KR20200119840A - T 세포의 제조 방법 - Google Patents

T 세포의 제조 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20200119840A
KR20200119840A KR1020207025919A KR20207025919A KR20200119840A KR 20200119840 A KR20200119840 A KR 20200119840A KR 1020207025919 A KR1020207025919 A KR 1020207025919A KR 20207025919 A KR20207025919 A KR 20207025919A KR 20200119840 A KR20200119840 A KR 20200119840A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
less
hours
days
cells
hour
Prior art date
Application number
KR1020207025919A
Other languages
English (en)
Inventor
맘타 칼라
조 코우린
아미르 알퍼트
스테펜 월터
알리 모하메드
아가테 부르고뉴
Original Assignee
이매틱스 유에스 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE102018108996.1A external-priority patent/DE102018108996B4/de
Application filed by 이매틱스 유에스 인코포레이티드 filed Critical 이매틱스 유에스 인코포레이티드
Publication of KR20200119840A publication Critical patent/KR20200119840A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4632—T-cell receptors [TCR]; antibody T-cell receptor constructs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0637—Immunosuppressive T lymphocytes, e.g. regulatory T cells or Treg
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2307—Interleukin-7 (IL-7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2312—Interleukin-12 (IL-12)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2315—Interleukin-15 (IL-15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2321—Interleukin-21 (IL-21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/51—B7 molecules, e.g. CD80, CD86, CD28 (ligand), CD152 (ligand)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

본 발명은 일반적으로 입양 면역요법을 위한 T 세포의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 유전적으로 T 세포를 형질도입하는 방법, T 세포를 사용하는 방법 및 그의 T 세포 군집을 제공한다. 한 양태에서, 본 개시는 동결된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 해동하는 단계; 해동된 PBMC를 정지시키는 단계; 배양된 PBMC 내 T 세포를 고체상에 부동화된 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체로 활성화시키는 단계; 활성화된 T 세포를 바이러스 벡터로 형질도입하는 단계; 및 형질도입된 T 세포 확장 및 확장된 T 세포를 획득하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

