CN108203720A - 能靶向Her2并封闭PD-L1降低肿瘤免疫逃逸的CAR-T载体及其构建方法和应用 - Google Patents

能靶向Her2并封闭PD-L1降低肿瘤免疫逃逸的CAR-T载体及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种能靶向Her2并封闭PD‑L1降低肿瘤免疫逃逸的CAR‑T载体，包括：用于嵌合抗原受体基因的真核转录的人EF1α启动子，如SEQ ID NO.1所示；用于组成集识别、传递、启动于一体的二代CAR或三代CAR的嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体包括Her2单链抗体轻链VL和Her2单链抗体重链VH；IRES核糖体结合序列，如SEQ ID NO.10所示；PD‑L1 scFv以及基因传递载体。此外，本发明还公开了该载体的构建方法及其在制备降低肿瘤免疫逃逸的药物中的应用。本发明所采用的针对Her2的CAR‑T技术，并通过T淋巴细胞内表达的PD‑L1 scFv，封闭肿瘤细胞表面的PD‑L1，阻止PD‑1与PD‑L1的相互作用，抑制肿瘤细胞免疫逃逸的发生，增强T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤，从而提高CAR‑T免疫疗法抗脑胶质瘤效果。

Description

能靶向Her2并封闭PD-L1降低肿瘤免疫逃逸的CAR-T载体及其 构建方法和应用
技术领域
本发明属于医学生物领域，具体涉及一种载体，尤其涉及一种能靶向Her2并封闭PD-L1降低肿瘤免疫逃逸的CAR-T载体。此外，本发明还涉及该载体的构建方法和应用。
背景技术
随着肿瘤免疫学理论和技术的发展，免疫细胞治疗在肿瘤治疗中的作用日益受到重视。研究发现，T淋巴细胞是肿瘤细胞的天敌，在肿瘤免疫应答中起主要作用，对肿瘤细胞有极强的杀伤作用。
嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T-CellImmunotherapy，CAR-T免疫疗法)是最近几年来迅速发展起来的一种新型细胞免疫治疗技术[Eleanor J.Cheadle，et al.CAR T cells:driving the road from the laboratoryto the clinic.Immunological Reviews 2014.Vol.257:91–106]。它是基于免疫系统识别与活化理论，通过基因工程技术，将靶向特异识别(单链抗体scFv)、启动免疫活性和攻击肿瘤细胞的元件整合成一个基因，并将其转导入患者自身T淋巴细胞中，并输回患者体内，使患者重新获得特异性识别肿瘤细胞，激活自身T细胞，有针对性地攻击并杀伤所识别的肿瘤细胞的能力。这是一个革命性和颠覆性的肿瘤治疗技术，在临床上已经显示其强大的对B淋巴性白血病的肿瘤治疗效果，能达到80％治愈B淋巴性白血病的效果。《科学》杂志将过继性靶向肿瘤免疫治疗列为2013年十大科学突破的首位。
CAR-T免疫疗法中最核心的理论基础是T淋巴细胞的识别与活化，它主要是通过不同的scFv识别肿瘤细胞上不同的特异性抗原，再通过CD8分子的Hinge和Transmembrane区将信号传至T淋巴细胞膜内的CD28或CD137和TCR共刺激激活区，从而达到激活自身T淋巴细胞，有针对性地攻击并杀伤所识别的肿瘤细胞的目的。但不同研究者们用不同的靶点和共刺激信号组合开展的研究所得到结果存在一定的差异性，不同的研究者用不同的肿瘤在体内和体外的研究中得到的结果不尽相同[Wilkie S，Picco G，Foster J，etal.Retargeting of human T cells to tumorassociated MΜC1:the evolution of achimeric antigen receptor.J Immunol2008；180:4901–4909.]。所以CAR-T免疫疗法之间的差异可能不止来自于信号传导激活、scFv胞外的抗原结合、重组T淋巴细胞的培养扩增，可能也和机体内肿瘤细胞对嵌合抗原受体T细胞适应性改变(如肿瘤细胞的免疫逃逸等)或复杂的肿瘤微环境相关，从而影响了CAR-T细胞的最终抗肿瘤效果。
CAR-T免疫疗法在治疗B细胞白血病和淋巴瘤上取得了前所未有的成功[Chimericantigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.N Engl JMed.2011；365(8):725-733.]，然而，这一治疗策略对大量的实体瘤患者来说却疗效欠佳[Prospects for gene-engineered T cell immunotherapy for solid cancers.NatMed.2016；22(1):26-36.]。早期的研究着眼于稳定产生肿瘤靶向的T淋巴细胞，而肿瘤周围抑制性的微环境却可能使CAR-T细胞变得毫无效用。因此，未来这一疗法的研究方向在于产生能够抵抗肿瘤微环境中免疫效应分子对CAR-T细胞的抑制和对其凋亡的诱导。近期单抗靶向免疫激活检查点(包括CTLA-4和PD-L1)在实体瘤治疗中的成功应用为通过免疫学途径控制癌症提供了强有力的证据。程序性死亡分子1及其配体(PD-L1/PD-L1)是一对负性免疫共刺激分子，是参与肿瘤免疫逃逸(Tumor escape)过程中的重要分子。当T淋巴细胞表面的PD-L1与肿瘤细胞表面高表达的PD-L1相互识别后，PD-L1将抑制性信号传递至T淋巴细胞内，抑制T细胞的功能、抑制炎性因子的释放，是导致肿瘤发生免疫逃逸的重要原因之一。所以，PD-L1与PD-L1之间相互作用的研究有望为肿瘤的靶向治疗提供重要的实验依据。
HER2是表皮生长因子受体2，在80％的恶性胶质瘤细胞表面均有表达，而在人出生以后的神经元和胶质细胞表面几乎没有表达，经过多个实验中心验证，是一种非常特异的免疫治疗靶点(Nabil Ahmed et al.HER2-specific T cells target primaryGlioblastoma stem cells and induce regression of autologous experimentaltumors.Clin Cancer Res.2010January 15；16(2):474–485.)，因此，最近几年在恶性胶质瘤(glioblastoma)的治疗上有着显著的疗效，被认为是最有前景的恶性胶质瘤的治疗方式之一。
因此，如何采用低成本的方法来抑制肿瘤细胞免疫逃脱的发生，增强T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤，从而提高CAR-T免疫疗法抗脑胶质瘤效果，成为CAR-T治疗的一个技术难题。
目前，尚未见有关能靶向Her2并封闭PD-L1降低肿瘤免疫逃逸的CAR-T载体的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种能靶向Her2并封闭PD-L1降低肿瘤免疫逃逸的CAR-T载体。本发明所采用的针对Her2的CAR-T技术，并通过T淋巴细胞内表达的PD-L1 scFv，封闭肿瘤细胞表面的PD-L1，阻止PD-1与PD-L1的相互作用，抑制肿瘤细胞免疫逃逸的发生，增强T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤，从而提高CAR-T免疫疗法抗脑胶质瘤效果。
本发明要解决的技术问题之二是提供该载体的构建方法。
本发明要解决的技术问题之三是提供该载体的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
在本发明的一方面，提供一种能靶向Her2并封闭PD-L1降低肿瘤免疫逃逸的CAR-T载体，包括：
用于嵌合抗原受体基因的真核转录的人EF1α启动子，如SEQ ID NO.1所示；
用于组成集识别、传递、启动于一体的二代CAR或三代CAR的嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体包括Her2单链抗体轻链VL和Her2单链抗体重链VH；
IRES核糖体结合序列，如SEQ ID NO.10所示；
PD-L1 scFv：包括如SEQ ID NO.2所示的CD8leader嵌合受体信号肽，如SEQ IDNO.11所示的PD-L1单链抗体轻链VL、如SEQ ID NO.4所示的单链抗体铰链Linker、如SEQ IDNO.12所示的PD-L1单链抗体轻链；
以及基因传递载体。
