KR20200032763A - B 세포 악성종양 및 다른 암을 치료하는데 유용한 자가 t 세포 및 그의 조성물의 생산 방법 - Google Patents

B 세포 악성종양 및 다른 암을 치료하는데 유용한 자가 t 세포 및 그의 조성물의 생산 방법 Download PDF

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카이트 파마 인코포레이티드
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Abstract

T 세포의 제조 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 표적 세포의 표면 상의 특이적 항원 모이어티를 인식하는 세포 표면 수용체를 발현하는 T 세포의 제조 방법이 제공된다. 이러한 방법은 (1) 공여 대상체로 얻은 림프구의 집단을 농축하는 단계; (2) 림프구의 집단을 1종 이상의 T-세포 자극제로 자극하여 활성화된 T 세포의 집단을 생산하며, 여기서 자극은 무혈청 배양 배지를 사용하여 폐쇄 시스템에서 수행되는 것인 단계; (3) 활성화된 T 세포의 집단을 단일 사이클 형질도입을 사용하여 세포 표면 수용체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입시켜 형질도입된 T 세포의 집단을 생산하며, 여기서 형질도입은 무혈청 배양 배지를 사용하여 폐쇄 시스템에서 수행되는 것인 단계; 및 (4) 형질도입된 T 세포의 집단을 미리 결정된 시간 동안 확장시켜 조작된 T 세포의 집단을 생산하며, 여기서 확장은 무혈청 배양 배지를 사용하여 폐쇄 시스템에서 수행되는 것인 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본원에 기재된 방법에 의해 생산되는 조작된 T 세포의 집단 및 그의 제약 조성물이 본원에 제공된다.

Description

B 세포 악성종양 및 다른 암을 치료하는데 유용한 자가 T 세포 및 그의 조성물의 생산 방법 {METHODS FOR PRODUCING AUTOLOGOUS T CELLS USEFUL TO TREAT B CELL MALIGNANCIES AND OTHER CANCERS AND COMPOSITIONS THEREOF}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2014년 2월 4일 출원된 미국 특허 가출원 61/935,833의 이익을 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
정부 지분의 진술
본 발명은 미국 보건복지부의 기관인 국립 암 연구소 (NCI)와의 공동 연구 개발 협정 하에 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.
암 요법에 사용하기 위한 자가 조작된 T 세포의 생산 공정은 긴 시간을 필요로 하고 (10-24일), 2 사이클의 레트로바이러스 형질도입을 수반하고, 상업적인 용도를 위해 적합성이 불량하다 (문헌 [Kochenderfer et al., Blood. 2012 119: 2709-2720; Johnson, et al., Blood. 2009; 114(3):535-546] 참조). 따라서, 이들 제한사항을 극복하기 위해 T 세포 제조 공정에 대한 개선을 개발하는 것이 바람직할 것이다.
본원에 기재된 특정 실시양태에 따르면, 표적 세포의 표면 상의 특이적 항원 모이어티를 인식하는 세포 표면 수용체를 발현하는 T 세포의 제조 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 표적 세포의 표면 상의 특이적 항원 모이어티를 인식하는 세포 표면 수용체를 발현하는 T 세포의 제조 방법이 본원에 제공되며, 이 방법은 공여 대상체로 얻은 림프구의 집단을 농축하는 단계; 림프구의 집단을 1종 이상의 T-세포 자극제로 자극하여 활성화된 T 세포의 집단을 생산하며, 여기서 자극은 무혈청 배양 배지를 사용하여 폐쇄 시스템에서 수행되는 것인 단계; 활성화된 T 세포의 집단을 단일 사이클 형질도입을 사용하여 세포 표면 수용체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입시켜 형질도입된 T 세포의 집단을 생산하며, 여기서 형질도입은 무혈청 배양 배지를 사용하여 폐쇄 시스템에서 수행되는 것인 단계; 및 형질도입된 T 세포의 집단을 미리 결정된 시간 동안 확장시켜 조작된 T 세포의 집단을 생산하며, 여기서 확장은 무혈청 배양 배지를 사용하여 폐쇄 시스템에서 수행되는 것인 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포 표면 수용체는 T 세포 수용체 (TCR) 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)일 수 있다. 특정 실시양태에서, 표적 세포는 암 세포일 수 있다. 특정 실시양태에서, 암 세포는 B 세포 악성종양일 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포 표면 수용체는 항-CD19 CAR일 수 있다. 특정 실시양태에서, 항-CD19 CAR은 FMC63-28Z CAR 또는 FMC63-CD828BBz CAR일 수 있다. 특정 실시양태에서, 1종 이상의 T-세포 자극제는 항-CD3 항체 및 IL-2일 수 있다. 특정 실시양태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 특정 실시양태에서, 레트로바이러스 벡터는 MSGV1 감마 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 특정 실시양태에서, MSGV1 감마 레트로바이러스 벡터는 MSGV-FMC63-28Z 또는 MSGV-FMC63-CD828BBz 감마 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 특정 실시양태에서, 형질도입된 T 세포의 집단을 확장시키기 위해 미리 결정된 시간은 3일일 수 있다. 특정 실시양태에서, 림프구 집단의 농축으로부터 조작된 T 세포의 생산까지의 시간은 6일일 수 있다. 특정 실시양태에서, 조작된 T 세포는 암 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 암 환자 및 공여 대상체는 동일한 개체일 수 있다. 특정 실시양태에서, 폐쇄 시스템은 폐쇄 백 시스템일 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포의 집단은 나이브 T 세포를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 조작된 T 세포의 집단 중 약 35-43%는 나이브 T 세포를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 조작된 T 세포의 집단 중 적어도 약 35%는 나이브 T 세포를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 조작된 T 세포의 집단 중 적어도 약 43%는 나이브 T 세포를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 실시양태에 따르면, 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 표적 세포의 표면 상의 특이적 항원 모이어티를 인식하는 세포 표면 수용체를 발현하는 조작된 T 세포의 집단이 제공된다. 특정 실시양태에서, 공여 대상체로 얻은 림프구의 집단을 농축하는 단계; 림프구의 집단을 1종 이상의 T-세포 자극제로 자극하여 활성화된 T 세포의 집단을 생산하며, 여기서 자극은 무혈청 배양 배지를 사용하여 폐쇄 시스템에서 수행되는 것인 단계; 활성화된 T 세포의 집단을 단일 사이클 형질도입을 사용하여 세포 표면 수용체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입시켜 형질도입된 T 세포의 집단을 생산하며, 여기서 형질도입은 무혈청 배양 배지를 사용하여 폐쇄 시스템에서 수행되는 것인 단계; 및 형질도입된 T 세포의 집단을 미리 결정된 시간 동안 확장시켜 조작된 T 세포의 집단을 생산하며, 여기서 확장은 무혈청 배양 배지를 사용하여 폐쇄 시스템에서 수행되는 것인 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 조작된 T 세포의 집단은 본원에 기재된 임의의 것일 수 있다.
본원에 기재된 특정 실시양태에 따르면, 조작된 T 세포의 집단을 포함하는 제약 조성물이 제공된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 T 세포의 집단을 포함하는 제약 조성물이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 치료 유효 용량의 조작된 T 세포를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포 표면 수용체는 T 세포 수용체 (TCR) 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)일 수 있다. 특정 실시양태에서, CAR은 FMC63-28Z CAR 또는 FMC63-CD828BBZ CAR일 수 있다. 특정 실시양태에서, 치료 유효 용량은 체중 킬로그램당 약 1백만개 초과 내지 약 3백만개 미만의 조작된 T 세포 (세포/kg)일 수 있다. 특정 실시양태에서, 치료 유효 용량은 약 2백만개의 조작된 T 세포/kg일 수 있다.
본원에 기재된 특정 실시양태에 따르면, T 세포의 제조 방법이 제공된다. 림프구의 집단을 얻는 단계; 림프구의 집단을 1종 이상의 자극제로 자극하여 활성화된 T 세포의 집단을 생산하며, 여기서 자극은 무혈청 배양 배지를 사용하여 폐쇄 시스템에서 수행되는 것인 단계; 활성화된 T 세포의 집단을 적어도 1회 사이클 형질도입을 사용하여 세포 표면 수용체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입시켜 형질도입된 T 세포의 집단을 생산하며, 여기서 형질도입은 무혈청 배양 배지를 사용하여 폐쇄 시스템에서 수행되는 것인 단계; 및 형질도입된 T 세포의 집단을 확장시켜 조작된 T 세포의 집단을 생산하며, 여기서 확장은 무혈청 배양 배지를 사용하여 폐쇄 시스템에서 수행되는 것인 단계를 포함하는, T 세포의 제조 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 조작된 T 세포의 집단은 본원에 기재된 임의의 것일 수 있다.
도 1은 본원에 기재된 특정 실시양태에 따른 T 세포 제조 공정 ("개선된" 공정)을 예시하는 다이어그램이다. T 세포의 배가 시간은 대상체마다 약간씩 상이할 수 있기 때문에, 총 세포수가 관심 표적 용량을 전달하기에 불충분한 경우에 백에서 72시간을 초과하는 추가의 성장 시간 (즉, 3-6일)이 고려된다 (* 참조).
도 2는 한 실시양태에 따라, 전통적으로 사용되는 공정 ("종래" 공정)에 비해 개선된 공정을 예시하는 다이어그램이다.
도 3은 한 실시양태에 따라, 종래 공정에 비해 개선된 공정에서의 배양 확장을 예시하는 막대 그래프이다. y 축은 각각의 5회 실행 (x 축)에 대한 세포의 배수 확장을 제시한다. 배수 배양 확장은 일정 규모 조작 실행에서 종래 및 개선된 공정 간에 유사하다.
도 4는 한 실시양태에 따라, 종래 및 개선된 공정에서 제시된 CD3+ 세포 표현형 (도 4A) 및 CD3+ 세포 활성화 (도 4B) 마커에 대한 제6일 및 제10일의 T 세포 표현형을 예시하는 일련의 그래프를 제시한다. T 세포 표현형은 종래 및 개선된 공정 사이에 대등하지만, 제6일 세포는 덜 분화된다. Teff= 이펙터 T 세포; Tem= 이펙터 기억 T 세포, Tcm= 중심 기억 T 세포.
도 5는 한 실시양태에 따라, 종래 및 개선된 공정에서 제6일의 세포 표현형을 예시하는 일련의 그래프를 제시한다.
도 6은 한 실시양태에 따라, 개선된 공정의 자극, 형질도입 및 확장기 동안 1일 세포 카운트를 제시하는 모식도이다.
도 7은 한 실시양태에 따라, MSGV1 감마 레트로바이러스 골격 (서열식별번호 (SEQ ID NO): 4)의 핵산 서열을 제시한다.
도 8은 한 실시양태에 따라, 백을 코팅하기 위해 사용되는 레트로넥틴(RetroNectin)® 농도의 함수로서의 형질도입 효율을 제시한다. RN= 레트로넥틴® 농도 (μg/mL). 결과는 2명의 공여자로부터의 PL07 백 내에서 형질도입 후 제6일에 측정하였다.
도 9는 한 실시양태에 따라, 세척 단계의 존재 및 부재 하의 형질도입 효율을 제시한다. 결과는 오리겐 퍼마라이프(Origen PermaLife)™ 백 내에서 형질도입 후 제6일에 측정하였다.
도 10은 한 실시양태에 따라, 옵트마이저(OpTmizer)™ 배지에서 형질도입 효율에 대한 레트로넥틴® 농도의 영향을 제시한다. RN= 레트로넥틴® 농도 (μg/mL). "개방"은 형질도입이 AIM V® + 5% 인간 혈청 내에서 플레이트에서 실행된 조건을 나타낸다.
도 11은 한 실시양태에 따라, FACS에 의해 평가된, 4시간 동안 CD19+ Nalm6 세포와의 공동-인큐베이션 후에 CD107a 발현 및 IFN-감마 발현에 의해 측정된 형질도입된 T 세포의 활성을 제시한다. "개방"은 형질도입이 AIM V®+ 5% 인간 혈청 내에서 플레이트에서 실행된 조건을 나타낸다. 대조군 T는 동결된 CAR-양성 형질도입된 PBMC의 참조 샘플을 나타낸다.
도 12는 최적화된 프로파일을 위한 속도 제어 동결기 챔버 (하부 선) 및 산물 온도 (상부 선)의 온도 프로파일을 제시한다. 표시된 프로파일은 중요한 영역만을 제시하기 위해 간결하게 말단부가 절단되었다.
본원에 기재된 실시양태에 따르면, 병리학적 질환 또는 병태를 갖는 환자의 치료에 유용할 수 있는 T 세포 제제의 제조를 위한 방법 또는 공정을 제공한다. T 세포 산물의 알려진 생산 방법에 비해, 본원에 기재된 방법 및 공정은 유의하게 더 짧은 시간, 대략 6일 내에 완료되고, 따라서 세포를 임상 장소로 보내는데 유의한 시간상 이점을 제공할 수 있다. 또한, 본원에 기재된 방법을 사용하여 생산된 조작된 T 세포의 집단, 및 그의 제약 조성물이 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 표적 세포의 표면 상의 특이적 항원 모이어티를 인식하는 세포 표면 수용체를 발현하는 T 세포를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 세포 표면 수용체는 야생형 또는 재조합 T 세포 수용체 (TCR), 키메라 항원 수용체 (CAR), 또는 표적 세포와 연관된 항원 모이어티를 인식할 수 있는 임의의 다른 표면 수용체일 수 있다. CAR 및 TCR에 의해 인식되는 항원 모이어티의 형태는 약간 상이하다. CAR은 표적 결합 도메인으로서 단일쇄 가변 단편 (scFv)을 갖고, 이것은 CAR의 단일쇄 단백질로서의 발현을 허용한다. 이에 의해, CAR은 표적 세포 표면 상의 무손상 단백질의 일부인 천연 암 항원을 인식할 수 있다. TCR은 특정 세포의 표면 상의 MHC 단백질에 의해 제시되는 특정 펩티드와 결합하도록 설계된 2개의 단백질 쇄를 갖는다. TCR은 표적 세포의 표면 상에 발현되는 MHC 분자의 맥락에서 펩티드를 인식하기 때문에, TCR은 암 세포의 표면 상에 직접 제시되는 암 항원 뿐만 아니라, 종양, 염증 및 감염된 미세환경에서 및 2차 림프 기관에서 항원-제시 세포에 의해 제시되는 암 항원을 인식하는 잠재력을 갖는다. 항원-제시 세포는 면역 반응의 증폭을 담당하는 천연 면역계 세포이다.
