ES2963718T3

ES2963718T3 - Capacidad presentadora de antígenos de células CAR-T potenciada mediante introducción conjunta de moléculas co-estimuladoras

Info

Publication number: ES2963718T3
Application number: ES15704414T
Authority: ES
Inventors: Carl H June; Xiaojun Lui; Devon J Shedlock; Yangbing Zhao
Original assignee: Novartis AG; University of Pennsylvania Penn
Current assignee: Novartis AG; University of Pennsylvania Penn
Priority date: 2014-01-21
Filing date: 2015-01-21
Publication date: 2024-04-01
Anticipated expiration: 2035-01-21
Also published as: US20210317183A1; EP3097117B1; WO2015112626A9; US11028143B2; US20160340406A1; EP4303229A2; WO2015112626A1; EP4303229A3; EP3097117A1; WO2015112626A8

Abstract

La invención proporciona células T que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico y una secuencia de ácido nucleico que codifica un potenciador del cebado de células T, composiciones que incluyen las células T y métodos para usar las células T para tratar enfermedades asociadas con la expresión de enfermedades. antígenos asociados. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Capacidad presentadora de antígenos de células CAR-T potenciada mediante introducción conjunta de moléculas co estimuladoras

Campo de la invención

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS

Esta solicitud reivindica prioridad de la solicitud de EE.UU. N° de serie: 61/929.813, presentada el 21 de enero de 2014.

ANTECEDENTES

Los receptores de antígenos quiméricos (CARs, por sus siglas en inglés) son moléculas que combinan la especificidad basada en anticuerpos para antígenos de superficie asociados a enfermedades con dominios intracelulares que activan receptores de células T con actividad inmunológica celular dirigida a enfermedades. Esta configuración permite que las células T modificadas por ingeniería genética para expresar un CAR logren una activación primaria independiente del MHC a través de regiones extracelulares específicas del antígeno Fv de cadena sencilla (scFv) condensadas a dominios intracelulares que proporcionan activación de células T y señales co-estimuladoras. Los CARs de segunda y tercera generación también proporcionan señales co-estimuladoras apropiadas a través de motivos de activación intracelulares CD28 y/o CD 137 (4-IBB), que aumentan la secreción de citoquinas y la actividad anti-tumoral en una diversidad de tumores sólidos y modelos de leucemia (Pinthus, et al. al, 2004, J Clin Invest 114(12): 1774-1781; Milone, et al, 2009, Mol Ther 17(8): 1453-1464; Sadelain, et al, 2009, Curr Opin Immunol 21(2): 215-223). El beneficio de evitar la necesidad de presentación de antígenos por parte de las moléculas del MHC para lograr la citotoxicidad hace que las células T modificadas por ingeniería genética con CAR sean una modalidad terapéutica atractiva.

La transferencia adoptiva de linfocitos T citotóxicos (CTLs, por sus siglas en inglés) se ha mostrado muy prometedora tanto en indicaciones virales como en cáncer. Después de muchos años de resultados menos que óptimos con la terapia de células T basada en CAR, sistemas de cultivo mejorados y tecnologías de modificación por ingeniería genética celular han hecho posibles células T con CAR con efectos antitumorales más potentes (Sadelain et al, 2009, Curr Opin Immunol 21:215-23). La tecnología también se ha aplicado con éxito en el contexto clínico, con resultados clínicos mejorados para los CARs introducidos con vectores retrovirales (Till et al, 2008, Blood 112:2261-71; Pule et al, 2008, Nat Med 14: 1264 70). Estas células CAR T también exhiben una toxicidad potenciada (Brentjens et al, 2010, Mol Ther 18:666-8; Morgan et al, 2010, Mol Ther 18:843-51).

Como tecnología emergente, existe una necesidad urgente en la técnica de mejorar las terapias basadas en CAR existentes que permitirían una transferencia adoptiva de CTLs más eficaz, segura y eficiente. Chmielewski et al., Cancer Research (2011);71:5697-5706, Chinnasamy et al., Clinical Cancer Research (2012);18(6):1672-1683, Chmielewski et al., Immunological Reviews (2014);257(1):83-90 y Hoyos et al., Leukemia (2010);24(6):1160-1170 se refieren a células T con CAR modificadas por ingeniería genética para expresar citoquinas. El documento US 2013/071414 A1 se refiere a linfocitos T específicos para CD19 modificados por ingeniería genética que co-expresan IL-15 y un gen suicida inducible basado en Caspasa-9 para el tratamiento de neoplasias malignas de células B. El documento WO 2013/126712 A1 se refiere a composiciones y métodos para generar una población persistente de células T útiles para el tratamiento del cáncer. El documento WO 2008/121420 A1 se refiere a la expresión constitutiva de ligandos co-estimuladores en linfocitos T transferidos adoptivamente.

SUMARIO

La presente invención proporciona una célula T que comprende ácido nucleico exógeno, en donde: (a) el ácido nucleico comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, y (b) el ácido nucleico comprende una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que potencia el cebado de células T, en donde:

la célula T tiene una capacidad de cebado de células T mejorada en relación con una célula T que carece de la segunda secuencia de ácido nucleico, y el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en CD70, CD86 y CD252, y fragmentos funcionales y variantes de CD70,<c>D86 y CD252. que conservan la capacidad de potenciar el cebado de células T, en donde la primera y/o segunda secuencia de ácido nucleico es un ARN, en donde, además, dicho primer y/o segundo ARN se expresa transitoriamente.

La presente invención también proporciona una composición que comprende una célula T de este tipo y que opcionalmente comprende, además, un segundo agente terapéutico.

La presente invención también proporciona una célula T de este tipo para uso en un método de:

i) proporcionar inmunidad antitumoral en un sujeto;

ii) tratar a un sujeto que tiene una enfermedad asociada con la expresión de un antígeno asociado a una enfermedad;

iii) potenciar la propagación del epítopo en un sujeto con cáncer; o

iv) vacunar a un sujeto,

en el que el método comprende administrar una cantidad eficaz de la célula T al sujeto, opcionalmente en donde el sujeto es un ser humano.

La presente invención también proporciona un método para generar una célula T que tiene actividad antitumoral potenciada, comprendiendo el método introducir un ácido nucleico, en el que: (a) el ácido nucleico comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, y (b) el ácido nucleico comprende una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que potencia el cebado de células T, en donde:

el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en CD70, CD86 y CD252, y fragmentos funcionales y variantes de CD70, CD86 y CD252. que conservan la capacidad de potenciar el cebado de células T, en donde la primera y/o segunda secuencia de ácido nucleico es un ARN, en donde, además, dicho primer y/o segundo ARN se expresa transitoriamente.

La presente invención también proporciona una célula T modificada por ingeniería genética para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR), para uso en el tratamiento del cáncer mediante la destrucción de células cancerosas mediada por CAR y el cebado potenciado de células T con antígeno tumoral, en donde la célula T modificada por ingeniería genética con CAR comprende ácido nucleico exógeno que comprende: (a) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica el CAR, en donde dicho CAR comprende un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, y (b) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que potencia el cebado de células T, en donde:

la célula T tiene una capacidad potenciada de cebado de células T en relación con una célula T que carece de la segunda secuencia de ácido nucleico, y

Éstas y realizaciones adicionales se recogen en las reivindicaciones adjuntas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La información técnica recogida a continuación puede, en algunos aspectos, ir más allá del alcance de la invención, que está definida por las reivindicaciones adjuntas. La información técnica adicional se proporciona para ubicar la invención en sí en un contexto técnico más amplio y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados. Las referencias incidentales a métodos para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia y a métodos de diagnóstico practicados en el cuerpo humano o animal no deben interpretarse como una reivindicación de protección para métodos de este tipo en sí, sino que deben interpretarse como referencias a productos, en particular sustancias o composiciones, para uso en cualquiera de estos métodos.

La presente invención proporciona células T modificadas por ingeniería genética para exhibir una actividad antitumoral incrementada mediante la co-expresión de un receptor de antígeno quimérico (CAR) y uno o más potenciadores del cebado de células T (en adelante "ETPs"). En la presente invención, el ETP se selecciona del grupo de CD70, CD86 y CD252, y fragmentos funcionales y variantes de c D70, CD86 y CD252 que conservan la capacidad de potenciar el cebado de células T. La adición de un componente ETP a la célula T con CAR confiere una función potenciada de la célula presentadora de antígeno (APC, por sus siglas en inglés) "profesional", lo que confiere inmunidad antitumoral permanente. En una realización, el CAR y uno o más ETPs se co-expresan transitoriamente en una célula T. Por lo tanto, las células T modificadas por ingeniería genética son seguras (dada la naturaleza transitoria de la expresión CAR/ETP) e inducen inmunidad prolongada (incluso permanente) a través de la función APC. Como tales, las células T se pueden utilizar para tratar una amplia diversidad de enfermedades asociadas con antígenos de la superficie celular (diana).

Por consiguiente, en esta memoria se describe una célula T que comprende ácido nucleico exógeno, en donde

(a) el ácido nucleico comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, y

(b) el ácido nucleico comprende una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que potencia el cebado de células T, o un fragmento funcional o variante del mismo,

con la condición de que que la primera y/o segunda secuencia de ácido nucleico comprenda un ARN. En la célula T de la invención, la célula T tiene una capacidad potenciada de cebado de células T en relación con una célula T que carece de la segunda secuencia de ácido nucleico; el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en CD70, CD86 y CD252, y fragmentos funcionales y variantes de CD70, CD86 y CD252. que conservan la capacidad de potenciar el cebado de células T, y la primera y/o segunda secuencia de ácido nucleico es un ARN, en donde dicho primer y/o segundo ARN se expresa transitoriamente.

El CAR puede comprender, además, un segundo dominio de señalización intracelular, p. ej., un dominio de señalización co-estimulador. En una realización, la primera y segunda secuencias de ácido nucleico están dispuestas en una única molécula de ácido nucleico. En la invención, la molécula de ácido nucleico comprende ARN.

En una realización, la primera y segunda secuencias de ácido nucleico están dispuestas en dos o más moléculas de ácido nucleico distintas. En la invención, una o las dos moléculas de ácido nucleico comprenden moléculas de ARN.

En una realización, una molécula de ácido nucleico comprende una molécula de ARN y el otro ácido nucleico comprende una molécula de ADN.

En una realización, el segundo dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización co-estimulador. En una realización, el CAR comprende uno o más dominios de señalización co-estimuladora.

En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio CD3zeta y el segundo dominio de señalización intracelular comprende un dominio 4-1BB.

En una realización, la primera secuencia de ácido nucleico comprende un ARN. En una realización, la segunda secuencia de ácido nucleico comprende un ARN. En una realización, la primera y la segunda secuencia de ácido nucleico comprende cada una ARN.

En una realización, la célula T se transfecta para expresar transitoriamente el primer y/o segundo ARN.

En una realización, la célula T no comprende un ADN exógeno que codifique el primer o segundo ARN.

En una realización, el primer y/o segundo ARN se generan mediante transcripción in vitro.

En una realización, el primer y/o segundo ARN son ARNs sintéticos.

En una realización, el primer y/o segundo ARNs se introducen en la célula T mediante electroporación.

En una realización, el CAR comprende, además, uno o más dominios de señalización co-estimuladores, y en donde la primera o segunda secuencia de ácido nucleico comprende ADN o ADNc.

En una realización, la primera o segunda secuencia de ácido nucleico comprende un vector. En una realización, el vector es un vector viral. En una realización, el vector viral es un vector retroviral o un vector lentiviral. En una realización, la célula T se transduce viralmente para expresar la primera o segunda secuencia de ácido nucleico.

En una realización, el dominio extracelular del CAR comprende un dominio de unión a antígeno. En una realización, el dominio de unión a antígeno es un dominio scFv.

En una realización, el dominio transmembrana comprende la porción transmembrana de una proteína seleccionada del grupo que consiste en la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 y CD154.

En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización funcional de CD3 zeta, FcR gamma común (FCER1G), Fc gamma RIIa, FcR beta (Fc Epsilon R1b), CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CD79a, CD79b, DAP10 y DAP12.

En una realización, el dominio extracelular está conectado al dominio transmembrana mediante una región bisagra. En una realización, el CAR comprende, además, uno o más dominios de señalización co-estimuladores. En una realización, el dominio de señalización coestimulador es un dominio de señalización funcional de una proteína seleccionada del grupo que consiste en OX40, CD27, CD28, CD30, CD40, PD-1, CD2, CD7, CD258, NKG2C, b 7-H3, un ligando que se une a CD83, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS y 4-1BB (CD137), o cualquier combinación de los mismos.

Los polipéptidos que potencian el cebado de células T (ETP) se pueden seleccionar del grupo que consiste en una molécula co-estimuladora, una citoquina soluble, un polipéptido implicado en la presentación de antígenos, un polipéptido implicado en el tráfico y/o migración, o un polipéptido implicado en la fijación como objetivo de células dendríticas, o un fragmento funcional o variante del mismo. Una molécula co-estimuladora ETP puede seleccionarse del grupo que consiste en CD70, CD83, CD80, CD86, CD40, CD154, CD137L (4-1BBL), CD252 (OX40L), CD275 (ICOS-L), CD54 (ICAM-1), CD49a, CD43, CD48, CD 112 (PVRL2), CD150 (SLAM), CD155 (PVR), CD265 (RANK), CD270 (HVEM), TL1A, CD127, IL-4R, GITR-L, CD160, CD258, TIM-4, CD153 (CD30L), CD200R (OX2R), CD44, ligandos de los mismos y fragmentos funcionales y variantes de los mismos. Una citoquina soluble puede seleccionarse del grupo que consiste en: IL-2, IL-12, IL-6, IL-7, IL-15, IL-18, IL-21, GM-CSF, IL-18, IL-21, IL-27 y fragmentos funcionales y variantes de las mismas. Se puede seleccionar un polipéptido implicado en la presentación de antígenos del grupo que consiste en CD64, MHC I, MHC II y fragmentos funcionales y variantes de los mismos. Se puede seleccionar un polipéptido implicado en el tráfico y/o la migración del grupo que consiste en CD183, CCR2, CCR6, CD50, CD197, CD58, CD62L y fragmentos funcionales y variantes de los mismos. Se puede seleccionar un polipéptido implicado en la fijación de objetivo de DC del grupo que consiste en ligandos de TLR, anticuerpo anti-DEC-205, un anticuerpo anti-DC-SIGN y fragmentos funcionales y variantes de los mismos. La presente invención utiliza un ETP que se selecciona del grupo que consiste en CD70, CD86 y CD252, y fragmentos funcionales y variantes de CD70, CD86 y CD252 que conservan la capacidad de potenciar el cebado de células T. Los casos de la divulgación que no utilizan un ETP de este tipo no están abarcados por la redacción de las reivindicaciones, aunque se consideran útiles para comprender la invención.

En una realización, el dominio de unión a antígeno se une a un antígeno asociado con un estado patológico. En una realización, el estado patológico se selecciona del grupo que consiste en una enfermedad proliferativa, una afección precancerosa, una indicación no cancerosa, una infección viral y una infección bacteriana. En una realización, el dominio de unión a antígeno se une a un antígeno tumoral, un antígeno viral o un antígeno bacteriano. En una realización, el antígeno tumoral es un antígeno asociado con un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de cerebro, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer colorrectal, cáncer de hígado, cáncer de riñón, linfoma, leucemia, cáncer de pulmón, melanoma, melanoma metastásico, mesotelioma, neuroblastoma, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer renal, cáncer de piel, timoma, sarcoma, linfoma no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, cáncer de útero y combinaciones de los mismos.

En una realización, la célula T tiene una capacidad potenciada de presentación de antígeno con respecto a una célula T que carece de la segunda secuencia de ácido nucleico.

En la invención, la célula T tiene una capacidad potenciada de cebado de células T en relación con una célula T que carece de la segunda secuencia de ácido nucleico.

En una realización, la célula T se transfecta para expresar transitoriamente un ácido nucleico que comprende una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que potencia el cebado de células T, o un fragmento funcional o variante del mismo, que difiere del polipéptido codificado por la segunda secuencia de ácido nucleico. En una realización, la célula T tiene una capacidad potenciada de cebado de células T con respecto a una célula T que comprende la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico, pero no la tercera secuencia de ácido nucleico. En una realización, la tercera secuencia de ácido nucleico comprende un ARN. En una realización, la célula T se transfecta para expresar transitoriamente el tercer ARN. En una realización, la célula no comprende un ADN exógeno que codifique el tercer ARN. En una realización, el CAR comprende uno o más dominios de señalización co-estimuladores, y en donde la tercera secuencia de ácido nucleico comprende ADN. En una realización, la célula T comprende, además, una o más secuencias de ácido nucleico distintas adicionales que codifican un polipéptido que potencia el cebado de células T, o un fragmento funcional o variante del mismo, que difieren de los polipéptidos codificados por la segunda y tercera secuencias de ácido nucleico. En una realización, la una o más secuencias de ácidos nucleicos adicionales comprenden ARN. En una realización, el CAR comprende uno o más dominios de señalización co-estimuladores, y en donde uno o más ácidos nucleicos adicionales comprenden ADN. En una realización, la primera, segunda y/o secuencias de ácido nucleico adicionales se transcriben a partir de uno o más vectores de transcripciónin vitro.

En una realización, la expresión del polipéptido codificado por la segunda y/o secuencias de ácido nucleico adicionales no afecta sustancialmente, p. ej., disminuye, reduce o inhibe la función de destrucción celular del CAR codificado por la primera secuencia de ácido nucleico.

En una realización, la célula T tiene una eficacia incrementada para matar células tumorales o reducir el tamaño del tumor en un sujeto con un tumor con respecto a una célula T que comprende solo el CAR codificado por la primera secuencia de ácido nucleico.

En una realización, la célula T potencia el cebado de las células T con un antígeno tumoral, un antígeno viral, un antígeno bacteriano.

Las células T descritas en esta memoria se pueden producir introduciendo un ácido nucleico, en donde (a) el ácido nucleico comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, y (b) el ácido nucleico comprende una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que potencia el cebado de células T, o un fragmento funcional o variante del mismo; con la condición de que la primera y/o segunda secuencia de ácido nucleico comprenda un ARN.

Por consiguiente, en otro aspecto, la invención proporciona un método para generar una célula T que tiene actividad anticancerígena potenciada, p. ej., actividad antitumoral, comprendiendo el método introducir un ácido nucleico, en el que:

(a) el ácido nucleico comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) descrito en esta memoria que comprende un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, y

(b) el ácido nucleico comprende una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que potencia el cebado de células T (ETP), en el que el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en CD70, CD86 y CD252, y fragmentos funcionales y variantes de CD70, CD86 y CD252 que conservan la capacidad de potenciar el cebado de células T;

en el que la primera y/o segunda secuencia de ácido nucleico es un ARN, en el que, además, dicho primer y/o segundo ARN se expresa transitoriamente. En una realización, el CAR comprende, además, un segundo dominio de señalización intracelular.

En una realización, la primera y segunda secuencias de ácido nucleico están dispuestas en una única molécula de ácido nucleico. En la invención, la molécula de ácido nucleico comprende ARN.

En una realización, el segundo dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización co-estimulador. En una realización, el CAR comprende uno o más dominios de señalización co-estimuladora. En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio CD3zeta y el segundo dominio de señalización intracelular comprende un dominio 4-1BB.

En una realización, el primer y/o segundo ARN son ARNs sintéticos.

La célula T se puede utilizar en un método para vacunar a un sujeto, que comprende administrar al sujeto la célula T. El método puede comprender, además, administrar al sujeto un antígeno. El antígeno puede ser un antígeno tumoral, un antígeno viral o un antígeno bacteriano.

También se describe en esta memoria una célula T, transfectada para expresar transitoriamente dos o más ARNs exógenos distintos, en donde (a) el primer ARN comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR que comprende un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, y (b) el segundo ARN comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que potencia el cebado de células T (es decir, un ETP). En la célula T de la invención, el ETP se selecciona del grupo que consiste en CD70, CD86 y CD252, y fragmentos funcionales y variantes de CD70, CD86 y CD252 que conservan la capacidad de potenciar el cebado de células T, y la célula T tiene capacidad de cebado de células T mejorada en relación con una célula T que carece del segundo ARN. En algunas realizaciones, las células T de la invención se transfectan para expresar transitoriamente un tercer ARN distinto que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un ETP, o un fragmento funcional o variante del mismo, que difiere del codificado por el segundo ARN.

Dominios extracelulares ejemplares del CAR incluyen, por ejemplo, un resto de unión a antígenos, p. ej., un dominio scFv, que se une a un antígeno asociado a una enfermedad (es decir, un antígeno que es único o se expresa más altamente en células enfermas en comparación con células normales). Antígenos de este tipo pueden estar asociados con una enfermedad proliferativa, una afección precancerosa y una indicación no cancerosa. En algunas realizaciones, el resto de unión a antígeno se une a un antígeno tumoral, por ejemplo, un antígeno asociado con cáncer de cerebro (p. ej., un glioma), cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer colorrectal, cáncer de hígado, cáncer de riñón, linfoma, leucemia, cáncer de pulmón, melanoma, melanoma metastásico, mesotelioma, neuroblastoma, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer renal, cáncer de piel, timoma, sarcoma, linfoma no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, cáncer de útero y combinaciones de los mismos.

En una realización, el dominio transmembrana del CAR es un dominio transmembrana descrito en esta memoria. Dominios transmembrana ejemplares del CAR incluyen un dominio transmembrana de, por ejemplo, la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 o CD154. El dominio extracelular puede estar conectado al dominio transmembrana mediante una región bisagra.

En una realización, el dominio intracelular del CAR es un dominio intracelular descrito en esta memoria. Dominios intracelulares ejemplares del CAR incluyen, por ejemplo, el dominio de señalización funcional de TCR zeta, FcR gamma, FcR beta, CD3 gamma, CD3 delta, c D3 épsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD66d, 4-1BB y/o CD3-zeta. En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización funcional de CD3 zeta, FcR gamma común (FCER1G), Fc gamma RIIa, FcR beta (Fc Epsilon R1b), CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CD79a, CD79b, DAP10 y DAP12.

El CAR también puede comprender uno o más dominios de señalización coestimuladora, p. ej., un dominio de señalización coestimulador descrito en esta memoria. Por ejemplo, el dominio de señalización coestimulador puede ser un dominio de señalización coestimulador de OX40, CD27, CD28, CD30, CD40, PD-1, CD2, CD7, CD258, NKG2C, B7-H3, un ligando que se une a CD83, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS y 4-1BB (CD137), o cualquier combinación de los mismos.

El ETP codificado por el segundo ARN se selecciona del grupo que consiste en CD70, CD86 y CD252, y fragmentos funcionales y variantes de CD70, CD86 y CD252 que conservan la capacidad de potenciar el cebado de células T. Casos de la divulgación en los que el segundo ARN no codifica un ETP de este tipo no están abarcados por la redacción de las reivindicaciones, aunque se consideran útiles para comprender la invención. Otros ETP incluyen, por ejemplo, una molécula coestimuladora (p. ej., CD70, CD83, CD80, CD86, CD40, CD154, CD137L (4-1BBL), CD252 (OX40L), CD275 (ICOS-L), CD54 (ICAM-1), CD49a, CD43, CD48, CD112 (PVRL2), CD150 (SLAM), CD155 (PVR), CD265 (RANK), CD270 (HVEM), TL1A, CD127, IL-4R, GITR-L, CD160, CD258, TIM-4, CD153 (CD30L), CD200R (OX2R), CD44, ligandos de los mismos, para fragmentos funcionales o variantes de los mismos), una citoquina soluble (p. ej., IL-2, IL-12, IL-6, IL-7, IL-15, IL-18, IL-21, GM-CSF, IL-18, IL-21 e IL-27, o fragmentos funcionales o variantes de los mismos), un polipéptido implicado en la presentación de antígenos (p. ej., CD64, MHC I y MHC II, o fragmentos funcionales o variantes de los mismos), un polipéptido implicado en el tráfico y/o la migración (p. ej., CD183, CCR2, CCR6, CD50, CD197, CD58 y CD62L, o fragmentos funcionales o variantes de los mismos), o un polipéptido implicado en la fijación como objetivo de células dendríticas (p. ej., ligandos de TLR, anticuerpo anti-DEC-205 y un anticuerpo anti-DC-SIGN, o fragmentos funcionales o variantes de los mismos).

Las células T con ARN de ETP-CAR de la invención tienen una capacidad de cebado de células T potenciada en relación con una célula T que carece del ARN que codifica el ETP y, opcionalmente, capacidad de presentación de antígenos en relación con una célula T que carece del ARN que codifica el ETP. Cuando dos o más ETPs se transfectan transitoriamente en una célula T, los ETPs adicionales potencian la presentación de antígenos y/o la capacidad de cebado de células T de una célula T que carece de los ETPs adicionales. En algunas realizaciones, la célula T se transfecta para expresar transitoriamente un tercer ARN distinto que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un ETP que difiere del ETP codificado por el segundo ARN. En este caso, la célula T tiene una presentación incrementada de antígenos y/o una capacidad de cebado de células T con respecto a una célula T que comprende el primer ARN y el segundo ARN, pero no el tercer ARN.

En algunas realizaciones, la expresión del CAR o los CARs no afecta sustancialmente el nivel de expresión del ETP o los ETPs en la célula T con ARN de ETP-CAR, en donde el CAR comprende un dominio de unión a antígeno que se une al antígeno, y la expresión del ETP o los ETPs no afecta sustancialmente el nivel de expresión o la función de destrucción celular del CAR o los CARs en la célula T con ARN de ETP-CAR.

Las células T con ARN de ETP-CAR de la invención tienen, por ejemplo, una eficacia incrementada para matar células tumorales y/o reducir el tamaño del tumor y/o cebar células T con un antígeno tumoral en un sujeto con un tumor en relación con una célula T con ARN CAR. célula, es decir, una célula T que expresa transitoriamente el CAR solo.

Los ARNs que codifican el CAR o los CARs y el ETP o los ETPs se transcriben, p. ej., a partir de un vector de transcripción in vitro y se introducen en las células T mediante, p. ej., electroporación.

En otro aspecto, la invención proporciona composiciones, por ejemplo, una composición farmacéutica que comprende un soporte farmacéuticamente aceptable, que comprende una célula T con ARN de ETP-CAR como se define en las reivindicaciones.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para generar una célula T que tiene actividad antitumoral potenciada, comprendiendo el método transfectar transitoriamente una célula T con dos o más ARNs exógenos distintos, en el que: (a) el primer ARN comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR que comprende un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, y b) el segundo ARN comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un ETP, o un fragmento funcional o variante del mismo, como se define en las reivindicaciones.

En otro aspecto, la invención se refiere a una célula T con ARN de ETP-CAR de la invención para uso en un método para proporcionar inmunidad antitumoral en un sujeto que comprende administrar al sujeto, por ejemplo, un sujeto humano, una cantidad eficaz de la célula T con ARN de ETP-CAR.

En otro aspecto, la invención se refiere a una célula T con ARN de ETP-CAR de la invención para uso en un método para tratar a un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano, que tiene una enfermedad asociada con un antígeno asociado a la enfermedad, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de la célula T con ARN de ETP-CAR. En algunas realizaciones, la enfermedad es una enfermedad proliferativa, una afección precancerosa o una indicación no relacionada con el cáncer. En una realización, el cáncer es un cáncer descrito en esta memoria. En una realización, la indicación no relacionada con el cáncer es una infección viral o una infección bacteriana.

En otro aspecto, la invención se refiere a una célula T con ARN de ETP-CAR de la invención para uso en un método para potenciar la propagación del epítopo en un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano, con cáncer, que comprende administrar al sujeto la célula T con ARN de Et P-CAR.

En otro aspecto, en esta memoria se describen las células T con ARN de ETP-CAR y composiciones de células T con ARN de ETP-CAR de la invención y su uso para preparar medicamentos o su uso para tratar enfermedades asociadas con antígenos asociados a enfermedades, tales como cáncer, enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias y enfermedades infecciosas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 muestra moléculas candidatas asociadas con diversos aspectos del cebado de CTL para la modificación por ingeniería genética de ARN y su uso junto con CARs. Las moléculas ejemplares enumeradas están altamente reguladas positivamente en las células dendríticas, que son potentes células presentadoras de antígenos (APCs, por sus siglas en inglés) profesionales.

La Figura 2 es un gráfico de barras que muestra la regulación positiva de la expresión de moléculas coestimuladoras en células dendríticas maduras. Se cultivaron DCs inmaduras a partir de monocitos adherentes en presencia de IL-4 y GM-CSF durante 7 días. Las DCs maduras se cultivaron primero en presencia de IL-4 y GM-CSF durante 5 días, seguido de la adición de TNFa, IL-1p, IL-6 y PGE2 durante 2 días adicionales. Las DCs inmaduras y maduras se tiñeron con anticuerpos (Abs) específicos para los marcadores indicados y se analizaron mediante citometría de flujo. El aumento de cada uno de los marcadores se calculó como una relación de la expresión del marcador en las DCs maduras sobre las DCs inmaduras.

La Figura 3 muestra la expresión de CD70, CD83, CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), CD275 (ICOS-L), CD43, CD137L (4-1BBL), CD252 (OX40L), CD58 (LFA-3), CD48, TL1A, CD270 (HVEM), CD40, CD154 (CD40L), CD 150 (SLAM) y CD64 después de la electroporación de sus ARNs en células T. Se produjo ARNm de alta calidad que codifica moléculas coestimuladoras tras la clonación de genes en un molde de ADN plasmídico. Se electroporaron de 8 10 |jg de ARN en 2,5 * 106 células T utilizando un electroporador BTX ECM 830 para un único pulso a 500 V durante 0,7 ms. Luego se cultivaron células T electroporadas durante la noche en medio de cultivo de células T estándar y luego se tiñeron para determinar la expresión de la molécula respectiva mediante citometría de flujo. Las líneas continuas muestran la expresión de moléculas coestimuladoras en células T que no se tiñeron, las líneas azules muestran células T que se electroporaron pero sin ARN y se tiñeron, y las líneas rojas designan células T que se electroporaron con los ARNs indicados y se tiñeron.

La Figura 4A describe el flujo experimental para el sistema de cebadoin vitromodificado que utiliza DCs para cebar MART-1 CTL. DCs se cultivaron (como se describe en la Figura 1) y luego se co-cultivaron en placas de seis pocillos con PBMCs autólogas en una relación de (1:10) en presencia del péptido MART-1 (0,25 |jg/mL), IL-2, IL-7, IL-15 e IL-21 durante 13 días. Después de una única ronda de estimulación peptídica durante 13 días, la inducción de CTL se midió mediante citometría de flujo y se detectaron células T MART-1 utilizando un tetrámero MART-1 conjugado con APC. La Figura 4B representa gráficos FACS que muestran la frecuencia de células T MART-1+ por pocillo cuando se utilizaron DCs inmaduras o maduras como células efectoras.

La Figura 5 muestra gráficos de FACs que demuestran que las células T que expresan moléculas coestimuladoras mediante electroporación de ARN son capaces de potenciar el cebado T:T de MART-1+CTL. De manera similar al ensayo de co-cultivo descrito para la Figura 3, las células T sometidas a electroporación con los ARNs indicados se cultivaron conjuntamente con PBLs autólogos en placas de seis pocillos en una relación de (1:10) en presencia de MART-1 o h- Clip (control) péptido (0,25 jg/mL), IL-2, IL-7, IL-15 e IL-21 durante un período de 13 días. Después de una única ronda de estimulación peptídica durante 13 días, la inducción de CTL se midió mediante citometría de flujo y se detectaron células T MART-1+ utilizando un tetrámero MART-1 conjugado con APC. Los números en los gráficos FACS indican el porcentaje de células T MART-1+ por pocillo.

La Figura 6 muestra la expresión de meso-CAR, CD70, CD86 (B7-2), CD137L (4-1BBL) y CD252 (OX40L) después de la co-electroporación de ARNs para meso-CAR y las moléculas coestimuladoras indicadas en células T. La co-expresión de Meso-CAR junto con moléculas coestimuladoras no tuvo efecto notable alguno ni sobre el CAR ni sobre la molécula coestimuladora. La electroporación se llevó a cabo como se describe en la Figura 3. Células T se co-electroporaron con 8 jg de Meso-CAR y 8 jg de ARN que codifica cada una de las moléculas coestimuladoras. Las líneas discontinuas representan células T que no se tiñeron y las líneas grises finas son células T que se electroporaron pero no recibieron ARN. Las líneas grises gruesas en la fila superior indican la expresión de CAR en ausencia de transfección de ARN de molécula coestimuladora, mientras que la línea negra designa la expresión de CAR cuando se combinan las dos. En la fila inferior, las líneas negras indican los niveles de expresión de las moléculas coestimuladoras transfectadas en ausencia de CAR, mientras que la línea gris gruesa muestra la expresión del marcador coestimulador en presencia de CAR.

La Figura 7 es un gráfico de barras que muestra que la co-expresión de CAR y moléculas coestimuladoras no afectó la destrucción celular mediada por CAR. Se incubaron células T que expresan meso-CAR y que también expresan moléculas coestimuladoras con dos líneas tumorales que expresan meso diferentes (K-meso y SKOV3) y una línea meso-negativa (K562) y se evaluaron la exposición a CD107a/LAMP-1 en superficies de células T en un ensayo de degranulación de 4 h. La co-expresión de CAR y moléculas coestimuladoras no disminuyó notablemente la muerte celular mediada por CAR.

