CN109913501A

CN109913501A - 一种靶向cd152的复制缺陷性重组慢病毒car-t转基因载体及构建方法

Info

Publication number: CN109913501A
Application number: CN201910155779.7A
Authority: CN
Inventors: 王依婷; 许姣姣; 康丽清; 张金芳; 徐南; 李明昊; 刘秧; 刘丽; 谭靖雯; 沈鸿伟; 骆声根; 闫志强; 王镜; 朱建中; 俞磊
Original assignee: East China Normal University
Current assignee: East China Normal University
Priority date: 2019-03-01
Filing date: 2019-03-01
Publication date: 2019-06-21
Anticipated expiration: 2039-03-01
Also published as: CN109913501B

Abstract

本发明公开了一种靶向CD152的复制缺陷性重组慢病毒CAR‑T转基因载体及构建方法，其转基因载体包括：用以控制复制起始位点的启动子、用于质粒复制的原核复制子、用于增强真核细胞内的复制的病毒复制子、用于检测的抗性基因、病毒转录后的调控元件、用于慢病毒包装的包装顺式元件cis及用于识别、传递及启动的嵌合抗原受体CAR；所述复制缺陷性重组慢病毒CAR‑T转基因载体的构建包括重组慢病毒质粒的构建、重组慢病毒载体的包装、浓缩及纯化，最终获得高纯度的靶向CD152的复制缺陷性重组慢病毒CAR‑T转基因载体。本发明的重组慢病毒CAR‑T转基因载体可显著提高细胞因子的分泌及对靶细胞CTLA‑4的特异性杀伤，对于肿瘤微环境的抑制性和实体瘤的攻克提供新的治疗方向。

Description

一种靶向CD152的复制缺陷性重组慢病毒CAR-T转基因载体及构建方法

技术领域

本发明属于医学生物领域，具体涉及一种载体，一种靶向CD152的复制缺陷性重组慢病毒CAR-T转基因载体。此外，本发明还涉及该载体的构建方法。

背景技术

2018年10月，诺贝尔生理学或医学奖授予美国科学家詹姆斯·艾利森(JamesP.Allison)与日本科学家本庶佑(Tasuku Honjo)，表彰他们在发现“抑制性免疫调节治疗癌症的疗法”中所做出的贡献。他们及无数科研人员在免疫学上的贡献彻底改变了人类对抗癌症的格局。在肿瘤免疫疗法之前，癌症最常见的治疗方法是手术、化疗、放疗和靶向治疗，前者通过手术切除肿瘤细胞，但通常切除并不彻底；而化疗和放疗虽然可以治愈很多肿瘤，但对机体的正常细胞损害极大。而肿瘤免疫疗法，则是通过激活人体自身的免疫系统，依靠自身免疫机能来消灭肿瘤细胞，特异性强、毒副作用小、疗效较好。

肿瘤免疫疗法通过从癌症患者体内抽提目的细胞，对其进行基因工程改造获得特异性识别肿瘤细胞的能力，在体外扩大培养并回输到癌症患者体内的疗法称为过继性细胞疗法(Adoptive cell therapy,ACT)。肿瘤浸润性淋巴细胞(Tumor-infiltratinglymphocytes,TIL)、T细胞受体T细胞(Gene Modified T cell receptor T cell,TCR-T)和嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy,CAR-T)均属于ACT细胞疗法。

TIL疗法是从肿瘤组织中分离白细胞，在体外经IL-2刺激后大量增殖，具有较好的增殖和特异性的杀瘤活性。是治疗实体瘤的热门疗法，尤其是肿瘤抗原比较明确的转移性黑色素瘤、宫颈癌、肝癌、结直肠癌、前列腺癌等(Rosenberg SA,Restifo NP.Adoptivecell transfer as personalized immunotherapy for human cancer.Science.2015；348(6230):62-68.)。但由于机体各种原因，如肿瘤微环境，肿瘤的免疫抑制环境限制了它们的数量和活性，大大降低其抗癌能力。此外TIL的生产通常需要5～6周的时间，还涉及到多种系统用药、回输后副反应的管理，都在一定程度上限制其应用推广。

TCR是所有T细胞表面的特征性标志，以非共价键的方式与CD3结合，形成TCR—CD3复合物。TCR的作用是识别抗原。而TCR疗法是通过转导嵌合抗原受体或TCRα/β异二聚体来改造T细胞，使其具有识别靶标的特异性，让T细胞重新识别靶细胞。滨州大学和Adaptimmune公司联合研发的一款“基因修改的TCR”，通过修改关键氨基酸使改造后的TCR与一种常见的癌症TAA，NY-ESO-1的亲和力显著提高，从而可以用来进攻有NY-ESO-1过量表达的癌症，如多发性骨髓瘤、乳腺癌(Andrew D.Fesnak,Carl H.June&BruceL.Levine.Engineered T cells:the promise and challenges of cancerimmunotherapy.Nat Rev Cancer.2016August 23；16(9):566–581.)。

CAR-T疗法和TCR-T疗法相似，都是通过基因改造技术来提高T细胞对癌症细胞抗原的特异性识别和杀伤能力。但两者使用的方法不同，CAR基础结构分三个部分：胞内信号区、跨膜区和胞外区，胞内是T细胞活化的分子，如CD3ζ、CD28或者41BB，刺激T细胞活化和增殖；胞外区主要是肿瘤相关抗(Tumor-associatedantigen,TAA)结合区，以非MHC方式激活T细胞(Carl H.June,1,2,3*Roddy S.O’Connor,1,2,CAR T cell immunotherapy forhuman cancer.June et al.,Science 359,1361–1365(2018).)。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。2017年，美国的两家医药巨头Novartis的Kymriah^TM(CTL019)和Kite制药Yescarta(axicabtageneciloleucel，KTE-C19)两款CAR-T药物制剂先后通过美国食品药品管理局(FDA)审批，CAR-T正式进入主流肿瘤学领域，真正开始走到攻克癌症的前沿位置。

肿瘤免疫疗法在治疗血液恶性肿瘤和具有强免疫原性的肿瘤(如黑色素瘤和肾细胞癌)效果显著，而对于其他实体瘤(如肺癌、胃癌和肝癌)的疗效却差强人意。其中，很重要的一个原因就是肿瘤微环境(Tumor microENVironment,TME)的免疫抑制特性。

TME即肿瘤细胞产生和生存的内环境，不是只有肿瘤细胞，也包括周围的基质细胞、炎症细胞、间层质细胞和微血管系统等成分。TEM具有低氧、低PH和高压的特点，与机体正常内环境存在显著的不同，而这种环境在肿瘤细胞的生长增殖、侵袭、血管生成和免疫抑制等方面扮演重要的角色。同时，TME可以通过决定哪条免疫抑制通路激活，阻止抗肿瘤免疫反应。这些影响因素包括效应T细胞活化、骨髓细胞上的免疫检查点受体，以及抑制性细胞因子和代谢物的释放(Obstacles Posed by the Tumor MicroENVironment to T cellActivity:A Case for Synergistic Therapies.Cancer Cell.2017Mar 13；31(3):311-325.)。以这些通路为靶点的治疗方法，特别是以免疫检查点受体为靶点，可以诱导持久的抗肿瘤反应。免疫治疗的阳性反应通常依赖于肿瘤细胞与TME内免疫调节的相互作用。在这些相互作用下，肿瘤微环境在抑制或增强免疫应答中发挥着重要的作用。所以要清除机体内的肿瘤细胞单靠识别肿瘤抗原是不够的。通过免疫治疗成功控制肿瘤需要免疫系统的激活，效应细胞的扩增，活化的效应细胞浸润到肿瘤组织并破坏肿瘤细胞(Immunotherapyand tumor microENVironment)。