따라서, 본원에 기재된 실시양태에 따르면, 세포 표면 수용체를 발현하는 제조된 T 세포는 감염된 세포, 손상된 세포, 또는 기능장애 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는, 임의의 표적 세포를 표적화하고 사멸시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 표적 세포의 예는 암 세포, 바이러스 감염 세포, 박테리아 감염 세포, 기능장애 활성화된 염증 세포 (예를 들어, 염증 내피 세포), 및 기능장애성 면역 반응에 수반된 세포 (예를 들어, 자가면역 질환에 수반된 세포)를 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 항원 모이어티는 암 또는 암 세포와 연관된다. 이러한 항원 모이어티는 707-AP (707 알라닌 프롤린), AFP (알파 (a)-태아단백질), ART-4 (T4 세포에 의해 인식되는 선암종 항원), BAGE (B 항원; b-카테닌/m, b-카테닌/돌연변이된), BCMA (B 세포 성숙 항원), Bcr-abl (절단점 클러스터 영역-Abelson), CAIX (탄산 탈수효소 IX), CD19 (분화 클러스터 19), CD20 (분화 클러스터 20), CD22 (분화 클러스터 22), CD30 (분화 클러스터 30), CD33 (분화 클러스터 33), CD44v7/8 (분화 클러스터 44, 엑손 7/8), CAMEL (흑색종 상 CTL-인식 항원), CAP-1 (암배아 항원 펩티드 - 1), CASP-8 (카스파제-8), CDC27m (세포-분열 사이클 27 돌연변이된), CDK4/m (시클린-의존성 키나제 4 돌연변이된), CEA (암배아 항원), CT (암/정소 (항원)), Cyp-B (시클로필린 B), DAM (분화 항원 흑색종), EGFR (표피 성장 인자 수용체), EGFRvIII (표피 성장 인자 수용체, 변이체 III), EGP-2 (상피 당단백질 2), EGP-40 (상피 당단백질 40), Erbb2, 3, 4 (적모구성 백혈병 바이러스 종양 유전자 상동체-2, -3, 4), ELF2M (신장 인자 2 돌연변이된), ETV6-AML1 (Ets 변이체 유전자 6/급성 골수성 백혈병 1 유전자 ETS), FBP (폴레이트 결합 단백질), fAchR (태아 아세틸콜린 수용체), G250 (당단백질 250), GAGE (G 항원), GD2 (디시알로강글리오시드 2), GD3 (디시알로강글리오시드 3), GnT-V (N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 V), Gp100 (당단백질 100kD), HAGE (헬리코스 항원), HER-2/neu (인간 표피 수용체-2/신경계; EGFR2로도 알려짐), HLA-A (인간 백혈구 항원-A) HPV (인간 유두종 바이러스), HSP70-2M (열 충격 단백질 70 - 2 돌연변이된), HST-2 (인간 반지세포 종양 - 2), hTERT 또는 hTRT (인간 텔로머라제 역전사효소), iCE (장 카르복실 에스테라제), IL-13R-a2 (인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2), KIAA0205, KDR (키나제 삽입 도메인 수용체), κ-경쇄, LAGE (L 항원), LDLR/FUT (저밀도 지질 수용체/GDP-L-푸코스: b-D-갈락토시다제 2-a-L푸코실트랜스퍼라제), LeY (루이스(Lewis)-Y 항체), L1CAM (L1 세포 부착 분자), MAGE (흑색종 항원), MAGE-A1 (흑색종-연관 항원 1), 메소텔린, 뮤린 CMV 감염 세포, MART-1/Melan-A (T 세포-1에 의해 인식되는 흑색종 항원/흑색종 항원 A), MC1R (멜라노코르틴 1 수용체), 미오신/m (미오신 돌연변이된), MUC1 (뮤신 1), MUM-1, -2, -3 (흑색종 유비쿼터스 돌연변이된 1, 2, 3), NA88-A (환자 M88의 NA cDNA 클론), NKG2D (천연 킬러 그룹 2, 멤버 D) 리간드, NY-BR-1 (뉴욕 유방 분화 항원 1), NY-ESO-1 (뉴욕 식도 편평 세포 암종-1), 종양태아성 항원 (h5T4), P15 (단백질 15), p190 마이너 bcr-abl (190KD bcr-abl의 단백질), Pml/RARa (전골수성 백혈병/레티노산 수용체 a), PRAME (흑색종의 우선적으로 발현되는 항원), PSA (전립선-특이적 항원), PSCA (전립선 줄기세포 항원), PSMA (전립선-특이적 막 항원), RAGE (신장 항원), RU1 또는 RU2 (신장 유비쿼터스 1 또는 2), SAGE (육종 항원), SART-1 또는 SART-3 (편평 항원 거부 종양 1 또는 3), SSX1, -2, -3, 4 (활막 육종 X1, -2, -3, -4), TAA (종양-연관 항원), TAG-72 (종양-연관 당단백질 72), TEL/AML1 (전위 Ets-패밀리 백혈병/급성 골수성 백혈병 1), TPI/m (트리오스포스페이트 이소머라제 돌연변이된), TRP-1 (티로시나제 관련 단백질 1, 또는 gp75), TRP-2 (티로시나제 관련 단백질 2), TRP-2/INT2 (TRP-2/인트론 2), VEGF-R2 (혈관 내피 성장 인자 수용체 2), 또는 WT1 (윌름스 종양 유전자)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 측면에서, 세포 표면 수용체는 항-707-AP TCR, 항-AFP TCR, 항-ART-4 TCR, 항-BAGE TCR, 항-Bcr-abl TCR, 항-CAMEL TCR, 항-CAP-1 TCR, 항-CASP-8 TCR, 항-CDC27m TCR, 항-CDK4/m TCR, 항-CEA TCR, 항-CT TCR, 항-Cyp-B TCR, 항-DAM TCR, 항-TCR, 항-EGFRvIII TCR, 항-ELF2M TCR, 항-ETV6-AML1 TCR, 항-G250 TCR, GAGE TCR, 항-GnT-V TCR, 항-Gp100 TCR, 항-HAGE TCR, 항-HER-2/neu TCR, 항-HLA-A TCR, 항-HPV TCR, 항-HSP70-2M TCR, 항-HST-2 TCR, 항-hTERT TCR 또는 항-hTRT TCR, 항-iCE TCR, 항-KIAA0205, 항-LAGE (L 항원), 항-LDLR/FUT TCR, 항-MAGE TCR, 항-MART-1/Melan-A TCR, 항-MC1R TCR, 항-미오신/m TCR, 항-MUC1 TCR, 항-MUM-1, -2, -3 TCR, 항-NA88-A TCR, 항-NY-ESO-1 TCR, 항-P15 TCR, 항-p190 마이너 bcr-abl TCR, 항-Pml/RARa TCR, 항-PRAME TCR, 항-PSA TCR, 항-PSMA TCR, 항-RAGE TCR, 항-RU1 TCR 또는 항-RU2 TCR, 항-SAGE TCR, 항-SART-1 TCR 또는 항-SART-3 TCR, 항-SSX1, -2, -3, 4 TCR, 항-TEL/AML1 TCR, 항-TPI/m TCR, 항-TRP-1 TCR, 항-TRP-2 TCR, 항-TRP-2/INT2 TCR, 또는 항-WT1 TCR을 포함하나, 이에 제한되지는 않는, 암 세포 상의 특이적 항원 모이어티를 인식하는 임의의 TCR이다.
다른 측면에서, 세포 표면 수용체는 T 세포에 의해 발현될 수 있고 암 세포 상의 특이적 항원 모이어티를 인식하는 임의의 CAR이다. 특정 CAR은 항원 결합 도메인 (예를 들어, scFv) 및 신호전달 도메인 (예를 들어, CD3 제타 쇄)을 함유한다. 다른 CAR은 항원 결합 도메인 (예를 들어, scFv), 신호전달 도메인 (예를 들어, CD3 제타 쇄), 및 공동-자극 도메인 (예를 들어, CD28)을 함유한다. 또 다른 CAR은 항원 결합 도메인 (예를 들어, scFv), 신호전달 도메인 (예를 들어, CD3 제타 쇄), 및 2개의 공동-자극 도메인 (예를 들어, CD28 및 4-1BB)을 함유한다. 본원에 기재된 방법에 따라 생성되는 T 세포에 의해 발현될 수 있는 표면 수용체 CAR의 예는 항-BCMA CAR, 항-CAIX CAR, 항-CD19 CAR, 항-CD20 CAR, 항-CD22 CAR, 항-CD30 CAR, 항-CD33 CAR, 항-CD44v7/8 CAR, 항-CEA CAR, 항-EGFRvIII, 항-EGP-2, 항-EGP-40 CAR, 항-Erbb2, 3, 4 CAR, 항-FBP CAR, 항-fAchR CAR, 항-GD2 CAR, 항-GD3 CAR, 항-HER2/neu CAR, 항-IL-13R-a2 CAR, 항-KDR CAR, 항-κ-경쇄 CAR, 항-LeY CAR, 항-L1CAM CAR, 항-MAGE-A1 CAR, 항-메소텔린 CAR, 항-뮤린 CMV 감염된 세포에 대해 지정된 CAR, 항-MUC1 CAR, 항-NKG2D 리간드 CAR, 항-NY-BR-1 CAR, 항-h5T4 CAR, 항-PSCA CAR, 항-PSMA CAR, 항-TAA CAR, 항-TAG-72 CAR, 또는 항-VEGF-R2 CAR을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 세포 표면 수용체는 임의의 항-CD19 CAR이다. 한 측면에서, 항-CD19 CAR은 세포외 scFv 도메인, CD28 분자의 세포내 및/또는 막횡단 부분, CD28 분자의 선택적인 세포외 부분, 및 세포내 CD3제타 도메인을 포함한다. 항-CD19 CAR은 또한 추가의 도메인, 예컨대 CD8 세포외 및/또는 막횡단 영역, 세포외 이뮤노글로불린 Fc 도메인 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), 또는 1개 이상의 추가의 신호전달 도메인, 예컨대 41BB, OX40, CD2, CD16, CD27, CD30, CD40, PD-1, ICOS, LFA-1, IL-2 수용체, Fc 감마 수용체, 또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프를 갖는 임의의 다른 공동자극 도메인을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 세포 표면 수용체는 문헌 [Kochenderfer et al., J Immunother. 2009 September; 32(7): 689-702, "Construction and Pre-clinical Evaluation of an Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor"]에 제시된 항-CD19 CAR, 예컨대 FMC63-28Z CAR 또는 FMC63-CD828BBZ CAR이고, 상기 문헌의 내용은 FMC63-28Z CAR 또는 FMC63-CD828BBZ CAR을 발현하는 T 세포를 생산하기 위해 사용되는 벡터를 구축하는 방법을 제공하기 위해 본원에 참조로 포함된다.
다른 실시양태에서, 항원 모이어티는 바이러스 감염 세포와 연관된다 (즉, 바이러스 항원 모이어티). 이러한 항원 모이어티는 엡스타인-바르 (Epstein-Barr) 바이러스 (EBV) 항원 (예를 들어, EBNA-1, EBNA-2, EBNA-3, LMP-1, LMP-2), A형 간염 바이러스 항원 (예를 들어, VP1, VP2, VP3), B형 간염 바이러스 항원 (예를 들어, HBsAg, HBcAg, HBeAg), C형 간염 바이러스 항원 (예를 들어, 외피 당단백질 E1 및 E2), 단순 포진 바이러스 1형, 2형, 또는 8형 (HSV1, HSV2, 또는 HSV8) 바이러스 항원 (예를 들어, 당단백질 gB, gC, gC, gE, gG, gH, gI, gJ, gK, gL, gM, UL20, UL32, US43, UL45, UL49A), 시토메갈로바이러스 (CMV) 바이러스 항원 (예를 들어, 당단백질 gB, gC, gC, gE, gG, gH, gI, gJ, gK, gL, gM 또는 다른 외피 단백질), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 바이러스 항원 (당단백질 gp120, gp41, 또는 p24), 인플루엔자 바이러스 항원 (예를 들어, 헤마글루티닌 (HA) 또는 뉴라미니다제 (NA)), 홍역 또는 볼거리 바이러스 항원, 인간 유두종바이러스 (HPV) 바이러스 항원 (예를 들어, L1, L2), 파라인플루엔자 바이러스 바이러스 항원, 풍진 바이러스 바이러스 항원, 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV) 바이러스 항원, 또는 수두-대상포진 바이러스 바이러스 항원을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 실시양태에서, 세포 표면 수용체는 표적 바이러스 감염 세포 상의 임의의 상기 언급된 바이러스 항원을 인식하는 임의의 TCR 또는 임의의 CAR일 수 있다.
다른 실시양태에서, 항원 모이어티는 면역 또는 염증 기능장애를 갖는 세포와 연관된다. 이러한 항원 모이어티는 미엘린 염기성 단백질 (MBP) 미엘린 단백지질 단백질 (PLP), 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 (MOG), 암배아 항원 (CEA), 프로-인슐린, 글루타민 데카르복실라제 (GAD65, GAD67), 열 충격 단백질 (HSP), 또는 병원성 자가면역 과정에 수반되거나 연관된 임의의 다른 조직 특이적 항원을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 공여 대상체로 얻은 림프구의 집단을 농축하는 단계를 포함할 수 있다. 공여 대상체는 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 세포의 집단으로 처리되는 암 환자 (즉, 자가 공여자)일 수 있거나, 또는 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 세포의 집단의 생성 시에 상이한 개체 또는 암 환자의 치료를 위해 사용될 림프구 샘플을 공여하는 개체 (즉, 동종 공여자)일 수 있다. 림프구의 집단은 관련 기술분야에서 사용되는 임의의 적합한 방법에 의해 공여 대상체로부터의 얻을 수 있다. 예를 들어, 림프구의 집단은 임의의 적합한 체외 방법, 정맥천자, 또는 혈액 및/또는 림프구의 샘플을 얻는 다른 혈액 수집 방법에 의해 얻을 수 있다. 한 실시양태에서, 림프구의 집단은 분리반출술에 의해 얻는다.
림프구 집단의 농축은 분리 배지의 사용 (예를 들어, 피콜-파크(Ficoll-Paque)™, 로제트셉(RosetteSep)™ HLA 총 림프구 농축 칵테일, 림프구 분리 배지 (LSA) (엠피 바이오메디칼 (MP Biomedical) 카탈로그 번호 0850494X) 등), 여과 또는 세광에 의한 세포 크기, 형태 또는 밀도 분리, 면역자기 분리 (예를 들어, 자기-활성화된 세포 분류 시스템, MACS), 형광 분리 (예를 들어, 형광 활성화된 세포 분류 시스템, FACS), 또는 비드 기반 칼럼 분리를 포함하나, 이에 제한되지는 않는, 임의의 적합한 분리 방법에 의해 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 림프구의 집단을 1종 이상의 T-세포 자극제로 자극하여 활성화된 T 세포의 집단을 생산하는 단계를 포함할 수 있다. T-세포 자극 또는 공동-자극 분자를 표적화하는 항체 또는 그의 기능적 단편 (예를 들어, 항-CD2 항체, 항-CD3 항체, 항-CD28 항체, 또는 그의 기능적 단편), T 세포 시토카인 (예를 들어, 임의의 단리된, 야생형, 또는 재조합 시토카인, 예컨대 인터류킨 1 (IL-1), 인터류킨 2, (IL-2), 인터류킨 4 (IL-4), 인터류킨 5 (IL-5), 인터류킨 7 (IL-7), 인터류킨 15 (IL-15), 종양 괴사 인자 α (TNFα)), 또는 임의의 다른 적합한 미토겐 (예를 들어, 테트라데카노일 포르볼 아세테이트 (TPA), 피토헤마글루티닌 (PHA), 콘카나발린 A (conA), 리포폴리사카라이드 (LPS), 억새풀 미토겐 (PWM)) 또는 T-세포 자극 또는 공동-자극 분자에 대한 천연 리간드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는, 1종 이상의 적합한 T-세포 자극제의 임의의 조합이 활성화된 T 세포의 집단을 생산하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 림프구의 집단을 자극하는 단계는 림프구의 집단을 미리 결정된 온도에서, 미리 결정된 시간 동안, 및/또는 미리 결정된 CO2 수준의 존재 하에 1종 이상의 T-세포 자극제로 자극하는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 자극을 위한 미리 결정된 온도는 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 또는 약 39℃일 수 있다. 특정 실시양태에서, 자극을 위한 미리 결정된 온도는 약 34-39℃일 수 있다. 특정 실시양태에서, 자극을 위한 미리 결정된 온도는 약 35-37℃일 수 있다. 특정 실시양태에서, 바람직한 자극을 위한 미리 결정된 온도는 약 36-38℃일 수 있다. 특정 실시양태에서, 자극을 위한 미리 결정된 온도는 약 36-37℃ 또는 보다 바람직하게는 약 37℃일 수 있다. 특정 실시양태에서, 림프구의 집단을 자극하는 단계는 림프구의 집단을 미리 결정된 시간 동안 1종 이상의 T-세포 자극제로 자극하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 자극을 위한 미리 결정된 시간은 약 24-72시간일 수 있다. 특정 실시양태에서, 자극을 위한 미리 결정된 시간은 약 24-36시간, 약 30-42시간, 약 36-48시간, 약 40-52시간, 약 42-54시간, 약 44-56시간, 약 46-58시간, 약 48-60시간, 약 54-66시간, 또는 약 60-72시간일 수 있다. 특정 실시양태에서, 자극을 위한 미리 결정된 시간은 약 48시간 또는 적어도 약 48시간일 수 있다. 특정 실시양태에서, 자극을 위한 미리 결정된 시간은 약 44-52시간일 수 있다. 특정 실시양태에서, 자극을 위한 미리 결정된 시간은 약 40-44시간, 약 40-48시간, 약 40-52시간, 또는 약 40-56시간일 수 있다. 특정 실시양태에서, 림프구의 집단을 자극하는 단계는 림프구의 집단을 미리 결정된 CO2 수준의 존재 하에 1종 이상의 T-세포 자극제로 자극하는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 자극을 위한 미리 결정된 CO2 수준은 약 1.0-10% CO2일 수 있다. 특정 실시양태에서, 자극을 위한 미리 결정된 CO2 수준은 약 1.0%, 약 2.0%, 약 3.0%, 약 4.0%, 약 5.0%, 약 6.0%, 약 7.0%, 약 8.0%, 약 9.0%, 또는 약 10.0% CO2일 수 있다. 특정 실시양태에서, 자극을 위한 미리 결정된 CO2 수준은 약 3-7% CO2일 수 있다. 특정 실시양태에서, 자극을 위한 미리 결정된 CO2 수준은 약 4-6% CO2일 수 있다. 특정 실시양태에서, 자극을 위한 미리 결정된 CO2 수준은 약 4.5-5.5% CO2일 수 있다. 특정 실시양태에서, 자극을 위한 미리 결정된 CO2 수준은 약 5% CO2일 수 있다. 일부 실시양태에서, 림프구의 집단을 자극하는 단계는 림프구의 집단을 미리 결정된 온도에서, 미리 결정된 시간 동안, 및/또는 미리 결정된 CO2 수준의 존재 하에 (이들의 임의의 조합 하에) 1종 이상의 T-세포 자극제로 자극하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 림프구의 집단을 자극하는 단계는 림프구의 집단을 약 36-38℃의 미리 결정된 온도에서, 약 44-52시간의 미리 결정된 시간 동안, 및 약 4.5-5.5% CO2의 미리 결정된 CO2 수준의 존재 하에 1종 이상의 T-세포 자극제로 자극하는 것을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 림프구의 집단을 자극하는 단계에 사용되는 림프구의 집단은 림프구의 미리 결정된 농도로 존재할 수 있다. 특정 실시양태에서, 림프구의 미리 결정된 농도는 약 0.1 - 10.0 x 106 세포/mL일 수 있다. 특정 실시양태에서, 림프구의 미리 결정된 농도는 약 0.1 - 1.0 x 106 세포/mL, 1.0 - 2.0 x 106 세포/mL, 약 1.0 - 3.0 x 106 세포/mL, 약 1.0 - 4.0 x 106 세포/mL, 약 1.0 - 5.0 x 106 세포/mL, 약 1.0 - 6.0 x 106 세포/mL, 약 1.0 - 7.0 x 106 세포/mL, 약 1.0 - 8.0 x 106 세포/mL, 1.0 - 9.0 x 106 세포/mL, 또는 약 1.0 - 10.0 x 106 세포/mL일 수 있다. 특정 실시양태에서, 림프구의 미리 결정된 농도는 약 1.0 - 2.0 x 106 세포/mL일 수 있다. 특정 실시양태에서, 림프구의 미리 결정된 농도는 약 1.0 - 1.2 x 106 세포/mL, 약 1.0 - 1.4 x 106 세포/mL, 약 1.0 - 1.6 x 106 세포/mL, 약 1.0 - 1.8 x 106 세포/mL, 또는 약 1.0 - 2.0 x 106 세포/mL일 수 있다. 특정 실시양태에서, 림프구의 미리 결정된 농도는 적어도 약 0.1 x 106 세포/mL, 적어도 약 1.0 x 106 세포/mL, 적어도 약 1.1 x 106 세포/mL, 적어도 약 1.2 x 106 세포/mL, 적어도 약 1.3 x 106 세포/mL, 적어도 약 1.4 x 106 세포/mL, 적어도 약 1.5 x 106 세포/mL, 적어도 약 1.6 x 106 세포/mL, 적어도 약 1.7 x 106 세포/mL, 적어도 약 1.8 x 106 세포/mL, 적어도 약 1.9 x 106 세포/mL, 적어도 약 2.0 x 106 세포/mL, 적어도 약 4.0 x 106 세포/mL, 적어도 약 6.0 x 106 세포/mL, 적어도 약 8.0 x 106 세포/mL, 또는 적어도 약 10.0 x 106 세포/mL일 수 있다.
