CN107119021A - Pd‑1敲除cd19car‑t细胞的制备 - Google Patents
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Abstract
PD‑1敲除CD19CAR‑T细胞的制备，包括将CD19CAR质粒及其转座酶质粒、用于敲除PD‑1基因的sgRNA质粒及CAS9质粒与电转试剂混合，加入PBMC细胞中进行电转染；采用偶联CD3或CD3+CD28抗体的磁珠富集CD3阳性T细胞；以及筛选并培养扩增转染后的T细胞以获得PD‑1敲除CD19CAR‑T细胞。本发明选用PiggyBac转座子系统提高了转染效率和转基因的表达效率和时间，简化CART的制备程序，增强了系统的负载量。另外，本发明敲除PD‑1基因时避免了使用病毒载体，安全性更高。
Description
技术领域
本发明涉及利用CRISPR-Cas9系统制备PD-1敲除CD19CAR-T细胞。
背景技术
白血病俗称“血癌”，是一类起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病。克隆性白血病细胞不断增生，浸润其他非造血组织和器官，并抑制正常造血功能。在中国每年大约有上万名患者被诊断为B系急性淋巴白血病(B-ALL)，美国大约有80％的人急性白血病都是B-ALL，其中80％的B-ALL患者被一线化化疗所缓解，但仍有60％的B-ALL会复发。由于白血病分型和预后分层复杂，如按起病的缓急可分为急、慢性白血病，按病变细胞种类分类，包括髓系和淋巴系，淋巴系又包括T和B细胞系，因此没有千篇一律的治疗方法。治疗这些患者的一个方法是基因修饰T细胞以通过嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor,CAR)的表达，靶向并结合在肿瘤细胞上表达的抗原，将信号传递至细胞内，引起T细胞增殖活化，从而靶向杀伤肿瘤细胞。
CAR分子主要包括胞外抗原结合区、穿膜区和胞内信号区。第一代CAR由scFV、穿膜区、CD3ζ链或FcεRIγ链组成，但表现出有限的扩增性和持久性，以及有限的抗肿瘤效应。第二、三代CAR则在第一代的基础上分别引入一个或者两个共刺激信号域(如CD28、4-1BB)，显著提高了CAR-T细胞的增值能力和抗肿瘤作用，延长了CAR-T细胞在体内的持续存在时间。
CD19作为B-ALL的一个理想治疗靶点，在治疗难治性B细胞恶性肿瘤获得了较高的缓解率。目前CD19CAR-T在治疗儿童和成人复发B-ALL，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，和B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)表现出稳定高效的抗肿瘤效力。在Peter研究小组中，给复发难治的CLL病人输注自体含有4-1BB共刺激信号的CD19-CAR-T细胞后，观察到持续超过两年的缓解，大多数病人低剂量CD19CAR-T细胞输注后，观察到CAR-T细胞在体内大量增殖、伴随着肿瘤溶解和正常B细胞的缺乏。
靶向CD19分子的CAR-T细胞在针对难治、复发的B细胞来源的血液肿瘤的治疗上，获得了传统疗法无法达到的临床疗效，完全缓解率(CR)普遍达到了80％，有些临床试验甚至高达100％，成为当下肿瘤免疫治疗中最为引人关注的领域。不过也暴露出在CAR-T细胞持久性较差、抗原逃逸导致肿瘤复发及安全性隐患等问题：(1)存活时间短。存活时间的长短已被证明与疗效密切相关，确保回输后的CAR-T细胞在患者体内的存活时间成为关键；(2)易复发。CAR-T细胞体内存活时间不够长，抗原丢失产生免疫逃逸机制，最终导致复发；(3)制备成功率不高。常用逆转录病毒系统来制备CAR-T，能有效感染宿主细胞，但其装载量有限，且重组病毒颗粒制备工艺较复杂。此外，病毒系统可能带来安全隐患。并且患者由于进行过多种治疗，会使其T细胞活性过低，体外培养无法保证回输CAR-T的量。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种安全高效的PD-1敲除CD19CAR-T细胞的制备方法。
根据本发明的第一方面，提供了一种(非治疗目的)制备PD-1敲除CD19CAR-T细胞的方法，包括以下步骤：
准备(制备)PBMC细胞；
准备CD19嵌合抗原受体(CAR)；
准备与CD19CAR配合使用的转座酶质粒，用于将CD19CAR整合到PBMC细胞的基因组上；
准备用于敲除PD-1基因的sgRNA质粒；
准备与sgRNA质粒配合使用来敲除PD-1基因的CAS9质粒；
将准备的CD19CAR质粒及其转座酶质粒、用于敲除PD-1基因的sgRNA质粒及CAS9质粒与电转试剂混合，加入准备的PBMC细胞中进行电转染；
采用偶联CD3或CD3+CD28抗体的磁珠富集CD3阳性T细胞；以及
筛选并培养扩增转染后的T细胞以获得PD-1敲除CD19CAR-T细胞。
根据本发明的一个优选实施例，CD19CAR可以是利用PiggyBac-transposon载体依次串联人启动子、CSF2RA嵌合受体信号肽、胞膜外抗原结合区、铰链区、胞内信号传导区和T2A短肽连接的抗性基因puromycin制备而成的。
根据本发明，胞膜外抗原结合区优选为用于结合CD19蛋白的CD19单链抗体(scFv)，依次串联c-myc表位标记、CD8Hinge嵌合受体铰链、CD8Transmembrane嵌合受体跨膜区。
根据本发明，胞内信号传导区优选为CD28-4-1BB-ITAM，CD28和4-1BB为嵌合受体共刺激分子。
根据本发明的一个具体实施例，准备PBMC细胞包括：(1)用抗凝管采集外周血，边采集边摇晃使外周血与抗凝剂充分混合，并用磷酸盐缓冲液PBS 1：1稀释；(2)外周血稀释液与淋巴细胞分离液等体积混合，离心，吸取离心后的白膜层细胞；(3)将得到的白膜层细胞与PBS或者无血清细胞培养基1640混合后离心，沉淀后获得PBMC细胞。
本发明的另一目的是提供一种用于制备PD-1敲除CD19CAR-T细胞的装置，其包括：
PBMC细胞准备系统；
Amaxa电转试剂盒；