Description

T 세포의 제조 방법
관련된 출원의 상호 참조
본원은 2018년 9월 3일자 출원된 미국 가출원 제62/726,350호, 2018년 3월23일자 출원된 미국 가출원 제62/647,571호, 2018년 2월 21일자 출원된 미국 가출원 제62/633,113호, 2018년 2월 9일자 출원된 미국 가출원 제62/628,521호, 2018년 4월 16일자 출원된 독일 특허 출원 제10 2018 108 996.1호, 2018년 2월 28일자 출원된 독일 특허 출원 제10 2018 104 628.6호; 및 2018년 2월 9일자 출원된 독일 특허 출원 제10 2018 102 971.3호를 우선권 주장하고, 이들 각각의 전문은 참조로 본원에 혼입된다.
기술분야
본 개시는 일반적으로 입양 면역요법을 위한 T 세포의 제조 방법에 관한 것이다. 본 개시는 또한 유전적으로 T 세포를 형질도입하는 방법, T 세포를 사용하는 방법 및 그의 T 세포 군집을 제공한다.
최근에 T 세포 수용체(TCR)와 키메라 항원 수용체(CAR)의 유전적으로 강화된 발현에 의해 T 세포의 특이성을 종양 관련 항원에 대해 재지정함으로 입양 T 세포 전이의 분야를 증가시켰다. 2 및 3세대 CAR 사용은 전이의 효율을 심하게 방해하는 전이 후 불충분한 생체 내 T 세포 지속성이라는 오래 지속된 문제의 해결에 도움이 되었다. 하지만 개인화 기반 T 세포 제제 생산에 대한 필요성과 같은 보다 넓은 용도에 대한 중요한 장애물이 남아 있으며, 이는 이러한 유망한 치료 접근방식을 경제적으로 가능케 하는 것을 어렵게 한다. 예를 들어 자가 T 세포와 같은 T 세포의 사용이 유망함을 보여주었으나, 사전 치료를 많이 환자에서 적절한 수의 자가 세포를 얻는 것이 어려울 수 있다.
U.S. 제2003/0170238호 및 U.S. 제2003/0175272호는 입양 면역요법을 기술하고 있으며, 여기서 T 세포를 적어도 48 내지 72시간, 보통 적어도 약 72 내지 120시간 동안 활성화 자극으로부터 제거하여 정지시킨 다음, 예를 들어 가용성 항-CD3 및 항-CD28 mAb와 같은 분열촉진성 단클론 항체(mAb)로 세포를 표지화한 후 표지화한 세포를 단핵세포와 과립구에서 선택적으로 강화된 자가 단핵 세포와 혼합하여 주입 전에 재활성화한다.
U.S. 제2017/0051252호는 T 세포와 항원 제시 세포(APC)를 함유하는 세포의 군집을 얻는 단계; (i) 하나 이상의 시토카인, (ii) 항-CD3 항체 또는 이의 CD3 결합 단편, 및 (iii) 항-CD28 항체 또는 이의 CD28 결합, B7-1 또는 이의 CD28 결합 단편 또는 B7-2 또는 CD28 결합 단편을 포함하는 세포 배양 배지에서 세포의 군집을 배양하며 그 배양이 T 세포를 활성화하고 자극하는 단계; 활성화된 세포의 군집을 바이러스 벡터로 형질도입하는 단계; 및 형질도입된 T 세포의 확장을 위해 세포 성장 배지에서 세포의 군집을 배양하여 T 세포 제제를 제조하는 단계를 포함하는 T 세포 제제의 제조 방법을 기술한다.
연구, 진단 및 치료 목적을 위해 충분한 T 세포를 생성할 수 있는 세포 군집의 시험관 내 형질도입을 위한 개선된 전략이 필요하다. 이 기술적 문제에 대한 해결안이 여기에서 제공된다.
한 양태에서, 본 개시는 동결된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 해동하는 단계; 해동된 PBMC를 정지시키는 단계; 배양된 PBMC 내 T 세포를 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체로 활성화시키는 단계; 활성화된 T 세포를 바이러스 벡터로 형질도입하는 단계; 형질도입된 T 세포를 확장하는 단계; 및 확장된 T 세포를 획득하는 단계를 포함하는 T 세포를 형질도입하는 방법에 관한 것이다.
한 양태에서, 고체상 지지체에 부동화된 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체로 배양된 PBMC에서 T 세포가 활성화된다.
다른 양태에서, 정지 단계는 약 1시간 이하, 약 2시간 이하, 약 3시간 이하, 약 4시간 이하, 약 5시간 이하, 약 6시간 이하, 약 7시간 이하, 약 8시간 이하, 약 9시간 이하, 약 10시간 이하, 약 11시간 이하, 약 12시간 이하, 약 18시간 이하, 약 24시간 이하, 약 36시간 이하, 약 48시간 이하, 약 60시간 이하, 약 72시간 이하, 약 84시간 이하, 약 96시간 이하, 약 108시간 이하 또는 약 120시간 이하의 기간 이내에 수행될 수 있다.
다른 양태에서, 정지는 약 0.5시간 내지 약 48시간, 약 0.5시간 내지 약 36시간, 약 0.5시간 내지 약 24시간, 약 0.5시간 내지 약 18시간, 약 0.5시간 내지 약 12시간, 약 0.5시간 내지 약 6시간, 약 1시간 내지 약 6시간, 약 2시간 내지 약 5시간, 약 3시간 내지 약 5시간, 약 3시간 내지 약 4시간, 약 4시간 내지 약 5시간, 약 1시간 내지 약 24시간, 약 2시간 내지 약 24시간, 약 12시간 내지 약 48시간, 약 0.5시간 내지 약 120시간, 약 0.5시간 내지 약 108시간, 약 0.5시간 내지 약 96시간, 약 0.5시간 내지 약 84시간, 약 0.5시간 내지 약 72시간 또는 약 0.5시간 내지 약 60시간의 기간 이내에 수행될 수 있다.
다른 양태에서, 정지 단계는 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간 또는 약 10시간의 기간 이내에 수행될 수 있다.
한 양태에서, 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 2시간 내지 약 5시간, 약 3시간 내지 약 5시간, 약 3시간 내지 약 4시간 또는 약 4시간 내지 약 5시간의 정지 단계로 생성된 T 세포의 배수 확장은 약 16시간, 약 17시간, 약 18시간, 약 19시간, 약 20시간, 약 24시간 또는 약 16시간 내지 약 20시간의 정지 단계로 생성된 T 세포의 배수 확장과 대략 동일하거나(약 1:1), 이보다 적어도 약 1.1배, 적어도 약 1.2배, 적어도 약 1.3배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 1.7배 또는 적어도 약 2.0배 더 크다. 한 바람직한 양태에서, 약 4시간의 정지 단계로 생성된 T 세포의 배수 확장은 약 16시간(예를 들어, 하룻밤 동안)의 정지 단계로 생성된 T 세포의 배수 확장보다 적어도 1.5배 더 크다. 한 양태에서, T 세포의 생성 간의 유일한 차이는 감소된 정지 시간이다.
한 양태에서, 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 2시간 내지 약 5시간, 약 3시간 내지 약 5시간, 약 3시간 내지 약 4시간 또는 약 4시간 내지 약 5시간의 정지 단계로 생성된 T 세포의 수는 약 16시간, 약 17시간, 약 18시간, 약 19시간, 약 20시간, 약 24시간 또는 약 16시간 내지 약 20시간의 정지 단계로 생성된 T 세포의 수와 대략 동일하거나(약 1:1), 이보다 적어도 약 1.1배, 적어도 약 1.2배, 적어도 약 1.3배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 1.7배 또는 적어도 약 2.0배 더 크다. 한 바람직한 양태에서, 약 4시간의 정지 단계로 생성된 T 세포의 수는 약 16시간(예를 들어, 하룻밤 동안)의 정지 단계로 생성된 T 세포의 수보다 적어도 약 1.5배 또는 약 1.3배 내지 약 2.0배 더 크다. 한 양태에서, T 세포의 생성 간의 유일한 차이는 감소된 정지 시간이다.
또 다른 양태에서, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체는 각각 약 0.1 μg/mL 이하, 약 0.2 μg/mL 이하, 약 0.3 μg/mL 이하, 약 0.4 μg/mL 이하, 약 0.5 μg/mL 이하, 약 0.6 μg/mL 이하, 약 0.7 μg/mL 이하, 약 0.8 μg/mL 이하, 약 0.9 μg/mL 이하, 약 1.0 μg/mL 이하, 약 2.0 μg/mL 이하, 약 4.0 μg/mL 이하, 약 6.0 μg/mL 이하, 약 8.0 μg/mL 이하 또는 약 10.0 μg/mL 이하의 농도를 가질 수 있다.
또 다른 양태에서, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체는 각각 약 0.1 μg/mL 내지 약 1.0 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 0.8 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 0.6 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 0.5 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 0.25 μg/mL, 약 0.2 μg/mL 내지 약 0.5 μg/mL, 약 0.2 μg/mL 내지 약 0.3 μg/mL, 약 0.3 μg/mL 내지 약 0.5 μg/mL, 약 0.3 μg/mL 내지 약 0.4 μg/mL, 약 0.2 μg/mL 내지 약 0.5 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 10.0 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 8.0 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 6.0 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 4.0 μg/mL 또는 약 0.1 μg/mL 내지 약 2.0 μg/mL의 농도를 가질 수 있다.
다른 양태에서, 본원에 기술된 활성화는 약 1시간 이하, 약 2시간 이하, 약 3시간 이하, 약 4시간 이하, 약 5시간 이하, 약 6시간 이하, 약 7시간 이하, 약 8시간 이하, 약 9시간 이하, 약 10시간 이하, 약 11시간 이하, 약 12시간 이하, 약 14시간 이하, 약 16시간 이하, 약 18시간 이하, 약 20시간 이하, 약 22시간 이하, 약 24시간 이하, 약 26시간 이하, 약 28시간 이하, 약 30시간 이하, 약 36시간 이하, 약 48시간 이하, 약 60시간 이하, 약 72시간 이하, 약 84시간 이하, 약 96시간 이하, 약 108시간 이하 또는 약 120시간 이하의 기간 이내에 수행될 수 있다.
다른 양태에서, 본원에 기술된 활성화는 약 1시간 내지 약 120시간, 약 1 내지 약 108시간, 약 1시간 내지 약 96시간, 약 1시간 내지 약 84시간, 약 1시간 내지 약 72시간, 약 1시간 내지 약 60시간, 약 1시간 내지 약 48시간, 약 1시간 내지 약 36시간, 약 1시간 내지 약 24시간, 약 2시간 내지 약 24시간, 약 4시간 내지 약 24시간, 약 6시간 내지 약 24시간, 약 8시간 내지 약 24시간, 약 10시간 내지 약 24시간, 약 12시간 내지 약 24시간, 약 12시간 내지 약 72시간, 약 24시간 내지 약 72시간, 약 6시간 내지 약 48시간, 약 24시간 내지 약 48시간, 약 6시간 내지 약 72시간 또는 약 1시간 내지 약 12시간의 기간 이내에 수행될 수 있다.
한 양태에서, 본원에 기술된 T 세포는 환자나 개인에 대해 자가세포이다. 다른 양태에서, 본원에 기술된 T 세포가 환자나 개인에 대해 동종세포이다.
다른 양태에서, 본원에 기술된 고체상은 비드, 플레이트, 플라스크 또는 백의 표면일 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 플레이트는 6웰, 12웰 또는 24웰 플레이트일 수 있다.
한 양태에서, 본원에 기술된 플라스크는 적어도 약 25 cm2, 약 75 cm2, 약 92.6 cm2, 약 100 cm2, 약 150 cm2, 약 162 cm2, 약 175 cm2, 약 225 cm2, 약 235 cm2, 약 300 cm2, 약 1,720 cm2, 약 25 cm2 내지 약 75 cm2, 약 25 cm2 내지 약 225 cm2 또는 약 25 cm2 내지 약 1,720 cm2의 파종 표면적을 가질 수 있다.
다른 양태에서, 본원에 기술된 백은 약 50 mL 내지 약 100 L, 약 100 mL 내지 약 100 L, 약 150 mL 내지 약 100 L, 약 200 mL 내지 약 100 L, 약 250 mL 내지 약 100 L, 약 500 mL 내지 약 100 L, 약 1 L 내지 약 100 L, 약 1 L 내지 약 75 L, 약 1 L 내지 약 50 L, 약 1 L 내지 약 25 L, 약 1 L 내지 약 20 L, 약 1 L 내지 약 15 L, 약 1 L 내지 약 10 L, 약 1 L 내지 약 5 L, 약 1 L 내지 약 2.5 L 또는 약 1 L 내지 약 2 L의 용적을 가질 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 활성화는 T 세포 활성화 자극의 존재 하에서 수행될 수 있다.
한 양태에서, 본원에 기술된 시토카인은 인터루킨 2(IL-2), 인터루킨 7(IL-7), 인터루킨 15(IL-15) 및/또는 인터루킨 21(IL-21)을 포함할 수 있다.
다른 양태에서, IL-7의 농도는 약 1 ng/mL 이하, 약 2 ng/mL 이하, 약 3 ng/mL 이하, 약 4 ng/mL 이하, 약 5 ng/mL 이하, 약 6 ng/mL 이하, 약 7 ng/mL 이하, 약 8 ng/mL 이하, 약 9 ng/mL 이하, 약 10 ng/mL 이하, 약 11 ng/mL 이하, 약 12 ng/mL 이하, 약 13 ng/mL 이하, 약 14 ng/mL 이하, 약 15 ng/mL 이하, 약 16 ng/mL 이하, 약 17 ng/mL 이하, 약 18 ng/mL 이하, 약 19 ng/mL 이하, 약 20 ng/mL 이하, 약 25 ng/mL 이하, 약 30 ng/mL 이하, 약 35 ng/mL 이하, 약 40 ng/mL 이하, 약 45 ng/mL 이하, 약 50 ng/mL 이하, 약 60 ng/mL 이하, 약 70 ng/mL 이하, 약 80 ng/mL 이하, 약 90 ng/mL 이하 또는 약 100 ng/mL 이하일 수 있다.
다른 양태에서, IL-7의 농도는 약 1 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 90 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 80 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 70 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 60 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 50 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 40 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 30 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 20 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 15 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 10 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 10 ng/mL, 약 4 ng/mL 내지 10 ng/mL, 약 6 ng/mL 내지 10 ng/mL 또는 약 5 ng/mL 내지 10 ng/mL일 수 있다.
또 다른 양태에서, IL-15의 농도는 약 5 ng/mL 이하, 약 10 ng/mL 이하, 약 15 ng/mL 이하, 약 20 ng/mL 이하, 약 25 ng/mL 이하, 약 30 ng/mL 이하, 약 35 ng/mL 이하, 약 40 ng/mL 이하, 약 45 ng/mL 이하, 약 50 ng/mL 이하, 약 60 ng/mL 이하, 약 70 ng/mL 이하, 약 80 ng/mL 이하, 약 90 ng/mL 이하, 약 100 ng/mL 이하, 약 110 ng/mL 이하, 약 120 ng/mL 이하, 약 130 ng/mL 이하, 약 140 ng/mL 이하, 약 150 ng/mL 이하, 200 ng/mL 이하, 250 ng/mL 이하, 300 ng/mL 이하, 350 ng/mL 이하, 400 ng/mL 이하, 450 ng/mL 이하 또는 500 ng/mL 이하일 수 있다.
다른 양태에서, IL-15의 농도는 약 5 ng/mL 내지 500 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 400 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 300 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 200 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 150 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 90 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 50 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 50 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 50 ng/mL 또는 약 20 ng/mL 내지 50 ng/mL일 수 있다.
다른 양태에서, IL-2의 농도는 약 1,000 IU/mL 이하, 약 950 IU/mL 이하, 약 900 IU/mL 이하, 약 850 IU/mL 이하, 약 800 IU/mL 이하, 약 750 IU/mL 이하, 약 700 IU/mL 이하, 약 650 IU/mL 이하, 약 600 IU/mL 이하, 약 550 IU/mL 이하, 약 500 IU/mL 이하, 약 450 IU/mL 이하, 약 400 IU/mL 이하, 약 350 IU/mL 이하, 약 300 IU/mL 이하, 약 250 IU/mL 이하, 약 200 IU/mL 이하, 약 150 IU/mL 이하, 약 100 IU/mL 이하, 약 90 IU/mL 이하, 약 80 IU/mL 이하, 약 70 IU/mL 이하, 약 65 IU/mL 이하, 약 60 IU/mL 이하, 약 55 IU/mL 이하, 약 50 IU/mL 이하, 약 40 IU/mL 이하, 약 30 IU/mL 이하, 약 20 IU/mL 이하, 약 10 IU/mL 이하 또는 약 5 IU/mL 이하일 수 있다.
다른 양태에서, IL-2의 농도는 약 10 IU /mL 내지 1,000 IU/mL, 약 20 IU/mL 내지 900 IU/mL, 약 30 IU/mL 내지 800 IU/mL, 약 40 IU/mL 내지 700 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 600 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 550 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 500 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 450 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 400 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 350 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 300 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 250 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 200 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 150 IU/mL 또는 약 50 IU/mL 내지 100 IU/mL일 수 있다.
다른 양태에서, IL-21의 농도는 약 1 ng/mL 이하, 약 2 ng/mL 이하, 약 3 ng/mL 이하, 약 4 ng/mL 이하, 약 5 ng/mL 이하, 약 6 ng/mL 이하, 약 7 ng/mL 이하, 약 8 ng/mL 이하, 약 9 ng/mL 이하, 약 10 ng/mL 이하, 약 11 ng/mL 이하, 약 12 ng/mL 이하, 약 13 ng/mL 이하, 약 14 ng/mL 이하, 약 15 ng/mL 이하, 약 16 ng/mL 이하, 약 17 ng/mL 이하, 약 18 ng/mL 이하, 약 19 ng/mL 이하, 약 20 ng/mL 이하, 약 25 ng/mL 이하, 약 30 ng/mL 이하, 약 35 ng/mL 이하, 약 40 ng/mL 이하, 약 45 ng/mL 이하, 약 50 ng/mL 이하, 약 60 ng/mL 이하, 약 70 ng/mL 이하, 약 80 ng/mL 이하, 약 90 ng/mL 이하 또는 약 100 ng/mL 이하일 수 있다.
다른 양태에서, IL-21의 농도는 약 1 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 90 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 80 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 70 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 60 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 50 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 40 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 30 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 20 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 15 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 10 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 10 ng/mL, 약 4 ng/mL 내지 10 ng/mL, 약 6 ng/mL 내지 10 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 10 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 20 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 30 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 40 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 50 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 60 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 70 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 80 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 90 ng/mL 또는 약 10 ng/mL 내지 100 ng/mL일 수 있다.
한 양태에서, 본원에 기술된 형질도입은 약 1시간 이하, 약 2시간 이하, 약 3시간 이하, 약 4시간 이하, 약 5시간 이하, 약 6시간 이하, 약 7시간 이하, 약 8시간 이하, 약 9시간 이하, 약 10시간 이하, 약 11시간 이하, 약 12시간 이하, 약 14시간 이하, 약 16시간 이하, 약 18시간 이하, 약 20시간 이하, 약 22시간 이하, 약 24시간 이하, 약 26시간 이하, 약 28시간 이하, 약 30시간 이하, 약 36시간 이하, 약 42시간 이하, 약 48시간 이하, 약 54시간 이하, 약 60시간 이하, 약 66시간 이하, 약 72시간 이하, 약 84시간 이하, 약 96시간 이하, 약 108시간 또는 120시간 이하의 기간 이내에 수행될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 형질도입은 약 1시간 내지 약 120시간, 약 1시간 내지 약 108시간, 약 1시간 내지 약 96시간, 약 1시간 내지 약 72시간, 약 1시간 내지 약 48시간, 약 1시간 내지 약 36시간, 약 1시간 내지 약 24시간, 약 1시간 내지 약 12시간, 약 2시간 내지 약 24시간, 약 4시간 내지 약 24시간, 약 12시간 내지 약 24시간, 약 12시간 내지 약 48시간, 약 12시간 내지 약 72시간, 약 24시간 내지 약 72시간, 약 36시간 내지 약 72시간의 기간 이내에 수행될 수 있다.
다른 양태에서, 본원에 기술된 바이러스 벡터는 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 γ-레트로바이러스 벡터일 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 바이러스 벡터는 TCR을 발현하는 렌티바이러스 벡터일 수 있다.
한 양태에서, 본원에 기술된 형질도입은 T 세포 활성화 자극의 존재 하에서 수행될 수 있다.
한 양태에서, 본원에 기술된 확장은 T 세포 활성화 자극의 존재 하에서 수행될 수 있다.
한 양태에서, 본원에 기술된 확장은 약 1일 이하, 약 2일 이하, 약 3일 이하, 약 4일 이하, 약 5일 이하, 약 6일 이하, 약 7일 이하, 약 8일 이하, 약 9일 이하, 약 10일 이하, 약 15일 이하, 약 20일 이하, 약 25일 이하 또는 약 30일 이하의 기간 이내에 수행될 수 있다.
다른 양태에서, 본원에 기술된 확장은 약 1일 내지 약 30일, 약 1일 내지 약 25일, 약 1일 내지 약 20일, 약 1일 내지 약 15일, 약 1일 내지 약 10일, 약 2일 내지 약 10일, 약 3일 내지 약 10일, 약 4일 내지 약 10일, 약 4일 내지 약 30일, 약 6일 내지 약 25일, 약 10일 내지 약 30일 또는 약 12일 내지 약 30일의 기간 이내에 수행될 수 있다.
한 양태에서, 획득된 T 세포의 수는 약 1 x 109개 이상, 약 2 x 109개 이상, 약 3 x 109개 이상, 약 4 x 109개 이상, 약 5 x 109개 이상, 약 6 x 109개 이상, 약 7 x 109개 이상, 약 8 x 109개 이상, 약 9 x 109개 이상, 약 1 x 1010개 이상, 약 5 x 1010개 이상, 약 1 x 1011개 이상, 약 5 x 1011개 이상, 약 1 x 1012개 이상, 약 5 x 1012개 이상 또는 약 1 x 1013개 이상의 세포일 수 있다.
다른 양태에서, 획득된 T 세포의 수는 약 1 x 109개 내지 약 1 x 1013개, 약 1 x 109개 내지 약 5 x 1012개, 약 1 x 109개 내지 약 1 x 1012개, 약 1 x 109개 내지 약 5 x 1011개, 약 1 x 109개 내지 약 1 x 1011개, 약 1 x 109개 내지 약 5 x 1010개, 약 1 x 109개 내지 약 1 x 1010개, 약 2 x 109개 내지 약 1 x 1010개, 약 3 x 109개 내지 약 1 x 1010개, 약 4 x 109개 내지 약 1 x 1010개, 약 5 x 109개 내지 약 1 x 1010개, 약 6 x 109개 내지 약 1 x 1010개, 약 7 x 109개 내지 약 1 x 1010개, 약 8 x 109개 내지 약 1 x 1010개 또는 약 9 x 109개 내지 약 1 x 1010개의 세포일 수 있다.
한 양태에서, 획득된 T 세포는 CD3+CD8+ T 세포 및/또는 CD3+CD4+ T 세포일 수 있다.
다른 양태에서, PBMC는 환자로부터 획득할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 본원에 기술된 방법으로 생성된 유전적으로 형질도입된 T 세포에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 개시는 본원에 기술된 방법으로 생성된 유전적으로 형질도입된 T 세포 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 개시는 동결된 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 해동하는 단계; 해동된 PBMC를 정지시키는 단계; 정지된 PBMC 내 T 세포를 고체상에 부동화된 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체로 활성화시키는 단계; 활성화된 T 세포를 확장하는 단계; 및 확장된 T 세포를 포함하는 T 세포 군집을 획득하는 단계를 포함하는 T 세포 군집을 제조하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 본원에 기술된 방법으로 제조된 T 세포 군집에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 개시는 환자 또는 암을 가지고 있거나 그에 대한 치료를 필요로 하는 개인을 치료하는 방법에 관한 것으로, 본원에 기술된 확장된 T 세포의 효과량을 환자에게 투여함을 포함한다. 한 양태에서, 그러한 필요가 있는 환자나 개인은 암 환자이다. 한 양태에서, 치료 대상 암은 간세포 암종(HCC), 대장 암종(CRC), 아교모세포종(GB), 위암(GC), 식도암, 비소세포 폐암(NSCLC), 췌장암(PC), 신세포 암종(RCC), 양성 전립선 비대증(BPH), 전립선암(PCA), 난소암(OC), 흑색종, 유방암, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 메르켈 세포 암종(MCC), 소세포 폐암(SCLC), 비호지킨 림프종(NHL), 급성 골수성 백혈병(AML), 담낭암 및 담관암종(GBC, CCC), 방광암(UBC), 급성 림프구성 백혈병(ALL) 및 자궁암(UEC) 중 하나 이상으로부터 선택된다.
다른 양태에서, 확장은 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15 및 IL-21로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 시토카인의 존재 하에서 실행할 수 있다. 한 양태에서, 확장은 IL-7 및 IL-15의 조합의 존재 하에서 발생한다.
다른 양태에서, 해동, 정지, 활성화, 형질도입, 확장 및/또는 획득은 폐쇄 시스템에서 수행할 수 있다.
다른 양태에서, 본 개시는 신선한 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 획득하는 단계(즉, PBMC가 저온보존된 PBMC를 해동하여 얻은 것이 아님); 신선한 PBMC에서 T 세포를 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체로 활성화시키는 단계; 활성화된 T 세포의 바이러스 벡터로 형질도입하는 단계; 형질도입된 T 세포를 확장하는 단계; 및 확장된 T 세포를 수확하는 단계를 포함하는 T 세포 군집을 제조하는 방법에 관한 것이다.
한 양태에서, 획득 및 활성화는 1일 이하 동안 수행할 수 있다.
한 양태에서, 확장은 1일 초과 동안 수행될 수 있다.
다른 양태에서, 확장은 약 1일 내지 2일, 약 1일 내지 3일, 약 1일 내지 4일, 약 1일 내지 약 5일, 약 1일 내지 6일, 약 1일 내지 7일, 약 1일 내지 8일, 약 1일 내지 9일, 약 1일 내지 10일, 약 2일 내지 3일, 약 2일 내지 4일, 약 2일 내지 5일, 약 2일 내지 6일, 약 2일 내지 7일, 약 2일 내지 8일, 약 2일 내지 9일, 약 2일 내지 10일, 약 3일 내지 4일, 약 3일 내지 5일, 약 3일 내지 6일, 약 3일 내지 7일, 약 3일 내지 8일, 약 3일 내지 9일, 약 3일 내지 10일, 약 4일 내지 5일, 약 4일 내지 6일, 약 4일 내지 7일, 약 4일 내지 8일, 약 4일 내지 9일, 약 4일 내지 10일, 약 5일 내지 6일, 약 5일 내지 7일, 약 5일 내지 8일, 약 5일 내지 9일 또는 약 5일 내지 10일 동안 수행될 수 있다.
다른 양태에서, 수확은 활성화 후 약 4일 내지 약 12일, 약 4일 내지 약 11일, 약 4일 내지 약 10일, 약 4일 내지 약 9일, 약 4일 내지 약 8일, 약 4일 내지 약 7일, 약 4일 내지 약 6일, 약 4일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 12일, 약 5일 내지 약 11일, 약 5일 내지 약 10일, 약 5일 내지 약 9일, 약 5일 내지 약 8일, 약 5일 내지 약 7일 또는 약 5일 내지 약 6일 이내에 수행할 수 있다.
다른 양태에서, 수확된 T 세포의 수는 약 2 x 109개 내지 약 5 x 109개, 약 5 x 109개 내지 약 10 x 109개, 약 10 x 109개 내지 약 15 x 109개, 약 5 x 109개 내지 약 35 x 109개, 약 5 x 109개 내지 약 30 x 109개, 약 10 x 109개 내지 약 30 x 109개, 약 15 x 109개 내지 약 20 x 109개, 약 20 x 109개 내지 약 35 x 109개, 약 24 x 109개 내지 약 33 x 109개 및 약 24.8 x 109개 내지 약 32.2 x 109개로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
다른 양태에서, 활성화, 형질도입, 확장 및 수확은 폐쇄 또는 반-폐쇄 시스템에서 수행될 수 있다.
다른 양태에서, 폐쇄 시스템은 클리니맥스 프로디지(CliniMACS Prodigy, 상표), 웨이브(WAVE)(수리(XURI, 상표)) 바이오리액터(Bioreactor), 웨이브(수리) 바이오리액터와 바이오세이프 세팍스(BioSafe Sepax, 상표) II의 조합, 지-렉스/가터렉스(G-Rex/GatheRex) 폐쇄 시스템, 또는 지-렉스/가터렉스 폐쇄 시스템과 바이오세이프 세팍스 II의 조합일 수 있다.
본 개시의 성격과 목적 및 이점을 더 잘 이해하기 위해, 동일한 참조 번호가 동일한 요소를 표시하는 다음의 도면과 결합하여 다음의 상세한 설명을 참조해야 한다.
도 1a 및 도 1b는 다른 공여자로부터 획득된 T 세포의 생체 외 배양의 연장에 의한 Tnaive/scm 및 Tcm 표현형의 손실을 보여준다.
도 2는 다른 공여자들로부터 성장한 세포 내 제15일의 IFN-γ 분비를 제10일의 분비와 비교할 때의 감소를 보여준다.
도 3은 T 세포 활성화 및 확장에 대한 정지 조건의 영향을 시험하는 실험 설계를 보여준다.
도 4는 다른 실험군에서 CD25, CD69 및 hLDL-R의 발현 수준을 보여준다.
도 5a 및 도 5b는 다른 실험군에서 제7일 확장 및 제10일 확장에서 배수 확장 및 세포 생존력을 각각 보여준다.
도 6은 다른 실험군에서 바이러스 벡터로 형질도입한 활성화된 T 세포의 제9일 배수 확장 및 생존력을 보여준다.
도 7은 다른 실험군에서 바이러스 벡터로 형질도입한 활성화된 T 세포의 제9일 배수 확장 및 생존력을 보여준다.
도 8은 다른 정지 시간 및 다른 규모의 생산에 따른 T 세포 내에서 형질도입 유전자의 발현을 보여준다.
도 9는 다른 정지 시간 및 다른 규모의 생산에 따른 제10일의 배수 확장을 보여준다.
도 10은 T 세포 활성화에 대한 항-CD3 및 항-CD28 항체 농도의 영향을 시험하는 실험 설계를 보여준다.
도 11은 다른 농도의 항-CD3 및 항-CD28 항체로 활성화된 T 세포 내에서 CD25, CD69 및 hLDL-R의 발현을 보여준다.
도 12는 다른 농도의 IL-15의 존재 하에서 다른 농도의 항-CD3 및 항-CD28 항체로 활성화된 T 세포의 제10일 확장 시 세포 수를 보여준다.
도 13은 다른 농도의 IL-15의 존재 하에서 다른 농도의 항-CD3 및 항-CD28 항체에 의해 활성화된 재조합 TCR 형질도입된 T 세포의 사합체 염색을 보여준다.
도 14a는 다른 기간의 활성화에 따른 CD3+CD8+사합체+ T 세포의 백분율을 보여준다.
도 14b는 다른 기간의 활성화에 따른 형질도입 유전자의 발현을 보여준다.
도 15는 플레이트 결합된 또는 플라스크 결합된 항-CD3 및 항-CD28 항체에 의해 활성화된 T 세포 내에서 CD25, CD69 및 LDL-R의 발현을 보여준다.
도 16a는 플라스크 결합(FB) 및 플레이트 결합(PB)으로 활성화된 T 세포 내에서 형질도입의 수준을 보여준다.
도 16b는 플라스크 결합(FB) 및 플레이트 결합(PB)으로 활성화된 T 세포 내에서 배수 확장을 보여준다.
도 17은 다른 공여자들에서 종양 관련 항원(TAA)을 발현하는 종양 세포에 반응하여 플라스크 결합(FB)으로 활성화된 LV-R73(T 세포 수용체를 발현하는 렌티바이러스 벡터) 형질도입된 T 세포 및 플레이트 결합(PB)으로 활성화 및 형질도입된 T 세포에 의해 유도된 항원 특이적 IFN-γ 수준을 보여준다.
도 18은 항-CD3 및 항-CD28 항체로 코팅된 백과 플레이트의 사용이 T 세포 활성화에 미치는 영향을 시험하는 실험 설계를 보여준다.
도 19는 백 결합 또는 플라스크 결합된 항-CD3 및 항-CD28 항체에서 활성화된 T 세포 내에서 CD25, CD69 및 LDL-R의 발현을 보여준다.
도 20은 다른 농도에서 백 결합 항체에 의해 활성화된 T 세포로 초래된 그리고 FB 조건 하에서 활성화된 T 세포로 초래된 제6일 확장 시 세포 확장을 보여준다.
도 21은 다른 농도에서 백 결합 항체에 의해 활성화된 T 세포로부터 초래된 그리고 FB 조건 하에서 활성화된 T 세포로부터 초래된 제10일 확장 시 세포 확장을 보여준다.