作为本发明优选的技术方案，所述用于组成集识别、传递、启动于一体的二代CAR的嵌合抗原受体包括：如SEQ ID NO.2所示的CD8leader嵌合受体信号肽、如SEQ ID NO.3所示的Her2单链抗体轻链VL、如SEQ ID NO.4所示的单链抗体铰链Linker、如SEQ ID NO.5所示的Her2单链抗体重链VH、如SEQ ID NO.6所示的CD8Hinge嵌合受体铰链、如SEQ ID NO.7所示的CD8 Transmembrane嵌合受体跨膜区、如SEQ ID NO.8所示的CD137嵌合受体共刺激因子、如SEQ ID NO.9所示的TCR嵌合受体T细胞激活域；
作为本发明优选的技术方案，所述用于组成集识别、传递、启动于一体的三代CAR的嵌合抗原受体包括：如SEQ ID NO.2所示的CD8leader嵌合受体信号肽、如SEQ ID NO.3所示的Her2单链抗体轻链VL、如SEQ ID NO.4所示的单链抗体铰链Linker、如SEQ ID NO.5所示的Her2单链抗体重链VH、如SEQ ID NO.6所示的CD8 Hinge嵌合受体铰链、如SEQ ID NO.7所示的CD8 Transmembrane嵌合受体跨膜区、如SEQ ID NO.8所示的CD137嵌合受体共刺激因子、如SEQ ID NO.9所示的TCR嵌合受体T细胞激活域；以及如SEQ ID NO.23所示的CD28嵌合受体共刺激因子。
所述基因传递载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等，优选第三代慢病毒载体，该第三代慢病毒载体包括含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列、原核复制子pUC Ori序列、病毒复制子SV40 Ori序列、RSV启动子、慢病毒5 terminal LTR、慢病毒3 terminal Self-Inactivating LTR、Gag顺式元件、RRE顺式元件、env顺式元件、cPPT顺式元件、IeWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件。所述eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件有6个核苷酸的增强突变，具体为：g.396G>A、g.397C>T、g.398T>C、g.399G>A、g.400A>T、g.411A>T。
在本发明的第二方面，提供一种上述能靶向Her2并封闭PD-L1降低肿瘤免疫逃逸的CAR-T载体的构建方法，包括以下步骤：
包括以下步骤：
(1)提供基因传递载体；
(2)将如SEQ ID NO.1所示的人EF1α启动子、用于组成集识别、传递、启动于一体的二代CAR或三代CAR的嵌合抗原受体、如SEQ ID NO.10所示的IRES核糖体结合序列、PD-L1scFv组合成二代CAR或三代CAR设计方案，经过酶切、连接、重组反应克隆至基因传递载体中，得到二代CAR或三代CAR设计的基因传递载体；
(3)包装基因传递载体；
(4)纯化载体，得到重组CAR-T载体。
作为本发明优选的技术方案，步骤(1)中所述基因传递载体为第三代慢病毒载体，该第三代慢病毒载体包括含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列、原核复制子pUC Ori序列、病毒复制子SV40Ori序列、RSV启动子、慢病毒5terminal LTR、慢病毒3terminal Self-Inactivating LTR、Gag顺式元件、RRE顺式元件、env顺式元件、cPPT顺式元件、eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件；步骤(3)具体为：将得到的二代CAR或三代CAR设计的载体分别与慢病毒包装质粒pPac-GP、pPac-R以及膜蛋白质粒pEnv-G共同转染HEK293T/17细胞，在HEK293T/17细胞中进行基因转录表达后，包装成功重组慢病毒载体会释放到细胞培养上清中，收集包含的重组慢病毒载体的上清液。
作为本发明优选的技术方案，步骤(4)具体为：所述纯化采用抽滤、吸附、洗脱的柱纯化方式。
作为本发明优选的技术方案，步骤(2)中，由人EF1α启动子启动整个CAR基因表达；CD8 leader嵌合受体信号肽位于CAR编码序列的N端，用于引导CAR蛋白定位于细胞膜；Her2单链抗体轻链VL、单链抗体铰链Linker、Her2单链抗体重链VH组合成scfv区域，用于识别Her2抗原；CD8 Hinge嵌合受体铰链用于将scfv锚定于细胞膜外侧；CD8 Transmembrane嵌合受体跨膜区用于将整个嵌合受体固定于细胞膜上；CD137嵌合受体共刺激因子用于刺激T细胞增殖和细胞因子分泌；TCR嵌合受体T细胞激活域用于激活下游信号通路的表达；当Her2scFv区域与Her2抗原结合时，信号通过嵌合受体传递至细胞内，从而产生T细胞增殖、细胞因子分泌增加、抗细胞凋亡蛋白分泌增加、细胞死亡延迟、裂解靶细胞一系列生物学效应；IRES核糖体结合序列后的PD-L1 scFv抑制T淋巴细胞PD-1与肿瘤细胞上的PD-L1结合，降低肿瘤免疫逃逸，增强对肿瘤细胞的杀伤。
作为本发明优选的技术方案，步骤(4)中，所述抽滤步骤要控制上清体积在200ml～2000ml，控制真空度在-0.5MPA～-0.9MPA，防止由于堵孔带来的载体损失；所述吸附步骤要控制溶液的PH值在6～8，防止PH的变化导致载体失活；所述洗脱步骤要控制洗脱液的离子强度在0.5M～1.0M，防止离子强度的变化导致洗脱不完全或者载体失活。
在本发明的第三方面，提供上述载体在制备降低肿瘤免疫逃逸的药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件(图1所示)，赋予T淋巴细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。本发明的CAR设计中包括一个Her2结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区，一个胞内信号转导区，通过一个IRES区连接一个PD-L1 scFv结合区。scFV段的设计对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来是关键的决定因素。而IRES区连接的PD-L1 scFv结合区可抑制T淋巴细胞表面PD-1与肿瘤细胞表面PD-L1相互作用，在抵制肿瘤细胞免疫逃逸中起关键作用。
本发明优选的基因传递载体，为第三代慢病毒载体(该第三代慢病毒载体已在2016年3月17日申请的“一种基于复制缺陷性重组慢病毒的CAR-T转基因载体及其构建方法和应用”发明专利中公开，专利申请号：201610008360.5)，3’SIN LTR去除了U3区域，消除了慢病毒载体自我复制的可能性，大大提高了安全性；增加了cPPT和WPRE元件，提高了转导效率和转基因的表达效率；采用RSV启动子保证了慢病毒载体包装时核心RNA的持续高效转录；采用人自身的EF1α启动子，使CAR基因能够在人体内长时间持续表达。
本发明的重组慢病毒载体可以实现在人T淋巴细胞上表达Her2嵌合抗原受体，引导并激活T淋巴细胞对Her2阳性细胞的杀伤作用，同时淋巴细胞分泌PD-L1 scFv封闭肿瘤细胞表面的PD-L1，增强T淋巴细胞对Her2阳性细胞的杀伤，降低肿瘤细胞的免疫逃逸，在临床上提高CAR-T-治疗恶性胶质瘤的疗效。
经实验验证，本发明采用的PD-L1 scFv抑制T淋巴细胞PD-1与肿瘤细胞上的PD-L1结合，降低肿瘤免疫逃逸，增强对肿瘤细胞的杀伤。与单纯的CAR-Her2相比，能够显著提高细胞因子的分泌、CAR-T细胞的体外杀伤作用以及临床治疗效果，达到了预料不到的技术效果。
附图说明
图1本发明所述的CAR的示意图，其中图1A是CAR的基本结构图，图1B是CAR的代次改进示意图；
图2本发明实施例1中的慢病毒载体结构示意图；
图3为本发明实施例1中构建本发明所述的重组慢病毒载体的构建流程图。其中，图3A是慢病毒骨架质粒pLenti-3G basic的结构示意图；图3B是pLenti-3G basic质粒内切酶切除ZsGreen1绿色荧光蛋白示意图；图3C是基因合成的CAR-Her2、CAR-Her2-IRES-PD-L1scFv片段示意图；图3D是pCAR-Her2质粒结构示意图；图3E是pCAR-Her2-IRES-PD-L1 scFv质粒结构示意图；图3F是膜蛋白pEnv-G质粒结构示意图；图3G是慢病毒包装质粒pPac-GP质粒结构示意图；图3H是慢病毒包装质粒pPac-R质粒结构示意图；
图4为本发明实施例3中重组慢病毒支原体检测结果，lane1为DL2000marker，从上到下条带条带从上到下依次为：2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp；lane2为阳性对照；lane3为阴性对照；lane4为PBS；lane5为H2O；lane6为lvCAR-Her2；lane7为lvCAR-Her2-IRES-PD-L1 scFv；