电转染系统，接收来自Amaxa电转试剂盒的电转试剂并将其与CD19CAR质粒及其转座酶质粒、用于敲除PD-1基因的sgRNA质粒及CAS9质粒混合后形成混合物；并接收来自PBMC细胞准备系统的PBMC细胞且在其中加入所述混合物进行电转染；
CD3阳性T细胞富集系统，包含用于偶联CD3或CD3+CD28抗体的磁珠；以及筛培系统，用于筛选并培养扩增转染后的T细胞以获得PD-1敲除CD19CAR-T细胞。
本发明的又一目的是提供一种根据上述方法获得的分离的T细胞或细胞系或其次代培养物。
本发明选用PiggyBac转座子系统提高了转染效率和转基因的表达效率和时间，简化CART的制备程序，增强了系统的负载量。另外，本发明敲除PD-1基因时避免了使用病毒载体，安全性更高。
本发明将基因敲除与CAR的装备放在同一个步骤里完成，提高了CAR-T细胞的制备效率和存活率，降低了多次操作的成本；同时缩短了CAR-T细胞在体外的培养周期，保证了其在体外扩增的活性。
附图说明
图1为根据本发明的PB-CD19CAR-BBZ-puro表达载体的基因结构图；
图2为根据本发明的PD1敲除CD19CAR-T细胞与未敲除的CD19CAR-T细胞中CAR表达率的对比结果图；
图3为根据本发明的PD1敲除CD19CAR-T细胞和未敲除的CD19CAR-T细胞中PD-1的敲除结果图；
图4为根据本发明的PD1敲除CD19CAR-T细胞和未敲除的CD19CAR-T细胞，分别与Raji人淋巴瘤细胞和K562白血病细胞系共培养后，细胞毒性检测的对比图。
图5为根据本发明的PD1敲除CD19CAR-T细胞和未敲除的CD19CAR-T细胞，分别与Raji人淋巴瘤细胞共培养后，细胞因子IFN-γ和GM-CSF的释放对比图。
具体实施方式
PBMC细胞制备
用抗凝管采集健康人外周血，边采集边摇晃使得外周血与抗凝剂充分混合并用磷酸盐缓冲液PBS 1：1稀释；将外周血稀释液缓慢加入装有等体积的淋巴细胞分离液(Ficoll)的50ml离心管中，450g，慢升慢降离心25min，中间不能停止离心；离心结束后，小心吸取淋巴细胞分离液上方的白膜层细胞，转入一个新的50ml离心管中，加入PBS，300g，慢升慢降离心10min，弃上清，保留离心管底部的细胞沉淀；再次加入PBS，160g，慢升慢降离心15min，弃上清；最后加入PBS，300g，慢升慢降离心10min，弃上清，即得到PBMC细胞。
制备CAR-T细胞
将PBMC用含10％FBS的AIM-V培养基(含IL-2细胞因子)进行培养。待细胞激活一段时间后细胞数目达到2-3×107个。
如序列表所示序列1所列PiggyBac-transposon载体序列(PB-CD19CAR-BBZ-puro，7704bp)，载体结构图如图1所示，包括依次串联的人EF1α启动子、CSF2RA嵌合受体信号肽、胞膜外抗原结合区、铰链区、胞内信号传导区和T2A短肽连接的抗性基因puromycin。将两个特异性靶向PD1基因的sgRNA同时连接在线性的pGL3-U6-sgRNA质粒上，与转座酶和pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒一起成功转染CD3阳性T细胞即可实现PD1基因的敲除。具体步骤为：将PiggyBac-transposon载体、转座酶质粒、用于敲除PD-1基因的sgRNA质粒、CAS9质粒各5μg与Amaxa电转试剂盒中的电转试剂混合，获得包含该四种质粒的100μl电转混合液，其中原始质粒pGL3-U6-sgRNA、pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF、PB-CD19CAR-BBZ-puro和转座酶四个质粒作为对照；将所述两组电转混合液加入2-3×107个PBMC细胞中进行电转，细胞转染2h后换液，采用偶联CD3或CD3+CD28抗体的磁珠富集CD3阳性T细胞；转染5-6天后加入0.5μg/ml的puromycin，筛选并培养扩增转染后的T细胞，而获得CAR-T细胞。通过流式细胞术检测CAR的阳性率，如图2所示。
随后提取CAR-T细胞基因组DNA，并用提前设计好检测on-target引物(引物未列出)，PCR扩增目的片段，纯化回收。使用T7EN1酶切检测突变体，3％的琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切，结果如图3凝胶电泳图所示。将PCR产物连接进T载体中，转化进DH5a细菌，随机挑取21个单菌落进行测序，评估目标片段被切割后碱基变化和切割效率。
PD1敲除CD19-CAR-T细胞杀伤效果评估
分别培养K562细胞、Raji细胞和效应细胞PD1-敲除CD19-CAR-T、CD19-CAR-T。
收集靶细胞(K562、Raji)各4×105cells和效应细胞(CART细胞)各3×106cells，300g，离心10min，慢升慢降，弃上清；用1ml PBS溶液分别重悬靶细胞和效应细胞，300g，离心10min，慢升慢降，弃上清；重复一次；用700μl培养基(AIM-V培养基+10％FBS)重悬效应细胞，用2ml培养基(1640培养基+10％FBS)重悬靶细胞。
设置效靶比为0.5:1、1:1、5:1、10:1的实验孔，并设置对照组，每组3个复孔，37℃5％CO2培养箱中培养2h；500g，离心5min，慢升慢降平板离心；取每个孔的20μl上清到新96孔板中，并且每孔加入50μl底物溶液(避光操作)，室温避光孵育15min；每孔加入50μl终止液，酶标仪检测490nm吸光度，结果如图4所示，PD1-敲除CD19-CAR-T细胞在Raji靶细胞中不同效靶比条件下杀伤效率明显高于普通的CD19-CAR-T细胞。
PD1敲除CD19-CAR-T细胞因子释放结果评估
分别培养K562细胞、Raji细胞和效应细胞PD1-敲除CD19-CAR-T、CD19-CAR-T。
将靶细胞K562和Raji分别以每孔1x 105种于96孔板中，将效应细胞CD19CAR-T和PD1-KO；CD19CAR-T分别以2x 105与靶细胞混合，以总体积200μl的培养液(RPMI 1640培养基+10％FBS)在37℃5％CO2培养箱中共培养24个小时。每组3个复孔。之后离心取上清10μl用PerkinElmer的AlphaLISA assay系列试剂盒(AL216、AL217)分别检测GM-CSF、IFN-γ的细胞因子浓度水平。如图5所示，GM-CSF和IFN-γ两种因子在两种CAR-T细胞中表达的水平没有明显区别，但均明显优于未进行电转的NT组。
