KR20220038020A - 키메라 수용체를 발현하기 위한 전달 벡터 및 입자 및 그의 사용 방법 - Google Patents

키메라 수용체를 발현하기 위한 전달 벡터 및 입자 및 그의 사용 방법 Download PDF

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KR20220038020A
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Abstract

본 개시내용은 대식세포 또는 수지상세포와 같은 단핵구 세포에서 키메라 수용체를 발현하기 위한 전달 벡터를 제공한다. 상기 키메라 수용체는 면역관문 단백질 또는 OX40과 같은 특정한 항원 또는 표적 분자에 특이적으로 결합할 수 있다. 개시된 전달 벡터는 생체내에서 대상의 단핵구 세포의 표면 상에서 키메라 수용체를 발현함으로써 대상에서 암을 치료하는데 사용될 수 있다.

Description

키메라 수용체를 발현하기 위한 전달 벡터 및 입자 및 그의 사용 방법
관련 출원의 교차-참조
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e)조 하에서, 전체 내용이 본원에 참고로 도입된, 2019년 5월 29일자로 출원된 미국 가출원 제 62/854,082 호를 우선권 주장한다.
기술분야
본 개시내용은 일반적으로 암 치료, 및 특히 표적화된 단핵구-기반 세포 치료 분야에 관한 것이다. 본 개시내용은 키메라 수용체를 암호화하는 유전자를 단핵구 세포, 예를 들어, 대식세포, 및 기타 면역 세포로 효과적으로 전달하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한 키메라 수용체를 암호화하는 벡터를 포함하는 입자를 환자에게 투여하여, 상기 키메라 수용체가 생체내에서 발현됨으로써, 키메라 수용체가 그의 표적 분자 또는 항원에 결합할 때 환자의 면역계가 암에 결합하도록 활성화시킴으로써 암을 치료하는 방법을 제공한다.
하기의 고찰은 단지 독자가 본 개시내용을 이해하는데 도움을 주기위해 제공되며, 본 개시내용에 선행 기술을 설명하거나 구성하는 것으로 인정하는 것이 아니다.
면역계는 신체내 병원체 또는 병적 세포의 존재를 검출하고 이들을 신체로부터 제거할 수 있는 다양한 유형의 세포들로 이루어진다. 때때로, 상기 작용은 면역계 세포로 감싸여서 파괴되거나 신체 밖으로 운반되는 외래 약제에 의해 일어난다. 살아있는 숙주 세포가 세균 세포 또는 바이러스에 의해 침범된 경우, 면역계 세포는 상기 감염된 세포를 표적화하고 파괴할 수 있다.
예를 들면, 단핵구 세포는 정상적으로 세균과 같은 외래의 비-자기항원을 찾아서 신체를 돌아다닌다. 단핵구 세포는 세균을 포식하고, 상기 세균은 이어서 리소좀에서 더 작은 항원 부분들로 소화된다. 생성된 세균 항원들은 면역계의 체액 및 세포 팔에 제공되기 위해 상기 세포들의 세포 표면으로 다시 순환된다. 더욱이, 단핵구 세포는 또한 손상되거나 유전적으로 돌연변이된 병적 세포들을 검출하고, 표적화하고 파괴할 수 있다. 암 세포는 면역계 세포들에 의해 사멸될 수 있는 상기와 같은 병적 세포의 한 예를 나타낸다.
단핵구들은 혈류에서 특정 조직으로 이동한 후에 대식세포 또는 수지상 세포로 분화할 수 있다. 중요하게, 많은 고형 종양들이 종양상 내에 대식세포의 거대한 존재를 갖는다. 상기 종양-연관 대식세포(TAM)는 종양의 저산소 및/또는 괴사성 미세환경으로 유인되고, 여기에서 상기 대식세포는 핵 인자-카파 Β(NF-κΒ)의 활성화 및 전-혈관생성 신호(예를 들면, VEGF)의 방출과 같은 다양한 경로를 통한 종양 성장 및 진행을 촉진하는 역할을 할 수 있다.
게다가, 많은 상황에서, 암 세포는 환자의 선천적인 면역계를 회피할 수 있다. 정상적인 환경하에서, T-세포는 T-세포 수용체(TCR)를 통해 특정 항원을 인식할 것이며, 상기 수용체는 T 세포의 표면 상의 TCR이 TCR의 특이적 항원을 함유하는 항원-제시 세포, 통상적으로 수지상 세포, 대식세포 또는 B 세포의 표면 상의 복합체에 결합할 때 "프라이밍"된다. 다음으로, T 세포는 항원-제시 세포로부터 공자극 신호를 수용해야 한다. 이것은 가장 일반적으로는 T 세포 상의 CD28 수용체와 그의 리간드들, B7-1 및 B7-2(각각 CD80 및 CD86으로도 불림) 중 어느 하나와의 결합에 의해 제공된다. 상기 과정이 일어나지 못하는 경우, 선천적인 면역계는 암 세포에 대한 내성을 나타낸다.
따라서, TAM의 선천적인 전-종양 활성을 역전시키고 대신 면역계를 자극하여 면역관문 억제 및 사이토카인 생성을 통해 종양 세포를 공격하도록 작용하는 방식으로 TAM을 이용하는 것이 유리할 것이다.
본원에서는 치료 단백질의 발현을 유도하기 위한 단핵구-특이적 비드 벡터를 사용하여 종양을 치료하기 위한 조성물 및 방법이 기술된다.
한 양태에서, 본 개시내용은 (i) 기반 입자, 및 (ii) 상기 입자의 외부에 부착된, 표적 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 암호화하는 핵산을 포함하는 비-감염성 바이러스를 포함하는 전달 벡터를 제공한다.
상기 양태의 일부 실시양태에서, 키메라 수용체를 암호화하는 핵산은 발현 벡터 내에 포함된다. 일부 실시양태에서, 상기 발현 벡터는 T7 프로모터 또는 저산소증-유도된 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 44를 포함한다.
상기 양태의 일부 실시양태에서, 상기 기반 입자는 효모 세포벽 입자(YCWP)이다. 일부 실시양태에서, YCWP에는 생체 물질, 예를 들어, 종양 용해물이 부하된다.
상기 양태의 일부 실시양태에서, 상기 기반 입자는 비드, 예를 들어, 강자성 입자, 미세비드 또는 미세구이다.
상기 양태의 일부 실시양태에서, 전달 벡터는 단핵구 세포, 예를 들어, 대식세포 또는 보다 특히 종양-연관 대식세포(TAM)에 의해 우세하게 포식되게 하는 크기이다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은, 그 표면 상에서 발현된, 표적 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 포함하는 단핵구 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 대식세포(예를 들면, 종양 연관 대식세포) 또는 수지상 세포이다.
상기 양태들의 일부 실시양태에서, 키메라 수용체의 표적 결합 도메인은 면역관문 단백질에 결합하는 scFv를 포함한다. 예를 들면, 상기 면역관문 단백질은 CTLA-4, PD-1, PD-L1, LAG3, B7.1, B7-H3, B7-H4, TIM3, VISTA, CD137, OX40, CD40, CD27, CCR4, GITR, NKG2D 및 KIR로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역관문 단백질은 CTLA-4이다. 일부 실시양태에서, 표적 결합 도메인은 서열번호 3 또는 IgK 리더 서열(leader sequence)이 제거된 서열번호 3을 포함하는 scFv를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 결합 도메인은 서열번호 1의 가변 중쇄 서열 및 서열번호 2의 가변 경쇄 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 면역관문 단백질은 PD-1이다. 일부 실시양태에서, 표적 결합 도메인은 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 세미플리맙, 스파탈리주맙, 캄렐리주맙 또는 신틸리맙의 각각의 가변 중쇄 서열 및 가변 경쇄 서열에 상응하는 가변 중쇄 서열 및 가변 경쇄 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역관물 단백질은 PD-L1이다. 일부 실시양태에서, 표적 결합 도메인은 더발루맙, 아테졸리주맙 또는 아벨루맙의 각각의 가변 중쇄 서열 및 가변 경쇄 서열에 상응하는 가변 중쇄 서열 및 가변 경쇄 서열을 포함한다.
상기 양태들의 일부 실시양태에서, 표적 결합 도메인은 OX40에 특이적이다(즉, 상기 도메인은 OX40을 특이적으로 인식하거나 그에 특이적으로 결합한다). 예를 들면, 일부 실시양태에서, 상기 표적 결합 도메인은, 9B12(NCT01644968), MOXR0916, PF-04518600, MEDI0562, MEDI6469, MEDI6383, PF-04518600 또는 BMS 986178의 CDR 및/또는 가변 도메인 영역을 포함할 수 있는 scFv의 각각의 가변 중쇄 서열 및 가변 경쇄 서열에 상응하는 가변 중쇄 서열 및 가변 경쇄 서열을 포함하는 scFv를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 결합 도메인은 OX40L의 세포외 도메인을 포함한다.
상기 양태들의 일부 실시양태에서, 막관통 도메인은 톨-유사(toll-like) 수용체, CD28, CD4, CD8, 4-1BB, CD27, ICOS, OX40, HVEM 또는 CD30의 적어도 막관통 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막관통 도메인은 서열번호 16 내지 서열번호 25 중 어느 하나를 포함한다.
상기 양태들의 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 톨-유사 수용체(TLR), 예를 들어, TLR4 또는 TLR9의 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 26 또는 서열번호 27을 포함한다.
상기 양태들의 일부 실시양태에서, 비-감염성 바이러스는 아데노바이러스(예를 들면, 재조합 아데노바이러스), 렌티바이러스 또는 아데노-연관 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 비-감염성 바이러스는 또한 비-복제성이다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 암을 갖는 환자에게 상기 실시양태들 중 어느 하나의 전달 벡터를 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 암을 갖는 환자에게 상기 실시양태들 중 어느 하나의 전달 벡터를 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 면역계를 자극하는 방법을 제공한다.
개시된 방법들의 일부 실시양태에서, 전달 벡터는 피내로 투여된다. 개시된 방법들의 일부 실시양태에서, 전달 벡터는 표적 림프절에 근접하게 투여된다.
개시된 방법들의 일부 실시양태에서, 암은 저산소성 미세환경을 포함하는 하나 이상의 종양을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 하나 이상의 종양은 종양-연관 대식세포(TAM)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 암은 하나 이상의 고형 종양을 포함한다.
개시된 방법들의 일부 실시양태에서, 전달 벡터는 대식세포에 의해 포식되고 상기 대식세포는 그 후에 그 표면 상에서 키메라 수용체를 발현한다.
본 개시내용은 또한 항암제로 사용하기 위한, 상기 실시양태들 중 어느 하나에 따르는 전달 벡터를 제공한다.
본 개시내용은 또한 대상에게 전달 벡터를 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 암을 치료하는데 사용하기 위한, 상기 실시양태들 중 어느 하나에 따르는 전달 벡터를 제공한다.
본 개시내용은 또한 대상에게 전달 벡터를 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 면역계를 자극하는데 사용하기 위한, 상기 실시양태들 중 어느 하나에 따르는 전달 벡터를 제공한다.
본 개시내용은 또한 항암제로서 상기 전달 벡터의 상기 실시양태들 중 어느 하나의 용도를 제공한다.
본 개시내용은 또한 대상에게 전달 벡터를 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 암을 치료하기 위한 전달 벡터의 상기 실시양태들 중 어느 하나의 용도를 제공한다.
본 개시내용은 또한 대상에게 전달 벡터를 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 면역계를 자극하기 위한 전달 벡터의 상기 실시양태들 중 어느 하나의 용도를 제공한다.
상기 일반적인 설명 및 하기의 상세한 설명은 예시적이고 설명적인 것이며 개시내용을 제한하는 것이 아니다.
도 1은 항-CTLA-4 scFv, Gly4/Ser1 링커, 인간 CD8 막관통 도메인, 및 인간 TLR4 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 예시적인 키메라 수용체의 암호화 서열 및 성분들을 나타낸다.
도 2는 항-CTLA-4 scFv, Gly4/Ser1 링커, 인간 CD8 막관통 도메인, 및 인간 TLR4 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 예시적인 키메라 수용체의 아미노산 서열 및 성분들을 나타낸다.
도 3은 키메라 수용체 융합 유전자를 포함하는 예시적인 발현 벡터를 나타낸다.
도 4는 개시된 입자를 제조하는데 사용될 수 있는 예시적인 렌티바이러스 벡터를 나타낸다.
도 5는 IL-12-특이적 ELISA 분석의 결과를 나타낸다. 상기 분석에서는, CTLA4-특이적 키메라 수용체를 발현하는 THP-1 세포를 다양한 농도의 재조합 CTLA4에 노출시켰다. 상기 세포는 농도-의존성 방식으로 IL-12를 발현함으로써 CTLA4 노출에 반응하였다. IL-12 발현은 LPS에 노출됨으로써 자극되지 않았고, 상기 LPS는 TLR 활성화에 양성 대조군의 역할을 하였다. P1 및 P2는 IL-12의 양성 대조군이었고, EB는 ELISA 키트에서 제공된 대조군이다.
일반적으로, 본 개시내용은 새로운 표적화 유전자 전달 벡터, 및 외인성 단백질을 발현시키고 암을 치료하기 위해 상기 벡터를 사용하는 방법을 제공한다. 특히, 본 개시내용은 단핵구 세포, 예를 들어, 대식세포 및 수지상 세포에서 키메라 수용체(즉, 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 변형된 톨-유사 수용체(TLR))를 발현하기 위한 비드- 또는 효모 세포벽 입자(YCWP)-기반 전달 벡터를 제공한다. 특히, 개시된 조성물 및 방법은 종양 또는 종양-주변 림프절의 미세환경에서 종양-연관 대식세포(TAM)에서 키메라 수용체를 발현하기 위해 이용될 수 있다. 개시된 키메라 수용체를 발현하는 단핵구 세포(예를 들면, TAM)는, 면역계가 종양을 공격하고 많은 종양이 면역계에 의해 검출되는 것을 피하게 하는 면역 내성을 극복하도록 면역계를 자극할 수 있다.
보다 특히, 개시된 키메라 수용체는 일반적으로 톨-유사 수용체(TLR)로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. TLR은 선천적 면역계에서 핵심 역할을 하는 단일, 막-횡단, 비-촉매 수용체의 한 부류이며, 통상적으로 대식세포 및 수지상 세포와 같은 단핵구 세포상에서 발현된다. 정상적인 상황하에서, TLR은 미생물 및 다른 외래의 비-자기 항원으로부터 유래된 구조적으로 보존된 분자를 인식하며, 상기 항원을 인식할 때, TLR은 사이토카인의 발현을 포함하나 이로 한정되지는 않는 면역 세포 반응들을 활성화시킬 수 있다. 보다 특히, TLR은 항원-유도된 신호 전달 경로를 확장시키기 위해 면역 세포의 시토졸 내에 어댑터 단백질(다른 단백질-단백질 상호작용을 매개하는 단백질)을 보충한다. 상기 보충된 단백질들은 이어서, 상기 신호를 더 증폭시키고 궁극적으로 염증 반응 및 다른 전사 사건들을 조정하는 유전자의 상향조절 또는 억제를 야기하는 단백질 키나제들(IKKi, IRAK1, IRAK4, 및 TBK1)을 포함하여, 다른 하류 단백질들의 후속 활성화의 원인이 된다. 상기 사건들 중 일부는 사이토카인 생성, 증식 및 생존을 야기하는 반면, 다른 사건들은 더 큰 후천적 면역을 야기한다.
