ以下の結合親和性ｋＤでＰＤ−Ｌ１に結合する。更なる実施形態において、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、約０．２５ｎＭ以下の結合親和性ｋＤでＰＤ−Ｌ１に結合する。更なる実施形態において、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、約０．２ｎＭ以下の結合親和性ｋＤでＰＤ−Ｌ１に結合する。更なる実施形態において、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、約０．１５ｎＭ以下の結合親和性ｋＤでＰＤ−Ｌ１に結合する。更なる実施形態において、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、約０．１ｎＭ以下の結合親和性ｋＤでＰＤ−Ｌ１に結合する。更なる実施形態において、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、約０．０７５ｎＭ以下の結合親和性ｋＤでＰＤ−Ｌ１に結合する。更なる実施形態において、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、約０．０５ｎＭ以下の結合親和性ｋＤでＰＤ−Ｌ１に結合する。更なる実施形態において、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、約０．０２５ｎＭ以下の結合親和性ｋＤでＰＤ−Ｌ１に結合する。更なる実施形態において、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、約０．０２ｎＭ以下の結合親和性ｋＤでＰＤ−Ｌ１に結合する。更なる実施形態において、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、約０．０１５ｎＭ以下の結合親和性ｋＤでＰＤ−Ｌ１に結合する。更なる実施形態において、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、約０．０１ｎＭ以下の結合親和性ｋＤでＰＤ−Ｌ１に結合する。一実施形態では、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び断片の結合親和性ｋＤは、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイにより測定される。
一実施形態では、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、ＰＤ−Ｌ１に対して約１ｎｇ／ｍＬ〜約２０００ｎｇ／ｍＬの結合ＥＣ５０を有する。更なる実施形態において、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、ＰＤ−Ｌ１に対して約１ｎｇ／ｍＬ〜約１５００ｎｇ／ｍＬの結合ＥＣ５０を有する。更なる実施形態において、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、ＰＤ−Ｌ１に対して約１ｎｇ／ｍＬ〜約１０００ｎｇ／ｍＬの結合ＥＣ５０を有する。更なる実施形態において、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、ＰＤ−Ｌ１に対して約２ｎｇ／ｍＬ〜約５００ｎｇ／ｍＬの結合ＥＣ５０を有する。更なる実施形態において、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、ＰＤ−Ｌ１に対して約２ｎｇ／ｍＬ〜約２５０ｎｇ／ｍＬの結合ＥＣ５０を有する。更なる実施形態において、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、ＰＤ−Ｌ１に対して約５ｎｇ／ｍＬ〜約２００ｎｇ／ｍＬの結合ＥＣ５０を有する。更なる実施形態において、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、ＰＤ−Ｌ１に対して約５ｎｇ／ｍＬ〜約５０ｎｇ／ｍＬの結合ＥＣ５０を有する。一実施形態では、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、ＰＤ−Ｌ１に対して約５００ｎｇ／ｍＬ以下、約４００ｎｇ／ｍＬ以下、約３００ｎｇ／ｍＬ以下、約２５０ｎｇ／ｍＬ以下、約２００ｎｇ／ｍＬ以下、約１５０ｎｇ／ｍＬ以下、約１００ｎｇ／ｍＬ以下、約７５ｎｇ／ｍＬ以下、約６０ｎｇ／ｍＬ以下、約５０ｎｇ／ｍＬ以下、約４０ｎｇ／ｍＬ以下、または約３０ｎｇ／ｍＬ以下の結合ＥＣ５０を有する。一実施形態では、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び断片のＥＣ５０は、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳにより測定される。
一実施形態では、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、約１ｎｇ／ｍＬ〜約１５００ｎｇ／ｍＬのＩＣ５０でＰＤＬ１／ＰＤ−１結合を阻害する。更なる実施形態において、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、約２ｎｇ／ｍＬ〜約１２００ｎｇ／ｍＬのＩＣ５０でＰＤＬ１／ＰＤ−１結合を阻害する。更なる実施形態において、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、約５ｎｇ／ｍＬ〜約５００ｎｇ／ｍＬのＩＣ５０でＰＤＬ１／ＰＤ−１結合を阻害する。更なる実施形態において、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、約５ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬのＩＣ５０でＰＤＬ１／ＰＤ−１結合を阻害する。更なる実施形態において、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約５０ｎｇ／ｍＬのＩＣ５０でＰＤＬ１／ＰＤ−１結合を阻害する。一実施形態では、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、約１２００ｎｇ／ｍＬ以下、約１０００ｎｇ／ｍＬ以下、約８００ｎｇ／ｍＬ以下、約４００ｎｇ／ｍＬ以下、約３００ｎｇ／ｍＬ以下、約２５０ｎｇ／ｍＬ以下、約２００ｎｇ／ｍＬ以下、約１５０ｎｇ／ｍＬ以下、約１００ｎｇ／ｍＬ以下、約７５ｎｇ／ｍＬ以下、約６０ｎｇ／ｍＬ以下、約５０ｎｇ／ｍＬ以下、約４０ｎｇ／ｍＬ以下、約３０ｎｇ／ｍＬ以下、約２０ｎｇ／ｍＬ以下、または約１０ｎｇ／ｍＬ以下のＩＣ５０でＰＤＬ１／ＰＤ−１結合を阻害する。一実施形態では、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び断片のＩＣ５０は、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳにより測定される。
一実施形態では、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号：４２の重鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号：４４の軽鎖可変領域アミノ酸；または、配列番号：４６の重鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号：４８の軽鎖可変領域アミノ酸配列を有するヒト化抗体であり、上記抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳにより測定する場合、約２００ｎｇ／ｍＬ以下、または約１５０ｎｇ／ｍＬ以下、または約１００ｎｇ／ｍＬ以下、または約８０ｎｇ／ｍＬ以下、または約６０ｎｇ／ｍＬ以下、または約５０ｎｇ／ｍＬ以下のＰＤ−Ｌ１結合ＥＣ５０を有する。別の実施形態において、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号：４２の重鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号：４４の軽鎖可変領域アミノ酸；または、配列番号：４６の重鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号：４８の軽鎖可変領域アミノ酸配列を有するヒト化抗体であり、上記抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳにより測定する場合、約１２００ｎｇ／ｍＬ以下、または約１０００ｎｇ／ｍＬ以下、または約８００ｎｇ／ｍＬ以下、または約６００ｎｇ／ｍＬ以下、または約５００ｎｇ／ｍＬ以下、または約４００ｎｇ／ｍＬ以下、または約３００ｎｇ／ｍＬ以下、または約２００ｎｇ／ｍＬ以下、または約１００ｎｇ／ｍＬ以下、または約６０ｎｇ／ｍＬ以下、または約３０ｎｇ／ｍＬ以下、または約２５ｎｇ／ｍＬ以下、または約２０ｎｇ／ｍＬ以下、または約１０ｎｇ／ｍＬ以下のＰＤＬ１／ＰＤ−１遮断ＩＣ５０を有する。別の実施形態において、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号：４２の重鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号：４４の軽鎖可変領域アミノ酸；または、配列番号：４６の重鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号：４８の軽鎖可変領域アミノ酸配列を有するヒト化抗体であり、上記抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイにより測定される、ＰＤ−Ｌ１に対する約１０ｎＭ以下、または約５ｎＭ以下、または約２ｎＭ以下、または約１ｎＭ以下、または約０．５ｎＭ以下、または約０．１ｎＭ以下、または約０．０５ｎＭ以下の結合親和性ｋＤを有する。一実施形態では、ヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−Ｌ１に対して約２ｎＭの結合親和性ｋＤを有する。別の実施形態において、ヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−Ｌ１に対して約１ｎＭの結合親和性ｋＤを有する。別の実施形態において、ヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−Ｌ１に対して約０．５ｎＭの結合親和性ｋＤを有する。別の実施形態において、ヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−Ｌ１に対して約０．１ｎＭの結合親和性ｋＤを有する。
一実施形態では、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片はＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の相互作用を阻害し、Ｔ細胞活性化の増加をもたらす。更なる実施形態において、抗体及びその断片はＰＤ−Ｌ１と結合し、Ｔ細胞増殖及び／またはサイトカイン産生の増加をもたらす。また更なる実施形態において、抗体及びその断片はＰＤ−Ｌ１に結合し、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、及びＧＭ−ＣＳＦからなる群から選択される１つ以上のサイトカインの増加をもたらす。したがって、一態様では、本発明はＴ細胞及び抗原提示細胞を抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその断片と接触させることを含む、免疫応答の調節方法を提供する。一実施形態では、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び断片による免疫応答の調節は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）で測定することができる。一実施形態では、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＭＬＲにおいてリンパ球からのサイトカイン産生量を増加させる。更なる実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＭＬＲにおいてＩＬ−２産生及び／またはＩＦＮγ産生量を増加させる。また更なる実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＭＬＲにおいてＩＬ−２産生及びＩＦＮγ産生量を増加させる。一実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はメモリーＴ細胞の応答を向上させる。更なる実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、メモリーＴ細胞からのＩＦＮγ産生の増加により測定される、メモリーＴ細胞の応答を向上させる。
一実施形態では、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は制御性Ｔ細胞の機能を阻害する。更なる実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、制御性Ｔ細胞によるエフェクターＴ細胞の抑制を阻害する。別の実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、制御性Ｔ細胞の存在下でＴ細胞のエフェクター機能を回復させる。更なる実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、制御性Ｔ細胞の存在下で、エフェクターＴ細胞が増殖するかつ／またはサイトカインを産生する能力を回復させる。したがって、一実施形態において、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、または制御性Ｔ細胞の抑制効果の阻害を必要とする対象における、制御性Ｔ細胞の抑制効果の阻害方法を提供する。
一態様では、ＰＤ−Ｌ１に結合する単離された抗体またはその断片を提供し、抗体は、本明細書で１３Ｃ５、５Ｇ９、５Ｇ１１、８Ｃ６、７Ｂ４、４Ｄ１、４Ａ８、８Ｈ４、８Ｈ３、及び１５Ｆ１と称されるハイブリドーマからなる群から選択されるハイブリドーマにより産生される。したがって、本発明は、ハイブリドーマ１３Ｃ５、５Ｇ９、５Ｇ１１、８Ｃ６、７Ｂ４、４Ｄ１、４Ａ８、８Ｈ４、８Ｈ３、及び１５Ｆ１、並びに本明細書にて開示した抗体を産生する任意のハイブリドーマもまた包含する。本発明はまた、本明細書において提供する抗体及びその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及びかかる発現ベクターを含む宿主細胞もまた、本発明に包含される。
一実施形態では、本発明は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体免疫複合体を提供する。したがって、本発明は、ＰＤ−Ｌ１に結合し、治療剤に連結される、または治療剤と複合体化される抗体またはその断片を提供する。抗ＰＤ−Ｌ１抗体に連結されてもよい、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体と複合体化されてもよい治療剤としては、細胞毒性薬、放射性同位元素、免疫調節剤、または抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
一態様では、本発明は、本明細書において提供する１種または複数種の抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその断片、及び薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。
一態様では、本発明は、対象における免疫応答を調節する方法を提供し、この方法は、対象に本明細書において提供する治療有効量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその断片を投与することを含む。一実施形態では、本発明は、疾患または障害の治療または予防を必要とする対象における、疾患または障害を治療または予防する方法を提供し、対象に、本明細書において提供する治療有効量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその断片を投与することを含む。
一実施形態では、本発明は、抗腫瘍応答の向上を必要とする対象における、抗腫瘍応答を向上させる方法を提供し、対象に、本発明の治療有効量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体または断片を投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、腫瘍の減少、または腫瘍細胞の増殖の阻害を必要とする対象における、腫瘍を減少させる方法、または腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供し、対象に、本発明の治療有効量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体または断片を投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、癌の治療を必要とする対象における、癌の治療方法を提供し、対象に、本発明の治療有効量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体または断片を投与することを含む。更なる実施形態において、癌は、リンパ腫、白血病、黒色腫、神経膠腫、乳癌、肺癌、大腸癌、骨肉腫、卵巣癌、膀胱癌、腎臓癌、肝癌、胃癌、直腸癌、精巣癌、唾液腺癌、甲状腺癌、胸腺癌、上皮癌、頭頸部癌、胃の癌、膵癌、膵臓癌、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される。
