ES2857226T3

ES2857226T3 - Receptor de antígeno quimérico regulable

Info

Publication number: ES2857226T3
Application number: ES15764851T
Authority: ES
Inventors: Boris Engels; Andreas Loew; Michael C Milone; Li Zhou
Original assignee: Novartis AG; University of Pennsylvania Penn
Current assignee: Novartis AG; University of Pennsylvania Penn
Priority date: 2014-03-15
Filing date: 2015-03-13
Publication date: 2021-09-28
Anticipated expiration: 2035-03-13
Also published as: US20170081411A1; US20210087279A1; EP3119425A1; EP3811970A1; EP3119425B1; EP3119425A4; WO2015142661A1

Abstract

Receptor CAR de células asesinas natural regulable (RNKR-CAR), en el que el RNKR-CAR comprende: (a) un miembro de unión a antígeno, que comprende: un elemento de dominio de unión que comprende un dominio de unión a antígeno derivado de una molécula de anticuerpo, un dominio transmembrana y un primer dominio de conmutación; y (b) un miembro de señalización intracelular que comprende un segundo dominio de conmutación, en el que el primer y segundo dominios de conmutación comprenden un conmutador de dimerización, en el que, además: (i) el miembro de unión a antígeno comprende, además, un dominio citoplasmático, en el que además 1) el dominio transmembrana y/o citoplasmático comprende un dominio transmembrana o citoplasmático de NKR, cada uno de los cuales se selecciona de un receptor de tipo inmunoglobulina de células asesinas (KIR), un receptor de citotoxicidad natural (NCR), la familia de molécula de activación de linfocitos de señalización (SLAM) de receptores de células inmunes, un receptor Fc (FcR), un receptor Ly49 o un NKR de la Tabla 24; y 2) el miembro de señalización intracelular comprende un dominio citoplasmático de NKR seleccionado de la Tabla 24, o un dominio de señalización intracelular primario seleccionado de la Tabla 1, o un dominio ITAM citoplasmático; (ii) el dominio transmembrana comprende un dominio transmembrana de NKR de un receptor de tipo inmunoglobulina de células asesinas (KIR), un receptor de citotoxicidad natural (NCR), la familia de moléculas de activación de linfocitos de señalización (SLAM) de receptores de células inmunes, un receptor Fc (FcR), un receptor Ly49 o un NKR de la Tabla 24, y el miembro de señalización intracelular comprende un dominio ITAM citoplasmático; o (iii) el miembro de señalización intracelular comprende, además, un dominio citoplasmático de NKR seleccionado de la Tabla 24, en el que, además, el conmutador de dimerización comprende un conmutador de dimerización basado en FKBP/FRB, opcionalmente en el que el primer y segundo dominios de conmutación están dimerizados por una rapamicina o un análogo de rapamicina; un conmutador basado en GyrB-GyrB, opcionalmente en el que el primer y segundo dominios de conmutación están dimerizados por cumermicina; un conmutador basado en GAI-GID1; un conmutador de dimerización basado en giberelina; o un conmutador basado en etiqueta Halo/etiqueta SNAP.

Description

DESCRIPCIÓN

Receptor de antígeno quimérico regulable

La presente solicitud reivindica la prioridad de la Patente de EE.UU. número de serie 61/953.822, presentada el 15 de marzo de 2014.

CAMPO DE LA PRESENTE INVENCIÓN

La presente invención se refiere en general a unos receptores de antígeno quimérico regulable que comprenden componentes de un receptor de célula asesina natural (RNKR-CARs), y células que expresan tales RNKR-CARs (células RNKR-CARX) o células que expresan una combinación de un receptor de antígeno quimérico regulable (RCAR) y un receptor de antígeno quimérico de receptor asesino natural (NKR-CAR) (células RCAR/NKR-CARX), así como procedimientos para fabricar y usar los mismos, por ejemplo, para reconocer y desactivar o matar células diana, por ejemplo, células de cáncer.

ANTECEDENTES

La terapia de transferencia de células adoptivas (ACT) con células T autólogas, especialmente con células T transducidas con Receptores de Antígeno Quimérico (CAR), se ha mostrado prometedora en los ensayos piloto de cáncer hematológico. El documento WO 2014/127261 se refiere a CARs heterodiméricos, condicionalmente activos. El documento WO 2014/145252 se refiere a CARs que comprenden componentes de un receptor que se encuentra en células asesinas naturales (NK). El documento US 2011/003385 se refiere a la oligomerización y la dimerización reguladas de proteínas intracelulares. El documento US 2012/029063 se refiere a moléculas de receptor inmune quimérico para reducir o eliminar los tumores

CARACTERÍSTICAS DE LA PRESENTE INVENCIÓN

Las realizaciones de la presente invención se dirigen a la optimización de la seguridad y la eficacia en el uso de células RNKR-CARX o células RCAR/NKR-CARX para proporcionar una respuesta inmune. Las realizaciones de la presente invención se basan, en parte, en el descubrimiento de que una molécula CAR puede dividirse de tal modo que un "dominio de unión" y un "dominio de señalización" están cada uno ligado a dos "dominios de conmutación" (“conmutador domains”) separados. En tales realizaciones, la activación de la señalización a través del CAR solo tiene lugar cuando los dominios de conmutación, y por tanto el dominio de unión y el dominio de señalización, se unen mediante una molécula de dimerización, es decir, para activar la señalización a través de CAR. Las realizaciones de la presente invención incluyen, entre otras, el uso de un conmutador de dimerización que enciende la activación de una señal para permitir el control externo, por ejemplo, temporal, sobre la respuesta efectora inmunitaria mediada por una célula que contiene un RNKR-CAR o una célula que contiene un RCAR y un NKR-CAR. Tal como se analiza con más detalle a continuación, En realizaciones, el RNKR-CAR o RCAR incluye un conmutador de dimerización que, en presencia de una molécula de dimerización, puede acoplar un dominio de señalización intracelular a un elemento de reconocimiento extracelular, por ejemplo, un dominio de unión a antígeno, un dominio de unión al ligando contra inhibidor, o dominio ECD coestimulador.

En algunos aspectos, la divulgación presenta un NKR-CAR purificado, o de origen no natural, regulable (RNKR-CAR) que comprende:

(a) un miembro de unión a antígeno que comprende: un elemento de dominio de unión (por ejemplo, un dominio de unión a antígeno, un dominio extracelular inhibidor o un dominio extracelular coestimulador), un dominio transmembrana, por ejemplo, un dominio transmembrana NKR, y un primer dominio de conmutación, por ejemplo, FKBP o FRB; y

(b) un miembro de señalización intracelular que comprende: un segundo dominio de conmutación, por ejemplo, FKBP o FRB; y un dominio ITAM citoplasmático, por ejemplo, un dominio de señalización DAP 12 citoplasmático. En un caso, dicho RNKR-CAR comprende un RKIR-CAR, por ejemplo, un RactKIR-CAR, un RNCR-CAR, por ejemplo, un RactNCR-CAR, un RFcR-CAR, por ejemplo, un RactCD16-CAR, o un RactCD64-CAR, o un RLy49-CAR, por ejemplo, un RactLy49CAR.

En un caso, dicho RNKR-CAR comprende un RactKIR-CAR.

En otro aspecto, la divulgación presenta un ácido nucleico que comprende la secuencia que codifica: un RNKR-CAR, por ejemplo, un RactKIR-CAR.

En un caso, el ácido nucleico comprende además un RCAR descrita en el presente documento.

En otro aspecto, la divulgación presenta una célula citotóxica, por ejemplo, una célula T, célula NK o célula NK cultivada, por ejemplo, una célula NK92, que comprende: un RNKR-CAR, por ejemplo, un RactKIR-CAR.

En un ejemplo, la célula comprende además un RCAR descrita en el presente documento.

En otro aspecto, la divulgación comprende además un procedimiento de tratamiento de un paciente que comprende: administrar al paciente una célula citotóxica, por ejemplo, una célula T, célula NK, o célula NK cultivada, por ejemplo, una célula NK92, que comprende:

un RNKR-CAR, por ejemplo, un RactKIR-CAR.

En un ejemplo, la célula comprende además una RCAR descrita en el presente documento.

En otro aspecto, la divulgación comprende un kit que comprende un ácido nucleico o una célula descrita en el presente documento.

En un aspecto, el presente documento describe un receptor CAR de células asesinas naturales regulables (RNKR-CAR), por ejemplo, un NKR-CAR aislado, en el que el RNKR-CAR comprende:

a) un miembro de unión a antígeno, que comprende

un elemento de dominio de unión,

un dominio transmembrana,

un primer dominio de conmutación, y

opcionalmente, un dominio citoplasmático de NKR,

en el que el elemento de dominio de unión comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio extracelular inhibidor, por ejemplo, seleccionado de la Tabla 4, o un dominio extracelular coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la Tabla 5; y

b) un miembro de señalización intracelular que comprende

un segundo dominio de conmutación,

un dominio citoplasmático de NKR o un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización primaria, por ejemplo, un dominio de señalización DAP12, o un dominio de señalización CD3zeta, y opcionalmente, un dominio transmembrana o un enlazador a membrana (“membrane tether”).

Más particularmente, la presente invención proporciona un receptor CAR de células asesinas naturales regulables (RNKR-CAR), en el que el RNKR-CAR comprende:

(a) un miembro de unión a antígeno, que comprende: un elemento de dominio de unión que comprende un dominio de unión a antígeno derivado de una molécula anticuerpo, un dominio transmembrana y un primer dominio de conmutación; y

(b) un miembro de señalización intracelular que comprende un segundo dominio de conmutación,

en el que el primer y segundo dominios de conmutación comprenden un conmutador de dimerización, en el que además:

(i) el miembro de unión a antígeno comprende además un dominio citoplasmático, en el que además (1) el dominio transmembrana y/o el dominio citoplasmático comprenden un dominio transmembrana o citoplasmático de NKR, cada uno de los cuales se selecciona de un receptor similar a la inmunoglobulina de células asesinas (KIR), un receptor de citotoxicidad natural (NCR), la familia de receptores de células inmunitarias de la molécula de activación de linfocitos de señalización (SLAM), un receptor Fc (FcR), un receptor Ly49, o un NKR de la Tabla 24; y (2) el miembro de señalización intracelular comprende un dominio citoplasmático de NKR seleccionado de la Tabla 24, o un dominio de señalización intracelular primario seleccionado de la Tabla 1, o un dominio ITAM citoplasmático; (ii) el dominio transmembrana comprende un dominio transmembrana de NKR de un receptor similar a inmunoglobulina de células asesinas (KIR), un receptor de citotoxicidad natural (NCR), la familia de receptores de células inmunitarias de la molécula de activación de linfocitos de señalización (SLAM), un receptor Fc (FcR), un receptor Ly49, o un NKR de la Tabla 24, y el miembro de señalización intracelular comprende un dominio ITAM citoplasmático; o

(iii) el miembro de señalización intracelular que comprende además un dominio citoplasmático de NKR seleccionado de la Tabla 24.

en el que además el conmutador de dimerización comprende

un conmutador de dimerización basado en FKBP/FRB, en el que opcionalmente el primero y el segundo dominios de conmutación son dimerizados por una rapamicina o un análogo de rapamicina;

un conmutador basado en GyrB-GyrB, en el que opcionalmente el primer y segundo dominios de conmutación son dimerizados por cumermicina;

un conmutador basado en GAI-GID1;

un conmutador de dimerización basado en giberelina; o

un conmutador basado en etiqueta Halo (“Halotag”)/etiqueta SNAP.

En realizaciones, el miembro de unión a antígeno comprende un dominio citoplasmático de NKR, por ejemplo, seleccionado de la Tabla 24.

En una realización, un RNKR-CAR comprende un dominio citoplasmático de NKR o un dominio transmembrana de NKR; y en una realización, el dominio citoplasmático de NKR es distinto de un dominio citoplasmático de FcR gamma (FCER1G), CD27, NKG2C, SLAMF7, NKP80 (KLRF1), CD160 (BY55), DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Táctil), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), NKp44, NKp30 y/o NKp46. En una realización, un RNKR-CAR comprende un dominio citoplasmático de NKR y un dominio de señalización primario de una molécula adaptadora de células NK, por ejemplo, DAP12. En una realización, un RNKR-CAR comprende un dominio citoplasmático de NKR y un dominio de señalización primario de una molécula adaptadora de células NK, por ejemplo, DAP12. En una realización, un RNKR-CAR comprende un dominio citoplasmático de NKR (distinto de un dominio citoplasmático de FcR gamma (FCER1G), CD27, NKG2C, SLAMF7, NKP80 (KLRF1), CD160 (BY55), DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Táctil), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), NKp44, NKp30, y/o NKp46) y un dominio de señalización primario de una molécula de células T, por ejemplo, CD3zeta.

En realizaciones, el miembro de unión a antígeno comprende dominios en la siguiente orientación desde el extremo N-terminal a C-terminal: N - elemento de dominio de unión — dominio transmembrana-dominio citoplasmático de NKR — primer dominio de conmutación-C. En otras realizaciones, el miembro de unión a antígeno comprende dominios en la siguiente orientación desde el extremo N-terminal a C-terminal: N- primer dominio de conmutación — dominio citoplasmático de NKR — dominio transmembrana — elemento de dominio de unión -C.

En realizaciones, el miembro de unión a antígeno comprende dominios en la siguiente orientación desde el extremo N-terminal a C-terminal-: N - elemento de dominio de unión -- dominio transmembrana-primer dominio de conmutación --dominio citoplasmático de NKR -C. En otras realizaciones, el miembro de unión a antígeno comprende dominios en la siguiente orientación desde el extremo N-terminal a C-terminal: N- dominio citoplasmático de NKR — primer dominio de conmutación — dominio transmembrana — elemento de dominio de unión -C.

En algunas realizaciones, el miembro de unión a antígeno no comprende un dominio citoplasmático de NKR.

En realizaciones, el miembro de unión a antígeno comprende dominios en la siguiente orientación desde el extremo N-terminal a C-terminal de la cadena polipeptídica: N- elemento de dominio de unión-dominio transmembrana — primer dominio de conmutación -C. En realizaciones, el miembro de unión a antígeno comprende dominios en la siguiente orientación desde el extremo N-terminal a C-terminal de la cadena polipeptídica: N- primer dominio de conmutación— dominio transmembrana — elemento de dominio de unión -C. En realizaciones, el miembro de señalización intracelular comprende un dominio citoplasmático de NKR, por ejemplo, seleccionado desde la Tabla 24. En realizaciones, el miembro de señalización intracelular comprende dominios en la siguiente orientación desde el extremo N-terminal a C-terminal: N- segundo dominio de conmutación — dominio citoplasmático de NKR -C. En realizaciones, el miembro de señalización intracelular comprende dominios en la siguiente orientación desde el extremo N-terminal a C-terminal: N- dominio citoplasmático de NKR — segundo dominio de conmutación -C. En realizaciones, el miembro de señalización intracelular no comprende un dominio citoplasmático de NKR.

En realizaciones, el miembro de señalización intracelular comprende un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización primario seleccionado de la Tabla 1. Por ejemplo, el dominio de señalización primario comprende un dominio CD3zeta. En 25 un ejemplo, el dominio de señalización primario comprende un dominio DAP12.

En realizaciones, el miembro de señalización intracelular comprende dominios en la siguiente orientación desde el extremo N-terminal a C-terminal: N- dominio de señalización intracelular --- segundo dominio de conmutación-C. En otras realizaciones, el miembro de señalización intracelular comprende dominios en la siguiente orientación desde el extremo N-terminal a C-terminal: N- segundo dominio de conmutación — dominio de señalización intracelular -C. En realizaciones, el miembro de señalización intracelular comprende un dominio citoplasmático de NKR y un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización primario seleccionado de la Tabla 1. En realizaciones, el miembro de señalización intracelular comprende dominios en la siguiente orientación desde el extremo N-terminal a C-terminal: N- segundo dominio de conmutación — dominio citoplasmático de NKR — dominio de señalización intracelular -C. En realizaciones, el miembro de señalización intracelular comprende dominios en la siguiente orientación desde el extremo N-terminal a C-terminal: N- dominio de señalización intracelular — dominio citoplasmático de NKR — segundo dominio de conmutación-C.

En realizaciones, el miembro de señalización intracelular comprende un dominio transmembrana o un enlazador a membrana. En realizaciones, el dominio transmembrana o el enlazador a membrana es N-terminal al segundo dominio de conmutación. En otras realizaciones, el dominio transmembrana o el enlazador a membrana es C-terminal al segundo dominio de conmutación. En algunos casos, el dominio transmembrana o el enlazador a membrana es N-terminal al miembro de señalización intracelular. En algunos casos, el dominio transmembrana o el enlazador a membrana es C-terminal al dominio de señalización intracelular.

En ciertas realizaciones, el miembro de unión a antígeno no comprende un dominio citoplasmático de NKR y en el que el miembro de señalización intracelular comprende un dominio citoplasmático de NKR, por ejemplo, seleccionado de la Tabla 24.

En realizaciones, el miembro de unión a antígeno no comprende un dominio citoplasmático de NKR, y en el que el miembro de señalización intracelular comprende un dominio citoplasmático de NKR, por ejemplo, seleccionado de la Tabla 24, y un dominio de señalización primario, por ejemplo, seleccionado de la Tabla 1.

En realizaciones, el dominio transmembrana del miembro de unión a antígeno y/o el miembro de señalización intracelular comprende un dominio transmembrana de NKR, por ejemplo, seleccionado de la Tabla 24. En realizaciones, el dominio transmembrana de NKR puede interaccionar con, por ejemplo, unirse a, una molécula adaptadora o una molécula de señalización intracelular, por ejemplo, DAP12. En realizaciones, el dominio transmembrana de NKR puede interaccionar con, por ejemplo, unirse a, el dominio transmembrana de una molécula adaptadora o una molécula de señalización intracelular, por ejemplo, DAP12. En realizaciones, el dominio transmembrana de NKR comprende un resto cargado positivamente, por ejemplo, un residuo de aminoácido que comprende un resto cargado positivamente, por ejemplo, cadena lateral. En realizaciones, el dominio transmembrana de NKR no comprende un resto cargado positivamente, por ejemplo, un residuo de aminoácido que comprende un resto cargado positivamente. En realizaciones, el dominio transmembrana de NKR no interacciona con (por ejemplo, se une a) una molécula adaptadora o una molécula de señalización intracelular, por ejemplo, DAP12. En realizaciones, el dominio transmembrana de NKR no comprende un resto cargado positivamente, por ejemplo, un residuo de aminoácido que comprende un resto cargado positivamente, que media la unión a un dominio transmembrana de NKR a una molécula adaptadora o una molécula de señalización intracelular, por ejemplo, DAP12. En casos, un RNKR-CAR descrito en el presente documento comprende un dominio transmembrana de NKR mutado (por ejemplo, un dominio transmembrana de KIR mutado, un dominio transmembrana de NCR mutado, un dominio transmembrana de FcR mutado, un dominio transmembrana de receptor Ly49 mutado, un dominio transmembrana de receptor de SLAMF mutado). Por ejemplo, un dominio transmembrana de NKR mutado comprende una mutación en comparación con una secuencia de aminoácidos del dominio transmembrana de NKR de origen natural, por ejemplo, de un NKR de origen natural descrito en el presente documento. Por ejemplo, el dominio transmembrana de NKR comprende una mutación, por ejemplo, donde el dominio transmembrana de NKR mutado no comprende un resto cargado positivamente, por ejemplo, un residuo de aminoácido que comprende un resto cargado positivamente. Por ejemplo, el dominio transmembrana de NKR mutado no comprende uno o más aminoácidos que median (por ejemplo, que son necesarios para) la unión a un dominio transmembrana de NKR a una molécula adaptadora o una molécula de señalización intracelular, por ejemplo, DAP12. Por ejemplo, la mutación en el dominio transmembrana de NKR mutado elimina un aminoácido que comprende un resto cargado positivamente o un aminoácido que media en la unión con una molécula adaptador o una molécula de señalización intracelular de un dominio transmembrana de NKR endógeno o de tipo salvaje que normalmente tiene dicho aminoácido. Por ejemplo, el dominio transmembrana de NKR mutado no se une a (por ejemplo, interacciona con) una molécula adaptadora o una molécula de señalización intracelular.

En realizaciones, el miembro de unión a antígeno comprende además un dominio bisagra extracelular dispuesto entre el dominio transmembrana y el elemento de dominio de unión.

En realizaciones, el dominio transmembrana de NKR y el dominio citoplasmático de NKR son de la misma molécula NKR de origen natural.

En otras realizaciones, el dominio transmembrana del miembro de unión a antígeno y/o el dominio transmembrana del miembro de señalización intracelular no se derivan de una molécula de NKR. Por ejemplo, el dominio transmembrana del miembro de unión a antígeno y/o el dominio transmembrana del miembro de señalización intracelular se derivan de una molécula de célula T. Por ejemplo, el dominio transmembrana del miembro de unión a antígeno y/o el dominio transmembrana del miembro de señalización intracelular se derivan de CD8alfa o CD3zeta. En algunas realizaciones, el miembro de unión a antígeno comprende, de la dirección extracelular a intracelular, un elemento de dominio de unión, un dominio transmembrana, un dominio citoplasmático de NKR y un primer dominio de conmutación y el miembro de señalización intracelular comprende un dominio de señalización primario, por ejemplo, un dominio DAP12, y un segundo dominio de conmutación. Por ejemplo, el miembro de señalización intracelular comprende el dominio de señalización primario y el segundo dominio de conmutación en la siguiente orientación desde el extremo N-terminal a C-terminal: N- dominio de señalización primario — segundo dominio de conmutación -C. En otros ejemplos, el miembro de señalización intracelular comprende el dominio de señalización primario y el segundo dominio de conmutación en la siguiente orientación desde el extremo N-terminal a C-terminal: N- segundo dominio de conmutación --- dominio de señalización primario-C.

En realizaciones, el miembro de unión a antígeno comprende, de la dirección extracelular a la intracelular, un elemento de dominio de unión, un dominio transmembrana, un primer dominio de conmutación, y un dominio citoplasmático de NKR y el miembro de señalización intracelular comprende un segundo dominio de conmutación y un dominio de señalización primario, por ejemplo, un dominio DAP12.

En realizaciones, el miembro de unión a antígeno comprende, de la dirección extracelular a la intracelular, un elemento de dominio de unión, un dominio transmembrana, un dominio citoplasmático de NKR, y un primer dominio de conmutación y el miembro de señalización intracelular comprende un segundo dominio conmutador y un dominio de señalización, por ejemplo, un dominio CD3zeta.

En realizaciones, el miembro de unión a antígeno comprende, de la dirección extracelular a la intracelular, un elemento de dominio de unión, un dominio transmembrana, y un primer dominio de conmutación y el miembro de señalización intracelular comprende un segundo dominio de conmutación, un dominio citoplasmático de NKR y un dominio de señalización primario, por ejemplo, un dominio CD3zeta.

En realizaciones, el miembro de unión a antígeno comprende, de la dirección extracelular a la intracelular, un elemento de dominio de unión, un dominio transmembrana, y un primer dominio de conmutación y el miembro de señalización intracelular comprende un segundo dominio de conmutación y un dominio citoplasmático de NKR. En realizaciones, el RNKR-CAR comprende:

un receptor CAR de inmunoglobulina de células asesinas regulables (RKIR-CAR), por ejemplo, un RactKIR-CAR; un RNCR-CAR, por ejemplo, un RactRNCR-CAR;

un RFcR-CAR, por ejemplo, un RactCD16-CAR o un RactCD64-CAR; o

un RLy49-CAR, por ejemplo, RactLy49-CAR.

En realizaciones, el dominio de unión a antígeno comprende un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un scFv, un Fv, un Fab, un (Fab')2, un anticuerpo de dominio único (SDAB), un dominio VH o VL, o un dominio VHH de camélido. En realizaciones, el dominio de unión a antígeno interacciona con, por ejemplo, se une a, un antígeno tumoral descrito en el presente documento. En realizaciones, el antígeno tumoral se selecciona de un grupo que consiste en: CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, Tn Ag, PSMA, ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, Mesotelina, IL-11Ra, PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, CD24, PDGFR-beta, SSEA-4, CD20, receptor alfa de folato, ERBB2 (Her2/neu), MUC1, EGFR, NCAM, Prostasa, PAP, ELF2M, Efrina B2, receptor de IGF-I, CAIX, LMP2, gp100, bcr-abl, tirosinasa, EphA2, Fucosil GM1, sLe, GM3 , TGS5, HMWMAA, o-acetil-GD2, receptor beta de folato, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, TSHR, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, ácido plisiálico, PLAC1, GloboH, NY- BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-1a, MAGE-A1, legumaína, HPV E6,E7, MAGE A1, ETV6-AML, proteína de esperma 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, antígeno 1 relacionado con Fos, p53, p53 mutante, prosteína, survivina y telomerasa, PCTA-1/Galectina 8, MelanA/MART1, Ras mutante, hTERT, puntos de ruptura de translocación de sarcoma, ML-IAP, ERG (gen de fusión de TMPRSS2 ETS), NA17, PAX3, receptor de andrógeno, Ciclina B1, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, s SX2, RAGE-1, transcriptasa inversa de telomerasa humana, RU1, RU2, esterasa de carboxilo intestinal, mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5 e IGLL1.

En algunas realizaciones, el RNKR-CAR comprende un KIR-CAR (RKIR-CAR) regulable. En realizaciones, el dominio transmembrana comprende un dominio transmembrana de KIR seleccionado de la Tabla 24. Por ejemplo, el dominio transmembrana puede interaccionar con, por ejemplo, unirse a, DAP12. En realizaciones, el dominio transmembrana del dominio de unión a antígeno y/o el dominio de señalización intracelular no comprenden un dominio transmembrana de KIR o un dominio transmembrana de KIR mutado. En algunos casos, el dominio citoplasmático de NKR comprende un dominio citoplasmático de KIR seleccionado de la Tabla 24.

En realizaciones, el RKIR-CAR es un RKIR-CAR de activación (RactKIR-CAR). Por ejemplo, el RactKIR-CAR comprende un dominio citoplasmático de KIR de activación (actKIR). En algunos casos, el RactKIR-CAR puede interaccionar y promover la señalización de un polipéptido o molécula adaptadora que contiene ITAM, por ejemplo, DAP12. En realizaciones, el RactKIR-CAR comprende un dominio D de KIR D, un dominio D1 de KIR o un dominio D2 de KIR. En realizaciones, el RactKIR-CAR comprende un dominio citoplasmático de actKIR seleccionado de KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4 o KIR2DS5. En realizaciones, el RactKIR-CAR comprende un dominio transmembrana de actKIR seleccionado de KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4 o KIR2DS5 En realizaciones, el RactKIR-CAR comprende un dominio transmembrana KIR2DS2. En realizaciones, el dominio de unión a antígeno se une a un antígeno tumoral.

En algunas realizaciones, el RKIR-CAR es un RKIR-CAR inhibidor (RinhKIR-CAR). En realizaciones, el RinhKIR-CAR comprende un dominio transmembrana inhKIR. En realizaciones, el RinhKIR-CAR comprende un dominio citoplasmático que contiene ITIM, por ejemplo, un dominio citoplasmático inhKIR. Por ejemplo, el dominio citoplasmático que contiene ITIM se selecciona de KIR2DL1, KIR2DL2/L3, KIR2DL5A, KI^r2^dL5B, KIR3DL2 o KIR3DL3.

En ciertas realizaciones, el RinhKIR-CAR comprende un dominio transmembrana que no es un dominio transmembrana de KIR, por ejemplo, un dominio transmembrana de PD-1, CTLA4 o receptores que contienen ITIM de ILT (CD85), Siglec, lMiR (Cd300) y/o familias de receptores de genes de SLAM.

En realizaciones, el RinhKIR-CAR comprende un dominio citoplasmático de un receptor inhibidor distinto de un KIR, por ejemplo, de PD-1, CTLA4 o receptores que contienen ITⁱM de ILT (CD85), Siglec, LMIR (CD300) y/o familias de receptores de genes de SLAM.

En realizaciones, el RinhKIR-CAR comprende un dominio citoplasmático y transmembrana de un receptor inhibidor distinto de un KIR, por ejemplo, un dominio citoplasmático y transmembrana, independientemente, de por ejemplo, PD-1, CTLA4 o receptores que contienen ITIM de ILT (Cd85), Siglec, LMIR (CD300) y/o familias de receptores de genes de SLAM.

En realizaciones, el RactKIR-CAR comprende un dominio D de KIR, un dominio D0 de KIR, un dominio D1 de KIR o un dominio D2 de KIR.

En realizaciones, el dominio de unión a antígeno del RinhKIR-CAR se une a un antígeno que se expresa mucho más en una célula no diana, por ejemplo, una célula no cancerosa, que en una célula diana, por ejemplo, célula cancerosa, por ejemplo, una célula cancerosa del mismo tipo que la célula diana.

En algunas realizaciones, el RNKR-CAR comprende un NCR-CAR (RNCR-CAR) regulable. Por ejemplo, el RNCR-CAR comprende un NKp30, NKp44 o NKp46-CAR regulables. En algunos ejemplos, el dominio transmembrana es un dominio transmembrana de NCR seleccionado de la Tabla 24, por ejemplo, un dominio transmembrana un NKp30, NKp44 o NKp46. En realizaciones, el dominio citoplasmático de NKR es un dominio citoplasmático de NCR seleccionado de la Tabla 24, por ejemplo, un dominio citoplasmático de NKp30, NKp44 o NKp46.

En realizaciones, el RNKR-CAR comprende un FcR-CAR regulable (RFCR-CAR). En realizaciones, el RFcR-CAR es un CD16-CAR regulable. En realizaciones, el RFcR-CAR es un CD64-CAR regulable. En realizaciones, el dominio transmembrana es un dominio transmembrana FcR seleccionado de la Tabla 24, por ejemplo, un dominio transmembrana CD16 o CD64. En realizaciones, el dominio citoplasmático de NKR es un dominio citoplasmático FcR seleccionado de la Tabla 24, por ejemplo, un dominio citoplasmático CD16 o CD64.

En algunas realizaciones, el RNKR-CAR comprende un Ly49-CAR regulable (RLy49-CAR). En realizaciones, el RLy49-CAR comprende un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático Ly49. En realizaciones, el RLy49-CAR es un Ly49-CAR de activación, por ejemplo, Ly49D o Ly49H. En realizaciones, el RLy49-CAR comprende un dominio transmembrana cargado positivamente, por ejemplo, un dominio transmembrana Ly49 cargado positivamente. En realizaciones, el RLy49-CAR es un Ly49-CAR inhibidor, por ejemplo, Ly49A o Ly49C. En realizaciones, el Rly49-CAR comprende un dominio citoplasmático que contiene ITIM, por ejemplo, un dominio citoplasmático Ly49. En realizaciones, el Rly49-CAR comprende un dominio transmembrana Ly49 o un dominio citoplasmático Ly49 seleccionado, independientemente de Ly49A-Ly49W. Por ejemplo, el dominio transmembrana es un dominio transmembrana Ly49 seleccionado de la Tabla 24. Por ejemplo, el dominio citoplasmático de NKR es un dominio citoplasmático Ly49 seleccionado de la Tabla 24.

En la presente invención, el primer y segundo dominios de conmutación del RNKR-CAR comprenden un conmutador de dimerización. En realizaciones, el conmutador de dimerización puede ser un conmutador de homodimerización o un conmutador de heterodimerización. En realizaciones, el conmutador de dimerización comprende un conmutador basado en FKB-FRB. Por ejemplo, uno de los primero y segundo dominios de conmutación comprende un dominio de conmutación basado en FKBP y el otro comprende un dominio de conmutación basado en FRB.

En realizaciones, los dominios de conmutación son dimerizados por un inhibidor de mTOR, por ejemplo, RAD001. En realizaciones, el dominio de conmutación basado en FRB comprende un fragmento de unión a FKBP o un análogo de FRB que comprende uno cualquiera de los siguientes:

i) una mutación E2032;

ii) una mutación E2032I o una mutación E2032L;

iii) una mutación T2098;

iv) una mutación T2098L;

v) una mutación E2032 y T2098;

vi) una mutación E2032I y T2098L;

vii) o una mutación E2032L y T2098L.

En ciertas realizaciones, el conmutador de dimerización comprende un conmutador basado en GyrB-GyrB. En realizaciones, la molécula de dimerización es una cumermicina.

En algunas realizaciones, el conmutador de dimerización comprende un conmutador basado en GAI-GID1. En realizaciones, la molécula de dimerización es una GA³-AM o GA³.

En una realización, el conmutador de dimerización comprende un conmutador basado en la etiqueta Halo/etiqueta SNAP. En realizaciones, la molécula de dimerización comprende la estructura 5.

En otras realizaciones, el conmutador de dimerización comprende dominios de conmutación que comprenden moléculas de etiqueta, por ejemplo, una etiqueta de péptido c-myc, una etiqueta de péptido FLAG, una etiqueta de péptido HA o una etiqueta de péptido V5, y el conmutador de dimerización comprende polipéptidos con afinidad por los dominios de conmutación, por ejemplo, moléculas de anticuerpo y armazón que no son anticuerpos.

En realizaciones, la molécula de dimerización comprende tres o más dominios, por ejemplo, etiquetas de proteína, que se unen a un dominio de conmutación, por ejemplo, un polipéptido, por ejemplo, una molécula de anticuerpo o un armazón que no es anticuerpo, que tiene afinidad por el dominio.

En un aspecto, el presente documento presenta un receptor CAR de células asesinas naturales regulable (RNKR-CAR), por ejemplo, un RNKR-CAR aislado, en el que el RNKR-CAR comprende:

a) un miembro de señalización intracelular que comprende:

un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primario, y

un primer dominio de conmutación;

b) un miembro de unión a antígeno que comprende:

un elemento de dominio de unión (por ejemplo, dominio de unión a antígeno, dominio extracelular inhibidor o dominio extracelular coestimulador),

un segundo dominio de conmutación; y

opcionalmente, uno o una pluralidad de dominios de señalización coestimuladores, y

c) opcionalmente, un dominio transmembrana.

(A menos que se indique lo contrario, cuando se describen en el presente documento los miembros o los elementos de un RNKR-CAR, el orden puede ser el que se proporciona, pero también se incluyen otros órdenes. En otras palabras, el orden puede ser el que se establece en el texto o el el orden puede ser diferente.)

En un caso, el dominio transmembrana puede estar dispuesto en el miembro de señalización intracelular o el miembro de unión a antígeno. En un caso, un dominio transmembrana puede estar dispuesto en el miembro de señalización intracelular y un dominio transmembrana o un ancla de membrana (ancla de membrana y dominio de anclaje a membrana se usan indistintamente en el presente documento) pueden estar dispuestos en el miembro de unión a antígeno.

En un caso, los primero y segundo dominios de conmutación pueden formar un conmutador de dimerización intracelular o extracelular.

En un caso, el conmutador de dimerización puede ser un conmutador de homodimerización o un conmutador de heterodimerización.

Tal como se desscribe en el presente documento, los casos de un RNKR-CAR pueden incluir un miembro, por ejemplo, un miembro de señalización intracelular, que comprende uno o más dominios de señalización intracelular, como, por ejemplo, se describe anteriormente. En otros casos, un miembro de unión a antígeno puede comprender un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización coestimulador.

En una realización, el dominio de señalización intracelular es un dominio de señalización intracelular primario, seleccionado, por ejemplo, de la lista en la Tabla 1.

En una realización, el dominio de señalización intracelular primario comprende un dominio CD3zeta.

En una realización, el dominio de señalización intracelular es un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 2.

En una realización, el dominio de señalización coestimulador comprende un dominio 4-1BB.

En una realización, el orden del dominio de conmutación y el dominio o los dominios de señalización intracelular (isd) es el siguiente, comenzando por el extremo amino terminal:

conmutador/isd; o

isd/conmutador.

En una realización, el orden del dominio de conmutación y el dominio o los dominios de señalización intracelular (isd) es el siguiente, comenzando por el extremo carboxi terminal:

conmutador/isd; o

isd/conmutador.

En un caso, las divulgación presenta, un RNKR-CAR, por ejemplo, un RNKR-CAR aislado, donde el RNKR-CAR comprende:

a) un miembro de unión a antígeno que comprende:

un elemento de dominio de unión (por ejemplo, un dominio de unión a antígeno, un dominio extracelular inhibidor o un dominio extracelular coestimulador),

un primer dominio transmembrana, y

un primer dominio de conmutación; y

b) un miembro de señalización intracelular que comprende:

un segundo dominio transmembrana o anclaje a membrana,

un segundo dominio de conmutación,

y un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primario.

En un caso, el miembro de unión a antígeno comprende opcionalmente uno o más dominios de señalización coestimuladores descritos en el presente documento. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende además uno o más dominios de señalización coestimuladores descritos en el presente documento.

En un caso, el primer y/o segundo dominio transmembrana comprende la región o las regiones transmembrana de, por ejemplo, la cadena alfa, beta o zeta del receptor de célula T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8 (por ejemplo, CD8 alfa, CD8 beta), CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, IL2Rbeta, IL2Rgamma, IL7Ra, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA- 6,CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Táctil), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp. En casos, el primer y/o segundo dominio transmembrana comprende la región o regiones transmembrana de un receptor de células asesinas naturales (NKR), por ejemplo, un NKR descrito en el presente documento. El primer dominio transmembrana dispuesto en el miembro de unión a antígeno y el segundo dominio transmembrana dispuesto en el miembro de señalización intracelular pueden ser el mismo dominio transmembrana, por ejemplo, tienen la misma secuencia, o pueden ser dominios transmembrana diferentes, por ejemplo, tienen secuencias diferentes.

Como se discute en el presente documento, el RNKR-CAR puede incluir cualquier de una variedad de conmutadores de dimerización, por ejemplo, un conmutador de dimerización descrito en el presente documento.

En una realización, los dominios de conmutación son componentes de un conmutador de heterodimerización.

En una realización, los dominios de conmutación son componentes de un conmutador de homodimerización.

En una realización, el conmutador de dimerización es intracelular.

En una realización, el conmutador de dimerización es extracelular.

En una realización, el dominio transmembrana dispuesto en el miembro de unión a antígeno y el conmutador de dimerización, por ejemplo, un conmutador de heterodimerización o un conmutador de homodimerización, es intracelular.

En una realización, cuando el dominio transmembrana dispuesto en el miembro de señalización intracelular y el conmutador de dimerización, por ejemplo, un conmutador de heterodimerización o de homodimerización, es extracelular.

En una realización, el conmutador de dimerización comprende un conmutador basado en FKBP-FRB.

En una realización, el conmutador de dimerización comprende:

un dominio de conmutación que comprende una secuencia de unión a análogo de rapamicina que tiene al menos 80, 85, 90, 95, 98 o 99% de identidad con FKBP y un dominio de conmutación que comprende una secuencia de unión a secuencia de unión a análogo de rapamicina que tiene al menos 80, 85, 90, 95, 98 o 99% de identidad con FRB. En una realización el conmutador de dimerización comprende un dominio de conmutación basado en FKBP y un dominio de conmutación basado en FRB descritos en el presente documento.

En una realización, el conmutador de dimerización comprende:

un dominio de conmutación que comprende una secuencia de unión a análogo de rapamicina, que no se diferencia en más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de la correspondiente secuencia de FKBP, y un dominio de conmutación que comprende una secuencia de unión a análogo de rapamicina que no se diferencia en más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de la correspondiente secuencia de FRB.

En una realización, el conmutador de dimerización comprende un fragmento de unión a FRB o un análogo de FKBP y un fragmento de unión a FKBP o un análogo de f Rb , y el fragmento de unión a FKBP o el análogo de FRB comprende una o más mutaciones que potencia la formación de un complejo entre un dominio de conmutación de FKBP, un dominio de conmutación de FRB y la molécula de dimerización, o una mutación descrita en la sección titulada en el presente documento CONMUTADORES DE DIMERIZACIÓN BASADOS EN FKBP/FRB MODIFICADOS. Por ejemplo, el fragmento de unión a FKBP o el análogo de FRB comprende: una mutación E2032, por ejemplo, una mutación E2032I o una mutación E2032L; una mutación T2098, por ejemplo, una mutación T2098L; o una mutación E2032 y T2098, por ejemplo, una mutación E2032I y una ^t2098L o una E2032L y una T2098L.

En una realización, en la que el conmutador es un conmutador basado en FKBP-FRB, la molécula de dimerización es un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor de mTOR alostérico, por ejemplo, rapamicina o un rapálogo, por ejemplo, RAD001.

En una realización, cualquiera de los regímenes de dosificación o formulaciones de un inhibidor de mTOR alostérico, por ejemplo, RAD001, descrito en la sección en el presente documento para una dosis baja, que aumenta la inmunidad, de un inhibidor de mTOR alostérico, por ejemplo, RAD001, se puede administrar para dimerizar un conmutador basado en FKBP-FRB.

En una realización, el conmutador es un conmutador basado en FKBP-FRB y la molécula de dimerización es RAD001.

En una realización, se administran de 0,1 a 20, de 0,5 a 10, de 2,5 a 7,5, de 3 a 6, o aproximadamente 5, mg de RAD001 por semana, por ejemplo, suministrados una vez por semana.

En una realización, se administran de 0,3 a 60, de 1,5 a 30, de 7,5 a 22,5, de 9 a 18 o aproximadamente 15 mg de RAD001 en una formulación de liberación sostenida por semana, por ejemplo, una vez por semana.

En una realización, se administran de 0,005 a 1,5, de 0,01 a 1,5, de 0,1 a 1,5, de 0,2 a 1,5, de 0,3 a 1,5, de 0,4 a 1,5, de 0,5 a 1,5, de 0,6 a 1,5, de 0,7 a 1,5, de 0,8 a 1,5, de 1,0 a 1,5 de 0,3 a 0,6, o aproximadamente 0,5 mg de RAD001 por día, por ejemplo, suministrados una vez al día.

En una realización, se administran de 0,015 a 4,5, de 0,03 a 4,5, de 0,3 a 4,5, de 0,6 a 4,5, de 0,9 a 4,5, de 1,2 a 4,5, de 1,5 a 4,5, de 1,8 a 4,5, de 2,1 a 4,5, de 2,4 a 4,5, de 3,0 a 4,5, de 0,9 a 1,8, o aproximadamente 1,5 mg de RAD001 en una formulación de liberación sostenida, por día, por ejemplo, suministrados una vez al día.

En una realización, se administran de 0,1 a 30, de 0,2 a 30, de 2 a 30, de 4 a 30, de 6 a 30, de 8 a 30, de 10 a 30, de 1,2 a 30, de 14 a 30, de 16 a 30, de 20 a 30, de 6 a 12, o aproximadamente 10 mg de RAD001 en una formulación de liberación sostenida por semana, por ejemplo, suministrados una vez por semana.

En una realización, el conmutador de dimerización comprende:

un dominio de conmutación que comprende una rapamicina o un análogo de rapamicina, una secuencia de unión a FKBP y un dominio de conmutación que comprende una rapamicina o un análogo de rapamicina, una secuencia de unión a FRB, por ejemplo, una secuencia que comprende una lisina en el residuo 2098.

En una realización, el conmutador de dimerización comprende:

un dominio de conmutación que comprende una secuencia de unión a análogo de rapamicina de FKBP y un dominio de conmutación que comprende una secuencia de unión a análogo de rapamicina de FRB, por ejemplo, una secuencia que comprende una lisina en el residuo 2098.

En una realización, el conmutador de dimerización comprende:

un dominio de conmutación que comprende una secuencia de unión AP21967 de FKBP, y un dominio de conmutación que comprende una secuencia de unión AP21967 de FRB, por ejemplo, una secuencia que comprende una lisina en el residuo 2098.

En una realización:

el primer dominio de conmutación comprende

una rapamicina, o un análogo de rapamicina, una secuencia de unión a FKBP;

una secuencia de unión a análogo de rapamicina de FKBP; o

una secuencia de unión AP21967 de FKBP; y,

el segundo dominio de conmutación comprende,

una rapamicina, o un análogo de rapamicina, una secuencia de unión a FRB;

una secuencia de unión a análogo de rapamicina de FRB; o

una secuencia de unión AP21967 de FRB, por ejemplo, una secuencia que comprende una lisina en el residuo 2098. En una realización:

el primer dominio de conmutación comprende,

una rapamicina, un análogo de rapamicina, una secuencia de unión a FRB;

una secuencia de unión a análogo de rapamicina de FRB; o

una secuencia de unión a AP21967 de FRB, por ejemplo, una secuencia que comprende una lisina en el residuo 2098; y

el segundo dominio de conmutación comprende,

una rapamicina, un análogo de rapamicina, una secuencia de unión a FKBP;

una secuencia de unión a análogo de rapamicina de FKBP; o una secuencia de unión a AP21967 de FKBP.

En una realización:

el primer dominio de conmutación comprende una secuencia de unión a AP21967 de FKBP; y

el segundo dominio de conmutación comprende una secuencia de unión a AP21967 de FRB, por ejemplo, una secuencia que comprende una lisina en el residuo 2098.

En una realización, el primer dominio de conmutación comprende una secuencia de unión a AP21967 de FRB, por ejemplo, una secuencia que comprende una lisina en el residuo 2098; y

el segundo dominio de conmutación comprende una secuencia de unión a AP21967 de FKBP.

En una realización, la molécula de dimerización es un análogo de rapamicina, por ejemplo, AP21967.

En una realización, el conmutador de dimerización comprende un conmutador basado en GyrB-GyrB.

En una realización, el conmutador de dimerización comprende:

un dominio de conmutación que comprende una secuencia de unión a cumermicina que tiene al menos un 80, 85, 90, 95, 98, o 99% de identidad con el subdominio del extremo amino terminal de 24 kDa de GyrB.

En una realización el conmutador de dimerización comprende:

un dominio de conmutación que comprende una secuencia de unión a cumermicina que se diferencia en no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, o 1 residuos de aminoácido de la secuencia correspondiente del subdominio del extremo amino terminal de 24 kDa de GyrB.

En una realización, el conmutador de dimerización comprende:

un dominio de conmutación que comprende una secuencia de unión a cumermicina del subdominio del extremo amino terminal de 24 kDa de GyrB.

En una realización, el conmutador de dimerización comprende:

el subdominio del extremo amino terminal de 24 kDa de GyrB.

En una realización, la molécula de dimerización es una cumermicina.

En una realización, el conmutador de dimerización comprende un conmutador basado en GAI-GID1.

En una realización, el conmutador de dimerización comprende:

un dominio de conmutación GID1 que comprende una secuencia de unión a giberelina, o un análogo de giberelina, por ejemplo, GA³, que tiene al menos un 80, 85, 90, 95, 98, o 99% de identidad con GID1 y un dominio de conmutación que comprende un dominio de conmutación GAI que tiene al menos un 80, 85, 90, 95, 98 o 99% de identidad con GAI.

En una realización, el conmutador de dimerización comprende:

un dominio de conmutación GID1 que comprende una secuencia de unión a giberelina, o un análogo de giberelina, por ejemplo, GA³, que se diferencia en no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de la secuencia correspondiente de un GID1 descrito en el presente documento, y un dominio de conmutación GAI que se diferencia en no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de la secuencia correspondiente de un GAI descrito en el presente documento.

En una realización:

el primer dominio de conmutación comprende un dominio de conmutación GID1; y

el segundo dominio de conmutación comprende un dominio de conmutación GAI.

En una realización:

el primer dominio de conmutación comprende un dominio de conmutación GAI; y

el segundo dominio de conmutación comprende un dominio de conmutación GID1.

En una realización, la molécula de dimerización es GA³-AM.

En una realización, la molécula de dimerización es GA³.

En una realización, la molécula de dimerización es una molécula pequeña, por ejemplo, es distinta de un polipéptido. En una realización, la molécula de dimerización es un polipéptido, por ejemplo, un polipéptido, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, o un armazón no de anticuerpo, por ejemplo, una fibronectina o adnectina, que tiene afinidad específica por uno o ambos de los primero y segundo dominios de conmutación.

En una realización, la molécula de dimerización, por ejemplo, un polipéptido, es una molécula de anticuerpo.

En una realización, el conmutador de dimerización comprende un conmutador basado en etiqueta Halo/etiqueta SNAP.

En una realización, el conmutador de dimerización comprende:

un dominio de conmutación de etiqueta SNAP que tiene al menos un 80, 85, 90, 95, 98 o 99% de identidad con la SEQ ID NO: 14, y un dominio de conmutación de etiqueta SNAP que tiene al menos un 80, 85, 90, 95, 98 o 99% de identidad con la SeQ ID NO: 15.

En una realización, el conmutador de dimerización comprende:

un dominio de conmutación de etiqueta Halo que comprende que difiere en no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, o 1 residuos de aminoácido de la SEQ ID NO: 14, y un dominio de conmutación de etiqueta SNAP que difiere en no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de la SEQ ID: 15.

En una realización:

el primer dominio de conmutación comprende un dominio de conmutación de etiqueta Halo; y

el segundo dominio de conmutación comprende un dominio de conmutación de etiqueta SNAP.

En una realización:

el primer dominio de conmutación comprende un dominio de conmutación de etiqueta SNAP; y

el segundo dominio de conmutación comprende un dominio de conmutación de etiqueta Halo.

En una realización, la molécula de dimerización comprende la estructura 5.

En una realización, la molécula de dimerización comprende tres o más dominios, por ejemplo, las etiquetas de proteína, que se unen a un dominio de conmutación, por ejemplo, un polipéptido, por ejemplo, una molécula de anticuerpo o un armazón no de anticuerpo, que tiene afinidad por el dominio.

En una realización, la molécula de dimerización es una molécula de dimerización no covalente.

En una realización, la molécula de dimerización es una molécula de dimerización covalente.

En un caso, el conmutador de dimerización, por ejemplo, un conmutador de homodimerización, por ejemplo, un conmutador de homodimerización extracelular, comprende dominios de conmutación que comprenden moléculas de etiqueta, por ejemplo, una etiqueta de péptido c-myc, una etiqueta de péptido flag, una etiqueta de péptido HA o una etiqueta de péptido V5, y el conmutador de dimerización comprende polipéptidos con afinidad por los dominios de conmutación por ejemplo, moléculas de anticuerpo y armazón no de anticuerpo.

En una realización, el RNKR-CAR comprende, además, un conmutador de dimerización de segundo orden.

En una realización, la molécula de dimerización tiene una valencia de más de dos, por ejemplo, es multivalente, y une, y por lo tanto agrupa o dimeriza, más de dos dominios de conmutación.

Las realizaciones de los conmutadores de dimerización descritos en el presente documento pueden presentar múltiples dominios de conmutación, a los que a veces se hace referencia en el presente documento como un conmutador múltiple. Un conmutador múltiple comprende una pluralidad de, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, dominios de conmutación, independientemente, en un primer miembro, por ejemplo, un miembro de unión a antígeno, y un segundo miembro, por ejemplo, un miembro de señalización intracelular, tal como se describe en la sección de el presente documento titulada DOMINIOS DE CONMUTACIÓN MÚLTIPLES.

En una realización, el primer miembro, por ejemplo, un miembro de unión a antígeno, comprende una pluralidad de primeros dominios de conmutación, por ejemplo, dominios de conmutación basados en FKBP, y el segundo miembro, por ejemplo, un miembro de señalización intracelular, comprende una pluralidad de segundos dominios de conmutación, por ejemplo, dominios de conmutación basados en FRB. En una realización, el primer miembro comprende un primer y un segundo dominio de conmutación, por ejemplo, un dominio de conmutación basado en FKBP y un dominio de conmutación basado en FRB, y el segundo miembro comprende un primer y un segundo dominio de conmutación, por ejemplo, un dominio de conmutación basado en FKBP y un dominio de conmutación basado en FRB.

En una realización, el primer miembro y el segundo miembro comprenden una pluralidad de dominios de conmutación de homodimerización, por ejemplo, dominios de conmutación basados en GyrB.

En realizaciones, el RNKR-CAR comprende un conmutador múltiple que comprende una pluralidad de, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, dominios de conmutación, independientemente, en un primer miembro, por ejemplo, un miembro de unión a antígeno, y un segundo miembro, por ejemplo, un miembro de señalización intracelular, tal como se describe en la sección de el presente documento titulada DOMINIOS DE CONMUTACIÓN MÚLTIPLES. En una realización, el primer miembro comprende una pluralidad de primeros dominios de conmutación, por ejemplo, dominios de conmutación basados en FKBP, y el segundo miembro comprende una pluralidad de segundos dominios de conmutación, por ejemplo, dominios de conmutación basados en FRB. En una realización, el primer miembro comprende un primer y un segundo dominio de conmutación, por ejemplo, un dominio de conmutación basado en FKBP y un dominio de conmutación basado en FRB, y el segundo miembro comprende un primer y un segundo dominio de conmutación, por ejemplo, un dominio de conmutación basado en FKBP y un dominio de conmutación basado en FRB.

En el presente documento también se dan a conocer RNKR-CAR donde el miembro de unión al antígeno comprende una pluralidad de dominios de unión al antígeno. En una realización, el miembro de unión al antígeno comprende una pluralidad de, por ejemplo, 2, 3, 4 o 5 dominios de unión al antígeno, por ejemplo, scFv, donde cada dominio de unión al antígeno se une a un antígeno diana. En una realización, dos o más de los dominios de unión al antígeno pueden unirse a diferentes antígenos. En una realización, dos o más de los dominios de unión al antígeno pueden unirse al mismo antígeno, por ejemplo, el mismo o diferentes epítopos en el mismo antígeno. En realizaciones, opcionalmente se dispone un enlazador o una región bisagra entre dos o cada uno de los dominios de unión al antígeno.

En una realización, la dimerización de los dominios de conmutación da como resultado la agrupación de los miembros de señalización intracelular.

En una realización, la dimerización de los dominios de conmutación da como resultado un aumento en la señalización por los dominios de señalización intracelular.

Los RNKR-CAR descritos en el presente documento pueden incluir, por ejemplo, en lugar de un dominio de unión al antígeno basado en scFv, un dominio extracelular de un receptor inhibidor, por ejemplo, PD1. Si bien no se desea ligarse a la teoría, se cree que el acoplamiento del dominio extracelular inhibidor con su contraligando (que normalmente regula por disminución la respuesta inmune), activa la respuesta inmune.

Los RNKR-CAR descritos en el presente documento pueden incluir, por ejemplo, en lugar de un dominio de unión al antígeno basado en scFv, un dominio extracelular de un dominio ECD coestimulador. Aunque no desea ligarse a la teoría, se cree que el acoplamiento del ECD con su contraligando activa la respuesta inmune a través del RNKR-CAR.

En una realización, el RNKR-CAR se asocia con, por ejemplo, se proporciona en la misma célula con: un inhibidor de una molécula inhibidora, por ejemplo, un inhibidor de una molécula inhibidora de la Tabla 3.

En una realización, el RNKR-CAR se asocia con, por ejemplo, se proporciona en la misma célula con, un inhibidor de ácido nucleico, por ejemplo, un siARN, un shARN, o una molécula antisentido, que reconoce una molécula inhibidora, por ejemplo, una molécula coinhibitoria de la Tabla 3.

En una realización, el shARN reconoce PD1.

En una realización, la dimerización aumenta el nivel de la proliferación o la persistencia de la célula que expresa RNKR-CAR.

En una realización, el RNKR-CAR comprende además:

un miembro de unión al contraligando inhibidor, que comprende

un dominio de unión a contraligando inhibidor seleccionado, por ejemplo, de la Tabla 4, y

un dominio transmembrana o una anclaje a membrana.

En otro aspecto, en el presente documento se describe un ácido nucleico que codifica un RNKR-CAR descrito en el presente documento. En particular, se proporciona un ácido nucleico que codifica un RNKR-CAR de la invención. En realizaciones, el ácido nucleico comprende:

i) una secuencia que codifica (a) un miembro de unión al antígeno y (b) un miembro de señalización intracelular que está dispuesto en una única molécula de ácido nucleico; o

ii) una secuencia que codifica (a) un miembro de unión al antígeno que está dispuesta en una primera molécula de ácido nucleico, y una secuencia que codifica (b) un miembro de señalización intracelular que está dispuesta en una segunda molécula de ácido nucleico.

En realizaciones, el ácido nucleico comprende además una secuencia que codifica (c) una molécula adaptadora o molécula de señalización intracelular, por ejemplo, DAP12 o Fcgamma R, en el que

i) la secuencia que codifica (a), (b) y (c), es proporcionada en una única molécula de ácido nucleico;

ii) la secuencia que codifica dos de (a), (b) y (c) es proporcionada en una primera molécula de ácido nucleico y la secuencia que codifica la otra es proporcionada en una segunda molécula de ácido nucleico; o

iii) la secuencia que codifica (a) es proporcionada en una primera molécula de ácido nucleico, la secuencia que codifica (b) es proporcionada en una segunda molécula de ácido nucleico y la secuencia que codifica (c) es proporcionada en una tercera molécula de ácido nucleico.

En realizaciones, el ácido nucleico comprende además una secuencia que codifica un segundo CAR, por ejemplo, un CAR estándar, RNKR-CAR, RCAR, o NKR-CAR.

En una realización, la secuencia que codifica el miembro de unión al antígeno está operativamente unida con una primera región de control y la secuencia que codifica el miembro de señalización intracelular está operativamente unido con una segunda región de control.

En una realización, la secuencia que codifica el miembro de unión al antígeno se transcribe como un primer ARN y la secuencia que codifica el miembro de señalización intracelular se traduce como un segundo ARN.

En una realización, el ácido nucleico comprende además una secuencia que codifica un shARN que reconoce un dominio coinhibidor.

En una realización, la secuencia que codifica el miembro de unión al antígeno, el miembro de señalización intracelular, y una secuencia que codifica un shARN que tiene reconoce un dominio coinhibidor, están presentes en una única molécula de ácido nucleico.

En una realización, la secuencia que codifica el miembro de unión al antígeno está presente en una primera molécula de ácido nucleico y la secuencia que codifica el miembro de señalización intracelular está presente en una segunda molécula de ácido nucleico y una secuencia que codifica un shARN que reconoce un dominio coinhibidor está presente en una o ambas de la primera y segunda moléculas de ácido nucleico.

En una realización, la secuencia que codifica el miembro de unión al antígeno está presente en una primera molécula de ácido nucleico, la secuencia que codifica miembro de señalización intracelular está presente en una segunda molécula de ácido nucleico, y una secuencia que codifica un shARN que reconoce un dominio coinhibidor está presente en una tercera molécula de ácido nucleico.

En un caso, el ácido nucleico codifica un RNKR-CAR, tal como se describe en cualquiera de las Tablas 6, 7, 8, 9, 10 ó 11.

En un caso, el ácido nucleico codifica un RNKR-CAR que comprende:

a) un miembro de señalización intracelular que comprende:

un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primario y

un primer dominio de conmutación;

b) un miembro de unión al antígeno que comprende:

un elemento de dominio de unión (por ejemplo, un dominio de unión al antígeno, un dominio extracelular inhibidor o un dominio extracelular coestimulador),

un segundo dominio de conmutación; y

opcionalmente, un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la Tabla 2, por ejemplo, un dominio 4-1BB; y

c) un dominio transmembrana

donde:

i) una secuencia que codifica a) y b) está dispuesta en una sola molécula de ácido nucleico, por ejemplo, un vector viral, por ejemplo, un vector de lentivirus; o

ii) la secuencia que codifica a) está dispuesta en una primera molécula de ácido nucleico, por ejemplo, un vector viral, por ejemplo, un vector de lentivirus, y la secuencia que codifica b) está dispuesta en una segunda molécula de ácido nucleico, por ejemplo, un vector viral, por ejemplo, un vector de lentivirus.

En un caso, el ácido nucleico codifica un RNKR-CAR que comprende:

a) un miembro de señalización intracelular que comprende:

un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primario y un primer dominio de conmutación;

b) un miembro de unión al antígeno que comprende:

un dominio de unión a antígeno,

un segundo dominio de conmutación;

un dominio transmembrana en a) o b); y

c) un miembro de unión al antígeno auxiliar que comprende:

un dominio de unión al antígeno que se une a un segundo antígeno; y

un dominio transmembrana o dominio de anclaje a la membrana,

donde:

i) la secuencia que codifica a) y b), y c) está dispuesta en una sola molécula de ácido nucleico, por ejemplo, un vector viral, por ejemplo, un vector de lentivirus;

ii) la secuencia que codifica a) y b) está dispuesta en una primera molécula de ácido nucleico, por ejemplo, un vector viral, por ejemplo, un vector de lentivirus, y una secuencia que codifica c está dispuesta en una segunda molécula de ácido nucleico, por ejemplo, un vector viral, por ejemplo, un vector de lentivirus.

iii) la secuencia que codifica a) y c) está dispuesta en una primera molécula de ácido nucleico, por ejemplo, un vector viral, por ejemplo, un vector de lentivirus, y la secuencia que codifica b) está dispuesta en una segunda molécula de ácido nucleico, por ejemplo, un vector viral, por ejemplo, un vector de lentivirus.

iii) la secuencia que codifica b) y c) está dispuesta en una primera molécula de ácido nucleico, por ejemplo, un vector viral, por ejemplo, un vector de lentivirus, y la secuencia que codifica c) está dispuesta en una segunda molécula de ácido nucleico por ejemplo, un vector viral, por ejemplo, un vector de lentivirus; o

v) la secuencia que codifica cada uno de a), b), y c) se proporciona en cada una de las tres moléculas separadas de ácido nucleico, por ejemplo, vectores virales, por ejemplo, vectores de lentivirus.

En una realización, el ácido nucleico comprende:

una primera molécula de ácido nucleico que codifica un primer dominio transmembrana y un primer dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primario, y

una segunda molécula de ácido nucleico que codifica un segundo dominio transmembrana y un segundo dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primario, y

una tercera molécula de ácido nucleico que codifica un dominio de unión a antígeno unido a un anclaje a membrana, donde el primer y el segundo dominios transmembrana están separados uno del otro por un conmutador de heterodimerización situado en la parte externa de una célula,

donde el conmutador de heterodimerización comprende un primer dominio de conmutación y un segundo dominio de conmutación, donde el primer y el segundo dominios de conmutación del conmutador de heterodimerización interaccionan juntos para formar un complejo en presencia de una molécula de heterodimerización tanto en el interior como en el exterior de la célula.

En una realización, el ácido nucleico comprende:

una primera molécula de ácido nucleico que codifica un dominio de unión a antígeno unido a un anclaje a membrana,

una segunda molécula de ácido nucleico que codifica un dominio extracelular inhibidor, y un dominio transmembrana unido al primer dominio de conmutación de un conmutador de heterodimerización; y

una tercera molécula de ácido nucleico que codifica el segundo dominio de conmutación de un conmutador de heterodimerización unido a un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primario,

en el que el dominio extracelular inhibidor está separado del dominio de señalización intracelular mediante un conmutador de heterodimerización, y

en el que el primer y el segundo dominios de conmutación interaccionan juntos para formar un complejo en presencia de una molécula de heterodimerización en el interior o el exterior de la célula.

En una realización, el ácido nucleico comprende:

una primera molécula de ácido nucleico que codifica un dominio de unión a antígeno que se une a una primera diana, un dominio transmembrana unido al primer dominio de conmutación de un conmutador de heterodimerización, una segunda molécula de ácido nucleico que codifica un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primario, donde el dominio de señalización intracelular está unido a un segundo dominio de conmutación de un conmutador de heterodimerización, y

una tercera molécula de ácido nucleico que codifica un dominio de unión a antígeno que se une a una segunda diana que es diferente de la primera diana y un dominio transmembrana, donde el conmutador de heterodimerización está presente en el interior de una célula, donde el primer dominio de conmutación y el segundo dominio de conmutación interaccionan juntos para formar un complejo en presencia de una molécula de heterodimerización en el interior de la célula.

En una realización, el ácido nucleico codifica un RNKR-CAR que comprende:

a) un miembro de señalización intracelular;

b) un miembro de unión al antígeno;

c) un segundo miembro de señalización intracelular,

donde

i) la secuencia que codifica a), b) y c) es proporcionada en una única molécula de ácido nucleico;

ii) la secuencia que codifica dos de a), b) y c) es proporcionada en una primera molécula de ácido nucleico y la secuencia que codifica la otra es proporcionada en una segunda molécula de ácido nucleico; o

iii) la secuencia que codifica a) es proporcionada en una primera molécula de ácido nucleico, la secuencia que codifica b) es proporcionada en una segunda molécula de ácido nucleico y la secuencia que codifica c) es proporcionada en una tercera molécula de ácido nucleico.

En una realización, el ácido nucleico codifica un RNKR-CAR que comprende

a) un miembro de señalización intracelular;

b) un miembro de unión al antígeno;

c) un segundo miembro de señalización intracelular,

donde,

la secuencia que codifica a) y b) es proporcionada en una primera molécula de ácido nucleico y la secuencia que codifica c) es proporcionada en una segunda molécula de ácido nucleico;

la secuencia que codifica a) y c) es proporcionada en una primera molécula de ácido nucleico y la secuencia que codifica b) es proporcionada en una segunda molécula de ácido nucleico; o

la secuencia que codifica b) y c) es proporcionada en una primera molécula de ácido nucleico y la secuencia que codifica a) es proporcionada en una segunda molécula de ácido nucleico.

En una realización, el ácido nucleico codifica un RNKR-CAR que comprende:

a) un miembro de señalización intracelular;

b) un miembro de unión al antígeno;

c) un miembro de unión al antígeno auxiliar,

donde

En una realización, el ácido nucleico codifica un RNKR-CAR que comprende

a) un miembro de señalización intracelular;

b) un miembro de unión al antígeno;

c) un segundo miembro de señalización intracelular,

donde

la secuencia que codifica b) y c) es proporcionada en una primera molécula de ácido nucleico y la secuencia que codifica a es proporcionada en una segunda molécula de ácido nucleico.

En una realización, el ácido nucleico codifica un RNKR-CAR donde el dominio de unión al antígeno está separado del dominio de señalización intracelular por un conmutador de dimerización que comprende un primero y un segundo dominios de conmutación, en el que el primer dominio de conmutación está unido al dominio de unión al antígeno y el segundo dominio de conmutación está unido al dominio de señalización intracelular, en el que el primer y segundo dominios de conmutación interaccionan juntos para formar un complejo en presencia de una molécula de dimerización.

En un aspecto, en el presente documento se proporciona un sistema de vectores, por ejemplo, uno o más vectores, que comprenden un ácido nucleico descrito en el presente documento.

En una realización, todos los elementos de un RNKR-CAR se codifican en un solo vector. Por ejemplo, el miembro de unión al antígeno y el miembro de señalización intracelular están codificados en un solo vector.

En realizaciones, un elemento de un RNKR-CAR está codificado en un primer vector y otro elemento del RNKR-CAR está codificado en un segundo vector, del sistema de vectores. Por ejemplo, un miembro de unión al antígeno es codificado en un primer vector y un miembro de señalización intracelular es codificado en un segundo vector del sistema de vectores.

En realizaciones, el sistema de vectores comprende un ADN, un ARN, un plásmido, un vector de lentivirus, un vector de adenovirus o un vector de retrovirus.

En realizaciones, el vector comprende un vector de lentivirus bicistrónico o tricistrónico.

En una realización, el sistema de vectores comprende un promotor bicistrónico o tricistrónico.

En un aspecto, en el presente documento se describe una célula que comprende un RNKR-CAR descrito en el presente documento, un ácido nucleico que codifica un RNKR-CAR descrito en el presente documento, o un sistema de vectores descrito en el presente documento. Dicha célula que contiene RNKR-CAR (por ejemplo, que expresa RNKR-CAR) también se denomina una célula RNKR-CARX. Se proporciona una célula que comprende un RNKR-CAR de la invención, un ácido nucleico que codifica un RNKR-CA^rde la invención o un sistema de vectores de la invención.

En algunas realizaciones, la célula comprende además un segundo RNKR-CAR, en el que el dominio de unión al antígeno del segundo RNKR-CAR reconoce un antígeno de tumor diferente.

En algunas realizaciones, la célula comprende además un CAR, RCAR o NKR-CAR estándar, en el que el dominio de unión al antígeno del CAR, RCAR o NKR-CAR estándar es diferente del dominio de unión al antígeno del RNKR-CAR, por ejemplo, se une a un antígeno diferente, por ejemplo, un antígeno tumoral.

En realizaciones, la célula es una célula humana.

En realizaciones, la célula es una célula efectora inmune. Por ejemplo, la célula efectora inmune es una célula T o una célula NK.

En otro aspecto, se proporciona en el presente documento un procedimiento de fabricación de una célula descrita en el presente documento (por ejemplo, una célula RNKR-CARX), que comprende introducir un ácido nucleico que codifica un RNKR-CAR descrito en el presente documento, o un sistema de vectores descrito en el presente documento, en dicha célula.

En otro aspecto, se describe en el presente documento un procedimiento de tratamiento de un sujeto con una enfermedad asociada con un antígeno tumoral que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una célula RNKR-CARX descrita en el presente documento.

En casos, la célula RNKR-CAR es una célula T autóloga. Por ejemplo, la célula RNKR-CAR es una célula T alogénica. En casos, la célula RNKR-CAR se selecciona de: una célula Nk autóloga; y una célula NK alogénica. En casos, el sujeto es un ser humano.

En casos, el procedimiento comprende tratar al sujeto del cáncer, por ejemplo, un cáncer descrito en el presente documento. En un caso, el cáncer es un tumor sólido, por ejemplo, un tumor sólido descrito en el presente documento, por ejemplo, mesotelioma (por ejemplo, mesotelioma pleural maligno), cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células escamosas, o cáncer de pulmón de células grandes), cáncer de páncreas (por ejemplo, adenocarcinoma ductal de páncreas), cáncer de ovario, cáncer colorrectal y cáncer de vejiga o cualquier combinación de los mismos. En un caso, la enfermedad es cáncer de páncreas, por ejemplo, adenocarcinoma ductal de páncreas metastásico (PDA), por ejemplo, en un sujeto que ha progresado en al menos una terapia estándar previa. En un caso, la enfermedad es mesotelioma (por ejemplo, mesotelioma pleural maligno), por ejemplo, en un sujeto que ha progresado en al menos una terapia estándar previa. En un caso, la enfermedad es cáncer de ovario, por ejemplo, cáncer de ovario epitelial seroso, por ejemplo, en un sujeto que ha progresado después de al menos un régimen previo de terapia estándar. En ciertos casos, el cáncer es carcinoma de páncreas, mesotelioma, carcinoma de pulmón, carcinoma de ovario, leucemia o linfoma. En determinadas realizaciones, el cáncer es glioblastoma multiforme (GBM), astrocitoma anaplásico, glioblastoma de células gigantes, gliosarcoma, oligodendroglioma anaplásico, ependimoma anaplásico, carcinoma del plexo coroideo, ganglioglioma anaplásico, pineoblastoma, meduloepitelioma, ependimoblastoma, meduloblastoma, tumor neuroectodérmico primitivo supratentorial y tumor teratoide/rabdoide atípico, carcinomas de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de pulmón, mama, próstata, ovario, colorectal o vejiga.

En un caso, el cáncer se selecciona de glioblastoma multiforme (GBM), astrocitoma anaplásico, glioblastoma de células gigantes, gliosarcoma, oligodendroglioma anaplásico, ependimoma anaplásico, carcinoma del plexo coroideo, ganglioglioma anaplásico, pineoblastoma, meduloepitelioma, ependimoblastoma, meduloblastoma, tumor neuroectodérmico primitivo supratentorial y tumor teratoide/rabdoide atípico, carcinomas de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de pulmón, mama, próstata, ovario, colorrectal y de vejiga.

En algunos casos, el cáncer es leucemia linfoide aguda de células B ("BALL"), leucemia linfoide aguda de células T ("TALL"), leucemia linfoide aguda (ALL), leucemia mielógena aguda (AML); una o más leucemias crónicas que incluyen, pero no se limitan a, leucemia mielógena crónica (CML), leucemia linfocítica crónica (CLL); cánceres hematológicos adicionales o afecciones hematológicas que incluyen, pero sin limitación, leucemia prolinfocítica de células B, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas, linfoma de Burkitt, linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular, leucemia de células pilosas, linfoma folicular de células pequeñas o de células grandes, afecciones linfoproliferativas malignas, linfoma MALT, linfoma de células del manto, linfoma de la zona marginal, mieloma múltiple, mielodisplasia y síndrome mielodisplásico, linfoma no de Hodgkin, linfoma plasmablástico, neoplasma de células dendríticas plasmacitoide, macroglobulinemia de Waldenstrom.

En casos, el procedimiento comprende administrar una molécula de dimerización al sujeto.

En casos, el RNKR-CAR comprende un conmutador de dimerización basado FKBP-FRB, y en donde el procedimiento comprende administrar una molécula de dimerización que comprende un inhibidor de mTOR, por ejemplo, RAD001.

En un caso, se describe en el presente documento un procedimiento para proporcionar una célula de RNKR-CAR descrita en el presente documento, que comprende:

proporcionar una célula efectora inmunitaria a una entidad receptora; y

recibir de dicha entidad, una célula de RNKR-CAR derivada de dicha célula efectora inmunitaria, o una célula hija de la misma, en el que el RNKR-CAR comprende un RNKR-CAR descrito en el presente documento, o un ácido nucleico o vector que codifica el RNKR-CAR, por ejemplo, tal como se describe en el presente documento.

En casos, la entidad insertó un ácido nucleico que codifica el RNKR-CAR en dicha célula efectora inmunitaria o una célula hija de la misma.

En casos, el procedimiento comprende además administrar dicho RNKR-CAR a un sujeto.

En un caso, en el presente documento se describe un procedimiento para proporcionar una célula RNKR-CAR que comprende:

recibir de una entidad una célula efectora inmunitaria de un ser humano; insertar un ácido nucleico que codifica un RNKR-CAR descrito en el presente documento en dicha célula efectora inmunitaria, o una célula hija de la misma, para formar una célula de RNKR-CAR; y, opcionalmente, proporcionar dicha célula de RNKR-CAR a dicha entidad. En casos, la entidad es un laboratorio, hospital o un proveedor de hospital.

En algunos casos, en el presente documento se describe un ácido nucleico descrito en el presente documento, un RNKR-CAR descrito en el presente documento, un sistema de vectores descrito en el presente documento, o célula RNKR-CARX descrita en el presente documento para su uso como un medicamento.

Los procedimientos y composiciones descritos en el presente documento presentan la combinación de un RCAR y un NKR-CAR. En una realización, un ácido nucleico descrito en el presente documento puede comprender, además de la secuencia que codifica un RCAR, una secuencia que codifica un NKR-CAR. En una realización, una célula, por ejemplo, una célula citotóxica, por ejemplo, una célula T o una célula NK, descrita en el presente documento, puede comprender, además de un RCAR, un NKR-CAR. Dicha célula se denomina aquí célula RCAR/NKR-CAR. Dicha "combinación" de ácidos nucleicos y células puede usarse en el procedimiento de la divulgación, por ejemplo, procedimientos para tratar a un paciente, por ejemplo, para el cáncer. En casos, un inhNKR-CAR, por ejemplo, un inhKIR-CAR, se usa en combinación con un RCAr .

En un aspecto, se describe en el presente documento una célula de RCAR/NKR-CAR que comprende:

A) un CAR regulable (RCAR) y un NKR-CAR;

B) un ácido nucleico que codifica un RCAR y un NKR-CAR; o

C) un sistema de vectores que comprende un ácido nucleico que codifica un RCAR y un NKR-CAR.

En un caso, la célula comprende un CAR regulable (RCAR) y un NKR-CAR.

En un caso, por ejemplo, en una célula de RCAR/NKR-CAR, el RCAR comprende:

a) un miembro de señalización intracelular que comprende:

un primer dominio de conmutación;

b) un miembro de unión a antígeno que comprende:

un dominio de unión a antígeno,

un segundo dominio de conmutación; y

c) opcionalmente, un dominio transmembrana. Véanse, por ejemplo, las Figs. 2 y 5.

(A menos que se indique lo contrario, cuando los miembros o elementos de un RCAR se describen en el presente documento, el orden puede ser como se indica, pero también se incluyen otros órdenes. En otras palabras, el orden puede ser como se establece en el texto, o el orden puede ser diferente.)

[0195] Más particularmente, la invención proporciona una célula de RCAR/NKR-CAR que comprende: A) un CAR regulable (RCAR) y un NKR-CAR; B) un ácido nucleico que codifica un RCAR y un NKR-CAR; o C) un sistema de vectores que comprende un ácido nucleico que codifica un RCAR y un NKR-CAR,

en el que el RCAR comprende: a) un miembro de señalización intracelular que comprende: un dominio de señalización intracelular primario y un primer dominio de conmutación; b) un miembro de unión a antígeno que comprende: un dominio de unión a antígeno, un segundo dominio de conmutación; y opcionalmente, uno o una pluralidad de dominios de señalización coestimuladores, y c) un dominio transmembrana,

donde el primer y segundo dominios de conmutación forman un conmutador de dimerización, que comprende: 1) un conmutador de dimerización basado en FKBP/FRB, en el que opcionalmente el primer y segundo dominios de conmutación están dimerizados por una rapamicina o un análogo de rapamicina; 2) un conmutador basado en GyrB-GyrB, en el que opcionalmente los primero y segundo dominios de conmutación están dimerizados por cumermicina; 3) un conmutador basado en GAI-GID1; 4) un conmutador de dimerización basado en giberelina; o 5) un conmutador basado en etiqueta Halo/etiqueta SNAP; y en el que el NKR-CAR comprende: a) un dominio de unión a antígeno derivado de una molécula de anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un scFv, un Fv, un Fab, un (Fab')2, un anticuerpo de dominio único (SDAB ), un dominio VH o VL, o un dominio VHH de camélido, b) un dominio transmembrana, y c) un dominio citoplasmático, en el que el NKR-CAR comprende un dominio transmembrana NKR y/o un dominio citoplasmático NKR.

En una realización, el dominio transmembrana puede estar dispuesto en el miembro de señalización intracelular o el miembro de unión a antígeno. En una realización, un dominio transmembrana puede estar dispuesto en el miembro de señalización intracelular y un dominio transmembrana o anclaje a membrana (el anclaje a membrana y el dominio de anclaje a membrana se usan indistintamente en el presente documento) pueden estar dispuestos en el miembro de unión a antígeno.

En una realización, los primero y segundo dominios de conmutación pueden formar un conmutador de dimerización intracelular o extracelular.

En una realización, el conmutador de dimerización puede ser un conmutador de homodimerización o un conmutador de heterodimerización.

Tal como se discute en el presente documento, las realizaciones de un RCAR pueden incluir un miembro, por ejemplo, un miembro de señalización intracelular, que comprende uno o más dominios de señalización intracelular, como, por ejemplo, se describe anteriormente. En realizaciones, un miembro de unión a antígeno puede comprender un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización coestimulador. Las realizaciones de dichos miembros, y los dominios de señalización intracelular, se describen en la sección que sigue inmediatamente a continuación, a la que a veces se hace referencia en el presente documento como Módulo de dominio de señalización intracelular.

En una realización, el RCAR comprende un segundo dominio de señalización intracelular.

En una realización, el segundo dominio de señalización intracelular es un dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 1.

En una realización, el segundo dominio de señalización intracelular es un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 2.

En una realización, el primer y segundo dominios de señalización intracelular comprenden:

un dominio 4-1BB y un dominio CD3zeta; o

un dominio CD28 y un dominio 4-1BB.

En una realización, el RCAR comprende un tercer dominio de señalización intracelular.

En una realización, el tercer dominio de señalización intracelular es un dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 1.

En una realización, el tercer dominio de señalización intracelular es un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 2.

En una realización, uno de los primero, segundo y tercer dominio de señalización intracelular es un dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 1, y los otros dos son dominios de señalización coestimuladores, por ejemplo, seleccionados de, tabla 2.

En una realización, dos de los primeros, segundos y terceros dominios de señalización intracelular son dominios de señalización intracelular primarios, por ejemplo, seleccionados de la lista en la Tabla 1, y el otro es un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la Tabla 2.

En una realización cada uno de los primero, segundo y tercer dominios de señalización intracelular es un dominio de señalización intracelular primaria, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 1,

En una realización, cada uno de los primeros, segundos y terceros dominios de señalización intracelular es un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 2.

En una realización, los primero, segundo, y tercer dominios de señalización intracelular comprenden: un dominio CD28; un dominio 4-1BB y un dominio CD3zeta.

En una realización, el RCAR comprende un cuarto dominio de señalización intracelular.

En una realización, el cuarto dominio de señalización intracelular es un dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 1.

En una realización, el cuarto dominio de señalización intracelular es un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 2.

En una realización, uno de los primero, segundo, tercero y cuarto dominios de señalización intracelular es un dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 1 y los otros tres son dominios de señalización coestimuladores, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 2.

En una realización, dos de los primero, segundo, tercero y cuarto dominios de señalización intracelular son dominios de señalización intracelular primarios, por ejemplo, seleccionados de la lista en la Tabla 1, y los otros dos son dominios de señalización coestimuladores, por ejemplo, seleccionados de la lista en la Tabla 2.

En una realización, tres de los primero, segundo, tercero y cuarto de dominios de señalización intracelular En una realización re dominios de señalización intracelular primaria, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 1, y el otro es un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la lista de la Tabla 2.

En una realización, cada uno de los primero, segundo, tercero, y cuarto dominios de señalización intracelular es un dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 1.

En una realización, cada uno de los primero, segundo, tercero, y cuarto dominios de señalización intracelular es un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 2.

En una realización, el orden de dominio conmutador y el dominio o dominios de señalización intracelular (Iisd) es el siguiente, comenzando por el extremo amino terminal:

conmutador/isd;

conmutador/isd1/isd2;

isd1/conmutador/isd2;

isd1/isd2/conmutador;

conmutador/isd1/isd2/isd3;

isd1/isd2/isd3/conmutador;

isd1/conmutador/isd2/isd3; e

isd1/isd2/conmutador/isd3.

En una realización, el orden de dominio conmutador y el dominio o dominios de señalización intracelular (isd) es el siguiente, comenzando por el extremo carboxi-terminal:

conmutador/isd;

conmutador/isd1/isd2

isd1/conmutador/isd2

isd1/isd2/conmutador;

conmutador/isd1/isd2/isd3

isd1/isd2/isd3/conmutador

isd1/conmutador/isd2/isd3

isd1/isd2/conmutador/isd3

En un caso, la invención presenta un RCAR, por ejemplo, un RCAR aislado, en el que el RCAR comprende: a) un miembro de unión a antígeno que comprende:

un dominio de unión a antígeno,

un primer dominio transmembrana y

un primer dominio de conmutación; y

b) un miembro de señalización intracelular que comprende:

un segundo dominio transmembrana o anclaje a la membrana,

un segundo dominio de conmutación,

y un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primaria.

Véase, por ejemplo, la Fig. 46.

En un caso, el miembro de unión a antígeno comprende opcionalmente uno o más dominios de señalización coestimuladores descritos en el presente documento. En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende además uno o más dominios de señalización coestimuladores descritos en el presente documento. En un caso, los primero y segundo dominios de conmutación pueden formar un conmutador de dimerización intracelular o extracelular.

En un caso, el primer y/o segundo dominio transmembrana comprende la región o las regiones transmembrana de, por ejemplo, la cadena alfa, beta o zeta de un receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8 (por ejemplo, CD8 alfa, CD8 beta), CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, IL2Rbeta, IL2Rgamma, IL7Ra, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA- 6,CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Táctil), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55),PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp. El primer dominio transmembrana dispuesto en el miembro de unión al antígeno y el segundo dominio transmembrana dispuesto en el miembro de señalización intracelular pueden ser el mismo dominio transmembrana, por ejemplo, tienen la misma secuencia, o pueden ser dominios transmembrana diferentes, por ejemplo, tienen secuencias diferentes.

Tal como se discute en el presente documento, el RCAR puede incluir cualquiera de una variedad de conmutadores de dimerización, por ejemplo, un conmutador de dimerización descrito en el presente documento.

En un caso, los dominios de conmutación son componentes de un conmutador de heterodimerización.

En un caso, los dominios de conmutación son componentes de un conmutador de homodimerización.

En un caso, el conmutador de dimerización es intracelular.

En un caso, el conmutador de dimerización es extracelular.

En un caso, el dominio transmembrana dispuesto en el miembro de unión al antígeno y el conmutador de dimerización, por ejemplo, un conmutador de heterodimerización o un conmutador de homodimerización, es intracelular.

En un caso, cuando el dominio transmembrana está dispuesto en el miembro de señalización intracelular y el conmutador de dimerización, por ejemplo, el conmutador de heterodimerización o homodimerización, es extracelular. En un caso, el conmutador de dimerización comprende un conmutador basado en FKBP-FRB.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende:

un dominio de conmutación que comprende una secuencia de unión a análogo de rapamicina que tiene al menos 80, 85, 90, 95, 98 o 99% de identidad con FKBP, y un dominio de conmutación que comprende una secuencia de unión a secuencia de unión a análogo de rapamicina que tiene al menos un 80, 85, 90, 95, 98 o 99% de identidad con FRB.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende un dominio de conmutación basado en FKBP y un dominio de conmutación basado en FRB descritos en el presente documento.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende:

un dominio de conmutación que comprende una secuencia de unión a análogo de rapamicina que difiere en no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de la correspondiente secuencia de FKBP, y un dominio de conmutación que comprende una secuencia de unión a análogo de rapamicina que difiere en no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de la correspondiente secuencia de FRB.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende un fragmento de unión a FRB o un análogo de FKBP y un fragmento de unión a FKBP o un análogo de FRB, y el fragmento de unión a FKBP o el análogo de FRB comprende una o más mutaciones que potencian la formación de un complejo entre un dominio de conmutación de FKBP, un dominio de conmutación de FRB y la molécula de dimerización, o una mutación descrita en la sección del presente documento titulada CONMUTADORES DE DIMERIZACIÓN BASADOS EN FKBP/FRB MODIFICADOS. Por ejemplo, el fragmento de unión a FKBP o el análogo de FRB comprende: una mutación E2032, por ejemplo, una mutación E2032I o una mutación E2032L; una mutación T2098, por ejemplo, una mutación T2098L; o una mutación E2032 y T2098, por ejemplo, una mutación E2032I y una mutación ^t2098^lo una mutación E2032L y una mutación T2098L.

En un caso, en el que el conmutador es un conmutador basado en FKBP-FRB, la molécula de dimerización es un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor de mTOR alostérico, por ejemplo, rapamicina o un rapálogo, por ejemplo, RAD001.

En un caso, cualquiera de los regímenes de dosificación o las formulaciones de un inhibidor de mTOR alostérico, por ejemplo, RAD001, descrito en la sección en el presente documento para una dosis baja, que aumenta la inmunidad, de un inhibidor de mTOR alostérico, por ejemplo, RAD001, se puede administrar para dimerizar un conmutador basado en FKBP-FRB.

En un caso, el conmutador es un conmutador basado en FKBP-FRB y la molécula de dimerización es RAD001. En un caso, se administra de 0,1 a 20, de 0,5 a 10, de 2,5 a 7,5, de 3 a 6, o aproximadamente 5, mg de RAD001 por semana, por ejemplo, suministrado una vez por semana.

En un caso, se administra de 0,3 a 60, de 1,5 a 30, de 7,5 a 22,5, de 9 a 18, o aproximadamente 15 mg de RAD001 en una formulación de liberación sostenida, por semana, por ejemplo, suministrado una vez por semana.

En un caso, se administra de 0,005 a 1,5, de 0,01 a 1,5, de 0,1 a 1,5, de 0,2 a 1,5, de 0,3 a 1,5, de 0,4 a 1,5, de 0,5 a 1,5, de 0,6 a 1,5, de 0,7 a 1,5, de 0,8 a 1,5, de 1,0 a 1,5, de 0,3 a 0,6, o aproximadamente 0,5 mg de RAD001 por día, por ejemplo, suministrado una vez al día.

En un caso, se administra de 0,015 a 4,5, de 0,03 a 4,5, de 0,3 a 4,5, de 0,6 a 4,5, de 0,9 a 4,5, de 1,2 a 4,5, de 1,5 a 4,5, de 1,8 a 4,5, de 2,1 a 4,5, de 2,4 a 4,5, de 3,0 a 4,5, de 0,9 a 1,8, o aproximadamente 1,5 mg de RAD001 en una formulación de liberación sostenida, por día, por ejemplo, suministrado una vez al día.

En un caso, se administra de 0,1 a 30, de 0,2 a 30, de 2 a 30, de 4 a 30, de 6 a 30, de 8 a 30, de 10 a 30, de 1,2 a 30, de 14 a 30, de 16 a 30, de 20 a 30, de 6 a 12, o aproximadamente 10 mg de RAD001 en una formulación de liberación sostenida, por semana, por ejemplo, suministrado una vez por semana.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende:

En un caso, el dominio de conmutación comprende:

un dominio de conmutación que comprende una secuencia de unión a AP21967 de FKBP y un dominio de c o n m u ta c ió n q u e c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia d e u n ió n a A P 21967 d e F R B , p o r e je m p lo , u n a s e c u e n c ia q u e c o m p re n d e u n a lis in a e n e l re s id u o 2098.

E n un e je m p lo :

e l p r im e r d o m in io d e c o n m u ta c ió n c o m p re n d e ,

u n a ra p a m ic in a , o un a n á lo g o d e ra p a m ic in a , u n a s e c u e n c ia d e u n ió n a F K B P ;

u n a s e c u e n c ia d e u n ió n a a n á lo g o d e ra p a m ic in a d e F K B P ; o

u n a s e c u e n c ia d e u n ió n a A P 21967 d e F K B P ; y,

e l s e g u n d o d o m in io d e c o n m u ta c ió n c o m p re n d e ,

u n a s e c u e n c ia d e u n ió n a ra p a m ic in a o a n á lo g o d e ra p a m ic in a d e F R B ;

u n a s e c u e n c ia d e u n ió n a a n á lo g o d e ra p a m ic in a d e F R B ; o

u n a s e c u e n c ia d e u n ió n a A P 21967 d e F R B , p o r e je m p lo , u n a s e c u e n c ia q u e c o m p re n d e u n a lis in a en e l re s id u o 2098.

E n un ca so :

e l p r im e r d o m in io d e c o n m u ta c ió n c o m p re n d e ,

u n a s e c u e n c ia d e u n ió n a ra p a m ic in a , o un a n á lo g o d e ra p a m ic in a , d e F R B ;

u n a s e c u e n c ia d e u n ió n a A P 21967 d e F R B , p o r e je m p lo , u n a s e c u e n c ia q u e c o m p re n d e u n a lis in a en e l re s id u o 2098 ; y,

e l s e g u n d o d o m in io d e c o n m u ta c ió n c o m p re n d e ,

u n a u n a s e c u e n c ia d e u n ió n a ra p a m ic in a , o un a n á lo g o d e ra p a m ic in a , d e F K B P ;

u n a s e c u e n c ia d e u n ió n a A P 21967 d e F K B P .

E n un ca so :

e l p r im e r d o m in io d e c o n m u ta c ió n c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia d e u n ió n a A P 21967 d e F K B P ; y,

e l s e g u n d o d o m in io d e c o n m u ta c ió n c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia d e u n ió n a A P 21967 d e F R B , p o r e je m p lo , u n a s e c u e n c ia q u e c o m p re n d e u n a lis in a e n e l re s id u o 2098.

E n un c a s o , e l p r im e r d o m in io d e c o n m u ta c ió n c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia d e u n ió n a A P 21967 d e F R B , p o r e je m p lo , u n a s e c u e n c ia q u e c o m p re n d e u n a lis in a e n e l re s id u o 2098 ; y,

e l s e g u n d o d o m in io d e c o n m u ta c ió n c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia d e u n ió n a A P 21967 d e F K B P .

E n un c a s o , la m o lé c u la d e d im e r iz a c ió n e s un a n á lo g o d e ra p a m ic in a , p o r e je m p lo , A P 21967.

E n un c a s o , e l c o n m u ta d o r d e d im e r iz a c ió n c o m p re n d e un c o n m u ta d o r b a s a d o e n G y rB -G y rB .

E n un c a s o , e l c o n m u ta d o r d e d im e r iz a c ió n c o m p re n d e :

un d o m in io d e c o n m u ta c ió n q u e c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia d e u n ió n a c u m e rm ic in a q u e t ie n e a l m e n o s un 80 , 85 , 90 , 95 , 98 o 99 % d e id e n tid a d c o n e l s u b d o m in io d e l e x tre m o a m in o te rm in a l d e 24 k D a d e G y rB .

un d o m in io d e c o n m u ta c ió n q u e c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia d e u n ió n a c u m e rm ic in a q u e s e d ife re n c ia e n n o m á s d e 10, 9, 8 , 7, 6 , 5, 4 , 3, 2, o 1 re s id u o s d e a m in o á c id o d e la s e c u e n c ia c o rre s p o n d ie n te d e l s u b d o m in io d e l e x tre m o a m in o te rm in a l d e 24 k D a d e G y rB .

un d o m in io d e c o n m u ta c ió n q u e c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia d e u n ió n a c u m e rm ic in a d e l s u b d o m in io d e l e x tre m o a m in o te rm in a l d e 24 k D a d e G y rB .

e l s u b d o m in io d e l e x tre m o a m in o te rm in a l d e 24 k D a d e G y rB .

E n un c a s o , la m o lé c u la d e d im e r iz a c ió n e s u n a c u m e rm ic in a .

E n un c a s o , e l c o n m u ta d o r d e d im e r iz a c ió n c o m p re n d e un c o n m u ta d o r b a s a d o en G A I-G ID 1.

un d o m in io d e c o n m u ta c ió n G ID 1 q u e c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia d e u n ió n a g ib e re lin a , o u n a n á lo g o d e g ib e re lin a , p o r e je m p lo , G A 3, q u e t ie n e a l m e n o s un 80 , 85 , 90 , 95 , 98 , o 99 % d e id e n t id a d c o n G ID 1 y un d o m in io d e c o n m u ta c ió n q u e c o m p re n d e un d o m in io d e c o n m u ta c ió n G A I q u e t ie n e a l m e n o s un 80 , 85 , 90 , 95 , 98 o 99 % d e id e n tid a d c o n G A I.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende:

un dominio de conmutación GID1 que comprende una secuencia de unión a giberelina, o un análogo de giberelina, por ejemplo, GA³, que difiere en no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 , 3, 2 o 1 residuos de aminoácido de la secuencia correspondiente de un GID1 descrito en el presente documento, y un dominio de conmutación GAI que difiere en no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácido de la secuencia correspondiente de un GAI descrito en el presente documento.

En un caso:

el primer dominio de conmutación comprende un dominio de conmutación GID1; y

el segundo dominio de conmutación comprende un dominio de conmutación GAI.

En un caso:

el primer dominio de conmutación comprende un dominio de conmutación GAI; y

el segundo dominio de conmutación comprende un dominio de conmutación GID¹.

En un caso, la molécula de dimerización es GA³-AM.

En un caso, la molécula de dimerización es GA³.

En un caso, la molécula de dimerización es una molécula pequeña, por ejemplo, es diferente de un polipéptido. En un caso, la molécula de dimerización es un polipéptido, por ejemplo, un polipéptido, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, o un armazón no de anticuerpo, por ejemplo, una fibronectina o adnectina, que tiene afinidad específica por uno o ambos primero y segundo dominios de conmutación.

En un caso, la molécula de dimerización, por ejemplo, un polipéptido, es una molécula de anticuerpo.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende un conmutador basado en etiqueta Halo/etiqueta SNAP. En un caso, el conmutador de dimerización comprende:

un dominio de conmutación de etiqueta Halo que tiene al menos un 80, 85, 90, 95, 98 o 99% de identidad con la SEQ ID NO: 14, y un dominio de conmutación de etiqueta SNAP que tiene al menos un 80, 85, 90, 95, 98 o 99% de identidad con la S^eQ ID NO: 15.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende:

un dominio de conmutación de etiqueta Halo que difiere en no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, o 1 residuos de aminoácido de la SEQ ID NO: 14, y un dominio de conmutación de etiqueta SNAP que difiere en no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de la SEQ ID: 15.

En un caso:

En un caso, la molécula de dimerización comprende la estructura 5.

En un caso, la molécula de dimerización comprende tres o más dominios, por ejemplo, las etiquetas de proteínas que se unen a un dominio de conmutación, por ejemplo, un polipéptido, por ejemplo, una molécula de anticuerpo o un armazón no de anticuerpo, que tiene afinidad para el dominio.

En un caso, la molécula de dimerización es una molécula de dimerización no covalente.

En un caso, la molécula de dimerización es una molécula de dimerización covalente.

En un caso, el conmutador de dimerización, por ejemplo, un conmutador de homodimerización, por ejemplo, un conmutador de homodimerización extracelular, comprende dominios de conmutación que comprenden moléculas de etiqueta, por ejemplo, una etiqueta de péptido c-myc, una etiqueta de péptido flag, una etiqueta de péptido HA o una etiqueta de péptido V5, y el conmutador de dimerización comprende polipéptidos con afinidad por los dominios de conmutación por ejemplo, moléculas de anticuerpo y armazones no de anticuerpo.

En un caso, el RCAR comprende además un conmutador de dimerización de segundo orden.

En un caso, la molécula de dimerización tiene una valencia de más de dos, por ejemplo, es multivalente, y une, y por lo tanto agrupa o dimeriza, más de dos dominios de conmutación.

Los casos de los conmutadores de dimerización descritos en el presente documento pueden presentar múltiples dominios de conmutación, a los que a veces se hace referencia en el presente documento como conmutador múltiple. Un conmutador múltiple comprende una pluralidad de, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, dominios de conmutación, independientemente, en un primer miembro, por ejemplo, un miembro de unión a antígeno, y un segundo miembro, por ejemplo, un miembro de señalización intracelular, tal como se describe en la sección de el presente documento titulada DOMINIOS DE CONMUTACIÓN MÚLTIPLES.

En un caso, el primer miembro, por ejemplo, un miembro de unión al antígeno, comprende una pluralidad de primeros dominios de conmutación, por ejemplo, dominios de conmutación basados en FKBP, y el segundo miembro, por ejemplo, un miembro de señalización intracelular, comprende una pluralidad de segundos dominios de conmutación, por ejemplo, dominios de conmutación basados en FRB. Ver, por ejemplo, la Figura 47A. En un caso, el primer miembro comprende un primer y un segundo dominio de conmutación, por ejemplo, un dominio de conmutación basado en FKBP y un dominio de conmutación basado en FRB, y el segundo miembro comprende un primer y un segundo dominio de conmutación, por ejemplo, un dominio de conmutación basado en FKBP y un dominio de conmutación basado en FRB. Véase, por ejemplo, la Figura 47B.

En un caso, el primer miembro y el segundo miembro comprenden una pluralidad de dominios de conmutación de homodimerización, por ejemplo, dominios de conmutación basados en GyrB.

Tal como se discute en el presente documento, los casos de un RCAR pueden incluir un miembro, por ejemplo, un miembro de unión al antígeno, que comprende un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización coestimulador. Aunque no se desea ligar a la teoría, se cree que la presencia de dicho dominio promueve la persistencia del miembro en una célula sin activación significativa en ausencia de asociación mediada por conmutador de dimerización de miembros del RCAR.

En un caso, el RCAR comprende:

a) un miembro de señalización intracelular que comprende:

un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización primario, por ejemplo, seleccionado de la Tabla 1, por ejemplo, un dominio CD3zeta, y

un primer dominio de conmutación, por ejemplo, un dominio de conmutación de FKBP; y

b) un miembro de unión al antígeno que comprende:

un dominio de unión a antígeno,

un dominio transmembrana,

un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la Tabla 2, por ejemplo, un dominio 4-1BB, y

un segundo dominio de conmutación, por ejemplo, un dominio de conmutación de FRB.

Véanse, por ejemplo, las Figuras 26, 34A y 36A.

En un caso, el miembro de unión a antígeno comprende: una pluralidad, por ejemplo, 2 o 3 dominios de señalización coestimuladores, elegidos, por ejemplo, de la Tabla 2, y en casos, ningún dominio de señalización intracelular primario.

En un caso, el miembro de unión al antígeno comprende: una pluralidad, por ejemplo, 2 o 3, dominios de señalización coestimuladores seleccionados entre 41BB, CD28, CD27, ICOS y OX40.

En un caso, los dos o más dominios coestimuladores pueden ser el mismo dominio de señalización coestimulador o diferentes dominios de señalización coestimuladores.

En un caso, el miembro de unión al antígeno comprende los siguientes dominios de señalización coestimuladores, desde la dirección extracelular a la intracelular:

41BB-CD27;

CD27-41BB;

41BB-CD28;

CD28-41BB;

OX40-CD28;

CD28-OX40;

CD28-41BB; o

41BB-CD28.

En un caso, el miembro de unión a antígeno comprende los siguientes dominios de señalización coestimuladores: CD28-41BB.

En un caso, el miembro de unión a antígeno comprende los siguientes dominios de señalización coestimuladores: CD28- OX40.

En un caso, el miembro de unión a antígeno comprende: una pluralidad, por ejemplo, 2 o 3 dominios de señalización coestimuladores, elegidos, por ejemplo, de la Tabla 2, por ejemplo, una combinación de dominios de señalización coestimuladores descritos en el presente documento, y el dominio de unión intracelular comprende un dominio CD3zeta.

En un caso, un miembro de unión a antígeno que tiene dos o más dominios de señalización coestimuladores no comprende un dominio de señalización intracelular primario.

En un caso, el primer y segundo dominios de conmutación comprenden un conmutador basado en FKBP-FRB, que comprende un dominio de conmutación que comprende un fragmento de unión a FRB o un análogo de FKBP y un dominio de conmutación que comprende un fragmento de unión a FKBP o un análogo de FRB, y el fragmento de unión a FKBP o el análogo de FRB comprende una o más mutaciones que potencian la formación de un complejo entre un dominio de conmutación de FKBP, un dominio de conmutación de ^fR^by la molécula de dimerización, o una mutación descrita en la sección de el presente documento titulada CONMUTADORES DE DIMERIZACIÓN BASADOS EN FKBP/FRB MODIFICADOS. Por ejemplo, el fragmento de unión a FKBP o el análogo de FRB comprende: una mutación E2032, por ejemplo, una mutación E2032I o una mutación E2032L; una mutación T2098, por ejemplo, una mutación T2098L; o una mutación E2032 y una mutación T2098, por ejemplo, una mutación E2032I y una mutación T2098L o una mutación E2032L y una mutación T2098L.

En tales casos, el RCAR comprende un conmutador múltiple que comprende una pluralidad de, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, dominios de conmutación, de forma independiente, en un primer miembro, por ejemplo, un miembro de unión al antígeno, y un segundo miembro, por ejemplo, un miembro de señalización intracelular, tal como se describe en la sección titulada en el presente documento DOMINIOS DE CONMUTACIÓN MÚLTIPLES. En un caso, el primer miembro comprende una pluralidad de los primeros dominios de conmutación, por ejemplo, dominios de conmutación basados en FKBP, y el segundo miembro comprende una pluralidad de segundos dominios de conmutación, por ejemplo, dominios de conmutación basados en FRB. En un caso, el primer miembro comprende un primer y un segundo dominio de conmutación, por ejemplo, un dominio de conmutación basado en FKBP y un dominio de conmutación basado en FRB, y el segundo miembro comprende un primer y un segundo dominios de conmutación, por ejemplo, un dominio de conmutación basado en FKBP y un dominio de conmutación basado en FRB.

También se describen en el presente documento los RCAR en los que el miembro de unión al antígeno comprende una pluralidad de dominios de unión a antígeno. En un caso, el miembro de unión al antígeno comprende una pluralidad de, por ejemplo, 2, 3, 4 o 5 dominios de unión al antígeno, por ejemplo, scFvs, donde cada dominio de unión al antígeno se une a un antígeno diana. En un caso, dos o más de los dominios de unión a antígeno pueden unirse a diferentes antígenos. En un caso, dos o más de los dominios de unión a antígeno pueden unirse al mismo antígeno, por ejemplo, el mismo o diferentes epítopos en el mismo antígeno. En casos, un enlazador o región bisagra se dispone opcionalmente entre dos o cada uno de los dominios de unión al antígeno.

En un caso, el RCAR comprende

a) un miembro de señalización intracelular que comprende:

un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la Tabla 1, por ejemplo, un dominio Cd3zeta, y

un dominio de conmutación de FDBP; y

b) un miembro de unión al antígeno que comprende:

(i) un dominio de unión al antígeno, por ejemplo, un dominio de unión al antígeno que reconoce CD19, por ejemplo, un dominio de unión al antígeno anti CDl9 descrito en el presente documento,

(ii) un dominio transmembrana,

(iii) uno de:

(A) un dominio de señalización coestimulador CD28 y un dominio de señalización coestimulador 4-1BB; o

(B) un dominio de señalización coestimulador CD28 y un dominio de señalización coestimulador OX-40; y

(iv) un dominio de conmutación de FRB que comprende una o más mutaciones descritas en la sección titulada en el presente documento, CONMUTADORES DE DIMERIZACIÓN BASADOS EN FKBP/FRB MODIFICADOS, por ejemplo, una mutación E2032I y una mutación T2098L o una mutación E2032L y una mutación T2098L.

En un caso, el orden de los elementos en el miembro de unión al antígeno es el siguiente, comenzando con el extremo amino terminal:

dominio de unión al antígeno/dominio transmembrana/dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la Tabla 2, por ejemplo, un dominio 4-lBB/dominio de conmutación; o

dominio de unión al antígeno/dominio transmembrana/dominio de conmutación/dominio de señalización intracelular, por ejemplo, dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la Tabla 2, por ejemplo, un dominio 4-1BB.

En un caso, el orden de los elementos en el miembro de señalización intracelular es el siguiente, comenzando por el extremo amino terminal:

dominio de conmutación/dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la Tabla 1, por ejemplo, un dominio CD3zeta, o

un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la Tabla 1, por ejemplo, un dominio CD3zeta/dominio de conmutación.

En un caso, el orden de los elementos en el miembro de unión al antígeno es el siguiente, comenzando por el extremo carboxilo terminal:

dominio de unión al antígeno/dominio transmembrana/dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la Tabla 2, por ejemplo, un dominio 4-1BB/dominio de conmutación; o

dominio de unión al antígeno/dominio transmembrana/dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la Tabla 2, por ejemplo, un dominio 4-1BB.

En un caso, el orden de los elementos en el miembro de señalización intracelular es el siguiente, comenzando con el extremo carboxilo terminal:

un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la Tabla 1, por ejemplo, un dominio CD3zeta /dominio de conmutación.

En un caso, un RCAR comprende un miembro de unión a antígeno auxiliar.

En un caso, el RCAR, por ejemplo, que comprende un miembro de unión a antígeno y un miembro de señalización intracelular, comprende además:

c) un miembro de unión al antígeno auxiliar que comprende:

un dominio de unión al antígeno que se une a un segundo antígeno; y

un dominio transmembrana o dominio de anclaje a la membrana.

En un caso, el dominio de unión al antígeno auxiliar no comprende un dominio de conmutación que pueda formar un conmutador de dimerización con un dominio de conmutación en el miembro de unión al antígeno o el miembro de señalización intracelular.

En un caso, el miembro de unión al antígeno auxiliar no comprende un dominio de señalización intracelular.

En un caso, dicho segundo antígeno es un antígeno de superficie de célula cancerosa.

En un caso, el RCAR, por ejemplo, que comprende un miembro de unión al antígeno y un miembro de señalización intracelular, comprende además:

d) un segundo miembro de unión al antígeno auxiliar que comprende

un dominio de unión al antígeno que se une a un tercer antígeno; y

un dominio transmembrana o un dominio de anclaje a la membrana.

En un caso, dicho tercer antígeno es diferente del antígeno reconocido por el dominio de unión al antígeno del miembro de unión al antígeno y diferente del antígeno reconocido por el dominio de unión al antígeno del miembro de unión al antígeno auxiliar.

En un caso, el RCAR comprende además:

un dominio de unión a antígeno que se une a la primera diana, un dominio transmembrana unido al primer dominio de conmutación de un conmutador de heterodimerización,

un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primario, donde el dominio de señalización intracelular está unido a un segundo dominio de conmutación de un conmutador de heterodimerización, y

un dominio de unión a antígeno que se une a una segunda diana que es diferente de la primera diana y un dominio transmembrana, donde el conmutador de heterodimerización está presente en el interior de una célula, donde el primer dominio de conmutación y el segundo dominio de conmutación interactúan juntos para formar un complejo en presencia de una molécula de heterodimerización en el interior de la célula.

En un caso, el RCAR comprende además

un miembro de unión al antígeno auxiliar no conmutado que comprende:

un dominio de unión a antígeno, por ejemplo, que se une a un segundo antígeno,

un dominio transmembrana, y

un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primario.

Véase, por ejemplo, la Figura 9.

En un caso, el miembro de unión a antígeno auxiliar no conmutado comprende además un dominio de señalización coestimulador.

En un caso, el miembro de unión al antígeno auxiliar no conmutado de miembro de señalización intracelular comprende un dominio de señalización intracelular primario y un dominio de señalización coestimulador.

En un caso, el miembro de unión al antígeno auxiliar no conmutado comprende un dominio 4-1BB. En un caso, el miembro de unión al antígeno auxiliar no conmutado comprende un dominio CD3zeta. En un caso, el miembro de unión al antígeno auxiliar no conmutado comprende un dominio CD3zeta y un dominio 4-1BB.

En un caso, el RCAR está asociado con, por ejemplo, se proporciona en la misma célula con: un inhibidor de una molécula inhibidora, por ejemplo, un inhibidor de una molécula inhibidora de la Tabla 3.

En un caso, el RCAR está asociado con, por ejemplo, se proporciona en la misma célula con, un shARN que reconoce una molécula inhibidora, por ejemplo, una molécula coinhibitoria de la Tabla 3.

En un caso, el shARN reconoce PD1.

En un caso, el dominio de unión a antígeno se une a un antígeno diana en una célula cancerosa, pero no activa la célula RCARX, por ejemplo, una célula RCART, hasta que se administra una molécula de dimerización.

En un caso, el dominio de unión al antígeno se une a un antígeno diana en una célula diana, por ejemplo, una célula cancerosa, pero no promueve una respuesta efectora inmunitaria, por ejemplo, una activación de células T, hasta que la molécula de dimerización, por ejemplo, una molécula de heterodimerización o una molécula de homodimerización, se administra.

En un caso, el miembro de señalización intracelular comprende un dominio de señalización intracelular primario y un dominio de señalización coestimulador.

En un caso, el miembro de señalización intracelular comprende un dominio 4-1BB. En una realización, el miembro de señalización intracelular comprende un dominio CD3zeta. En una realización, el miembro de señalización intracelular comprende un dominio CD3zeta y un dominio 4-1BB.

En un caso, el RCAR comprende además

un miembro de unión a contraligando inhibidor que comprende,

un dominio de unión a contraligando inhibidor, y

un dominio transmembrana o anclaje a membrana.

En un caso, el miembro de unión a contraligando inhibidor comprende un dominio de conmutación que puede formar un conmutador de dimerización con un dominio de conmutación en el miembro de señalización intracelular.

En un caso, el miembro de unión a contraligando inhibidor no comprende un dominio de conmutación que pueda formar un conmutador de dimerización con un dominio de conmutación en el miembro de señalización intracelular. En un caso, el dominio de unión a contraligando inhibidor se selecciona de la Tabla 4.

En un caso el RCAR comprende:

a) un miembro de señalización intracelular que comprende,

un primer dominio de conmutación;

b) un miembro de unión al antígeno que comprende,

un dominio de unión a antígeno,

un segundo dominio de conmutación; y

un dominio transmembrana,

donde el primer y el segundo dominios de conmutación son intracelulares.

En un caso, el RCAR comprende:

un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular primario, en el que el dominio de unión a antígeno está separado del dominio de señalización intracelular primario mediante un conmutador de dimerización que comprende el primer dominio de conmutación y el segundo dominio de conmutación,

en el que el segundo dominio de conmutación está unido al dominio de unión al antígeno y el primer dominio de conmutación está unido al dominio de señalización intracelular, donde el primer y el segundo dominios de conmutación interactúan juntos para formar un complejo en presencia de una molécula de dimerización.

En un caso, el RCAR comprende:

un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primario,

en el que el dominio de unión a antígeno está separado del dominio de señalización intracelular por un conmutador de heterodimerización presente en el interior de una célula,

donde el conmutador de heterodimerización comprende un primer dominio de conmutación y un segundo dominio de conmutación, en el que el primer dominio de conmutación está unido al dominio transmembrana y el segundo dominio de conmutación está unido al dominio de señalización intracelular,

en el que el primer dominio de conmutación y el segundo dominio de conmutación interactúan juntos para formar un compuesto en el presencia de una molécula de heterodimerización en el interior de la célula.

En un caso, el dominio transmembrana está dispuesto entre el segundo dominio de conmutación y el dominio de unión al antígeno.

En un caso, el miembro de señalización intracelular no comprende un dominio transmembrana.

En un caso, el RCAR comprende:

a) un miembro de señalización intracelular que comprende

un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primario,

un primer dominio de conmutación,

un dominio transmembrana; y

b) un miembro de unión al antígeno que comprende

un dominio de unión al antígeno, y

un segundo dominio de conmutación,

donde el primer y el segundo dominios de conmutación son extracelulares.

En un caso, el RCAR comprende:

en el que el dominio de unión al antígeno está separado del dominio de señalización intracelular mediante un conmutador de dimerización situado en la parte exterior de una célula,

donde el conmutador de dimerización comprende el primer dominio de conmutación y el segundo dominio de conmutación,

donde el segundo dominio de conmutación está unido al dominio de unión a antígeno unido a un anclaje a membrana y el primer dominio de conmutación está unido al dominio transmembrana,

en el que el primer dominio de conmutación y el segundo dominio de conmutación interactúan juntos para formar un complejo en presencia de una molécula de dimerización en el exterior de la célula.

En un caso, el RCAR comprende

en el que el dominio de unión a antígeno está separado del dominio de señalización intracelular por un conmutador de heterodimerización presente en el exterior de una célula,

donde el conmutador de homodimerización comprende el primer dominio de conmutación y el segundo dominio de conmutación,

en el que el primer dominio de conmutación y el segundo dominio de conmutación interactúan juntos para formar un complejo en presencia de una molécula de homodimerización en el exterior de la célula.

En un caso, el segundo dominio de conmutación se dispone entre el dominio de unión al antígeno y un anclaje a membrana o un dominio transmembrana.

En un caso, el miembro de unión al antígeno no comprende un dominio transmembrana.

En un caso, el segundo dominio de conmutación está unido al dominio de unión a antígeno unido a un anclaje a membrana y el primer dominio de conmutación está unido al dominio transmembrana,

En un caso, la molécula dimerización se selecciona de una molécula de anticuerpo, un anticuerpo específico dual, un anticuerpo monoespecífico, un armazón no de anticuerpo, por ejemplo, una fibronectina o una adnectina, y un péptido.

En un caso, el primer dominio de conmutación y el segundo dominio de conmutación son diferentes y la molécula de heterodimerización es una molécula de anticuerpo específico dual que se une al primer dominio de conmutación y al segundo dominio de conmutación.

En un caso, el RCAR comprende:

a) un miembro de señalización intracelular que comprende:

un primer dominio de conmutación;

b) un miembro de unión al antígeno que comprende:

un dominio de unión a antígeno,

un segundo dominio de conmutación; y

c) y opcionalmente, un dominio transmembrana,

donde dichos primer y segundo dominios de conmutación forman un conmutador basado en FKBP-FRB.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende un primer y un segundo dominio de conmutación basado en FKBP-FRB descrito en el presente documento, por ejemplo, en el Módulo de Dominios de Conmutación en el presente documento anteriormente.

En un caso, el conmutador basado en FKBP-FRB comprende un dominio de conmutación que comprende un fragmento de unión a FRB o un análogo de FKBP y un dominio de conmutación que comprende un fragmento de unión a FKBP o un análogo de FRB, y el fragmento de unión a FKBP o un análogo de FRB comprende una o más mutaciones que potencian la formación de un complejo entre un dominio de conmutación de FKBp , un dominio de conmutación de FRB y la molécula de dimerización, o una mutación descrita en la sección del presente documento titulada CONMUTADORES DE DIMERIZACIÓN BASADOS EN FKBP/FRB MODIFICADOS. Por ejemplo, el fragmento de unión a FKBP o el análogo de FRB comprenden:

una mutación E2032, por ejemplo, una mutación E2032I o una mutación E2032L; una mutación T2098, por ejemplo, una mutación T2098L; o una mutación E2032 y una mutación T2098, por ejemplo, una mutación E2032I y una mutación T2098L o una mutación E2032L y una mutación T2098L.

En un caso, el RCAR comprende un conmutador extracelular basado en FKBP-FRB, por ejemplo, el RCAR comprende:

a) un miembro de señalización intracelular que comprende (en la dirección de extracelular a citoplasmático, cuando está situado la membrana de una célula):

un primer dominio de conmutación,

un dominio transmembrana, y

un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primario;

b) un miembro de unión al antígeno que comprende (en la dirección de extracelular a citoplasmático, cuando está situado en la membrana de una célula):

un dominio de unión a antígeno,

un segundo dominio de conmutación, y

un dominio transmembrana o un dominio de anclaje a la membrana,

donde dichos primer y segundo dominios de conmutación forman un conmutador extracelular basado en FKPB-FRB. En un caso, el conmutador de dimerización comprende un primer y un segundo dominio de conmutación basado en FKBP-FRB descrito en el presente documento, por ejemplo, en el Módulo de Dominios de Conmutación en el presente documento anteriormente.

En un caso, cualquiera de los regímenes de dosificación o formulaciones de un inhibidor de mTOR alostérico, por ejemplo, RAD001, descrito en la sección en el presente documento para una dosis baja, que aumenta la inmunidad, de un inhibidor de mTOR alostérico, por ejemplo, RAD001, se puede administrar para dimerizar un conmutador basado en FKBP-FRB.

En un caso, se administra de 0,005 a 1,5, de 0,01 a 1,5, de 0,1 a 1,5, de 0,2 a 1,5, de 0,3 a 1,5, de 0,4 a 1,5, de 0,5 a 1,5, de 0,6 a 1,5, de 0,7 a 1,5, de 0,8 a 1,5 de 1,0 a 1,5 de 0,3 a 0,6, o aproximadamente 0,5 mg de RAD001 por día, por ejemplo, suministrado una vez una vez al día.

En un caso, se administra de 0,015 a 4,5, de 0,03 a 4,5, de 0,3 a 4,5, de 0,6 a 4,5, de 0,9 a 4,5, de 1,2 a 4,5, de 1,5 a 4,5, de 1,8 a 4,5, de 2,1 a 4,5, de 2,4 a 4,5, de 3,0 a 4,5, de 0,9 a 1,8, o aproximadamente 1,5 mg de RAD001 en una formulación de liberación sostenida, por día, por ejemplo, suministrado una vez una vez al día.

a) un miembro de señalización intracelular que comprende (por ejemplo, en la dirección del extremo amino terminal al extremo carboxilo terminal):

un primer dominio de conmutación, y

un dominio de unión a antígeno,

un dominio transmembrana, y

un segundo dominio de conmutación

donde dichos primer y segundo dominios de conmutación forman un conmutador basado en FKPB-FRB intracelular. En un caso, el conmutador de dimerización comprende un primer y un segundo dominio de conmutación basado en FKBP-FRB descrito en el presente documento, por ejemplo, en el Módulo de Dominios de Conmutación en el presente documento anteriormente.

En un caso, en el que el conmutador es un conmutador basado en FKBP-FRB, la molécula de dimerización es un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor de mTOR alostérico, por ejemplo, rapamicina o un derivado de rapamicina, por ejemplo, RAD001.

En un caso, se administra de 0,3 a 60, de 1,5 a 30, de 7,5 a 22,5, de 9 a 18 o aproximadamente 15 mg de RAD001 en una formulación de liberación sostenida, por semana, por ejemplo, suministrado una vez por semana.

En un caso, el RCAR comprende:

a) un miembro de señalización intracelular que comprende (por ejemplo, en la dirección del extremo amino terminal al extremo carboxilo terminal);

un primer dominio de conmutación, y

un dominio de unión a antígeno,

un dominio transmembrana, y

un segundo dominio de conmutación.

donde dichos primer y segundo dominios de conmutación forman un conmutador intracelular.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende un conmutador basado en FKBP-FRB, por ejemplo, un conmutador basado en FKBP-FRB descrito en el presente documento, por ejemplo, un conmutador basado en FKBP-FRB, tal como se describe en el presente documento, por ejemplo, en el Módulo de Conmutadores de Dimerización.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende un conmutador basado en GyrB-GyrB, por ejemplo, un conmutador basado en GyrB-GyrB descrito en el presente documento, por ejemplo, un conmutador basado en GyrB-GyrB, tal como se describe en el presente documento, por ejemplo, en el Módulo de Conmutadores de Dimerización. En un caso, el conmutador de dimerización comprende un conmutador basado en GAI-GID1, por ejemplo, un conmutador basado en GAI-GID1 descrito en el presente documento, por ejemplo, un conmutador basado en GAI-GID1, tal como se describe en el presente documento, por ejemplo, en el Módulo de Conmutadores de Dimerización. En un caso, el conmutador de dimerización comprende un conmutador basado en etiqueta Halo/etiqueta SNAP, por ejemplo, un conmutador basado en etiqueta Halo/etiqueta SNAP descrito en el presente documento, por ejemplo, un conmutador basado en etiqueta Halo/etiqueta SNAP, tal como se describe en el presente documento, por ejemplo, en el Módulo de Conmutadores de Dimerización.

En un caso, el RCAR comprende:

a) un miembro de señalización intracelular que comprende (en la dirección de extracelular a citoplasmático cuando está situado en la membrana de una célula):

un primer dominio de conmutación, por ejemplo, un dominio de conmutación de FKBP,

un dominio transmembrana, y

b) un miembro de unión al antígeno que comprende (en la dirección de extracelular a citoplasmático cuando está situado en la membrana de una célula):

un dominio de unión a antígeno,

un segundo dominio de conmutación, por ejemplo, un dominio de conmutación de FRB, y

un dominio transmembrana o un dominio de anclaje a la membrana,

donde dichos primer y segundo dominios de conmutación forman un conmutador extracelular.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende un conmutador basado en GyrB-GyrB, por ejemplo, un conmutador basado en GyrB-GyrB descrito en el presente documento, por ejemplo, un conmutador basado en GyrB-GyrB, tal como se describe en el presente documento, por ejemplo, en el Módulo de Conmutadores de Dimerización. En un caso, el conmutador de dimerización comprende un conmutador basado en GAI-GID1, por ejemplo, un conmutador basado en GAI-GID1 descrito en el presente documento, por ejemplo, un conmutador basado en GAI-GID1, tal como se describe en el presente documento, por ejemplo, en el Módulo de Conmutadores de Dimerización. En un caso, el conmutador de dimerización comprende un conmutador basado en etiqueta Halo/etiqueta SNAP, por ejemplo, un conmutador basado en etiqueta Halo/etiqueta SNAP descrito en el presente docmento, por ejemplo, un conmutador basado en etiqueta Halo/etiqueta SNAP, tal como se describe en el presente documento, por ejemplo, en el Módulo de Conmutadores de Dimerización.

Un caso proporciona RCAR donde el miembro de unión a antígeno no está unido a la superficie de la célula CAR. Esto permite que una célula que tiene un miembro de señalización intracelular se empareje convenientemente con uno o más dominios de unión a antígeno, sin transformar la célula con la secuencia que codifica el miembro de unión a antígeno, tal como se describe en la sección titulada en el presente documento RCAR UNIVERSALES. En ocasiones, en el presente documento se hace referencia a ellos como RCAR universales.

En un caso, el RCAR comprende:

a) un miembro de señalización intracelular que comprende:

un dominio transmembrana,

un primer dominio de conmutación, por ejemplo, un dominio de conmutación de FKPB; y

b) un miembro de unión al antígeno que comprende:

un dominio de unión a antígeno, y

un segundo dominio de conmutación, por ejemplo, un dominio de conmutación de FRB,

en el que el miembro de unión a antígeno no comprende un dominio transmembrana o dominio de anclaje a la membrana y, opcionalmente, no comprende un dominio de señalización intracelular.

En un caso, el primer y segundo dominios de conmutación comprenden un conmutador basado en FKBP/FRB. En un caso, el primer dominio de conmutación comprende un fragmento de unión a FRB de FKBP.

En un caso, el segundo dominio de conmutación comprende un fragmento de unión a FKBP de FRB.

En un caso, el conmutador basado en FKBP-FRB comprende un dominio de conmutación que comprende un fragmento de unión a FRB o un análogo de FKBP y un dominio de conmutación que comprende un fragmento de unión a FKBP o un análogo de FRB, y el fragmento de unión a FKBP o un análogo de FRB comprende una o más mutaciones que potencian la formación de un complejo entre un dominio de conmutación de FKB^p, un dominio de conmutación de FRB y la molécula de dimerización, o una mutación descrita en la sección del presente documento titulada CONMUTADORES DE DIMERIZACIÓN BASADOS EN FKBP/FRB MODIFICADOS. Por ejemplo, el fragmento de unión a FKBP o el análogo de FKBP comprende: una mutación E2032, por ejemplo, una mutación E2032I o una mutación E2032L; una mutación T2098, por ejemplo, una mutación T2098L; o una mutación E2032 y una mutación T2098, por ejemplo, una mutación E2032I y una mutación T2098L o una mutación E2032L y una mutación T2098L.

En tal caso, el RCAR comprende un conmutador múltiple que comprende una pluralidad de, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10, dominios de conmutación, de forma independiente, en un primer miembro, por ejemplo, un miembro de unión al antígeno, y un segundo miembro, por ejemplo, un miembro de señalización intracelular, tal como se describe en la sección en el presente documento titulada DOMINIOS DE CONMUTACIÓN MÚLTIPLES. En un caso, el primer miembro comprende una pluralidad de primeros dominios de conmutación, por ejemplo, dominios de conmutación basados en FKBP, y el segundo miembro comprende una pluralidad de segundos dominios de conmutación, por ejemplo, dominios de conmutación basados en FRB. En un caso, el primer miembro comprende un primer y un segundo dominio de conmutación, por ejemplo, un dominio de conmutación basado en FKBP y un dominio de conmutación basado en FRB, y el segundo miembro comprende un primer y un segundo dominio de conmutación, por ejemplo, un dominio de conmutación basado en FKBp y un dominio de conmutación basado en FRB.

En un caso, el miembro de señalización intracelular comprende un dominio de señalización primario, por ejemplo, de la Tabla 1, y un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, de la Tabla 2.

En un caso, el miembro de señalización intracelular comprende un dominio de señalización primario, por ejemplo, de la Tabla 1, y una pluralidad, por ejemplo, 2 o 3, dominios de señalización coestimuladores, por ejemplo, de la Tabla 2.

En un caso, el miembro de señalización intracelular comprende CD3zeta.

En un caso, el RCAR comprende además:

c) un segundo miembro de unión al antígeno que comprende:

un segundo dominio de unión a antígeno, por ejemplo, un segundo dominio de unión a antígeno que se une a un antígeno diferente que está unido por el dominio de unión a antígeno; y

un segundo dominio de conmutación.

En un caso, el miembro de unión a antígeno comprende una pluralidad de, por ejemplo, 2, 3, 4, ó 5, dominios de unión a antígeno, por ejemplo, scFvs, en el que cada dominio de unión al antígeno se une a un antígeno diana. En un caso, dos o más de los dominios de unión a antígeno pueden unirse a diferentes antígenos. En un caso, dos o más de los dominios de unión a antígeno pueden unirse al mismo antígeno, por ejemplo, el mismo o diferentes epítopos en el mismo antígeno. En casos, un enlazador o región bisagra se dispone opcionalmente entre dos o cada uno de los dominios de unión al antígeno.

En un segundo aspecto, la divulgación presenta un RCAR, por ejemplo, un RCAR aislado que comprende:

a) un miembro de señalización intracelular que comprende,

un primer dominio de conmutación, y

un dominio transmembrana; y

b) un miembro de unión al antígeno comprende

un dominio de unión a antígeno, y

un anclaje a membrana o un segundo dominio transmembrana.

Ver, por ejemplo, la Figura 6 en el panel derecho.

En un caso, el miembro de unión a antígeno no comprende un dominio de conmutación que forme un conmutador de dimerización con un conmutador de miembro de señalización intracelular.

En un caso, el miembro de unión al antígeno no comprende un dominio de señalización intracelular.

En un caso, dos copias del primer dominio de conmutación son componentes de un conmutador de homodimerización.

En un caso, el RCAR comprende además:

un segundo miembro de señalización intracelular que comprende

un segundo dominio de conmutación,

donde el primer dominio de conmutación y el segundo dominio de conmutación son componentes de un conmutador de heterodimerización.

En un caso, la dimerización de los dominios de conmutación da lugar a la agrupación de los miembros de señalización intracelular.

En un caso, la dimerización de los dominios de conmutación da lugar a un aumento en la señalización de los dominios de señalización intracelulares.

En un caso, el conmutador de dimerización es extracelular.

En un caso, el conmutador de dimerización es intracelular.

En un caso:

el conmutador de dimerización es un conmutador de homodimerización extracelular, y

el miembro de unión a antígeno no comprende un dominio de conmutación que pueda dimerizarse con un dominio de conmutación en el miembro de señalización intracelular.

En un caso:

el conmutador de dimerización es un conmutador de homodimerización intracelular, y

En un caso, el RCAR comprende:

un segundo miembro de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización intracelular y un segundo dominio de conmutación, que junto con el primer dominio de conmutación, forma un conmutador de heterodimerización extracelular, y

el miembro de unión a antígeno no comprende un dominio de conmutación que pueda dimerizarse con un dominio de conmutación en un miembro de señalización intracelular.

En un caso, el RCAR comprende:

un segundo miembro de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización intracelular y un segundo dominio de conmutación, que junto con el primer dominio de conmutación, forma un conmutador de heterodimerización intracelular, y

En un caso, el RCAR comprende:

un segundo miembro de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización intracelular y un segundo dominio de conmutación, que junto con el primer dominio de conmutación, forma un conmutador de homodimerización extracelular, y

En un caso, el RCAR comprende:

un segundo miembro de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización intracelular y un segundo dominio de conmutación, que junto con el primer dominio de conmutación, forma un conmutador de homodimerización intracelular, y

En un caso, el dominio de señalización intracelular es un dominio de señalización intracelular primario seleccionado, por ejemplo, de la Tabla 1.

En un caso, el dominio de señalización intracelular primario comprende un dominio CD3zeta.

En un caso, el dominio de señalización intracelular es un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 2.

En un caso, el dominio de señalización coestimulador comprende un dominio 4-1BB.

En un caso, el RCAR comprende un segundo dominio de señalización intracelular.