개시된 키메라 수용체들은, TLR의 정상적인 결합/항원-인식 도메인을 대체하고 상기 도메인을 면역관문 단백질 또는 면역 신호전달에 수반되는 또 다른 수용체 또는 분자(예를 들면, CTLA4, PD-1, PD-L1, OX40)를 인식하는 표적 결합 도메인으로 대체함으로써 변형된 TLR로서 작용한다. 따라서, 상기 키메라 수용체가 그 표적 분자에 결합하는 것은 TLR 활성화를 야기하여 공격적인 항-종양 면역 반응을 유발할 것이다. 상기 반응은 해당 키메라 수용체에 사용된 세포내 TLR 도메인에 따라 달라질 수 있지만, M1-형(즉, 전-염증성) 사이토카인, 예를 들어, IL-12, IFN-α, IRN-γ, TNF-α, IL-6, 및/또는 IL-1β의 발현을 야기하는 TLR(예를 들면, TLR-4, TLR-9 등)의 신호전달 도메인을 사용하는 것이 바람직하다. 결과적으로, 대식세포와 같은 단핵구 세포에 의한 개시된 키메라 수용체의 발현 및 활성화는 키메라 수용체-발현 세포가 통상적인 CAR T-세포와 같은 종양 세포를 직접 공격하거나 포식하지 않고 대부분의 종양들에 의해 조성된 면역 억제 환경을 극복할 수 있게 한다. 더욱이, 상기 수용체들의 추정상의 작용 메카니즘은 간접적이고 면역 자극 전파를 기반으로 하기 때문에, 키메라 수용체-발현 세포가 종양과 물리적으로 접촉하거나 또는 종양 미세환경내에 존재할 필요는 없다(상기 편재가 완벽하게 허용되고 여전히 표적 종양을 파괴하도록 작용할 지라도). 사실상, 종양 인접 림프절(예를 들어, 종양-주변 림프절) 내에 상기 키메라 수용체-발현 세포의 편재는 면역 활성인 환경 또는 배경을 야기함으로써 종양을 파괴하기에 충분하다.
본 개시내용 전체에 걸쳐, 다양한 공개공보, 특허 및 공개된 특허 명세서들이 식별 인용구에 의해 참조된다. 상기 공개공보, 특허 및 공개된 특허 명세서들의 개시내용들은 본 개시내용이 속하는 당해 분야의 상태를 보다 충분히 기술하기 위해 본 개시내용에 참고로 도입된다.
정의
본원에서 사용된 기술 과학 용어들은 달리 정의되지 않는 한 당해 분야에 통상의 숙련가에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 당해 분야에 통상의 숙련가들에게 공지되어 있는 임의의 적합한 재료 및/또는 방법들을 본원에 기술된 방법들을 수행하는데 이용할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 당해 분야에 통상의 숙련가에 의해 이해될 것이며, 상기 용어가 사용되는 맥락에 따라 어느 정도 달라질 것이다. 상기 용어가 사용된 맥락을 고려하여 당해 분야의 숙련가에게 명확하지 않은 용어가 사용되는 경우, "약"은 상기 특정 용어뿐 아니라 명시된 용어의 10% 전후까지를 의미할 것이다. 예를 들면, "약 10"은 "10" 뿐 아니라 "9 내지 11"을 의미하는 것으로 이해해야 한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항원 결합 도메인"은 "표적 결합 도메인"과 호환적으로 사용될 수 있다. 상기 용어들은 개시된 키메라 수용체들(예를 들면, PD-1, PD-L1, CTLA4, OX-40 등)에 의해 결합되고자 하는 표적 분자를 지칭하는 것으로 이해해야 한다. 상기 용어는, 표적 분자가 그 자체로 필연적으로 면역원성 또는 항원성이지만, 단지 결합 도메인의 일부로 항체 또는 항체 단편을 포함할 수 있는 개시된 수용체가 단리된 항체가 그 표적 항원에 결합할 수 있다는 것과 동일한 의미로 표적 분자에 결합할 수 있다고 시사하는 것으로 이해해서는 안된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이 나열된 요소들을 포함하지만 다른 것들을 배제하지는 않는 것을 의미하는 것이다. 조성물 및 방법을 정의하기 위해 사용될 때, "필수적으로 이루어지는"은 상기 조성물 또는 방법에 어떤 필수적인 중요성을 갖는 다른 요소들은 배제하는 것을 의미한다. "이루어지는"은 청구된 조성물 및 실질적인 방법 단계들에 대해 미량보다 많은 요소들의 다른 성분들은 배제하는 것을 의미한다. 상기 추이적 용어들 각각에 의해 정의된 실시양태들은 본 개시내용의 범위 안에 있다. 따라서, 상기 방법 및 조성물은 추가의 단계 및 성분들을 포함할 수 있거나(포함하는), 그렇지 않으면 중요하지 않은 단계 및 조성물을 포함하거나(필수적으로 이루어지는), 그렇지 않으면 언급된 방법 단계 또는 조성물 만을 의도하는(이루어지는) 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료 효과량"이란 어구는 개시된 입자의 용량이, 상기 치료를 필요로 하는 대상에서 약물이 투여되는 특정한 약리학적 효과, 즉, 면역계를 활성화시킴으로써 암/종양 성장, 진행 또는 재발을 감소시키거나, 개선하거나 또는 없애기 위한 효과를 제공하는 것을 의미한다. 입자의 치료 효과량은, 상기 투여량이 당해 분야의 숙련가에 의해 치료 효과량인 것으로 여겨진다 할지라도, 항상 모든 개별적 대상의 암/종양을 치료하는데 효과적이진 않을 것임이 강조된다. 당해 분야의 숙련가들은 특정 대상 및/또는 특정 유형의 암 또는 종양을 치료하기 위해 필요한 대로 표준 관행에 따라 치료 효과량인 것으로 생각되는 것을 조정할 수 있다. 치료 효과량은 투여 경로, 투여 부위, 투여형, 대상의 연령 및 체중, 및/또는 치료시에 암 또는 종양의 진행, 단계 및/또는 종류를 포함하여, 대상의 건강상태에 기반하여 달라질 수 있다.
암 또는 종양과 관련하여 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 암/종양 성장 및/또는 진행을 감소, 개선 또는 제거하거나, 또는 암/종양 세포 사멸을 야기하는 것을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "예방하다" 또는 "예방하는"은 암/종양 세포의 생성을 중단시키거나 암/종양 성장의 재발을 억제하는 것을 지칭한다.
용어 "개인", "대상" 및 "환자"는 본원에서 호환적으로 사용되며, 임의의 개별적인 포유동물 대상, 예를 들면, 소, 개, 고양이, 말 또는 인간을 지칭한다.
본 개시내용의 조성물 및 방법은 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재하에서 적절하게 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 용어 "구성하는", "포함하는", "함유하는" 등은 확장적으로 제한없이 읽힐 것이다. 또한, 본원에서 사용된 용어 및 표현들은 제한하는 것이 아니고 설명하는 용어로 사용되었으며, 나타내고 설명한 특징들 또는 그의 일부분의 임의의 등가물을 배제하는 상기 용어 및 표현들을 사용하려는 의도는 없지만, 청구된 본 개시내용의 범위내에서 다양한 변경이 가능한 것으로 인지된다.
키메라 수용체
개시된 전달 벡터는 키메라 수용체를 암호화하는 핵산을 표적 세포, 예를 들어, 단핵구 세포 내로 전달하도록 설계된다. 본 개시내용의 목적에 있어서, 본 개시내용의 키메라 수용체는 하나 이상의 표적 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체는 힌지/링커 도메인 및/또는 공자극 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 결합 도메인은 외인성 또는 비-천연 서열(예를 들면, scFv 단편)일 수 있으나, 키메라 수용체 서열의 나머지 부분은 톨-유사 수용체(TLR) 서열을 포함한다. 예를 들면, 예시적인 키메라 수용체는 Gly4/Ser1 링커를 통해 CD8 막관통 도메인에 연결된 항-CTLA-4 scFv, 및 인간 TLR4 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 상기 예시적인 키메라 수용체에 대한 암호화 서열은 도 1에 나타내었다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체는 막관통 도메인, 및/또는 TLR로부터 유래되지 않은 세포내 도메인(예를 들면, CDζ 신호전달 도메인)을 포함할 수 있다.
A. 표적 결합 도메인
개시된 키메라 수용체의 표적 결합 도메인은 수용체의 특이성을 좌우한다. 일반적으로, 표적 결합 도메인은 항체의 가변 도메인(예를 들면, scFv 도메인)을 포함할 것이지만, 일부 실시양태에서, 표적 결합 도메인은 표적화된 수용체에 결합하는 펩티드, 예를 들어, PD-1의 세포외 도메인, CTLA-4의 세포외 도메인, 또는 OX40 또는 OX40L의 세포외 도메인(gp34, CD252, 및 TNFSF4로도 알려져 있음)을 포함할 수 있다. PD-1 세포외 도메인은 인간(NP_005009, NM_005018), 마우스(NP_032824, NM_008798), 소(NP_001277851, NM_001290922), 또는 다른 동물 기원으로부터 유래될 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 PD-1의 적합한 세포외 도메인을 확인할 수 있을 것이다. 예를 들면, 인간 PD-1은 288개 아미노산의 길이이고, 아미노산 14 내지 130은 세포의 도메인을 나타내는 반면, 뮤린 PD-1도 또한 288개 아미노산이지만 아미노산 21 내지 169가 세포외 도메인을 나타낸다. OX40 세포외 도메인은 인간(NP_003318, NM_003327), 마우스(NP_035789, NM_011659), 또는 다른 동물 기원으로부터 유래될 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 OX40의 적합한 세포외 도메인을 확인할 수 있을 것이다. 예를 들면, 인간 OX40의 N-말단의 아미노산 1 내지 191은 세포외 도메인을 구성한다. OX40L 세포외 도메인은 인간(NP_003317, NM_003326; NM_001297562, NP_001284491) 또는 다른 동물 기원으로부터 유래될 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 OX40L의 적합한 세포외 도메인을 확인할 수 있을 것이다. 예를 들면, 인간 OX40L의 N-말단의 아미노산 1 내지 133은 세포외 도메인을 구성한다. 하기 표 1에 열거된 억제 또는 공자극 수용체 중 어느 하나의 세포외 도메인, 예를 들어, 상기 수용체의 리간드 결합 도메인도 또한 개시된 키메라 수용체내에 적합한 표적 결합 도메인으로서 도입될 수 있다.
사실상 어떤 종양-관련 항원 또는 면역 경로 신호전달 분자에 대한 특이성을 갖는 표적 결합 도메인도 개시된 키메라 수용체내에 도입될 수 있는 것으로 이해해야 하지만, 바람직한 표적은 면역관문 단백질 또는 OX40이다.
면역관문 단백질은, 정상적인 조건하에서, 병원체 감염에 따른 부차적인 조직 손상을 최소화하기 위해 자기-관용을 유지하고 생리적 면역 반응의 기간 및 크기를 조절하는데 결정적인 면역계의 억제 경로에 수반되는 단백질이다. 그러나, 면역관문 단백질의 발현은 종종 면역 내성 및 면역 회피의 중요한 메카니즘으로서 종양에 의해 이상조절된다.
많은 면역관문 단백질들이 리간드-수용체 상호작용에 의해 개시되기 때문에, 이들은 면역관문 리간드 및/또는 수용체에 특이적인 항체 또는 결합 단편들에 의해 용이하게 차단될 수 있다. 따라서, 개시된 키메라 수용체의 표적 결합 도메인은 표 1에 나타낸 단백질들을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 면역관문 단백질들에 특이적이도록 설계될 수 있으며, 키메라 수용체가 그의 표적 면역관문 단백질에 결합하는 것은 면역관문 신호전달을 억제할 것이다.
표적 생물학적 기능
CTLA-4 억제 수용체
PD-1 억제 수용체
PD-L1 PD1에 대한 리간드
LAG3 억제 수용체
B7.1 공자극 분자
B7-H3 억제 리간드
B7-H4 억제 리간드
TIM3 억제 수용체
VISTA 억제 수용체
CD137 공자극 분자
OX40 공자극 수용체
CD40 공자극 분자
CD27 공자극 수용체
CCR4 공자극 수용체
GITR 공자극 수용체
NKG2D 활성화 수용체
KIR 공자극 수용체
CTLA4, 세포독성 T-림프구-연관 항원 4; LAG3, 림프구 활성화 유전자 3; PD1, 세포 예정사 단백질 1; PDL, PD1 리간드; TIM3, T 세포 막 단백질 3; VISTA, T-세포 활성화의 V-도메인 면역글로불린(Ig)-함유 억제인자; KIR, 살해 IgG-유사 수용체.
본 개시내용의 목적에 있어서, 면역관문 단백질을 표적으로 하는 표적 결합 도메인은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 표적 결합 도메인은 인간, 키메라, 인간화 또는 비-인간(예를 들면, 마우스, 래트, 토끼, 양, 염소, 소, 돼지 등) 항체의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 모 항체(즉, 키메라 수용체내에 도입하기 위해 사용된 항체 서열)는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgE, 또는 IgM, 또는 그의 변이체 또는 단편일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 결합 도메인은 단일쇄 Fv (scFv) 항체 단편(예를 들면, 문헌[Bird et al., Science, 242:423-26 (1988)]; 문헌[Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-83 (1988)] 참조), 특히, 상기 표 1에 열거된 임의의 면역관문 단백질을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 면역관문 단백질에 결합하는 scFv를 포함한다.
예를 들면, 일부 실시양태에서, 키메라 수용체는 그의 결합 도메인으로 항-CTLA-4 scFv를 포함할 수 있다. 항-CTLA-4 scFv는 하기 표에 나타낸 이필리무맙의 상보성 결정 영역(CDR) 및/또는 가변 도메인 영역을 포함할 수 있다.
Figure pct00001
또 다른 예시적인 항-CTLA4 scFv는 트레멜리무맙의 가변 쇄 서열로부터 유래된 scFv, 또는 다음 서열을 포함하는 scFv를 포함하지만 이로 한정되지는 않는다: METDTLLLWVLLLWVPGSTGDDIRRA DIVMTQTTLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLGWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGTGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSGSGGGSGGGSGGGSEAKLQESGPVLVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMNLVKQSHGKSLEWIGVINPYNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELNSLTSEDSAVYYCARYYGSWFAYWGQGTLITVSTAKTTPPSVYPLAPRSSREQKLISEEDL (서열번호 3; 굵은/이탤릭체 본문은 IgK 리더 서열을 나타낸다). 상기 scFv가 유래된 항체의 전장 서열 뿐 아니라, 상기 항체를 암호화하는 핵산 서열은 본원에 참고로 도입된 US 2011/0044953 호에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, 키메라 수용체는 그의 결합 도메인으로 항-PD-1 scFv를 포함할 수 있다. 항-PD-1 scFv는 하기 표에 나타낸 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 세미플리맙, 스파탈리주맙, 캄렐리주맙 또는 신틸리맙의 CDR 및/또는 가변 도메인 영역을 포함할 수 있다.
