JP2023506184A - Ｌｉｌｒｂ１ベースのキメラ抗原受容体 - Google Patents

Abstract

ＬＩＬＲＢ１のヒンジ、膜貫通領域、および／もしくは細胞内ドメイン、またはそれらの機能的断片もしくは変異体を有するキメラ抗原受容体が提供される。ＬＩＬＲＢ１ベースの受容体を含む細胞、ならびにそれを作製および使用する方法もまた、本明細書に提供される。【選択図】図８

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１２月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／９４６，８８８号、および２０２０年８月３０日に出願された同第６３／０８５，９６９号に対する優先権を主張し、それらの各々の内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

配列表の参照による組み込み
本出願は、ＥＦＳ－ＷＥＢによりＡＳＣＩＩフォーマットで提出されている配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２０年１２月１１日に作成された、このＡＳＣＩＩコピーは、Ａ２ＢＩ－０１５－０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔと名付けられ、サイズは２２８ＫＢである。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法、およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）療法は、様々な疾患、特に血液悪性腫瘍だけでなく、他のがんに対しても効果的な治療アプローチであることが証明されている。ＣＡＲ ＮＫ細胞はまた、臨床応用も有し得る。従来のＣＡＲは、操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）に刺激シグナルを提供する。ＣＡＲ－Ｔ細胞において、これは、ＣＡＲの抗原結合ドメインによって識別される標的細胞に対して死滅活性をもたらす。阻害性ＣＡＲ（ｉＣＡＲ）は、細胞活性を制御するかまたは活性化ＣＡＲの活性を特定の細胞型に制限する手段として開発された。Fedorov et al. Sci. Transl. Med. 5(215):215ra172 (2013)。阻害性ＣＡＲは一般に、膜貫通領域および適宜ヒンジ領域を介して抗原結合性ドメイン（例えば、一本鎖可変断片、ｓｃＦｖ）に融合した阻害性シグナル伝達分子（ＰＤ－１またはＣＴＬＡ－４など）の細胞内ドメインを有する。

多数の代替のｉＣＡＲ構造が当該技術分野において説明されてきた。しかしながら、関連する組成物およびその使用方法と共に、新規の代替の阻害性受容体および優れた性能を有する特定の阻害性受容体構造の識別について満たされていない必要性が存在したままである。

一態様では、本開示は、ＬＩＬＲＢ１のヒンジ、膜貫通領域、および／もしくは細胞内ドメイン、またはそれらの機能的断片もしくは変異体を有するキメラ抗原受容体を提供する。キメラ抗原受容体は、単一のポリペプチド、または１つより多いポリペプチドを含み得る。受容体は、以下のうちの１つもしくは複数、または全てを含み得る：（ａ）ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインまたはその機能的断片もしくは変異体；（ｂ）ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインまたはその機能的変異体；および（ｃ）ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメインまたはその機能的変異体、例えば、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン、および／またはＬＩＬＲＢ１のポリペプチド配列に見出される少なくとも１つの免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む細胞内ドメイン。一部の実施形態では、受容体は、ＬＩＬＲＢ１のポリペプチド配列に見出される少なくとも２つのＩＴＩＭを含む。ＬＩＬＲＢ１のＩＴＩＭは、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号８）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号９）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１０）、およびＳＩＹＡＴＬ（配列番号１１）である。受容体は、同じＩＴＩＭの複数のコピーを含む任意の組合せにおいて、これらのＩＴＩＭのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上を含み得る。

本開示の受容体の一部の実施形態では、細胞内ドメインは、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号８）およびＶＴＹＡＥＶ（配列番号９）の両方のＩＴＩＭを含む。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、配列番号１２と少なくとも９５％同一である配列を含む。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号９）およびＶＴＹＡＱＬ（配列番号１０）の両方のＩＴＩＭを含む。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、配列番号１３と少なくとも９５％同一である配列を含む。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１０）およびＳＩＹＡＴＬ（配列番号１１）の両方のＩＴＩＭを含む。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、配列番号１４と少なくとも９５％同一である配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも３つの免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含み、各ＩＴＩＭが、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号８）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号９）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１０）、およびＳＩＹＡＴＬ（配列番号１１）から独立して選択される、細胞内ドメインを含む。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号８）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号９）、およびＶＴＹＡＱＬ（配列番号１０）のＩＴＩＭを含む。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、配列番号１５と少なくとも９５％同一である配列を含む。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号９）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１０）、およびＳＩＹＡＴＬ（配列番号１１）のＩＴＩＭを含む。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、配列番号１６と少なくとも９５％同一である配列を含む。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号８）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号９）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１０）、およびＳＩＹＡＴＬ（配列番号１１）のＩＴＩＭを含む。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、配列番号１７と少なくとも９５％同一である配列を含む。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン（配列番号７）と少なくとも９５％同一である配列を含む。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、配列番号１２～１７の配列を含む。

本開示の受容体の一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインまたはその機能的変異体を含む。一部の実施形態では、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインまたはその機能的変異体は、配列番号５と少なくとも９５％同一である配列を含む。一部の実施形態では、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインは、配列番号５を含む。

本開示の受容体の一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインまたはその機能的断片もしくは変異体を含む。一部の実施形態では、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインまたはその機能的断片もしくは変異体は、配列番号４、配列番号１８、配列番号１９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４または配列番号９３と少なくとも９５％同一である配列を含む。一部の実施形態では、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインは、配列番号４、配列番号１８、配列番号１９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４または配列番号９３と同一である配列を含む。一部の実施形態では、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインまたはその機能的断片もしくは変異体は、配列番号４、配列番号１８、配列番号１９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３または配列番号８４と少なくとも９５％同一である配列を含む。一部の実施形態では、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインは、配列番号４、配列番号１８、配列番号１９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３または配列番号８４と同一である配列を含む。

本開示の受容体の一部の実施形態では、ポリペプチドは、（ａ）ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインまたはその機能的断片もしくは変異体、および（ｂ）ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインまたはその機能的変異体を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２０と少なくとも９５％同一である配列を含む。

本開示の受容体の一部の実施形態では、ポリペプチドは、（ａ）ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインまたはその機能的変異体、ならびに（ｂ）ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン、および／または少なくとも２つの免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含み、各ＩＴＩＭが、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号８）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号９）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１０）、およびＳＩＹＡＴＬ（配列番号１１）から独立して選択される、細胞内ドメインを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２１と少なくとも９５％同一である配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２１の配列を含む。

本開示の受容体の一部の実施形態では、ポリペプチドは、（ａ）ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインまたはその機能的断片もしくは変異体、（ｂ）ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインまたはその機能的変異体、ならびに（ｃ）ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン、および／または少なくとも２つの免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含み、各ＩＴＩＭが、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号８）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号９）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１０）、およびＳＩＹＡＴＬ（配列番号１１）から独立して選択される、細胞内ドメインを含む。

本開示の受容体の一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２または配列番号３と少なくとも９５％同一である配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２０と少なくとも９９％同一である配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２１と少なくとも９９％同一である配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２または配列番号３と少なくとも９９％同一である配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２０と同一である配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２１と同一である配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２または配列番号３と同一である配列を含む。

本開示の受容体の一部の実施形態では、ポリペプチドは、抗原結合性ドメインを含む。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、ＬＩＬＲＢ１細胞外リガンド結合タンパク質以外の抗原結合性ドメインである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、２つ以上の抗原結合性ドメインを含む。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。一部の実施形態では、受容体は、第２のポリペプチドを含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、抗体の第１の鎖を含み、第２のポリペプチドは、前記抗体の第２の鎖を含む。一部の実施形態では、受容体は、抗体のＦａｂ断片を含む。一部の実施形態では、（ａ）第１のポリペプチドは、抗体の重鎖の抗原結合性断片を含み、（ｂ）第２のポリペプチドは、抗体の軽鎖の抗原結合性断片を含む。一部の実施形態では、（ａ）第１のポリペプチドは、抗体の軽鎖の抗原結合性断片を含み、（ｂ）第２のポリペプチドは、抗体の重鎖の抗原結合性断片を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の第１の鎖を含み、第２のポリペプチドは、前記ＴＣＲの第２の鎖を含む。一部の実施形態では、受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞外断片を含む。一部の実施形態では、（ａ）第１のポリペプチドは、ＴＣＲのアルファ鎖の抗原結合性断片を含み、（ｂ）第２のポリペプチドは、ＴＣＲのベータ鎖の抗原結合性断片を含む。一部の実施形態では、（ａ）第１のポリペプチドは、ＴＣＲのベータ鎖の抗原結合性断片を含み、（ｂ）第２のポリペプチドは、ＴＣＲのアルファ鎖の抗原結合性断片を含む。一部の実施形態では、受容体は、一本鎖ＴＣＲを含む。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２２～３３のいずれか１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号３５～４６または１２５のいずれか１つと少なくとも９５％同一である配列を含む。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号３５、３９、４６または１２５のいずれか１つと少なくとも９５％同一である配列を含む。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号３５～４６または１２５のいずれか１つと同一である配列を含む。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号３５、３９、４６または１２５のいずれか１つと同一である配列を含む。一部の実施形態では、抗体の重鎖は、配列番号２５～２７または３１～３３のいずれか１つの重鎖ＣＤＲを含み、抗体の軽鎖は、配列番号２２～２４または２８～３０のいずれか１つの軽鎖ＣＤＲを含む。一部の実施形態では、抗体の重鎖は、配列番号３５～４６または１２５のいずれか１つの重鎖部分と少なくとも９５％同一である配列を含み、抗体の軽鎖は、配列番号３５～４６または１２５のいずれか１つの軽鎖部分と少なくとも９５％同一である配列を含む。一部の実施形態では、抗体の重鎖は、配列番号３５～４６または１２５のいずれか１つの重鎖部分と同一である配列を含み、抗体の軽鎖は、配列番号３５～４６または１２５のいずれか１つの軽鎖部分と同一である配列を含む。一部の実施形態では、抗体の重鎖は、配列番号３５、３９、４６または１２５のいずれか１つの重鎖部分と同一である配列を含み、抗体の軽鎖は、配列番号３５、３９、４６または１２５のいずれか１つの軽鎖部分と同一である配列を含む。

本開示の受容体の一部の実施形態では、受容体は、配列番号４７～７１、７７～７９、８９～９２、１２０または１２２のいずれか１つと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、受容体は、配列番号４７～７１、７７～７９、８９～９２、１２０または１２２のアミノ酸配列を含む。

本開示の受容体の一部の実施形態では、受容体は、阻害性受容体である。

本開示は、本開示の受容体またはポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。

本開示は、本開示のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。一部の実施形態では、ベクターは、ポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターをコードする配列をさらに含む。

本開示は、本開示の受容体、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは受容体を含む免疫細胞を提供する。一部の実施形態では、細胞が、抗原または表面上に抗原を発現する細胞と接触すると、免疫細胞活性化が低下する。一部の実施形態では、免疫細胞活性化は、ＮＦＡＴプロモーターに作動可能に連結した遺伝子の発現を含む。一部の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞である。一部の実施形態では、アクチベーター受容体をさらに含む。一部の実施形態では、アクチベーター受容体は、キメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体である。

本開示は、免疫細胞を作製する方法であって、本開示のポリヌクレオチドまたはベクターを、免疫細胞に導入することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、免疫細胞は、受容体を発現する。一部の実施形態では、細胞は、免疫細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞である。一部の実施形態では、細胞が、キメラ抗原受容体に特異的な抗原、または表面上に抗原を発現する細胞と接触すると、免疫細胞活性化が低下する。一部の実施形態では、免疫細胞活性化は、ＮＦＡＴプロモーターに作動可能に連結した遺伝子の発現を含む。

本開示は、疾患または障害を有する対象を処置する方法であって、本開示の複数の免疫細胞を対象に投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、疾患または障害は、がんである。

本開示は、本開示の受容体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターまたは免疫細胞を含む、キットを提供する。

本開示は、ポリペプチドを含むキメラ抗原受容体を含む免疫細胞であって、ポリペプチド配列が、配列番号２１と少なくとも９５％の同一性または少なくとも１００％の同一性を共有する、免疫細胞を提供する。

本開示の免疫細胞の一部の実施形態では、ポリペプチド配列は、配列番号３と少なくとも９５％の同一性または少なくとも１００％の同一性を共有する。一部の実施形態では、ポリペプチド配列は、配列番号２と少なくとも９５％の同一性または少なくとも１００％の同一性を共有する。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、配列番号２２～２７に従って、それぞれ、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３配列を含む抗原結合性ドメインを含む。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、配列番号２８～３３に従って、それぞれ、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３配列を含む抗原結合性ドメインを含む。一部の実施形態では、ポリペプチド配列は、配列番号１２２と少なくとも９５％の同一性または少なくとも１００％の同一性を共有する。一部の実施形態では、ポリペプチド配列は、配列番号２と組み合わせて配列番号３５、３９、４６または１２５のいずれか１つと少なくとも９５％の同一性または少なくとも１００％の同一性を共有する。

一部の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、腫瘍細胞上に発現される標的に特異的に結合するキメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体を含む。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、エチオレート受容体、ανββインテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＤＬＬ４、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ－４０、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、ＦＢＰ、胎児アセチルコリン受容体、Ｆｚｄ７、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、ｈ５Ｔ４、ＩＬ－１１Ｒ、ＩＬ１３Ｒ－ａ２、ＫＤＲ、κ軽鎖、λ軽鎖、ＬｅＹ、ＬＩ ＣＡＭ、ＭＡＧＥ－Ａ１、メソテリン、ＭＨＣ提示ペプチド、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｎｏｔｃｈｌ、Ｎｏｔｃｈ２／３、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、サバイビン、ＴＡＧ－７２、ＴＥＭ、ＴＥＲＴ、ＶＥＧＦＲ２、およびＲＯＲ１から選択される標的に特異的に結合するキメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体を含む。

本開示は、それを必要とする対象におけるがんを処置および／または予防する方法であって、本開示の免疫細胞を対象に投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、それを必要とする対象におけるがんを処置および／または予防することであって、本開示の免疫細胞を対象に投与することを含む、処置および／または予防することを含む。

本明細書に提供される例示的なＣＡＲには、限定されないが、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ＣＡＲ、Ｆａｂ ＣＡＲ、またはその他などの抗体ベースのＣＡＲ、およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ベースのＣＡＲが含まれる。

他の態様では、本開示は、このような受容体をコードするポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドをデリバリーするためのベクター、ならびにこのようなポリヌクレオチドおよび受容体を有する免疫細胞を提供する。

さらなる態様では、本開示は、このような受容体をコードするポリヌクレオチドまたはベクターを細胞に導入する方法を提供する。有利には、細胞が、抗原または表面上で抗原を発現する細胞と接触すると、免疫細胞活性化は低下する。