도 22는 본 개시의 한 구현에 따른 T 세포 제조 공정을 보여준다.
도 23a는 본 개시의 한 구현예에 따라 제조된 T 세포의 배수 확장을 보여준다.
도 23b는 본 개시의 한 구현예에 따라 제조된 T 세포의 형질도입된 TCR 발현을 보여준다.
도 23c는 본 개시의 한 구현예에 따라 제조된 T 세포의 표현형을 보여준다.
도 23d는 본 개시의 한 구현예에 따라 제조된 T 세포의 종양 세포 성장 억제 활성도를 보여준다.
도 23e는 본 개시의 다른 구현예에 따라 제조된 T 세포의 종양 세포 성장 억제 활성도를 보여준다.
도 23f는 본 개시의 다른 구현예에 따라 제조된 T 세포의 종양 세포 성장 억제 활성도를 보여준다.
도 23g는 본 개시의 다른 구현예에 따라 제조된 T 세포의 종양 세포 살해 활성도를 보여준다.
도 23h는 본 개시의 다른 구현예에 따라 제조된 T 세포의 종양 세포 살해 활성도를 보여준다.
도 24는 하룻밤 동안의 정지(약 16시간)가 포함된 T 세포 제조 공정을 보여준다.
도 25a는 하룻밤 동안의 정지(약 16시간)로 제조된 T 세포의 배수 확장을 보여준다.
도 25b는 하룻밤 동안의 정지(약 16시간)로 제조된 T 세포의 형질도입된 TCR 발현을 보여준다.
도 25c는 하룻밤 동안의 정지(약 16시간)로 제조된 T 세포의 표현형을 보여준다.
도 25d는 하룻밤 동안의 정지(약 16시간)로 제조된 T 세포의 종양 세포 성장의 억제 활성도를 보여준다.
도 25e 및 도 25f는 하룻밤 동안의 정지(약 16시간)로 제조된 T 세포의 세포 독성 활성도를 보여준다.
도 26은 개방 및 폐쇄 시스템에서 생체 외 조작 프로토콜을 보여준다.
도 27은 본 개시의 한 구현예에 따른 폐쇄 시스템에서의 생체 외 조작 프로토콜을 보여준다.
도 28은 본 개시의 다른 구현예에 따른 폐쇄 시스템에서의 생체 외 조작 프로토콜을 보여준다.
도 29는 개방 및 폐쇄 시스템에서 제조된 T 세포로부터의 IFN-γ 방출을 보여준다.
도 30은 본 개시의 일부 구현예에 따른 T 세포 제조의 개략도를 보여준다.
도 31은 본 개시의 한 구현에 따른 백혈구 성분 채집으로부터 주입 준비 완료까지의 대표적 소요 시간을 보여준다. LP#: 백혈구 성분 채집, 처리 및 동결(선택적). CoA: 분석인증서의 발급에 요구되는 추가 시간.
도 32는 본 개시의 한 구현예에 따른 T 세포 제조 공정을 보여준다.
도 33은 본 개시의 한 구현예에 따른 제조 공정에 의해 생산된 T 세포의 T 세포 기억 표현형 판독을 보여준다.
도 34는 본 개시의 한 구현예에 따른 제조 공정에 의해 생산된 T 세포의 CD27 및 CD28 공동 자극 표현형 판독을 보여준다.
도 35는 본 개시의 한 구현예에 따른 확장 시간 의존 방식에 의한 IL-7, IL-15 또는 IL-2 감소에 의해 유도된 T 세포 성장을 보여준다.
도 36은 본 개시의 한 구현에 의거하여 발현 시간 의존 방식에 대한 IFN-γ 분비의 감소를 보여준다.
도 37은 본 개시의 한 구현에 따라 발현 시간 의존 방식에 대한 EC50의 증가를 보여준다.
도 38은 본 개시의 한 구현예에 따른 확장 측정 기준을 보여준다.
도 39는 본 개시의 한 구현예에 따른 TCR의 표면 발현을 보여준다.
도 40은 본 개시의 한 구현예에 따른 최종 산물의 T 세포 기억 표현형을 보여준다.
도 41은 본 개시의 한 구현예에 따른 표적 세포에 대한 노출 반응에 따른 IFN-γ 방출을 보여준다.
도 42는 본 개시의 한 구현예에 따른 EC50 결정을 보여준다.
도 43은 본 개시의 한 구현예에 따른 T 세포의 세포독성 가능성을 보여준다.
도 44는 본 개시의 한 구현예에 따라 건강한 공여자 및 암 환자로부터 획득된 T 세포 제제 사이의 세포 회수에 대한 비교를 보여준다.
도 45는 본 개시의 한 구현예에 따라 건강한 공여자 및 암 환자로부터 획득된 T 세포 제제 사이의 세포 생존력에 대한 비교를 보여준다.
도 46은 본 개시의 한 구현예에 따라 건강한 공여자 및 암 환자로부터 획득된 T 세포 제제 사이의 배수 확장에 대한 비교를 보여준다.
도 47은 본 개시의 한 구현예에 따라 건강한 공여자 및 암 환자로부터 획득된 T 세포 제제 사이의 세포 표현형에 대한 비교를 보여준다.
도 48은 본 개시의 한 구현예에 따라 건강한 공여자 및 암 환자로부터 획득된 T 세포 제제 사이의 세포 표현형에 대한 비교를 보여준다.
도 49는 본 개시의 한 구현예에 따라 T 세포 제제의 TCR 발현을 보여준다.
도 50은 본 개시의 한 구현예에 따라 건강한 공여자 및 암 환자로부터 획득된 T 세포 제제 사이의 TCR 발현에 대한 비교를 보여준다.
도 51은 본 개시의 한 구현예에 따라 건강한 공여자 및 암 환자로부터 획득된 T 세포 제제 사이의 TCR 발현에 대한 비교를 보여준다.
도 52는 본 개시의 구현예에 따른 게이팅 방식 및 T기억 하위조합을 보여준다.
도 53은 본 개시의 한 구현예에 따라 건강한 공여자 및 암 환자로부터 획득된 T 세포 제제 사이의 세포 표현형에 대한 비교를 보여준다.
도 54는 본 개시의 구현예에 따른 T 세포 제제 내에서 시토카인 발현을 보여준다.
도 55는 본 개시의 한 구현예에 따라 건강한 공여자로부터 획득된 T 세포 제제 내 시토카인 발현을 보여준다.
도 56은 본 개시의 한 구현예에 따라 건강한 공여자 및 암 환자로부터 획득된 T 세포 제제 사이의 시토카인 발현에 대한 비교를 보여준다.
도 57은 본 개시의 구현예에 따라 암 환자로부터 획득된 T 세포 제제로부터의 IFN-γ 방출을 보여준다.
도 58은 본 개시의 구현예에 따라 건강한 공여자로부터 획득된 T 세포 제제로부터의 IFN-γ 방출을 보여준다.
도 59는 본 개시의 구현예에 따라 건강한 공여자로부터 획득된 T 세포 제제로부터 IFN-γ 방출을 보여준다.
도 60은 본 개시의 구현예에 따라 암 환자로부터 획득된 T 세포 제제로부터의 IFN-γ 방출을 보여준다.
도 61은 본 개시의 구현예에 따라 건강한 공여자로부터 획득된 T 세포 제제의 세포 살해 활성도를 보여준다.
도 62는 본 개시의 구현예에 따라 건강한 공여자로부터 획득된 T 세포 제제의 세포 살해 활성도를 보여준다.
도 63a는 본 개시의 한 구현예에 따라 건강한 공여자 및 암 환자로부터 획득된 T 세포 제제 사이의 세포 살해에 대한 비교를 보여준다.
도 63b는 본 개시의 한 구현예에 따라 건강한 공여자 및 암 환자로부터 획득된 T 세포 제제 사이의 세포 살해에 대한 비교를 보여준다.
도 63c는 본 개시의 한 구현예에 따라 건강한 공여자 및 암 환자로부터 획득된 T 세포 제제 사이의 세포 살해에 대한 비교를 보여준다.
한 양태에서, 본 개시는 동결된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 해동하는 단계; 해동된 PBMC를 정지시키는 단계; 정지된 PBMC 내 T 세포를 고체상에 부동화된 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체로 활성화시키는 단계; 활성화된 T 세포를 확장하는 단계; 및 확장된 T 세포를 포함하는 T 세포 군집을 획득하는 단계를 포함하는 방법으로 생성된 세포 군집을 제공한다.
한 양태에서, 본 개시는 동결된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 해동하는 단계; 해동된 PBMC를 정지시키는 단계; 배양한 PBMC 내 T 세포를 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체로 활성화시키는 단계; 활성화된 T 세포를 바이러스 벡터로 형질도입하는 단계; 형질도입된 T 세포를 확장하는 단계; 및 확장된 T 세포를 획득하는 단계를 포함하는 T 세포의 형질도입 방법; 동결된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 해동하는 단계; 해동된 PBMC를 정지시키는 단계; 정지된 PBMC 내 T 세포를 고체상에 부동화된 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체로 활성화시키는 단계; 활성화된 T 세포를 확장하는 단계; 및 확장된 T 세포를 포함하는 T 세포 군집을 획득하는 단계를 포함하는 T 세포 군집의 제조 방법; 및 환자에게 본원에 기술된 확장된 T 세포의 효과량을 투여함을 포함하는, 암을 갖거나 치료를 필요로 하는 환자나 개인의 치료 방법을 제공한다. 한 양태에서, 치료를 필요로 하는 환자나 개인은 암 환자이다. 한 양태에서, 치료할 암은 간세포 암종(HCC), 대장 암종(CRC), 아교모세포종(GB), 위암(GC), 식도암, 비소세포 폐암(NSCLC), 췌장암(PC), 신세포 암종(RCC), 양성 전립선 비대증(BPH), 전립선암(PCA), 난소암(OC), 흑색종, 유방암, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 메르켈 세포 암종(MCC), 소세포 폐암(SCLC), 비호지킨 림프종(NHL), 급성 골수성 백혈병(AML), 담낭암 및 담관암종(GBC, CCC), 방광암(UBC), 급성 림프구성 백혈병(ALL) 및 자궁암(UEC) 중 하나 이상으로부터 선택된다.
T 세포 기반의 면역요법은 종양 관련 또는 종양 특정 단백질로부터 유래된 펩티드 에피톱을 표적으로 하며, 이는 주조직적합 복합체(MHC)의 분자에 의해 제시된다. 종양특이적 세포 독성 T 림프구에 의해 인식되는 항원, 즉 그들의 에피톱은, 발현되고, 같은 원조의 변형없는 세포들에 비해서, 각각의 종양의 대개 상향조절된 세포인 효소, 수용체, 전사 인자 등과 같은 모든 단백질 클래스에서 유도된 분자일 수 있다.
MHC 분자에는 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II의 두 클래스가 있다. MHC 클래스 I 분자는 알파 중쇄와 베타-2-마이크로글로불린으로 구성되어 있고, MHC 클래스 II 분자는 알파와 베타 쇄로 구성되어 있다. 이들의 3차원 형태는 결합 홈을 형성하며, 이는 펩티드와의 비공유 상호작용에 사용된다. MHC 클래스 I 분자는 대부분의 유핵 세포에서 찾을 수 있다. 이는 대부분 내인성 단백질, 결손 리보솜 생성물(DRIP)과 보다 큰 펩티드의 단백질분해성 절단으로 인해 생성된 펩티드를 제시한다. 하지만 엔도솜 구획이나 외생 출처로부터 유래된 펩티드 또한 MHC 클래스 I 분자에서 발견된다. 이러한 비고전적 방식의 클래스 I 제시를 교차 제시라고 칭한다. MHC 클래스 II 분자는 대부분 전문적인 항원 제시 세포(APC)에서 찾아볼 수 있으며, 이들은 주로 APC에 의해 섭취된 외인성 또는 막횡단 단백질의 펩티드를 제시하며(예: 세포내이입 동안), 이는 차후에 처리된다.
펩티드와 MHC 클래스 I 분자의 복합체는 적절한 T 세포 수용체(TCR)를 갖는 CD8 양성 T 세포에 의해서 인식되는 반면, 펩티드와 MHC 클래스 II 분자의 복합체는 적절한 TCR을 갖는 CD4 양성 조력자 T 세포에 의해 인식된다. TCR, 펩티드 및 MHC가 이로써 1:1:1의 화학량적 반응량으로 존재한다는 사실은 잘 알려져 있다.
CD4 양성 보조 T 세포는 CD8 양성 세포 독성 T 세포에 의한 효과적인 반응을 유도하고 지속하는 데 중요한 역할을 한다. 종양 관련 항원(TAA)에서 유도된 CD4-양성 T 세포 에피톱의 식별은 항종양 면역 반응을 일으키기 위한 의약품의 개발에 아주 중요하다. 종양 부위에서, T 조력자 세포는, 세포독성 T 세포(CTL) 친화적 시토카인 주위 환경을 지원하고 효과기 세포, 예를 들면 CTL, 자연 살해(NK) 세포, 대식 세포, 과립구를 유인한다.
염증이 없는 경우, MHC 클래스 II 분자의 발현은 주로 면역계의 세포, 특히 전문적 항원 제시 세포(APC)(예: 단핵 세포, 단핵 세포-유도된 세포, 대식 세포, 수지상 세포)로 제한된다. 암 환자에서, 종양의 세포는 MHC 클래스 II를 발현하는 것으로 밝혀졌다. 본 설명의 연장된 펩티드는 MHC 클래스 II 활성 에피톱으로 작용할 수 있다.
MHC 클래스 II에 의해 활성화된 T 조력자 세포는 항종양 면역에서 CTL 효과기 기능을 조절하는데 중요한 역할을 한다. CD8 양성 살해 T 세포의 TH1 유형 지원 효과기 기능의 T 조력자 세포 반응을 일으키는 T 조력자 세포 에피톱은, 세포 표면에 종양 관련 펩티드/MHC 복합체를 보이는 종양 세포에 대한 세포 독성 기능을 포함한다. 이런 식으로 종양 관련 T 조력자 세포 펩티드 에피톱은, 단독으로 또는 다른 종양 관련 펩티드와 함께, 항종양 면역 반응을 자극하는 백신 조성의 활성 약학 원료로 사용될 수 있다.
예를 들면, 쥐 같은 포유류 동물 모델에서 CD8 양성 T 림프구 부재 시에도, CD4 양성 T 세포가 인터페론-감마(IFNγ)의 분비에 의한 혈관신생의 저해를 통한 종양의 발현 억제에 충분한 것으로 나타났다. CD4-양성 T 세포가 직접적 항종양 효과기라는 증거가 있다.
이전에는 HLA 클래스 II 분자의 항시적 발현이 일반적으로 면역 세포로 제한되기 때문에, 클래스 II 펩티드를 원발성 종양에서 직접 분리하는 것은 가능하지 않다고 간주되었다. 그러나, Dengjel 등은 MHC 클래스 II 에피톱을 종양에서 직접적으로 식별하는 데 성공했다(WO 2007/028574, EP 1 760 088 B1, 이 내용은 그 전문이 본원에 참조로 혼입되어 있다).
CD8 및 CD4에 의존하는 두 유형의 반응이 함께 상승작용에 의해 항종양 효과에 기여하므로, CD8+ T 세포(리간드:MHC 클래스 I 분자 + 펩티드 에피톱) 또는 CD4 양성 T 조력자 세포(리간드:MHC 클래스 II 분자 + 펩티드 에피톱)에 의해 인식되는 종양 관련 항원의 식별 및 특성화가 종양 백신의 개발에 중요하다.
MHC 클래스 I 펩티드가 세포 면역 반응을 촉발(유도)하려면 MHC 분자에도 결합해야 한다. 이 과정은 MHC 분자의 대립형질 그리고 그 펩티드의 아미노산 서열의 특정적 다형성에 의존한다. MHC 클래스 I 결합 펩티드는 대개 길이가 8 내지 12개의 아미노산 잔기이며, 또한 대개 그 서열 내에 MHC 분자의 상응하는 결합 홈과 상호작용하는 두 개의 보전되는 잔기("고정부")를 포함하고 있다. 이렇게 함으로써 각 MHC 대립형질은 어떤 펩티드가 결합 홈에 특정적으로 결합할 수 있는지 결정하는 "결합 모티프"를 갖는다.
MHC 클래스 I 의존 면역 반응에서, 펩티드는 종양 세포에 의해 발현되는 특정 MHC 클래스 I 분자와 결합할 수 있어야 하며, 또한 추후 특정한 T 세포 수용체(TCR)를 갖는 T 세포에 의해 인식될 수 있어야 한다.
종양 특이 또는 연관 항원으로서 T 림프구에 의해 단백질이 인식되고, 치료에 사용되려면, 특정한 전제 조건이 충족되어야 한다. 항원은 주로 종양 세포에 의해 발현되어야 하며 비교적 소량일지라도 건강한 정상 조직에 의해서 발현되어서는 안 된다. 바람직한 구현 예에서, 펩티드는 건강한 정상 조직과 비교하여 종양 세포에 의해 과다 제시되어야 한다. 더 바람직하게는, 각각의 항원이 하나의 유형의 종양에서뿐만 아니라 높은 농도로 나타나는 것이다(즉, 세포당 각 펩티드의 복제 수). 종양 특이 및 종양 관련 항원은 흔히 기능(예: 세포 주기 조절 또는 세포자멸사의 억제) 때문에 정상 세포를 종양 세포로 전환하는 것과 직접 관련된 단백질에서 유도된다. 또한, 변환을 직접적으로 일으키는 단백질의 하류 표적은 상향조절될 수 있으며, 따라서 간접적으로 종양과 연관될 수 있다. 그런 간접적 종양 연관된 항원은 백신 접근법의 표적이 될 수도 있다. 종양 관련 항원에서 유도된 그러한 펩티드("면역성 펩티드")가 시험관 내 또는 생체 내 T 세포 반응을 유도하도록 하기 위해서 에피톱이 항원의 아미노산 서열에 존재한다.
그러므로, TAA는 종양 백신으로 제한되지 않지만 이를 포함하는 T 세포 기반 요법의 개발에 있어서 시작점이 된다. TAA의 식별과 특성화의 방법은 대개 환자 또는 건강한 대상에서 분리될 수 있는 CTL의 사용에 기반하거나, 다른 전송 프로파일 또는 종양과 정상 조직 사이의 차등 전사 프로파일이나 차등 펩티드 발현 패턴의 생성에 기반한다. 그러나, 종양 조직 또는 인간 종양 세포주에서 과발현되거나 그런 조직 또는 세포주에서 선택적으로 발현되는 유전자의 식별은 면역 요법에서 이런 유전자에서 전사된 항원의 이용에 대한 정밀한 정보를 제공하지 않는다. 이것은 상응하는 TCR이 있는 T 세포가 나타나야 하고 이 특정 에피톱에 대한 면역 내성이 없거나 최소화되어야 하므로 이러한 항원의 에피톱의 개개의 하위집단만이 그런 응용에 적합하기 때문이다. 따라서 본 설명의 매우 바람직한 구현예에서, 기능성 및/또는 증식성 T 세포가 발견될 수 있는, 과발현되거나 선택적으로 발현된 펩티드만 선택하는 것이 중요하다. 이러한 기능성 T 세포는 특정 항원에 의해 자극되었을 때 클론에 의해 확대되고 효과기 기능("효과기 T 세포")을 실행할 수 있는 T 세포로 정의된다.
본원에 사용된 "T 세포 수용체(TCR)"란 용어는 알파(α) 및 베타(β) 쇄의 이종이합체로 구성된 T 세포 상의 단백질 수용체를 지칭하지만, 일부 세포에서 TCR은 감마 및 델타(γ/δ) 쇄로 구성된다. 본 개시의 구현예에서, TCR은 예를 들어 조력자 T 세포, 세포독성 T 세포, 기억 T 세포, 규제 T 세포, 자연 살해 T 세포 및 감마 델타 T 세포 등의 TCR을 포함하는 일체의 세포 상에서 변형될 수 있다.
TCR은 주조직접합 복합체(MHC) 분자에 결합된 항원의 인식에 일반적으로 책임이 있는 T 림프구(또는 T 세포)의 표면에서 발견되는 분자이다. 이것은 T 세포의 95%에서 알파 및 베타 쇄로 구성되는 이종이합체인 반면, T 세포의 5%는 감마 및 델타 쇄로 구성된 TCR을 갖는다. TCR의 항원 및 MHC에 대한 관여는 연관있는 효소, 공동수용체 및 특화된 보조 분자에 의해 매개되는 일련의 생화학적 사건을 통해 그 T 림프구의 활성화를 초래한다. 면역학에서 CD3 항원(CD는 포유동물에서 분화의 클러스터(cluster of differentiation)를 의미한다)은 T 세포 수용체(TCR)와 ζ 쇄로 분자와 연관시켜 T 림프구에서 활성화 신호를 생성시키는 4개의 뚜렷한 쇄(CD3-γ, CD3δ 및 2번의 CD3ε)로 구성되는 단백질 복합체이다. TCR, ζ 쇄 및 CD3 분자가 함께 TCR 복합체를 포함한다. CD3-γ, CD3δ 및 CD3ε 쇄는 단일 세포의 면역글로불린 도메인을 함유하는 면역글로불린 상과의 고도로 관련된 세포 표면 단백질이다. CD3 쇄의 막통과 영역은 음전하를 가지며, 이는 이 쇄가 양전하를 가진 TCR 쇄(TCRα 및 TCRβ)과 연관시킬 수 있도록 하는 특성이다. CD3 분자의 세포내 꼬리는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(약자는 ITAM)로 알려진 하나의 보존된 모티프를 함유하며, 이는 TCR의 신호전달 능력에 필수적이다.
CD28은 T 세포 활성화에 요구되는 공동자극 신호를 제공하는 T 세포 상에 발현되는 분자 중 하나이다. CD28은 B7.1(CD80) 및 B7.2(CD86)에 대한 수용체이다. 톨유사 수용체 리간드에 의해 활성화될 때, B7.1 발현은 항원 제시 세포(APC)에서 상향조절된다. 항원 제시 세포 상의 B7.2 발현은 항상성이다. CD28은 미경험 T 세포 상에 항시적으로 발현된 유일한 B7 수용체이다. TCR 외에도 CD28을 통한 자극은 다양한 인터루킨(특히 IL-2 및 IL-6)의 생성을 위해 강력한 공동자극 신호를 T 세포에 제공할 수 있다.
한 양태에서, T 세포의 확장 및/또는 활성화는 IL-2, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-21 중 하나 이상의 존재 하에 발생한다. 다른 양태에서, T 세포의 확장 및/또는 활성화는 IL-2와만, IL-7과만, IL-15와만, IL-2 및 IL-15의 조합 또는 IL-7 및 IL-15의 조합과 함께 발생한다.
본 개시의 TCR 구조체는 암을 가지거나 가진 것으로 의심되는 시험대상자에서 이러한 시험대상자의 종양 크기 감소나 종양의 성장이나 재성장의 방지에 의해 적용될 수 있다. 따라서 본 개시는 또한 시험대상자에서 본 개시의 TCR 구조체를 시험대상자의 분리된 T 세포 안으로 도입한 다음 형질 변환된 T 세포를 시험대상자에게 재도입함으로써 항종양 반응에 영향을 미쳐 시험대상자의 종양을 감소시키거나 제거하는 시험대상자에서 종양의 성장 감소나 그 형성의 방지 방법에 관한 것이다. 사용할 수 있는 적합한 T 세포에는 세포독성 림프구(CTL)나 방해에 필요한 T 세포 수용체를 갖는 일체의 세포가 포함된다. 당업자에 잘 알려진 다양한 방법이 시험대상자로부터 이러한 세포를 분리하는 데 용이하게 이용 가능하다. 예를 들어, 세포 표면 표지자 발현의 사용이나 상업적으로 제공되는 키트의 사용(예: ISOCELL??, 미국 일리노이주 락포드 피어스 소재)이 있다.
TCR 구조체를 맨(naked) DNA나 적합한 벡터로 시험대상자에 도입시킬 수 있다고 사료된다(당업계에서 맨 DNA를 사용하여 전기천공에 의한 안정한 T 세포의 형질감염의 방법. 미국 특허 공보 제6,410,319호 참조. 전문이 참조로 본원에 혼입된다). 맨 DNA는 일반적으로 발현을 위해 적절한 방향의 플라즈미드 발현 벡터에 포함된 본 개시의 TCR을 인코딩하는 DNA를 지칭한다. 유리하게 맨(naked) DNA의 사용은 본 개시의 TCR을 발현하는 T 세포의 생성이 요구되는 시간을 감소시킨다.
대안적으로 바이러스 벡터(예: 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터)를 사용하여 TCR 구조체를 T 세포 안으로 도입시킬 수 있다. 본 개시의 방법에 따른 사용에 적합한 벡터는 시험대상자의 T 세포 내에서 비복제이다. 바이러스에 기반하는 많은 벡터가 알려져 있으며, 세포 내에 유지되는 바이러스의 복제 수가 세포의 생존력을 유지하기에 충분할 정도로 낮다. 예시적 벡터에는 pFB-neo 벡터(STRATAGENE®) 그리고 HIV, SV40, EBV, HSV 또는 BPV에 기반하는 벡터가 포함된다.
형질감염되거나 형질도입된 T 세포가 표면 막 단백질로 TCR 구조체를 원하는 조절 및 원하는 수준으로 발현할 수 있음이 확립되면, 숙주 세포 내에서 TCR이 원하는 신호 유도를 제공하는 기능을 하는지 여부를 결정할 수 있다. 그에 따라 형질도입된 T 세포가 시험대상자에게 재도입되거나 투여되어 시험대상자에서 항종양 반응을 활성화시킨다.
투여가 용이하도록 하기 위해, 본 개시에 따른 형질도입된 T 세포를 적절한 수용체나 희석제와 함께 약학 조성물로 만들거나 생체 내 투여에 적절한 임플란트로 만들 수 있으며, 이것은 더욱 약학적으로 허용가능할 수 있다. 이러한 조성물이나 임플란트를 만드는 수단은 당업계에 기술되어 있다(예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mack, ed. 참조(1980, 전문이 참조로 본원에 혼입된다)). 적절한 경우, 각 투여 경로에 대한 일상적 방식으로 형질도입된 T 세포를 캡슐, 용액, 주사제, 흡입제 또는 에어로솔과 같은 반고체나 액체 형태의 제제로 배합할 수 있다. 당업계에 알려진 수단을 활용하여 조성물이 대상 조직이나 기관에 도달할 때까지 조성물의 방출과 흡수를 방지 또는 최소화하거나 조성물의 시한 방출을 보장할 수 있다. 하지만 바람직하게는 세포가 TCR 발현을 방해하지 않는 약학적으로 허용가능한 형태가 사용된다. 그리하여 가급적이면 평형 염액, 바람직하게는 평형 행크 용액이나 생리 식염수를 포함하는 약학 조성물로 형질도입된 T 세포를 만들 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명은 TCR을 인코딩하는 DNA 구조체를 함유하는 발현 벡터로 T 세포를 형질감염한 다음 선택적으로 세포의 증식을 초래하기 위해 수용체에 대한 항원 양성 세포, 재조합 항원 또는 항체로 세포를 자극하는 것을 포함하는 항원 특이적인 재지정된 T 세포의 제조 및/또는 확장에 대한 방법을 포함한다.
다른 양태에서, 맨 DNA를 사용하여 전기천공이나 다른 비바이러스 유전자 전달에 의한 T 세포의 안정적인 형질감염 및 재지정 방법이 제공된다. 대부분의 시험자들은 이종 유전자를 T 세포로 운반하는 데 바이러스 벡터를 사용했다. 맨 DNA를 사용하여 재지정된 T 세포의 생성에 요구되는 시간을 감소시킬 수 있다. "맨 DNA"란 발현에 적절한 방향의 발현 카세트나 벡터에 포함된 TCR을 인코딩하는 DNA를 의미한다. 본 개시의 전기천공 방법은 그 표면에서 TCR을 발현하여 운반하는 안정한 형질감염물질을 생성한다.
특정 양태에서, T 세포는 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), G-CSF로 자극 이후 수집된 PBMC, 골수 또는 제대혈로부터 유래된 T 세포와 같은 일차 인간 T 세포이다. 조건에는 mRNA 및 DNA의 사용과 전기천공이 포함된다. 형질감염 이후, 세포는 즉시 주입할 수 있거나 보관할 수 있다. 특정 양태에서, 형질감염 이후, 세포 안으로 유전자 전달한 다음 약 1, 2, 3, 4, 5일 이상 이내에 세포를 대량 집단으로 생체 외에서 수일, 수주 또는 수개월 동안 증식시킬 수 있다. 추가 양태에서, 형질감염 이후, 형질감염물질을 클로닝하고, 하나의 통합되거나 에피솜 유지된 발현 카세트나 플라즈미드의 존재를 보여주는 클론 그리고 TCR의 발현이 생체 외 확장된다. 확장을 위해 선택된 클론은 펩티드 발현 표적 세포를 특이적으로 인식하고 분해하는 능력을 나타낸다. 재조합 T 세포는 IL-2 또는 일반 감마 쇄(예: IL-7, IL-12, IL-15, IL-21 및 기타)에 결합하는 다른 시토카인의 자극에 의해 확장시킬 수 있다. 재조합 T 세포는 인공 항원 제시 세포를 사용하는 자극으로 확장시킬 수 있다. 재조합 T 세포는 인공 항원 제시 세포 상에서 또는 T 세포 표면에서 CD3과 교차하는 OKT3과 같은 항체로 확장시킬 수 있다. 재조합 T 세포의 하위 조합은 인공 항원 제시 세포와 T 세포 표면에서 CD52에 결합하는 Campath와 같은 항체로 삭제시킬 수 있다. 추가 양태에서, 유전적으로 변형된 세포를 저온보존할 수 있다.
본 발명의 조성물을 단위 용량 형태(예: 주사제)로 제공할 수 있으며, 이에는 사전결정된 양의 조성물만 또는 다른 활성 제제와의 적절한 조합이 포함된다. 본원에 사용된 단위 용량 형태란 용어는 인간과 동물 시험대상을 위한 단위 용량으로 적합한 물리적으로 별개 단위를 말하며, 각 단위는 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 적절한 경우 부형제와 연계하여 사전결정된 양의 본 발명의 조성물만을 또는 원하는 효과를 생성하는데 충분하도록 계산된 다른 활성 제제와의 조합을 포함한다. 본 발명의 신규 단위 용량 형태에 대한 상세 내용은 특정 시험대상자에서 약학 조성물과 연관 있는 특정 약력학에 의존한다.
바람직하게는 그러한 치료의 부재 시 달리 초래될 것보다, 종양의 크기를 감소시키거나 종양 성장이나 재성장을 제거시키는 장기적이며 특이적인 항종양 반응이 확립되도록, 분리된 형질도입된 T 세포의 효과량이나 충분한 수가 조성물에 존재하며 시험대상자에게 도입된다. 바람직하게는, 시험대상자에게 재도입된 형질도입된 T 세포의 양은, 형질도입된 T 세포가 존재하지 않는 것을 제외하고는 다른 조건이 동일한 경우와 비교할 때 종양 크기의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 98% 또는 약 99%의 감소를 초래한다.
따라서, 투여되는 형질도입된 T 세포의 양은 투여 경로를 고려해야 하며 또한 원하는 치료 효과를 달성하기에 충분한 수의 형질도입된 T 세포가 도입되도록 해야 한다. 더욱이, 여기서 기술되는 조성물에 포함되는 각 활성 제제의 양(예: 각 세포 당 접촉되어야 하는 양이나 특정 체중에 따른 양)은 용도에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 형질도입된 T 세포의 농도는 치료 중인 시험대상자에서 환자의 m2(또는 kg)당 적어도 약 1x106개 내지 약 1x109개의 형질도입된 T 세포, 더욱 바람직하게는 환자의 m2(또는 kg)당 약 1x107개 내지 약 5x108개의 형질도입된 T 세포를 제공하는 데 충분해야 하지만, 예를 들어 환자의 m2(또는 kg)당 5x108개의 세포를 초과하거나, 예를 들어 환자의 m2(또는 kg)당 1x107개의 세포 미만의 일체의 적절한 양을 이용할 수 있다. 투여 일정은 잘 확립된 세포 기반 요법(예를 들어 미국 특허 공보 제4,690,915호 참조, 그 전문이 본원에 참조로 혼입되어 있음)에 기반할 수 있거나 교대의 연속 주입 전략을 사용할 수 있다.
이러한 값들은 본 발명의 실행을 위한 본 발명의 방법을 최적화한 다음 일반의가 활용하는 형질도입된 T 세포의 범위에 대한 일반적 지침을 제공한다. 여기에서 이러한 범위의 인용은 특정 용도에서 필요할 수 있는 어떤 구성성분의 더 높거나 낮은 양의 사용을 절대로 불가능하게 하지 않는다. 예를 들어, 실제 용량 및 일정은 조성물이 다른 약학 조성물과 조합으로 투여되는 가에 따라 또는 약동학, 약물 기질 및 대사에 대한 개인간 차이에 따라 달라질 수 있다. 당업자는 특정 상황의 긴급성에 따라 필요한 일체의 조절을 용이하게 할 수 있다.
"T 세포" 또는 "T 림프구"라는 용어는 흉선 세포, 미경험 T 림프구, 미성숙 T 림프구, 성숙 T 림프구, 정지 상태의 T 림프구 또는 활성화된 T 림프구를 포함하도록 인식되고 의도한다. 특정 구현예에서의 사용에 적합한 T 세포의 예시적 군집에는 조력자 T 세포(HTL; CD4+T 세포), 세포독성 T 세포(CTL; CD8+T 세포), CD4+CD8+ T 세포, CD4-CD8- T 세포 또는 모든 다른 T 세포의 하위조합이 포함되지만 이로써 제한되지 않는다. 특정 구현예의 사용에 적합한 T 세포의 다른 예시적 군집에는 다음 표지자의 하나 이상을 발현하는 T 세포들이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다: CD3, CD4, CD8, CD27, CD28, CD45RA, CD45RO, CD62L, CD127, CD197 및 HLA-DR. 그리고, 바람직한 경우 양성 또는 음성 선택 기법으로 분리될 수도 있다.
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 둥근 핵을 가진 일체의 혈액 세포(즉, 림프구, 단핵세포 또는 대식세포)로 정의된다. 이러한 혈액 세포는 감염에 대항하고 침입자에 적응하는 면역계 내의 중대한 구성요소이다. 림프구 군집은 CD4+ 및 CD8+ T 세포, B 세포 및 자연 살해 세포, CD14+ 단핵세포 그리고 호염기 세포/호중구/호산구/수지상 세포로 구성된다. 이 세포들은 혈장의 층 아래에 연층을 형성하는 단핵세포와 림프구를 포함하는 혈액의 층을 분리하는, 친수성 다당류인 FICOLLTM을 사용하여 전혈이나 백혈구 성분 채집 산물로부터 흔히 분리된다. 한 구현예에서, "PBMC"는 적어도 T 세포 그리고 선택적으로 NK 세포 및 항원 제시 세포를 포함하는 세포의 군집을 말한다.
"활성화"란 용어는 검출가능한 세포 증식을 유도하도록 충분히 자극된 T 세포의 상태를 말한다. 특정 구현예에서, 활성화는 유도된 시토카인 생성과 검출가능한 효과기 기능과도 연관될 수 있다. "활성화된 T 세포"란 용어는 그 중에서도 특히 증식하는 T 세포를 말한다. TCR만을 통해 생성되는 신호는 T 세포의 완전한 활성화에 불충분하며 하나 이상의 이차나 공동자극 신호 또한 요구된다. 그리하여 T 세포 활성화는 TCR/CD3 복합체 및 하나 이상의 이차 공동자극 신호를 통한 일차 자극 신호를 포함한다. 공동자극은 CD3/TCR 복합체를 통하거나 CD2를 통한 자극과 같은 일차 활성화 신호를 받은 T 세포에 의한 증식 및/또는 시토카인 생성이 그 증거가 될 수 있다.
본원에 사용된 정지 상태의 T 세포는 분열하지 않거나 시토카인을 생성하지 않는 T 세포를 의미한다. 정지 상태의 T 세포는 크기가 활성화된 T 세포(약 12 내지 15 μm)에 비해 작다(약 6 내지 8 μm).
본원에 사용된 초회감작된 T 세포는 이전에 적어도 1회 활성화되었으며, 적어도 약 1시간, 적어도 약 2시간, 적어도 약 3시간, 적어도 약 4시간, 적어도 약 5시간, 적어도 약 6시간, 적어도 약 12시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 48시간, 적어도 약 60시간, 적어도 약 72시간, 적어도 약 84시간, 적어도 약 96시간, 적어도 약 108시간 또는 적어도 약 120시간 활성화 자극으로부터 제거된 정지 상태 T 세포이다. 대안적으로, 정지는 약 0.5시간 내지 약 120시간, 약 0.5시간 내지 약 108시간, 약 0.5시간 내지 약 96시간, 약 0.5시간 내지 약 84시간, 약 0.5시간 내지 약 72시간, 약 0.5시간 내지 약 60시간, 약 0.5시간 내지 약 48시간, 약 0.5시간 내지 약 36시간, 약 0.5시간 내지 약 24시간, 약 0.5시간 내지 약 18시간, 약 0.5시간 내지 약 12시간, 약 0.5시간 내지 약 6시간, 약 1시간 내지 약 6시간, 약 2시간 내지 약 5시간, 약 3시간 내지 약 5시간, 약 4시간 내지 약 5시간의 기간 이내에 수행될 수 있다. 초회 감작된 T 세포는 대개 기억 표현형을 갖는다.
T 세포의 군집은 T 세포의 활성화 및 보조 분자에 결합하는 리간드로 T 세포의 표면 상에서 보조 분자를 자극하여 증식하도록 유도할 수 있다. T 세포 군집의 활성화는 T 세포 내 TCR/CD3 복합체 관련 신호를 자극하는 제1 제제를 T 세포와 접촉시켜 성취할 수 있다. T 세포 내에서 TCR/CD3 복합체 관련 신호의 자극은 T 세포 수용체 (TCR)/CD3 복합체 또는 CD2 표면 단백질의 결찰에 의해 또는 수용체 결합 신호전달 경로에 의해 성취할 수 있다. 그리하여 항-CD3 항체, 항-CD2 항체 또는 단백질 키나제를 칼슘 이온담체와 결합하여 사용해서 T 세포의 군집을 활성화할 수 있다.
증식의 유도를 위해, T 세포의 활성화된 군집을 T 세포의 표면에 있는 보조 분자를 자극하는 제2 제제로 접촉시킬 수 있다. 예를 들어, CD4+ T 세포의 군집을 자극하여 T 세포의 표면에 있는 CD28 분자를 표적으로 하는 항-CD28 항체와 함께 증식시킬 수 있다. 대안적으로, CD4+T 세포를 B7-1 및 B7-2와 같은 CD28의 천연 리간드로 자극할 수 있다. 천연 리간드는 세포 막에서 용해되거나 고체상 표면에 결합할 수 있다. CD8+ T 세포 군집의 증식은, 활성화된 T 세포 상에 존재하며 분자량이 약 27 kD인 보조 분자인 CD9에 결합하는 단클론 항체 ES5.2D8의 사용으로 성취할 수 있다. 대안적으로, 활성화된 T 세포 군집의 증식은 CD28과 같은 보조 분자의 결찰에 따른 하나 이상의 세포 내 신호의 자극으로 유도할 수 있다.
일차 활성화 신호를 제공하는 제제와 공동자극 제제를 제공하는 제제를 가용성 형태로 추가하거나 고체상 표면에 결합시킬 수 있다. 바람직한 구현예에서, 이러한 두 제제가 같은 고체상 표면에 결합할 수 있다.
T 세포의 표면 상에서 보조 분자의 활성화 및 자극 이후, 세포 내에서 작용하여 보조 분자가 매개하는 경로를 모방하는 리간드나 다른 제제에 대해 지속적인 노출에 대한 반응으로서의 T 세포 증식의 진행을 모니터링할 수 있다. T 세포 증식의 속도가 감소하면, 추가의 항-CD3 항체 및 공동자극 리간드와 같은 것으로 T 세포를 재활성화 및 재자극하여 증식을 더 유도할 수 있다. 한 구현예에서, 세포 크기를 검사하여 T 세포 증식의 속도를 모니터링할 수 있다. 대안적으로, 리간드나 B7-1이나 B7-2와 같은 다른 제제에 대한 노출에 대한 반응으로서의 세포 표면 분자의 발현을 분석하여 T 세포 증식을 모니터링할 수 있다. 증식 유지를 위해 T 세포의 모니터링과 재자극을 반복하여 원래 T 세포 군집의 수보다 약 100배 내지 약 100,000배 증가하도록 T 세포 군집을 생성할 수 있다.
본 개시의 방법을 사용하여 감염성 질환이나 암의 치료에서의 사용을 위해 선택된 T 세포 군집을 확장시킬 수 있다. 그에 따른 T 세포 군집을 유전적으로 형질도입하여 면역요법에 사용할 수 있거나 감염성 제제의 시험관 내 분석에 사용할 수 있다. T 세포 군집을 충분한 수로 확장한 다음, 확장된 T 세포를 개인으로 복원시킬 수 있다. 본 개시의 방법은 또한 T 세포의 재개 가능한 출처를 제공할 수 있다. 그리하여 개인의 T 세포를 생체 외 확장시킬 수 있으며, 확장된 군집의 한 부분은 개인에게 재투여가 가능하며 다른 부분은 장기 보존 그리고 이후의 확장 및 개인에 대한 투여를 위해 분취하여 동결시킬 수 있다. 유사하게, 암에 걸린 개인으로부터 종양 침윤 림프구의 군집을 얻을 수 있으며, T 세포를 자극하여 충분한 수로 증식시킨 다음 개인에게 복원시킬 수 있다.
본 개시는 또한 T 세포 확장을 위해 T 세포에 공동자극 신호를 제공하는 고체상 표면에 결합된 제제(예: 항-CD28 항체, B7-1 또는 B7-2 리간드)를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 이 제제는 동일한 고체상 표면에 결합하는 일차 활성화 신호를 T 세포에 제공하는 제제(예: 항-CD3 항체)를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 제제는 바람직하게 비드나 플라스크 또는 백에 부착될 수 있다. 다른 고체상 표면에 결합하는 각 제제(즉, 일차 T 세포 활성화 신호를 제공하는 제1 고체상 표면에 결합된 제제 그리고 공동자극 신호를 제공하는 제2 고체상 표면에 결합된 제제)를 포함하는 조성물 또한 본 개시의 범위에 속할 수 있다.