Figure pct00002
Figure pct00003
일부 실시양태에서, 키메라 수용체는 그의 결합 도메인으로 항-PD-L1 scFv를 포함할 수 있다. 항-PD-L1 scFv는 더발루맙, 아테졸리주맙 및 아벨루맙의 CDR 및/또는 가변 도메인 영역을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 키메라 수용체는 그의 결합 도메인으로 항-OX40 scFv를 포함할 수 있다. 항-OX40 scFv는 9B12(NCT01644968), MOXR0916, PF-04518600, MEDI0562, MEDI6469, MEDI6383, PF-04518600 또는 BMS 986178의 CDR 및/또는 가변 도메인 영역을 포함할 수 있다. OX40은 그의 독특한 신호전달 성질로 인해 본원에 개시된 표적 분자들 중에서 특히 바람직하다. 예를 들면, OX40은 다수의 상이한 유형의 T 세포 상에서 발현될 수 있고, 그의 기능은 세포 유형에 따라 달라질 것이다. T 효과기 또는 T 헬퍼 세포 상에서 발현되는 OX40이 그의 리간드와 결합할 때, 세포들이 활성화된다. 그러나, T 조절 세포 상에서 발현되는 OX40이 그의 리간드와 결합할 때, 세포들은 불활성화된다. 따라서, OX40 신호전달을 작동시키는 것은 많은 종양들에 의해 조성된 면역 억제 환경을 극복하고 공격적 면역 반응을 증대시킴으로써 활성 면역 환경을 야기하는 것을 촉진할 것이다.
B. 막관통 도메인
개시된 키메라 수용체는 표적 결합 도메인을 세포내 신호전달 도메인에 연결시키는 막관통 도메인을 포함한다. 일반적으로, 인간 단백질 서열은 본 발명의 키메라 수용체의 막관통 도메인의 목적에 바람직하다. 공지되어 있는 키메라 항원 수용체(CAR)에 일반적으로 사용되는 다양한 막관통 도메인들을 본 발명에서 사용할 수 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 막관통 도메인은 톨-유사 수용체, CD28, CD4, CD8, 4-1BB, CD27, ICOS, OX40, HVEM 또는 CD30의 적어도 막관통 부분을 포함할 수 있다. 특정한 예시적인 막관통 도메인은 하기 표에 포함되어 있으나, 이로 한정하려는 것은 아니다.
Figure pct00004
C. 세포내 신호전달 도메인
키메라 수용체의 세포내 신호전달 도메인은 키메라 수용체가 생성하는 세포 반응에 영향을 미친다. 일반적으로, 인간 단백질 서열이 본 발명의 키메라 수용체의 세포내 신호전달 도메인의 목적에 바람직하다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 키메라 수용체는 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12, 및 TLR13을 포함하여, TLR의 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 다양한 TLR들 사이의 전환은 단핵구 세포의 사이토카인 반응을 변화시킬 것이다. TLR4 및 TLR9의 신호전달 도메인은 암을 치료하는데 특히 유용하지만, 본 개시내용의 목적을 위해, 키메라 수용체는 그 대신에 TLR1, TLR2, TLR3, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR10, TLR11, TLR12, 또는 TLR13의 신호전달 도메인을 포함할 수 있다.
Figure pct00005
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 키메라 수용체는 다음의 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함할 수 있다:
(RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR; 서열번호 43).
D. 링커/힌지
개시된 키메라 수용체는 표적 결합 도메인을 막관통 도메인과 연결시키는 링커 또는 힌지를 선택적으로 포함할 수 있다. 공지되어 있는 키메라 항원 수용체(CAR)에 일반적으로 사용되는 다양한 링커/힌지를 본 발명에서 사용할 수 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 링커 또는 힌지는 IgG4 힌지 또는 그의 유도체, IgG2 힌지 또는 그의 유도체, CD28 힌지, 또는 CD8 힌지를 포함할 수 있다. 특정한 예시적인 막관통 도메인은 하기 표에 포함되어 있으나, 이로 한정하려는 것은 아니다.
Figure pct00006
E. 공자극 도메인
개시된 키메라 수용체는 막관통 도메인과 세포내 신호전달 도메인 사이에 공자극 도메인을 선택적으로 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간 단백질 서열이 본 발명의 키메라 수용체의 공자극 도메인의 목적에 바람직하다. 공지되어 있는 키메라 항원 수용체(CAR)에 일반적으로 사용되는 다양한 공자극 도메인을 본 발명에서 사용할 수 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 공자극 도메인은 CD28, 4-1BB, CD3, CD27, ICOS, OX40, HVEM, CD30, 및/또는 T 세포 공자극 분자 군의 임의의 다른 구성원의 일부를 포함할 수 있다. 특정한 예시적인 막관통 도메인은 하기 표에 포함되어 있으나, 이로 한정하려는 것은 아니다.
Figure pct00007
키메라 수용체를 발현하기 위한 벡터
본 개시내용의 목적에 있어서, 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열은 표적 세포(예를 들면, 대식세포와 같은 단핵구 세포)에서 키메라 수용체를 발현할 수 있는 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. 보다 특히, 상기 발현 벡터를 사용하여 표적 세포의 표면 상에서 하나 이상의 키메라 항체를 발현할 수 있다. 상기 벡터는, 예를 들면, 암호화 서열, 인핸서 및/또는 리보솜 진입 부위에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한 조절 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 벡터는 선택적으로, 예를 들면, 시험관내 세균 또는 세포 배양 시스템에서의 증식을 위한 선택성 마커 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 선택성 마커는 절두 단백질 또는 펩티드, 예를 들어, 절두형 CD19일 수 있다.
바람직한 발현 벡터는 하나 이상의 복제 기점, 적합한 프로모터 및/또는 인핸서, 및 또한 임의의 필수적인 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여체 및 수용체 부위, 전사 종료 서열, 및 5' 측면 비전사 서열을 포함할 수 있다. SV40 또는 사이토메갈로바이러스(CMV) 바이러스 게놈으로부터 유래된 DNA 서열, 예를 들면, SV40 기점, 초기발현 프로모터, 인핸서, 스플라이스 및 폴리아데닐화 서열을 사용하여 필요한 비-전사 유전 요소들을 제공할 수 있다. 예시적인 발현 벡터를 도 2에 나타내었다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 T7 프로모터일 수 있다.
특정한 개시 신호도 또한 키메라 수용체의 효과적인 번역 및 발현에 필요할 수 있다. 상기 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열들을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 그 자체의 개시 코돈을 포함할 수 있고, 인접 서열들이 적절한 발현 벡터내에 삽입될 수 있으며, 추가의 번역 조절 신호는 필요하지 않을 수 있다. 그러나, 일부 실시양태에서, 개방 판독 프레임(ORF)의 일부만이 사용될 수 있으며, 예를 들면, ATG 개시 코돈을 포함한 외인성 번역 조절 신호가 제공될 수 있다. 더욱이, 개시 코돈은 전체 표적 서열의 번역을 보장하기 위해 목적하는 암호화 서열(즉, 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열)의 판독 프레임과 일치할 수 있다.
외인성 번역 조절 신호 및 개시 코돈은 천연 및 합성 둘 다의 다양한 기점을 가질 수 있다. 발현의 효율은 적절한 전사 인핸서 요소, 전사 종결인자 등의 혼입에 의해 증대될 수 있다(문헌[Bittner et al., Methods in Enzymol. 153:516-544 (1987)] 참조). 몇몇 적절한 발현 벡터들이 본원에 참고로 도입된 문헌[Sambrook, et al., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]에 기술되어 있다. 바람직한 경우, 발현을 증대시키고 적절한 단백질 접힘을 촉진하기 위해, 서열의 코돈 환경 및 코돈 쌍을 핫필드(Hatfield) 등의 미국특허 제 5,082,767 호에 설명된 바와 같이 최적화할 수 있다.
프로모터는 EF-1a 프로모터, CMV 즉시 초기발현형, HSV 티미딘 키나제, 초기 및 후기 SV40, 레트로바이러스로부터의 LTR, 및 마우스 메탈로티오네인-I를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 예시적인 벡터는 pWLneo, pSV2cat, pOG44, pXT1, pSG(스트라타진(Stratagene)), pSVK3, pBPV, pMSG, 및 pSVL(파마시아(Pharmacia))을 포함한다. 선택성 마커는 CAT(클로람페니콜 트랜스퍼라제)를 포함한다. 바람직한 벡터는 또한 T7 벡터 시스템과 같은 세포질 벡터를 포함한다(와그너(Wagner) 등의 미국특허 제 5,591,601 호(1997년 1월 7일자) 참조).
일부 실시양태에서, 벡터는 추가로 다른 기능성 서열, 예를 들어, FSV 비-구조적 단백질 유전자 및/또는 FSV 서브게놈 프로모터를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 프로모터는 유도성일 수 있다. 유도성 프로모터는 표적 유전자(예를 들면, 키메라 수용체)의 발현을 특정 신호 또는 특별한 생물 또는 비생물 인자에 작동가능하게 연결시킨다. 개시된 발현 시스템에 사용될 수 있는 유도성 프로모터의 유형은 화학-유도된 프로모터(즉, 항생제, 스테로이드, 금속 등), 광-유도된 프로모터, 열-유도된 프로모터 및 저산소증-유도된 프로모터를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 키메라 수용체의 전사 및 발현은 저산소증-유도된 프로모터에 의해 조절될 수 있다. 저산소증하에서 유전자 발현의 전사 조절은 저산소증 유도 인자 1(HIF1)에 의해 매개될 수 있다. 프로모터의 인핸서 서열 내에서 HIF1의 HIF1 반응 요소(HRE)로의 결합은 유전자 발현을 유도한다. 에리트로포이에틴 유전자, 포스포글리세레이트 키나제-1 및 VEGF를 포함하나 이로 한정되지는 않는 여러 유전자 프로모터들이 저산소증-유도된 것으로 밝혀졌다(문헌[The Journal of Experimental Biology 201, 1153-1162, 1998]).
천연 프로모터는 여러 전사 인자들에 의해 조절되기 때문에, 저산소증에 더 특이적인 키메라 프로모터를 제조하는 것도 또한 가능하다(문헌[Gene Therapy (2002) 9, 1403-1411]). 따라서, 일부 실시양태에서, SV40 및 CMV와 같은 무-인핸서 기저 바이러스 프로모터, 및 HRE의 여러 카피를 사용하여 키메라 프로모터를 구성할 수 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 개시된 발현 시스템은 HREx3+Basal SV40 프로모터의 키메라 프로모터를 포함할 수 있다.
저산소증-유도된 프로모터를 키메라 수용체를 발현하기 위한 발현 벡터 내에 도입하는 것은 개시된 전달 벡터를 포식할 수 있는 종양 연관 대식세포(TAM)에 의해 종양 표적화를 증가시킬 수 있다. 종양의 미세환경은 일반적으로 다른 건강한 신체에서는 유일한 저산소 환경이며, TAM은 저산소 종양상에 편재할 수 있다. 따라서, 개시된 전달 벡터가 대상에게 전신적으로 (예를 들면, 종양-주변 림프절에 가깝게) 투여되고 상기 림프절에서 또는 순환시에 단핵구 세포에 의해 포식되는 경우, 상기 발현 벡터에 의해 암호화된 키메라 수용체는 단핵구 세포가 종양상 내로 침윤되어 저산소 조건에 노출될 때까지 발현되지 않을 것이다. 이것은 개시된 키메라 수용체의 종양 표적화된 발현을 야기할 것이다.
상기 설명을 고려하여, 일부 실시양태에서, 본 개시내용은, 키메라 수용체, 예를 들어, 면역관문-특이적 표적 결합 도메인(예를 들면, 항-CTLA-4 scFv) 또는 OX40-특이적 표적 결합 도메인(예를 들면, 9B12, MOXR0916, PF-04518600, MEDI0562, MEDI6469, MEDI6383, PF-04518600 또는 BMS 986178로부터 유래된 scFv), 막관통 도메인(예를 들면, CD8 막관통 도메인), 및 세포내 신호전달 도메인(예를 들면, TLR4 또는 TLR9와 같은 TLR의 세포내 신호전달 도메인)을 포함하는 수용체를 발현하도록 종양-연관 대식세포(TAM) 및 다른 단핵구 세포를 조작함으로써 면역계를 활성화시키기 위한 전달 벡터 및 발현 벡터를 제공한다. 단핵구 세포에 의해 상기 개시된 키메라 수용체의 발현은 전신적(예를 들어, 종양 인접 림프절에서)이든 또는 특정하게 종양상 내에서든, 면역관문 단백질, 예를 들어, CTLA-4, PD-1, 및 PD-L1의 결합을 경쟁적으로 차단하고/하거나 OX40 신호전달을 자극함으로써, 종양의 파괴 및 질환의 치료를 야기하는 강하고 종양 특이적인 항-종양 반응을 유도하도록 면역계를 활성화시킬 수 있다. 더욱이, 키메라 수용체가 그의 표적 분자(예를 들면, CTLA-4, PD-1, PD-L1, OX40 등)에 결합하는 것은 면역관문 신호전달을 억제하거나 OX40 신호전달을 작동시킬 뿐 아니라, 키메라 수용체의 세포내 신호전달 도메인(즉, TLR의 세포내 도메인)을 자극한다. 이것은, 예를 들면, 활성 면역 환경을 야기하고 공격적 면역 반응을 증대시킴으로써 종양을 더 공격하고 파괴하는 사이토카인 반응을 개시할 수 있다. 다양한 TLR 도메인, 예를 들어, TLR4 및 TLR9가 키메라 수용체의 세포내 신호전달 도메인으로 사용되는 경우, 표적 분자에 결합하는 것에 의한 키메라 수용체의 활성화는 IL-12, IFN-α, IRN-γ, TNF-α, IL-6, 및/또는 IL-1β를 포함하나 이로 한정되지는 않는 사이토카인의 발현을 촉발함으로써, 종양의 면역 억제 환경을 극복하거나 회피할 것이다.