回输到体内的过继转输T细胞会高表达抑制性分子，如CD152、PD-1、LAG-3和TIM-3，而肿瘤微环境内存在上述分子的配体，配体-受体的结合抑制了效应T细胞的免疫应答。其中，多种肿瘤细胞可以表达PD-L1分子，通过结合T细胞膜上的抑制性受体PD-1分子来抑制T细胞的功能，并使其耗竭(Xiaolei Li,Changshun Shao,Yufang ShiEmail author andWeidong Han.Journal of Hematology&Oncology.Lessons learned from the blockadeof immune checkpoints in cancer immunotherapy.27February 2018.)。PD-1/PD-L1的阻断抗体在临床前和临床研究中均取得了令人瞩目的广谱抗癌效果，适应症包括非小细胞性肺癌、黑色素瘤和霍奇金淋巴瘤。各大制药企业纷纷斥巨资研发PD-1/PD-L1的阻断抗体，争夺该免疫治疗药物的巨大市场，其中包括美国施贵宝公司生产的PD-1抗体(Nivolumab)，默沙东公司的Pembrolizumab，罗氏公司的Atezolizumab和阿斯利康的Durvalumab，这4个产品到2020年的销售额总计预计超过百亿美元。Kobold S,J Natl Cancer Inst,2015,Impact of a New Fusion Receptor on PD-1-Mediated Immunosuppression inAdoptive T Cell Therapy；Liu X,Cancer Res,2016,A Chimeric Switch-ReceptorTargeting PD1Augments the Efficacy of Second-Generation CAR T Cells inAdvanced Solid Tumors)。此外，阻断CTLA-4和LAG-3通路同样可以增强ACT疗法的抑癌效果。

细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)又名CD152，是一种白细胞分化抗原，是T细胞上的一种跨膜受体，与CD28共同享有B7分子配体，而正常情况下，T淋巴细胞的活化需要两条信号通路共同激活，其一是T细胞受体(TCR)与抗原呈递细胞(APC)呈递的MHC-抗原肽复合物相结合(信号1)，其二是B7分子(B7-1或B7-2)与T细胞表面的共刺激分子CD28相结合(信号2)。CTLA-4与APC表面的配体B7是一对协同共刺激信号(Lucy S.K.Walker and David M.Sansom,Cellpress.Confusingsignals:Recent progressin CTLA-4 biology.Trends in Immunology,February 2015,Vol.36,No.2)。CTLA-4与B7分子结合后诱导T细胞无反应性，会降低T细胞活性、阻碍T细胞活化，从而发挥肿瘤免疫抑制作用。

但如今，这种免疫检查点疗法彻底改变了临床治疗转移性黑色素瘤患者的方式，2011年，FDA批准首款CTLA-4抑制剂Ipilimumab用于黑色素瘤的治疗。虽然疗效方面十分显著，给那些预后非常差(平均生存期低于一年)的和具有很少治疗方法的患者带来了新的希望。但是应该清醒的认识到，目前，实际上只有约5％～10％的患者能够从这一昂贵的治疗方法中获益，大多数患者要么没有作出反应，要么在治疗后会复发，由于副作用大和销售量增长缓慢，并没有更多的发展。

发明内容

本发明的目的是提供一种靶向CD152的复制缺陷性重组慢病毒CAR-T转基因载体。

本发明另一目的是提供一种靶向CD152的复制缺陷性重组慢病毒CAR-T转基因载体的构建方法。

本发明所述的转基因载体包含靶向CD152的嵌合抗原受体CAR。

实现本发明目的的具体技术方案是：

一种靶向CD152的复制缺陷性重组慢病毒CAR-T转基因载体，该转基因载体包括：用以控制复制起始位点的启动子、用于质粒复制的原核复制子、用于增强真核细胞内的复制的病毒复制子、用于检测的抗性基因、病毒转录后的调控元件、用于慢病毒包装的包装顺式元件cis及用于识别、传递及启动的嵌合抗原受体CAR；

所述用于识别、传递及启动的嵌合抗原受体CAR包括：胞内信号区、跨膜区和胞外区；胞内信号区是刺激T细胞活化和增殖，包括：CD3z嵌合受体信号肽及CD137嵌合受体共刺激因子；跨膜区起到连接、信号传导作用，即为CD8 Transmembrane嵌合受体；胞外区是肿瘤相关抗原结合区，特异性识别抗原，包括：单链抗体链接OLC、CD8αSP嵌合受体铰链、CD152单链抗体轻链VL及CD152单链抗体重链VH；其中，

所述用于控制复制起始位点的启动子为EF1α、CMV、CAG或T7；

所述用于质粒复制的原核复制子pUC Ori或pMB1Ori；

所述用于增强真核细胞内的复制的病毒复制子fi Ori或SV40Ori；

所述用于检测的抗性基因为AmpR、Kan或Neo；

所述病毒转录后的调控元件为WPRE或HPRE；

所述用于慢病毒包装的包装顺式元件cis为慢病毒5terminal LTR、慢病毒3terminal Self-Inactivating LTR、Gag、RRE、ENV和cPPT；

所述CD3z嵌合受体信号肽，即SEQ ID NO.7序列；

所述CD137嵌合受体共刺激因子，即SEQ ID NO.6序列；

所述CD8 Transmembrane嵌合受体，即SEQ ID NO.5序列；

所述单链抗体链接OLC，即SEQ ID NO.3序列；

所述CD8αSP嵌合受体铰链，即SEQ ID NO.4序列；

所述CD152单链抗体轻链VL，即SEQ ID NO.8/10/12序列；

所述CD152单链抗体重链VH，即SEQ ID NO.9/11/13序列。

一种上述靶向CD152的复制缺陷性重组慢病毒的CAR-T转基因载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)将原核复制子、病毒复制子、抗性基因、慢病毒包装的包装顺式元件cis及病毒转录后的调控元件存储于慢病毒骨架质粒上；

(2)将启动子、嵌合抗原受体CAR经过酶切、连接、重组反应克隆至步骤(1)中慢病毒骨架质粒中，得到含CAR的重组慢病毒质粒；

(3)将得到的重组慢病毒质粒与慢病毒包装质粒共同转染细胞，在细胞中进行基因转录表达后，包装成功的复制缺陷性重组慢病毒载体会释放到细胞培养上清中，收集复制缺陷性重组慢病毒载体的上清液；

(4)将得到的重组慢病毒上清液采用抽滤、吸附、洗脱的慢病毒载体柱纯化方式进行纯化，得到所述的靶向CD152的复制缺陷性重组慢病毒的CAR-T转基因载体。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明所采用的针对CD152的CAR-T技术，是一种综合了肿瘤单克隆抗体和肿瘤免疫治疗优点的靶向治疗新技术。首先构建靶向CTLA-4的复制缺陷性重组慢病毒CAR-T转基因载体，包括重组慢病毒载体骨架、膜定位信号肽、单链抗体轻链、单链抗体链接、单链抗体重链、铰链区、跨膜区、增强域、效应域构建形成嵌合抗原受体重组慢病毒载体，得到的重组慢病毒载体可以实现在人T淋巴细胞上表达针对CD152的嵌合抗原受体，引导并激活T淋巴细胞对CD152阳性细胞的杀伤作用。通过体外细胞因子分泌试验及LDH杀伤效率评估实验，实验表明靶向CD152的复制缺陷性重组慢病毒载体转导的CAR-T细胞在杀伤效率及细胞因子(IL-2、IFN-gamma)分泌方面得到显著提高。

