TW202045207A - 用於病毒遞送之介孔二氧化矽顆粒組成物 - Google Patents

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山迪普 泰瑞安 科希
史蒂芬 M 肯漢
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瑞士商諾華公司
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Abstract

本發明總體上關於包含可被表面修飾的介孔二氧化矽顆粒之組成物在 遞送病毒載體中的用途。在一些實施方式中，該病毒載體用於轉導T細胞以表現嵌合抗原受體(CAR)，以治療患有疾病、例如與腫瘤抗原表現相關的疾病的受試者。

Description

用於病毒遞送之介孔二氧化矽顆粒組成物
相關申請之交叉引用
本申請要求2019年2月25日提交的美國序號62/810,260之優先權，將該美國申請之內容藉由引用以其全文併入本文。
序列表
本申請含有已經以ASCII格式電子遞交的序列表並且該序列表特此藉由引用以其全文併入。所述ASCII副本創建於2020年2月20日，名為N2067-7161WO_SL.txt，大小為232,920位元組。
本發明總體上關於介孔二氧化矽組成物在遞送病毒載體或藥物物質中的用途。在一些實施方式中，病毒載體包括經工程改造以表現嵌合抗原受體(CAR)的核苷酸序列，以治療患有疾病(例如，與腫瘤抗原的表現相關的疾病)的受試者。
T細胞過繼轉移方案在許多治療應用(例如癌症)中示出潛力，最近已批准CAR T細胞療法用於B細胞惡性腫瘤之治療。需要以局部方式遞送病毒載體或藥物物質，並尋找有效的製造方法。
本文考慮的是一種組成物，該組成物包含介孔二氧化矽顆粒之第一群體和病毒載體。在一些實施方式中，將病毒載體軛合(conjugated)至介孔二氧化矽顆粒之第一群體。在一些實施方式中，將病毒載體靜電地或共價地軛合至介孔二氧化矽顆粒之第一群體。在一些實施方式中，介孔二氧化矽顆粒之第一群體係表面經修飾的。在一些實施方式中，在介孔二氧化矽顆粒之第一群體上的表面修飾係-OH(羥基)、胺、羧酸、膦酸酯、鹵化物、疊氮化物、炔、環氧化物、巰基、聚乙烯亞胺、疏水部分、或其鹽，視需要使用C1至C20烷基或(-O(CH2-CH2-)1-25連接子(linker)。在一些實施方式中，在介孔二氧化矽顆粒之第一群體上的表面修飾係一級胺、二級胺、三級胺或季胺。在一些實施方式中，在介孔二氧化矽顆粒之第一群體上的表面修飾係聚乙烯亞胺，其平均分子量係約1000至20,000Da、約1,200至15,000Da、約1,500至12,000Da、約2,000Da、約3,000Da、約4,000Da、約5,000Da、約6,000Da、約7,000Da、約8,000Da、約9,000Da或約10,000Da，如藉由凝膠滲透層析法(GPC)測量。在一些實施方式中，病毒載體係逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒或慢病毒。在一些實施方式中，該病毒載體包含表現載體，該表現載體包含重組多核苷酸，該重組多核苷酸包含與待表現的核苷酸序列可操作地連接的表現控制序列。在一些實施方式中，該核苷酸序列編碼嵌合抗原受體(CAR)、工程改造的TCR、 一種或多種細胞介素、一種或多種趨化因子、用於阻斷抑制性分子的shRNA，或其中該核苷酸序列包含用於誘導蛋白質表現的mRNA。在一些實施方式中，核苷酸序列編碼經工程改造以靶向腫瘤抗原的多肽。在一些實施方式中，多肽靶向選自以下群組之腫瘤抗原，該群組由以下項組成：TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、間皮素、IL-11Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、葉酸受體α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、前列腺酶(Prostase)、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受體、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪胺酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙醯基-GD2、葉酸受體β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、豆莢蛋白(legumain)、HPV E6、HPV E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相關抗原1、p53、p53突變體、前列腺特異性蛋白(prostein)、存活素和端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MART1、Ras突變體、hTERT、肉瘤易位中斷點、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄性激素受體、週期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆轉錄酶、RU1、RU2、腸道羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、 以及其任何組合。在一些實施方式中，蛋白質係CAR，其包含抗原結合結構域、跨膜結構域、共刺激傳訊區域和傳訊結構域。在一些實施方式中，傳訊結構域係CD3ζ傳訊結構域。在一些實施方式中，該組成物還包含T細胞刺激化合物或腫瘤抗原。在一些實施方式中，T細胞刺激化合物或腫瘤抗原軛合至或吸附到介孔二氧化矽顆粒之第一群體或介孔二氧化矽顆粒之第二群體上，並且其中T細胞刺激化合物係IL-2、IL-15、抗CD2 mAb、抗CD3 mAb、抗CD28 mAb、新抗原肽、來自共用抗原(例如TRP2、gp100、腫瘤細胞裂解物、CD19、CD20、CD22、ROR1、間皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR、MAGE A3 TCR)的肽或其組合。在一些實施方式中，T細胞刺激化合物或腫瘤抗原軛合至或吸附到介孔二氧化矽顆粒之第一群體上。在其中組成物包含介孔二氧化矽顆粒之第二群體的一些實施方式中，該T細胞刺激化合物或腫瘤抗原軛合至介孔二氧化矽顆粒的該第二群體上或軛合至介孔二氧化矽顆粒的該第二群體的表面上的脂質包膜上。在一些實施方式中，組成物還包含細胞介素。在一些實施方式中，細胞介素軛合至或吸附到介孔二氧化矽顆粒的第一或第二群體上。在一些實施方式中，細胞介素係IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21或轉化生長因子β(TGF-β)或其促效劑、其模擬物、其變體、其功能片段，或其組合。在一些實施方式中，介孔二氧化矽顆粒包含直徑2nm-50nm之孔。在一些實施方式中，介孔二氧化矽顆粒的表面積係至少約100m2/g。在一些實施方式中，組成物適合於注射使用。在一些實施方式中，介孔二氧化矽顆粒係介孔二氧化矽棒之形式。
本文還考慮了一種方法，該方法包括：使T淋巴細胞與包含介孔二氧化矽顆粒之第一群體和病毒載體之組成物接觸；
其中該病毒載體包含表現載體，該表現載體包含重組多核苷酸，該重組多核苷酸包含與待表現的核苷酸序列可操作地連接的表現控制序列。在一些實施方式中，接觸在體外進行。在一些實施方式中，T淋巴細胞在與介孔二氧化矽顆粒之第一群體接觸之前或之後被活化。在一些實施方式中，病毒載體軛合至介孔二氧化矽顆粒之第一群體。在一些實施方式中，將病毒載體靜電地或共價地軛合至介孔二氧化矽顆粒之第一群體。在一些實施方式中，介孔二氧化矽顆粒之第一群體係表面經修飾的。在一些實施方式中，在介孔二氧化矽顆粒之第一群體上的表面修飾係-OH(羥基)、胺、羧酸、膦酸酯、鹵化物、疊氮化物、炔、環氧化物、巰基、聚乙烯亞胺、疏水部分、或其鹽，視需要使用C1至C20烷基或(-O(CH2-CH2-)1-25連接子。在一些實施方式中，在介孔二氧化矽顆粒之第一群體上的表面修飾係一級胺、二級胺、三級胺或季胺。在一些實施方式中，介孔二氧化矽顆粒之第一群體係表面用聚乙烯亞胺修飾的，該聚乙烯亞胺之平均分子量係約1000至20,000Da、約1,200至15,000Da、約1,500至12,000Da、約2,000Da、約3,000Da、約4,000Da、約5,000Da、約6,000Da、約7,000Da、約8,000Da、約9,000Da或約10,000Da，如藉由凝膠滲透層析法(GPC)測量。在一些實施方式中，病毒載體係慢病毒、逆轉錄病毒或腺病毒。在一些實施方式中，核苷酸序列編碼嵌合抗原受體(CAR)。在一些實施方式中，將CAR工程改造以靶向腫瘤抗原。在一些實施方式中，藉由使T淋巴細胞與T細胞刺激化合物或腫瘤抗原接觸來活化T淋巴細胞。在一些實施方式中，該T細胞刺激化合物或腫瘤抗原軛合至或吸附到介孔二氧化矽顆粒的該第一群體或介孔二氧化矽顆粒之第二群體上。在一些實施方式中，T細胞刺激化合物或腫瘤抗原軛合至或吸附到介孔二氧化矽顆粒之第一群體上。在一些實施方式中，T細胞刺激化合物或腫瘤抗原直 接軛合至介孔二氧化矽顆粒之第二群體上或直接軛合至介孔二氧化矽顆粒之第二群體的表面上的脂質包膜上。在一些實施方式中，方法還包括使T淋巴細胞與細胞介素接觸。在一些實施方式中，細胞介素在介質中或軛合至或吸附到介孔二氧化矽顆粒的第一或第二群體上。在一些實施方式中，細胞介素係IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21或轉化生長因子β(TGF-β)或其促效劑、其模擬物、其變體、其功能片段，或其組合。在一些實施方式中，介孔二氧化矽顆粒係介孔二氧化矽棒之形式。
本文還考慮了一種利用重組多核苷酸體內遺傳轉導T淋巴細胞之方法，該方法包括：向具有一種或多種T淋巴細胞的受試者投與包含介孔二氧化矽顆粒之第一群體和病毒載體之組成物；其中該病毒載體包含表現載體，該表現載體包含重組多核苷酸，該重組多核苷酸包含與待表現的核苷酸序列可操作地連接的表現控制序列，並且其中當該組成物接觸一種或多種T淋巴細胞時，該T淋巴細胞被該重組多核苷酸遺傳轉導。在一些實施方式中，病毒載體軛合至介孔二氧化矽顆粒之第一群體。在一些實施方式中，將病毒載體靜電地或共價地軛合至介孔二氧化矽顆粒之第一群體。在一些實施方式中，介孔二氧化矽顆粒之第一群體係表面經修飾的。在一些實施方式中，在介孔二氧化矽顆粒之第一群體上的表面修飾係-OH(羥基)、胺、羧酸、膦酸酯、鹵化物、疊氮化物、炔、環氧化物、巰基、聚乙烯亞胺、疏水部分、或其鹽，視需要使用C1至C20烷基或(-O(CH2-CH2-)1-25連接子。在一些實施方式中，在介孔二氧化矽顆粒之第一群體上的表面修飾係一級胺、二級胺、三級胺或季胺。在一些實施方式中，介孔二氧化矽顆粒之第一群體係表面用聚乙烯亞胺修飾的，該聚乙烯亞胺之平均分子量係約1000至20,000Da、約1,200至15,000Da、約1,500至12,000Da、約2,000 Da、約3,000Da、約4,000Da、約5,000Da、約6,000Da、約7,000Da、約8,000Da、約9,000Da或約10,000Da，如藉由凝膠滲透層析法(GPC)測量。在一些實施方式中，病毒載體係慢病毒、逆轉錄病毒或腺病毒。在一些實施方式中，核苷酸序列編碼嵌合抗原受體(CAR)。在一些實施方式中，將CAR工程改造以靶向腫瘤抗原。在一些實施方式中，該組成物還包含軛合至或吸附到介孔二氧化矽顆粒的該第一群體或介孔二氧化矽顆粒之第二群體上的T細胞刺激化合物或腫瘤抗原。在一些實施方式中，T細胞刺激化合物或腫瘤抗原軛合至或吸附到介孔二氧化矽顆粒之第一群體上。在一些實施方式中，該組成物包含介孔二氧化矽顆粒之第二群體，並且其中該T細胞刺激化合物或腫瘤抗原直接軛合至介孔二氧化矽顆粒的該第二群體上或直接軛合至介孔二氧化矽顆粒的該第二群體的表面上的脂質包膜上。在一些實施方式中，介孔二氧化矽顆粒的該第一或第二群體還包含軛合至或吸附到介孔二氧化矽顆粒的該第一或第二群體上的細胞介素。在一些實施方式中，細胞介素係IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21或轉化生長因子β(TGF-β)或其促效劑、其模擬物、其變體、其功能片段，或其組合。在一些實施方式中，受試者的T淋巴細胞在體內擴增。在一些實施方式中，介孔二氧化矽顆粒係介孔二氧化矽棒之形式。
本文還考慮了一種體外擴增T淋巴細胞群體之方法，該方法包括(a)使該T淋巴細胞群體與包含介孔二氧化矽顆粒之第一群體和病毒載體之組成物接觸以提供轉導的T淋巴細胞群體；並且(b)使該轉導的T淋巴細胞群體與T細胞刺激化合物或腫瘤抗原以及視需要的的細胞介素接觸；其中該病毒載體包含表現載體，該表現載體包含重組多核苷酸，該重組多核苷酸包含與待表現的核苷酸序列可操作地連接的表現控制序列。在一些實施方式中，病毒載體軛合至 介孔二氧化矽顆粒之第一群體。在一些實施方式中，將病毒載體靜電地或共價地軛合至介孔二氧化矽顆粒之第一群體。在一些實施方式中，介孔二氧化矽顆粒之第一群體係表面經修飾的。在一些實施方式中，在介孔二氧化矽顆粒之第一群體上的表面修飾係-OH(羥基)、胺、羧酸、膦酸酯、鹵化物、疊氮化物、炔、環氧化物、巰基、聚乙烯亞胺、疏水部分、或其鹽，視需要使用C1至C20烷基或(-O(CH2-CH2-)1-25連接子。在一些實施方式中，在介孔二氧化矽顆粒之第一群體上的表面修飾係一級胺、二級胺、三級胺或季胺。在一些實施方式中，介孔二氧化矽顆粒之第一群體係表面用聚乙烯亞胺修飾的，該聚乙烯亞胺之平均分子量係約1000至20,000Da、約1,200至15,000Da、約1,500至12,000Da、約2,000Da、約3,000Da、約4,000Da、約5,000Da、約6,000Da、約7,000Da、約8,000Da、約9,000Da或約10,000Da，如藉由凝膠滲透層析法(GPC)測量。在一些實施方式中，病毒載體係慢病毒、逆轉錄病毒或腺病毒。在一些實施方式中，核苷酸序列編碼嵌合抗原受體(CAR)。在一些實施方式中，將CAR工程改造以靶向腫瘤抗原。在一些實施方式中，T細胞刺激化合物或腫瘤抗原軛合至或吸附到介孔二氧化矽顆粒之第一群體或介孔二氧化矽顆粒之第二群體上，並且其中T細胞刺激化合物或腫瘤抗原係IL-2、IL-15、抗CD2 mAb、抗CD3 mAb、抗CD28 mAb、新抗原肽、CD19、CD20、CD22、ROR1、間皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR、MAGE A3 TCR，或其組合。在一些實施方式中，T細胞刺激化合物或腫瘤抗原軛合至或吸附到介孔二氧化矽顆粒之第一群體上。在包含介孔二氧化矽顆粒之第二群體的一些實施方式中，該T細胞刺激化合物或腫瘤抗原軛合至介孔二氧化矽顆粒的該第二群體上或軛合至介孔二氧化矽顆粒的該第二群體的表面上的脂質包膜上。在一些實施方式中， 該方法還包括：(c)使T淋巴細胞與細胞介素接觸；其中該細胞介素係IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21或轉化生長因子β(TGF-β)或其促效劑、其模擬物、其變體、其功能片段，或其組合。在一些實施方式中，介孔二氧化矽顆粒係介孔二氧化矽棒之形式。
本文還考慮了一種治療患有與腫瘤抗原的表現升高相關的疾病、障礙或病症的受試者之方法，該方法包括：向該受試者投與包含介孔二氧化矽顆粒之第一群體和病毒載體之組成物，其中該病毒載體包含重組多核苷酸，該重組多核苷酸包含表現控制序列，該表現控制序列與編碼嵌合抗原受體(CAR)的核苷酸序列可操作地連接，該嵌合抗原受體被工程改造以靶向該腫瘤抗原，從而治療該受試者。在一些實施方式中，病毒載體軛合至介孔二氧化矽顆粒之第一群體。在一些實施方式中，將病毒載體靜電地或共價地軛合至介孔二氧化矽顆粒之第一群體。在一些實施方式中，介孔二氧化矽顆粒之第一群體係表面經修飾的。在一些實施方式中，在介孔二氧化矽顆粒之第一群體上的表面修飾係-OH(羥基)、胺、羧酸、膦酸酯、鹵化物、疊氮化物、炔、環氧化物、巰基、聚乙烯亞胺、疏水部分、或其鹽，視需要使用C1至C20烷基或(-O(CH2-CH2-)1-25連接子。在一些實施方式中，在介孔二氧化矽顆粒之第一群體上的表面修飾係一級胺、二級胺、三級胺或季胺。在一些實施方式中，介孔二氧化矽顆粒之第一群體係表面用聚乙烯亞胺修飾的，該聚乙烯亞胺之平均分子量係約1000至20,000Da、約1,200至15,000Da、約1,500至12,000Da、約2,000Da、約3,000Da、約4,000Da、約5,000Da、約6,000Da、約7,000Da、約8,000Da、約9,000Da或約10,000Da，如藉由凝膠滲透層析法(GPC)測量。在某些實施方案中，病毒載體係慢病毒、逆轉錄病毒或腺病毒。在一些實施方式中，該組成 物還包含軛合至或吸附到介孔二氧化矽顆粒的該第一群體或介孔二氧化矽顆粒之第二群體上的T細胞刺激化合物或腫瘤抗原。在一些實施方式中，T細胞刺激化合物或腫瘤抗原軛合至或吸附到介孔二氧化矽顆粒之第一群體上。在其中組成物包含介孔二氧化矽顆粒之第二群體的一些實施方式中，T細胞刺激化合物或腫瘤抗原直接軛合至介孔二氧化矽顆粒之第二群體上或直接軛合至介孔二氧化矽顆粒之第二群體的表面上的脂質包膜上，並且T細胞刺激化合物或腫瘤抗原係IL-2、IL-15、抗CD2 mAb、抗CD3 mAb、抗CD28 mAb、新抗原肽、CD19、CD20、CD22、ROR1、間皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR、MAGE A3 TCR，或其組合。在一些實施方式中，介孔二氧化矽顆粒的該第一或第二群體還包含軛合至或吸附到介孔二氧化矽顆粒的該第一或第二群體上的細胞介素。在一些實施方式中，細胞介素係IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21或轉化生長因子β(TGF-β)或其促效劑、其模擬物、其變體、其功能片段，或其組合。在一些實施方式中，介孔二氧化矽顆粒係介孔二氧化矽棒之形式。
本文還考慮了一種將病毒載體遞送至受試者中所需的作用位點之方法，該方法包括向該受試者投與包含介孔二氧化矽顆粒之第一群體和病毒載體之組成物。在一些實施方式中，病毒載體軛合至介孔二氧化矽顆粒之第一群體。在一些實施方式中，將病毒載體靜電地或共價地軛合至介孔二氧化矽顆粒之第一群體。在一些實施方式中，介孔二氧化矽顆粒之第一群體係表面經修飾的。在一些實施方式中，在介孔二氧化矽顆粒之第一群體上的表面修飾係C1-20烷基胺、C1-20羧酸、C1-20疊氮化物和取代或未取代的C1-20烷基。在一些實施方式中，在介孔二氧化矽顆粒之第一群體上的表面修飾係一級胺、二級胺、三級胺 或季胺。在一些實施方式中，病毒載體係逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒或慢病毒。在一些實施方式中，介孔二氧化矽顆粒之第一群體包含直徑2nm-50nm之孔。在一些實施方式中，介孔二氧化矽顆粒之第一群體的表面積係至少約100m2/g。在一些實施方式中，介孔二氧化矽顆粒係介孔二氧化矽棒之形式。
本文還考慮了一種擴增嵌合抗原受體(CAR)T(CAR-T)細胞群體之方法，該方法包括使該CAR-T細胞群體與軛合至靶向部分的介孔二氧化矽顆粒接觸，其中該靶向部分與該CAR互補。在一些實施方式中，CAR係經工程改造以靶向腫瘤抗原之蛋白質。在一些實施方式中，腫瘤抗原選自由以下項組成之群組：TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、間皮素、IL-11Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、葉酸受體α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受體、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪胺酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙醯基-GD2、葉酸受體β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、豆莢蛋白、HPV E6、HPV E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相關抗原1、p53、p53突變體、前列腺特異性蛋白、存活素和端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MART1、 Ras突變體、hTERT、肉瘤易位中斷點、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄性激素受體、週期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆轉錄酶、RU1、RU2、腸道羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、以及其任何組合。在一些實施方式中，介孔二氧化矽顆粒係介孔二氧化矽棒之形式。
本文還考慮了包含與聚乙烯亞胺軛合的介孔二氧化矽顆粒之組成物。在一些實施方式中，介孔二氧化矽顆粒係介孔二氧化矽棒之形式。在一些實施方式中，組成物還包含活性劑。在一些實施方式中，活性劑被吸收或吸附在介孔二氧化矽顆粒上。
本文還考慮了一種將活性劑遞送至受試者中所需的作用位點之方法，該方法包括向該受試者投與包含軛合至聚乙烯亞胺的介孔二氧化矽顆粒並且還包含活性劑之組成物。在一些實施方式中，活性劑被吸收或吸附在介孔二氧化矽顆粒上。在一些實施方式中，組成物提供了活性劑向受試者的持續遞送。
本文還考慮了一種治療患有疾病、障礙或病症的受試者之方法，該方法包括：向該受試者投與包含與聚乙烯亞胺軛合的介孔二氧化矽顆粒並且還包含活性劑之組成物。在一些實施方式中，活性劑被吸收或吸附在介孔二氧化矽顆粒上。在一些實施方式中，該疾病、障礙或病症與腫瘤抗原相關。
本文還考慮了包含軛合至聚乙烯亞胺的介孔二氧化矽顆粒並且還包含活性劑之組成物，該組成物用於治療患有疾病、障礙、或病症的受試者 之方法。在一些實施方式中，活性劑被吸收或吸附在介孔二氧化矽顆粒上。在一些實施方式中，該疾病、障礙或病症與腫瘤抗原相關。本文還考慮了包含如本文所述製造的細胞之組成物，該組成物用於在治療患有疾病、障礙或病症的受試者之方法中使用。在一些實施方式中，該疾病、障礙或病症與腫瘤抗原相關。
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[圖1]顯示介孔二氧化矽顆粒上的一系列表面修飾。
[圖2]顯示將病毒包膜蛋白(VSV-G)假型慢病毒吸附到MSR上後，MSR表面上的VSV-G染色之結果。對照MSR顯示在上圖，並且病毒孵育的棒顯示在下圖。
[圖3]係MSR上的病毒吸附和T細胞轉導之示意圖。
[圖4]提供與游離慢病毒或結合MSR的慢病毒孵育的T細胞之GFP表現結果。如圖所示，從40μg/ml的起始濃度開始稀釋病毒包被的MSR。「1x慢病毒」條件等同於用MSR條件孵育的病毒數量。「2x慢病毒」條件等同於用於包被MSR條件之數量的兩倍。
[圖5]提供MSR表面上配位基呈遞的總體策略之示意圖。將脂質體與MSR一起孵育以形成支撐的脂質雙層。可以使用鏈黴親和素-生物素相互作用將配位基偶聯至MSR-脂質雙層。
[圖6]示出用POPC脂質體包被的MSR的圖片，該POPC脂質體含有1mol% PE-羧基螢光素。亮場(左)、螢光(中)、和重疊(右)圖像被示出。
[圖7]描述EGFRvIII CAR結合肽的肽序列(LEEKKGNYVVTDH(SEQ ID NO：674))。
[圖8]說明藉由肽固定在MSR上，EGFRvIII CART的細胞介素產生。結果提供與對照條件相比，由呈遞EGFRvIII CAR結合肽的、脂質包被的MSR(脂質包被中有1% PE-生物素)刺激的EGFRvIII CART的干擾素-γ和介白素2的產生。
[圖9]說明藉由肽固定在MSR上，EGFRvIII CART之增殖。將0.01% PE-生物素的脂質包被的MSR組成物用於肽固定，並且孔中的MSR濃度為30μg/ml。在指示條件下培養的第7天進行細胞計數。
[圖10A和10B]說明藉由肽固定在MSR上，EGFRvIII CART之增殖和最終細胞組成物。起始MSR濃度為50μg/ml，並且從該起始濃度開始的MSR的稀釋度如軸所示。圖10A：在培養期結束時，在所示材料情況下的CD4和CD8 T細胞之百分比。圖10B：在3天的培養期內，使用具有不同量的EGFRvIII CAR結合肽的MSR(在MSR表面上帶有或不帶有抗CD28)，對稀釋CFSE的CD8+和CD4+ CAR T細胞的FACS分析。
[圖11A和11B]說明藉由BCMA蛋白固定在MSR上，BCMA CART之增殖和最終細胞組成物。起始MSR濃度為50μg/ml，並且從該起始濃度開始的MSR的稀釋度如軸所示。圖11A：在培養期結束時，在所示材料情況下的CD4和CD8 T細胞之百分比。圖11B：在3天的培養期內，使用具有不同量的EGFRvIII CAR結合肽的MSR(在MSR表面上帶有或不帶有抗CD28)，對稀釋CFSE的CD8+和CD4+ CAR T細胞的FACS分析。
[圖12]顯示根據一些實施方式的使用MSR同時刺激和轉導未刺激的人T細胞之示意圖。創建兩個MSR群體-1)呈遞激動性CD3/CD28抗體來用於刺激T細胞的MSR，2)帶正電的PEI-MSR，其已與慢病毒結合來促進向T細胞之病毒遞送。可以將兩種類型的MSR以不同的比例混合在一起，以調整刺激和T細胞所暴露的病毒之數量。
[圖13]說明暴露於刺激性(固定抗CD3/CD28抗體的MSR)和與病毒一起孵育的PEI-MSR的T細胞之轉導效率。T細胞與不同數量的刺激棒一起孵育(刺激1.00代表70μg/ml MSR)，並以不同感染複數(MOI)(與PEI-MSR結合或呈游離病毒形式)暴露於GFP-慢病毒。在病毒條件下，MSR之最高濃度為22μg/ml。
[圖14]說明暴露於刺激性(固定抗CD3/CD28抗體的)MSR和與病毒一起孵育的PEI-MSR的T細胞之轉導效率。圖示出在各種病毒總量下，作為刺激性MSR濃度的函數之轉導效率。刺激性MSR條件1.0的MSR濃度為70μg/ml。PEI MSR條件1中的MSR濃度為22μg/ml。在培養開始後3天對轉導進行評估。
[圖15]提供比較病毒遞送策略之轉導效率之結果。在「PEI」和「游離」條件下，用「高」水平的與MSR(MSR濃度為70μg/ml)結合的CD3/CD28抗體刺激T細胞，並分別給予與PEI-MSR相關的或在介質中游離遞送的病毒(病毒濃度1.0含有22μg/ml MSR，MOI約6.7)。在「PEI+CD3/CD28」中，病毒和CD3/CD28激動性抗體與PEI-MSR(濃度1.0為22μg/ml MSR)結合。在培養開始後3天對轉導進行評估。
[圖16]提供比較各種遞送策略在PBMC群體中的轉導之結果。將如圖15所示的條件添加到PBMC。對在每種細胞類型中的轉導的細胞的比例進行定量。在培養開始後3天對轉導進行評估。
[圖17]提供在各種病毒遞送策略情況下在PBMC中的不同轉導分數。上圖提供了在圖15的條件下PBMC群體中存在之總細胞組成。下圖提供在使用圖15的條件進行病毒遞送後存在的轉導的細胞級分之組成。在培養開始後3天對轉導進行評估。
定義
除非另外定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同含義。
術語「一個/種(a/an)」係指一個/種或多於一個/種(即，至少一個/種)該冠詞的語法賓語。藉由舉例，「一個元件」意指一個元件或多於一個元件。
當指可測量的值如量、時距等時，術語「約」意在涵蓋與規定值±20%或在一些情況下±10%、或在一些情況下±5%、或在一些情況下±1%、或在一些情況下±0.1%的變化，因為此類變化適於執行所揭露之方法。
術語「嵌合抗原受體」或者「CAR」係指重組多肽構建體，該重組多肽構建體至少包含細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和包含源自如下定義的刺激分子的功能性傳訊結構域的胞質傳訊結構域(本文還稱為「細胞內傳訊結構域」)。在一些實施方式中，CAR多肽構建體中的結構域在同一多肽鏈 中，例如包含嵌合融合蛋白。在一些實施方式中，例如，如在如本文所述之RCAR中所提供，CAR多肽構建體中的結構域彼此不連續，例如在不同的多肽鏈中。
在一些方面，胞質傳訊結構域包含初級傳訊結構域(例如CD3-ζ的初級傳訊結構域)。在一些方面，胞質傳訊結構域還包含源自如下定義的至少一種共刺激分子的一個或多個功能性傳訊結構域。在一些方面，共刺激分子選自41BB(即，CD137)、CD27、ICOS和/或CD28。在一些方面，CAR包含嵌合融合蛋白(其包含細胞外抗原識別結構域)、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域(其包含源自刺激分子之功能傳訊結構域)。在一些方面，CAR包含嵌合融合蛋白(其包含細胞外抗原識別結構域)、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域(其包含源自共刺激分子之功能傳訊結構域和源自刺激分子之功能傳訊結構域)。在一些方面，CAR包含嵌合融合蛋白(其包含細胞外抗原識別結構域)|跨膜結構域和細胞內傳訊結構域(其包含源自一種或多種共刺激分子的兩個功能傳訊結構域和源自刺激分子之功能傳訊結構域)。在一些方面，CAR包含嵌合融合蛋白(其包含細胞外抗原識別結構域)|跨膜結構域和細胞內傳訊結構域(其包含源自一種或多種共刺激分子的至少兩個功能傳訊結構域和源自刺激分子之功能傳訊結構域)。在一些方面，CAR包含CAR融合蛋白的胺基-末端(N-ter)的視需要的之前導序列。在一些方面，CAR還包含在細胞外抗原識別結構域的N末端之前導序列，其中前導序列視需要在細胞加工和CAR定位至細胞膜期間從抗原識別結構域(例如，scFv)切割。
包含靶向特定腫瘤標記X的抗原結合結構域(例如，scFv(單結構域抗體)或TCR(例如，TCRα結合結構域或TCRβ結合結構域))的CAR(其中X可為如本文所述之腫瘤標記)也稱為XCAR。例如，包含靶向BCMA的抗原 結合結構域的CAR被稱為BCMA CAR。CAR可以在任何細胞中表現，例如，如本文所述之免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)。
術語「傳訊結構域」係指蛋白質的功能性部分，其藉由在細胞內傳遞資訊以藉由產生第二傳訊者或藉由響應於此類傳訊者而用作效應子，經由定義的傳訊途徑調控細胞活性起作用。
如本文所用，術語「抗體」係指源自與抗原特異性地結合的免疫球蛋白分子之蛋白質或多肽序列。抗體可為多株或單株、多鏈或單鏈、或完整免疫球蛋白，並且可以源自天然來源或來自重組來源。抗體可為免疫球蛋白分子的四聚體。
術語「抗體片段」係指抗體的至少一部分，該部分保留與抗原表位特異性地相互作用(例如，藉由結合、空間位阻、穩定/去穩定、空間分佈)的能力。抗體片段之實例包括但不限於Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗體片段、二硫鍵連接的Fv(sdFv)、由VH和CH1結構域組成的Fd片段、線性抗體、單結構域抗體如sdAb(VL或VH)、駱駝科VHH結構域、由抗體片段(如包含在鉸鏈區藉由二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段)形成的多特異性抗體、和分離的CDR、或抗體的其他表位結合片段。抗原結合片段還可以摻入到單結構域抗體、大型抗體(maxibodies)、微型抗體(minibodies)、奈米抗體、細胞內抗體、雙體抗體、三體抗體、四體抗體、v-NAR和bis-scFv中(參見例如，Hollinger和Hudson,Nature Biotechnology[自然生物技術]23：1126-1136,2005)。還可以將抗原結合片段移植到基於多肽如纖網蛋白III型(Fn3)的支架中(參見美國專利案號6,703,199，其描述了纖網蛋白多肽微型抗體)。
包含抗體或其抗體片段的本發明CAR部分可以按多種形式存在，其中抗原結合結構域表現為連續多肽鏈的一部分，該連續多肽鏈包括例如單結構域抗體片段(sdAb)、單鏈抗體(scFv)、人源化抗體或雙特異性抗體(Harlow等人，1999：Using Antibodies：A Laboratory Manual[使用抗體：實驗室手冊],Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港實驗室出版社]，紐約；Harlow等人，1989：Antibodies：A Laboratory Manual[抗體：實驗室手冊]，Cold Spring Harbor[冷泉港]，紐約；Houston等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美國國家科學院院刊]85：5879-5883；Bird等人，1988,Science[科學]242：423-426)。在一些方面，本發明之CAR組成物的抗原結合結構域包含抗體片段。在另一個方面，CAR包含含有scFv的抗體片段。給定CDR的精確胺基酸序列邊界可以使用許多眾所周知的方案中的任一種來確定，該等方案包括由以下文獻描述的那些：Kabat等人(1991),「Sequences of Proteins of Immunological Interest」[具有免疫學重要性的蛋白序列]，第5版，美國國立衛生研究院，公共衛生事業部，馬里蘭州貝塞斯達市(「卡巴特」編號方案)；Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273,927-948(「喬西亞」編號方案)、或其組合。
如本文所用，術語「結合結構域」或「抗體分子」係指包含至少一個免疫球蛋白可變結構域序列之蛋白質，例如免疫球蛋白鏈或其片段。術語「結合結構域」或「抗體分子」涵蓋抗體和抗體片段。在一些實施方式中，抗體分子係多特異性抗體分子，例如其包含多個免疫球蛋白可變結構域序列，其中該多個中的第一免疫球蛋白可變結構域序列對第一表位具有結合特異性並且該多個中的第二免疫球蛋白可變結構域序列對第二表位具有結合特異性。在一些實施方式中，多特異性抗體分子係雙特異性抗體分子。雙特異性抗體對不多 於兩種抗原具有特異性。雙特異性抗體分子的特徵在於具有對第一表位的結合特異性的第一免疫球蛋白可變結構域序列、和具有對第二表位的結合特異性的第二免疫球蛋白可變結構域序列。
術語「抗體重鏈」係指抗體分子中天然存在的構象中存在的兩種類型多肽鏈中較大的一種，並且通常決定抗體所屬的類別。
術語「抗體輕鏈」係指抗體分子中天然存在的構象中存在的兩種類型多肽鏈中較小的一種。κ(kappa)和λ(lambda)輕鏈係指兩種主要的抗體輕鏈同種型。
術語「重組抗體」係指使用重組DNA技術產生的抗體，例如像由噬菌體或酵母表現系統表現的抗體。該術語還應解釋為意指藉由合成編碼抗體的DNA分子和表現抗體蛋白的DNA分子或指定抗體的胺基酸序列產生的抗體，其中該DNA或胺基酸序列已經使用本領域可得和熟知的重組DNA或胺基酸序列技術獲得。
術語「抗原」或「Ag」係指引起免疫應答的分子。免疫應答可以涉及抗體產生或特定免疫活性細胞的活化或兩者。技術人員將理解實際上包括所有蛋白質或肽的任何大分子都可以充當抗原。此外，抗原可以源自重組或基因組DNA。技術人員將理解包含編碼引發免疫應答之蛋白質的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA都因此編碼「抗原」(當該術語在本文中使用時)。此外，熟悉該項技術者將理解抗原不需要僅由基因的全長核苷酸序列編碼。顯而易見的是，本發明包括但不限於使用多於一種基因的部分核苷酸序列，並且該等核苷酸序列以各種組合排列以編碼引發所希望的免疫應答的多肽。另外，技術人員將理解抗原根本不需要由「基因」編碼。顯而易見的是，抗原可以合 成或可以源自生物樣本，或者可為除多肽外之大分子。這種生物樣本可以包括但不限於組織樣本、腫瘤樣本、細胞或具有其他生物組分之流體。
術語「抗癌作用」係指可以藉由各種手段顯現的生物學作用，包括但不限於例如腫瘤體積減少、癌細胞數量減少、轉移數量減少、預期壽命延長、癌細胞增生減少、癌細胞存活率降低、或改善與癌症相關的各種生理症狀。「抗癌作用」還可以藉由肽、多核苷酸、細胞和抗體首先預防癌症發生之能力來顯現。術語「抗腫瘤作用」係指可以藉由各種手段顯現的生物學作用，包括但不限於例如腫瘤體積減少、腫瘤細胞數量減少、腫瘤細胞增生減少、或腫瘤細胞存活率降低。
術語「自體的」係指源自與後來將其重新引入個體中的同一個體的任何材料。
術語「同種異體的」係指源自與引入材料的個體相同的物種的不同動物之任何材料。當一個或多個基因座處的基因不相同時，稱兩個或更多個個體彼此是同種異體的。在一些方面，來自相同物種的個體的同種異體材料可以在遺傳上充分不同以抗原性地相互作用。
術語「異種的」係指源自不同物種的動物之移植物。
術語「癌症」係指特徵在於異常細胞不受控制生長之疾病。癌細胞可以局部或通過血流和淋巴系統擴散到身體的其他部位。本文描述了各種癌症之實例，並且包括但不限於乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、皮膚癌、胰臟癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。術語「腫瘤」和「癌症」在本文中可互換使用，例如，這兩個術語包括實體和液體，例 如彌散或循環腫瘤。如本文所用，該術語「癌症」或「腫瘤」包括惡化前以及惡性癌症和腫瘤。
「源自」(當該術語在本文中使用時)表示第一分子和第二分子之間的關係。它通常是指第一分子和第二分子之間的結構相似性，並不暗示或包括對源自第二分子的第一分子的過程或來源的限制。例如，在源自CD3ζ分子的細胞內傳訊結構域之情況下，細胞內傳訊結構域保留足夠的CD3ζ結構，這樣使得其具有所需的功能，即在適當條件下產生訊號的能力。它沒有暗示或包括對產生細胞內傳訊結構域的特定過程之限制，例如，它並不意指為了提供細胞內傳訊結構域，必須從CD3ζ序列開始並刪除不需要的序列，或強加突變，以到達細胞內傳訊結構域。
短語「與如本文描述的腫瘤抗原的表現相關的疾病」包括但不限於與如本文描述的腫瘤抗原的表現相關的疾病或與表現如本文描述的腫瘤抗原的細胞相關之病症，包括例如增生性疾病(如癌症或惡性腫瘤)或癌前病症(如骨髓化生不良、骨髓化生不良症候群或前白血病)；或與表現如本文描述的腫瘤抗原的細胞相關之非癌症相關適應症。在一些方面，與如本文描述的腫瘤抗原的表現相關之癌症係血液癌症。在一些方面，與如本文描述的腫瘤抗原的表現相關之癌症係實體癌。與本文描述的腫瘤抗原的表現相關的其他疾病包括但不限於例如非典型和/或非經典癌症、惡性腫瘤、癌前病症或與如本文描述的腫瘤抗原的表現相關的增生性疾病。與如本文描述的腫瘤抗原的表現相關的非癌症相關適應症包括但不限於例如自體免疫性疾病(例如狼瘡)、炎性病症(過敏症和氣喘)和移植。在一些實施方式中，表現腫瘤抗原的細胞表現或在任何時間表現編碼腫瘤抗原的mRNA。在一些實施方式中，表現腫瘤抗原的細胞產生 腫瘤抗原蛋白(例如野生型或突變體)，並且腫瘤抗原蛋白可以以正常水平或降低的水平存在。在一些實施方式中，表現腫瘤抗原的細胞在一個時間點產生可檢測水平的腫瘤抗原蛋白，並且隨後基本上不產生可檢測的腫瘤抗原蛋白。
術語「刺激」係指藉由刺激分子(例如，TCR/CD3複合物或CAR)與其同源配位基(或在CAR情況下的腫瘤抗原)的結合誘導之初級應答，從而介導訊息傳導事件，如但不限於，藉由TCR/CD3複合物的訊息傳導或藉由適當的NK受體或CAR的傳訊結構域之訊息傳導。刺激可以介導某些分子的改變的表現。
術語「刺激分子」係指由免疫細胞(例如T細胞、NK細胞、B細胞)表現的分子，其提供以針對免疫細胞傳訊通路的至少一些方面的刺激方式調節免疫細胞啟動的一個或多個細胞質傳訊序列。在一些方面，訊號係初級訊號，該初級訊號藉由例如TCR/CD3複合物與載有肽的MHC分子的結合而活化，並且導致了介導T細胞應答，包括但不限於增殖、活化、分化等。以刺激方式起作用的初級胞質傳訊序列(也稱為「初級傳訊結構域」)可以含有被稱為基於免疫受體酪胺酸的活化模體或ITAM的傳訊模體。在本發明中特別有用的含有ITAM的細胞質傳訊序列之實例包括但不限於源自CD3ζ、常見FcRγ(FCER1G)、Fcγ RIIa、FcRβ(Fcε R1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12的那些。在本發明之特定CAR中，本發明之任何一種或多種CAR中的細胞內傳訊結構域包含細胞內傳訊序列，例如CD3-ζ的初級傳訊序列。在本發明之特定CAR中，CD3-ζ的初級傳訊序列係提供為SEQ ID NO：18的序列，或來自非人物種的等同殘基，例如小鼠、齧齒動物、猴子、猿等。在本發明之特定CAR 中，CD3-ζ的初級傳訊序列係SEQ ID NO：20中提供的序列，或來自非人物種(例如小鼠、齧齒動物、猴、猿等)的等同殘基。
術語「抗原呈遞細胞」或「APC」係指免疫系統細胞如輔助細胞(例如，B細胞、樹突細胞等)，該免疫系統細胞在其表面上展示與主要組織相容性複合物(MHC)複合的外源抗原。T細胞可以使用它們的T細胞受體(TCR)識別該等複合物。APC處理抗原並將它們呈遞給T細胞。
如本文所用的術語「細胞內傳訊結構域」係指分子的細胞內部分。細胞內傳訊結構域產生訊號，該訊號促進含有CAR的細胞(例如CART細胞)的免疫效應子功能。免疫效應子功能之實例，例如在CART細胞中，包括細胞溶解活性和輔助活性(包括分泌細胞介素)。
在一些實施方式中，細胞內傳訊結構域可以包含初級細胞內傳訊結構域。示例性初級細胞內傳訊結構域包含源自負責初級刺激、或抗原依賴性模擬的分子的那些。在一些實施方式中，細胞內傳訊結構域可以包含共刺激細胞內結構域。示例性共刺激細胞內傳訊結構域包含源自負責共刺激訊號、或抗原非依賴性刺激的分子的那些。例如，在CART之情況下，初級細胞內傳訊結構域可以包括T細胞受體的胞質序列，並且共刺激細胞內傳訊結構域可以包括來自共受體或共刺激分子的胞質序列。
初級細胞內傳訊結構域可以包含被稱為基於免疫受體酪胺酸的活化模體或ITAM的傳訊模體。含有初級細胞質傳訊序列的ITAM之實例包括但不限於源自以下的那些：CD3ζ、常見FcRγ(FCER1G)、Fcγ RIIa、FcRβ(Fcε R1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12。
術語「ζ」或者「ζ鏈」、「CD3-ζ」或「TCR-ζ」係指CD247。Swiss-Prot登錄號P20963提供了示例性的人CD3ζ胺基酸序列。「ζ刺激結構域」或者「CD3-ζ刺激結構域」或「TCR-ζ刺激結構域」係指CD3-ζ或其變體的刺激結構域(例如，具有突變(例如，點突變)、片段、插入或缺失的分子)。在一些實施方式中，ζ的胞質結構域包含GenBank登錄號BAG36664.1或其變體的殘基52至164(例如，具有突變(例如，點突變)、片段、插入或缺失的分子)。在一些實施方式中，「ζ刺激結構域」或「CD3-ζ刺激結構域」係SEQ ID NO：9或10提供的序列或其變體(例如，具有突變(例如，點突變)、片段、插入或缺失的分子)。可替代地或另外地，術語「ζ」或可替代地「ζ鏈」、「CD3-ζ」(或「CD3ζ、CD3 ζ或CD3z)或「TCR-ζ」被定義為以GenBan登錄號BAG36664.1提供之蛋白質或來自非人物種例如小鼠、齧齒動物、猴子、猿等的等效殘基，並且「ζ刺激結構域」或可替代地「CD3-ζ刺激結構域」或「TCR-ζ刺激結構域」被定義為來自ζ鏈的細胞質結構域的胺基酸殘基或其功能衍生物，其足以在功能上傳遞T細胞活化所必需的初始訊號。在一些方面，ζ的細胞質結構域包含GenBank登錄號BAG36664.1的殘基52至164或係其功能性異種同源物的來自非人物種(例如小鼠、齧齒動物、猴、猿等)的等效殘基。在一些方面，「ζ刺激結構域」或「CD3-ζ刺激結構域」係提供為SEQ ID NO：18的序列。在一些方面，「ζ刺激結構域」或「CD3-ζ刺激結構域」係提供為SEQ ID NO：20的序列。