일부 실시양태에서, 단핵구 세포는 포식작용에 노출될 수 있으므로, 하나보다 많은 발현 벡터를 포함하는 전달 벡터에 노출될 수 있고, 발현 벡터는 같거나 다른 키메라 수용체를 암호화할 수 있다. 예를 들면, 단일 전달 벡터는 항-CTLA-4 키메라 수용체 및 항-PD-1 키메라 수용체를 암호화하는 발현 벡터를 포함할 수 있다. 추가로 또는 양자택일로, 일부 실시양태에서, 해당 단핵구 세포는 포식작용에 노출될 수 있으므로, 각각 상이한 키메라 수용체를 암호화하는 상이한 발현 벡터를 포함하는 하나보다 많은 전달 벡터에 노출될 수 있다. 예를 들면, 단핵구 세포는 2개의 상이한 전달 벡터를 포식할 수 있으며, 상기 벡터 중 하나는 항-CLTA-4 키메라 수용체를 암호화하는 발현 벡터를 포함하고, 상기 벡터 중 또 다른 하나는 항-PD-1 키메라 수용체를 암호화하는 발현 벡터를 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 1, 2, 3, 4 또는 5개 이상의 상이한, 본원에 개시된 바와 같은 키메라 수용체를 발현하는 단핵구 세포(예를 들어, 종양 연관 대식세포)를 제공한다.
전달 벡터
본 개시내용은 단핵구 세포 내로의 유도된 진입을 위한 고체 매트릭스-기반 조성물을 제공한다(이하에서 "전달 벡터"). 본 개시내용에 따른 전달 벡터는 일반적으로 기반 입자의 표면에 부착된 바이러스 성분을 갖는 단핵구 세포에 의해 포식될 수 있는 기반 입자로 이루어진다. 상기 바이러스 성분은 단핵구 세포에 의한 포식작용시 리소좀을 피하도록 돕는 기능을 할 뿐 아니라, 상기에서 논의된 바와 같이, 키메라 수용체를 암호화하기 위한 발현 벡터를 포함할 수 있다. 개시된 전달 벡터는 수지상 세포 및 대식세포를 포함한 단핵구 세포와 같은 포식 세포에 매우 특이적이다. 단핵구 세포에 대한 상기 현저한 선택성으로 인해 전달 벡터는 유전자 치료, 및 단핵구 계통의 세포에 유전자(예를 들면, 키메라 수용체를 암호화하는 유전자)의 도입 및 발현을 필요로 하는 다른 유전자 의료 방법에 매우 유용하게 된다.
A. 기반 입자
개시된 전달 벡터는 세균처럼 "보임"으로써 단핵구 세포의 포식 활성을 이용한다. 따라서, 기반 입자에 바람직한 크기는 단핵구 세포가 전형적으로 흡수하는 세균 항원의 크기에 가까운 크기이다. 일반적으로, 벡터 입자는 약 0.5 내지 약 2.5 μm, 또는 약 0.5 내지 약 1 μm일 것이다. 따라서, 벡터 입자는 약 0.5, 약 0.6, 약 0.7, 약 0.8, 약 0.9, 약 1.0, 약 1.1, 약 1.2, 약 1.3, 약 1.4, 약 1.5, 약 1.6, 약 1.7, 약 1.8, 약 1.9, 약 2.0, 약 2.1, 약 2.2, 약 2.3, 약 2.4, 또는 약 2.5 μm일 수 있다.
일부 실시양태에서, 기반 입자는 효모 세포벽 입자(YCWP), 예를 들여, 효모 글루칸 입자일 수 있다. 일부 실시양태에서, 기반 입자는 비드일 수 있다.
i. 효모 세포벽 입자(YCWP)
YCWP는 입자가 다양한 거대분자의 전달에 다공성이도록 효모 세포벽으로부터 제조될 수 있다. 한 실시양태에서, YCWP는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)로부터 제조될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, YCWP는 자이모산 입자일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, YCWP는 단핵 식세포계의 세포 및 다른 포식 세포가 전형적으로 흡수하는 미생물 구조(예를 들면, 세균)의 크기에 가깝다. 특정 실시양태에서, YCWP는 약 1 내지 5 μm일 수 있다.
일부 실시양태에서, YCWP는 (a) 효모를 현탁시켜 현탁액을 생성하고, (b) 상기 현탁액을 배양하고, (c) 상기 현탁액을 원심분리하고 상등액을 제거하고, (d) 생성된 YCWP를 회수함으로써 제조할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 단계 (a) 내지 (d)는 적어도 1, 2, 3 또는 4 회 반복한다.
일부 실시양태에서, YCWP는 (a) 효모를 용액중에 현탁하여 1차 현탁액을 생성하고, (b) 상기 1차 현탁액을 배양하고, (c) 상기 1차 현탁액을 원심분리하고 상등액을 제거하고, (d) 생성된 펠릿을 현탁시켜 2차 현탁액을 생성하고, (e) 상기 2차 현탁액을 배양하고, (f) 상기 2차 현탁액을 원심분리하고 상등액을 제거하고, (g) 생성된 펠릿을 세척하여 YCWP를 회수함으로써 제조할 수 있다. 일부 실시양태에서, YCWP는 멸균한다.
일부 실시양태에서, 효모는 1M NaOH를 포함하여 NaOH 중에 현탁시킨다. 일부 실시양태에서, 상기 1차 현탁액은 약 80 ℃에서 약 1 시간동안 또는 1 시간동안 배양한다. 일부 실시양태에서, 원심분리는 약 2000배 중력에서 약 10 분동안, 또는 2000배 중력에서 10 분동안 수행한다. 일부 실시양태에서, 펠릿은 약 pH 4.5 또는 pH 4.5의 물을 포함하여 물에 현탁시킨다. 일부 실시양태에서, 상기 2차 현탁액은 약 55 ℃에서 약 1 시간동안 또는 55 ℃에서 1 시간동안 배양한다. 일부 실시양태에서, 펠릿은 물에 적어도 1, 2, 3 또는 4 회 세척한다. 일부 실시양태에서, 펠릿은 1회 세척한다.
일부 실시양태에서, YCWP는 이소프로판올 및/또는 아세톤을 사용하여 멸균한 후 펠릿을 세척한다. 특정 실시양태에서, 다른 공지된 알콜이 적절하다. 일부 실시양태에서, YCWP는 멸균후에 완전히 건조시킨다. 일부 실시양태에서, YCWP는 건조시킨 후에 재현탁시킨다. 일부 실시양태에서, YCWP는 냉동 건조시키고 4 ℃에서 저장한다.
YCWP는 적어도 약 30 nm의 기공 크기를 가지므로, 30 nm 이하의 회전 반경을 갖는 임의의 분자/물체를 효모 세포벽 입자내에 부하시킬 수 있다. 예를 들면, 30 nm 미만의 크기를 갖는 몇몇 바이러스들 또는 바이러스 입자(예를 들면, 담배 모자이크 바이러스) 뿐 아니라, 종양 용해물을 포함하여 다른 항원들이 효모 세포벽 입자 내에 부하될 수 있다. YCWP를 개시된 전달 벡터에 기반 입자로 사용하는 경우, YCWP에 항원 성분, 예를 들어, 종양 항원 또는 종양 세포 용해물을 부하시킴으로써 전달 벡터의 항-종양 활성이 증대될 수 있다. 이것은 전달 벡터가 종양 백신으로서 동시에 기능하게 함으로써 전달 벡터의 면역 자극을 키메라 수용체의 발현 이상으로 더하거나 상승시킬 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, YCWP는 일부가 PBS, 예를 들어, 1X PBS 중에 존재한다. 일부 실시양태에서, YCWP를 사용 전 저장하기 위해, 종양 용해물이 YCWP 내에 부하되기 전에 YCWP를 건조시킨 다음 냉동시킨다. 일부 실시양태에서, YCWP는 냉동 건조시키고 약 4 ℃ 이하에서 저장한다.
"종양 용해물"은 종양 세포의 세포막이 물리적 또는 화학적 방법에 의해 붕괴될 때 생성된 용액을 말한다. 일부 실시양태에서, 종양 용해물은 암종 및 육종을 포함하나 이로 한정되지는 않는 고형 종양으로부터 제조한다. 일부 실시양태에서, 종양 용해물은 종양 세포주로부터 제조한다. 일부 실시양태에서, 종양 용해물은 유방암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 신경교종, 수모세포종, 신경모세포종, 윌름스(Wilms) 종양, 횡문근육종, 골육종, 간암, 췌장암, 흑색종, 전립선암 및 안구 흑색종과 관련한 임의의 고형 종양 또는 종양 세포주들로부터 제조한다. 일부 실시양태에서, 종양 용해물은 반복 냉동 및 해동, 균질화, 고장액 또는 저장액과의 접촉 또는 하나 이상의 비-이온성 붕해제와의 접촉을 포함한 여러 조건하에서 생성된다.
YCWP에는 특정 단백질 또는 그의 단편, 핵산, 탄수화물, 종양 용해물 또는 그의 혼합물과 같은 생체 물질들을 부하시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 생체 물질 및 YCWP의 현탁액을 함께 배양하고 생체 물질을 입자 내부의 중공으로 침투시킴으로써 상기 생체 물질을 YCWP 내에 부하시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, YCWP를 배양하거나 생체 물질을 부하한 후에, 상기 혼합물을 냉동-건조시켜 무수 입자를 생성한다. 냉동-건조시킴으로써 생체 물질이 입자 내에 포착된다. 일부 실시양태에서, 냉동-건조는 생체 물질을 입자 내에 포착시키기 위해 사용된 유일한 메카니즘이다. 일부 실시양태에서, 포착은, 예를 들면, 물리적 포착, 소수성 결합, 임의의 다른 결합에 의해, 입자에서 생체 물질이 유출되는 것을 차단시키는 별도의 성분에 의해서 야기되지 않는다. 일부 실시양태에서, 포착은, 냉동-건조시 일어날 수 있는 임의의 부착 이외에 생체 물질을 입자에 가교결합시키거나 아니면 부착시킴으로써 야기되지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 특별히 리소좀 회피를 용이하게 하는 임의의 추가 성분을 포함하지 않는다. 생체 물질은, 예를 들면, 특정 단백질 또는 그의 단편, 핵산, 탄수화물, 종양 용해물 또는 그의 혼합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, YCWP의 수는 약 1 x 109이고, 생체 물질의 부피는 약 50 μL이다. 특정 실시양태에서, 배양은 약 4 ℃에서 약 1 시간 또는 1 시간 미만 동안 수행한다. 일부 실시양태에서, YCWP와 생체 물질의 혼합물은 약 2 시간 이하의 시간동안 냉동 건조시킨다.
일부 실시양태에서, 생체 물질은 (a) 생체 물질 및 YCWP의 현탁액을 배양하여 생체 물질을 입자 내부의 중공에 침투시키고, 부하된 입자의 현탁액을 냉동-건조시키고, (b) 선택적으로, 입자를 재현탁하고, 재현탁된 입자를 배양하고, 재현탁된 입자를 냉동 건조시킴으로써 입자 내에 부하시킨다.
YCWP를 사용하는 일부 실시양태에서, YCWP의 수는 약 1 x 109이고, 생체 물질의 부피는 약 50 μL이다. 일부 실시양태에서, YCWP의 수는 1 x 109이고, 생체 물질의 부피는 50 μL이다. 일부 실시양태에서, 단계 (a)의 배양은 약 4 ℃에서 1 시간 미만 동안이다. 특정 실시양태에서, 단계 (a)의 배양은 4 ℃에서 약 1 시간 동안이다. 일부 실시양태에서, 상기 현탁액은 단계 (a)에서 2 시간 미만 동안 또는 약 2 시간에 걸쳐 냉동 건조시킨다. 일부 실시양태에서, 단계 (b)에서 YCWP는 약 50 μL의 물 또는 50 μL의 물을 포함하여 물에 재현탁시킨다. 일부 실시양태에서, 재현탁된 YCWP는 단계 (b)에서 약 4 ℃에서 약 1 시간 이하동안 또는 4 ℃에서 약 2 시간 이하동안 배양한다. 생체 물질은 특정 단백질 또는 그의 단편, 핵산, 탄수화물, 종양 용해물 또는 그의 혼합물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 부하된 YCWP는 실리케이트로 코팅시킨다. 구체적으로, 일부 실시양태에서, 부하된 YCWP는, 부하된 YCWP가 실리케이트로 캡핑되도록, 암모니아의 존재하에서 YCWP를 테트라알킬오쏘실리케이트와 같은 실리케이트와 접촉시킴으로써 코팅시킨다. 바람직한 실시양태에서, 부하된 YCWP는 약 60 분, 약 45 분, 약 30 분, 약 15 분, 약 10 분, 약 5 분 또는 약 2 분 이내에 실리케이트로 캡핑시킨다. 테트라알킬오쏘실리케이트의 반응성은, 암모니아에 의해 매개된 가수분해하에 테트라알킬오쏘실리케이트가 YCWP의 β-글루칸 구조의 1차 하이드록실과 반응하는 정도이다. 테트라알킬오쏘실리케이트는 또한 상기 세포벽 실리케이트의 말단과 자가-반응하여 "가교", 예를 들어, -O-Si(OH)2-O- 또는 3차원으로, 예를 들어, -O-Si(-O-Si-O-)(OH)-O- 또는 -Si(-O-Si-O-)2-O-를 형성한다. 이들 가교는 YCWP 안에 부하된 약물 또는 생체 물질의 체류가 증가하도록 YCWP 안의 기공들을 교차하여 발생할 수 있다. 상기 캡핑된, 부하된 YCWP는 동결 건조시킬 수 있다.
ii. 비드 입자
비드를 기반 입자로 사용하는 경우의 실시양태에서, 주어진 필요에 이상적인 비드를 결정하기 위해 여러 요인들을 비교 검토하여야 한다. 예를 들면, 흡수의 관점에서, 범위 중 더 작은 쪽이 바람직한데, 그 이유는 작은 쪽 값이 세균 크기와 더 밀접하게 가깝기 때문이다. 다른 한편으로, 제조의 목적에서는, 약간 더 큰 입자가 바람직한데, 그 이유는 약간 더 큰 입자들이 서로 달라붙을 가능성이 덜할수 있기 때문이다.
더욱이, 비드 입자는 형태 또는 재료에 의해 제한받지 않는다. 비드 입자는, 비드 벡터가 단핵구 세포에 의해 포식되게 하는 임의의 형태, 크기 또는 재료일 수 있다.
일부 실시양태에서, 기반 입자는 중합체 코팅에 의해 피복된 임의의 공지된 강자성 중심으로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, 기반 입자로 사용될 수 있는 비드는 미세비드, 미세구 및 실리케이트 비드를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 상기 비드들은 특정 용도에서 바람직할 수 있는데, 그 이유는 자력 분리를 이용하여 가공중 비드-결합 성분들이 없도록 분리할 수 있기 때문이다. 그러나, 개시된 전달 벡터에 사용하기 위한 비드 입자는 특정 유형의 물질로 제한되지 않고, 폴리스티렌 또는 기타 플라스틱과 같은 합성 물질 뿐 아니라 생체 물질로도 제조될 수 있다.