일부 실시양태에서, 항-CD3 항체 (또는 그의 기능적 단편), 항-CD28 항체 (또는 그의 기능적 단편), 또는 항-CD3 및 항-CD28 항체의 조합물은 림프구의 집단을 자극하는 단계에 따라 사용될 수 있다. 임의의 가용성 또는 고정된 항-CD2, 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체 또는 그의 기능적 단편이 사용될 수 있다 (예를 들어, 클론 OKT3 (항-CD3), 클론 145-2C11 (항-CD3), 클론 UCHT1 (항-CD3), 클론 L293 (항-CD28), 클론 15E8 (항-CD28)). 일부 측면에서, 항체는 밀테니이 바이오텍 (Miltenyi Biotec), 비디 바이오사이언시즈 (BD Biosciences) (예를 들어, MACS GMP CD3 퓨어(pure) 1 mg/mL, 파트 번호 170-076-116), 및 이바이오사이언스, 인크. (eBioscience, Inc.)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는, 관련 기술분야에 알려진 공급처로부터의 상업적으로 구입할 수 있다. 또한, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 표준 방법에 의해 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체를 생산하는 방법을 이해할 것이다. 본원에 기재된 방법에서 사용되는 임의의 항체는 생물학적 제품에 대한 관련 당국 지침을 따르기 위해 우수 제조 관리기준 (Good Manufacturing Practices; GMP) 하에 생산되어야 한다. 일부 실시양태에서, 림프구의 집단을 자극하는 단계에 따라 사용될 수 있는 1종 이상의 T 세포 자극제는 T 세포 시토카인의 존재 하에 T-세포 자극 또는 공동-자극 분자를 표적화하는 항체 또는 그의 기능적 단편을 포함한다. 한 측면에서, 1종 이상의 T 세포 자극제는 항-CD3 항체 및 IL-2를 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 자극제는 항-CD3 항체를 약 20 ng/mL-100 ng/mL의 농도로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항-CD3 항체의 농도 약 20 ng/mL, 약 30 ng/mL, 약 40 ng/mL, 약 50 ng/mL, 약 60 ng/mL, 약 70 ng/mL, 약 80 ng/mL, 약 90 ng/mL, 또는 약 100 ng/mL일 수 있다. 특정 실시양태에서, 항-CD3 항체의 농도는 약 50 ng/mL일 수 있다. 대체 실시양태에서, T 세포 활성화는 필요하지 않다. 이러한 실시양태에서, 활성화된 T 세포의 집단을 생산하기 위해 림프구의 집단을 자극하는 단계는 방법으로부터 생략되고, T 림프구에 대해 농축될 수 있는 림프구의 집단은 하기 단계에 따라 형질도입된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 활성화된 T 세포의 집단을 단일 사이클 형질도입을 사용하여 세포 표면 수용체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입시켜 형질도입된 T 세포의 집단을 생산하는 단계를 포함할 수 있다. 몇몇의 재조합 바이러스가 유전 물질을 세포로 전달하기 위한 바이러스 벡터로서 사용되어 왔다. 형질도입 단계에 따라 사용될 수 있는 바이러스 벡터는 재조합 레트로바이러스 벡터, 재조합 렌티바이러스 벡터, 재조합 아데노바이러스 벡터, 및 재조합 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터를 포함하나, 이에 제한되지는 않는, 임의의 동종향성 또는 양종향성 바이러스 벡터일 수 있다. 한 실시양태에서, 활성화된 T 세포의 집단을 형질도입시키기 위해 사용되는 바이러스 벡터는 MSGV1 감마 레트로바이러스 벡터이다. 한 측면에서, 이러한 MSGV1 감마 레트로바이러스 벡터는 도 6에 제시된 골격 핵산 서열 (서열식별번호: 4)를 포함할 수 있으며, 여기서 세포 표면 수용체 (예를 들어, CAR 또는 TCR)의 서열을 포함하는 핵산 단편은 MSGV1 감마 레트로바이러스 벡터의 서열을 포함하는 핵산 단편과 라이게이션된다. 특정 실시양태에서, 활성화된 T 세포의 집단의 형질도입을 위해 사용되는 바이러스 벡터는 문헌 [Kochenderfer et al., J Immunother. 2009 September; 32(7): 689-702]에 제시된 MSGV-FMC63-28Z 레트로바이러스 벡터 또는 MSGV-FMC63-CD828BBZ 레트로바이러스 벡터일 수 있고, 상기 문헌의 내용은 상기 문헌의 "Materials and Methods" 내의 "Construction of MSGV-FMC63-28Z and MSGV-FMC63-CD828BBZ Recombinant Retroviral Vectors" 섹션에서 제시되는 레트로바이러스 벡터를 구축하는 방법을 제공하기 위해 본원에 참조로 포함된다. 이러한 실시양태의 한 측면에 따르면, 바이러스 벡터는 바이러스 벡터 제조에 특이적인 배지에서의 배양에 의해 성장한다. 바이러스 벡터의 성장을 위한 임의의 적합한 성장 배지 및/또는 보충물이 본원에 기재된 방법에 따라 바이러스 벡터 접종물에 사용될 수 있다. 일부 측면에 따르면, 바이러스 벡터는 이어서 형질도입 단계 동안 하기 기재된 무혈청 배양 배지에 첨가될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 활성화된 T 세포의 집단의 형질도입 단계는 미리 결정된 시간 동안, 미리 결정된 온도에서 및/또는 미리 결정된 CO2 수준의 존재 하에 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 형질도입을 위한 미리 결정된 온도는 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 또는 약 39℃일 수 있다. 특정 실시양태에서, 형질도입을 위한 미리 결정된 온도는 약 34-39℃일 수 있다. 특정 실시양태에서, 형질도입을 위한 미리 결정된 온도는 약 35-37℃일 수 있다. 특정 실시양태에서, 바람직한 형질도입을 위한 미리 결정된 온도는 약 36-38℃일 수 있다. 특정 실시양태에서, 형질도입을 위한 미리 결정된 온도는 약 36-37℃ 또는 보다 바람직하게는 약 37℃일 수 있다. 특정 실시양태에서, 형질도입을 위한 미리 결정된 시간은 약 12-36시간일 수 있다. 특정 실시양태에서, 형질도입을 위한 미리 결정된 시간은 약 12-16시간, 약 12-20시간, 약 12-24시간, 약 12-28시간, 또는 약 12-32시간일 수 있다. 특정 실시양태에서, 형질도입을 위한 미리 결정된 시간은 약 20시간 또는 적어도 약 20시간일 수 있다. 특정 실시양태에서, 형질도입을 위한 미리 결정된 시간은 약 16-24시간일 수 있다. 특정 실시양태에서, 형질도입을 위한 미리 결정된 시간은 적어도 약 14시간, 적어도 약 16시간, 적어도 약 18시간, 적어도 약 20시간, 적어도 약 22시간, 적어도 약 24시간, 또는 적어도 약 26시간일 수 있다. 일부 실시양태에서, 활성화된 T 세포의 집단의 형질도입 단계는 활성화된 T 세포의 집단을 미리 결정된 CO2 수준에서 바이러스 벡터로 형질도입시키는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 형질도입을 위한 미리 결정된 CO2 수준은 약 1.0-10% CO2일 수 있다. 특정 실시양태에서, 형질도입을 위한 미리 결정된 CO2 수준은 약 1.0%, 약 2.0%, 약 3.0%, 약 4.0%, 약 5.0%, 약 6.0%, 약 7.0%, 약 8.0%, 약 9.0%, 또는 약 10.0% CO2일 수 있다. 특정 실시양태에서, 형질도입을 위한 미리 결정된 CO2 수준은 약 3-7% CO2일 수 있다. 특정 실시양태에서, 형질도입을 위한 미리 결정된 CO2 수준은 약 4-6% CO2일 수 있다. 특정 실시양태에서, 형질도입을 위한 미리 결정된 CO2 수준은 약 4.5-5.5% CO2일 수 있다. 특정 실시양태에서, 형질도입을 위한 미리 결정된 CO2 수준은 약 5% CO2일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 활성화된 T 세포의 집단의 형질도입 단계는 미리 결정된 시간 동안, 미리 결정된 온도에서 및/또는 미리 결정된 CO2 수준의 존재 하에 (이들의 임의의 조합 하에) 수행될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 활성화된 T 세포의 집단의 형질도입 단계는 약 16-24시간의 미리 결정된 시간 동안, 및 약 4.5-5.5% CO2의 미리 결정된 CO2 수준의 존재 하에 약 36-38℃의 미리 결정된 온도를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 형질도입된 T 세포의 집단을 미리 결정된 시간 동안 확장시켜 조작된 T 세포의 집단을 생산하는 단계를 포함할 수 있다. 확장을 위한 미리 결정된 시간은 (i) 환자에게 투여하기 위한 적어도 1회 용량을 위한 조작된 T 세포의 집단 내의 충분한 수의 세포, (ii) 전형적인 보다 긴 공정에 비해 유약 세포의 유리한 비율을 갖는 조작된 T 세포의 집단, 또는 (iii) (i) 및 (ii) 둘 다의 생산을 허용하는 임의의 적합한 시간일 수 있다. 이러한 시간은 T 세포에 의해 발현되는 세포 표면 수용체, 사용되는 벡터, 치료 효과를 얻기 위해 필요한 용량, 및 다른 변수에 따라 결정될 것이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 확장을 위한 미리 결정된 시간은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 또는 21일 초과일 수 있다. 일부 측면에서, 확장을 위한 미리 결정된 시간은 관련 기술분야에 알려진 확장 방법보다 더 짧다. 예를 들어, 확장을 위한 미리 결정된 시간은 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75% 더 짧을 수 있거나, 또는 75% 초과로 더 짧을 수 있다. 한 측면에서, 확장을 위한 미리 결정된 시간은 약 3일이다. 이러한 측면에서, 림프구 집단의 농축시부터 조작된 T 세포의 생산까지의 시간은 약 6일이다. 특정 실시양태에서, 형질도입된 T 세포의 집단을 확장시키는 단계는 미리 결정된 온도에서 및/또는 미리 결정된 CO2 수준의 존재 하에 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 미리 결정된 온도는 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 또는 약 39℃일 수 있다. 특정 실시양태에서, 미리 결정된 온도는 약 34-39℃일 수 있다. 특정 실시양태에서, 미리 결정된 온도는 약 35-37℃일 수 있다. 특정 실시양태에서, 바람직한 미리 결정된 온도는 약 36-38℃일 수 있다. 특정 실시양태에서, 미리 결정된 온도는 약 36-37℃ 또는 보다 바람직하게는 약 37℃일 수 있다. 일부 실시양태에서, 형질도입된 T 세포의 집단을 확장시키는 단계는 형질도입된 T 세포의 집단을 미리 결정된 CO2 수준의 존재 하에 확장시키는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 미리 결정된 CO2 수준은 1.0-10% CO2일 수 있다. 특정 실시양태에서, 미리 결정된 CO2 수준은 약 1.0%, 약 2.0%, 약 3.0%, 약 4.0%, 약 5.0%, 약 6.0%, 약 7.0%, 약 8.0%, 약 9.0%, 또는 약 10.0% CO2일 수 있다. 특정 실시양태에서, 미리 결정된 CO2 수준은 약 4.5-5.5% CO2일 수 있다. 특정 실시양태에서, 미리 결정된 CO2 수준은 약 5% CO2일 수 있다. 특정 실시양태에서, 미리 결정된 CO2 수준은 약 3.5%, 약 4.0%, 약 4.5%, 약 5.0%, 약 5.5%, 또는 약 6.5% CO2일 수 있다. 일부 실시양태에서, 형질도입된 T 세포의 집단을 확장시키는 단계는 미리 결정된 온도에서 및/또는 미리 결정된 CO2 수준의 존재 하에 (이들의 임의의 조합 하에) 수행될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 형질도입된 T 세포의 집단을 확장시키는 단계는 약 36-38℃의 미리 결정된 온도 및 약 4.5-5.5% CO2의 미리 결정된 CO2 수준의 존재 하를 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 방법의 각각의 단계는 폐쇄 시스템에서 수행된다. 특정 실시양태에서, 폐쇄 시스템은 임의의 적합한 세포 배양 백 (예를 들어, 밀테니이 바이오텍 MACS® GMP 세포 분화 백, 오리겐 바이오메디칼 퍼마라이프(Origen Biomedical PermaLife)™ 세포 배양 백)을 사용하는 폐쇄 백 배양 시스템이다. 일부 실시양태에서, 폐쇄 백 배양 시스템에서 사용되는 세포 배양 백은 형질도입 단계 동안 재조합 인간 피브로넥틴 단백질로 코팅된다. 특정 실시양태에서, 폐쇄 백 배양 시스템에서 사용되는 세포 배양 백은 형질도입 단계 동안 재조합 인간 피브로넥틴 단백질 단편으로 코팅된다. 재조합 인간 피브로넥틴 단편은 3개의 기능적 도메인을 포함할 수 있다: 중앙 세포-결합 도메인, 헤파린-결합 도메인 II, 및 CS1-서열. 재조합 인간 피브로넥틴 단백질 또는 그의 단편은 표적 세포 및 바이러스 벡터의 공동-국재화를 도움으로써 면역 세포의 레트로바이러스 형질도입의 유전자 효율을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 재조합 인간 피브로넥틴 단편은 레트로넥틴® (다카라 바이오(Takara Bio), 일본)이다. 특정 실시양태에서, 세포 배양 백은 약 1-60 μg/mL, 바람직하게는 1-40 μg/mL의 농도에서 재조합 인간 피브로넥틴 단편으로 코팅될 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포 배양 백은 약 1-20 μg/mL, 20-40 μg/mL, 또는 40-60 μg/mL의 농도에서 재조합 인간 피브로넥틴 단편으로 코팅될 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포 배양 백은 약 1 μg/mL, 약 2 μg/mL, 약 3 μg/mL, 약 4 μg/mL, 약 5 μg/mL, 약 6 μg/mL, 약 7 μg/mL, 약 8 μg/mL, 약 9 μg/mL, 약 10 μg/mL, 약 11 μg/mL, 약 12 μg/mL, 약 13 μg/mL, 약 14 μg/mL, 약 15 μg/mL, 약 16 μg/mL, 약 17 μg/mL, 약 18 μg/mL, 약 19 μg/mL, 또는 약 20 μg/mL의 재조합 인간 피브로넥틴 단편으로 코팅될 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포 배양 백은 약 2-5 μg/mL, 약 2-10 μg/mL, 약 2-20 μg/mL, 약 2-25 μg/mL, 약 2-30 μg/mL, 약 2-35 μg/mL, 약 2-40 μg/mL, 약 2-50 μg/mL, 또는 약 2-60 μg/mL의 재조합 인간 피브로넥틴 단편으로 코팅될 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포 배양 백은 적어도 약 2 μg/mL, 적어도 약 5 μg/mL, 적어도 약 10 μg/mL, 적어도 약 15 μg/mL, 적어도 약 20 μg/mL, 적어도 약 25 μg/mL, 적어도 약 30 μg/mL, 적어도 약 40 μg/mL, 적어도 약 50 μg/mL, 또는 적어도 약 60 μg/mL의 재조합 인간 피브로넥틴 단편으로 코팅될 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포 배양 백은 적어도 약 10 μg/mL의 재조합 인간 피브로넥틴 단편으로 코팅될 수 있다. 특정 실시양태에서, 폐쇄 백 배양 시스템에서 사용되는 세포 배양 백은 형질도입 단계 동안 인간 알부민 혈청 (HSA)으로 차단될 수 있다. 대체 실시양태에서, 세포 배양 백은 형질도입 단계 동안 HSA로 차단되지 않는다. 다른 측면에서, (a) 림프구 집단의 자극, (b) 활성화된 T 세포 집단의 형질도입, 및 (c) 형질도입된 T 세포 집단의 확장 중 하나 이상의 단계가 혈청을 첨가하지 않은 무혈청 배양 배지를 사용하여 수행된다. 또 다른 측면에서, (a) 림프구 집단의 자극, (b) 활성화된 T 세포 집단의 형질도입, 및 (c) 형질도입된 T 세포 집단의 확장 단계는 각각 무혈청 배양 배지를 사용하여 수행된다. 본원에 언급된 바와 같이, 용어 "무혈청 배지" 또는 "무혈청 배양 배지"는 사용되는 성장 배지가 혈청 (예를 들어, 인간 혈청 또는 소 혈청)으로 보충되지 않음을 의미한다. 즉, 배양된 세포의 생존율, 활성화 및 성장을 지지하기 위한 개별적으로 분리된 별개의 성분으로서 어떠한 혈청도 배양 배지에 첨가되지 않는다. 임의의 적합한 배양 배지 T 세포 성장 배지가 본원에 기재된 방법에 따라 현탁액에서 세포를 배양하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, T 세포 성장 배지는 적합한 양의 완충제, 마그네슘, 칼슘, 피루브산나트륨, 및 중탄산나트륨을 포함하는 멸균 저 글루코스 글루코스 용액을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, T 세포 성장 배지는 옵트마이저™ (라이프 테크놀로지스(Life Technologies))이지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 유사한 배지를 제조하는 방법을 이해할 것이다. 조작된 T 세포를 생산하기 위한 전형적인 방법과 대조적으로, 본원에 기재된 방법은 혈청 (예를 들어, 인간 또는 소)으로 보충되지 않은 배양 배지를 이용한다.