術語「共刺激分子」係指T細胞上與共刺激配位基特異性結合、從而介導T細胞的共刺激應答(如但不限於增殖)之同源結合配偶體。共刺激分子係除抗原受體或其配位基之外的細胞表面分子，其有助於高效的免疫應答。共刺激分子包括但不限於MHC I類分子、BTLA和Toll配位基受體、以及OX40、 CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、以及4-1BB(CD137)。此類共刺激分子的其他實例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、和特異性地結合CD83的配位基。
共刺激細胞內傳訊結構域可為共刺激分子的細胞內部分。共刺激分子可以在以下蛋白質家族中表示：TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞介素受體、整聯蛋白、傳訊淋巴細胞活化分子(SLAM蛋白)和活化型NK細胞受體。此類分子之實例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、ICAM-1、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)、CD2、CDS、CD7、CD287、LIGHT、NKG2C、NKG2D、SLAMF7、NKp80、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、B7-H3、以及與CD83特異性地結合的配位基等。
細胞內傳訊結構域可以包含衍生它的分子的整個細胞內部分或整個天然細胞內傳訊結構域，或其功能片段或衍生物。
當該術語在本文中使用時，「免疫效應細胞」係指參與免疫應答(例如促進免疫效應子應答)之細胞。免疫效應細胞之實例包括T細胞，例如α/β T細胞和γ/δ T細胞、B細胞、天然殺傷(NK)細胞、天然殺傷T(NKT)細胞、肥大細胞、和骨髓來源的吞噬細胞。
當該術語在本文中使用時，「免疫效應子功能或免疫效應子應答」係指例如免疫效應細胞的增強或促進靶細胞的免疫攻擊的功能或應答。例如，免疫效應子功能或應答係指T細胞或NK細胞的促進靶細胞的殺傷或抑制生長或增生的特性。在T細胞之情況下，初級刺激和共刺激係免疫效應子功能或應答之實例。
術語「編碼(encoding或encode)」係指多核苷酸(如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列用作在生物過程中用於合成具有確定核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或確定胺基酸序列的其他聚合物和大分子的模板的固有特性，以及由此產生的生物學特性。因此，如果與基因對應的mRNA的轉錄和翻譯在細胞或其他生物系統中產生蛋白質，則該基因、cDNA或RNA編碼該蛋白質。編碼股(其核苷酸序列與mRNA序列相同並且通常在序列表中提供)和非編碼股(用作基因或cDNA轉錄的模板)都可以稱為編碼蛋白質或者該基因或cDNA的其他產物。
除非另外說明，否則「編碼胺基酸序列的核苷酸序列」包括彼此呈簡並形式且編碼相同胺基酸序列的所有核苷酸序列。短語編碼蛋白質或RNA的核苷酸序列還可以包含內含子，其程度為編碼該蛋白質的核苷酸序列可以在某些形式中含有一個或多個內含子。
術語「有效量」或「治療有效量」在本文中可互換使用，並且是指如本文描述的化合物、配製物、材料或組成物的有效於實現特定的生物學結果的量。
術語「內源的」係指來自生物體、細胞、組織或系統或在其內部產生的任何材料。
術語「外源的」係指從生物體、細胞、組織或系統引入或在其外部產生的任何材料。
術語「表現」係指由啟動子驅動的特定核苷酸序列的轉錄和/或翻譯。
術語「轉移載體」係指包含分離的核酸並且可用於向細胞內部遞送該分離的核酸的物質組成物。許多載體在本領域中是已知的，包括但不限於線性多核苷酸、與離子化合物或兩親化合物相關的多核苷酸、質體、以及病毒。因此，術語「轉移載體」包括自主複製的質體或病毒。該術語還應當解釋為還包括促進將核酸轉移到細胞中的非質體和非病毒化合物，例如像聚離胺酸化合物、脂質體等。病毒轉移載體之實例包括但不限於腺病毒載體、腺相關病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體等。
術語「表現載體」係指包含重組多核苷酸的載體，該重組多核苷酸包含與有待表現的核苷酸序列可操作地連接的表現控制序列。表現載體包含足夠的用於表現的順式作用元件；用於表現的其他元件可以由宿主細胞提供或在體外表現系統中提供。表現載體包括本領域已知的所有表現載體，包括摻入重組多核苷酸的黏粒、質體(例如，裸露的或包含在脂質體中)和病毒(例如，慢病毒、逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒，「病毒載體」)。
術語「慢病毒」係指逆轉錄病毒科的一個屬。慢病毒在逆轉錄病毒中是獨特的，能夠感染非分裂細胞；它們可以將顯著量的遺傳信息遞送到宿主細胞的DNA中，因此它們係基因遞送載體的最有效方法中的一種。HIV、SIV、和FIV都是慢病毒之實例。
術語「慢病毒載體」係指源自慢病毒基因組的至少一部分的載體，尤其包括如下提供的自滅活慢病毒載體：Milone等人，Mol.Ther.[分子療法]17(8)：1453-1464(2009)。可以在臨床中使用的慢病毒載體的其他實例包括但不限於例如來自牛津生物醫藥公司(Oxford BioMedica)的LENTIVECTOR®基因遞送技術、來自Lentigen公司的LENTIMAXTM載體系統等。非臨床類型的慢病毒載體也是可得的並且是熟悉該項技術者已知的。
術語「同源的」或「同一性」係指兩個聚合分子之間，例如兩個核酸分子(如兩個DNA分子或兩個RNA分子)之間或兩個多肽分子之間的亞模體列同一性。當這兩個分子中的亞基位置被相同的單體亞基佔據時；例如，如果兩個DNA分子的每一個中的位置被腺嘌呤佔據，則它們在該位置係同源的或相同的。兩個序列之間的同源性係匹配或同源位置數的直接函數；例如，如果兩個序列中該等位置的一半(例如，長度為10個亞基的聚合物中的5個位置)係同源的，則這兩個序列係50%同源的；如果該等位置的90%(例如，10個中的9個)係匹配的或同源的，則這兩個序列係90%同源的。
非人(例如鼠)抗體的「人源化」形式係嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體的其他抗原結合子序列)，其含有來自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多數情況下，人源化抗體及其抗體片段係人免疫球蛋白(受體抗體或抗體片段)，其中來自受體的互補決定區 (CDR)的殘基被來自非人物種(供體抗體)(如具有所希望的特異性、親和力、和能力的小鼠、大鼠或兔)的CDR的殘基置換。在一些情況下，人免疫球蛋白的Fv框架區(FR)殘基由相應非人殘基置換。此外，人源化抗體/抗體片段可以包含既不在受體抗體中也不在導入的CDR或框架序列中發現的殘基。該等修飾可以進一步改進和優化抗體或抗體片段性能。通常，人源化抗體或其抗體片段將包含基本上所有如下項：至少一個(典型地兩個)可變結構域，其中所有或基本上所有CDR區對應於非人免疫球蛋白的那些CDR區，且FR區的所有或顯著一部分係人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗體或抗體片段還可以包含免疫球蛋白恒定區(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的恒定區的至少一部分。有關進一步的細節，參見Jones等人，Nature[自然],321：522-525,1986；Reichmann等人，Nature[自然],332：323-329,1988；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.[結構生物學新見],2：593-596,1992。
「完全人」係指如下免疫球蛋白，如抗體或抗體片段，其中整個分子係人起源或由與抗體或免疫球蛋白的人形式相同的胺基酸序列組成。
術語「分離的」意指從天然狀態改變的或去除的。例如，天然存在於活體動物中的核酸或肽不是「分離的」，但是與其天然狀態的共存材料部分或完全分開的相同核酸或肽係「分離的」。分離的核酸或蛋白質能以基本上純化的形式存在，或者可以存在於非天然環境(例如像宿主細胞)中。
術語「可操作地連接」或「轉錄控制」係指調控序列和異源核酸序列之間的導致後者的表現之功能性連接。例如，當第一核酸序列被放置成與第二核酸序列有功能關係時，該第一核酸序列與該第二核酸序列可操作地連接。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉錄或表現，則該啟動子與該編碼序列可操 作地連接。可操作地連接的DNA序列可以彼此鄰接，並且例如在需要連接兩個蛋白質編碼區之情況下，它們處於同一閱讀框中。
術語「核酸」或「多核苷酸」係指單股或雙股形式的去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特別限定，否則該術語涵蓋含有已知的天然核苷酸類似物的核酸，該核酸具有與參考核酸相似的結合特性並且以與天然存在的核苷酸相似的方式進行代謝。除非另外指出，否則特定的核酸序列還隱含地涵蓋其保守修飾的變體(例如，簡並密碼子取代)、等位基因、異種同源物、SNP和互補序列以及明確指明的序列。具體地，簡並密碼子取代可以藉由產生如下序列而獲得，在該等序列中，一個或多個所選的(或全部)密碼子的第三位被混合鹼基和/或去氧肌苷殘基取代(Batzer等人，Nucleic Acid Res.[核酸研究]19：5081(1991)；Ohtsuka等人.,J.Biol.Chem.[生物化學雜誌]260：2605-2608(1985)；和Rossolini等人.,Mol.Cell.Probes[分子與細胞探針]8：91-98(1994))。
術語「肽」、「多肽」和「蛋白質」可互換使用，並且是指包含由肽鍵共價連接的胺基酸殘基的化合物。蛋白質或肽必須含有至少兩個胺基酸，並且對可構成蛋白質或肽序列的胺基酸的最大數量沒有限制。多肽包括包含由肽鍵彼此相連的兩個或更多個胺基酸的任何肽或蛋白質。如本文所用，該術語係指短鏈，例如其在本領域中通常也稱為肽、寡肽和寡聚體；並且還是指較長的鏈，其在本領域中通常稱為蛋白質，該蛋白質存在有很多類型。「多肽」包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚體、異源二聚體、多肽的變體、經修飾的多肽、衍生物、類似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重組肽或其組合。
術語「啟動子」係指啟動多核苷酸序列的特異性轉錄所需的由細胞合成機器或引入的合成機器所識別的DNA序列。
術語「啟動子/調控序列」係指表現與啟動子/調控序列可操作地連接的基因產物所需的核酸序列。在一些情況下，該序列可為核心啟動子序列，並且在其他情況下，該序列還可以包含增強子序列和表現基因產物所需的其他調控元件。啟動子/調控序列可為例如以組織特異性方式表現基因產物的啟動子/調控序列。
術語「組成型」啟動子係指當與編碼或指定基因產物的多核苷酸可操作地連接時，在細胞的大多數或全部生理條件下致使基因產物在細胞中產生的核苷酸序列。
術語「誘導型」啟動子係指當與編碼或指定基因產物的多核苷酸可操作地連接時，基本上僅在對應於啟動子的誘導物存在於細胞中時才致使基因產物在細胞中產生的核苷酸序列。
術語「組織特異性」啟動子係指當與編碼或由基因指定的多核苷酸可操作地連接時，基本上僅在細胞係對應於啟動子的組織類型的細胞時才致使基因產物在細胞中產生的核苷酸序列。
術語「癌症相關抗原」或「腫瘤抗原」可互換地指在癌細胞表面上完全或作為片段(例如，MHC/肽)表現的分子(典型地是蛋白質、碳水化合物或脂質)，並且其可用於優先將藥理學藥劑靶向癌細胞。在一些實施方式中，腫瘤抗原係由正常細胞和癌細胞兩者表現的標誌，例如譜系標誌，例如B細胞上的CD19。在一些實施方式中，腫瘤抗原係與正常細胞相比在癌細胞中過表現的細胞表面分子，例如，與正常細胞相比，1倍過表現、2倍過表現、3倍過表現或 更多。在一些實施方式中，腫瘤抗原係在癌細胞中不適當合成的細胞表面分子，例如，與正常細胞上表現的分子相比含有缺失、添加或突變的分子。在一些實施方式中，腫瘤抗原將僅在癌細胞的細胞表面上完全或作為片段(例如，MHC/肽)表現，並且不在正常細胞的表面上合成或表現。在一些實施方式中，本發明之CAR包括包含結合MHC呈遞的肽的抗原結合結構域(例如抗體或抗體片段)的CAR。通常，源自內源性蛋白質的肽填充主要組織相容性複合物(MHC)I類分子的口袋，並且被CD8+ T淋巴細胞上的T細胞受體(TCR)識別。MHC I類複合物由所有有核細胞組成型表現。在癌症中，病毒特異性和/或腫瘤特異性肽/MHC複合物代表用於免疫療法的獨特類別的細胞表面靶標。已經描述了在人白血球抗原(HLA)-A1或HLA-A2的上下文中靶向源自病毒或腫瘤抗原的肽的TCR樣抗體(參見，例如，Sastry等人，J Virol.[病毒學雜誌]2011 85(5)：1935-1942；Sergeeva等人，Blood[血液],2011 117(16)：4262-4272；Verma等人，J Immunol[免疫學雜誌]2010 184(4)：2156-2165；Willemsen等人，Gene Ther[基因療法]2001 8(21)：1601-1608；Dao等人，Sci Transl Med[科學轉化醫學]2013 5(176)：176ra33；Tassev等人，Cancer Gene Ther[癌基因療法]2012 19(2)：84-100)。例如，可以從篩選文庫(如人scFv噬菌體展示文庫)鑒定TCR樣抗體。
術語「支持腫瘤的抗原」或「支持癌症的抗原」可互換地指在細胞表面上表現的分子(典型地是蛋白質、碳水化合物或脂質)，該細胞本身不是癌性的、但例如藉由促進其生長或存活、例如對免疫細胞的抗性而支持癌細胞。這種類型的示例性細胞包括基質細胞和骨髓源性的抑制細胞(MDSC)。支持腫瘤的抗原本身不需要在支持腫瘤細胞中發揮作用，只要該抗原存在於支持癌細胞的細胞上。
如本文所用，「體外轉錄的RNA」係指已在體外合成的RNA，較佳的是mRNA。通常，體外轉錄的RNA由體外轉錄載體產生。體外轉錄載體包含用於產生體外轉錄的RNA的模板。
如本文所用，「聚(A)」係藉由聚腺苷酸化與mRNA附接的一系列腺苷。在用於暫態表現的構建體的較佳的實施方式中，聚A為50個至5000個之間(SEQ ID NO：34)、較佳的是大於64個、更較佳的是大於100個、最較佳的是大於300個或400個。聚(A)序列可以被化學修飾或酶促修飾以調節mRNA功能，如定位、穩定性或翻譯效率。
如本文結合表現、例如CAR分子的表現所使用，「暫態」係指非整合轉基因的持續數小時、數天或數週的表現，其中表現的時間段小於如果整合到基因組中或包含在宿主細胞中的穩定質體複製子內的基因的表現的時間段。
如本文所用，術語「治療(treat、treatment和treating)」係指減少或改善增生性障礙的進展、嚴重程度和/或持續時間，或者改善增生性障礙的一種或多種症狀(較佳的是，一種或多種可辨別的症狀)，這由投與一種或多種療法(例如一種或多種治療劑，如本發明之CAR)引起。在具體的實施方式中，術語「治療(treat、treatment和treating)」係指改善增生性障礙的至少一種可測量的物理參數，如腫瘤的生長，這不一定係患者可辨別的。在其他實施方式中，術語「治療(treat、treatment和treating)」係指藉由例如穩定可辨別的症狀來物理地，或藉由例如穩定物理參數來生理地，或藉由兩者，抑制增生性障礙的進展。在其他實施方式中，該術語「治療(treat、treatment和treating)」係指減少或穩定腫瘤大小或癌細胞計數。
術語「訊息傳導途徑」係指在多種訊息傳導分子之間的生物化學關係，該等訊息傳導分子在訊號從細胞的部分傳遞至細胞的另一部分中發揮作用。短語「細胞表面受體」包括能夠接收訊號並且傳遞訊號跨過細胞膜的分子以及分子複合物。
術語「受試者」旨在包括可以在其中引發免疫應答的活生物體(例如，哺乳動物、人)。
術語「基本上純化的」細胞係指本質上不含其他細胞類型之細胞。基本上純化的細胞還指已經與其天然存在狀態下正常相關的其他細胞類型分離之細胞。在一些情況下，基本上純化的細胞群體係指同質的細胞群體。在其他情況下，該術語僅指已經與其天然狀態下天然相關的細胞分離之細胞。在一些方面，在體外培養細胞。在其他方面，不在體外培養細胞。
如本文所用的術語「治療劑」意指治療。藉由減少、抑制、緩解或根除疾病症態來獲得治療效果。
如本文所用的術語「預防」意指對疾病或疾病症態的預防或保護性治療。
術語「轉染的」或「轉化的」或「轉導的」係指將外源核酸轉移或引入宿主細胞中的過程。「轉染的」或「轉化的」或「轉導的」細胞係已用外源核酸轉染、轉化或轉導之細胞。細胞包括原代主體細胞及其子代。
術語「特異性地結合」係指識別樣本中存在的結合配偶體(例如，腫瘤抗原)蛋白並與其結合的抗體或配位基，但該抗體或配位基基本上不識別或結合樣本中的其他分子。
如本文所用的「難治性」係指對治療無應答的疾病，例如癌症。在實施方式中，難治性癌症可以在治療開始之前或治療開始時對治療具有抗性。在其他實施方式中，難治性癌症可能在治療期間變得有抗性。難治性癌症也稱為抗性癌症。
如本文所用的「復發」係指疾病(例如，癌症)或疾病的體征和症狀(如改善期之後，例如在療法(例如癌症療法)的先前治療後的癌症)的回返。
當該術語在本文中結合例如基因編輯使用時，「系統」係指一起用於產生所希望的功能的一組分子，例如一種或多種分子。
當該術語在本文中使用時，「基因編輯系統」係指指導和影響由所述系統靶向的基因組DNA位點處或附近的一種或多種核酸的改變(例如缺失)的系統，例如一種或多種分子。基因編輯系統係本領域中已知的，並且在下文更全面地描述。
「顯性負性」基因產物或蛋白質係干擾基因產物或蛋白質的功能之基因產物或蛋白質。受影響的基因產物可能與顯性負性蛋白質相同或不同。顯性負性基因產物可以具有多種形式，包括截短、具有點突變的全長蛋白質或其片段、或全長野生型或突變型蛋白質或其片段與其他蛋白質的融合物。所觀察到的抑制水平可以非常低。例如，與過程中涉及的一種或多種功能性蛋白質相比，可能需要大量過量的顯性負性蛋白質以觀察作用。在正常生物測定條件下可能難以觀察到作用。
術語「比例」係指群體中特定分子與分子總數之比率。在一個示例性實施方式中，具有特定表型的T細胞(例如，TSCM細胞)的比例係指群體中 具有該表型的T細胞之數量相對於T細胞的總數之比率。在一個示例性實施方式中，具有特定表型的T細胞(例如，CD45RA+CD62L+細胞)的比例係指群體中具有該表型的T細胞之數量相對於T細胞的總數之比率。應當理解，可以在指示之情況下針對某些細胞亞群測量此類比例。例如，可以針對CD4+ T細胞的總數測量CD4+ TSCM細胞的比例。
如本文所用的術語「免疫效應細胞群體」係指包含至少兩種、例如兩種或更多種、例如多於一種免疫效應細胞之組成物，並且不表示任何純度水平或其他細胞類型的存在或不存在。在一個示例性實施方式中，群體基本上不含其他細胞類型。在另一個示例性實施方式中，群體包含至少兩種指定細胞類型的細胞，或具有指定的功能或特性。
術語「TSCM樣細胞」、「初始T細胞(naive T Cell)」和「初始T細胞(naïve T cell)」可互換使用，並且是指分化程度較低的T細胞狀態，其特徵在於CD45RA和CD62L的表面表現(例如，為CD45RA陽性和CD62L陽性(有時寫為CD45RA+CD62L+))。一般來說，T細胞分化從大多數「初始」到大多數「耗竭」TSCM樣(例如，CD45RA+CD62L+細胞)>TCM(例如，CD45RA-CD62L+細胞)>TEM(例如，CD45RA-CD62L-細胞)>TEFF進行。初始T細胞可以相對於更耗竭的T細胞表型被表徵為，例如具有增加的自我更新、抗腫瘤功效、增殖和/或存活。在一個示例性實施方式中，初始T細胞係指CD45RA+CD62L+ T細胞。在另一個示例性實施方式中，初始T細胞係指TSCM細胞，例如CD45RA+CD62L+CCR7+CD27+CD95+ T細胞。
術語「TSCM」係指具有幹細胞記憶表型的T細胞，其特徵在於它在它的細胞表面上表現CD45RA、CD62L、CCR7、CD27和CD95(例如，為CD45RA 陽性、CD62L陽性、CCR7陽性、CD27陽性和CD95陽性(有時寫為CD45RA+CD62L+CCR7+CD27+CD95+))。TSCM細胞係初始T細胞的一個實例。該T細胞可為CD4+和/或CD8+ T細胞。
如本文所用，術語「烷基」係指包含1至20個碳原子的完全飽和的支鏈或無支鏈(或直鏈或線性)烴部分。較佳的是烷基包含1-6個碳原子且更較佳的是1-4個碳原子。烷基的代表性實例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、二級丁基、異丁基、三級丁基、正戊基、異戊基、新戊基、正己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、正庚基。例如，術語「C1-6烷基」係指具有一至六個碳原子的烴，並且術語「C1-7烷基」係指具有一至七個碳原子的烴。
如本文所用，術語「鹵代烷基」係指被一個或多個本文所定義的鹵素基團取代的本文所定義的烷基。較佳的是，鹵代烷基可為單鹵代烷基、二鹵代烷基或多鹵代烷基，包括全鹵代烷基。單鹵代烷基可以在烷基內具有一個碘、溴、氯或氟。二鹵代烷基和多鹵代烷基基團可以在烷基內具有兩個或更多個相同的鹵原子或不同的鹵基基團的組合。較佳的是，多鹵代烷基含有多達12或10、或8、或6、或4、或3、或2個鹵基基團。鹵代烷基的代表性實例係氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、五氟乙基、七氟丙基、二氟氯甲基、二氯氟甲基、二氟乙基、二氟丙基、二氯乙基和二氯丙基。全鹵代烷基係指所有氫原子均被鹵素原子替換的烷基。例如，術語「鹵代-C1-6烷基」係指具有一至六個碳原子並被一個或多個鹵基基團取代的烴，並且術語「鹵代-C1-7烷基」係指具有一至七個碳原子並被一個或多個鹵素基團取代的烴。
如本文所用，「鹽」包括藥學上可接受的酸加成鹽，其可以採用無機酸和有機酸形成，例如乙酸鹽、天冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、溴化物/氫溴酸鹽、碳酸氫鹽/碳酸鹽、硫酸氫鹽/硫酸鹽、樟腦磺酸鹽、氯化物/鹽酸鹽、膽茶鹼(chlortheophyllonate)、檸檬酸鹽、乙二磺酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽、葡糖酸鹽、葡糖醛酸鹽、馬尿酸鹽、氫碘酸鹽/碘化物、羥乙基磺酸鹽、乳糖醛酸鹽、乳糖酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、苦杏仁酸鹽、甲磺酸鹽、甲基硫酸鹽、萘甲酸鹽、萘磺酸鹽、菸酸鹽、硝酸鹽、十八酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、磷酸鹽/磷酸氫鹽/磷酸二氫鹽、聚半乳糖醛酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、磺基水楊酸鹽、酒石酸鹽、甲苯磺酸鹽和三氟乙酸鹽。
可以衍生出鹽的無機酸包括例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等等。可以衍生出鹽的有機酸包括例如乙酸、丙酸、乙醇酸、草酸、馬來酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、苦杏仁酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、磺基水楊酸等。可以用無機鹼和有機鹼形成藥學上可接受的鹼加成鹽。
可以衍生出鹽的無機鹼包括例如銨鹽和來自元素週期表第I至XII列的金屬。在某些實施方式中，鹽源自鈉、鉀、銨、鈣、鎂、鐵、銀、鋅和銅；特別合適的鹽包括銨鹽、鉀鹽、鈉鹽、鈣鹽和鎂鹽。
可以衍生出鹽的有機鹼包括例如一級胺、二級胺和三級胺；取代的胺(包括天然存在的取代的胺)；環胺；鹼性離子交換樹脂等。某些有機胺包括異丙胺、苄星、膽鹼鹽、二乙醇胺、二乙胺、離胺酸、葡甲胺、哌
Figure 109105885-A0202-12-0039-90
和胺丁三醇。
範圍：貫穿本揭露內容，能以範圍形式呈現本發明之各個方面。應該理解的是，範圍形式的描述僅僅是為了方便以及簡潔，不應該被理解為對本發明範圍的不靈活的限制。因此，範圍的描述應當被認為係具有確切揭露的所有可能的子範圍以及該範圍內的單獨數值。例如，範圍如從1至6的描述應當被認為係具有確切揭露的子範圍，如從1至3、從1至4、從1至5、從2至4、從2至6、從3至6等，以及該範圍內的單獨數字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3、和6。作為另一個實例，範圍如95%-99%同一性包括具有95%、96%、97%、98%或99%同一性，並且包括如96%-99%、96%-98%、96%-97%、97%-99%、97%-98%和98%-99%同一性的子範圍。無論範圍的寬度如何，這都適用。
標題、小標題或編號或字母元素，例如(a)、(b)、(i)等僅為了便於閱讀而呈現。在本文件中使用標題或編號或字母元素不要求步驟或元素以字母循序執行，或者步驟或元素必須彼此離散。
本文所提及的所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻藉由引用以其整體併入。
根據說明書和附圖並且如申請專利範圍，本發明之其他特徵、目標和優點將是清楚的。
表面修飾的介孔二氧化矽顆粒
在一些實施方式中，本發明提供了介孔二氧化矽顆粒。介孔二氧化矽顆粒包含例如具有六邊密排的、圓柱形的、均勻孔的多孔體。介孔二氧化矽顆粒可以藉由使用表面活性劑的棒狀膠束作為模板來合成，其係在酸性或鹼性催化劑的存在下，藉由將二氧化矽源(如烷氧基矽烷、矽酸鈉溶液、水矽佘石、二氧化矽細顆粒)溶於水或乙醇中並進行水解而在水中形成。參見，例如， 美國公開號2015-0072009和Hoffmann等人，Angewandte Chemie International Edition[德國應用化學國際版],45,3216-3251,2006。已經將多種表面活性劑(例如陽離子、陰離子和非離子表面活性劑)作為表面活性劑研究，並且已知，大體上，陽離子表面活性劑的烷基三甲基銨鹽導致具有最大比表面積和孔體積的介孔二氧化矽。參見美國公開案號2013/0052117和Katiyar等人(Journal of Chromatography[層析學報]1122(1-2)：13-20)。
介孔二氧化矽顆粒可以以各種形式(例如微球、不規則顆粒、矩形棒、圓形奈米棒)提供。介孔二氧化矽顆粒可具有各種預定的形狀，包括例如，球體形狀、橢圓體形狀、棒狀形狀、或彎曲的圓柱形狀。在特定的實施方式中，本文所述之組成物和方法使用介孔二氧化矽棒(MSR)。組裝介孔二氧化矽以產生微棒之方法係本領域已知的。參見，Wang等人，Journal of Nanoparticle Research[奈米顆粒研究雜誌],15：1501,2013。在一些實施方式中，藉由使正矽酸乙酯與由膠束棒製成的模板反應來合成介孔二氧化矽顆粒。結果係填充了規則排列的孔的介孔二氧化矽球體或棒的集合。然後可以藉由用調節至適當pH的溶劑洗滌來除去模板。在此實例中，在去除表面活性劑模板之後，製備特徵為均勻的有序的和連通的介孔隙的、具有例如約600m2/g至約1200m2/g、特別地約800m2/g至約1000m2/g、以及特別地約850m2/g至約950m2/g的比表面積的介孔二氧化矽顆粒。在另一實施方式中，可以使用溶膠-凝膠法或噴霧乾燥法合成介孔二氧化矽顆粒。正矽酸乙酯也與另外的聚合物單體(作為模板)一起使用。在又一個實施方式中，可以將一個或多個四烷氧基矽烷和一個或多個(3-氰基丙基)三烷氧基矽烷共縮合以提供作為棒的介孔矽酸鹽顆粒。參見美國公開案號2013-0145488、2012-0264599和2012-0256336，其內容藉由引用整體併入本文。
介孔二氧化矽顆粒(MSP)(例如，MSR)可以包含孔，該孔可為有序的或隨機分佈的，直徑係2nm至100nm，或直徑係2nm-50nm，例如直徑2nm-5nm、10nm-20nm、10nm-30nm、10nm-40nm、20nm-30nm、30nm-50nm、30nm-40nm、40-50nm之孔。在一些實施方式中，微棒包含直徑係約5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、11nm、12nm或更大之孔。孔徑可以根據應用類型而改變。
在一些實施方式中，MSR的長度在微米範圍內，範圍從約5μm至約500μm。在一示例中，MSR的長度係5μm-50μm，例如10μm-20μm、10μm-30μm、10μm-40μm、20μm-30μm、30μm-50μm、30μm-40μm、40μm-50μm。在一些實施方式中，MSR包括50μm至250μm的長度，例如，約60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、120μm、150μm、180μm、200μm、225μm或更長。在一些實施方式中，使用具有更高的縱橫比的MSR，例如具有長度50μm至200μm、特別是長度80μm至120μm、尤其是長度約100μm或更長的棒。
在又一個實施方式中，MSP(例如MSR)提供高表面積用於附接和/或結合至靶細胞例如T細胞。獲得高表面積介孔矽酸鹽之方法係本領域已知的。參見例如美國專利案號8,883,308和美國公開案號2011-0253643，其全部內容藉由引用併入本文。在一些實施方式中，高表面積歸因於奈米顆粒的纖維形態，這使得可以在表面上獲得高濃度的高度分散的且易於接近的部分。在某些實施方式中，高表面積MSP(例如MSR)具有至少約100m2/g，至少150m2/g或至少300m2/g的表面積。在其他實施方式中，高表面積MSP(例如，MSR)具有約100m2/g至約1000m2/g的表面積，包括例如其之間的所有值或子範圍，例如50m2/g、 100m2/g、200m2/g、300m2/g、400m2/g、600m2/g、800m2/g、100-500m2/g、100-300m2/g、500-800m2/g或500-1000m2/g。
在一些實施方式中，介孔二氧化矽顆粒可包括表面修飾。如本文所用，「表面修飾」係指在MSP(例如，MSR)的表面上附接或附加官能基。在一些實施方式中，官能基被吸附或被共價鍵合到孔襯裡和/或奈米通道襯裡的表面上或MSP(例如MSR)的表面上。如本文所用，「官能基」定義與MSR連接的化學部分。在一些實施方式中，官能基係-OH(羥基)、胺、羧酸、膦酸酯、鹵化物、疊氮化物、炔、環氧化物、巰基、二硫化物、聚乙烯亞胺、疏水部分、或其鹽。在一些實施方式中，可以將官能基(即-OH(羥基)、胺、羧酸、膦酸酯、鹵化物、疊氮化物、炔、環氧化物、巰基、二硫化物、聚乙烯亞胺、疏水部分、或其鹽)與二氧化矽表面藉由連接子分開。在一些實施方式中，官能基經由C1至C20烷基連接子共價鍵合至MSP或MSR表面。在其他實施方式中，官能基經由聚乙二醇連接子共價鍵合至MSP或MSR表面。在特定的實施方式中，聚乙二醇連接子具有式(-O(CH2-CH2-)1-25。在特定的實施方式中，表面修飾係C1至C20烷基全鹵代烷基或C1至C20烷基全氟代烷基。
表面修飾的一般結構如下：
Figure 109105885-A0202-12-0043-388
其中L係連接子，並且
X係官能基。
在一些實施方式中，L可為C1至C20烷基或聚乙二醇基，並且
X可為-OH(羥基)、一級胺、二級胺、三級胺或季胺、羧酸、膦酸酯、鹵化物、疊氮化物、炔、環氧化物、巰基、二硫化物、聚乙烯亞胺或疏水部分、或其鹽。
如本文所用，具有膦酸酯的表面修飾(也稱為膦酸酯修飾的奈米顆粒)具有至少一個膦酸(-P(O)(OH)2)基團或次膦酸(-P(O)(OH)R，其中R係C1至C20烷基)。膦酸或次膦酸可以取決於pH值而帶電或不帶電。在生理pH下，膦酸和次膦酸帶負電或係陰離子。例如，可以藉由用帶有膦酸酯的三烷基矽氧烷化合物或帶有膦酸酯的三羥基矽烷化合物(例如(三羥基矽基)丙基甲基膦酸酯)處理二氧化矽體表面來製備膦酸酯修飾。
在一些實施方式中，用一級胺、二級胺、三級胺或季胺對介孔二氧化矽顆粒(例如，MSR)進行表面修飾。二級胺、三級胺和季胺可以被C1至C20烷基取代並且可以帶電荷。在一些實施方式中，胺基可為鹽形式。在一些實施方式中，一級胺、二級胺、三級胺或季胺可藉由連接子與MSP表面分開。在特定的實施方式中，介孔二氧化矽顆粒用聚乙烯亞胺修飾。在特定的實施方式中，聚乙烯亞胺係支鏈的或非支鏈的。在可替代實施方式中，如藉由凝膠滲透層析法(GPC)測量，聚乙烯亞胺基團具有約1000至100,000道耳頓(Da)之平均分子量。在一些實施方式中，如藉由凝膠滲透層析法(GPC)測量，聚乙烯亞胺基團具有約1,200至15,000Da、約1,500至12,000Da、約2,000Da、約3,000Da、約4,000Da、約5,000Da、約6,000Da、約7,000Da、約8,000Da、約9,000Da、約10,000Da或約20,000Da之平均分子量。
各種示例性的表面修飾的介孔二氧化矽顆粒的結構在圖1中示出。
如本文所述，本文所述之MSP(例如，MSR)藉由熟悉該項技術者已知之方法製備。通常，可以藉由以下方法製備具有表面修飾的MSP。
通常，能夠與MSP(例如，MSR)的矽基氫氧化物表面反應的任何反應都可以用於共價修飾該表面。例如，MSP(例如MSR)的表面可以用三烷氧基矽烷化合物或三羥基矽烷化合物處理。在一些實施方式中，將介孔二氧化矽顆粒懸浮在合適的反應溶劑中。在一些實施方式中，反應溶劑可為水性溶劑或pH為0-14的緩衝液。可以使用水溶液與1種或多種有機溶劑(包括但不限於四氫呋喃、2-甲基四氫呋喃、乙酸乙酯、甲苯、三乙胺、二甲基甲醯胺、二甲基乙醯胺、二甲基亞碸、甲醇、乙醇、二氯甲烷、或二氯乙烷)的另外的共混物。在一些實施方式中，使懸浮的介孔二氧化矽顆粒與具有如本文所述期望的官能基的三烷氧基矽基或三烴基矽基試劑反應。例如，可以藉由用帶有胺的三烷氧基矽烷化合物(例如胺基丙基三乙氧基矽烷、3-(2-胺基乙基胺基)丙基-三甲氧基矽烷、或3-三甲氧基矽基丙基乙二胺)處理MSP來製備胺修飾。在某些實施方式中，三烷氧基矽基係三甲氧基矽基或三乙氧基矽基。在可替代實施方式中，三烷氧基矽基試劑係三烷氧基烷基胺。在一些實施方式中，三烷氧基烷基胺包括一級胺、二級胺、三級胺或季胺。
在某些實施方式中，三烷氧基矽基試劑包括聚乙烯亞胺基團。在特定的實施方式中，聚乙烯亞胺係支鏈的或非支鏈的。在可替代實施方式中，如藉由凝膠滲透層析法(GPC)測量，聚乙烯亞胺基團具有約1000至20,000Da、約1,200至15,000Da、約1,500至12,000Da、約2,000Da、約3,000Da、約4,000Da、約5,000Da、約6,000Da、約7,000Da、約8,000Da、約9,000Da或約10,000Da之平均分子量。在一些實施方式中，三烷氧基矽基試劑包括C1-20烷基疊氮化物基團。 在某些實施方式中，三烷氧基矽基試劑包括C1-20烷基羧酸基團。在其他實施方式中，三烷氧基矽基試劑包括C1-20烷基基團。
例如，可以藉由用帶有巰基的三烷氧基矽烷化合物(例如3-巰基丙基三乙氧基矽烷)處理MSP來製備MSP(例如，MSR)上的巰基修飾。
例如，可以藉由用帶有二硫化物的三烷氧基矽烷化合物處理奈米顆粒的表面、或者藉由用2,2'-二硫代二吡啶或其他二硫化物處理巰基修飾的表面，來製備MSP(例如，MSR)上的二硫化物修飾。
例如，可以藉由用帶有羧酸的三烷氧基矽烷化合物處理表面、或者藉由用帶有官能基(該官能基可以被化學上轉化為羧酸)的三烷氧基矽烷化合物處理MSP，來製備包括羧酸基團的MSP(例如，MSR)表面修飾。例如，MSP可以用3-氰基丙基三乙氧基矽烷處理，然後用硫酸水解。
例如，可以藉由用帶有環氧化物的三烷氧基矽烷化合物(例如甘油氧基丙基三乙氧基矽烷)處理MSP來製備MSP(例如，MSR)表面修飾，該MSP表面修飾包括環氧化物(將具有至少一種環氧化物)。
具有疏水部分的表面修飾將具有至少一個部分，該部分旨在降低在水中的溶解度、或增加在有機溶劑中的溶解度。疏水部分之實例包括長鏈烷基(例如，C8-C20烷基)，脂肪酸酯(例如，C1-C22烷基酸酯)和具有C6-C10碳原子的芳族環。
在一些實施方式中，MSP(例如，MSR)與三烷氧基矽基試劑的反應在環境溫度或室溫下進行。在其他實施方式中，反應在升高的溫度下進行。在進一步的實施方式中，反應溫度係約40℃至約120℃、約50℃至約100℃、 約60℃至約80℃、約70℃至約80℃、或約50℃、約55℃、約60℃、約65℃、約70℃、約75℃、約80℃、約85℃、約90℃、約95℃、或約100℃。
病毒載體
在一些實施方式中，本文所述之組成物可包括本文所述之介孔二氧化矽顆粒和病毒載體。
病毒載體可為任何病毒載體。病毒載體技術在本領域中是熟知的，並且例如描述於Sambrook等人，2012,MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL[分子選殖：實驗室手冊]，第1-4卷，Cold Spring Harbor Press[冷泉港出版社]，紐約中，以及其他病毒學和分子生物學手冊中。舉例來說，病毒載體可為腺病毒、慢病毒、逆轉錄病毒、腺相關病毒或皰疹病毒。在一些實施方式中，病毒載體係慢病毒載體或腺病毒載體。
源自逆轉錄病毒如慢病毒的載體係實現長期基因轉移的合適工具，因為它們允許轉基因的長期穩定整合及其在子細胞中的繁殖。慢病毒載體相對於源自腫瘤逆轉錄病毒如鼠白血病病毒的載體具有附加優點，因為它們可以轉導非增殖性細胞，例如肝細胞。它們還具有低免疫原性的附加優點。逆轉錄病毒載體還可為例如γ逆轉錄病毒載體。γ逆轉錄病毒載體可以包括例如啟動子、包裝訊號(ψ)、引物結合位點(PBS)、一個或多個(例如兩個)長末端重複(LTR)、和目的轉基因(例如編碼CAR的基因)。γ逆轉錄病毒載體可能缺少病毒結構基因(例如gag、pol、和env)。示例性γ逆轉錄病毒載體包括鼠白血病病毒(MLV)、形成脾臟病灶病毒(SFFV)、和骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)，以及由其衍生的載體。其他γ逆轉錄病毒載體描述於例如Tobias Maetzig等人， 「Gammaretroviral Vectors：Biology,Technology and Application[γ逆轉錄病毒載體：生物學/技術和應用]」Viruses.[病毒]2011年6月；3(6)：677-713)。
在另一個實施方式中，包含編碼本發明所希望CAR的核酸的載體係腺病毒載體(A5/35)。在另一個實施方式中，可以使用轉座子(如sleeping beauty)、CRISPR、CAS9、和鋅指核酸酶來完成編碼CAR的核酸的表現。見June等人2009 Nature Reviews Immunology[自然免疫學綜述]9.10：704-716，該文獻藉由引用併入本文。
在一些實施方式中，該病毒載體包含表現載體，該表現載體包含重組多核苷酸，該重組多核苷酸包含與待表現的核苷酸序列可操作地連接的表現控制序列。在一些實施方式中，核苷酸序列表現嵌合抗原受體(CAR)、工程改造的TCR、細胞介素、趨化因子、用於阻斷抑制性分子的shRNA、或用於誘導蛋白質表現的mRNA。在一些實施方式中，蛋白質係CAR，其包含抗原結合結構域、跨膜結構域、共刺激傳訊區域和傳訊結構域。在一些實施方式中，傳訊結構域係CD3ζ傳訊結構域。
在一些實施方式中，病毒載體中的核苷酸序列表現經工程改造以靶向腫瘤抗原的肽。在一些實施方式中，該肽靶向選自以下群組的腫瘤抗原，該群組由以下項組成：TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、間皮素、IL-11Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、葉酸受體α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受體、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪胺 酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙醯基-GD2、葉酸受體β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、豆莢蛋白、HPV E6、HPV E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相關抗原1、p53、p53突變體、前列腺特異性蛋白、存活素和端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MART1、Ras突變體、hTERT、肉瘤易位中斷點、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄性激素受體、週期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆轉錄酶、RU1、RU2、腸道羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、以及其任何組合。在一些實施方式中，該肽係嵌合抗原受體(CAR)或工程改造的TCR。此類肽在下文標題為「嵌合抗原受體技術的一般說明」的部分中更詳細地描述。
介孔二氧化矽顆粒和病毒載體的組成
本文還描述了一種組成物，該組成物包含介孔二氧化矽顆粒之第一群體和病毒載體。在一些實施方式中，MSP(例如MSR)還包含多個吸附或共價鍵合在孔襯裡和/或奈米通道襯裡的表面上或表面的官能基。在一些實施方式中，官能基係-OH(羥基)、胺、羧酸、膦酸酯、鹵化物、疊氮化物、炔、環氧化物、巰基、二硫化物、聚乙烯亞胺、疏水部分或其鹽。在一些實施方式中，可以將官能基(即-OH(羥基)、胺、羧酸、膦酸酯、鹵化物、疊氮化物、炔、 環氧化物、巰基、二硫化物、聚乙烯亞胺、疏水部分、或其鹽)直接附接至MSP的表面。在一些實施方式中，官能基經由C1至C20烷基連接子共價鍵合至MSP(例如MSR)表面。在其他實施方式中，官能基經由聚乙二醇連接子共價鍵合至MSP表面。在特定的實施方式中，聚乙二醇連接子具有式(-O(CH2-CH2-)1-25。在特定的實施方式中，表面修飾係C1至C20烷基全鹵代烷基或C1至C20烷基全氟代烷基。
在一些實施方式中，用一級胺、二級胺、三級胺或季胺對MSP(例如，MSR)進行表面修飾。在特定的實施方式中，介孔二氧化矽棒用聚乙烯亞胺修飾。在特定的實施方式中，聚乙烯亞胺係支鏈的或非支鏈的。在可替代實施方式中，如藉由凝膠滲透層析法(GPC)測量，聚乙烯亞胺基團具有約1000至20,000道耳頓(Da)之平均分子量。在一些實施方式中，如藉由凝膠滲透層析法(GPC)測量，聚乙烯亞胺基團具有約1,200至15,000Da、約1,500至12,000Da、約2,000Da、約3,000Da、約4,000Da、約5,000Da、約6,000Da、約7,000Da、約8,000Da、約9,000Da、或約10,000Da之平均分子量。
在一些實施方式中，病毒載體軛合至介孔二氧化矽顆粒。如本文所述，「軛合至」係指藉由本文所述之任何方式關聯至或附接至。在一些實施方式中，將病毒載體靜電地或共價地軛合至介孔二氧化矽顆粒。在一些實施方式中，介孔二氧化矽顆粒和病毒載體之間的靜電軛合係由於病毒載體和介孔二氧化矽顆粒表面電荷相反。例如但不受理論的束縛，藉由聚乙烯亞胺或帶正電荷的一級銨、二級銨、三級銨或季銨基團表面修飾的介孔二氧化矽顆粒可以與表面帶負電荷的病毒載體軛合。因此，在一些實施方式中，病毒載體帶負電，而介孔二氧化矽顆粒帶正電。在一些實施方式中，介孔二氧化矽顆粒和病毒載 體之間的共價軛合藉由熟悉該項技術者已知之方法、藉由連接子或不藉由連接子來實現。例如但不限於，連接子可為聚乙二醇、烷基、聚合物、聚醯胺鍵等。
在一些方面，本文提供藥物組成物，該藥物組成物包含本文所述之介孔二氧化矽顆粒，其被配製用於製造免疫效應細胞例如T淋巴細胞的群體。在一些實施方式中，用CAR轉導T淋巴細胞。在一些實施方式中，MSP與本文所述之病毒載體軛合。在一些實施方式中，用於製造免疫效應細胞例如T淋巴細胞的群體的MSP可以如本文所述進行表面修飾。
在一些實施方式中，組成物適合用作包含介孔二氧化矽顆粒和病毒載體的可注射組成物，其中該病毒載體包含表現載體，該表現載體包含重組多核苷酸，該重組多核苷酸包含與待表現的核苷酸序列可操作地連接的表現控制序列。在一些實施方式中，病毒載體軛合至如本文所述之介孔二氧化矽顆粒。