한 양태에서, 본원에 기술된 방법 및 구현예와 함께 사용할 수 있는 TAA 펩티드는 예를 들어, 미국 특허 공보 제2016/0187351호, 미국 특허 공보 제2017/0165335호, 미국 특허 공보 제2017/0035807호, 미국 특허 공보 제2016/0280759호, 미국 특허 공보 제2016/0287687호, 미국 특허 공보 제2016/0346371호, 미국 특허 공보 제2016/0368965호, 미국 특허 공보 제2017/0022251호, 미국 특허 공보 제2017/0002055호, 미국 특허 공보 제2017/0029486호, 미국 특허 공보 제2017/0037089호, 미국 특허 공보 제2017/0136108호, 미국 특허 공보 제2017/0101473호, 미국 특허 공보 제2017/0096461호, 미국 특허 공보 제2017/0165337호, 미국 특허 공보 제2017/0189505호, 미국 특허 공보 제2017/0173132호, 미국 특허 공보 제2017/0296640호, 미국 특허 공보 제2017/0253633호, 미국 특허 공보 제2017/0260249호, 미국 특허 공보 제2018/0051080호 및 미국 특허 공보 제2018/0164315호에 기술된 TAA 펩티드를 포함하며, 이러한 공보에 기술된 내용과 거기에 기술된 서열 목록의 전문이 참조로 본원에 혼입된다.
한 양태에서, 본원에 기술된 T 세포는 위에 기술된 특허 및 공보의 하나 이상에 기술된 TAA 펩티드를 제시하는 세포를 선택적으로 인식한다.
다른 양태에서, 본원에 기술된 방법 및 구현예와 함께 사용할 수 있는 TAA는 서열 식별 번호 1 내지 서열 식별 번호 157로부터 선택되는 적어도 하나를 포함한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
실시예
실시예 1
자가 T 세포 제조 공정
정제된 미경험(Tn), 줄기 세포 기억(Tscm) 및 중앙 기억(Tcm) T 세포 하위조합에 대한 입양 세포 전이는 더 분화된 효과기 기억(Tem) 및 효과기(Teff) T 세포의 이전에 비해 탁월한 종양 퇴행을 유발한다. 조작된 T 세포 산물의 기존 제조 공정에는 10 내지 15일이 걸릴 수 있다. 하지만 약 12일보다 더 긴(예: 14일) 공정은 세포의 감소된 역가를 초래할 수 있다(예: 더 효과적인 Tn, Tscm 및 Tcm T 세포 하위조합이 더 적고 덜 효과적인 Tem 및 Teff T 세포 하위조합이 더 많음). 예를 들어, 도 1a는 2명의 건강한 공여자(예: 공여자 6 및 공여자 8)로부터의 T 세포 생체 외 배양의 연장(예: 14일)을 보여주며, 이 경우 바람직한 Tcm T 세포의 하위조합이 0, 6 또는 10일의 배양보다 감소했다. 반면에, 더 분화되고 덜 지속적인 Tem T 세포 하위조합이 0, 6 또는 10일 동안 배양된 것으로부터 증가했다. 도 1b는 3명의 환자(예: 환자 864, 환자 453 및 환자 265)의 T 세포 생체 외 배양 연장(예: 14일)을 보여주며, 이 경우 바람직한 Tcm T 세포의 하위조합이 0, 6 또는 10일의 배양보다 감소했다. 반면에, 더 분화되고 덜 지속적인 Tem T 세포 하위조합이 0, 6 또는 10일 동안 배양된 것으로부터 증가했다.
더 효과적인 Tn, Tscm 및 Tcm T 세포의 하위조합이 더 적으면 시토카인(예: 인터페론 감마(INF-γ))을 분비하는 효과적으로 활성화된 T 세포가 더 적어질 수 있다. 도 2는 3명의 건강한 공여자(예: 공여자 6(D6), 공여자 7(D7) 및 공여자 8(D8))로부터 얻은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 활성화 및 15일 동안의 배양 후 INF-γ 분비의 감소를 활성화 및 10일 동안의 배양 후의 경우와 비교하여 보내준다.
제조 공정의 단축을 위해, 본 개시의 구현예에는 역가의 손실 없이 100억(10 x 109)개가 넘는 세포 제조를 유도하는 약 7 내지 약 10일의 공정이 포함된다. 그 밖에, 몇 가지 원료의 농도를 최적화하여 재질의 원가를 30%까지 절감시킬 수 있다.
자가 T 세포의 제조 공정에서 정지 조건의 제거나 변형이 T 세포 활성화에 미치는 영향
도 3은 T 세포 활성화 및 확장에 대한 정지 조건의 영향을 시험하는 실험 설계를 보여준다. 간략하게, A군은 제0일에 해동한 다음 시토카인 없이 하룻밤 동안(O/N) 즉, 24시간 동안 정지시킨 후 정지된 PBMC를 비조직 배양 처리된 플레이트 상에 부동화된 항-CD3 및 항-CD28로 활성화시킨 PBMC의 제1 배치를 나타낸다. IL-7은 세포자멸사를 방지하여 T 세포의 생존을 촉진시키는 항상성 시토카인이다. IL-7은 정지 동안 PBMC에 첨가할 수 있다. B1 내지 B3군은 제1일에 해동한 다음 IL-7(B1군)의 존재 하에서 또는 IL-7 + IL-15(B2군)의 존재 하에서 또는 시토카인 없이(B3군) 4 내지 6시간 동안 정지시킨 후 정지된 PBMC를 비조직 배양 처리된 플레이트 상에 부동화된 항-CD3 및 항-CD28로 활성화시킨 PBMC의 제2 배치를 나타낸다. C군은 제1일에 해동한 다음(정지 및 시토카인 없이) 해동된 PBMC를 조직 배양 플레이트 상에 부동화된 항-CD3 및 항-CD28 항체로 활성화시킨 제3 배치를 나타낸다. 세포는 제8일 내지 제10일에 수확하여 계수한 다음 활성화 패널 분석을 실행할 수 있다.
CD25 및 CD69는 시토카인이나 미토겐 활성화된 림프구의 표면에 있는 활성화 표지자이다. LV-R73과 같은 VSV-G 유사형 렌티바이러스 벡터의 결합 및 진입은 VSV-G 외피 단백질과 숙주 세포 상의 저밀도 지질 단백질 수용체(LDL-R)의 상호 작용에 의해 매개되는 것으로 나타났다. 정지 상태의 T 세포는 LDL-R을 발현하지 않지만, 항-CD3 및 항-CD28 항체를 사용한 활성화는 T 세포 상에서 LDL-R 발현을 유도하며 효율적인 렌티바이러스 형질도입을 허용한다. 이는 활성화의 수준으로 조절되는 LDL-R 발현의 동태학이 VSV-G 렌티바이러스 벡터에 의한 형질도입 효율에 영향을 줄 수 있음을 시사한다.
도 4는 A, B1 내지 B3 및 C군 사이에 CD25, CD69 및 hLDL-R 발현 수준이 유사함을 보여주며, 이는 T 세포 활성화의 상당한 절감 없이 정지 시간을 단축시킬 수 있음을 나타낸다(예: 24시간에서 4 내지 6시간으로).
자가 T 세포 제조 공정에서 정지 조건의 제거나 변형이 T 세포 확장에 미치는 영향
도 5a 및 도 5b는 A군 및 B1 내지 B3군에서 배수 확장 및 세포 생존력이 제7일의 확장과 제10일의 확장에서 유사함을 보여준다. 하지만 정지가 없는 C군은 제7일 확장(5배)(도 5a) 및 제10일 확장(16배)(도 5b)의 배수 확장이 최저이다. 이 결과는 T 세포 확장의 상당한 감소 없이 정지 시간을 단축시킬 수 있음을 시사한다.
도 6 및 도 7은 제9일 확장 시 A군, B1 내지 B3군 및 C군의 두 명의 공여자(즉, 공여자 1(제6도) 또는 공여자 2(제7도))에서 TCR을 발현하는 바이러스 벡터(예: LV-R73)로 형질도입한 활성화 T 세포의 배수 확장 및 생존력을 보여준다. B1 및 B2군은 A, B3 및 C군보다 더 나은 세포 확장을 보여주며, 이는 시토카인(예: IL-7 또는 IL-7 + IL-15)의 존재 하에서 짧은 정지 시간(예: 5시간)이 형질도입된 T 세포의 확장을 증가시킬 수 있음을 나타낸다. Rep1 및 Rep2는 2개의 복제본을 나타낸다. 이 결과는 T 세포 확장의 상당한 감소 없이 시토카인(예: IL-7 및/또는 IL-15)의 존재 하에서 자가 T 세포 제조 공정의 단축된 정지 시간의 사용을 뒷받침한다(예: 24시간에서 4 내지 6시간으로).
자가 T 세포 제조 공정에서 정지 조건의 제거나 변형이 T 세포의 형질도입 유전자에 미치는 영향
펩티드/MHC 복합체에 특이적으로 결합하는 형질도입된 TCR을 발현하는 T 세포를 검출하기 위해, 펩티드/MHC 복합체가 로딩된 사합체의 사용 시, 도 8은 공여자 13, 공여자 14 및 공여자 16에 대한 대규모 생산 실행 시 T75 조직 배양 플라스크에서 4시간(IL-7 존재) 및 24시간(시토카인 부재) 또는 G-Rex 100 플라스크에서 4시간(IL-7 존재)의 정지된 T 세포 내 형질도입 유전자 발현(예: 재조합 TCR 발현)이 유사함을 보여준다. 이 결과는 형질도입된 T 세포 내 형질도입 유전자 발현의 상당한 감소 없이 규모 확대 제조 공정에서 정지 시간을 단축할 수 있음을 시사한다(24시간에서 4 내지 6시간으로). 그 밖에, G-Rex 100 플라스크 1개 사용으로 복수의 T75 플라스크를 교체하며 정지 공정을 더 간소화할 수 있다.
도 9는 공여자 13, 공여자 14 및 공여자 16에 대한 소규모나 대규모 생산에서 4 내지 6시간, 6시간 또는 24시간 동안 정지된 T 세포의 제10일 확장 시 유사한 배수 확장을 보여준다. 이 결과는 형질도입된 T 세포의 확장에 상당한 영향을 미치지 않으면서 규모확대 제조 공정에서 정지 시간을 단축할 수 있음을 시사한다(24시간에서 4 내지 6시간으로).
자가 T 세포 제조 공정에서 항-CD3 및 항-CD28 항체와 농도가 T 세포 활성화에 미치는 영향
형질도입 효율과 확장의 속도 모두 T 세포 활성화에 의존하기 때문에 활성화는 자가 T 세포 제조 공정에서 중요한 단계이다. 항체를 사용하여 CD3 수용체 및 CD28과 같은 공동수용체의 참여를 통한 T 세포의 자극이 T 세포의 활성화를 위한 흔한 방법이다. T 세포 활성화는 렌티바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터에 의한 형질도입의 준비 단계 역할을 한다.
도 10은 T 세포 활성화에 대한 항-CD3 및 항-CD28 항체 농도의 영향을 시험하는 실험 설계를 보여준다. 간략하게, 제0일에 PBMC를 해동한 다음 하룻밤 동안 또는 24시간 동안 배양하거나 시토카인의 활성화 없이 정지시켰다. 제1일에, 정지 상태의 PBMC를 여러 농도(예: 0.1 μg/mL, 0.25 μg/mL, 0.5 μg/mL, 1.0 μg/mL)의 항-CD3 및 항-CD28 항체로 코팅된 2개의 24웰 플레이트에서 IL-7 + IL-15의 존재 하에 배양했다. 제2일에, 활성화된 T 세포를 CD25, CD69 및 hLDL-R 발현에 대해 분석하고 VSV-G 유사형 렌티바이러스 벡터(예: 1xEng LV-R73)로 형질도입했다. 제6일/제7일 및 제9일에, 계수, 생존력, 그리고 재조합 TCR을 발현하는 T 세포 검출을 위한 복수의 플루오레세인 및 펩티드/MHC 복합체를 포함하는 덱스트란 백본 기반의 다합체인 덱스트라머(Dex)로 형광 활성화 세포 분류(FACS)와 같은 분석을 수행했다.
도 11은 바이러스 형질도입 전, 0.5 μg/mL 및 1.0 μg/mL의 항-CD3 및 항-CD28 항체로 활성화시킨 T 세포가 공여자 16 및 공여자 14 각각에서 CD25, CD69 및 hLDL-R 발현의 수준이 유사함을 보여준다. 하지만 이러한 발현 수준은 더 낮은 농도(예: 0.1 μg/mL 및 0.25 μg/mL)의 항-CD3 및 항-CD28 항체로 활성화시킨 T 세포의 발현 수준보다 훨씬 더 높다. 이러한 결과는 T 세포 활성화를 상당히 감소시키지 않으면서 항-CD3 및 항-CD28 항체의 농도를 감소시킬 수 있음을 시사한다(예: 1.0 μg/mL에서 0.5 μg/mL로).
자가 T 세포 제조 공정에서 항-CD3 및 항-CD28 항체의 농도가 T 세포 확장에 미치는 영향
도 12는 제10일 확장 시, IL_15의 여러 농도(예: 25 ng/mL, 50 ng/mL 또는 100 ng/mL)의 존재 하에서 0.5 μg/mL 또는 1.0 μg/mL의 항-CD3 및 항-CD28 항체로 활성화시킨 T 세포의 세포 계수가 공여자 16, 공여자 13 및 공여자 14 내에서 각각 유사함을 보여준다. 이 결과는 T 세포 확장의 상당한 감소 없이 항-CD3 및 항-CD28의 농도를 감소시킬 수 있으며(예: 1.0 μg/mL에서 0.5 μg/mL로), IL-15의 농도를 감소시킬 수 있음(예: 100 ng/mL에서 25 ng/mL로)을 시사한다.
도 13은 여러 농도(예: 25 ng/mL, 50 ng/mL 또는 100 ng/m)의 IL-15 존재 하에서 0.5 μg/mL 또는1.0 μg/mL의 항-CD3 및 항-CD28 항체로 활성화시킨 재조합 TCR 형질도입된 T 세포의 사합체 염색이 공여자 16, 공여자 13 및 공여자 14 내에서 각각 유사함을 보여준다. 이 결과는 T 세포의 바이러스 형질도입의 상당한 감소 없이 항-CD3 및 항-CD28의 농도를 감소시킬 수 있으며(예: 1.0 μg/mL에서 0.5 μg/mL로), IL-15의 농도를 감소시킬 수 있음(예: 100 ng/mL에서 25 ng/mL로)을 시사한다.
이러한 결과를 종합하면 (1) T 세포 활성화, 형질도입 유전자 발현 및 T 세포 확장의 상당한 감소 없이 PBMC 해동 후 정지 시간을 단축시킬 수 있으며(예: 24시간에서 4 내지 6시간으로) 또한 (2) T 세포 활성화, 형질도입 유전자 발현 및 T 세포 확장의 상당한 감소 없이 항-CD3 및 항-CD28 항체의 농도를 감소시킬 수 있으며(예: 1.0 μg/mL에서 0.5 μg/mL로), IL-15와 같은 시토카인의 농도를 감소시킬 수 있음(예: 100 ng/mL에서 25 ng/mL로)을 시사한다.
자가 T 세포 제조 공정에서 활성화 기간이 렌티바이러스 벡터 내 형질도입 효율에 미치는 영향
자가 T 세포 제조 공정을 개발하는 주요 목표의 하나는 TCR을 인코딩하는 렌티바이러스 구조체에 의한 일차 인간 T 세포에서 성취되는 형질도입의 속도 개선이다. 분열하는 세포의 형질도입만 가능한 감마 레트로바이러스와 달리, 렌티바이러스는 이론 상 분열하는 그리고 분열하지 않는 세포 모두를 형질도입시킬 수 있다. 하지만 레트로바이러스에 의한 정지 T 세포의 형질도입은 불량한 형질도입 효율을 초래했다. T 세포의 활성화가 렌티바이러스에 의한 형질도입을 원활하게 하는 것으로 나타났다. 그리하여 부동화된 비드나 용해 형태의 항-CD3 및 항-CD28 항체에 의한 T 세포의 자극이 렌티바이러스 형질도입의 전제조건이 되었으며, 입양 세포 요법을 위한 유전적으로 변형된 T 세포 제조 표준의 일부이다.
T 세포의 활성화 단계가 형질도입을 위한 T 세포의 준비에서 중대한 역할을 수행하기 때문에, 항-CD3 및 항-CD28 항체를 사용하는 활성화의 효과적인 기간을 최적화해야 할 필요가 있을 수 있다.
활성화의 최적 기간을 결정하기 위해, 여러 활성화 기간이 형질도입 효율에 미치는 영향을 평가하는 시간 과정 연구를 수행했다. 그 결과는 T 세포의 형질도입을 위한 최적의 창이 항-CD3 및 항-CD28 항체를 사용한 활성화 이후 16 내지 24시간일 수 있음을 보여준다. 그리하여, 형질도입 이전 T 세포 활성화 시간을 추가의 공정 개발 및 임상 제조를 위해 48시간에서 16 내지 24시간으로 감소시킬 수 있다.
본 개시의 다른 구현예에서, 신선한, 즉 동결되지 않은 PBMC의 경우 정지가 필요하지 않을 수 있다. 그리하여 정지 없이 신선한 PBMC를 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체로 활성화한 다음 바이러스 벡터를 형질도입하여 형질도입된 T 세포를 얻을 수 있다.
T 세포의 형질도입 방법에는 조직 배양에서 T 세포의 활성화 그리고 활성화된 T 세포를 다른 조직 배양으로 전이(이 때 바이러스 벡터에 의한 활성화된 T 세포의 형질도입이 발생)의 순차적 단계가 포함될 수 있지만, 활성화 및 형질도입 단계를 동시에 실행할 수도 있다. 예를 들어, T 세포가 항-CD3 및 항-CD28 항체에 의해 활성화되는 동안, 활성화된 T 세포의 형질도입이 같은 배양에서 동시에 수행될 수 있다. 그렇게 함으로써, 전체 T 세포 형질도입 공정, 즉 PBMC 제공부터 형질도입된 T 세포의 획득까지가 예를 들어 3 내지 4일로 단축될 수 있다.
실시예 2
렌티바이러스 구조체에 의한 형질도입 효율의 개선에 필요한 최적의 T 세포 활성화 기간을 결정한다.
건강한 공여자들의 PBMC를 형질도입 하기 위한 준비를 위해 다른 시간 간격으로 항-CD3 및 항-CD28 항체로 활성화시켰다. PBMC로부터 활성화된 T 세포를 R7P1D5 TCR을 표적으로 하여 TAA를 발현하는 여러 렌티바이러스 구조체를 사용하여 생성된 농축 상층액으로 처리했다. 형질도입된 세포를 IL-7 및 IL-15 존재 하에서 확장했다. 그 산물을 특정 덱스트라머/사합체를 사용하는 유세포 분석에 의해 결정된 R7P1D5 TCR 형질도입 유전자의 발현에 근거하여 비교했다.
Figure pct00004
Figure pct00005
대표적 방법
T 세포 활성화의 여러 기간을 비교하기 위해, 예를 들어 4단계: 해동/정지, 활성화, 형질도입 및 확장을 포함하는 표준 소규모 T 세포 생성 공정에 따라 본원에 기술된 대표적 실험을 실행했다.
해동 및 정지
건강한 공여자(n=3, D3, D4, D9)의 동결된 PBMC를 5% 인간 AB 혈청으로 보충시킨 따뜻한 TexMACS 배지에서 해동했다. 세포를 37°C에서 벤조나제 핵산분해효소(50 U/mL)로 15분 동안 처리한 다음 세척하고 계수하고 나서 완전 TexMACS 배지에서 하룻밤 동안 정지시켰다.
활성화
세포가 해동되는 날, 24웰 비조직 배양 플레이트를 PBS(1 μg/mL)에 희석시킨 항-CD3 및 항-CD28 항체로 코팅한 다음 밀봉하여 4°C에서 하룻밤 동안 배양했다. 다음 날, 정지된 PBMC를 수확한 다음 세척하여 1 x 106개/mL 농도에서 다시 현탁했다. 항체 용액을 흡인하고, 웰을 완전 배지로 세척한 다음, 웰 당 2 x 106개 세포를 첨가했다. 명시된 시간 간격 동안 37°C에서 활성화를 실행했다.
형질도입
활성화된 T 세포를 수확한 다음 세척하여 계수했다. 농축 바이러스 상층액, 황산 프로타민(10 μg/mL), IL-7(10 ng/mL) 및 IL-15(100 ng/mL)를 포함하는 형질도입 혼합물을 제조했다. 형질도입마다, 1.0 x 106개 세포를 무균 마이크로원심분리 튜브에서 분리한 다음 400 x g에서 5분 동안 원심분리했다. 세포 펠릿을 하나씩 특정 MOI에 상응하는 형질도입 혼합물 0.5 mL에 재현탁했다. 세포 현탁액을 24웰 G-Rex 플레이트가 적절히 라벨 표기된 웰에 배치했다. 37°C 및 5% CO2에서 24시간 동안 배양한 다음, IL-7(10 ng/mL) 및 IL-15(100 ng/mL)로 보충된 1.5 mL 배지를 셀마다 첨가했다. 형질도입 후 96시간에 형질도입 유전자 발현을 유세포 분석으로 결정했다. 다합체의 MHC-펩티드 복합체(덱스트라머 또는 사합체)를 사용하여 형질도입 유전자 TCR의 표면 발현을 FACS로 모니터링했다.
유세포 분석
강력하게, 주어진 렌티바이러스 감염 다중도(MOI)에서 형질도입된 1.0 x 106개의 세포를 다음 작업 지시를 따라 염색했다. 사합체 염색을 위해, 50 μL 흐름 완충액이 포함된 1 μL의 TAA 사합체를 세포와 함께 어두운 곳에서 RT에서 15분 동안 배양했다. 사합체 염색 이후 T 세포 표면 표지자용 항체(예: CD3, CD4, CD8 등)로 염색했다. 보상 비드에서 유래된 자동보상 기질로 샘플을 획득했다.
결과
2명의 공여자(D3 및 D4)로부터 얻은 PBMC를 플레이트에 결합된 항-CD3 및 CD28 항체를 사용하여 16, 24 및 48시간 동안 활성화시켰다. 세포를 3가지 다른 렌티바이러스 구조체(R72, R21 및 R22)로 형질도입했다.
도 14a는 % CD3+CD8+사합체+ T 세포가 16시간 > 24시간 > 48시간의 순서로 활성화 기간의 증가에 따라 점점 감소함을 보여준다. 이 순서는 시험한 구조체와 공여자 모두에서 일관적으로 관찰되었다.
형질도입 유전자의 높은 발현을 초래할 수 있는 바이러스 형질도입에 대한 최적의 기간을 결정하기 위해 시간 과정 시험을 수행했다. 한 공여자(D9)의 PBMC를 명시된 활성화 기간(예: 0 내지 48시간) 동안 플레이트 결합된 항-CD3 및 항-CD28 항체로 활성화시킨 다음 R7P1D5 TCR을 인코딩하는 두 가지 다른 렌티바이러스 구조체(즉, LV-R73 및 LV-R78)로 각각 형질도입했다.
도 14b는 16 내지 20시간 활성화시킨 세포에서 형질도입 유전자 발현이 가장 높음을 보여준다. 결과는 형질도입 후 96시간에 유세포 분석으로 % CD3+CD8+사합체+ T 세포를 측정한 형질도입 유전자의 수준을 나타낸다. 최적의 활성화에 대한 창은 약 16시간 내지 약 20시간으로 판정되었으며 GMP 제조에 대한 유연성을 부가하기 위해 최대 24시간까지 연장될 수 있다.
전체적으로, 이 결과는 48시간 동안 활성화시킨 T 세포에서 관찰된 낮은 형질도입 속도의 한 원인을 설명할 수 있으며, 16 내지 24시간의 더 짧은 활성화가 렌티바이러스 형질도입의 수행에 최적일 수 있음을 보여준다. 48시간 활성화에 의해 성취되는 확실한 확장이 활성화 시간을 16 내지 24시간으로 제한함으로 인해 영향을 받을 수 있지만, 이러한 변경은 해당 산물에 대해 매우 유익한 것으로 간주될 수 있으며 추가의 공정 개발과 임상적 제조를 위해 이행가능하다.
실시예 3
모든 생물공정과 마찬가지로, T 세포 제조의 규모 확대는 공정 개발에서 도전이 되는 부분이다. 제품 효능을 보존하기 위해서는 T 세포 기능과 질의 유지가 모든 규모 확대 단계를 통해 매우 중요하다. 자가 T 세포 제조 공정에 있어서, 본 발명자는 중대한 단계들을 파악하여 규모 확대를 두 부분으로 나누었다: 활성화의 규모 확대는 비조직 배양액 표면 상에서 실행할 수 있으며 형질도입과 확장의 규모 확대는 G-Rex 장치에서 실행할 수 있다.
비드나 가용성 항체가 쉽게 확대가능한 세포의 활성화를 위한 보다 간단한 방법을 제시하지만, 활성화를 위해 비조직 배양액 표면(24웰 플레이트) 상에 부동화된 항체를 사용하는 자가 T 세포 제조 공정이 렌티바이러스에 의한 최상의 형질도입 및 확장 속도를 가져온다. 하지만 복수의 24웰 비조직 배양 항체로 코팅된 플레이트로부터 활성화된 세포의 수확은 노력과 시간이 많이 드는 단계로서, 간소화될 수 있는 공정에 복잡성을 부가했다. 최대 1 x 109개 PBMC까지의 활성화를 고려할 때, 예를 들어 각 제조 실행에서 활성화된 세포의 수확에 약 20개 플레이트와 480회의 조작이 요구될 수 있다.
T 세포의 활성화를 위한 기존의 방법에는 상용 비드나 비조직 배양액으로 처리한, 각각 1 μg/mL 농도의 항-CD3 및 항-CD28 항체로 코팅한 24웰 또는 6웰 플레이트("플레이트 결합된")를 사용하는 개방 시스템 및 노동력이 많이 드는 공정이 포함될 수 있다. 하지만 개방 시스템 방법은 완료하는 데 비교적 긴 시간(예: 약 8시간)이 걸릴 수 있다. 이러한 개방 시스템과 노동력이 많이 드는 공정의 간소화를 위해, 본 개시의 구현예는 상용 폐쇄 시스템(예: G-RexTM 시스템 및 XuriTM 세포 확장 시스템)의 용기(예: 백)와 조합이 가능한 폐쇄 시스템에 적응시킬 수 있는 복잡하지 않은 폐쇄 시스템을 포함할 수 있으며, 이 시스템은 T 세포 활성화 프로필, T 세포의 형질도입성 및 최종 산물의 기능성이 기존의 방법으로 활성화시킨 T 세포에서와 유사하다. 그 밖에, 본 개시의 방법(예: 플라스크 결합 방법)은 완료하는 데 비교적 짧은 시간이 걸릴 수 있으며(예: 약 1시간), 이것은 기존의 방법보다 약 8배 더 빠른 것이다.
자가 T 세포 제조 공정의 개발을 위한 최적화를 소규모로 수행했으며, 활성화에는 24웰 비조직 배양 플레이트 그리고 형질도입과 확장에는 24웰 G-Rex 플레이트를 사용했다. 이 규모에서, 제2일에 형질도입된 1 내지 2백만 개 T 세포가 제10일까지 30배 내지 40배의 확장을 거쳐 수확 시 30 내지 80백만 개의 세포를 생성했다. 하지만 최종 공정의 목표는 제조 기간은 10일로 유지하면서 2억5천만 내지 4억 개의 활성화된 세포를 형질도입하여 100억 여개의 생존하는 CD3+ T 세포로 확장시키는 것일 수 있다. 그러므로, 한 양태에서 전체 공정의 규모 확대가 여기에 제공된다.
더 많은 세포를 활성화시키는 방법을 포함하는 본 개시의 구현예의 경우, 비조직 배양 처리된 T175cm2 플라스크가 매우 적은 조작을 필요로 하면서 보다 큰 표면적과 보다 간단한 플랫폼을 제공한다. 최적화 이후, T 세포의 활성화를 위한 플라스크 결합 항체의 사용은 플레이트 결합 항체와 유사한 확장과 형질도입을 초래했다. 그리하여 활성화 단계의 규모 확대가 임상적 제조를 위한 자가 T 세포 제조 공정의 간소화에 있어 주요 개발 노력이었다. 형질도입과 확장은 더 많은 수의 세포에 기반하여 G-Rex-24웰 플레이트에서 G-Rex 100으로 규모 확대를 실행했다. G-Rex 장치의 사용은 특히 파종 밀도의 측면에서 활성화 이후 단계의 거의 직선적 규모 확대를 원활하게 할 수 있다. 공급 및 분할의 수와 같은 다른 매개변수를 표준화하여 최대의 확장 비율과 생존력을 성취할 수 있다. 전체 규모의 PD 실행에서 전체 규모 확대 공정에 대한 검증은 GMP에서 T 세포 제제 #1 공정의 성공적인 기술 이전을 보장한다.
플레이트 결합 대 플라스크 결합
T 세포 활성화와 그 이후의 형질도입 및 확장이 T 세포 제조의 중대한 단계이다. 이러한 단계의 규모 확대 조건을 최적화하기 위해, T175cm2 플라스크의 사용은 표면적이 더 크며 조작 수가 더 적은 활성화를 위한 적절한 플랫폼을 제시하여 항-CD3 및 항-CD28 항체로 코팅된 24웰 플레이트를 대체했다. T175cm2 플라스크에서 중대한 매개변수의 최적화 이후의 비교 연구에서, 항체가 코팅된 플라스크(플라스크 결합)를 사용하여 활성화시킨 세포는 복수의 공여자에서 항체로 코팅한 24웰 플레이트(플레이트 결합)를 사용하여 활성화시킨 세포와 활성화, 형질도입 및 확장으 수준이 유사함을 나타냈다.
더욱이 형질도입 및 확장 단계를 소규모(G-Rex-24웰 플레이트)에서 중간 규모(2-6 G-Rex10 또는 1 G-Rex100) 그리고 전체 규모(5-8 G-Rex100)로 규모를 확대했다. 규모 확대 공정의 전체를 2회의 전체 규모 공정 개발(PD) 실행에서 검증될 수 있다. 최종 공정을 사용하여 생성된 모든 생성물은 %Dex+ CD3+CD8+ 세포와 생성된 세포 수의 측면에서 임상적 방출 기준에 합격했다.
활성화 수준(유세포 분석), 형질도입성(덱스트라머 염색, FACS), 확장(세포 계수) 및 기능성(IFN-γ ELISA)에 대하여 플레이트 결합 방법 및 플라스크 결합 방법(비조직 배양 처리한 플라스크를 항-CD3 및 항-CD28 항체로 코팅함)에 의해 활성화된 T 세포 사이의 비교
건강한 공여자 들의 PBMC를 형질도입 준비를 위해 비조직 배양 처리된 T175cm2 플라스크 또는 24웰 플레이트를 사용하여 항-CD3 및 항-CD28 항체로 활성화시켰다. 활성화된 T 세포를 R7P1D5 TCR를 인코딩하고 렌티바이러스 구조체로 형질도입시킨 다음 G-Rex 24웰 플레이트 또는 G-Rex10/G-Rex100 플라스크에 파종했다. 형질도입된 T 세포를 IL-7 및 IL-15의 존재 하에 확장시킨 다음 이 공정의 제10일에 수확했다. 생성물에 대한 공정 중 및 최종 시험을 수행하여 형질도입된 CD8+ T 세포의 수, 생존력 및 퍼센트 비율을 결정했다.
대표적 물질 및 방법
Figure pct00006
Figure pct00007
방법
해동/정지, 활성화, 형질유전 및 확장의 4단계가 포함되는 표준 자가 T 세포 제조 공정에 따라 실험을 다른 규모에서 실행했다.
해동 및 정지
건강한 공여자의 동결된 PBMC를 5% 인간 AB 혈청으로 보충된 따뜻한 TexMACS 배지(완전 배지)에서 해동한다. 세포를 37°C에서 벤조나제 핵산분해효소(50 U/mL)로 15분 동안 처리한 다음 세척하고 계수하고 나서 완벽한 TexMACS 배지에서 하룻밤 동안 정지시켰다.
활성화
세포가 해동되는 날, 24웰 비조직 배양 플레이트 또는 T175cm2 플라스크를 PBS(1 μg/mL)에 희석시킨 항-CD3 및 항-CD28 항체로 코팅한 다음 밀봉하여 4°C에서 하룻밤 동안 배양했다. 다음 날, 정지된 PBMC를 수확한 다음 세척하여 1 x 106개/mL 농도에서 다시 현탁했다. 항체 용액을 흡인하고, 웰을 완전 배지로 세척한 다음, 웰 당 2 x 106개 세포를 첨가했다. 활성화는 명시된 시간 간격 동안 37°C에서 실행했다.
형질도입
활성화된 T 세포를 수확한 다음 세척하여 계수했다. 임상전 렌티바이러스 상충액(명시된 MOI에 근거하여 계산), 황산 프로타민(10 μg/mL) 및 IL-7(10 ng/mL) 및 IL-15(100 ng/mL)를 함유하는 형질도입 혼합물. 각 형질도입마다, 활성화된 세포를 분리하고 400 x g에서 5분 동안 원심분리했다. 각 세포 펠렛을 형질도입 혼합물(2 x 106개 세포 당 1 mL)에서 재현탁한 다음, 적절한 크기의 G-Rex 플라스크에 파종했다. 37°C 및 5% CO2에서 24시간 동안의 배양 후, 각 G-Rex 플라스크의 배양 부피를 IL-7(10 ng/mL) 및 IL-15(100 ng/mL)로 보충된 배지를 사용하여 명시된 용량의 절반이나 전체로 조직했다. 세포 계수 및 생존력을 공정의 제10일까지 규칙적으로 모니터링했다. 다합체의 MHC-펩티드 복합체(덱스트라머 또는 사합체)를 사용하여 형질도입 유전자 TCR의 표면 발현을 FACS로 모니터링했다.
유세포 분석
간략하게, 1.0 x 106개의 형질도입된 세포는 다음의 작업 지시에 따라 염색했다. 사합체 염색 이후 T 세포 표면 표지자용 항체로 염색했다. 보상 비드에서 유래된 자동보상 기질로 샘플을 획득했다.
결과
T 세포의 활성화를 위해 항-CD3 및 항-CD28 항체를 코팅하는 24웰 플레이트에 대한 대안으로 비조직 배양 처리된 T175cm2 플라스크를 평가하기 위해, 항체 농도를 소규모의 그것과 동일하게 유지한 상태에서 코팅 용적, 세포 밀도 및 파종 용적과 같은 다른 매개변수를 플라스크의 더 큰 면적에 대해 최적화했다.
활성화 표지자인 CD25 및 CD69의 생존력과 발현 그리고 플레이트 결합(PB) 및 플라스크 결합(FB)에 의해 활성화된 PBMC에서 LDL-R을 비교하기 위해, FB 또는 PB 항-CD3 및 CD28 항체를 사용하여 활성화한 다음 16 내지 24시간 후에 FACS 염색과 획득을 수행했다. 자극하지 않은 PBMC를 음성 대조군으로 사용했다.
도 15는 최적화된 조건 하에서, T175cm2 플라스크(플라스크 결합, FB)에서 활성화시킨 T 세포가 활성화 표지자인 CD25 및 CD69 LDL-R의 발현 수준이 플레이트 결합(PB) 조건 하에서 활성화된 그것과 유사하게 나타냄을 보여준다. 이 결과는 FB 및 PB 활성화된 T 세포에 따른 활성화 수준이 유사하다는 점에서 FB 항체를 사용하는 규모 확대 활성화가 가능할 수 있음을 시사한다.
활성화를 위해 PB 또는 FB 항체를 사용하는 경우 제10일에 수확된 T 세포 제제에서(공여자 6, 공여자 7 및 공여자 8에서 유래) 형질도입 유전자의 발현 및 확장을 비교하기 위해, TAA 특이적 덱스트라머나 형질도입 유전자 TCR β 쇄 특이적 항체를 사용하는 유세포 분석으로 R7P1D5 TCR의 표면 발현을 결정했다. 형질도입 시(제2일) 그리고 수확일(제10일)에 G-Rex 플레이트나 플라스크에 파종된 생존하는 세포 수에 근거하여 배수 확장을 계산했다. 도 16a 및 도 16b는 FB 및 PB 활성화된 T 세포에서 유사한 수준의 형질도입과 배수 확장을 각각 보여준다. 이 결과는 FB 및 PB 활성화된 T 세포에 따른 형질도입과 확장의 수준이 유사함을 고려할 때 FB 항체를 사용하는 규모 확대 형질유전 및 확장이 가능할 수 있음을 시사한다.
활성화의 성공적인 규모 확대에 대한 추가의 검증을 위해 FB 및 PB 활성화 방법에 의해 생성된 T 세포 제제의 기능성을 비교했다. 활성화를 위해 PB나 FB 항체를 사용하여 생성된 LV-R73 형질도입되는 T 세포 제제에 의한 항원 특이적 IFN-γ의 유도를 평가하기 위해, 종양 세포주(Target+ve, Target-ve)로 공동자극한 T 세포의 상층액에 방출된 IFN-γ를 상업용 ELISA 키트를 사용하여 정량화했다.
도 17은 공여자 6, 공여자 7 및 공여자 8 각각에서 TAA를 발현하는 종양 세포에 반응하여 분비된 항원 특이적 IFN-γ가 FB 활성화 LV-R73에 의해 형질유도된 T 세포의 그것과 유사함을 보여준다. 이 결과는 FB 및 PB 활성화 T 세포로부터 초래되는 IFN-γ 분비의 수준이 유사함을 고려할 때 FB 항체를 사용하는 IFN-γ 분비하는 T 세포에 대한 규모 확대가 가능할 수 있음을 시사한다.
나머지 공정의 규모 확대를 위해, 2.5 x 108개 내지 4.0 x 108개의 활성화 T 세포를 형질도입한 다음 최적의 파종 밀도인 G-Rex100 플라스크의 표면적 cm2 당 0.5 x 106개로 파종했다. 형질도입된 세포를 최적의 밀도로 파종하기 위해 복수의 G-Rex100 플라스크를 사용했다. 세포의 공급 및 분할을 위한 조건과 같은 추가의 매개변수 또한 최적화하여 최대의 확장을 성취했다. 최종 제조 공정을 2회의 전체 규모 공정 개발(PD) 실행에서 시험했다. 최종 공정을 사용하여 생성된 모든 생성물이 % 덱스트라머 및 통합 복제 수 방출 기준에 합격했다. 이러한 제조 실행에서 생성된 세포 수는 모든 코호트 수준에서 임상적 용량에 부합했다. PD 규모 확대 실행의 결과는 다음 표 1에 요약되어 있다.
[표 1]
Figure pct00008
상기 공정의 GMP 제조에서 몇몇 공여자에 대하여 200억 개가 넘는 세포가 생성되었다.
플라스크 결합 대 백 결합
활성화 수준(유세포 분석), 형질도입성(덱스트라머 염색, FACS), 확장(세포 계수) 및 기능성(IFN-γ ELISA)에 대하여 플라스크 결합 방법 및 백 결합 방법(예: 항-CD3 및 항-CD28 항체로 코팅한 Saint-Gobain VueLife AC 백)에 의해 활성화된 T 세포 간의 비교
항-CD3 및 항-CD28 항체로 코팅한 백 대 플레이트를 사용한 T 세포의 활성화를 비교하기 위해, 도 18은 항-CD3 및 항-CD28 항체로 코팅한 백 및 플레이트가 T 세포 활성화에 미치는 영향을 시험하는 데 사용된 실험 설계를 보여준다. 간략하게, 제0일에 PBMC를 해동한 다음 하룻밤 동안(24시간) 정지시켰다. 제1일에, 정지된 PBMC를 항-CD3 및 항-CD28 항체로 코팅한 플라스크(예: T175cm2 플라스크) 또는 백(예: Saint-Gobain VueLife AC 백) 상에 파종하여 16 내지 20시간 동안 활성화시켰다. 제2일에, 활성화된 T 세포를 CD25, CD69 및 hLDL-R 발현에 대해 분석한 다음, VSV-G 유사형 렌티바이러스 벡터(예: 1xEng LV-R73)로 형질도입했다. 제6일/제7일 및 제10일에, 세포 계수, 생존력 및 덱스트라머(Dex)에 의한 형광 활성화 세포 분류(FACS)와 같은 분석을 수행했다.
도 19는 최적화 조건 하에서, 1 μg/mL 또는 2 μg/mL 농도의 항체가 결합된 백에서 활성화시킨 T 세포(공여자 16 및 공여자 14로부터 유래)가 플라스크 결합(T175cm2 플라스크, "표준"으로 라벨 표기) 조건 하에서 활성화시킨 T 세포와 활성화 표지자 CD25 및 CD69 그리고 hLDL-R 발현이 유사함을 나타내는 것을 보여준다. 이 결과는 백 결합(Bag)과 플라스크 결합(FB) 활성화시킨 T 세포에 의한 활성화의 수준이 유사함을 고려할 때 백 결합(Bag) 항체를 사용하는 규모 확대 활성화가 가능할 수 있음을 시사한다.
도 20 및 도 21은 각각 제6일 및 제10일의 확장 시, 1 μg/mL 또는 2 μg/mL 농도의 항체로 결합된 백에서 활성화된 T 세포(공유자 16 및 공여자 14에서 유래)가 FB 조건하에서 활성화된 T 세포와 유사한 T 세포 계수(즉, 세포 확장)를 나타냄을 보여준다. 이 결과는 백 결합과 플라스크 결합으로 활성화시킨 T 세포에 의한 확장 수준이 유사함을 고려할 때, 백 결합 항체를 사용하는 규모 확대가 가능할 수 있음을 시사한다.
실시예 4
T 세포 제조 공정에서 짧은 정지 대 하룻밤 동안 정지
도 22는 본 개시의 한 구현예에 따라 PBMC를 약 4시간의 기간 동안 정지시키는 T 세포 제조 공정(220)을 보여준다. 예를 들어, T 세포 제조 공정(220)은 무균성을 시험할 수 있는 백혈구 성분 채집으로부터의 PBMC 분리 및 저온보존(221), T 세포의 해동, 정지(예를 들어 약 4시간) 및 활성화(222); 바이러스 벡터에 의한 형질도입(223); 시토카인에 의한 확장(224); 세포 계수 및 면역 표현형 검사를 시험할 수 있는 세포의 분할/공급(225), 세포 계수 및 미코플라스마를 시험할 수 있는 완제 의약품 세포의 수확 및 저온보존(226) 그리고 생존력, 무균성, 엔도톡신, 면역표현형 검사, 통합된 벡터의 복제 수 및 수포성구내염 바이러스 당단백질 G(VSV-g)를 시험할 수 있는 저온보존 후 방출(227)을 포함할 수 있다.
표 2는 T 세포 제조 공정(220)의 3가지 다른 적격성 평가 실행에 의해 제조된 T 세포의 특성을 보여주며, 본 개시의 한 구현예에 따라 IL-7의 존재 하에 짧은 기간 동안(예: 약 4 내지 6시간) PBMC를 정지시킨 것이다.
[표 2]
짧은 기간 동안(예: 약 4시간 내지 약 6시간으로 바람직하게는 약 4시간) (GMP 클린룸에서) PBMC의 정지에 의한 T 세포 제조 공정(220)의 적격성 평가 실행(QR)
Figure pct00009
도 23a 및 표 2는 하룻밤 동안 정지시킨 PBMC로 제조된 T 세포(n = 7)의 배수 확장이 약 78.7배임을 보여준다.
형질도입된 TCR이 확장된 T 세포의 세포 표면에 발현되는지 결정하기 위해, 확장된 T 세포를 형질도입된 TCR에 특이적으로 결합하는 펩티드/MHC 복합체가 로딩된 덱스트라머로 염색한 다음 유세포 분석으로 형질도입된 TCR을 발현하는 CD8+ T 세포를 확인했다. 도 23b 및 표 2는 짧은 정지에 의해 제조된 Dex+/CD8+ T 세포(n = 7)의 평균 %가 약 53.4%임을 보여주며, 이는 형질도입된 TCR이 확장된 T 세포의 세포 표면에 발현됨을 나타낸다.