본원에 기재된 실시양태에 따르면, 표적 세포의 표면 상의 특이적 항원 모이어티를 인식하는 세포 표면 수용체를 발현하는 T 세포를 제조하는 방법은 (1) 공여 대상체로 얻은 림프구의 집단을 농축하는 단계; (2) 림프구의 집단을 1종 이상의 T-세포 자극제로 자극하여 활성화된 T 세포의 집단을 생산하며, 여기서 자극은 무혈청 배양 배지를 사용하여 폐쇄 시스템에서 수행되는 것인 단계; (3) 활성화된 T 세포의 집단을 단일 사이클 형질도입을 사용하여 세포 표면 수용체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입시켜 형질도입된 T 세포의 집단을 생산하며, 여기서 형질도입은 무혈청 배양 배지를 사용하여 폐쇄 시스템에서 수행되는 것인 단계; 및 (4) 형질도입된 T 세포의 집단을 미리 결정된 시간 동안 확장시켜 조작된 T 세포의 집단을 생산하며, 여기서 확장은 무혈청 배양 배지를 사용하여 폐쇄 시스템에서 수행되는 것인 단계를 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 표적 세포의 표면 상의 특이적 항원 모이어티를 인식하는 세포 표면 수용체를 발현하는 T 세포를 제조하는 방법은 (1) 공여 대상체로 얻은 림프구의 집단을 농축하는 단계; (2) 림프구의 집단을 단일 사이클 형질도입을 사용하여 세포 표면 수용체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입시켜 형질도입된 T 세포의 집단을 생산하며, 여기서 형질도입은 무혈청 배양 배지를 사용하여 폐쇄 시스템에서 수행되는 것인 단계; 및 (3) 형질도입된 T 세포의 집단을 미리 결정된 시간 동안 확장시켜 조작된 T 세포의 집단을 생산하며, 여기서 확장은 무혈청 배양 배지를 사용하여 폐쇄 시스템에서 수행되는 것인 단계를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 공정 또는 방법은 (1) 환자로부터 분리반출술 산물의 수집 및 폐쇄 시스템에서 단핵 세포의 분리, (2) 폐쇄 시스템에서 T 세포의 세포 성장을 자극하기 위해 IL2의 존재 하에 CD3에 대한 항체로 단핵 세포 집단의 자극, (3) 폐쇄 시스템에서 감마 레트로바이러스 벡터를 사용한, T 세포가 암 표적 세포의 표면 상의 특이적 항원 모이어티를 인식하도록 허용하는 새로운 세포 표면 수용체 유전자의 도입 또는 형질도입, (4) 폐쇄 시스템에서 형질도입된 T 세포의 확장, 및 (5) 암 환자에게 재투여하기 위한, 폐쇄 시스템에서 확장된 자가 T 세포의 세척 및 제제화를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 측면에서, 확장 단계는 3일이고, 이에 의해 전체 제조 공정이 1주 미만 내에 완료될 수 있다. T 세포가 활발하게 성장하는 공정 단계 2-4는 인간 혈청을 함유하지 않는 규정된 세포 배양 배지 (즉, 무혈청 배지)에서 수행된다. 본 공정에 의해 생산된 T 세포는 생물학적 활성을 보이고, 암 세포의 표면 상의 표적 항원에 의해 활성화되고, 이에 반응하여 감마 인터페론을 생산한다. 본원에 기재된 방법의 일부 측면은 다음을 포함한다:
Figure pat00001
이러한 공정은 T 세포 제조 동안 오염 가능성이 최소인 폐쇄 시스템에서 수행됨;
Figure pat00002
공정은 임상 용도의 T 세포 생산에 적합함;
Figure pat00003
세포는 인간 혈청을 함유하지 않는 세포 배양 배지에서 증식함;
Figure pat00004
수용체 유전자는 폐쇄 백 시스템에서 T 세포 내로 도입됨;
Figure pat00005
세포는 단지 6일 내에 임상 용도를 위해 제조될 수 있음; 및
Figure pat00006
세포는 생체 내에서의 생물학적 활성을 표시하는 생물학적 활성을 보임.
이들 측면은 현장에서 현재 사용되는 방법에 비해 다음과 같은 여러 우수성 및/또는 개선을 제공한다. 인간 무혈청 세포 배양 배지를 사용하면, 공정에서 원료로부터의 인간 병원체의 도입 가능성을 최소화하고 향후에 쉽게 입수할 수 없는 원료의 사용을 방지할 수 있다. 또한, 상이한 혈청 로트는 유의한 배양 시험을 필요로 하고 재현성 및 공정 강건함을 보장할 것을 공표해야 하기 때문에, 이러한 사용은 GMP 준수를 지지한다. 무혈청 배지에서 T 세포 성장은 이전에 보고된 바 있지만 ([Carstens et al., ISCT meeting in San Diego, 2012; Zuliani, 2011]), 암 치료를를 위한 임상 용도를 위한 T 세포의 생산 공정 내로 이전에 도입된 바 없고, 이전의 연구는 무혈청 배지 내에서의 T 세포 활성화, 형질도입, 및 확장이 강건함을 제시한 바 없다. 본원에 기재된 연구에서 고려되는 개선된 공정에서, 항-CD3 모노클로날 항체 및 IL2의 사용은 T 세포 집단의 자극을 위해 유지되었다. 또한, 폐쇄 시스템 백에서의 세포 배양은 세포 배양 동안 가능한 오염을 방지하고 cGMP 제조 및 제품 상품화에 적합한 단순화되고 단축된 공정을 제공한다는 유의한 이점을 제공할 것이다. T 세포 증식을 위해 문헌에 기재된 많은 공정은 광범한 상업적 용도에 적합하지 않기 때문에, 이러한 실제 적용의 중요성은 유의한 것이다.
이전에, 감마 레트로바이러스 벡터를 사용한 바이러스 형질도입은 효율적이지 않았고, '원심접종'으로 불린 개방 공정이 미량역가 플레이트에서 수행되었으며, 여기서 바이러스 및 세포는 레트로넥틴®으로 코팅된 웰의 바닥에 원심분리되었다. 이러한 공정은 일반적으로 형질도입 효율을 최대화하기 위해 후속적으로 2회 반복된다. 이러한 형질도입 단계는 형질도입이 레트로넥틴®으로 코팅된 백 (플레이트가 아니라)을 사용하여 폐쇄 백 시스템에서 수행되고 공정이 2회가 아니라 단일회 실행되도록 본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에 따라 변형되었다. 본원에 기재된 방법은 또한 현장에서 역사적으로 사용된 개방 시스템 플라스크가 아니라 폐쇄 시스템 세포 배양 백에서 세포의 증식을 수반할 수 있다. 일부 문헌이 백 시스템에서의 형질도입에 대한 보고를 포함하지만 ([Lamers et al., Cytotherapy 2008, 10:406-416; Tumanini et al., Cytotherapy 2013, 11, 1406-1415]), 이들 경우 - 본원에 기재된 방법과 달리 -는 혈청을 함유하는 세포 배양 배지에서 완료된 적어도 2회의 형질도입, 및 적어도 9일의 확장 시간을 포함한다. 본원에 기재된 실시양태에서 개발 연구는 무혈청 배지에서 백 내에서의 형질도입이 실행가능할 뿐만 아니라, 형질도입 수준이 단일 형질도입 및 단지 3일의 확장 후에 추가의 임상 개발을 위해 허용가능함을 입증한다.