在本文所述之介孔二氧化矽顆粒之組成物中，MSP(例如MSR)可以以0.01μg/ml至1000μg/ml的濃度存在。在可替代實施方式中，本文所述之組成物中的MSP或MSR的濃度可為0.1μg/ml至500μg/ml、0.5μg/ml至100μg/ml、1μg/ml至90μg/ml、1μg/ml至80μg/ml、1μg/ml至70μg/ml、1μg/ml至60μg/ml、1μg/ml至50μg/ml或1μg/ml至40μg/ml。
在特定的實施方式中，MSP(例如MSR)可以以下濃度存在：約1μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml、100μg/ml、110μg/ml、120μg/ml、130μg/ml、140μg/ml或150μg/ml。
一般而言，本文所述之組成物將經由本領域中已知的任何常用和可接受的方式，以如上所述之治療有效量單獨地或與一種或多種治療劑組合投與。
可注射之組成物可為水性等滲懸浮液。該等組成物可為滅菌的和/或含有佐劑(如防腐劑、穩定劑、潤濕劑或乳化劑、溶液促進劑、用於調節滲透壓的鹽和/或緩衝劑)。另外，它們還可以包含其他治療有效物質。
本發明之藥物組成物能以適合於待治療(或預防)的疾病的方式投與。投與的總量和頻率將由如患者的狀況以及患者的疾病的類型和嚴重程度等因素來確定，然而適當的劑量可以藉由臨床試驗來確定。
在一些實施方式中，藥物組成物基本上不含，例如不存在可檢測水平的例如選自以下群組的污染物，該群組由以下項組成：內毒素、支原體、複製型慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIV gag、殘留的抗CD3/抗CD28包被的珠、小鼠抗體、合併的人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培養基組分、載體包裝細胞或質體組分、細菌和真菌。在一些實施方式中，細菌係選自以下群組的至少一種，該群組由以下項組成：糞產鹼菌、白色念珠菌、大腸桿菌、流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟氏菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、以及釀膿鏈球菌A組。
用於施加的藥物組成物(或配製物)可以根據用於投與本文所述組成物之方法而以多種方式包裝。一般來說，用於分配的對象包括藥物配製物以適當形式在其內貯存的容器。適合的容器對於熟悉該項技術者係熟知的並且包括材料如瓶(塑膠和玻璃)、小袋、安瓿、塑膠袋、金屬圓筒及其類似物。 容器還可以包括防干擾組件，以防止不小心接觸到包裝的內容物。另外，容器設有描述容器的內容物的標籤。標籤還可以包括適當的警示語。
在一些實施方式中，本文所述之組成物還包括T細胞刺激化合物或腫瘤抗原。在一些實施方式中，T細胞刺激化合物或腫瘤抗原軛合至或吸附到介孔二氧化矽顆粒之第一群體上。在另外的或可替代的實施方式中，T細胞刺激化合物或腫瘤抗原軛合至或吸附到介孔二氧化矽顆粒之第二群體上。在進一步的實施方式中，T細胞刺激化合物或腫瘤抗原係IL-2、IL-15、GM-CSF，抗CD2 mAb、抗CD3 mAb、抗CD28 mAb、新抗原肽、來自共用抗原(例如TRP2、gp100、腫瘤細胞裂解物、CD19、CD20、CD22、ROR1、間皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR、MAGE A3 TCR)的肽或其組合。對MSP(例如MSR)表面的吸附通常被理解為分子黏附於該表面。
在T細胞刺激化合物或腫瘤抗原軛合至介孔二氧化矽顆粒之第二群體的實施方式中，T細胞刺激化合物或腫瘤抗原可以軛合至介孔二氧化矽顆粒之第二群體的表面上的脂質雙層。在介孔二氧化矽顆粒上製備脂質雙層之方法係已知的。參見例如國際申請公開案號WO 2018/013797。簡而言之，含有預定量的標記如生物素的脂質體用於包被MSP。然後可以使用互補標記例如鏈黴親和素將標記用於附著至T細胞刺激化合物。用於製備脂質體的脂質係熟悉該項技術者已知的，並且包括但不限於具有兩個烴鏈(通常為醯基鏈)和極性頭基的形成囊泡的脂質。此類脂質包括磷脂，例如磷脂醯膽鹼(PC)，磷脂醯乙醇胺(PE)，磷脂酸(PA)，磷脂醯肌醇(PI)和鞘磷脂(SM)，其中兩個烴鏈長度通常是約14-22個碳原子，並且具有不同程度的不飽和度。在一些實施方式中，脂質係相對不飽和的磷脂(在烴鏈中具有一個、兩個或三個雙鍵)。在一些實 施方式中，脂質係磷脂醯膽鹼。磷脂醯膽鹼係一種以膽鹼為頭基並組合甘油磷酸和兩個脂肪酸的磷脂。在一些實施方式中，磷脂醯膽鹼係棕櫚醯基磷脂醯膽鹼或油醯基磷脂醯膽鹼或1-棕櫚醯基、2-油醯基-磷脂醯膽鹼。在製備脂質體組成物中可以使用一種類型以上的脂質。脂質和比例的選擇可以改變，以實現所需程度的流動性或剛性，和/或控制穩定性。在製備脂質體組成物中使用一種類型以上的脂質之情況下，應使用適量的相對不飽和的脂質(例如PC)以形成穩定的脂質體。在一些實施方式中，在配製物中使用的脂質的至少45mol%-50mol%係PC。脂質體還可以包括用親水性聚合物例如聚乙二醇(PEG)衍生的脂質。合適的親水性聚合物包括聚乙烯吡咯啶酮、聚乙烯基甲醚、聚甲基
Figure 109105885-A0202-12-0054-91
唑啉、聚乙基
Figure 109105885-A0202-12-0054-92
唑啉、聚羥丙基
Figure 109105885-A0202-12-0054-93
唑啉、聚羥丙基甲基丙烯醯胺、聚甲基丙烯醯胺、聚二甲基丙烯醯胺、聚羥丙基甲基丙烯酸酯、聚羥乙基丙烯酸酯、羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、聚乙二醇、聚天冬醯胺和親水性肽序列。製備用親水性聚合物衍生的脂質之方法係已知的(參見，例如，美國專利案號5,395,619，其藉由引用併入本文)。
在一些實施方式中，介孔二氧化矽顆粒之第一群體或第二群體還包括細胞介素。細胞介素可為但不限於IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21、或轉化生長因子β(TGF-β)或其促效劑，其模擬物，其變體，其功能片段或其組合。在特定的實施方式中，細胞介素軛合至或吸附到介孔二氧化矽顆粒的第一或第二群體上。在實施方式中，當細胞介素吸附到介孔二氧化矽顆粒之第二群體時，MSP(例如MSR)之第二群體可以進一步被脂質雙層覆蓋，如上所述。
方法
在一些實施方式中，本發明關於一種方法，該方法包括：
使T淋巴細胞與包含介孔二氧化矽顆粒(例如MSR)之第一群體和病毒載體之組成物接觸；
其中該病毒載體包含表現載體，該表現載體包含重組多核苷酸，該重組多核苷酸包含與待表現的核苷酸序列可操作地連接的表現控制序列。
在一些實施方式中，該接觸在體外進行。在一些實施方式中，T淋巴細胞在與介孔二氧化矽顆粒接觸之前或之後被活化。
在一些實施方式中，本發明關於一種利用重組多核苷酸體內遺傳轉導T淋巴細胞之方法，該方法包括：
向具有一種或多種T淋巴細胞的受試者投與包含介孔二氧化矽顆粒(例如，MSR)之第一群體和病毒載體之組成物；
其中該病毒載體包含表現載體，該表現載體包含重組多核苷酸，該重組多核苷酸包含與待表現的核苷酸序列可操作地連接的表現控制序列，並且
其中當該組成物接觸一種或多種T淋巴細胞時，該T淋巴細胞被該重組多核苷酸遺傳轉導。
在一些實施方式中，本發明關於體外擴增T淋巴細胞群體之方法，該方法包括使T淋巴細胞群體與以下接觸：
(a)組成物，其包含介孔二氧化矽顆粒(例如，MSR)之第一群體和病毒載體以提供轉導的T淋巴細胞群體；和
(b)使該轉導的T淋巴細胞群體與T細胞刺激化合物或腫瘤抗原以及視需要的的細胞介素接觸；
其中該病毒載體包含表現載體，該表現載體包含重組多核苷酸，該重組多核苷酸包含與待表現的核苷酸序列可操作地連接的表現控制序列。
在當前描述之方法的一些實施方式中，該方法導致群體中T淋巴細胞的比例增加。
在一些實施方式中，本發明關於擴增嵌合抗原受體(CAR)T細胞群體之方法，該方法包括使CAR-T細胞群體與軛合至靶向部分的介孔二氧化矽顆粒(例如，MSR)接觸，其中該靶向部分與該CAR互補。
在一些實施方式中，本發明關於一種選擇性地擴增培養物中T淋巴細胞比例之方法，該方法包括使T淋巴細胞群體與以下接觸：
(a)組成物，其包含介孔二氧化矽顆粒(例如，MSR)之第一群體和病毒載體以提供轉導的T淋巴細胞群體；和
(b)使該轉導的T淋巴細胞群體與T細胞刺激化合物或腫瘤抗原以及視需要的的細胞介素接觸；
其中該病毒載體包含表現載體，該表現載體包含重組多核苷酸，該重組多核苷酸包含與待表現的核苷酸序列可操作地連接的表現控制序列。
在一些實施方式中，培養物包括不同的效應細胞類型，包括NK細胞、單核細胞、B細胞。在特定的實施方式中，與接觸MSP組成物之前的T淋巴細胞的比例相比，T淋巴細胞的比例提高了約10%、20%、30%、40%或50%。在一些實施方式中，細胞群體擴增8天或更短的時間。
在一些實施方式中，本發明係將病毒載體遞送至受試者中所需的作用位點之方法，該方法包括向該受試者投與包含介孔二氧化矽顆粒之第一群 體和病毒載體之組成物。介孔二氧化矽顆粒(例如，MSR)和病毒載體之組成物如上所述。
在一些方面，在本文所述之方法中，介孔二氧化矽顆粒可以用多個吸附或共價鍵合在孔襯裡和/或奈米通道襯裡的表面上或MSP(例如MSR)的表面上的官能基進行表面修飾，如本文所述。在一些實施方式中，官能基係-OH(羥基)、胺、羧酸、膦酸酯、鹵化物、疊氮化物、炔、環氧化物、巰基、二硫化物、聚乙烯亞胺、疏水部分或其鹽。在一些實施方式中，可以將官能基(即-OH(羥基)、胺、羧酸、膦酸酯、鹵化物、疊氮化物、炔、環氧化物、巰基、二硫化物、聚乙烯亞胺、疏水部分或其鹽)與二氧化矽表面藉由連接子分開。在一些實施方式中，官能基經由C1至C20烷基連接子共價鍵合至MSP或MSR表面。在其他實施方式中，官能基經由聚乙二醇連接子共價鍵合至MSP(例如MSR)表面。在特定的實施方式中，表面修飾係C1至C20烷基全鹵代烷基或C1至C20烷基全氟代烷基。
在另一方面，在本文所述之方法中，病毒載體如本文所述。在本發明之方法中，病毒載體可以與本文所述之介孔二氧化矽顆粒(例如MSR)軛合。在一些實施方式中，介孔二氧化矽顆粒和病毒載體之間的靜電軛合係由於病毒載體和介孔二氧化矽顆粒電荷相反。例如但不受理論的束縛，藉由聚乙烯亞胺或帶正電荷的一級銨、二級銨、三級銨或季銨基團表面修飾的介孔二氧化矽顆粒可以與帶負電荷的病毒載體軛合。因此，在一些實施方式中，病毒載體帶負電，而表面修飾的介孔二氧化矽顆粒帶正電。在一些實施方式中，介孔二氧化矽顆粒和病毒載體之間的共價軛合藉由熟悉該項技術者已知之方法、藉由 連接子或不藉由連接子來實現。例如但不限於，連接子可為聚乙二醇、烷基、聚合物、聚醯胺鍵等。
在本文敘述的一些方法中，核苷酸序列表現嵌合抗原受體(CAR)、工程改造的TCR、細胞介素、趨化因子、用於阻斷抑制性分子的shRNA、或用於誘導蛋白質表現的mRNA。在特定的實施方式中，待表現的核苷酸序列表現CAR。
在本文所述之一些方法中，可以藉由使T淋巴細胞與T細胞刺激化合物或腫瘤抗原接觸來活化T淋巴細胞。本文提供了T細胞刺激化合物之實例。在一些實施方式中，T細胞刺激化合物或腫瘤抗原軛合至或吸附到介孔二氧化矽顆粒之第一群體或介孔二氧化矽顆粒之第二群體或MSP(例如MSR)的兩個群體上。在其他實施方式中，T細胞刺激化合物或腫瘤抗原軛合至或吸附到介孔二氧化矽顆粒之第一群體上。在特定實施方式中，T細胞刺激化合物或腫瘤抗原直接軛合至介孔二氧化矽顆粒之第二群體上或直接軛合至介孔二氧化矽顆粒之第二群體的表面上的脂質包膜上。在MSP的表面上的脂質包膜的製備係已知的並且在本文中進行了描述。參見例如國際申請公開案號WO 2018/013797。
本文所述之方法可還包括使T淋巴細胞與細胞介素接觸。在一些實施方式中，細胞介素在具有MSP(例如MSR)的介質中，或軛合至或吸附到介孔二氧化矽顆粒之第一群體或第二群體或兩個群體上。在一些實施方式中，細胞介素係IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21或轉化生長因子β(TGF-β)或其促效劑、其模擬物、其變體、其功能片段，或其組合。
在一些實施方式中，該方法還包括在轉導後擴增T細胞群體。可以藉由本文描述之方法擴增T細胞/T淋巴細胞。在一些實施方式中，細胞群體擴增8天或更短的時間。
在又其他實施方式中，使細胞群體在體外擴增5天，並且與在相同培養條件下在培養物中擴增9天的相同細胞相比，所得細胞表現出更高的促炎性IFN-γ和/或GM-CSF水平。
不受理論的束縛，據信本文所述之方法在CAR-T細胞製造過程中保存慢病毒。材料系統的刺激能力藉由允許抗原特異性刺激CAR T細胞，從而允許來自當前使用的CAR T細胞製造試劑的獨特能力，這可以在轉移到體內時增強CAR T細胞的功能，或者可以用於選擇性地刺激和擴增CAR T細胞(相對於培養物中的非CAR T細胞)以增強CAR T細胞產物的純度。
在一些實施方式中，本發明係將活性劑遞送至受試者中所需的作用位點之方法，該方法包括向該受試者投與包含軛合至聚乙烯亞胺的介孔二氧化矽顆粒之組成物。在特定實施方式中，聚乙烯亞胺共價軛合至介孔二氧化矽顆粒。在一些實施方式中，如藉由凝膠滲透層析法(GPC)測量，聚乙烯亞胺基團具有約1000至20,000Da、約1,200至15,000Da、約1,500至12,000Da、約2,000Da、約3,000Da、約4,000Da、約5,000Da、約6,000Da、約7,000Da、約8,000Da、約9,000Da或約10,000Da之平均分子量。
在一些實施方式中，本發明提供向受試者在所需的作用位點提供持續的藥物遞送之方法，該方法包括向該受試者投與組成物，該組成物包含軛合至聚乙烯亞胺的介孔二氧化矽顆粒、和在介孔二氧化矽顆粒上吸收或吸附的活性劑。
在一些實施方式中，活性劑係抗癌藥。
嵌合抗原受體技術概述
在本發明之一些實施方式中，本文描述使用介孔二氧化矽顆粒製造(例如，活化和/或擴增)工程改造以表現CAR分子(例如，如本文所述)的免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)群體之方法，其中該細胞具有增強的活性(例如，增殖、細胞介素釋放、和/或腫瘤靶向功效)。
在一些實施方式中，重組多肽構建體編碼嵌合抗原受體(CAR)，該嵌合抗原受體包含結合至支持腫瘤的抗原(例如，如本文描述的支持腫瘤的抗原)的抗原結合結構域(例如，抗體或抗體片段，TCR或TCR片段)、跨膜結構域(例如，本文描述的跨膜結構域)和細胞內傳訊結構域(例如，本文描述的細胞內傳訊結構域)(例如，包含共刺激結構域(例如，本文描述的共刺激結構域)和/或初級傳訊結構域(例如，本文描述的初級傳訊結構域)的細胞內傳訊結構域)。在一些實施方式中，該支持腫瘤的抗原係存在於基質細胞或骨髓源性抑制細胞(MDSC)上的抗原。在其他方面，本發明之特徵在於由此類核酸編碼的多肽以及含有此類核酸和/或多肽的宿主細胞。
在一些實施方式中，載體中的核苷酸序列表現經工程改造以靶向腫瘤抗原之蛋白質。
在一些實施方式中，該腫瘤抗原選自以下中的一種或多種：CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1(也稱為CD2亞群1、CRACC、SLAMF7、CD319、以及19A24)；C型凝集素樣分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生長因子受體變體III(EGFRvIII)；神經節苷脂G2(GD2)；神經節苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；TNF受體家族成員B 細胞成熟(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特異性膜抗原(PSMA)；受體酪胺酸激酶樣孤兒受體1(ROR1)；Fms樣酪胺酸激酶3(FLT3)；腫瘤相關糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮細胞黏附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白血球介素-13受體亞基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；間皮素；白血球介素11受體α(IL-11Ra)；前列腺幹細胞抗原(PSCA)；蛋白酶絲胺酸21(睾蛋白或PRSS21)；血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板來源的生長因子受體β(PDGFR-β)；階段特異性胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20；葉酸受體α；受體酪胺酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；黏蛋白1，細胞表面相關的(MUC1)；表皮生長因子受體(EGFR)；神經細胞黏附分子(NCAM)；前列腺酶；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突變的延伸因子2(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纖維細胞活化蛋白α(FAP)；胰島素樣生長因子1受體(IGF-I受體)，碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶體(Prosome，Macropain)亞基，β型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；由斷裂點簇集區(BCR)和Abelson鼠白血病病毒致癌基因同源物1(Abl)組成的致癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪胺酸酶；肝配蛋白A型受體2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸Lewis黏附分子(sLe)；神經節苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；轉麩醯胺酸酶5(TGS5)；高分子量-黑色素瘤相關抗原(HMWMAA)；o-乙醯基-GD2神經節苷脂(OAcGD2)；葉酸受體β；腫瘤內皮標記1(TEM1/CD248)；腫瘤內皮標記7相關的(TEM7R)；密封蛋白6(CLDN6)；促甲狀腺激素受體(TSHR)；G蛋白偶聯受體C類5組，成員D(GPRC5D)；染色體X可讀框61(CXORF61)；CD97；CD179a；間變性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盤特異性1(PLAC1)； globoH糖基神經醯胺(GloboH)的六糖部分；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿溶蛋白2(UPK2)；甲型肝炎病毒細胞受體1(HAVCR1)；腎上腺素受體β 3(ADRB3)；泛連接蛋白3(PANX3)；G蛋白偶聯受體20(GPR20)；淋巴細胞抗原6複合物，基因座K 9(LY6K)；嗅覺受體51E2(OR51E2)；TCR γ替代性閱讀框蛋白(TARP)；腎母細胞瘤蛋白(WT1)；癌/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑色素瘤相關抗原1(MAGE-A1)；ETS易位變異基因6，位於染色體12p上(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成員1A(XAGE1)；血管生成素結合細胞表面受體2(Tie 2)；黑色素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑色素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相關的抗原1；腫瘤蛋白p53(p53)；p53突變體；前列腺特異性蛋白(prostein)；存活蛋白(surviving)；端粒酶；前列腺癌腫瘤抗原-1(PCTA-1或半乳糖蛋白8)、T細胞1識別的黑色素瘤抗原(MelanA或MART1)；大鼠肉瘤(Ras)突變體；人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)；肉瘤易位中斷點；黑色素瘤細胞凋亡抑制劑(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶、絲胺酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙醯葡糖胺基轉移酶V(NA17)；配對盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受體；週期蛋白B1；v-myc禽類骨髓細胞瘤病毒致癌基因神經母細胞瘤來源同源物(MYCN)；Ras同源物家族成員C(RhoC)；酪胺酸酶相關蛋白2(TRP-2)；細胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC-結合因子(鋅指蛋白)樣(BORIS或印記位點調節因子樣蛋白(Brother of the Regulator of Imprinted Sites))，T細胞3識別的鱗狀細胞癌抗原(SART3)；配對盒蛋白Pax-5(PAX5)；前頂體蛋白結合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴細胞特異性蛋白酪胺酸激酶(LCK)；激酶錨蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X中斷點2(SSX2)；晚期糖基化終產物受體 (RAGE-1)；腎遍在蛋白1(RU1)；腎遍在蛋白2(RU2)；Legumain；人乳頭狀瘤病毒E6(HPV E6)；人乳頭狀瘤病毒E7(HPV E7)；腸羧酸酯酶；突變的熱休克蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白血球相關的免疫球蛋白樣受體1(LAIR1)；IgA受體的Fc片段(FCAR或CD89)；白血球免疫球蛋白樣受體亞家族A成員2(LILRA2)；CD300分子樣家族成員f(CD300LF)；C型凝集素結構域家族12成員A(CLEC12A)；骨髓基質細胞抗原2(BST2)；含EGF樣模組的黏蛋白樣激素受體樣2(EMR2)；淋巴細胞抗原75(LY75)；磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受體樣5(FCRL5)；以及免疫球蛋白λ樣多肽1(IGLL1)。
本文所述之CAR可以包含與支持腫瘤的抗原(例如，如本文所述之支持腫瘤的抗原)結合的抗原結合結構域(例如，抗體或抗體片段，TCR或TCR片段)。在一些實施方式中，該支持腫瘤的抗原係存在於基質細胞或骨髓源性抑制細胞(MDSC)上的抗原。基質細胞可以分泌生長因子以促進微環境中的細胞分裂。MDSC細胞可以抑制T細胞增殖和活化。不希望受理論束縛，在一些實施方式中，表現CAR的細胞破壞支持腫瘤的細胞，從而間接地抑制腫瘤生長或存活。
在實施方式中，基質細胞抗原選自以下中的一種或多種：骨髓基質細胞抗原2(BST2)、成纖維細胞活化蛋白(FAP)和腱生蛋白。在一些實施方式中，FAP特異性抗體係西羅珠單抗，與西羅珠單抗競爭結合、或具有與西羅珠單抗相同的CDR。在實施方式中，MDSC抗原選自以下中的一種或多種：CD33、CD11b、C14、CD15和CD66b。因此，在一些實施方式中，該支持腫瘤的抗原選 自以下中的一種或多種：骨髓基質細胞抗原2(BST2)、成纖維細胞活化蛋白(FAP)或腱生蛋白、CD33、CD11b、C14、CD15、以及CD66b。
在一些實施方式中，編碼的CAR分子的抗原結合結構域包含抗體、抗體片段、scFv、Fv、Fab、(Fab’)2、單結構域抗體(SDAB)、VH或VL結構域、駱駝科VHH結構域或雙功能(例如雙特異性)雜合抗體(例如，Lanzavecchia等人，Eur.J.Immunol.[歐洲免疫學雜誌]17,105(1987))。
在一些情況下，可以根據本領域已知之方法製備scFv(參見例如，Bird等人，(1988)Science[科學]242：423-426和Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美國國家科學院院刊]85：5879-5883)。可以藉由使用柔性多肽連接子將VH和VL區連接在一起來產生ScFv分子。scFv分子包含具有優化的長度和/或胺基酸組成的連接子(例如，Ser-Gly連接子)。連接子長度可以極大地影響scFv的可變區折疊和相互作用的方式。事實上，如果採用短多肽連接子(例如，5-10個胺基酸)，則可以防止鏈內折疊。還需要鏈間折疊以將兩個可變區組合在一起形成功能性表位結合位點。對於連接子取向和大小之實例，參見例如，Hollinger等人，1993 Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.[美國國家科學院院刊]90：6444-6448；美國專利申請公開案號2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794；以及PCT公開案號WO2006/020258和WO2007/024715，該文獻藉由引用併入本文中。
scFv可以在其VL與VH區之間包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、或更多個胺基酸殘基的連接子。連接子序列可以包含任何天然存在的胺基酸。在一些實施方式中，連接子序列包含胺基酸甘胺酸和絲胺酸。在另一個實施方式中，該連接子序列包含甘胺酸和絲胺酸重複序列組，如(Gly4Ser)n，其中n 為等於或大於1的正整數(SEQ ID NO：22)。在一些實施方式中，連接子可為(Gly4Ser)4(SEQ ID NO：29)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：30)。連接子長度的變化可以保留或增強活性，從而在活性研究中產生優異的功效。
在另一方面，抗原結合結構域係T細胞受體(「TCR」)或其片段，例如單鏈TCR(scTCR)。用於製備此類TCR之方法係本領域中已知的。參見例如Willemsen RA等人，Gene Therapy[基因療法]7：1369-1377(2000)；Zhang T等人，Cancer Gene Ther[癌症基因療法]11：487-496(2004)；Aggen等人，Gene Ther.[基因療法]19(4)：365-74(2012)(將參考文獻以其整體併入本文)。例如，scTCR可以工程化為含有來自藉由連接子(例如柔性肽)連接的T細胞殖株的Vα和Vβ基因。此途徑對於本身在細胞內的癌症相關靶標非常有用，然而，這種抗原(肽)的片段藉由MHC呈遞在癌細胞的表面上。
在某些實施方式中，編碼的抗原結合結構域具有10-4M至10-8M的結合親和力KD。
在一些實施方式中，編碼的CAR分子包含如下抗原結合結構域，該抗原結合結構域對靶抗原的結合親和力KD為10-4M至10-8M，例如10-5M至10-7M，例如10-6M或10-7M。在一些實施方式中，該抗原結合結構域的結合親和力比參考抗體(例如本文所述之抗體)的結合親和力低至少5倍、10倍、20倍、30倍、50倍、100倍或1,000倍。在一些實施方式中，編碼的抗原結合結構域的結合親和力比參考抗體(例如，該抗原結合結構域所來源的抗體)的結合親和力低至少5倍。在一些方面，此類抗體片段係功能性的，因為它們提供生物學應答，該生物學應答可以包括但不限於免疫應答的活化、起源於其靶抗原的訊息傳導的抑制、激酶活性的抑制等，如熟練技術人員所理解的那樣。
在一些方面，CAR的抗原結合結構域係scFv抗體片段，該scFv抗體片段與它所來源的scFv的鼠序列相比係人源化的。
在一些方面，本發明之CAR的抗原結合結構域(例如，scFv)由核酸分子編碼，該核酸分子的序列已進行密碼子優化以在哺乳動物細胞中表現。在一些方面，本發明之整個CAR構建體由核酸分子編碼，該核酸分子的整個序列已進行密碼子優化以在哺乳動物細胞中表現。密碼子優化係指如下發現：在編碼DNA中同義密碼子(即編碼相同胺基酸的密碼子)的出現頻率在不同物種中有偏差。此種密碼子簡並性允許相同的多肽由多種核苷酸序列編碼。多種密碼子優化方法係本領域中已知的，並且包括例如在至少美國專利案號5,786,464和6,114,148中揭露之方法。
在涉及被工程化為表現例如，如本文描述的CAR分子的免疫效應細胞的實施方式中，應理解該治療方法可以還包括下文在關於嵌合抗原受體的章節中描述的任何步驟、方面或特徵。
該等細胞較佳的是免疫效應細胞。在一些實施方式中，該等細胞係T細胞。在一些實施方式中，該等細胞係NK細胞。在實施方式中，本發明關於本發明之細胞群體，例如本發明之免疫效應細胞群體。在實施方式中，本發明之細胞群體包含所指示類型的細胞，並且可以包含其他類型(例如，被工程化為表現例如，如本文描述的CAR分子的免疫效應細胞群體(例如T細胞)可以包含被工程化為表現CAR分子的T細胞以及未被工程化為表現CAR分子的T細胞(或其他細胞類型))。在實施方式中，用於本發明之方法中的細胞群體基本上由所指示類型的細胞組成。在實施方式中，本發明之細胞群體基本上不含其他細胞類型。在實施方式中，本發明之細胞群體由所指示的細胞類型組成。
在任何前述方面和實施方式中，細胞和/或細胞群體係或包含免疫效應細胞，例如免疫效應細胞群體包含T細胞或NK細胞，例如由T細胞或NK細胞組成。在實施方式中，該等細胞係T細胞，例如CD8+ T細胞、CD4+ T細胞或它們的組合。在實施方式中，該等細胞係NK細胞。
在實施方式中，該等細胞係人細胞。在實施方式中，該等細胞例如對於有待投與該等細胞的受試者係自體的。在實施方式中，該等細胞例如對於有待投與該等細胞的受試者係同種異體的。
一般而言，在本文所述之方法中，本文所述之組成物將經由本領域中已知的任何常用和可接受的方式，以如上所述之治療有效量單獨地或與一種或多種治療劑組合投與。在特定的實施方式中，組成物藉由注射投與。在又特定實施方式中，對於體內投與，將組成物皮下投與給需要其的受試者。在其他實施方式中，可以在所需的作用位點以植入物的形式投與組成物。作用位點可以由熟悉該項技術者根據受試者的需要確定。
CAR靶標
本文所述之係病毒載體以轉導免疫效應細胞(例如，T細胞、NK細胞)，該等免疫效應細胞被工程化為含有一種或多種CAR，該一種或多種CAR將免疫效應細胞引導至不希望的細胞(例如，癌細胞)。這藉由CAR上的抗原結合結構域實現，該抗原結合結構域對癌症相關抗原具有特異性。存在兩類可以藉由本發明之CAR靶向的癌症相關抗原(腫瘤抗原)：(1)在癌細胞表面上表現的癌症相關抗原；和(2)本身在細胞內的癌症相關抗原，然而，這種抗原(肽)的片段藉由MHC(主要組織相容性複合物)呈遞在癌細胞的表面上。
在一些實施方式中，該腫瘤抗原選自以下中的一種或多種：CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1(也稱為CD2亞群1、CRACC、SLAMF7、CD319、以及19A24)；C型凝集素樣分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生長因子受體變體III(EGFRvIII)；神經節苷脂G2(GD2)；神經節苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；TNF受體家族成員B細胞成熟(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特異性膜抗原(PSMA)；受體酪胺酸激酶樣孤兒受體1(ROR1)；Fms樣酪胺酸激酶3(FLT3)；腫瘤相關糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮細胞黏附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白血球介素-13受體亞基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；間皮素；白血球介素11受體α(IL-11Ra)；前列腺幹細胞抗原(PSCA)；蛋白酶絲胺酸21(睾蛋白或PRSS21)；血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板來源的生長因子受體β(PDGFR-β)；階段特異性胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20；葉酸受體α；受體酪胺酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；黏蛋白1，細胞表面相關的(MUC1)；表皮生長因子受體(EGFR)；神經細胞黏附分子(NCAM)；前列腺酶；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突變的延伸因子2(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纖維細胞活化蛋白α(FAP)；胰島素樣生長因子1受體(IGF-I受體)，碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶體(Prosome，Macropain)亞基，β型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；由斷裂點簇集區(BCR)和Abelson鼠白血病病毒致癌基因同源物1(Abl)組成的致癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪胺酸酶；肝配蛋白A型受體2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸Lewis黏附分子(sLe)；神經節苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；轉麩醯胺酸酶5(TGS5)； 高分子量-黑色素瘤相關抗原(HMWMAA)；o-乙醯基-GD2神經節苷脂(OAcGD2)；葉酸受體β；腫瘤內皮標記1(TEM1/CD248)；腫瘤內皮標記7相關的(TEM7R)；密封蛋白6(CLDN6)；促甲狀腺激素受體(TSHR)；G蛋白偶聯受體C類5組，成員D(GPRC5D)；染色體X可讀框61(CXORF61)；CD97；CD179a；間變性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盤特異性1(PLAC1)；globoH糖基神經醯胺(GloboH)的六糖部分；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿溶蛋白2(UPK2)；甲型肝炎病毒細胞受體1(HAVCR1)；腎上腺素受體β 3(ADRB3)；泛連接蛋白3(PANX3)；G蛋白偶聯受體20(GPR20)；淋巴細胞抗原6複合物，基因座K 9(LY6K)；嗅覺受體51E2(OR51E2)；TCR γ替代性閱讀框蛋白(TARP)；腎母細胞瘤蛋白(WT1)；癌/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑色素瘤相關抗原1(MAGE-A1)；ETS易位變異基因6，位於染色體12p上(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成員1A(XAGE1)；血管生成素結合細胞表面受體2(Tie 2)；黑色素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑色素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相關的抗原1；腫瘤蛋白p53(p53)；p53突變體；前列腺特異性蛋白(prostein)；存活蛋白(surviving)；端粒酶；前列腺癌腫瘤抗原-1(PCTA-1或半乳糖蛋白8)、T細胞1識別的黑色素瘤抗原(MelanA或MART1)；大鼠肉瘤(Ras)突變體；人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)；肉瘤易位中斷點；黑色素瘤細胞凋亡抑制劑(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶、絲胺酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙醯葡糖胺基轉移酶V(NA17)；配對盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受體；週期蛋白B1；v-myc禽類骨髓細胞瘤病毒致癌基因神經母細胞瘤來源同源物(MYCN)；Ras同源物家族成員C(RhoC)；酪胺酸酶相關蛋白2(TRP-2)； 細胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC-結合因子(鋅指蛋白)樣(BORIS或印記位點調節因子樣蛋白(Brother of the Regulator of Imprinted Sites))，T細胞3識別的鱗狀細胞癌抗原(SART3)；配對盒蛋白Pax-5(PAX5)；前頂體蛋白結合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴細胞特異性蛋白酪胺酸激酶(LCK)；激酶錨蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X中斷點2(SSX2)；晚期糖基化終產物受體(RAGE-1)；腎遍在蛋白1(RU1)；腎遍在蛋白2(RU2)；Legumain；人乳頭狀瘤病毒E6(HPV E6)；人乳頭狀瘤病毒E7(HPV E7)；腸羧酸酯酶；突變的熱休克蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白血球相關的免疫球蛋白樣受體1(LAIR1)；IgA受體的Fc片段(FCAR或CD89)；白血球免疫球蛋白樣受體亞家族A成員2(LILRA2)；CD300分子樣家族成員f(CD300LF)；C型凝集素結構域家族12成員A(CLEC12A)；骨髓基質細胞抗原2(BST2)；含EGF樣模組的黏蛋白樣激素受體樣2(EMR2)；淋巴細胞抗原75(LY75)；磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受體樣5(FCRL5)；以及免疫球蛋白λ樣多肽1(IGLL1)。
CD19
非限制性示例性腫瘤抗原係CD19。結合CD19的CAR係本領域已知的。例如，在WO2012/079000和WO2014/153270中揭露的那些。可以根據本揭露使用本領域任何已知的CD19 CAR，例如任何已知的CD19 CAR的CD19抗原結合結構域。例如，LG-740；CD19 CAR描述於以下中：美國專利案號8,399,645；美國專利案號7,446,190；Xu等人，Leuk Lymphoma.[白血病淋巴瘤]2013 54(2)：255-260(2012)；Cruz等人，Blood[血液]122(17)：2965-2973(2013)；Brentjens等人，Blood[血液]118(18)：4817-4828(2011)；Kochenderfer等人，Blood[血液] 116(20)：4099-102(2010)；Kochenderfer等人，Blood[血液]122(25)：4129-39(2013)；以及16th Annu Meet Am Soc Gen Cell Ther(ASGCT)[美國基因與細胞治療學會(ASGCT)第16屆年度會議](5月15-18日，鹽湖城)2013，文摘10。
非限制性的示例性CD19 CAR包括本文所述之CD19 CAR、或描述於以下中的抗CD19 CAR：Xu等人Blood[血液]123.24(2014)：3750-9；Kochenderfer等人Blood[血液],122.25(2013)：4129-39；Cruz等人Blood[血液]122.17(2013)：2965-73、NCT00586391、NCT01087294、NCT02456350、NCT00840853、NCT02659943、NCT02650999、NCT02640209、NCT01747486、NCT02546739、NCT02656147、NCT02772198、NCT00709033、NCT02081937、NCT00924326、NCT02735083、NCT02794246、NCT02746952、NCT01593696、NCT02134262、NCT01853631、NCT02443831、NCT02277522、NCT02348216、NCT02614066、NCT02030834、NCT02624258、NCT02625480、NCT02030847、NCT02644655、NCT02349698、NCT02813837、NCT02050347、NCT01683279、NCT02529813、NCT02537977、NCT02799550、NCT02672501、NCT02819583、NCT02028455、NCT01840566、NCT01318317、NCT01864889、NCT02706405、NCT01475058、NCT01430390、NCT02146924、NCT02051257、NCT02431988、NCT01815749、NCT02153580、NCT01865617、NCT02208362、NCT02685670、NCT02535364、NCT02631044、NCT02728882、NCT02735291、NCT01860937、NCT02822326、NCT02737085、NCT02465983、NCT02132624、NCT02782351、NCT01493453、NCT02652910、NCT02247609、NCT01029366、NCT01626495、NCT02721407、NCT01044069、NCT00422383、NCT01680991、NCT02794961或NCT02456207，該等文獻各自藉由引用以其全文併入本文。
在一些實施方式中，該CD19 CAR包含在WO2012/079000中作為SEQ ID NO：12提供的融合多肽序列，其提供特異性結合至人CD19的鼠來源的scFv片段。
在一些實施方式中，CD19 CAR包含在WO2012/079000中作為SEQ ID NO：12提供的胺基酸序列。
在一些實施方式中，CD19 CAR包含胺基酸序列：
Figure 109105885-A0202-12-0072-389
(SEQ ID NO：675)、或與其基本上同源的序列。
在一些實施方式中，CD19 CAR包含胺基酸序列：
Figure 109105885-A0202-12-0072-390
Figure 109105885-A0202-12-0072-391
(SEQ ID NO：676)
在一些實施方式中，CD19 CAR係人源化的CD19 CAR，其包含胺基酸序列：
Figure 109105885-A0202-12-0072-392
Figure 109105885-A0202-12-0073-393
(SEQ ID NO：677)
在一些實施方式中，CD19 CAR包含序列，例如揭露於以下表1中的CDR、VH、VL、scFv、或全長-CAR序列，或與其具有至少80%、85%、90%、95%、或99%同一性的序列。
Figure 109105885-A0202-12-0073-394
Figure 109105885-A0202-12-0074-395
Figure 109105885-A0202-12-0075-396
BCMA