En un caso, el segundo dominio de señalización intracelular es un dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 1.

En un caso, el segundo dominio de señalización intracelular es un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 2.

En un caso, el primer y segundo dominios de señalización intracelular comprenden:

un dominio 4-1BB y un dominio CD3zeta; o

un dominio CD28 y un dominio 4-1BB.

En un caso, el RCAR comprende un tercer dominio de señalización intracelular.

En un caso, el tercer dominio de señalización intracelular es un dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 1.

En un caso, el tercer dominio de señalización intracelular es un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 2.

En un caso, uno del primer, segundo y tercer dominio de señalización intracelular es un dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 1, y los otros dos son dominios de señalización coestimuladores, por ejemplo, seleccionados de la lista de la Tabla 2.

En un caso, dos de los primero, segundo y tercero dominios de señalización intracelular son dominios de señalización intracelulares primarios, por ejemplo, seleccionados de la lista en la Tabla 1, y el otro es un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la lista en Tabla 2.

En un caso, cada uno de los primero, segundo y tercero dominios de señalización intracelular es un dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 1.

En un caso, cada uno de los primero, segundo y tercero dominios de señalización intracelular es un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la lista de la Tabla 2.

En un caso, el primer, segundo, y tercer dominios de señalización intracelular comprenden: el dominio A CD28; un dominio 4-1BB y un dominio CD3zeta.

En un caso, el RCAR comprende un cuarto dominio de señalización intracelular.

En un caso, el cuarto dominio de señalización intracelular es un dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 1.

En un caso, el cuarto dominio de señalización intracelular es un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 2.

En un caso, uno del primer, segundo, tercer y cuarto dominio de señalización intracelular es un dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 1 y los otros tres son dominios de señalización coestimuladores, por ejemplo, seleccionados de la lista en la Tabla 2.

En un caso, dos de los primero, segundo, tercero y cuarto dominios de señalización intracelular son dominios de señalización intracelular primarios, por ejemplo, seleccionados de la lista en la Tabla 1, y los otros dos son dominios de señalización coestimuladores, por ejemplo, seleccionados de la lista en la Tabla 2.

En un caso, tres de los primero, segundo, tercero y cuarto dominios de señalización intracelular son dominios de señalización intracelular primarios, por ejemplo, seleccionados de la lista en la Tabla 1, y el otro es un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 2.

En un caso, cada uno de los primero, segundo, tercero y cuarto dominios de señalización intracelular es un dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 1.

En un caso, cada uno de los primero, segundo, tercero y cuarto dominios de señalización intracelular es un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 2.

En un caso, el orden del dominio de conmutación y el dominio o dominios de señalización intracelular (isd) es el siguiente, comenzando con el término amino:

conmutador/isd;

conmutador/isd1/isd2;

isd1/conmutador/isd2

isd1/isd2/conmutador:

conmutador/isd1/isd2/isd3

isd1/isd2/isd3/conmutador

isd1/conmutador/isd2/isd3

isd1/isd2/conmutador/isd3

En un caso, el orden del dominio de conmutación y el dominio o dominios de señalización intracelular (isd) es el siguiente, comenzando con el término carboxi:

conmutador/isd;

conmutador/isd1/isd2;

isd1/conmutador/isd2

isd1/isd2/conmutador:

conmutador/isd1/isd2/isd3

isd1/isd2/isd3/conmutador

isd1/conmutador/isd2/isd3

isd1/isd2/conmutador/isd3

En un caso, la molécula de dimerización, por ejemplo, un polipéptido, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende un primer resto, por ejemplo, una primera región variable, que se une específicamente al primer dominio de conmutación, y un segundo resto, por ejemplo, una segunda región variable, que se une específicamente al segundo dominio de conmutación, en la que el primer y segundo dominios de conmutación son componentes de un conmutador de heterodimerización.

En un caso, la molécula de dimerización es un polipéptido, por ejemplo, una molécula de anticuerpo que se une a los dominios de conmutación.

En un caso, la molécula de dimerización, por ejemplo, un polipéptido, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, se une específicamente al primer y segundo dominio de conmutación, en el que el primer y segundo dominios de conmutación son componentes de un conmutador de homodimerización.

En un caso, la molécula de heterodimermerization se selecciona del grupo que consiste en una molécula de anticuerpo, un armazón no de anticuerpo, por ejemplo, una fibronectina o adnectina, conmutador de molécula, y un péptido.

En un caso, la molécula de homodimerización es una molécula de anticuerpo monoespecífico.

En un caso, la molécula de dimerización es una molécula de anticuerpo de especificidad dual.

En un caso, el dominio de unión a antígeno se une a un antígeno diana en una célula de cáncer pero no promueve una respuesta efectora inmune de una célula T, hasta que se administra la molécula de dimerización.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende un conmutador basado en FKBP-FRB.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende:

un dominio de conmutación que comprende una secuencia de unión a análogo de rapamicina que tiene al menos un 80, 85, 90, 95, 98 o 99% de identidad con FKBP, y un dominio de conmutación que comprende una secuencia de unión a secuencia de unión a análogo de rapamicina que tiene al menos un 80, 85, 90, 95, 98 o 99% de identidad con FRB.

En un caso, el conmutador basado en FKBP-FRB comprende un dominio de conmutación que comprende un fragmento de unión a FRB o análogo de FKBP y un dominio de conmutación que comprende un fragmento de unión a FKBP o análogo de FRB, y el fragmento de unión a FKBP o análogo de f Rb comprende una o más mutaciones que potencian la formación de un complejo entre un dominio de conmutación de FKBP, un dominio de conmutación de FRB y la molécula de dimerización, o una mutación descrita en la sección del presente documento titulada CONMUTADORES DE DIMERIZACIÓN BASADOS EN FKBP/FRB MODIFICADOS. Por ejemplo, el fragmento de unión a FKBP o análogo de FRB comprende: una mutación E2032, por ejemplo, una mutación E2032I o una mutación E2032L; una mutación T2098, por ejemplo, una mutación T2098L; o una mutación E2032 y T2098, por ejemplo, una mutación E2032I y una mutación T2098L o una mutación E2032L y una mutación T2098L.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende:

un dominio de conmutación que comprende una secuencia de unión a análogo de rapamicina que difiere en no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de la secuencia correspondiente de FKBP, y un dominio de conmutación que comprende una secuencia de unión al análogo de rapamicina que difiere en no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de la secuencia correspondiente de FRB.

En un caso, se puede administrar cualquiera de los regímenes de dosificación o formulaciones de un inhibidor de mTOR alostérico, por ejemplo, RAD001, descrito en la sección del presente documento para una dosis baja, que aumenta la inmunidad, de un inhibidor de mTOR alostérico, por ejemplo, RAD001, para dimerizar un conmutador basado en FKBP-FRB.

En un caso, el conmutador es un conmutador basado en FKBP-FRB y la molécula de dimerización es RAD001. En un caso, se administran de 0,1 a 20, de 0,5 a 10, de 2,5 a 7,5, de 3 a 6 o aproximadamente 5 mg de RAD001 por semana, por ejemplo, suministrado una vez por semana.

En un caso, de administran de 0,3 a 60, de 1,5 a 30, de 7,5 a 22,5, de 9 a 18, o aproximadamente 15 mg de RAD001 en una formulación de liberación sostenida, por semana, por ejemplo, suministrado una vez por semana.

En un caso, se administran de 0,005 a 1,5, de 0,01 a 1,5, de 0,1 a 1,5, de 0,2 a 1,5, de 0,3 a 1,5, de 0,4 a 1,5, de 0,5 a 1,5, de 0,6 a 1,5, de 0,7 a 1,5, de 0,8 a 1,5, de 1,0 a 1,5, de 0,3 a 0,6, o aproximadamente 0,5 mg de RAD001 por día, por ejemplo, suministrado una vez al día.

En un caso, se administran de 0,015 a 4,5, de 0,03 a 4,5, de 0,3 a 4,5, de 0,6 a 4,5, de 0,9 a 4,5, de 1,2 a 4,5, de 1,5 a 4,5, de 1,8 a 4,5, de 2,1 a 4,5, de 2,4 a 4,5, de 3,0 a 4,5, de 0,9 a 1,8, o aproximadamente 1,5 mg de RAD001 en una formulación de liberación sostenida, por día, por ejemplo, suministrado una vez al día.

En un caso, se administran de 0,1 a 30, de 0,2 a 30, de 2 a 30, de 4 a 30, de 6 a 30, de 8 a 30, de 10 a 30, de 1,2 a 30, de 14 a 30, de 16 a 30, de 20 a 30, de 6 a 12, o aproximadamente 10 mg de RAD001 en una formulación de liberación sostenida, por semana, por ejemplo, suministrado una vez por semana.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende:

un dominio de conmutación que comprende una secuencia de unión a rapamicina o análogo de rapamicina, de FKBP y un dominio de conmutación que comprende una secuencia de unión a rapamicina o análogo de rapamicina, de FRB, por ejemplo, una secuencia que comprende una lisina en el residuo 2098.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende:

un dominio de conmutación que comprende una secuencia de unión a AP21967 de FKBP y un dominio de conmutación que comprende una secuencia de unión a AP21967 de FRB, por ejemplo, una secuencia que comprende una lisina en el residuo 2098.

En un caso:

el primer dominio de conmutación comprende

una secuencia de unión a rapamicina o análogo de rapamicina de FKBP;

una secuencia de unión al análogo de rapamicina de FKBP; o

una secuencia de unión a AP21967 de FKBP; y

el segundo dominio de conmutación comprende

una secuencia de unión a rapamicina, o análogo de rapamicina, de FRB;

una secuencia de unión al análogo de rapamicina de FRB; o

una secuencia de unión a AP21967 de FRB, por ejemplo, una secuencia que comprende una lisina en el residuo 2098.

En un caso:

el primer dominio de conmutación comprende

una secuencia de unión a rapamicina, o análogo de rapamicina, de FRB;

una secuencia de unión al análogo de rapamicina de FRB; o

el segundo dominio de conmutación comprende

una secuencia de unión a rapamicina o análogo de rapamicina de FKBP;

una secuencia de unión al análogo de rapamicina de FKBP; o

una secuencia de unión a AP21967 de FKBP.

En un caso:

En un caso, el primer dominio de conmutación comprende una secuencia de unión a AP21967 de FRB, por ejemplo, una secuencia que comprende una lisina en el residuo 2098; y

En un caso, la molécula de dimerización es un análogo de rapamicina, por ejemplo, AP21967.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende un conmutador basado en GyrB-GyrB.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende:

un dominio de conmutación que comprende una secuencia de unión a cumermicina que difiere en no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de la secuencia correspondiente del subdominio del extremo amino terminal de 24 kDa de GyrB.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende:

el subdominio del extremo amino terminal de 24 kDa de GyrB.

En un caso, la molécula de dimerización es una cumermicina.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende un conmutador basado en GAI-GID1.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende:

un dominio de conmutación GID1 que comprende una secuencia de unión a giberelina, o un análogo de giberelina, por ejemplo, GA³, que tiene al menos un 80, 85, 90, 95, 98 o 99% de identidad con GID1 y un dominio de conmutación que comprende un dominio de conmutación GAI que tiene al menos un 80, 85, 90, 95, 98 o 99% de identidad con GAI.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende: un dominio de conmutación GID1 que comprende una secuencia de unión a giberelina, o un análogo de giberelina, por ejemplo, GA³, que difiere en no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 , 3, 2 o 1 residuos de aminoácido de la secuencia correspondiente de FKBP, y un dominio de conmutación GAI que difiere en no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácido de la secuencia correspondiente de FRB.

En un caso:

el primer dominio de conmutación comprende un dominio de conmutación GID1; y

el segundo dominio de conmutación comprende un dominio de conmutación GAI.

En un caso:

el primer dominio de conmutación comprende un dominio de conmutación GAI; y

el segundo dominio de conmutación comprende un dominio de conmutación GID1.

En un caso, la molécula de dimerización es GA³-AM.

En un caso, la molécula de dimerización es GA³.

En un caso, la molécula de dimerización es una molécula pequeña, por ejemplo, es diferente de un polipéptido. En un caso, la molécula de dimerización es un polipéptido, por ejemplo, un polipéptido, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, o un armazón no de anticuerpo, por ejemplo, una fribronectina o adnectina, que tiene afinidad específica por uno o ambos del primero y segundo dominios de conmutación.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende un conmutador basado en etiqueta Halo/etiqueta SNAP. En un ejemplo, el conmutador de dimerización comprende:

un dominio de conmutación de etiqueta Halo que comprende que tiene al menos un 80, 85, 90, 95, 98, o 99% de identidad con SEQ ID NO: 14, y un dominio de conmutación de etiqueta SNAP que tiene al menos un 80, 85, 90, 95, 98 o 99% de identidad con SeQ ID NO: 15.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende:

un dominio conmutador de etiqueta Halo que comprende que difiere en no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, o 1 residuos de aminoácidos de SEQ ID NO : 14, y un dominio de conmutación de etiqueta SNAP que difiere en no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15.

En un caso:

el segundo dominio de conmutación comprende un dominio de conmutación de etiqueta SNA^p.

En un caso:

En un caso, la molécula de dimerización comprende la estructura 5.

En un caso, la molécula de dimerización comprende tres o más dominios, por ejemplo, etiquetas de proteína, que se unen a un dominio de conmutación, por ejemplo, un polipéptido, por ejemplo, una molécula de anticuerpo o un armazón no de anticuerpo, que tiene afinidad por el dominio.

En un caso, el conmutador de dimerización, por ejemplo, un conmutador de homodimerización, por ejemplo, un conmutador de homodimerización extracelular, comprende dominios de conmutación que comprenden moléculas de etiqueta, por ejemplo, una etiqueta de péptido c-myc, etiqueta de péptido flag, etiqueta de péptido HA o etiqueta de péptido V5, y el conmutador de dimerización comprende polipéptidos con afinidad por los dominios de conmutación, por ejemplo, moléculas de anticuerpo y armazón no de anticuerpo.

En un caso, la molécula de dimerización tiene una valencia mayor de dos, por ejemplo, es multivalente y se une, y por tanto agrupa o dimeriza, más de dos dominios de conmutación.

En un caso, el RCAR comprende:

un primer dominio transmembrana y un primer dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primario, y

un segundo dominio transmembrana y un segundo dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primario y

un dominio de unión a antígeno unido a un anclaje a membrana,

donde el primer y segundo dominios transmembrana están separados entre sí por un conmutador de heterodimerización presente en el exterior de una célula,

donde el conmutador de heterodimerización comprende un primer dominio de conmutación y un segundo dominio de conmutación, donde el primer y segundo dominios de conmutación del conmutador de heterodimerización interaccionan juntos para formar un complejo en presencia de una molécula de heterodimerización en el interior o el exterior de la célula.

En un caso, el miembro de unión a antígeno comprende

un dominio de unión a antígeno,

un segundo dominio transmembrana y

un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, un dominio de señalización coestimulador de la Tabla 2, por ejemplo, un dominio 4-1BB.

En un caso, el RCAR comprende además:

un miembro de unión a antígeno auxiliar no conmutado que comprende:

un dominio de unión a antígeno, por ejemplo, que une a un segundo antígeno,

un dominio transmembrana y

En un caso, el miembro de señalización intracelular, el miembro de unión a antígeno auxiliar no conmutado comprende un dominio de señalización intracelular primario y un dominio de señalización coestimulador.

En un caso, el miembro de unión a antígeno auxiliar no conmutado comprende un dominio 4-1BB.

En un caso, el miembro de unión a antígeno auxiliar no conmutado comprende un dominio CD3zeta.

En un caso, el miembro de unión a antígeno auxiliar no conmutado comprende un dominio CD3zeta y un dominio 4-1BB.

En un caso, el RCAR está asociado con, por ejemplo, se proporciona en la misma célula con un inhibidor de una molécula inhibidora, por ejemplo, un inhibidor de una molécula inhibidora de la Tabla 3.

En un caso, el RCAR está asociado con, por ejemplo, se proporciona en la misma célula con un shARN que reconoce una molécula inhibidora, por ejemplo, una molécula coinhibidora de la Tabla 3.

En un caso, el shARN reconoce PD1.

En un caso, el dominio de unión a antígeno se une a un antígeno diana en una célula cancerosa pero no activa la célula RCARX, por ejemplo, una célula RCART, hasta que se administra una molécula de dimerización.

En un caso, el dominio de unión a antígeno se une a un antígeno diana en una célula diana, por ejemplo, una célula cancerosa, pero no promueve una respuesta efectora inmune, por ejemplo, una activación de células T, hasta que se administra la molécula de dimerización, por ejemplo, una molécula de heterodimerización o una molécula de homodimerización.

Los RCAR descritos en el presente documento pueden incluir, por ejemplo, en lugar de un dominio de unión a antígeno basado en scFv, un dominio extracelular de un receptor inhibidor, por ejemplo, PD1. Aunque no desea ligarse a la teoría, se cree que el acoplamiento del dominio extracelular inhibidor con su contraligando (que normalmente regula por disminución la respuesta inmunitaria) activa la respuesta inmunitaria. Esto se analiza inmediatamente a continuación.

En un tercer aspecto, la divulgación presenta un RCAR, por ejemplo, un RCAR aislado, que comprende:

a) un miembro del dominio extracelular inhibidor que comprende

un dominio extracelular inhibidor,

una región transmembrana y

un dominio de conmutación;

b) un miembro de señalización intracelular que comprende

un dominio de conmutación; y opcionalmente,

c) un miembro de unión a antígeno que comprende

un dominio de unión a antígeno y

un dominio de anclaje a la membrana o un dominio transmembrana.

Véase, por ejemplo, la figura 10.

En un caso:

el miembro de unión a antígeno no comprende un dominio de señalización intracelular y no comprende un dominio de conmutación que forma un conmutador de dimerización con un dominio de conmutación en el miembro de dominio extracelular inhibidor o el dominio conmutador en el miembro de señalización intracelular. Véase, por ejemplo, la Fig. 10, panel del extremo derecho.

En un caso, el miembro de unión a antígeno comprende

un dominio de unión a antígeno,

un segundo dominio transmembrana y

En un caso: el dominio extracelular inhibidor se selecciona de la Tabla 4.

En un caso: el primer dominio de conmutación está unido al dominio de señalización intracelular y el segundo dominio de conmutación está unido al dominio transmembrana.

En un caso: el dominio extracelular inhibidor se une a su ligando en la célula diana y redirige la activación de la señal en presencia de una molécula de heterodimerización.

En un caso, el dominio de señalización intracelular es un dominio de señalización intracelular primario, seleccionado, por ejemplo, de la Tabla 1.

un dominio 4-1BB y un dominio CD3zeta; o

un dominio CD28 y un dominio 4-1BB.

En un caso, el RCAR comprende un tercer dominio de señalización intracelular.

En un caso, uno del primer, segundo y tercer dominio de señalización intracelular es un dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 1, y los otros dos son dominios de señalización coestimuladores, por ejemplo, seleccionados de la Tabla 2.

En un caso, dos de los primero, segundo y tercero dominios de señalización intracelular son dominios de señalización intracelular primarios, por ejemplo, seleccionados de la lista en la Tabla 1, y el otro es un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la Tabla 2.

En un ejemplo, el primer, segundo, y tercer dominios de señalización intracelular comprenden: el dominio A CD28; un dominio 4-1BB y un dominio CD3zeta.

En un caso, el RCAR comprende un cuarto dominio de señalización intracelular.

En un caso, el cuarto dominio de señalización intracelular es un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la lista de la Tabla 2.

En un caso, cada uno de los primero, segundo, tercero y cuarto dominios de señalización intracelular es un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la lista de la Tabla 2.

En un caso, el orden del dominio de conmutación y el dominio o dominios de señalización intracelular (isd) es el siguiente, comenzando con el extremo amino terminal:

conmutador/isd;

conmutador/isd1/isd2;

isd1/conmutador/isd2

isd1/isd2/conmutador:

conmutador/isd1/isd2/isd3

isd1/isd2/isd3/conmutador

isd1/conmutador/isd2/isd3

isd1/isd2/conmutador/isd3

En un caso, el orden del dominio de conmutación y el dominio o dominios de señalización intracelular (isd) es el siguiente, comenzando con el extremo carboxi terminal:

conmutación/isd;

conmutación/isd1/isd2;

isd1/conmutación/isd2;

isd1/isd2/conmutación;

conmutación/isd1/isd2/isd3;

isd1/isd2/isd3/conmutación;

isd1/conmutación/isd2/isd3; e

isd1/isd2/conmutaciónr/isd3.

En un caso, el conmutador de dimerización es intracelular.

En un caso, el conmutador de dimerización es extracelular.

En un caso, el dominio transmembrana dispuesto en el miembro de unión a antígeno y el conmutador de dimerización, por ejemplo, un conmutador de heterodimerización o conmutador de homodimerización, es intracelular. En un caso, cuando el dominio transmembrana está dispuesto en el elemento de señalización intracelular y el conmutador de dimerización, por ejemplo, conmutador de heterodimerización o homodimerización, es extracelular. En un caso, el conmutador de dimerización comprende un conmutador basado en FKBP-FRB.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende:

En un caso, el conmutador basado en FKBP-FRB comprende un dominio de conmutación que comprende un fragmento de unión a FRB o análogo de FKBP y un dominio de conmutación que comprende un fragmento de unión a FKBP o un análogo de FRB, y el fragmento de unión a FKBP o análogo de FRB comprende una o más mutaciones que potencian la formación de un complejo entre un dominio de conmutación de FKBP, un dominio de conmutación de FRB y la molécula de dimerización, o una mutación descrita en la sección en el presente documento titulada CONMUTADORES DE DIMERIZACIÓN BASADOS EN FKBP/FRB MODIFICADOS. Por ejemplo, el fragmento de unión a FKBP o análogo de FRB comprende: una mutación E2032, por ejemplo, una mutación E2032I o una mutación E2032L; una mutación T2098, por ejemplo, una mutación T2098L; o una mutación E2032 y una mutación T2098, por ejemplo, una mutación E2032I y una mutación T2098L o una mutación E2032L y una mutación T2098L. En un caso, el conmutador de dimerización comprende:

un dominio de conmutación que comprende una secuencia de unión al análogo de rapamicina que difiere en no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de la secuencia correspondiente de FKBP, y un dominio de conmutación que comprende una secuencia de unión al análogo de rapamicina que difiere en no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de la secuencia correspondiente de FRB.

En un caso, se puede administrar cualquiera de los regímenes de dosificación o formulaciones de un inhibidor de mTOR alostérico, por ejemplo, RAD001, descrito en la sección en el presente documento para una dosis baja, que aumenta la inmunidad, de un inhibidor de mTOR alostérico, por ejemplo, RAD001, para dimerizar un conmutador basado en FKBP-FRB.

En un caso, el conmutador es un conmutador basado en FKBP-FRB y la molécula de dimerización es RAD001. En un caso, se administran de 0,1 a 20, de 0,5 a 10, de 2,5 a 7,5, de 3 a 6, o aproximadamente 5 mg de RAD001 por semana, por ejemplo, suministrado una vez por semana.

En un caso, se administran de 0,3 a 60, de 1,5 a 30, de 7,5 a 22,5, de 9 a 18, o aproximadamente 15 mg de RAD001 en una formulación de liberación sostenida, por semana, por ejemplo, suministrado una vez por semana.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende:

En un caso:

el primer dominio de conmutación comprende

una secuencia de unión a rapamicina o análogo de rapamicina de FKBP;

una secuencia de unión al análogo de rapamicina de FKBP; o

una secuencia de unión a AP21967 de FKBP; y

el segundo dominio de conmutación comprende

una secuencia de unión a rapamicina, o análogo de rapamicina, de FRB;

una secuencia de unión al análogo de rapamicina de FRB; o

En un caso:

el primer dominio de conmutación comprende

una secuencia de unión a rapamicina, o análogo de rapamicina, de FRB;

una secuencia de unión al análogo de rapamicina de FRB; o

el segundo dominio de conmutación comprende

una secuencia de unión a rapamicina o análogo de rapamicina de FKBP;

una secuencia de unión al análogo de rapamicina de FKBP; o

una secuencia de unión a AP21967 de FKBP.

En un caso:

En un caso, el conmutador de dimerización comprende:

un dominio de conmutación que comprende una secuencia de unión a cumermicina que tiene al menos un 80, 85, 90, 95, 98 o 99% de identidad con el subdominio del extremo amino terminal de 24 kDa de GyrB.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende:

el subdominio del extremo amino terminal de 24 kDa de GyrB.

En un caso, la molécula de dimerización es una cumermicina.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende:

un dominio de conmutación GID1 que comprende una secuencia de unión a giberelina, o un análogo de giberelina, por ejemplo, GA³, que difiere en no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 , 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de la secuencia correspondiente de GID1, y un dominio de conmutación GAI que no difiere en más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de la secuencia correspondiente de GAI.

En un caso:

el primer dominio de conmutación comprende un dominio de conmutación GID1; y

el segundo dominio de conmutación comprende un dominio de conmutación GAI.

En un caso:

el primer dominio de conmutación comprende un dominio de conmutación GAI; y

el segundo dominio de conmutación comprende un dominio de conmutación GID1. En un caso, la molécula de dimerización es GA³-AM.

En un caso, la molécula de dimerización es GA³.

un dominio de conmutación de etiqueta Halo que comprende tener al menos un 80, 85, 90, 95, 98 o 99% de identidad con SEQ ID NO 14, y un dominio de conmutación de etiqueta SNAP que tiene al menos un 80, 85, 90, 95, 98 o 99% de identidad con SEQ ID NO 15.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende:

un dominio de conmutación de etiqueta Halo que difiere en no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de la SEQ ID NO 14, y un dominio de conmutación de etiqueta SNAP que difiere en no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15.

En un caso:

En un caso, la molécula de dimerización comprende la estructura 5.

En un caso, la molécula de dimerización comprende tres o más dominios, por ejemplo, etiquetas de proteínas, que se unen a un dominio de conmutación, por ejemplo, un polipéptido, por ejemplo, una molécula de anticuerpo o un armazón no de anticuerpo, que tiene afinidad por el dominio.

En un caso, la molécula de dimerización tiene una valencia de más de dos, por ejemplo, es multivalente y se une, y por lo tanto agrupa o dimeriza, más de dos dominios de conmutación.

Tal como se describe en el presente documento, los casos de un RCAR pueden incluir un miembro, por ejemplo, un miembro de dominio extracelular inhibidor, que comprende un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización coestimulador. Aunque no desea ligarse a la teoría, se cree que la presencia de dicho dominio promueve la persistencia del miembro en una célula sin activación significativa en ausencia de asociación mediada por conmutador de dimerización de miembros del RCAR. Los ejemplos de tales miembros se describen en la sección que sigue inmediatamente a continuación.

En un caso, el RCAR comprende:

a) un miembro del dominio extracelular inhibidor que comprende,

un dominio extracelular inhibidor,

una región transmembrana,

un dominio de conmutación;

b) un miembro de señalización intracelular que comprende

un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la Tabla 1, por ejemplo, un dominio CD3zeta y

un dominio de conmutación; y opcionalmente,

c) un miembro de unión a antígeno que comprende,

un dominio de unión a antígeno,

un dominio de anclaje a la membrana o un dominio transmembrana y

opcionalmente, un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo,

seleccionado de la Tabla 2, por ejemplo, un dominio 4-1BB

Ver, por ejemplo, la Figura 11.

En un caso, el orden de los elementos en el miembro del dominio extracelular inhibidor es el siguiente, comenzando por el extremo amino terminal:

dominio extracelular inhibidor/dominio transmembrana/dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la Tabla 2, por ejemplo, un dominio 4-lBB/dominio de conmutación; o

dominio extracelular inhibidor/dominio transmembrana/dominio de conmutación/dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la Tabla 2, por ejemplo, un dominio 4-1BB.

En un caso, el orden de los elementos en el miembro de señalización intracelular es el siguiente, comenzando con el extremo amino terminal:

dominio de conmutación/dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la Tabla 1, por ejemplo, un dominio CD3zeta; o

dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la Tabla 1, por ejemplo, un dominio CD3zeta/dominio de conmutación.

En un caso, el orden de los elementos en el miembro del dominio extracelular inhibidor es el siguiente, comenzando con el extremo carboxi terminal:

dominio extracelular inhibidor/dominio transmembrana/dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la Tabla 2, por ejemplo, un dominio 4-1BB/dominio de conmutación; o

En un caso, el orden de los elementos en el miembro de señalización intracelular es el siguiente, comenzando con el extremo carboxi terminal:

En un caso, el primer y segundo dominios de conmutación forman un conmutador basado en FKBP-FRB.

En un caso, uno del primer y segundo conmutadores de dimerización comprende:

un dominio de conmutación que comprende una secuencia de unión a rapamicina o análogo de rapamicina que tiene al menos un 80, 85, 90, 95, 98 o 99% de identidad con FKBP, y el otro comprende un dominio de conmutación que comprende una secuencia de unión a la secuencia de unión a rapamicina o análogo de rapamicina que tiene al menos un 80, 85, 90, 95, 98 o 99% de identidad con FRB.

En un caso, el conmutador basado en FKBP-FRB comprende un dominio de conmutación que comprende un fragmento de unión a FRB o análogo de FKBP y un dominio de conmutación que comprende un fragmento de unión a FKBP o un análogo de FRB, y el fragmento de unión a FKBP o análogo de FRB comprende una o más mutaciones que potencian la formación de un complejo entre un dominio de conmutación de FKBP, un dominio de conmutación de FRB y la molécula de dimerización, o una mutación descrita en la sección del presente documento titulada CONMUTADORES DE DIMERIZACIÓN BASADOS EN FKBP/FRB MODIFICADOS. Por ejemplo, el fragmento de unión a FKBP o análogo de FRB comprende: una mutación E2032, por ejemplo, una mutación E2032I o una mutación E2032L; una mutación T2098, por ejemplo, una mutación T2098L; o una mutación E2032 y T2098, por ejemplo, una mutación E2032I y una mutación T2098L o una mutación E2032L y una mutación T2098L.

En un caso, se puede administrar cualquiera de los regímenes de dosificación o formulaciones de un inhibidor de mTOR alostérico, por ejemplo, RAD001, descrito en la sección en el presente documento para una dosis baja, que aumenta la inmunidad, de un inhibidor de mTOR alostérico, por ejemplo, RAD001 para dimerizar un conmutador basado en FKBP-FRB.

En un caso, el conmutador es un conmutador basado en FKBP-FRB y la molécula de dimerización es RAD001. En una realización, se administran de 0,1 a 20, de 0,5 a 10, de 2,5 a 7,5, de 3 a 6, o aproximadamente 5, mg de RAD001 por semana, por ejemplo, suministrados una vez por semana.

En un caso, se administran de 0,3 a 60, de 1,5 a 30, de 7,5 a 22,5, de 9 a 18 o aproximadamente 15 mg de RAD001 en una formulación de liberación sostenida, por semana, por ejemplo, suministrado una vez por semana.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende un conmutador basado en GyrB-GyrB, por ejemplo, un conmutador basado en GyrB-GyrB descrito en el presente documento, por ejemplo, un conmutador basado en GyrB-GyrB tal como se describe en el presente documento, por ejemplo, en el Módulo de conmutadores de dimerización. En un caso, el conmutador de dimerización comprende un conmutador basado en GAI-GID1, por ejemplo, un conmutador basado en GAI-GID1 descrito en el presente documento, por ejemplo, un conmutador basado en GAI-GID1, tal como se describe en el presente documento, por ejemplo, en el Módulo de conmutadores de dimerización. En un caso, el conmutador de dimerización comprende un conmutador basado en etiqueta Halo/etiqueta SNAP, por ejemplo, un conmutador basado en etiqueta Halo/etiqueta SNAP descrito en el presente documento, por ejemplo, un conmutador basado en etiqueta Halo/etiqueta SNAP, tal como se describe en el presente documento, por ejemplo, en el Módulo de conmutadores de dimerización.

En un caso, el RCAR comprende:

a) un miembro de señalización intracelular que comprende, comenzando con el extremo amino terminal: un dominio CD3zeta y

un primer dominio de conmutación; y

b) un miembro de dominio extracelular inhibidor que comprende, empezando con el extremo amino terminal: un dominio inhibidor extracelular,

un dominio transmembrana,

un dominio de 4-1BB, y

un segundo dominio de conmutación,

en el que los primer y segundo dominios de conmutación forman un conmutador basado en FKBP-FRB.

En un caso, el RCAR está asociado, por ejemplo, se proporciona en la misma célula con: un inhibidor de una molécula inhibidora, por ejemplo, un inhibidor de una molécula inhibidora de la Tabla 3.

En un ejemplo, el RCAR se asocia con, por ejemplo, se proporciona en la misma célula con, un shARN que reconoce una molécula inhibidora, por ejemplo, una molécula de coinhibidora de la Tabla 3.

En un caso, el RCAR comprende un shARN que reconoce PD1.

En un caso, el dominio de unión a antígeno se une a un antígeno diana en una célula de cáncer pero no activa la célula RCARX, por ejemplo, una célula RCART, hasta que se administra una molécula de dimerización.

En un caso:

el miembro de unión a antígeno comprende

un dominio de unión a antígeno;

un dominio transmembrana; y

un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, un dominio de señalización coestimulador de la Tabla 2, por ejemplo, un dominio 4-1BB.

Ver, por ejemplo, la Fig.11.

En un caso:

el miembro de unión a antígeno no comprende un dominio de conmutación que forme un conmutador de dimerización con el conmutador en el miembro de unión a contraligando inhibidor o el conmutador en el miembro de señalización intracelular.

En un caso, el dominio de unión al contraligando inhibidor se selecciona de la Tabla 4.

Como se discutió en el caso anterior, el miembro de unión a antígeno comprende un dominio de señalización intracelular, realizaciones adicionales de los cuales se discuten inmediatamente a continuación.

En un caso, el dominio de señalización intracelular del miembro de unión a antígeno es un dominio de señalización intracelular primario, seleccionado, por ejemplo, de la Tabla 1.

En un caso, el dominio de señalización intracelular primario del miembro de unión a antígeno comprende un dominio CD3zeta.

En un caso, el dominio de señalización intracelular del miembro de unión a antígeno es un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 2.

En un caso, el dominio de señalización coestimulador comprende un dominio de 4-1BB.

En un caso, el miembro de unión a antígeno comprende un segundo dominio de señalización intracelular.

En un caso, el segundo dominio de señalización intracelular del miembro de unión a antígeno es un dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 1.

En un caso, el segundo dominio de señalización intracelular del miembro de unión a antígeno es un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 2.

En un caso, el primer y segundo dominios de señalización intracelular del miembro de unión a antígeno comprenden: un dominio 4-1BB y un dominio CD3zeta; o

un dominio CD28 y un dominio 4-1BB.

En un caso, el miembro de unión a antígeno comprende un tercer dominio de señalización intracelular.

En un caso, el tercer dominio de señalización intracelular del miembro de unión a antígeno es un dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 1.

En un caso, el tercer dominio de señalización intracelular del miembro de unión a antígeno es un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la lista de la Tabla 2.

En un caso, uno del primer, segundo y tercer dominio de señalización intracelular del miembro de unión a antígeno es un dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 1, y los otros dos son dominios de señalización coestimuladores, por ejemplo, seleccionados de la lista en la Tabla 2.

En un caso, dos de los primero, segundo y tercero dominios de señalización intracelular del miembro de unión a antígeno son dominios de señalización intracelular primarios, por ejemplo, seleccionados de la lista en la Tabla 1, y el otro es un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la lista de la Tabla 2.

En un caso, cada uno de los primero, segundo y tercer dominios de señalización intracelulares del miembro de unión a antígeno es un dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 1. En un caso, cada uno de los primeros, segundos y terceros dominios de señalización intracelulares de miembro de unión a antígeno es un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 2. En un caso, el primer, segundo y tercer dominios de señalización intracelulares de miembro de unión a antígeno comprenden: un dominio CD28; un dominio 4-1BB y un dominio CD3zeta.

En un caso, el miembro de unión a antígeno comprende un cuarto dominio de señalización intracelular.

En un caso, el cuarto dominio de señalización intracelular del miembro de unión a antígeno es un dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 1.

En un caso, el cuarto dominio de señalización intracelular del miembro de unión a antígeno es un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 2.

En un caso, uno del primer, segundo, tercer y cuarto dominio de señalización intracelular del miembro de unión a antígeno es un dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 1 y los otros tres son dominios de señalización coestimuladores, por ejemplo, seleccionados de la lista de la Tabla 2.

En un caso, dos de los primero, segundo, tercero y cuarto dominios de señalización intracelular del miembro de unión a antígeno son dominios de señalización intracelular primarios, por ejemplo, seleccionados de la lista en la Tabla 1, y los otros dos son dominios de señalización coestimuladores, por ejemplo, seleccionados de la lista de la Tabla 2.

En un caso, tres de los primero, segundo, tercero y cuarto dominios de señalización intracelular de los miembros de unión a antígeno se seleccionan de la lista en la Tabla 1, y el otro es un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la lista en Tabla 2.

En un caso, cada uno de los primero, segundo, tercero, y cuarto dominios de señalización intracelulares de miembro de unión a antígeno es un dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 1.

En un caso, cada uno de los primero, segundo, tercero, y cuarto dominios de señalización intracelulares de miembro de unión a antígeno es un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 2.

En un caso, los dos o más dominios coestimuladores pueden ser el mismo dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 2, o dominios de señalización coestimuladores diferentes, por ejemplo, seleccionados de la lista en la Tabla 2.

En un caso, el orden del dominio de conmutación y el dominio o los dominios de señalización intracelular (isd) del miembro de unión a antígeno es el siguiente, comenzando con amino:

conmutador/isd;

conmutador/isd1/isd2;

isd1/conmutador/isd2

isd1/isd2/conmutador:

conmutador/isd1/isd2/isd3

isd1/isd2/isd3/conmutador;

isd1/conmutador/isd2/isd3; e

isd 1/isd2/conmutador/isd3.

En un caso, el orden del dominio de conmutación y el dominio o los dominios de señalización intracelular (isd) del miembro de unión a antígeno es el siguiente, comenzando con el extremo terminal carboxi:

conmutador/isd;

conmutador/isd1/isd2;

isd1/conmutador/isd2

isd1/isd2/conmutador

conmutador/isd1/isd2/isd3

isd1/isd2/isd3/conmutador

isd1/conmutador/isd2/isd3

isd1/isd2/conmutador/isd3.

En un caso:

el miembro de unión a antígeno comprende

un dominio de unión a antígeno;

un dominio de conmutación; y

un dominio transmembrana.

En un caso:

el dominio de conmutación del miembro de unión intracelular forma un conmutador de heterodimerización con uno o ambos de:

el conmutador del miembro del dominio extracelular inhibidor, y

el conmutador del dominio de unión a antígeno.

Como se discutió anteriormente, el miembro de unión a antígeno conmutado comprende un dominio de señalización intracelular, otros ejemplos de los cuales se discuten inmediatamente a continuación.

En un caso, el dominio de señalización intracelular del miembro de unión a antígeno conmutado es un dominio de señalización intracelular primario, seleccionado, por ejemplo, de la lista de la Tabla 1.

En un caso, el dominio de señalización intracelular primario del miembro de unión a antígeno conmutado comprende un dominio CD3zeta.

En un caso, el dominio de señalización intracelular del miembro de unión a antígeno conmutado es un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la lista de la Tabla 2.

En un caso, el miembro de unión a antígeno conmutado comprende un segundo dominio de señalización intracelular.

En un caso, el segundo dominio de señalización intracelular del miembro de unión a antígeno conmutado es un dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 1.

En un caso, el segundo dominio de señalización intracelular del miembro de unión a antígeno conmutado es un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la lista de la Tabla 2.

En un caso, el primer y segundo dominios de señalización intracelular del miembro de unión a antígeno conmutado comprenden:

un dominio 4-1BB y un dominio CD3zeta; o

un dominio CD28 y un dominio 4-1BB.

En un caso, el tercer dominio de señalización intracelular del miembro de unión a antígeno conmutado es un dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 1.

En un caso, el tercer dominio de señalización intracelular del miembro de unión a antígeno conmutado es un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la lista de la Tabla 2.

En un caso, uno del primer, segundo y tercer dominio de señalización intracelular del miembro de unión a antígeno conmutado es un dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 1, y los otros dos son dominios de señalización coestimuladores, por ejemplo, seleccionados de la lista de la Tabla 2. En un caso, dos de los primero, segundo y tercero dominios de señalización intracelular del miembro de unión a antígeno conmutado son dominios de señalización intracelular primarios, por ejemplo, seleccionados de la lista en la Tabla 1, y el otro es un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 2. En un caso, cada uno de los primero, segundo y tercero dominios de señalización intracelular del miembro de unión a antígeno conmutado es un dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 1.

En un caso, cada uno de los primero, segundo y tercero dominios de señalización intracelular del miembro de unión a antígeno conmutado es un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 2.

En un caso, el primer, segundo y tercer dominios de señalización intracelular del miembro de unión a antígeno conmutado comprenden: un dominio CD28; un dominio 4-1BB y un dominio CD3zeta.

En un caso, el miembro de unión a antígeno conmutado comprende un cuarto dominio de señalización intracelular. En un caso, el cuarto dominio de señalización intracelular del miembro de unión a antígeno conmutado es un dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 1.

En un caso, el cuarto dominio de señalización intracelular del miembro de unión a antígeno conmutado es un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la lista de la Tabla 2.

En un caso, uno del primer, segundo, tercer y cuarto dominio de señalización intracelular del miembro de unión a antígeno conmutado es un dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 1 y los otros tres son dominios de señalización coestimuladores, por ejemplo, seleccionados de la lista de la Tabla 2.

En un caso, dos de los primero, segundo, tercero y cuarto dominios de señalización intracelular del miembro de unión a antígeno conmutado son dominios de señalización intracelular primarios, por ejemplo, seleccionados de la lista en la Tabla 1, y los otros dos son dominios de señalización coestimuladores, por ejemplo, seleccionados de la lista de la Tabla 2.

En un caso, tres de los primero, segundo, tercero y cuarto dominios de señalización intracelular de los miembros de unión a antígeno conmutados se seleccionan de la lista en la Tabla 1, y el otro es un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 2.

En un caso, cada uno de los primero, segundo, tercero y cuarto dominios de señalización intracelular del miembro de unión a antígeno conmutado es un dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la lista de la Tabla 1.

En un caso, cada uno de los primero, segundo, tercero y cuarto dominios de señalización intracelular del miembro de unión a antígeno conmutado es un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la lista de la Tabla 2.

En un caso, el orden del dominio de conmutación y el dominio o los dominios de señalización intracelular (isd) del miembro de unión a antígeno conmutado es el siguiente, comenzando con el extremo amino terminal: conmutador/isd;

conmutador/isd1/isd2;

isd1/conmutador/isd2

isd1/isd2/conmutador:

conmutador/isd1/isd2/isd3

isd1/isd2/isd3/conmutador

isd1/conmutador/isd2/isd3

isd1/isd2/conmutador/isd3.

En un caso, el orden del dominio de conmutación y el dominio o los dominios de señalización intracelular (isd) del miembro de unión a antígeno conmutado es el siguiente, comenzando con el extremo carboxi terminal: conmutador/isd;

conmutador/isd1/isd2;

isd1/conmutador/isd2;

isd1/isd2/conmutador;

conmutador/isd1/isd2/isd3;

isd1/isd2/isd3/conmutador;

isd1/conmutador/isd2/isd3; e

isd1/isd2/conmutador/isd3.

En una realización del dominio de unión a antígeno conmutado, el RCAR se asocia con, por ejemplo, se proporciona en la misma célula con:

un inhibidor de una molécula inhibidora, por ejemplo, un inhibidor de una molécula inhibidora de la Tabla 3.

En un caso del dominio de unión a antígeno conmutado, el RCAR se asocia con, por ejemplo, se proporciona en la misma célula con un shARN que reconoce una molécula inhibidora, por ejemplo, una molécula coinhibidora de la Tabla 3.

En un caso del dominio de unión a antígeno conmutado, el RCAR comprende además un ARNhc que reconoce PD1. En un caso del dominio de unión a antígeno conmutado, el dominio de unión a antígeno se une a un antígeno diana en una célula cancerosa, pero no activa la célula RCARX, por ejemplo, una célula RCART, hasta que se administra una molécula de dimerización.

En un caso de dominio de unión a antígeno conmutado, el dominio de unión a antígeno se une a un antígeno diana en una célula diana, por ejemplo, una célula cancerosa, pero no promueve una respuesta efectora inmunitaria, por ejemplo, una activación de células T, hasta que se administra la molécula de dimerización, por ejemplo, una molécula de heterodimerización o una molécula de homodimerización.

Los RCAR descritos en el presente documento pueden incluir, por ejemplo, en lugar de un dominio de unión a antígeno basado en scFv, un dominio extracelular de un dominio ECD coestimulador. Sin desear ligar se a la teoría, se cree que el acoplamiento del ECD con su contraligando activa la respuesta inmune a través del RCAR. Esto se analiza inmediatamente a continuación.

En un cuarto aspecto, la divulgación presenta un RCAR, por ejemplo, un RCAR aislado que comprende:

a) un miembro de ECD coestimulador que comprende

un dominio de ECD coestimulador;

una región transmembrana y

un dominio de conmutación;

b) un miembro de señalización intracelular que comprende

un dominio de conmutación; y opcionalmente,

c) un miembro de unión a antígeno que comprende

un dominio de unión a antígeno;

un dominio transmembrana; y

un dominio de conmutación.

Véase, por ejemplo, la Fig. 11.

En un caso:

el conmutador del miembro de ECD coestimulador y

el conmutador de miembro de unión a antígeno.

En un caso, el dominio de ECD coestimulador se selecciona de la Tabla 5.

un dominio 4-1BB y un dominio CD3zeta; o

un dominio CD28 y un dominio 4-1BB.

En un caso, el RCAR comprende un tercer dominio de señalización intracelular.

En un caso, uno del primer, segundo y tercer dominio de señalización intracelular es un dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 1, y los otros dos son dominios de señalización coestimuladores, por ejemplo, seleccionados de la lista en la Tabla 2.

En un caso, dos de los primero, segundo y tercero dominios de señalización intracelular son dominios de señalización intracelular primarios, por ejemplo, seleccionados de la lista en la Tabla 1, y el otro es un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la lista en Tabla 2.

En un ejemplo, cada uno de los primero, segundo y tercer dominios de señalización intracelular es un dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 1.

En un caso, el primer, segundo y tercer dominios de señalización intracelular comprenden: un dominio CD28; un dominio 4-1BB y un dominio CD3zeta.

En un caso, el RCAR comprende un cuarto dominio de señalización intracelular.

conmutador/isd;

conmutador/isd1/isd2

isd1/conmutador/isd2

isd1/isd2/conmutador:

conmutador/isd1/isd2/isd3

isd1/isd2/isd3/conmutador

isd1/conmutador/isd2/isd3 e

isd1/isd2/conmutador/isd3.

conmutador/isd;

conmutador/isd1/isd2;

isd1/conmutador/isd2

isd1/isd2/conmutador

conmutador/isd1/isd2/isd3

isd1/isd2/isd3/conmutador

isd1/conmutador/isd2/isd3

isd 1/isd2/conmutador/isd3

En un caso, el conmutador de dimerización es intracelular.

En un caso, el conmutador de dimerización es extracelular.

En un caso, el dominio transmembrana dispuesto en el miembro de unión a antígeno y el conmutador de dimerización, por ejemplo, un conmutador de heterodimerización o conmutador de la homodimerización, es intracelular.

En un caso, cuando el dominio transmembrana está dispuesto en el miembro de señalización intracelular y el conmutador de dimerización, por ejemplo, el conmutador de heterodimerización u homodimerización, es extracelular. En un caso, el conmutador de dimerización comprende un conmutador basado en FKBP-FRB.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende:

En un caso, el conmutador basado en FKBP-FRB comprende un dominio de conmutación que comprende un fragmento de unión a FRB o análogo de FKBP y un dominio de conmutación que comprende un fragmento de unión a FKBP o un análogo de FRB, y el fragmento de unión a FKBP o análogo de FRB comprende una o más mutaciones que potencian la formación de un complejo entre un dominio de conmutación de FKBP, un dominio de conmutación de FRB y la molécula de dimerización, o una mutación descrita en la sección del presente documento titulada CONMUTADORES DE DIMERIZACIÓN BASADOS EN FKBP/FRB MODIFICADOS. Por ejemplo, el fragmento de unión a FKBP o análogo de FRB comprende: una mutación E2032, por ejemplo, una mutación E2032I o una mutación E2032L; una mutación T2098, por ejemplo, una mutación T2098L; o una mutación E2032 y una mutación T2098, por ejemplo, una mutción E2032I y una mutación T2098L o una mutación E2032L y una mutación T2098L.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende:

un dominio de conmutación que comprende una secuencia de unión a rapamicina, o un análogo de rapamicina, de FKBP, y un dominio de conmutación que comprende una secuencia de unión a rapamicina, o un análogo de rapamicina, de FRB, por ejemplo, una secuencia que comprende una lisina en el residuo 2098.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende:

En un caso:

el primer dominio de conmutación comprende una secuencia de unión a rapamicina o análogo de rapamicina de FKBP;

una secuencia de unión al análogo de rapamicina de FKBP; o

una secuencia de unión a AP21967 de FKBP; y

el segundo dominio de conmutación comprende

una secuencia de unión a rapamicina, o análogo de rapamicina, de FRB;

una secuencia de unión al análogo de rapamicina de FRB; o

En un caso:

el primer dominio de conmutación comprende

una secuencia de unión a rapamicina, o análogo de rapamicina, de FRB;

una secuencia de unión al análogo de rapamicina de FRB; o

el segundo dominio de conmutación comprende

una secuencia de unión a rapamicina o análogo de rapamicina de FKBP;

una secuencia de unión al análogo de rapamicina de FKBP; o

una secuencia de unión a AP21967 de FKBP.

En un caso:

En un caso, el conmutador de dimerización comprende:

el subdominio del extremo amino terminal de 24 kDa de GyrB.

En un caso, la molécula de dimerización es una cumermicina.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende:

un dominio de conmutación GID1 que comprende una secuencia de unión a giberelina, o un análogo de giberelina, por ejemplo, GA³, que difiere en no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 , 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de la secuencia correspondiente de FKBP, y un dominio de conmutación GAI que difiere en no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de la secuencia correspondiente de FRB.

En un caso:

el primer dominio de conmutación comprende un dominio de conmutación GID1; y

el segundo dominio de conmutación comprende un dominio de conmutación GAI.

En un caso:

el primer dominio de conmutación comprende un dominio de conmutación GAI; y

el segundo dominio de conmutación comprende un dominio de conmutación GID¹.

En un caso, la molécula de dimerización es GA³-AM.

En un caso, la molécula de dimerización es GA³.

En un caso, la molécula de dimerización es una molécula pequeña, por ejemplo, es distinta de un polipéptido.

En un caso, la molécula de dimerización es un polipéptido, por ejemplo, un polipéptido, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, o un armazón no de anticuerpo, por ejemplo, una fibronectina o adnectina, que tiene afinidad específica por uno o ambos del primer y segundo dominios de conmutación.

un dominio de conmutación de etiqueta Halo que comprende tener al menos un 80, 85, 90, 95, 98 o 99% de identidad con SEQ ID NO: 14, y un dominio de conmutación de etiqueta SNAP que tiene al menos al menos 80, 85, 90, 95, 98 o 99% de identidad con SEQ ID NO: 15.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende:

un dominio de conmutación de etiqueta Halo que difiere en no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14, y un dominio de conmutación de etiqueta SNAP que difiere en no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15.

En un caso:

En un caso, la molécula de dimerización comprende la estructura 5.

En un caso, la molécula de dimerización comprende tres o más dominios, por ejemplo, etiquetas de proteína que se unen a un dominio de conmutación, por ejemplo, un polipéptido, por ejemplo, una molécula de anticuerpo o un armazón no de anticuerpo, que tiene afinidad por el dominio.

En un caso, el miembro de unión a antígeno comprende

un dominio de unión a antígeno,

un dominio transmembrana,

un dominio de conmutación y

En un caso, el RCAR comprende:

a) un miembro de ECD coestimulador que comprende

un dominio de ECD coestimulador;

una región transmembrana,

un dominio de conmutación;

b) un miembro de señalización intracelular que comprende

un dominio de conmutación; y opcionalmente,

c) un miembro de unión a antígeno que comprende

un dominio de unión a antígeno;

un dominio transmembrana;

un dominio de conmutación y,

opcionalmente, un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la Tabla 2, por ejemplo, un dominio 4-1BB.

En un caso, el orden de los elementos en el miembro de ECD coestimulador es el siguiente, comenzando con el extremo amino terminal:

un dominio ECD coestimulador/dominio transmembrana/dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la Tabla 2, por ejemplo, un dominio 4-1BB/dominio de conmutación; o

un dominio ECD coestimulador/dominio transmembrana/dominio de conmutación/dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la Tabla 2, por ejemplo, un dominio 4-1BB.

En un caso, el orden de los elementos en un miembro de ECD coestimulador es el siguiente, comenzando con el extremo carboxi terminal:

un dominio de ECD coestimulador/dominio transmembrana/dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la Tabla 2, por ejemplo, un dominio 4-1BB/dominio de conmutación; o

un dominio de ECD coestimulador/dominio transmembrana/dominio de conmutación/dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la Tabla 2, por ejemplo, un dominio 4-1BB.

En un caso, los primero y segundo dominios de conmutación forman un conmutador basado en FKBP-FRB.

En un caso, uno del primer y segundo conmutadores de dimerización comprende: un dominio de conmutación que comprende una secuencia de unión a rapamicina o al análogo de rapamicina que tiene al menos un 80, 85, 90, 95, 98 o 99% de identidad con FKBP, y el otro comprende un dominio de conmutación que comprende una secuencia de unión a secuencia de unión a rapamicina o análogo de rapamicina que tiene al menos un 80, 85, 90, 95, 98 o 99% de identidad con FRB.

En un caso, el conmutador es un conmutador basado en FKBP-FRB y la molécula de dimerización es RAD001. En una realización, se administran de 0,1 a 20, de 0,5 a 10, de 2,5 a 7,5, de 3 a 6 o aproximadamente 5 mg de RAD001 por semana, por ejemplo, suministrado una vez por semana.

En un caso, se administra de 0,3 a 60, de 1,5 a 30, de 7,5 a 22,5, de 9 a 18 o aproximadamente 15 mg de RAD001 en una formulación de liberación sostenida, por semana, suministrado una vez por semana.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende un conmutador basado en GyrB-GyrB, por ejemplo, un conmutador basado en GyrB-GyrB descrito en el presente documento, por ejemplo, un conmutador basado en GyrB-GyrB, tal como se describe en el presente documento, por ejemplo, en el Módulo de conmutadores de dimerización. En un caso, el conmutador de dimerización comprende un conmutador basado en GAI-GID1, por ejemplo, un conmutador basado en GAI-GID1 descrito en el presente documento, por ejemplo, un conmutador basado en GAI-GID1, tal como se describe en el presente documento, por ejemplo, en el Módulo de conmutadores de dimerización. En un caso, el conmutador de dimerización comprende un conmutador basado en etiqueta Halo/etiqueta SNAP, por ejemplo, un conmutador basado en etiqueta Halo/etiqueta SNAP descrito en el presente documento, por ejemplo, un conmutador basado en etiqueta Halo/etiqueta SNAP, tal como se describe en el presente documento, por ejemplo, en el Módulo del conmutadores de dimerización.

En un caso, el RCAR comprende:

a) un miembro de señalización intracelular que comprende, comenzando con el extremo amino terminal:

un dominio CD3zeta y

un primer dominio de conmutación; y

b) un miembro de dominio ECD coestimulador que comprende, comenzando con el extremo amino terminal: un dominio de ECD coestimulador,

un dominio transmembrana,

un dominio de 4-1BB, y

un segundo dominio de conmutación,

En un caso, el RCAR se asocia con, por ejemplo, se proporciona en la misma célula con un shARNhc que reconoce una molécula inhibidora, por ejemplo, una molécula coinhibidora de la Tabla 3.

En un caso, el RCAR comprende además: un shARN que reconoce PD1.

En un caso, el dominio de unión a antígeno se une a un antígeno diana en una célula diana, por ejemplo, una célula cancerosa, pero no promueve una respuesta efectora inmunitaria, por ejemplo, una activación de células T, hasta que se administra la molécula de dimerización, por ejemplo, una molécula de heterodimerización o una molécula de homodimerización.

La divulgación también proporciona RCAR que tienen una configuración que permite la conmutación de la proliferación. Por ejemplo, tras el encuentro con el antígeno, el RCAR constituye la señal primaria, por ejemplo, dirigen la eliminación celular, y permite la regulación de una segunda señal, por ejemplo, proliferación, supervivencia y secreción de citocinas.

Por consiguiente, en otro aspecto, la divulgación presenta un receptor de antígeno quimérico regulable (RCAR), por ejemplo, un RCAR aislado, en el que el RCAR comprende:

a) un miembro de señalización intracelular que comprende:

opcionalmente, un dominio transmembrana o dominio de unión a membrana;

un dominio de señalización coestimulador, seleccionado, por ejemplo, de la Tabla 2, y

un dominio de conmutación; y

b) un miembro de unión a antígeno que comprende:

un dominio de unión a antígeno,

un dominio transmembrana y

un dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la Tabla 1, por ejemplo, un dominio CD3zeta,

en el que el miembro de unión a antígeno no comprende un dominio de conmutación, o no comprende un dominio de conmutación que dimerice con un dominio de conmutación en el miembro de señalización intracelular.

En un caso, el miembro de unión a antígeno no comprende un dominio de señalización coestimulador.

En un caso, el miembro de señalización intracelular comprende un segundo dominio de señalización coestimulador, seleccionado, por ejemplo, de la Tabla 2. En un caso, los dos o más dominios coestimuladores pueden ser el mismo dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 2, o dominios de señalización coestimuladores diferentes, por ejemplo, seleccionados de la lista en la Tabla 2. En un caso, el miembro de señalización intracelular comprende: una pluralidad, por ejemplo, 2 o 3, dominios de señalización coestimuladores seleccionados de 41BB, CD28, CD27, ICOS y OX40.

En un caso, el miembro de señalización intracelular comprende los siguientes dominios de señalización coestimuladores, desde la dirección extracelular a la intracelular:

41BB-CD27;

CD27-41BB;

41BB-CD28;

CD28-41BB;

OX40-CD28;

CD28-OX40;

CD28-41BB; o

41BB-CD28.

En un caso, el miembro de señalización intracelular comprende los siguientes dominios de señalización coestimuladores: CD28-41BB.

En un caso, el miembro de señalización intracelular comprende los siguientes dominios de señalización coestimuladores: CD28-OX40.

En un caso, además de uno o una pluralidad de dominios de señalización coestimuladores, el miembro de señalización intracelular comprende un dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la Tabla 1, por ejemplo, un dominio CD3zeta.

En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización coestimulador CD28, un dominio de señalización coestimulador 4-1BB y un dominio CD3zeta.

En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización coestimulador CD28, un dominio de señalización coestimulador OX40 y un dominio CD3zeta.

En un caso, el miembro de señalización intracelular no comprende un dominio transmembrana o dominio de unión a membrana. En tales casos, el dominio de conmutación es intracelular. En tales casos, el miembro de señalización intracelular comprende dos dominios de señalización coestimuladores, donde los dos dominios coestimuladores se seleccionan entre 4-1BB, OX40, CD27, CD28 e ICOS. En un caso, el orden de los elementos en el miembro de señalización intracelular es el siguiente, de la dirección extracelular a la intracelular:

un primer dominio de señalización coestimulador/un segundo dominio de señalización coestimulador y un dominio de conmutación dispuesto entre cualquiera de los elementos de señalización, o, de la dirección extracelular a la intracelular, después de todos los otros elementos de señalización. Véase, por ejemplo, la Fig. 48D.

En un caso, el miembro de señalización intracelular comprende un dominio transmembrana. En tales casos, el dominio de conmutación puede ser intracelular o extracelular. En tales casos, el miembro de señalización intracelular comprende dos dominios de señalización coestimuladores, donde los dos dominios coestimuladores se seleccionan de 4-1BB, OX40, CD27, CD28 e ICOS.

En un caso en el que el dominio de conmutación es extracelular, el orden de los elementos en el miembro de señalización intracelular es el siguiente, desde la dirección extracelular a la intracelular:

un dominio de conmutación/un dominio transmembrana/un primer dominio de señalización coestimulador/un segundo dominio de señalización coestimulador. Véase, por ejemplo, la Fig. 48C.

En un caso en el que el dominio de conmutación es intracelular, el orden de los elementos en el miembro de señalización intracelular es el siguiente, desde la dirección extracelular a intracelular:

dominio transmembrana/un primer dominio de señalización coestimulador/un segundo dominio de señalización coestimulador y un dominio de conmutación dispuesto intracelularmente entre cualquiera de los elementos de señalización o, de extracelular a intracelular, después de todos los otros elementos de señalización. Véase, por ejemplo, la Fig. 48A.

En un caso, el miembro de señalización intracelular comprende un dominio de anclaje de membrana. En uno de esos casos, el dominio de conmutación es intracelular. En tales casos, el miembro de señalización intracelular comprende dos dominios de señalización coestimuladores, donde los dos dominios coestimuladores se seleccionan entre 4-1BB, OX40, CD27, CD28 e ICOS. En un caso, el orden de los elementos en el miembro de señalización intracelular es el siguiente, desde la dirección extracelular a la intracelular:

un dominio de unión a la membrana/un primer dominio de señalización coestimulador/un segundo dominio de señalización coestimulador y un dominio de conmutación dispuesto extracelularmente, entre cualquiera de los elementos de señalización, o, de extracelular a intracelular, después de todos los otros elementos de señalización. Véase, por ejemplo, la Fig. 48B.

En un caso, el dominio de conmutación es: extracelular; dispuesto entre el dominio transmembrana o el dominio de unión a la membrana y un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, el dominio de señalización coestimulador más cercano a la membrana; entre un primer y un segundo dominio de señalización coestimulador; entre un dominio de señalización coestimulador y un dominio de señalización intracelular primario; o, de extracelular a intracelular, después de todos los dominios de señalización intracelular.

En un caso, el orden de los elementos en el miembro de señalización intracelular, de extracelular a intracelular, es el siguiente:

dominio transmembrana o dominio de anclaje de membrana/un primer dominio de señalización coestimulador/opcionalmente un segundo dominio de señalización coestimulador/y opcionalmente un dominio de señalización intracelular primario, y un dominio de conmutación dispuesto extracelularmente, entre cualquiera de los elementos, o, de extracelular a intracelular, después de todos los otros elementos.

En un caso, el orden de los elementos en el miembro de unión a antígeno, desde extracelular a intracelular, es el siguiente:

dominio de unión a antígeno/dominio transmembrana/dominio de señalización intracelular primario, por ejemplo, seleccionado de la Tabla 1, por ejemplo, un dominio CD3zeta.

En un caso, el miembro de señalización intracelular comprende un dominio de conmutación de un conmutador de homodimerización.

En un caso, el miembro de señalización intracelular comprende un primer dominio de conmutación de un conmutador de heterodimerización y el RCAR comprende un segundo miembro de señalización intracelular que comprende un segundo dominio de conmutación del conmutador de heterodimerización. En casos, el segundo miembro de señalización intracelular comprende los mismos dominios de señalización intracelular que el miembro de señalización intracelular.

En un caso, el miembro de unión a antígeno comprende una pluralidad de, por ejemplo, 2, 3, 4, o 5, dominios de unión a antígeno, por ejemplo, scFv, en el que cada dominio de unión a antígeno se une a un antígeno diana. En un caso, dos o más de los dominios de unión a antígenos pueden unirse a diferentes antígenos. En un caso, dos o más de los dominios de unión a antígeno pueden unirse al mismo antígeno, por ejemplo, al mismo o diferentes epítopos en el mismo antígeno. En casos, un enlazador o región de bisagra se dispone opcionalmente entre dos o cada uno de los dominios de unión a antígeno.

En un caso, el conmutador de dimerización es intracelular.

En un caso, el conmutador de dimerización es extracelular.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende:

un dominio de conmutación que comprende una secuencia de unión a análogo de rapamicina que tiene al menos un 80, 85, 90, 95, 98 o 99% de identidad con FKBP, y un dominio de conmutación que comprende una secuencia de unión a una secuencia de unión a análogo de rapamicina que tiene al menos un 80, 85, 90, 95, 98 o 99% de identidad con FRB.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende:

En un caso, el conmutador de dimerización comprende un fragmento de unión a FRB o análogo de FKBP y un fragmento de unión a FKBP o análogo de FRB, y el fragmento de unión a FKBP o análogo de FRB comprende una o más mutaciones que aumentan la afinidad de unión con rapamicina o un rapálogo, por ejemplo, RAD001, o una mutación descrita en la sección de el presente documento titulada CONMUTADORES DE DIMERIZACIÓN BASADOS EN FKBP/FRB MODIFICADOS. Por ejemplo, el fragmento de unión a FKBP o análogo de FRB comprende: una mutación E2032, por ejemplo, una mutación E2032I o una mutación E2032L; una mutación T2098, por ejemplo, una mutación T2098L; o una mutación E2032 y T2098, por ejemplo, una mutación E2032I y una mutación T2098L o una mutación E2032L y una mutación T2098L.

En un caso, el conmutador de dimerización es un conmutador múltiple que comprende una pluralidad de, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, dominios de conmutación, independientemente, en el miembro de señalización intracelular. En casos en los que el miembro de señalización intracelular comprende una pluralidad de primeros dominios de conmutación de un conmutador de heterodimerización, por ejemplo, dominios de conmutación basados en FKBP, el RCAR comprende además un segundo miembro de señalización intracelular que comprende una pluralidad de segundos dominios de conmutación de un conmutador de heterodimerización, por ejemplo, dominios de conmutación basados en FRB. En los casos en los que el miembro de señalización intracelular comprende un primer y un segundo dominio de conmutación, por ejemplo, un dominio de conmutación basado en FKBP y un dominio de conmutación basado en FRB, el RCAR comprende además un segundo miembro de señalización intracelular que comprende un primer y un segundo dominio de conmutación, por ejemplo, un dominio de conmutación basado en FKBP y un dominio de conmutación basado en FRB.

En un caso, se administran de 0,3 a 60, de 1,5 a 30, de 7,5 a 22,5, de 9 a 18 o aproximadamente 15 mg de RAD001 en una formulación de liberación sostenida, por semana, suministrado una vez por semana.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende:

En un caso:

el primer dominio de conmutación comprende

una secuencia de unión a rapamicina o análogo de rapamicina de FKBP;

una secuencia de unión al análogo de rapamicina de FKBP; o

una secuencia de unión a AP21967 de FKBP; y

el segundo dominio de conmutación comprende

una secuencia de unión a rapamicina, o análogo de rapamicina, de FRB;

una secuencia de unión al análogo de rapamicina de FRB; o

En un caso:

el primer dominio de conmutación comprende

una secuencia de unión a rapamicina, o análogo de rapamicina, de FRB;

una secuencia de unión al análogo de rapamicina de FRB; o

el segundo dominio de conmutación comprende

una secuencia de unión a rapamicina o análogo de rapamicina de FKBP;

una secuencia de unión al análogo de rapamicina de FKBP; o

una secuencia de unión a AP21967 de FKBP.

En un caso:

el primer dominio de conmutación comprende

una secuencia de unión a AP21967 de FKBP; y

En un caso, el primer dominio de conmutación comprende una secuencia de unión a AP21967de FRB, por ejemplo, una secuencia que comprende una lisina en el residuo 2098; y

En un caso, el conmutador de dimerización comprende:

el subdominio del extremo amino terminal de 24 kDa de GyrB.

En un caso, la molécula de dimerización es una cumermicina.

En un caso, el conmutador de dimerización comprende:

un dominio de conmutación GID1 que comprende una secuencia de unión a giberelina, o un análogo de giberelina, por ejemplo, GA³, que no difiere en más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 , 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de la secuencia correspondiente de G1D1, y un dominio de conmutación GAI que no difiere en más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácido de la secuencia correspondiente de GAI.

En un caso:

el primer dominio de conmutación comprende un dominio de conmutación GID1; y

el segundo dominio de conmutación comprende un dominio de conmutación GAI.

En un caso:

el primer dominio de conmutación comprende un dominio de conmutación GAI; y

el segundo dominio de conmutación comprende un dominio de conmutación GID¹.

En un caso, la molécula de dimerización es GA³-AM.

E n un c a s o , la m o lé c u la d e d im e r iz a c ió n e s G A 3.

E n un c a s o , la m o lé c u la d e d im e r iz a c ió n e s u n a m o lé c u la p e q u e ñ a , p o r e je m p lo , e s d ife re n te d e un p o lip é p tid o . E n un c a s o , la m o lé c u la d e d im e r iz a c ió n e s un p o lip é p tid o , p o r e je m p lo , un p o lip é p tid o , p o r e je m p lo , u n a m o lé c u la d e a n t ic u e rp o , o un a rm a z ó n n o d e a n t ic u e rp o , p o r e je m p lo , u n a f r ib ro n e c t in a o a d n e c t in a , q u e t ie n e a f in id a d e s p e c íf ic a p o r u n o o a m b o s d e l p r im e ro y s e g u n d o d o m in io s d e c o n m u ta c ió n .

E n un c a s o , la m o lé c u la d e d im e r iz a c ió n , p o r e je m p lo , un p o lip é p tid o , e s u n a m o lé c u la d e a n tic u e rp o .

E n un c a s o , e l c o n m u ta d o r d e d im e r iz a c ió n c o m p re n d e un c o n m u ta d o r b a s a d o e n e t iq u e ta H a lo /e t iq u e ta S N A P . E n un c a s o , e l c o n m u ta d o r d e d im e r iz a c ió n c o m p re n d e :

un d o m in io d e c o n m u ta c ió n d e e t iq u e ta H a lo q u e c o m p re n d e te n e r a l m e n o s un 80 , 85 , 90 , 95 , 98 o 99 % d e id e n tid a d c o n S E Q ID N O : 14, y un d o m in io d e c o n m u ta c ió n d e e t iq u e ta S N A P q u e t ie n e a l m e n o s a l m e n o s un 80 , 85 , 90 , 95 , 98 o 99 % d e id e n tid a d c o n S E Q ID N O : 15.

un d o m in io d e c o n m u ta c ió n d e e t iq u e ta H a lo q u e d if ie re en n o m á s d e 10, 9, 8 , 7, 6 , 5, 4 , 3, 2 o 1 re s id u o s d e a m in o á c id o s d e la S E Q ID N O : 14, y un d o m in io d e c o n m u ta c ió n d e e t iq u e ta S N A P q u e d if ie re en no m á s d e 10, 9, 8 , 7, 6 , 5, 4, 3, 2 o 1 re s id u o s d e a m in o á c id o s d e la S E Q ID N O : 15.

E n un ca so :

e l p r im e r d o m in io d e c o n m u ta c ió n c o m p re n d e un d o m in io d e c o n m u ta c ió n d e e t iq u e ta H a lo ; y

e l s e g u n d o d o m in io d e c o n m u ta c ió n c o m p re n d e un d o m in io d e c o n m u ta c ió n d e e t iq u e ta S N A p .

E n un ca so :

e l p r im e r d o m in io d e c o n m u ta c ió n c o m p re n d e un d o m in io d e c o n m u ta c ió n d e e t iq u e ta S N A P ; y

e l s e g u n d o d o m in io d e c o n m u ta c ió n c o m p re n d e un d o m in io d e c o n m u ta c ió n e t iq u e ta H a lo .

E n un c a s o , la m o lé c u la d e d im e r iz a c ió n c o m p re n d e la e s tru c tu ra 5.

E n un c a s o , la m o lé c u la d e d im e r iz a c ió n c o m p re n d e tre s o m á s d o m in io s , p o r e je m p lo , e t iq u e ta s d e p ro te ín a s q u e se u n e n a un d o m in io d e c o n m u ta c ió n , p o r e je m p lo , un p o lip é p tid o , p o r e je m p lo , u n a m o lé c u la d e a n t ic u e rp o o un a rm a z ó n n o d e a n t ic u e rp o , q u e t ie n e n a f in id a d p o r e l d o m in io .

E n un c a s o , la m o lé c u la d e d im e r iz a c ió n e s u n a m o lé c u la d e d im e r iz a c ió n n o c o v a le n te .

E n un c a s o , la m o lé c u la d e d im e r iz a c ió n e s u n a m o lé c u la d e d im e r iz a c ió n c o v a le n te .

E n un c a s o , e l c o n m u ta d o r d e d im e r iz a c ió n , p o r e je m p lo , un c o n m u ta d o r d e h o m o d im e r iz a c ió n , p o r e je m p lo , un c o n m u ta d o r d e h o m o d im e r iz a c ió n e x tra c e lu la r , c o m p re n d e d o m in io s d e c o n m u ta c ió n q u e c o m p re n d e n m o lé c u la s d e e t iq u e ta , p o r e je m p lo , u n a e t iq u e ta d e p é p tid o c -m y c , u n a e t iq u e ta d e p é p tid o f la g , u n a e t iq u e ta d e p é p tid o H A o u n a e t iq u e ta d e p é p tid o V 5 , y e l c o n m u ta d o r d e d im e r iz a c ió n c o m p re n d e p o lip é p tid o s c o n a f in id a d p o r lo s d o m in io s de c o n m u ta c ió n , p o r e je m p lo , m o lé c u la s d e a n t ic u e rp o y a rm a z ó n n o d e a n tic u e rp o .

E n un c a s o , e l R C A R c o m p re n d e a d e m á s un c o n m u ta d o r d e d im e r iz a c ió n d e s e g u n d o o rd e n .

E n un c a s o , la m o lé c u la d e d im e r iz a c ió n t ie n e u n a v a le n c ia d e m á s d e d o s , p o r e je m p lo , e s m u lt iv a le n te y s e u n e , y p o r ta n to a g ru p a o d im e r iz a , m á s d e d o s d o m in io s d e c o n m u ta c ió n .

E n un c a s o , e l R C A R se a s o c ia c o n , p o r e je m p lo , se p ro p o rc io n a en la m is m a c é lu la con : un in h ib id o r d e u n a m o lé c u la in h ib id o ra , p o r e je m p lo , un in h ib id o r d e u n a m o lé c u la in h ib id o ra d e la T a b la 3.

E n un c a s o , e l R C A R se a s o c ia co n , p o r e je m p lo , se p ro p o rc io n a en la m is m a c é lu la c o n un in h ib id o r d e á c id o n u c le ic o , p o r e je m p lo , un s iA R N , un s h A R N o u n a m o lé c u la a n t is e n t id o , q u e re c o n o c e u n a m o lé c u la in h ib id o ra , p o r e je m p lo , u n a m o lé c u la c o in h ib id o ra d e la T a b la 3.

E n un c a s o , e l s h A R N re c o n o c e P D 1.

E n un c a s o , la d im e r iz a c ió n a u m e n ta e l n iv e l d e p ro li fe ra c ió n o p e rs is te n c ia d e la c é lu la R C A R X , p o r e je m p lo , R C A R T .

E n un c a s o , e l R C A R c o m p re n d e a d e m á s :

un m ie m b ro d e u n ió n a c o n tra lig a n d o in h ib id o r q u e c o m p re n d e ,

un dominio de unión a contraligando inhibidor, seleccionado, por ejemplo, de la Tabla 4, y

un dominio transmembrana o anclaje de membrana.

En una realización, en una célula RCAR/NKR-CAR, dicho NKR-CAR comprende un dominio de unión a antígeno extracelular; un dominio transmembrana (por ejemplo, un dominio transmembrana NKR) y un dominio citoplasmático (por ejemplo, un dominio citoplasmático NKR). En realizaciones, el NKR-CAR comprende un KIR-CAR; un NCR-C^aR; un SLAMF-CAR; un FcR-CAR; o un Ly49-CAR. En realizaciones, el NKR-CAR comprende un NKR-CAR inhibidor (inhNKR-CAR). En realizaciones, el inhNKR-CAR es un inhKIR-CAR, un inhSLAMF-CAR o un inhLy49-CAR.

En una realización, dicho NKR-CAR comprende un KIR-CAR, por ejemplo, un actKIR-CAR o inhKIR-CAR, un NCR-CAR, por ejemplo, un actNCR-CAR, un SlAMF-CAR, por ejemplo, un inhSLAMF- CAR, un FcR-CAR, por ejemplo, CD16-CAR, por ejemplo, un actCD16-CAR, o CD64-CAR, por ejemplo, un actCD64-CAR, o un Ly49-CAR, por ejemplo, un actLy49-CAR o inhLy49-CAR. En una realización, el NKR-CAR comprende un dominio transmembrana y un dominio de unión a antígeno extracelular, y comprende además un dominio bisagra dispuesto entre dicho dominio transmembrana y dicho dominio de unión a antígeno extracelular. En una realización, el NKR-CAR es un NKR-CAR activador, y el dominio de unión a antígeno extracelular es un dominio de unión a antígeno descrito en el presente documento.

En una realización, el KIR-CAR comprende un dominio de unión a antígeno extracelular y un dominio transmembrana, por ejemplo, un dominio transmembrana KIR o un dominio citoplasmático, por ejemplo, un dominio citoplasmático que contiene ITIM, o un dominio citoplasmático KIR . En una realización, el KIR-CAR comprende un dominio de unión a antígeno extracelular, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático que contiene ITIM, o un dominio citoplasmático KIR. En una realización, dicho dominio transmembrana puede interaccionar con, por ejemplo, unirse al dominio transmembrana de DAP12. En una realización, dicho dominio transmembrana comprende un resto cargado positivamente, por ejemplo, un residuo de aminoácido que comprende un resto cargado positivamente, por ejemplo, cadena lateral. En una realización, dicho dominio transmembrana comprende un dominio transmembrana KIR.

En una realización, dicho KIR-CAR es un KIR-CAR activador. En una realización, dicho KIR-CAR comprende un dominio transmembrana KIR. En una realización, dicho KIR-CAR es un KIR-CAR inhibidor. En una realización, dicho KIR-CAR comprende un dominio citoplasmático KIR. En una realización, dicho KIR-CAR comprende un dominio de unión a antígeno extracelular y un dominio transmembrana, por ejemplo, un dominio transmembrana que comprende un resto cargado positivamente, por ejemplo, un residuo de aminoácido que comprende un resto cargado positivamente, por ejemplo, cadena lateral, o un dominio transmembrana KIR.

En una realización, un KIR-CAR descrito en el presente documento comprende un dominio de unión a antígeno que comprende un scFv. En una realización, dicho dominio de unión a antígeno comprende un único dominio VH, por ejemplo, un único dominio VH de camélido, tiburón o lamprea, o un único dominio VH derivado de una secuencia humana o de ratón, o un armazón no de anticuerpos, por ejemplo, una fibronectina, por ejemplo, una molécula similar a un anticuerpo de fibronectina de tipo III. En una realización, dicho dominio de unión a antígeno comprende un nanocuerpo. En una realización, dicho dominio de unión a antígeno comprende un dominio VHH de camélido. En una realización, el KIR-CAR es un KIR-CAR activador, y el dominio de unión a antígeno extracelular es un dominio de unión a antígeno descrito en el presente documento.

En una realización, un KIR-CAR descrito en el presente documento comprende un dominio bisagra extracelular. En una realización, el dominio bisagra extracelular es distinto de un dominio bisagra KIR, por ejemplo, distinto de un dominio bisagra KIR2DS2. En una realización, el dominio bisagra extracelular se deriva de una molécula natural. En una realización, el dominio bisagra extracelular se deriva de una molécula natural distinta de KIR. En una realización, el dominio bisagra extracelular comprende una secuencia polipeptídica no natural. En una realización, el dominio bisagra extracelular comprende la bisagra extracelular de CD8-alfa humano. En una realización, el dominio bisagra extracelular comprende una bisagra extracelular sintética. En una realización, el dominio bisagra extracelular tiene una longitud menor de 50, 20 o 10 aminoácidos. En una forma de realización, el dominio bisagra extracelular tiene menos aminoácidos que un dominio bisagra KIR2DS2.

En una realización, el KIR-CAR descrito en el presente documento es un actKIR-CAR. En una realización, dicho actKIR-CAR comprende un dominio transmembrana que comprende un resto cargado positivamente, por ejemplo, un residuo de aminoácido que comprende un resto cargado positivamente, por ejemplo, una cadena lateral cargada positivamente o un dominio transmembrana actKIR. En una realización, dicho actKIR-CAR puede interaccionar y promover la señalización de un polipéptido o molécula adaptadora que contiene ITAM. En una realización, dicho actKIR-CAR puede interaccionar y promover la señalización de un polipéptido DAP12. En una realización, dicho actKIR-CAR comprende un dominio KIR D. En una realización, dicho actKIR-CAR comprende un dominio KIR D1. En una realización, dicho actKIR-CAR comprende un dominio KIR D2. En una realización, dicho actKIR-CAR no comprende un dominio KIR D. En una realización, dicho actKIR-CAR comprende un dominio transmembrana KIR2DS2. En una realización, dicho actKIR-CAR comprende además un dominio citoplasmático KIR2DS2. En una realización, dicho actKIR-CAR no comprende un dominio KIR D.

En una realización, el dominio de unión a antígeno de un KIR-CAR descrito en el presente documento se une a un antígeno presente en una célula diana, por ejemplo, una célula cancerosa. En una realización, dicho dominio de unión a antígeno se une a un antígeno que se expresa más en una célula diana, por ejemplo, una célula cancerosa, que en una célula no diana, por ejemplo, una célula no cancerosa, por ejemplo, una célula no cancerosa del mismo tipo que la célula diana. En una realización, dicho dominio de unión a antígeno se une a un antígeno descrito en el presente documento, por ejemplo, un antígeno tumoral descrito en el presente documento. En una realización, el antígeno tumoral se expresa en un tumor sólido, por ejemplo, un tumor sólido descrito en el presente documento, por ejemplo, mesotelioma (por ejemplo, mesotelioma pleural maligno), cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células escamosas o cáncer de pulmón de células grandes), cáncer de páncreas (por ejemplo, adenocarcinoma ductal de páncreas), cáncer de ovario, cáncer colorrectal y cáncer de vejiga o cualquier combinación de los mismos.

En una realización, el KIR-CAR descrito en el presente documento es un inhKIR-CAR. En una realización, el inhKIR-CAR comprende un dominio transmembrana inhKIR. En una realización, el inhKIR-CAR comprende un dominio citoplasmático que contiene ITIM, por ejemplo, un dominio citoplasmático inhKIR, por ejemplo, un dominio citoplasmático KIR2DL o KIR3DL. En una realización, el inhKIR-CAR comprende un transmembrana distinto de un transmembrana de KIR, por ejemplo, un dominio transmembrana de PD-1, CTLA4 o receptores que contienen ITIM de las familias de genes de receptores ILT (CD85), Siglec, LMIR (CD300) y/o SLAM. En una realización, el inhKIR-CAR comprende un dominio citoplasmático de un receptor inhibidor distinto de KIR, por ejemplo, de familias de genes de receptores de PD-1, ^cT^lA4 o receptores que contienen ITIM de ILT (CD85), Siglec, LMIR (CD300) y/o SLAM. En una realización, el inhKIR-CAR comprende un dominio transmembrana y citoplasmático de un receptor inhibidor distinto de KIR, por ejemplo, un dominio transmembrana y citoplasmático, independientemente, por ejemplo, de receptores de PD-1, CTLA4 o que contienen ITIM de familias de genes de receptores ILT (CD85), Siglec, LMIR (CD300) y/o SLAM. En una realización, dicho dominio citoplasmático comprende un ITIM. En una realización, el inhKIR-CAR comprende un dominio KIR D. En una realización, el inhKIR-CAR comprende un dominio KIR D0. En una realización, inhKIR-CAR comprende un dominio KIR D1. En una realización, inhKIR-CAR comprende un dominio KIR D2. En una realización, inhKIR-CAR no comprende un dominio KIR D.

En una realización, el dominio de unión a antígeno de los inhKIR-CAR descritos en el presente documento se une a un antígeno que no está presente en una célula diana, por ejemplo, una célula cancerosa. En una realización, dicho dominio de unión a antígeno se une a un antígeno que se expresa más en una célula no diana, por ejemplo, una célula no cancerosa, que en una célula diana, por ejemplo, una célula cancerosa, por ejemplo, una célula cancerosa del mismo tipo que la célula diana. En una realización, dicho dominio de unión a antígeno se une a desmogleína1/3 (DSG1/3). En una realización, se proporciona un inhCAR, por ejemplo, un inhTCAR o inhNKR-CAR, por ejemplo, un inhKIR-CAR, y un actCAR, por ejemplo, un actTCAR o actNKR-CAR, por ejemplo, un actKIR-CAR, en los que el inhCAR comprende un dominio de unión a antígeno que reconoce desmogleína1/3 (DSG1/3) y el actCAR comprende un dominio de unión a antígeno que reconoce un antígeno distinto de DSG1/3, por ejemplo, EGFR. En una encarnación, este par se usa para tratar un cáncer que expresa EGFR, por ejemplo, un adenocarcinoma de pulmón o colon. En una realización, las células cancerosas expresan menos DSG1/3 que las células no cancerosas. En una realización, esta combinación puede minimizar el ataque mediado por CAR de las células de la piel o las células escamosas de la vía GI (es decir, la mucosa oral). En una realización, dicho dominio de unión a antígeno se une a un receptor de efrina o una claudina.

En una realización, un NCR-CAR, por ejemplo, un NCR-CAR activador, comprende un dominio de unión a antígeno extracelular, un dominio transmembrana, por ejemplo, un dominio transmembrana que comprende un resto cargado positivamente, por ejemplo, un residuo de aminoácido que comprende un resto cargado positivamente, por ejemplo, una cadena lateral cargada positivamente o un dominio transmembrana NCR, y un dominio citoplasmático, por ejemplo, un dominio citoplasmático NCR.

En una realización, dicho NCR-CAR comprende un dominio transmembrana que comprende un resto cargado positivamente, por ejemplo, un residuo de aminoácido que comprende un resto cargado positivamente, por ejemplo, una cadena lateral cargada positivamente, por ejemplo, un dominio transmembrana NCR, por ejemplo, un dominio citoplasmático NKp30, NKp44 o NKp46. En una realización, dicho NCR-CAR comprende un dominio citoplasmático que puede interaccionar con una molécula adaptadora o molécula de señalización intracelular que comprende, por ejemplo, un dominio citoplasmático DAP12, F^cR^yo CD3Z. En una realización, dicho NCR-CAR, por ejemplo, un NKp30-CAR, comprende un dominio transmembrana que puede interaccionar con una molécula adaptadora o molécula de señalización intracelular, por ejemplo, DAP12. En una realización, dicho NCR-CAR comprende un NKp46-CAR. En una realización, dicho NKp46-CAR, comprende un dominio transmembrana que comprende un resto cargado positivamente, por ejemplo, un residuo de aminoácido que comprende un resto cargado positivamente, por ejemplo, una cadena lateral cargada positivamente o, por ejemplo, un dominio transmembrana NCR, que puede interaccionar con una molécula adaptadora o molécula de señalización intracelular, por ejemplo, una que tiene un dominio citoplasmático FcRy o CD3Z. En una realización, dicho NCR-CAR descrito en el presente documento comprende además un dominio bisagra dispuesto entre dicho dominio transmembrana y dicho dominio de unión a antígeno extracelular.

En una realización, el NCR-CAR es un NCR-CAR activador, y el dominio de unión a antígeno extracelular es un dominio de unión a antígeno descrito en el presente documento.

En una realización, el SLAMF-CAR, por ejemplo, un SLAMF-CAR inhibidor, comprende un dominio de unión a antígeno extracelular, un dominio transmembrana, por ejemplo, un dominio transmembrana que comprende un resto cargado positivamente, por ejemplo, un residuo de aminoácido que comprende un resto cargado positivamente, por ejemplo, una cadena lateral cargada positivamente, por ejemplo, un dominio transmembrana SLAMF y un dominio citoplasmático SLAMF. En una realización, dicho SLAMF-CAR comprende un dominio citoplasmático SLAMF, CD48, Cd229, 2B4, CD84, NTB-A, CRACC, BLAME o CD2F-10. En una realización, dicho SLAMF-CAR comprende además un dominio bisagra, dispuesto entre dicho dominio transmembrana y dicho dominio de unión a antígeno extracelular.

En una realización, el FcR-CAR, por ejemplo, CD16-CAR, por ejemplo, comprende un CD16-CAR activador o un CD64-CAR, por ejemplo, un CD64-CAR activador, que comprende un dominio de unión a antígeno extracelular, un dominio transmembrana, y un dominio citoplasmático CD 16 o CD64. En una realización, dicho FcR-CAR es un CD16-CAR. En una realización, dicho FcR-CAR es un CD64-CAR. En una realización, dicho FcR-CAR puede interaccionar con una molécula adaptadora o molécula de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio FcRy o CD3Z, por ejemplo, a través de un dominio transmembrana, por ejemplo, un dominio transmembrana que comprende un resto cargado positivamente, por ejemplo, un residuo de aminoácido que comprende un resto cargado positivamente, por ejemplo, una cadena lateral cargada positivamente o, por ejemplo, un dominio transmembrana CD16 o CD64. En una realización, dicho FcR-CAR comprende además un dominio bisagra, dispuesto entre dicho dominio transmembrana y dicho dominio de unión a antígeno extracelular.

En una realización, el Ly49-CAR comprende un dominio de unión a antígeno extracelular y un dominio transmembrana, por ejemplo, un dominio transmembrana Ly49, o un dominio citoplasmático, por ejemplo, un dominio citoplasmático que contiene ITIM, por ejemplo, un dominio citoplasmático Ly49. En una realización, el Ly49-CAR comprende un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático Ly49. En una realización, dicho Ly49-CAR es un Ly49-CAR activador, por ejemplo, Ly49D o Ly49H. En una realización, dicho Ly49-CAR comprende un dominio transmembrana cargado positivamente, por ejemplo, un dominio transmembrana Ly49 cargado positivamente. En una realización, dicho Ly49-CAR puede interaccionar con un dominio citoplasmático que contiene ITAM, por ejemplo, DAP 12. En una realización, dicho Ly49-CAR comprende un dominio transmembrana Ly49. En una realización, dicho KIR-CAR es un Ly49-CAR inhibidor, por ejemplo, Ly49A o Ly49C. En una realización, dicho Ly49-CAR comprende un dominio citoplasmático que contiene ITIM, por ejemplo, un dominio citoplasmático Ly49. En una realización, dicho Ly49-CAR comprende un dominio transmembrana Ly49 o un dominio citoplasmático Ly49 seleccionado, independientemente de Ly49A-Ly49W. En una realización, dicho Ly49-CAR comprende además un dominio bisagra, dispuesto entre dicho dominio transmembrana y dicho dominio de unión a antígeno extracelular. En una realización, la célula RCAR/NKR-CAR comprende un ácido nucleico que codifica un RCAR y un NKR-CAR. En una realización, una única molécula de ácido nucleico comprende una secuencia que codifica un RCAR y una secuencia que codifica un NKR-CAR. En realizaciones, el ácido nucleico comprende una primera molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un RCAR y una segunda molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un NKR-CAR.

En un caso, por ejemplo, en una célula RCAR/NKR-CAR o para su uso en la generación de una célula RCAR/NKR-CAR, un ácido nucleico aislado que codifica un RCAR comprende una secuencia que codifica el miembro de unión a antígeno y el miembro de señalización intracelular está presente en una sola molécula de ácido nucleico. En un caso, la secuencia que codifica el miembro de unión a antígeno está unida operativamente a una primera región de control y la secuencia que codifica el miembro de señalización intracelular está unida operativamente a una segunda región de control. En un caso, la secuencia que codifica el miembro de unión a antígeno se transcribe como un primer ARN y la secuencia que codifica el miembro de señalización intracelular se traduce como un segundo ARN. En un caso, la secuencia que codifica el miembro de unión a antígeno está presente en una primera molécula de ácido nucleico y la secuencia que codifica el miembro de señalización intracelular está presente en una segunda molécula de ácido nucleico. En un caso, la secuencia que codifica el miembro de unión a antígeno y el miembro de señalización intracelular están presentes en una única molécula de ácido nucleico. En un caso, el ácido nucleico codifica un RCAR, tal como se describe en cualquiera de las Tablas 6, 7, 8, 9, 10 u 11.

En casos, por ejemplo, en una célula RCAR/NKR-CAR o para su uso en la generación de una célula RCAR/NKR-CAR, el ácido nucleico comprende una secuencia de ADN o ARN, por ejemplo, un ARNm, que comprende una secuencia que codifica un NKR-CAR descrito en el presente documento. En un caso, el ácido nucleico comprende además una secuencia que codifica una molécula adaptadora o dominio de señalización intracelular que interacciona con dicho NKR-CAR. En un caso, el ácido nucleico codifica un NKR-CAR activador o inhibidor, y el dominio de unión a antígeno extracelular codificado es un dominio de unión a antígeno descrito en el presente documento.

En realizaciones, la célula comprende un sistema de vectores que comprende un ácido nucleico que codifica un RCAR y un NKR-CAR. En realizaciones, un solo vector comprende una secuencia que codifica un RCAR y una secuencia que codifica un NKR-CAR. En realizaciones, el sistema de vectores comprende un primer vector que comprende una secuencia que codifica un RCAR y un segundo vector que comprende una secuencia que codifica un NKR-CAR.

En una realización, todos los elementos de un RCAR se codifican en un solo vector.

En una realización, un elemento de un RCAR se codifica en un primer vector y otro elemento de RCAR se codifica en un segundo vector, del sistema de vectores.

En una realización, el sistema de vectores comprende un ADN, un ARN, un plásmido, un vector de lentivirus, un vector adenoviral o un vector de retrovirus.

En una realización, el sistema de vectores comprende un vector lentivirus bi-cistrónico o tri-cistrónico.

En una realización, el sistema de vectores comprende un promotor bi-cistrónico o tri-cistrónico.

En una realización, la secuencia o secuencias de ácido nucleico que codifican un RCAR y la secuencia o secuencias de ácido nucleico que codifican un NKR-CAR se disponen en la misma molécula de ácido nucleico, por ejemplo, el mismo vector, por ejemplo, el mismo vector viral, por ejemplo, un vector lentiviral. En una realización, la secuencia o secuencias de ácido nucleico que codifica un RCAR se dispone en una primera molécula de ácido nucleico, por ejemplo, un primer vector, por ejemplo, un vector viral, por ejemplo, un vector lentiviral, y la secuencia o secuencias de ácido nucleico que codifican un NKR-CAR se disponen en una segunda molécula de ácido nucleico, por ejemplo, un segundo vector, por ejemplo, un vector viral, por ejemplo, un vector lentiviral.

En formas de realización, por ejemplo, en/sobre una célula RCAR/NKR-CAR, el dominio de RCAR y el dominio de unión a antígeno de NKR-CAR, por ejemplo, el inhNKR-CAR, reconocen diferentes antígenos. En realizaciones, el dominio de unión a antígeno del RCAR se une a un antígeno tumoral. En realizaciones, el dominio de unión a antígeno del inhNKR-CAR se une a un antígeno diana que se expresa en células normales, por ejemplo, células no tumorales o no cancerosas, pero no se expresa en gran medida en células cancerosas o tumorales. En realizaciones, cuando los dominios de unión a antígeno del RCAR y el inhNKR-CAR se unen ambos a su antígeno diana, la célula no se activa.

En formas de realización, el dominio de unión a antígeno del RCAR o NKR-CAR no comprende un dominio variable ligero y un dominio variable pesado, y el otro (por ejemplo, RCAR o NKR-CAR) no es un scFv.

En un aspecto, en el presenet documento se describe un ácido nucleico que comprende:

(i) una secuencia que codifica un RCAR y

(ii) una secuencia que codifica un NKR-CAR,

donde el RCAR comprende:

A) un miembro de señalización intracelular que comprende:

un primer dominio de conmutación;

B) un miembro de unión a antígeno que comprende:

un dominio de unión a antígeno,

un segundo dominio de conmutación; y opcionalmente,

C) un dominio transmembrana, y

donde el NKR-CAR comprende:

a) un dominio de unión a antígeno,

b) un dominio transmembrana, por ejemplo, un dominio transmembrana NKR, y

c) un dominio citoplasmático, por ejemplo, un dominio citoplasmático NKR.

En casos, la secuencia que codifica el RCAR comprende:

i) una secuencia que codifica (A) y (B) se dispone en una única molécula de ácido nucleico; o

ii) una secuencia que codifica (A) se dispone en una primera molécula de ácido nucleico, y una secuencia que codifica (B) se dispone en una segunda molécula de ácido nucleico.

En casos, una secuencia que codifica (A) y (B) está presente en una sola molécula de ácido nucleico, y se transcribe como un solo producto de transcripción, y se configura de la siguiente manera:

un promotor, está operativamente ligado a (A), (B) y (D), en donde (D) codifica un péptido escindible y el elemento (D) está dispuesto entre (A) y (B).

En otros casos, una secuencia que codifica (A) y una secuencia que codifica (B) están presentes en una única molécula de ácido nucleico, se transcriben como un único producto de transcripción y se configuran de la siguiente manera:

un promotor está operativamente unido a (A), (B) y (D), donde el elemento (D) codifica un IRES, y el elemento (D) está dispuesto entre (A) y (B).

En casos, el ácido nucleico comprende además (iii) una secuencia que codifica un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, una molécula adaptadora, que interacciona con dicho NKR-CAR.

En casos, el dominio de señalización intracelular, por ejemplo, la molécula adaptadora, produce una señal inhibidora. En casos, la (ii) secuencia que codifica un NKR-CAR y (iii) una secuencia que codifica un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, una molécula adaptadora, están dispuestas en la misma molécula de ácido nucleico, por ejemplo, el mismo vector, por ejemplo, el mismo vector viral, por ejemplo, un vector lentiviral.

En algunos casos, una de (ii) secuencia que codifica un NKR-CAR y (iii) una secuencia que codifica un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, molécula adaptadora, está dispuesta en una primera molécula de ácido nucleico, por ejemplo, un primer vector, por ejemplo, un vector viral, por ejemplo, un vector lentiviral, y el otro está dispuesto en una segunda molécula de ácido nucleico, por ejemplo, un segundo vector, por ejemplo, un vector viral, por ejemplo, un vector lentiviral.

En casos, el ácido nucleico comprende una secuencia de ADN o ARN, por ejemplo, ARNm.

En otro aspecto, también se describe en el presente documento un sistema de vectores que comprende un ácido nucleico descrito en el presente documento. En realizaciones, el sistema de vectores comprende un ADN, un ARN, un plásmido, un lentivirus, un vector adenoviral o un vector retrovírico.

En un aspecto, se describe en el presente documento un procedimiento de tratamiento de un sujeto con una enfermedad asociada con un antígeno tumoral, por ejemplo, un procedimiento para proporcionar una inmunidad antitumoral en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una célula RCAR/NKR-CAR descrita en el presente documento.

En casos, la enfermedad comprende una enfermedad proliferativa, una afección precancerosa y una afección no relacionada con el cáncer asociada con la expresión de un antígeno tumoral. En un caso, la enfermedad asociada con la expresión de un antígeno tumoral es cáncer, por ejemplo, un cáncer descrito en el presente documento. En un caso, el cáncer es un tumor sólido, por ejemplo, un tumor sólido descrito en el presente documento, por ejemplo, mesotelioma (por ejemplo, mesotelioma pleural maligno), cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células escamosas o cáncer de pulmón de células grandes), cáncer de páncreas (por ejemplo, adenocarcinoma ductal de páncreas), cáncer de ovario, cáncer colorrectal y cáncer de vejiga o cualquier combinación de los mismos. En un caso, la enfermedad es cáncer de páncreas, por ejemplo, adenocarcinoma ductal de páncreas metastásico (PDA), por ejemplo, en un sujeto que ha progresado en al menos una terapia estándar previa. En un caso, la enfermedad es mesotelioma (por ejemplo, mesotelioma pleural maligno), por ejemplo, en un sujeto que ha progresado en al menos una terapia estándar previa. En un caso, la enfermedad es cáncer de ovario, por ejemplo, cáncer de ovario epitelial seroso, por ejemplo, en un sujeto que ha progresado después de al menos un régimen previo de terapia estándar.

En un caso, el cáncer se selecciona de glioblastoma multiforme (GBM), astrocitoma anaplásico, glioblastoma de células gigantes, gliosarcoma, oligodendroglioma anaplásico, ependimoma anaplásico, carcinoma del plexo coroideo, ganglioglioma anaplásico, pineoblastemoblantoma, meduloblastoma, tumor neuroectodérmico primitivo supratentorial y tumor teratoide/rabdoide atípico, carcinomas de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de pulmón, mama, próstata, ovario, colorrectal y vejiga.

En algunos casos, el cáncer es leucemia linfoide aguda de células B ("BALL"), leucemia linfoide aguda de células T ("TALL"), leucemia linfoide aguda (ALL), leucemia mielógena aguda (AML); una o más leucemias crónicas que incluyen, pero no se limitan a, leucemia mielógena crónica (CML), leucemia linfocítica crónica (CLL); cánceres hematológicos o afecciones hematológicas adicionales que incluyen, pero sin limitación, leucemia prolinfocítica de células B, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas, linfoma de Burkitt, linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular, leucemia de células pilosas, linfoma folicular de células pequeñas o de células grandes, afecciones linfoproliferativas malignas, linfoma MALT, linfoma de células del manto, linfoma de la zona marginal, mieloma múltiple, mielodisplasia y síndrome mielodisplásico, linfoma no Hodgkin, linfoma plasmablástico, neoplasma de células dendríticas plasmacitoides, macroglobulinemia de Waldenstrom.

En casos, la célula RCAR/NKR-CAR es una célula T autóloga. Por ejemplo, la célula RCAR/NKR-CAR es una célula T alogénica.

En casos, la célula RCAR/NKR-CAR se selecciona de: una célula NK autóloga; y una célula NK alogénica.

En casos, el sujeto es un ser humano.

En casos, el procedimiento comprende tratar al sujeto por cáncer.

En casos, el procedimiento comprende administrar una molécula de dimerización al sujeto. Por ejemplo, el RCAR/NKR-CAR comprende un conmutador de dimerización basado en FKBP-FRB, y el procedimiento comprende administrar una molécula de dimerización que comprende un inhibidor de mTOR, por ejemplo, RAD001.

En otro aspecto, en el presente documento también se muestra un procedimiento para proporcionar una célula RCAR/NKR-CAR descrito en el presente documento que comprende:

proporcionar una célula efectora inmunitaria a una entidad receptora; y

recibir de dicha entidad, una célula RCAR/NKR-CAR derivada de dicha célula efectora inmunitaria, o una célula hija de la misma, en la que RCAR/NKR-CAR comprende:

a) un CAR regulable (RCAR) y un NKR-CAR;

b) un ácido nucleico que codifica un RCAR y un NKR-CAR;

c) un primer ácido nucleico que codifica un RCAR y un segundo ácido nucleico que codifica un NKR-CAR; o d) un sistema de vectores que comprende un ácido nucleico que codifica un RCAR y un NKR-CAR o que comprende un primer ácido nucleico que codifica un RCAR y un segundo ácido nucleico que codifica un NKR-CAR.

En casos, la entidad insertó en dicha célula efectora inmunitaria o una célula hija de la misma, uno o las siguientes: a) un ácido nucleico que codifica un RCAR y un NKR-CAR; o b) un primer ácido nucleico que codifica un RCAR y un segundo ácido nucleico que codifica un NKR-CAR.

En casos, el procedimiento comprende además administrar dicho RCAR y dicho NKR-CAR a un sujeto.

En un aspecto, en el presente documento también se muestra un procedimiento para proporcionar una célula RCAR/NKR-CAR que comprende:

recibir de una entidad una célula efectora inmune de un ser humano; insertar en dicha célula efectora inmune o una célula hija de la misma uno de los siguientes: a) un ácido nucleico que codifica un RCAR y un NKR-CAR, o b) un primer ácido nucleico que codifica un RCAR y un segundo ácido nucleico que codifica un NKR-CAR, para formar una célula RCAR/NKR-Ca R; y, opcionalmente, proporcionar dicha célula RCa R/NKR-CAR a dicha entidad.

En un caso, la entidad es un laboratorio, hospital o proveedor de un hospital.

A menos que se indique lo contrario, cuando se describen en el presente documento miembros o elementos de un CAR, por ejemplo, RCAR, RNKR-CAR o NKR-CAR, el orden puede ser el indicado, pero también se incluyen otros órdenes. En otras palabras, en una realización, el orden es el que se establece en el texto, pero en otras realizaciones, el orden puede ser diferente.

Basado en la divulgación en el presente documento, se proporciona la invención tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Los dibujos se describen brevemente en primer lugar.

La figura 1 muestra las estructuras de un CAR estándar en comparación con un CAR regulable (RCAR).

La figura 2 representa RCAR que tienen una heterodimerización de FKBP/FRB inducida por un análogo de rapamicina. El dominio de unión a antígeno puede ser un scFv, por ejemplo, que reconoce EGFRvIII. El conmutador A y el conmutador B muestran los dominios del conmutador FKBP y FRB en diferentes orientaciones con respecto al miembro de unión a antígeno y al miembro de señalización intracelular.

La figura 3 representa un RCAR que tiene un conmutador de dimerización de GyrB inducido por cumermicina. El dominio de unión a antígeno puede ser un scFv, por ejemplo, que reconoce EGFRvIII. Los dominios de conmutación son subunidades de GyrB.

La figura 4 representa RCAR que tienen un conmutador de dimerización GAI/GID1 inducido por giberelina. El dominio de unión a antígeno puede ser un scFv, por ejemplo, que reconoce EGFRvIII. El conmutador A y el conmutador B muestran los dominios de conmutación gA i y G1D1 en diferentes orientaciones con respecto al miembro de unión a antígeno y al miembro de señalización intracelular.

La figura 5 representa un RCAR que tiene un conmutador extracelular inducido por un fármaco de molécula pequeña. El conmutador de dimerización extracelular puede ser un conmutador FKBP/FRB, un conmutador GyrB/GyrB o un conmutador GAI/G1D1.

La figura 6 representa RCAR que tienen conmutadores extracelulares inducidos por una molécula de anticuerpo, un armazón no de anticuerpo, o un polipéptido. En el sistema de RCAR de la izquierda, los dos dominios de conmutación de heterodimerización se unen mediante un anticuerpo específico dual. En el sistema RCAR de la derecha, dos miembros de señalización intracelular pueden unirse mediante un anticuerpo monoespecífico para iniciar la señalización de CAR.

La figura 7 representa un sistema RCAR dual, donde se pueden reconocer dos dianas diferentes (Diana A y Diana B).

La figura 8 proporciona células efectoras inmunes que se pueden diseñar para expresar RCAR.

La figura 9 representa un RCAR que comprende un miembro de unión a antígeno auxiliar, en el que el miembro de unión a antígeno auxiliar reconoce un segundo antígeno (por ejemplo, diana B) que es diferente del antígeno reconocido por el miembro de unión a antígeno que comprende un dominio de conmutación (por ejemplo, diana A). El miembro de unión al antígeno auxiliar no comprende un dominio de conmutación, y no se dimeriza con el miembro de señalización intracelular del RCAR.

La figura 10 representa RCAR que redirigen una vía inhibitoria.

La figura 11 representa RCAR que tienen elementos dependientes del contexto, donde el receptor conmutable puede ser un receptor coinhibidor conmutable redirigido, por ejemplo, cualquiera de los enumerados en la Tabla 4, o un receptor coestimulador, por ejemplo, cualquiera de los enumerados en la Tabla 5. Los pares óptimos de receptores coinhibidores o receptores coestimuladores y las dianas pueden depender de los tipos de cáncer, etapas del cáncer, tipos de donantes, etc.

Las figuras 12A y 12B representan la activación como se observa con las células RCAR que expresan construcciones de RCAR, tal como se muestra en la figura 2. Se utilizó un CART EGFRvIII estándar para el control positivo. Los RCAR se incubaron sin una molécula de heterodimerización (sin HD) o con una molécula de heterodimerización 500 nM (HD), donde la molécula de heterodimerización fue AP21967 (Figura 12A). Se realizó un ensayo de respuesta a la dosis usando concentraciones variables de la molécula de heterodimerización heterodimerizador A/C (figura 12B). Los RCAR probados contenían un dominio scFv que reconocía EGFRvIII (barra izquierda en cada conjunto) o IgG1 para el control (barra derecha en cada conjunto).

La figura 13 representa RCAR que tienen un conmutador de dimerización de etiqueta de halo/snap. El dominio de unión al antígeno puede ser un scFv, por ejemplo, que reconoce EGFRvIII. El conmutador A y el conmutador B muestran los dominios de conmutación de etiqueta Halo y etiqueta Snap en diferentes orientaciones con respecto al miembro de unión al antígeno y al miembro de señalización intracelular.

Las figuras 14A y 14B representan una activación por anticuerpos solubles y una activación por anticuerpos solubles 2° anticuerpos (conmutadores de dimerización de segundo orden).

La figura 15 representa un RCAR que tiene un conmutador extracelular y una molécula de dimerización multivalente. Las figuras 16A, 16B, 16C, 16D y 16E representan vectores para expresar un RCAR.

Las figuras 17A y 17B representan la activación de un CAR de PD1 y un RCAR de PD1. La figura 17A muestra los resultados de una actividad luciferasa impulsada por un promotor inducible por NFAT de un CAR de PD1 en comparación con el tratamiento de control por IgG1-Fc. La figura 17B muestra los resultados de una actividad luciferasa impulsada por un promotor inducible por NFAT de un RCAR de PD1 que incluye PD1-ECD-TC-FRB y FKBP-41BB-CD3 zeta en comparación con el tratamiento de control con IgG1-Fc.

La figura 18 demuestra una respuesta a la dosis con el tratamiento de AP21967. La barra de la izquierda para cada dosis probada es el RCAR de PD1, mientras que la barra de la derecha para cada dosis probada es el control de CAR de PD1.

La figura 19, la actividad de un RCAR que tiene un conmutador extracelular basado en FKBP-FRB, por ejemplo, como se muestra en la figura 5.

Las figuras 20A y 20B muestran la actividad de un RCAR que tiene un conmutador intracelular basado en GyrB-GyrB, por ejemplo, como se muestra en la figura 3.

Las figuras 21A y 21B muestran la actividad de un RCAR que tiene un conmutador intracelular basado en GAI-GID1, por ejemplo, como se muestra en la figura 4.

La figura 22 representa la disposición de los elementos RCAR en un único vector de ácido nucleico. Las construcciones 143774 y 143775 utilizan diferentes IRES (por ejemplo, IRES EV71 o IRES EMCV) entre el miembro de unión a antígeno (por ejemplo, scFv unido a FKBP) y el miembro de unión intracelular (por ejemplo, FRB unido a 41BB/CD3zeta). Las construcciones 143776 y 143777 utilizan dos promotores diferentes (por ejemplo, CMV min o EF1 min) entre el miembro de unión a antígeno (por ejemplo, scFv unido a FKBP) y el miembro de unión intracelular (por ejemplo, FRB unido a 41BB/CD3zeta).

La figura 23 muestra la actividad de RCAR de RCAR codificados por un solo vector, donde la disposición de los vectores individuales se muestra en la figura 22.

Las figuras 24A y 24B muestran la activación de un RCAR de CD19 por diferentes moléculas de heterodimerización, RAD001 (figura 24A) o rapamicina (figura 24B) a las concentraciones nM indicadas. El RCAR está codificado por la construcción 143775, tal como se muestra en la figura 22.

Las figuras 25A y 25B muestran la activación de un RCAR de CD19 por diferentes moléculas de heterodimerización, RAD001 (figura24A) o rapamicina (figura 24B) a las concentraciones nM indicadas. El RCAR está codificado por la construcción 143775, tal como se muestra en la figura 22.

La figura 26 representa una mitad de la estructura de RCAR que tiene un dominio de señalización coestimulador en el miembro de unión al antígeno. El dominio de señalización coestimulador puede ser cualquiera de los enumerados o de la Tabla 2.

La figura 27 es una representación gráfica de la unión de FRAP con RAD001. El área punteada representa el bolsillo que se une a RAD001. Los residuos que se encuentran en las proximidades de RAD001 o median la interacción con RAD001 están marcados con un círculo y la posición del aminoácido en FRAP.

L a f ig u ra 28 m u e s tra la d is tr ib u c ió n d e a m in o á c id o s d e la b ib lio te c a N K K u til iz a d a p a ra g e n e ra r b ib lio te c a s d e m u ta n te s d e F R B . L o s d ife re n te s a m in o á c id o s s e e n u m e ra n e n e l e je x , y e l p o rc e n ta je r e p re s e n ta d o e n la b ib lio te c a s e m u e s tra e n e l e je y.

L a s f ig u ra s 29 A y 29 B m u e s tra n lo s re s u lta d o s d e la e x p re s ió n d e p ro te ín a s d e c a d a u n a d e la s d ife re n te s b ib lio te c a s d e F R B m u ta n te s . L a s 11 d ife re n te s b ib lio te c a s d e F R B m u ta n te s s e e n u m e ra n e n e l e je x . E n la f ig u ra 29 A , e l e je y m u e s tra e l p o rc e n ta je d e p o c il lo s q u e e x p re s a n e l F R B m u ta n te . E n la f ig u ra 29 B , e l e je y m u e s tra la c o n c e n tra c ió n d e p ro te ín a p ro m e d ia d e te rm in a d a p a ra c a d a b ib lio te c a .

L a s f ig u ra s 30 A , 30 B , 30 C , 30 D y 30 E m u e s tra n la s c u rv a s d e u n ió n p a ra e l e n s a y o d e u n ió n c o m p e t it iv a d e E C 50 p a ra m u ta n te s d e F R B : E 2032 L ( f ig u ra 30 A ), E 2032 I ( f ig u ra 30 B ), T 2098 L ( f ig u ra 30 C ), E 2032 L , T 2098 L ( f ig u ra 30 D ) y E 2032 I, T 2098 L ( f ig u ra 30 E ).

L a s f ig u ra s 31 A , 31 B , y 31 C m u e s tra n la s c u rv a s d e u n ió n p a ra e l e n s a y o d e u n ió n d ire c ta d e E C 50 p a ra m u ta n te s d e fR B : E 2032 L ( f ig u ra 31 A ), E 2032 I ( f ig u ra 31 B ) y T 2098 L ( f ig u ra 31 C ).

L a f ig u ra 32 re p re s e n ta e l k n o c k d o w n d e P D 1 h u m a n o a la s 24 , 48 y 72 h o ra s , p o r la s s e c u e n c ia s d e s h A R N d e PD 1 h u m a n o in d ic a d a s en e l e je x . E l k n o c k d o w n e s tá re p re s e n ta d o p o r e l p o rc e n ta je d e tra n s c r ip c ió n d e P D 1 re s ta n te (e je y). L a s s e c u e n c ia s d e s h A R N d e P D 1 h u m a n o s e p ro p o rc io n a n e n la T a b la 19.

L a f ig u ra 33 re p re s e n ta e l k n o c k d o w n d e P D 1 d e ra tó n a la s 24 y 48 h o ra s , p o r la s s e c u e n c ia s d e s h A R N d e P D 1 d e ra tó n in d ic a d a s en e l e je x. E l k n o c k d o w n e s tá re p re s e n ta d o p o r e l p o rc e n ta je d e tra n s c r ip c ió n d e P D 1 re s ta n te (e je y ). L a s s e c u e n c ia s d e s h A R N d e P D 1 d e ra tó n s e p ro p o rc io n a n en la T a b la 18.

L a s f ig u ra s 34 A y 34 B s o n re p re s e n ta c io n e s e s q u e m á t ic a s d e v a r ia s c o n s tru c c io n e s d e R C A R c o n c o n m u ta d o re s e x tra c e lu la re s e v a lu a d o s e n la f ig u ra 35. L o s m e d io s R C A R c o n e l c o n m u ta d o r e x t ra c e lu la r s e m u e s tra n e n la f ig u ra 34 B , co n lo s d o m in io s d e c o n m u ta c ió n F K B P y F R B en d o s o r ie n ta c io n e s d ife re n te s . L o s c o n m u ta d o re s c o m p le to s d e R C A R c o m p le to c o n e l c o n m u ta d o r e x t ra c e lu la r s e m u e s tra n en la f ig u ra 34 B , c o n lo s d o m in io s d e c o n m u ta c ió n F K B P y F R B e n d o s o r ie n ta c io n e s d ife re n te s .

L a s f ig u ra s 35 A , 35 B , 35 C y 35 D m u e s tra n la a c t iv a c ió n d e la s c o n s tru c c io n e s d e m e d io c o n m u ta d o r d e R C A R d e la s f ig u ra s 34 A y 34 B co n c o n c e n tra c io n e s v a r ia b le s d e R A D 001. L a s f ig u ra s 35 A y 35 B m u e s tra n lo s re s u lta d o s de la a c t iv a c ió n d e l m e d io c o n m u ta d o r d e R C A R c o n lo s d o m in io s d e l c o n m u ta c ió n en a m b a s o r ie n ta c io n e s . L a s f ig u ra s 35 C y 35 D m u e s tra n lo s re s u lta d o s d e la a c t iv a c ió n d e l c o n m u ta d o r c o m p le to d e R C A R c o n lo s d o m in io s d e l c o n m u ta c ió n en a m b a s o r ie n ta c io n e s . La a c t iv a c ió n d e N F A T e s tá re p re s e n ta d a p o r la lu m in is c e n c ia d e te c ta d a p o r L u c ife ra s a O n e G lo (e je y ) y la s d ife re n te s c o n c e n tra c io n e s d e R A D 001 s e e n u m e ra n e n e l e je x.

L a s f ig u ra s 36 A y 36 B m u e s tra n la s c o n s tru c c io n e s d e m e d io R C A R c o n un c o n m u ta d o r in tra c e lu la r . La f ig u ra 36 A m u e s tra u n a re p re s e n ta c ió n e s q u e m á t ic a d e la s c o n s tru c c io n e s d e m e d io R C A R . L a f ig u ra 36 B m u e s tra la a c t iv a c ió n d e la m ita d d e R C A R c o n d ife re n te s d o m in io s d e s e ñ a liz a c ió n c o e s t im u la d o re s e n p re s e n c ia o a u s e n c ia d e R A D 001. L a s f ig u ra s 37 A y 37 B m u e s tra n la a c t iv a c ió n d e d o s c o n s tru c c io n e s d e m e d io R C A R c o n c o n c e n tra c io n e s v a r ia b le s d e R A D 001. L a a c t iv a c ió n d e la m ita d d e R C A R c o n un d o m in io d e s e ñ a liz a c ió n c o e s t im u la d o r d e C D 28 s e m u e s tra en la f ig u ra 37 A . L a a c t iv a c ió n d e la m ita d d e R C A R c o n un d o m in io d e s e ñ a liz a c ió n c o e s t im u la d o r d e 41 B B se m u e s tra en la f ig u ra 37 B . La a c t iv a c ió n d e N F A T e s tá re p re s e n ta d a p o r la lu m in is c e n c ia d e te c ta d a p o r L u c ife ra s a O n e G lo (e je y ) y la s d ife re n te s c o n c e n tra c io n e s d e R A D 001 s e e n u m e ra n en e l e je x.

L a f ig u ra 38 e s un p a n e l d e im á g e n e s q u e m u e s tra la e x p re s ió n d e la m ita d d e R C A R en c é lu la s T p r im a r ia s t r a n s d u c id a s . L o s n ú m e ro s in d ic a n e l p o rc e n ta je d e c é lu la s T p o s it iv a s d e la m ita d d e R C A R (% ) y la in te n s id a d d e f lu o re s c e n c ia m e d ia d e la p o b la c ió n p o s it iv a d e C A R (103 G e o M e a n ).

L a f ig u ra 39 m u e s tra la c ito to x ic id a d d e la m ita d d e R C A R q u e e x p re s a c é lu la s T t ra n s d u c id a s . L o s R C A R T se c u lt iv a ro n c o n c é lu la s N a lm 6 q u e e x p re s a n lu c ife ra s a e n p re s e n c ia d e d ife re n te s c o n c e n tra c io n e s d e R A D 001. L a f ig u ra 40 m u e s tra la p ro li fe ra c ió n d e la m ita d d e R C A R q u e e x p re s a n c é lu la s T tra n s d u c id a s . L o s R C A R T se c u lt iv a ro n co n c é lu la s N a lm 6 en p re s e n c ia d e d ife re n te s c o n c e n tra c io n e s d e R A D 001. S e e v a lu ó e l n ú m e ro d e c é lu la s T p o s it iv a s p a ra C D 3 p o s it iv a s p a ra R C A R d e s p u é s d e 4 d ía s d e c o c u lt iv o .

L a f ig u ra 41 m u e s tra la s e c re c ió n d e IF N y p o r C A R q u e e x p re s a n c é lu la s T tra n s d u c id a s . L o s C A R T se c u lt iv a ro n c o n c é lu la s N a lm 6 en p re s e n c ia d e d ife re n te s c o n c e n tra c io n e s d e R A D 001. La c o n c e n tra c ió n d e IF N y en el s o b re n a d a n te d e l c u lt iv o c e lu la r s e d e te rm in ó d e s p u é s d e 20 h d e c o c u lt iv o .

L a f ig u ra 42 m u e s tra la a c t iv a c ió n d e R C A R c o n un c o n m u ta d o r c o v a le n te d e e t iq u e ta h a lo /s n a p . L a a c t iv a c ió n d e N F A T e s tá re p re s e n ta d a p o r la lu m in is c e n c ia d e te c ta d a p o r L u c ife ra s e O n e G lo (e je y ) y la s d ife re n te s c o n c e n tra c io n e s d e N V P -H A L 421 s e e n u m e ra n e n e l e je x.

L a f ig u ra 43 m u e s tra la a c t iv a c ió n d e R C A R c o n un c o n m u ta d o r c o v a le n te d e e t iq u e ta h a lo /s n a p e n p re s e n c ia d e las c o n c e n tra c io n e s in d ic a d a s d e N V P -H A L 421. La a c t iv a c ió n d e N F A T e s tá re p re s e n ta d a p o r la lu m in is c e n c ia d e te c ta d a p o r L u c ife ra s e O n e G lo (e je y ) y la s d ife re n te s c o n c e n tra c io n e s d e N V P -H A L 421 s e e n u m e ra n e n e l e je x. L a f ig u ra 44 m u e s tra u n a c o n s tru c c ió n d e d o b le m ita d d e R C A R , d o n d e d o s d o m in io s d e s e ñ a liz a c ió n c o e s t im u la d o re s e s tá n p re s e n te s e n e l m ie m b ro d e u n ió n a a n tíg e n o .

L a f ig u ra 45 m u e s tra u n a c o n s tru c c ió n C A R u n iv e rs a l q u e c o m p re n d e un c o n m u ta d o r d e d im e r iz a c ió n e x tra c e lu la r , d o n d e e l m ie m b ro d e u n ió n a l a n tíg e n o c o m p re n d e un d o m in io d e c o n m u ta c ió n , p e ro no c o m p re n d e un d o m in io t ra n s m e m b ra n a o un a n c la d e m e m b ra n a .

L a f ig u ra 46 m u e s tra la e s t ru c tu ra d e un R C A R q u e c o m p re n d e un m ie m b ro d e u n ió n a a n t íg e n o q u e c o m p re n d e un d o m in io d e u n ió n a a n tíg e n o (s c F v ) , un d o m in io t r a n s m e m b ra n a (T m ) y un p r im e r d o m in io d e c o n m u ta c ió n , y un m ie m b ro d e s e ñ a liz a c ió n in t ra c e lu la r q u e c o m p re n d e un d o m in io t ra n s m e m b ra n a (T m ), un s e g u n d o d o m in io d e c o n m u ta c ió n , un d o m in io d e s e ñ a liz a c ió n c o e s t im u la d o r (41 B B )

y un d o m in io d e s e ñ a liz a c ió n in tra c e lu la r p r im a r io (C D 3 z e ta ) .

L a s f ig u ra s 47 A y 47 B m u e s tra n d o s e s tru c tu ra s d e R C A R q u e c o m p re n d e n un c o n m u ta d o r m ú ltip le . E n la f ig u ra La figura 62 es un panel de imágenes que muestra que la expresión de un TCR endógeno no se ve afectada por la expresión de SS1-KIRS2 y DAP12. 5x10⁶células T humanas primarias se sometieron a electroporación con 10 ug de a Rn transcrito in vitro que codifica SS1-KIRS2 o se transfectaron de manera simulada utilizando un electroporador BTX ECM830. Después de la incubación durante la noche, las células T transfectadas se tiñeron para la expresión de SS1-KIRS2 usando un anticuerpo policlonal específico de F(ab)2 de cabra anti-ratón biotinilado seguido de estreptavidina-PE. La expresión de Vp13.1 se evaluó usando un anticuerpo monoclonal conjugado con PE específico para esta cadena Vp del TCR.

La figura 63 es un conjunto de gráficos que ilustran la capacidad de un CAR basado en KIR específico de mesotelina (SS1-KIRS2) para estimular la proliferación de células T que es dependiente de antígeno, pero independiente de la coestimulación adicional de CD28. Se estimularon células T humanas primarias con microperlas de CD3/28, seguido de transducción lentiviral de SS1-KIRS2 y DAP12 o el CAR TCR-zeta específico de mesotelina (SS1-zeta). Se utilizaron células no transducidas simuladas (NTD) como control negativo. Las células diana K562 sin mesotelina (K562 wt) o que expresan mesotelina (K562-mesotelina) se mezclaron con las diferentes condiciones de las células T, tal como se indica en una relación 2:1 de células T con respecto a células diana. Las células T estimuladas con mesotelina-K562 se dividieron además en una condición con o sin un anticuerpo agonista anti-CD28 monoclonal (clon 9,3) en 1 ug/ml. Se enumero el número de las células T viables mediante citometría de flujo usando el recuento basado en perlas en puntos del tiempo indicados para calcular el número de duplicaciones de la población después de la estimulación de antígeno.

La figura 64, que comprende las figuras 64A-64E, son un conjunto de imágenes que demuestran que las células T modificadas con KIR-CAR específicas de mesotelina muestran una actividad antitumoral mejorada in vivo en comparación con los CAR basados en TCR- ^de segunda generación que llevan dominios coestimuladores CD28 o CD137 (4-1BB). La figura 64A muestra un experimento en el que ratones NOD-SCID-y^c^ (NSG) fueron implantados subcutáneamente con 2x10⁶células derivadas de mesotelioma que expresan mesotelina (células EM-meso). 20 días después de la implantación del tumor, a cada animal se inyectaron por vía intravenosa 5x10⁶células T que fueron estimuladas con perlas estimuladoras anti-CD3/anti-CD28 seguido de la transducción lentiviral con una serie de CAR basado en CD3 ^ con o sin un dominio coestimulador (SS1-£, SS1-BB ^y 331-28 )^ o los CAR basados en KIR específicos de mesotelina, SS1-KIRS2 con DAP12. Se utilizaron células T transducidas simuladas (NTD) como control. El volumen del tumor se midió mediante calibre en los tiempos indicados (n = 7 ratones por grupo). La figura 64B muestra que la actividad in vivo del KIR-CAR es independiente del injerto de células T en sangre, bazo o tumor. La frecuencia de células T CD45+ humanas se evaluó al final del experimento mediante citometría de flujo, y los datos se expresan como un porcentaje del total de células viables en la sangre, el bazo y el digesto tumoral. La figura 64C muestra frecuencias comparables de TIL CD3+ que se observaron en los grupos tratados con células T CAR 331-28 ^y SS1-KIRS2/DAP12. Se utilizó el mismo modelo que el mostrado en la figura 64A. La frecuencia de linfocitos humanos CD3+ en tumores el día 30 (10 días después de la infusión de CAR T) se evaluó mediante citometría de flujo. La figura 64D muestra que las células T modificadas con DAP12 requieren el CAR basado en KIR específico de mesotelina para la erradicación del tumor. Se utilizó el mismo modelo que el mostrado en la figura 64A. Se inyectaron 4 millones de células T que expresan DAP12 y dsRed (DAP12), SS1-28z o SS1-KIRS2 y DAP12 (SS1-KIRS2) por vía intravenosa el día 20, y se evaluó el volumen del tumor a lo largo del tiempo mediante una medición con calibre. La flecha indica el tiempo de aislamiento de TIL utilizado para el análisis funcional y fenotípico. La figura 64E muestra la actividad citotóxica específica de antígeno de los TIL aislados de los ratones descritos en la figura 64D. La citotoxicidad específica de antígeno se evaluó mediante el cultivo conjunto con las células Em-meso o las células EMp que expresan luciferasa de luciérnaga (células EM parentales que carecen de expresión de mesotelina) en proporciones E:T indicadas durante 18 horas.

La figura 65 que comprende las figuras 65A-65B, son un conjunto de imágenes que demuestran que un CAR basado en KIR con especificidad de CD19 puede desencadenar citotoxicidad de células diana específicas de antígeno. Después de la activación de perlas anti-CD3/anti-CD28, las células T se transdujeron con un vector lentiviral bicistrónico que expresa DAP12 junto con un CAR basado en KIR específico de CD19 en el que el scFv derivado de FMC63 se fusiona con KIR2DS2 de longitud completa (CD19-KIR2DS2) o un CAR basado en KIR generado mediante la fusión del scFv de FMC63 con el dominio transmembrana y citoplasmático de KIR2DS2 mediante un enlazador corto [Gly]⁴-Ser enlazador (CD19-KIRS2). Las células T transducidas se cultivaron hasta el final del crecimiento en la fase logarítmica, y la expresión del CAR basado en KIR específico de CD19 se evaluó mediante citometría de flujo utilizando un anticuerpo policlonal F(ab)²de cabra anti-ratón biotinilado seguido de SA-PE. Se mezclaron células diana K562 marcadas con ⁵¹Cr con expresión de CD19 (K562-CD19) o sin expresión de CD19 (K562-wt) en proporciones variables con células T con respecto a células diana (proporción E:T). La citotoxicidad se determinó midiendo la fracción de ⁵¹Cr liberada en el sobrenadante a las 4 horas. Las células T de control que fueron traducidas de modod simulado (NTD) o transducidas con un CAR especifico basado en CD3 êspecífico para CD19 (CD19-z) también se incluyeron como controles negativos y positivos, respectivamente.