本发明所采用慢病毒载体柱纯化的方式，不同于通常常用的高速或超速离心，后两者是利用离心沉降原理分离病毒颗粒，会有很多沉降系数相近的杂质也被沉降下来，导致病毒滴度较低。此外，装管过程繁琐耗时，多次转换容器会增大病毒被污染的概率。而本发明的慢病毒载体柱纯化工艺为半自动化操作，所有操作均在百级实验区域里进行，可避免支原体污、减低内毒素含量，此外也避免了人工操作的繁琐和失误，使效益最大化。

本发明采用的包装系统是无辅助病毒的四质粒包装系统，将四种质粒，即重组慢病毒质粒和三种慢病毒包装质粒共同转染至细胞中，产生复制缺陷性重组慢病毒载体。重组后的慢病毒载体是复制缺陷型载体，能将外源片段整合到宿主基因内，安全性有很大提高。

附图说明

图1为本发明转基因载体的粗产品构建流程图；

图2为本发明转基因载体对粗产品的纯化流程图；

图3为本发明转基因载体的滴度检测结果图；

图4为本发明转基因载体的支原体检测结果图；

图5为本发明转基因载体的内毒素检测结果图；

图6为本发明转基因载体的CAR拷贝数检测结果图；

图7为CAR152-1～3细胞的CAR蛋白及细胞亚型检测结果图；

图8为CAR152-1～3细胞分化状况检测结果图；

图9为CAR152-1～3细胞中调节性T细胞检测结果图；

图10为LDH检测不同效靶比下的杀伤效率图；

图11为效靶比为5∶1下的细胞因子表达水平检测结果图。

具体实施方式

材料

1、慢病毒骨架质粒pLenti-3GBasic2，慢病毒包装质粒pEnv-G、pPac-R、pPac-GP，293T细胞、同源重组酶由世翱(上海)生物医药科技有限公司提供；

2、根据引物设计原则设计扩增DNA片段、靶位点所需的引物和DNA序列，均由上海生物公司合成，并以寡核苷酸干粉或者质粒形式保存；具体为：

hEF1a启动子(SEQ ID NO.1)

CD8a膜定位信号肽(SEQ ID NO.2)

OLC(SEQ ID NO.3)

CD8a铰链区(SEQ ID NO.4)

CD8a跨膜区(SEQ ID NO.5)

CD137增强域(SEQ ID NO.6)

CD3z效应域(SEQ ID NO.7)

CD152 VL-1(SEQ ID NO.8)

CD152 VH-1(SEQ ID NO.9)

CD152 VL-2(SEQ ID NO.10)

CD152 VH-2(SEQ ID NO.11)

CD152 VL-3(SEQ ID NO.12)

CD152 VH-3(SEQ ID NO.13)

EF1α-F(SEQ ID NO.14)

EF1α-R(SEQ ID NO.15)

CAR-F(SEQ ID NO.16)

CAR-R(SEQ ID NO.17)

WPRE-QPCR-F(SEQ ID NO.18)

WPRE-QPCR-R(SEQ ID NO.19)

Actin-QPCR-F(SEQ ID NO.20)

Actin-QPCR-R(SEQ ID NO.21)

3、工具酶BsrG I、Nco I、ApaL I、Sac I、Cla I、Sal I、T4 DNA连接酶均购自NEB公司；

4、高保真酶PrimeSTAR、RN购自Takara公司；

5、0.22μm-0.8μm PES滤器购自millipore公司；

6、质粒抽提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自MN公司；

7、感受态细胞TOP10购自Tiangen公司；

8、NaCl、KCl、Na2HPO4.12H2O、KH2PO4、Trypsin、EDTA、CaCl2、NaOH、PEG6000均购自上海生工；

9、Opti-MEM、FBS、DMEM、1640、Hepes、PBS均购自invitrogen公司；

10、淋巴细胞分离液购自深圳达科为公司；

11、支原体检测试剂盒、内毒素检测试剂盒、CD152及K562细胞系购自上海世翱公司；

12、LDH检测试剂盒购自promega公司；

13、抗体及CBA检测试剂盒购自BD代理商优宁维公司；

14、内毒素检测试剂盒购自R&D公司。

实施例1

重组慢病毒质粒pCAR152-0、pCAR152-1、pCAR152-2和pvCAR152-3的构建方法如下：

CAR152-0、CAR152-1、CAR152-2、CAR152-3(见表1)和人EF1α启动子、序列均交由基因合成公司全序列合成。然后如表2所示将合成的人的EF1α启动子、CAR结构(CAR152-0、CAR152-1、CAR152-2、CAR152-3)克隆至重组慢病毒骨架质粒pLenti-3G basic2(结构示意图见附图1A)中，分别得到重组慢病毒质粒pCAR152-0～pCAR152-3(pCAR152-0为阴性对照，故不做结构示意图展示；pCAR152-1～pCAR152-3结构示意图见图1B、图1C和图1D)。

表1嵌合抗原受体结构

表2重组慢病毒质粒组成原件

重组慢病毒质粒	重组慢病毒骨架质粒	启动子	嵌合抗原受体
				pCAR152-0	pLenti-3G basic	hEF1a	CAR152-0
pCAR152-1	pLenti-3G basic	hEF1a	CAR152-1
				pCAR152-2	pLenti-3G basic	hEF1a	CAR152-2
pCAR152-3	pLenti-3G basic	hEF1a	CAR152-3

1.具体实施过程如下：

1.1.将重组慢病毒骨架质粒pLenti-3G basic2使用Cla I和EcoR I限制性内切酶进行双酶切，产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认5823bp的片段V1，并割胶回收置于Eppendorf管内，用MN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表3)，并测定产物的纯度和浓度；

表3琼脂糖凝胶回收步骤

1.2.用引物EF1α-F(SEQ ID NO.14)和EF1α-R(SEQ ID NO.15)以合成的SEQ IDNO.1为模板，使用表2中的体系，PCR循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃2min)*35cycle，72℃10min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认1208bp的片段a，并割胶回收置于Eppendorf管内，用MN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表4)，并测定产物的纯度和浓度；

表4 50μL PCR反应体系

试剂	体积(μL)
		H2O	32.5
5×Buffer(with Mg2+)	10
		dNTP(各2.5mM)	4
Primer1(+)(10μM)	1
		Primer2(－)(10μM)	1
Template	1
		PrimeSTAR	0.5

1.3.用引物CAR-F(SEQ ID NO.16)和CAR-R(SEQ ID NO.17)以合成的CAR152-0为模板，使用表2中的体系，PCR循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认732bp的片段b，并割胶回收置于Eppendorf管内，用MN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表3)，并测定产物的纯度和浓度；

1.4.用引物CAR-F(SEQ ID NO.16)和CAR-R(SEQ ID NO.17)以合成的CAR152-1为模板，使用表2中的体系，PCR循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认1458bp的片段c，并割胶回收置于Eppendorf管内，用MN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表1)，并测定产物的纯度和浓度；