一実施形態では、本発明は、感染症の治療を必要とする対象における感染症の治療方法を提供し、対象に、本発明の治療有効量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体または断片を投与することを含む。更なる実施形態において、感染症は、カンジダ症、カンジダ血症、アスペルギルス症、連鎖球菌性肺炎、連鎖球菌性の皮膚及び口咽頭の状態、グラム陰性菌による敗血症、結核、単核細胞症、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルスにより引き起こされる呼吸器疾患、マラリア、住血吸虫症、及びトリパノゾーマ症からなる群から選択される。
[本発明1001]
ＰＤ−Ｌ1に結合する単離された抗体またはその断片であって、
配列番号：81、87、93、99、105、111、117、123、129、及び135からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有する重鎖ＣＤＲ1配列；
配列番号：82、88、94、100、106、112、118、124、130、及び136からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有する重鎖ＣＤＲ2配列；
配列番号：83、89、95、101、107、113、119、125、131、及び137からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有する重鎖ＣＤＲ3配列；
配列番号：84、90、96、102、108、114、120、126、132、及び138からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有する軽鎖ＣＤＲ1配列；
配列番号：85、91、97、103、109、115、121、127、133、及び139からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有する軽鎖ＣＤＲ2配列；及び
配列番号：86、92、98、104、110、116、122、128、134、及び140からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有する軽鎖ＣＤＲ3配列
を含む、前記単離された抗体またはその断片。
[本発明1002]
配列番号：81、87、93、99、105、111、117、123、129、及び135からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ1；
配列番号：82、88、94、100、106、112、118、124、130、及び136からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ2；
配列番号：83、89、95、101、107、113、119、125、131、及び137からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ3；
配列番号：84、90、96、102、108、114、120、126、132、及び138からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ1；
配列番号：85、91、97、103、109、115、121、127、133、及び139からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ2；及び
配列番号：86、92、98、104、110、116、122、128、134、及び140からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ3
を含む、本発明1001の抗体またはその断片。
[本発明1003]
それぞれ配列番号：81、82、及び83のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3；及び
それぞれ配列番号：84、85、及び86のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3
を含む、本発明1001の抗体または断片。
[本発明1004]
それぞれ配列番号：87、88、及び89のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3；及び
それぞれ配列番号：90、91、及び92のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3
を含む、本発明1001の抗体または断片。
[本発明1005]
それぞれ配列番号：93、94、及び95のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3；及び
それぞれ配列番号：96、97、及び98のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3
を含む、本発明1001の抗体または断片。
[本発明1006]
それぞれ配列番号：99、100、及び101のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3；及び
それぞれ配列番号：102、103、及び104のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3
を含む、本発明1001の抗体または断片。
[本発明1007]
それぞれ配列番号：105、106、及び107のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3；及び
それぞれ配列番号：108、109、110のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3
を含む、本発明1001の抗体または断片。
[本発明1008]
それぞれ配列番号：111、112、及び113のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3；及び
それぞれ配列番号：114、115、及び116のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3
を含む、本発明1001の抗体または断片。
[本発明1009]
それぞれ配列番号：117、118、及び119のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3；及び
それぞれ配列番号：120、121、及び122のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3
を含む、本発明1001の抗体または断片。
[本発明1010]
それぞれ配列番号：123、124、及び125のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3；及び
それぞれ配列番号：126、127、及び128のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3
を含む、本発明1001の抗体または断片。
[本発明1011]
それぞれ配列番号：129、130、及び131のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3；及び
それぞれ配列番号：132、133、及び134のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3
を含む、本発明1001の抗体または断片。
[本発明1012]
それぞれ配列番号：135、136、及び137のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3；及び
それぞれ配列番号：138、139、及び140のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3
を含む、本発明1001の抗体または断片。
[本発明1013]
キメラである、またはヒト化されている、本発明1001〜1012のいずれかの単離された抗体またはその断片。
[本発明1014]
ＰＤ−Ｌ1に結合する単離された抗体またはその断片であって、
配列番号：2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、及び46からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び
配列番号：4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、及び48からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、前記単離された抗体またはその断片。
[本発明1015]
配列番号：2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、及び46からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び
配列番号：4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、及び48からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、本発明1014の単離された抗体またはその断片。
[本発明1016]
ＰＤ−Ｌ1に結合する単離された抗体またはその断片であって、
配列番号：42の重鎖可変領域；及び
配列番号：44の軽鎖可変領域
を含む、前記単離された抗体またはその断片。
[本発明1017]
ＰＤ−Ｌ1に結合する単離された抗体またはその断片であって、
配列番号：46の重鎖可変領域；及び
配列番号：48の軽鎖可変領域
を含む、前記単離された抗体またはその断片。
[本発明1018]
ＰＤ−Ｌ1に結合する単離された抗体またはその断片であって、
配列番号：70の重鎖；及び
配列番号：74の軽鎖
を含む、前記単離された抗体またはその断片。
[本発明1019]
ＰＤ−Ｌ1に結合する単離された抗体またはその断片であって、
配列番号：72の重鎖；及び
配列番号：74の軽鎖
を含む、前記単離された抗体またはその断片。
[本発明1020]
ＰＤ−Ｌ1に結合する単離された抗体またはその断片であって、
配列番号：76の重鎖；及び
配列番号：80の軽鎖
を含む、前記単離された抗体またはその断片。
[本発明1021]
ＰＤ−Ｌ1に結合する単離された抗体またはその断片であって、
配列番号：78の重鎖；及び
配列番号：80の軽鎖
を含む、前記単離された抗体またはその断片。
[本発明1022]
本発明1001〜1021のいずれかの抗体またはその断片と同じエピトープに結合する、単離された抗体またはその断片。
[本発明1023]
本発明1001〜1021のいずれかの抗体またはその断片とＰＤ−Ｌ1への結合について競合し、前記競合がＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、または表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイにより測定される、単離された抗体またはその断片。
[本発明1024]
モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、及びＦ（ａｂ）’断片からなる群から選択される、本発明1001〜1021のいずれかの単離された抗体またはその断片。
[本発明1025]
治療剤に連結される、または治療剤と複合体化される、本発明1001〜1021のいずれかの抗体またはその断片。
[本発明1026]
前記治療剤が、細胞毒性薬、放射性同位体、免疫調節剤、または抗体である、本発明1025の抗体またはその断片。
[本発明1027]
ＰＤ−Ｌ1に結合する単離された抗体またはその断片であって、ＰＤ−Ｌ1に対して約10ｎＭ〜約0．01ｎＭの親和性を有する、前記単離された抗体またはその断片。
[本発明1028]
ＰＤ−Ｌ1に対して約10ｎＭ以下の親和性を有する、本発明1027の単離された抗体またはその断片。
[本発明1029]
ＰＤ−Ｌ1に対して約1．0ｎＭ以下の親和性を有する、本発明1027の単離された抗体またはその断片。
[本発明1030]
ＰＤ−Ｌ1に結合する単離された抗体またはその断片であって、前記抗体が、約5ｎｇ／ｍＬ〜約1000ｎｇ／ｍＬの結合ＥＣ50を有する、前記単離された抗体またはその断片。
[本発明1031]
ＰＤ−Ｌ1に結合する単離された抗体またはその断片であって、前記抗体が、ＰＤ−Ｌ1のＰＤ−1への結合を遮断する、前記単離された抗体またはその断片。
[本発明1032]
ＰＤ−Ｌ1のＰＤ−1への結合を約5ｎｇ／ｍＬ〜約1000ｎｇ／ｍＬのＩＣ50で遮断する、本発明1031の単離された抗体またはその断片。
[本発明1033]
ＰＤ−Ｌ1に結合する単離された抗体またはその断片であって、炎症性サイトカインの産生により測定されるＴ細胞活性化を増加させる、前記単離された抗体またはその断片。
[本発明1034]
ＩＬ−2及びＩＦＮγのＴ細胞による産生を増加させる、本発明1028の単離された抗体またはその断片。
[本発明1035]
ＰＤ−Ｌ1に結合する単離された抗体またはその断片であって、13Ｃ5、5Ｇ9、5Ｇ11、8Ｃ6、7Ｂ4、4Ｄ1、4Ａ8、8Ｈ4、8Ｈ3、及び／または15Ｆ1からなる群から選択されるハイブリドーマにより産生される、前記単離された抗体またはその断片。
[本発明1036]
本発明1001〜1035のいずれかの抗体またはその断片、及び
薬学的に許容される担体
を含む組成物。
[本発明1037]
本発明1001〜1035のいずれかの抗体またはその断片をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
[本発明1038]
本発明1037の単離されたポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
[本発明1039]
本発明1038の発現ベクターを含む、宿主細胞。
[本発明1040]
13Ｃ5、5Ｇ9、5Ｇ11、8Ｃ6、7Ｂ4、4Ｄ1、4Ａ8、8Ｈ4、8Ｈ3、及び15Ｆ1からなる群から選択される、単離されたハイブリドーマ細胞株。
[本発明1041]
Ｔ細胞の活性化を増加させるための方法であって、Ｔ細胞を本発明1001〜1035のいずれかの抗体またはその断片と接触させる段階を含む、前記方法。
[本発明1042]
対象において腫瘍を減少させるための方法または腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法であって、前記対象に治療有効量の本発明1001〜1035のいずれかの単離された抗体またはその断片を投与する段階を含む、前記方法。
[本発明1043]
癌の処置を必要とする対象において癌を処置するための方法であって、治療有効量の本発明1001〜1035のいずれかの単離された抗体またはその断片を前記対象に投与する段階を含む、前記方法。
[本発明1044]
前記癌が、リンパ腫、白血病、黒色腫、神経膠腫、乳癌、肺癌、大腸癌、骨肉腫、卵巣癌、膀胱癌、腎臓癌、肝癌、胃癌、直腸癌、精巣癌、唾液腺癌、甲状腺癌、胸腺癌、上皮癌、頭頸部癌、胃の癌、膵臓癌、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、本発明1043の方法。
[本発明1045]
感染症の処置を必要とする対象において感染症を処置するための方法であって、治療有効量の本発明1001〜1035のいずれかの単離された抗体またはその断片を前記対象に投与する段階を含む、前記方法。
[本発明1046]
前記感染症が、カンジダ症、カンジダ血症、アスペルギルス症、連鎖球菌性肺炎、連鎖球菌性の皮膚及び口咽頭の状態、グラム陰性菌による敗血症、結核、単核細胞症、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルスにより引き起こされる呼吸器疾患、マラリア、住血吸虫症、並びにトリパノゾーマ症からなる群から選択される、本発明1045の方法。