La figura 66 que comprende las figuras 66A-66B muestra la actividad de CD19-KIRS2 in vivo. Se injertaron NOD-SCID-y^c^NSG) de ratón por vía intravenosa en la vena de la cola el día 0 con 1 millón de células tumorales Nalm-6 CBG, una línea celular de leucemia que expresa CD19. Las células T se estimularon con perlas estimuladoras anti-CD3/anti-CD28 seguidas de transducción lentiviral el día 1 con una serie de CAR basado en CD3 êspecífico de CD19 con o sin un dominio coestimulador (CD19z, 19BBz) o los CAR basados en KIR específicos de ^cD19, CD19-KIRS2 con DAP12 (19KIRS2). Se utilizaron células T no transducidas simuladas (NTD) como control. Las células T se expandieron hasta el final del crecimiento en fase logarítmica ex vivo y se inyectaron por vía intravenosa el día 5 después de la inyección de la línea celular leucémica con 2 millones de células T CAR por ratón. La carga tumoral se evaluó mediante imágenes bioluminiscentes. Se analizaron 5 animales para cada condición de células T. La figura 66A muestra el flujo de fotones bioluminiscentes individuales para animales individuales el día 5 (línea de referencia antes de la inyección de células T) y el día 15 después de la injerto de células leucémicas. La figura 66B muestra la media del flujo total para cada grupo de tratamiento a lo largo del tiempo.

La figura 67, que comprende las figuras 67A y 67B, son un conjunto de gráficos que demuestran que un NCR CAR basado en NKp46 con especificidad de mesotelina desencadena citotoxicidad específica del antígeno. Después de la activación de perlas anti-CD3/anti-CD28, las células T se transdujeron con un vector lentiviral bicistrónico que expresa DAP12 y SS1-KIRS2 (control), o FceRy y un CAR basado en NKp46 específico de mesotelina (SS1-NKp46) o FceRy y un CAR NKp46 específico de mesotelina en el que el dominio extracelular NKp46 natural estaba truncado (SS1-TNKp46). La expresión de los CAR específicos de mesotelina se evaluó mediante la citometría de flujo usando un anticuerpo policlonal F(ab)2 de cabra anti-ratón biotinilado seguido de SA-PE, tal como se muestra en la figura 67A. Las células T se mezclaron con células diana K562 marcadas con 51Cr que expresan mesotelina en proporciones variables de células T efectoras con respecto a células K562 diana (relación E:T). La citotoxicidad se determino mediante la medición de la fracción de 51Cr liberada en el sobrenadante a las 4 horas en comparación con la liberación espontánea que se muestra en la figura 67B.

La figura 68 muestra una representación esquemática de los receptores usados en los Experimentos mostrados en las figuras 70-72.

La figura 69 es un conjunto de imágenes que demuestra la generación y la caracterización de una línea celular K562-meso que expresa el ligando de KIR2DL3 HLA-Cw. Las células K562 (K562) o las células K562 que expresan mesotelina (K562-meso) se transdujeron con el alelo HLA-Cw3 seguido de la clasificación de células activadas por fluorescencia para obtener células K562 que expresan HLA-Cw con expresión de mesotelina (K562-meso-HLACw) o sin expresión de mesotelina (K562-HLACw). La expresión de HLA-Cw3 se evaluó mediante citometría de flujo utilizando un anticuerpo monoclonal conjugado con ^aP^cque reconoce los alelos HLA-A, B y C (clon W6/32).

La figura 70 es un conjunto de imágenes que demuestran la coexpresión de SS1-KIRS2 y KIR2DL3 en células T humanas primarias. Las células T humanas primarias se estimularon con microperlas de CD3/28 seguido de transducción lentiviral con SS1-KIRS2 y DAP12 (SS1-KIRS2) o transducción simulada (NTD) en combinación con KIR2DL3 de tipo salvaje. Las células T se expandieron hasta el final del crecimiento en fase logarítmica. La expresión en superficie del CAR específico de mesotelina y KIR2DL3 se determinó mediante tinción con mesotelina-Fc seguida de Fc antihumano de cabra conjugado con PE y un anticuerpo monoclonal del ectodominio KIR2DL3. La figura 71 es un conjunto de gráficos que demuestran que KIR2DL3 expresado conjuntamente con un KIR CAR puede suprimir la citotoxicidad específica de antígeno en presencia de HLA-Cw en las células diana. Las células T que se generaron y se caracterizaron como se describe en la figura 70 se mezclaron con células K562 diana marcadas con 51-Cr que se generaron y se caracterizaron como se describe en la figura 71. La citotoxicidad se determinó midiendo la fracción de51Cr liberada en el sobrenadante a las 4 horas en comparación con las células diana sin células efectoras.

La figura 72 muestra una representación esquemática de los receptores usados en los Experimentos mostrados en la figura 73.

La figura 73 es un conjunto de imágenes que demuestran la incapacidad de expresar conjuntamente dos receptores quiméricos basados en scFv en la superficie de la célula T, mientras se retiene la respectiva especificidad de unión de cada receptor. Las células T Jurkat se transdujeron usando un vector lentiviral que codifica SS1-KIR2DL3. Estas células se transdujeron posteriormente con un segundo vector lentiviral que codifica CD19-KIR2DS2 a diferentes diluciones del vector. La expresión del scFv específico de SS1 se evaluó usando mesotelina-Fc seguida de Fc de cabra anti-humano conjugado con PE. La expresión de scFv específica de CD19 se evaluó usando un anticuerpo monoclonal conjugado con PE específico para el idiotipo FMC63.

La figura 74 es un panel de imágenes que demuestra que la expresión de un CAR específico de CD19 también redujo la expresión de los sitios de unión a mesotelina en la superficie de las células que expresan de manera conjunta un CAR de fusión SS1-zeta-mCherry. Las células T humanas primarias se estimularon con microperlas anti-CD3/28 seguido de transducción lentiviral con SS1 scFv zeta CAR que lleva una fusión mCherry C-terminal (SS1z-mCh) o el CAR 41BB-zeta específico de CD19 derivado de FMC63 (19bbz) solo o en combinación. Para el control se utilizaron células transducidas simuladas. Las células T se expandieron hasta el final del crecimiento en fase logarítmica y se determinó la expresión tanto de dsRed como de CAR en superficie mediante la citometría de flujo después de teñir con mesotelina-Fc seguida de un anticuerpo policlonal específico Fc de cabra anti humano conjugado con FITC.

La figura 75 es un panel de imágenes que demuestran que la expresión excluyente mutuamente de los sitios de unión para el scFv de SS1 no es exclusiva para el scFv de FMC63. Se estimularon células T humanas primarias con microperlas de CD3/28 seguido de transducción lentiviral con un CAR scFv zeta de SS1 o varios CAR 41BB-zeta específicos de CD19 (19BBz [FMC63 scFv, 214d scFv o los CARs BL22 scFv con orientaciones alternas VH y VL [H2L y L2H]). NTD representa células transducidas simuladas utilizadas como control de tinción. Además, un conjunto separado de células T se transdujo conjuntamente con el CAR scFv zeta de SS1 y los diferentes CAR específicos de CD19 como se ha mencionado anteriormente. Las células T se expandieron hasta el final del crecimiento en fase logarítmica, y la expresión de CAR en superficie se determinó mediante tinción con proteína L biotinilada (reconoce la cadena ligera kappa) seguida de estreptavidina APC simultáneamente con mesotelina-Fc, seguida de un anticuerpo policlonal específico de Fc de cabra anti humano conjugado con PE. Las células transducidas de manera conjunta mostraron que la expresión excluyente mutuamente observada con CAR basado en FMC63 también se observa con otros scFv-CAR.

L a f ig u ra 76 , q u e c o m p re n d e la s f ig u ra s 76 A -76 B , re p re s e n ta n e l m e c a n is m o p u ta t iv o p a ra la p é rd id a d e u n ió n a s c F v c u a n d o d o s m o lé c u la s d e s c F v se e x p re s a n d e m a n e ra c o n ju n ta en la s u p e r f ic ie c e lu la r ( f ig u ra 76 A ) y la s u p u e s ta e v ita c ió n d e e s ta in te ra c c ió n c u a n d o un C A R b a s a d o e n e l d o m in io V H H ú n ic o d e c a m é lid o s e e x p re s a en s u p e r f ic ie d e la c é lu la T e n c o m b in a c ió n c o n un C A R b a s a d o e n s c F v .

L a f ig u ra 77 e s un p a n e l d e im á g e n e s q u e d e m u e s tra q u e un C A R b a s a d o e n e l d o m in io V H H ú n ic o d e un c a m é lid o p u e d e e x p re s a rs e en la s u p e r f ic ie d e u n a c é lu la T en c o m b in a c ió n c o n un C A R b a s a d o en s c F v s in u n a in te ra c c ió n a p re c ia b le d e l re c e p to r . S e t ra n s d u je ro n c é lu la s T J u rk a t q u e e x p re s a n G F P b a jo un p ro m o to r d e p e n d ie n te d e N F A T ( N f -G F P ) c o n un C A R a c t iv a d o r e s p e c íf ic o d e m e s o te lin a (S S 1 -C A R ) , a c t iv a d o r e s p e c íf ic o d e C D 19 (19 -C A R ) o un C A R g e n e ra d o u s a n d o un d o m in io V H H d e c a m é lid o e s p e c íf ic o p a ra E G F R (V H H -C A R ) . D e s p u é s d e la tra n s d u c c ió n c o n e l C A R a c tiv a d o r , la s c é lu la s se t ra n s d u je ro n a c o n t in u a c ió n c o n un C A R in h ib id o r a d ic io n a l q u e re c o n o c e C D 19 (19 -P D 1 ) p a ra g e n e ra r c é lu la s q u e e x p re s a n d e m a n e ra c o n ju n ta ta n to e l C A R a c t iv a d o r c o m o e l in h ib id o r (S S 1 19 P D 1 , 19 19 P D 1 o V H H 19 P D 1 ) . L a s c é lu la s T J u rk a t t r a n s d u c id a s s e c u lt iv a ro n c o n ju n ta m e n te d u ra n te 24 h o ra s co n d ife re n te s lín e a s c e lu la re s q u e so n 1) c a re n te s d e to d o s lo s a n tíg e n o s d ia n a (K 562 ), 2 ) e x p re s a n m e s o te lin a (K -m e s o ) , C D 19 (K -19 ) o E G F r (A 431 ) s o la m e n te , 3 ) e x p re s a n u n a c o m b in a c ió n d e E G F R y m e s o te lin a (A 431 -m e s o te lin a ) o C D 19 (A 431 -C D 19 ) o 4 ) e x p re s a n u n a c o m b in a c ió n d e C D 19 y m e s o te lin a (K -19 /m e s o ) . L a s c o n d ic io n e s a d ic io n a le s q u e in c lu y e n c é lu la s no e s t im u la n te s (s in e s t im u la c ió n ) o K 562 co n 1 u g /m L d e O K T 3 (O K T 3 ) ta m b ié n s e in c lu y e ro n c o m o c o n tro le s n e g a t iv o s y p o s it iv o s p a ra la a c t iv a c ió n d e N F A T , re s p e c t iv a m e n te . La e x p re s ió n d e G F P , c o m o m a rc a d o r d e a c t iv a c ió n d e N F A T , s e e v a lu ó m e d ia n te c ito m e tr ía d e f lu jo .

L a f ig u ra 78 m u e s tra u n a A n o ta c ió n d e S e c u e n c ia K IR 2 D S 2 (S E Q ID N O : 219 p a ra la s e c u e n c ia d e á c id o n u c le ic o m o s tra d a ; S E Q ID N O : 220 p a ra la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o m o s tra d a ).

L a f ig u ra 79 m u e s tra u n a A n o ta c ió n d e S e c u e n c ia K IR 2 D L 3 (S E Q ID N O : 221 p a ra la s e c u e n c ia d e á c id o n u c le ic o m o s tra d a ; S E Q ID N O : 222 p a ra la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o m o s tra d a ).

L a f ig u ra 80 m u e s tra u n a A n o ta c ió n d e S e c u e n c ia N K p 46 (S E Q ID N O : 223 p a ra la s e c u e n c ia d e á c id o n u c le ic o m o s tra d a ; S E Q ID N O : 224 p a ra la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o m o s tra d a ).

L a f ig u ra 81 m u e s tra u n a A n o ta c ió n d e S e c u e n c ia S S 1 -K IR S 2 (S E Q ID N O : 225 p a ra la s e c u e n c ia d e á c id o n u c le ic o m o s tra d a ; S E Q ID N O : 226 p a ra la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o m o s tra d a ).

L a f ig u ra 82 m u e s tra u n a A n o ta c ió n d e S e c u e n c ia S S 1 -K IR 2 D S 2 (S E Q ID N O : 227 p a ra la s e c u e n c ia d e á c id o n u c le ic o m o s tra d a ; S E Q ID N O : 228 p a ra la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o m o s tra d a ).

L a f ig u ra 83 m u e s tra u n a A n o ta c ió n d e S e c u e n c ia S S 1 - tN K p 46 (S E Q ID N O : 229 p a ra la s e c u e n c ia d e á c id o n u c le ic o m o s tra d a ; S E Q ID N O : 230 p a ra la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o m o s tra d a ).

L a f ig u ra 84 m u e s tra u n a A n o ta c ió n d e S e c u e n c ia S S 1 -K IR L 3 (S E Q ID N O : 231 p a ra la s e c u e n c ia d e á c id o n u c le ic o m o s tra d a ; S E Q ID N O : 232 p a ra la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o m o s tra d a ).

L a f ig u ra 85 e s un p a r d e g rá f ic o s q u e m u e s tra n q u e lo s C A R s b a s a d o s en K IR y C D 3 ê s p e c íf ic o s d e m e s o te lin a t ie n e n u n a c ito to x ic id a d in v it ro e s p e c íf ic a d e a n tíg e n o s im ila r h a c ia la s c é lu la s d e r iv a d a s d e m e s o te lio m a q u e e x p re s a n m e s o te lin a ( c é lu la s E M -m e s o ) . L a s c é lu la s T h u m a n a s p r im a r ia s se e s t im u la ro n co n p e r la s e s t im u la n te s a n t i-C D 3 /C D 28 y se t ra n s d u je ro n co n un v e c to r le n t iv ira l q u e e x p re s a e l C A R e s p e c íf ic o d e m e s o te lin a S S 1 -K IR S 2. D e s p u é s d e la e x p a n s ió n , la s c é lu la s T se m e z c la ro n c o n la s c é lu la s K 562 m a rc a d a s c o n 51C r q u e e x p re s a n E M m e s o e n la re la c ió n e fe c to r /d ia n a in d ic a d a (E :T ) . S e d e te rm in ó e l % d e lis is .

L a f ig u ra 86 e s u n p a r d e g rá f ic o s q u e m u e s tra n q u e lo s T IL d e 28 C^ A R T t r a ta d o s d e ra to n e s p e rd ie ro n la s e c re c ió n d e IF N c o n e s t im u la c ió n co n c é lu la s d e r iv a d a s d e m e s o te lio m a q u e e x p re s a n m e s o te lin a ( c é lu la s E M -m e s o ) . N O D -S C ID -yc - / - (N S G ) d e lo s ra to n e s fu e ro n in y e c ta d o s p o r v ía s u b c u tá n e a c o n c é lu la s E m -m e s o 2 x 106. L a s c é lu la s T h u m a n a s p r im a r ia s 5 x 106 tra n s d u c id a s c o n e l C A R in d ic a d o se in y e c ta ro n IV en e l d ía 16. 18 d ía s d e s p u é s d e la in fu s ió n d e la s c é lu la s C A R T , lo s T IL s s e a is la ro n c o n p e r la s m a g n é t ic a s C D 45 y s e m e z c la ro n c o n E m -m e s o e n la re la c ió n e fe c to r /d ia n a in d ic a d a (E :T ) . L a s c o n c e n tra c io n e s d e c ito c in a s se d e te rm in a ro n en lo s s o b re n a d a n te s m e d ia n te E L IS A .

L a f ig u ra 87 m u e s tra q u e la s c é lu la s T S S 1 -K IR S 2 /D A P 12 m e d ia n u n a in te n s a a c t iv id a d a n ti tu m o ra l in v iv o . N O D -S C ID -yc - / - (N S G ) d e ra to n e s se in y e c ta ro n v ía s u b c u tá n e a c o n la s c é lu la s d e r iv a d a s d e m e s o te lio m a 2 x 106 q u e e x p re s a n m e s o te lin a ( c é lu la s E M -m e s o ) . L a s c é lu la s T h u m a n a s p r im a r ia s 5 x 106 tr a n s d u c id a s c o n e l C A R in d ic a d o s e in y e c ta ro n IV e n e l d ía 20. E l v o lu m e n d e l tu m o r s e m id ió p o r e l c a l ib ra d o r e n lo s t ie m p o s in d ic a d o s .

L a s f ig u ra s 88 A , 88 B , 88 C , 88 D , 88 E y 88 F so n e s q u e m a s q u e m u e s tra n c o n f ig u ra c io n e s d e e je m p lo d e un R N K R -C A R .

L a f ig u ra 89 e s un g rá f ic o q u e m u e s tra e l g ra d o d e m u e r te d e la s c é lu la s d ia n a p o r la s c é lu la s T q u e e x p re s a n R C A R (M e z c la 2 ) en c o m p a ra c ió n c o n la s c é lu la s T q u e e x p re s a n C A R e s tá n d a r (h u C A R 19 ) y la s c é lu la s T q u e no e x p re s a n C A R s (U T D ) a d iv e rs a s c o n c e n tra c io n e s d e R A D 001.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

DEFINICIONES

A m e n o s q u e se d e f in a d e o tro m o d o , to d o s lo s té rm in o s té c n ic o s y c ie n tí f ic o s u s a d o s en e l p re s e n te d o c u m e n to t ie n e n e l m is m o s ig n if ic a d o q u e e l c o m ú n m e n te e n te n d id o p o r un e x p e rto en la m a te r ia a la q u e p e r te n e c e la in v e n c ió n .

"U n " y "u n a " , ta l c o m o se u sa e l té rm in o en e l p re s e n te d o c u m e n to , se re f ie re a u n o o m á s d e u n o (e s d e c ir , a l m e n o s u n o ) d e l o b je to g ra m a t ic a l d e l a r t íc u lo . A m o d o d e e je m p lo , "u n e le m e n to " s ig n if ic a un e le m e n to o m á s d e un e le m e n to .

"A p ro x im a d a m e n te " , ta l c o m o se u s a e l té rm in o en e l p re s e n te d o c u m e n to , c u a n d o se re f ie re a un v a lo r q u e se p u e d e m e d ir , ta l c o m o u n a c a n tid a d , u n a d u ra c ió n te m p o ra l y s im ila re s , p re te n d e a b a rc a r v a r ia c io n e s d e ± 20 % o en a lg u n a s re a liz a c io n e s ± 10 % , o en a lg u n a s re a liz a c io n e s ± 5 % , o en a lg u n a s re a liz a c io n e s ± 1 % , o en a lg u n a s re a liz a c io n e s ± 0,1 % d e l v a lo r e s p e c if ic a d o , y a q u e ta le s v a r ia c io n e s so n a p ro p ia d a s p a ra re a liz a r los p ro c e d im ie n to s d e s c r ito s .

"A u tó lo g o " , ta l c o m o s e u s a e l té rm in o e n e l p re s e n te d o c u m e n to , s e re f ie re a c u a lq u ie r m a te r ia l d e r iv a d o d e l m is m o in d iv id u o a l q u e s e v o lv e rá a in t ro d u c ir d e n u e v o p o s te r io rm e n te .

"A lo g é n ic o " , ta l c o m o se u sa e l té rm in o en e l p re s e n te d o c u m e n to , se re f ie re a c u a lq u ie r m a te r ia l d e r iv a d o d e un a n im a l d ife re n te d e la m is m a e s p e c ie q u e e l in d iv id u o a l q u e se le in tro d u c e e l m a te r ia l. S e d ic e q u e d o s o m á s in d iv id u o s so n a lo g é n ic o s e n tre s í c u a n d o lo s g e n e s en u n o o m á s lo c i no so n id é n tic o s . E n a lg u n o s a s p e c to s , e l m a te r ia l a lo g é n ic o d e in d iv id u o s d e la m is m a e s p e c ie p u e d e s e r s u f ic ie n te m e n te d ife re n te s g e n é t ic a m e n te p a ra in te ra c tu a r a n tig é n ic a m e n te .

U n "d o m in io d e u n ió n a a n tíg e n o " , ta l c o m o se u sa e l té rm in o en e l p re s e n te d o c u m e n to , se re f ie re a u n a m o lé c u la q u e t ie n e a f in id a d p o r un a n tíg e n o d ia n a , t íp ic a m e n te un a n tíg e n o en u n a c é lu la d ia n a , p o r e je m p lo , u n a c é lu la c a n c e ro s a . U n d o m in io d e u n ió n a a n tíg e n o d e e je m p lo c o m p re n d e un p o lip é p tid o , p o r e je m p lo , u n a m o lé c u la de a n t ic u e rp o (q u e in c lu y e un a n t ic u e rp o y lo s f ra g m e n to s d e u n ió n a a n tíg e n o d e l m is m o , p o r e je m p lo , u n a in m u n o g lo b u lin a , un a n t ic u e rp o d e d o m in io ú n ic o (s d A b , p o r e je m p lo , un n a n o c u e rp o y un s c F v ), o un a rm a z ó n n o d e a n t ic u e rp o , p o r e je m p lo , u n a f ib ro n e c t in a , y s im ila re s . En re a liz a c io n e s , e l d o m in io d e u n ió n a a n tíg e n o e s un p o lip é p tid o ú n ic o . E n re a liz a c io n e s , e l d o m in io d e u n ió n a l a n tíg e n o c o m p re n d e u n o , d o s o m á s p o lip é p tid o s . En re a liz a c io n e s , e l d o m in io d e u n ió n a l a n tíg e n o c o m p re n d e un f ra g m e n to d e un a n t ic u e rp o , q u e e s s u f ic ie n te p a ra c o n c e d e r e l r e c o n o c im ie n to y la u n ió n e s p e c íf ic a a l a n tíg e n o d ia n a . E l té rm in o " fra g m e n to d e a n t ic u e rp o " s e re f ie re a a l m e n o s u n a p a rte d e un a n t ic u e rp o , q u e c o n s e rv a la c a p a c id a d d e in te ra c tu a r e s p e c íf ic a m e n te co n (p o r e je m p lo , m e d ia n te u n ió n , im p e d im e n to e s té r ic o , e s ta b i l iz a c ió n /d e s e s ta b il iz a c ió n , d is tr ib u c ió n e s p a c ia l) un e p íto p o d e un a n tíg e n o . L o s e je m p lo s d e un fra g m e n to d e a n t ic u e rp o in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a, F a b , F a b ', F (a b ' )2 o f ra g m e n to F v, un f ra g m e n to d e a n t ic u e rp o s c F v , un F v u n id o p o r d is u lfu ro (s d F v ), un fra g m e n to F d q u e c o n s is te e n lo s d o m in io s V H y C H 1 , un a n t ic u e rp o lin e a l, un a n t ic u e rp o d e d o m in io ú n ico , ta l c o m o un s d A b , p o r e je m p lo , un n a n o c u e rp o (ya s e a V L o V H ), un d o m in io V H H d e c a m é lid o , a n t ic u e rp o s m u lt ie s p e c í f ic o s fo rm a d o s a p a r t ir d e f r a g m e n to s d e a n tic u e rp o s , ta le s c o m o un f ra g m e n to b iv a le n te q u e c o m p re n d e d o s fra g m e n to s F a b u n id o s p o r un p u e n te de d is u lfu ro en la re g ió n b is a g ra , y u n a C D R a is la d a u o tro s fra g m e n to s d e u n ió n a e p íto p o d e un a n t ic u e rp o . U n f ra g m e n to d e u n ió n a a n tíg e n o ta m b ié n se p u e d e in c o rp o ra r en a n t ic u e rp o s d e d o m in io ú n ic o , m a x ic u e rp o s , m in ic u e rp o s , n a n o c u e rp o s , in tra c u e rp o s , d ia c u e rp o s , t r ia c u e rp o s , te tra c u e rp o s , v -N A R y b is -s c F v (v e r, p o r e je m p lo , H o ll in g e r y H u d s o n , N a tu re B io te c h n o lo g y 23 :1126 -1136 , 2005 ) . L o s fra g m e n to s d e u n ió n a a n tíg e n o se p u e d e n in je r ta r en lo s a rm a z o n e s b a s a d o s en p o lip é p tid o s , ta le s c o m o u n a f ib ro n e c t in a d e l t ip o III (F n 3 ) ( v e r la P a te n te d e lo s E s ta d o s U n id o s N ú m e ro : 6.703.199 q u e d e s c r ib e m in ic u e rp o s d e p o lip é p tid o d e f ib ro n e c t in a ) .

E n u n a re a liz a c ió n , e l d o m in io d e u n ió n a a n t íg e n o e s un "s c F v " , q u e p u e d e c o m p re n d e r u n a p ro te ín a d e fu s ió n q u e c o m p re n d e u n a c a d e n a V L y u n a c a d e n a V H d e un a n t ic u e rp o , d o n d e V H y V L se u n e n m e d ia n te un e n la z a d o r de p o lip é p tid o f le x ib le c o rto . E l s c F v e s c a p a z d e e x p re s a rs e c o m o un p o lip é p tid o m o n o c a te n a r io y c o n s e rv a la e s p e c if ic id a d d e l a n t ic u e rp o in ta c to d e l q u e se d e r iv a . A d e m á s , la s c a d e n a s v a r ia b le s V L y V H se p u e d e n u n ir en c u a lq u ie r o rd e n , p o r e je m p lo , c o n re s p e c to a lo s e x tre m o s N - te rm in a l y C - te rm in a l d e l p o lip é p tid o , e l s c F v p u e d e c o m p re n d e r V L -e n la z a d o r -V H o p u e d e c o m p re n d e r V H -e n la z a d o r -V L . E n re a liz a c io n e s , e l d o m in io d e u n ió n a l a n tíg e n o c o m p re n d e un a rm a z ó n no d e a n t ic u e rp o , p o r e je m p lo , u n a f ib ro n e c t in a , a n q u ir in a , un a n t ic u e rp o d e d o m in io , p o r e je m p lo , un n a n o c u e rp o , l ip o c a lin a , in m u n o fá rm a c o m o d u la r p e q u e ñ o , m a x ic u e rp o , P ro te ín a A o a f ilin a . E l a rm a z ó n no d e a n t ic u e rp o t ie n e la c a p a c id a d d e u n irs e a l a n tíg e n o d ia n a en u n a c é lu la . E n re a liz a c io n e s , e l d o m in io d e u n ió n a a n tíg e n o e s un p o lip é p tid o o f r a g m e n to d e l m is m o d e u n a p ro te ín a d e o r ig e n n a tu ra l e x p re s a d a en u n a c é lu la . E n u n a re a liz a c ió n , e l d o m in io d e u n ió n a a n tíg e n o se u n e a un fa c to r d e c re c im ie n to o re c e p to r d e h o rm o n a s . S in d e s e a r e s ta r l ig a d o a la te o r ía , e l d o m in io d e u n ió n a a n tíg e n o s irv e p a ra p ro p o rc io n a r e s p e c if ic id a d p a ra la s c é lu la s d ia n a y, E n re a liz a c io n e s , o p t im iz a u n a fu n c ió n e fe c to ra in m u n ita r ia a c o p la n d o la u n ió n a a n tíg e n o a la g e n e ra c ió n d e u n a s e ñ a l m e d ia n te un d o m in io d e s e ñ a liz a c ió n in t ra c e lu la r en un m ie m b ro d e s e ñ a liz a c ió n in tra c e lu la r .

"M ie m b ro d e u n ió n a a n tíg e n o " , ta l c o m o se u sa e l té rm in o en e l p re s e n te d o c u m e n to , c o m p re n d e un e le m e n to d e d o m in io d e u n ió n (p o r e je m p lo , un d o m in io d e u n ió n a a n tíg e n o , d o m in io e x t ra c e lu la r in h ib id o r o d o m in io e x tra c e lu la r c o e s t im u la d o r ) y, o p c io n a lm e n te , un d o m in io t ra n s m e m b ra n a o un a n c la je a m e m b ra n a . U n m ie m b ro d e u n ió n a a n tíg e n o p u e d e c o m p re n d e r ta m b ié n un d o m in io d e c o n m u ta c ió n . E n re a liz a c io n e s , e l d o m in io d e c o n m u ta c ió n e n e l m ie m b ro d e u n ió n a a n tíg e n o p u e d e fo rm a r un c o n m u ta d o r d e d im e r iz a c ió n co n un d o m in io d e c o n m u ta c ió n en un m ie m b ro d e s e ñ a liz a c ió n in tra c e lu la r . E l c o n m u ta d o r d e d im e r iz a c ió n fo rm a d o p o r e s to s d o s d o m in io s de c o n m u ta c ió n p u e d e a c o p la r la u n ió n a a n tíg e n o a la g e n e ra c ió n d e s e ñ a l in tra c e lu la r y, p o r lo ta n to , o p t im iz a r u n a fu n c ió n e fe c to ra in m u n ita r ia d e la c é lu la . E n re a liz a c io n e s , e l m ie m b ro d e u n ió n a a n tíg e n o c o m p re n d e un d o m in io d e u n ió n a a n tíg e n o q u e e s d is t in to d e l d o m in io e x t ra c e lu la r n a tiv o d e u n a m o lé c u la a p a r t ir d e la c u a l se d e r iv a un dominio de señalización intracelular en el miembro de señalización intracelular. En realizaciones, el miembro de unión a antígeno comprende un dominio de unión a antígeno que se une a un antígeno que no es el ligando del dominio extracelular nativo de una molécula del que se deriva un dominio de señalización intracelular en el miembro de señalización intracelular.

"Efecto anticáncer", tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un efecto biológico que puede manifestarse por diversos medios, que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, una disminución en el volumen del tumor, una disminución en el número de células cancerosas, una disminución en el número de metástasis, un aumento en la esperanza de vida, una disminución en la proliferación de células cancerosas, una disminución en la supervivencia de las células cancerosas o una mejoría de varios síntomas fisiológicos asociados con la afección cancerosa. Un “efecto anticáncer” también puede manifestarse con la capacidad de los péptidos, los polinucleótidos, las células y los anticuerpos para prevenir la aparición del cáncer en primer lugar. El término "efecto antitumoral" se refiere a un efecto biológico que puede manifestarse por diversos medios, que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, una disminución del volumen del tumor, una disminución en el número de las células cancerosas, una disminución en la proliferación de las células tumorales, o una disminución de la supervivencia de las células tumorales.

"Miembro de unión a antígeno auxiliar", tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a una molécula que comprende un dominio de unión a antígeno que se une a un antígeno distinto al antígeno unido por otro dominio de unión a antígeno de RCAR, NKR-CAR o RNKR, por ejemplo, distinto del dominio de unión a antígeno del miembro de unión a antígeno. En realizaciones, comprende un dominio transmembrana o un dominio de anclaje a la membrana.

"Elemento de dominio de unión", tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un dominio de unión a antígeno, un dominio extracelular inhibidor o un dominio extracelular coestimulador.

"Cáncer", tal como se usa el término en el presente documento, se refiere a una enfermedad caracterizada por un crecimiento incontrolado de células aberrantes. Las células cancerosas pueden diseminarse localmente o a través del torrente sanguíneo y el sistema linfático a otras partes del cuerpo. Los ejemplos de varios cánceres incluyen, pero no se limitan a, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer cervical, cáncer de piel, cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de cerebro, linfoma, leucemia, cáncer de pulmón y similares.

El término "Receptor de Antígeno Quimérico" o alternativamente un "CAR", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido quimérico que comparte propiedades estructurales o funcionales con un receptor de función inmune celular o una molécula adaptadora, por ejemplo, una célula T o una célula NK. Al unirse al antígeno afín, un CAR puede activar o desactivar la célula citotóxica en la que está dispuesto, o modular la actividad antitumoral de la célula o modular de otro modo la respuesta inmune de las células.

Los CAR incluyen, por ejemplo, TCAR, RCAR, NKR-CAR, RNKR-CAR, que se definen a continuación. En algunas realizaciones, en RCAR, por ejemplo, el conjunto de polipéptidos incluye un conmutador de dimerización que, en presencia de una molécula de dimerización, puede acoplar los polipéptidos entre sí, por ejemplo, puede acoplar un dominio de unión a antígeno a un dominio de señalización intracelular. En realizaciones, en NKR-CAR, el conjunto de polipéptidos comprende uno o más elementos (por ejemplo, dominio) de un receptor de células asesinas naturales (NKR). En realizaciones, en RNKR-CAR, el conjunto de polipéptidos comprende uno o más elementos (por ejemplo, dominio) de un NKR, y el conjunto de polipéptidos incluye un conmutador de dimerización que, en presencia de una molécula de dimerización, puede acoplar los polipéptidos entre sí, por ejemplo, puede acoplar un dominio de unión a antígeno a un dominio de señalización intracelular. En algunas realizaciones, en TCAR (también denominados CAR estándares), por ejemplo, un elemento del CAR se deriva de una célula T, por ejemplo, un receptor de células T. Por ejemplo, la molécula estimuladora es la cadena zeta asociada con el complejo de receptores de células T.

"Dominio de señalización coestimulador", tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a una molécula, por ejemplo, una molécula endógena, de la célula RCAR/NKR-CAR^xo RNKR-CARX que, al unirse a su contraligando afín en una célula diana, potencia, por ejemplo, aumenta, una respuesta efectora inmunitaria.

"Dominio extracelular coestimulador" (también denominado ECD coestimulador o dominios de unión a ligando extracelular de moléculas coestimuladoras), tal como se usan los términos en el presente documento, se refiere a un dominio extracelular de una molécula coestimuladora, por ejemplo, una molécula coestimuladora descrita en el presente documento.

"Derivado de", tal como se usa en el presente documento, indica una relación entre una primera y una segunda molécula. Generalmente se refiere a la similitud estructural entre la primera molécula y una segunda molécula y no connota ni incluye una limitación del proceso o fuente en una primera molécula que se deriva de una segunda molécula. Por ejemplo, en el caso de un dominio de señalización intracelular que se deriva de una molécula CD3zeta, el dominio de señalización intracelular retiene suficiente estructura de CD3zeta para que tenga la función requerida, es decir, la capacidad de generar una señal en las condiciones apropiadas. No connota ni incluye una limitación a un proceso particular de producción del dominio de señalización intracelular, por ejemplo, no significa que, para proporcionar el dominio de señalización intracelular, se tenga que empezar con una secuencia de Cd3zeta y eliminar la secuencia no deseada, o imponer mutaciones para llegar al dominio de señalización intracelular.

"Molécula de dimerización", tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a una molécula que promueve la asociación de un primer dominio de conmutación con un segundo dominio de conmutación. En realizaciones, por ejemplo, en las que el conmutador de dimerización está dispuesto de manera intracelular, la molécula de dimerización puede atravesar la membrana plasmática. En realizaciones, por ejemplo, en las que el conmutador de dimerización está dispuesto de manera extracelular, no es necesario que la molécula de dimerización atraviese la membrana plasmática. En realizaciones, la molécula de dimerización no se produce de forma natural en el sujeto, o no se produce en concentraciones que darían como resultado una dimerización significativa. En realizaciones, la molécula de dimerización es una molécula pequeña, por ejemplo, rapamicina o un derivado de rapamicina. En realizaciones, la molécula de dimerización es un polipéptido. En realizaciones, la molécula de dimerización es una molécula de anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. En realizaciones, el primer y segundo dominios de conmutación de un conmutador de homodimerización o un conmutador de heterodimerización se asocian juntos en presencia de una molécula de dimerización de molécula pequeña, por ejemplo, rapamicina o un derivado de rapamicina. En realizaciones, el primer y el segundo dominios de conmutación de un conmutador de homodimerización o un conmutador de heterodimerización se asocian juntos en presencia de una molécula de dimerización polipeptídica. En realizaciones, el primer y el segundo dominios de conmutación de un conmutador de homodimerización o un conmutador de heterodimerización se asocian juntos en presencia de una molécula de dimerización peptídica multimérica. En realizaciones, el primer y el segundo dominios de conmutación de un conmutador de homodimerización o un conmutador de heterodimerización se asocian juntos en presencia de una molécula de dimerización de molécula de anticuerpo. En realizaciones, la molécula de anticuerpo comprende una molécula de anticuerpo monoespecífica. En realizaciones, la molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo específica dual.

Generalmente, una molécula de dimerización promoverá la asociación de al menos dos moléculas de conmutación (y por lo tanto la asociación de dominios intracelulares unidos a los dominios de conmutación). En realizaciones, la molécula de dimerización tiene una valencia mayor de dos, por ejemplo, es multivalente y se une, y por tanto agrupa o dimeriza, más de dos dominios de conmutación. Por ejemplo, una molécula de dimerización puede comprender una pluralidad, por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10, dominios de unión, cada uno de los cuales puede unirse a un dominio de conmutación.

"dsARN", tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico, que tiene al menos una región de estructura en doble cadena, que es capaz de mediar la inhibición específica de secuencia de la expresión de un gen diana. Los dsARN comprenden ARN interferencia corto (siARN) y ARN de horquilla corta (shARN). En realizaciones, el shARN es similar en estructura a un siARN pero incluye un resto, típicamente uno o más monómeros de ARN, que conectan una región doble cadena de sentido y una secuencia antisentido. En una realización, el shARN, después de procesamiento intracelular (por ejemplo, por Dicer), da como resultado un siARN de doble cadena de 19-23 nucleótidos con salientes en 3' de 2 nucleótidos.

"Endógeno", tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a cualquier material, por ejemplo, un polipéptido, de o producido dentro de un organismo, célula, tejido o sistema.

"Exógeno", tal como se usa el término en el presente documento, se refiere a cualquier material, por ejemplo, un polipéptido o molécula de dimerización, introducido de o producido fuera de un organismo, célula, tejido o sistema. "Célula efectora inmune o inmunitaria", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una célula que está implicada en una respuesta inmunitaria, por ejemplo, en la promoción de una respuesta efectora inmunitaria. Los ejemplos de células efectoras inmunes incluyen células T, por ejemplo, células T alfa/beta y células T gamma/delta, células B, células asesinas naturales (NK), células T asesinas naturales (NKT), mastocitos y fagocitos derivados de mieloide. "Función efectora inmune o inmunitaria o respuesta efectora inmune o inmunitaria", tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a la función o la respuesta, por ejemplo, de una célula efectora inmune, que potencia o promueve un ataque inmune de una célula diana. Por ejemplo, una función o una respuesta efectora inmune se refiere a una propiedad de una célula T o NK que promueve la eliminación o la inhibición del crecimiento o la proliferación de una célula diana. En el caso de una célula T, la estimulación primaria y la coestimulación son ejemplos de una función o respuesta efectora inmune. Una función o respuesta efectora inmune puede ser promovida por la acción de un RCAR o un RNKR-CAR, y puede, por ejemplo, dar como resultado una célula RCAR/NKR-CARX o RNKR-CARX que es más efectiva en la proliferación, producción de citocinas, citotoxicidad o regulación por incremento de marcadores de superficie celular, tales como c D25, CD69, CD 107a.

Un "dominio extracelular inhibidor", tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un polipéptido que comprende un dominio extracelular de una molécula inhibidora. Normalmente, la unión a su contraligando tiene un efecto inhibidor sobre la generación de una respuesta efectora inmunitaria. Cuando se une, por ejemplo, se fusiona o se acopla mediante un conmutador de dimerización, a un dominio de señalización intracelular, redirige una interacción que normalmente inhibe la generación de una respuesta efectora inmune en una que promueve una respuesta efectora inmune.

"Miembro de unión inhibidor", tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un polipéptido que comprende un dominio extracelular inhibidor, un dominio transmembrana y un dominio de conmutación.

"Molécula inhibidora", tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a una molécula, por ejemplo, una molécula endógena, de la célula RCAR/NKR-CARX o RNKR-CARX que, al unirse a su contraligando afín en una célula diana, minimiza, por ejemplo, suprime o inhibe, una respuesta efectora inmunitaria. Los ejemplos de moléculas inhibidoras incluyen PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1 y TGFR beta. "Dominio de señalización intracelular", tal como se usa el término en el presente documento, se refiere a una parte intracelular de una molécula. El dominio de señalización intracelular genera una señal que promueve una función efectora inmunitaria de la célula RCAR/NKR-CARX o RNKR-CARX. Los ejemplos de función efectora inmunitaria incluyen actividad citolítica y actividad auxiliar, incluida la secreción de citocinas.

En una realización, el dominio de señalización intracelular puede comprender un dominio de señalización intracelular primario. Los dominios de señalización intracelular primarios de ejemplo incluyen aquellos derivados de las moléculas responsables de estimulación primaria o estimulación dependiente de antígeno. En una realización, el dominio de señalización intracelular puede comprender un dominio intracelular coestimulador. Los dominios de señalización intracelular coestimuladores de ejemplo incluyen aquellos derivados de moléculas responsables de señales coestimuladoras o estimulación independiente del antígeno. Por ejemplo, en el caso de un RCART o un RNKR-CART, un dominio de señalización intracelular primario puede comprender secuencias citoplasmáticas del receptor de células T, y un dominio de señalización intracelular coestimulador puede comprender una secuencia citoplasmática de un correceptor o una molécula coestimuladora.

Una secuencia de señalización citoplasmática primaria (también denominada "dominio de señalización primaria") que actúa de forma estimuladora puede contener un motivo de señalización que se conoce como motivo de activación inmunorreceptor basado en tirosina o ITAM. Los ejemplos de una secuencia de señalización citoplasmática que contiene ITAM que es de uso particular en la invención incluye, pero no se limita a, aquellas derivadas de c D3 zeta, FcR gamma común (FCER1G), Fc gamma RIIa, FcR beta (Fc Épsilon R1b), CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CD79a, CD79b, DAP¹⁰y DAP12. En un RNKR-CAR o R^cA^respecífico de la divulgación, el dominio de señalización intracelular en uno o más RNKR-CAR o RCAR de la divulgación comprende una secuencia de señalización intracelular, por ejemplo, una secuencia de señalización primaria de CD3-zeta.

Un dominio de señalización intracelular coestimulador puede derivarse de la parte intracelular de una molécula coestimuladora. Una molécula coestimuladora puede representarse en las siguientes familias de proteína: proteínas receptoras de TNF, proteínas similares a inmunoglobulinas, receptores de citocinas, integrinas, moléculas de activación linfocítica de señalización (proteínas SLAM) y receptores de células NK activadores. Los ejemplos de tales moléculas incluyen CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, ICAM-1, antígeno 1 asociado a la función de los linfocitos (lFa -1), CD2, CDS , CD7, CD287, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, y un ligando que se une específicamente con CD83 y similares. Otros ejemplos de tales moléculas coestimuladoras incluyen CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Táctil), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, y PAG/Cbp.

El dominio de señalización intracelular puede comprender la parte intracelular completa, o el dominio de señalización intracelular nativo completo, de la molécula de la que se deriva, o un fragmento funcional o derivado de la misma. "Miembro señalización intracelular", tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un polipéptido que comprende un dominio de señalización intracelular y un dominio de conmutación. En realizaciones, comprende un dominio de señalización intracelular primario y, opcionalmente, un dominio de señalización coestimulador. En realizaciones con más de un dominio de señalización intracelular, dichos dominios pueden estar unidos entre sí en un orden aleatorio o específico. Opcionalmente, un enlazador oligopéptido o polipéptido corto, por ejemplo, entre 2 y 10 aminoácidos de longitud, puede disponerse entre dominios de señalización intracelulares. Un doblete de glicina-serina proporciona un enlazador particularmente adecuado. En una realización, el miembro de señalización intracelular comprende el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de CD28. En una realización, el miembro de señalización intracelular comprende el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de 4-1BB. En una realización, el dominio de señalización intracelular de 4-1BB es un dominio de señalización de la SEQ ID NO: 138. En una realización, el dominio de señalización de CD3-zeta es un dominio de señalización de la SEQ ID NO: 139.

"Aislado", tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un ácido nucleico o polipéptido separado de al menos un compuesto contaminante. En relación con un ácido nucleico o un polipéptido que existe en la naturaleza, significa libre de un compuesto con el que se encuentra en la naturaleza, donde, en realizaciones, el compuesto contaminante es un polinucleótido o un polipéptido. En relación con un ácido nucleico o un polipéptido que se prepara sintéticamente, esto significa libre de un reactivo o un compuesto utilizado en su preparación, por ejemplo, un disolvente o un reactivo de partida. Por ejemplo, un ácido nucleico o un polipéptido presente de forma natural en un animal vivo no está "aislado", pero el mismo ácido nucleico o polipéptido separado parcial o completamente de los materiales coexistentes de su estado natural está "aislado". Un ácido nucleico o proteína aislados pueden existir en una forma purificada substancialmente o pueden existir en un ambiente no nativo tal como, por ejemplo, una célula huésped.

"Dosis baja, que aumenta la inmunidad", cuando se usa en el presente documento junto con un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor de mTOR alostérico, por ejemplo, RAD001 o rapamicina, o un inhibidor de mTOR catalítico, se refiere a una dosis de inhibidor de mTOR que parcialmente, pero no completamente, inhibe la actividad de mTOR, por ejemplo, según se mide mediante la inhibición de la actividad de la quinasa P70 S6. Los procedimientos para evaluar la actividad de mTOR, por ejemplo, mediante la inhibición de la quinasa P70 S6, se describen en el presente documento. La dosis es insuficiente para dar como resultado una inmunosupresión completa, pero es suficiente para mejorar la respuesta inmunitaria. En una realización, la dosis baja, que aumenta la inmunidad, del inhibidor de mTOR da como resultado una disminución en el número de células T positivas para PD-1 y/o un aumento en el número de células T negativas para PD-1, o un aumento en la proporción de células T negativas de PD-1/células T positivas de PD-1. En una realización, la dosis baja, que aumenta la inmunidad, del inhibidor mTOR da como resultado un aumento en el número de células T sin tratar. En una realización, la dosis baja, que aumenta la inmunidad, del inhibidor de mTOR da como resultado uno o más de los siguientes:

un aumento en la expresión de uno o más de los siguientes marcadores: CD62Lalto, CD127alto, CD27+, y BCL2, por ejemplo, en células T de memoria, por ejemplo, precursores de células T de memoria;

una disminución en la expresión de KLRG1, por ejemplo, en células T de memoria, por ejemplo, precursores de células T de memoria; y

un aumento en el número de precursores de células T de memoria, por ejemplo, células con una cualquiera o una combinación de las siguientes características: aumento de CD62Lalto, aumento de CD127alto, aumento de CD27+, disminución de KLRG1 y aumento de BCL2;

y en el que cualquiera de los cambios descritos anteriormente se produce, por ejemplo, al menos de forma transitoria, por ejemplo, en comparación con un sujeto no tratado.

"Anclaje a membrana", "dominio de anclaje a la membrana" o "dominio de unión a membrana", tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un resto o un polipéptido suficiente para anclar un dominio extracelular a la membrana plasmática. Los ejemplos de restos no polipeptídicos incluyen glicofosfatidilinositol (anclaje de GPI) o un grupo miristoílo (miristoilación).

"Inhibidor basado en ácido nucleico", tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede inhibir la expresión de un gen diana, por ejemplo, una molécula inhibidora. Comprende ARN bicatenario (dsARN), incluido ARN en horquilla corta (shARN) y ARN de interferencia corto (siARN), ARN antisentido y microARN (miARN). En una realización, el inhibidor basado en ácido nucleico se une al ARNm diana e inhibe la producción de proteína a partir del mismo, por ejemplo, mediante escisión del ARNm diana.

"Receptor de antígeno quimérico regulable (RCAR)", tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un conjunto de polipéptidos, típicamente dos en las realizaciones más simples, que cuando están en una célula RCARX o RCAR/Nk R-CARX, proporcionan a la célula RCARX o RCAR/Nk R-CARX especificidad para una célula diana, típicamente una célula cancerosa, y con generación de señal intracelular regulable que puede optimizar una propiedad efectora inmune de la célula RCARX o RCAR/NKR-CARX, por ejemplo, actividad citolítica, secreción de citocinas, supervivencia celular, o proliferación celular. Una célula RCARX o RCAR/NKR-CARX se basa, al menos en parte, en un dominio de unión a antígeno para proporcionar especificidad a una célula diana que comprende el antígeno unido por el dominio de unión a antígeno. En una realización, un RCAR incluye un conmutador de dimerización que, en presencia de una molécula de dimerización, puede acoplar un dominio de señalización intracelular a un elemento de reconocimiento extracelular. Un elemento de reconocimiento extracelular puede ser un dominio de unión a antígeno, un dominio de unión de contraligando inhibidor o un dominio ECD coestimulador. En una realización, un RCAR incluye un conmutador de dimerización que, en presencia de una molécula de dimerización, puede acoplar un dominio de señalización intracelular a un elemento de reconocimiento extracelular, que no es expresado por la célula RCARX o RCAR/NKR-CARX, sino proporcionado de forma exógena.

"Receptor de antígeno quimérico del receptor de células asesinas naturales regulable (RNKR-CAR)", tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un conjunto de polipéptidos, típicamente dos en las realizaciones más simples, que cuando están en una célula RNKR-CARX, proporcionan la célula RNKR-CARX con la especificidad para una célula diana, típicamente una célula cancerosa, y con la generación de señal intracelular regulable que puede optimizar una propiedad efectora inmunitaria de la célula RNKR-CARX, por ejemplo, actividad citolítica, secreción de citocinas, supervivencia celular o proliferación celular. Una célula RNKR-CARX se basa, al menos en parte, en un dominio de unión a antígeno para proporcionar especificidad a una célula diana que comprende el antígeno unido por el dominio de unión a antígeno. En una realización, un RNKR-CAR incluye un conmutador de dimerización que, en presencia de una molécula de dimerización, puede acoplar un dominio de señalización intracelular a un elemento de reconocimiento extracelular. Un elemento de reconocimiento extracelular puede ser un dominio de unión a antígeno, un dominio de unión a contraligando inhibidor o un dominio ECD coestimulador. En una realización, un RNKR-CAR incluye un conmutador de dimerización que, en presencia de una molécula de dimerización, puede acoplar un dominio de señalización intracelular a un dominio de unión a antígeno. En una realización, un RNKR-CAR comprende un dominio citoplasmático de NKR o un dominio transmembrana de NKR; y, en una realización, el dominio citoplasmático de NKR es distinto de un dominio citoplasmático de FcR gamma (FCER1G), CD27, NKG2C, SLAMF7, NKP80 (KLRF1), CD160 (BY55), DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Táctil), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), NKp44, NKp30 y/o NKp46. En una realización, un RNKR-CAR comprende un dominio citoplasmático de NKR y un dominio de señalización primario de una molécula adaptadora de células NK, por ejemplo, DAP12. En una realización, un RNKR-CAR comprende un dominio transmembrana de NKR y un dominio de señalización primario de una molécula adaptadora de células NK, por ejemplo, DAP12. En una realización, un RNKR-CAR comprende un dominio citoplasmático de NKR (distinto de un dominio citoplasmático de FcR gamma (FCER1G), CD27, NKG2C, SLAMF7, NKP80 (KLRF1), CD160 (BY55), DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (táctil), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), NKp44, NKp30 y/o NKp46) y un dominio de señalización primario de una molécula de células T, por ejemplo, CD3zeta.

"Célula RCARX," tal como el término se usa en el presente documento, se refiere a una célula que comprende RCAR. Cualquier célula diseñada para expresar un RCAR se puede usar como una célula RCARX. En una realización, la célula RCARX es una célula T y se denomina una célula RCART. En una realización, la célula RCARX es una célula NK y se denomina una célula RCARN.

"Célula RNKR-CARX" (también denominada "célula RNKR-CAR"), tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a una célula que comprende RNKR-CAR. Cualquier célula que esté diseñada para expresar un RNKR-CAR puede usarse como una célula RNKR-CARX. En una realización, la célula RNKR-CARX es una célula T, y se denomina una célula RNKR-CART. En una realización, la célula RNKR-CARX es una célula NK, y se denomina una célula RNKR-CARN.

"Célula RCAR/NKR-CARX", tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a una célula que comprende un RCAR y un NKR-CAR. Cualquier célula que esté diseñada para expresar un RCAR y/o un NKR-CAR se puede utilizar como una célula RCAR/ⁿKR-CARX. En una realización, la célula RCAR/NKR-CAR^xes una célula T y se denomina como una célula RCAR/NKR-CART. En una realización, la célula RCAR/NKR-CARX es una célula n K y se denomina una célula RCAR/NKR-CARN.

En una realización, la célula RCARX, RNKR-CARX o RCAR/NKR-CARX es autóloga del paciente. En una realización, RCARX, RNKR-CARX o RCAR/NKR-CARX es alogénica al paciente. En una realización, un paciente recibe más de un tipo de célula RCARX, RNKR-CARX o RCAR/NKR-cArX, por ejemplo, el paciente recibe una célula RCART y una célula RCARN, o una célula RNKR-CART y una célula RⁿK^r-^cA^rN, o una célula RCAR/NKR-CART y una célula RCAR/NKR-CARN.

"Se une específicamente", tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un anticuerpo, o un ligando, que reconoce y se une con una proteína asociada de unión (por ejemplo, antígeno tumoral) presente en una muestra, pero cuyo anticuerpo o ligando no reconoce o se une sustancialmente a otras moléculas en la muestra.

"Dominio de conmutación", tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a una entidad, normalmente una entidad basada en polipéptidos, que, en presencia de una molécula de dimerización, se asocia con otro dominio de conmutación. La asociación da como resultado un acoplamiento funcional de una primera entidad unida a, por ejemplo, fusionada a, un primer dominio de conmutación, y una segunda entidad unid a, por ejemplo, fusionada a, un segundo dominio de conmutación. Un primer y un segundo dominios de conmutación se denominan colectivamente conmutador de dimerización. En realizaciones, el primer y el segundo dominios de conmutación son iguales entre sí, por ejemplo, son polipéptidos que tienen la misma secuencia de aminoácidos primaria, y se denominan colectivamente conmutador de homodimerización. En una realización, el primer y el segundo dominios de conmutación son distintos uno del otro, por ejemplo, son polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos primaria diferente, y se refieren colectivamente como un conmutador de heterodimerización. En una realización el conmutador es intracelular En realizaciones, el conmutador es extracelular. En realizaciones, el dominio de conmutación es una entidad basada en polipéptidos, por ejemplo, FKBP-FRB, y la molécula de dimerización es una molécula pequeña, por ejemplo, un derivado de rapamicina. En casos, el dominio de conmutación es una entidad basada en polipéptidos, por ejemplo, un scFv que se une a un péptido myc, y la molécula de dimerización es un polipéptido, un fragmento del mismo o un multímero de un polipéptido, por ejemplo, un ligando myc o multímeros de un ligando myc que se une a uno o más scFv de myc. En casos, el dominio de conmutación es una entidad basada en polipéptidos, por ejemplo, un receptor de myc, y la molécula de dimerización es un anticuerpo o fragmentos del mismo, por ejemplo, anticuerpo myc.

"Dominio transmembrana", tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un polipéptido que se extiende por la membrana plasmática. En una realización, une una secuencia extracelular, por ejemplo, un dominio de conmutación, un elemento de reconocimiento extracelular, por ejemplo, un dominio de unión a antígeno, un dominio de unión a contraligando inhibidor o un dominio ECD coestimulador, a una secuencia intracelular, por ejemplo, a un dominio de conmutación o un dominio de señalización intracelular. Un dominio transmembrana de uso particular en esta invención puede incluir al menos la región o regiones transmembrana de, por ejemplo, la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8 (por ejemplo, Cd 8 alfa, CD8 beta), CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. En algunas realizaciones, un dominio transmembrana incluye al menos la región o regiones transmembrana de un NKR. En algunas realizaciones, un dominio transmembrana, puede incluir al menos la región o regiones transmembrana de, por ejemplo, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, IL2R beta, IL2R gamma, IL7Ra, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Táctil), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp.

"Tratar", "tratamiento" y "que tratoa", tal como estos términos se usan indistintamente en el presente documento, se refieren a la reducción o la mejora de la progresión, gravedad y/o duración de un trastorno proliferativo, o la mejora de uno o más síntomas (preferiblemente, uno o más síntomas discernibles) de un trastorno proliferativo resultante de la administración de una o más terapias (por ejemplo, uno o más agentes terapéuticos, tales como un CAR de la invención). En realizaciones específicas, los términos "tratar", "tratamiento" y "que trata" se refieren a la mejora de al menos un parámetro físico medible de un trastorno proliferativo, tal como crecimiento de un tumor, no necesariamente discernible por el paciente. En otras realizaciones, los términos “tratar”, “tratamiento” y “que trata” se refieren a la inhibición de la progresión de un trastorno proliferativo, ya sea físicamente mediante, por ejemplo, la estabilización de un síntoma discernible, fisiológicamente mediante, por ejemplo, la estabilización de un parámetro físico, o ambos. En otras realizaciones, los términos "tratar'1, "tratamiento" y "que trata" se refieren a la reducción o la estabilización de tamaño de tumor o el recuento de células cancerosas.

"Antígeno tumoral" o "antígeno asociado al cáncer", tal como estos términos se usan indistintamente en el presente documento, se refiere a una molécula (típicamente una proteína, carbohidrato o lípido) que se expresa en la superficie de una célula cancerosa, ya sea en su totalidad o como un fragmento (por ejemplo, MHC/péptido), y que es útil para el direccionamiento preferencial de un agente farmacológico a la célula cancerosa. En algunas realizaciones, un antígeno tumoral es un marcador expresado tanto por células normales como por células cancerosas, por ejemplo, un marcador de linaje, por ejemplo, CD19 en células B. En algunas realizaciones, un antígeno tumoral es una molécula de la superficie celular que se sobreexpresa en una célula cancerosa en comparación con una célula normal, por ejemplo, una sobreexpresión de 1 vez, una sobreexpresión de 2 veces, una sobreexpresión de 3 veces o más en comparación con una célula normal. En algunas realizaciones, un antígeno tumoral es una molécula de la superficie celular que se sintetiza de manera inapropiada en la célula cancerosa, por ejemplo, una molécula que contiene deleciones, adiciones o mutaciones en comparación con la molécula expresada en una célula normal. En algunas realizaciones, un antígeno tumoral se expresará exclusivamente en la superficie celular de una célula cancerosa, en su totalidad o como un fragmento (por ejemplo, MHC/péptido), y no se sintetizará o se expresará en la superficie de una célula normal. En algunas realizaciones, los RNKR-CAR, NKR-CAR o RCAR de la presente divulgación incluyen RNKR-CAR, NKR-CAR o RCAR que comprenden un dominio de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de anticuerpo) que se une a un péptido presentado por MHC. Normalmente, los péptidos derivados de proteínas endógenas llenan los bolsillos de las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (MHC), y son reconocidos por los receptores de células T (TCR) en los linfocitos T CD8 . Los complejos de MHC de clase I son expresados de manera constitutiva por todas las células nucleadas. En el cáncer, los complejos de péptido/MHC específicos de virus y/o específicos de tumor representan una clase única de dianas de superficie celular para inmunoterapia. Se han descrito anticuerpos de tipo TCR que reconocen péptidos derivados de antígenos virales o tumorales en el contexto del antígeno de leucocito humano (HLA)-A1 o h La -A2 (véanse, por ejemplo, Sastry et al., J Virol. 2011 85 (5): 1935-1942; Sergeeva et al., Bood, 2011 117 (16):4262-4272; Verma et al., J Immunol 2010 184 (4):2156-2165; Willemsen et al., Gene Ther 2001 8 (21): 1601-1608; Dao et al., Sci Transl Med 20135 (176): 176ra33; Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100). Por ejemplo, un anticuerpo de tipo TCR se puede identificar a partir del cribado de una biblioteca, tal como una biblioteca presentada en fagos scFv humana.

"Miembro de unión a antígeno auxiliar no conmutado", tal como se usa el término en el presente documento, se refiere a un polipéptido que comprende: un dominio de unión a antígeno que se une a un antígeno distinto del antígeno unido por otro dominio de unión a antígeno del RNKR-CAR, NKR -CAR, o RCAR; un dominio transmembrana; y un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primario. Normalmente, no comprende un dominio de conmutación que pueda formar un conmutador de dimerización con un dominio de conmutación en otro componente del RNKR-CAR, NKR-CAR o RCAR.

"Forma de dosificación unitaria", tal como se usa el término en el presente documento, se refiere a una dosificación para una administración adecuada. A modo de ejemplo, una forma de dosificación unitaria puede ser un comprimido, una cápsula o una cantidad de agente terapéutico dispuesto en un dispositivo de administración, por ejemplo, una jeringa o una bolsa de goteo intravenosa. En una realización, se administra una forma de dosificación unitaria en una sola administración. En una realización, se pueden administrar simultáneamente más de una forma de dosificación unitaria, por ejemplo, dos comprimidos.

"Xenogénico", tal como se usa el término en el presente documento, se refiere a un injerto derivado de un animal de una especie diferente.

La molécula "adaptadora", tal como se usa el término en el presente documento, se refiere a un polipéptido con una secuencia que permite la interacción con dos o más moléculas y, en realizaciones, promueve la activación o desactivación de una célula citotóxica. Por ejemplo, en el caso de DAP12, esto comprende interacciones con un KIR activador a través de interacciones de carga dentro del dominio transmembrana e interacciones con moléculas de señalización como ZAP70 o Syk a través de una secuencia ITAM fosforilada dentro del dominio citoplasmático. El término "antígeno" o "Ag", tal como se usa en el presente documento, se define como una molécula que provoca una respuesta inmune. Esta respuesta inmune puede implicar la producción de anticuerpos o la activación de células inmunológicamente competentes específicas, o ambas. El experto en la materia comprenderá que cualquier macromolécula, incluidas prácticamente todas las proteínas o péptidos, puede servir como antígeno. Además, los antígenos se pueden derivar de ADN recombinante o genómico. Además, un experto en la materia comprenderá que cualquier ADN que comprende una secuencia de nucleótidos o una secuencia de nucleótidos parcial que codifica una proteína que provoca una respuesta inmune, por lo tanto, codifica un “antígeno”, tal como el término que se usa en el presente documento. Además, un experto en la materia comprenderá que no es necesario que un antígeno esté codificado únicamente por una secuencia de nucleótidos de longitud completa de un gen. Es fácilmente evidente que la presente divulgación incluye, pero no se limita a, el uso de secuencias de nucleótidos parciales de más de un gen y que estas secuencias de nucleótidos están dispuestas en diversas combinaciones para codificar polipéptidos que provocan la respuesta inmune deseada. Además, un experto en la materia comprenderá que un antígeno no necesita estar codificado por un "gen" en absoluto. Es evidente que se puede generar un antígeno sintetizado o que se puede derivar de una muestra biológica. Dicha muestra biológica puede incluir, pero no se limita a, una muestra de tejido, una muestra de tumor, una célula o un fluido biológico.

El término "autoantígeno" significa, de acuerdo con la presente divulgación, cualquier autoantígeno que sea reconocido por el sistema inmunológico como si fuera extraño. Los autoantígenos comprenden, pero no se limitan a, proteínas celulares, fosfoproteínas, proteínas de superficie celular, lípidos celulares, ácidos nucleicos, glicoproteínas, incluidos los receptores de la superficie celular.

El término "enfermedad autoinmune", tal como se usa en el presente documento, se define como un trastorno que es resultado de una respuesta autoinmune. Una enfermedad autoinmune es el resultado de una respuesta inapropiada y excesiva a un autoantígeno. Los ejemplos de las enfermedades autoinmunes incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de Addision, alopecia areata, espondilitis anquilosante, hepatitis autoinmune, parotiditis autoinmune, enfermedad de Crohn, diabetes (Tipo I), epidermólisis ampollosa distrófica, epididimitis, glomerulonefritis, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barr, enfermedad de Hashimoto, anemia hemolítica, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, miastenia grave, pénfigo vulgar, psoriasis, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, espondiloartropatías, tiroiditis, vasculitis, vitiligo, mixedema, anemia perniciosa, colitis ulcerosa, entre otras.

Tal como se usa en el presente documento, el término "autólogo" pretende referirse a cualquier material derivado del individuo al cual más tarde será introducido de nuevo en el individuo.

"Alogénico" se refiere a un injerto derivado de un animal diferente de la misma especie.

Tal como se usa en el presente documento, el término "modificaciones conservativas de secuencia" pretende hacer referencia a modificaciones de aminoácidos que no afectan o alteran significativamente las características de unión del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos. Tales modificaciones conservativas incluyen sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos. Pueden introducirse modificaciones en un anticuerpo de la divulgación mediante técnicas estándar conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones de aminoácidos conservativas son aquellas en las que el residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por tanto, por ejemplo, uno o más residuos de aminoácidos dentro de las regiones CDR de un anticuerpo de la divulgación pueden reemplazarse con otros residuos de aminoácidos de la misma familia de cadenas laterales y el anticuerpo alterado puede evaluarse para determinar la capacidad de unirse a FRp usando los ensayos funcionales descritos en el presente documento.

Un promotor "constitutivo" es una secuencia de nucleótidos que, cuando se une operativamente con un polinucleótido que codifica o especifica un producto génico, hace que el producto génico se produzca en una célula en la mayoría o todas las condiciones fisiológicas de la célula.

"Citoplasmático" e "intracelular", según se aplican a moléculas adaptadoras y dominios de señalización, se usan indistintamente en el presente documento. Por ejemplo, un dominio citoplasmático o intracelular comprende un dominio de una proteína citoplasmática (por ejemplo, una proteína que normalmente se encuentra en el citosol de una célula), o comprende un dominio de una proteína, típicamente una proteína transmembrana (por ejemplo, una proteína, péptido o polipéptido que comprende un péptido o polipéptido que atraviesa una membrana celular), donde el dominio está ubicado en el citoplasma de una célula. En una realización, una proteína transmembrana incluye un receptor integrado en la membrana. En una realización, un dominio citoplasmático o intracelular comprende un dominio citoplasmático o intracelular de un receptor descrito en el presente documento, por ejemplo, un receptor de células T o un NKR. En otros ejemplos, un dominio citoplasmático o intracelular comprende un dominio de una proteína citoplasmática de células T o células NK. En algunos ejemplos, un dominio citoplasmático o intracelular comprende un dominio de una molécula adaptadora descrita en el presente documento, por ejemplo, de una célula T o una célula NK. En otros ejemplos, un dominio citoplasmático o intracelular comprende un dominio citoplasmático de una molécula inhibidora descrita en el presente documento. En una realización, un dominio citoplasmático o intracelular comprende un dominio citoplasmático de NKR, que es un dominio de un NKR que se encuentra naturalmente en el citoplasma de una célula. Los dominios citoplasmáticos de NKR se describen con mayor detalle a continuación. Los dominios citoplasmáticos o intracelulares pueden incluir dominios de señalización, por ejemplo, dominios de señalización intracelulares, que pueden incluir dominios de señalización primarios y dominios coestimuladores. Los dominios primarios y coestimuladores se describen con mayor detalle a continuación.

"Codificación" se refiere a la propiedad inherente de secuencias específicas de nucleótidos en un polinucleótido, tal como un gen, un ADNc o un ARNm, para servir como plantillas para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procesos biológicos que tienen una secuencia definida de nucleótidos (es decir, ARNr, ARNt y ARNm) o una secuencia de aminoácidos y las propiedades biológicas resultantes de la misma. Por consiguiente, un gen codifica una proteína si la transcripción y traducción del ARNm correspondiente a ese gen produce la proteína en una célula u otro sistema biológico. Tanto la cadena codificante, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia de ARNm y generalmente se proporciona en listas de secuencias, como la cadena no codificante, utilizada como plantilla para la transcripción de un gen o ADNc, pueden referirse como codificante de la proteína u otro producto de ese gen o ADNc.

A menos que se especifique lo contrario, una "secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos" incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas entre sí y que codifican la misma secuencia de aminoácidos. Las secuencias de nucleótidos que codifican proteínas y ARN pueden incluir intrones. "Cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se utilizan indistintamente en el presente documento y se refieren a una cantidad de un compuesto, formulación, material o composición, tal como se describe en el presente documento, eficaz para lograr un resultado biológico particular. Tales resultados pueden incluir, pero no se limitan a, la inhibición de infección viral, tal como se determina por cualquier medio en la técnica.

El término "expresión", tal como se usa en el presente documento, se define como la transcripción y/o traducción de una secuencia de nucleótidos particular dirigida por su promotor.

"Vector de expresión" se refiere a un vector que comprende un polinucleótido recombinante que comprende secuencias de control de expresión unidas operativamente a una secuencia de nucleótidos que se va a expresar. Un vector de expresión comprende suficientes elementos que actúan en cis para la expresión; otros elementos para la expresión pueden ser suministrados por la célula huésped o en un sistema de expresión in vitro. Los vectores de expresión incluyen todos los conocidos en la técnica, tales como cósmidos, plásmidos (por ejemplo, desnudos o contenidos en liposomas) y virus (por ejemplo, lentivirus, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados) que incorporan el polinucleótido recombinante.

FcR-CAR, tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un CAR que comparte propiedades funcionales y estructurales con un FcR. Los FcR-CAR se describen en el presente documento con mayor detalle a continuación.

"Homólogo", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la identidad de secuencia de subunidades entre dos moléculas poliméricas, por ejemplo, entre dos moléculas de ácido nucleico, tales como dos moléculas de ADN o dos moléculas de ARN, o entre dos moléculas de polipéptido. Cuando una posición de subunidad en ambas moléculas está ocupada por la misma subunidad monomérica; por ejemplo, si una posición en cada una de las dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, entonces son homólogas en esa posición. La homología entre dos secuencias es una función directa del número de posiciones coincidentes u homólogas; por ejemplo, si la mitad (por ejemplo, cinco posiciones en un polímero de diez subunidades de longitud) de las posiciones en dos secuencias son homólogas, las dos secuencias son 50% homólogas; si el 90% de las posiciones (por ejemplo, 9 de 10) coinciden o son homólogas, las dos secuencias son un 90% homólogas.

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de anticuerpos de unión a antígeno) que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor se reemplazan por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región estructural (FR) de Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de estructura o CDR importadas. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente y optimizar el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá de manera óptima al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann y col., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992.

En el contexto de la presente invención, se utilizan las siguientes abreviaturas para las bases de ácido nucleico que se encuentran habitualmente. "A" se refiere a adenosina, "C" se refiere a citosina, "G" se refiere a guanosina, "T" se refiere a timidina y "U" se refiere a uridina.

A menos que se especifique lo contrario, una "secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos" incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas entre sí y que codifican la misma secuencia de aminoácidos. La frase secuencia de nucleótidos que codifica una proteína o un ARN también puede incluir intrones en la medida en que la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína puede contener en alguna versión un intrón o intrones.

KIR-CAR, tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un CAR que comparte propiedades funcionales y estructurales con un KIR. Los KIR-CAR se describen en el presente documento con mayor detalle a continuación.

Un "lentivirus" tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un género de la familia Retroviridae. Los lentivirus son únicos entre los retrovirus en poder infectar células que no se dividen; pueden suministrar una cantidad significativa de la información genética en el ADN de la célula huésped, por lo que son uno de los procedimientos más eficientes de un vector de suministro de genes. El VIH, el VIS y el VIF son todos ejemplos de lentivirus. Los vectores derivados de lentivirus ofrecen los medios para lograr niveles significativos de transferencia de genes in vivo.

El Ly49-CAR, tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un CAR que comparte propiedades funcionales y estructurales con Ly49. Los Ly49-CARs se describen en el presente documento con mayor detalle a continuación.

El NCR-CAR, tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un CAR que comparte propiedades funcionales y estructurales con un NCR. Los NCR-CARs se describen en el presente documento con mayor detalle a continuación.

El receptor de función inmune de células NK (o NKR), tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a una proteína de transmembrana de origen natural endógena expresada en células NK, que puede unirse a un ligando en una célula presentadora de antígeno y modular la respuesta de función inmune de células NK, por ejemplo, puede modular la actividad citolítica o la secreción de citocinas de la célula NK. El NKR puede contribuir a la activación (un NKR activador o actNKR) o la inhibición (un NKR inhibidor o inhNKR). Normalmente, un NKR comprende un dominio de unión a ligando extracelular (ECD), un dominio transmembrana (TM) y un dominio citoplasmático intracelular (ICD). Los NKR incluyen la familia de receptores del Receptor de tipo Inmunoglobulina de células asesinas (KIR), tales como KIR2DS2, la familia de receptores del receptor de células NK (NCR), tales como NKp46 (NCR1), la familia de receptores del receptor de activación de linfocitos de señalización (SLAM) (SLAMF), tales como 2B4, y los receptores de unión a Fc, tales como el receptor de unión a IgG, CD16 (FcyRNI). Los ejemplos de respuestas de función inmunitaria de células NK moduladas por los NKR comprenden la destrucción de las células diana (a menudo denominado citotoxicidad o citólisis), secreción y/o proliferación de citocinas. Normalmente, un NKR adecuado para su uso en los procedimientos y las composiciones descritos en el presente documento es un NKR humano (o hNKR). En una realización, también se incluye la familia de receptor Ly49 en Mus musculus, que surgió por evolución convergente para proporcionar la misma función que un KIR en células NK y T murinas.

El NKR-CAR, tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un CAR que comparte propiedades funcionales y estructurales con un NKR o una molécula adaptadora de una célula NK. Los NKR-CARs se describen en el presente documento con mayor detalle a continuación.

El término "unido operativamente" se refiere a la unión funcional entre una secuencia reguladora y una secuencia de ácido nucleico heteróloga que da como resultado la expresión de este último. Por ejemplo, una primera secuencia de ácido nucleico está operativamente unida con una segunda secuencia de ácido nucleico cuando la primera secuencia de ácido nucleico se coloca en una relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor está operativamente unido a una secuencia codificante si el promotor afecta la transcripción o la expresión de la secuencia codificante. Generalmente, las secuencias de ADN operativamente unidas son contiguas y, cuando es necesario para unir dos regiones codificantes de proteínas, en el mismo marco de lectura. La administración "parenteral" de una composición inmunogénica incluye, por ejemplo, inyección subcutánea (s.c.), intravenosa (i.v.), intramuscular (i.m.) o intraesternal, o técnicas de infusión.

El término "polinucleótido", tal como se usa en el presente documento, se define como una cadena de nucleótidos. Además, los ácidos nucleicos son polímeros de nucleótidos. Por tanto, los ácidos nucleicos y polinucleótidos como se usan en el presente documento son intercambiables. Un experto en la materia tiene el conocimiento general de que los ácidos nucleicos son polinucleótidos, que pueden hidrolizarse en los "nucleótidos" monoméricos. Los nucleótidos monoméricos se pueden hidrolizar en nucleósidos. Tal como se usa en el presente documento, los polinucleótidos incluyen, pero no se limitan a, todas las secuencias de ácido nucleico que se obtienen por cualquier medio disponible en la técnica, incluyendo, sin limitación, medios recombinantes, es decir, la clonación de secuencias de ácido nucleico de una biblioteca recombinante o un genoma de células, usando tecnología de clonación ordinaria y PCR™, y similares, y por medios sintéticos.

Tal como se usa en el presente documento, los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente, y se refieren a un compuesto compuesto por residuos de aminoácidos unidos de manera covalente por enlaces peptídicos. Una proteína o un péptido debe contener al menos dos aminoácidos y no se impone ninguna limitación al número máximo de aminoácidos que puede comprender la secuencia de una proteína o un péptido. Los polipéptidos incluyen cualquier péptido o proteína que comprenda dos o más aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos. Tal como se usa en el presente documento, el término se refiere tanto a cadenas cortas, que también se denominan comúnmente en la técnica como péptidos, oligopéptidos y oligómeros, por ejemplo, como a cadenas más largas, que generalmente se denominan en la técnica como proteínas, de las cuales hay muchos tipos. Los "polipéptidos" incluyen, por ejemplo, fragmentos biológicamente activos, polipéptidos sustancialmente homólogos, oligopéptidos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipéptidos, polipéptidos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusión, entre otros. Los polipéptidos incluyen péptidos naturales, péptidos recombinantes, péptidos sintéticos o una combinación de los mismos.

El término "promotor", tal como se usa en el presente documento, se define como una secuencia de ADN reconocida por la maquinaria sintética de la célula, o maquinaria sintética introducida, necesaria para iniciar la transcripción específica de una secuencia de polinucleótidos.

Tal como se usa en el presente documento, el término "secuencia promotora/reguladora" significa una secuencia de ácido nucleico que se requiere para la expresión de un producto génico unido operativamente a la secuencia promotora/reguladora. En algunos casos, esta secuencia puede ser la secuencia promotora central y, en otros casos, esta secuencia también puede incluir una secuencia potenciadora y otros elementos reguladores que se requieren para la expresión del producto génico. La secuencia promotora/reguladora puede ser, por ejemplo, una que exprese el producto génico de una manera específica de tejido.

Un promotor "inducible" es una secuencia de nucleótidos que, cuando se une operativamente con un polinucleótido que codifica o especifica un producto génico, hace que el producto génico se produzca en una célula sustancialmente solo cuando está presente en la célula un inductor que corresponde al promotor.

TCAR (también denominado CAR estándar), tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un CAR que comparte propiedades funcionales y estructurales con un receptor de función inmune celular o una molécula adaptadora de una célula T. En casos, un TCAR comprende un dominio de antígeno, un dominio de señalización intracelular y opcionalmente uno o más dominios coestimuladores.

Un promotor "específico de tejido" es una secuencia de nucleótidos que, cuando se une operativamente con un polinucleótido que codifica o es especifica por un gen, hace que el producto génico se produzca en una célula sustancialmente solo si la célula es una célula del tipo tejido.

Una "vía de transducción de señales" se refiere a la relación bioquímica entre una variedad de moléculas de transducción de señales que desempeñan un papel en la transmisión de una señal desde una parte de una célula a otra parte de una célula. La frase "receptor de la superficie celular" incluye moléculas y complejos de moléculas capaces de recibir una señal y transmitirla a través de la membrana de una célula.

El término "sujeto" pretende incluir organismos vivos en los que se puede provocar una respuesta inmunitaria (por ejemplo, mamíferos).

Tal como se usa en el presente documento, una célula "sustancialmente purificada" es una célula que está esencialmente libre de otros tipos de células. Una célula sustancialmente purificada también se refiere a una célula que se ha separado de otros tipos de células con las que normalmente está asociada en su estado natural. En algunos casos, una población de células sustancialmente purificadas se refiere a una población homogénea de células. En otros casos, este término se refiere simplemente a las células que se han separado de las células con las que están asociadas naturalmente en su estado natural. En algunas realizaciones, las células se cultivan in vitro. En otras realizaciones, las células no se cultivan in vitro.

Como se usa en el presente documento, un casquete 5' (también denominado casquete de ARN, un casquete de ARN 7-metilguanosina o un casquete de ARN m7G) es un nucleótido de guanina modificado que se ha agregado al extremo "frontal" o 5' de un ARN mensajero eucariota poco después del inicio de la transcripción. El casquete 5 'consiste en un grupo extremo terminal que está unido al primer nucleótido transcrito. Su presencia es fundamental para el reconocimiento por parte del ribosoma y la protección frente a las ARNasas. La adición del casquete está acoplada a la transcripción y se produce cotranscripcionalmente, de modo que cada una influye en la otra. Poco después del inicio de la transcripción, el extremo 5 'del ARNm que se sintetiza se une a un complejo de síntesis de casquete asociado con la ARN polimerasa. Este complejo enzimático cataliza las reacciones químicas necesarias para el capping del ARNm. La síntesis procede como una reacción bioquímica de varios pasos. El resto de capping se puede modificar para modular la funcionalidad de ARNm tal como su estabilidad o eficiencia de traducción.

Como se usa en el presente documento, "ARN transcrito in vitro" se refiere a ARN, preferiblemente ARNm, que se ha sintetizado in vitro. Generalmente, el ARN transcrito in vitro se genera a partir de un vector de transcripción in vitro. El vector de transcripción in vitro comprende una plantilla que se usa para generar el ARN transcrito in vitro. Como se usa en el presente documento, un "poli (A)" es una serie de adenosinas unidas por poliadenilación al ARNm. En la realización preferida de una construcción para la expresión transitoria, el poliA está entre 50 y 5000, preferiblemente mayor que 64, más preferiblemente mayor que 100, lo más preferiblemente mayor que 300 o 400. Las secuencias de poli(A) se pueden modificar química o enzimáticamente para modular la funcionalidad de ARNm como la localización, la estabilidad o la eficiencia de la traducción.

Tal como se usa en el presente documento, "poliadenilación" se refiere al enlace covalente de un resto poliadenililo, o su variante modificada, a una molécula de ARN mensajero. En los organismos eucariotas, la mayoría de las moléculas de ARN mensajero (ARNm) están poliadeniladas en el extremo 3'. La cola 3' poli(A) es una secuencia larga de nucleótidos de adenina (a menudo varios cientos) añadidos al pre-ARNm mediante la acción de una enzima, poliadenilato polimerasa. En eucariotas superiores, la cola de poli(A) se agrega a las transcripciones que contienen una secuencia específica, la señal de poliadenilación. La cola de poli(A) y la proteína unida a ella ayudan a proteger el ARNm de la degradación por exonucleasas. La poliadenilación también es importante para la terminación de la transcripción, la exportación del ARNm desde el núcleo y la traducción. La poliadenilación ocurre en el núcleo inmediatamente después de la transcripción de ADN en ARN, pero, además, también puede ocurrir más tarde en el citoplasma. Una vez finalizada la transcripción, la cadena de ARNm se escinde mediante la acción de un complejo de endonucleasa asociado con la ARN polimerasa. El sitio de escisión se caracteriza habitualmente por la presencia de la secuencia de bases AAUAAA cerca del sitio de escisión. Una vez que se ha escindido el ARNm, se añaden residuos de adenosina al extremo 3' libre en el sitio de escisión.

Como se usa en el presente documento, "transitorio" se refiere a la expresión de un transgén no integrado durante un período de horas, días o semanas, en el que el período de tiempo de expresión es menor que el período de tiempo para la expresión del gen si está integrado en el genoma o contenido dentro de un replicón de plásmido estable en la célula huésped.

El término "terapéutico" como se usa en el presente documento significa un tratamiento y/o profilaxis. Un efecto terapéutico se obtiene mediante la supresión, la remisión o la erradicación de una enfermedad.

El término "transfectado" o "transformado" o "transducido", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un proceso mediante el cual se transfiere o se introduce ácido nucleico exógeno en la célula huésped. Una célula "transfectada" o "transformada" o "transducida" es una que ha sido transfectada, transformada o transducida con ácido nucleico exógeno. La célula incluye la célula sujeto primaria y su progenie.

La frase "bajo control transcripcional" o "unido operativamente" como se usa en el presente documento significa que el promotor está en la ubicación y la orientación correctas en relación con un polinucleótido para controlar el inicio de la transcripción por la ARN polimerasa y la expresión del polinucleótido.

Un "vector" es una composición de materia que comprende un ácido nucleico aislado y que se puede usar para administrar el ácido nucleico aislado al interior de una célula. Se conocen numerosos vectores en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, polinucleótidos lineales, polinucleótidos asociados con compuestos iónicos o anfifílicos, plásmidos y virus. Por tanto, el término "vector" incluye un plásmido o virus de replicación autónoma. El término también debe interpretarse para incluir compuestos no plásmidos y no virales que facilitan la transferencia de ácido nucleico a las células, tales como, por ejemplo, compuestos de polilisina, liposomas y similares. Los ejemplos de vectores virales incluyen, pero no se limitan a, vectores adenovirales, vectores de virus adenoasociados, vectores retrovirales, vectores lentivirales y similares.

Por el término "estimulación", se entiende una respuesta primaria inducida por la unión de una molécula estimulante con su ligando afín mediando así un evento de transducción de señales, como, pero no limitado a, la transducción de señales a través del receptor apropiado, por ejemplo, receptor T o NK.

Rangos: a lo largo de esta descripción, se pueden presentar varios aspectos de la invención en un formato de rango. Debe entenderse que la descripción en formato de rango es meramente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance de la invención. Por consiguiente, se debe considerar que la descripción de un rango ha revelado específicamente todos los subrangos posibles, así como los valores numéricos individuales dentro de ese rango. Por ejemplo, se debe considerar que la descripción de un rango como de 1 a 6 tiene subrangos específicamente descritos como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como números individuales dentro de ese rango, por ejemplo, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del rango.

RECEPTORES DE ANTÍGENO QUIMÉRICO DE CÉLULAS ASESINAS NATURALES REGULABLES (RNKR-CARS)

En algunos aspectos, un CAR descrito en el presente documento comprende un NKR-CAR regulable (RNKR-CAR). En algunas realizaciones, un RNKR-CAR es un CAR que comprende un elemento (por ejemplo, dominio) de un receptor de células NK (por ejemplo, un receptor NK descrito en el presente documento, por ejemplo, seleccionado de la Tabla 24) y que comprende un dominio de conmutación que le permite ser regulado (por ejemplo, por una molécula de dimerización descrita en el presente documento).

En realizaciones, el RNKR-CAR se regula (por ejemplo, se activa) mediante la adición de una molécula de dimerización descrita en el presente documento. Por ejemplo, el RNKR-CAR no envía señales a los efectores posteriores a menos que se agregue una molécula de dimerización. En algunas realizaciones, una ventaja de un RNKR-CAR es la capacidad de regular temporalmente (por ejemplo, activar) la actividad de un NKR-CAr . Otra ventaja de un RNKR-CAR es que no requiere coestimulación (por ejemplo, no requiere la presencia de un dominio coestimulador) para provocar la proliferación de una célula que expresa el RNKR-CAR. En realizaciones, el RNKR-CAR es útil para regular la especificidad de una célula citotóxica, por ejemplo, célula T, para controlar la actividad fuera de diana de célula citotóxica diseñada para expresar el RNKR-CAR.

En una realización, el RNKR-CAR comprende un miembro de unión a antígeno que confiere especificidad para una célula diana, por ejemplo, una célula cancerosa, que comprende el antígeno unido por el dominio de unión a antígeno. En casos, el miembro de unión a antígeno de un RNKR-CAR comprende un elemento de dominio de unión (por ejemplo, un dominio de unión a antígeno, un dominio extracelular inhibidor o un dominio extracelular coestimulador), un dominio transmembrana, un primer dominio de conmutación y, opcionalmente, un dominio citoplasmático de NKR. El miembro de unión a antígeno puede comprender dominios en cualquier orientación desde el extremo N- a C- terminal o en la dirección extracelular a intracelular. Los miembros de unión a antígeno de ejemplo y sus componentes, por ejemplo, dominios de unión a antígeno, dominios extracelulares de moléculas inhibidoras o dominios extracelulares de moléculas coestimuladoras se describen en el presente documento. En el presente documento se describen miembros de unión a antígeno de ejemplo, moléculas inhibidoras, moléculas coestimuladoras, dominios transmembrana, dominios de conmutación, dominios citoplasmáticos NKR, por ejemplo, en las secciones DOMINIO DE UNIÓN A ANTÍGENO, MOLÉCULAS INHIBIDORAS, DOMINIO DE UNIÓN AL LIGANDO DE MOLÉCULAS COESTIMULADORA, DOMINIO TRANSMEMBRANA, DOMINIOS DE CONMUTACIÓN Y RECEPTORES DE FUNCIÓN INMUNE DE CÉLULAS NK (NKRS) Y CÉLULAS NK, RECEPTORES DE UNIÓN DE FC, LY49 Y RECEPTORES SIMILARES A LECTINA DE CÉLULAS ASESINAS.

En una realización, el RNKR-CAR comprende un miembro de señalización intracelular que genera una señal intracelular de una manera regulable, por ejemplo, mediante la adición de una molécula, por ejemplo, una molécula de dimerización descrita en el presente documento. La señal intracelular puede optimizar una propiedad efectora inmunitaria de la célula RNKR-CARX, por ejemplo, señales de activación (por ejemplo, actividad citolítica, secreción de citocinas, supervivencia celular y/o proliferación). En otras realizaciones, por ejemplo, en el caso de un RNKR-CARX inhibidor, la señal intracelular conduce a la abrogación de las señales de activación, lo que conduce a la inhibición de la actividad citolítica y productora de citocinas NK.

En presencia de una molécula de dimerización, el miembro de señalización intracelular se acopla (por ejemplo, se une a, de otra manera interactúa con, o se acerca a) al miembro de unión al antígeno. Por ejemplo, la molécula de dimerización acopla el primer conmutador al segundo conmutador. En un caso, el miembro de señalización intracelular está acoplado por la presencia de una molécula de dimerización a un elemento de reconocimiento extracelular, por ejemplo, un dominio de unión a antígeno del miembro de unión a antígeno.

En realizaciones, el miembro de unión intracelular comprende un segundo dominio de conmutación, un dominio citoplasmático de NKR o un dominio de señalización intracelular y, opcionalmente, un dominio transmembrana o un anclaje de membrana. El miembro de señalización intracelular puede comprender dominios en cualquier orientación desde el extremo N- al C- terminal. Los miembros de unión intracelular de ejemplo y sus componentes se describen aquí. Dominios de conmutación de ejemplo, dominios citoplasmáticos de n Kr , dominios de señalización intracelular y dominios transmembrana/amarres de membrana se describen en el presente documento, por ejemplo en las secciones DOMINIO DE SEÑALIZACIÓN INTRACELULAR, DOMINIO TRANSMEMBRANA, INTERRUPTORES DE DIMERIZACIÓN Y RECEPTRORES DE FUNCIÓN INMUNE DE CÉLULAS NK (NKRS) Y CÉLULAS NK (por ejemplo, KIR-CARS, KIR-CARS, NCRS, RECEPTORES SLAM, RECEPTORES DE UNIÓN DE FC, RECEPTORES LY49 Y SIMILARES A LECTINA DE CÉLULAS ASESINAS).

En realizaciones, el miembro de unión a antígeno comprende un dominio bisagra extracelular dispuesto entre el dominio transmembrana y el elemento de dominio de unión. Los dominios de bisagra extracelulares de ejemplo se describen en el presente documento, por ejemplo, en la sección DOMINIO DE BISAGRA EXTRACELULAR.

En realizaciones, un RNKR-CAR comprende un elemento, por ejemplo, un dominio, de cualquiera de los NKR descritos en el presente documento, por ejemplo, en los RECEPTORES DE FUNCIÓN INMUNITARIA DE CÉLULAS NK (NKR) Y CÉLULAS NK (por ejemplo, KIR-CARS, KIR-CARS, NCRS, RECEPTORES SLAM, RECEPTORES DE UNIÓN FC, LY49 Y RECEPTORES DE LECTINA DE CÉLULAS ASESINAS RELACIONADOS). Por consiguiente, un RNKR-CAR comprende cualquier tipo de NKR-CAR (por ejemplo, cualquier NKR-CAR descrito en el presente documento) que sea regulable con un conmutador. Por ejemplo, el RNKR-CAR comprende un receptor de inmunoglobulina asesino regulable-CAR (RKIR-CAR); un NCR-CAR regulable (RNCR-CAR); un receptor-CAR de Fc regulable (RFcR-CAR); un receptor-CAR regulable Ly49 (RLy49-CAR); o un receptor-CAR de SLAMF regulable (RSLAMF-CAR).

También se proporcionan en el presente documento ácidos nucleicos que codifican un RNKR-CAR descrito en el presente documento. También se proporcionan sistemas de vectores que comprenden ácidos nucleicos que codifican un RNKR-CAR descrito en el presente documento. También se proporcionan células que comprenden un RNKR-CAR descrito aquí, o un ácido nucleico que codifica un RNKR-CAR descrito aquí, o un sistema de vector que comprende un ácido nucleico que codifica un RNKR-CAR descrito aquí. Los ácidos nucleicos y los sistemas de vectores se describen con mayor detalle en el presente documento, por ejemplo, en la sección VECTORES. Las células adecuadas para su uso de acuerdo con la invención, por ejemplo, para expresar o contener RNKR-CAR, se describen aquí, por ejemplo, en la sección FUENTES DE CÉLULAS.

También se describe en el presente documento un procedimiento para hacer una célula que expresa RNKR-CAR descrito en el presente documento, un procedimiento para usar una célula que expresa RNKR-CAR descrito en el presente documento, un procedimiento para proporcionar una célula que expresa RNKR-CAR descrito en el presente documento, o un procedimiento para tratar a un sujeto con una enfermedad asociada con un antígeno tumoral que comprende administrar una célula que expresa RNKR-CAR descrita en el presente documento.

COMBINACIÓN DE RCAR Y NKR-CAR

En el presente documento se proporciona una combinación de RCAR y NKR-CAR en/en una célula, por ejemplo, donde ambos tipos de CAR se expresan en/sobre la misma célula. Estas células se denominan células RCAR/NKR-CAR o células R^cAR/NKR-CARX. En algunos casos, el NKR-CAR comprende un NKR-CAR inhibidor (inhNKR-CAR) y el RCAR comprende un RCAR activador. En algunos ejemplos, el inhNKR-CAR amortigua la señal de activación (por ejemplo, Actividad citolítica, secreción de citocinas, supervivencia celular y/o proliferación) del RCAR, por ejemplo, Cuando el RCAR se activa mediante la adición de una molécula de dimerización. En algunos casos, esto puede prevenir la sobreactivación de las propiedades de destrucción de células (por ejemplo, Actividad citolítica, secreción de citocinas) que a su vez pueden causar la muerte de un número excesivo de células no diana (por ejemplo, no cancerosas). De este modo, la presencia del inhNKR-CAR en la misma célula como un RCAR puede servir como mecanismo de seguridad.

En algunos casos, el dominio de unión a antígeno del RCAR es diferente del dominio de unión a antígeno del NKR-CAR (por ejemplo, InhNKR-CAR). Por ejemplo, el dominio de unión a antígeno del RCAR se dirige a un antígeno diferente al dominio de unión a antígeno del NKR-CAR (por ejemplo, inhNR-CAR). En realizaciones, el dominio de unión a antígeno comprende un dominio de unión a antígeno descrito en el presente documento, por ejemplo, en la sección DOMINIO DE UNIÓN A ANTÍGENO. Por ejemplo, el dominio de unión a antígeno se une a un antígeno tumoral. En realizaciones, el dominio de unión a antígeno del inhNKR-CAR se une a un antígeno diana que se expresa en células normales, por ejemplo, células no tumorales o no cancerosas, pero que no se expresa en gran medida en células cancerosas o tumorales.

En algunos casos, al dirigirse a una célula normal o no cancerosa, el inhNKR-CAR reduce la activación de las propiedades de destrucción celular por el RCAR cuando la célula RCAR/NKR-CARX está cerca de la célula normal o no cancerosa. . Por ejemplo, el inhNKR-CAR reduce la activación de las propiedades de destrucción celular del RCAR cuando el inhNKR-CAR se une a su antígeno diana en una célula normal/no cancerosa. En otros ejemplos, una célula RCAR/NKR-CARX (que expresa tanto un RCAR como un inhNKR-CAR) exhibe una menor activación de las propiedades de destrucción celular en comparación con una célula que expresa un RCAR sin un inhNKR-CAR. En realizaciones, cuando los dominios de unión a antígeno del RCAR y el inhNKR-CAR se unen ambos a sus antígenos diana, la célula RCAR/inhNKR-CARX no se activa.

En realizaciones, el dominio de unión a antígeno del RCAR o inhNKR-CAR comprende un dominio ligero variable y un dominio pesado variable, y el otro (por ejemplo, RCAR o inhNKR-CAR) no es un scFv.

En algunas realizaciones, la célula RCAR/NKR-CAR comprende un RCAR y un NKR-CAR. En realizaciones, la célula RCAR/NKR-CAR comprende un ácido nucleico que codifica un RCAR y un NKR-CAR. En realizaciones, una única molécula de ácido nucleico comprende una secuencia que codifica un RCAR y una secuencia un NKR-CAR. En otras realizaciones, el ácido nucleico comprende una primera molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un RCAR y una segunda molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un NKR-CAR.

En realizaciones, la célula RCAR/NKR-CAR comprende un sistema de vector/vector que comprende un ácido nucleico que codifica un RCAR y un NKR-CAR. En algunos ejemplos, un solo vector comprende una secuencia que codifica un RCAR y una secuencia que codifica un NKR-CAR. En otros ejemplos, el sistema de vector comprende un primer vector que comprende una secuencia que codifica un RCAR y un segundo vector que comprende una secuencia que codifica un NKR-CAR.

Los ácidos nucleicos y los vectores/sistemas de vectores que codifican un RCAR y/o NKR-CAR se describen en el presente documento.

Los procedimientos para usar o proporcionar una célula RCAR/NKR-CAR se describen en el presente documento. En ciertos casos, el RCAR comprende un RCAR descrito en el presente documento, por ejemplo, que comprende un miembro de señalización intracelular, un miembro de unión a antígeno y un dominio transmembrana. En casos, el NKR-CAR comprende un NKR-CAR descrito en el presente documento, por ejemplo, que comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático (por ejemplo, dominio citoplasmático NKR). En algunas realizaciones, el NKR-CAR comprende un NKR-CAR inhibidor, tal como inhKIR-CAR, inhSLAMF-CAR o inhL49-CAR.

CONMUTADORES DE DIMERIZACIÓN

En realizaciones, un RCAR o RNKR-CAR descrito en el presente documento comprende un conmutador de dimerización. Los conmutadores de dimerización pueden ser no covalentes o covalentes, dependiendo de la forma de interacción entre los dominios de conmutación.

CONMUTADORES DE DIMERIZACIÓN NO COVALENTES

En un conmutador de dimerización no covalente, la molécula de dimerización promueve una interacción no covalente entre los dominios de conmutación. Ejemplos de conmutadores de dimerización no covalentes incluyen los conmutadores de dimerización basados en FKB^p/F^rAP, los conmutadores de dimerización basados en GyrB-GyrB y los conmutadores de dimerización basados en giberelina, descritos en el presente documento.

CONMUTADORES DE DIMERIZACIÓN BASADOS EN FKBP/FRB.

FKBP12 (FKBP o proteína de unión a FK506) es una proteína citoplasmática abundante que sirve como diana intracelular inicial para el fármaco inmunosupresor de producto natural, rapamicina. La rapamicina se une a FKBP y al homólogo de PI3K grande FRAP (RAFT, mTOR), actuando así para dimerizar estas moléculas.

En realizaciones, un conmutador basado en FKBP/FRAP, también denominado aquí como un conmutador basado en FKBP/FRB, puede usar una molécula de heterodimerización, por ejemplo, rapamicina o un análogo de rapamicina. FRB es una parte de 93 aminoácidos de FRAP, que es suficiente para unirse al complejo FKBP-rapamicina (Chen, J., Zheng, XF, Brown, EJ & Schreiber, SL (1995) Identification of an 11-kDa FKBP12-rapamycinbinding domain within the 289-kDa FKBP12-rapamycin-associated protein and characterization of a critical serine residue. Proc Natl Acad Sci USA 92: 4947-51).

Las secuencias de FKBP son las siguientes:

FKBP D V P D Y A S L G G P S S P K K K R K V S R G V O V E T I S P G D G R T F P K R G O T C V V H Y T G M L E D G K K F D S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A O M S V G O R A K F T I S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H A T F V F D V E L L K L E T S Y (SEQ ID NO: 1)

En realizaciones, un dominio de conmutación de FKBP puede comprender un fragmento de unión a FRB de FKBP, por ejemplo, la parte subrayada de SEQ ID NO 1, que es:

V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K F D S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L T I S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H A T L V F D V E L L K L E T S (SEQ ID NO:141).

La secuencia de FRB es la siguiente:

ILWHEMWHEG LEEASRLYFG ERNVKGMFEV LEPLHAMMER GPQTLKETSF NQAYGRDLME AQEWCRKYMK SGNVKDLTQA W DLYYHVFRRISK

(SEQ ID NO: 2)

En una realización, un dominio de conmutación comprende residuos de aminoácidos descritos en SEQ ID NO: 1, o un fragmento de unión a FRB o un análogo del mismo, por ejemplo, SEQ ID NO: 141, y un dominio de conmutación comprende residuos de aminoácidos descritos en SEQ ID NO: 2 o un fragmento de unión a FKPB o un análogo del mismo. En una realización, el fragmento de unión a FRB de FKBP comprende 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 75, 80, 85 o 90 aminoácidos de la secuencia de FKBP, SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 141. En una realización, el fragmento de unión a FRB de FKBP es al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 aminoácidos más corto que la secuencia de FKBP, SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 141. En una realización, el fragmento de unión a FKBP de Fr B comprende 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 75, 80, 85 o 90 aminoácidos de la secuencia de FRB, SEQ ID NO: 2. En una realización, el fragmento de unión a FKBP de FRB es al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 aminoácidos más corto que la secuencia de FRB, SEQ ID NO: 2. En una realización, el fragmento de unión a FKBP o análogo de FRB comprende una o más mutaciones que potencian la formación de un complejo entre un dominio de conmutación de FKBP, un dominio de conmutación de FRB y la molécula de dimerización, por ejemplo, rapamicina o un rapálogo, por ejemplo RAD001, o una mutación descrita en la sección titulada CONMUtAd Or ES DE DIMERIZACIÓN Ba Sa d Os EN FKBP/FRB MODIFICADOS. Por ejemplo, el fragmento de unión a FKBP o análogo de FRB comprende: una mutación E2032, por ejemplo, una mutación E2032I o una mutación E2032L; una mutación T2098, por ejemplo, una mutación T2098L; o una mutación E2032 y T2098, por ejemplo, una mutación E2032I y una mutación T2098L o una mutación E2032L y una mutación T2098L.

En una realización, un dominio de conmutación comprende residuos de aminoácidos descritos en SEQ ID NO: 1 (o SEQ ID NO: 141) y un dominio de conmutación comprende residuos de aminoácidos descritos en SEQ ID NO: 2. En realizaciones, un dominio de conmutación, o una rapamicina, o rapalog, por ejemplo, RAD001, secuencia de unión al mismo, tendrá al menos 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, o identidad del 99% con la secuencia FKBP de SEQ ID NO: 1 (o SEQ ID NO: 141). En realizaciones, un dominio de conmutación, o una rapamicina, o rapalog, por ejemplo, RAD001, su secuencia de unión, diferirá en no más de 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de la secuencia correspondiente de SEQ ID NO: 1 (o SEQ ID NO: 141).

En una realización, un dominio de conmutación se une a FRB (o FRB y rapamicina, o un análogo de rapamicina) y tiene al menos 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% identidad con, o difiere en no más de 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de la secuencia FKBP de SEQ ID NO: 1.

En realizaciones, un dominio de conmutación, o una rapamicina, o rapalog, por ejemplo, RAD001, secuencia de unión al mismo, tendrá al menos 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, o 99% de identidad con la secuencia FRB de SEQ ID NO: 2. En realizaciones, un dominio de conmutación, o una rapamicina, o rapalog, por ejemplo, RAD001, su secuencia de unión, diferirá en no más de 35, 30, 25, 20 , 15, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de la secuencia correspondiente de SEQ ID NO: 2.

En una realización, el otro dominio de conmutación se une a FKBP (o FKBP y rapamicina, o un análogo de rapamicina) y tiene al menos 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% identidad con, o difiere en no más de 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de la secuencia FRB de SEQ ID NO: 2. Véase, por ejemplo, Figura 2.

En realizaciones, un dominio de conmutación, o una rapamicina, o rapalog, por ejemplo, RAD001, secuencia de unión al mismo, tendrá al menos 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con una secuencia FKBP no humana, por ejemplo, mamífero, por ejemplo, roedor, por ejemplo, ratón, rata o hámster. En realizaciones, un dominio de conmutación, o una rapamicina, o rapalog, por ejemplo, RAD001, su secuencia de unión, diferirá en no más de 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de una FKBP no humana, por ejemplo, mamífero, por ejemplo, roedor, por ejemplo, ratón, rata o hámster.

En una realización, el dominio de conmutación se une a FRB (o FRB y rapamicina, o un análogo de rapamicina) y tiene al menos 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con, o difiere en no más de 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de un no humano, por ejemplo, mamífero, por ejemplo, roedor, por ejemplo, ratón, rata o hámster, FKBP.

En realizaciones, un dominio de conmutación, o una rapamicina, o rapalog, por ejemplo, RAD001, secuencia de unión al mismo, tendrá al menos 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, o 99% de identidad con una secuencia FRB no humana, por ejemplo, mamífero, por ejemplo, roedor, por ejemplo, ratón, rata o hámster. En realizaciones, un dominio de conmutación, o una rapamicina, o rapalog, por ejemplo, RAD001, su secuencia de unión, diferirá en no más de 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de una secuencia FRB no humana, por ejemplo, mamífero, por ejemplo, roedor, por ejemplo, ratón, rata o hámster.

En una realización, el otro dominio de conmutación se une a FKBP (o FKBP y rapamicina, o un análogo de rapamicina) y tiene al menos 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% identidad con, o difiere en no más de 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de un no humano, por ejemplo, mamífero, por ejemplo, roedor, por ejemplo, ratón, rata o hámster, FRB.

"FKBP/FRAP, por ejemplo, un conmutador basado en FKBP/FRB", tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un conmutador de dimerización que comprende: un primer dominio de conmutación, que se une a rapamicina, o un análogo de rapamicina, y tiene al menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con, o difiere en no más de 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de la secuencia FKBP de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 141; y un segundo dominio de conmutación, que se une a rapamicina, o un análogo de rapamicina, y tiene al menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con, o difiere en no más de 30 , 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de la secuencia FRB de SEQ ID NO: 2. Véase, por ejemplo, la Fig. 2.

En realizaciones, un conmutador basado en FKBP/FRB puede usar una molécula de heterodimerización, por ejemplo, un análogo de rapamicina, que carece de las propiedades indeseables de la rapamicina, por ejemplo, carece o tiene menos actividad inmunosupresora.

CONMUTADORES DE DIMERIZACIÓN BASADOS EN FKBP/FRB MODIFICADOS

También se proporcionan en el presente documento conmutadores de dimerización FKBP/FRB mejorados, en los que el dominio de conmutación basado en FRB comprende una o más mutaciones que optimizan el rendimiento, por ejemplo, que alteran, por ejemplo, mejoran la formación de un complejo entre un dominio de conmutación de FKB^p, un dominio de conmutación de FRB y la molécula de dimerización, por ejemplo, rapamicina, o un rapálogo, por ejemplo, RAD001. En una realización, el dominio de conmutación basado en FRB que comprende una o más mutaciones, también denominado en el presente documento "FRB mutante", comprende una mayor afinidad por una molécula de dimerización, por ejemplo, rapamicina o un rapalog, por ejemplo, en comparación con la afinidad de un dominio de conmutación basado en FRB de tipo salvaje para la molécula de dimerización.

Sin desear estar ligado a la teoría, se cree que las mutaciones descritas en el presente documento pueden permitir el uso de concentraciones más bajas de la molécula de dimerización para ensamblar el RCAR o RNKR-CAR. Algunas moléculas de dimerización que dimerizan los conmutadores de dimerización de FKBP/FRB exhiben efectos inmunosupresores y, por lo tanto, previenen o mitigan los efectos beneficiosos de la terapia RCAR o RNKR-CAR. Por lo tanto, la capacidad de usar concentraciones más bajas de la molécula de dimerización para ensamblar RCAR o RNKR-CAR puede aumentar la ventana terapéutica para la actividad celular que expresa RCAR o RNKR-CAR, por ejemplo, aumentar el rango de dosis de la molécula de dimerización que se puede usar sin inducir inmunosupresión y, por lo tanto, da como resultado el aumento del beneficio terapéutico de la célula que expresa RCAR o RNKR-CAR. Alternativamente o además, sin desear estar ligado a la teoría, se cree que las mutaciones descritas en el presente documento pueden dar como resultado la unión preferencial de la molécula de dimerización al FRB mutante en lugar de unirse e inhibir FRAP/mTOR endógeno. La prevención de la inhibición de FRAP/mTOR endógeno disminuye o inhibe los efectos adversos asociados con la inhibición de FRAP/mTOR endógeno, por ejemplo, toxicidad o inmunosupresión.

Un FRB mutante puede identificarse usando el procedimiento de selección descrito en el presente documento. Primero, las regiones o residuos de aminoácidos en un FRB de tipo salvaje que están presentes en el bolsillo de unión a la molécula de dimerización del FRB de tipo salvaje plegado de forma nativa, o que contribuyen a la interacción, por ejemplo, directa o indirectamente, con la molécula de dimerización, pueden determinarse a partir de datos estructurales, por ejemplo, estructuras cristalográficas de rayos X, o modelado informático, por ejemplo, homología o modelado comparativo de proteínas homólogas unidas a la molécula de dimerización o derivados de la misma. Se puede generar un FRB mutante candidato mutando una región diana o un residuo diana, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio de PCR. En una realización, se puede generar una biblioteca de mutantes de FRB candidatos que comprenden una o más mutaciones puntuales usando un enfoque de mutagénesis de saturación, donde un residuo diana se muta a todos los demás aminoácidos posibles aleatorizando el codón que codifica el residuo diana. La aleatorización de cada codón correspondiente a un residuo diana se puede lograr utilizando una biblioteca de codones que represente los 20 aminoácidos, por ejemplo, una biblioteca NNK, donde N puede ser adenina (A), citosina (C), guanina (G) o timina (T), y K puede ser guanina (G) o timina (T). La Tabla 13 muestra la distribución de codones de una biblioteca NNK ejemplar y los aminoácidos correspondientes. Cada codón de la biblioteca NNK se incorpora en la posición del residuo diana, produciendo así una biblioteca de mutantes FRB candidatos para cada posición del residuo diana donde la posición del residuo diana se ha mutado a todos los demás aminoácidos posibles. La biblioteca de mutantes de FRB candidatos se puede cribar para identificar los mutantes de FRB descritos en el presente documento.

Tabla 13. Biblioteca de NNK

Se pueden usar varios ensayos de cribado para evaluar cada FRB mutante candidato para identificar el FRB mutante que mejora la formación de un complejo entre un dominio de conmutación de FKBP, un dominio de conmutación de FRB y la molécula de dimerización, por ejemplo, rapamicina, o un rapalog, por ejemplo, RAD001. En un ensayo de unión directa, se incuba FRB mutante candidato no marcado en solución con FKBP de tipo salvaje marcado en presencia de la molécula de dimerización, por ejemplo, en condiciones adecuadas para la unión a FRB a la molécula de dimerización y dimerización de FRB y FKBP. La FKBP marcada se puede eliminar de la reacción mediante purificación por afinidad; También se eliminará el FRB candidato mutante que sea capaz de unirse a la molécula de dimerización y dimerizar con la FKBP marcada. La cantidad de FRB mutante candidato libre que no se dimeriza con la FKBP de tipo salvaje marcada puede calcularse determinando la concentración de proteína de la reacción. Los valores de CE50 para la afinidad de unión directa pueden calcularse a continuación usando procedimientos conocidos en la técnica.

Alternativamente o además del ensayo de unión directa descrito anteriormente, también se puede realizar un ensayo de unión competitiva para identificar un FRB mutante. En este ensayo, una FRB mutante candidata no etiquetada se incuba en solución con: 1) FKBP de tipo salvaje unida a una primera etiqueta, por ejemplo, FKBP de tipo salvaje biotinilada; 2) FRB de tipo salvaje enlazado a una segunda etiqueta, por ejemplo, FRB de tipo salvaje marcado con FLAG; y 3) la molécula de dimerización; en condiciones adecuadas para la unión a FRB a la molécula de dimerización y dimerización de FRB y FKBP. La FKBP de tipo salvaje marcada y la FRB de tipo salvaje marcada pueden eliminarse de la reacción mediante purificación por afinidad. La cantidad de FRB mutante candidato libre que no se dimeriza con la FKBP de tipo salvaje marcada en presencia de FRB de tipo salvaje puede calcularse determinando la concentración de proteína de la reacción.

En una realización, un FRB mutante comprende una o más, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más, mutaciones en la secuencia de aminoácidos de un FRB de tipo salvaje, por ejemplo, una FRB que comprende la SEC ID N°: 2. La FRB mutante comprende una afinidad aumentada por una molécula de dimerización, por ejemplo, en comparación con la afinidad de la FRB de tipo salvaje por la molécula de dimerización. La numeración de la posición de los aminoácidos de una FRB de tipo salvaje o mutante a la que se hace referencia en el presente documento se puede determinar a partir de la SEQ ID NO: 2, donde el primer aminoácido de la SEQ ID NO: 2 es la posición 2021 y el último aminoácido de la SEQ ID NO: 2 es la posición 2113.

En una realización, un FRB mutante comprende una o más mutaciones en el aminoácido o aminoácidos seleccionados de una leucina en la posición 2031 (L2031), un ácido glutámico en la posición 2032 (E2032), una serina en la posición 2035 (S2035), una arginina en la posición 2036 (R2036), una fenilalanina en la posición 2039 (F2039), una glicina en la posición 2040 (G2040), una treonina en la posición 2098 (T2098), un triptófano en la posición 2101 (W2101), un ácido aspártico en la posición 2102 (D2102), una tirosina en la posición 2105 (Y2105) y una fenilalanina en la posición 2108 (F2108), donde L2031, E2032, S2035, R2036, F2039, G2040, T2098, W2101, D2102, Y2105 y/o F2108 está mutado a cualquier otro aminoácido de origen natural. En una realización, una FRB mutante comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 170-180, donde X puede ser cualquier aminoácido de origen natural. Las secuencias de aminoácidos de dominios de conmutación de FRB mutantes de ejemplo que tienen mayor afinidad por RAD001 se proporcionan en la Tabla 14 a continuación. Se puede realizar un cribado como se describe en el presente documento para identificar un FRB mutante.

Tabla 14. FRB mutantes de eem lo.

Se realizó un cribado para evaluar los FRB mutantes candidatos, tal como se describe adicionalmente en el Ejemplo 17.

En una realización, un FRB mutante, por ejemplo, comprende una o más mutaciones en el aminoácido o aminoácidos seleccionados entre L2031, E2032, S2035, R2036, F2039, G2040, T2098, W2101, D2102, Y2105 y F2108, donde el salvaje- El tipo de aminoácido está mutado a cualquier otro aminoácido de origen natural. En una realización, un FRB mutante comprende una mutación en E2032, donde E2032 se muta a fenilalanina (E2032F), metionina (E2032M), arginina (E2032R), valina (E2032V), tirosina (E2032Y), isoleucina (E2032I), por ejemplo, SEQ ID NO: 181, o leucina (E2032L), por ejemplo, SEQ ID NO: 182. En una realización, una FRB mutante comprende una mutación en T2098, donde T2098 está mutado a fenilalanina (T2098F) o leucina (T2098L), por ejemplo SEQ ID NO: 183. En una realización, un FRB mutante comprende una mutación en E2032 y en T2098, donde E2032 está mutado a cualquier aminoácido,

Tabla 15. FRB mutantes de eem lo.

El FRB mutante permite el uso de dosis de RAD001 más bajas que la dosis que se usa actualmente en entornos clínicos, o más bajas que una dosis que induce inmunosupresión en un sujeto, para estimular la dimerización de un conmutador basado en FKBP-FRB. En una realización, una dosis de RAD001 que estimula la dimerización de un conmutador basado en FKBP-FRB modificado, por ejemplo, que comprende un FRB mutante descrito en el presente documento, es menor que la dosis que se usa actualmente para tratar el cáncer, por ejemplo, una dosis de RAD001 comprende menos de 10 mg por día, por ejemplo, menos de 10 mg, 9 mg, 8 mg, 7 mg, 6 mg, 5 mg, 4 mg, 3 mg, 2 mg, 1 mg por día. En una realización, una dosis de RAD001 que estimula la dimerización de un conmutador basado en FKBP-FRB modificado, por ejemplo, que comprende un FRB mutante descrito en el presente documento, comprende menos de 1 mg por día, por ejemplo, 0,5 mg por día. En una encarnación, una dosis de RAD001 que estimula la dimerización de un conmutador basado en FKBP-FRB modificado, por ejemplo, que comprende un FRB mutante descrito en el presente documento, comprende menos de 10 mg por semana, por ejemplo, 5 mg por semana. Dosis adicionales de moléculas de dimerización adecuadas para su uso con los conmutadores basados en FKBP-FRB modificados se describen en el presente documento en la sección titulada "Composiciones y tratamientos farmacéuticos".

AP21967 Y BRB QUE SE UNE A AP21967

En una realización, la molécula de dimerización es un análogo de rapamicina, por ejemplo, AP21967, que no se une a FRAP endógeno de tipo salvaje, por ejemplo, FRB, pero que se une a un FRB modificado. Sin desear estar ligado a ninguna teoría, se cree que la falta de unión a FRB endógena reduce la actividad inmunosupresora. Un ejemplo de FRB modificado contiene un único cambio de aminoácido (T2098L). La incorporación de esta mutación en el componente FRB de un conmutador de dimerización permite que AP21967 se utilice como molécula de dimerización.

En una realización, un dominio de conmutación comprende una secuencia de FKBP que se une a un análogo de rapamicina, por ejemplo, AP21967, y el otro dominio de conmutación comprende una secuencia de FRB que se une a un análogo de rapamicina, por ejemplo, AP21967.

FKBP

D V P D Y A S L G G P S S P K K K R K V S R G V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K F D S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L T I S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H A T L V F D V E L L K L E T S Y (SEQ ID NO: 1)

FRB ( T 2098 L )

M A S R I L W H E M W H E G L E E A S R L Y F G E R N V K G M

F E V L E P L H A M M E R G P Q T L K E T S F N Q A Y G R D L

M E A Q E W C R K Y M K S G N V K D L L Q A W D L Y Y H V F R

R I S K T S (SEQ I D NO: 142 )

En una realización, un dominio de conmutación comprende residuos de aminoácidos descritos en SEQ ID NO: 1 y un dominio de conmutación comprende residuos de aminoácidos descritos en SEQ ID NO: 2.

En realizaciones, el dominio de conmutación, o una secuencia de unión a un análogo de rapamicina, por ejemplo, AP21967, del mismo, tendrá al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con la secuencia de FKBP de SEQ ID NO: 1. En realizaciones, el dominio de conmutación, o una secuencia de unión a análogo de rapamicina, por ejemplo, AP21967, del mismo, diferirá en no más de 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de la secuencia correspondiente de SEQ ID NO: 1

En realizaciones, el dominio de conmutación, o secuencia de unión a un análogo de rapamicina, por ejemplo, AP21967, del mismo, tendrá al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con la secuencia de FRB de SEQ ID NO: 142. En realizaciones, el dominio de conmutación, o una secuencia de unión a un análogo de rapamicina, por ejemplo, AP21967, del mismo, diferirá en no más de 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de la secuencia de FRB correspondiente de SEQ ID NO: 142.

Estructura 1: AP21967

S e h a n u t il iz a d o c o n m u ta d o re s s im ila re s p a ra c o n tro la r la lo c a liz a c ió n y la a c t iv id a d d e lo s d o m in io s d e s e ñ a liz a c ió n , ta l c o m o s e h a d e s c r ito a n te r io rm e n te (ve r, p o r e je m p lo , G ra e f, IA, H o ls in g e r, LJ, D iv e r, S ., S c h re ib e r , S L & C ra b tre e , G R (1997 ) P ro x im ity a n d o r ie n ta t io n u n d e r lie s ig n a lin g b y th e n o n - re c e p to r ty ro s in e k in a s e Z A P 70. E m b o J 16: 5618 28 ).

L a s s e c u e n c ia s c a n d id a ta s p a ra su u s o c o m o d o m in io d e c o n m u ta c ió n q u e c o m p re n d e n u n a s e c u e n c ia d e u n ió n a a n á lo g o d e ra p a m ic in a , p o r e je m p lo , A P 21967 , d e F K B P , o u n a s e c u e n c ia d e u n ió n a a n á lo g o d e ra p a m ic in a , p o r e je m p lo , A P 21967 , d e F R B p u e d e n e v a lu a rs e in c o rp o ra n d o e l c a n d id a to en u n s is te m a , ta l c o m o el d e s c r ito e n e l p re s e n te d o c u m e n to .

M O L É C U L A S D E D IM E R IZ A C IÓ N P A R A C O N M U T A D O R E S B A S A D O S E N F K P B /F R B

La ra p a m ic in a y lo s a n á lo g o s d e ra p a m ic in a (a v e c e s d e n o m in a d o s ra p á lo g o s ) p u e d e n u s a rs e c o m o m o lé c u la s d e d im e r iz a c ió n e n c o n m u ta d o re s d e d im e r iz a c ió n b a s a d o s e n F K B P -F R B . E n u n a re a liz a c ió n , la m o lé c u la d e d im e r iz a c ió n p u e d e s e le c c io n a rs e e n tre ra p a m ic in a (s iro lim u s ) , R A D 001 (e v e ro lim u s ) , z o ta ro lim u s , te m s iro lim u s , A P -23573 ( r id a fo ro lim u s ) , b io lim u s y A P 21967.

S e p u e d e n u s a r n u m e ro s o s a n á lo g o s d e ra p a m ic in a c o m o u n a m o lé c u la d e h e te ro d im e r iz a c ió n e n u n c o n m u ta d o r d e d im e r iz a c ió n b a s a d o e n F K B P /F R A P . P o r e je m p lo , a n á lo g o s O -s u s t itu id o s e n lo s q u e e l g ru p o h id ro x ilo d e l a n il lo c ic lo h e x ilo d e la ra p a m ic in a se re e m p la z a p o r O R 1 e n lo s q u e R 1e s h id ro x ia lq u ilo , h id ro x ia lc o x ia lq u ilo , a c ila m in o a lq u ilo o a m in o a lq u ilo ; p o r e je m p lo , R A D 001 , ta m b ié n c o n o c id o c o m o e v e ro lim u s c o m o s e d e s c r ib e e n lo s d o c u m e n to s U S 5.665.772 y W O 94 /09010. O tro s a n á lo g o s d e ra p a m ic in a a d e c u a d o s in c lu y e n lo s s u s t itu id o s e n la p o s ic ió n 26 o 28. E l a n á lo g o d e ra p a m ic in a p u e d e s e r u n e p ím e ro d e u n a n á lo g o m e n c io n a d o a n te r io rm e n te , p a r t ic u la rm e n te un e p ím e ro d e u n a n á lo g o s u s t itu id o e n la p o s ic ió n 40 , 28 o 26 , y o p c io n a lm e n te p u e d e h id ro g e n a rs e a d ic io n a lm e n te , p o r e je m p lo , c o m o se d e s c r ib e e n lo s d o c u m e n to s U S 6.015.815 , W O 95 /14023 y W O 99 /15530 , p o r e je m p lo , A B T 578 ta m b ié n c o n o c id o c o m o z o ta ro l im u s o u n a n á lo g o d e ra p a m ic in a d e s c r ito e n lo s d o c u m e n to s U s 7.091.213 , W O 98 /02441 y W O 01 /14387 , p o r e je m p lo A P 23573 ta m b ié n c o n o c id o c o m o r id a fo ro lim u s .

E je m p lo s d e a n á lo g o s d e ra p a m ic in a a d e c u a d o s p a ra su u s o e n la p re s e n te in v e n c ió n d e l d o c u m e n to U S 5.665.772 in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a, 40 -O -b e n c i l- ra p a m ic in a , 40 -O - (4 '-h id ro x im e t il) b e n c il- ra p a m ic in a , 40 -O - [4 '- (1 ,2 -d ih id ro x ie t i l) ] b e n c il- ra p a m ic in a , 40 -O -a li l- ra p a m ic in a , 40 -O - [3 ' - (2 ,2 -d im e t i l- 1 ,3 -d io x o la n -4 (S ) - il) - p ro p -2 '-e n -1 '- i l] -ra p a m ic in a , (2 'E , 4 'S ) -40 -O - (4 ', 5 '-d ih id ro x ip e n t-2 '-e n -1 '- i l) - ra p a m ic in a , 40 -O - (2 -h id ro x i) e to x ic a rb o n ilm e t il -ra p a m ic in a , 40 -O - (2 -h id ro x i) e t i l- ra p a m ic in a , 40 -O - (3 -h id ro x i) p ro p il- ra p a m ic in a , 40 -O - (6 -h id ro x i) h e x il- ra p a m ic in a , 40 -O - [2 - (2 -h id ro x i) e to x i] e t i l- ra p a m ic in a , 40 -O - [(3 S ) -2 ,2 -d im e t i ld io x o la n -3 - i l ] m e t il- ra p a m ic in a , 40 -O - [(2 S ) -2 ,3 -d ih id ro x ip ro p -1 - i l ] - ra p a m ic in a , 40 -O - (2 -a c e to x i) e t i l- ra p a m ic in a , 40 -O - (2 -n ic o t in o ilo x i) e t i l- ra p a m ic in a , 40 -O - [2 - (N -m o r fo lin o ) a c e to x i le t i l- ra p a m ic in a ,40 -O - (2 -N - im id a z o lila c e to x i) e t i l- ra p a m ic in a , 40 -O - [2 - (N -m e t il-N '-p ip e ra z in il) acetoxi] etil-rapamicina, 39-O-desmetil-39,40-O, O-etileno-rapamicina, (26R) -26-dihidro-40-O- (2-hidroxi) etilrapamicina, 40-O- (2-aminoetil) -rapamicina, 40-O- (2-acetaminoetil) -rapamicina , 40-O- (2-nicotinamidoetil) -rapamicina, 40-O- (2- (N-metil-imidazo-2'-ilcarbetoxamido) etil) -rapamicina, 40-O- (2-etoxicarbonilaminoetil) -rapamicina, 40 -O-(2-tolilsulfonamidoetil) -rapamicina y 40-O-[2-(4 ', 5'-dicarboetoxi-1', 2 ', 3'-triazol-1'-il) -etil] -rapamicina.40-O- (2- (N-metil-imidazo-2'-ilcarbetoxamido) etil) -rapamicina, 40-O- (2-etoxicarbonilaminoetil) -rapamicina, 40-O-(2-tolilsulfonamidoetil) -rapamicina y 40- O-[2-(4 ', 5'-dicarboetoxi-1', 2 ', 3'-triazol-1'-il) -etil] -rapamicina.40-O- (2- (N-metil-imidazo-2'-ilcarbetoxamido) etil) -rapamicina, 40-O- (2-etoxicarbonilaminoetil) -rapamicina, 40-O-(2-tolilsulfonamidoetil) -rapamicina y 40- O-[2-(4 ', 5'-dicarboetoxi-1', 2 ', 3'-triazol-1'-il) -etil] -rapamicina.

Se conocen otros ejemplos de análogos de rapamicina donde el grupo hidroxilo en el anillo ciclohexilo de rapamicina y/o el grupo hidroxi en la posición 28 se reemplaza con un grupo hidroxiéster, por ejemplo, análogos de rapamicina encontrados en US RE44,768, p. temsirolimus.

Otros análogos de rapamicina incluyen aquellos en los que el grupo metoxi en la posición 16 se reemplaza con otro sustituyente, preferiblemente alquiniloxi (opcionalmente sustituido con hidroxi), bencilo, ortometoxibencilo o clorobencilo y/o en los que el grupo metoxi en la posición 39 se elimina junto con el carbono 39 de modo que el anillo ciclohexilo de la rapamicina se convierta en un anillo ciclopentilo que carece del grupo metioxi de la posición 39; por ejemplo, como se describe en WO95/16691 y WO96/41807. Los análogos se pueden modificar adicionalmente de manera que el hidroxi en la posición 40 de la rapamicina se alquila y/o se reduce el 32-carbonilo.

Los análogos de rapamicina de WO95/16691 incluyen, pero no se limitan a, 16-demtoxi-16- (pent-2-inil) oxirapamicina, 16-demtoxi-16-(but-2-inil) oxirapamicina, 16- demtoxi-16-(propargil) oxi-rapamicina, 16-demetoxi-16-(4-hidroxi-but-2-inil) oxi-rapamicina, 16-demtoxi-16-benciloxi-40-O- (2-hidroxietil) - rapamicina, 16-demtoxi-16-benciloxi-rapamicina, 16-demetoxi-16-orto-metoxibencil-raparicina, 16-demetoxi-40-O-(2-metoxietil) -16-pent-2-inil) oxirapamicina, 39-demetoxi-40-desoxi-39-formil-42-nor-rapamicina, 39-demetoxi-40-desoxi-39-hidroximetil-42-norrapamicina, 39-demetoxi-40-desoxi-39-carboxi-42- nor-rapamicina, 39-demetoxi-40-desoxi-39-(4-metil-piperazin-1-il) carbonil-42-nor-rapamicina, 39-demetoxi-40-desoxi-39-(morfolin-4-ilo) carbonil-42-nor-rapamicina, 39-demetoxi-40-desoxi-39- [N-metilo,N- (2-piridin-2-il-etil)] carbamoil-42-nor-rapamicina y 39-demetoxi-40-desoxi-39- (ptoluenosulfonilhidrazonometil) -42-nor-rapamicina.

Los análogos de rapamicina de WO96/41807 incluyen, pero no se limitan a, 32-desoxo-rapamicina, 16-O-pent-2-inil-32-desoxo-rapamicina, 16-O-pent-2-inil-32 -desoxo-40-O-(2-hidroxi-etil)-rapamicina, 16-O-pent-2-inil-32-(S)-dihidro-40-O-(2-hidroxietil)-rapamicina, 32 (S)-dihidro-40-O-(2-metoxi) etil-rapamicina y 32 (S)-dihidro-40-O-(2-hidroxietil) -rapamicina.

Otro análogo de rapamicina adecuado es biolimus, tal como se describe en el documento US2005/0101624.

RAD001, también conocido como everolimus (Afinitor®), tiene el nombre químico (41R, 9S, 12S, 15R, 16E, 18R, 19R, 21R, 23S, 24E, 26E, 28E, 30S, 32S, 35R)-1,18-dihidroxi-12-{(1R)-2-[(1S, 3R, 4R)-4-(2-hidroxietoxi)-3-metoxiciclohexil]-1-metiletil}-19,30-dimetoxi-15,17,21,23,29,35-hexametil-11,36-dioxa-4-aza-triciclo [30.3.1.04,9] hexatriaconta-16,24,26,28-tetraeno-2,3,10,14,20-pentaona (también conocida como 40-O-(2-hidroxi)etil-rapamicina) y la siguiente estructura química:

CONMUTADORES DE DIMERIZACIÓN BASADOS EN GYRB-GYRB

100

L a c u m e rm ic in a , u n p ro d u c to d e S tre p to m y c e s , s e u n e a l s u b d o m in io a m in o te rm in a l d e 24 K d e la s u b u n id a d B d e la A D N g ira s a b a c te r ia n a , G y rB . L a c u m e rm ic in a s e u n e a d o s s u b u n id a d e s G y rB , v é a s e , p o r e je m p lo , R a r ra r e t a l., (1996 ) A c t iv a t io n o f th e R a f -1 k in a s e c a s c a d e b y c o u m e rm y c in in d u c e d d im e r iz a t io n , N a tu re 383 : 178 ; G ilb e r t e t a l. (1994 ) T h e 24 k D a N - te rm in a l s u b -d o m a in o f th e D N A g y ra s e B p ro te in b in d s c o u m a r in d ru g s , M o le c u la r M ic ro b io lo g y 12 : 365. P o r ta n to , la c u m e rm c in a s e p u e d e u s a r c o m o m o lé c u la d e d im e r iz a c ió n e n u n c o n m u ta d o r d e h o m o d im e r iz a c ió n q u e c o m p re n d e d o m in io s d e c o n m u ta c ió n q u e c o m p re n d e n u n a s e c u e n c ia d e u n ió n a c u m e rm ic in a d e G y rB .