1.5.用引物CAR-F(SEQ ID NO.16)和CAR-R(SEQ ID NO.17)以合成的CAR152-2为模板，使用表2中的体系，PCR循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认1455bp的片段d，并割胶回收置于Eppendorf管内，用MN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表1)，并测定产物的纯度和浓度；

1.6.用引物CAR-F(SEQ ID NO.16)和CAR-R(SEQ ID NO.17)以合成的CAR152-3为模板，使用表2中的体系，PCR循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认1476bp的片段e，并割胶回收置于Eppendorf管内，用MN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表3)，并测定产物的纯度和浓度；

1.7.将重组慢病毒质粒DNA片段组合(见表5)以5μl总体积且摩尔比1:1:1:1的比例加入Eppendorf管内，加入同源重组酶反应液15μl，混匀后在42℃孵育30分钟，转移至冰上放置2-3分钟，将反应液加入50μl TOP10中，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟，将管放到预加温到42℃的恒温水浴锅中热激90秒，快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3分钟，每管加900μl LB培养液，然后将管转移到37℃摇床上，温育1小时使细菌复苏，取100μl的转化菌液涂布于Amp LB琼脂平板上，倒置平皿，于恒温培养箱中37℃培养，16小时。挑取克隆进行菌落PCR鉴定，鉴定正确的克隆即为重组慢病毒质粒pCAR152-0～pCAR152-3，并送测序复核结果。

表5重组慢病毒质粒DNA片段组合

重组慢病毒质粒	片段组合
		pCAR152-0	V1、a、b
pCAR152-1	V1、a、c
		pCAR152-2	V1、a、d
pCAR152-3	V1、a、e

实施例2

lvCAR152-0～lvCAR152-3重组慢病毒载体上清液的获得

将实施例1得到的重组慢病毒质粒pCAR152-0～pCAR152-3(pCAR152-1结构示意图见图1B、pCAR152-2结构示意图见图1C、pCAR152-3结构示意图见图1C；因pCAR152-0为阴性对照，故图中不做表示)分别与包装质粒(结构示意图见图1E、图1F、图1G)共同转染到293T细胞内，转染72h后收取含重组慢病毒载体lvCAR152-0～lvCAR152-3的细胞上清液。

2.1.完全培养基：取出预热好的新鲜培养基，加入10％FBS+5ml Pen-Srep，上下颠倒混匀即可；

2.2. 1XPBS溶液：称量NaCl 8g，KCl 0.2，Na₂HPO₄.12H₂O 3.58g，KH₂PO4 0.24g

2.3.置于1000ml烧杯中，加入900ml Milli-Q grade超纯水溶解，溶解完成后，使用1000ml量筒定容至1000ml，121℃高温湿热灭菌20min；

2.4. 0.25％Trypsin溶液:称量Trypsin 2.5g，EDTA0.19729g置于1000ml烧杯中，加入900ml 1XPBS溶解，溶解完成后，使用1000ml量筒定容至1000ml，0.22μM过滤除菌，长期使用可保存至-20℃冰箱；

2.5. 0.5M CaCl2溶液：称量35.75g CaCl₂用400ml Milli-Q grade超纯水溶解；用Milli-Q grade超纯水将总体积定容至500ml，混匀；0.22μm过滤除菌，分装保存到50ml离心管中，每管45ml左右，4℃保存。

2.5. 2XHBS溶液：称量4.09g NaCl，0.269g Na₂HPO4，5.96g Hepe，用400mlMilli-Q grade超纯水溶解；校准pH仪后，用2M NaOH溶液将HBS溶液的pH调到6.05。调整每瓶HBS的PH消耗2M NaOH为3ml左右；

2.6.从液氮罐中取出冻存的293T细胞，迅速转移到37℃水浴中，1～2min后转移到超净台中，无菌操作将冻存管中的液体全部转移至10cm²培养皿中，补足含10％FBS的DMEM至8mL/10cm²dish，24h后显微镜观察细胞，细胞汇合的程度大于80％进行传代；

2.7.选择细胞状态良好、无污染的293T细胞，每2-6个培养皿为一组，将细胞胰酶消化后，用电动移液器吸取4-12ml完全培养基，向每个消化后的培养皿中加2ml，避免培养皿变干；

2.8.使用1ml移液器将所有细胞吹打成单细胞悬液，转移到培养基瓶中；

2.9.将上述一组培养皿中的剩余细胞转移到培养基瓶中，并用培养基再冲洗一便培养皿；

2.10.盖紧培养基瓶盖，上下颠倒10次左右充分混匀细胞悬液，将细胞传到8-24个10cm²培养皿中，每皿的细胞密度应当约4×10⁶个/10ml完全培养基左右。如果细胞密度和预期的相差较大，则需要对细胞进行计数，然后按照4×10⁶个/皿的量接种；

2.11.将培养皿左右、前后晃动数次，然后放入5％CO₂培养箱。剩余细胞做同样处理；

2.12.检查所传代细胞，细胞汇合度应当为70-80％，轮廓饱满，贴壁良好，在细胞培养皿中均匀分布；

2.13.为细胞换液，将培养基替换为新鲜完全培养基,每皿9mL，并将培养箱的CO₂浓度设定值提高到8％；

2.14.配DNA/CaCl2溶液。每皿293T细胞转染质粒量按照下列比例配制：0.5MCaCl2：0.25ml、重组慢病毒质粒(图1的B或C或D)20μg、pPac-G(图E)10μg、pPac-R(图F)(6.5μg)、pEnv-G(图G)15μg，补充超纯水至0.5ml，盖上盖子，打开涡旋振荡器，充分混匀；

2.15.吸取0.5mL 2×HBS溶液，缓慢滴加进入2.14中的离心管中，控制流速，半分钟滴完为宜。然后继续涡旋振荡5秒钟，停止振荡；

2.16.取一皿细胞，将离心管中的1mL钙转液滴加进去，尽可能使钙转试剂分布到整个培养皿中；

2.17.钙转液加入后，在皿盖上做好标记，将培养皿放还到另一个5％CO₂培养箱中。确保培养皿水平放置，在5％CO₂培养箱中放置(6–8h)；

2.18.将第一个培养箱的CO₂浓度设定值调回到5％；

2.19. 24小时后，检查细胞状态。细胞汇合度应当为80–85％左右，状态良好。将培养基吸走，更换10ml新鲜的DMEM完全培养基；

2.20. 48小时后，观察转染效率。绝大多数细胞仍然是贴壁的。可以看到超过95％细胞都会带有绿色荧光。将同一个病毒包装上清液收集到一起，并向培养皿中继续添加10mL新鲜培养基；

2.21. 72小时后，再次将同一个病毒上清液收集到一起，两次收集的病毒可以放在一起，丢弃培养皿；此时收取得到含重组慢病毒载体lvCAR152-0～lvCAR152-3的细胞上清液。

实施例3

重组慢病毒载体lvCAR152-0～lvCAR152-3纯化

纯化流程图如图2所示，首先将2.21收集的细胞上清液经真空泵抽滤后，再经离子交换柱和内毒素去除柱去除杂质和内毒素，然后经过蠕动泵的蠕动以一定流速往离子交换柱进样后，洗脱获得复制缺陷性慢病毒载体收获液。此种方法洗脱得到的lvCAR152纯度更高、操作更简便。

具体操作步骤如下：

3.1.将收集的上清液使用Thermo真空泵，经0.22μm-0.8μm的PES滤器抽滤，除去杂质；

3.2.按适当的比例往上清中加入1.5M NaCl 250mM Tris-HCl(pH 6-8)；

3.3.将2个离子交换柱和内毒素去除柱串联放置，用4ml 1M NaOH、4ml 1M NaCl、5ml 0.15M NaCl 25mM Tris-HCl(pH 6-8)溶液依次过柱；