일부 실시양태에서, 상기 기재된 방법에 의해 생산된 조작된 T 세포의 집단은 세포를 추후 사용할 수 있도록 임의로 동결보존될 수 있다. 따라서, 조작된 T 세포의 집단을 동결보존하는 방법이 본원에 제공된다. 이러한 방법은 조작된 T 세포의 집단을 희석제 용액으로 세척 및 농축하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 희석제 용액은 생리 염수, 0.9% 염수, 플라즈마라이트(PlasmaLyte) A (PL), 5% 덱스트로스/0.45% NaCl 염수 용액 (D5), 인간 혈청 알부민 (HSA), 또는 이들의 조합물이다. 일부 측면에서, HSA는 해동 후에 개선된 세포 생존율 및 세포 회복을 위해 세척 및 농축된 세포에 첨가될 수 있다. 또 다른 측면에서, 세척 용액은 생리 염수이고, 세척 및 농축된 세포는 HSA (5%)로 보충된다. 방법은 또한 동결보존 혼합물을 생성하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 동결보존 혼합물은 희석제 용액 내의 희석된 세포의 집단 및 적합한 동결보존 용액을 포함한다. 일부 측면에서, 동결보존 용액은 조작된 T 세포의 희석제 용액과 1:1 또는 2:1의 비로 혼합된 크리오스토르10(CryoStor10) (바이오라이프 솔루션(BioLife Solution))을 포함하나, 이에 제한되지는 않는, 임의의 적합한 동결보존 용액일 수 있다. 특정 실시양태에서, HSA는 동결보존된 혼합물 내의 약 1.0-10% HSA의 최종 농도를 제공하도록 첨가될 수 있다. 특정 실시양태에서, HSA는 동결보존된 혼합물 내의 약 1.0%, 약 2.0%, 약 3.0%, 약 4.0%, 약 5.0%, 약 6.0%, 약 7.0%, 약 8.0%, 약 9.0%, 또는 약 10.0% HSA의 최종 농도를 제공하도록 첨가될 수 있다. 특정 실시양태에서, HSA는 동결보존된 혼합물 내의 약 1-3% HSA, 약 1-4% HSA, 약 1-5% HSA, 약 1-7% HSA, 약 2-4% HSA, 약 2-5% HSA, 약 2-6% HSA, 또는 약 2-7% HSA의 최종 농도를 제공하도록 첨가될 수 있다. 특정 실시양태에서, HSA는 동결보존된 혼합물 내의 약 2.5% HSA의 최종 농도를 제공하도록 첨가될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 조작된 T 세포의 집단의 동결보존은 세포를 0.9% 생리 염수로 세척하고, HSA를 5%의 최종 농도로 세척된 세포에 첨가하고, 세포를 크리오스토르™ CS10로 1:1로 희석하는 (최종 동결보존 혼합물 내의 2.5% HSA의 최종 농도를 위해) 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 또한 동결보존 혼합물을 동결하는 단계를 포함한다. 한 측면에서, 동결보존 혼합물은 규정된 동결 사이클을 사용하여 속도 제어 동결기에서 동결보존 혼합물 mL당 약 1e6 내지 약 1.5e7 세포의 세포 농도로 동결된다. 이 방법은 또한 동결보존 혼합물을 기상 액체 질소 내에 보관하는 단계를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 조작된 T 세포의 집단은 미리 결정된 용량으로 동결보존될 수 있다. 특정 실시양태에서, 미리 결정된 용량은 치료 유효 용량일 수 있고, 이것은 아래에서 제시되는 임의의 치료 유효 용량일 수 있다. 조작된 T 세포의 미리 결정된 용량은 T 세포에 의해 발현되는 세포 표면 수용체 (예를 들어, 세포 상에 발현되는 세포 표면 수용체의 친화도 및 밀도), 표적 세포의 종류, 치료되는 질환 또는 병리학적 병태의 특성, 또는 둘 다의 조합에 의해 결정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 조작된 T 세포에 의해 발현되는 세포 표면 수용체는 문헌 [Kochenderfer et al., J Immunother. 2009 September; 32(7): 689-702]에 제시된 항-CD19 CAR, 예컨대 FMC63-28Z CAR 또는 FMC63-CD828BBZ CAR일 수 있고, 상기 문헌의 내용은 FMC63-28Z CAR 또는 FMC63-CD828BBZ CAR을 발현하는 T 세포를 생산하기 위해 사용되는 벡터를 구축하는 방법을 제공하기 위해 본원에 참조로 포함된다. 특정 실시양태에서, FMC63-28Z CAR 또는 FMC63-CD828BBZ CAR을 발현하는 조작된 T 세포의 미리 결정된 용량은 약 1백만개 초과 내지 약 3백만개 미만의 형질도입된 조작된 T 세포/kg일 수 있다. 특정 실시양태에서, FMC63-28Z CAR 또는 FMC63-CD828BBZ CAR을 발현하는 조작된 T 세포의 미리 결정된 용량은 체중 킬로그램당 약 1백만개 초과 내지 약 2백만개의 형질도입된 조작된 T 세포 (세포/kg)일 수 있다. 특정 실시양태에서, FMC63-28Z CAR 또는 FMC63-CD828BBZ CAR을 발현하는 조작된 T 세포의 미리 결정된 용량은 체중 킬로그램당 1백만개 초과 내지 약 2백만개의 형질도입된 조작된 T 세포 (세포/kg)일 수 있다. 특정 실시양태에서, FMC63-28Z CAR 또는 FMC63-CD828BBZ CAR을 발현하는 조작된 T 세포의 미리 결정된 용량은 적어도 약 2백만개 내지 약 3백만개 미만의 형질도입된 조작된 T 세포/kg일 수 있다. 특정 실시양태에서, FMC63-28Z CAR 또는 FMC63-CD828BBZ CAR을 발현하는 조작된 T 세포의 바람직한 미리 결정된 용량은 약 2백만개의 형질도입된 조작된 T 세포/kg일 수 있다. 특정 실시양태에서, FMC63-28Z CAR 또는 FMC63-CD828BBZ CAR을 발현하는 조작된 T 세포의 미리 결정된 용량은 적어도 약 2백만개의 형질도입된 조작된 T 세포/kg일 수 있다. 특정 실시양태에서, FMC63-28Z CAR 또는 FMC63-CD828BBZ CAR을 발현하는 조작된 T 세포의 미리 결정된 용량은 약 2.0백만개, 약 2.1백만개, 약 2.2백만개, 약 2.3백만개, 약 2.4백만개, 약 2.5백만개, 약 2.6백만개, 약 2.7백만개, 약 2.8백만개, 또는 약 2.9백만개의 형질도입된 조작된 T 세포/kg일 수 있다. 특정 실시양태에서, 조작된 T 세포의 집단은 체중 킬로그램당 약 1백만개의 조작된 T 세포 (세포/kg)의 미리 결정된 용량으로 동결보존될 수 있다. 특정 실시양태에서, 조작된 T 세포의 집단은 약 500,000개 내지 약 1백만개의 조작된 T 세포/kg의 미리 결정된 용량으로 동결보존될 수 있다. 특정 실시양태에서, 조작된 T 세포의 집단은 적어도 약 1백만개, 적어도 약 2백만개, 적어도 약 3백만개, 적어도 약 4백만개, 적어도 약 5백만개, 적어도 약 6백만개, 적어도 약 7백만개, 적어도 약 8백만개, 적어도 약 9백만개, 적어도 약 10백만개의 조작된 T 세포/kg의 미리 결정된 용량으로 동결보존될 수 있다. 다른 측면에서, 조작된 T 세포의 집단은 1백만개 미만의 세포/kg, 1백만개 세포/kg, 2백만개 세포/kg, 3백만개 세포/kg, 4백만개 세포/kg, 5백만개 세포/kg, 6백만개 세포/kg, 7백만개 세포/kg, 8백만개 세포/kg, 9백만개 세포/kg, 10백만개 세포/kg, 10백만개 초과의 세포/kg, 20백만개 초과의 세포/kg, 30백만개 초과의 세포/kg, 40백만개 초과의 세포/kg, 50백만개 초과의 세포/kg, 60백만개 초과의 세포/kg, 70백만개 초과의 세포/kg, 80백만개 초과의 세포/kg, 90백만개 초과의 세포/kg, 또는 100백만개 초과의 세포/kg의 미리 결정된 용량으로 동결보존될 수 있다. 특정 실시양태에서, 조작된 T 세포의 집단은 약 1백만개 내지 약 2백만개의 조작된 T 세포/kg의 미리 결정된 용량으로 동결보존될 수 있다. 다른 실시양태에서, 조작된 T 세포의 집단은 약 1백만개 세포 내지 약 2백만개 세포/kg, 약 1백만개 세포 내지 약 3백만개 세포/kg, 약 1백만개 세포 내지 약 4백만개 세포/kg, 약 1백만개 세포 내지 약 5백만개 세포/kg, 약 1백만개 세포 내지 약 6백만개 세포/kg, 약 1백만개 세포 내지 약 7백만개 세포/kg, 약 1백만개 세포 내지 약 8백만개 세포/kg, 약 1백만개 세포 내지 약 9백만개 세포/kg, 약 1백만개 세포 내지 약 10백만개 세포/kg의 미리 결정된 용량으로 동결보존될 수 있다. 특정 실시양태에서, 조작된 T 세포의 집단의 미리 결정된 용량은 대상체의 체중을 기초로 하여 계산될 수 있다. 특정 실시양태에서, 조작된 T 세포의 집단은 약 0.5-200 mL의 동결보존 배지에서 동결보존될 수 있다. 특정 실시양태에서, 조작된 T 세포의 집단은 약 0.5 mL, 약 1.0 mL, 약 5.0 mL, 약 10.0 mL, 약 20 mL, 약 30 mL, 약 40 mL, 약 50 mL, 약 60 mL, 약 70 mL, 약 80 mL, 약 90 mL, 또는 약 100 mL의 동결보존 배지에서 동결보존될 수 있다. 특정 실시양태에서, 조작된 T 세포의 집단은 약 10-30 mL, 약 10-50 mL, 약 10-70 mL, 약 10-90 mL, 약 50-70 mL, 약 50-90 mL, 약 50-110 mL, 약 50-150 mL, 또는 약 100-200 mL의 동결보존 배지에서 동결보존될 수 있다. 특정 실시양태에서, 조작된 T 세포의 집단은 바람직하게는 약 50-70 mL의 동결보존 배지에서 동결보존될 수 있다.
본원에 기재된 방법은 치료 유효량 또는 치료 유효 용량의 조작된 T 세포를 대상체에게 투여함으로써 질환 또는 병리학적 병태가 존재하는 대상체에서 질환 또는 병리학적 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있는 조작된 T 세포의 집단을 생산하기 위해 사용된다. 따라서, 표적 세포의 표면 상의 특이적 항원 모이어티를 인식하는 세포 표면 수용체를 발현하는 조작된 T 세포의 집단은 본원에 제공되는 방법에 의해 생산된다. 본원에 기재된 방법에 의해 생산되는 조작된 T 세포를 사용하여 치료할 수 있는 병원성 병태는 암, 바이러스 감염, 급성 또는 만성 염증, 자가면역 질환 또는 임의의 다른 면역-기능장애를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 조작된 T 세포의 투여로 환자를 치료하는 방법의 예는 문헌 [Kochenderfer, et al., J Clin Oncol. 2014 Aug 25. pii: JCO.2014.56.2025 (entitled "Chemotherapy-Refractory Diffuse Large B-Cell Lymphoma and Indolent B-Cell Malignancies Can Be Effectively Treated With Autologous T Cells Expressing an Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor") 및 Kochenderfer et al. Blood. 2012 Mar 22;119(12):2709-20 (entitled "B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor-transduced T cells")]에서 볼 수 있고, 상기 문헌의 내용은 조작된 T 세포의 투여로 환자를 치료하는 표준 실무에 대한 상세한 내용을 제공하기 위해, 마치 그 전체가 본원에 제시되는 것처럼, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에 따르면, 상기 기재된 방법에 의해 생산된 조작된 T 세포의 집단은 세포의 1종 이상의 하위집단을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포의 1종 이상의 하위집단은 나이브 T 세포, 이펙터 T 세포, 이펙터 기억 T 세포, 및/또는 중심 기억 T 세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 하기 실시예 2에서 제시되는 바와 같이, 본원에 기재된 방법의 사용은 배양 기간을 10일 이상으로부터 6일로 단순히 단축하는 것에 추가로, 나이브 T 세포의 제시 증가 및 분화된 이펙터 T 세포의 제시 감소와 함께 보다 많은 유약 T 세포 분포를 유도할 것으로 예상되었다. 특정 실시양태에서, 조작된 T 세포의 집단은 나이브 T 세포의 하위집단을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 조작된 T 세포의 집단 중 적어도 약 34-43%는 나이브 T 세포의 하위집단을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 조작된 T 세포의 집단 중 적어도 약 35%는 나이브 T 세포의 하위집단을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 조작된 T 세포의 집단 중 적어도 약 40%는 나이브 T 세포의 하위집단을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 조작된 T 세포의 집단 중 적어도 약 34%, 적어도 약 35%, 적어도 약 36%, 적어도 약 37%, 적어도 약 38%, 적어도 약 39%, 적어도 약 40%, 적어도 약 41%, 적어도 약 42%, 적어도 약 43%, 또는 적어도 약 44%는 나이브 T 세포의 하위집단을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 조작된 T 세포의 집단은 중심 기억 T 세포의 하위집단을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 조작된 T 세포의 집단 중 약 15% 이하는 중심 기억 T 세포의 하위집단을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 조작된 T 세포의 집단 중 약 15% 이하, 약 14% 이하, 약 13% 이하, 약 12% 이하, 또는 약 11% 이하는 중심 기억 T 세포의 하위집단을 포함할 수 있다.
본원에 언급된 바와 같이, "암"은 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 선양 낭포 암종, 부신피질 암종, AIDS-관련 암, 항문암, 맹장암, 성상세포종, 비정형 기형종/횡문근양 종양, 중추 신경계, B-세포 백혈병, 림프종 또는 다른 B 세포 악성종양, 기저 세포 암종, 담관암, 방광암, 골암, 골육종 및 악성 섬유성 조직구종, 뇌간 신경교종, 뇌 종양, 유방암, 기관지 종양, 버킷 림프종, 카르시노이드 종양, 중추 신경계암, 자궁경부암, 척삭종, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 골수증식 질환, 결장암, 결장직장암, 두개인두종, 피부 t-세포 림프종, 배아성 종양, 중추 신경계, 자궁내막암, 상의모세포종, 상의세포종, 식도암, 감각신경모세포종, 종양의 유잉 육종 패밀리, 두개외 배세포 종양, 생식선외 배세포 종양, 간외 담관암, 안암, 골의 섬유성 조직구종, 악성, 및 골육종, 담낭암, 위의 (위) 암, 위장 카르시노이드 종양, 위장 기질 종양 (GIST), 연부 조직 육종, 배세포 종양, 임신성 영양막 종양, 신경교종, 모발상 세포 백혈병, 두경부암, 심장암, 간세포 (간) 암, 조직구증, 호지킨 림프종, 하인두암, 안내 흑색종, 섬세포 종양 (내분비 췌장), 카포시 육종, 신장암, 랑게르한스 세포 조직구증, 후두암, 백혈병, 구순 및 구강 암, 간암 (원발성), 소엽성 상피내 암종 (LCIS), 폐암, 림프종, 마크로글로불린혈증, 남성 유방암, 골의 악성 섬유성 조직구종 및 골육종, 수모세포종, 수질상피종, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 중피종, NUT 유전자를 수반하는 잠복 원발성 정중선 관 암종을 갖는 전이성 편평 경부암, 구강암, 다발 내분비 신생물 증후군, 다발성 골수종/형질 세포 신생물, 균상식육종, 골수이형성 증후군, 골수이형성/골수 증식성 신생물, 골수성 백혈병, 만성 (CML), 골수성 백혈병, 급성 (AML), 골수종, 다발성 골수 증식 질환, 비강 및 부비동 암, 비인두암, 신경모세포종, 비-호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 구내암, 구강암, 구강인두암, 골육종 및 골의 악성 섬유성 조직구종, 난소암, 췌장암, 유두종증, 부신경절종, 부비동 및 비강 암, 부갑상선암, 음경암, 인두암, 크롬친화세포종, 중간 분화의 송과체 실질 종양, 송과체모세포종 및 천막상 원시 신경외배엽 종양, 뇌하수체 종양, 형질 세포 신생물/다발성 골수종, 흉막폐 모세포종, 임신 및 유방암, 원발성 중추 신경계 (CNS) 림프종, 전립선암, 직장암, 신세포 (신장) 암, 신우 및 요관, 이행 세포암, 망막모세포종, 횡문근육종, 타액선암, 육종, 세자리 증후군, 소세포 폐암, 소장암, 연부 조직 육종, 편평 세포 암종, 편평 경부암, 위 (위의 암), 천막상 원시 신경외배엽 종양, t-세포 림프종, 피부암, 고환암, 인후암, 흉선종 및 흉선 암종, 갑상선암, 신우 및 요관의 이행 세포암, 영양막 종양, 요관 및 신우 암, 요도암, 자궁암, 자궁 육종, 질암, 외음부암, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 윌름스 종양을 포함하나, 이에 제한되지는 않는, 표면 항원 또는 암 마커와 연관된 임의의 암일 수 있다.
일부 측면에서, 암은 B 세포 악성종양이다. B 세포 악성종양의 예는 비-호지킨 림프종 (NHL), 미만성 거대 B 세포 림프종 (DLBCL), 소림프구성 림프종 (SLL/CLL), 외투 세포 림프종 (MCL), 여포성 림프종 (FL), 변연부 림프종 (MZL), 림프절외 (MALT 림프종), 림프절 (단핵구성 B-세포 림프종), 비장, 미만성 대세포 림프종, B 세포 만성 림프구성 백혈병/림프종, 버킷 림프종 및 림프모구성 림프종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 언급된 바와 같이, "바이러스 감염"은 숙주에서 질환 또는 병리학적 병태를 야기하는 임의의 바이러스에 의해 야기되는 감염일 수 있다. 본원에 기재된 방법에 의해 생산되는 조작된 T 세포로 치료될 수 있는 바이러스 감염의 예는 엡스타인-바르 바이러스 (EBV)에 의해 야기되는 바이러스 감염; A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스 또는 C형 간염 바이러스에 의해 야기되는 바이러스 감염; 단순 포진 1형 바이러스, 단순 포진 2형 바이러스, 또는 단순 포진 8형 바이러스에 의해 야기되는 바이러스 감염, 시토메갈로바이러스 (CMV)에 의해 야기되는 바이러스 감염, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)에 의해 야기되는 바이러스 감염, 인플루엔자 바이러스에 의해 야기되는 바이러스 감염, 홍역 또는 볼거리 바이러스에 의해 야기되는 바이러스 감염, 인간 유두종바이러스 (HPV)에 의해 야기되는 바이러스 감염, 파라인플루엔자 바이러스에 의해 야기되는 바이러스 감염, 풍진 바이러스에 의해 야기되는 바이러스 감염, 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV)에 의해 야기되는 바이러스 감염, 또는 수두-대상포진 바이러스에 의해 야기되는 바이러스 감염을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 측면에서, 바이러스 감염은 바이러스에 감염된 대상체에서 암 발생을 유도하거나 야기할 수 있다 (예를 들어, HPV 감염은 자궁경부, 외음부, 질, 음경, 항문, 구강인두암을 비롯한 여러 암의 발생을 야기하거나 이와 연관될 수 있고, HIV 감염은 카포시 육종의 발생을 야기할 수 있다).
본원에 기재된 방법에 의해 생산되는 조작된 T 세포로 치료될 수 있는 만성 염증 질환, 자가면역 질환 또는 임의의 다른 면역-기능장애의 예는 다발성 경화증, 루푸스, 및 건선을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 병태 또는 질환에 대해 본원에 사용된 바와 같이, 병태 또는 질환의 억제, 병태 또는 질환의 발병 또는 발생 속도의 둔화, 병태 또는 질환의 발생 위험 감소, 병태 또는 질환과 연관된 증상의 억제 또는 발생 지연, 병태 또는 질환과 연관된 증상의 감소 또는 종결, 병태 또는 질환의 완전한 또는 부분적인 퇴행의 생성, 또는 이들의 일부의 조합을 나타낼 수 있다.