非限制性示例性腫瘤抗原係BCMA。結合BCMA的CAR係本領域已知的。例如，揭露於WO2016/014565或WO2019/241426的那些。可以根據本揭露使用本領域任何已知的BCMA CAR，例如任何已知的BCMA CAR的BCMA抗原結合結構域。例如WO2016/014565中揭露的BCMA-1、BCMA-2、BCMA-3、BCMA-4、BCMA-5、BCMA-6、BCMA-7、BCMA-8,BCMA-9、BCMA-10、 BCMA-11、BCMA-12、BCMA-13、BCMA-14、BCMA-15、149362、149363、149364、149365、149366、149367、149368、149369、BCMA_EBB-C1978-A4、BCMA_EBB-C1978-G1、BCMA_EBB-C1979-C1、BCMA_EBB-C1978-C7、BCMA_EBB-C1978-D10、BCMA_EBB-C1979-C12、BCMA_EBB-C1980-G4、BCMA_EBB-C1980-D2、BCMA_EBB-C1978-A10、BCMA_EBB-C1978-D4、BCMA_EBB-C1980-A2、BCMA_EBB-C1981-C3、BCMA_EBB-C1978-G4、A7D12.2、C11D5.3、C12A3.2或C13F12.1。
在一些實施方式中，該BCMA CAR包含揭露於WO2016/014565中的BCMA-1、BCMA-2、BCMA-3、BCMA-4、BCMA-5、BCMA-6、BCMA-7、BCMA-8、BCMA-9、BCMA-10、BCMA-11、BCMA-12、BCMA-13、BCMA-14、BCMA-15、149362、149363、149364、149365、149366、149367、149368、149369、BCMA_EBB-C1978-A4、BCMA_EBB-C1978-G1、BCMA_EBB-C1979-C1、BCMA_EBB-C1978-C7、BCMA_EBB-C1978-D10、BCMA_EBB-C1979-C12、BCMA_EBB-C1980-G4、BCMA_EBB-C1980-D2、BCMA_EBB-C1978-A10、BCMA_EBB-C1978-D4、BCMA_EBB-C1980-A2、BCMA_EBB-C1981-C3、BCMA_EBB-C1978-G4、A7D12.2、C11D5.3、C12A3.2、或C13F12.1的一種或多種CDR、VH、VL、scFv、或全長序列、或基本上(例如，95%-99%)與其相同的序列。
在一些實施方式中，BCMA CAR包含序列，例如揭露於表2-14中的CDR、VH、VL、scFv、或全長-CAR序列，或與其具有至少80%、85%、90%、95%、或99%同一性的序列。
[表2].示例性PALLAS來源的抗BCMA分子的胺基酸和核酸序列
Figure 109105885-A0202-12-0077-397
Figure 109105885-A0202-12-0078-398
Figure 109105885-A0202-12-0079-399
Figure 109105885-A0202-12-0080-400
Figure 109105885-A0202-12-0081-401
Figure 109105885-A0202-12-0082-402
Figure 109105885-A0202-12-0083-403
Figure 109105885-A0202-12-0084-404
Figure 109105885-A0202-12-0085-405
Figure 109105885-A0202-12-0085-406
Figure 109105885-A0202-12-0086-407
Figure 109105885-A0202-12-0086-408
Figure 109105885-A0202-12-0086-409
Figure 109105885-A0202-12-0087-410
Figure 109105885-A0202-12-0087-411
Figure 109105885-A0202-12-0088-412
Figure 109105885-A0202-12-0089-413
Figure 109105885-A0202-12-0090-414
Figure 109105885-A0202-12-0091-415
Figure 109105885-A0202-12-0092-416
Figure 109105885-A0202-12-0093-417
Figure 109105885-A0202-12-0094-418
Figure 109105885-A0202-12-0095-419
Figure 109105885-A0202-12-0096-420
Figure 109105885-A0202-12-0096-421
Figure 109105885-A0202-12-0096-422
Figure 109105885-A0202-12-0097-423
Figure 109105885-A0202-12-0097-424
Figure 109105885-A0202-12-0097-425
Figure 109105885-A0202-12-0098-426
Figure 109105885-A0202-12-0099-427
Figure 109105885-A0202-12-0100-428
Figure 109105885-A0202-12-0100-429
Figure 109105885-A0202-12-0101-430
Figure 109105885-A0202-12-0102-431
Figure 109105885-A0202-12-0103-432
Figure 109105885-A0202-12-0104-433
Figure 109105885-A0202-12-0105-434
Figure 109105885-A0202-12-0106-435
Figure 109105885-A0202-12-0106-436
Figure 109105885-A0202-12-0107-437
Figure 109105885-A0202-12-0107-438
Figure 109105885-A0202-12-0107-439
Figure 109105885-A0202-12-0108-440
在一些實施方式中，使用來自WO 2012/0163805(將其藉由引用以其整體特此併入)的VH和VL序列產生BCMA CAR。在一些實施方式中，可以使用來自WO2019/241426(將其藉由引用以其整體特此併入)的CDR、VH、VL、scFv或完整CAR序列產生BCMA CAR。
其他示例性靶標
另外的非限制性示例性腫瘤抗原包括CD20、CD22、EGFR、CD123和CLL-1。
結合CD20的CAR係本領域已知的。例如，在WO2018/067992或WO2016/164731(藉由引用併入本文)中揭露的那些。可以根據本揭露使用本領域任何已知的CD20 CAR，例如任何已知的CD20 CAR的CD20抗原結合結構域。示例性的結合CD20的序列或CD20 CAR序列揭露於例如WO2018/067992(藉由引用併入本文)的表1-5。在一些實施方式中，CD20 CAR包含在 WO2018/067992或WO2016/164731(兩者藉由引用併入本文)中揭露的CD20 CAR的CDR、可變區、scFv或全長序列。
結合CD22的CAR係本領域已知的。例如，在WO2018/067992或WO2016/164731中揭露的那些。可以根據本揭露使用本領域任何已知的CD22 CAR，例如任何已知的CD22 CAR的CD22抗原結合結構域。
示例性CD22結合序列或CD22 CAR序列揭露於例如WO 2016164731的表6A、6B、7A、7B、7C、8A、8B、9A、9B、10A、和10B以及WO 2018067992的表6-10中。在一些實施方式中，CD22 CAR序列包含WO 2018067992或WO 2016164731中揭露的CD22 CAR的CDR、可變區、scFv或全長序列。
在實施方式中，CAR包含結合CD22的抗原結合結構域(CD22 CAR)。在一些實施方式中，抗原結合結構域靶向人CD22。在一些實施方式中，抗原結合結構域包括如本文所述之單鏈Fv序列。
人CD22 CAR的序列在如下提供。在一些實施方式中，人CD22 CAR係CAR22-65。
人CD22 CAR scFv序列
Figure 109105885-A0202-12-0109-441
(SEQ ID NO：671)
人CD22 CAR重鏈可變區
Figure 109105885-A0202-12-0110-442
Figure 109105885-A0202-12-0110-443
(SEQ ID NO 672)
人CD22 CAR輕鏈可變區
Figure 109105885-A0202-12-0110-444
Figure 109105885-A0202-12-0110-445
(SEQ ID NO 673)
Figure 109105885-A0202-12-0110-446
Figure 109105885-A0202-12-0110-447
結合EGFR的CAR係本領域已知的。例如，在WO2014/130657(藉由引用併入本文)中揭露的那些。可以根據本揭露使用本領域任何已知的EGFR CAR，例如任何已知的EGFR CAR的EGFR抗原結合結構域。示例性的EGFRvIII CAR可以包括WO2014/130657(藉由引用併入本文)例如WO2014/130657的表2中揭露的CDR、可變區、scFv或全長CAR序列。
結合CD123的CAR係本領域已知的。例如，在WO2014/130635或WO2016/028896中揭露的那些。可以根據本揭露使用本領域任何已知的CD123 CAR，例如任何已知的CD123 CAR的CD123抗原結合結構域。例如，WO2014/130635中揭露的CAR1至CAR8；或WO2016/028896中揭露的CAR123-1至CAR123-4和hzCAR123-1至hzCAR123-32。編碼CD123 CAR分子和抗原結合結構域的胺基酸序列和核苷酸序列(例如，包含根據卡巴特或喬西亞的一個、兩個、三個VH CDR；和一個、兩個、三個VL CDR)在WO 2014/130635和WO2016/028896中指定。
結合CLL-1的CAR係本領域已知的。例如，在US2016/0051651A1(藉由引用併入本文)中揭露的那些。可以根據本揭露使用本領域任何已知的CLL-1 CAR，例如任何已知的CLL-1 CAR的CLL-1抗原結合結構域。
在一些實施方式中，CAR包含根據WO2016/014535(藉由引用併入本文)的表2的CLL-1 CAR或抗原結合結構域。編碼CLL-1 CAR分子和抗原結合結構域的胺基酸序列和核苷酸序列(例如，包含根據卡巴特或喬西亞的一個、兩個、三個VH CDR；和一個、兩個、三個VL CDR)在WO2016/014535中指定。
結合CD33的CAR係本領域已知的。例如，在US2016/0096892A1和WO2016/014576(藉由引用併入本文)中揭露的那些。可以根據本揭露使用本領域任何已知的CD33 CAR，例如任何已知的CD33 CAR的CD33抗原結合結構域。例如，WO2016/014576中揭露的CAR33-1至CAR33-9。
在一些實施方式中，CAR包含根據WO2016/014576(藉由引用併入本文)的表2或9的CD33 CAR或抗原結合結構域。編碼CD33 CAR分子和抗原結合結構域的胺基酸序列和核苷酸序列(例如，包含根據卡巴特或喬西亞的一 個、兩個、三個VH CDR；和一個、兩個、三個VL CDR)在WO2016/014576中指定。
結合間皮素的CAR係本領域已知的。例如，WO 2015090230和WO 2017112741(藉由引用併入本文，例如WO 2017112741的表2、3、4和5)中揭露的結合間皮素的那些。可以根據本揭露使用本領域任何已知的間皮素CAR，例如任何已知的間皮素CAR的間皮素抗原結合結構域。
結合GFR α-4的CAR係本領域已知的。例如，在WO2016/025880中揭露的那些。可以根據本揭露使用本領域任何已知的GFR α-4 CAR，例如任何已知的GFR α-4 CAR的GFR α-4抗原結合結構域。編碼GFR α-4 CAR分子和抗原結合結構域的胺基酸序列和核苷酸序列(例如，包含根據卡巴特或喬西亞的一個、兩個、三個VH CDR；和一個、兩個、三個VL CDR)在WO2016/025880中指定。
抗原結合結構域結構
在一些實施方式中，編碼的CAR分子的抗原結合結構域包含抗體、抗體片段、scFv、Fv、Fab、(Fab’)2、單結構域抗體(SDAB)、VH或VL結構域、駱駝科VHH結構域或雙功能(例如雙特異性)雜合抗體(例如，Lanzavecchia等人，Eur.J.Immunol.[歐洲免疫學雜誌]17,105(1987))。
在一些情況下，可以根據本領域已知之方法製備scFv(參見例如，Bird等人，(1988)Science[科學]242：423-426和Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美國國家科學院院刊]85：5879-5883)。可以藉由使用柔性多肽連接子將VH和VL區連接在一起來產生ScFv分子。scFv分子包含具有優化的長度和/或胺基酸組成的連接子(例如，Ser-Gly連接子)。連接子長度可以極大地影響scFv 的可變區折疊和相互作用的方式。事實上，如果採用短多肽連接子(例如，5-10個胺基酸)，則可以防止鏈內折疊。還需要鏈間折疊以將兩個可變區組合在一起形成功能性表位結合位點。對於連接子取向和大小之實例，參見例如，Hollinger等人，1993 Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.[美國國家科學院院刊]90：6444-6448；美國專利申請公開案號2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794；以及PCT公開案號WO2006/020258和WO2007/024715，該文獻藉由引用併入本文中。
scFv可以在其VL與VH區之間包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、或更多個胺基酸殘基的連接子。連接子序列可以包含任何天然存在的胺基酸。在一些實施方式中，連接子序列包含胺基酸甘胺酸和絲胺酸。在另一個實施方式中，連接子序列包含多組甘胺酸和絲胺酸重複序列，如(Gly4Ser)n，其中n係等於或大於1的正整數(SEQ ID NO：22)。在一些實施方式中，連接子可為(Gly4Ser)4(SEQ ID NO：29)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：30)。連接子長度的變化可以保留或增強活性，從而在活性研究中產生優異的功效。
在另一方面，抗原結合結構域係T細胞受體(「TCR」)或其片段，例如單鏈TCR(scTCR)。用於製備此類TCR之方法係本領域中已知的。參見例如Willemsen RA等人，Gene Therapy[基因療法]7：1369-1377(2000)；Zhang T等人，Cancer Gene Ther[癌症基因療法]11：487-496(2004)；Aggen等人，Gene Ther.[基因療法]19(4)：365-74(2012)(將參考文獻以其整體併入本文)。例如，scTCR可以工程化為含有來自藉由連接子(例如柔性肽)連接的T細胞殖株的Vα和Vβ基因。此途徑對於本身在細胞內的癌症相關靶標非常有用，然而，這種抗原(肽)的片段藉由MHC呈遞在癌細胞的表面上。
在某些實施方式中，編碼的抗原結合結構域具有10-4M至10-8M的結合親和力KD。
在一些實施方式中，編碼的CAR分子包含如下抗原結合結構域，該抗原結合結構域對靶抗原的結合親和力KD為10-4M至10-8M，例如10-5M至10-7M，例如10-6M或10-7M。在一些實施方式中，該抗原結合結構域的結合親和力比參考抗體(例如本文所述之抗體)的結合親和力低至少5倍、10倍、20倍、30倍、50倍、100倍或1,000倍。在一些實施方式中，編碼的抗原結合結構域的結合親和力比參考抗體(例如，該抗原結合結構域所來源的抗體)的結合親和力低至少5倍。在一些方面，此類抗體片段係功能性的，因為它們提供生物學應答，該生物學應答可以包括但不限於免疫應答的活化、起源於其靶抗原的訊息傳導的抑制、激酶活性的抑制等，如熟練技術人員所理解的那樣。
在一些方面，CAR的抗原結合結構域係scFv抗體片段，該scFv抗體片段與它所來源的scFv的鼠序列相比係人源化的。
在一些方面，本文所述之CAR的抗原結合結構域(例如，scFv)由核酸分子編碼，該核酸分子的序列已進行密碼子優化以在哺乳動物細胞中表現。在一些方面，本發明之整個CAR構建體由核酸分子編碼，該核酸分子的整個序列已進行密碼子優化以在哺乳動物細胞中表現。密碼子優化係指如下發現：在編碼DNA中同義密碼子(即編碼相同胺基酸的密碼子)的出現頻率在不同物種中有偏差。此種密碼子簡並性允許相同的多肽由多種核苷酸序列編碼。多種密碼子優化方法係本領域中已知的，並且包括例如在至少美國專利案號5,786,464和6,114,148中揭露之方法。
特異性抗原抗體對係本領域已知的。抗原抗體對及其組分的非限制性示例性實施方式在本文以上標題為靶標的部分中及以下提供。
CD19
在一些實施方式中，抗原結合結構域結合CD19並且具有與描述於Nicholson等人Mol.Immun.[分子免疫學]34(16-17)：1157-1165(1997)中的FMC63 scFv片段相同或相似的結合特異性。在一些實施方式中，抗原結合結構域結合CD19並且包括在Nicholson等人Mol.Immun.[分子免疫學]34(16-17)：1157-1165(1997)中描述的scFv片段。
在一些實施方式中，抗原結合結構域(例如，人源化抗原結合結構域)結合CD19並且包含來自WO2014/153270(藉由引用併入本文)的表3的序列。WO2014/153270還描述了測定多種CAR構建體的結合和功效之方法。
對於臨床環境，鼠CD19抗體的人源化可為所希望的，其中小鼠特異性殘基在接受CART19治療(即，用CAR19構建體轉導的T細胞治療)的患者中可以誘導人-抗-小鼠抗原(HAMA)應答。人源化CD19 CAR序列的產生、表徵和功效描述於國際申請WO 2014/153270中，將該文獻藉由引用以其整體併入本文，包括實例1-5(第115-159頁)。
在一些實施方式中，抗原結合結構域包含WO2012/079000(藉由引用併入本文)中提供的CAR19構建體的親本小鼠scFv序列。在一些實施方式中，抗原結合結構域結合CD19並且包含WO2012/079000中描述的scFv。
BCMA
結合BCMA的示例性抗原結合結構域揭露於WO2012/0163805、WO 2017/021450、WO 2017/011804、WO 2017/025038、WO 2016/090327、WO 2016/130598、WO 2016/210293、WO 2016/090320、WO 2016/014789、WO 2016/094304、WO 2016/154055、WO 2015/166073、WO 2015/188119、WO 2015/158671、US 9,243,058、US 8,920,776、US 9,273,141、US 7,083,785、US 9,034,324、US 2007/0049735、US 2015/0284467、US 2015/0051266、US 2015/0344844、US 2016/0131655、US 2016/0297884、US 2016/0297885、US 2017/0051308、US 2017/0051252、US 2017/0051252、WO 2016/020332、WO 2016/087531、WO 2016/079177、WO 2015/172800、WO 2017/008169、US 9,340,621、US 2013/0273055、US 2016/0176973、US 2015/0368351、US 2017/0051068、US 2016/0368988、和US 2015/0232557中，將其內容藉由引用併入本文。在一些實施方式中，其中揭露的一個或多個BCMA抗原結合結構域的抗原結合結構域。
在一些實施方式中，抗原結合結構域包含人抗體或結合BCMA的人抗體片段。在一些實施方式中，抗原結合結構域包含本文(例如，表2-14中)所述之人抗BCMA結合結構域的一個或多個(例如，全部三個)LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，和/或本文(例如，表2-14中)所述之人抗BCMA結合結構域的一個或多個(例如，全部三個)HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3。在一些實施方式中，人抗BCMA結合結構域包含本文(例如，表2、表6和表10中)所述之人VL和/或本文(例如，表2、表6和表10中)所述之人VH。在一些實施方式中，抗原結合結構域係scFv，該scFv包含表2、表6和表10的胺基酸序列的VL和VH。在一些實施方式中，抗原結合結構域(例如，scFv)包含：VL，該VL包含具有表2、表6和表10中提供的胺基酸序列的至少一個、兩個或三個修飾(例如置換，例如保守置換)但不超過30個、20個或10個修飾(例如置換，例如保 守置換)的胺基酸序列，或與表2、6和10的胺基酸序列具有95%-99%的同一性的序列；和/或VH，該VH包含具有表2、表6和表10中提供的胺基酸序列的至少一個、兩個或三個修飾(例如置換，例如保守置換)但不超過30個、20個或10個修飾(例如置換，例如保守置換)的胺基酸序列，或與表2、6和10的胺基酸序列具有95%-99%的同一性的序列。
在某些實施方式中，本文所述之抗原結合結構域包括：
(1)選自以下中的一個、兩個或三個輕鏈(LC)CDR：
(i)SEQ ID NO：54的LC CDR1、SEQ ID NO：55的LC CDR2和SEQ ID NO：56的LC CDR3；和/或
(2)選自以下中的一者的一個、兩個或三個重鏈(HC)CDR：
(i)SEQ ID NO：44的HC CDR1、SEQ ID NO：45的HC CDR2和SEQ ID NO：84的HC CDR3；(ii)SEQ ID NO：44的HC CDR1、SEQ ID NO：45的HC CDR2和SEQ ID NO：46的HC CDR3；(iii)SEQ ID NO：44的HC CDR1、SEQ ID NO：45的HC CDR2和SEQ ID NO：68的HC CDR3；或(iv)SEQ ID NO：44的HC CDR1、SEQ ID NO：45的HC CDR2和SEQ ID NO：76的HC CDR3。
在某些實施方式中，本文所述之抗原結合結構域包括：
(1)選自以下中的一者的一個、兩個或三個輕鏈(LC)CDR：
(i)SEQ ID NO：95的LC CDR1、SEQ ID NO：131的LC CDR2和SEQ ID NO：132的LC CDR3；(ii)SEQ ID NO：95的LC CDR1、SEQ ID NO：96的LC CDR2和SEQ ID NO：97的LC CDR3；(iii)SEQ ID NO：95的LC CDR1、SEQ ID NO：114的LC CDR2和SEQ ID NO：115的LC CDR3；或(iv)SEQ ID NO：95的LC CDR1、SEQ ID NO：114的LC CDR2和SEQ ID NO：97的LC CDR3；和/或
(2)選自以下中的一者的一個、兩個或三個重鏈(HC)CDR：
(i)SEQ ID NO：86的HC CDR1、SEQ ID NO：130的HC CDR2和SEQ ID NO：88的HC CDR3；(ii)SEQ ID NO：86的HC CDR1、SEQ ID NO：87的HC CDR2和SEQ ID NO：88的HC CDR3；或(iii)SEQ ID NO：86的HC CDR1、SEQ ID NO：109的HC CDR2和SEQ ID NO：88的HC CDR3。
在某些實施方式中，本文所述之抗原結合結構域包括：
(1)選自以下中的一者的一個、兩個或三個輕鏈(LC)CDR：
(i)SEQ ID NO：147的LC CDR1、SEQ ID NO：182的LC CDR2和SEQ ID NO：183的LC CDR3；(ii)SEQ ID NO：147的LC CDR1、SEQ ID NO：148的LC CDR2和SEQ ID NO：149的LC CDR3；或(iii)SEQ ID NO：147的LC CDR1、SEQ ID NO：170的LC CDR2和SEQ ID NO：171的LC CDR3；和/或
(2)選自以下中的一者的一個、兩個或三個重鏈(HC)CDR：
(i)SEQ ID NO：179的HC CDR1、SEQ ID NO：180的HC CDR2和SEQ ID NO：181的HC CDR3；(ii)SEQ ID NO：137的HC CDR1、SEQ ID NO：138的HC CDR2和SEQ ID NO：139的HC CDR3；或(iii)SEQ ID NO：160的HC CDR1、SEQ ID NO：161的HC CDR2和SEQ ID NO：162的HC CDR3。
在一些實施方式中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：44、45、84、54、55和56的胺基酸序列。在一些實施方式中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：44、45、46、54、55和56的胺基酸序列。在一些實施方式中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：44、45、68、54、55和56的胺基酸序列。在一些實施方式 中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：44、45、76、54、55和56的胺基酸序列。
在一些實施方式中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：47、48、84、57、58和59的胺基酸序列。在一些實施方式中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：47、48、46、57、58和59的胺基酸序列。在一些實施方式中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：47、48、68、57、58和59的胺基酸序列。在一些實施方式中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：47、48、76、57、58和59的胺基酸序列。
在一些實施方式中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：49、50、85、60、58和56的胺基酸序列。在一些實施方式中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：49、50、51、60、58和56的胺基酸序列。在一些實施方式中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：49、50、69、60、58和56的胺基酸序列。在一些實施方式中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：49、50、77、60、58和56的胺基酸序列。
其他示例性靶標
結合CD20的示例性抗原結合結構域描述於WO2016/164731和WO2018/067992(藉由引用併入本文)中。在一些實施方式中，其中揭露的一個或多個CD20抗原結合結構域的抗原結合結構域。
結合CD22的示例性抗原結合結構域描述於WO2016/164731和WO2018/067992(藉由引用併入本文)中。
在一些實施方式中，抗原結合結構域包含表15中列出的任何重鏈結合結構域胺基酸序列的HC CDR1、HC CDR2、和HC CDR3。在實施方式中，抗原結合結構域還包含LC CDR1、LC CDR2、和LC CDR3。在實施方式中，抗原結合結構域包含表16中列出的LC CDR1、LC CDR2、和LC CDR3胺基酸序列。
在一些實施方式中，抗原結合結構域包含表16中列出的任何輕鏈結合結構域胺基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3中的一個、兩個或全部，以及表15中列出的任何重鏈結合結構域胺基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3中的一個、兩個或全部。
在WO2014/130657中描述了結合EGFRvIII的示例性抗原結合結構域。
結合CD123的示例性抗原結合結構域描述於WO 2014/130635和WO2016/028896(藉由引用併入本文)中。
在一些實施方式中，抗原結合結構域包含來自WO2014/130635(藉由引用併入本文)的表1-2的序列。
在一些實施方式中，抗原結合結構域包含來自WO2016/028896(藉由引用併入本文)的表2、6和9的序列。
結合CLL-1的示例性抗原結合結構域在WO2016/014535(藉由引用併入本文)中揭露。
在一些實施方式中，抗原結合結構域包含一個、兩個、三個(例如全部三個)重鏈CDR，HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，該等重鏈CDR來自 本文所述之抗體(例如描述於藉由引用併入本文的WO2015/142675、US-2015-0283178-A1、US-2016-0046724-A1、US2014/0322212A1、US2016/0068601A1、US2016/0051651A1、US2016/0096892A1、US2014/0322275A1、或WO2015/090230中的抗體)，和/或一個、兩個、三個(例如全部三個)輕鏈CDR，LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，該等輕鏈CDR來自本文所述之抗體(例如描述於藉由引用併入本文的WO2015/142675、US-2015-0283178-A1、US-2016-0046724-A1、US2014/0322212A1、US2016/0068601A1、US2016/0051651A1、US2016/0096892A1、US2014/0322275A1、或WO2015/090230中的抗體)。在一些實施方式中，該抗原結合結構域包含上文列出抗體的重鏈可變區和/或可變輕鏈區。
在實施方式中，抗原結合結構域係WO 2015/142675、US-2015-0283178-A1、US-2016-0046724-A1、US 2014/0322212 A1、US 2016/0068601 A1、US 2016/0051651 A1、US 2016/0096892 A1、US 2014/0322275 A1、或WO 2015/090230(藉由引用併入本文)中描述的抗原結合結構域。
可以使用表現CAR的細胞靶向的示例性靶抗原包括但不限於CD19、CD123、EGFRvIII、CD33、間皮素、BCMA、和GFR α-4等等，描述於例如WO 2014/153270、WO 2014/130635、WO 2016/028896、WO 2014/130657、WO 2016/014576、WO 2015/090230、WO 2016/014565、WO 2016/014535、和WO 2016/025880(其各自藉由引用以其整體併入本文)中。
在一些實施方式中，本文所述之任何CAR(例如CD19、CD123、EGFRvIII、CD33、間皮素、BCMA、和GFR α-4中的任一個)的抗原結合結構域包含來自上文列出抗體的一個、兩個、三個(例如全部三個)重鏈CDR，HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，和/或來自上文列出抗原結合結構域的一個、兩個、三個(例如全部三個)輕鏈CDR，LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。在一些實施方式中，抗原結合結構域包含上文列出或描述抗體的重鏈可變區和/或可變輕鏈區。
在一些實施方式中，該抗原結合結構域包含來自上文列出的抗體的一個、兩個、三個(例如全部三個)重鏈CDR(HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3)，和/或來自上文列出的抗體的一個、兩個、三個(例如全部三個)輕鏈CDR(LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3)。在一些實施方式中，抗原結合結構域包含上文列出或描述抗體的重鏈可變區和/或可變輕鏈區。
雙特異性CAR
在某些實施方式中，抗原結合結構域係雙特異性或多特異性分子(例如，多特異性抗體分子)。在一些實施方式中，多特異性抗體分子係雙特異性抗體分子。雙特異性抗體對不多於兩種抗原具有特異性。雙特異性抗體分子的特徵在於具有對第一表位的結合特異性的第一免疫球蛋白可變結構域序列、和具有對第二表位的結合特異性的第二免疫球蛋白可變結構域序列。在一些實施方式中，第一和第二表位在相同抗原，例如，相同蛋白質(或多聚體蛋白質的亞單位)上。在一些實施方式中，第一表位和第二表位重疊。在一些實施方式中，第一表位和第二表位不重疊。在一些實施方式中，第一表位和第二表位在不同的抗原，例如不同之蛋白質(或多聚體蛋白質的不同亞基)上。在一些實施方式中，雙特異性抗體分子包含對第一表位具有結合特異性的重鏈可變結構域序列和輕鏈可變結構域序列以及對第二表位具有結合特異性的重鏈可變結構域序列和輕鏈可變結構域序列。在一些實施方式中，雙特異性抗體分子 包含對第一表位具有結合特異性的半抗體和對第二表位具有結合特異性的半抗體。在一些實施方式中，雙特異性抗體分子包含對第一表位具有結合特異性的半抗體或其片段，以及對第二表位具有結合特異性的半抗體或其片段。在一些實施方式中，雙特異性抗體分子包含對第一表位具有結合特異性的scFv或其片段，以及對第二表位具有結合特異性的scFv或其片段。
在一些實施方式中，抗體分子係多特異性(例如雙特異性或三特異性)抗體分子。此類分子包括雙特異性融合蛋白，例如含有兩個scFv(它們之間具有親水性螺旋肽連接子)和一個完全恒定區的表現構建體，如例如在US5637481中所描述；具有連接的VL和VH鏈(它們進一步用肽間隔區連接至抗體鉸鏈區和CH3區)的微型抗體構建體，其可以二聚化形成雙特異性/多價分子，如例如在US5837821所述；VH結構域(或家族成員中的VL結構域)的串，其藉由肽鍵與C-末端的可交聯基團連接，該等可交聯基團進一步與VL結構域相關聯以形成一系列FV(或scFv)，如例如在US5864019中所述；以及具有經肽連接子連接的VH和VL結構域兩者的單鏈結合多肽藉由非共價或化學交聯組合成多價結構，以使用scFV或雙體抗體類型形式形成例如同二價、異二價、三價和四價結構，如例如在US5869620中所述。上述申請的內容藉由引用以其整體併入本文中。
在雙特異性抗體分子的每個抗體或抗體片段(例如scFv)內，VH可以在VL的上游或下游。在一些實施方式中，上游抗體或抗體片段(例如scFv)在其VL(VL1)上游佈置有其VH(VH1)，並且下游抗體或抗體片段(例如scFv)在其VH(VH2)上游佈置有其VL(VL2)，使得整個雙特異性抗體分子具有佈置VH1-VL1-VL2-VH2。在其他實施方式中，上游抗體或抗體片段(例如scFv) 在其VH(VH1)上游佈置有其VL(VL1)，並且下游抗體或抗體片段(例如scFv)在其VL(VL2)上游佈置有其VH(VH2)，使得整個雙特異性抗體分子具有佈置VL1-VH1-VH2-VL2。視需要，如果構建體被佈置為VH1-VL1-VL2-VH2則連接子設置在兩個抗體或抗體片段(例如scFv)之間，例如VL1與VL2之間，如果構建體被佈置為VL1-VH1-VH2-VL2則連接子設置在VH1與VH2之間。連接子可為如本文所述之連接子，例如(Gly4-Ser)n連接子，其中n係1、2、3、4、5或6，較佳的是4(SEQ ID NO：691)。一般來說，兩個scFv之間的連接子應足夠長以避免兩個scFv的結構域之間的錯配。視需要，連接子設置在第一scFv的VL與VH之間。視需要，連接子設置在第二scFv的VL與VH之間。在具有多個連接子的構建體中，連接子中的任何兩個或更多個可以相同或不同。因此，在一些實施方式中，雙特異性CAR在如本文描述的佈置中包含VL、VH、和視需要的一個或多個連接子。
1.跨膜結構域
關於跨膜結構域，在各種實施方式中，本文所述之嵌合分子(例如，CAR)可以被設計成包含附接至該嵌合分子的細胞外結構域的跨膜結構域。跨膜結構域可以包括與跨膜區相鄰的一個或多個另外的胺基酸，例如與跨膜來源之蛋白質的細胞外區域相關的一個或多個胺基酸(例如該細胞外區域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10至15個胺基酸)和/或與跨膜蛋白來源之蛋白質的細胞內區域相關的一個或多個另外的胺基酸(例如該細胞內區域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10多至15個胺基酸)。在一些方面，跨膜結構域與嵌合蛋白(例如，CAR)的其他結構域中的一個締合，例如在一些實施方式中，跨膜結構域可以來自傳訊結構域、共刺激結構域或鉸鏈結構域所來源的相同蛋白質。在另 一個方面，跨膜結構域不源自嵌合蛋白(例如，CAR)的任何其他結構域所來源的相同蛋白質。在一些情況下，可以選擇或藉由胺基酸置換修飾跨膜結構域，以避免此類域與相同或不同表面膜蛋白的跨膜結構域結合，例如以最小化與受體複合物的其他成員的相互作用。在一些方面，跨膜結構域能夠與表現CAR的細胞的細胞表面上的另一種CAR同源二聚化。在不同的方面，可以修飾或取代跨膜結構域的胺基酸序列，以便最小化與存在於相同表現CAR的細胞中的天然結合配偶體的結合結構域的相互作用。
跨膜結構域可以源自天然來源或來自重組來源。在來源係天然之情況下，該結構域可以源自任何膜結合或跨膜蛋白。在一些方面，每當CAR結合靶標時，跨膜結構域能夠將傳訊至一個或多個細胞內結構域。在本發明中特別使用的跨膜結構域可以至少包括例如T細胞受體的α、β或ζ鏈、CD28、CD27、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154的一個或多個跨膜區。在一些實施方式中，跨膜結構域可以至少包括以下中的一個或多個跨膜區：例如KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、 Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D或NKG2C。
在一些情況下，跨膜結構域可以藉由鉸鏈(例如來自人蛋白質的鉸鏈)附接到CAR的細胞外區域(例如CAR的抗原結合結構域)。例如，在一些實施方式中，鉸鏈可為人Ig(免疫球蛋白)鉸鏈(例如IgG4鉸鏈、IgD鉸鏈)、GS連接子(例如本文所述之GS連接子)、KIR2DS2鉸鏈或CD8a鉸鏈。在一些實施方式中，鉸鏈或間隔區包含SEQ ID NO：4的胺基酸序列(例如由其組成)。在一些方面，跨膜結構域包含SEQ ID NO：12的跨膜結構域(例如由其組成)。
在一些實施方式中，編碼的跨膜結構域包含具有SEQ ID NO：12的胺基酸序列的至少一個、兩個或三個修飾、但不超過20、10或5個修飾的CD8跨膜結構域的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：12的胺基酸序列具有95%-99%同一性的序列。在一些實施方式中，編碼的跨膜結構域包含SEQ ID NO：12的序列。
在其他實施方式中，編碼CAR的核酸分子包含CD8跨膜結構域的核苷酸序列，例如包含SEQ ID NO：13的序列，或其具有95%-99%同一性的序列。
在一些實施方式中，編碼的抗原結合結構域藉由鉸鏈區與跨膜結構域連接。在一些實施方式中，編碼的鉸鏈區包含CD8鉸鏈的胺基酸序列，例如SEQ ID NO：4；或IgG4絞鏈的胺基酸序列，例如SEQ ID NO：6，或與SEQ ID NO：4或6具有95%-99%同一性的序列。在其他實施方式中，編碼鉸鏈區的核酸序列包含分別對應於CD8鉸鏈或IgG4鉸鏈的SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的序列，或與SEQ ID NO：5或7具有95%-99%同一性的序列。
在一些方面，鉸鏈或間隔區包含IgG4鉸鏈。例如，在一些實例中，鉸鏈或間隔區包含胺基酸序列
Figure 109105885-A0202-12-0127-448
Figure 109105885-A0202-12-0127-449
(SEQ ID NO：6)的鉸鏈。在一些實施方式中，鉸鏈或間隔區包含由
Figure 109105885-A0202-12-0127-450
Figure 109105885-A0202-12-0127-451
(SEQ ID NO：7)的核苷酸序列編碼的鉸鏈。
在一些方面，鉸鏈或間隔區包含IgD鉸鏈。例如，在一些實例中，鉸鏈或間隔區包含胺基酸序列
Figure 109105885-A0202-12-0128-452
Figure 109105885-A0202-12-0128-453
(SEQ ID NO：8)的鉸鏈。在一些實施方式中，鉸鏈或間隔區包含由
Figure 109105885-A0202-12-0128-454
Figure 109105885-A0202-12-0129-455
(SEQ ID NO：9)的核苷酸序列編碼的鉸鏈。
在一些方面，跨膜結構域可為重組的，在這種情況下其將主要包含疏水性殘基，如白胺酸和纈胺酸。在一些方面，可以在重組跨膜結構域的每個末端處發現苯丙胺酸、色胺酸和纈胺酸的三聯體。
視需要，長度在2與10個胺基酸之間的短的寡肽或多肽連接子可以在CAR的跨膜結構域與胞質區域之間形成鍵聯。甘胺酸-絲胺酸雙聯體提供特別適合的連接子。例如，在一些方面，連接子包含GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：10)的胺基酸序列。在一些實施方式中，連接子由GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(SEQ ID NO：11)的核苷酸序列編碼。
在一些方面，鉸鏈或間隔區包含KIR2DS2鉸鏈。
2.傳訊結構域
在具有細胞內傳訊結構域的本發明實施方式中，這種結構域可以含有例如初級傳訊結構域和/或共刺激傳訊結構域中的一個或多個。在一些實施方式中，細胞內傳訊結構域包含編碼初級傳訊結構域的序列。在一些實施方式中，細胞內傳訊結構域包含共刺激傳訊結構域。在一些實施方式中，細胞內傳訊結構域包含初級傳訊結構域和共刺激傳訊結構域。
本發明之CAR的胞質部分內的細胞內傳訊序列可以按隨機或指定的順序彼此連接。視需要，短的寡肽或多肽連接子，例如，長度在2與10個胺基酸之間(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸)可以形成細胞內傳訊序列之間的鍵聯。在一些實施方式中，甘胺酸-絲胺酸雙聯體可以用作適合的 連接子。在一些實施方式中，單個胺基酸(例如丙胺酸、甘胺酸)可以用作適合的連接子。
在一些方面，細胞內傳訊結構域被設計成包含兩個或更多個(例如2、3、4、5、或更多個)共刺激傳訊結構域。在一些實施方式中，兩個或更多個(例如2、3、4、5、或更多個)共刺激傳訊結構域藉由連接子分子(例如本文描述的連接子分子)分開。在一些實施方式中，細胞內傳訊結構域包含兩個共刺激傳訊結構域。在一些實施方式中，連接子分子係甘胺酸殘基。在一些實施方式中，連接子係丙胺酸殘基。
初級傳訊結構域
初級傳訊結構域以刺激方式或以抑制方式調控TCR複合物的初級活化。以刺激方式起作用的初級細胞內傳訊結構域可以含有被稱為基於免疫受體酪胺酸的活化模體或ITAM的傳訊模體。在CAR中，此類域用於相同目的。
含有在本發明中特別使用的初級細胞內傳訊結構域的ITAM之實例包括以下的那些：CD3 ζ、常見FcR γ(FCER1G)、Fc γ RIIa、FcR β(Fc ε R1b)、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD79a、CD79b、DAP10、以及DAP12。在一些實施方式中，本發明之CAR包含細胞內傳訊結構域，例如CD3-ζ的初級傳訊結構域。