本発明のなおさらなる態様および実施形態は、以下の詳細な説明に提供される。

図１は、リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）、ヒンジ、膜貫通（ＴＭ）および細胞内シグナル伝達ドメイン（ＩＣＤ）を有する、一実施形態におけるドメイン配置の説明図を示す。 図２Ａ～２Ｂは、リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）、ヒンジ、膜貫通（ＴＭ）および細胞内シグナル伝達ドメイン（ＩＣＤ）を有する、実施形態におけるドメイン配置の説明図を示す。リガンド結合ドメインが２つのペプチド、例えば、Ｔ細胞受容体由来のヘテロ二量体ＬＤＢを含む場合、各ペプチドをヒンジ、ＴＭ、および細胞内ドメインと融合させてもよい（図２Ａ）。代わりに、リガンド結合ドメインの１つのペプチドのみをヒンジ、ＴＭおよび細胞内ドメインと融合させてもよい（図２Ｂ）。 同上。 図３は、アクチベーターｓｃＦｖベースのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）［１０１および１０２］またはアクチベーターＴ細胞受容体［１０３および１０４］および阻害性のｓｃＦｖベースのＣＡＲ［１０１および１０３］または阻害性のＴＣＲベースのＣＡＲ［１０２および１０４］を有する、免疫細胞の４つの例示的な実施形態を示す。 図４は、５０μＭ ＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチドの存在下にある、示されているコンストラクトについての、ＭＡＧＥ－Ａ３活性化ペプチド１の様々な濃度（ＭＰ１、マイクロリットル、μＭ）でのＮＦＡＴベースのレポーターアッセイにおける発光の図（相対発光強度、ＲＬＵ）を示す。 図５は、様々な濃度（μＭ）のＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチドの存在下にある、示されているコンストラクトについての、ＭＡＧＥ－Ａ３ペプチド１（ＭＰ１、ｎＭ）の様々な濃度でのＮＦＡＴベースのレポーターアッセイにおける発光の図（ＲＬＵ）を示す。 図６は、様々な濃度（μＭ）のＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチドの存在下にある、示されているコンストラクトについての、ＭＡＧＥ－Ａ３ペプチド１（ＭＰ１、ｎＭ）の様々な濃度でのＮＦＡＴベースのレポーターアッセイにおける発光の図（ＲＬＵ）を示す。 図７は、５０μＭ ＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチドの存在下にある、示されているコンストラクトについての、ＭＡＧＥ－Ａ３ペプチド１（ＭＰ１、ｎＭ）の様々な濃度でのＮＦＡＴベースのレポーターアッセイにおける発光の図（ＲＬＵ）を示す。 図８は、５０μＭ ＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチドの存在下にある、示されているコンストラクトについての、ＭＡＧＥ－Ａ３ペプチド１（ＭＰ１、ｎＭ）の様々な濃度でのＮＦＡＴベースのレポーターアッセイにおける発光の図（ＲＬＵ）を示す。 図９は、５μＭ ＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチドの存在下にある、示されているコンストラクトについての、ＭＡＧＥ－Ａ３ペプチド１（ＭＰ１、ｎＭ）の様々な濃度でのＮＦＡＴベースのレポーターアッセイにおける発光の図（ＲＬＵ）を示す。 図１０は、５０μＭ ＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチドの存在下にある、示されているコンストラクトについての、ＭＡＧＥ－Ａ３ペプチド１（ＭＰ１、ｎＭ）の様々な濃度でのＮＦＡＴベースのレポーターアッセイにおける発光の図（ＲＬＵ）を示す。 図１１は、５０μＭ ＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチドの存在下にある、示されているコンストラクトについての、ＭＡＧＥ－Ａ３ペプチド１（ＭＰ１、ｎＭ）の様々な濃度でのＮＦＡＴベースのレポーターアッセイにおける発光の図（ＲＬＵ）を示す。 図１２Ａは、ＫＲＡＳ ＴＣＲによるＪｕｒｋａｔ細胞の活性化を遮断するＨＬＡ－Ａ＊０２ ｓｃＦｖ阻害性受容体の能力に対するＬＩＲ－１ヒンジの効果を示すグラフである。Ｈ：ヒンジ、Ｔ：膜貫通ドメイン、ＩＣＤ：細胞内ドメイン、ｓ：短い。ＬＩＲ－１コンストラクトは、図１２Ｂに更に詳細に記載されている。より短いＬＩＲ－１ヒンジを有するヒト化ＰＡ２．１およびヒト化ＢＢ７．２は、元の、より長いヒンジと同様に遮断する。 図１２Ｂは、下の表に示されているＫＲＡＳ ＴＣＲアクチベーターおよびＨＬＡ－Ａ＊０２ ｓｃＦｖ ＬＩＲ－１阻害性受容体を発現するＪｕｒｋａｔ細胞のＥＣ５０シフト（＋／－ＨＬＡ－Ａ＊０２標的細胞）を示すグラフおよび表である。 図１３Ａは、ＫＲＡＳ ＴＣＲによるＪｕｒｋａｔ細胞の活性化を遮断するＨＬＡ－Ａ＊０２阻害性受容体の能力に対するＬＩＲ－１ヒンジの効果を示すグラフである。Ｈ：ヒンジ、ＴＭ：膜貫通ドメイン、ＩＣＤ：細胞内ドメイン、ｓ：短い：ｔｒ：短縮型。ＬＩＲ－１コンストラクトは、図１３Ｂに更に詳細に記載されている。わずかにより長いヒンジを有するマウスＰＡ２．１は、Ｔ２－Ｊｕｒｋａｔアッセイにおいて、元のＬＩＲ－１ヒンジと同様に機能する。 図１３Ｂは、下の表に示されており、ヒンジ長が表中左に示されている、ＫＲＡＳ ＴＣＲアクチベーターおよびＨＬＡ－Ａ＊０２ ｓｃＦｖ ＬＩＲ－１阻害性受容体を発現するＪｕｒｋａｔ細胞のＥＣ５０シフト（＋／－ＨＬＡ－Ａ＊０２標的細胞）を示すグラフおよび一対の表である。 図１４Ａは、ブロッカーコンストラクトを評価するＴ２－Ｊｕｒｋａｔ実験の概略を示す図である。 図１４Ｂは、固定濃度（５０μＭ）のＮＹ－ＥＳＯ－１ブロッカーペプチドが積載されている細胞のＭＡＧＥペプチド滴定によって測定されたＭＡＧＥ－Ａ３ ＣＡＲアクチベーター（ＭＰ１－ＬＢＤ １－ＣＡＲ）のＥＣ５０に対する、様々なＮＹ－ＥＳＯ－１ ｓｃＦｖ ＬＢＤブロッカーモジュール（ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＩＲ－１）の効果を示すグラフ、表、および図である。図１４Ｂ～１４Ｆの各々で、アクチベーターおよびブロッカーペプチド積載されているＴ２細胞との６時間の共培養の後における、アクチベーターＣＡＲ単独または各ブロッカー受容体との組合せのいずれかでトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞のＮＦＡＴ－ルシフェラーゼシグナルをアッセイした。ベースライン（Ｊｕｒｋａｔのみ）は、様々なアクチベーター単独コンストラクトにより異なり、ＣＡＲの存在下で特に高くなりうる；ほとんどの場合、そのリガンドがないブロッカー受容体の発現は、ベースラインを抑制する。アクチベーターペプチド濃度は、０から１０^－６、そして１０^２μＭまで変動し、発光測定値は、０から８００００ＲＬＵにわたった。 図１４Ｃは、図１４Ｂの場合のように、固定（５０μＭ）ペプチド濃度で対応するブロッカーペプチドが積載されているときの、ＭＡＧＥ－Ａ３ ＣＡＲアクチベーター（ＭＰ１－ＣＡＲ）のＥＣ５０に対する、様々なｓｃＦｖ ＬＢＤ（ＥＳＯ、ＭＰ１ ＬＢＤ １、ＭＰ１ ＬＢＤ ２、ＨＰＶ Ｅ６ ＬＢＤ １、ＨＰＶ Ｅ６ ＬＢＤ ２、ＨＰＶ Ｅ７）を有するＬＩＲ－１ブロッカー受容体の効果を示すグラフ、表、および図である。ＲＬＵ＝相対発光量；エラーバーは±ＳＤ（ｎ＝２）を示す。アクチベーターペプチド濃度は、０から１０^－３、そして１０^２μＭまで変動し、発光測定値は、０から１０００００ＲＬＵにわたった。 図１４Ｄは、５０μＭ ＮＹ－ＥＳＯ－１ブロッカーペプチドが積載されているときの、様々なＭＡＧＥ－Ａ３ ＣＡＲアクチベーター（ＭＰ１－ＬＢＤ １－ＣＡＲまたはＭＰ２－ＣＡＲ）のＥＣ５０に対する、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ｓｃＦｖ ＬＢＤを有するＬＩＲ－１ブロッカー受容体の効果を示すグラフ、表、および図である。アクチベーターペプチド濃度は、０から１０^－４、そして１０^２μＭまで変動し、発光測定値は、０から８００００ＲＬＵにわたった。 図１４Ｅは、５０μＭ ＮＹ－ＥＳＯ－１ブロッカーペプチドが積載されているときの、様々なＴＣＲアクチベーター（ＭＰ１－ＴＣＲ、ＭＰ２－ＴＣＲ、ＨＰＶ Ｅ６－ＴＣＲ）のＥＣ５０に対する、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ｓｃＦｖ ＬＢＤを有するＬＩＲ－１ブロッカー受容体の効果を示すグラフ、表、および図である。アクチベーターペプチド濃度は、０から１０^－４、そして１０^２μＭまで変動し、正規化された発光測定値は、０から１５０ＲＬＵにわたった。 図１４Ｆは、５０μＭ ＮＹ－ＥＳＯ－１ブロッカーペプチドが積載されているときの、ＭＡＧＥ－Ａ３ ＣＡＲおよびＴＣＲアクチベーター（ＭＰ１－ＬＢＤ １－ＣＡＲ、ＭＰ１－ＴＣＲ）のＥＣ５０に対する、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ ＬＢＤを有するＬＩＲ－１ブロッカー受容体の効果を示すグラフ、表、および図である。ＲＬＵ＝相対発光量；エラーバーは±ＳＤ（ｎ＝２）を示す。アクチベーターペプチド濃度は、０から１０^－７、そして１０^１μＭまで変動し、正規化された発光測定値は、０から１５０ＲＬＵにわたった。 図１５は、活性化ＭＡＧＥ－Ａ３ ＣＡＲに対するブロッカーペプチド積載（各５０μＭのＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＨＰＶ Ｅ６、およびＨＰＶ Ｅ７）の効果を示すグラフである。ＭＰ２－ＣＡＲ［０μＭ］、ＥＣ５０＝４４ｎＭ；ＭＰ２－ＣＡＲ［５０μＭ ＨＰＶｐ２］、ＥＣ５０＝４９５ｎＭ。ＲＬＵ＝相対発光量；エラーバーは、±ＳＤ（ｎ＝２）を示す。 図１６Ａは、アクチベーターＭＡＧＥ－Ａ３ ＣＡＲ単独または様々な量のＮＹ－ＥＳＯ－１ ｓｃＦｖ ＬＢＤブロッカーとの組合せのいずれかでトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞のＮＦＡＴ－ルシフェラーゼシグナルを示す一連のグラフである（アクチベーターおよびブロッカー受容体成分のＤＮＡ比率が左にＡ：Ｂ、すなわちアクチベーターおよびブロッカーペプチドが積載されているＴ２細胞との６時間の共培養の後におけるアクチベーター受容体：ブロッカー受容体として示されている。Ｔ２細胞には、滴定量のアクチベーターＭＡＧＥ－Ａ３ペプチドおよび固定量のブロッカーＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチド濃度が積載された。アクチベーターペプチドおよび／またはブロッカーペプチド濃度は、０から１０^－６、そして１０^２μＭにまでわたり、発光測定値は、０から２０００００ＲＬＵにわたった。 図１６Ｂは、アクチベーターＭＡＧＥ－Ａ３ ＣＡＲ単独または様々な量のＮＹ－ＥＳＯ－１ ｓｃＦｖ ＬＢＤブロッカーとの組合せのいずれかでトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞のＮＦＡＴ－ルシフェラーゼシグナルを示す一連のグラフである。Ｔ２細胞には、滴定量のブロッカーＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチドおよびＥｍａｘ濃度（約０．１ｍＭ）を超える固定量のアクチベーターＭＡＧＥ－Ａ３ペプチド濃度が積載された。アクチベーターペプチドおよび／またはブロッカーペプチド濃度は、１０^－５から１０^２μＭにまでわたり、発光測定値は、０から２０００００ＲＬＵにわたった。 図１６Ｃは、アクチベーターＭＡＧＥ－Ａ３ ＣＡＲ単独または様々な量のＮＹ－ＥＳＯ－１ ｓｃＦｖ ＬＢＤブロッカーとの組合せのいずれかでトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞のＮＦＡＴ－ルシフェラーゼシグナルを示す一連のグラフおよび２つの表である。図１６Ｂからのｘ値ブロッカーＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチド濃度を、各曲線用に使用した一定のアクチベーターＭＡＧＥペプチド濃度に対して正規化し、ｘ軸上にプロットした。５０％ブロッキングに必要なアクチベーターペプチドに対するブロッカーペプチドの比（ＩＣ５０）が各曲線について示されている。すべてのＤＮＡ比について、必要とされるＢ：Ａペプチド比は、１未満であり、これは、この対のアクチベーターＣＡＲとブロッカーについて、アクチベーターｐＭＨＣ抗原を遮断するのに同様の（またはより少ない）ブロッカーｐＭＨＣ抗原が標的細胞上に必要とされることを示している。アクチベーターペプチドおよび／またはブロッカーペプチド濃度は、１０^－１０から１０^４μＭにまでわたり、発光測定値は、０から２０００００ＲＬＵにわたった。 図１６Ｄは、ブロッキングＣＤ１９ＣＡＲアクチベーターは、ｐＭＨＣ ＣＡＲを活性化するのに必要な密度と同様のブロッカーｐＭＨＣ抗原密度のｐＭＨＣブロッカーを用いて可能であることを示す表およびグラフである。内在性レベルのＣＤ１９抗原を発現する、ブロッカーペプチドが積載されているＴ２細胞との６時間の共培養の後における、アクチベーターＣＤ１９ ＣＡＲ単独または様々な量のＮＹ－ＥＳＯ－１ブロッカーとの組合せ（示されているＤＮＡ比）のいずれかでトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞のＮＦＡＴ－ルシフェラーゼシグナル。ＩＣ５０は、約１，５００～３，５００ｐＭＨＣ／細胞に対応する０．１～１．０ｍＭの範囲の阻害曲線から推定される。ＲＬＵ＝相対発光量；エラーバーは、±ＳＤ（ｎ＝２）を示す。 図１７Ａは、様々な濃度のＮＹ－ＥＳＯ－１ブロッカーペプチドを積載している場合における、活性化ＭＡＧＥ－Ａ３ ＣＡＲ（ＭＰ１－ＣＡＲ）のＥＣ５０に対する、ＮＹ－ＥＳＯ－１－ＬＩＲ－１ブロッカーの効果を示すグラフである。ブロッカーペプチド（ＮＹ－ＥＳＯ－１）の濃度が増大するに従い、ＥＣ５０シフトが大きくなる。陰性対照ＨＰＶペプチド（ＨＬＡ－Ａ＊０２には結合するがＮＹ－ＥＳＯ－１ブロッカーｓｃＦｖには結合しない）の存在下でのシフトはルーチン的に見られ、Ｔ２ ＨＬＡ－Ａ＊０２分子上の結合部位についての対照ペプチドの競合によって引き起こされ、これがアクチベーター標的の数を低減していると考えられている。アクチベーター濃度は、０から１０^－４、そして１０^２μＭにまでわたり、発光測定値は、０から１４００００ＲＬＵにわたった。 図１７Ｂは、１０μＭのＮＹ－ＥＳＯ－１ブロッカーペプチドを積載している場合の、ＭＡＧＥ－Ａ３ ＣＡＲアクチベーター（ＭＰ２－ＣＡＲ）のＥＣ５０に対する、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ｓｃＦｖ ＬＢＤがあり、ＩＣＤを含有していないか、突然変異したＩＣＤを含有している改変されたＬＩＲ－１ブロッカー受容体の効果を示すグラフである。アクチベーター濃度は、０から１０^－４、そして１０^２μＭにまでわたり、発光測定値は、０から１４００００ＲＬＵにわたった。 図１７Ｃ～１７Ｅは、ブロッカーが刺激された場合、または刺激されていない場合における、ＭＡＧＥ－Ａ３ ＣＡＲアクチベーター（ＭＰ１－ＬＢＤ １－ＣＡＲ）のＥＣ５０に対する、様々なＮＹ－ＥＳＯ－１ ｓｃＦｖ ＬＢＤブロッカー受容体（ＣＴＬＡ－４（図１７Ｃ）、ＰＤ－１（図１７Ｄ）、およびＬＩＲ－１（図１７Ｅ））の効果を示す一連のグラフである。ペプチドが積載されているＴ２細胞との６時間の共培養の後における、アクチベーターＣＡＲ単独または各ブロッカーとの組合せのいずれかでトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞のＮＦＡＴ－ルシフェラーゼシグナル。Ｔ２細胞には、滴定量のアクチベーターＭＡＧＥペプチドが積載され、追加の一定量（５０μＭ）のＮＹ－ＥＳＯ－１ブロッカーペプチドの積載あり、またはなしで試験された。ＲＬＵ＝相対発光量；エラーバーは、±ＳＤ（ｎ＝２）を示す。アクチベーター濃度は、０から１０^－６、そして１０^２μＭにまでわたり、発光測定値は、０から１０００００ＲＬＵにわたった。 同上。 同上。 図１８Ａは、様々な比率のアクチベーター（ＨＰＶ Ｅ７）とブロッカー（ＮＹ－ＥＳＯ－１）抗原を提示するビーズと共培養された、ＨＰＶ Ｅ７－ＣＡＲまたはＨＰＶ Ｅ７－ＣＡＲ＆Ａ２－ＬＩＲ－１でトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞がシスではブロッキングを示すが、トランスでは示さないことを示す図および一対のグラフである。 図１８Ｂは、ＨＬＡ－Ａ＊０２－ＬＩＲ－１ブロッカー受容体が、様々なアクチベーター対ブロッカー比で、ＣＤ１９－ＣＡＲアクチベーターを遮断することを示すグラフである。比率は、０から１０にわたり、発光（ＲＬＵ）は０から７００００にわたった。 図１８Ｃは、滴定されたＨＬＡ－Ａ＊０２（Ａ２）ＬＩＲ－１ブロッカー受容体の表面発現を示すグラフである。 図１８Ｄは、ＨＬＡ－Ａ＊０２に対するｓｃＦｖは、アクチベーターＣＡＲと融合した場合、アクチベーターとしても働くことができることを示すグラフである。内在性ＨＬＡ－Ａ＊０２を発現するＴ２細胞は、標的として働く。ＲＬＵ＝相対発光量；エラーバーは、±ＳＤ（ｎ＝２）を示す。 図１９Ａは、ＮＹ－ＥＳＯ－１ブロッカーペプチドを積載された場合における、様々なＴＣＲアクチベーター（ＭＰ１－ＴＣＲ、ＭＰ２－ＴＣＲ、ＨＰＶ Ｅ６－ＴＣＲ）のＥＣ５０に対する、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ｓｃＦｖ ＬＢＤを有するＬＩＲ－１ブロッカー受容体の効果を示すグラフである。図１４Ｅのため、各セットは、アクチベーターのみの応答を示す曲線のＥｍａｘに対して正規化された。アクチベーター濃度は、０から１０^－４、そして１０^２μＭにまでわたり、発光測定値は、０から１４００００ＲＬＵにわたった。 図１９Ｂは、ＭＡＧＥ－Ａ３ ＣＡＲおよびＴＣＲアクチベーター（ＭＰ１－ＬＢＤ １－ＣＡＲ、ＭＰ１－ＴＣＲ）のＥＣ５０に対する、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ ＬＢＤを有するＬＩＲ－１ブロッカー受容体の効果を示すグラフである。各セットは、アクチベーターのみの応答を示す曲線のＥｍａｘに対して正規化された。ＲＬＵ＝相対発光量；エラーバーは、±ＳＤ（ｎ＝２）を示す。アクチベーター濃度は、０から１０^－７、そして１０^１μＭにまでわたり、発光測定値は、０から１４００００ＲＬＵにわたった。 図２０Ａは、ＨＰＶ Ｅ７－ＴＣＲアクチベーターおよびＥＳＯ－ＬＩＲ－１ブロッカーで形質導入された初代Ｔ細胞（ドナー１）が初代Ｔ細胞殺滅アッセイでＥＣ５０を約２５×シフトする（ＨＰＶ Ｅ７ ＴＣＲ ＥＣ５０＝０．０４４ｎＭ；ＨＰＶ Ｅ７ ＴＣＲ＋ＥＳＯ－ＬＩＲ－１、ＥＣ５０＝１．１ｎＭ）ことを示すグラフである。アッセイは、３：１のＥ：Ｔでペプチドが積載されているＭＣＦ７標的細胞を使用して行った。ルシフェラーゼ測定は、４８時間目の生きている標的細胞を意味する。 図２０Ｂは、ＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチドが積載されたＴ２標的細胞を使用して、Ｊｕｒｋａｔ細胞における様々なアクチベーター：ブロッカーＤＮＡ比で、ＨＬＡ－Ａ＊０２－ＬＩＲ－１がＮＹ－ＥＳＯ－１ ＣＡＲアクチベーターを遮断することを示すグラフである。ＲＬＵ＝相対発光量；エラーバーは、±ＳＤ（ｎ＝２）を示す。 図２１Ａは、ＣＤ１９ ＣＡＲアクチベーターおよびＨＬＡ－Ａ＊０２ブロッカーで形質導入された初代Ｔ細胞（ドナー１）が、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）細胞傷害性アッセイにおいて「腫瘍」細胞を「正常」細胞から識別し、３：１のＥ：Ｔの混合標的細胞アッセイにおいて「腫瘍」細胞の選択的な殺滅を示すことを示す一連のイメージおよびグラフである。示されている画像は、７２時間目にとらえた。非形質導入、ＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ細胞、およびＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ＋Ａ２－ＬＩＲ－１が示されている。測定値は、０時と１５０時間目の間にとられ、正規化された蛍光タンパク質強度（ＧＦＰまたはＲＦＰ）は０から１０にわたった。 図２１Ｂは、Ｉｎｃｕｃｙｔｅイメージングアッセイにおいて、初代Ｔ細胞（ドナー１）が、同様に、様々な腫瘍対「正常」細胞比で、３：１のＥ：Ｔ比で、腫瘍細胞を選択的に殺滅することを示す一連のグラフである。ＲＬＵ値は、初代Ｔ細胞の非存在下で成長した標的細胞混合物に対して正規化した。非形質導入、ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞、およびＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ＋Ａ２－ＬＩＲ－１が示されている。測定値は、０時と１５０時間目の間にとられ、正規化された蛍光タンパク質強度（ＧＦＰまたはＲＦＰ）は、最上行、左から右に：０～３×１０^７、０～２×１０^７、０～１．６×１０^７、０～７×１０^６、０～２×１０^６；最下行、左から右に：０～７×１０^５、０～２×１０^５、０～４×１０^５、０～６×１０^５、０～７×１０^５にわたった。 図２１Ｃは、定量的標的細胞溶解およびＩＦＮγ分泌において、初代Ｔ細胞（ドナー１）が、同様に、様々な腫瘍対「正常」細胞比で、３：１のＥ：Ｔ比率で、腫瘍細胞を選択的に殺滅することを示す一連のグラフである。非形質導入、ＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ細胞、およびＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ＋Ａ２－ＬＩＲ－１が示されている。 図２２Ａは、ＭＳＬＮまたはＭＳＬＮ＆ＨＬＡ－Ａ＊０２を発現するＫ５６２細胞と共培養された、ＭＳＬＮ ＬＢＤ１－ＣＡＲまたはＭＳＬＮ ＬＢＤ１－ＣＡＲ＆Ａ２－ＬＩＲ－１でトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞が、ＨＬＡ－Ａ＊０２の存在下でのみ、Ａ２－ＬＩＲ－１ブロッカーを有する高密度抗原による活性化の遮断を示すことを示す一対のグラフである。 図２２Ｂは、ＭＬＳＮ ＬＢＤ１－ＣＡＲ Ｔ細胞による内在性ＭＳＬＮ＋ＨｅＬａ細胞の殺滅が、Ａ２－ＬＩＲ－１ブロッカーを有するＨＬＡ－Ａ＊０２の存在下で遮断されることを示す一対のグラフである。 図２２Ｃは、ＭＬＳＮ ＬＢＤ２－ＣＡＲ Ｔ細胞による内在性ＭＳＬＮ＋ＨｅＬａ細胞の殺滅を示す一対のグラフである。Ｔ細胞殺滅に対するＡ２－ＬＩＲ－１ブロッカーの効果は、アクチベーターＬＢＤによって部分的に制御される。 図２３は、ブロッカー抗原の非存在下では、ＬＩＲ－１ブロッカー受容体が、アクチベーターの殺滅有効性に対する効果をほとんど有しないことを示すグラフである。ＮＹ－ＥＳＯ－１ブロッカー抗原の非存在下では、ＨＰＶ Ｅ７－ＴＣＲアクチベーターおよびＥＳＯ－ＬＩＲ－１ブロッカーで形質導入された初代Ｔ細胞（ドナー１）が、ＨＰＶ Ｅ７－ＴＣＲアクチベーターのみで形質導入された初代Ｔ細胞に類似した殺滅有効性を提示する。ルシフェラーゼ測定は、生きている標的細胞を意味する。ＲＬＵ＝相対発光量；エラーバーは、±ＳＤ（ｎ＝２）を示す。 図２４Ａは、Ａ２－ＬＩＲ－１が、Ａ２＋Ｒａｊｉ細胞ではＪｕｒｋａｔ活性化を遮断するが、ＷＴ Ｒａｊｉ細胞ではしないことを示す一対のグラフである。ヒストグラムは、ＨＬＡ－Ａ＊０２がＲａｊｉ Ａ２「正常」細胞のみに発現されているのに対して、Ｒａｊｉ ＷＴ「腫瘍」細胞およびＲａｊｉ Ａ２＋「正常」細胞が同一のＣＤ１９表面発現を有することを示す。 図２４Ｂは、Ａ２－ＬＩＲ－１は、Ａ２＋Ｒａｊｉ細胞ではＪｕｒｋａｔ活性化を遮断するが、ＷＴ Ｒａｊｉ細胞ではしないことを示すグラフである。ＣＤ１９またはＣＤ１９＋Ａ２－ＬＩＲ－１のいずれかでトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞を、ＷＴ（Ａ２－）Ｒａｊｉ細胞またはＡ２＋Ｒａｊｉ細胞のいずれかと様々な細胞比率で共培養した。ＲＬＵ＝相対発光量；エラーバーは、±ＳＤ（ｎ＝２）を示す。 図２５Ａ～２５Ｂはそれぞれ、ＬＩＲ－１阻害性受容体による遮断の可逆性を示す一連の画像である。ＣＤ１９ ＣＡＲアクチベーターおよびＨＬＡ－Ａ＊０２ブロッカーで形質導入された初代Ｔ細胞（ドナー２）は、３：１のＥ：Ｔのインビトロ細胞傷害性アッセイにおいて、３ラウンドの抗原曝露（ＡＢ－Ａ－ＡＢおよびＡ－ＡＢ－Ａ）の後、可逆的な遮断（図２５Ａ）および活性化（図２５Ｂ）を示す。初代Ｔ細胞細胞傷害性アッセイは、３種のＨＬＡ－Ａ＊０２陰性ドナーで再現された。示されている画像は、７２時間目にとらえた。 同上。 図２５Ｃ～２５Ｄはそれぞれ、Ｅ：Ｔが３：１の正常および標的細胞（ドナー２からのＴ細胞）の複数のラウンドへ繰り返し曝露に応答した、標的細胞溶解（図２５Ｃ）およびＩＦＮγ（図２５Ｄ）の定量化を示す一対のグラフである。示されている条件は、非形質導入、ＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ細胞、およびＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ＋Ａ２－ＬＩＲ－１である。エラーバーは、±ＳＥＭ（ｎ＝２）を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；これらは、２元配置分散分析およびそれに続くＴｕｋｅｙの多重比較検定を使用して決定された。この実験では、細胞傷害性は頑健なままであったが、ＩＦＮγ応答は経時的に低減した。 同上。 図２６Ａ～２６Ｂはそれぞれ、細胞傷害性Ｔ細胞殺滅および別のドナー（ドナー３）との共培養におけるＩＦＮγの分泌を示す一対のグラフである。細胞傷害性ＣＤ１９ ＣＡＲアクチベーターおよびＨＬＡ－Ａ＊０２ブロッカーで形質導入されたＴ細胞は、９：１のＥ：Ｔで、複数ラウンドの抗原曝露の後に、細胞傷害性アッセイおよびＩＦＮγで、可逆的な遮断を示す。本発明者らは、このドナーのＴ細胞生存および活性が、培養中、経時的に小さくなったことに気づいた。示されている条件は、非形質導入、ＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ細胞、およびＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ＋Ａ２－ＬＩＲ－１である。細胞傷害性（図２６Ａ）およびＩＦＮγ（図２６Ｂ）の結果は、図２５Ｃ～２５Ｄと対応する。エラーバーは、±ＳＥＭ（ｎ＝２）を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；これらは、２元配置分散分析およびそれに続くＴｕｋｅｙの多重比較検定を使用して決定された。 同上。 図２７Ａは、ＣＤ１９ ＣＡＲアクチベーターおよびＨＬＡ－Ａ＊０２ブロッカーで形質導入された初代Ｔ細胞が１０日間にわたるＣＤ３／２８刺激で約２０倍の増殖を示すことを示すグラフである。 図２７Ｂは、ＬＩＲ－１ブロッカー受容体を発現しているＣＡＲ－Ｔ細胞が、異種移植モデルで腫瘍を選択的に殺滅することを示す実験を示す図である。ＨＬＡ－Ａ＊０２ ＮＳＧマウスに、「腫瘍細胞」（Ａ２陰性Ｒａｊｉ細胞）または「正常細胞」（Ａ２陽性Ｒａｊｉ細胞）のいずれかを皮下投与し、Ｒａｊｉ異種移植片が平均約７０ｍｍ^３になったとき、初代Ｔ細胞（ヒト、ＨＬＡ－Ａ＊０２陰性ドナー４）を尾静脈に注射した。 図２７Ｃ～２７Ｅはそれぞれ、ノギス測定（図２７Ｃ）、フローサイトメトリーによる末梢血中のヒトＴ細胞数（図２７Ｄ）、および生存（図２７Ｅ）による、読取りを示す一対のグラフである。Ｃ～Ｄのエラーバーは、±ＳＥＭ（ｎ＝７）を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；これらは、２元配置分散分析およびそれに続くＴｕｋｅｙの多重比較検定を使用して決定された。 同上。 同上。 図２８Ａは、マウス尾静脈注射用に調製された、濃縮および増殖後の初代Ｔ細胞のフローサイトメトリー解析を示す一連のグラフである。腫瘍体積は、Ｔ細胞注射から特定の日数、すなわち、Ｔ細胞注射の１０日前（－１０）から始めて、Ｔ細胞注射の４０日後（４０）まで測定した。腫瘍体積は、０から２５００ｍｍ^３にわたった。 図２８Ｂは、各群内の個々のマウスについてプロットした、ノギスによる腫瘍測定を示す一連のグラフである。 同上。 図２８Ｃは、マウス血液中のｈｕＣＤ３＋Ｔ細胞と腫瘍成長の相関を示す一連のグラフである。Ｔ細胞注射の１０日後および１７日後の腫瘍体積と比較したｈｕＣＤ３＋Ｔ細胞のグラフ。 図２８Ｄは、フローサイトメトリーによる、末梢血中のｈｕＣＤ４＋およびｈｕＣＤ８＋Ｔ細胞数を示す一対のグラフである。白抜きの円、「正常」細胞が移植されたマウス；黒塗りの円、腫瘍細胞が移植されたマウス。１００細胞に満たない試料は、解析から除外した。エラーバーは、±ＳＥＭを示す（ＣＤ１９－ＣＡＲ＋Ａ２－ＬＩＲ－１ Ｔ細胞で処置されたＣＤ１９＋／Ａ２－Ｒａｊｉ群ではｎ＝６、それ以外はすべての群でｎ＝７）。 図２９Ａは、腫瘍内のＴ細胞浸潤の組織学的解析を示す一連の画像である。研究終了時に収集され、薄切にされ、ｈｕＣＤ３について染色された腫瘍試料の代表的画像を示す。 図２９Ｂは、ＩｍａｇｅＪを使用したＴ細胞浸潤の定量化を示すグラフである。Ｔ細胞浸潤は、ＣＤ１９＋／Ａ２－腫瘍内のＣＤ１９－ＣＡＲまたはＣＤ１９－ＣＡＲ＋Ａ２－ＬＩＲ－１を有するＴ細胞では、形質導入されていない細胞と比較して有意に高かった。しかし、ＣＤ１９＋／Ａ２＋腫瘍内で、ＣＤ１９－ＣＡＲ＋Ａ２－ＬＩＲ－１ Ｔ細胞は、形質導入されていない細胞と比較して、有意差はなかった。ＣＤ１９＋／Ａ２－腫瘍とＣＤ１９＋／Ａ２＋腫瘍の間で、ＣＤ１９－ＣＡＲ＋Ａ２－ＬＩＲ－１ Ｔ細胞の浸潤にも有意な低下があった。定性的には、ＣＤ１９－ＣＡＲ＋Ａ２－ＬＩＲ－１ Ｔ細胞は、ＣＤ１９－ＣＡＲのみのＴ細胞と比較して、ＣＤ１９＋／Ａ２＋腫瘍内で優勢でなかった；しかし、この差は、統計的に有意ではなかった。バックグラウンド染色レベルを示すために、食塩水試料を同様に定量化した。データの群は、通常の一元配置分散分析を使用して解析し、一方、「腫瘍」と「標準」の間の個々の対は、独立ｔ検定を使用して解析した。ｎｓ＝有意でない、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。

本開示は、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー１（時々、ＬＩＲ１またはＬＩＲ－１と称されるＬＩＬＲＢ１）からの１つまたは複数のドメインを有する受容体を記載している。多数の受容体、操作された細胞、およびそれらの使用が、本明細書で企図される。本発明者らは、抗原結合性ドメイン、ならびにＬＩＬＲＢ１細胞内ドメインを含む、１つまたは複数のＬＩＬＲＢ１ドメインを含むキメラ受容体が、活性化キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在下でさえ、免疫細胞シグナル伝達を阻害することができることを見出した。

本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、例えば、人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、またはキメラ免疫受容体を指す場合があり、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋）またはＮＫ細胞などの、特定の免疫エフェクター細胞に人工特異性を移植する操作された受容体を包含する。ＣＡＲは、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に付与するために利用され得、それによって、例えば、養子細胞療法に使用するための、多数の特異的Ｔ細胞を生成することができる。特定の実施形態では、ＣＡＲは、細胞の特異性を腫瘍関連抗原に誘導する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、および抗原結合性領域を含む細胞外ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインに融合した、モノクローナル抗体に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）またはｓｃＦａｂの融合物を含む。融合物はまた、ヒンジも含み得る。重－軽（Ｈ－Ｌ）および軽－重（Ｌ－Ｈ）ｓｃＦｖのいずれかが使用され得る。ＣＡＲ設計の特異性は、受容体のリガンド（例えば、ペプチド）に由来し得る。細胞内ドメインの種類に応じて、ＣＡＲは、活性化受容体であってもよいか、または阻害性受容体であってもよい。一部の実施形態では、例えば、ＣＡＲが活性化受容体である場合、ＣＡＲは、ＣＤ３、ＦｃＲ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＤＡＰ１０、および／または０Ｘ４０などの、さらなる共刺激シグナル伝達のためのドメインを含む。一部の実施形態では、分子は、共刺激分子、イメージングのため（例えば、陽電子放射断層撮影のため）のレポーター遺伝子、プロドラッグの添加時にＴ細胞を条件付きで除去する遺伝子産物、ホーミング受容体、サイトカイン、およびサイトカイン受容体を含み、ＣＡＲと共発現され得る。本明細書で使用される場合、キメラ抗原受容体に起因する特徴は、受容体自体または受容体を含む宿主細胞を指すと理解され得る。

本明細書で使用される場合、時々、「ＴＣＲ複合体」または「ＴＣＲ／ＣＤ３複合体」とも呼ばれる「ＴＣＲ」とは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、および時々、サブユニットと称される、不変ＣＤ３鎖（ゼータ、ガンマ、デルタおよびイプシロン）のうちの１つまたは複数を含むタンパク質複合体を指す。ＴＣＲアルファおよびベータ鎖は、ジスルフィド結合して、ヘテロダイマーとして機能してペプチド－ＭＨＣ複合体に結合することができる。ＴＣＲアルファ／ベータヘテロダイマーが、ペプチド－ＭＨＣに係合すると、関連する不変ＣＤ３サブユニットにおけるＴＣＲ複合体の構造変化が誘導され、それらのリン酸化および下流タンパク質との会合がもたらされ、それによって一次刺激シグナルを伝達する。例示的なＴＣＲ複合体において、ＴＣＲアルファおよびＴＣＲベータポリペプチドはヘテロダイマーを形成し、ＣＤ３イプシロンおよびＣＤ３デルタはヘテロダイマーを形成し、ＣＤ３イプシロンおよびＣＤ３ガンマはヘテロダイマーを形成し、２つのＣＤ３ゼータはホモダイマーを形成する。

「刺激」という用語は、刺激ドメインまたは刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）の、その同族リガンドとの結合によって誘導され、それによって限定されないが、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介するシグナル伝達などのシグナル伝達事象を媒介する、一次応答を指す。刺激は、ある特定の分子の発現の変化、および／または細胞骨格構造の再編成などを媒介し得る。