3.4.将步骤2中获得的溶液通过蠕动泵以1-10ml/min的速度给离子交换柱上样；

3.5.全部上清液过柱后，使用10ml 0.15M NaCl 25mM Tris-HCl(pH 6-8)溶液清洗一遍；

3.6.根据上样量使用1-5ml 1.5M NaCl 25mM Tris-HCl(pH 6-8)进行洗脱，收集洗脱液；

3.7.将洗脱液分成25到50μl一管，冻存到-80℃冰箱，进行长期保存。

实施例4

重组慢病毒载体lvCAR152-0～lvCAR152-3滴度测定

4.1.取24孔板接种293T细胞，不同种类的细胞生长速度有所差异，进行病毒感染时的细胞融合率为40％-60％；

4.2.准备3个无菌Eppendorf管，在每个管中加入新鲜完全培养基(高糖DMEM+10％FBS)，接种细胞24小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数，确定感染时细胞的实际数目，记为N；

4.3.取待测定的病毒原液10ul加入到第一个管中，轻轻混匀后，取10ul加入到第二个管中，然后依次操作直到最后一管；在每管中加入410ul完全培养基(高糖DMEM+10％FBS),终体积为500ul；

4.4.感染开始后20小时，除去培养上清，更换为500μl完全培养基(高糖DMEM+10％FBS)，5％CO₂继续培养48小时；

4.5. 72小时后，观察荧光表达情况，正常情况下，荧光细胞数随稀释倍数增加而相应减少,并拍照；

4.6.用0.2ml 0.25％胰酶-EDTA溶液消化细胞，在37℃放置1分钟。用培养基吹洗整个细胞面，离心收集细胞。按照DNeasy试剂盒的说明抽提基因组DNA。每个样品管中加入200μl洗脱液洗下DNA并定量；

4.7.准备目的DNA检测qPCRmix总管Ⅰ(QPCR引物序列为SEQ ID NO.18---SEQ IDNO.19)：

2×TaqMan Master Mix	25μl×n
		Forward primer(100pmol ml-1)	0.1μl×n
Reverse primer(100pmol ml-1)	0.1μl×n
		Probe(100pmol ml-1)	0.1μl×n
H<sub>2</sub>O	19.7μl×n

n＝number of reactions.例如：总反应数为40，将1ml 2×TaqMan UniversalPCR Master Mix，4μl forward primer，4μl reverse primer，4μl probe和788μl H2O混和；震荡后放在冰上。

4.8.准备内参DNA检测qPCRmix管Ⅱ(QPCR引物序列为SEQ ID NO.20---SEQ IDNO.21)：

2×TaqMan Master Mix	25μl×n
		10×RNaseP primer/probe mix	2.5μl×n
H<sub>2</sub>O	16.5μl×n

n＝number of reactions.例如：总反应数为40，将1ml 2×TaqMan UniversalPCR Master Mix，100μl 10×RNaseP primer/probe mix和700μl H2O混和，震荡后放在冰上。

4.9.在预冷的96孔PCR板上完成PCR体系建立。从总管Ⅰ中各取45μl加入到A-D各行的孔中，从总管Ⅱ中各取45μl加入到E-G各行的孔中；

4.10.分别取5μl质粒标准品和待测样品基因组DNA加入到A-D行中，每个样品重复1次。另留1个孔加入5μl的水做为无模板对照(no-template control)；

4.11.分别取5μl基因组标准品和待测样品基因组DNA加入到E-G行中，每个样品重复1次。另留1个孔加入5μl的水做为无模板对照(no-template control)；

4.12.所使用定量PCR仪为ABI PRISM 7500定量系统。循环条件设定为：50℃2分钟，95℃10分钟，然后是95℃15秒，60℃1分钟的40个循环；

4.13.数据分析：测得的DNA样品中整合的慢病毒载体拷贝数用基因组数加以标定，得到每基因组整合的病毒拷贝数；

滴度(integration units per ml，IU ml-1)的计算公式如下：

IU ml-1＝(C×N×D×1000)/V

其中：C＝平均每基因组整合的病毒拷贝数

N＝感染时细胞的数目(约为1×105)

D＝病毒载体的稀释倍数

V＝加入的稀释病毒的体积数

4.14.重组慢病毒载体lvCAR152-0～lvCAR152-3的滴度。

结果见图3，滴度越高，表明对细胞的感染能力越大，检测结果表明，lvCAR152-2滴度检测结果偏低，其余复制缺陷性重组慢病毒载体检测结果均较高。

实施例5

重组慢病毒载体lvCAR152-0～lvCAR152-3支原体测定步骤

5.1.实验前准备

5.1.1.细胞样品处理

5.1.1.1.取1mL细胞悬液(细胞量＞1x10⁵个)，250xg离心5min，收取上清；

5.1.1.2.将上清转移到新的Eppendorf管内，15000xg离心10min；

5.1.1.3.弃上清，加入50μL的buffer solution于95±1℃中水浴3min；

5.1.1.4.水浴后可将供试品放于-20℃冰箱待用。

5.2.反应体系的配制见下表

5.3.上机检测：将上述配置好的体系，经过瞬时离心机瞬离后，放于PCR仪中。经以下反应条件进行PCR反应：

5.4.琼脂糖凝胶电泳

5.4.1.琼脂糖凝胶的制备：称取4g琼脂糖，置于250mL锥形瓶中，加入200mL 1xTAE缓冲液，置于微波炉加热5min，中间间隔摇匀，待琼脂糖全部融化后，即得到2％琼脂糖凝胶液，室温放置冷却；

5.4.2.胶板的制备：取有机玻璃内槽，洗净、晾干；

5.4.3.插入尺寸合适的梳子；

5.4.4.冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液，加入EB染料，混匀后小心地倒在有机玻璃内槽上，控制灌胶速度，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置10min；

5.4.5.待凝胶完全凝固后，轻轻拔出梳子，将有机玻璃内槽整个取出，放置于电泳槽内备用，并加入1xTAE电泳缓冲液，液面必须淹没凝胶上表面；

5.4.6.按加样孔顺序，依次加入1μL 1kb Marker，20μL待测样品；

5.4.7.设置电压120V，时间30min，并启动电泳仪；

5.4.8.凝胶成像系统照胶后，保存胶图。

5.5.结果保存及结果判定

5.5.1.保存原始图片；

5.5.2.结果判定：当阳性对照在270bp有条带；阴性对照270bp处无条带时，样本在270bp处有条带则为阳性结果，270bp无条带则为阴性结果。

如图4所示，条带从上到下依次为：2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp；E为270bp条带，+VE为阳性对照；-VE为阴性对照；PBS和H₂O为溶剂对照；1为lvCAR152-1、2为lvCAR152-2、3为lvCAR152-3、4为lvCAR152-0，均无支原体条带，结果表明此种包装、纯化方式下的复制缺陷性慢病毒载体无支原体污染，安全系数较高。

实施例6

重组慢病毒载体lvCAR152-0～lvCAR152-3内毒素测定步骤

6.1.每批新的鲎试剂在用于试验前都要进行灵敏度的验证。

6.2.细菌内毒素标准溶液配制：取细菌内毒素工作品1支，使用细菌内毒素检查用水将细菌内毒素工作品稀释成50.0EU/mL的内毒素溶液，并在旋涡混合器上剧烈振荡混匀15min；以50.0EU/mL的内毒素溶液为母液稀释成5，0.5，0.05，0.005EU/mL的浓度梯度。