B. 바이러스 성분
기반 입자 이외에, 본 개시내용의 전달 벡터는 또한 바이러스 성분, 예를 들면, 기반 입자에 부착되거나 접합된 레트로바이러스 또는 아데노바이러스를 포함할 수 있다. 전달 벡터와 관련하여 바이러스 성분의 역할은 벡터가 단핵구 세포에 의한 포식작용후에 리소좀의 강한 환경을 벗어나는 것을 돕고, 표적 단핵구 세포의 표면 상에서의 발현을 위해 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 또는 발현 구조물을 전달하는 것이다.
단핵구 세포가 거대 항원을 흡수하는 경우, 항원을 완전히 감싸는 식세포 소낭(식포)이 형성된다. 다음으로, 단핵구 세포에 함유된 분화된 리소좀이 새로 형성된 식포와 융합한다. 융합시, 포식된 항원은 여러 고-반응성 분자 뿐 아니라 리소좀 하이드롤라제의 농축 혼합물에 노출된다. 상기 고-반응성 분자 및 리소좀 하이드롤라제는 식포의 내용물들을 소화시킨다. 바이러스 성분을 입자에 부착시킴으로써, 바이러스 내에 함유된 핵산은 리소좀 내의 물질에 의한 소화를 피하여 온전한 단핵구의 세포질에 진입할 수 있다. 선행기술의 시스템들은 상기 특징의 중요성을 인식하지 못하였으며, 따라서 본 개시내용의 발현 시스템보다 훨씬 더 낮은 수준의 발현을 달성하였다(팔로(Falo) 등의 WO 97/11605 호(1997) 참조).
따라서, 본 개시내용은 표적 세포(예를 들면, 단핵구 세포)에서 키메라 수용체를 발현할 수 있는 하나 이상의 바이러스가 기반 입자(예를 들면, YCWP 또는 비드 입자)의 표면에 부착된 전달 벡터를 제공한다. 상기 바이러스는 레트로바이러스와 같은 RNA 바이러스, 또는 아데노바이러스와 같은 DNA 바이러스일 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 재조합 및/또는 비-복제성 및/또는 비-감염성일 수 있다. 당해 분야의 숙련가라면 바이러스를 비-복제성 및/또는 비-감염성으로 만들기 위해 일반적으로 사용되는 방법을 인지할 것이다.
일부 실시양태에서, 바이러스는 자체로 리소좀을 붕괴할 수 있다. 또는, 바이러스는 리소좀을 붕괴할 수 없다. 그러한 경우에, 별도의 리소좀 회피 성분을 첨가할 수 있다. 바람직한 바이러스는 아데노바이러스(예를 들면, Ad5), 렌티바이러스(예를 들면, HIV-유래 바이러스), 및 아데노 연관 바이러스("AAV"; 예를 들면, AAv5, AAV9 등)를 포함한다.
단일 기반 입자는 그 표면에 부착되거나 접합된 많은 바이러스 성분들을 가질 수 있다. 각각의 바이러스 성분은 단일 키메라 수용체 또는 하나보다 많은(예를 들면, 2, 3, 4, 5개 이상) 키메라 수용체를 암호화할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 기반 입자는, 그 표면에 부착되거나 접합된, 각각 상이한 키메라 수용체를 암호화하는 여러 바이러스 성분들을 가질 수 있다. 그러므로, 상기 전달 벡터를 포식하는 단핵구 세포는 그 표면 상에서 여러 상이한 키메라 수용체, 예를 들면, CTLA-4에 특이적으로 결합하는 1개의 키메라 수용체 및 PD-1 또는 PD-L1에 특이적으로 결합하는 1개의 키메라 수용체를 발현할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용은, 본원에 개시된 바와 같이, 1, 2, 3, 4 또는 5개 이상의 상이한 키메라 수용체를 발현하는 단핵구 세포(예를 들어, 종양 연관 대식세포)를 제공한다.
바이러스 감염은 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 또는 발현 벡터가 단핵구 세포의 세포질에 도달하는데 필수적이 아니기 때문에, 바이러스는 또한 복제/감염이 결핍될 수 있다. 예를 들면, 복제/감염 결핍 아데노바이러스를 생성하기 위한 한가지 방법은 바이러스 섬유 단백질을 변이시킴으로써 달성할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 섬유 단백질이 항체에는 결합하지만 그의 동족 세포 수용체에는 결합하지 않게 하는 특이적 돌연변이에 의해 섬유 단백질이 조작된 바이러스를 본 개시내용의 입자에 사용할 수 있다.
복제/감염 결핍 바이러스를 생성하는 또 다른 방법은 감염의 원인이 되는 바이러스 성분의 변성을 의도적으로 야기하는 것이다. 아데노바이러스의 경우, 예를 들면, 섬유 단백질을 바이러스 제조시 붕괴시킬 수 있다. HIV의 경우, 상기 섬유 단백질은 외피(env) 단백질을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 개시된 비드 입자에 부착하기 위한 감염 결핍 바이러스를 생성하는 방법은 바이러스 코어만 남도록 바이러스의 외막을 제거하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 키메라 수용체를 암호화하는 발현 벡터가 표적 세포 염색체에 안정하게 통합되는 것이 유리할 수 있다. 예를 들면, 안정한 통합을 달성하는 한가지 방식은 아데노바이러스 하이브리드를 사용하는 것이다. 상기 아데노바이러스 하이브리드는, 예를 들면, 키메라 수용체 및 레트로바이러스 인테그라제 유전자를 암호화하는 핵산 성분의 측면에 위치한 레트로바이러스 5' 및 3' 긴 말단 반복(LTR) 서열을 갖는 아데노바이러스 벡터를 포함할 수 있다(문헌[Zheng, et al. Nature Biotechnology, 18:176-180, 2000] 참조).
일부 실시양태에서, 일시적 발현이 바람직할 수 있으며, 그러므로, 예를 들면, 신드비스(Sindbis) 바이러스와 같은 세포질 바이러스를 사용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 리소좀 회피 성분이 바이러스 상에 천연으로 존재하지 않는 경우, 부가할 수 있다. 예를 들면, 신드비스 또는 다른 상기와 같은 바이러스의 경우, 리소좀 회피 목적으로 아데노바이러스 펜톤 단백질의 전부 또는 일부를 발현하도록 바이러스를 조작할 수 있다.
일부 실시양태에서, 개시된 전달 벡터는 기반 입자에 부착된 리소좀을 회피하거나 붕괴시킬 수 있는 추가의 리소좀 회피 성분을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 리소좀 회피 성분은 단백질, 탄수화물, 지질, 지방산, 생체모방 중합체, 미생물 및 그의 혼합물을 포함할 수 있다. 용어 "단백질"은 많은 아미노산을 포함하는 중합체 분자를 포함하는 것에 주목된다. 그러므로, 당해 분야의 통상의 숙련가는 "단백질"이, 일반적으로 "짧은" 단백질인 것으로 이해되는 펩티드를 포함함을 알 것이다. 일부 실시양태에서, 리소좀 회피 성분은 특정 바이러스 단백질을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 예를 들면, 아데노바이러스 펜톤 단백질은 바이러스가 리소좀/식포를 회피/붕괴시키게 하는 복합체이다. 따라서, 온전한 아데노바이러스 또는 단리된 펜톤 단백질, 또는 그의 일부(예를 들면, 문헌[Bal et al., Eur J Biochem 267:6074-81 (2000)] 참조)를 리소좀 회피 성분으로 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 서브유닛 HA-2의 N-말단 서열로부터 유래된 융합성 펩티드도 또한 리소좀 회피 성분으로 사용할 수 있다(문헌[Wagner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:7934-7938, 1992]).
다른 리소좀 회피 성분으로는 생체모방 중합체, 예를 들어, 관심 플라스미드를 함유하는 접합체의 엔도솜 방출의 증대로 인해 세포 형질감염 효율을 증대시키는 것으로 밝혀진 폴리(2-프로필 아크릴산)(PPAAc)이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다(문헌[Lackey et al., Abstracts of Scientific Presentations: The Third Annual Meeting of the American Society of Gene Therapy, Abstract No. 33, May 31, 2000-Jun. 4, 2000, Denver, Colo.] 참조). 본 발명에 고려되는 다른 리소좀 회피 성분의 예는 문헌[Stayton, et al. J. Control Release, 1;65(1-2):203-20, 2000]에 논의되어 있다.
바이러스는 통상적인 방법을 이용하여 직접적으로, 또는 간접적으로 기반 입자에 부착될 수 있다(문헌[Hammond et al., Virology 254:37-49 (1999)] 참조). 예를 들면, YCWP를 과요오드산 나트륨으로 산화시켜 알데하이드를 생성할 수 있고, 상기 알데하이드는 추가로 아디프산 다이하이드라지드와 반응하여 ADH-입자를 형성할 수 있다. 이들 ADH-입자는 SPDP(숙신이미딜 3-(2-피리딜다이티오)프로피오네이트) 가교결합제로 유도체화하고 SPDS 유도체화된 아비딘과 반응시켜 아비딘과 접합된 YCWP, 즉, 아비딘-변형된 YCWP를 형성할 수 있다. 아비딘-변형된 YCWP는 비오티닐화 바이러스 입자(예를 들면, 비오티닐화 아데노바이러스)의 접합에 바로 사용할 수 있거나, 또는 이들은 비오틴-폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 추가로 변형시킬 수 있다. 아비딘-변형된 YCWP는 PEI-g-PEG-비오틴으로 포화시켜 PEI 변형된 입자, 곧 PEI-입자를 형성할 수 있다. 아데노바이러스(및 다른 음이온성 바이러스)는 PEI와 바이러스 피막의 음이온성 전하 사이의 전하 상호작용을 통해 PEI-입자에 함유될 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 표적 핵산을, 비오틴-스트렙타비딘 결합을 통해 기반 입자에 접합된 재조합 아데노바이러스 내에서 전달할 수 있다. 기반 입자는 스트렙타비딘을 포함하는 링커를 부착하도록 변형될 수 있고, 재조합 바이러스는 비오티닐화될 수 있다.
다른 공정 또는 메카니즘들도 또한 바이러스 성분을 기반 입자에 부착시키는데 이용할 수 있다. 예를 들면, 항체 부착은 기반 입자에 목적 바이러스를 부착하기 위한 유사하게 효과적인 방법일 수 있다. 포함되는 항체 부착의 한 예는 비드 벡터 입자에 화학적으로 고착된 단일 항체를 포함할 수 있다. 상기 항체는 기반 입자에 부착될 성분에 특이적이다.
또는, 2개 이상의 항체를 사용할 수 있다. 이 경우에, 기반 입자에 부착된 1개의 항체는 제 2 항체에 특이적일 수 있다. 상기 제 2의 항체는 기반 입자에 부착될 바이러스에 특이적이다. 따라서, 바이러스-특이적 항체가 바이러스에 결합하고, 상기 항체는 이어서 기반 입자-결합된 항체에 의해 결합된다. 예를 들면, 염소- 또는 토끼-항-마우스 항체는 비드, 및 특정 바이러스에 결합하기 위해 사용된 마우스 단일클론 항체에 결합될 수 있다. 또는, 또 다른 대안적 구성으로, 2개 이상의 항체들이 각각 입자에 부착될 상이한 바이러스에 특이적일 수 있어서, 상기 입자는 2개 이상의 별개의 성분들(즉, 2개의 별개의 바이러스 입자들)로 구성될 수 있다.
항체 부착의 또 다른 예로, 단백질 A, 또는 항체에 대한 친화성을 갖는 임의의 유사한 분자를 사용한다. 이 예에서, 기반 입자는 항체에 결합하는 단백질 A로 코팅될 수 있고, 이어서 기반 입자에 부착되는 바이러스에 결합된다.
일부 실시양태에서, 기반 입자에 바이러스를 부착시키는 것은 또한 바이러스가 그 표면상에서 특정 단백질을 발현하도록 바이러스를 조작함으로써 달성될 수 있다. 예를 들면, HIV env 단백질을 아데노바이러스 펜톤 단백질 또는 그의 일부로 대체할 수 있다. 이어서, 재조합 바이러스를 항-펜톤 항체를 통해 부착할 수 있으며, 이때 기반 입자에 대한 부착은, 예를 들면, 또 다른 항체 또는 단백질 A에 의해 매개된다. 일부 실시양태에서, 펜톤 단백질도 또한 리소좀 회피 성분으로 작용할 수 있다.
약학 조성물
본원에 개시된 방법에 사용하기에 적합한 약학 조성물은 개시된 전달 벡터 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다.
상기 조성물은 피내, 정맥내, 종양내, 피하, 복강내, 근육내, 구강, 비강, 폐, 안구, 질 또는 직장 투여를 위해 제형화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 개시된 전달 벡터는 피내, 정맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 투여를 위해, 용액, 현탁액, 유화액 등과 같이 제형화된다. 일부 실시양태에서, 개시된 전달 벡터는 경구 투여를 위해, 예를 들어, 정제, 캡슐, 분말, 과립 또는 경구 투여에 적합한 액체로 제형화된다.
일부 실시양태에서, 개시된 전달 벡터는, 예를 들면, 피내, 정맥내, 근육내 또는 피하 주사에 의한 비경구 투여를 위해 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 단위 투여형으로, 선택적으로 보존제 첨가하에, 예를 들면, 앰플에 또는 다회-용량 용기에 제공될 수 있다. 상기 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 유화액과 같은 형태를 가질 수 있고, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형보조제를 함유할 수 있다. 전달 벡터는 또한 약학적으로 허용되는 부형제를 사용하여 제형화될 수 있다. 상기 부형제는 당해 분야에 공지되어 있으나, 전형적으로 생리적으로 허용되는 수용액일 것이다. 생리적으로 허용되는 용액은 필수적으로 무독성인 것들이다. 바람직한 부형제는 불활성이거나 또는 강화성일 것이다.
일부 실시양태에서, 전달 벡터는 또 다른 치료제와 함께 투여되도록 제형화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 전달 벡터는 또 다른 치료제와 차례로 투여되도록 제형화될 수 있다. 예를 들면, 전달 벡터는 대상이 화학치료 요법을 받기 전에 또는 받은 후에 투여될 수 있다.
치료 방법
본원에는 개시된 전달 벡터를 사용하여 종양, 암, 악성 질환 또는 암세포 증식을 치료하는 방법이 제공된다. 보다 특히, 본 개시내용은 단핵구 세포 상에서 키메라 수용체의 발현을 통해 항종양 또는 항암 반응을 시작하도록 면역계를 자극하는 방법을 제공한다. 면역 자극의 메카니즘은 여러 측면이 있을 수 있으며, 키메라 수용체의 성분 및 전달 벡터의 기반 입자에 면역 반응을 자극하기 위한 생체 물질, 예를 들어, 종양 용해물이 함께 부하되는지 여부에 따라 달라질 수 있다. 면역 반응은 또한 키메라 수용체의 특이성(즉, 수용체가 CTLA-4, PD-1, PD-L1, OX40, 또는 본원에 개시된 임의의 다른 표적에 특이적으로 결합하는지 여부) 및 많은 별개의 키메라 수용체들이 해당 단핵구 세포 상에서 발현되는 방법에 따라 달라질 수 있는데, 그 이유는 개시된 전달 벡터를 사용하여 단일 단핵구 세포 상에서 여러 별개의 키메라 수용체들을 발현할 수 있기 때문이다.