형질도입된 TCR을 발현하는 확장된 T 세포가 어떤 T 세포의 표현형에 존재하는지 결정하기 위해, 세포를 다양한 면역세포 표면 표지자로 염색한 다음 유세포 분석으로 T 세포 표현형(예: Tn/scm, Tcm, Tem 및 Teff)을 식별했다. 이들 가운데, Tn/scm이 다른 것보다 면역요법에 더 바람직할 수 있는데 이는 Tn/scm이 림프구 귀소, 증식 기능성, 자가 재생 및 복수 역가의 성질을 가질 수 있기 때문이다. 도 23c는 Tn/scm 표현형을 나타내는 형질도입된 TCR(n = 4)을 발현하는 확장된 T 세포의 약 50% 평균을 보여준다.
형질도입된 TCR을 발현하는 확장된 T 세포의 세포독성 활성도를 결정하기 위해, 여러 농도의 표적 펩티드로 펄스화된 종양 세포를 표적 펩티드/MHC 복합체를 특이적으로 인식하는 형질도입된 TCR을 발현하는 확장된 T 세포로 배양한 다음 종양 세포의 성장을 측정했다. 도 23d는 형질도입된 TCR을 발현하는 확장된 T 세포가 펩티드 농도에 의존하는 방식으로 종양세포의 성장을 억제시키는 것을 보여준다.
형질도입된 TCR을 발현하는 확장된 T 세포의 세포독성 활성도가 건강한 공여자(예: 공여자 7, 13, 17, 18 및 21(도 23e))로부터 얻은 PBMC와 다른 환자들(예: 환자 312, 319, 351, 472 및 956(도 23f)로부터 획득된 T 세포와 유사하게 나타난다.
형질도입된 TCR을 발현하는 확장된 T 세포의 세포독성 가능성을 결정하기 위해, 표적 펩티드를 발현하는 종양 세포를 표적 펩티드/MHC 복합체를 특이적으로 인식하는 형질도입된 TCR(220-T)을 발현하는 확장된 T 세포와 함께 배양한 다음 종양 세포의 배수 성장을 측정했다. 도 23g 및 도 23h는 10:1 및 3:1의 효과기 대 종양 세포 비율로 형질도입된 TCR(220-T)(효과기)을 발현하는 확장된 T 세포와의 배양에 따른 종양 성장의 퇴행이나 억제의 감소를 표적 특이적 TCR(NT)이 결여된 형질도입되지 않은 T 세포와 비교하여 보여준다.
도 24는 PBMC를 하룻밤 동안(약 16시간) 정지시키는 T 세포 제조 공정(240)을 보여준다. 예를 들어, T 세포 제조 공정(240)에는 PBMC를 신선하게 사용하거나 사용하기 전까지 동결시켜 보관할 수 있거나, T 세포 제조의 개시 물질로 사용할 수 있거나, 림프구 군집(예: CD8, CD4 또는 둘 다)의 선택도 가능할 수 있는 PBMC의 분리(241), 세포자멸사 세포가 죽거나 T 세포 기능의 복원을 허용할 수 있는(신선한 재료를 사용하면 이 단계는 필요하지 않을 수 있음) 림프구의 하룻밤 동안(예: 약 16시간) 해동 및 정지(242), 항-CD3 및 항-CD28 항체(가용성 또는 표면 결합, 예: 자기나 생물분해성 비드에 결합)를 사용할 수 있는 림프구의 활성화(243), CAR이나 TCR을 인코딩하는 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 구조체를 사용할 수 있거나 비바이러스 방법을 사용할 수 있는 CAR이나 TCR의 형질도입(244), 그리고 시토카인, 혈청(ABS 또는 FBS) 및/또는 저온보존 배지의 존재 하에서 실행할 수 있는 림프구의 확장,수확 및 저온보존(245)이 포함될 수 있다.
표 3은 PBMC를 하룻밤 동안(약 16시간) 정지시키는 T 세포 제조 공정(240)에 대한 3가지 다른 적격성 평가 실행에 의해 제조된 T 세포의 특성을 보여준다.
[표 3]
Figure pct00010
짧은 정지(예: 약 4시간)를 실행한 T 세포 제조 공정과 대조적으로, 약 16시간의 정지에 의해 제조된 T 세포는 T 세포의 배수 확장이 더 적다. 도 25a 및 표 3은 약 16시간의 PBMC 정지에 의해 제조된 T 세포(n = 7)의 평균 배수 확장이 약 45배이며, 이에 비해 약 4시간의 짧은 정지(표 2)의 경우에는 약 78.7배이다. TT 및 PQ는 각각 기술 이전(Technology Transfer) 및 공정 적격성 평가(Process Qualification) 실행을 의미한다.
하룻밤 동안 정지(약 16시간)는 약 4시간의 정지에 비해 형질도입된 TCR을 발현하는 확장된 T 세포의 감소를 초래했다. 도 25b 및 표 3은 약 16시간의 PBMC 하룻밤 동안 정지에 의해 제조된 평균 % Dex+/CD8+ T 세포(n = 7)가 약 51.9%임을 보여주며, 이에 비해 약 4시간의 정지의 경우에는 약 53.4%(표 2)이다.
약 16시간의 하룻밤 동안 정지를 실행한 경우 Tn/scm 표현형을 가진 형질도입된 TCR을 발현하는 확장된 T 세포의 수율이 약 4시간의 정지에 비해 더 적었다. 도 25c는 Tn/scm 표현형을 갖는 확장된 T 세포(n = 5)의 평균이 약 40%임을 보여주여, 이에 비해 약 4시간의 정지 시에는 약 50%이다(도 23c).
도 25d는 효과기 대 종양 세포의 비가 10:1, 3:1 및 1:1인 경우 형질도입된 TCR(효과기)을 발현하는 확장된 T 세포와 종양 세포의 배양 시 종양 세포 성장의 억제가, 음성 대조군(예: 형질도입된 TCR(Target-ve)을 발현하지 않는 확장된 T 세포 또는 효과기가 없는 경우 배양되는 종양 세포)보다 유의하게 더 높음을 보여준다. 그 밖에, 형질도입된 TCR을 발현하는 확장된 T 세포의 세포독성 활성도는 건강한 공여자(n = 5)로부터 얻은 PBMC(도 25e)와 암 환자(n = 7)로부터 얻은 PBMC(도 25f)에서 서로 유사하게 나타난다.
표 4는 본 개시의 한 구현에 따른 약 4시간의 짧은 정지로 제조된 T 세포의 특성(공정 220) 그리고 약 16시간의 하룻밤 동안 정지로 제조된 경우의 특성(공정 240)을 요약한다.
[표 4]
Figure pct00011
표 4는 짧은(약 4 내지 6시간) 정지를 사용한(220)에 확장에서 1일을 추가로 허용할 수 있으며(예: 공정 240의 제8일이 공정 220의 제9일에 해당) 이에 따라 더 많은 세포를 초래함을 보여준다.
실시예 5
폐쇄 시스템에서 T 세포 제조
위에서 지적한 바와 같이, 공정들(220 및 240)은 G-RexTM와 같은 개방 시스템에서 실행할 수 있다. 하지만 개방 시스템에서 조혈 세포(예: T 세포)의 생체 외 조작은 감염성 제제에 의한 오염의 위험을 개입시킬 수 있으며 생착가능성과 조혈 적합성을 감소시킬 수 있다. 임상적 세포 제제의 제조에서, 배양 공정에 걸쳐 무균성의 보장으로 인해 폐쇄 세포 배양 시스템이 바람직할 수 있다.
도 26은 개방 및 폐쇄 시스템에서 생체 외 조작 프로토콜을 보여준다. 폐쇄 시스템은 외부 처리의 위험과 오염을 완화시킬 수 있으며 제품의 견고성과 품질을 촉진시키고, 또한 제품 보안을 증가시켜 하류 처리, 최종 제품 분석 및 검사에 따른 문제점을 감소시킬 수 있다. 개방 시스템에서는 상대적으로 작은 용적(예: 1 L)에서 상대적으로 적은 수의 세포(예: ≤ 1 x 109개)를 배양할 수 있지만, 폐쇄 시스템에서는 상대적으로 큰 용적(예: 5 L(예: WAVE(XURITM)의 바이오리액터 백 및 G-RexTM 플라스크)부터 50 L까지(예: 정적 백))에서 상대적으로 많은 수의 세포(예: 약 1 x 109개 내지 약 2 x 1011개)를 배양할 수 있다. 이러한 폐쇄 시스템 세포 배양 기술은 조절되고 보다 빠르고 또는 비용효과적인 세포 제조의 경로로 고품질의 개별화된 세포 요법을 인도할 수 있다.
본 개시의 T 세포 제조 공정은 상용 시스템, 예를 들어, 클리니맥스 프로디지(상표(밀텐위(Miltenyi)), 웨이브(수리(상표)) 바이오리액터(지이 바이오사이언시즈(GE Biosciences)) 단독 또는 바이오세이프 세팍스(상표) II와의 조합 및 지-렉스/가터렉스(상표) 폐쇄 시스템(윌슨 울프(Wilson Wolf)) 단독 또는 바이오세이프 세팍스(상표) II와의 조합 등 일체의 세포 배양 폐쇄 시스템에서 실행할 수 있다. G-RexTM-폐쇄 시스템은 확장 용기이며 GatheRexTM는 농축 및 수확용 펌프이다.
CliniMACS ProdigyTM(Miltenyi)
CliniMACS ProdigyTM 및 TCT 공정 소프트웨어와 TS520 튜브 세트는 세포 농축, 형질도입, 세척 및 확장을 위한 폐쇄 시스템 처리를 허용할 수 있다. 예를 들어, MACS-CD4 및 CD8-MicroBeads는 농축에 사용될 수 있고, TransACT 비드(예: CD3/CD28 시약)는 활성화에 사용될 수 있고, 재조합 TCR을 발현하는 렌티바이러스 벡터는 형질도입에 사용될 수 있고, TexMACS 배지-3%-HS-IL2는 배양에 그리고 인산 완충 식염수/에틸렌디아민테트라아세트 완충액은 세척에 사용될 수 있다. 이 시스템은 약 4 내지 5 x 109개의 세포를 생성하며, 챔버 최대 약 300 mL의 충전 용적을 갖춘 자동화 제조 프로토콜을 포함하고, 선택 및 활성화(TransACT 비드), 형질도입 및 확장을 10 내지 14일 공정으로 수행할 수 있다.
WAVE(XuriTM) Bioreactor(GE Biosciences)
WAVE(XuriTM) Bioreactor에서는 T 세포를 배양 백(예: Xuri Cellbags)에서 관류의 사용 및/또는 미사용 조건 하에 배양할 수 있다. 공급용 배지 백은 5 L Hyclone Labtainer일 수 있다. 폐기물 백은 Mbag(GE Healthcare로부터 구매)일 수 있다. 이 시스템은 약 15 내지 30 x 109개 세포를 생성하며, 배양 제어 및 모니터링을 허용하는 유니콘 소프트웨어를 사용하며, 약 0.3 L 내지 약 25 L를 보유할 수 있는 로킹 트레이를 포함하고 배양 용적의 유지 그리고 기체 교환의 매개, 신선한 배지 및 시토카닌의 세포 배양에 대한 공급을 위해 관류 기능을 수행할 수 있다.
WAVE(XuriTM) Bioreactor에는 확장용 Xuri 백 해동 및 정지를 위한 Saint Gobain의 VueLife 백 그리고 활성화를 위한 VueLife AC 백이 포함될 수 있다. WAVE(XuriTM) Bioreactor는 배양액 세척 및 용적 감소 단계를 위해, 예를 들면 SepaxTM 세포 분리 시스템(GE Biosciences)과 같은 다른 기술과 병용할 수 있다. 용액 이전을 위한 무균 백의 연결 시 무균 용접기(Terumo BCTTM)를, 튜브 밀봉을 위해 가열 밀봉기를 사용할 수 있다.
SepaxTM 세포 분리 시스템은 시린지 챔버의 회전을 통한 분리(원심분리)와 시린지 피스톤의 치환을 통한 성분의 이전을 제공하는 분리 챔버에 의존한다. 광 센서는 분리된 성분의 흡광도를 측정하여 올바른 출력 용기에서 각 성분의 흐름 방향을 관리하는 데, 예를 들면 혈장, 연층 및 적혈구가 혈액 샘플로부터 분리되어 수집될 수 있다.
도 27은 제0일에, SepaxTM 세포 분리 시스템으로 분리되어 동결된 PBMC를 해동, 세척 및 정지시킬 수 있으며(예: 하룻밤 동안(O/N)), 배양 백(예: VueLife AC 세포백)을 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체로 코팅할 수 있고; 제1일에, 정지된 PBMC를 활성화를 위해 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체로 코팅한 배양 백으로 이전시킬 수 있으며; 제2일에, 세포를 세척하고 SepaxTM 세포 분리 시스템을 사용하여 바이러스 형질도입(TCR을 발현하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입)에 적합한, 적절한 용적으로 배지를 감소시킬 수 있음을 보여준다. 세포 확장은 배양 용적의 유지 그리고 가스 교환의 매개와 세포 배양액에 신선한 배지와 시토카인의 공급을 위한 관류 기능을 갖춘 로킹 트레이 위의 XuriTM 배양 백에서 수행할 수 있다. 확장시키고 형질도입된 T 세포는 SepaxTM 세포 분리 시스템을 사용하여 수확 및 세척할 수 있다.
G-Rex/GatheRexTM 폐쇄 시스템(Wilson Wolf)
G-Rex/GatheRexTM 폐쇄 시스템은 세포 확장을 위한 가스교환 용기(G-Rex-CS) 그리고 작업자가 배양액에 존재하는 과도한 배지를 배수할 수 있으며 오염의 위험 없이 세포를 수집하는 자동화 펌프(GatheRex)로 구성된다. 수확 공정은 세포 농축 및 세포 수확의 두 단계로 나뉠 수 있다. 세포 농축 공정에서는, GatheRexTM 폐쇄 시스템이 공기 펌프를 통해 작동할 수 있으며, 이 펌프는 G-RexTM 장치, 예를 들어 플라스크를 무균 공기로 압축하여 세포 위에 거주하는 배지의 90%를 배지 수집 백 안으로 옮길 수 있다. 이 공정이 완료되면, 제1 광 검출기가 배지 수입 라인에서 공기의 존재를 감지하여 자동으로 펌프를 중지시킨다. 수확 공정의 시작 전에, 작업자는 G-RexTM 장치를 수동으로 흔들어서 가스 투과막으로부터 세포를 분리한 다음 배지의 잔여 10%를 사용하여 세포를 재현탁할 수 있다. 그 다음 공기 펌프가 재작동하며, 재현탁된 세포가 세포 수집 백 안으로 인입된다. 이 단계는 제2 광 검출기가 세포 수집 라인에서 공기를 검출하면 자동적으로 종료될 수 있다. 이 시스템은 약 15 내지 20 x 109개 세포를 생성할 수 있으며 용기당 5 L를 보유할 수 있다.
G-Rex/GatheRexTM 폐쇄 시스템은 용기에서 형질도입과 확장을 지원하고 펌프로 수확할 수 있다. 해동 정지 및 활성화 단계는 VueLifeTM 백에서 수행할 수 있다. GatheRexTM 폐쇄 시스템은 배양액 세척과 용적 감소 단계를 위해 다른 기술(예: SepaxTM 세포 분리 시스템)과 조합하여 사용할 수 있다. 무균 용접기(Terumo BCTTM)는 용액 이전용 무균 백 연결에, 가열 밀봉기는 튜브 밀봉에 사용할 수 있다.
도 28은, 제0일에 SepaxTM 분리 시스템으로 분리하여 동결시킨 PBMC를 해동, 세척, 정지(예: 하룻밤 동안(O/N))시킬 수 있으며; 제1일에, 배양 백을 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체로 코팅하고 정지된 PBMC를 활성화를 위해 코팅된 배양 백으로 이전할 수 있으며; 제2일에, 세포를 세척하고 SepaxTM 세포 분리 시스템을 사용하여 바이러스 형질도입(TCR을 발현하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입)에 적합한, 적절한 용적으로 배지를 감소시킬 수 있음을 보여준다. G-RexTM 폐쇄 시스템 장치에서는 세포 확장 및 공급을 수행할 수 있다. 그 다음 GatheRexTM 펌프를 사용하여 확장되고 형질도입된 T 세포를 수확하고, SepaxTM 세포 분리 시스템을 사용하여 세척할 수 있다.
표 5는 표 4에 나와 있는 즉 공정(220 및 240)에서 개방 시스템(예: G-RexTM)으로 획득된 T 세포와 폐쇄 시스템(예: CliniMACS ProdigyTM, WAVE(XURITM) Bioreactor와 BioSafe SepaxTM II의 조합) 그리고 G-Rex/GatheRexTM 폐쇄 시스템과 BioSafe SepaxTM II와의 조합으로 획득된 T 세포 사이의 비교를 보여준다.
[표 5]
Figure pct00012
이 결과는 본 개시의 T 세포 제조 공정을 폐쇄 시스템에서 쉽게 수행하여 개방 시스템에서 생성된 T 세포와 유사한 특성을 갖는 T 세포를 생성할 수 있으며 또한 외부 처리의 위험과 오염의 완화, 제품의 견고함과 품질의 촉진 그리고 제품 보안을 증가시켜 하류 처리와 최종 제품 분석 및 시험에 대한 문제점의 제거가 가능함을 보여준다.
폐쇄 시스템에서 제조된 조작 T 세포의 기능적 특성을 개방 시스템에서 제조된 경우와 더 비교하기 위해, 공여자 17로부터 얻은 PBMC를 처리하여 본 개시의 공정에 따라 확장되고 형질도입된 T 세포를 생성했다. 그 다음으로 TCR을 발현하는 확장되고 형질도입된 T 세포를 TCR 특이적 펩티드/MHC 복합체(표적)의 존재 또는 부재 하에서 IFN-γ 방출에 대해 측정했다.
도 29는 폐쇄 시스템에서 제조한 조작된 T 세포가 2회의 실행(실행 #1 및 실행 #2)에서 측정한 결과 개방 시스템(예: 공정 220)에서 제조한 경우에 비해 표적의 존재 하에서 훨씬 더 많은 IFN-γ를 방출했음을 보여준다. 이 결과는 폐쇄 시스템에서 제조한 조작된 T 세포가 개방 시스템에서 제조한 경우보다 더 큰 세포 독성 활성도를 나타낼 수 있음을 시사한다.
실시예 6
약 5 내지 6일내 TCR 조작된 T 세포의 GMP 제조
동종의 조작된 T 세포 접근방식에 의한 입양 세포 요법은 안전하고 효과적인 표적과 그 동족 TCR의 번역 개발 노력을 활용한다. 이 TCR은 고형 종양의 면역 요법을 위해 환자 자신의 (자가) T 세포 안으로 유전적으로 조작된다.
도 30은 3개의 T 세포 제제(T 세포 제제 #1, T 세포 제제 #2 및 T 세포 제제 #3)의 제조 요약을 보여주며, 각각 자체의 HLA-A*02:01 제약된 표적 항원에 대해 형질도입 유전 TCR을 발현한다. T 세포 제제 #1 및 T 세포 제제 #2는 약 8 내지 11일 및 약 7 내지 10일 후에 각각 제조되었으며, 동결된 PBMC의 해동, 해동된 PBMC의 정지 그리고 정지된 PBMC의 활성화(단계 2) 그리고 활성화된 T 세포의 형질도입(단계 3)을 거쳐 최초 임상시험 제1상 주도 IND를 위해 개방 시스템을 사용하여 "완제의약품 세포의 수확 및 저온보존"(단계 6)을 수행했다.
T 세포 제제 #3은 확장 단계를 약 5 내지 8일에서(T 세포 생싱물 #1 및 #2) 약 3 내지 4일로 단축하여 제조할 수 있다. 그 밖에, T 세포 제제 #3은 신선한 PBMC, 즉, 제0일에 PBMC의 저온보존 및 그에 따른 해동 없이 활성화시켜 제조할 수 있다. 이것은 제0일에 저온보존된 PBMC의 해동 및 그 이후 제1일의 해동된 PBMC의 활성화에 의한 T 세포 제제 #1의 제조 그리고 제0일에 저온보존된 PBMC의 해동과 해동된 PBMC의 활성화에 의한 T 세포 제제 #2의 제조와 대조된다.
공개 시스템을 사용하여 제조하는 T 세포 제제 #1 및 #2와 대조하며, T 세포 제제 #3은 완전 폐쇄 시스템이나 반폐쇄 시스템을 사용하여 제조할 수 있으며 여기서 일부 단계(예: T 세포 활성화부터 형질도입을 위한 용적 감소까지) 및/또는 수확부터 세척, 농축 및 저온보존까지)는 개방 시스템을 사용하여 수행할 수 있다.
도 31은 백혈구 성분 채집부터 주입 준비 완료 TCR T 세포 제품 #1까지의 소요 시간이 약 30일 걸릴 수 있으며(예를 들어 샘플 채집부터 수확까지 약 14일 그리고 품질 관리(QC)부터 제품 출시까지의 약 16일); TCR T 세포 제제 #2의 제조 소요 시간이 약 26일 걸릴 수 있음(예를 들어 샘플 채집부터 수확까지의 약 10일 및 QC부터 제품 출시까지 약 16일임)을 보여준다.
하지만 신속한 처리 시간에 대한 요구가 있다. 도 30은 T 세포 제제 #3을 더 짧은 제조 공정(예를 들어 5 내지 6일)을 사용하여 제조했으며, "최적의 해동, 정지 및 활성화"(단계 2)에서 "완제의약품 세포의 수확 및 저온 보존"(단계 6)까지 반폐쇄 시스템을 사용했음을 보여준다. 도 31은 TCR T 세포 제제 #3의 제조에 약 23일이 걸릴 수 있음(예를 들어 샘플 수집부터 수확까지 약 7일 및 QC부터 제품 출시까지 약 16일)을 보여준다. 상업용 제조의 경우, 예를 들어 TCR T 세포 제제, 즉, T 세포 제제 #1, T 세포 제제 #2 및 T 세포 제제 #3은 제조에 약 13일이 걸릴 수 있다(예를 들어 샘플 수집부터 수확까지 약 6일 및 QC부터 제제 출시까지 약 7일).
도 32는 신선한 PBMC를 사용하는 T 세포 제조 공정(320)을 보여주며, 이것은 저온보존된 PBMC를 해동하여 얻는 것이 아니므로 PBMC의 동결, 해동 및/또는 정지에 의한 세포 손실을 최소화하고 제조 공정의 시작 시 세포 수를 최대화한다. 예를 들어, T 세포 제조 공정(320)에는 제0일에 신선한 PBMC의 분리(321), 그리고 예를 들어 항-CD3 및 항-CD28 항체(가용성이나 표면 결합된, 예를 들어 자기 또는 생물분해성 비드)를 사용하여 백(예를 들어 Saint-Gobain VueLife AC 백, 항CD3 및 항28로 코팅됨)에서 활성화(322); 제1일에, 예를 들어 CAR이나 TCR로 형질도입(323), 그리고 제2일에, 림프구의 확장, 제5/6일에 수확 그리고 시토카인, 혈청(ABS 또는 FBS) 및/또는 저온보존 배지의 존재 하에 저온보존(324)이 포함될 수 있다.
보다 짧은 확장에 의한 개선된 제품 프로파일
T 세포 면역성의 질, 효능, 수명 및 위치는 미경험 T 세포(Tn)를 보호 면역성에서 특정 역할을 갖는 다양한 표현형으로 뚜렷한 하위조합 안으로의 다양화로부터 유래할 수 있다. 여기에는 기억 줄기(Tscm), 중앙 기억(Tcm), 효과기 기억(Tem) 및 고도로 분화된 효과기(Teff) T 세포가 포함된다. 항원 특이적 Tn은 자가재생하며 보다 수명이 짧은 Tem 및 Teff 세포의 증식하는 군집을 제공하는 수명이 긴 Tscm 및 Tcm을 발생시킨다. 그러므로 유전적 변형을 위해 분화가 덜한 Tn, Tscm 또는 Tcm 하위조합을 선택하면 치료 효능이 더 큰 세포를 제공할 수 있다.
제조 중 다른 시간에 수확된 T 세포 제제의 분화 상태를 평가하기 위해, 3명의 공여자(공여자 1, 공여자 2 및 공여자 3)로부터 얻은 CD8+ T 세포를 제조의 제4일(3일 동안 확장), 제7일(6일 동안 확장) 및 제10일(9일 동안 확장)에 수확한 다음 T 세포 기억 표현형 분석을 실행했다.
도 33은 분화가 적은 표현형을 나타내는 CD8+ T 세포(예: Tn/scm -CD45RA+CCR7+ 및 Tcm-CD45RO+CCR7+)의 양이 확장 시간에 의존하는 방식으로 감소함을 보여준다(즉, 제4일 > 제7일 > 제10일). 반대로, 더 많이 분화된 표현형을 나타내는 CD8+ T 세포(예: Tem-CD45RO+CCR7- 및 Teff-CD45RA+CCR7-)의 양은 확장 시간에 의존하는 방식으로 증가하며(즉, 제4일 < 제7일 < 제10일), 이것은 제4일의 확장된 세포에서 더 적게 분화된 표현형이 제7일 및 제10일의 확장된 세포보다 더 많음을 나타낸다. 이 결과는 T 세포의 확장이 짧을수록 더 많은 T 세포가 덜 분화된 기억 표현형을 나타내며, 따라서 치료 효능이 더 큼을 시사한다.
일차 CD8+ T 세포 반응 동안 CD27 및 CD28 공동자극이 요구될 수 있다. 이 공동자극은 미경험 CD8+ T 세포에 대한 증식 및 생존 신호를 제공할 수 있다. 제조의 다른 시간에 수확한 T 세포 제제의 TD27 및 CD28 공동자극 가능성을 평가하기 위해, 3명의 공여자(공여자 1, 공여자 2 및 공여자 3)로부터 얻은 CD8+ T 세포를 제조의 제4일, 제7일 및 제10일에 수확한 다음 CD27 및 CD28 발현 분석을 실행했다.
도 34는 CD27+CD28+ 공동자극 표현형을 나타내는 CD8+ T 세포의 양이 확장 시간에 의존하는 방식으로 감소함을 보여주며(즉, 제4일 > 제7일 > 제10일), 이는 제4일의 확장된 세포의 CD27 및 CD28 공동자극이 제7일 및 제10일의 확장된 세포의 경우보다 우수함을 나타낸다. 이 결과는 일반적으로 T 세포의 확장 시간이 짧을수록 T 세포가 CD27 및 CD28을 더 많음을 시사한다.
다른 제조 시간에 수확된 T 세포 제제의 복제 가능성을 평가하기 위해, T 세포를 제조의 제4일, 제7일 및 제10일에 수확한 다음 시토카인 민감도 분석에서 관련있는 시토카인(예: IL-7, IL-15 또는 IL-2)의 반응에 대한 성장을 모니터링했다.
도 35는 IL-7, IL-15 또는 IL-2에 의해 약 21일 동안 유도된 T 세포 성장이 확장 시간에 의존하는 방식으로 감소함을 보여주며(즉, 제4일 > 제7일 > 제10일), 이는 제4일의 확장된 세포의 복제 가능성이 제7일 및 제10일의 확장된 세포의 경우보다 우수함을 나타낸다. 이 결과는 T 세포의 확장 시간이 짧을수록 더 많은 T 세포가 증식에 필요한 시토카인에 반응함을 시사한다.
제조의 다른 시간에 수확한 T 세포 제제의 항종양 활성도를 평가하기 위해, 4명의 공여자(공여자 1, 공여자 2, 공여자 3 및 공여자 4)로부터 획득된 T 세포 제제 제조의 제5일, 제7일 및 제9일에 수확한 다음 표적 양성 세포주에 대한 노출에 반응하는 인터페론감마(IFN-γ) 방출의 분석을 실행했다.
도 36은 IFN-γ 분비가 확장 시간에 의존하는 방식으로 감소함을 보여주며(즉, 제5일 > 제7일 > 제9일), 이는 일반적으로 제5일의 확장된 세포의 항종양 활성도가 제7일 및 제9일의 확장된 세포의 경우보다 우수함을 나타낸다. 이 결과는 일반적으로 T 세포 확장 시간이 짧을수록 더 많은 T 세포가 IFN-γ를 분비함을 시사한다.
제조의 다른 시간에 수확한 T 세포 제제의 세포독성 활성도를 더욱 평가하기 위해, 농도가 감소하는 동족 펩티드로 펄스된 T2 세포에 대한 IFN-γ 반응에 기반하는 EC50을 결정했다.
도 37은 EC50이 확장 시간에 의존하는 방식으로 증가함을 보여주며(즉, 제5일 > 제7일 > 제9일), 이는 제5일의 확장된 세포의 펩티드 특이적 세포독성 활성도가 제7일 및 제9일의 확장된 세포의 경우보다 우수함을 나타낸다.
T 세포 제제 #3의 GMP 제조
최종 T 세포 제제 #3 공정으로 제조된 제품의 특성화
도 38은 확장 측정치를 보여준다. 2회의 기술 이전(TT) 제조 실행과 2회의 공정 검증(PQ) 제조 실행에서(n=4), 짧은 확장(예: 약 6일) 이후 >90% 생존력을 갖는 평균 1.3 x 1010개 세포를 수확했다.
도 39는 TCR 특이적 HLA 덱스트라머를 사용하는 유세포 분석에 의해 검출되는 T 세포 제제 #3 TCR의 표면 발현을 보여준다. 건강한 공여자들의 백혈구 성분 채집 산물을 사용하여 수행한 기술 이전(TT) 및 공정 검증(PQ) 제조 실행(n =4)에 기반하는 대표적 FACS 플롯 및 합쳐진 데이터(평균 ± SD)를 보여준다.
도 40은 최종 T 세포 제제 #3의 T 세포 기억 표현형을 보여주며, 여기서 기술 이전(TT1, TT2) 및 공정 검증(PQ1, PQ2) 제조 실행에 의해 생성된 T 세포가 제조(n=4)에 사용된 PBMC에서 T 세포 군집의 고도의 가변 기억 표현형을 나타내는 공여자들에서 덜 분화된 표현형을 보존한다(각각 Tn/scm-17.9%, 19.2%, 11.2%, 35.0% Tcm-23.4%, 15.7%, 0.9%, 2.4% Tem- 34.8%, 27.0%, 25.9%, 43% Teff-23.8%, 38.2%, 62.0%, 16.1%).
도 41은 표적 양성(LVR11KEA) 및 음성(NT) 세포주에 대한 노출에 반응하는 IFN-γ 방출을 보여준다. 기술 이전(TT) 및 공정 검증(PQ) 제조 실행에 의해 생성된 T 세포의 표적 양성 세포에 대한 특이적 세포독성 활성도(즉, IFN-γ 방출)를 보여준다. 음성 대조군 세포에 대해서는 어떠한 IFN-γ 방출도 검출되지 않았다.
도 42는 감소하는 농도의 동족 펩티드로 펄스한 표적 세포에 대한 IFN-γ 반응을 기반으로 하는 EC50 결정을 보여준다. 그 결과는 공정 검증(PQ1) 제조 실행에 의해 생성된 T 세포가 분석에서의 양성 대조군에 의해 생성되는 항종양 활성도(EC50 = 0.3149)와 유사한 항종양 활성도(EC50 = 0.7037)를 나타냄을 보여준다.
도 43은 Incucyte® 사멸 분석에서 T 세포 제제 #3의 세포독성 가능성에 대한 대표적 도면을 보여준다. 감소하는 농도의 관련 있는 펩티드로 펄스된 표적 음성 세포주와 72시간의 공동배양 기간에 걸쳐 T 세포 제제 #3의 존재 하에서 배수 종양 성장의 데이터가 제시되어 있다. 그 결과는 공정 검증(PQ1) 제조 실행에 의해 생성된 T 세포에 의한 펩티드 용량에 의존하는 표적 세포의 사멸을 보여준다.
요약하면, 더 짧은 생체 외 확장 및 전체 "소요 시간"이 세포 제제의 질 그리고 세포 면역요법의 임상적 적응성에도 상당한 영향을 미칠 수 있다. TCR 조작된 T 세포의 GMP 제조 동안 확장 단계를 단축시키는 공정 개발 노력이 T 세포 제제 #3을 위한 견고한 5 내지 6일 기간의 반폐쇄 T 세포 제조 공정으로 완료되었다. GMP 환경 클린룸에서 T 세포 제제 #3 제조를 위한 기술 이전(TT) 및 공정 검증(PQ) 실행으로부터 확장 기간이 단축된 제조 공정의 재현성과 가능성이 확인되었다. TCR 조작된 T 세포의 모든 방출, 표현형 및 기능성 시험이 GMP 제조에 의한 T 세포 제제에 대해 확인되었다.
실시예 7
암 환자로부터 생성된 T 세포 제제의 제조 및 기능성
위에서 지적한 바와 같이, 건강한 공여자로부터 생성된 T 세포 제제 #3은 T 세포 기억 표현형과 세포독성 가능성을 보여준다. 아래에 나와 있는 바와 같이, 암 환자로부터 생성된 T 세포 제품 #3을 건강한 공여자들로부터 생성된 T 세포 제제 #3과 비교할 때 유사한 특성이 관찰되었다.
Figure pct00013
T 세포 제제 #3은 암 환자와 건강한 공여자로부터 얻은 PBMC를 사용하여 소규모로 제조했다. 간략히 말하면, 제0일에, 4명의 암 환자와 4명의 건강한 공여자의 백혈구 성분 채집 산물로부터 분리하여 저온보존한 PBMC를 해동하여 IL-7의 존재 하에서 약 4 내지 6시간 동안 정지시킨 다음 NTC 24웰 플레이트에서 활성화 및 약 16 내지 24시간의 배양을 실행했다. 제1일에, 세포를 재조합 TCR을 발현하는 바이러스 벡터(예: R11KEA TCR)를 5 μL/106개 세포의 비율로 형질도입했다. 형질도입되지 않은(NT) 세포를 대조군으로 포함시켰다. 형질도입된 세포 및 형질도입되지 않은 세포를 최소 1.0 x 106개 세포/mL(예: 2.0 x 106개 세포/mL)의 비율로 파종했다. 제2일에, 형질도입된 세포 및 형질도입되지 않은 세포를 IL-7 및 IL-15와 TexMACS 완전 배지에서 확장했다. 제6일에, 즉, 4일의 확장 후, 확장된 세포를 수확한 다음 유세포 분석 및 기능적 분석을 실행하여 예를 들어 회수, 생존력, 표현형, 통합 DNA 복제 수 및 기능성을 결정했다.
도 44는 해동 후, 정지시키고 활성화 후에 암 환자(Pt) 및 건강한 공여자(HD)로부터 획득된 T 세포의 회수가 유사함을 보여준다.
도 45는 모든 세포가 형질도입된 PT1 및 PT4를 제외한 모든 개인에 있어서, 제6일에(즉, 4일의 확장) 형질도입된 세포 및 형질도입되지 않은 세포에서 T 세포 제제 #3의 총 생존 세포 및 % 생존력이 유사함을 보여준다.
도 46은 모든 세포가 형질도입된 PT1 및 PT4를 제외한 모든 개인에 있어서, 제6일에(즉, 4일의 확장) 형질도입된 세포 및 형질도입되지 않은 세포에서 T 세포 제제 #3의 배수 확장이 유사함을 보여준다.
표현형 분석
도 47은 암 환자(PT1 내지 PT4)와 건강한 공여자(D1 내지 D4)로부터 얻은 PBMC에서 CD3+CD4+ 세포의 우선적 확장에 비교한 CD3+CD8+ 세포(화살표로 표시)의 우선적 확장을 보여준다.
도 48은 환자(PT1 내지 PT4)와 건강한 공여자(D1 내지 D4)로부터 획득된 T 세포 제제 #3과 비형질도입된 세포(NT)에서 CD3+CD8+ 세포와 CD3+CD4+ 세포의 전체 평균이 유사함을 보여준다.
도 49는 T 세포 제제 #3의 유세포 분석의 한 예를 보여준다. 이 결과는 T 세포 제제 #3의 43.8%가 CD3+CD8+ 세포를 포함하며, 여기서 펩티드/MHC 덱스트라머(Dex) 염색이 나타내는 바와 같이 세포의 64.7%는 R11KEA TCR을 발현하며 세포의 35.3%는 R11KEA TCR을 발현하지 않는다.
도 50은 암 환자(PT1 내지 PT4)와 건강한 공여자(D1 내지 D4)로부터 생성된 CD8+ T 세포 제제 #3에서 유사한 R11KEA TCR 발현을 보여준다.
도 51은 또한 암 환자(PT1 내지 PT4)(예: 64.3%) 및 건강한 공여자(D1 내지 D4)(예: 68.2%)로부터 생성된 CD8+ T 세포 제제 #3에서 유사한 평균 R11KEA TCR 발현을 보여준다.
도 52는 T 세포 제제 #3의 T 세포 기억(T기억) 표현형을 결정하는 게이팅 방식을 보여준다. 예를 들어, CD45RA 및 CCR7의 게이팅에 의해, 미경험의 "어린" T 세포(CD45RA+CCR7+), 말단 분화된 "늙은" T 세포(TemRA)(CD45RA+CCR7-), 효과기 기억 T 세포(Tem)(CD45RA-CCR7-) 그리고 중앙 기억 T 세포(Tcm)(CD45RA-CCR7+)의 식별이 가능하다.
도 53은 환자(PT1 내지 PT4) 및 건강한 공여자(D1 내지 D4) 모두로부터 생성된 T 세포 제제 #3의 바람직한 미경험 및 Tcm 구획에 대한 뚜렷한 평균의 증가를 보여준다. 이 결과는 형질도입된 세포가 주입 후 지속되는 더 큰 능력을 소유하며 더 오래 지속되는 생체 내 반응을 생성할 수 있음을 시사한다.
기능적 분석
T 세포 제제 #3의 기능성을 결정하기 위해, R11KEA TCR에 특이적으로 결합하는 관련있는 펩티드(예: 1 μg/mL) 또는 R11KEA TCR에 결합하지 않는 무관한 펩티드(예: 1 μg/mL)를 대조군으로 사용하여 세포를 자극할 수 있다. 모든 림프구를 활성화하는 PMA 및 이오노마이신에 의한 자극은 양성 대조군의 역할을 하며 비자극은 음성 대조군의 역할을 한다. 2시간의 자극 후, 단백질 수송체 억제제를 첨가했다. 자극 후 6시간에, CD3+CD8+ 세포 내에서 시토카인 및 신호전달 분자(예: CD107a, IFN-γ, TNF-α, IL-2 및 대식세포 염증성 단백질-1-베타(MIP-1β))의 발현을 세포내 염색(ICS)에 의해 평가했다.
도 54는 T 세포 제제 #3의 한 예에서, 관련있는 펩티드(d)로 자극한 후 T 세포 제제 #3에서 CD107a, IFN-γ, TNF-α, IL-2 및 MIP-1β의 발현 수준이 관련 없는 펩티드(c)로 자극한 후의 수준과 비교해 증가하는 것을 보여준다. 모든 림프구를 활성화하는 PMA 및 이오노마이신에 의한 자극은 양성 대조군의 역할을 하며(b), 비자극은 음성 대조군의 역할을 한다(a).
도 55는 T 세포 제제 #3의 다기능성을 보여준다. 숫자 0, 1, 2, 3, 4 및 5는 각각 T 세포 제제 #3의 일부가 CD107a, IFN-γ, TNF-α, IL-2 및 MIP-1β 가운데 0개, 1개, 2개, 3개, 4개 및 5개 모두를 발현함을 나타낸다. 예를 들어, 관련있는 펩티드로 자극한 다음, R11KEA TCR(R11)로 형질도입된 건강한 공여자(D3)로부터 획득된 T 세포 제제 #3의 50%를 초과하는 양이 관련 없는 펩티드로 자극한 후와 비교할 때(즉, 세포의 0%가 적어도 2개의 시토카인을 발현), CD107a, IFN-γ, TNF-α, IL-2 및 MIP-1β로부터 적어도 2개의 시토카인을 발현하다. 대조적으로, 형질도입되지 않은(NT) 세포에서는 관련 있는 펩티드와 관련 없는 펩티드의 자극 사이에 시토카인 발현에 대한 유의한 차이가 없다. 이 결과는 R11KEA TCR로 형질도입된 건강한 공여자들로부터 T 세포 제제 #3이 다기능성임을 보여준다. 양성 대조군, 즉, PMA/이오노마이신으로 자극한 T 세포가 TCR 형질도입의 유무에 관계 없이 다기능성을 나타낸다. 음성 대조군, 즉, 자극 없는 T 세포가 TCR의 형질도입과 관계없이 불량한 다기능성을 나타낸다.
도 56은 건강한 공여자(예: D3 및 D2) 그리고 암 환자(예: PT1, PT2 및 PT3)로부터 생성된 R11KEA TCR+(CD8+Vb8+) T 세포 제제 #3이 관련 있는 펩티드로 자극한 후 다기능성이 있음을 보여준다. D1, D4 및 PT4로부터 생성된 T 세포는 이러한 기능적 분석에 의해 결정되는 다기능성으로 나타나지 않을 수 있다. 하지만 다음에 나와 있는 바와 같이, D1, D4 및 PT4로부터 생성된 T 세포는 여전히 표적 세포에 대해 세포독성 활성도를 갖는다.
도 57은 암 환자(예: PT1 내지 PT4)로부터 생성된 T 세포 제제 #3에서, 그 세포를 E:T 비율의존 방식으로(예: 10:1 > 3.3:1 > 1:1) 세포 표면에 제시된 약 1,000 카피/세포의 관련 있는 펩티드를 갖는 농도 표적 세포주와 접촉시켰을 때 IFN-γ 방출을 보여준다. 도 56에서 다기능성으로 나타나지 않을 수 있는 PT4로부터 생성된 T 세포 또한 E:T 비율의존 방식의 IFN-γ 방출을 보여준다.
도 58은 건강한 공여자(예: D1 내지 D4)로부터 생성된 T 세포 제제 #3에서, 그 세포를 E:T 비율의존 방식으로(예: 10:1 > 3.3:1 > 1:1) 세포 표면에 제시된 약 1,000 카피/세포의 관련 있는 펩티드를 갖는 농도 표적 세포주와 접촉시켰을 때 IFN-γ 방출을 보여준다. 도 56에서 다기능성으로 나타나지 않을 수 있는 D1 및 D4로부터 생성된 T 세포 또한 E:T 비율의존 방식의 IFN-γ 방출을 보여준다.
도 59는 건강한 공여자(D1 내지 D4)로부터 생성된 T 세포 제제 #3에서, 그 세포를 다른 수준의 세포 표면에 제시된 관련 있는 펩티드, 예를 들어 세포 표면에 약 1,000 카피/세포의 관련있는 펩티드가 제시되는 고표적 세포주, 세포 표면에 약 50 카피/세포의 관련 있는 펩티드가 제시되는 저표적 세포주 및 세포 표면에 관련있는 펩티드가 제시되어 있는 무표적 세포주로 접촉시켰을 때, 평균 IFN-γ가 펩티드 제시 수준에 의존하는 방식으로(즉, 고표적 > 저표적 > 무표적) 방출되는 것을 보여준다.
도 60은 유사하게, 암 환자(PT1 내지 PT4)로부터 생성된 T 세포 제제 #3에서, 그 세포를 고표적 세포주, 저표적 세포주 및 무표적 세포주와 접촉시켰을 때, 평균 IFN-γ가 펩티드 제시 수준에 의존하는 방식으로(즉, 고표적 > 저표적 > 무표적) 방출되는 것을 보여준다.
도 61은 건강한 공여자(예: D3)로부터 생성된 T 세포 제제 #3을 관련있는 펩티드가 세포 표면에 제시되지 않는 표적 음성 세포주와 접촉시킬 때 살해 활성도의 결여를 보여준다. 간략히 말해서, R11KEA TCR(R11)로 형질도입하거나 형질도입하지 않은(NT), D3으로부터 생성된 T 세포를 표적 음성 세포주와 10:1, 3.3:1 및 1:1의 E:T 비율로 공동자극했다. 세포 살해 활성도를 IncuCyte 살해 분석을 사용하여 측정했다. 이 결과는 TCR 형질도입(R11)한 T 세포 그리고 형질도입하지 않은(NT) T 세포 사이에 표적 음성 세포주에 따른 유의한 세포 살해 차이가 없음을 보여준다.