La Figura 8A describe el flujo experimental para el sistema de cebadoin vitromodificado utilizando células T estimuladas con perlas electroporadas con ARN para cebar MART-1+ CTL. Se cultivaron células T estimuladas con perlas, se sometieron a electroporación con los ARNs indicados y luego se co-cultivaron en placas de 24 pocillos con células T CD8+ purificadas autólogas en una relación de (1:10) en presencia del péptido MART-1 (0,25 -1 jg/mL) e IL-21 durante 3 días, seguido de alimentaciones posteriores con medio reciente que contiene IL-2, IL-7 e IL-15 durante 10 días adicionales. Después de una única ronda de estimulación peptídica durante 13 días, la inducción de CTL se midió mediante citometría de flujo y se detectaron células T MART-1+ utilizando un tetrámero MART-1 conjugado con APC. La Figura 8B muestra los resultados resumidos del experimento que demuestran que las células T estimuladas con perlas que expresan moléculas coestimuladoras mediante electroporación de ARN son capaces de potenciar el cebado T:T de MART-1+CTL.

La Figura 9A demuestra que el cebado T:T de MART-1+ CTL, como se describe en la Figura 8, puede potenciarse adicionalmente mediante la aplicación de irradiación en dosis bajas de células T estimuladas con perlas modificadas por ingeniería genética con ARN. Se cultivaron células T estimuladas con perlas, se sometieron a electroporación con la dosis indicada de ARN de CD70, se sometieron a irradiación de dosis baja a las dosis indicadas y luego se co-cultivaron en placas de 24 pocillos con células T CD8+ purificadas autólogas en una relación de (1:10) en presencia del péptido MART-1 (0,25 -1 jg/mL) e IL-21 durante 3 días, seguido de alimentaciones posteriores con medio reciente que contiene IL-2, IL-7 e IL-15 durante 10 días adicionales. Después de una única ronda de estimulación peptídica durante 13 días, la inducción de CTL se midió mediante citometría de flujo y se detectaron células T MART-1+ utilizando un tetrámero MART-1 conjugado con APC. Los datos se resumen en el diagrama de dispersión y se muestran líneas de tendencia lineales para cada una de las dosificaciones de irradiación; las formas y líneas azules representan datos de células T estimuladas con perlas que no fueron irradiadas, las verdes de las que recibieron 1 Gy, las naranjas de las que recibieron 3 Gy y las rojas de las que recibieron 5 Gy. La Figura 9B muestra el número total de células T MART+ CD8+ por pocillo en función del aumento de la irradiación. Estos datos demuestran que el tratamiento con irradiación en dosis bajas de células T estimuladas con perlas modificadas por ingeniería genética con ARN puede potenciar su capacidad para el cebado T:T de MARt CTL.

DESCRIPCIÓN DETALLADA ADICIONAL

Definiciones

A menos que se defina lo contrario, todos los términos y expresiones técnicos y científicos utilizados en esta memoria tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece la invención.

El término "un" y "uno/a" se refiere a uno o a más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

El término "aproximadamente" cuando se refiere a un valor mensurable tal como una cantidad, una duración temporal y similares, pretende abarcar variaciones de ± 20 % o en algunos casos ± 10 %, o en algunos casos ± 5 %, o en algunos casos ± 1 %, o en algunos casos ± 0,1 % del valor especificado, ya que variaciones de este tipo son apropiadas para realizar los métodos descritos.

Tal como se utiliza en esta memoria, un casquete 5' (también denominado casquete de ARN, casquete de ARN 7-metilguanosina o casquete de ARN m7G) es un nucleótido de guanina modificado que se ha añadido al extremo "frontal" o 5' de un ARN mensajero eucariótico poco después del inicio de la transcripción. El casquete 5' consiste en un grupo terminal que está enlazado al primer nucleótido transcrito. Su presencia es crítica para el reconocimiento por parte del ribosoma y la protección contra las RNasas. La adición del casquete está acoplada a la transcripción y se produce de forma co-transcripcional, de modo que cada una influye en la otra. Poco después del inicio de la transcripción, el extremo 5' del ARNm que está siendo sintetizado se une a un complejo sintetizador del casquete asociado con la ARN polimerasa. Este complejo enzimático cataliza las reacciones químicas que son necesarias para la generación del casquete del ARNm. La síntesis prosigue como una reacción bioquímica multi-etapa. El resto de generación del casquete puede modificarse para modular la funcionalidad del ARNm, tal como su estabilidad o eficiencia de traducción.

Tal como se utiliza en esta memoria, "poliadenilación" se refiere al enlace covalente de un resto poliadenililo, o su variante modificada, a una molécula de ARN mensajero. En organismos eucarióticos, la mayoría de las moléculas de ARN mensajero (ARNm) están poliadeniladas en el extremo 3'. La cola 3' poli(A) es una secuencia larga de nucleótidos de adenina (a menudo varios cientos) añadidos al pre-ARNm mediante la acción de una enzima, la poliadenilato polimerasa. En los eucariotas superiores, la cola poli(A) se añade a las transcripciones que contienen una secuencia específica, la señal de poliadenilación. La cola de poli(A) y la proteína unida a ella ayudan a proteger el ARNm de la degradación por parte de exonucleasas. La poliadenilación también es importante para la terminación de la transcripción, la exportación del ARNm desde el núcleo y la traducción. La poliadenilación se produce en el núcleo inmediatamente después de la transcripción del ADN en ARN, pero adicionalmente también se puede producir más tarde en el citoplasma. Una vez terminada la transcripción, la cadena de ARNm se escinde mediante la acción de un complejo de endonucleasa asociado con la ARN polimerasa. El sitio de escisión se caracteriza habitualmente por la presencia de la secuencia de bases AAUAAA cerca del sitio de escisión. Una vez que se ha escindido el ARNm, se añaden residuos de adenosina al extremo 3' libre en el sitio de escisión.

La expresión "ARN transcrito in vitro" se refiere a ARN, preferiblemente ARNm, que ha sido sintetizado in vitro. Generalmente, el ARN transcrito in vitro se genera a partir de un vector de transcripción in vitro. El vector de transcripción in vitro comprende un molde que se utiliza para generar el ARN transcrito in vitro.

La expresión "Receptor de Antígeno Quimérico" o alternativamente un "CAR" se refiere a una construcción polipeptídica recombinante que comprende al menos un dominio de unión a antígenos extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización citoplasmático (al que también se alude como "dominio de señalización intracelular") que comprende un dominio de señalización funcional derivado de una molécula estimulante como se define más adelante (al que también se alude en esta memoria como "dominio de señalización primario"). En algunas realizaciones, la molécula estimuladora es TCR zeta, FcR gamma, FcR beta, CD3 gamma, CD3 delta, c D3 épsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD66d, 4-1BB y/o CD3-zeta. En una realización particular, la molécula estimulante es la cadena zeta asociada con el complejo receptor de células T. En una realización, la molécula estimulante es 4-1BB. En una realización, el dominio de señalización citoplasmático comprende además uno o más dominios de señalización funcionales derivados de al menos una molécula coestimuladora como se define más adelante (al que también se alude como "dominio de señalización coestimulador"). En una realización, la molécula coestimuladora se elige de una molécula coestimuladora descrita en esta memoria, p. ej., OX40, CD27, CD28, CD30, CD40, PD-1, CD2, CD7, CD258, NKG2C, B7-H3, un ligando que se une a CD83, Ic A m -1, LFA-1 (CD1 1a/CD18), ICOS y 4-1BB (CD137), o cualquier combinación de los mismos. En una realización, el CAR comprende una proteína de fusión quimérica que comprende un dominio de reconocimiento de antígenos extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización funcional derivado de una molécula estimuladora (un dominio de señalización primario). En una realización, el CAR comprende una proteína de fusión quimérica que comprende un dominio de reconocimiento de antígenos extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización funcional derivado de una molécula co-estimuladora (un dominio de señalización coestimulador) y un dominio de señalización funcional derivado de de una molécula estimulante (un dominio de señalización primario). En un aspecto, el CAR comprende una proteína de fusión quimérica que comprende un dominio de unión al antígeno extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que comprende dos dominios de señalización funcionales derivados de una o más moléculas coestimuladoras y un dominio de señalización funcional derivado de una molécula estimuladora. En una realización, el CAR comprende una proteína de fusión quimérica que comprende un dominio de unión a antígeno extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que comprende al menos dos dominios de señalización funcionales derivados de una o más moléculas coestimuladoras y un dominio de señalización funcional derivado de una molécula estimuladora. En una realización, el CAR comprende una secuencia conductora opcional en el extremo amino (N-ter) de la proteína de fusión CAR. En una realización, el CAR comprende, además, una secuencia conductora en el extremo N del dominio de unión al antígeno extracelular, en donde la secuencia conductora se escinde opcionalmente del dominio scFv durante el procesamiento celular y la localización del CAR en la membrana celular. En una realización, la secuencia conductora comprende (p. ej., consiste en) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. En una realización, el CAR es un receptor de antígeno quimérico regulable (RCAR, por sus siglas en inglés).

La expresión "receptor de antígeno quimérico regulable (RCAR)", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un conjunto de polipéptidos, típicamente dos en las realizaciones más simples, que cuando se expresan en una célula, p. ej., una célula RCARX, proporciona a la célula especificidad para una célula diana, típicamente una célula cancerosa, y con generación o proliferación de señales intracelulares regulables, que pueden optimizar una propiedad efectora inmune de la célula que expresa RCAR. Una célula que expresa RCAR depende, al menos en parte, de un dominio de unión a antígeno para proporcionar especificidad a una célula diana que comprende el antígeno unido por el dominio de unión a antígeno. En una realización, un RCAR incluye un interruptor de dimerización que, ante la presencia de una molécula de dimerización, puede acoplar un polipéptido que comprende un dominio de señalización intracelular a un polipéptido que comprende un dominio de unión a antígeno.

La expresión "molécula de dimerización", tal como se utiliza en esta memoria, p. ej., cuando se hace referencia a un RCAR, se refiere a una molécula que fomenta la asociación de un primer dominio de tipo interruptor con un segundo dominio de tipo interruptor. En realizaciones, la molécula de dimerización no se produce de forma natural en el sujeto, o no se produce en concentraciones que darían como resultado una dimerización significativa. En realizaciones, la molécula de dimerización es una molécula pequeña, p. ej., rapamicina o un rapálogo, p. ej., RAD001.

La expresión "dominio de señalización" se refiere a la porción funcional de una proteína que actúa transmitiendo información dentro de la célula para regular la actividad celular a través de vías de señalización definidas generando segundos mensajeros o funcionando como efectores respondiendo a mensajeros de este tipo.

El término "anticuerpo", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una proteína o secuencia polipeptídica derivada de una molécula de inmunoglobulina que se une específicamente a un antígeno. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas policlonales o monoclonales, de cadena sencilla o múltiple, o intactas, y pueden derivarse de fuentes naturales o de fuentes recombinantes. Los anticuerpos son típicamente tetrámeros de moléculas de inmunoglobulina.

La expresión "fragmento de anticuerpo" se refiere a al menos una porción de un anticuerpo, que conserva la capacidad de interactuar específicamente con (p. ej., mediante unión, impedimento estérico, estabilización/desestabilización, distribución espacial) un epítopo de un antígeno. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, entre otros, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fv, fragmentos de anticuerpos scFv, Fv enlazados por disulfuro (sdFv), un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1, anticuerpos lineales, anticuerpos de dominio único tales como sdAb (ya sea VL o VH), dominios VHH de camélidos, anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos, tales como un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente disulfuro en la región bisagra, y una CDR aislada u otros fragmentos de unión al epítopo de un anticuerpo. También se puede incorporar un fragmento de unión al antígeno en anticuerpos de dominio único, maxicuerpos, minicuerpos, nanocuerpos, intracuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, v-NAR y bis-scFv (véase, p. ej., Hollinger y Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005). Fragmentos de unión al antígeno también se pueden injertar en armazones de base polipeptídica tales como una fibronectina de tipo III (Fn3) (véase la patente de EE.UU. N°: 6.703.199, que describe minicuerpos de polipéptido de fibronectina). El término "scFv" se refiere a una proteína de fusión que comprende al menos un fragmento de anticuerpo que comprende una región variable de una cadena ligera y al menos un fragmento de anticuerpo que comprende una región variable de una cadena pesada, en donde las regiones variables de las cadenas ligera y pesada están enlazadas de forma contigua, p. ej., mediante un enlazador sintético, p. ej., un enlazador polipeptídico corto flexible, y capaz de expresarse como un polipéptido de cadena sencilla, y en donde el scFv conserva la especificidad del anticuerpo intacto del que se deriva. A menos que se especifique, tal como se utiliza en esta memoria, un scFv puede tener las regiones variables VL y VH en cualquier orden, p. ej., con respecto a los extremos N-terminal y C-terminal del polipéptido, el scFv puede comprender VL-enlazador-VH o puede comprender VH-enlazador-VL.

La porción del CAR de uso en la invención que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo puede existir en una diversidad de formas en las que el dominio de unión al antígeno se expresa como parte de una cadena polipeptídica contigua que incluye, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo de dominio único (sdAb), un anticuerpo de cadena sencilla (scFv), un anticuerpo humanizado o anticuerpo biespecífico (Harlow et al., 1999, En: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, En: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426). En un aspecto, el dominio de unión al antígeno de una composición de CAR utilizada en la invención comprende un fragmento de anticuerpo. En un aspecto adicional, el CAR comprende un fragmento de anticuerpo que comprende un scFv.

La expresión "cadena pesada del anticuerpo" se refiere a la mayor de los dos tipos de cadenas polipeptídicas presentes en las moléculas de anticuerpo en sus conformaciones de origen natural y que normalmente determina la clase a la que pertenece el anticuerpo.

La expresión "cadena ligera de anticuerpo" se refiere al más pequeño de los dos tipos de cadenas polipeptídicas presentes en las moléculas de anticuerpo en sus conformaciones que se producen de forma natural. Las cadenas ligeras kappa (k) y lambda (A) se refieren a los dos isotipos principales de cadenas ligeras de anticuerpos.

La expresión "anticuerpo recombinante" se refiere a un anticuerpo que se genera utilizando tecnología de ADN recombinante, tal como, por ejemplo, un anticuerpo expresado por un bacteriófago o un sistema de expresión en levaduras. El término también debe interpretarse en el sentido de un anticuerpo que se ha generado mediante la síntesis de una molécula de ADN que codifica el anticuerpo y cuya molécula de ADN expresa una proteína del anticuerpo, o una secuencia de aminoácidos que especifica el anticuerpo, en el que el ADN o la secuencia de aminoácidos se ha obtenido utilizando ADN recombinante o tecnología de secuencia de aminoácidos que está disponible y es bien conocida en la técnica.

La expresión "efecto anticancerígeno" se refiere a un efecto biológico que puede manifestarse por diversos medios, incluyendo, pero no limitados, p. ej., a una disminución del volumen del tumor, una disminución del número de células cancerosas, una disminución del número de metástasis, un aumento de la esperanza de vida, una disminución de la proliferación de células cancerosas, una disminución de la supervivencia de las células cancerosas o una mejora de diversos síntomas fisiológicos asociados con la afección cancerosa Un "efecto anticancerígeno" también puede manifestarse por la capacidad de los péptidos, polinucleótidos, células y anticuerpos en la prevención de la aparición de cáncer en primer lugar. La expresión "efecto antitumoral" se refiere a un efecto biológico que se puede poner de manifiesto por diversos medios, que incluyen, pero sin limitación, p. ej., una disminución del volumen tumoral, una disminución del número de células tumorales, una disminución de la proliferación de células tumorales o una disminución de la supervivencia de células tumorales.

El término "autólogo" se refiere a cualquier material derivado del mismo individuo al que posteriormente se le reintroducirá en el individuo.

El término "alogénico" se refiere a cualquier material derivado de un animal diferente de la misma especie que el individuo al que se le introduce el material. Se dice que dos o más individuos son alogénicos entre sí cuando los genes en uno o más loci no son idénticos. En algunos aspectos, el material alogénico de individuos de la misma especie puede ser lo suficientemente diferente desde un punto de vista genético para interactuar de manera antigénica.

El término "xenogénico" se refiere a un injerto derivado de un animal de una especie diferente.

La expresión "enfermedad proliferativa" se refiere a cualquier enfermedad o trastorno que incluye cánceres, neoplasias malignas, crecimientos benignos y otras afecciones que resultan de la hiperactividad o hiperplasia de células somáticas.

El término "cáncer" se refiere a una enfermedad caracterizada por el crecimiento descontrolado de células aberrantes. Las células cancerosas pueden diseminarse localmente o a través del torrente sanguíneo y el sistema linfático a otras partes del cuerpo. Ejemplos de diversos cánceres incluyen, pero no se limitan a cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de piel, cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de cerebro, linfoma, leucemia, cáncer de pulmón y similares.

La expresión "cebado de células T" se refiere al proceso mediante el cual una célula T virgen sufre una expansión clonal y diferenciación en una célula T citotóxica efectora (CTL) después de ser estimulada por contacto con un antígeno.

La expresión "potenciador del cebado de células T" o "ETP" se refiere a una molécula que, cuando se introduce en una célula, potencia la presentación del antígeno de la célula y las actividades de cebado de las células T. ETPs ejemplares incluyen, pero no se limitan a moléculas coestimuladoras (p. ej., CD70, CD83, CD80, CD86, CD40, CD154, CD137L (4-1BBL), CD275 (ICOS-L), CD54 (ICAM-1), CD49a, CD43, CD48, CD 112 (PVRL2), CD150 (SLAM), CD155 (PVR), CD265 (RANK), CD270 (HVEM), TL1A, CD127, IL-4R, GITR-L, CD160, CD258, TIM-4, CD153 (CD30L), CD200R (OX2R), CD44 y ligandos de los mismos), citoquinas solubles (p. ej., IL-2, IL-12, IL-6, IL-7, IL-15, IL-18, IL-21, GM-CSF, IL-18, IL-21, IL-27), polipéptidos implicados en la presentación de antígenos (p. ej., CD64, MHC I y MHC II, polipéptidos implicados en el tráfico y/o la migración (p. ej., CD183, CCR2, CCR6, CD50, CDl97, CD58, CD62L), y polipéptidos implicados en la fijación como objetivo de células dendríticas (p. ej., ligandos de TLR, anticuerpo anti-DEC-205, anticuerpo anti-DC-SIGN). La presente invención utiliza un ETP que se selecciona del grupo que consiste en CD70, CD86 y CD252, y fragmentos funcionales y variantes de CD70, CD86 y CD252 que conservan la capacidad de potenciar el cebado de células T. Los casos de la divulgación que no utilizan un ETP de este tipo no están abarcados por la redacción de las reivindicaciones, aunque se consideran útiles para comprender la invención. ETPs candidatos se pueden testar para determinar la actividad de cebado de células T utilizando ensayos descritos en los Ejemplos. A células T que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR y un ácido nucleico que codifica un ETP se las alude en esta memoria como "células T ETP-CAR". A células T transfectadas transitoriamente con un ARN que codifica un CAR y un ARN que codifica un ETP se las alude en esta memoria como "células T con ARN de ETP-CAR".

La expresión "propagación de epítopos" o "propagación de antígenos" se refiere a la capacidad del sistema inmunológico de atacar nuevas dianas más allá de aquellas para las que está diseñada una vacuna, mediante el reconocimiento de fragmentos antigénicos de células muertas como nuevas dianas.

La expresión "modificaciones de secuencias conservadoras" se refiere a modificaciones de aminoácidos que no afectan ni alteran significativamente las características de unión del anticuerpo o fragmento de anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos. Modificaciones conservadoras de este tipo incluyen sustituciones, adiciones y deleciones de aminoácidos. Se pueden introducir modificaciones en un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de uso en la invención mediante técnicas estándares conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR Sustituciones conservadoras de aminoácidos son aquellas en las que el residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales de carácter básico (p. ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales de carácter ácido (p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (p. ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (p. ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

El término "estimulación" se refiere a una respuesta primaria inducida por la unión de una molécula estimuladora (p. ej., un complejo TCR/CD3) con su ligando afín para mediar con ello en un evento de transducción de señales, tal como, pero no limitado a transducción de señales a través del complejo TCR/CD3. La estimulación puede mediar en la expresión alterada de determinadas moléculas, tales como la regulación negativa de TGF-p y/o la reorganización de estructuras citoesqueléticas, y similares.

La expresión "molécula estimulante" se refiere a una molécula expresada por una célula inmunitaria, p. ej., una célula T, una célula NK o una célula B, que proporciona la o las secuencias de señalización citoplasmática que regulan la activación de la célula inmunitaria en una manera estimuladora para al menos algún aspecto de la vía de señalización de las células inmunes. En un aspecto, la señal es una señal primaria que se inicia, por ejemplo, mediante la unión de un complejo TCR/CD3 con una molécula de MHC cargada con un péptido, y que conduce a la mediación de una respuesta de células T, que incluye, pero no se limita a proliferación, activación, diferenciación y similares. Secuencias de señalización citoplasmática primaria (dominio de señalización primario) que actúan de manera estimuladora pueden contener motivos de señalización que se conocen como motivos de activación basados en tirosina de inmunorreceptores o ITAMs (por sus siglas en inglés). Ejemplos de ITAM que contienen secuencias de señalización citoplasmática que son de uso particular en la invención incluyen los derivados de CD3 zeta, FcR gamma común (FCER1G), Fc gamma RIIa, FcR beta (Fc Epsilon R1b), CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CD79a, CD79b, DAP10 y DAPl2. En una realización, la molécula de señalización citoplasmática en uno o más CARs de uso en la invención comprende una secuencia de señalización citoplasmática derivada de CD3-zeta. En una realización, la secuencia de señalización citoplasmática derivada de CD3-zeta es la secuencia proporcionada como SEQ ID NO: 18 o los residuos equivalentes de una especie no humana, p. ej., ratón, roedor, mono, simio y similares.

La expresión "célula presentadora de antígenos" se refiere a una célula del sistema inmunológico tal como una célula accesoria (p. ej., una célula B, una célula dendrítica y similares) que muestra antígenos extraños formando complejos con complejos mayores de histocompatibilidad (MHCs) en sus superficies. Las células T pueden reconocer estos complejos utilizando sus receptores de células T (TCRs, por sus siglas en inglés). Las APCs procesan antígenos y los presentan a las células T.

El término "zeta" o, alternativamente, la expresión "cadena zeta", "CD3-zeta" o "TCR-zeta" se define como la proteína proporcionada como GenBank N° de Acceso BAG36664.1, o los residuos equivalentes de una especie no humana, p. ej., ratón, roedor, mono, simio y similares, y un "dominio estimulador zeta" o, alternativamente, un "dominio estimulador zeta CD3" o un "dominio estimulador zeta TCR" se define como los residuos de aminoácidos del dominio citoplasmático de la cadena zeta, o derivados funcionales de la misma, que son suficientes para transmitir funcionalmente una señal inicial necesaria para la activación de las células T. En un aspecto, el dominio citoplasmático de zeta comprende los residuos 52 a 164 de GenBank N° de Acceso BAG36664.1 o los residuos equivalentes de una especie no humana, p. ej., ratón, roedor, mono, simio y similares, que son ortólogos funcionales del mismo. En un aspecto, el "dominio estimulador zeta" o un "dominio estimulador zeta-CD3" es la secuencia proporcionada como SEQ ID NO:18.

La expresión "molécula coestimuladora" se refiere a un participante en la unión afín en una célula T que se une específicamente con un ligando coestimulador, mediando de este modo en una respuesta coestimuladora por l a célula T, tal como, pero sin limitación, la proliferación. Moléculas coestimuladoras son moléculas de la superficie celular distintas de los receptores de antígenos o sus ligandos que se requieren para una respuesta inmunitaria eficiente. Moléculas coestimuladoras, p. ej., que pueden conferir actividad de cebado de células T cuando se expresan en una célula T con ETP-CAR como se describe en esta memoria, incluyen, pero no se limitan a una molécula de MHC de clase I, BTLA y un receptor de ligando Toll, así como CD70, CD83, CD80, CD86, CD40, CD154, CD137L (4-1BBL), CD252 (OX40L), CD275 (ICOS-L), CD54 (ICAM-1), CD49a, CD43, CD48, CD43, CD48, CD 112 (PVRL2), CD150 (SLAM), CD155 (PVR), CD265 (RANK), CD270 (HVEM), TL1A, CD112 (PVRL2), CD150 (SLAM), CD155 (PVR), CD265 (RANK), CD270 (HVEM), TL1A, CD127, IL-4R, GITR-L, CD160, CD258, TIM-4, CD153 (CD30L), CD200R (OX2R) y CD44.

Un dominio de señalización intracelular coestimulador de un CAR descrito en esta memoria puede ser la porción intracelular de una molécula coestimuladora. Una molécula coestimuladora puede representarse en las siguientes familias de proteínas: proteínas receptoras de TNF, proteínas de tipo inmunoglobulina, receptores de citocinas, integrinas, moléculas de activación linfocítica de señalización (proteínas SLAM, por sus siglas en inglés) y receptores de células NK activadoras. Ejemplos de moléculas de este tipo incluyen CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, ICAM-1, antígeno 1 asociado a la función linfocitaria (LFA-1), CD2, CDS, CD7, CD287, LIGHT, NKG2C, NKG2D, SLAMF7, NKp80, NKp30, NKp44, NKp46, CD160, B7-H3 y un ligando que se une específicamente con CD83, y similares.

El dominio de señalización intracelular puede comprender la porción intracelular completa, o el dominio de señalización intracelular nativo completo, de la molécula de la que procede, o un fragmento funcional o derivado de la misma.

El término "4-1BB" se refiere a un miembro de la superfamilia TNFR con una secuencia de aminoácidos proporcionada como GenBank N° de Acceso AAA62478.2, o los residuos equivalentes de una especie no humana, p. ej., ratón, roedor, mono, simio y similares; y un "dominio coestimulador 4-1BB" se definen los residuos de aminoácidos 214-255 de GenBank N° de Acceso AAA62478.2, o los residuos equivalentes de una especie no humana, p. ej., ratón, roedor, mono, simio y similares En un aspecto, el "dominio de co-estimulación 4-1BB" es la secuencia proporcionada como la SEQ ID NO: 14 o los residuos equivalentes de una especie no humana, p. ej., ratón, roedor, mono, simio y similares.

El término "codificar" se refiere a la propiedad inherente de secuencias específicas de nucleótidos en un polinucleótido, tal como un gen, un ADNc o un ARNm, de servir como moldes para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procesos biológicos que tienen una secuencia definida de nucleótidos (es decir, ARNr, ARNt y ARNm) o una secuencia definida de aminoácidos y las propiedades biológicas resultantes de la misma. Por lo tanto, un gen, ADNc o ARN codifica una proteína si la transcripción y traducción del ARNm correspondiente a ese gen produce la proteína en una célula u otro sistema biológico. Tanto la cadena codificante, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia de ARNm y habitualmente se proporciona en listados de secuencias, como la cadena no codificante, utilizada como molde para la transcripción de un gen o ADNc, puede denominarse codificante de la proteína u otro producto de ese gen o ADNc.

A menos que se especifique lo contrario, una "secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos" incluye todas las secuencias de ácidos nucleicos que son versiones degeneradas entre sí y que codifican la misma secuencia de aminoácidos. La expresión secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína o un ARN también puede incluir intrones en la medida en que la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína puede contener en alguna versión uno o más intrones.

La expresión "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se utilizan indistintamente en esta memoria y se refieren a una cantidad de un compuesto, formulación, material o composición, como se describe en esta memoria, eficaz para lograr un resultado biológico particular. Resultados de este tipo pueden incluir, pero no se limitan a la inhibición de la infección por virus determinada por cualquier medio adecuado en la técnica.

El término "endógeno" se refiere a cualquier material procedente de un organismo, célula, tejido o sistema o producido dentro de él.

El término "exógeno" se refiere a cualquier material introducido desde fuera de un organismo, célula, tejido o sistema o producido fuera de estos.

El término "expresión" se refiere a la transcripción y/o traducción de una secuencia de nucleótidos particular impulsada por su promotor.

La expresión "vector de expresión" se refiere a un vector que comprende un polinucleótido recombinante que comprende secuencias de control de la expresión enlazadas operativamente a una secuencia de nucleótidos que se ha de expresar. Un vector de expresión comprende suficientes elementos que actúan en cis para la expresión; otros elementos para la expresión pueden ser suministrados por la célula huésped o en un sistema de expresión in vitro. Vectores de expresión incluyen todos los conocidos en la técnica, tales como cósmidos, plásmidos (p. ej., desnudos o contenidos en liposomas) y virus (p. ej., lentivirus, retrovirus, adenovirus y virus adeno-asociados) que incorporan el polinucleótido recombinante.

El término "homólogo" se refiere a la identidad de secuencia de subunidades entre dos moléculas poliméricas, p. ej., entre dos moléculas de ácido nucleico, tales como dos moléculas de ADN o dos moléculas de ARN, o entre dos moléculas de polipéptido. Cuando una posición de subunidad en ambas moléculas está ocupada por la misma subunidad monomérica; p. ej., si una posición en cada una de dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, entonces son homólogas en esa posición. La homología entre dos secuencias es una función directa del número de posiciones coincidentes u homólogas; p. ej., si la mitad (p. ej., cinco posiciones en un polímero de diez subunidades de longitud) de las posiciones en dos secuencias son homólogas, las dos secuencias son un 50 % homólogas; si el 90 % de las posiciones (p. ej., 9 de 10) son coincidentes u homólogas, las dos secuencias son un 90 % homólogas.

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (p. ej., murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de estas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de unión al antígeno de anticuerpos) que contienen una secuencia mínima procedente de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados y fragmentos de anticuerpos de los mismos son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo o fragmento de anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región determinante de la complementariedad (CDR) del receptor son reemplazados por restos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata o conejo que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región marco (FR, por sus siglas en inglés) Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos/fragmentos de anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en la CDR importada o en las secuencias de marco. Estas modificaciones se realizan para refinar y optimizar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado o fragmento de anticuerpo del mismo comprenderá sustancialmente todos los de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo humanizado también puede comprender al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véanse Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992.

El término "variante", tal como se usa con respecto a un ETP, se refiere a un ARN o polipéptido que difiere de un ETP de tipo salvaje que codifica el ARN o polipéptido respectivamente, pero conserva propiedades esenciales de la ETP de tipo salvaje (p. ej., capacidad para potenciar presentación de antígenos y/o el cebado de células T).

La expresión "completamente humana" se refiere a una inmunoglobulina, tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, en que la molécula completa es de origen humano o consiste en una secuencia de aminoácidos idéntica a una forma humana del anticuerpo o inmunoglobulina.

La expresión "fragmento funcional", en relación con un ETP, pretende significar una porción del ETP que mantiene la capacidad de potenciar el cebado de células T.

El término "aislado" significa alterado o eliminado del estado natural. Por ejemplo, un ácido nucleico o un péptido presente de forma natural en un animal vivo no está "aislado", pero el mismo ácido nucleico o péptido separado parcial o completamente de los materiales con los que coexiste en su estado natural está "aislado". Un ácido nucleico o proteína aislado puede existir en una forma sustancialmente purificada, o puede existir en un entorno no nativo, tal como, por ejemplo, una célula huésped.

En el contexto de la presente invención, se utilizan las siguientes abreviaturas para las bases de ácidos nucleicos que se producen de manera habitual. "A" se refiere a adenosina, "C" se refiere a citosina, "G" se refiere a guanosina, "T" se refiere a timidina y "U" se refiere a uridina.

El término "lentivirus" se refiere a un género de la familia Retroviridae. Los lentivirus son únicos entre los retrovirus al ser capaces de infectar células que no se dividen; pueden suministrar una cantidad significativa de información genética al<a>D<n>de la célula huésped, por lo que son uno de los métodos más eficaces de un vector de suministro de genes. VIH, SIV y FIV son todos ejemplos de lentivirus.

La expresión "vector lentiviral" se refiere a un vector derivado de al menos una porción de un genoma de lentivirus, incluyendo especialmente un vector lentivírico auto-inactivante como se proporciona en Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009). Otros ejemplos de vectores lentivíricos que pueden utilizarse en la clínica incluyen, entre otros, p. ej., la tecnología de suministro de genes LENTIVECTOR® de Oxford BioMedica, el sistema de vectores LENTIMAX™ de Lentigen y similares. También están disponibles tipos no clínicos de vectores lentivíricos y el experto en la técnica estará familiarizado con ellos.

"Ancla de membrana" o "dominio de fijación de membrana", como se utiliza ese término en esta memoria, se refiere a un polipéptido o resto, p. ej., un grupo miristoílo, suficiente para anclar un dominio extracelular o intracelular a la membrana plasmática.

"Sustancialmente complementario", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a secuencias de nucleótidos en las que la mayoría o todas las bases en la secuencia del cebador son complementarias, o una o más bases no son complementarias o no coinciden. Las secuencias sustancialmente complementarias son capaces de reasociarse o hibridarse con la diana de ADN deseada en las condiciones de reasociación utilizadas para la PCR. Los cebadores pueden diseñarse para que sean sustancialmente complementarios a cualquier porción del molde de ADN. Por ejemplo, los cebadores pueden diseñarse para amplificar la porción de un gen que normalmente se transcribe en las células (el marco de lectura abierto), incluyendo las UTRs en 5' y 3'. Los cebadores también pueden diseñarse para amplificar una porción de un gen que codifica un dominio de interés particular. En una realización, los cebadores están diseñados para amplificar la región codificante de un ADNc humano, incluyendo la totalidad o porciones de las UTRs en 5' y 3'. Cebadores útiles para la PCR se generan mediante métodos sintéticos que son bien conocidos en la técnica.