E n u n a re a liz a c ió n , el d o m in io d e c o n m u ta c ió n c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia d e u n ió n a c u m e rm ic in a d e l s u b d o m in io d e l e x tre m o a m in o te rm in a l d e 24 k D a d e G y rB .

E n re a liz a c io n e s , e l d o m in io d e c o n m u ta c ió n , o u n a s e c u e n c ia d e u n ió n a c u m e rm ic in a d e l d o m in io d e c o n m u ta c ió n d e la m is m a , te n d rá a l m e n o s u n 70 , 75 , 80 , 85 , 90 , 95 , 96 , 97 , 98 o 99 % d e id e n t id a d c o n la s e c u e n c ia d e G y rB d e R a r ra r e t a l., (1996 ) . E n re a liz a c io n e s , el d o m in io d e c o n m u ta c ió n , o u n a s e c u e n c ia d e u n ió n a c u m e rm ic in a d e l m is m o , d ife r irá en n o m á s d e 30 , 25 , 20 , 15 , 10 , 5 , 4 , 3 , 2 o 1 re s id u o s d e a m in o á c id o s d e la s e c u e n c ia c o r re s p o n d ie n te d e R a r ra r e t a l. a l., (1996 ) . V e r , p o r e je m p lo , la F ig . 3.

L a s s e c u e n c ia s c a n d id a ta s p a ra su u s o c o m o d o m in io d e c o n m u ta c ió n q u e c o m p re n d e n la s e c u e n c ia d e u n ió n a c u m e rm ic in a d e l s u b d o m in io d e l e x tre m o a m in o te rm in a l d e 24 k D a d e G y rB , p u e d e n e v a lu a rs e in c o rp o ra n d o la c a n d id a ta e n u n s is te m a c o m o e l d e s c r ito e n R a r ra r e t a l., (1996 ) .

E s tru c tu ra 2 : c u m e rm ic in a

CONMUTADORES DE DIMERIZACIÓN BASADOS EN GIBERELINA.

L a s g ib e re lin a s s o n h o rm o n a s v e g e ta le s q u e re g u la n e l c re c im ie n to y d e s a rro llo d e la s p la n ta s . L a g ib e re lin a s e u n e a su re c e p to r , e l e n a n o 1 in s e n s ib le a la g ib e re lin a (G ID 1 ) e in d u c e u n c a m b io c o n fo rm a c io n a l e n G ID 1. L a n u e v a c o n fo rm a c ió n p e rm ite q u e G ID 1 s e u n a a o tra p ro te ín a , la g ib e re lin a in s e n s ib le (G A I) . S e p u e d e u s a r g ib e re lin a , o un a n á lo g o d e g ib e re lin a , p o r e je m p lo , G A 3 - A M /G A 3 , p a ra d im e r iz a r un d o m in io d e c o n m u ta c ió n q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e u n ió n a G A 3 d e G ID 1 (u n d o m in io d e c o n m u ta c ió n d e G ID I) y u n d o m in io d e c o n m u ta c ió n q u e c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia d e G A I s u f ic ie n te p a ra u n irs e a G A 3 e n la c e s G ID 1. G A 3 -A M p u e d e a tra v e s a r la m e m b ra n a p la s m á tic a d e la s c é lu la s d ia n a . U n a v e z d e n tro d e la s c é lu la s , G A 3 -A M e s e s c in d id a p o r u n a e s te ra s a p a ra fo rm a r G A 3. V e r M iy a m o to e t a l. (2010 ) B lo q u e o ló g ic o rá p id o y o r to g o n a l co n u n s is te m a d e d im e r iz a c ió n in d u c id o p o r g ib e re lin a s , N a t. C h e m . B io l. 8 : 465.

E n re a liz a c io n e s , u n d o m in io d e c o n m u ta c ió n d e G A I, o u n a s e c u e n c ia d e G A I e s s u f ic ie n te p a ra u n irs e a u n a n á lo g o d e g ib e re lin a , p o r e je m p lo , G A 3 ;y u n a v e z u n id o a l a n á lo g o , p o r e je m p lo , G A 3, u n irs e a G ID 1 , d e l m is m o , te n d rá al m e n o s 70 , 75 , 80 , 85 , 90 , 95 , 96 , 97 , 98 o 99 % d e id e n t id a d co n u n a s e c u e n c ia G A I d e M iy a m o to e t a l. (2010 ) ; o d ife r ir á e n n o m á s d e 30 , 25 , 20 , 15 , 10 , 5 , 4 , 3 , 2 o 1 re s id u o s d e a m in o á c id o s d e la c o r re s p o n d ie n te s e c u e n c ia a d e M iy a m o to e t a l. (2010 ) . V é a s e , p o r e je m p lo , la f ig u ra 4.

E n re a liz a c io n e s , u n d o m in io d e c o n m u ta c ió n G ID 1 , o u n a s e c u e n c ia d e G ID 1 s u f ic ie n te p a ra u n irs e a u n d o m in io d e conmutación GAI, del mismo, tendrá al menos UN 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con la secuencia GID1 de Miyamoto et al. (2010); o diferirá en no más de 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos del correspondiente de Miyamoto et al. (2010).

Las secuencias candidatas para su uso como dominio de conmutación GAI o GID1 pueden evaluarse incorporando el candidato en un sistema como el descrito en una secuencia de Miyamoto et al. (2010).

Estructura 3: GA³-AM y GA³

CONMUTADORES DE ETIQUETA/ENLAZADOR

En casos, un conmutador de dimerización, por ejemplo, un conmutador de homodimerización, por ejemplo, un conmutador de homodimerización extracelular comprende dominios de conmutación que comprenden moléculas de etiqueta, por ejemplo, una etiqueta de péptido c-myc, una etiqueta de péptido flag, una etiqueta de péptido HA o una etiqueta de péptido V5. Los conmutadores de dimerización adecuados incluyen polipéptidos con afinidad por los dominios de conmutación, por ejemplo, moléculas de anticuerpo y armazón no de anticuerpos. Véase, por ejemplo, la figura 6.

CONMUTADORES DE DIMERIZACIÓN COVALENTES

En un conmutador de dimerización covalente, la molécula de dimerización promueve una interacción covalente entre los dominios de conmutación. En una realización, un conmutador de dimerización comprende primero y segundo dominios de conmutación, que, tras el contacto con una molécula de dimerización, se unen covalentemente entre sí. En casos, un conmutador de dimerización covalente es un conmutador de homodimerización, en el que la molécula de dimerización acopla covalentemente un primer y un segundo dominio de conmutación que tiene la misma estructura. En los casos de un conmutador de homodimerización covalente, la molécula de unión comprende un primer y un segundo resto, cada uno de los cuales puede unirse a un dominio de conmutación, uniendo así covalentemente los dominios de conmutación. El primer y segundo resto pueden tener la misma estructura o estructuras diferentes. En realizaciones, un conmutador de dimerización covalente es un conmutador de heterodimerización, en el que la molécula de dimerización acopla covalentemente el primer y segundo dominios de conmutación que tienen estructuras que difieren entre sí. En realizaciones de un conmutador de heterodimerización covalente, la molécula de unión puede tener un primer resto que se une covalentemente al primer dominio de conmutación, pero no al segundo dominio de conmutación, y un segundo resto que se une covalentemente al segundo dominio de conmutación, pero no al primer dominio de conmutación. En realizaciones, la molécula de dimerización comprende un resto adicional que altera su solubilidad o permeabilidad celular. Por ejemplo, en el caso de un conmutador de heterodimerización covalente intracelular, la molécula de dimerización puede comprender un resto que optimiza la permeabilidad celular de la molécula de dimerización.

Un conmutador de etiqueta Halo/etiqueta SNAP es un ejemplo de un conmutador de heterodimerización covalente. En una realización, la molécula de dimerización comprende un primer resto, por ejemplo, un resto O6-bencilguanina, que reacciona covalentemente con un dominio de etiqueta SNAP, un segundo resto, por ejemplo, un resto cloroalcano, que reacciona con un dominio Halotag, y un resto que hace que la molécula de dimerización sea permeable a las células.

Los conmutadores de dimerización covalente se describen en Erhart et al., 2013 Chem Biol 20 (4): 549-557. Las especies de HaXS descritas allí son útiles como moléculas de dimerización en un conmutador de etiqueta Halo/etiqueta SNAP. En realizaciones, una molécula de dimerización covalente minimiza las limitaciones cinéticas potenciales relacionadas con las velocidades de desactivación y la necesidad de acumulación de moléculas de dimerización no covalente en la célula como requisitos previos para la activación de las cascadas de señal requeridas, por ejemplo, para la muerte mediada por células T.

En una realización, una dimerización de etiqueta Halo/etiqueta SNAP comprende un primer dominio de conmutación que comprende un resto de etiqueta Halo, por ejemplo, SEQ ID NO: 14, o un derivado funcional o fragmento del mismo, y un segundo dominio de conmutación que comprende una etiqueta SNAP, por ejemplo, SEQ ID NO: 15, o un derivado funcional o fragmento del mismo. En realizaciones, la molécula de dimerización comprende grupos funcionales para unir una etiqueta Halo con una etiqueta SNAP junto con un núcleo de penetración celular. La Estructura 5 representa una molécula de dimerización adecuada para su uso en este sistema. Ver, por ejemplo, la Fig.13.

Un dominio de etiqueta halo (SEQ ID NO: 14) Gseigtgfpfdphyvevlgermhyvdvgprdgtpvlflhgnptssyvwrniiphvapthrciapdligmgksdkpdlgyff ddhvrfmdafiealgleewlvihdwgsalgfhwakrnpervkgiafmefirpiptwdewpefaretfqafrttdvgrkliid qnvfiegtlpmgwrpltevemdhyrepflnpvdreplwrfpnelpiagepanivalveeymdwlhqspvpkllfwgtpg vlippaeaarlakslpnckavdigpglnllqednpdligseiarwlstleisg

Un dominio de etiqueta SNAP (SEQ ID NO: 15)

Mdkdcemkrttldsplgklelsgceqglhriiflgkgtsaadavevpapaavlggpeplmqatawlnayfhqpeaieefpvp alhhpvfqqesftrqvlwkllkvvkfgevisyshlaalagnpaataavktalsgnpvpilipchrvvqgdldvggyegglavk ewllaheghrlgkpglg

Estructura 5; HaXS

En una realización, un dominio de conmutación comprende residuos de aminoácidos descritos en SEQ ID NO: 14 y un dominio de conmutación comprende residuos de aminoácidos descritos en SEQ ID NO: 15.

En realizaciones, el primer dominio de conmutación tendrá al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con la secuencia de SEQ ID NO: 14. En realizaciones, el primer dominio de conmutación diferirá en no más de 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de la secuencia correspondiente de SEQ ID NO: 14.

En realizaciones, el segundo dominio de conmutación tendrá al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con la secuencia de SEQ ID NO: 15. En realizaciones, el segundo dominio de conmutación diferirá en no más de 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de la secuencia correspondiente de SEQ ID NO: 15.

Las secuencias candidatas para usar como un dominio de conmutación pueden evaluarse incorporando el candidato en un sistema, tales como los descritos en el presente documento.

DOMINIOS DE CONMUTACIÓN MÚLTIPLES

En una realización, un conmutador de dimerización descrito en el presente documento comprende dominios de conmutación múltiples, y algunas veces se lo denomina aquí como un conmutador múltiple. Un conmutador múltiple comprende una pluralidad de, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, dominios de conmutación, independientemente, en un primer miembro, por ejemplo, un miembro de unión a antígeno, y un segundo miembro, por ejemplo, un miembro de señalización intracelular. Opcionalmente, un enlazador, espaciador o región de bisagra, por ejemplo, como se describe en el presente documento, está dispuesto entre dos dominios de conmutación en el miembro, por ejemplo, el miembro de unión a antígeno o el miembro de señalización intracelular.

En una realización, el primer miembro comprende una pluralidad de primeros dominios de conmutación, por ejemplo, dominios de conmutación basados en FKBP, y el segundo miembro puede comprender una pluralidad de segundos dominios de conmutación, por ejemplo, dominios de conmutación basados en FRB. Por ejemplo, el miembro de unión a antígeno comprende una pluralidad de primeros dominios de conmutación, por ejemplo, dominios de conmutación basados en FKBP, y el miembro de señalización intracelular comprende una pluralidad de segundos dominios de conmutación, por ejemplo, dominios de conmutación basados en FRB. Véase, por ejemplo, la Fig. 47A.

En una realización, el primer miembro comprende un primer y un segundo dominio de conmutación, por ejemplo, un dominio de conmutación basado en FKBP y un dominio de conmutación basado en FRB, y el segundo miembro comprende un primer y un segundo dominio de conmutación, por ejemplo, un dominio de conmutación basado en FKBP y un dominio de conmutación basado en aFRB. Por ejemplo, el miembro de unión a antígeno comprende un primer y un segundo dominio de conmutación, por ejemplo, un dominio de conmutación basado en FKBP y un dominio de conmutación basado en FRB, y el miembro de señalización intracelular comprende un primer y un segundo dominio de conmutación, por ejemplo, un FKBP- dominio de conmutación basado en y un dominio de conmutación basado en FRB. Véase, por ejemplo, la Fig. 47B.

En una realización, un conmutador de dimerización, por ejemplo, un conmutador de dimerización basado en FKBP/FRB, comprende una distribución asimétrica de dominios de conmutador en un primer y segundo miembro donde el número de dominios de conmutador en el primer miembro no es igual al número de dominios de conmutación en el segundo miembro. En una realización, un miembro comprende al menos X dominios de conmutación, donde X es una pluralidad, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, y el otro miembro tiene menos dominios de conmutación, por ejemplo, 1 , 2, 3, 4 o 5 dominios de conmutador menos que el primer miembro mencionado. En una realización, un miembro comprende dos dominios de conmutación para un conmutador de dimerización basado en FKBP-FRB y el otro miembro comprende menos de dos dominios de conmutación para un conmutador de dimerización basado en FKBP/FRB. Véase, por ejemplo, la Fig. 47A.

En una realización, el conmutador de dimerización, por ejemplo, un conmutador de dimerización basado en FKBP-FRB, comprende una distribución simétrica de dominios de conmutador, en la que el número de dominios de conmutador en un miembro es igual al número de dominios de conmutador en el otro miembro. . Véase, por ejemplo, las figuras 47A y 47B.

En una realización, el primer miembro y el segundo miembro comprenden una pluralidad de dominios de conmutación de homodimerización, por ejemplo, dominios de conmutación basados en giberelina. Por ejemplo, el miembro de unión a antígeno comprende una pluralidad de dominios de conmutación de homodimerización, por ejemplo, dominios de conmutación basados en GyrB, y el miembro de señalización intracelular comprende una pluralidad de dominios de conmutación de homodimerización, por ejemplo, dominios de conmutación basados en GyrB.

CONMUTADORES DE DIMERIZACIÓN DE SEGUNDO ORDEN

En una realización, un RCAR o RNKR-CAR comprende un conmutador de dimerización de primer orden que comprende un primer y un segundo dominio de conmutación. La molécula de dimerización del conmutador de dimerización de primer orden promueve la asociación del primer y segundo dominio de conmutación. Este conmutador de dimerización puede denominarse conmutador de dimerización de primer orden. En realizaciones, también está presente un conmutador de dimerización de segundo orden. En el cambio de dimerización de segundo orden, la molécula de dimerización de primer orden sirve como dominios de conmutación de segundo orden. La molécula de dimerización de segundo orden promueve la asociación de dos o más dominios de conmutación de segundo orden (cada uno de los cuales comprende una molécula de dimerización de primer orden). La dimerización o agrupación inducida por el cambio de segundo orden aumenta aún más el nivel de agrupación de dominios intracelulares; en tales realizaciones, la molécula de dimerización de segundo orden da como resultado más agrupación de la que se vería si solo se usara un conmutador de primer orden. La molécula de dimerización de primer orden promueve la asociación (o agrupamiento) de los dominios de conmutación de primer orden, por ejemplo, los dominios de conmutación de homodimerización (y de los dominios de señalización intracelular unidos a ellos). Dichos dominios de conmutación de primer orden pueden comprender una molécula de etiqueta tal como etiqueta de péptido c-myc, etiqueta de péptido bandera, etiqueta de péptido HA o etiqueta de péptido V5. En tales casos, la molécula de dimerización de primer orden puede comprender un anticuerpo, u otro ligante, dirigido al dominio de conmutación. En el segundo orden, la molécula de dimerización de segundo orden promueve la asociación o agrupación de las moléculas de dimerización de primer orden. En otras palabras, un cambio de segundo orden comprende dominios de conmutación que comprenden la molécula de dimerización de primer orden y una molécula de dimerización, por ejemplo, un anticuerpo contra la molécula de dimerización de primer orden, que provoca la asociación de los dominios de conmutación de segundo orden. El primer y segundo orden no implica ninguna secuencia para la adición de las moléculas de dimerización de primer y segundo orden. En las formas de realización, la molécula de dimerización de primer orden se administra primero, o se pone en contacto con sus dominios de conmutación primero, antes de la administración, o se ponen en contacto las moléculas de dimerización de primer orden con la molécula de dimerización de segundo orden. En realizaciones, la molécula de dimerización de segundo orden se administra primero, o se pone en contacto con su primer dominio de conmutación, antes de la administración, o se ponen en contacto las moléculas de dimerización de primer orden con sus dominios de conmutación.

Véase, por ejemplo, la figura 14.

También se pueden utilizar dominios de conmutación de tercer orden y superior.

MOLÉCULA DE DIMERIZACIÓN

Si bien no desea ligarse a la teoría, se cree que en algunas realizaciones, denominadas en el presente documento molécula de dimerización de unión a dos dominios, la molécula de dimerización comprende un primer resto de unión a dominio que se une, o interacciona, con un primer dominio de conmutación, y un segundo resto de unión al dominio que se une, o interacciona, con un segundo dominio de conmutación. Si bien no se desea ceñirse a la teoría, en algunas realizaciones, denominadas en el presente documento molécula de dimerización dependiente de la conformación, la molécula de dimerización se une o interacciona con uno de los dominios de conmutación, y altera la conformación de ese dominio de conmutación de modo que se une al otro dominio de conmutación. De nuevo, aunque no se desea ceñirse a la teoría, se cree que algunas moléculas de dimerización podrían operar mediante una combinación de esos u otros mecanismos. La asociación entre los dominios de conmutación es promovida por la molécula de dimerización. En presencia de molécula de dimerización, la interacción o asociación entre dominios de conmutación permite la transducción de señales entre un polipéptido asociado con, por ejemplo, fusionado a, un primer dominio de conmutación, y un polipéptido asociado con, por ejemplo, fusionado a, un segundo dominio de conmutación. En presencia de niveles no limitantes de dimerización, la transducción de la señal de la molécula aumenta en 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 5, 10, 50, 100 veces, por ejemplo, según se mide en un sistema descrito en el presente documento. fusionado a, un segundo dominio de conmutación. En presencia de niveles no limitantes de dimerización, la transducción de la señal de la molécula aumenta en 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 5, 10, 50, 100 veces, por ejemplo, según se mide en un sistema descrito en el presente documento. fusionado a, un segundo dominio de conmutación. En presencia de niveles no limitantes de dimerización, la transducción de la señal de la molécula aumenta en 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 5, 10, 50, 100 veces, por ejemplo, según se mide en un sistema descrito en el presente documento.

En realizaciones, la molécula de dimerización es una molécula pequeña, por ejemplo, AP21967.

En realizaciones, la molécula de dimerización es una molécula pequeña, por ejemplo, es diferente de un polipéptido. En realizaciones, la molécula de dimerización es un polipéptido, por ejemplo, Un polipéptido, por ejemplo, Una molécula de anticuerpo, o un armazón no de anticuerpo, por ejemplo, Una fibronectina o adnectina, que tiene afinidad específica por uno o ambos del primero y segundo cambiar dominios. En realizaciones, la molécula de dimerización es un polipéptido multimérico, por ejemplo, un polipéptido que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o más dominios proteicos unidos entre sí por un enlazador, por ejemplo, un enlazador GS. En realizaciones, la molécula de dimerización es un anticuerpo o fragmento del mismo. En una realización, la molécula de heterodimerización es un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo monoespecífico o un fragmento del mismo o un anticuerpo de doble especificidad, o un fragmento del mismo.

En una realización, el conmutador de dimerización es un conmutador de heterodimerización, es decir, tiene dominios de conmutador primero y segundo que son diferentes entre sí y la molécula de dimerización es una molécula de heterodimerización. En una realización, la molécula de heterodimerización es una molécula pequeña que se une a uno o ambos del primer y segundo dominio de conmutación. En una realización, la molécula de heterodimerización es un polipéptido o un fragmento del mismo que tiene afinidad específica por uno o ambos del primer y segundo dominio de conmutación. En una realización, la molécula de heterodimerización es un polipéptido mutimérico, o un fragmento del mismo que tiene afinidad específica por el primer y segundo dominios de conmutación. En una realización, la molécula de heterodimerización es un polipéptido mutimérico, o un fragmento del mismo que tiene afinidad específica por múltiples dominios de conmutación, ver, por ejemplo, la Fig. 15.

En una realización, el conmutador de dimerización es un conmutador de homodimerización, es decir, tiene dominios de conmutador primero y segundo que son iguales entre sí y la molécula de dimerización es una molécula de homodimerización. En una realización, la molécula de homodimerización n es una molécula pequeña que se une a uno o ambos del primer y segundo dominio de conmutación. En una realización, la molécula de homodimerización es un polipéptido o un fragmento del mismo que tiene afinidad específica por uno o ambos del primer y segundo dominio de conmutación. En una realización, la molécula de homodimerización es un polipéptido mutimérico, o un fragmento del mismo que tiene una afinidad específica por el primer y segundo dominios de conmutación. En una realización, la molécula de homodimerización es un polipéptido multimérico, o un fragmento del mismo, que tiene afinidad específica por múltiples dominios de conmutación, ver 5. 17. En una encarnación, Las moléculas de dimerización pueden ser no covalentes o covalentes, dependiendo de la forma de interacción entre los dominios de conmutación.

En una realización, la molécula de dimerización es escasamente permeable a través de la membrana plasmática. En una realización, la molécula de dimerización comprende un resto, por ejemplo, un resto cargado que inhibe la entrada en las células. Por ejemplo, una molécula de dimerización, por ejemplo, rapamicina o un análogo de rapamicina, puede modificarse para inhibir la entrada en las células. Dichas moléculas de dimerización pueden usarse con RCAR o RNKR-CAR que tienen conmutadores extracelulares. Su entrada relativamente pobre en las células no compromete la capacidad de invocar la dimerización (porque el cambio es extracelular) pero puede reducir la toxicidad. GA ³, que no penetra fácilmente en las células, se puede utilizar con un conmutador externo basado en GID1-GAI. En una realización, una molécula de dimerización que ha sido modificada acumula en una célula sólo el 50, 40, 20 o 10% tanto como la molécula de dimerización no modificada.

MOLÉCULAS DE DIMERIZACIÓN MULTIVALENTE

Generalmente, una molécula de dimerización promueve la asociación de al menos dos moléculas de cambio. En realizaciones, esta asociación de dominios de conmutación promueve la asociación de dominios intracelulares enlazados a los dominios de conmutación. En realizaciones, la molécula de dimerización tiene una valencia mayor de dos, por ejemplo, es multivalente y se une, y por tanto agrupa o dimeriza, más de dos dominios de conmutación. Por ejemplo, una molécula de dimerización puede comprender una pluralidad, por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, dominios de unión, cada uno de los cuales puede unirse a un dominio de conmutación. En realizaciones, el dominio de conmutación es una molécula de anticuerpo, armazón no anticuerpo, ligando u otro polipéptido que tiene afinidad por una molécula de dimerización. Las moléculas de dimerización multivalentes de ejemplo comprenden moléculas que comprenden más de dos dominios, por ejemplo, más de dos dominios que comprenden cada uno una etiqueta de péptido c-myc, una etiqueta de péptido bandera, una etiqueta de péptido HA o un dominio de etiqueta de péptido V5. Una molécula de dimerización multivalente puede ser una molécula de dimerización de primer o segundo orden. Véase, por ejemplo, la figura 14.

DISPOSICIONES DE DOMINIO

Un RCAR descrito en el presente documento, por ejemplo, para su uso en una célula RCAR/NKR-CARX, comprende dominios dispuestos en una variedad de configuraciones.

En un caso, tanto un dominio de señalización primario como un dominio de señalización coestimulador se separan del dominio de unión a antígeno mediante un conmutador.

En consecuencia, en un caso, la disposición RCAR comprende una primera y una segunda construcción quimérica en la que:

(1) la primera construcción quimérica, por ejemplo, un miembro de unión a antígeno, comprende: un dominio de unión a antígeno; un dominio transmembrana; y un primer dominio de conmutación intracelular, por ejemplo, FRB (en este caso, la primera construcción quimérica no comprende un dominio de señalización intracelular); y (2) una segunda construcción quimérica, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular (que en este caso no comprende un dominio transmembrana o un ancla de membrana) que comprende: un segundo dominio de conmutación intracelular, por ejemplo, FKBP; y un dominio de señalización, por ejemplo, un dominio de señalización primario o secundario.

En un caso, tanto un dominio de señalización primario, por ejemplo, un dominio CD3zeta, como un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, un dominio 4-1BB, están presentes en la segunda construcción quimérica. En un caso, el orden en la segunda construcción quimérica es: un segundo dominio de conmutación, dominio de señalización parental, por ejemplo, un dominio CD3zeta, y un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, un dominio 4-1BB. En un caso, el orden en la segunda construcción quimérica es un segundo dominio de conmutación, un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, un dominio 4-1BB, y un dominio de señalización primario, por ejemplo, un dominio CD3zeta. En un caso, el orden en la segunda construcción quimérica es un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, un dominio 4-1BB, un segundo dominio de conmutación y un dominio de señalización primario, por ejemplo, un dominio CD3zeta. En un caso,

Los casos se refieren a FRB en las primeras construcciones quiméricas y FKBP en las segundas construcciones quiméricas, pero la ubicación se puede invertir.

El orden de los dominios en los casos se da en la dirección del N-terminal al C-terminal, pero especialmente con respecto a las construcciones quiméricas intracelulares, el orden puede ser del C-terminal al N-terminal.

En un caso, uno, pero no ambos, del dominio de señalización primario y del dominio de señalización coestimulador, está separado por un conmutador del dominio de unión a antígeno.

En consecuencia, en otro caso, el acuerdo RCAR comprende:

(1) una primera construcción quimérica, por ejemplo, un miembro de unión a antígeno, que comprende: un dominio de unión a antígeno; un dominio transmembrana; un primer dominio de conmutación intracelular, por ejemplo, FRB; y un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización primario, por ejemplo, un dominio CD3zeta, o un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, un dominio 4-1BB;y (2) una segunda construcción quimérica, por ejemplo, un miembro de señalización intracelular (que en este caso no comprende un dominio transmembrana o un ancla de membrana) que comprende: un segundo dominio de conmutación intracelular, por ejemplo, FKBP; y un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización primario, por ejemplo, un dominio CD3zeta, o un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, un dominio 4-1BB.

En un caso, el orden en la primera construcción quimérica es un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana, un primer dominio de conmutación intracelular, por ejemplo, FRB, y un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización primario, por ejemplo, un Dominio CD3zeta, o un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, un dominio 4-1BB.

En un caso, el orden en la primera construcción quimérica es un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana, un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización primario, por ejemplo, un dominio CD3zeta, o un dominio de señalización coestimulante, por ejemplo, un dominio 4-1BB y un primer dominio de conmutación intracelular, por ejemplo, FRB.

En un caso, la primera construcción quimérica comprende uno, pero no ambos, un dominio de señalización primario, por ejemplo, un dominio CD3zeta, y un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, un dominio 4-1BB. En un caso, el orden en la segunda construcción quimérica es: un segundo dominio de conmutación intracelular, por ejemplo, FKBP, y uno, pero no ambos, un dominio de señalización primario, por ejemplo, Un dominio CD3zeta, y un dominio de señalización coestimulador , por ejemplo, un dominio 4-1BB.

En un caso, el orden en la segunda construcción quimérica es: uno, pero no ambos, un dominio de señalización primario, por ejemplo, Un dominio CD3zeta, y un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, Un dominio 4-1BB y un segundo dominio de conmutación intracelular, por ejemplo, FKBP.

En un caso:

(1) la primera construcción quimérica, por ejemplo, un miembro de unión a antígeno, comprende: un dominio de unión a antígeno, por ejemplo, un scFv; un dominio transmembrana; un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, un dominio 4-1BB; y un primer dominio de conmutación; y

(2) la segunda construcción quimérica, por ejemplo, un miembro de señalización intracelular, comprende un segundo dominio de conmutación; y un dominio de señalización primario, por ejemplo, un dominio CD3zeta (y en casos, ningún dominio transmembrana o anclaje de membrana).

En un caso:

(1) la primera construcción quimérica, por ejemplo, un miembro de unión a antígeno, comprende: un dominio de unión a antígeno, por ejemplo, un scFv; un dominio transmembrana; un dominio de señalización primario, por ejemplo, un dominio CD3zeta; y un primer dominio de conmutación; y

(2) la segunda construcción quimeica, por ejemplo, un miembro de señalización intracelular, comprende: un segundo dominio de conmutación; y un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, un dominio 4-1BB (y en casos, ningún dominio transmembrana o anclaje de membrana).

En un caso, la disposición RCAR comprende una primera y una segunda construcción quimérica en la que:

(1) la primera construcción quimérica, por ejemplo, un miembro de unión a antígeno, comprende: un dominio de unión a antígeno; un dominio transmembrana; un primer dominio de señalización intracelular y un primer dominio de conmutación intracelular, por ejemplo, FRB; y

(2) una segunda construcción quimérica, por ejemplo, un miembro de señalización intracelular (que en este caso no comprende un dominio transmembrana o un ancla de membrana) que comprende: un segundo dominio de conmutación intracelular, por ejemplo, FKBP; y un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización primario o coestimulador.

Los órdenes de los casos se proporcionan en la dirección N-terminal a C-terminal, pero especialmente con respecto a las construcciones quiméricas intracelulares, el orden puede ser de C-terminal a N-terminal.

MIEMBROS RCAR, POR EJEMPLO, DOMINIOS DE UNIÓN A ANTÍGENO U OTROS DOMINIOS DE UNIÓN EXTRACELULARES, QUE TIENEN UN DOMINIO DE SEÑALIZACIÓN COSTIMULATORIA

La persistencia y expansión de los linfocitos T que expresan el receptor de antígeno quimérico en la superficie está mediada por la inclusión de varios dominios intracelulares fusionados al receptor unido a la membrana. Por ejemplo, un elemento de un RCAR (por ejemplo, un RCAR de una célula RCAR/NKR-CARX) que tiene un dominio extracelular que se acopla a un ligando diana en una célula diana, por ejemplo, una célula cancerosa, puede comprender un dominio de señalización intracelular coestimulador, por ejemplo, un dominio de señalización coestimulador seleccionado de la Tabla 2.

En casos, la colocación de un dominio de señalización intracelular coestimulador, por ejemplo, 4-1BB, en el primer dominio de conmutación del CD3 zeta en el segundo dominio de conmutación modulará positivamente la actividad de RCAR in vivo al tiempo que limita la actividad del CAR en ausencia de la molécula de cambio de dimerización. Los miembros de RCAR que tienen un dominio extracelular que se acopla a un ligando diana en una célula, por ejemplo, un dominio de unión a antígeno, pueden comprender una pluralidad, por ejemplo, 2 o 3, dominios de señalización intracelular coestimuladores, por ejemplo, seleccionados de la Tabla 2. En un caso, el miembro RCAR comprende una pluralidad de dominios de señalización coestimuladores seleccionados entre 41BB, CD28, CD27, ICOS y OX40. A modo de ejemplo, el miembro, por ejemplo, un miembro de unión a antígeno, comprende, desde la dirección extracelular a la intracelular:

41BB-CD27;

CD27-41BB;

41BB-CD28;

CD28-41BB;

OX40-CD28;

CD28-OX40;

CD28-41BB; o

41BB-CD28.

Un miembro de unión a antígeno puede comprender: una pluralidad, por ejemplo, 2 o 3 dominios de señalización coestimuladores, elegidos, por ejemplo, de la Tabla 2, por ejemplo, seleccionados de 41BB, CD28, CD27, ICOS y OX40. Los dominios de señalización coestimuladores pueden disponerse en cualquier orden, pero las configuraciones de ejemplo incluyen las siguientes (en la dirección de extracelular a intracelular):

41BB-CD27;

CD27-41BB;

41BB-CD28;

CD28-41BB;

OX40-CD28;

CD28-OX40;

CD28-41BB; o

41BB-CD28.

En un caso, el miembro de unión a antígeno comprende los siguientes dominios de señalización coestimuladores: CD28-OX40.

En un caso, un miembro de unión a antígeno comprende a) [un dominio de unión a antígeno] - [un dominio transmembrana] - [un primer dominio de señalización coestimulador] - [un segundo dominio de señalización coestimulador] y donde el primer y segundo dominios de señalización coestimuladores:

(i) son cada uno independiente seleccionado de la Tabla 2;

(ii) cada uno se selecciona independientemente entre 41BB, CD28, CD27, ICOS y OX40;

(iii) comprenden uno de los siguientes pares de dominios de señalización coestimuladores (desde la dirección extracelular a la intracelular): 41BB-CD27;

CD27-41BB;

41BB-CD28;

CD28-41BB;

OX40-CD28;

CD28-OX40;

CD28-41BB; o

41BB-CD28.

(iv) comprenden los siguientes pares de dominios de señalización coestimuladores: CD28-41BB; o

(v) comprenden los siguientes pares de dominios de señalización coestimuladores: CD28-OX40; y

(b) un [dominio de conmutación],

en el que el dominio de conmutación está dispuesto: (i) entre el dominio transmembrana y el primer dominio de señalización coestimulador;

(ii) entre el primer dominio de señalización coestimulador y el segundo dominio de señalización coestimulador; o (iii) después del segundo dominio de señalización coestimulador,

y opcionalmente, el dominio de conmutación comprende un fragmento de unión a FKBP o un análogo de FRB, y el fragmento de unión a FKBP o análogo de FRB comprende una o más mutaciones que potencian la formación de un complejo entre un El dominio de conmutación de FKBP, un dominio de conmutación de FRB y la molécula de dimerización, o una mutación descrita en la presente sección titulada CONMUTADORES DE DIMERIZACIÓN BASADOS EN FKBP/FRB MODIFICADOS. Por ejemplo, el fragmento de unión a FKBP o análogo de FRB comprende: una mutación E2032, por ejemplo, una mutación E2032I o una mutación E2032L; una mutación T2098, por ejemplo, una mutación T2098L; o una mutación E2032 y T2098, por ejemplo, una E2032I y una T2098L o una E2032L y una mutación T2098L;

y opcionalmente, el miembro de unión a antígeno no comprende un dominio de señalización intracelular primario.

En un caso, el miembro de unión a antígeno comprende: una pluralidad, por ejemplo, 2 o 3 dominios de señalización coestimuladores, elegidos, por ejemplo, de la Tabla 2, por ejemplo, una combinación de dominios de señalización coestimuladores descritos en el presente documento, y el miembro de señalización intracelular comprende un dominio CD3zeta.

A continuación se proporcionan secuencias de aminoácidos de miembros de RCAR de ejemplo que comprenden un miembro de unión a antígeno que comprende la siguiente estructura: [un dominio de unión a antígeno] -[un dominio transmembrana] - [un primer dominio de señalización coestimulador] - [un segundo dominio de señalización coestimulador] -[dominio de conmutación]. Para los RCAR de ejemplo enumerados a continuación, el dominio de unión a antígeno comprende un scFv de CD19 (la secuencia está subrayada), un primer dominio de señalización coestimulador (la secuencia está en cursiva), un segundo dominio de señalización coestimulador (la secuencia está en cursiva y en negrita), y un dominio de conmutación (la secuencia está subrayada y en negrita).

A continuación se proporcionan secuencias de aminoácidos para el miembro de señalización intracelular que comprende un dominio de conmutación (la secuencia está en negrita y subrayada) y un dominio de señalización primario (la secuencia está en cursiva).

La divulgación también proporciona RCAR que tienen una configuración que permite la conmutación de la proliferación. Por ejemplo, tras el encuentro con el antígeno, el RCAR exhibe una señal primaria constitutiva, por ejemplo, muerte de células diana, y permite la regulación de una segunda señal, por ejemplo, proliferación, supervivencia y secreción de citocinas.

a) un miembro de señalización intracelular que comprende:

opcionalmente, un dominio transmembrana o dominio de unión a membrana;

un dominio de conmutación; y

b) un miembro de unión a antígeno que comprende:

un dominio de unión a antígeno,

un dominio transmembrana, y

un dominio de señalización intracelular primaria, por ejemplo, seleccionado de la Tabla 1, por ejemplo, un dominio CD3zeta,

en el que el miembro de unión a antígeno no comprende un dominio de conmutación, o no comprende un dominio de conmutación que se dimeriza con un dominio de conmutación en el miembro de señalización intracelular.

En un caso, el miembro de señalización intracelular comprende un segundo dominio de señalización coestimulador seleccionado, por ejemplo, de la Tabla 2. En un caso, los dos o más dominios coestimuladores pueden ser el mismo dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, seleccionado de la lista en la Tabla 2, o dominios de señalización coestimuladores diferentes, por ejemplo, seleccionados de la lista en la Tabla 2. En un caso, el miembro de señalización intracelular comprende: una pluralidad, por ejemplo, 2 o 3, dominios de señalización coestimuladores seleccionados de 41BB, CD28, CD27, ICOS y OX40.

41BB-CD27;

CD27-41BB;

41BB-CD28;

CD28-41BB;

OX40-CD28;

CD28-OX40;

CD28-41BB; o

41BB-CD28.

En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización coestimulador de CD28, un dominio de señalización coestimulador 4-1BB y un dominio de CD3zeta.

En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización coestimulador de CD28, un dominio de señalización coestimulador de OX40 y un dominio de CD3zeta.

un primer dominio de señalización coestimulador/un segundo dominio de señalización coestimulador y un dominio de conmutación dispuesto entre cualquiera de los elementos de señalización, o, de la dirección extracelular a la intracelular, después de todos los demás elementos de señalización. Véase, por ejemplo, la Fig. 48D.

En un caso en el que el dominio de conmutación es extracelular, el orden de los elementos en el miembro de señalización intracelular es el siguiente, de la dirección extracelular a la intracelular:

En un caso en el que el dominio de conmutación es intracelular, el orden de los elementos en el miembro de señalización intracelular es el siguiente, desde la dirección extracelular a la intracelular:

dominio transmembrana/un primer dominio de señalización coestimulador/un segundo dominio de señalización coestimulador y un dominio de conmutación dispuesto intracelularmente entre cualquiera de los elementos de señalización, o, de extracelular a intracelular, después de todos los demás elementos de señalización. Véase, por ejemplo, la Fig. 48A.

En un caso, el miembro de señalización intracelular comprende un dominio de unión a membrana. En uno de esos casos, el dominio de conmutación es intracelular. En tales casos, el miembro de señalización intracelular comprende dos dominios de señalización coestimuladores, donde los dos dominios coestimuladores se seleccionan entre 4-1BB, OX40, CD27, CD28 e ICOS. En un caso, el orden de los elementos en el miembro de señalización intracelular es el siguiente, desde la dirección extracelular a la intracelular:

un dominio de unión a la membrana/un primer dominio de señalización coestimulador/un segundo dominio de señalización coestimulador y un dominio de conmutación dispuesto extracelularmente, entre cualquiera de los elementos de señalización, o, de extracelular a intracelular, después de todos los demás elementos de señalización. Véase, por ejemplo, la Fig. 48B.

dominio transmembrana o dominio de unión a membrana/un primer dominio de señalización coestimulador/opcionalmente un segundo dominio de señalización coestimulador/y opcionalmente un dominio de señalización intracelular primario, y un dominio de conmutación dispuesto extracelularmente, entre cualquiera de los elementos, o, de extracelular a intracelular, después de todos los demás elementos.

En un caso, el orden de los elementos en el miembro de unión a antígeno, de extracelular a intracelular, es el siguiente:

RCAR Y RNKR-CAR UNIVERSALES

Un caso proporciona RCAR o RNKR-CAR en los que el miembro de unión a antígeno no está unido a la superficie de la célula RCARX (por ejemplo, RCART) o Rn Kr-CARX (por ejemplo, RNKR-CART). Típicamente, dicha célula RCARX (por ejemplo, R^cA^rT) o RNKR-C^aRX (por ejemplo, ^rN^kR-CART) incluirá un dominio de señalización intracelular que tiene un primer dominio de conmutación externo o extracelular. La célula puede ponerse en contacto con un miembro de unión a antígeno que comprende un dominio de unión a antígeno y un segundo dominio de conmutación (y ningún dominio transmembrana o dominio de unión a membrana). Esto permite que una célula RCARX (por ejemplo, RCART) o RNKR-CARX (por ejemplo, RNKR-CART) que tiene un miembro de señalización intracelular se empareje convenientemente con uno o más dominios de unión a antígeno, sin transformar la célula con la secuencia que codifica el miembro de unión a antígeno. Se puede proporcionar una alícuota de células RCARX (por ejemplo, RCART) o RNKR-CARX (por ejemplo, RNKR-CART) que comprenden el miembro de señalización intracelular, pero no un miembro de unión a antígeno. Según sea necesario, se puede proporcionar una célula RCARX (por ejemplo, RCART) o RNKR-CARX (por ejemplo, RNKR-CART), por ejemplo, que tenga propiedades de unión a antígeno seleccionadas mediante la adición de un miembro de unión a antígeno. Dicho RCAR o RNKR-CAR a veces se denomina en el presente documento RCAR universal o RNKR-CAR universal, respectivamente. Véase, por ejemplo, la Fig. 45. Por ejemplo, una célula RCARX (por ejemplo, RCART) o RNKR-CARX (por ejemplo, RNKR-CART) que tiene el dominio de unión intracelular puede ponerse en contacto, por ejemplo, ex vivo, con el miembro de unión a antígeno de un RCAR universal o RNKR-CAR universal, y opcionalmente una molécula de dimerización. El miembro de unión a antígeno puede seleccionarse de un panel de miembros de unión a antígeno que comprenden diferentes dominios de unión a antígeno, por ejemplo, que se unen a diferentes antígenos. En un caso, basándose en el genotipo o fenotipo de un sujeto o tumor del sujeto, por ejemplo, agresividad del tumor, tipo de tumor, etapa de la enfermedad, tratamiento previo y similares, se selecciona un dominio de unión a antígeno. En un caso, las células efectoras inmunes, por ejemplo, las células T, se pueden obtener de un sujeto y se pueden obtener células RCART o RNKR-CART universales a partir de ellas. Se puede combinar una primera alícuota de las células RCARX o RNKR-CARX con un primer dominio de unión a antígeno. Se puede combinar una segunda alícuota con un segundo dominio de unión a antígeno. Por ejemplo, un RCARX universal o un RNKR-CARX universal con el primer dominio de unión a antígeno se puede usar en un primer ciclo de tratamiento y un RCARX universal o un RNKR-CARX universal con el segundo dominio de unión a antígeno se puede usar como un segundo ciclo de tratamiento, por ejemplo, administrado después del inicio del primer ciclo de tratamiento. En un caso, se ponen en contacto más de un dominio de antígeno, por ejemplo, 2, 3 o 4, dominio de unión a antígeno, con una célula RCARX (por ejemplo, RCART) o RNKR-CARX (por ejemplo, RNKR-CART) para proporcionar una célula que tenga RCAR o Rn k R-CAr con más de una especifidad de antígeno.

En una realización, RCARX o RNKR-CARX es una célula asesina natural. Estas células pueden aislarse del sujeto. En una realización, las células son líneas celulares estables de células asesinas naturales, por ejemplo, una línea celular alogénica estable NK-92 disponible en Conkwest. Estas líneas de células NK-92 estables se derivaron de células NK-92 que se obtuvieron, transfectaron y cultivaron utilizando los procedimientos descritos por Gong et al (abril de 1994), Leukemia Macmillan Press, Ltd, 8: 652-658, y descritos en EP1007630. También se puede utilizar una célula NK-92 o una célula de una línea celular NK con propiedades similares a la línea celular NK-92.

RNKR-CAR Y NKR-CAR

En el presente documento se describen composiciones y procedimientos para regular la especificidad y actividad de células citotóxicas, por ejemplo, células T o células NK, por ejemplo, con un receptor de antígeno quimérico (CAR) no natural, por ejemplo, un RⁿKR-CAR o un NKR-CAR. En un caso, el CAR es un NKR-CAR. Alternativamente, el CAR es un RNKR-CAR. Un NKR-CAR o RNKR-CAR es un CAR que comparte propiedades funcionales y estructurales con un receptor de función inmune de células NK (o NKR). Por ejemplo, un RNKR-CAR o un NKR-CAR comprende un elemento, por ejemplo, dominio, de un NKR. Los NKR, RNKR-CAr y NKR-CAR se describen en el presente documento, por ejemplo, en la sección siguiente. Como se analiza a continuación, una variedad de NKR (por ejemplo, una variedad de elementos/dominios de NKR) pueden servir como base para un RNKR-CAR o un NKR-CAR.

En un aspecto, la presente invención proporciona composiciones y procedimientos para regular la especificidad y actividad de las células T u otras células citotóxicas, por ejemplo, células NK. En un caso, se proporciona un receptor de antígeno quimérico (un CAR), por ejemplo, un receptor de células NK CAR (un NKR-CAR) basado en un receptor de células n K (un Nk R), por ejemplo, un KIR-CAR, un NCR-CAR, un SLAMF-CAR, un FcR-CAR o Ly49-CAR. En un caso, se proporciona un CAR, por ejemplo, un RNKR-CAR, por ejemplo, un RKIR-CAR, un RNCR-CAR, un RSLAMF-CAR, un RFcR-CAR o un Rly49-CAR. En un caso, la divulgación proporciona un tipo de receptor de antígeno quimérico (CAR) en el que el CAR se denomina NKR, por ejemplo, un "NKR-CAR" o "RNKR-CAR", que es un diseño de CAR que comprende un componente de un receptor que se encuentra en las células asesinas naturales (NK). En un caso, el receptor de ⁿK incluye, pero no se limita a, un receptor de tipo inmunoglobulina de células asesinas (KIR). Los KIR pueden funcionar como KIR activadores o inhibidores.

Una ventaja de los NKR-CAR (por ejemplo, KIR-CAR) o RNKR-CAR (por ejemplo, RKIR-CAR) es que un NKR-CAR (por ejemplo, un KIR-CAR) o RNKR-CAR (por ejemplo, RKIR -CAR), proporciona un procedimiento para regular la especificidad de las células citotóxicas, por ejemplo, las células T para controlar la actividad fuera de la diana de las células T modificadas. En algunos casos, los NKR-CAR (por ejemplo, KIR-CAR) o RNKR-CAR (por ejemplo, RKIR-CAR) de la divulgación no requieren una coestimulación para proliferar.

Los NKR-CAR o los RNKR-CAR pueden enviar una señal a través de una proteína adaptadora, por ejemplo, una proteína adaptadora que contiene ITAM. En un caso, los NKR-CAR (por ejemplo, KIR-CAR) o RNKR-CAR (por ejemplo, RKIR-CAR) descritos en el presente documento comprenden un KIR activador o un KIR activador regulable que envía su señal a través de una interacción con la proteína de membrana que contiene el motivo de activación basado en inmunotirosina (ITAM), DAP12, que está mediada por residuos dentro de los dominios transmembrana de estas proteínas.

En una realización, un NKR-CAR o RNKR-CAR puede enviar una señal inhibidora por medio de un motivo inhibidor. En una realización, los KIR-CAR o RKIR-CAR descritos en el presente documento comprenden un KIR inhibidor que entrega su señal a través de una interacción con los motivos inhibidores basados en inmunotirosina (ITIM). Los KIR que llevan dominios citoplasmáticos que contienen ITIM anulan la señal de activación que conduce a la inhibición de la actividad citolítica de NK y productora de citocinas. Sin embargo, la invención no debería limitarse a los KIR inhibidores. Por el contrario, cualquier proteína inhibidora que tenga un dominio citoplasmático que esté asociada con una señal inhibidora puede usarse en la construcción de los CAR de la presente invención.

Por consiguiente, la divulgación proporciona una composición que comprende un NKR-CAR (por ejemplo, un KIRCAR) o un RNKR-CAR (por ejemplo, RKIR-CAR), vectores que comprenden los mismos, composiciones que comprenden un NKR-CAR (por ejemplo, un KⁱR-CAR ) o RNKR-CAR (por ejemplo, RKIR-C^aR), vectores empaquetados en partículas virales y células T recombinantes u otras células citotóxicas que comprenden un NKR-CAR (por ejemplo, un KIR-CAR) o RNKR-CAR (por ejemplo, RKIR-CAR). La divulgación también incluye procedimientos para producir una célula T modificada genéticamente u otra célula citotóxica, por ejemplo, una célula NK, o una célula NK cultivada, por ejemplo, una célula NK92, que expresa un RNKR-CAR (por ejemplo, un RKIR-CAR (RKIR-CART )) o NKR-CAR (por ejemplo, KIR-CAR (KIR-CART)), donde el RNKR-CAR expresado, (por ejemplo, RKIR-CAR) o NKR-CAR expresado (por ejemplo, KIR-CAR), comprende un reconocimiento de antígeno dominio de un anticuerpo específico con una molécula de señalización intracelular de un NKR, por ejemplo, un KIR.

Por consiguiente, la divulgación proporciona composiciones y procedimientos para regular la especificidad y actividad de las células T u otras células citotóxicas modificadas para expresar un NKR-CAR (por ejemplo, un KIR-CAR) o RNKR-CAR (por ejemplo, RKIR-CAR). La presente invención también proporciona células que comprenden una pluralidad de tipos de NKR-CAR, por ejemplo, KIR-CAR (por ejemplo, activando NKR-CAR, por ejemplo, actKIR-CAR e inhibiendo NKR-CAR, por ejemplo, un inhKIR-CAR), donde la pluralidad de los tipos de N^kR-CAR, por ejemplo, KIR-CAR, participan en la señalización para regular la activación de las células T. En casos, también se proporcionan células que comprenden una pluralidad de tipos de RNKR-CAR (por ejemplo, Activando RNKR-CAR e inhibiendo RNKR-Ca R), tipos de NKR-Ca R (por ejemplo, Activando o inhibiendo Nk R-CAR) y/o tipos de RCAR, donde la pluralidad de tipos de NKR-CAR, RNKR-CARS, y/o RCAR participan en la señalización para regular la activación de las células T. En este aspecto, es beneficioso controlar y regular eficazmente las células citotóxicas RCAR/NKR-CARX, por ejemplo, las células RCAR/KIR-CART, o controlar y regular eficazmente las células RNKR-CARX, de modo que maten las células tumorales sin afectar las células normales. células transeúntes. Así, en un caso, la presente divulgación también proporciona procedimientos para matar células cancerosas mientras se minimiza el agotamiento de las células no cancerosas normales, mejorando así la especificidad de un CAR, por ejemplo, NKR-CAR (por ejemplo, un KIR-CAR), RCAR y/o terapia con Rn KR-CAR.

En un caso, las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento incluyen la separación física de una pluralidad de tipos de CAR expresados en una célula. En casos, se requiere la unión a una pluralidad de tipos de NKR-CAR (por ejemplo, KIR-CAR), RCAR y/o RNKR-CAR a su antígeno diana para la activación de células citotóxicas R^cA^r/NKR-C^aRX o de células citotóxicas RNKR-CARX . Por ejemplo, en tal enfoque, cada CAR de la pluralidad de tipos de CAR tiene diferentes dominios de señalización intracelular. Por ejemplo, cuando se usa una pluralidad de tipos de CAR para inducir la activación de células RCAR/NKR-CARX o RNKR-CARX, el primer tipo de CAR solo puede comprender un dominio intracelular de una NKR activante (por ejemplo, KIR) y el segundo tipo de CAR sólo puede comprender un dominio intracelular de un NKR inhibidor (por ejemplo, KIR). De esta forma, La activación condicional de las células T se genera mediante el acoplamiento del CAR activador (por ejemplo, RCAR, actKIR-CAR o RactKIR-CAR) a un antígeno en una célula maligna de interés. Un KIR-CAR inhibidor (inhKlR-CAR) o un RKIR-CAR inhibidor (RinhKIR-CAR) que lleva un resto de unión a antígeno dirigido contra un antígeno que está presente en una célula normal, pero no maligna, amortigua los efectos activadores del CAR activador cuando la célula T se encuentra con células normales.

En un caso, la presente divulgación proporciona una célula T u otra célula citotóxica diseñada para expresar al menos dos CAR, por ejemplo, en la que el primer CAR, por ejemplo, un RCAR, es un RCAR de activación, y el segundo CAR, por ejemplo, un NKR-CAR, es un inhNKR-CAR, por ejemplo, un inhKIR-CAR. En un caso, la divulgación proporciona un inhNKR-CAR, por ejemplo, un inhKIR-CAR, en el que la unión al inhNKR-CAR, por ejemplo, un inhKIR-CAR, a una célula normal da como resultado la inhibición de la célula citotóxica, por ejemplo, la inhibición de Actividad de las células T RCAR. En un caso, la unión al inhNKR-CAR, por ejemplo, un inhKIR-CAR, a un antígeno asociado con una célula no cancerosa da como resultado la muerte de la célula citotóxica que expresa CAR, por ejemplo, una célula T RCAR o KIR-CAR. Célula T.

En un caso, un inhNKR-CAR de la divulgación se puede usar en combinación con los CAR existentes para regular la actividad de los CAR. Se han descrito CAR de ejemplo en PCT/US11/64191.

También se ha descubierto que, en células que tienen una pluralidad de receptores embebidos en la membrana quimérica que comprenden un dominio de unión a antígeno (CMER), las interacciones entre el dominio de unión a antígeno de las CMER pueden ser indeseables, por ejemplo, porque la interacción inhibe la capacidad de uno o más de los dominios de unión a antígeno para unirse a su antígeno afín o podría generar nuevos sitios de unión con antígeno afín desconocido. Por consiguiente, en el presente documento se describen células que tienen un primer y un segundo CMER de origen no natural en los que los dominios de unión a antígeno minimizan tales interacciones. También se describen en el presente documento ácidos nucleicos que codifican un primer y un segundo CMER de origen no natural, así como procedimientos para fabricar y usar tales células y ácidos nucleicos. En un caso, el dominio de unión a antígeno de uno de dichos primeros segundos CMER de origen no natural, comprende un scFv, y el otro comprende un único dominio VH, por ejemplo, un dominio VH único de camélido, tiburón, lamprea, o un único dominio VH derivado de una secuencia de humano o ratón o un armazón no de anticuerpo.

RECEPTORES DE FUNCIÓN INMUNOLÓGICA DE CÉLULAS NK (NKRS) Y CÉLULAS NK

Como se describe en el presente documento, el receptor de función inmune de células NK (o NKR) se refiere a una proteína transmembrana endógena de origen natural expresada en células NK, que puede unirse a un ligando en una célula presentadora de antígeno y modular una respuesta de función inmune de células NK, por ejemplo, puede modular la actividad citolítica o la secreción de citocinas de la célula NK.

Las células NK son células mononucleares que se desarrollan en la médula ósea a partir de progenitores linfoides, y las características morfológicas y las propiedades biológicas incluyen típicamente la expresión de los determinantes de agrupamiento (CD) CD16, CD56 y/o CD57; la ausencia del complejo alfa/beta o gamma/delta TCR en la superficie celular; la capacidad de unirse y destruir las células diana que no expresan proteínas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC)/antígeno leucocitario humano (HLA) "propio" y la capacidad de destruir células tumorales u otras células enfermas que expresan ligandos para activar receptores NK. Las células NK se caracterizan por su capacidad para unirse y matar varios tipos de líneas de células tumorales sin necesidad de inmunización o activación previas.Las células NK también pueden liberar proteínas solubles y citocinas que ejercen un efecto regulador sobre el sistema inmunológico; y puede sufrir múltiples rondas de división celular y producir células hijas con propiedades biológicas similares a las de la célula madre. Tras la activación por interferones y/o citocinas, las células NK median la lisis de las células tumorales y de las células infectadas con patógenos intracelulares mediante mecanismos que requieren contactos físicos directos entre la célula NK y la célula diana. La lisis de las células diana implica la liberación de gránulos citotóxicos de la célula NK a la superficie de la diana unida, y proteínas efectoras como la perforina y la granzima B que penetran la membrana plasmática diana e inducen la apoptosis o muerte celular programada. Las células normales y sanas están protegidas de la lisis por las células NK. La actividad de las células NK está regulada por un mecanismo complejo que involucra señales tanto estimulantes como inhibidoras.

Brevemente, la actividad lítica de las células NK está regulada por varios receptores de la superficie celular que transducen señales intracelulares positivas o negativas tras la interacción con ligandos en la célula diana. El equilibrio entre las señales positivas y negativas transmitidas a través de estos receptores determina si una célula diana es lisada (muerta) o no por una célula NK. Las señales estimulantes de células Nk pueden estar mediadas por receptores de citotoxicidad natural (NCR) tales como NKp30, NKp44 y NKp46; así como receptores NKG2^c, receptores NKG2D, ciertos receptores similares a inmunoglobulina de células asesinas activadores (KIR) y otros receptores NK activadores (Lanier, Annual Review of Immunology 2005; 23: 225-74). Las señales inhibidoras de las células NK pueden estar mediadas por receptores como Ly49, CD94/NKG2A, así como por ciertos KIR inhibidores, que reconocen moléculas de clase I del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) (Karre et al., Nature 1986; 319: 675-8; Ohlen et al, Science 1989; 246: 666-8). Estos receptores inhibidores se unen a determinantes polimórficos de moléculas de MHC de clase I (incluido el HLA de clase I) presentes en otras células e inhiben la lisis mediada por células NK.

KIR-CAR

En el presente documento se describe una molécula de receptor de antígeno quimérico (CAR), por ejemplo, un RNKR-CAR o un NKR-CAR, que comprende un resto de unión a antígeno y un elemento (por ejemplo, dominio) de un receptor de tipo inmunoglobulina de células asesinas (KIR-CAR). En un caso, el RKIR-CAR o KIR-CAR de la divulgación se expresa en la superficie de una célula T o una célula NK.

KIR-CAR

Los KIR, denominados receptores similares a las inmunoglobulinas de células asesinas, se han caracterizado en humanos y primates no humanos, y son moléculas transmembrana polimórficas de tipo 1 presentes en ciertos subconjuntos de linfocitos, incluidas las células NK y algunas células T. Los KIR interaccionan con determinantes en los dominios alfa 1 y 2 de las moléculas del MHC de clase I y, como se describe en otra parte del presente documento, los KIR distintos son estimuladores o inhibidores de las células NK.

Los RNKR-CAR y los NKCAR descritos en el presente documento incluyen los RKIR-CAR y los KIR-CAR, respectivamente, que comparten propiedades funcionales y estructurales con los KIR. Por ejemplo, los RKIR-CAR y los KIR-CAR comprenden un elemento (por ejemplo, dominio) de un KIR.

Los KIR son una familia de proteínas de la superficie celular que se encuentran en las células NK. Regulan la función destructora de estas células al interaccionar con moléculas del MHC de clase I, que se expresan en todos los tipos de células. Esta interacción les permite detectar células infectadas por virus o células tumorales. La mayoría de los KIR son inhibidores, lo que significa que su reconocimiento de MHC suprime la actividad citotóxica de la célula NK que los expresa. Solo un número limitado de KIR tiene la capacidad de activar células.

La familia de genes de KIR tiene al menos 15 loci de genes (KIR2DL1, KIR2DL2/L3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DL1/S1, KIR3DL2, KIR3DL3 y dos pseudogenes, KIR2DP1 y KIR3DP1) codificado dentro de una región de 100-200 Kb del Complejo de Receptor de Leucocitos (LRC) ubicado en el cromosoma 19 (19q13.4). El LRC constituye un grupo grande, de 1 Mb y denso de genes inmunes de rápida evolución que contiene genes que codifican otras moléculas de la superficie celular con dominios extracelulares similares a Ig distintivos. Además, el LRC extendido contiene genes que codifican las moléculas adaptadoras transmembrana DAP10 y DAP12.

Los genes de KIR varían en longitud de 4 a 16 Kb (secuencia genómica completa) y pueden contener de cuatro a nueve exones. Los genes de KIR se clasifican como pertenecientes a uno de tres grupos según sus características estructurales: (1) genes de KIR2D de tipo I, que codifican dos proteínas de dominio extracelular con una conformación D1 y D2; (2) Los genes de KIR2D de tipo II estructuralmente divergentes que codifican dos proteínas de dominio extracelular con una conformación D0 y ^d2; y finalmente (3) genes de KIR3D que codifican proteínas con tres dominios extracelulares similares a Ig (D0, D1 y D2).

Los genes de KIR2D de tipo I, que incluyen el pseudogén de KIR2DP1 así como los genes de KIR2DL1-3 y KIR2DS1-5, poseen ocho exones y una secuencia del pseudoexón 3. Este pseudoexón está inactivo en el KIR2D tipo I. En algunos casos, esto se debe a una sustitución de nucleótidos ubicada en el sitio de corte y empalme del intrón 2-exón 3 donde su secuencia de nucleótidos exhibe un alto grado de identidad con las secuencias del exón 3 de KIR3D y posee una deleción característica de tres pares de bases. En otros casos, un codón de parada prematuro inicia el corte y empalme diferencial del exón 3. Dentro del grupo de genes de KIR2D de tipo I, KIR2DL1 y KIR2DL2 comparten una deleción común en el exón 7 que los distingue de todos los demás KIR en este exón, lo que da como resultado una secuencia de exón 7 más corta. De manera similar, dentro de KIR2D de tipo I, KIR2DL1-3 difiere de KIR2DS 1-5 solo en la longitud de su región codificadora de cola citoplásmica en el exón 9. La estructura del pseudogén KIR2DP1 difiere de la de KIR2DL1-3 en que la primera tiene una secuencia de exón 4 más corta debido a una única deleción del par de bases.

Los genes KIR2D de tipo II incluyen KIR2DL4 y KIR2DL5. A diferencia de KIR3D y KIR2D de tipo I, el KIR2D de tipo II ha eliminado de forma característica la región correspondiente al exón 4 en todos los demás KIR. Además, los genes KIR2D de Tipo II se diferencian de los genes KIR2D de Tipo I en que los primeros poseen un exón 3 traducido, mientras que los genes KIR2D de Tipo I tienen una secuencia de pseudoexón 3 sin traducir en su lugar. Dentro de los genes KIR2D de tipo II, KIR2DL4 se diferencia aún más de KIR2DL5 (así como de otros genes KIR) por la longitud de su secuencia del exón 1. En KIR2DL4, se encontró que el exón 1 era seis nucleótidos más largo y poseía un codón de iniciación diferente de los presentes en los otros genes KIR. Este codón de iniciación concuerda mejor con la 'secuencia de consenso de iniciación de la transcripción de Kozak'

Los genes KIR3D poseen nueve exones e incluyen los genes KIR3DL1, KIR3DS1, KIR3DL2 y KIR3DL3 relacionados estructuralmente. Las secuencias de nucleótidos KIR3DL2 son las más largas de todos los genes KIR y abarcan 16.256 pb en secuencias genómicas completas y 1.368 pb en cDNA. Dentro del grupo KIR3D, los cuatro genes KIR difieren en la longitud de la región que codifica la cola citoplasmática en el exón 9. La longitud de la cola citoplásmica de las proteínas KIR puede variar desde 14 residuos de aminoácidos (en algunos alelos KIR3DS1) hasta 108 residuos de aminoácido de largo (en proteínas KIR2DL4). Además, KIR3DS1 se diferencia de KIR3DL1 o KIR3DL2 en que el primero tiene una secuencia del exón 8 más corta. KIR3DL3 se diferencia de otras secuencias de KIR en que carece completamente del exón 6. La diferencia más extrema en la estructura del gen KIR observada fue la de KIR3DP1. Este fragmento de gen carece por completo de los exones 6 a 9,

Las proteínas KIR poseen dominios característicos similares a Ig en sus regiones extracelulares, que en algunas proteínas KIR están implicadas en la unión al ligando HLA de clase I. También poseen regiones transmembrana y citoplasmática que son funcionalmente relevantes ya que definen el tipo de señal que se transduce a la célula NK. Las proteínas KIR pueden tener dos o tres dominios similares a Ig (de ahí KIR2D o KIR3D), así como colas citoplasmáticas cortas o largas (representadas como KIR2DS o KIR2DL). Las proteínas KIR de dos dominios se subdividen en dos grupos dependiendo del origen de los dominios similares a Ig distales de la membrana presentes. Las proteínas KIR2D de tipo I (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4 y KIR2DS5) poseen un dominio similar a Ig distal de membrana similar en origen al dominio similar a Ig KIR3D D1 pero carecen de un dominio D0. Este dominio de tipo Ig D1 está codificado principalmente por el cuarto exón de los genes KIR correspondientes. Las proteínas KIR2D de tipo II, KIR2DL4 y KIR2DL5, poseen un dominio similar a Ig distal a la membrana de secuencia similar al dominio d0 presente en las proteínas KIR3D, sin embargo, KIR2D de tipo II carece de un dominio D1. Las colas citoplasmáticas largas suelen contener dos motivos inhibidores inmunitarios basados en tirosina (ITIM) que transducen señales inhibidoras a la célula NK. Las colas citoplasmáticas cortas poseen un residuo de aminoácido cargado positivamente en su región transmembrana que les permite asociarse con una molécula de señalización DAP12 capaz de generar una señal de activación.

Las excepciones a esto son KIR2DL4, que contiene solo un ITIM N-terminal. Además, KIR2DL4 también posee un residuo cargado (arginina) en su dominio transmembrana, una característica que permite a este receptor generar señales tanto inhibidoras como activadoras. Los KIR controlan la respuesta de las células NK humanas mediante la entrega de señales inhibidoras o de activación tras el reconocimiento de ligandos del MHC de clase I en la superficie de las células diana potenciales.

Las proteínas KIR varían en longitud de 306 a 456 residuos de aminoácidos. Aunque las diferencias en la longitud de la proteína son principalmente consecuencia del número de dominios similares a Ig presentes, la diversidad de la longitud de la región citoplasmática también es un factor de influencia. El péptido líder de la mayoría de las proteínas KIR tiene una longitud de 21 residuos de aminoácidos. Sin embargo, la presencia de un codón de iniciación diferente genera un péptido líder correspondientemente más largo en las proteínas KIR2DL4.

El dominio de tipo Ig D0 presente en las proteínas KIR2D de tipo II y las proteínas KIR3D tiene una longitud de aproximadamente 96 residuos de aminoácidos. El dominio D1 de las proteínas KIR2D de tipo I y KIR3D tiene una longitud de 102 residuos de aminoácidos, mientras que el dominio D2 de todas las proteínas KIR tiene una longitud de 98 residuos de aminoácidos. La longitud de la región del tallo varía desde los 24 residuos de aminoácidos presentes en la mayoría de las proteínas KIR, hasta sólo siete residuos de aminoácidos en la proteína KIR3DL3 divergente. La región transmembrana tiene 20 residuos de aminoácidos de longitud para la mayoría de las proteínas KIR, pero un residuo más corto en las proteínas KIR2DL1 y KIR2DL2 como resultado de una deleción de tres pares de bases en el exón 7. Finalmente, la región citoplásmica de las proteínas KIR exhibe mayores variaciones de longitud, que van desde 23 residuos de aminoácidos en algunos alelos KIR3DS1 hasta los 96 residuos de aminoácidos presentes en las proteínas KIR3DL2.

Las secuencias de aminoácidos para polipéptidos KIR humanos (Homo sapiens) están disponibles en la base de datos NCBI, ver, por ejemplo, el número de acceso NP_037421.2 (GI: 134268644), NP_703144.2 (GI: 46488946), NP_001229796.1 (GI: 338968852), NP_001229796.1 (GI: 338968852), NP_006728.2 (GI: 134268642), NP_065396.1 (GI: 11968154), NP_001018091.1 (GI: 66267727), NP_001077008.1 (GI: NP 134 ,.133244) 1 (GI: 6912472), NP_055327.1 (GI: 7657277), NP_056952.2 (GI: 71143139), NP_036446.3 (GI: 116517309), NP_001074239.1 (GI: 124107610), NP_002246.5 (GI6.6: 124107 ), NP_001074241.1 (GI: 124107604), NP_036445.1 (GI: 6912474).

La nomenclatura de los KIR se basa en el número de dominios extracelulares (KIR2D y KIR3D que tienen dos y tres dominios Ig extracelulares, respectivamente) y si la cola citoplasmática es larga (KIR2DL o KIR3DL) o corta (KIR2DS o KIR3DS). La presencia o ausencia de un KIR dado es variable de una célula NK a otra dentro de la población NK presente en un solo individuo. Entre los seres humanos, también hay un nivel relativamente alto de polimorfismo de genes KIR, con ciertos genes KIR presentes en algunos, pero no en todos los individuos. La expresión de los alelos KIR en las células NK está regulada estocásticamente, lo que significa que, en un individuo dado, un linfocito dado puede expresar uno, dos o más KIR diferentes, dependiendo del genoptipo del individuo. Las células NK de un solo individuo expresan típicamente diferentes combinaciones de KIR,

[Ciertos productos del gen KIR provocan la estimulación de la actividad de los linfocitos cuando se unen a un ligando apropiado. Todos los KIR activadores tienen una cola citoplasmática corta con un residuo transmembrana cargado que se asocia con una molécula adaptadora que tiene motivos de activación inmunorreceptores basados en tirosina (ITAM) que transducen señales estimulantes a la célula NK. Por el contrario, los KIR inhibidores tienen una cola citoplasmática larga que contiene un motivo inhibidor inmunorreceptor basado en tirosina (ITIM), que transduce señales inhibidoras a la célula NK tras el acoplamiento de sus ligandos MHC de clase I. Los KIR inhibidores conocidos incluyen miembros de las subfamilias KIR2DL y KIR3DL. Los KIR inhibidores que tienen dos dominios Ig (KIR2DL) reconocen los alotipos HLA-C: KIR2DL2 (anteriormente denominado p58.2) y el producto génico alélico KIR2DL3, estrechamente relacionado, ambos reconocen el "grupo 1" Los alotipos HLA-C (incluidos HLA-Cw1, -3, -7 y -8), mientras que KIR2DL1 (p58.1) reconoce los alotipos HLA-C del "grupo 2" (como HLA-Cw2, -4, -5, y -6). El reconocimiento por KIR2DL1 está dictado por la presencia de un residuo de Lys en la posición 80 de los alelos HLA-C. El reconocimiento de KIR2DL2 y KIR2DL3 viene dictado por la presencia de un residuo Asn en la posición 80 en HLA-C. Es importante destacar que la gran mayoría de los alelos HLA-C tienen un residuo Asn o Lys en la posición 80. Por lo tanto, KIR2DL1, -2 y -3 reconocen colectivamente esencialmente todos los alotipos HLA-C encontrados en humanos. Un KIR con tres dominios Ig, KIR3DL1 (p70), reconoce un epítopo compartido por alelos HLA-Bw4. Finalmente, KIR3DL2 (p140), un homodímero de moléculas con tres dominios Ig, reconoce HLA-A3 y -A11.

Sin embargo, la divulgación no debe limitarse a los KIR inhibidores que comprenden una cola citoplasmática que contiene ITIM. Más bien, cualquier proteína inhibidora que tenga un dominio citoplasmático que esté asociado con una señal inhibidora puede usarse en la construcción de los CAR (por ejemplo, RNKR-CAR o NKR-CAR) de la divulgación. Los ejemplos no limitantes de una proteína inhibidora incluyen, pero no se limitan a CTLA-4, PD-1 y similares. Se sabe que estas proteínas inhiben la activación de las células T.

Por consiguiente, la divulgación proporciona un RKIR-CAR o un KIR-CAR que comprende un dominio extracelular que comprende un elemento de unión específico de la diana denominado también dominio de unión a antígeno fusionado a un KIR o fragmento del mismo. En un caso, el KIR es un KIR activador que comprende una cola citoplasmática corta que se asocia con una molécula adaptadora que tiene motivos de activación inmunorreceptores basados en tirosina (ITAM) que transducen señales estimulantes a la célula NK (referidos en otro lugar como actKIR-CAR). En un caso, el KIR es un KIR inhibidor que comprende una cola citoplasmática larga que contiene un motivo inhibidor inmunorreceptor basado en tirosina (ITIM), que transduce señales inhibidoras (referidas en otra parte en el presente documento como RinhKIR-CAR o inhKIR-CAR). En ciertas ocasiones, es deseable eliminar la región de bisagra para los KIR activadores al construir un RactKIR-CAR o un actKIR-CAR. Esto se debe a que la divulgación se basa en parte en el descubrimiento de que un RKIR-CAR activador o un KIR-CAR de activación en el que se eliminó la bisagra KIR2DS2 para generar el KIR2S CAR, este KIRS2 CAR exhibió una actividad citolítica mejorada en comparación con un RactKIR-CAR o un actKIR-CAR que comprende un KIR2DS2 de tipo salvaje completo. Las secuencias de ácido nucleico que codifican las moléculas deseadas de la presente invención se pueden obtener usando procedimientos recombinantes conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, rastreando bibliotecas de células que expresan el gen, derivando el gen de un vector que se sabe que incluye el mismo, o aislándolo directamente de células y tejidos que lo contengan, utilizando técnicas estándar. Alternativamente, el gen de interés puede producirse sintéticamente, en lugar de clonarse.

La presente divulgación incluye construcciones de vectores retrovirales y lentivirales que expresan un RKIR-CAR o KIR-CAR que pueden transducirse directamente en una célula. La presente divulgación también incluye una construcción de ARN que se puede transfectar directamente en una célula. Un procedimiento para generar ARNm para su uso en transfección implica la transcripción in vitro (IVT) de una plantilla con cebadores especialmente diseñados, seguida de la adición de poliA, para producir una construcción que contenga 3 'y 5' secuencias no traducidas ("UTR"), una 5 ' cap y/o sitio de entrada de ribosoma interno (IRES), el gen que se va a expresar, y una cola de poliA, típicamente de 50-2000 bases de longitud. El ARN así producido puede transfectar eficazmente diferentes tipos de células. En un caso, la plantilla incluye secuencias para RKIR-CAR o KIR-CAR.

En una realización, un RKIR-CAR o KIR-CAR comprende un dominio de unión a antígeno y un dominio transmembrana KIR. En una realización, un RKIR-CAR o KIR-CAR comprende un dominio de unión a antígeno y un dominio intracelular KIR, por ejemplo, un dominio intracelular RinhKIR-CAR o inhKIR.

El dominio D de KIR, tal como se usa el término en el presente documento, se refiere a un dominio DO, D1 o D2 de un KIR.

El dominio D de KIR, tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un dominio polipeptídico que tiene propiedades estructurales y funcionales de un dominio D de un KIR.

El dominio D0 de KIR, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un dominio D0 de un KIR. En una realización, el dominio KIR D0 de un RKIR-Ca R o KIR-CAR tiene al menos un 70, 80, 85, 90, 95 o 99% de homología con una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio KIR D0 de origen natural o un KIR D0 dominio descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio KIR D0 de un RKIR-CAR o KIR-CAR difiere en no más del 15, 10, 5, 2 o 1% de sus residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio KIR D0 de origen natural o un KIR Dominio D0 descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio KIR D0 de un RKIR-CAR o KIR-CAR difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuo de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio KIR D0 de origen natural o un dominio KIR D0 descrito en el presente documento. . En realizaciones, el dominio KIR D0 de un RKIR-CAR o KIR-CAR no difiere de, o comparte un 100% de homología con, una secuencia de referencia, un dominio D0 de KIR natural o un dominio D0 de KIR descrito en el presente documento.

El dominio D1 de KIR, tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un dominio de polipéptido que tiene propiedades estructurales y funcionales de un dominio D1 de un KIR. En una realización, el dominio KIR D1 de un RKIR-CAR o KIR-CAR tiene al menos un 70, 80, 85, 90, 95 o 99% de homología con una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio KIR D1 de origen natural o un KIR D1 dominio descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio KIR D1 de un RKIR-CAR o KIR-CAR difiere en no más del 15, 10, 5, 2 o 1% de sus residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio KIR D1 de origen natural o un KIR Dominio D1 descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio KIR D1 de un RKIR-CAR o KIR-CAR difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuo de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio KIR D0 de origen natural o un dominio KIR D1 descrito en el presente documento.

El dominio KIR D2, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un dominio polipeptídico que tiene propiedades estructurales y funcionales de un dominio D2 de un KIR. En una realización, el dominio KIR D2 de un RKIR-CAR o KIR-CAR tiene al menos un 70, 80, 85, 90, 95 o 99% de homología con una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio KIR D2 de origen natural o un KIR D2 dominio descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio KIR D2 de un RKIR-CAR o KIR-CAR difiere en no más del 15, 10, 5, 2 o 1% de sus residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio KIR D2 de origen natural o un KIR Dominio D2 descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio KIR D2 de un RKIR-CAR o KIR-CAR difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuo de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio KIR D2 de origen natural o un dominio KIR D2 descrito en el presente documento.

El dominio de bisagra o tallo de KIR, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un dominio de polipéptido que tiene propiedades estructurales y funcionales de un dominio de bisagra o tallo de un KIR. En una realización, el dominio de bisagra o tallo KIR de un RKIR-CAR o KIR-CAR tiene al menos un 70, 80, 85, 90, 95 o 99% de homología con una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio de bisagra o tallo KIR de origen natural o un dominio de tallo o bisagra KIR descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio de bisagra o tallo KIR de un RKIR-CAR o KIR-CAR difiere en no más del 15, 10, 5, 2 o 1% de sus residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, una bisagra o tallo KIR de origen natural dominio o un dominio de bisagra o tallo KIR descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio de bisagra o tallo KIR de un RKIR-CAR o KIR-CAR difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuo de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio de bisagra o tallo KIR de origen natural o un dominio de bisagra o tallo KIR descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio de bisagra o tallo KIR de un RKIR-CAR o KIR-CAR no difiere de, o comparte 100% de homología con, una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio de bisagra o tallo KIR de origen natural o un dominio de bisagra o tallo KIR descrito aquí.

El dominio transmembrana KIR, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un dominio polipeptídico que tiene propiedades estructurales y funcionales de un dominio transmembrana de un KIR. En una realización, el dominio transmembrana KIR de un RKIR-CAR o KIR-CAR tiene al menos 70, 80, 85, 90, 95 o 99% de homología con una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio transmembrana KIR de origen natural o una transmembrana KIR dominio descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio transmembrana KIR de un RKIR-CAR o KIR-CAR difiere en no más del 15, 10, 5, 2 o 1% de sus residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio transmembrana KIR de origen natural o un KIR dominio transmembrana descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio transmembrana KIR de un RKIR-CAR o KIR-CAR difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuo de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio transmembrana KIR de origen natural o un dominio transmembrana KIR descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio transmembrana KIR de un RKIR-CAR o KIR-CAR no difiere de, o comparte un 100% de homología con, una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio transmembrana KIR de origen natural o un dominio transmembrana KIR descrito aquí.

El dominio intracelular de KIR, tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un dominio polipeptídico que tiene propiedades estructurales y funcionales de un dominio intracelular de un KIR. Los dominios intracelulares KIR comprenden dominios intracelulares KIR inhibidores (denominados aquí dominios intracelulares inhKIR) y dominios intracelulares KIR activadores (denominados aquí dominios intracelulares actKIR). En una realización, el dominio intracelular inhKIR comprende una secuencia ITIM. En una realización, el dominio intracelular KIR de un RKIR-CAR o KIR-CAR tiene al menos un 70, 80, 85, 90, 95 o 99% de homología con una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio intracelular KIR de origen natural o un dominio intracelular KIR dominio descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio intracelular KIR de un RKIR-CAR o KIR-CAR difiere en no más de 15, 10, 5, 2, o 1% de sus residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio intracelular KIR de origen natural o un dominio intracelular KIR descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio intracelular KIR de un RKIR-CAR o KIR-CAR difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuo de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio intracelular KIR de origen natural o un dominio intracelular KIR descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio intracelular KIR de un RKIR-CAR o KIR-CAR no difiere de, o comparte un 100% de homología con, una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio intracelular KIR de origen natural o un dominio intracelular KIR descrito en el presente documento.

NCR

Los RNKR-CAR o NKR-CAR descritos en el presente documento incluyen RNCR-CAR o NCR-CAR, respectivamente, que comparten propiedades funcionales y estructurales con los NCR. Por ejemplo, los RNCR-CAR y los NCR-CAR comprenden un elemento (por ejemplo, un dominio) de un NCR.

Las células asesinas naturales (NK) son células linfoides citotóxicas especializadas en destruir tumores y células infectadas por virus. A diferencia de los linfocitos T citotóxicos, las células NK no expresan receptores específicos de antígeno. El reconocimiento de células transformadas se produce mediante la asociación de una multitud de receptores de superficie celular con marcadores de superficie en la célula diana. Los receptores de la superficie de las células NK se pueden distinguir según activen o inhiban la citotoxicidad mediada por células NK. Numerosas interacciones entre diferentes receptores parecen conducir a la formación de sinapsis entre NK y células diana. La integración de las señales de activación e inhibición en la sinapsis dicta si las células NK ejercen o no su función citolítica en la célula diana. Entre los receptores activadores, la familia de moléculas similares a Ig se denomina receptores de citotoxicidad natural (NCR). Estos receptores de citotoxicidad naturales incluyen moléculas NKp30, NKp44 y NKp46. Los NCR son receptores de activación clave para las células NK en el reconocimiento de células tumorales. Las tres NCR participan en la eliminación de células infectadas por virus y tumores. En este último, la actividad antiviral se inicia por la interacción de NKp44 con hemaglutinina del virus de la influenza o virus Sendai. NKp46 se dirige a las células infectadas por virus uniéndose a la hemaglutinina del virus de la influenza o la hemaglutinina-neuraminidasa del virus Sendai. Por el contrario, se ha demostrado que la citotoxicidad mediada por células NK se inhibe mediante la unión a NKp30 a la proteína citomegaloviral humana pp65 (véase, por ejemplo, Arnon, et. Al., Nat. Immunol. (2005) 6: 515-523).

Las secuencias de aminoácidos para polipéptidos de NCR humanos (Homo sapiens) están disponibles en la base de datos NCBI, véase, por ejemplo, el número de acceso NP_004819.2 (GI: 153945782), 014931.1 (GI: 47605770), O95944.2 (GI: 251757303), 076036.1 (GI: 47605775), NP_001138939.1 (GI: 224586865) y/o NP_001138938.1 (GI: 224586860).

En una realización, un RNCR-CAR o NCR-CAR comprende un dominio de unión a antígeno y un dominio transmembrana de NCR. En una realización, un RNCR-CAR o NCR-CAR comprende un dominio de unión a antígeno y un dominio intracelular de NCR.

El dominio extracelular de NCR, tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un dominio polipeptídico que tiene propiedades estructurales y funcionales de un dominio extracelular de una NCR. En una realización, el dominio extracelular NCR de un RNCR-CAR o NCR-CAR tiene al menos un 70, 80, 85, 90, 95 o 99% de homología con una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio extracelular NCR de origen natural o un NCR extracelular dominio descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio extracelular de NCR de un RNCR-CAR o NCR-CAR difiere en no más del 15, 10, 5, 2 o 1% de sus residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio extracelular de NCR de origen natural o un NCR dominio extracelular descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio extracelular NCR de un RNCR-CAR o NCR-CAR difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuo de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio extracelular NCR de origen natural o un dominio extracelular NCR descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio extracelular NCR de un RNCR-CAR o NCR-CAR no difiere de, o comparte un 100% de homología con, una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio extracelular NCR de origen natural o un dominio extracelular NCR descrito en el presente documento.

El dominio de tallo o bisagra de NCR, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un dominio polipeptídico que tiene propiedades estructurales y funcionales de un dominio de tallo o bisagra de un NCR. En una realización, el dominio de bisagra o tallo de NCR de un RNCR-CAR o NCR-CAR tiene al menos un 70, 80, 85, 90, 95 o 99% de homología con una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio de bisagra o tallo de NCR de origen natural o un dominio de tallo o bisagra NCR descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio de bisagra o tallo NCR de un RNCR-CAR o NCR-CAR difiere en no más del 15, 10, 5, 2 o 1% de sus residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, una bisagra o tallo NCR de origen natural dominio o un dominio de tallo o bisagra NCR descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio de bisagra o tallo NCR de un RNCR-CAR o NCR-CAR difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuo de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio de tallo o bisagra NCR de origen natural o un dominio de tallo o bisagra NCR descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio de bisagra o tallo NCR de un RNCR-CAR o NCR-CAR no difiere de, o comparte 100% de homología con, una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio de bisagra o tallo NCR de origen natural o un dominio de tallo o bisagra NCR descrito aquí.

El dominio transmembrana de NCR, tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un dominio polipeptídico que tiene propiedades estructurales y funcionales de un dominio transmembrana de un NCR. En una realización, el dominio transmembrana NCR de un RNCR-CAR o NCR-CAR tiene al menos un 70, 80, 85, 90, 95 o 99% de homología con una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio transmembrana NCR de origen natural o una transmembrana NCR dominio descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio transmembrana NCR de un RNCR-CAR o NCR-CAR difiere en no más del 15, 10, 5, 2 o 1% de sus residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio transmembrana NCR de origen natural o un NCR dominio transmembrana descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio transmembrana NCR de un RNCR-CAR o NCR-CAR difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuo de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio transmembrana NCR de origen natural o un dominio transmembrana NCR descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio transmembrana NCR de un RNCR-CAR o NCR-CAR no difiere de, o comparte un 100% de homología con, una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio transmembrana NCR de origen natural o un dominio transmembrana NCR descrito en el presente documento.

El dominio intracelular de NCR, tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un dominio polipeptídico que tiene propiedades estructurales y funcionales de un dominio intracelular de una NCR. En una realización, el dominio intracelular NCR de un RNCR-CAR o NCR-CAR tiene al menos un 70, 80, 85, 90, 95 o 99% de homología con una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio intracelular NCR de origen natural o un dominio intracelular NCR descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio intracelular de NCR de un RNCR-CAR o NCR-CAR difiere en no más del 15, 10, 5, 2 o 1% de sus residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio intracelular de NCR de origen natural o un NCR dominio intracelular descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio intracelular NCR de un RNCR-CAR o NCR-CAR difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuo de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio intracelular NCR de origen natural o un dominio intracelular NCR descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio intracelular NCR de un RNCR-CAR o NCR-CAR no difiere de, o comparte un 100% de homología con, una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio intracelular NCR de origen natural o un dominio intracelular NCR descrito en el presente documento.

Receptores SLAM

Los RNKR-CAR o NKR-CAR descritos en el presente documento incluyen RSLAMF-CAR o SLAMF-CAR, respectivamente, que comparten propiedades funcionales y estructurales con SLAMF. Por ejemplo, RSLAMF-CAR y SLAMF-CAR comprenden un elemento (por ejemplo, dominio) de un receptor SLAMF.

La familia de receptores de células inmunitarias de la molécula de activación de linfocitos de señalización (SLAM) está estrechamente relacionada con la familia CD2 de la superfamilia de moléculas de inmunoglobulina (Ig). La familia SLAM (SLAMF) incluye actualmente nueve miembros llamados SLAM, CD48, CD229, 2B4, CD84, Nt B-A, CRACC, BLAME y CD2F-10. En general, las moléculas SLAM poseen de dos a cuatro dominios Ig extracelulares, un segmento transmembrana y una región intracelular rica en tirosina. Las moléculas se expresan diferencialmente en una variedad de tipos de células inmunes. Varios son autoligandos y SLAM se ha identificado como el receptor del virus del sarampión humano. Se sabe que varias proteínas adaptadoras pequeñas que contienen SH2 se asocian con los dominios intracelulares de los miembros de la familia SLAM y modulan la señalización del receptor, incluyendo SH2D1A (también conocida como proteína asociada a SLAM [SAP]) y SH2D1B (también conocida como EAT2). Por ejemplo, en las células T y NK, los receptores de la familia SLAM activados se fosforilan en tirosina y reclutan el adaptador SAP y posteriormente la Src quinasa Fyn. La consiguiente cascada de transducción de señales influye en el resultado de las interacciones entre células T y células presentadoras de antígenos y entre células NK y células diana.

Las secuencias de aminoácidos para los polipéptidos del receptor SLAM humano (Homo sapiens) están disponibles en la base de datos del NCBI, véase, por ejemplo, el número de acceso NP_057466.1 (GI: 7706529), NP_067004.3 (GI: 19923572), NP_003028.1 (GI : 4506969), NP_001171808.1 (GI: 296434285), NP_001171643.1 (GI: 296040491), NP_001769.2 (GI: 21361571), NP_254273.2 (GI: 226342990), NP_064510.1 (GI: 9910342) y/o NP_002339.2 (GI: 55925578)

En una realización, un RSLAMF-CAR o SLAMF-CAR comprende un dominio de unión a antígeno y un dominio transmembrana SLAMF. En una realización, un RSLAMF-CAR o SLAMF-CAR comprende un dominio de unión a antígeno y un dominio intracelular SLAMF.

El dominio extracelular de SLAMF, tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un dominio polipeptídico que tiene propiedades estructurales y funcionales de un dominio extracelular de un SLAMF. En una realización, el dominio extracelular SLAMF de un RSLAMF-CAR o SLAMF-CAR tiene al menos un 70, 80, 85, 90, 95 o 99% de homología con una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio extracelular SLAMF de origen natural o un SLAMF extracelular dominio descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio extracelular SLAMF de un RSLAMF-CAR o SLAMF-CAR difiere en no más del 15, 10, 5, 2 o 1% de sus residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio extracelular SLAMF de origen natural o un SLAMF dominio extracelular descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio extracelular SLAMF de un RSLAMF-CAR o SLAMF-CAR difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuo de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio extracelular SLAMF de origen natural o un dominio extracelular SLAMF descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio extracelular SLAMF de un RSLAMF-CAR o SLAMF-CAR no difiere de, o comparte 100% de homología con, una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio extracelular SLAMF natural o un dominio extracelular SLAMF descrito en el presente documento.

El dominio de tallo o bisagra de SLAMF, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un dominio polipeptídico que tiene propiedades estructurales y funcionales de un dominio de tallo o bisagra de un SLAMF. En una realización, el dominio de bisagra o tallo SL^aM^fde un RSLAMF-CAR o SLAMF-CAR tiene al menos un 70, 80, 85, 90, 95 o 99% de homología con una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio de bisagra o tallo SLAMF de origen natural o un dominio de tallo o bisagra SLAMF descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio de bisagra o tallo SLAMF de un RSLAMF-CAR o SLAMF-CAR difiere en no más del 15, 10, 5, 2 o 1% de sus residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, una bisagra o tallo SLAMF de origen natural dominio o un dominio de tallo o bisagra SLAMF descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio de bisagra o tallo SLAMF de un RSLAMF-CAR o SLAMF-CAR difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuo de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio de tallo o bisagra SLAMF de origen natural o un dominio de tallo o bisagra SLAMF descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio de bisagra o tallo SLAMF de un RSLAMF-CAR o SLAMF-CAR no difiere de, o comparte 100% de homología con, una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio de bisagra o tallo SLAMF de origen natural o un dominio de bisagra o tallo SLAMF descrito aquí.

El dominio transmembrana de SLAMF, tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un dominio polipeptídico que tiene propiedades estructurales y funcionales de un dominio transmembrana de un SLAMF. En una realización, el dominio transmembrana SLAMF de un RSLAMF-CAR o SLAMF-CAR tiene al menos un 70, 80, 85, 90, 95 o 99% de homología con una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio transmembrana SLAMF natural o una transmembrana SLAMF dominio descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio transmembrana SLAMF de un RSLAMF-CAR o SLAMF-CAR difiere en no más del 15, 10, 5, 2 o 1% de sus residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio transmembrana SLAMF de origen natural o un SLAMF dominio transmembrana descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio transmembrana SLAMF de un RSLAMF-CAR o SLAMF-CAR difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuo de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio transmembrana SLAMF de origen natural o un dominio transmembrana SLAMF descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio transmembrana SLAMF de un RSLAMF-CAR o SLAMF-CAR no difiere de, o comparte un 100% de homología con, una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio transmembrana SLAMF natural o un dominio transmembrana SLAMF descrito en el presente documento. El dominio intracelular de SLAMF, tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un dominio polipeptídico que tiene propiedades estructurales y funcionales de un dominio intracelular de un SLAMF. En una realización, el dominio intracelular SLAMF de un ^rS^lAMF-CAR o SLAMF-CAR tiene al menos un 70, 80, 85, 90, 95 o 99% de homología con una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio intracelular SLAMF natural o un SLAMF intracelular dominio descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio intracelular SLAMF de un RSLAMF-CAR o SLAMF-CAR difiere en no más del 15, 10, 5, 2 o 1% de sus residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio intracelular SLAMF de origen natural o un SLAMF dominio intracelular descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio intracelular SLAMF de un RSLAMF-CAR o SLAMF-CAR difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuo de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio intracelular SLAMF de origen natural o un dominio intracelular SLAMF descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio intracelular SLAMF de un RSLAMF-CAR o SLAMF-CAR no difiere de, o comparte 100% de homología con, una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio intracelular SLAMF natural o un dominio intracelular SLAMF descrito en el presente documento.

Receptores de unión a Fc

Los RNKR-CAR y los NKCAR descritos en el presente documento incluyen los CAR basados en los receptores Fc, RFcR-CAR o FcR-CAR, respectivamente, que comparten propiedades funcionales y estructurales con CD16 y CD64. Los RFcR-CAR de ejemplo incluyen los RCD16 -C^aR y los CD64-CAR. Los FcR-CAR de ejemplo incluyen CD16-CAR y CD64-CAR. Por ejemplo, RFcR-CAR y FcR-CAR comprenden un elemento (por ejemplo, dominio) de un FcR, por ejemplo, CD16 o ^cD64.

Tras la activación, las células NK producen citocinas y quimiocinas en abundancia y al mismo tiempo exhiben una potente actividad citolítica. La activación de las células NK puede ocurrir mediante la unión directa de los receptores de las células NK a ligandos en la célula diana, como se observa con la muerte directa de las células tumorales, o mediante la reticulación del receptor Fc (CD 16; F^cyRIII) al unirse a la parte Fc de anticuerpos unidos a una célula portadora de antígeno. Este compromiso de CD16 (entrecruzamiento de CD16) inicia las respuestas de las células NK a través de señales intracelulares que se generan a través de una, o ambas, de las cadenas adaptadoras asociadas a CD16, F^cR^yo CD3 Z. La activación de CD16 conduce a la fosforilación de la cadena ^yo Z, que a su vez recluta tirosina quinasas, syk y ^zAP-70, iniciando una cascada de transducción de señales que conduce a funciones efectoras rápidas y potentes. La función efectora más conocida es la liberación de gránulos citoplasmáticos que transportan proteínas tóxicas para destruir las células diana cercanas mediante el proceso de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. La reticulación de CD16 también da como resultado la producción de citocinas y quimiocinas que, a su vez, activan y orquestan una serie de respuestas inmunes.

Sin embargo, a diferencia de los linfocitos T y B, se cree que las células NK tienen solo una capacidad limitada para el reconocimiento de blancos utilizando receptores de activación codificados por la línea germinal (Bottino et al., Curr Top Microbiol Immunol. 298: 175-182 (2006); Stewart et al. ., Curr Top Microbiol Immunol. 298: 1 - 21 (2006)). Las células NK expresan el receptor CD 16 de Fc activador, que reconoce las células diana recubiertas de IgG, ampliando así el reconocimiento de la diana (Ravetch & Bolland, Annu Rev Immunol. 19: 275-290 (2001); Lanier Nat. Immunol. 9 (5): 495-502 (2008); Bryceson y Long, Curr Opin Immunol.20 (3): 344-352 (2008)). La actividad de expresión y transducción de señales de varios receptores de activación de células NK requiere adaptadores físicamente asociados, que transducen señales a través de motivos de activación inmunorreceptores basados en tirosina (ITAM). Entre estos adaptadores, las cadenas de FcRy y CD3Z se pueden asociar con CD16 y receptores de citoxicidad natural (NCR) como homodímeros o heterodímeros unidos a disulfuro, y estas cadenas se cree que son expresadas por todas las células NK maduras.

La secuencia de aminoácidos para CD16 (Homo sapiens) está disponible en la base de datos del NCBI; consulte, por ejemplo, el número de acceso NP_000560.5 (GI: 50726979), NP_001231682.1 (GI: 348041254)

En una realización, un RFcR-CAR o FcR-CAR comprende un dominio de unión a antígeno y un dominio transmembrana FcR. En una realización, un RFcR-CAR o FcR-CAR comprende un dominio de unión a antígeno y un dominio intracelular FcR.

El dominio extracelular de CD16, tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un dominio de polipéptido que tiene propiedades estructurales y funcionales de un dominio extracelular de un CD16. En una realización, el dominio extracelular CD 16 de un RCD 16-CAR o CD16-CAR tiene al menos un 70, 80, 85, 90, 95 o 99% de homología con una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio extracelular CD 16 de origen natural o un dominio extracelular de CD 16 descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio extracelular de CD 16 de un RCD 16-CAR o CD16-CAR difiere en no más del 15, 10, 5, 2 o 1% de sus residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio extracelular de CD 16 de origen natural o un dominio extracelular de CD 16 descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio extracelular de CD 16 de un RCD 16-CAR o CD16-CAR difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuo de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio extracelular CD16 de origen natural o un dominio extracelular CD16 descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio extracelular CD16 de un RCD 16-CAR o CD16-CAR no difiere de, o comparte un 100% de homología con, una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio extracelular CD16 de origen natural o un dominio extracelular CD16 descrito en el presente documento.

El dominio de bisagra o tallo de CD16, tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un dominio de polipéptido que tiene propiedades estructurales y funcionales de un dominio de bisagra o tallo de un CD16. En una realización, el dominio de bisagra o tallo de CD16 de un RCD 16-CAR o CD16-CAR tiene al menos un 70, 80, 85, 90, 95 o 99% de homología con una secuencia de referencia, por ejemplo, una bisagra o tallo de CD16 de origen natural dominio o un dominio de bisagra o tallo CD16 descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio de bisagra o tallo de CD16 de un RCD 16-CAR o CD16-CAR difiere en no más del 15, 10, 5, 2 o 1% de sus residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, una bisagra de CD16 de origen natural o dominio de tallo o un dominio de tallo o bisagra de CD16 descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio de bisagra o tallo de CD16 de un RCD 16-CAR o CD16-CAR difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuo de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio de bisagra o tallo de CD 16 de origen natural o un dominio de bisagra o tallo de CD 16 descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio de bisagra o tallo de CD 16 de un RCD 16-CAR o CD 16-CAR no difiere o comparte un 100% de homología con una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio de bisagra o tallo de CD 16 de origen natural o un CD 16 dominio de bisagra o tallo descrito en el presente documento.

El dominio transmembrana de CD 16, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un dominio polipeptídico que tiene propiedades estructurales y funcionales de un dominio transmembrana de un CD 16. En una realización, el dominio transmembrana de CD 16 de un RCD 16-CAR o CD 16-CAR tiene al menos un 70, 80, 85, 90, 95 o 99% de homología con una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio transmembrana CD 16 de origen natural o un dominio transmembrana CD 16 descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio transmembrana de CD 16 de un RCD 16-CAR o CD 16-CAR difiere en no más del 15, 10, 5, 2 o 1% de sus residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, una transmembrana CD 16 de origen natural dominio o un dominio transmembrana CD 16 descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio transmembrana de CD 16 de un RCD 16-CAR o CD16-CAR difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuo de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio transmembrana CD 16 de origen natural o un dominio transmembrana CD 16 descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio transmembrana CD 16 de un RCD 16-CAR o CD16-CAR no difiere de, o comparte 100% de homología con, una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio transmembrana CD 16 de origen natural o un dominio transmembrana CD 16 descrito en el presente documento. .

El dominio intracelular de CD16, tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un dominio polipeptídico que tiene propiedades estructurales y funcionales de un dominio intracelular de un CD 16. En una realización, el dominio intracelular de CD 16 de un R^cD 16-CAR o CD16-CAR tiene en al menos 70, 80, 85, 90, 95 o 99% de homología con una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio intracelular CD 16 de origen natural o un dominio intracelular CD 16 descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio intracelular de CD 16 de un RCD 16-CAR o CD 16-CAR difiere en no más del 15, 10, 5, 2 o 1% de sus residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, un CD 16 intracelular de origen natural. dominio o un dominio intracelular CD 16 descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio intracelular de CD 16 de un RCD 16-CAR o CD 16-CAR difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuo de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio intracelular CD16 de origen natural o un dominio intracelular CD 16 descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio intracelular CD 16 de un RCD 16-CAR o CD 16-CAR no difiere de, o comparte un 100% de homología con, una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio intracelular CD16 de origen natural o un dominio intracelular CD 16 descrito en el presente documento.

El dominio extracelular de CD64, tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un dominio de polipéptido que tiene propiedades estructurales y funcionales de un dominio extracelular de un CD64. En una realización, el dominio extracelular de CD64 de un RCD64-CAR o CD64-CAR tiene al menos un 70, 80, 85, 90, 95 o 99% de homología con una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio extracelular CD64 de origen natural o un CD64 extracelular dominio descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio extracelular de CD64 de un RCD64-CAR o CD64-CAR difiere en no más del 15, 10, 5, 2 o 1% de sus residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio extracelular de CD64 de origen natural o un CD64 dominio extracelular descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio extracelular CD64 de un RCD64-CAR o CD64-CAR difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuo de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio extracelular CD64 de origen natural o un dominio extracelular CD64 descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio extracelular CD64 de un RCD64-CAR o CD64-CAR no difiere de, o comparte un 100% de homología con, una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio extracelular CD64 de origen natural o un dominio extracelular CD64 descrito en el presente documento.

El dominio de bisagra o tallo de CD64, tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un dominio de polipéptido que tiene propiedades estructurales y funcionales de un dominio de bisagra o tallo de un CD64. En una realización, el dominio de bisagra o tallo de CD64 de un RCD64-CAR o CD64-CAR tiene al menos un 70, 80, 85, 90, 95 o 99% de homología con una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio de bisagra o tallo de CD64 de origen natural o un dominio de tallo o bisagra CD64 descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio de bisagra o tallo de CD64 de un RCD64-CAR o CD64-CAR difiere en no más del 15, 10, 5, 2 o 1% de sus residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, una bisagra o tallo de CD64 de origen natural dominio o un dominio de bisagra o tallo CD64 descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio de bisagra o tallo de CD64 de un RCD64-CAR o CD64-CAR difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuo de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio de bisagra o tallo de CD64 de origen natural o un dominio de bisagra o tallo de CD64 descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio de bisagra o tallo de CD64 de un RCD64-CAR o CD64-CAR no difiere de, o comparte un 100% de homología con, una secuencia de referencia, por ejemplo, Un dominio de bisagra o tallo de CD64 de origen natural o un dominio de bisagra o tallo de CD64 descrito aquí.

El dominio transmembrana de CD64, tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un dominio polipeptídico que tiene propiedades estructurales y funcionales de un dominio transmembrana de un CD64. En una realización, el dominio transmembrana CD64 de un RCD64-CAR o CD64-CAR tiene al menos un 70, 80, 85, 90, 95 o 99% de homología con una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio transmembrana CD64 de origen natural o una transmembrana CD64 dominio descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio transmembrana CD64 de un RCD64-CAR o CD64-CAR difiere en no más del 15, 10, 5, 2 o 1% de sus residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio transmembrana CD64 de origen natural o un CD64 dominio transmembrana descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio transmembrana de CD64 de un RCD64-CAR o CD64-CAR difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuo de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio transmembrana CD64 de origen natural o un dominio transmembrana CD64 descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio transmembrana CD64 de un RCD64-CAR o CD64-CAR no difiere de, o comparte un 100% de homología con, una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio transmembrana CD64 de origen natural o un dominio transmembrana CD64 descrito en el presente documento.

El dominio intracelular de CD64, tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un dominio de polipéptido que tiene propiedades estructurales y funcionales de un dominio intracelular de un CD64. En una realización, el dominio intracelular CD64 de un RCD64-CAR o CD64-CAR tiene al menos un 70, 80, 85, 90, 95 o 99% de homología con una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio intracelular CD64 de origen natural o un dominio intracelular CD64 dominio descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio intracelular de CD64 de un RCD64-CAR o CD64-CAR difiere en no más del 15, 10, 5, 2 o 1% de sus residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio intracelular de CD64 de origen natural o un CD64 dominio intracelular descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio intracelular de CD64 de un RCD64-CAR o CD64-CAR difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuo de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio intracelular CD64 de origen natural o un dominio intracelular CD64 descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio intracelular CD64 de un RCD64-CAR o CD64-CAR no difiere de, o comparte un 100% de homología con, una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio intracelular CD64 de origen natural o un dominio intracelular CD64 descrito en el presente documento.

Ly49 y receptores similares a lectina de células asesinas relacionados

Los RNKR-CAR y NKCAR descritos en el presente documento incluyen RLy49CAR o Ly49-CAR, respectivamente, que comparten propiedades funcionales y estructurales con Ly49. Por ejemplo, RLy49-CAR y Ly49-CAR comprenden un elemento (por ejemplo, dominio) de un receptor Ly49.

Los receptores Ly49 se derivan de al menos 23 genes identificados (Ly49A-W) en ratones. Estos receptores comparten muchas de las mismas funciones en células NK y células T de ratón que las que desempeñan los KIR en los seres humanos a pesar de su estructura diferente (proteínas integrales de membrana de tipo II de la superfamilia de lectinas de tipo C), y también contienen un grado considerable de variación genética como los KIR humanos. La notable similitud funcional entre los receptores Ly49 y KIR sugiere que estos grupos de receptores han evolucionado de forma independiente pero convergente para realizar las mismas funciones fisiológicas en las células NK y las células T.

Al igual que los KIR en los seres humanos, los diferentes receptores Ly49 reconocen diferentes alelos del MHC de clase I y se expresan de forma diferencial en subconjuntos de células NK. Los receptores Ly49 prototípicos originales, Ly49A y Ly49C, poseen un dominio citoplasmático que lleva dos motivos inhibidores basados en inmunotirosina (ITIM) similares a los KIR inhibidores, tales como KIR2DL3. Estos dominios se han identificado para reclutar la fosfatasa, SHP-1 y, al igual que los KIR inhibidores, sirven para limitar la activación de las células T y NK. Además de las moléculas Ly49 inhibidoras, varios miembros de la familia, tales como Ly49D y Ly49H, han perdido los dominios que contienen ITIM y, en cambio, han adquirido la capacidad de interaccionar con la molécula adaptadora de señalización, DAP12, similar a los KIR activadores, tales como KIR2DS2 en humanos.

La secuencia de aminoácidos para los miembros de la familia Ly49 está disponible en la base de datos del NCBI, ver, por ejemplo, los números de acceso AAF82184.1 (GI: 9230810), AAF99547.1 (GI: 9801837), NP_034778.2 (GI: 133922593), NP_034779 .1 (GI: 6754462), NP_001095090.1 (GI: 197333718), NP_034776.1 (GI: 21327665), AAK11559.1 (GI: 13021834) y/o NP_038822.3 (GI: 9256549).

En una realización, un RLy49-CAR o Ly49-CAR comprende un dominio de unión a antígeno y un dominio transmembrana Ly49. En una realización, un RLy49-CAR o Ly49-CAR comprende un dominio de unión a antígeno y un dominio intracelular Ly49.

El dominio extracelular de LY49, tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un dominio polipeptídico que tiene propiedades estructurales y funcionales de un dominio extracelular de un LY49. En una realización, el dominio extracelular LY49 de un RLy49-CAR o LY49-CAR tiene al menos un 70, 80, 85, 90, 95 o 99% de homología con una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio extracelular LY49 de origen natural o un dominio extracelular LY49 descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio extracelular LY49 de un RLy49-CAR o LY49-CAR difiere en no más del 15, 10, 5, 2 o 1% de sus residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio extracelular LY49 de origen natural o un dominio extracelular LY49 descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio extracelular LY49 de un RLy49-CAR o LY49-CAR difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio extracelular LY49 de origen natural o un dominio extracelular LY49 descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio extracelular LY49 de un RLy49-CAR o LY49-CAR no difiere de, o comparte un 100% de homología con, una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio extracelular LY49 de origen natural o un dominio extracelular LY49 descrito en el presente documento.

El dominio bisagra o tallo de LY49, tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un dominio de polipéptido que tiene propiedades estructurales y funcionales de un dominio bisagra o tallo de un LY49. En una realización, el dominio bisagra o tallo de LY49 de un RLy49-CAR o LY49-CAR tiene al menos un 70, 80, 85, 90, 95 o 99% de homología con una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio de bisagra o tallo LY49 de origen natural o un dominio bisagra o tallo de LY49 descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio bisagra o tallo de LY49 de un RLy49-CAR o LY49-CAR difiere en no más del 15, 10, 5, 2 o 1% de sus residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio bisagra o tallo de LY49 de origen natural o un dominio bisagra o tallo de LY49 descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio bisagra o tallo de LY49 de un RLy49-CAR o LY49-CAR difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio bisagra o tallo de LY49 de origen natural o un dominio bisagra o tallo de LY49 descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio bisagra o tallo de LY49 de un RLy49-CAR o LY49-CAR no difiere en, o comparte un 100% de homología con, una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio bisagra o tallo de LY49 natural o un dominio bisagra o tallo de LY49 descrito en el presente documento.

El dominio transmembrana LY49, tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un dominio polipeptídico que tiene propiedades estructurales y funcionales de un dominio transmembrana de un LY49. En una realización, el dominio transmembrana LY49 de un RLy49-CAR o LY49-CAR tiene al menos un 70, 80, 85, 90, 95 o 99% de homología con una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio transmembrana LY49 de origen natural o un dominio transmembrana LY49 descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio transmembrana LY49 de un RLy49-CAR o LY49-CAR difiere en no más del 15, 10, 5, 2 o 1% de sus residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio transmembrana LY49 de origen natural o un LY49 dominio transmembrana descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio transmembrana LY49 de un RLy49-CAR o LY49-CAR difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio transmembrana LY49 de origen natural o un dominio transmembrana LY49 descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio transmembrana LY49 de un RLy49-CAR o LY49-CAR no difiere de, o comparte 100% de homología con, una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio transmembrana LY49 de origen natural o un dominio transmembrana LY49 descrito en el presente documento.

El dominio intracelular de LY49, tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un dominio de polipéptido que tiene propiedades estructurales y funcionales de un dominio intracelular de un LY49. En una realización, el dominio intracelular LY49 de un RLy49-CAR o LY49-CAR tiene al menos 70, 80, 85, 90, 95 o 99% de homología con una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio intracelular LY49 de origen natural o un dominio intracelular LY49 dominio descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio intracelular LY49 de un RLy49-CAR o LY49-CAR difiere en no más del 15, 10, 5, 2 o 1% de sus residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio intracelular LY49 de origen natural o un LY49 dominio intracelular descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio intracelular LY49 de un RLy49-CAR o LY49-CAR difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuo de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio intracelular LY49 de origen natural o un dominio intracelular LY49 descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio intracelular LY49 de un RLy49-CAR o LY49-CAR no difiere de, o comparte un 100% de homología con, una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio intracelular LY49 de origen natural o un dominio intracelular LY49 descrito en el presente documento.

Además de los NKR descritos anteriormente, se pueden usar otros receptores (por ejemplo, receptores de células inmunes, por ejemplo, NKR) de acuerdo con las composiciones y procedimientos proporcionados en el presente documento (por ejemplo, en NKR-CAR o RNKR-CAR). Otros receptores (por ejemplo, receptores de células inmunitarias, por ejemplo, NKR) incluyen, pero no se limitan a: NKG2D, CD160 (variante o variantes de corte y empalme que contienen TM), DNAM1, CRTAM, CD27, PSGL1, CD96, CD100, NKp80, CEACAM1 y CD244.

Los números de acceso de Genbank para las secuencias de aminoácidos de estos receptores son, por ejemplo, NKG2D humano (NP_031386.2; GI: 169234653), CD160 humano (XP_005272987.1; GI: 530363840, o XP_005272986.1; GI: 530363838), DNAM1 humano (NP_001290548.1; GI: 746816112, o NP_001290547.1; GI: 746816106), CRTAM humano (NP_001291711.1; GI: 755571554, o NP_062550.2; GI: 51593098), CD27 humano (NP_00123375.1; GI: ), PSGL1 humano (NP_001193538.1; GI: 331284238, o NP_002997.2; GI: 331284236), CD96 humano (NP_937839.1; GI: 38683840 o NP_005807.1; GI: 5032141), CD100 humano (NP_006369.3 ; GI: 214010218, o NP_001135759.1; GI: 214010220), NKp80 humano (NP_001278751.1; GI: 625180299, o NP_001278752.1; GI: 625180293, o NP_057607.1; GI: 7705574), humano CE00AC1703. 2 GI: 19923195, o NP_001020083.1 GI: 68161541, o NP_001171742.1 GI: 296317305, o NP_001171744.1 GI: 296317312, o NP_001171745.1 GI: 296317314, o NP_001192273.1 GI: 329112547) y CD244 humano (NP_057466.1; GI: 7706529, o NP_001160135.1; GI: 262263435, o NP_001160136.1; GI: 262263438).

RNKR-CAR Y NKR-CAR INHIBIDORES

La presente divulgación proporciona composiciones y procedimientos para limitar el agotamiento de células no cancerosas mediante un tipo de terapia con células que expresan CAR (por ejemplo, terapia CART o CARN). Tal como se describe en el presente documento, un tipo de terapia celular que expresa CAR comprende el uso de receptores NK que incluyen, pero no se limitan a, receptores activadores e inhibidores de células NK conocidos como receptor de tipo inmunoglobulina de células asesinas (KIR). En consecuencia, la divulgación proporciona composiciones y procedimientos para usar un RNKR-CAR, por ejemplo, un RKIR-CAR, que incluye, pero sin limitación, un Rn Kr-CAR activador (RactNKR-CAR), por ejemplo, un RKIR-CAR activador (RactKIR-CAR) y un RNKR-CAR inhibidor (RinhNKR-CAR), por ejemplo, un RKIR-CAR inhibidor (RinhKIR-CAR). También se proporcionan composiciones y procedimientos de uso de un NKR-CAR, por ejemplo, un KIR-CAR, que incluye, pero sin limitación, un NKR-CAR activador (actNKR-CAR), por ejemplo, un KIR-CAR activador (actKIR-CAR) y un NKR-CAR inhibidor (inhNKR-CAR), por ejemplo, un KIR-^cAR inhibidor (inhKIR-CAR)

En algunas realizaciones, el KIR de un RinhKIR-CAR o inhKIR-CAR es un KIR inhibidor que comprende una cola citoplasmática larga que contiene un Motivo Inhibidor Inmunorreceptor basado en Tirosina (ITIM), que transduce señales inhibidoras (referidas en otra parte en el presente documento como RinhKIR- CAR o inhKIR-CAR).

En algunas realizaciones, un RinhKIR-CAR o inhKIR-CAR comprende un dominio citoplasmático de una molécula inhibidora distinta de KIR. Estas moléculas inhibidoras pueden, en algunas realizaciones, disminuir la capacidad de una célula para montar una respuesta efectora inmunitaria. Los dominios citoplasmáticos de moléculas inhibidoras pueden acoplarse, por ejemplo, por fusión, a dominios transmembrana de KIR. En la tabla 3 se muestran ejemplos de moléculas inhibidoras.

En algunas realizaciones, un RinhKIR-CAR o inhKIR-CAR comprende un dominio citoplasmático PD1. Un dominio citoplasmático de PD1, tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un dominio polipeptídico que tiene propiedades estructurales y funcionales de un dominio citoplasmático de un PD1. En una realización, el dominio citoplasmático PD1 de un r KiR-CAR o KIR-CAR tiene al menos un 70, 80, 85, 90, 95 o 99% de homología con una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio citoplasmático PD1 de origen natural o un dominio citoplasmático PD1 dominio descrito en el presente documento (SEQ ID NO: 164). En realizaciones, el dominio citoplasmático PD1 de un RKIR-CAR o KIR-CAR difiere en no más del 15, 10, 5, 2 o 1% de sus residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio citoplasmático PD1 de origen natural o un PD1 dominio citoplasmático descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio citoplasmático PD1 de un RKIR-CAR o KIR-CAR difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio citoplasmático PD1 de origen natural o un dominio citoplasmático PD 1 descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio citoplasmático PD1 de un RKIR-CAR o KIR-CAR no difiere de, o comparte un 100% de homología con, una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio citoplasmático PD1 de origen natural o un dominio citoplasmático PD1 descrito en el presente documento.

En algunas realizaciones, un RinhKIR-CAR o inhKIR-CAR comprende un dominio citoplasmático CTLA-4. Un dominio citoplasmático CTLA-4, tal como se usa este término en el presente documento, se refiere a un dominio polipeptídico que tiene propiedades estructurales y funcionales de un dominio citoplasmático de un CTLA-4. En una realización, el dominio citoplasmático CTLA-4 de un RKIR-CAR o KIR-CAR tiene al menos un 70, 80, 85, 90, 95 o 99% de homología con una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio citoplasmático CTLA-4 de origen natural o un dominio citoplasmático CTLA-4 descrito en el presente documento (SEQ ID NO: 165). En realizaciones, el dominio citoplasmático CTLA-4 de un RKIR-CAR o KIR-CAR difiere en no más del 15, 10, 5, 2 o 1% de sus residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio citoplasmático CTLA-4 de origen natural o un dominio citoplasmático CTLA-4 descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio citoplasmático CTLA-4 de un RKIR-CAR o KIR-CAR difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio citoplasmático CTLA-4 de origen natural o un dominio citoplasmático CTLA-4 descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio citoplasmático CTLA-4 de un RKIR-CAR o KIR-CAR no difiere de, o comparte un 100% de homología con, una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio citoplasmático CTLA-4 de origen natural o un dominio citoplasmático CTLA-4 descrito en el presente documento.

En una realización, un RinhNKR-CAR o inhNKR-CAR, por ejemplo, un RinhNKR-CAR o inhKIR-CAR, al acoplarse con un antígeno en una célula no diana o espectadora, inactiva la célula citotóxica que comprende el RinhNKR-CAR o inhNKR-CAR. Si bien gran parte de la descripción a continuación se refiere a RinhNKR-CAR o inhKIR-CAR, la invención incluye la aplicación análoga de otros RinhNKR-CAR o inhNKR-CAR.

En una realización, las células T que expresan RactKIR-CAR o actKIR-CAR exhiben una propiedad antitumoral cuando se unen a su diana, mientras que las células T que expresan RinhKIR-CAR o inhKIR-CAR dan como resultado la inhibición de la actividad celular cuando RinhKIR- CAR o inhKIR-CAR se une a su diana.

Independientemente del tipo de RKIR-CAR o KIR-CAR, los RKIR-CAR y los KIR-CAR están diseñados para comprender un dominio extracelular que tiene un dominio de unión a antígeno fusionado a un dominio citoplasmático. En una realización, los RKIR-CAR o KIR-CAR, cuando se expresan en una célula T, pueden redirigir el reconocimiento de antígenos basándose en la especificidad del antígeno. Un antígeno de ejemplo es CD19 porque este antígeno se expresa en linfoma de células B. Sin embargo, CD19 también se expresa en células B normales y, por tanto, los cAr que comprenden un dominio anti-CD 19 pueden dar como resultado el agotamiento de las células B normales. El agotamiento de las células B normales puede hacer que un sujeto tratado sea susceptible a la infección, ya que las células B normalmente ayudan a las células T en el control de la infección. La presente divulgación proporciona composiciones y procedimientos para limitar el agotamiento del tejido normal durante la terapia celular que expresa RKIR-CAR o que expresa KIR-CAR. En un caso, la presente divulgación proporciona procedimientos para tratar cáncer y otros trastornos utilizando terapia celular que expresa RKIR-CAR o que expresa KIR-CAR, a la vez que se limita el agotamiento de células espectadoras sanas.

En un caso, la divulgación comprende controlar o regular la actividad celular que expresa RKIR-CAR o que expresa KIR-CAR. En un caso, la divulgación comprende composiciones y procedimientos relacionados con la modificación genética de células inmunes, por ejemplo, células T o NK, para expresar una pluralidad de tipos de RKIR-CAR o KIR-CAR, donde la activación celular que expresa RKIR-CAR o que expresa KIR-CAR depende de la unión a una pluralidad de tipos de RKIR-CAR o KIR-CAR a su receptor diana. La dependencia de la unión de una pluralidad de tipos de RKIR-CAR o KIR-CAR mejora la especificidad de la actividad lítica de la célula que expresa RKIR-CAR o que expresa KIR-CAR, reduciendo así el potencial de agotamiento del tejido sano normal.

En otro caso, la divulgación comprende composiciones y procedimientos relacionados con la modificación genética de células inmunes, por ejemplo células T o NK, con un RKIR-CAR o KIR-CAR inhibidor. En un caso, el RKIR-CAR inhibidor o KIR-CAR comprende un dominio de unión a antígeno extracelular que reconoce un antígeno asociado con una célula normal, no cancerosa, y un dominio citoplasmático inhibidor.

En una realización, la invención proporciona un RKIR-CAR o KIR-CAR dual en el que una célula inmunitaria se modifica genéticamente para expresar un RinhKIR-CAR o inhKIR-CAR y un RactKIR-CAR y actKIR-CAR. En una realización, la unión a RinhKIR-CAR o inhKIR-CAR a una célula normal no cancerosa da como resultado la inhibición de la célula que expresa RKIR-CAR dual o que expresa KIR-CAR. Por ejemplo, en una realización, la unión a RinhKIR-CAR o inhKIR-CAR a una célula normal no cancerosa da como resultado la muerte de la célula dual que expresa RKIR-CAR o que expresa KIR-CAR. En otra realización, la unión a RinhKIR-CAR o inhKIR-CAR a una célula normal no cancerosa da como resultado la inhibición de la transducción de señales de RactKIR-CAR o actKIR-CAR. En otra realización más, la unión al RinhKIR-CAR o inhKIR-CAR a un normal, La célula no cancerosa da como resultado la inducción de una señal de transducción de señales que evita que la célula que expresa RactKIR-CAR o que expresa actKIR-CAR muestre su actividad antitumoral. En consecuencia, el RKIR-CAR dual o KIR-CAR que comprende al menos un RinhKIR-CAR o inhKIR-CAR y al menos un RactKIR-CAR o actKIR-CAR de la divulgación proporciona un mecanismo para regular la actividad del RKIR-CAR dual- célula que expresa o que expresa KIR-CAR.

En un caso, la presente divulgación proporciona procedimientos para tratar el cáncer y otros trastornos usando terapias celulares que expresan RKIR-CAR o que expresan KIR-CAR mientras se minimiza el agotamiento del tejido sano normal. El cáncer puede ser una neoplasia maligna hematológica, un tumor sólido, un tumor primario o metastatizante. Otras enfermedades que se pueden tratar usando las composiciones y procedimientos de la divulgación incluyen infecciones virales, bacterianas y parasitarias, así como enfermedades autoinmunes.

DOMINIO BISAGRA EXTRACELULAR

El dominio de bisagra extracelular, tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a una secuencia de polipéptidos de un RCAR, RNKR-CAR o NKR-CAR dispuesto entre el dominio transmembrana y el dominio de unión a antígeno. En una realización, el dominio de bisagra extracelular permite una distancia suficiente de la superficie exterior de la célula y el dominio de unión a antígeno, así como flexibilidad para minimizar el impedimento estérico entre la célula y el dominio de unión a antígeno. En una realización, el dominio de bisagra extracelular es suficientemente corto o flexible para que no interfiera con el acoplamiento de la célula que incluye el RCAR, RNKR-CAR o NKR-CAR con una célula portadora de antígeno, por ejemplo, una célula diana. En una realización, el dominio bisagra extracelular tiene una longitud de 2 a 20, 5 a 15, 7 a 12 u 8 a 10 aminoácidos. En una realización, el dominio de bisagra incluye al menos 50, 20 o 10 residuos. En realizaciones, la bisagra tiene una longitud de 10 a 300, 10 a 250 o 10 a 200 residuos. En una realización, la distancia desde la que se extiende la bisagra desde la célula es suficientemente corta para que la bisagra no obstaculice el acoplamiento con la superficie de una célula objetivo. En una realización, la bisagra se extiende menos de 20, 15 o 10 nanómetros desde la superficie de la célula citotóxica. Por tanto, la idoneidad para una bisagra puede verse influida por la longitud lineal, el número de residuos de aminoácidos y la flexibilidad de la bisagra. Una bisagra de IgG4 puede tener hasta 200 aminoácidos de longitud, pero la distancia que se extiende desde la superficie de la célula citotóxica es menor debido al plegamiento del dominio de Ig. Una bisagra CD8alpha, que tiene ~43 aminoácidos, es bastante lineal a ~ 8 nm de longitud. En contraste, la bisagra de IgG4 C2 y C3) tiene una longitud de ~ 200 aminoácidos, pero tiene una distancia de la superficie de la célula citotóxica comparable a la de la bisagra CD8 alfa. Si bien no desea ceñirse a la teoría, la similitud en la extensión está influenciada por la flexibilidad.

En algunos casos, el dominio de bisagra extracelular es, por ejemplo, una bisagra de una proteína humana, un fragmento de la misma, o un enlazador oligo o polipéptido corto.

En algunas realizaciones, la bisagra es una secuencia artificial. En una realización, la bisagra es un conector oligopéptido corto que comprende un doblete de glicina-serina.

En algunas realizaciones, la bisagra es una secuencia de origen natural. En algunas realizaciones, la bisagra puede ser una bisagra de Ig humana (inmunoglobulina) o un fragmento de la misma. En una realización, por ejemplo, la bisagra comprende (por ejemplo, consiste en) la secuencia de aminoácidos de la bisagra de IgG4 (SEQ ID NO: 166). En una realización, por ejemplo, la bisagra comprende (por ejemplo, consiste en) la secuencia de aminoácidos de la bisagra de IgD (SEQ ID NO: 167). En algunas realizaciones, la bisagra puede ser una bisagra CD8 humana o un fragmento de la misma. En una realización, por ejemplo, la bisagra comprende (por ejemplo, consta de) la secuencia de aminoácidos de la bisagra CD8 (SEQ ID NO: 168).

DOMINIO DE UNION A ANTIGENO

Los CAR descritos en el presente documento, por ejemplo, los RCAR, NKR-CAR y RNKR-CAR descritos en el presente documento, incluyen un dominio de unión a antígeno en la región extracelular del miembro de unión a antígeno. Un "dominio de unión a antígeno" como se usa el término en el presente documento, se refiere a una molécula que tiene afinidad por un antígeno diana, típicamente un antígeno en una célula diana, por ejemplo, una célula cancerosa. Un dominio de unión a antígeno ejemplar comprende un polipéptido, por ejemplo, Una molécula de anticuerpo (que incluye un anticuerpo y sus fragmentos de unión a antígeno, por ejemplo, Una inmunoglobulina, un anticuerpo de dominio único (sdAb) y un scFv) o un armazón no de anticuerpo, por ejemplo, una fibronectina y similares. En realizaciones, el dominio de unión a antígeno es un único polipéptido. En realizaciones, el dominio de unión a antígeno comprende uno, dos o más polipéptidos.

La elección de un dominio de unión a antígeno puede depender del tipo y número de ligandos o receptores que definen la superficie de una célula diana. Por ejemplo, el dominio de unión a antígeno puede elegirse para reconocer un ligando o receptor que actúa como marcador de superficie celular en células diana asociadas con una enfermedad particular. Ejemplos de marcadores de superficie celular que pueden actuar como ligandos o receptores incluyen un marcador de superficie celular asociado con un estado de enfermedad particular, por ejemplo, productores de superficie celular para enfermedades virales, enfermedades bacterianas, infecciones parasitarias, enfermedades autoinmunes y trastornos asociados con la proliferación celular no deseada, por ejemplo, un cáncer, por ejemplo, un cáncer descrito en el presente documento.

En el contexto de la presente divulgación, "antígeno tumoral" o "antígeno de trastorno proliferativo" o "antígeno asociado con un trastorno proliferativo" se refiere a antígenos que son comunes a trastornos proliferativos específicos. En ciertos aspectos, los antígenos del trastorno proliferativo de la presente divulgación se derivan de cánceres que incluyen, entre otros, melanoma primario o metastásico, timoma, linfoma, sarcoma, cáncer de pulmón (por ejemplo, NSCLC o SCLC), cáncer de hígado, linfoma no Hodgkin. , Linfoma de Hodgkin, leucemias, mieloma múltiple, glioblastoma, neuroblastoma, cáncer de útero, cáncer de cuello uterino, cáncer de riñón, cáncer de tiroides, cáncer de vejiga, cáncer de riñón, mesotelioma y adenocarcinomas como cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de colon cáncer y similares. En algunas realizaciones, el cáncer es leucemia linfoide aguda de células B ("BALL"), leucemia linfoide aguda de células T ("TALL"), leucemia linfoide aguda (ALL), leucemia mielógena aguda (AML); una o más leucemias crónicas que incluyen, pero no se limitan a, leucemia mielógena crónica (CML), leucemia linfocítica crónica (CLL); cánceres hematológicos o afecciones hematológicas adicionales que incluyen, entre otros, leucemia prolinfocítica de células B, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas, linfoma de Burkitt, linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular, leucemia de células pilosas, linfoma folicular de células pequeñas o de células grandes, afecciones linfoproliferativas malignas, linfoma MALT, linfoma de células del manto, linfoma de la zona marginal, mieloma múltiple, mielodisplasia y síndrome mielodisplásico, linfoma no Hodgkin, linfoma plasmablástico, neoplasma de células dendríticas plasmacitoides, macroglobulinemia de Waldenstrom.