일부 실시양태에서, 개시된 전달 벡터는 대식세포 또는 수지상 세포와 같은 단핵구 세포, 면역관문 단백질, 예를 들어, CTLA-4, PD-1, PD-L1, OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열 및/또는 발현 벡터, 또는 표 1에 개시된 임의의 다른 표적 단백질에 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 개시된 전달 벡터는 단핵구 세포, 상이한 표적 특이성 및/또는 상이한 세포내 TLR 도메인을 갖는, 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 이상의 상이한 키메라 수용체를 암호화하는 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 이상의 핵산 서열 및/또는 발현 벡터에 제공될 수 있다. 상기 키메라 수용체가 종양 연관 대식세포(TAM)와 같은 단핵구 세포의 표면 상에서 발현될 때, 상기 세포는 자체로 표적 단백질에 결합하고 종양 면역 반응을 하향조절하는 신호전달을 방지함으로써 면역관문 억제제로서 작용할 수 있다.
예를 들면, CD152(분화 클러스터 152)로도 알려진 CTLA-4는 면역관문으로 작용함으로써 면역 반응을 하향조절하는 단백질 수용체이다. CTLA-4는 T 조절세포 상에서 구조적으로 발현되지만, 활성화후에는 통상적인 T 세포에서만 상향조절된다. 상기 CTLA-4는 항원-제시 세포의 표면상에서 CD80 또는 CD86에 결합할 때 "오프" 스위치로 작용한다. CTLA-4는 T-세포 공자극 단백질, CD28과 상동성이고, 두 분자 모두 항원-제시 세포 상에서, 각각 B7-1 및 B7-2로도 불리는 CD80 및 CD86에 결합한다. CTLA-4는 CD28보다 큰 친화성 및 결합활성 하에 CD80 및 CD86에 결합하므로, 그의 리간드에 대해 CD28을 능가할 수 있다. CTLA-4는 T 세포에 억제 신호를 전달하는 반면, CD28은 자극 신호를 전달한다. CTLA-4는 또한 조절 T 세포에서 발견되며, 그의 억제 기능에 기여한다. T 세포 수용체 및 CD28을 통한 T 세포 활성화는 CTLA-4의 증가된 발현을 야기한다.
CTLA-4가 T 세포 상에서 작용하는 메카니즘은 여전히 다소 논란의 여지가 있다. 생화학적 증거는 CTLA-4가 T 세포 수용체(TCR)에 포스파타제를 동원하므로, 신호를 약화시킴을 시사한다. 보다 최근의 작업은 CTLA-4가 생체내에서 항원-제시 세포의 막으로부터 B7-1 및 B7-2를 포획하고 제거하여, 이들을 CD28의 촉발에 이용할 수 없게 함으로써 기능할 수 있음을 시사하였다. 단핵구 세포, 특히 TAM과 같은 종양상 내의 단핵구 세포 상에서 개시된 키메라 수용체의 발현은 CTLA-4를 포박하여, CD28 신호전달이 전파되고 면역계를 자극하게 할 수 있다. 이것은 물론 단지 한 예일뿐이고, PD-1 또는 PD-L1과 같은 대안적 면역관문 단백질을 표적화함으로써 유사한 결과들이 달성될 수 있다.
따라서, 본 개시내용은 종양-연관 대식세포(TAM)를 면역관문 단백질과 결합하고/하거나 억제할 수 있는 키메라 수용체를 발현하도록 조작함으로써 면역계를 활성화시키는 방법을 제공한다. 종양상 내에서 또는 종양 인접 림프절(예를 들어, 종양-주변 림프절) 내에서 개시된 수용체의 발현은 면역관문 신호전달을 경쟁적으로 차단하고, 종양의 파괴 및 질환의 치료를 야기하는 강하고 종양-특이적인 종양내 면역관문 억제를 유도할 수 있다.
상기 독특한 작용 메카니즘은 현재의 면역관문 억제 치료 상태에 비해 극적인 개선이다. 현재, 펨브롤리주맙(Pembrolizumab)(케이트루다(Keytruda)), 니볼루맙(Nivolumab)(오프디보(Opdivo)), 아테졸리주맙(Atezolizumab)(테센트리크(Tecentriq)), 및 이필리무맙(Ipilimumab)(예르보이(Yervoy))과 같은 면역관문 억제제들이 다양한 유형의 암을 치료하는데 효과적이다. 그러나, 이들 약물은 전신 투여되므로, 생명을 위협할 수 있는 비표적(off-target) 효과를 야기한다. 실제로, 면역관문 억제제는, 피부, 위장, 간, 내분비 및 다른 기관계 부작용을 포함할 수 있는, 면역-관련 이상반응(irAE)으로 불리는 독특한 스펙트럼의 부작용을 야기하는 것으로 알려져 있다. 개시된 전달 벡터는 종양 미세환경 내에서 또는 그 부근에서만 암호화된 키메라 수용체를 발현함으로써 상기 비표적 효과를 방지하거나 최소화하여, 세포-기반 종양 표적화를 통해 부작용을 감소시킨다.
OX40 작용제(예를 들면, OX40L 또는 항-OX40 항체, 예를 들어, 9B12, MOXR0916, PF-04518600, MEDI0562, MEDI6469, MEDI6383, PF-04518600 또는 BMS 986178의 세포내 도메인)를 표적 결합 도메인으로 사용하는 실시양태에서, 키메라 수용체는 T 세포 활성화 및 T 세포 효과기 기능을 조절할 것이다. OX40을 작동시키는 것은, 주로 과도한 T 세포 사멸을 방지하는 항-세포자멸 신호를 전달함으로써, 효과기 T 세포가 연장된 기간동안 생존하고 증식을 지속하게 할 것이다. 이것은 궁극적으로 1차 면역 반응을 견디고 기억 T 세포로 진화한 다음, 항원이 나중에 다시 접하게 될 때 2차 면역 반응에서 대응할 수 있는 더 많은 수의 T 세포를 야기한다. 더욱이, 전임상 연구는 또한 OX40 작용제가, 높은 수준의 OX40을 발현하는 FoxP3+ 조절 T (Treg) 세포의 수를 고갈시킴으로써 추가의 항암 활성을 나타낼 수 있음을 밝혔다. 따라서, OX40은 개시된 키메라 수용체가 결합하기에 특히 매력적인 표적 분자이다.
상기에서 논의한 면역관문 억제 작용 메카니즘 및/또는 OX40 작용제의 작용 메카니즘 이외에, 키메라 수용체를 발현하는 개시된 단핵구 세포는 사이토카인 발현을 자극함으로써 면역 활성화 및 항종양 반응을 추가로 유도할 수 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 키메라 수용체는 TLR 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어, TLR4 (참조 서열 NP_003257, NP_612564, 또는 NP_612567; 유니프롯(UniProt) O00206; 엔트레즈(Entrez) 7099) 또는 TLR9 (참조 서열 NP_059138; 유니프롯 Q9NR96; 엔트레즈 54106)의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 키메라 수용체의 그 표적 분자(예를 들면, CTLA-4, PD-1, PD-L1, OX40 등)로의 결합은 세포내 도메인을 활성화시킬 것이다, 즉, TLR의 세포내 도메인을 사용하는 경우, 표적 결합은 신호전달 연속반응을 촉발하여 전-염증성 사이토카인 반응을 유도할 것이다. 정확한 사이토카인 반응은 사용되는 TLR 도메인에 따라 달라질 것이다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체는, 공격적 항-종양 면역 반응을 시작하고 통상적으로 종양 미세환경의 특징인 면역 억제 및/또는 면역 회피 신호를 극복하거나 회피하기 위해, M1-형 사이토카인, 예를 들어, IL-12, IFN-α, IRN-γ, TNF-α, IL-6, 및/또는 IL-1β의 발현을 촉발하도록 설계될 것이다. 상기 메카니즘은 CAR T-세포와 같은 다른 세포-기반 치료 접근방법과는 다른데, 그 이유는 종양/암이 직접 공격당하거나 포식되지 않고 대신에 면역 활성인 종양 주위의 환경을 야기하고 확장시킴으로써 상기 종양/암이 파괴되기 때문이다. 상기 새로운 메카니즘의 결과로, 키메라 수용체-발현 세포가 종양 또는 종양 세포와 직접 접촉하지 않는 경우에도 암 또는 종양이 치료될 수 있다. 예를 들면, 종양 인접 림프절, 예를 들어, 종양-주변 림프절에 키메라 수용체-발현 세포의 편재는 종양을 파괴시키도록 면역계를 활성화시키기에 충분할 것이다. 따라서, 본원에 개시된 바와 같은 면역관문-특이적 키메라 수용체를 발현하는 단핵구 세포는 적어도 2가지의 독특한 방법으로 항-종양 이점을 제공할 수 있다.
더욱이, 개시된 전달 벡터가 기반 입자로 YCWP를 포함하는 경우, 상기 벡터는 종양 용해물과 같은 생체 물질을 YCWP에 부하시킴으로써 훨씬 더 항-종양 활성을 가질 수 있다. YCWP 내에 종양 용해물과 같은 생체 물질의 혼입은, 전달 벡터가 단핵구, 대식세포, 수지상 세포 또는 미성숙 수지상 세포를 포함하여 단핵 포식계의 세포와 같은 항원 제시 세포(APC)에 의해 흡수되는 경우 백신-유사 기능을 제공한다. 백신접종 분야에서, 단핵 포식계의 세포들은 "적절한" 항원 제시 세포로 간주되므로, 백신 전달에 이상적인 표적이다. APC 내에 항원을 제공하는 것은 임의의 다른 세포 유형 내에서 상기 동일한 항원의 발현보다 강한 세포 면역 반응을 생성하는데 훨씬 더 효과적인 것으로 공지되어 있다. 따라서, YWCP에 종양 용해물과 같은 항원 생체 물질의 부하는 클래스 I MHC 및 클래스 II MHC 분자를 통한 항원 제시 세포 상에 종양 항원을 제공하여, 개시된 전달 벡터에 의해 유도된 면역 반응을 극적으로 증대시킬 것이다.
종양상 내로의 새로운 대식세포의 지속적인 침윤으로 인해, 개시된 전달 벡터는, 피내, 피하, 전신(예를 들면, 비경구)으로, 또는 종양 또는 표적 림프절(즉, 종양학자들이 전이 징후를 평가하는 림프절과 같은 종양 주변 림프절) 내로의 직접 주사에 의해 투여되는 경우 상기 개선된 효과들을 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 개시된 전달 벡터는 종양 림프절 부근의 피부에 피내 주사하는데, 이것이 포식 단핵구에 의한 최대 흡수량을 유도할 수 있기 때문이다.
개시된 전달 벡터는 단핵구 세포(예를 들면, 대식세포, 수지상 세포 또는 TAM)에 매우 선택적이다. 그러므로, 상기 전달 벡터는 단핵구 세포에 발현을 선택적으로 도입하는 것을 포함하는 임의의 용도에 유용하다. 일부 실시양태에서, 암, 및 특히 고형 종양을 치료하기 위해 개시된 벡터를 투여한다. 추정상의 작용 메카니즘에 대한 상기 설명을 고려하여, 개시된 전달 벡터는 거의 임의 유형의 암, 특히 유방암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 신경교종, 수모세포종, 신경모세포종, 윌름스 종양, 횡문근육종, 골육종, 간암, 췌장암, 흑색종, 전립선암, 결장암, 방광암, 두경부암, 식도암 및 안구 흑색종을 포함할 수 있으나 이로 한정되지는 않는 하나 이상의 고형 종양을 포함하는 암을 치료하는데 사용할 수 있는 것으로 생각된다. 전형적인 방법은 단핵구 세포를 전달 벡터와 접촉시켜, 전달 벡터가 단핵구 세포에 의해 포식되고 키메라 수용체가 이어서 상기 세포의 표면상에서 발현되는 것을 포함한다.
상기 언급된 바와 같이, 전달 벡터는 종양 내에 직접 주사할 수 있거나, 또는 피내, 피하 또는 전신으로(즉, 대상의 복막 내로) 투여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 전달 벡터는 종양 또는 종양-주변 림프절에 가깝게 피내로 투여할 수 있다. 고형 종양내로 대식세포가 지속적으로 유입되므로, 전신적으로 전달 입자를 포식하는 대식세포도 여전히 종양상에 침윤하여 종양을 치료하거나 종양 성장을 방지하도록 작용할 수 잇다. 더욱이, 일부 실시양태에서, 키메라 수용체의 발현은 저산소증-유도된 프로모터의 조절하에 있을 수 있으며, 이 경우 키메라 수용체는 일단 전달 벡터를 포식한 단핵구 세포가 종양상에 침윤하였을 때만 발현될 것이다.
양자택일로 또는 추가로, 전달 벡터는 일단 치료될 종양 또는 암에 근접한 림프절에서 발현됨으로써 대식세포에 의해 포식되면 작용할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 개시된 전달 벡터는 치료의 표적이 되는 종양에 최근접 림프절(예를 들면, "표적 림프절")에 근접한 영역에서 피내 또는 피하로 투여할 수 있다. 이러한 의미에서, 표적 림프절에 근접한 투여는 표적 림프절 내에 또는 가능한 한 표적 림프절에 가깝게, 그러나 임의의 다른 림프절보다는 표적 림프절에 적어도 더 가깝게 투여하는 것을 의미한다. 일단 표적 림프절에서, 전달 벡터를 포식한 대식세포는 키메라 수용체를 발현할 것이다. 이렇게, 개시된 전달 벡터 및 방법을 이용하여 표적 림프절의 유전자 구성을 변형할 수 있으며, 이것은 항-종양 면역 반응을 활성화시키고 상기 반응을 종양 부위에 국소화시키는 것을 촉진할 것이다.
일부 실시양태에서, 단핵구 세포를 생체내 또는 시험관내에서 개시된 전달 벡터와 접촉시킬 수 있다. 따라서, 생체내 및 생체외 치료 방법은 둘 다 본 발명에 고려된다. 단핵구 세포를 표적화한 선행 기술의 방법은 주로, 단리된 환자의 단핵구 세포 및 상기 단핵구 세포를 시험관내에서 조작한 다음 그 세포를 환자에게 되돌려 보내는 것에 의존한다. 상기 실시양태들이 본 개시내용에 고려되지만, 개시된 전달 벡터는, 이들을 생체내 및 생체외 방법 모두에서 사용될 수 있기 때문에 실질적인 개선을 제공한다. 더욱이, 투여 경로의 변화는 표적화된 단핵구 세포를 변화시킬 수 있다. 예를 들면, 정맥내 주사의 경우, 대식세포가 표적화될 수 있으며, 피하 주사의 경우에는 수지상 세포가 표적화될 수 있지만, 종양-주변 림프절 부근에 피내 투여의 경우에는 TAM이 표적화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 생체내 방법은 전달 벡터를 비경구로, 예를 들면, 정맥내, 근육내, 피하 또는 피내로, 바람직하게는 표적 림프절과 근접하여 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 생체외 방법은 단핵구 세포를 체외에서 접촉시킨 다음 접촉된 세포를 그를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 상기 세포는 또한 비경구로, 예를 들면, 주입을 통해 투여할 수 있다. 생체외 방법으로 전달 벡터에 의해 접촉되는 단핵구 세포는 자기유래 세포이거나 또는 동종이계 세포일 수 있다. 생체외 방법에 사용하기 위한 단핵구 세포는 공여체로부터 또는 환자(즉, 개시된 비드 벡터와 접촉할 단핵구 세포의 궁극적인 수용자)로부터 백혈구성분채집술의 공지된 방법에 의해 단리할 수 있다.