在一些實施方式中，編碼的初級傳訊結構域包含CD3 ζ的功能性傳訊結構域。編碼的CD3 ζ初級傳訊結構域可以包含具有SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20的胺基酸序列的至少一個、兩個或三個修飾、但不超過20、10或5個修飾的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20的胺基酸序列具有95%-99%同一性的序列。在一些實施方式中，編碼的初級傳訊結構域包含SEQ ID NO：18 或SEQ ID NO：20的序列。在其他實施方式中，編碼初級傳訊結構域的核酸序列包含SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：21的序列，或其具有95%-99%同一性的序列。
共刺激傳訊結構域
在一些實施方式中，編碼的細胞內傳訊結構域包含共刺激傳訊結構域。例如，細胞內傳訊結構域可以包含初級傳訊結構域和共刺激傳訊結構域。在一些實施方式中，編碼的共刺激傳訊結構域包含選自以下中的一種或多種之蛋白質的功能性傳訊結構域：CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、與CD83特異性地結合的配位基、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、以及NKG2D。
在一些實施方式中，編碼的共刺激傳訊結構域包含具有SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16的胺基酸序列的至少一個、兩個或三個修飾、但不超過20、10或5個修飾的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有95%-99%同一性的序列。在一些實施方式中，編碼的共刺激傳訊結構 域包含SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16的序列。在其他實施方式中，編碼共刺激傳訊結構域的核酸序列包含SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：17的序列，或其具有95%-99%同一性的序列。
在其他實施方式中，編碼的細胞內結構域包含SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16的序列，和SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20的序列，其中包含細胞內傳訊結構域的序列在同一框架中表現並且表現為單個多肽鏈。
在一些實施方式中，編碼細胞內傳訊結構域的核酸序列包含SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：17的序列，或其具有95%-99%同一性的序列；以及SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：21的序列，或其具有95%-99%同一性的序列。
在一些實施方式中，該核酸分子進一步編碼前導序列。在一些實施方式中，前導序列包含SEQ ID NO：2的序列。
在一些方面，細胞內傳訊結構域被設計成包含CD3-ζ的傳訊結構域和CD28的傳訊結構域。在一些方面，細胞內傳訊結構域被設計成包含CD3-ζ的傳訊結構域和4-1BB的傳訊結構域。在一些方面，4-1BB的傳訊結構域係SEQ ID NO：14的傳訊結構域。在一些方面，CD3-ζ的傳訊結構域係SEQ ID NO：18的傳訊結構域。
在一些方面，細胞內傳訊結構域被設計成包含CD3-ζ的傳訊結構域和CD27的傳訊結構域。在一些方面，CD27的傳訊結構域包含
Figure 109105885-A0202-12-0132-456
(SEQ ID NO：16)的胺基酸序列。在一些方面，CD27的傳訊結構域由
Figure 109105885-A0202-12-0132-457
Figure 109105885-A0202-12-0133-458
Figure 109105885-A0202-12-0133-459
(SEQ ID NO：17)的核酸序列編碼。
抑制性結構域
在一些實施方式中，載體包含編碼CAR(例如，本文描述的CAR)的核酸序列，和編碼包含以下的抑制性分子的核酸序列：inhKIR胞質結構域；跨膜結構域，例如KIR跨膜結構域；和抑制劑胞質結構域，例如ITIM結構域，例如inhKIR ITIM結構域。在一些實施方式中，抑制性分子係天然存在的inhKIR，或與天然存在的inhKIR共有至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或99%同源性或相差不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20個殘基的序列。
在一些實施方式中，編碼抑制性分子的核酸序列包含：SLAM家族胞質結構域；跨膜結構域，例如SLAM家族跨膜結構域；和抑制劑胞質結構域，例如SLAM家族結構域，例如SLAM家族ITIM結構域。在一些實施方式中，抑制性分子係天然存在的SLAM家族成員，或與天然存在的SLAM家族成員共有至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或99%同源性或相差不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20個殘基的序列。
在一些實施方式中，載體係體外轉錄的載體，例如轉錄本文描述的核酸分子的RNA的載體。在一些實施方式中，載體中的核酸序列還包含聚(A)尾，例如聚A尾。在一些實施方式中，載體中的核酸序列還包含3'UTR，例如本文描述的3'UTR，例如包含源自人β-球蛋白的3'UTR的至少一個重複。在一些實施方式中，載體中的核酸序列還包含啟動子，例如T2A啟動子。
啟動子
在一些實施方式中，載體還包含啟動子。在一些實施方式中，該啟動子選自EF-1啟動子、CMV IE基因啟動子、EF-1α啟動子、泛素C啟動子或磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子。在一些實施方式中，啟動子係EF-1啟動子。在一些實施方式中，EF-1啟動子包含SEQ ID NO：1的序列。
在本方面的一些方面，可以使用任何數量的熟悉該項技術者已知的技術(如FicollTM分離)從自受試者收集的血液單位獲得免疫效應細胞，例如T細胞。在一些方面，藉由單採血液成分術獲得來自個體的循環血液之細胞。單採血液成分術產物典型地含有淋巴細胞，包括T細胞、單核細胞、粒細胞、B細胞、其他有核白血球、紅血球、和血小板。在一些方面，可以洗滌藉由單採血液成分術收集的細胞以去除血漿部分，並且視需要將細胞懸浮在緩衝液或培養基中以用於後續處理步驟。在一些實施方式中，用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌細胞。在替代性實施方式中，洗滌溶液缺少鈣並且可能缺少鎂，或者可能缺少許多(如果不是全部)二價陽離子。
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Figure 109105885-A0202-12-0136-462
Figure 109105885-A0202-12-0137-463
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體外CAR-T製造
儘管本文考慮之方法涉及細胞的體內轉導，但也認識到體外製備的挑戰。
在一些實施方式中，例如藉由本文所述之方法對轉導了本文所述之病毒載體的細胞進行擴增。在一些實施方式中，使細胞在培養物中擴增數小時(例如約2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18、21小時)至約14天(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)的一段時間。在一些實施方式中，使細胞擴增4至9天的一段時間。在一些實施方式中，使細胞擴增8天或更少(例如7、6或5天)的一段時間。在一些實施方式中，使細胞在培養物中擴增5天，並且所得細胞比在相同培養條件下在培養物中擴增9天的相同細胞更有效。效力可以例如藉由各種T細胞功能來定義，例如增殖、靶細胞殺傷、細胞介素產生、活化、遷移、或其組合。在一些實施方式中，與在相同培養條件下在培養物中擴增9天的相同細胞相比，擴增5天的細胞在抗原刺激後顯示細胞倍增 的至少一倍、兩倍、三倍或四倍增加。在一些實施方式中，使細胞在培養物中擴增5天，並且與在相同培養條件下在培養物中擴增9天的相同細胞相比，所得細胞表現出更高的促炎性細胞介素產生(例如，IFN-γ和/或GM-CSF水平)。在一些實施方式中，與在相同培養條件下在培養物中擴增9天的相同細胞相比，擴增5天的細胞顯示促炎性細胞介素產生(例如，IFN-γ和/或GM-CSF水平)的至少一倍、二倍、三倍、四倍、五倍、十倍或更多倍增加(pg/ml)。
在不存在鈣之情況下的初始活化步驟可以導致放大的活化。如熟悉該項技術者將容易理解的，洗滌步驟可以藉由熟悉該項技術者已知之方法完成，如藉由根據製造商說明書使用半自動「流通」離心機(例如，Cobe 2991細胞處理器、Baxter CytoMate、或Haemonetics Cell Saver 5)。在洗滌後，可以將細胞重懸於多種生物相容性緩衝液中，例如像無Ca、無Mg的PBS、勃脈力-A(PlasmaLyte A)、或者含有或不含緩衝液的其他鹽溶液。替代性地，可以除去單採血液成分術樣本中不希望的組分，並將細胞直接重懸於培養基中。
應當認識到，本申請的體外方法可利用包含5%或更少(例如2%)的人AB血清的培養基條件，並使用已知的培養基條件和組成物，例如描述於以下的那些：Smith等人，「Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement[使用新型無Xeno CTS免疫細胞血清替代物進行過繼免疫治療的人T細胞的離體擴增]」Clinical & Translational Immunology[臨床和移植免疫學](2015)4,e31；doi：10.1038/cti.2014.31。
在一些方面，藉由例如藉由PERCOLLTM梯度離心或藉由逆流離心淘洗來裂解紅血球和耗減單核細胞，從外周血淋巴細胞分離T細胞。分離的T細胞可進一步用於本文所述之方法。
本文所述之方法可以包括，例如使用例如(例如本文所述之)陰性選擇技術選擇免疫效應細胞(例如T細胞)的特定亞群，該亞群係T調節性細胞耗減的群體，CD25+耗減之細胞。較佳的是，T調節性耗減的細胞群體含有少於30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、1%的CD25+細胞。
在一些實施方式中，使用抗CD25抗體或其片段或CD25結合配位基(IL-2)從群中去除調節性T細胞，例如CD25+ T細胞。在一些實施方式中，將抗CD25抗體或其片段、或CD25結合配位基與底物(例如珠)軛合、或以其他方式包被在底物(例如珠)上。在一些實施方式中，抗CD25抗體或其片段與本文所述之底物軛合。
在一些實施方式中，使用來自MiltenyiTM的CD25耗減藥劑從該群體除去T調節性細胞(例如CD25+ T細胞)。在一些實施方式中，細胞與CD25耗減藥劑之比率係1×107個細胞比20μL、或1 x 107個細胞比15μL、或1 x 107個細胞比10μL、或1 x 107個細胞比5μL、或1 x 107個細胞比2.5μL、或1 x 107個細胞比1.25μL。在一些實施方式中，例如對於T調節性細胞(例如CD25+)耗減，使用大於5億個細胞/ml。在另外的方面，使用6、7、8、或9億個細胞/ml的細胞濃度。
在一些實施方式中，有待耗減的免疫效應細胞群體包括約6 x 109個CD25+ T細胞。在其他方面，有待耗減的免疫效應細胞群體包括約1 x 109至1 x 1010個CD25+ T細胞，以及其間的任何整數值。在一些實施方式中，所得群體T 調節性耗減的細胞具有2 x 109個T調節性細胞(例如，CD25+細胞)或更少(例如，1 x 109個、5 x 108個、1 x 108個、5 x 107個、1 x 107個或更少的CD25+細胞)。
在一些實施方式中，使用具有耗減管組(例如像管162-01)的CliniMAC系統從該群體除去T調節性細胞(例如CD25+細胞)。在一些實施方式中，將CliniMAC系統在耗減設置(例如像DEPLETION2.1)上運行。
不希望受特定理論的束縛，在單採血液成分術之前或在製造表現CAR的細胞產物期間降低受試者中免疫細胞的陰性調節劑水平(例如，減少不需要的免疫細胞(例如TREG細胞)之數量)可以降低受試者復發的風險。例如，耗減TREG細胞之方法係本領域已知的。減少TREG細胞之方法包括但不限於環磷醯胺、抗GITR抗體(本文所述之抗GITR抗體)、CD25耗減、及其組合。
在一些實施方式中，製造方法包括在製造表現CAR的細胞之前降低例如，耗減)TREG細胞之數量。例如，製造方法包括使樣本(例如單採血液成分術樣本)與抗GITR抗體和/或抗CD25抗體(或其片段、或CD25結合配位基)接觸，例如以在製造表現CAR的細胞(例如T細胞、NK細胞)產物之前耗減TREG細胞。
在一些實施方式中，在收集用於表現CAR的細胞產物製造的細胞之前，用一種或多種減少TREG細胞的療法預先治療受試者，從而降低受試者對表現CAR的細胞治療復發的風險。在一些實施方式中，減少TREG細胞之方法包括但不限於向受試者投與環磷醯胺、抗GITR抗體、CD25耗減、或其組合中的一種或多種。投與環磷醯胺、抗GITR抗體、CD25耗減、或其組合中的一種或多種可以在輸注表現CAR的細胞產物之前、期間或之後發生。
在一些實施方式中，在收集用於表現CAR的細胞產物製造的細胞之前，用環磷醯胺預先治療受試者，從而降低受試者對表現CAR的細胞治療復發的風險。在一些實施方式中，在收集用於表現CAR的細胞產物製造的細胞之前，用抗GITR抗體預先治療受試者，從而降低受試者對表現CAR的細胞治療復發的風險。
在一些實施方式中，有待除去的細胞群體既不是調節性T細胞、或腫瘤細胞，也不是以其他方式對CART細胞的擴增和/或功能產生負面影響的細胞(例如表現CD14、CD11b、CD33、CD15、或由潛在免疫抑制細胞表現的其他標誌的細胞)。在一些實施方式中，設想將此類細胞與調節性T細胞和/或腫瘤細胞並行去除，或在所述耗減之後，或以另一種順序去除。
本文所述之方法可以包括多於一個的選擇步驟，例如多於一個的耗減步驟。可以例如用針對陰性選擇的細胞特有的表面標誌的抗體組合來完成藉由陰性選擇富集T細胞群體。一種方法係藉由負磁性免疫吸附或流式細胞分析技術進行細胞分選和/或選擇，該負磁性免疫吸附或流式細胞分析技術使用針對存在於陰性選擇的細胞上的細胞表面標記的單株抗體的混合物。例如，為了藉由陰性選擇富集CD4+細胞，單株抗體混合物可以包括針對CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、和CD8的抗體。
本文所述之方法可以還包括從表現腫瘤抗原(例如不包含CD25的腫瘤抗原，例如CD19、CD30、CD38、CD123、CD20、CD14或CD11b)的群體除去細胞，從而提供T調節性耗減的(例如CD25+耗減的)和腫瘤抗原耗減的細胞群體，該細胞群體適於表現CAR(例如本文所述之CAR)。在一些實施方式中，將表現腫瘤抗原的細胞與T調節性例如CD25+細胞同時除去。例如，抗 CD25抗體或其片段、和抗腫瘤抗原抗體或其片段可以附接至可以用於除去細胞、或抗CD25抗體或其片段、或抗腫瘤抗原抗體或其片段的同一底物(例如珠)，可以附接至分開的珠(其混合物可以用於除去細胞)。在其他實施方式中，T調節性細胞(例如CD25+細胞)的除去和表現腫瘤抗原的細胞的除去係連續的，並且可以例如以任何順序發生。
還提供了包括以下之方法：從表現檢查點抑制劑(例如本文所述之檢查點抑制劑)的群體除去細胞(例如PD1+細胞、LAG3+細胞、和TIM3+細胞中的一種或多種)，從而提供T調節性耗減的(例如CD25+耗減的)細胞和檢查點抑制劑耗減的細胞(例如PD1+、LAG3+和/或TIM3+耗減的細胞)的群體。示例性檢查點抑制劑包括B7-H1、B7-1、CD160、P1H、2B4、PD1、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、TIGIT、CTLA-4、BTLA和LAIR1。在一些實施方式中，將表現檢查點抑制劑的細胞與T調節性例如CD25+細胞同時除去。例如，抗CD25抗體或其片段、和抗檢查點抑制劑抗體或其片段可以附接至可以用於除去細胞或抗CD25抗體或其片段、和抗檢查點抑制劑抗體或其片段的同一珠，可以附接至分開的珠(其混合物可以用於除去細胞)。在其他實施方式中，T調節性細胞(例如CD25+細胞)的除去和表現檢查點抑制劑的細胞的除去係連續的，並且可以例如以任何順序發生。
本文描述之方法可以包括陽性選擇步驟。例如，可以藉由與抗CD3/抗CD28(例如3x28)軛合的珠(如DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T)孵育足以陽性選擇所希望的T細胞的時間段來分離T細胞。在一些實施方式中，該時間段係約30分鐘。在另外的實施方式中，該時間段的範圍為從30分鐘至36小時或更長以及其間的所有整數值。在另外的實施方式中，該時間段係至少1、 2、3、4、5、或6小時。在又另一個實施方式中，該時間段係10至24小時，例如24小時。與其他細胞類型相比，在存在較少T細胞的任何情況下，如從腫瘤組織或免疫受損個體分離腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，可以使用更長的孵育時間來分離T細胞。此外，使用更長的孵育時間可以提高CD8+ T細胞捕獲的效率。因此，藉由簡單地縮短或延長使T細胞與CD3/CD28珠結合的時間和/或藉由增加或減少珠與T細胞之比率(如本文進一步描述的)，可以在培養起始時或在該過程期間的其他時間點優先地選擇或針對T細胞亞群。另外，藉由增加或減少抗CD3和/或抗CD28抗體在珠或其他表面上之比率，可以在培養起始時或在其他所希望的時間點優先地選擇或針對T細胞亞群。在一些實施方式中，可以選擇表現以下中的一種或多種的T細胞群體：IFN-γ、TNFα、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、顆粒酶B、和穿孔素、或其他適當的分子(例如其他細胞介素)。用於篩選細胞表現之方法可以藉由例如PCT公開案號：WO 2013/126712中。
為了藉由陽性或陰性選擇分離希望的細胞群體，可以改變細胞和表面(例如顆粒(如珠))的濃度。在一些方面，可能希望顯著減小其中珠和細胞混合在一起的體積(例如，增加細胞的濃度)，以確保細胞和珠的最大接觸。例如在一些方面，使用100億個細胞/ml、90億/ml、80億/ml、70億/ml、60億/ml或50億/ml的濃度。在一些方面，使用10億個細胞/ml的濃度。在又一些方面，使用0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、或1億個細胞/ml的細胞濃度。在另外的方面，可以使用1.25或1.5億個細胞/ml的濃度。
使用高濃度可以導致細胞產量增加、細胞活化、和細胞擴增。此外，使用高細胞濃度允許更有效地捕獲可能弱表現目的靶抗原的細胞(如CD28陰性T細胞)、或來自存在許多腫瘤細胞的樣本(例如白血病的血、腫瘤組織等) 之細胞。此類細胞群體可能具有治療價值，並且是希望獲得的。例如，使用高濃度的細胞允許更有效地選擇通常具有較弱CD28表現的CD8+T細胞。
在一些實施方式中，可能希望使用較低的細胞濃度。藉由顯著稀釋T細胞和表面(例如，顆粒如珠)的混合物，使顆粒與細胞之間的相互作用最小化。這選擇了表現大量有待結合顆粒的所希望抗原之細胞。例如，CD4+ T細胞表現較高水平的CD28，並且在稀釋濃度下比CD8+ T細胞更有效地捕獲。在一些方面，所使用的細胞濃度係5 x 106/ml。在其他方面，所使用的濃度可為從約1 x 105/ml至1 x 106/ml，以及其間的任何整數值。
在其他方面，可以將該等細胞在旋轉器上以不同的速度在2℃-10℃或室溫下孵育不同的時間長度。
用於刺激的T細胞也可以在洗滌步驟後冷凍。不希望受理論束縛，冷凍和後續解凍步驟藉由除去細胞群體中的粒細胞和一定程度的單核細胞來提供更均勻的產物。在除去血漿和血小板的洗滌步驟之後，可以將細胞懸浮在冷凍溶液中。雖然許多冷凍溶液和參數係本領域已知的並且在這種情況下將是有用的，但一種方法涉及使用含有20% DMSO和8%人血清白蛋白的PBS，或含有10%葡聚糖40和5%葡萄糖、20%人血清白蛋白和7.5% DMSO的培養基，或含有31.25% Plasmalyte-A、31.25%葡萄糖5%、0.45% NaCl、10%葡聚糖40和5%葡萄糖、20%人血清白蛋白和7.5% DMSO的培養基，或含有例如Hespan和PlasmaLyte A的其他適合的細胞冷凍培養基，然後將細胞以每分鐘1°的速率冷凍至-80℃並儲存在液氮儲罐的氣相中。可以使用其他控制冷凍之方法以及在-20℃或液氮中立即不受控制的冷凍。
在一些方面，如本文所述將冷凍保存的細胞解凍和洗滌，並允許在使用本發明之方法活化之前在室溫靜置1小時。
在本發明之上下文中還考慮了在可能需要如本文描述的擴增細胞之前的時間段從受試者收集血液樣本或單採血液成分術產物。因此，可以在任何必要的時間點收集有待擴增的細胞來源，並且可以分離和冷凍所希望的細胞(如T細胞)以便以後在免疫效應細胞療法中用於任何數量將受益於免疫效應細胞療法(如本文描述的那些)的疾病或病症。在一些方面，血液樣本或單採血液成分術取自基本健康的受試者。在一些方面，血液樣本或單採血液成分術取自基本健康的受試者，該受試者處於發展疾病的風險中，但尚未患發展疾病，並且將目的細胞分離並冷凍供以後使用。在一些方面，T細胞可以擴增、冷凍，並在以後使用。在一些方面，在診斷如本文所述之特定疾病之後但在任何治療之前不久從患者收集樣本。在另外的方面，在任何數量的相關治療方式之前，從受試者的血液樣本或單採血液成分術分離細胞，該等相關治療方式包括但不限於用以下進行治療：藥劑(如那他珠單抗(natalizumab)、依法珠單抗、抗病毒劑)、化療、放射、免疫抑制劑(如環孢素、硫唑嘌呤、胺甲喋呤、黴酚酸酯、和FK506)、抗體或其他免疫清除劑(如CAMPATH、抗CD3抗體、環磷醯胺、氟達拉濱(fludarabine)、環孢素、FK506、雷帕黴素、黴酚酸、類固醇、FR901228)、和照射。
在本發明之另一個方面，在治療後直接從患者獲得T細胞使得受試者具有功能性T細胞。在這點上，已觀察到在某些癌症治療(特別是使用破壞免疫系統的藥物之治療)之後，在患者通常將從治療恢復期間治療後不久，所獲得的T細胞的品質因其離體擴增的能力可能是最佳或改善的。同樣地，在使用 本文描述之方法進行離體操作之後，該等細胞可以處於較佳的狀態以增強植入和體內擴增。因此，在本發明之上下文中，預期在該恢復期期間收集血細胞，包括T細胞、樹突細胞或造血譜系的其他細胞。此外，在一些方面，動員(例如，用GM-CSF動員)和調整方案可以用於在受試者中產生病症，其中特定細胞類型的再增殖、再循環、再生、和/或擴增係有利的，尤其是在治療後確定的時間窗口。例證性細胞類型包括免疫系統的T細胞、B細胞、樹突細胞、和其他細胞。
在一些實施方式中，T細胞群體係甘油二酯激酶(DGK)缺陷型。DGK缺陷型細胞包括不表現DGK RNA或蛋白質，或具有降低或抑制的DGK活性之細胞。DGK缺陷型細胞可以藉由遺傳方法產生，例如投與RNA干擾劑(例如siRNA、shRNA、miRNA)以降低或預防DGK表現。替代性地，可以藉由用本文描述的DGK抑制劑處理產生DGK缺陷型細胞。
在一些實施方式中，T細胞群體係Ikaros缺陷型。Ikaros缺陷型細胞包括不表現Ikaros RNA、或蛋白質、或具有降低或抑制的Ikaros活性的細胞，Ikaros缺陷型細胞可以藉由遺傳方法產生，例如投與RNA干擾劑(例如siRNA、shRNA、miRNA)以減少或預防Ikaros表現。可替代地，可以藉由用Ikaros抑制劑(例如，來那度胺(lenalidomide))處理產生Ikaros缺陷型細胞。
在實施方式中，T細胞群體係DGK缺陷型且Ikaros缺陷型的，例如不表現DGK和Ikaros、或者具有降低、或抑制的DGK和Ikaros活性。可以藉由本文描述的任何方法產生此類DGK和Ikaros缺陷型細胞。
在一些實施方式中，從受試者獲得NK細胞。在另一個實施方式中，NK細胞係NK細胞系，例如NK-92細胞系(Conkwest公司)。
在特定的示例性方面，受試者可以經歷白血球單採法，其中離體收集、富集、或耗減白血球以選擇和/或分離目的細胞(例如T細胞)。該等T細胞分離物可以藉由本文描述之方法擴增。有需要的受試者可以隨後經歷使用高劑量化療的標準治療，隨後進行外周血幹細胞移植。在某些方面，在移植之後或與之同時，受試者接受藉由本發明之方法製備的擴增的CAR T細胞的輸注。在另外的方面，在手術之前或之後投與擴增之細胞。
另外的表現的藥劑
在本文考慮的實施方式中，應理解，其他藥劑可以被編碼在上文描述的載體中。因此，以下關於表現CAR的細胞描述該等藥劑。
在另一個實施方式中，本文描述的表現CAR的免疫效應細胞可以進一步表現另一種藥劑，例如增強表現CAR的細胞的活性的藥劑。例如，在一些實施方式中，藥劑可為對抑制性分子進行抑制的藥劑。抑制性分子之實例包括例如，如本文描述的PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFR β。在一些實施方式中，對抑制性分子進行抑制的藥劑包含第一多肽(例如抑制性分子)，該第一多肽與向細胞提供陽性訊號的第二多肽(例如本文描述的細胞內傳訊結構域)相關聯。在一些實施方式中，該藥劑包含例如抑制性分子(如PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFR β、或該等中的任一者的片段)的第一多肽，和第二多肽，該第二多肽係本文描述的細胞內傳訊結構域(例如，包含共刺激結構域(例如，41BB、CD27或CD28，例如如本文描述)和/或初級傳訊結 構域(例如，本文描述的CD3 ζ傳訊結構域)。在一些實施方式中，該藥劑包含PD-1的第一多肽或其片段，和本文描述的細胞內傳訊結構域(例如，本文描述的CD28、CD27、OX40或4-IBB傳訊結構域和/或本文描述的CD3 ζ傳訊結構域)的第二多肽。
在一些實施方式中，本文描述的表現CAR的免疫效應細胞可以還包含第二CAR，例如，包含例如針對相同靶標(例如，上述靶標)或不同靶標的不同抗原結合結構域的第二CAR。在一些實施方式中，該第二CAR包含針對在與第一CAR的靶標相同的癌細胞類型上表現的靶標的抗原結合結構域。在一些實施方式中，表現CAR的免疫效應細胞包含靶向第一抗原並且包含具有共刺激傳訊結構域但不具有初級傳訊結構域的細胞內傳訊結構域的第一CAR，以及靶向第二不同的抗原並且包含具有初級傳訊結構域但不具有共刺激傳訊結構域的細胞內傳訊結構域的第二CAR。雖然不希望受理論束縛，但是將共刺激傳訊結構域(例如，4-1BB、CD28、CD27或OX-40)置於第一CAR上，並將初級傳訊結構域(例如CD3 ζ)置於第二CAR上可以將CAR活性限制於表現兩種靶標之細胞。在一些實施方式中，表現CAR的免疫效應細胞包含第一CAR，該第一CAR包含靶向例如上述靶標的抗原結合結構域、跨膜結構域和共刺激結構域；和第二CAR，該第二CAR靶向除由該第一CAR靶向的抗原以外的抗原(例如，在與第一靶標相同的癌細胞類型上表現的抗原)並且包含抗原結合結構域、跨膜結構域和初級傳訊結構域。在另一個實施方式中，表現CAR的免疫效應細胞包含第一CAR，該第一CAR包含靶向例如上述靶標的抗原結合結構域、跨膜結構域和初級傳訊結構域；和第二CAR，該第二CAR靶向除由該第一CAR靶向的抗原 以外的抗原(例如，在與第一靶標相同的癌細胞類型上表現的抗原)並且包含針對該抗原的抗原結合結構域、跨膜結構域和共刺激傳訊結構域。
在一些實施方式中，表現CAR的免疫效應細胞包含本文描述的CAR(例如，針對上述靶標的CAR)和抑制性CAR。在一些實施方式中，抑制性CAR包含結合在正常細胞而非癌細胞(例如也表現該靶標的正常細胞)上發現的抗原的抗原結合結構域。在一些實施方式中，抑制性CAR包含抑制性分子的抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內結構域。例如，抑制性CAR的細胞內結構域可為PD1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFR β的細胞內結構域。
在一些實施方式中，免疫效應細胞(例如，T細胞、NK細胞)包含第一CAR，該第一CAR包含結合至如本文描述的腫瘤抗原的抗原結合結構域；和第二CAR，該第二CAR包含PD1細胞外結構域或其片段。
在一些實施方式中，該細胞還包含如上所述之抑制性分子。
在一些實施方式中，該細胞中的第二CAR係抑制性CAR，其中該抑制性CAR包含抑制性分子的抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內結構域。抑制性分子可以選自以下中的一個或多個：PD1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、TGFR β、CEACAM-1、CEACAM-3、和CEACAM-5。在一些實施方式中，第二CAR分子包含PD1的細胞外結構域或其片段。
在實施方式中，該細胞中的第二CAR分子還包含細胞內傳訊結構域，該細胞內傳訊結構域包含初級傳訊結構域和/或細胞內傳訊結構域。
在其他實施方式中，該細胞中的細胞內傳訊結構域包含含有CD3 ζ的功能性結構域的初級傳訊結構域和含有4-1BB的功能性結構域的共刺激傳訊結構域。
在一些實施方式中，第一CAR分子的抗原結合結構域包含scFv，並且第二CAR分子的抗原結合結構域不包含scFv。例如，第一CAR分子的抗原結合結構域包含scFv，並且第二CAR分子的抗原結合結構域包含駱駝科VHH結構域。
CAR的構象
在本文考慮的實施方式中，應理解，一個或多個CAR的構象可以被本文以上描述的載體調節。因此，以下關於表現CAR的細胞描述該等構象。
分離的CAR
在一些實施方式中，表現CAR的細胞使用分離的CAR。分離的CAR方法更詳細地描述於公開WO2014/055442和WO2014/055657中。簡言之，分離的CAR系統包含表現具有第一抗原結合結構域和共刺激結構域(例如41BB)的第一CAR的細胞，並且該細胞還表現具有第二抗原結合結構域和細胞內傳訊結構域(例如CD3ζ)的第二CAR。當該細胞遇到第一抗原時，共刺激結構域被活化，並且細胞增殖。當該細胞遇到第二抗原時，細胞內傳訊結構域被活化並開始細胞殺傷活性。因此，該表現CAR的細胞僅在兩種抗原都存在下完全活化。
多重CAR
在一些方面，本文描述的表現CAR的細胞可以還包含第二CAR，例如包含例如針對相同靶標或不同靶標(例如，除本文描述的癌症相關抗原或本文描述的不同癌症相關抗原的靶標)的第二CAR。在一些實施方式中，第二 CAR包含針對在與癌症相關抗原相同的癌細胞類型上表現的靶標的抗原結合結構域。在一些實施方式中，表現CAR的細胞包含靶向第一抗原並且包含具有共刺激傳訊結構域但不具有初級傳訊結構域的細胞內傳訊結構域的第一CAR，以及靶向第二不同的抗原並且包含具有初級傳訊結構域但不具有共刺激傳訊結構域的細胞內傳訊結構域的第二CAR。雖然不希望受理論束縛，但是將共刺激傳訊結構域(例如，4-1BB、CD28、CD27或OX-40)置於第一CAR上，並將初級傳訊結構域(例如CD3 ζ)置於第二CAR上可以將CAR活性限制於表現兩種靶標之細胞。在一些實施方式中，表現CAR的細胞包含第一癌症相關抗原CAR，該第一癌症相關抗原CAR包含結合本文描述的靶抗原的抗原結合結構域、跨膜結構域和共刺激結構域；和第二CAR，該第二CAR靶向不同靶抗原(例如，在與第一靶抗原相同的癌細胞類型上表現的抗原)並且包含抗原結合結構域、跨膜結構域和初級傳訊結構域。在另一個實施方式中，表現CAR的細胞包含第一CAR，該第一CAR包含結合本文描述的靶抗原的抗原結合結構域、跨膜結構域和初級傳訊結構域；和第二CAR，該第二CAR靶向除第一靶抗原以外的抗原(例如，在與第一靶抗原相同的癌細胞類型上表現的抗原)並且包含針對該抗原的抗原結合結構域、跨膜結構域和共刺激傳訊結構域。
在一些實施方式中，要求保護的本發明包括第一CAR和第二CAR，其中所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原結合結構域不包含可變輕結構域和可變重結構域。在一些實施方式中，所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原結合結構域係scFv，而另一者不是scFv。在一些實施方式中，所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原結合結構域包含單個VH結構域，例如駱駝科、鯊魚、或七鰓鰻單個VH結構域，或源自人或小鼠序列的單個VH結構 域。在一些實施方式中，所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原結合結構域包含奈米抗體。在一些實施方式中，所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原結合結構域包含駱駝科VHH結構域。
一旦執行了本文所述之方法，各種測定可用於評估適當的體外和動物模型中的以下活性，例如抗原刺激後擴增T細胞的能力，在沒有重新刺激之情況下維持T細胞擴增的能力以及抗癌活性。評估本發明之CAR的作用的測定係熟悉該項技術者已知的，並在下文中進行總體描述。
原代T細胞中CAR表現之蛋白質印跡分析可用於檢測單體和二聚體的存在。參見例如，Milone等人，Molecular Therapy[分子療法]17(8)：1453-1464(2009)。非常簡單地，表現CAR的T細胞(CD4+和CD8+ T細胞的1：1混合物)在體外擴增超過10天，然後在還原條件下進行裂解和SDS-PAGE。使用針對TCR-ζ鏈的抗體藉由蛋白質印跡來檢測含有全長TCR-ζ胞質結構域和內源性TCR-ζ鏈的CAR。相同的T細胞亞群用於在非還原條件下的SDS-PAGE分析，以允許評估共價二聚體的形成。
可以藉由流式細胞分析技術測量抗原刺激後CAR+ T細胞的體外擴增。
還可以測量在沒有再刺激之情況下持續的CAR+ T細胞擴增。參見例如，Milone等人，Molecular Therapy[分子療法]17(8)：1453-1464(2009)。簡而言之，在第0天用αCD3/αCD28包被的磁珠刺激，以及在第1天用指示的CAR轉導後，使用Coulter Multisizer III粒子計數器、Nexcelom Cellometer Vision或Millipore Scepter在培養的第8天測量平均T細胞體積(fl)。
動物模型也可用於測量CART活性。例如，可以使用異種移植模型，該異種移植模型使用人本文描述的癌症相關抗原特異性CAR+ T細胞來治療免疫缺陷小鼠中的初級人前-B ALL。參見例如，Milone等人，Molecular Therapy[分子療法]17(8)：1453-1464(2009)。
可以評估劑量依賴性CAR治療應答。參見例如，Milone等人，Molecular Therapy[分子療法]17(8)：1453-1464(2009)。例如，在第21天用CAR T細胞、相同數量的模擬轉導的T細胞、或無T細胞注射的小鼠中建立白血病之後35-70天獲得外周血。將來自每組的小鼠隨機放血以確定外周血如本文描述的癌症相關抗原+ ALL胚細胞計數，並且然後在第35天和第49天處死。在第57天和第70天評價剩餘的動物。
先前已經描述了細胞增殖和細胞介素產生的評估，例如在Milone等人，Molecular Therapy[分子療法]17(8)：1453-1464(2009)中。
可藉由標準51Cr釋放測定來評估細胞毒性。參見例如，Milone等人，Molecular Therapy[分子療法]17(8)：1453-1464(2009)。
成像技術可用於評估荷腫瘤的動物模型中CAR的特定運輸和增殖。例如，Barrett等人，Human Gene Therapy[人基因療法]22：1575-1586(2011)中已經描述了此類測定。
其他測定，包括本文實例部分中描述的那些測定以及本領域中已知的那些測定也可以用於評價本文描述的CAR。
治療方法
在一些實施方式中，本發明係一種治療患有與腫瘤抗原的表現升高相關的疾病、障礙或病症的受試者之方法，該方法包括：
向受試者投與包含介孔二氧化矽顆粒之第一群體和病毒載體之組成物；
其中該病毒載體包含表現載體，該表現載體包含重組多核苷酸，該重組多核苷酸包含可操作地連接至核苷酸序列的表現控制序列，該核苷酸序列表現被工程改造以靶向腫瘤抗原的嵌合抗原受體(CAR)。
在另一方面，本發明之特徵在於一種治療患有與腫瘤抗原(例如本文所述之抗原)的表現相關的疾病的受試者之方法，該方法包含向該受試者投與有效量之組成物，該組成物包含介孔二氧化矽顆粒和本文所述之病毒載體，其中該病毒載體包含表現載體，該表現載體包含重組多核苷酸，該重組多核苷酸包含可操作地連接至核苷酸序列的表現控制序列，該核苷酸序列表現被工程改造以靶向腫瘤抗原的嵌合抗原受體(CAR)。
在一些實施方式中，MSP係棒狀的(MSR)。在一些實施方式中，MSP(例如MSR)還包含多個吸附或共價鍵合在孔襯裡和/或奈米通道襯裡的表面上或MSP或MSR的表面上的官能基。如本文所用，「官能基」定義了直接或經由連接子連接至MSR(例如，MSP)表面的化學部分。在一些實施方式中，官能基係-OH(羥基)、胺、羧酸、膦酸酯、鹵化物、疊氮化物、炔、環氧化物、巰基、二硫化物、聚乙烯亞胺、疏水部分或其鹽。在一些實施方式中，可以將官能基(即-OH(羥基)、胺、羧酸、膦酸酯、鹵化物、疊氮化物、炔、環氧化物、巰基、二硫化物、聚乙烯亞胺、疏水部分、或其鹽)與二氧化矽表面藉由連接子分開。在一些實施方式中，官能基經由C1至C20烷基連接子共價鍵合至MSP表面。在其他實施方式中，官能基經由聚乙二醇連接子共價鍵合至MSP表面。在特定的實施方式中，聚乙二醇連接子具有式(-O(CH2-CH2-)1-25。在特定的實施方式中，表面修飾係C1至C20烷基全鹵代烷基或C1至C20烷基全氟代烷基。
在該方法的一些實施方式中，介孔二氧化矽顆粒和病毒載體之間的靜電軛合係由於病毒載體和介孔二氧化矽顆粒電荷相反。例如但不受理論的束縛，藉由聚乙烯亞胺或帶正電荷的一級銨、二級銨、三級銨或季銨基團表面修飾的介孔二氧化矽顆粒(例如，MSR)可以與帶負電荷的病毒載體軛合或締合。因此，在一些實施方式中，病毒載體帶負電，而介孔二氧化矽顆粒(例如MSR)帶正電。在一些實施方式中，介孔二氧化矽顆粒(例如，MSR)和病毒載體之間的共價軛合藉由熟悉該項技術者已知之方法、藉由連接子或不藉由連接子來實現。例如但不限於，連接子可為聚乙二醇、烷基、聚合物、聚醯胺鍵等。
在一些實施方式中，組成物還包含T細胞刺激化合物或腫瘤抗原，該T細胞刺激化合物或腫瘤抗原軛合至或吸附到介孔二氧化矽顆粒之第一群體或介孔二氧化矽顆粒之第二群體或MSP(例如MSR)的兩個群體上。可替代地，方法包括將介孔二氧化矽顆粒之第二群體與MSP(例如，MSR)之第一群體的投與組合(例如，同時或之後不久)投與。可替代地，可以在MSP之第一群體投與之後較長時間之後投與MSP(例如，MSR)之第二群體。
在一些實施方式中，方法包含投與細胞介素，其中該細胞介素軛合至或吸附到介孔二氧化矽顆粒的第一或第二群體上。
在一些實施方式中，MSP(例如，MSR)之第二群體與MSP之第一群體同時向受試者投與(例如，在同一天投與)，或在MSP之第一群體投與之後不久向受試者投與(例如，投與之後1天、2天、3天、4天、5天、6天、或7天投與)。在其他實施方式中，在MSP之第一群體投與之後較長時間(例如， 例如，至少2週、3週、4週、6週、8週、10週、或更長)之後，向受試者投與細胞介素。
在一些方面，在本文所述之方法中，可以如本文所述對介孔二氧化矽顆粒進行表面修飾。在一些實施方式中，MSP(例如MSR)還包含多個吸附或共價鍵合在孔襯裡和/或奈米通道襯裡的表面上或MSP或MSR的表面上的官能基。如本文所用，「官能基」定義了直接或經由連接子連接至MSR或MSP表面的化學部分。在一些實施方式中，官能基係-OH(羥基)、胺、羧酸、膦酸酯、鹵化物、疊氮化物、炔、環氧化物、巰基、二硫化物、聚乙烯亞胺、疏水部分或其鹽。在一些實施方式中，可以將官能基(即-OH(羥基)、胺、羧酸、膦酸酯、鹵化物、疊氮化物、炔、環氧化物、巰基、二硫化物、聚乙烯亞胺、疏水部分、或其鹽)與二氧化矽表面藉由連接子分開。在一些實施方式中，官能基經由C1至C20烷基連接子共價鍵合至MSP(例如MSR)表面。在其他實施方式中，官能基經由聚乙二醇連接子共價鍵合至MSP(例如MSR)表面。在特定的實施方式中，聚乙二醇連接子具有式(-O(CH2-CH2-)1-25。在特定的實施方式中，表面修飾係C1至C20烷基全鹵代烷基或C1至C20烷基全氟代烷基。
在另一方面，在本文所述之方法中，病毒載體可以軛合至本文所述之介孔二氧化矽顆粒(例如，MSR)。在一些實施方式中，介孔二氧化矽顆粒和病毒載體之間的靜電軛合係由於病毒載體和介孔二氧化矽顆粒電荷相反。例如但不受理論的束縛，藉由聚乙烯亞胺或帶正電荷的一級銨、二級銨、三級銨或季銨基團表面修飾的介孔二氧化矽顆粒(例如，MSR)可以與帶負電荷的病毒載體軛合或締合。因此，在一些實施方式中，病毒載體帶負電，而介孔二氧化矽顆粒帶正電。在一些實施方式中，介孔二氧化矽顆粒和病毒載體之間的 共價軛合藉由熟悉該項技術者已知之方法、藉由連接子或不藉由連接子來實現。例如但不限於，連接子可為聚乙二醇、烷基、聚合物、聚醯胺鍵等。
在特定實施方式中，該病毒載體包含表現載體，該表現載體包含重組多核苷酸，該重組多核苷酸包含可操作地連接至核苷酸序列的表現控制序列，該核苷酸序列表現被工程改造以靶向腫瘤抗原的嵌合抗原受體(CAR)。本文描述了示例性CAR。
在任何前述方法或用途的一些實施方式中，該與腫瘤抗原(例如，本文描述的腫瘤抗原)相關的疾病選自增生性疾病如癌症或惡性腫瘤，或癌前病症如骨髓化生不良、骨髓化生不良症候群或前白血病，或係與本文描述的腫瘤抗原的表現相關的非癌症相關適應症。在一些實施方式中，疾病係本文描述的癌症，例如本文描述為與本文描述的靶標相關之癌症。在一些實施方式中，疾病係血液癌症。在一些實施方式中，血液癌症係白血病。在一些實施方式中，癌症選自以下群組，該群組由以下項組成：一種或多種急性白血病，該等急性白血病包括但不限於B細胞急性淋巴球性白血病(「BALL」)、T細胞急性淋巴球性白血病(「TALL」)、急性淋巴球性白血病(ALL)；一種或多種慢性白血病，該等慢性白血病包括但不限於慢性髓細胞性白血病(CML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)；另外的血液癌症或血液病症包括但不限於B細胞幼淋巴細胞性白血病、母細胞性漿細胞樣樹突細胞腫瘤、柏基特氏淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、毛細胞白血病、小細胞或大細胞濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴組織增生性病症、MALT淋巴瘤、外膜細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、多發性骨髓瘤、骨髓化生不良和骨髓化生不良症候群、非何杰金氏淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、漿母細胞性淋巴瘤、漿細胞樣樹突細胞腫瘤、華氏(Waldenstrom) 巨球蛋白血症、和為由骨髓血細胞的無效產生(或發育異常)聯合在一起的各種血液病症集合的「前白血病」，並且與本文描述的腫瘤抗原的表現相關的疾病包括但不限於表現如本文描述的腫瘤抗原的非典型和/或非經典癌症、惡性腫瘤、癌前病症或增生性疾病；以及它們的任何組合。在另一個實施方式中，與本文描述的腫瘤抗原相關的疾病係實體瘤。