「刺激分子」または「刺激ドメイン」という用語は、Ｔ細胞によって天然に発現された場合、Ｔ細胞シグナル伝達経路の少なくとも一部の態様について刺激性の手段でＴＣＲ複合体の活性化を調節する一次細胞質シグナル伝達配列を提供する分子またはその部分を指す。野生型ＴＣＲ複合体のＴＣＲアルファおよび／またはＴＣＲベータ鎖は、刺激ドメインを含有せず、シグナル伝達を開始するためにＣＤ３ゼータなどのＣＤ３サブユニットとの会合を必要とする。一態様では、一次刺激シグナルは、例えば、ペプチドに結合した主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）とのＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によって開始され、これにより、限定されないが、増殖、活性化、分化などを含む、Ｔ細胞応答の媒介がもたらされる。本明細書に記載される１つまたは複数の刺激ドメインは、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマおよびＣＤ３イプシロンを含む、ＴＣＲ複合体のいずれか１つまたは複数のサブユニットの細胞内部分に融合され得る。

本明細書で使用される場合、「刺激シグナルを提供することができるドメイン」とは、Ｔ細胞シグナル伝達の少なくとも一部の態様を増強するためにＴＣＲ複合体によって媒介されるシグナル伝達の有効性を増強または増加させる刺激シグナルを直接的または間接的に提供することができる任意のドメインを指す。刺激シグナルを提供することができるドメインは、このシグナルを直接的に提供することができ、例えば、刺激シグナルを提供することができるドメインは、一次刺激ドメインまたは共刺激ドメインである。代替として、または加えて、刺激シグナルを提供することができるドメインは、間接的に作用することができる。例えば、ドメインは、刺激タンパク質をＴＣＲに動員する足場であり得るか、または刺激シグナルを提供するために下流標的を介して作用するキナーゼ活性などの酵素活性を提供することができる。

本明細書で使用される場合、「阻害性シグナルを提供することができるドメイン」とは、ＴＣＲ複合体によって媒介されるシグナル伝達の有効性を阻害または減少させる阻害性シグナルを直接的または間接的に提供することができる任意のドメインを指す。阻害性シグナルを提供することができるドメインは、Ｔ細胞シグナル伝達または機能の少なくとも一部の態様を全体的または部分的に低減または遮断することができる。阻害性シグナルを提供することができるドメインは、このシグナルを直接的に提供することができ、例えば、阻害性シグナルを提供することができるドメインは、一次阻害性シグナルを提供する。代替として、または加えて、刺激シグナルを提供することができるドメインは、間接的に作用することができる。例えば、ドメインは、さらなる阻害タンパク質をＴＣＲに動員することができるか、または阻害性シグナルを提供するために下流標的を介して作用する酵素活性を提供することができる。

範囲：本開示全体を通して、本発明の様々な態様は、範囲の形式で提示することができる。範囲の形式での説明は、単に便宜上および簡潔さのためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことは理解されるべきである。したがって、範囲の説明は、具体的に開示されている全ての可能な部分範囲およびその範囲内の個々の数値を有すると考慮されるべきである。例えば、１～６などの範囲の説明は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの具体的に開示された部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数字、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、および６を有すると考慮されるべきである。別の例として、９５～９９％の同一性などの範囲は、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するものを含み、９６～９９％、９６～９８％、９６～９７％、９７～９９％、９７～９８％および９８～９９％の同一性などの部分範囲を含む。これは、範囲の幅に関係なく適用される。

一般に、「配列同一性」または「配列相同性」とは、それぞれ、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応を指す。典型的に、配列同一性を決定するための技術には、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定すること、および／またはそれによってコードされるアミノ酸配列を決定すること、ならびにこれらの配列を第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較することが含まれる。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらの「パーセント同一性」を決定することによって比較され得る。核酸またはアミノ酸配列にかかわらず２つの配列のパーセント同一性は、２つの整列された配列の間の完全一致の数を短い方の配列の長さで割って、１００を掛けたものである。パーセント同一性はまた、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈから入手可能なバージョン２．２．９を含む、アドバンストＢＬＡＳＴコンピュータープログラムを使用して配列情報を比較することによって決定され得る。ＢＬＡＳＴプログラムは、Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 (1990)のアラインメント法に基づき、Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Karlin And Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877 (1993);およびAltschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)に論じられている。簡潔に述べると、ＢＬＡＳＴプログラムは、同一の整列された記号の数（一般にヌクレオチドまたはアミノ酸）を、２つの配列のうちの短い方の配列の記号の総数で割ったものとして同一性を定義する。このプログラムは、比較されるタンパク質の全長にわたるパーセント同一性を決定するために使用され得る。デフォルトのパラメーターが、例えば、ｂｌａｓｔｐプログラムでの短いクエリー配列での検索を最適化するために提供される。所望の程度の配列同一性の範囲は約８０％～１００％およびそれらの間の整数値である。典型的に、開示された配列と請求された配列との間のパーセント同一性は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％である。

本明細書で使用される場合、「部分配列」とは、本明細書に記載される配列の一部を形成する連続するアミノ酸またはヌクレオチドの長さを指す。部分配列は、完全長配列と整列された場合、完全長配列の一部と同一であり得るか、または整列される完全長配列の部分に対して１００％未満の同一性であり得る（例えば、全配列の５０％と９０％同一など）。

「外因性」という用語は、生物の外部に由来する核酸、タンパク質またはペプチド、小分子化合物などを含む、任意の分子を指すために本明細書で使用される。対照的に、「内因性」という用語は、生物の内部に由来する任意の分子を指す（すなわち、生物によって天然に産生される）。

ポリヌクレオチドは、他のポリヌクレオチドと機能的関係に置かれる場合、別のポリヌクレオチドに「作動可能に連結」される。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結される。それらをコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結される場合、ペプチドは別のペプチドに「作動可能に連結」され、好ましくは、それらは同じオープンリーディングフレーム内にある。

「プロモーター」は、遺伝子をオンまたはオフにするのに必要とされるＤＮＡの配列である。プロモーターは、転写開始部位のすぐ上流および／または転写開始部位と重複して位置し、通常、約１００から数１００塩基対の間の長さである。

本明細書で言及される全ての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、本明細書での任意の定義を含め、本出願が優先する。しかしながら、本明細書で引用される任意の参考文献、論文、刊行物、特許、特許公報、および特許出願の言及は、それらが、有効な先行技術を構成するか、または世界のいずれの国においても共通の一般知識の一部を形成することの承認、または示唆のいかなる形態としても解釈されず、解釈されるべきではない。

本説明では、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲、または整数範囲は、別段の指示がない限り、列挙された範囲内の任意の整数の値、および適切な場合、その分数（整数の１０分の１および１００分の１など）を含むと理解されるべきである。「約」という用語は、数字または数値のすぐ前にある場合、数字または数値が、プラスまたはマイナス１０％の範囲であることを意味する。

本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同程度まで参照により本明細書に組み込まれる。

白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー１（ＬＩＬＲＢ１）
本開示は、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー１（ＬＩＬＲＢ１、またはＬＩＲ１）からの１つまたは複数のドメインを有する受容体を記載している。多数の受容体、操作された細胞、およびそれらの使用が、本明細書で企図される。

白血球免疫グロブリン様受容体Ｂ１としても知られている、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー１（ＬＩＬＲＢ１）、ならびにＩＬＴ２、ＬＩＲ１、ＭＩＲ７、ＰＩＲＢ、ＣＤ８５Ｊ、ＩＬＴ－２ ＬＩＲ－１、ＭＩＲ－７およびＰＩＲ－Ｂは、白血球免疫グロブリン様受容体（ＬＩＲ）ファミリーのメンバーである。ＬＩＬＲＢ１タンパク質は、ＬＩＲ受容体のサブファミリーＢクラスに属する。これらの受容体は、２～４個の細胞外免疫グロブリンドメイン、膜貫通ドメイン、および２～４個の細胞質免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する。ＬＩＬＲＢ１受容体は、免疫細胞上で発現し、それは、抗原提示細胞上でＭＨＣクラスＩ分子に結合し、免疫応答の刺激を阻害する負のシグナルを伝達する。ＬＩＬＲＢ１は、炎症反応、および細胞傷害性を調節し、自己反応性を制限する際に役割を果たすと考えられている。ＬＩＬＲＢ１の異なるアイソフォームをコードする複数の転写物変異体が存在し、それらの全ては、本開示の範囲内であることが企図される。

ＬＩＬＲＢ１の１つまたは複数のドメインを有する受容体の一部の実施形態では、ＬＩＬＲＢ１の１つまたは複数のドメインは、配列番号１の配列または部分配列と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％であるかまたは同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＬＩＬＲＢ１の１つまたは複数のドメインは、配列番号１の配列または部分配列と同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＬＩＬＲＢ１の１つまたは複数のドメインは、配列番号１の配列または部分配列と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％であるかまたは同一であるアミノ酸配列からなる。一部の実施形態では、ＬＩＬＲＢ１の１つまたは複数のドメインは、配列番号１の配列または部分配列と同一であるアミノ酸配列からなる。

ＬＩＬＲＢ１の１つまたは複数のドメインを有する受容体の一部の実施形態では、ＬＩＬＲＢ１の１つまたは複数のドメインは、配列番号３４の配列または部分配列と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％であるかまたは同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる。

ＬＩＬＲＢ１の１つまたは複数のドメインを有する受容体の一部の実施形態では、ＬＩＬＲＢ１の１つまたは複数のドメインは、配列番号３４の配列または部分配列と同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる。

受容体
様々な実施形態では、ポリペプチドを含む、キメラ抗原受容体であって、ポリペプチドが、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインまたはその機能的断片もしくは変異体、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインまたはその機能的変異体、およびＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン、または少なくとも１つ、もしくは少なくとも２つの免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含み、各ＩＴＩＭが、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号８）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号９）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１０）、およびＳＩＹＡＴＬ（配列番号１１）から独立して選択される、細胞内ドメインのうちの１つまたは複数を含む、キメラ抗原受容体が提供される。

細胞内ドメイン
本開示は、キメラ抗原受容体、ポリペプチドを含むキメラ抗原受容体を提供する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、細胞内ドメインを含む。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメインまたはその機能的変異体である。

本明細書で使用される場合、「細胞内ドメイン」とは、細胞の内部と相互作用し、細胞質機能を実行する受容体などの、タンパク質の細胞質または細胞内ドメインを指す。本明細書で使用される場合、「細胞質機能」とは、細胞の細胞質ゾルにおいて実行されるタンパク質またはタンパク質複合体の機能を指す。例えば、細胞内シグナル伝達カスケードは、細胞質機能である。

本明細書で使用される場合、「免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ」または「ＩＴＩＭ」とは、免疫系の多くの阻害性受容体の細胞質尾部に見出される、Ｓ／Ｉ／Ｖ／ＬｘＹｘｘＩ／Ｖ／Ｌ（配列番号１２４）などのコンセンサス配列を有するアミノ酸の保存配列を指す。ＩＴＩＭを保有する阻害性受容体が、それらのリガンドと相互作用した後、ＩＴＩＭモチーフがリン酸化され、阻害性受容体が、ホスホチロシンホスファターゼＳＨＰ－１およびＳＨＰ－２、またはＳＨＩＰと呼ばれるイノシトールホスファターゼなどの他の酵素を動員することを可能にする。

一部の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも１つの免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）、少なくとも２つのＩＴＩＭ、少なくとも３つのＩＴＩＭ、少なくとも４つのＩＴＩＭ、少なくとも５つのＩＴＩＭまたは少なくとも６つのＩＴＩＭを含む細胞内ドメインを含む。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＩＴＩＭを有する。

一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号８）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号９）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１０）、およびＳＩＹＡＴＬ（配列番号１１）からなるＩＴＩＭの群から選択される少なくとも１つのＩＴＩＭを含む細胞内ドメインを含む。

さらなる特定の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも２つの免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含み、各ＩＴＩＭが、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号８）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号９）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１０）、およびＳＩＹＡＴＬ（配列番号１１）から独立して選択される、細胞内ドメインを含む。

一部の実施形態では、細胞内ドメインは、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号８）およびＶＴＹＡＥＶ（配列番号９）の両方のＩＴＩＭを含む。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、配列番号１２と少なくとも９５％同一である配列を含む。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、配列番号１２と同一である配列を含むかまたはそれから本質的になる。

一部の実施形態では、細胞内ドメインは、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号９）およびＶＴＹＡＱＬ（配列番号１０）の両方のＩＴＩＭを含む。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、配列番号１３と少なくとも９５％同一である配列を含む。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、配列番号１３と同一である配列を含むかまたはそれから本質的になる。

一部の実施形態では、細胞内ドメインは、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１０）およびＳＩＹＡＴＬ（配列番号１１）の両方のＩＴＩＭを含む。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、配列番号１４と少なくとも９５％同一である配列を含む。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、配列番号１４と同一である配列を含むかまたはそれから本質的になる。

一部の実施形態では、細胞内ドメインは、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号８）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号９）、およびＶＴＹＡＱＬ（配列番号１０）のＩＴＩＭを含む。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、配列番号１５と少なくとも９５％同一である配列を含む。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、配列番号１５と同一である配列を含むかまたはそれから本質的になる。

一部の実施形態では、細胞内ドメインは、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号９）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１０）、およびＳＩＹＡＴＬ（配列番号１１）のＩＴＩＭを含む。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、配列番号１６と少なくとも９５％同一である配列を含む。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、配列番号１６と同一である配列を含むかまたはそれから本質的になる。

一部の実施形態では、細胞内ドメインは、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号８）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号９）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１０）、およびＳＩＹＡＴＬ（配列番号１１）のＩＴＩＭを含む。実施形態では、細胞内ドメインは、配列番号１７と少なくとも９５％同一である配列を含む。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、配列番号１７と同一である配列を含むかまたはそれから本質的になる。

一部の実施形態では、細胞内ドメインは、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン（配列番号７）と少なくとも９５％同一である配列を含む。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン（配列番号７）と同一である配列を含むかまたはそれから本質的になる。

本開示のＬＩＬＲＢ１細胞内ドメインまたはその機能的変異体は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも４つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのＩＴＩＭを有し得る。一部の実施形態では、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメインまたはその機能的変異体は、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＩＴＩＭを有する。

特定の実施形態では、ポリペプチドは、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含み、各ＩＴＩＭが、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号８）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号９）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１０）、およびＳＩＹＡＴＬ（配列番号１１）から独立して選択される、細胞内ドメインを含む。

特定の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも３つの免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含み、各ＩＴＩＭが、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号８）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号９）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１０）、およびＳＩＹＡＴＬ（配列番号１１）から独立して選択される、細胞内ドメインを含む。

特定の実施形態では、ポリペプチドは、３つの免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含み、各ＩＴＩＭが、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号８）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号９）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１０）、およびＳＩＹＡＴＬ（配列番号１１）から独立して選択される、細胞内ドメインを含む。

特定の実施形態では、ポリペプチドは、４つの免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含み、各ＩＴＩＭが、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号８）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号９）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１０）、およびＳＩＹＡＴＬ（配列番号１１）から独立して選択される、細胞内ドメインを含む。

特定の実施形態では、ポリペプチドは、５つの免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含み、各ＩＴＩＭが、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号８）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号９）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１０）、およびＳＩＹＡＴＬ（配列番号１１）から独立して選択される、細胞内ドメインを含む。

特定の実施形態では、ポリペプチドは、６つの免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含み、各ＩＴＩＭが、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号８）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号９）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１０）、およびＳＩＹＡＴＬ（配列番号１１）から独立して選択される、細胞内ドメインを含む。

特定の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも７つの免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含み、各ＩＴＩＭが、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号８）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号９）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１０）、およびＳＩＹＡＴＬ（配列番号１１）から独立して選択される、細胞内ドメインを含む。

一部の実施形態では、細胞内ドメインは、ＴＣＲアルファ細胞内ドメインを含む。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、本明細書に記載されるように、ＴＣＲアルファ細胞内ドメインおよびＬＩＬＲＢ１細胞内ドメインを含む。一部の実施形態では、ＴＣＲアルファ細胞内ドメインは、Ｓｅｒ－Ｓｅｒを含む。一部の実施形態では、ＴＣＲアルファ細胞内ドメインは、ＴＣＣＡＧＣの配列によってコードされる。

一部の実施形態では、細胞内ドメインは、ＴＣＲベータ細胞内ドメインを含む。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、本明細書に記載されるように、ＴＣＲベータ細胞内ドメインおよびＬＩＬＲＢ１細胞内ドメインを含む。一部の実施形態では、ＴＣＲベータ細胞内ドメインは、ＭＡＭＶＫＲＫＤＳＲ（配列番号９４）の配列と、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性を有するかまたは同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴＣＲベータ細胞内ドメインは、ＭＡＭＶＫＲＫＤＳＲ（配列番号９４）を含むかまたはそれから本質的になる。一部の実施形態では、ＴＣＲベータ細胞内ドメインは、ＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＴＣＡＡＧＡＧＡＡＡＧＧＡＴＴＣＣＡＧＡ（配列番号９５）の配列によってコードされる。

膜貫通ドメイン
本開示は、キメラ抗原受容体であって、ポリペプチドを含む、その受容体を提供する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインまたはその機能的変異体である。

本明細書で使用される場合、「膜貫通ドメイン」とは、細胞の膜に及ぶタンパク質のドメインを指す。膜貫通ドメインは、典型的に、非極性アミノ酸から主になり、脂質二重層を１回または複数回横切ることができる。膜貫通ドメインは、通常、内部水素結合を最大化する構成である、アルファヘリックスを含む。

任意の供給源から単離されたかまたはそれに由来する膜貫通ドメインは、本開示の融合タンパク質の範囲内であると想定される。
特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインまたはその機能的変異体を含む。

一部の実施形態では、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインまたはその機能的変異体は、配列番号５と、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％である配列を含む。一部の実施形態では、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインまたはその機能的変異体は、配列番号５と少なくとも９５％同一である配列を含む。一部の実施形態では、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインは、配列番号５と同一である配列を含む。実施形態では、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインは、配列番号５と同一である配列から本質的になる。

本開示のキメラ抗原受容体の一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインではない。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、融合タンパク質の他のドメインの１つと関連するもの、または融合タンパク質の他のドメインの１つと同じタンパク質から単離されたかもしくはそれに由来するものである。

膜貫通ドメインは、天然または組換え源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合または膜貫通タンパク質に由来し得る。例示的な膜貫通ドメインには、例えば、ＴＣＲのアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロンまたはＣＤ３ガンマ、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の膜貫通領域が少なくとも含まれ得る。

一部の実施形態では、膜貫通は、ＴＣＲアルファ膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、ＴＣＲアルファ膜貫通ドメインは、ＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷ（配列番号９６）の配列と、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するかまたは同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴＣＲアルファ膜貫通ドメインは、ＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷ（配列番号９６）を含むかまたはそれから本質的になる。一部の実施形態では、ＴＣＲアルファ膜貫通ドメインは、ＧＴＧＡＴＴＧＧＧＴＴＣＣＧＡＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＡＡＡＧＴＧＧＣＣＧＧＧＴＴＴＡＡＴＣＴＧＣＴＣＡＴＧＡＣＧＣＴＧＣＧＧＣＴＧＴＧＧ（配列番号９７）の配列によってコードされる。

一部の実施形態では、膜貫通は、ＴＣＲベータ膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、ＴＣＲベータ膜貫通ドメインは、ＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＡＬＶＬ（配列番号９８）の配列と、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するかまたは同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴＣＲベータ膜貫通ドメインは、ＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＡＬＶＬ（配列番号９８）を含むかまたはそれから本質的になる。一部の実施形態では、ＴＣＲベータ膜貫通ドメインは、ＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡＴＧＡＧＡＴＣＴＴＧＣＴＡＧＧＧＡＡＧＧＣＣＡＣＣＴＴＧＴＡＴＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＴＣＡＧＴＧＣＣＣＴＣＧＴＧＣＴＧ（配列番号９９）の配列によってコードされる。

一部の実施形態では、ＴＣＲアルファおよび／またはＴＣＲベータ膜貫通ドメインは、ＴＣＲ ＣＤ３サブユニットとのＴＣＲの相互作用を減衰させるかまたは無効にする１つまたは複数の突然変異を含む。一部の実施形態では、ＴＣＲアルファ膜貫通ドメインは、Ｒ２５３Ｌ突然変異を含む。一部の実施形態では、ＴＣＲベータ膜貫通ドメインは、Ｋ２８８Ｌ突然変異を含む。

一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号１００）の配列と、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するかまたは同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号１００）を含むかまたはそれから本質的になる。一部の実施形態では、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、ＴＴＣＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＣＧＴＴＧＴＧＧＧＣＧＧＣＧＴＧＣＴＧＧＣＣＴＧＣＴＡＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＴＴＧＧＧＴＧ（配列番号１０１）の配列と、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するかまたは同一であるヌクレオチド配列によってコードされる。

一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ヒンジ、例えば、ヒトタンパク質由来のヒンジを介して、細胞外領域キメラ抗原受容体、例えば、抗原結合性ドメインまたはリガンド結合性ドメインに付着され得る。例えば、一部の実施形態では、ヒンジは、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）ヒンジ、例えば、ＩｇＧ４ヒンジ、ＣＤ８ａヒンジまたはＬＩＬＲＢ１ヒンジであり得る。

ヒンジドメイン
本開示は、キメラ抗原受容体であって、ポリペプチド配列を含む、その受容体を提供する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ヒンジドメインを含む。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインまたはその機能的変異体である。

ＬＩＬＲＢ１タンパク質は、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３およびＤ４と呼ばれる、４つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインを有する。一部の実施形態では、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインは、ＬＩＬＲＢ１ Ｄ３Ｄ４ドメインまたはその機能的変異体を含む。一部の実施形態では、ＬＩＬＲＢ１ Ｄ３Ｄ４ドメインは、配列番号１８と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一または同一である配列を含む。一部の実施形態では、ＬＩＬＲＢ１ Ｄ３Ｄ４ドメインは、配列番号１８を含むかまたはそれから本質的になる。

一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインまたはその機能的断片もしくは変異体を含む。実施形態では、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインまたはその機能的断片もしくは変異体は、配列番号４、配列番号１８、または配列番号１９と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるかまたは同一である配列を含む。実施形態では、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインまたはその機能的断片もしくは変異体は、配列番号４、配列番号１８、または配列番号１９と少なくとも９５％同一である配列を含む。

一部の実施形態では、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインは、配列番号４、配列番号１８、または配列番号１９と同一である配列を含む。

一部の実施形態では、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインは、配列番号４、配列番号１８、または配列番号１９と同一である配列から本質的になる。

一部の実施形態では、本開示のキメラ抗原受容体、ポリペプチドは、ＬＩＬＲＢ１から単離されていないかまたはそれに由来しないヒンジを含む。

一部の実施形態では、ヒンジは、ＣＤ８αまたはＣＤ２８から単離されているかまたはそれらに由来する。一部の実施形態では、ＣＤ８αヒンジは、ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号１０２）の配列と、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するかまたは同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ８αヒンジは、ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号１０２）を含む。一部の実施形態では、ＣＤ８αヒンジは、ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号１０２）から本質的になる。一部の実施形態では、ＣＤ８αヒンジは、ａｃｃａｃｇａｃｇｃｃａｇｃｇｃｃｇｃｇａｃｃａｃｃａａｃａｃｃｇｇｃｇｃｃｃａｃｃａｔｃｇｃｇｔｃｇｃａｇｃｃｃｃｔｇｔｃｃｃｔｇｃｇｃｃｃａｇａｇｇｃｇｔｇｃｃｇｇｃｃａｇｃｇｇｃｇｇｇｇｇｇｃｇｃａｇｔｇｃａｃａｃｇａｇｇｇｇｇｃｔｇｇａｃｔｔｃｇｃｃｔｇｔｇａｔ（配列番号１０３）の配列と、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するかまたは同一であるヌクレオチド配列によってコードされる。

一部の実施形態では、ＣＤ２８ヒンジは、ＣＴＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号１０４）の配列と、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するかまたは同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ２８ヒンジは、ＣＴＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号１０４）を含むかまたはそれから本質的になる。一部の実施形態では、ＣＤ２８ヒンジは、ｔｇｔａｃｃａｔｔｇａａｇｔｔａｔｇｔａｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｔａｃｃｔａｇａｃａａｔｇａｇａａｇａｇｃａａｔｇｇａａｃｃａｔｔａｔｃｃａｔｇｔｇａａａｇｇｇａａａｃａｃｃｔｔｔｇｔｃｃａａｇｔｃｃｃｃｔａｔｔｔｃｃｃｇｇａｃｃｔｔｃｔａａｇｃｃｃ（配列番号１０５）の配列と、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するかまたは同一であるヌクレオチド配列によってコードされる。

ＬＩＬＲＢ１ドメインの組合せ
一部の実施形態では、本開示のキメラ抗原受容体は、１つより多いＬＩＬＲＢ１ドメインまたはその機能的等価物を含むポリペプチドを含む。例えば、一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン、またはＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含む。

特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインまたはその機能的断片もしくは変異体、およびＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインまたはその機能的変異体を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２０と、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一または同一である配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２０と少なくとも９５％同一である配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２０と同一である配列を含む。

さらなる実施形態では、ポリペプチドは、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインまたはその機能的変異体、ならびにＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン、および／または少なくとも１つの免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含み、ＩＴＩＭが、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号８）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号９）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１０）、およびＳＩＹＡＴＬ（配列番号１１）から選択される、細胞内ドメインを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインまたはその機能的変異体、ならびにＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン、および／または少なくとも２つのＩＴＩＭを含み、各ＩＴＩＭが、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号８）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号９）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１０）、およびＳＩＹＡＴＬ（配列番号１１）から独立して選択される、細胞内ドメインを含む。

一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２１と、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一または同一である配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２１と少なくとも９５％同一である配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２１と同一である配列を含む。

好ましい実施形態では、ポリペプチドは、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインまたはその機能的断片もしくは変異体、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインまたはその機能的変異体、ならびにＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン、および／または少なくとも２つの免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含み、各ＩＴＩＭが、ＬＹＡＡＶ（配列番号８）、ＶＴＹＡＥ（配列番号９）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１０）、およびＳＩＹＡＴＬ（配列番号１１）から独立して選択される、細胞内ドメインを含む。

一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号３と少なくとも９５％同一である配列、または配列番号２もしくは配列番号３と少なくとも９９％同一である配列、または配列番号２もしくは配列番号３と同一である配列を含む。

一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２０と少なくとも９９％同一である配列、または配列番号２０と少なくとも９９％同一である配列、または配列番号２０と同一である配列を含む。

一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２１と少なくとも９９％同一である配列、または配列番号２１と少なくとも９９％同一である配列、または配列番号２１と同一である配列を含む。

細胞外ドメイン
本開示は、ポリペプチドを含むキメラ抗原受容体を提供する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、抗原結合性ドメインなどのリガンド結合性ドメインを含む。適切な抗原結合性ドメインには、限定されないが、抗体由来の抗原結合性ドメイン、抗体断片、ｓｃＦｖ、Ｔ細胞受容体に由来する抗原結合性ドメインなどが含まれる。当該技術分野で公知の抗原結合性ドメインの全ての形態は、本開示の範囲内であると想定される。