図１ａ〜ｄは、ＥＬＩＳＡにより測定した、抗体濃度の範囲にわたるマウスハイブリドーマ抗ＰＤ−Ｌ１抗体のＰＤ−Ｌ１への結合を示すグラフのセットである。ハイブリドーマ抗体８Ｈ３−ｍＩｇＧ（ｍ８Ｈ３）、１５Ｆ１−ｍＩｇＧ（ｍ１５Ｆ１）、５Ｇ９−ｍＩｇＧ（ｍ５Ｇ９）、及び４Ａ８−ｍＩｇＧ（ｍ４Ａ８）の結合を、図１ａに示す。ハイブリドーマ抗体５Ｇ１１−ｍＩｇＧ（ｍ５Ｇ１１）、７Ｂ４−ｍＩｇＧ（ｍ７Ｂ４）、４Ｄ１−ｍＩｇＧ（ｍ４Ｄ１）、及び８Ｈ４−ｍＩｇＧ（ｍ８Ｈ４）の結合を、図１ｂに示す。ハイブリドーマ抗体８Ｃ６−ｍＩｇＧ（ｍ８Ｃ６）の結合を、図１ｃに示す。ハイブリドーマ抗体１３Ｃ５−ｍＩｇＧ（ｍ１３Ｃ５）の結合を、図１ｄに示す。図１ａ〜１ｄのそれぞれにおいて、ｍＩｇＧ１の結合を陰性対照として示す。 図２ａ〜ｃは、ＥＬＩＳＡにより測定した、濃度の範囲にわたるキメラ抗ＰＤ−Ｌ１抗体のＰＤ−Ｌ１への結合を示すグラフのセットである。キメラ抗体ｃｈ５Ｇ１１−ｈＩｇＧ４及びｃｈ５Ｇ１１−ｈＩｇＧ１の結合を、図２ａに示す。キメラ抗体ｃｈ１３Ｃ５−ｈＩｇＧ４、ｃｈ１３Ｃ５−ｈＩｇＧ１、及びｃｈ８Ｈ４−ｈＩｇＧ４の結合を、図２ｂに示す。キメラ抗体ｃｈ８Ｃ６−ｈＩｇＧ４の結合を、図２ｃに示す。図２ａ〜２ｃのそれぞれにおいて、ｈＩｇＧ４の結合を陰性対照として示す。 図３ａ〜ｂは、ＥＬＩＳＡにより測定した、抗体濃度の範囲にわたるヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体のＰＤ−Ｌ１への結合を示すグラフのセットである。対象ｈＩｇＧ４、並びにヒト化抗体ｈｕ５Ｇ１１−ｈＩｇＧ１及びｈｕ５Ｇ１１−ｈＩｇＧ４の結合を、図３ａに示す。対照ｈＩｇＧ４、並びにヒト化抗体ｈｕ１３Ｃ５−ｈＩｇＧ１及びｈｕ１３Ｃ５−ｈＩｇＧ４の結合を、図３ｂに示す。 図４ａ〜ｃは、ＥＬＩＳＡにより測定した、抗体濃度の範囲にわたるハイブリドーマ抗ＰＤ−Ｌ１抗体によるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の遮断を示すグラフのセットである。対照ｍＩｇＧ１と比較した、ハイブリドーマ抗体１３Ｃ５−ｍＩｇＧ（ｍ１３Ｃ５）、８Ｃ６−ｍＩｇＧ（ｍ８Ｃ６）、５Ｇ９−ｍＩｇＧ（ｍ５Ｇ９）、及び４Ａ８−ｍＩｇＧ（ｍ４Ａ８）によるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１結合の遮断を、図４ａに示す。対照ｍＩｇＧ１と比較した、ハイブリドーマ抗体５Ｇ１１−ｍＩｇＧ（ｍ５Ｇ１１）、７Ｂ４−ｍＩｇＧ（ｍ７Ｂ４）、４Ｄ１−ｍＩｇＧ（ｍ４Ｄ１）、及び８Ｈ４−ｍＩｇＧ（ｍ８Ｈ４）によるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１結合の遮断を、図４ｂに示す。対照ｍＩｇＧ１と比較した、ハイブリドーマ抗体８Ｈ３−ｍＩｇＧ（ｍ８Ｈ３）及び１５Ｆ１−ｍＩｇＧ（ｍ１５Ｆ１）によるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１結合の遮断を、図４ｃに示す。 図５ａ〜ｃは、ＥＬＩＳＡにより測定した、抗体濃度の範囲にわたるキメラ抗ＰＤ−Ｌ１抗体によるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の遮断を示すグラフのセットである。対照ｈＩｇＧ４と比較した、キメラ抗体ｃｈ５Ｇ１１ ｈＩｇＧ４及びｃｈ５Ｇ１１ ｈＩｇＧ１によるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１結合の遮断を、図５ａに示す。対照ｈＩｇＧ４と比較した、キメラ抗体ｃｈ８Ｃ６−ｈＩｇＧ４によるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１結合の遮断を、図５ｂに示す。対照ｈＩｇＧ４と比較した、キメラ抗体ｃｈ８Ｈ４−ｈＩｇＧ４、ｃｈ１３Ｃ５−ｈＩｇＧ１、及びｃｈ１３Ｃ５−ｈＩｇＧ４によるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１結合の遮断を、図５ｃに示す。 図６ａ〜ｂは、ＥＬＩＳＡにより測定した、抗体濃度の範囲にわたるヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体によるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の遮断を示すグラフのセットである。対照ｈＩｇＧ４、並びにヒト化抗体５Ｇ１１−ｈＩｇＧ１及び５Ｇ１１−ｈＩｇＧ４によるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１結合の遮断を、図６ａに示す。対照ｈＩｇＧ４、並びにヒト化抗体１３Ｃ５−ｈＩｇＧ１及び１３Ｃ５−ｈＩｇＧ４によるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１結合の遮断を、図６ｂに示す。 図７ａおよび７ｂは、ＦＡＣＳにより測定した、抗体濃度の範囲にわたるハイブリドーマ抗ＰＤ−Ｌ１抗体のＰＤ−Ｌ１への結合を示す。対照抗体ｍＩｇＧ１と比較した、ハイブリドーマ抗体４Ａ８、１５Ｆ１、４Ｄ１、１３Ｃ５、８Ｈ４、及び８Ｈ３の結合（平均蛍光強度により測定）を、図７ａに示す。対照抗体ｍＩｇＧ１と比較した、ハイブリドーマ抗体５Ｇ１１、８Ｃ６、５Ｇ９、または７Ｂ４の結合（平均蛍光強度により測定）を、図７ｂに示す。 ＦＡＣＳにより測定した、抗体濃度の範囲にわたるキメラ抗ＰＤ−Ｌ１抗体のＰＤ−Ｌ１への結合を示す。対照抗体ｈＩｇＧ４、並びにキメラ抗体ｃｈ１３Ｃ５−ｈＩｇＧ１、ｃｈ５Ｇ１１−ｈＩｇＧ１、及びｃｈ５Ｇ１１−ｈＩｇＧ４の結合を示す。 ＦＡＣＳにより測定した、抗体濃度の範囲にわたるヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体のＰＤ−Ｌ１への結合を示す。対照抗体ｈＩｇＧ４、並びにヒト化抗体ｈｕ１３Ｃ５−ｈＩｇＧ１、ｈｕ１３Ｃ５−ｈＩｇＧ４、ｈｕ５Ｇ１１−ｈＩｇＧ１、及びｈｕ５Ｇ１１−ｈＩｇＧ４の結合を示す。 図１０ａおよび１０ｂは、ＦＡＣＳにより測定した、抗体濃度の範囲にわたるハイブリドーマ抗ＰＤ−Ｌ１抗体によるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の遮断を示す。対照抗体ｍＩｇＧ１、並びにハイブリドーマ抗体ｍ４Ｄ１、ｍ５Ｇ１１、ｍ１３Ｃ５、ｍ７Ｂ４、及びｍ８Ｈ４によるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１結合の遮断を、図１０ａに示す。対照抗体ｍＩｇＧ１、並びにハイブリドーマ抗体ｍ４Ａ８、ｍ５Ｇ９、ｍ８Ｃ６、ｍ８Ｈ３、及びｍ１５Ｆ１によるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１結合の遮断を、図１０ｂに示す。 ＦＡＣＳにより測定した、対照抗体ｈＩｇＧ４、またはキメラ抗ＰＤ−Ｌ１抗体ｃｈ８Ｃ６−ｈＩｇＧ４、ｃｈ５Ｇ１１−ｈＩｇＧ１、ｃｈ５Ｇ１１−ｈＩｇＧ４、ｃｈ１３Ｃ５−ｈＩｇＧ１、ｃｈ１３Ｃ５−ｈＩｇＧ４、もしくはｃｈ８Ｈ４−ｈＩｇＧ４の濃度の範囲にわたる、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の遮断を示す。 ＦＡＣＳにより測定した、対照抗体ｈＩｇＧ４、またはヒト化抗体ｈｕ１３Ｃ５−ｈＩｇＧ１、ｈｕ１３Ｃ５−ｈＩｇＧ４、ｈｕ５Ｇ１１−ｈＩｇＧ１、もしくはｈｕ５Ｇ１１−ｈＩｇＧ４の濃度の範囲にわたる、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の遮断を示す。 異なる濃度のハイブリドーマ抗ＰＤ−Ｌ１抗体に対応する、ＭＬＲでのＩＬ−２（ｐｇ／ｍＬ）産生を示すグラフである。試験した抗体は左から右に向かって、対照ｍＩｇＧ１、ｍ８Ｃ６、ｍ４Ｄ１、ｍ５Ｇ１１、ｍ７Ｂ４、ｍ８Ｈ４、ｍ５Ｇ９、ｍ１３Ｃ５、ｍ８Ｈ３、及びｍ１５Ｆ１であった。Ｔ細胞のみ、及び／またはＤＣのみのウェルもまた、陰性対照として含めた。ｘ軸に示すように、各抗体を２０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．０２μｇ／ｍＬ、及び０．００２μｇ／ｍＬで試験した。 異なる濃度のハイブリドーマ抗ＰＤ−Ｌ１抗体に対応する、ＭＬＲでのＩＦＮγ（ｐｇ／ｍＬ）産生を示すグラフである。試験した抗体は左から右に向かって、対照ｍＩｇＧ１、ｍ８Ｃ６、ｍ４Ｄ１、ｍ５Ｇ１１、ｍ７Ｂ４、ｍ８Ｈ４、ｍ５Ｇ９、ｍ１３Ｃ５、ｍ８Ｈ３、及びｍ１５Ｆ１であった。Ｔ細胞のみ、及び／またはＤＣのみのウェルもまた、陰性対照として含めた。ｘ軸に示すように、各抗体を２０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．０２μｇ／ｍＬ、及び０．００２μｇ／ｍＬで試験した。 異なる濃度のキメラ抗ＰＤ−Ｌ１抗体に対応する、ＭＬＲでのＩＬ−２（ｐｇ／ｍＬ）産生を示すグラフである。試験した抗体は左から右に向かって、対照ｈＩｇＧ４、キメラ８Ｃ６−ｈＩｇＧ４、キメラ８Ｈ４−ｈＩｇＧ４、キメラ５Ｇ１１−ｈＩｇＧ４、及びキメラ１３Ｃ５−ｈＩｇＧ１であった。ｘ軸に示すように、各抗体を２０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．０２μｇ／ｍＬ、及び０．００２μｇ／ｍＬで試験した。 異なる濃度のキメラ抗ＰＤ−Ｌ１抗体に対応する、ＭＬＲでのＩＦＮγ（ｐｇ／ｍＬ）産生を示すグラフである。試験した抗体は左から右に向かって、対照ｈＩｇＧ４、キメラ８Ｃ６−ｈＩｇＧ４、キメラ８Ｈ４−ｈＩｇＧ４、キメラ５Ｇ１１−ｈＩｇＧ４、及びキメラ１３Ｃ５−ｈＩｇＧ１であった。ｘ軸に示すように、各抗体を２０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．０２μｇ／ｍＬ、及び０．００２μｇ／ｍＬで試験した。 異なる濃度のヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体に対応する、ＭＬＲでのＩＬ−２（ｐｇ／ｍＬ）産生を示すグラフである。試験した抗体は左から右に向かって、対照ｈＩｇＧ４、ｈｕ１３Ｃ５−ｈＩｇＧ１、ｈｕ１３Ｃ５−ｈＩｇＧ４、ｈｕ５Ｇ１１−ｈＩｇＧ１、及びｈｕ５Ｇ１１−ｈＩｇＧ４であった。ｘ軸に示すように、各抗体を２０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．０２μｇ／ｍＬ、及び０．００２μｇ／ｍＬで試験した。 異なる濃度のヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体に対応する、ＭＬＲでのＩＦＮγ（ｐｇ／ｍＬ）産生を示すグラフである。試験した抗体は左から右に向かって、対照ｈＩｇＧ４、ｈｕ１３Ｃ５−ｈＩｇＧ１、ｈｕ１３Ｃ５−ｈＩｇＧ４、ｈｕ５Ｇ１１−ｈＩｇＧ１、及びｈｕ５Ｇ１１−ｈＩｇＧ４であった。ｘ軸に示すように、各抗体を２０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．０２μｇ／ｍＬ、及び０．００２μｇ／ｍＬで試験した。 ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞、及び樹状細胞による同種異系ＭＬＲでの、Ｔｒｅｇが仲立ちするＩＦＮγ産生（ｐｇ／ｍＬ）阻害に対する、キメラ（ｃｈ）またはヒト化（ｈｕ）抗ＰＤ−Ｌ１抗体の効果を示す。試験した抗体は左から右に向かって、対照ｈＩｇＧ４、ｃｈ１３Ｃ５−ｈＩｇＧ１、ｃｈ１３Ｃ５−ｈＩｇＧ４、ｈｕ１３Ｃ５−ｈＩｇＧ１、ｈｕ１３Ｃ５−ｈＩｇＧ４、ｃｈ５Ｇ１１−ｈＩｇＧ１、ｃｈ５Ｇ１１−ｈＩｇＧ４、ｈｕ５Ｇ１１−ｈＩｇＧ１、及びｈｕ５Ｇ１１−ｈＩｇＧ４であった。 ヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ｈｕ１３Ｃ５−ｈＩｇＧ１、ｈｕ１３Ｃ５−ｈＩｇＧ４、ｈｕ５Ｇ１１−ｈＩｇＧ１、もしくはｈｕ５Ｇ１１−ｈＩｇＧ４）、アイソタイプコントロール（ｈＩｇＧ４）抗体の存在下で、または抗体無しで、自己ＤＣ及び抗ＣＤ３抗体の同時刺激に応答したＴ細胞からのＩＦＮ−γ産生（ｐｇ／ｍＬ）を示す。 図１８ａおよび１８ｂは、ＩＦＮ−γ産生（ｐｇ／ｍＬ）により測定した、破傷風毒素によりリコールされたメモリーＴ細胞応答に対するヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体の効果を示す。陰性対照ｈＩｇＧ４、またはヒト化抗体ｈｕ１３Ｃ５−ｈＩｇＧ１、ｈｕ１３Ｃ５−ｈＩｇＧ４、ｈｕ５Ｇ１１−ｈＩｇＧ１、もしくはｈｕ５Ｇ１１−ｈＩｇＧ４を、以下の濃度：２０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．０２μｇ／ｍＬ、及び０．００２μｇ／ｍＬで試験した。
詳細な説明
ＰＤ１／ＰＤＬ１相互作用は、ＴＣＲシグナリングを妨げるＳＨＰ１及びＳＨＰ２ホスファターゼを動員することによりＴ細胞受容体シグナリングを阻害する（Ｃｈｅｍｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：９４５−９５４）。ＰＤ−Ｌ１はＰＤ１発現免疫エフェクターの阻害により腫瘍の進行を促進することができるだけでなく、いくつかの感染症において、細胞が仲立ちする免疫を調節することもできる（Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２０：２５０８−２５１５）。更に、同種異系のエフェクターＴ細胞応答は、移植片拒絶においてＰＤ−１経路の調節を受けやすい（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：６９２９−６９３５）。したがって、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１との相互作用は、Ｔ細胞活性化、寛容、及び免疫が仲立ちする組織損傷において、不可欠かつ多様な範囲における免疫制御の役割を果たす。しかし相互作用は、ＰＤ−１の、ＰＤ−Ｌ１との局所結合を遮断することにより逆に作用することができる（Ｉｗａｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１２２９３−７；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：１２５７−６６）。
ＰＤ−１は、効率的な免疫破壊から腫瘍細胞を保護する役割によって、癌の増殖及び発症と相関があることが見出されている。ＰＤ−１のリガンドであるＰＤ−Ｌ１は、多数のマウス及びヒト腫瘍で著しく発現することが明らかとなっており、免疫回避を仲立ちすると仮定されている（Ｉｗａｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９９：１２２９３−１２２９７（２００２）；Ｓｔｒｏｍｅ Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６３：６５０１−６５０５（２００３）；Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：７８７−９）。ヒトにおいては、（腫瘍浸潤リンパ球上での）ＰＤ−１、及び／または（腫瘍細胞上での）ＰＤ−Ｌ１の発現は、免疫組織化学により評価されている多数の原発腫瘍生検にて見出されている。かかる組織としては、肺、肝臓、卵巣、子宮頸部、皮膚、結腸、神経膠腫、膀胱、乳房、腎臓、食道、胃、口腔扁平上皮細胞、尿路上皮細胞、及び膵臓の癌、並びに頭頸部の腫瘍が挙げられる（Ｂｒｏｗｎ Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：１２５７−１２６６（２００３）；Ｄｏｎｇ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：７９３−８００（２００２）；Ｗｉｎｔｔｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６３：７４６２−７４６７（２００３）；Ｓｔｒｏｍｅ Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６３：６５０１−６５０５（２００３）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｒ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６６：３３８１−５（２００６）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１３：１７５７−６１（２００７）；Ｎｏｍｉ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１３：２１５１−７．（２００７））。より著しいことには、腫瘍細胞でのＰＤ−１リガンドの発現は、複数種の腫瘍にわたって、癌患者の予後不良と相関している（ＯｋａＺａｋｉ ａｎｄ Ｈｏｎｊｏ，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：８１３−８２４（２００７）で検討されている）。
ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の相互作用は、腫瘍浸潤リンパ球の減少、Ｔ細胞受容体が仲立ちする増殖の減少、及び癌細胞による免疫回避をもたらすが（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．８１：２８１−７；Ｂｌａｎｋ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５４： ３ ０７−３ １４；Ｋｏｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００４） Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０：５０９４−１００）、一方で、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の遮断はそれに従って、腫瘍特異的Ｔ細胞免疫を向上させ、免疫系による腫瘍細胞の除去に役立つことが示された。侵襲性膵臓癌のマウスモデルにおいて、例えば、Ｎｏｍｉ Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１３：２１５１−２１５７，２００７）は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断の治療効果を示した。ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１のいずれかを指向する抗体の投与により、腫瘍増殖を著しく阻害した。抗体による遮断は、腫瘍への腫瘍反応性ＣＤ８＋ Ｔ細胞の浸潤を効率的に促進し、ＩＦＮ−γ、グランザイムＢ及びパーフォリンを含む抗腫瘍エフェクターの上方制御をもたらした。更に著者らは、ＰＤＬ１／ＰＤ−１遮断は、化学療法と効果的に組み合わせて相乗効果を得ることができることを示した。別の研究では、マウスの扁平上皮細胞癌モデルを使用して、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の抗体による遮断により腫瘍増殖を著しく阻害した（Ｔｓｕｓｈｉｍａ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｏｒａｌ Ｏｎｃｏｌ．４２：２６８−２７４（２００６））。