El término "sustancialmente" se refiere a un grado de variaciones de /- en aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 25 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 35 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 45 %, aproximadamente un 50 %, o más. En una realización, un ETP co-expresado con un CAR en una célula T no inhibe la función de destrucción celular de un CAR en más de aproximadamente un 40 %.

"Cebadores directos" son cebadores que contienen una región de nucleótidos que son sustancialmente complementarios a los nucleótidos en el molde de ADN que están aguas arriba de la secuencia de ADN que se ha de amplificar.

"Aguas arriba" se utiliza en esta memoria para referirse a una ubicación 5 con respecto a la secuencia de ADN que se ha de amplificar respecto a la cadena codificante.

"Cebadores inversos" son cebadores que contienen una región de nucleótidos que son sustancialmente complementarios a un molde de ADN de doble cadena que están aguas abajo de la secuencia de ADN que se ha de amplificar.

"Aguas abajo" se utiliza en esta memoria para referirse a una ubicación 3' con respecto a la secuencia de ADN que se ha de amplificar respecto a la cadena codificante.

La expresión "enlazado operativamente" o "control transcripcional" se refiere a un enlace funcional entre una secuencia reguladora y una secuencia de ácido nucleico heteróloga que da como resultado la expresión de esta última. Por ejemplo, una primera secuencia de ácido nucleico está enlazada operativamente a una segunda secuencia de ácido nucleico cuando la primera secuencia de ácido nucleico se coloca en una relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor está enlazado operativamente a una secuencia codificante si el promotor afecta a la transcripción o expresión de la secuencia codificante. Secuencias de ADN enlazadas operativamente pueden ser contiguas entre sí y, cuando sea necesario para unir dos regiones codificantes de proteínas, están en el mismo marco de lectura.

La expresión administración "parenteral" de una composición inmunogénica incluye, p. ej., inyección subcutánea (s.c.), intravenosa (i.v.), intramuscular (i.m.) o intraesternal, o técnicas de infusión.

La expresión "ácido nucleico" o "polinucleótido" se refiere a ácidos desoxirribonucleicos (ADN) o ácidos ribonucleicos (ARN) y a polímeros de los mismos en forma de cadena sencilla o de doble cadena. A menos que se limite de forma específica, la expresión engloba ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen unas propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia y que se metabolizan de manera similar a la de los nucleótidos de que se producen de forma natural. A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca implícitamente variantes modificadas de forma conservadora de la misma (p. ej., sustituciones de codones degenerados), alelos, ortólogos, SNPs y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, se pueden lograr sustituciones de codones degenerados generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye con residuos de base mixta y/o desoxi-inosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); y Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).

Los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" se utilizan indistintamente y se refieren a un compuesto compuesto por residuos de aminoácidos enlazados covalentemente mediante enlaces peptídicos. Una proteína o péptido debe contener al menos dos aminoácidos y no se impone limitación alguna al número máximo de aminoácidos que pueden comprender la secuencia de una proteína o péptido. Los polipéptidos incluyen cualquier péptido o proteína que comprende dos o más aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos. Tal como se utiliza en esta memoria, el término se refiere tanto a cadenas cortas, a las que también se alude comúnmente en la técnica como péptidos, oligopéptidos y oligómeros, por ejemplo, como a cadenas más largas, a las que generalmente se alude en la técnica como proteínas, de las cuales hay hay muchos tipos. "Polipéptidos" incluyen, por ejemplo, fragmentos con actividad biológica, polipéptidos sustancialmente homólogos, oligopéptidos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipéptidos, polipéptidos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusión, entre otros. Los polipéptidos incluyen péptidos naturales, péptidos recombinantes, péptidos recombinantes o una combinación de los mismos.

El término "promotor" se refiere a una secuencia de ADN reconocida por la maquinaria sintética de la célula, o maquinaria sintética introducida, necesaria para iniciar la transcripción específica de una secuencia de polinucleótidos.

La expresión "secuencia promotora/reguladora" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que se requiere para la expresión de un producto génico enlazado operativamente a la secuencia promotora/reguladora. En algunos casos, esta secuencia puede ser la secuencia promotora central y, en otros casos, esta secuencia también puede incluir una secuencia potenciadora y otros elementos reguladores que son necesarios para la expresión del producto génico. La secuencia promotora/reguladora puede ser, por ejemplo, una que exprese el producto génico de una manera específica para el tejido.

La expresión "enlazador polipeptídico flexible", tal como se utiliza en el contexto de un scFv, se refiere a un enlazador peptídico que consiste en aminoácidos tales como residuos de glicina y serina utilizados solos o en combinación, para enlazar regiones de cadena pesada y ligera variables entre sí. En una realización, el enlazador polipeptídico flexible es un enlazador Gly/Ser y comprende la secuencia de aminoácidos (Gly-Gly-Gly-Ser)n, en donde n es un número entero positivo igual a o mayor que 1. Por ejemplo, n = 1, n = 2, n = 3, n = 4, n = 5 y n = 6, n = 7, n = 8, n = 9 y n = 10. En una realización, los enlazadores polipeptídicos flexibles incluyen, pero no se limitan a (Gly4 Ser)4 o (Gly4 Ser)3. En otra realización, los enlazadores incluyen múltiples repeticiones de (Gly2Ser), (GlySer) o (Gly3Ser). También se incluyen dentro del alcance de la invención los enlazadores descritos en el documento WO2012/138475.

La expresión "vía de transducción de señales" se refiere a la relación bioquímica entre una diversidad de moléculas de transducción de señales que desempeñan un papel en la transmisión de una señal de una porción de una célula a otra porción de una célula. La expresión "receptor de la superficie celular" incluye moléculas y complejos de moléculas capaces de recibir una señal y transmitir la señal a través de la membrana de una célula.

El término "sujeto" se refiere a cualquier organismo vivo en el que se pueda provocar una respuesta inmunitaria (p. ej., mamíferos, seres humanos).

La expresión "dominio de tipo interruptor", tal como se utiliza en esta memoria, p. ej., cuando se hace referencia a un RCAR, se refiere a una entidad, típicamente una entidad basada en polipéptido, que, en presencia de una molécula de dimerización, se asocia con otro dominio de tipo interruptor. La asociación da como resultado un acoplamiento funcional de una primera entidad enlazada, p. ej., condensada a, un primer dominio de tipo interruptor, y una segunda entidad enlazada, p. ej., condensada a un segundo dominio de tipo interruptor. A un primer y un segundo dominio de tipo interruptor se les alude colectivamente como un interruptor de la dimerización. En algunas realizaciones, el primer y el segundo dominio de tipo interruptor son iguales entre sí, p. ej., son polipéptidos que tienen la misma secuencia de aminoácidos primaria, y se les alude colectivamente como cambio de la homodimerización. En algunas realizaciones, el primer y el segundo dominio de tipo interruptor son diferentes entre sí, p. ej., son polipéptidos que tienen diferentes secuencias de aminoácidos primarios, y se les alude colectivamente como cambio de la heterodimerización. En algunas realizaciones, el cambio es intracelular. En algunas realizaciones, el cambio es extracelular. En algunas realizaciones, el dominio de tipo interruptor es una entidad basada en polipéptidos, p. ej., basada en FKBP o FRB, y la molécula de dimerización es una molécula pequeña, p. ej., un rapálogo. En algunas realizaciones, el dominio de tipo interruptor es una entidad basada en polipéptidos, p. ej., un scFv que se une a un péptido myc, y la molécula de dimerización es un polipéptido, un fragmento del mismo o un multímero de un polipéptido, p. ej., un ligando myc o multímeros de un ligando myc que se unen a uno o más scFvs myc. En algunas realizaciones, el dominio de tipo interruptor es una entidad basada en polipéptidos, p. ej., receptor myc, y la molécula de dimerización es un anticuerpo o fragmentos del mismo, p. ej., anticuerpo myc.

La expresión célula "sustancialmente purificada" se refiere a una célula que está esencialmente libre de otros tipos de células. Una célula sustancialmente purificada también se refiere a una célula que se ha separado de otros tipos celulares con los que normalmente está asociada en su estado natural. En algunos casos, una población de células sustancialmente purificadas se refiere a una población homogénea de células. En otros casos, este término se refiere simplemente a células que han sido separadas de las células con las que están asociadas naturalmente en su estado natural. En algunos aspectos, las células se cultivan in vitro. En otros aspectos, las células no se cultivan in vitro.

El término "terapéutico", tal como se utiliza en esta memoria, significa un tratamiento. Se obtiene un efecto terapéutico mediante la reducción, supresión, remisión o erradicación de una patología.

El término "profilaxis", tal como se utiliza en esta memoria, significa la prevención o el tratamiento protector de una enfermedad o patología.

En el contexto de la presente invención, "antígeno tumoral" o "antígeno de un trastorno hiperproliferativo" o "antígeno asociado con un trastorno hiperproliferativo" se refiere a antígenos que son comunes a trastornos hiperproliferativos específicos. En determinados aspectos, los antígenos del trastorno hiperproliferativo de uso con la presente invención se derivan de cánceres que incluyen, pero no se limitan a melanoma primario o metastásico, timoma, linfoma, sarcoma, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, linfoma no Hodgkin, linfoma no Hodgkin, leucemias, cáncer de útero, cáncer de cuello uterino, cáncer de vejiga, cáncer de riñón y adenocarcinomas, tales como cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, y similares.

El término "transfectado" se refiere a un proceso mediante el cual se transfiere o introduce ácido nucleico exógeno en la célula huésped. Una célula "transfectada" es aquella que ha sido transfectada con ácido nucleico exógeno. La célula incluye la célula objeto primaria y su progenie.

Tal como se utiliza en esta memoria, "transitorio" se refiere a la expresión de un transgén no integrado durante un período de horas, días o semanas, en donde el período de tiempo de expresión es menor que el período de tiempo para la expresión del gen si está integrado en el genoma o está contenido dentro de un replicón de plásmido estable en la célula huésped.

Tal como se utilizan en esta memoria, los términos "tratar", "tratamiento" y "tratando" se refieren a la reducción o mejora de la progresión, gravedad y/o duración de un trastorno proliferativo, o la mejora de uno o más síntomas (preferentemente, uno o síntomas más perceptibles) de un trastorno proliferativo resultante de la administración de una o más terapias (p. ej., uno o más agentes terapéuticos tales como un CAR de uso en la invención). En algunas realizaciones específicas, los términos "tratar", "tratamiento" y "tratando" se refieren a la mejora de al menos un parámetro físico mensurable de un trastorno proliferativo tal como el crecimiento de un tumor, no necesariamente perceptible por el paciente. En otras realizaciones, los términos "tratar", "tratamiento" y "tratando" se refieren a la inhibición de la progresión de un trastorno proliferativo, ya sea físicamente, p. ej., mediante la estabilización de un síntoma perceptible, fisiológicamente mediante, p. ej., la estabilización de un parámetro físico, o ambos. En otras realizaciones, los términos "tratar", "tratamiento" y "tratando" se refieren a la reducción o estabilización del tamaño del tumor o el recuento de células cancerosas.

La expresión "se une específicamente" se refiere a un anticuerpo, o un ligando, que reconoce y se une a una proteína compañera de unión (p. ej., un antígeno tumoral) presente en una muestra, pero cuyo anticuerpo o ligando no reconoce sustancialmente ni se une a otras moléculas en la muestra.

Intervalos: a lo largo de esta divulgación, se pueden presentar en un formato de intervalo diversos aspectos de la invención. Se debe entender que la descripción en formato de intervalo es meramente por conveniencia y brevedad y no se debe interpretar como una limitación inflexible en el alcance de la invención. Por consiguiente, se debe considerar que la descripción de un intervalo ha revelado específicamente todos los subintervalos posibles, así como los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, se debe considerar que la descripción de un intervalo tal como de 1 a 6 tiene subintervalos específicamente descritos tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.

Descripción general

La presente invención se basa en el descubrimiento de que las actividades antitumorales de las células T que expresan secuencias de ácido nucleico que codifican CARs se pueden potenciar adicionalmente mediante la co-expresión de secuencias de ácido nucleico que codifican moléculas que potencian el cebado de células T (es decir, en lo sucesivo, "ETPs"), p. ej., moléculas implicadas en la co-estimulación celular y/o la presentación de antígenos. A células T de este tipo se las alude en esta memoria como "células T con ETP-CAR". De esta manera, las células T con ETP-CAR están armadas no solo con la capacidad de destrucción celular dirigida por células T con CAR, sino que también exhiben una función de presentación de antígenos potenciada, lo que permite el cebado mediado por células T con ETP-CAR de células T reactivas a tumores no modificadas por ingeniería genética, tanto vírgenes como experimentadas con antígenos. Es decir, las células T con ETP-CAR son células T de doble función con función APC asesina y "profesional", lo que crea una terapia transitoria con efectos antitumorales permanentes. En la presente invención, las células T expresan transitoriamente ARNs que codifican CARs y/o ARNs que codifican ETPs. Las células T también pueden exhibir una expresión prolongada de CAR o ETP, p. ej., mediante transducción mediada por virus de ácidos nucleicos que codifican CARs y/o ETPs. En las células T de la presente invención, el ETP se selecciona del grupo que consiste en CD70, CD86 y CD252, y fragmentos funcionales y variantes de CD70, CD86 y CD252 que conservan la capacidad de potenciar el cebado de células T.

Además, se descubrió que las células T con ETP-CAR, p. ej., las células T con ARN de ETP-CAR, proporcionan el beneficio adicional de potenciar la propagación del epítopo, que se define clásicamente por una respuesta inmunitaria a un único antígeno que conduce al desarrollo de inmunidad contra otros antígenos. en el mismo tumor (Lehmann, Forsthuber et al. 1992, Kaufman, Clare-Salzler et al. 1993, Tisch, Yang et al. 1993, McRae, Vanderlugt et al. 1995, Vanderlugt y Miller 2002). Sin estar ligado a teoría alguna, se cree que, en el contexto del rechazo tumoral, las células T con ETP-CAR, p. ej., las células T con ARN de ETP-CAR, que reaccionan específicamente a un antígeno tumoral dado a través del CAR induce una cascada inflamatoria en el sitio del encuentro con antígenos. Esto luego da como resultado la destrucción del tejido y la liberación de antígenos tumorales que pueden ser procesados y presentados de forma cruzada por células T con ETP-CAR (que han sido dotadas de capacidades mejoradas de presentación de antígenos y de cebado de células T a través del componente ETP), p. ej., células T con ARN de ETP-CAR y otras células presentadoras de antígenos, amplificando así la respuesta debido al reclutamiento de un repertorio diversificado de células T y B que reaccionan a epítopos subdominantes y/o crípticos derivados de tumores.

Las células T descritas en esta memoria pueden modificarse genéticamente, p. ej., mediante transfección o transducción, para expresar una secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR descrito en esta memoria y una secuencia de ácido nucleico que codifica un ETP descrito en esta memoria. Dependiendo del contexto clínico, p. ej., la condición del paciente o la condición a tratar, puede desearse una expresión prolongada o permanente del CAR y/o el ETP, p. ej., para una actividad CAR robusta y duradera, p. ej., actividad antitumoral y actividad de cebado de células T basada en ETP. Las células T pueden modificarse genéticamente, p. ej., transducirse, p. ej., transducirse viralmente, usando vectores que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican un CAR y/o ETP descritos en esta memoria para conferir una expresión prolongada del CAR y/o del ETP.

Alternativamente, puede desearse la expresión transitoria del CAR y/o del ETP. La presencia transitoria de células T con ARN de ETP-CAR (es decir, la reversibilidad de la expresión de CAR y ETP) en un huésped presenta una plataforma flexible para el ajuste fino y la terapia de células T adoptivas adaptada al paciente, que se distingue de la estrategia de modificar genéticamente de manera permanente células T con, p. ej., suministro de c A r mediado por virus. Por ejemplo, las células T con ARN de ETP-CAR se pueden administrar a sujetos según sea necesario (p. ej., con infusiones únicas o múltiples), y la expresión de los componentes (ETP y CAR) se puede controlar alterando la cantidad de ARN que codifica cada uno para un ajuste fino de la destrucción de células basada en CAR o de la actividad de cebado de células T basada en ETP, dependiendo de la condición del paciente. Esta estrategia puede ser particularmente atractiva en determinados contextos clínicos, por ejemplo, cuando existe el deseo de limitar la duración de la toxicidad fuera del tumor, particularmente en los casos en los que los antígenos asociados a la enfermedad también se expresan en tejidos normales.

La presente invención utiliza secuencias de ácido nucleico que codifican receptores de antígenos quiméricos (CAR) para la expresión en células T con secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos que potencian el cebado de células T (ETP). Componentes de los CARs se describen con más detalle en esta memoria.

En la presente invención, un CAR descrito en esta memoria se utiliza para generar una célula T con actividad de cebado de células T potenciada.

Receptor de Antígeno Quimérico (CAR)

La presente invención utiliza una secuencia de ácido nucleico, p. ej., una construcción de ADN o ARN, que codifica un CAR, en donde el CAR comprende, además, un fragmento de anticuerpo que se une a un antígeno asociado a una enfermedad. En una realización, la secuencia que codifica el fragmento de anticuerpo es contigua y está en el mismo marco de lectura que una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio intracelular. El dominio intracelular comprende una región de señalización coestimuladora y/o una cadena zeta. La región de señalización coestimuladora se refiere a una porción del CAR que comprende el dominio intracelular de una molécula coestimuladora.

En una realización, la construcción CAR comprende una secuencia conductora opcional, un dominio de unión a antígeno extracelular, una bisagra, un dominio transmembrana y un dominio estimulador intracelular. En un aspecto, la construcción CAR comprende una secuencia conductora opcional, un dominio de unión a antígeno extracelular, una bisagra, un dominio transmembrana, un dominio coestimulador intracelular y un dominio estimulador intracelular.

Una secuencia conductora ejemplar se proporciona como SEQ ID NO: 2. Una secuencia de bisagra/espaciador ejemplar se proporciona como SEQ ID NO: 4, S<e>Q ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8. Una secuencia de un dominio transmembrana ejemplar se proporciona como SEQ ID NO: 12. Una secuencia ejemplar del dominio estimulador intracelular, p. ej., dominio coestimulador intracelular, de la proteína 4-1BB se proporciona como SEQ ID NO: 14. Otra secuencia ejemplar de un dominio estimulador intracelular, p. ej., dominio de señalización coestimulador, de la proteína CD27 se proporciona como SEQ ID NO: 16. Se proporciona una secuencia del dominio de CD3zeta de ejemplo como la SEQ ID NO: 18 o 20.

Dominios transmembrana ejemplares que pueden utilizarse en el CAR incluyen, pero no se limitan a un dominio transmembrana de la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, c D3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154 y similares.

Dominios intracelulares ejemplares que se pueden utilizar en el CAR incluyen, pero no se limitan a uno o más dominios de señalización intracelular que incluyen, pero no se limitan a, p. ej., CD3-zeta, CD28, 4-1BB y similares. En algunos casos, el CAR puede comprender cualquier combinación de CD3-zeta, CD28, 4-1BB y similares.

Dominios de señalización coestimuladores ejemplares que se pueden utilizar en el CAR incluyen, pero no se limitan a cualquier combinación de OX40, CD27, CD28, CD30, CD40, PD-1, CD2, CD7, CD258, NKG2C, B7-H3, un ligando que se une a CD83, ICAM-1, LFA-1 (CD1 1a/CD18), ICOS, 4-1BB (CD137) y similares.

Las secuencias de ácido nucleico que codifican las moléculas deseadas se pueden obtener utilizando métodos recombinantes conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, detectando colecciones de células que expresan el gen, derivando el gen de un vector que se sabe que lo incluye, o aislando directamente de células y tejidos que los contienen, utilizando técnicas estándares. Como alternativa, el gen de interés puede producirse sintéticamente, en lugar de clonarse.

La presente invención incluye una construcción de ARN que puede transfectarse o electroporarse directamente en una célula. Un método para generar ARNm para uso en la transfección implica la transcripción in vitro (IVT) de un molde con cebadores especialmente diseñados, seguida de la adición de poliA, para producir una construcción que contiene una secuencia no traducida ("UTR") 3' y 5', una secuencia de casquete 5' y/o Sitio Interno de Entrada al Ribosoma (IRES), el gen que se ha de expresar, y una cola poliA, típicamente de 50-2000 bases de longitud. El ARN así producido puede transfectar eficazmente diferentes tipos de células. En una realización, el molde incluye secuencias para el CAR.

Dominio de unión a antígenos

En una realización, el CAR de uso en la invención comprende un elemento de unión específico para la diana al que se alude de otro modo como un dominio de unión a antígeno. La elección del resto depende del tipo y número de ligandos que definen la superficie de una célula diana. Por ejemplo, el dominio de unión a antígenos se puede elegir para reconocer un ligando que actúa como un marcador de la superficie celular en las células diana asociadas con un estado patológico particular. Por lo tanto, ejemplos de marcadores de la superficie celular que pueden actuar como ligandos para el dominio del resto de antígeno en el CAR de uso en la invención incluyen los asociados con infecciones virales, bacterianas y parasitarias, enfermedades autoinmunitarias y células cancerosas.

En otra realización, la respuesta de células T mediada por CAR puede dirigirse a un antígeno de interés mediante la modificación por ingeniería genética de un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno deseado en el CAR.

La presente invención utiliza CAR que comprende un dominio de unión a antígeno en el CAR que es específico para un antígeno tumoral. Hay dos clases de antígenos tumorales a los que pueden fijar como objetivo los CARs de uso en la presente invención: (1 ) antígenos tumorales que se expresan en la superficie de células cancerosas; y (2) antígenos tumorales que en sí mismos son intracelulares, sin embargo, el MHC (complejo mayor de histocompatibilidad) presenta un fragmento de un antígeno de este tipo (péptido) en la superficie de las células cancerosas.

Por consiguiente, la presente invención utiliza CARs que fijan como objetivo los siguientes antígenos asociados al cáncer (antígenos tumorales): CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL-1 (CLECL1), CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, Tn Ag, PSMA, ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, Mesotelina, IL-11Ra, PSCA, VEGFR2, LewisY, CD24, PDGFR-beta, PRSS21, SSEA-4, CD20, receptor folato alfa, ERBB2 (Her2/neu), MUC1, EGFR, NCAM, Prostasa, PAP, ELF2M, Efrina B2, receptor IGF-I, CAIX, LMP2, gp100, bcr-abl, tirosinasa, EphA2, Fucosilo GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-acetil-GD2, receptor folato beta, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6 , TSHR, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, ácido plisiálico, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-1a, legumaina, HPV E6,E7, MAGE-A1, MAGE A1, ETV6-AML, proteína 17 del esperma, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, antígeno 1 relacionado con Fos, p53, p53 mutante, prosteína, survivina y telomerasa, PCTA-1/Galectina 8, MelanA/MART1, Ras mutante, hTERT, sarcoma puntos de interrupción de la translocación, ML-IAP, ERG (gen de fusión TMPRSS2 ETS), NA17, PAX3, receptor de andrógeno, Ciclina B1, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, telomerasa transcriptasa inversa humana, RU1, RU2, carboxil esterasa intestinal, mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5 e IGLL1.

La presente invención también utiliza un CAR que comprende un dominio de unión a antígeno que es específico para un antígeno viral o un antígeno bacteriano.

El dominio de unión a antígeno puede ser cualquier dominio que se una al antígeno, incluyendo, pero no limitados a dominios de unión a antígenos derivados de uno cualquiera o más de anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos recombinantes, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados y fragmentos de los mismos, incluyendo, pero no limitados a anticuerpos de dominio único, tales como un dominio variable de la cadena pesada (VH), un dominio variable de la cadena ligera (VL) y un dominio variable (VHH) de nanocuerpo derivado de camélido, y a armazones alternativos conocidos en la técnica que funcionan como dominios de unión a antígenos, tales como dominios de fibronectina recombinante, y similares. En algunos casos, es beneficioso que el dominio de unión a antígenos se derive de la misma especie en la que finalmente se utilizará el CAR. Por ejemplo, para su uso en seres humanos, puede ser beneficioso que el dominio de unión a antígenos del CAR comprenda residuos humanos o humanizados para el dominio de unión a antígeno de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Por lo tanto, en un aspecto, el dominio de unión a antígenos comprende un anticuerpo humanizado o un fragmento de anticuerpo.

En otras realizaciones, se humaniza un anticuerpo no humano, en que se modifican secuencias o regiones específicas del anticuerpo para aumentar la similitud con un anticuerpo producido de forma natural en un ser humano o un fragmento del mismo. En un aspecto, el dominio de unión al antígeno está humanizado.

Se puede producir un anticuerpo humanizado utilizando una diversidad de técnicas conocidas en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a injerto de CDR (véase, p. ej., la patente europea N° EP 239.400; la Publicación Internacional N° WO 91/09967; y las patentes de EE.UU. N° 5.225.539, 5.530.101 y 5.585.089), remodelación o acondicionamiento de superficie (véanse, por ejemplo, las patentes europeas N° EP 592.106 y EP 519.596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814; y Roguska et al., 1994, PNAS, 91:969-973), reordenamiento de cadenas (véase, p. ej., la patente de EE.UU. N° 5.565.332), y técnicas descritas, p. ej., en la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N° US2005/0042664, Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N° US2005/0048617, patente de EE.UU. N° 6.407.213, patente de EE.UU. N° 5.766.886, Publicación Internacional N° WO 9317105, Tan et al., 2002, J. Immunol., 169:1119-25; Caldas et al., 2000, Protein Eng., 13(5):353-60; Morea et al., 2000, Methods, 20:267-79; Baca et al., 1997, J. Biol. Chem., 272:10678-84; Roguska et al., 1996, Protein Eng., 9(10):895-904; Couto et al., 1995, Cancer Res., 55 :5973s-5977; Couto et al., 1995, Cancer Res., 55(8):1717-22; Sandhu 1994 Gene, 150(2):409-10; y Pedersen et al., 1994, J. Mol. Biol., 235(3):959-73. A menudo, los residuos de marco en las regiones de marco se sustituirán con el residuo correspondiente del anticuerpo donante de CDR para alterar, por ejemplo mejorar, la unión al antígeno. Estas sustituciones de marco conservado se identifican mediante métodos bien conocidos en la técnica, p. ej., modelando las interacciones de la CDR y los residuos de marco conservado para identificar residuos de marco conservado importantes para la unión a antígenos y comparación de secuencias para identificar residuos de marco conservado inusuales en posiciones particulares. (Véanse, por ejemplo, Queen et al., Pat. de EE.UU. N° 5.585.089; y Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323).

Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos que permanecen en él de una fuente que no es humana. A estos residuos de aminoácidos no humanos se les denomina a menudo residuos "importados", que típicamente se toman de un dominio variable "importado". Como se proporciona en esta memoria, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo humanizados comprenden una o más CDRs de moléculas de inmunoglobulina no humanas y regiones marco conservadas en donde los residuos de aminoácidos que comprenden el marco conservado proceden completa o principalmente de la línea germinal humana. Se conocen bien en la técnica múltiples técnicas para la humanización de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos y esencialmente se pueden realizar siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo CDRs o secuencias de CDR de roedor con las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano, es decir, CDR- injerto (documento EP 239.400; publicación PCT N° WO 91/09967; y patentes de EE.UU. N° 4.816.567; 6.331.415; 5.225.539; 5.530.101; 5.585.089; 6.548.640). En anticuerpos y fragmentos de anticuerpos quiméricos humanizados de este tipo, se ha sustituido sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto con la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de marco (FR) se sustituyen con residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores. La humanización de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos también se puede lograr mediante remodelación o acondicionamiento (documentos EP 592.106; EP 519.596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994); y Roguska et al., PNAS, 91:969-973 (1994)) o reordenamiento de cadenas (Patente de EE.UU. N° 5.565.332).

La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que se van a utilizar en la preparación de anticuerpos humanizados es para reducir la antigenicidad. Según el método denominado de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se rastrea frente a la biblioteca completa de secuencias conocidas de dominio variable humano. La secuencia humana más cercana a la del roedor se acepta entonces como el marco conservado (FR) humano para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Otro método usa un marco particular procedente de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. El mismo marco se puede utilizar para varios anticuerpos humanizados diferentes (véase, p. ej., Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)).

En determinadas realizaciones, la porción de la composición de CAR de uso en la invención que comprende un fragmento de anticuerpo se humaniza con retención de alta afinidad por el antígeno diana y otras propiedades biológicas favorables. De acuerdo con un aspecto de la invención, los anticuerpos y los fragmentos de anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias originales y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias originales y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina están disponibles habitualmente y los expertos en la técnica están familiarizados con ellos. Se encuentran disponibles programas informáticos que ilustran y muestran probables estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. La inspección de estas presentaciones permite el análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse al antígeno diana. De esta manera, los residuos de f R se pueden seleccionar y combinar a partir de las secuencias receptoras e importadas de modo que se consiga la característica deseada del anticuerpo o fragmento de anticuerpo, tal como una afinidad incrementada por el antígeno diana. En general, los residuos de CDR están directa y más sustancialmente implicados en influir en la unión al antígeno.

En otras realizaciones, los anticuerpos de uso en la invención pueden existir en una diversidad de otras formas, incluyendo, por ejemplo, Fv, Fab y (Fab')2, así como anticuerpos híbridos bifuncionales (es decir, biespecíficos) (p. ej., Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)). En un aspecto, el fragmento de anticuerpo proporcionado en esta memoria es un scFv. En algunos casos, un scFv humano también puede derivarse de una colección de visualización de levaduras.

En algunos casos, los scFvs pueden prepararse de acuerdo con un método conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Bird et al., (1988) Science 242:423-426 y Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Las moléculas de scFv se pueden producir enlazando regiones VH y VL utilizando enlazadores polipeptídicos flexibles. Las moléculas de scFv comprenden un enlazador polipeptídico flexible (p. ej., un enlazador Ser-Gly) con una longitud y/o composición de aminoácidos optimizada. La longitud del enlazador polipeptídico flexible puede afectar en gran medida cómo se pliegan e interactúan las regiones variables de un scFv. De hecho, si se emplea un enlazador de polipéptido corto (p. ej., entre 5-10 aminoácidos, se evita el plegamiento intercatenario. También se requiere plegamiento intercatenario para unir las dos regiones variables con el fin de formar un sitio de unión al epítopo funcional. Para ejemplos de orientación y tamaño del enlazador véanse, p. ej., Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448, Publicaciones de solicitudes de patente de EE.UU. N°s 2005/0100543, 2005/0175606, 2007/0014794 y publicaciones PCT N°s WO2006/020258 y WO2007/024715.

El scFv puede comprender una secuencia de enlazador polipeptídica de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más residuos de aminoácidos entre sus regiones VL y VH. La secuencia de enlazador polipeptídica flexible puede comprender cualquier aminoácido que se produzca de forma natural. En algunas realizaciones, la secuencia de enlazador polipeptídica flexible comprende los aminoácidos glicina y serina. En otra realización, la secuencia de enlazador polipeptídico flexible comprende conjuntos de repeticiones de glicina y serina tales como (Gly4Ser)n, en que n es un número entero positivo igual o mayor que 1. En una realización, los enlazadores polipeptídicos flexibles incluyen, pero son sin limitarse a (Gly4Ser)4 o (Gly4Ser)3. La variación en la longitud del enlazador polipeptídico flexible puede conservar o potenciar la actividad, dando lugar a una eficacia superior en los estudios de actividad.

En un aspecto, la presente invención contempla modificaciones de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo o fragmento inicial (p. ej., svFv) que generan moléculas funcionalmente equivalentes. Por ejemplo, la VH o VL de un scFv comprendido en el c Ar se puede modificar para conservar al menos aproximadamente el 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad de la región de marco VH o VL inicial del scFv. La presente invención también contempla modificaciones de la construcción CAR completa, p. ej., modificaciones en una o más secuencias de aminoácidos de los diversos dominios de la construcción CAR con el fin de generar moléculas funcionalmente equivalentes. La construcción de CAR se puede modificar para mantener una identidad de al menos aproximadamente un 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad de la construcción de CAR inicial.

Dominio transmembrana

Con respecto al dominio transmembrana, en diversas realizaciones, el CAR está diseñado para comprender un dominio transmembrana que está condensado al dominio extracelular del CAR. En una realización, el dominio transmembrana es uno que está asociado de forma natural con uno de los dominios en el CAR. En algunos casos, el dominio transmembrana puede seleccionarse o modificarse mediante sustitución de aminoácidos para evitar la unión de dominios de este tipo a los dominios transmembrana de proteínas de membrana de superficie iguales o diferentes para minimizar las interacciones con otros miembros del complejo receptor. En otra realización, el dominio transmembrana es capaz de homodimerización con otro CAR en la superficie de la célula T con CAR. En otra realización, la secuencia de aminoácidos del dominio transmembrana se puede modificar o sustituir para minimizar las interacciones con los dominios de unión del participante en la unión nativa presente en la misma célula T con CAR.