En una realización, el antígeno tumoral comprende uno o más epítopos de cáncer antigénicos reconocidos inmunológicamente por linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) derivados de un tumor canceroso de un mamífero. Los antígenos tumorales son proteínas producidas por las células tumorales que provocan una respuesta inmunitaria, en particular respuestas inmunitarias mediadas por células T. La selección del dominio de unión a antígeno de la divulgación dependerá del tipo particular de cáncer a tratar. Los antígenos tumorales son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, un antígeno asociado a glioma, antígeno carcinoembrionario (CEA), EGFRvIlI, IL-11Ra, IL-13Ra, EGFR, FAP, B7H3, Kit, CA-IX, CS- 1, MUC1, BCMA, bcr-abl, HER2, gonadotropina coriónica humana p, alfafetoproteína (AFP), ALK, CD19, CD123, ciclina B1, AFP reactiva a lectina, antígeno 1 relacionado con Fos, ADRB3, tiroglobulina, EphA2, RAGE -1, RU1, RU2, SSX2, AKAP-4, LCK, OY-TES1, PAX5, SART3, CLL-1, fucosyl GM1, GloboH, MN-CA IX, EPCAM, EVT6-AML, TGS5, transcriptasa inversa de telomerasa humana, ácido plisálico, PLAC1, RU1, RU2 (AS), receptor de folato beta, ROR1, Flt3, T^aG72, TN Ag, Tie 2, TEM1, TEM7R, CLDN6, TSHR, UPK2 y mesotelina. En una realización preferida, el antígeno tumoral se selecciona del grupo que consiste en receptor de folato (FRa), mesotelina, EGFRvIlI, IL-13Ra, CD123, CD19, CD33, BCMA, GD2, CLL-1, CA-IX, MUC1, HER2 y cualquier combinación de los mismos.

En una realización, el antígeno tumoral comprende uno o más epítopos antigénicos de cáncer asociados con un tumor maligno. Los tumores malignos expresan una serie de proteínas que pueden servir como antígenos diana para un ataque inmunológico. Estas moléculas incluyen, pero no se limitan a, antígenos específicos de tejido tales como MART-1, tirosinasa y GP 100 en melanoma y fosfatasa de ácido prostático (PAP) y antígeno prostático específico (PSA) en cáncer de próstata. Otros antígenos diana incluyen moléculas relacionadas con la transformación como el oncogén HER-2/Neu/ErbB-2. Otro grupo más de antígenos diana son los antígenos onco-fetales como el antígeno carcinoembrionario (CEA). En el linfoma de células B, la inmunoglobulina idiotipo específica del tumor constituye un antígeno de inmunoglobulina verdaderamente específico del tumor que es exclusivo del tumor individual. Antígenos de diferenciación de células B como CD19,

Los ejemplos no limitantes de antígenos tumorales incluyen los siguientes: Antígenos de diferenciación como MART-1/MelanA (MART-I), gp100 (Pmel 17), tirosinasa, TRP-1, TRP-2 y antígenos multilinaje específicos de tumores como MAGE -1, MAGE-3, Ba Ge , Ga Ge-1, GAGE-2, p15; antígenos embrionarios sobreexpresados tales como CEA; oncogenes sobreexpresados y genes supresores de tumores mutados tales como p53, Ras, HER-2/neu; antígenos tumorales únicos resultantes de translocaciones cromosómicas; tales como BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; y antígenos virales, tales como los antígenos EBVA del virus de Epstein Barr y los antígenos E6 y E7 del virus del papiloma humano (VPH). Otros antígenos grandes basados en proteínas incluyen TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, beta-catenina, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, Dependiendo del antígeno deseado al que se dirija, los RCAR, NKR-CAR o RNKR-CAR descritos en el presente documento pueden diseñarse para incluir el dominio de unión a antígeno apropiado que es específico para el antígeno diana deseado.

Un RCAR, NKR-CAR o RNKR-CAR como se describe en el presente documento, comprende un dominio de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de anticuerpo) que se une a un péptido presentado por MHC. Normalmente, los péptidos derivados de proteínas endógenas llenan el bolsillo de las moléculas de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) y son reconocidos por los receptores de células T (TCR) en los linfocitos T CD8 . Los complejos MHC de clase I son expresados constitutivamente por todas las células nucleadas. En el cáncer, los complejos de péptido/MHC específicos de virus y/o específicos de tumor representan una clase única de dianas de superficie celular para inmunoterapia. Se han descrito anticuerpos de tipo t Cr que se dirigen a péptidos derivados de antígenos virales o tumorales en el contexto del antígeno leucocitario humano (HLA) -A1 o HLA-A²(véase, por ejemplo, Sastry et al., J Virol. 2011 85 (5): 1935-1942; Sergeeva et al., Bood, 2011 117 (16): 4262-4272; Verma et al., J Immunol 2010 184 (4): 2156-2165; Willemsen et al., Gene Ther 2001 8 (21): 1601 1608; Dao y col., Sci Transl Med 20135 (176): 176ra33; Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19 (2): 84-100). Por ejemplo, un anticuerpo similar a TCR se puede identificar a partir del cribado de una biblioteca, tal como una biblioteca presentada en fagos scFv humano. En consecuencia, la presente divulgación proporciona un CAR, por ejemplo, un RCAR, NKR-CAR o RNKR-CAR descrito en el presente documento, que comprende un dominio de unión a antígeno que se une a un péptido presentado por MHC de una molécula seleccionada de cualquier antígeno tumoral descrito anteriormente que sea expresado intracelularmente, por ejemplo, p53, BCR-Abl, Ras, K-ras, NY-ESO-1 y c-met.

También se proporcionan en el presente documento RCAR, NKR-CAR o RNKR-CAR en los que el miembro de unión a antígeno comprende una pluralidad de dominios de unión a antígeno. Sin pretender imponer ninguna teoría, se cree que un miembro de unión a antígeno que comprende dos o más dominios de unión a antígeno puede dar como resultado una mejora aditiva o sinérgica de las funciones de activación y efectoras cuando se encuentran los dos o más antígenos correspondientes. Sin desear ceñirse a la teoría, también se cree que un miembro de unión a antígeno que comprende dos o más dominios de unión a antígeno puede aumentar la especificidad de las células efectoras para las células cancerosas frente a las células normales, para compensar el escape de antígeno o para permitir que se dirija al cáncer celular y el microambiente del cáncer.

En esta realización, el miembro de unión a antígeno puede comprender una pluralidad de, por ejemplo, 2, 3, 4 o 5 dominios de unión a antígeno, por ejemplo, scFv, en el que cada dominio de unión a antígeno se une a un antígeno diana. En una realización, dos o más de los dominios de unión a antígenos pueden unirse a diferentes antígenos. En una realización, dos o más de los dominios de unión a antígeno pueden unirse al mismo antígeno, por ejemplo, el mismo o diferentes epítopos en el mismo antígeno. En una realización, la pluralidad de dominios de unión a a n t íg e n o s e s tá n u n id o s e n tre sí, p o r e je m p lo , e l e x t re m o C d e un p r im e r d o m in io d e u n ió n a a n t íg e n o s e s tá u n id o a l e x tre m o N d e un s e g u n d o d o m in io d e u n ió n a a n tíg e n o s . E n u n a re a liz a c ió n , e l e x tre m o C d e un p r im e r d o m in io de u n ió n a a n tíg e n o se u n e a l e x tre m o N d e un s e g u n d o d o m in io d e u n ió n a a n tíg e n o m e d ia n te un e n la c e c o v a le n te , p o r e je m p lo , un e n la c e p e p tíd ic o . El o rd e n d e lo s d o m in io s d e u n ió n a a n tíg e n o se p u e d e o p t im iz a r p a ra a u m e n ta r la u n ió n a lo s a n tíg e n o s d ia n a s im u ltá n e a m e n te , p o r e je m p lo , m e d ia n te e l ta m a ñ o re la t iv o d e lo s a n tíg e n o s d ia n a c o r re s p o n d ie n te s . P o r e je m p lo , p a ra e l m a y o r d e lo s a n tíg e n o s d ia n a , e l d o m in io d e u n ió n a a n tíg e n o c o r re s p o n d ie n te e s tá d is p u e s to m á s c e rc a d e l d o m in io t ra n s m e m b ra n a d e l m ie m b ro d e u n ió n a a n tíg e n o ; y p a ra e l m á s p e q u e ñ o d e lo s a n tíg e n o s d ia n a , e l d o m in io d e u n ió n a a n tíg e n o c o rre s p o n d ie n te e s tá d is p u e s to m á s le jo s d e l d o m in io t ra n s m e m b ra n a d e l m ie m b ro d e u n ió n a a n tíg e n o , p o r e je m p lo , m á s e x tra c e lu la rm e n te . (V é a s e , p o r e je m p lo , G ra d a e t a l., 2013 , M o l T h e r , 2: e 105 ).

E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , se d is p o n e un e n la z a d o r o re g ió n b is a g ra e n tre c a d a u n o d e lo s d o m in io s d e u n ió n a a n tíg e n o , p o r e je m p lo , se d is p o n e un e n la z a d o r o re g ió n b is a g ra e n tre e l e x tre m o C - te rm in a l d e un p r im e r d o m in io d e u n ió n a a n tíg e n o y e l e x tre m o N - te rm in a l d e un s e g u n d o d o m in io d e u n ió n a a n tíg e n o . A m o d o d e e je m p lo , un m ie m b ro d e u n ió n a a n tíg e n o q u e c o m p re n d e d o s d o m in io s d e u n ió n a a n tíg e n o (p o r e je m p lo , A B D 1 y A B D 2) p u e d e d is p o n e rs e en la s ig u ie n te c o n f ig u ra c ió n : [A B D 1 ] - [e n la z a d o r /b is a g ra ] - [A B D 2]. P u e d e n a ñ a d irs e d o m in io s d e u n ió n a a n tíg e n o a d ic io n a le s d e u n a m a n e ra s im ila r , o p c io n a lm e n te c o n re g io n e s d e u n ió n o b is a g ra d is p u e s ta s e n tre e l e x tre m o C d e un d o m in io d e u n ió n a a n tíg e n o y e l e x t re m o N d e l s ig u ie n te d o m in io d e u n ió n a a n tíg e n o . L o s e n la z a d o re s o re g io n e s d e b is a g ra a d e c u a d o s p a ra u s a r e n u n ir u n a p lu ra lid a d d e m ie m b ro s d e u n ió n a a n tíg e n o so n f le x ib le s , no e s c in d ib le s y p e rm ite n e l m o v im ie n to c a s i lib re d e c a d a d o m in io d e u n ió n a a n tíg e n o in d e p e n d ie n te d e lo s o tro s d o m in io s d e u n ió n a a n tíg e n o p a ra e s t im u la r la u n ió n co n m ú lt ip le s a n tíg e n o s d ia n a s im u ltá n e a m e n te . S e p u e d e u s a r c u a lq u ie r e n la z a d o r f le x ib le o re g ió n d e b is a g ra c o n o c id a en la té c n ic a . L o s e je m p lo s d e e n la z a d o re s in c lu y e n e n la z a d o re s p e p tíd ic o s q u e c o m p re n d e n re s id u o s d e g lic in a y s e r in a , p o r e je m p lo , (G G G S ) n, d o n d e n e s un n ú m e ro e n te ro p o s it iv o ig u a l o m a y o r q u e 1, p o r e je m p lo , n = 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9 o 10 (S E Q ID N O : 150 ). L o s e je m p lo s d e re g io n e s d e b is a g ra in c lu y e n S E Q i D N O : 136.

Dominios de unión a antígeno derivados de una molécula de anticuerpo

E l d o m in io d e u n ió n a a n tíg e n o p u e d e d e r iv a rs e d e u n a m o lé c u la d e a n t ic u e rp o , p o r e je m p lo , u n o o m á s d e los a n t ic u e rp o s m o n o c lo n a le s , a n t ic u e rp o s p o lic lo n a le s , a n t ic u e rp o s re c o m b in a n te s , a n t ic u e rp o s h u m a n o s , a n t ic u e rp o s h u m a n iz a d o s , a n t ic u e rp o s d e d o m in io ú n ic o , p o r e je m p lo , un d o m in io v a r ia b le d e c a d e n a p e s a d a (V H ). , un d o m in io v a r ia b le d e c a d e n a lig e ra (V L ) y un d o m in io v a r ia b le (V H H ) d e , p o r e je m p lo , o r ig e n h u m a n o o c a m é lid o . E n a lg u n o s c a s o s , e s b e n e f ic io s o q u e e l d o m in io d e u n ió n a a n tíg e n o se d e r iv e d e la m is m a e s p e c ie en la q u e e l R C A R , N K R -C A R o R N K R -C A R se u t iliz a rá f in a lm e n te , p o r e je m p lo , p a ra su u so en s e re s h u m a n o s , p u e d e s e r b e n e f ic io s o p a ra e l d o m in io d e u n ió n a a n tíg e n o d e l C A R , p o r e je m p lo , e l R C A R , N K R -C A R o R N K R -C A R , p o r e je m p lo , d e s c r ito e n e l p re s e n te d o c u m e n to , c o m p re n d e un d o m in io d e u n ió n a a n tíg e n o h u m a n o o h u m a n iz a d o . L o s a n t ic u e rp o s p u e d e n o b te n e rs e u s a n d o té c n ic a s c o n o c id a s c o n o c id a s e n la té c n ic a .

E l té rm in o "a n t ic u e rp o " , ta l c o m o se u s a en e l p re s e n te d o c u m e n to , se re f ie re a u n a m o lé c u la d e in m u n o g lo b u lin a q u e se u n e e s p e c íf ic a m e n te a un a n tíg e n o d ia n a . U n a n t ic u e rp o p u e d e s e r in m u n o g lo b u lin a in ta c ta d e r iv a d a d e fu e n te s n a tu ra le s o d e fu e n te s re c o m b in a n te s y p u e d e s e r u n a p a rte in m u n o r re a c t iv a d e in m u n o g lo b u lin a in ta c ta . L o s a n t ic u e rp o s so n t íp ic a m e n te te t rá m e ro s d e m o lé c u la s d e in m u n o g lo b u lin a . La m o lé c u la d e a n t ic u e rp o d e s c r ita en e l p re s e n te d o c u m e n to p u e d e e x is t ir en u n a v a r ie d a d d e fo rm a s en la s q u e la p a rte d e u n ió n a a n tíg e n o d e l a n t ic u e rp o se e x p re s a c o m o p a rte d e u n a c a d e n a p o lip e p tíd ic a c o n t ig u a q u e in c lu y e , p o r e je m p lo , un fra g m e n to d e a n t ic u e rp o d e d o m in io ú n ic o (s d A b ), un a n t ic u e rp o d e c a d e n a ú n ic a ( s c F v ) y un a n t ic u e rp o h u m a n iz a d o o h u m a n o , p o r e je m p lo , c o m o s e d e s c r ib e e n e l p re s e n te d o c u m e n to .

E l té rm in o " f ra g m e n to d e a n t ic u e rp o " se re f ie re a u n a p a rte d e un a n t ic u e rp o in ta c to y se re f ie re a la s re g io n e s v a r ia b le s d e te rm in a n te s a n t ig é n ic a s d e un a n t ic u e rp o in ta c to . L o s e je m p lo s d e fra g m e n to s d e a n t ic u e rp o s in c lu y e n , p e ro no s e lim ita n a, un a n t ic u e rp o d e d o m in io d e c a d e n a s im p le (s d A b ), f ra g m e n to s F ab , F a b ', F (a b ') 2 y Fv, a n t ic u e rp o s lin e a le s , a n t ic u e rp o s s c F v , un a n t ic u e rp o lin e a l, a n t ic u e rp o d e d o m in io ú n ic o c o m o un s d A b (y a s e a V L o V H ), un d o m in io V H H d e c a m é lid o y a n t ic u e rp o s m u lt ie s p e c íf ic o s fo rm a d o s a p a r t ir d e fra g m e n to s d e a n t ic u e rp o s .

U n a " c a d e n a p e s a d a d e a n t ic u e rp o " , ta l c o m o s e u s a en e l p re s e n te d o c u m e n to , s e re f ie re a l m a y o r d e lo s d o s t ip o s d e c a d e n a s p o lip e p tíd ic a s p re s e n te s e n to d a s la s m o lé c u la s d e a n t ic u e rp o e n s u s c o n fo rm a c io n e s n a tu ra le s .

U n a " c a d e n a lig e ra d e a n t ic u e rp o " , ta l c o m o s e u s a e n e l p re s e n te d o c u m e n to , s e re f ie re a l m á s p e q u e ñ o d e lo s d o s t ip o s d e c a d e n a s p o lip e p tíd ic a s p re s e n te s en to d a s la s m o lé c u la s d e a n t ic u e rp o en s u s c o n fo rm a c io n e s n a tu ra le s . L a s c a d e n a s lig e ra s k y A s e re f ie re n a lo s d o s is o t ip o s p r in c ip a le s d e c a d e n a s lig e ra s d e a n t ic u e rp o s .

P o r e l té rm in o " a n t ic u e rp o s in té t ic o " c o m o s e u s a e n e l p re s e n te d o c u m e n to , s e e n t ie n d e u n a m o lé c u la d e a n t ic u e rp o q u e se g e n e ra u s a n d o te c n o lo g ía d e A D N re c o m b in a n te , ta l c o m o , p o r e je m p lo , u n a m o lé c u la d e a n t ic u e rp o e x p re s a d a p o r un b a c te r ió fa g o c o m o se d e s c r ib e en e l p re s e n te d o c u m e n to . E l té rm in o ta m b ié n d e b e in te rp re ta rs e en e l s e n t id o d e u n a m o lé c u la d e a n t ic u e rp o q u e ha s id o g e n e ra d a p o r la s ín te s is d e u n a m o lé c u la d e A D N q u e c o d if ic a la m o lé c u la d e a n t ic u e rp o y c u y a m o lé c u la d e A D N e x p re s a u n a p ro te ín a d e a n t ic u e rp o , o u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s q u e e s p e c if ic a e l a n t ic u e rp o , en la q u e e l A D N o e l a m in o á c id o La s e c u e n c ia se ha o b te n id o u s a n d o A D N s in té t ic o o te c n o lo g ía d e s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s q u e e s tá d is p o n ib le y e s b ie n c o n o c id a en la té c n ic a .

E n re a liz a c io n e s , e l d o m in io d e u n ió n a a n tíg e n o c o m p re n d e un f ra g m e n to d e un a n t ic u e rp o q u e e s s u f ic ie n te p a ra c o n fe r ir r e c o n o c im ie n to y u n ió n e s p e c íf ic a a l a n tíg e n o d ia n a . L o s e je m p lo s d e un fra g m e n to d e a n t ic u e rp o in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a, un f ra g m e n to F a b , F a b ', F ( a b ') 2, o F v, un f ra g m e n to d e a n t ic u e rp o s c F v , un a n t ic u e rp o lin e a l, un a n t ic u e rp o d e d o m in io ú n ic o c o m o un s d A b (y a s e a V L o V H ), un d o m in io V H H d e c a m é lid o y a n t ic u e rp o s m u lt ie s p e c íf ic o s fo rm a d o s a p a r t ir d e f ra g m e n to s d e a n t ic u e rp o s .

E n u n a re a liz a c ió n , e l d o m in io d e u n ió n a a n t íg e n o e s un "s c F v " , q u e p u e d e c o m p re n d e r u n a p ro te ín a d e fu s ió n q u e c o m p re n d e u n a c a d e n a V L y u n a c a d e n a V H d e un a n t ic u e rp o , d o n d e V H y V L e s tá n , p o r e je m p lo , u n id o s a t ra v é s d e un p o lip é p tid o f le x ib le c o r to e n la z a d o r , p o r e je m p lo , un e n la z a d o r d e s c r ito en e l p re s e n te d o c u m e n to . E l s c F v es c a p a z d e e x p re s a rs e c o m o un p o lip é p tid o m o n o c a te n a r io y c o n s e rv a la e s p e c if ic id a d d e l a n t ic u e rp o in ta c to d e l q u e se d e r iv a . A d e m á s , la s c a d e n a s v a r ia b le s V L y V H s e p u e d e n e n la z a r e n c u a lq u ie r o rd e n , p o r e je m p lo , c o n re s p e c to a lo s e x tre m o s N - te rm in a l y C - te rm in a l d e l p o lip é p tid o , e l s c F v p u e d e c o m p re n d e r V L -e n la z a d o r -V H o p u e d e c o m p re n d e r V H -e n la z a d o r -V L . U n s c F v q u e se p u e d e p re p a ra r d e a c u e rd o co n un p ro c e d im ie n to c o n o c id o en la té c n ic a (v e r , p o r e je m p lo , B ird e t a l., (1988 ) S c ie n c e 242 : 423 -426 y H u s to n e t a l., (1988 ) P ro c . N a tl. A c a d . S c i. U S A 85 : 5879 -5883 ).

C o m o s e d e s c r ib ió a n te r io rm e n te y e n o tro s lu g a re s , la s m o lé c u la s s c F v p u e d e n p ro d u c ir s e u n ie n d o V H y V L c h ia n s e n tre s í u s a n d o e n la z a d o re s p o lip e p tíd ic o s f le x ib le s . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , la s m o lé c u la s s c F v c o m p re n d e n un e n la z a d o r p o lip e p tíd ic o f le x ib le co n u n a lo n g itu d o p t im iz a d a y /o c o m p o s ic ió n d e a m in o á c id o s . La lo n g itu d d e l c o n e c to r p o lip e p tíd ic o f le x ib le p u e d e a fe c ta r en g ra n m e d id a c ó m o la s re g io n e s v a r ia b le s d e un s c F v se p lie g a n e in te ra c c io n a n . D e h e c h o , s i s e e m p le a un e n la z a d o r p o lip e p tíd ic o c o r to (p o r e je m p lo , e n tre 5 -10 a m in o á c id o s , se e v ita e l p le g a m ie n to in tra c a d e n a . P a ra e je m p lo s d e o r ie n ta c ió n y ta m a ñ o d e l e n la z a d o r , v é a s e , p o r e je m p lo , H o ll in g e r e t a l. 1993 P ro c N a tl A c a d . S c i. u S a 90 : 6444 -6448 , P u b lic a c io n e s d e S o lic itu d d e P a te n te d e E E .U U . N o s .

2005 /0100543 , 2005 /0175606 , 2007 /0014794 , y P u b lic a c io n e s P C T N o s . W O 2006 /020258 y W O 2007 /024715. En u n a re a liz a c ió n , e l p é p tid o e n la z a d o r d e l s c F v c o n s is te en a m in o á c id o s ta le s c o m o re s id u o s d e g lic in a y /o s e r in a u s a d o s s o lo s o en c o m b in a c ió n , p a ra u n ir re g io n e s d e c a d e n a v a r ia b le p e s a d a y c a d e n a lig e ra v a r ia b le ju n ta s . En u n a re a liz a c ió n , e l e n g a rc e p o lip e p tíd ic o f le x ib le e s un e n g a rc e G ly /S e r y, p o r e je m p lo , c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s (G ly -G ly -G ly -S e r ) n, d o n d e n e s un n ú m e ro e n te ro p o s it iv o ig u a l o m a y o r q u e 1. P o r e je m p lo , n = 1, n = 2, n = 3. n = 4 , n = 5 y n = 6, n = 7, n = 8, n = 9 y n = 10. E n u n a re a liz a c ió n , lo s e n g a rc e s p o lip e p tíd ic o s f le x ib le s in c lu y e n , p e ro n o se lim ita n a, (G ly 4 S e r) 4 o (G ly 4 S e r) 3. E n o tra re a liz a c ió n , lo s e n la z a d o re s in c lu y e n m ú lt ip le s re p e t ic io n e s d e (G ly 2 S e r) , (G ly S e r) o (G ly 3 S e r) .

E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l d o m in io d e u n ió n a a n tíg e n o e s u n a m o lé c u la d e u n ió n a a n tíg e n o d e d o m in io ú n ic o (S D A B ). U n a m o lé c u la d e S D A B in c lu y e m o lé c u la s c u y a s re g io n e s d e te rm in a n te s d e c o m p le m e n ta r ie d a d so n p a rte d e un p o lip é p tid o d e d o m in io ú n ico . L o s e je m p lo s in c lu y e n , p e ro no se lim ita n a, d o m in io s v a r ia b le s d e c a d e n a p e s a d a , m o lé c u la s d e u n ió n n a tu ra lm e n te d e s p ro v is ta s d e c a d e n a s lig e ra s , d o m in io s ú n ic o s d e r iv a d o s d e a n t ic u e rp o s c o n v e n c io n a le s d e 4 c a d e n a s , d o m in io s d is e ñ a d o s y a rm a z o n e s d e d o m in io ú n ic o d is t in to s d e lo s d e r iv a d o s d e a n t ic u e rp o s (p o r e je m p lo , D e s c r ito s en m á s d e ta l le a c o n t in u a c ió n ) . L a s m o lé c u la s d e S D A B p u e d e n s e r c u a lq u ie ra d e la té c n ic a o c u a lq u ie r m o lé c u la fu tu ra d e d o m in io ú n ic o . L a s m o lé c u la s d e S D A B p u e d e n d e r iv a rs e d e c u a lq u ie r e s p e c ie , in c lu id o s , e n tre o tro s , ra tó n , h u m a n o , c a m e llo , lla m a , p ez , t ib u ró n , c a b ra , c o n e jo y b o v in o .

E n un a s p e c to , u n a m o lé c u la d e S D A B p u e d e d e r iv a rs e d e u n a re g ió n v a r ia b le d e la in m u n o g lo b u lin a q u e se e n c u e n tra en e l p e s c a d o , c o m o , p o r e je m p lo , la q u e se d e r iv a d e l is o t ip o d e in m u n o g lo b u lin a c o n o c id o c o m o R e c e p to r d e A n t íg e n o N u e v o (N A R ) q u e se e n c u e n tra en e l s u e ro . d e t ib u ró n . L o s p ro c e d im ie n to s p a ra p ro d u c ir m o lé c u la s d e d o m in io ú n ic o d e r iv a d a s d e u n a re g ió n v a r ia b le d e N A R ( " Ig N A R ") se d e s c r ib e n en W O 03 /014161 y S tre lts o v (2005 ) P ro te in S c i. 14: 2901 -2909.

S e g ú n o tro a s p e c to , u n a m o lé c u la d e S D A B e s u n a m o lé c u la d e u n ió n a a n t íg e n o d e d o m in io ú n ic o d e o r ig e n n a tu ra l c o n o c id a c o m o c a d e n a p e s a d a d e s p ro v is ta d e c a d e n a s lig e ra s . T a le s m o lé c u la s d e d o m in io ú n ic o se d e s c r ib e n en W O 9404678 y H a m e rs -C a s te rm a n , C . e t a l. (1993 ) N a tu re 363 : 446 -448 , p o r e je m p lo . P o r ra z o n e s d e c la r id a d , e s te d o m in io v a r ia b le d e r iv a d o d e u n a m o lé c u la d e c a d e n a p e s a d a n a tu ra lm e n te d e s p ro v is ta d e c a d e n a lig e ra s e c o n o c e a q u í c o m o V H H o n a n o c u e rp o p a ra d is t in g u ir lo d e l V H c o n v e n c io n a l d e in m u n o g lo b u lin a s d e c u a tro c a d e n a s . T a l m o lé c u la d e V H H se p u e d e d e r iv a r d e e s p e c ie s d e c a m é lid o s , p o r e je m p lo en c a m e llo , lla m a , d ro m e d a r io , a lp a c a y g u a n a c o . O tra s e s p e c ie s a d e m á s d e C a m e lid a e p u e d e n p ro d u c ir m o lé c u la s d e c a d e n a p e s a d a n a tu ra lm e n te d e s p ro v is ta s d e c a d e n a lig e ra ; ta le s V H H e s tá n d e n tro d e l a lc a n c e d e la p re s e n te in v e n c ió n .

L a s p ro te ín a s d e a n t ic u e rp o s o b te n id a s d e m ie m b ro s d e la fa m il ia d e lo s c a m e llo s y d ro m e d a r io s (C a m e lu s b a c tr ia n u s y C a le lu s d ro m a d e r iu s ) , in c lu id o s lo s m ie m b ro s d e l n u e v o m u n d o , c o m o la s e s p e c ie s d e lla m a s (L a m a p a c c o s , L a m a g la m a y L a m a v ic u g n a ) , se h a n c a ra c te r iz a d o p o r su ta m a ñ o , c o m p le jid a d e s tru c tu ra l a n t ig e n ic id a d p a ra s u je to s h u m a n o s . C ie r to s a n t ic u e rp o s Ig G d e e s ta fa m il ia d e m a m ífe ro s q u e se e n c u e n tra n en la n a tu ra le z a c a re c e n d e c a d e n a s lig e ra s y, p o r ta n to , so n e s tru c tu ra lm e n te d is t in to s d e la e s tru c tu ra c u a te rn a r ia t íp ic a d e c u a tro c a d e n a s q u e t ie n e d o s c a d e n a s p e s a d a s y d o s lig e ra s , p a ra a n t ic u e rp o s d e o tro s a n im a le s . V é a s e P C T /E P 93 /02214 (WO 94/04678 publicado el 3 de marzo de 1994).

Una región del anticuerpo de camélido, que es el pequeño dominio variable individual identificado como VHH, puede obtenerse mediante ingeniería genética para producir una pequeña proteína que tiene una alta afinidad por un objetivo, lo que da como resultado una proteína derivada de anticuerpos de bajo peso molecular conocida como "nanocuerpo de camélido ". Véase la patente estadounidense número 5.759.808 expedida el 2 de junio de 1998; véase también Stijlemans et al., (2004) J Biol Chem 279: 1256-1261; Dumoulin y col., (2003) Nature 424: 783 788; Pleschberger y col., (2003) Bioconjugate Chem 14: 440-448; Cortez-Retamozo y col., (2002) Int J Cancer 89: 456-62; y Lauwereys et al., (1998) EMBO J 17: 3512-3520. Las bibliotecas manipuladas de anticuerpos de camélidos y fragmentos de anticuerpos están disponibles comercialmente, por ejemplo, en Ablynx, Ghent, Bélgica (por ejemplo, US20060115470; Domantis (US20070065440, US20090148434). Al igual que con otros anticuerpos de origen no humano, una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de camélido se puede alterar de forma recombinante para obtener una secuencia que se parezca más a una secuencia humana, es decir, el nanocuerpo se puede "humanizar". Por tanto, la baja antigenicidad natural de los anticuerpos de los camélidos contra los seres humanos puede reducirse aún más.

El nanocuerpo de camélido tiene un peso molecular de aproximadamente una décima parte del de una molécula de IgG humana, y la proteína tiene un diámetro físico de sólo unos pocos nanómetros. Una consecuencia del pequeño tamaño es la capacidad de los nanocuerpos de camélidos para unirse a sitios antigénicos que son funcionalmente invisibles para proteínas de anticuerpos más grandes, es decir, los nanocuerpos de camélidos son útiles como reactivos para detectar antígenos que de otro modo serían crípticos usando técnicas inmunológicas clásicas y como posibles agentes terapéuticos . Por lo tanto, otra consecuencia del tamaño pequeño es que un nanocuerpo de camélido puede inhibir como resultado de unirse a un sitio específico en un surco o hendidura estrecha de una proteína diana y, por lo tanto, puede servir en una capacidad que se asemeja más a la función de un fármaco clásico de bajo peso molecular que el de un anticuerpo clásico.

El bajo peso molecular y el tamaño compacto también dan como resultado que los nanocuerpos de camélidos sean extremadamente termoestables, estables a pH extremos y a la digestión proteolítica, y poco antigénicos. Otra consecuencia es que los nanocuerpos de los camélidos se mueven fácilmente desde el sistema circulatorio a los tejidos, e incluso atraviesan la barrera hematoencefálica y pueden tratar trastornos que afectan el tejido nervioso. Los nanocuerpos pueden facilitar aún más el transporte de fármacos a través de la barrera hematoencefálica. Véase la solicitud de patente estadounidense 20040161738 publicada el 19 de agosto de 2004. Estas características combinadas con la baja antigenicidad para los seres humanos indican un gran potencial terapéutico. Además, estas moléculas pueden expresarse completamente en células procarióticas como E. coli y se expresan como proteínas de fusión con bacteriófagos y son funcionales.

Un dominio de unión a antígeno puede comprender un anticuerpo o nanocuerpo de camélido, o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Tales anticuerpos pueden tener una gran afinidad por su antígeno afín. En determinadas realizaciones del presente documento, el anticuerpo o nanocuerpo de camélido se produce naturalmente en el animal de camélido, es decir, es producido por el camélido después de la inmunización con antígeno o un fragmento de péptido del mismo. Alternativamente, el nanocuerpo de camélido se modifica por ingeniería genética, es decir, se produce mediante selección, por ejemplo, de una biblioteca de fagos que presentan proteínas de nanocuerpo de camélido mutagenizadas de manera apropiada usando procedimientos de cribado con el antígeno diana. Los nanocuerpos diseñados pueden personalizarse aún más mediante ingeniería genética para que tengan una vida media en un sujeto receptor de 45 minutos a dos semanas. En una realización específica, Un dominio de unión a antígeno puede comprender un anticuerpo de dominio único, por ejemplo, Que se basa únicamente en una región variable de cadena pesada para unirse, por ejemplo, Un nanocuerpo. Los nanocuerpos adecuados para su uso en la presente se pueden preparar mediante los procedimientos descritos en los documentos US2010/0028341, WO2009/030285 y WO2010/007376.

En ciertas realizaciones, la molécula de SDAB es un polipéptido de fusión de cadena simple que comprende una o más moléculas de dominio único (por ejemplo, Nanocuerpos), desprovistas de un dominio variable complementario o una constante de inmunoglobulina, por ejemplo, Región Fc, que se une a una o más antígenos diana.

Las moléculas de SDAB pueden ser recombinantes, injertadas con CDR, humanizadas, camelizadas, desinmunizadas y/o generadas in vitro (por ejemplo, seleccionadas mediante presentación de fagos).

En una realización, la parte del dominio de unión a antígeno comprende un anticuerpo humano o un fragmento del mismo.

En algunas realizaciones, se humaniza un anticuerpo no humano, donde las secuencias o regiones específicas del anticuerpo se modifican para aumentar la similitud con un anticuerpo producido naturalmente en un ser humano. En una realización, el dominio de unión a antígeno está humanizado.

Los anticuerpos no humanos se pueden humanizar usando una variedad de técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo, injerto de CDR (ver, por ejemplo, la patente europea número EP 239.400; la publicación internacional número WO 91/09967; y las patentes estadounidenses números 5.225.539, 5.530.101 y 5.585.089), revestimiento o revestimiento (véanse, por ejemplo, las patentes europeas números EP 592,106 y EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28 (4/5): 489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7 (6): 805-814; y Roguska et al., 1994, PNAS, 91: 969-973), barajado de cadenas (ver, por ejemplo, la patente de EE.UU. Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. No. US2005/0042664, Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. No. US2005/0048617, Patente de EE.UU. N° 6.407.213, patente de EE.UU. N° 5.766.886, publicación internacional n° WO 9317105, Tan et al., 2002, J. Immunol., 169: 1119-25; Caldas et al., 2000, Protein Eng., 13 (5): 353-60; Morea et al., 2000, Methods, 20: 267-79; Baca y col., 1997, J. Biol. Chem., 272: 10678-84; Roguska y col., 1996, Protein Eng., 9 (10): 895 904; Couto y col., 1995, Cancer Res., 55: 5973s-5977; Couto y col., 1995, Cancer Res., 55 (8): 1717-22; Sandhu 1994 Gene, 150 (2): 409-10; y Pedersen y col., 1994, J. Mol. Biol., 235 (3): 959-73. A menudo, los residuos de la estructura en las regiones de la estructura se sustituirán por el residuo correspondiente del anticuerpo donante de CDR para alterar, por ejemplo, mejorar, la unión a antígeno. Estas sustituciones de estructura se identifican mediante procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, modelando las interacciones de la CDR y los residuos de estructura para identificar residuos de estructura importantes para la unión a antígenos y comparación de secuencias para identificar residuos de estructura inusuales en posiciones particulares. (Ver, por ejemplo, Queen et al., Patente de EE.UU. N° 5.585.089; y Riechmann et al., 1988, Nature, 332: 323). En realizaciones preferidas, la molécula de anticuerpo humanizado comprende una secuencia descrita aquí, por ejemplo, una cadena ligera variable y/o una cadena pesada variable descrita aquí.

Un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en él de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos a menudo se denominan residuos "importados", que normalmente se toman de un dominio variable "importado". Por tanto, los anticuerpos humanizados comprenden una o más CDR de moléculas de inmunoglobulina no humanas y regiones marco de seres humanos. La humanización de anticuerpos es bien conocida en la técnica y esencialmente se puede realizar siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), sustituyendo las secuencias de CDR o CDR de roedor por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano, es decir, injerto de CDR (documento EP 239.400; PCT Publicación No. WO 91/09967; y Patentes de Estados Unidos No. 4.816.567; 6, 331.415; 5,225,539; 5,530,101; 5,585,089; 6.548.640).

En tales anticuerpos quiméricos humanizados, sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de estructura (FR) se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores. La humanización de anticuerpos también se puede lograr mediante recubrimiento o rejuvenecimiento (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28 (4/5): 489-498; Studnicka et al., Protein Engineering, 7 (6): 805 -814 (1994); y Roguska et al., PNAS, 91: 969-973 (1994)) o barajado de cadenas (patente de EE.UU. n° 5.565.332).

En algunos casos, el anticuerpo de la divulgación se prepara adicionalmente usando un anticuerpo que tiene una o más de las secuencias VH y/o VL descritas en el presente documento que se pueden usar como material de partida para diseñar un anticuerpo modificado, cuyo anticuerpo modificado puede haber alterado propiedades en comparación con el anticuerpo de partida. En varios casos, el anticuerpo se modifica modificando uno o más aminoácidos dentro de una o ambas regiones variables (es decir, VH y/o VL), por ejemplo, dentro de una o más regiones CDR y/o dentro de una o más regiones marco.

En otro aspecto, el dominio de unión a antígeno es un receptor de células T ("TCR"), o un fragmento del mismo, por ejemplo, un TCR de cadena sencilla (scTCR). Se conocen en la técnica procedimientos para preparar tales TCR. Véase, por ejemplo, Willemsen RA y col., Gene Therapy 7: 1369-1377 (2000); Zhang T y col., Cancer Gene Ther 11: 487 - 496 (2004); Aggen y col., Gene Ther. 19 (4): 365-74 (2012). Por ejemplo, se puede diseñar scTCR que contenga los genes Va y Vp de un clon de células T unido por un enlazador (por ejemplo, un péptido flexible). Este enfoque es muy útil para la diana asociada al cáncer que en sí misma es intracelular, sin embargo, el MHC presenta un fragmento de dicho antígeno (péptido) en la superficie de las células cancerosas. Las secuencias de TCR pueden ser de origen natural o secuencias sintéticas de origen no natural.

Armazones no de anticuerpos

En casos, el dominio de unión a antígeno comprende un armazón que no es de anticuerpo, por ejemplo, una fibronectina, anquirina, dominio de anticuerpo, lipocalina, inmunofármaco modular pequeño, cuerpo maxy, proteína A o filina. El andamio sin anticuerpos tiene la capacidad de unirse al antígeno diana en una célula. En casos, el dominio de unión a antígeno es un polipéptido o fragmento del mismo de una proteína de origen natural expresada en una célula. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno comprende un armazón que no es de anticuerpo. Puede emplearse una amplia variedad de armazones sin anticuerpos siempre que el polipéptido resultante incluya al menos una región de unión que se una específicamente al antígeno diana en una célula diana.

Los andamios sin anticuerpos incluyen: fibronectina (Novartis, MA), anquirina (Molecular Partners AG, Zurich, Suiza), anticuerpos de dominio (Domantis, Ltd., Cambridge, MA y Ablynx nv, Zwijnaarde, Bélgica), lipocalina ( Pieris Proteolab AG, Freising, Alemania), inmunofármacos modulares pequeños (Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA), maxybodies (Avidia, Inc., Mountain View, CA), Proteína A (Affibody AG, Suecia) y filial ( gamma-cristalina o ubiquitina) (Scil Proteins GmbH, Halle, Alemania).

Los armazones de fibronectina pueden basarse en el dominio de fibronectina tipo III (por ejemplo, El décimo módulo de la fibronectina tipo III (10Dominio Fn3)). El dominio de fibronectina tipo III tiene 7 u 8 cadenas beta que se distribuyen entre dos hojas beta, que a su vez se compactan entre sí para formar el núcleo de la proteína, y además contienen bucles (análogos a las CDR) que conectan las cadenas beta entre sí. y están expuestos a solventes. Hay al menos tres de tales bucles en cada borde del emparedado de hoja beta, donde el borde es el límite de la proteína perpendicular a la dirección de las cadenas beta (véase el documento US 6.818.418). Debido a esta estructura, este armazón sin anticuerpos imita las propiedades de unión a antígeno que son similares en naturaleza y afinidad a las de los anticuerpos. Estos armazones se pueden usar en una estrategia de aleatorización y barajado de bucles in vitro que es similar al proceso de maduración por afinidad de anticuerpos in vivo.

La tecnología de la anquirina se basa en el uso de proteínas con módulos repetidos derivados de la anquirina como andamios para llevar regiones variables que pueden usarse para unirse a diferentes objetivos. El módulo de repetición de anquirina es un polipéptido de 33 aminoácidos que consta de dos hélices a antiparalelas y un giro p. La unión a las regiones variables se optimiza principalmente mediante el uso de visualización de ribosomas.

Los avímeros se derivan de proteínas que contienen dominio A natural, como HER3. Estos dominios se utilizan por naturaleza para interacciones proteína-proteína y en humanos más de 250 proteínas se basan estructuralmente en dominios A. Los avímeros consisten en varios monómeros de "dominio A" diferentes (2-10) unidos mediante conectores de aminoácidos. Se pueden crear avímeros que se pueden unir al antígeno diana usando la metodología descrita, por ejemplo, en las publicaciones de solicitud de patente de EE.UU. Nos.

20040175756; 20050053973; 20050048512; y 20060008844. Los ligandos de afinidad aficuerpo son proteínas pequeñas y simples compuestas por un haz de tres hélices basado en el andamio de uno de los dominios de unión a IgG de la proteína A. La proteína A es una proteína de superficie de la bacteria Staphylococcus aureus. Este dominio de andamio consta de 58 aminoácidos, 13 de los cuales se asignan al azar para generar bibliotecas de afficuerpos con un gran número de variantes de ligando (véase, por ejemplo, el documento US 5.831.012). Las moléculas aficuerpos imitan a los anticuerpos, tienen un peso molecular de 6 kDa, en comparación con el peso molecular de los anticuerpos, que es de 150 kDa. A pesar de su pequeño tamaño, el sitio de unión a las moléculas de un anticuerpo es similar al de un anticuerpo.

Los miméticos de epítopos de proteínas (PEM) son moléculas de tamaño medio, cíclicas, similares a péptidos (PM 1-2 kDa) que imitan las estructuras secundarias de las proteínas en forma de horquilla beta, la principal estructura secundaria implicada en las interacciones proteína-proteína. Los dominios de unión a antígeno, por ejemplo, los que comprenden scFv, anticuerpos de dominio único o anticuerpos de camélido, pueden dirigirse a cualquier receptor/ligando diana descrito en el presente documento, por ejemplo, los receptores PD1, PD1-L1 o PD1-L2. DOMINIOS DE UNIÓN A ANTÍGENOS NO EMPAREJADOS

En algunos casos, una célula descrita en el presente documento comprende un CAR (por ejemplo, RCAR, NKR-CAR o RNKR-CAR) que contiene un primer dominio de unión a antígeno y un segundo CAR (por ejemplo, RCAR, NKR-CAR o RNKR-CAR) que contiene un segundo dominio de unión a antígeno. Por ejemplo, una célula descrita en el presente documento comprende un RCAR y un inhNKR-CAR, donde el RCAR y el inhNKR-CAR comprenden diferentes dominios de unión a antígeno. Se ha descubierto que las células que tienen una pluralidad de receptores embebidos en la membrana quimérica, cada uno de los cuales comprende un dominio de unión a antígeno (CMER), que las interacciones entre el dominio de unión a antígeno del CMER pueden ser indeseables, por ejemplo, porque inhibe la capacidad de uno o más de los dominios de unión a antígeno para unir su antígeno afín. Por consiguiente, en el presente documento se describen un primer y un segundo CMER de origen no natural, que comprende dominios de unión a antígeno que minimizan tales interacciones cuando se expresan en la misma célula en la que dicho primer CMER es un R^cA^r, RNKR-CAR o NKR-CAR. En un caso, una pluralidad de CMER comprende dos CAR, por ejemplo, dos RCAR, RNKR-CAR o NKR-CAR. En un caso, una pluralidad de CMER comprende un RCAR y un NKR-CAR, por ejemplo, un RCAR y un inhNKR-CAR.

En algunos casos, la divulgación comprende un primer y segundo CMER, en el que el dominio de unión a antígeno de uno de dichos primeros CMER, dicho segundo CMER no comprende un dominio ligero variable y un dominio pesado variable, en el que uno de dichos primeros y segundos CMER es un RCAR, RNKR-CAR o NKR-CAR. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno de uno de dichos primeros CMER, dicho segundo CMER es un scFv, y el otro no es un scFv, en el que uno de dichos primeros y segundos CMER es un RCAR, RNKR-CAR o NKR-CAR. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno de uno de dichos primeros CMER, dicho segundo CMER comprende un único dominio VH, por ejemplo, un único dominio VH de camélido, tiburón o lamprea, o un único dominio VH derivado de una secuencia humana o de ratón o una armazón que no es de anticuerpo, en el que uno de dicho primer y segundo CMER es un RCAR, RNKR-CAR o NKR-CAR. En ciertas ocasiones, el dominio de unión a antígeno de uno de dichos primeros CMER, dicho segundo CMER comprende un nanocuerpo, en el que uno de dichos primeros y segundos CMER es un RCAR, RNKR-CAR o NKR-CAR. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno de uno de dichos primeros CMER, dicho segundo CMER comprende un dominio VHH de camélido, en el que uno de dichos primeros y segundos CMER es un RCAR, RNKR-CAR o NKR-CAR.

En algunos casos, el dominio de unión a antígeno de uno de dichos primeros CMER, dicho segundo CMER comprende un scFv, y el otro comprende un solo dominio VH, por ejemplo, un solo dominio VH de camélido, tiburón o lamprea, o un solo VH dominio derivado de una secuencia humana o de ratón, en el que uno de dicho primer y segundo CMER es un RCAR, RNKR-CAR o NKR-CAR. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno de uno de dichos primeros CMER, dicho segundo CMER comprende un scFv, y el otro comprende un nanocuerpo, en el que uno de dichos primeros y segundos CMER es un RCAR, RNKR-CAR o NKR-CAR. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno de uno de dichos primeros CMER, dicho segundo CMER comprende un scFv, y el otro comprende un dominio VHH de camélido, en el que uno de dichos primeros y segundos CMER es un RCAR, RNKR-CAR o NKR-CAR. .

En algunos casos, cuando está presente en la superficie de una célula, la unión al dominio de unión a antígeno de dicho primer CMER a su antígeno afín no se reduce sustancialmente por la presencia de dicho segundo CMER, en el que uno de dichos primeros y segundos CMER es un RCAR, RNKR-CAR o NKR-CAR. En algunos casos, la unión al dominio de unión a antígeno de dicho primer CMER a su antígeno afín en presencia de dicho segundo CMER es el 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de la unión al dominio de unión a antígeno de dicho primer CMER a su antígeno afín en ausencia de dicho segundo CMER, en el que uno de dicho primer y segundo CMER es un RCAR, RNKR-CAR o NKR-CAR.

En algunos casos, cuando están presentes en la superficie de una célula, los dominios de unión a antígeno de dicho primer CMER, dicho segundo CMER, se asocian entre sí menos que si ambos fueran dominios de unión a antígeno scFv, en donde uno de dichos primeros y segundos CMER es un RCAR, RNKR-CAR o NKR-CAR. En algunos casos, los dominios de unión a antígeno de dicho primer CMER, dicho segundo CMER, se asocian entre sí 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% menos que si ambos fueran dominios de unión a antígeno scFv, en el que uno de dicho primer y segundo CMER es un RCAR, RNKR-CAR o NKR-CAR.

DOMINIO DE SEÑALIZACIÓN INTRACELULAR

En realizaciones, un dominio de señalización intracelular produce una señal intracelular cuando un dominio extracelular, por ejemplo, un dominio de unión a antígeno, al que está fusionado o acoplado mediante un conmutador de dimerización, se une a un ligando contrario. Los dominios de señalización intracelular pueden incluir dominios de señalización intracelular primarios y dominios de señalización coestimuladores. En una realización, se puede construir una molécula RNKR-CAR, RCAR o NKR-CAR para la expresión en una célula inmunitaria, por ejemplo, una célula T o NK, de manera que la molécula RNKR-CAR, RCAR o NKR-CAR comprende una dominio, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primario, dominio de señalización coestimulador, dominios inhibidores, etc., que se deriva de un polipéptido que se asocia típicamente con la célula inmunitaria. Por ejemplo, un RNKR-CAR, RCAR, o NKR-CAR para la expresión en una célula T puede comprender un dominio 41BB y un dominio zeta de CD3. En este caso, tanto los dominios zeta 41BB como CD3 se derivan de polipéptidos asociados con la célula T. En otra realización, se puede construir una molécula RNKR-CAR, RCAR o NKR-CAR para la expresión en una célula inmunitaria, por ejemplo, una célula T o NK, de manera que la molécula RNKR-CAR, RCAR o NKR-CAR comprende un dominio que se deriva de un polipéptido que no está asociado típicamente con la célula inmunitaria. Por ejemplo, un RNKR-CAR, RCAR o NKR-CAR para la expresión en una célula T puede comprender un dominio KIR derivado de una célula NK. Alternativamente, un RNKR-CAR, RCAR o NKR-CAR para la expresión en una célula NK puede comprender un dominio 41BB y un dominio zeta CD3 derivado de una célula T (ver, por ejemplo, WO2013/033626).

DOMINIO DE SEÑALIZACIÓN INTRACELULAR PRIMARIO

En una realización, un dominio de señalización intracelular primario produce una señal intracelular cuando un dominio extracelular, por ejemplo, un dominio de unión a antígeno, al que está fusionado o acoplado mediante un conmutador de dimerización, se une a un antígeno afín. Se deriva de una molécula estimuladora primaria, por ejemplo, comprende la secuencia intracelular de una molécula estimuladora primaria. Comprende suficiente secuencia de moléculas estimulantes primarias para producir una señal intracelular, por ejemplo, cuando un dominio de unión a antígeno al que está fusionado, o acoplado mediante un conmutador de dimerización, se une a un antígeno afín.

Una molécula estimuladora primaria es una molécula que, al unirse al ligando análogo, media una respuesta efectora inmunitaria, por ejemplo, en la célula en la que se expresa. Normalmente, genera una señal intracelular que depende de la unión a un ligando análogo que comprende el antígeno. El complejo TCR/CD3 contiene moléculas estimulantes primarias de ejemplo; el complejo genera una señal intracelular al unirse al ligando análogo, por ejemplo, una molécula de MHC cargada con un péptido. Típicamente, por ejemplo, en el caso de la molécula estimuladora primaria de TCR/CD3, la generación de una señal intracelular por un dominio de señalización intracelular primario depende de la unión a la molécula estimuladora primaria a su ligando, por ejemplo, antígeno. La estimulación primaria puede mediar la expresión alterada de ciertas moléculas, tal como la regulación por disminución de TGF-p y/o la reorganización de las estructuras citoesqueléticas y similares. La estimulación, por ejemplo, en presencia de coestimulación, puede resultar en una optimización, por ejemplo, un aumento, en una función efectora inmune de la célula RNKR-CARX, RCAR/NKR-C^aRX o RCARX, por ejemplo, RNKR-CART, RCAR/NKR-CART, o célula RCART o RNKR-CARN, RCAR/NKR-CARN o RCARN. La estimulación, por ejemplo, en el contexto de una célula RNKR-CART, RCAR/NKR-CART o RCART, puede mediar una respuesta de células T, por ejemplo, proliferación, secreción de citocinas, destrucción, activación, diferenciación y similares.

En una realización, el dominio de señalización intracelular primario comprende un motivo de señalización, por ejemplo, un motivo de activación inmunorreceptor basado en tirosina o ITAM. Un dominio de señalización intracelular primario puede comprender secuencias de señalización citoplásmicas que contienen ITAM de TCR zeta (CD3 zeta), FcR gamma, FcR beta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 epsilon, CD5, C^d22, CD79a y CD79b.

En la Tabla 1 se proporcionan dominios de señalización intracelular primarios de ejemplo.

Un dominio de señalización intracelular primario comprende un fragmento funcional, o análogo, de una molécula estimuladora primaria (por ejemplo, c D3 zeta - GenBank accno. BAG36664.1). Puede comprender la región intracelular completa o un fragmento de la región intracelular que es suficiente para la generación de una señal intracelular cuando un dominio de unión a antígeno al que está fusionado, o acoplado mediante un conmutador de dimerización, se une a un antígeno afín. En realizaciones, el dominio de señalización intracelular primario tiene al menos 70, 75. 80. 85, 90, 95, 98 o 99% de identidad de secuencia con una molécula estimuladora primaria de origen natural, por ejemplo, un CD3 zeta humano (GenBank Acc No. AAY57330. 1), u otro mamífero, por ejemplo, una especie no humana, por ejemplo, roedor, mono, simio o molécula estimulante primaria intracelular murina.

En realizaciones, el dominio de señalización intracelular primario tiene al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con, o difiere en no más de 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de los residuos correspondientes de una molécula estimuladora primaria humana de origen natural, por ejemplo, una molécula estimuladora primaria humana de origen natural descrita en el presente documento, por ejemplo, SEQ ID NO: 139.

DOMINIO DE SEÑALIZACIÓN COESTIMULADOR

En una realización, un dominio de señalización coestimulador produce una señal intracelular cuando un dominio extracelular, por ejemplo, un dominio de unión a antígeno al que está fusionado o acoplado mediante un conmutador de dimerización, se une a un ligando afín. Se deriva de una molécula coestimuladora. Comprende suficiente secuencia de molécula coestimuladora para producir una señal intracelular, por ejemplo, cuando un dominio extracelular, por ejemplo, un dominio de unión a antígeno, al que está fusionado o acoplado mediante un conmutador de dimerización, se une a un ligando afín.

Las moléculas coestimuladoras son moléculas de la superficie celular, distintas de los receptores de antígenos o sus contra-ligandos, que promueven una respuesta efectora inmunitaria. En algunos casos, son necesarios para una respuesta inmunitaria eficaz o mejorada. Por lo general, una molécula coestimuladora genera una señal intracelular que depende de la unión a un ligando análogo que es, en casos, diferente a un antígeno, por ejemplo, El antígeno reconocido por un dominio de unión a antígeno de un RNKR-CARX, RCAR/NKR-CARX , o célula RCARX, por ejemplo, célula RNKR-CART, RCAR/NKR-CART, o célula RCART o RNKR-CARN, RCAR/NKR-CARN o RCARN. Normalmente, la señalización de una molécula estimuladora primaria y una molécula coestimuladora contribuyen a una respuesta efectora inmunitaria y, en algunos casos, ambas son necesarias para la generación eficaz o mejorada de una respuesta efectora inmunitaria.

Un dominio de señalización coestimulador comprende un fragmento funcional, o análogo, de una molécula coestimuladora (por ejemplo, 4-1BB). Puede comprender la región intracelular completa o un fragmento de la región intracelular que es suficiente para la generación de una señal intracelular, por ejemplo, cuando un dominio de unión a antígeno al que está fusionado, o acoplado mediante un conmutador de dimerización, se une a un antígeno afín. En realizaciones, el dominio de señalización coestimulador tiene al menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 o 99% de identidad de secuencia con una molécula coestimuladora de origen natural, por ejemplo, un ser humano u otro mamífero, por ejemplo, una especie no humana. , por ejemplo, molécula coestimuladora intracelular de roedor, mono, simio o murino. En realizaciones, el dominio de señalización coestimulador tiene al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 138.

En la Tabla 2 se proporcionan dominios de señalización coestimuladores de ejemplo (dominios de señalización intracelular).

En realizaciones, el dominio de señalización coestimulador tiene al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con, o difiere en no más de 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de los residuos correspondientes de una molécula estimuladora primaria humana de origen natural, por ejemplo, una molécula coestimuladora humana de origen natural descrita en el presente documento.

Dominios de señalización intracelular o moléculas adaptadoras, por ejemplo, DAP12

Algunos RNKR-CAR o NKR-CAR interaccionan con otras moléculas, por ejemplo, moléculas que comprenden un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un ITAM. En una realización, un dominio de señalización intracelular es DAP12.

DAP12 se llama así debido a sus características estructurales y supuesta función. Ciertos receptores de la superficie celular carecen de funcionalidad intrínseca, que hipotéticamente puede interaccionar con otra proteína asociada, que se sugiere es una proteína de 12 kD. El mecanismo de la señalización puede involucrar una señal ITAM.

El DAP12 se identificó a partir de bases de datos de secuencias basadas en una relación hipotética con CD3 (ver Olcese, et al. (1997) J. Immunol. 158: 5083-5086), la presencia de una secuencia ITAM (ver Thomas (1995) J. Exp. Med. 181: 1953-1956), ciertas predicciones de tamaño (ver Olcese; y Takase, et al. (1997) J. Immunol. 159: 741 747, y otras características. En particular, el dominio transmembrana fue hipotetizado para contener un residuo cargado, lo que permitiría un puente salino con los segmentos transmembrana correspondientes de sus presuntos receptores asociados, proteína KIR CD94 y posiblemente otras proteínas similares Véase Daeron, et al. (1995) Immunity 3: 635-646.

De hecho, muchas de las moléculas receptoras KIR, MIR, ILT y CD94/NKG2 conocidas pueden funcionar en realidad con una proteína accesoria que es parte del complejo receptor funcional. Ver Olcese, et al. (1997) J. Immunol. 158: 5083-5086; y Takase, et al. (1997) J. Immunol. 159: 741-747.

Un dominio DAP 12, tal como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un dominio polipeptídico que tiene propiedades estructurales y funcionales de un dominio citoplasmático de un DAP 12, y típicamente incluirá un dominio ITAM. En una realización, un dominio DAP 12 de un RKIR-CAR o KIR-CAR tiene al menos un 70, 80, 85, 90, 95 o 99% de homología con una secuencia de referencia, por ejemplo, un DAP 12 de origen natural o un DAP 12 descrito Aquí en. En realizaciones, el dominio DAP 12 de un RKIR-CAR o KIR-CAR difiere en no más del 15, 10, 5, 2 o 1% de sus residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, un DAP 12 de origen natural o un DAP 12 descrito aquí. En realizaciones, el dominio DAP 12 de un RKIR-CAR o KIR-CAR difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuo de una secuencia de referencia, por ejemplo, un DAP 12 de origen natural o un DAP 12 descrito en el presente documento.

El DAP10 se identificó en parte por su homología con el DAP12 y otras características. En particular, en contraste con el DAP12, que exhibe un motivo de activación ITAM, el DAP10 exhibe un motivo inhibidor ITIM. El MDL-1 se identificó por su asociación funcional con DAP12.

La interacción funcional entre, por ejemplo, DAP12 o DAP10, y su receptor accesorio puede permitir el uso de la combinación estructural en receptores que normalmente no se encuentran en una forma de receptor truncado. Por tanto, el mecanismo de señalización a través de proteínas accesorias como DAP12 y DAP10 permite la ingeniería interesante de otros complejos de receptores similares a KIR, por ejemplo, con los receptores de tipo KIR, MIR, ILT y CD94 NKG2. Pueden construirse formas truncadas de receptores intactos que interaccionen con un DAP12 o DAP10 para formar un complejo de señalización funcional.

La secuencia de nucleótidos de primate de DAP12 corresponde a la secuencia de DAP12 en SEQ ID NO: 158; la secuencia de aminoácidos corresponde a la secuencia de DAP12 en SEQ ID NO: 159. La secuencia señal parece ir de met (-26) a gln (-1) o ala1; la proteína madura debe ir desde aproximadamente ala1 (o gln2), el dominio extracelular desde aproximadamente ala1 hasta pro14; el dominio extracelular contiene dos cisteínas en 7 y 9, que probablemente permitan enlaces disulfuro a proteínas accesorias homotípicas o heterotípicas adicionales; la región transmembrana va desde aproximadamente gly15 o val16 hasta aproximadamente gly39; y un motivo ITAM de tyr65 a leu79 (YxxL-6/8x-YxxL). Se identificó el LVA03A EST y se utilizó para extraer otras secuencias superpuestas. Véase también Genbank Human ESTs que forman parte de DAP12 humano; algunos, pero no todos, Genbank Accession # AA481924; H39980; W60940; N41026; R49793; W60864; W92376; H12338; T52100; AA480109; H12392; W74783; y T55959.

MIEMBRO DE UNIÓN A ANTÍGENO AUXILIAR

Se puede incluir un miembro auxiliar de unión a antígeno en un RCAR o RNKR-CAR. En realizaciones, su inclusión puede aumentar la seguridad y eficacia de la célula RNKR-CARX o RCARX, por ejemplo, aumentando la especificidad mediante la unión a un antígeno adicional, por ejemplo, de la segunda célula diana. En realizaciones, la unión tanto del miembro de unión a antígeno como del miembro de unión a antígeno auxiliar puede dar una mayor especificidad que la observada con cualquiera de ellos solo. En realizaciones, el RCAR o RNKR-CAR incluirá dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez miembros auxiliares de unión a antígeno, todos los cuales se unen a diferentes antígenos.

En una realización, el dominio de unión a antígeno auxiliar no comprende un dominio de conmutación que pueda formar un conmutador de dimerización con un dominio de conmutación en el miembro de unión a antígeno o en el miembro de señalización intracelular. En realizaciones, el dominio de unión a antígeno auxiliar no comprende un dominio de señalización intracelular. En una realización, el dominio de unión a antígeno se dirige contra un receptor de mesotelina y el dominio de unión a antígeno auxiliar se dirige contra un receptor de folato. En una realización, el dominio de unión a antígeno se dirige contra un receptor de folato y el dominio de unión a antígeno auxiliar se dirige contra un receptor de mesotelina.

MOLÉCULAS INHIBIDORAS: INHIBICIÓN

En un caso, se puede administrar al sujeto un agente que mejore la actividad o aptitud de una célula que expresa CAR, por ejemplo, una célula que expresa RNKR-CAR, una célula que expresa RCAR, una célula que expresa NKR o RCAR/NKR-CAR. -expresión celular. Por ejemplo, en un caso, el agente puede ser un agente que inhibe una molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T. En algunos casos, la molécula que modula o regula la función de las células T es una molécula inhibidora. Las moléculas inhibidoras, por ejemplo, PD1, pueden, en algunos casos, disminuir la capacidad de una célula RNKR-CARX, RCAR/NKR-CARX o RCARX para montar una respuesta efectora inmunitaria. En la Tabla 3 se proporcionan ejemplos de moléculas inhibidoras. Inhibición de una molécula inhibidora que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T, por ejemplo, mediante inhibición a nivel de ADN, ARN o proteína, puede optimizar el rendimiento de una célula RNKR-CARX, RCAR/NKR-CARX o RCARX. En casos, un agente, por ejemplo, Un ácido nucleico inhibidor, por ejemplo, Un dsRNA, por ejemplo, Un siRNA o shRNA, o por ejemplo, Una proteína o sistema inhibidor, por ejemplo, Repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR), un activador de la transcripción como nucleasa efectora (TALEN), o una endonucleasa de dedo de zinc (ZFN), por ejemplo, como se describe en el presente documento, puede usarse para inhibir la expresión de una molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función celular en el RN^kR-CARX, RCAR/Célula NKR-CARX o RC^aR^x. En un caso, el inhibidor es un ARNhc. En un caso, la molécula inhibidora se inhibe dentro de una célula RNKR-CARX, RCAR/NKR-CARX o RCARX. En estos casos, una molécula de dsRNA que inhibe la expresión de la molécula inhibidora se une al ácido nucleico que codifica un componente, por ejemplo, todos los componentes del RNKR-CAR, NKR-CAR o RCAR. En la Tabla 3 se proporcionan ejemplos de moléculas inhibidoras, útiles, por ejemplo, como dianas de ARNhc.

En un caso, una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de dsRNA que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T está operativamente ligada a un promotor, por ejemplo, un promotor derivado de H1 o U6. tal que la molécula de dsRNA que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T se expresa, por ejemplo, se expresa dentro de una célula que expresa RCAR, que expresa RNKR-CAR o que expresa NKR-CAR . Véase, por ejemplo, Tiscornia G., "Desarrollo de vectores lentivirales que expresan ARNip", Capítulo 3, en Transferencia de genes: Entrega y expresión de ADN y ARN (eds. Friedmann y Rossi). Prensa de laboratorio Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor, Nueva York, ^eE. UU., 2007; Brummelkamp TR y col. (2002) Science 296: 550-553; Miyagishi M y col. (2002) Nat. Biotechnol. 19: 497-500. En un caso, la molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de dsRNA que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, Inhibe, la función de las células T está presente en el mismo vector, por ejemplo, Un vector lentiviral, que comprende un ácido nucleico. molécula que codifica un componente, por ejemplo, todos los componentes, de RNKR-CAR, NKR-CAR o RCAR. En tal caso, la molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de dsRNA que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, Inhibe, la función de la célula T se encuentra en el vector, por ejemplo, El vector lentiviral, 5'- o 3 '- al ácido nucleico que codifica un componente, por ejemplo, todos los componentes, de RNKR-CAR, NKR-CAR o RCAR. La molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de dsRNA que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T se puede transcribir en la misma o diferente dirección que el ácido nucleico que codifica un componente, por ejemplo, todos los componentes, de RNKR-CAR, NKR-CAR o RCAR. En un caso, la molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de dsRNA que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, Inhibe, la función de las células T está presente en un vector distinto del vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un componente. , por ejemplo, todos los componentes del RNKR-CAR, NKR-CAR o RCAR. En un caso, la molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de dsRNA que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de la célula T que expresó transitoriamente dentro de un RNKR-CAR que expresa, NKR expresa y/o Célula que expresa RCAR. En un caso, la molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de dsRNA que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T se integra de forma estable en el genoma de un RNKR-CAR que expresa, NKR y/o RCAR -expresión celular. La figura 16 representa ejemplos de vectores para expresar un componente, por ejemplo, todos los componentes, de RNKR-CAR, NKR-CAR o RCAR con una molécula de ARNdc que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de células T.

Se proporcionan ejemplos de moléculas de dsARN útiles para inhibir la expresión de una molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T, en donde la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T es PD-1 en el Ejemplo 10 y las Tablas 18 y 19.

RECEPTORES INHIBIDORES CONMUTABLES REDIRIGIDOS:

DOMINIOS EXTRACELULARES INHIBIDORES

Los dominios extracelulares de los receptores inhibidores se pueden acoplar, por ejemplo, mediante conmutadores de dimerización a dominios de señalización intracelular que promueven una respuesta efectora inmunitaria. Por tanto, el acoplamiento con un contraligando de la molécula coinhibidora se redirige hacia una optimización de la respuesta efectora inmunitaria. Los dominios extracelulares de los receptores inhibidores pueden usarse en actRNKR-CAR o RCAR.

En un caso, el dominio extracelular (ECD) de una molécula inhibidora, por ejemplo, una molécula inhibidora descrita en el presente documento, como, por ejemplo, Muerte programada 1 (PD1), se puede fusionar con un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular descritos en el presente documento, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización coestimulador tal como, por ejemplo, 41BB OX40, Cd28, CD27, y/o un dominio de señalización primario, por ejemplo, de CD3 zeta. En un caso, un actRNKR-CAR descrito en el presente documento comprende un ECD de una molécula inhibidora y un elemento (por ejemplo, Dominio) de una n Kr activante, por ejemplo, Un dominio TM y/o un dominio citoplasmático de NKR de una NKR activante. En un caso, la molécula inhibidora actRNKR-CAR o rCa R, por ejemplo, PD1 actRNKR-CAR o PD1 RCAR, puede usarse sola. En un caso, la molécula inhibidora CAR, por ejemplo, la molécula inhibidora actRNKR-CAR (por ejemplo, PD1 actRNKR-CAR) o molécula inhibidora RCAR (por ejemplo, PD1 RCAR), se pueden usar en combinación con otro CAR, por ejemplo, CD19CAR (por ejemplo, un CD19RCAR o un CD19CAR regulable). En un caso, PD1 RCAR o PD1 actRNKR-CAR (o PD1 Ca R) mejora la persistencia de la célula T. Ejemplos de moléculas inhibidoras incluyen PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CeAcAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 y TGFR beta. En un caso, la molécula inhibidora actRNKR-CAR o la molécula inhibidora RCAR comprende un primer polipéptido, por ejemplo, de una molécula inhibidora como PD1, LAG3, CTLA4, CD160, BTLA, LAIR1, T iM3, CeAcAM (por ejemplo, CeACAM-1, CEACAM -3 y/o CEACAM-5), 2B4 y TIGIT, o un fragmento de cualquiera de estos (por ejemplo, al menos una parte de un dominio extracelular de cualquiera de estos)

En un caso, el RNKR-CAR de PD1 o RCAR de PD1 mejora la persistencia de la célula que expresa RNKR-CAR o RCAR. En un caso, el RNKR-CAR de PD1 o RCAR de PD1 comprende el dominio extracelular de PD1 indicado como subrayado en SEQ ID NO: 147. En un caso, el RNKR-CAR de PD1 o RCAR de PD1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 147.

Malpvtalllplalllhaarppgwfldspdrpwnpptfspallwtegdnatftcsfsntsesfvlnwvrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvv rarrndsgtvlcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiviwaplagt cgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqe glynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr (SEQ ID NO: 147).

En un caso, el RNKR-CAR de PD1 o RCAR de PD1 comprende la secuencia de aminoácidos proporcionada a continuación.

pgwfldspdrpwnpptfspallyvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfh

mswrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvttpaprpptpaptiasqplslrpeacr

paaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrs

adapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdgly qglstatkdtydalhmqalppr (SEQ ID NO: 148)

En un caso, el RNKR-CAR de PD1 o RCAR de PD1, por ejemplo, el RNKR-CAR de PD1 o RCAR de PD1 descrito en el presente documento, está codificado por una secuencia de ácido nucleico que se muestra a continuación, o al menos comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio extracelular de PD 1 (que se muestra subrayado a continuación).

atggccctccctgtcactgccctgcttctccccctcgcactcctgctccacgccgctagaccacccggatggtttctggactct ccggatcgcccgtggaatcccccaaccttctcaccggcactcttggttgtgactgagggcgataatgcgaccttcacgtgctcgttctcca acacctccgaatcattcgtgctgaactggtaccgcatgagcccgtcaaaccagaccgacaagctcgccgcgtttccggaagatcggtc gcaaccgggacaggattgtcggttccgcgtgactcaactgccgaatggcagagacttccacatgagcgtggtccgcgctaggcgaaa cgactccgggacctacctgtgcggagccatctcgctggcgcctaaggcccaaatcaaagagagcttgagggccgaactgagagtgac cgagcgcagagctgaggtgccaactgcacatccatccccatcgcctcggcctgcggggcagtttcagaccctggtcacgaccactcc ggcgccgcgcccaccgactccggccccaactatcgcgagccagcccctgtcgctgaggccggaagcatgccgccctgccgccgga ggtgctgtgcatacccggggattggacttcgcatgcgacatctacatttgggctcctctcgccggaacttgtggcgtgctccttctgtccct ggtcatcaccctgtactgcaagcggggtcggaaaaagcttctgtacattttcaagcagcccttcatgaggcccgtgcaaaccacccagg aggaggacggttgctcctgccggttccccgaagaggaagaaggaggttgcgagctgcgcgtgaagttctcccggagcgccgacgcc cccgcctataagcagggccagaaccagctgtacaacgaactgaacctgggacggcgggaagagtacgatgtgctggacaagcggc gcggccgggaccccgaaatgggcgggaagcctagaagaaagaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaagat ggccgaggcctactccgaaattgggatgaagggagagcggcggaggggaaaggggcacgacggcctgtaccaaggactgtccac cgccaccaaggacacatacgatgccctgcacatgcaggcccttccccctcgc. (SEQ ID NO: 149)

En la Tabla 4 se proporcionan ejemplos de dominios extracelulares inhibidores.

En casos, el dominio extracelular inhibidor tiene al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con, o difiere en no más de 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de los residuos correspondientes de una molécula inhibidora humana de origen natural, por ejemplo, una molécula estimuladora primaria humana de origen natural descrita en el presente documento.

DOMINIOS DE UNIÓN A LIGANDO DE MOLÉCULAS COESTIMULADORAS

Los dominios de unión a ligandos extracelulares de moléculas coestimuladoras, denominados dominio ECD coestimulador, pueden acoplarse, por ejemplo, mediante conmutadores de dimerización, a dominios de señalización intracelular que promueven una respuesta efectora inmunitaria. Por tanto, el acoplamiento con un ligando contrario de la molécula coestimuladora da como resultado la optimización de la respuesta efectora inmunitaria. Los dominios de ECD coestimuladores se pueden utilizar en actRNKR-CAR o RCAR. En un caso, un actRNKR-CAR descrito en el presente documento comprende un dominio ECD coestimulador, por ejemplo, y además comprende un elemento (por ejemplo, dominio) de una NKR activante, por ejemplo, un dominio TM y/o un dominio citoplasmático NKR de una NKR activante.

En casos, el dominio ECD coestimulador tiene al menos un 70, 75,80, 85,90, 95,96, 97, 98 o 99% de identidad con, o difiere en no más de 30, 25,20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de los residuos correspondientes de una molécula inhibidora humana de origen natural, por ejemplo, una molécula coestimuladora humana de origen natural descrita en el presente documento.

DOMINIO TRANSMEMBRANA

En casos, un RNKR-CAR, NKR-CAR o RCAR comprende un dominio transmembrana que se fusiona con una secuencia extracelular, por ejemplo, Un elemento de reconocimiento extracelular, que puede comprender un dominio de unión a antígeno, un dominio de unión a ligando de contador inhibidor , o dominio ECD coestimulador. En realizaciones, un RNKR-CAR, NKR-CAR o RCAR comprende un dominio transmembrana que está fusionado con una secuencia intracelular, por ejemplo, dominio de señalización intracelular primario, dominio de señalización coestimulador o conmutador de dimerización. En una realización, el dominio transmembrana es uno que está naturalmente asociado con uno de los dominios en el RNKR-CAR, NKR-CAR o RCAR. En una realización, el dominio transmembrana es uno que no está asociado de forma natural con uno de los dominios en RNKR-CAR, NKR-CAR o RCAR.

En realizaciones, el dominio transmembrana es uno que minimiza las interacciones con otros elementos, por ejemplo, otros dominios transmembrana. En algunos casos, el dominio transmembrana minimiza la unión a dichos dominios a los dominios transmembrana de la misma o diferentes proteínas de la superficie de la membrana, por ejemplo, para minimizar las interacciones con otros miembros del complejo receptor. Se pueden derivar ejemplos adecuados mediante selección o modificación de la sustitución de aminoácidos de un dominio transmembrana conocido. En una realización, el dominio transmembrana es capaz de promover la homodimerización con otro RNKR-CAR, NKR-CAR o RCAR en la superficie celular.

El dominio transmembrana puede comprender una secuencia sintética de origen natural o no natural. Cuando se produce de forma natural, el dominio transmembrana puede derivarse de cualquier proteína transmembrana o unida a la membrana. En una realización, la región transmembrana es capaz de señalizar, a través de un conmutador de dimerización, al dominio o dominios intracelulares siempre que el RNKR-CAR, NKR-CAR o RCAR se haya unido a una diana.

Las regiones transmembrana adecuadas para su uso en las moléculas descritas en el presente documento pueden derivarse de una o más de, por ejemplo, la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16. , CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. En algunas realizaciones, un dominio transmembrana puede incluir al menos la región o regiones transmembrana de, por ejemplo, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, IL2R beta, IL2R gamma, IL7Ra, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4 ), CD84, CD96 (táctil), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp. En una realización, el dominio transmembrana se deriva de CD8. En una realización, el dominio transmembrana se deriva de CD28. En un aspecto, el dominio transmembrana es un dominio transmembrana de la secuencia proporcionada como SEQ ID NO: 137.

En una realización, el dominio transmembrana comprende un dominio transmembrana NKR. Por ejemplo, la transmembrana NKR comprende una transmembrana seleccionada de la Tabla 24. En realizaciones, la transmembrana NKR comprende un dominio transmembrana del receptor KIR, NCR, SLAMF, FcR, receptor Ly49. En realizaciones, el dominio transmembrana KIR comprende un dominio transmembrana actKIR, dominio transmembrana KIR2DS2. En realizaciones, el dominio transmembrana de NCR comprende un dominio transmembrana NKp30, NKp44 o NKp46. En realizaciones, el dominio transmembrana de FcR comprende un dominio transmembrana CD16 o CD64. En realizaciones, el dominio transmembrana Ly49 comprende un dominio transmembrana seleccionado independientemente de Ly49A-Ly49W.

En una realización, el dominio transmembrana comprende un resto cargado positivamente, por ejemplo, un residuo de aminoácido que comprende un resto cargado positivamente, por ejemplo, una cadena lateral cargada positivamente.

En realizaciones, el dominio transmembrana puede interaccionar con, por ejemplo, unirse, un adaptador o molécula de señalización intracelular, por ejemplo, una molécula de señalización intracelular descrita en el presente documento, por ejemplo, en la Tabla 1 o 2, por ejemplo, un dominio citoplasmático DAP12, FcRy o CD3 Z. En realizaciones, el dominio transmembrana interacciona con un dominio citoplasmático que contiene ITAM. Por ejemplo, el dominio transmembrana puede interaccionar con, por ejemplo, unirse al dominio transmembrana de un adaptador o molécula de señalización intracelular descrita en el presente documento, por ejemplo, DAP12.

En una realización, se puede disponer una secuencia, por ejemplo, una secuencia de bisagra o espaciadora, entre un dominio transmembrana y otra secuencia o dominio al que se fusiona. En realizaciones, también se puede emplear una variedad de bisagras humanas (también conocidas como "espaciadores"), por ejemplo, que incluyen, pero no se limitan a, la bisagra de Ig humana (inmunoglobulina). Opcionalmente, un enlazador oligo o polipéptido corto, de entre 2 y 10 aminoácidos de longitud, puede formar el enlace entre el dominio transmembrana y otro dominio, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular o de conmutación, de un RNKR-CAR, NKR-CAR, o RCAR. Un doblete de glicina-serina proporciona un enlazador particularmente adecuado. En un aspecto, la bisagra o espaciador es la secuencia de aminoácidos proporcionada como SEQ ID NO: 136. En un aspecto, la bisagra o espaciador comprende una bisagra KIR2DS2.

En una realización, el dominio transmembrana puede ser una secuencia de origen no natural, en cuyo caso puede comprender predominantemente residuos hidrófobos, tales como leucina y valina. En una realización, se encontrará un triplete de fenilalanina, triptófano y valina en cada extremo de un dominio transmembrana.

ICAR

Los RNKR-CAR o RCAR descritos en el presente documento pueden incluir un miembro de CAR inhibidor (iCAR). Por ejemplo, una célula comprende un miembro de unión a antígeno y un miembro de señalización intracelular de un RCAR y un iCAR. En una realización, una célula comprende un miembro de unión a antígeno y un miembro de señalización intracelular de un RNKR-CAR y un iCAR. En una realización, una célula comprende un RCAR, un NKR-CAR y un iCAR. Un miembro de iCAR comprende: un dominio de unión a antígeno (u otro dominio extracelular) que reconoce un antígeno en una célula no diana, por ejemplo, una célula no cancerosa; un dominio transmembrana; y un dominio de una molécula inhibidora, por ejemplo, un dominio intracelular de una molécula inhibidora, por ejemplo, de PD-1, CTLA4, o de una proteína enumerada en la Tabla 12. En una realización, el miembro iCAR comprende una segunda señalización intracelular inhibidora dominio, por ejemplo, de PD-1, CTLA4, Tras el acoplamiento del dominio de unión a antígeno (u otro dominio extracelular) del miembro iCAR con su antígeno diana (o contra-ligando), el iCAR contribuye a inhibir, por ejemplo, inhibir reversiblemente, o minimizar, la activación de la célula que comprende el iCAR. Como tal, la inclusión de un miembro de iCAR en una célula RNKR-CAR o RCAR, por ejemplo, y RNKR-CARX o RCARX, puede limitar el daño a las células no objetivo, por ejemplo, espectadores. Sin desear estar ligado a ninguna teoría, se cree que un miembro de iCAR, al acoplarse con su antígeno (o contra-ligando), limita uno o más de la secreción, citotoxicidad y proliferación de citocinas. En realizaciones, el efecto es temporal, y tras el acoplamiento posterior con una célula objetivo, la célula RNKR-CAR o RCAR, por ejemplo, RNKR-CARX o R^cARX, se activa y ataca a la célula objetivo.

Un antígeno diana para un miembro de iCAR puede ser un antígeno que tiene un perfil de expresión en las células diana y en las células no diana tal que un nivel de ataque aceptablemente alto en las células diana y un nivel aceptablemente bajo de ataque en células no diana se consigue. No solo la elección del antígeno, sino también la afinidad de iCAR por su antígeno (o contra-ligando), la afinidad de CAR (por ejemplo, RNKR-CAR o RCAR) por su antígeno, el nivel de expresión de iCAR o los niveles de expresión de cAr (por ejemplo, RNKR-CAR o RCAR) se pueden utilizar para optimizar la relación de respuesta dentro/fuera del objetivo.

En una realización, el antígeno está ausente o está regulado por disminución en las células tumorales. En una realización, el antígeno comprende una molécula de HLA. En una realización, el antígeno comprende un antígeno supresor de tumores de la superficie celular. En una realización, el antígeno comprende PCML (u otro antígeno que está regulado negativamente en linfomas, cáncer de mama o de próstata), HYAL2, DCC o SMAR1.

En una realización, el antígeno comprende una proteína, carbohidrato, lípido o una modificación postraduccional de un resto de la superficie celular, por ejemplo, un O-glicano de tipo mucina (un núcleo 3 O-glicano).

En una realización, el antígeno comprende un resto que está regulado por disminución por las células tumorales que experimentan una transición epitelial a mesenquimal.

En una realización, el antígeno comprende E-cadherina.

En una realización, un dominio de una molécula inhibidora, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular de PD-1 o CTLA4, produce una señal intracelular cuando un dominio extracelular, por ejemplo, un dominio de unión a antígeno, al que se fusiona se une a un antígeno afín. (o contra ligando). El dominio de señalización intracelular inhibidor se deriva de una molécula inhibidora, por ejemplo, comprende la secuencia intracelular de una molécula inhibidora. Comprende suficiente secuencia de moléculas inhibidoras para producir una señal intracelular, por ejemplo, cuando un dominio de unión a antígeno al que está fusionado se une a un antígeno afín.

En una realización, el dominio de señalización intracelular primario comprende un motivo de señalización, por ejemplo, un motivo de activación inmunorreceptor basado en tirosina o ITIM.

Un dominio de una molécula inhibidora comprende un fragmento funcional, o análogo, de un dominio intracelular de una molécula inhibidora. Puede comprender la región intracelular completa o un fragmento de la región intracelular que es suficiente para la generación de una señal intracelular cuando un dominio de unión a antígeno al que está fusionado se une a un antígeno afín. En realizaciones, el dominio de señalización intracelular inhibidor tiene al menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 o 99% de identidad de secuencia con, o difiere en no más de 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos de los residuos correspondientes de una molécula inhibidora de origen natural, por ejemplo, una molécula de la Tabla 12.

En la Tabla 12 se proporcionan ejemplos de moléculas inhibidoras que pueden proporcionar dominios de señalización intracelular.

Por tanto, en un aspecto, se describe en el presente documento un RNKR-CAR o RCAR que comprende un miembro de iCAR. El miembro de iCAR comprende:

un dominio de unión a antígeno (u otro dominio extracelular) que reconoce un antígeno en una célula no diana, por ejemplo, una célula no cancerosa;

un dominio transmembrana; y

un dominio de una molécula inhibidora, por ejemplo, de PD-1, CTLA4 o de una proteína enumerada en la Tabla 4. En una realización, el miembro iCAR comprende un segundo dominio de señalización intracelular inhibidor, por ejemplo, de PD-1, CTLA4 o de una proteína enumerada en la Tabla 12.

VECTORES

La presente divulgación también proporciona vectores que comprenden una secuencia que codifica RCAR, una secuencia que codifica RNKR-CAR o una secuencia que codifica NKR-CAR. Los vectores derivados de virus, por ejemplo, lentivirus, son herramientas adecuadas para lograr la transferencia de genes a largo plazo, ya que permiten la integración estable a largo plazo de un transgén y su propagación en células hijas. Los vectores lentivirales tienen la ventaja añadida sobre los vectores derivados de retrovirus, por ejemplo, virus de leucemia murina, en que pueden transducir células no proliferantes, tales como hepatocitos. También tienen la ventaja añadida de una baja inmunogenicidad.

En una realización, la expresión de ácidos nucleicos que codifican RCAR, RNKR-CAR o NKR-CAR se logra mediante un ácido nucleico que codifica el polipéptido RCAR, RNKR-CAR o NKR-CAR o porciones o componentes del mismo enlazados operativamente a un promotor, que se incorpora a un vector de expresión. Los vectores pueden ser adecuados para la replicación e integración en eucariotas. Los vectores típicos contienen terminadores de transcripción y traducción, secuencias de iniciación y promotores útiles para la regulación de la expresión de la secuencia de ácido nucleico deseada.

El ácido nucleico se puede clonar en varios tipos de vectores. Por ejemplo, el ácido nucleico se puede clonar en un vector que incluye, pero no se limita a, un plásmido, un fagémido, un derivado de fago, un virus animal y un cósmido. Los vectores de particular interés incluyen vectores de expresión, vectores de replicación, vectores de generación de sondas y vectores de secuenciación.

En una realización, el vector es un vector viral. La tecnología de vectores virales es conocida en la técnica y se describe, por ejemplo, en Sambrook et al., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, volúmenes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY), y en otra virología y biología molecular. Manuales. En una realización, los virus que son útiles como vectores son retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes y lentivirus. En una realización, el vector es un vector lentivirus. En general, un vector adecuado contiene un origen de replicación funcional en al menos un organismo, una secuencia promotora, sitios convenientes de endonucleasa de restricción y uno o más marcadores seleccionables (por ejemplo, WO 01/96584; WO 01/29058; y patente de EE.UU. No.

6.326.193).

En una realización, un vector que expresa dos o más genes, cada gen se expresa por separado bajo el control de una región promotora diferente, por ejemplo, usando promotores bi o tri-cistrónicos. La expresión de dos o más genes del mismo vector se puede lograr usando un plásmido promotor múltiple, por ejemplo, promotores bi o tricistrónicos. En la bibliografía se conocen ejemplos de vectores lentivirus que contienen múltiples promotores. Por ejemplo, el vector pLENTI-bi-cistrónico dirige la expresión de dos genes usando el promotor ^pK^gy el promotor mini CMV en direcciones opuestas (Applied Biological Material Inc., Richmond, BC, Canadá). De manera similar, el vector tri-cistrónico pLENTI-tri-cistrónico impulsa la expresión de tres genes.

En otra realización, también se pueden construir vectores bi o tri-cistrónicos haciendo uso de sitios de entrada ribosómica internos (IRES) como, por ejemplo, el elemento del virus de la encefalomiocarditis (EMCV) para la traducción de dos o más marcos de lectura abiertos (ORF). . Dichos vectores están diseñados para impulsar la transcripción del mensaje bi o tri-cistrónico bajo el control de una región reguladora de un promotor humano fuerte, por ejemplo, CMV o EF1 alfa. Los IRES son secuencias de ADN relativamente cortas que pueden iniciar la traducción del ARN de una manera independiente del casquete 5 '. Mientras que el primer cistrón se traduce de una manera dependiente del casquete impulsada por un fuerte promotor de mamíferos, los siguientes utilizan regiones intercistrónicas de origen viral como el sitio de entrada ribosomal interno del poliovirus o el potenciador de la traducción independiente del casquete del virus de la encefalomiocarditis para mejorar la traducción. (N Chinnasamy et al. (2009), Producción de vectores lentivirales basados en VIH-1 multicistrónicos; Procedimientos Mol Biol 515: 1 14).

Elementos promotores adicionales, por ejemplo, potenciadores, regulan la frecuencia de inicio de la transcripción. Típicamente, estos se encuentran en la región 30-110 pb cadena arriba del sitio de inicio, aunque se ha demostrado que varios promotores contienen elementos funcionales también cadena abajo del sitio de inicio. El espaciado entre los elementos promotores es frecuentemente flexible, de modo que la función del promotor se conserva cuando los elementos se invierten o se mueven entre sí. En el promotor de timidina quinasa (tk), el espaciamiento entre los elementos del promotor se puede aumentar a 50 pb antes de que la actividad comience a disminuir. Dependiendo del promotor, parece que los elementos individuales pueden funcionar de forma cooperativa o independiente para activar la transcripción.

Otro ejemplo de un promotor es la secuencia promotora del citomegalovirus temprano inmediato (CMV). Esta secuencia promotora es una secuencia promotora constitutiva fuerte capaz de impulsar altos niveles de expresión de cualquier secuencia polinucleotídica unida operativamente a la misma. Sin embargo, también se pueden usar otras secuencias promotoras constitutivas, que incluyen, entre otras, el promotor temprano del virus simio 40 (SV40), el virus del tumor mamario de ratón (MMTV), el promotor de repetición terminal larga (LTR) del virus de inmunodeficiencia humana (VIH), MoMuLV promotor, un promotor del virus de la leucemia aviar, un promotor temprano inmediato del virus de Epstein-Barr, un promotor del virus del sarcoma de Rous, así como promotores de genes humanos como, entre otros, el promotor de actina, el promotor de miosina, el factor de elongación 1a promotor (EF1a), el promotor de hemoglobina y el promotor de creatina quinasa. Más lejos, las realizaciones no se limitan al uso de promotores constitutivos. Las formas de realización comprenden promotores inducibles. El uso de un promotor inducible proporciona un conmutador molecular capaz de activar la expresión de la secuencia de polinucleótidos a la que está operativamente enlazada cuando se desea dicha expresión, o desactivar la expresión cuando no se desea la expresión. Los ejemplos de promotores inducibles incluyen, pero no se limitan a, un promotor de metalotionina, un promotor de glucocorticoides, un promotor de progesterona y un promotor de tetraciclina. o apagando la expresión cuando no se desea expresión. Los ejemplos de promotores inducibles incluyen, pero no se limitan a, un promotor de metalotionina, un promotor de glucocorticoides, un promotor de progesterona y un promotor de tetraciclina o desactivando la expresión cuando no se desea expresión. Los ejemplos de promotores inducibles incluyen, pero no se limitan a, un promotor de metalotionina, un promotor de glucocorticoides, un promotor de progesterona y un promotor de tetraciclina.

La secuencia que codifica varios elementos de un RCAR o RNKR-CAR puede disponerse en la misma molécula de ácido nucleico, por ejemplo, El mismo plásmido o vector, por ejemplo, Vector viral, por ejemplo, Vector lentiviral. Por ejemplo, tanto (i) la secuencia que codifica un miembro de unión a antígeno como (ii) la secuencia que codifica un miembro de señalización intracelular, pueden estar presentes en el mismo ácido nucleico, por ejemplo, vector. La producción de las proteínas correspondientes se puede lograr, por ejemplo, Mediante el uso de promotores separados o mediante el uso de un producto de transcripción bicistrónico (que puede resultar en la producción de dos proteínas por escisión de un solo producto de traducción, la producción de dos proteínas por salto ribosómico durante la traducción de un producto de transcripción, o por la traducción de dos productos proteicos separados). En consecuencia, en una realización, (i) la secuencia que codifica un miembro de unión a antígeno y (ii) la secuencia que codifica un miembro de señalización intracelular, están presentes en una única molécula de ácido nucleico, se transcriben como un único producto de transcripción y se configuran como siguiente: un promotor, por ejemplo, un promotor descrito en el presente documento, por ejemplo, un promotor EF1 alfa, está operativamente unido a (i), (ii) y a (iii) la secuencia que codifica el péptido, p. Secuencia F2A. El elemento (iii) se dispone entre (i) y (ii). En una realización, (i), (ii) y (iii) se transcriben como un solo ARN. En una realización, el orden, en el ácido nucleico, es (i) -(iii) -(ii). En una realización, el orden, en el ácido nucleico, es (ii) -(iii) -(i).

En una realización, el elemento (iii) comprende: una secuencia P2A o F2A, o un fragmento eficaz de la misma. Las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos para P2A y F2A se proporcionan a continuación:

P2A:

Ggcagcggcgccaccaacttcagcctgctgaagcaggccggcgacgtggaggaaaaccctggcccc SEQ ID NO: 143 GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP SEQ ID NO: 144

F2A:

Gtgaagcagaccctgaacttcgacctgctgaaactggccggcgacgtggagagcaatcccggccct SEQ ID NO: 145 VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP SEQ ID NO: 146

En una realización (i) y (ii) forman un RCAR o RNKR-CAR que tiene un conmutador intracelular.

En una realización (i) y (ii) forman un RCAR o RNKR-CAR que tiene un conmutador extracelular.

En una realización (ii) comprende una secuencia que codifica un dominio 4-1BB y un dominio CD3zeta.

En una realización (ii) comprende una secuencia que codifica un dominio DAP12 o un dominio CD3zeta.

En una realización (ii) comprende una secuencia que codifica un dominio citoplasmático NKR.

En una realización (ii) comprende una secuencia que codifica un dominio citoplasmático de NKR y un dominio DAP12 o CD3zeta.

En una realización (i) comprende una secuencia que codifica un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, un dominio 4-1BB.

En una realización (i) comprende una secuencia que codifica un dominio citoplasmático de NKR.

En una realización, (i) la secuencia que codifica un miembro de unión a antígeno y (ii) la secuencia que codifica un miembro de señalización intracelular, están presentes en una única molécula de ácido nucleico, se transcriben como un único producto de transcripción y se configuran de la siguiente manera:

un promotor, por ejemplo, un promotor descrito en el presente documento, por ejemplo, un promotor EF1 alfa, está operativamente unido a (i), (ii) y a (iii) la secuencia que codifica un IRES, por ejemplo, un IRES de EMCV o EV71. En una realización (iii) se dispone entre (i) y (ii). En una realización, (i), (ii) y (iii) se transcriben como un solo ARN. En una realización, el orden, en el ácido nucleico, es (i) -(iii) -(ii). En una realización, el orden, en el ácido nucleico, es (ii) -(iii) -(i).

En una realización (ii) comprende una secuencia que codifica un dominio citoplasmático de NKR.

En otra realización, (i) la secuencia que codifica un miembro de unión a antígeno y (ii) la secuencia que codifica un miembro de señalización intracelular, se transcriben como productos de transcripción separados, están presentes en una única molécula de ácido nucleico y se configuran de la siguiente manera:

un promotor, por ejemplo, un promotor descrito en el presente documento, por ejemplo, un promotor EF1 alfa, está operativamente unido a (i), y un segundo promotor, por ejemplo, un promotor descrito aquí, puede estar operativamente enlazado a (ii). En una realización (i) y (ii) se transcriben como ARNm separados. En una realización, el orden, en el ácido nucleico, es primer promotor-(i) -segundo promotor-(ii). En una realización, el orden, en el ácido nucleico, es primer promotor-(ii) -segundo promotor-(i). En una realización, el primer promotor es un promotor descrito en el presente documento, por ejemplo, un promotor EF1 alfa. En una realización, el segundo promotor es un promotor descrito en el presente documento, por ejemplo, un promotor alfa de CMV o EF1. En una realización, el segundo promotor es un promotor mínimo.

La secuencia que codifica (i) un miembro del dominio extracelular inhibidor y (ii) la secuencia que codifica un miembro de señalización intracelular pueden estar presentes en el mismo ácido nucleico, por ejemplo, un vector. En consecuencia, en una realización, (i) la secuencia que codifica el miembro del dominio extracelular inhibidor y (ii) la secuencia que codifica un miembro de señalización intracelular, están presentes en una única molécula de ácido nucleico, se transcriben como un único producto de transcripción y se configuran como siguiente: un promotor, por ejemplo, un promotor descrito en el presente documento, por ejemplo, un promotor EF1 alfa, está operativamente unido a (i), (ii) y a (iii) la secuencia que codifica el péptido, por ejemplo, un péptido escindible, por ejemplo, un P2A o Secuencia F2A. El elemento (iii) se dispone entre (i) y (ii). En una realización, (i), (ii) y (iii) se transcriben como un solo ARN. En una realización, el orden, en el ácido nucleico, es (i) -(iii) -(ii). En una realización, el orden, en el ácido nucleico, es (ii) -(iii) -(i).

En una realización, el elemento (iii) comprende: una secuencia P2A o P3A, o un fragmento eficaz de la misma. En un caso, (i) la secuencia que codifica un miembro extracelular inhibidor y (ii) la secuencia que codifica un miembro de señalización intracelular, están presentes en una sola molécula de ácido nucleico, se transcriben como un único producto de transcripción y se configuran de la siguiente manera:

un promotor, por ejemplo, un promotor descrito en el presente documento, por ejemplo, un promotor EFlalpha, está operativamente unido a (i), (ii) y a (iii) la secuencia que codifica un IRES, por ejemplo, un EMCV o EV71 IRE^s. En un caso (iii) se dispone entre (i) y (ii). En un caso, (i), (ii) y (iii) se transcriben como un solo ARN. En un caso, el orden, en el ácido nucleico, es (i) -(iii) -(ii). En un caso, el orden, en el ácido nucleico, es (ii) -(iii) -(i).

En un caso (i) y (ii) forman un RCAR o RNKR-CAR que tiene un conmutador intracelular.

En un caso (i) y (ii) forman un RCAR o RNKR-CAR que tiene un conmutador extracelular.

En un caso (ii) comprende una secuencia que codifica un dominio 4-1BB y un dominio CD3zeta.

En un caso (ii) comprende una secuencia que codifica un dominio DAP12 o un dominio CD3zeta.

En un caso (ii) comprende una secuencia que codifica un dominio citoplasmático de NKR.

En un caso (ii) comprende una secuencia que codifica un dominio citoplasmático de NKR y un dominio DAP12 o CD3zeta.

En un caso (i) comprende una secuencia que codifica un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, un dominio 4-1BB.

En un caso (i) comprende una secuencia que codifica un dominio citoplasmático de NKR.

En otro caso, (i) la secuencia que codifica un miembro extracelular inhibidor y (ii) la secuencia que codifica un miembro de señalización intracelular, se transcriben como productos de transcripción separados, están presentes en una sola molécula de ácido nucleico y se configuran de la siguiente manera:

un promotor, por ejemplo, un promotor descrito en el presente documento, por ejemplo, un promotor EFlalfa, está operativamente unido a (i), y un segundo promotor, por ejemplo, un promotor descrito en el presente documento, puede estar operativamente unido a (ii). En un caso (i) y (ii) se transcriben como ARNm separados. En un caso, el orden, en el ácido nucleico, es primer promotor-(i)-segundo promotor-(ii). En un caso, el orden, en el ácido nucleico, es primer promotor-(ii)-segundo promotor-(i).

En un caso, el primer promotor es un promotor descrito en el presente documento, por ejemplo, un promotor EFlalfa. En un caso, el segundo promotor es un promotor descrito en el presente documento, por ejemplo, un promotor CMV o EF1. En un caso, el segundo promotor es un promotor mínimo.

La secuencia que codifica (i) un miembro de ECD coestimulador y (ii) la secuencia que codifica un miembro de señalización intracelular, pueden estar presentes en el mismo ácido nucleico, por ejemplo, vector.

En consecuencia, en un caso, (ia) la secuencia que codifica el miembro de ECD coestimulador y (iai) la secuencia que codifica un miembro de señalización intracelular, están presentes en una única molécula de ácido nucleico, se transcriben como un único producto de transcripción y se configuran de la siguiente manera : un promotor, por ejemplo, un promotor descrito en el presente documento, por ejemplo, un promotor EFlalpha, está operativamente unido a (i), (ii) y a (iii) la secuencia que codifica el péptido, por ejemplo, un péptido escindible, por ejemplo, un P2A o F2A secuencia. El elemento (iii) se dispone entre (i) y (ii). En un caso, (i), (ii) y (iii) se transcriben como un solo ARN. En un caso, el orden, en el ácido nucleico, es (i) -(iii) -(ii). En un caso, el orden, en el ácido nucleico, es (ii) -(iii) -(i).

En un caso, el elemento (iii) comprende: una secuencia P2A o P3A, o un fragmento eficaz de la misma.

En un caso, la secuencia (ib) que codifica un miembro de ECD coestimulador y la secuencia (iib) que codifica un miembro de señalización intracelular están presentes en una única molécula de ácido nucleico, se transcriben como un único producto de transcripción y se configuran de la siguiente manera:

un promotor, por ejemplo, un promotor descrito en el presente documento, por ejemplo, un promotor EFlalfa, está operativamente unido a (ib), (iib) y a (iii) secuencia que codifica un IRES, por ejemplo, un IRES de EMCV o EV71. En un caso (iii) está dispuesto entre (ib) y (iib). En un caso, (ib), (iib) y (iii) se transcriben como un solo ARN. En un caso, el orden, en el ácido nucleico, es (ib) -(iii) -(iib). En un caso, el orden, en el ácido nucleico, es (iib) -(iii) -(ib). En un caso (ib) y (iib) forman un RCAR o RNKR-CAR que tiene un conmutador intracelular.

En un caso (ib) y (iib) forman un RCAR o RNKR-CAR que tiene un conmutador extracelular.

En un caso (iib) comprende una secuencia que codifica un dominio 4-1BB y un dominio CD3zeta.

En un caso (iib) comprende una secuencia que codifica un dominio DAP12 o un dominio CD3zeta.

En un caso (iib) comprende una secuencia que codifica un dominio citoplasmático de NKR.

En un caso (iib) comprende una secuencia que codifica un dominio citoplasmático de NKR y un dominio DAP12 o CD3zeta.

En un caso (ib) comprende una secuencia que codifica un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, un dominio 4-1BB.

En un caso (ib) comprende una secuencia que codifica un dominio citoplasmático de NKR.

En otro caso, la secuencia (ib) que codifica un miembro de ECD coestimulador y la secuencia (iib) que codifica un miembro de señalización intracelular se transcriben como productos de transcripción separados, están presentes en una única molécula de ácido nucleico y se configuran de la siguiente manera:

un promotor, por ejemplo, un promotor descrito en el presente documento, por ejemplo, un promotor EFlalfa, está operativamente unido a (ib), y un segundo promotor, por ejemplo, un promotor descrito aquí, puede estar operativamente unido a (iib). En un caso (ib) y (iib) se transcriben como ARNm separados. En un caso, el orden, en el ácido nucleico, es primer promotor-(ib) -segundo promotor-(iib). En un caso, el orden, en el ácido nucleico, es primer promotor-(iib) -segundo promotor-(ib). En un caso, el primer promotor es un promotor descrito en el presente documento, por ejemplo, un promotor EFlalfa. En un caso, el segundo promotor es un promotor descrito en el presente documento, por ejemplo, un promotor CMV o EF1. En un caso, el segundo promotor es un promotor mínimo.

En un caso (ib) y (iib) forman un RCAR o RNKR-CAR que tiene un conmutador intracelular.

En algunas realizaciones, un ácido nucleico que codifica un RNKR-CAR comprende:

una secuencia que codifica (a) un miembro de unión a antígeno y (b) un miembro de señalización intracelular se dispone en una única molécula de ácido nucleico.

En otra realización, un ácido nucleico que codifica un RNKR-CAR comprende una secuencia que codifica (a) un miembro de unión a antígeno que está dispuesto en una primera molécula de ácido nucleico, y una secuencia que codifica (b) un miembro de señalización intracelular que está dispuesto en una segunda molécula de ácido nucleico. En algunas realizaciones, un ácido nucleico que codifica un RNKR-CAR comprende además una secuencia que codifica (c) una molécula adaptadora o una molécula de señalización intracelular, por ejemplo, DAP12 o Fcgamma R. Por ejemplo, una secuencia que codifica (a), (b) y (c), se proporciona en una única molécula de ácido nucleico. En otro ejemplo, se proporciona una secuencia que codifica dos de (a), (b) y (c) en una primera molécula de ácido nucleico y la secuencia que codifica la otra se proporciona en una segunda molécula de ácido nucleico. En otro ejemplo, se proporciona una secuencia que codifica (a) en una primera molécula de ácido nucleico, se proporciona una secuencia que codifica (b) en una segunda molécula de ácido nucleico y se proporciona una secuencia que codifica (c) en una tercera molécula de ácido nucleico.

En algunas realizaciones, un ácido nucleico que codifica un RNKR-CAR también comprende una secuencia que codifica un segundo CAR, por ejemplo, un CAR descrito en el presente documento, por ejemplo, un CAR estándar, RCAR, RNKR-CAR o NKR-CAR.

Las realizaciones de construcciones de molécula única incluyen las representadas en la Fig. 22.

En algunos aspectos, un ácido nucleico descrito en el presente documento, por ejemplo, para introducirlo en una célula para producir una célula RCAR/NKR-CAR, comprende (i) una secuencia que codifica un RCAR y (ii) una secuencia que codifica un NKR-CAR.

En el presente documento se describen construcciones de ejemplo que comprenden un ácido nucleico que codifica un RCAR. En algunas realizaciones, el ácido nucleico comprende además una secuencia que codifica un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, una molécula adaptadora, que interacciona con el NKR-CAR. Por ejemplo, la secuencia que codifica el dominio de señalización intracelular está dispuesta en la misma molécula de ácido nucleico, por ejemplo, el mismo vector, que la secuencia que codifica el NKR-CAR. En otros ejemplos, la secuencia que codifica el dominio de señalización intracelular se dispone en una molécula de ácido nucleico separada, por ejemplo, un vector separado, de la secuencia que codifica el NKR-CAR.

En algunas realizaciones, la secuencia o secuencias que codifican RCAR y la secuencia que codifica NKR-CAR están dispuestas en la misma molécula de ácido nucleico, por ejemplo, el mismo vector. Por ejemplo, la secuencia o secuencias que codifican RCAR y la secuencia que codifica NKR-CAR están separadas por una secuencia que codifica una secuencia de péptido escindible descrita en el presente documento o por una secuencia que codifica un IRES descrito en el presente documento.

En realizaciones, un promotor descrito en el presente documento, por ejemplo, un promotor EF1alfa, está operativamente unido a una secuencia que codifica RCAR o la secuencia que codifica NKR-CAR.

En una realización, un promotor que es capaz de expresar el transgén RCAR, NKR-CAR o RNKR-CAR es una célula T de mamífero es el promotor EFIalpha (EF1a). El promotor nativo de EF1a dirige la expresión de la subunidad alfa del complejo factor de alargamiento 1, que es responsable de la entrega enzimática de los ARNt de aminoacilo al ribosoma. El promotor EF1a se ha utilizado en plásmidos de expresión de mamíferos y se ha demostrado que es eficaz para impulsar la expresión de RCAR, NKR-CAR o RNKR-CAR a partir de transgenes clonados en un vector lentiviral. Véase, por ejemplo, Milone et al., Mol. El r. 17 (8): 1453-1464 (2009). En una realización, el promotor EF1a comprende la secuencia proporcionada como SEQ ID NO: 140.

Para evaluar la expresión de un polipéptido RCAR, NKR-CAR o RNKR-CAR o porciones del mismo, el vector que se va a introducir en una célula también puede contener un gen marcador seleccionable o un gen informador o ambos para facilitar identificación y selección de células que expresan de la población de células que se busca transfectar o infectar a través de vectores virales. En realizaciones, el marcador seleccionable puede llevarse en una pieza separada de ADN y usarse en un procedimiento de cotransfección. Los marcadores seleccionables útiles incluyen, por ejemplo, genes de resistencia a antibióticos, tales como neo y similares.

Los genes indicadores se utilizan para identificar células potencialmente transfectadas y para evaluar la funcionalidad de secuencias reguladoras. En general, un gen informador es un gen que no está presente ni es expresado por el organismo o tejido receptor y que codifica un polipéptido cuya expresión se manifiesta por alguna propiedad fácilmente detectable, por ejemplo, actividad enzimática. La expresión del gen indicador se ensaya en un momento adecuado después de que el ADN se haya introducido en las células receptoras. Los genes indicadores adecuados pueden incluir genes que codifican luciferasa, beta-galactosidasa, cloranfenicol acetil transferasa, fosfatasa alcalina secretada o el gen de la proteína verde fluorescente (por ejemplo, Ui-Tei y col., 2000 FEBS Letters 479: 79-82). Se conocen sistemas de expresión adecuados y pueden prepararse usando técnicas conocidas u obtenerse comercialmente. En general, la construcción con la región flanqueante 5 'mínima que muestra el nivel más alto de expresión del gen indicador se identifica como el promotor. Dichas regiones promotoras pueden unirse a un gen indicador y usarse para evaluar la capacidad de los agentes para modular la transcripción dirigida por el promotor.

Se conocen en la técnica procedimientos para introducir y expresar genes en una célula. En el contexto de un vector de expresión, el vector se puede introducir fácilmente en una célula huésped, por ejemplo, una célula de mamífero, bacteriana, de levadura o de insecto mediante cualquier procedimiento en la técnica. Por ejemplo, el vector de expresión se puede transferir a una célula huésped por medios físicos, químicos o biológicos.

Los procedimientos físicos para introducir un polinucleótido en una célula huésped incluyen precipitación con fosfato cálcico, lipofección, bombardeo de partículas, microinyección, electroporación y similares. Los procedimientos para producir células que comprenden vectores y/o ácidos nucleicos exógenos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, volúmenes 1-4, Cold Spring Harbor Press, ⁿY).

Los procedimientos biológicos para introducir un polinucleótido en una célula huésped incluyen el uso de vectores de ADN y ARN como se describió anteriormente. Los vectores virales, y especialmente los vectores retrovirales, se han convertido en el procedimiento más ampliamente utilizado para insertar genes en células de mamíferos, por ejemplo, humanas. Otros vectores virales pueden derivarse de lentivirus, poxvirus, virus del herpes simple I, adenovirus y virus adenoasociados, y similares. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5.350.674 y 5.585.362.

Los medios químicos para introducir un polinucleótido en una célula huésped incluyen sistemas de dispersión coloidal, tales como complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Un sistema coloidal ejemplar para usar como vehículo de administración in vitro e in vivo es un liposoma (por ejemplo, una vesícula de membrana artificial). Se encuentran disponibles otros procedimientos de administración dirigida de ácidos nucleicos de última generación, como la administración de polinucleótidos con nanopartículas dirigidas.

En el presente documento se describen procedimientos para producir un ARN NKR-CAR, RCAR o RNKR-CAR transcrito in vitro. La presente divulgación también incluye una construcción de ARN que codifica NKR-CAR, que codifica RCAR o que codifica RNKR-CAR que puede transfectarse directamente en una célula. Un procedimiento para generar ARNm para su uso en transfección puede implicar la transcripción in vitro (IVT) de una plantilla con cebadores especialmente diseñados, seguida de la adición de poliA, para producir una construcción que contenga secuencias no traducidas 3 'y 5' ("UTR"), una 5 'cap y/o sitio de entrada de ribosoma interno (IREs ), el ácido nucleico que se va a expresar, y una cola poliA, típicamente 50-2000 bases en. El ARN así producido puede transfectar eficazmente diferentes tipos de células. En un aspecto, la plantilla incluye secuencias para NKR-CAR, RCAR o RNKR-CAR.

En un aspecto, el NKR-CAR, RCAR o RNKR-CAR está codificado por un ARN mensajero (ARNm). En un aspecto, el ARNm que codifica NKR-CAR, RCAR o RNKR-CAR se introduce en una célula T para la producción de una célula NKR-CAR, RCAR o RNKR-CAR.

En una realización, el ARN NKR-CAR, RCAR o RNKR-CAR transcrito in vitro se puede introducir en una célula como una forma de transfección transitoria. El ARN se produce mediante transcripción in vitro utilizando una plantilla generada por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El ADN de interés de cualquier fuente se puede convertir directamente mediante PCR en un molde para la síntesis de ARNm in vitro utilizando cebadores apropiados y ARN polimerasa. La fuente del ADN puede ser, por ejemplo, ADN genómico, ADN plasmídico, ADN de fago, ADNc, secuencia de ADN sintético o cualquier otra fuente apropiada de ADN. En un caso, el templo deseado para la transcripción in vitro es un NKR-CAR, RCA^ro RNKR-CAR de la presente divulgación. Por ejemplo, el molde para el ARN NKR-CAR, RCAR o RNKR-CAR comprende una región extracelular que comprende un dominio variable de cadena sencilla de un anticuerpo antitumoral; una región de bisagra, un dominio transmembrana (por ejemplo, un dominio transmembrana de un receptor, por ejemplo, receptor de células T o NKR). En un caso, las plantillas deseadas para la transcripción in vitro comprenden Rn KR-CAr , RCAR o NKR-CAR en una plantilla separada de un dominio de señalización intracelular o dominio de molécula adaptadora. Por ejemplo, las plantillas deseadas para la transcripción in vitro comprenden KIR-CAR y DAP12 o CD3zeta en plantillas separadas. En un caso, las plantillas deseadas para la transcripción in vitro comprenden RNKR-CAR, RCAR o NKR-CA^ren una plantilla separada de un dominio de señalización intracelular o dominio de molécula adaptadora. Por ejemplo, el templo deseado para la transcripción in vitro comprende KIR-CAR y DAP12 o CD3zeta en el mismo molde. En un caso, la plantilla para DAP12 o CD3zeta comprende un dominio transmembrana y una región intracelular.

En una realización, el ADN que se utilizará para la PCR contiene un marco de lectura abierto. El ADN puede provenir de una secuencia de ADN de origen natural del genoma de un organismo. En una realización, el ácido nucleico puede incluir algunas o todas las regiones no traducidas (UTR) 5 'y/o 3'. El ácido nucleico puede incluir exones e intrones. En una realización, el ADN que se utilizará para la PCR es una secuencia de ácido nucleico humano. En otra realización, el ADN que se utilizará para la PCR es una secuencia de ácido nucleico humano que incluye las UTR 5 'y 3'. Alternativamente, el ADN puede ser una secuencia de ADN artificial que normalmente no se expresa en un organismo natural. Una secuencia de ADN artificial ejemplar es aquella que contiene porciones de genes que se ligan entre sí para formar un marco de lectura abierto que codifica una proteína de fusión.

La PCR se usa para generar una plantilla para la transcripción in vitro de ARNm que se usa para la transfección. Los procedimientos para realizar la pCr son bien conocidos en la técnica. Los cebadores para su uso en la PCR están diseñados para tener regiones que sean sustancialmente complementarias a las regiones del ADN que se usarán como molde para la PCR. "Sustancialmente complementaria", tal como se usa en el presente documento, se refiere a secuencias de nucleótidos en las que la mayoría o todas las bases en la secuencia del cebador son complementarias, o una o más bases no son complementarias o no coinciden. Las secuencias sustancialmente complementarias pueden hibridar o hibridar con la diana de ADN pretendida en las condiciones de hibridación utilizadas para la PCR. Los cebadores pueden diseñarse para que sean sustancialmente complementarios a cualquier parte del molde de ADN. Por ejemplo, los cebadores pueden diseñarse para amplificar la parte de un ácido nucleico que normalmente se transcribe en las células (el marco de lectura abierto), incluidas las UTR 5 'y 3'. Los cebadores también pueden diseñarse para amplificar una parte de un ácido nucleico que codifica un dominio de interés particular. En una realización, los cebadores se diseñan para amplificar la región codificante de un ADNc humano, incluyendo todas o porciones de las UTR 5 'y 3'. Los cebadores útiles para la PCR se pueden generar mediante procedimientos sintéticos que son bien conocidos en la técnica. Los "cebadores directos" son cebadores que contienen una región de nucleótidos que son sustancialmente complementarios a los nucleótidos en la plantilla de ADN que están cadena arriba de la secuencia de ADN que se va a amplificar. "Aguas arriba" se utiliza en el presente documento para referirse a una ubicación 5, a la secuencia de ADN a amplificar con respecto a la cadena codificante. Los "cebadores inversos" son cebadores que contienen una región de nucleótidos que son sustancialmente complementarios a un molde de ADN bicatenario que se encuentra cadena abajo de la secuencia de ADN que se va a amplificar. "Aguas abajo" se usa en el presente documento para referirse a una ubicación 3 'de la secuencia de ADN que se va a amplificar en relación con la cadena codificante.

Cualquier ADN polimerasa útil para PCR puede usarse en los procedimientos descritos en el presente documento. Los reactivos y la polimerasa están disponibles comercialmente de varias fuentes.

También pueden usarse estructuras químicas con la capacidad de promover la estabilidad y/o la eficiencia de traducción. El ARN tiene preferiblemente UTR 5 'y 3'. En una realización, la UTR 5 'tiene una longitud de entre uno y 3000 nucleótidos. La longitud de las secuencias de UTR 5 'y 3' que se añaden a la región codificante puede alterarse mediante diferentes procedimientos, que incluyen, entre otros, el diseño de cebadores para PCR que se hibridan con diferentes regiones de las UTR. Usando este enfoque, un experto en la materia puede modificar las longitudes de UTR 5 'y 3' requeridas para lograr una eficiencia de traducción óptima después de la transfección del ARN transcrito. Las UTR 5 'y 3' pueden ser las UTR 5 'y 3' endógenas de origen natural para el ácido nucleico de interés. Alternativamente, las secuencias de UTR que no son endógenas al ácido nucleico de interés se pueden añadir incorporando las secuencias de UTR en los cebadores directo e inverso o mediante cualquier otra modificación del molde. El uso de secuencias de UTR que no son endógenas al ácido nucleico de interés puede ser útil para modificar la estabilidad y/o la eficiencia de traducción del ARN. Por ejemplo, se sabe que los elementos ricos en AU en las secuencias 3 'UTR pueden disminuir la estabilidad del ARNm. Por lo tanto, las 3 'UTR pueden seleccionarse o diseñarse para aumentar la estabilidad del ARN transcrito basándose en las propiedades de las UTR que son bien conocidas en la técnica.

En una realización, el 5 'UTR puede contener la secuencia Kozak del ácido nucleico endógeno. Alternativamente, cuando se añade mediante PCR una UTR 5 'que no es endógena al ácido nucleico de interés, como se describe anteriormente, se puede rediseñar una secuencia Kozak de consenso añadiendo la secuencia UTR 5'. Las secuencias de Kozak pueden aumentar la eficiencia de la traducción de algunas transcripciones de ARN, pero no parece ser necesario para que todos los ARN permitan una traducción eficiente. El requisito de secuencias de Kozak para muchos ARNm es conocido en la técnica. En otras realizaciones, la UTR 5 'puede ser la UTR 5' de un virus de ARN cuyo genoma de ARN es estable en las células. En otras realizaciones, se pueden usar varios análogos de nucleótidos en la UTR 3 'o 5' para impedir la degradación por exonucleasa del ARNm.

Para permitir la síntesis de ARN a partir de una plantilla de ADN sin necesidad de clonación de genes, se debe unir un promotor de la transcripción a la plantilla de ADN corriente arriba de la secuencia que se va a transcribir. Cuando se añade una secuencia que funciona como un promotor de una ARN polimerasa al extremo 5 'del cebador directo, el promotor de ARN polimerasa se incorpora al producto de PCR corriente arriba del marco de lectura abierto que se va a transcribir. En una realización preferida, el promotor es un promotor de polimerasa T7, como se describe en otra parte del presente documento. Otros promotores útiles incluyen, pero no se limitan a, promotores de ARN polimerasa de T3 y SP6. Las secuencias de nucleótidos consensuadas para los promotores T7, T3 y SP6 se conocen en la técnica.

En una realización preferida, el ARNm tiene una tapa en el extremo 5 'y una cola de poli (A) 3' que determina la unión al ribosoma, el inicio de la traducción y la estabilidad del ARNm en la célula. En una plantilla de ADN circular, por ejemplo, ADN plásmido, la ARN polimerasa produce un producto concatemérico largo que no es adecuado para la expresión en células eucariotas. La transcripción del ADN plasmídico linealizado al final de la UTR 3 'da como resultado un ARNm de tamaño normal que no es eficaz en la transfección eucariota incluso si está poliadenilado después de la transcripción.

En una plantilla de ADN lineal, la ARN polimerasa del fago T7 puede extender el extremo 3 'de la transcripción más allá de la última base de la plantilla (Schenborn y Mierendorf, Nuc Acids Res., 13: 6223-36 (1985); Nacheva y Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270: 1485-65 (2003).

El procedimiento convencional de integración de tramos poliA/T en un molde de ADN es la clonación molecular. Sin embargo, la secuencia poliA/T integrada en el ADN plasmídico puede causar inestabilidad del plásmido, razón por la cual las plantillas de ADN plasmídico obtenidas de células bacterianas a menudo están altamente contaminadas con deleciones y otras aberraciones. Esto hace que los procedimientos de clonación no solo sean laboriosos y prolongados, sino que a menudo no sean fiables. Es por eso que un procedimiento que permite la construcción de moldes de ADN con estiramiento poliA/T 3 'sin clonación es altamente deseable.

El segmento poliA/T de la plantilla de ADN transcripcional se puede producir durante la PCR mediante el uso de un cebador inverso que contiene una cola polyT, como una cola 100T (el tamaño puede ser 50-5000 T (SEQ ID NO: 169), o después PCR mediante cualquier otro procedimiento, que incluye, entre otros, ligación de ADN o recombinación in vitro. Las colas de poli (A) también proporcionan estabilidad a los ARN y reducen su degradación. En general, la longitud de una cola de poli (A) se correlaciona positivamente con la estabilidad del ARN transcrito En una realización, la cola de poli (A) está entre 100 y 5000 adenosinas.

Las colas de poli (A) de ARN se pueden extender aún más después de la transcripción in vitro con el uso de una poli (A) polimerasa, tal como E. coli poliA polimerasa (E-PAP). En una realización, el aumento de la longitud de una cola de poli (A) de 100 nucleótidos a entre 300 y 400 nucleótidos da como resultado un aumento de aproximadamente el doble en la eficacia de traducción del ARN. Además, la unión a diferentes grupos químicos al extremo 3 'puede aumentar la estabilidad del ARNm. Tal unión puede contener nucleótidos modificados/artificiales, aptámeros y otros compuestos. Por ejemplo, los análogos de ATP se pueden incorporar en la cola de poli (A) usando polimerasa de poli (A). Los análogos de ATP pueden aumentar aún más la estabilidad del ARN.

Los bloqueo 5' también proporcionan estabilidad a las moléculas de ARN. En una realización preferida, los ARN producidos por los procedimientos descritos en el presente documento incluyen un bloqueo 5'. El bloqueo 5' se proporciona utilizando técnicas conocidas en la técnica y descritas en el presente documento (Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29: 436-444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7: 1468- 95 (2001); Elango y col., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330: 958-966 (2005)).

Los ARN producidos por los procedimientos descritos en el presente documento también pueden contener una secuencia de sitio de entrada de ribosoma interno (IRES). La secuencia de IRES puede ser cualquier secuencia viral, cromosómica o diseñada artificialmente que inicie la unión al ribosoma independiente del casquete al ARNm y facilite el inicio de la traducción. Se puede incluir cualquier soluto adecuado para la electroporación celular, que pueda contener factores que faciliten la permeabilidad y viabilidad celular, tales como azúcares, péptidos, lípidos, proteínas, antioxidantes y tensioactivos.

En algunas realizaciones, el ARNm puede introducirse directamente en la célula o el paciente en un sistema de administración no viral e inyectarse directamente en el paciente. En el caso de que se utilice un sistema de administración no viral, un vehículo de administración ejemplar es un liposoma. Se contempla el uso de formulaciones lipídicas para la introducción de ácidos nucleicos en una célula huésped (in vitro, ex vivo o in vivo). En una realización, el ácido nucleico puede asociarse con un lípido. El ácido nucleico asociado con un lípido puede encapsularse en el interior acuoso de un liposoma, intercalado dentro de la bicapa lipídica de un liposoma, unido a un liposoma mediante una molécula de enlace que está asociada tanto con el liposoma como con el oligonucleótido, atrapado en un liposoma, complejado con un liposoma, dispersado en una solución que contiene un lípido, mezclado con un lípido, combinado con un lípido, contenido como una suspensión en un lípido, contenido o complejado con una micela, o asociado de otro modo con un lípido. Las composiciones asociadas a lípidos, lípidos/ADN o lípidos/vectores de expresión no se limitan a ninguna estructura particular en solución. Por ejemplo, pueden estar presentes en una estructura de dos capas, como micelas o con una estructura "colapsada". También pueden simplemente estar intercalados en una solución, posiblemente formando agregados que no son uniformes en tamaño o forma. Los lípidos son sustancias grasas que pueden ser lípidos naturales o sintéticos. Por ejemplo, los lípidos incluyen las gotitas grasas que se encuentran naturalmente en el citoplasma, así como la clase de compuestos que contienen hidrocarburos alifáticos de cadena larga y sus derivados, tales como ácidos grasos, alcoholes, aminas, aminoalcoholes y aldehídos.

Los lípidos adecuados para su uso se pueden obtener de fuentes comerciales. Por ejemplo, la dimiristilfosfatidilcolina ("DMPC") se puede obtener de Sigma, St. Louis, MO; el fosfato de dicetilo ("DCP") se puede obtener de K & K Laboratories (Plainview, NY); el colesterol ("Choi") se puede obtener de Calbiochem-Behring; El dimiristilfosfatidilglicerol ("DMPG") y otros lípidos pueden obtenerse de Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL.). Las soluciones madre de lípidos en cloroformo o cloroformo/metanol se pueden almacenar a aproximadamente -20°C. El cloroformo se utiliza como único disolvente, ya que se evapora más fácilmente que el metanol. "Liposoma" es un término genérico que abarca una variedad de vehículos lipídicos simples y multilaminares formados por la generación de bicapas o agregados lipídicos encerrados. Los liposomas pueden caracterizarse por tener estructuras vesiculares con una membrana de bicapa de fosfolípidos y un medio acuoso interno. Los liposomas multilaminares tienen múltiples capas lipídicas separadas por medio acuoso. Se forman espontáneamente cuando los fosfolípidos se suspenden en un exceso de solución acuosa. Los componentes lipídicos se reorganizan antes de la formación de estructuras cerradas y atrapan el agua y los solutos disueltos entre las bicapas lipídicas (Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10). Sin embargo, también se incluyen composiciones que tienen diferentes estructuras en solución que la estructura vesicular normal. Por ejemplo, los lípidos pueden asumir una estructura micelar o simplemente existir como agregados no uniformes de moléculas lipídicas. También se contemplan los complejos lipofectamina-ácido nucleico.

Los componentes RCAR, RNKR-CAR o NKR-CAR pueden ser codificados en una o más moléculas de ácido nucleico. Las moléculas de ácido nucleico de ejemplo incluyen vectores virales, por ejemplo, vectores lentivirales, vectores retrovirales, vectores adenovirales y similares. En realizaciones, los componentes se pueden proporcionar en una sola molécula de ácido nucleico, por ejemplo, vector viral, por ejemplo, vector lentiviral, vectores retrovirales, vectores adenovirales y similares, o se pueden disponer en más de una molécula de ácido nucleico, por ejemplo, vector viral, por ejemplo, vector lentiviral, vectores retrovirales, vectores adenovirales y similares.

Las tablas 6-11 a continuación proporcionan configuraciones de ejemplo de conmutadores de dimerización en RCAR o RNKR-CAR.

INHIBIDORES A BASE DE ACIDO NUCLEICO ARN DOBLE CADENA (DSARN)

Un inhibidor basado en ácido nucleico útil para disminuir la expresión del gen diana, por ejemplo, un gen de molécula inhibidora, comprende dsARN, tal como shARN. Si bien no se desea ligarse a la teoría, se cree que el dsARN actúa mediante un mecanismo de ARNi. ARNi se refiere al proceso de silenciamiento génico postranscripcional específico de secuencia en animales mediado por ARN de interferencia cortos (ARNip). El dsARN, tal como se usa en el presente documento, incluye siARN y shARN.

El dsARN puede sintetizarse químicamente, expresarse a partir de un vector o sintetizarse enzimáticamente. Los dsARN pueden ser no modificados o, por ejemplo, en el caso de los dsARN administrados como ARN, pueden modificarse químicamente. Los dsARN sintetizados enzimáticamente pueden mejorar diversas propiedades de las moléculas de dsARN nativas, tales como, una mayor resistencia a la degradación de nucleasas in vivo y/o mediante una captación celular mejorada.

Los dsARN que reconocen un ácido nucleico pueden estar compuestos de dos moléculas de ARN separadas denominadas en el presente documento siARN, o de una molécula de ARN, que se pliega para formar una estructura de horquilla, denominada en el presente documento shARN. En las realizaciones, un dsARN adecuado para inhibir la expresión de un gen diana puede identificarse mediante cribado de una biblioteca de siARN, tal como una biblioteca de siARN adenoviral o lentiviral. Un dsARN, por ejemplo, un shARN, se puede proporcionar a una célula como ARN o en la forma de un ADN que se transcribe para proporcionar el dsARN, por ejemplo, shARN. Un gen de dsARN, por ejemplo, un shARN, se puede expresar a partir de un vector, por ejemplo, vector viral, tal como un vector lentiviral o adenoviral. Un dsARN, por ejemplo, un shARN, puede ser expresado por promotores de polimerasa III, por ejemplo, un promotor U6 o HI o por un promotor de polimerasa II. El shARN puede expresarse en la célula a partir de una construcción de ADN que codifica una secuencia de ARN monocatenario y su complemento, separados por un fragmento de relleno o enlazador, lo que permite que la molécula de ARN se repliegue sobre sí misma, creando una molécula de dsARN con un bucle de horquilla. Sin ligarse a la teoría, se cree que el shARN expresado a partir de una secuencia de ADN que codifica el shARN es procesado por Dicer a siARN, que continúa a lo largo de la vía del ARNi a través de RISC para silenciar el gen diana.