대조적으로, 도 62는 건강한 공여자(예: D3)로부터 생성된 T 세포 제제 #3을 관련있는 펩티드가 세포 표면에 제시되는 표적 양성 세포주와 접촉시킬 때 TCR 특이적 살해 활성도를 보여준다. 즉, R11KEA TCR 발현 T 세포는 E:T 비율에 의존하는 방식으로(예: 10:1 > 3.3:1 > 1:1) 표적 양성 세포를 살해한다. 대조적으로, 다른 E:T 비율에서 형질도입하지 않은(NT) T 세포 사이에는 유의한 세포 살해의 차이가 없다.
도 63a 내지 도 63c는 건강한 공여자(예: D3 및 D4) 그리고 암 환자(예: PT1 및 PT2)로부터 생성되고 R11KEA TCR(R11)로 형질도입된 T 세포 제제 #3을 관련있는 펩티드가 세포 표면에 제시되는 표적 양성 세포주와 접촉시킬 때 TCR 특이적 살해 활성도를 보여준다. D3, D4, PT1 및 PT2로부터 생성된 R11KEA TCR(R11)을 발현하는 T 세포는 E:T 비율에 의존하는 방식으로(예: 10:1(도 63a) > 3.3:1(도 63b) > 1:1(도 63c)) 표적 양성 세포를 살해한다. 대조적으로, 다른 E:T 비율에서 R11KEA TCR 형질도입하지 않은(NT) T 세포 사이에는 유의한 세포 살해의 차이가 없다.
요약하면, 이 결과는 T 세포 제제 #3 공정에서 표적 특이성을 갖는 TCR 형질도입 유전자를 발현하는 T 세포 제제를 생성할 수 있음을 보여준다. 이 공정은 건강한 공여자들로부터 얻은 출발 물질에서와 마찬가지로 암 환자들로부터 얻은 출발 물질에도 적용된다. T 세포 제제 #3 공정은 T 세포 제제 # 1 및 #2의 제조 시간보다 더 짧은 시간이 걸리면서도 많은 수의 미경험 및 Tcm 세포를 가진 제품을 생성한다. T 세포 제제 #3은 다기능성이며 표적 양성 종양 세포주에 반응하여 IFN-γ를 분비할 수 있다. T 세포 제제 #3은 또 세포주 살해 분석에서 양호한 효과기 기능을 나타낼 수 있다.
본 개시의 이점에는 조작된 TCR T 세포 제제의 임상적 제조에 있어서 정지 시간을, 예를 들어 4 내지 6시간으로, 활성화 시간을, 예를 들어 16 내지 20시간으로, 형질도입 시간을, 예를 들어 24시간으로, 그리고 확장 단계를, 예를 들어 5 내지 7일로 단축시킬 수 있는 자가 T 세포 제조 공정이 포함될 수 있다. 각 단계에 영향을 주는 중대한 매개변수를 조직적으로 평가하고 최적화하여, 표적을 발현하는 종양 세포를 인식하여 살해하는 강력한 능력을 가진 100억 여개의 젊은 종양 반응성 T 세포를 생성할 수 있다. T 세포 제제의 품질 개선 외에도, 이러한 최적화는 또한 제조 원가를 30% 감소시킬 수 있다. 더욱이 본 개시의 자가 T 세포 제조 공정은 T 세포의 활성화를 위해 플라스크 결합 및/또는 백 결합 항-CD3 및 항-CD28 항체를 사용하며 규모를 확대하여, 유사한 수준의 활성화, 형질도입성 및 확장을 제공할 수 있으며, 이러한 규모 확대 공정은 플레이트 결합 항체를 사용하는 공정보다 더 빠를 수 있다.
본 명세서에 인용된 모든 참조문헌은 각 참조문헌이 참조에 의해 구체적으로 그리고 개별적으로 표시되어 혼입되는 것과 같이 참조로 본원에 혼입된다. 모든 참조문헌의 인용은 출원일 이전의 개시를 위한 것이며, 본 개시가 이전 발명의 이점에 의해 그러한 참조문헌을 선행할 자격이 없음을 시인하는 것으로 해석해서는 안 된다.
위에 기술된 요소들 각각 또는 2개 이상이 합쳐져 위에 기술된 유형과 차이가 있는 다른 유형의 방법에서 유용한 용도를 찾을 수도 있다. 더 이상의 분석 없이, 위의 내용은 본 개시의 요지를 완전히 나타내어, 당업자는 현재의 지식을 응용하여, 선행 기술의 관점으로부터, 첨부된 특허청구범위에 명시된 본 개시의 일반적이거나 구체적인 양태의 필수적 특성을 공정하게 구성하는 특징의 생략 없이 다양한 적용에 그 지식을 용이하게 맞출 수 있다. 상기의 구현예들은 단지 예로서 제시되고, 본 개시의 범위는 하기 특허청구범위에 의해서만 제한되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> IMMATICS US, INC. <120> METHODS FOR MANUFACTURING T CELLS <130> 3000011-006977 <140> PCT/US2019/017237 <141> 2019-02-08 <150> US 62/628,521 <151> 2018-02-09 <150> DE 10 2018 102 971.3 <151> 2018-02-09 <150> US 62/633,113 <151> 2018-02-21 <150> DE 10 2018 104 628.6 <151> 2018-02-28 <150> US 62/647,571 <151> 2018-03-23 <150> DE 10 2018 108 996.1 <151> 2018-04-16 <150> US 62/726,350 <151> 2018-09-03 <160> 157 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Tyr Leu Tyr Asp Ser Glu Thr Lys Asn Ala 1 5 10 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 His Leu Met Asp Gln Pro Leu Ser Val 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gly Leu Leu Lys Lys Ile Asn Ser Val 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Phe Leu Val Asp Gly Ser Ser Ala Leu 1 5 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Phe Leu Phe Asp Gly Ser Ala Asn Leu Val 1 5 10 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Phe Leu Tyr Lys Ile Ile Asp Glu Leu 1 5 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Phe Ile Leu Asp Ser Ala Glu Thr Thr Thr Leu 1 5 10 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ser Val Asp Val Ser Pro Pro Lys Val 1 5 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Val Ala Asp Lys Ile His Ser Val 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Ile Val Asp Asp Leu Thr Ile Asn Leu 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Gly Leu Leu Glu Glu Leu Val Thr Val 1 5 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Thr Leu Asp Gly Ala Ala Val Asn Gln Val 1 5 10 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Ser Val Leu Glu Lys Glu Ile Tyr Ser Ile 1 5 10 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Leu Leu Asp Pro Lys Thr Ile Phe Leu 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Tyr Thr Phe Ser Gly Asp Val Gln Leu 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Tyr Leu Met Asp Asp Phe Ser Ser Leu 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Lys Val Trp Ser Asp Val Thr Pro Leu 1 5 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Leu Leu Trp Gly His Pro Arg Val Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Lys Ile Trp Glu Glu Leu Ser Val Leu Glu Val 1 5 10 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Leu Leu Ile Pro Phe Thr Ile Phe Met 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Phe Leu Ile Glu Asn Leu Leu Ala Ala 1 5 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Leu Leu Trp Gly His Pro Arg Val Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Phe Leu Leu Glu Arg Glu Gln Leu Leu 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Ser Leu Ala Glu Thr Ile Phe Ile Val 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Thr Leu Leu Glu Gly Ile Ser Arg Ala 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Ile Leu Gln Asp Gly Gln Phe Leu Val 1 5 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Val Ile Phe Glu Gly Glu Pro Met Tyr Leu 1 5 10 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Ser Leu Phe Glu Ser Leu Glu Tyr Leu 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Ser Leu Leu Asn Gln Pro Lys Ala Val 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Gly Leu Ala Glu Phe Gln Glu Asn Val 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Lys Leu Leu Ala Val Ile His Glu Leu 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Thr Leu His Asp Gln Val His Leu Leu 1 5 <210> 33 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Thr Leu Tyr Asn Pro Glu Arg Thr Ile Thr Val 1 5 10 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Lys Leu Gln Glu Lys Ile Gln Glu Leu 1 5 <210> 35 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Ser Val Leu Glu Lys Glu Ile Tyr Ser Ile 1 5 10 <210> 36 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Arg Val Ile Asp Asp Ser Leu Val Val Gly Val 1 5 10 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Val Leu Phe Gly Glu Leu Pro Ala Leu 1 5 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Gly Leu Val Asp Ile Met Val His Leu 1 5 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Phe Leu Asn Ala Ile Glu Thr Ala Leu 1 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Ala Leu Leu Gln Ala Leu Met Glu Leu 1 5 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Ala Leu Ser Ser Ser Gln Ala Glu Val 1 5 <210> 42 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Ser Leu Ile Thr Gly Gln Asp Leu Leu Ser Val 1 5 10 <210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Gln Leu Ile Glu Lys Asn Trp Leu Leu 1 5 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Leu Leu Asp Pro Lys Thr Ile Phe Leu 1 5 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Arg Leu His Asp Glu Asn Ile Leu Leu 1 5 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Tyr Thr Phe Ser Gly Asp Val Gln Leu 1 5 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Gly Leu Pro Ser Ala Thr Thr Thr Val 1 5 <210> 48 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Gly Leu Leu Pro Ser Ala Glu Ser Ile Lys Leu 1 5 10 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Lys Thr Ala Ser Ile Asn Gln Asn Val 1 5 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu 1 5 <210> 51 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Tyr Leu Met Asp Asp Phe Ser Ser Leu 1 5 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Leu Met Tyr Pro Tyr Ile Tyr His Val 1 5 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Lys Val Trp Ser Asp Val Thr Pro Leu 1 5 <210> 54 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Leu Leu Trp Gly His Pro Arg Val Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Val Leu Asp Gly Lys Val Ala Val Val 1 5 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Gly Leu Leu Gly Lys Val Thr Ser Val 1 5 <210> 57 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Lys Met Ile Ser Ala Ile Pro Thr Leu 1 5 <210> 58 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Gly Leu Leu Glu Thr Thr Gly Leu Leu Ala Thr 1 5 10 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Thr Leu Asn Thr Leu Asp Ile Asn Leu 1 5 <210> 60 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Val Ile Ile Lys Gly Leu Glu Glu Ile 1 5 <210> 61 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Tyr Leu Glu Asp Gly Phe Ala Tyr Val 1 5 <210> 62 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Lys Ile Trp Glu Glu Leu Ser Val Leu Glu Val 1 5 10 <210> 63 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Leu Leu Ile Pro Phe Thr Ile Phe Met 1 5 <210> 64 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Ile Ser Leu Asp Glu Val Ala Val Ser Leu 1 5 10 <210> 65 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ala Thr Val 1 5 10 <210> 66 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Lys Leu Ile Gly Asn Ile His Gly Asn Glu Val 1 5 10 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Ile Leu Leu Ser Val Leu His Gln Leu 1 5 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Leu Asp Ser Glu Ala Leu Leu Thr Leu 1 5 <210> 69 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Val Leu Gln Glu Asn Ser Ser Asp Tyr Gln Ser Asn Leu 1 5 10 <210> 70 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 His Leu Leu Gly Glu Gly Ala Phe Ala Gln Val 1 5 10 <210> 71 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Ser Leu Val Glu Asn Ile His Val Leu 1 5 <210> 72 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Tyr Thr Phe Ser Gly Asp Val Gln Leu 1 5 <210> 73 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Ser Leu Ser Glu Lys Ser Pro Glu Val 1 5 <210> 74 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Ala Met Phe Pro Asp Thr Ile Pro Arg Val 1 5 10 <210> 75 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Phe Leu Ile Glu Asn Leu Leu Ala Ala 1 5 <210> 76 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Phe Thr Ala Glu Phe Leu Glu Lys Val 1 5 <210> 77 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Ala Leu Tyr Gly Asn Val Gln Gln Val 1 5 <210> 78 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Leu Phe Gln Ser Arg Ile Ala Gly Val 1 5 <210> 79 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Ile Leu Ala Glu Glu Pro Ile Tyr Ile Arg Val 1 5 10 <210> 80 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 Phe Leu Leu Glu Arg Glu Gln Leu Leu 1 5 <210> 81 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Leu Leu Leu Pro Leu Glu Leu Ser Leu Ala 1 5 10 <210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Ser Leu Ala Glu Thr Ile Phe Ile Val 1 5 <210> 83 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 Ala Ile Leu Asn Val Asp Glu Lys Asn Gln Val 1 5 10 <210> 84 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Arg Leu Phe Glu Glu Val Leu Gly Val 1 5 <210> 85 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85 Tyr Leu Asp Glu Val Ala Phe Met Leu 1 5 <210> 86 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 Lys Leu Ile Asp Glu Asp Glu Pro Leu Phe Leu 1 5 10 <210> 87 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87 Lys Leu Phe Glu Lys Ser Thr Gly Leu 1 5 <210> 88 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 88 Ser Leu Leu Glu Val Asn Glu Ala Ser Ser Val 1 5 10 <210> 89 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Gly Val Tyr Asp Gly Arg Glu His Thr Val 1 5 10 <210> 90 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90 Gly Leu Tyr Pro Val Thr Leu Val Gly Val 1 5 10 <210> 91 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 91 Ala Leu Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala 1 5 <210> 92 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92 Thr Leu Leu Glu Gly Ile Ser Arg Ala 1 5 <210> 93 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93 Ser Leu Ile Glu Glu Ser Glu Glu Leu 1 5 <210> 94 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94 Ala Leu Tyr Val Gln Ala Pro Thr Val 1 5 <210> 95 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 Lys Leu Ile Tyr Lys Asp Leu Val Ser Val 1 5 10 <210> 96 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96 Ile Leu Gln Asp Gly Gln Phe Leu Val 1 5 <210> 97 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97 Ser Leu Leu Asp Tyr Glu Val Ser Ile 1 5 <210> 98 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 98 Leu Leu Gly Asp Ser Ser Phe Phe Leu 1 5 <210> 99 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99 Val Ile Phe Glu Gly Glu Pro Met Tyr Leu 1 5 10 <210> 100 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100 Ala Leu Ser Tyr Ile Leu Pro Tyr Leu 1 5 <210> 101 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 101 Phe Leu Phe Val Asp Pro Glu Leu Val 1 5 <210> 102 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 102 Ser Glu Trp Gly Ser Pro His Ala Ala Val Pro 1 5 10 <210> 103 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 103 Ala Leu Ser Glu Leu Glu Arg Val Leu 1 5 <210> 104 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 104 Ser Leu Phe Glu Ser Leu Glu Tyr Leu 1 5 <210> 105 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 105 Lys Val Leu Glu Tyr Val Ile Lys Val 1 5 <210> 106 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 106 Val Leu Leu Asn Glu Ile Leu Glu Gln Val 1 5 10 <210> 107 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 107 Ser Leu Leu Asn Gln Pro Lys Ala Val 1 5 <210> 108 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 108 Lys Met Ser Glu Leu Gln Thr Tyr Val 1 5 <210> 109 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 109 Ala Leu Leu Glu Gln Thr Gly Asp Met Ser Leu 1 5 10 <210> 110 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 110 Val Ile Ile Lys Gly Leu Glu Glu Ile Thr Val 1 5 10 <210> 111 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 111 Lys Gln Phe Glu Gly Thr Val Glu Ile 1 5 <210> 112 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 112 Lys Leu Gln Glu Glu Ile Pro Val Leu 1 5 <210> 113 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 113 Gly Leu Ala Glu Phe Gln Glu Asn Val 1 5 <210> 114 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 114 Asn Val Ala Glu Ile Val Ile His Ile 1 5 <210> 115 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 115 Ala Leu Ala Gly Ile Val Thr Asn Val 1 5 <210> 116 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 116 Asn Leu Leu Ile Asp Asp Lys Gly Thr Ile Lys Leu 1 5 10 <210> 117 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 117 Val Leu Met Gln Asp Ser Arg Leu Tyr Leu 1 5 10 <210> 118 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 118 Lys Val Leu Glu His Val Val Arg Val 1 5 <210> 119 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 119 Leu Leu Trp Gly Asn Leu Pro Glu Ile 1 5 <210> 120 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 120 Ser Leu Met Glu Lys Asn Gln Ser Leu 1 5 <210> 121 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 121 Lys Leu Leu Ala Val Ile His Glu Leu 1 5 <210> 122 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 122 Ala Leu Gly Asp Lys Phe Leu Leu Arg Val 1 5 10 <210> 123 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 123 Phe Leu Met Lys Asn Ser Asp Leu Tyr Gly Ala 1 5 10 <210> 124 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 124 Lys Leu Ile Asp His Gln Gly Leu Tyr Leu 1 5 10 <210> 125 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 125 Gly Pro Gly Ile Phe Pro Pro Pro Pro Pro Gln Pro 1 5 10 <210> 126 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 126 Ala Leu Asn Glu Ser Leu Val Glu Cys 1 5 <210> 127 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 127 Gly Leu Ala Ala Leu Ala Val His Leu 1 5 <210> 128 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 128 Leu Leu Leu Glu Ala Val Trp His Leu 1 5 <210> 129 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 129 Ser Ile Ile Glu Tyr Leu Pro Thr Leu 1 5 <210> 130 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 130 Thr Leu His Asp Gln Val His Leu Leu 1 5 <210> 131 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 131 Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys 1 5 <210> 132 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 132 Phe Leu Leu Asp Lys Pro Gln Asp Leu Ser Ile 1 5 10 <210> 133 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 133 Tyr Leu Leu Asp Met Pro Leu Trp Tyr Leu 1 5 10 <210> 134 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 134 Gly Leu Leu Asp Cys Pro Ile Phe Leu 1 5 <210> 135 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 135 Val Leu Ile Glu Tyr Asn Phe Ser Ile 1 5 <210> 136 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 136 Thr Leu Tyr Asn Pro Glu Arg Thr Ile Thr Val 1 5 10 <210> 137 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 137 Ala Val Pro Pro Pro Pro Ser Ser Val 1 5 <210> 138 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 138 Lys Leu Gln Glu Glu Leu Asn Lys Val 1 5 <210> 139 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 139 Lys Leu Met Asp Pro Gly Ser Leu Pro Pro Leu 1 5 10 <210> 140 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 140 Ala Leu Ile Val Ser Leu Pro Tyr Leu 1 5 <210> 141 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 141 Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ala Asn Val 1 5 <210> 142 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 142 Ala Leu Asp Pro Ser Gly Asn Gln Leu Ile 1 5 10 <210> 143 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 143 Ile Leu Ile Lys His Leu Val Lys Val 1 5 <210> 144 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 144 Val Leu Leu Asp Thr Ile Leu Gln Leu 1 5 <210> 145 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 145 His Leu Ile Ala Glu Ile His Thr Ala 1 5 <210> 146 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 146 Ser Met Asn Gly Gly Val Phe Ala Val 1 5 <210> 147 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 147 Met Leu Ala Glu Lys Leu Leu Gln Ala 1 5 <210> 148 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 148 Tyr Met Leu Asp Ile Phe His Glu Val 1 5 <210> 149 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 149 Ala Leu Trp Leu Pro Thr Asp Ser Ala Thr Val 1 5 10 <210> 150 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 150 Gly Leu Ala Ser Arg Ile Leu Asp Ala 1 5 <210> 151 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 151 Ser Tyr Val Lys Val Leu His His Leu 1 5 <210> 152 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 152 Val Tyr Leu Pro Lys Ile Pro Ser Trp 1 5 <210> 153 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 153 Asn Tyr Glu Asp His Phe Pro Leu Leu 1 5 <210> 154 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 154 Val Tyr Ile Ala Glu Leu Glu Lys Ile 1 5 <210> 155 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 155 Val His Phe Glu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Leu Phe 1 5 10 <210> 156 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 156 Val Leu Ser Pro Phe Ile Leu Thr Leu 1 5 <210> 157 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 157 His Leu Leu Glu Gly Ser Val Gly Val 1 5