종양(1차 종양 및 전이종양 둘 다 마찬가지로)이 수 밀리미터 직경 이상으로 성장하여 산소가 부족하게 될 때, 종양 내에 저산소성 미세환경을 형성하는 것으로 알려져 있다. 상기 종양이 산소 결핍이 될 때, 상기 종양은 신호 단백질, 예를 들면, 혈관생성 인자를 분비하여 종양의 저산소성 영역 내에 혈액 공급을 증가시킨다.
혈관생성 유도 메카니즘의 일부로서, 저산소성 종양은 단핵구를 종양으로 유인하는 신호전달 케모카인 단백질을 분비한다. 이어서, 성장하는 종양 부위로 유인된 단핵구는 대식세포가 되고 종양 혈관생성 유도를 조장한다. 그러므로, 효과적인 종양 표적화 방법은 키메라 수용체를 암호화하는 전달 벡터 치료 효과량을 암 환자에게 직접적으로 또는 단핵구 세포와의 생체외 접촉을 통해 투여하는 것을 포함한다. 포식된 전달 벡터를 함유하는 단핵구 세포는 종양 부위로 유인되고, 저산소증-유도된 프로모터의 조절하에 발현이 이루어지는 경우, 종양 미세환경에서 키메라 수용체를 선택적으로 발현할 것이다.
일부 실시양태에서, 전달 벡터의 투여는 종양-연관 대식세포에 의해 항-면역관문 키메라 수용체의 발현을 제공할 것이다. 예를 들면, 전달 벡터를 포식한 TAM은 종양 미세환경에서 항-CTLA-4, 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 키메라 수용체를 발현하여, CTLA-4 및/또는 PD-1 면역관문 신호전달의 억제를 야기할 것이다.
일부 실시양태에서, 치료되는 종양 또는 암은 신경계 암, 유방암, 위장 암(예를 들면, 결장암), 신세포 암종(예를 들면, 투명 세포 신세포 암종), 또는 비뇨생식기 암(예를 들면, 난소암)을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 암은 흑색종, 폐암(예를 들면, 비-소세포 폐암), 두경부암, 간암, 췌장암, 뼈암, 전립선암, 방광암 또는 혈관암이다. 사실상, 개시된 방법은 종양, 암, 악성 질환 또는 암세포 증식을 치료하는데 광범위한 접근방법을 제공하므로, 치료될 질환의 유형은 특별히 제한되지 않는다.
투여 요법은 최적의 목적하는 반응(예를 들면, 종양 퇴행 또는 관해와 같은 치료 반응)을 제공하도록 조정할 수 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 전달 벡터의 단일 볼루스를 투여할 수 있지만, 일부 실시양태에서는, 여러개의 분할 용량을 시간에 걸쳐 투여할 수 있거나, 또는 상기 용량을 상황이 가리키는 대로 비례적으로 감소 또는 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 개시된 전달 벡터는 1 주일에 1회 또는 2회 피하 또는 피내 주사로 투여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 개시된 전달 벡터는 1 개월에 1회 또는 2회 피내 주사로 투여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 개시된 전달 벡터는 매주 1회, 2 주에 1회, 3 주에 1회, 4 주에 1회, 2 개월에 1회, 3 개월에 1회, 4 개월에 1회, 5 개월에 1회 또는 6 개월에 1회 투여될 수 있다.
용량도 마찬가지로 최적의 목적하는 반응(예를 들면, 종양 퇴행 또는 관해와 같은 치료 반응)을 제공하도록 조정할 수 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 개시된 전달 벡터의 용량은 1.0 x 108 내지 1.0 x 1012 개의 벡터를 포함할 수 있다. 예를 들면, 단일 용량은 1.0 x 108, 1.5 x 108, 2.0 x 108, 2.5 x 108, 3.0 x 108, 3.5 x 108, 4.0 x 108, 4.5 x 108, 5.0 x 108, 5.5 x 108, 6.0 x 108, 6.5 x 108, 7.0 x 108, 7.5 x 108, 8.0 x 108, 8.5 x 108, 9.0 x 108, 9.5 x 108, 1.0 x 109, 1.5 x 109, 2.0 x 109, 2.5 x 109, 3.0 x 109, 3.5 x 109, 4.0 x 109, 4.5 x 109, 5.0 x 109, 5.5 x 109, 6.0 x 109, 6.5 x 109, 7.0 x 109, 7.5 x 109, 8.0 x 109, 8.5 x 109, 9.0 x 109, 9.5 x 109, 1.0 x 1010, 1.5 x 1010, 2.0 x 1010, 2.5 x 1010, 3.0 x 1010, 3.5 x 1010, 4.0 x 1010, 4.5 x 1010, 5.0 x 1010, 5.5 x 1010, 6.0 x 1010, 6.5 x 1010, 7.0 x 1010, 7.5 x 1010, 8.0 x 1010, 8.5 x 1010, 9.0 x 1010, 9.5 x 1010, 1.0 x 1011, 1.5 x 1011, 2.0 x 1011, 2.5 x 1011, 3.0 x 1011, 3.5 x 1011, 4.0 x 1011, 4.5 x 1011, 5.0 x 1011, 5.5 x 1011, 6.0 x 1011, 6.5 x 1011, 7.0 x 1011, 7.5 x 1011, 8.0 x 1011, 8.5 x 1011, 9.0 x 1011, 9.5 x 1011, 또는 1.0 x 1012 개의 벡터를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 용량은 약 9.5 x 108, 약 9.75 x 108, 약 9.85 x 108, 약 9.95 x 108, 약 1.0 x 109, 약 1.1 x 109, 약 1.15 x 109, 약 1.2 x 109, 약 1.25 x 109, 약 1.3 x 109, 약 1.35 x 109, 약 1.4 x 109, 약 1.45 x 109, 또는 약 1.5 x 109 개의 벡터일 수 있다.
또한, 개시된 치료 방법은 개시된 비드 벡터 이외에 제 2의 치료 화합물의 투여를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 상기 추가의 치료 화합물은 CAR-T 세포, 종양-표적화 항체, 면역 반응 강화 약제, 면역관문 억제제, 또는 소분자 약물, 예를 들어, BTK 억제제(예를 들면, 이브루티닙), EGFR 억제제(예를 들면, CK-101), BET 억제제(예를 들면. CK-103), PARP 억제제(예를 들면, 올라파립 또는 CK-102), PI3K델타 억제제(예를 들면. TGR-1202), BRAF 억제제(예를 들면. 베무라페닙(Vemurafenib)), 또는 당해 분야에 공지된 다른 화학치료제일 수 있다.
특별한 치료 요법은 해당 환자의 결과를 개선할 것인지 여부, 즉 치료가 재발 위험성을 감소시키거나 해당 암 또는 종양의 무진행 생존 가능성을 증가시킬 것인지에 따라 평가할 수 있다.
따라서, 본 개시내용의 목적에 있어서, 대상은 목적하는 임상 결과를 포함하여 하나 이상의 유리하거나 목적하는 결과가 수득되는 경우 치료된다. 예를 들면, 유리하거나 목적하는 임상 결과는 다음 중 하나 이상을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다: 질환으로부터 비롯된 하나 이상의 증상의 감소, 질환을 앓고 있는 환자들의 삶의 질의 증가, 질환을 치료하기 위해 필요한 다른 약물의 용량의 감소, 질환 진행의 지연, 및/또는 개인들의 생존 연장.
더욱이, 상기 방법의 대상은 일반적으로 암 환자이긴 하지만, 환자의 연령은 제한되지 않는다. 개시된 방법은, 모든 연령 군 및 코호트에 걸쳐서 다양한 재발 및 진단 결과 하에 종양, 암, 악성 질환 또는 암세포 증식을 치료하는데 유용하다. 따라서, 일부 실시양태에서, 대상은 소아 대상일 수 있는 반면, 다른 실시양태에서, 대상은 성인 대상일 수 있다.
하기의 실시예는 본 개시내용을 예시하기 위해 주어진다. 본 발명은 이들 실시예에 기술된 특정한 조건 또는 세부사항으로 한정되지 않음을 이해해야 한다.
실시예
실시예 1 - 렌티바이러스의 제조
개시된 입자들의 다양한 실시양태에서, 기반 입자에 부착된 비-감염성 바이러스는 렌티바이러스일 수 있다. 그러나, 아데노바이러스 및 AAV와 같은 다른 비-감염성 바이러스도 또한 개시된 입자 내에 도입하기에 적합하다. 본 실시예는 하나의 예시적인 렌티바이러스의 제조를 상술한다.
293 FT 세포에서 제3 세대 패키징 믹스(어플라이드 바이올로지컬 머티리얼스 인코포레이티드(Applied Biological Materials Inc.), 캐나다 리치몬드 소재)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 렌티바이러스 벡터(도 4에 나타냄)를 렌티바이러스 입자 내에 패키징하였다. 렌티바이러스 입자를 퓨레트로(PuRetro) 렌티바이러스 정제 키트를 사용하여 상등액으로부터 정제하고, qPCR 렌티바이러스 적정 키트(어플라이드 바이올로지컬 머티리얼스 인코포레이티드, 캐나다 리치몬드 소재)를 사용하여 역가를 측정하였다.
실시예 2 - 발현 세포주의 수립
다양한 세포주를 사용하여 기반 입자에 부착되는 비-감염성 바이러스(예를 들면, 렌티바이러스)를 발현시킬 수 있다. 본 실시예는 예시적인 발현 세포주의 생성을 상술한다.
인간 단핵구 THP-1 세포를 12 웰 플레이트에서 10% FBS 및 항생제로 보충된 RPMI 배지 1640 배지에 배양시켰다. THP-1 세포를 폴리브렌(8 μg/ml)의 존재하에 10의 MOI에서 렌티바이러스 입자로 형질도입시켰다. 바이러스 감염된 THP-1 세포를 퓨로마이신(1 μg/ml)을 사용해 선별하여 THP-1 발현 세포주를 수립하였다.
실시예 3 - 개시된 입자에 의한 CTLA 자극
항-CTLA4 scFv, CD8 막관통 도메인 및 TLR4 세포내 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 발현하는 THP-1 세포(핵산 서열은 도 1에 나타내었고, 아미노산 서열은 도 2에 나타내었다)를 24 웰 플레이트에서 배양하고, 재조합 CTLA4 단백질을 500 ng/ml로 배양물에 첨가하였다. 밤새 배양한 후에, 전-염증성 사이토카인, 특히 IL-12의 측정을 위해 상등액을 수거하고, ELISA로 측정하였다. 리포폴리사카라이드(LPS)는 TLR의 전형적인 자극제이며, 이것을 10 ng/ml의 농도에서 양성 대조군으로 사용하였다. 상기 실험에 대한 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5에서 나타나듯이, 재조합 CTLA4의 첨가는 IL-12의 발현에 농도-의존성 증가를 야기하여, 키메라 수용체를 발현하는 세포에서 강한 면역 활성화 반응을 시사하였다. 상기 결과들은 키메라 수용체의 그 표적(CTLA4)에 대한 결합이 다른 M1-형 사이토카인, 예를 들어, IFN-α, IRN-γ, TNF-α, IL-6, 및/또는 IL-1β의 생성을 유사하게 자극할 것임을 시사한다.
실시예 4 - 예측성 생체내 연구
C57 B6 마우스에게 1 x 106 B16 뮤린 흑색종 세포를 주사한다. 12 일후에, 마우스는 뚜렷한 이종이식 종양을 갖는다.
B16 뮤린 흑색종 세포를 주사한지 12 일 후에, 마우스를 2개 전달 벡터 중 하나로 처리한다. 대조군 마우스에게는 벡터의 바이러스 성분으로 1 x 107 개 녹색 형광 단백질(GFP)-발현 아데노바이러스를 함유하는 1 x 106 개의 전달 벡터를 피내에 투여한다. 실험군의 마우스에게는 항-CTLA4 scFv, 링커, CD8 알파쇄 힌지 및 막관통 도메인, 및 세포질 TLR4 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 발현하도록 설계된 1 x 107 개 아데노바이러스를 함유하는 1 x 106 개의 전달 벡터를 피내 주사한다.
각 마우스의 종양의 부피는 단일 용량 처리 후에 측정한다. 대조군의 모든 마우스들은 처리후 28 일 이전에 죽을 것으로 예상된다. 키메라 수용체-발현 전달 벡터를 투여받은 실험군의 모든 마우스들은 처리후 45 일을 넘어 생존할 것으로 예상되며, 그들의 종양 부피는 감소할 것으로 예상된다.
당해 분야의 숙련가라면 본 개시내용이 목적을 수행하고 언급된 목적 및 이점들 뿐 아니라 그 안에 내포된 것들을 달성하기에 적합함을 쉽게 인지할 것이다. 당해 분야의 숙련가들에게 본 개시내용의 변경 및 다른 용도들도 고려될 것이다. 상기 변경들은 본 개시내용의 진의 안에 포함되고, 본 개시내용의 비-제한적 실시양태들을 나타낸 청구항들의 범위로 한정된다.