在實施方式中，該癌症選自以下群組，該群組由以下項組成：結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝癌、非小細胞肺癌、小腸癌、食道癌、黑素瘤、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚或眼內惡性黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛區癌、胃癌、睾丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金病、非何杰金氏淋巴瘤、內分泌系統癌症、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、兒童實體瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統腫瘤(CNS)、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊軸腫瘤、腦幹膠質瘤、垂體腺瘤、卡波濟肉瘤、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、T細胞淋巴瘤、環境誘導的癌症、該癌症的組合、以及該癌症的轉移性病灶。
在一些實施方式中，可以用本發明之表現CAR的細胞治療的癌症係多發性骨髓瘤。通常，藉由流式細胞分析技術，骨髓瘤細胞被認為對於如本文描述的癌症相關抗原表現係陰性的。因此，在一些實施方式中，例如如本文描述的CD19 CAR可以用於靶向骨髓瘤細胞。在一些實施方式中，本發明之car療法可以與一種或多種另外的療法(例如來那度胺治療)組合使用。
在各個方面，在向患者投與T細胞或NK細胞後，藉由本文所述之方法產生並投與於患者的免疫效應細胞(例如T細胞，NK細胞)或其後代在患 者中持續至少四個月、五個月、六個月、七個月、八個月、九個月、十個月、十一個月、十二個月、十三個月、十四個月、十五個月、十六個月、十七個月、十八個月、十九個月、二十個月、二十一個月、二十二個月、二十三個月、兩年、三年、四年、或五年。
本發明還包括一種類型的細胞療法，其中例如藉由體外或體內轉錄的RNA修飾免疫效應細胞(例如T細胞、NK細胞)以暫態表現嵌合抗原受體(CAR)。所得細胞能夠殺死受試者或患者中的腫瘤細胞。因此，在各個方面，在投與如本文所述之組成物之後，免疫效應細胞(例如，T細胞，NK細胞)存在少於一個月，例如，三週，兩週，一星期。
不希望受任何特定理論的束縛，由CAR修飾的免疫效應細胞(例如T細胞、NK細胞)引發的抗腫瘤免疫應答可為主動或被動免疫應答，或者可替代地可為由於直接與間接免疫應答。在一些方面，CAR轉導的免疫效應細胞(例如，T細胞、NK細胞)表現出響應於表現如本文描述的癌症相關抗原的人癌細胞的特異性促炎性細胞介素分泌和有效細胞溶解活性，抵抗可溶性如本文描述的癌症相關抗原抑制，介導旁觀者(bystander)殺傷並介導已確立的人腫瘤的消退。例如，表現如本文描述的癌症相關抗原的腫瘤的異質區域內的無抗原腫瘤細胞可能易受先前已經針對鄰近的抗原陽性癌細胞反應的如本文描述的癌症相關抗原重定向的免疫效應細胞(例如，T細胞、NK細胞)的間接破壞。
在一些方面，本發明之完全人CAR修飾的免疫效應細胞(例如，T細胞、NK細胞)可為用於哺乳動物的離體免疫和/或體內療法的一類疫苗。在一些方面，哺乳動物係人。
在一些方面，本發明之表現CAR的細胞可用於治療增生性疾病，如癌症或惡性腫瘤、或係癌前病症(如骨髓化生不良、骨髓化生不良症候群或前白血病)。與如本文描述的癌症相關抗原表現相關的其他疾病包括但不限於例如非典型和/或非經典癌症、惡性腫瘤、癌前病症或表現如本文描述的癌症相關抗原的增生性疾病。與如本文描述的癌症相關抗原的表現相關的非癌症相關適應症包括但不限於例如自體免疫性疾病(例如狼瘡)、炎性病症(過敏症和氣喘)和移植。
本發明之CAR修飾的免疫效應細胞(例如，T細胞、NK細胞)可以單獨投與或作為藥物組成物與稀釋劑和/或與其他組分(如IL-2或其他細胞介素或細胞群體)組合投與。
血液癌症
血液癌症病症係癌症的類型，如白血病、淋巴瘤以及影響血液、骨髓和淋巴系統的惡性淋巴組織增生性病症。
白血病可以分類為急性白血病和慢性白血病。急性白血病可以進一步分類為急性髓細胞性白血病(AML)和急性淋巴球性白血病(ALL)。慢性白血病包括慢性髓細胞性白血病(CML)和慢性淋巴球性白血病(CLL)。其他相關病症包括骨髓化生不良症候群(MDS，以前稱為「前白血病」)，其係由骨髓血細胞的無效產生(或發育異常)和轉化為AML的風險聯合的血液病症的多樣化集合。
淋巴瘤係一組從淋巴細胞發展的血細胞腫瘤。示例性淋巴瘤包括非何杰金氏淋巴瘤和何杰金氏淋巴瘤。
本發明還提供了抑制增生或減少如本文所述之癌症相關抗原之方法，該方法包括使包含如本文所述之癌症相關抗原的細胞群體與包含介孔二氧化矽顆粒和病毒載體之組成物接觸。在特定方面，如本文所述對MSP進行表面修飾。在其他實施方式中，該病毒載體包含表現載體，該表現載體包含重組多核苷酸，該重組多核苷酸包含與待表現的核苷酸序列可操作地連接的表現控制序列。示例性核苷酸序列表現嵌合抗原受體(CAR)、工程改造的TCR、細胞介素、趨化因子、用於阻斷抑制性分子的shRNA、或用於誘導蛋白質表現的mRNA。在一些方面，在患有骨髓性白血病或與表現如本文描述的癌症相關抗原的細胞相關的另一種癌症的受試者中、或骨髓性白血病或與表現如本文描述的癌症相關抗原的細胞相關的另一種癌症的動物模型中，相對於陰性對照，本發明之表現CAR的T細胞或NK細胞使細胞和/或癌細胞之數量(quantity)、數目(number)、量(amount)或百分比減少至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少65%、至少75%、至少85%、至少95%、或至少99%。在一些方面，受試者係人。
組合療法
如本文所用，「組合」投與意指在受試者患病期間將兩種(或更多種)不同之治療遞送至受試者，例如在受試者被診斷患有病症後並且在該病症被治癒或清除前或者在由於其他原因終止治療前遞送兩種或多種治療。在一些實施方式中，第一治療的遞送在第二治療的遞送開始時仍在進行，所以就投與而言存在重疊。這在本文中有時被稱為「同時遞送」或「並行遞送」。在其他實施方式中，一種治療的遞送在另一種治療的遞送開始前結束。在每一種情況的一些實施方式中，治療因組合投與而更有效。例如，第二治療更有效，例 如，與第一治療不存在之情況下投與第二治療所觀察到之結果相比，使用較少的第二治療觀察到等效的作用，或者第二治療使症狀減少更大的程度，或對第一治療觀察到類似的情況。在一些實施方式中，與一種治療不存在之情況下遞送另一種治療所觀察到之結果相比，遞送使得症狀或與該障礙相關的有他參數減少更多。兩種治療的作用可以部分累加、完全累加或大於累加。該遞送可以使得當遞送第二治療時，遞送的第一治療的作用仍然係可檢測的。
在一些實施方式中，該等方法或用途與增加免疫效應細胞的功效的藥劑(例如，如本文描述的藥劑)組合進行。
在本文描述之方法或用途的一些實施方式中，介孔二氧化矽棒組成物與增加免疫效應細胞的功效的藥劑，例如蛋白磷酸酶抑制劑、激酶抑制劑、細胞介素、免疫抑制性分子的抑制劑；或降低TREG細胞的水平或活性的藥劑中的一個或多個組合投與。
在本文描述之方法或用途的一些實施方式中，蛋白磷酸酶抑制劑係SHP-1抑制劑和/或SHP-2抑制劑。
在本文描述之方法或用途的其他實施方式中，激酶抑制劑選自以下中的一種或多種：CDK4抑制劑、CDK4/6抑制劑(例如，帕博西尼)、BTK抑制劑(例如，依魯替尼或RN-486)、mTOR抑制劑(例如，雷帕黴素或依維莫司(RAD001))、MNK抑制劑或雙重P13K/mTOR抑制劑。在一些實施方式中，BTK抑制劑不會降低或抑制白血球介素-2誘導型激酶(ITK)的激酶活性。
在本文描述之方法或用途的其他實施方式中，抑制免疫抑制性分子的藥劑包括抗體或抗體片段、抑制性核酸、聚集的規則間隔短回文重複序列 (CRISPR)、轉錄活化因子樣效應核酸酶(TALEN)或對抑制性分子的表現進行抑制的鋅指核酸內切酶(ZFN)。
在本文描述之方法或用途的其他實施方式中，降低TREG細胞的水平或活性的藥劑選自環磷醯胺、抗GITR抗體、CD25耗減或它們的組合。
在本文描述之方法或用途的一些實施方式中，免疫抑制性分子選自由以下項組成之群組：PD1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、TGFR β、CEACAM-1、CEACAM-3和CEACAM-5。
在其他實施方式中，對抑制性分子進行抑制的藥劑包含含有抑制性分子的第一多肽或其片段以及向細胞提供陽性訊號的第二多肽，並且其中該第一多肽和第二多肽在含有CAR的免疫細胞上表現，其中(i)該第一多肽包含PD1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、TGFR β、CEACAM-1、CEACAM-3、以及CEACAM-5或其片段；和/或(ii)該第二多肽包含細胞內傳訊結構域，該細胞內傳訊結構域包含初級傳訊結構域和/或共刺激傳訊結構域。在一些實施方式中，初級傳訊結構域包含CD3 ζ的功能性結構域；和/或共刺激傳訊結構域包含選自41BB、CD27和CD28之蛋白質的功能性結構域。
在其他實施方式中，細胞介素選自IL-7、IL-15或IL-21、或它們的組合。
在其他實施方式中，包含CAR分子的免疫效應細胞和第二，例如本文揭露的任何組合療法(例如，增加免疫效應細胞的功效的藥劑)基本上同時或順序地投與。
在其他實施方式中，包含CAR分子的免疫細胞與靶向GITR和/或調節GITR功能的分子組合投與。在一些實施方式中，靶向GITR和/或調節GITR功能的分子在表現CAR的細胞或細胞群體之前或在單採血液成分術之前投與。
在一些實施方式中，淋巴細胞輸注(例如同種異體淋巴細胞輸注)用於治療癌症，其中淋巴細胞輸注包含至少一種本發明之表現CAR之細胞。在一些實施方式中，自體淋巴細胞輸注用於治療癌症，其中自體淋巴細胞輸注包含至少一種本文描述的表現CAR之細胞。
在一些實施方式中，細胞係T細胞，並且該T細胞係甘油二酯激酶(DGK)缺陷的。在一些實施方式中，細胞係T細胞，並且該T細胞係Ikaros缺陷的。在一些實施方式中，細胞係T細胞，並且該T細胞係DGK和Ikaros兩者缺陷的。
在任何前述方法或用途的實施方式中，可以進一步投與治療與腫瘤抗原表現相關的疾病的藥劑，例如本文揭露的第二種或第三療法中的任何一種。另外的示例性組合包括以下中的一種或多種。
在另一個實施方式中，可以進一步投與另一種藥劑，例如本文所述之激酶抑制劑和/或檢查點抑制劑。例如，可以進一步投與增強表現CAR的細胞的活性的藥劑。
例如，在一些實施方式中，增強表現CAR的細胞的活性的藥劑可為對抑制性分子進行抑制的藥劑(例如，免疫抑制劑分子)。抑制性分子之實例包括PD1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFR β。
在一些實施方式中，對抑制性分子進行抑制的藥劑係抑制性核酸，係dsRNA、siRNA或shRNA。在實施方式中，該抑制性核酸與編碼CAR分子的組分的核酸連接。例如，抑制性分子可以在表現CAR的細胞上表現。
在另一個實施方式中，對抑制性分子進行抑制的藥劑如是本文描述的分子，例如包含第一多肽(例如，抑制性分子)的藥劑，該第一多肽與向細胞提供陽性訊號的第二多肽(例如，本文描述的細胞內傳訊結構域)締合。在一些實施方式中，該藥劑包含例如抑制性分子(如PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFR β、或該等中的任一者的片段(例如，該等中的任一者的細胞外結構域的至少一部分))的第一多肽，和第二多肽，該第二多肽係本文描述的細胞內傳訊結構域(例如，包含共刺激結構域(例如，41BB、CD27或CD28，例如如本文描述)和/或初級傳訊結構域(例如，本文描述的CD3 ζ傳訊結構域)。在一些實施方式中，該藥劑包含PD1或其片段(例如PD1的細胞外結構域的至少一部分)的第一多肽，和本文描述的細胞內傳訊結構域(例如本文描述的CD28傳訊結構域和/或本文描述的CD3ζ傳訊結構域)的第二多肽。
在一些實施方式中，將本發明之表現CAR的免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)投與至已接受先前幹細胞移植(例如自體幹細胞移植)的受試者。
在一些實施方式中，將本發明之表現CAR的免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)投與至已接受先前劑量的美法侖的受試者。
在一些實施方式中，將表現CAR分子(例如，本文描述的CAR分子)的細胞與增加表現CAR分子的細胞的功效的藥劑(例如本文描述的藥劑)組合投與。
在一些實施方式中，表現CAR分子(例如，本文描述的CAR分子)的細胞與改善與表現CAR分子的細胞的投與相關的一種或多種副作用的藥劑(例如，本文描述的藥劑)組合投與。
在一些實施方式中，表現CAR分子(例如，本文描述的CAR分子)的細胞與治療與如本文描述的癌症相關抗原相關的疾病的藥劑(例如，本文描述的藥劑)組合投與。
在一些實施方式中，將表現兩種或更多種CAR分子(例如，如本文描述)的細胞投與至有需要的受試者以治療癌症。在一些實施方式中，將包含表現CAR的細胞的細胞群體(例如，如本文描述)投與至有需要的受試者以治療癌症。
在本文描述之方法或用途的一些實施方式中，該CAR分子與另一種藥劑組合投與。在一些實施方式中，該藥劑可為激酶抑制劑，例如CDK4/6抑制劑、BTK抑制劑、mTOR抑制劑、MNK抑制劑或雙重PI3K/mTOR激酶抑制劑、以及它們的組合。在一些實施方式中，激酶抑制劑係CDK4抑制劑，例如本文所述之CDK4抑制劑，例如CD4/6抑制劑，如6-乙醯基-8-環戊基-5-甲基-2-(5-哌
Figure 109105885-A0202-12-0167-94
-1-基-吡啶-2-基胺基)-8H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮鹽酸鹽(也稱為帕博西尼(palbociclib)或PD0332991)。在一些實施方式中，激酶抑制劑係BTK抑制劑，例如本文描述的BTK抑制劑，例如像依魯替尼。在一些實施方式中，激酶抑制劑係mTOR抑制劑，例如本文描述的mTOR抑制劑，例如像雷帕黴素、雷帕黴素 類似物、OSI-027。該mTOR抑制劑可為例如mTORC1抑制劑和/或mTORC2抑制劑，例如本文描述的mTORC1抑制劑和/或mTORC2抑制劑。在一些實施方式中，激酶抑制劑係MNK抑制劑，例如本文描述的MNK抑制劑，例如像4-胺基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。該MNK抑制劑可為例如MNK1a、MNK1b、MNK2a和/或MNK2b抑制劑。該雙重PI3K/mTOR抑制劑可為例如PF-04695102。
在本文描述之方法或用途的一些實施方式中，激酶抑制劑係選自以下的CDK4抑制劑：aloisine A；flavopiridol或HMR-1275，2-(2-氯苯基)-5,7-二羥基-8-[(3S,4R)-3-羥基-1-甲基-4-哌啶基]-4-色滿酮；克唑替尼(PF-02341066；2-(2-氯苯基)-5,7-二羥基-8-[(2R,3S)-2-(羥甲基)-1-甲基-3-吡咯啶基]-4H-1-苯并哌喃-4-酮鹽酸鹽(P276-00)；1-甲基-5-[[2-[5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基]-4-吡啶基]氧基]-N-[4-(三氟甲基)苯基]-1H-苯并咪唑-2-胺(RAF265)；英迪舒蘭(E7070)；roscovitine(CYC202)；帕博西尼(PD0332991)；地那西利(SCH727965)；N-[5-[[(5-三級丁基
Figure 109105885-A0202-12-0168-95
唑-2-基)甲基]硫代]噻唑-2-基]哌啶-4-甲醯胺(BMS 387032)；4-[[9-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5H-嘧啶并[5,4-d][2]苯并氮雜-2-基]胺基]-苯甲酸(MLN8054)；5-[3-(4,6-二氟-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吲唑-5-基]-N-乙基-4-甲基-3-吡啶甲胺(AG-024322)；4-(2,6-二氯苯甲醯基胺基)-1H-吡唑-3-甲酸N-(哌啶-4-基)醯胺(AT7519)；4-[2-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-咪唑-5-基]-N-[4-(甲基磺醯基)苯基]-2-嘧啶胺(AZD5438)；和XL281(BMS908662)。
在本文描述之方法或用途的一些實施方式中，激酶抑制劑係CDK4抑制劑，例如帕博西尼(PD0332991)，並且將帕博西尼以每天約50mg、60mg、70mg、75mg、80mg、90mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg(例如75mg、100mg或125mg)的劑量投與持 續一段時間，例如每天投與28天週期的14-21天、或每天投與21天週期的7-12天。在一些實施方式中，投與帕博西尼的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多個週期。
在本文描述之方法或用途的一些實施方式中，激酶抑制劑係選自以下的BTK抑制劑：依魯替尼(PCI-32765)；GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；和LFM-A13。在一些實施方式中，BTK抑制劑不會降低或抑制白血球介素-2誘導型激酶(ITK)的激酶活性，並且選自GDC-0834、RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；和LFM-A13。
在本文描述之方法或用途的一些實施方式中，激酶抑制劑係BTK抑制劑(例如，依魯替尼(PCI-32765))，並且將依魯替尼以每天約250mg、300mg、350mg、400mg、420mg、440mg、460mg、480mg、500mg、520mg、540mg、560mg、580mg、600mg(例如，250mg、420mg或560mg)的劑量投與持續一段時間，例如每天投與持續21天週期，或每天投與持續28天週期。在一些實施方式中，投與1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多個週期的依魯替尼。
在本文描述之方法或用途的一些實施方式中，激酶抑制劑係不會抑制ITK(例如RN-486)的激酶活性的BTK抑制劑，並且將RN-486以每天約100mg、110mg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、170mg、180mg、190mg、200mg、210mg、220mg、230mg、240mg、250mg(例如，150mg、200mg或250mg)的劑量投與一段時間，例如28天週期。在一些實施方式中，投與RN-486的1、2、3、4、5、6、7或更多個週期。
在本文描述之方法或用途的一些實施方式中，激酶抑制劑係選自以下的mTOR抑制劑：替西羅莫司；地磷莫司(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羥基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧雜-11,36-二氧雜-4-氮雜三環[30.3.1.04,9]三十六碳-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基環己基二甲基次膦酸酯，也稱為AP23573和MK8669；依維莫司(RAD001)；雷帕黴素(AY22989)；塞馬莫德(simapimod)；(5-{2,4-雙[(3S)-3-甲基啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-胺基-8-[反式-4-(2-羥基乙氧基)環己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502)；和N 2-[1,4-二側氧基-4-[[4-(4-側氧基-8-苯基-4H-1-苯并哌喃-2-基)啉-4-基]甲氧基]丁基]-L-精胺醯甘胺醯-L-α-天冬胺醯L-絲胺酸-(SEQ ID NO：692)內鹽(SF1126)；和XL765。
在本文描述之方法或用途的一些實施方式中，激酶抑制劑係mTOR抑制劑，例如雷帕黴素，並且將雷帕黴素以每天約3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg(例如6mg)的劑量投與持續一段時間，例如每天投與持續21天週期、或每天投與持續28天週期。在一些實施方式中，投與雷帕黴素的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多個週期。在一些實施方式中，激酶抑制劑係mTOR抑制劑，例如依維莫司，並且將依維莫司以每天約2mg、2.5mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg(例如10mg)的劑量投與持續一段時間，例如每天投與持續28天週期。在一些實施方式中，投與依維莫司的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多個週期。
在本文描述之方法或用途的一些實施方式中，激酶抑制劑係選自以下的MNK抑制劑：CGP052088；4-胺基-3-(對氟苯基胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶(CGP57380)；尾孢素醯胺(cercosporamide)；ETC-1780445-2；和4-胺基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。
在本文描述之方法或用途的一些實施方式中，激酶抑制劑係雙重磷脂醯肌醇3-激酶(PI3K)和mTOR抑制劑，其選自2-胺基-8-[反式-4-(2-羥基乙氧基)環己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF-04691502)；N-[4-[[4-(二甲基胺基)-1-哌啶基]羰基]苯基]-N'-[4-(4,6-二-4-啉基-1,3,5-三
Figure 109105885-A0202-12-0171-96
-2-基)苯基]尿素(PF-05212384，PKI-587)；2-甲基-2-{4-[3-甲基-2-側氧基-8-(喹啉-3-基)-2,3-二氫-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基}丙腈(BEZ-235)；阿托利司(GDC-0980，RG7422)；2,4-二氟-N-{2-(甲基氧基)-5-[4-(4-嗒
Figure 109105885-A0202-12-0171-97
基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺醯胺(GSK2126458)；8-(6-甲氧基吡啶-3-基)-3-甲基-1-(4-(哌
Figure 109105885-A0202-12-0171-98
-1-基)-3-(三氟甲基)苯基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-(3H)-馬來酸(NVP-BGT226)；3-[4-(4-啉基吡啶并[3',2'：4,5]呋喃并[3,2-d]嘧啶-2-基]苯酚(PI-103)；5-(9-異丙基-8-甲基-2-啉代-9H-嘌呤-6-基)嘧啶-2-胺(VS-5584，SB2343)；和N-[2-[(3,5-二甲氧基苯基)胺基]喹
Figure 109105885-A0202-12-0171-99
啉-3-基]-4-[(4-甲基-3-甲氧基苯基)羰基]胺基苯磺醯胺(XL765)。
在本文描述之方法或用途的一些實施方式中，可以進一步投與蛋白酪胺酸磷酸酶抑制劑，例如本文描述的蛋白酪胺酸磷酸酶抑制劑。在一些實施方式中，蛋白酪胺酸磷酸酶抑制劑係SHP-1抑制劑，例如本文描述的SHP-1抑制劑，例如像葡萄糖酸銻鈉。在一些實施方式中，蛋白酪胺酸磷酸酶抑制劑係SHP-2抑制劑。
在本文描述之方法或用途的一些實施方式中，可以進一步投與另一種藥劑，並且該藥劑係細胞介素。該細胞介素可為例如IL-7、IL-15、IL-21或它們的組合。在另一個實施方式中，將CAR分子與檢查點抑制劑(例如本文描述的檢查點抑制劑)組合投與。例如，在一些實施方式中，檢查點抑制劑抑制選自PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、CEACAM(例如，CEACAM-1,CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFR β的抑制性分子。
在本文描述之方法或用途的其他實施方式中，可以進一步投與改善與表現CAR分子的細胞相關的一種或多種副作用的藥劑。與表現CAR的細胞相關的副作用可以選自細胞介素釋放綜合症(CRS)或噬血細胞性淋巴組織細胞增多症(HLH)。
本發明還提供了預防、治療和/或管理與表現本文所述之癌症相關抗原的細胞相關的疾病(例如，表現如本文所述之癌症相關抗原的血液癌症或非典型癌症)之方法，該方法包括向受試者投與包含介孔二氧化矽顆粒之第一群體和病毒載體之組成物，並且其中該病毒載體包含表現載體，該表現載體包含重組多核苷酸，該重組多核苷酸包含可操作地連接至核苷酸序列的表現控制序列，該核苷酸序列表現被工程改造以靶向腫瘤抗原的嵌合抗原受體(CAR)。在一些方面，受試者係人。與表現如本文描述的癌症相關抗原的細胞相關的病症的非限制性實例包括自體免疫性病症(如狼瘡)、炎性病症(如過敏症和氣喘)和癌症(如表現如本文描述的癌症相關抗原的血液癌症或非典型癌症)。
本發明還提供了預防、治療和/或管理與表現本文所述之癌症相關抗原的細胞相關的疾病之方法，該等方法包括向受試者投與包含介孔二氧化 矽顆粒之第一群體和病毒載體之組成物，且其中該病毒載體包含表現載體，該表現載體包含重組多核苷酸，該重組多核苷酸包含可操作地連接至核苷酸序列的表現控制序列，該核苷酸序列表現被工程改造以靶向腫瘤抗原的嵌合抗原受體(CAR)。在一些方面，受試者係人。
本發明提供了預防與表現本文所述之癌症相關抗原的細胞相關之癌症復發之方法，該等方法包括向受試者投與包含介孔二氧化矽顆粒之第一群體和病毒載體之組成物，且其中該病毒載體包含表現載體，該表現載體包含重組多核苷酸，該重組多核苷酸包含可操作地連接至核苷酸序列的表現控制序列，該核苷酸序列表現被工程改造以靶向腫瘤抗原的嵌合抗原受體(CAR)。
當指示「免疫有效量」、「抗腫瘤有效量」、「腫瘤抑制有效量」或「治療量」時，醫生可以考慮到年齡、體重、腫瘤大小、感染或轉移的程度以及患者(受試者)的狀況的個體差異來確定待投與的本發明組成物的精確量。
在一些方面，可能希望向受試者投與活化的免疫效應細胞(例如，T細胞、NK細胞)，並且然後隨後重抽血液(或進行單採血液成分術)，根據本發明活化並且擴增免疫效應細胞(例如，T細胞、NK細胞)，並用該等活化和擴增的免疫效應細胞(例如，T細胞、NK細胞)回輸患者。該過程可以每隔幾週進行多次。在一些方面，可以將來自從10cc至400cc抽血的免疫效應細胞(例如，T細胞、NK細胞)活化。在一些方面，將來自20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、或100cc抽血的免疫效應細胞(例如，T細胞、NK細胞)活化。
能以任何常規方式投與主題組成物，包括藉由霧化吸入、注射、攝取、輸血、植入或移植。可以向患者經動脈、皮下、真皮內、瘤內、結內、 髓內、肌內、藉由靜脈內(i.v.)注射、或者腹膜內投與本文描述之組成物。在一些方面，藉由真皮內或皮下注射向患者投與本發明之MSP(例如MSR)組成物。在一些方面，本發明之T細胞組成物腸胃外投與。術語「腸胃外」投與T細胞組成物包括例如鞘內、硬膜外、顱內，皮下(s.c.)、靜脈內(i.v.)、肌肉內(i.m.)、或胸骨內注射、腫瘤內或輸注技術。在特定實施方式中，T細胞組成物靜脈內投與。在一些實施方式中，MSP(例如MSR)和病毒載體之組成物可以直接注射到腫瘤、淋巴結或感染部位。
實例
實例A 介孔二氧化矽顆粒的合成和後官能化
除非另有說明，否則所有試劑均從商業來源獲得並按原樣使用。
1.介孔二氧化矽顆粒的示例性合成
將聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)平均Mn約5,800(普朗尼克P-123，80.0g，487mmol；西格瑪公司(Sigma))表面活性劑在室溫下溶解於3L 1.6M HCl中，在5L帶夾套的燒瓶中加熱至40攝氏度，並藉由頂置式攪拌器以0-600rpm(但最通常地為300rpm)的速率機械攪拌。原矽酸四乙酯(TEOS，184mL，826mmol；西格瑪公司)在<5分鐘內以一個部分添加，並在40攝氏度下加熱並保持攪拌至少2小時，但最通常地為20小時。將得到的漿料加熱至80-130攝氏度(最通常地為100攝氏度)6-72小時(但最通常地為24小時)以進行水熱處理，之後冷卻至室溫。將漿料在布氏漏斗中過濾，先後用去離子水和乙醇洗滌，並在室溫下風乾。將得到的二氧化矽材料在爐中煆燒，其中在8 小時內從室溫緩慢升溫至550攝氏度，然後在550攝氏度下再保持8個小時，然後冷卻至室溫，以得到47g介孔二氧化矽顆粒。
攪拌速率的變化可以使微顆粒的縱橫比變化。改變水熱溫度和持續時間的條件係介孔材料常用的孔徑控制。有關更多資訊，請參見J.Chem.Educ.[化學教育雜誌]2017, 94,91-94及其內的參考文獻。
藉由光學顯微鏡、Malvern Morphologi G3、掃描電子顯微鏡(SEM)、熱重分析(TGA)對最終的介孔材料進行表徵。
2.二氧化矽微顆粒的後修飾
實例2(a)：乙基膦酸二乙酯官能化的微顆粒
乙基膦酸二乙酯官能化的二氧化矽微顆粒藉由在New J.Chem[新化學雜誌].,2014, 38,3853中報導的改進之方法製備，其中進行了一些修改。將二乙基磷酸乙基三乙氧基矽烷(4.15mL，13.03mmol)添加到懸浮在300mL甲苯中的2.0g介孔二氧化矽微顆粒的漿料中。將漿料攪拌並在110攝氏度下回流14小時，然後冷卻至室溫並過濾。將該顆粒先後用去離子水和乙醇洗滌，然後在烘箱中在100攝氏度下乾燥20小時，以得到乙基膦酸二乙酯官能化的顆粒。
實例2(b)：乙基膦酸官能化的微顆粒
乙基膦酸官能化的微顆粒係藉由對New J.Chem[新化學雜誌].,2014, 38,3853中報導的程序改進之方法製備的。將三甲基矽基氯矽烷(1.388mL，10.86mmol)添加到懸浮在150mL甲苯中的2.0g乙基膦酸二乙酯官能化的微顆粒的漿料中，並加熱至110攝氏度持續24小時。將漿料冷卻至室溫並過濾，用去離子水和乙醇洗滌，然後在烘箱中在100攝氏度下乾燥24小時。然後將介孔二氧化矽顆粒懸浮在100mL的12M HCl中，並加熱至100攝氏度持續18小時。將漿料 冷卻至室溫，過濾並用去離子水和乙醇洗滌，然後在烘箱中在100攝氏度下乾燥24小時，以得到乙基膦酸官能化的微顆粒。
實例2(c)：丙胺官能化的微顆粒
丙胺官能化的微顆粒係藉由對Langmuir 2015, 31,6457-6462中報導的程序改進之方法製備的。將(3-胺基丙基)三甲氧基矽烷(3.05ml，19.54mmol；APTMS，西格瑪公司)添加到在150mL試劑級乙醇中的3.0克介孔二氧化矽微顆粒的漿料中。將漿料在75攝氏度下回流7小時。冷卻至室溫後，過濾漿料，先後用去離子水和乙醇洗滌顆粒，然後在烘箱中在100攝氏度下乾燥24小時。
實例2(d)：生物素官能化的微顆粒
將(+)-生物素N-琥珀醯亞胺酯(246mg，0.720mmol)添加到在10.0mL PBS緩衝液(調節至pH 7.4)中的1.0g丙胺官能化的微顆粒的漿料中，並在室溫下攪拌18小時。將漿料過濾並用去離子水和乙醇洗滌，然後在烘箱中在100攝氏度下乾燥24小時，以得到生物素官能化的微顆粒。
實例2(e)：生物素-PEG4官能化的微顆粒
將PEG4-生物素N-羥基琥珀醯亞胺(106mg，0.180mmol；賽默飛世爾公司(ThermoFischer)EZ-連接(EZ-Link)NHS-PEG4-生物素)添加到在2.5mL PBS緩衝液(調節至pH 7.4)中的0.25g丙胺官能化的微顆粒的漿料中，並在室溫下攪拌18小時。將漿料過濾並用去離子水和乙醇洗滌，然後在烘箱中在100攝氏度下乾燥24小時，以得到生物素-PEG4官能化的微顆粒。
實例2(f)：3(2-吡啶基二硫代)丙醯胺基)己酸酯官能化的微顆粒
將琥珀醯亞胺基6-(3(2-吡啶基二硫代)丙醯胺基)己酸酯(112mg，0.360mmol；LC-SPDP，賽默飛世爾公司)添加到在2.5mL PBS緩衝液(調節至 pH 7.4)中的0.50g丙胺官能化的微顆粒的漿料中，並在室溫下攪拌18小時。將漿料過濾並用去離子水和乙醇洗滌，然後在烘箱中在100攝氏度下乾燥24小時，以得到3(2-吡啶基二硫代)丙醯胺基)己酸酯官能化的微顆粒。
實例2(g)：4-側氧基-4-(丙基胺基)丁酸官能化的微顆粒
將琥珀酸酐(4g，40.0mmol)添加到在無水DMF中的1.0g丙胺官能化的微顆粒的漿料中，並在室溫下攪拌24小時。將該漿料過濾並用去離子水和乙醇洗滌，然後在烘箱中在100攝氏度下乾燥24小時，以得到4-側氧基-4-(丙基胺基)丁酸官能化的微顆粒。
實例2(h)：丙基二伸乙基三胺官能化的微顆粒
將三甲氧基矽基丙基二伸乙基三胺(1.678mL，6.51mmol)添加到懸浮在150mL試劑級乙醇中的1.0g介孔二氧化矽微顆粒中。將漿料在75攝氏度下攪拌7小時。冷卻至室溫後，過濾漿料，先後用去離子水和乙醇洗滌顆粒，然後在烘箱中在100攝氏度下乾燥20小時以得到丙基二伸乙基三胺官能化的顆粒。
實例2(i)：3-丙基二氫呋喃-2,5-二酮官能化的微顆粒(琥珀酸酐)
將3-(3-(三乙氧基矽基)丙基)二氫呋喃-2,5-二酮(4.94mL，17.37mmol)添加到在300mL甲苯中的3.0g介孔二氧化矽微顆粒的漿料中。將漿料加熱至110攝氏度20小時，然後冷卻至室溫，過濾並用去離子水和乙醇洗滌。將官能化的微顆粒在烘箱中在100攝氏度下乾燥24小時。
實例2(j)：支鏈聚乙烯亞胺官能化的微顆粒
將聚乙烯亞胺(25.1g，47.0mmol；支鏈的，平均Mw約25,000，西格瑪公司)溶於600mL無水DMF中，然後添加6.0g 3-丙基二氫呋喃-2,5-二酮 官能化的微顆粒，並在室溫下攪拌20小時。將漿料過濾，並先後用去離子水和乙醇洗滌該顆粒，然後在烘箱中在100攝氏度下乾燥20小時，以得到支鏈的聚乙烯亞胺官能化的微顆粒。
實例2(k)：N,N,N-三甲基丙烷-1-銨官能化的微顆粒
將三甲氧基矽基丙基三甲基氯化銨(3.61mL，6.51mmol；在甲醇中的50%溶液)添加到在150mL試劑級乙醇中的1.0g介孔二氧化矽微顆粒的漿料中，並加熱至75攝氏度持續7小時。冷卻至室溫後，過濾漿料，先後用去離子水和乙醇洗滌顆粒，然後在烘箱中在100攝氏度下乾燥20小時，以得到N,N,N-三甲基丙烷-1-銨官能化的微顆粒。
以三甲氧基矽基丙基三甲基氯化銨與二氧化矽微顆粒的不同比例(0.25mmol三甲氧基矽基三甲基氯化銨/克微顆粒)重複上述步驟，以實現改變功能密度的比例。
實例2(1)：辛基官能化的微顆粒
將三乙氧基(辛基)矽烷(2.05mL，6.51mmol)添加到在150mL試劑級乙醇中的1.0g介孔二氧化矽微顆粒的漿料中，並加熱至75攝氏度持續7小時。冷卻至室溫後，過濾漿料，先後用去離子水和乙醇洗滌顆粒，然後在烘箱中在100攝氏度下乾燥20小時，以得到辛基官能化的微顆粒。
實例2(m)：十六烷基官能化的微顆粒
將十六烷基三甲氧基矽烷(2.54mL，6.51mmol)添加到在150mL試劑級乙醇中的1.0g介孔二氧化矽微顆粒的漿料中，並加熱至75攝氏度持續7小時。冷卻至室溫後，過濾漿料，先後用去離子水和乙醇洗滌顆粒，然後在烘箱中在100攝氏度下乾燥20小時，以得到十六烷基官能化的微顆粒。
實例2(n)：11-疊氮基十一烷基官能化的微顆粒
將(11-疊氮基十一烷基)三甲氧基矽烷(1.0g，3.15mmol)添加到在150mL試劑級乙醇中的1.0g介孔二氧化矽微顆粒的漿料中，並加熱至75攝氏度持續7小時。冷卻至室溫後，過濾漿料，先後用去離子水和乙醇洗滌顆粒，然後在烘箱中在100攝氏度下乾燥20小時，以得到11-疊氮基十一烷基官能化的微顆粒。
實例2(o)：3-疊氮基丙基官能化的微顆粒
將(3-疊氮基丙基)三甲氧基矽烷(1.0g，4.87mmol)添加到在150mL試劑級乙醇中的1.0g介孔二氧化矽微顆粒的漿料中，並加熱至75攝氏度持續7小時。冷卻至室溫後，過濾漿料，先後用去離子水和乙醇洗滌顆粒，然後在烘箱中在100攝氏度下乾燥20小時，以得到3-疊氮基丙基官能化的顆粒。
實例2(p)：3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三烷氟辛基官能化的微顆粒
將三乙氧基(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三烷氟辛基)矽烷(2.499mL，6.51mmol)添加到在150mL試劑級乙醇中的1.0g介孔二氧化矽微顆粒的漿料中，並加熱至75攝氏度持續7小時。冷卻至室溫後，過濾漿料，先後用去離子水和乙醇洗滌顆粒，然後在烘箱中在100攝氏度下乾燥20小時，以得到3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三烷氟辛基官能化的微顆粒。
實例B.針對病毒結合來測試MSR表面修飾
為了測試慢病毒與MSP的結合，製備了多種具有不同表面化學性質的MSP(圖1)。將乾燥的MSR批次以10mg/ml重懸於冰冷的pH 7.5的Tris-NaCl-EDTA緩衝液(NTE緩衝液)中。將表現綠色螢光蛋白(GFP)的慢病毒(FCT067，Kerafast公司)的儲備液在冰冷的NTE緩衝液中稀釋至3x10 6 /ml的 效價。將MSR懸浮液和稀釋的病毒以1：1體積/體積的比例混合，並在冰上孵育30分鐘。將對照顆粒與不含病毒的NTE緩衝液以1：1體積/體積孵育。孵育後，在4℃下用含1%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌一次，然後在4℃下用PBS洗滌一次。然後將樣本用PBS中的4.2%多聚甲醛固定。樣本用抗病毒包膜的抗體(來自Kerafast公司的抗VSV-G，8G5F11；1：50稀釋)染色，然後用Dylight-488標記的抗小鼠IgG(英傑公司(Invitrogen))染色。樣本用PBS洗滌兩次，並使用配備有GFP LED燈箱的Evos螢光顯微鏡成像(圖2)。成像顯示染色劑與未攜帶病毒的MSR沒有可檢測的結合。軛合病毒的棒顯示不同水平的定量結合，其中三甲基銨和胺官能基顯示最大結合。
實例C.使用MSR對GFP慢病毒轉導T細胞的體外測定
MSR用於T細胞病毒轉導之示意圖如圖3所示。用Dynabead T細胞活化劑珠以3：1的珠：細胞比例刺激原初人T細胞兩天。使用磁鐵去除珠子，並將細胞轉移到新鮮的培養基中。如上所述製備病毒軛合的MSR，並以80μg/ml重懸於細胞培養基中。如圖3所示對其進行系列稀釋。將該懸浮液與T細胞5x10 5 /ml以1：1合併，並孵育4天。在培養物中的活單線態細胞中評估GFP表現，以評估轉導效率。結果(圖4)表明與僅在培養基中給予的病毒相比，軛合MSR的病毒的轉導發生的水平更高。三甲基銨官能化的MSR提供了最高水平的轉導。
實例D.T細胞與呈遞CD3/CD28激動性抗體、EGFRvIII肽或BCMA蛋白的MSR的相互作用；
如Cheung,A.S.，等人中所述製備具有固定在表面的配位基的MSR，模擬抗原呈遞細胞的支架使原代T細胞能夠離體擴增。Nature Biotechnology[自然生物技術],36(2),160-169。該方法的方案示於圖5中。
簡而言之，使用薄膜再水化方法並通過100nm聚碳酸酯膜擠出形成主要由具有1mol% PE-生物素的POPC構成的脂質體。將羥基官能化的MSR與該脂質體一起孵育，以允許在MSR表面上形成支撐的脂質雙層(圖6)。為了用CD3和CD28激動性抗體官能化MSR，用PBS洗滌MSR數次，與鏈黴親和素孵育，然後與生物素化的CD3和CD28抗體拴系在一起。對於EGFRvIII CAR結合肽的MSR固定化，使用生物素化的EGFRvIII CAR結合肽(圖7)。對於BCMA CART刺激，使用生物素-NHS對重組BCMAFc蛋白進行生物素化，並類似地偶聯至MSR表面。
與所需的配位基一起孵育後，MSR用PBS洗滌數次，並以各種濃度重懸於培養基中，並與T細胞孵育。使用CFSE標記T細胞並藉由流式細胞分析技術評估染料稀釋度來讀出T細胞增殖。使用多重細胞介素分析方法(Mesoscale Delivery V-Plex)評估細胞介素的產生。
EGFRvIII CART響應結合在MSR表面的EGFRvIII CAR結合肽而產生干擾素γ和IL-2，而溶液中的游離EGFRvIII CAR結合肽(MSR上呈遞的非刺激性肽(OVA))，或未修飾的MSR沒有給出來自CART的響應(圖8)。在另一個實驗中，使用細胞計數來監測EGFRvIII CART響應於各種刺激之增殖(圖9)。
為了進一步分析不同T細胞亞群的表型擴增，使用流式細胞分析技術評估EGFRvIII CART之增殖。將CART用CFSE染色並藉由流式細胞分析技術監測染料稀釋度以指示增殖(圖10)。使用用MSR表面上呈遞的BCMAFc蛋白抗原官能化的MSR進行類似的實驗(圖11)。
為了測試使用兩種MSR(帶有刺激性誘因的MSR和與慢病毒混合的MSR)同時用病毒刺激和轉導T細胞，使用圖12所示的實驗方案。如上所述，將MSR的一個群體用脂質雙層包被並接枝抗CD3/CD28抗體。用慢病毒孵育MSR之第二群體。圖13所示之結果表明，與溶液中的游離病毒相比，當用抗CD3/CD28激動性抗體刺激T細胞並暴露於用PEI-MSR孵育的病毒時，轉導水平更高。
為了測試在MSR的相同群體上兩種誘因對T細胞的同時刺激和轉導，T細胞暴露於(1)帶有抗CD3/CD28激動性抗體的、脂質包被的刺激性MSR，和培養基中的病毒，(2)帶有抗CD3/CD28激動性抗體的、脂質包被的刺激性MSR，和預先與病毒孵育的PEI-MSR，或(3)吸附有抗CD3/CD28促效劑抗體的PEI MSRS，然後與病毒孵育。培養三天後，評估T細胞之轉導效率。圖14顯示在各種病毒量下，刺激性MSR濃度對條件(1)和(2)的MSR的影響。如圖14所示，在PEI-MSR與病毒孵育的條件(2)下，總體轉導得到增強。
圖15比較了所有三個條件，其中條件(1)和(2)處於刺激性MSR之最高濃度。如圖15所示，刺激性誘因與PEI-MSR結合的條件(3)產生最高的相對轉導效率。相同的配製物用於研究人外周血單核細胞(PBMC)的MSR介導的轉導。在圖16中，顯示對於條件(1)和(2)在最高刺激水平處的作為病毒濃度成函數的不同細胞群體的轉導。圖17顯示對於條件(1)和(2)在最高刺激水平收集的在總GFP+轉導的細胞級分中以及在總細胞群體中每個細胞群體的比例。
實例E.MSR誘導的T細胞轉導的體內研究。
與病毒載體軛合的介孔二氧化矽顆粒之組成物被注射到小鼠的皮膚下。大約5-7天後，在該位點注射吸附有編碼抗小鼠CD19 CAR的病毒的MSR。小鼠血液中CD19+ B細胞的耗減將被監測，以指示已產生的抗CD19 CART。在血液和骨髓中證實了該等CART的存在。使用原位雜交技術對CAR轉基因進行該注射位點以及引流淋巴結、脾臟和肝臟的詳細組織學評估，以評估病毒向不希望的位點的漏出。
實例F.藥物載入到介孔二氧化矽微顆粒上
可以將多種藥物載入到介孔二氧化矽微顆粒上。
Figure 109105885-A0202-12-0183-90
1.實例1：將TLR7促效劑載入到介孔二氧化矽微顆粒上。
將在氯仿中的咪喹莫特(imiquimod)溶液添加到在2.0mL氯仿中的100mg二氧化矽微顆粒的漿料中(濃度為100μg-500μg咪喹莫特/10mg介孔二氧化矽顆粒)，並在40攝氏度下以500rpm振盪72小時。將MSP以1000rpm離心3分鐘，然後除去剩餘的溶液。將MSP用2.0mL氯仿洗滌，然後離心並除去上清液。用乙醇重複洗滌步驟，以去除過量和未吸收的咪喹莫特。將最終的微顆粒在水中製成漿液並凍乾。
2.實例2：介孔二氧化矽顆粒的體外藥物釋放。