本发明采用PiggyBac转座子系统，从而A、制备工艺简单，不需要病毒制备所需要的各种复杂条件；B、PiggyBac系统负载可以超过14KB，而病毒系统负载不能超过8KB，否则得不到符合要求的病毒；C、病毒系统感染后的有效表达时间窗在两周左右，这是病毒系统介导治疗容易复发的原因之一；而PiggyBac系统可以介导长期表达，延长CAR的表达时间，更好地满足了T细胞治疗的要求。
另外，本发明采用电转的方法，既不需要病毒包装的复杂工艺，又避免病毒感染带来的安全隐患。
此外，本发明采用人自身的EF1α启动子，使CAR基因能够在人体内长时间持续表达；人PD-1基因的特异性敲除，增强了T细胞的抗肿瘤能力。
序 列 表
<110> 王小平
<120> PD-1敲除CD19 CAR-T细胞的制备
<160> 1
<210> 1
<211> 7704
<212> DNA
<213> 人工序列PB-CD19 CAR-BBZ-puro
<400> 1
actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata 60
catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa 120
agtgccacct aaattgtaag cgttaatatt ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa 180
atcagctcat tttttaacca ataggccgaa atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa 240
tagaccgaga tagggttgag tgttgttcca gtttggaaca agagtccact attaaagaac 300
gtggactcca acgtcaaagg gcgaaaaacc gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa 360
ccatcaccct aatcaagttt tttggggtcg aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct 420
aaagggagcc cccgatttag agcttgacgg ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa 480
gggaagaaag cgaaaggagc gggcgctagg gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc 540
gtaaccacca cacccgccgc gcttaatgcg ccgctacagg gcgcgtccca ttcgccattc 600
aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg 660
gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca 720
cgacgttgta aaacgacggc cagtgagcgc gcctcgttca ttcacgtttt tgaacccgtg 780
gaggacgggc agactcgcgg tgcaaatgtg ttttacagcg tgatggagca gatgaagatg 840
ctcgacacgc tgcagaacac gcagctagat taaccctaga aagataatca tattgtgacg 900
tacgttaaag ataatcatgt gtaaaattga cgcatgtgtt ttatcggtct gtatatcgag 960
gtttatttat taatttgaat agatattaag ttttattata tttacactta catactaata 1020
ataaattcaa caaacaattt atttatgttt atttatttat taaaaaaaac aaaaactcaa 1080
aatttcttct ataaagtaac aaaactttta tgagggacag ccccccccca aagcccccag 1140
ggatgtaatt acgtccctcc cccgctaggg ggcagcagcg agccgcccgg ggctccgctc 1200
cggtccggcg ctccccccgc atccccgagc cggcagcgtg cggggacagc ccgggcacgg 1260
ggaaggtggc acgggatcgc tttcctctga acgcttctcg ctgctctttg agcctgcaga 1320
cacctggggg gatacgggga aaaggcctcc acggccaagg atctgcgatc gctccggtgc 1380
ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg gaggggtcgg 1440
caattgaacg ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg atgtcgtgta 1500
ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag tagtcgccgt 1560
gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag ctgaagcttc gaggggctcg 1620
catctctcct tcacgcgccc gccgccctac ctgaggccgc catccacgcc ggttgagtcg 1680