本明細書で使用される場合、「細胞外ドメイン」とは、タンパク質の細胞外部分を指す。例えば、ＴＣＲアルファおよびベータ鎖の各々は、ペプチド－ＭＨＣ認識に関与する定常および可変領域を含む、細胞外ドメインを含む。「細胞外ドメイン」はまた、例えば、特異的抗原に結合し、それをターゲティングすることができる追加のドメインと、ＴＣＲサブユニットの内因性細胞外ドメインとの間の融合物の融合ドメインを含み得る。

本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、抗原に特異的に結合する、免疫グロブリン分子に由来する、タンパク質、またはポリペプチド配列を指す。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル起源の無傷免疫グロブリン、またはその断片であり得、天然または組換え源に由来し得る。

「抗体断片」または「抗体結合性ドメイン」という用語は、抗原結合性ドメイン、すなわち、抗原およびその規定されたエピトープなどの、標的に対する抗体断片の認識および特異的結合を与えるのに十分である、無傷抗体の抗原決定可変領域を含有する、抗体、またはその組換え変異体の少なくとも一部を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片、一本鎖（ｓｃ）Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）抗体断片、線形抗体、単一ドメイン抗体（「ｓｄＡｂ」と略される）（ＶＬまたはＶＨのいずれか）、ラクダＶＨＨドメイン、および抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。

「ｓｃＦｖ」という用語は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片、および重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片を含む融合タンパク質を指し、軽鎖および重鎖可変領域は、短いフレキシブルなポリペプチドリンカーを介して連続して連結されており、単一のポリペプチド鎖として発現することができ、ｓｃＦｖは、それが由来する無傷抗体の特異性を保持する。

抗体に関して、「重鎖可変領域」または「ＶＨ」（または単一ドメイン抗体、例えば、ナノボディ、「ＶＨＨ」の場合）とは、フレームワーク領域として知られている隣接するストレッチの間に介在する３つのＣＤＲを含有する重鎖の断片を指し、これらのフレームワーク領域は、一般に、ＣＤＲよりも高度に保存されており、ＣＤＲを支持するために足場を形成する。

特に明記しない限り、本明細書で使用される場合、ｓｃＦｖは、例えば、ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端に関して、いずれかの順序でＶＬおよびＶＨ可変領域を有し得、ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨを含み得るかまたはＶＨ－リンカー－ＶＬを含み得る。

「抗体軽鎖」という用語は、それらの天然に存在するコンフォメーションにおいて抗体分子に存在する２つの種類のポリペプチド鎖のうちの小さい方を指す。カッパ（「Κ」）およびラムダ（「λ」）軽鎖とは、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。

「組換え抗体」という用語は、例えば、バクテリオファージまたは酵母発現系によって発現される抗体などの、組換えＤＮＡ技術を使用して生成される抗体を指す。この用語はまた、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成によって生成されており、そのＤＮＡ分子が抗体タンパク質を発現する、抗体、または抗体を特定するアミノ酸配列を意味すると解釈されるべきであり、そのＤＮＡまたはアミノ酸配列は、当該技術分野において利用可能であり、周知である組換えＤＮＡまたはアミノ酸配列技術を使用して得られている。

一部の実施形態、例えば、受容体が第１および第２のポリペプチドを含むこれらの実施形態では、抗原結合性ドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）細胞外ドメインまたは抗体から単離されるかまたはそれに由来する。

好ましい実施形態では、ポリペプチドは、抗原結合性ドメイン、例えば、ＬＩＬＲＢ１抗原結合タンパク質以外の抗原結合性ドメインを含む。単一の抗原結合性ドメインを有する受容体の例示的な実施形態は図１に示される。本開示が企図するキメラ抗原受容体は、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の抗原結合性ドメインを有する。抗原結合性ドメインは、キメラ抗原受容体の同じまたは異なる鎖上に提供され得る。実施形態では、キメラ抗原受容体は、例えば、Leung et al. JCI Insight. 2019 Jun 6; 4(11):e124430、ＷＯ２０１５０１７２１４Ａ１；およびＷＯ２０１７１５６４８４Ａ１に記載されているようにＤＡＲＩＣである。

一部の実施形態では、受容体は、阻害性キメラ抗原受容体（ｉＣＡＲ）である。本明細書での実施形態の開示による使用に適した様々な方法および組成物には、ＵＳ２０１８／００４４３９９Ａ１；ＷＯ２０１８１４８４５４Ａ１；およびＷＯ２０１７０８７７２３Ａ１に提供されているものが含まれ、それらの各々は全ての目的のために本明細書に組み込まれる。

一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。

一部の実施形態では、受容体は、第２のポリペプチドを含む。本開示は、図２Ａに示すように、各々が、リガンド結合性ドメイン（例えば、ＴＣＲα／β－またはＦａｂベースのＬＢＤなどの、ヘテロ二量体ＬＤＢの同族体）の一部を有し、各々が、細胞内ドメインを有する、２つのポリペプチドを有する受容体を提供する。本開示は、図２Ｂに示すように、各々が、リガンド結合性ドメイン（例えば、ＴＣＲα／β－またはＦａｂベースのＬＢＤなどの、ヘテロ二量体ＬＤＢの同族体）の一部を有し、リガンド結合性ドメインの一方の部分が、ヒンジまたは膜貫通ドメインに融合しているのに対して、リガンド結合性ドメインの他方の部分が、細胞内ドメインを有していない、２つのポリペプチドを有する受容体をさらに提供する。さらなる変形には、各ポリペプチドがヒンジドメインを有し、各ポリペプチドがヒンジおよび膜貫通ドメインを有する受容体が含まれる。一部の実施形態では、ヒンジドメインは存在しない。他の実施形態では、ヒンジドメインは、ＬＩＬＲＢ１ Ｄ３Ｄ４ドメインなどの、膜近位細胞外領域（ＭＰＥＲ）である。本明細書に開示される実施形態のいずれかでは、ドメインは、それらの間のリンカーにより互いに隣接して融合され得る。

一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、抗体の第１の鎖を含み、第２のポリペプチドは、前記抗体の第２の鎖を含む。

一部の実施形態では、受容体は、抗体のＦａｂ断片を含む。実施形態では、抗体の重鎖の抗原結合性断片、および第２のポリペプチドは、抗体の軽鎖の抗原結合性断片を含む。実施形態では、第１のポリペプチドは、抗体の軽鎖の抗原結合性断片を含み、第２のポリペプチドは、抗体の重鎖の抗原結合性断片を含む。

一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の第１の鎖を含み、第２のポリペプチドは、前記ＴＣＲの第２の鎖を含む。実施形態では、受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞外断片を含む。実施形態では、第１のポリペプチドは、ＴＣＲのアルファ鎖の抗原結合性断片を含み、第２のポリペプチドは、ＴＣＲのベータ鎖の抗原結合性断片を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、ＴＣＲのベータ鎖の抗原結合性断片を含み、第２のポリペプチドは、ＴＣＲのアルファ鎖の抗原結合性断片を含む。

一部の実施形態では、受容体は、限定されないが、ＷＯ２０１７０９１９０５Ａ１に開示されているものなどの、一本鎖ＴＣＲを含む。

例示的な抗原結合性ドメイン
当該技術分野で公知であるかまたは本明細書に開示されている様々な単一可変ドメインは、実施形態での使用に適している。このようなｓｃＦｖには、例えば、限定されないが、ペプチド非依存性の手段でＨＬＡ－Ａ^＊０２に結合する、以下のマウスおよびヒト化ｓｃＦｖ抗体が含まれる（相補性決定領域には下線が引かれている）：

一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２２～３３のいずれか１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２２～３３のいずれか１つと少なくとも９５％同一である配列を含む。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２２～３３のいずれか１つと同一である配列を含む。一部の実施形態では、抗体の重鎖は、配列番号２５～２７または３１～３３のいずれか１つの重鎖ＣＤＲを含み、抗体の軽鎖は、配列番号２２～２４または２８～３０のいずれか１つの軽鎖ＣＤＲを含む。一部の実施形態では、抗体の重鎖は、配列番号３５～４６または１２５のいずれか１つの重鎖部分と少なくとも９５％同一である配列を含み、抗体の軽鎖は、配列番号３５～４６または１２５のいずれか１つの軽鎖部分と少なくとも９５％同一である配列を含む。一部の実施形態では、重鎖は、配列番号２５～２７の全てを含み、軽鎖は、配列番号２２～２４の全てを含む。一部の実施形態では、重鎖は、配列番号３１～３３の全てを含み、軽鎖は、配列番号２８～３０の全てを含む。

一部の実施形態では、抗体の重鎖は、配列番号３５～４６または１２５のいずれか１つの重鎖部分と同一である配列を含み、抗体の軽鎖は、配列番号３５～４６または１２５のいずれか１つの軽鎖部分と同一である配列を含む。

一部の実施形態では、ＳｃＦｖは、配列番号３５～４６または１２５のいずれか１つと、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一または同一である配列を含む。

Ｂリンパ球およびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）ドメイン
一部の実施形態では、ポリペプチドは、Ｂリンパ球およびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメイン、またはそれらの機能的変異体、誘導体もしくは組合せを含む。

一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＢＴＬＡ細胞内ドメインを含む。一部の実施形態では、ＢＴＬＡ細胞内ドメインは、ＲＲＨＱＧＫＱＮＥＬＳＤＴＡＧＲＥＩＮＬＶＤＡＨＬＫＳＥＱＴＥＡＳＴＲＱＮＳＱＶＬＬＳＥＴＧＩＹＤＮＤＰＤＬＣＦＲＭＱＥＧＳＥＶＹＳＮＰＣＬＥＥＮＫＰＧＩＶＹＡＳＬＮＨＳＶＩＧＰＮＳＲＬＡＲＮＶＫＥＡＰＴＥＹＡＳＩＣＶＲＳ（配列番号８７）の配列を含む。一部の実施形態では、ＢＴＬＡ細胞内ドメインは、配列番号８７、またはそれと少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ＢＴＬＡ細胞内ドメインは、配列番号８７から本質的になる。

一部の実施形態では、ＢＴＬＡ膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインは、ＬＬＰＬＧＧＬＰＬＬＩＴＴＣＦＣＬＦＣＣＬＲＲＨＱＧＫＱＮＥＬＳＤＴＡＧＲＥＩＮＬＶＤＡＨＬＫＳＥＱＴＥＡＳＴＲＱＮＳＱＶＬＬＳＥＴＧＩＹＤＮＤＰＤＬＣＦＲＭＱＥＧＳＥＶＹＳＮＰＣＬＥＥＮＫＰＧＩＶＹＡＳＬＮＨＳＶＩＧＰＮＳＲＬＡＲＮＶＫＥＡＰＴＥＹＡＳＩＣＶＲＳ（配列番号８８）の配列と少なくとも９５％同一である配列を含む。一部の実施形態では、ＢＴＬＡ膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインは、配列番号８８の配列を含むかまたはそれから本質的になる。

シグナルペプチド
一部の実施形態では、ポリペプチドは、シグナルペプチドを含む。例えば、ポリペプチドは、ＶＫ１シグナルペプチドを含む。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、Ｎ末端シグナルペプチドである。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣ（配列番号１２８）の配列と少なくとも９５％同一である配列を含む。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣ（配列番号１２８）の配列を含む。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、ＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＣＣＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＡＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＧＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡＴＧＴ（配列番号１２９）の配列と少なくとも９５％同一である配列、またはそれと同一である配列によってコードされる。

抗原
事実上全てのタンパク質またはペプチドを含む、いかなる高分子も、本明細書に記載されたＬＩＬＲＢ１ベースの受容体に対する抗原として働き得ることを、当業者は理解しているだろう。さらに、抗原は、組換えまたはゲノムＤＮＡに由来し得る。免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡが、「抗原」という用語が本明細書で使用される場合の「抗原」をコードすることを当業者は理解しているだろう。さらに、抗原が、もっぱら遺伝子の完全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要はないことを当業者は理解しているだろう。さらに、抗原が、「遺伝子」によりコードされる必要は全くないことを当業者は理解しているだろう。抗原が生成もしくは合成され得、または生体試料から引き出され得、またはポリペプチド以外の高分子であり得ることは容易に明らかである。そのような生体試料には、組織試料、腫瘍試料、細胞、または他の生物学的成分を含む液体が挙げられ得るが、それらに限定されない。

一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、エチオレート受容体、ανββインテグリン、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１７（ＢＣＭＡ）、ＣＤ２７６分子（Ｂ７－Ｈ３）、ナチュラルキラー細胞細胞傷害性受容体３リガンド１（Ｂ７－Ｈ６）、炭酸脱水酵素９（ＣＡＩＸ）、ＣＤ１９分子（ＣＤ１９）、膜貫通４－ドメインＡ１（ＣＤ２０）、ＣＤ２２分子（ＣＤ２２）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー８（ＣＤ３０）、ＣＤ３３分子（ＣＤ３３）、ＣＤ３７分子（ＣＤ３７）、ＣＤ４４分子（ＣＤ４４）、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０分子（ＣＤ７０）、インターロイキン３受容体サブユニットアルファ（ＣＤ１２３）、シンデカン１（ＣＤ１３８）、Ｌ１細胞接着分子（ＣＤ１７１）、ＣＥＡ細胞接着分子（ＣＥＡ）、デルタ様カノニカルＮｏｔｃｈリガンド４（ＤＬＬ４）、上皮細胞接着分子（ＥＧＰ－２）、上皮細胞接着分子（ＥＧＰ－４０）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）、ＥＰＨ受容体Ａ２（ＥｐｈＡ２）、ＥｐＣＡＭ、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）、葉酸受容体アルファ（ＦＢＰ）、胎児アセチルコリン受容体、ｆｒｉｚｚｌｅｄクラス受容体７（Ｆｚｄ７）、ジガングリオシドＧＤ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧＤ３（ＧＤ３）、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、栄養膜糖タンパク質（ｈ５Ｔ４）、インターロイキン１１受容体サブユニットアルファ（ＩＬ－１１Ｒ）、インターロイキン１３受容体サブユニットアルファ２（ＩＬ１３Ｒ－ａ２）、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、κ軽鎖、λ軽鎖、ＬｅＹ、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ ＣＡＭ）、ＭＡＧＥ－Ａ１、メゾテリン、ＭＨＣ提示ペプチド、細胞表面結合型ムチン１（ＭＵＣ１）、細胞表面結合型ムチン１６（ＭＵＣ１６）、神経細胞接着分子１（ＮＣＡＭ）、キラー細胞レクチン様受容体Ｋ１（ＮＫＧ２Ｄ）リガンド、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２／３、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＡＭＥ核内受容体転写制御因子（ＰＲＡＭＥ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、葉酸ヒドロラーゼ１（ＰＳＭＡ）、サバイビン、ＴＡＧ－７２、ＴＥＭ、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＶＥＧＦＲ２）、および受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）から選択される標的と特異的に結合する。

一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、臓器特異抗原、血液脳関門特異的抗原、上皮間葉転換（ＥＭＴ）抗原、Ｅ－カドヘリン、サイトケラチン、オピオイド結合性タンパク質／細胞接着分子（ＯＰＣＭＬ）、ＨＹＬＡ２、結腸直腸癌欠失（ＤＣＣ）、足場／マトリックス付着領域結合性タンパク質１（ＳＭＡＲ１）、細胞表面糖鎖、およびムチン型Ｏ－グリカンから選択される標的と特異的に結合する。

一部の実施形態では、本明細書に記載されたＬＩＬＲＢ１ベースの受容体の細胞外ドメインは、対象の細胞におけるヘテロ接合性喪失を通して喪失している抗原に特異的な抗原結合性ドメインを含む。

本明細書で使用される場合、「ヘテロ接合性喪失（ＬＯＨ）」は、がんにおいて高頻度で起こり、それにより、２つの対立遺伝子の１つが欠失し、たった１つの単一対立遺伝子（ヘミ接合性）座を残す遺伝子変化を指す。

一部の実施形態では、ＬＩＬＲＢ１ベースの受容体は、マイナー組織適合抗原（ＭｉＨＡ）に特異的な抗原結合性ドメインを含む。ＭｉＨＡは、対立遺伝子間の非同義的差を含有するタンパク質に由来したペプチドであり、共通のＨＬＡ対立遺伝子により提示される。非同義的差は、ＭｉＨＡをコードする遺伝子のコード配列におけるＳＮＰ、欠失、フレームシフト突然変異、または挿入から生じ得る。例示的なＭｉＨＡは、約９～１２アミノ酸長であり得、かつＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩタンパク質と結合することができる。ＭｉＨＡを提示するＭＨＣ複合体とのＴＣＲの結合は、Ｔ細胞を活性化することができる。ＭｉＨＡの遺伝学的および免疫学的性質は、当業者に知られており、特定のＭｉＨＡは、ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０４５２２８（その内容は参照により組み込まれている）に記載されている。

一部の実施形態では、ＬＩＬＲＢ１ベースの受容体は、Ｙ染色体喪失を通して対象のがん細胞において喪失している抗原に特異的な抗原結合性ドメインを含む。

一部の実施形態では、ＬＩＬＲＢ１ベースの受容体は、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子に特異的な抗原結合性ドメインを含む。主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩは、免疫系の細胞へ抗原を提示し、免疫応答を引き起こすタンパク質複合体である。ＭＨＣクラスＩに対応するヒト白血球抗原（ＨＬＡ）は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃである。ＨＬＡ－Ｅは、非古典的ＭＨＣクラスＩ分子として当技術分野において知られている。一部の実施形態では、ＬＩＬＲＢ１ベースの受容体に対する抗原は、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子を含む。一部の実施形態では、ＨＬＡクラスＩの対立遺伝子は、ヘテロ接合性喪失（ＬＯＨ）を通して、がん細胞などの標的細胞において喪失している。

ＨＬＡ－Ａは、ＨＬＡ－Ａ遺伝子座によりコードされる主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）の一群のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）である。ＨＬＡ－Ａは、ヒトＭＨＣクラスＩ細胞表面受容体の３つの主要な型の１つである。その受容体は、重鎖α鎖およびより小さいβ鎖を含むヘテロダイマーである。α鎖は、ＨＬＡ－Ａの変異体によりコードされ、一方、β鎖（β２－ミクログロブリン）は不変である。数千個のＨＬＡ－Ａ変異体があり、それらの全部が、本開示の範囲内にある。

一部の実施形態では、ＬＩＬＲＢ１ベースの受容体は、ＨＬＡ－Ｂ対立遺伝子に特異的な抗原結合性ドメインを含む。ＨＬＡ－Ｂ遺伝子は、多くの可能なバリエーション（対立遺伝子）を有する。ＨＬＡ－Ｂ遺伝子の何百個というバージョン（対立遺伝子）が知られており、それらのそれぞれが、特定の番号を与えられている（例えば、ＨＬＡ－Ｂ２７）。

一部の実施形態では、ＬＩＬＲＢ１ベースの受容体は、ＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子に特異的な抗原結合性ドメインを含む。ＨＬＡ－Ｃは、ＨＬＡクラスＩ重鎖パラログに属する。このクラスＩ分子は、重鎖および軽鎖（ベータ－２ミクログロブリン）からなるヘテロダイマーである。

一部の実施形態では、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子は、広範なまたは遍在性のＲＮＡ発現を生じる。

一部の実施形態では、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子は、既知のまたは一般的に高いマイナー対立遺伝子頻度を有する。

一部の実施形態では、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子は、例えばＨＬＡクラスＩ対立遺伝子が汎ＨＬＡリガンド結合性ドメインにより認識される時、ペプチド－ＭＨＣ抗原を必要としない。

一部の実施形態では、ＬＩＬＲＢ１ベースの受容体は、ＨＬＡ－Ａ対立遺伝子に特異的な抗原結合性ドメインを含む。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ａ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ^＊０２を含む。ＨＬＡ－Ａ^＊０２と結合しかつそれを認識する、当技術分野において知られたまたは本明細書に開示された様々な単一可変ドメインは、実施形態における使用に適しており、本明細書に記載されている。

一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、ＨＬＡ－Ａ^＊０２抗原と特異的に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、ＨＬＡ－Ａ^＊０２抗原とペプチド非依存性様式で特異的に結合する。

ポリヌクレオチドおよびベクター
他の態様では、本開示は、本開示の受容体をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン、およびＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン、またはその機能的誘導体もしくは断片の１つまたは複数をコードする。

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１～７または１２～２１のいずれか１つと少なくとも９５％同一であるポリペプチドをコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４７～７１、７７～７９、８９～９２、１２０、または１２２のいずれか１つと少なくとも９５％同一であるポリペプチドをコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３５～４６または１２５のいずれか１つの重鎖部分または軽鎖部分と少なくとも９５％同一であるポリペプチドをコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３５、３９、４６、または１２５のいずれか１つの重鎖部分または軽鎖部分と少なくとも９５％同一であるポリペプチドをコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３５、３９、４６、または１２５のいずれか１つの重鎖部分または軽鎖部分と同一であるポリペプチドをコードする核酸配列を含む。別の態様では、本開示は、本開示の受容体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１２１または１２３と少なくとも９５％同一である配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは配列番号１２１または１２３を含む。

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＬＩＬＲＢ１ヒンジ、膜貫通、および細胞内ドメインの配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１２６と少なくとも９５％同一である配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１２６の配列を含む。

レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来したベクターは、それらが導入遺伝子の長期の安定な組込みおよび娘細胞におけるそれの伝播を可能にするため、長期遺伝子移入を達成するための適切なツールである。レンチウイルスベクターは、それらが肝細胞などの非増殖性細胞を形質導入することができる点において、マウス白血病ウイルスなどのオンコレトロウイルスに由来したベクターを凌ぐ追加の利点を有する。それらはまた、低免疫原性という追加の利点を有する。

受容体をコードする天然または合成核酸の発現は、典型的には、受容体またはその一部分をコードする核酸をプロモーターに作動可能に連結し、そのコンストラクトを発現ベクターへ組み入れることにより達成される。ベクターは、真核生物における複製および組込みに適し得る。典型的なクローニングベクターは、所望の核酸配列の発現の制御に有用な転写および翻訳ターミネーター、開始配列、ならびにプロモーターを含有する。

受容体をコードするポリヌクレオチドは、いくつかの型のベクターへクローニングすることができる。例えば、ポリヌクレオチドは、非限定的にプラスミド、ファージミド、ファージ派生物、動物ウイルス、およびコスミドを含むベクターへクローニングすることができる。特に対象となるベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、およびシーケンシングベクターが挙げられる。

さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形をとって、免疫細胞などの細胞へ供給され得る。ウイルスベクターテクノロジーは当技術分野においてよく知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York）ならびに他のウイルス学および分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用であるウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスが挙げられるが、それらに限定されない。一般的に、適切なベクターは、少なくとも１つの生物体において機能し得る複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、および１つまたは複数の選択マーカーを含有する（例えば、ＷＯ０１／９６５８４；ＷＯ０１／２９０５８；および米国特許第６，３２６，１９３号）。

いくつかのウイルスベース系は、哺乳動物細胞への遺伝子移入のために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子デリバリー系のための好都合なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子を、当技術分野において知られた技術を使用して、ベクターへ挿入し、レトロウイルス粒子中にパッケージングすることができる。その後、組換えウイルスを、単離し、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）かまたはエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）かのいずれかで、対象の細胞へデリバリーすることができる。いくつかのレトロウイルス系が当技術分野において知られている。一部の実施形態では、アデノウイルスベクターが使用される。いくつかのアデノウイルスベクターが当技術分野において知られている。一実施形態では、レンチウイルスベクターが使用される。

一部の実施形態では、ベクターは、プロモーターを含む。ベクターはまた、追加の制御エレメントを含み得る。追加の制御エレメント、例えばエンハンサーは、転写開始の頻度を制御する。典型的には、これらは、開始部位から３０～１１０塩基対（ｂｐ）上流の領域に位置するが、いくつかのプロモーターが、おまけに、開始部位の下流に機能的エレメントを含有することが最近、示されている。プロモーターエレメント間のスペーシングは、エレメントがお互いに対して逆転または移動された時にプロモーター機能が保存されるように、フレキシブルである。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターにおいて、プロモーターエレメント間のスペーシングは、活性が低下し始める前に、５０ｂｐ離れるまで増加することができる。プロモーターに依存して、個々のエレメントは、転写を活性化するために協同的かまたは非依存的かのいずれかで機能し得ると思われる。

適切なプロモーターの一例は、最初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それと作動可能に連結した任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動する能力がある強い構成的プロモーター配列である。適切なプロモーターの別の例は、伸長増殖因子－１α（ＥＦ－１α）である。しかしながら、他の構成的プロモーター配列もまた使用され得、それには、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、加えて、非限定的に、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターなどのヒト遺伝子プロモーターが挙げられるが、それらに限定されない。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターもまた、本発明の一部として企図される。誘導性プロモーターの使用は、それが作動可能に連結しているポリヌクレオチド配列の発現を、そのような発現が望まれる時にオンにし、または発現が望まれない時に発現をオフにする能力がある分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例には、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターが挙げられるが、それらに限定されない。

受容体の発現を評価するために、細胞へ導入される発現ベクターはまた、ウイルスベクターを通してトランスフェクトされまたは感染するように求められた細胞集団からの発現細胞の同定および選択を容易にするために選択マーカー遺伝子かもしくはレポーター遺伝子かのいずれかまたは両方を含有し得る。他の態様では、選択マーカーは、別個のＤＮＡ小片上に保有されて、同時トランスフェクション手順で使用され得る。選択マーカーおよびレポーター遺伝子のどちらも、宿主細胞における発現を可能にするように適切な制御配列と隣接され得る。有用な選択マーカーには、例えば、ｎｅｏなどの抗生物質抵抗性遺伝子が挙げられる。

遺伝子を細胞へ導入し、かつ発現する方法は、当技術分野において知られている。発現ベクターの関連において、ベクターは、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母、または昆虫の細胞へ、当技術分野における任意の方法により容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、物理学的、化学的、または生物学的手段により宿主細胞へ移入することができる。

ポリヌクレオチドを宿主細胞へ導入するための物理学的方法には、リン酸カルシウム沈澱、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、電気穿孔などが挙げられる。ベクターおよび／または外因性核酸を含む細胞を作製するための方法は当技術分野においてよく知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York）参照されたい。ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入のための一つの方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。

目的のポリヌクレオチドを宿主細胞へ導入するための生物学的方法には、ＤＮＡおよびＲＮＡベクターの使用が挙げられる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えばヒト細胞へ遺伝子を挿入するための最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号および第５，５８５，３６２号参照。