更に、マウス肥満細胞腫株へのＰＤ−Ｌ１のトランスフェクションは、腫瘍特異的ＣＴＬクローンと共培養した際に腫瘍細胞の細胞溶解の低下をもたらした。抗ＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂを加えた際、細胞溶解は回復した（Ｉｗａｉ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９９：１２２９３−１２２９７（２００２））。ｉｎ ｖｉｖｏでは、ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の遮断は、マウス腫瘍モデルにおける養子Ｔ細胞移入治療の効果を増加することが示された（Ｓｔｒｏｍｅ Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６３：６５０１−６５０５（２００３））。癌治療におけるＰＤ−１の役割についての更なる証拠は、ＰＤ−１ノックアウトマウスで実施した実験からのものである。ＰＤ−Ｌ１発現骨髄腫細胞は野生型動物のみで増殖したが（腫瘍増殖及びそれに伴う動物の死をもたらす）、ＰＤ−１欠損マウスでは増殖しなかった（Ｉｗａｉ Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９９：１２２９３−１２２９７（２００２））。ヒトの研究では、Ｒ．Ｍ．Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：１２２３−１２３４（２００７））が、完全なヒト抗ＰＤ−１抗体を使用したＰＤ−１遮断が、ワクチン抗原及びワクチン接種した個体からの細胞を使用したｅｘ ｖｉｖｏ刺激アッセイにおける、腫瘍特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞（ＣＴＬ）の絶対数を増大させたことを示した。同様の研究において、ＰＤ−Ｌ１の抗体による遮断は、腫瘍関連抗原特異的細胞障害性Ｔ細胞の、向上した細胞溶解活性をもたらし、また、腫瘍特異的ＴＨ細胞によるサイトカイン産生を増加させた（Ｂｌａｎｋ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １１９：３１７−３２７（２００６））。同じ著者らは、ＰＤ−Ｌ１遮断は、抗ＣＴＬＡ−４遮断と組み合わせて使用した際にｉｎ ｖｉｔｒｏでの腫瘍特異的Ｔ細胞応答を増加させたことを示した。全体的に見て、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路は癌治療に対する抗体治療剤の開発の標的である。抗ＰＤ−Ｌ１抗体は慢性ウイルス感染でもまた有用であり得る。急性ウイルス感染後に生成されたメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞は高度に機能的であり、防御免疫の重要な構成要素となっている。対照的に、慢性感染は多くの場合、ウイルス特異的Ｔ細胞応答の種々の程度の機能障害（疲弊）を特徴とし、この欠陥が、残存する病原体を宿主が取り除くことができない主な理由である。機能的エフェクターＴ細胞は最初、感染の初期段階の過程で生成されるが、これらの細胞は慢性感染の過程で、機能を徐々に失う。Ｂａｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｂａｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４３９： ６８２−６８７（２００６））は、ＬＣＭＶの実験室株で感染させたマウスが慢性感染を発症し、血液及び他の組織内で非常に多くの量のウイルスがもたらされたことを示した。これらのマウスは最初、強力なＴ細胞応答を展開したが、最終的にはＴ細胞疲弊により感染に屈した。著者らは、慢性的に感染したマウスにおけるエフェクターＴ細胞の数の減少及び機能の低下が、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断する抗体を注入することにより逆転させることができることを見出した。
一態様では、本発明は、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供する。一実施形態では、抗体またはその断片はヒトＰＤ−Ｌ１に結合する。別の実施形態において、抗体またはその断片はヒト及びカニクイザルのＰＤ−Ｌ１に結合する。別の実施形態において、抗体またはその断片は、ＰＤ−Ｌ１の、Ｔ細胞上のその受容体ＰＤ−１との相互作用を遮断する。一態様では、本発明は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその断片の作製及び使用方法、並びに、医薬組成物を含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその断片を含む組成物を提供する。
本明細書で使用する場合、用語「抗体」とは、少なくとも１つの抗原結合ドメインを有する結合タンパク質を意味する。本発明の抗体及びその断片は、全長抗体、またはその任意の断片であってもよい。したがって、本発明の抗体及び断片は、モノクローナル抗体またはその断片、及び抗体バリアントまたはその断片、並びに免疫複合体を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’断片、Ｆｖ断片、単離されたＣＤＲ領域、単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、及び当該技術分野において公知の他の抗体断片が挙げられる。抗体及びその断片としては更に、組換えポリペプチド、融合タンパク質、及び二重特異的抗体も挙げてもよい。本明細書にて開示した抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプであってもよい。用語「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によりコードされた抗体クラスを意味する。一実施形態では、本明細書にて開示した抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプである。本発明のＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、マウス、ラット、ウサギ、霊長類、ラマ、及びヒトを含むがこれらに限定されない任意の種に由来してよい。ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片はキメラ、ヒト化、または完全ヒト抗体であってもよい。一実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、マウス由来のハイブリドーマ細胞株により作製される抗体である。したがって、一実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はマウス抗体である。別の実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はキメラ抗体である。更なる実施形態において、キメラ抗体はマウス−ヒトキメラ抗体である。別の実施形態において、抗体はヒト化抗体である。更なる実施形態において、抗体はマウス抗体に由来し、ヒト化されている。
「キメラ抗体」は、ある種に由来する重鎖可変領域の少なくとも一部と軽鎖可変領域の少なくとも一部；及び別の種に由来する定常領域の少なくとも一部を有する抗体である。例えば、一実施形態において、キメラ抗体はマウス可変領域及びヒト定常領域を含んでよい。
「ヒト化抗体」は、非ヒト抗体に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）；並びにヒト抗体に由来するフレームワーク領域及び定常領域を含有する抗体である。例えば、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、１種または複数種のマウス抗体に由来するＣＤＲ、並びにヒトフレームワーク及び定常領域を含んでよい。したがって、一実施形態において、本明細書において提供するヒト化抗体は、抗体のＣＤＲが由来するマウス抗体と同一の、ＰＤ−Ｌ１上のエピトープに結合する。例示的なヒト化抗体を本明細書において提供する。本明細書において提供する重鎖及び軽鎖ＣＤＲ、またはこれらのバリアントを含む更なる抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ヒトフレームワーク配列を使用して生成されてよく、これらもまた本発明に包含される。一実施形態では、本発明での使用に適したフレームワーク配列としては、本明細書において提供するフレームワーク配列に構造が類似したこれらのフレームワーク配列が挙げられる。フレームワーク領域の更なる改変を行い、本明細書において提供する抗体の性質を改善してよい。かかる更なるフレームワーク改変としては、化学修飾；免疫原性を低下させるもしくはＴ細胞エピトープを取り除くための点突然変異；または、元の生殖細胞系配列における残基への復帰突然変異を挙げてよい。いくつかの実施形態において、かかる改変としては、生殖細胞系配列への復帰突然変異を含む、本明細書で例示する変異に対応するものが挙げられる。例えば、一実施形態において、本明細書において提供するヒト化抗体のＶＨ及び／またはＶＬのヒトフレームワーク領域内の１つまたは複数のアミノ酸を、マウス親抗体の対応するアミノ酸に復帰突然変異させる。例として、ヒト化５Ｇ１１及びヒト化１３Ｃ５のＶＨ及びＶＬに関して、上述の鋳型ヒト抗体のフレームワークアミノ酸のいくつかの部位を、マウス５Ｇ１１及び１３Ｃ５抗体の対応するアミノ酸配列に復帰突然変異させた。一実施形態では、軽鎖可変領域の位置５３及び／または６０及び／または６７におけるアミノ酸を、マウス５Ｇ１１または１３Ｃ５軽鎖可変領域のその位置で見出される対応するアミノ酸に復帰突然変異させる。別の実施形態において、重鎖可変領域の位置２４及び／または２８及び／または３０及び／または４９及び／または７３及び／または８３及び／または９４におけるアミノ酸を、マウス５Ｇ１１または１３Ｃ５重鎖可変領域のその位置で見出される対応するアミノ酸に復帰突然変異させる。一実施形態では、ヒト化５Ｇ１１抗体は、位置６０のアミノ酸がＳｅｒ（Ｓ）からＡｓｐ（Ｄ）に変異し、位置６７のアミノ酸がＳｅｒ（Ｓ）からＴｙｒ（Ｙ）に変異した軽鎖可変領域、及び、位置２４のアミノ酸がＰｈｅ（Ｆ）からＶａｌ（Ｖ）に変異し、位置４９のアミノ酸がＡｌａ（Ａ）からＧｌｙ（Ｇ）に変異し、位置７３のアミノ酸がＴｈｒ（Ｔ）からＡｓｎ（Ｎ）に変異し、位置８３のアミノ酸がＴｈｒ（Ｔ）からＡｓｎ（Ｎ）に変異した重鎖可変領域を含む。一実施形態では、ヒト化１３Ｃ５抗体は、位置５３のアミノ酸がＴｙｒ（Ｙ）からＬｙｓ（Ｋ）に変異した軽鎖可変領域、及び、位置２８のアミノ酸がＴｈｒ（Ｔ）からＩｌｅ（Ｉ）に変異し、位置３０のアミノ酸がＳｅｒ（Ｓ）からＡｒｇ（Ｒ）に変異し、位置４９のアミノ酸がＳｅｒ（Ｓ）からＡｌａ（Ａ）に変異し、位置９４のアミノ酸がＴｙｒ（Ｙ）からＡｓｐ（Ｄ）に変異した重鎖可変領域を含む。抗体の性質を向上させるために、本明細書において提供するヒト化抗体のフレームワーク領域内で、更なる、または代替の復帰突然変異を行ってよい。本発明はまた、ＰＤ−Ｌ１に結合し、任意の好適なフレームワーク配列、及び抗体の性質を別様で向上させる他のフレームワーク改変に関して、本明細書で記載される例示的改変に対応するフレームワークの改変を含むヒト化抗体を包含する。
本明細書で使用する場合、用語「由来の」は、参照抗体または他の結合タンパク質に関する分子またはポリペプチドを指すのに使用する場合、参照抗体または他の結合タンパク質と同じエピトープへの特異性を有して結合可能な分子またはポリペプチドを意味する。
本明細書にて開示した抗体及びその抗原結合断片はＰＤ−Ｌ１に特異的である。一実施形態では、抗体及びその断片はヒトＰＤ−Ｌ１に特異的である。一実施形態では、本明細書において提供する抗体及び断片は、ヒトまたは霊長類ＰＤ−Ｌ１には結合するが、任意の他の哺乳類に由来するＰＤ−Ｌ１には結合しない。更なる実施形態において、抗体及びその断片はマウスＰＤ−Ｌ１には結合しない。用語「ヒトＰＤ−Ｌ１」「ｈＰＤ−Ｌ１」、及び「ｈｕＰＤ−Ｌ１」等は、本明細書では同じ意味で用いられ、ヒトＰＤ−Ｌ１、及びヒトＰＤ−Ｌ１のバリアントまたはアイソフォームを意味する。「特異的」とは、任意の他の標的よりも高い親和性でＰＤ−Ｌ１に結合する抗体及びその断片を意味する。本明細書で使用する場合、用語「ＥＣ５０」とは、抗体の最大の応答の５０％を得る有効濃度を意味する。本明細書で使用する場合、用語「ＩＣ５０」とは、抗体の最大の応答の５０％を得る阻害濃度を意味する。ＥＣ５０及びＩＣ５０は共に、ＥＬＩＳＡもしくはＦＡＣＳ分析、または当該技術分野において公知の任意の他の方法により測定されてもよい。
一実施形態では、抗ＰＤ１抗体及びその断片またはバリアントは、ＰＤ−Ｌ１に対して、約０．００１ｎＭ〜約１００ｎＭ、約０．００２ｎＭ〜約５０ｎＭ、約０．００５ｎＭ〜約５ｎＭ、約０．０１ｎＭ〜約１ｎＭ、または約０．０５ｎＭ〜約０．１ｎＭの範囲の結合親和性（ＫＤ）を有する。一実施形態では、抗体及びその断片は、ＰＤ−Ｌ１に対して、約５０ｎＭ以下、約２５ｎＭ以下、約２０ｎＭ以下、約１５ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約８ｎＭ以下、約６ｎＭ以下、約５ｎＭ以下、約４ｎＭ以下、約３ｎＭ以下、約２ｎＭ以下、約１ｎＭ以下、約０．９ｎＭ以下、約０．８ｎＭ以下、約０．７ｎＭ以下、約０．６ｎＭ以下、約０．５ｎＭ以下、約０．４ｎＭ以下、約０．３ｎＭ以下、約０．２ｎＭ以下、約０．１ｎＭ以下、約０．０９ｎＭ以下、約０．０８ｎＭ以下、約０．０７ｎＭ以下、約０．０６ｎＭ以下、約０．０５ｎＭ以下、約０．０４ｎＭ以下、約０．０３ｎＭ以下、約０．０２ｎＭ以下、約０．０１ｎＭ以下、約０．００９ｎＭ以下、約０．００８ｎＭ以下、約０．００７ｎＭ以下、約０．００６ｎＭ以下、約０．００５ｎＭ以下、約０．００４ｎＭ以下、約０．００３ｎＭ以下、約０．００２ｎＭ以下、または約０．００１ｎＭ以下の結合親和性（ＫＤ）を有する。一実施形態では、抗体及びその断片は、ＰＤ−Ｌ１に対して、約１０ｎＭ、約９ｎＭ、約８ｎＭ、約７ｎＭ、約６ｎＭ、約５ｎＭ、約４ｎＭ、約３ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約０．９ｎＭ、約０．８ｎＭ、約０．７ｎＭ、約０．６ｎＭ、約０．５ｎＭ、約０．４ｎＭ、約０．３ｎＭ、約０．２ｎＭ、約０．１ｎＭ、約０．０９ｎＭ、約０．０８ｎＭ、約０．０７ｎＭ、約０．０６ｎＭ、約０．０５ｎＭ、約０．０４ｎＭ、約０．０３ｎＭ、約０．０２ｎＭ、約０．０１ｎＭ、約０．００９ｎＭ、約０．００８ｎＭ、約０．００７ｎＭ、約０．００６ｎＭ、約０．００５ｎＭ、約０．００４ｎＭ、約０．００３ｎＭ、約０．００２ｎＭ、または約０．００１ｎＭの結合親和性（ＫＤ）を有する。
一実施形態では、本明細書において提供する抗体及び断片は軽鎖及び重鎖を含み、そのそれぞれが３つのＣＤＲ領域を含む。本発明のＰＤ−Ｌ１抗体に対する例示的な重鎖ＣＤＲ配列（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）を、以下の表１に示す。本発明のＰＤ−Ｌ１抗体に対する例示的な軽鎖ＣＤＲ配列（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）を、以下の表２に示す。本発明のＰＤ−Ｌ１抗体に対する、例示的な可変領域、並びに完全長重鎖配列及び軽鎖配列を、以下の表３に示す。
（表１）重鎖ＣＤＲ配列
Figure 0006909153
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（表２）軽鎖ＣＤＲ配列
Figure 0006909153
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（表３）重鎖及び軽鎖可変領域、並びに完全長重鎖及び軽鎖アミノ酸配列
Figure 0006909153