图5为本发明实施例4中mRNA相对表达量的柱状图，QPCR结果表明CAR和PD-L1scFv在PBMC细胞内高效表达；
图6为本发明实施例4中LDH检测不同效靶比条件下的杀伤效率示意图，E为效应细胞，T为靶细胞，结果表明lvCAR-Her2-IRES-PD-L1 scFv组的杀伤效率明显高于lvCAR-Her2组；
图7为本发明实施例4中QPCR检测不同效靶比条件下细胞因子表达水平，E为效应细胞，T为靶细胞；图7A表示IL-2的mRNA转录水平；图7B表示IFN-γ的mRNA转录水平；结果表明，与lvCAR-Her2组相比，lvCAR-Her2-IRES-PD-L1 scFv组能明显上调IL-2和IFN-γ炎症因子的表达，有助于CAR-T效应细胞对肿瘤细胞的杀伤。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述此发明。应理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，并不作为对本发明的限制。在不偏离本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。
实施例1构建CAR重组慢病毒载体
一、材料
1、慢病毒骨架质粒pLenti-3G basic(慢病毒载体结构见图2)，慢病毒包装质粒pPac-GP、pPac-R以及膜蛋白质粒pEnv-G，HEK293T/17细胞、同源重组酶由世翱(上海)生物医药科技有限公司提供；
2、人EF1α启动子(SEQ ID NO.1)、CD8leader嵌合受体信号肽(SEQ ID NO.2)、Her2单链抗体轻链VL(SEQ ID NO.3)、单链抗体铰链Linker(SEQ ID NO.4)、Her2重链VH(SEQ IDNO.5)、CD8 Hinge嵌合受体铰链(SEQ ID NO.6)、CD8 Transmembrane嵌合受体跨膜区(SEQID NO.7)、CD137嵌合受体共刺激因子(SEQ ID NO.8)、TCR嵌合受体T细胞激活域(SEQ IDNO.9)、IRES核糖体结合序列(SEQ ID NO.10)、PD-L1单链抗体轻链VL(SEQ ID NO.11)、Linker(SEQ ID NO.4)、PD-L1单链抗体轻链VH(SEQ ID NO.12)。3、引物：根据引物设计原则设计扩增DNA片段所需的引物，该引物由上海生物公司合成，具体为：
WPRE-QPCR-F：5’-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3’(SEQ ID NO.13)
WPRE-QPCR-R：5’-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3’(SEQ ID NO.14)
Actin-QPCR-F：5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’(SEQ ID NO.15)
Actin-QPCR-R：5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’(SEQ ID NO.16)
CAR-QPCR-F：5’-GACTTGTGGGGTCCTTCTCCT-3’(SEQ ID NO.17)
CAR-QPCR-R：5’-GCAGCTACAGCCATCTTCCTC-3’(SEQ ID NO.18)
IL2-QPCR-F：5’-GGACTTAATCAGCAATATCAAC-3’(SEQ ID NO.19)
IL2-QPCR-R：5’-AAGGTAATCCATCTGTTCAG-3’(SEQ ID NO.20)
IFN-γ-QPCR-F：5’-TTCTCTTGGCTGTTACTG-3’(SEQ ID NO.21)
IFN-γ-QPCR-R：5’-TTCTGTCACTCTCCTCTT-3’(SEQ ID NO.22)
4、SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ IDNO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22所示的DNA序列由上海生物公司合成，并以寡核苷酸干粉或者质粒形式保存；
5、工具酶Cla I、Sal I均购自NEB公司；
6、高保真酶PrimeSTAR、RN购自Takara公司；
7、0.22μm-0.8μm PES滤器购自millipore公司；
8、质粒抽提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自MN公司；
9、感受态细胞TOP10购自tiangen公司；
10、NaCl、KCl、Na2HPO4.12H2O、KH2PO4、Trypsin、EDTA、CaCl2、NaOH均购自上海生工；
11、Opti-MEM、FBS、DMEM、RPMI-1640、Hepes、购自invitrogen公司；
12、DNeasy试剂盒购自上海捷瑞公司；
13、淋巴细胞分离液购自深圳达科为公司；
14、支原体检测试剂盒、内毒素检测试剂盒、Her2+K562细胞购自世翱(上海)公司；
15、LDH检测试剂盒购自promega公司。
二、重组慢病毒载体pCAR-Her2、pCAR-Her2-IRES-PD-L1 scFv的构建方法。
参见图3，本发明所述重组慢病毒载体的构建方法如下：
将合成的人EF1α启动子(SEQ ID NO.1)、CD8leader嵌合受体信号肽(SEQ IDNO.2)、Her2单链抗体轻链VL(SEQ ID NO.3)、单链抗体铰链Linker(SEQ ID NO.4)、Her2单链抗体重链VH(SEQ ID NO.5)、CD8 Hinge嵌合受体铰链(SEQ ID NO.6)、CD8Transmembrane嵌合受体跨膜区(SEQ ID NO.7)、CD137嵌合受体共刺激因子(SEQ ID NO.8)、TCR嵌合受体T细胞激活域片段(SEQ ID NO.9)、IRES核糖体结合序列(SEQ ID NO.10)、CD8 leader嵌合受体信号肽(SEQ ID NO.2)、PD-L1单链抗体轻链VL(SEQ ID NO.11)、单链抗体铰链Linker(SEQ ID NO.4)、PD-L1单链抗体轻链VH(SEQ ID NO.12)克隆至慢病毒骨架质粒pLenti-3Gbasic，分别得到重组慢病毒质粒pCAR-Her2、pCAR-Her2-IRES-PD-L1 scFv。
(1)将慢病毒骨架质粒pLenti-3G basic使用Cla I和Sal I限制性内切酶进行双酶切(图3B)，产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，并割胶回收大片段V1(5833bp)，置于Eppendorf管内，用MN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表1)，并测定产物的纯度和浓度；
1、溶胶 按200μl NTI/100mg gel比例加入溶胶液，50℃水浴放置5-10分钟。
2、结合DNA 11000g离心30秒，弃去滤液。
3、洗膜 加入700μl NT3，11000g离心30秒，弃去滤液。
4、洗膜 重复第三步一次
5、晾干 11000g离心1分钟，换新的收集管，室温放置1分钟。
6、洗脱DNA 加入15-30μl NE，室温放置1分钟，11000g离心1分钟，收集滤液。
表1琼脂糖凝胶回收步骤
(2)将DNA片段V1分别与CAR-Her2、CAR-Her2-IRES-PD-L1 scFv片段以5μl总体积且摩尔比1:4的比例加入Eppendorf管内，加入同源重组酶反应液15μl，混匀后在42℃孵育30分钟，转移至冰上放置2-3分钟，将反应液加入50μl TOP10中，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟，将管放到预加温到42℃的恒温水浴锅中热激90秒，快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3分钟，每管加900μl LB培养液，然后将管转移到37℃摇床上，温育1小时使细菌复苏，取100μl的转化菌液涂布于Amp LB琼脂平板上，倒置平皿，于恒温培养箱中37℃培养，16小时。
挑取单克隆至1ml LB(Amp+)液体培养基中，37℃摇床200转过夜，第二天送检测序，鉴定正确的克隆；(3)将相应的重组慢病毒质粒甘油菌20ul接种与200ml LB(Amp+)液体培养基中，37℃摇床200转过夜，第二天收获菌液，行质粒抽提(MN公司质粒抽提试剂盒)，检测质粒纯度和浓度，-20℃备用；
实施例2重组慢病毒lvCAR-Her2、lvCAR-Her2-IRES-PD-L1 scFv的包装。