ポリヌクレオチドを宿主細胞へ導入するための化学的手段には、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質ベース系などのコロイド分散系が挙げられる。インビトロおよびインビボでのデリバリー媒体としての使用のための例示的なコロイド系はリポソーム（例えば、人工膜ベシクル）である。

外因性核酸を宿主細胞へ導入するために使用される方法であろうと、別のやり方で細胞を本発明のインヒビターへ曝露させるために使用される方法であろうと、宿主細胞における組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、様々なアッセイが実施され得る。そのようなアッセイには、例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲおよびＰＣＲなどの当業者によく知られた「分子生物学的」アッセイ；例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット）により、または本発明の範囲内にある作用物質を同定するための本明細書に記載されたアッセイにより、特定のペプチドの存在または非存在を検出することなどの「生化学的」アッセイが挙げられる。

操作された細胞
別の態様では、本開示は、本開示の受容体をコードする核酸配列もしくはベクターを含みおよび／または本開示の受容体を発現する免疫細胞を提供する。

実施形態では、免疫細胞活性化は、その細胞が、本開示のＬＩＬＲＢ１ベースの受容体の抗原、または表面上にその抗原を発現する細胞と接触した時、低下する。実施形態では、免疫細胞活性化は、ＮＦＡＴプロモーターに作動可能に連結した遺伝子の発現を含む。免疫細胞活性化および／または活性化の阻害は、当技術分野において知られた様々な他の方法により測定することができる。一部の実施形態では、免疫細胞は、追加の外因性受容体、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴＣＲなどのアクチベーター受容体を含む。

実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。

本明細書で使用される場合、用語「免疫細胞」は、自然または適応（獲得）免疫系に関与する細胞を指す。例示的な自然免疫細胞には、好中球、単球、およびマクロファージなどの食細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、好酸球、および好塩基球などの多形核（ｐｏｌｙｍｏｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ）白血球、ならびに単球、マクロファージ、およびマスト細胞などの単核細胞が挙げられる。獲得免疫において役割をもつ免疫細胞には、Ｔ細胞およびＢ細胞などのリンパ球が挙げられる。

本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞」は、胸腺において発達する骨髄前駆体が起源である一種のリンパ球を指す。胸腺への遊走により発達するいくつかの別々の型のＴ細胞があり、それには、ヘルパーＣＤ４＋ Ｔ細胞、細胞傷害性ＣＤ８＋ Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、制御性ＣＤ４＋ Ｔ細胞、および幹メモリーＴ細胞が挙げられる。異なる型のＴ細胞は、それらのマーカーの発現に基づいて当業者により区別することができる。Ｔ細胞型間を区別する方法は、当業者にとって容易に明らかであろう。

操作された細胞を作製する方法
別の態様では、本開示は、本開示のポリヌクレオチドを細胞へ、適宜、本開示のベクターを使用して、導入することを含む方法を提供する。実施形態では、生じた細胞は、ポリヌクレオチドによりコードされるＬＩＬＲＢ１ベースの受容体を発現する。実施形態では、細胞は免疫細胞である。実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。

Ｔ細胞などの免疫細胞の集団を、本開示のベクターで形質転換する方法は、当業者にとって容易に明らかだろう。例えば、ＣＤ３＋ Ｔ細胞が、ＣＤ３＋ Ｔ細胞ネガティブ単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して製造会社の使用説明書に従って、ＰＢＭＣから単離することができる。Ｔ細胞は、ＣＤ３／２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（１：１ 細胞対ビーズ比）および３００ユニット／ｍＬのＩＬ－２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）の存在下で、５％ヒトＡ／Ｂ血清および１％Ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを補充したＸ－Ｖｉｖｏ １５培地中１×１０^６個の細胞／ｍＬの密度で培養することができる。２日後、Ｔ細胞に、当技術分野において知られた方法を使用して、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクターを形質導入することができる。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、５の感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入される。その後、細胞は、濃縮前の追加の５日間、ＩＬ－２または他のサイトカイン、例えばＩＬ－７／１５／２１の組合せにおいて、培養され得る。Ｂ細胞などの免疫細胞の他の集団、またはＴ細胞の他の集団を単離および培養する方法は当業者にとって容易に明らかだろう。この方法は有望なアプローチを描いているとはいえ、これらの方法論が急速に進化しつつあることは留意されるべきである。例えば、末梢血単核球の優れたウイルス形質導入は、５日間の成長後に達成されて、＞９９％ＣＤ３＋の高度に形質導入された細胞集団を生じることができる。

本開示の受容体、ポリヌクレオチド、またはベクターを含むＴ細胞の集団を活性化および培養する方法は、当業者にとって容易に明らかだろう。

遺伝子改変の前であろうと後であろうと、Ｔ細胞は、一般的には、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号；第６，５３４，０５５号；第６，９０５，６８０号；第６，６９２，９６４号；第５，８５８，３５８号；第６，８８７，４６６号；第６，９０５，６８１号；第７，１４４，５７５号；第７，０６７，３１８号；第７，１７２，８６９号；第７，２３２，５６６号；第７，１７５，８４３号；第５，８８３，２２３号；第６，９０５，８７４号；第６，７９７，５１４号；第６，８６７，０４１、第１００４０８４６号；および米国特許出願公開第２００６／０１２１００５号に記載されている方法を使用して、活性化および増殖することができる。

一部の実施形態では、本開示のＴ細胞は、インビトロで増殖および活性化される。一般的に、本開示のＴ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する作用物質およびＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドを付着している表面との接触により、インビトロで増殖される。特に、Ｔ細胞集団は、抗ＣＤ３抗体との接触によるなど、本明細書に記載されているように刺激され得る。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激について、アクセサリー分子を結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の集団を、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。ＣＤ４＋ Ｔ細胞またはＣＤ８＋ Ｔ細胞のいずれの増殖も刺激するために、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を使用することができる。抗ＣＤ２８抗体の例には、９．３、Ｂ－Ｔ３、ＸＲ－ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、Ｂｅｓａｎｃｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）が挙げられ、それらは、当技術分野において一般的に知られた他の方法が使用することができるように、使用することができる［Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999］。

一部の実施形態では、Ｔ細胞に対する一次刺激シグナルおよび共刺激シグナルは、異なるプロトコールにより与えられ得る。例えば、各シグナルを与える作用物質は、溶液中にあり得、または表面と連結し得る。表面と連結している場合、作用物質は、同じ表面に（すなわち、「シス」形成で）、または別個の表面に（すなわち、「トランス」形成で）連結し得る。あるいは、一方の作用物質が表面に連結し得、他方の作用物質が溶液中にあり得る。一部の実施形態では、共刺激シグナルを与える作用物質は、細胞表面と結合しており、一次活性化シグナルを与える作用物質は溶液中にありまたは表面と連結している。ある特定の実施形態では、両方の作用物質が溶液中にあり得る。別の実施形態では、作用物質は、溶液の形をとり得、その後、Ｆｃ受容体、または抗体、またはその作用物質と結合する他の結合性物質を発現する細胞などの表面と架橋し得る。この関連において、例えば、本発明においてＴ細胞を活性化および増殖することにおける使用を企図される人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）について米国特許出願公開第２００４０１０１５１９号および第２００６００３４８１０号を参照されたい。

一部の実施形態では、２つの作用物質は、同じビーズ上に、すなわち、「シス」かまたは別個のビーズに、すなわち、「トランス」かのいずれかで、ビーズ上に固定化される。例として、一次活性化シグナルを与える作用物質は抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性断片であり、共刺激シグナルを与える作用物質は抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合性断片であり、両方の作用物質が、同じビーズに等しい分子数量で同時固定化される。一実施形態では、ＣＤ４＋ Ｔ細胞増殖およびＴ細胞成長のためのビーズと結合した１：１比の各抗体が使用される。一部の実施形態では、ビーズと結合したＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比は、１００：１から１：１００までで、その間にある全ての整数値を含む、範囲である。本発明の一態様では、抗ＣＤ３抗体より多い抗ＣＤ２８抗体が粒子に結合しており、すなわち、ＣＤ３：ＣＤ２８の比は１未満である。本発明のある特定の実施形態では、ビーズと結合した、抗ＣＤ２８抗体対抗ＣＤ３抗体の比は、２：１より大きい。

１：５００から５００：１までで、その間の任意の整数値を含む、粒子対細胞の比が、Ｔ細胞または他の標的細胞を刺激するために使用され得る。当業者が容易に理解することができるように、粒子対細胞の比は、標的細胞に対する粒子サイズに依存し得る。例えば、小さいサイズのビーズは、少ない細胞を結合し得るのみであり、一方、より大きいビーズは多くの細胞を結合し得る。ある特定の実施形態では、細胞対粒子の比は、１：１００から１００：１までで、その間の任意の整数値を含む範囲であり、さらなる実施形態では、その比は、１：９～９：１で、その間の任意の整数値を含み、それもまたＴ細胞を刺激するために使用することができる。一部の実施形態では、１：１の細胞対ビーズの比が使用される。様々な他の比が本発明における使用に適し得ることを当業者は理解しているだろう。特に、比は、粒子サイズならびに細胞サイズおよび型に依存して異なる。

本発明のさらなる実施形態では、Ｔ細胞などの細胞は、作用物質コーティング化ビーズと組み合わせられ、引き続いて、ビーズと細胞は分離され、その後、細胞が培養される。代替の実施形態では、培養前に、作用物質コーティング化ビーズと細胞は分離されず、一緒に培養される。さらなる実施形態では、ビーズと細胞はまず、磁力などの力の適用により濃縮され、細胞表面マーカーのライゲーションの増加を生じ、それにより、細胞刺激を誘導する。

例として、細胞表面タンパク質は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８が付着している常磁性ビーズがＴ細胞と接触することを可能にすることにより、ライゲーションされ得る。一実施形態では、細胞（例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞）およびビーズ（例えば、１：１の比におけるＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ常磁性ビーズ）が緩衝液中で組み合わされる。この場合もやはり、任意の細胞濃度が使用され得ることを当業者は容易に理解できるだろう。ある特定の実施形態では、細胞と粒子の最大限の接触を保証するために粒子と細胞が一緒に混合される体積をかなり減少させる（すなわち、細胞の濃度を増加させる）ことが望ましくあり得る。例えば、一実施形態では、約２０億個の細胞／ｍｌの濃度が使用される。別の実施形態では、１億個の細胞／ｍｌより高い濃度が使用される。さらなる実施形態では、１千万個、１千５百万個、２千万個、２千５百万個、３千万個、３千５百万個、４千万個、４千５百万個、または５千万個の細胞／ｍｌの細胞の濃度が使用される。さらに別の実施形態では、７千５百万個、８千万個、８千５百万個、９千万個、９千５百万個、または１億個の細胞／ｍｌからの細胞の濃度が使用される。さらなる実施形態では、１億２千５百万個または１億５千万個の細胞／ｍｌの濃度が使用され得る。一実施形態では、１×１０^６個の細胞／ｍＬの密度で培養される細胞が使用される。

一部の実施形態では、混合物が、数時間（約３時間）～約１４日間またはその間の任意の時間単位の整数値の間、培養され得る。別の実施形態では、ビーズとＴ細胞が一緒に２～３日間、培養される。Ｔ細胞培養に適切な条件は、血清（例えば、ウシ胎仔またはヒト血清）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＧＦβ、およびＴＮＦ－α、または当業者に知られた細胞の成長のための任意の他の添加物を含む、増殖および生存能に必要な因子を含有し得る適切な培地（例えば、基礎培地またはＲＰＭＩ培地１６４０、またはＸ－ｖｉｖｏ １５（Ｌｏｎｚａ））を含む。細胞の成長のための他の添加物には、界面活性剤、プラスマネート（ｐｌａｓｍａｎａｔｅ）、ならびにＮ－アセチル－システインおよび２－メルカプトエタノールなどの還元剤が挙げられるが、それらに限定されない。培地には、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンを添加した、無血清の、またはＴ細胞の成長および増殖に十分な、適切な量の血清（または血漿）もしくは定義済みのホルモンのセット、および／もしくはいくらかのサイトカインを補充した、ＲＰＭＩ １６４０、ＡＩＭ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ １５、およびＸ－Ｖｉｖｏ ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを挙げることができる。一部の実施形態では、培地は、５％ヒトＡ／Ｂ血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）、および３００ユニット／ｍｌのＩＬ－２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を補充したＸ－ＶＩＶＯ－１５培地を含む。

Ｔ細胞は、成長を支援するのに必要な条件、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、５％ＣＯ２を加えた空気）下で維持される。

一部の実施形態では、本開示の受容体を含むＴ細胞は自家性である。増殖および遺伝子改変の前に、Ｔ細胞の供給源が対象から入手される。Ｔ細胞などの免疫細胞は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含むいくつかの供給源から得ることができる。本発明のある特定の実施形態では、当技術分野において入手可能なＴ細胞系のいくつでも使用され得る。本発明のある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離などの当業者に知られた技術のいくつでも使用して、対象から収集された１単位の血液から得ることができる。

一部の実施形態では、個体の循環血液由来の細胞は、アフェレーシスにより得られる。アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒細胞、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含むリンパ球を含有する。一部の実施形態では、アフェレーシスにより収集された細胞を、洗浄して、血漿画分を除去し、その後の処理工程のために適切な緩衝液または培地中に細胞を置き得る。一部の実施形態では、細胞を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。代替の実施形態では、洗浄溶液は、カルシウムを欠損し、マグネシウムを欠損する場合もあり、または全部の二価陽イオンではないが多くを欠損する場合がある。当業者が容易に理解するように、洗浄工程は、半自動「フロースルー」遠心機（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１細胞処理装置、Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅ、またはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｓａｖｅｒ ５）を製造会社の使用説明書に従って使用することによるなどの、当業者に知られた方法により達成され得る。洗浄後、細胞を、様々な生体適合性緩衝液、例えば、Ｃａ２＋フリー、Ｍｇ２＋フリーＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ、または緩衝液を含むもしくは含まない他の食塩溶液中に再懸濁させ得る。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を培地中に直接、再懸濁させ得る。

一部の実施形態では、Ｔ細胞などの免疫細胞は、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を通しての遠心分離によりまたは対向流遠心溶出法により、赤血球を溶解し、かつ単球を除去することにより、末梢血リンパ球から単離される。Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはＣＤ４＋ Ｔ細胞などの免疫細胞の特定の亜集団は、ポジティブまたはネガティブ選択技術によりさらに単離することができる。例えば、一実施形態では、Ｔ細胞は、抗ＣＤ４コンジュゲート化ビーズとの、所望のＴ細胞のポジティブ選択に十分な時間でのインキュベーションにより、単離される。

Ｔ細胞集団などの免疫細胞集団のネガティブ選択による濃縮は、ネガティブに選択される細胞に固有の表面マーカーに方向づけられた抗体の組合せを用いて達成することができる。一つの方法は、ネガティブに選択される細胞上に存在する細胞表面マーカーに方向づけられたモノクローナル抗体のカクテルを使用するネガティブ磁気免疫接着またはフローサイトメトリーによる細胞選別および／または選択である。例えば、ネガティブ選択によりＣＤ４＋細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体を含む。

ポジティブまたはネガティブ選択による免疫細胞の所望の集団の単離について、細胞および表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度は様々であり得る。ある特定の実施形態では、細胞とビーズの最大限の接触を保証するために、ビーズと細胞が一緒に混合される体積をかなり減少させる（すなわち、細胞の濃度を増加させる）ことが望ましくあり得る。

一部の実施形態では、細胞は、２～１０℃かまたは室温かのいずれかで、様々な速度で、様々な長さの時間の間、回転子上でインキュベートされ得る。

刺激のためのＴ細胞、またはＴ細胞などの免疫細胞が単離されるＰＢＭＣはまた、洗浄工程後、凍結することができる。理論によって縛られるつもりはないが、凍結およびその後の融解工程は、細胞集団において顆粒細胞、およびある程度、単球を除去することにより、より均一な産物を提供する。血漿および血小板を除去する洗浄工程後、細胞は、凍結保存溶液（ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中に懸濁され得る。多くの凍結保存溶液およびパラメーターが当技術分野において知られており、この関連において有用であるが、一つの方法は、２０％ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、または１０％デキストラン４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン、ならびに７．５％ＤＭＳＯを含有する培地、または３１．２５％Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ－Ａ、３１．２５％のデキストロース５％、０．４５％ＮａＣｌ、１０％デキストラン４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン、ならびに７．５％ＤＭＳＯを含有する培地、または例えば、ＨｅｓｐａｎおよびＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを含有する他の適切な細胞凍結保存培地を使用することを含み、その後、細胞が、１分あたり１°の速度で－８０℃へ凍結され、液体窒素貯蔵タンクの気相中で保存される。制御凍結の他の方法、加えて、－２０℃でのまたは液体窒素中での即時の無制御凍結も使用され得る。

シグナル伝達のアッセイ
一部の実施形態では、免疫細胞活性化は、その細胞が、本開示のＬＩＬＲＢ１ベースの受容体に対応する抗原または表面上にその抗原を発現する細胞と接触した時、低下する。一部の実施形態では、免疫細胞活性化は、ＮＦＡＴプロモーターに作動可能に連結した遺伝子の発現を含む。活性化Ｔ細胞の核内因子（ＮＦＡＴ）は、免疫応答において重要であることが示された転写因子のファミリーである。ＮＦＡＴ転写因子ファミリーは、５つのメンバーＮＦＡＴｃ１、ＮＦＡＴｃ２、ＮＦＡＴｃ３、ＮＦＡＴｃ４、およびＮＦＡＴ５からなる。ＮＦＡＴは炎症を制御することにおいて役割を果たす。

本明細書で使用される場合、ＮＦＡＴプロモーターは、ＮＦＡＴが細胞において発現した時に制御される（すなわち、活性化または抑圧される）プロモーターである。ＮＦＡＴ標的プロモーターは、Badran, B. M. et al.(2002) J. Biological Chemistry Vol. 277: 47136-47148に記載され、ＧＧＡＡＡなどのＮＦＡＴコンセンサス配列を含有する。

受容体活性化の遺伝子発現への効果を評価する方法は、当技術分野において知られており、レポーター遺伝子の使用を含み、そのレポーター遺伝子の発現が定量化され得る。レポーター遺伝子は、潜在的にトランスフェクトまたは形質導入された細胞を同定するために、および制御配列の機能性を評価するために使用される。一般的に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物体に存在せずまたはそれによって発現しておらず、かつ発現がいくつかの容易に検出可能な性質、例えば酵素活性により顕在化される、ポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞へ導入された後の適切な時点でアッセイされる。適切なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリフォスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子が挙げられ得る（例えば、Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82）。適切な発現系はよく知られており、知られた技術を使用して調製されまたは商業的に入手され得る。一般的に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す、最小の５’隣接領域を有するコンストラクトがプロモーターとして同定される。そのようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子と連結されて、プロモーター駆動型転写を調節する能力について作用物質を評価するために使用され得る。例示的な実施形態では、レポーター遺伝子に作動可能に連結したＮＦＡＴプロモーターは、ＮＦＡＴシグナル伝達時における本開示の受容体の発現を評価するために使用される。

医薬組成物
本開示は、本開示のＬＩＬＲＢ１ベースの受容体を含む免疫細胞、および薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。

そのような組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロース、またはデキストラン、マンニトールなどの糖質；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；および保存剤を含み得る。

疾患を処置する方法
本明細書に記載されたＬＩＬＲＢ１ベースの受容体を含む複数の免疫細胞を含む組成物の治療有効量を対象に投与することを含む、それを必要とする対象を処置する方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、免疫細胞は、アクチベーターＣＡＲまたはＴＣＲなどのアクチベーター受容体をさらに含む。

対象を処置する追加の方法、および阻害性受容体と組み合わされたアクチベーター受容体の組合せは、ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０４５２２８に記載されており、その内容は全体として参照により本明細書に組み込まれている。

一部の実施形態では、それを必要とする対象はがんを有する。一部の実施形態では、対象を処置する方法は、本開示のＬＩＬＲＢ１受容体を含む複数の免疫細胞を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、複数の免疫細胞は、ＣＡＲまたはＴＣＲなどのアクチベーター受容体をさらに含む。一部の実施形態では、ＣＡＲまたはＴＣＲは、がん抗原に特異的な抗原結合性ドメインを含む。がん抗原に特異的なアクチベーター受容体は、任意の抗体から単離されもしくは引き出された抗原結合性ドメインまたは当技術分野において知られた抗原結合性ドメインを含み得、その抗原結合性ドメインには、ウレルマブ、ウトミルマブ、オレクルマブ、ナプツモマブ、アスクリンバクマブ、タカツズマブ、ネスバクマブ、バヌシズマブ、ベリムマブ、タバルマブ、チブリズマブ、ベランタマブ、イゴボマブ（ｉｇｏｖｏｍａｂ）、オレゴボマブ、ソフィツズマブ、モガムリズマブ、タラコツズマブ、タボリマブ、ボンレロリズマブ、イピリムマブ、ドゥボルツキシズマブ、ブリナツモマブ、コルツキシマブ（ｃｏｌｔｕｘｉｍａｂ）、デニンツズマブ、イネビリズマブ、ロンカスツキシマブ、タプリツモマブ（ｔａｐｌｉｔｕｍｏｍａｂ）、イブリツモマブ、オビヌツズマブ、オカラツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、リツキシマブ、トシツモマブ、ベルツズマブ、サマリズマブ、ベクツモマブ、エプラツズマブ、イノツズマブ、モキセツモマブ、ピナツズマブ（ｐｉｎａｔｕｚｕｍａｂ）、ゴミリキシマブ、ルミリキシマブ、カミダンルマブ、バシリキシマブ、イノリモマブ（ｉｎｏｌｉｍｏｍａｂ）、ダクリズマブ、バルリルマブ（ｖａｒｌｉｌｕｍａｂ）、エノブリツズマブ、オムブルタマブ、ブレンツキシマブ、イラツツムマブ、ゲムツズマブ、リンツズマブ、バダスツキシマブ、リロトマブ、オツレルツズマブ（ｏｔｌｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、テツロマブ（ｔｅｔｕｌｏｍａｂ）、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ビバツズマブ（ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）、アビツズマブ（ａｂｉｔｕｚｕｍａｂ）、インテツムマブ、ロルボツズマブ、イトリズマブ、クサツズマブ（ｃｕｓａｔｕｚｕｍａｂ）、ボルセツズマブ、ミラツズマブ、ポラツズマブ、イラダツズマブ（ｉｌａｄａｔｕｚｕｍａｂ）、ガリキシマブ（ｇａｌｉｘｉｍａ）、アルツモマブ、アルシツモマブ、ラベツズマブ、シビサタマブ、ゾルベツキシマブ、ラクノツズマブ（ｌａｃｎｏｔｕｚｕｍａｂ）、カビラリズマブ（ｃａｂｉｒａｌｉｚｕｍａｂ）、エマクツズマブ、ジムシルマブ、レンジルマブ、オチリマブ、マブリリムマブ、トレメリムマブ、ウロクプルマブ（ｕｌｏｃｕｐｌｕｍａｂ）、テポジタマブ（ｔｅｐｏｄｉｔａｍａｂ）、ロバルピツズマブ、デムシズマブ、ドロジツマブ、パルサツズマブ（ｐａｒｓａｔｕｚｕｍａｂ）、セツキシマブ、デパツキシズマブ、フツキシマブ（ｆｕｔｕｘｉｍａｂ）、イムガツズマブ、ラプリツキシマブ（ｌａｐｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、マツズマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、モドツキシマブ、アミバンタマブ、トムゾツキシマブ（ｔｏｍｕｚｏｔｕｘｉｍａｂ）、ロサツキシズマブ（ｌｏｓａｔｕｘｉｚｕｍａｂ）、アデカツムマブ、シタツズマブ（ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ）、エドレコロマブ、オポルツズマブ、ソリトマブ（ｓｏｌｉｔｏｍａｂ）、ツコツズマブ、カツマキソマブ、イファボツズマブ（ｉｆａｂｏｔｕｚｕｍａｂ）、ダリゴツズマブ、エルゲムツマブ（ｅｌｇｅｍｔｕｍａｂ）、ルムレツズマブ、パトリツマブ、セリバンツマブ、ゼノクツズマブ、アプルツマブ（ａｐｒｕｔｕｍａｂ）、ベマリツズマブ（ｂｅｍａｒｉｔｕｚｕｍａｂ）、バンチクツマブ、ジヌツキシマブ、エクロメキシマブ、ミツモマブ、コドリツズマブ（ｃｏｄｒｉｔｕｚｕｍａｂ）、グレンバツムマブ、ザツキシマブ（ｚａｔｕｘｉｍａｂ）、エルツマキソマブ（ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）、マルジェツキシマブ、チミグツズマブ（ｔｉｍｉｇｕｔｕｚｕｍａｂ）、ガンコタマブ、ペルツズマブ、トラスツズマブ、フィクラツズマブ、リロツムマブ、テリソツズマブ、エミベツズマブ（ｅｍｉｂｅｔｕｚｕｍａｂ）、シクスツムマブ、ダロツズマブ、フィギツムマブ、ガニツマブ、ロバツムマブ、テプロツムマブ、フロテツズマブ、ベルメキマブ、セルグツズマブ、ボロシキシマブ、エタラシズマブ、レラトリマブ、カルルマブ、アマツキシマブ、クリバツズマブ、ガチポツズマブ（ｇａｔｉｐｏｔｕｚｕｍａｂ）、ペムツモマブ、カンツズマブ、パンコマブ（ｐａｎｋｏｍａｂ）、ラコツモマブ（ｒａｃｏｔｕｍｏｍａｂ）、ブロンチクツズマブ、タレクスツマブ（ｔａｒｅｘｔｕｍａｂｍ）、ベセンクマブ、カムレリズマブ、セトレリマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、セミプリマブ、スパルタリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、シルムツズマブ（ｃｉｒｍｔｕｚｕｍａｂ）、テナツモマブ、フレソリムマブ、ブロルシズマブ、ベバシズマブ、ラニビズマブ、バリサクマブ（ｖａｒｉｓａｃｕｍａｂ）、ファリシマブ、イクルクマブ、アラシズマブ（ａｌａｃｉｚｕｍａｂ）、およびラムシルマブが挙げられるが、それらに限定されない。