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一実施形態において、本発明は、抗体１３Ｃ５、５Ｇ９、５Ｇ１１、８Ｃ６、７Ｂ４、４Ｄ１、４Ａ８、８Ｈ４、８Ｈ３、及び／または１５Ｆ１の軽鎖ＣＤＲ及び重鎖ＣＤＲを含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体を提供する。当業者は、本明細書において提供する抗体の重鎖及び軽鎖ＣＤＲを独立して選択し、または混合及び適合させて、本明細書において提供する抗体に由来する、任意の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；並びに任意の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む抗体またはその結合断片を形成することができることを理解するであろう。したがって、本発明は、配列番号：８１、８７、９３、９９、１０５、１１１、１１７、１２３、１２９、及び１３５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；配列番号：８２、８８、９４、１００、１０６、１１２、１１８、１２４、１３０、及び１３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；配列番号：８３、８９、９５、１０１、１０７、１１３、１１９、１２５、１３１、及び１３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；配列番号：８４、９０、９６、１０２、１０８、１１４、１２０、１２６、１３２、及び１３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；配列番号：８５、９１、９７、１０３、１０９、１１５、１２１、１２７、１３３、及び１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；配列番号：８６、９２、９８、１０４、１１０、１１６、１２２、１２８、１３４、及び１４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体を提供する。一実施形態では、本発明は、本明細書において提供する対応する軽鎖または重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３に、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖及び軽鎖ＣＤＲ領域を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体を提供する。一実施形態では、本発明は、本明細書において提供する対応する軽鎖または重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３に対して、１、２、３、４、５、または６個のアミノ酸置換、欠失、または挿入を有するアミノ酸配列を含む重鎖及び軽鎖ＣＤＲ領域を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体を提供する。
一実施形態において、本発明は、１３Ｃ５、５Ｇ９、５Ｇ１１、８Ｃ６、７Ｂ４、４Ｄ１、４Ａ８、８Ｈ４、８Ｈ３、及び／または１５Ｆ１からなる群から選択される抗体の可変重鎖、並びに、１３Ｃ５、５Ｇ９、５Ｇ１１、８Ｃ６、７Ｂ４、４Ｄ１、４Ａ８、８Ｈ４、８Ｈ３、及び／または１５Ｆ１からなる群から選択される抗体の可変軽鎖を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体を提供する。一実施形態において、本明細書において提供する抗体及び断片は、配列番号：２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、及び４６からなる群から選択される重鎖可変領域に、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態において、本明細書において提供する抗体及び断片は、配列番号：２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、４６のアミノ酸配列またはこれらのバリアントを含む重鎖可変領域を含み、バリアントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸置換もしくは欠失、またはこれらの組み合わせを含む。更なる実施形態において、アミノ酸置換基は保存的置換である。
一実施形態において、本明細書において提供する抗体及び断片は、配列番号：４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、または４８からなる群から選択される軽鎖可変領域に、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態において、本明細書において提供する抗体及び断片は、配列番号：４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８のアミノ酸配列、またはこれらのバリアントを含む軽鎖可変領域を含み、バリアントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはより多いのアミノ酸置換、挿入、もしくは欠失、またはこれらの組み合わせを含む。更なる実施形態において、アミノ酸置換基は保存的置換である。
ＣＤＲまたは可変軽鎖もしくは重鎖領域内に、１つまたは複数のアミノ酸置換、挿入、欠失、またはこれらの組み合わせを有する、本明細書にて開示した抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、アミノ酸置換、挿入、または欠失を有しない対応する抗ＰＤ−Ｌ１抗体の生物活性を維持している。したがって、本明細書において提供する変異抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−Ｌ１への結合を維持する。本明細書で使用する場合、「パーセント相同性」とは、２つの参照配列により共有される同一のアミノ酸配列の数を、アミノ酸位置の総数で割って１００を掛けた数を意味する。
いくつかの実施形態において、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体は保存的アミノ酸置換を含む。当業者は、保存的アミノ酸置換とは、あるアミノ酸の、類似の構造的または化学的性質（例えば類似した側鎖）を持った別のアミノ酸との置換であることを理解するであろう。例示的な保存的置換は当該技術分野において、例えば、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，Ｔｈｅ Ｂｅｎｇａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ，４ｔｈ Ｅｄ．（１９８７）に記載されている。
当業者は、可変軽鎖及び可変重鎖が、本明細書において提供する抗体から独立して選択されるか、または混合及び適合されてもよいと理解するであろう。したがって、本発明は、配列番号：２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、及び４６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有する重鎖可変領域；並びに、配列番号：４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、及び４８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有する軽鎖可変領域を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体を提供する。
一実施形態では、本発明は、本明細書にて開示した例示的抗体のいずれか１つと同じエピトープに結合する抗体を提供する。したがって、一実施形態において、本発明は、本明細書において提供する例示的抗体と、ＰＤ−Ｌ１への結合が競合する抗体を提供する。
本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、エフェクター機能を変更させるＦｃ領域改変をさらに含んでよい。Ｆｃ改変はアミノ酸挿入、欠失、もしくは置換、または化学修飾であってもよい。例えば、Ｆｃ領域を改変して、補体結合を増減させる、抗体依存性細胞傷害を増減させる、または、抗体の半減期を増減させることができる。いくつかのＦｃ改変は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、またはＦｃＲｎ等のＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を増減させる。種々のＦｃ改変が、当該技術分野において、例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７６；６５９１（２００１）；Ｔａｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １１９；２０７４（２０１２）；Ｓｐｉｅｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ １９６；３０３（２００２）；Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．ｍＡｂｓ ２：２；１８１（２０１０）；Ｍｅｄｚｉｈｒａｄｓｋｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４４６；２９３（２００８）；Ｍａｎｎａｎ ｅｔ ａｌ． Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ３５；８６（２００７）；ａｎｄ Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４；４１７８（２０００）等に記載されてきた。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域のグリコシル化パターンを変化させる。別の実施形態において、Ｆｃ領域をＰＥＧ化（例えば、抗体またはその断片をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と反応させること）により改変する。
一実施形態では、本明細書において提供する抗体またはその断片は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその断片を含み、かつ、追加の治療剤、細胞毒性剤、免疫付着分子及び造影剤を含む群から選択される薬剤を更に含む免疫複合体である。いくつかの実施形態において、造影剤は、放射線標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識、及びビオチンからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、造影剤は、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ、及び１５３Ｓｍからなる群から選択される放射線標識である。いくつかの実施形態において、治療剤または細胞毒性剤は、化学療法剤、免疫抑制剤、免疫刺激剤、代謝拮抗薬、アルキル化剤、抗生物質、増殖因子、サイトカイン、抗血管新生剤、有糸分裂阻害剤、アントラサイクリン、毒素、及びアポトーシス剤を含む群から選択される。いくつかの実施形態において、結合タンパク質は薬剤に直接複合体化される。別の実施形態において、結合タンパク質は薬剤にリンカーを介して複合体化される。好適なリンカーとしては、本明細書にて開示したアミノ酸及びポリペプチドリンカーが挙げられるが、これらに限定されない。リンカーは切断可能であっても、切断不可能であってもよい。
一実施形態では、本発明は、ＰＤ−Ｌ１、及び少なくとも１つの他の抗原またはエピトープに特異的な二重特異的または多重特異的抗体を提供する。本明細書において提供する結合アッセイ、または当該技術分野において公知の任意の他の結合アッセイを使用して、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片のＰＤ−Ｌ１への結合を試験してもよい。
特に指示しない限り、本発明の実施には、当該技術分野において公知であり、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８−１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｃ．Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩ ｅｔ ａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１）；及びＵｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）に記載されている、従来の分子生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の技術を用いる。
一態様では、本発明は、免疫応答の向上、刺激、または誘発に対応する疾病または状態に関する対象の治療方法を提供する。本発明で使用する場合、用語「処置」または「処置すること」とは、治療的処置、及び予防的または予防用手段の両方を意味する。処置を必要とする対象としては、既に疾患または状態を有するこれらの対象、及び、疾患または状態を発症する可能性があり、疾患または状態を予防、遅延、または減少させることを目的とする対象が挙げられる。本明細書で使用する場合、用語「対象」とは、げっ歯類、ネコ科、イヌ科、及び霊長類等の哺乳動物を意味する。本発明に従う対象はヒトであることが好ましい。
用語「治療有効量」とは、本明細書で使用する場合、対象に治療的及び／または予防的有益性をもたらすのに必要な化合物または組成物の量を意味する。
一態様では、抗体及びその抗原結合断片は、固形または非固形腫瘍の処置に有用である。したがって、一態様では、本発明は癌の処置方法を提供する。本明細書で使用する場合、「癌」とは、通常は制御されていない細胞増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態を意味する。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫（脂肪肉腫、骨原性肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、平滑筋肉腫、脊索腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、横紋筋肉腫、線維肉腫、粘液肉腫、軟骨肉腫を含む）、神経内分泌腫瘍、中皮腫、滑膜腫、神経鞘腫、髄膜腫、腺癌、黒色腫、及び白血病またはリンパ系悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。かかる癌のより詳細な例としては、扁平上皮細胞癌（例えば上皮扁平上皮細胞癌）、ホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫（バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫／慢性リンパ性白血病、菌状息肉症、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、有毛細胞白血病及びリンパ形質細胞性白血病）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫及びＴ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫を含むリンパ球前駆細胞の腫瘍、胸腺腫、末梢Ｔ細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病／Ｔ細胞リンパ腫及び大顆粒リンパ球性白血病を含む成熟Ｔ細胞及びＮＫ細胞の腫瘍、ランゲルハンス細胞組織球症、骨髄性腫瘍、例えば、分化型ＡＭＬ、非分化型ＡＭＬ、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄性単球性白血病、及び急性単球性白血病を含む急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫など、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌を含む肺癌、小細胞肺癌腫、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃の癌または胃癌、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫または子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌または腎癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、肛門癌腫、陰茎癌腫、精巣癌、食道癌、胆道の腫瘍、ユーイング腫瘍、基底細胞癌腫、腺癌、汗腺癌腫、脂腺癌腫、乳頭状癌腫、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌腫、気管支原性癌腫、腎細胞癌腫、ヘパトーマ、胆管癌腫、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌腫、ウィルムス腫瘍、精巣腫瘍、肺癌腫、膀胱癌腫、上皮癌腫、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、骨髄異形成疾患、重鎖病、神経内分泌腫瘍、神経鞘腫、ならびにその他の癌腫、加えて頭頸部癌が挙げられる。