"치료 유효량" 또는 "치료 유효 용량"은 표적 세포를 치사시킴으로써 대상체에서 요구되는 치료 효과, 예컨대 표적 병태의 예방 또는 치료 또는 병태와 연관된 증상의 완화를 생성하는 조작된 T 세포의 양이다. 제시된 대상체에서 치료 효능의 측면에서 가장 효과적인 결과는 조작된 T 세포의 특징 (수명, 활성, 약동학, 약역학, 및 생체이용성 포함), 대상체의 생리학적 상태 (연령, 성별, 질환의 종류 및 병기, 전반적인 신체 상태, 제시된 투여량에 대한 반응, 및 의약의 종류 포함), 사용되는 임의의 조성물 내의 임의의 제약상 허용되는 담체 또는 담체들의 특성, 및 투여 경로를 포함하나, 이에 제한되지는 않는, 다양한 인자에 따라 상이할 것이다. 조작된 T 세포의 치료 유효 용량은 또한 T 세포에 의해 발현되는 세포 표면 수용체 (예를 들어, 세포 상에 발현되는 세포 표면 수용체의 친화도 및 밀도), 표적 세포의 종류, 치료되는 질환 또는 병리학적 병태의 특성, 또는 둘 다의 조합에 의해 결정된다. 따라서, 일부 측면에서, 형질도입된 조작된 T 세포의 치료 유효 용량은 체중 킬로그램당 약 1백만개 내지 약 2백만개의 형질도입된 조작된 T 세포 (세포/kg)이다. 따라서, 일부 측면에서, 형질도입된 조작된 T 세포의 치료 유효 용량은 약 1백만개 내지 약 3백만개의 형질도입된 조작된 T 세포/kg이다. 특정 실시양태에서, 치료 유효 용량은 약 2백만개의 형질도입된 조작된 T 세포/kg이다. 특정 실시양태에서, 치료 유효 용량은 적어도 약 2백만개의 형질도입된 조작된 T 세포/kg이다. 특정 실시양태에서, 치료 유효 용량은 적어도 약 1백만개, 적어도 약 2백만개, 적어도 약 3백만개, 적어도 약 4백만개, 적어도 약 5백만개, 적어도 약 6백만개, 적어도 약 7백만개, 적어도 약 8백만개, 적어도 약 9백만개, 적어도 약 10백만개의 조작된 T 세포/kg이다. 다른 측면에서, 치료 유효 용량은 1백만개 미만의 세포/kg, 1백만개 세포/kg, 2백만개 세포/kg, 3백만개 세포/kg, 4백만개 세포/kg, 5백만개 세포/kg, 6백만개 세포/kg, 7백만개 세포/kg, 8백만개 세포/kg, 9백만개 세포/kg, 10백만개 세포/kg, 10백만개 초과의 세포/kg, 20백만개 초과의 세포/kg, 30백만개 초과의 세포/kg, 40백만개 초과의 세포/kg, 50백만개 초과의 세포/kg, 60백만개 초과의 세포/kg, 70백만개 초과의 세포/kg, 80백만개 초과의 세포/kg, 90백만개 초과의 세포/kg, 또는 100백만개 초과의 세포/kg일 수 있다. 다른 실시양태에서, 치료 유효 용량은 약 1백만개 세포 내지 약 2백만개 세포/kg, 약 1백만개 세포 내지 약 3백만개 세포/kg, 약 1백만개 세포 내지 약 4백만개 세포/kg, 약 1백만개 세포 내지 약 5백만개 세포/kg, 약 1백만개 세포 내지 약 6백만개 세포/kg, 약 1백만개 세포 내지 약 7백만개 세포/kg, 약 1백만개 세포 내지 약 8백만개 세포/kg, 약 1백만개 세포 내지 약 9백만개 세포/kg, 약 1백만개 세포 내지 약 10백만개 세포/kg일 수 있다. 일부 실시양태에서, 총 치료 유효 용량은 (환자당 형질도입된 세포)은 약 1e6 형질도입된 세포, 약 1e6 내지 약 1e7 형질도입된 세포, 약 1e7 내지 약 1e8 형질도입된 세포, 약 1e8 내지 약 1e9 형질도입된 세포, 약 1e9 내지 약 1e10 형질도입된 세포, 약 1e10 내지 약 1e11 형질도입된 세포, 약 1e11 형질도입된 세포, 또는 약 1e11 초과의 형질도입된 세포만큼 높을 수 있다. 한 측면에서, 치료 유효 용량은 약 1e8 내지 약 2e8 형질도입된 세포일 수 있다. 임상 및 약학 분야의 통상의 기술자는 통상적인 실험을 통해, 즉 화합물의 투여에 대한 대상체의 반응을 모니터링하고 투여량을 그에 따라 조정함으로써 치료 유효량을 결정할 수 있을 것이다. 특정 실시양태에서, 조작된 T 세포에 의해 발현되는 세포 표면 수용체는 항-CD19 CAR이다. 특정 실시양태에서, 항-CD19 CAR은 문헌 [Kochenderfer et al., J Immunother. 2009 September; 32(7): 689-702]에 제시된 FMC63-28Z CAR 또는 FMC63-CD828BBZ CAR일 수 있고, 상기 문헌의 내용은 FMC63-28Z CAR 또는 FMC63-CD828BBZ CAR을 발현하는 T 세포를 생산하기 위해 사용되는 벡터를 구축하는 방법을 제공하기 위해 본원에 참조로 포함된다. 특정 실시양태에서, FMC63-28Z CAR 또는 FMC63-CD828BBZ CAR을 발현하는 조작된 T 세포의 치료 유효 용량은 체중 킬로그램당 약 1백만개 초과 내지 약 3백만개 미만의 형질도입된 조작된 T 세포 (세포/kg)일 수 있다. 특정 실시양태에서, FMC63-28Z CAR 또는 FMC63-CD828BBZ CAR을 발현하는 조작된 T 세포의 치료 유효 용량은 체중 킬로그램당 1백만개 초과 내지 약 2백만개의 형질도입된 조작된 T 세포 (세포/kg)일 수 있다. 특정 실시양태에서, FMC63-28Z CAR 또는 FMC63-CD828BBZ CAR을 발현하는 조작된 T 세포의 치료 유효 용량은 약 2백만개 내지 약 3백만개 미만의 형질도입된 조작된 T 세포/kg이다. 특정 실시양태에서, FMC63-28Z CAR 또는 FMC63-CD828BBZ CAR을 발현하는 조작된 T 세포의 치료 유효 용량은 약 2.0백만개, 약 2.1백만개, 약 2.2백만개, 약 2.3백만개, 약 2.4백만개, 약 2.5백만개, 약 2.6백만개, 약 2.7백만개, 약 2.8백만개, 또는 약 2.9백만개의 형질도입된 조작된 T 세포/kg이다. 특정 실시양태에서, FMC63-28Z CAR 또는 FMC63-CD828BBZ CAR을 발현하는 조작된 T 세포의 바람직한 치료 유효 용량은 약 2백만개의 형질도입된 조작된 T 세포/kg이다. 특정 실시양태에서, FMC63-28Z CAR 또는 FMC63-CD828BBZ CAR을 발현하는 조작된 T 세포의 치료 유효 용량은 적어도 약 2백만개의 형질도입된 조작된 T 세포/kg이다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 본원에 기재된 방법에 의해 생산되는 조작된 T 세포의 집단을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 또한 제약상 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 담체는 관심 세포를 한 조직, 장기, 또는 신체의 일부로부터 또 다른 조직, 장기, 또는 신체의 일부로 운반하거나 수송하는데 수반되는 제약상 허용되는 물질, 조성물, 또는 비히클일 수 있다. 예를 들어, 담체는 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매, 또는 캡슐화 물질, 또는 이들의 일부의 조합일 수 있다. 담체의 각각의 성분은 제제의 다른 성분과 상용성이어야 한다는 점에서 "제약상 허용"되어야 한다. 이들은 또한 이들이 만날 수 있는 임의의 조직, 장기, 또는 신체의 일부와의 접촉에 적합하여야 하고, 이것은 이들이 그의 치료상 이점을 훨씬 능가하는 독성, 자극, 알레르기 반응, 면역원성, 또는 임의의 다른 합병증의 위험을 갖지 않아야 함을 의미한다.
용어 "약"은 본원에 사용될 때 언급된 값 또는 값의 범위의 5% 또는 10% 이내를 의미한다.
다음 실시예는 본 발명의 다양한 실시양태를 예시하고자 의도된다. 따라서, 논의된 구체적인 실시양태는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 아래 실시예는 항-CD19 키메라 항원 수용체 (CAR)가 형질도입된 T 세포에 관한 것이지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 방법이 임의의 CAR이 형질도입된 T 세포에 적용될 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 동등물, 변화, 및 변형이 이루어질 수 있음이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이고, 이러한 동등한 실시양태는 본원에 포함되어야 함이 이해된다. 추가로, 본원에 인용된 모든 참고문헌은 마치 본원에 그 전체가 제시되는 바와 같이, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
실시예 1: 생체 외에서 유전자-변형된 자가 세포의 제조
한 실시양태에 따른 예시적인 T 세포 제조 공정 ("개선된" 공정)의 개요가 도 1에 제시된다. 이러한 개선된 공정은 T 세포 산물의 특징을 유지하면서 T 세포 제조를 위해 전통적으로 사용되는 공정 ("종래" 공정)에 대한 개선을 포함한다 (이들 개선을 예시하는 도 2 참조). 구체적으로, 개선된 공정은 예상치 않게 혈청 사용을 제외할 수 있는 폐쇄 공정이다. 추가로, 이러한 개선된 공정은 형질도입된 T 세포의 집단을 생산하기 위해 단일 사이클 형질도입을 사용한다. 또한, 이러한 공정을 사용하여 총 6일 동안 확장을 겪은 세포가 10일 동안 확장을 겪은 세포보다 더 많은 유약 면역-표현형 프로파일을 보인다. 이러한 공정은 예를 들어 CD19에 대한 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 형질감염된 T 세포의 표적 수를 갖는 산물을 재현가능하게 제조할 수 있지만; 이들 방법은 임의의 CAR로 형질도입된 T 세포에 적용된다.
구체적으로, 공정은 표준 분리반출술 장비 및 절차를 사용하여 수집된 분리반출술 산물에 적합하고, 림프구에 대해 대상체의 분리반출술 산물을 농축하고 재조합 IL-2 및 항 CD3 항체의 존재 하에 규정된 배양 기간 동안 대상체의 T 세포를 활성화하고, T 세포가 선택적으로 생존하고 증식하는 생체외 배양 환경을 제공하고, CD19 키메라 항원 수용체를 일정한 형질감염 효율 범위 내에서 발현하도록 조작된 레트로바이러스 벡터를 사용하여 대상체의 T 세포를 형질감염시키고, 산물 관련 불순물을 일정한 수준으로 감소시키고 (산물 관련 불순물은 대상체로부터의 출발 물질 내의 비-T 세포를 포함함), 공정 관련 불순물을 일정한 수준으로 감소시키도록 (공정 관련 불순물은 성장 배지, 시토카인, 및 다른 공정 시약을 포함함) 설계된다.
분리반출술 수집. 표준 분리반출술 장비, 예컨대 코베(Cobe)® 스펙트라, 스펙트라 옵티아(Spectra Optia)®, 펜월(Fenwal)™ 아미쿠스(Amicus)® 또는 동등한 장비를 사용하여 백혈구를 수집하였다 (백혈구 분리반출술). 백혈구 분리반출술 공정을 통해 일반적으로 환자로부터 대략 200-400 mL의 분리반출술 산물을 얻었다. 분리반출술 산물은 현장에서 제조 공정에 적용되거나, 또는 임의로 상이한 위치에서 제조 공정을 수행하기 위한 설비로 1-10℃에서 운송될 수 있다. 추가의 공정 단계는 도 1에 개관된 바와 같이, ISO 7 세포 배양 공정 스위트 (또는 유사한 클린 룸 타입 환경)에서 수행될 수 있다.
부피 감소. 적절한 경우, 개선된 공정 부피 감소 단계는 세포 가공처리 기기, 예컨대 세팍스(Sepax)® 2 실험 기기 (바이오세이프 에스에이(Biosafe SA); 미국 텍사스주 휴스턴) 또는 동등한 기기를 사용하여 수행하고, 표준 무균 배관 키트를 사용하여 수행하였다. 세포의 수 및 각각의 대상체로부터의 도입 공급 물질의 부피 (대략 200-400 mL)의 가변성을 고려하여, 부피 감소 단계는 세포의 부피를 대략 120 mL로 표준화하도록 설계된다. 분리반출술 부피가 120 mL 미만인 경우, 부피 감소 단계는 수행할 필요가 없고, 세포는 직접 림프구 농축 단계로 전달된다. 부피 감소 단계는 각각의 대상체로부터 받은 세포의 부피를 표준화하고, 단핵 세포를 보유하고, 일관된 세포 수율 및 높은 세포 생존율을 달성하고, 오염 위험을 최소화하기 위해 폐쇄 시스템을 유지하도록 설계된다.
림프구 농축. 부피 감소 단계 후에, 세포를 기기 제조사 (니트셀 프로그램(NeatCell Program))에 의해 개발되고 권고되는 분리 프로토콜을 사용하고 표준 무균 배관 키트를 사용하여 세포 가공처리 기기, 예컨대 세팍스® 2 또는 동등한 기기에서 피콜 기반 분리에 적용하였다. 림프구 농축 단계는 산물 관련 불순물, 예컨대 RBC, 및 과립구를 감소시키고, 단핵 세포를 풍부화 및 농축하고, 공정 관련 잔류물, 예컨대 피콜을 세척하고 감소시키고, 세포 활성화를 위해 제조 중의 성장 배지 내의 세포를 제제화하고, 일관된 세포 수율 및 높은 세포 생존율을 달성한다. 폐쇄 시스템은 환경 오염을 최소화한다.
공정은 주위 온도에서 ISO 7 영역에서 수행할 수 있고, 모든 연결은 멸균 배관 용접기를 사용하여 수행하거나, 또는 ISO 5 층류 후드에서 수행할 수 있다.
T 세포 활성화. T 세포 활성화 단계는 림프구 농축으로부터 새로 가공처리된 세포, 또는 이전에 동결보존된 세포를 사용하여 수행할 수 있다. 동결보존된 세포가 사용되는 경우, 세포는 개발된 프로토콜을 사용하여 사용 전에 해동될 수 있다.
T 세포 활성화 단계는 레트로바이러스 벡터 형질도입에 대해 수용성이 되도록 T 세포를 선택적으로 활성화하고, 모든 다른 세포 종류의 생존 집단을 감소시키고, 일관된 세포 수율 및 높은 T 세포 생존율을 달성하고, 오염 위험을 최소화하기 위해 폐쇄 시스템을 유지한다.
세척 1. T 세포 활성화 단계 후에, 세포는 제조사에 의해 개발된 프로토콜을 사용하여 표준 무균 키트에서 신선한 배양 배지를 사용하여 세포 처리 장비, 예컨대 세팍스® 2 또는 동등한 기기를 사용하여 세척하였다. 세포를 레트로바이러스 벡터 형질도입을 위해 제제에 대략 100 mL의 최종 부피로 임의로 농축하였다. 세척 1 단계는 공정 관련 잔류물, 예컨대 항-CD3 항체, 소비된 성장 배지, 및 세포 파편을 감소시키고; 일관된 세포 수율 및 높은 T 세포 생존율을 달성하고, 오염 위험을 최소화하기 위해 폐쇄 시스템을 유지하고; 충분한 수의 생존 T 세포를 형질도입의 개시를 위해 적절한 작은 부피로 농축하고 전달한다.
레트로바이러스 형질도입. 먼저 백을 재조합 피브로넥틴 또는 그의 단편, 예컨대 레트로넥틴® (다카라 바이오, 일본)으로 코팅함으로써 이전에 제조된 후, 활성화된 세포의 도입 전에 규정된 절차에 따라 레트로바이러스 벡터와 함께 인큐베이션된 세포 배양 백 (오리겐 바이오메디칼 PL240 또는 동등한 백)에, 신선한 세포 성장 배지 내의 세척 1 단계로부터의 활성화된 세포를 이송하였다. 레트로넥틴® 코팅 (10 μg/mL)은 2-8℃의 온도에서 20 ± 4시간 동안 수행하고, 희석 완충제로 세척한 후, 해동된 레트로바이러스 벡터와 함께 대략 180 - 210분 동안 37 ± 1℃ 및 5 ± 0.5% CO2에서 인큐베이션하였다. 백에 세포를 첨가한 후, 형질도입을 20 ± 4시간 동안 37 ± 1℃ 및 5 ± 0.5% CO2에서 수행하였다. 레트로바이러스 형질도입 단계는 효율적인 형질도입의 발생을 허용하기 위해 제어된 조건 하에 레트로바이러스 벡터의 존재 하에 활성화된 T 세포를 배양하고, 일관된 세포 수율 및 높은 세포 생존율을 달성하고, 오염 위험을 최소화하기 위해 폐쇄 시스템을 유지한다.