(1)完全培养基：取出预热好的新鲜培养基，加入10％FBS+5ml Pen-Srep，上下颠倒混匀即可；
(2)1XPBS溶液：称量NaCl 8g，KCl 0.2，Na2HPO4.12H2O 3.58g，KH2PO4 0.24g
置于1000ml烧杯中，加入900ml Milli-Q grade超纯水溶解，溶解完成后，使用1000ml量筒定容至1000ml，121℃高温湿热灭菌20min；
(3)0.25％Trypsin溶液:称量Trypsin 2.5g，EDTA 0.19729g置于1000ml烧杯中，加入900ml 1XPBS溶解，溶解完成后，使用1000ml量筒定容至1000ml，0.22μM过滤除菌，长期使用可保存至-20℃冰箱；
(4)0.5M CaCl2溶液：称量36.75g CaCl2用400ml Milli-Q grade超纯水溶解；用Milli-Q grade超纯水将总体积定容至500ml，混匀；0.22μm过滤除菌，分装保存到50ml离心管中，每管45ml左右，4℃保存。(5)2XHBS溶液：称量4.09g NaCl，0.269g Na2HPO4，5.96gHepes，用400ml Milli-Q grade超纯水溶解；校准pH仪后，用2M NaOH溶液将HBS溶液的pH调到7.05。调整每瓶HBS的PH消耗2M NaOH为3ml左右；
(6)从液氮罐中取出冻存的HEK293T/17细胞，迅速转移到37℃水浴中，1～2min后转移到超净台中，无菌操作将冻存管中的液体全部转移至10cm2培养皿中，补足含10％FBS的DMEM至8mL/10cm2dish，24h后显微镜观察细胞，细胞汇合的程度大于80％进行传代；
(7)选择细胞状态良好、无污染的HEK293T/17细胞，每2-6个培养皿为一组，将细胞胰酶消化后，用电动移液器吸取4-12ml完全培养基，向每个消化后的培养皿中加2ml，避免培养皿变干；使用1ml移液器将所有细胞吹打成单细胞悬液，转移到培养基瓶中；
(8)将上述2-6个培养皿中的剩余细胞转移到培养基瓶中，并用培养基再冲洗一便培养皿；
(9)盖紧培养基瓶盖，上下颠倒10次左右充分混匀细胞悬液，将细胞传到8-24个10cm2培养皿中，每皿的细胞密度应当约4×106个/10ml完全培养基左右。如果细胞密度和预期的相差较大，则需要对细胞进行计数，然后按照4×106个/皿的量接种；
(10)每6个培养皿整理为一摞，注意保持上下皿之间的配合。将培养皿左右，前后晃动数次，使细胞充分铺开，然后放入5％CO2培养箱。剩余细胞做同样处理；
(11)检查所传代细胞，细胞汇合度应当为70-80％，轮廓饱满，贴壁良好，在细胞培养皿中均匀分布；(12)为细胞换液，将培养基替换为新鲜完全培养基,每皿9ml，并将培养箱的CO2浓度设定值提高到8％；(13)按照N+0.5配DNA/CaCl2溶液。每皿HEK293T/17细胞转染质粒量按照下列比例使用：重组慢病毒质粒(20μg),pPac-GP(15μg)，pPac-R(10μg),pEnv-G(7.5μg)。取一个新的5ml离心管，加入0.5M CaCl2：0.25ml，重组慢病毒质粒20μg：pPac-GP15μg：pPac-R 10μg：pEnv-G 7.5μg，补充超纯水至0.5ml盖上盖子，充分混匀；
(14)另取一支5ml离心管，加入0.5ml DNA/CaCl2溶液。打开涡旋振荡器，一只手拿住5ml离心管的上端，使管底接触振荡头，使液体在管壁上散开流动，另一只手拿一把1mL移液枪，吸取0.5mL 2×HBS溶液，缓慢滴加进入离心管，控制流速，以半分钟滴完为宜。2×HBS加入后，继续振荡5秒钟，停止振荡，可直接加入需要转染的细胞中；
(15)取一皿细胞，将离心管中的1mL钙转液滴加进去，尽可能使钙转试剂分布到整个培养皿中；
(16)钙转液加入后，在皿盖上做好标记，将培养皿放还到另一个5％CO2培养箱中。确保培养皿水平放置，每摞培养皿不要超过6个。在5％CO2培养箱中放置(6–8h)；
(17)将第一个培养箱的CO2浓度设定值调回到5％；
(18)24小时后，检查细胞状态。细胞汇合度应当为80–85％左右，状态良好。将培养基吸走，更换10ml新鲜的DMEM完全培养基；
(19)48小时后，观察转染效率。绝大多数细胞仍然是贴壁的。可以看到超过95％细胞都会带有绿色荧光。将同一个病毒包装上清液收集到一起，并向培养皿中继续添加10mL新鲜培养基；
(20)72小时后，再次将同一个病毒上清液收集到一起，两次收集的病毒可以放在一起，丢弃培养皿；此时收集的上清里包含了重组慢病毒lvCAR-Her2、lvCAR-Her2-IRES-PD-L1 scFv。
实施例3重组慢病毒载体的浓缩及检测
1、离子交换色谱法纯化重组慢病毒
(1)将收集的上清液使用Thermo真空泵，经0.22μm-0.8μm的PES滤器抽滤，除去杂质；
(2)按1:1～1:10的比例往上清中加入1.5M NaCl 250mM Tris-HCl(pH 6-8)；
(3)将2个离子交换柱串联放置，用4ml 1M NaOH、4ml 1M NaCl、5ml 0.15M NaCl25mM Tris-HCl(pH 6-8)溶液依次过柱；
(4)将步骤2中获得的溶液通过蠕动泵以1-10ml/min的速度给离子交换柱上样；
(5)全部上清液过柱后，使用10ml 0.15M NaCl 25mM Tris-HCl(pH 6-8)溶液清洗一遍；
(6)根据上样量使用1-5ml 1.5M NaCl 25mM Tris-HCl(pH 6-8)进行洗脱，收集洗脱液；
(7)将洗脱液分成25到50μl一管，冻存到-80℃冰箱，进行长期保存；
2、重组慢病毒滴度测定；
(1)取24孔板接种293T细胞。每孔细胞为5×104个，所加培养基体积为500ul,不同种类的细胞生长速度有所差异，进行病毒感染时的细胞融合率为40％-60％；
(2)准备3个无菌EP管，在每个管中加入90ul的新鲜完全培养基(高糖DMEM+10％FBS)接种细胞24小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数，确定感染时细胞的实际数目，记为N；
(3)取待测定的病毒原液10ul加入到第一个管中，轻轻混匀后，取10ul加入到第二个管中，然后依次操作直到最后一管；在每管中加入410ul完全培养基(高糖DMEM+10％FBS),终体积为500ul；
(4)感染开始后20小时，除去培养上清，更换为500μl完全培养基(高糖DMEM+10％FBS)，5％CO2继续培养48小时；
(5)72小时后，观察荧光表达情况，正常情况下，荧光细胞数随稀释倍数增加而相应减少,并拍照；
(6)用0.2ml 0.25％胰酶-EDTA溶液消化细胞，在37℃放置1分钟。用培养基吹洗整个细胞面，离心收集细胞。按照DNeasy试剂盒的说明抽提基因组DNA。每个样品管中加入200μl洗脱液洗下DNA并定量；
(7)准备目的DNA检测qPCRmix总管Ⅰ(QPCR引物为SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.14)：
n＝number of reactions.例如：总反应数为40，将1ml 2×TaqMan UniversalPCR Master Mix，4μl forward primer，4μl reverse primer，4μl probe和788μl H2O混和。震荡后放在冰上；
(8)准备内参DNA检测qPCRmix管Ⅱ(QPCR引物序列为SEQ ID NO.15-SEQ IDNO.16)：
2×TaqMan Master Mix 25μl×n
10×RNaseP primer/probe mix 2.5μl×n
H2O 17.5μl×n
n＝number of reactions.例如：总反应数为40，将1ml 2×TaqMan UniversalPCR Master Mix，100μl 10×RNaseP primer/probe mix和700μl H2O混和。震荡后放在冰上；
(9)在预冷的96孔PCR板上完成PCR体系建立。从总管Ⅰ中各取45μl加入到A-D各行的孔中，从总管Ⅱ中各取45μl加入到E-G各行的孔中。
(10)分别取5μl质粒标准品和待测样品基因组DNA加入到A-D行中，每个样品重复1次。另留1个孔加入5μl的水做为无模板对照(no-template control)。
(11)分别取5μl基因组标准品和待测样品基因组DNA加入到E-G行中，每个样品重复1次。另留1个孔加入5μl的水做为无模板对照(no-template control)。
(12)所使用定量PCR仪为ABI PRISM 7500定量系统。循环条件设定为：50℃2分钟，95℃10分钟，然后是95℃15秒，60℃1分钟的40个循环。
数据分析：测得的DNA样品中整合的慢病毒载体拷贝数用基因组数加以标定，得到每基因组整合的病毒拷贝数。