En una realización el inhibidor es un dsARN, por ejemplo, un shARN, que comprende una región de doble cadena que es de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 pares de base de longitud (por ejemplo, aproximadamente 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, ó 29 pares de base de longitud. En una realización el inhibidor es un shARN que comprende una región de doble cadena de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 pares de base de longitud (por ejemplo, aproximadamente 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, ó 29 pares de base de longitud). En una realización, el dsARN, incluye extremos salientes de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 (por ejemplo, 1, 2 ó 3) nucleótidos. Por “saliente” se entiende que el extremo 3' de una cadena del dsARN se extiende más allá del extremo 5' de la otra cadena, o viceversa. El dsARN puede tener un saliente en uno o ambos extremos de la molécula de dsARN. En algunas realizaciones, el saliente de cadena única se localiza en el extremo 3'-terminal de la cadena antisentido, o, alternativamente, en el extremo 3'-terminal de la cadena de sentido. En algunas realizaciones, el saliente es un saliente de dinucleótido TT o UU, por ejemplo, un saliente de dinucleótido TT o UU. Por ejemplo, en una realización, el dsARN incluye una cadena antisentido de 21 nucleótidos, una región de doble cadena de 19 pares de bases y un dinucleótido de terminal 3'. En otra realización más, un dsARN incluye un ácido nucleico de doble cadena en el que ambos extremos son romos o, alternativamente, donde uno de los extremos es romo.

En una realización, el shARN, después del procesamiento intracelular (por ejemplo, por Dicer), da como resultado un siARN de doble cadena de 19-23 nucleótidos con salientes 3' de 2 nucleótidos.

En una realización, el dsARN, por ejemplo, un shARN, incluye una primera y una segunda secuencia, cada secuencia tiene de aproximadamente 18 a aproximadamente 28 nucleótidos de longitud, por ejemplo, de aproximadamente 19 a aproximadamente 23 nucleótidos de longitud, donde la primera secuencia del dsARN incluye una secuencia de nucleótidos que tiene suficiente complementariedad con el ARN diana para que el dsARN dirija la escisión de la diana mediante la interferencia del ARN, y la segunda secuencia del dsARN incluye una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la primera cadena.

En una realización, un dsARN incluye una primera y una segunda secuencia de una región de doble cadena, en la que cada secuencia de la región de doble cadena tiene de aproximadamente 18 a aproximadamente 28 nucleótidos de longitud, por ejemplo, de aproximadamente 19 a aproximadamente 23 nucleótidos de longitud. La primera secuencia del hsARN incluye una secuencia de nucleótidos que tiene suficiente complementariedad con el ARN diana para que el hsARN dirija la escisión de la diana mediante la interferencia del ARN, y la segunda cadena del hsARN incluye una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la primera cadena.

En una realización, el dsARN (por ejemplo, las secuencias o las cadenas de la región de doble cadena de un shARN) incluye una secuencia antisentido que tiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos del gen diana o una parte de la misma, y una secuencia de sentido que tiene una secuencia de nucleótidos sustancialmente similar a la secuencia de nucleótidos del gen diana o una parte de la misma. En una realización, la secuencia antisentido y la secuencia sentido, independientemente, incluyen de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30) nucleótidos, donde la secuencia antisentido incluye de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,29 ó 30) nucleótidos que son complementarios a los nucleótidos de la secuencia sentido.

En una realización, un dsARN se proporciona como un ARN (y no como un ADN que se transcribe para proporcionar el dsARN) e incluye una o más modificaciones químicas. Los ejemplos no limitantes de tales modificaciones químicas incluyen, sin limitación, enlaces internucleotídicos de fosforotioato, 2'-desoxirribonucleótidos, 2'-O-metil ribonucleótidos, 2'-deoxi-2'-fluoro ribonucleótidos, nucleótidos de "base universal", nucleótidos "acíclicos", 5-C-metil nucleótidos e incorporación de glicerilo terminal y/o de residuo abásico desoxi invertido. Se ha demostrado que tales modificaciones químicas conservan la actividad de ARNi en las células y, al mismo tiempo, aumentan drásticamente la estabilidad sérica de estos compuestos. Además, una o más sustituciones de fosforotioato son bien toleradas y se ha demostrado que confieren aumentos sustanciales en la estabilidad sérica para construcciones de dsARN modificadas. El dsARN puede incluir nucleótidos modificados como un porcentaje del número total de nucleótidos presentes en la molécula. Como tal, el dsARN generalmente puede incluir de aproximadamente 5% a aproximadamente 100% de nucleótidos modificados (por ejemplo, aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de nucleótidos modificados).

ANTISENTIDO

Los inhibidores basados en ácidos nucleicos adecuados incluyen ácidos nucleicos antisentido. Aunque no está ligado a la teoría, se cree que la inhibición antisentido se basa típicamente en la hibridación basada en enlaces de hidrógeno de cadenas o segmentos de oligonucleótidos de manera que al menos una cadena o segmento se escinde, se degrada o se vuelve inoperable.

Un agente antisentido puede tener una modificación química descrita anteriormente como adecuada para dsARN. Los agentes antisentido pueden incluir, por ejemplo, de aproximadamente 8 a aproximadamente 80 nucleobases (es decir, de aproximadamente 8 a aproximadamente 80 nucleótidos), por ejemplo, de aproximadamente 8 a aproximadamente 50 nucleobases, o de aproximadamente 12 a aproximadamente 30 nucleobases. Los compuestos antisentido incluyen ribozimas, oligonucleótidos de secuencia guía externa (EGS) (oligozimas) y otros ARN catalíticos cortos u oligonucleótidos catalíticos que hibridan con el ácido nucleico diana y modulan su expresión. Los compuestos antisentido pueden incluir un tramo de al menos ocho nucleobases consecutivas que son complementarias a una secuencia en el gen diana. Un oligonucleótido no necesita ser 100% complementario a su secuencia de ácido nucleico diana para ser específicamente hibridable. Un oligonucleótido es específicamente hibridizable cuando la unión del oligonucleótido a la diana interfiere con la función normal de la molécula diana para causar la perdida de utilidad, y hay un grado suficiente de complementariedad para evitar la unión no específica del oligonucleótido con secuencias no diana en condiciones en las que la unión específica es deseada, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de los ensayos in vivo del tratamiento terapéutico o, en el caso de los ensayos in vitro, en condiciones en las que se llevan a cabo los ensayos.

Sin ligarse a ninguna teoría, se cree que las funciones del ARNm en las que se interfiere incluyen todas las funciones clave, tales como, por ejemplo, la translocación del ARN al sitio de traducción de proteína, la traducción de proteína del ARN, el corte y empalme del ARN para producir una o más especies de ARNm, y la actividad catalítica que puede ser activada por el ARN. La unión de la proteína o proteínas específicas al ARN también puede verse interferida por la hibridación de oligonucleótidos antisentido con el ARN.

IDENTIDAD DE SECUENCIA

El porcentaje de identidad en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias polipeptídicas se refiere a dos o más secuencias que son iguales. Dos secuencias son "sustancialmente idénticas" si las dos secuencias tienen un porcentaje específico de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales (es decir, 60% de identidad, opcionalmente 70%, 71%. 72%. 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92% , 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad en una región específica o, cuando no se especifica, en toda la secuencia, por ejemplo, la más corta de las secuencias comparadas), cuando se compara y se alinea para una correspondencia máxima sobre una ventana de comparación, o región designada como se mide usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencia o por alineación manual e inspección visual. Opcionalmente, la identidad existe en una región que tiene al menos aproximadamente 50 nucleótidos (o 10 aminoácidos) de longitud, o más preferiblemente en una región que tiene de 100 a 500 ó 1000 o más nucleótidos (o 20, 50, 200 o más aminoácidos) de longitud.

Para la comparación de secuencias, normalmente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se entran en un ordenador, se designan coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan parámetros del programa de algoritmo de secuencia. Se pueden usar parámetros de programa predeterminados o se pueden designar parámetros alternativos. A continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidades de secuencia para las secuencias de prueba en relación con la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa. Se conocen en la técnica procedimientos de alineación de secuencias para la comparación. El alineamiento óptimo de secuencias para comparación puede realizarse, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, (1970) Adv. Appl. Math.

2:482c, mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443, mediante el procedimiento de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante alineación manual e inspección visual (ver, por ejemplo, Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology). Dos ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; y Altschul y col., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. El software para realizar el análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos también se puede determinar usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller, (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17) que se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de espacio de 12 y una penalización de espacio de 4. Adicionalmente, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453) que se ha incorporado al programa GAP del paquete de software GCG (disponible en www.gcg.com), utilizando una matriz Blossom 62 o una matriz PAM250, y un peso de espacio de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6.

En una realización, la presente invención contempla modificaciones de la secuencia de aminoácidos del dominio de unión a antígeno (por ejemplo, svFv) que generan moléculas funcionalmente equivalentes. Por ejemplo, el VH o VL de un scFv de RCAR, RNKR-CAR o NKR-CAR se puede modificar para retener al menos aproximadamente 70%, 71%. 72%. 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de las secuencias de VH o VL iniciales del scFv. En determinadas realizaciones, las secuencias de polipéptidos codificadas por las secuencias de ácido nucleico se modifican reemplazando uno o más residuos de aminoácidos por otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadenas laterales, es decir, las sustituciones conservadoras. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares, incluyendo cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

Los procedimientos alternativos útiles para disminuir la expresión de gen diana, por ejemplo, un gen de molécula inhibidora como se describe en este documento, incluyen repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR), una nucleasa efectora similar a activador de transcripción (TALEN) o una endonucleasa con dedos de zinc (ZFN), por ejemplo, tal como se describe en el presente documento.

FUENTES DE CÉLULAS

En las realizaciones, antes de la expansión y la modificación genética u otra modificación, se puede obtener una fuente de células, por ejemplo, células T o células asesinas naturales (NK), de un sujeto. El término "sujeto" pretende incluir organismos vivos en los que se puede provocar una respuesta inmunitaria (por ejemplo, mamíferos). Los ejemplos de sujetos incluyen humanos, monos, chimpancés, perros, gatos, ratones, ratas y especies transgénicas de los mismos. Las células T pueden obtenerse de diversas fuentes, incluidas células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de ganglios linfáticos, sangre del cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo y tumores.

CÉLULAS T

E n u n a re a liz a c ió n , la s c é lu la s so n c é lu la s T . S e p u e d e n u s a r la s lín e a s d e c é lu la s T d is p o n ib le s e n la té c n ic a . E n las re a liz a c io n e s , la s c é lu la s T se p u e d e n o b te n e r d e u n a u n id a d d e s a n g re e x tra íd a d e un s u je to u s a n d o c u a lq u ie r n ú m e ro d e té c n ic a s c o n o c id a s p o r e l e x p e rto en la m a te r ia , c o m o la s e p a ra c ió n F ic o ll™ . E n un a s p e c to , la s c é lu la s d e la c irc u la c ió n s a n g u ín e a d e un in d iv id u o se o b t ie n e n p o r a fé re s is . E l p ro d u c to d e a fé re s is n o rm a lm e n te c o n t ie n e lin fo c ito s , in c lu id a s c é lu la s T , m o n o c ito s , g ra n u lo c ito s , c é lu la s B, o tro s g ló b u lo s b la n c o s n u c le a d o s , g ló b u lo s ro jo s y p la q u e ta s . E n un a s p e c to , la s c é lu la s re c o le c ta d a s p o r a fé re s is p u e d e n la v a rs e p a ra e l im in a r la f ra c c ió n d e l p la s m a y, o p c io n a lm e n te , c o lo c a r la s c é lu la s en un ta m p ó n o m e d io a p ro p ia d o p a ra la s e ta p a s d e p ro c e s a m ie n to p o s te r io re s . E n u n a re a liz a c ió n , la s c é lu la s se la v a n co n s o lu c ió n s a lin a ta m p o n a d a co n fo s fa to (P B S ). E n u n a re a liz a c ió n a lte rn a t iv a , la s o lu c ió n d e l la v a d o c a re c e d e c a lc io y p u e d e c a re c e r d e m a g n e s io y p u e d e c a re c e r d e m u c h o s , s i n o to d o s lo s c a t io n e s d iv a le n te s .

L a s e ta p a s d e a c t iv a c ió n in ic ia l en a u s e n c ia d e c a lc io p u e d e n c o n d u c ir a u n a a c t iv a c ió n m a g n if ic a d a . C o m o lo s e x p e r to s en la m a te r ia e n te n d e rá n fá c ilm e n te , u n a e ta p a d e la v a d o se p u e d e re a liz a r m e d ia n te p ro c e d im ie n to s c o n o c id o s p o r lo s e x p e r to s en la té c n ic a , ta l c o m o m e d ia n te e l u s o d e u n a c e n tr í fu g a d e f lu jo c o n t in u o s e m ia u to m a tiz a d a (p o r e je m p lo , e l p ro c e s a d o r d e c é lu la s C o b e 2991 , e l B a x te r C y to M a te o e l H a e m o n e t ic s C e ll S a v e r 5 ) d e a c u e rd o c o n la s in s t ru c c io n e s d e l fa b r ic a n te . D e s p u é s d e l la v a d o , la s c é lu la s p u e d e n re s u s p e n d e rs e en u n a v a r ie d a d d e ta m p o n e s b io c o m p a t ib le s , ta le s c o m o , p o r e je m p lo , P B S s in C a , P B s s in M g , P la s m a L y te A u o tra s o lu c ió n s a lin a co n o s in ta m p ó n . A lte rn a tiv a m e n te , lo s c o m p o n e n te s in d e s e a b le s d e la m u e s tra d e a fé re s is se p u e d e n e lim in a r y la s c é lu la s se re s u s p e n d e n d ire c ta m e n te e n m e d io d e c u lt iv o .

E n un a s p e c to , la s c é lu la s T se a ís la n d e lin fo c ito s d e s a n g re p e r ifé r ic a m e d ia n te e l l is a d o d e g ló b u lo s ro jo s y a g o ta m ie n to d e lo s m o n o c ito s , p o r e je m p lo , m e d ia n te c e n tr ifu g a c ió n a t ra v é s d e un g ra d ie n te P E R C O L L ™ o m e d ia n te e lu tr ia c ió n p o r c e n tr ifu g a c ió n a c o n tra f lu jo .

L o s p ro c e d im ie n to s d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to p u e d e n in c lu ir , p o r e je m p lo , la s e le c c ió n d e u n a s u b p o b la c ió n e s p e c íf ic a d e c é lu la s e fe c to ra s in m u n e s , p o r e je m p lo , c é lu la s T , q u e s o n u n a p o b la c ió n co n d e p le c ió n d e c é lu la s T re g u la d o ra s , c é lu la s a g o ta d a s C D 25 , u s a n d o , p o r e je m p lo , u n a té c n ic a d e s e le c c ió n n e g a tiv a , p o r e je m p lo , d e s c r ita en e s te d o c u m e n to . P re fe r ib le m e n te , la p o b la c ió n d e c é lu la s T re g u la d o ra s a g o ta d a s c o n t ie n e m e n o s d e l 30 % , 25 % , 20 % , 15 % , 10 % , 5 % , 4 % , 3 % , 2 % , 1 % d e c é lu la s C D 25 .

E n u n a re a liz a c ió n , la s c é lu la s T re g u la d o ra s , p o r e je m p lo , c é lu la s T C D 25 , se e lim in a n d e la p o b la c ió n u s a n d o un a n t ic u e rp o a n ti-C 25 , o un f ra g m e n to d e l m is m o , o un lig a n d o d e u n ió n a C D 25 , IL -2. E n u n a re a liz a c ió n , e l a n t ic u e rp o a n t i-C D 25 , o f ra g m e n to d e l m is m o , o lig a n d o d e u n ió n a C D 25 s e c o n ju g a c o n un s u s tra to , p o r e je m p lo , u n a p e rla , o s e re c u b re d e o tro m o d o s o b re un s u s tra to , p o r e je m p lo , u n a p e rla . E n u n a re a liz a c ió n , e l a n t ic u e rp o a n t i-C D 25 , o un f ra g m e n to d e l m is m o , s e c o n ju g a co n un s u s tra to c o m o s e d e s c r ib e e n e l p re s e n te d o c u m e n to .

E n u n a re a liz a c ió n , la s c é lu la s T re g u la d o ra s , p o r e je m p lo , c é lu la s T C D 25 , se e lim in a n d e la p o b la c ió n u s a n d o re a c t iv o d e a g o ta m ie n to d e C D 25 d e M ilite n y i™ . E n u n a re a liz a c ió n , la p ro p o rc ió n d e c é lu la s co n re s p e c to a re a c tiv o d e a g o ta m ie n to d e C D 25 e s d e 1 e 7 c é lu la s a 20 uL , o d e 1 e 7 c é lu la s a 15 uL, o d e 1 e 7 c é lu la s a 10 uL, o d e 1e7 c é lu la s a 5 uL , o d e 1 e 7 c é lu la s a 2 ,5 uL , o d e 1 e 7 c é lu la s a 1 ,25 uL.

E n u n a re a liz a c ió n , la p o b la c ió n d e c é lu la s e fe c to ra s in m u n e s a a g o ta rs e in c lu y e a lre d e d o r d e 6 x 109 c é lu la s T C D 25 . E n o tro s a s p e c to s , la p o b la c ió n d e c é lu la s e fe c to ra s in m u n e s a a g o ta rs e in c lu y e d e a p ro x im a d a m e n te 1 x 109 a 1 x 1010 d e c é lu la s T C D 25 , y c u a lq u ie r v a lo r e n te ro en e l m e d io . E n u n a re a liz a c ió n , la p o b la c ió n re s u lta n te d e c é lu la s a g o ta d a s re g u la d o ra s t ie n e 2 x 109 d e c é lu la s T re g u la d o ra s , p o r e je m p lo , c é lu la s C D 25 , o m e n o s (p o r e je m p lo , 1 x 109 , 5 x 108 , 1 x 108 , 5 x 107 , 1 x 107 o m e n o s c é lu la s C D 25 ).

E n u n a re a liz a c ió n , la s c é lu la s T re g u la d o ra s , p o r e je m p lo , la s c é lu la s C D 25 , s e e lim in a n d e la p o b la c ió n u s a n d o el s is te m a C lin iM A C c o n un c o n ju n to d e tu b o s d e a g o ta m ie n to , c o m o , p o r e je m p lo , e l tu b o 162 -01. E n u n a re a liz a c ió n , e l s is te m a C lin iM A C s e e je c u ta e n u n a c o n f ig u ra c ió n d e a g o ta m ie n to , ta l c o m o , p o r e je m p lo , D E P L E T IO N 2.1.

L o s p ro c e d im ie n to s d e s c r ito s e n e l p re s e n te d o c u m e n to p u e d e n in c lu ir m á s d e u n a e ta p a d e s e le c c ió n , p o r e je m p lo , m á s d e u n a e ta p a d e d e p le c ió n . E l e n r iq u e c im ie n to d e u n a p o b la c ió n d e c é lu la s T m e d ia n te s e le c c ió n n e g a t iv a se p u e d e lo g ra r , p o r e je m p lo , c o n u n a c o m b in a c ió n d e a n t ic u e rp o s d ir ig id o s a m a rc a d o re s d e s u p e r f ic ie ú n ic o s p a ra las c é lu la s s e le c c io n a d a s n e g a t iv a m e n te . U n p ro c e d im ie n to e s la c la s if ic a c ió n c e lu la r y /o s e le c c ió n d e c é lu la s m e d ia n te in m u n o a d h e re n c ia m a g n é t ic a n e g a t iv a o c ito m e tr ía d e f lu jo q u e u s a un c ó c te l d e a n t ic u e rp o s m o n o c lo n a le s d ir ig id o s a m a rc a d o re s d e s u p e r f ic ie c e lu la r p re s e n te s en la s c é lu la s s e le c c io n a d a s n e g a t iv a m e n te . P o r e je m p lo , p a ra e n r iq u e c e r la s c é lu la s C D 4 m e d ia n te s e le c c ió n n e g a tiv a , un c ó c te l d e a n t ic u e rp o s m o n o c lo n a le s p u e d e in c lu ir a n t ic u e rp o s c o n tra C D 14 , C D 20 , C D 11 b , C D 16 , H L A -D R y C D 8.

L o s p ro c e d im ie n to s d e s c r ito s en e s te d o c u m e n to p u e d e n in c lu ir a d e m á s la e lim in a c ió n d e c é lu la s d e la p o b la c ió n q u e e x p re s a n un a n tíg e n o tu m o ra l, p o r e je m p lo , un a n tíg e n o tu m o ra l q u e no c o m p re n d e C D 25 , p o r e je m p lo , C D 19 , C D 30 , C D 38 , C D 123 , C D 20 , C D 14 o C D 11 b , p a ra p ro p o rc io n a r a s í u n a p o b la c ió n d e c é lu la s T re g u la d o ra s agotadas, por ejemplo, CD25+ agotadas, y las células con depleción de antígeno tumoral que son adecuadas para la expresión de un CAR, por ejemplo, un CAR descrito en el presente documento. En una realización, las células que expresan el antígeno tumoral se eliminan simultáneamente con las células T reguladoras, por ejemplo, células CD25 . Por ejemplo, un anticuerpo anti-C25, o fragmento del mismo, y un anticuerpo de antígeno antitumoral, o fragmento del mismo, puede unirse al mismo sustrato, por ejemplo, perla que puede usarse para eliminar las células, o un anticuerpo anti-CD25, o un fragmento del mismo, y el anticuerpo de antígeno antitumoral, o un fragmento del mismo, puede unirse a perlas separadas, una mezcla de las que se puede utilizar para eliminar las células. En otras realizaciones, la eliminación de células T reguladoras, por ejemplo, células CD25+, y la eliminación de las células que expresan el antígeno tumoral es secuencial, y puede ocurrir, por ejemplo, en cualquier orden.

También se proporcionan procedimientos que incluyen la eliminación de células de la población que expresan un inhibidor de punto de control, por ejemplo, un inhibidor de puntos de control descrito en este documento, por ejemplo, uno o más de células PD1+, células LAG3+ y células TIM3+, para así proporcionar una población de células T reguladoras con depleción, por ejemplo, y células con depleción CD25+, células con depleción de inhibidor de puntos de control, por ejemplo, células con depleción en PD1+, LAG3+ y/o TIM3+. Los inhibidores de puntos de control ejemplares incluyen B7-H1, B&-1, CD160, P1H, 2B4, PD1, TI^m3, CEACAM (por ejemplo, ^cE^aCAM-1, CEACAM-3 y/o CEACa M-5), LAG3, TIGIT, CTLA-4, BTLA y LAIR1. En una realización, las células que expresan el inhibidor de punto de control se eliminan simultáneamente con las células T reguladoras, por ejemplo, células CD25 . Por ejemplo, un anticuerpo anti-C25, o un fragmento del mismo, y un anticuerpo inhibidor anti-punto de control, o un fragmento del mismo, puede unirse a la misma perla que puede usarse para eliminar las células, o un anticuerpo anti-CD25, o un fragmento del mismo, y el anticuerpo inhibidor de anti-punto de control, o un fragmento del mismo, puede unirse a perlas separadas, una mezcla de que se puede utilizar para eliminar las células. En otras realizaciones, la eliminación de células T reguladoras, por ejemplo, células CD25+, y la eliminación de las células que expresan el inhibidor de punto de control es secuencial, y puede ocurrir, por ejemplo, en cualquier orden.

Los procedimientos descritos en este documento pueden incluir una etapa de selección positiva. Por ejemplo, las células T se pueden aislar mediante incubación con perlas conjugadas anti-CD3/anti-CD28 (por ejemplo, 3x28), como DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T, durante un período de tiempo suficiente para la selección positiva de las células T deseadas. En una realización, el período de tiempo es de aproximadamente 30 minutos. En una realización adicional, el período de tiempo varía de 30 minutos a 36 horas o más y todos los valores enteros entre ellos. En una realización adicional, el período de tiempo es de al menos 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 horas. En otra realización más, el período de tiempo es de 10 a 24 horas, por ejemplo, 24 horas. Se pueden usar tiempos de incubación más largos para aislar las células T en cualquier situación, donde haya pocas células T en comparación con otros tipos de células, como en el aislamiento de linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) de tejido tumoral o de individuos inmunodeprimidos. Además, el uso de tiempos de incubación más prolongados puede aumentar la eficiencia de captura de células T CD8+. Por lo tanto, simplemente acortando o alargando el tiempo que permite que las células T se unan a las perlas CD3/CD28 y/o aumentando o disminuyendo la proporción de perlas a células T (como se describe más adelante en este documento), se puede seleccionar preferentemente subpoblaciones de células T a favor o en contra al inicio del cultivo o en otros momentos durante el proceso. Adicionalmente, aumentando o disminuyendo la proporción de anticuerpos anti-CD3 y/o anti-CD28 en las perlas u otra superficie, se puede seleccionar preferentemente subpoblaciones de células T a favor o en contra al inicio del cultivo o en otros puntos de tiempo deseados.

En una realización, se puede seleccionar una población de células T que expresa uno o más de IFN-y, TNFa, IL-17A, IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-13, granzima B, y perforina, u otras moléculas apropiadas, por ejemplo, otras citocinas. Los procedimientos para el cribado de la expresión celular se pueden determinar, por ejemplo, mediante los procedimientos descritos en la publicación PCT número: WO 2013/126712.

Para el aislamiento de una población deseada de células mediante selección positiva o negativa, se puede variar la concentración de las células y la superficie (por ejemplo, partículas tales como perlas). En ciertos aspectos, puede ser deseable disminuir significativamente el volumen en el que se mezclan juntas las perlas y las células (por ejemplo, aumentar la concentración de células), para asegurar el máximo contacto de las células y las perlas. Por ejemplo, en un aspecto, se usa una concentración de 10 mil millones de células/ml, 9 mil millones/ml, 8 mil millones/ml, 7 mil millone/ml, 6 mil millones/ml o 5 mil millones/ml. En un aspecto, se usa una concentración de mil millones de células/ml. En un aspecto más, se usa una concentración de células de 75, 80, 85, 90, 95 ó 100 millones de células/ml. En otros aspectos, se puede usar concentraciones de 125 ó 150 millones de células/ml.

El uso de concentraciones altas puede dar como resultado un incremento en la producción de células, la activación celular y la expresión celular. Además, el uso de altas concentraciones de células permite una captura más eficiente de células que pueden expresar débilmente los antígenos diana de interés, tales como las células T CD28 negativas, o de muestras donde hay muchas células tumorales presentes (por ejemplo, sangre leucémica, tejido tumoral, etc.). Tales poblaciones de células pueden tener un valor terapéutico y sería deseable obtenerlas. Por ejemplo, el uso de una alta concentración de células permite una selección más eficiente de células T CD8+ que normalmente tienen una expresión de CD28 más débil.

E n un a s p e c to re la c io n a d o , p u e d e s e r d e s e a b le u t i l iz a r c o n c e n tra c io n e s m á s b a ja s d e c é lu la s . D ilu y e n d o s ig n if ic a t iv a m e n te la m e z c la d e c é lu la s T y la s u p e r f ic ie (p o r e je m p lo , p a r tíc u la s c o m o p e r la s ) , se m in im iz a n las in te ra c c io n e s e n tre la s p a r t íc u la s y la s c é lu la s . E s to s e le c c io n a la s c é lu la s q u e e x p re s a n g ra n d e s c a n t id a d e s d e a n tíg e n o s d e s e a d o s p a ra u n irs e a la s p a r tíc u la s . P o r e je m p lo , la s c é lu la s T C D 4 e x p re s a n n iv e le s m á s a lto s d e C D 28 y se c a p tu ra n d e m a n e ra m á s e f ic ie n te q u e la s c é lu la s T C D 8 e n c o n c e n tra c io n e s d ilu id a s . E n un a s p e c to , la c o n c e n tra c ió n d e c é lu la s u t i l iz a d a e s d e 5 x 106/m l. E n o tro s a s p e c to s , la c o n c e n tra c ió n u t il iz a d a p u e d e s e r d e a p ro x im a d a m e n te 1 x 105/m l a 1 x 106/m l, y c u a lq u ie r v a lo r e n te ro in te rm e d io .

E n o tro s a s p e c to s , la s c é lu la s p u e d e n in c u b a rs e en un ro ta d o r d u ra n te p e río d o s d e t ie m p o v a r ia b le s a v e lo c id a d e s v a r ia b le s a 2 -10 °C o a te m p e ra tu ra a m b ie n te .

L a s c é lu la s T p a ra la e s t im u la c ió n ta m b ié n p u e d e n c o n g e la rs e d e s p u é s d e un p a s o d e la v a d o . S e d e s e a no c e ñ irs e a la te o r ía , la e ta p a d e c o n g e la c ió n y d e s c o n g e la c ió n p o s te r io r p ro p o rc io n a un p ro d u c to m á s u n ifo rm e a l e l im in a r los g ra n u lo c ito s y, h a s ta c ie r to p u n to , lo s m o n o c ito s d e la p o b la c ió n c e lu la r . D e s p u é s d e la e ta p a d e la v a d o q u e e lim in a e l p lá s m id o y la s p la q u e ta s , la s c é lu la s p u e d e n s u s p e n d e rs e en u n a s o lu c ió n c o n g e la d a . M ie n tra s se c o n o c e n en la té c n ic a m u c h a s s o lu c io n e s c o n g e la d a s y p a rá m e tro s s e rá ú til en en e s te c o n te x to , un p ro c e d im ie n to im p lic a e l u so d e P B S q u e c o n t ie n e 20 % d e D M S O y 8 % d e a lb ú m in a d e s u e ro h u m a n o , o m e d io d e c u lt iv o q u e c o n t ie n e 10 % de D e x tra n o 40 y 5 % d e D e x tro s a , 20 % d e A lb ú m in a d e s u e ro h u m a n o y 7 ,5 % d e D M S O , o 31 ,25 % d e P la s m a ly te -A , 31 ,25 % d e d e x tro s a a l 5 % , 0 ,45 % d e N a C l, 10 % d e d e x tra n o 40 y 5 % d e d e x tro s a , 20 % d e a lb ú m in a d e s u e ro h u m a n o y 7 ,5 % d e D M S O u o tro m e d io d e c o n g e la c ió n c e lu la r a d e c u a d o q u e c o n tie n e , p o r e je m p lo , H e s p a n y P la s m a L y te A , la s c é lu la s s e c o n g e la n a c o n t in u a c ió n a -80 °C a u n a v e lo c id a d d e 1° p o r m in u to y se a lm a c e n a n en la fa s e d e v a p o r d e un ta n q u e d e a lm a c e n a m ie n to d e n itró g e n o líq u id o . S e p u e d e n u t il iz a r o tro s p ro c e d im ie n to s d e c o n g e la c ió n c o n tro la d a , a s í c o m o la c o n g e la c ió n d e s c o n tro la d a in m e d ia ta m e n te a -20 ° C o e n n it ró g e n o líq u id o .

E n c ie r to s a s p e c to s , la s c é lu la s c r io c o n s e rv a d a s se d e s c o n g e la n y se la v a n c o m o se d e s c r ib e en e l p re s e n te d o c u m e n to y se d e ja n re p o s a r d u ra n te u n a h o ra a te m p e ra tu ra a m b ie n te a n te s d e la a c t iv a c ió n u s a n d o lo s p ro c e d im ie n to s d e la p re s e n te in v e n c ió n .

T a m b ié n s e c o n te m p la en e l c o n te x to d e la in v e n c ió n la re c o g id a d e m u e s tra s d e s a n g re o p ro d u c to d e a fé re s is d e un s u je to en un p e río d o d e t ie m p o a n te s d e q u e la s c é lu la s e x p a n d id a s p o d ría n s e r n e c e s a r ia s c o m o se d e s c r ib e n en e s te d o c u m e n to . C o m o ta l, la fu e n te d e la s c é lu la s q u e se v a n a e x p a n d ir se p u e d e re c o le c ta r en c u a lq u ie r m o m e n to n e c e s a r io , y la s c é lu la s d e s e a d a s , c o m o c é lu la s T , a is la d a s y c o n g e la d a s p a ra su u so p o s te r io r en la te ra p ia d e c é lu la s e fe c to ra s in m u n e s p a ra c u a lq u ie r n ú m e ro d e e n fe rm e d a d e s o c o n d ic io n e s q u e s e b e n e f ic ia r ía n d e la te ra p ia c o n c é lu la s e fe c to ra s in m u n e s , ta le s c o m o la s d e s c r ita s en e s te d o c u m e n to . E n un a s p e c to , s e to m a u n a m u e s tra d e s a n g re o u n a a fé re s is d e un s u je to g e n e ra lm e n te s a n o . E n c ie r to s a s p e c to s , se to m a u n a m u e s tra d e s a n g re o u n a a fé re s is d e un s u je to g e n e ra lm e n te s a n o q u e e s tá en r ie s g o d e d e s a r ro l la r u n a e n fe rm e d a d , p e ro q u e a ú n no la ha d e s a rro lla d o , y la s c é lu la s d e in te ré s se a ís la n y c o n g e la n p a ra su u so p o s te r io r . E n c ie r to s a s p e c to s , la s c é lu la s T p u e d e n e x p a n d irs e , c o n g e la rs e y u s a rs e en un m o m e n to p o s te r io r . E n c ie r to s a s p e c to s , la s m u e s tra s se re c o g e n d e un p a c ie n te p o c o d e s p u é s d e l d ia g n ó s t ic o d e u n a e n fe rm e d a d p a r t ic u la r c o m o se d e s c r ib e en e s te d o c u m e n to p e ro a n te s d e c u a lq u ie r t ra ta m ie n to . E n un a s p e c to a d ic io n a l, la s c é lu la s se a ís la n d e u n a m u e s tra d e s a n g re o u n a a fé re s is d e un s u je to a n te s d e c u a lq u ie r n ú m e ro d e m o d a lid a d e s d e tra ta m ie n to s re le v a n te s , q u e in c lu y e n p e ro no se lim ita n a l t ra ta m ie n to co n a g e n te s c o m o n a ta l iz u m a b , e fa liz u m a b , a g e n te s a n tiv ira le s , q u im io te ra p ia , ra d ia c ió n , a g e n te s in m u n o s u p re s o re s , c o m o c ic lo s p o r in a , a z a t io p r in a , m e to tre x a to , m ic o fe n o la to y F K 506 , a n t ic u e rp o s u o tro s a g e n te s in m u n o a b la t iv o s c o m o C A M P A T H , a n t ic u e rp o s a n ti-C D 3 , c ito x a n o , f lu d a ra b in a , c ic lo s p o r in a , F K 506 , ra p a m ic in a , á c id o m ic o fe n ó lic o , e s te ro id e s , F R 901228 e ir ra d ia c ió n .

E n un a s p e c to a d ic io n a l d e la p re s e n te in v e n c ió n , la s c é lu la s T s e o b t ie n e n d e un p a c ie n te d ire c ta m e n te d e s p u é s d e l t ra ta m ie n to q u e d e ja a l s u je to co n c é lu la s T fu n c io n a le s . En e s te s e n tid o , se h a o b s e rv a d o q u e tra s d e te rm in a d o s tra ta m ie n to s d e c á n c e r, en p a r t ic u la r t ra ta m ie n to s co n fá rm a c o s q u e d a ñ a n el s is te m a in m u n o ló g ic o , p o c o d e s p u é s d e l t ra ta m ie n to d u ra n te e l p e r ío d o en e l q u e lo s p a c ie n te s n o rm a lm e n te se e s ta r ía n re c u p e ra n d o d e l t ra ta m ie n to , la c a lid a d d e la s c é lu la s T o b te n id a s p u e d e s e r ó p t im a o m e jo ra d a p o r su c a p a c id a d p a ra e x p a n d irs e e x v iv o . A s im is m o , d e s p u é s d e la m a n ip u la c ió n e x v iv o u s a n d o lo s p ro c e d im ie n to s d e s c r ito s e n e l p re s e n te d o c u m e n to , e s ta s c é lu la s p u e d e n e s ta r en un e s ta d o p re fe r id o p a ra un in je r to m e jo ra d o y u n a e x p a n s ió n in v iv o . P o r c o n s ig u ie n te , se c o n te m p la d e n tro d e l c o n te x to d e la p re s e n te in v e n c ió n re c o le c ta r c é lu la s s a n g u ín e a s , in c lu y e n d o c é lu la s T, c é lu la s d e n d r í t ic a s u o tra s c é lu la s d e l lin a je h e m a to p o y é tic o , d u ra n te e s ta fa s e d e re c u p e ra c ió n . A d e m á s , en c ie r to s a s p e c to s , la m o v iliz a c ió n (p o r e je m p lo , m o v iliz a c ió n co n G M -C S F ) y lo s re g ím e n e s d e a c o n d ic io n a m ie n to p u e d e n u s a rs e p a ra c re a r u n a c o n d ic ió n en un s u je to en la q u e se fa v o re c e la re p o b la c ió n , la re c irc u la c ió n , la re g e n e ra c ió n y /o la e x p a n s ió n d e t ip o s d e c é lu la s p a r t ic u la re s , e s p e c ia lm e n te d u ra n te u n a v e n ta n a d e t ie m p o d e f in id a d e s p u é s d e la te ra p ia . L o s t ip o s d e c é lu la s i lu s tra t iv o s in c lu y e n c é lu la s T , c é lu la s B, c é lu la s d e n d r í t ic a s y o tra s c é lu la s d e l s is te m a in m u n o ló g ic o .

E n un c a s o , la s c é lu la s e fe c to ra s in m u n e s q u e e x p re s a n u n a m o lé c u la C A R , p o r e je m p lo , u n a m o lé c u la C A R d e s c r ita en e l p re s e n te d o c u m e n to , p o r e je m p lo , un R C A R , R N K R -C A R o N K R -C A R d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to , se o b tie n e n d e un s u je to q u e ha re c ib id o u n a d o s is b a ja , q u e a u m e n ta la in m u n id a d , d e un in h ib id o r de m T O R . E n un c a s o , la p o b la c ió n d e c é lu la s e fe c to ra s in m u n e s , p o r e je m p lo , c é lu la s T , q u e se v a n a d is e ñ a r p a ra expresar un CAR, por ejemplo, un RCAR, RNKR-CAR o NKR-CAR, se recolecta después de un tiempo suficiente o después de una dosis suficiente de la dosis baja, que aumenta la inmunidad, de un inhibidor de mTOR, de tal manera que el nivel de células efectoras inmunes negativas de PD1, por ejemplo, células T, o la proporción de células efectoras inmunes negativas de PD1, por ejemplo, células T/células efectoras inmunes positivas de PD1, por ejemplo, células T, en el sujeto o recolectadas del sujeto, se han incrementado, al menos transitoriamente.

En otros casos, la población de células efectoras inmunes, por ejemplo, células T, que tienen, o serán modificadas para expresar un CAR, por ejemplo, un RCAR, RNKR-CAR o NKR-CAR, pueden tratarse ex vivo por contacto con una cantidad de un inhibidor de mTOR que aumenta el número de células efectoras inmunes negativas para PD1, por ejemplo, células T o aumenta la proporción de células efectoras inmunes negativas para PD1, por ejemplo, células T/células efectoras inmunes positivas para PD1, por ejemplo, células T.

En una realización, una población de células T es deficiente en diacilglicerol quinasa (DGK). Las células deficientes en DGK incluyen células que no expresan ARN o proteína de DGK, o que tienen una actividad de DGK reducida o inhibida. Las células deficientes en DGK pueden generarse mediante enfoques genéticos, por ejemplo, administrando agentes que interfieren con ARN, por ejemplo, siARN, shARN, miARN, para reducir o prevenir la expresión de DGK. Alternativamente, se pueden generar células deficientes en DGK mediante el tratamiento con inhibidores de DGK descritos en el presente documento.

En una realización, una población de células T es deficiente en Ikaros. Las células deficientes en Ikaros incluyen células que no expresan ARN o proteína de Ikaros, o que tienen actividad reducida o inhibida de Ikaros, las células deficientes en Ikaros pueden generarse mediante enfoques genéticos, por ejemplo, administrando agentes que interfieren con ARN, por ejemplo, siARN, shARN, miARN, para reducir o prevenir la expresión de Ikaros. Alternativamente, las células deficientes en Ikaros se pueden generar mediante tratamiento con inhibidores de Ikaros, por ejemplo, lenalidomida.

En las realizaciones, una población de células T es deficiente en DGK y deficiente en Ikaros, por ejemplo, no expresa DGK e Ikaros, o tiene actividad reducida o inhibida de DGK e Ikaros. Tales células deficientes en DGK e Ikaros pueden generarse mediante cualquiera de los procedimientos descritos en este documento.

CÉLULAS NK

En una realización, las células son células asesinas naturales. Estas células se pueden aislar de los pacientes. En una realización, las células son líneas celulares estables de células asesinas naturales, por ejemplo, una línea celular NK-92 alogénica estable disponible en Conkwest. Estas líneas de células NK-92 estables se derivaron de las células NK-92 que se obtuvieron, transfectaron y cultivaron usando los procedimientos descritos por Gong et al (Abril de 1994), Leukemia Macmillan Press, Ltd, 8: 652-658, y descritos en EP1007630. También se puede utilizar una línea celular NK con propiedades similares a la línea celular NK-92. En una realización, las células NK de circulación sanguínea de un individuo se obtienen por aféresis. En una realización, las células NK están diseñadas para expresar un RNKR-CAR o un RCAR en combinación con un NKR-CAR (por ejemplo, inhNKR-CAR), y estas células RNKR-CARN o RCAR/NKR-CARN diseñados pueden usarse para tratar a un paciente que no sea un paciente del que se aislaron las células NK. Por tanto, estas células RNKR-CARN o RCAR/NKR-CARN son células "universales" que se pueden administrar a múltiples pacientes sin efectos adversos. Es decir, las células NK pueden aislarse de un paciente y diseñarse para expresar Rn KR-CAR o RCAR NKR-CAR, produciendo así las células RNKR-CARN o RCAR/NKR-CARN, respectivamente, y estas células RNKR-CARN o ^rC^aR/NKR-CARN se pueden administrar al mismo paciente o a un paciente diferente. Las células NK, por ejemplo, células NK-92, no expresan receptores inhibidores asesinos y, por lo tanto, no pueden desactivarse evadiendo las células cancerosas. Se han descrito los procedimientos para el aislamiento y el uso de las células NK (por ejemplo, líneas celulares NK-92 o líneas celulares NK similares derivadas de las células mononucleares de la sangre periférica de un paciente con linfoma de no Hodgkins) (Ver Zhang et al (2013) NK-92 de reorientación para la actividad de anti-melanoma por un anticuerpo de dominio único similar a TCR; Immunol Cell Biol.91: 615-624; Tonn et al. (2013) El tratamiento de los pacientes con cáncer avanzado con las líneas celulares asesinas naturales NK-92 Citoterapia, 15: 1563-1570.

Se encontró que la línea celular NK-92 exhibía los marcadores de superficie CD56alto, CD2, CD7, CD1 la, CD28, CD45 y CD54. Además, no muestra los marcadores CD1, CD3, CD4, CD5, CD8, CD10, CD14, CD 16, CD19, CD20, CD23 y CD34. El crecimiento de células NK-92 en cultivo es dependiente de la presencia de interleucina 2 recombinante (rIL-2), siendo suficiente una dosis tan baja como 10 UI/ml para mantener la proliferación. También se puede utilizar líneas celulares NK con propiedades similares.

Las células NK-92 se mantienen fácilmente en un medio de cultivo, tal como un medio esencial mínimo alfa enriquecido (MEM, Sigma Chemical Co. St Louis, MO) complementado con suero de ternero fetal (por ejemplo, al 12,5%, Sigma Chemical Co., St Louis, MO) y suero de caballo (por ejemplo, al 12,5%, (Sigma Chemical Co., St Louis, MO). Inicialmente, se requiere hidrocortisona 10 M, pero con el avance se encuentra que se puede omitir la hidrocortisona. Además, la IL-2, tal como la IL-2 humana recombinante (500 U/mL, Chiron, Emeryville, CA), es necesaria para el crecimiento a largo plazo. Cuando los cultivos en suspensión se mantienen de esta manera con cambios bisemanales de medio, las células exhiben un tiempo de duplicación de aproximadamente 24 h.

Las células NK-92 in vitro demuestran actividad lítica contra una amplia gama de células diana malignas. Éstas incluyen líneas celulares derivadas de células diana circulantes, tales como leucemia linfoblástica y mielógena aguda y crónica, linfoma, mieloma, melanoma, así como células de tumores sólidos, tales como líneas celulares de cáncer de próstata, neuroblastoma y cáncer de mama.

OTRAS CÉLULAS EFECTORAS INMUNES

En otro caso, cualquier número de células efectoras inmunes puede aislarse y diseñarse para expresar un RNKR-CAR o un RCAR en combinación con un NKR-CAR (por ejemplo, inhNKR-CAR), por ejemplo, células B, mastocitos., fagocitos derivados de mieloides, células NKT o células yST. En la Figura 8 se enumeran ejemplos de células efectoras inmunes.

CAR ALOGÉNICO

En las realizaciones descritas en el presente documento, la célula efectora inmune puede ser una célula efectora inmune alogénica, por ejemplo, célula T o célula NK. Por ejemplo, la célula puede ser una célula T alogénica, por ejemplo, una célula T alogénica que carece de expresión de un receptor de células T funcional (TCR) y/o antígeno leucocitario humano (HLA), por ejemplo, HLA de clase I y/o HLA de clase II.

Una célula T que carece de un TCR funcional puede, por ejemplo, modificarse de tal manera que no exprese ningún TCR funcional en su superficie, modificarse de tal manera que no exprese una o más subunidades que comprenden un TCR funcional o modificarse de tal manera que produzca muy poco TCR funcional en su superficie. Alternativamente, la célula T puede expresar un TCR sustancialmente alterado, por ejemplo, mediante la expresión de formas mutadas o truncadas de una o más de las subunidades del TCR. El término "TCR sustancialmente alterado" significa que este TCR no provocará una reacción inmune adversa en un huésped.

Una célula T descrita en el presente documento puede, por ejemplo, modificarse de tal modo que no exprese un HLA funcional en su superficie. Por ejemplo, una célula T descrita en el presente documento puede modificarse de modo que la expresión de HLA en la superficie celular, por ejemplo, HLA de clase 1 y/o HLA de clase II, se regule por disminución.

En algunas realizaciones, la célula T puede carecer de un TCR funcional y un HLA funcional, por ejemplo, HLA de clase I y/o HLA de clase II.

Las células T modificadas que carecen de expresión de un TCR y/o HLA funcionales pueden obtenerse por cualquier medio adecuado, que incluye la desactivación o la desactivación de una o más subunidades de TCR o HLA. Por ejemplo, la célula T puede incluir una desactivación de TCR y/o HLA usando siARN, shARN, repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR), nucleasa efectora similar a activador de la transcripción (TALEN) o endonucleasa de dedo de zinc (ZFN). En algunas realizaciones, la célula alogénica puede ser una célula que no expresa o expresa en niveles bajos una molécula inhibidora, por ejemplo, mediante cualquier procedimiento descrito en el presente documento. Por ejemplo, la célula puede ser una célula que no expresa o expresa a niveles bajos una molécula inhibidora, por ejemplo, que puede disminuir la capacidad de una célula que expresa CAR para montar una respuesta efectora inmunitaria. Los ejemplos de moléculas inhibidoras incluyen PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 y TGFR beta. La inhibición de una molécula inhibidora, por ejemplo, por inhibición a nivel de ADN, ARN o proteína, puede optimizar el rendimiento de una célula que expresa CAR. En las realizaciones, se puede usar un ácido nucleico inhibidor, por ejemplo, un ácido nucleico inhibidor, por ejemplo, un dsARN, por ejemplo, un siARN o shARN, las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR), una nucleasa efectora similar a activador de la transcripción (TALEN), o una endonucleasa de dedo de zinc (ZFN), por ejemplo, tal como se describe en el presente documento.

siARN y shARN para inhibir TCR o HLA

En algunas realizaciones, la expresión de TCR y/o la expresión de HLA se puede inhibir usando siARN o shARN que reconoce un ácido nucleico que codifica un TCR y/o HLA en una célula T.

La expresión de siARN y de shARN en las células T se puede conseguir usando cualquier sistema de expresión convencional, por ejemplo, tal como un sistema de exprensión lentiviral.

Los ejemplos de shARNs que regulan por disminución la expresión de componentes del TCR se describen, por ejemplo, en la publicación de EE.UU No: 2012/0321667. Los ejemplos de siARN y shARN que regulan por disminución la expresión de genes de HLA de clase I y/o HLA de clase II se describen, por ejemplo, en la publicación de EE.UU número: US 2007/0036773.

CRISPR para inhibir TCR o HLA

"CRISPR" o "CRISPR a TCR y/o HLA" o "CRISPR para inhibir TCR y/o HLA", tal como se usa en este documento, se refiere a un conjunto de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas, o un sistema que comprende tal conjunto de repeticiones. "Cas", como se usa en este documento, se refiere a una proteína asociada a CRISPR. Un sistema "CRISPR/Cas" se refiere a un sistema derivado de CRISPR y Cas que se puede usar para silenciar o mutar un gen de TCR y/o HLA.

Los sistemas CRISPR/Cas de origen natural se encuentran en aproximadamente el 40% de los genomas de eubacterias secuenciadas y el 90% de las arqueas secuenciadas. Grissa et al. (2007) BMC Bioinformatics 8: 172. Este sistema es un tipo de sistema inmunológico procariota que confiere resistencia a elementos genéticos extraños tales como plásmidos y fagos y proporciona una forma de inmunidad adquirida. Barrangou et al. (2007) Science 315: 1709-1712; Marragini et al. (2008) Science 322: 1843-1845.

El sistema CRISPR/Cas se ha modificado para su uso en la edición de genes (silenciar, mejorar o cambiar genes específicos) en eucariotas, tales como ratones o primates. Wiedenheft et al. (2012) Nature 482: 331-8. Esto se logra introduciendo en la célula eucariota un plásmido que contiene un CRISPR diseñado específicamente y uno o más Cas apropiados.

La secuencia de CRISPR, a veces llamada locus CRISPR, comprende repeticiones alternas y espaciadores. En un CRISPR de origen natural, los espaciadores normalmente comprenden secuencias extrañas a la bacteria, tal como una secuencia de plásmido o fago; en el sistema CRISPR/Cas de TCR y/o HLA, los espaciadores se derivan de la secuencia genética de TCR o HLA.

El ARN del locus CRISPR es expresado y procesado constitutivamente por proteínas Cas en ARN pequeños. Estos comprenden un espaciador flanqueado por una secuencia repetida. Los ARN guían a otras proteínas Cas para silenciar elementos genéticos exógenos al nivel de ARN o ADN. Horvath et al. (2010) Science 327: 167 170; Makarova et al. (2006) Biology Direct 1: 7. Por consiguiente, los espaciadores sirven como plantillas para moléculas de ARN, de manera análoga a los siARN. Pennisi (2013) Science 341: 833-836.

Como estos aparecen de forma natural en muchos tipos diferentes de bacterias, las disposiciones exactas del CRISPR y la estructura, la función y el número de genes Cas y su producto difieren de alguna manera de una especie a otra. Haft et al. (2005) PLoS Comput. Biol. 1: e60; Kunin et al. (2007) Genome Biol. 8: R61; Mojica et al. (2005) J. Mol. Evol. 60: 174-182; Bolotin et al. (2005) Microbiol. 151: 2551-2561; Pourcel et al. (2005) Microbiol. 151: 653-663; y Stern et al. (2010) Trends. Genet. 28: 335-340. Por ejemplo, las proteínas Cse (subtipo Cas, E. coli) (por ejemplo, CasA) forman un complejo funcional, Cascade, que procesa las transcripciones de ARN CRISPR en unidades espaciadoras repetidas que Cascade retiene. Brouns et al. (2008) Science 321: 960-964. En otros procariotas, Cas6 procesa la transcripción CRISPR. La desactivación de fagos basada en CRISPR en E. coli requiere Cascade y Cas3, pero no Cas1 o Cas2. Las proteínas Cmr (módulo Cas RAMP) en Pyrococcus furiosus y otros procariotas forman un complejo funcional con pequeños ARN CRISPR que reconocen y escinden los ARN diana complementarios. Un sistema CRISPR más simple se basa en la proteína Cas9, que es una nucleasa con dos sitios de corte activos, uno para cada hebra de la doble hélice. La combinación de Cas9 y ARN de locus CRISPR modificado se puede utilizar en un sistema para la edición de genes. Pennisi (2013) Science 341: 833-836.

Por tanto, el sistema CRISPR/Cas puede utilizarse para editar un gen de TCR y/o HLA (añadiendo o suprimiendo un par de bases), o introduciendo una parada prematura que, por tanto, disminuye la expresión de un TCR y/o HLA. El sistema CRISPR/Cas se puede utilizar alternativamente como interferencia de ARN, desactivando el gen TCR y/o HLA de una forma reversible. En una célula de mamífero, por ejemplo, el ARN puede guiar a la proteína Cas hacia un promotor de TCR y/o HLA, bloqueando estéricamente las ARN polimerasas.

Se pueden generar sistemas CRISPR/Cas artificiales que inhiben TCR y/o HLA, usando tecnología conocida en la técnica, por ejemplo, la descrita en la publicación de Estados Unidos número 20140068797.

TALEN para inhibir TCR y/o HLA

"TALEN" o "TALEN para HLA y/o TCR" o "TALEN para inhibir HLA y/o TCR" se refiere a una nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción, una nucleasa artificial que se puede usar para editar el gen de HLA y/o TCR. Los TALEN se producen artificialmente fusionando un dominio de unión a ADN efector de TAL a un dominio de escisión de ADN. Los efectos de tipo activador de la transcripción (TALE) se pueden diseñar para unir cualquier secuencia de ADN deseada, incluida una parte del gen de HLA o TCR. Combinando un TALE diseñado con un dominio de escisión de ADN, se puede producir una enzima de restricción que sea específica para cualquier secuencia de ADN deseada, incluida una secuencia de HLA o TCR. Estas se pueden introducir en una célula, en la que se pueden utilizar para la edición del genoma. Boch (2011) Nature Biotech. 29: 135-6; y Boch et al. (2009) Science 326: 1509-12; Moscou et al. (2009) Science 326: 3501.

Las TALE son proteínas secretadas por la bacteria Xanthomonas. El dominio de unión a ADN contiene una secuencia de 33-34 aminoácidos repetida y altamente conservada, con la excepción de los aminoácidos 12° y 13°. Estas dos posiciones son muy variables, mostrando una fuerte correlación con el reconocimiento de nucleótidos específicos. Por tanto, pueden diseñarse para unirse a una secuencia de ADN deseada.

Para producir un TALEN, una proteína TALE se fusiona con una nucleasa (N), que es una endonucleasa FokI de tipo salvaje o mutada. Se han realizado varias mutaciones en FokI para su uso en TALENs; éstos, por ejemplo, mejoran la especificidad o la actividad de escisión. Cermak et al. (2011) Nucl. Acids Res. 39: e82; Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8; Hockemeyer et al. (2011) Nature Biotech. 29: 731-734; Wood et al. (2011) Science 333: 307; Doyon et al. (2010) Nature Methods 8: 74-79; Szczepek et al. (2007) Nature Biotech. 25: 786-793; y Guo et al. (2010) J. Mol. Biol. 200: 96.

El dominio FokI funciona como un dímero, requiriendo dos construcciones con dominios de unión a ADN únicos para sitios en el genoma diana con la orientación y el espaciado adecuados. Tanto el número de residuos de aminoácidos entre el dominio de unión de ADN a TALE y el dominio de escisión de FokI como el número de bases entre los dos sitios de unión de TALEN individuales parecen ser parámetros importantes para lograr altos niveles de actividad. Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8.

Se puede utilizar una TALEN de HLA o TCR dentro de una célula para producir una rotura de doble cadena (DSB). Se puede introducir una mutación en el sitio de la rotura si los mecanismos de reparación reparan incorrectamente la rotura a través de la unión de extremos no homólogos. Por ejemplo, una reparación incorrecta puede introducir una mutación de cambio de marco. Alternativamente, se puede introducir ADN extraño en la célula junto con TALEN; dependiendo de las secuencias de ADN extraño y la secuencia cromosómica, este proceso puede usarse para corregir un defecto en el gen de HLA o TCR o introducir tal defecto en un gen HLA o TCR de tipo salvaje, disminuyendo así la expresión de HLA o TCR.

Los TALEN específicos para secuencias en HLA o TCR pueden construirse usando cualquier procedimiento conocido en la técnica, incluidos varios esquemas que usan componentes modulares. Zhang et al. (2011) Nature Biotech. 29: 149-53; Geibler et al. (2011) PLoS ONE 6: e19509.

Nucleasa de dedos de zinc para inhibir HLA y/o TCR

"ZFN" o "Nucleasa de dedo de zinc" o "ZFN a HLA y/o TCR" o "ZFN para inhibir HLA y/o TCR" se refieren a una nucleasa de dedo de zinc, una nucleasa artificial que se puede utilizar para editar la Gen HLA y/o TCR.

Como un TALEN, un ZFN comprende un dominio nucleasa FokI (o derivado del mismo) fusionado a un dominio de unión al ADN. En el caso de un ZFN, el dominio de unión al ADN comprende uno o más dedos de zinc. Carroll y col. (2011) Sociedad de Genética de América 188: 773-782; y Kim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1156 1160.

Un dedo de zinc es un pequeño motivo estructural de proteína estabilizado por uno o más iones de zinc. Un dedo de zinc puede comprender, por ejemplo, Cys2His2 y puede reconocer una secuencia de aproximadamente 3 pb. Se pueden combinar varios dedos de zinc de especificidad conocida para producir polipéptidos de múltiples dedos que reconocen secuencias de aproximadamente 6, 9, 12, 15 o 18 pb. Se encuentran disponibles diversas técnicas de selección y ensamblaje modular para generar dedos de zinc (y combinaciones de los mismos) que reconocen secuencias específicas, que incluyen presentación de fagos, sistemas de levadura de un híbrido, sistemas bacterianos de un híbrido y dos híbridos y células de mamífero.

Como un TALEN, un ZFN debe dimerizarse para dividir el ADN. Por tanto, se requieren un par de ZFN para apuntar a sitios de ADN no palindrómicos. Los dos ZFN individuales deben unirse a cadenas opuestas del ADN con sus nucleasas debidamente espaciadas. Bitinaite y col. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 95: 10570-5.

También como un TALEN, un ZFN puede crear una ruptura de doble cadena en el ADN, lo que puede crear una mutación de cambio de marco si se repara incorrectamente, lo que lleva a una disminución en la expresión y cantidad de HLA y/o TCR en un célula. Los ZFN también se pueden usar con recombinación homóloga para mutar en el gen HLA o TCR.

Las ZFN específicas para secuencias en HLA Y/O TCR pueden construirse usando cualquier procedimiento conocido en la técnica. Cathomen y col. (2008) Mol. El r. 16: 1200-7; y Guo et al. (2010) J. Mol. Biol. 400: 96.

ACTIVACIÓN Y EXPANSIÓN DE CÉLULAS T

Las células efectoras inmunes tales como las células T pueden activarse y expandirse generalmente usando procedimientos como se describe, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos 6.352.694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964;5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7.067.318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,90 5,874; 6,797,514; 6,867,041; y la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos No. 20060121005.

Generalmente, una población de células efectoras inmunes puede expandirse por contacto con una superficie que tiene unido a ella un agente que estimula una señal asociada al complejo CD3/TCR y un ligando que estimula una molécula coestimuladora en la superficie de las células T. En particular, las poblaciones de células T pueden estimularse como se describe en el presente documento, como por contacto con un anticuerpo anti-CD3, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un anticuerpo anti-CD2 inmovilizado en una superficie, o por contacto con una proteína quinasa C activador (por ejemplo, briostatina) junto con un ionóforo de calcio. Para la coestimulación de una molécula accesoria en la superficie de las células T, se usa un ligando que se une a la molécula accesoria. Por ejemplo, una población de células T puede ponerse en contacto con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, en condiciones apropiadas para estimular la proliferación de las células T. Para estimular la proliferación de células T CD4 o células T CD8 , un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28. Los ejemplos de un anticuerpo anti-CD28 incluyen 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besangon, Francia) pueden usarse como otros procedimientos comúnmente conocidos en la técnica (Berg et al., Transplant Proc.30 (8): 3975-3977, 1998; Haanen y col., J. Exp. Med. 190 (9): 13191328, 1999; Garland y col., J. Immunol Meth. 227 (1-2): 53-63, 1999). Exp. Medicina. 190 (9): 13191328, 1999; Garland y col., J. Immunol Meth. 227 (1-2): 53-63, 1999). Exp. Medicina. 190 (9): 13191328, 1999; Garland y col., J. Immunol Meth. 227 (1-2): 53-63, 1999).

En ciertos aspectos, la señal estimuladora primaria y la señal coestimuladora para la célula T pueden ser proporcionadas por diferentes protocolos. Por ejemplo, los agentes que proporcionan cada señal pueden estar en solución o acoplados a una superficie. Cuando se acoplan a una superficie, los agentes se pueden acoplar a la misma superficie (es decir, en formación "cis") oa superficies separadas (es decir, en formación "trans"). Alternativamente, un agente puede acoplarse a una superficie y el otro agente en solución. En un aspecto, el agente que proporciona la señal coestimuladora se une a una superficie celular y el agente que proporciona la señal de activación primaria está en solución o acoplado a una superficie. En ciertos aspectos, ambos agentes pueden estar en solución. En un aspecto, los agentes pueden estar en forma soluble y a continuación reticulados a una superficie, tal como una célula que expresa receptores de Fc o un anticuerpo u otro agente de unión que se unirá a los agentes. A este respecto, véanse, por ejemplo, las publicaciones de solicitud de patente de EE.UU. Nos.

20040101519 y 20060034810 para células presentadoras de antígenos artificiales (aAPC) que se contemplan para su uso en la activación y expansión de células T en la presente invención.

En un aspecto, los dos agentes se inmovilizan en perlas, ya sea en la misma perla, es decir, "cis", o en perlas separadas, es decir, "trans". A modo de ejemplo, el agente que proporciona la señal de activación primaria es un anticuerpo anti-CD3 o un fragmento de unión a antígeno del mismo y el agente que proporciona la señal coestimuladora es un anticuerpo anti-CD28 o un fragmento de unión a antígeno del mismo; y ambos agentes se co inmovilizan en la misma perla en cantidades moleculares equivalentes. En un aspecto, se usa una relación 1: 1 de cada anticuerpo unido a las perlas para la expansión de células T CD4 y el crecimiento de células T. En ciertos aspectos de la presente invención, se usa una proporción de anticuerpos anti CD3: CD28 unidos a las perlas de manera que se observa un aumento en la expansión de las células T en comparación con la expansión observada usando una proporción de 1:1. En un aspecto particular, se observa un aumento de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 veces en comparación con la expansión observada usando una relación de 1: 1. En un aspecto, la relación de anticuerpo CD3: CD28 unido a las perlas varía de 100: 1 a 1: 100 y todos los valores enteros entre ellos. En un aspecto, se une más anticuerpo anti-CD28 a las partículas que anticuerpo anti-CD3, es decir, la proporción de CD3: CD28 es menor que uno. En ciertos aspectos, la relación de anticuerpo anti CD28 a anticuerpo anti CD3 unido a las perlas es superior a 2:1. En un aspecto particular, se usa una relación 1: 100 CD3: CD28 de anticuerpo unido a perlas. En un aspecto, se usa una relación 1:75 CD3: CD28 de anticuerpo unido a perlas. En un aspecto adicional, se usa una relación 1:50 de CD3: CD28 de anticuerpo unido a perlas. En un aspecto, se usa una relación 1:30 CD3: CD28 de anticuerpo unido a perlas. En un aspecto preferido, un 1: Se utiliza una relación de 10 CD3: CD28 de anticuerpo unido a perlas. En un aspecto, se usa una relación 1: 3 de CD3: CD28 de anticuerpo unido a las perlas. Todavía en un aspecto, se usa una proporción de CD3: CD28 de 3: 1 de anticuerpo unido a las perlas.

[1582] Pueden usarse proporciones de partículas a células de 1: 500 a 500: 1 y cualquier valor entero intermedio para estimular las células T u otras células diana. Como pueden apreciar fácilmente los expertos en la técnica, la relación de partículas a células puede depender del tamaño de partícula en relación con la célula diana. Por ejemplo, las perlas de tamaño pequeño solo podrían unir unas pocas células, mientras que las perlas más grandes podrían unir muchas. En ciertos aspectos, la proporción de células a partículas varía de 1: 100 a 100: 1 y cualquier valor entero intermedio y, en otros aspectos, la proporción comprende 1: 9 a 9: 1 y también se puede utilizar cualquier valor entero intermedio. para estimular las células T. La proporción de partículas acopladas anti-CD3 y anti-CD28 a células T que dan como resultado la estimulación de las células T puede variar como se indicó anteriormente, sin embargo, ciertos valores preferidos incluyen 1: 100, 1:50, 1:40, 1:301:20, 1:10, 1: 9, 1: 8, 1: 7, 1: 6, 1: 5, 1: 4, 1: 3, 1: 2, 1: 1, 2: 1, 3: 1, 4: 1, 5: 1, 6: 1, 7: 1, 8: 1, 9: 1, 10: 1 y 15 : 1 con una proporción preferida de al menos 1: 1 de partículas por célula T. En un aspecto, se usa una relación de partículas a células de 1: 1 o menos. En un aspecto particular, una relación partícula: célula preferida es 1: 5. En otros aspectos, la proporción de partículas a células se puede variar dependiendo del día de estimulación. Por ejemplo, en un aspecto, la proporción de partículas a células es de 1: 1 a 10: 1 el primer día y se añaden partículas adicionales a las células todos los días o cada dos días a p e ro n o se lim ita n a, te n s io a c t iv o , p la s m a n a to y a g e n te s re d u c to re s ta le s c o m o N -a c e t ilc is te ín a y 2 -m e rc a p to e ta n o l. L o s m e d io s p u e d e n in c lu ir R P M I 1640 , A IM -V , D M E M , M E M , a -M E M , F -12 , X -V iv o 15 y X -V iv o 20 , O p t im iz e r , c o n a m in o á c id o s a ñ a d id o s , p iru v a to d e s o d io , y v ita m in a s , s in s u e ro o s u p le m e n ta d a s co n u n a c a n tid a d a p ro p ia d a d e s u e ro (o p la s m a ) o un c o n ju n to d e f in id o d e h o rm o n a s , y /o u n a c a n t id a d d e c ito q u in a s s u f ic ie n te p a ra e l c re c im ie n to y e x p a n s ió n d e la s c é lu la s T. L o s a n t ib ió tic o s , p o r e je m p lo , p e n ic il in a y e s tre p to m ic in a , se in c lu y e n s o lo en c u lt iv o s e x p e r im e n ta le s , no en c u lt iv o s d e c é lu la s q u e se v a n a in fu n d ir en un s u je to . L a s c é lu la s d ia n a se m a n t ie n e n en la s c o n d ic io n e s n e c e s a r ia s p a ra s o p o r ta r e l c re c im ie n to , p o r e je m p lo , u n a te m p e ra tu ra a d e c u a d a (p o r e je m p lo , 37 ° C ) y u n a a tm ó s fe ra (p o r e je m p lo , a ire m á s 5 % d e C O n o e n c u lt iv o s d e c é lu la s q u e s e v a n a in fu n d ir en un s u je to . L a s c é lu la s d ia n a se m a n t ie n e n en la s c o n d ic io n e s n e c e s a r ia s p a ra s o p o r ta r e l c re c im ie n to , p o r e je m p lo , u n a te m p e ra tu ra a d e c u a d a (p o r e je m p lo , 37 ° C ) y u n a a tm ó s fe ra (p o r e je m p lo , a ire m á s 5 % d e C O n o e n c u lt iv o s d e c é lu la s q u e se v a n a in fu n d ir en un s u je to . L a s c é lu la s d ia n a se m a n tie n e n en la s c o n d ic io n e s n e c e s a r ia s p a ra s o p o r ta r e l c re c im ie n to , p o r e je m p lo , u n a te m p e ra tu ra a d e c u a d a (p o r e je m p lo , 37 ° C ) y u n a a tm ó s fe ra (p o r e je m p lo , a ire m á s 5 % d e C O 2 ).

E n u n a re a liz a c ió n , la s c é lu la s se e x p a n d e n en un m e d io a p ro p ia d o (p o r e je m p lo , m e d io d e s c r ito en e l p re s e n te d o c u m e n to ) q u e in c lu y e u n a o m á s in te r le u c in a s q u e d a n c o m o re s u lta d o a l m e n o s 200 v e c e s (p o r e je m p lo , 200 v e c e s , 250 v e c e s , 300 v e c e s , 350 v e c e s ) a u m e n to en la s c é lu la s d u ra n te un p e río d o d e e x p a n s ió n d e 14 d ía s , p o r e je m p lo , m e d id o p o r un p ro c e d im ie n to d e s c r ito en e l p re s e n te d o c u m e n to , ta l c o m o c ito m e tr ía d e f lu jo . E n u n a re a liz a c ió n , la s c é lu la s s e e x p a n d e n e n p re s e n c ia d e IL -15 y /o IL -7 (p o r e je m p lo , IL -15 e IL -7 ).

L a s c é lu la s T q u e h a n e s ta d o e x p u e s ta s a d is t in to s t ie m p o s d e e s t im u la c ió n p u e d e n p re s e n ta r c a ra c te r ís t ic a s d ife re n te s . P o r e je m p lo , la s a n g re t íp ic a o lo s p ro d u c to s d e c é lu la s m o n o n u c le a re s d e s a n g re p e r ifé r ic a a fé re s is t ie n e n u n a p o b la c ió n d e c é lu la s T a u x il ia re s (T H , C D 4 ) q u e e s m a y o r q u e la p o b la c ió n d e c é lu la s T c ito tó x ic a s o s u p re s o ra s (T C , C D 8 ). La e x p a n s ió n e x v iv o d e la s c é lu la s T m e d ia n te la e s t im u la c ió n d e lo s re c e p to re s C D 3 y ^cD28 ^{p ro d u c e u n a p o b la c ió n d e c é lu la s T q u e a n te s d e a p ro x im a d a m e n te lo s d ía s 8 -9 c o n s is te p re d o m in a n te m e n te}en c é lu la s T H , m ie n tra s q u e d e s p u é s d e a p ro x im a d a m e n te lo s d ía s 8 -9 , la p o b la c ió n d e c é lu la s T c o m p re n d e u n a p o b la c ió n c a d a v e z m a y o r d e c é lu la s T C . P o r c o n s ig u ie n te , d e p e n d ie n d o d e l p ro p ó s ito d e l t ra ta m ie n to , p u e d e s e r ^{v e n ta jo s o in fu n d ir a un s u je to co n u n a p o b la c ió n d e c é lu la s T q u e c o m p re n d a p re d o m in a n te m e n te c é lu la s}Th .

A d e m á s , a d e m á s d e lo s m a rc a d o re s C D 4 y C D 8 , o tro s m a rc a d o re s fe n o típ ic o s v a r ía n s ig n if ic a t iv a m e n te , p e ro en g ra n p a rte , d e fo rm a re p ro d u c ib le d u ra n te e l c u rs o d e l p ro c e s o d e e x p a n s ió n c e lu la r. P o r ta n to , d ic h a re p ro d u c ib il id a d p e rm ite la c a p a c id a d d e a d a p ta r un p ro d u c to d e c é lu la s T a c t iv a d a s p a ra f in e s e s p e c íf ic o s .

EVALUACIÓN DE EFICACIA

P u e d e n g e n e ra rs e R C A R c a n d id a to s u s a n d o lo s c o m p o n e n te s y p ro c e d im ie n to s d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to . D ic h o s R C A R c a n d id a to s p u e d e n p ro b a rs e p a ra d e te rm in a r su e f ic a c ia in v iv o a d m in is tra n d o R C A R c a n d id a to s en m o d e lo s d e c á n c e r d e ra tó n y m o n ito r iz a n d o y e v a lu a n d o el e fe c to a n t ic a n c e r íg e n o o a n t itu m o ra l y la s u p e rv iv e n c ia g lo b a l d e lo s ra to n e s .

A m o d o d e e je m p lo , la e f ic a c ia d e un R C A R q u e t ie n e un d o m in io d e u n ió n a a n tíg e n o q u e c o m p re n d e un a n t ic u e rp o a n t i-C D 19 h u m a n o p u e d e e n s a y a rs e en un m o d e lo d e c á n c e r d e ra tó n , p o r e je m p lo , un m o d e lo d e ra tó n C D 19 /A L L . S e im p la n ta n c é lu la s p r im a r ia s d e le u c e m ia lin fo b lá s t ic a a g u d a h u m a n a (L L A ), p o r e je m p lo , p o r v ía in tra v e n o s a , en ra to n e s in m u n o c o m p ro m e tid o s , p o r e je m p lo , N O D .C g - P r k d c scid I l2 rg tm1Wjl/ R a to n e s S z J (N S G o N O D s c id g a m m a ). D e s p u é s d e un p e río d o d e t ie m p o s u f ic ie n te p a ra e l e s ta b le c im ie n to d e A L L , p o r e je m p lo , 2 -3 s e m a n a s , se p u e d e n a d m in is t ra r c é lu la s c a n d id a ta s q u e e x p re s a n R C A R . D e s p u é s d e l t ra ta m ie n to co n la s c é lu la s q u e e x p re s a n R C A R c a n d id a ta s , lo s ra to n e s s e a n a liz a n , p o r e je m p lo , s e m a n a lm e n te , p a ra d e te rm in a r la p ro g re s ió n d e la e n fe rm e d a d , la c a rg a tu m o ra l, la in f i lt ra c ió n y /o la p e rs is te n c ia d e la s c é lu la s q u e e x p re s a n R C A R , u s a n d o v a r io s p ro c e d im ie n to s c o n o c id o s en la té c n ic a . P o r e je m p lo , e l p o rc e n ta je d e c é lu la s A L L h u m a n a s , p o r e je m p lo , c é lu la s C D 19 h u m a n a s en la s a n g re , p a ra in d ic a r la c a rg a d e e n fe rm e d a d . T a m b ié n se p u e d e e v a lu a r la s u p e rv iv e n c ia g lo b a l, p o r e je m p lo , la m o rb ilid a d , d e lo s ra to n e s d e s p u é s d e l tra ta m ie n to .

S e p u e d e n u s a r v a r io s e n s a y o s p a ra e v a lu a r la a c t iv id a d d e la m o lé c u la R C A R , c o m o , e n tre o tro s , la c a p a c id a d d e e x p a n d ir la s c é lu la s T d e s p u é s d e la e s t im u la c ió n a n t ig é n ic a , m a n te n e r la e x p a n s ió n d e la s c é lu la s T e n a u s e n c ia d e re e s t im u la c ió n , y a c t iv id a d e s e n m o d e lo s a n im a le s a p ro p ia d o s . L o s e n s a y o s p a ra e v a lu a r lo s e fe c to s d e l R C A R , p o r ^{e je m p lo , un}RCAr ^{E G F R v III , s e d e s c r ib e n c o n m á s d e ta l le a c o n tin u a c ió n .}

E l a n á lis is d e t r a n s fe re n c ia W e s te rn d e la e x p re s ió n d e R C A R e n c é lu la s T p r im a r ia s p u e d e u s a rs e p a ra d e te c ta r su p re s e n c ia u s a n d o p ro c e d im ie n to s p u b lic a d o s p a ra C A R . V é a s e , p o r e je m p lo , M ilo n e e t a l., M o le c u la r T h e ra p y 17 (8 ): ^{1453 -1464 (2009 ). M u y b re v e m e n te , la s c é lu la s T (m e z c la 1: 1 d e c é lu la s T C D 4 y C D 8 ) q u e e x p re s a n lo s}RC^aR se e x p a n d e n in v it ro d u ra n te m á s d e 10 d ía s , s e g u id o d e lis is y S D S -P A G E en c o n d ic io n e s re d u c to ra s . L o s R C A R q u e c o n t ie n e n e l d o m in io c ito p la s m á t ic o d e T C R - le n g th d e lo n g itu d c o m p le ta y la c a d e n a T C R -Z e n d ó g e n a se d e te c ta n m e d ia n te tra n s fe re n c ia d e W e s te rn u s a n d o un a n t ic u e rp o c o n tra la c a d e n a d e T C R -.. L o s m is m o s s u b c o n ju n to s d e c é lu la s T se u t iliz a n p a ra e l a n á lis is d e S D S -P A G E en c o n d ic io n e s no re d u c to ra s p a ra p e rm it ir la e v a lu a c ió n d e la fo rm a c ió n d e d ím e ro s c o v a le n te s .

L a e x p a n s ió n in v it ro d e c é lu la s T R C A R (e s d e c ir , c é lu la s R C A R T ) d e s p u é s d e la e s t im u la c ió n c o n a n tíg e n o p u e d e m e d irs e m e d ia n te c ito m e tr ía d e f lu jo . P o r e je m p lo , u n a m e z c la d e l in fo c ito s T C D 4 y C D 8 se e s t im u la c o n a A P C a C D 3 /a C D 28 s e g u id o d e tra n s d u c c ió n c o n v e c to re s le n t iv ira le s q u e e x p re s a n G F P b a jo e l c o n tro l d e lo s p ro m o to re s a a n a liz a r . L o s p ro m o to re s d e e je m p lo in c lu y e n lo s p ro m o to re s d e l g e n IE d e C M V , E F -1 a , u b iq u it in a C o fo s fo g lic e ro q u in a s a (P G K ). La f lu o re s c e n c ia d e G F P se e v a lú a e l d ía 6 d e c u lt iv o en lo s s u b c o n ju n to s d e c é lu la s T C D 4 y /o C D 8 m e d ia n te c ito m e tr ía d e f lu jo . V é a s e , p o r e je m p lo , M ilo n e e t a l., M o le c u la r T h e ra p y 17 (8 ): 1453 1464 (2009 ) . A lte rn a tiv a m e n te , u n a m e z c la d e C D 4 y C D 8 L a s c é lu la s T se e s t im u la n co n p e r la s m a g n é t ic a s re c u b ie r ta s d e a C D 3 /a C D 28 el d ía 0 y s e tra n s d u c e n co n R C A R el d ía 1 u s a n d o un v e c to r le n t iv ira l b ic is tró n ic o q u e e x p re s a R C A R ju n to c o n e G F P u s a n d o u n a s e c u e n c ia d e o m is ió n r ib o s ó m ic a 2 A . L o s c u lt iv o s s e v u e lv e n a e s t im u la r c o n c o n s tru c c io n e s R C A R e n p re s e n c ia d e a n t ic u e rp o a n t iC D 3 y a n t i-C D 28 (K 562 -B B L -3 /28 ) d e s p u é s d e l la v a d o . S e a ñ a d e IL -2 e x ó g e n a a lo s c u lt iv o s c a d a d o s d ía s a 100 U l/m l. L a s c é lu la s T G F P se e n u m e ra n m e d ia n te c ito m e tr ía d e f lu jo u t iliz a n d o un re c u e n to b a s a d o en p e r la s . V é a s e , p o r e je m p lo , M ilo n e e t a l., M o le c u la r T h e ra p y 17 (8 ): 1453 1464 (2009 ).

T a m b ié n se p u e d e m e d ir la e x p a n s ió n s o s te n id a d e c é lu la s T R C A R en a u s e n c ia d e re e s t im u la c ió n . V é a s e , p o r e je m p lo , M ilo n e e t a l., M o le c u la r T h e ra p y 17 (8 ): 1453 -1464 (2009 ) . B re v e m e n te , e l v o lu m e n m e d io d e c é lu la s T (fl) se m id e e l d ía 8 d e c u lt iv o u s a n d o un c o n ta d o r d e p a rtíc u la s C o u lte r M u lt is iz e r III d e s p u é s d e la e s t im u la c ió n co n p e r la s m a g n é t ic a s re c u b ie r ta s d e a C D 3 /a C D 28 e l d ía 0, y la t ra n s d u c c ió n co n e l R C A R in d ic a d o e l d ía 1.

L a e v a lu a c ió n d e la p ro li fe ra c ió n c e lu la r y la p ro d u c c ió n d e c ito c in a s se ha d e s c r ito p re v ia m e n te , p o r e je m p lo , en M ilo n e e t a l., M o le c u la r T h e ra p y 17 (8 ): 1453 -1464 (2009 ). B re v e m e n te , la e v a lu a c ió n d e la p ro li fe ra c ió n m e d ia d a p o r R C A R s e re a liz a e n p la c a s d e m ic ro t itu la c ió n m e z c la n d o c é lu la s T la v a d a s c o n c é lu la s d ia n a , c o m o c é lu la s U 87 M G , B H K o C H O q u e e x p re s a n un a n t íg e n o tu m o ra l, p o r e je m p lo , E G F R v lI I o E G F R d e t ip o s a lv a je (w t) o C D 32 y C D 137 (K T 32 -B B L ) p a ra u n a re la c ió n f in a l d e c é lu la s T : c é lu la s d ia n a d e 1: 1. L o s a n t ic u e rp o s m o n o c lo n a le s a n t i-C D 3 (c lo n O K T 3 ) y a n t i-C D 28 (c lo n 9.3 ) s e a g re g a n a c u lt iv o s c o n c é lu la s K T 32 -B B L p a ra q u e s irv a n c o m o c o n tro l p o s it iv o p a ra e s t im u la r la p ro li fe ra c ió n d e c é lu la s T, y a q u e e s ta s s e ñ a le s a p o y a n C D 8 a la rg o p la z o E x p a n s ió n d e c é lu la s T e x v iv o . L a s c é lu la s T s e e n u m e ra n e n c u lt iv o s u s a n d o p e r la s f lu o re s c e n te s C o u n tB r ig h t ™ ( In v it ro g e n , C a r ls b a d , C A ) y c ito m e tr ía d e f lu jo c o m o d e s c r ib e e l fa b r ic a n te . L a s c é lu la s T R C A R se id e n t if ic a n m e d ia n te la e x p re s ió n d e G F P u t il iz a n d o c é lu la s T q u e se d is e ñ a n c o n v e c to re s le n t iv ira le s q u e e x p re s a n R C A R u n id o s a e G F P -2 A . P a ra la s c é lu la s T R C A R q u e n o e x p re s a n G F P , la s c é lu la s T R C A R se d e te c ta n c o n p ro te ín a re c o m b in a n te b io t in ila d a , p o r e je m p lo , E G F R v III y un c o n ju g a d o s e c u n d a r io d e a v id in a -P E . C D 4 y C D 8 La e x p re s ió n en c é lu la s T ta m b ié n se d e te c ta s im u ltá n e a m e n te c o n a n t ic u e rp o s m o n o c lo n a le s e s p e c íf ic o s (B D B io s c ie n c e s ) . L a s m e d ic io n e s d e c ito c in a s s e re a liz a n en s o b re n a d a n te s re c o le c ta d o s 24 h o ra s d e s p u é s d e la re e s t im u la c ió n u s a n d o el k it d e m a tr iz d e p e r la s c ito m é tr ic a s d e c ito c in a s T H 1 /T H 2 h u m a n a (B D B io s c ie n c e s , S a n D ie g o , C A ) s e g ú n la s in s tru c c io n e s d e l fa b r ic a n te . L a f lu o re s c e n c ia se e v a lú a u t il iz a n d o un c itó m e tro d e f lu jo F A C S c a lib u r y lo s d a to s se a n a liz a n d e a c u e rd o c o n la s in s t ru c c io n e s d e l fa b r ic a n te .

L a c ito to x ic id a d s e p u e d e e v a lu a r m e d ia n te un e n s a y o e s tá n d a r d e l ib e ra c ió n d e 51 C r. V é a s e , p o r e je m p lo , M ilo n e e t a l., M o le c u la r T h e ra p y 17 (8 ): 1453 -1464 (2009 ) . E n re s u m e n , la s c é lu la s d ia n a (p o r e je m p lo , C é lu la s U 87 M G , B H K o C H O q u e e x p re s a n R C A R , p o r e je m p lo , E G F R v II I o E G F R d e t ip o s a lv a je (w t) s e c a rg a n c o n 51 C r ( c o m o N a C rO 4, N e w E n g la n d N u c le a r, B o s to n , m A ) a 37 ° C d u ra n te 2 h o ra s c o n a g ita c ió n f re c u e n te , se la v ó d o s v e c e s en R P M I c o m p le to y s e s e m b ró e n p la c a s d e m ic ro v a lo ra c ió n . L a s c é lu la s T e fe c to ra s s e m e z c la n co n la s c é lu la s d ia n a e n los p o c il lo s en R P M I c o m p le to en p ro p o rc io n e s v a r ia b le s d e c é lu la e fe c to ra : c é lu la d ia n a (E : T ). T a m b ié n se p re p a ra n p o c il lo s a d ic io n a le s q u e c o n t ie n e n s o lo m e d io ( l ib e ra c ió n e s p o n tá n e a , S R ) o u n a s o lu c ió n a l 1 % d e d e te rg e n te t r ito n -X 100 ( l ib e ra c ió n to ta l, T R ). D e s p u é s d e 4 h o ra s d e in c u b a c ió n a 37 ° C, se re c o le c ta e l s o b re n a d a n te d e c a d a p o c illo . A c o n t in u a c ió n , se m id e e l 51 C r lib e ra d o u s a n d o un c o n ta d o r d e p a r t íc u la s g a m m a (P a c k a rd In s t ru m e n t C o ., W a lth a m , M A ). C a d a c o n d ic ió n se re a liz a p o r lo m e n o s p o r t r ip l ic a d o , y e l p o rc e n ta je d e lis is se c a lc u la u s a n d o la fó rm u la :% d e lis is = (E R -S R ) /(T R - S R ), d o n d e E R re p re s e n ta e l p ro m e d io 51C r lib e ra d o p a ra c a d a c o n d ic ió n e x p e r im e n ta l. T a m b ié n se p u e d e n u s a r e n s a y o s d e c ito to x ic id a d a lte rn a t iv o s , ta le s c o m o e n s a y o s d e c ito to x ic id a d b a s a d o s en f lu jo . T a m b ié n s e p u e d e n u s a r o tro s e n s a y o s , in c lu id o s lo s d e s c r ito s en la s e c c ió n d e E je m p lo s d e l p re s e n te d o c u m e n to , a s í c o m o lo s c o n o c id o s e n la té c n ic a , p a ra e v a lu a r la s c o n s tru c c io n e s R C A R .

P u e d e n u s a rs e p ro c e d im ie n to s a n á lo g o s p a ra p ro b a r lo s R N K R -C A R , p o r e je m p lo , p a ra e v a lu a r la e f ic a c ia d e los R N K R -C A R . T a m b ié n p u e d e n u t iliz a rs e p ro c e d im ie n to s a n á lo g o s p a ra p ro b a r la c o m b in a c ió n d e R C A R e in h N K R -C A R , p o r e je m p lo , e n u n a c é lu la , p o r e je m p lo , p a ra e v a lu a r la e f ic a c ia y /o s e g u r id a d d e la c o m b in a c ió n d e C A R .

APLICACIÓN TERAPÉUTICA

L o s p ro c e d im ie n to s p a ra in h ib ir la p ro li fe ra c ió n o re d u c ir un c á n c e r en u n a p o b la c ió n d e c é lu la s q u e e x p re s a n a n tíg e n o s c a n c e ro s o s , p o r e je m p lo , u n a p o b la c ió n d e c é lu la s q u e e x p re s a n E G F R v II I , se d e s c r ib e n en e l p re s e n te d o c u m e n to . E n c ie r to s c a s o s , la c é lu la e fe c to ra in m u n ita r ia d is e ñ a d a p a ra e x p re s a r un R C A R y un N K R -C A R (p o r e je m p lo , C é lu la s R C A R /N K R -C A R X , p o r e je m p lo , C é lu la s R C A R /N K R -C A r T, c é lu la s R C A R /N K R -C A R N ) o p a ra e x p re s a r un R N K R - C A R (p o r e je m p lo , C é lu la s R N K R -C A R X ) re d u c e la c a n t id a d , n ú m e ro , c a n t id a d o p o rc e n ta je de c é lu la s y /o c é lu la s c a n c e ro s a s en a l m e n o s un 25 % , a l m e n o s un 30 % , a l m e n o s un 40 % , a l m e n o s un 50 % , a l menos un 65% , al menos el 75%, al menos el 85%, al menos el 95% o al menos el 99% en un sujeto con un cáncer asociado con células que expresan antígenos en relación con un control negativo. En un caso, el sujeto es un ser humano.

Los procedimientos descritos en el presente documento incluyen un tipo de terapia celular en la que las células efectoras inmunes se modifican genéticamente para expresar RCAR y NKR-CAR, o RNKR-CAR. Las células CARX resultantes (por ejemplo, células RCAR/NKR-CARX o células RNKR-CARX) se infunden en un receptor que las necesita. La célula RCAR/NKR-CARX infundida o la célula RNKR-CARX es capaz de destruir o inhibir las células tumorales en el receptor. A diferencia de las terapias con anticuerpos, las células RCAR/NKR-CARX o las células RNKR-CARX pueden replicarse in vivo, lo que da como resultado una persistencia a largo plazo que puede conducir a un control tumoral sostenido. En varios casos, las células RCAR/NKR-CARX o las células RNKR-CARX, administradas al paciente, o su progenie, persisten en el paciente durante al menos cuatro meses, cinco meses, seis meses, siete meses, ocho meses, nueve meses. , diez meses, once meses, doce meses, trece meses, catorce meses,

Sin desear estar ligado a ninguna teoría en particular, la respuesta inmune contra el cáncer provocada por las células RCAR/NKR-CARX o las células RNKR-CARX puede ser una respuesta inmune activa o pasiva, o alternativamente puede deberse a respuesta inmune directa vs. indirecta. En una realización, las células RCAR/NKR-CARX o las células RNKR-CARX exhiben secreción de citocinas proinflamatorias específicas y una potente actividad citolítica en respuesta a las células cancerosas humanas que expresan el antígeno diana, resisten la inhibición de RCAR soluble o RNKR-CAR, median en la muerte de espectadores y median regresión de un tumor humano establecido. En una realización, las células RCAR/NKR-CARX o las células RNKR-CARX pueden ser un tipo de vacuna para inmunización ex vivo y/o terapia in vivo en un mamífero. En una realización, el mamífero es un ser humano.

En realizaciones, con respecto a la inmunización ex vivo, al menos uno de los siguientes ocurre in vitro antes de administrar la célula a un mamífero: i) expansión de las células, ii) introducción de un ácido nucleico que codifica un RCAR, NKR-CAR, RCAR/NKR-CAR, o RNKR-CAR a las células o iii) crioconservación de las células RCARX, RCAR/NKR-CARX o RNKR-CARX. Los procedimientos ex vivo son conocidos en la técnica y se comentan con más detalle a continuación. Brevemente, las células se aíslan de un mamífero (por ejemplo, Un ser humano) y se modifican genéticamente (es decir, se transducen o transfectan in vitro) con un vector que expresa un RCAR, NKR-CAR, RCAR/NKR-CAR o RNKR-CAR descrito en el presente documento. Las células rCa R/NKR-CARX o las células RNKR-CARX resultantes se pueden administrar a un receptor de mamífero para proporcionar un beneficio terapéutico. El mamífero receptor puede ser un ser humano y las células RCAR/NKR-CARX o las células RNKR-Ca Rx pueden ser autólogas con respecto al receptor. Alternativamente, las células pueden ser alogénicas, singénicas o xenogénicas con respecto al receptor.

Un procedimiento para la expansión ex vivo de células madre y progenitoras hematopoyéticas se describe en la patente de EE.UU. N° 5.199.942, se puede aplicar a las células descritas en el presente documento. En la técnica se conocen otros procedimientos adecuados, por lo que los procedimientos descritos en el presente documento no se limitan a ningún procedimiento particular de expansión ex vivo de las células. Brevemente, el cultivo ex vivo y la expansión de células T comprenden: (1) recolectar células madre y progenitoras hematopoyéticas CD34 de un mamífero a partir de muestras de sangre periférica o explantes de médula ósea; y (2) expandir tales células ex vivo. Además de los factores de crecimiento celular descritos en la patente de EE.UU. N° 5.199.942, se pueden usar otros factores tales como flt3-L, IL-1, IL-3 y ligando c-kit, para el cultivo y expansión de las células.

Además de usar una vacuna basada en células en términos de inmunización ex vivo, también se proporcionan composiciones y procedimientos para la inmunización in vivo para provocar una respuesta inmune dirigida contra un antígeno en un paciente.

Generalmente, las células activadas y expandidas como se describe en el presente documento pueden utilizarse en el tratamiento y prevención de enfermedades que surgen en individuos inmunodeprimidos. En particular, las células RCAR/NKR-CARX o las células RNKR-CARX se utilizan en el tratamiento de enfermedades, trastornos y afecciones asociadas con la expresión de un antígeno tumoral. En ciertos casos, las células RCAR/NKR-CARX o las células RNKR-CARX se utilizan en el tratamiento de pacientes con riesgo de desarrollar enfermedades, trastornos y afecciones asociadas con la expresión del antígeno tumoral. Por lo tanto, la presente divulgación proporciona procedimientos para el tratamiento o prevención de enfermedades, trastornos y afecciones asociadas con la expresión de antígeno tumoral que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite, una cantidad terapéuticamente eficaz de células modificadas con RCAR/NKR-CAR o células modificadas con RNKR-CAR. células.

Las células RCAR/NKR-CARX o las células RNKR-CARX pueden administrarse solas o como una composición farmacéutica en combinación con diluyentes y/o con otros componentes tales como IL-2 u otras citocinas o poblaciones celulares.

En un aspecto, la presente invención se refiere al tratamiento de un sujeto in vivo usando un CAR (por ejemplo, RCAR, NKR-CAR o RNKR-CAR) de manera que se inhibe el crecimiento de tumores cancerosos. Se puede usar un CAR (por ejemplo, RCAR, NKR-CAR o RNKR-CAR) solo para inhibir el crecimiento de tumores cancerosos. Alternativamente, CAR (por ejemplo, RCAR, NKR-CAR o RNKR-CAR) se puede utilizar junto con otros CAR (por ejemplo, RCAR, NKR-CAR o RNKR-CAR), agentes inmunogénicos, tratamientos estándar contra el cáncer u otros anticuerpos.

En otro aspecto, se describe un procedimiento para tratar a un sujeto, por ejemplo, reducir o mejorar, una afección o trastorno hiperproliferativo (por ejemplo, un cáncer), por ejemplo, un tumor sólido, un tumor de tejido blando o una lesión metastásica, en un sujeto. Como se usa en el presente documento, el término "cáncer" pretende incluir todos los tipos de crecimientos cancerosos o procesos oncogénicos, tejidos metastásicos o células, tejidos u órganos transformados malignamente, independientemente del tipo histopatológico o etapa de invasión. Los cánceres que pueden tratarse incluyen tumores que no están vascularizados, o que aún no están sustancialmente vascularizados, así como tumores vascularizados. Los cánceres pueden comprender tumores no sólidos (tales como tumores hematológicos, por ejemplo, leucemias y linfomas) o pueden comprender tumores sólidos. Tipos de cánceres que se tratarán con los CAR (por ejemplo, RCAr , NKR-CAR, o RNKR-CARs) de la divulgación incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, blastoma y sarcoma y ciertas leucemias o neoplasias linfoides, tumores benignos y malignos y neoplasias, por ejemplo, sarcomas, carcinomas y melanomas. También se incluyen tumores/cánceres de adultos y tumores/cánceres pediátricos. En una realización, el cáncer a tratar es un tumor sólido, por ejemplo, un tumor sólido descrito en el presente documento. En otra realización, el cáncer a tratar es un cáncer hematológico.

Los cánceres hematológicos son cánceres de la sangre o de la médula ósea. Ejemplos de cánceres hematológicos (o hematógenos) incluyen leucemias, incluyendo leucemias agudas (como leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mielógena aguda y mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucemia), leucemias granulocíticas crónica (como leucemia, leucemia mielógena crónica y leucemia linfocítica crónica), policitemia vera, linfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (formas indolentes y de alto grado), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadenas pesadas, síndrome mielodisplásico y leuceplasia de células pilosas .

Los tumores sólidos son masas anormales de tejido que generalmente no contienen quistes o áreas líquidas. Los tumores sólidos pueden ser benignos o malignos. Los diferentes tipos de tumores sólidos se nombran según el tipo de células que los forman (como sarcomas, carcinomas y linfomas). Los ejemplos de tumores sólidos incluyen, pero no se limitan a, sarcomas y carcinomas, incluyen fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, osteosarcoma y otros sarcomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer de mama linfoide, pancreato cáncer, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma medular de tiroides, carcinoma papilar de tiroides, feocromocitomas carcinoma de glándulas sebáceas,

En realizaciones, los tumores sólidos incluyen malignidades, por ejemplo, sarcomas, adenocarcinomas y carcinomas, de los diversos sistemas de órganos, tales como los que afectan al hígado, pulmón, mama, linfoides, gastrointestinales (por ejemplo, colon), tracto genitourinario (por ejemplo, células renales, uroteliales), próstata y faringe. Los adenocarcinomas incluyen tumores malignos como la mayoría de los cánceres de colon, cáncer de recto, carcinoma de células renales, cáncer de hígado, carcinoma de pulmón de células no pequeñas, cáncer de intestino delgado y cáncer de esófago.

En casos, las lesiones metastásicas de los cánceres mencionados anteriormente se pueden tratar o prevenir usando los procedimientos y composiciones de la divulgación. tumores sólidos de la infancia, linfoma linfocítico, cáncer de vejiga, cáncer de riñón o de uréter, carcinoma de pelvis renal, neoplasia del sistema nervioso central (SNC), linfoma primario del SNC, angiogénesis tumoral, tumor del eje espinal, glioma de tronco encefálico , adenoma pituitario, sarcoma de Kaposi, cáncer epidermoide, cáncer de células escamosas, linfoma de células T, cánceres inducidos por el medio ambiente, incluidos los inducidos por amianto, y combinaciones de dichos cánceres. El tratamiento de cánceres metastásicos, por ejemplo, cánceres metastásicos que expresan PD-L1 (Iwai y col. (2005) Int. Immunol.

17: 133-144) se puede realizar usando las moléculas CAR descritas en el presente documento. En casos, las lesiones metastásicas de los cánceres mencionados anteriormente se pueden tratar o prevenir usando los procedimientos y composiciones de la divulgación.

Los cánceres de ejemplo cuyo crecimiento puede inhibirse incluyen cánceres que responden típicamente a la inmunoterapia. Los ejemplos no limitantes de cánceres para el tratamiento incluyen melanoma (por ejemplo, Melanoma maligno metastásico), cáncer renal (por ejemplo, Carcinoma de células claras), cáncer de próstata (por ejemplo, Adenocarcinoma de próstata resistente a hormonas), cáncer de mama, cáncer de colon y cáncer de pulmón (por ejemplo cáncer de pulmón celular). Además, las neoplasias malignas refractarias o recurrentes se pueden tratar usando las moléculas descritas en el presente documento.En una realización, se puede administrar al sujeto un agente que reduce o mejora un efecto secundario asociado con la administración de una célula que expresa CAR (por ejemplo, célula RNKR-CARX o célula RCAR/NKR-CARX).

Los efectos secundarios asociados con la administración de una célula que expresa CAR incluyen, pero no se limitan a, CRS y linfohistiocitosis hemofagocítica (HLH), también denominado síndrome de activación de macrófagos (MAS). Los síntomas de CRS incluyen fiebre alta, náuseas, hipotensión transitoria, hipoxia y similares. El CRS puede incluir signos y síntomas clínicos constitucionales como fiebre, fatiga, anorexia, mialgias, arthalgias, náuseas, vómitos y dolor de cabeza. El SRC puede incluir signos y síntomas cutáneos clínicos, como erupción cutánea. El SRC puede incluir signos y síntomas gastrointestinales clínicos como náuseas, vómitos y diarrea. El SRC puede incluir signos y síntomas respiratorios clínicos como taquipnea e hipoxemia. El SRC puede incluir signos y síntomas cardiovasculares clínicos como taquicardia, aumento de la presión del pulso, hipotensión, aumento del gasto cardíaco (temprano) y gasto cardíaco potencialmente disminuido (tardío). La CRS puede incluir signos y síntomas clínicos de coagulación como dímero D elevado, hipofibrinogenemia con o sin hemorragia. El SRC puede incluir signos y síntomas renales clínicos como azotemia. El SRC puede incluir signos y síntomas hepáticos clínicos como transaminitis e hiperbilirrubinemia. El SRC puede incluir signos y síntomas neurológicos clínicos como dolor de cabeza, cambios en el estado mental, confusión, delirio, dificultad para encontrar palabras o afasia franca, alucinaciones, temblor, dimetría, marcha alterada y convulsiones. En consecuencia, los procedimientos descritos en el presente documento pueden comprender administrar una célula que expresa CAR descrita en el presente documento a un sujeto y además administrar uno o más agentes para controlar niveles elevados de un factor soluble resultante del tratamiento con una célula que expresa CAR. En una realización, el factor soluble elevado en el sujeto es uno o más de IFN-^y, TNFa, IL-2 e IL-6. En una realización, el factor elevado en el sujeto es uno o más de IL-1, GM-CSF, IL-10, IL-8, IL-5 y fraktalkine. Por tanto, un agente administrado para tratar este efecto secundario puede ser un agente que neutralice uno o más de estos factores solubles. En una realización, el agente que neutraliza una o más de estas formas solubles es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. Los ejemplos de tales agentes incluyen, pero no se limitan a, un esteroide (por ejemplo, Corticosteroide), un inhibidor de TNFa, y un inhibidor de lL-6. Un ejemplo de un inhibidor de TNFa es una molécula de anticuerpo anti-TNFa como infliximab, adalimumab, certolizumab pegol y golimumab. Otro ejemplo de un inhibidor de TNFa es una proteína de fusión como entanercept. Los inhibidores de molécula pequeña de TNFa incluyen, pero no se limitan a, derivados de xantina (por ejemplo, pentoxifilina) y bupropión. Un ejemplo de un inhibidor de IL-6 es una molécula de anticuerpo anti-IL-6 como tocilizumab (toc), sarilumab, elsilimomab, CNTO 328, ALD518/BMS-945429, CNTO 136, CPSI-2364, CDP6038, VX30, ARGX- 109, FE301 y FM101. En una realización, la molécula de anticuerpo anti-IL-6 es tocilizumab. Un ejemplo de un inhibidor basado en IL-1R es anakinra. Otro ejemplo de un inhibidor de TNFa es una proteína de fusión como entanercept. Los inhibidores de molécula pequeña de TNFa incluyen, pero no se limitan a, derivados de xantina (por ejemplo, pentoxifilina) y bupropión. Un ejemplo de un inhibidor de IL-6 es una molécula de anticuerpo anti-IL-6 como tocilizumab (toc), sarilumab, elsilimomab, CNTO 328, ALD518/BMS-945429, CNTO 136, CPSI-2364, CDP6038, VX30, ARGX- 1o9, FE301 y FM101. En una realización, la molécula de anticuerpo anti-IL-6 es tocilizumab. Un ejemplo de un inhibidor basado en IL-1R es anakinra. Otro ejemplo de un inhibidor de TNFa es una proteína de fusión como entanercept. Los inhibidores de molécula pequeña de TNFa incluyen, pero no se limitan a, derivados de xantina (por ejemplo, pentoxifilina) y bupropión. Un ejemplo de un inhibidor de IL-6 es una molécula de anticuerpo anti-IL-6 como tocilizumab (toc), sarilumab, elsilimomab, CⁿTO 328, ALD518/BMS-945429, CNTO 136, CPSI-2364, CDP6038, VX30, ARGX- 109, FE301 y FM101. En una realización, la molécula de anticuerpo anti-IL-6 es tocilizumab. Un ejemplo de un inhibidor basado en IL-1R es anakinra. CNTO 136, CPSI-2364, CDP6038, VX30, ARGX-109, FE301 y FM101. En una realización, la molécula de anticuerpo anti-IL-6 es tocilizumab. Un ejemplo de un inhibidor basado en IL-1R es anakinra. CNTO 136, CPSI-2364, CDP6038, VX30, ARGX-109, FE301 y FM101. En una realización, la molécula de anticuerpo anti-IL-6 es tocilizumab. Un ejemplo de un inhibidor basado en IL-1R es anakinra.

pero no tejido maligno) proporciona inhibición de la señal de activación del RCAR cuando la célula RCAR/NKR-CARX encuentra células normales. Ejemplos de antígenos que sirven como dianas útiles para los CAR inhibidores (por ejemplo, InhNKR-CAR) incluyen los receptores de efrina (Pasquale, 2010, Nat Rev Cancer 10 (3): 165-80) y las claudinas (Singh et al., 2010, J Oncol, 2010: 541957), que se expresan en células epiteliales de tejidos normales, pero que a menudo se pierden selectivamente por cánceres (por ejemplo, EPHA7).

COMPOSICIONES Y TRATAMIENTOS FARMACÉUTICOS

Las composiciones farmacéuticas pueden comprender células RCAR/NKR-CARX, por ejemplo, células RCAR/NKR-CART o células RCAR/NKR-CARN, o células RNKR-CARX (por ejemplo, células RNKR-CART o RNKR-CARN) en combinación con uno o más vehículos, diluyentes o excipientes farmacéutica o fisiológicamente aceptables. Tales composiciones pueden comprender tampones tales como solución salina tamponada neutra, solución salina tamponada con fosfato y similares; carbohidratos como glucosa, manosa, sacarosa o dextranos, manitol; proteinas; polipéptidos o aminoácidos tales como glicina; antioxidantes; agentes quelantes como EDTA o glutatión; adyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio); y conservantes. En una realización, las composiciones farmacéuticas se formulan para administración intravenosa.

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar de una manera apropiada para la enfermedad que se va a tratar (o prevenir). La cantidad y frecuencia de administración vendrán determinadas por factores tales como el estado del paciente y el tipo y gravedad de la enfermedad del paciente, aunque las dosis apropiadas pueden d e te rm in a rs e m e d ia n te e n s a y o s c lín ic o s .

C u a n d o se in d ic a "u n a c a n t id a d in m u n o ló g ic a m e n te e f ic a z " , "u n a c a n t id a d e f ic a z c o n tra e l c á n c e r" , "u n a c a n t id a d e f ic a z in h ib id o ra d e l c á n c e r" o " c a n t id a d te ra p é u t ic a " , la c a n t id a d p re c is a d e la s c o m p o s ic io n e s a a d m in is t r a r se p u e d e d e te rm in a r m e d ia n te un m é d ic o q u e te n g a e n c u e n ta la s d ife re n c ia s in d iv id u a le s e n e d a d , p e s o , e s ta d o d e la e n fe rm e d a d , p o r e je m p lo , ta m a ñ o d e l tu m o r , e x te n s ió n d e la in fe c c ió n o m e tá s ta s is y e s ta d o d e l p a c ie n te (s u je to ) . En c a s o s , u n a c o m p o s ic ió n fa rm a c é u tic a q u e c o m p re n d e la s c é lu la s R C A R /N K R -C A R X (p o r e je m p lo , c é lu la s R C A R /N K R -C A R T o c é lu la s R C A R /N K R -C A R N ) o c é lu la s R N K R -C A R X (p o r e je m p lo , c é lu la s R N K R -C A R T o R N K R -C A R N ) d e s c r ita s en e l p re s e n te d o c u m e n to p u e d e a d m in is tra rs e a u n a d o s is d e 10 4 a 10 9 c é lu la s /k g d e p e s o c o rp o ra l,c é lu la s /k g d e p e s o c o rp o ra l, in c lu id o s to d o s lo s v a lo re s e n te ro s d e n tro d e e s o s ra n g o s . L a s c o m p o s ic io n e s d e c é lu la s T ta m b ié n se p u e d e n a d m in is t r a r m ú lt ip le s v e c e s a e s ta s d o s is .

E n c ie r to s c a s o s , la s c é lu la s R C A R /N K R -C A R X (p o r e je m p lo , la s c é lu la s R C A R /N K R -C A R T o la s c é lu la s R C A R /N K R -C A R N ) o la s c é lu la s R N K R -C A R X (p o r e je m p lo , la s c é lu la s R N K R -C A R T o R N K R -C A R N ) se a c t iv a n y e x p a n d e n a n iv e le s te ra p é u t ic o s , y se a d m in is tra n a un p a c ie n te u s a n d o té c n ic a s d e in fu s ió n q u e se c o n o c e n c o m ú n m e n te en in m u n o te ra p ia (v é a s e , p o r e je m p lo , R o s e n b e rg y co l., N e w E n g . J. o f M e d . 319 : 1676 , 1988 ). La d o s is ó p t im a y e l ré g im e n d e tra ta m ie n to p a ra un p a c ie n te p a r t ic u la r p u e d e n s e r d e te rm in a d o s p o r un e x p e rto en la m a te r ia d e la m e d ic in a c o n tro la n d o a l p a c ie n te en b u s c a d e s ig n o s d e e n fe rm e d a d y a ju s ta n d o e l t ra ta m ie n to en c o n s e c u e n c ia .

E n c ie r to s c a s o s , p u e d e d e s e a rs e e x tra e r s a n g re (o re a liz a r u n a a fé re s is ) , a c t iv a r y m o d if ic a r g e n é t ic a m e n te las c é lu la s T d e la m is m a d e a c u e rd o co n la p re s e n te d iv u lg a c ió n , y r e in fu n d ir a l p a c ie n te co n e s ta s c é lu la s T m o d if ic a d a s g e n é t ic a m e n te a c t iv a d a s y e x p a n d id a s . E s te p ro c e s o s e p u e d e re a liz a r v a r ia s v e c e s c a d a p o c a s s e m a n a s . E n c ie r to s c a s o s , la s c é lu la s T s e p u e d e n a c t iv a r a p a r t ir d e e x tra c c io n e s d e s a n g re d e 10 c c a 400 cc . En c ie r to s c a s o s , la s c é lu la s T s e a c t iv a n a p a r t ir d e e x t ra c c io n e s d e s a n g re d e 20 cc , 30 cc , 40 cc , 50 cc , 60 cc , 70 cc, 80 cc , 90 c c o 100 cc. S in c e ñ irs e a la te o r ía , e l u so d e e s te p ro to c o lo d e e x tra c c ió n d e s a n g re m ú lt ip le /re in fu s ió n m ú ltip le p u e d e s e rv ir p a ra s e le c c io n a r d e te rm in a d a s p o b la c io n e s d e c é lu la s T.

L a a d m in is t ra c ió n d e la s c o m p o s ic io n e s o b je to s e p u e d e l le v a r a c a b o d e c u a lq u ie r m a n e ra c o n v e n ie n te , in c lu y e n d o in h a la c ió n , in y e c c ió n , in g e s tió n , t ra n s fu s ió n , im p la n ta c ió n o t r a s p la n te d e a e ro s o l. L a s c o m p o s ic io n e s d e s c r ita s e n e l p re s e n te d o c u m e n to s e p u e d e n a d m in is t r a r a un p a c ie n te p o r v ía s u b c u tá n e a , in tra d é rm ic a , in tra tu m o ra l, in tra n o d a l, in tra m e d u la r , in tra m u s c u la r , p o r in y e c c ió n in tra v e n o s a ( iv ) o in tra p e r ito n e a l. E n u n a re a liz a c ió n , la s c o m p o s ic io n e s d e c é lu la s T d e la p re s e n te in v e n c ió n se a d m in is tra n a un p a c ie n te m e d ia n te in y e c c ió n in tra d é rm ic a o s u b c u tá n e a . E n o tra re a liz a c ió n , la s c o m p o s ic io n e s d e c é lu la s T d e la p re s e n te in v e n c ió n se a d m in is tra n p re fe r ib le m e n te m e d ia n te in y e c c ió n iv. L a s c o m p o s ic io n e s d e c é lu la s T se p u e d e n in y e c ta r d ire c ta m e n te en un tu m o r , g a n g lio lin fá t ic o o s it io d e in fe c c ió n .

E n un c a s o , e l C A R (p o r e je m p lo , R N K R -C A R , R C A R y /o N K R -C A R ) s e in tro d u c e e n c é lu la s e fe c to ra s in m u n e s (p o r e je m p lo , C é lu la s T, c é lu la s N K ), p o r e je m p lo , M e d ia n te tra n s c r ip c ió n in v itro , y e l s u je to (p o r e je m p lo , h u m a n o ) re c ib e u n a a d m in is tra c ió n in ic ia l d e c é lu la s e fe c to ra s in m u n e s C A R (p o r e je m p lo , c é lu la s T, c é lu la s N K ) d e la d iv u lg a c ió n , y u n a o m á s a d m in is t ra c io n e s p o s te r io re s d e la s c é lu la s e fe c to ra s in m u n ita r ia s C A R (p o r e je m p lo , c é lu la s T , c é lu la s N K ) d e la d iv u lg a c ió n , e n e l q u e u n a o m á s a d m in is t ra c io n e s p o s te r io re s se a d m in is tra n m e n o s d e 15 d ía s , p o r e je m p lo , 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 , 5, 4, 3 o 2 d ía s d e s p u é s d e la a d m in is tra c ió n a n te r io r . E n u n a re a liz a c ió n , se a d m in is t ra m á s d e u n a a d m in is t ra c ió n d e la s c é lu la s e fe c to ra s in m u n e s C A R (p o r e je m p lo , C é lu la s T, c é lu la s N K ) d e la p re s e n te in v e n c ió n a l s u je to (p o r e je m p lo , S e r h u m a n o ) p o r s e m a n a , p o r e je m p lo , 2, 3 o 4 a d m in is t ra c io n e s d e l C A R c é lu la s e fe c to ra s in m u n e s (p o r e je m p lo , L a s c é lu la s T , c é lu la s N K ) d e la p re s e n te in v e n c ió n se a d m in is tra n p o r s e m a n a . E n u n a re a liz a c ió n , e l s u je to (p o r e je m p lo , un s u je to h u m a n o ) re c ib e m á s de u n a a d m in is tra c ió n d e la s c é lu la s e fe c to ra s in m u n e s C A R (p o r e je m p lo , c é lu la s T , c é lu la s N K ) p o r s e m a n a (p o r e je m p lo , 2 , 3 o 4 a d m in is t ra c io n e s p o r s e m a n a ) ( ta m b ié n d e n o m in a d o en e l p re s e n te d o c u m e n to c o m o un c ic lo ) , s e g u id a d e u n a s e m a n a s in a d m in is t ra c io n e s d e c é lu la s e fe c to ra s in m u n e s C A R (p o r e je m p lo , c é lu la s T , c é lu la s N K ), y a c o n t in u a c ió n u n a o m á s a d m in is t ra c io n e s a d ic io n a le s d e la s c é lu la s e fe c to ra s in m u n e s C A R (p o r e je m p lo , c é lu la s T , c é lu la s N K ) ( p o r e je m p lo , s e a d m in is t ra a l s u je to m á s d e u n a a d m in is t ra c ió n d e la s c é lu la s e fe c to ra s in m u n ita r ia s C A R (p o r e je m p lo , c é lu la s T , c é lu la s N K ) p o r s e m a n a ) . E n o tra re a liz a c ió n , e l s u je to (p o r e je m p lo , un s u je to h u m a n o ) re c ib e m á s d e un c ic lo d e c é lu la s e fe c to ra s in m u n e s C A R (p o r e je m p lo , c é lu la s T, c é lu la s N K ), y e l t ie m p o e n tre c a d a c ic lo e s in fe r io r a 10, 9, 8, 7, 6. , 5, 4 o 3 d ía s . E n u n a re a liz a c ió n , la s c é lu la s e fe c to ra s in m u n ita r ia s C A R (p o r e je m p lo , c é lu la s T , c é lu la s N K ) se a d m in is tra n c a d a d o s d ía s d u ra n te 3 a d m in is tra c io n e s p o r s e m a n a . E n u n a re a liz a c ió n , la s c é lu la s e fe c to ra s in m u n ita r ia s C A R (p o r e je m p lo , c é lu la s T , c é lu la s N K ) d e la p re s e n te in v e n c ió n se a d m in is tra n d u ra n te a l m e n o s d o s , tre s , c u a tro , c in c o , s e is , s ie te , o c h o o m á s s e m a n a s .

E n re a liz a c io n e s , la s c é lu la s R C A R /N K R -C A R X o la s c é lu la s R N K R -C A R X co n R C A R o R N K R -C A R q u e c o m p re n d e n u n o o m á s d o m in io s d e c o n m u ta c ió n , g e n e ra n u n a s e ñ a l in tra c e lu la r q u e p ro m u e v e u n a re s p u e s ta e fe c to ra in m u n ita r ia en p re s e n c ia d e u n a m o lé c u la d e d im e r iz a c ió n , p. , u n a m o lé c u la d e h e te ro d im e r iz a c ió n d e m o lé c u la p e q u e ñ a , p o r e je m p lo , R A D 001 o A P 21967.

L a a d m in is tra c ió n d e la m o lé c u la d e d im e r iz a c ió n se p u e d e re a liz a r d e c u a lq u ie r m a n e ra c o n v e n ie n te , in c lu s o mediante inhalación, inyección, ingestión, transfusión o implantación de aerosol. En una realización, la molécula de dimerización se administra por vía oral. La molécula de dimerización puede administrarse a un paciente por vía transarterial, subcutánea, intradérmica, intratumoral, intranodal, intramedular, intramuscular, por inyección intravenosa (iv) o intraperitoneal. En una realización, la molécula de dimerización se administra por vía oral, por ejemplo, en forma de tableta. En una realización, la molécula de dimerización se administra mediante inyección intradérmica o subcutánea. En una realización, la molécula de dimerización se administra mediante inyección iv.

En un caso, la molécula de dimerización se administra después de que se hayan infundido al paciente las células RCAR/NKR-CARX o las células RNKR-CARX. En un caso, la molécula de dimerización se administra un día después de que se hayan infundido al paciente las células RCAR/NKR-CARX o las células RNKR-CARX. En una realización, la molécula de dimerización se administra 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12,13, 14,15, 16,17, 18, 19, 20,21,22 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 días después de que se hayan infundido al paciente las células RCAR/NKR-CARX o las células RNKR-CARX. En un caso, la molécula de dimerización se administra después de la administración de las células RCAR/NKR-CARX o células RNKR-CARX, por ejemplo, en o después de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12,16, 17,18, 19, 20, 21, 22 o 23 horas, o en o después de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 días, después de la administración de células RCAR/NKR-CARX o células RNKR-CARX. En un caso, la molécula de dimerización se administra más de una vez después de que las células RCAR/NKR-CARX o las células RNKR-CARX se hayan infundido en el paciente, por ejemplo, Basándose en un programa de dosificación adaptado al paciente, por ejemplo, La administración de la molécula de dimerización quincenal, semanal, mensual, semestral, anual. En un caso, la dosificación de la molécula de dimerización será diaria, cada dos días, dos veces por semana o semanalmente, pero en algunos casos no excederá de 5 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg o 50 mg. mg, semanalmente. En un caso, la molécula de dimerización se dosifica continuamente, por ejemplo, mediante el uso de una bomba, por ejemplo, una bomba portátil. En un caso, la administración continua dura al menos 4 horas, 12 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 4 días o 5 días. En un caso,

En un caso, se administra una molécula de dimerización al mismo tiempo, por ejemplo, el mismo día, que la administración de las células RCAR/NKR-CARX o las células RNKR-CARX.

En un caso, se controla al paciente después de que se haya administrado la molécula de dimerización para detectar una disminución del cáncer. Si el cáncer reaparece, la molécula de dimerización se puede volver a administrar en ese momento. En un caso, un sujeto se someterá a infusiones de células RCAR/NKR-CARX o RNKR-CARX adicionales o posteriores, por ejemplo, segunda, tercera o cuarta, por ejemplo, a intervalos semanales o mensuales, o según se determine que sea necesario. En un caso, una administración posterior va acompañada o seguida de la administración de la molécula de dimerización. En un caso, la administración posterior de células RCAR/NKR-CARX o células RNKR-CARX, o la molécula de dimerización continúa, por ejemplo, hasta que se elimina la carga tumoral, no se percibe ningún beneficio adicional o se cumple un criterio preseleccionado. En un caso, un procedimiento descrito en el presente documento comprende la administración de terapia celular en la que las células T se modifican genéticamente para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR), por ejemplo, un RCAR, NKR-CAR y/o RNKR-CAR. La célula CAR T se infunde a un receptor que la necesita. La célula infundida es capaz de matar las células tumorales en el receptor, pero solo en presencia de la molécula de dimerización. Además, en presencia de la molécula de dimerización, las células RCAR/NKR-CART o las células RNKR-CART se expandirán y replicarán in vivo tras el acoplamiento de su antígeno diana lo que conducirá a un control tumoral sostenido. La liberación de citocinas durante la destrucción de las células tumorales también se puede medir en el suero. La célula infundida es capaz de matar las células tumorales en el receptor, pero solo en presencia de la molécula de dimerización. Además, en presencia de la molécula de dimerización, las células RCAR/NKR-CART o las células RNKR-CART se expandirán y replicarán in vivo tras el acoplamiento de su antígeno diana, lo que conducirá a un control tumoral sostenido. La liberación de citocinas durante la destrucción de las células tumorales también se puede medir en el suero. La célula infundida es capaz de matar las células tumorales en el receptor, pero solo en presencia de la molécula de dimerización. Además, en presencia de la molécula de dimerización, las células RCAR/NKR-CART o las células RNKR-CART se expandirán y replicarán in vivo tras el acoplamiento de su antígeno diana, lo que conducirá a un control tumoral sostenido. La liberación de citocinas durante la destrucción de las células tumorales también se puede medir en el suero.

Esta expansión y producción de citocinas se pueden medir en el paciente mediante extracciones de sangre de rutina y análisis subsiguientes de la expresión de CAR y los niveles séricos de citocinas. Este procedimiento también informará a un experto en la materia para modificar la estrategia de dosificación de la molécula de dimerización para mantener la población celular funcional RCAR/NKR-CART o RNKR-CART. Se prevé que la dosificación de la molécula de dimerización continuará mientras se reduzca la carga tumoral.

En otros casos, las células RCAR/NKRX o las células RNKR-CARX se pueden usar en un régimen de tratamiento en combinación con quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos o otros agentes inmunoablativos como CAMPAT^h, anticuerpos anti-CD3 u otras terapias con anticuerpos, citoxina, fludarabina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228, citocinas e irradiación. Fármacos que inhiben la fosfatasa calcineurina dependiente de calcio (ciclosporina y FK506) o inhiben la quinasa p70S6 que es importante para la señalización inducida por el factor de c re c im ie n to ( ra p a m ic in a ) . (L iu y co l., C e ll 66 : 807 -815 , 1991 ; H e n d e rs o n y co l., Im m u n . 73 : 316 -321 , 1991 ; B ie re r y co l., C u rr. O p in . Im m u n . 5: 763 -773 , 1993 ) p u e d e ta m b ié n s e u tiliz a rá .

E n u n a re a liz a c ió n a d ic io n a l, la s c o m p o s ic io n e s d e c é lu la s se a d m in is tra n a un p a c ie n te ju n to co n (p o r e je m p lo , A n te s , s im u ltá n e a m e n te o d e s p u é s ) d e un tra s p la n te d e m é d u la ó s e a , te ra p ia a b la t iv a d e c é lu la s T u s a n d o a g e n te s d e q u im io te ra p ia c o m o f lu d a ra b in a , ra d io te ra p ia d e h a z e x te rn o (X R T ) , c ic lo fo s fa m id a o a n t ic u e rp o s c o m o O K T 3 o C A M P A T H . E n u n a re a liz a c ió n , la s c o m p o s ic io n e s d e c é lu la s se a d m in is tra n d e s p u é s d e u n a te ra p ia a b la t iv a de c é lu la s B ta le s c o m o a g e n te s q u e re a c c io n a n c o n C D 20 , p o r e je m p lo , R itu x a n . P o r e je m p lo , en u n a re a liz a c ió n , lo s s u je to s p u e d e n s o m e te rs e a un tra ta m ie n to e s tá n d a r c o n q u im io te ra p ia d e d o s is a lta s e g u id a d e un tra s p la n te d e c é lu la s m a d re d e s a n g re p e r ifé r ic a . E n c ie r ta s re a liz a c io n e s , d e s p u é s d e l t ra s p la n te , lo s s u je to s re c ib e n u n a in fu s ió n d e la s c é lu la s in m u n e s e x p a n d id a s d e s c r ita s en e l p re s e n te d o c u m e n to . E n un c a s o en e l q u e se a d m in is tra n c é lu la s R C A R /N K R X o c é lu la s R N K R -C A R X d e s p u é s d e l t ra s p la n te , la s c é lu la s e fe c to ra s in m u n e s , p o r e je m p lo , la s c é lu la s T , u t i l iz a d a s p a ra p ro d u c ir la s c é lu la s R C A R /N K R X o la s c é lu la s R N K R -C A R X , se o b tie n e n d e l s u je to d e s p u é s d e l t ra s p la n te . E n un c a s o , la s c é lu la s e fe c to ra s in m u n e s , p o r e je m p lo , la s c é lu la s T , u t i l iz a d a s p a ra fa b r ic a r la s c é lu la s R C A R /N K R X o la s c é lu la s R N K R -C A R X , so n d e o r ig e n d o n a n te , p o r e je m p lo , se d e r iv a n d e c é lu la s d o n a n te s im p la n ta d a s e n e l s u je to .

E n un c a s o a d ic io n a l, la s c é lu la s e x p a n d id a s se a d m in is tra n a n te s o d e s p u é s d e la c iru g ía . En un c a s o , la s c é lu la s R C A R /N K R X o la s c é lu la s R N K R -C A R X se a d m in is tra n a l s u je to d e s p u é s d e la c iru g ía q u e re d u c e e l v o lu m e n d e l tu m o r .

E n un c a s o e je m p la r p a r t ic u la r , lo s s u je to s p u e d e n s u fr ir le u c o c ita fé re s is , en la q u e lo s le u c o c ito s se re c o g e n , se e n r iq u e c e n o se a g o ta n e x v iv o p a ra s e le c c io n a r y /o a is la r la s c é lu la s d e in te ré s , p o r e je m p lo , c é lu la s T. E s to s a is la d o s d e c é lu la s T p u e d e n e x p a n d irs e m e d ia n te p ro c e d im ie n to s c o n o c id o s en la té c n ic a y t r a ta r s e d e ta l m a n e ra q u e s e p u e d a n in t ro d u c ir u n a o m á s c o n s tru c c io n e s R C A R , N K R -C A R o R N K R -C A R d e la s d e s c r ita s en e l p re s e n te d o c u m e n to , c re a n d o a s í R C A R /N K R -C A R T o R N K R -C A R T c é lu la . L o s s u je to s q u e lo n e c e s ite n p u e d e n s o m e te rs e p o s te r io rm e n te a u n tra ta m ie n to e s tá n d a r c o n q u im io te ra p ia d e d o s is a lta s e g u id a d e un t r a s p la n te d e c é lu la s m a d re d e s a n g re p e r ifé r ic a . E n c ie r to s c a s o s , d e s p u é s d e l t ra s p la n te o s im u ltá n e a m e n te c o n é l, lo s s u je to s re c ib e n u n a in fu s ió n d e la s c é lu la s e x p a n d id a s R C A R /N K R -C A R T o R N K R -C A R T d e s c r ita s en e l p re s e n te d o c u m e n to . E n un c a s o a d ic io n a l, la s c é lu la s e x p a n d id a s s e a d m in is tra n a n te s o d e s p u é s d e la c iru g ía .

TRATAMIENTO ADYUNTIVO CON UNA DOSIS BAJA QUE AUMENTA LA INMUNIDAD DE UN INHIBIDOR DE MTOR

C o m o s e u s a en e l p re s e n te d o c u m e n to , e l té rm in o " in h ib id o r d e m T O R " s e re f ie re a un c o m p u e s to o lig a n d o , o u n a s a l fa rm a c é u t ic a m e n te a c e p ta b le d e l m is m o , q u e in h ib e la q u in a s a m T O R e n u n a c é lu la . E n un c a s o , un in h ib id o r d e m T O R e s un in h ib id o r a lo s té r ic o . E n un c a s o , un in h ib id o r d e m T O R e s un in h ib id o r c a ta lí t ic o .

L a a d m in is tra c ió n d e u n a d o s is b a ja q u e a u m e n ta la in m u n id a d d e un in h ib id o r d e m T O R p u e d e c o m b in a rs e c o n la a d m in is tra c ió n d e c é lu la s R C A R /N K R -C A R X o R N K R -C A R X d e s c r ita s en e l p re s e n te d o c u m e n to , p o r e je m p lo , c é lu la s e fe c to ra s in m u n ita r ia s (p o r e je m p lo , c é lu la s T o c é lu la s N K ). d is e ñ a d o p a ra e x p re s a r u n re c e p to r d e a n tíg e n o ^{q u im é r ic o re g u la b le (R C A R ) y un n}K^r-C^aR, ^{o p a ra e x p re s a r un r}N^kR-CAR.

L a a d m in is tra c ió n d e u n a d o s is b a ja , q u e a u m e n ta la in m u n id a d , d e un in h ib id o r d e m T O R p u e d e o p t im iz a r e l re n d im ie n to d e la s c é lu la s e fe c to ra s in m u n e s en e l s u je to . D e p e n d ie n d o d e l m o m e n to y la d o s is d e l in h ib id o r d e m T O R , s e p u e d e o p t im iz a r e l re n d im ie n to d e la s c é lu la s T re c o le c ta d a s , la s c é lu la s T n o re c o le c ta d a s o a m b a s .

S i b ie n no se d e s e a c e ñ irs e a la te o r ía , se c re e q u e e l t ra ta m ie n to c o n u n a d o s is b a ja q u e m e jo ra la in m u n id a d (p o r e je m p lo , U n a d o s is q u e e s in s u f ic ie n te p a ra s u p r im ir c o m p le ta m e n te e l s is te m a in m u n o ló g ic o p e ro s u f ic ie n te p a ra m e jo ra r la fu n c ió n in m u n o ló g ic a ) s e a c o m p a ñ a d e u n a d is m in u c ió n d e la E P . -1 c é lu la s T p o s it iv a s o un a u m e n to d e c é lu la s P D -1 n e g a tiv a s , a l m e n o s d e fo rm a t ra n s ito r ia , en c o m p a ra c ió n co n un s u je to no tra ta d o . L o s l in fo c ito s T p o s it iv o s p a ra P D -1 , p e ro no lo s l in fo c ito s T n e g a t iv o s p a ra P D -1 , p u e d e n a g o ta rs e m e d ia n te e l a c o p la m ie n to co n c é lu la s q u e e x p re s a n un lig a n d o P D -1 , p o r e je m p lo , P D -L 1 o P D -L 2. A d e m á s o a lte rn a t iv a m e n te , d e n u e v o , a u n q u e s in d e s e a r e s ta r l ig a d o a la te o r ía , s e c re e q u e u n a d o s is b a ja , q u e a u m e n ta la in m u n id a d , d e un in h ib id o r d e m T O R p u e d e a u m e n ta r e l n ú m e ro d e c é lu la s T v írg e n e s , p o r e je m p lo , a l m e n o s tra n s ito r ia m e n te , p o r e je m p lo , en c o m p a ra c ió n c o n -s u je to tra ta d o . A lte rn a t iv a m e n te o a d ic io n a lm e n te , n u e v a m e n te s in d e s e a r e s ta r l ig a d o a la te o r ía , un a u m e n to e n la e x p re s ió n d e u n o o m á s d e lo s s ig u ie n te s m a rc a d o re s : C D 62 L alto, C D 127 a lto, C D 27 y B C L 2 , p o r e je m p lo , en c é lu la s T d e m e m o r ia , p o r e je m p lo , p re c u rs o re s d e c é lu la s T d e m e m o r ia ; u n a d is m in u c ió n en la e x p re s ió n d e K L R G 1 , p o r e je m p lo , en c é lu la s T d e m e m o r ia , p o r e je m p lo , p re c u rs o re s d e c é lu la s T d e m e m o r ia ; y

un a u m e n to en e l n ú m e ro d e p re c u rs o re s d e c é lu la s T d e m e m o r ia , p o r e je m p lo , c é lu la s co n u n a c u a lq u ie ra o u n a c o m b in a c ió n d e la s s ig u ie n te s c a ra c te r ís t ic a s : a u m e n to d e C D 62 L alto, a u m e n to d e C D 127 alto, a u m e n to d e C D 27 , d is m in u c ió n d e K L R G 1 y a u m e n to d e B C L 2 ;

y en e l q u e se p ro d u c e c u a lq u ie ra d e lo s c a m b io s d e s c r ito s a n te r io rm e n te , p o r e je m p lo , a l m e n o s d e fo rm a tra n s ito r ia , p o r e je m p lo , e n c o m p a ra c ió n c o n un s u je to n o tra ta d o .