cgttctgccg cctcccgcct gtggtgcctc ctgaactgcg tccgccgtct aggtaagttt 1740
aaagctcagg tcgagaccgg gcctttgtcc ggcgctccct tggagcctac ctagactcag 1800
ccggctctcc acgctttgcc tgaccctgct tgctcaactc tacgtctttg tttcgttttc 1860
tgttctgcgc cgttacagat ccaagctgtg accggcgcct actctagagc caccatgctg 1920
ctgctggtca cttctctgct gctgtgcgaa ctgccccacc ccgcctttct gctgattccc 1980
gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 2040
atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 2100
gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 2160
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 2220
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 2280
gggaccaagc tggagatcac aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc 2340
ggatctgagg tgaaactgca ggagtcagga cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg 2400
tccgtcacat gcactgtctc aggggtctca ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc 2460
cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac 2520
tataattcag ctctcaaatc cagactgacc atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt 2580
ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgat gacacagcca tttactactg tgccaaacat 2640
tattactacg gtggtagcta tgctatggac tactggggcc aaggaacctc agtcaccgtc 2700
tcctcagaac agaaactgat ttccgaggaa gatctgttcg tccccgtgtt cctgcctgcc 2760
aagccaacaa ctacccctgc tccacgacca cctactccag cacctaccat cgcaagtcag 2820
cccctgtcac tgcgacctga ggcttgccgg ccagcagctg gaggagcagt gcacacccga 2880
ggcctggact tcgcatgcga tatctacatt tgggcaccac tggctggaac ctgtggggtc 2940
ctgctgctga gcctggtcat caccctgtat tgtaaccaca gaaatcggtt cagcgtcgtg 3000
aaaagggggc gcaagaaact gctgtacatc ttcaagcagc cttttatgcg cccagtgcag 3060
acaactcagg aggaagacgg atgctcttgt cggttcccag aggaggagga aggaggctgc 3120
gagctgagag tgaagttcag ccggagcgcc gatgcaccag catatcagca gggacagaat 3180
cagctgtaca acgagctgaa tctgggcagg cgcgaggaat atgacgtgct ggataagcga 3240
cgaggacggg accccgaaat gggaggaaaa cccagaagga agaaccctca ggaggggctg 3300
tataatgaac tgcagaaaga caagatggct gaggcataca gcgaaattgg aatgaaagga 3360
gagcgccgac gggggaaggg acacgatggg ctgtaccagg gactgtcaac cgccactaaa 3420
gatacctacg acgcactgca catgcaggct ctgcccccaa gagaattcga aggatccgcg 3480
gccgctgagg gcagaggaag tcttctaaca tgcggtgacg tggaggagaa tcccggccct 3540
tccgggatga ccgagtacaa gcccacggtg cgcctcgcca cccgcgacga cgtccccagg 3600
gccgtacgca ccctcgccgc cgcgttcgcc gactaccccg ccacgcgcca caccgtcgat 3660
ccggaccgcc acatcgagcg ggtcaccgag ctgcaagaac tcttcctcac gcgcgtcggg 3720
ctcgacatcg gcaaggtgtg ggtcgcggac gacggcgccg cggtggcggt ctggaccacg 3780
ccggagagcg tcgaagcggg ggcggtgttc gccgagatcg gcccgcgcat ggccgagttg 3840
agcggttccc ggctggccgc gcagcaacag atggaaggcc tcctggcgcc gcaccggccc 3900