滴度(integration units per ml，IU ml-1)的计算公式如下：
IU ml-1＝(C×N×D×1000)/V
其中：C＝平均每基因组整合的病毒拷贝数
N＝感染时细胞的数目(约为1×105)
D＝病毒载体的稀释倍数
V＝加入的稀释病毒的体积数
3、重组慢病毒内毒素测定；
(1)、内毒素工作标准品为15EU/支；
(2)、鲎试剂灵敏度λ＝0.25EU/ml，0.5ml/管
(3)、内毒素标准品稀释：取内毒素标准品一支，分别用BET水按比例稀释成4λ和2λ的溶解，封口膜封口，震荡溶解15min；稀释时每稀释一步均应在漩涡混合器上混匀30s；
(4)、加样：取鲎试剂若干支，每支加入BET水0.5ml溶解，分装至若干支无内毒素试管中，每管0.1ml。其中2支为阴性对照管，加入BET水0.1ml；
2支为阳性对照管，加入2λ浓度的内毒素工作标准品溶液0.1ml；
2支为样品阳性对照管，加入0.1ml含2λ内毒素标准品的样品溶液(稀释20倍的待测样品1ml+4λ的内毒素标准品溶液1ml＝2ml含2λ内毒素标准品的稀释40倍样品)。
样品管中加入0.1ml样品，稀释比例见表2，37±1℃水浴(或培养箱)保温60±1min；
表2内毒素稀释比例及对应内毒素含量
(5)、重组慢病毒载体pCAR-Her2、pCAR-Her2-IRES-PD-L1 scFv的内毒素检测结果(如表3所示)，内毒素含量在0～2.5EU/ml之间，符合要求；
稀释倍数 原液 5 10 20 40 80 160
对应EU/ml 0.25 1.25 2.5 5 10 20 40
pCAR-Her2 + + - - - - -
pCAR-Her2-IRES-PD-L1 scFv + + - - - - -
表3重组慢病毒载体的内毒素检测结果
4、重组慢病毒支原体测定；
(1)在实验前三日，细胞样品用无抗生素培养基进行培养；
(2)收集1ml细胞悬浮液(细胞数大于1*105)，置于1.5ml离心管中；
(3)13000×g离心1min，收集沉淀，弃去培养基；
(4)加入500ul PBS用枪头吹吸或涡旋振荡，重悬沉淀。13000×g离心5min；
(5)步骤4重复一次；
(6)加入50μl Cell Lysis Buffer，用枪头吹吸，充分混匀后，在55℃水浴中孵育20min；
(7)将样品置于95℃中加热5min；
(8)13000×g离心5min后，取5μl上清作为模板，25μlPCR反应体系为：ddH20 6.5μl、Myco Mix 1μl、2x Taq Plus Mix Master(Dye Plus)12.5μl、模板5μl；PCR循环条件为：95℃30sec，(95℃30sec，56℃30sec，72℃30sec)*30cycle，72℃5min。
(9)支原体检测结果显示(如图4所示)，纯化的重组慢病毒均不含支原体。
实施例4重组慢病毒lvCAR-Her2、lvCAR-Her2-IRES-PD-L1 scFv的功能检测。
1、CAR基因的细胞水平表达检测：
(1)重组慢病毒lvCAR-Her2、lvCAR-Her2-IRES-PD-L1 scFv感染PBMC细胞后，收集细胞采用QPCR进行CAR mRNA转录水平的检测，验证CAR基因的表达，如果CAR mRNA转录水平增高，则说明CAR基因的转录水平表达成功；
(2)分别将MOI＝15的lvCAR-Her2、lvCAR-Her2-IRES-PD-L1 scFv和对照病毒MOCK感染细胞，48h后提取6孔板中细胞的总RNA进行荧光定量PCR实验。具体步骤：包被6孔板的四个孔，每个孔加入相应的PBS和RN，4℃过夜。12小时后按MOI＝15包被病毒，37℃培养箱放置5h；取出的6孔板，弃掉病毒上清，用PBS洗两遍，按1*106/孔，包被PBMC(用淋巴细胞分离液从人血中分离)，加入500ul培养基(含10％血清、20U/ml IL-2、Polybrene 8ug/ml)。静置20min，1000g 20℃离心30min，37℃培养48h。(3)Trizol法提取6孔板中PBMC细胞的总RNA，逆转录扩增cDNA,用QPCR引物(序列为SEQ ID NO.17-SEQ ID NO.18)进行荧光定量PCR实验，反应体系见表4，以内参Actin为对照组，验证其mRNA的转录情况。
试剂 体积(μl)
SYBR premix ex taq: 10μl
ROX Reverse Dye(50x) 0.4μl
上游引物(2.5μM)： 0.5μl
下游引物(2.5μM)： 0.5μl
cDNA 1.0μl
ddH2O 7.6μl
表4 20μl qPCR反应体系
(4)QPCR检测显示，重组慢病毒感染PBMC后的CAR-Her2的表达水平比对照病毒MOCK和空细胞有明显升高(如图5所示)，说明CAR-Her2和PD-L1 scFv基因表达成功。
2、杀伤效果评估及细胞因子分泌检测。
(1)分别培养Her2+K562细胞和效应细胞lvCAR-Her2、lvCAR-Her2-IRES-PD-L1scFv；
(2)收集靶细胞(Her2+K562)4x105cells和效应细胞(CART细胞)2.8x106cells，800g，6min离心，弃上清；
(3)用1ml 1xPBS溶液分别重悬靶细胞和效应细胞，800g，6min离心，弃上清；
(4)重复步骤3一次；
(5)用700ul培养基(1640培养基+10％FBS)重悬效应细胞，用2ml培养基(1640培养基+10％FBS)重悬靶细胞；
(6)设置效靶比为1:1、5:1、10:1的实验孔，并设置对照组，每组3个复孔；
(7)250xg，5min平板离心；
(8)37℃5％CO2培养箱中培养4小时；
(9)250xg，5min平板离心；
(10)取每个孔的50ul上清到新96孔板中，并且每孔加入50ul底物溶液(避光操作)；
(11)避光孵育25分钟；
(12)每孔加入50ul终止液；
(13)酶标仪检测490nm吸光度；
(14)将3个复孔取平均值；将所有实验孔、靶细胞孔和效应细胞孔的吸光值减去培养基背景吸光值的均值；将靶细胞最大值的吸光值减去体积校正对照吸光值的均值。
(15)将步骤14中获得的经过校正的值带入下面公式，计算每个效靶比所产生的细胞毒性百分比。结果如图6所示，重组慢病毒lvCAR-Her2-IRES-PD-L1 scFv感染的PBMC细胞在不同效靶比条件下杀伤效率明显高于lvCAR-Her2感染的PBMC细胞，说明PD-L1 scFv有效增强CAR-T效应细胞对肿瘤细胞的杀伤作用；
杀伤效率＝(实验孔-效应细胞孔-靶细胞孔)/(靶细胞最大孔-靶细胞孔)X100％
(16)重复准备一份步骤6的样品用于QPCR检测细胞因子表达水平，结果如图7所示，重组慢病毒lvCAR-Her2-IRES-PD-L1 scFv感染的PBMC细胞在不同效靶比条件下IL-2和IFN-γ的mRNA转录水平明显高于lvCAR-Her2感染的PBMC细胞，说明PD-L1 scFv能明显上调IL-2和IFN-γ炎症因子的表达，有效增强炎症因子的表达，从而明显提高CAR-T效应细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
经实验验证，本发明采用的PD-L1 scFv抑制T淋巴细胞PD-1与肿瘤细胞上的PD-L1结合，降低肿瘤免疫逃逸，增强对肿瘤细胞的杀伤。与单纯的CAR-Her2相比，能够显著提高细胞因子的分泌、CAR-T细胞的体外杀伤作用以及临床治疗效果，达到了预料不到的技术效果。
序列表
<110>上海生博生物医药科技有限公司
<120>能靶向Her2并封闭PD-L1降低肿瘤免疫逃逸的CAR-T载体及其构建方法和应用
<130>HJ16-12450
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1178
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 1
gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg 60
gaggggtcgg caattgaacc ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg 120
atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag 180
tagtcgccgt gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag gtaagtgccg 240
tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg ccttgaatta 300
cttccacctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga agtgggtggg 360
agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt gaggcctggc 420
ctgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt ctcgctgctt 480
tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt tttttctggc 540
aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt tttggggccg 600
cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg ggcctgcgag 660
cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct ctggtgcctg 720
gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg tcggcaccag 780
ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca aaatggagga 840
cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg gcctttccgt 900
cctcagccgt cgcttcatgt gactccactg agtaccgggc gccgtccagg cacctcgatt 960
agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt tatgcgatgg 1020
agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac ttgatgtaat 1080
tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag cctcagacag 1140
tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtga 1178
<210> 2
<211> 63
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 2
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccg 63
<210> 3
<211> 357
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 3
caggtacaac tgcagcagtc aggacctgaa ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60
tcctgcaagg cctctgggta tcctttcaca aactatggaa tgaactgggt gaagcaggct 120
ccaggacagg gtttaaagtg gatgggctgg attaacacct ccactggaga gtcaacattt 180
gctgatgact tcaagggacg gtttgacttc tctttggaaa cctctgccaa cactgcctat 240
ttgcagatca acaacctcaa aagtgaagac atggctacat atttctgtgc aagatgggag 300
gtttaccacg gctacgttcc ttactggggc caagggacca cggtcaccgt ttcctct 357
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 4
ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg ggtggcggcg gatct 45
<210> 5
<211> 321
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 5
gacatccagc tgacccagtc tcacaaattc ctgtccactt cagtaggaga cagggtcagc 60
atcacctgca aggccagtca ggatgtgtat aatgctgttg cctggtatca acagaaacca 120
ggacaatctc ctaaacttct gatttactcg gcatcctccc ggtacactgg agtcccttct 180
cgcttcactg gcagtggctc tgggccggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 240
gaagacctgg cagtttattt ctgtcagcaa cattttcgta ctccattcac gttcggctcg 300
gggacaaaat tggagatcaa a 321
<210> 6
<211> 141
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 6
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgatatcta c 141
<210> 7
<211> 66
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 7
atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt 60
tactgc 66
<210> 8
<211> 126
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 8
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 9
<211> 336
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 9
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 10
<211> 575
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 10
gcccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt 60
gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat gtgagggccc 120
ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct ctcgccaaag 180
gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac 240
aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc gacaggtgcc 300
tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa ccccagtgcc 360
acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct cacctcaagc gtattcaaca 420
aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg gggcctcggt 480
gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg 540
ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatg ataat 575
<210> 11
<211> 333
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 11
gatattgtgc tgacccagag cccggcgagc ctggcggtga gcccgggcca gcgcgcgacc 60
attacctgcc gcgcgagcca gagcgtgagc accagcagca gcagctttat gcattggtat 120