6.3.准备工作

6.3.1.打开酶标仪，将机器设置温度37℃后待用；

6.3.2.供试品的pH值应在5.0–8.0之间；

6.3.3.若供试品中可能存在鲎实验的干扰物质，需要做供试品的干扰试验；

6.4.配制鲎试剂：每瓶鲎试剂中加入1700μL鲎试剂溶解液，轻轻颠倒混匀后等溶液澄清即可使用；

6.5.配制供试品：取100μL复融后的供试品悬液，离心后取上清，使用细菌内毒素检查用水稀释40倍后作为供试溶液；细菌内毒素检查用水为阴性对照：。

6.6.操作步骤

6.6.1.根据阴性对照、内毒素标准品梯度管和待测供试品，计算取用需要的无热原试管数；

6.6.2.根据下面实验操作，在除热原的微孔板里分别加入100μl细菌内毒素检查用水、内毒素标准溶液，或供试品于相应的微孔板里。再在每管中分别加入100μL鲎试剂溶液；

6.6.3.使用酶标仪，在405nm波长处读取吸光度值，按照仪器标准操作规程得出内毒素标准溶液的线性方程和R2值；

6.7.结果计算：将供试溶液405nm波长吸光度值带入线性方程，计算得供试溶液的内毒素含量，单位EU/mL，乘以供试品稀释倍数即得。

检测结果见图5，A图表示显示标曲线性较好，B图中三种复制缺陷性慢病毒载体的内毒素检测结果均为0EU/mL，表明慢病毒载体中不含内毒素。

实施例7

慢病毒转导T细胞流程

原代T细胞分选

7.1.将患者单采血袋上下颠倒数次混匀，转至50mL离心管内，加入等体积的PBS稀释血液样本，上下颠倒数次混匀；

7.2.新取一直50mL离心管，加入15mL单核细胞分离液，缓慢加入等体积的血样稀释液；

7.3.离心，离心后的血液分三层：血细胞沉淀、单个核细胞(Peripheral bloodmononuclear cell,PBMC)、血浆。用移液枪吸弃上层血浆，小心吸取中间白膜层至新的15mL离心管内；

7.4.用洗液洗涤2遍，离心；

7.5.弃去上清，根据细胞沉淀加入适量洗液重悬，75um筛网过滤，去除杂质和细胞碎片；取0.2mL用于计数，其余细胞悬液离心；

7.6.弃上清，根据细胞计数结果，用洗液重悬细胞沉淀，加入CD3磁珠共孵育，2-8℃/15min；

7.7.准备分选柱，将孵育完的细胞悬液进行阳性分选，得到CD3+的细胞，即为原代T细胞。

病毒液包被

7.8.用8ug/孔的retronectin(纤维连接蛋白)包被6孔板，2-8℃冰箱过夜。

7.9.次日上午，吸弃包被液，加0.5mL洗液洗一遍。根据病毒滴度、MOI和T细胞数，计算病毒使用量。将1/2体积的总病毒量病毒平均加入到6孔板中，2-8℃冰箱放置；

7.10. 4.0h后，弃去病毒悬液，每孔加入5uL polybrane(聚凝胺)，2-8℃冰箱放置。

原代T细胞处理

7.11.将原代T细胞离心，弃上清，根据细胞数结果，加适量完全培养基重悬，细胞密度约0.5～1.0*10^6个/mL；

7.12.将细胞加入到T25瓶中，根据体积和细胞数加入CD3/CD28单克隆抗体磁珠作为细胞刺激剂刺激细胞活化，置于37℃、5％CO2培养箱中过夜培养；

7.13. 48h后，将T细胞轻轻吹打混匀，取0.2mL用于计数，其余细胞悬液转至50mL离心管中离心；

7.14.弃上清，根据计数结果，向细胞沉淀中加入适量完全培养基，细胞密度为1.0*10^6个/mL。

病毒转导

7.15.将原代T细胞加入到2.2.2.1-(2)中的6孔板中，每孔加入0.5mL原代T细胞悬液及1/2体积的总病毒量；

7.16.将6孔板用封口膜封住边缘，置于水平离心机上离心；

7.17.取出，转入培养箱中过夜培养，每天观察培养基颜色及细胞状态，进行适当处理，扩大培养，即得到CAR152细胞(CAR152-1、CAR152-2和CAR152-3)。

7.18.在Day7～Day14中检测CAR慢病毒转导效率，在RT-qPCR上检测CAR拷贝数(图6)，流式细胞仪上检测CAR蛋白表达(图7)、不同分化阶段的T细胞(图8)和调节性T细胞含量(图9)。具体操作步骤见如下的八、九、十、十一。

实施例7

CAR拷贝数检测步骤

8.1.CART细胞基因组DNA提取

8.1.1.在1000rpm下离心约5分钟，收集细胞；

8.1.2.加入400μL ACL Solution和10μL的Proteinase K。震荡混匀1分钟，然后置于55℃水浴40分钟，在此期间可以适当取出混匀，有助于充分裂解；

8.1.3.取出样品，待降至室温时轻轻震荡混匀；

8.1.4.在经过预处理好的供试品中，依次加入300μL Ext solution和300μL ABsolution，用力摇匀，然后12000rpm离心5分钟。溶液将分层，上层为蓝色的抽提层，下层为透明水相，两层溶液中间可能会有部分沉淀层，DNA在下层水相中。

注：如样品量较少或溶液澄清不粘稠，可不添加Ext Solution，只添加300μL ABSolution摇匀后离心。

8.1.5.将枪头穿过上层溶液，深入到下层溶液，将下层溶液仔细吸出到GenCleanColumn中，尽量避免吸到上层溶液及中间层的沉淀；

8.1.6. 8000rpm离心1分钟，取下GenClean Column，倒掉收集管中废液；

8.1.7.将GenClean Column放回收集管，加500μL Wash Solution 8000rpm，室温离心1分钟；

8.1.8.再将GenClean Column放回收集管，加500μL Wash Solution，8000rpm，室温离心1分钟；

8.1.9.取下GenClean柱，弃去收集管中的废液。将柱放回收集管中，12000rpm，室温离心1分钟，以除去残留Wash Solution；

8.1.10.将柱放入新的洁净1.5mL离心管中，在柱中央加入50μL Elution Buffer，室温或55℃放置8分钟；

8.1.11.然后12000rpm，室温离心1分钟。离心管中的液体即为基因组DNA。之后可用于浓度、纯度测定以及qPCR定量检测。

8.2.qPCR操作步骤

8.2.1.所用引物信息如下：

8.2.2.标准曲线

质粒标准品pUT485，用Library Dilution Buffer 10倍梯度稀释，取ST1、ST2、ST3、ST4、ST5、ST6做WPRE4和GAPDH的标准曲线。

8.2.3.qPCR反应液的制备和加样

8.2.3.1.设计待测基因组DNA的排版：标准品ST1、ST2、ST3、ST4、ST5和ST6，Library Dilution Buffer作为阴性对照NTC。每个样品做两个复孔，用于查看加样稳定性；