Claims (88)

  1. 동결된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 해동하는 단계;
    해동된 PBMC를 정지시키는 단계;
    정지된 PBMC 내 T 세포를 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체로 활성화시키는 단계;
    활성화된 T 세포를 바이러스 벡터로 형질도입하는 단계;
    형질도입된 T 세포를 확장하는 단계; 및
    확장된 T 세포를 획득하는 단계
    를 포함하는, T 세포를 형질도입하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    활성화 단계가 정지된 PBMC 내 T 세포를 고체상 지지체 상에서 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체로 부동화함을 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    정지 단계가 약 0.5시간 내지 약 48시간, 약 0.5시간 내지 약 36시간, 약 0.5시간 내지 약 24시간, 약 0.5시간 내지 약 18시간, 약 0.5시간 내지 약 12시간, 약 0.5시간 내지 약 6시간, 약 1시간 내지 약 6시간, 약 2시간 내지 약 5시간, 약 3시간 내지 약 5시간, 약 1시간 내지 약 24시간, 약 2시간 내지 약 24시간, 약 12시간 내지 약 48시간, 약 0.5시간 내지 약 120시간, 약 0.5시간 내지 약 108시간, 약 0.5시간 내지 약 96시간, 약 0.5시간 내지 약 84시간, 약 0.5시간 내지 약 72시간 또는 약 0.5시간 내지 약 60시간의 기간 이내에 수행되는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    항-CD3 항체 및 항-CD28 항체 각각이 약 0.1 μg/mL 이하, 약 0.2 μg/mL 이하, 약 0.3 μg/mL 이하, 약 0.4 μg/mL 이하, 약 0.5 μg/mL 이하, 약 0.6 μg/mL 이하, 약 0.7 μg/mL 이하, 약 0.8 μg/mL 이하, 약 0.9 μg/mL 이하, 약 1.0 μg/mL 이하, 약 2.0 μg/mL 이하, 약 4.0 μg/mL 이하, 약 6.0 μg/mL 이하, 약 8.0 μg/mL 이하 또는 약 10.0 μg/mL 이하의 농도를 갖는, 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    항-CD3 항체 및 항-CD28 항체 각각이 약 0.1 μg/mL 내지 약 10.0 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 8.0 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 6.0 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 4.0 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 2.0 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 1.0 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 0.8 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 0.6 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 0.5 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 0.25 μg/mL, 약 0.2 μg/mL 내지 약 0.5 μg/mL, 약 0.2 μg/mL 내지 약 0.3 μg/mL, 약 0.3 μg/mL 내지 약 0.5 μg/mL, 약 0.3 μg/mL 내지 약 0.4 μg/mL 또는 약 0.4 μg/mL 내지 약 0.5 μg/mL의 농도를 갖는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    활성화가 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 14시간, 약 16시간, 약 18시간, 약 20시간, 약 22시간, 약 24시간, 약 26시간, 약 28시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 48시간, 약 60시간, 약 72시간, 약 84시간, 약 96시간, 약 108시간 또는 약 120시간 이하의 기간 이내에 수행되는, 방법.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    활성화가 약 1시간 내지 약 120시간, 약 1시간 내지 약 108시간, 약 1시간 내지 약 96시간, 약 1시간 내지 약 84시간, 약 1시간 내지 약 72시간, 약 1시간 내지 약 60시간, 약 1시간 내지 약 48시간, 약 1시간 내지 약 36시간, 약 1시간 내지 약 24시간, 약 2시간 내지 약 24시간, 약 4시간 내지 약 24시간, 약 6시간 내지 약 24시간, 약 8시간 내지 약 24시간, 약 10시간 내지 약 24시간, 약 12시간 내지 약 24시간, 약 12시간 내지 약 72시간, 약 24시간 내지 약 72시간, 약 6시간 내지 약 48시간, 약 24시간 내지 약 48시간, 약 6시간 내지 약 72시간 또는 약 1시간 내지 약 12시간의 기간 이내에 수행되는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    고체상이 비드, 플레이트, 플라스크 또는 백의 표면인, 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    플레이트가 6웰, 12웰 또는 24웰 플레이트인, 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    플라스크가 약 25 cm2 내지 약 75 cm2, 약 25 cm2 내지 약 100 cm2, 약 25 cm2 내지 약 150 cm2 또는 약 50 cm2 내지 약 1,720 cm2의 파종 표면적을 갖는, 방법.
  11. 제8항에 있어서,
    백이 약 5 mL 내지 약 100 L, 약 100 mL 내지 약 100 L, 약 150 mL 내지 약 100 L, 약 200 mL 내지 약 100 L, 약 250 mL 내지 약 100 L, 약 500 mL 내지 약 100 L, 약 1 L 내지 약 100 L, 약 1 L 내지 약 75 L, 약 1 L 내지 약 50 L, 약 1 L 내지 약 25 L, 약 1 L 내지 약 20 L, 약 1 L 내지 약 15 L, 약 1 L 내지 약 10 L, 약 1 L 내지 약 5 L, 약 1 L 내지 약 2.5 L 또는 약 1 L 내지 약 2 L의 용적을 갖는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    정지가 하나 이상의 시토카인의 존재 하에서 수행되는, 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    하나 이상의 시토카인이 인터루킨 7(IL-7) 및/또는 인터루킨 15(IL-15)를 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    IL-7의 농도가 약 1 ng/mL 이하, 약 2 ng/mL 이하, 약 3 ng/mL 이하, 약 4 ng/mL 이하, 약 5 ng/mL 이하, 약 6 ng/mL 이하, 약 7 ng/mL 이하, 약 8 ng/mL 이하, 약 9 ng/mL 이하, 약 10 ng/mL 이하, 약 11 ng/mL 이하, 약 12 ng/mL 이하, 약 13 ng/mL 이하, 약 14 ng/mL 이하, 약 15 ng/mL 이하, 약 16 ng/mL 이하, 약 17 ng/mL 이하, 약 18 ng/mL 이하, 약 19 ng/mL 이하, 약 20 ng/mL 이하, 약 25 ng/mL 이하, 약 30 ng/mL 이하, 약 35 ng/mL 이하, 약 40 ng/mL 이하, 약 45 ng/mL 이하, 약 50 ng/mL 이하, 약 60 ng/mL 이하, 약 70 ng/mL 이하, 약 80 ng/mL 이하, 약 90 ng/mL 이하 또는 약 100 ng/mL 이하인, 방법.
  15. 제13항에 있어서,
    IL-7의 농도가 약 1 ng/mL 내지 90 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 80 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 70 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 60 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 50 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 40 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 30 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 20 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 15 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 10 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 10 ng/mL, 약 4 ng/mL 내지 10 ng/mL, 약 6 ng/mL 내지 10 ng/mL 또는 약 5 ng/mL 내지 10 ng/mL인, 방법.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL-15의 농도가 약 5 ng/mL 이하, 약 10 ng/mL 이하, 약 15 ng/mL 이하, 약 20 ng/mL 이하, 약 25 ng/mL 이하, 약 30 ng/mL 이하, 약 35 ng/mL 이하, 약 40 ng/mL 이하, 약 45 ng/mL 이하, 약 50 ng/mL 이하, 약 60 ng/mL 이하, 약 70 ng/mL 이하, 약 80 ng/mL 이하, 약 90 ng/mL 이하, 약 100 ng/mL 이하, 약 110 ng/mL 이하, 약 120 ng/mL 이하, 약 130 ng/mL 이하, 약 140 ng/mL 이하, 약 150 ng/mL 이하, 200 ng/mL 이하, 250 ng/mL 이하, 300 ng/mL 이하, 350 ng/mL 이하, 400 ng/mL 이하, 450 ng/mL 이하 또는 500 ng/mL 이하인, 방법.
  17. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL-15의 농도가 약 5 ng/mL 내지 500 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 400 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 300 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 200 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 150 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 90 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 50 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 50 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 50 ng/mL 또는 약 40 ng/mL 내지 50 ng/mL인, 방법.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    형질도입이 약 1시간 이하, 약 2시간 이하, 약 3시간 이하, 약 4시간 이하, 약 5시간 이하, 약 6시간 이하, 약 7시간 이하, 약 8시간 이하, 약 9시간 이하, 약 10시간 이하, 약 11시간 이하, 약 12시간 이하, 약 14시간 이하, 약 16시간 이하, 약 18시간 이하, 약 20시간 이하, 약 22시간 이하, 약 24시간 이하, 약 26시간 이하, 약 28시간 이하, 약 30시간 이하, 약 36시간 이하, 약 42시간 이하, 약 48시간 이하, 약 54시간 이하, 약 60시간 이하, 약 66시간 이하, 약 72시간 이하, 약 84시간 이하, 약 96시간 이하, 약 108시간 이하 또는 120시간 이하의 기간 이내에 수행되는, 방법.
  19. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    형질도입이 약 1시간 내지 120시간, 약 1시간 내지 108시간, 약 1시간 내지 96시간, 약 1시간 내지 72시간, 약 1시간 내지 48시간, 약 1시간 내지 36시간, 약 1시간 내지 24시간, 약 2시간 내지 24시간, 약 4시간 내지 24시간, 약 6시간 내지 24시간, 약 8시간 내지 24시간, 약 10시간 내지 24시간, 약 12시간 내지 24시간, 약 14시간 내지 24시간, 약 16시간 내지 24시간, 약 18시간 내지 24시간, 약 20시간 내지 24시간 또는 약 22시간 내지 24시간의 기간 이내에 수행되는, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    바이러스 벡터가 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 레트로바이러스 벡터인, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    바이러스 벡터가 TCR을 발현하는 렌티바이러스 벡터인, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    형질도입이 하나 이상의 시토카인의 존재 하에서 수행되는, 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    하나 이상의 시토카인이 인터루킨 7(IL-7) 및/또는 인터루킨 15(IL-15)를 포함하는, 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    IL-7의 농도가 약 1 ng/mL 이하, 약 2 ng/mL 이하, 약 3 ng/mL 이하, 약 4 ng/mL 이하, 약 5 ng/mL 이하, 약 6 ng/mL 이하, 약 7 ng/mL 이하, 약 8 ng/mL 이하, 약 9 ng/mL 이하, 약 10 ng/mL 이하, 약 11 ng/mL 이하, 약 12 ng/mL 이하, 약 13 ng/mL 이하, 약 14 ng/mL 이하, 약 15 ng/mL 이하, 약 16 ng/mL 이하, 약 17 ng/mL 이하, 약 18 ng/mL 이하, 약 19 ng/mL 이하, 약 20 ng/mL 이하, 약 25 ng/mL 이하, 약 30 ng/mL 이하, 약 35 ng/mL 이하, 약 40 ng/mL 이하, 약 45 ng/mL 이하, 약 50 ng/mL 이하, 약 60 ng/mL 이하, 약 70 ng/mL 이하, 약 80 ng/mL 이하, 약 90 ng/m 이하 또는 약 100 ng/mL 이하인, 방법.
  25. 제23항에 있어서,
    IL-7의 농도가 약 1 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 90 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 80 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 70 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 60 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 50 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 40 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 30 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 20 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 15 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 10 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 10 ng/mL, 약 4 ng/mL 내지 10 ng/mL, 약 6 ng/mL 내지 10 ng/mL, 약 8 ng/mL 내지 10 ng/mL 또는 약 9 ng/mL 내지 10 ng/mL인, 방법.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL-15의 농도가 약 5 ng/mL 이하, 약 10 ng/mL 이하, 약 15 ng/mL 이하, 약 20 ng/mL 이하, 약 25 ng/mL 이하, 약 30 ng/mL 이하, 약 35 ng/mL 이하, 약 40 ng/mL 이하, 약 45 ng/mL 이하, 약 50 ng/mL 이하, 약 60 ng/mL 이하, 약 70 ng/mL 이하, 약 80 ng/mL 이하, 약 90 ng/mL 이하, 약 100 ng/mL 이하, 약 110 ng/mL 이하, 약 120 ng/mL 이하, 약 130 ng/mL 이하, 약 140 ng/mL 이하, 약 150 ng/mL 이하, 200 ng/mL 이하, 250 ng/mL 이하, 300 ng/mL 이하, 350 ng/mL 이하, 400 ng/mL 이하, 450 ng/mL 이하 또는 500 ng/mL 이하인, 방법.
  27. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL-15의 농도가 약 5 ng/mL 내지 500 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 400 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 300 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 200 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 150 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 90 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 50 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 50 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 50 ng/mL 또는 약 40 ng/mL 내지 50 ng/mL인, 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    확장이 하나 이상의 시토카인의 존재 하에서 수행되는, 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    하나 이상의 시토카인이 인터루킨 7(IL-7) 및/또는 인터루킨 15(IL-15)를 포함하는, 방법.
  30. 제29항에 있어서,
    IL-7의 농도가 약 1 ng/mL 이하, 약 2 ng/mL 이하, 약 3 ng/mL 이하, 약 4 ng/mL 이하, 약 5 ng/mL 이하, 약 6 ng/mL 이하, 약 7 ng/mL 이하, 약 8 ng/mL 이하, 약 9 ng/mL 이하, 약 10 ng/mL 이하, 약 11 ng/mL 이하, 약 12 ng/mL 이하, 약 13 ng/mL 이하, 약 14 ng/mL 이하, 약 15 ng/mL 이하, 약 16 ng/mL 이하, 약 17 ng/mL 이하, 약 18 ng/mL 이하, 약 19 ng/mL 이하, 약 20 ng/mL 이하, 약 25 ng/mL 이하, 약 30 ng/mL 이하, 약 35 ng/mL 이하, 약 40 ng/mL 이하, 약 45 ng/mL 이하, 약 50 ng/mL 이하, 약 60 ng/mL 이하, 약 70 ng/mL 이하, 약 80 ng/mL 이하, 약 90 ng/mL 이하 또는 약 100 ng/mL 이하인, 방법.
  31. 제29항에 있어서,
    IL-7의 농도가 약 1 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 90 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 80 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 70 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 60 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 50 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 40 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 30 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 20 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 15 ng/mL 또는 약 1 ng/mL 내지 10 ng/mL인, 방법.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL-15의 농도가 약 5 ng/mL 이하, 10 ng/mL 이하, 15 ng/mL 이하, 20 ng/mL 이하, 25 ng/mL 이하, 30 ng/mL 이하, 35 ng/mL 이하, 40 ng/mL 이하, 45 ng/mL 이하, 50 ng/mL 이하, 60 ng/mL 이하, 70 ng/mL 이하, 80 ng/mL 이하, 90 ng/mL 이하, 100 ng/mL 이하, 110 ng/mL 이하, 120 ng/mL 이하, 130 ng/mL 이하, 140 ng/mL 이하, 150 ng/mL 이하, 200 ng/mL 이하, 250 ng/mL 이하, 300 ng/mL 이하, 350 ng/mL 이하, 400 ng/mL 이하, 450 ng/mL 이하 또는 500 ng/mL 이하인, 방법.
  33. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL-15의 농도가 약 5 ng/mL 내지 500 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 400 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 300 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 200 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 150 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 90 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 50 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 50 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 50 ng/mL 또는 약 40 ng/mL 내지 50 ng/mL인, 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    확장이 약 1일 이하, 약 2일 이하, 약 3일 이하, 약 4일 이하, 약 5일 이하, 약 6일 이하, 약 7일 이하, 약 8일 이하, 약 9일 이하, 약 10일 이하, 약 15일 이하, 약 20일 이하, 약 25일 이하 또는 약 30일 이하의 기간 이내에 수행되는, 방법.
  35. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    확장이 약 1일 내지 약 30일, 약 1일 내지 약 25일, 약 1일 내지 약 20일, 약 1일 내지 약 15일, 약 1일 내지 약 10일, 약 2일 내지 약 10일, 약 3일 내지 약 10일, 약 4일 내지 약 10일, 약 5일 내지 약 10일, 약 6일 내지 약 10일, 약 7일 내지 약 10일, 약 8일 내지 약 10일 또는 약 9일 내지 약 10일의 기간 이내에 수행되는, 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    획득된 T 세포의 수가 약 1 x 109개 이상, 약 2 x 109개 이상, 약 3 x 109개 이상, 약 4 x 109개 이상, 약 5 x 109개 이상, 약 6 x 109개 이상, 약 7 x 109개 이상, 약 8 x 109개 이상, 약 9 x 109개 이상, 약 1 x 1010개 이상, 약 5 x 1010개 이상, 약 1 x 1011개 이상, 약 5 x 1011개 이상, 약 1 x 1012개 이상, 약 5 x 1012개 이상 또는 약 1 x 1013개 이상의 세포인, 방법.
  37. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    획득된 T 세포의 수가 약 1 x 109개 내지 약 1 x 1013개, 약 1 x 109개 내지 약 5 x 1012개, 약 1 x 109개 내지 약 1 x 1012개, 약 1 x 109개 내지 약 5 x 1011개, 약 1 x 109개 내지 약 1 x 1011개, 약 1 x 109개 내지 약 5 x 1010개, 약 1 x 109개 내지 약 1 x 1010개, 약 2 x 109개 내지 약 1 x 1010개, 약 3 x 109개 내지 약 1 x 1010개, 약 4 x 109개 내지 약 1 x 1010개, 약 5 x 109개 내지 약 1 x 1010개, 약 6 x 109개 내지 약 1 x 1010개, 약 7 x 109개 내지 약 1 x 1010개, 약 8 x 109개 내지 약 1 x 1010개 또는 약 9 x 109개 내지 약 1 x 1010개의 세포인, 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    획득된 T 세포가 CD3+CD8+ T 세포인, 방법.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조되어 획득된 T 세포의 효과량을 암을 가진 환자에게 투여함을 포함하는, 상기 환자를 치료하는 방법.
  40. 제39항에 있어서,
    PBMC를 환자로부터 획득하는, 방법.
  41. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 유전적으로 형질도입된 T 세포.
  42. 제41항에 따른 유전적으로 형질도입된 T 세포 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  43. 동결된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 해동하는 단계;
    해동된 PBMC를 정지시키는 단계;
    정지된 PBMC 내 T 세포를 고체상에 부동화된 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체로 활성화시키는 단계;
    활성화된 T 세포를 확장하는 단계; 및
    확장된 T 세포를 포함하는 T 세포 군집을 획득하는 단계
    를 포함하는, T 세포 군집을 제조하는 방법.
  44. 제43항에 있어서,
    정지가 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 14시간, 약 16시간, 약 18시간, 약 20시간, 약 22시간, 약 24시간, 약 26시간, 약 28시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 48시간, 약 60시간, 약 72시간, 약 84시간, 약 96시간, 약 108시간 또는 약 120시간 이하의 기간 이내에 수행되는, 방법.
  45. 제43항에 있어서,
    정지가 약 1시간 내지 약 120시간, 약 1시간 내지 약 108시간, 약 1시간 내지 약 96시간, 약 1시간 내지 약 84시간, 약 1시간 내지 약 72시간, 약 1시간 내지 약 60시간, 약 1시간 내지 약 48시간, 약 1시간 내지 약 36시간, 약 1시간 내지 약 24시간, 약 2시간 내지 약 24시간, 약 4시간 내지 약 24시간, 약 6시간 내지 약 24시간, 약 8시간 내지 약 24시간, 약 10시간 내지 약 24시간, 약 12시간 내지 약 24시간, 약 12시간 내지 약 72시간, 약 24시간 내지 약 72시간, 약 6시간 내지 약 48시간, 약 24시간 내지 약 48시간, 약 6시간 내지 약 72시간 또는 약 1시간 내지 약 12시간의 기간 이내에 수행되는, 방법.
  46. 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
    항-CD3 항체 및 항-CD28 항체 각각이 약 0.1 μg/mL 이하, 약 0.2 μg/mL 이하, 약 0.3 μg/mL 이하, 약 0.4 μg/mL 이하, 약 0.5 μg/mL 이하, 약 0.6 μg/mL 이하, 약 0.7 μg/mL 이하, 약 0.8 μg/mL 이하, 약 0.9 μg/mL 이하, 약 1.0 μg/mL 이하, 약 2.0 μg/mL 이하, 약 4.0 μg/mL 이하, 약 6.0 μg/mL 이하, 약 8.0 μg/mL 이하 또는 약 10.0 μg/mL 이하의 농도를 갖는, 방법
  47. 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
    항-CD3 항체 및 항-CD28 항체 각각이 약 0.1 μg/mL 내지 약 10.0 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 8.0 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 6.0 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 4.0 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 2.0 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 1.0 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 0.8 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 0.6 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 0.5 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 0.25 μg/mL 또는 약 0.2 μg/mL 내지 약 0.5 μg/mL의 농도를 갖는, 방법.
  48. 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    활성화가 약 1시간 이하, 약 2시간 이하, 약 3시간 이하, 약 4시간 이하, 약 5시간 이하, 약 6시간 이하, 약 7시간 이하, 약 8시간 이하, 약 9시간 이하, 약 10시간 이하, 약 11시간 이하, 약 12시간 이하, 약 14시간 이하, 약 16시간 이하, 약 18시간 이하, 약 20시간 이하, 약 22시간 이하, 약 24시간 이하, 약 26시간 이하, 약 28시간 이하, 약 30시간 이하, 약 36시간 이하, 약 42시간 이하, 약 48시간 이하, 약 54시간 이하, 약 60시간 이하, 약 66시간 이하, 약 72시간 이하, 약 84시간 이하, 약 96시간 이하, 약 108시간 이하 또는 약 120시간 이하의 기간 이내에 수행되는, 방법.
  49. 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    활성화가 약 1시간 내지 약 120시간, 약 1시간 내지 약 108시간, 약 1시간 내지 약 96시간, 약 1시간 내지 약 84시간, 약 1시간 내지 약 72시간, 약 1시간 내지 약 60시간, 약 1시간 내지 약 48시간, 약 1시간 내지 약 36시간, 약 1시간 내지 약 24시간, 약 2시간 내지 약 24시간, 약 4시간 내지 약 24시간, 약 6시간 내지 약 24시간, 약 8시간 내지 약 24시간, 약 10시간 내지 약 24시간, 약 12시간 내지 약 24시간, 약 14시간 내지 약 24시간, 약 16시간 내지 약 24시간, 약 18시간 내지 약 24시간, 약 20시간 내지 약 24시간, 약 22시간 내지 약 24시간 또는 약 23시간 내지 약 24시간의 기간 이내에 수행되는, 방법.
  50. 제43항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
    고체상이 비드, 플레이트, 플라스크 또는 백의 표면인, 방법.
  51. 제50항에 있어서,
    플레이트가 6웰, 12웰 또는 24웰 플레이트인, 방법.
  52. 제50항에 있어서,
    플라스크가 약 25 cm2 내지 약 75 cm2, 약 25 cm2 내지 약 100 cm2, 약 25 cm2 내지 약 150 cm2, 또는 약 50 cm2 내지 약 1,720 cm2의 파종 표면적을 갖는, 방법.
  53. 제50항에 있어서,
    백이 약 50 mL 내지 약 100 L, 약 100 mL 내지 약 100 L, 약 150 mL 내지 약 100 L, 약 200 mL 내지 약 100 L, 약 250 mL 내지 약 100 L, 약 500 mL 내지 약 100 L, 약 1 L 내지 약 100 L, 약 1 L 내지 약 75 L, 약 1 L 내지 약 50 L, 약 1 L 내지 약 25 L, 약 1 L 내지 약 20 L, 약 1 L 내지 약 15 L, 약 1 L 내지 약 10 L, 약 1 L 내지 약 5 L, 약 1 L 내지 약 2.5 L 또는 약 1 L 내지 약 2 L의 용적을 갖는, 방법.
  54. 제43항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서,
    정지가 하나 이상의 시토카인의 존재 하에서 수행되는, 방법.
  55. 제54항에 있어서,
    하나 이상의 시토카인이 인터루킨 7(IL-7) 및/또는 인터루킨 15(IL-15)를 포함하는, 방법.
  56. 제55항에 있어서,
    IL-7의 농도가 약 1 ng/mL 이하, 약 2 ng/mL 이하, 약 3 ng/mL 이하, 약 4 ng/mL 이하, 약 5 ng/mL 이하, 약 6 ng/mL 이하, 약 7 ng/mL 이하, 약 8 ng/mL 이하, 약 9 ng/mL 이하, 약 10 ng/mL 이하, 약 11 ng/mL 이하, 약 12 ng/mL 이하, 약 13 ng/mL 이하, 약 14 ng/mL 이하, 약 15 ng/mL 이하, 약 16 ng/mL 이하, 약 17 ng/mL 이하, 약 18 ng/mL 이하, 약 19 ng/mL 이하, 약 20 ng/mL 이하, 약 25 ng/mL 이하, 약 30 ng/mL 이하, 약 35 ng/mL 이하, 약 40 ng/mL 이하, 약 45 ng/mL 이하, 약 50 ng/mL 이하, 약 60 ng/mL 이하, 약 70 ng/mL 이하, 약 80 ng/mL 이하, 약 90 ng/mL 이하 또는 약 100 ng/mL 이하인, 방법.
  57. 제55항에 있어서,
    IL-7의 농도가 약 1 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 90 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 80 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 70 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 60 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 50 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 40 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 30 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 20 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 15 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 10 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 10 ng/mL, 약 4 ng/mL 내지 10 ng/mL, 약 6 ng/mL 내지 10 ng/mL 또는 약 5 ng/mL 내지 10 ng/mL인, 방법.
  58. 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL-15의 농도가 약 5 ng/mL 이하, 약 10 ng/mL 이하, 약 15 ng/mL 이하, 약 20 ng/mL 이하, 약 25 ng/mL 이하, 약 30 ng/mL 이하, 약 35 ng/mL 이하, 약 40 ng/mL 이하, 약 45 ng/mL 이하, 약 50 ng/mL 이하, 약 60 ng/mL 이하, 약 70 ng/mL 이하, 약 80 ng/mL 이하, 약 90 ng/mL 이하, 약 100 ng/mL 이하, 약 110 ng/mL 이하, 약 120 ng/mL 이하, 약 130 ng/mL 이하, 약 140 ng/mL 이하 또는 약 500 ng/mL 이하인, 방법.
  59. 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL-15의 농도가 약 5 ng/mL 내지 500 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 400 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 300 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 200 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 150 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 90 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 50 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 50 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 50 ng/mL 또는 약 20 ng/mL 내지 50 ng/mL인, 방법.
  60. 제43항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서,
    활성화된 T 세포를 바이러스 벡터로 형질도입함을 추가로 포함하는 방법.
  61. 제60항에 있어서,
    바이러스 벡터가 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 레트로바이러스 벡터인, 방법.
  62. 제60항 또는 제61항에 있어서,
    바이러스 벡터가 TCR을 발현하는 렌티바이러스 벡터인, 방법.
  63. 제60항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서,
    형질도입이 하나 이상의 시토카인의 존재 하에서 수행되는, 방법.
  64. 제63항에 있어서,
    하나 이상의 시토카인이 인터루킨 7(IL-7) 및/또는 인터루킨 15(IL-15)를 포함하는, 방법.
  65. 제64항에 있어서,
    IL-7의 농도가 약 1 ng/mL 이하, 약 2 ng/mL 이하, 약 3 ng/mL 이하, 약 4 ng/mL 이하, 약 5 ng/mL 이하, 약 6 ng/mL 이하, 약 7 ng/mL 이하, 약 8 ng/mL 이하, 약 9 ng/mL 이하, 약 10 ng/mL 이하, 약 11 ng/mL 이하, 약 12 ng/mL 이하, 약 13 ng/mL 이하, 약 14 ng/mL 이하, 약 15 ng/mL 이하, 약 16 ng/mL 이하, 약 17 ng/mL 이하, 약 18 ng/mL 이하, 약 19 ng/mL 이하, 약 20 ng/mL 이하, 약 25 ng/mL 이하, 약 30 ng/mL 이하, 약 35 ng/mL 이하, 약 40 ng/mL 이하, 약 45 ng/mL 이하, 약 50 ng/mL 이하, 약 60 ng/mL 이하, 약 70 ng/mL 이하, 약 80 ng/mL 이하, 약 90 ng/m 이하 또는 약 100 ng/mL 이하인, 방법.
  66. 제64항에 있어서,
    IL-7의 농도가 약 1 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 90 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 80 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 70 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 60 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 50 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 40 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 30 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 20 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 15 ng/mL 또는 약 1 ng/mL 내지 10 ng/mL인, 방법.
  67. 제64항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL-15의 농도가 약 5 ng/mL 이하, 약 10 ng/mL 이하, 약 15 ng/mL 이하, 약 20 ng/mL 이하, 약 25 ng/mL 이하, 약 30 ng/mL 이하, 약 35 ng/mL 이하, 약 40 ng/mL 이하, 약 45 ng/mL 이하, 약 50 ng/mL 이하, 약 60 ng/mL 이하, 약 70 ng/mL 이하, 약 80 ng/mL 이하, 약 90 ng/mL 이하, 약 100 ng/mL 이하, 약 110 ng/mL 이하, 약 120 ng/mL 이하, 약 130 ng/mL 이하, 약 140 ng/mL 이하, 약 150 ng/mL 이하, 약 200 ng/mL 이하, 약 250 ng/mL 이하, 약 300 ng/mL 이하, 약 350 ng/mL 이하, 약 400 ng/mL 이하, 약 450 ng/mL 이하 또는 약 500 ng/mL 이하인, 방법.
  68. 제64항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL-15의 농도가 약 5 ng/mL 내지 500 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 400 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 300 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 200 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 150 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 100 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 100 ng/mL 또는 약 50 ng/mL 내지 100 ng/mL인, 방법.
  69. 제43항 내지 제68항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 T 세포 군집.
  70. 제1항 내지 제38항 및 제43항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서,
    확장이 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15 및 IL-21로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 시토카인의 존재 하에서 수행되는, 방법.
  71. 제70항에 있어서,
    하나 이상의 시토카인이 IL-2를 포함하는, 방법.
  72. 제70항에 있어서,
    하나 이상의 시토카인이 IL-7 및 IL-15를 포함하는, 방법.
  73. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 해동하는 단계;
    해동된 PBMC를 약 4시간 내지 6시간 동안 정지시키는 단계;
    정지된 PBMC 내 T 세포를 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체로 활성화시키는 단계;
    활성화된 T 세포를 바이러스 벡터로 형질도입하는 단계;
    형질도입된 T 세포를 확장하는 단계; 및
    확장된 T 세포를 획득하는 단계
    를 포함하는, T 세포 군집을 제조하는 방법.
  74. 제73항에 있어서,
    획득된 T 세포를 약 2배 내지 5배, 약 5배 내지 약 10배, 약 5배 내지 약 15배, 약 5배 내지 약 20배, 약 5배 내지 약 25배, 약 25배 내지 약 50배, 약 50배 내지 약 60배, 약 60배 내지 약 100배, 약 65배 내지 약 90배, 약 70배 내지 약 85배 및 약 67배 내지 약 88배로 구성되는 군으로부터 선택되는 배수만큼 확장하는 방법.
  75. 제73항에 있어서,
    약 4시간 내지 약 6시간의 정지 시간으로 획득된 T 세포의 배수 확장이, 약 16시간 내지 약 20시간의 정지 시간으로 동일한 조건 하에서 제조되어 획득된 T 세포의 배수 확장보다 약 1.5배 이상 큰, 방법.
  76. 제73항에 있어서,
    획득된 T 세포의 수가 약 2 x 109개 내지 약 5 x 109개, 약 5 x 109개 내지 약 10 x 109개, 약 10 x 109개 내지 약 15 x 109개, 약 5 x 109개 내지 약 35 x 109개, 약 5 x 109개 내지 약 30 x 109개, 약 10 x 109개 내지 약 30 x 109개, 약 15 x 109개 내지 약 20 x 109개, 약 20 x 109개 내지 약 35 x 109개, 약 24 x 109개 내지 약 33 x 109개 및 약 24.8 x 109개 내지 약 32.2 x 109개로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.
  77. 제73항에 있어서,
    약 4시간 내지 약 6시간의 정지 시간으로 획득된 T 세포의 수가, 약 16시간 내지 20시간의 정지 시간으로 동일한 조건 하에서 제조되어 획득된 T 세포의 수보다 약 1.5배 내지 약 2.0배 많은, 방법.
  78. 제1항 내지 제38항, 제43항 내지 제68항 및 제70항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서,
    해동, 정지, 활성화, 형질도입, 확장 및 획득이 폐쇄 시스템에서 수행되는 방법.
  79. 제78항에 있어서,
    폐쇄 시스템이 클리니맥스 프로디지(CliniMACS Prodigy), 웨이브(WAVE)(수리(XURI)) 바이오리액터(Bioreactor), 웨이브(수리) 바이오리액터와 바이오세이프 세팍스(BioSafe Sepax) II의 조합, 지-렉스/가터렉스(G-Rex/GatheRex) 폐쇄 시스템, 또는 지-렉스/가터렉스 폐쇄 시스템과 바이오세이프 세팍스 II의 조합인, 방법.
  80. 신선한 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 획득하는 단계;
    신선한 PBMC 내 T 세포를 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체로 활성화시키는 단계;
    활성화된 T 세포를 바이러스 벡터로 형질도입하는 단계;
    형질도입된 T 세포를 확장하는 단계; 및
    확장된 T 세포를 수확하는 단계
    를 포함하는, T 세포 군집을 제조하는 방법.
  81. 제80항에 있어서,
    확장이 약 1일 내지 2일, 약 1일 내지 3일, 약 1일 내지 약 4일, 약 1일 내지 약 5일, 약 1일 내지 6일, 약 1일 내지 7일, 약 1일 내지 8일, 약 1일 내지 9일, 약 1일 내지 10일, 약 2일 내지 3일, 약 2일 내지 4일, 약 2일 내지 5일, 약 2일 내지 6일, 약 2일 내지 7일, 약 2일 내지 8일, 약 2일 내지 9일, 약 2일 내지 10일, 약 3일 내지 4일, 약 3일 내지 5일, 약 3일 내지 6일, 약 3일 내지 7일, 약 3일 내지 8일, 약 3일 내지 9일, 약 3일 내지 10일, 약 4일 내지 5일, 약 4일 내지 6일, 약 4일 내지 7일, 약 4일 내지 8일, 약 4일 내지 9일, 약 4일 내지 10일, 약 5일 내지 6일, 약 5일 내지 7일, 약 5일 내지 8일, 약 5일 내지 9일 또는 약 5일 내지 10일 동안 수행되는, 방법.
  82. 제80항에 있어서,
    수확이 활성화 이후 약 4일 내지 약 12일, 약 4일 내지 약 11일, 약 4일 내지 약 10일, 약 4일 내지 약 9일, 약 4일 내지 약 8일, 약 4일 내지 약 7일, 약 4일 내지 약 6일, 약 4일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 12일, 약 5일 내지 약 11일, 약 5일 내지 약 10일, 약 5일 내지 약 9일, 약 5일 내지 약 8일, 약 5일 내지 약 7일 또는 약 5일 내지 약 6일 이내에 수행되는, 방법.
  83. 제80항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서,
    수확된 T 세포의 수가 약 2 x 109개 내지 약 5 x 109개, 약 5 x 109개 내지 약 10 x 109개, 약 10 x 109개 내지 약 15 x 109개, 약 5 x 109개 내지 약 35 x 109개, 약 5 x 109개 내지 약 30 x 109개, 약 10 x 109개 내지 약 30 x 109개, 약 15 x 109개 내지 약 20 x 109개, 약 20 x 109개 내지 약 35 x 109개, 약 24 x 109개 내지 약 33 x 109개 및 약 24.8 x 109개 내지 약 32.2 x 109개로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.
  84. 제80항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서,
    활성화, 형질도입, 확장 및 수확이 폐쇄 시스템에서 수행되는, 방법.
  85. 제84항에 있어서,
    폐쇄 시스템이 클리니맥스 프로디지, 웨이브(수리) 바이오리액터, 웨이브(수리) 바이오리액터와 바이오세이프 세팍스 II의 조합, 지-렉스/가터렉스 폐쇄 시스템, 또는 지-렉스/가터렉스 폐쇄 시스템과 바이오세이프 세팍스 II의 조합인, 방법.
  86. 제80항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서,
    신선한 PBMC가 저온보존된 PBMC의 해동에 의해 획득되지 않는, 방법.
  87. 제80항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서,
    획득 및 활성화가 1일 이하 동안 수행되는, 방법.
  88. 제80항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서,
    확장이 1일 초과 동안 수행되는, 방법.
KR1020207025919A 2018-02-09 2019-02-08 T 세포의 제조 방법 KR20200119840A (ko)