一部の実施形態では、本開示のＬＩＬＲＢ１ベースの受容体は、ヘテロ接合性喪失を通してがん細胞において喪失している抗原に特異的な抗原結合性ドメインを含む。一部の実施形態では、抗原は、マイナー組織適合抗原（ＭｉＨＡ）である。一部の実施形態では、抗原はＨＬＡクラスＩ対立遺伝子である。一部の実施形態では、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃを含む。一部の実施形態では、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子はＨＬＡ－Ｅを含む。一部の実施形態では、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子はＨＬＡ－Ａ^＊０２対立遺伝子である。一部の実施形態では、抗原は、Ｙ染色体の喪失により標的細胞において発現していない。一部の実施形態では、ＬＩＬＲＢ１ベースの受容体に特異的な抗原は、ＨＬＡ－Ａ^＊０２抗原である。

一部の実施形態では、それを必要とする対象はがんを有する。がんは、異常な細胞が制御なしに分裂し、近くの組織へ伝播する疾患である。一部の実施形態では、がんは液性腫瘍または固形腫瘍を含む。例示的な液性腫瘍には、白血病およびリンパ腫が挙げられる。液性腫瘍であるさらなるがんは、例えば、血液、骨髄、およびリンパ節に起こるものであり得、それには、例えば、白血病、骨髄性白血病、リンパ性白血病、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、黒色腫、および多発性骨髄腫を挙げることができる。白血病には、例えば、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、およびヘアリー細胞白血病が挙げられる。例示的な固形腫瘍には肉腫および癌腫が挙げられる。がんは、身体において実質的に器官に生じ得、その器官には、血液、骨髄、肺、乳房、結腸、骨、中枢神経系、膵臓、前立腺、および卵巣が挙げられる。固形腫瘍であるさらなるがんには、例えば、前立腺がん、精巣がん、乳がん、脳がん、膵臓がん、結腸がん、甲状腺がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、カポジ肉腫、皮膚がん、扁平上皮皮膚がん、腎がん、頭頚部がん、咽頭がん、鼻、口、咽頭の湿性粘膜内層に形成する扁平上皮癌腫、膀胱がん、骨肉腫、子宮頚がん、子宮内膜がん、食道がん、肝臓がん、および腎臓がんが挙げられる。一部の実施形態では、本明細書に記載された方法により処置される状態は、黒色腫細胞、前立腺がん細胞、精巣がん細胞、乳がん細胞、脳がん細胞、膵臓がん細胞、結腸がん細胞、甲状腺がん細胞、胃がん細胞、肺がん細胞、卵巣がん細胞、カポジ肉腫細胞、皮膚がん細胞、腎がん細胞、頭部もしくは頚部がん細胞、咽頭がん細胞、扁平上皮癌腫細胞、膀胱がん細胞、骨肉腫細胞、子宮頚がん細胞、子宮内膜がん細胞、食道がん細胞、肝臓がん細胞、または腎臓がん細胞の転移である。

がん細胞の複数が第１のアクチベーターリガンドを発現し、かつ第２のインヒビターリガンドを発現しない任意のがんが、本開示の範囲内として構想される。例えば、本明細書に記載された方法を使用して処置することができるＣＥＡ陽性がんには、結腸直腸がん、膵臓がん、食道がん、胃がん、肺腺がん、頭頚部がん、びまん性大細胞型Ｂ細胞がん、または急性骨髄性白血病がんが挙げられる。

がんを処置することは、結果として、腫瘍のサイズの低下を生じ得る。腫瘍のサイズの低下はまた、「腫瘍退縮」とも呼ばれ得る。好ましくは、処置後、腫瘍サイズは、処置前のそれのサイズに対して５％以上、低下し、より好ましくは、腫瘍サイズは、１０％以上、低下し；より好ましくは、２０％以上、低下し；より好ましくは、３０％以上、低下し；より好ましくは、４０％以上、低下し；さらにより好ましくは、５０％以上、低下し；最も好ましくは、７５％以上より大きく、低下する。腫瘍のサイズは、任意の再現性のある測定手段により測定され得る。腫瘍のサイズは腫瘍の直径として測定され得る。

がんを処置することは、結果として、腫瘍体積の低下を生じ得る。好ましくは、処置後、腫瘍体積は、処置前のそのサイズに対して５％以上低下し；より好ましくは、腫瘍体積は、１０％以上、低下し；より好ましくは、２０％以上、低下し；より好ましくは、３０％以上、低下し；より好ましくは、４０％以上、低下し；さらにより好ましくは、５０％以上、低下し；最も好ましくは７５％以上より大きく、低下する。腫瘍体積は、任意の再現性のある測定手段により測定され得る。

がんを処置することは、結果として、腫瘍の数の減少を生じる。好ましくは、処置後、腫瘍数は、処置前の数に対して５％以上、低下し；より好ましくは、腫瘍数は、１０％以上、低下し；より好ましくは、２０％以上、低下し；より好ましくは、３０％以上、低下し；より好ましくは、４０％以上、低下し；さらにより好ましくは、５０％以上、低下し；最も好ましくは７５％より大きく、低下する。腫瘍の数は、任意の再現性のある測定手段により測定され得る。腫瘍の数は、肉眼でまたは特定の倍率で見える腫瘍を計数することにより、測定され得る。好ましくは、特定の倍率は、２×、３×、４×、５×、１０×、または５０×である。

がんを処置することは、結果として、原発腫瘍部位から遠い他の組織または臓器における転移病変の数の減少を生じ得る。好ましくは、処置後、転移病変の数は、処置前の数に対して５％以上低下し；より好ましくは、転移病変の数は、１０％以上、低下し；より好ましくは、２０％以上、低下し；より好ましくは、３０％以上、低下し；より好ましくは、４０％以上、低下し；さらにより好ましくは、５０％以上、低下し；最も好ましくは７５％より大きく、低下する。転移病変の数は、任意の再現性のある測定手段により測定され得る。転移病変の数は、肉眼でまたは特定の倍率で見える転移病変を計数することにより、測定され得る。好ましくは、特定の倍率は、２×、３×、４×、５×、１０×、または５０×である。

がんを処置することは、結果として、担体を単独で受けた集団と比較して、処置された対象の集団の平均生存時間の増加を生じ得る。好ましくは、平均生存時間は、３０日間より多く；より好ましくは、６０日間より多く；より好ましくは、９０日間より多く；最も好ましくは、１２０日間より多く増加する。集団の平均生存時間の増加は、任意の再現性のある手段により測定され得る。集団の平均生存時間の増加は、例えば、活性化合物での処置の開始後の平均の生存の長さを集団について計算することにより、測定され得る。集団の平均生存時間の増加はまた、例えば、活性化合物での処置の第１ラウンドの完了後の平均の生存の長さを集団について計算することにより、測定され得る。

がんを処置することは、結果として、処置されていない対象の集団と比較して、処置された対象の集団の平均生存時間の増加を生じ得る。好ましくは、平均生存時間は、３０日間より多く；より好ましくは、６０日間より多く；より好ましくは、９０日間より多く；最も好ましくは、１２０日間より多く増加する。集団の平均生存時間の増加は、任意の再現性のある手段により測定され得る。集団の平均生存時間の増加は、例えば、活性化合物での処置の開始後の平均の生存の長さを集団について計算することにより、測定され得る。集団の平均生存時間の増加はまた、例えば、活性化合物での処置の第１ラウンドの完了後の平均の生存の長さを集団について計算することにより、測定され得る。

がんを処置することは、結果として、本発明の化合物ではない薬物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、代謝産物、アナログ、もしくは誘導体での単剤治療を受けた集団と比較して、処置された対象の集団の平均生存時間の増加を生じ得る。好ましくは、平均生存時間は、３０日間より多く；より好ましくは、６０日間より多く；より好ましくは、９０日間より多く；最も好ましくは、１２０日間より多く増加する。集団の平均生存時間の増加は、任意の再現性のある手段により測定され得る。集団の平均生存時間の増加は、例えば、活性化合物での処置の開始後の平均の生存の長さを集団について計算することにより、測定され得る。集団の平均生存時間の増加はまた、例えば、活性化合物での処置の第１ラウンドの完了後の平均の生存の長さを集団について計算することにより、測定され得る。

がんを処置することは、結果として、担体を単独で受けた集団と比較して、処置された対象の集団の死亡率の減少を生じ得る。がんを処置することは、結果として、処置されていない集団と比較して、処置された対象の集団の死亡率の減少を生じ得る。がんを処置することは、結果として、本発明の化合物ではない薬物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、代謝産物、アナログ、もしくは誘導体での単剤治療を受けた集団と比較して、処置された対象の集団の死亡率の減少を生じ得る。好ましくは、死亡率は、２％より大きく；より好ましくは、５％より大きく；より好ましくは、１０％より大きく；最も好ましくは、２５％より大きく減少する。処置された対象の集団の死亡率の減少は、任意の再現性のある手段により測定され得る。集団の死亡率の減少は、例えば、活性化合物での処置の開始後の単位時間あたりの平均疾患関連死数を集団について計算することにより、測定され得る。集団の死亡率の減少はまた、例えば、活性化合物での処置の第１ラウンドの完了後の単位時間あたりの平均疾患関連死数を集団について計算することにより、測定され得る。

がんを処置することは、結果として、腫瘍成長速度の減少を生じ得る。好ましくは、処置後、腫瘍成長速度は、処置前の数に対して少なくとも５％低下し；より好ましくは、腫瘍成長速度は、少なくとも１０％低下し；より好ましくは、少なくとも２０％低下し；より好ましくは、少なくとも３０％低下し；より好ましくは、少なくとも４０％低下し；より好ましくは、少なくとも５０％低下し；さらにより好ましくは、少なくとも５０％低下し；最も好ましくは、少なくとも７５％低下する。腫瘍成長速度は、任意の再現性のある測定手段により測定され得る。腫瘍成長速度は、単位時間あたりの腫瘍直径の変化により、測定することができる。

がんを処置することは、結果として、腫瘍再成長の減少を生じ得る。好ましくは、処置後、腫瘍再成長は、５％未満であり；より好ましくは、腫瘍再成長は、１０％未満；より好ましくは、２０％未満；より好ましくは、３０％未満；より好ましくは、４０％未満；より好ましくは、５０％未満；さらにより好ましくは、５０％未満；最も好ましくは、７５％未満である。腫瘍再成長は、任意の再現性のある測定手段により測定され得る。腫瘍再成長は、例えば、処置後に生じた以前の腫瘍縮小後の腫瘍の直径の増加を測定することにより、測定される。腫瘍再成長の減少は、処置が停止した後に腫瘍が再発することができないことにより、示される。

細胞増殖性障害を処置または予防することは、結果として、細胞増殖の速度の低下を生じ得る。好ましくは、処置後、細胞増殖の速度は、少なくとも５％；より好ましくは、少なくとも１０％；より好ましくは、少なくとも２０％；より好ましくは、少なくとも３０％；より好ましくは、少なくとも４０％；より好ましくは、少なくとも５０％；さらにより好ましくは、少なくとも５０％；最も好ましくは、少なくとも７５％低下する。細胞増殖の速度は、任意の再現性のある測定手段により測定され得る。細胞増殖の速度は、例えば、単位時間あたりの組織試料における分裂細胞の数を測定することにより、測定される。

細胞増殖性障害を処置または予防することは、結果として、増殖細胞の割合の低下を生じ得る。好ましくは、処置後、増殖細胞の割合は、少なくとも５％；より好ましくは、少なくとも１０％；より好ましくは、少なくとも２０％；より好ましくは、少なくとも３０％；より好ましくは、少なくとも４０％；より好ましくは、少なくとも５０％；さらにより好ましくは、少なくとも５０％；最も好ましくは、少なくとも７５％低下する。増殖細胞の割合は、任意の再現性のある測定手段により測定され得る。好ましくは、増殖細胞の割合は、例えば、組織試料において非分裂細胞の数に対して分裂性細胞の数を定量化することにより、測定される。増殖細胞の割合は、分裂指数と等価であり得る。

細胞増殖性障害を処置または予防することは、結果として、細胞増殖のエリアまたはゾーンのサイズの減少を生じ得る。好ましくは、処置後、細胞増殖のエリアまたはゾーンのサイズは、処置前のそれのサイズに対して少なくとも５％低下し；より好ましくは、少なくとも１０％低下し；より好ましくは、少なくとも２０％低下し；より好ましくは、少なくとも３０％低下し；より好ましくは、少なくとも４０％低下し；より好ましくは、少なくとも５０％低下し；さらにより好ましくは、少なくとも５０％低下し；最も好ましくは、少なくとも７５％低下する。細胞増殖のエリアまたはゾーンのサイズは、任意の再現性のある測定手段により測定され得る。細胞増殖のエリアまたはゾーンのサイズは、細胞増殖のエリアまたはゾーンの直径または幅として測定され得る。

細胞増殖性障害を処置または予防することは、結果として、異常な外観または形態を有する細胞の数または割合の減少を生じ得る。好ましくは、処置後、異常な形態を有する細胞の数は、処置前のそれのサイズに対して少なくとも５％低下し；より好ましくは、少なくとも１０％低下し；より好ましくは、少なくとも２０％低下し；より好ましくは、少なくとも３０％低下し；より好ましくは、少なくとも４０％低下し；より好ましくは、少なくとも５０％低下し；さらにより好ましくは、少なくとも５０％低下し；最も好ましくは、少なくとも７５％低下する。異常な細胞外観または形態は、任意の再現性のある測定手段により測定され得る。異常な細胞形態は、例えば組織培養倒立顕微鏡を使用する、顕微鏡観察により、測定することができる。異常な細胞形態は、核多形性（ｐｌｅｉｏｍｏｒｐｈｉｓｍ）の形をとり得る。

キットおよび製造品
本開示は、本明細書に記載された受容体をコードするポリヌクレオチドおよびベクターを含むキットおよび製造品を提供する。一部の実施形態では、キットは、バイアル、シリンジ、および使用説明書などの品物を含む。

一部の実施形態では、キットは、本開示の１つまたは複数のキメラ抗原受容体をコードする配列を含むポリヌクレオチドまたはベクターを含む。例えば、ポリヌクレオチドまたはベクターは、本明細書に記載されている１つまたは複数のＬＩＬＲＢ１ドメインの配列を含む。

一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載されているキメラ抗原受容体を含む複数の免疫細胞を含む。一部の実施形態では、複数の免疫細胞は複数のＴ細胞を含む。

本記載は、多数の例示的な構成、方法、パラメーターなどを示している。しかしながら、そのような記載が、本開示の範囲への限定として意図されるのではなく、それよりむしろ、例示的な実施形態の記載として提供されることは認識されるべきである。

［実施例１］
ＰＤ－１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３と比較したＬＩＬＲＢ１ベースの阻害性ｓｃＦｖ－ＣＡＲ
ＮＹ－ＥＳＯ－１応答性の阻害性コンストラクトは、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー１、ＬＩＬＲＢ１（ＬＩＬＲＢ１）；キラー細胞免疫グロブリン様受容体３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ２；キラー細胞免疫グロブリン様受容体３ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ３；および／またはＢリンパ球およびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）のヒンジ、膜貫通領域、および／または細胞内ドメインを含む受容体のドメインに、ＮＹ－ＥＳＯ－１リガンド結合ｓｃＦｖドメイン（Ｃ－２６６）を融合させることによって作出した。遺伝子セグメントは、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅクローニングを使用して結合し、レンチウイルス発現プラスミド（ｐＬｅｎｔｉ１）中に含有されているｅＦ１αプロモーターの下流に挿入した。

レポーター細胞として、ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーターをコードしているＪｕｒｋａｔ細胞を、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、および０．４ｍｇ／ｍｌのＧ４１８／ジェネテシンを補充したＲＰＭＩ培地中に維持した。Ｔ２細胞（ＡＴＣＣ ＣＬＲ－１９９２）は、ＩＭＤＭ培地＋２０％ＦＢＳおよび１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ中に維持した。各コンストラクトを評価するために、製造会社のプロトコールに従い、以下の設定：３パルス、１５００Ｖ、１０ｍｓｅｃを使用して１００μＬフォーマットＮｅｏｎ電子穿孔システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によって、Ｊｕｒｋａｔ細胞にトランスフェクトした。

コトランスフェクションは、１００万細胞あたり３μｇの活性化ＣＡＲコンストラクト（Ｃ－５６３）またはＴＣＲコンストラクト（ＣＴ－１３９）および３μｇの不活性化ＣＡＲコンストラクトまたは空ベクター（ｐＬｅｎｔｉ０）のいずれかで行い、２０％熱不活性化ＦＢＳおよび０．１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＲＰＭＩ培地中で回復させた。

ＭＡＧＥ－Ａ３（ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ）（配列番号１０６）および改変ＮＹ－ＥＳＯ－１（ＳＬＬＭＷＩＴＱＶ）（配列番号１０７）というペプチドをＧｅｎｓｃｒｉｐｔによって合成した。活性化ペプチドであるＭＡＧＥ－Ａ３を、５０μＭから始めて、連続的に５倍希釈した。不活性化ペプチドであるＮＹ－ＥＳＯ－１を５０μＭ、５μＭ、０．５μＭ、または０．０５μＭに希釈し、これらの一定量をＭＡＧＥ－Ａ３の段階希釈に添加し、続いて、１％ＢＳＡおよび０．１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＲＰＭＩ１５μＬ中１０，０００個のＴ２細胞に積載し、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）３８４ウェルローフランジ白平底ポリスチレンＴＣ処理マイクロプレート中でインキュベートした。次の日に、１０，０００個のＪｕｒｋａｔ細胞を、１０％熱不活性化ＦＢＳおよび０．１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＲＰＭＩ１５μＬ中に再懸濁し、ペプチドが積載されているＴ２細胞に添加し、６時間共培養した。ＯＮＥ－Ｓｔｅｐルシフェラーゼアッセイシステム（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、Ｊｕｒｋａｔ発光を評価した。アッセイは、テクニカルデュプリケート（ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｄｕｐｌｉｃａｔｅｓ）で行った。

ＰＤ－１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３と比較したＬＩＬＲＢ１
図４は、表１に示すコンストラクトの試験を示す。データは、ｓｃＦｖ－ＬＩＬＲＢ１は、ＣＡＲ活性化をトランスで阻害することを示している。ＬＩＬＲＢ１ドメインを有するコンストラクトが、ＭＡＧＥ－Ａ３アクチベーターペプチドの高い方の濃度でシグナル伝達の阻害を示しているので、データは、ＬＩＬＲＢ１由来のヒンジ、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを有するＣＡＲは、ＰＤ－１、ＫＩＲ３ＤＬ２またはＫＩＲ３ＤＬ３由来の同じドメインで生成されているＣＡＲより優れていることを実証する。

ＬＩＬＲＢ１ベースのＣＡＲによる阻害は、そのリガンド結合ドメインによる抗原認識を必要とする
図５は、表１から選択されたコンストラクトの試験を示す。データは、ＬＩＬＲＢ１がトランスで用量依存的にシグナル伝達を阻害することを示している。阻害性ペプチドＮＹ－ＥＳＯ－１の濃度を増大させると、活性化ペプチドＭＡＧＥ－Ａ３に対する応答が下方にシフトする。これは、ＬＩＬＲＢ１ベースのＣＡＲの阻害効果が、リガンド結合ドメインが特異性を示す抗原のエンゲージメントに依存していることを示す。

ＬＩＬＲＢ１ ＣＡＲはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介してシグナル伝達を阻害する
図６は、表１から選択されたコンストラクト、詳細には、前の実験で使用されたＣＡＲではなく、活性化ペプチドＭＡＧＥ－Ａ３に特異的なＴＣＲの試験を示す。ＬＩＬＲＢ１ベースの阻害性ＣＡＲは、ＴＣＲ媒介シグナル伝達を用量依存的に阻害する。

ＬＩＲＬＢ１ ＣＡＲ阻害は、４つの天然のＩＴＩＭのうちの２つが存在する場合に保存される
図７は、ＬＩＬＲＢ１のＩＴＩＭモチーフに不活性化突然変異を有するＬＩＬＲＢ１細胞内ドメインの試験を示す。チロシンからフェニルアラニンへ（Ｙ→Ｆ）の突然変異を使用して、表２中で星が付いた数で示されるＩＴＩＭを不活性化した。

４つのＩＴＩＭすべての不活性化は、機能しない阻害性ＣＡＲをもたらした（Ｃ２１８２）。４つのＩＴＩＭのうちの２つのみの不活性化は、試験された濃度でＣＡＲのインヒビター機能を保存した（Ｃ１７６０およびＣ１７６２）。４つのＩＴＩＭすべての不活性化（Ｃ１７５９）は、ＩＴＩＭが阻害機能に必要であることを実証している。４つのＩＴＩＭすべてが突然変異している場合、分子は阻害機能を失う。４つのＩＴＩＭのうちの２つのみが突然変異している場合、阻害活性は保持される。

図８は、天然のＬＩＬＲＢ１細胞内ドメインのものとは異なる組合せでのＬＩＬＲＢ１ ＩＴＩＭの試験を示す。表３に示すように、ＬＩＬＲＢ１の３番目および４番目のＩＴＩＭを全部で４または６コピー有するＣＡＲは、天然のＬＩＬＲＢ１細胞内ドメインに匹敵する阻害活性を達成する。阻害活性は、３番目および４番目のＩＴＩＭがそれぞれ１コピーのみ使用されている（Ｃ２１７９）か、または２コピーの各ＩＴＩＭが使用されている（Ｃ２１８０）か、または複数コピーが使用されている（Ｃ２３０２またはＣ２１８０）場合にも観察される。

［実施例２］

ＬＩＬＲＢ１ヒンジおよび膜貫通ドメインは、ＢＴＬＡベースの阻害性ＣＡＲの阻害活性を増強する
ＢＴＬＡベースのＣＡＲおよびＬＩＬＲＢ１／ＢＴＬＡベースのＣＡＲは、ＮＦＡＴを介したシグナル伝達を阻害する
ＣＤ２７２（表面抗原分類２７２）とも知られているＢリンパ球およびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）は、Ｂ７相同性のＢ７Ｈ４と相互作用する。ＣＴＬＡ－４およびＰＤ－１とは異なり、それは、腫瘍壊死因子（受容体）スーパーファミリーメンバー１４（ＴＮＦＲＳＦ１４）のリガンドでもある。ＢＴＬＡを介した阻害性シグナル伝達が、Ｂ７Ｈ４またはＴＮＦＲＳＦ１４の結合に応じて起こる。

全長ＢＴＬＡタンパク質を、細胞外ｓｃＦｖドメインを有するコンストラクトにクローニングし（Ｃ２２２０）、表４および図９に示すように、ＢＴＬＡの細胞外ドメインをＬＩＬＲＢ１のもので置き換えたコンストラクト（Ｃ２２１９）、ならびにＢＴＬＡの細胞外（ｅｘｔｒａｃｅｌｌ７ｕｌａｒ）ドメインおよび膜貫通ドメインをＬＩＬＲＢ１のもので置き換えたコンストラクト（Ｃ２２１８）を生成し、試験した。ＬＩＬＲＢ１－ＢＴＬＡ融合体は、ＬＩＬＲＢ１ベースのＣＡＲに匹敵する阻害性シグナル伝達を示す。

［実施例３］

ＣＤ８またはＣＤ２８と比較したＬＩＬＲＢ１ヒンジおよび膜貫通
ＬＩＬＲＢ１ヒンジおよび膜貫通を有するＬＩＬＲＢ１ベースのＣＡＲは、ＣＤ８ヒンジおよびＣＤ２８膜貫通領域より優れている
表５および図１０に示すように、ＬＩＬＲＢ１ベースのＣＡＲを、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメインを有するが、ヒンジおよび膜貫通領域がＣＤ８ヒンジおよびＣＤ２８膜貫通領域であるＣＡＲと比較した。

ＬＩＬＲＢ１ヒンジおよび膜貫通領域は、ＣＤ８ヒンジおよびＣＤ２８膜貫通領域を有するコンストラクトより驚くほど優れた結果を生じる。Ｅｍｉｎが低減する。全体的なダイナミックレンジが増大する。阻害力が増大する。

［実施例４］

ＴＣＲベースの阻害性キメラ抗原受容体
コンストラクト設計およびクローニング
高親和性抗ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１／ＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４α９５：ＬＹ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）変異体を使用して、ＮＹ－ＥＳＯ－１応答性の阻害性コンストラクトを作出した。ＴＣＲα（Ｒ２５３およびＫ２５８）およびＴＣＲβ（Ｋ２８８）のＴＭ中の荷電残基をロイシンに突然変異させた。次いで、ＬＩＬＲＢ１ ＩＴＩＭ（残基４８４～６５０）を突然変異型ＴＣＲαまたはＴＣＲβに付け加えた。抗ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１／ＭＡＧＥ－Ａ３一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を社内で生成した。この研究で使用した抗ＨＬＡ－Ａ２＊０２：０１／ＭＡＧＥ－Ａ３キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、抗ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１／ＭＡＧＥ－Ａ３ ｓｃＦｖ、ＣＤ８ヒンジ、ＣＤ２８ ＴＭ、ならびにＣＤ２８、４１ＢＢ、およびＣＤ３ζの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）を含有する。５’および３’ＢｓｍＢＩ部位を含む、すべての断片は、Ｑ５ポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して増幅し、ＤｐｎＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で３７℃で６０分間消化した。生成したＰＣＲ断片は、ＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎゲルおよびＰＣＲ精製キット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を使用して精製した。ＢｓｍＢＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０ｍＭ ＡＴＰ、および１×ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有する反応液中でプラスミドをＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブルした。

Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化アッセイ
アクチベーターＴ細胞の核因子（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ）（ＮＦＡＴ）転写因子（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の制御下にホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するＪｕｒｋａｔ Ｔリンパ球を、Ｎｅｏｎトランスフェクションシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、ＴＣＲおよび／またはｓｃＦｖ融合コンストラクトをコードするプラスミドでコトランスフェクションした。電気穿孔された細胞を、５６℃で６０分間の熱不活性化を受けた２０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）（ＨＩＡ－ＦＢＳ）および０．１％ペニシリン（ｐｅｎｃｉｌｌｉｎ）－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ培地中でインキュベートした。様々な量の改変ＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチド（ＳＬＬＭＷＩＴＱＶ）（配列番号１０７）単独、ＭＡＧＥ－Ａ３ペプチド（ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ）（配列番号１０６）単独、または５０μＭ ＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチドに加えて様々な量のＭＡＧＥ－Ａ３ペプチドを含む１％ＢＳＡおよび０．１％Ｐ／Ｓ（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩで、ＴＡＰ欠損Ｔ２リンパ芽球（ＡＴＣＣ ＲＬ－１９９２）に積載した。アッセイにおいて使用されたペプチドは、質量分析（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）によるアセスメントで＞９５％の純度に合成した。トランスフェクションの１８時間後に、１０％ＨＩＡ－ＦＢＳおよび１％Ｐ／Ｓを補充したＲＰＭＩ中に、１ｍｌあたり０．８×１０^６細胞でＪｕｒｋａｔを再懸濁した。３８４ウェルプレート中で、１ウェルあたり１２０００個のＪｕｒｋａｔを、ペプチドが積載されている１２０００個のＴ２と３７℃、５％ＣＯ_２で６時間共培養した。１５μＬのＯＮＥ－Ｓｔｅｐルシフェラーゼアッセイ試薬（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を添加することによって、ＮＦＡＴ媒介ルシフェラーゼ産生を測定した。２０分後に、プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）を使用して、発光を検出した。

ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメインを使用するＴＣＲベースの阻害性ＣＡＲ
表７および図１１に示すように、ＴＣＲの細胞外ドメインのみを有するか、または極性残基への突然変異を有するＴＣＲの膜貫通領域も有するＴＣＲベースのＣＡＲの同時発現は、機能的な阻害性ＣＡＲを生ずる。

ＴＣＲベースＣＡＲは、抗ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ＭＡＧＥ－Ａ３ ＣＡＲをトランスで阻害する。Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター細胞は、（１）抗ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１／ＭＡＧＥ－Ａ３ ＣＡＲ（Ｃ５６３）単独でトランスフェクションされたか、（２）ＭＡＧＥ－Ａ３ ＣＡＲ（Ｃ５６３）ならびにＴＣＲα（Ｒ２５３Ｌ／Ｋ２５８Ｌ）－ＬＩＬＲＢ１融合およびＴＣＲβ（Ｋ２８８Ｌ）－ＬＩＬＲＢ１ ＩＣＤ融合ＴＣＲ阻害性融合コンストラクト（Ｃ２１５６＋Ｃ２１５７）でコトランスフェクションされたか、または（３）ＭＡＧＥ－Ａ３ ＣＡＲおよびＴＣＲαＥＣＤ／ＴＣＲβＥＣＤ－ＬＩＲＴ１（ＴＭ＋ＩＣＤ）融合（Ｃ２０５７＋Ｃ２０５８）ＴＣＲ阻害性融合コンストラクトでコトランスフェクションされた。トランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞を、様々な量のＭＡＧＥ－Ａ３ペプチドと組み合わせた５０μＭ ＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチドが積載されているＴ２細胞と共培養することによって、ＮＦＡＴ活性化に対する２つの阻害性変異体の効果を測定した。データを表８にまとめる。

短縮型ＴＣＲアルファまたはＴＣＲベータ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、ＬＩＬＲＢ１ ＴＭ－ＩＣＤ融合体と、ＣＡＲ活性化を阻害する。ＴＣＲ膜貫通突然変異がＴＣＲ－ＣＤ３サブユニット相互作用を消失させる場合、ＴＣＲアルファまたはＴＣＲベータ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、ＴＣＲ ＴＭ－ＬＩＬＲＢ１ ＩＣＤ融合体と共に、インヒビターＣＡＲとしても作用した。実験は、ＣＤ３サブユニットによって刺激性因子の動員に干渉することによって阻害性キメラ抗原受容体を生成するのに、ＴＣＲα鎖およびβ鎖を使用することができることを実証している。
［実施例５］

実施例６～１４のための方法
細胞培養
ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーターをコードしているＪｕｒｋａｔ細胞は、ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから得た。この研究で使用されたすべての他の細胞系は、ＡＴＣＣから得た。培養中、Ｊｕｒｋａｔ細胞は、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、および０．４ｍｇ／ｍｌのＧ４１８／ジェネテシンを補充したＲＰＭＩ培地で維持した。Ｔ２、ＭＣＦ７、Ｒａｊｉ、Ｋ５６２、およびＨｅＬａ細胞は、ＡＴＣＣによって提案されているように維持した。「正常な」Ｒａｊｉ細胞は、ＭＯＩ５のＨＬＡ－Ａ＊０２レンチウイルス（カスタムメイドのレンチウイルス、Ａｌｓｔｅｍ）でＲａｊｉ細胞に形質導入することによって作製した。ＨＬＡ－Ａ＊０２陽性Ｒａｊｉ細胞は、ＦＡＣＳＭｅｌｏｄｙ細胞選別機（ＢＤ）を使用してソーティングした。

プラスミド構築
白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー１、ＬＩＬＲＢ１（ＬＩＲ－１）、プログラム細胞死タンパク質１、ＰＤＣＤ１（ＰＤ－１）、または細胞傷害性Ｔリンパ球タンパク質４、ＣＴＬＡ４（ＣＴＬＡ－４）のヒンジ、膜貫通領域、および／または細胞内ドメインを含む受容体のドメインにＮＹ－ＥＳＯ－１ ｓｃＦｖ ＬＢＤを融合させることによって、ＮＹ－ＥＳＯ－１応答性の阻害性コンストラクトを作出した。すべての活性化ＣＡＲコンストラクトは、ＣＤ８αヒンジ、ＣＤ２８ ＴＭ、ならびにＣＤ２８、４－１ＢＢ、およびＣＤ３ゼータのＩＣＤに融合したｓｃＦｖを含有した。ＣＤ１９活性化ＣＡＲ ｓｃＦｖは、ＦＭＣ６３マウスハイブリドーマから得た。ＭＳＬＮ活性化ＣＡＲ ｓｃＦｖは、記載されているヒトＭ５（ＬＢＤ１）およびヒト化ＳＳ１（ＬＢＤ２）から得た。遺伝子セグメントは、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅクローニングを使用して結合し、レンチウイルス発現プラスミドに含有されていたヒトＥＦ１αプロモーターの下流に挿入した。

Ｊｕｒｋａｔ細胞トランスフェクション
製造会社のプロトコールに従い、以下の設定：３パルス、１５００Ｖ、１０ｍｓｅｃを使用して１００μＬフォーマットＮｅｏｎ電子穿孔システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって、Ｊｕｒｋａｔ細胞を一過性にトランスフェクトした。１ｅ６細胞あたり１～３μｇのアクチベーターＣＡＲまたはＴＣＲコンストラクトおよび１～３μｇのｓｃＦｖもしくはＴＣＲアルファ／ＴＣＲベータＬＩＲ－１ブロッカーコンストラクトまたは空ベクターでコトランスフェクションを行い、２０％熱不活性化ＦＢＳおよび０．１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＲＰＭＩ培地中で回復させた。ブロッカーの表面発現を確認するため、トランスフェクションの１８～２４時間後に、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中、４℃で６０分間、１０μｇ／ｍＬストレプトアビジン－ＰＥ－ＨＬＡ－Ａ＊０２－ｐＭＨＣ四量体でＪｕｒｋａｔ細胞を染色し、フローサイトメトリー（ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ）で特徴づけた。

Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼ活性化研究
ＭＡＧＥ－Ａ３（ＭＰ１；ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ；配列番号１０６）、ＭＡＧＥ－Ａ３（ＭＰ２；ＭＰＫＶＡＥＬＶＨＦＬ；配列番号１０８）、ＨＰＶ Ｅ６（ＴＩＨＤＩＩＬＥＣＶ；配列番号１０９）、ＨＰＶ Ｅ７（ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ；配列番号１１０）ペプチドおよび改変ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＥＳＯ（ＥＳＯ；ＳＬＬＭＷＩＴＱＶ；配列番号１０７）は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔによって合成した。活性化ペプチドは、５０μＭから始めて、段階希釈した。ブロッカーペプチドであるＮＹ－ＥＳＯ－１は、５０μＭ（特に明記しない限り）に希釈し、これを、活性化ペプチドの段階希釈液に添加し続いて、１％ＢＳＡおよび０．１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＲＰＭＩ１５μＬ中の１ｅ４個のＴ２細胞に積載し、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）３８４ウェルローフランジ白平底ポリスチレンＴＣ処理マイクロプレート中でインキュベートした。次の日に、１ｅ４個のＪｕｒｋａｔ細胞を、１０％熱不活性化ＦＢＳおよび０．１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＲＰＭＩ１５μＬ中に再懸濁し、ペプチドが積載されているＴ２細胞に添加し、６時間共培養した。ＯＮＥ－Ｓｔｅｐルシフェラーゼアッセイシステム（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、Ｊｕｒｋａｔ発光を評価した。高密度標的を含むアッセイには、Ｊｕｒｋａｔ細胞を同様にトランスフェクションし、標的抗原を発現する腫瘍細胞と、様々なＪｕｒｋａｔ：腫瘍細胞比で共培養した。アッセイは、テクニカルデュプリケートで行った。

初代Ｔ細胞の形質導入、増殖、および濃縮
ロイコパック（Ｌｅｕｋｏｐａｋ）は、ＡｌｌＣｅｌｌｓ（登録商標）から購入した。収集プロトコールおよびドナーインフォームドコンセントは、厳格な監督の下、施設内倫理委員会（ＩＲＢ）の承認を得た。ＨＩＰＡＡ遵守および承認されたプロトコールにも従った。凍ったＰＢＭＣを３７℃の水浴で解凍し、１％ヒト血清を含むＬｙｍｐｈｏＯＮＥ（Ｔａｋａｒａ）中で１ｅ６細胞／ｍＬで培養し、ＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ－２１（１０ｎｇ／ｍｌ）を補充した１：１００のＴ細胞ＴｒａｎｓＡｃｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して活性化した。２４時間後に、ＭＯＩ＝５でレンチウイルスをＰＢＭＣに添加した。アクチベーターおよびブロッカー受容体は、各レンチウイルについてＭＯＩ＝５で同時に同時導入した。ＰＢＭＣをさらに２～３日間培養して、細胞がＴｒａｎｓＡｃｔ刺激の下で増殖するのを可能にした。増殖後、製造会社の指示に従って抗ＰＥミクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用した陽性選択によって、形質導入されたアクチベーターおよびブロッカー初代Ｔ細胞からブロッカー陽性Ｔ細胞を濃縮した。簡潔には、初代Ｔ細胞を１０μｇ／ｍＬストレプトアビジン－ＰＥ－ＨＬＡ－Ａ＊０２－ｐＭＨＣ四量体と、ＭＡＣＳ緩衝液（０．５％ＢＳＡ＋２ｍＭ ＥＤＴＡのＰＢＳ溶液）中、４℃で６０分間インキュベートした。細胞をＭＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を通過させて、アクチベーターのみの非形質導入細胞からブロッカー陽性細胞（ブロッカーのみの細胞とアクチベーター＋ブロッカー細胞の混合物）を分離した。

初代Ｔ細胞インビトロ細胞傷害性研究
ｐＭＨＣ標的を用いた細胞傷害性研究には、濃縮した初代Ｔ細胞を、上述のように３：１のエフェクター：標的比で標的ペプチドの滴定が積載されている、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｂｉｏｓｅｔｔｉａ）を発現する２ｅ３個のＭＣＦ７細胞と４８時間インキュベートした。ウミシイタケルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、生きてルシフェラーゼを発現しているＭＣＦ７細胞を定量化した。非ｐＭＨＣ標的を用いた細胞傷害性研究には、濃縮した初代Ｔ細胞を２ｅ３個のＷＴ Ｒａｊｉ細胞（「腫瘍」細胞）またはＨＬＡ－Ａ＊０２を形質導入したＲａｊｉ細胞（「正常」細胞）と３：１のエフェクター：標的比で最長６日間インキュベートした。ＧＦＰおよびウミシイタケルシフェラーゼ（Ｂｉｏｓｅｔｔｉａ）を安定的に発現するＷＴ「腫瘍」Ｒａｊｉ細胞またはＲＦＰおよびホタルルシフェラーゼ（Ｂｉｏｓｅｔｔｉａ）を安定的に発現するＨＬＡ－Ａ＊０２形質導入「正常」Ｒａｊｉ細胞を無標識の初代Ｔ細胞と共に、ＩｎｃｕＣｙｔｅ生細胞イメージャーを使用して画像化した。生きているＲａｊｉ細胞の経時的な蛍光強度をＩｎｃｕＣｙｔｅイメージングソフトウェアを使用して定量化した。可逆性研究には、濃縮した初代Ｔ細を、「正常」または「腫瘍」Ｒａｊｉ細胞と３日間同様に共培養し、画像化した。３日後に、ＣＤ１９陰性選択を使用して、Ｔ細胞を残りのＲａｊｉ細胞から分離し、記載のように、新しい「正常」または「腫瘍」Ｒａｊｉ細胞と共に再播種した。別々のウェルで、７２時間目に、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、生きているルシフェラーゼ発現Ｒａｊｉ細胞を定量化した。ＩＦＮγ分泌がアセスメントされた研究には、４８時間の共培養の後に収集された上清をＩＦＮγについて、製造会社の厳密な指示に従ってＢＤヒトＩＦＮγ Ｆｌｅｘキットを使用して試験した。

マウス異種移植研究
凍ったＰＢＭＣは、３７℃の水浴中で解凍し、活性化の前に、無血清ＴｅｘＭＡＣＳ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）中で終夜休ませた。Ｔ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）ならびにＩＬ－１５（２０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ－２１（２０ｎｇ／ｍｌ）を補充したＴｅｘＭＡＣＳ培地を使用して、ＰＢＭＣを１．５ｅ６細胞／ｍＬで活性化した。２４時間後に、ＭＯＩ５でレンチウイルスをＰＢＭＣに添加した。ＰＢＭＣをさらに８～９日間培養して、細胞がＴｒａｎｓＡｃｔ刺激下で増殖するのを可能にした。増殖後、インビボ注射前にさらに２～５日間、ストレプトアビジン－ＰＥ－ＨＬＡ－Ａ＊０２－ｐＭＨＣに対する抗ＰＥミクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、Ｔ細胞をＡ２－ＬＩＲ－１について濃縮した。濃縮したＴ細胞は、アクチベーター用のＣＤ１９－Ｆｃ（１：１００；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびヤギ抗ヒトＩｇＧＦＩＴＣ（１：２００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ならびにブロッカー用の１０μｇ／ｍＬストレプトアビジン－ＡＰＣ－ＨＬＡ－Ａ＊０２－ｐＭＨＣによる逐次染色によるフローサイトメトリー（ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ）によって、ＣＤ１９ ｓｃＦｖアクチベーターおよびＨＬＡ－Ａ＊０２ ＬＩＲ－１ブロッカーの発現についても検証した。

インビボ実験は、施設内動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）承認のプロトコールを使用してＥｘｐｌｏｒａ ＢｉｏＬａｂｓが行った。５～６週齢の雌性ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ Ｔｇ．（ＨＬＡ－Ａ／Ｈ２－Ｄ／Ｂ２Ｍ）１Ｄｖｓ／ＳｚＪ（ＮＳＧ－ＨＬＡ－Ａ２／ＨＨＤ）マウスをＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓから購入した。動物は、研究開始の前に、少なくとも３日間、飼育環境に順化させた。動物に、２ｅ６個のＷＴ Ｒａｊｉ細胞またはＨＬＡ－Ａ＊０２形質導入Ｒａｊｉ細胞を１００μＬ体積で右側腹部に皮下注射した。腫瘍が平均７０ｍｍ^３（Ｖ＝Ｌ×Ｗ×Ｗ／２）に達したとき、動物を５群（ｎ＝７）にランダム化し、２ｅ６または１ｅ７個のＴ細胞を尾静脈を介して投与した。Ｔ細胞注射後、腫瘍測定を１週に３回行い、１０日目および１７日目にフロー分析用に血液を収集した。１ｅ７個のＣＤ１９－ＣＡＲ＋Ａ２－ＬＩＲ－１ Ｔ細胞の投与を受けたＷＴ Ｒａｊｉ群の１頭の動物が、尾静脈注射失敗およびそれに続く血液中のヒトＴ細胞の欠如のフローサイトメトリー確認のため研究から除外された。各時点に、ＲＢＣ溶解後、血液中のヒトＴ細胞をフローサイトメトリー（ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ）によって定量化した。細胞を抗マウスＣＤ４５－ＦＩＴＣ（クローン３０－Ｆ１１）、抗ヒトＣＤ３－ＰＥ（クローンＳＫ７）、抗ヒトＣＤ４－ＡＰＣ（クローンＯＫＴ４）、および抗ヒトＣＤ８－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（クローンＲＰＡ－Ｔ８）で染色した。すべての抗体はＢｉｏｌｅｇｅｎｄから入手し、１：１００希釈で使用した。ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、死んだ細胞を解析から除外した。組織病理学的分析には、腫瘍サンプルを固定し、薄片にし、ｈｕＣＤ３（クローンＥＰ４４９Ｅ）について染色した。イメージ定量化は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して行った。

統計解析
統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して行った。特に明記しない限り、すべてのペプチドおよび細胞滴定研究は、平均±標準偏差（ＳＤ）で示されており、一方、初代Ｔ細胞を使用したインビトロおよびインビボ研究は、平均±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）で示されている。ペプチドおよび細胞滴定曲線は、４パラメータ非線形回帰分析法を使用してフィットさせた。ＥＣ５０値は、曲線から直接的に計算した。データのすべての他の群は、特に明記しない限り、通常の２元配置分散分析およびそれに続くＴｕｋｅｙの多重比較検定を使用して分析した。
［実施例６］

活性の遮断に対するＬＩＲ－１ヒンジの効果をアッセイする
ＫＲＡＳ ＴＣＲアクチベーターを発現するＪｕｒｋａｔ細胞による殺滅を遮断するＨＬＡ－Ａ＊０２ ｓｃＦｖ ＬＩＲ－１阻害性受容体の能力に対する様々なＬＩＲ－１ヒンジの効果を、上記のＪｕｒｋａｔ ＮＦａｔルシフェラーゼアッセイを使用してアッセイした。より短いＬＩＲ－１ヒンジを有するヒト化ＰＡ２．１ ｓｃＦｖ ＬＩＲ－１受容体およびヒト化ＢＢ７．２ ｓｃＦｖ ＬＩＲ－１を、前述のとおり、Ｊｕｒｋａｔ細胞でアッセイした。結果を図１２Ａ～１２Ｂに示す。ＫＲＡＳ ＴＣＲアクチベーター受容体および／または様々なＬＩＲ－１由来のヒンジを有するＨＬＡ－Ａ＊０２ ｓｃＦｖ ＬＩＲ－１阻害性受容体（ヒト化ＰＡ２．１またはヒト化ＢＢ７．２）でＪｕｒｋａｔ細胞をトランスフェクトし、ＨＬＡ：Ａ１１陽性、またはＨＡ：Ａ１１およびＨＬＡ：Ａ０２陽性だったＴ２標的細胞と共培養した。より短いヒンジおよびより長いヒンジを有する阻害性受容体は、同様に挙動した（図１２Ａ～１２Ｂ）。マウスＰＡ２．１ ｓｃＦｖおよびわずかにより長いヒンジを有する阻害性受容体も、アッセイされ、Ｔ２－Ｊｕｒｋａｔアッセイで、より短いＬＩＲ－１ヒンジと同様に機能した（図１３Ａ～１３Ｂ）。ヒンジ配列は、図１２Ｂおよび図１３Ｂに黒で示されており、図１３Ｂの配列中の灰色のＳＳは、抗原結合性ドメインとヒンジの間のリンカーを表し、灰色のＶＩＧＩＬは、ＬＩＲ－１膜貫通ドメインの開始を表す。阻害性受容体のヒンジ、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインはすべてＬＩＲ－１に由来した。図１２Ａ～１２Ｂおよび１３Ａ～１３Ｂは、ＬＩＲ－１阻害性受容体を負の影響を与えることなく、ＬＩＲ－１ヒンジ長を変化させることができることを示している。より短いヒンジは、ＬＩＲ－１阻害性受容体をコードしている核酸配列を送達用にレンチウイルスベクターにパッケージングするときに利点を提供することができる。

［実施例７］

ＬＩＲ－１、ＣＴＬＡ－４、およびＰＤ－１阻害性受容体の比較
白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー１、ＬＩＬＲＢ１（ＬＩＲ－１）、プログラム細胞死タンパク質１、ＰＤＣＤ１（ＰＤ－１）、または細胞傷害性Ｔリンパ球タンパク質４、ＣＴＬＡ４（ＣＴＬＡ－４）のヒンジ、膜貫通領域、および／または細胞内ドメインを含む受容体のドメインにＮＹ－ＥＳＯ－１ ｓｃＦｖ ＬＢＤを融合させることによって、ＮＹ－ＥＳＯ－１応答性の阻害性コンストラクトを作出した。ＭＡＧＥ－Ａ３活性化ＣＡＲコンストラクトは、ＣＤ８αヒンジ、ＣＤ２８ ＴＭ、ならびにＣＤ２８、４－１ＢＢ、およびＣＤ３ゼータの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）に融合したｓｃＦｖを含有した。遺伝子セグメントは、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅクローニングを使用して結合し、レンチウイルス発現プラスミドに含有されていたヒトＥＦ１αプロモーターの下流に挿入した。

アクチベーターおよびブロッカー受容体両方のためのペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）がシステムの薬理学の好都合な定量化を可能にするので、最初に、ｐＭＨＣ標的を使用した（図１４Ａ）。具体的には、ＨＬＡ－Ａ＊０２－ＮＹ－ＥＳＯ－１（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ／Ｖ）に結合する一本鎖断片可変（ｓｃＦｖ）をインヒビター受容体リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）として使用し、ＨＬＡ－Ａ＊０２－ＭＡＧＥ－Ａ３（ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ）ｐＭＨＣ（Ｇａｌｌｏ、未発表）に対する第２のｓｃＦｖをアクチベーター受容体第三世代ＣＡＲの一部として使用した。ＮＦＡＴ活性化の際にルシフェラーゼを発現するＪｕｒｋａｔエフェクター細胞を、アクチベーター感受性を読み取るのに使用し、ＥＣ５０値は、応答に必要である最大半量アクチベーターペプチド濃度を報告する。ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４の両細胞内ドメイン（ＩＣＤ）は、刺激としてＴ２細胞上に積載されているペプチドの滴定による測定で、約１０×より少ないＪｕｒｋａｔ細胞で、活性化のＥＣ５０のシフトを媒介した（図１４Ｂ）。

様々な潜在的インヒビター（ブロッカー）受容体コンストラクトをスクリーニングし、ＬＩＲ－１ブロッカーコンストラクト（ｔｈｅ ＬＩＲ－１ ｂｌｏｃｋｅｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ）が、ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４より強いブロッキング特性を有することを発見した。このブロッカー受容体は、ヒトゲノムによってコードされているいくつかのＬＩＲ－ファミリー分子のうちの１つであるＬＩＲ－１（ＬＩＬＲＢ１）受容体の細胞内ドメイン、膜貫通（ＴＭ）ドメイン、およびヒンジドメインを含む。ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＬＢＤに融合したＬＩＲ－１ブロッカー（以降ＬＩＲ－１と称する）は、＞５，０００×のＥＣ５０シフトを媒介した（図１４Ｂ、図１７Ａ～１７Ｄ）。対照である無関係なＨＬＡ－Ａ＊０２結合ペプチドの滴定は、利用可能なＨＬＡ分子についての、Ｔ２細胞上での、積載されているペプチドの競合によって引き起こされるシフトの推定を提供し、完全なシフトへの貢献は、典型的には約１０×未満と推定された（図１５）。ここで報告されているＥＣ５０シフト値について、比較は、典型的には、アクチベーターのみのコンストラクトのＥＣ５０との比較であった。さらに、アクチベーター／ブロッカー受容体の所与の対について、阻害の滴定の中間点は、ほぼ一定であり、遮断ペプチドに対する活性化ペプチドの比に依存し、おそらく標的－抗原比と直接的に相関していた（図１６Ａ～１６Ｄ）。これらの実験の大部分で探索された標的濃度は、約１，０００～１０，０００コピー／細胞の範囲にあると推定される。
［実施例８］

複数のｓｃＦｖリガンド結合ドメインを有するＬＩＲ－１阻害性受容体
ＬＩＲ－１阻害性受容体の活性を、他のｐＭＨＣ標的に特異的な様々な抗原結合性ドメインで試験した。４種の異なるｐＭＨＣ標的について、ＬＩＲ－１上に移植された合計６種の異なるｓｃＦｖは、１０から１，０００×にわたる、ＥＣ５０の劇的なシフトを媒介した（図１４Ｃ）。アクチベーター受容体とのその相互作用に関して、ＬＩＲ－１受容体は、頑健でもあり、そのブロッキング挙動は、複数の標的およびｓｃＦｖに適用可能だった（図１４Ｄ）。遮断は、リガンド依存的だった（図１７Ａ）が、多くのＬＩＲ－１コンストラクトは、特異的なアクチベーター受容体と対になった場合、より低い基底／緊張性シグナル伝達を生成した。ＩＣＤを完全に失っていているか、またはＩＣＤの重要な要素に突然変異を含有するＬＩＲ－１コンストラクトは、効果がなかったので、ＥＣ５０シフトは、融合したＩＣＤの存在に依存していた（図１７Ｂ）。しかし、リガンド非依存性のブロッカー活性は、リガンド不在の活性化ＥＣ５０にほとんど効果がなかった（図１６Ａ～１６Ｄ）。ＬＩＲ－１阻害性受容体は、複数の標的および抗原結合性ドメインにわたって機能するモジュラーかつ適応性のあるリガンド依存性のシステムである。
［実施例９］

ＴＣＲアルファおよびＴＣＲベータに融合したＬＩＲ－１阻害性ドメイン
ＴＣＲアルファおよびＴＣＲベータサブユニットに融合した場合、またはＴＣＲアクチベーター受容体と組み合わせた場合におけるＬＩＲ－１阻害性受容体を試験した。ＴＣＲは、ＭＡＧＥ－Ａ３由来の２種およびＨＰＶ由来の１種である３種の異なるｐＭＨＣ標的に対して指示した（上記方法を参照）。いずれの場合でも、ＬＩＲ－１は、活性化ＥＣ５０を大きくシフトさせ、＞１，０００×の範囲に及ぶと推定された（図１４Ｅ；図１９Ａ）。さらに、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ ＬＢＤも、ＬＩＲ－１と融合した場合、実質的なＥＣ５０シフトを生成した（図１４Ｆ；図１９Ｂ）。実際、ＮＹ－ＥＳＯ－１（ＳＬＬＭＷＩＴＱＶ）ｓｃＦｖまたはＴＣＲと、ＭＡＧＥ－Ａ３（ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ）ＣＡＲまたはＴＣＲのすべての組合せは、大きなシフトを示した。したがって、ＬＩＲ－１阻害性受容体は、ＣＡＲおよびＴＣＲを包含したモジュラリティーを示した。
［実施例１０］