一実施形態では、本明細書において提供する抗体及びその断片は、感染因子に起因する疾患の処置に有用である。感染因子としては、細菌因子、菌類因子、寄生因子、及びウイルス因子が挙げられるが、これらに限定されない。かかる感染因子の例としては、以下が挙げられる：ブドウ球菌属、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Sｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ストレプトコッカス科、ナイセリア科、球菌、腸内細菌科、腸球菌、バンコマイシン耐性腸球菌、クリプトコッカス、ヒストプラスマ症、アスペルギルス、シュードモナス科、ビブリオ科、カンピロバクター、パスツレラ科、ボルデテラ、フランキセラ、ブルセラ、レジオネラ科、バクテロイデス科、グラム陰性桿菌、クロストリジウム、コリネバクテリウム、プロピオニバクテリウム、グラム陽性桿菌、炭疽、アクチノマイセス、ノカルジア、マイコバクテリウム、トレポネーマ、ボレリア、レプトスピラ、マイコプラズマ、ウレアプラズマ、リケッチア、クラミジア、カンジダ、全身性真菌、日和見性真菌、原虫、線虫、吸虫、条虫、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス及びエプスタインバーウイルス、並びに帯状疱疹ウイルスを含む）、ポックスウイルス、パポーバウイルス、肝炎ウイルス（例えばＢ型肝炎ウイルス及びＣ型肝炎ウイルスを含む）、パピローマウイルス、オルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型、及びインフルエンザＣ型を含む）、パラミクソウイルス、コロナウイルス、ピコルナウイルス、レオウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス並びにレトロウイルス。例示的な感染症としては、カンジダ症、カンジダ血症、アスペルギルス症、連鎖球菌性肺炎、連鎖球菌性の皮膚及び口咽頭の状態、グラム陰性菌による敗血症、結核、単核球症、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルスにより引き起こされる呼吸器疾患、マラリア、住血吸虫症、及びトリパノゾーマ症が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、本明細書において提供する抗体及びその断片は、Ｔヘルパー２型（Ｔｈ２）Ｔ細胞が仲立ちする疾患、例えば喘息、アレルギー、または移植片対宿主病等の処置において有益である。
一実施形態では、本明細書において提供する抗体及びその断片は、免疫応答の刺激を必要とする対象における免疫応答の刺激において有益である。例えば、一実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその断片は、抗原に対する免疫応答を誘発するために、対象の該抗原と共に投与されてよい。対象の抗原は、ウイルスまたは細菌等の病原体と関係する抗原であってもよい。したがって一実施形態において、本発明は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び抗原を含むワクチンを提供し、ワクチンは抗原特異的免疫応答を誘発する。
一実施形態において、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体は制御性Ｔ細胞機能を調節する。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞は、エフェクターＴ細胞機能の効果を抑制または低下させるリンパ球である。用語「制御性Ｔ細胞」及び「Ｔｒｅｇ」は、本明細書では同じ意味で用いられる。一実施形態では、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、エフェクターＴ細胞のサイトカイン産生に対する制御性Ｔ細胞の阻害効果を予防または逆に作用させる。例えば、一実施形態において、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体は制御性Ｔ細胞と接触して、エフェクターＴ細胞がＩＦＮγを産生する能力を回復させる。
一実施形態では、本明細書にて開示した抗体及びその断片は、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液包内、胸腔内、鼓室内、子宮内、膀胱内、硝子体内、ボーラス、結膜下、膣、直腸、頬、舌下、鼻腔内、腫瘍内、及び経皮から選択される少なくとも１つの経路により、対象に投与されることができる。
一実施形態では、本明細書にて開示した抗体及びその断片は、投与を必要とする対象に、１つまたは複数の追加の治療剤と組み合わせて投与されることができる。一実施形態では、抗体及びその断片は、対象への追加の治療剤の投与前、投与中、及び／または投与後に、対象に投与されることができる。一実施形態では、追加の治療剤は、化学療法剤、放射線治療剤、サイトカイン、抗体もしくはその断片、または疾患を処置するために必要な任意の他の更なる治療剤である。一実施形態では、同時または逐次的投与に関わらず共に投与される場合に、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び追加の治療剤は、治療上の相乗効果を示す。一実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び追加の治療剤は別々の製剤で投与される。別の実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び追加の治療剤は同じ製剤で投与される。一実施形態では、本明細書において提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び断片は、１つまたは複数の追加の治療剤の免疫調節効果を向上させる。別の実施形態において、１つまたは複数の追加の治療剤は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその断片の効果を向上させる。
本発明は、単離された抗体及びその抗原結合断片、並びに、かかる抗体及び断片をコードする核酸、並びにかかる単離された抗体、断片、及び核酸を含む組成物を提供する。用語「単離された」とは、自然環境から分離されている、対象の化合物（例えば抗体または核酸）を意味する。本発明は更に、単離された抗体もしくはその断片、またはかかる抗体もしくは断片をコードする核酸を含み、１種または複数種の薬学的に許容される担体を更に含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容される担体としては、例えば、賦形剤、希釈剤、封入材料、充填剤、緩衝剤、または他の薬剤が挙げられる。
別途特に明記しない限り、単数形の使用は複数を含む。別途特に明記しない限り、単語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」を意味する。別途明記しない限り、「または（ｏｒ）」の使用は「及び／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味する。語句「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」の意味は、語句「１つまたは複数の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」の意味と等価である。更に、用語「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、並びに、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「〜を含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」等の他の形態の使用は限定的ではない。また、「要素」または「構成要素」等の用語は、別途特に明記しない限り、１つの単位を含む要素または構成要素、及び２つ以上の単位を含む要素または構成要素の両方を包含する。
前述の発明を、理解を明瞭にする目的で例証及び例示によって、ある程度詳細に記載してきたが、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく一定の変更及び修正を本発明に行うことができることが当業者には容易に明らかとなるであろう。以下の実施例は例証として提供されているにすぎず、限定をするために提供されるものではない。当業者は、変更または修正を行って、本質的に類似した結果を得ることができる種々の重要でないパラメーターを容易に認識するであろう。
実施例１：ｈＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体の生成
ｈＰＤ−Ｌ１−ＨｉｓＴａｇ及びｈＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃによるマウスへの免疫付与
ヒトＰＤ−Ｌ１に対する抗体を生成するために、ヒスチジンタグ（ｈＰＤ−Ｌ１−ＨｉｓＴａｇ、配列番号：１４３及び１４４）、マウスＦｃ（ｈＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃ、配列番号：１４５及び１４６）、並びにヒトＦｃタグ（ｈＰＤ−Ｌ１−ｈＦｃ、配列番号：１４７及び１４８）と融合したｈＰＤ−Ｌ１の細胞外領域のオープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡをＰＣＲにより得、それぞれ発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣａｔ番号：Ｖ−７９０）にサブクローニングした。ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３細胞での一過性発現の後、ｈＰＤ−Ｌ１−ＨｉｓタグをＮＴＡカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製し、ｈＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃ及びｈＰＤ−Ｌ１−ｈＦｃをプロテインＧカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。
ＢＡＬＢ／ｃＪマウスを、等体積のフロイント完全／不完全アジュバントで乳化した組換えｈＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓタグタンパク質（１００μｇ／マウス）またはｈＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃで２週間毎に６週間、皮下より免疫付与した。融合の３日前に、アジュバントを含まない抗原を静脈内注射することでマウスを追加免疫した。免疫付与したマウスの脾臓細胞（１×１０８）を、ＰＥＧ Ｈｙｂｒｉ−Ｍａｘ（Ｓｉｇｍａ Ｉｎｃ．，Ｃａｔ番号：７１８１）を有するＳＰ２／０骨髄腫細胞（１．５×１０７）と融合した。融合後、細胞を９６ウェルプレート内にウェルあたり０．１ｍＬで分配し、３７℃、５％ ＣＯ２のインキュベーターでインキュベーションした。１日目に、ウェルあたり０．１ｍＬの、血清及びＨＡＴ加えて２×メトトレキサートを含有する培地を更に加えて細胞に供給した。３日目及び７日目に、各ウェルの培地０．１ｍＬを、新鮮なＨＴ培地０．１ｍＬで置き換えた。スクリーニングは通常９〜１４日目の間に行い、培養液の上清をＥＬＩＳＡにより、ｈＰＤ−Ｌ１−ｈＦｃと反応する抗体について試験した。
選択したハイブリドーマ細胞をクローニングするために、限界希釈を４回実施した。ハイブリドーマ細胞を、１０％のウシ胎児血清、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、２％のＬ−グルタミン、及び１％に調節したＮａＨＣＯ３溶液を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＧＩＢＣＯ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）内で培養した。選択したハイブリドーマ細胞を続いて無血清培地に適応させ、プロテインＧカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、上清から抗体を精製した。ＰＢＳで洗浄した後、０．１Ｍのグリシン（ｐＨ３．０）を使用して結合した抗体を溶出させ、続いて２．０Ｍのトリスを使用してｐＨを中性化した。ウルトラ１５遠心分離濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ）を、緩衝剤交換及び抗体濃縮に使用した。
実施例２：抗ＰＤ−Ｌ１抗体ｃＤＮＡ配列のクローニング及びヒト化
免疫グロブリンｃＤＮＡのクローニング
ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃａｔ番号：７４１０４）により、ｈＰＤ−Ｌ１抗体を産生するハイブリドーマ細胞から単離した全ＲＮＡを鋳型として使用し、メーカーの取扱説明書に従って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｔ番号：１８０６４−１４）により一本鎖ｃＤＮＡを合成した。次にｃＤＮＡ生成物を、５０μＬ体積の反応混合物内で縮重マウスＩｇＧプライマーを使用したＰＣＲに供した（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ＣＡ，ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２３：２０６−２１１（１９９３），Ｓｔｒｅｂｅ Ｎ，ｅｔ ａｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １：３−１４（２０１０））。反応は、Ｓ１０００（商標）Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｃａｔ番号：１８４−２０００）において、９４℃、１．５分の変性；５０℃、１分のアニーリング；及び７２℃、１分の合成を３０サイクル実施した。３０回目のサイクルの終わりに、伸長のため７２℃で、反応混合物を更に７分間インキュベーションした。
ＰＣＲ混合物を、０．５μｇ／ｍＬのエチジウムブロマイドを含有する１％アガロース／トリスホウ酸ゲル内で電気泳動に通した。想定されるサイズ（重鎖及び軽鎖が約４５０ｂｐ）を有するＤＮＡ断片をゲルから取り除き精製した。精製したＰＣＲ産物（３μＬ）をｐＭＤ−１８Ｔベクター（Ｔａｋａｒａ，Ｃａｔ番号：Ｄ１０１Ａ）にクローニングし、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０のケミカルコンピテント大腸菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ番号：Ｃ４０４０−０３）を形質転換した。クローンを、ユニバーサルＭ１３フォワード及びリバースプライマーを使用したコロニーＰＣＲによりスクリーニングし、Ｍ１３フォワードプライマー及びＭ１３リバースプライマーを使用した両方向でのＤＮＡシークエンシングのために、各反応物から１０個の陽性クローンを選択した。
抗体ｍ４Ａ８（配列番号：２５〜２８）、ｍ４Ｄ１（配列番号：２１〜２４）、ｍ５Ｇ９（配列番号：５〜８）、ｍ５Ｇ１１（配列番号：９〜１２）、ｍ８Ｃ６（配列番号：１３〜１６）、ｍ８Ｈ３（配列番号：３３〜３６）、ｍ８Ｈ４（配列番号：２９〜３２）、ｍ７Ｂ４（配列番号：１７〜２０）、ｍ１３Ｃ５（配列番号：１〜４）及びｍ１５Ｆ１（配列番号：３７〜４０）の重鎖及び軽鎖可変領域配列を、対応するハイブリドーマクローンから増幅した。これらの抗体は、所望の機能、例えば、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合の遮断、並びに向上したＴ細胞活性化及びサイトカイン放出を示した。
キメラ５Ｇ１１及び１３Ｃ５抗体の構築及び発現
８Ｃ６、８Ｈ４、５Ｇ１１及び１３Ｃ５キメラ軽鎖（それぞれ配列番号：５２、５６、６２、及び６８）は、ＰＣＲでクローニングしたマウスＶＬ領域のｃＤＮＡをヒトκ鎖定常領域にそれぞれ連結することにより構築した。８Ｃ６、８Ｈ４、５Ｇ１１及び１３Ｃ５キメラ重鎖（配列番号：５０（８Ｃ６−ＩｇＧ４）、５４（８Ｈ４−ＩｇＧ４）、５８（５Ｇ１１−ＩｇＧ１）、６０（５Ｇ１１−ＩｇＧ４）、６４（１３Ｃ５−ＩｇＧ１）、及び６６（１３Ｃ５−ＩｇＧ４））は、ＰＣＲでクローニングしたマウスＶＨ領域のｃＤＮＡをヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ４定常領域に連結することにより構築した。マウスｃＤＮＡ配列の５’末端を、軽鎖及び重鎖の両方にリーダー配列を加えるように設計されたＰＣＲプライマーを使用して改変した。
Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３細胞（１０６／ｍＬで２００ｍＬ）に、１００μｇのキメラ重鎖及び軽鎖発現プラスミドのそれぞれをトランスフェクションし、６日間培養した。次に、上清内のキメラ抗体をプロテインＧカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。キメラ抗体のＰＤ−Ｌ１への結合をＥＬＩＳＡ及びＢｉａｃｏｒｅにより測定し、マウス親抗体の親和性に匹敵する親和性で、ＰＤ−Ｌ１へ結合することを示した。
抗体のヒト化設計
５Ｇ１１及び１３Ｃ５抗体を、ＣＤＲ移植アプローチ（例えば米国特許第５，２２５，５３９号を参照）を使用してヒト化した。マウス抗体５Ｇ１１及び１３Ｃ５の軽鎖及び重鎖可変鎖配列を、構造バイオインフォマティクス研究共同体（ＲＣＳＢ）のタンパク質データバンク（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／ｉｇｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）で入手可能な配列と比較した。５Ｇ１１及び１３Ｃ５のモデルをそれぞれ、最も配列相同性の高いＶＨ及びＶＬに基づいて生成した。
マウス５Ｇ１１及び１３Ｃ５抗体のＶＨ及びＶＬ内の相補性決定領域（ＣＤＲ）を移植するための鋳型ヒト抗体を、国際免疫遺伝学情報システムウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＤＢ／ｃｇｉ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ．ｃｇｉ）を調査することにより、マウス５Ｇ１１及び１３Ｃ５抗体と高い配列相同性を有するヒト抗体生殖細胞系から選択した。５Ｇ１１に関して、選択した鋳型ヒトＶＨはＩＧＨＶ２−５＊１０とＩＧＨＪ４＊０１の組み合わせであり、選択した鋳型ヒトＶＬはＩＧＫＶ１−３３＊０１とＩＧＫＪ２＊０１の組み合わせであった。１３Ｃ５に関して、選択した鋳型ヒトＶＨはＩＧＨＶ３−２１＊０４とＩＧＨＪ４＊０１の組み合わせであり、選択した鋳型ヒトＶＬはＩＧＫＶ７−３＊０１及びＩＧＫＪ２＊０１の組み合わせであった。