세척 2. 레트로바이러스 형질도입 단계 후에, 세포는 제조사에 의해 개발된 프로토콜을 사용하여 표준 무균 키트에서 신선한 성장 배지를 사용하여 세포 처리 장비, 예컨대 세팍스® 2 또는 동등한 기기를 사용하여 세척하고, 세포를 확장 단계를 위해 제제에 대략 100 mL의 최종 부피로 농축하였다. 세척 2 단계는 공정 관련 잔류물, 예컨대 레트로바이러스 벡터 입자, 벡터 생산 공정 잔류물, 소비된 성장 배지, 및 세포 파편을 감소시키고; 일관된 세포 수율 및 높은 세포 생존율을 달성하고, 오염 위험을 최소화하기 위해 폐쇄 시스템을 유지하고; 소비된 성장 배지를, 확장 단계의 개시에 적절한 특정된 부피의 표적 수의 세포를 갖는 신선한 배지로 교환하도록 설계된다.
T 세포 확장. 세척 2 단계로부터의 세포를 배양 백 (오리겐 바이오메디칼 PL325 또는 동등한 배양기)에 무균 상태로 옮기고, 신선한 세포 성장 배지로 희석하고, 대략 72시간 동안 37 ± 1℃ 및 5 ± 0.5% CO2에서 배양하였다. 세포 밀도는 제5일부터 매일 측정하였다. T 세포의 배가 시간은 대상체마다 약간씩 상이할 수 있기 때문에, 총 세포수가 CAR-양성 T 세포/kg (대상체의 체중)의 표적 용량을 전달하기에 불충분한 경우에 72시간을 초과하는 추가의 성장 시간 (즉, 3-6일)이 필요할 수 있다. T 세포 확장 단계는 효과적인 용량을 전달하기 위해 충분한 수의 형질도입된 세포를 생산하고, 오염 위험을 최소화하기 위해 폐쇄 시스템을 유지하고, 일관된 세포 수율 및 높은 세포 생존율을 달성하기 위해 제어된 조건 하에서 세포를 배양하도록 설계된다. 하나의 이러한 효과적인 용량 또는 표적 용량은 둘 다 문헌 [Kochenderfer et al., J Immunother. 2009 September; 32(7): 689-702]에 상세하게 기재되어 있는 MSGV-FMC63-28Z 레트로바이러스 벡터 또는 MSGV-FMC63-CD828BBZ 레트로바이러스 벡터를 사용한 형질도입을 통해 생산된 2 x 106 FMC63-28Z CAR 양성 또는 FMC63-CD828BBZ CAR 양성 T 세포/kg (대상체 체중) (± 20%)를 포함하고, 상기 문헌의 내용은 마치 그 전체가 본원에 제시되는 것처럼 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
세척 3 및 농축. T 세포 확장 단계 후에, 세포는 제조사에 의해 개발된 프로토콜을 사용하여 표준 무균 키트에서 세포 가공처리 기기, 예컨대 세팍스® 2 또는 동등한 기기를 사용하여 0.9% 염수로 세척하고, 세척하고, 세포를 제제화 및 동결보존을 위해 제제에 대략 35 mL의 최종 부피로 농축하였다. 세척 3 단계는 공정 관련 잔류물, 예컨대 레트로바이러스 생산 공정 잔류물, 소비된 성장 배지, 및 세포 파편을 감소시키고; 일관된 세포 수율 및 높은 세포 생존율을 달성하고, 오염 위험을 최소화하기 위해 폐쇄 시스템을 유지하도록 설계된다.
일단 세포가 농축되고 0.9% 염수 내에서 세척된 후, 적절한 세포 용량은 최종 동결보존된 산물의 제조를 위해 제제화될 수 있다. 세포는 동결보존을 위해 제조되고, 하기 실시예 4에서 제시되는 방법에 따라 동결보존되었다.
실시예 2: 세포 배양 백에서 확장된 T 세포의 성장 성능
본원에 기재된 실시양태는 6일 내에 조작된 자가 T 세포 요법제의 효율적인 생산을 제공한다. 선행 기술에 대한 다음과 같은 개선이 달성되었다: 이전에 사용된 24, 14, 또는 10일 대신 6일로 단축된 공정 (이것은 산물 방출에 필요한 시험 (RCR 시험 포함)의 수를 감소시킨다); 증가된 효능 및 효과를 위한 유약 T 세포의 더 높은 비율을 비롯한 개선된 T 세포 산물; 더 짧은 제조 시간을 상쇄하기 위해 매우 많은 세포로 개시할 수 있는 배양; 본원에 기재된 방법의 단계를 수행하는 폐쇄 시스템; T 세포 성장을 지지하는 인간 무혈청 배양 조건의 확인; 백 내의 단일 사이클 레트로바이러스 형질도입; 플라스크가 아니라 백 내에서 수행되는 세포 배양 활성화 및 확장; 및 동결 산물의 제공. 이들 개선은 다수의 암 증상의 치료를 위한 신규한 조작된 말초 혈액 자가 T 세포 치료제 (eACT)의 개발 및 상업화를 위해 사용되었다. 개발 프로그램으로부터 생성되는 T 세포는 이전의 방법에 의해 증식된 세포와 동일한 표현형 및 활성 프로파일을 유지하였다.
조작된 T 세포의 생성. 도 2는 개선된 공정에서 본원에 기재된 개선을 보이는 T 세포 제조 공정에 대한 개요를 제시한다. 간략하게, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 분리반출술에 의해 B 세포 악성종양이 있는 대상체로부터 얻고, 분할하고, 종래 기술 및 본원에 기재된 개선된 기술을 사용하여 나란히 가공처리하였다. 5개의 연구는 제6일에 성장을 통한 모든 공정 단계를 평가하였지만, 최종 세척 및 동결보존 작업은 실시하지 않았다. 2개의 추가의 연구에서, 개선된 공정은 다시 림프종 환자로부터의 분리반출술 산물을 사용하여 분리반출술 물질의 초기 가공처리로부터 최종 제제화 및 동결 단계까지 실시하였다.
분리반출술 산물 (또는 "샘플")을 폐쇄된 세팍스 2 공정에 의해 PBMC의 피콜 분리에 의해 림프구에 대해 농축하였다. 이어서, 림프구를 개발 중인 프로토타입 보충물 (T 세포 SR 배지 보충물, 라이프 테크놀로지스)로 보충된 무혈청 배지 (옵트마이저™, 라이프 테크놀로지스)에서 폐쇄된 배양 백 내에서 성장시키고, T 세포 활성화를 위해 항-CD3 항체 및 rIL-2 (재조합 IL-2)로 48시간 (제0-2일) 동안 자극하였다. 활성화된 T 세포를 이어서 폐쇄된 세팍스 2 공정을 사용하여 세척하였다.
제조 공정의 제2-3일에, 활성화된 T 세포를 감마 레트로바이러스 벡터를 사용하여 항-CD19 CAR로 형질도입시켰다. 형질도입은 다음과 같이 폐쇄 시스템에서 수행하였다. 폐쇄된 세포 배양 백 (즉, 오리겐 퍼마라이프™ PL240 백)을 2-10 μg/mL으로 레트로넥틴®으로 코팅한 후, 레트로넥틴®을 제거하고, 백을 완충 염수로 세척하였다. 감마 레트로바이러스를 이어서 폐쇄 시스템 백에 도입한 후, 인큐베이션하였다. 활성화된 T 세포를 이어서 레트로바이러스 벡터가 존재하는 백 내로 직접 첨가하고, 밤새 37℃에서 인큐베이션하였다. 레트로넥틴®-코팅 배양 백으로부터의 물질을 제거하고, 세포 확장을 위해 별 세포 배양 백에 두었다. 임의의 세척 단계를 세포 확장 전에 추가할 수 있다. 형질도입된 T 세포는 3일 (제3-6일) 동안 항생제가 없는 폐쇄 백 시스템에서 팽상시켰다. 생성되는 조작된 T 세포를 이어서 수거하고, 동결보존하였다 (동결보존은 선택적인 단계임).
조작된 T 세포 표현형. 조작된 T 세포는 (i) CAR 유전자 발현을 확인하고, (ii) T 세포 집단 순도를 확인하고, (iii) T 세포 하위세트 마커 CCR7, CD45RA, CD62L 및 기능적 능력 마커 CD27 및 CD28의 세포 표면 발현을 사용하여 조작된 T 세포의 집단에 존재하는 세포 표현형을 결정하기 위해 형광-활성화된 세포 분류 (FACS)에 의해 분석하였다.
조작된 T 세포 활성. 조작된 T 세포는 또한 항원 (Ag) 양성 (즉, CD19+) 표적 세포와의 공동-배양 후에 조작된 T 세포에 의한 인터페론 감마 (IFNγ)의 생산을 측정하기 위해 시험관내 공동-배양 생물검정을 사용하여 분석하였다. 조작된 T 세포는 또한 FACS에 의해 Ag 양성 표적 세포와의 공동-배양 후에 조작된 T 세포에 의한 인터페론 감마 (IFNγ)의 세포내 생산 및 CD107a의 발현에 대해 분석하였다.
성장 연구. T 세포 성장 및 생존율은 세포 성장이 강력하고, 일관되고, 종래 연구와 유사함 (또는 더 우수함)을 보장하기 위해 각각의 실험에서 평가하였다.
동결보존. 세포를 제6일에 생리 염수로 세척하고, 이어서 HSA를 5%로 첨가하고, 세포를 크리오스토르™ 10 (바이오라이프 솔루션™)과 1:1로 혼합하였다. 이어서, 세포를 규정된 동결 사이클을 사용하여 속도 제어 동결기에서 동결한 후, 기상 액체 질소 내에 보관하였다. mL당 약 1 x 106 내지 1.5 x 10e7의 세포가 이러한 공정에 의해 성공적으로 동결보존 및 해동될 수 있는 것으로 제시되었다. HSA가 존재하는 염수는 시험된 다른 용액 (예를 들어, PL/D5)만큼 양호하거나 이보다 더 우수하였고, HSA는 동결-해동 회복을 개선하였다.
세포를 트리판 블루 배제 및 FACS (애넥신 V 및 7AAD에 대한 FACS 기반 염색)에 의해 해동 시 생존율에 대해 평가하였다. 세포는 해동 후에 IFN-감마에 의해 측정될 때 그의 표현형 및 생물학적 기능을 보유하였다.
결과
성장 연구는 배지 성장 보충물과 함께 무혈청 배지에서 수행하였다. 이들 연구에서, 그 성과는 가변적이었고, 성공은 5% 인간 혈청을 함유하는 배지 (AIMV)와 유사한 표현형을 유도하는 배지로 규정되었다. 상기 기재된 방법에서 사용된 무혈청 배지는 우수한 T 세포 성장 및 AIMV에서의 성장과 유사한 표현형을 유도하였다. 하나의 예기치 않은 관찰은 우수한 성장 및 생존율을 달성하기 위해, 세포는 세포 밀도가 대략 1.5 x 106/mL에 도달할 때까지 계대배양될 필요가 있었다. 세포가 대략 이러한 세포 농도로 계대배양되지 않으면, 생존율은 저하될 수 있었다. 그러나, 대략 0.4 내지 1.5e6/mL의 범위에서, 세포는 플라스크 또는 폐쇄 백 시스템에서 37℃에서 배양물 내에서 24시간 이하의 배가 시간으로 잘 성장하였다.
새로운 수용체 유전자가 감마 레트로바이러스 벡터를 사용하여 T 세포 내로 도입된 조작된 T 세포를 생성하는 공정은 세포가 성공적으로 형질도입될 수 있도록 활발히 성장할 것을 필요로 한다. 여기서, T 세포는 항-CD19 CAR로 형질도입되었지만, 본원에 기재된 공정은 임의의 CAR 또는 TCR에 대해 사용될 수 있다. 인간 T 세포 성장은 개방 T 플라스크 또는 폐쇄된 세포 배양 백 시스템에서 항-CD3 항체 및 IL2를 사용하여 옵트마이저™ 배지에서 자극될 수 있음이 입증되었다. FACS를 사용하여, CFSE로 염색된 세포가 이러한 자극 동안 옵트마이저™ 배지 또는 AIMV 플러스 5% 인간 혈청에서 동등하게 잘 성장함이 입증되었다. T 세포 성장이 다른 인큐베이션 시간에서 관찰되었지만, 항-CD3 항체 및 IL2와의 2일 인큐베이션이 옵트마이저™ 배지에서 활발하게 성장하는 세포를 얻는데 최적임이 입증되었다.
폐쇄 백 시스템에서 옵트마이저™ 배지 내의 형질도입을 조사하기 위해 다양한 조건을 평가하였다. 본 발명의 신규한 한가지 측면은 폐쇄 백 시스템에서 옵트마이저™ 배지 내의 형질도입을 달성하기 위해 개발된 단계의 특정 순서이다. 기재된 공정은 작동상 간단하다는 이점을 갖지만, 이전에 사용된 조건과 유사한 형질도입 빈도를 계속 제공한다. 이전에 형질도입 프로토콜에 포함된 단계 (예를 들어 단백질, 예컨대 HSA를 사용한 코팅된 표면의 차단)가 필요하지 않음을 알게 되었다. 형질도입 빈도는 레트로넥틴®-코팅 세포 배양 백으로부터의 제거 후에 세포의 세척에 의해 영향을 받지 않았다.
자극 공정 개시 후 6일 또는 10일에 세포의 표현형 분석은 옵트마이저™ 배지에서 세포가 일반적인 사용 시에 유사한 백 또는 플레이트 시스템에서 AIMV 배지 내에서 성장한 세포와 전반적으로 유사함을 보여주었다 (도 4-5 참조). 이와 유사하게, 옵트마이저™ 배지에서 간단한 폐쇄된 공정 백 시스템에서 생산된 세포는 시험관내 공동-배양 검정에서 Ag-양성 표적 세포에 반응하여 IFN감마를 생산할 수 있고, 이것은 이러한 증진된 공정에 의해 제조된 T 세포가 생물학적으로 활성임을 보여준다.
하기 표 1은 본원에 기재된 개선된 공정을 사용한 제6일의 IFN감마 생산 (pg/ml)을 제시한다.
<표 1>
Figure pat00007
샘플은 전체 규모 조작 실행으로부터 유래한 것이었다.
UT - 비형질도입된; TD - 형질도입된.
또 다른 예상치 못한 관찰은 10일 이상의 배양 기간을 단순히 본 발명의 6일로 단축함으로써 나이브 중심 기억 세포의 제시가 증가하고 분화된 이펙터 T 세포의 제시가 감소함과 동시에 보다 많은 유약 T 세포 분포를 얻을 수 있다는 것이다 (도 4-5 참조). 이것은 산물 효능 및 다른 특질에 대한 유용한 영향을 갖는다. 구체적으로, 충분한 세포를 단지 배양 3일 후에 확장된 산물로부터 수집할 수 있다. 자극 개시로부터 확장된 형질도입된 세포의 수거까지의 총 시간은 6일이고, 이것은 대략 1-2 x 108 CAR-양성 세포의 용량을 지지한다 (도 6). 매우 많은 세포가 필요할 경우, 세포는 백에서 계속 활발하게 성장하고, 세포 배양물은 10일 이상의 시간에 수거될 수 있다. 별법으로, 출발 집단 내의 보다 높은 수의 세포가 6일의 기간 내에 더 큰 세포 집단을 생성하기 위해 이용될 수 있다.
추가로, 림프종 환자로부터의 분리반출술을 사용하여 2가지의 연구를 전체 규모로 수행하였며, 여기서 제6일 세포를 0.9% 염수에서 추가로 세척하고, 최종 산물 제제로 제제화하고 동결보존하였다. 제6일 세포 산물을 많은 파라미터에 대해 해동전 및 해동후 평가하였다. 동결전 수준에 비해 해동후 3일에 CAR-양성 T 세포 비율의 유의한 차이는 존재하지 않았고, 이것은 동결보존 프로토콜이 CAR 발현에 유해하지 않음을 시사한다. 또한, CAR-양성 세포는 CD19-양성 표적과의 공동-배양 후에 IFN-감마 방출에 의해 측정 시에 CD19-특이적 항원 인식을 계속 제시하였다. 해동 시 세포의 생존율은 시험된 2종의 산물에 대해 각각 90% 및 79%이었다.
실시예 3: 폐쇄 시스템의 형질도입 조건의 개발
이전에, 비-조직 배양물 처리된 6웰 플레이트에서 PBMC의 형질도입을 수행하였다. 플레이트를 2-8℃에서 밤새, 또는 실온에서 2시간 동안 10 μg/mL에서 레트로넥틴®으로 코팅하였다. 인큐베이션 후에, 레트로넥틴®을 제거하고, 플레이트를 2.5% HSA로 30분 동안 차단한 후, HBSS + 5 mM HEPES로 세척하였다. 플레이트-기반 공정에서, 레트로바이러스 벡터를 코팅된 웰에 적용하고, 원심분리기에서 원심분리한 후, 대략 75%의 바이러스 상청액을 제거하고, 원심접종에 의한 형질도입을 위해 세포를 첨가하였다.