cagcagaaac cgggccagcc gccgaaactg ctgattaaat atgcgagcaa cctggaaagc 180
ggcgtgccgg cgcgctttag cggcagcggc agcggcaccg attttaccct gaccattaac 240
ccggtggaag cgaacgatac cgcgaactat tattgccagc atagctggga aattccgtat 300
acctttggcc agggcaccaa actggaaatt aaa 333
<210> 12
<211> 348
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 12
gaagtgcagc tggtggaaag cggcggcggc ctggtgaaac cgggcggcag cctgcgcctg 60
agctgcgcgg cgagcggctt tatttttcgc agctatggca tgagctgggt gcgccaggcg 120
ccgggcaaag gcctggaatg ggtggcgagc attagcagcg gcggcagcac ctattatccg 180
gatagcgtga aaggccgctt taccattagc cgcgataacg cgaaaaacag cctgtatctg 240
cagatgaaca gcctgcgcgc ggaagatacc gcggtgtatg attgcgcgcg cggctatgat 300
agcggctttg cgtattgggg ccagggcacc ctggtgaccg tgagcagc 348
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223>引物
<400> 13
cctttccggg actttcgctt t 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223>引物
<400> 14
gcagaatcca ggtggcaaca 20
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223>引物
<400> 15
catgtacgtt gctatccagg c 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223>引物
<400> 16
ctccttaatg tcacgcacga t 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
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<221> misc_feature
<223>引物
<400> 17
gacttgtggg gtccttctcc t 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
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<221> misc_feature
<223>引物
<400> 18
gcagctacag ccatcttcct c 21
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<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列
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<221> misc_feature
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<400> 19
ggacttaatc agcaatatca ac 22
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<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
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<221> misc_feature
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<400> 20
aaggtaatcc atctgttcag 20
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
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<221> misc_feature
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ttctcttggc tgttactg 18
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223>引物
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ttctgtcact ctcctctt 18
<210> 23
<211> 123
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 23
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123

Claims (9)

1.一种能靶向Her2并封闭PD-L1降低肿瘤免疫逃逸的CAR-T载体，其特征在于，包括：
用于嵌合抗原受体基因的真核转录的人EF1α启动子，如SEQ ID NO.1所示；
用于组成集识别、传递、启动于一体的二代CAR或三代CAR的嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体包括Her2单链抗体轻链VL和Her2单链抗体重链VH；
IRES核糖体结合序列，如SEQ ID NO.10所示；
PD-L1scFv：包括如SEQ ID NO.2所示的CD8leader嵌合受体信号肽，如SEQ ID NO.11所示的PD-L1单链抗体轻链VL、如SEQ ID NO.4所示的单链抗体铰链Linker、如SEQ ID NO.12所示的PD-L1单链抗体轻链；
以及基因传递载体。
2.如权利要求1所述的载体，其特征在于，
所述用于组成集识别、传递、启动于一体的二代CAR的嵌合抗原受体包括：如SEQ IDNO.2所示的CD8leader嵌合受体信号肽、如SEQ ID NO.3所示的Her2单链抗体轻链VL、如SEQID NO.4所示的单链抗体铰链Linker、如SEQ ID NO.5所示的Her2单链抗体重链VH、如SEQID NO.6所示的CD8Hinge嵌合受体铰链、如SEQ ID NO.7所示的CD8Transmembrane嵌合受体跨膜区、如SEQ ID NO.8所示的CD137嵌合受体共刺激因子、如SEQ ID NO.9所示的TCR嵌合受体T细胞激活域；
所述用于组成集识别、传递、启动于一体的三代CAR的嵌合抗原受体包括：如SEQ IDNO.2所示的CD8leader嵌合受体信号肽、如SEQ ID NO.3所示的Her2单链抗体轻链VL、如SEQID NO.4所示的单链抗体铰链Linker、如SEQ ID NO.5所示的Her2单链抗体重链VH、如SEQID NO.6所示的CD8Hinge嵌合受体铰链、如SEQ ID NO.7所示的CD8Transmembrane嵌合受体跨膜区、如SEQ ID NO.8所示的CD137嵌合受体共刺激因子、如SEQ ID NO.9所示的TCR嵌合受体T细胞激活域；以及如SEQ ID NO.23所示的CD28嵌合受体共刺激因子。
3.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述基因传递载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体。
4.如权利要求3所述的载体，其特征在于，所述基因传递载体为第三代慢病毒载体，该第三代慢病毒载体包括含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列、原核复制子pUC Ori序列、病毒复制子SV40Ori序列、RSV启动子、慢病毒5terminal LTR、慢病毒3terminal Self-Inactivating LTR、Gag顺式元件、RRE顺式元件、env顺式元件、cPPT顺式元件、eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件。