上述の鋳型ヒト抗体のＣＤＲアミノ酸配列を、ハイブリドーマ（マウス）５Ｇ１１（配列番号：９３〜９８）及び１３Ｃ５（配列番号：８１〜８６）抗体のＣＤＲで置換した。上述の鋳型ヒト抗体ＶＨ及びＶＬのフレームワークに、マウス５Ｇ１１及び１３Ｃ５抗体のＶＨ及びＶＬから必要なアミノ酸配列を移植し機能的ヒト化抗体を得た。５Ｇ１１及び１３Ｃ５のＶＨ及びＶＬに関して、上述の鋳型ヒト抗体のフレームワークアミノ酸のいくつかの部位を、マウス５Ｇ１１及び１３Ｃ５抗体の対応するアミノ酸配列に復帰突然変異させた。ヒト化５Ｇ１１抗体の軽鎖可変領域に関して、位置６０のアミノ酸はＳｅｒ（Ｓ）からＡｓｐ（Ｄ）に変異し、位置６７のアミノ酸はＳｅｒ（Ｓ）からＴｙｒ（Ｙ）に変異している。また、ヒト化５Ｇ１１抗体の重鎖可変領域に関して、位置２４のアミノ酸はＰｈｅ（Ｆ）からＶａｌ（Ｖ）に変異し、位置４９のアミノ酸はＡｌａ（Ａ）からＧｌｙ（Ｇ）に変異し、位置７３のアミノ酸はＴｈｒ（Ｔ）からＡｓｎ（Ｎ）に変異し、位置８３のアミノ酸はＴｈｒ（Ｔ）からＡｓｎ（Ｎ）に変異している。ヒト化１３Ｃ５の軽鎖可変領域に関して、位置５３のアミノ酸はＴｙｒ（Ｙ）からＬｙｓ（Ｋ）に変異している。また、ヒト化１３Ｃ５の重鎖可変領域に関して、位置２８のアミノ酸はＴｈｒ（Ｔ）からＩｌｅ（Ｉ）に変異し、位置３０のアミノ酸はＳｅｒ（Ｓ）からＡｒｇ（Ｒ）に変異し、位置４９のアミノ酸はＳｅｒ（Ｓ）からＡｌａ（Ａ）に変異し、位置９４のアミノ酸はＴｙｒ（Ｙ）からＡｓｐ（Ｄ）に変異している。ヒト化５Ｇ１１のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：４２と配列番号：４４として提供される。ヒト化５Ｇ１１のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号：４１と配列番号：４３として提供される。ヒト化１３Ｃ５のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：４６と配列番号：４８として提供され、ヒト化１３Ｃ５のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号：４５と配列番号：４７として提供される。
ヒト化抗体５Ｇ１１及び１３Ｃ５の完全長軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：７４及び８０として提供される。完全長ヒト化５Ｇ１１及び１３Ｃ５をコードするＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号：７３及び８９として提供される。ヒト化５Ｇ１１及び１３Ｃ５抗体のＩｇＧ１及びＩｇＧ４版を作製した。ＩｇＧ１の定常領域はＤ２６５Ａ変異を有し（Ｃｌｙｎｅｓ Ｒ，ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６：４４３−４４６（２０００））、一方、ＩｇＧ４の定常領域はＦ２３４ＡとＬ２３５Ａの二重変異を有する（Ｘｕ Ｄ，ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００：１６−２６（２０００））。ヒト化抗体５Ｇ１１−ｈＩｇＧ１の完全長ＩｇＧ１重鎖のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：６９及び７０として提供される。ヒト化抗体５Ｇ１１−ｈＩｇＧ４の完全長ＩｇＧ４重鎖のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：７１及び７２として提供される。ヒト化抗体１３Ｃ５−ｈＩｇＧ１の完全長ＩｇＧ１重鎖のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：７５及び７６として提供される。ヒト化抗体１３Ｃ５−ｈＩｇＧ４の完全長ＩｇＧ４重鎖のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：７７及び７８として提供される。
ヒト化５Ｇ１１及び１３Ｃ５抗体の構築及び発現
ヒト化５Ｇ１１及び１３Ｃ５抗体の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡを合成し、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ番号Ｖ−７９０）にクローニングした。Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３細胞（１０６／ｍＬで２００ｍＬ）に、１００μｇのヒト化重鎖及び軽鎖発現プラスミドのそれぞれをトランスフェクションし、６日間培養した。次に、上清内のヒト化抗体をプロテインＧカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。
ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−Ｌ１抗体との結合反応速度を、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００装置で２５℃にて実施するＢｉａｃｏｒｅ分析により測定し、１Ｈｚのデータ収集速度で記録した。ポリクロナールウサギ抗マウスＩｇＧ（ＧＥ，ＢＲ−１００８−３８）を１０ｍＭ（ｐＨ５．０）の酢酸ナトリウムで希釈して、アミンカップリングキット（ＧＥ，ＢＲ１００５０）を使用して、約１５０００ＲＵでＣＭ５バイオセンサーチップの参照用及び実験用フローセルに固定した。各サイクルの最初に、希釈した試験抗体（１．５μｇ／ｍＬ）を実験用フローセルに１分間注入して捕捉した。原液をランニング緩衝液で１００ｎＭに希釈した後、同じ緩衝液中で連続２倍希釈して０．７８ｎＭにすることによりＰＤ−Ｌ１分析物系列を調製した。分析物を、３０μＬ／分の速度で３分間、参照用及び実験用フローセルに連続して注入した。ランニング緩衝液（０．０５％ Ｐ２０を含むＰＢＳ）を、３０μＬ／分の流速で１０分間流した。各サイクルの最後で、１０ｍＭ（ｐＨ１．７）のグリシン−ＨＣｌ緩衝液を１０μＬ／分の流速で３分間注入することで、バイオセンサー表面を再生した。各分析物サンプルの注入（即ち各サイクル）に関して、同時に記録した参照表面での応答を差し引き、続いて単一参照用のランニング緩衝液サンプルでの応答を差し引くことにより、実験用バイオセンサー表面から得られた結合応答を二重参照した。Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．０ソフトウェアを使用して、力価測定系列全体の二重参照したセンサグラムをラングミュアモデル（１：１）に当てはめることにより、会合及び解離速度定数（ｋａ及びｋｄ）を同時に決定した。解離定数（ＫＤ）は、決定した速度定数から関係ＫＤ＝ｋｄ／ｋａによって計算した。抗ＰＤ−Ｌ１抗体のヒトＰＤ−Ｌ１及びカニクイザルＰＤ−Ｌ１（ｃｙｎｏ−ＰＤ−Ｌ１）の結合親和性を、表４にまとめている。
（表４）抗ＰＤ−Ｌ１抗体のＰＤ−Ｌ１結合親和性
Figure 0006909153
実施例３：ＥＬＩＳＡをベースにした抗ＰＤ−Ｌ１抗体の結合分析
ＥＬＩＳＡによる結合分析を、ヒトＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃ（キメラ及びヒト化抗体検出用）、並びにＰＤ−Ｌ１−ｈＦｃタンパク質（ハイブリドーマ抗体検出用）に基づいて実施した。９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｔ番号：９０１８）を、コーティング緩衝液ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｃａｔ番号：ＳＨ３０２５６．０１Ｂ）内の２μｇ／ｍＬのＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃ（Ｃｒｏｗｎｂｉｏ）１００μＬで、４℃にて一晩コーティングした。ウェルを吸引し、ブロッキング緩衝液（１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，Ｒｏｃｈｅ，Ｃａｔ番号：７３８３２８）を含むＰＢＳ）２００μＬを加えて、３７℃で１時間インキュベーションすることにより、非特異的結合を遮断した。洗浄緩衝液（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ番号：Ｐ１３７９）を含むＰＢＳ）でプレートを３回洗浄した後、ブロッキング緩衝液（２０μｇ／ｍＬから開始）中のハイブリドーマ（図１）、キメラ（図２）、またはヒト化（図３）抗ＰＤ−Ｌ１抗体の１：１０連続希釈液（１００μＬ／ウェル）を加え、室温で１時間インキュベーションした。プレートを洗浄して、ブロッキング緩衝液中のヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｔｈｅｒｍｏ，Ｃａｔ番号：３１４３２）（１００μＬ／ウェル）で６０分間インキュベーションした。プレートを洗浄した後、基質溶液のＴＭＢ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ番号：００−４２０１−５６）（１００μＬ／ウェル）を加え、プレートを室温で２分間インキュベーションした。停止液（２ＮのＨ２ＳＯ４）（１００μＬ／ウェル）を加えて反応を停止した。比色分析用シグナルを発生させ、Ａｕｔｏ Ｐｌａｔｅ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ（供給業者：Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ；モデル：ＭＮＲ０６４３；ソフトウェア：ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ｖ５．４）を使用して４５０ｎｍで読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５を使用してデータを分析し、ＥＣ５０を計算した（図１〜３、表５〜７）。これらのデータは、ＥＬＩＳＡで測定したとおり、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ハイブリドーマ、キメラ、及びヒト化）がＰＤ−Ｌ１に結合することを示した。
（表５）ＥＬＩＳＡに基づいた、抗ＰＤ−Ｌ１ハイブリドーマモノクローナル抗体のＰＤ−Ｌ１との結合ＥＣ５０
Figure 0006909153
（表６）ＥＬＩＳＡに基づく、抗ＰＤ−Ｌ１キメラ抗体のＰＤ−Ｌ１との結合ＥＣ５０
Figure 0006909153
（表７）ＥＬＩＳＡに基づく、ヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体のＰＤ−Ｌ１との結合ＥＣ５０
Figure 0006909153
ビオチン化ヒトＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃのヒトＰＤ−１−ｈＦｃへの結合をブロックすることにより、ＥＬＩＳＡをベースにしたリガンド遮断分析を実施した。ＰＤ−１−ｈＦｃ抗原（Ｃｒｏｗｎｂｉｏ）をＰＢＳ緩衝液（２μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル）に懸濁し、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｔ番号：９０１８）に４℃で一晩コーティングした。ウェルを吸引し、ブロッキング緩衝液（１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，Ｒｏｃｈｅ，Ｃａｔ番号：７３８３２８）を含むＰＢＳ）２００μＬを加えて、３７℃で１時間インキュベーションすることにより、非特異的結合部位を遮断した。洗浄緩衝液（０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ番号：Ｐ１３７９）を含むＰＢＳ）でプレートを３回洗浄した後、ブロッキング緩衝液（２０μｇ／ｍＬから開始）中のハイブリドーマ（図４）、キメラ（図５）、またはヒト化（図６）抗ＰＤ−Ｌ１抗体の１：３連続希釈液（１００μＬ／ウェル）を加え、３７℃で１時間インキュベーションした。次に１００μＬのＰＤＬ−１−ｍＦｃビオチン（０．１μｇ／ｍＬ）を各ウェルに加え、３７℃で２時間インキュベーションした。プレートを３回洗浄した後、二次抗体（アビジンＨＲＰ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＣａｔ番号：Ｅ０７４１８−１６３２，１：５００，１００μＬ／ウェル）を加え、３７℃で０．５時間インキュベーションした。プレートを洗浄した後、基質溶液のＴＭＢ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ番号：００−４２０１−５６）（１００μＬ／ウェル）を加え、プレートを室温で３分間インキュベーションした。停止液（２ＮのＨ２ＳＯ４）（１００μＬ／ウェル）を加えて反応を停止した。比色分析用シグナルを発生させ、Ａｕｔｏ Ｐｌａｔｅ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ（供給業者：Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ；モデル：ＭＮＲ０６４３；ソフトウェア：ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ｖ５．４）を使用して４５０ｎｍで読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５を使用してデータを分析し、ＩＣ５０を計算した（図４〜６、表８〜１０）。これらのデータは、ＥＬＩＳＡで測定したとおり、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ハイブリドーマ、キメラ、及びヒト化）は、細胞表面でのＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１との結合を遮断することができることを示した。
（表８）固体表面上での、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１との結合を阻害する抗ＰＤ−Ｌ１ハイブリドーマモノクローナル抗体のＩＣ５０
Figure 0006909153
（表９）固体表面上での、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１との結合を阻害する抗ＰＤ−Ｌ１キメラ抗体のＩＣ５０
Figure 0006909153
（表１０）固体表面上での、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１との結合を阻害するヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体のＩＣ５０
Figure 0006909153
実施例４：細胞ベースの、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の結合分析
ＰＤ−Ｌ１を安定的に発現する２９３Ｔ細胞株（ＰＤ−Ｌ１−２９３Ｔ）への結合に基づいて、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の細胞結合分析を実施した。２×１０５個の２９３Ｔ−ＰＤ−Ｌ１細胞を、９６ウェル培養プレートの各ウェルに加え、示した抗体（１：５で希釈し、２０μｇ／ｍＬ）と、４℃で１時間インキュベーションした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した後、二次抗体（ＰＥヤギ抗マウス、１：２００；ＰＥマウス抗ヒト、１：１０）を細胞に１００μＬ／ウェルで加え、４℃で４０分間インキュベーションした。ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を３回洗浄し、ＦＡＣＳアレイにより分析した。ハイブリドーマ抗体の結合を図７ａ及び７ｂに示す。キメラ抗体の結合を図８に示す。ヒト化抗体の結合を図９に示す。ハイブリドーマ、キメラ、及びヒト化抗体の計算したＥＣ５０をそれぞれ、以下の表１１、１２、及び１３に示す。これらのデータは、ＦＡＣＳ分析により測定したとおり、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ハイブリドーマ、キメラ、及びヒト化）はＰＤ−Ｌ１に結合することを示した。
（表１１）細胞表面上での、抗ＰＤ−Ｌ１ハイブリドーマモノクローナル抗体のＰＤ−Ｌ１とのＥＣ５０
Figure 0006909153
（表１２）細胞表面上での、抗ＰＤ−Ｌ１キメラ抗体のＰＤ−Ｌ１とのＥＣ５０
Figure 0006909153
（表１３）細胞表面上での、ヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体のＰＤ−Ｌ１とのＥＣ５０
Figure 0006909153