Un dominio transmembrana puede incluir uno o más aminoácidos adicionales adyacentes a la región transmembrana, p. ej., uno o más aminoácidos asociados con la región extracelular de la proteína de la que se derivó la transmembrana (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9, 10 hasta 15 aminoácidos de la región extracelular) y/o uno o más aminoácidos adicionales asociados con la región intracelular de la proteína de la que se deriva la proteína transmembrana (p. ej., 1, 2 , 3 , 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10 hasta 15 aminoácidos de la región intracelular). En un aspecto, el dominio transmembrana es uno que está asociado con uno de los otros dominios del CAR, p. ej., en una realización, el dominio transmembrana puede ser de la misma proteína de la que procede el dominio de señalización, el dominio coestimulante o el dominio bisagra. En otro aspecto, el dominio transmembrana no procede de la misma proteína de la que procede cualquier otro dominio del CAR. En algunos casos, el dominio transmembrana puede seleccionarse o modificarse mediante sustitución de aminoácidos para evitar la unión de dominios de este tipo a los dominios transmembrana de las proteínas de membrana de superficie iguales o diferentes, p. ej., para minimizar las interacciones con otros miembros del complejo receptor. En un aspecto, el dominio transmembrana tiene capacidad de homodimerización con otro CAR en la superficie celular de una célula que expresa CAR. En un aspecto diferente, la secuencia de aminoácidos del dominio transmembrana se puede modificar o sustituir para minimizar las interacciones con los dominios de unión del participante en la unión nativa presente en la misma célula que expresa CAR.

El dominio transmembrana puede proceder de una fuente natural o recombinante. En los casos en los que la fuente sea natural, el dominio puede derivarse de cualquier proteína transmembrana o unida a membrana. En una realización, la región transmembrana es capaz de enviar señales al o a los dominios intracelulares siempre que el CAR se haya unido a una diana. Regiones transmembrana de uso particular en esta invención pueden derivarse de (es decir, comprender al menos la(s) región(es) transmembrana de), pero sin limitarse a, p. ej., regiones seleccionadas de una cualquiera o más de, p. ej., cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, Cd 33, CD37, CD64, CD80, CD86, c D134, CD137, CD154. En algunas realizaciones, un dominio transmembrana puede incluir al menos la(s) región(regiones) transmembrana de, p. ej., KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6 , CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKG2D o NKG2C.

En algunos casos, también se puede emplear una diversidad de bisagras (también conocidas como "espaciadores"), p. ej., que incluyen, pero no se limitan a la bisagra de Ig (inmunoglobulina) humana (p. ej., una bisagra de IgG4, una bisagra de IgD), un enlazador GS (p. ej., un enlazador GS descrito en esta memoria), una bisagra KIR2DS2 o una bisagra CD8a. En un aspecto, la bisagra o espaciador es la secuencia de aminoácidos proporcionada como SEQ ID NO: 4. En un aspecto, el dominio transmembrana es un dominio transmembrana de la secuencia proporcionada como SEQ ID NO: 12.

En un aspecto, el dominio transmembrana puede ser recombinante, en cuyo caso comprenderá predominantemente residuos hidrófobos, tales como leucina y valina. En un aspecto, se encontrará un triplete de fenilalanina, triptófano y valina en cada uno de los extremos de un dominio transmembrana recombinante. Opcionalmente, un enlazador oligopeptídico o polipeptídico corto, de entre 2 y 10 aminoácidos de longitud, puede formar el enlace entre el dominio transmembrana y el dominio de señalización citoplásmico del CAR. Un doblete de glicina-serina proporciona un enlazador particularmente adecuado, p. ej., GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 35). En algunas realizaciones, el enlazador está codificado por una secuencia de nucleótidos de GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC (SEQ ID NO: 36). Otros enlazadores adecuados se pueden encontrar en la Tabla 2.

En un aspecto, la bisagra o espaciador comprende una bisagra KIR2DS2.

Dominio citoplasmático

El dominio citoplasmático o dominio de señalización intracelular del CAR de uso en la invención es el responsable de la activación de al menos una de las funciones efectoras normales de la célula inmunitaria en la que se ha colocado el CAR. La expresión "función efectora" se refiere a una función especializada de una célula. La función efectora de una célula T, por ejemplo, puede ser una actividad citolítica o una actividad auxiliar, incluyendo la secreción de citoquinas. Por lo tanto, la expresión "dominio de señalización intracelular" se refiere a la porción de una proteína que transduce la señal de la función efectora y dirige a la célula para realizar una función especializada. Aunque habitualmente se puede emplear todo el dominio de señalización intracelular, en muchos casos no es necesario usar la cadena completa. En la medida en que se use una porción truncada del dominio de señalización intracelular, dicha porción truncada puede usarse en lugar de la cadena intacta, siempre que transduzca la señal de la función efectora. Por lo tanto, la expresión dominio de señalización intracelular pretende incluir cualquier porción truncada del dominio de señalización intracelular suficiente para transducir la señal de la función efectora.

Ejemplos de dominios de señalización intracelular para uso en el CAR de uso en la invención incluyen las secuencias citoplasmáticas del receptor de células T (TCR, por sus siglas en inglés) y co-receptores que actúan en concierto para iniciar la transducción de señales después de la interacción con el receptor de antígeno, así como cualquier derivado o variante de estas secuencias y cualquier secuencia recombinante que tenga la misma capacidad funcional.

Se sabe que las señales generadas a través del TCR solo son insuficientes para la activación completa de la célula T y que también se requiere una señal secundaria y/o coestimuladora. Por lo tanto, se puede decir que la activación de las células T está mediada por dos clases distintas de secuencias de señalización citoplasmática: aquellas que inician la activación primaria dependiente de antígeno a través del TCR (secuencias de señalización citoplasmáticas primarias) y aquellas que actúan de manera independiente del antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimuladora (secuencias de señalización citoplásmica secundaria).

Las secuencias de señalización citoplasmáticas primarias regulan la activación primaria del complejo TCR de forma estimuladora o inhibidora. Secuencias de señalización citoplasmática primaria que actúan de manera estimuladora pueden contener motivos de señalización que se conocen como motivos de activación basados en tirosina de inmunorreceptores o ITAMs.

Ejemplos de ITAM que contienen dominios de señalización citoplasmática que son de uso particular en la invención incluyen los derivados de CD3 zeta, FcR gamma común (FCER1G), Fc gamma RIIa, FcR beta (Fc Epsilon R1b), CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CD79a, CD79b, DAP10 y DAP12. En una realización, un CAR de uso en la invención comprende un dominio de señalización intracelular, p. ej., un dominio de señalización primario de CD3-zeta.

En un aspecto, el dominio citoplasmático del CAR está diseñado para comprender el dominio de señalización CD3-zeta por sí mismo o combinado con cualquier otro dominio o dominios citoplasmáticos deseados útiles en el contexto del CAR de uso en la invención. Por ejemplo, el dominio citoplásmico del CAR puede comprender una porción de la cadena CD3 zeta y una región de señalización coestimuladora. La región de señalización coestimuladora se refiere a una porción del CAR que comprende el dominio intracelular de una molécula coestimuladora. Una molécula coestimuladora es una molécula de la superficie celular distinta que no es un receptor de antígeno o sus ligandos que se requiere para una respuesta eficaz de los linfocitos frente a un antígeno. Los ejemplos de tales moléculas incluyen CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno asociado a la función linfocítica-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, y un ligando que se une específicamente a CD83, y similares. Ejemplos adicionales de moléculas coestimuladoras de este tipo incluyen CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, La T, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, y un ligando que se une específicamente con CD83.

Las secuencias de señalización citoplasmática dentro de la porción de señalización citoplasmática del CAR de uso en la invención pueden enlazarse entre sí en un orden aleatorio o específico. Opcionalmente, un enlazador oligopeptídico o polipeptídico corto, por ejemplo, de entre 2 y 10 aminoácidos de longitud, puede formar el enlace. Un doblete de glicinaserina proporciona un enlazador particularmente adecuado. En la Tabla 2 se enumeran enlazadores de glicina-serina ejemplares, p. ej., SEQ ID NOs: 22, 24, 25, 26 o 27.

En un aspecto, el dominio citoplasmático está diseñado para comprender el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de CD28. En un aspecto, el dominio citoplasmático está diseñado para comprender el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de 4-1BB. En un aspecto, el dominio de señalización de 4-1BB es un dominio de señalización recogido en SEQ ID NO: 14. En un aspecto, el dominio de señalización de CD3-zeta es un dominio de señalización recogido en SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 20.

Receptores de antígenos quiméricos regulables

En algunas realizaciones, un CAR regulable (RCAR) en el que la actividad CAR se puede controlar es deseable para optimizar la seguridad y eficacia de una terapia con CAR. Se puede utilizar un RCAR en sustitución de un CAR en cualquiera de las realizaciones descritas en esta memoria.

Hay muchas maneras en que se pueden regular las actividades del CAR. Por ejemplo, la apoptosis inducible utilizando, p. ej., una caspasa fusionada con un dominio de dimerización (véase, p. ej., Di et al., N Egnl. J. Med. 3 de noviembre de 2011; 365 (18): 1673-1683), se puede utilizar como un interruptor de seguridad en la terapia con CAR de la presente invención. En un aspecto, un RCAR comprende un conjunto de polipéptidos, normalmente dos en las realizaciones más simples, en los que los componentes de un CAR estándar descrito en el presente documento, p. ej., un dominio de unión al antígeno y un dominio de señalización intracelular, se reparten en polipéptidos o miembros separados. En algunas realizaciones, el conjunto de polipéptidos incluye un conmutador de la dimerización que, tras la presencia de una molécula de dimerización, puede acoplar los polipéptidos entre sí, p. ej., puede acoplar un dominio de unión al antígeno a un dominio de señalización intracelular.

En un aspecto, un RCAR comprende dos polipéptidos o miembros: 1) un miembro de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización intracelular, p. ej., un dominio de señalización intracelular primario descrito en esta memoria, y un primer dominio de tipo interruptor; 2) un miembro de unión a antígeno que comprende un dominio de unión a antígeno, p. ej., que fija como objetivo un antígeno tumoral, como se describe en esta memoria, y un segundo dominio de tipo interruptor. Opcionalmente, el RCAR comprende un dominio transmembrana descrito en esta memoria. En una realización, se puede disponer un dominio transmembrana en el miembro de señalización intracelular o el miembro de unión a antígenos, o en ambos. (A menos que se indique lo contrario, cuando se describen en esta memoria miembros o elementos de un RCAR, el orden puede ser según se proporciona, pero también se incluyen otros órdenes. Dicho de otra manera, en una realización el orden es como se expone en el texto, pero en otras realizaciones el orden puede ser diferente. P. ej., el orden de los elementos en un lado de la región transmembrana puede ser diferente del ejemplo, p. ej., la ubicación de un dominio de tipo interruptor respecto a un dominio de señalización intracelular puede ser diferente, p. ej., invertido).

En una realización, el primer y segundo dominios de tipo interruptor pueden formar un interruptor de dimerización intracelular o extracelular. En una realización, el interruptor de dimerización puede ser un interruptor de homodimerización, p. ej., donde el primer y segundo dominio de tipo interruptor son idénticos, o un interruptor de heterodimerización, p. ej., donde el primer y segundo dominios de tipo interruptor son diferentes entre sí.

En algunas realizaciones, un RCAR puede comprender un "multiinterruptor". Un multiinterruptor puede comprender dominios de tipo interruptor de heterodimerización o dominios de tipo interruptor de homodimerización. Un multiinterruptor comprende una pluralidad de, p. ej., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, dominios de tipo interruptor, independientemente, en un primer miembro, p. ej., un miembro de unión a antígenos, y un segundo miembro, p. ej., un miembro de señalización intracelular. En una realización, el primer miembro puede comprender una pluralidad de primeros dominios de tipo interruptor, p. ej., dominios de tipo interruptor basados en FKBP, y el segundo miembro puede comprender una pluralidad de segundos dominios de tipo interruptor, p. ej., dominios de tipo interruptor basados en FRB. En una realización, el primer miembro puede comprender un primer y un segundo dominio de tipo interruptor, p. ej., un dominio de tipo interruptor basado en FKBP y un dominio de tipo interruptor basado en FRB, y el segundo miembro puede comprender un primer y un segundo dominio de tipo interruptor, p. ej., un dominio de tipo interruptor basado en FKBP y un dominio de tipo interruptor basado en FRB.

En una realización, el miembro de señalización intracelular comprende uno o más dominios de señalización intracelular, p. ej., un dominio de señalización intracelular primaria y uno o más dominios de señalización coestimulantes.

En una realización, el miembro de unión a antígenos puede comprender uno o más dominios de señalización intracelular, p. ej., uno o más dominios de señalización coestimulantes. En una realización, el miembro de unión a antígenos comprende una pluralidad, p. ej., 2 o 3 dominios de señalización coestimulantes descritos en esta memoria, p. ej., seleccionados entre 41BB, CD28, CD27, ICOS y OX40, y, en algunas realizaciones, ningún dominio de señalización intracelular primario. En una realización, el miembro de unión a antígenos comprende los siguientes dominios de señalización coestimulantes, desde la dirección extracelular a la intracelular: 41BB-CD27; 41BB-CD27; CD27-41BB; 41BB-CD28; CD28-41BB; OX40-CD28; CD28-OX40; CD28-41BB; o 41BB-CD28. En tales realizaciones, el miembro de unión intracelular comprende un dominio CD3zeta. En una realización de este tipo, el RCAR comprende (1) un miembro de unión a antígenos que comprende un dominio de unión a antígenos, un dominio transmembrana y dos dominios coestimulantes y un primer dominio de tipo interruptor; y (2) un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio transmembrana o dominio de fijación a la membrana y al menos un dominio de señalización intracelular primario, y un segundo dominio de tipo interruptor.

Una realización utiliza RCARs en los que el miembro de unión al antígeno no está unido a la superficie de la célula CAR. Esto permite que una célula que tiene un miembro de señalización intracelular se empareje convenientemente con uno o más dominios de unión a antígenos, sin transformar la célula con una secuencia que codifica el miembro de unión a antígenos. En tales realizaciones, el RCAR comprende: 1) un miembro de señalización intracelular que comprende: un primer dominio de tipo interruptor, un dominio transmembrana, un dominio de señalización intracelular, p. ej., un dominio de señalización intracelular primario

y un primer dominio de tipo interruptor; y 2) un miembro de unión a antígeno que comprende: un dominio de unión a antígeno y un segundo dominio de tipo interruptor, en el que el miembro de unión a antígeno no comprende un dominio transmembrana o un dominio de unión a membrana y, opcionalmente, no comprende un dominio de señalización intracelular. En algunas realizaciones, el RCAR puede comprender además 3) un segundo miembro de unión a antígenos que comprende: un segundo dominio de unión a antígenos, p. ej., un segundo dominio de unión a antígenos que se une a un antígeno diferente del que se une al dominio de unión a antígenos; y un segundo dominio de tipo interruptor.

También se proporcionan en esta memoria RCARs en donde el miembro de unión a antígenos comprende capacidad de activación y direccionamiento biespecíficas. En esta realización, el miembro de unión a antígenos puede comprender una pluralidad, p. ej., 2, 3, 4 o 5 dominios de unión a antígenos, p. ej., scFvs, en donde cada dominio de unión a antígenos se une a un antígeno diana, p. ej., antígenos diferentes o el mismo antígeno, p. ej., el mismo o diferentes epítopos en el mismo antígeno. En una realización, la pluralidad de dominios de unión a antígenos están en tándem y, opcionalmente, se dispone un enlazador o región de bisagra entre cada uno de los dominios de unión a antígenos. En esta memoria se describen enlazadores y regiones de bisagra adecuados.

Una realización utiliza RCARs que tienen una configuración que permite la conmutación de proliferación. En esta realización, el RCAR comprende: 1) un miembro de señalización intracelular que comprende: opcionalmente, un dominio transmembrana o dominio de fijación a la membrana; uno o más dominios de señalización coestimulantes, p. ej., seleccionados entre 41BB, CD28, CD27, ICOS y OX40, y un dominio de tipo interruptor; y 2) un miembro de unión a antígenos que comprende: un dominio de unión a antígenos, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular primario, p. ej., un dominio de CD3zeta, en donde el miembro de unión a antígenos no comprende un dominio de tipo interruptor o no comprende un dominio de tipo interruptor que dimeriza con un dominio de tipo interruptor en el miembro de señalización intracelular. En una realización, el miembro de unión a antígenos no comprende un dominio de señalización coestimulante. En una realización, el miembro de señalización intracelular comprende un dominio de tipo interruptor de un interruptor de homodimerización. En una realización, el miembro de señalización intracelular comprende un primer dominio de tipo interruptor de un interruptor de heterodimerización y el RCAR comprende un segundo miembro de señalización intracelular que comprende un segundo dominio de tipo interruptor del interruptor de heterodimerización. En tales realizaciones, el segundo miembro de señalización intracelular comprende los mismos dominios de señalización intracelular que el miembro de señalización intracelular. En una realización, el interruptor de dimerización es intracelular. En una realización, el interruptor de dimerización es extracelular.

En cualquiera de las configuraciones RCAR descritas aquí, el primer y segundo dominios de tipo interruptor comprenden un interruptor basado en FKBP-FRB como se describe en esta memoria.

También se proporcionan en esta memoria células que comprenden un RCAR descrito en esta memoria. Como célula RCARX se puede utilizar cualquier célula que se haya modificado para expresar un RCAR. En una realización, la célula RCARX es un célula T y se denomina célula T-RCAR. En una realización, la célula RCARX es un célula NK y se denomina célula N-RCAR.

También se proporcionan en esta memoria ácidos nucleicos y vectores que comprenden secuencias que codifican RCAR. Las secuencias que codifican diversos elementos de un RCAR se pueden disponer en la misma molécula de ácido nucleico, p. ej., el mismo plásmido o vector, p. ej., vector vírico, p. ej., vector lentivírico. En una realización, (i) una secuencia que codifica un miembro de unión a antígenos y (ii) una secuencia que codifica un miembro de señalización intracelular pueden estar presentes en el mismo ácido nucleico, p. ej., vector. La producción de las correspondientes proteínas se puede lograr, p. ej., mediante el uso de promotores separados o mediante el uso de un producto de transcripción bicistrónico (que puede dar lugar a la producción de dos proteínas mediante la escisión de un único producto de traducción o mediante la traducción de dos productos proteicos separados). En una realización, se dispone entre (i) y (ii) una secuencia que codifica un péptido escindible, p. ej., secuencia P2A o F2A. En una realización, se dispone entre (i) y (ii) una secuencia que codifica un IRES, p. ej., un Em Cv o EV71 IRES. En estas realizaciones, (i) y (ii) se transcriben como un ARN único. En una realización, un primer promotor está ligado operativamente a (i) y un segundo promotor está ligado operativamente a (ii), de modo que (i) y (ii) se transcriben como ARNm separados.

Como alternativa, la secuencia que codifica diversos elementos de un RCAR se puede disponer en las diferentes moléculas de ácido nucleico, p. ej., diferentes plásmidos o vectores, p. ej., vector vírico, p. ej., vector lentivírico. P. ej., la (i) secuencia que codifica un miembro de unión a antígenos puede estar presente en un primer ácido nucleico, p. ej., un primer vector, y la (ii) secuencia que codifica un miembro de señalización intracelular puede estar presente en el segundo ácido nucleico, p. ej., el segundo vector.

Interruptores de dimerización

Los interruptores de dimerización pueden ser no covalentes o covalentes. En un interruptor de dimerización no covalente, la molécula de dimerización promueve una interacción no covalente entre los dominios de tipo interruptor. En un interruptor de dimerización covalente, la molécula de dimerización promueve una interacción covalente entre los dominios de tipo interruptor.

En una realización, el RCAR comprende un interruptor de dimerización basado en FKBP/FRB o FKBP/FRAP. FKBP12 (FKBP o proteína de unión a FK506) es una proteína citoplasmática abundante que actúa como la diana intracelular inicial para el fármaco inmunosupresor de tipo producto natural rapamicina. La rapamicina se une a FKBP y al homólogo de PI3K grande FRAP (RAFT, mTOR). FRB es una porción de 93 aminoácidos de FRAP que es suficiente para unirse al complejo FKBP-rapamicina (Chen, J., Zheng, X. F., Brown, E. J. y Schreiber, S. L. (1995) Identification of an 11-kDa FKBP12-rapamycin-binding domain within the 289-kDa FKBP12-rapamycin-associated protein and characterization of a critical serine residue. Proc Natl Acad Sci USA 92: 4947-51.)

En algunas realizaciones, un interruptor basado en FKBP/FRAP, p. ej., FKBP/FRB, puede usar una molécula de dimerización, p. ej., rapamicina o un análogo de rapamicina.

La secuencia de aminoácidos de FKBP es la siguiente:

En algunas realizaciones, un dominio de tipo interruptor FKBP puede comprender un fragmento de FKBP que tiene la capacidad de unirse a FRB, o un fragmento o análogo de este, en presencia de rapamicina o un rapálogo, p. ej., la porción subrayada de la SEQ ID NO: 37, que es:

V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K F D S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L T I S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H A T L V F D V E L L K L E T S (SEQ ID N O :38)

La secuencia de aminoácidos de FRB es la siguiente:

ILWHEMWHEG LEEASRLYFG ERNVKGMFEV LEPLHAMMER GPQTLKETSF NQAYGRDLME AQEWCRKYMK SGNVKDLTQA WDLYYHVFRR ISK (SEQ ID NO: 39 )

"Interruptor basado en FKBP/FRAP, p. ej., FKBP/FRB", tal como se utiliza la expresión en el presente documento, se refiere a un interruptor de dimerización que comprende: un primer dominio de tipo interruptor, que comprende un fragmento de FKBP o un análogo de este que tiene la capacidad de unirse a FRB, o un fragmento o análogo de este, en presencia de rapamicina o un rapálogo, p. ej., RAD001, y que tiene al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad respecto a, o difiere en como máximo 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos aminoacídicos de, la secuencia FKBP de la SEQ ID NO: 18 o 19; y un segundo dominio de tipo interruptor, que comprende un fragmento de FRB o un análogo de este que tiene la capacidad de unirse a FRB, o un fragmento o análogo de este, en presencia de rapamicina o un rapálogo, y que tiene al al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad respecto a, o difiere en como máximo 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos aminoacídicos de, la secuencia FRB de la SEQ ID NO: 20. En una realización, un RCAR descrito en el presente documento comprende un dominio de tipo interruptor que comprende residuos aminoacídicos divulgados en la SEQ ID NO: 37 (o la SEQ ID NO: 38) y un dominio de tipo interruptor comprende residuos aminoacídicos divulgados en la SEQ ID NO: 39.

En algunas realizaciones, el interruptor de dimerización FKBP/FRB comprende un dominio de tipo interruptor FRB modificado que muestra una formación de complejo alterada, p. ej., potenciada, entre un dominio de tipo interruptor basado en FRB, p. ej., el dominio de tipo interruptor FRB modificado, un dominio de tipo interruptor basado en FKBP y la molécula de dimerización, p. ej., rapamicina o un rapálogo, p. ej., RAD001. En una realización, el dominio de tipo interruptor FRB modificado comprende una o más mutaciones, p. ej., 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10 o más, seleccionadas entre mutaciones en la posición o las posiciones aminoacídicas L2031, E2ü32,<s>2035, R2036, F2039, G2040, T2098, W2101, D2102, Y2105 y F2108, donde el aminoácido de tipo natural está mutado a cualquier otro aminoácido de origen natural. En una realización, un FRB mutante comprende una mutación en E2032, donde E2032 se muta a fenilalanina (E2032F), metionina (E2032M), arginina (E2032R), valina (E2032V), tirosina (E2032Y), isoleucina (E2032I), p. ej., la SEQ ID NO: 40, o leucina (E2032L), p. ej., la SEQ ID NO: 41. En una realización, un FRB mutante comprende una mutación en T2098, donde T2098 se muta a fenilalanina (T2098F) o leucina (T2098L), p. ej., la SEQ ID NO: 42. En una realización, un FRB mutante comprende una mutación en E2032 y en T2098, donde E2032 se muta a cualquier aminoácido, y donde T2098 se muta a cualquier aminoácido, p. ej., la SEQ ID NO: 43. En una realización, un FRB mutante comprende una mutación E2032I y una T2098L, p. ej., la SEQ ID NO: 44. En una realización, un FRB mutante comprende una mutación E2032L y una T2098L, p. ej., la SEQ ID NO: 45.

Tabla 1. FRB mutante de eemplo que tiene una ma or afinidad por una molécula de dimerización.

Otros interruptores de dimerización adecuados incluyen un interruptor de dimerización basado en GyrB-GyrB, un interruptor de dimerización basado en giberelina, un interruptor de dimerización de etiqueta/aglutinante y un interruptor de dimerización de etiqueta de halo/etiqueta instantánea. Siguiendo las directrices que se proporcionan en esta memoria, tales interruptores y moléculas de dimerización relevantes serán evidentes para un experto en la técnica.

Molécula de dimerización

La asociación entre los dominios de tipo interruptor está fomentada por la molécula de dimerización. En presencia de la molécula de dimerización la interacción o asociación entre dominios de tipo interruptor permite la transducción de señales entre un polipéptido asociado con, p. ej., fusionado con, un primer dominio de tipo interruptor, y un polipéptido asociado con, p. ej., fusionado con, un segundo dominio de tipo interruptor. En presencia de niveles no limitantes de la molécula de dimerización la transducción de señales aumenta en 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 5, 10, 50, 100 veces, p. ej., según se mide en un sistema descrito en esta memoria.

Se pueden utilizar rapamicina y análogos de rapamicina (denominados a veces rapálogos), p. ej., RAD001, como moléculas de dimerización en un interruptor de dimerización basado en FKBP/FRB descrito en esta memoria. En una realización, la molécula de dimerización se puede seleccionar de rapamicina (sirolimus), RAD001 (everolimus), zotarolimus, temsirolimus, AP-23573 (ridaforolimus), biolimus, simapimo, XI,765, AP21967 y análogos o derivados de los mismos.

Potenciadores del cebado de células T (ETPs)

La presente invención también proporciona ácidos nucleicos, p. ej., construcciones de ADN o ARN, que codifican ETPs para el suministro conjunto con ácidos nucleicos, p. ej., construcciones de ADN o ARN, que codifican CARs. Los ETPs de uso en la invención potencian la presentación del antígeno de las células T que expresan CAR y las actividades de cebado de las células T, lo que conduce a efectos anti-enfermedad potenciados. En el contexto del cáncer, sin estar limitado por teoría alguna, se cree que el suministro conjunto de ETP, p. ej., ADNs de ETP o ARNs de ETP, con CAR, p. ej., ARN de CAR o ETP de CAR en una célula T potencia la actividad antitumoral al aumentar la capacidad de las células T de funcionar como células presentadoras de antígenos y células T primarias, además de la capacidad de destrucción de células mediada por CAR. Esto permite el cebado mediado por células T de células T reactivas a tumores no modificadas por ingeniería genética, que pueden persistir como supresores de tumores una vez que la expresión de CAR por células T con ETP-CAR adoptivas, p. ej., células T con ARN de ETP-CAR, ha disminuido, creando una transición transitoria. terapia con efectos anticancerígenos permanentes, p. ej., efectos antitumorales.

Un ETP puede ser una molécula coestimuladora. Moléculas coestimuladoras ejemplares incluyen, pero no se limitan a CD70, CD83, CD80, CD86, CD40, CD154, CD137L (4-1BBL), CD252 (OX40L), CD275 (ICOS-L), CD54 (ICAM-1), CD49a, CD43, CD48, CD112 (PVRL2), CD150 (SLAM), CD155 (PVR), CD265 (RANK), CD270 (HVEM), TL1A, CD127, IL-4R, GITR-L, CD160, CD258, TIM-4, CD153 (CD30L), CD200R (OX2R), CD44, ligandos de los mismos y fragmentos funcionales y variantes de los mismos. La invención utiliza un ETP seleccionado del grupo que consiste en CD70, CD86 y CD252, y fragmentos funcionales y variantes de CD70, CD86 y CD252 que conservan la capacidad de potenciar el cebado de células T. Los casos de la divulgación que no utilizan un ETP de este tipo no están abarcados por la redacción de las reivindicaciones, aunque se consideran útiles para comprender la invención.

En una realización, el ETP comprende una secuencia de aminoácidos de CD70 (p. ej., N° de Acceso de GenBank NP_001243.1) o una secuencia de ácido nucleico de CD70 (p. ej., N° de Acceso de GenBank NM_001252.4). En un caso de la divulgación, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de CD83 (p. ej., N° de Acceso de GenBank AAH30830.1) o una secuencia de ácido nucleico de CD83 (p. ej., N° de Acceso de GenBank BC030830.1). En un caso, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de c D80 (p. ej., N° de Acceso de GenBank AAH42665.1) o una secuencia de ácido nucleico de CD80 (p. ej., N° de Acceso de GenBank BC042655.1). En una realización, el ETP comprende una secuencia de aminoácidos de CD86 (p. ej., N° de Acceso de GenBank AAB03814.1) o una secuencia de ácido nucleico de CD86 (p. ej., N° de Acceso de GenBank U04343.1). En un caso, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de CD40 (p. ej., N° de Acceso de GenBank AAH64518.1, AAH12419.1) o una secuencia de ácido nucleico de CD40 (p. ej., N° de Acceso de GenBank BC064518.1 o BC012419.1). En un caso, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de CD154 (p. ej., N° de Acceso de GenBank NP_000065.1 o AAH74950.1) o una secuencia de ácido nucleico de CD154 (p. ej., N° de Acceso de GenBank NM_000074.2 o BC074950.2). En un caso, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de CD137L (4-1BBL) (p. ej., N° de Acceso de GenBank NP_003802.1) o una secuencia de ácido nucleico de CD137L (4-1BBL) (p. ej., N° de Acceso de GenBank NM_003811.3). En una realización, el ETP comprende una secuencia de aminoácidos de CD252 (OX40L) (p. ej., N° de Acceso de GenBank AAH41663.1) o una secuencia de ácido nucleico de CD252 (OX40L) (p. ej., N° de Acceso de GenBank BC041663.1). En un caso, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de CD275 (ICOSL) (p. ej., N° de Acceso de GenBank AAH20674.1) o una secuencia de ácido nucleico de CD275 (ICOSL) (p. ej., N° de Acceso de GenBank BC020674.1). En un caso, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de CD54 (ICAM-1) (p. ej., N° de Acceso de GenBank AAP35500.1 o CAA41977.1) o una secuencia de ácido nucleico de CD54 (ICa M-1) (p. ej., N° de Acceso de GenBank BT006854.1 o X59286.1). En un caso, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de CD49a (p. ej., N° de Acceso de GenBank No.AAI37123.1) o una secuencia de ácido nucleico de CD49a (p. ej., N° de Acceso de GenBank BC137122.1). En una realización, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de CD43 (p. ej., N° de Acceso de GenBank NP_001025459.1 o AAB20910.1) o una secuencia de ácido nucleico de CD43 (p. ej., N° de Acceso de GenBank NM_001030288.2 o AAB20910.1). En un caso, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de CD48 (p. ej., N° de Acceso de GenBank CAG33293.1) o una secuencia de ácido nucleico de CD48 (p. ej., N° de Acceso de GenBank CR457012.1). En un caso, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de CD112 (PVRL2) (p. ej., N° de Acceso de GenBank CAG33099.1) o una secuencia de ácido nucleico de CD112 (PVRL2) (p. ej., N° de Acceso de GenBank CR456818.1). En un caso, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de CD150 (SLAM) (p. ej., N° de Acceso de GenBank NP_003028.1) o una secuencia de ácido nucleico de CD150 (SLAM) (p. ej., N° de Acceso de GenBank NM_003037.3). En un caso, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de CD155 (PVR) (p. ej., N° de Acceso de GenBank NP_006496.4) o una secuencia de ácido nucleico de CD155 (PVR) (p. ej., N° de Acceso de GenBank NM_006505.4). En un caso, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de CD265 (RANK) (p. ej., N° de Acceso de GenBank Q9Y6Q6.1) o una secuencia de ácido nucleico de CD265 (RANK) (p. ej., N° de Acceso de GenBank AF018253.1). En un caso, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de CD270 (HVEM) (p. ej., N° de Acceso de GenBank<c>A<g>33190.1 o AAH29848.1) o una secuencia de ácido nucleico de CD270 (H<v>EM) (p. ej., N° de Acceso de GenBank CR456909.1 o BC029848.1). En un caso, un ETP comprende una

secuencia de aminoácidos de TL1A (p. ej., N° de Acceso de GenBank AAI04464.1) o una secuencia de ácido nucleico de TL1A (p. ej., N° de Acceso de GenBank BC104463.1). En un caso, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de CD127 (p. ej., N° de Acceso de GenBank AAH69999.1) o una secuencia de ácido nucleico de CD127 (p. ej., N° de Acceso de GenBank BC069999.1). En un caso, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de GITR-L (p. ej., N° de Acceso de GenBank AAQ89227.1) o una secuencia de ácido nucleico de GITR-L (p. ej., N° de Acceso de GenBank AY358868.1). En un caso, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de CD160 (p. ej., N° de Acceso de GenBank CAG46665.1) o una secuencia de ácido nucleico de CD160 (p. ej., N° de Acceso de GenBank CR541867.1). En un caso, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de CD258 (p. ej., N° de Acceso de GenBank NP_742011.2) o una secuencia de ácido nucleico de CD258 (p. ej., N° de Acceso de GenBank NM_172014.2). En un caso, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de TIM-4 (p. ej., N° de Acceso de GenBank AFO66594.1) o una secuencia de ácido nucleico de TIM-4 (p. ej., N° de Acceso de GenBank No.JX049980.1). En un caso, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de CD153 (CD30L) (p. ej., N° de Acceso de GenBank AAI11940.1) o una secuencia de ácido nucleico de CD153 (CD30L) (p. ej., N° de Acceso de GenBank No.BC111939.1). En una realización, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de CD200R (OX2R) (p. ej., N° de Acceso de GenBank AAI43394.1) o una secuencia de ácido nucleico de CD200R (OX2R) (p. ej., N° de Acceso de GenBank BC143393.1). En un caso, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de CD44 (p. ej., N° de Acceso de GenBank ACI46596.1) o una secuencia de ácido nucleico de CD44 (p. ej., N° de Acceso de GenBank FJ21664.1).

Un ETP puede ser una citoquina soluble. Citoquinas solubles ejemplares incluyen, pero no se limitan a IL-2, IL-12, IL-6 , IL-7, IL-15, IL-18, IL-21, GM-CSF, IL-18, IL-21 e IL-27, y fragmentos funcionales y variantes de los mismos.

En un caso de la divulgación, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de interleuquina 2 (IL-2) (p. ej., N° de Acceso de GenBank AAB46833.1) o una secuencia de ácido nucleico de IL-2 (p. ej., N° de Acceso de GenBank S82692.1). En un caso, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de interleuquina12 (IL-12) (p. ej., N° de Acceso de GenBank AAD16432.1) o una secuencia de ácido nucleico de IL-12 (p. ej., N° de Acceso de GenBank AF101062.1). En un caso, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de interleuquina 6 (IL-6) (p. ej., N° de Acceso de GenBank AAD13886.1 o NP_000591.1) o una secuencia de ácido nucleico de IL-6 (p. ej., N° de Acceso de GenBank S56892.1 o NM_000600.3). En un caso, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de interleuquina 7 (IL-7) (p. ej., N° de Acceso de GenBank AAH47698.1 o NP_000871.1) o una secuencia de ácido nucleico de IL-7 (p. ej., N° de Acceso de GenBank BC047698.1 o NM_000880.3). En un caso, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de interleuquina15 (IL-15) (p. ej., N° de Acceso de GenBank AAU21241.1) o una secuencia de ácido nucleico de IL-15 (p. ej., N° de Acceso de GenBank AY720442.1). En un caso, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de interleuquina18 (IL-18) (p. ej., N° de Acceso de GenBank AAK95950.1) o una secuencia de ácido nucleico de IL-18 (p. ej., N° de Acceso de GenBank AY044641.1). En un caso, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de interleuquina 21 (IL-21) (p. ej., N° de Acceso de GenBank AAG29348.1) o una secuencia de ácido nucleico de IL-21 (p. ej., N° de Acceso de GenBank AF254069.1). En un caso, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de GM-CSF (p. ej., N° de Acceso de GenBank AAA52578.1) o una secuencia de ácido nucleico de GM-CSF (p. ej., N° de Acceso de GenBank M11220.1).

Un ETP puede ser un polipéptido implicado en la presentación de antígenos. Polipéptidos ejemplares implicados en la presentación de antígenos incluyen, pero no se limitan a CD64, MHC I y MHC II, y fragmentos funcionales y variantes de los mismos.

En un caso de la divulgación, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de CD64 (p. ej., N° de Acceso de GenBank AAI52384.1) o una secuencia de ácido nucleico de CD64 (p. ej., N° de Acceso de GenBank BC152383.1). En un caso, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de MHCI (p. ej., N° de Acceso de GenBank AAH40479.1) o una secuencia de ácido nucleico de MHCI (p. ej., N° de Acceso de GenBank BC040479.1).

Un ETP puede ser un polipéptido implicado en el tráfico/la migración. Polipéptidos ejemplares implicado en el tráfico y/o la migración incluyen, pero no se limitan a CD183, CCR2, CCR6, CD50, CD197, Cd 58, Cd 62L y fragmentos funcionales y variantes de los mismos.

En un caso de la divulgación, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de CD183 (p. ej., N° de Acceso de GenBank AAH34403.1) o una secuencia de ácido nucleico de CD183 (p. ej., N° de Acceso de GenBank BC034403.1). En un caso, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de CCR2 (p. ej., N° de Acceso de GenBank AAH95540.1) o una secuencia de ácido nucleico de CCR2 (p. ej., N° de Acceso de GenBank BC095540.1). En un caso, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de CCR6 (p. ej., N° de Acceso de GenBank NP_113597.2) o una secuencia de ácido nucleico de CCR6 (p. ej., N° de Acceso de GenBank NM_031409.3). En un caso, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de CD50 (p. ej., N° de Acceso de GenBank AAH58903.1) o una secuencia de ácido nucleico de CD50 (p. ej., N° de Acceso de GenBank BC058903.1). En un caso, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de CD197 (p. ej., N° de Acceso de GenBank NP_001829.1) o una secuencia de ácido nucleico de CD197 (p. ej., N° de Acceso de GenBank NM_001838.3). En un caso, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de CD58 (p. ej., N° de Acceso de GenBank CAG33220.1) o una secuencia de ácido nucleico de CD58 (p. ej., N° de Acceso de GenBank CR456939.1). En un caso, un ETP comprende una secuencia de aminoácidos de CD62L (p. ej., N° de Acceso de GenBank AAH20758.1) o una secuencia de ácido nucleico de CD62L (p. ej., N° de Acceso de GenBank BC020758.1).

Un ETP puede ser un polipéptido implicado en la fijación como objetivo de células dendríticas. Polipéptido ejemplares implicado en la fijación como objetivo de células dendríticas incluyen ligandos de TLR, anticuerpo anti-DEC-205, un anticuerpo anti-DC-SIGN y fragmentos funcionales y variantes de los mismos.

En otra realización, más de 1, tal como 2, 3, 4, 5, 6 o más ETPs se suministran conjuntamente con una secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR, p. ej., un ARN de CAR, en una célula T. En un aspecto, el suministro conjunto de 1 o más ETP no afecta, p. ej., disminuye sustancialmente o inhibe sustancialmente la expresión o actividad del CAR suministrado conjuntamente o co-expresado en la célula T con ETP-CAR, p. ej., célula T con ARN de ETP-CAR. En otro aspecto, el suministro conjunto de un CAR no afecta, p. ej., disminuye sustancialmente o inhibe sustancialmente la expresión o actividad del ETP o de los ETPs suministrados conjuntamente o co-expresados.

Moléculas candidatas (es decir, ETPs candidatos) se pueden testar para determinar la actividad de cebado de células T solas o junto con un CAR utilizando ensayos descritos en los Ejemplos.

Un ETP puede comprender una secuencia de aminoácidos con al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad o que no difiere en más de 30, 25, 20, 15, 10 o 5 residuos de aminoácidos de un ETP descrito en esta memoria, o un fragmento funcional del mismo, o un ETP que se produce de forma natural, p. ej., un ETP que se produce de forma natural descrito en esta memoria, p. ej., al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad con un ETP descrito en esta memoria, o un fragmento funcional del mismo.

El porcentaje de identidad en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias polipeptídicas, se refiere a dos o más secuencias que son iguales. Dos secuencias son "sustancialmente idénticas" si dos secuencias tienen un porcentaje específico de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales (es decir, 60 % de identidad, opcionalmente 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad a lo largo de una región específica o, cuando no se especifica, a lo largo de toda la secuencia), cuando se compara y se alinea para obtener la correspondencia máxima en una ventana de comparación, o región designada como medida utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante alineamiento manual e inspección visual. Opcionalmente, la identidad existe en una región que tiene al menos aproximadamente 50 nucleótidos (o 10 aminoácidos) de longitud, o más preferiblemente en una región que tiene de 100 a 500 o 1000 o más nucleótidos (o 20, 50, 200 o más aminoácidos) de longitud.

Para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de ensayo y de referencia se introducen en un ordenador, se designan coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencias. Pueden usarse parámetros por defecto del programa o pueden indicarse parámetros alternativos. Después, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidades de secuencia para las secuencias de prueba con respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa. Métodos de alineamiento de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. El alineamiento óptimo de secuencias para comparación puede realizarse, p. ej., mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443, mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de programas informáticos de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) o mediante alineamiento manual e inspección visual (véase, p. ej., Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology).

Dos ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; y Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. El programa informático para realizar análisis BLAST está a disposición del público a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos también se puede determinar usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller, (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17) que se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de pesos de residuos PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453) que se ha incorporado al programa GAP en el paquete informático GCG (disponible en www.gcg.com), usando una matriz Blossom 62 o una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.

Variantes funcionales de un ETP proporcionado en esta memoria pueden comprender una o más mutaciones, de modo que la variante conserve algún nivel de actividad de cebado de células T del ETP descrito en esta memoria. La variante funcional puede tener al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99 % (p. ej., al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99 %) de la actividad de cebado de células T como el correspondiente ETP que se produce de forma natural o parental. La variante funcional puede tener al menos 200 %, al menos 300 %, al menos 400 %, al menos 500 %, al menos 1000 % o más de la actividad de cebado de células T como el correspondiente ETP que se produce de forma natural o parental. Las mutaciones presentes en una variante funcional incluyen sustituciones, adiciones y deleciones de aminoácidos. Mutaciones pueden introducirse mediante técnicas estándares conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. La mutación puede ser una sustitución de aminoácido conservadora, en la que el residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar.

Un ETP puede comprender un fragmento funcional de un ETP que se produce de forma natural, p. ej., un ETP descrito en esta memoria. El fragmento funcional puede comprender al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o 95 % de los residuos de aminoácidos del ETP que se produce de forma natural. Por ejemplo, el ETP comprende un dominio o un fragmento funcional de un dominio de una ETP descrito en esta memoria, que comprende actividad de cebado de células T.

Ácidos Nucleicos

En esta memoria se describen métodos para producir los CARs y ETPs de uso en la invención. En una realización, el ácido nucleico que codifica el CAR o ETP que se ha de introducir en una célula T es una molécula de ADN (p. ej., una molécula de ADNc). En la presente invención, el ácido nucleico que codifica el CAR y/o ETP que se ha de introducir en una célula T es una molécula de ARN. En otra realización, el ARN se genera mediante transcripciónin vitro.En una realización, el ARN se produce mediante transcripciónin vitroutilizando un molde generado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El ADN de interés de cualquier fuente se puede convertir directamente mediante PCR en un molde para la síntesis de ARNm in vitro utilizando cebadores adecuados y ARN polimerasa. La fuente del ADN puede ser, por ejemplo, ADN genómico, ADN plasmídico, ADN de fago, ADNc, secuencia de ADN sintético o cualquier otra fuente apropiada de ADN.

Construcciones de ARN

En esta memoria se describen métodos para expresar un ARN que codifica un CAR y/o un ARN que codifica un ETP. La presente invención también utiliza una construcción de ARN que codifica un CAR y/o una construcción de ARN que codifica un ETP que puede transfectarse directamente en una célula. Un método para generar ARNm para uso en la transfección puede implicar la transcripción in vitro (IVT, por sus siglas en inglés) de un molde con cebadores especialmente diseñados, seguida de la adición de poliA, para producir una construcción que contiene una secuencia no traducida ("UTR") 3' y 5', una secuencia de casquete 5' y/o Sitio Interno de Entrada al Ribosoma (IRES), el ácido nucleico que se ha de expresar, y una cola poliA, típicamente de 50-2000 bases de longitud (SEQ ID NO:46). El ARN así producido puede transfectar eficazmente diferentes tipos de células. En un aspecto, el molde incluye secuencias para el CAR y/o el ETP.

En una realización, el ARN del CAR y/o el ARN del ETP transcritosin vitrose pueden introducir en una célula como una forma de transfección transitoria. El ARN se produce mediante transcripciónin vitrousando un molde generado por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El ADN de interés de cualquier fuente se puede convertir directamente mediante PCR en un molde para la síntesis de ARNm in vitro utilizando cebadores adecuados y ARN polimerasa. La fuente del ADN puede ser, por ejemplo, ADN genómico, ADN plasmídico, ADN de fago, ADNc, secuencia de ADN sintético o cualquier otra fuente apropiada de ADN. El molde deseado para la transcripciónin vitroes un CAR o ETP descrito en esta memoria. Por ejemplo, el molde para el ARN del CAR comprende una región extracelular que comprende un dominio variable de cadena sencilla de un anticuerpo contra un antígeno asociado a un tumor descrito en esta memoria; una región bisagra (p. ej., una región bisagra descrita en esta memoria), un dominio transmembrana (p. ej., un dominio transmembrana descrito en esta memoria tal como un dominio transmembrana de CD8a); y una región citoplasmática que incluye un dominio de señalización intracelular, p. ej., un dominio de señalización intracelular descrito en esta memoria, p. ej., que comprende el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de 4-1BB.

En una realización, el molde para la transcripción in vitro es el CAR de uso en la presente invención. Por ejemplo, el molde para el ARN del CAR comprende un dominio extracelular que comprende un dominio variable de cadena sencilla de un anticuerpo de interés (p. ej., un anticuerpo antitumoral); un dominio transmembrana (p. ej., de la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154); y uno o más dominios de señalización intracelular (p. ej., 4-1BB, CD3-zeta).

En una realización, el molde para la transcripción in vitro es un ETP. Por ejemplo, un molde para un ETP puede comprender la secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula coestimuladora (p. ej., CD70, CD83, CD80, CD86, CD40, CD154, CD137L (4-1BBL), CD275 (OX40L), CD275 (ICOS-L), CD54 (ICAM-1), CD49a, CD43, CD48, CD112 (PVRL2), CD150 (SLAM), CD155 (PVR), CD265 (RANK), CD270 (HVEM), TL1A, CD127, IL-4R, GITR-L, CD160, CD258, T iM-4, Cd 153 (CD30L), CD200R (OX2R), CD44, ligandos de los mismos, o fragmentos funcionales o variantes de los mismos), una citocina soluble (p. ej., IL-2, IL-12, IL-6 , IL-7, IL-15, IL-18, IL-21, GM-CSF, IL-18, IL-21, IL-27), un polipéptido implicado en la presentación de antígenos (p. ej., CD64, MHC I y MHC II), un polipéptido implicado en el tráfico y/o la migración (p. ej., CD183, CCR2, CCR6, c D50, CD197, CD58, CD62L), o un polipéptido implicado en la fijación como objetivo de células dendríticas (p. ej., ligandos de TLR, anticuerpo anti-DEC-205, anticuerpo anti-DC-SIGN). En la invención, las células T comprenden un ácido nucleico que codifica un ETP seleccionado del grupo que consiste en CD70, CD86 y CD252, y fragmentos funcionales y variantes de CD70, CD86 y CD252 que conservan la capacidad de potenciar el cebado de células T.

En una realización, el ADN que se ha de utilizar para la PCR contiene un marco de lectura abierto. El ADN puede ser de una secuencia de ADN que se produce de forma natural procedente del genoma de un organismo. En una realización, el ADN es un gen de interés de longitud completa de una porción de un gen. El gen puede incluir algunas o todas las regiones no traducidas (UTRs) 5' y/o 3'. El gen puede incluir exones e intrones. En una realización, el ADN a utilizar para la PCR es un gen humano. En otra realización, el ADN a utilizar para la PCR es un gen humano que incluye las UTRs 5' y 3'. Alternativamente, el ADN puede ser una secuencia de ADN artificial que normalmente no se expresa en un organismo que se produce de forma natural. Una secuencia de ADN artificial ilustrativa es aquella que contiene porciones de genes que se ligan entre sí para formar un marco de lectura abierto que codifica una proteína de fusión. Las porciones de ADN que se ligan entre sí pueden ser de un solo organismo o de más de un organismo.

Los genes que pueden utilizarse como fuentes de ADN para PCR incluyen genes que codifican polipéptidos que proporcionan un efecto terapéutico o profiláctico a un organismo o que pueden utilizarse para diagnosticar una enfermedad o trastorno en un organismo. Genes preferidos son genes que son útiles para un tratamiento a corto plazo, o en los casos en los que existen preocupaciones de seguridad con respecto a la dosis o el gen expresado. Por ejemplo, para el tratamiento de cáncer, trastornos autoinmunes, infecciones parasitarias, virales, bacterianas, fúngicas u otras infecciones, el o los transgenes a expresar pueden codificar un polipéptido que funciona como ligando o receptor para células del sistema inmunológico, o puede funcionar para estimular o inhibir el sistema inmunológico de un organismo. No es deseable tener una estimulación continua y prolongada del sistema inmunológico, ni necesario producir cambios que duren después de un tratamiento exitoso, ya que esto puede provocar un nuevo problema. Para el tratamiento de un trastorno autoinmune, puede ser deseable inhibir o suprimir el sistema inmunológico durante un brote, pero no a largo plazo, lo que podría provocar que el paciente se volviera demasiado sensible a una infección.

La PCR se utiliza para generar un molde para la transcripción in vitro de ARNm que se utiliza para la transfección. Se conocen bien en la técnica métodos para realizar la PCR. Cebadores para utilizar en la PCR están diseñados para tener regiones que son sustancialmente complementarias de las regiones del ADN que se han de utilizar como un molde para la PCR. En los métodos descritos en esta memoria se puede utilizar cualquier ADN polimerasa útil para la PCR. Los reactivos y la polimerasa están disponibles comercialmente de un cierto número de fuentes.

También se pueden utilizar estructuras químicas con la capacidad de fomentar la estabilidad y/o la eficiencia de la traducción. El ARN tiene preferentemente UTRs en 5' y 3'. En una realización, la UTR 5' tiene una longitud de entre cero y 3000 nucleótidos. La longitud de las secuencias UTR 5' y 3' a añadir a la región codificante se puede alterar mediante diferentes métodos, incluyendo, pero no limitados al diseño de cebadores para PCR que se reasocian con diferentes regiones de las UTRs. Utilizando esta estrategia, un experto ordinario en la técnica puede modificar las longitudes de UTR 5' y 3' requeridas para lograr una eficiencia de traducción óptima después de la transfección del ARN transcrito.

Las UTRs 5' y 3' pueden ser las UTRs 5' y 3' endógenas y que se producen de forma natural para el gen de interés. Alternativamente, se pueden añadir secuencias de UTR que no son endógenas al gen de interés incorporando las secuencias de UTR en los cebadores directos e inversos o mediante cualquier otra modificación del molde. El uso de secuencias de UTR que no son endógenas del gen de interés puede ser útil para modificar la estabilidad y/o la eficiencia de la traducción del ARN. Por ejemplo, se sabe que los elementos ricos en AU en secuencias 3' UTR pueden disminuir la estabilidad del ARNm. Por lo tanto, se pueden seleccionar o diseñar UTR 3' para aumentar la estabilidad del ARN transcrito basándose en propiedades de UTRs que son bien conocidas en la técnica.

En una realización, la UTR 5' puede contener la secuencia Kozak del gen endógeno. Alternativamente, cuando se añade mediante PCR una UTR 5' que no es endógena al gen de interés como se describe arriba, se puede rediseñar una secuencia Kozak consenso añadiendo la secuencia UTR 5'. Las secuencias de Kozak pueden aumentar la eficiencia de la traducción de algunas transcripciones de ARN, pero no parecen ser necesarias para que todos los ARNs permitan una traducción eficiente. En la técnica se conoce la necesidad de secuencias de Kozak para muchos ARNm. En otras realizaciones, la UTR 5' puede derivarse de un virus de ARN cuyo genoma de ARN es estable en las células. En otras realizaciones, se pueden usar diversos análogos de nucleótidos en la UTR en 3' o 5' para impedir la degradación por exonucleasa del ARNm.

Para permitir la síntesis de ARN a partir de un molde de ADN sin la necesidad de clonación génica, se debe unir un promotor de la transcripción al molde de ADN en dirección 5' respecto a la secuencia que se va a transcribir. Cuando una secuencia que funciona como un promotor para una ARN polimerasa se añade al extremo 5' del cebador directo, el promotor de ARN polimerasa se incorpora al producto de PCR en dirección 5' respecto al marco de lectura abierto que se va a transcribir. En una realización preferida, el promotor es un promotor de la polimerasa T7, como se describe en otra parte del presente documento. Otros promotores útiles incluyen, ente otros, promotores de la ARN polimerasa T3 y SP6. Se conocen en la técnica secuencias de nucleótidos consensuadas para los promotores T7, T3 y SP6.

En una realización, el ARNm tiene un casquete en el extremo 5' y una cola poli(A) en 3' que determinan la unión al ribosoma, el inicio de la traducción y la estabilidad del ARNm en la célula. En un molde de ADN circular, por ejemplo, ADN plasmídico, la ARN polimerasa produce un producto concatamérico largo que no es adecuado para la expresión en células eucarióticas. La transcripción del ADN plasmídico linealizado al final de la UTR 3' da como resultado un ARNm de tamaño normal que no es eficaz en la transfección eucariótica incluso si se poliadenila después de la transcripción.

En un molde de ADN lineal, la ARN polimerasa del fago T7 puede extender el extremo 3' del transcrito más allá de la última base del molde (Schenbom y Mierendorf, Nuc Acids Res., 13 :6223-36 (1985); Nacheva y Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270: 1485-65 (2003).

Tramos de poliA/T se pueden integrar en un molde de ADN (p. ej., un plásmido) mediante clonación molecular. Alternativamente, el segmento poliA/T del molde de ADN transcripcional se puede producir durante la PCR utilizando un cebador inverso que contiene una cola poliT, tal como una cola 100T (el tamaño puede ser de 50-5000 T), o después de la PCR mediante cualquier otro método, incluyendo, pero no limitado a ligamiento de ADN o recombinación in vitro. Las colas de poli(A) también proporcionan estabilidad a los ARN y reducen su degradación. Generalmente, la longitud de una cola de poli(A) se correlaciona positivamente con la estabilidad del ARN transcrito. En una realización, la cola de poli(A) tiene entre 100 y 5000 adenosinas.

Las colas de poli(A) de los ARNs se pueden ampliar adicionalmente después de la transcripción in vitro con el uso de una poli(A) polimerasa tal como la poliA polimerasa de E. coli (E-PAP). En una realización, aumentar la longitud de una cola de poli(A) de 100 nucleótidos a entre 300 y 400 nucleótidos da como resultado un aumento de aproximadamente el doble en la eficiencia de traducción del ARN. Adicionalmente, la unión de diferentes grupos químicos al extremo 3' puede aumentar la estabilidad del ARNm. Una unión de este tipo puede contener nucleótidos modificados/artificiales, aptámeros y otros compuestos. Por ejemplo, se pueden incorporar análogos de ATP en la cola de poli(A) utilizando poli(A) polimerasa. Los análogos de ATP pueden aumentar adicionalmente la estabilidad del ARN.

Los casquetes en 5' también proporcionan estabilidad a las moléculas de ARN. En una realización preferida, los ARN producidos por los métodos descritos en esta memoria incluyen un casquete en 5'. El casquete en 5' se proporciona utilizando técnicas conocidas en la técnica y descritas en esta memoria (Cougot, et al, Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al, RNA, 7: 1468-95 (2001); Elango, et al, Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)).

Los ARN producidos mediante los métodos descritos en esta memoria también pueden contener una secuencia del sitio de entrada al ribosoma interno (IRES). La secuencia IRES puede ser cualquier secuencia viral, cromosómica o modificada por ingeniería genética artificialmente que inicie la unión del ribosoma independiente del casquete al ARNm y facilite el inicio de la traducción. Puede incluirse cualquier soluto adecuado para la electroporación celular, que pueda contener factores que faciliten la permeabilidad y la viabilidad celular, tales como azúcares, péptidos, lípidos, proteínas, antioxidantes y tensioactivos.

En una realización, la presente invención incluye ARN sintético y análogos similares a ARN que codifican los CARs y ETPs de uso en la invención. Es decir, la presente invención incluye ARN que codifica CAR y ETP y construcciones similares a ARN fabricadas con cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, por ejemplo, ARN IVT y ARN sintetizado. En una realización, el ARN se sintetiza mediante métodos conocidos de síntesis de oligonucleótidos. Métodos de síntesis de oligonucleótidos incluyen, por ejemplo, síntesis de H-fosfonato, síntesis de fosfodiéster, síntesis de fosfotriéster, síntesis de fosfito-triéster y el método de la fosforamidita. En algunos casos, la síntesis de la construcción de ARN incluye la incorporación de derivados o análogos de nucleótidos/nucleósidos. Como tal, en una realización, el ARN de uso en la invención comprende un derivado o análogo de nucleótido/nucleósido. Por ejemplo, un tipo de análogo es LNA, tal como beta-D-oxi-LNA, alfa-L-oxi-LNA, beta-D-amino-LNA y beta-D-tio-LNA y beta-D-oxi-LNA. Métodos para producir ARN sintetizado son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. N°: 8.242.248, la patente de EE.UU. N°: 6.111.095, la publicación de solicitud de patente de EE.UU. N°: 2010/0324278, la publicación de solicitud de patente de EE.UU. N°: 2010/0137010 y la publicación internacional PCT N°: WO 2007/031081. Además, la presente invención incluye construcciones de ARN y similares a ARN que codifican CAR y ETP fabricadas mediante métodos hasta ahora desconocidos, con la condición de que las construcciones comprendan una secuencia que codifique los componentes del CAR o ETP descritos en esta memoria.

Se puede introducir ARN o ADN en células diana utilizando cualquiera de un cierto número de métodos diferentes, por ejemplo, métodos disponibles comercialmente que incluyen, pero no se limitan a electroporación (Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Colonia, Alemania)), (ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, Mass.) o Gene Pulser II (BioRad, Denver, Colorado), Multiporator (Eppendort, Hamburgo, Alemania), transfección mediada por liposomas catiónicos utilizando lipofección, encapsulación de polímeros, transfección mediada por péptidos o sistemas de suministro de partículas biolísticas tales como "pistolas de genes" (véase, por ejemplo, Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001).

Construcciones de ADN

En esta memoria se describen métodos para expresar un ADN o un ADNc que codifica un CAR y/o un ADN o un ADNc que codifica un ETP. La presente invención puede utilizar vectores en los que se inserta un ADN de uso en la presente invención. Los vectores derivados de retrovirus tales como el lentivirus son herramientas adecuadas para lograr la transferencia de genes a largo plazo, ya que permiten la integración estable a largo plazo de un transgén y su propagación en células hijas. Los vectores lentivíricos tienen la ventaja añadida frente a los vectores procedentes de oncorretrovirus, tales como los virus de la leucemia murina, de que pueden transducir células no proliferantes, tales como los hepatocitos. También tienen la ventaja añadida de una baja inmunogenicidad.

En otra realización, el vector que comprende el ácido nucleico que codifica el CAR deseado de uso en la invención es un vector adenoviral (A5/35). En otra realización, la expresión de ácidos nucleicos que codifican CARs se puede lograr utilizando transposones tales como nucleasas sleeping beauty, crisper, CAS9 y dedos de zinc. Véase, más adelante, June et al. 2009 Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716.

En resumen, la expresión de ácidos nucleicos naturales o sintéticos que codifican los CAR se logra normalmente ligando operativamente un ácido nucleico que codifica el polipéptido CAR o porciones del mismo a un promotor e incorporando la construcción en un vector de expresión. Los vectores pueden ser adecuados para la replicación y la integración en eucariotas. Vectores de clonación típicos contienen terminadores de la transcripción y traducción, secuencias de iniciación y promotores útiles para la regulación de la expresión de la secuencia de ácido nucleico deseada.

Las construcciones de expresión de uso en la presente invención también se pueden utilizar para la inmunización con ácido nucleico y terapia génica, utilizando protocolos estándares de administración de genes. Métodos para el suministro de genes se conocen en la técnica. Véanse, por ejemplo, las Pat. de EE.UU. N.° 5.399.346, 5.580.859, 5.589.466. En otra realización, la invención puede utilizar un vector de terapia génica

El ácido nucleico se puede clonar en varios tipos de vectores. Por ejemplo, el ácido nucleico se puede clonar en un vector que incluye, entre otros, un plásmido, un fagémido, un derivado de fago, un virus animal y un cósmido. Vectores de particular interés incluyen vectores de expresión, vectores de replicación, vectores de generación de sondas y vectores de secuenciación.

Además, el vector de expresión se puede proporcionar a una célula en forma de un vector viral. La tecnología de vectores virales es bien conocida en la técnica y se describe, por ejemplo, en Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volúmenes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY), y en otros manuales de virología y biología molecular. Virus que son útiles como vectores incluyen, entre otros, retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes y lentivirus. En general, un vector adecuado contiene un origen de replicación funcional en al menos un organismo, una secuencia promotora, sitios de endonucleasas de restricción convenientes y uno o más marcadores seleccionables (p. ej., documentos WO 01/96584; WO 01/29058; y patente de EE.UU. N° 6.326.193).

Se ha desarrollado un cierto número de sistemas basados en virus para la transferencia de genes a células de mamíferos. Por ejemplo, los retrovirus proporcionan una plataforma conveniente para los sistemas de suministro de genes. Un gen seleccionado puede insertarse en un vector y empaquetarse en partículas retrovirales utilizando técnicas conocidas en la técnica. A continuación, el virus recombinante puede aislarse y suministrarse a las células del sujeto in vivo o ex vivo. En la técnica se conoce un cierto número de sistemas retrovíricos. En algunas realizaciones, se utilizan vectores de retrovirus. En algunas realizaciones, se usan vectores adenovíricos. En la técnica se conocen varios vectores adenovíricos. En una realización, se usan vectores lentivíricos.

Elementos promotores adicionales, p. ej., potenciadores, regulan la frecuencia del inicio de la transcripción. Típicamente, estos están ubicados en la región 30-110 pb aguas arriba del sitio de inicio, aunque se ha demostrado que un cierto número de promotores contienen también elementos funcionales aguas abajo del sitio de inicio. El espaciamiento entre los elementos promotores frecuentemente es flexible, de modo que la función del promotor se conserva cuando los elementos se invierten o se mueven entre sí. En el promotor de timidina quinasa (tk), el espaciamiento entre los elementos del promotor se puede incrementar a 50 pb antes de que la actividad comience a declinar. Dependiendo del promotor, parece que los elementos individuales pueden funcionar de forma cooperativa o independiente para activar la transcripción. Promotores ejemplares incluyen los promotores del gen IE de CMV, EF-1a, ubiquitina C o fosfogliceroquinasa (PGK).

Células T modificadas por ingeniería genética ("células T con ETP-CAR")

En esta memoria se describen células T que comprenden una o más, por ejemplo, una, dos o más moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR descrito en esta memoria y una secuencia de ácido nucleico que codifica un ETP descrito en esta memoria. En la invención, las células T comprenden un ácido nucleico que codifica un ETP seleccionado del grupo que consiste en CD70, CD86 y CD252, y fragmentos funcionales y variantes de CD70, CD86 y CD252 que conservan la capacidad de potenciar el cebado de células T. En una realización, el ácido nucleico comprende tanto la secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR descrito en esta memoria como la secuencia de ácido nucleico que codifica un ETP de acuerdo con las reivindicaciones, p. ej., las secuencias de ácido nucleico que comprenden el CAR y el ETP están dispuestas en la misma molécula de ácido nucleico. En una realización, el ácido nucleico comprende dos moléculas de ácido nucleico, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR descrito en esta memoria está dispuesta en una molécula de ácido nucleico y la secuencia de ácido nucleico que codifica un ETP de acuerdo con las reivindicaciones está dispuesta en la otra molécula de ácido nucleico. En la presente invención, la molécula de ácido nucleico comprende ARN. En realizaciones en las que las secuencias de ácido nucleico que codifican el CAR y ETP están dispuestas en dos moléculas de ácido nucleico, ambas moléculas de ácido nucleico comprenden ARN. Alternativamente, en realizaciones en las que las secuencias de ácido nucleico que codifican el CAR y ETP están dispuestas en dos moléculas de ácido nucleico, una molécula de ácido nucleico puede comprender ARN y la otra molécula de ácido nucleico puede comprender ADN.

En la presente invención, una o ambas de las secuencias de ácido nucleico que codifican un CAR y las secuencias de ácido nucleico que codifican un ETP comprenden ARN. Por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico que codifica el CAR puede comprender ARN y la secuencia de ácido nucleico que codifica el ETP puede comprender ADN. En otro ejemplo, la secuencia de ácido nucleico que codifica el CAR puede comprender ADN y la secuencia de ácido nucleico que codifica el ETP puede comprender ARN.

En algunas realizaciones en las que la secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR comprende ADN, p. ej., un vector, p. ej., un vector viral, el CAR comprende un dominio extracelular, p. ej., un dominio de unión a antígeno descrito en esta memoria, un dominio transmembrana y dos o más dominios de señalización intracelulares, p. ej., un dominio de señalización primario y un dominio de señalización coestimulador. En una realización, el CAR comprende un dominio de señalización primario, p. ej., un dominio CD3 zeta como se describe en esta memoria, y un dominio de señalización coestimulador, p. ej., un dominio 4-1BB como se describe en esta memoria. En realizaciones de este tipo, el CAR comprende uno o más dominios de señalización intracelular adicionales, p. ej., 1, 2, 3, 4 o 5 dominios de señalización coestimuladores adicionales como se describe en esta memoria. En cualquiera de las realizaciones anteriores, el CAR puede ser un CAR regulable, p. ej., un RCAR descrito en esta memoria, en el que la actividad del CAR puede controlarse, p. ej., administrando o retirando la molécula de dimerización. En realizaciones de este tipo en las que se utiliza un RCAR, la actividad del CAR puede ser transitoria, mientras que la actividad de presentación del antígeno o de cebado de las células T se prolonga y da como resultado una respuesta inmunitaria más duradera contra la enfermedad.

En realizaciones, la célula T comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR descrito en esta memoria y dos o más, p. ej., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más secuencias de ácido nucleico que codifican un ETP, en donde las secuencias de ácido nucleico codifican diferentes ETPs descritos en esta memoria. En la invención, las células T comprenden un ácido nucleico que codifica un ETP seleccionado del grupo que consiste en CD70, CD86 y CD252, y fragmentos funcionales y variantes de CD70, CD86 y CD252 que conservan la capacidad de potenciar el cebado de células T. En realizaciones en las que la célula T comprende más de una secuencia de ácido nucleico que codifica un ETP descrito en esta memoria, cada una de las secuencias de ácido nucleico que codifica los ETPs puede estar presente en la misma molécula de ácido nucleico o en diferentes moléculas de ácido nucleico. En la misma molécula de ácido nucleico pueden disponerse dos o más secuencias de ácido nucleico que codifican ETP, p. ej., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más. A modo de ejemplo, en una realización en la que la célula T comprende tres secuencias de ácido nucleico que codifican ETPs, dos de las secuencias de ácido nucleico que codifican ETPs pueden disponerse en una molécula de ácido nucleico, y una secuencia de ácido nucleico que codifica un ETP puede disponerse en otra molécula de ácido nucleico. En cualquiera de estas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR descrito en esta memoria puede disponerse en una molécula de ácido nucleico que comprende, además, una o más secuencias de ácido nucleico que codifican un ETP. En una realización alternativa, la secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR descrito en esta memoria está dispuesta en una molécula de ácido nucleico que no comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un ETP.

También se describen en esta memoria métodos para generar una célula T que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR y una secuencia de ácido nucleico que codifica un ETP. En métodos en los que una o ambas secuencias de ácido nucleico que codifican un CAR y ETP comprenden ARN, la(s) molécula(s) de ARN se transfectan, p. ej., mediante electroporación, en la célula T utilizando métodos de transfección estándares y reactivos conocidos en la técnica. En métodos en los que una o ambas secuencias de ácido nucleico que codifican un CAR y ETP comprenden ADN, la(s) molécula(s) de ADN pueden introducirse, p. ej., mediante transfección, electroporación, transducción viral, en la célula T utilizando métodos y reactivos estándar conocidos en la técnica.

El ARNm de CAR y el ARNm, ADNc o vectores de ETP transcritosin vitro,p. ej., vectores retrovirales o lentivirales, que codifican el CAR y ETP de interés, pueden suministrarse en diferentes tipos de linfocitos (p. ej., células T), así como en tejidos y organismos completos que utilizan células transfectadas como soportes o suministro local o sistémico libre de células de moléculas de ácido nucleico encapsuladas, unidas o desnudas, p. ej., vectores de ARN, ARNm, ADNc o ADN transcritos in vitro. El método utilizado puede ser para cualquier propósito en el que se requiera o sea suficiente una expresión transitoria. A células T que han sido modificadas para expresar una secuencia de ácido nucleico que codifica CAR y una secuencia de ácido nucleico que codifica un ETP se las alude como "células T con ETP-CAR". Células T pueden transducirse, p. ej., transducirse viralmente, con ADN del CAR, p. ej., un vector que codifica un CAR, y ADN de ETP, p. ej., un vector que codifica un ETP. Células T co-transfectadas con ARN de CAR y ARN de ETP se denominan "células T con ARN de ETP-CAR".

Los métodos descritos se pueden aplicar a la modulación de la actividad celular en investigación y terapia básica, en los campos del cáncer, células madre, infecciones agudas y crónicas y enfermedades autoinmunes, incluyendo la modulación de las vías de desarrollo.

Los métodos también proporcionan la capacidad de controlar el nivel de expresión en un amplio intervalo cambiando la cantidad de ARN de entrada, haciendo posible regular individualmente el nivel de expresión de cada uno de los genes transfectados. Además, la técnica de producción de ARNm basada en PCR facilita enormemente el diseño de los ARNm de receptores quiméricos con diferentes estructuras y combinación de sus dominios. Por ejemplo, la variación de diferentes dominios efectores/coestimuladores intracelulares en múltiples receptores quiméricos en la misma célula permite la determinación de la estructura de las combinaciones de receptores que evalúan el nivel más alto de citotoxicidad contra objetivos multi-antigénicos y, al mismo tiempo, la citotoxicidad más baja hacia células normales.

Una ventaja de los métodos de la invención es que la transfección de ARN es esencialmente transitoria y está libre de vectores. Además, la transfección de ARN de múltiples ARNs distintos se puede realizar con alta eficacia sin alterar sustancialmente la expresión de los distintos polipéptidos codificados por moléculas de ARN administradas conjuntamente. Un transgén de ARN puede suministrarse a un linfocito y expresarse allí después de una breve activación celular in vitro, como un casete de expresión mínima sin necesidad de secuencias virales adicionales. En estas condiciones, la integración del transgén en el genoma de la célula huésped es poco probable. La clonación de células no es necesaria debido a la alta eficacia de la transfección del ARN y su capacidad para modificar uniformemente toda la población de linfocitos. Por lo tanto, células que contienen una construcción de ARN introducida de acuerdo con el método descrito pueden utilizarse terapéuticamente. Por ejemplo, se extrae una población de células linfocitarias de un paciente, se transfecta con diferentes construcciones de ARN y luego se reintroduce en el paciente. La población de células transfectadas puede entonces fijar entonces como objetivo, p. ej., células cancerosas o células que contienen otros antígenos asociados a enfermedades. Un beneficio del uso de células transfectadas con ARN es que el transgén de ARN tiene una semivida limitada. La proteína codificada solo será producida por la célula transfectada durante un período de tiempo limitado. Esto sirve para reducir el riesgo de cualesquiera consecuencias no deseadas cuando se introducen células genéticamente modificadas en un paciente.

En una realización preferida, la tecnología se utiliza para terapia personalizada. Por ejemplo, para el tratamiento de tumores, la sangre o las células del paciente se recogen mediante un método apropiado tal como aféresis, biopsia o venopunción. Las células se cultivan durante al menos 24 horas, tiempo durante el cual las células se modifican con un ácido nucleico apropiado, p. ej., se transfectan con una construcción de ARN apropiada o se transducen con un ADN apropiado, p. ej., un vector, una construcción, para tratar el tumor. Las células se pueden almacenar congeladas antes de la transfección o transducción, si es necesario. Luego se devuelven al paciente en el momento adecuado y en la dosis adecuada. En una realización, se administran al paciente múltiples veces células modificadas, p. ej., células modificadas con ARN o células modificadas con ADN.

La inmunoterapia con ARN transcrito in vitro (ARN-IVT) hace uso de dos estrategias diferentes, las cuales han sido testadas sucesivamente en diversos modelos animales. Las células se transfectan con ARN transcrito in vitro mediante lipofección o electroporación y se administran al sujeto. Preferiblemente, es deseable estabilizar el ARN-IVT utilizando diversas modificaciones con el fin de lograr una expresión prolongada del ARN-IVT transferido.

En la bibliografía se conocen algunos vectores IVT que se utilizan de manera estandarizada como molde para la transcripción in vitro y que han sido modificados genéticamente de tal manera que se producen transcritos de ARN estabilizados. Actualmente, los protocolos utilizados en la técnica se basan en un vector plásmido con la siguiente estructura: un promotor de ARN polimerasa 5' que permite la transcripción de ARN, seguido de un gen de interés que está flanqueado en 3' y/o 5' por regiones no traducidas (UTR) y un casete de poliadenilo 3' que contiene una cadena de nucleótidos A. Antes de la transcripción in vitro, el plásmido circular se lineariza aguas abajo del casete de poliadenilo mediante enzimas de restricción de tipo II (la secuencia de reconocimiento corresponde al sitio de escisión). El casete de poliadenilo corresponde, por lo tanto, a la última secuencia poli(A) en el transcrito. Como resultado de este procedimiento, algunos nucleótidos permanecen como parte del sitio de escisión de la enzima después de la linearización y extienden o enmascaran la secuencia de poli(A) en el extremo 3'. No está claro si este exceso no fisiológico afecta la cantidad de proteína producida intracelularmente a partir de una construcción de este tipo.

El ARN tiene varias ventajas sobre los enfoques virales o de plásmidos más tradicionales. La expresión génica a partir de una fuente de ARN no requiere transcripción y el producto proteico se produce rápidamente después de la transfección. Además, el ARN solo necesita acceder al citoplasma, en lugar de al núcleo y, por lo tanto, los métodos de transfección típicos dan como resultado una tasa de transfección extremadamente alta. Además, los enfoques basados en plásmidos requieren que el promotor que impulsa la expresión del gen de interés esté activo en las células en estudio.

En otra realización, los ARNs de uso en la invención se pueden suministrar al interior de las células mediante electroporación. Véanse, p. ej., las formulaciones y metodología de electroporación de construcciones de ácido nucleico en células de mamíferos como se enseña en los documentos US 2004/0014645, US 2005/0052630A1, US 2005/0070841 A1, US 2004/0059285A1, US 2004/0092907A1. Los diversos parámetros, incluyendo la intensidad del campo eléctrico, necesarios para la electroporación de cualquier tipo de célula conocido, se conocen generalmente en la bibliografía de investigación relevante, así como en numerosas patentes y aplicaciones en este campo. Véanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. N° 6.678.556, la patente de EE.UU. N.° 7,171,264 y la Pat. de EE.UU. 7.173.116. Hay aparatos para la aplicación terapéutica de la electroporación disponibles comercialmente, p. ej., el sistema de terapia por electroporación de ADN MedPulser™ (Inovio/Genetronics, San Diego, Calif.), y se describen en patentes tales como la patente de EE.UU. N° 6.567.694; la patente de EE.UU. N° 6.516.223, la patente de EE.UU. N° 5.993.434, la patente de EE.UU. N° 6.181.964, la patente de<e>E.UU. N.° 6.241.701 y la patente de EE.UU. N° 6.233.482; la electroporación también se puede utilizar para la transfección de células in vitro como se describe, p. ej., en el documento US20070128708A1. También se puede utilizar la electroporación para suministrar ácidos nucleicos al interior de las células in vitro. Por consiguiente, la administración mediada por electroporación en células de ácidos nucleicos, incluyendo construcciones de expresión que utilizan cualquiera de los muchos dispositivos y sistemas de electroporación disponibles conocidos por los expertos en la técnica, presenta un medio nuevo e interesante para suministrar un ARN de interés a una célula diana.

En otras realizaciones, los ARNs pueden administrarse al interior de las células mediante precipitación con fosfato cálcico, lipofección, bombardeo de partículas, microinyección y similares. Métodos para producir células que comprenden vectores y/o ácidos nucleicos exógenos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volúmenes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY).

Medios químicos para introducir un polinucleótido en una célula hospedadora incluyen sistemas de dispersión coloidal, tales como complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas a base de lípidos que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Un sistema coloidal ejemplar para uso como un vehículo de suministro in vitro e in vivo es un liposoma (p. ej., una vesícula de membrana artificial). Se encuentran disponibles otros métodos de última generación de suministro fijado como objetivo de ácidos nucleicos, tales como el suministro de polinucleótidos con nanopartículas fijadas como objetivo.

Se contempla el uso de formulaciones lipídicas para la introducción de los ARNs en una célula huésped (in vitro, ex vivo o in vivo). En otro aspecto, el ARN puede estar asociado con un lípido. El ARN asociado con un lípido puede encapsularse en el interior acuoso de un liposoma, intercalarse dentro de la bicapa lipídica de un liposoma, fijarse a un liposoma a través de una molécula de enlace que está asociada tanto con el liposoma como con el oligonucleótido, atraparse en un liposoma, formar complejo con un liposoma, dispersarse en una solución que contiene un lípido, mezclarse con un lípido, combinarse con un lípido, contenido como una suspensión en un lípido, contenido o formando complejo con una micela, o asociarse de otro modo con un lípido. Composiciones asociadas a lípidos/ARN no se limitan a estructura particular alguna en solución. Por ejemplo, pueden estar presentes en una estructura bicapa, como micelas o con una estructura "colapsada". También pueden simplemente estar intercaladas en una solución, posiblemente formando agregados que no son uniformes en tamaño o forma. Los lípidos son sustancias grasas que pueden ser lípidos naturales o sintéticos. Por ejemplo, los lípidos incluyen las gotitas grasas que se producen de forma natural en el citoplasma, así como la clase de compuestos que contienen hidrocarburos alifáticos de cadena larga y sus derivados, tales como ácidos grasos, alcoholes, aminas, aminoalcoholes y aldehídos.

Se pueden obtener lípidos adecuados para su uso de fuentes comerciales. Por ejemplo, la dimiristilfosfatidilcolina ("DMPC") se puede obtener en Sigma, St. Louis, MO; el fosfato de dicetilo ("DCP") se puede obtener en K & K Laboratories (Plainview, NY); el colesterol ("Choi") se puede obtener en Calbiochem-Behring; el dimiristilfosfatidilglicerol ("DMPG") y otros lípidos se pueden obtener en Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL.). Soluciones madre de lípidos en cloroformo o cloroformo/metanol se pueden almacenar a aproximadamente -200 °C. El cloroformo se usa como el único disolvente, ya que se evapora más fácilmente que el metanol. "Liposoma" es un término genérico que abarca una diversidad de vehículos lipídicos simples y multilamelares formados por la generación de bicapas o agregados lipídicos encerrados. Los liposomas pueden estar caracterizados por tener estructuras vesiculares con una membrana de bicapa de fosfolípidos y un medio acuoso interno. Los liposomas multilaminares tienen múltiples capas de lípidos separadas por un medio acuoso. Se forman espontáneamente cuando los fosfolípidos se suspenden en un exceso de solución acuosa. Los componentes lipídicos se auto-reorganizan antes de la formación de estructuras cerradas y atrapan agua y solutos disueltos entre las bicapas lipídicas (Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10). Sin embargo, también se incluyen composiciones que tienen estructuras en solución diferentes a las de la estructura vesicular normal. Por ejemplo, los lípidos pueden asumir una estructura micelar o simplemente existir como agregados no uniformes de moléculas lipídicas. También se contemplan complejos de lipofectamina-ácido nucleico.

Fuentes de Células

Antes de la expansión y modificación genética u otra modificación, se puede obtener de un sujeto una fuente de células, p. ej., células T. El término "sujeto" pretende incluir organismos vivos en los que se puede provocar una respuesta inmunitaria (p. ej., mamíferos). Ejemplos de sujetos incluyen seres humanos, monos, chimpancés, perros, gatos, ratones, ratas y especies transgénicas de estos. Células T pueden obtenerse de un cierto número de fuentes, que incluyen células mononucleares de la sangre periférica, médula ósea, tejido de los ganglios linfáticos, sangre del cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo y tumores.

En determinados aspectos de la presente divulgación, las células efectoras inmunitarias, p. ej., células T, pueden obtenerse de una unidad de sangre recogida de un sujeto utilizando cualquiera de un cierto número de técnicas conocidas por el experto en la técnica, tales como la separación con Ficoll™. En un aspecto preferido, se obtienen células de la sangre circulante de un individuo por aféresis. El producto de aféresis contiene típicamente linfocitos, incluyendo células T, monocitos, granulocitos, células B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos y plaquetas. En un aspecto, las células recogidas por aféresis pueden lavarse para eliminar la fracción de plasma y, opcionalmente, colocar las células en un tampón o medio apropiado para los pasos de procesamiento posteriores. En una realización, las células se lavan con solución salina tamponada con fosfato (PBS). En una realización alternativa, la solución de lavado está exenta de calcio y puede estar exento de magnesio o puede estar exento de muchos, si no todos, cationes divalentes.

Las etapas de activación iniciales en ausencia de calcio pueden dar lugar a una activación ampliada. Como apreciarán fácilmente los expertos en la técnica, una etapa de lavado se puede realizar mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, tales como utilizando una centrífuga de "flujo continuo" semiautomática (por ejemplo, el procesador de células Cobe 2991, Baxter CytoMate o Haemonetics Cell Saver 5) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después del lavado, las células se pueden resuspender en diversos tampones biocompatibles, tales como, por ejemplo, PBS exento de Ca, exento de Mg, PlasmaLyte A u otra solución salina con o sin tampón. Como alternativa, los componentes indeseables de la muestra de aféresis se pueden separar y las células resuspender directamente en medios de cultivo.

En un aspecto, las células T se aíslan de linfocitos de la sangre periférica lisando los glóbulos rojos y agotando los monocitos, por ejemplo, mediante centrifugación a través de un gradiente PERCOLL™ o mediante elutriación centrífuga a contraflujo.

Los métodos descritos en esta memoria pueden incluir, p. ej., la selección de una subpoblación específica de células efectoras inmunitarias, p. ej., células T, que son una población con depleción de células T reguladoras, células reducidas en CD25+, utilizando, p. ej., una técnica de selección negativa, p. ej., descrita en esta memoria. Preferiblemente, la población de células T reguladoras reducidas contiene menos del 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % de células CD25+.

En una realización, las células T reguladoras, p. ej., células T CD25+, se eliminan de la población utilizando un anticuerpo anti-C25, o un fragmento del mismo, o un ligando de unión a CD25, IL-2. En una realización, el anticuerpo anti-CD25, o fragmento del mismo, o ligando de unión a CD25 se conjuga con un sustrato, p. ej., una perla, o se recubre de otro modo sobre un sustrato, p. ej., una perla. En una realización, el anticuerpo anti-CD25, o fragmento del mismo, se conjuga con un sustrato como se describe en esta memoria.

En una realización, las células T reguladoras, p. ej., células T CD25+, se eliminan de la población utilizando un reactivo de agotamiento de CD25 de Militenyi™. En una realización, la relación de células a reactivo de agotamiento de CD25 es 1e7 células a 20 uL, o 1e7 células a 15 uL, o 1e7 células a 10 uL, o 1e7 células a 5 uL, o 1e7 células a 2,5 uL, o 1e7 células a 1,25 uL.

En una realización, la población de células efectoras inmunitarias que va a experimentar depleción incluye aproximadamente 6 x 109 linfocitos T CD25+. En otros aspectos, la población de células efectoras inmunitarias que va a experimentar depleción incluye aproximadamente de 1 * 109 a 1 * 1010 linfocitos T CD25+ y cualquier valor entero intermedio. En una realización, la población resultante de células con agotamiento de linfocitos T tiene 2 x 109 linfocitos T reguladores, p. ej., células CD25+, o menos (p. ej., 1 * 109, 5 * 108, 1 * 108, 5 * 107, 1 * 107 o menos células CD25+).

En una realización, las células T reguladoras, p. ej., células CD25+, se eliminan de la población utilizando el sistema CliniMAC con un conjunto de tubos de agotamiento, tal como, por ejemplo, el tubo 162-01. En una realización, el sistema CliniMAC se ejecuta en una configuración de agotamiento tal como, p. ej., DEPLETION2.1.

Los métodos descritos en esta memoria pueden incluir más de una etapa de selección, p. ej., más de una etapa de agotamiento. El enriquecimiento de una población de células T mediante selección negativa se puede lograr, p. ej., con una combinación de anticuerpos dirigidos a marcadores de la superficie únicos para las células seleccionadas de manera negativa. Un método es la clasificación y/o selección celular mediante inmunoadherencia magnética negativa o citometría de flujo que utiliza un combinado de anticuerpos monoclonales dirigidos a marcadores de la superficie celular presentes en las células seleccionadas de manera negativa. Por ejemplo, para enriquecer en células CD4+ por selección negativa, un combinado de anticuerpos monoclonales puede incluir anticuerpos contra CD14, CD20, CD11bb, CD16, HLA-DR y CD8.

Los métodos descritos en esta memoria pueden incluir, además, la eliminación de células de la población que expresan un antígeno tumoral, p. ej., un antígeno tumoral que no comprende CD25, p. ej., CD19, CD30, C<d>38, CD123, CD20, CD14 o CD11b, para proporcionar de esta manera una población de células con agotamiento de células T reguladores, p. ej., agotamiento de CD25+, y agotamiento de antígenos tumorales que son adecuadas para la expresión de un CAR, p. ej., un CAR descrito en esta memoria. En una realización, las células que expresan antígenos tumorales se eliminan simultáneamente con las células T reguladoras, p. ej., células CD25+. Por ejemplo, un anticuerpo anti-C25, o un fragmento del mismo, y un anticuerpo anti-antígeno tumoral, o un fragmento del mismo, se pueden fijar al mismo sustrato, p. ej., una perla, que se puede utilizar para eliminar las células o un anticuerpo anti-CD25, o fragmento del mismo, o el anticuerpo anti-antígeno tumoral, o fragmento del mismo, se pueden fijar a perlas separadas, cuya mezcla se puede utilizar para eliminar las células. En otras realizaciones, la eliminación de células T reguladoras, p. ej., células CD25+, y la eliminación de las células que expresan el antígeno tumoral es secuencial y puede ocurrir, p. ej., en cualquier orden.

También se proporcionan métodos que incluyen eliminar células de la población que expresan un inhibidor de puntos de control, por ejemplo, un inhibidor de puntos de control descrito en esta memoria, por ejemplo, una o más células PD1+, células LAG3+ y células TIM3+, para proporcionar de esta manera una población de células con agotamiento de linfocitos T reguladores, p. ej., células con agotamiento de CD25+, y células con agotamiento de inhibidores de puntos de control, p. ej., células con agotamiento de PD1+, LAG3+ y/o TIM3+. Inhibidores de puntos de control ejemplares incluyen B7-H1, B&-1, CD160, P1H, 2B4, PD1, TIM3, CEACAM (p. ej., CEACAM-1, CEACAM-3 and/or CEACAM-5), LAG3, TIGIT, CTLA-4, BTLA y LAIR1. En una realización, células que expresan el inhibidor del punto de control se eliminan simultáneamente con las células T reguladoras, p. ej., células CD25+. Por ejemplo, un anticuerpo anti-C25, o un fragmento del mismo, y un anticuerpo inhibidor del punto de control, o un fragmento del mismo, se pueden fijar a la misma perla que se puede utilizar para eliminar las células, o un anticuerpo anti-CD25, o un fragmento del mismo y el anticuerpo inhibidor del punto de control, o un fragmento del mismo, se pueden fijar a perlas separadas, una mezcla de las cuales se puede utilizar para eliminar las células. En otras realizaciones, la eliminación de células T reguladoras, p. ej., células CD25+, y la eliminación de las células que expresan el inhibidor del punto de control es secuencial y puede ocurrir, p. ej., en cualquier orden.

Los métodos descritos en esta memoria pueden incluir una etapa de selección positiva. Por ejemplo, las células T se pueden aislar mediante incubación con perlas conjugadas anti-CD3/anti-CD28 (p. ej., 3x28) tales como M-450 CD3/CD28 T DYNABEADS®, durante un período de tiempo suficiente para la selección positiva de las células T deseadas. En una realización, el período de tiempo es de aproximadamente 30 minutos. En una realización adicional, el período de tiempo varía de 30 minutos a 36 horas o más y todos los valores enteros intermedios. En una realización adicional, el período de tiempo es al menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 horas. En aún otra realización, el período de tiempo es de 10 a 24 horas, p. ej., 24 horas. Se pueden utilizar tiempos de incubación más largos para aislar células T en cualquier situación en la que haya pocas células T en comparación con otros tipos de células, tal como en el aislamiento de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL, por sus siglas en inglés) del tejido tumoral o de individuos inmunocomprometidos. Además, el uso de tiempos de incubación más prolongados puede aumentar la eficacia de captura de células T CD8+. Por lo tanto, simplemente acortando o alargando el tiempo en que se permite que las células T se unan a las perlas de CD3/CD28 y/o aumentando o disminuyendo la relación de perlas respecto a células T (tal como se describe más adelante en esta memoria), se puede seleccionar preferentemente a favor o en contra de subpoblaciones de células T en el inicio del cultivo o en otros momentos durante el proceso. Adicionalmente, al aumentar o disminuir la relación de anticuerpos anti-CD3 y/o anti-CD28 en las perlas u otra superficie, se pueden seleccionar subpoblaciones de células T preferentemente a favor o en contra al inicio del cultivo o en otros momentos deseados.

En una realización, se puede seleccionar una población de linfocitos T que expresa uno o más de: IFN-Y, TNFa, IL-17A, IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-13, granzima B y perforina, u otras moléculas apropiadas, p. ej., otras citocinas. Se pueden determinar métodos para la detección de la expresión celular, p. ej., según los métodos descritos en la Publicación PCT N°: WO 2013/126712.

Para el aislamiento de una población deseada de células mediante selección positiva o negativa, se puede variar la concentración de células y la superficie (p. ej., partículas tales como perlas). En determinados aspectos, puede ser deseable disminuir significativamente el volumen en el que se mezclan juntas las perlas y las células (p. ej., aumentar la concentración de células), para asegurar el máximo contacto de las células y las perlas. Por ejemplo, en un aspecto, se utiliza una concentración de 10 billones de células/ml, 9 billones/ml, 8 billones/ml, 7 billones/ml, 6 billones/ml o 5 billones/ml. En un aspecto, se utiliza una concentración de 1 billón de células/ml. Aún en un aspecto, se utiliza una concentración de células de 75, 80, 85, 90, 95 o 100 millones de células/ml. En aspectos adicionales, pueden usarse concentraciones de 125 o 150 millones de células/ml.

El uso de concentraciones elevadas puede dar como resultado un mayor rendimiento celular, activación celular y expansión celular. Además, el uso de altas concentraciones de células permite una captura más eficaz de las células que puedan expresar débilmente antígenos diana de interés, tales como células T CD28-negativas, o de muestras en las que hay muchas células tumorales presentes (p. ej., sangre leucémica, tejido tumoral, etc.). Este tipo de poblaciones de células pueden tener valor terapéutico y sería deseable obtenerlas. Por ejemplo, el uso de una concentración elevada de células permite una selección más eficaz de linfocitos T CD8+ que normalmente tienen una expresión de CD28 más débil.

En un aspecto relacionado, puede ser deseable utilizar concentraciones más bajas de células. Diluyendo significativamente la mezcla de células T y la superficie (p. ej., partículas tales como perlas), se minimizan las interacciones entre las partículas y las células. Esto selecciona las células que expresan grandes cantidades de antígenos deseados para unirse a las partículas. Por ejemplo, células T CD4+ expresan niveles más altos de CD28 y se capturan de manera más eficiente que las células T<c>D8+ en concentraciones diluidas. En un aspecto, la concentración de células utilizadas es 5 x 106/ml. En otros aspectos, la concentración utilizada puede ser de aproximadamente 1 * 105/ml a 1 * 106/ml, y cualquier valor entero intermedio.

En otros aspectos, las células se pueden incubar en un dispositivo rotatorio durante períodos de tiempo variables a velocidades variables a 2-10 °C o a temperatura ambiente.

Los células T para estimulación también se pueden congelar después de una etapa de lavado. Sin desear ceñirse a ninguna teoría, el paso de congelación y descongelación posterior proporciona un producto más uniforme al separar granulocitos y, en cierta medida, monocitos en la población celular. Después de la etapa de lavado que separa el plasma y las plaquetas, las células se pueden suspender en una solución de congelación. Si bien se conocen en la técnica muchas soluciones y parámetros de congelación y serán útiles en este contexto, un método implica el uso de PBS que contiene DMSO al 20 % y seroalbúmina humana al 8 %, o medios de cultivo que contienen dextrano 40 al 10 % y dextrosa al 5 %, seroalbúmina humana al 20 % y DMSO al 7,5 % o Plasmalyte-A al 31,25 %, dextrosa del 5 % al 31,25 %, NaCl al 0,45 %, dextrano 40 al 10 % y dextrosa al 5 %, seroalbúmina humana al 20 % y DMSO al 7,5 % u otro medio de congelación celular adecuado que contiene, por ejemplo, Hespan y PlasmaLyte A, las células se congelan después a -80 °C a una velocidad de 1 ° por minuto y se almacenan en la fase de vapor de un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido. Pueden usarse otros métodos de congelación controlada, así como la congelación incontrolada inmediatamente a -20 °C o en nitrógeno líquido.

En determinados aspectos, las células crioconservadas se descongelan y se lavan como se describe en el presente documento y se dejan reposar durante una hora a temperatura ambiente antes de la activación usando los métodos de la presente invención.

También se contempla en el contexto de la invención la extracción de muestras de sangre o producto de aféresis de un sujeto en un período de tiempo anterior al momento en que se podrían necesitar las células expandidas como se describe en el presente documento. Como tal, la fuente de las células que se va a expandir se puede recoger en cualquier momento necesario y las células deseadas, tales como células T, se pueden aislar y congelar para su uso posterior en la terapia con células efectoras inmunitarias para cualquiera de un cierto número de enfermedades o afecciones que se beneficiarían de la terapia con células efectoras inmunitarias, tales como las descritas en esta memoria. En un aspecto, se toma una muestra de sangre o una aféresis de un sujeto generalmente sano. En determinados aspectos, se toma una muestra de sangre o una aféresis de un sujeto generalmente sano que está en riesgo de desarrollar una enfermedad, pero que aún no ha desarrollado una enfermedad, y las células de interés se aíslan y se congelan para su uso posterior. En determinados aspectos, los linfocitos T pueden expandirse, congelarse y utilizarse en un momento posterior. En determinados aspectos, se recogen muestras de un paciente poco después del diagnóstico de una enfermedad particular como se describe en esta memoria, pero antes de cualquier tratamiento. En un aspecto adicional, las células se aíslan de una muestra de sangre o una aféresis de un sujeto antes de cualquiera de varias modalidades de tratamiento relevantes, que incluyen, pero sin limitación, el tratamiento con agentes tales como natalizumab, efalizumab, agentes antivíricos, quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos, tales como CAMPATH, anticuerpos anti-CD3, citoxano, fludarabina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228 e irradiación.

En un aspecto adicional de la presente invención, las células T se obtienen de un paciente directamente después del tratamiento que deja al sujeto con células T funcionales. A este respecto, se ha observado que después de determinados tratamientos contra el cáncer, en particular los tratamientos con fármacos que dañan el sistema inmunitario, poco después del tratamiento durante el período en que los pacientes normalmente se recuperarían del tratamiento, la calidad de las células T obtenidas puede ser óptima o mejorada en lo que respecta a su capacidad de expandirse ex vivo. Del mismo modo, después de la manipulación ex vivo utilizando los métodos descritos en esta memoria , estas células pueden estar en un estado preferido para un mejor injerto y expansión in vivo. Por lo tanto, se contempla dentro del contexto de la presente invención recoger células de la sangre, incluidos linfocitos T, células dendríticas u otras células del linaje hematopoyético, durante esta fase de recuperación. Además, en determinados aspectos, la movilización (por ejemplo, la movilización con GM-CSF) y las pautas de acondicionamiento se pueden utilizar para crear una condición en un sujeto en donde se favorezca la repoblación, recirculación, regeneración y/o expansión de tipos de células particulares, especialmente durante una ventana de tiempo definida después de la terapia. Tipos ilustrativos de células incluyen células T, células B, células dendríticas y otras células del sistema inmunitario.

En una realización, las células efectoras inmunitarias que expresan una molécula CAR, p. ej., una molécula CAR descrita en esta memoria, se obtienen de un sujeto que ha recibido una dosis baja, de potenciación inmunitaria, de un inhibidor de mTOR. En una realización, la población de células efectoras inmunitarias, p. ej., células T, que se va a modificar para expresar un CAR, se recolecta después de un tiempo suficiente, o después de una dosificación suficiente con la dosis baja, de potenciación inmunitaria, de un inhibidor de mTOR, de modo que el nivel de células efectoras inmunitarias negativas para PD1, p. ej., células T, o la proporción de células efectoras inmunitarias negativas para PD1, p. ej., células T/células efectoras inmunitarias positivas para PD1, p. ej., células T, en el sujeto o recolectadas del sujeto se haya incrementado, al menos de manera transitoria.

En otras realizaciones, la población de células efectoras inmunitarias, p. ej., células T, que tienen, o se modificarán para expresar un CAR, se pueden tratar ex vivo por contacto con una cantidad de un inhibidor de mTOR que incrementa el número de células efectoras inmunitarias negativas para PD1, p. ej., células T, o incrementa la proporción de células efectoras inmunitarias negativas para PD1, p. ej., células T/células efectoras inmunitarias positivas para PD1, p. ej., células T.

En una realización, una población de células T es deficiente en diaglicerol quinasa (DGK, por sus siglas en inglés). Células deficientes en DGK incluyen células que no expresan ARN o proteína de DGK, o tienen una reducción o inhibición de la actividad de DGK. Células deficientes en DGK pueden generarse mediante enfoques genéticos, p. ej., administrando agentes que interfieren con el ARN, p. ej., ARNip, ARNsh, miARN, para reducir o prevenir la expresión de DGK. Como alternativa, las células deficientes en DGK se pueden generar mediante tratamiento con los inhibidores de DGK descritos en esta memoria .

En una realización, una población de células T es deficiente en Ikaros. Las células deficientes en Ikaros incluyen células que no expresan ARN o proteína de Ikaros, o tienen una reducción o inhibición de la actividad de Ikaros, las células deficientes en Ikaros se pueden generar mediante estrategias genéticas, p. ej., administrando agentes de interferencia por ARN, p. ej., ARNip, ARNhc, miARN, para reducir o evitar la expresión de Ikaros. Como alternativa, las células deficientes en Ikaros se pueden generar mediante tratamiento con inhibidores de Ikaros, p. ej., lenalidomida.

En realizaciones, una población de células T es deficiente en DGK y deficiente en Ikaros, p. ej., no expresa DGK ni Ikaros, o tiene una reducción o inhibición de la actividad de DGK e Ikaros. Células deficientes en DGK e Ikaros de este tipo se pueden generar mediante cualquiera de los métodos descritos en esta memoria.

En una realización, las células NK se obtienen del sujeto. En otra realización, las células NK son una línea celular NK, p. ej., la línea celular NK-92 (Conkwest).

Activación y Expansión de Células T

Células efectoras inmunitarias, tales como células T, pueden activarse y expandirse generalmente utilizando métodos como los descritos, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. 6.352.694; 6.534.055; 6.905.680; 6.692.964; 5.858.358; 6.887.466; 6.905.681; 7.144.575; 7.067.318; 7.172.869; 7.232.566; 7.175.843; 5.883.223; 6.905.874; 6.797.514; 6.867.041; y publicación de solicitud de patente de EE.UU. N° 20060121005.

Generalmente, una población de células efectoras inmunitarias puede expandirse por contacto con una superficie que tiene unido a ella un agente que estimula una señal asociada al complejo CD3/TCR y un ligando que estimula una molécula coestimulante en la superficie de las células T. En particular, poblaciones de células T pueden estimularse como se describe en esta memoria, tal como mediante contacto con un anticuerpo anti-CD3, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un anticuerpo anti-CD2 inmovilizado en una superficie, o mediante contacto con un activador de proteína quinasa C (p. ej., briostatina) junto con un ionóforo de calcio. Para la coestimulación de una molécula accesoria sobre la superficie de las células T se utiliza un ligando que se une a la molécula accesoria. Por ejemplo, una población de células T se puede poner en contacto con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, en condiciones apropiadas para estimular la proliferación de las células T. Para estimular la proliferación de células T CD4+ o células T CD8+, un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28. Ejemplos de un anticuerpo anti-CD28 incluyen 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besangon, Francia) pueden usarse al igual que otros métodos comúnmente conocidos en la técnica (Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999).

En determinados aspectos, la señal estimuladora primaria y la señal coestimuladora para la célula T pueden proporcionarse mediante protocolos diferentes. Por ejemplo, los agentes que proporcionan cada una de las señales pueden estar en solución o acoplados a una superficie. Cuando están acoplados a una superficie, los agentes pueden acoplarse a la misma superficie (es decir, en formación "cis") o a superficies separadas (es decir, en formación "trans"). Como alternativa, un agente puede estar acoplado a una superficie y el otro agente en solución. En un aspecto, el agente que proporciona la señal coestimuladora está unido a una superficie celular y el agente que proporciona la señal de activación primaria está en solución o acoplado a una superficie. En determinados aspectos, ambos agentes pueden estar en solución. En un aspecto, los agentes pueden estar en forma soluble y luego reticulados a una superficie, tal como una célula que expresa receptores Fc o un anticuerpo u otro agente de unión que se unirá a los agentes. A este respecto, véanse, por ejemplo, las publicaciones de solicitudes de patente de EE.UU. N°s. 20040101519 y 20060034810 para células de presentación de antígenos artificiales (aAPCs, por sus siglas en inglés) que se contemplan para su uso en la activación y expansión de células T en la presente invención.

En un aspecto, los dos agentes se inmovilizan en perlas, ya sea en la misma perla, es decir, "cis", o en perlas separadas, es decir, "trans". A modo de ejemplo, el agente que proporciona la señal de activación primaria es un anticuerpo anti-CD3 o un fragmento de unión a antígeno del mismo y el agente que proporciona la señal coestimuladora es un anticuerpo anti-CD28 o un fragmento de unión a antígeno del mismo; y ambos agentes están co-inmovilizados en la misma perla en cantidades moleculares equivalentes. En un aspecto, se utiliza una relación de 1:1 de cada uno de los anticuerpos unidos a las perlas para la expansión de células T CD4+ y el crecimiento de células T. En determinados aspectos de la presente invención, se utiliza una relación de anticuerpos anti-CD3:CD28 unidos a las perlas tal que se observa un aumento en la expansión de células T en comparación con la expansión observada utilizando una relación de 1:1. En un aspecto particular, se observa un aumento de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 veces en comparación con la expansión observada utilizando una relación de 1:1. En un aspecto, la relación de anticuerpo CD3 :CD28 unido a las perlas oscila entre 100:1 y 1:100 y todos los valores enteros intermedios. En un aspecto, se une más anticuerpo anti-CD28 a las partículas que anticuerpo anti-CD3, es decir, la relación de CD3:CD28 es menor que uno. En determinados aspectos, la relación de anticuerpo anti CD28 a anticuerpo anti CD3 unido a las perlas es mayor que 2:1. En un aspecto particular, se utiliza una relación CD3:CD28 1:100 del anticuerpo unido a perlas. En un aspecto, se utiliza una relación de CD3:CD28 de 1:75 del anticuerpo unido a perlas. En un aspecto adicional, se utiliza una relación de CD3:CD28 de 1:50 del anticuerpo unido a perlas. En un aspecto, se utiliza una relación de CD3:CD28 de 1:30 del anticuerpo unido a perlas. En un aspecto preferido, se utiliza una relación de CD3:CD28 de 1:10 del anticuerpo unido a perlas. En un aspecto, se utiliza una relación de CD3:CD28 de 1:3 del anticuerpo unido a las perlas. En un aspecto más, se utiliza una relación de CD3:CD28 de 3:1 de anticuerpo unido a las perlas.

Pueden utilizarse relaciones de partículas con respecto a células de 1:500 a 500:1 y cualquier valor entero intermedio para estimular células T u otras células diana. Como podrán apreciar fácilmente los expertos en la técnica, la relación de partículas a células puede depender del tamaño de las partículas con respecto a la célula diana. Por ejemplo, las perlas de tamaño pequeño solo podrían unirse a unas pocas células, mientras que las perlas más grandes podrían unirse a muchas. En determinados aspectos, la relación de células con respecto a partículas varía de 1:100 a 100:1 y cualquier valor entero intermedio y, en aspectos adicionales, la relación comprende de 1:9 a 9:1 y también se puede utilizar cualquier valor entero intermedio para estimular células T. La proporción de partículas acopladas anti-CD3 y anti-CD28 respecto a las células T que dan como resultado la estimulación de células T puede variar como se ha indicado anteriormente, sin embargo, determinados valores preferidos incluyen 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 y 15:1 siendo una relación preferida al menos 1:1 de partículas por célula T. En un aspecto, se utiliza una relación de partículas a células de 1:1 o menos. En un aspecto particular, una relación de partículas:células preferida es 1:5. En aspectos adicionales, la relación de partículas con respecto a células puede variar dependiendo del día de estimulación. Por ejemplo, en un aspecto, la relación de partículas a células es de 1:1 a 10:1 el primer día y se añaden partículas adicionales a las células cada día o cada dos días después durante hasta 10 días, en relaciones finales de 1:1 a 1:10 (basado en el recuento de células el día de la adición). En un aspecto particular, la relación de partículas con respecto a células es 1:1 el primer día de estimulación y se ajusta a 1:5 el tercer y el quinto día de estimulación. En un aspecto, las partículas se añaden diariamente o cada dos días hasta una relación final de 1:1 el primer día y de 1:5 el tercer y el quinto días de estimulación. En un aspecto, la relación de partículas con respecto a células es 2:1 el primer día de estimulación y se ajusta a 1:10 el tercer y el quinto día de estimulación. En un aspecto, las partículas se añaden diariamente o cada dos días hasta una relación final de 1:1 el primer día y de 1:10 el tercer y el quinto días de estimulación. Un experto en la técnica apreciará que una diversidad de otras relaciones puede ser adecuada para su uso en la presente invención. En particular, las relaciones variarán dependiendo del tamaño de partícula y del tamaño y tipo de célula. En un aspecto, las relaciones de uso más típicas están en el entorno de 1:1,2:1 y 3:1 el primer día.

En aspectos adicionales, las células, tales como células T, se combinan con perlas recubiertas con agente, las perlas y las células se separan posteriormente y luego se cultivan las células. En un aspecto alternativo, antes del cultivo, las perlas recubiertas con agente y las células no se separan, sino que se cultivan juntas. En un aspecto adicional, las perlas y las células se concentran primero mediante la aplicación de una fuerza, tal como una fuerza magnética, lo que da lugar a un aumento del ligamiento de los marcadores de la superficie celular, induciendo con ello la estimulación de las células.

A modo de ejemplo, las proteínas de la superficie celular pueden ligarse permitiendo que las perlas paramagnéticas a las que se unen anti-CD3 y anti-CD28 (3x28 perlas) entren en contacto con las células T. En un aspecto, las células (p. ej., 104 a 109 células T) y las perlas (p. ej., perlas paramagnéticas DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T en una relación de 1:1) se combinan en un tampón, por ejemplo, p Bs (sin cationes divalentes tales como calcio y magnesio). De nuevo, los expertos ordinarios en la técnica pueden apreciar fácilmente que se puede utilizar cualquier concentración de células. Por ejemplo, la célula diana puede ser muy rara en la muestra y comprender solo el 0,01 % de la muestra o la muestra completa (es decir, el 100 %) puede comprender la célula diana de interés. Por consiguiente, cualquier número de células está dentro del contexto de la presente invención. En determinados aspectos, puede ser deseable disminuir significativamente el volumen en donde se mezclan juntas las partículas y las células (es decir, aumentar la concentración de células), para garantizar el máximo contacto de las células y las partículas. Por ejemplo, en un aspecto, se utiliza una concentración de aproximadamente 2 billones de células/ml. En un aspecto, se utilizan más de 100 millones de células/ml. En un aspecto adicional, se utiliza una concentración de células 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 millones de células/ml. En un aspecto más, se utiliza una concentración de células de 75, 80, 85, 90, 95 o 100 millones de células/ml. En aspectos adicionales, pueden utilizarse concentraciones de 125 o 150 millones de células/ml. El uso de concentraciones elevadas puede dar como resultado un mayor rendimiento celular, activación celular y expansión celular. Además, el uso de altas concentraciones celulares permite una captura más eficaz de células que pueden expresar débilmente antígenos diana de interés, tales como las células T CD28-negativas. Este tipo de poblaciones de células pueden tener valor terapéutico y sería deseable obtenerlas en determinados aspectos. Por ejemplo, el uso de una concentración elevada de células permite una selección más eficaz de células T CD8+ que normalmente tienen una expresión de CD28 más débil.

En una realización, las células transducidas con un ácido nucleico que codifica un CAR, p. ej., un CAR descrito en esta memoria, se expanden, p. ej., mediante un método descrito en esta memoria. En una realización, las células se expanden en cultivo durante un período de varias horas (p. ej., aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 18, 21 horas) a aproximadamente 14 días (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 días). En una realización, las células se expanden durante un período de 4 a 9 días. En una realización, las células se expanden durante un período de 8 días o menos, p. ej., 7, 6 o 5 días. En una realización, las células, p. ej., una célula CAR CD19 descrita en el presente documento, se expanden en cultivo durante 5 días y las células resultantes son más potentes que las mismas células expandidas en cultivo durante 9 días en las mismas condiciones de cultivo. La potencia se puede definir, p. ej., mediante diversas funciones de células T, p. ej., proliferación, eliminación de células diana, producción de citoquinas, activación, migración o combinaciones de éstas. En una realización, las células, p. ej., una célula CAR CD19 descrita en esta memoria, expandidas durante 5 días muestran al menos un aumento de una, dos, tres o cuatro veces en duplicaciones celulares tras la estimulación con antígeno en comparación con las mismas células expandidas en cultivo durante 9 días en las mismas condiciones de cultivo. En una realización, las células, p. ej., las células que expresan un CAR CD19 descrito en esta memoria, se expanden en cultivo durante 5 días, y las células resultantes presentan una mayor producción de citoquinas proinflamatorias, p. ej., niveles de IFN-y y/o g M-CSF, en comparación con las mismas células expandidas en cultivo durante 9 días en las mismas condiciones de cultivo. En una realización, las células, p. ej., una célula CAR CD19 descrita en esta memoria, expandidas durante 5 días muestran un aumento de al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, diez veces o más en pg/ml de producción de citoquinas proinflamatorias, p. ej., niveles de IFN-y y/o GM-CSF, en comparación con las mismas células expandidas en cultivo durante 9 días en las mismas condiciones de cultivo.

También pueden ser deseables varios ciclos de estimulación, de modo que el tiempo de cultivo de las células T pueda ser de 60 días o más. Condiciones apropiadas para el cultivo de células T incluyen un medio apropiado (p. ej., Medio Esencial Mínimo o Medio RPMI 1640 o X-vivo 15, (Lonza)) que puede contener factores necesarios para la proliferación y viabilidad, incluido suero (p. ej., suero fetal bovino o humano), interleuquina-2 (IL-2), insulina, IFN-y, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFp y TNF-a o cualesquiera otros aditivos para el crecimiento de células conocidos por el experto en la técnica. Otros aditivos para el crecimiento de células incluyen, pero no se limitan a tensioactivos, plasmanato y agentes reductores tales como N-acetilcisteína y 2-mercaptoetanol. Los medios pueden incluir RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 15 y X-Vivo 20, Optimizer, con aminoácidos añadidos, piruvato de sodio y vitaminas, ya sea exentos de suero o complementados con una cantidad apropiada de suero (o plasma) o un conjunto definido de hormonas, y/o una cantidad de citoquina o citoquinas suficiente para el crecimiento y la expansión de células T. Antibióticos, p. ej., penicilina y estreptomicina, se incluyen solo en cultivos experimentales, no en cultivos de células que se han de infundir en un sujeto. Las células diana se mantienen en las condiciones necesarias para sustentar el crecimiento, por ejemplo, una temperatura (p. ej., 37 °C) y una atmósfera (p. ej., aire más un 5 % de CO2) apropiadas.

En una realización, las células se expanden en un medio apropiado (p. ej., medio descrito en esta memoria) que incluye una o más interleuquinas que dan como resultado al menos 200 veces (p. ej., 200 veces, 250 veces, 300 veces, 350 veces) en células durante un período de expansión de 14 días, p. ej., medido mediante un método descrito en esta memoria tal como citometría de flujo. En una realización, las células se expanden en presencia de IL-15 y/o IL-7 (p. ej., IL-15 e IL-7).

Las células T que se han expuesto a tiempos de estimulación variados pueden presentar características diferentes. Por ejemplo, los productos de células mononucleares de la sangre periférica o aféresizados típicos tienen una población de células T auxiliares (TH, CD4+) que es mayor que la población de células T citotóxicas o supresoras (TC, CD8+). La expansión ex vivo de las células T mediante la estimulación de receptores CD3 y CD28 produce una población de células T que antes de aproximadamente los días 8-9 consiste predominantemente en células TH, mientras que después de aproximadamente los días 8-9, la población de células T comprende una población cada vez mayor de células T<c>. Por consiguiente, dependiendo del propósito del tratamiento, puede ser ventajoso infundir a un sujeto una población de células T que comprende predominantemente células TH. De manera similar, si se ha aislado un subconjunto de células TC específicas para el antígeno, puede ser beneficioso expandir este subconjunto hasta un grado mayor.

Además, aparte de los marcadores CD4 y CD8, otros marcadores fenotípicos varían significativamente, pero en gran parte, de forma reproducible durante el curso del proceso de expansión celular. Por lo tanto, una reproducibilidad de este tipo permite la capacidad de adaptar un producto de células T activadas para fines específicos

Ensayos

Una vez que se construye un CAR, se pueden utilizar diversos ensayos para evaluar la actividad de la molécula, tales como, pero no limitados a la capacidad de expandir las células T después de la estimulación con antígeno, mantener la expansión de las células T en ausencia de re-estimulación y actividades anti-cancerosas en modelos animales apropiados. Ensayos para evaluar los efectos de un CAR se describen con más detalle a continuación.

El análisis de transferencia Western de la expresión de CAR en células T primarias se puede utilizar para detectar la presencia de monómeros y dímeros. Véase,p. ej.,Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Muy brevemente, células T (mezcla 1:1 de células T CD4+ y CD8+) que expresan los CARs se expandenin vitrodurante más de 10 días seguido de lisis y SDS-PAGE en condiciones reductoras. CARs que contienen el dominio citoplásmico TCR-Z de longitud completa y la cadena TCR-Z endógena se detectan mediante transferencia Western utilizando un anticuerpo contra la cadena TCR-Z. Los mismos subconjuntos de células T se utilizan para el análisis SDS-PAGE en condiciones no reductoras para permitir la evaluación de la formación de dímero covalente.

La expansiónin vitrode células T CAR+ después de la estimulación con antígeno se puede medir mediante citometría de flujo. Por ejemplo, se estimula una mezcla de linfocitos T CD4+ y CD8+ con aAPCs aCD3/aCD28, lo cual va seguido de transducción con vectores lentivíricos que expresan GFP bajo el control de los promotores que se han de analizar. Promotores ejemplares incluyen el gen CMV IE, EF-1a, ubiquitina C o promotores de fosfogliceroquinasa (PGK). La fluorescencia de GFP se evalúa el día 6 de cultivo en los subconjuntos de linfocitos T CD4+ y/o CD8+ mediante citometría de flujo. Véase,p. ej.,Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009).

También se puede medir la expansión sostenida de las células CAR+ T en ausencia de re-estimulación. Véase,p. ej.,Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Resumiendo, el volumen medio de linfocitos T (fl) se mide el día 8 de cultivo utilizando un contador de partículas Coulter Multisizer III después de la estimulación con perlas magnéticas recubiertas con aCD3/aCD28 el día 0, y la transducción con el CAR indicado el día 1.

La evaluación de la proliferación celular y la producción de citoquinas se puede realizar como se describe previamente,p. ej.,en Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009).

La citotoxicidad se puede evaluar mediante un ensayo convencional de liberación de 51Cr. Véase,p. ej.,Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009), o mediante ensayos de degranulación estándares, como se describe en el Ejemplo 5. Por ejemplo, células T con CAR de ARN que co-expresan un CAR y una o más moléculas coestimuladoras se incuban con células diana que expresan el antígeno fijado como objetivo por el CAR. A modo de ejemplo, un CAR que fija como objetivo mesotelina que expresa células T que también expresan una o más moléculas co-estimuladoras se incuba con células diana que expresan mesotelina (K-meso, SKOV3) y células mesotelina-negativas (K562) y se evalúa para la exposición a CD107a en un ensayo de degranulación.

Se puede testar la capacidad de los ETPs candidatos para potenciar el cebado de células T utilizando el sistema de cebado in vitro modificado descrito en los Ejemplos 2 y 3. Brevemente, cada uno de los ETPs candidatos se suministra conjuntamente con un CAR en las células T y se expone a una ronda de estimulación antigénica con, p. ej., un antígeno tumoral tal como MART-1. En los ejemplos que figuran más adelante se proporciona un método ejemplar.

También se pueden utilizar otros ensayos, incluidos los descritos en la sección de Ejemplos de esta memoria, así como los que se conocen en la técnica, para evaluar las construcciones CAR de uso en la invención.

Aplicaciones terapéuticas

La presente invención proporciona células T para uso en una diversidad de métodos terapéuticos, estando las células T modificadas genéticamente para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) y uno o más ETPs de acuerdo con las reivindicaciones, p. ej., células T con ETP-CAR. En una realización, las células T se modifican genéticamente para expresar transitoriamente un ARN que codifica CAR y un ARN que codifica ETP, p. ej., células T con ETP-CAR de ARN. Esto se logra infundiendo células T con ETP-CAR, p. ej., células T con ETP-CAR de ARN, en un receptor que lo necesite. La célula infundida es capaz de matar células que expresan el antígeno al que se une la porción del CAR que se une al antígeno. En determinadas realizaciones, el antígeno es un antígeno tumoral y la célula T se administra a un receptor con cáncer. La respuesta antitumoral provocada por la célula T con ETP-CAR, p. ej., la célula T con ETP-CAR de ARN, implica tanto la destrucción celular mediada por CAR como el cebado de linfocitos T citotóxicos potenciado por ETP con péptidos antigénicos específicos del tumor

derivados de, p. ej., células tumorales exterminadas por la actividad del CAR. La expresión de CAR de ARN y ETP de ARN da como resultado una terapia transitoria (debido a la expresión transitoria de CAR y ETPs) con efectos antitumorales permanentes (debido a la persistencia del cebado de células T con ETP-CAR de ARN de células T reactivas a tumores). En realizaciones particulares, los CAR y ETP de ARNs en las células T con ETP-CAR de ARN administradas al paciente, o su progenie, persisten en el paciente durante 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 días después de la transducción después de la administración de la célula T con ETP-CAR de ARN al paciente.

Por consiguiente, en una realización, la invención proporciona células T con ETP-CAR de ARN de la invención para uso en un método para inhibir la proliferación o reducir una población celular que expresa un antígeno asociado a una enfermedad poniendo en contacto una población de células que expresan el antígeno asociado a una enfermedad con una célula T con ETP-CAR de ARN de la invención que se une al antígeno asociado a la enfermedad. En una realización, las células son células cancerosas. En otras realizaciones, la célula T con ETP-CAR, p. ej., la célula T con ETP-CAR de ARN, reduce la cantidad, el número, la cantidad o el porcentaje de células y/o células cancerosas en al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 65 %, al menos un 75 %, al menos un 85 %, al menos un 95 % o al menos un 99 % en un sujeto con cáncer o un modelo animal de cáncer con respecto a un control negativo. En otra realización, el sujeto es un ser humano.

La eficacia de las células T con ETP-CAR, p. ej., células T con ETP-CAR de ARN, de la invención se puede testar utilizando modelos animales reconocidos en la técnica para la indicación particular de interés. Por ejemplo, en el contexto del cáncer, los modelos de ratón con cáncer establecidos están ampliamente disponibles para el cáncer de interés particular.

En otra realización, la invención proporciona células T con ETP-CAR de la invención para uso en métodos para prevenir, tratar y/o gestionar un trastorno asociado con células que expresan un antígeno asociado a una enfermedad mediante la administración a un sujeto que lo necesita de una célula T con ETP-CAR, p. ej., célula T con ETP-CAR de ARN, de la invención que se une a la célula que expresa antígeno asociada a la enfermedad. En una realización, el sujeto es un ser humano.

En otra realización, la invención proporciona células T con ETP-CAR de la invención para uso en métodos para prevenir la recaída del cáncer asociada con células que expresan un antígeno tumoral particular mediante la administración a un sujeto que lo necesita de una célula T con ETP-CA<r>, p. ej., una célula T con ETP-CAR de ARN, de la invención que se une a la célula que expresa el antígeno tumoral. En otra realización, los métodos comprenden administrar al sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de una célula T con ETP-CAR, p. ej., célula T con ETP-CAR de ARN

de la invención que se une a la célula que expresa antígeno asociada a la enfermedad en combinación con una cantidad eficaz de otra terapia.

En otra realización, la invención proporciona células T con ETP-CAR de la invención para uso en un método para inhibir el crecimiento de una célula que expresa un antígeno tumoral, poniendo en contacto la célula tumoral con una célula T con ETP-CAR, p. ej., célula T con ETP-CAR de ARN, de la presente invención, de manera que la célula T con ETP-CAR se activa en respuesta al antígeno y fija como objetivo la célula cancerosa, en donde se inhibe el crecimiento del tumor. En una realización, la célula T con ETP-CAR activada, p. ej., la célula T con ETP-CAR de ARN, fija como objetivo y mata la célula cancerosa y/o potencia la propagación del epítopo.

En otra realización, la invención proporciona células T con ETP-CAR de la invención para uso en un método para tratar una enfermedad proliferativa (p. ej., cáncer) mediante la administración a un sujeto de una célula T con ETP-CAR, p. ej., célula T con ETP-CAR de ARN, de la presente invención, de manera que el cáncer se trate en el sujeto. Ejemplos no limitativos de un cáncer que se puede tratar mediante la presente invención incluye cáncer de cerebro, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer colorrectal, cáncer de hígado, cáncer de riñón, linfoma, leucemia, cáncer de pulmón, melanoma, melanoma metastásico, mesotelioma, neuroblastoma, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer renal, cáncer de piel, timoma, sarcoma, linfoma no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, cáncer de útero y combinaciones de los mismos.

En otra realización, la invención proporciona células T con ETP-CAR de la invención para uso en un método para tratar una afección precancerosa mediante la administración a un sujeto de una célula T con ETP-CAR, p. ej., célula T con ETP-CAR de ARN, de la invención, de manera que la afección precancerosa sea tratada en el sujeto

En otra realización, la invención proporciona células T con ETP-CAR de la invención para uso en un método para tratar una indicación no cancerosa administrando a un sujeto una célula T con ETP-CAR, p. ej., célula T con ETP-CAR de ARN, de la presente invención de manera que la indicación no cancerosa sea tratada en el sujeto. Ejemplos no limitantes de indicaciones no cancerosas incluyen trastornos inflamatorios, trastornos autoinmunes, infecciones parasitarias, virales, bacterianas, fúngicas u otras infecciones.

En una realización particular, las células T con ETP-CAR totalmente humanas de la invención se utilizan como vacuna para la inmunización ex vivo y/o terapia in vivo en un mamífero (p. ej., un ser humano). Para la inmunización ex vivo, al menos se produce al menos uno de lo siguiente preferiblemente in vitro antes de administrar la célula a un mamífero: i) expansión de las células, ii) introducción de un ácido nucleico que codifica un CAR y un ETP, como se describe en esta memoria, a las células o iii) crioconservación de las células. En otra realización, la invención proporciona células T con ETP-CAR de la invención para uso en un método para vacunar a un sujeto, que comprende administrar

al sujeto una célula T con ETP-CAR, p. ej., una célula T con ETP-CAR de ARN, de la presente invención. P. ej., el sujeto es vacunado contra un cáncer, una infección viral o una infección bacteriana. En una realización, el método comprende, además, administrar al sujeto un antígeno, p. ej., un antígeno tumoral, un antígeno viral o un antígeno bacteriano. La vacunación de un sujeto se puede determinar detectando la capacidad del sujeto para generar una respuesta inmunitaria a la enfermedad particular, p. ej., midiendo el título de anticuerpos contra un antígeno asociado a la enfermedad, p. ej., un antígeno tumoral, un antígeno viral o un antígeno bacteriano.

Procedimientos ex vivo son bien conocidos en la técnica y se comentan más detalladamente en lo que sigue . En resumen, las células se aíslan de un mamífero (p. ej., un ser humano) y se modifican genéticamente (es decir, se transducen o transfectan in vitro) con un vector que expresa un CAR descrito en esta memoria. La célula modificada con un CAR se puede administrar a un receptor mamífero para proporcionar un beneficio terapéutico. El receptor mamífero puede ser un ser humano y la célula modificada con un CAR puede ser autóloga con respecto al receptor. Como alternativa, las células pueden ser alogénicas, singénicas o xenogénicas con respecto al receptor.

Procedimientos para la expansión ex vivo de células madre hematopoyéticas y progenitoras se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. N° 5.199.942 se puede aplicar a las células de la presente invención. Se conocen otros métodos adecuados en la técnica, por lo tanto, la presente invención no se limita a método particular alguno de expansión ex vivo de las células. En resumen, el cultivo y la expansión ex vivo de células T comprende: (1) recoger células madre y progenitoras hematopoyéticas CD34+ de un mamífero a partir de extracciones de sangre periférica o explantes de médula ósea; y (2) expandir células de este tipo ex vivo. Además de los factores de crecimiento celular descritos en la patente de los EE.UU. N° 5.199.942, se pueden utilizar otros factores tales como flt3-L, IL-1, IL-3 y ligando c-kit, para el cultivo y la expansión de las células.

Además de proporcionar una vacuna basada en células para inmunización ex vivo, la presente invención también proporciona composiciones para la inmunización in vivo para provocar una respuesta inmune dirigida contra un antígeno en un paciente.

Generalmente, las células activadas y expandidas como se describe en esta memoria pueden utilizarse en el tratamiento y la prevención de enfermedades que surgen en personas inmunocomprometidas. En determinados aspectos, las células de la invención se utilizan en el tratamiento de pacientes en riesgo de desarrollar enfermedades, trastornos y afecciones asociadas con la expresión de un antígeno asociado a una enfermedad. Por lo tanto, la presente invención proporciona células T con ETP-CAR de la invención para uso en métodos para el tratamiento o la prevención de enfermedades, trastornos y afecciones asociados con la expresión de un antígeno asociado a una enfermedad, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de células T con ETP-CAR de la invención, p. ej., células T con ETP-CAR de ARN, que se unen a células que expresan el antígeno asociado a la enfermedad.

Las células T con ETP-CAR de la presente invención, p. ej., células T con ETP-CAR de ARN, se pueden administrar solas o como una composición farmacéutica en combinación con diluyentes y/o con otros componentes tales como IL-2 u otras citoquinas o poblaciones de células.

Composiciones farmacéuticas

Composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden una célula T con ETP-CAR, p. ej., una célula T con ETP-CAR de ARN de la presente invención, en combinación con uno o más soportes, diluyentes o excipientes farmacéutica o fisiológicamente aceptables. Composiciones de este tipo pueden comprender tampones tales como solución salina tamponada neutra, solución salina tamponada con fosfato y similares; hidratos de carbono, tales como glucosa, manosa, sacarosa o dextranos, manitol; proteínas; polipéptidos o aminoácidos tales como glicina; antioxidantes; agentes quelantes tales como EDTA o glutatión; adyuvantes (p. ej., hidróxido de aluminio); y conservantes. Las composiciones de la presente invención están en un aspecto formuladas para la administración intravenosa.

Se pueden administrar composiciones farmacéuticas de la presente invención de una manera apropiada para la enfermedad que se ha de tratar (o prevenir). La cantidad y frecuencia de administración serán determinadas por factores tales como la condición del paciente, y el tipo y gravedad de la enfermedad del paciente, aunque las dosificaciones apropiadas se pueden determinar mediante ensayos clínicos.

Cuando se indica "una cantidad inmunológicamente eficaz", "una cantidad antitumoral eficaz", "una cantidad eficaz inhibidora de tumores" o "cantidad terapéutica", se puede determinar la cantidad precisa de las composiciones de la presente invención que se han de administrar por un médico teniendo en cuenta las diferencias individuales en edad, peso, tamaño del tumor, extensión de la infección o metástasis y condición del paciente (sujeto). Generalmente se puede afirmar que una composición farmacéutica que comprende las células T descritas en esta memoria se puede administrar con una dosificación de 104 a 109 células/kg de peso corporal, en algunos casos de 105 a 106 células/kg de peso corporal, incluidos todos los valores enteros dentro de esos intervalos. Composiciones de células T también se pueden administrar múltiples veces a estas dosificaciones. Las células se pueden administrar utilizando técnicas de infusión que se conocen comúnmente en inmunoterapia (véase, p. ej., Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988). Un experto en la técnica de la medicina puede determinar fácilmente la dosificación y el régimen de tratamiento óptimos para un paciente particular vigilando al paciente para detectar signos de enfermedad y ajustando el tratamiento en consecuencia.

En determinados casos, puede ser deseable administrar células T activadas a un sujeto y luego volver a extraer sangre (o realizar una aféresis), activar células T a partir de la misma de acuerdo con la presente divulgación y reinfundir al paciente estas células T activadas y expandidas. Este proceso se puede realizar varias veces cada pocas semanas. En determinados aspectos, las células T pueden activarse a partir de extracciones de sangre de 10 cc a 400 cc. En determinados aspectos, las células T se activan a partir de extracciones de sangre de 20 cc, 30 cc, 40 cc, 50 cc, 60 cc, 70 cc, 80 cc, 90 cc o 100 cc. Sin querer estar ligados a teoría alguna, el uso de este protocolo de extracción de sangre múltiple/reinfusión múltiple puede seleccionar determinadas poblaciones de células T.

La administración de las composiciones se puede realizar de cualquier manera conveniente, incluyendo mediante inhalación de aerosol, inyección, ingestión, transfusión, implantación o trasplante. Las composiciones se pueden administrar a un paciente por vía transarterial, subcutánea, intradérmica, intratumoral, intranodal, intramedular, intramuscular, mediante inyección intravenosa (i.v.) o intraperitoneal. En una realización, las composiciones se administran a un paciente mediante inyección intradérmica o subcutánea. En una realización, las composiciones se administran mediante inyección i.v. En una realización, las composiciones se inyectan directamente en un tumor, ganglio linfático o sitio de infección.

En una realización, las células activadas y expandidas utilizando los métodos descritos en esta memoria, u otros métodos conocidos en la técnica en que las células T se expanden a niveles terapéuticos, se administran a un paciente junto con (p. ej., antes, simultáneamente o después) cualquier número de modalidades de tratamiento relevantes que incluyen, pero no se limitan a tratamiento con agentes tales como terapia antiviral, tratamiento con cidofovir e interleuquina-2, citarabina (también conocida como ARA-C) o natalizumab para pacientes con MS o tratamiento con efalizumab para pacientes con psoriasis u otros tratamientos para pacientes con PML (leucoencefalopatía multifocal progresiva). En aspectos adicionales, las células T de la invención se pueden utilizar en un régimen de tratamiento en combinación con quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos tales como CAMPATH, anticuerpos anti-CD3 u otras terapias con anticuerpos, citotoxina, fludarabina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228, citoquinas e irradiación. También se pueden utilizar medicamentos que inhiben la fosfatasa calcineurina dependiente del calcio (ciclosporina y FK506) o inhiben la quinasa p70S6 que es importante para la señalización inducida por el factor de crecimiento (rapamicina). (Liu et al., Cell 66 :807-815, 1991 ; Henderson et al., Immun. 73 :316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993). En un aspecto adicional, las composiciones celulares de la presente invención se administran a un paciente junto con (p. ej., antes, simultáneamente o después) de un trasplante de médula ósea, terapia ablativa de células T utilizando agentes de quimioterapia tales como fludarabina, terapia con radiación de haz externo (XRT), ciclofosfamida o anticuerpos tales como OKT3 o CAMPATH. En un aspecto, las composiciones celulares de la presente invención se administran después de una terapia ablativa de células B, tal como agentes que reaccionan con CD20, p. ej., Rituxan. Por ejemplo, en una realización, los sujetos se pueden someter a un tratamiento convencional con una dosis elevada de quimioterapia seguida del trasplante de células madre de la sangre periférica. En determinadas realizaciones, después del trasplante, los sujetos reciben una infusión de las células inmunitarias expandidas de la presente invención. En una realización adicional, las células expandidas se administran antes o después de la cirugía.

En una realización particular, los sujetos se someten a leucocitaféresis, en la que los leucocitos se recogen, enriquecen o agotan ex vivo para seleccionar y/o aislar las células de interés,p. ej.,células T. Estos aislados de células T pueden expandirse mediante métodos conocidos en la técnica y tratarse de manera que se puedan introducir una o más construcciones CAR y ETP de uso en la invención, creando así una célula T con ETP-CAR de la invención, p. ej., célula T con ETP-CAR de ARN. Los sujetos que lo necesiten pueden someterse posteriormente a un tratamiento estándar con dosis altas de quimioterapia seguida de un trasplante de células madre de la sangre periférica. En determinados aspectos, después o simultáneamente con el trasplante, los sujetos reciben una infusión de células T con ETP-CAR expandidas de la presente invención, p. ej., células T con ETP-CAR de ARN. En un aspecto adicional, las células expandidas se administran antes o después de la cirugía.

La dosificación de los tratamientos anteriores para administrar a un paciente variará con la naturaleza precisa de la afección que se está tratando y el receptor del tratamiento. El cambio de escala de las dosificaciones para la administración humana se puede realizar de acuerdo con las prácticas aceptadas en la técnica. La dosis de CAMPATH, por ejemplo, estará generalmente en el intervalo de 1 a aproximadamente 100 mg para un paciente adulto, habitualmente administrada diariamente durante un período de entre 1 y 30 días. La dosis diaria preferida es de 1 a 10 mg al día, aunque en algunos casos se pueden utilizar dosis mayores de hasta 40 mg al día (descritas en la patente de EE.UU. N° 6.120.766).

La invención se describe adicionalmente en más detalle haciendo referencia a los siguientes ejemplos experimentales. Estos ejemplos se proporcionan a efectos únicamente ilustrativos, y no se pretende que sean limitantes a menos que se especifique lo contrario. Por tanto, la invención no debe interpretarse de ninguna manera como limitada a los siguientes ejemplos. La invención está definida por las reivindicaciones adjuntas.

Sin una descripción adicional, se cree que un experto ordinario en la técnica puede, utilizando la descripción anterior y los siguientes ejemplos ilustrativos, preparar y utilizar los compuestos de la presente invención y poner en práctica los métodos reivindicados. Los siguientes ejemplos prácticos señalan específicamente diversos aspectos de la presente invención, y no se han de considerar limitantes de modo alguno del resto de la divulgación.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Materiales y Métodos Generales

Los siguientes materiales y métodos generales se utilizan en los experimentos y ejemplos descritos en esta memoria.

Cultivo celular

PBMs primarias, células T CD4+ purificadas y células T CD8+ purificadas procedían de donantes HLA-A2+ sanos normales y se adquirieron de University of Pennsylvania Perelman School of Medicine Human Immunology Core, Filadelfia, PA. Células K562 y SKOV3 eran de ATCC (Manassas, VA) y las células K-meso eran del Laboratorio de C. June (Filadelfia, PA). Las células K562 se derivaron de una leucemia mieloide crónica (NY-ESO-1-CD19-), SKOV3 de un adenocarcinoma y las células K-meso fueron células K562 transducidas para expresar mesotelina. Todas las células se cuantificaron y dimensionaron utilizando un CONTADOR COULTER Multisizer 3 (MS3; Beckman Coulter, Brea, CA).

Las DCs se cultivaron a partir de PBMCs que se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS; Gibco® Life Technologies (LTI), Grand Island, NY), se resuspendieron en medio AlM-V® (AIM-V; LTI) y luego se incubaron en un matraz tratado con cultivo de tejido de plástico (Corning, Tewksbury, MA) durante 2 h a 37 ° C en una incubadora con 5 % de CO2. Las células no adherentes (PBLs) se separaron de las células adherentes (monocitos) agitando primero el medio en el matraz hasta que las células no adherentes se reunieron, transfiriendo el sobrenadante que contenía las células no adherentes a un recipiente separado y luego lavando las células adherentes dos veces con PBS para eliminar las células no adherentes restantes. Luego se congelaron las PBLs no adherentes para su uso posterior como efectores en el ensayo de cebado in vitro modificado. Brevemente, las PBLs recién aisladas se lavaron dos veces con PBS, se resuspendieron en medio AIM-V que contenía suero bovino fetal al 40 % (FBS; HyClone® Thermo Fisher Scientific, Logan, Ut ) y sulfóxido de dimetilo (Dm SO) al 10 % Hybri-Max® (DMSO; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), se congelaron en un recipiente con velocidad controlada a -80 °C y luego se transfirieron a nitrógeno líquido para su almacenamiento.

Se cultivaron DCs inmaduras a partir de monocitos adherentes en AIM-V que contenía IL-4 humana recombinante (500 U/ml) y GM-CSF (800 U/ml) durante 7 días (R&D, Minneapolis, MN), incluidas las alimentaciones en los días 1, 3 y 5. El día 7, las DCs inmaduras adherentes se lavaron con PBS y luego se recogieron utilizando incubación con Versene (EDTA) (Versene; BioWhittaker® Lonza, Walkersville, MD) durante 15 min en una incubadora a 37 °C. Se cultivaron DCs maduras AIM-V que contenían IL-4 (500 U/ml) y GM-CSF (800 U/ml) durante 5 días, incluidas las alimentaciones en los días 1 y 3, seguido de la adición de reactivos de estimulación el día 5 que incluyó TNFa (10 ng/ml; R&D), IL-1p (2 ng/ml; R&D), IL-6 (1000 U/ml; R&D) y prostaglandina E2 (PGE2) (1000 ng/ml; Sigma-Aldrich). El día 7, se recogieron del sobrenadante DCs maduras no adherentes.

Células T CD4+ y CD8+ humanas primarias purificadas se estimularon mediante perlas CD3/CD28 (Dynabeads® Human T-Expander CD3/CD28 (Invitrogen Dynal, Osol, Noruega); perlas inmunomagnéticas a las que se habían conjugado anticuerpos monoclonales específicos de CD3 y CD28) como se describe (Carpenito, Milone et al. 2009). Brevemente, células CD4+ y CD8+ purificadas se lavaron dos veces en PBS, se mezclaron entre sí en una relación de 1:1 y luego se resuspendieron a una concentración final de 0,6 - 0,8*10® células/ml en medio de cultivo de células T reciente (Medio RPMI 1640 (RPMI; LTI), que contiene AB de suero humano al 10 % (HABS; GemCell™ Gemini Bio-products, West Sacramento, CA), HEPES, GlutaMAX™ (L-glut), Pen Strep, piruvato de sodio, aminoácidos no esenciales MEM (NEAA) y 2-mercaptotanol (BME) LTI). Las perlas se mezclaron extensamente y suavemente, se lavaron tres veces en PBS y luego se combinaron con células T en una relación de 3:1, perlas a células T. La solución de células T de perlas se transfirió a un matraz tratado con cultivo de tejidos y se incubó a 37 °C en una incubadora con 5 % de CO2 durante 3 días, sin perturbaciones. El día 3, se añadió medio de cultivo de células T reciente al cultivo en un volumen de A del volumen de cultivo inicial y luego se incubó durante 2 días más. El día 5, las perlas magnéticas se retiraron del cultivo utilizando un imán DynaMag™ (Invitrogen Dynal) y luego las células se resuspendieron con medio de cultivo de células T hasta una concentración de ~0,7 - 0,8 *10® células/ml. A partir del Día 6, el cultivo se alimentó con medio de cultivo de células T reciente hasta una concentración de ~0,7 - 0,8 *10® células/ml cada dos días. Las células T se congelaron como se describió arriba cuando el diámetro celular promedio del cultivo disminuyó a ~250 pm3.

Transcripción in vitro

CARs que fijan como objetivo CD19 y mesotelina (meso) con dominios de señalización 4-1BB y CD3 (19-BBz y ss1-BBz, respectivamente) se han descrito previamente (Carpenito, Milone et al. 2009, Milone, Fish et al. 2009). Los productos de PCR se subclonaron en un vector basado en pGEM.64A reemplazando GFP de pGEM-GFP.64A (Zhao, Zheng et al. 2006) con productos de PCR digeridos con enzimas de restricción con HindlII y Notl (New England Biolabs Inc. (NEB), Ipswich, MA) para producir pGEM-ss1.bbz.64A y pGEM-CD19bbz.64A. De manera similar, se construyeron versiones de tercera generación de los CARs utilizando el dominio de señalización CD28. Los ADNc de CAR reemplazados se confirmaron mediante secuenciación directa y se linearizaron mediante digestión con Spe I (NEB) antes de la transcripción de ARN in vitro. Se utilizó el sistema de<a>R<n>mScript (Epicentre, Madison, WI) o el sistema de producción de ARNm estándar T7 mScript™ (CELLSCRIPT, Madison, WI) para generar ARN IVT rematado. El ARN de la IVT se purificó utilizando un kit RNeasy Mini (Qiagen, Valencia, CA) y el ARN purificado se eluyó en agua libre de ARNasa a 1-2 mg/ml.

Electroporación de ARN

Células T humanas fueron estimuladas por perlas CD3/CD28 como se describió arriba. Las células T estimuladas se lavaron tres veces con medio de suero reducido Opti-MEM® I (OPTI-MEM; LTI) y se resuspendieron en OPTI-MEM a la concentración final de 25x106/ml antes de la electroporación. Posteriormente, las células T estimuladas se mezclaron con 8-10 pg/0,1 ml de células T de ARN de la IVT y se sometieron a electroporación durante un único pulso a 500 V durante 0,7 ms en una cubeta de 2 mm (Harvard Apparatus BTX, Holliston, M<a>) utilizando un equipo ECM830 Electro Square Wave Porator (Harvard Apparatus BTX). Luego, las células T electroporadas se cultivaron durante la noche en un medio de cultivo de células T estándar y luego se tiñeron para determinar la expresión de la molécula coestimuladora respectiva mediante citometría de flujo. Células T se co-electroporaron con 8 pg de Meso-CAR y 8 pg de ARN que codifica cada una de las moléculas coestimuladoras.

Citometría de flujo/FACS

Las células se tiñeron con anticuerpos disponibles comercialmente (BD Biosciences (BD), San Jose, CA; BioLegend, San Diego, CA; dBioscience, Inc., San Diego, CA; Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) específicos para los marcadores indicados y se analizaron por citometría de flujo (FACS). Las células se lavaron y suspendieron en tampón FACS (PBS con FBS al 1 %) que contenía los Abs indicados, se incubaron a 4 °C durante 30 min y luego se lavaron dos veces con tampón FACS. La tinción con tetrámero se realizó utilizando MART-1 marcado con APC (iTAg Tetramer/APC - HLA-A*0201 Mart-1 (ELAGIGILTV)) o tetrámeros Flu-M1 (iTAg Tetramer/APC - HLA-A*0201 Influenza-M1 (GILGFVFTL)) en una dilución de 1:40 (MBL International Co., Woburn, MA). La adquisición de citometría de flujo se realizó con un BD LSR II (BD Biosciences) y el análisis se realizó con FlowJo (Treestar, Ashland, OR).

Los resultados se muestran en las Figuras 2, 3, 4B, 5 y 6.

Ensayo de cebadoin vitromodificado

Se utilizó un ensayo de cebado de células Tin vitromodificado para evaluar la capacidad de las células T electroporadas con ARN para cebar células T específicas del péptido MART-1 vírgenes. Este ensayo se ha descrito, en parte, anteriormente y se modifica en esta memoria (Li, Bleakley et al. 2005, Li y Yee 2008, Kaka, Shaffer et al. 2009, Wolfl, Merker et al. 2011, Ramos, Narala et al. 2013). Todas las células derivadas de donantes procedían de donantes HLA-A2+ sanos y normales. Las células estimuladoras autólogas (DCs o células T modificadas por ingeniería genética con ARN) y las células efectoras/respondedoras (PBLs descongeladas), tal como se adquirieron y cultivaron arriba, se lavaron tres veces con PBS antes del establecimiento del ensayo de cebado de cocultivo (Figura 4A; Día 0). Se co-cultivaron células estimuladoras (3,5 x 105/pocillo) y efectoras (3,5 x 106/pocillo) en una relación de 1:10 en una placa de 6 pocillos, en 6 ml/pocillo de medio de cultivo de células T que contenía IL-2 humana recombinante (10 U /ml; R&D), IL-21 (30 ng/ml; LTI; se ha informado que IL-21 suprime la actividad de las células T reguladoras que pueden estar presentes en las PBLs) y péptido (0,25 pg/ml). Los péptidos eran MART-126-35 (ELAGIGILTV (SEQ ID NO: 47)), Flu-M158-66 (GILGFVFTL (SEQ ID NO: 48); control positivo) o h-CLIP103-117 (PVSKMRMATPLLMQA (SEQ ID NO: 49); control negativo), y se adquirieron en GenScript USA Inc. (Piscataway, NJ). Los días 3, 5, 7, 9 y 11, los cocultivos se alimentaron reemplazando cuidadosamente 3 ml de medio de cocultivo (1/2 del volumen total de cocultivo por pocillo) con 3 ml de medio de cultivo de células T reciente que contenía IL-2 humana recombinante (20 U/ml), IL-21 (60 ng/ml), iL-7 (20 ng/ml; R&D) e IL15 (20 ng/ml; R&D), cada una a una concentración final 2X. El Día 13, FACS evaluó la inducción de respuestas de células T específicas de péptidos mediante tinción con tetrámero, como se describió anteriormente.

Ensayo de desgranulación

El ensayo de movilización de CD107a se realizó como se describe (Betts, Brenchley et al. 2003). Se sembraron cien microlitros de células efectoras y diana en placas de fondo redondo de 96 pocillos en una relación de 1:1, 2:1 o 4:1 (1, 2 o 4x105 efectores 105 dianas). Se añadieron diez microlitros de anticuerpo anti-CD107a marcado con PE-Cy5 (eBioscience) a cada una de las mezclas de células y se incubaron a 37 °C durante 1 h antes de añadir GolgiStop (BD). Después de 2,5 h adicionales de incubación, estas células se tiñeron con anti-CD8-APC-Cy7 (BD) y los niveles de CD107 en la superficie se determinaron mediante citometría de flujo, como se describió arriba.

Ejemplo 2: Detección de moléculas candidatas implicadas en el cebado de linfocitos T citotóxicos (CTL) para su suministro conjunto con CARs o TCRs en células T

Los siguientes estudios se realizaron para demostrar que la actividad antitumoral de las células T que expresan CAR/TCR puede potenciarse mediante la administración conjunta de moléculas coestimuladoras, aumentando con ello la capacidad de las células T de funcionar como células presentadoras de antígenos y células T primarias (es decir, cebado T:T). Como se describe en esta memoria, además de la destrucción de células tumorales dirigida por células T con CAR, esto permitió el cebado mediado por células T de células T reactivas a tumores no modificadas por ingeniería genética, que pueden persistir como supresores de tumores una vez que la expresión de CAR por parte de las células T con c A r de ARN adoptivas ha disminuido, creando una terapia transitoria con efectos antitumorales permanentes.

Dados los muchos posibles genes inmunomoduladores que pueden utilizarse para potenciar la función de las células presentadoras de antígenos (APC) de las células T con<c>A<r>de ARN (p. ej., moléculas unidas a la superficie que suministran coestimulación primaria y secundaria, están asociadas con la presentación de antígenos, determinan el tráfico y patrones de migración, son ligandos para DC, así como citoquinas que facilitan el cebado o suprimen las respuestas de las células T reguladoras (Treg), el presente ejemplo se centró en evaluar genes regulados en células dendríticas (una de las APCs profesionales más potentes) (Chen y Flies 2013).

Inicialmente, se examinaron proteínas que se sabe que funcionan como moléculas coestimuladoras. Se cultivaron y evaluaron las DCs inmaduras (iDCs) y las DCs maduras (mDCs) para determinar la expresión de moléculas coestimuladoras (CD252, CD70, CD83, CD80, CD49a, CD40, HLA-ABC, CD86, HLA-DR, CD275, CD154, CD137L y CD43). Como se muestra en la Figura 2, un cierto número de marcadores candidatos se regularon positivamente de manera eficiente en las mDCs. En particular, CD252, CD70, CD83 y CD80 mostraron una expresión sustancialmente mayor en mDCs en comparación con iDCs. En consecuencia, se eligieron CD252 y CD70 para análisis adicionales como moléculas coestimuladoras candidatas para el suministro conjunto con CARs en células T. CD86 y CD137l también se incluyeron como moléculas coestimuladoras candidatas porque se ha informado que proporcionan importantes señales de coestimulación secundaria para el cebado de células T. La Figura 2 es simplemente un ejemplo que demuestra que las moléculas coestimuladoras pueden regularse drásticamente durante el cebado clásico de células APC-T.

Para confirmar que los candidatos anteriores se expresarían tras la electroporación de sus ARNms en células T, CD70, CD83, CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), CD275 (ICOS-L), CD43, CD137L (4-1BBL), CD252 (OX40L), CD58 (LFA-3), CD48, TL1A, CD270 (HVEM), CD40, CD154 (CD40L), CD150 (SLAM) y CD64 se clonaron y utilizaron como moldes para la transcripciónin vitropara producir ARNm de alta calidad. Todos los candidatos se expresaron altamente cuando sus ARNms se electroporaron en células T (Figura 3), lo que indica que estos candidatos podrían utilizarse para expresarse en células T para potenciar la capacidad de cebado de las células T.

Ejemplo 3: Establecimiento de un sistema de cebado in vitro para la identificación de moléculas coestimuladoras candidatas que fomentan el cebado de células T específicas de tumores

Para testar la capacidad de cada una de las moléculas coestimuladoras candidatas suministradas conjuntamente en células T con CAR de ARN para potenciar el cebado, se estableció un sistema de cebadoin vitromodificado. Este sistema se basó en estudios publicados que describen ensayos de co-cultivo autólogo utilizando DCs y células T que se han utilizado para la inducción de células Tin vitro(Li, Bleakley et al. 2005, Han y Chang 2009, Ramos, Narala et al. 2013), pero modificados para incluir solo una ronda de estimulación antigénica, a diferencia de hasta 3 o 4 como se describe en estudios previos, ya que se observaron respuestas de CTL detectables en múltiples donantes con una ronda de estimulación (Figura 4A).

Para validar el sistema modificado, se utilizaron DCs y PBLs autólogas como efectores, como se describe en estudios publicados. Como antígeno tumoral modelo se utilizó el epítopo de células T A2+ CD8+ MART-1, que está presente en frecuencias relativamente altas en individuos sanos (Pittet, Valmori et al. 1999). De acuerdo con informes anteriores con este antígeno peptídico (Li, Bleakley et al. 2005, Li y Yee 2008, Kaka, Shaffer et al. 2009, Wolfl, Merker et al. 2011, Ramos, Narala et al. 2013), las DCs maduras cultivadas (mDCs) en el sistema modificado fueron capaces de cebar células T MART-1+ en un grado esperado mayor que las DCs inmaduras (iDCs) (Figura 4B).

Este resultado sugiere que el sistema de cebadoin vitromodificado recientemente desarrollado se puede utilizar para testar el cebado T:T y detectar eficazmente un panel de ARNs co-suministrados que codifican moléculas asociadas con el cebado de CTL.

Ejemplo 4: Cebado potenciado de células T mediado por moléculas coestimuladoras

Utilizando el ensayo de cebado de co-cultivoin vitromodificado, se testó la capacidad de cada una de las cuatro moléculas coestimuladoras candidatas para potenciar la capacidad de las células T de cebar directamente los CTLs MART-1+. Cuando sus ARNs se electroporaron en células T, cada una de las moléculas coestimuladoras fue capaz de potenciar el cebado de CTL MART-1+, como se refleja en el número incrementado de células T CD8+MART-1+ en relación con los controles (sin electroporación, péptido h-Clip irrelevante). control de antígeno (h-CLIP103-117 (PVSKMRMATPLLMQA (SEQ ID NO: 50))), y estimuladores de PBL solos; Figura 5).

De las cuatro moléculas coestimuladoras candidatas testadas, CD70 proporcionó el potenciamiento más fuerte de la inducción de CTL MART-1+ mediada por T:T, aumentando el cebado en más de 10 veces en comparación con las células de control que se sometieron a electroporación sin ARN. Las células T que expresan CD86, CD137L y CD252 fueron capaces de potenciar el cebado 8,5 veces, 3,2 veces y 3,2 veces, respectivamente, en relación con las células de control. Estos resultados demuestran que las moléculas coestimuladoras, tales como las 4 candidatas testadas, pueden potenciar la capacidad de cebado.

Ejemplo 5: El co-suministro de molécula coestimuladora con CAR no afecta la expresión de ninguna de las construcciones

Un objetivo importante de esta estrategia de co-suministro es que la expresión de moléculas asociadas con el cebado de CTL no interfiera, p. ej., disminuya o inhiba, la expresión o función de CAR. Con este fin, primero se evaluó el efecto de la expresión de la molécula coestimuladora sobre la expresión de CAR en células T. Para testar esto, se introdujo en las células T un CAR ejemplar, mesotelina-CAR (Meso-CAR), que nuestro grupo publicó anteriormente (Zhao, Moon et al.

2010), junto con cada una de las cuatro moléculas coestimuladoras de ETP CD70, CD86, CD 137L y CD252, para evaluar cómo la expresión de las moléculas coestimuladoras de ETP afectó la expresión de mesotelina-CAR, o viceversa.

(MALPVTALLLPLALLLHAARPGSQVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYTMN WVKQSHGKSLEWIGLITPYNGASSYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVY FCARGGYDGRGFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSSGGGSDIELTQSPAIMSASPGEK VTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTISSV EAEDDATYYCQQWSKHPLTYGAGTKLEIKASTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRP AAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPV QTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVL DKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQ GLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 51)). El ARN de meso-CAR y el ARN de cada una de las cuatro moléculas coestimuladoras de ETP se administró conjuntamente en la misma célula T y la expresión de cada una en la superficie de las células T se evaluó al día siguiente (Figura 5).

La co-expresión de Meso-CAR junto con moléculas coestimuladoras no dio como resultado un efecto adverso ni sobre el CAR ni sobre la molécula coestimuladora, p. ej., no dio como resultado una expresión disminuida de CAR o ETP, ni una inhibición de la expresión de CAR o ETP. Estos datos demuestran que los CARs pueden co-expresarse eficazmente con moléculas adicionales, p. ej., ETP, con una interferencia mínima en la expresión superficial del CAR.

Ejemplo 6: La co-expresión de moléculas coestimuladoras no afecta a la destrucción celular mediada por CAR

Una consideración clave cuando se co-expresan moléculas coestimuladoras para mejorar la capacidad de cebado de las células T con CAR es que la co-expresión tiene un efecto mínimo sobre la destrucción celular mediada por CAR, p. ej., no reduce ni inhibe sustancialmente la destrucción celular mediada por CAR. De hecho, la destrucción de células tumorales mediada por CAR tiene importantes efectos aguas abajo, tales como el potencial de alterar el entorno inmunosupresor local del tumor al destruir las células tumorales, liberar antígenos tumorales, reclutar células pro-inmunes y presentadoras de antígenos (APCs) y secretar citoquinas pro-inflamatorias y fomentar la inflamación en general. Todos estos eventos inmunomoduladores pueden trabajar juntos para facilitar el cebadoin vivoen el sitio del tumor y/o ganglios linfáticos locales de células T CD8+ específicas del tumor no modificadas por ingeniería genética que pueden reconocer antígenos tumorales no solo fijados como objetivo por el propio CAR, sino también otros dentro del mismo tumor (es decir, diseminación del epítopo).

En este ejemplo, se evaluó la capacidad de destrucción celular mediada por CAR de células T que co-expresan moléculas coestimuladoras Meso-CAR y<e>T<p>para determinar si la co-expresión de un CAR con moléculas coestimuladoras afectaría negativamente la destrucción celular mediada por CAR. Se incubaron células T que expresan meso-CAR que también expresan moléculas coestimuladoras con dos líneas tumorales diferentes que expresan mesotelina (K-meso y SKOV3) y una línea mesotelina-negativa (K562) y se evaluaron para determinar la exposición a CD107a en un ensayo de degranulación. El ensayo de movilización de CD107a se utiliza ampliamente para medir la capacidad de las células T de matar células diana, lo que se ha correlacionado directamente con su nivel de desgranulación cuantificado por la exposición de la proteína LAMP 1 (CD107a) que normalmente reside en los gránulos líticos de las células T citotóxicas (Betts, Brenchley et al. 2003). La coexpresión de CAR y moléculas coestimuladoras no afectó notablemente la función del CAR (Figura 6). Se añadieron al gráfico puntos de datos para Meso-CAR solo de otro experimento para células K-meso y K562, de Zhao, Moon et al., 2010.

Estos resultados sugieren que la co-expresión de moléculas coestimuladoras con CAR tiene poco impacto en la función de CAR, p. ej., no reduce ni inhibe sustancialmente la capacidad de destrucción celular mediada por CAR.

Ejemplo 7: Efectos de diferentes moléculas implicadas en el cebado de CTL, individualmente y en combinación, sobre la capacidad de cebado de las células T con CAR de ARN

Se testan los efectos de diferentes moléculas candidatas implicadas en vías asociadas con el cebado de CTL para determinar la capacidad de potenciar el cebado de CTLs por células T con CAR de ARN, como se describe en los Ejemplos anteriores. Las moléculas candidatas que aumentan el cebado de las células T:T también se testarán en diferentes combinaciones para detectar efectos sinérgicos.

Ejemplo 8: Eficacia de células T con CAR de ARN que co-expresan moléculas implicadas en el cebado de CTL para erradicar células tumorales

Células T con CAR de ARN que co-expresan ETP se testan en otros sistemas de cebado in vitro. Por ejemplo, células T con CAR humanas se cultivan conjuntamente con células tumorales (probablemente irradiadas), en presencia de un agrupamiento de células T no modificadas por ingeniería genética y posiblemente DCs. La lectura de este ensayo incluye la inducción de respuestas de células T específicas para tumores en el agrupamiento de células T no modificadas por ingeniería genética, que pueden ser el resultado del cebado cruzado de Ags tumorales liberados por las células T con CAR modificadas por ingeniería genética para ser presentadores de Ag de doble función.

Las secuencias de algunos ejemplos de diversos componentes de CARs de la presente invención se enumeran en la Tabla 2, en que aa representa aminoácidos y na representa ácidos nucleicos que codifican el péptido correspondiente.

Tabla 2. Secuencias de diversos componentes de CAR (aa - aminoácidos, na - ácidos nucleicos que codifican la proteína correspondiente)

EQUIVALENTES

Aunque esta invención se ha divulgado haciendo referencia a aspectos específicos, es evidente que los expertos en la técnica pueden diseñar otros aspectos y variaciones de esta invención sin alejarse del alcance de la invención tal como la definen las reivindicaciones.

Referencias

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una célula T que comprende ácido nucleico exógeno, en donde:

(a) el ácido nucleico comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, y (b) el ácido nucleico comprende una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que potencia el cebado de células T, en donde

el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en CD70, CD86 y CD252, y fragmentos funcionales y variantes de CD70, CD86 y CD252 que conservan la capacidad de potenciar el cebado de células T.

en donde la primera y/o segunda secuencia de ácido nucleico es un ARN, en donde, además, dicho primer y/o segundo ARN se expresa transitoriamente.

2. La célula T de la reivindicación 1, en donde la primera y segunda secuencias de ácido nucleico están dispuestas en una sola molécula de ácido nucleico, o en dos o más moléculas de ácido nucleico distintas, en donde la única o dos o más moléculas de ácido nucleico distintas son ARN.

3. La célula T de la reivindicación 1 o 2, en donde el CAR comprende, además, un segundo dominio de señalización intracelular.

4. La célula T de la reivindicación 3, en donde el dominio de señalización intracelular del CAR comprende un dominio CD3zeta y el segundo dominio de señalización intracelular comprende un dominio 4-1BB.

5. La célula T de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la célula T no comprende un ADN exógeno que codifique el primer o segundo ARN.

6. La célula T de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el primer y/o segundo ARNs:

i) incluyen derivados o análogos de nucleótidos/nucleósidos,

ii) se generan por transcripción in vitro,

iii) son ARNs sintéticos, y/o

iv) se introducen en la célula T mediante electroporación.

7. La célula T de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la primera o segunda secuencias de ácido nucleico están comprendidas en un vector, p. ej., un vector viral tal como un vector retroviral o un vector lentiviral.

8. La célula T de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el dominio extracelular del CAR comprende un dominio de unión a antígeno, opcionalmente en donde el dominio de unión a antígeno es un dominio scFv.

9. La célula T de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde:

i) el dominio transmembrana comprende una porción transmembrana de una proteína seleccionada del grupo que consiste en la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, C<d>9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 y CD154;

ii) el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización funcional de una proteína seleccionada del grupo que consiste en CD3 zeta, FcR gamma común (FCER1G), Fc gamma RIIa, FcR beta (Fc Epsilon R1b), CD3 gamma,<c>D3 delta, CD3 épsilon, CD79a, CD79b, DAP10 y DAP12, y/o

iii) el dominio extracelular está conectado al dominio transmembrana mediante una región bisagra.

10. La célula T de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el CAR comprende, además, uno o más dominios de señalización coestimuladores, opcionalmente en donde el dominio de señalización coestimulador es un dominio de señalización funcional de una proteína seleccionada del grupo que consiste en OX40, CD27, CD28, CD30, CD40, PD-1, CD2, CD7, CD258, NKG2C, B7-H3, un ligando que se une a CD83, ICAM-1, LFA-1 (CD1a/CD18), ICOS y 4-1BB (CD137), o cualquier combinación de los mismos.

11. La célula T de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el dominio extracelular del CAR comprende un dominio de unión a antígeno que se une a un antígeno asociado con un estado patológico, opcionalmente en donde el estado patológico se selecciona del grupo que consiste en un enfermedad proliferativa, una condición precancerosa, una indicación no cancerosa, una infección viral y una infección bacteriana.

12. La célula T de la reivindicación 11, en donde el dominio de unión al antígeno se une a un antígeno tumoral, un antígeno viral o un antígeno bacteriano, opcionalmente en donde el antígeno tumoral es un antígeno asociado con un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de cerebro, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer colorrectal, cáncer de hígado, cáncer de riñón, linfoma, leucemia, cáncer de pulmón, melanoma, melanoma metastásico, mesotelioma, neuroblastoma, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer renal, cáncer de piel, timoma, sarcoma, linfoma no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, cáncer de útero y combinaciones de los mismos.

13. La célula T de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde:

i) la célula T tiene una eficacia incrementada para matar células tumorales o reducir el tamaño del tumor en un sujeto con un tumor con respecto a una célula T que comprende solo la primera secuencia de ácido nucleico;

ii) la célula T potencia el cebado de las células T con un antígeno tumoral, un antígeno viral, un antígeno bacteriano; y/o iii) la primera y/o segunda secuencias de ácido nucleico se transcriben a partir de un vector de transcripciónin vitro.

14. Una composición que comprende la célula T de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes y, opcionalmente, que comprende, además, un segundo agente terapéutico.

15. Un método para generar una célula T que tiene actividad antitumoral potenciada, comprendiendo el método introducir un ácido nucleico, en el que:

16. La célula T de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, para uso en un método de:

i) proporcionar inmunidad antitumoral en un sujeto;

ii) tratar a un sujeto que tiene una enfermedad asociada con la expresión de un antígeno asociado a una enfermedad; iii) potenciar la propagación del epítopo en un sujeto con cáncer; o

iv) vacunar a un sujeto,

17. La célula T, para uso de la reivindicación 16, en donde

(a) la enfermedad de ii) se selecciona del grupo que consiste en una enfermedad proliferativa, una afección precancerosa, una indicación no cancerosa, una infección viral y una infección bacteriana; o

(b) el método comprende, además, iv) administrar al sujeto un antígeno, opcionalmente en donde el antígeno es un antígeno tumoral, un antígeno viral o un antígeno bacteriano.

18. Una célula T modificada por ingeniería genética para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR), para uso en el tratamiento del cáncer mediante la destrucción de células cancerosas mediada por CAR y el cebado potenciado de células T con antígeno tumoral, en donde la célula T modificada por ingeniería genética con CAR comprende ácido nucleico exógeno, que comprende:

(a) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica el CAR, en donde dicho CAR comprende un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, y

(b) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que potencia el cebado de células T, en donde: la célula T tiene una capacidad potenciada de cebado de células T en relación con una célula T que carece de la segunda secuencia de ácido nucleico, y

19. La célula T para uso de la reivindicación 18, en donde la célula T modificada por ingeniería genética con CAR tiene una capacidad de presentación de antígenos potenciada en relación con una célula T que carece de la segunda secuencia de ácido nucleico.

20. La célula T, para uso de la reivindicación 18 o 19, en donde la célula T es como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 2-13.