Los precursores de células T de memoria son células T de memoria que se encuentran en las primeras etapas del programa de diferenciación. Por ejemplo, las células T de memoria tienen una o más de las siguientes características: aumento de CD62L alto, aumento de CD127alto, aumento de CD27 , disminución de KLRG1 y/o aumento de BCL2.

En un caso, las células que expresan una molécula de CAR, por ejemplo, una molécula de CAR descrita en el presente documento, se administran en combinación con una dosis baja que mejora la inmunidad de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor de mTOR alostérico, incluidos rapalogs como RAD001. .

En un caso, la administración de una dosis baja, que aumenta la inmunidad, de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor alostérico, por ejemplo, RAD001, o un inhibidor catalítico, se inicia o completa antes de la administración (por ejemplo, antes de la recolección o después de la recolección de las células efectoras inmunes, por ejemplo, células T diseñadas para expresar un RCAR y NKR-CAR, o células T diseñadas para expresar un RNKR-CAR, pero antes de la administración de las células ^rC^aR/NKR-CARX o RNKR-CARX) de una célula RCAR/NKR-C^aR^xo RNKR-CARX descrita en el presente documento, por ejemplo, células efectoras inmunes, por ejemplo, células T, diseñadas para expresar un RCAR y NKR-CAR o para expresar RNKR-CAR, o se inicia o completa después de la administración de una célula RCAR/NKR-CARX o RNKR-CARX descrita en el presente documento.

En un caso, una dosis de un inhibidor de mTOR se asocia con, o proporciona, una inhibición de mTOR de al menos 5 pero no más del 90%, al menos 10 pero no más del 90%, al menos 15, pero no más del 90% , al menos 20 pero no más del 90%, al menos 30 pero no más del 90%, al menos 40 pero no más del 90%, al menos 50 pero no más del 90%, al menos 60 pero no más del 90% , al menos 70 pero no más del 90%, al menos 5 pero no más del 80%, al menos 10 pero no más del 80%, al menos 15, pero no más del 80%, al menos 20 pero no más del 80 %, al menos 30 pero no más del 80%, al menos 40 pero no más del 80%, al menos 50 pero no más del 80%, al menos 60 pero no más del 80%, al menos 5 pero no más del 70 %, al menos 10 pero no más del 70%, al menos 15, pero no más del 70%, al menos 20 pero no más del 70%, al menos 30 pero no más del 70%,al menos 40 pero no más del 70%, al menos 50 pero no más del 70%, al menos 5 pero no más del 60%, al menos 10 pero no más del 60%, al menos 15, pero no más del 60% , al menos 20 pero no más del 60%, al menos 30 pero no más del 60%, al menos 40 pero no más del 60%, al menos 5 pero no más del 50%, al menos 10 pero no más del 50% , al menos 15, pero no más del 50%, al menos 20 pero no más del 50%, al menos 30 pero no más del 50%, al menos 40 pero no más del 50%, al menos 5 pero no más del 40 %, al menos 10 pero no más del 40%, al menos 15, pero no más del 40%, al menos 20 pero no más del 40%, al menos 30 pero no más del 40%, al menos 35 pero no más del 40%, al menos 5 pero no más del 30%, al menos 10 pero no más del 30%, al menos 15, pero no más del 30%, al menos 20 pero no más del 30%, o al menos 25 pero no mas de 30%.

En un caso, una dosis de un inhibidor de mTOR se asocia con, o proporciona, una inhibición de mTOR de al menos 1, 2, 3, 4 o 5 pero no más del 20%, al menos 1, 2, 3, 4 o 5 pero no más del 30%, al menos 1, 2, 3, 4 o 5, pero no más del 35, al menos 1, 2, 3, 4 o 5 pero no más del 40%, o al menos 1,2, 3, 4 o 5 pero no más del 45%.

En un caso, una dosis de un inhibidor de mTOR se asocia con, o proporciona, una inhibición de mTOR de al menos 1, 2, 3, 4 o 5 pero no más del 90%.

Como se discute en el presente documento, el grado de inhibición de mTOR se puede expresar como el grado de inhibición de la quinasa P70 S6, por ejemplo, El grado de inhibición de mTOR puede determinarse por el nivel de disminución en la actividad de la quinasa P70 S6, por ejemplo disminución de la fosforilación de un sustrato de quinasa P70 S6. El nivel de inhibición de mTOR puede evaluarse mediante un procedimiento descrito en el presente documento, por ejemplo, mediante el ensayo de Boulay, o la medición de los niveles de S6 fosforilada mediante transferencia Western.

mTOR fosforila la quinasa P70 S6, activando así la quinasa P70 S6 y permitiéndole fosforilar su sustrato. El grado de inhibición de mTOR se puede expresar como el grado de inhibición de la quinasa P70 S6, por ejemplo, El grado de inhibición de mTOR puede determinarse por el nivel de disminución de la actividad de la quinasa P70 S6, por ejemplo, Mediante la disminución de la fosforilación de una quinasa P70 S6 sustrato. Se puede determinar el nivel de inhibición de mTOR, midiendo la actividad de la quinasa P70 S6 (la capacidad de la quinasa P70 S6 para fosforilar un sustrato), en ausencia de inhibidor, por ejemplo, Antes de la administración del inhibidor y en presencia de inhibidor, o después de la administración de inhibidor. El nivel de inhibición de la quinasa P70 S6 da el nivel de inhibición de mTOR. Por lo tanto, si la quinasa P70 S6 se inhibe en un 40%, la actividad de mTOR, medida por la actividad de la quinasa P70 S6, se inhibe en un 40%. El grado o nivel de inhibición al que se hace referencia en el presente documento es el nivel medio de inhibición durante el intervalo de dosificación. A modo de ejemplo, si el inhibidor se administra una vez por semana, el nivel de inhibición viene dado por el nivel medio de inhibición durante ese intervalo, es decir, una semana.

Boulay y col., Cancer Res, 2004, 64: 252-61, enseña un ensayo que puede usarse para evaluar el nivel de inhibición de mTOR (denominado en el presente documento ensayo de Boulay). En un caso, el ensayo se basa en la medición d e la a c t iv id a d q u in a s a P 70 S 6 d e m u e s tra s b io ló g ic a s a n te s y d e s p u é s d e la a d m in is tra c ió n d e un in h ib id o r d e m T O R , p o r e je m p lo , R A D 001. L a s m u e s tra s se p u e d e n to m a r en m o m e n to s p re s e le c c io n a d o s d e s p u é s d e l t ra ta m ie n to c o n un in h ib id o r d e m T O R , p o r e je m p lo , 24 , 48 y 72 h o ra s d e s p u é s d e l t ra ta m ie n to . P u e d e n u s a rs e m u e s tra s b io ló g ic a s , p o r e je m p lo , d e p ie l o c é lu la s m o n o n u c le a re s d e s a n g re p e r ifé r ic a (P B M C ). S e p re p a ra n e x tra c to s d e p ro te ín a s to ta le s a p a r t ir d e la s m u e s tra s . La q u in a s a P 70 S 6 se a ís la d e lo s e x tra c to s d e p ro te ín a s m e d ia n te in m u n o p re c ip ita c ió n u s a n d o un a n t ic u e rp o q u e re c o n o c e e s p e c íf ic a m e n te la q u in a s a P 70 S 6. La a c t iv id a d d e la q u in a s a P 70 S 6 a is la d a s e p u e d e m e d ir en un e n s a y o d e q u in a s a in v it r o .32 P en c o n d ic io n e s q u e p e rm ita n la fo s fo r ila c ió n d e l s u s tra to . A c o n tin u a c ió n , la m e z c la d e re a c c ió n se p u e d e re s o lv e r en un g e l S D S -P A G E , y se p u e d e a n a liz a r la s e ñ a l d e 32 P u s a n d o un P h o s p h o r Im a g e r . U n a s e ñ a l d e 32 P c o rre s p o n d ie n te a l ta m a ñ o d e la s u b u n id a d r ib o s ó m ic a 40 S in d ic a s u s tra to fo s fo r ila d o y la a c t iv id a d d e la q u in a s a P 70 S 6. L o s a u m e n to s y d is m in u c io n e s e n la a c t iv id a d d e la q u in a s a se p u e d e n c a lc u la r c u a n ti f ic a n d o e l á re a y la in te n s id a d d e l 32S e ñ a l P d e l s u s tra to fo s fo r ila d o (p o r e je m p lo , u s a n d o Im a g e Q u a n t, M o le c u la r D y n a m ic s ) , a s ig n a n d o v a lo re s u n ita r io s a rb it ra r io s a la s e ñ a l c u a n tif ic a d a y c o m p a ra n d o lo s v a lo re s d e s p u é s d e la a d m in is tra c ió n c o n lo s v a lo re s a n te s d e la a d m in is tra c ió n o c o n un v a lo r d e re fe re n c ia . P o r e je m p lo , e l p o rc e n ta je d e in h ib ic ió n d e la a c t iv id a d q u in a s a s e p u e d e c a lc u la r c o n la s ig u ie n te fó rm u la : 1 - ( v a lo r o b te n id o d e s p u é s d e la a d m in is t ra c ió n /v a lo r o b te n id o a n te s d e la a d m in is t ra c ió n ) X 100. C o m o se d e s c r ib ió a n te r io rm e n te , e l g ra d o o n iv e l d e in h ib ic ió n a l q u e s e h a c e re fe re n c ia a q u í e s e l n iv e l p ro m e d io d e in h ib ic ió n d u ra n te e l in te rv a lo d e d o s if ic a c ió n .

L o s p ro c e d im ie n to s p a ra la e v a lu a c ió n d e la a c t iv id a d q u in a s a , p o r e je m p lo , a c t iv id a d q u in a s a P 70 S 6 , ta m b ié n se p ro p o rc io n a n e n e l d o c u m e n to U S 7.727.950.

E l n iv e l d e in h ib ic ió n d e m T O R ta m b ié n p u e d e e v a lu a rs e m e d ia n te un c a m b io en la p ro p o rc ió n d e c é lu la s T PD 1 n e g a t iv a s a P D 1 p o s it iv a s . L a s c é lu la s T d e s a n g re p e r ifé r ic a se p u e d e n id e n t if ic a r c o m o P D 1 n e g a t iv a s o p o s it iv a s m e d ia n te p ro c e d im ie n to s c o n o c id o s en la té c n ic a .

EJEMPLOS

L a d iv u lg a c ió n se d e s c r ib e a d ic io n a lm e n te en d e ta lle m e d ia n te re fe re n c ia a lo s s ig u ie n te s e je m p lo s e x p e r im e n ta le s . E s to s e je m p lo s se p ro p o rc io n a n ú n ic a m e n te c o n f in e s ilu s tra t iv o s y n o p re te n d e n s e r lim ita n te s a m e n o s q u e se e s p e c if iq u e lo c o n tra r io . P o r ta n to , la d iv u lg a c ió n n o d e b e in te rp re ta rs e d e n in g u n a m a n e ra c o m o lim ita d a a lo s s ig u ie n te s e je m p lo s , s in o q u e , m á s b ie n , d e b e in te rp re ta rs e p a ra a b a rc a r to d a s y c a d a u n a d e las v a r ia c io n e s q u e re s u lte n e v id e n te s c o m o re s u lta d o d e la e n s e ñ a n z a p ro p o rc io n a d a e n e l p re s e n te d o c u m e n to .

S in d e s c r ip c ió n a d ic io n a l, se c re e q u e un e x p e r to e n la m a te r ia p u e d e , u s a n d o la d e s c r ip c ió n a n te r io r y lo s s ig u ie n te s e je m p lo s ilu s tra t iv o s , p re p a ra r y u t i l iz a r lo s c o m p u e s to s d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n y p ra c t ic a r lo s p ro c e d im ie n to s re iv in d ic a d o s . L o s s ig u ie n te s e je m p lo s d e tra b a jo s e ñ a la n e s p e c íf ic a m e n te v a r io s a s p e c to s d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n y n o d e b e n in te rp re ta rs e c o m o lim ita n te s d e n in g u n a m a n e ra e l re s to d e la d iv u lg a c ió n .

Ejemplo 1: CAR regulable usando un conmutador de rapálogo

E s te e je m p lo ilu s tra un c o n c e p to g e n e ra l im p o r ta n te q u e s u b y a c e a re a liz a c io n e s d e re c e p to re s d e a n tíg e n o s q u im é r ic o s re g u la b le s (R C A R ), q u e s e b a s a e n la s e p a ra c ió n d e un m ie m b ro d e u n ió n a a n tíg e n o ( "e v e n to d e u n ió n ") d e un m ie m b ro d e s e ñ a liz a c ió n in t ra c e lu la r ( "e v e n to d e s e ñ a liz a c ió n " ) . E n p re s e n c ia d e u n a m o lé c u la d e d im e r iz a c ió n , p o r e je m p lo , u n a m o lé c u la p e q u e ñ a , lo s d o m in io s d e c o n m u ta c ió n d e l m ie m b ro d e u n ió n a a n tíg e n o y e l m ie m b ro d e s e ñ a liz a c ió n in t ra c e lu la r a s o c ia n y a c t iv a n la t ra n s d u c c ió n d e s e ñ a le s en la m o lé c u la R C A R a h o ra a s o c ia d a . A m o d o d e e je m p lo , un d o m in io d e u n ió n a a n tíg e n o e x tra c e lu la r , c o m o un s c F v , se fu s io n a co n un d o m in io t ra n s m e m b ra n a y un p r im e r d o m in io d e c o n m u ta c ió n (p o r e je m p lo , un d o m in io d e c o n m u ta c ió n d e F K B P o F R B ) d e l c o n m u ta d o r d e d im e r iz a c ió n (p o r e je m p lo , un c o n m u ta d o r d e h e te ro d im e r iz a c ió n ) . El d o m in io de s e ñ a liz a c ió n in t ra c e lu la r c o m p re n d e un s e g u n d o d o m in io d e c o n m u ta c ió n (p o r e je m p lo , F R B o F K B P ) d e l c o n m u ta d o r d e h e te ro d im e r iz a c ió n y u n o o m á s d o m in io s d e s e ñ a liz a c ió n in t ra c e lu la r ta le s c o m o 4 -1 B B y C D 3 z e ta . La d im e r iz a c ió n y e l in ic io d e la c a s c a d a d e s e ñ a liz a c ió n se c o n s ig u ie ro n m e d ia n te la a d ic ió n d e un h e te ro d im e r iz a d o r d e m o lé c u la p e q u e ñ a ( "m o lé c u la d e h e te ro d im e r iz a c ió n " p o rq u e lo s d o m in io s d e c o n m u ta c ió n no s o n lo s m is m o s ) q u e u n e e l d o m in io d e u n ió n e x tra c e lu la r a l d o m in io d e s e ñ a liz a c ió n in tra c e lu la r . E n e s te e je m p lo , la m o lé c u la p e q u e ñ a q u e in d u c e la d im e r iz a c ió n p u e d e s e r ra p a m ic in a o a n á lo g o s d e la m is m a (d e n o m in a d a " ra p á lo g o " ) . La ra p a m ic in a o ra p á lo g o s fu n c io n a n u n ié n d o s e co n a lta a f in id a d a F K B P y a l d o m in io F R B d e m T O R , a c tu a n d o a s í c o m o un h e te ro d im e r iz a d o r p a ra in d u c ir la fo rm a c ió n d e l c o m p le jo C h o i, J ., e t a l (1996 ) E s tru c tu ra d e l c o m p le jo F K B P 12 - ra p a m ic in a q u e in te ra c c io n a c o n la u n ió n d o m in io d e la c ie n c ia F R A P h u m a n a 273 : 239 -42 ) .

L o s s ig u ie n te s e je m p lo s ilu s tra n q u e e l c o n m u ta d o r d e d im e r iz a c ió n p u e d e e s ta r en e l in te r io r o e l e x te r io r d e la c é lu la .

S ó lo c o n f in e s ilu s tra t iv o s , e l f ra g m e n to s c F v d e E G F R v III d e n o m in a d o "139 " se u só c o m o un d o m in io d e u n ió n a a n tíg e n o e x tra c e lu la r p a ra g e n e ra r lo s R C A R . E s te s c F v se d e r iv a d e un a n t ic u e rp o h u m a n o c o n tra E G F R v III (M o rg a n e t a l., 2012 H u m G e n e T h e r 23 (10 ): 1043 -53 ). P a ra g e n e ra r un R C A R , s e g e n e ró un p a r d e c o n s tru c c io n e s y se c o e x p re s ó en la c é lu la e fe c to ra in m u n ita r ia d ia n a . L o s d iv e rs o s d o m in io s d e c o n m u ta c ió n d e l c o n m u ta d o r d e heterodimerización se pueden enlazar a diferentes dominios de la construcción RCAR.

"Conmutador 1" comprende un par de construcciones. La primera construcción se diseñó en la que el dominio de unión a antígeno (139 scFv) se construyó fusionando una secuencia líder al 139 scFv seguido de una región bisagra, una región transmembrana, un enlazador y el primer dominio de conmutación intracelular - FRB (SEQ ID NO : 3). La segunda construcción se diseñó fusionando el segundo dominio de conmutación - FKBP a un segundo enlazador y los dominios de señalización 4-1BB seguidos por CD3zeta (SEQ ID NO: 4).

El "conmutador 2" comprende un par de construcciones. La primera construcción se diseñó en la que el dominio de unión a antígeno se construyó fusionando una secuencia líder al 139 scFv seguido de una región bisagra, una región transmembrana, un enlazador y el primer dominio de conmutación intracelular - FKBP (SEQ ID NO: 5) . La construcción de señalización intracelular correspondiente se diseñó fusionando el segundo dominio de conmutación - FRB a un segundo enlazador y los dominios de señalización intracelular 4-1BB seguidos de CD3zeta (SEQ ID NO: 6).

La secuencia de CAR EGFRvIII para 139 scFv se clonó con los dominios de señalización para 4-1BB y CD3 zeta. La construcción de CAR no regulable (139scFv-BBZ, SEQ ID NO: 7) se expresa a partir del vector pELNS para la producción de lentivirus y se usa en los experimentos posteriores como control.

Clon EGFRvIII 139-CD8alfaTM-FRB (SEQ ID NO: 3) Malpvtalllplalllhaarpdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgimnlawyqqkpgkapkrliyaasnlqsgvpsrftgsg sgteftlivsslqpedfatyyclqhhsypltsgggtkveikrtgstsgsgkpgsgegsevqvlesggglvqpggslrlscaasgftfs syamswvrqapgkglewvsaisgsggstnyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycagssgwseywgqgtlv tvsstttpaprpptpaptiasqplskpeacrpaaggavhtrgldfacdiviwaplagtcgvlllslvitlvckrgrkkllggggsggg gsasrilwhemwhegleeasrlyfgernvkgmfevleplhammergpqtlketsfnqaygrdlmeaqewcrkymksgnv kdllqawdlyyhvfrriskts

FKBP-4- lBB-CD3zeta (SEQ ID NO: 4) mgvqvetispgdgrtfpkrgqtcvvhytgmledgkkfdssrdmkpfkfmlgkqevirgweegvaqmsvgqrakltispdy aygatghpgiipphatlvfdvellkletsggggsggggskrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfs Malpvtalllplalllhaarpdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgimnlawyqqkpgkapkrliyaasnlqsgvpsrftgsg sgteftlivsslqpedfatyyclqhhsypltsgggtkveikrtgstsgsgkpgsgegsevqvlesggglvqpggslrlscaasgftfs syamswvrqapgkglewvsaisgsggstnyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycagssgwseywgqgtlv tvs stttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaag gavhtr gldfacdiyi waplagtc gvlllslvitlyckrgrkkll ggggsggg gsgvqvetispgdgrtfpkrgqtcvvhvtgmledgkkfdssrdmkpfkfmlgkqevirgweegvaqmsvgqrakltispdy aygatghpgiipphatlvfdvellklets

FRB-4- lBB-CD3zeta (SEQ ID NO: 6)

Masrilwhemwhegleeasrlyfgernvkgmfevleplhammergpqtlketsfnqaygrdlmeaqewcrkymksgnv kdllqawdlyyhvfrrisktsggggsggggskrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapa ykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqgl statkdtydalhmqalppr

139scFv-BBz (Control) (SEQ ID NO: 7)

MALPVTALLLPLALLLHAARPGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNNLA WYQQKPGKAPKRLIYAASNLQSGVPSRFTGSGSGTEFTLIVSSLQPEDFATYYCLQH HSYPLTSGGGTKVEIKRTGSTSGSGKPGSGEGSEVQYLESGGGLVQPGGSLRLSCAA SGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCAGSSGWSEYWGQGTLVTVSSASTTTPAPRPPTPAPTIASQ PLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRK KLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQ LYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEI GMKGERRRGKGHDGLY QGLST ATKDTYD ALHMQ ALPPR

Estructura 1: AP21967

Estructura de heterodimerizador A/C

Materiales y procedimientos

Expresión en superficie de construcciones EGFRvIlI CAR y tinción por FACS

Se sometieron a electroporación células Jurkat E6 con las diversas construcciones EGFRvIlI CAR o el vector de control 139 CAR usando el kit Amaxa Cell Line Nucleofector V (Lonza, Colgne AG, Alemania) y el programa X-001. Un día después de la transfección, 0.5x10⁶las células se colocaron en cada pocillo de una placa de 96 pocillos en forma de V (Greiner Bio-One, Alemania) en 0,2 ml de tampón FACS (tampón DPBS que contenía FBS al 5%) y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, las células se centrifugaron y se resuspendieron en 0,2 ml del tampón FACS con 100 nM de EGFRvIII-Fc y se incubaron a 4°C durante 60 minutos. Después, las células se lavaron con tampón FACS dos veces y se incubaron con 0,2 ml del tampón FACS con 1 |jl de PE anti-IgG Fc humana (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) durante 30 minutos a 4°C en la oscuridad. Después de lavar con 0,2 ml de tampón FACS dos veces, las células se analizaron en una máquina LSRII (BD Biosciences, San José, CA) utilizando el software FACSDiva (BD Biosciences, San José, CA). La tinción de inmunofluorescencia se analizó como la fluorescencia relativa logarítmica de las células vivas, Generación de la línea celular informadora Jurkat para la caracterización inicial de la función CAR

Como alternativa a la transducción y activación de células T primarias, se puede usar una línea de células informadoras Jurkat-NFAT para evaluar la actividad funcional de las construcciones CAR. La línea de células Jurkat T (E6-1) se transfectó con un constructo informador de NFAT-luciferasa y se seleccionó una línea celular clonal estable de células Jurkat con informador NFAT-LUC (JNL) para una caracterización adicional basada en una fuerte inducción del informador NFAT después de la estimulación con PMA e ionomicina.

Transfección de la línea celular indicadora Jurkat y activación de NFAT mediante el conmutador 1 o el conmutador 2 Se cultivaron células Jurkat con indicador NFAT-LUC (JNL) hasta la densidad de 0,5 x 10⁶/ml en medio de crecimiento de células Jurkat con puromicina a 0,5 jg/ml. Por cada transfección 2,5 x 10⁶las células se centrifugaron a 100 g durante 10 minutos. Se utilizaron dos jg de ADN por construcción por transfección. Se mezclaron la solución V de Nucleofector de Amaxa y el suplemento I y se añadieron 100 j l al tubo con la construcción de ADN. A continuación se añadió la mezcla a las células y se transfirió a la cubeta de electroporación. La electroporación se realizó en el ajuste X-001 utilizando el dispositivo Amaxa Nucleofector II. Se añadieron 0,5 ml de medio de crecimiento inmediatamente después de la electroporación y la mezcla se transfirió a 2 ml de medio de crecimiento en un pocillo de la placa de 6 pocillos. Después de una hora, se aplicó el compuesto A/Z a la concentración final de 500 nM. Las células se incubaron en la incubadora a 37 ° C con 5% de CO ²durante la noche durante 18 hrs. La placa de cultivo de tejido se revistió con 5 jg/ml de EGFRvIII-Fc o IgG1-Fc durante 2 horas, bloqueada con el tampón de bloqueo (DPBS con suero al 5%) durante 1 hora. Las células transfectadas con o sin compuesto A/Z se resuspendieron y se añadieron a la placa diana con 100 j l por pocillo y se incubaron durante 18 horas. Se añadieron 100 j l de reactivo Luciferase One Glo por pocillo. Las muestras se incubaron durante 5 min a 37 ° C y a continuación se midió la luminiscencia usando un luminómetro.

Respuesta a la dosis de rapálogo sobre la activación de NFAT

Se midió la capacidad de las construcciones RCAR para demostrar la activación de la señal dependiente de rapálogo después del acoplamiento del antígeno diana del dominio de unión a antígeno con las células Jurkat con la línea celular informadora NFAT-LUC (JNL). Específicamente, se cultivaron JNL a una densidad de 0,5 x 10⁶/ml en medio de crecimiento de células Jurkat con puromicina a 0,5 jg/ml. Por cada transfección 2,5 x 10⁶las células se centrifugaron a 100 g durante 10 minutos. Se utilizaron dos jg de ADN por construcción por transfección. Se mezclaron la solución V de Nucleofector de Amaxa y el suplemento I y se añadieron 100 j l al tubo con la construcción de ADN. A continuación se añadió la mezcla a las células y se transfirió a la cubeta de electroporación. La electroporación se realizó en el ajuste X-001 utilizando el dispositivo Amaxa Nucleofector II. Se añadieron 0,5 ml de medio de crecimiento inmediatamente después de la electroporación y la mezcla se transfirió a 2 ml de medio de crecimiento en un pocillo de la placa de 6 pocillos. Después de una hora, se añadió a las células el compuesto rapálogo a diversas concentraciones. Las células se incubaron en la incubadora a 37 ° C con 5% de CO2 durante la noche durante 18 hrs. La placa de cultivo de tejidos se revistió con 5 jg/ml de EGFRvIII-Fc o IgG1-Fc durante 2 horas, bloqueada con el tampón de bloqueo (DPBS con suero al 5%) durante 1 hora. Las células transfectadas se añadieron a la placa diana con 100 j l por pocillo y se incubaron durante 18 horas más. Se añadieron 100 j l de reactivo Luciferase One Glo por pocillo. Las muestras se incubaron durante 5 min a 37 ° C y a continuación se midió la luminiscencia usando un luminómetro.

Resultados

Ensayo informador Jurkat para probar la actividad mediada por diana del CAR-EGFRvIII regulado por rapálogo En conjunto, estos experimentos demuestran que varios componentes de un RCAR pueden diseñarse por separado y combinarse en presencia de una molécula de dimerización para activar la señalización en el RCAR. La expresión superficial del scFv se evaluó mediante citometría de flujo y se demostró que era de aproximadamente -50%. para todos los constructos (datos no mostrados). Las células JNL-RCAR-EGFRvIII se estimularon a continuación con o sin rapálogo (molécula de heterodimerización) demostrando que las construcciones RCAR se expresaban en la superficie de las células. Las células parentales JNL y las células JNL que expresan un CAR de control se incluyeron como controles adicionales. La Fig. 12A muestra los resultados de estudios diseñados para investigar los eventos de señalización entre el RCAR que expresa el dominio de unión a antígeno, por ejemplo, scFv, y RCAR que expresa los dominios de señalización intracelular en presencia de una molécula de heterodimerización. Los datos muestran una activación regulada por la diana significativa tras la estimulación con el rapálogo igual al RCAR de control. Además, no se observó una activación significativa en el objetivo en ausencia del rapálogo, lo que indica un cambio mediado por la heterodimerización regulada por moléculas pequeñas de los dominios de conmutación (FKBP y FRB). Finalmente, no se observó activación contra un objetivo de control (solo IgG1-Fc) (barras abiertas). Estos datos demuestran la especificidad de las construcciones RCAR para EGFRvIII diana en presencia del rapálogo solamente, y la falta de reactividad cruzada para controlar el diana o en ausencia de rapálogo. Estos datos muestran por primera vez que las construcciones RCAR se pueden regular con un conmutador de heterodimerización. Los datos muestran una activación regulada por la diana significativa tras la estimulación con el rapálogo igual al RCAR de control. Además, no se observó una activación significativa en el objetivo en ausencia del rapálogo, lo que indica un cambio mediado por la heterodimerización regulada por moléculas pequeñas de los dominios de conmutación (FKBP y FRB). Finalmente, no se observó activación contra un objetivo de control (solo IgG1-Fc) (barras abiertas). Estos datos demuestran la especificidad de las construcciones RCAR para EGFRvIII diana en presencia del rapálogo solamente, y la falta de reactividad cruzada para controlar el diana o en ausencia de rapálogo. Estos datos muestran por primera vez que las construcciones RCAR se pueden regular con un conmutador de heterodimerización. Los datos muestran una activación regulada por la diana significativa tras la estimulación con el rapálogo igual al RCAR de control. Además, no se observó una activación significativa en el objetivo en ausencia del rapálogo, lo que indica un cambio mediado por la heterodimerización regulada por moléculas pequeñas de los dominios de conmutación (FKBP y FRB). Finalmente, no se observó activación contra un objetivo de control (solo IgG1-Fc) (barras abiertas). Estos datos demuestran la especificidad de las construcciones RCAR para EGFRvIII diana en presencia del rapálogo solamente, y la falta de reactividad cruzada para controlar el diana o en ausencia de rapálogo. Estos datos muestran por primera vez que las construcciones RCAR se pueden regular con un conmutador de heterodimerización

Para determinar la respuesta a la dosis, se aplicó rapaloque ("heterodimerizador A/C" AP21967), en varias concentraciones, a las células transfectadas que se cotransfectaron con el clon 139-CD8alphaTM-FKBP de EGFRvIII (SEQ ID NO: 5, construcción 66 ) y FRB-4-1BB-CD3zeta (SEQ ID NO: 6, construcción 67) y se midió la activación de NFAT. Se utilizó EGFRvIII 139scFv-BBz (SEQ ID NO: 7) como control.

Como se muestra en la Fig. 12B, el número de veces de activación de NFAT permaneció relativamente constante desde una concentración de 500 nM hasta tan baja como 20 nM. Sorprendentemente, incluso a una concentración de rapálogo de 0,8 nM, todavía hay 2-3 veces la inducción de NFAT mediada por la diana. La disminución en el número de veces de activación se debió probablemente a una disminución en la extensión de 4-1BB-CD3 zeta dimerizado, mientras que la expresión fue bastante comparable a lo largo de las diversas concentraciones del tratamiento con rapálogo. Este resultado indicó que rapálogo es potente en la mediación de la dimerización de FKRP y FBP en el contexto de un conmutador de heterodimerización utilizado en RCAR. Uno esperaría ver resultados similares cuando los conmutadores se invierten de manera que la FKBP esté en el dominio de señalización intracelular y la FRB esté en el dominio de unión a antígeno de 139 scFv. Como en la Fig. 12A, no se observó activación contra un IgG1-Fc diana de control (segundo conjunto de barras para cada pareja de barras).

El concepto, los procedimientos y las composiciones descritos en este ejemplo son aplicables a los RNKR-CAR. El concepto, procedimientos y composiciones descritos en este ejemplo son aplicables a células RCAR/NKR-CARX y/o células RNKR-CARX.

Ejemplo 2: CAR regulable con un conmutador de cumermicina

El siguiente ejemplo ilustra el uso de dimerización regulada por cumermicina (Farrar, MA et al, 1996, nature. 383,: 178-181) para activar una construcción RCAR. En este ejemplo, el conmutador se diseña fusionando una secuencia líder al 139 scFv seguido de una región bisagra, una región transmembrana, un enlazador y el primer dominio de conmutación intracelular - GyrB (SEQ ID NO: 8). La segunda construcción se diseñó fusionando el segundo dominio de conmutación GyrB con un segundo enlazador y los dominios de señalización intracelular 4-1BB seguido de CD3zeta (SEQ ID NO: 9). Como los dominios de conmutación son iguales, este conmutador de dimerización se denomina "conmutador de homodimerización". La activación de la señal de la célula T se regulará mediante la adición de la molécula pequeña cumermicina (Estructura 2).

Estructura 2; Cumermicina

Clon EGFRvIlI 139-CD8alfaTM-gyrB (SEQ ID NO: 8)

Malpvtalllplalllhaarpdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgirnnlawyqqkpgkapkrliyaasnlqsgvpsrftgsg

sgteftlivsslqpedfatyyclqhhsypltsgggtkveikrtgstsgsgkpgsgegsevqvlesggglvqpggslrlscaasgftfs

syamswvrqapgkglewvsaisgsggstnyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycagssgwseywgqgtlv

tvsstttpaprpptpaptiasqp1s1rpeacrpaaggavhtrg1dfacdiviwap1agtcgv111s1vit1vckrgrkk11ggggsggg

gsSNSYDSSSIKVLKGLDAVRKRPGMYIGDTDDGTGLHHMVFEVVDNAIDEALAGHCKEIIVTIHADN

SVSVQDDGRGIPTGIHPEEGVSAAEVIMTVLHAGGKFDDNSYKVSGGLHGVGVSVVNALSQKLELVI QREGKIHRQIYEHGVPQAPLAVTGETEKTGTMVRFWPSLETFTNVTEFEYEILAKRLRELSFLNSGVSI RLRDKRDGKEDHFHYEG

GyrB-4-lBB-CD3zeta (SEQ ID NO: 9)

MSNSYDSSSIKVLKGLDAVRKRPGMYIGDTDDGTGLHHMVFEVVDNAIDEALAGHCKEIIVTIHADN SVSVQDDGRGIPTGIHPEEGVSAAEVIMTVLHAGGKFDDNSYKVSGGLHGVGVSVVNALSQKLELVI

QREGKIHRQIYEHGVPQAPLAVTGETEKTGTMVRFWPSLETFTNVTEFEYEILAKRLRELSFLNSGVSI

RLRDKRDGKEDHFHYEGggggsggggski’grkkllyifkqpfm i’pvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsada

paykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpem ggkprrknpqeglynelqkdkm aeayseigm kgerrrgkghdgly

qglstatkdtydalhm qalppr

Materiales y procedimientos

Síntesis de ADN para CAR regulable usando el conmutador de cumermicina

La cumermicina está disponible comercialmente de varios proveedores. La secuencia para el scFv 139 se clonó con los dominios de señalización para 4-1BB y CD3 zeta. La construcción CAR no regulable, 139scFv-BBZ, SEQ ID: 7, se puede utilizar como control. Para el RCAR de cumermicina, el 139 scFv se clonó con un dominio transmembrana seguido del dominio de conmutación GyrB en el extremo c-terminal (SEQ ID NO: 8) y la construcción de activación correspondiente realizada fusionando GyrB con un enlazador y los dominios de señalización 4-1BB seguido de CD3zeta (SEQ ID NO: 9). Los ensayos Jurkat se realizaron esencialmente como se describe en el Ejemplo 1, con la excepción de que la etapa final implica incubar las células transfectadas durante 18 horas en presencia de concentraciones variables de cumermicina. Se añadieron 100 pl de reactivo Luciferasa One Glo por pocillo. Las muestras se incubaron durante 5 min a 37°C y, a continuación, se midió la luminiscencia utilizando un luminómetro.

Las figuras 20A y 20B representan el efecto de la adición de cumermicina sobre la señal en dos relaciones diferentes de miembro de unión a antígeno: miembro de señalización intracelular (5:1 y 1:5). La adición de cumericina resultó en un aumento significativo en la señal tanto a 1 mM como a 10 mM, en ambas proporciones.

Ejemplo 3: CAR regulable usando un conmutador de glberellna

El siguiente ejemplo ilustra el uso de heterodimerización mediada por giberelina para activar una construcción RCAR (Takafumi M et al, 2012. Nat Chem Biol.; 8 (5): 465-470). Para generar un RCAR, se generó un par de construcciones y se coexpresaron en la célula diana. Los diversos dominios de heterodimerización de los dominios de conmutación pueden unirse a diferentes dominios de la construcción RCAR.

"Conmutador 1" comprende un par de construcciones. La primera construcción se diseñó fusionando una secuencia líder al 139 scFv seguido de una región bisagra, una región transmembrana, un enlazador y el primer dominio de conmutación intracelular - GAI (SEQ ID NO: 10). La segunda construcción correspondiente se diseñó fusionando el segundo dominio de conmutación -GID1, con un segundo enlazador y los dominios de señalización 4-1BB seguidos por CD3zeta (SEQ ID NO: 11).

"Conmutador 2" comprende un par de construcciones. La primera construcción se diseñó fusionando una secuencia líder al scFv seguida de una región bisagra, una región transmembrana, un enlazador y el primer dominio de conmutación intracelular - GID1 (SEQ ID NO: 12). La segunda construcción correspondiente se diseñó fusionando el segundo dominio de conmutación -GAI, con un segundo enlazador y los dominios de señalización intracelular 4-1BB seguidos por CD3zeta (SEQ ID NO: 13).

La inducción del conmutador de heterodimerización se logra mediante la adición de éster acetoximetílico de ácido giberélico (estructura 3, disponible comercialmente en Toronto Research Chemicals, Inc)

Estructura 3: éster acetoximetílico de ácido giberélico

Clon EGFRvIII 139-CD8alfaTM-GAI (SEQ ID NO: 10)

Malpvtalllplalllhaarpdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgimnlawyqqkpgkapkrliyaasnlqsgvpsrftgsg

tvsstttpaprpptpaptiasqplskpeacrpaaggavhtrgldfacdiviwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllggggsggg

gsKRDHHHHHHQDKKTMMMNEEDDGNGMDELLAVLGYKVRSSEMADVAQKLEQ

LEVMMSNVQEDDLSQLATETVHYNPAELYTWLDSMLTDLN

GID1 -4- lBB-CD3zeta (SEQ ID NO: 11) MAASDEVNLIESRTVVPLNTWVLISNFKVAYNILRRPDGTFNRHLAEYLDRKVTAN ANPVDGVFSFDVLIDRRINLLSRVYRPAYADQEQPPSILDLEKPVDGDIVPVILFFHG GSFAHSSANSAIYDTLCRRLVGLCKCVVVSVNYRRAPENPYPCAYDDGWIALNWV NSRSWLKSKKDSKVHIFLAGDSSGGNIAHNVALRAGESGIDVLGNILLNPMFGGNE RTESEKSLDGKYFVTVRDRDWYWKAFLPEGEDREHPACNPFSPRGKSLEGVSFPKS LVVVAGLDLIRDWQLAYAEGLKKAGQEVKLMHLEKATVGFYLLPNNNHFHNVM DEISAFVNAECggggsggggskrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqg qnqlynelnlgiTeeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatk dtydalhmqalppr

Clon EGFRvIlI 139-CD8alfaTM-GID1 (SEQ ID NO: 12) Malpvtalllplalllhaarpdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgimnlawyqqkpgkapkrliyaasnlqsgvpsrftgsg sgteftlivsslqpedfatyyclqhhsypltsgggtkveikrtgstsgsgkpgsgegsevqvlesggglvqpggslrlscaasgftfs syamswvrqapgkglewvsaisgsggstnyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycagssgwseywgqgtlv tvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiviwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllggggsggg gsAASDEVNLIESRTVVPLNTWVLISNFKVAYNILRRPDGTFNRHLAEYLDRKVTAN ANPVDGVFSFDVLIDRRINLLSRVYRPAYADQEQPPSILDLEKPVDGDIVPVILFFHG GSFAHSSANSAIYDTLCRRLVGLCKCVVVSVNYRRAPENPYPCAYDDGWIALNWV NSRSWLKSKKDSKVHIFLAGDSSGGNIAHNVALRAGESGIDVLGNILLNPMFGGNE RTESEKSLDGKYFVTVRDRDWYWKAFLPEGEDREHPACNPFSPRGKSLEGVSFPKS LVVVAGLDLIRDWQLAYAEGLKKAGQEVKLMHLEKATVGFYLLPNNNHFHNVM DEISAFVNAEC

GAI-4-1 BB-CD3zeta (SEQ ID NO: 13)

MKRDHHHHHHQDKKTMMMNEEDDGNGMDELLAVLGYKVRSSEMADVAQKLEQ

LEVMMSNVQEDDLSQLATETVHYNPAELYTWLDSMLTDLNggggsggggskrgrkkllyifk qpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpcmggkprrkn pqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr

Materiales y procedimientos

Síntesis de ADN para CAR regulable utilizando el conmutador de cumermicina

El éster acetoximetílico de ácido giberélico está disponible comercialmente en Toronto Research Chemicals, Inc. La secuencia para el 139 scFv se clonará con los dominios de señalización para 4-1BB y CD3 zeta. La construcción de CAR no regulable, 139scFv-BBZ, SEQ ID: 7, se puede utilizar como control. Para el RCAR de giberelina, "Conmutador 1" comprende un par de construcciones. En la primera construcción, el 139 scFv se clonará con el dominio de conmutación GAI en el extremo c-terminal (SEQ ID NO: 10) y la segunda construcción correspondiente se diseñará fusionando el dominio de conmutación GID1 con un enlazador y los dominios de señalización intracelular 4-1BB seguido de CD3zeta (SEQ ID NO: 11).

"Conmutador 2" comprende un par de construcciones. En la primera construcción, el scFv 139 se clonará con el dominio de conmutación GID1 en el extremo c-terminal (SEQ ID NO: 12) y la segunda construcción correspondiente se diseñará fusionando el dominio de conmutación GAI a un enlazador y los dominios de señalización intracelular 4-1BB seguido de CD3zeta (SEQ ID NO: 13).

Los ensayos Jurkat se realizaron como se describe en el Ejemplo 1, con la excepción de que la etapa final implicó incubar las células transfectadas durante 18 horas en presencia de concentraciones variables de éster acetoximetílico del ácido giberélico o ácido giberélico. Se añadieron 100 pl de reactivo Luciferasa One Glo por pocillo. Las muestras se incubaron durante 5 min a 37 °C y a continuación se midió la luminiscencia usando un luminómetro.

La figura 21A muestra el efecto de DMSA, éster acetoximetílico del ácido giberélico y ácido giberélico sobre la expresión de NFAT.

La figura 21B muestra la respuesta de la expresión de NFAT al aumento de la dosis de éster acetoximetílico del ácido giberélico.

Ejemplo 4: Conmutador covalente interno

Recientemente se ha descrito el uso de agentes de reticulación covalentes específicos como alternativas para la heterodimerización (Erhart et al., 2013 Chem Biol 20 (4): 549-557), aunque no en el contexto de los RCAR. En realizaciones, estos agentes, denominados HaXS, pueden superar las limitaciones cinéticas potenciales relacionadas con las tasas de inactividad y la necesidad de acumulación de moléculas no covalentes en la célula como requisitos previos para la activación de las cascadas de señales requeridas para la destrucción mediada por células T. Los HaXS contienen grupos funcionales para unir un Halo-Tag (ver, por ejemplo, SEQ ID NO: 14) con un SNAP-Tag (ver, por ejemplo, SEQ ID NO: 15) junto con un núcleo de penetración celular. La evaluación de las moléculas de HaXS en el contexto de RCAR regulables se realizará utilizando EGFRvIII RCAR (139 scFv) como sistema modelo. Ver, por ejemplo, la Fig.13.

Materiales y procedimientos

Síntesis de HaXS y ADN para CAR regulable

Se sintetizará químicamente un HaXS representativo (Estructura 5) como describen Erhart et. Al supra. La secuencia para el 139 scFv se clonará con los dominios de señalización intracelular para 4-1BB y CD3 zeta. La construcción CAR no regulable, 139scFv-BBZ, SEQ ID: 7, se utilizará como control. Para el RCAR de HaX, los diversos dominios de heterodimerización de los dominios de conmutación se pueden unir a diferentes dominios de la construcción RCAR.

El "conmutador 1" comprende un par de construcciones. En la primera construcción, el 139 scFV se clonará con la etiqueta SNAP en el extremo c-terminal (SEQ ID NO: 16) y la segunda construcción correspondiente se diseñará fusionando la etiqueta Halo con un enlazador y los dominios de señalización intracelular 4-1BB seguido de CD3zeta (SEQ ID NO: 17). El "conmutador 2" comprende un par de construcciones. En la primera construcción, el 139 scFV se clonará con la etiqueta Halo en el extremo c-terminal (SEQ ID NO: 18) y la segunda construcción correspondiente se diseñará fusionando la etiqueta SNAP con un enlazador y los dominios de señalización intracelular 4-1BB seguido de CD3zeta (SEQ ID NO: 19). Los ensayos de Jurkat se realizarán tal como se describe en el Ejemplo 1, con la excepción de que la etapa final implicará incubar las células transfectadas durante 18 horas en presencia de concentraciones variables de HaXS. Se añadirán 100 pl de reactivo Luciferasa One Glo por pocillo. Las muestras se incubarán durante 5 min a 37 °C y a continuación se medirá la luminiscencia utilizando un luminómetro.

Etiqueta Halo (SEQ ID NO: 14)

Gseigtgfpfdphyvevlgermhyvdvgprdgtpvlflhgnptssyvwrniiphvapthrciapdligmgksdkpdlgyff ddhvrfmdaíiealgleevvlvlhdwgsalgfhwakrnpervkgiaímefirpiptwdewpefaretlqafrttdvgrkliid qnvfiegtlpmgvvrpltevemdhyrepflnpvdreplwrfpnelpiagepanivalveeymdwlhqspvpkllfwgtpg vlippaeaarlakslpnckavdigpglnllqednpdligseiarwlstleisg

Etiqueta SNAP (SEQ ID NO: 15)

Mdkdcemkrttldsplgklelsgceqglhriiflgkgtsaadavevpapaavlggpeplmqatawlnayfhqpeaieefpvp alhhpvfqqesftrqvlwkllkvvkfgevisyshlaalagnpaataavktalsgnpvpilipchrvvqgdldvggyegglavk ewll ahegh rl gkpgl g

139scFV-CD8alfaTM-SNAP (SEQ ID NO: 16) Malpvtalllplalllhaarpdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgirnnlawyqqkpgkapkrliyaasnlqsgvpsiftgs gsgteftlivsslqpedfatyyclqhhsypltsgggtkveikrtgstsgsgkpgsgegsevqvlesggglvqpggslrlscaasgf tfssyamswvrqapgkglewvsaisgsggstnyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycagssgwseywgq gtlvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllggg gsggggsdkdcemkrttldsplgklelsgceqglhriiflgkgtsaadavevpapaavlggpeplmqatawlnayfhqpeai eefpvpalhhpvfqqesftrqvlwkllkvvkfgevisyshlaalagnpaataavktalsgnpvpilipchrvvqgdldvggye gglavkewllaheghrlgkpglg

Halo-4-1 BB-CD3zeta (SEQ ID NO: 17)

MGseigtgfpfdphyvevlgennhyvdvgprdgtpvlflhgnptssyvwmiiphvapthrciapdligmgksdkpdlgy ffddhvifmdafíealgleevvlvihdwgsalgfhwakrnpervkgiafmefirpiptwdewpefaretfqafrttdvgrklii dqnvfiegtlpmgvvipltevemdhyrepflnpvdreplwifpnelpiagepanivalveeymdwlhqspvpkllfwgtp gvlippaeaarlakslpnckavdigpglnllqednpdligseiarwlstleisgggggsggggskrgrkkllyifkqpfmrpvqt tqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglyne lqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr

139scFV-CD8alfaTM-halo (SEQ ID NO: 18)

Malpvtalllplalllhaarpdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgimnlawyqqkpgkapkrliyaasnlqsgvpsiítgs

gsgteftlivsslqpedfatyyclqhhsypltsgggtkveikrtgstsgsgkpgsgegsevqvlesggglvqpggslrlscaasgf

tfssyamswvrqapgkglewvsaisgsggstnyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycagssgwseywgq

gtlvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllggg

gsggggsGseigtgfpfdphyvevlgermhyvdvgprdgtpvlflhgnptssyvwrniiphvapthrciapdligmgksd

kpdlgyffddhvrfmdañealgleevvlvihdwgsalgfhwakrnpervkgiafmefirpiptwdewpefaretfqafrttd

vgrkliidqnvfiegtlpmgvvrpltevemdhyrepflnpvdreplwrfpnelpiagepanivalveeymdwlhqspvpkl

lfwgtpgvlippaeaarlakslpnckavdigpglnllqednpdligseiarwlstleisg

SNAP-4-1 BB-CD3zeta (SEQ ID NO: 19)

Mdkdcemkrttldsplgklelsgceqglhriiflgkgtsaadavevpapaavlggpeplmqatawlnayfhqpeaieefpvp

alhhpvfqqesftrqvlwkllkvvkfgevisyshlaalagnpaataavktalsgnpvpilipchrvvqgdldvggyegglavk

ewllaheghrlgkpglgggggsggggskrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapay

kqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkpiTknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgeiTrgkghdglyqg

lstatkdtydalhmqalppr

Ejemplo 5: Conmutador de dimerización basado en péptidos - Etiqueta Myc

En realizaciones, la muerte celular mediada por células T requiere la vinculación de un evento de unión externo a la cascada de activación de señalización en el espacio intracelular, ver, por ejemplo, la Fig. 6. Co-localización y agrupamiento de estos dominios de señalización intracelular a través de un conmutador mostrado externamente El dominio (por ejemplo, etiqueta peptídica c-myc) y un ligando soluble con el receptor/scFv unido a la célula diana (por ejemplo, anticuerpo anti-myc) permite la inducción de la respuesta de señalización deseada. El dominio de conmutación extracelular puede ser cualquier molécula de etiqueta, tal como etiqueta de péptido c-myc, etiqueta de péptido bandera, etiqueta de péptido HA o etiqueta de péptido V5, que interactúe con la molécula de dimerización apropiada. En estos casos, la molécula de dimerización actúa como un reactivo de reticulación y puede incluir anticuerpos contra las moléculas de etiqueta de péptido comprendidas por el dominio de conmutación. El dominio extracelular también puede ser scFv contra antígenos del cáncer, como scFv (por ejemplo, 139) contra el antígeno EGFRvIII. En este caso, el reactivo de reticulación puede ser el propio antígeno, como la molécula EGFRvIII-Fc. Cuando un dominio de conmutación que actúa como un único reactivo de reticulación, tal como un anticuerpo anti-etiqueta, es insuficiente para formar agrupaciones y activar una señal, se puede usar un reactivo de reticulación adicional. Estos pueden ser anticuerpos contra anticuerpos anti-etiqueta, o anticuerpos contra Fc para reticular adicionalmente EGFRvIII-Fc. Específicamente, en este ejemplo, el conmutador es un conmutador de homodimerización externo y los dominios de conmutador primero y segundo son péptidos etiqueta myc que están unidos a los dominios de señalización intracelular, transmembrana e intracelular. El dominio de unión a antígeno, por ejemplo, 139 scFv, no tiene un dominio de conmutación y solo sirve para unirse a la célula cancerosa objetivo. En este ejemplo, la señalización se inicia mediante la adición de un anticuerpo myc policlonal de conejo entrecruzado (es decir, una molécula de homodimerización) que se une a cada uno de los dominios de conmutación de péptido myc externos primero y segundo provocando que se agrupen. Este agrupamiento del conmutador de homodimerización externo hace que los dominios de señalización intracelular se agrupen y activen la señalización; véase la Fig. 14A. Se logra una mejora adicional del evento de señalización intracelular aumentando la coagrupación externa con la adición de más anticuerpos de reticulación. En este ejemplo, la agrupación adicional se logra mediante la adición de un anticuerpo anti-conejo contra el anticuerpo myc policlonal de conejo como se muestra en la Fig. 14B.

Procedimientos y materiales

Se diseñará RCAR con marcador o etiqueta de péptido c-myc que se muestra en la superficie celular fusionando las secuencias correspondientes a un enlazador y los dominios de señalización intracelular 4-1BB seguidos de CD3zeta (SEQ ID NO: 20 y 21, respectivamente) . La construcción CAR no regulable, 139scFv-BBZ, SEQ ID: 7, se utilizará como control. Se cultivaron células Jurkat con indicador NFAT-LUC (JNL) hasta la densidad de 0,5 x 106/ml en medio de crecimiento de células Jurkat con puromicina a 0,5 qg/ml. Por cada transfección 2,5 x 106las células se centrifugaron a 100 g durante 10 minutos. Se usaron dos qg de ADN por construcción por transfección. Se mezclaron la solución V de Nucleofector de Amaxa y el suplemento I y se añadieron 100 ql al tubo con la construcción de ADN. A continuación se añadió la mezcla a las células y se transfirió a la cubeta de electroporación. La electroporación se realizó en el ajuste X-001 utilizando el dispositivo Amaxa Nucleofector II. Se añadieron 0,5 ml de medio de crecimiento inmediatamente después de la electroporación y la mezcla se transfirió a 2 ml de medio de crecimiento en un pocillo de la placa de 6 pocillos. Las células se incubaron en la incubadora a 37 ° C con 5% de CO2 durante la noche. Se añadió anticuerpo policlonal de conejo contra la etiqueta myc a las células que se transfectaron con la construcción RCAR con etiqueta myc como dominio extracelular. La concentración del anticuerpo policlonal fue de 100 nM. Una hora y media más tarde, se añadieron 100 nM de anticuerpo anti-conejo con el fin de mejorar la formación de grupos. La mezcla de células se incubó a 37 ° C durante 18 h. Se añadieron 100 ql de reactivo Luciferase One Glo por pocillo. Las muestras se incubaron durante 5 min a 37 ° C y a continuación se midió la luminiscencia usando un luminómetro.

De manera similar, se usó una construcción con etiqueta peptídica Flag como dominio extracelular para transfectar células informadoras. Se usó anticuerpo policlonal de conejo contra la etiqueta peptídica Flag a 100 nM; y para facilitar la agrupación adicional, se usó un anticuerpo contra el anticuerpo policlonal de conejo a 100 nM. Además, se usó una construcción con scFv 139 como dominio extracelular para transfectar células informadoras, y se usó EGFRvIII-Fc a 100 nM, y una hora y media más tarde se usó anticuerpo anti-Fc.

flag tag CAR (SEQ ID NO: 20)

Malpvtalllplalllhaarpgsdykddddkggggsggggstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwapla

gtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldk

rrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr

myc tag CAR (SEQ ID NO: 21)

Malpvtalllplalllhaarpgseqkliseedlggggsggggstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwapla

rrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr

Como se muestra en la Fig. 14A, RCAR con etiqueta peptídica c-myc como dominio extracelular mostró mayor actividad NFAT cuando se incubó con anticuerpo anti-myc policlonal de conejo en comparación con otros anticuerpos. Esto indicó que la activación se debió específicamente a la reticulación de la etiqueta de péptido c-myc en la superficie celular que forma grupos. La activación se mejoró aún más mediante la adición de anticuerpo anti conejo, tal como se muestra en la Fig. 14A.

RCAR con etiqueta Flag sólo mostró activación cuando se añadieron ambos reactivos de reticulación, es decir, tanto el anticuerpo policlonal de conejo anti-Flag como el anticuerpo anti-conejo. De forma similar, RCAR con 139 scFv como dominio extracelular mostró activación cuando se añadieron EGRFvIII-Fc y anticuerpo anti-Fc. Véase la figura 14.

Ejemplo 6: Multimerización basada en péptidos de dominios de señalización de activación

En realizaciones, la muerte celular mediada por linfocitos T requiere la unión a un evento de unión externa a la cascada de activación de señalización en el espacio intracelular. La colocalización y agrupamiento de estos dominios de señalización intracelular a través de una molécula externa mostrada, un dominio de conmutación y una molécula de dimerización que comprende un ligando soluble multimerizado en combinación con un receptor/scFv unido a la célula diana pueden usarse para inducir la respuesta deseada. Véase, por ejemplo, la Fig. 15. La ejemplificación de este principio en el contexto de los CAR regulables se puede realizar usando EGFRvIII RCAR (139sFv) como un sistema modelo con un scFv adicional (como dominios de conmutación) mostrado a varios multímeros de la etiqueta peptídica c-myc (como la molécula de dimerización).

Materiales y procedimientos

Síntesis de multímeros de péptido c-myc y ADN para RCAR regulable

Los monómeros, dímeros, trímeros y tetrámeros del péptido c-myc (SEQ ID NO: 22-25) se sintetizarán mediante síntesis de péptidos en fase sólida estándar y se usarán como conmutadores de dimerización multiméricos. Cada uno de los monómeros del péptido c-myc está unido por un enlazador GS. La secuencia para el 139 scFv se clonará con los dominios de señalización intracelular para 4-1BB y CD3 zeta. La construcción CAR no regulable, 139scFv-BBZ, SEQ ID: 7, se utilizará como control. Para el CAR regulable por c-myc, el 139 scFv se clonará con el dominio transmembrana CD8 alfa (SEQ ID NO: 26) y la construcción de señalización intracelular correspondiente diseñada fusionando el scFv anti-myc 9E10 con el enlazador y los dominios de señalización intracelular 4 -1BB seguido de CD3zeta (9e10 scFv-BBZ, SEQ ID NO: 27).

Péptido de monómero c-myc (SEQ ID NO: 22)

EEQKLISEEDL

Péptido de dímero c-myc (SEQ ID NO: 23)

EEQKLISEEDLGGGGSGGGGSGGGGSEEQKLISEEDL

Péptido trímero c-myc (SEQ ID NO; 24) EEQKLISEEDLGGGGSGGGGSGGGGSEEQKLISEEDLGGGGSGGGGSGGGGSEEQ KLISEEDL

péptido tetrámero c-myc (SEQ ID NO: 25) EEQKLISEEDLGGGGSGGGGSGGGGSEEQKLISEEDLGGGGSGGGGSGGGGSEEQ KLISEEDLGGGGSGGGGSGGGGSEEQKLISEEDL

139scFV-CD8alphaTM (SEQ ID NO: 26) Malpvtalllplalllhaarpdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgirnnlawyqqkpgkapkrliyaasnlqsgvpsrftgs gsgteftlivsslqpedfatyyclqhhsypltsgggtkveikrtgstsgsgkpgsgegsevqvlesggglvqpggslrlscaasgf tfssyamswvrqapgkglewvsaisgsggstnyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycagssgwseywgq gtlvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkll 9E10scFv-BBz (SEQ ID NO: 27)

MALPVTALLLPLALLLHAARPGSDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYG

FSFMNWFQQKPGQPPKLLIYAISNRGSGYPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDPAM

YFCQQTKEVPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVHLVESGGDLVKPGGS

LKLSCAASGFTFSHYGMSWVRQTPDKRLEWVATIGSRGTYTHYPDSVKGRFTISR

DNDKNALYLQMNSLKSEDTAMYYCARRSEFYYYGNTYYYSAMDYWGQGASVT

VSSASTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPL

AGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGG

CELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPR

RKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDA

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Ensayo de activación de NFAT

S e c u lt iv a ro n c é lu la s J u rk a t c o n in fo rm a d o r N F A T -L U C (J N L ) h a s ta la d e n s id a d d e 0 ,5 x 106/m l e n m e d io d e c re c im ie n to d e c é lu la s J u rk a t c o n p u ro m ic in a a 0 ,5 p g /m l. P a ra c a d a tra n s fe c c ió n , 2 ,5 x 106 c é lu la s s e c e n tr ifu g a ro n a 100 g d u ra n te 10 m in u to s . S e u t il iz a ro n d o s p g d e A D N p o r c o n s tru c c ió n p o r t ra n s fe c c ió n . S e m e z c la ro n la s o lu c ió n V d e N u c le o fe c to r d e A m a x a y el s u p le m e n to I y s e a ñ a d ie ro n 100 pl al tu b o c o n la c o n s tru c c ió n d e A D N . A c o n t in u a c ió n , s e a ñ a d ió la m e z c la a la s c é lu la s y s e tra n s f ir ió a la c u b e ta d e e le c tro p o ra c ió n . La e le c tro p o ra c ió n s e re a liz ó e n X -001 u t il iz a n d o el d is p o s it iv o A m a x a N u c le o fe c to r II. S e a ñ a d ie ro n 0 ,5 m l d e m e d io d e c re c im ie n to in m e d ia ta m e n te d e s p u é s d e la e le c t ro p o ra c ió n y la m e z c la s e t r a n s f ir ió a 2 m l d e m e d io d e c re c im ie n to e n un p o c illo d e la p la c a d e 6 p o c il lo s y s e in c u b ó d u ra n te d o s h o ra s . P a ra la s e t iq u e ta s m y c e n s o lu c ió n , la s c é lu la s s e d is tr ib u y e ro n e n 96 p o c illo s , s e a p lic a ro n e t iq u e ta s m y c d e m o n ó m e ro , d ím e ro , t r ím e ro o te t rá m e ro o F c d e IgG 1 a 100 nM . L a s c é lu la s s e in c u b a ro n d u ra n te 18 h. A lte rn a tiv a m e n te , la p la c a d e c u lt iv o d e te j id o s s e re c u b r ió c o n 100 n M d e v a r ia s e t iq u e ta s m y c o Ig G 1 F c d u ra n te d o s h o ra s , s e b lo q u e ó c o n e l ta m p ó n d e b lo q u e o (D P B S c o n s u e ro al 5 % ) d u ra n te 1 h o ra . L a s c é lu la s t r a n s fe c ta d a s s e a ñ a d ie ro n a la p la c a d ia n a c o n 100 pl p o r p o c illo y s e in c u b a ro n d u ra n te 18 h o ra s . S e a ñ a d ie ro n 100 pl d e re a c t iv o L u c ife ra s a O n e G lo p o r p o c illo . L a s m u e s tra s s e in c u b a ro n d u ra n te 5 m in a 37 °C y a c o n t in u a c ió n s e m id ió la lu m in is c e n c ia u s a n d o un le c to r d e p la c a s E n v is io n .

Resultados

T a l c o m o s e m u e s tra e n la F ig . 49 , la a c t iv a c ió n d e N F A T d e p e n d ía de l n ú m e ro d e m u ltím e ro s d e la s e t iq u e ta s m yc . S e o b s e rv ó u n a a c t iv a c ió n d e N F A T m á s a lta c u a n d o s e u s a ro n e t iq u e ta s m y c d e m u ltím e ro m á s a lto , p o r e je m p lo , t r ím e ro o te trá m e ro , p a ra la s c é lu la s t ra n s fe c ta d a s . L a e t iq u e ta d e p o li m y c e n s o lu c ió n a 100 n M d io c o m o re s u lta d o u n a m a y o r a c t iv a c ió n d e N F A T e n c o m p a ra c ió n c o n la a c t iv a c ió n d e la p la c a re c u b ie r ta c o n e t iq u e ta m y c 100 nM . E s to s re s u lta d o s m u e s tra n q u e s e p u e d e n u s a r m u ltím e ro s d e e t iq u e ta s m y c p a ra a c t iv a r R C A R d e c o n m u ta c ió n e x tra c e lu la r .

El c o n c e p to , lo s p ro c e d im ie n to s y la s c o m p o s ic io n e s d e s c r ito s e n e s te e je m p lo s o n a p lic a b le s a lo s R N K R -C A R . El c o n c e p to , p ro c e d im ie n to s y c o m p o s ic io n e s d e s c r ito s e n e s te e je m p lo s o n a p lic a b le s a c é lu la s R C A R /N K R -C A R X y /o c é lu la s R N K R -C A R X .

Ejemplo 7: RCAR inhibidor redirigido

U n p r in c ip io g e n e ra l de l s is te m a in m u n o ló g ic o e s q u e la s c é lu la s T d e te c ta n s u m ic ro a m b ie n te y a c o n t in u a c ió n s e a c t iv a n o in h ib e n , s e g ú n la s s e ñ a le s q u e p e rc ib a n . E s te e q u ilib r io f in a m e n te s in to n iz a d o e s t r a n s m it id o p o r v a r io s re c e p to re s a c t iv a d o re s ta le s c o m o C D 28 e IC O S y v a r io s re c e p to re s in a c t iv a d o re s , p o r e je m p lo , C T L A 4 , P D -1 y ^{B T L A (R ile y e t a l., 2005 , B lo o d 105 : 13 -21 ). L o s l ig a n d o s d e P D -1 s o n P D L1 y}PDl2. ^{L o s l ig a n d o s d e P D -1 a}m e n u d o s e e x p re s a n e n el m ic ro a m b ie n te d e l tu m o r , y la p a r t ic ip a c ió n d e P D -1 (m u e r te c e lu la r p ro g ra m a d a 1) e n la s c é lu la s T p o r P D L 1 o P D L 2 , p u e d e c o n d u c ir a la in a c t iv a c ió n d e la s c é lu la s T . L a s lim ita c io n e s e n la s o p c io n e s d e t r a ta m ie n to p a ra s u p e ra r e s ta in a c t iv a c ió n d e c é lu la s T e n el m ic ro a m b ie n te tu m o ra l s e r ía n , p o r ta n to , b e n e f ic io s a s . L o s p ro c e d im ie n to s d e s c r ito s e n el p re s e n te d o c u m e n to re d ir ig e n la s e ñ a l in h ib id o ra u t i l iz a n d o te ra p ia d e c é lu la s T a d o p tiv a s , lo q u e g e n e ra la s e ñ a l re g u la d o ra n e g a t iv a p o r e je m p lo , s e a c t iv a m e d ia n te la a c t iv a c ió n d e l re c e p to r P D 1 , e n u n a s e ñ a l p o s it iv a q u e m e jo ra la a c t iv id a d d e la s c é lu la s T c u a n d o s e a c t iv a . El c o n c e p to g e n e ra l como se describe aquí se basa en el conmutador regulable RCAR como se describió anteriormente. Sin embargo, en esta realización, el RCAR comprende un resto dirigido al cáncer que comprende un dominio extracelular de un receptor inhibidor tal como PD1. Además, el RCAR puede o no mostrar un CAR estándar o un scFv unido a la membrana que se utiliza como reactivo localizador para una célula cancerosa en particular. Ver, por ejemplo, los RCAR representados en la Fig. 9. En este ejemplo, el conmutador se diseña fusionando una secuencia líder al dominio extracelular de PD1 seguida de una región bisagra, una región transmembrana, un enlazador y el primer dominio de conmutación intracelular - FKBP (SEQ ID NO: 28). La segunda construcción se diseñó fusionando el segundo dominio de conmutación de FRB con un segundo enlazador y los dominios de señalización internos 4-1BB seguidos por CD3zeta (SEQ ID NO: 6). La activación de la célula T se regulará mediante el acoplamiento de los ligandos PD1 PDL1 o PDL2 en presencia de una molécula de dimerización, por ejemplo, rapálogo, únicamente. La coexpresión de CAR estándar o un scFv de direccionamiento también puede incluirse en el RCAR para mejorar la especificidad de la célula T quimérica. El concepto, las composiciones y los procedimientos descritos en este ejemplo también son aplicables a los RNKR-CAr , por ejemplo, para diseñar/generar RNKR-CAR inhibidores redirigidos. El concepto, procedimientos y composiciones descritos en este ejemplo son aplicables a células RCAR/NKR-CARX y/o células RNKR-CARX.

Materiales y procedimientos

Síntesis de ADN para redireccionar RCAR inhibidor

La secuencia para el dominio extracelular del receptor PD1 humano se clonará con el dominio FRB en el extremo cterminal (SEQ ID NO: 29) y la construcción de activación correspondiente diseñada fusionando el dominio FKBP con un enlazador y los dominios de activación 4-1BB seguido de CD3zeta (SEQ ID NO: 4). En otra realización, el dominio extracelular del receptor PD1 humano se clonará con el dominio FRBP en el extremo c-terminal (SEQ ID NO: 28) y la construcción de activación correspondiente se diseñará fusionando el dominio FRB a un enlazador y los dominios de activación 4-1BB seguido de CD3zeta (SEQ ID NO: 6). Los ensayos Jurkat se realizarán como se describe en el Ejemplo 1. La estimulación del CAR inhibidor redirigido se puede lograr mediante la adición de ligando extracelular PD1L o PD2L o mediante la coincubación de células que expresan PD1L o PD2L. Se añadirán 100 pl de reactivo Luciferasa One Glo por pocillo. Las muestras se incubarán durante 5 min a 37 °C y a continuación se medirá la luminiscencia utilizando un luminómetro.

CART FRB conmutador de PD1 humano (SEQ ID NO: 29) MalpvtalllplalllhaarpPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFV

LNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDS

GTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVtttpapippt paptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiviwaplagtcgvlllslvitlvckrgrkkllggggsggggsasrilwhemw hegleeasrlyfgernvkgmfevleplhammergpqtlketsfnqaygrdlmeaqewcrkymksgnvkdllqawdlyyhv frriskts

CART FKBP conmutador de PD1 humano (SEQ ID NO: 28) MalpvtalllplalllhaarpPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYR MSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAP KAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggav htrgldfacdiviwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllggggsggggsgvavetispgdgrtfpkrgqtcvvhytgmledgkkfdssrdr nkpi'kfnilgkqcvirgweegvaqmsvgqrakltispdyaygatghpgiipphatlvfdvellklets

Ensayo de activación de RCAR inhibidor redirigido

Se cultivaron células Jurkat con indicador NFAT-LUC (JNL) hasta la densidad de 0,5 x 106/ml en medio de crecimiento de células Jurkat con puromicina a 0,5 pg/ml. Por cada transfección 3 x 106las células se centrifugaron a 100 g durante 10 minutos. Se usaron cuatro pg de ADN por construcción por transfección. Se mezclaron la solución V de Nucleofector de Amaxa y el suplemento I y se añadieron 100 pl al tubo con la construcción de ADN. A continuación se añadió la mezcla a las células y se transfirió a la cubeta de electroporación. La electroporación se realizó en el ajuste X-001 utilizando el dispositivo Amaxa Nucleofector II. Se añadieron 0,5 ml de medio de crecimiento inmediatamente después de la electroporación y la mezcla se transfirió a 2 ml de medio de crecimiento en un pocillo de la placa de 6 pocillos. Después de dos horas, se añadió a las células el compuesto rapálogo a diversas concentraciones. Las células se aplicaron a los pocillos de la placa de cultivo de tejidos que fueron recubiertos por el objetivo. La placa de cultivo de tejidos se recubrió con 5 pg/ml de PDL1-Fc o IgG1-Fc o cualquier objetivo durante 2 horas a 37 ° C, a continuación bloqueado con el tampón de bloqueo (DPBS con suero al 5%) durante 30 minutos. Las células transfectadas se añadieron a la placa diana con 100 pl por pocillo y se incubaron durante 16 horas más. Se añadieron 100 pl de reactivo Luciferase One Glo por pocillo. Las muestras se incubaron durante 5 min a 37 ° C y a continuación se midió la luminiscencia usando un lector de placas Envision.

La construcción CAR de PD1 comprende PD1-ECD -TM- 41BB- CD3zeta. Esta construcción puede mejorar la persistencia de las células transfectadas con la construcción, por ejemplo, células CART transfectadas con CAR de PD1.

La construcción PD1 RCAR (PD1 CAR conmutable) usa el conmutador de heterodimerización FRB-FKBP y la molécula de hetermodimerización rapálogo AP21967. Específicamente, el PD1 RCAR comprende una construcción PD1-ECD-TM - FRB; y construcción zeta de FKBP-41BB-CD3, que se cotransfectaron en células Jurkat. Estas construcciones pueden mejorar la persistencia de células transfectadas con la construcción, por ejemplo, células RCART transfectadas con pD1 R^cA^r.

Como se muestra en la Fig. 17A: PD1 CAR mostró una activación significativa inducida por PD1 de la actividad luciferasa impulsada por el promotor inducible por NFAT, en comparación con el tratamiento de control con IgG1-Fc. Esto sugiere que la interacción de PD1 con PDL-1 es suficiente para provocar la agrupación de PD1 en la superficie de la célula Jurkat y desencadena la fuerte activación de la vía NFAT. Este PD1 CAR se utilizó como control para los experimentos PD1 RCAR. En la Fig. 17B, cuando las células indicadoras Jurkat fueron cotransfectadas por el RCAR PD1 que incluye PD1-ECD -TM-FRB y FKBP-4 1BB-CD3 zeta, y se incubaron con la molécula de heterodimerización AP21967 500 nM, hubo una inducción significativa de señalización por la diana PDL-1, que indica que la molécula de heterodimerización AP21967 indujo la dimerización de PD1 de una construcción con 41BB-CD3 zeta de otra construcción, y esto dio como resultado la activación de la señalización de NFAT. Para investigar más a fondo el efecto de la molécula de heterodimerización de AP21967 sobre el RCAR, se añadieron a las células concentraciones variables de la molécula de heterodimerización de AP21967. Como se muestra en la Fig. 18, hubo una respuesta a la dosis con el tratamiento AP21967. Cada barra de la izquierda es el PD1 RCAR, mientras que cada barra activa es el control PD1 CAR a diferentes concentraciones de AP21967. El AP21967 fue potente incluso a una concentración sub nM para inducir la dimerización del conmutador de heterodimerización, lo que dio como resultado la activación de la señalización de NFAT.

Ejemplo 8: Activación de CART conmutable por receptores coagrupados, incluido PD1

Las células cancerosas no solo expresan antígenos cancerosos de manera anormal, sino que también pueden expresar ligandos de PD1, que permiten escapar del ataque inmunitario de las células T efectoras. PD1, al unirse al ligando, forma micro grupos con TCR e inhibe directamente la activación de las células T. La formación de agrupaciones por coestimuladores o co-inhibidores se usa por naturaleza para mejorar o inhibir una respuesta inmune similar a un evento digital, es decir, está "activada" o "desactivada". En otras palabras, la respuesta inmune se activa cuando se alinean múltiples factores. Esto diferencia las señales "reales" del "ruido", que puede ser dañino. Vea la figura 10.

El fenómeno de las agrupaciones de coestimulador/co-inhibidor se puede utilizar para la terapia CART para asegurar la especificidad de focalización/destrucción. Esto se puede combinar con moléculas pequeñas (rapálogo) como conmutador de dimerización para la actividad celular RCAR. En una realización, esto aumentará la ventana terapéutica y reducirá los efectos secundarios tóxicos.

El reconocimiento y la unión a las células cancerosas por las células T representan el paso inicial importante para establecer la especificidad de destrucción. El co-direccionamiento de células cancerosas por antígeno específico de células cancerosas que es reconocido por scFv de baja afinidad y PDL1/2 por PD1 se puede lograr mediante interacciones de baja afinidad: PD1 con PDL1 o PDL2 de células cancerosas, e interacción de baja afinidad de scFv con antígenos cancerosos. en las células cancerosas. Este evento de unión dual se amplifica a través del efecto de avidez y se amplifica aún más a través de la formación de microgrupos de scFv y PD1. Estos eventos de reconocimiento y unión permitirán la formación de sinapsis inmunes entre las células diana y las células RCART, el primer paso para la destrucción de células cancerosas reguladas por RCART. La adición de rapálogo dimerizará/cluster 4-1BB/CD3 zeta, lo que activará aún más las células RCART para la destrucción de células cancerosas.

Procedimiento experimental

El ECD de PD1 humano o de ratón se fusionará con un dominio transmembrana seguido de un dominio de conmutación de FKBP. El scFv de baja afinidad contra uno de los antígenos tumorales, como la mesotelina, se fusionará con un dominio transmembrana seguido de un dominio de conmutación de FKBP. El dominio de conmutación de FRB se fusionará con los dominios de señalización intracelular 4-1BB y CD3 zeta. Véase, por ejemplo, el RCAR representado en la Fig. 10. Células T Jurkat con indicador de luciferasa dirigido por NFAT se cotransfectarán con las tres construcciones: PD1-TM-FKBP, scFv-TM-FKPB y FRB-4-1BB-CD3 zeta. La transfección se realizará con nucleofactor Amaxa con 3 x 10⁶células Jurkat por transfección con 2 |jg de ADN por construcción. Las células se incubarán a 37 ° C con 8% de CO ²durante un día de incubación después de la cotransfección. Las células Jurkat se aplicarán a continuación a los pocillos que están recubiertos con 5 jg/ml de mesotelina humana y 5 jg/ml de PD-L1 o PD-L2 de ratón. Después de un día de incubación a 37 ° C, se medirá la actividad luciferasa con el reactivo One-Glo de Promega.

Además, las células cotransfectadas se mezclarán con células cancerosas que expresan tanto mesotelina como PDL1 o PDL2, así como células normales en una proporción 1:0,3 de células CART efectoras:células diana. Después de un día de incubación, se medirá la actividad de luciferasa.

Se probarán las células cancerosas diana que muestran una sobreexpresión de PDL1 o PDL2.

Ejemplo 9: Activación de CAR regulada por moléculas pequeñas - conmutador extracelular

La muerte celular mediada por células T requiere la unión del evento de unión externo a la cascada de activación de señalización en el espacio intracelular. En una realización, un RCAR comprende un conmutador de dimerización extracelular, por ejemplo, un conmutador de heterodimerización extracelular activado por una molécula de heterodimerización de molécula pequeña. Véase, por ejemplo, el RCAR representado en la figura 5. El siguiente ejemplo ilustra el diseño de dicho conmutador de "molécula pequeña extracelular".

En este ejemplo, el conmutador se diseña fusionando una secuencia líder al 139 scFv seguido por el enlazador y el primer dominio de conmutación - FKBP, una región bisagra y una región transmembrana (SEQ ID NO: 31). La segunda construcción se diseña fusionando una secuencia líder al dominio de conmutación de FRB, una región transmembrana y los dominios de señalización intracelular 4-1BB seguidos por CD3zeta (SEQ ID NO: 32).

Alternativamente, también se puede usar un par de construcciones con el siguiente diseño (139-FRB-TM (SEQ ID NO: 30) FKBP-TM-41BB-CD3zeta (SEC ID NO: 33).

La cotransfección de la célula T del par de construcciones producirá un conmutador de activación extracelular ajustable regulado por la adición del rapálogo de molécula pequeña (Estructura 1).

Clon EGFRvIII 139-FRB-Cd8alfa TM (SEQ ID NO: 30) Malpvtalllplalllhaarpdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgimnlawyqqkpgkapkrliyaasnlqsgvpsrftgsg sgteftlivsslqpedfatyyclqhhsypltsgggtkveikrtgstsgsgkpgsgegsevqvlesggglvqpggslrlscaasgftfs syamswvrqapgkglewvsaisgsggstnyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycagssgwseywgqgtlv tvsskrgrkkllggggsggggsasrilwhemwhegleeasrlvfgemvkgmfevleplhammergpqtlketsfnqaygrdl meaqewcrkymksgnvkdllqawdlyyhvfrrisktstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyi waplagtcgvlllslvitlyc

Clon EGFRvIII 139-FKBP-Cd8alfa TM (SEQ ID NO: 31)

Malpvtalllplalllhaarpdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgimnlawyqqkpgkapkrliyaasnlqsgvpsrftgsg sgteftlivsslqpedfatyyclqhhsypltsgggtkveikrtgstsgsgkpgsgegsevqvlesggglvqpggslrlscaasgftfs syamswvrqapgkglewvsaisgsggstnyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycagssgwseywgqgtlv tvsskrgrkkllggggsggggsgvqvetispgdgrtfpkrgqtcvvhvtgmledgkkfdssrdmkpfkfmlgkqevirgwee

gvaqmsvgqrakltispdyaygatghpgiipphatlvfdvellkletstttpapipptpaptiasqplslipeacrpaaggavhtrgl dfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyc

FRB-bisagra-CD8alfaTM-4-1BB-CD3zeta (SEQ ID NO: 32) Malpvtalllplalllhaarasrilwhemwhegleeasrlyfgemvkgmfevleplhammergpqtlketsfnqaygrdlmea qewcrkymksgnvkdllqawdlyyhvfmsktsTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGA VHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCggggsggggskrgrkkllyií'kqpfmrpvqtt qeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgiTeeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelq kdkmaeayseigmkgeirrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr

FKBP-bisagra-CD8alfaTM-4-1BB-CD3zeta (SEQ ID NO: 33) Malpvtalllplalllhaargvqvetispgdgrtfpkrgqtcvvhytgmledgkkfdssrdrnkpfkfmlgkqevirgweegvaqinsvg qrakltispdyaygatghpgiipphatlvfdvellkletsTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVH TRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCggggsggggskrgrkkllyil'kqpl'mrpvqttqeedgcscrf pceeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkinaeayseignik gerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr

Las transfecciones y activaciones de conmutadores extracelulares se llevaron a cabo esencialmente como se describe para los conmutadores intracelulares en el Ejemplo 1.

La figura 19 muestra los resultados de estudios diseñados para investigar los eventos de señalización entre un RCAR que expresa el dominio de unión a antígeno, por ejemplo, scFv, y un RCAR que expresa los dominios de señalización intracelular, en los que los dominios de conmutación de heterodimerización son externos, en presencia de una molécula de heterodimerización. Los datos muestran una activación regulada por la diana significativa tras la estimulación con el rapálogo a 250 nM. Además, no se observó una activación significativa en la diana en ausencia del rapálogo, lo que indica una conmutación externa mediada por la heterodimerización regulada por moléculas pequeñas de los dominios de conmutación (FKBP y FRB). Finalmente, no se observó activación contra una diana de control (solo IgG1-Fc). Estos datos demuestran la especificidad de construcciones RCAR conmutadas externamente para la diana EGFRvIII en presencia del rapálogo únicamente, y la falta de reactividad cruzada para controlar la diana o en ausencia de rapálogo.

Construcciones de RCAR adicionales que comprenden conmutadores extracelulares y análisis funcional de los mismos se describen en el Ejemplo 18.

Ejemplo 10: Direccionamiento del gen de muerte celular programada 1 (PDCD1) de ratón y humano utilizando shARN

Además de las construcciones RCAR descritas en los Ejemplos 1-9, se puede proporcionar una regulación adicional modificando el ARNhc en los ácidos nucleicos que codifican el RCAR Los promotores comúnmente usados tales como U6 y H1 pueden colocarse aguas abajo de las construcciones de lentivirus RCAR. PDCD1, TIM3 u otros reguladores negativos de la actividad de las células T pueden atenuarse mediante la expresión de construcciones de ARNhc adecuadas. En la figura 16 se proporciona un mapa genérico que muestra diferentes configuraciones de construcciones que codifican el CAR regulable con un shRNA para la coexpresión de RCAR y un shRNA.

Los dos miembros que contienen dominios de conmutación (RCARa y RCARb), por ejemplo, un miembro de unión a antígeno y un miembro de señalización intracelular, están regulados por una combinación del promotor EF1alpha y un elemento IRES adecuado como el EMCV. Como se muestra en la Fig. 16, el promotor de EF1 alfa está ubicado cadena arriba de un primer miembro RCAR, por ejemplo, RCARa, que va seguido de un elemento IRES, y finalmente el segundo miembro RCAR, por ejemplo, RCARb. En realizaciones, el ARNhc está regulado por el promotor U6. En realizaciones, los elementos que codifican shRNA y RCAR están presentes en un solo vector. Las figuras 16A-16D muestran las diversas configuraciones en un solo vector, por ejemplo, donde el ARNhc regulado por U6 está aguas arriba o aguas abajo de los elementos codificadores RCA^rregulados por EF1alpha. En las construcciones de ejemplo representadas en la Fig. 16A y 16B, la transcripción se produce a través de los promotores alfa U6 y EF1 en la misma dirección. En las construcciones de ejemplo representadas en la Fig. 16C y 16D, la transcripción se produce a través de los promotores U6 y EF1 alfa en diferentes direcciones. En otra realización, el ARNhc (y el correspondiente promotor U6) está en un primer vector, y el RCAR (y el correspondiente promotor EF1alpha) está en un segundo vector (Fig. 16E). La atenuación constitutiva de los receptores inhibidores como PD1 en las células T que se dirigen específicamente a las células cancerosas debería superar la inmunosupresión mediada por la vía PD1 en el microambiente tumoral.

Análisis computacional para selección de secuencias

Se llevó a cabo un diseño de ARNhc para identificar ARNhc que se dirigen al gen de ratón y al gen de muerte celular programada 1 (PDCD1) del gen humano. El diseño utilizó la transcripción NM_008798.2 (ratón) y NM_005018.2 de la colección NCBI RefSeq, respectivamente. La potencia y especificidad previstas de todos los 19 meros posibles se predijo a partir de cada secuencia. Para la predicción de la potencia, se seleccionaron secuencias de 19 meros que contenían una puntuación de BioPred> 0,8 y una puntuación de Dharmacon> 4. Para la especificidad, se seleccionaron secuencias de 19 meros que carecían de repeticiones de más de 4 nucleótidos y que no contenían coincidencias de regiones de semillas con múltiples (> 10) miARN humanos conocidos. Además, cuando se buscan secuencias de 19 mer contra el transcriptoma humano y de ratón, respectivamente (definido como el conjunto de registros NM_ y XM_ dentro del humano, ratón NCBI Refseq set) usando el algoritmo BLAST se descartaron cuando la cadena antisentido o la cadena sentido (incluida la posición 1 o 2 contando desde el extremo 5 'de la cadena guía) tenía> 15 nucleótidos consecutivos en común con cualquier otra transcripción de ARNm en NCBI Refseq. Además, se descartaron las secuencias que contenían motivos de los que se informó que inducen potencialmente una respuesta inmune innata así como una respuesta citotóxica.

En una etapa final, las secuencias de 19 unidades aceptables se clasificaron de acuerdo con la puntuación de potencia prevista y las doce secuencias principales se seleccionaron en forma de sus correspondientes secuencias de 21 unidades para la síntesis de shARN.

En la Tabla 18 a continuación se proporcionan los nombres de los agentes de ARNi de PDCD1 (PD1) (derivados de su posición en la secuencia del gen de PDCD1 de ratón NM_008798.2), junto con las SEQ ID NO: 34-81 que representan la secuencia de ADN. Tanto las secuencias de sentido (S) como las antisentido (AS) se presentan como secuencias 19 unidades y 21 unidades en esta tabla. También cabe indicar que la posición (PoS, por ejemplo, 176) se deriva del número de posición en la secuencia del gen de PDCD1 de ratón NM_008798.2. Las SEQ ID NO se indican en grupos de 12 que se corresponden con las SEQ ID NO: 34-45 de "sentido 19"; SEQ ID N°: 46-57 "sentido 21"; SEQ ID NO: 58-69 “antisentido 21”; SEQ ID N°: 70-81 “antisentido 19”.

En la Tabla 19 a continuación se proporcionan los nombres de los agentes de ARNi de PDCD1 (PD1) (derivados de su posición en la secuencia del gen de PDCD1 humano, junto con las SEQ ID NO. 82-129 que representan la secuencia de ADN. Ambas secuencias de sentido (S) y antisentido (AS) se presentan como secuencias de 19 unidades y 21 unidades. Las SEQ ID NO se indican en grupos de 12 que se corresponden con las SEQ ID NO: 82 93 "sentido 19"; SEQ ID NO: 94-105 “sentido 21”; SEQ ID NO: 106-117 “antisentido 21”; SEQ ID NO: 118-129 “antisentido 19”.

Validación del knockdown de PD1 mediado por shARN

L a s s e c u e n c ia s d e A R N h c q u e re c o n o c e n P D 1 d e s e r h u m a n o y d e ra tó n se v a lid a ro n m e d ia n te un e n s a y o d e k n o c k d o w n in v itro . S e s in te t iz a ro n la s s e c u e n c ia s d e s h A R N d e 21 u n id a d e s h u m a n o e n u m e ra d a s en la T a b la 19 (S E Q ID N O : 106 -117 ) y la s s e c u e n c ia s d e s h A R N d e 21 u n id a d e s d e ra tó n e n u m e ra d a s en la T a b la 18 (S E Q ID N O : 46 -57 ) d e a c u e rd o c o n e l s ig u ie n te e s q u e m a d e d is e ñ o .

5'-G xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx ^{t t c a a g a g a y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y} t t t t t t -3 ^{'(S E Q id N O : 151 )}

S e a ñ a d ió un s o lo 5 'G a la s e c u e n c ia d e s e n t id o o b je t iv o re p re s e n ta d a a n te r io rm e n te , c o n la s e c u e n c ia d e s e n tid o o b je t iv o d e s ig n a d a p o r x (p ro p o rc io n a d a en la s T a b la s 18 o 19), s e g u id a d e un b u c le d e h o rq u il la d e la s e c u e n c ia T T C A A G A G A (S E Q ID N O : 152 ), la c o r re s p o n d ie n te s e c u e n c ia d ia n a a n t is e n t id o (d e s ig n a d a p o r y ) y u n a s e c u e n c ia te rm in a d o ra p o li-T 3 '(s u b ra y a d a a n te r io rm e n te ) . P a ra fa c i l i ta r la c lo n a c ió n , c a d a c o n s tru c c ió n ta m b ié n e s ta b a f la n q u e a d a p o r un s it io 5 'B a m H I y un s it io E c o R I 3'. F in a lm e n te , la s c o n s tru c c io n e s s in te t iz a d a s se s u b c lo n a ro n en p L V X -s h R N A 2 (C lo n te c h ) u t i l iz a n d o té c n ic a s d e A D N re c o m b in a n te .

E l e n s a y o d e e lim in a c ió n d e P D 1 h u m a n a se re a liz ó c o m o s ig u e . S e n u c le o fe c ta ro n d o s m illo n e s d e c é lu la s J u rk a t J N L c o n 1 -2 | jg d e A D N p la s m íd ic o d e A R N h c (d e p e n d ie n d o d e la c o n c e n tra c ió n d e s to c k ) u s a n d o e l k it S E C e ll L in e 4 D d e L o n z a y e l c ó d ig o d e p u ls o C L -116 , d e a c u e rd o co n la s re c o m e n d a c io n e s d e l fa b r ic a n te . L a s c é lu la s se re s u s p e n d ie ro n in m e d ia ta m e n te y se s e m b ra ro n en A n t ib ió t ic o lib re d e m e d io d e c re c im ie n to a u n a d e n s id a d d e 1 x 10 6/m l. L a s c é lu la s J u rk a t J N L n u c le o fe c c io n a d a s se in c u b a ro n a 37 ° C, 5 % d e C O 2., 24 h o ra s , 48 h o ra s o 72 h o ra s . A l f in a l d e c a d a p u n to d e t ie m p o , la lis is c e lu la r s e re a liz ó u t i l iz a n d o e l k it F a s tL a n e C e ll M u lt ip le x d e Q IA G E N d e a c u e rd o c o n la s re c o m e n d a c io n e s d e l fa b r ic a n te . La q P C R m u lt ip le x se re a liz ó en lis a d o s c e lu la re s d ilu id o s u s a n d o la s o n d a d e h P D C D 1 T a q m a n , H s 01550088 _ m 1 y la s o n d a d e h G A P D H T a q m a n , 4326317 E . E l p o rc e n ta je d e tra n s c r ip c ió n re s ta n te se d e te rm in ó u t iliz a n d o e l p ro c e d im ie n to d e lta d e lta C t en re la c ió n co n e l c o n tro l d e n u c le o fe c c ió n d e P B S . L a s b a rra s d e e r ro r s o n la d e s v ia c ió n e s tá n d a r d e la s ré p lic a s té c n ic a s y b io ló g ic a s .

C o m o se m u e s tra en la F ig u ra 32 , to d a s la s c o n s tru c c io n e s d e A R N h c d e P D 1 h u m a n o e n s a y a d a s a n u la ro n la e x p re s ió n d e P D 1 , c o m o se re p re s e n ta p o r m e n o s d e l 100 % d e la t ra n s c r ip c ió n d e P D 1 re s ta n te , p o r e je m p lo , 24 h o ra s d e s p u é s d e la n u c le o fe c c ió n . L o s s h R N A q u e se d ir ig e n a la s p o s ic io n e s 1867 , 1868 , 1869 , 1870 y 2079 d e m o s tra ro n u n a e x p re s ió n d e P D 1 re d u c id a a m e n o s d e l 75 % d e lo s n iv e le s d e e x p re s ió n n o rm a l, co n la p o s ic ió n d e d e s t in o d e l s h R N A 2079 q u e t ie n e la c a íd a m á s s ó lid a e n lo s t re s p u n to s d e t ie m p o p ro b a d o s , 24 , 48 y 72 h o ra s .

E l e n s a y o d e c a íd a d e P D 1 d e ra tó n s e re a liz ó c o m o s ig u e . S e n u c le o fe c ta ro n 200.000 c é lu la s E L 4 c o n 0 ,5 -1 j g d e A D N p la s m íd ic o d e A R N h c (d e p e n d ie n d o d e la c o n c e n tra c ió n d e s to c k ) u s a n d o el k it S F C e ll L in e 4 D d e L o n z a y e l c ó d ig o d e p u ls o C M -120 -A A , d e a c u e rd o co n la s re c o m e n d a c io n e s d e l fa b r ic a n te . L a s c é lu la s se re s u s p e n d ie ro n in m e d ia ta m e n te y se s e m b ra ro n en A n t ib ió t ic o lib re d e m e d io d e c re c im ie n to a u n a d e n s id a d d e 2.5 x 10 6/m L . L a s c é lu la s E L 4 n u c le o fe c ta d a s se in c u b a ro n a 37 ° C , 5 % d e C O 2 ., 24 h o ra s o 48 h o ra s . A l f in a l d e c a d a p u n to de t ie m p o , la lis is c e lu la r s e re a liz ó u t iliz a n d o e l k it F a s tL a n e C e ll M u lt ip le x d e Q IA G E N d e a c u e rd o co n la s re c o m e n d a c io n e s d e l fa b r ic a n te . S e re a liz ó q P C R m u lt ip le x en lis a d o s c e lu la re s d ilu id o s u s a n d o s o n d a T a q m a n de m P D C D 1 , M m 01285676 _ m 1 , y s o n d a T a q m a n d e m p -a c t in a , 4352341 E . El p o rc e n ta je d e tra n s c r ip c ió n re s ta n te se d e te rm in ó u t il iz a n d o e l p ro c e d im ie n to d e lta d e lta C t e n re la c ió n c o n e l c o n tro l d e n u c le o fe c c ió n c o n P B S . L a s b a rra s d e e r ro r so n la d e s v ia c ió n e s tá n d a r d e la s ré p lic a s té c n ic a s y b io ló g ic a s .

T a l c o m o s e m u e s tra e n la F ig u ra 33 , la s d ife re n te s c o n s tru c c io n e s d e s h A R N p ro b a d a s e x h ib ie ro n n iv e le s v a r ia b le s d e k n o c k d o w n d e P D 1. L a s c o n s tru c c io n e s d e s h A R N q u e re c o n o c e n la s p o s ic io n e s 584 (m m P D 1 _ 584 ) y 1097 (m m P D 1 _ 1097 ) d e m o s tra ro n e l k n o c k d o w n d e P D 1 m á s ro b u s to d e to d a s la s c o n s tru c c io n e s .

Ejemplo 11: Análisis de construcciones CAR regulables en células T

P a ra e v a lu a r la v ia b il id a d d e la te c n o lo g ía d e C A R re g u la r iz a b le s , lo s C A R re g u la b le s se c lo n a rá n en un v e c to r d e e x p re s ió n d e C A R le n t iv ira l co n la c a d e n a C D 3 z e ta y la m o lé c u la c o e s t im u la d o ra 4 -1 B B en d ife re n te s c o n f ig u ra c io n e s b a jo e l c o n tro l d e un p ro m o to r EF1 a lfa . La s e c u e n c ia q u e c o d if ic a un d o m in io d e u n ió n a a n tíg e n o , p o r e je m p lo , un s c F v d e s c r ito en e l p re s e n te d o c u m e n to , p u e d e in s e r ta rs e e n tre la s s e c u e n c ia s líd e r y b is a g ra d e s c r ita s a c o n tin u a c ió n .

Componentes RCAR - Secuencias de ácidos nucleicos

- líd e r ( s e c u e n c ia d e á c id o n u c le ic o ) ; (S E Q ID N O : 130 )

ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGC

CGCCAGGCCG

- b is a g ra (s e c u e n c ia d e á c id o n u c le ic o ) ; (S E Q ID N O : 131 )

ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGC

AGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGT

GCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT

-transmembrana (secuencia de ácido nucleico); (SEQ ID NO: 132)

ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACT

GGTTATCACCCTTTACTGC

- dominio intracelular 4-1BB (secuencia de ácido nucleico); (SEQ ID NO: 133)

AA ACGGGGC AG A A AG A A ACTCCTGT AT AT ATTC A A AC A ACC ATTT ATG AG AC

CAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAA

GAAGAAGGAGGATGTGAACTG

- CD3 zeta (secuencia de ácido nucleico); (SEQ ID NO: 134) AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAG AACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTT

TGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGA AGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGG AGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGC ACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGC CCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC

Componentes RCAR - Secuencias de aminoácidos

- líder (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO: 135)

MALPVTALLLPLALLLHAARP

- bisagra (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO: 136) TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD

-transmembrana (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO:137)

IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC

- Dominio intracelular 4-1BB) (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO: 138) KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL

- Dominio CD3 zeta (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO: 139)

RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNP

QEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQ

ALPPR

Promotor EF1 alfa (SEQ ID NO: 140)

CGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCG AGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGC GGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGT GGGGG AG A ACCGT AT AT A AGTGC AGT AGTCGCCGTG A ACGTTCTTTTTCGC A AC GGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGC CTCTTT ACGGGTT ATGGCCCTTGCGTGCCTTG A ATT ACTTCC ACCTGGCTGC AGT ACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGC CTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGC GCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTT TCG AT A AGTCTCT AGCC ATTT A A A ATTTTTG ATG ACCTGCTGCG ACGCTTTTTTT

CTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGT TTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGC GAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAG CTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCT GGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCG CTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGA GCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCG TCGCTTC ATGTG ACTCC ACGG AGT ACCGGGCGCCGTCC AGGC ACCTCG ATT AGT TCTCG AGCTTTTGG AGT ACGTCGTCTTT AGGTTGGGGGG AGGGGTTTT ATGCG A TGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACT TGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTC AAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA

La construcción óptima se seleccionará basándose en la cantidad y calidad de las células T transducidas con RCAR regulables por respuesta de células T efectoras en respuesta a dianas EGFRvIII+ y EGFR de tipo salvaje. Las respuestas de las células T efectoras incluyen, pero no se limitan a, expansión celular, proliferación, duplicación, producción de citocinas y destrucción de células diana o actividad citolítica (desgranulación).

Generación de células T CAR regulables

Los vectores de transferencia lentivirales RCAR se utilizan para producir el material genómico empaquetado en las partículas lentivirales pseudotipadas de VSVg. El ADN del vector de transferencia lentiviral se mezcla con los tres componentes de empaquetamiento de VSVg, gag/pol y rev en combinación con reactivo de lipofectamina para transfectarlos juntos en células 293T. Después de 24 y 48 horas, el medio se recoge y se filtra. El medio se concentra por ultracentrifugación. Alternativamente, se realiza una única recolección 30 horas después del cambio de medio. Los medios que contienen virus se utilizan alternativamente sin concentrar o concentrados por el concentrador Lenti-X (Clontech, Cat # 631232). La preparación viral resultante se almacena a -80°C. El número de unidades transductoras se determina mediante titulación en células SupTI.

Por ejemplo, las células RCART específicas de EGFRvIlI redirigidas se producen activando células T frescas mediante la unión con perlas CD3x28 durante 24 horas y a continuación añadiendo el número apropiado de unidades transductoras para obtener el porcentaje deseado de células T transducidas. Se permite que estas células T modificadas se expandan hasta que descansen y bajen de tamaño (-300 fl), momento en el que se criopreservan para un análisis posterior. Los números y tamaños de las células se miden usando un Coulter multisizer III, un Nexcelom Cellometer Vision o Millipore Sceptre. Antes de la criopreservación, el porcentaje de células transducidas (que expresan el CAR específico de EGFRvIII en la superficie celular) y su intensidad de fluorescencia relativa de esa expresión se determinan mediante análisis de citometría de flujo en un LSRII. De los gráficos de histograma,

Evaluación de la actividad citolítica, las capacidades de proliferación y la secreción de atocinas de las células CAR T regulables y redirigidas por EGFRvIII.

Para evaluar las capacidades funcionales de las células T RCAR específicas de EGFRvIII para matar, proliferar y secretar citocinas, las células se descongelan y se dejan recuperar durante la noche o se usan de inmediato. Además de las construcciones RCAR, el CAR estándar de segunda generación EGFRvIII-clon 139-BBz se usa con fines comparativos, mientras que SS1-BBz (específico de mesotelina) se usa como CAR expresado no dirigido para el efecto de fondo de células CAR/T. Para este ensayo de citotoxicidad basado en flujo, las células diana se tiñen con CSFE para cuantificar su presencia. Las células diana también se tiñen para la expresión de EGFRvIII para confirmar niveles de antígenos diana similares. Las actividades citolíticas de las células EGFRvIII CAR T se miden con una titulación de las proporciones de células efectoras: diana de 10: 1, 3: 1, 1: 1, 0,3: 1 y 0: 1 donde los efectores se definieron como células T que expresan el receptor quimérico anti-EGFRvIII. Los ensayos se iniciaron mezclando un número apropiado de células T con un número constante de células diana. También se añade a los cultivos una titulación de la dosis de la molécula de dimerización, de concentraciones de 0 a 1000 nM para el rapálogo o el anticuerpo anti-Myc. Después de 4 o 16 horas, se retira el volumen total de cada mezcla y se lava cada pocillo. Las células T se tiñen para CD3 y todas las células se tiñen con el marcador vivo/muerto 7AAD. Después del lavado final, las células sedimentadas se resuspenden en un volumen específico con un número predeterminado de perlas de recuento. Los datos de tinción celular se recopilan mediante citometría de flujo LSRII y se analizan con el software FlowJo utilizando perlas para cuantificar los resultados.

Para medir la proliferación celular y la producción de citocinas de células T RCAR-EGFRvIII, las células se descongelan y se dejan recuperar durante la noche. Además de las construcciones RCAR, el CAR estándar de segunda generación EGFRvIII-clon 139-BBz se usa con fines comparativos, mientras que SS1-BBz (específico de mesotelina) se usa como CAR expresado no dirigido para el efecto de fondo de células CAR/T. Las células T se dirigen hacia U87, una línea celular de glioblastoma, astrocitoma que expresa o no EGFRvIII. Además, las perlas CD3x28 se utilizan para evaluar el potencial de las células T para responder a la segunda ronda de señales inmunológicas endógenas. También se añade a los cultivos una titulación de la dosis de la molécula de dimerización, de concentraciones de 0 a 1000 nM para el rapálogo o el anticuerpo anti-Myc. Para analizar la proliferación, las células T se tiñen con CSFE. La proliferación es la dilución de la tinción CSFE que refleja la separación de las marcas parentales ahora en dos células hijas. El ensayo prueba solo una relación efector: diana de 1: 1 y 1: 0 donde los efectores se definieron como células T totales (CD4 y 8) normalizadas para expresar el receptor quimérico anti-EGFRvIII en un porcentaje común. El ensayo se realiza por duplicado y, 24 horas después de mezclar las células, se elimina el sobrenadante para la producción de citocinas. Después de 5 días, las células T se tiñen para ver si están vivas/muertas con Live/Dead Violet (Invitrogen), a continuación se tiñen para la expresión de CAR y se fenotipifican como células CD4 o CD8. Después del lavado final, las células sedimentadas se resuspenden en un volumen específico con un número predeterminado de perlas de recuento de BD. Los datos de tinción celular se recopilan mediante citometría de flujo LSRII y se analizan con el software FlowJo utilizando perlas para cuantificar los resultados. Los recuentos de células totales se determinan por el número de células contadas en relación con un número específico de perlas multiplicado por la fracción de perlas que aún no se han contado.

Evaluación de CART regulables in vivo

Los siguientes experimentos se diseñaron para abordar si la función de los CART regulables se puede modular in vivo. Los experimentos están diseñados para probar la administración y función in vivo de la molécula de dimerización en el contexto de un modelo de tumor. Los parámetros a medir incluyen, pero no se limitan a, expansión de CART, estado de activación de las células CART en la periferia medido por FACS de muestras de sangre periférica y muerte de células tumorales. Se prevén tres experimentos in vivo diferentes para abordar la utilidad del RCAR y la molécula de dimerización. Estos experimentos incluirán la evaluación de 1) la función básica del RCAR con la molécula de dimerización, 2) un modelo de tumor dependiente de PD-1 con el RCAR inhibidor conmutable redirigido y 3) un modelo de tumor dependiente de PD-1 con un RCAR y co -expresión de un ARNhc a PD-1.

El ratón NOD/scid/Ycnull (NSG) inmunodeficiente es un modelo de xenotrasplante adecuado para injertar líneas de células tumorales humanas o tumores primarios y células T humanas. Después del injerto, las células T humanas se pueden mantener en ratones NSG durante aproximadamente 2 meses, o hasta que se desarrolle la GVHD xenogénica fatal (xGVHD), que depende de la dosis de células T humanas infundidas. La administración de la m o lé c u la d e d im e r iz a c ió n se p u e d e l le v a r a c a b o d e c u a lq u ie r m a n e ra c o n v e n ie n te , en b a s e a la s p ro p ie d a d e s fa rm a c o c in é t ic a s d e la m o lé c u la y la d o s is o p t im iz a d a y e l ré g im e n d e tra ta m ie n to p re v ia m e n te d e te rm in a d o .

E l c o n c e p to , lo s p ro c e d im ie n to s y la s c o m p o s ic io n e s d e s c r ito s en e s te e je m p lo s o n a p lic a b le s a lo s R N K R -C A R . El c o n c e p to , p ro c e d im ie n to s y c o m p o s ic io n e s d e s c r ito s e n e s te e je m p lo s o n a p lic a b le s a c é lu la s R C A R /N K R -C A R X y /o c é lu la s R N K R -C A R X .

Ejemplo 12: Análisis in vivo del RCAR básico con una molécula de dimerización

P a ra e v a lu a r la a c t iv a c ió n d e la fu n c ió n R C A R T in v iv o co n la m o lé c u la d e d im e r iz a c ió n , la s c é lu la s T h u m a n a s q u e e x p re s a n e l c o n m u ta d o r 1 o e l c o n m u ta d o r 2 c o n un s c F v e s p e c íf ic o d e C D 19 h u m a n o (F M C 63 ) se p ro b a rá n en un m o d e lo d e tu m o r d e A L L u t il iz a n d o la N A L M 6 -L u c ife ra s a (N A L M 6 -L u c ) lín e a d e c é lu la s tu m o ra le s q u e e x p re s a C D 19 h u m a n a . E l s c F v d e F M C 63 se ha v a lid a d o a m p lia m e n te c o m o p a rte d e u n a c o n s tru c c ió n c A r d e s e g u n d a g e n e ra c ió n (C D 19 -41 B B -z e ta ) q u e m e d ia la re g re s ió n tu m o ra l c o m p le ta en m o d e lo s p re c lín ic o s (M ilo n e e t a l., M o le c u la r T h e ra p y 17 ( 8): 1453 -1464 (2009 )) . E n re s u m e n , la s c o n s tru c c io n e s le n t iv ira le s se g e n e ra rá n co n e l c o n m u ta d o r 1 o e l c o n m u ta d o r 2 u t iliz a n d o e l s c F v F M C 63 y e s ta s c o n s tru c c io n e s se tra n s d u c irá n en c é lu la s T h u m a n a s p r im a r ia s . L a s c é lu la s T se e x p a n d irá n e x v iv o d u ra n te 10 -12 d ía s y a c o n t in u a c ió n se c r io p re s e rv a rá n m e d ia n te p ro c e d im ie n to s d e s c r ito s a n te r io rm e n te . A lo s ra to n e s N S G se le s im p la n ta rá la lín e a c e lu la r tu m o ra l N A L M 6 -L u c m e d ia n te in o c u la c ió n in t ra v e n o s a y s e p e rm it irá q u e la c a rg a tu m o ra l s e e s ta b le z c a d u ra n te 5 -8 d ía s . La c a rg a tu m o ra l se p u e d e m e d ir m e d ia n te im á g e n e s e s tá n d a r p a ra la a c t iv id a d lu c ife ra s a . L o s ra to n e s se a s ig n a n a l a z a r en c u a n to a g ru p o s d e t ra ta m ie n to q u e in c lu y e n lo s s ig u ie n te s g ru p o s : 1) M o c k /P B S , 2 ) C é lu la s T no t r a n s d u c id a s , 3 ) C A R T 19 (2 nd g e n e ra c ió n in ta c ta c A r ), 4 ) C D 19 -C o n m u ta d o r 1, 5 ) C D 19 -C o n m u ta d o r 1 m á s ra p á lo g o o R A D 001 y 6 ) R a p á lo g o o R A D 001 so lo . L o s g ru p o s d e t r a ta m ie n to re c ib irá n y a s e a P B S (g ru p o s 1 y 6 ) o 5 x 10 6 c é lu la s c o m p ra /ra tó n 5 -8 d ía s im p la n ta c ió n d e l tu m o r p o s te r io r . E n un t ie m p o p re d e te rm in a d o d e s p u é s d e la in fu s ió n d e c é lu la s T, p o r e je m p lo , 1 -3 d ía s , se d o s if ic a rá a lo s ra to n e s c o n e l ra p á lo g o o R A D 001. La d o s if ic a c ió n y e l p ro g ra m a se b a s a rá n en la s d o s is d e la m o lé c u la d e d im e r iz a c ió n q u e no in h ib e e l c re c im ie n to d e la s c é lu la s tu m o ra le s p o r s í m is m a . A lo la rg o d e l e s tu d io , s e to m a rá n im á g e n e s d e lo s ra to n e s p a ra d e te rm in a r la c a rg a tu m o ra l c a d a d o s d ía s o co n la f re c u e n c ia n e c e s a r ia p a ra e v a lu a r c o n p re c is ió n e l im p a c to en e l c re c im ie n to d e l tu m o r . A v a r io s in te rv a lo s , s e re c o le c ta rá n m u e s tra s d e s a n g re p a ra a n á lis is d e in m u n o fe n o t ip if ic a c ió n y re c u e n to s d e c é lu la s T p e r ifé r ic a s .

L o s e fe c to s d e p e n d ie n te s d e la d o s is d e l ra p á lo g o o R A D 001 se p u e d e n e v a lu a r m á s a fo n d o en e x p e r im e n to s a d ic io n a le s co n g ru p o s t r a ta d o s q u e re c ib e n d ife re n te s d o s is d e l ra p á lo g o o R A D 001 y /o re g ím e n e s d e d o s if ic a c ió n a lte rn a t iv o s . T a n to e l c u rs o te m p o ra l d e la re g re s ió n d e l tu m o r c o m o el g ra d o d e re g re s ió n d e l tu m o r p u e d e n c u a n tif ic a rs e b a s á n d o s e en e l a n á lis is d e im á g e n e s .

Ejemplo 13: Análisis in vivo del RCAR básico junto con el reconocimiento de un inhibidor de punto de control con un ARNhc

P a ra e v a lu a r e l R C A R in h ib id o r c o n m u ta b le re d ir ig id o , se e v a lu a rá n la s c é lu la s T h u m a n a s q u e e x p re s a n e l R C A R en un m o d e lo d e tu m o r d e x e n o in je r to d e m e s o te lin a q u e e x p re s a P D -L 1. S e g e n e ra rá n c é lu la s T q u e c o e x p re s a n e l c o n m u ta d o r 1 c o n un s c F v (S S 1 ) e s p e c íf ic o d e m e s o te lin a h u m a n a ju n to co n un A R N h c a P D -1. E l s c F v d e SS 1 ha s id o a m p lia m e n te v a lid a d o c o m o p a rte d e u n a c o n s tru c c ió n C A R d e s e g u n d a g e n e ra c ió n q u e m e d ia la re g re s ió n tu m o ra l en m o d e lo s p re c lín ic o s (C a rp e n ito e t a l, P N A S , 106 : 3360 -3365 , 2009 ) . E n re s u m e n , se in y e c ta rá n c é lu la s tu m o ra le s q u e e x p re s a n m e s o te lin a y P D -L 1 en lo s f la n c o s d e lo s ra to n e s N S G . E s ta s c é lu la s tu m o ra le s p u e d e n d e r iv a r d e un tu m o r p r im a r io c o m o M 108 o d e u n a lín e a d e c é lu la s tu m o ra le s c o m o O v C A R 8. P a ra O v C A R 8 , la lín e a c e lu la r p u e d e d is e ñ a rs e p a ra e x p re s a r P D -L 1 si no e x p re s a n iv e le s e n d ó g e n o s d e la p ro te ín a .3 , lo s ra to n e s se d is tr ib u irá n a le a to r ia m e n te en lo s s ig u ie n te s g ru p o s d e t ra ta m ie n to : 1) M o c k /P B S , 2 ) C é lu la s T no tra n s d u c id a s , 3 ) S S 1 -B B z ( C A R in ta c to d e 2‘ g e n e ra c ió n ) , 4 ) M e s o -C o n m u ta d o r 1 m á s ra p á lo g o , 5 ) M e s o - C a m b ie 1 c o n s h R N A P D -1 y ra p á lo g o , y 6 ) R a p á lo g o so lo . L o s g ru p o s d e t ra ta m ie n to re c ib irá n P B S (g ru p o s 1 y 6 ) o 5 x 105 c é lu la s C A R T /ra tó n . E n un t ie m p o p re d e te rm in a d o d e s p u é s d e la in fu s ió n d e c é lu la s T , p o r e je m p lo , 1 -3 d ía s , se a d m in is tra rá e l ra p á lo g o a lo s ra to n e s . D u ra n te e l tra n s c u rs o d e l e s tu d io , se m e d irá e l v o lu m e n d e l tu m o r co n c a lib ra d o re s . A v a r io s in te rv a lo s , se re c o le c ta rá n m u e s tra s d e s a n g re p a ra a n á lis is d e in m u n o fe n o t ip if ic a c ió n y re c u e n to s d e c é lu la s T p e r ifé r ic a s . T a m b ié n se m e d irá n lo s n iv e le s d e e x p re s ió n d e P D -1 e n la s c é lu la s R C A R T p a ra e v a lu a r e l n iv e l d e e lim in a c ió n d e l o b je t iv o p o r p a r te d e l A R N h c .

L o s e fe c to s d e p e n d ie n te s d e la d o s is d e l ra p á lo g o p u e d e n e v a lu a rs e m á s a fo n d o en e x p e r im e n to s a d ic io n a le s co n g ru p o s tra ta d o s q u e re c ib e n d ife re n te s d o s is d e l ra p á lo g o y /o re g ím e n e s d e d o s if ic a c ió n a lte rn a t iv o s . T a n to la e v o lu c ió n te m p o ra l d e la re g re s ió n d e l tu m o r c o m o el g ra d o d e re g re s ió n d e l tu m o r p u e d e n c u a n ti f ic a rs e b a s á n d o s e e n e l v o lu m e n d e l tu m o r .

Ejemplo 14: Expresión de construcciones de un solo vector

Se construyeron vectores virales Lenti que codifican dos elementos de un RCAR.

La construcción 143775 es un vector de ácido nucleico único que comprende un promotor alfa EF1 unido operativamente a una secuencia que codifica un miembro de unión a antígeno CD19 basado en scFV, un IRES y un miembro de señalización intracelular que comprende un dominio 4-1BB y un dominio CD3zeta. Expresa una única transcripción de la que se transcriben los dos productos por separado.

El constructo 143776 es un vector de ácido nucleico único que comprende un promotor alfa EF1 unido operativamente a la secuencia que codifica un miembro de unión a antígeno CD19 scFV basado, y un promotor mínimo de CMV unido operativamente a una secuencia que codifica un miembro de señalización intracelular que comprende Dominio 1BB y dominio CD3zeta.

El constructo 143777 es un vector de ácido nucleico único que comprende un promotor alfa EF1 unido operativamente a la secuencia que codifica un miembro de unión a antígeno CD19 scFV basado, y un promotor mínimo de CMV unido operativamente a una secuencia que codifica un miembro de señalización intracelular que comprende un componente de 4 Dominio 1BB y dominio CD3zeta.

Las construcciones y las partículas virales se prepararon y probaron esencialmente como se describe en el Ejemplo 11. Se introdujeron partículas virales en células JNL y se evaluó la actividad esencialmente como se describe en el Ejemplo 1, excepto que la diana era CD19 (en oposición a EGFRviii).

La Fig. 23 muestra la capacidad de las construcciones RCART expresadas a partir de la construcción de vector único para activar RCART. La molécula de dimerización fue RAD001. El gráfico muestra que los elementos de un RCAR codificado por un solo vector se expresan y responden a la molécula de dimerización para activar las células, medido por la expresión de un promotor indicador bajo el control de NFAT.

Ejemplo 15: Respuesta a la dosis de la molécula de dimerización

Se introdujo el constructo 143775 en las células y se evaluó el efecto de la concentración de la molécula de dimerización sobre la activación esencialmente como se describe en el Ejemplo 14.

La figura 24A muestra el efecto de dosis nM de RAD001 sobre la activación. La figura 24B muestra el efecto de dosis nM de rapamicina sobre la activación.

La figura 25A muestra el efecto de dosis nM a sub-nM de RAD001 sobre la activación. La figura 25B muestra el efecto de nM a dosis sub-nM de rapamicina sobre la activación. Los datos muestran que tanto RAD001 como rapamicina son eficaces en una amplia gama de concentraciones.

Ejemplo 16: Miembros optimizados que tienen un dominio de unión a antígeno u otro dominio de unión extracelular

Construcción

El ADN que codifica la secuencia de aminoácidos del scFv anti-EGFRvIII 139 humano se clonará con una bisagra CD8 y un dominio transmembrana seguido del endodominio para 4-1BB y el primer dominio de conmutación intracelular FKBP. También se sintetizará el ADN correspondiente al miembro de señalización intracelular que tiene el segundo dominio de conmutación de FRB y CD3 zeta. Además, el ADN se sintetizará mediante el cual los dominios FRB y FKBP se intercambian entre sí. También se pueden clonar conmutadores adicionales sustituyendo los endodominios coestimuladores mostrados en la Tabla 2 para 4-1BB.

Generación de la línea celular informadora Jurkat para la caracterización inicial de la función CAR

C o m o a lte rn a t iv a a la t ra n s d u c c ió n y a c t iv a c ió n d e c é lu la s T p r im a r ia s , se p u e d e u s a r u n a lín e a d e c é lu la s in fo rm a d o ra s J u rk a t-N F A T p a ra e v a lu a r la a c t iv id a d fu n c io n a l d e la s c o n s tru c c io n e s C A R . La lín e a d e c é lu la s J u rk a t T (E 6 -1 ) s e t r a n s fe c ta c o n u n a c o n s tru c c ió n in fo rm a d o ra d e N F A T - lu c ife ra s a y s e s e le c c io n a u n a lín e a c e lu la r c lo n a l e s ta b le ( J N L ) p a ra u n a c a ra c te r iz a c ió n a d ic io n a l b a s a d a e n u n a fu e r te in d u c c ió n d e l in fo rm a d o r N F A T d e s p u é s d e la e s t im u la c ió n co n P M A e io n o m ic in a .

Transfección de células Jurkat con informador NFAT-LUC y ensayo funcional usando proteínas purificadas

L a s c é lu la s J u rk a t c o n e l re p o r te ro d e N F A T -L U C (J N L ) se c u lt iv a n co n la d e n s id a d d e 5 X 10 5 c é lu la s p o r m l en m e d io d e c u lt iv o d e c é lu la s J u rk a t co n p u ro m ic in a a 0 ,5 u g /m l. P o r c a d a tra n s fe c c ió n 2.5 X 106la s c é lu la s se c e n tr ifu g a rá n a 100 g d u ra n te 10 m in u to s . S e u t iliz a rá n d o s ug d e A D N p o r c o n s tru c c ió n p o r t ra n s fe c c ió n . La s o lu c ió n V d e N u c le o fe c to r d e A m a x a y e l s u p le m e n to I se m e z c la rá n y se a ñ a d irá n 100 u l en e l tu b o co n c a d a c o n s tru c c ió n d e A D N . A c o n tin u a c ió n , la m e z c la se a g re g a rá a la s c é lu la s y se tra n s fe r irá a la c u b e ta d e e le c t ro p o ra c ió n . La e le c t ro p o ra c ió n se re a liz a rá e n e l a ju s te X -001 u t il iz a n d o e l d is p o s it iv o A m a x a N u c le o fe c to r II. S e a ñ a d irá n 500 u l d e m e d io d e c re c im ie n to in m e d ia ta m e n te d e s p u é s d e la e le c tro p o ra c ió n y la m e z c la se t ra n s fe r irá p o s te r io rm e n te a 2 m l a d ic io n a le s d e m e d io d e c re c im ie n to en un p o c illo d e la p la c a d e 6 p o c illo s . L a s c é lu la s se in c u b a rá n e n la in c u b a d o ra a 37 ° C co n 5 % d e C O 2 d u ra n te 24 h o ra s . L a p la c a d e c u lt iv o d e te jid o s s e re c u b r irá co n 5 u g /m l d e E G F R v I I I -F c o 5 u g /m l d e Ig G 1 -F c d u ra n te 2 h o ra s y se b lo q u e a rá c o n s u e ro a l 5 % en D P B S d u ra n te 1 h o ra . L a s c é lu la s t r a n s fe c ta d a s se a ñ a d irá n a la p la c a d ia n a co n 100 u l p o r p o c illo y se in c u b a rá n d u ra n te 18 h o ra s m á s e n p re s e n c ia d e c o n c e n tra c io n e s v a r ia b le s d e un ra p á lo g o a d e c u a d o . S e a ñ a d irá n 100 u l d e re a c t iv o L u c ife ra s e O n e G lo p o r p o c illo . L a s m u e s tra s se in c u b a rá n d u ra n te 5 m in a 37 ° C y a c o n t in u a c ió n se m e d irá la lu m in is c e n c ia c o n un lu m in ó m e tro .

E l g ra d o e n e l q u e la c o n s tru c c ió n m e jo ra la p e rs is te n c ia p u e d e e v a lu a rs e m e d ia n te lo s p ro c e d im ie n to s d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to .

Ejemplo 17: Generación y caracterización de conmutadores de dimerización FKBP/FRB mutantes

E n e s te e je m p lo , s e re a liz ó la m u ta c ió n d e lo s re s id u o s in v o lu c ra d o s e n la u n ió n e n tre lo s d o m in io s d e c o n m u ta c ió n , p o r e je m p lo , F R B o F K B P , c o n la m o lé c u la d e d im e r iz a c ió n p a ra id e n t if ic a r m u ta c io n e s q u e m e jo ra n la fo rm a c ió n d e un c o m p le jo e n tre F K B P , F R B y la m o lé c u la d e d im e r iz a c ió n , p o r e je m p lo , ra p a m ic in a o un ra p a lo g , p o r e je m p lo , R A D 001. S e g e n e ra ro n y s e le c c io n a ro n b ib lio te c a s d e d o m in io s d e c o n m u ta c ió n d e F K B P y F R B m u ta n te s c a n d id a to s y s e e x a m in a ro n c o m o s e d e s c r ib e e n e l p re s e n te d o c u m e n to . L a F K B P o F R B m u ta n te p e rm ite e l u s o d e c o n c e n tra c io n e s c irc u la n te s d e la m o lé c u la d e d im e r iz a c ió n , p o r e je m p lo , R A D 001 , q u e so n m e n o re s q u e la s c o n c e n tra c io n e s u t il iz a d a s p a ra m e d ia r la in m u n o s u p re s ió n .

L a in te r fa z e n tre F K B P , F R B y ra p a m ic in a e s tá c la ra m e n te d e f in id a , lo q u e p e rm ite la in s p e c c ió n d e la in te r fa z F R B /ra p a m ic in a y F R B /F K B P . E n la e s t ru c tu ra d e ra y o s X d e 2 ,2 A d e l c o m p le jo te rn a r io F K B P /F R B /ra p a m ic in a , los re s id u o s d e F R B L e u 2031 , G lu 2032 , S e r2035 , A rg 2036 , P h e 2039 , G ly 2040 , T h r2098 , T rp 2101 , T y r2015 y P h e 2108 h a c e n 38 c o n ta c to s d ire c to s c o n lo s re s id u o s d e ra p a m ic in a y F R B 2042 B . y A s p 2102 h a c e n c o n ta c to s m e d ia d o s p o r a g u a co n e l c o m p u e s to (L ia n g e t a l., 1999 , J. A c ta C ry s t. D 55 : 736 -744 ). L a F ig u ra 27 m u e s tra la in te ra c c ió n d e la ra p a m ic in a co n F K B P y F R B q u e se d e te rm in a ro n en la e s tru c tu ra d e ra y o s X d e l c o m p le jo te rn a r io , c ó d ig o R C S B 2 F a P, g e n e ra d o u s a n d o e l M o le c u la r O p e ra t in g E n v iro n m e n t (M O E ) (C la rk e t a l., 2007 , J. C h e m . In f .M o d e lo .47 (5 ): 1933 -1944 ). L a m o lé c u la d e F R B e s la c a d e n a B e n la e s tru c tu ra .

L o s re s id u o s d e F R B e le g id o s p a ra la m u ta c ió n in c lu y e ro n : L 2031 , E 2032 , S 2035 , R 2036 , F 2039 , G 2040 , T 2098 , W 2101 , D 2102 , Y 2105 y F 2108. C a d a b ib lio te c a d e m u ta n te s p u n tu a le s se g e n e ró a le a to r iz a n d o e l c o d ó n en la p o s ic ió n d e s e a d a u t il iz a n d o u n a b ib lio te c a N N K , d o n d e N p u e d e s e r a d e n in a (A ), c ito s in a (C ), g u a n in a (G ) o t im in a (T ), y K p u e d e s e r g u a n in a ( G ) o t im in a (T ). L a T a b la 13 m u e s tra la d is tr ib u c ió n d e c o d o n e s d e u n a b ib lio te c a N N K y lo s a m in o á c id o s c o r re s p o n d ie n te s . L a F ig u ra 28 m u e s tra la s d is tr ib u c io n e s d e lo s a m in o á c id o s p ro d u c id o s a p a r t ir d e lo s c o d o n e s en la b ib lio te c a N N K , q u e v a n d e s d e un m ín im o d e 3 ,1 % a un a lto 9 ,4 % . C a d a b ib lio te c a d e m u ta n te s p u n tu a le s se c lo n ó en e l v e c to r p N A T 43 co n u n a e t iq u e ta d e h is t id in a N - te rm in a l. L a s S E Q ID N O : 195 -205 d a n la c o m p o s ic ió n d e a m in o á c id o s d e c a d a b ib lio te c a d e m u ta n te s p u n tu a le s , d o n d e X in d ic a la p o s ic ió n d e la b ib lio te c a N N K . El A D N d e c a d a b ib lio te c a s e tra n s fo rm ó en E. co li q u ím ic a m e n te c o m p e te n te d e A c e lla , se s e m b ró en p la c a s d e a g a r L B d e 100 m m c o n 50 p g /m l d e s u lfa to d e k a n a m ic in a y s e in c u b ó d u ra n te la n o c h e a 37 °C . S e tra n s f ir ie ro n 94 c o lo n ia s d e c a d a p la c a d e b ib lio te c a a p la c a s C o s ta r d e 96 p o c il lo s d e fo n d o p ira m id a l d e 2 m l c o n 1 m l d e m e d io d e a u to in d u c c ió n Z Y P -5052 q u e c o n te n ía 75 p g /m l d e s u lfa to d e k a n a m ic in a . L a s p la c a s se in c u b a ro n d u ra n te 40 h o ra s a 800 rp m a 30 ° C e n u n a in c u b a d o ra d e m ic ro p la c a s .

L o s c lo n e s c a n d id a to s d e F R B s e a is la ro n c o m o s ig u e . P r im e ro , se lis a ro n la s c é lu la s . L a s c é lu la s s e s e d im e n ta ro n m e d ia n te c e n tr ifu g a c ió n a 2.000 x g a 4 ° C d u ra n te 30 m in u to s . S e d e s c a r tó e l s o b re n a d a n te y se a lm a c e n a ro n lo s s e d im e n to s c e lu la re s a -80 °C . L a s p la c a s d e 96 p o c illo s q u e c o n t ie n e n lo s s e d im e n to s c e lu la re s se s a c a ro n d e l a lm a c e n a m ie n to a -80 °C y se d e s c o n g e la ro n a te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ra n te 1 h o ra . S e a ñ a d ie ro n a c a d a p o c illo 0 ,5 m l d e H E P E S 50 m M pH 7 ,5 , N a C l 150 m M , E D T A 5 m M , T r ito n X -100 a l 0 ,25 % (v /v ), 2 ,5 m g /m l d e lis o z im a . L o s s e d im e n to s se re s u s p e n d ie ro n p ip e te a n d o 180 p L 60 v e c e s . L a s m u e s tra s se in c u b a ro n a te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ra n te 0 ,1 a 1 h o ra . 0 ,5 m l d e H E P E S 50 m M pH 7 ,5 , N a C l 150 m M , C a C l 2 20 m M , M g C l 2 20 m M , S e a ñ a d ie ro n 0. 5 m g /m l d e A D N a s a I a c a d a p o c illo . L a s m u e s tra s se m e z c la ro n p ip e te a n d o 180 p L 10 v e c e s . L a s p la c a s se in c u b a ro n d u ra n te 30 m in u to s a te m p e ra tu ra a m b ie n te . L a s c é lu la s lis a d a s se s e d im e n ta ro n m e d ia n te c e n tr ifu g a c ió n a 2.000 x g a 4 °C d u ra n te 30 m in u to s . E l s o b re n a d a n te se d e s c a r tó d e c a d a p la c a m e d ia n te in v e rs ió n s e g u id a de g o lp e c ito s s u a v e s . L a s p la c a s s e a lm a c e n a ro n d u ra n te la n o c h e a -80 ° C.