細胞表面上での、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への結合に対する抗ＰＤ−Ｌ１抗体の効果もまた調査した。簡単に説明すると、ＰＤ−Ｌ１−２９３ＴをＦＡＣＳ緩衝液（３％ウシ胎児血清を含むＰＢＳ）中に懸濁した。種々の濃度のハイブリドーマ（図１０）、キメラ（図１１）、またはヒト化（図１２）抗ＰＤ−Ｌ１抗体を細胞懸濁液に加え、９６ウェルプレートで４℃にて６０分間インキュベーションした。次に、ビオチン標識したＰＤ−Ｌ１タンパク質をウェルに加え、４℃で６０分間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、マウス抗ビオチンＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ番号４０９００４）でインキュベーションした。次にＦＡＣＳアレイを使用して、細胞と関係する蛍光をフローサイトメトリーにより検出した。染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）により、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１−２９３Ｔとの結合に対する抗ＰＤ−Ｌ１抗体の効果を測定した。抗ＰＤ−Ｌ１ハイブリドーマ抗体によるＰＤ−１結合の阻害を、図１０ａ及び１０ｂに示す。抗ＰＤ−Ｌ１キメラ抗体によるＰＤ−１結合の阻害を図１１に示す。抗ＰＤ−Ｌ１ヒト化抗体によるＰＤ−１結合の阻害を図１２に示す。ハイブリドーマ（表１４）、キメラ（表１５）、及びヒト化（表１６）抗体についての計算したＩＣ５０を下表中で示す。これらのデータは、ＦＡＣＳにより測定したとおり、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ハイブリドーマ、キメラ、及びヒト化）は、細胞表面上での、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１との結合をブロックすることができることを示した。
（表１４）細胞表面上での、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１との結合を阻害する抗ＰＤ−Ｌ１ハイブリドーマモノクローナル抗体のＩＣ５０
Figure 0006909153
（表１５）細胞表面上での、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１との結合を阻害する抗ＰＤ−Ｌ１キメラ抗体のＩＣ５０
Figure 0006909153
（表１６）細胞表面上での、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１との結合を阻害するヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体のＩＣ５０
Figure 0006909153
実施例５：混合リンパ球反応における、Ｔ細胞活性化に対する抗ＰＤ−Ｌ１抗体の効果
リンパ球エフェクター細胞内でのＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１経路の遮断における、マウス（図１３ａ、１３ｂ）、キメラ（図１４ａ、１４ｂ）、またはヒト化（図１５ａ、１５ｂ）抗ＰＤ−Ｌ１抗体の効果を示すために、混合リンパ球反応を用いた。アッセイでは、ヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体の存在下または非存在下で、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−２産生についてＴ細胞を試験した。
ＣＤ４＋陰性選択単離キット（Ｍｉｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｃａｔ番号１３０−０９１−１５５）を使用して、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞をヒトＰＢＭＣから精製した。Ｍｏ−ＤＣ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｔｏｏｌｂｏｘ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，Ｃａｔ番号１３０−０９３−５６８）を使用して、ヒトＰＢＭＣから単離した単球から未成熟樹状細胞（ＤＣ）を誘導した。Ｍｏ−ＤＣ分化培地で７日間細胞を培養し、続いてＭｏ−Ｄｃ成熟培地で２日間、成熟ＤＣを誘発させた。ＭＬＲを設定するために、各反応において、１０５個の精製したＴ細胞と１０４個の同種異系成熟ＤＣ細胞を加え、総体積を２００μＬとした。試験抗体を、図１３ａ、１３ｂ、１４ａ、１４ｂ、１５ａ、及び１５ｂに示すように異なる濃度（即ち２０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．０２μｇ／ｍＬ、及び０．００２μｇ／ｍＬ）でアッセイした。陰性対照は、抗体を使用しないものか、アイソタイプ対照抗体を使用するものとした。細胞を３７℃で５日間培養した。６日目に、ＩＬ−２ ＥＬＩＳＡキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びｈＩＦＮ−γＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ，Ｃａｔ番号ＤＹ２８５）を使用して培地内のＩＦＮ−γ及びＩＬ−２の量を測定した。図１３ａ、１４ａ、及び１５ａではＩＬ−２分泌の、そして図１３ｂ、１４ｂ、及び１５ｂではＩＦＮ−γ分泌の結果を示す。研究の結果は、ハイブリドーマ、キメラ、及びヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、濃度に依存してＴ細胞のＩＦＮ−γ及びＩＬ−２分泌を促進したことを示した。対照的に、アイソタイプ対照抗体を含有する培養液は、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−２分泌の増加を示さなかった。
実施例６：制御性Ｔ細胞の機能に対する抗ＰＤ−Ｌ１抗体の効果
制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋）は免疫応答を抑制するリンパ球である。ＭＬＲにおける、エフェクターＴ細胞のサイトカイン分泌に対する制御性Ｔ細胞の効果を、キメラまたはヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体の存在下または非存在下にて試験した。制御性Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｃａｔ番号１３０−０９１−３０１）を使用して、制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ ＣＤ２５＋）をＰＢＭＣから精製した。Ｍｏ−ＤＣ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｔｏｏｌｂｏｘ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，Ｃａｔ番号１３０−０９３−５６８）を使用して、ヒトＰＢＭＣから単離した単球から、未成熟樹状細胞（ＤＣ）を誘導した。Ｍｏ−ＤＣ分化培地で７日間細胞を培養し、続いてＭｏ−Ｄｃ成熟培地で２日間、成熟ＤＣを誘発させた。精製したＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞と、同種異系樹状細胞とを含有する混合リンパ球反応系に、ＣＤ４＋ＣＤ２５−と制御性Ｔ細胞の比が４：１となるように制御性Ｔ細胞を加えた。例えば、反応に１×１０５細胞／ウェルのＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞、１×１０４細胞／ウェルのｍＤＣ、及び０．２５×１０５細胞／ウェルのＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を加えた。各反応に１０μｇ／ｍＬの濃度で抗体を加えた。陰性対照は、抗体を使用しないものか、アイソタイプ対照抗体を使用するものとした。細胞を３７℃で５日間培養した。５日目に、５０μＬの培地を採取してＩＬ−２及びＩＦＮγの濃度を検出した。各ウェルに５０μＬの培地を補充した後、細胞を更に２日間培養し、その後ＣＴＧ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇ７５７３）により細胞増殖を分析した。培地内のＩＦＮ−γ及びＩＬ−２の量を、ｈＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ，Ｃａｔ番号ＤＹ２８５）及びＩＬ−２ ＥＬＩＳＡキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して測定した。図１６に示すとおり、キメラ及びヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体であるｃｈ−１３Ｃ５−ｈＩｇＧ１、ｃｈ−１３Ｃ５−ｈＩｇＧ４、ｈｕ−１３Ｃ５−ＩｇＧ１、ｈｕ−１３Ｃ５−ＩｇＧ４、ｃｈ−５Ｇ１１−ＩｇＧ１、ｃｈ−５Ｇ１１−ＩｇＧ４、ｈｕ−５Ｇ１１−ＩｇＧ１、及びｈｕ−５Ｇ１１−ＩｇＧ４は、ＣＤ４＋ＣＤ２５−エフェクターＴ細胞によるＩＦＮ−γの分泌に対する、Ｔｒｅｇ細胞による阻害効果を減少させることができ、このことは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体が制御性Ｔ細胞の免疫抑制機能を調節することができることを示唆している。
実施例７：自己Ｔ細胞活性化に対するヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体の効果
本実施例では、Ｔ細胞活性化に対する、抗ＰＤ−Ｌ１抗体によるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路の遮断効果を試験した。精製したヒトＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｍｉｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｃａｔ番号１３０−０９１−１５５）を、自己単球由来の樹状細胞（ＤＣ）の存在下で１μｇ／ｍＬの可溶性抗ＣＤ３抗体（Ｒ＆Ｄ，Ｃａｔ番号ＭＡＢ１００）を用いて活性化した。力価測定用抗ＰＤ−Ｌ１抗体の存在下または非存在下にて３日間活性化を行った後に培地を回収し、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮγの濃度を測定した。結果を図１７に示し、ヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体によるＰＤ−Ｌ１遮断は、Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ分泌を向上させたことを示唆している。
実施例８：ヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体により、破傷風トキソイド負荷に対するヒトリコールＴ細胞応答が改善される
抗原特異的Ｔ細胞受容体誘発が、抗ＰＤ−Ｌ１抗体によるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路の遮断により調整されたかどうかを調査するために、破傷風トキソイド（ＴＴ）抗原を使用してヒトＴ細胞リコールアッセイを行い、健康なＴＴ免疫付与ドナーの血液に予め存在するメモリーＴ細胞を刺激した。この目的のために、８０Ｕ／ｍＬのペニシリン、８０ｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び３０％の自己血清を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ番号Ａ１０４９１−０１）を使用して、最近（１年未満に）ＴＴ免疫付与されたドナーの新鮮なＰＢＭＣを９６ウェルの丸底プレート（ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｔ番号３７９９）に４×１０５細胞／ウェルで播種し、種々の濃度でヒト化５Ｇ１１または１３Ｃ５を加え、０．１μｇ／ｍＬのＳＥＢ及び１μｇ／ｍＬのＴＴ（Ａｓｔａｒｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ）で刺激した。３７℃、５％ ＣＯ２で７日間共培養した後、上清を回収してＩＦＮ−γの濃度を測定した。図１８ａ及び１８ｂは、２つの別のドナーのＰＢＭＣを使用したアッセイの結果を示す。研究結果は、ＴＴ抗原のみと比較して、抗ＰＤ−Ｌ１抗体によるＰＤ−Ｌ１遮断は、メモリーＴ細胞によるＩＦＮ−γ分泌を向上させたことを示す。
まとめると、ヒト化５Ｇ１１及び１３Ｃ５抗体は、ヒト化の処理過程の間にその親抗体の機能活性を維持した。

Claims (18)

  1. ＰＤ−Ｌ１に結合する単離された抗体またはその断片であって、該抗体またはその断片が、
    それぞれ配列番号：９３、９４、及び９５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、及び
    それぞれ配列番号：９６、９７、及び９８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３
    を含む、前記抗体または断片。
  2. 請求項１に記載のＰＤ−Ｌ１に結合する単離された抗体またはその断片であって、
    配列番号：４２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び
    配列番号：４４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
    を含む、前記単離された抗体またはその断片。
  3. 請求項１に記載のＰＤ−Ｌ１に結合する単離された抗体またはその断片であって、
    配列番号：４２の重鎖可変領域、及び
    配列番号：４４の軽鎖可変領域
    を含む、前記単離された抗体またはその断片。
  4. モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、及びＦ（ａｂ）’断片からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその断片。
  5. 治療剤に連結される、または治療剤と複合体化される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその断片。
  6. 前記治療剤が、細胞毒性薬、放射性同位体、免疫調節剤、または抗体である、請求項５に記載の単離された抗体またはその断片。
  7. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体またはその断片であって、ＰＤ−Ｌ１に対して約１０ｎＭ〜約０．０１ｎＭの親和性を有する、前記単離された抗体またはその断片。
  8. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体またはその断片であって、ＰＤ−Ｌ１に対して約１０ｎＭ以下の親和性を有する、前記単離された抗体またはその断片。
  9. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体またはその断片であって、ＰＤ−Ｌ１に対して約１．０ｎＭ以下の親和性を有する、前記単離された抗体またはその断片。
  10. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体またはその断片であって、前記抗体が、約５ｎｇ／ｍＬ〜約１０００ｎｇ／ｍＬの結合ＥＣ５０を有する、前記単離された抗体またはその断片。
  11. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体またはその断片であって、前記抗体がＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合を遮断する、前記単離された抗体またはその断片。
  12. 請求項１１に記載の抗体またはその断片であって、前記抗体またはその断片がＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合を約５ｎｇ／ｍＬ〜約１０００ｎｇ／ｍＬのＩＣ５０で遮断する、前記単離された抗体またはその断片。
  13. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体またはその断片、及び
    薬学的に許容される担体
    を含む組成物。
  14. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体またはその断片をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
  15. 請求項１４に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
  16. 請求項１５に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  17. 治療有効量の請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその断片を含む、その処置を必要とする対象において癌または感染症を処置するための医薬組成物。
  18. 前記癌が、リンパ腫、白血病、黒色腫、神経膠腫、乳癌、肺癌、大腸癌、骨肉腫、卵巣癌、膀胱癌、腎臓癌、肝癌、胃癌、直腸癌、精巣癌、唾液腺癌、甲状腺癌、胸腺癌、上皮癌、頭頸部癌、胃の癌、膵臓癌、またはこれらの組み合わせからなる群から選択され、または
    前記感染症が、カンジダ症、カンジダ血症、アスペルギルス症、連鎖球菌性肺炎、連鎖球菌性の皮膚及び口咽頭の状態、グラム陰性菌による敗血症、結核、単核細胞症、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルスにより引き起こされる呼吸器疾患、マラリア、住血吸虫症、並びにトリパノゾーマ症からなる群から選択される、請求項１７に記載の医薬組成物。
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