본원에 제시된 바와 같이, 폐쇄된 세포 배양 백에서 PBMC의 형질도입을 위한 레트로넥틴®의 농도를 최적화하고 HSA 세척 및 바이러스 상청액 제거가 형질도입에 영향을 주는지 결정하기 위해 3개의 연구를 완료하였다. 제1 실험은 오리겐 퍼마라이프™ PL07 백에서 수행하였며, 여기서 세포 활성화, 형질도입, 및 확장은 AIM V® 배지 + 5% 인간 혈청에서 수행하였다. 2-40 μg/mL의 레트로넥틴® 농도 범위를 3명의 별개의 공여자로부터의 PBMC에서 평가하였다. 95% 신뢰도 수준에서 10 및 40 μg/mL 레트로넥틴® 농도에서 플레이트에서의 형질도입 vs. 백에서의 형질도입, 또는 HSA 차단 없이 수행된 형질도입 사이에 유의한 차이는 존재하지 않았다. 그러나, 동일한 신뢰도 수준에서, 레트로넥틴® 농도의 2 μg/mL로의 감소, 또는 형질도입 전에 백으로부터 레트로바이러스 벡터의 제거는 하기 표 2에 표시된 바와 같이 형질도입 효율을 다소 감소시키는 것으로 보였다.
<표 2> 플레이트에서의 형질도입에 비해 세포 배양 백에서의 형질도입에 대한 레트로넥틴® 농도, HSA 차단, 및 레트로바이러스 벡터 제거의 영향
Figure pat00008
2명의 별개의 공여자로부터의 PBMC를 사용하여 오리겐 퍼마라이프™ PL07 백 내의 AIM V® 배지 + 5% 인간 혈청에서의 제2 연구는 제1 연구로부터의 결과를 확인해주고, 백에서의 최대 형질도입 효율이 1-20 μg/mL 레트로넥틴® 범위에서 발생함을 보여주었다 (도 8 참조). 추가로, HSA 차단 단계는 공정을 증진시키거나 형질도입 효율을 증가시키지 않는다 (도 9 참조). 또한, 연구는 형질도입된 세포 표현형 (CD45RA/CCR7)이 HSA 차단 단계의 제거에 의해 영향받지 않음을 제시하였다.
제3 연구에서, 2명의 공여자로부터 PBMC를 오리겐 퍼마라이프™ PL70 백 내의 옵트마이저™ + 2.5% 보충물 또는 AIM V® + 5% HSA에서 2일 동안 자극하였다. 제2일에, 세포를 세척하고, PL30 또는 6-웰 플레이트에서 레트로바이러스 벡터로 형질도입시켰다. 형질도입 동안 세포 농도는 0.5 x 106/mL이었다. 제3일에, 형질도입된 세포를 T175 플라스크 (대조군으로서) 또는 PL30 백에 옮겼다. 제6일 및 제7일에, 세포를 CAR 발현 및 표현형에 대해 공동-배양 검정에서 및 FACS에 의해 효능에 대해 평가하였다. 도 10은 형질도입 빈도에 대한 레트로넥틴® 농도의 영향을 제시하며, 여기서 5 μg/mL 초과의 레트로넥틴®은 백 내의 형질도입 빈도에 영향을 주지 않았다. 도 11은 이들 조건에서 시험된 세포의 활성이 표적 세포 상의 CD19 항원 인식에 반응하여 세포 활성화의 척도 (CD107a 발현 및 IFN-감마 생산)가 평가될 때 유사함을 제시한다. 이 경우, 형질도입된 세포를 CD19-양성 Nalm6 세포와 4시간 동안 인큐베이션한 후, CD107a의 세포 표면 발현, 및 세포내 IFN-감마 생산에 대한 염색을 수행하였다.
따라서, 본원에 제시된 방법에 따르면, 백이 레트로넥틴®으로 10 μg/mL에서 코팅되고; 형질도입이 옵트마이저™ 배지 + 2.5% 보충물을 사용하여 백에서 수행되는 것이고; HSA를 사용한 차단 단계가 형질도입 효율 또는 세포 효능 또는 표현형에 대한 영향을 갖지 않고; 백 내에서의 형질도입이 플레이트에서의 형질도입과 유사한 표현형을 갖는 T 세포 산물을 유도하고; 형질도입 동안 백에 세포를 첨가하기 전에 레트로바이러스 벡터 제거가 전체적인 형질도입 빈도를 증가시키지 않았고 약간 감소시킬 수 있는 공정이 지지된다.
실시예 4: 제조된 항-CD19 CAR+ T 세포에 대한 동결보존 단계의 개발
제조된 항-CD19 CAR T 세포의 동결보존을 위한 최적 조건을 결정하기 위해 일련의 개발 연구를 수행하였다. 연구는 해동 시 높은 생존율을 위한 조건, 동결된 산물 제제, 최적화된 동결 프로토콜을 확립하고, 세포 표현형 및 효능에 대한 동결 해동의 영향을 결정하도록 설계되었다. 성능을 평가하기 위해 다음 분석 척도를 사용하였다: 해동 전 및 후의 트리판 블루 배제에 의한 세포 카운트, 해동 후 FACS에 의한 애넥신 염색, CAR+ T 세포 및 표현형 (CCR7, CD45RA)을 결정하기 위한 FACS 염색, 해동 후 동결보존된 세포의 배양물에서의 성장, 및 CD19+ 세포와의 공동-배양 후 IFN-감마 생산 효능.
레트로바이러스 벡터로 형질도입된 PBMC는 상기 언급된 성능 척도를 평가하기 위해 사용되었다. 개발 연구에서, 3 - 12 x 106/mL의 농도 범위의 동결보존된 세포를 20 mL의 최종 동결보존된 부피로 사용하였다. 실제 임상 산물의 세포 밀도는 대상체 체중 및 CAR 형질도입 빈도를 기초로 하여 이러한 범위 내에 해당할 것으로 예상된다. 연구를 뚜렷한 차이가 없는 상태에서 오리겐 CS50 백 또는 AFC 크리오슈어(KryoSure)® 20-F 백에서 수행하였다.
형질도입된 세포를 세척하고, 인간 혈청 알부민 (HSA)이 있거나 없는, 0.9% 염수 또는 플라즈마-라이트® A와 D5 절반 생리 염수 (5% 덱스트로스 / 0.45% NaCl)의 1:1 혼합물을 함유하는 용액 내에 재현탁하였다. 세포를 이어서 1:1 또는 1:2의 비로 크리오스토르® CS10과 혼합하였다. 다양한 연구에서, 세포를 속도 제어 동결기 (CRF)에서 동결보존하고, 기상 LN2에서 2일 초과 동안 보관한 후, 해동하고, 생존율, CAR 발현, 표현형 및 활성에 대해 평가하였다. 일부 실험에서, 세포를 대조군으로서 80% 인간 AB 혈청 + 20% DMSO와 1:1로 혼합하였다.
해동 시 세포 회복은 2.5% 최종 농도의 HSA가 동결보존된 산물에 포함될 때 증진되었다 (표 3). 또한, HSA와 함께 동결된 세포는 보다 높은 생존율을 유지하고, 배양물에 다시 도입될 때 보다 신속하게 성장하기 시작하고, 높은 세포 생존율을 보다 신속하게 회복하였다 (표 4).
<표 3> 동결보존물의 상이한 희석액에서 동결보존된 항 CD19 CAR+ T 세포의 해동 직후 세포 회복.
Figure pat00009
<표 4> 동결보존물의 다양한 희석액에서 동결보존된 항 CD19 CAR+ T 세포의 해동 후 세포 회복 및 성장.
Figure pat00010
플라즈마-라이트® A/D5 절반 생리 염수를 0.9% 염수와 비교한 연구는 해동 시 회복, 해동 후 배양물에서의 세포 성장 성능 또는 표현형에서 유의한 차이가 존재하지 않음을 제시하였다 (표 5). 또한, 세포를 크리오스토르® CS10으로 1:1로 희석하는 것에 비해 크리오스토르® CS10으로 1:2로 희석할 때 이들 파라미터에 개선이 존재하지 않았다. 동결보존된 산물 내의 2.5%의 HSA의 최종 농도와 함께 T 세포 희석제 내에 5% 인간 혈청을 사용하는 대부분의 실험에서, 성능은 80% 인간 AB 혈청/20% DMSO와 1:1로 동결된 세포의 성능과 동일하거나 이를 초과하였다. 따라서, 세포를 0.9% 생리 염수로 세척하고, HSA를 5%로 첨가한 후, 세포를 크리오스토르® CS10으로 1:1로 희석한 최종 동결보존된 산물을 선택하기로 결정하였다.
<표 5> 0.9% 생리 염수 vs. 플라즈마-라이트®/D5 절반 생리 염수 내에 희석된 세포의 성능
Figure pat00011
0.45% 생리 염수, 2.5% HSA 및 50% 크리오스토르® CS10의 선택된 제제, 및 오리겐™ CS250 백 내의 대략 50-60 mL의 최종 산물 부피에 대한 동결 사이클 개발을 수행하였다. 모든 실행은 각각의 실행에 대해 단일 배지 제제 및 부피를 사용하여 개별적으로 수행하였다. 공기를 백으로부터 제거하고, 백의 외부 표면에 열전쌍을 부착함으로써 산물 온도를 모니터링하였다. 개개의 백을 CS250 백을 수용하도록 설계된 동결 카세트, 예컨대 커스텀 바이오제닉 시스템즈(Custom BioGenic Systems)™, 파트 넘버 ZC021에 넣고, 속도 제어 동결기 내의 동결 선반의 중앙부에 위치시켰다.
온도 스파이크를 개시하는 지점의 결정을 돕기 위해 0.45% 생리 염수, 2.5% HSA 및 50% 크리오스토르® CS10이 자연적으로 응집되는 지점을 결정하기 위해 일련의 동결 사이클을 평가하였다. 각각의 실행 후에, 만족스러운 샘플 온도 프로파일이 생성될 때까지 동결 프로토콜을 변경하였다. 만족스러운 샘플의 생성에 대한 기준은 차가운 스파이크가 융합 열을 가장 큰 가능한 정도로 상쇄하고 샘플이 1℃/분의 냉각 속도를 유지한다는 것이었다. 속도 제어 동결기 (CRF)에서 50 mL 백에 대한 최적화된 프로토콜을 표 6에 표시하고, 챔버 및 산물의 대응하는 온도 프로파일을 도 12에 표시한다.
<표 6> 속도 제어 동결기에서 항 CD19 CAR+ T 세포 산물 제제에 대한 최적화된 동결 사이클.
Figure pat00012
SEQUENCE LISTING <110> BETTER, Marc FELDMAN, Steven A. ROSENBERG, Steven A. <120> METHODS FOR PRODUCING AUTOLOGOUS T CELLS USEFUL TO TREAT B CELL MALIGNANCIES AND OTHER CANCERS AND COMPOSITIONS THEREOF <130> 077488.8001.WO00 <140> PCT/US2015/014520 <141> 2015-02-04 <150> US 61/935,833 <151> 2014-02-04 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <400> 1 000 <210> 2 <400> 2 000 <210> 3 <400> 3 000 <210> 4 <211> 5542 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid sequence of MSGV1 gamma retroviral vector backbone <400> 4 ggatccgata aaataaaaga ttttatttag tctccagaaa aaggggggaa tgaaagaccc 60 cacctgtagg tttggcaagc tagcttaagt aacgccattt tgcaaggcat ggaaaataca 120 taactgagaa tagagaagtt cagatcaagg ttaggaacag agagacagca gaatatgggc 180 caaacaggat atctgtggta agcagttcct gccccggctc agggccaaga acagatggtc 240 cccagatgcg gtcccgccct cagcagtttc tagagaacca tcagatgttt ccagggtgcc 300 ccaaggacct gaaaatgacc ctgtgcctta tttgaactaa ccaatcagtt cgcttctcgc 360 ttctgttcgc gcgcttctgc tccccgagct caataaaaga gcccacaacc cctcactcgg 420 cgcgccagtc 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aatacataac tgagaataga gaagttcaga tcaaggttag 3840 gaacagagag acagcagaat atgggccaaa caggatatct gtggtaagca gttcctgccc 3900 cggctcaggg ccaagaacag atggtcccca gatgcggtcc cgccctcagc agtttctaga 3960 gaaccatcag atgtttccag ggtgccccaa ggacctgaaa atgaccctgt gccttatttg 4020 aactaaccaa tcagttcgct tctcgcttct gttcgcgcgc ttctgctccc cgagctcaat 4080 aaaagagccc acaacccctc actcggcgcg ccagtcctcc gatagactgc gtcgcccggg 4140 tacccgtatt cccaataaag cctcttgctg tttgcatccg aatcgtggac tcgctgatcc 4200 ttgggagggt ctcctcagat tgattgactg cccacctcgg gggtctttca tttggaggtt 4260 ccaccgagat ttggagaccc ctgcctaggg accaccgacc cccccgccgg gaggtaagct 4320 ggccagcggt cgtttcgtgt ctgtctctgt ctttgtgcgt gtttgtgccg gcatctaatg 4380 tttgcgcctg cgtctgtact agttagctaa ctagctctgt atctggcgga cccgtggtgg 4440 aactgacgag ttcggaacac ccggccgcaa ccctgggaga cgtcccaggg acttcggggg 4500 ccgtttttgt ggcccgacct gagtccaaaa atcccgatcg ttttggactc tttggtgcac 4560 cccccttaga ggagggatat gtggttctgg taggagacga gaacctaaaa cagttcccgc 4620 ctccgtctga atttttgctt tcggtttggg accgaagccg cgccgcgcgt cttgtctgct 4680 gcagcatcgt tctgtgttgt ctctgtctga ctgtgtttct gtatttgtct gagaatatgg 4740 gcccgggcta gcctgttacc actcccttaa gtttgacctt aggtcactgg aaagatgtcg 4800 agcggatcgc tcacaaccag tcggtagatg tcaagaagag acgttgggtt accttctgct 4860 ctgcagaatg gccaaccttt aacgtcggat ggccgcgaga cggcaccttt aaccgagacc 4920 tcatcaccca ggttaagatc aaggtctttt cacctggccc gcatggacac ccagaccagg 4980 tcccctacat cgtgacctgg gaagccttgg cttttgaccc ccctccctgg gtcaagccct 5040 ttgtacaccc taagcctccg cctcctcttc ctccatccgc cccgtctctc ccccttgaac 5100 ctcctcgttc gaccccgcct cgatcctccc tttatccagc cctcactcct tctctaggcg 5160 cccccatatg gccatatgag atcttatatg gggcaccccc gccccttgta aacttccctg 5220 accctgacat gacaagagtt actaacagcc cctctctcca agctcactta caggctctct 5280 acttagtcca gcacgaagtc tggagacctc tggcggcagc ctaccaagaa caactggacc 5340 gaccggtggt acctcaccct taccgagtcg gcgacacagt gtgggtccgc cgacaccaga 5400 ctaagaacct agaacctcgc tggaaaggac cttacacagt cctgctgacc acccccaccg 5460 ccctcaaagt agacggcatc gcagcttgga tacacgccgc ccacgtgaag gctgccgacc 5520 ccgggggtgg accatcctct ag 5542

Claims (1)

  1. 공여 대상체로 얻은 림프구의 집단을 농축하는 단계;
    림프구의 집단을 1종 이상의 T-세포 자극제로 자극하여 활성화된 T 세포의 집단을 생산하며, 여기서 자극은 무혈청 배양 배지를 사용하여 폐쇄 시스템에서 수행되는 것인 단계;
    활성화된 T 세포의 집단을 단일 사이클 형질도입을 사용하여 세포 표면 수용체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입시켜 형질도입된 T 세포의 집단을 생산하며, 여기서 형질도입은 무혈청 배양 배지를 사용하여 폐쇄 시스템에서 수행되는 것인 단계; 및
    형질도입된 T 세포의 집단을 미리 결정된 시간 동안 확장시켜 조작된 T 세포의 집단을 생산하며, 여기서 확장은 무혈청 배양 배지를 사용하여 폐쇄 시스템에서 수행되는 것인 단계
    를 포함하는, 표적 세포의 표면 상의 특이적 항원 모이어티를 인식하는 세포 표면 수용체를 발현하는 T 세포의 제조 방법의 용도.
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