A c o n t in u a c ió n , lo s lis a d o s a lm a c e n a d o s se p ro c e s a ro n m e d ia n te p u r if ic a c ió n p o r a f in id a d p a ra a is la r e l F R B m u ta n te c o m o s ig u e . A la m a ñ a n a s ig u ie n te , la s p la c a s se s a c a ro n d e l a lm a c e n a m ie n to a -80 ° C y se d e s c o n g e la ro n a te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ra n te 1 h o ra . S e a ñ a d ie ro n a c a d a p o c illo 0 ,7 m l d e H E P E S 50 m M , N a C l 500 m M , T C E P 5 m M , T r ito n X -100 a l 5 % (v /v ), pH 7 ,5. L o s s e d im e n to s se re s u s p e n d ie ro n p ip e te a n d o 180 p l 50 v e c e s , s e g u id o d e u n a in c u b a c ió n d e 1 h o ra a te m p e ra tu ra a m b ie n te . L a s p la c a s se c e n tr ifu g a ro n d u ra n te 30 m in u to s a 2.000 x g a 4 ° C y s e d e s e c h ó e l s o b re n a d a n te d e c a d a u n a . S e a ñ a d ie ro n a c a d a p o c illo 0 ,5 m l d e H E P E S 50 m M p H 7 ,5 , T C E P 1 m M , e ta n o l a l 60 % . L o s s e d im e n to s s e re s u s p e n d ie ro n p ip e te a n d o 180 p l 50 v e c e s , s e g u id o d e u n a in c u b a c ió n d e 1 h o ra a te m p e ra tu ra a m b ie n te . L a s p la c a s s e c e n tr ifu g a ro n d u ra n te 30 m in u to s a 2.000 x g a 4 ° C y se d e s e c h ó e l s o b re n a d a n te d e c a d a u n a . 0 ,5 m L d e H E P E S 50 m M pH 7. S e a ñ a d ie ro n 5, N a C l 500 m M , T C E P 1 m M , u re a 8 M a c a d a p o c illo . L o s s e d im e n to s s e re s u s p e n d ie ro n p ip e te a n d o 180 p l 50 v e c e s y s e in c u b a ro n d u ra n te la n o c h e a te m p e ra tu ra a m b ie n te . A la m a ñ a n a s ig u ie n te , la s m u e s tra s se t ra n s f ir ie ro n a p la c a s d e 96 p o c il lo s f r i ta d a s d e 20 p m . L a s m u e s tra s s e f i l t r a ro n a t r a v é s d e la s p la c a s a n u e v a s p la c a s C o s ta r d e 96 p o c il lo s d e 2 m l m e d ia n te c e n tr ifu g a c ió n d u ra n te 5 m in u to s a 1.500 x g a 4 ° C. S e p re p a ró u n a s u s p e n s ió n a l 25 % d e re s in a N i S e p h a ro s e 6 F a s t F lo w e n H E P E S 50 m M pH 7 ,5 , N a C l 500 m M , T C E P 1 m M , u re a 8 M . S e a ñ a d ie ro n a c a d a p o c illo 100 p l d e s u s p e n s ió n , 25 p l d e re s in a . La re s in a se in c u b ó c o n la s m u e s tra s d u ra n te 1 h o ra a te m p e ra tu ra a m b ie n te . D e s p u é s , la re s in a se tra n s f ir ió a p la c a s d e 96 p o c il lo s f r i ta d a s d e 20 p m y e l f lu jo d e la c o lu m n a se e lim in ó m e d ia n te v a c ío . S e a ñ a d ie ro n 500 p l d e H E P E S 50 m M pH 7 ,5 , N a C l 150 m M , t C e P 1 m M , u re a 4 M a c a d a p o c illo , se in c u b ó d u ra n te 5 m in u to s , y se re t ira a l v a c ío . S e a ñ a d ie ro n a c a d a p o c illo 500 \ m u l d e H E P E S 50 m M pH 7 ,5 , N a C l 150 m M , T C E P 1 m M , u re a 2 M , se in c u b ó d u ra n te 5 m in u to s y se e lim in ó a l v a c ío . S e a ñ a d ie ro n 500 p l d e H E P E S 50 m M pH 7 ,5 , N a C l 150 m M , T C E P 1 m M , u re a 1 M a c a d a p o c illo , s e in c u b ó d u ra n te 5 m in u to s y se e lim in ó a l v a c ío . S e a ñ a d ie ro n 500 \ m u l d e H E P E S 50 m M pH 7 ,5 , N a C l 150 m M , T C E P 1 m M , im id a z o l 25 m M a c a d a p o c illo , se in c u b a ro n d u ra n te 5 m in u to s y s e re t ira ro n a l v a c ío . S e a ñ a d ie ro n a c a d a u n o 200 p l d e H E P E S 50 m M pH 7 ,5 , N a C l 150 m M , T C E P 1 m M , im id a z o l 500 m M y s e in c u b ó d u ra n te 5 m in u to s . La p ro te ín a u n id a se e lu y ó m e d ia n te c e n tr i fu g a c ió n d u ra n te 2 m in u to s a 500 x g a 4 °C e n u n a n u e v a p la c a d e 96 p o c il lo s B D F a lc o n d e 300 \ m u 1. L a c o n c e n tra c ió n d e p ro te ín a en m g /m L p a ra c a d a p o c il lo s e m id ió u s a n d o e l e n s a y o d e B ra d fo rd co n B S A c o m o e s tá n d a r . L a s c o n c e n tra c io n e s d e p ro te ín a se c o n v ir t ie ro n en p M u s a n d o e l p e s o m o le c u la r p a ra F R B d e t ip o s a lv a je . L a s b ib lio te c a s d e m u ta n te s p u n tu a le s te n ía n e x p re s ió n en a l m e n o s e l 50 % d e lo s p o c illo s e x c e p to f R b D 2102 , q u e e ra d e l 47 % . La F ig u ra 29 A m u e s tra lo s n iv e le s d e e x p re s ió n d e c a d a b ib lio te c a y la F ig u ra 29 B m u e s tra la c o n c e n tra c ió n p ro m e d io p a ra lo s p o c il lo s d e e x p re s ió n .

S e c a lc u ló la in h ib ic ió n p a ra c a d a p o c illo q u e e x p re s a b a p ro te ín a p a ra c a d a b ib lio te c a u s a n d o e l c o n o c id o p o r no c o n te n e r p ro te ín a c o m o m e d id a d e l b la n c o . P a ra c a d a p la c a d e b ib lio te c a , se c a lc u ló e l p ro m e d io d e lo s p o c il lo s en b la n c o . S e d e fin ió q u e lo s p o c il lo s d e e x p re s ió n co n v a lo re s s u p e r io re s a l p ro m e d io d e lo s p o c il lo s en b la n c o te n ía n u n a in h ib ic ió n d e l 0 % . E l p o rc e n ta je d e in h ib ic ió n p a ra lo s p o c il lo s c o n v a lo re s in fe r io re s o ig u a le s a l p ro m e d io d e los p o c il lo s en b la n c o s e c a lc u ló re s ta n d o e l p ro m e d io p a ra lo s p o c il lo s en b la n c o d e l v a lo r d e l p o c illo , d iv id ie n d o p o r -1 m u lt ip l ic a d o p o r e l p ro m e d io d e lo s p o c illo s en b la n c o y m u lt ip l ic a n d o p o r 100 C u a n d o el v a lo r d e lo s p o c il lo s fu e d e 0, h a b ía un 100 % d e in h ib ic ió n y c u a n d o e l v a lo r d e lo s p o c il lo s e ra ig u a l a l p ro m e d io d e lo s p o c il lo s e n b la n c o , h a b ía un 0 % d e in h ib ic ió n . L o s p o c il lo s c o n in h ib ic ió n m a y o r o ig u a l a l 75 % s e e lig ie ro n p a ra la re d is tr ib u c ió n . La T a b la 26 m u e s tra e l n ú m e ro d e p o c illo s s e le c c io n a d o s p a ra c a d a b ib lio te c a y e l n ú m e ro d e p o c illo s q u e se e s p e ra q u e se a n F R B d e t ip o s a lv a je . S e e lig ie ro n 320 d e 1034 p o z o s , 31 ,3 % . L o s p o c illo s s e le c c io n a d o s s e c u lt iv a ro n , p u r if ic a ro n y a n a liz a ro n , ta l c o m o se d e s c r ib e . El A D N d e c a d a u n o d e lo s p o c il lo s s e le c c io n a d o s s e s e c u e n c ió p a ra id e n t if ic a r las m u ta c io n e s in d iv id u a le s . La c o n c e n tra c ió n d e p ro te ín a p a ra c a d a u n o d e lo s m u ta n te s s e e v a lu ó m e d ia n te e l e n s a y o d e B ra d fo rd . La a c t iv id a d d e c a d a m u ta n te s e c o m p a ró co n la c a p a c id a d d e l F R B d e t ip o s a lv a je p a ra u n irs e a e v e ro lim u s , p o r e je m p lo , R A D 001 , e n m ú lt ip le s fo rm a to s d e e n s a y o .

Tabla 20 ^{. P o c il lo s s e le c c io n a d o s p a ra re p e t ir la p ru e b a p a ra c a d a b ib lio te c a d e m u ta n te s p u n tu a le s e n e l c r ib a d o}in ic ia l

Para el ensayo de competición, las mutaciones de FRB de interés se clasifican en comparación con las FRB de tipo salvaje. Las proteínas FRB no marcadas de interés (SEQ ID NO: 207-211) y las FRB de tipo salvaje sin marcar (SEQ ID NO: 206) se diluyeron en serie 1: 3 a partir de una concentración final inicial de entre 0,9 y 4 uM dependiendo de la expresión y se añadieron en solución Flag-FRB de tipo salvaje 30 nM (final) (SEQ ID NO: 212) y FKBP de tipo salvaje biotinilada 30 nM (final) (SEQ ID NO: 218) en presencia de everolimus 60 nM (final) en una superficie plana de 96 pocillos placa inferior (PerkinElmer). Todas las diluciones se realizaron en tampón de inmunoensayo AlphaLISA 1x (PerkinElmer). La placa se incubó durante una hora a temperatura ambiente con agitación suave. A continuación, se añadieron perlas aceptoras anti-Flag (PerkinElmer) a una concentración final de 10 |jg/ml y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente con agitación suave. A continuación, se añadieron perlas donantes de estreptavidina (PerkinElmer) a una concentración final de 40 ug/ml y se protegió la placa de la luz durante 30 minutos de incubación a temperatura ambiente con agitación suave. A continuación, se leyó la placa en el lector PerkinElmer EnVision Multiplate equipado con el módulo Alpha utilizando una excitación de ⁶⁸⁰nm y un filtro de emisión de 570 nm. Las CE50 de cada secuencia de FRB del ensayo de competición se muestran en la Tabla 27 en comparación con WT FRB analizadas en la misma placa. Las mutaciones de un solo punto E2032L (SEQ ID NO: 208) y E2032I (SEQ ID NO: 207) fueron aproximadamente 2 veces mejores que las de tipo salvaje (Figura 30A y 30B; T2098L (SEQ ID NO: 209) se mejoró 3 veces ( Figura 30C) Las proteínas FRB que incorporan mutaciones en ambos sitios (SEQ ID NO: 210 y 211) demostraron una mejora relativa de 5 veces (Figura 30D y 30E).

Tabla 21. Valores EC50 del ensa o de com etición

Las mutaciones de FRB también se clasificaron en un formato de ensayo alternativo. Brevemente, las proteínas FRB que incorporan mutaciones simples y dobles (SEQ ID NO: 213-217) se produjeron como construcciones etiquetadas con FLAG en E. coli como se describió previamente. Se combinaron 30 nM (final) de FKBP biotinilada (SEQ ID NO: 218) y cada proteína FLAG FRB en presencia de everolimus en serie diluida 1: 3 a partir de una concentración final inicial de 600 nM en una placa de fondo plano de superficie A de 96 pocillos (PerkinElmer ) y se incubó durante una hora a temperatura ambiente. Todas las diluciones se realizaron en tampón de inmunoensayo AlphaLISA 1x (PerkinElmer). Se añadieron perlas aceptoras anti-Flag (PerkinElmer) a una concentración final de 10 jg/ml y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Cuentas de donante de estreptavidina (PerkinElmer), a continuación se añadieron a una concentración final de 40 ug/ml y la placa se protegió de la luz y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se leyó la placa en el lector PerkinElmer EnVision Multiplate equipado con el módulo Alpha utilizando una excitación de 680 nm y un filtro de emisión de 570 nm. Las CE50 de cada secuencia de FRB de este ensayo se muestran en la Tabla 28. Las mutaciones de un solo punto E2032I (SEQ ID NO: 213) y E2032L (SEQ ID NO: 214) fueron aproximadamente 1,5-2 veces mejores que las de tipo salvaje (FIG.

31A y 31B); T2098L (SEQ ID NO: 215) se mejoró tres veces (Figura 31C). Las proteínas FRB marcadas con bandera que incorporaron las mutaciones dobles (SEQ ID NO: 216 y 217) demostraron un rango dinámico limitado en este ensayo y, por lo tanto, no pudieron evaluarse.

Tabla 22: Valores de EC50 del ensayo de unión directa

Tabla 23: Secuencias de FRB y FRB candidatos mutantes usados en ensayos de unión

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Ejemplo 18: Activación de RCAR con un conmutador extracelular

En este ejemplo, se evaluó la activación de RCAR con un conmutador extracelular en presencia de la molécula de dimerización RAD001. Se probaron cuatro RCAR: dos construcciones de medio conmutador, por ejemplo, Con el conmutador de dimerización en ambas orientaciones (Fig. 34A), y dos construcciones de conmutador completo, por ejemplo, Con el conmutador de dimerización en ambas orientaciones (Fig. 34B), donde el conmutador de dimerización es una dimerización extracelular de FKBP/FRB, como se muestra en las Figs. 34A y 34B. En las construcciones de medio conmutador, el miembro de unión a antígeno comprende un dominio scFV, un dominio de conmutación extracelular, un dominio transmembrana, un dominio de señalización coestimulador intracelular 4-1BB, y el miembro de señalización intracelular comprende un dominio de conmutación extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización primario intracelular, CD3zeta (Fig. 34A). En las construcciones de cambio completo,

Materiales y procedimientos

Las construcciones RCAR se expresaron en una línea celular indicadora Jurkat. Se cultivaron células Jurkat con indicador NFAT-LUC (JNL) hasta la densidad de 0,5 x 106/ml en medio de crecimiento de células Jurkat con puromicina a 0,5 pg/ml. Por cada transfección 2,5 x 106las células se centrifugaron a 100 g durante 10 minutos. Se utilizaron dos pg de ADN por construcción RCAR por transfección. Se mezclaron la solución V de Nucleofector de Amaxa y el suplemento I y se añadieron 100 pl al tubo con la construcción de ADN. Después, la mezcla se añadió a las células y se transfirió a la cubeta de electroporación. La electroporación se realizó en el ajuste X-001 utilizando el dispositivo Amaxa Nucleofector II. Se añadieron 0,5 ml de medio de crecimiento inmediatamente después de la electroporación y la mezcla se transfirió a 2 ml de medio de crecimiento en un pocillo de la placa de 6 pocillos.

Después de una hora, se aplicó el compuesto RAD001 a diversas concentraciones: 0 nM, 0,01 nM, 0,03 nM, 0,1 nM, 0,3 nM, 1 nM, 5 nM y 50 nM. La placa de cultivo de tejido se revistió con 5 pg/ml de anticuerpo anti-CD 19 o control de isotipo durante 2 horas, bloqueado con el tampón de bloqueo (DPBS con suero al 5%) durante 1 hora. Las células transfectadas con o sin Rad001 se resuspendieron y se añadieron a la placa diana con 100 pl por pocillo y se incubaron durante 18 horas. Se añadieron 100 pl de reactivo Luciferase One Glo por pocillo. Las muestras se incubaron durante 5 min a 37 ° C y a continuación se midió la luminiscencia usando un lector de placas Envision. Resultados

Como se muestra en las Figs. 35A y 35B, el aumento de la concentración de RAD001 se correlacionó con el aumento de la actividad de NFAT para ambos semicontactos extracelulares, representado por la luminiscencia detectada. Se observó una respuesta dependiente de la dosis para ambas construcciones de medio conmutador RCAR. Para el medio cambio 2, la actividad de NFAT alcanzó su punto máximo con la dosis de RAD001 1 nM, mientras que la actividad de NFAT disminuyó con las dosis más altas de Rad001 (5 nM y 50 nM). La disminución observada en la activación puede deberse a la inmunosupresión general por las dosis más altas de RAD001. Para el medio cambio 1, no se observó inhibición de la actividad con las dosis más altas de RAD001, por ejemplo, 5 nM y 50 nM.

Como se muestra en las Figs. 35C y 35D, el aumento de la concentración de RAD001 también se correlacionó con el aumento de la actividad de NFAT para ambos conmutadores completos extracelulares, como lo representa la luminiscencia detectada. El patrón de activación para los conmutadores completos RCAR fue similar al del medio conmutador RCAR 2 (Fig.34B), donde la actividad de NFAT alcanzó su punto máximo con la dosis de RAD001 1 nM y disminuyó con las dosis más altas de Rad001, por ejemplo, 5 nM y 50 nM .

Estos datos muestran que RAD001 desencadena la dimerización de los dominios de conmutación extracelulares FKBP/FRB presentes en las construcciones de medio conmutador RCAR y conmutador completo y la activación de NFAT dependiente del objetivo.

El concepto, los procedimientos y las composiciones descritos en este ejemplo son aplicables a los RNKR-CAR. El c o n c e p to , p ro c e d im ie n to s y c o m p o s ic io n e s d e s c r ito s e n e s te e je m p lo s o n a p lic a b le s a c é lu la s R C A R /N K R -C A R X y /o c é lu la s R N K R -C A R X .

Ejemplo 19: Activación de medios conmutadores RCAR

E n e s te e je m p lo , se e v a lu ó la a c t iv a c ió n d e un m e d io c o n m u ta d o r R C A R en p re s e n c ia d e la m o lé c u la d e d im e r iz a c ió n R A D 001. S e p ro b a ro n d o s c o n s tru c c io n e s R C A R en la s q u e e l c o n m u ta d o r d e d im e r iz a c ió n e s un c o n m u ta d o r d e d im e r iz a c ió n in tra c e lu la r d e F K B P /F R B , y lo s d o m in io s d e c o n m u ta c ió n e s tá n u b ic a d o s en a m b a s o r ie n ta c io n e s co n re s p e c to a l m ie m b ro d e u n ió n a a n tíg e n o y a l m ie m b ro in tra c e lu la r . P o r e je m p lo , e l m ie m b ro de u n ió n a a n tíg e n o c o m p re n d e un d o m in io s c F V , un d o m in io t ra n s m e m b ra n a , un d o m in io d e c o n m u ta c ió n in tra c e lu la r y un d o m in io d e s e ñ a liz a c ió n c o e s t im u la d o r in tra c e lu la r ; y e l m ie m b ro d e s e ñ a liz a c ió n in tra c e lu la r c o m p re n d e un d o m in io d e c o n m u ta c ió n e x tra c e lu la r , un d o m in io t r a n s m e m b ra n a y un d o m in io d e s e ñ a liz a c ió n p r im a r io in tra c e lu la r , p o r e je m p lo , C D 3 z e ta (F ig . 36 A ).

Materiales y procedimientos

L a s c é lu la s J u rk a t co n e l re p o r te ro d e N F A T -L U C (J N L ) se h ic ie ro n c re c e r a la d e n s id a d d e 0 ,5 x 10 6/m l en m e d io d e c re c im ie n to d e c é lu la s J u rk a t c o n p u ro m ic in a a 0 ,5 g /m l. P a ra c a d a t ra n s fe c c ió n , s e c e n tr i fu g a ro n 2 ,5 x 106 c é lu la s a 100 g d u ra n te 10 m in u to s . S e u t il iz a ro n d o s | jg d e A D N p o r c o n s tru c c ió n p o r t ra n s fe c c ió n . S e m e z c la ro n la s o lu c ió n V d e N u c le o fe c to r d e A m a x a y e l s u p le m e n to I y s e a ñ a d ie ro n 100 j l a l tu b o c o n la c o n s tru c c ió n d e A D N . A c o n t in u a c ió n se a ñ a d ió la m e z c la a la s c é lu la s y se tra n s f ir ió a la c u b e ta d e e le c tro p o ra c ió n . L a e le c tro p o ra c ió n se re a liz ó en e l a ju s te X -001 u t il iz a n d o e l d is p o s it iv o A m a x a N u c le o fe c to r II. S e a ñ a d ie ro n 0 ,5 m l d e m e d io d e c re c im ie n to in m e d ia ta m e n te d e s p u é s d e la e le c tro p o ra c ió n y la m e z c la s e tra n s f ir ió a 2 m l d e m e d io d e c re c im ie n to e n un p o c il lo d e la p la c a d e 6 p o c illo s .

D e s p u é s d e u n a h o ra , e l c o m p u e s to R A D 001 se a d m in is tró a 50 nM c u a n d o se p ro b a ro n R C A R co n d ife re n te s d o m in io s d e s e ñ a liz a c ió n c o e s t im u la d o re s (F ig . 36 ), o v a r ia s c o n c e n tra c io n e s : 0 nM , 0 ,01 n M , 0 ,03 nM , 0,1 nM , 0 ,3 n M , 1 nM , 3 nM y 10 nM (F ig . 37 ). La p la c a d e c u lt iv o d e te j id o se re v is tió co n 5 jg / m l d e a n t ic u e rp o a n t i-C D 19 o c o n tro l d e is o t ip o d u ra n te 2 h o ra s , b lo q u e a d o co n e l ta m p ó n d e b lo q u e o (D P B S co n s u e ro a l 5 % ) d u ra n te 1 h o ra . L a s c é lu la s tra n s fe c ta d a s co n o s in R A D 001 s e re s u s p e n d ie ro n y se a ñ a d ie ro n a la p la c a d ia n a co n 100 j l p o r p o c illo y se in c u b a ro n d u ra n te 18 h. S e a ñ a d ie ro n 100 j l d e re a c t iv o L u c ife ra s e O n e G lo p o r p o c illo . L a s m u e s tra s se in c u b a ro n d u ra n te 5 m in a 37 ° C y a c o n t in u a c ió n s e m id ió la lu m in is c e n c ia u s a n d o un le c to r d e p la c a s E n v is io n .

Resultados

S e g e n e ra ro n c in c o c o n s tru c c io n e s d e m e d io c o n m u ta d o r R C A R d ife re n te s co n d ife re n te s d o m in io s d e s e ñ a liz a c ió n c o e s t im u la d o re s : C D 27 , C D 28 , IC O S , O X 40 y 4 -1 B B ; y se e v a lu ó la a c t iv a c ió n d e N F A T d e s p u é s d e la in c u b a c ió n c o n R a d 001. C o m o se m u e s tra en la F ig . 36 B , lo s R C A R q u e c o n t ie n e n C D 27 , C D 28 , IC O S , O X 40 y 41 B B c o m o d o m in io c o e s t im u la d o r , co n C D 3 z e ta c o m o d o m in io d e s e ñ a liz a c ió n p r in c ip a l, p u d ie ro n a c t iv a r la a c t iv id a d N F A T d e p e n d ie n te d e la d ia n a d e s p u é s d e la a d ic ió n d e R A D 001. S e d e m o s tró q u e e l R C A R c o n d ím e ro s z e ta C D 28 -C D 3 y O X 40 -C D 3 z e ta t ie n e la a c t iv a c ió n m á s ro b u s ta en c o m p a ra c ió n c o n lo s o tro s d ím e ro s z e ta d e l d o m in io de s e ñ a liz a c ió n c o e s t im u la d o r -C D 3 (p o r e je m p lo , 4 -1 B B -C D 3 z e ta , IC O S -C D 3 z e ta y O X 40 - C D 3 z e ta ) .

T a m b ié n se e v a lu ó la a c t iv id a d d e N F A T en d o s m e d io s c o n m u ta d o re s R C A R , q u e c o n te n ía n d o m in io s d e s e ñ a liz a c ió n c o e s t im u la d o re s C D 28 o 4 -1 B B , en re s p u e s ta a d o s is c re c ie n te s d e R A D 001. C o m o se m u e s tra en la F ig . 37 A y 37 B , a m b o s m e d io s c o n m u ta d o re s g e n e ra lm e n te e x h ib ie ro n a c t iv id a d N F A T d e p e n d ie n te d e la d o s is , d o n d e e l a u m e n to d e la s c o n c e n tra c io n e s d e R A D 001 s e c o r re la c io n ó co n e l a u m e n to d e lu m in is c e n c ia , o a c t iv id a d N F A T . P a ra a m b o s m e d io s c a m b io s , la a c t iv id a d d e N F A T a lc a n z ó su p u n to m á x im o e n la c o n c e n tra c ió n d e R A D 001 1 n M , y la a c t iv id a d d e N F A T d is m in u y ó a la s c o n c e n tra c io n e s d e R A D 001 m á s a lta s (p o r e je m p lo , 3 nM y 10 n M ).

E s to s re s u lta d o s m u e s tra n q u e R A D 001 d e s e n c a d e n a la d im e r iz a c ió n d e la m ita d d e lo s c o n m u ta d o re s R C A R co n v a r io s d o m in io s d e s e ñ a liz a c ió n c o e s t im u la d o re s d ife re n te s y a c t iv a c ió n d e N F A T d e p e n d ie n te d e l o b je t iv o .

E l c o n c e p to , lo s p ro c e d im ie n to s y la s c o m p o s ic io n e s d e s c r ito s en e s te e je m p lo so n a p lic a b le s a la s c é lu la s R C A R /N K R -C A R X .

Ejemplo 20: Análisis de construcciones de medio conmutador

P a ra e v a lu a r la v ia b il id a d d e la te c n o lo g ía d e m e d io c o n m u ta d o r , se p ro d u je ro n le n t iv iru s p a ra to d a s las c o n s tru c c io n e s d e m e d io c o n m u ta d o r y se tra n s d u je ro n la s c é lu la s T. L a s c o n s tru c c io n e s p ro b a d a s e s ta b a n c o m p u e s ta s p o r d o s g e n e s , c o e x p re s a d o s a p a r t ir d e un v e c to r u s a n d o e l E M C V IR E S . L o s g e n e s c o d if ic a b a n d o s p ro te ín a s , q u e e ra n a ) e l s c F v a n t i-C D 19 fu s io n a d o c o n la b is a g ra C D 8 y e l d o m in io t ra n s m e m b ra n a , un d o m in io d e s e ñ a liz a c ió n c o e s t im u la d o r y e l d o m in io h e te ro d im e r iz a n te d e F K B P y b ) e l d o m in io h e te ro d im e r iz a n te d e F R B fu s io n a d o c o n e l d o m in io c ito p la s m á tic o d e C D 3 z . L o s d o m in io s d e s e ñ a liz a c ió n c o e s t im u la d o re s p ro b a d o s fu e ro n 41 B B , C D 28 , C D 27 , IC O S y O X 40. L o s m e d io s c o n m u ta d o re s se c o m p a ra ro n c o n un C A R d e c o n m u ta d o r c o m p le to de 41BB y el CAR de 41BB no regulable. Todas las células T transducidas con CAR (CART) se analizaron para determinar las respuestas de las células T efectoras, es decir, la muerte de las células diana y la proliferación inducida por las células diana y la producción de citocinas.

Materiales y procedimientos

Generación de células T transducidas con CAR (CART)

Los vectores de transferencia lentivirales CAR se utilizan para producir el material genómico empaquetado en las partículas lentivirales pseudotipadas de VSVg. El ADN del vector de transferencia lentiviral se mezcla con los tres componentes de empaquetamiento VSVg env, gag/pol y rev en combinación con reactivo de lipofectamina para transfectar células Lenti-X 293T. El medio se cambia después de 24 horas y después de otras 24 horas, el medio se recoge, se filtra y se almacena a -80 ° C. Los CART se generan por transducción de células T vírgenes frescas o congeladas obtenidas por selección magnética negativa de sangre de un donante sano. Las células T se activan mediante incubación con perlas anti-CD3/anti-CD28 durante 24 h, después de lo cual se añade 1 ml de sobrenadante viral o virus concentrado (moi = 10) a los cultivos. Se permite que estas células T modificadas se expandan durante aproximadamente 10 días.

Evaluación de la actividad citolítica, la proliferación y la secreción de citocinas de los CART

Para evaluar la funcionalidad de los CART, las células T se descongelan, se cuentan y se evalúa la viabilidad con el Cellometer. El número de células positivas para CAR en cada cultivo se normaliza utilizando células T no transducidas. La inducción de los CART regulables se probó en titulaciones con RAD001, comenzando a 50 nM. La línea celular diana utilizada en todos los experimentos de cocultivo es Nalm-6, una línea celular de leucemia linfoblástica aguda (LLA) de células pre-B humana que expresa CD19 y transducida para expresar luciferasa. La línea de glioblastoma humano U87MG que expresa luciferasa sirve como control negativo.

Las actividades citolíticas de los CART se miden en una relación efector: diana de 4: 1, donde los efectores se definieron como células T totales y se dirigen a las respectivas líneas cancerosas positivas o negativas. Después de 20 h de cocultivo, los cultivos se lisan y se añade un sustrato para luciferasa (BrightGlo) para cuantificar las células diana supervivientes. Las placas se leen en el luminómetro (EnVision) y la lisis específica (%) se calcula como lum (muestra)/lum (máx) * 100.

Para medir la producción de citocinas mediante CART, las células T se cultivan con células diana en una proporción de 1: 1. Además, se usa PMA/Ionomicina para evaluar la secreción máxima de las poblaciones CART y las células CAR T solas dan una lectura de la actividad basal. El ensayo se realiza durante 24 horas, cuando se retira el medio para el análisis de citocinas utilizando el kit CBA para la detección de citocinas humanas; Se midieron las cantidades de IFNy, IL2 y TNFa.

Para medir la proliferación de CART, las células T se cultivan con células diana en una proporción de 1: 1. El ensayo se realiza durante 4 días, cuando las células se tiñen para la expresión de CD3, CD4, CD8 y CAR. El número de células T se evalúa mediante citometría de flujo usando perlas de recuento como referencia.

Resultados

La mayoría de los CAR utilizados para este experimento mostraron una expresión superficial muy similar; el huCART19 estándar, el conmutador completo 41BB, así como los medios conmutadores OX40, CD27, CD28 e ICOS están bien expresados y son comparables con respecto al porcentaje de población CAR y al número de moléculas CAR por célula (GeoMean). Solo el medio cambio de 41BB mostró una expresión más baja por célula, mientras que la población de células CAR positivas es similar a las otras CART (Fig. 38).

El potencial de estos CAR para matar células diana positivas para CD19 (Nalm6-Luc) en presencia de diferentes concentraciones de RAD001 se probó en un ensayo de 20 h. Se observó casi el 100% de muerte para el huCART19 no inducible, mientras que las células T no transducidas (UTD) mostraron muerte de fondo (Fig. 39). Los CART de conmutación completa 41BB mostraron una inducción de muerte con concentraciones de RAD crecientes, con un máximo de RAD001 de 0,4 nM, y una disminución de la muerte a concentraciones más altas. Los CART de medio conmutador CD28, CD27 y OX40 mostraron un aumento en la muerte, con un máximo en la concentración más alta de RAD001. La matanza máxima observada para estos medios conmutadores fue mayor que la observada para el conmutador completo. Los CART de medio conmutador 41BB e ICOS mostraron una muerte no inducible a niveles moderados y bajos, respectivamente.

La capacidad proliferativa de las células CART se probó en un ensayo de cocultivo de 4 días. Se evaluó el número de células T positivas para CD3 positivas para CAR después de cultivar las células T transducidas de manera diferente con Nalm6 (Fig. 40). Las células huCART19 se expandieron drásticamente cuando se cultivaron en presencia de menos de 0,016 nM de RAD001, y en menor grado a concentraciones más altas del compuesto. Los m e d io s c o n m u ta d o re s 41 B B , O X 40 y C D 27 s e e x p a n d ie ro n a n iv e le s s im ila re s m á s b a jo s , m o s tra n d o un m á x im o en

0.016 nM R A D 001. L o s m e d io s c o n m u ta d o re s IC O S y C D 28 y e l c o n m u ta d o r c o m p le to 41 B B n o m o s tra ro n u n a e x p a n s ió n d e te c ta b le .

L a s c a p a c id a d e s d e lo s C A R T re g u la b le s p a ra p ro d u c ir c ito c in a s se p ro b a ro n en un e n s a y o s im ila r, en e l q u e se c u lt iv a ro n c é lu la s C A R T c o n c é lu la s N a lm 6 e n u n a p ro p o rc ió n d e 1: 1 d u ra n te 20 h. S e re c o g ió e l s o b re n a d a n te y se m id ie ro n la s c o n c e n tra c io n e s d e IF N y . N u e v a m e n te , v im o s la fu n c ió n m á s fu e r te d e h u C A R T 19 y u n a in h ib ic ió n a n iv e le s m á s a lto s d e R A D 001 (F ig . 4 l ) . E n tre lo s C A R T d e c a m b io , e l m e d io c a m b io d e C D 28 fu e e l ú n ic o q u e m o s tró un a u m e n to c la ro en e l IF N s e c re ta d o . La in d u c c ió n m á s a lta se o b s e rv ó p a ra lo s n iv e le s m á s a lto s de

R A D 001.

E l c o n c e p to , lo s p ro c e d im ie n to s y la s c o m p o s ic io n e s d e s c r ito s en e s te e je m p lo so n a p lic a b le s a la s c é lu la s

R C A R /N K R -C A R X .

Ejemplo 21: Conmutador de dimerización covalente por etiqueta Halo/snap

E n e s te e je m p lo , s e e v a lu ó la a c t iv a c ió n d e un R C A R c o n un c o n m u ta d o r d e d im e r iz a c ió n c o v a le n te d e s p u é s d e la a d ic ió n d e la m o lé c u la d e d im e r iz a c ió n N V P -H A L 421. E n la F ig u ra 1 s e m u e s tra n e je m p lo s d e c o n s tru c c io n e s R C A R

c o n c o n m u ta d o re s d e d im e r iz a c ió n c o v a le n te . 13.

Materiales y procedimientos

S e c u lt iv a ro n c é lu la s J u rk a t co n in d ic a d o r N F A T -L U C (J N L ) h a s ta la d e n s id a d d e 0 ,5 x 106/m l en m e d io d e c re c im ie n to d e c é lu la s J u rk a t c o n p u ro m ic in a a 0 ,5 p g /m l. P a ra c a d a tra n s fe c c ió n , s e c e n tr i fu g a ro n 2 ,5 x 106 c é lu la s a

100 g d u ra n te 10 m in u to s . S e u t iliz a ro n d o s pg d e A D N p o r c o n s tru c c ió n p o r t ra n s fe c c ió n . S e m e z c la ro n la s o lu c ió n

V d e N u c le o fe c to r d e A m a x a y e l s u p le m e n to I y se a ñ a d ie ro n 100 p l a l tu b o c o n la c o n s tru c c ió n d e A D N . A c o n t in u a c ió n se a ñ a d ió la m e z c la a la s c é lu la s y se tra n s f ir ió a la c u b e ta d e e le c tro p o ra c ió n . L a e le c tro p o ra c ió n se re a liz ó en e l a ju s te X -001 u t il iz a n d o e l d is p o s it iv o A m a x a N u c le o fe c to r II. S e a ñ a d ie ro n 0 ,5 m l d e m e d io d e c re c im ie n to in m e d ia ta m e n te d e s p u é s d e la e le c tro p o ra c ió n y la m e z c la s e tra n s f ir ió a 2 m l d e m e d io d e c re c im ie n to e n un p o c il lo d e la p la c a d e 6 p o c illo s .

u

Resultados

E l c o n c e p to d e R C A R c o n h a lo - ta g y s n a p -ta g c o m o d o m in io s d e c o n m u ta c ió n se ilu s tra en la F ig . 13. S e c o tra n s fe c ta ro n c é lu la s J N L co n u n a c o n s tru c c ió n R C A R q u e c o m p re n d e d o m in io s d e c o n m u ta c ió n d e h a lo - ta g y s n a p -ta g . La a d ic ió n d e N V P -H A L 421 a 50 nM d io c o m o re s u lta d o un e n la c e c o v a le n te e n tre lo s d o m in io s d e c o n m u ta c ió n d e e t iq u e ta d e h a lo y d e e t iq u e ta rá p id a , q u e a la la rg a c o n d u c e n a la a c t iv a c ió n d e N F A T , c o m o se m u e s tra e n la f ig u ra 42. E l n iv e l d e a c t iv id a d d e N F A T a lc a n z ó un m á x im o d e 50 n M d e N V P -H A L 421 , m ie n tra s q u e la a c t iv a c ió n d e N F A T s e re d u jo a la s c o n c e n tra c io n e s m á s a lta s d e N V P -H A L 421 (500 nM y 5 p M ), e n c o m p a ra c ió n c o n la a c t iv id a d a 50 nM . E s ta d is m in u c ió n en la a c t iv a c ió n e s p e c íf ic a d e l o b je t iv o p o d ría d e b e rs e a la to x ic id a d d e l c o m p u e s to .

S e re a liz ó un s e g u n d o e n s a y o p a ra e v a lu a r la a c t iv id a d N F A T p a ra d o s is v a r ia b le s d e N V P -H A L 421 e n tre 0 nM y 60 nM . C o m o s e m u e s tra e n la F ig . 43 , la a c t iv id a d d e N F A T a u m e n tó a m e d id a q u e a u m e n ta b a la d o s is d e la m o lé c u la d e d im e r iz a c ió n N V P -H A L 421 , d e te c tá n d o s e e l n iv e l m á s a lto d e a c t iv id a d d e N F A T a la d o s is m á s a lta p ro b a d a , 60 nM .

Ejemplo 22: Ensayo de destrucción con células T primarias que expresan RCAR

S e e v a lu ó in v it ro la c a p a c id a d d e la s c é lu la s T R C A R (g e n e ra c ió n d e c é lu la s T R C A R d e s c r ita a n te r io rm e n te ) p a ra a p u n ta r y d e s t ru ir c é lu la s tu m o ra le s . S e u t il iz ó un e n s a y o b a s a d o e n lu c ife ra s a , c o n lín e a s d e c é lu la s tu m o ra le s q u e e x p re s a n in d ic a d o re s d e lu c ife ra s a . L a s c é lu la s d ia n a (c é lu la s tu m o ra le s ) se s e m b ra ro n en p la c a s a 25.000 c é lu la s /p o c il lo . L a s c é lu la s T R C A R , a s í c o m o la s c é lu la s T q u e e x p re s a n C A R e s tá n d a r y la s c é lu la s T q u e no expresan CAR se añadieron a la relación efector: diana 1: 1 por duplicado. Además, se añadió RAD001 en siete pasos de dilución de 5 veces, comenzando con 50 nM. Un duplicado recibió medio puro, no RAD001. Las células se cultivaron durante 20 horas, después de lo cual se detectó la luminiscencia de cada pocillo para determinar el porcentaje de células diana muertas (BrightGlo, protocolo Promega). Muerte específica (%) = Luminiscencia (muestra)/Luminiscencia (sin células T) * 100. Se usó como célula diana la línea celular Nalm6 (LLA humana pre-B) que expresa luciferasa.

Como se muestra en la FIG. 89, la muerte de las células diana por las células T que expresan el CART19 estándar no se vio influenciada por la adición de RAD001. La destrucción por células T que expresan RCAR se indujo mediante la adición de RAD001 de una manera dependiente de la dosis; mostrando niveles de fondo sin RAD001 y muerte máxima a una concentración de RAD001 alrededor de 1 nM.

Ejemplo 23: Receptores NK quiméricos

Los resultados presentados en el presente documento demuestran un enfoque alternativo para la construcción de CAR para células T que pueden regularse con mayor precisión en comparación con los diseños CAR actuales. Se diseñaron experimentos para desarrollar un nuevo sistema CAR regulado que comprende al menos dos o tres proteínas de fusión quiméricas. La señal de activación y las señales inhibidoras primarias de las células T se basan en los receptores inhibidores y activadores de origen natural de las células NK, conocidos como receptores de tipo inmunoglobulina de células asesinas (KIR).

Los KIR existen tanto como formas activantes como inhibidoras que dependen del dominio intracelular del receptor. Los KIR activadores entregan sus señales a través de una interacción con el motivo de activación basado en inmunotirosina (ITAM) que contiene la proteína de membrana, DAP12, que es reclutada por residuos dentro de los dominios transmembrana de estas proteínas. Los KIR inhibidores tienen un dominio citoplasmático que contiene motivos inhibidores basados en inmunotirosina (ITIM), que anulan la señal de activación que conduce a la inhibición de la actividad citolítica y productora de citocinas NK. Al igual que los TCR, los KIR pertenecen a la familia de receptores de proteínas de las inmunoglobulinas y muchos se unen a MHC invariantes y ligandos similares a MHC. Sin desear estar sujeto a ninguna teoría en particular,

Se han construido receptores de antígenos quiméricos similares a KIR (KIR-CAR) que fusionan un scfv con un antígeno diana de interés con KIR activadores e inhibidores, como se muestra en la Figura 50. La activación condicional de las células T se genera mediante el acoplamiento de un KIR-CAR activador (actKIR-CAR) o TCR-zeta CAR estándar que lleva un scfv para un antígeno en la célula maligna de interés. Un CAR inhibidor (inhCAR) que lleva un scfv dirigido contra un antígeno que está presente en tejido normal, pero no maligno, amortiguaría la señal primaria del CAR activador cuando la célula T se encuentra con células normales. Ejemplos de antígenos que sirven como dianas útiles para los CAR inhibidores incluyen los receptores de efrina (Pasquale, 2010, Nat Rev Cancer 10 (3): 165-80) y claudinas (Singh et al., 2010, J Oncol, 2010: 541957), que se expresan por células epiteliales de tejidos normales,

Ejemplo 24: Activación de la construcción y actividad de KIR-CAR

Se diseñaron experimentos para construir KIR-CAR activadores basados en la fusión del anti-CD 19 o antimesotelina scFv (SS-1) que se incorporaron previamente en los CAR basados en el dominio citoplasmático TCR-zeta que se encuentran actualmente en ensayos clínicos. El receptor KIR activador de KIR2DS2 humano se eligió como receptor base inicial para actKIR-CAR. Para entregar señales de activación, los actKIR-CAR requerían la coexpresión de DAP12, que no se expresa normalmente en las células T. Por lo tanto, se construyó un vector lentiviral que expresa tanto el actKIR-CAR como el DAP12 humano utilizando un casete de genes "bicistrónico" basado en el péptido de salto ribosómico 2A. En la Figura 51 se ilustra un diagrama del vector lentiviral. Los estudios iniciales demostraron que los actKIR-CAR se expresaban eficazmente en células T humanas primarias y que actKIR-CAR SS1 se unía a mesotelina (Figura 52). Similar al CAR de SS1 scFv CD3 zeta (SS1-Z) desarrollado y publicado previamente (Carpenito et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106 (9): 3360-5), las células T que expresan el SS1 actKIR-CAR demostraron ser citotóxicas actividad hacia las células diana K562 diseñadas para expresar el ligando de mesotelina (KT-meso) como se muestra en la Figura 53. Ninguno de los receptores exhibe la muerte de K562 de tipo salvaje que carece de la diana de mesotelina.

Dado que la actividad citotóxica del SS1 KIR CAR hacia las células diana positivas para mesotelina fue menor que la del CAR estándar basado en TCRzeta que se dirige al mismo antígeno con una expresión de superficie de CAR comparable, se cree que el CAR de mesotelina puede tener una bisagra extracelular (basada en wild -tipo KIR2DS2) que no es óptimo para la segregación de CD45 debido a su longitud. Se cree que la segregación cinética de la activación de receptores basados en ITAM de CD45 es un mecanismo clave para la activación de TCR, y depende de una escala de longitud entre las membranas de células T y células diana de -14-15 nm (Choudhuri et al., 2005, Nature 436 (7050): 578-82). Se estima que el SS1 KIR-C^aR basado en KIR2DS2 tiene una escala de longitud superior a 20 nm según la estructura cristalina parcial de la mesotelina, lo que demuestra que el epítopo SS1 probablemente se encuentra a una distancia de -10 nm de la membrana de la célula diana (Ma et al., 2012, J Biol Chem 287 (40): 33123-31) y CAR que se estima en ~ 10 nm asumiendo que cada dominio similar a Ig es -3,5 nm en la bisagra KIR2DS2 además del scFv. Por lo tanto, se construyó un KIR CAR activador en el que se quitó la bisagra KIR2DS2 (KIRS2 CAR) como se muestra esquemáticamente en la Figura 54. Se demostró que un CAR KIRS2 basado en SS1 scFv exhibió una actividad citolítica mejorada hacia las células diana que expresan mesotelina en comparación con el CAR formado por la fusión del ^sS1 scFv en KIR2DS2 de tipo salvaje de longitud completa (Figura 55).

El concepto, los procedimientos y las composiciones descritos en este ejemplo son aplicables a los RNKR-CAR. El concepto, los procedimientos y las composiciones descritos en este ejemplo son aplicables a las células RNKR-CARX.

Ejemplo 25: Construcción y actividad de InhKIR-CAR

Se construyó un KIR-CAR inhibidor basado en la fusión del scFv anti-mesotelina SS1 con la base del receptor inhibidor KIR2DL3. Los estudios iniciales demostraron que los inhKIR-CAR se expresaban eficazmente en células T humanas primarias. CD 19 actKIR-CAR, SS1 actKIR-CAR y SS1 inhKIR-CAR solos o en combinación se han introducido en células T Jurkat que llevan un indicador dsGFP bajo el control de un promotor dirigido por NFAT para monitorizar la activación de esta vía de señalización crítica de células T. Mientras que los linfocitos T Jurkat que expresan CD19 actKIR-CAR o SS1 actKIR-CAR solos se activan eficazmente mediante K562 que expresa tanto c D19 como mesotelina (KT-meso/CD19), los linfocitos T Jurkat que coexpresan CD19 actKIR-CAR y SS1 inhKIR-CAR mostró una activación marcadamente reducida por las mismas células diana KT-meso/CD19 (Figura 56A); sin embargo,

Ejemplo 26: Sensibilidad de los diseños de KIR-CAR activadores a los sistemas de receptores inhibidores naturales

Dado que la coexpresión de dos CAR scFv es limitada, se siguió una estrategia para evaluar la sensibilidad de los CAR activadores basados en KIR a las señales inhibidoras derivadas del receptor PD-1. El PD-1 es un receptor natural en las células T que usa un ITIM en el dominio citoplasmático similar a los KIR inhibidores para reclutar fosfatasas que regulan negativamente la señalización del TCR. En la Figura 68 se muestra una representación esquemática. Los resultados presentados en el presente documento demuestran que el PD-1 de tipo salvaje puede sobreexpresarse tanto con un CAR basado en KIR activador como con una mesotelina dirigida a CAR basada en TCR-zeta (Figuras 57A y 57C). Los resultados también muestran que esta combinación condujo a la inhibición dependiente del ligando 1 de PD-1 (PDL-1) de la citotoxicidad activante específica de mesotelina KIR-CAR (Figura 58). En el contexto de la expresión normal de PD-1 por las células T (es decir, Células T sin transfección de PD-1), el KIR-CAR exhibe menos inhibición cuando se encuentra con células diana que sobreexpresan PD-L1 en comparación con el CAR basado en TCR-zeta. Sin desear estar ligado a ninguna teoría en particular, se cree que esto puede ser una ventaja de los KIR-CAR cuando se encuentran tumores que comúnmente expresan ligandos de receptores inhibidores.

Ejemplo 27: Activación dependiente de la coestimulación de KIR CAR

Se diseñaron experimentos para evaluar los efectos de los receptores coestimuladores quiméricos (CCR) en el sistema KIR-CAR en comparación con el descrito con los CAR estándar por Kloss et al. (Kloss y col., 2013, Nat Biotechnol 31 (1): 71-5). También se han diseñado experimentos para evaluar los requisitos de activación dependiente coestimuladora para los KIR mediante la activación del receptor CD28 endógeno en la célula T usando el anticuerpo agonista, clon 9.3. Como se muestra en la Figura 63, el KIRS2 CAR mostró una fuerte proliferación en respuesta a dianas positivas para mesotelina en ausencia de coestimulación de CD28. Esta proliferación es superior a la observada con un TCR-zeta CAR en el que se ha demostrado que la coestimulación es fundamental para la proliferación. Estos datos sugieren que el CAR basado en KIR puede no tener los mismos requisitos de coestimulación que los CAR de TCR-zeta para la proliferación específica de antígeno (Milone et al., 2009, Mol Ther 17 (8): 1453-64; Carpenito et al., 2009, Proc Natl Acad Sci uSa 106 (9): 3360-5), y esta independencia de la coestimulación puede ser una ventaja significativa de los CAR basados en KIR para los CAR actuales basados en TCR-zeta. Se han diseñado experimentos para evaluar los CAR basados en KIR en ratones humanizados para probar el CAR basado en KIR contra CAR con y sin dominios coestimuladores en un entorno preclínico in vivo (los datos y experimentos del ejemplo 27 también se presentan en el ejemplo 28) .

Ejemplo 28: Receptores de antígenos quiméricos (CAR) basados en receptores de tipo inmunoglobulina de células asesinas (KIR) desencadenan una actividad citotóxica robusta en tumores sólidos

Los receptores de antígenos quiméricos (CAR) que llevan un dominio de unión a antígenos unido en cis a los dominios citoplasmáticos de CD3-Z y los receptores coestimuladores proporcionan un procedimiento potente para modificar la citotoxicidad de las células T hacia tumores (Grupp et al., The New England journal of medicine, 368 (16): 1509-18, 2013; Brentjens et al., Science Translational Medicine, 5 (177): 177ra38, 2013; Porter et al., The New England Journal of Medicine, 365 (8): 725-33, 2011). Un receptor quimérico alternativo en el que un fragmento variable de cadena única (scFv) dirigido a mesotelina (SS1) se fusionó con el dominio transmembrana y citoplasmático de KIR2DS2, un receptor de tipo inmunoglobulina estimulante asesino (KIR) normalmente expresado por células asesinas naturales (NK) es descrito aquí. Este CAR basado en SS1-KIRS2 KIR desencadena una sólida actividad citotóxica específica de antígeno y función efectora in vitro, como la secreción y proliferación de citocinas cuando se introduce en células T humanas en combinación con la molécula adaptadora DAP12. Las células T modificadas para expresar un KIR-CAR y DAP12 exhiben una actividad antitumoral significativamente mejorada en un modelo de xenoinjerto tumoral resistente en comparación con las células T transducidas con un CAR estándar basado en CD3Z, lo que sugiere que el CAR basado en KIR puede superar las señales inhibidoras dentro de los tumores que limitan los CAR de segunda y tercera generación basados en CD3Z. Los datos presentados en el presente documento respaldan la evaluación clínica futura de un CAR basado en KIR en cánceres que incluyen tumores sólidos.

Los CAR de "primera generación" se diseñaron mediante la incorporación de un dominio citoplasmático que contiene el motivo de activación basado en inmunotirosina (ITAM) en un único receptor quimérico que utiliza un fragmento variable de cadena única (scFv) de un anticuerpo para la selección de antígenos específicos (Sadelain et al ., Cancer discovery, 3 (4): 388-98, 2013). Posteriormente se incorporaron varios dominios de señalización adicionales diferentes de receptores coestimuladores como CD28, ICOS, 4-1BB y OX-40 en tándem en estos receptores para mejorar la proliferación, supervivencia y función de las células T (Finney HM et al. J Immunol. 1998; 161: 2791-2797; Maher J. et al. Nat Biotech 2002; 20: 70-75; Finney HM et al. J Immunol.2004; 18: 676-684; Milone et al., 2009, Mol Ther 17 (8): 1453-64; Carpenito y col., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106 (9): 3360-5).

Aunque los CAR monocatenarios desencadenan una fuerte actividad citotóxica específica de antígeno, los receptores naturales que utilizan los dominios ITAM altamente conservados generalmente se estructuran en complejos multicatenarios compuestos por cadenas de señalización que contienen ITAM y de unión a ligandos separados, como el receptor de células T (TCR) -Complejo CD3, complejo receptor de células B (BCR) -Iga/p y complejo receptor Fc (FcR). Los beneficios potenciales de un complejo inmunorreceptor de múltiples cadenas son múltiples, incluida una mayor diversidad de señales disponibles a través de las múltiples interacciones entre las moléculas de unión y señalización de ligando y la señalización sostenida de ITAM que es separable de la internalización de la cadena de unión a ligando (Sigalov et al. , Avances en medicina y biología experimental, 640: ixxi, 2008). Las consecuencias de combinar varios componentes del receptor que normalmente se encuentran en receptores heterólogos en un CAR no se han dilucidado por completo; sin embargo, se han observado señales independientes de anergia y antígeno con algunos diseños (Brocker, Blood, 96 (5): 1999-2001,2000; Brocker et al., The Journal of experimental medicine. 181 (5): 1653-9, 1995; Milone et al., Terapia molecular: la revista de la Sociedad Americana de Terapia Genética, 17 (8): 1453-64, 2009).

La invención reivindicada en el presente documento describe CAR construidos sobre un diseño de inmunorreceptor multicadena más "natural" que tiene mayor potencia para activar las células T debido a las interacciones seleccionadas naturalmente entre las subunidades dentro del complejo receptor y otros receptores dentro de las células inmunes. El receptor de tipo inmunoglobulina asesino (KIR) y el complejo inmunorreceptor de múltiples cadenas DAP12 se eligieron como base para el CAR (Thielens et al., Current opinion in immunology, 24 (2): 239-45, 2012). Aunque expresado por células asesinas naturales donde contribuyen a su citotoxicidad natural, la expresión de KIR también se ha observado en células T CD4 y CD8 (Moretta et al., Immunological reviews, 155: 105-17, 1997; Falk et al., Human inmunología; 61 (12): 1219-32, 2000; Remtoula et al., Journal of immunology, 180 (5): 2767-71, 2008). Activando KIRs, como KIR2DS2, poseen un dominio citoplasmático corto sin actividad de señalización endógena conocida. Sin embargo, los KIR forman un complejo no covalente con dímeros de DAP12, una molécula adaptadora que contiene ITAM capaz de unir quinasas Syk y Zap70 en células NK (Lanier et al., Nature, 391 (6668): 703-7, 1998). Además de estimular la citotoxicidad tras la unión al ligando, también se ha demostrado que los KIR exhiben efectos coestimuladores dentro de las células T en ausencia de DAP12, lo que sugiere que estas moléculas podrían proporcionar tanto actividad desencadenante primaria como coestimulación en las células T (Snyder et al., Revista de inmunología, 173 (6): 3725-31,2004).

Se construyó un CAR basado en KIR empalmando el scFv SS1 específico de mesotelina en el dominio transmembrana y citoplasmático corto del KIR activador, KIR2DS2 (SS1-KIRS2) como se ilustra esquemáticamente en la Figura 50 (Hassan et al., Clinical cancer research: an revista oficial de la Asociación Estadounidense para la Investigación del Cáncer, 8 (11): 3520-6, 2002). La molécula adaptadora que contiene ITAM, DAP12, se expresa constitutivamente en células asesinas naturales (NK), pero solo se expresa en un subconjunto de células T humanas (Moretta et al.). Por lo tanto, se generó un vector lentiviral bicistrónico que codifica tanto el CAR basado en KIR específico de mesotelina (SS1-KIRS2) como la molécula DAP12 separada por la secuencia del virus Thoseaasigna 2A (T2A) para lograr la coexpresión de ambas moléculas (Fig. 51). La transducción de células T humanas primarias con lentivirus bicistroínico SS1-KIRS2 y DAP12 después de la activación anti-CD3 y anti-CD28 demostró una expresión de superficie robusta de SS1-KIRS2 que era comparable con el CAR SS1Z basado en CD3Z (Fig. 55). Las células T cotransducidas SS1-KIRS2/DAP12 se expandieron después de la estimulación policlonal anti-CD3/anti-CD28 con una cinética comparable a la observada con las células T transducidas simuladas o las células T transducidas con un CAR específico de mesotelina que contiene el dominio citoplasmático CD3Z (datos no mostrados). Se compararon las actividades citotóxicas de las células T CAR basadas en KIR versus CD3 CD (SS1-z). Las células T transducidas con SS1-KIRS2/DAP12 mostraron una potente actividad citotóxica hacia las células K562 que expresan mesotelina humana (K-meso) con una magnitud similar a la construcción SS1Z.

Dado que la expresión de KIR2DS2 se ha descrito en células T en ausencia de expresión de DAP12 detectable, se evaluó la expresión y función del receptor SS1-KIRS2 con o sin la co-entrega de DAP12. Usando un vector lentiviral que co-expresó DAP12 con la proteína roja fluorescente, dsRed (DAP12-dsRed) o un vector de control que expresa dsRed (dsRed), las células T se transdujeron con el DAP12 lentiviral o el vector de control seguido de transfección con el vector de control transcrito in vitro ARN que expresa SS1-KIRS2. SS1-KIRS2 se expresó en la superficie de las células T sin la adición de DAP12; sin embargo, la expresión de superficie de SS1-KIRS2 aumentó en —1-log con la adición de DAP12 (Fig. 61A). A pesar de la expresión de SS1-KIRS2, Las células T sin DAP12 no lisan las células diana que expresan mesotelina, lo que demuestra un requisito de DAP12 en la actividad citotóxica de las células T activada por SS1-KIRS2 (Fig. 61B). Estos datos no excluyen la posibilidad de que el KIR quimérico pueda proporcionar señales independientemente de su asociación con DAP12 como se informó anteriormente para el receptor KIR2DS2 natural en clones de células T (Snyder et al.).

La asociación no covalente de KIR2DS2 natural y DAP12 depende de las interacciones electrostáticas entre un residuo de ácido aspártico en el dominio transmembrana (TM) de KIR y un residuo de lisina en el dominio DAP12 TM (Feng et al., PLoS biology, 4 (5): e142, 2006). Aunque se cree que la configuración de estos residuos de aminoácidos ionizables en los dominios TM de las subunidades TCR y CD3 difiere de los KIR y DAP12, lo que proporciona cierta especificidad para las interacciones, la posibilidad de que SS1-KIRS2 pueda estar interactuando con componentes del complejo CD3 en lugar de DAP12 coadministrado. Dado que la asociación entre el complejo CD3 y las cadenas de TCR es necesaria para la expresión de TCR en la superficie celular, Se esperaría que la competencia del KIR por los componentes CD3 interfiriera con la expresión normal de TCR como se observó previamente con la expresión de TCR clonados. Se ha demostrado que la introducción de una cadena Vp ectópica en las células T reduce la expresión superficial de Vp de TCR endógeno debido a la competencia durante el ensamblaje complejo (Varela-Rohena et al., Nature medicine, 14 (12): 1390-5, 2008). La frecuencia e intensidad similares de TCR Vp 13.1+ en las células T policlonales transducidas con KIRS2 en comparación con las células T control transducidas de forma simulada apoya la ausencia de una interacción significativa entre SS1-KIRS2 y los miembros del complejo CD3 endógeno (Fig.62). 14 (12): 1390-5, 2008). La frecuencia e intensidad similares de TCR Vp 13.1+ en las células T policlonales transducidas con KIRS2 en comparación con las células T control transducidas de manera simulada apoya la ausencia de una interacción significativa entre SS1-KIRS2 y miembros del complejo CD3 endógeno (Fig.62). 14 (12): 1390-5, 2008). La frecuencia e intensidad similares de TCR Vp 13.1 en las células T policlonales transducidas con KIRS2 en comparación con las células T control transducidas de manera simulada apoya la ausencia de una interacción significativa entre SS1-KIRS2 y miembros del complejo CD3 endógeno (Fig.62).

Aunque la actividad citotóxica es una función efectora importante para la actividad antitumoral in vivo de las células T, la capacidad de un receptor de antígeno para desencadenar la secreción de citocinas y la proliferación de células T también son características importantes que generalmente se correlacionan con una actividad antitumoral sólida in vivo. Por lo tanto, la secreción de interferón-y (IFN-y) e interleucina-2 (IL-2) activada por antígenos por células T modificadas con SS1-KIRS2/DAP12 a células T que llevan un CAR basado en CD3Z sin un dominio coestimulador (SS1-Z ) o con dominios coestimuladores CD28 o 4-1BB (se compararon SS1-28Z y SS1-BBZ, respectivamente. La construcción SS1-Z estimula la secreción más baja de IFN-y e IL-2 (Fig. 59, 60 ). La producción de interferón-y está aumentada y es comparable en las células T que expresan SS1-KIRS2/DAP12 o SS1-BBZ, mientras que las células T que expresan el cAr de SS1-28Z muestran una producción de IL-2 e IFN-y significativamente mayor (Fig. 59). El c é lu la s T C A R S S 1 -28 Z e n re la c ió n c o n la s c é lu la s T n o tra n s d u c id a s d e n tro d e l m ic ro a m b ie n te tu m o ra l.

E n c o n c lu s ió n , lo s d a to s p re s e n ta d o s en e l p re s e n te d o c u m e n to d e m u e s tra n q u e la c o m b in a c ió n d e C A R y D A P 12 b a s a d o s en K IR p ro p o rc io n a un s is te m a re c e p to r e s p e c íf ic o d e a n t íg e n o a lta m e n te e f ic a z p a ra c o n fe r ir e s p e c if ic id a d d e a n tíg e n o a r t if ic ia l a la s c é lu la s T . A p e s a r d e la a c t iv id a d in v it ro re la t iv a m e n te e q u iv a le n te , se ha d e m o s tra d o a d e m á s q u e e s te C A R b a s a d o en K IR t ie n e u n a e f ic a c ia a n t itu m o ra l m u c h o m e jo r en c o m p a ra c ió n c o n lo s C A R b a s a d o s en C D 3 Z co n u n o o m á s d o m in io s c o e s t im u la d o re s en e l s is te m a tu m o ra l m o d e lo u t iliz a d o a q u í, q u iz á s d e b id o a u n a m a y o r re s is te n c ia a la in a c t iv a c ió n . S e p ro s e g u irá la e x p lo ra c ió n d e lo s m e c a n is m o s d e e s ta m a y o r e f ic a c ia y d e lo s d is e ñ o s d e re c e p to re s q u im é r ic o s b a s a d o s en o tro s re c e p to re s d e u n ió n a lig a n d o s a s o c ia d o s a D A P 12 , a s í c o m o en s is te m a s d e re c e p to re s q u e c o n t ie n e n IT A M n a tu ra le s a d ic io n a le s ta le s c o m o F cR y .

E l c o n c e p to , lo s p ro c e d im ie n to s y la s c o m p o s ic io n e s d e s c r ito s en e s te e je m p lo s o n a p lic a b le s a lo s R N K R -C A R . El c o n c e p to , lo s p ro c e d im ie n to s y la s c o m p o s ic io n e s d e s c r ito s en e s te e je m p lo so n a p lic a b le s a la s c é lu la s R N K R -C A R X .

Ejemplo 29: Un CAR basado en KIR puede coexpresarse con un KIR inhibidor natural que permite la regulación mediante la expresión de HLA en las células diana

Generación y caracterización de una línea celular K562-meso que expresa el ligando de KIR2DL3 HLA-Cw

Material y procedimiento ^{: S e tra n s d u je ro n c é lu la s K 562 d e t ip o s a lv a je o u n a lín e a K 562 p re v ia m e n te d is e ñ a d a p a ra}e x p re s a r m e s o te lin a (K 562 -m e s o ) c o n un v e c to r le n t iv ira l q u e c o d if ic a e l a le lo H L A -C w 3. L a s c é lu la s se c la s if ic a ro n p a ra la e x p re s ió n u n ifo rm e d e m e s o te lin a y H L A -C w 3 m e d ia n te c la s if ic a c ió n d e c é lu la s a c t iv a d a s p o r f lu o re s c e n c ia . La e x p re s ió n d e H L A -C w 3 se c o n f irm ó m e d ia n te c ito m e tr ía d e f lu jo d e s p u é s d e la t in c ió n c o n el a n t ic u e rp o a n t i-H L A A , B, C W 6 /32 c o n ju g a d o co n A P C .

Resultado^: ^{se p u e d e n g e n e ra r lín e a s c e lu la re s K 562 q u e e x p re s a n m e s o te lin a o H L A -C w 3 s o la s o en c o m b in a c ió n}(F ig . 69 ).

C o e x p re s ió n d e S S 1 -K IR S 2 y K IR 2 D L 3 e n c é lu la s T h u m a n a s p r im a r ia s

Material y procedimiento^: ^{S e e s t im u la ro n c é lu la s T h u m a n a s p r im a r ia s c o n m ic ro p e r la s a n t i-C D 3 /28 s e g u id o d e}tra n s d u c c ió n c o n un v e c to r le n t iv ira l b ic is tró n ic o q u e e x p re s a D A P 12 y S S 1 -K IR S 2 s o lo o en c o m b in a c ió n co n un v e c to r le n t iv ira l q u e e x p re s a K IR 2 D L 3 e l d ía 1 d e s p u é s d e la a c t iv a c ió n . . L a e x p re s ió n d e l C A R S S 1 -K IR S 2 se e v a lu ó m e d ia n te c ito m e tr ía d e f lu jo u s a n d o un a n t ic u e rp o p o lic lo n a l F (a b ) 2 a n t i- ra tó n d e c a b ra b io t in ila d o s e g u id o d e S A -A P C . L a e x p re s ió n d e K IR 2 D L 3 s e d e te rm in ó u s a n d o un a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l e s p e c íf ic o d e K IR 2 D .

Resultado^: ^{S e p u e d e n g e n e ra r c é lu la s T h u m a n a s p r im a r ia s q u e e x p re s a n un C A R b a s a d o en K IR e s p e c íf ic o de}m e s o te lin a c o n D A P 12 (K IR S 2 ) s o lo , K IR 2 D L 3 s o lo o u n a c o m b in a c ió n d e lo s d o s re c e p to re s (F ig . 70 ).

K IR 2 D L 3 c o e x p re s a d o co n un K IR C A R p u e d e s u p r im ir la c ito to x ic id a d e s p e c íf ic a d e l a n tíg e n o e n p re s e n c ia d e H L A -C w e n la s c é lu la s d ia n a

Material y procedimiento^: ^{S e e s t im u la ro n c é lu la s T h u m a n a s p r im a r ia s c o n m ic ro p e r la s a n t i-C D 3 /28 s e g u id o d e}tra n s d u c c ió n co n un v e c to r le n t iv ira l b ic is tró n ic o q u e e x p re s a D A P 12 y S S 1 -K IR S 2. S e in tro d u je ro n 5 |jg d e A R N m tra n s c r ito in v it ro q u e c o d if ic a K IR 2 D L 3 en la s c é lu la s T tra n s d u c id a s le n t iv ira lm e n te m e d ia n te e le c tro p o ra c ió n d e s p u é s d e 10 d ía s d e e x p a n s ió n e x v iv o . E s ta s p o b la c io n e s d e c é lu la s T se m e z c la ro n c o n c é lu la s d ia n a K 562 m a rc a d a s co n 51 C r (K 562 , K 562 -m e s o , K 562 -H L A C w y K 562 -m e s o /H L A C w ) c o m o se in d ic a en p ro p o rc io n e s v a r ia b le s d e c é lu la s T e fe c to ra s a c é lu la s K 562 d ia n a ( re la c ió n E :T ). La c ito to x ic id a d se d e te rm in ó m id ie n d o la f ra c c ió n d e 51 C r lib e ra d a e n e l s o b re n a d a n te a la s 4 h o ra s .

Resultado^: ^{la s c é lu la s T q u e e x p re s a n S S 1 -K IR S 2 /D A P 12 fu e ro n c a p a c e s d e m a ta r la s c é lu la s K 562 d ia n a q u e}e x p re s a n m e s o te lin a in d e p e n d ie n te m e n te d e la e x p re s ió n d e H L A -C w 3. P o r e l c o n tra r io , la s c é lu la s T q u e c o e x p re s a n e l c o m p le jo d e l re c e p to r S S 1 -K IR S 2 /D A P 12 y e l in h ib id o r K IR , K IR 2 D L 3 no m o s tra ro n u n a c ito to x ic id a d ro b u s ta c o n tra K 562 q u e e x p re s a b a m e s o te lin a co n H L A -C w 3 ; s in e m b a rg o , e s ta s c é lu la s d e m o s tra ro n u n a a c t iv id a d c ito tó x ic a h a c ia la s c é lu la s K 562 q u e e x p re s a n m e s o te lin a s o la q u e e ra c o m p a ra b le a la s c é lu la s T m o d if ic a d a s co n S S 1 -K IR S 2 /D A P 12. E s to s re s u lta d o s d e m u e s tra n la c a p a c id a d d e lo s re c e p to re s K IR in h ib id o re s p a ra re g u la r la a c t iv id a d fu n c io n a l d e a c t iv a r lo s C A R b a s a d o s e n K IR (F ig . 71 ).

Ejemplo 30: Un CAR basado en KIR con especificidad de CD19 puede desencadenar citotoxicidad de células diana específicas de antígeno in vitro e in vivo

U n C A R b a s a d o en K IR co n e s p e c if ic id a d d e C D 19 p u e d e d e s e n c a d e n a r in v it ro c ito to x ic id a d d e c é lu la s d ia n a e s p e c íf ic a s d e a n tíg e n o

Material y procedimiento ^{: D e s p u é s d e la a c t iv a c ió n d e m ic ro e s fe ra s a n t i-C D 3 /a n t i-C D 28 , la s c é lu la s T se}tra n s d u je ro n c o n un v e c to r le n t iv ira l b ic is t ró n ic o q u e e x p re s a D A P 12 ju n to c o n un C A R b a s a d o e n K IR e s p e c íf ic o d e C D 19 en e l q u e e l s c F v d e r iv a d o d e F M C 63 se fu s io n a co n K IR 2 D S 2 d e lo n g itu d c o m p le ta (C D 19 -K IR 2 D S 2 ) o un C A R b a s a d o en K IR g e n e ra d o fu s io n a n d o el s c F v F M C 63 co n e l d o m in io t ra n s m e m b ra n a y c ito p la s m á t ic o d e K IR 2 D S 2 m e d ia n te un e n la z a d o r c o r to [G ly ] 4 -S e r e n la z a d o r (C D 19 -K IR S 2 ) . L a s c é lu la s T tra n s d u c id a s se c u lt iv a ro n h a s ta e l f in a l d e l c re c im ie n to en fa s e lo g a r í tm ic a , y la e x p re s ió n d e l C A R b a s a d o en K IR e s p e c íf ic o d e C D 19 se e v a lu ó m e d ia n te c ito m e tr ía d e f lu jo u t i l iz a n d o un a n t ic u e rp o p o lic lo n a l F (a b ) 2 de c a b ra a n t i- ra tó n b io t in ila d o s e g u id o d e S A -E D U C A C IÓ N F ÍS IC A . 51S e m e z c la ro n c é lu la s d ia n a K 562 m a rc a d a s c o n C r c o n (K 562 -C D 19 ) o s in e x p re s ió n d e (K 562 -w t) C D 19 en p ro p o rc io n e s v a r ia b le s c o n c é lu la s T a c é lu la s d ia n a (p ro p o rc ió n E: T ). La c ito to x ic id a d se d e te rm in ó m id ie n d o la fra c c ió n d e 51 C r lib e ra d a en e l s o b re n a d a n te a la s 4 h o ra s . L a s c é lu la s T d e c o n tro l q u e fu e ro n s im u la d a s d e t r a n s d u c c ió n (N T D ) o t ra n s d u c id a s c o n un C A R b a s a d o e n C D 3 Z e s p e c íf ic o p a ra C D 19 (C D 19 -z ) ta m b ié n se in c lu y e ro n c o m o c o n tro le s n e g a t iv o s y p o s it iv o s , re s p e c t iv a m e n te .

Resultado^: ^{e l a n á lis is d e c ito m e tr ía d e f lu jo d e m u e s tra la e x p re s ió n d e l s c F v e s p e c íf ic o d e C D 19 en la s u p e r f ic ie d e}la s c é lu la s T tra n s d u c id a s c o n C D 19 -K IR 2 D S 2 , C D 19 -K IR S 2 y C D 19 -z (F ig . 65 A ). L a s c é lu la s T q u e e x p re s a n D A P 12 c o n C D 19 -K IR 2 D S 2 o C D 19 -K IR S 2 fu e ro n c a p a c e s d e m a ta r la s c é lu la s d ia n a d e u n a m a n e ra e s p e c íf ic a d e a n tíg e n o (F ig . 65 B ). La c ito to x ic id a d e x h ib id a p o r la s c é lu la s T m o d if ic a d a s co n C A R b a s a d a s en K IR fu e c o m p a ra b le o s u p e r io r a la s c é lu la s T q u e e x p re s a n u n a C A R b a s a d a en C D 3 Z e s p e c íf ic a d e C D 19.

L a s c é lu la s T t r a n s d u c id a s co n C D 19 -K IR S 2 /D A P 12 in d u c e n la re g re s ió n d e l tu m o r en un x e n o in ie r to d e le u c e m ia h u m a n a

Material y procedimiento^: ^{N O D -S C ID - y c -/" (N S G ) s e in je r ta ro n p o r v ía in tra v e n o s a e n la v e n a d e la c o la e l d ía 0 c o n 1}m illó n d e c é lu la s tu m o ra le s N a lm -6 C B G , u n a lín e a c e lu la r d e le u c e m ia q u e e x p re s a C D 19. E n e l e x p e r im e n to , las c é lu la s T s e e s t im u la ro n c o n p e r la s e s t im u la d o ra s a n t i-C D 3 /a n t i-C D 28 s e g u id o d e t r a n s d u c c ió n le n t iv ira l e l d ía 1 co n u n a s e r ie d e C A R b a s a d o en C D 3 c o n o s in un d o m in io c o e s t im u la d o r (C D 19 -z , C D 19 -B B z ) o e l C A R b a s a d o s en K IR e s p e c íf ic o s d e C D 19 , C D 19 -K IR S 2 co n D A P 12 c o m o s e in d ic a en la f ig u ra . S e u t il iz a ro n c é lu la s T t r a n s d u c id a s s im u la d a s (N T D ) c o m o c o n tro l. L a s c é lu la s T se e x p a n d ie ro n h a s ta e l f in a l d e l c re c im ie n to en fa s e lo g a r í tm ic a e x v iv o y se in y e c ta ro n p o r v ía in tra v e n o s a e l d ía 5 d e s p u é s d e la in y e c c ió n d e la lín e a c e lu la r d e le u c e m ia co n 2 m illo n e s d e c é lu la s C A R T p o r ra tó n . L a c a rg a tu m o ra l s e e v a lu ó m e d ia n te im á g e n e s b io lu m in is c e n te s . S e a n a liz a ro n 5 a n im a le s p a ra c a d a c o n d ic ió n d e c é lu la s T (F ig u ra 66 ).

Resultado^: ^{en e l e x p e r im e n to in v iv o p re s e n ta d o (F ig . 66 ), la s c é lu la s T N T D n o tu v ie ro n e fe c to s o b re e l c re c im ie n to}tu m o ra l, m ie n tra s q u e la s c é lu la s T tra n s d u c id a s co n C D 19 z , C D 19 B B z y C D 19 -K IR S 2 e x h ib e n v a r io s e fe c to s a n t itu m o ra le s . L o s ra to n e s a lo s q u e se le s in fu n d ie ro n c é lu la s T C D 19 z m o s tra ro n u n a lig e ra re d u c c ió n en la c a rg a tu m o ra l p e ro re tu v ie ro n n iv e le s d e te c ta b le s d e lu m in is c e n c ia . P o r e l c o n tra r io , la lu m in is c e n c ia d e la s c é lu la s tu m o ra le s e n ra to n e s in fu n d id o s c o n c é lu la s T C D 19 B B z o C D 19 K IR S 2 c a y ó a l lím ite in fe r io r d e d e te c c ió n (F ig .66 B , lín e a d e p u n to s ) s o lo 7 d ía s d e s p u é s d e la in y e c c ió n d e c é lu la s T , m o s tra n d o un a c la ra m ie n to c o m p le to fu e ra d e un p e q u e ñ o d e p ó s ito d e c é lu la s le u c é m ic a s e n la ra íz d e l d ie n te in a c c e s ib le p a ra la s c é lu la s T . P a ra e l d ía 15 , la c a rg a tu m o ra l en e l g ru p o d e c é lu la s T s im u la d a s s u p e ró e l c r ite r io d e v a lo ra c ió n (2 x 10 10 fo to n e s /s e g u n d o ) y se s a c r if ic a ro n , m ie n tra s q u e la lu m in is c e n c ia e n lo s g ru p o s C D 19 B B z y C D 19 K IR S 2 p e rm a n e c ió e n e l lím ite in fe r io r d e d e te c c ió n .

Ejemplo 31: Un CAR basado en el dominio VHH único de un camélido se puede expresar en la superficie de una célula T en combinación con un CAR basado en scFv sin una interacción apreciable del receptor.

Material y procedimiento^: ^{S e tra n s d u je ro n c é lu la s T J u rk a t q u e e x p re s a n G F P b a jo un p ro m o to r d e p e n d ie n te d e}N F A T (N F -G F P ) c o n un C A R a c t iv a d o r e s p e c íf ic o d e m e s o te lin a (S S 1 -C A R ) , a c t iv a d o r e s p e c íf ic o d e c D 19 (19 -C A R ) o un C A R g e n e ra d o u s a n d o un d o m in io V H H d e c a m é lid o e s p e c íf ic o d e E G F R (V H H -C A R ) . D e s p u é s d e la t ra n s d u c c ió n co n e l C A R a c tiv a d o r , la s c é lu la s se t ra n s d u je ro n c o n un C A R in h ib id o r a d ic io n a l q u e re c o n o c e C D 19 (19 -P D 1 ) p a ra g e n e ra r c é lu la s q u e c o e x p re s a n ta n to e l C A R a c t iv a d o r c o m o e l in h ib id o r (S S 1 19 P D 1 , 19 19 P D 1 o V H H 19 P D 1 ). L a s c é lu la s T J u rk a t t ra n s d u c id a s se c u lt iv a ro n c o n ju n ta m e n te d u ra n te 24 h o ra s c o n d ife re n te s lín e a s c e lu la re s q u e 1) c a re c e n d e to d o s lo s a n t íg e n o s d ia n a (K 562 ), 2 ) e x p re s a n m e s o te lin a (K -m e s o ) , C D 19 (K -19 ) o E G F R (A 431 ) s o la m e n te , 3 ) e x p re s a n u n a c o m b in a c ió n d e E G f R y m e s o te lin a (A 431 -m e s o te lin a ) o C D 19 (A 431 -C D 19 ) o 4 ) e x p re s a n u n a c o m b in a c ió n d e C D 19 y m e s o te lin a (K -19 /m e s o ) . L a s c o n d ic io n e s a d ic io n a le s q u e in c lu y e n c é lu la s no e s t im u la n te s (s in e s t im u la c ió n ) o K 562 co n 1 p g /m l d e O K T 3 (O K T 3 ) ta m b ié n se in c lu y e ro n c o m o c o n tro le s n e g a t iv o s y p o s it iv o s p a ra la a c t iv a c ió n d e N F A T , re s p e c t iv a m e n te . La e x p re s ió n d e G F P , c o m o m a rc a d o r d e a c t iv a c ió n d e N F A T , s e e v a lu ó m e d ia n te c ito m e tr ía d e flu jo .

R e s u lta d o : lo s c a m e llo s y la s e s p e c ie s re la c io n a d a s (p o r e je m p lo , la l la m a ) p ro d u c e n d e fo rm a n a tu ra l a n t ic u e rp o s q u e t ie n e n un ú n ic o d o m in io v a r ia b le s im ila r a u n a c a d e n a p e s a d a . E s te d o m in io , c o n o c id o c o m o d o m in io V H H de c a m é lid o s , ha e v o lu c io n a d o p a ra e x is t ir s in e m p a re ja rs e c o n un d o m in io v a r ia b le d e c a d e n a lig e ra . La F ig .76 A m u e s tra e s q u e m á t ic a m e n te la p o s ib il id a d d e q u e d o s m o lé c u la s s c F v h e te ró lo g a s p u e d a n d is o c ia rs e y v o lv e r a a s o c ia rs e e n tre s í c u a n d o se m u e s tra n en la s u p e r f ic ie d e u n a c é lu la , c o m o lo d e m u e s tra la in te r ru p c ió n o b s e rv a d a e n la u n ió n a s c F v a l lig a n d o a fín d u ra n te la c o e x p re s ió n d e l re c e p to r (F ig .74 y F ig u ra 75 ). L a f ig u ra 76 B m u e s tra u n a ^{re p re s e n ta c ió n e s q u e m á tic a d e la in te ra c c ió n re d u c id a e s p e ra d a e n tre un}cAr ^{s c F v p re s e n ta d o en la s u p e r f ic ie d e}u n a c é lu la en c o m b in a c ió n co n un C A R b a s a d o en e l d o m in io V H H . L a f ig u ra 77 d e m u e s tra q u e la c o e x p re s ió n d e d o s C A R s b a s a d o s en s c F v (C A R q u e a c t iv a S S 1 -z y C A R in h ib id o r d e C D 19 -P D 1 ) en la s u p e r f ic ie d e un J u rk a t c o n d u c e a la in c a p a c id a d d e l C A R a c t iv a d o r (S S 1 -z ) p a ra re c o n o c e r su lig a n d o a n á lo g o en e l la c é lu la d ia n a y d e s e n c a d e n a la a c t iv a c ió n d e la s c é lu la s T a p e s a r d e la a u s e n c ia d e l lig a n d o d e l re c e p to r in h ib id o r . E s to e s c o n s is te n te co n la u n ió n a lig a n d o re d u c id a o b s e rv a d a en la s u p e r f ic ie (F ig 74 ). P o r e l c o n tra r io , la c o e x p re s ió n d e l m is m o C A R in h ib id o r (C D 19 -P D 1 ) co n un C A R a c t iv a d o r b a s a d o en V H H d e c a m é lid o (V H H -z ) no t ie n e n in g ú n im p a c to e n la c a p a c id a d d e l C A R a c t iv a d o r b a s a d o e n V H H p a ra re c o n o c e r su lig a n d o E G F R a fín .

Ejemplo 32: Un CAR NCR basado en NKp46 con especificidad de mesotelina desencadena citotoxicidad específica de antígeno

M a te r ia l y p ro c e d im ie n to : D e s p u é s d e la a c t iv a c ió n d e m ic ro e s fe ra s a n t i-C D 3 /a n t i-C D 28 , la s c é lu la s T se ^{tra n s d u je ro n co n un v e c to r le n t iv ira l b i-c is tró n ic o q u e e x p re s a D A P 12 y S S 1 -K IR S 2 (c o n tro l) , o}FceRy ^{y un C A R b a s a d o en N K p 46 e s p e c íf ic o d e m e s o te lin a . (S S 1 -N K p 46 ) o}FceRy ^{y un C A R N K p 46 e s p e c íf ic o d e m e s o te lin a en e l}q u e e l d o m in io e x t ra c e lu la r d e N K p 46 n a tu ra l e s ta b a t r u n c a d o ( s S l- T N K p 46 ) . La e x p re s ió n d e lo s C A R e s p e c íf ic o s d e m e s o te lio se e v a lu ó m e d ia n te c ito m e tr ía d e f lu jo u t iliz a n d o un a n t ic u e rp o p o lic lo n a l F (a b ) 2 d e c a b ra a n ti- ra tó n b io t in ila d o s e g u id o d e S A -P E (F ig u ra 67 ). L a s c é lu la s T se m e z c la ro n c o n 51 m a rc a d a s co n C r c é lu la s d ia n a K 562 q u e e x p re s a n la m e s o te lin a en re la c io n e s v a r ia b le s d e c é lu la s T e fe c to r a d ia n a c é lu la s K 562 (p ro p o rc ió n E: T ). La c ito to x ic id a d se d e te rm in ó m id ie n d o la fra c c ió n d e 51S e lib e ra C r en e l s o b re n a d a n te a la s 4 h o ra s en c o m p a ra c ió n c o n la lib e ra c ió n e s p o n tá n e a .

R e s u lta d o : lo s re c e p to re s S S 1 -N K p 46 y S S 1 -s N K p 46 e x h ib e n e x p re s ió n s u p e r f ic ia l en la s c é lu la s T . L o s lin fo c ito s T tra n s d u c id o s c o n S S 1 -T N K p 46 m u e s tra n u n a c ito lis is d e c é lu la s d ia n a ro b u s ta q u e e s c o m p a ra b le a l C A R S S 1 -K IR S 2 b a s a d o en K IR . S S 1 -N K p 46 e x h ib ió u n a a c t iv id a d c ito tó x ic a m á s d é b il q u e e ra e v id e n te s o lo a a lta s p ro p o rc io n e s d e e fe c to r a c é lu la d ia n a (F ig u ra 67 ). E s to s d a to s d e m u e s tra n q u e se p u e d e g e n e ra r un in m u n o r re c e p to r q u im é r ic o e s p e c íf ic o d e a n tíg e n o p a ra su u s o e n la re d ire c c ió n d e la a c t iv id a d c ito lí t ic a d e c é lu la s T a p a r t ir d e re c e p to re s d e c ito to x ic id a d n a tu ra l (N C R ) u s a n d o un d is e ñ o s im ila r a l u s a d o p a ra c re a r un C A R b a s a d o e n K IR .

Ejemplo 33: Interacción de dominios scFv

M a te r ia l y p ro c e d im ie n to : E n la f ig u ra 73 , se tra n s d u je ro n c é lu la s T J u rk a t c o n un v e c to r le n t iv ira l q u e c o d if ic a un C A R b a s a d o e n K IR in h ib id o r e s p e c íf ic o d e m e s o te lin a (S S 1 -K IR 2 D L 3 ) . E s ta s c é lu la s tra n s d u c id a s s e tra n s d u je ro n a c o n t in u a c ió n co n d i lu c io n e s v a r ia b le s d e un v e c to r le n t iv ira l q u e c o d if ic a un C A R b a s a d o e n K IR a c t iv a d o r e s p e c íf ic o d e C D 19 (C D 19 -K IR 2 D S 2 ) . E s to s K IR -C A R se m u e s tra n e s q u e m á t ic a m e n te en la F ig u ra 72. D e s p u é s d e la t ra n s d u c c ió n co n a m b o s C A R , la f re c u e n c ia d e la s c é lu la s co n e x p re s ió n s u p e r f ic ia l d e un C A R co n un s c F v in ta c to c a p a z d e u n irs e a su lig a n d o d ia n a se e v a lu ó m e d ia n te c ito m e tr ía d e f lu jo d e s p u é s d e la t in c ió n co n m e s o te lin a -F c p ro te ín a d e fu s ió n s e g u id a d e un a n t ic u e rp o a n t i-F c s e c u n d a r io m a rc a d o co n P E y un a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l a n t iid io t ip o a n t i-C D 19 e s p e c íf ic o (c lo n F M C 63 ) m a rc a d o c o n A P C . E n la f ig u ra 74 , S e tra n s d u je ro n c é lu la s T h u m a n a s p r im a r ia s a c t iv a d a s co n a n t i-C D 3 /28 co n d ife re n te s v e c to re s le n t iv ira le s q u e c o d if ic a n un C A R b a s a d o en C D 3 z e s p e c íf ic o d e m e s o te lin a q u e lle v a u n a fu s ió n d e m C h e r ry a l e x tre m o C - te rm in a l (S S 1 z -m C h ) , un C A R e s p e c íf ic o d e C D 19 co n C D 3 z y D o m in io c ito p la s m á tic o 4 -1 B B (19 b b z ) o u n a c o m b in a c ió n d e S S 1 z -m C h y 19 b b z . La e x p re s ió n d e m C h e r ry y un s c F v S S 1 fu n c io n a l se e v a lu ó m e d ia n te c ito m e tr ía d e f lu jo d e s p u é s d e la t in c ió n c o n u n a p ro te ín a d e fu s ió n m e s o te lin a -F c s e g u id a d e un a n t ic u e rp o a n t i-F c s e c u n d a r io m a rc a d o co n F IT C . En la f ig u ra 75 , s e tra n s d u je ro n c é lu la s T h u m a n a s p r im a r ia s a n t i-C D 3 /28 a c t iv a d a s c o n d ife re n te s v e c to re s le n t iv ira le s q u e c o d if ic a n un C A R b a s a d o en C D 3 z e s p e c íf ic o d e m e s o te lin a (S S 1 z ) , un C A R e s p e c íf ic o d e C D 19 q u e lle v a el Fm C63 ^{s c F v (19 b b z ) o un C A R e s p e c íf ic o d e C D 19 q u e lle v a e l 21 d 4 s c F v (21 d 4 b b z ) o un C A R e s p e c íf ic o d e C D 19}q u e lle v a e l B L 22 s c F v (B L 22 b b z ) en e l q u e e l s c F v e s ta b a c o m p u e s to p o r u n a v a r ia b le d e c a d e n a p e s a d a d o m in io (VH) 5 'al dominio variable de cadena ligera (VL) en el scFv (H2L) o el VL ubicado 5' al VH (L2H). Después de la transducción con cada uno de los CAR específicos de CD19, las células T se cotransdujeron con SS1z. La unión al SS1z a la mesotelina y la expresión superficial del scFv anti-CD19 se evaluó mediante citometría de flujo después de la tinción con una proteína de fusión mesotelina-Fc seguida de un anticuerpo anti-Fc secundario marcado con FITC o proteína L biotinilada seguido de estreptavidina- APC conjugado.

Resultado: la Fig. 73 muestra que la coexpresión de dos CARs intactos basados en scFv de unión a ligando (SS1-KIR2DL3 y CD19-KIR2DS2) en la superficie celular es mutuamente excluyente. La Figura 75 demuestra que la pérdida de unión al ligando ocurre a pesar de la expresión del CAR en la célula, como lo ilustra la presencia de células que expresan mCherry con unión reducida de mesotelina en células cotransducidas con SS1z-mCh y 19bbz. La Figura 75 demuestra que la interacción entre scFv que conduce a la pérdida de la función de unión a scFv se puede observar utilizando diferentes CAR basados en scFv que respaldan la naturaleza universal de este efecto. Estas observaciones son consistentes con el modelo representado en la Fig. 76 Panel A en el que el dominio variable de un scFv puede experimentar apareamiento intermolecular con un receptor quimérico basado en scFv heterólogo que conduce a la pérdida de unión por el scFv dentro de un solo CAR.

Ejemplo 34: Un receptor de antígeno quimérico (CAR) basado en un receptor de tipo inmunoglobulina de células asesinas (KIR) desencadena la actividad citotóxica en tumores sólidos

Los receptores de antígenos quiméricos (CAR) basados en una única molécula quimérica que lleva un dominio de unión a antígeno unido en cis a los dominios citoplasmáticos de CD3Z y los receptores coestimuladores CD28 o 4-1BB proporcionan un procedimiento potente para modificar la citotoxicidad de las células T hacia tumores. Se usó un receptor quimérico de múltiples cadenas basado en receptores de tipo inmunoglobulina asesinos (KIR) expresados normalmente por células asesinas naturales (NK) y células T. Construido mediante la fusión de un fragmento variable de cadena única (scFv) al dominio transmembrana y citoplasmático de un KIR, se demostró que un CAR basado en KIR dirigido a mesotelina (SS1-KIR) desencadena una actividad citotóxica específica de antígeno y una producción de citocinas comparable a CAR basados en CD3Z con proliferación inducida por antígenos que es independiente de la coestimulación adicional. Utilizando un modelo de xenoinjerto de mesotelioma resistente a la inmunoterapia de células T, se demostró además que una mesotelina dirigida a CAR basada en KIR exhibe una actividad antitumoral más potente en comparación con las células T que llevan CAR basadas en CD3Z específicas de mesotelina con coestimulación a pesar de la persistencia in vivo de las últimas células T modificadas con CAR. La evaluación de los linfocitos que se infiltran en el tumor demuestra que las células T CAR basadas en KIR muestran resistencia a la hipofunción adquirida dentro del microentorno tumoral en comparación con los CAR basados en CD3Z con dominios de receptores coestimuladores. La capacidad de un CAR basado en KIR para inducir la regresión de un tumor en el que los CAR basados en CD3Z de segunda generación muestran una actividad limitada respalda la evaluación clínica futura de un CAR basado en KIR en mesotelioma y otros tumores, por ejemplo, otros tumores sólidos.

Ejemplo 35: Secuencias KIR-CAR

Secuencia del gen de SS1 KIR2DS2 (SEQ ID NO: 153)

gtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgag cacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcaga atgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccat gagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatca tgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatgg caacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagtt gcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatca ttgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaata gacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaactt catttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtca gaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctacca gcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtcctt ctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgct gccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggg gttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgctt cccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccaggggga aacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctat ggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctg tggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgagga agcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgact ggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcg tatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagcgcgcaattaaccctcact aaagggaacaaaagctggagctgcaagcttaatgtagtcttatgcaatactcttgtagtcttgcaacatggtaacgatgagttagcaac atgccttacaaggagagaaaaagcaccgtgcatgccgattggtggaagtaaggtggtacgatcgtgccttattaggaaggcaacag acgggtctgacatggattggacgaaccactgaattgccgcattgcagagatattgtatttaagtgcctagctcgatacaataaacgggt ctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtg cttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtg gcgcccgaacagggacctgaaagcgaaagggaaaccagagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaa gaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtc agtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatat agtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggac agctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggata gagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccgc tgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattagg agtagcaixcaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagcUtgttccttgggttcttg ggagcagcaggaagcactatgggcgcagcctcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagc agaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcc tggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttgg aatgctagttggagtaataaatctctggaacagattggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaa gcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttg tggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgct gtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggc ccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcgattaga ctgtagcccaggaatatggcagctagattgtacacatttagaaggaaaagttatcttggtagcagttcatgtagccagtggatatataga agcagaagtaattccagcagagacagggcaagaaacagcatacttcctcttaaaattagcaggaagatggccagtaaaaacagtac atacagacaatggcagcaatttcaccagtactacagttaaggccgcctgttggtgggcggggatcaagcaggaatttggcattcccta caatccccaaagtcaaggagtaatagaatctatgaataaagaattaaagaaaattataggacaggtaagagatcaggctgaacatctt aagacagcagtacaaatggcagtattcatccacaattttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagt agacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttcgggtttattacagggacagca gagatccagtttggctgcatacgcgtcgtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaag ttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctcc gcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaac acaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacctggctgc agtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgc ttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtct ctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatt tcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggcc accgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgg gcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatgg aggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgt gactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgtgcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggt tttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccct ttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgagctagaATGGG GGGACTTGAACCCTGCAGCAGGCTCCTGCTCCTGCCTCTCCTGCTGGCTGTAAG TGGTCTCCGTCCTGTCCAGGCCCAGGCCCAGAGCGATTGCAGTTGCTCTACGGT GAGCCCGGGCGTGCTGGCAGGGATCGTGATGGGAGACCTGGTGCTGACAGTGC TCATTGCCCTGGCCGTGTACTTCCTGGGCCGGCTGGTCCCTCGGGGGCGAGGGG CTGCGGAGGCAGCGACCCGGAAACAGCGTATCACTGAGACCGAGTCGCCTTAT CAGGAGCTCCAGGGTCAGAGGTCGGATGTCTACAGCGACCTCAACACACAGAG GCCGTATTACAAAgTCGAGGGCGGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACAT GCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTAGGatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgct ggccttgctgctccacgccgccaggccgggatcccaggtacaactgcagcagtctgggcctgagctggagaagcctggcgcttca gtgaagatatcctgcaaggcttctggttactcattcactggctacaccatgaactgggtgaagcagagccatggaaagagccttgagt ggattggacttattactccttacaatggtgcttctagctacaaccagaagttcaggggcaaggccacattaactgtagacaagtcatcc agcacagcctacatggacctcctcagtctgacatctgaagactctgcagtctatttctgtgcaagggggggttacgacgggaggggtt ttgactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggtggaggcggttcaggcggcggtggctctagcggtggtggatc ggacatcgagctcactcagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcaccatgacctgcagtgccagctcaagtgt aagttacatgcactggtaccagcagaagtcaggcacctcccccaaaagatggatttatgacacatccaaactggcttctggagtccca ggtcgcttcagtggcagtgggtctggaaactcttactctctcacaatcagcagcgtggaggctgaagatgatgcaacttattactgcca gcagtggagtaagcaccctctcacgtacggtgctgggacaaagttggaaatcaaagctagcACGCGTggtggcggaggttct ggaggtgggggttcccagggggcctggccacatgagggagtccacagaaaaccttccctcctggcccacccaggtcccctggtg aaatcagaagagacagtcatcctgcaatgttggtcagatgtcaggtttgagcacttccttctgcacagagaggggaagtataaggaca ctttgcacctcattggagagcaccatgatggggtctccaaggccaacttctccatcggtcccatgatgcaagaccttgcagggaccta cagatgctacggttctgttactcactccccctatcagttgtcagctcccagtgaccctctggacatcgtcatcacaggtctatatgagaa accttctctctcagcccagccgggccccacggttttggcaggagagagcgtgaccttgtcctgcagctcccggagctcctatgacat gtaccatctatccagggagggggaggcccatgaacgtaggttctctgcagggcccaaggtcaacggaacattccaggccgactttc ctctgggccctgccacccacggaggaacctacagatgcttcggctctttccgtgactctccctatgagtggtcaaactcgagtgaccc actgcttgtttctgtcacaggaaacccttcaaatagttggccttcacccactgaaccaagctccaaaaccggtaaccccagacacctg catgttctgattgggacctcagtggtcaaaatccctttcaecatcctcctcttctttctccttcatcgctggtgctccaacaaaaaaaatgct gctgtaatggaccaagagcctgcagggaacagaacagtgaacagcgaggattctgatgaacaagaccatcaggaggtgtcatacg cataaGtcgacaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatac 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acaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttcccaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctattt gtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatga gtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaaga tgctgaagatc agttgg

Secuencia del gen de SS1 KIRS2 (SEQ ID NO: 154)

gtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgag cacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcaga atgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccat gagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatca tgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatgg caacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagtt gcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatca ttgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaata gacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaactt catttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtca gaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctacca 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Secuencia del gen de SS1 KIR2DL3 (SEQ ID NO: 155)

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Secuencia de la construcción CD19 KIR2DS2 (SEQ ID NO: 156)

gtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgag cacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcaga atgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccat gagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatca tgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatgg caacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagtt gcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatca ttgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaata gacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaactt catttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtca gaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctacca 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ctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatt tcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggcc accgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgg gcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatgg aggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgt gactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgtgcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggt tttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccct ttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgagctagaATGGG GGGACTTGAACCCTGCAGCAGGCTCCTGCTCCTGCCTCTCCTGCTGGCTGTAAG TGGTCTCCGTCCTGTCCAGGCCCAGGCCC.AGAGCGATTGCAGTTGCTCTACGGT GAGCCCGGGCGTGCTGGCAGGGATCGTGATGGGAGACCTGGTGCTGACAGTGC TCATTGCCCTGGCCGTGTACTTCCTGGGCCGGCTGGTCCCTCGGGGGCGAGGGG CTGCGGAGGCAGCGACCCGGAAACAGCGTATCACTGAGACCGAGTCGCCTTAT 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agatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtagtagttcatgtcatcttattattcagtatttataacttgcaaagaaat gaatatcagagagtgagaggaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcat ttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggctctagctatcccgcccctaactccgcccagtt ccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagt gaggaggcttttttggaggcctacgcttttgcgtcgagacgtacccaattcgccctatagtgagtcgtattacgcgcgctcactggccg tcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaat agcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcgacgcgccctgtagcggcgc attaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttccctt cctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcga ccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgtt ctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcc tattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttcccaggtggcacttttcggg gaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaat aatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcaccca gaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgg

Secuencia del CAR quimérico CD19-PD1 (SEQ ID NO: 157)

TGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTG CACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCC GCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTA CAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTC ATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGT T A ATGTC ATG AT A AT A ATGGTTTCTT AG ACGTC AGGTGGC ACTTTTCGGGG A A A TGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCG CTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAG TATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCC TTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATC AGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCC TTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCT GCTATGTGGCGCGGT ATT ATCCCGT ATTG ACGCCGGGCA AG AGC A ACTCGGTCG CCGC AT AC ACT ATTCTCAG A ATG ACTTGGTTG AGT ACTC ACCAGTC ACAG A AA A GCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCAT GAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGG AGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTT GGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATG CCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACT CTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGG ACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGA GCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAA GCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGA ACG A A AT AG ACAG ATCGCTG AG AT AGGTGCCTC ACTG ATT A AGC ATTGGTA ACT

CiTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAA TTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTT AACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGAT CTTCTTG AG ATCCTTTTTTTCTGCGCGT A ATCTGCTGCTTGC A A AC A A A A A A ACC ACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCG A AGGT A ACTGGCTTC AGC AG AGCGC AG AT ACC A A ATACTGTTCTTCT AGTGT AG CCGT AGTT AGGCC ACC ACTTC A AG A ACTCTGT AGC ACCGCCT AC ATACCTCGCT CTGCTA ATCCTGTT ACC AGTGGCTGCTGCC AGTGGCG ATA AGTCGTGTCTT ACC GGGTTGG ACTC A AG ACG AT AGTT ACCGG ATA AGGCGC AGCGGTCGGGCTG A AC GGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGA GATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAG GCGG AC AGGT ATCCGGTA AGCGGC AGGGTCGG A AC AGG AG AGCGC ACG AGGG AGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACC TCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGA AAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTnTGC TCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCC TTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTC AGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGC GTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGG GCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGG CTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACA ATTTCACACACiGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCTAATACGACTC ACTATAGGGAGACAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACATGGCCTTACCAGTGAC CGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGACATCCA GATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCAT CAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAA ACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGG AGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCAT TAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATAC GCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGTGGCGGTG GCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGG ATCTG AGGTG A A ACTC.C AGG AG TCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTC TCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGA A AGGGTCTGG AGTGGCTGGG AGTA AT ATGGGGT AGTG A A ACC ACAT ACT AT A A TTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCA AGGACAACTCCAAGAGCCAAGT TTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGC C A A AC ATT ATT ACTACGGTGGT AGCTATGCT ATGG ACT ACTGGGGTC A AGG A AC CTCAGTCACCGTCTCCTCAgctagcACGCGTggtggcggaggttctggaggtgggggttccaccctggtgg ttggtgtcgtgggcggcctgctgggcagcctggtgctgctagtctgggtcctggccgtcatctgctcccgggccgcacgagggaca ataggagccaggcgcaccggccagcccctgaaggaggacccctcagccgtgcctgtgttctctgtggactatggggagctggattt ccagtggcgagagaagaccccggagccccccgtgccctgtgtccctgagcagacggagtatgccaccattgtctttcctagcggaa tgggcacctcatcccccgcccgcaggggctcagctgacggccctcggagtgcccagccactgaggcctgaggatggacactgct cttggcccctctgaGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACTAG TGGCGCC

DAP12-T2A-SS1-KIRS2 (SEQ ID NO: 158)

ADN de 1464 pb

CARACTERISTICAS Localización

DAP12 1 ..339

Secuencia T2A 352 ..408

SS1 -scFV 481 .. 1200

Enlazador GS 1207 .. 1236

Secuencia derivada de KIR2DS2 1237 .. 1464

ATGGGGGGAC TTGAACCCTG CAGCAGGTTC CTGCTCCTGC CTCTCCTGCT GGCTGTAAGT GGTCTCCGTC CTGTCCAGGT CCAGGCCCAG AGCGATTGCA GTTGCTCTAC GGTGAGCCCG GGCGTGCTGG CAGGGATCGT GATGGGAGAC CTGGTGCTGA CAGTGCTCAT TGCCCTGGCC GTGTACTTCC TGGGCCGGCT GGTCCCTCGG GGGCGAGGGG CTGCGGAGGC AGCGACCCGG AAACAGCGTA TCACTGAGAC CGAGTCGCCT TATCAGGAGC TCCAGGGTCA GAGGTCGGAT GTCTACAGCG ACCTCAACAC ACAGAGGCCG TATTACAAAG TCGAGGGCGG CGGAGAGGGC AGAGGAAGTC TTCTAACATG CGGTGACGTG GAGGAGAATC CCGGCCCTAG GATGGCCTTA CCAGTGACCG CCTTGCTCCT GCCGCTGGCC TTGCTGCTCC ACGCCGCCAG GCCGGGATCC CAGGTACAAC TGCAGCAGTC TGGGCCTGAG CTGGAGAAGC CTGGCGCTTC AGTGAAGATA TCCTGCAAGG CTTCTGGTTA CTCATTCACT GGCTACACCA TGAACTGGGT GAAGCAGAGC CATGGAAAGA GCCTTGAGTG GATTGGACTT ATTACTCCTT ACAATGGTGC TTCTAGCTAC AACCAGAAGT TCAGGGGCAA GGCCACATTA ACTGTAGACA AGTCATCCAG CACAGCCTAC ATGGACCTCC TCAGTCTGAC ATCTGAAGAC TCTGCAGTCT ATTTCTGTGC AAGGGGGGGT TACGACGGGA GGGGTTTTGA CTACTGGGGC CAAGGGACCA CGGTCACCGT CTCCTCAGGT GGAGGCGGTT CAGGCGGCGG TGGCTCTAGC GGTGGTGGAT CGGACATCGA GCTCACTCAG TCTCCAGCAA TCATGTCTGC ATCTCCAGGG GAGAAGGTCA CCATGACCTG CAGTGCCAGC TCAAGTGTAA GTTACATGCA CTGGTACCAG CAGAAGTCAG GCACCTCCCC CAAAAGATGG ATTTATGACA CATCCAAACT GGCTTCTGGA GTCCCAGGTC GCTTCAGTGG CAGTGGGTCT GGAAACTCTT ACTCTCTCAC AATCAGCAGC GTGGAGGCTG AAGATGATGC AACTTATTAC TGCCAGCAGT GGAGTAAGCA CCCTCTCACG TACGGTGCTG GGACAAAGTT GGAAATCAAA GCTAGCGGTG GCGGAGGTTC TGGAGGTGGG GGTTCCTCAC CCACTGAACC AAGCTCCAAA ACCGGTAACC CCAGACACCT GCATGTTCTG ATTGGGACCT CAGTGGTCAA AATCCCTTTC ACCATCCTCC TCTTCTTTCT CCTTCATCGC TGGTGCTCCA ACAAAAAAAA TGCTGCTGTA ATGGACCAAG AGCCTGCAGG GAACAGAACA GTGAACAGCG AGGATTCTGA TGAACAAGAC DAP12-T2A-SS1-KIRS2 (SEQ ID NO: 159)

Proteína 488 aa

CARACTERISTICAS Localización

DAP12 1 .. 113

Secuencia T2A 118 .. 136

Péptido señal de CD8alfa 138 .. 158

SS1-scFV 161 ..400

Enlazador GS 403 ..412

Secuencia derivada de KIR2DS2 413 ..487

Secuencia

MGGLEPCSRF LLLPLLLAVS GLRPVQVQAQ SDCSCSTVSP GVLAGIVMGD LVLTVLIALA VYFLGRLVPR GRGAAEAATR KQRITETESP YQEFQGQRSD VYSDFNTQRP YYKVEGGGEG RGSFETCGDV EENPGPRMAF PVTAFFFPFA EFFHAARPGS QVQEQQSGPE FEKPGASYKI SCKASGYSFT GYTMNWVKQS HGKSEEWIGEITPYNGASSY NQKFRGKATE TVDKSSSTAY MDLLSLTSED SAVYFCARGG YDGRGFDYWG QGTTVTVSSG GGGSGGGGSS GGGSDIELTQ SPAIMSASPG EKYTMTCSAS SSVSYMHWYQ QKSGTSPKRW IYDTSKLASG VPGRFSGSGS GNSYSLTISS VEAEDDATYY CQQWSKHPLT YGAGTKLEIK ASGGGGSGGG GSSPTEPSSK TGNPRHLHVLIGTSVVKIPF TILLFFLLHR WCSNKKNAAV MDQEPAGNRT VNSEDSDEQD HQEVSYA FCERG-T2A-SS1-TNKp46 (SEQ ID NO: 160)

ADN 1365 pb

CARACTERISTICAS Localización

FCERG 1 ..258

T2A 271 ..327

Péptido señal de CD8alfa 331 ..393

SS1-scFV 400 .. 1119

Enlazador GS 1126 .. 1155

Secuencia derivada de NKp46 1156 .. 1365

Secuencia

ATGATTCCAG CAGTGGTCTT GCTCTTACTC CTTTTGGTTG AACAAGCAGC GGCCCTGGGA GAGCCTCAGC TCTGCTATAT CCTGGATGCC ATCCTGTTTC TGTATGGAAT TGTCCTCACC CTCCTCTACT GCCGACTGAA GATCCAAGTG CGAAAGGCAG CTATAACCAG CTATGAGAAA TCAGATGGTG TTTACACGGG CCTGAGCACC AGGAACCAGG AGACTTACGA GACTCTGAAG CATGAGAAAC CACCACAGTC CGGAGGCGGC GGAGAGGGCA GAGGAAGTCT TCTAACATGC GGTGACGTGG AGGAGAATCC CGGCCCTAGG ATGGCCTTAC CAGTGACCGC CTTGCTCCTG CCGCTGGCCT TGCTGCTCCA CGCCGCCAGG CCGGGATCCC AGGTACAACT GCAGCAGTCT GGGCCTGAGC TGGAGAAGCC TGGCGCTTCA GTGAAGATAT CCTGCAAGGC TTCTGGTTAC TCATTCACTG GCTACACCAT GAACTGGGTG AAGCAGAGCC ATGGAAAGAG CCTTGAGTGG ATTGGACTTA TTACTCCTTA CAATGGTGCT TCTAGCTACA ACCAGAAGTT CAGGGGCAAG GCCACATTAA CTGTAGACAA GTCATCCAGC ACAGCCTACA TGGACCTCCT CAGTCTGACA TCTGAAGACT CTGCAGTCTA TTTCTGTGCA AGGGGGGGTT ACGACGGGAG GGGTTTTGAC TACTGGGGCC AAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGGTG GAGGCGGTTC AGGCGGCGGT GGCTCTAGCG GTGGTGGATC GGACATCGAG CTCACTCAGT CTCCAGCAAT CATGTCTGCA TCTCCAGGGG AGAAGGTCAC CATGACCTGC AGTGCCAGCT CAAGTGTAAG TTACATGCAC TGGTACCAGC AGAAGTCAGG CACCTCCCCC AAAAGATGGA TTTATGACAC ATCCAAACTG GCTTCTGGAG TCCCAGGTCG CTTCAGTGGC AGTGGGTCTG GAAACTCTTA CTCTCTCACA ATCAGCAGCG TGGAGGCTGA AGATGATGCA ACTTATTACT GCCAGCAGTG GAGTAAGCAC CCTCTCACGT ACGGTGCTGG GACAAAGTTG GAAATCAAAG CTAGCGGTGG CGGAGGTTCT GGAGGTGGGG GTTCCTTAAC CACAGAGACG GGACTCCAGA AAGACCATGC CCTCTGGGAT CACACTGCCC AGAATCTCCT TCGGATGGGC CTGGCCTTTC TAGTCCTGGT GGCTCTAGTG TGGTTCCTGG TTGAAGACTG GCTCAGCAGG AAGAGGACTA GAGAGCGAGC CAGCAGAGCT TCCACTTGGG AAGGCAGGAG AAGGCTGAAC ACACAGACTC TTTGA

FCERG-T2A-SS1-TNKp46 (SEQ ID NO: 161)

Proteína 455 aa

CARACTERISTICAS Localización

FCERG 1 ..86

T2A 91 .. 109

Péptido señal de CD8alfa 111 .. 131

SS1-scFV 134.. 373

Enlazador GS 376 ..385

Secuencia derivada de NKp46 386 ..454

Secuencia

MIPAVVLLLL LLVEQAAALG EPQLCYILDA ILFLYGIVLT LLYCRLKIQV RKAAITSYEK SDGVYTGLST RNQETYETLK HEKPPQSGGG GEGRGSLLTC GDVEENPGPR MALPVTALLL PLALLLHAAR PGSQVQLQQS GPELEKPGAS VKISCKASGY SFTGYTMNWV KQSHGKSLEW IGLITPYNGA SSYNQKFRGK ATLTVDKSSS TAYMDLLSLT SEDSAVYFCA RGGYDGRGFD YWGQGTTVTV SSGGGGSGGG GSSGGGSDIE LTQSPAIMSA SPGEKVTMTC SASSSVSYMH WYQQKSGTSP KRWIYDTSKL ASGVPGRFSG SGSGNSYSLTISSVEAEDDA TYYCQQWSKH PLTYGAGTKL EIKASGGGGS GGGGSLTTET GLQKDHALWD HTAQNLLRMG LAFLVLVALV WFLVEDWLSR KRTRERASRA STWEGRRRLN TQTL DAP12-T2A-CD19-KIRS2 (SEQ ID NO: 162)

ADN de 1470 pb

CARACTERISTICAS Localización

DAP12 1 ..339

Secuencia T2A 352 ..408

CD19-scFV 481 ..481

Enlazador GS 1213 .. 1242

Secuencia derivada de KIR2DS2 1243 .. 1470

Secuencia

ATGGGGGGAC TTGAACCCTG CAGCAGGTTC CTGCTCCTGC CTCTCCTGCT GGCTGTAAGT GGTCTCCGTC CTGTCCAGGT CCAGGCCCAG AGCGATTGCA GTTGCTCTAC GGTGAGCCCG GGCGTGCTGG CAGGGATCGT GATGGGAGAC CTGGTGCTGA CAGTGCTCAT TGCCCTGGCC GTGTACTTCC TGGGCCGGCT GGTCCCTCGG GGGCGAGGGG CTGCGGAGGC AGCGACCCGG AAACAGCGTA TCACTGAGAC CGAGTCGCCT TATCAGGAGC TCCAGGGTCA GAGGTCGGAT GTCTACAGCG ACCTCAACAC ACAGAGGCCG TATTACAAAG TCGAGGGCGG CGGAGAGGGC AGAGGAAGTC TTCTAACATG CGGTGACGTG GAGGAGAATC CCGGCCCTAG GATGGCCTTA CCAGTGACCG CCTTGCTCCT GCCGCTGGCC TTGCTGCTCC ACGCCGCCAG GCCGGGATCC GACATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA CAGAGTCACC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA GGACATTAGT AAATATTTAA ATTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTG TTAAACTCCT GATCTACCAT ACATCAAGAT TACACTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTAGCAA CCTGGAGCAA GAAGATATTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGTAATACGC TTCCGTACAC GTTCGGAGGG GGGACTAAGT TGGAAATAAC AGGTGGCGGT GGCTCGGGCG GTGGTGGGTC GGGTGGCGGC GGATCTGAGG TGAAACTGCA GGAGTCAGGA CCTGGCCTGG TGGCGCCCTC ACAGAGCCTG TCCGTCACAT GCACTGTCTC AGGGGTCTCA TTACCCGACT ATGGTGTAAG CTGGATTCGC CAGCCTCCAC GAAAGGGTCT GGAGTGGCTG GGAGTAATAT GGGGTAGTGA AACCACATAC TATAATTCAG CTCTCAAATC CAGACTGACC ATCATCAAGG ACAACTCCAA GAGCCAAGTT TTCTT A A A A A TGAACAGTCT GCAAACTGAT GACACAGCCA TTTACTACTG TGCCAAACAT TATTACTACG GTGGTAGCTA TGCTATGGAC TACTGGGGTC AAGGAACCTC AGTCACCGTC TCCTCAGCTA GCGGTGGCGG AGGTTCTGGA GGTGGGGGTT CCTCACCCAC TGAACCAAGC TCCAAAACCG GTAACCCCAG ACACCTGCAT GTTCTGATTG GGACCTCAGT GGTCAAAATC CCTTTCACCA TCCTCCTCTT CTTTCTCCTT CATCGCTGGT GCTCCAACAA AAAAAATGCT GCTGTAATGG ACCAAGAGCC TGCAGGGAAC AGAACAGTGA ACAGCGAGGA TTCTGATGAA CAAGACCATC AGGAGGTGTC ATACGCATAA DAP12-T2A-CD19-KIRS2 (SEQ ID NO: 163)

Proteína de 489 aa

CARACTERÍSTICAS Localización

Secuencia T2A 118 ..136

Péptido señal de CD8alfa 138 ..158

CD19-scFV 161 ..402

Enlazador GS 405 ..414

Secuencia derivada de KIR2DS2 415 ..489

Secuencia

MGGLEPCSRF LLLPLLLAVS GLRPVQVQAQ SDCSCSTVSP GVLAGIVMGD LVLTVLIALA VYFLGRLVPR GRGAAEAATR KQRITETESP YQELQGQRSD VYSDLNTQRP YYKVEGGGEG RGSLLTCGDV EENPGPRMAL PVTAEELPLA LLLHAARPGS DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS KYLNWYQQKP DGTVKELIYH TSREHSGVPS RFSGSGSGTD YSETISNEEQ EDIATYFCQQ GNTEPYTFGG GTKFEITGGG GSGGGGSGGG GSEVKLQESG PGLVAPSQSL SVTCTVSGVS EPDYGVSWIR QPPRKGEEWE GVIWGSETTY YNSAFKSRFT IIKDNSKSQV FLKMNSEQTD DTAIYYCAKH YYYGGSYAMD YWGQGTSVTV SSASGGGGSG GGGSSPTEPS SKTGNPRHFH VEIGTSVVKI PFTIEEFFEE HRWCSNKKNA AVMDQEPAGN RTVNSEDSDE QDHQEVSYA*

Dominio intracelular 4-1BB (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO: 138) KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL

Dominio CD3zeta (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO: 139)

r v k f s r s a d a p a y k q g q n q l y n e l n l g r r e e y d v l d k r r g r d p e m g g k p r r k n p QEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQ ALPPR

Dominio citoplasmático de PD1 (SEQ ID NO: 164)

Aminoácidos 192-288 CSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTE YATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL

Dominio citoplasmático de CTLA-4 (SEQ ID NO: 165)

Aminoácidos 183-223

A V S L S K M L K K R S P L T T G V Y V K M P P T E P E C E K Q F Q P Y F IP IN

Traducción bisagra de IgG4H (SEQ ID NO: 166)

230 aa UNA lineal

ESKYGPPCPP CPAPEFLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSQ EDPEVQFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQFNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PSSIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSLGKM

Traducción bisagra de IgDH (SEQ ID NO: 167)

282 aa UNA lineal

RWPESPKAQA SSVPTAQPQA EGSLAKATTA PATTRNTGRG GEEKKKEKEK

EEQEERETKT PECPSHTQPL GVYLLTPAVQ DLWLRDKATF TCFVVGSDLK

DAHLTWEVAG KVPTGGVEEG LLERHSNGSQ SQHSRLTLPR SLWNAGTSVT

CTLNHPSLPP QRLMALREPA AQAPVKLSLN LLASSDPPEA ASWLLCEVSG

FSPPNILLMW LEDQREVNTS GFAPARPPPQ PGSTTFWAWS VLRVPAPPSP

QPATYTCVVS HEDSRTLLNA SRSLEVSYVT DH

Bisagra CD8 humana (SEQ ID NO: 168)

43 aa UNA lineal 10-FEB-2009

TTTPAPRPPT PAPTIASQPL SLRPEACRPA AGGAVHTRGL DFA

Ejemplo 36: NKR-CAR regulable (RNKR-CAR) usando un conmutador de dimerización

Este ejemplo ilustra un concepto general subyacente a las realizaciones de NKR-CAR regulables que se basa en la separación de un miembro de unión a antígeno ("evento de unión") de un miembro de señalización intracelular ("evento de señalización"). En presencia de una molécula de dimerización, por ejemplo, una molécula pequeña, los dominios de conmutación del miembro de unión a antígeno y el miembro de señalización intracelular se asocian y activan la transducción de señales en la molécula RNKR-CAR ahora asociada.

A modo de ejemplo, un dominio de unión a antígeno extracelular, tal como un scFv, se fusiona con un dominio transmembrana y un primer dominio de conmutación (por ejemplo, un dominio de conmutación descrito en el presente documento, por ejemplo, un dominio de conmutación de FKBP o FRB) del conmutador de dimerización (por ejemplo, un conmutador de heterodimerización). El dominio de señalización intracelular comprende un segundo dominio de conmutación (por ejemplo, FRB o FKBP) del conmutador de heterodimerización y uno o más dominios de señalización intracelular, tales como un dominio de señalización primario descrito en el presente documento, por ejemplo, CD3zeta o DAP12.

La dimerización y el inicio de la cascada de señalización se logra mediante la adición de un heterodimerizador de molécula pequeña ("molécula de heterodimerización" porque los dominios de conmutación no son los mismos) que une el dominio de unión extracelular con el dominio de señalización intracelular. Por ejemplo, la molécula pequeña que induce la dimerización puede ser rapamicina o análogos de la misma (denominada "rapálogo"). La rapamicina o rapálogos funcionan uniéndose con alta afinidad a FKBP y al dominio FRB de mTOR, actuando así como un heterodimerizador para inducir la formación de complejos Choi, J., et al (1996) Structure of the FKBP12-rapamycin complex interacting with the binding domain of human FRAP Science 273: 239-42). Pueden usarse otras moléculas de dimerización, por ejemplo, moléculas de heterodimerización, descritas en el presente documento, para regular un RNKR-CAR.

Los siguientes ejemplos ilustran que el conmutador de dimerización puede estar en el interior o el exterior de la célula

Sólo con fines ilustrativos, se usa un fragmento scFv como dominio de unión a antígeno extracelular para generar los RNKR-CAR. Para generar un RNKR-CAR, se genera un par de construcciones y se coexpresa en la célula efectora inmunitaria diana. Los diversos dominios de conmutación del conmutador de heterodimerización pueden unirse a diferentes dominios de la construcción RNKR-CAR.

El "conmutador A" comprende un par de construcciones. La primera construcción está diseñada en la que el miembro de unión a antígeno se construye fusionando un scFv a una región transmembrana, seguido de un dominio citoplasmático de NKR y el primer dominio de conmutación intracelular. En algunos casos, se dispone una región de bisagra entre el scFv y la región transmembrana, y/o se dispone un enlazador entre el dominio citoplasmático NKR y el primer dominio de conmutación. El elemento/construcción de señalización intracelular correspondiente se diseña fusionando el segundo dominio de conmutación a un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, el dominio de señalización primario (por ejemplo, DAP12 o CD3zeta). En algunos casos, se dispone un enlazador entre el segundo dominio de conmutación y el dominio de señalización intracelular. Las construcciones se pueden generar de manera que los dominios enumerados en el orden anterior estén presentes en un polipéptido en cualquier orientación, es decir, desde el extremo N- al C- terminal, el C- al N- terminal, desde extracelular a intracelular o intracelular. a extracelular. En algunos ejemplos, el miembro de señalización intracelular y el miembro de unión a antígeno están orientados en una célula de manera que el dominio citoplasmático NKR es capaz de interaccionar, por ejemplo, con

Claims

REIVINDICACIONES

1. Receptor CAR de células asesinas natural regulable (RNKR-CAR), en el que el RNKR-CAR comprende:

(a) un miembro de unión a antígeno, que comprende:

un elemento de dominio de unión que comprende un dominio de unión a antígeno derivado de una molécula de anticuerpo,

un dominio transmembrana y

un primer dominio de conmutación; y

(b) un miembro de señalización intracelular que comprende un segundo dominio de conmutación, en el que el primer y segundo dominios de conmutación comprenden un conmutador de dimerización, en el que, además:

(i) el miembro de unión a antígeno comprende, además, un dominio citoplasmático, en el que además

1) el dominio transmembrana y/o citoplasmático comprende un dominio transmembrana o citoplasmático de NKR, cada uno de los cuales se selecciona de un receptor de tipo inmunoglobulina de células asesinas (KIR), un receptor de citotoxicidad natural (NCR), la familia de molécula de activación de linfocitos de señalización (SLAM) de receptores de células inmunes, un receptor Fc (FcR), un receptor Ly49 o un NKR de la Tabla 24; y

2) el miembro de señalización intracelular comprende un dominio citoplasmático de NKR seleccionado de la Tabla 24, o un dominio de señalización intracelular primario seleccionado de la Tabla 1, o un dominio ITAM citoplasmático; (ii) el dominio transmembrana comprende un dominio transmembrana de NKR de un receptor de tipo inmunoglobulina de células asesinas (KIR), un receptor de citotoxicidad natural (NCR), la familia de moléculas de activación de linfocitos de señalización (SLAM) de receptores de células inmunes, un receptor Fc (FcR), un receptor Ly49 o un NKR de la Tabla 24, y el miembro de señalización intracelular comprende un dominio ITAM citoplasmático; o

(iii) el miembro de señalización intracelular comprende, además, un dominio citoplasmático de NKR seleccionado de la Tabla 24,

en el que, además, el conmutador de dimerización comprende

un conmutador de dimerización basado en FKBP/FRB, opcionalmente en el que el primer y segundo dominios de conmutación están dimerizados por una rapamicina o un análogo de rapamicina;

un conmutador basado en GyrB-GyrB, opcionalmente en el que el primer y segundo dominios de conmutación están dimerizados por cumermicina;

un conmutador basado en GAI-GID1;

un conmutador de dimerización basado en giberelina; o

un conmutador basado en etiqueta Halo/etiqueta SNAP.

2. RNKR-CAR, según la reivindicación 1, en el que el dominio citoplasmático de NKR comprende un dominio citoplasmático de KIR seleccionado de la Tabla 24.

3. RNKR-CAR, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el dominio de señalización intracelular primario es:

(a) derivado de CD3 zeta, FcR gamma común (FCER1G), Fc gamma RIIa, FcR beta (Fc Epsilon R1b), CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CD79a, CD79b, DAP10 y DAP12; o

(b) un dominio de señalización DAP12, un dominio de señalización DAP10 o un dominio de señalización CD3zeta.

4. RNKR-CAR, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que:

(a) el dominio transmembrana comprende un dominio transmembrana de KIR seleccionado de la Tabla 24;

(b) el RNKR-CAR comprende un dominio transmembrana de NKR mutado seleccionado del grupo que consiste en un dominio transmembrana de KIR mutado, dominio transmembrana de NCR mutado, dominio transmembrana de FcR mutado, dominio transmembrana de receptor Ly49 mutado y dominio transmembrana de receptor SLAMF mutado; o

(c) el RNKR-CAR comprende un dominio transmembrana de una molécula de células T seleccionada entre CD8alfa y CD3zeta.

5. RNKR-CAR, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que uno de los primero y segundo dominios de conmutación de un conmutador basado en FKBP-FRB comprende un dominio de conmutación basado en FKBP y el otro comprende un dominio de conmutación basado en FRB, en el que, además, el dominio de conmutación basado en FKBP comprende un fragmento de unión a FRB o análogo de FKBP y el dominio de conmutación basado en FRB comprende un fragmento de unión a FKBP o análogo de FRB que comprende una mutación E2032, tal como E2032I o E2032L y/o una mutación T2098, tal como T2098L.

6. RNKR-CAR, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el dominio de unión a antígeno derivado de una molécula de anticuerpo incluye:

(a) un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un scFv, un Fv, un Fab, un (Fab')2, un anticuerpo de dominio único (SDAB), un dominio VH o VL, o un dominio VHH de camélido; o

(b) un scFV, un dominio VH, un nanocuerpo o un dominio VHH de camélido.

7. RNKR-CAR, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el dominio de unión a antígeno se une a un antígeno tumoral seleccionado del grupo que consiste en:

(a) receptor de folato (FRa), mesotelina, EGFRvIlI, IL-13Ra, CD123, CD19, CD33, BCMA, GD2, CLL-1, CA-IX, MUC1, HER2 y cualquier combinación de los mismos; o

(b) CD19, mesotelina, CD123 y BCMA.

8. RNKR-CAR, según la reivindicación 1(iii), en el que el miembro de señalización intracelular comprende un dominio de señalización intracelular primario seleccionado de la Tabla 1.

9. Ácido nucleico que codifica un RNKR-CAR, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

10. Sistema de vectores, por ejemplo, uno o más vectores, que comprende un ácido nucleico de la reivindicación 9.

11. Célula que comprende un RNKR-CAR, según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, un ácido nucleico que codifica un RNKR-CAr de la reivindicación 9, o el sistema de vectores de la reivindicación 10.

12. Procedimiento para fabricar una célula, según la reivindicación 11, que comprende introducir un ácido nucleico que codifica un RNKR-CAR de la reivindicación 9, o el sistema de vectores de la reivindicación 10, en dicha célula.

13. Célula RNKR-CAR, según la reivindicación 11, para su uso en un procedimiento de

(a) tratamiento de un sujeto con una enfermedad asociada con un antígeno tumoral; o

(b) tratamiento de un sujeto por cáncer,

en el que el procedimiento comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de la célula RNKR-CAR.

14. Procedimiento para proporcionar una célula RNKR-CAR que comprende:

recibir de una entidad una célula efectora inmunitaria de un ser humano;

insertar un ácido nucleico que codifica un RNKR-CAR, según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en dicha célula efectora inmunitaria, o una célula hija de la misma, para formar una célula RNKR-CAR; y,

opcionalmente, proporcionar dicha célula RNKR-CAr a dicha entidad.

15. Célula RCAR/NKR-CAR que comprende:

A) un CAR regulable (RCAR) y un NKR-CAR;

B) un ácido nucleico que codifica un RCAR y un NKR-CAR; o

C) un sistema de vectores que comprende un ácido nucleico que codifica un RCAR y un NKR-CAR,

en el que el RCAR comprende:

a) un miembro de señalización intracelular que comprende:

un dominio de señalización intracelular primario y

un primer dominio de conmutación;

b) un miembro de unión a antígeno que comprende:

un dominio de unión a antígeno,

un segundo dominio de conmutación; y

c) un dominio transmembrana,

en el que el primer y segundo dominios de conmutación forman un conmutador de dimerización, que comprende: 1) un conmutador de dimerización basado en FKBP/FRB, en el que opcionalmente el primer y segundo dominios de conmutación están dimerizados por una rapamicina o un análogo de rapamicina;

2) un conmutador basado en GyrB-GyrB, en el que opcionalmente los primero y segundo dominios de conmutación están dimerizados por cumermicina;

3) un conmutador basado en GAI-GID1;

4) un conmutador de dimerización basado en giberelina; o

5) un conmutador basado en etiqueta Halo/etiqueta SNAP; y

en el que el NKR-CAR comprende:

a) un dominio de unión a antígeno derivado de una molécula de anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un scFv, un Fv, un Fab, un (Fab')2, un anticuerpo de dominio único (SDAB ), un dominio VH o VL, o un dominio VHH de camélido,

b) un dominio transmembrana, y

c) un dominio citoplasmático,

en el que el NKR-CAR comprende un dominio transmembrana de NKR y/o un dominio citoplasmático de NKR.