8.2.3.2.按照下表配制qPCR反应体系，并加入到对应的孔中；

试剂	体积(μL)
		ddH2O	5.6
2×AceQ Probe Master Mix	10.0
		Primer1(10μM)	0.4
Primer2(10μM)	0.4
		Taqman Probe(10μM)	0.2
50×ROX Refernce Dye2	0.4
		DNA	2.0
总体积	20

8.2.4.qPCR程序参数设置

8.2.4.1.设置两步法反应程序：预变性95℃，5min，之后每一步变性95℃，10sec，退火、延伸60℃，34sec，共进行40个循环，每次在延伸阶段读取吸光值。反应体积选择20μL；

8.2.5.单个细胞拷贝数计算方式

8.2.5.1.将qPCR结果中的CT值代入标准曲线中，即可计算得出供试品中WPRE基因和GAPDH基因拷贝数；

8.2.5.2.单个CAR-T细胞拷贝数＝WPRE拷贝数/GAPDH拷贝数×2。

结果见图6，图A为两条内参的标准曲线，结果显示线性良好；表B根据标准曲线和单个CAR-T细胞拷贝数检测结果，根据结果可知阴性对照CAR152-0和Blank空白对照组拷贝数均极低，而复制缺陷性慢病毒载体组CAR152-3拷贝数最高,表明CAR在原代T细胞内高效转录。

实施例9

CAR152细胞中CAR蛋白及细胞亚型检测步骤

9.1.将1mL细胞置于1.5mL Eppendorf管，离心，1500rpm，3min；

9.2.弃上清，加入1mL PBS重悬，离心，1500rpm，3min；

9.3.弃上清，加入1mL PBS重悬，再次离心，1500rpm，3min；

9.4.弃上清，加入1mL PBS重悬，加入CD8、CD4和FITC-ProteinL各1μL，4℃避光孵育45～60min，；

9.5.加入1mL PBS重悬，1500rpm，3min离心，弃上清；

9.6.弃上清，加入0.2mL PBS重悬，Autten NxT流式细胞仪上机检测。

检测结果见图7，三种不同慢病毒载体(lvCAR1521～3)转导的T细胞，对CAR-T阳性细胞和细胞亚群CD4(辅助性T细胞)、CD8(细胞毒性T细胞)细胞含量进行检测。结果显示，CAR152-3感染效率最高，CD4/CD8ratio＜1，预示临床效果较好。

实施例10

CAR152细胞中T细胞分化状态检测步骤

10.1.将1mL细胞置于1.5mL Eppendorf管，离心；

10.2.弃上清，加入1mL PBS重悬，离心；

10.3.弃上清，加入1mL PBS重悬，再次离心；

10.4.弃上清，加入1mL PBS重悬，加入CD3、CD8、CD45RA和CD62L，室温避光孵育20～30min，；

10.5.加入1mL PBS重悬，离心，弃上清；

10.6.弃上清，加入0.2mL PBS重悬，Autten NxT流式细胞仪上机检测。

检测结果见图8，本实验选择CD3+CD8+CD45ROCCR7来标记Tscm(干细胞样的记忆T细胞)、Tcm(记忆T细胞)、Tem(效应T细胞)和Teff(终末端效应性T细胞)；Tscm和Tcm细胞较多时，表明细胞增殖和杀伤效果越好。结果显示CAR152-3细胞偏年轻化，分化、增殖能力较强。

实施例11

调节性T细胞检测步骤

11.1.将1mL细胞置于1.5mL Eppendorf管，离心；

11.2.弃上清，加入1mL PBS重悬，离心；

11.3.弃上清，加入1mL PBS重悬，再次离心；

11.4.弃上清，加入1mL PBS重悬，加入CD3、CD4、CD25和CD127，室温避光育20～30min，；

11.5.加入1mL PBS重悬，离心，弃上清；

11.6.弃上清，加入0.2mL PBS重悬，Autten NxT流式细胞仪上机检测。

检测结果见图9，本实验选择CD3+CD4+CD25+CD127low为Treg细胞；Treg是一类具有显著免疫抑制作用的CD4+T细胞亚群，检测结果显示三种不同慢病毒载体(lvCAR1521～3)构建的CAR1521～3的Treg表达均不高，对免疫抑制作用较弱。

实施例12

LDH检测不同效靶比下的杀伤效率步骤

12.1.培养基的配置：

12.1.1.杀伤培养基配置：AIMV基本培养基+4％FBS混匀，密封待用；

12.1.2.LDH底物配置：12mL Assay Buffer+LDH Substrate Mix底物混合物，混匀备用。

12.2.细胞计数

12.2.1.收集靶细胞K562、CTLA-4(可被CAR152效应细胞特异性识别)及效应细胞NC、CAR152；

12.2.2.分别用PBS洗涤两遍后用培养基重悬台盼蓝计数调整细胞密度。

12.3.铺板

靶细胞与效应细胞各铺50μL每孔。细胞铺板后封口膜封口250g 5min离心，离心后，去封口膜，37℃5％CO2培养箱培养过夜。

12.4.检测

12.4.1. 96孔板细胞培养过夜后向最大裂解组每孔分别加入10μL裂解液，放于37℃培养箱继续培养40min；

12.4.2.上述96孔板细胞封口膜封口250g 5min离心50μL上清于新的96孔板中，每组上清分别加50μL底物，室温孵育15min；

12.4.3酶标仪设置波长490nm测OD值。

检测结果见图10，总体来看，各种效应细胞对靶细胞均有杀伤，结果显示随着效靶比的降低，杀伤效率降低，但CAR152-3对靶细胞杀伤效果最佳。

实施例13

细胞因子表达水平检测步骤

13.1.微球准备：

13.1.1.准备与前述总管数相同数目的1.5mLEppendorf管，做好标记(标准品或者血清样本)。每个样品分别加入7种捕获微球各10μL。加之前，用涡旋仪混匀磁珠。标记为W，300g,离心5min，用枪头吸去上清，切勿吸到微球；

13.1.2.加入等体积的H溶液，室温避光30min～40min。

13.2.标曲制备：

13.2.1打开一管冻干的人Th1、Th2、Th17标准品(C)，向标准品中加入2mL稀释液(G)，重悬后的标准品溶液需室温下平衡至少15min；

13.2.2.转入5mLEppendorf管中，此管为最高浓度标准品，标记为10；

13.2.3.取10个Eppendorf管按下表编号、配制标曲管

编号	10	9	8	7	6	5	4	3	2	1
											稀释倍数	Top	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64	1:128	1:256	0

13.2.4.每管各加300μL稀释液(G)，梯度稀释标准品，从最高浓度标准品管取300μL液体到1:4管，吹打混匀，从1:4管取300μL液体到1:16管，吹打混匀，依此类推，直到1:1024管。(注：仅可用枪吹打混匀，不可涡旋)