aaggagcccg cgtggttcct ggccaccgtc ggcgtctcgc ccgaccacca gggcaagggt 3960
ctgggcagcg ccgtcgtgct ccccggagtg gaggcggccg agcgcgccgg ggtgcccgcc 4020
ttcctggaga cctccgcgcc ccgcaacctc cccttctacg agcggctcgg cttcaccgtc 4080
accgccgacg tcgaggtgcc cgaaggaccg cgcacctggt gcatgacccg caagcccggt 4140
gcctgaatct aggtcgacaa tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt 4200
attcttaact atgttgctcc ttttacgcta tgtggatacg ctgctttaat gcctttgtat 4260
catgcgttaa ctaaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat 4320
cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact 4380
catcaatgta tcttatcatg tctggaattg actcaaatga tgtcaattag tctatcagaa 4440
gctcatctgg tctcccttcc gggggacaag acatccctgt ttaatattta aacagcagtg 4500
ttcccaaact gggttcttat atcccttgct ctggtcaacc aggttgcagg gtttcctgtc 4560
ctcacaggaa cgaagtccct aaagaaacag tggcagccag gtttagcccc ggaattgact 4620
ggattccttt tttagggccc attggtatgg ctttttcccc gtatcccccc aggtgtctgc 4680
aggctcaaag agcagcgaga agcgttcaga ggaaagcgat cccgtgccac cttccccgtg 4740
cccgggctgt ccccgcacgc tgccggctcg gggatgcggg gggagcgccg gaccggagcg 4800
gagccccggg cggctcgctg ctgcccccta gcgggggagg gacgtaatta catccctggg 4860
ggctttgggg gggggctgtc cctgatatct ataacaagaa aatatatata taataagtta 4920
tcacgtaagt agaacatgaa ataacaatat aattatcgta tgagttaaat cttaaaagtc 4980
acgtaaaaga taatcatgcg tcattttgac tcacgcggtc gttatagttc aaaatcagtg 5040
acacttaccg cattgacaag cacgcctcac gggagctcca agcggcgact gagatgtcct 5100
aaatgcacag cgacggattc gcgctattta gaaagagaga gcaatatttc aagaatgcat 5160
gcgtcaattt tacgcagact atctttctag ggttaatcta gctgcatcag gatcatatcg 5220
tcgggtcttt tttccggctc agtcatcgcc caagctggcg ctatctgggc atcggggagg 5280
aagaagcccg tgccttttcc cgcgaggttg aagcggcatg gaaagagttt gccgaggatg 5340
actgctgctg cattgacgtt gagcgaaaac gcacgtttac catgatgatt cgggaaggtg 5400
tggccatgca cgcctttaac ggtgaactgt tcgttcaggc cacctgggat accagttcgt 5460
cgcggctttt ccggacacag ttccggatgg tcagcccgaa gcgcatcagc aacccgaaca 5520
ataccggcga cagccggaac tgccgtgccg gtgtgcagat taatgacagc ggtgcggcgc 5580
tgggatatta cgtcagcgag gacgggtatc ctggctggat gccgcagaaa tggacatgga 5640
taccccgtga gttacccggc gggcgcgctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt 5700
gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa 5760
agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc 5820
tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag 5880
aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 5940
cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 6000
atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 6060
taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 6120
aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 6180
tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 6240
gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 6300
cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 6360
cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 6420
atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 6480
tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat 6540
ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 6600
acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 6660
aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 6720
aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 6780
tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga 6840
cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 6900
catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg 6960
ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat 7020
aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat 7080
ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg 7140
caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc 7200
attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa 7260
agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc 7320
actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt 7380
ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag 7440
ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt 7500
gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag 7560
atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac 7620
cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc 7680
gacacggaaa tgttgaatac tcat 7704
Claims (7)
1.一种制备PD-1敲除CD19 CAR-T细胞的方法，包括以下步骤：
准备PBMC细胞；
准备CD19嵌合抗原受体(CAR)；
准备与CD19 CAR配合使用的转座酶质粒，用于将CD19 CAR整合到PBMC细胞的基因组上；
准备用于敲除PD-1基因的sgRNA质粒；
准备与sgRNA质粒配合使用来敲除PD-1基因的CAS9质粒；
将准备的CD19 CAR质粒及其转座酶质粒、用于敲除PD-1基因的sgRNA质粒及CAS9质粒与电转试剂混合，加入准备的PBMC细胞中进行电转染；
采用偶联CD3或CD3+CD28抗体的磁珠作为T细胞活化剂并培养扩增转染后的T细胞以获得PD-1敲除CD19 CAR-T细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中CD19 CAR是利用PiggyBac-transposon载体依次串联人启动子、CSF2RA嵌合受体信号肽、胞膜外抗原结合区、铰链区、胞内信号传导区和T 2A短肽连接的抗性基因puromycin制备而成的。
3.根据权利要求2所述的方法，其中胞膜外抗原结合区为用于结合CD19蛋白的CD19单链抗体(scFv)，依次串联c-myc表位标记、CD8 Hinge嵌合受体铰链、CD8 Transmembrane嵌合受体跨膜区。
4.根据权利要求3所述的方法，其中胞内信号传导区为CD28-4-1BB-ITAM，CD28和4-1BB为嵌合受体共刺激分子。
5.根据权利要求1所述的方法，其中准备PBMC细胞包括：(1)用抗凝管采集外周血，边采集边摇晃使外周血与抗凝剂充分混合；(2)外周血细胞与淋巴细胞分离液等体积混合，离心，吸取离心后的白膜层细胞；(3)将得到的白膜层细胞与PBS或者无血清细胞培养基1640混合后离心，沉淀后获得PBMC细胞。
6.一种用于制备PD-1敲除CD19 CAR-T细胞的装置，包括：
PBMC细胞准备系统；
Amaxa电转试剂盒；
电转染系统，接收来自Amaxa电转试剂盒的电转试剂并将其与CD19 CAR质粒及其转座酶质粒、用于敲除PD-1基因的sgRNA质粒及CAS9质粒混合后形成混合物；并接收来自PBMC细胞准备系统的PBMC细胞且在其中加入所述混合物进行电转染；
CD3阳性T细胞富集系统，包含用于偶联CD3或CD3+CD28抗体的磁珠；以及
筛培系统，用于筛选并培养扩增转染后的T细胞以获得PD-1敲除CD19CAR-T细胞。
7.根据权利要求1-5之一所述的方法所获得的分离的T细胞或细胞系或其次代培养物。
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