將10.0mg(或相當的300μg藥物負載材料)的藥物負載MSP懸浮於1.0mL的pH 7.4(0.0067M)的磷酸鹽緩衝液中，並置於37攝氏度下。在1h、3h、6h、24h、2天和5天收集樣本；藉由UPLC對該等樣本進行分析，並繪製成標準分析曲線。在每個時間點都將上清液去除並替換為新鮮的緩衝液。
前述書面說明書被認為足以使熟悉該項技術者能夠實踐本發明。本發明之範圍不受所保藏的構建體的限制，因為所保藏的實施方式僅意圖說明 本發明之某些方面，並且任何功能等效的構建體都在本發明之範圍之內。本文中材料的保藏並不構成承認本文所包含的書面描述不足以實現本發明之任何方面(包括其最佳模式)的實踐，也不應被解釋為限制申請專利範圍之範圍。事實上，除了本文示出和描述的那些之外，本發明之各種修改將藉由前述描述對於熟悉該項技術者變得清楚並且處於所附申請專利範圍之範圍內。
應當理解，根據本文所包含的傳授內容，將本發明之傳授內容應用於特定問題或情況將在熟悉該項技術者的能力範圍內。
本說明書中每一個引用的揭露內容藉由引用明確地併入本文。
實例G.MSR誘導的CAR-T生成的體內研究
使用已知之方法建立植入人T細胞和B細胞的小鼠(人CD34+幹細胞人源化小鼠或人外周血單核細胞注射小鼠)。將與CAR19慢病毒軛合的介孔二氧化矽顆粒之組成物注射到小鼠皮膚下以轉導T細胞。使用流式細胞分析技術對連續採血樣本(注射前0天和注射MSR-病毒後第1天至第21天之間每週兩次)監測用MSR-CAR19慢病毒軛合物處理的小鼠血液中表現CAR19的T細胞(使用抗CAR19獨特型抗體染色)的存在和CD19+B細胞的耗減，並與注射MSR-GFP慢病毒的對照小鼠進行比較，以指示已經產生了抗CD19 CART，並且在殺死其靶標中發揮功能。從相同的血液樣本中測定人干擾素-γ和腫瘤壞死因子α的濃度，以作為針對CD19 CAR T細胞的產生和活化的第二種生物標誌物。使用原位雜交技術對CAR轉基因進行該注射位點以及淋巴結、骨髓、脾臟和肝臟的詳細組織學評估，以評估病毒向不希望的位點的漏出，並研究所產生的CAR19 T細胞至該等位點的運輸。
在另一項實驗中，含人T和B細胞的小鼠被靜脈內注射表現螢光素酶報導基因的表現CD19的Nalm6白血病腫瘤。從腫瘤注射前7天至腫瘤注射後7天，向小鼠群組皮下注射與CAR19或GFP慢病毒軛合的介孔二氧化矽顆粒之組成物的單一注射，以轉導T細胞。藉由IVIS成像上的螢光素酶訊號監測該Nalm6腫瘤負荷，以研究產生的抗CD19 CART的抗腫瘤功效。對連續採血樣本(注射前0天和注射MSR-病毒後第1天至第21天之間每週兩次)監測用MSR-CAR19慢病毒軛合物處理的小鼠血液中表現CAR19的T細胞的存在和CD19+ B細胞的耗減，並與注射MSR-GFP慢病毒的對照小鼠進行比較。從相同的血液樣本中測定人干擾素-γ和腫瘤壞死因子α的濃度，以作為針對CD19 CAR T細胞的產生和活化的第二種生物標誌物。
使用針對其它癌症/腫瘤靶標(包括但不限於BCMA、CD20、CD22、CD123、EGFRvIII、CLL-1及其組合(彼此和/或與CD19))的MSR-慢病毒軛合物重複該等研究。
<110> 諾華公司(NOVARTIS AG)
<120> 用於病毒遞送之介孔二氧化矽顆粒組成物
<130> N2067-7161AR
<140>
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<150> 62/810,260
<151> 2019-02-25
<160> 692
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 1184
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 1
Figure 109105885-A0202-12-0186-91
<210> 2
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 2
Figure 109105885-A0202-12-0187-92
<210> 3
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400> 3
Figure 109105885-A0202-12-0187-93
<210> 4
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 4
Figure 109105885-A0202-12-0187-94
<210> 5
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 5
Figure 109105885-A0202-12-0187-95
<210> 6
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 6
Figure 109105885-A0202-12-0188-96
<210> 7
<211> 690
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 7
Figure 109105885-A0202-12-0189-97
<210> 8
<211> 282
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 8
Figure 109105885-A0202-12-0189-98
Figure 109105885-A0202-12-0190-99
<210> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 9
Figure 109105885-A0202-12-0190-100
Figure 109105885-A0202-12-0191-101
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 10
Figure 109105885-A0202-12-0191-102
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400> 11
Figure 109105885-A0202-12-0191-103
<210> 12
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 12
Figure 109105885-A0202-12-0191-104
<210> 13
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400> 13
Figure 109105885-A0202-12-0191-105
Figure 109105885-A0202-12-0192-106
<210> 14
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 14
Figure 109105885-A0202-12-0192-107
<210> 15
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 15
Figure 109105885-A0202-12-0192-108
<210> 16
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 16
Figure 109105885-A0202-12-0192-109
<210> 17
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的 多核苷酸
<400> 17
Figure 109105885-A0202-12-0193-110
<210> 18
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 18
Figure 109105885-A0202-12-0193-111
<210> 19
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 19
Figure 109105885-A0202-12-0193-112
<210> 20
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 20
Figure 109105885-A0202-12-0194-113
<210> 21
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 21
Figure 109105885-A0202-12-0194-114
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<220>
<223> 有關取代和較佳實施方式之詳細說明，請參見所提交的說明書
<400> 22
Figure 109105885-A0202-12-0195-115
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400> 23
Figure 109105885-A0202-12-0195-116
<210> 24
<211> 150
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 24
Figure 109105885-A0202-12-0195-117
<210> 25
<211> 450
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 25
Figure 109105885-A0202-12-0196-118
<210> 26
<211> 394
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 26
Figure 109105885-A0202-12-0196-120
Figure 109105885-A0202-12-0197-121
<210> 27
<211> 1182
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 27
Figure 109105885-A0202-12-0198-122
<210> 28
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(40)
<223> 該序列可以涵蓋1-10個"Gly Gly Gly Ser" 重複單元
<400> 28
Figure 109105885-A0202-12-0198-123
Figure 109105885-A0202-12-0199-124
<210> 29
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 29
Figure 109105885-A0202-12-0199-125
<210> 30
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 30
Figure 109105885-A0202-12-0199-126
<210> 31
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 31
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<210> 32
<400> 32
000
<210> 33
<400> 33
000
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<211> 5000
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(5000)
<223> 該序列可以涵蓋50-5000個核苷酸
<220>
<223> 有關取代和較佳實施方式之詳細說明，請參見所提交的說明書
<400> 34
Figure 109105885-A0202-12-0200-128
Figure 109105885-A0202-12-0201-129
Figure 109105885-A0202-12-0202-130
<210> 35
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 39
Figure 109105885-A0202-12-0202-132
Figure 109105885-A0202-12-0203-133
Figure 109105885-A0202-12-0204-134
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
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Figure 109105885-A0202-12-0204-135
<210> 45
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 45
Figure 109105885-A0202-12-0205-136
<210> 46
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 46
Figure 109105885-A0202-12-0205-137
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 47
Figure 109105885-A0202-12-0205-138
<210> 48
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 48
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<210> 49
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 49
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<210> 50
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 50
Figure 109105885-A0202-12-0206-141
<210> 51
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 51
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<210> 52
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 52
Figure 109105885-A0202-12-0206-143
<210> 53
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的 多核苷酸
<400> 53
Figure 109105885-A0202-12-0207-144
<210> 54
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 54
Figure 109105885-A0202-12-0207-145
<210> 55
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 55
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<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 56
Figure 109105885-A0202-12-0207-147
<210> 57
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 57
Figure 109105885-A0202-12-0207-148
Figure 109105885-A0202-12-0208-149
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 58
Figure 109105885-A0202-12-0208-150
<210> 59
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 59
Figure 109105885-A0202-12-0208-151
<210> 60
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 60
Figure 109105885-A0202-12-0208-154
<210> 61
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 61
Figure 109105885-A0202-12-0208-153
Figure 109105885-A0202-12-0209-155
<210> 62
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 62
Figure 109105885-A0202-12-0209-156
<210> 63
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 63
Figure 109105885-A0202-12-0209-157
<210> 64
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 64
Figure 109105885-A0202-12-0209-158
Figure 109105885-A0202-12-0210-159
<210> 65
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 65
Figure 109105885-A0202-12-0210-160
Figure 109105885-A0202-12-0211-161
<210> 66
<211> 473
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 66
Figure 109105885-A0202-12-0211-162
Figure 109105885-A0202-12-0212-163
Figure 109105885-A0202-12-0213-164
<210> 67
<211> 1419
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 67
Figure 109105885-A0202-12-0213-165
<210> 68
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 68
Figure 109105885-A0202-12-0214-166
<210> 69
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 69
Figure 109105885-A0202-12-0214-167
<210> 70
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 70
Figure 109105885-A0202-12-0214-168
<210> 71
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 71
Figure 109105885-A0202-12-0215-169
<210> 72
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 72
Figure 109105885-A0202-12-0215-170
Figure 109105885-A0202-12-0216-171
<210> 73
<211> 744
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 73
Figure 109105885-A0202-12-0216-172
<210> 74
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 74
Figure 109105885-A0202-12-0217-173
Figure 109105885-A0202-12-0218-174
<210> 75
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 75
Figure 109105885-A0202-12-0218-175
Figure 109105885-A0202-12-0219-176
<210> 76
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 76
Figure 109105885-A0202-12-0219-177
<210> 77
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 77
Figure 109105885-A0202-12-0219-179
<210> 78
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 78
Figure 109105885-A0202-12-0220-180
<210> 79
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 79
Figure 109105885-A0202-12-0220-181
<210> 80
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 80
Figure 109105885-A0202-12-0221-182
<210> 81
<211> 744
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 81
Figure 109105885-A0202-12-0222-183
<210> 82
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 82
Figure 109105885-A0202-12-0222-184
Figure 109105885-A0202-12-0223-185
Figure 109105885-A0202-12-0224-186
<210> 83
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 83
Figure 109105885-A0202-12-0224-187
Figure 109105885-A0202-12-0225-188
<210> 84
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> 無或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 無或Pro
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Trp或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Gly,Tyr,或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Glu,Asp,或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> Ser或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Leu或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> Phe或Leu
<400> 84
Figure 109105885-A0202-12-0225-189
<210> 85
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 無或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 無或Pro
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Trp或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> Gly,Tyr,或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> Glu,Asp,或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Ser或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> Leu或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> Phe或Leu
<400> 85
Figure 109105885-A0202-12-0226-190
<210> 86
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 86
Figure 109105885-A0202-12-0226-191
<210> 87
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 87
Figure 109105885-A0202-12-0226-192
Figure 109105885-A0202-12-0227-193
<210> 88
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 88
Figure 109105885-A0202-12-0227-194
<210> 89
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 89
Figure 109105885-A0202-12-0227-195
<210> 90
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 90
Figure 109105885-A0202-12-0227-196
<210> 91
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 91
Figure 109105885-A0202-12-0227-197
<210> 92
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 92
Figure 109105885-A0202-12-0228-198
<210> 93
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 93
Figure 109105885-A0202-12-0228-199
<210> 94
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 94
Figure 109105885-A0202-12-0228-200
<210> 95
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 95
Figure 109105885-A0202-12-0229-201
<210> 96
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 96
Figure 109105885-A0202-12-0229-202
<210> 97
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 97
Figure 109105885-A0202-12-0229-203
<210> 98
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 98
Figure 109105885-A0202-12-0229-204
<210> 99
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 99
Figure 109105885-A0202-12-0229-205
<210> 100
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 100
Figure 109105885-A0202-12-0230-206
<210> 101
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 101
Figure 109105885-A0202-12-0230-207
<210> 102
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 102
Figure 109105885-A0202-12-0230-208
<210> 103
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 103
Figure 109105885-A0202-12-0231-209
<210> 104
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 104
Figure 109105885-A0202-12-0231-210
<210> 105
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 105
Figure 109105885-A0202-12-0231-211
Figure 109105885-A0202-12-0232-212
<210> 106
<211> 747
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 106
Figure 109105885-A0202-12-0232-213
<210> 107
<211> 472
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 107
Figure 109105885-A0202-12-0233-214
Figure 109105885-A0202-12-0234-215
<210> 108
<211> 1416
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 108
Figure 109105885-A0202-12-0235-216
<210> 109
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 109
Figure 109105885-A0202-12-0235-217
<210> 110
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 110
Figure 109105885-A0202-12-0236-218
<210> 111
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 111
Figure 109105885-A0202-12-0236-219
<210> 112
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 112
Figure 109105885-A0202-12-0236-220
<210> 113
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 113
Figure 109105885-A0202-12-0237-221
<210> 114
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 114
Figure 109105885-A0202-12-0237-222
<210> 115
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 115
Figure 109105885-A0202-12-0237-223
<210> 116
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 116
Figure 109105885-A0202-12-0237-224
<210> 117
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 117
Figure 109105885-A0202-12-0238-225
<210> 118
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 118
Figure 109105885-A0202-12-0238-226
<210> 119
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 119
Figure 109105885-A0202-12-0238-229
<210> 120
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 120
Figure 109105885-A0202-12-0239-230
<210> 121
<211> 762
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 121
Figure 109105885-A0202-12-0240-231
<210> 122
<211> 477
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 122
Figure 109105885-A0202-12-0240-232
Figure 109105885-A0202-12-0241-234
Figure 109105885-A0202-12-0242-235
<210> 123
<211> 1431
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 123
Figure 109105885-A0202-12-0242-236
Figure 109105885-A0202-12-0243-237
<210> 124
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 124
Figure 109105885-A0202-12-0243-238
<210> 125
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 125
Figure 109105885-A0202-12-0243-239
<210> 126
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 126
Figure 109105885-A0202-12-0244-240
Figure 109105885-A0202-12-0245-241
<210> 127
<211> 762
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 127
Figure 109105885-A0202-12-0245-242
<210> 128
<211> 477
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 128
Figure 109105885-A0202-12-0245-243
Figure 109105885-A0202-12-0246-244
Figure 109105885-A0202-12-0247-245
<210> 129
<211> 1431
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 129
Figure 109105885-A0202-12-0247-246
Figure 109105885-A0202-12-0248-247
<210> 130
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Asp或Lys
<400> 130
Figure 109105885-A0202-12-0248-248
<210> 131
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Asp或Glu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Pro或Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Ser或Arg
<400> 131
Figure 109105885-A0202-12-0248-250
<210> 132
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Thr或Ala
<400> 132
Figure 109105885-A0202-12-0249-251
<210> 133
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Asp或Lys
<400> 133
Figure 109105885-A0202-12-0249-252
<210> 134
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Asp或Glu
<400> 134
Figure 109105885-A0202-12-0249-253
<210> 135
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Thr或Ala
<400> 135
Figure 109105885-A0202-12-0250-254
<210> 136
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Asp或Lys
<400> 136
Figure 109105885-A0202-12-0250-255
<210> 137
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 137
Figure 109105885-A0202-12-0250-465
<210> 138
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 138
Figure 109105885-A0202-12-0250-256
<210> 139
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 139
Figure 109105885-A0202-12-0251-257
<210> 140
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 140
Figure 109105885-A0202-12-0251-258
<210> 141
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 141
Figure 109105885-A0202-12-0251-259
<210> 142
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 142
Figure 109105885-A0202-12-0251-260
<210> 143
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 143
Figure 109105885-A0202-12-0251-261
<210> 144
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 144
Figure 109105885-A0202-12-0251-262
Figure 109105885-A0202-12-0252-263
<210> 145
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 145
Figure 109105885-A0202-12-0252-264
<210> 146
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 146
Figure 109105885-A0202-12-0252-265
<210> 147
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 147
Figure 109105885-A0202-12-0253-266
<210> 148
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 148
Figure 109105885-A0202-12-0253-267
<210> 149
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 149
Figure 109105885-A0202-12-0253-268
<210> 150
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 150
Figure 109105885-A0202-12-0253-269
<210> 151
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 151
Figure 109105885-A0202-12-0253-270
<210> 152
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 152
Figure 109105885-A0202-12-0254-271
<210> 153
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 153
Figure 109105885-A0202-12-0254-272
<210> 154
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 154
Figure 109105885-A0202-12-0254-273
<210> 155
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 155
Figure 109105885-A0202-12-0255-274
<210> 156
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 156
Figure 109105885-A0202-12-0255-275
Figure 109105885-A0202-12-0256-276
<210> 157
<211> 756
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 157
Figure 109105885-A0202-12-0256-277
<210> 158
<211> 475