ＬＩＲ－１阻害性受容体は、アクチベーター受容体標的抗原にシスで存在する標的抗原に応答する
アクチベーターおよびインヒビター標的がシスで提示された場合における、アクチベーター受容体による活性化を阻害するＬＩＲ－１ブロッカー受容体の能力をアッセイした。第１のアッセイでは、標的が積載されているおおよそ細胞のサイズ（直径約２．８μｍ）のビーズからなる簡略化された刺激を使用した。アクチベーターおよびブロッカー受容体を発現しているＪｕｒｋａｔ細胞は、Ａ（アクチベーター）標的を含有したビーズのみによって活性化され、二重Ａ／Ｂ（アクチベーター／ブロッカー）標的によるビーズによっては活性化されなかった（図１８Ａ）。興味深いことに、エフェクター細胞は、Ａ＋ビーズが全体のわずか２０％を占めた場合でさえ、Ａ＋ビーズとＢ＋ビーズの混合物によって活性化された。これは、アクチベーターおよびブロッカー受容体を発現している細胞は、（ｉ）標的が同じ表面にシスで存在する場合に、ブロッカー受容体によって活性化から遮断され、（ｉｉ）過剰のＢ＋ビーズの中にある個々のＡ＋ビーズによって活性化されることを実証した。
［実施例１１］

ＬＩＲ－１阻害性受容体および細胞表面抗原
１００，０００エピトープ／細胞の領域に伸長することができる表面抗原を表す、非ｐＭＨＣ標的に応答して活性化を遮断するＬＩＲ－１インヒビター受容体の能力をアッセイした。Ｂ細胞マーカーＣＤ１９、固形腫瘍抗原メソテリン（ＭＳＬＮ）、またはＨＬＡ－Ａ＊０２のいずれかにペプチド依存的に結合するｓｃＦｖを試験した。これらの場合に、標的抗原濃度は、ｐＭＨＣの場合のように、外因性ペプチドの場合のように、制御されなかった。代わりに、一時的なトランスフェクションアッセイに様々なＤＮＡ濃度を使用して、ブロッカー発現に対するアクチベーターの比率を変化させた。アッセイ感度により全範囲のＥＣ５０シフトの探索はできなかったが、１０×超のＥｍａｘのシフトが観察された。これらの実験は、二重受容体システムにおけるＬＩＲ－１受容体の特性が、高密度標的について、一般に同じだった（図１８Ｂ；図１６～１６Ｄ、図２１Ａ）こと、およびブロッカー受容体が、エフェクター細胞上のその相対的な表面レベルによって反映される程度に、Ａ受容体の活性化を遮断した（図１８Ｃ）ことを示した。ＬＩＲ－１受容体は、この高抗原密度設定で、モジュラー式の挙動も示した。ＨＬＡ－Ａ＊０２に対するｓｃＦｖは、アクチベーターまたはブロッカー受容体に融合したとき、それぞれ、アクチベーター（図１８Ｄ）またはブロッカーとして作用した。ＬＩＲ－１受容体は、低標的密度および高標的密度を収容するのに十分に柔軟であり、これにより、原則として、ｐＭＨＣ標的および非ｐＭＨＣ表面抗原についての最適化が可能となっている。
［実施例１２］

初代Ｔ細胞中のＬＩＲ－１阻害性受容体
初代Ｔ細胞の活性化を遮断するＬＩＲ－１受容体の能力をアッセイした。ｐＭＨＣ標的を最初に使用した。物理的な選択を介して、形質導入Ｔ細胞を濃縮した後、生細胞の読み出し情報としてルシフェラーゼを発現するように操作されている標的細胞を使用して、アクチベーターおよびブロッカー受容体を発現している操作されたＴ細胞をアッセイした。ＨＰＶ ＴＣＲをアクチベーターとした場合、ＬＩＲ－１に融合したＮＹ－ＥＳＯ－１ ｓｃＦｖは、ペプチドが積載されているＭＣＦ７腫瘍細胞において、細胞数対ペプチド濃度曲線を約２５×シフトした（図２０Ａ；図２３）。したがって、Ｊｕｒｋａｔ細胞活性化アッセイで実証されたＬＩＲ－１受容体の挙動は、細胞傷害性を含めた、初代Ｔ細胞機能に拡張された。

概念実証を確立するため、ＨＬＡ－Ａ＊０２ ＬＩＲ－１コンストラクトは、Ｔ２標的細胞と共に、Ｊｕｒｋａｔ細胞で、ｐＭＨＣ依存的なアクチベーターの存在下でブロッカーとして機能することが示された（図２０Ｂ）。アクチベーターには、ＣＤ１９ ｓｃＦｖをＣＡＲとして使用した。このアクチベーター／ブロッカー対は、一緒に、Ｊｕｒｋａｔ細胞で以前に試験された他の対と同じくらい頑健に機能することが示された（図１８Ｂ）。ＬＩＲ－１受容体リガンドを差次的に発現する腫瘍細胞をモデル化するには、ＣＤ１９陽性ＨＬＡ－Ａ＊０２陰性Ｒａｊｉ細胞を使用した。対応する正常細胞をモデル化するには、ＨＬＡ－Ａ＊０２遺伝子を安定的に発現している同じ細胞系を使用した（図２４Ａ）。標的細胞がＣＤ１９のみを発現した場合、細胞系は、Ｊｕｒｋａｔ細胞を活性化したが、それらがＣＤ１９およびＨＬＡ－Ａ＊０２の両方を発現した場合には活性化しなかった；すなわち、ＨＬＡ－Ａ＊０２ブロッカー受容体は、リガンド依存的にＣＤ１９－ＣＡＲによる活性化を遮断した（図２４Ｂ）。

ＣＤ１９／ＨＬＡ－Ａ＊０２受容体対は、初代Ｔ細胞にも作用した（図２１）。操作されたＴ細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２発現がない場合、ＣＤ１９を発現しているＲａｊｉ細胞を殺滅した。ＣＤ１９およびＨＬＡ－Ａ＊０２の両方を発現したＲａｊｉ細胞は、細胞傷害性から遮断された。重要なことに、この受容体対を保持する初代Ｔ細胞が、混合培養物中のＣＤ１９＋「腫瘍」細胞を、ＣＤ１９＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２＋「正常」細胞から識別した。これらの結果は、上記のビーズ実験から結果を写したものであったが、「正常」細胞によって囲まれていた場合でさえ、エフェクター細胞の細胞傷害性が「腫瘍」標的に集中した、より複雑な細胞設定におけるものだった。いずれの受容体も、最大限の選択性のために計画的な最適化を受けていなかったということを考えれば、この選択性の程度は、印象的なものだった。この挙動は、第２の抗原であるＭＳＬＮで確認された（図２２Ｂ）。
［実施例１３］

ＬＩＲ－１阻害性受容体による阻害の可逆性
ＬＩＲ－１阻害性受容体を、可逆的に機能する、すなわち、遮断の状態から、活性化へ、そして遮断へと循環するその能力について試験した。ＬＩＲ－１受容体およびアクチベーター受容体を発現しているエフェクターＴ細胞を、それらが可逆的かつ反復的に機能できるかどうかみるために試験した。腫瘍（ＣＤ１９＋）細胞遭遇または正常（ＣＤ１９＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２＋）細胞遭遇のいずれかを模倣するために、エフェクター細胞をＲａｊｉ細胞と共培養した。標的細胞への曝露の各ラウンドの後、Ｒａｊｉ細胞を培養から取り除き、標的細胞の新しい集団を導入した。細胞傷害性およびガンマインターフェロン（ＩＦＮγ）を各ラウンドの終わりに測定した。遮断－殺滅－遮断および殺滅－遮断－殺滅の両方の順列で、このタイプの細胞治療薬によって求められるように、Ｔ細胞は機能した（図２５Ａ～２５Ｄ）。それらの細胞は、それらが曝露された標的細胞に依存して遮断の状態から細胞傷害性へ、そしてまた元に可逆的に循環した。この結果は、アクチベーター受容体およびＬＩＲ－１阻害性受容体を発現しているＴ細胞が、正常細胞および腫瘍細胞からのシグナルを組み込むので、１つの状態（遮断または活性化）で動けなくなることはなく、相互に切り替わることができることを実証する。加えて、これらの実験は、それらの複雑さ、不均一性、およびドナー間の多様性にもかかわらず、複数のドナーからの初代Ｔ細胞で再現された（図２１Ａ～Ｄ、図２５Ａ～２５Ｄ；図２６Ａ～２６Ｂ）。これは、ＬＩＲ－１阻害性受容体の頑健な機能を実証する。
［実施例１４］

マウスモデルでがん細胞を選択的に標的にするアクチベーター受容体およびＬＩＲ－１ブロッカー受容体を発現するヒトＴ細胞
標準的なＣＤ３／ＣＤ２８刺激を使用して、Ｔ細胞が多数までインビトロで増殖するのを可能にする、初代Ｔ細胞で操作されたＣＤ１９／ＨＬＡ－Ａ＊０２アクチベーター／ブロッカー対の能力をアッセイした（図２７Ａ；図２８Ａ）。したがって、アクチベーターおよびＬＩＲ－１受容体を発現するＴ細胞は、動物実験用に、そして最終的には患者用に十分な数にまで増殖することができる。

ＣＤ１９＋腫瘍細胞の選択的な殺滅を実証するために、マウス異種移植がんモデルでＣＤ１９＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２＋細胞を温存しながら（図２７Ｂ）、ＣＤ１９／ＨＬＡ－Ａ＊０２アクチベーター／ブロッカーの組合せをインビトロで試験した。１つがＣＤ１９＋であり、もう１つがＣＤ１９＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２＋である、上述の同じ２つのＲａｊｉ細胞系を、免疫不全（ＮＧＳ－ＨＬＡ－Ａ２．１）マウスの側腹部に注射した。試験コンストラクトで操作されたＴ細胞を２つの用量、Ｔ細胞２ｅ６個（示していない）または１ｅ７個で注射した。腫瘍の成長および移植されたＴ細胞の残留性を経時的に解析した。移植されたＴ細胞数で追跡すると、ＣＤ１９＋腫瘍細胞のみが、マウスおよび腫瘍対照で殺滅され、宿主マウスの生存を促進した（図２７Ｃ～２７Ｅ；図２８Ｂ～２８Ｃ）。正常な細胞をモデル化するように設計されたＣＤ１９＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２＋細胞は、影響を受けなかった。対照対応物で追跡された、操作された細胞を保持するマウス、すなわち、「腫瘍」移植マウス中の血液中のヒトＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞比は、ＣＤ１９ ＣＡＲ陽性対照マウスの場合のように、ＣＤ４＋細胞＞ＣＤ８＋細胞であり、「正常」移植マウスでは、非形質導入Ｔ細胞を保持するマウスと同様に、ＣＤ４＋細胞＜ＣＤ８＋細胞であった（図２８Ｄ）。また、腫瘍内のｈｕＣＤ３＋細胞（図２９Ａ～２９Ｂ）は、腫瘍体積と逆相関しており、２種の受容体を発現している操作されたＴ細胞は、「正常」移植片（低浸潤物）中の非形質導入Ｔ細胞のように、そして「腫瘍」移植片（高浸潤物）中のＣＤ１９ ＣＡＲのように挙動した。最後に、マウスは、典型的な臨床的観察に関して正常のようだった（表１０）。合わせて、これらの結果は、患者体内で遭遇するであろう様々な正常細胞型および腫瘍細胞型を模倣するように考案された簡略化された設定において、ＬＩＲ－１阻害性受容体が、アクチベーター受容体を阻害するようにインビボで機能できることを実証した。

腫瘍細胞および「正常」細胞は、研究０日目に注射し、処置は、研究１０日目に開始した。臨床的観察（ＣＯ）は、健康不良、ストレス、および疼痛に集中して、３×／週行った。ＩＡＣＵＣガイドラインに従い、腫瘍が＞２０００ｍｍ^３に達した場合、マウスを安楽死させた。コード：Ｎ＝正常；１９Ａ＝異常な腫瘍［Ｎ＝壊死、Ｏ＝開放性］、ＥＵＴ＝安楽死させた。重症度コード：０＝存在しない、１＝中等度、２＝重度。

Claims (90)

1. ポリペプチドを含むキメラ抗原受容体であって、前記ポリペプチドが、
   ａ）ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインまたはその機能的断片もしくは変異体、
   ｂ）ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインまたはその機能的変異体、あるいは
   ｃ）ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン、または少なくとも１つの免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含み、前記ＩＴＩＭが、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号８）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号９）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１０）、およびＳＩＹＡＴＬ（配列番号１１）から選択される、細胞内ドメイン
   のうちの１つまたは複数を含む、キメラ抗原受容体。
2. 前記ポリペプチドが、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン、および／または少なくとも２つの免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む細胞内ドメインを含み、各ＩＴＩＭが、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号８）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号９）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１０）、およびＳＩＹＡＴＬ（配列番号１１）から独立して選択される、請求項１に記載の受容体。
3. 前記細胞内ドメインが、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号８）およびＶＴＹＡＥＶ（配列番号９）の両方のＩＴＩＭを含む、請求項２に記載の受容体。
4. 前記細胞内ドメインが、配列番号１２と少なくとも９５％同一である配列を含む、請求項３に記載の受容体。
5. 前記細胞内ドメインが、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号９）およびＶＴＹＡＱＬ（配列番号１０）の両方のＩＴＩＭを含む、請求項２に記載の受容体。
6. 前記細胞内ドメインが、配列番号１３と少なくとも９５％同一である配列を含む、請求項５に記載の受容体。
7. 前記細胞内ドメインが、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１０）およびＳＩＹＡＴＬ（配列番号１１）の両方のＩＴＩＭを含む、請求項２に記載の受容体。
8. 前記細胞内ドメインが、配列番号１４と少なくとも９５％同一である配列を含む、請求項５に記載の受容体。
9. 前記ポリペプチドが、少なくとも３つの免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む細胞内ドメインを含み、各ＩＴＩＭが、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号８）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号９）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１０）、およびＳＩＹＡＴＬ（配列番号１１）から独立して選択される、請求項１に記載の受容体。
10. 前記細胞内ドメインが、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号８）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号９）、およびＶＴＹＡＱＬ（配列番号１０）の前記ＩＴＩＭを含む、請求項２に記載の受容体。
11. 前記細胞内ドメインが、配列番号１５と少なくとも９５％同一である配列を含む、請求項１０に記載の受容体。
12. 前記細胞内ドメインが、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号９）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１０）、およびＳＩＹＡＴＬ（配列番号１１）の前記ＩＴＩＭを含む、請求項２に記載の受容体。
13. 前記細胞内ドメインが、配列番号１６と少なくとも９５％同一である配列を含む、請求項１２に記載の受容体。
14. 前記細胞内ドメインが、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号８）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号９）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１０）、およびＳＩＹＡＴＬ（配列番号１１）の前記ＩＴＩＭを含む、請求項２に記載の受容体。
15. 前記細胞内ドメインが、配列番号１７と少なくとも９５％同一である配列を含む、請求項１４に記載の受容体。
16. 前記細胞内ドメインが、前記ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン（配列番号７）と少なくとも９５％同一である配列を含む、請求項１５に記載の受容体。
17. 前記細胞内ドメインが、配列番号１２～１７の配列を含む、請求項１に記載の受容体。
18. 前記ポリペプチドが、前記ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインまたはその機能的変異体を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の受容体。
19. 前記ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインまたはその機能的変異体が、配列番号５と少なくとも９５％同一である配列を含む、請求項１８に記載の受容体。
20. 前記ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインが、配列番号５を含む、請求項１９に記載の受容体。
21. 前記ポリペプチドが、前記ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインまたはその機能的断片もしくは変異体を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の受容体。
22. 前記ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインまたはその機能的断片もしくは変異体が、配列番号４、配列番号１８、配列番号１９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４または配列番号９３と少なくとも９５％同一である配列を含む、請求項２１に記載の受容体。
23. 前記ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインが、配列番号４、配列番号１８、配列番号１９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４または配列番号９３と同一である配列を含む、請求項２１に記載の受容体。
24. 前記ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインまたはその機能的断片もしくは変異体が、配列番号４、配列番号１８、配列番号１９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３または配列番号８４と少なくとも９５％同一である配列を含む、請求項２１に記載の受容体。
25. 前記ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインが、配列番号４、配列番号１８、配列番号１９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３または配列番号８４と同一である配列を含む、請求項２１に記載の受容体。
26. 前記ポリペプチドが、
    ａ）ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインまたはその機能的断片もしくは変異体、および
    ｂ）前記ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインまたはその機能的変異体
    を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の受容体。
27. 前記ポリペプチドが、配列番号２０と少なくとも９５％同一である配列を含む、請求項２６に記載の受容体。
28. 前記ポリペプチドが、
    ａ）前記ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインまたはその機能的変異体、ならびに
    ｂ）ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン、および／または少なくとも２つの免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含み、各ＩＴＩＭが、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号８）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号９）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１０）、およびＳＩＹＡＴＬ（配列番号１１）から独立して選択される、細胞内ドメイン
    を含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の受容体。
29. 前記ポリペプチドが、配列番号２１と少なくとも９５％同一である配列を含む、請求項２８に記載の受容体。
30. 前記ポリペプチドが、配列番号２１の配列を含む、請求項２８に記載の受容体。
31. 前記ポリペプチドが、
    ａ）ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインまたはその機能的断片もしくは変異体、
    ｂ）ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインまたはその機能的変異体、ならびに
    ｃ）ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン、および／または少なくとも２つの免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含み、各ＩＴＩＭが、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号８）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号９）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１０）、およびＳＩＹＡＴＬ（配列番号１１）から独立して選択される、細胞内ドメイン
    を含む、請求項１に記載の受容体。
32. 前記ポリペプチドが、配列番号２または配列番号３と少なくとも９５％同一である配列を含む、請求項１に記載の受容体。
33. 前記ポリペプチドが、配列番号２０と少なくとも９９％同一である配列を含む、請求項１に記載の受容体。
34. 前記ポリペプチドが、配列番号２１と少なくとも９９％同一である配列を含む、請求項１に記載の受容体。
35. 前記ポリペプチドが、配列番号２または配列番号３と少なくとも９９％同一である配列を含む、請求項１に記載の受容体。
36. 前記ポリペプチドが、配列番号２０と同一である配列を含む、請求項１に記載の受容体。
37. 前記ポリペプチドが、配列番号２１と同一である配列を含む、請求項１に記載の受容体。
38. 前記ポリペプチドが、配列番号２または配列番号３と同一である配列を含む、請求項１に記載の受容体。
39. 前記ポリペプチドが、抗原結合性ドメインを含む、請求項１に記載の受容体。
40. 前記抗原結合性ドメインが、前記ＬＩＬＲＢ１細胞外リガンド結合タンパク質以外の抗原結合性ドメインである、請求項３９に記載の受容体。
41. 前記ポリペプチドが、２つ以上の抗原結合性ドメインを含む、請求項３９に記載の受容体。
42. 阻害性受容体である、請求項１～４１のいずれか一項に記載の受容体。
43. 前記抗原結合性ドメインが、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、請求項３９に記載の受容体。
44. 第２のポリペプチドを含む、請求項１に記載の受容体。
45. 前記第１のポリペプチドが、抗体の第１の鎖を含み、前記第２のポリペプチドが、前記抗体の第２の鎖を含む、請求項４４に記載の受容体。
46. 抗体のＦａｂ断片を含む、請求項４４に記載の受容体。
47. ａ）前記第１のポリペプチドが、前記抗体の重鎖の抗原結合性断片を含み、
    ｂ）前記第２のポリペプチドが、前記抗体の軽鎖の抗原結合性断片を含む、
    請求項４４に記載の受容体。
48. ａ）前記第１のポリペプチドが、前記抗体の軽鎖の抗原結合性断片を含み、
    ｂ）前記第２のポリペプチドが、前記抗体の重鎖の抗原結合性断片を含む、
    請求項４４に記載の受容体。
49. 前記第１のポリペプチドが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の第１の鎖を含み、前記第２のポリペプチドが、前記ＴＣＲの第２の鎖を含む、請求項４４に記載の受容体。
50. Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞外断片を含む、請求項４４に記載の受容体。
51. ａ）前記第１のポリペプチドが、前記ＴＣＲのアルファ鎖の抗原結合性断片を含み、
    ｂ）前記第２のポリペプチドが、前記ＴＣＲのベータ鎖の抗原結合性断片を含む、
    請求項５０に記載の受容体。
52. ａ）前記第１のポリペプチドが、前記ＴＣＲのベータ鎖の抗原結合性断片を含み、
    ｂ）前記第２のポリペプチドが、前記ＴＣＲのアルファ鎖の抗原結合性断片を含む、
    請求項５０に記載の受容体。
53. 一本鎖ＴＣＲを含む、請求項１に記載の受容体。
54. 前記ｓｃＦｖが、配列番号２２～３３のいずれか１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項４３に記載の受容体。
55. 前記ｓｃＦｖが、配列番号３５～４６または１２５のいずれか１つと少なくとも９５％同一である配列を含む、請求項４３に記載の受容体。
56. 前記ｓｃＦｖが、配列番号３５～４６または１２５のいずれか１つと同一である配列を含む、請求項４３に記載の受容体。
57. 前記抗体の前記重鎖が、配列番号２５～２７または３１～３３のいずれか１つの重鎖ＣＤＲを含み、前記抗体の前記軽鎖が、配列番号２２～２４または２８～３０のいずれか１つの軽鎖ＣＤＲを含む、請求項４７または請求項４８に記載の受容体。
58. 前記抗体の前記重鎖が、配列番号３５～４６または１２５のいずれか１つの重鎖部分と少なくとも９５％同一である配列を含み、前記抗体の前記軽鎖が、配列番号３５～４６または１２５のいずれか１つの軽鎖部分と少なくとも９５％同一である配列を含む、請求項４７または請求項４８に記載の受容体。
59. 前記抗体の前記重鎖が、配列番号３５～４６または１２５のいずれか１つの重鎖部分と同一である配列を含み、前記抗体の前記軽鎖が、配列番号３５～４６または１２５のいずれか１つの軽鎖部分と同一である配列を含む、請求項４７または請求項４８に記載の受容体。
60. 配列番号４７～７１、７７～７９、８９～９２、１２０または１２２のいずれか１つと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の受容体。
61. 配列番号４７～７１、７７～７９、８９～９２、１２０または１２２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の受容体。
62. 請求項１～６１のいずれか一項に記載の受容体をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
63. 請求項６２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
64. 前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターをコードする配列をさらに含む、請求項６３に記載のベクター。
65. 請求項１～６１のいずれか一項に記載の受容体、請求項６２に記載のポリヌクレオチド、または請求項６３もしくは６４に記載のベクターを含む免疫細胞。
66. 前記細胞が、前記抗原または表面上に前記抗原を発現する細胞と接触すると、免疫細胞活性化が低下する、請求項６５に記載の免疫細胞。
67. 免疫細胞活性化が、ＮＦＡＴプロモーターに作動可能に連結した遺伝子の発現を含む、請求項６５または請求項６６に記載の免疫細胞。
68. Ｔ細胞である、請求項６５～６７のいずれか一項に記載の免疫細胞。
69. アクチベーター受容体をさらに含む、請求項６５～６８のいずれか一項に記載の免疫細胞。
70. 前記アクチベーター受容体が、キメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体である、請求項６９に記載の免疫細胞。
71. 免疫細胞を作製する方法であって、請求項６２に記載のポリヌクレオチド、または請求項６３もしくは６４に記載のベクターを、前記免疫細胞に導入することを含む、方法。
72. 前記免疫細胞が、前記受容体を発現する、請求項６９に記載の方法。
73. 前記細胞が、免疫細胞である、請求項６９または請求項７０に記載の方法。
74. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞である、請求項７１に記載の方法。
75. 前記細胞が、前記キメラ抗原受容体に特異的な抗原、または表面上に前記抗原を発現する細胞と接触すると、免疫細胞活性化が低下する、請求項６９～７２のいずれか一項に記載の方法。
76. 免疫細胞活性化が、ＮＦＡＴプロモーターに作動可能に連結した遺伝子の発現を含む、請求項７３に記載の方法。
77. 疾患または障害を有する対象を処置する方法であって、請求項６５～７０のいずれか一項に記載の複数の免疫細胞を前記対象に投与することを含む、方法。
78. 前記疾患または障害が、がんである、請求項７７に記載の方法。
79. 請求項１～６１のいずれか一項に記載の受容体、請求項６２に記載のポリヌクレオチド、請求項６３もしくは６４に記載のベクター、または請求項６５～６８のいずれか一項に記載の免疫細胞を含む、キット。
80. ポリペプチドを含むキメラ抗原受容体を含む免疫細胞であって、ポリペプチド配列が、配列番号２１と少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を共有する、免疫細胞。
81. 前記ポリペプチド配列が、配列番号３と少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を共有する、請求項８０に記載の免疫細胞。
82. 前記ポリペプチド配列が、配列番号２と少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を共有する、請求項８０に記載の免疫細胞。
83. 前記キメラ抗原受容体が、配列番号２２～２７に従って、それぞれ、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３配列を含む抗原結合性ドメインを含む、請求項８１に記載の免疫細胞。
84. 前記キメラ抗原受容体が、配列番号２８～３３に従って、それぞれ、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３配列を含む抗原結合性ドメインを含む、請求項８１に記載の免疫細胞。
85. 前記ポリペプチド配列が、配列番号１２２と少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を共有する、請求項８０に記載の免疫細胞。
86. Ｔ細胞である、請求項８０～８３のいずれか一項に記載の免疫細胞。
87. 前記Ｔ細胞が、腫瘍細胞上に発現される標的に特異的に結合するキメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体を含む、請求項８４に記載の免疫細胞。
88. 前記Ｔ細胞が、エチオレート受容体、ανββインテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＤＬＬ４、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ－４０、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、ＦＢＰ、胎児アセチルコリン受容体、Ｆｚｄ７、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、ｈ５Ｔ４、ＩＬ－１１Ｒ、ＩＬ１３Ｒ－ａ２、ＫＤＲ、κ軽鎖、λ軽鎖、ＬｅＹ、Ｌ１ ＣＡＭ、ＭＡＧＥ－Ａ１、メソテリン、ＭＨＣ提示ペプチド、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｎｏｔｃｈｌ、Ｎｏｔｃｈ２／３、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、サバイビン、ＴＡＧ－７２、ＴＥＭ、ＴＥＲＴ、ＶＥＧＦＲ２、およびＲＯＲ１から選択される標的に特異的に結合するキメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体を含む、請求項８７に記載の免疫細胞。
89. それを必要とする対象におけるがんを処置および／または予防する方法であって、請求項８７に記載の免疫細胞を前記対象に投与することを含む、方法。
90. それを必要とする対象におけるがんを処置および／または予防する方法であって、請求項８８に記載の免疫細胞を前記対象に投与することを含む、方法。

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