5.一种如权利要求1-4任一项所述的能靶向Her2并封闭PD-L1降低肿瘤免疫逃逸的CAR-T载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提供基因传递载体；
(2)将如SEQ ID NO.1所示的人EF1α启动子、用于组成集识别、传递、启动于一体的二代CAR或三代CAR的嵌合抗原受体、如SEQ ID NO.10所示的IRES核糖体结合序列、PD-L1scFv组合成二代CAR或三代CAR设计方案，经过酶切、连接、重组反应克隆至基因传递载体中，得到二代CAR或三代CAR设计的基因传递载体；
(3)包装基因传递载体；
(4)纯化载体，得到重组CAR-T载体。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述基因传递载体为第三代慢病毒载体，该第三代慢病毒载体包括含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列、原核复制子pUC Ori序列、病毒复制子SV40Ori序列、RSV启动子、慢病毒5terminal LTR、慢病毒3terminal Self-Inactivating LTR、Gag顺式元件、RRE顺式元件、env顺式元件、cPPT顺式元件、eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件；步骤(3)具体为：将得到的二代CAR或三代CAR设计的载体分别与慢病毒包装质粒pPac-GP、pPac-R以及膜蛋白质粒pEnv-G共同转染HEK293T/17细胞，在HEK293T/17细胞中进行基因转录表达后，包装成功重组慢病毒载体会释放到细胞培养上清中，收集包含的重组慢病毒载体的上清液。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(4)具体为：所述纯化采用抽滤、吸附、洗脱的柱纯化方式。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，由人EF1α启动子启动整个CAR基因表达；CD8leader嵌合受体信号肽位于CAR编码序列的N端，用于引导CAR蛋白定位于细胞膜；Her2单链抗体轻链VL、单链抗体铰链Linker、Her2单链抗体重链VH组合成scfv区域，用于识别Her2抗原；CD8Hinge嵌合受体铰链用于将scfv锚定于细胞膜外侧；CD8Transmembrane嵌合受体跨膜区用于将整个嵌合受体固定于细胞膜上；CD137嵌合受体共刺激因子用于刺激T细胞增殖和细胞因子分泌；TCR嵌合受体T细胞激活域用于激活下游信号通路的表达；当Her2scFv区域与Her2抗原结合时，信号通过嵌合受体传递至细胞内，从而产生T细胞增殖、细胞因子分泌增加、抗细胞凋亡蛋白分泌增加、细胞死亡延迟、裂解靶细胞一系列生物学效应；IRES核糖体结合序列后的PD-L1scFv抑制T淋巴细胞PD-1与肿瘤细胞上的PD-L1结合，降低肿瘤免疫逃逸，增强对肿瘤细胞的杀伤。
9.如权利要求1-4任一项所述的载体在制备降低肿瘤免疫逃逸的药物中的应用。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108864310A (zh) * 2018-07-31 2018-11-23 苏州茂行生物科技有限公司 一种靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的CAR-T细胞的构建及其应用
CN109694884A (zh) * 2019-01-09 2019-04-30 上海美丽人生医疗科技有限公司 用于在结肠癌治疗中应用的car-t载体的制备及其构建方法
WO2020042648A1 (zh) * 2018-08-28 2020-03-05 法罗斯疫苗株式会社 改进的慢病毒载体
CN110863013A (zh) * 2018-08-28 2020-03-06 北京永泰瑞科生物科技有限公司 改进的治疗性t细胞
CN115141806A (zh) * 2021-03-31 2022-10-04 深圳宾德生物技术有限公司 靶向Her2并表达PD-L1抗体的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用
CN116514998A (zh) * 2023-05-12 2023-08-01 再少年(北京)生物科技有限公司 一种嵌合抗原受体、嵌合抗原受体-自然杀伤细胞及其在制备抗肿瘤药物中的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016022630A1 (en) * 2014-08-05 2016-02-11 Jiping Zha Anti-pd-l1 antibodies
CN105331585A (zh) * 2015-11-13 2016-02-17 科济生物医药（上海）有限公司 携带pd-l1阻断剂的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞
CN105837692A (zh) * 2015-12-10 2016-08-10 苏州佰通生物科技有限公司 一种阻断免疫检测点的嵌合抗原受体及其应用
CN105949318A (zh) * 2016-04-12 2016-09-21 上海优卡迪生物医药科技有限公司 抗her2嵌合抗原受体、编码基因、重组表达载体及其构建方法和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016022630A1 (en) * 2014-08-05 2016-02-11 Jiping Zha Anti-pd-l1 antibodies
CN105331585A (zh) * 2015-11-13 2016-02-17 科济生物医药（上海）有限公司 携带pd-l1阻断剂的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞
CN105837692A (zh) * 2015-12-10 2016-08-10 苏州佰通生物科技有限公司 一种阻断免疫检测点的嵌合抗原受体及其应用
CN105949318A (zh) * 2016-04-12 2016-09-21 上海优卡迪生物医药科技有限公司 抗her2嵌合抗原受体、编码基因、重组表达载体及其构建方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ELOAH RABELLO SUAREZ ET AL.: "《Chimeric antigen receptor T cells secreting anti-PD-L1 antibodies more effectively regress renal cell carcinoma in a humanized mouse model》", 《ONCOTARGET》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108864310A (zh) * 2018-07-31 2018-11-23 苏州茂行生物科技有限公司 一种靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的CAR-T细胞的构建及其应用
WO2020042648A1 (zh) * 2018-08-28 2020-03-05 法罗斯疫苗株式会社 改进的慢病毒载体
CN110863013A (zh) * 2018-08-28 2020-03-06 北京永泰瑞科生物科技有限公司 改进的治疗性t细胞
CN109694884A (zh) * 2019-01-09 2019-04-30 上海美丽人生医疗科技有限公司 用于在结肠癌治疗中应用的car-t载体的制备及其构建方法
CN115141806A (zh) * 2021-03-31 2022-10-04 深圳宾德生物技术有限公司 靶向Her2并表达PD-L1抗体的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用
CN116514998A (zh) * 2023-05-12 2023-08-01 再少年(北京)生物科技有限公司 一种嵌合抗原受体、嵌合抗原受体-自然杀伤细胞及其在制备抗肿瘤药物中的应用
CN116514998B (zh) * 2023-05-12 2023-09-15 再少年(北京)生物科技有限公司 一种嵌合抗原受体、嵌合抗原受体-自然杀伤细胞及其在制备抗肿瘤药物中的应用

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