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 158
Figure 109105885-A0202-12-0257-278
Figure 109105885-A0202-12-0258-279
<210> 159
<211> 1425
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 159
Figure 109105885-A0202-12-0258-280
Figure 109105885-A0202-12-0259-281
<210> 160
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 160
Figure 109105885-A0202-12-0259-282
<210> 161
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 161
Figure 109105885-A0202-12-0259-467
<210> 162
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 162
Figure 109105885-A0202-12-0260-284
<210> 163
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 163
Figure 109105885-A0202-12-0260-285
<210> 164
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 164
Figure 109105885-A0202-12-0260-286
<210> 165
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 165
Figure 109105885-A0202-12-0260-287
<210> 166
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 166
Figure 109105885-A0202-12-0260-288
<210> 167
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 167
Figure 109105885-A0202-12-0261-289
<210> 168
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 168
Figure 109105885-A0202-12-0261-290
<210> 169
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 169
Figure 109105885-A0202-12-0261-291
Figure 109105885-A0202-12-0262-292
<210> 170
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 170
Figure 109105885-A0202-12-0262-293
<210> 171
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 171
Figure 109105885-A0202-12-0262-294
<210> 172
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 172
Figure 109105885-A0202-12-0262-295
<210> 173
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 173
Figure 109105885-A0202-12-0262-296
Figure 109105885-A0202-12-0263-297
<210> 174
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 174
Figure 109105885-A0202-12-0263-298
<210> 175
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 175
Figure 109105885-A0202-12-0263-299
Figure 109105885-A0202-12-0264-300
<210> 176
<211> 753
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 176
Figure 109105885-A0202-12-0264-301
Figure 109105885-A0202-12-0265-302
<210> 177
<211> 474
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 177
Figure 109105885-A0202-12-0265-303
Figure 109105885-A0202-12-0266-304
<210> 178
<211> 1422
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 178
Figure 109105885-A0202-12-0267-305
<210> 179
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Gly或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Trp或Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Ser或Asn
<400> 179
Figure 109105885-A0202-12-0268-306
<210> 180
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Asn或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Lys或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Gln或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Asp或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Gly或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Glu或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> Lys或Ile
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> Val或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> Arg或Lys
<400> 180
Figure 109105885-A0202-12-0269-307
<210> 181
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Ala或Trp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Asp或Ser
<400> 181
Figure 109105885-A0202-12-0269-308
<210> 182
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Tyr或Phe
<400> 182
Figure 109105885-A0202-12-0269-309
<210> 183
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Thr或Met
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Leu或Ile
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Glu或Gly
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Ser或無
<400> 183
Figure 109105885-A0202-12-0270-310
<210> 184
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Gly或Ser
<400> 184
Figure 109105885-A0202-12-0270-311
<210> 185
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Lys或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Gln或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Asp或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Gly或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Glu或Tyr
<400> 185
Figure 109105885-A0202-12-0271-312
<210> 186
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Leu或Ile
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Glu或Gly
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Ser或無
<400> 186
Figure 109105885-A0202-12-0271-313
<210> 187
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Gly或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Trp或Arg
<400> 187
Figure 109105885-A0202-12-0271-314
<210> 188
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Lys或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Gln或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Asp或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Gly或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Glu或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Lys或Ile
<400> 188
Figure 109105885-A0202-12-0272-315
<210> 189
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Ala或Trp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Asp或Ser
<400> 189
Figure 109105885-A0202-12-0272-316
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<210> 201
<400> 201
000
<210> 202
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 202
Figure 109105885-A0202-12-0274-317
<210> 203
<400> 203
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<400> 209
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<400> 252
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<210> 253
<211> 747
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 253
Figure 109105885-A0202-12-0278-319
Figure 109105885-A0202-12-0279-320
<210> 254
<211> 207
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 254
Figure 109105885-A0202-12-0279-321
<210> 255
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 255
Figure 109105885-A0202-12-0279-322
<210> 256
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 256
Figure 109105885-A0202-12-0279-324
<210> 257
<211> 493
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 257
Figure 109105885-A0202-12-0280-325
Figure 109105885-A0202-12-0281-326
<210> 258
<211> 1479
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的 多核苷酸
<400> 258
Figure 109105885-A0202-12-0282-327
<210> 259
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 678
Figure 109105885-A0202-12-0325-348
<210> 679
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 679
Figure 109105885-A0202-12-0326-349
<210> 680
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 680
Figure 109105885-A0202-12-0326-350
<210> 681
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 681
Figure 109105885-A0202-12-0326-351
<210> 682
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 682
Figure 109105885-A0202-12-0326-352
<210> 683
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 683
Figure 109105885-A0202-12-0326-353
<210> 684
<211> 486
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 684
Figure 109105885-A0202-12-0327-354
Figure 109105885-A0202-12-0328-355
<210> 685
<211> 1458
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 685
Figure 109105885-A0202-12-0328-356
Figure 109105885-A0202-12-0329-357
<210> 686
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 686
Figure 109105885-A0202-12-0329-358
Figure 109105885-A0202-12-0330-359
<210> 687
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 687
Figure 109105885-A0202-12-0330-360
<210> 688
<211> 813
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 688
Figure 109105885-A0202-12-0331-361
<210> 689
<211> 486
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 689
Figure 109105885-A0202-12-0331-362
Figure 109105885-A0202-12-0332-363
Figure 109105885-A0202-12-0333-364
<210> 690
<211> 1458
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 690
Figure 109105885-A0202-12-0333-365
Figure 109105885-A0202-12-0334-366
<210> 691
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(30)
<223> 該序列可以涵蓋1-6個"Gly Gly Gly Gly Ser" 重複單元
<220>
<223> 有關取代和較佳實施方式之詳細說明，請參見所提交的說明書
<400> 691
Figure 109105885-A0202-12-0334-367
<210> 692
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 692
Figure 109105885-A0202-12-0334-368

Claims (107)

  1. 一種組成物，該組成物包含介孔二氧化矽顆粒之第一群體和病毒載體。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之組成物，其中該病毒載體軛合至介孔二氧化矽顆粒的該第一群體。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之組成物，其中該病毒載體靜電地或共價地軛合至介孔二氧化矽顆粒的該第一群體。
  4. 如申請專利範圍第2項所述之組成物，其中介孔二氧化矽顆粒的該第一群體係表面經修飾的。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之組成物，其中在介孔二氧化矽顆粒的該第一群體上的表面修飾係-OH(羥基)、胺、羧酸、膦酸酯、鹵化物、疊氮化物、炔、環氧化物、巰基、聚乙烯亞胺、疏水部分、或其鹽，視需要使用C1至C20烷基或(-O(CH2-CH2-)1-25連接子。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之組成物，其中在介孔二氧化矽顆粒的該第一群體上的表面修飾係一級胺、二級胺、三級胺或季胺。
  7. 如申請專利範圍第5項所述之組成物，其中在介孔二氧化矽顆粒的該第一群體上的表面修飾係聚乙烯亞胺，如藉由凝膠滲透層析法(GPC)測量，該聚乙烯亞胺之平均分子量係約1000至20,000Da、約1,200至15,000Da、約1,500至12,000Da、約2,000Da、約3,000Da、約4,000Da、約5,000Da、約6,000Da、約7,000Da、約8,000Da、約9,000Da或約10,000Da。
  8. 如前述申請專利範圍中任一項所述之組成物，其中該病毒載體係逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒或慢病毒。
  9. 如前述申請專利範圍中任一項所述之組成物，其中該病毒載體包含表現載體，該表現載體包含重組多核苷酸，該重組多核苷酸包含與待表現的核苷酸序列可操作地連接的表現控制序列。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之組成物，其中該核苷酸序列編碼嵌合抗原受體(CAR)、工程改造的TCR、一種或多種細胞介素、一種或多種趨化因子、用於阻斷抑制性分子的shRNA，或其中該核苷酸序列包含用於誘導蛋白質表現的mRNA。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之組成物，其中該核苷酸序列編碼經工程改造以靶向腫瘤抗原的多肽。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之組成物，其中該多肽靶向選自以下群組的腫瘤抗原，該群組由以下項組成：TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、間皮素、IL-11Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、葉酸受體α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受體、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪胺酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙醯基-GD2、葉酸受體β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、豆莢蛋白、HPV E6、HPV E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相關 抗原1、p53、p53突變體、前列腺特異性蛋白、存活素和端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MART1、Ras突變體、hTERT、肉瘤易位中斷點、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄性激素受體、週期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆轉錄酶、RU1、RU2、腸道羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、以及其任何組合。
  13. 如申請專利範圍第10至12項中任一項所述之組成物，其中該蛋白質係CAR，該CAR包含抗原結合結構域、跨膜結構域、共刺激傳訊區域和傳訊結構域。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之組成物，其中該傳訊結構域係CD3ζ傳訊結構域。
  15. 如前述申請專利範圍中任一項所述之組成物，該組成物還包含T細胞刺激化合物或腫瘤抗原。
  16. 如申請專利範圍第15項所述之組成物，其中該T細胞刺激化合物或腫瘤抗原軛合至或吸附到介孔二氧化矽顆粒的該第一群體或介孔二氧化矽顆粒之第二群體上，並且其中該T細胞刺激化合物係IL-2、IL-15、抗CD2 mAb、抗CD3 mAb、抗CD28 mAb、新抗原肽、來自共用抗原的肽、或其組合，該共用抗原係例如TRP2、gp100、腫瘤細胞裂解物、CD19、CD20、CD22、ROR1、間皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR、MAGE A3 TCR。
  17. 如申請專利範圍第16項所述之組成物，其中該T細胞刺激化合物或腫瘤抗原軛合至或吸附到介孔二氧化矽顆粒的該第一群體上。
  18. 如申請專利範圍第16項所述之組成物，該組成物包含介孔二氧化矽顆粒的該第二群體，並且其中該T細胞刺激化合物或腫瘤抗原軛合至介孔二氧化矽顆粒的該第二群體上或軛合至介孔二氧化矽顆粒的該第二群體的表面上的脂質包膜上。
  19. 如申請專利範圍第15至18項中任一項所述之組成物，該組成物還包含細胞介素。
  20. 如申請專利範圍第19項所述之組成物，其中該細胞介素軛合至或吸附到介孔二氧化矽顆粒的該第一或第二群體上。
  21. 如申請專利範圍第19項或申請專利範圍第20項中任一項所述之組成物，其中該細胞介素係IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21或轉化生長因子β(TGF-β)或其促效劑、其模擬物、其變體、其功能片段，或其組合。
  22. 如前述申請專利範圍中任一項所述之組成物，其中該介孔二氧化矽顆粒包含直徑2nm-50nm之孔。
  23. 如前述申請專利範圍中任一項所述之組成物，其中該介孔二氧化矽顆粒的表面積係至少約100m2/g。
  24. 如前述申請專利範圍中任一項所述之組成物，其中該組成物適合於注射使用。
  25. 一種方法，該方法包括：
    使T淋巴細胞與包含介孔二氧化矽顆粒之第一群體和病毒載體之組成物接觸；
    其中該病毒載體包含表現載體，該表現載體包含重組多核苷酸，該重組多核苷酸包含與待表現的核苷酸序列可操作地連接的表現控制序列。
  26. 如申請專利範圍第25項所述之方法，其中該接觸在體外發生。
  27. 如申請專利範圍第25項所述之方法，其中該T淋巴細胞在與介孔二氧化矽顆粒的該第一群體接觸之前或之後被活化。
  28. 如申請專利範圍第25-27項中任一項所述之方法，其中該病毒載體軛合至介孔二氧化矽顆粒的該第一群體。
  29. 如申請專利範圍第28項所述之方法，其中該病毒載體靜電地或共價地軛合至介孔二氧化矽顆粒的該第一群體。
  30. 如申請專利範圍第25至29項中任一項所述之方法，其中介孔二氧化矽顆粒的該第一群體係表面經修飾的。
  31. 如申請專利範圍第30項所述之方法，其中在介孔二氧化矽顆粒的該第一群體上的表面修飾係-OH(羥基)、胺、羧酸、膦酸酯、鹵化物、疊氮化物、炔、環氧化物、巰基、聚乙烯亞胺、疏水部分、或其鹽，視需要使用C1至C20烷基或(-O(CH2-CH2-)1-25連接子。
  32. 如申請專利範圍第31項所述之方法，其中在介孔二氧化矽顆粒的該第一群體上的表面修飾係一級胺、二級胺、三級胺或季胺。
  33. 如申請專利範圍第31項所述之方法，其中介孔二氧化矽顆粒之第一群體係表面用聚乙烯亞胺修飾的，如藉由凝膠滲透層析法(GPC)測量，該聚乙烯亞胺之平均分子量係約1000至20,000Da、約1,200至15,000Da、約1,500 至12,000Da、約2,000Da、約3,000Da、約4,000Da、約5,000Da、約6,000Da、約7,000Da、約8,000Da、約9,000Da或約10,000Da。
  34. 如申請專利範圍第25至33項中任一項所述之方法，其中該病毒載體係慢病毒、逆轉錄病毒或腺病毒。
  35. 如申請專利範圍第25至34項中任一項所述之方法，其中該核苷酸序列編碼嵌合抗原受體(CAR)。
  36. 如申請專利範圍第35項所述之方法，其中將該CAR工程改造以靶向腫瘤抗原。
  37. 如申請專利範圍第25至36項中任一項所述之方法，其中藉由使該T淋巴細胞與T細胞刺激化合物或腫瘤抗原接觸來活化該T淋巴細胞。
  38. 如申請專利範圍第37項所述之方法，其中該T細胞刺激化合物或腫瘤抗原軛合至或吸附到介孔二氧化矽顆粒的該第一群體或介孔二氧化矽顆粒之第二群體上。
  39. 如申請專利範圍第38項所述之方法，其中該T細胞刺激化合物或腫瘤抗原軛合至或吸附到介孔二氧化矽顆粒的該第一群體上。
  40. 如申請專利範圍第39項所述之方法，其中該T細胞刺激化合物或腫瘤抗原直接軛合至介孔二氧化矽顆粒的該第二群體上或直接軛合至介孔二氧化矽顆粒的該第二群體的表面上的脂質包膜上。
  41. 如申請專利範圍第25至40項中任一項所述之方法，該方法還包括使該T淋巴細胞與細胞介素接觸。
  42. 如申請專利範圍第41項所述之方法，其中該細胞介素在介質中或軛合至或吸附到介孔二氧化矽顆粒的該第一或第二群體上。
  43. 如申請專利範圍第40至42項中任一項所述之方法，其中該細胞介素係IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21或轉化生長因子β(TGF-β)或其促效劑、其模擬物、其變體、其功能片段，或其組合。
  44. 一種利用重組多核苷酸體內遺傳轉導T淋巴細胞之方法，該方法包括：
    向具有一種或多種T淋巴細胞的受試者投與包含介孔二氧化矽顆粒之第一群體和病毒載體之組成物；
    其中該病毒載體包含表現載體，該表現載體包含重組多核苷酸，該重組多核苷酸包含與待表現的核苷酸序列可操作地連接的表現控制序列，並且
    其中當該組成物接觸一種或多種T淋巴細胞時，該T淋巴細胞被該重組多核苷酸遺傳轉導。
  45. 如申請專利範圍第44項所述之方法，其中該病毒載體軛合至介孔二氧化矽顆粒的該第一群體。
  46. 如申請專利範圍第45項所述之方法，其中該病毒載體靜電地或共價地軛合至介孔二氧化矽顆粒的該第一群體。
  47. 如申請專利範圍第44至46項中任一項所述之方法，其中介孔二氧化矽顆粒的該第一群體係表面經修飾的。
  48. 如申請專利範圍第47項所述之方法，其中在介孔二氧化矽顆粒的該第一群體上的表面修飾係-OH(羥基)、胺、羧酸、膦酸酯、鹵化物、疊氮化物、炔、環氧化物、巰基、聚乙烯亞胺、疏水部分、或其鹽，視需要使用C1至C20烷基或(-O(CH2-CH2-)1-25連接子。
  49. 如申請專利範圍第48項所述之方法，其中在介孔二氧化矽顆粒的該第一群體上的表面修飾係一級胺、二級胺、三級胺或季胺。
  50. 如申請專利範圍第44至48項中任一項所述之方法，其中介孔二氧化矽顆粒之第一群體係表面用聚乙烯亞胺修飾的，如藉由凝膠滲透層析法(GPC)測量，該聚乙烯亞胺之平均分子量係約1000至20,000Da、約1,200至15,000Da、約1,500至12,000Da、約2,000Da、約3,000Da、約4,000Da、約5,000Da、約6,000Da、約7,000Da、約8,000Da、約9,000Da或約10,000Da。
  51. 如申請專利範圍第44至50項中任一項所述之方法，其中該病毒載體係慢病毒、逆轉錄病毒或腺病毒。
  52. 如申請專利範圍第44至51項中任一項所述之方法，其中該核苷酸序列編碼嵌合抗原受體(CAR)。
  53. 如申請專利範圍第51項所述之方法，其中將該CAR工程改造以靶向腫瘤抗原。
  54. 如申請專利範圍第44至53項中任一項所述之方法，其中該組成物還包含軛合至或吸附到介孔二氧化矽顆粒的該第一群體或介孔二氧化矽顆粒之第二群體上的T細胞刺激化合物或腫瘤抗原。
  55. 如申請專利範圍第54項所述之方法，其中該T細胞刺激化合物或腫瘤抗原軛合至或吸附到介孔二氧化矽顆粒的該第一群體上。
  56. 如申請專利範圍第54項所述之方法，其中該組成物包含介孔二氧化矽顆粒的該第二群體，並且其中該T細胞刺激化合物或腫瘤抗原直接軛合至介孔二氧化矽顆粒的該第二群體上或直接軛合至介孔二氧化矽顆粒的該第二群體的表面上的脂質包膜上。
  57. 如申請專利範圍第44至56項中任一項所述之方法，其中介孔二氧化矽顆粒的該第一或第二群體還包含軛合至或吸附到介孔二氧化矽顆粒的該第一或第二群體上的細胞介素。
  58. 如申請專利範圍第57項所述之方法，其中該細胞介素係IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21或轉化生長因子β(TGF-β)或其促效劑、其模擬物、其變體、其功能片段，或其組合。
  59. 如申請專利範圍第44至58項中任一項所述之方法，其中該受試者的T淋巴細胞在體內擴增。
  60. 一種體外擴增T淋巴細胞群體之方法，該方法包括
    (a)使該T淋巴細胞群體與包含介孔二氧化矽顆粒之第一群體和病毒載體之組成物接觸以提供轉導的T淋巴細胞群體；和
    (b)使該轉導的T淋巴細胞群體與T細胞刺激化合物或腫瘤抗原以及視需要的的細胞介素接觸；
    其中該病毒載體包含表現載體，該表現載體包含重組多核苷酸，該重組多核苷酸包含與待表現的核苷酸序列可操作地連接的表現控制序列。
  61. 如申請專利範圍第60項所述之方法，其中該病毒載體軛合至介孔二氧化矽顆粒的該第一群體。
  62. 如申請專利範圍第61項所述之方法，其中該病毒載體靜電地或共價地軛合至介孔二氧化矽顆粒的該第一群體。
  63. 如申請專利範圍第60至62項中任一項所述之方法，其中介孔二氧化矽顆粒的該第一群體係表面經修飾的。
  64. 如申請專利範圍第63項所述之方法，其中在介孔二氧化矽顆粒的該第一群體上的表面修飾係-OH(羥基)、胺、羧酸、膦酸酯、鹵化物、疊氮化物、炔、環氧化物、巰基、聚乙烯亞胺、疏水部分、或其鹽，視需要使用C1至C20烷基或(-O(CH2-CH2-)1-25連接子。
  65. 如申請專利範圍第64項所述之方法，其中在介孔二氧化矽顆粒的該第一群體上的表面修飾係一級胺、二級胺、三級胺或季胺。
  66. 如申請專利範圍第60至65項中任一項所述之方法，其中介孔二氧化矽顆粒之第一群體係表面用聚乙烯亞胺修飾的，如藉由凝膠滲透層析法(GPC)測量，該聚乙烯亞胺之平均分子量係約1000至20,000Da、約1,200至15,000Da、約1,500至12,000Da、約2,000Da、約3,000Da、約4,000Da、約5,000Da、約6,000Da、約7,000Da、約8,000Da、約9,000Da或約10,000Da。
  67. 如申請專利範圍第60至66項中任一項所述之方法，其中該病毒載體係慢病毒、逆轉錄病毒或腺病毒。
  68. 如申請專利範圍第60至67項中任一項所述之方法，其中該核苷酸序列編碼嵌合抗原受體(CAR)。
  69. 如申請專利範圍第68項所述之方法，其中將該CAR工程改造以靶向腫瘤抗原。
  70. 如申請專利範圍第60至69項中任一項所述之方法，其中該T細胞刺激化合物或腫瘤抗原軛合至或吸附到介孔二氧化矽顆粒的該第一群體或介孔二氧化矽顆粒之第二群體上，並且其中該T細胞刺激化合物或腫瘤抗原係IL-2、IL-15、抗CD2 mAb、抗CD3 mAb、抗CD28 mAb、新抗原肽、CD19、CD20、 CD22、ROR1、間皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR、MAGE A3 TCR，或其組合。
  71. 如申請專利範圍第70項所述之方法，其中該T細胞刺激化合物或腫瘤抗原軛合至或吸附到介孔二氧化矽顆粒的該第一群體上。
  72. 如申請專利範圍第70項所述之方法，該方法包括介孔二氧化矽顆粒的該第二群體，並且其中該T細胞刺激化合物或腫瘤抗原軛合至介孔二氧化矽顆粒的該第二群體上或軛合至介孔二氧化矽顆粒的該第二群體的表面上的脂質包膜上。
  73. 如申請專利範圍第60至72項中任一項所述之方法，該方法還包括：
    (c)使該T淋巴細胞與細胞介素接觸；
    其中該細胞介素係IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21或轉化生長因子β(TGF-β)或其促效劑、其模擬物、其變體、其功能片段，或其組合。
  74. 一種治療患有與腫瘤抗原的表現升高相關的疾病、障礙或病症的受試者之方法，該方法包括：
    向該受試者投與包含介孔二氧化矽顆粒之第一群體和病毒載體之組成物，
    其中該病毒載體包含重組多核苷酸，該重組多核苷酸包含表現控制序列，該表現控制序列與編碼嵌合抗原受體(CAR)的核苷酸序列可操作地連接，該嵌合抗原受體被工程改造以靶向該腫瘤抗原，
    從而治療該受試者。
  75. 如申請專利範圍第74項所述之方法，其中該病毒載體軛合至介孔二氧化矽顆粒的該第一群體。
  76. 如申請專利範圍第75項所述之方法，其中該病毒載體靜電地或共價地軛合至介孔二氧化矽顆粒的該第一群體。
  77. 如申請專利範圍第74至76項中任一項所述之方法，其中介孔二氧化矽顆粒的該第一群體係表面經修飾的。
  78. 如申請專利範圍第77項所述之方法，其中在介孔二氧化矽顆粒的該第一群體上的表面修飾係-OH(羥基)、胺、羧酸、膦酸酯、鹵化物、疊氮化物、炔、環氧化物、巰基、聚乙烯亞胺、疏水部分、或其鹽，視需要使用C1至C20烷基或(-O(CH2-CH2-)1-25連接子。
  79. 如申請專利範圍第78項所述之方法，其中在介孔二氧化矽顆粒的該第一群體上的表面修飾係一級胺、二級胺、三級胺或季胺。
  80. 如申請專利範圍第74至78項中任一項所述之方法，其中介孔二氧化矽顆粒之第一群體係表面用聚乙烯亞胺修飾的，如藉由凝膠滲透層析法(GPC)測量，該聚乙烯亞胺之平均分子量係約1000至20,000Da、約1,200至15,000Da、約1,500至12,000Da、約2,000Da、約3,000Da、約4,000Da、約5,000Da、約6,000Da、約7,000Da、約8,000Da、約9,000Da或約10,000Da。
  81. 如申請專利範圍第74至80項中任一項所述之方法，其中該病毒載體係慢病毒、逆轉錄病毒或腺病毒。
  82. 如申請專利範圍第74至81項中任一項所述之方法，其中該組成物還包含軛合至或吸附到介孔二氧化矽顆粒的該第一群體或介孔二氧化矽顆粒之第二群體上的T細胞刺激化合物或腫瘤抗原。
  83. 如申請專利範圍第82項所述之方法，其中該T細胞刺激化合物或腫瘤抗原軛合至或吸附到介孔二氧化矽顆粒的該第一群體上。
  84. 如申請專利範圍第83項所述之方法，其中該組成物包含介孔二氧化矽顆粒的該第二群體，並且其中該T細胞刺激化合物或腫瘤抗原直接軛合至介孔二氧化矽顆粒的該第二群體上或直接軛合至介孔二氧化矽顆粒的該第二群體的表面上的脂質包膜上，並且其中該T細胞刺激化合物或腫瘤抗原係IL-2、IL-15、抗CD2 mAb、抗CD3 mAb、抗CD28 mAb、新抗原肽、CD19、CD20、CD22、ROR1、間皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR、MAGE A3 TCR，或其組合。
  85. 如申請專利範圍第74至84項中任一項所述之方法，其中介孔二氧化矽顆粒的該第一或第二群體還包含軛合至或吸附到介孔二氧化矽顆粒的該第一或第二群體上的細胞介素。
  86. 如申請專利範圍第85項所述之方法，其中該細胞介素係IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21或轉化生長因子β(TGF-β)或其促效劑、其模擬物、其變體、其功能片段，或其組合。
  87. 一種將病毒載體遞送至受試者中所需的作用位點之方法，該方法包括向該受試者投與包含介孔二氧化矽顆粒之第一群體和病毒載體之組成物。
  88. 如申請專利範圍第87項所述之方法，其中該病毒載體軛合至介孔二氧化矽顆粒的該第一群體。
  89. 如申請專利範圍第88項所述之方法，其中該病毒載體靜電地或共價地軛合至介孔二氧化矽顆粒的該第一群體。
  90. 如申請專利範圍第87至89項中任一項所述之方法，其中介孔二氧化矽顆粒的該第一群體係表面經修飾的。
  91. 如申請專利範圍第90項所述之方法，其中在介孔二氧化矽顆粒的該第一群體上的表面修飾係C1-20烷基胺、C1-20羧酸、C1-20疊氮化物和取代或未取代的C1-20烷基。
  92. 如申請專利範圍第91項所述之方法，其中在介孔二氧化矽顆粒的該第一群體上的表面修飾係一級胺、二級胺、三級胺或季胺。
  93. 如申請專利範圍第87至92項中任一項所述之方法，其中該病毒載體係逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒或慢病毒。
  94. 如申請專利範圍第87至93項中任一項所述之方法，其中介孔二氧化矽顆粒的該第一群體包含直徑2nm-50nm之孔。
  95. 如申請專利範圍第87至94項中任一項所述之方法，其中介孔二氧化矽顆粒的該第一群體的表面積係至少約100m2/g。
  96. 一種擴增嵌合抗原受體(CAR)T(CAR-T)細胞群體之方法，該方法包括使該CAR-T細胞群體與軛合至靶向部分的介孔二氧化矽顆粒接觸，其中該靶向部分與該CAR互補。
  97. 如申請專利範圍第96項所述之方法，其中該CAR係經工程改造以靶向腫瘤抗原之蛋白質。
  98. 如申請專利範圍第96項或申請專利範圍第97項中任一項所述之方法，其中該腫瘤抗原選自由以下項組成之群組：TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、 B7H3、KIT、IL-13Ra2、間皮素、IL-11Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、葉酸受體α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受體、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪胺酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙醯基-GD2、葉酸受體β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、豆莢蛋白、HPV E6、HPV E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相關抗原1、p53、p53突變體、前列腺特異性蛋白、存活素和端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MART1、Ras突變體、hTERT、肉瘤易位中斷點、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄性激素受體、週期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆轉錄酶、RU1、RU2、腸道羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、以及其任何組合。
  99. 如申請專利範圍第1-24項中任一項所述之組成物，或如申請專利範圍第25-98項中任一項所述之方法，其中該介孔二氧化矽顆粒係介孔二氧化矽棒之形式。
  100. 一種組成物，該組成物包含與聚乙烯亞胺軛合的介孔二氧化矽顆粒。
  101. 如申請專利範圍第100項所述之組成物，其中該介孔二氧化矽顆粒係介孔二氧化矽棒之形式。
  102. 如申請專利範圍第100項或申請專利範圍第101項所述之組成物，該組成物還包含活性劑。
  103. 如申請專利範圍第102項所述之組成物，其中該活性劑軛合至或吸附到該介孔二氧化矽顆粒上。
  104. 一種將活性劑遞送至受試者中所需的作用位點之方法，該方法包括向該受試者投與如申請專利範圍第102項或申請專利範圍第103項所述之組成物。
  105. 如申請專利範圍第104項所述之方法，其中該組成物提供該活性劑向該受試者的持續遞送。
  106. 一種治療患有疾病、障礙或病症的受試者之方法，該方法包括：向該受試者投與如申請專利範圍第102項或申請專利範圍第103項所述之組成物。
  107. 如申請專利範圍第106項所述之方法，其中該疾病、障礙或病症與腫瘤抗原相關。
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