SEQUENCE LISTING <110> ORBIS HEALTH SOLUTIONS, LLC <120> DELIVERY VECTORS AND PARTICLES FOR EXPRESSING CHIMERIC RECEPTORS AND METHODS OF USING THE SAME <130> 096630-0192 <140> PCT/US2020/034960 <141> 2020-05-28 <150> US 62/854,082 <151> 2019-05-29 <160> 45 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 108 <212> PRT <213> 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Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 35 40 45 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 50 55 60 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 65 70 75 80 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys 85 90 95 Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 100 105 110 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 115 120 125 Lys <210> 39 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 39 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu 1 5 10 15 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 100 105 <210> 40 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 40 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Gln Tyr Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 40 <210> 41 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 41 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 42 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 42 Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His 1 5 10 15 Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln 20 25 30 Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile 35 40 <210> 43 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 43 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 44 <211> 1803 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 44 atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60 gacgatatca ggcgcgccga cattgtgatg acccagacta cactttccct gcctgtcagt 120 cttggagatc aagcctccat ctcttgcaga tctagtcaga gcattgtaca tagtaatgga 180 aacacctatt taggatggta cctgcagaaa ccaggccagt ctccaaagct cctgatctac 240 aaagtttcca accgattttc tggggtccca gacaggttca gtggcactgg atcagggaca 300 gatttcacac tcaagatcag cagagtggag gctgaggatc tgggagttta ttactgcttt 360 caaggttcac atgttcctta cacgttcgga ggggggacca agctggaaat aaaacgggct 420 gatgctgcac caactgtatc cggatccgga ggtgggagtg gtggcggaag tggcggaggg 480 agcgaggcaa agctgcagga gtctggacct gtgctggtga agcctggggc ttcagtgaag 540 atgtcctgta aggcttctgg atacacattc actgactact atatgaactt ggtgaagcaa 600 agccatggaa agagccttga gtggattgga gttattaatc cttataacgg tgatactagc 660 tacaaccaga agttcaaggg caaggccaca ttgactgttg acaagtcctc cagcacagcc 720 tacatggagc tcaacagcct gacatctgag gactctgcag tctattactg tgcaagatac 780 tatggttcct ggtttgctta ctggggccaa gggactctga tcactgtctc tacagccaaa 840 acaacacccc catcagtcta tccactggcc cctagatctt ctcgagaaca aaaactcatc 900 tcagaagagg atctgggtgg cggaggttct ggtggcggag gttctggtgg cggaggttct 960 tcggccctga gcaactccat catgtacttc agccacttcg tgccggtctt cctgccagcg 1020 aagcccacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 1080 cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 1140 gggctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc 1200 cttctcctgt cactggttat caccctttac tgcaaccaca agttctattt tcacctgatg 1260 cttcttgctg gctgcataaa gtatggtaga ggtgaaaaca tctatgatgc ctttgttatc 1320 tactcaagcc aggatgagga ctgggtaagg aatgagctag taaagaattt agaagaaggg 1380 gtgcctccat ttcagctctg ccttcactac agagacttta ttcccggtgt ggccattgct 1440 gccaacatca tccatgaagg tttccataaa agccgaaagg tgattgttgt ggtgtcccag 1500 cacttcatcc agagccgctg gtgtatcttt gaatatgaga ttgctcagac ctggcagttt 1560 ctgagcagtc gtgctggtat catcttcatt gtcctgcaga aggtggagaa gaccctgctc 1620 aggcagcagg tggagctgta ccgccttctc agcaggaaca cttacctgga gtgggaggac 1680 agtgtcctgg ggcggcacat cttctggaga cgactcagaa aagccctgct ggatggtaaa 1740 tcatggaatc cagaaggaac agtgggtaca ggatgcaatt ggcaggaagc aacatctatc 1800 taa 1803 <210> 45 <211> 600 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 45 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Asp Ile Arg Arg Ala Asp Ile Val Met Thr Gln 20 25 30 Thr Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser 35 40 45 Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu 50 55 60 Gly Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 65 70 75 80 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Thr 85 90 95 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 100 105 110 Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr 115 120 125 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro 130 135 140 Thr Val Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ser Glu Ala Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Gly 165 170 175 Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp 180 185 190 Tyr Tyr Met Asn Leu Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp 195 200 205 Ile Gly Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys 210 215 220 Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 225 230 235 240 Tyr Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 245 250 255 Cys Ala Arg Tyr Tyr Gly Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 260 265 270 Leu Ile Thr Val Ser Thr Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro 275 280 285 Leu Ala Pro Arg Ser Ser Arg Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp 290 295 300 Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 305 310 315 320 Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val 325 330 335 Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr 340 345 350 Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala 355 360 365 Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe 370 375 380 Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val 385 390 395 400 Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Lys Phe Tyr 405 410 415 Phe His Leu Met Leu Leu Ala Gly Cys Ile Lys Tyr Gly Arg Gly Glu 420 425 430 Asn Ile Tyr Asp Ala Phe Val Ile Tyr Ser Ser Gln Asp Glu Asp Trp 435 440 445 Val Arg Asn Glu Leu Val Lys Asn Leu Glu Glu Gly Val Pro Pro Phe 450 455 460 Gln Leu Cys Leu His Tyr Arg Asp Phe Ile Pro Gly Val Ala Ile Ala 465 470 475 480 Ala Asn Ile Ile His Glu Gly Phe His Lys Ser Arg Lys Val Ile Val 485 490 495 Val Val Ser Gln His Phe Ile Gln Ser Arg Trp Cys Ile Phe Glu Tyr 500 505 510 Glu Ile Ala Gln Thr Trp Gln Phe Leu Ser Ser Arg Ala Gly Ile Ile 515 520 525 Phe Ile Val Leu Gln Lys Val Glu Lys Thr Leu Leu Arg Gln Gln Val 530 535 540 Glu Leu Tyr Arg Leu Leu Ser Arg Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Glu Asp 545 550 555 560 Ser Val Leu Gly Arg His Ile Phe Trp Arg Arg Leu Arg Lys Ala Leu 565 570 575 Leu Asp Gly Lys Ser Trp Asn Pro Glu Gly Thr Val Gly Thr Gly Cys 580 585 590 Asn Trp Gln Glu Ala Thr Ser Ile 595 600

Claims (63)

  1. (i) 기반 입자, 및
    (ii) 상기 입자의 외부에 부착된, 표적 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 암호화하는 핵산을 포함하는 비-감염성 바이러스
    를 포함하는 전달 벡터.
  2. 제 1 항에 있어서,
    키메라 수용체의 표적 결합 도메인이 면역관문 단백질에 결합하는 scFv를 포함하는, 전달 벡터.
  3. 제 2 항에 있어서,
    면역관문 단백질이 CTLA-4, PD-1, PD-L1, LAG3, B7.1, B7-H3, B7-H4, TIM3, VISTA, CD137, OX40, CD40, CD27, CCR4, GITR, NKG2D 및 KIR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 전달 벡터.
  4. 제 3 항에 있어서,
    면역관문 단백질이 CTLA-4인, 전달 벡터.
  5. 제 4 항에 있어서,
    표적 결합 도메인이 서열번호 3, 또는 IgK 리더 서열(leader sequence)이 제거된 서열번호 3을 포함하는 scFv를 포함하는, 전달 벡터.
  6. 제 4 항에 있어서,
    표적 결합 도메인이 서열번호 1의 가변 중쇄 서열 및 서열번호 2의 가변 경쇄 서열을 포함하는, 전달 벡터.
  7. 제 3 항에 있어서,
    면역관문 단백질이 PD-1인, 전달 벡터.
  8. 제 7 항에 있어서,
    표적 결합 도메인이 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 세미플리맙, 스파탈리주맙, 캄렐리주맙 또는 신틸리맙의 각각의 가변 중쇄 서열 및 가변 경쇄 서열에 상응하는 가변 중쇄 서열 및 가변 경쇄 서열을 포함하는, 전달 벡터.
  9. 제 3 항에 있어서,
    면역관문 단백질이 PD-L1인, 전달 벡터.
  10. 제 9 항에 있어서,
    표적 결합 도메인이 더발루맙, 아테졸리주맙 또는 아벨루맙의 각각의 가변 중쇄 서열 및 가변 경쇄 서열에 상응하는 가변 중쇄 서열 및 가변 경쇄 서열을 포함하는, 전달 벡터.
  11. 제 1 항에 있어서,
    표적 결합 도메인이 OX40에 특이적인, 전달 벡터.
  12. 제 11 항에 있어서,
    표적 결합 도메인이, 9B12(NCT01644968), MOXR0916, PF-04518600, MEDI0562, MEDI6469, MEDI6383, PF-04518600 또는 BMS 986178의 CDR 및/또는 가변 도메인 영역을 포함할 수 있는 scFv의 각각의 가변 중쇄 서열 및 가변 경쇄 서열에 상응하는 가변 중쇄 서열 및 가변 경쇄 서열을 포함하는 scFv를 포함하는, 전달 벡터.
  13. 제 11 항에 있어서,
    표적 결합 도메인이 OX40L의 세포외 도메인을 포함하는, 전달 벡터.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    막관통 도메인이 톨-유사(toll-like) 수용체, CD28, CD4, CD8, 4-1BB, CD27, ICOS, OX40, HVEM 또는 CD30의 적어도 막관통 부분을 포함하는, 전달 벡터.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    막관통 도메인이 서열번호 16 내지 서열번호 25 중 어느 하나를 포함하는, 전달 벡터.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포내 신호전달 도메인이 톨-유사 수용체(TLR)의 세포내 도메인을 포함하는, 전달 벡터.
  17. 제 16 항에 있어서,
    TLR이 TLR4 또는 TLR9인, 전달 벡터.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포내 신호전달 도메인이 서열번호 26 또는 서열번호 27을 포함하는, 전달 벡터.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    비-감염성 바이러스가 아데노바이러스인, 전달 벡터.
  20. 제 19 항에 있어서,
    아데노바이러스가 재조합 아데노바이러스인, 전달 벡터.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    비-감염성 바이러스가 또한 비-복제성인, 전달 벡터.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    키메라 수용체를 암호화하는 핵산이 발현 벡터 내에 포함되는, 전달 벡터.
  23. 제 22 항에 있어서,
    발현 벡터가 T7 프로모터를 포함하는, 전달 벡터.
  24. 제 22 항에 있어서,
    발현 벡터가 저산소증-유도된 프로모터를 포함하는, 전달 벡터.
  25. 제 22 항에 있어서,
    발현 벡터가 서열번호 44를 포함하는, 전달 벡터.
  26. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    기반 입자가 효모 세포벽 입자(YCWP)인, 전달 벡터.
  27. 제 26 항에 있어서,
    YCWP에 생체 물질이 부하되는, 전달 벡터.
  28. 제 27 항에 있어서,
    생체 물질이 종양 용해물인, 전달 벡터.
  29. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    기반 입자가 비드인, 전달 벡터.
  30. 제 29 항에 있어서,
    비드가 강자성 입자, 미세비드 또는 미세구인, 전달 벡터.
  31. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단핵구 세포에 의해 우세하게 포식되게 하는 크기인 전달 벡터.
  32. 제 31 항에 있어서,
    단핵구 세포가 대식세포인, 전달 벡터.
  33. 제 32 항에 있어서,
    대식세포가 종양-연관 대식세포(TAM)인, 전달 벡터.
  34. 제 1 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 따른 전달 벡터를 암을 갖는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법.
  35. 제 34 항에 있어서,
    전달 벡터를 피내로 투여하는 방법.
  36. 제 34 항 또는 제 35 항에 있어서,
    전달 벡터를 표적 림프절에 근접하게 투여하는 방법.
  37. 제 34 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서,
    암이 저산소성 미세환경을 포함하는 하나 이상의 종양을 포함하는, 방법.
  38. 제 34 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 종양이 종양-연관 대식세포(TAM)를 포함하는, 방법.
  39. 제 34 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서,
    전달 벡터가 대식세포에 의해 포식되고, 그 후에 대식세포가 그 표면 상에 키메라 수용체를 발현하는, 방법.
  40. 제 1 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 따른 전달 벡터를 암을 갖는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 면역계를 자극하는 방법.
  41. 제 40 항에 있어서,
    전달 벡터를 피내로 투여하는 방법.
  42. 제 40 항 또는 제 41 항에 있어서,
    전달 벡터를 표적 림프절에 근접하게 투여하는 방법.
  43. 그 표면 상에 발현된, 표적 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 포함하는 단핵구 세포.
  44. 제 43 항에 있어서,
    대식세포 또는 수지상 세포인 단핵구 세포.
  45. 제 43 항 또는 제 44 항에 있어서,
    키메라 수용체의 표적 결합 도메인이 면역관문 단백질에 결합하는 scFv를 포함하는, 단핵구 세포.
  46. 제 45 항에 있어서,
    면역관문 단백질이 CTLA-4, PD-1, PD-L1, LAG3, B7.1, B7-H3, B7-H4, TIM3, VISTA, CD137, OX40, CD40, CD27, CCR4, GITR, NKG2D 및 KIR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단핵구 세포.
  47. 제 45 항에 있어서,
    면역관문 단백질이 CTLA-4, PD-1 또는 PD-L1인, 단핵구 세포.
  48. 제 43 항 내지 제 47 항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적 결합 도메인이 서열번호 3, 또는 IgK 리더 서열이 제거된 서열번호 3을 포함하는 scFv를 포함하는, 단핵구 세포.
  49. 제 43 항 내지 제 47 항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적 결합 도메인이 이필리무맙, 트레멜리무맙, 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 세미플리맙, 스파탈리주맙, 캄렐리주맙, 신틸리맙, 더발루맙, 아테졸리주맙 또는 아벨루맙의 각각의 가변 중쇄 서열 및 가변 경쇄 서열에 상응하는 가변 중쇄 서열 및 가변 경쇄 서열을 포함하는, 단핵구 세포.
  50. 제 43 항 또는 제 44 항에 있어서,
    키메라 수용체의 표적 결합 도메인이 OX40에 특이적인, 단핵구 세포.
  51. 제 50 항에 있어서,
    표적 결합 도메인이, 9B12(NCT01644968), MOXR0916, PF-04518600, MEDI0562, MEDI6469, MEDI6383, PF-04518600 또는 BMS 986178의 CDR 및/또는 가변 도메인 영역을 포함할 수 있는 scFv의 각각의 가변 중쇄 서열 및 가변 경쇄 서열에 상응하는 가변 중쇄 서열 및 가변 경쇄 서열을 포함하는 scFv를 포함하는, 단핵구 세포.
  52. 제 50 항에 있어서,
    표적 결합 도메인이 OX40L의 세포외 도메인을 포함하는, 단핵구 세포.
  53. 제 43 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서,
    막관통 도메인이 톨-유사 수용체, CD28, CD4, CD8, 4-1BB, CD27, ICOS, OX40, HVEM 또는 CD30의 적어도 막관통 부분을 포함하는, 단핵구 세포.
  54. 제 43 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항에 있어서,
    막관통 도메인이 서열번호 16 내지 서열번호 25 중 어느 하나를 포함하는, 단핵구 세포.
  55. 제 43 항 내지 제 54 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포내 신호전달 도메인이 톨-유사 수용체(TLR)의 세포내 도메인을 포함하는, 단핵구 세포.
  56. 제 55 항에 있어서,
    TLR이 TLR4 또는 TLR9인, 단핵구 세포.
  57. 제 43 항 내지 제 56 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포내 신호전달 도메인이 서열번호 26 또는 서열번호 27을 포함하는, 단핵구 세포.
  58. 제 1 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항암제로 사용하기 위한 전달 벡터.
  59. 제 1 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서,
    전달 벡터를 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 암을 치료하는데 사용하기 위한 전달 벡터.
  60. 제 1 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서,
    그를 필요로 하는 대상의 면역계를 자극하는데 사용하기 위한 전달 벡터.
  61. 제 1 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 따른 전달 벡터의 항암제로서의 용도.
  62. 전달 벡터를 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 암을 치료하기 위한 제 1 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 따른 전달 벡터의 용도.
  63. 그를 필요로 하는 대상의 면역계를 자극하기 위한 제 1 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 따른 전달 벡터의 용도.
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