13.3.样本制备：

13.3.1.用涡旋仪混匀W，每管加入W中混合微球50μL到对应的1.5mL Eppendorf管中。

13.3.2.加入50μL待测血清标本和50μLPE到标记的流式试验管中；

13.3.3.室温、避光孵育3～3.1小时；

13.3.4.加入1mL Wash Buffer入每个试验管中，200g,离心5分钟；轻轻倒掉上清；

13.3.5.加入300μL Wash Buffer到每一个管中，重悬磁珠。

13.3.6.流式分析之前，每个样本上机前涡旋10s，上机检测；

13.3.7.上机检测之前先用试剂盒自带的PE、APC微球调试电压和荧光溢漏。根据最高浓度和最低浓度线性样本调试PE和APC通道电压，以所有微球均没有压轴为准。

13.4.数据分析

13.4.1.导出fcs，用Biolegend多因子分析软件分析。设置标准曲线的最高浓度、稀释倍数及复孔数；

13.4.2.设置微球种类数及每种检测因子及对应的编号，仪器自动圈门，检查核对，若不合理的圈门可手动更改；

13.4.3.核对数据，确认无误导出数据即可。

结果如图11，构建的不同重组慢病毒载体转导的T细胞对靶细胞杀伤效果均较好，尤其是lvCAR152-3慢病毒载体转导的CAR152-3。

序列表

<110> 华东师范大学

<120> 一种靶向CD152 的复制缺陷性重组慢病毒的 CAR-T转基因载体及其构建方法

<130> CPC-NP-16-100071

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1178

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 1

gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg 60

gaggggtcgg caattgaacc ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg 120

atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag 180

tagtcgccgt gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag gtaagtgccg 240

tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg ccttgaatta 300

cttccacctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga agtgggtggg 360

agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt gaggcctggc 420

ctgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt ctcgctgctt 480

tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt tttttctggc 540

aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt tttggggccg 600

cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg ggcctgcgag 660

cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct ctggtgcctg 720

gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg tcggcaccag 780

ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca aaatggagga 840

cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg gcctttccgt 900

cctcagccgt cgcttcatgt gactccactg agtaccgggc gccgtccagg cacctcgatt 960

agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt tatgcgatgg 1020

agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac ttgatgtaat 1080

tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag cctcagacag 1140

tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtga 1178

<210> 2

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 2

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccg 63

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 3

ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg ggtggcggcg gatct 45

<210> 4

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 4

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgatatcta c 141

<210> 5

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 5

atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt 60

tactgc 66

<210> 6

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 6

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 7

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 7

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 8

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 8

gagatcgtgc tgacccagag ccccggcacc ctgagcctga gccccggcga gcgcggcacc 60

ctgagctgcc gcgccagcca gagcatcagc agcagcttcc tggcctggta ccagcagcgc 120

cccggccagg ccccccgcct gctgatctac ggcggcagca gccgcgccac cggcatcccc 180

gaccgcttca gcggcagcgg cagcggcacc gacttcaccc tgaccatcag ccgcctggag 240

cccgaggacc ccgccgtgta ctactgccag cagtacgcca ccagcccctg gaccttcggc 300

cagggcacca aggtggagat caagcgc 327

<210> 9

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 9

caggtgcagc tggtggagag cggcggcggc gtggtgcagc ccggccgcag cctgcgcctg 60

agctgcgtgg gcagcggctt caccttcagc agccacggca tgcactgggt gcgccagggc 120

cccggcaagg gcctggagtg ggtggccgtg atctggtacg acggccgcaa caagtactac 180

gccgacagcg tgaagggccg cttcaccatc agccgcgaca acagcaagaa caccctgttc 240

ctgcagatga acagcctgcg cgccgaggac accgccgtgt actactgcgg ccgcggcggc 300

cacttcggcc ccttcgacta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cagc 354

<210> 10

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 10

gagatcgtgc tgacccagag ccccggcacc ctgagcctga gccccggcga gcgcggcacc 60

ctgagctgcc gcggcagcca gagcgtgagc agctacctgg cctggtacca gcagaagccc 120

ggccaggccc cccgccccct gatctacgcc gtgagcagcc gcgccaccgg catccccgac 180

cgcttcagcg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagccg cctggagccc 240

gaggacttcg ccgtgtacta ctgccagcag tacgccatca gccccttcac cttcggcccc 300

gccaccaagg tggacatcaa gcgc 324

<210> 11

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 11

caggtgcagc tggtggagag cggcggcggc gtggtggagc ccggccgcag cctgcgcctg 60

agctgcaccg gcagcggctt caccttcagc agctacggca tgcactgggt gcgccaggcc 120

cccggcaagg gcctggagtg ggtgggcgtg atctggtacg acggcagcaa caagcactac 180

gccgacagcg ccaagggccg cttcaccatc agccgcgaca acagcaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga acagcctgcg cgccgaggac accgccgtgt actactgcgg ccgcggcggc 300

ctgctgggct acttcgacta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cagc 354

<210> 12

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 12

gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga ccgcgtgacc 60

atcacctgcc gcgccagcca gagcatcaac agctacctgg actggtacca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgcc gccagcagcc tgcagagcgg cgtgcccagc 180

cgcttcagcg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240

gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tactacagca cccccttcac cttcggcccc 300

ggcaccaagg tggagatcaa gcgc 324

<210> 13

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 13

caggtgcagc tggtggagag cggcggcggc gtggtgcagc ccggccgcag cctgcgcctg 60

agctgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacggca tgcactgggt gcgccaggcc 120

cccggcaagg gcctggagtg ggtggccgtg atctggtacg acggcagcaa caagtactac 180

gccgacagcg tgaagggccg ccccaccatc agccgcgaca acagcaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga acagcctgcg cgccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccgcgacccc 300

cgcggcgcca ccctgtacta ctactactac ggcatggacg tgtggggcca gggcaccacc 360

gtgaccgtga gcagc 375

<210> 14

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<220>

<221> misc_feature

Claims

1.一种靶向CD152的复制缺陷性重组慢病毒CAR-T转基因载体，其特征在于，该转基因载体包括：用以控制复制起始位点的启动子、用于质粒复制的原核复制子、用于增强真核细胞内的复制的病毒复制子、用于检测的抗性基因、病毒转录后的调控元件、用于慢病毒包装的包装顺式元件cis及用于识别、传递及启动的嵌合抗原受体CAR；

所述用于识别、传递及启动的嵌合抗原受体CAR包括：胞内信号区、跨膜区和胞外区；胞内信号区是刺激T细胞活化和增殖，包括：CD3z嵌合受体信号肽及CD137嵌合受体共刺激因子；跨膜区起到连接、信号传导作用，即为CD8Transmembrane嵌合受体；胞外区是肿瘤相关抗原结合区，特异性识别抗原，包括：单链抗体链接OLC、CD8αSP嵌合受体铰链、CD152单链抗体轻链VL及CD152单链抗体重链VH；其中，

所述用于控制复制起始位点的启动子为EF1α、CMV、CAG或T7；

所述用于质粒复制的原核复制子pUCOri或pMB1Ori；

所述用于增强真核细胞内的复制的病毒复制子fi Ori或SV40Ori；

所述用于检测的抗性基因为AmpR、Kan或Neo；

所述病毒转录后的调控元件为WPRE或HPRE；

所述用于慢病毒包装的包装顺式元件cis为慢病毒5terminal LTR、慢病毒3terminalSelf-Inactivating LTR、Gag、RRE、ENV和cPPT；

所述CD3z嵌合受体信号肽，即SEQ ID NO.7序列；

所述CD137嵌合受体共刺激因子，即SEQ ID NO.6序列；

所述CD8Transmembrane嵌合受体，即SEQ ID NO.5序列；

所述单链抗体链接OLC，即SEQ ID NO.3序列；

所述CD8αSP嵌合受体铰链，即SEQ ID NO.4序列；

所述CD152单链抗体轻链VL，即SEQ ID NO.8/10/12序列；

所述CD152单链抗体重链VH，即SEQ ID NO.9/11/13序列。

2.一种权利要求1所述靶向CD152的复制缺陷性重组慢病毒的CAR-T转基因载体的构建方法，包括以下步骤：