Applications Claiming Priority (15)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862628521P 2018-02-09 2018-02-09
US62/628,521 2018-02-09
DE102018102971 2018-02-09
DE102018102971.3 2018-02-09
US201862633113P 2018-02-21 2018-02-21
US62/633,113 2018-02-21
DE102018104628 2018-02-28
DE102018104628.6 2018-02-28
US201862647571P 2018-03-23 2018-03-23
US62/647,571 2018-03-23
DE102018108996.1A DE102018108996B4 (de) 2018-02-09 2018-04-16 Verfahren zur Herstellung autologer T-Zellen
DE102018108996.1 2018-04-16
US201862726350P 2018-09-03 2018-09-03
US62/726,350 2018-09-03
PCT/US2019/017237 WO2019157298A1 (en) 2018-02-09 2019-02-08 Methods for manufacturing t cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20200119840A true KR20200119840A (ko) 2020-10-20

Family

ID=67542216

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207025919A KR20200119840A (ko) 2018-02-09 2019-02-08 T 세포의 제조 방법

Country Status (14)

Country Link
US (2) US11464800B2 (ko)
EP (1) EP3749753A1 (ko)
JP (1) JP7470640B2 (ko)
KR (1) KR20200119840A (ko)
CN (1) CN111684062A (ko)
AU (1) AU2019218093A1 (ko)
BR (1) BR112020016176A2 (ko)
CA (1) CA3090416A1 (ko)
IL (1) IL276600B2 (ko)
MA (1) MA51792A (ko)
MX (1) MX2020008327A (ko)
SG (1) SG11202007543TA (ko)
TW (1) TWI834635B (ko)
WO (1) WO2019157298A1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023195764A1 (ko) * 2022-04-06 2023-10-12 주식회사 지씨셀 면역세포에 대한 표적 유전자 도입 방법
WO2024144300A1 (ko) * 2022-12-28 2024-07-04 서울대학교산학협력단 항원 특이적 t 세포의 증식 유도 방법

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102375218B1 (ko) 2016-12-08 2022-03-17 이매틱스 바이오테크놀로지스 게엠베하 T 세포 수용체 및 이를 사용하는 면역 요법
GB201700621D0 (en) 2017-01-13 2017-03-01 Guest Ryan Dominic Method,device and kit for the aseptic isolation,enrichment and stabilsation of cells from mammalian solid tissue
EA202193139A1 (ru) 2019-05-27 2022-03-01 Имматикс Юс, Инк. Вирусные векторы и их применение в адоптивной клеточной терапии
CA3142386A1 (en) 2019-06-06 2020-12-10 Immatics Biotechnologies Gmbh Sorting with counter selection using sequence similar peptides
DE102019121007A1 (de) 2019-08-02 2021-02-04 Immatics Biotechnologies Gmbh Antigenbindende Proteine, die spezifisch an MAGE-A binden
BR112022009152A2 (pt) * 2019-11-13 2022-07-26 Crispr Therapeutics Ag Processo de fabricação para preparar células t expressando receptores de antígenos quiméricos
EP4058559A1 (en) * 2019-11-13 2022-09-21 CRISPR Therapeutics AG Methods of manufacturing car-t cells
CA3164986A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Instil Bio (Uk) Limited Devices and methods for isolating tumor infiltrating lymphocytes and uses thereof
TW202140790A (zh) * 2020-01-22 2021-11-01 愛爾蘭商佧琺藥業有限公司 病毒載體轉導細胞的方法
DE102020106710A1 (de) 2020-03-11 2021-09-16 Immatics US, Inc. Wpre-mutantenkonstrukte, zusammensetzungen und zugehörige verfahren
DE102020111571A1 (de) 2020-03-11 2021-09-16 Immatics US, Inc. Wpre-mutantenkonstrukte, zusammensetzungen und zugehörige verfahren
WO2021236548A1 (en) * 2020-05-18 2021-11-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Engineered t cell receptors and methods of use
CN113801844A (zh) * 2020-06-12 2021-12-17 西比曼生物科技（香港）有限公司 一种全封闭一体化免疫细胞制备方法
MX2023007817A (es) 2020-12-31 2023-09-13 Immatics Us Inc Polipéptidos de cd8, composiciones y métodos de uso de estos.
DE102021100038A1 (de) 2020-12-31 2022-06-30 Immatics US, Inc. Modifizierte cd8-polypeptide, zusammensetzungen und verfahren zu deren verwendung
IL308258A (en) 2021-05-05 2024-01-01 Immatics Biotechnologies Gmbh BMA031 antigen-binding polypeptides
CN113512529B (zh) * 2021-07-21 2022-11-25 上海赛傲生物技术有限公司 特异性抗病毒过继免疫细胞ab的制备方法
WO2023212691A1 (en) 2022-04-28 2023-11-02 Immatics US, Inc. DOMINANT NEGATIVE TGFβ RECEPTOR POLYPEPTIDES, CD8 POLYPEPTIDES, CELLS, COMPOSITIONS, AND METHODS OF USING THEREOF
US20230348548A1 (en) 2022-04-28 2023-11-02 Immatics US, Inc. Membrane-bound il-15, cd8 polypeptides, cells, compositions, and methods of using thereof
US20240066127A1 (en) 2022-04-28 2024-02-29 Immatics US, Inc. Il-12 polypeptides, il-15 polypeptides, il-18 polypeptides, cd8 polypeptides, compositions, and methods of using thereof
US20230355678A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Immatics US, Inc. Methods for improving t cell efficacy
CN117343927B (zh) * 2023-12-06 2024-03-12 上海药明巨诺生物医药研发有限公司 一种工程化细胞的核酸提取方法

Family Cites Families (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4690915A (en) 1985-08-08 1987-09-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans
US5827642A (en) 1994-08-31 1998-10-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center Rapid expansion method ("REM") for in vitro propagation of T lymphocytes
AU2472400A (en) 1998-10-20 2000-05-08 City Of Hope CD20-specific redirected T cells and their use in cellular immunotherapy of CD20+ malignancies
JP3501775B2 (ja) 2000-05-31 2004-03-02 ファイザー株式会社 ヒトバニロイド受容体様タンパク質
DE10134604A1 (de) 2001-07-17 2003-02-06 Hilti Ag Spreizdübel
JP2004538331A (ja) 2001-08-17 2004-12-24 ロジャー ウィリアムス ホスピタル インサイチュ免疫法
US20030175272A1 (en) * 2002-03-07 2003-09-18 Medcell Biologics, Inc. Re-activated T-cells for adoptive immunotherapy
US20030170238A1 (en) 2002-03-07 2003-09-11 Gruenberg Micheal L. Re-activated T-cells for adoptive immunotherapy
WO2006120439A2 (en) * 2005-05-10 2006-11-16 Avaris Ab Cellular vaccine and use thereof
ES2341295T3 (es) 2005-09-05 2010-06-17 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptidos asociados a tumores unidos promiscuamente a moleculas del antigeno de leucocito humano (hla) de clase ii.
AU2008262487B2 (en) 2007-05-23 2013-10-31 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for increased transgene expression
DK2279253T3 (en) * 2008-04-09 2017-02-13 Maxcyte Inc Construction and application of therapeutic compositions of freshly isolated cells
CN102875667B (zh) * 2012-09-05 2014-07-09 南方医科大学 一种HIV-1肽Env120-128特异性TCR、其重组逆转录病毒载体与应用
WO2014186469A2 (en) 2013-05-14 2014-11-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Human application of engineered chimeric antigen receptor (car) t-cells
WO2015087599A1 (ja) 2013-12-09 2015-06-18 ソニー株式会社 撮像ユニット、レンズ鏡筒および携帯端末
KR20200032763A (ko) * 2014-02-04 2020-03-26 카이트 파마 인코포레이티드 B 세포 악성종양 및 다른 암을 치료하는데 유용한 자가 t 세포 및 그의 조성물의 생산 방법
BR112016024957A2 (pt) * 2014-04-25 2017-10-24 Bluebird Bio Inc métodos aperfeiçoados para fabricação de terapias celulares adotivas
NZ728555A (en) 2014-07-24 2024-07-26 2Seventy Bio Inc Bcma chimeric antigen receptors
BR112017009220B1 (pt) 2014-11-05 2022-04-12 Juno Therapeutics Inc Método de transdução de células
GB201423361D0 (en) 2014-12-30 2015-02-11 Immatics Biotechnologies Gmbh Method for the absolute Quantification of naturally processed HLA-Restricted cancer peptides
US9944894B2 (en) 2015-01-16 2018-04-17 General Electric Company Pluripotent stem cell expansion and passage using a rocking platform bioreactor
GB201504502D0 (en) 2015-03-17 2015-04-29 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against pancreatic cancer and other cancers
GB201505305D0 (en) 2015-03-27 2015-05-13 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against various tumors
GB201505585D0 (en) 2015-03-31 2015-05-13 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides and scaffolds for use in immunotherapy against renal cell carinoma (RCC) and other cancers
GB201507719D0 (en) 2015-05-06 2015-06-17 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides and scaffolds thereof for use in immunotherapy against colorectal carcinoma (CRC) and other cancers
GB201510771D0 (en) 2015-06-19 2015-08-05 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy and methods for generating scaffolds for the use against pancreatic cancer
GB201511191D0 (en) 2015-06-25 2015-08-12 Immatics Biotechnologies Gmbh T-cell epitopes for the immunotherapy of myeloma
GB201511546D0 (en) 2015-07-01 2015-08-12 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against ovarian cancer and other cancers
GB201511792D0 (en) 2015-07-06 2015-08-19 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against esopageal cancer and other cancers
MY189596A (en) 2015-07-15 2022-02-18 Immatics Biotechnologies Gmbh A novel peptides for use in immunotherapy against epithelial ovarian cancer and other cancers
GB201513921D0 (en) 2015-08-05 2015-09-23 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against prostate cancer and other cancers
US20170136108A1 (en) 2015-08-28 2017-05-18 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides, combination of peptides and scaffolds for use in immunotherapeutic treatment of various cancers
GB201517538D0 (en) 2015-10-05 2015-11-18 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against small cell lung cancer and other cancers
MA45004A (fr) 2015-10-09 2019-03-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Anticorps spécifiques anti-wt1-hla
EP3365453A2 (en) 2015-10-22 2018-08-29 Juno Therapeutics GmbH Methods, kits, agents and apparatuses for transduction
IL295858A (en) * 2015-12-04 2022-10-01 Novartis Ag Preparations and methods for immuno-oncology
GB201521746D0 (en) 2015-12-10 2016-01-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against CLL and other cancers
GB201521894D0 (en) 2015-12-11 2016-01-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against various cancers
GB201522667D0 (en) 2015-12-22 2016-02-03 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against breast cancer and other cancers
WO2017127729A1 (en) * 2016-01-20 2017-07-27 Fate Therapeutics, Inc. Compositions and methods for immune cell modulation in adoptive immunotherapies
GB201602918D0 (en) 2016-02-19 2016-04-06 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against NHL and other cancers
GB201603568D0 (en) 2016-03-01 2016-04-13 Immatics Biotechnologies Gmbh Efficient treatment options including peptides and combination of peptide and cell based medicaments for use in immunotherapy against urinary bladder cancer
GB201603987D0 (en) 2016-03-08 2016-04-20 Immatics Biotechnologies Gmbh Uterine cancer treatments
AU2017238054B2 (en) * 2016-03-21 2023-10-19 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. T-cell exhaustion state-specific gene expression regulators and uses thereof
AU2017248259A1 (en) * 2016-04-07 2018-10-25 Bluebird Bio, Inc. Chimeric antigen receptor T cell compositions
ES2957890T3 (es) 2016-04-08 2024-01-29 Univ Emory Métodos de tratamiento del cáncer y las enfermedades infecciosas mediante terapias celulares
EP3463396A1 (en) * 2016-06-07 2019-04-10 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin in der Helmholtz-Gemeinschaft Chimeric antigen receptor and car-t cells that bind bcma
WO2018026953A1 (en) * 2016-08-02 2018-02-08 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
DE102016115246C5 (de) 2016-08-17 2018-12-20 Immatics Biotechnologies Gmbh Neue t-zellrezeptoren und deren verwendung in immuntherapie
DE102016123859B3 (de) 2016-12-08 2018-03-01 Immatics Biotechnologies Gmbh Neue T-Zellrezeptoren und deren Verwendung in Immuntherapie

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023195764A1 (ko) * 2022-04-06 2023-10-12 주식회사 지씨셀 면역세포에 대한 표적 유전자 도입 방법
WO2024144300A1 (ko) * 2022-12-28 2024-07-04 서울대학교산학협력단 항원 특이적 t 세포의 증식 유도 방법

Also Published As

Publication number Publication date
CN111684062A (zh) 2020-09-18
BR112020016176A2 (pt) 2022-02-22
CA3090416A1 (en) 2019-08-15
US20190247433A1 (en) 2019-08-15
JP7470640B2 (ja) 2024-04-18
AU2019218093A1 (en) 2020-09-10
MX2020008327A (es) 2020-10-28
IL276600A (en) 2020-09-30
TW202002995A (zh) 2020-01-16
JP2021512621A (ja) 2021-05-20
SG11202007543TA (en) 2020-09-29
IL276600B2 (en) 2024-07-01
US20210030803A1 (en) 2021-02-04
US11464800B2 (en) 2022-10-11
IL276600B1 (en) 2024-03-01
EP3749753A1 (en) 2020-12-16
MA51792A (fr) 2020-12-16
WO2019157298A1 (en) 2019-08-15
TWI834635B (zh) 2024-03-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7470640B2 (ja) Ｔ細胞を製造する方法
US10968431B2 (en) Adoptive transfer of CD8+ T cell clones derived from central memory cells
CA2938887C (en) Chimeric antigen receptors and methods of making
BR112021003305A2 (pt) métodos para produzir células que expressam receptor de antígeno quimérico
KR20220031615A (ko) 직접 분류에 의한 t 세포의 제조 방법 및 이의 조성물
CN110713977B (zh) 一种cd8 t细胞的培养扩增方法
US20210292427A1 (en) Method for treating tumor using immune effector cell
US20220096615A1 (en) Compositions and methods for treating immunological dysfunction
WO2021148019A1 (zh) 病毒载体转导细胞的方法
US20200297768A1 (en) Cd28 t cell cultures, compositions, and methods of using thereof
EA045289B1 (ru) Способ получения т-клеток
US20240117309A1 (en) Methods for expanding t cell populations
EP3941487B1 (en) Cd28 t cell cultures, compositions, and methods of using thereof
WO2024153124A1 (zh) 经修饰的原代t细胞及其用途
TW202332765A (zh) 用於ｔ細胞療法之ｔ細胞群體的單核球耗盡
CN117979978A (zh) 从干细胞产生经工程化的t细胞

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination