CN111836827B - 包含nkg2d结构域的多特异性嵌合受体和其使用方法 - Google Patents

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Abstract

提供了靶向NKG2D配体的嵌合受体和包含NKG2D结构域和例如IL‑3结构域的第二抗原结合域的多特异性嵌合受体。还提供了双嵌合受体系统，所述双嵌合受体系统包括包含NKG2D结构域的第一嵌合受体和包含例如IL‑3结构域的第二抗原结合域的第二嵌合受体。还提供了工程化免疫效应细胞(例如T细胞)、药物组合物、药盒和治疗癌症的方法。

Description

包含NKG2D结构域的多特异性嵌合受体和其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年12月28日申请的国际专利申请No.PCT/CN2017/119397的优先权益，所述专利申请的内容以引用的方式整体并入本文中。
ASCII文本文件上提交序列表
以下在ASCII文本文件上提交的内容以引用的方式整体并入本文中：序列表的计算机可读形式(computer readable form，CRF)(文件名：761422000941SEQLISTING.txt，记录日期：2018年12月28日，大小：85KB)。
技术领域
本发明涉及嵌合受体、多特异性嵌合受体、双嵌合受体系统、工程化免疫效应细胞和其使用方法。
背景技术
急性骨髓性白血病(Acute myeloid leukemia，AML)的特征是在骨髓和血液中占据主要地位的骨髓前体异常克隆增殖，这严重损害正常的造血作用。AML是急性白血病中最常见的类型，它在西方世界中占所有成人发作型白血病大约25％。每年AML的发病率是每100,000名成人中3-5名发病，它在所有白血病当中具有最高的死亡率(DiNardo和Cortes2016)。在近40年间，AML患者的五年相对整体存活率已经从1975年至1980年之间的凄凉的6.3％稍微增加至2007年至2012年之间的23.9％(Mardiros等人2015)。
AML的标准一线治疗是使用阿糖胞苷(cytarabine)与蒽环类药物(anthracycline)组合的化学疗法作为诱导疗法，然后针对在诱导疗法之后实现完全缓解(complete remission，CR)的患者，重复循环高剂量的阿糖胞苷和/或同种异体干细胞移植(allogenic stem cell transplant，alloSCT)。虽然可在将近70％青年患者中通过当前的诱导化学疗法实现初始CR，但43％的患者最终将会复发，且18％使用一线诱导治疗从未实现CR(Forman和Rowe 2013)。AlloSCT是在二次症状缓解后的优选治疗方法。在接受alloSCT的患者当中五年无病存活率达40-50％，这证明了AML对基于免疫的疗法的敏感性。然而，患有原发性难治性疾病或初始CR持续少于6个月的患者几乎未从alloSCT治疗获得益处(Mardiros等人2015)。另外，常规的补救性化学疗法对患者器官的细胞毒性破坏进一步减少了alloSCT成功的机会。因此，AML患者在复发或诱导失败后需要更有效且毒性更小的治疗剂。
T细胞能够攻击和根除肿瘤，特别是具有产生新抗原的高突变负荷的肿瘤。然而，T细胞的抗肿瘤能力常常受到免疫抑制性肿瘤微环境(TME)的主动抑制(McGranahan等人2016)。通过使编码包含以下的融合蛋白的基因转导来构建嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)：针对肿瘤细胞上的抗原的胞外抗原结合域、铰链区和在抗原结合后诱导T细胞活化的T细胞受体(TCR)的胞内信号传导结构域。不同于常规的依赖于天然TCR识别肿瘤抗原的T细胞，CAR-T细胞重定向至未加工的抗原，由此独立于对主要组织相容性复合体(MHC)抗原的表达，杀死肿瘤细胞。因此，CAR-T细胞能够克服免疫疗法的许多固有限制。在二十年临床前研究和临床试验之后，已经证实基于CAR-T的疗法的安全性和可行性，并已经在恶性血液病中获得了空前的临床结果(Kochenderfer等人2015；Louis等人2011)。
本文中提及的所有公布、专利、专利申请和公布的专利申请的公开在此以引用的方式整体并入本文中。
发明内容
本申请提供了靶向NKG2D配体和例如肿瘤抗原、例如CD123的第二抗原的多特异性嵌合受体和双嵌合受体系统。还提供了靶向NKG2D配体的嵌合受体。
本申请的一方面提供一种嵌合受体，所述嵌合受体包含：(a)包含NKG2D结构域的胞外结构域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，胞外结构域包含第一NKG2D结构域和第二NKG2D结构域。
本申请的一方面提供一种多特异性嵌合受体，所述多特异性嵌合受体包含：(a)包含NKG2D结构域和第二抗原结合域的胞外结构域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内信号传导结构域。
本申请的一方面提供一种多特异性嵌合受体，所述多特异性嵌合受体包括包含以下的多肽链：(a)包含第一NKG2D结构域、第二NKG2D结构域和第二抗原结合域的胞外结构域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，胞外结构域从N端至C端包含：第二抗原结合域、第一NKG2D结构域和第二NKG2D结构域。在一些实施方案中，第二抗原结合域经由肽连接子与第一NKG2D结构域融合。在一些实施方案中，肽连接子至多约50个氨基酸长。在一些实施方案中，肽连接子包含选自SEQ ID NO：12-15的氨基酸序列。
本申请的一方面提供一种多特异性嵌合受体，所述多特异性嵌合受体包含第一多肽链和第二多肽链，每个多肽链包含：(a)包含NKG2D结构域和第二抗原结合域的胞外结构域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，每个胞外结构域还包含二聚化基序。在一些实施方案中，二聚化基序在NKG2D结构域与第二抗原结合域之间移位。在一些实施方案中，二聚化基序为亮氨酸拉链或半胱氨酸拉链。在一些实施方案中，第二抗原结合域经由肽连接子与NKG2D结构域融合。在一些实施方案中，肽连接子至多约50个氨基酸长。在一些实施方案中，肽连接子包含选自SEQ ID NO：12-15的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一多肽链的NKG2D结构域经由一个或多个二硫键与第二多肽链的NKG2D结构域交联。在一些实施方案中，第一多肽链和第二多肽链中的每一个从N端至C端包含：第二抗原结合域、NKG2D结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。
在根据上述任一种多特异性嵌合受体的一些实施方案中，多特异性嵌合受体为双特异性嵌合受体。
在根据上述任一种多特异性嵌合受体的一些实施方案中，第二抗原结合域为抗体片段。在一些实施方案中，抗体片段特异性地结合于选自由以下组成的组的抗原：CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、BCMA、CS1、ROR1、GPC3、CD123、CD138、c-Met、EGFR、EGFRvIII、HER2、HER3、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3和糖脂F77。在一些实施方案中，第二抗原结合域为配体或配体结合域。在一些实施方案中，配体或配体结合域源自于选自由以下组成的组的分子：NKG2A、NKG2C、NKG2F、IL-3、IL-13、LLT1、AICL、DNAM-1和NKp80。在一些实施方案中，第二抗原结合域为IL-3结构域。在一些实施方案中，IL-3结构域包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列，或其与SEQ ID NO：9的氨基酸序列具有至少约85％(例如至少约90％、92％、95％、98％或99％)序列同一性的变体。
在根据上述任一种嵌合受体或多特异性嵌合受体的一些实施方案中，NKG2D结构域或第一NKG2D结构域和/或第二NKG2D结构域包含SEQ ID NO：7或8的氨基酸序列，或其与SEQ ID NO：7或8的氨基酸序列具有至少约85％(例如至少约90％、92％、95％、98％或99％)序列同一性的变体。
在根据上述任一种嵌合受体或多特异性嵌合受体的一些实施方案中，跨膜结构域源自于选自由以下组成的组的分子：CD8α、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152和PD1。在一些实施方案中，跨膜结构域包含SEQ ID NO：4或45的氨基酸序列。
在根据上述任一种嵌合受体或多特异性嵌合受体的一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的主要胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，主要胞内信号传导结构域源自于CD3ζ。在一些实施方案中，主要胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
在根据上述任一种嵌合受体或多特异性嵌合受体的一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含协同刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，协同刺激信号传导结构域源自于选自由以下组成的组的协同刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、CD30、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83配体和它们的组合。在一些实施方案中，协同刺激信号传导结构域包含CD28的胞质结构域和/或4-1BB的胞质结构域。在一些实施方案中，协同刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO∶5的氨基酸序列。
在根据上述任一种嵌合受体或多特异性嵌合受体的一些实施方案中，嵌合受体或多特异性嵌合受体还包含位于胞外结构域的C端与跨膜结构域的N端之间的铰链区。在一些实施方案中，铰链区源自于CD8α。在一些实施方案中，铰链区包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供一种或多种分离核酸，所述分离核酸包含编码上述任一种嵌合受体或多特异性嵌合受体中的一个或多个多肽链的核酸序列。
本申请的一方面提供一种双嵌合受体系统，所述双嵌合受体系统包含：(i)包含第一多肽链和第二多肽链的第一嵌合受体，每个多肽链包含：(a)包含NKG2D结构域的第一胞外结构域；(b)第一跨膜结构域；和(c)第一胞内信号传导结构域；和(ii)包含第三多肽链的第二嵌合受体，所述第三多肽链包含：(a)包含第二抗原结合域的第二胞外结构域；和(b)第二跨膜结构域。在一些实施方案中，第二嵌合受体还包含第二胞内信号传导结构域。
本申请的一方面提供一种双嵌合受体系统，所述双嵌合受体系统包含：(i)包含第一多肽链的第一嵌合受体，所述第一多肽链包含：(a)包含第一NKG2D结构域和第二NKG2D结构域的第一胞外结构域；(b)第一跨膜结构域；和(c)第一胞内信号传导结构域；和(ii)包含第二多肽链的第二嵌合受体，所述第二多肽链包含：(a)包含第二抗原结合域的第二胞外结构域；和(b)第二跨膜结构域。在一些实施方案中，第二嵌合受体还包含第二胞内信号传导结构域。
在根据上述任一种双嵌合受体系统的一些实施方案中，第二抗原结合域为抗体片段。在一些实施方案中，抗体片段特异性地结合于选自由以下组成的组的抗原：CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、BCMA、CS1、ROR1、GPC3、CD123、CD138、c-Met、EGFR、EGFRvIII、HER2、HER3、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3和糖脂F77。在一些实施方案中，第二抗原结合域为配体或配体结合域。在一些实施方案中，配体或配体结合域源自于选自由以下组成的组的分子：NKG2A、NKG2C、NKG2F、IL-3、IL-13、LLT1、AICL、DNAM-1和NKp80。在一些实施方案中，第二抗原结合域为IL-3结构域。在一些实施方案中，IL-3结构域包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列，或其与SEQ ID NO：9的氨基酸序列具有至少约85％(例如至少约90％、92％、95％、98％或99％)序列同一性的变体。
在根据上述任一种双嵌合受体系统的一些实施方案中，NKG2D结构域或第一NKG2D结构域和/或第二NKG2D结构域包含SEQ ID NO：7或8的氨基酸序列，或其与SEQ ID NO：7或8的氨基酸序列具有至少约85％(例如至少约90％、92％、95％、98％或99％)序列同一性的变体。
在根据上述任一种双嵌合受体系统的一些实施方案中，第一和/或第二跨膜结构域源自于选自由以下组成的组的分子：CD8α、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152和PD1。在一些实施方案中，第一和/或第二跨膜结构域包含SEQ ID NO：4或45的氨基酸序列。
在根据上述任一种双嵌合受体系统的一些实施方案中，第一和/或第二胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的主要胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，主要胞内信号传导结构域源自于CD3ζ。在一些实施方案中，主要胞内信号传导结构域包含SEQ IDNO：6的氨基酸序列。
在根据上述任一种双嵌合受体系统的一些实施方案中，第一和/或第二胞内信号传导结构域包含协同刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，协同刺激信号传导结构域源自于选自由以下组成的组的协同刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、ICOS、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83配体和它们的组合。在一些实施方案中，协同刺激信号传导结构域包含CD28的胞质结构域和/或4-1BB的胞质结构域。在一些实施方案中，协同刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO∶5的氨基酸序列。
在根据上述任一种双嵌合受体系统的一些实施方案中，第一和/或第二嵌合受体还包含位于胞外结构域的C端与跨膜结构域的N端之间的铰链区。在一些实施方案中，铰链区源自于CD8α。在一些实施方案中，铰链区包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供一种或多种分离核酸，所述分离核酸包含编码上述任一种双嵌合受体系统中的一个或多个多肽链的核酸序列。在一些实施方案中，提供一种分离核酸，所述分离核酸包含编码第一嵌合受体的第一核酸序列和编码第二嵌合受体的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列经由编码自裂解肽的第三核酸序列可操作地连接于第二核酸序列。在一些实施方案中，自裂解肽为T2A、P2A或F2A肽。
在一些实施方案中，提供一种嵌合受体，所述嵌合受体包含选自由SEQ ID NO：16-20和SEQ ID NO：33-35组成的组的氨基酸序列，或其与由SEQ ID NO：16-20和SEQ ID NO：33-35组成的组的氨基酸序列具有至少约85％(例如至少约90％、92％、95％、98％或99％)序列同一性的变体。在一些实施方案中，提供一种双嵌合受体系统，所述双嵌合受体系统包含第一嵌合受体，所述第一嵌合受体包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列，或其与SEQ ID NO：34的氨基酸序列具有至少约85％(例如至少约90％、92％、95％、98％或99％)序列同一性的变体；和第二嵌合受体，所述第二嵌合受体包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列，或其与SEQ IDNO：41的氨基酸序列具有至少约85％(例如至少约90％、92％、95％、98％或99％)序列同一性的变体。在一些实施方案中，提供一种双嵌合受体系统，所述双嵌合受体系统包含第一嵌合受体，所述第一嵌合受体包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列，或其与SEQ ID NO：35的氨基酸序列具有至少约85％(例如至少约90％、92％、95％、98％或99％)序列同一性的变体；和第二嵌合受体，所述第二嵌合受体包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列，或其与SEQ ID NO：42的氨基酸序列具有至少约85％(例如至少约90％、92％、95％、98％或99％)序列同一性的变体。在一些实施方案中，提供一种多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：36或37的氨基酸序列，或其与SEQ ID NO：36或37的氨基酸序列具有至少约85％(例如至少约90％、92％、95％、98％或99％)序列同一性的变体。在一些实施方案中，提供一种分离核酸，所述分离核酸包含选自由SEQ ID NO：21-27和38-40组成的组的核酸序列，或其与选自由SEQ ID NO：21-27和38-40组成的组的核酸序列具有至少约85％(例如至少约90％、92％、95％、98％或99％)序列同一性的变体。
在一些实施方案中，提供一种或多种载体，所述载体编码上述任一或多种分离核酸。在一些实施方案中，载体为慢病毒载体。
本申请的另一方面提供一种工程化免疫效应细胞，所述工程化免疫效应细胞包含上述嵌合受体、多特异性嵌合受体或双嵌合受体系统、分离核酸或载体中的任一种。在一些实施方案中，免疫效应细胞为T细胞、NK细胞、外周血单核细胞(PBMC)、造血干细胞、多能干细胞或胚胎干细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞为T细胞。
在一些实施方案中，提供一种药物组合物，所述药物组合物包含上述任一种工程化免疫效应细胞和药学上可接受的载剂。
本申请的另一个方面提供一种治疗个体中的癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的任一种上述药物组合物。在一些实施方案中，癌症为多发性骨髓瘤、急性淋巴母细胞性白血病或慢性淋巴细胞性白血病。
还提供了包含上述嵌合受体、多特异性嵌合受体、双嵌合受体系统、工程化免疫效应细胞、分离核酸或载体中的任一种的使用方法、药盒和制品。
附图说明
图1A展示包含单一多肽链的示例性双特异性嵌合受体(LIC2001)的示意图，所述多肽链包含IL-3结构域和两个NKG2D结构域。带正电的残基(R)在第一NKG2D结构域(例如反向NKG2D结构域)的N端进行工程化，且带负电的残基(D)在第二NKG2D结构域(例如正向NKG2D结构域)的C端进行工程化。工程化的R和D残基彼此形成盐桥以促进二聚。
图1B展示包含单一多肽链的示例性双特异性嵌合受体(LIC2001-1)的示意图，所述多肽链包含IL-3结构域和两个NKG2D结构域。
图1C展示包含两个多肽链的示例性双特异性嵌合受体的示意图，每个多肽链包含IL-3结构域、亮氨酸拉链基序和NKG2D结构域。每个多肽链的亮氨酸拉链基序促进二聚。另外，NKG2D结构域可经由二硫键彼此交联。LIC2002包含IL-3结构域、亮氨酸拉链基序和反向NKG2D结构域。LIC2002-2包含IL-3结构域、亮氨酸拉链基序和正向NKG2D结构域。
图1D展示包含两个多肽链的示例性双特异性嵌合受体(LIC2002-1)的示意图，每个多肽链包含IL-3结构域和NKG2D结构域。NKG2D结构域经由二硫键彼此交联。
图1E展示示例性双嵌合受体系统(LIC2003)的示意图，所述双嵌合受体系统包含靶向NKG2D配体的第一嵌合受体和靶向CD123的第二嵌合受体。第一嵌合受体包括包含两个NKG2D结构域的多肽链，所述NKG2D结构域可经由二硫键彼此交联。第二嵌合受体包含IL-3结构域。第二嵌合受体可含有或可不含胞内信号传导结构域。
图1F展示示例性双嵌合受体系统(LIC2004)的示意图，所述双嵌合受体系统包含靶向NKG2D配体的第一嵌合受体和靶向CD123的第二嵌合受体。第一嵌合受体包含两个多肽链，每个多肽链包含单一NKG2D结构域，其中所述NKG2D结构域经由二硫键彼此交联。第二嵌合受体包含IL-3结构域。第二嵌合受体可含有或可不含胞内信号传导结构域。此图展示没有胞内信号传导结构域的示例性第二IL-3嵌合受体。
图2展示如通过流式细胞术所确定的NKG2D×IL-3嵌合受体构建体(LIC2004和LIC2002-2)在工程化T细胞中的表达。
图3A-3C展示表达各种NKG2D×IL-3嵌合受体构建体的工程化T细胞针对以下肿瘤细胞的体外细胞毒活性：K562-CD123-Luc(图3A)、K562-Luc(图3B)和KG1-Luc(图3C)。
图4展示比较表达各种嵌合受体构建体的工程化T细胞针对K562-CD123-Luc的剂量依赖性细胞毒活性的图。
图5A-5B展示表达各种构建体的工程化T细胞针对以下肿瘤细胞的细胞毒活性：K562-CD123-Luc(图5A)和K562-Luc(图5B)。“NKG2D-CD123结合剂”表示表达LTC2004双嵌合受体系统的工程化T细胞。“NKG2D”表示仅仅表达包含LIC2004双嵌合受体系统中的NKG2D结构域的嵌合受体(即LTC2004-1)的工程化T细胞。“CD123结合剂”表示仅仅表达包含LIC2004双嵌合受体系统中的IL-3结构域的嵌合受体的工程化T细胞。
图6A展示MICA(NKG2D的同源配体)对表达NKG2D×IL-3嵌合受体构建体的工程化T细胞杀死K562-CD123-Luc和K562-Luc细胞的阻断作用。图6B展示BSA对表达NKG2D×IL-3嵌合受体构建体的工程化T细胞杀死K562-CD123-Luc和K562-Luc细胞没有显著的阻断作用。
图7展示表达LIC2004和LIC2002-2构建体的工程化T细胞针对K562和K562-CD123-Luc肿瘤细胞的细胞毒活性。
图8A-8C展示通过表达LIC2002-2、LIC2004和LIC2004-1构建体的工程化T细胞与K562-CD123-Luc、K562-Luc和KG1-Luc细胞系共培养而分泌的IFNγ水准。
具体实施方式
本申请提供了靶向NKG2D配体和例如CD123(例如IL-3结构域)的第二抗原的多特异性(例如双特异性)嵌合受体和双嵌合受体系统。在一些实施方案中，不同于基于抗体的CAR，本文所述的嵌合受体和双嵌合受体系统利用配体与其在T细胞上的同源受体之间的高亲和力和特异性。NKG2D配体仅仅在应激细胞上、特别是在肿瘤细胞上表达。表达本文所述的NKG2D嵌合受体和双嵌合受体系统的工程化免疫细胞具有增强的抗肿瘤能力，且提供可用于抗癌症治疗的治疗剂。
因此，本申请的一方面提供一种多特异性嵌合受体，所述多特异性嵌合受体包含：(a)包含NKG2D结构域和第二抗原结合域(例如靶向CD123的结合域)的胞外结构域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，提供一种包含多肽链的多特异性嵌合受体，所述多肽链包含：(a)包含第二抗原结合域(例如IL-3结构域)、第一NKG2D结构域和第二NKG2D结构域的胞外结构域；(b)跨膜结构域和(c)胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，提供一种多特异性嵌合受体，所述多特异性嵌合受体包含第一多肽链和第二多肽链，每个多肽链包含：(a)包含NKG2D结构域和第二抗原结合域(例如IL-3结构域)的胞外结构域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，胞外结构域还包含二聚化基序，例如亮氨酸拉链。
在另一方面，提供一种双嵌合受体系统，所述双嵌合受体系统包含：(i)第一嵌合受体，所述第一嵌合受体包含(a)包含NKG2D结构域的第一胞外结构域；(b)第一跨膜结构域；和(c)第一胞内信号传导结构域；(ii)第二嵌合受体，所述第二嵌合受体包含：(a)包含第二抗原结合域(例如IL-3结构域)的第二胞外结构域；(b)第二跨膜结构域；和任选地(c)第二胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第一嵌合受体包含单一多肽链，其中所述第一胞外结构域包含第一NKG2D结构域和第二NKG2D结构域。在一些实施方案中，第一嵌合受体包含第一多肽链和第二多肽链，每个多肽链包含：(a)包含NKG2D结构域的第一胞外结构域；(b)第一跨膜结构域；和(c)第一胞内信号传导结构域。
本文还描述了包含嵌合受体、多特异性嵌合受体或双嵌合受体系统的工程化免疫效应细胞(例如T细胞)、使用工程化免疫效应细胞的药物组合物、药盒、制品和治疗癌症的方法。
I.定义
如本文所用的“嵌合受体”是指基因工程受体，其可用于通过抗原-抗体相互作用或配体-受体结合将一种或多种特异性多肽相互作用移植至例如T细胞的免疫效应细胞上。一些嵌合受体又名“嵌合抗原受体”、“人工T细胞受体”、“嵌合T细胞受体”或“嵌合免疫受体”。在一些实施方案中，嵌合受体包含对一种或多种抗原(例如肿瘤抗原)具有特异性的胞外抗原结合域、跨膜结构域和T细胞和/或其它受体的胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，胞外抗原结合域包含至少一个源自于配体的结构域或受体的胞外结构域，其中所述配体或受体为细胞表面抗原，例如肿瘤抗原。
“NKG2D嵌合受体”是指具有包含一个或多个对NKG2D配体具有特异性的结合域(例如NKG2D结构域)的胞外结构域的嵌合受体。“NKG2D×IL-3嵌合受体”是指具有包含对NKG2D配体具有特异性的结合域(例如NKG2D结构域)和对CD123具有特异性的结合域(例如IL-3结构域)的胞外结构域的嵌合受体。
如本文所用，“NKG2D结构域”是指NKG2D的胞外结构域中的功能片段，其在NKG2D结构域二聚化后可特异性地结合于一种或多种NKG2D配体。示例性人NKG2D配体包括(但不限于)MICA、MICB和ULBP分子。
如本文所用，“IL-3结构域”是指IL-3的功能片段(包括全长IL-3)，其可特异性地结合于CD123，例如IL-3R复合物和/或IL-3RA亚基。
如本文所用，术语“靶向”、“特异性地结合”、“特异性地识别”或“对……具有特异性”是指可测量的和可复现的相互作用，例如靶标与抗原结合蛋白(例如抗原结合域、配体或嵌合受体)之间的结合，其决定了在包括生物分子在内的分子的异质性群体存在下靶标的存在。举例来说，特异性地结合靶标的抗原结合蛋白为以比结合其它靶标更大的亲和力、亲合力、更容易地和/或在更大的持续时间下结合此靶标的抗原结合蛋白。在一些实施方案中，如例如通过放射免疫测定法(RIA)所测量，抗原结合蛋白与无关靶标结合的程度小于抗原结合蛋白与靶标结合的约10％。在一些实施方案中，特异性地结合靶标的抗原结合蛋白具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白特异性地结合蛋白质上在来自不同物种的蛋白质当中保守的表位。在一些实施方案中，特异性结合可包括但不要求排他性结合。
术语“特异性”是指抗原结合蛋白(例如抗原结合域、配体或嵌合受体)对抗原具体表位的选择性识别。如本文所用的术语“多特异性”表示抗原结合蛋白(例如嵌合受体)具有两个或更多个抗原结合位点，其中至少二个抗原结合位点结合不同的抗原。如本文所用的术语“双特异性”表示抗原结合蛋白(例如嵌合受体)具有两种不同的抗原结合特异性。
“结合亲和力”泛指分子的单一结合位点(例如抗原结合域、配体或嵌合受体)与其结合搭配物(例如抗原)之间的非共价相互作用的强度总和。除非另外指示，否则如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如抗原结合域与抗原)之间的1∶1相互作用的内部结合亲和力。分子X对其搭配物Y的亲和力一般可由解离常数(Kd)表示。亲和力可通过本领域中已知的常见方法，包括本文所述的那些方法来测量。低亲和力抗体一般慢慢结合抗原且往往易解离，而高亲和力抗体一般更快地结合抗原且往往保持更长时间的结合。本领域中已知多种测量结合亲和力的方法，其中任一种方法均可用于达成本申请的目的。
术语“抗体”包括单克隆抗体(包括全长4链抗体或具有免疫球蛋白Fc区的全长仅重链抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、多特异性抗体(例如双特异性抗体、双功能抗体和单链分子)以及抗体片段(例如Fab、F(ab′)2和Fv)。本文中涵盖的抗体包括单域抗体，例如仅重链抗体。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合和/或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双功能抗体；线性抗体(参见美国专利No.5,641，870实施例2；Zapata等人，Protein Eng.8(10)：1057-1062[1995])；单链抗体分子；单域抗体(例如VHH)和由抗体片段形成的多特异性抗体。
“单链Fv”还缩写成“sFv”或“scFv”，是包含连接成单一多肽链的VH和VL抗体结构域的片段。优选地，sFv多肽在VH与VL结构域之间进一步包含能够使sFv形成抗原结合所需结构的多肽连接子。关于sFv的综述，参见Pluckthun，The Pharmacology of MonoclonalAntibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，New York，第269-315页(1994)。
关于肽、多肽或抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同源性”被定义为在比对所述序列并在必要时引入缺口以实现最大序列同一性百分比后且不考虑任何保守性取代作为序列同一性的一部分下，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。可根据本领域技能内的多种方式，例如使用公众可获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)软件，实现比对，以确定氨基酸序列同一性百分比。本领域的技术人员可确定用于测量比对的适当参数，包括实现在所比较的序列全长上的最大比对所需的任何算法。
编码本文所述的嵌合受体或双嵌合受体系统的“分离”核酸分子是经过鉴定并与在产生其的环境中通常相关联的至少一种污染核酸分子分离的核酸分子。优选地，分离核酸不与所有与产生环境相关联的组分相关联。编码本文中的多肽和抗体的分离核酸分子呈除在自然界中发现其所呈的形式或设置以外的形式。因此，分离核酸分子与细胞中天然存在的编码本文中的多肽和抗体的核酸不同。
术语“控制序列”是指具体宿主生物体中可操作地连接的编码序列表达所必需的DNA序列。适合于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选地操纵序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多聚腺苷酸化信号和增强子。
当核酸与另一核酸序列处于功能关系时，所述核酸“可操作地连接”。举例来说，如果前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，那么所述DNA可操作地连接于多肽的DNA；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么所述启动子或增强子可操作地连接于所述编码序列；或如果核糖体结合位点的位置有助于翻译，那么所述核糖体结合位点可操作地连接于编码序列。一般地，“可操作地连接”意指所连接的DNA序列是相邻的，且在分泌前导序列的情况下，相邻并处于阅读期内。但是，增强子无需相邻。通过在适宜限制位点连接来实现连接。如果这类位点不存在，那么根据通常的做法来使用合成寡核苷酸衔接子或连接子。
如本文所用，术语“载体”是指能够繁殖其所连接的另一核酸的核酸分子。所述术语包括呈自我复制的核酸结构的载体以及并入已经引入了载体的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导其可操作地连接的核酸的表达。这类载体在本文中称为“表达载体”。
如本文所用，术语“自体同源”意指源自于同一名个体并且后面将再次引入所述个体中的任何物质。
“同种异体”是指源自于相同物种的不同个体的移植物。
如本文所用的术语“转染”或“转化”或“转导”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞中的方法。“转染”或“转化”或“转导”细胞为已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代受试者细胞和其后代。
如本文所用，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，且所有此类名称包括后代。因此，词语“转染体”和“转染细胞”包括原代受试者细胞和源自于其的培养物，与转移次数无关。还了解到由于故意或无意突变，所有后代不可能在DNA内含物方面精确一致。包括具有与在最初转化细胞中所筛选相同的功能或生物活性的变异后代。
如本文所用，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”为获得包括临床结果在内的有益或所需结果的方法。出于本发明的目的，有益或所需临床结果包括(但不限于)以下中的一个或多个：减轻由疾病产生的一种或多种症状、减弱疾病程度、稳定疾病(例如预防或延迟疾病恶化)、预防或延迟疾病传播(例如转移)、预防或延迟疾病复发、延迟或减缓疾病进展、改善疾病病况、提供疾病的症状缓解(部分或全部)、降低一种或多种其它药物治疗疾病所需的剂量、延迟疾病进展、提高生活质量和/或延长存活期。“治疗”还涵盖减少癌症的病理性结果。本申请的方法涵盖这些治疗方面中的任一个或多个。
如本文所用，“个体”或“受试者”是指哺乳动物，包括但不限于人、牛类动物、马、猫科动物、犬科动物、啮齿动物或灵长类动物。在一些实施方案中，个体为人。
本文中使用的术语“有效量”是指例如工程化免疫效应细胞或其药物组合物的剂足够治疗指定病症、疾患或疾病，例如改善、缓和、减轻和/或延迟其症状中的一个或多个的量。关于癌症，有效量包含足够引起肿瘤缩小和/或降低肿瘤生长速率(达到抑制肿瘤生长的程度)或预防或延迟其它不必要的细胞增殖的量。在一些实施方案中，有效量为足够延迟发育的量。在一些实施方案中，有效量为足够预防或延迟复发的量。有效量可分一次或多次施用来施用。药物或组合物的有效量可：(i)减少癌细胞的数目；(ii)减小肿瘤尺寸；(iii)抑制、延迟、在某种程度上减缓且优选终止癌细胞浸润至外周器官中；(iv)抑制(即在某种程度上减缓且优选终止)肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)预防或延迟肿瘤出现和/或复发；和/或(vii)在某种程度上减轻与癌症相关的症状中的一种或多种。
如本文所用，“延迟癌症显现”意指延迟、阻碍、减缓、推迟、稳定和/或延缓疾病之发展。此延迟可具有变化的时间长度，取决于病史和/或治疗的个体。如本领域的技术人员显而易见，足够或显著延迟实际上可涵盖预防，因为个体未显现疾病。“延迟”癌症显现的方法为与不使用所述方法相比时降低在给定时间范围内疾病显现的概率和/或降低在给定时间范围内疾病的程度的方法。此类比较典型地基于临床研究，使用统计上显著数目的个体。癌症显现可使用标准方法，包括(但不限于)计算机轴向断层成像法(CAT扫描)、磁共振成像(MRI)、腹部超声波、凝血测试、动脉造影术或活组织检查来检测。显现还可指最初不可检测的癌症进展且包括出现、复发和发作。
应了解本文所述的本申请的实施方案包括“由实施方案组成”和/或“基本上由实施方案组成”。
本文中提及“约”值或参数包括(且描述)针对该值或参数本身的变化。举例来说，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
如本文所用，提及“非”值或参数一般意指且描述“除值或参数以外”。举例来说，所述方法不用来治疗X型癌症意指所述方法用于治疗除X以外的癌症类型。
本文中使用的术语“约X-Y”具有与“约X至约Y”相同的含义。
如本文和随附权利要求书中所用，除非上下文另外清楚规定，否则单数形式“一种(a/an)”和“所述”包括多个指示物。
II.多特异性嵌合受体和双嵌合受体系统
本申请提供了靶向NKG2D配体的嵌合受体和嵌合受体系统。本申请的一方面提供一种多特异性嵌合受体，所述多特异性嵌合受体包括包含NKG2D结构域和第二抗原结合域、例如CD123结合域、例如IL-3结构域的胞外结构域。
在一些实施方案中，提供一种嵌合受体，所述嵌合受体包含：(a)包含NKG2D结构域的胞外结构域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域源自于选自由以下组成的组的分子：CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞(例如T细胞)的主要胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，主要胞内信号传导结构域源自于CD3ζ。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含协同刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，协同刺激信号传导结构域源自于选自由以下组成的组的协同刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、ICOS、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83配体和它们的组合。在一些实施方案中，嵌合受体还包含位于胞外结构域的C端与跨膜结构域的N端之间的铰链区(例如CD8α铰链区)。在一些实施方案中，嵌合受体从N端至C端包含：第一NKG2D结构域、肽连接子、第二NKG2D结构域、跨膜结构域(CD8α)、源自于4-1BB的协同刺激域和源自于CD3ζ的主要信号传导结构域。在一些实施方案中，NKG2D结构域包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供一种嵌合受体，所述嵌合受体包含第一多肽链和第二多肽链，每个多肽链包含：(a)包含NKG2D结构域和二聚化基序(例如亮氨酸拉链或半胱氨酸拉链)的胞外结构域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第一多肽链的NKG2D结构域经由一个或多个二硫键与第二多肽链的NKG2D结构域交联。在一些实施方案中，跨膜结构域源自于选自由以下组成的组的分子：CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞(例如T细胞)的主要胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，主要胞内信号传导结构域源自于CD3ζ。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含协同刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，协同刺激信号传导结构域源自于选自由以下组成的组的协同刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、ICOS、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83配体和它们的组合。在一些实施方案中，每个多肽链还包含位于第一胞外结构域的C端与第一跨膜结构域的N端之间的铰链区(例如CD8α铰链区)。在一些实施方案中，每个多肽链还包含位于每个多肽链的N端的信号肽(例如CD8α信号肽)。
在一些实施方案中，提供一种嵌合受体，所述嵌合受体包含：(a)包含第一NKG2D结构域和第二NKG2D结构域的胞外结构域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域源自于选自由以下组成的组的分子：CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞(例如T细胞)的主要胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，主要胞内信号传导结构域源自于CD3ζ。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含协同刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，协同刺激信号传导结构域源自于选自由以下组成的组的协同刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、ICOS、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83配体和它们的组合。在一些实施方案中，嵌合受体还包含位于胞外结构域的C端与跨膜结构域的N端之间的铰链区(例如CD8α铰链区)。在一些实施方案中，嵌合受体从N端至C端包含：第一NKG2D结构域、肽连接子、第二NKG2D结构域、跨膜结构域(CD8α)、源自于4-1BB的协同刺激域和源自于CD3ζ的主要信号传导结构域。在一些实施方案中，NKG2D结构域包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供一种嵌合受体，所述嵌合受体包含与SEQ ID NO：33的氨基酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一百分比的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供一种分离核酸序列，所述分离核酸序列包含与SEQ ID NO：38的核酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一百分比的序列同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，提供一种多特异性(例如双特异性)嵌合受体，所述多特异性嵌合受体包含：(a)包含NKG2D结构域和第二抗原结合域(例如IL-3结构域)的胞外结构域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第二抗原结合域特异性地结合于选自由以下组成的组的抗原：CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、BCMA、CS1、ROR1、GPC3、CD123、IL-13R、CD138、c-Met、EGFR、EGFRvIII、HER2、HER3、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3和糖脂F77。在一些实施方案中，第二抗原结合域为源自于选自由以下组成的组的分子的配体或配体结合域：NKG2A、NKG2C、NKG2F、IL-3、IL-13、LLT1、AICL、DNAM-1和NKp80。在一些实施方案中，跨膜结构域源自于选自由以下组成的组的分子：CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞(例如T细胞)的主要胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，主要胞内信号传导结构域源自于CD3ζ。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含协同刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，协同刺激信号传导结构域源自于选自由以下组成的组的协同刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、ICOS、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83配体和它们的组合。在一些实施方案中，多特异性嵌合受体还包含位于胞外结构域的C端与跨膜结构域的N端之间的铰链区(例如CD8α铰链区)。
嵌合受体(例如多特异性嵌合受体)可包含一个或多个多肽链。在一些实施方案中，嵌合受体为单体。在一些实施方案中，单体嵌合受体包括包含第一NKG2D结构域和第二NKG2D结构域的胞外结构域。在一些实施方案中，胞外结构域从N端至C端包含：第二抗原结合域(例如IL-3结构域)、第一NKG2D结构域和第二NKG2D结构域。在一些实施方案中，胞外结构域从N端至C端包含：第一NKG2D结构域、第二NKG2D结构域和第二抗原结合域(例如IL-3结构域)。在一些实施方案中，第一NKG2D结构域与第二NKG2D结构域交联。在一些实施方案中，第一NKG2D结构域在N端处包含第一工程化残基，且第二NKG2D结构域在C端处包含第二工程化残基，其中第一工程化残基与第二工程化残基例如经由二硫键或盐桥缔合。在一些实施方案中，第二抗原结合域经由肽连接子与第一NKG2D结构域融合，所述肽连接子例如至多约50个氨基酸长的肽连接子，例如包含选自SEQ ID NO：12-15的氨基酸序列的肽连接子。
在一些实施方案中，嵌合受体(例如多特异性嵌合受体)为二聚的，例如同二聚体或异二聚体。在一些实施方案中，二聚嵌合受体包含各包含单一NKG2D结构域的两个多肽链。在一些实施方案中，二聚嵌合受体包含两个相同的多肽链。在一些实施方案中，二聚嵌合受体包含两个不同的多肽链。在一些实施方案中，每个多肽链从N端至C端包含：第二抗原结合域、NKG2D结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，每个多肽链从N端至C端包含：NKG2D结构域、第二抗原结合域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，二聚嵌合受体的每个多肽链的NKG2D结构域互相非共价缔合，形成二聚体。在一些实施方案中，二聚嵌合受体的每个多肽链的NKG2D结构域例如通过二硫键和/或经由胞外结构域中的二聚化基序(例如亮氨酸拉链或半胱氨酸拉链)彼此共价缔合，形成二聚体。在一些实施方案中，第二抗原结合域经由肽连接子与NKG2D结构域融合，所述肽连接子例如至多约50个氨基酸长的肽连接子，例如包含选自SEQ ID NO：12-15的氨基酸序列的肽连接子。在一些实施方案中，第二抗原结合域经由二聚化基序，例如亮氨酸拉链或半胱氨酸拉链与NKG2D结构域融合。
因此，在一些实施方案中，提供一种多特异性(例如双特异性)嵌合受体，所述多特异性嵌合受体包括包含以下的多肽链：(a)包含第一NKG2D结构域、第二NKG2D结构域和第二抗原结合域的胞外结构域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第二抗原结合域特异性地结合于选自由以下组成的组的抗原：CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、BCMA、CS1、ROR1、GPC3、CD123、IL-13R、CD138、c-Met、EGFR、EGFRvIII、HER2、HER3、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3和糖脂F77。在一些实施方案中，第二抗原结合域为源自于选自由以下组成的组的分子的配体或配体结合域：NKG2A、NKG2C、NKG2F、IL-3、IL-13、LLT1、AICL、DNAM-1和NKp80。在一些实施方案中，第二抗原结合域经由肽连接子与第一NKG2D结构域或第二NKG2D结构域融合，所述肽连接子例如至多约50个氨基酸长的肽连接子，例如包含选自SEQID NO：12-15的氨基酸序列的肽连接子。在一些实施方案中，跨膜结构域源自于选自由以下组成的组的分子：CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞(例如T细胞)的主要胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，主要胞内信号传导结构域源自于CD3ζ。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含协同刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，协同刺激信号传导结构域源自于选自由以下组成的组的协同刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、ICOS、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83配体和它们的组合。在一些实施方案中，多特异性嵌合受体还包含位于胞外结构域的C端与跨膜结构域的N端之间的铰链区(例如CD8α铰链区)。在一些实施方案中，多特异性嵌合受体还包含位于多肽的N端的信号肽(例如CD8α信号肽)。在一些实施方案中，多肽链从N端至C端包含：第二抗原结合域(例如IL-3结构域)、第一肽连接子、第一NKG2D结构域、第二肽连接子、第二NKG2D结构域、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、源自于4-1BB的协同刺激信号传导结构域和源自于CD3ζ的主要胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，提供一种多特异性(例如双特异性)嵌合受体，所述多特异性嵌合受体包含第一多肽链和第二多肽链，每个多肽链包含以下：(a)包含NKG2D结构域和第二抗原结合域的胞外结构域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第一多肽链的NKG2D结构域经由一个或多个二硫键与第二多肽链的NKG2D结构域交联。在一些实施方案中，第二抗原结合域特异性地结合于选自由以下组成的组的抗原：CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、BCMA、CS1、ROR1、GPC3、CD123、IL-13R、CD138、c-Met、EGFR、EGFRvIII、HER2、HER3、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3和糖脂F77。在一些实施方案中，第二抗原结合域为源自于选自由以下组成的组的分子的配体或配体结合域：NKG2A、NKG2C、NKG2F、IL-3、IL-13、LLT1、AICL、DNAM-1和NKp80。在一些实施方案中，第二抗原结合域经由肽连接子与NKG2D结构域融合，所述肽连接子例如至多约50个氨基酸长的肽连接子，例如包含选自SEQID NO：12-15的氨基酸序列的肽连接子。在一些实施方案中，跨膜结构域源自于选自由以下组成的组的分子：CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞(例如T细胞)的主要胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，主要胞内信号传导结构域源自于CD3ζ。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含协同刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，协同刺激信号传导结构域源自于选自由以下组成的组的协同刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、ICOS、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83配体和它们的组合。在一些实施方案中，每个多肽链还包含位于第一胞外结构域的C端与第一跨膜结构域的N端之间的铰链区(例如CD8α铰链区)。在一些实施方案中，每个多肽链还包含位于每个多肽链的N端的信号肽(例如CD8α信号肽)。在一些实施方案中，第一多肽链和第二多肽链中的每一个从N端至C端包含：第二抗原结合域(例如IL-3结构域)、肽连接子、NKG2D结构域、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、源自于4-1BB的协同刺激信号传导结构域和源自于CD3ζ的主要胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，提供一种多特异性(例如双特异性)嵌合受体，所述多特异性嵌合受体包含第一多肽链和第二多肽链，每个多肽链包含以下：(a)包含NKG2D结构域、二聚化基序(例如亮氨酸拉链或半胱氨酸拉链)和第二抗原结合域的胞外结构域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第一多肽链的NKG2D结构域经由一个或多个二硫键与第二多肽链的NKG2D结构域交联。在一些实施方案中，第二抗原结合域特异性地结合于选自由以下组成的组的抗原：CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、BCMA、CS1、ROR1、GPC3、CD123、IL-13R、CD138、c-Met、EGFR、EGFRvIII、HER2、HER3、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3和糖脂F77。在一些实施方案中，第二抗原结合域为源自于选自由以下组成的组的分子的配体或配体结合域：NKG2A、NKG2C、NKG2F、IL-3、IL-13、LLT1、AICL、DNAM-1和NKp80。在一些实施方案中，跨膜结构域源自于选自由以下组成的组的分子：CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞(例如T细胞)的主要胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，主要胞内信号传导结构域源自于CD3ζ。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含协同刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，协同刺激信号传导结构域源自于选自由以下组成的组的协同刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、ICOS、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83配体和它们的组合。在一些实施方案中，每个多肽链还包含位于第一胞外结构域的C端与第一跨膜结构域的N端之间的铰链区(例如CD8α铰链区)。在一些实施方案中，每个多肽链还包含位于每个多肽链的N端的信号肽(例如CD8α信号肽)。在一些实施方案中，第一多肽链和第二多肽链中的每一个从N端至C端包含：第二抗原结合域(例如IL-3结构域)、亮氨酸拉链、NKG2D结构域、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、源自于4-1BB的协同刺激信号传导结构域和源自于CD3ζ的主要胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，第二抗原结合域特异性地结合于例如肿瘤抗原的细胞表面抗原。示例性肿瘤抗原包括(但不限于)CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、BCMA、CS1、ROR1、GPC3、CD123、CD138、c-Met、EGFR、EGFRvIII、HER2、HER3、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3和糖脂F77。在一些实施方案中，第二抗原结合域为抗体片段，例如单链抗体(例如scFv)或单域抗体(例如VHH)。在一些实施方案中，第二抗原结合域为特异性地结合于CD123(例如IL-3R或IL-3RA亚基)的抗体片段(例如scFv或VHH)。
在一些实施方案中，第二抗原结合域为配体。在一些实施方案中，第二抗原结合域为配体结合域，例如受体的胞外结构域。示例性配体和受体包括(但不限于)NKG2A、NKG2C、NKG2F、IL-3、IL-13、LLT1、AICL、DNAM-1和NKp80。在一些实施方案中，第二抗原结合域为IL-3结构域。
因此，在一些实施方案中，提供一种多特异性(例如双特异性)嵌合受体，所述多特异性嵌合受体包括包含以下的多肽链：(a)包含第一NKG2D结构域、第二NKG2D结构域和CD123结合域(例如IL-3结构域)的胞外结构域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CD123结合域经由肽连接子与第一NKG2D结构域或第二NKG2D结构域融合，所述肽连接子例如至多约50个氨基酸长的肽连接子，例如包含选自SEQ ID NO：12-15的氨基酸序列的肽连接子。在一些实施方案中，CD123结合域为抗CD123抗体片段(例如scFv或VHH)。在一些实施方案中，CD123结合域为IL-3结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域源自于选自由以下组成的组的分子：CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞(例如T细胞)的主要胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，主要胞内信号传导结构域源自于CD3ζ。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含协同刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，协同刺激信号传导结构域源自于选自由以下组成的组的协同刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、ICOS、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83配体和它们的组合。在一些实施方案中，多特异性嵌合受体还包含位于胞外结构域的C端与跨膜结构域的N端之间的铰链区(例如CD8α铰链区)。在一些实施方案中，多特异性嵌合受体还包含位于多肽的N端的信号肽(例如CD8α信号肽)。在一些实施方案中，多肽链从N端至C端包含：IL-3结构域、第一肽连接子、第一NKG2D结构域、第二肽连接子、第二NKG2D结构域、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、源自于4-1BB的协同刺激信号传导结构域和源自于CD3ζ的主要胞内信号传导结构域。示例性多特异性嵌合受体展示于图1A-1B中。
在一些实施方案中，提供一种多特异性(例如双特异性)嵌合受体，所述多特异性嵌合受体包含第一多肽链和第二多肽链，每个多肽链包含以下：(a)包含NKG2D结构域和CD123结合域(例如IL-3结构域)的胞外结构域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第一多肽链的NKG2D结构域经由一个或多个二硫键与第二多肽链的NKG2D结构域交联。在一些实施方案中，CD123结合域经由肽连接子与NKG2D结构域融合，所述肽连接子例如至多约50个氨基酸长的肽连接子，例如包含选自SEQ ID NO：12-15的氨基酸序列的肽连接子。在一些实施方案中，CD123结合域为抗CD123抗体片段(例如scFv或VHH)。在一些实施方案中，CD123结合域为IL-3结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域源自于选自由以下组成的组的分子：CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞(例如T细胞)的主要胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，主要胞内信号传导结构域源自于CD3ζ。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含协同刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，协同刺激信号传导结构域源自于选自由以下组成的组的协同刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、ICOS、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83配体和它们的组合。在一些实施方案中，每个多肽链还包含位于第一胞外结构域的C端与第一跨膜结构域的N端之间的铰链区(例如CD8α铰链区)。在一些实施方案中，每个多肽链还包含位于每个多肽链的N端的信号肽(例如CD8α信号肽)。在一些实施方案中，第一多肽链和第二多肽链中的每一个从N端至C端包含：IL-3结构域、肽连接子、NKG2D结构域、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、源自于4-1BB的协同刺激信号传导结构域和源自于CD3ζ的主要胞内信号传导结构域。一种示例性多特异性嵌合受体展示于图1D中。
在一些实施方案中，提供一种多特异性(例如双特异性)嵌合受体，所述多特异性嵌合受体包含第一多肽链和第二多肽链，每个多肽链包含以下：(a)包含NKG2D结构域、二聚化基序(例如亮氨酸拉链或半胱氨酸拉链)和CD123结合域(例如IL-3结构域)的胞外结构域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第一多肽链的NKG2D结构域经由一个或多个二硫键与第二多肽链的NKG2D结构域交联。在一些实施方案中，CD123结合域为抗CD123抗体片段(例如scFv或VHH)。在一些实施方案中，CD123结合域为IL-3结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域源自于选自由以下组成的组的分子：CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞(例如T细胞)的主要胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，主要胞内信号传导结构域源自于CD3ζ。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含协同刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，协同刺激信号传导结构域源自于选自由以下组成的组的协同刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、ICOS、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83配体和它们的组合。在一些实施方案中，每个多肽链还包含位于第一胞外结构域的C端与第一跨膜结构域的N端之间的铰链区(例如CD8α铰链区)。在一些实施方案中，每个多肽链还包含位于每个多肽链的N端的信号肽(例如CD8α信号肽)。在一些实施方案中，第一多肽链和第二多肽链中的每一个从N端至C端包含：IL-3结构域、亮氨酸拉链、NKG2D结构域、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、源自于4-1BB的协同刺激信号传导结构域和源自于CD3ζ的主要胞内信号传导结构域。一种示例性多特异性嵌合受体展示于图1C中。
示例性NKG2D×IL-3嵌合受体和其序列展示于表1中。对于具有两个相同的多肽链的二聚嵌合受体，展示单体亚基的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供一种NKG2D×IL-3嵌合受体，所述嵌合受体包含与选自由SEQ ID NO：16-20组成的组的氨基酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一百分比的序列同一性的多肽。在一些实施方案中，提供一种NKG2D×IL-3嵌合受体，所述嵌合受体包含选自由SEQ ID NO：16-20组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供一种NKG2D嵌合受体，所述嵌合受体包含与SEQ ID NO：33的氨基酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一百分比的序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的NKG2D嵌合受体。还提供了一种包含选自由SEQ IDNO：16-20和33组成的组的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中，提供一种或多种分离核酸，所述分离核酸编码本文提供的嵌合受体或多特异性嵌合受体中的任一种。在嵌合受体为具有两个相同的多肽链的二聚嵌合受体的一些实施方案中，提供编码嵌合受体的单体亚基，即多肽链的单个拷贝的分离核酸。在一些实施方案中，提供一种分离核酸，所述分离核酸与选自由SEQ ID NO：21-25和38组成的组的核酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一百分比的序列同一性。在一些实施方案中，分离核酸为DNA。在一些实施方案中，分离核酸为RNA(例如mRNA)。在一些实施方案中，提供一种或多种载体，所述载体包含编码上述嵌合受体或多特异性嵌合受体的核酸中的任一种。在一些实施方案中，载体为表达载体。在一些实施方案中，载体为病毒载体，例如慢病毒载体。在一些实施方案中，载体为非病毒载体。
表1.示例性NKG2D×IL-3嵌合受体
Figure GDA0002926794110000301
双嵌合受体系统
本申请的一方面提供一种双嵌合受体系统，所述双嵌合受体系统包含：(i)第一嵌合受体，所述嵌合受体包含：(a)包含NKG2D结构域的第一胞外结构域、(b)第一跨膜结构域和(c)第一胞内信号传导结构域；以及(ii)第二嵌合受体，所述嵌合受体包含：(a)包含第二抗原结合域的第二胞外结构域、(b)第二跨膜结构域和任选地(c)第二胞内信号传导结构域。第一嵌合受体特异性地结合于NKG2D配体，且第二嵌合受体特异性地结合于第二抗原，例如肿瘤抗原，例如CD123。
第一嵌合受体和第二嵌合受体中的每种嵌合受体可包含一个或多个多肽链。双嵌合受体系统可包含本文所述的嵌合受体和第二嵌合受体的任何组合。
在一些实施方案中，第一嵌合受体包含包括以下的单一多肽链：(a)包含第一NKG2D结构域和第二NKG2D结构域的第一胞外结构域、(b)第一跨膜结构域和(c)第一胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第一NKG2D结构域与第二NKG2D结构域交联。在一些实施方案中，第一NKG2D结构域在N端处包含第一工程化残基，且第二NKG2D结构域在C端处包含第二工程化残基，其中第一工程化残基与第二工程化残基例如经由二硫键或盐桥缔合。在一些实施方案中，第一跨膜结构域源自于选自由以下组成的组的分子：CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1。在一些实施方案中，第一胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞(例如T细胞)的主要胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，主要胞内信号传导结构域源自于CD3ζ。在一些实施方案中，第一胞内信号传导结构域包含协同刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，协同刺激信号传导结构域源自于选自由以下组成的组的协同刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、ICOS、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83配体和它们的组合。在一些实施方案中，第一嵌合受体还包含位于第一胞外结构域的C端与第一跨膜结构域的N端之间的铰链区(例如CD8α铰链区)。在一些实施方案中，第一嵌合受体还包含位于多肽链的N端的信号肽(例如CD8α信号肽)。在一些实施方案中，第一嵌合受体包含从N端至C端包含以下的多肽链：第一NKG2D结构域、肽连接子、第二NKG2D结构域、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、源自于4-1BB的协同刺激信号传导结构域和源自于CD3ζ的主要胞内信号传导结构域。一种示例性第一嵌合受体展示于图1E中。
在一些实施方案中，第一嵌合受体包含第一多肽链和第二多肽链，每个多肽链包含：(a)包含NKG2D结构域的第一胞外结构域、(b)第一跨膜结构域和(c)第一胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第一多肽链的NKG2D结构域经由一个或多个二硫键与第二多肽链的NKG2D结构域交联。在一些实施方案中，第一跨膜结构域源自于选自由以下组成的组的分子：CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1。在一些实施方案中，第一胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞(例如T细胞)的主要胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，主要胞内信号传导结构域源自于CD3ζ。在一些实施方案中，第一胞内信号传导结构域包含协同刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，协同刺激信号传导结构域源自于选自由以下组成的组的协同刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、ICOS、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83配体和它们的组合。在一些实施方案中，每个多肽链还包含位于第一胞外结构域的C端与第一跨膜结构域的N端之间的铰链区(例如CD8α铰链区)。在一些实施方案中，每个多肽链还包含位于每个多肽链的N端的信号肽(例如CD8α信号肽)。在一些实施方案中，第一多肽链和第二多肽链中的每一个从N端至C端包含：NKG2D结构域、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、源自于4-1BB的协同刺激信号传导结构域和源自于CD3ζ的主要胞内信号传导结构域。一种示例性第一嵌合受体展示于图1F中。
在一些实施方案中，第一嵌合受体包含第一多肽链和第二多肽链，每个多肽链包含：(a)包含NKG2D结构域和二聚化结构域(例如亮氨酸拉链或半胱氨酸拉链)的第一胞外结构域、(b)第一跨膜结构域和(c)第一胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，二聚化结构域位于NKG2D结构域的N端。在一些实施方案中，二聚化结构域位于NKG2D结构域的C端。在一些实施方案中，第一多肽链的NKG2D结构域还经由一个或多个二硫键与第二多肽链的NKG2D结构域交联。在一些实施方案中，第一跨膜结构域源自于选自由以下组成的组的分子：CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1。在一些实施方案中，第一胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞(例如T细胞)的主要胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，主要胞内信号传导结构域源自于CD3ζ。在一些实施方案中，第一胞内信号传导结构域包含协同刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，协同刺激信号传导结构域源自于选自由以下组成的组的协同刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、ICOS、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83配体和它们的组合。在一些实施方案中，每个多肽链还包含位于第一胞外结构域的C端与第一跨膜结构域的N端之间的铰链区(例如CD8α铰链区)。在一些实施方案中，每个多肽链还包含位于每个多肽链的N端的信号肽(例如CD8α信号肽)。在一些实施方案中，第一多肽链和第二多肽链中的每一个从N端至C端包含：亮氨酸拉链、NKG2D结构域、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、源自于4-1BB的协同刺激信号传导结构域和源自于CD3ζ的主要胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，第二嵌合受体包括包含以下的多肽链：(a)包含第二抗原结合域的第二胞外结构域和(b)第二跨膜结构域。在一些实施方案中，第二嵌合受体不包含胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第二胞外结构域还包含NKG2D结构域，例如第二胞外结构域从N端至C端包含：NKG2D结构域和第二抗原结合域或第二抗原结合域和NKG2D结构域。在一些实施方案中，第二抗原结合域特异性地结合于选自由以下组成的组的抗原：CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、BCMA、CS1、ROR1、GPC3、CD123、IL-13R、CD138、c-Met、EGFR、EGFRvIII、HER2、HER3、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3和糖脂F77。在一些实施方案中，第二抗原结合域为源自于选自由以下组成的组的分子的配体或配体结合域：NKG2A、NKG2C、NKG2F、IL-3、IL-13、LLT1、AICL、DNAM-1和NKp80。在一些实施方案中，第二抗原结合域为CD123结合域，例如IL-3结构域。在一些实施方案中，第二跨膜结构域源自于选自由以下组成的组的分子：CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1。在一些实施方案中，第二嵌合受体还包含位于第二胞外结构域的C端与第二跨膜结构域的N端之间的铰链区(例如CD8α铰链区)。在一些实施方案中，第二嵌合受体还包含位于多肽链的N端的信号肽(例如CD8α信号肽)。在一些实施方案中，第二嵌合受体包含从N端至C端包含以下的多肽链：IL-3结构域、CD8α铰链区和CD8α跨膜结构域。一种示例性第二嵌合受体展示于图1E和图1F中。
在一些实施方案中，第二嵌合受体包括包含以下的多肽链：(a)包含第二抗原结合域的第二胞外结构域、(b)第二跨膜结构域和(c)第二胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第二胞外结构域还包含NKG2D结构域，例如第二胞外结构域从N端至C端包含：NKG2D结构域和第二抗原结合域或第二抗原结合域和NKG2D结构域。在一些实施方案中，第二抗原结合域特异性地结合于选自由以下组成的组的抗原：CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、BCMA、CS1、ROR1、GPC3、CD123、IL-13R、CD138、c-Met、EGFR、EGFRvIII、HER2、HER3、GD-2、NY-ESO-1、MAGEA3和糖脂F77。在一些实施方案中，第二抗原结合域为源自于选自由以下组成的组的分子的配体或配体结合域：NKG2A、NKG2C、NKG2F、IL-3、IL-13、LLT1、AICL、DNAM-1和NKp80。在一些实施方案中，第二抗原结合域为CD123结合域，例如IL-3结构域。在一些实施方案中，第二跨膜结构域源自于选自由以下组成的组的分子：CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1。在一些实施方案中，第二胞内信号传导结构域包含协同刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，协同刺激信号传导结构域源自于选自由以下组成的组的协同刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、ICOS、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83配体和它们的组合。在一些实施方案中，第二胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞(例如T细胞)的主要胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，主要胞内信号传导结构域源自于CD3ζ。在一些实施方案中，第二胞内信号传导结构域不包含主要胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第二嵌合受体还包含位于胞外结构域的C端与跨膜结构域的N端之间的铰链区(例如CD8α铰链区)。在一些实施方案中，第二嵌合受体还包含位于多肽链的N端的信号肽(例如CD8α信号肽)。在一些实施方案中，第二嵌合受体包含从N端至C端包含以下的多肽链：IL-3结构域、CD8α铰链区、CD8α跨膜区和源自于4-1BB的协同刺激信号传导结构域。
在一些实施方案中，提供一种双嵌合受体系统，所述双嵌合受体系统包含：(i)包含第一多肽链和第二多肽链的第一嵌合受体，每个多肽链包含：(a)包含NKG2D结构域的第一胞外结构域、(b)第一跨膜结构域和(c)第一胞内信号传导结构域；以及(ii)包含第三多肽链的第二嵌合受体，所述多肽链包含：(a)包含第二抗原结合域(例如IL-3结构域)的第二胞外结构域、(b)第二跨膜结构域和任选地(c)第二胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第一多肽链的NKG2D结构域经由一个或多个二硫键与第二多肽链的NKG2D结构域交联。在一些实施方案中，第一跨膜结构域和/或第二跨膜结构域源自于选自由以下组成的组的分子：CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1。在一些实施方案中，第一胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞(例如T细胞)的主要胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，主要胞内信号传导结构域源自于CD3ζ。在一些实施方案中，第一胞内信号传导结构域和/或第二胞内域包含协同刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，协同刺激信号传导结构域源自于选自由以下组成的组的协同刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、ICOS、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83配体和它们的组合。在一些实施方案中，第二嵌合受体不包含胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，每个多肽链还包含位于第一胞外结构域的C端与第一跨膜结构域的N端之间的铰链区(例如CD8α铰链区)。在一些实施方案中，每个多肽链还包含位于每个多肽链的N端的信号肽(例如CD8α信号肽)。在一些实施方案中，第一多肽链和第二多肽链中的每一个从N端至C端包含：NKG2D结构域、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、源自于4-1BB的协同刺激信号传导结构域和源自于CD3ζ的主要胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第三多肽链从N端至C端包含：IL-3结构域和CD8α跨膜结构域。一种示例性双嵌合受体系统展示于图1F中。
在一些实施方案中，第一嵌合受体的多肽和第二嵌合受体的多肽经由多顺反子核酸构建体表达。举例来说，第一嵌合受体的多肽经由自裂解肽与第二嵌合受体的多肽融合。示例性自裂解肽包括(但不限于)T2A、P2A和F2A肽。已经描述T2A肽，例如参见Szymczak AL.等人，Correction of multi-gene deficiency in vivo using a“self-cleaving”2Apeptide-based retroviral vector.Nat Biotechnol 2004；22(5)589-594。
在一些实施方案中，提供一种或多种分离核酸，所述分离核酸编码本文所述的任一种双嵌合受体系统。在一些实施方案中，提供一种分离核酸，所述分离核酸包含编码第一嵌合受体的第一核酸序列和编码第二嵌合受体的第二核酸序列，其中第一核酸序列经由编码自裂解肽(例如T2A)的第三核酸序列可操作地连接于第二核酸序列。在第一嵌合受体为具有两个相同的多肽链的二聚嵌合受体的一些实施方案中，第一核酸编码第一嵌合受体的单体亚基，即多肽链的单个拷贝。
在一些实施方案中，提供一种嵌合受体，所述嵌合受体包含与选自由SEQ ID NO：34-35和41-42组成的组的氨基酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一百分比的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供一种NKG2D×IL-3双嵌合受体系统，所述双嵌合受体系统包含：第一嵌合受体，所述第一嵌合受体包含与SEQ ID NO：34的氨基酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一百分比的序列同一性的氨基酸序列；和第二嵌合受体，所述第二嵌合受体包含与SEQ ID NO：41的氨基酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一百分比的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供一种NKG2D×IL-3双嵌合受体系统，所述双嵌合受体系统包含：第一嵌合受体，所述第一嵌合受体包含与SEQ ID NO：35的氨基酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一百分比的序列同一性的氨基酸序列；和第二嵌合受体，所述第二嵌合受体包含与SEQ ID NO：42的氨基酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一百分比的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供一种多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO：36或37的氨基酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一百分比的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供一种分离核酸，所述分离核酸具有与选自由SEQ ID NO：26-27、39-40和43-44组成的组的核酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一百分比的序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，分离核酸为DNA。在一些实施方案中，分离核酸为RNA(例如mRNA)。在一些实施方案中，提供一种或多种载体，所述载体包含编码上文所述的双嵌合受体系统或嵌合受体的核酸中的任一种或多种。在一些实施方案中，载体为表达载体。在一些实施方案中，载体为病毒载体，例如慢病毒载体。在一些实施方案中，载体为非病毒载体。下文展示一种示例性双嵌合受体系统：
表2.示例性NKG2D×IL-3双嵌合受体系统
Figure GDA0002926794110000371
胞外结构域
包括多特异性嵌合受体、双嵌合受体系统的第一嵌合受体和第二嵌合受体在内的本文所述的嵌合受体包括包含一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一个)抗原结合域，包括一个或多个NKG2D结构域和/或第二抗原结合域的胞外结构域。NKG2D结构域和第二抗原结合域可直接经由肽键、经由肽连接子或经由例如亮氨酸拉链或半胱氨酸拉链的二聚化基序直接彼此融合。
NKG2D结构域
嵌合受体的胞外结构域包含一个或多个NKG2D结构域。在一些实施方案中，嵌合受体的胞外结构域包含单个NKG2D结构域。在一些实施方案中，胞外结构域包含第一NKG2D结构域和第二NKG2D结构域。在一些实施方案中，第一NKG2D结构域与第二NKG2D结构域相同。在一些实施方案中，第一NKG2D结构域与第二NKG2D结构域不同。在一些实施方案中，第一NKG2D结构域与第二NKG2D结构域经由肽键或经由肽连接子彼此直接融合。
在一些实施方案中，NKG2D结构域源自于人NKG2D分子。在一些实施方案中，NKG2D结构域源自于NKG2D、例如人NKG2D的胞外结构域。在一些实施方案中，NKG2D结构域为正向NKG2D结构域，即具有与野生型NKG2D结构域相同次序的氨基酸序列的结构域。在一些实施方案中，NKG2D结构域包含来自野生型NKG2D的胞外结构域的至少约100个、105个、110个、115个、120个、125个、130个、135个、140个、150个或更多中的任一数目的氨基酸。在一些实施方案中，NKG2D结构域为反向NKG2D结构域，即具有与野生型NKG2D结构域相反序列的结构域。在一些实施方案中，NKG2D结构域(包括第一NKG2D结构域和/或第二NKG2D结构域)包含与SEQ ID NO：7或8具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一百分比的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，NKG2D结构域与NKG2D的对应野生型序列相比包含至少1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)。
NKG2D为NKG2家族的独特成员，NKG2家族是刺激或抑制NK细胞的细胞毒活性的C型凝集素受体。NKG2D为II型锚定跨膜的糖蛋白，主要在NK细胞和CD8+T细胞(例如αβ T细胞和γδ T细胞)的表面上表达。其在多种物种中高度保守，其中在人与鼠科受体之间享有70％序列同一性。不同于与CD94异二聚化且结合于非经典MHC糖蛋白I类的其它NKG2受体，NKG2D形成同二聚体并结合于细胞应激诱导型分子。越来越多的证据表明NKG2D在针对应激细胞或异常细胞，例如自体同源肿瘤细胞和病毒感染细胞的免疫监视中起关键作用。
已经在人中鉴定多种NKG2D配体，包括由MHC家族中的基因编码的MIC分子(MHC I类链相关蛋白A和B或MICA和MICB)和集聚在人的染色体6上的ULBP分子(UL16结合蛋白，又名RAET1蛋白)(Bahram等人2005)。所有的NKG2D配体都与MHC I类分子同源并展现大量的等位基因变异。虽然NKG2D配体RNA在身体的所有组织和器官上广泛地表达，但NKG2D配体一般在正常成人细胞的表面上不存在(Le Bert和Gasser 2014)。然而，对包括热休克、DNA破坏和停滞DNA重复在内的细胞应激作出应答，主要在上皮来源的组织中诱发或上调NKG2D配体的表达。NKG2D配体在细胞上的存在标志着所述细胞用于靶向NK细胞和可能消除(Le Bert和Gasser 2014)。有趣的是，跨越多种血液学和实体瘤，在转化细胞中DNA修复通路的高活性引起NKG2D配体的表达，这使得这些细胞容易发生NK介导的溶解(Sentman等人2006)。
NKG2D由KLRK1基因编码。NKG2D为包含三个结构域的跨膜受体蛋白：胞质结构域(人NKG2D的残基1-51)、跨膜结构域(人NKG2D的残基52-72)和胞外结构域(人NKG2D的残基73-216)。NKG2D的胞外结构域含有C型凝集素域(人NKG2D的残基98-213)。
第二抗原结合域
第二抗原结合域特异性地结合于细胞表面分子。第二抗原结合域可经过选择，识别与特殊疾病病况相关的靶细胞上用作细胞表面标志物的抗原。第二抗原结合域所靶向的抗原可直接或间接与疾病有关。在一些实施方案中，抗原为肿瘤抗原。在一些实施方案中，肿瘤抗原与B细胞恶性病相关联。
肿瘤抗原是由肿瘤细胞产生的可引起免疫反应、尤其是T细胞介导的免疫反应的蛋白质。关于本发明的靶向抗原的选择将取决于有待治疗的癌症的具体类型。示例性肿瘤抗原包括例如胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CAIX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、p53、前列腺特异性蛋白(prostein)、PSMA、HER2/neu、存活素和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性粒细胞弹性蛋白酶、ephrinB2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。
在一些实施方案中，肿瘤抗原为肿瘤特异抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。TSA是肿瘤细胞所独有的，且在体内其它细胞上不存在。TAA相关抗原并非肿瘤细胞所独有，而是在正常细胞上在无法诱发针对抗原的免疫耐受性状态的条件下也表达。肿瘤上抗原的表达可在使免疫系统能对抗原作出应答的条件下发生。TAA可为在胎儿发育期间当免疫系统不成熟且不会作出应答时在正常细胞上表达的抗原，或其可为通常以极低水平存在于正常细胞上但以高得多的水平在肿瘤细胞上表达的抗原。
TSA或TAA抗原的非限制性实例包括以下：分化抗原，例如MART-1/MelanA(MART-I)、gp 100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤特异性多谱系抗原，例如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15；过度表达的胚胎抗原，例如CEA；过度表达的致癌基因和突变肿瘤抑制基因，例如p53、Ras、HER2/neu；由染色体易位产生的独特肿瘤抗原；例如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；以及病毒抗原，例如爱泼斯坦-巴尔病毒抗原(Epstein Barr virus antigen，EBVA)和人乳头状瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其它大的基于蛋白质的抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、pl85erbB2、pl80erbB-3、c-met、nm-23HI、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-链蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS 1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。
第二抗原结合域可具有任何合适的格式。在一些实施方案中，第二抗原结合域源自于抗体，例如四链抗体，或单域抗体，例如仅重链抗体。在一些实施方案中，第二抗原结合域为抗体片段，例如Fab、Fv、scFv或VHH。在一些实施方案中，第二抗原结合域为特异性地结合于选自由以下组成的组的抗原的抗体片段：CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、BCMA、CS1、ROR1、GPC3、CD123、IL-13R、CD138、c-Met、EGFR、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3和糖脂F77。
在一些实施方案中，第二抗原结合域为配体或受体的配体结合域。在一些实施方案中，第二抗原结合域为源自于选自由以下组成的组的分子的配体或配体结合域：NKG2A、NKG2C、NKG2F、IL-3、IL-13、LLT1、AICL、DNAM-1和NKp80。
CD123结合域
在一些实施方案中，第二抗原结合域为CD123结合域。在一些实施方案中，CD123结合域为抗CD123抗体的抗体片段(例如scFv或VHH)。在一些实施方案中，CD123结合域为CD123的配体或IL-3结构域。在一些实施方案中，IL-3结构域源自于人IL-3，例如人IL-3的全长或功能片段。在一些实施方案中，CD123结合域包含与SEQ ID NO：9具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一百分比的序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供一种嵌合受体，所述嵌合受体包含：(a)包含CD123结合域的胞外结构域；和(b)跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域源自于选自由以下组成的组的分子：CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1。在一些实施方案中，嵌合受体还包含胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞(例如T细胞)的主要胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，主要信号传导结构域源自于CD3ζ。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域不包含免疫效应细胞的主要胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含协同刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域由一个或多个协同刺激信号传导结构域组成(或基本上由其组成)。在一些实施方案中，协同刺激信号传导结构域源自于选自由以下组成的组的协同刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、ICOS、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83配体和它们的组合。在一些实施方案中，嵌合受体还包含位于胞外结构域的C端与跨膜结构域的N端之间的铰链区(例如CD8α铰链区)。在一些实施方案中，嵌合受体从N端至C端包含：CD123结合域和跨膜结构域(CD8α)。在一些实施方案中，CD123结合域为IL-3结构域。在一些实施方案中，CD123结合域包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供一种嵌合受体，所述嵌合受体包含与SEQ ID NO：41或42具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一百分比的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供一种分离核酸，所述分离核酸包含与SEQ ID NO：43或44具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一百分比的序列同一性的核酸序列。
IL-3(白细胞介素-3)基因定位于编码152个氨基酸长的蛋白质的染色体5上。IL-3是能够支持大量细胞活性，例如细胞生长、分化和细胞凋亡的细胞因子。IL-3通过结合于白细胞介素-3受体(IL-3R)起作用，又名CD123抗原。IL-3R为异二聚体受体，包含配体特异性α亚基和信号转导β亚基，由IL-3、集落刺激因子2(CSF2/GM-CSF)和白细胞介素5(IL5)共享。IL-3R的活化导致βc链的磷酸化、例如Vav1的含有SH2的衔接分子的募集和经由Jak2/STAT5和Ras/MAPK通路的下游信号转导。
IL-3R是75kD糖蛋白，并在通过N-糖苷酶水解时，变成43kD。IL-3R具有负责特异性结合于IL-3的三个胞外结构域、跨膜结构域和对胞内信号传导来说不可缺少的短的胞间域(Sato等人1993)。IL-3R是对IL-3具有低亲和力和高特异性的异二聚体受体。在结合于IL-3后，IL-3R得到活化并促进细胞增殖和存活(Liu等人2015)。
CD123在AML母细胞(即成髓细胞)上过度表达。75％至89％AML患者中，AML母细胞和白血病干细胞(LSC)表达CD123。与之形成鲜明对比的是，CD123在正常造血干细胞(HSC)上的表达低或无法检测到(Frankel等人2014；Jordan等人2000)。除AML外，CD123还在多种血液恶性病中过度表达，所述血液恶性病包括B细胞谱系急性淋巴母细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、浆细胞样树突状细胞肿瘤和毛细胞白血病(Munoz等人2001)。此表达谱使CD123成为疾病的临床诊断、预后和介入中的一种重要生物标志物。当前，早期临床试验已经证明，靶向CD123的疗法是安全的且对造血没有重大副作用。仍然研究着靶向CD123的疗法在人中的抗白血病活性。
二聚化基序
在一些实施方案中，胞外结构域包含二聚化基序和单个NKG2D结构域。在一些实施方案中，胞外结构域包含第二抗原结合域、单个NKG2D结构域和布置在两者之间的二聚化基序。二聚化基序促进嵌合受体中两条多肽链的二聚化，由此有助于NKG2D同二聚体的形成和NKG2D同二聚体结合于NKG2D配体。本领域中已知合适的二聚化基序。在一些实施方案中，二聚化基序为亮氨酸拉链。在一些实施方案中，亮氨酸拉链包含SEQ ID NO：10的氨基酸。在一些实施方案中，二聚化基序为半胱氨酸拉链。本领域中已知示例性半胱氨酸拉链。参见例如Guilaume等人(2015)PLoS ONE 10(6)：e0128779。
肽连接子
在一些实施方案中，NKG2D结构域和第二抗原结合域(例如IL-3结构域)经由肽连接子彼此融合。在一些实施方案中，第一NKG2D结构域与第二NKG2D结构域经由肽连接子彼此融合。嵌合受体的不同域也可以经由肽连接子彼此融合。连接不同域的肽连接子可为相同或不同的。
嵌合受体中的每个肽连接子可具有相同或不同的长度和/或序列，取决于多种域的结构和/或功能特征。每个肽连接子可独立地选择和优化。用于嵌合受体中的肽的长度、柔性和/或其它性质可对包括但不限于对一种或多种具体抗原或表位的亲和力、特异性或亲合力在内的性质产生一些影响。举例来说，可选择较长的肽连接子以保证二个相邻结构域在空间上不互相干扰。在一些实施方案中，短的肽连接子可布置在嵌合受体的跨膜结构域与胞内信号传导结构域之间。在一些实施方案中，肽连接子包含柔性残基(例如甘氨酸和丝氨酸)，以便相邻结构域相对于彼此自由地移动。举例来说，甘氨酸-丝氨酸对可为合适的肽连接子。
肽连接子可具有任何合适的长度。在一些实施方案中，肽连接子为至少约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、50个、75个、100个或更多中的任一数目的氨基酸长。在一些实施方案中，肽连接子为至多约100个、75个、50个、40个、35个、30个、25个、20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个或更少中的任一数目的氨基酸长。在一些实施方案中，肽连接子的长度为以下中的任一种：约1个氨基酸至约10个氨基酸、约1个氨基酸至约20个氨基酸、约1个氨基酸至约30个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约10个氨基酸至约25个氨基酸、约5个氨基酸至约30个氨基酸、约10个氨基酸至约30个氨基酸长、约30个氨基酸至约50个氨基酸、约50个氨基酸至约100个氨基酸或约1个氨基酸至约100个氨基酸。
肽连接子可具有天然存在的序列，或非天然存在的序列。举例来说，源自于仅重链抗体的铰链区的序列可用作连接子。参见例如WO1996/34103。在一些实施方案中，肽连接子为柔性连接子。示例性柔性连接子包括甘氨酸聚合物(G)n(SEQ ID NO：28)、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n(SEQ ID NO：29)、(GSGGS)n(SEQ ID NO：30)、(GGGS)n(SEQ ID NO：31)和(GGGGS)n(SEQ ID NO：32)，其中n为至少一的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域中已知的其它柔性连接子。在一些实施方案中，肽连接子包含选自SEQ ID NO：12-15的氨基酸序列。
跨膜结构域
包括多特异性嵌合受体、双嵌合受体系统的第一嵌合受体和第二嵌合受体在内的本申请的嵌合受体包含可直接或间接地与胞外抗原结合域融合的跨膜结构域。跨膜结构域可源自于天然或合成来源。如本文所用，“跨膜结构域”是指在细胞膜、优选真核细胞膜中热力学稳定的任何蛋白质结构。可从天然存在的蛋白质获得适合用于本文所述的嵌合受体中的跨膜结构域。可替代地，其可为合成的非天然存在的蛋白质区段，例如在细胞膜中热力学稳定的疏水性蛋白质区段。
跨膜结构域是基于跨膜结构域的三维结构分类。举例来说，跨膜结构域可形成α螺旋、超过一个α螺旋的复合物、β-桶状结构或能够跨越细胞的磷脂双层的任何其它稳定结构。此外，同样或可替代地，跨膜结构域可基于跨膜结构域拓扑结构，包括跨膜结构域跨膜所形成的通道的数目和蛋白质定向进行分类。举例来说，单通膜蛋白跨越细胞膜一次，并且多通膜蛋白跨越细胞膜至少两次(例如2次、3次、4次、5次、6次、7次或更多次)。取决于相对于细胞内部与外部的膜蛋白末端和膜通过区段的拓扑结构，膜蛋白可定义为I型、II型或III型。I型膜蛋白具有单个跨膜区，且定向成蛋白质的N端存在于细胞脂质双层的胞外侧，而蛋白质的C端存在于胞质侧上。II型膜蛋白也具有单个跨膜区，但定向成蛋白质的C端存在于细胞脂质双层的胞外侧，而蛋白质的N端存在于胞质侧上。III型膜蛋白具有多个跨膜区段，且可进一步基于跨膜区段的数目和N端和C端的定位细分。
在一些实施方案中，本文所述的嵌合受体的跨膜结构域源自于I型单通膜蛋白。在一些实施方案中，来自多通膜蛋白的跨膜结构域也适用于本文所述的嵌合受体。多通膜蛋白可包含(至少2个、3个、4个、5个、6个、7个或更多个)α螺旋的复合物或β片状结构。优选地，多通膜蛋白的N端和C端存在于脂质双层的对侧上，例如蛋白质的N端存在于脂质双层的胞质侧上，且蛋白质的C端存在于胞外侧上。
在一些实施方案中，嵌合受体的跨膜结构域包含选自以下的跨膜结构域的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ξ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRFl)、CD160、CD19、IL-2R β、IL-2Rγ、IL-7R a、ITGAl、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CDIOO(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D和/或NKG2C。在一些实施方案中，跨膜结构域源自于选自由以下组成的组的分子：CD8α、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152和PD1。
在一些实施方案中，跨膜结构域源自于CD28。在一些实施方案中，跨膜结构域源自于CD8α。在一些实施方案中，跨膜结构域为CD8α的全长跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域为CD8α的截短跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域为包含SEQ ID NO：4或45的氨基酸序列的CD8α的跨膜结构域。
用于本文所述的嵌合受体中的跨膜结构域还可包含合成的非天然存在的蛋白质区段的至少一部分。在一些实施方案中，跨膜结构域为合成的非天然存在的α螺旋或β片状结构。在一些实施方案中，蛋白质区段为至少大约20个氨基酸，例如至少18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或更多个氨基酸。本领域中，例如美国专利No.7，052，906B1和PCT公布No.WO 2000/032776 A2中已知合成跨膜结构域的实例，所述文献的有关公开内容以引用的方式并入本文中。
跨膜结构域可包含跨膜区和位于跨膜结构域的C端侧的胞质区。跨膜结构域的胞质区可包含三个或更多个氨基酸且在一些实施方案中帮助跨膜结构域在脂质双层中定向。在一些实施方案中，一个或多个半胱氨酸残基存在于跨膜结构域的跨膜区中。在一些实施方案中，一个或多个半胱氨酸残基存在于跨膜结构域的胞质区中。在一些实施方案中，跨膜结构域的胞质区包含带正电的氨基酸。在一些实施方案中，跨膜结构域的胞质区包含氨基酸精氨酸、丝氨酸和赖氨酸。
在一些实施方案中，跨膜结构域的跨膜区包含疏水性氨基酸残基。在一些实施方案中，嵌合受体跨膜区包含人工疏水性序列。举例来说，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体可存在于跨膜结构域的C端。在一些实施方案中，跨膜区包含大多疏水性氨基酸残基，例如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或缬氨酸。在一些实施方案中，跨膜区为疏水性的。在一些实施方案中，跨膜区包含多聚亮氨酸-丙氨酸序列。蛋白质或蛋白质区段的亲水性或疏水性或亲水性特征可通过本领域中已知的任何方法，例如凯都氏亲水性分析(Kyte and Doolittle hydropathy analysis)来评定。
胞内信号传导结构域
包括多特异性嵌合受体、双嵌合受体系统的第一嵌合受体和第二嵌合受体在内的本申请的嵌合受体包含胞内信号传导结构域。胞内信号传导结构域负责活化表达嵌合受体的免疫效应细胞的至少一种正常效应功能。术语“效应功能”是指细胞的专门功能。T细胞的效应功能例如可为细胞溶解活性或辅助活性，包括分泌细胞因子。因此，术语“胞质信号传导结构域”是指转导效应功能信号且指导细胞进行专门功能的蛋白质部分。虽然通常可采用整个胞质信号传导结构域，但多数情况下不需要使用整条链。在使用胞质信号传导结构域的截短部分的情况下，此类截短部分可代替完整链使用，只要其转导效应功能信号即可。因此，术语胞质信号传导结构域意味着包括足够转导效应功能信号的胞质信号传导结构域的任何截短部分。
在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的主要胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合受体包含基本上由免疫效应细胞的主要胞内信号传导结构域组成的胞内信号传导结构域。“主要胞内信号传导结构域”是指以刺激方式用以诱发免疫效应功能的胞质信号传导序列。在一些实施方案中，主要胞内信号传导结构域含有信号基序，称为免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM。如本文所用，“ITAM”是一般存在于在许多免疫细胞中表达的信号传导分子的尾部中的保守蛋白质基序。基序可包含由6-8个氨基酸分开的氨基酸序列YxxL/I的两个重复序列，其中每个x独立地为任何氨基酸，产生保守基序YxxL/Ix(6-8)YxxL/I。信号传导分子内的ITAM对于细胞内的信号转导来说是重要的，信号转导至少部分地通过在激活信号传导分子后ITAM中的酪氨酸残基的磷酸化介导。ITAM还可充当与信号传导通路相关的其它蛋白质的停泊位点。示例性含ITAM的主要胞质信号传导序列包括源自于CD3ζ、FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεRib)、CD3γ、CD3δ、CD3g、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的这些信号传导序列。
在一些实施方案中，主要胞内信号传导结构域源自于CD3ζ。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域由CD3ζ的胞质信号传导结构域组成。在一些实施方案中，主要胞内信号传导结构域由野生型CD3ζ的胞质信号传导结构域组成。在一些实施方案中，野生型CD3ζ的主要胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
协同刺激信号传导结构域
除抗原特异性信号的刺激外，许多免疫效应细胞需要协同刺激，以促进细胞增殖、分化和存活以及激活细胞的效应功能。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含至少一个协同刺激信号传导结构域。如本文所用，术语“协同刺激信号传导结构域”是指介导细胞内的信号转导以诱发例如效应功能的免疫应答的蛋白质至少一部分。本文所述的嵌合受体的协同刺激信号传导结构域可为来自协同刺激蛋白的胞质信号传导结构域，其转导信号并调节由例如T细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞的免疫细胞介导的应答。“协同刺激信号传导结构域”可为协同刺激分子的胞质部分。术语“协同刺激分子”是指免疫细胞(例如T细胞)上与协同刺激配体特异性地结合，从而介导免疫细胞的协同刺激应答，例如但不限于增殖和存活的同源结合搭配物。
在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含单个协同刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含两个或更多个(例如约2个、3个、4个或更多中的任一数目)协同刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含两个或更多个相同的协同刺激信号传导结构域，例如CD28的协同刺激信号传导结构域的两个拷贝。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含来自不同的协同刺激蛋白的两个或更多个协同刺激信号传导结构域，例如任两个或更多个本文所述的协同刺激蛋白质。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含主要胞内信号传导结构域(例如CD3ζ的胞质信号传导结构域)和一个或多个协同刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，一个或多个协同刺激信号传导结构域和主要胞内信号传导结构域(例如CD3ζ的胞质信号传导结构域)经由任选的肽连接子彼此融合。主要胞内信号传导结构域和一个或多个协同刺激信号传导结构域可呈任何合适的次序排列。在一些实施方案中，一个或多个协同刺激信号传导结构域位于跨膜结构域与主要胞内信号传导结构域(例如CD3ζ的胞质信号传导结构域)之间。多个协同刺激信号传导结构域可提供累加或协同刺激效应。
宿主细胞(例如免疫细胞)中协同刺激信号传导结构域的激活可诱导细胞增加或减少细胞因子的产生和分泌、吞噬细胞特性、增殖、分化、存活和/或细胞毒性。任何协同刺激分子的协同刺激信号传导结构域都适合用于本文所述的嵌合受体中。基于例如将表达效应分子的免疫效应细胞的类型(例如T细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞)和所需免疫效应功能(例如ADCC效应)等因素，选择协同刺激信号传导结构域的类型。用于嵌合受体中的协同刺激信号传导结构域的实例可为协同刺激蛋白的胞质信号传导结构域，所述协同刺激蛋白包括不限于B7/CD28家族的成员(例如B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BTLA/CD272、CD28、CTLA-4、Gi24/VISTA/B7-H5、ICOS/CD278、PD-1、PD-L2/B7-DC和PDCD6)；TNF超家族的成员(例如4-1BB/TNFSF9/CD137、4-1BB配体/TNFSF9、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BAFF R/TNFRSF13C、CD27/TNFRSF7、CD27配体/TNFSF7、CD30/TNFRSF8、CD30配体/TNFSF8、CD40/TNFRSF5、CD40/TNFSF5、CD40配体/TNFSF5、DR3/TNFRSF25、GITR/TNFRSF18、GITR配体/TNFSF18、HVEM/TNFRSF14、LIGHT/TNFSF14、淋巴毒素-α/TNF-β、OX40/TNFRSF4、OX40配体/TNFSF4、RELT/TNFRSF19L、TACI/TNFRSF13B、TL1A/TNFSF15、TNF-α和TNF RII/TNFRSF1B)；SLAM家族的成员(例如2B4/CD244/SLAMF4、BLAME/SLAMF8、CD2、CD2F-10/SLAMF9、CD48/SLAMF2、CD58/LFA-3、CD84/SLAMF5、CD229/SLAMF3、CRACC/SLAMF7、NTB-A/SLAMF6和SLAM/CD150)；和任何其它的协同刺激分子，例如CD2、CD7、CD53、CD82/Kai-1、CD90/Thy1、CD96、CD160、CD200、CD300a/LMIR1、HLAI类、HLA-DR、Ikaros、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、LAG-3、TCL1A、TCL1B、CRTAM、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DPPIV/CD26、EphB6、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TSLP、TSLP R、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)和NKG2C。
在一些实施方案中，一个或多个协同刺激信号传导结构域选自由以下组成的组：CD27、CD28、4-1BB(即CD137)、ICOS、OX40、CD30、CD40、CD3、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和特异性地结合于CD83的配体。
在一些实施方案中，本申请的嵌合受体中的胞内信号传导结构域包含源自于CD28的协同刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含CD3ζ的胞质信号传导结构域和CD28的协同刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，本申请的嵌合受体中的胞内信号传导结构域包含源自于4-1BB(即CD137)的协同刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含CD3ζ的胞质信号传导结构域和4-1BB的协同刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包括包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的4-1BB的协同刺激信号传导结构域。
在一些实施方案中，本申请的嵌合受体中的胞内信号传导结构域包含CD28的协同刺激信号传导结构域和4-1BB的协同刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含CD3ζ的胞质信号传导结构域、CD28的协同刺激信号传导结构域和4-1BB的协同刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含从N端至C端包含以下的多肽：CD28的协同刺激信号传导结构域、4-1BB的协同刺激信号传导结构域和CD3ζ的胞质信号传导结构域。
本文所述的任一种协同刺激信号传导结构域的变体也在本公开的范围内，因此协同刺激信号传导结构域能够调节免疫细胞的免疫应答。在一些实施方案中，与野生型对应物相比，协同刺激信号传导结构域包含多达10个氨基酸残基变异(例如1个、2个、3个、4个、5个或8个)。这类包含一个或多个氨基酸变异的协同刺激信号传导结构域可称为变体。相对于不包含突变的协同刺激信号传导结构域，协同刺激信号传导结构域的氨基酸残基的突变可引起信号转导增加和免疫应答的刺激增强。相对于不包含突变的协同刺激信号传导结构域，协同刺激信号传导结构域的氨基酸残基的突变可引起信号转导下降和免疫应答的刺激减少。
铰链区
包括多特异性嵌合受体、双嵌合受体系统的第一嵌合受体和第二嵌合受体在内的本申请的嵌合受体可包含位于胞外抗原结合域与跨膜结构域之间的铰链区。铰链区是一般在蛋白质的两个域之间发现且可允许蛋白质具有柔性并使结构域中的一个或两个相对于彼此移动的氨基酸区段。可使用提供这类柔性和胞外抗原结合域相对于效应分子的跨膜结构域移动的任何氨基酸序列。
铰链区可含有约10-100个氨基酸，例如约15-75个氨基酸、20-50个氨基酸或30-60个氨基酸中的任一种。在一些实施方案中，铰链区可为至少约10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个或75个中的任一数目的氨基酸长。
在一些实施方案中，铰链区为天然存在的蛋白质的铰链区。本领域中已知的包含铰链区的任何蛋白质的铰链区都适合用于本文所述的嵌合受体中。在一些实施方案中，铰链区是天然存在的蛋白质的铰链区的至少一部分并赋予嵌合受体柔性。在一些实施方案中，铰链区源自于CD8α。在一些实施方案中，铰链区为CD8α的铰链区的一部分，例如含有CD8α的铰链区的至少15个(例如20个、25个、30个、35个或40个)连续氨基酸的片段。在一些实施方案中，CD8α的铰链区包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
例如IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗体的抗体的铰链区也适合用于本文所述的嵌合受体中。在一些实施方案中，铰链区为将抗体的恒定域CH1和CH2接合的铰链区。在一些实施方案中，铰链区属于抗体并包含抗体的铰链区和抗体的一个或多个恒定区。在一些实施方案中，铰链区包含抗体的铰链区和抗体的CH3恒定区。在一些实施方案中，铰链区包含抗体的铰链区和抗体的CH2和CH3恒定区。在一些实施方案中，抗体为IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗体。在一些实施方案中，抗体为IgG抗体。在一些实施方案中，抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。在一些实施方案中，铰链区包含IgG1抗体的铰链区和CH2和CH3恒定区。在一些实施方案中，铰链区包含IgG1抗体的铰链区和CH3恒定区。
非天然存在的肽也可用作本文所述的嵌合受体的铰链区。在一些实施方案中，Fc受体的胞外配体结合域的C端与跨膜结构域的N端之间的铰链区为肽连接子，例如(GxS)n连接子，其中x和n独立地可为介于3与12之间的整数，包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多。
信号肽
包括多特异性嵌合受体、双嵌合受体系统的第一嵌合受体和第二嵌合受体在内的本申请的嵌合受体可包含位于多肽N端的信号肽(又名信号序列)。一般说来，信号肽是使多肽靶向细胞中的期望位点的肽序列。在一些实施方案中，信号肽使效应分子靶向细胞的分泌通路并允许将效应分子整合和锚定至脂质双层中。本领域的技术人员将清楚适合用于本文所述的嵌合受体中的信号肽，包括天然存在的蛋白质的信号序列或合成的非天然存在的信号序列。在一些实施方案中，信号肽源自于选自由以下组成的组的分子：CD8α、GM-CSF受体α、IL-3和IgG1重链。在一些实施方案中，信号肽源自于CD8α。在一些实施方案中，IL-3的信号肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD8α的信号肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
III.工程化免疫效应细胞
本申请中还提供了宿主细胞(例如工程化免疫效应细胞)，所述宿主细胞包含本文所述的嵌合受体、多特异性嵌合受体或双嵌合受体系统中的任一种。
因此，在一些实施方案中，提供一种工程化免疫效应细胞(例如T细胞)，所述工程化免疫效应细胞包含嵌合受体，所述嵌合受体包含：(a)包含NKG2D结构域的胞外结构域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，胞外结构域包含第一NKG2D结构域和第二NKG2D结构域。
在一些实施方案中，提供一种工程化免疫效应细胞(例如T细胞)，所述工程化免疫效应细胞包含多特异性(例如双特异性)嵌合受体，所述多特异性嵌合受体包含：(a)包含NKG2D结构域和第二抗原结合域的胞外结构域(例如IL-3结构域)；(b)跨膜结构域；和(c)胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，提供一种工程化免疫效应细胞(例如T细胞)，所述工程化免疫效应细胞包含多特异性(例如双特异性)嵌合受体，所述多特异性嵌合受体包括包含以下的多肽链：(a)包含第一NKG2D结构域、第二NKG2D结构域和CD123结合域(例如IL-3结构域)的胞外结构域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CD123结合域为抗CD123抗体片段(例如scFv或VHH)。在一些实施方案中，CD123结合域为IL-3结构域。在一些实施方案中，多肽链从N端至C端包含：IL-3结构域、第一肽连接子、第一NKG2D结构域、第二肽连接子、第二NKG2D结构域、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、源自于4-1BB的协同刺激信号传导结构域和源自于CD3ζ的主要胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，提供一种工程化免疫效应细胞(例如T细胞)，所述工程化免疫效应细胞包含多特异性(例如双特异性)嵌合受体，所述多特异性嵌合受体包含第一多肽链和第二多肽链，每个多肽链包含以下：(a)包含NKG2D结构域和CD123结合域(例如IL-3结构域)的胞外结构域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第一多肽链的NKG2D结构域经由一个或多个二硫键与第二多肽链的NKG2D结构域交联。在一些实施方案中，第一多肽链和第二多肽链中的每一个从N端至C端包含：IL-3结构域、肽连接子、NKG2D结构域、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、源自于4-1BB的协同刺激信号传导结构域和源自于CD3ζ的主要胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，胞外结构域还包含置于NKG2D结构域与CD123结合域之间的二聚化基序(例如亮氨酸拉链或半胱氨酸拉链)。在一些实施方案中，第一多肽链和第二多肽链中的每一个从N端至C端包含：IL-3结构域、亮氨酸拉链、NKG2D结构域、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、源自于4-1BB的协同刺激信号传导结构域和源自于CD3ζ的主要胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，提供一种工程化免疫效应细胞(例如T细胞)，所述工程化免疫效应细胞包含双嵌合受体系统，所述双嵌合受体系统包含：(i)第一嵌合受体，所述第一嵌合受体包含第一多肽链和第二多肽链，每个多肽链包含：(a)包含NKG2D结构域的第一胞外结构域；(b)第一跨膜结构域；和(c)第一胞内信号传导结构域；以及(ii)第二嵌合受体，所述第二嵌合受体包括包含以下的第三多肽链：(a)包含第二抗原结合域的第二胞外结构域；(b)第二跨膜结构域；和任选地(c)第二胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第一多肽链和第二多肽链中的每一个从N端至C端包含：NKG2D结构域、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、源自于4-1BB的协同刺激信号传导结构域和源自于CD3ζ的主要胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第二嵌合受体包含从N端至C端包含以下的多肽：IL-3结构域、CD8α铰链区、CD8α跨膜区和任选地源自于4-1BB的协同刺激信号传导结构域。
在一些实施方案中，提供一种工程化免疫效应细胞(例如T细胞)，所述工程化免疫效应细胞包含双嵌合受体系统，所述双嵌合受体系统包含：(i)第一嵌合受体，所述第一嵌合受体包括包含以下的第一多肽链：(a)包含第一NKG2D结构域和第二NKG2D结构域的第一胞外结构域；(b)第一跨膜结构域；和(c)第一胞内信号传导结构域；以及(ii)第二嵌合受体，所述第二嵌合受体包括包含以下的第二多肽链：(a)包含第二抗原结合域的第二胞外结构域；(b)第二跨膜结构域；和任选地(c)第二胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第一嵌合受体包含从N端至C端包含以下的多肽：第一NKG2D结构域、第二NKG2D结构域、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、源自于4-1BB的协同刺激信号传导结构域和源自于CD3ζ的主要胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第二嵌合受体包含从N端至C端包含以下的多肽：IL-3结构域、CD8α铰链区、CD8α跨膜区和任选地源自于4-1BB的协同刺激信号传导结构域。
在一些实施方案中，工程化免疫效应细胞表达一种或多种免疫调节剂。在一些实施方案中，工程化哺乳动物细胞包含编码免疫调节剂的异源核酸。在一些实施方案中，编码免疫调节剂的异源核酸存在于编码本文所述的嵌合受体、多特异性嵌合受体或双嵌合受体系统的载体上。在一些实施方案中，免疫调节剂为Runx3调控剂。在一些实施方案中，调控剂为多肽，例如源自于Runx3或MITF的多肽。在一些实施方案中，调控剂为RNA，例如miRNA或siRNA。Runx3可帮助T细胞归巢和浸润至实体瘤中，这是成功的T细胞介导的免疫疗法中的一个重要因素。
载体
本申请提供了用于克隆和表达本文所述的嵌合受体、多特异性嵌合受体或双嵌合受体系统中的任一种的载体。在一些实施方案中，载体适合于例如哺乳动物细胞的真核细胞中的复制和整合。在一些实施方案中，载体为病毒载体。病毒载体的实例包括(但不限于)腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、牛痘载体、单纯性疱疹病毒载体和它们的衍生物。病毒载体技术是本领域中众所周知的，且描述于例如Sambrook等人(2001，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork)和其它病毒学和分子生物学手册中。
已经研发出许多基于病毒的系统用于基因转移至哺乳动物细胞中。举例来说，逆转录病毒提供了一个适于基因递送系统的平台。异源核酸可被插入载体中并使用本领域中已知的技术包装在逆转录病毒颗粒中。接着可分离重组病毒并在体外或离体递送至工程化哺乳动物活细胞中。本领域中已知许多逆转录病毒系统。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。本领域中已知许多腺病毒载体。在一些实施方案中，使用慢病毒载体。在一些实施方案中，使用自失活慢病毒载体。举例来说，可用本领域中已知的方案包装运载嵌合受体、多特异性嵌合受体或双嵌合受体系统的自失活慢病毒载体。所得到的慢病毒载体可用于使用本领域中已知的方法转导哺乳动物细胞(例如主要人类T细胞)。源自于例如慢病毒的逆转录病毒的载体是适于实现长期基因转移的工具，因为它们允许将转基因长期地稳定整合并在后代细胞中繁殖。慢病毒载体还具有低的免疫原性，且可转导非增殖细胞。
在一些实施方案中，载体包含编码本文所述的嵌合受体、多特异性嵌合受体或双嵌合受体系统的核酸中的任一种。可使用本领域中的任何已知的分子克隆方法，包括例如使用限制性核酸内切酶位点和一种或多种可选择标志物将核酸克隆至载体中。在一些实施方案中，核酸可操作地连接于启动子。已经探索各种启动子用于哺乳动物细胞中的基因表达，且本领域中已知的任一种启动子都可用于本发明中。启动子可大致分为组成型启动子或调控型启动子，例如诱导型启动子。
在一些实施方案中，编码嵌合受体、多特异性嵌合受体或双嵌合受体系统的核酸可操作地连接于组成型启动子。组成型启动子允许异源基因(又称为转基因)在宿主细胞中组成性地表达。本文中涵盖的示例性组成型启动子包括(但不限于)巨细胞病毒(CMV)启动子、人延伸因子-1α(hEF1α)、泛素C启动子(UbiC)、磷酸甘油激酶启动子(PGK)、猿猴病毒40早期启动子(SV40)和鸡β-肌动蛋白启动子联合CMV早期增强子(CAGG)。已经在大量的研究中广泛地比较这类组成型启动子驱动转基因表达的效率。举例来说，Michael C.Milone等人比较CMV、hEF1α、UbiC和PGK驱动嵌合受体在原代人T细胞中的表达的效率，并推断hEF1α启动子不仅诱导最高水平的转基因表达，还在CD4和CD8人T细胞中最佳地维持(MolecularTherapy，17(8)：1453-1464(2009))。
在一些实施方案中，编码嵌合受体、多特异性嵌合受体或双嵌合受体系统的核酸可操作地连接于诱导型型启动子。诱导型启动子属于调控型启动子类别。诱导型启动子可通过一种或多种条件，例如物理条件、工程化免疫效应细胞的微环境或工程化免疫效应细胞的生理状态、诱导剂(即诱导剂)或它们的组合来诱导。在一些实施方案中，诱导条件不诱导内源基因在工程化哺乳动物细胞中和/或在接受药物组合物的受试者中的表达。在一些实施方案中，诱导条件选自由以下组成的组：诱导剂、辐照(例如电离辐射、光)、温度(例如热)、氧化还原态、肿瘤环境和工程化哺乳动物细胞的激活状态。
在一些实施方案中，载体还含有可选择标志物基因或报告基因以从通过慢病毒载体转染的宿主细胞群体中选择表达嵌合受体、多特异性嵌合受体或双嵌合受体系统的细胞。可选择标志物和报告基因可侧接实现在宿主细胞中表达的适当调控序列。举例来说，载体可含有可用于调控核酸序列表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。
免疫效应细胞
“免疫效应细胞”是能够执行免疫效应功能的免疫细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应功能。介导ADCC的免疫效应细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞球。
在一些实施方案中，免疫效应细胞为T细胞。在一些实施方案中，T细胞为CD4+/CD8-、CD4-/CD8+、CD4+/CD8+、CD4-/CD8-或它们的组合。在一些实施方案中，T细胞在表达嵌合受体、多特异性嵌合受体或双嵌合受体系统并结合于例如CD20+或CD19+肿瘤细胞等靶细胞后产生IL-2、TFN和/或TNF。在一些实施方案中，在表达嵌合受体、多特异性嵌合受体或双嵌合受体系统并结合于靶细胞后CD8+T细胞使抗原特异性靶细胞溶解。
在一些实施方案中，免疫效应细胞为NK细胞。在其它实施方案中，免疫效应细胞可为确立细胞系，例如NK-92细胞。
在一些实施方案中，免疫效应细胞是从干细胞，例如造血干细胞、多能干细胞、iPS或胚胎干细胞分化而来。
通过将嵌合受体、多特异性嵌合受体或双嵌合受体系统引入例如T细胞的免疫效应细胞中来制备工程化免疫效应细胞。在一些实施方案中，通过转染本文所述的任一分离核酸或任一载体将嵌合受体、多特异性嵌合受体或双嵌合受体系统引入免疫效应细胞中。在一些实施方案中，通过将蛋白质插入细胞膜中同时使细胞通过例如CELL
Figure GDA0002926794110000601
的微流体系统(参见例如美国专利申请公布No.20140287509)，将嵌合受体、多特异性嵌合受体或双嵌合受体系统引入免疫效应细胞中。
本领域中已知将载体或分离核酸引入哺乳动物细胞中的方法。所述载体可通过物理、化学或生物学方法转移至免疫效应细胞中。
用于将载体引入免疫效应细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质体转染、粒子轰击、微量注射、电穿孔等等。用于产生包含载体和/或外源性核酸的细胞的方法是本领域中众所周知的。参见例如Sambrook等人(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York。在一些实施方案中，载体通过电穿孔引入细胞中。
用于将载体引入免疫效应细胞中的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体已经变成最广泛使用的将基因插入例如人的哺乳动物的细胞中的方法。
用于将载体引入免疫效应细胞中的化学手段包括胶态分散系统，例如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠粒和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。一种用作体外递送媒介物的示例性胶态系统是脂质体(例如人工膜囊)。
在一些实施方案中，编码本文所述的嵌合受体、多特异性嵌合受体或双嵌合受体系统中的任一种的RNA分子可通过常规方法(例如体外转录)制备，然后经由已知的方法，例如mRNA电穿孔来引入免疫效应细胞中。参见例如Rabinovich等人，Human Gene Therapy17：1027-1035。
在一些实施方案中，在引入载体或分离核酸后经过转导或转染的免疫效应细胞离体繁殖。在一些实施方案中，将经过转导或转染的免疫效应细胞培养进行繁殖，历时至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天或14天中的任一时长。在一些实施方案中，进一步地对经过转导或转染的免疫效应细胞进行评估或筛选以选择工程化哺乳动物细胞。
报告基因可用于鉴定可能转染的细胞和用于评估调控序列的功能性。一般说来，报告基因是一种在受体生物体或组织中不存在或不表达并编码表达可体现在一些容易检测的特性，例如酶活性上的多肽的基因。在DNA引入受体细胞中后的合适时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如Ui-Tei等人FEBS Letters 479：79-82(2000))。合适的表达系统是众所周知的，且可使用已知的技术制备或商业上获得。
其它的证实编码嵌合受体、多特异性嵌合受体或双嵌合受体系统的核酸在工程化免疫效应细胞中的存在的方法包括例如本领域的技术人员众所周知的分子生物学测定法，例如DNA印迹法(Southem blotting)和RNA印迹法(Northern blotting)、RT-PCR和PCR；生物化学测定法，例如通过免疫学方法(例如ELISA和蛋白质印迹法)检测具体肽的存在或缺乏。
T细胞来源
在T细胞扩张和基因修饰前，从个体获得T细胞来源。可从许多来源获得T细胞，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在一些实施方案中，可使用本领域中可利用的许多T细胞系。在一些实施方案中，可使用熟练的技术人员已知的许多技术，例如FICOLLTM分离，从收集自受试者的血液单元获得T细胞。在一些实施方案中，通过单采血液成分术从个体的循环血液中获得细胞。单采血液成分术产物典型地含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、颗粒细胞、B细胞、其它有核白血球、红血球和血小板。在一些实施方案中，可洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以去除血浆部分并将细胞放在适当缓冲液或介质中进行后续加工步骤。在一些实施方案中，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。在一些实施方案中，洗涤溶液缺乏钙，且可能缺乏镁，或可能缺乏许多(如果不是所有)二价阳离子。再次，意外地，在缺乏钙下的初始激活步骤引起扩大的激活。如本领域的一般技术人员容易了解，可通过本领域的技术人员已知的方法，例如通过使用半自动化的“直流”离心机(例如Cobe 2991细胞处理机、BaxterCytoMate或Haemonetics Cell Saver 5)根据制造商的说明书实现洗涤步骤。在洗涤后，可使细胞再悬浮于多种生物相容的缓冲液中，所述缓冲液例如无Ca2+、无Mg2+PBS、PlasmaLyteA或有或者没有缓冲剂的其它盐水溶液。可替代地，可去除单采血液成分术样品的非所需组分，并使细胞直接再悬浮于培养基中。
在一些实施方案中，通过溶解红血球和消耗单核细胞，例如通过利用PERCOLLTM梯度进行离心或通过逆流离心淘洗，从外周血淋巴细胞分离T细胞。例如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞等T细胞特定亚群可通过阳性或阴性选择技术进一步分离。举例来说，在一些实施方案中，通过与抗CD3/抗CD28(即3×28)缀合的珠粒，例如
Figure GDA0002926794110000621
M-450CD3/CD28T一起孵育足够对所需T细胞进行阳性选择的时间段来分离T细胞。在一些实施方案中，时间段为约30分钟。在另一实施方案中，时间段在30分钟至36小时或更长时间的范围内和其间的所有整数值。在另一实施方案中，时间段为至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时。在一些实施方案中，时间段为10至24小时。在一些实施方案中，孵育时间段为24小时。为从白血病患者分离T细胞，使用更长的孵育时间、例如24小时可增加细胞产量。在与其它细胞类型相比T细胞较少的情况下，例如在从肿瘤组织或从免疫受损个体分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)时，可使用较长的孵育时间来分离T细胞。此外，使用较长的孵育时间可增加CD8+T细胞的捕获效率。因此，仅仅通过缩短或延长使T细胞结合于CD3/CD28珠粒的时间和/或通过增加或降低珠粒与T细胞的比率(如本文中进一步描述)，可在培养起始时或在过程期间的其它时间点对或针对T细胞亚群优先选择。另外，通过增加或降低珠粒或其它表面上抗CD3和/或抗CD28抗体的比率，可在培养起始时或在其它所需时间点对或针对T细胞亚群优先选择。熟练的技术人员将认识到还可以使用多轮选择。在一些实施方案中，在激活和扩张过程中可能需要进行选择程序和使用“未经过选择的”的细胞。“未经过选择”的细胞还可以经受另外数轮的选择。
可利用针对阴性选择的细胞所独有的表面标志物的抗体的组合来实现通过阴性选择富集T细胞群体。一种方法是经由阴性磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，它使用针对阴性选择的细胞上所存在的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物。举例来说，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物典型地包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些实施方案中，可能需要富集或阳性选择典型地表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+的调控T细胞。可替代地，在某些实施方案中，调节T细胞通过抗C25缀合的珠粒或其它类似的选择方法来消耗。
为了通过阳性或阴性选择分离所需细胞群体，细胞浓度和表面(例如颗粒，例如珠粒)可变化。在某些实施方案中，可能需要显著减少珠粒和细胞混合在一起的体积(即增加细胞浓度)，以确保细胞和珠粒最大程度地接触。举例来说，在一个实施方案中，使用20亿细胞/毫升的浓度。在一个实施方案中，使用10亿细胞/毫升的浓度。在另一实施方案中，使用超过1亿细胞/毫升。在另一实施方案中，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万细胞/毫升的细胞浓度。在又一个实施方案中，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿细胞/毫升的细胞浓度。在另一实施方案中，可使用1.25亿或1.5亿细胞/毫升的浓度。使用高浓度可增加细胞产量、细胞激活和细胞扩张。此外，高细胞浓度的使用允许更高效地捕获可能微弱地表达所关注的靶抗原的细胞，例如CD28阴性T细胞，或从存在许多肿瘤细胞的样品(即白血病的血液、肿瘤组织等)中更高效地捕获。这类细胞群体可具有治疗价值并且需要获得。举例来说，使用高浓度的细胞允许更高效地选择通常具有较弱的CD28表达的CD8+T细胞。
在一些实施方案中，需要使用较低的细胞浓度。通过显著地稀释T细胞与表面(例如颗粒，例如珠粒)的混合物，使颗粒与细胞之间的相互作用减到最少。这将选择出表达大量的结合于颗粒的所需抗原的细胞。举例来说，CD4+T细胞表达较高水平的CD28且在稀浓度下比CD8+T细胞更有效地捕获。在一些实施方案中，使用的细胞浓度为5×106/mL。在一些实施方案中，使用的浓度可为约1×105/mL至1×106/mL，和中间的任何整数值。
在一些实施方案中，细胞可在旋转器上在变速下在2-10℃下或在室温下孵育变化的时长。
用于刺激的T细胞还可以在洗涤步骤后冷冻。不希望受理论束缚，冷冻和随后解冻步骤通过去除细胞群体中的颗粒细胞和在某种程度上的单核细胞提供更均一的产物。在去除血浆和血小板的洗涤步骤后，细胞可悬浮在冷冻溶液中。虽然本领域中已知许多冷冻溶液和参数并在此背景下可用，但一种方法包括使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO或31.25％Plasmalyte-A、31.25％右旋糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人类血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基或含有例如Hespan和PlasmaLyte A的其它合适细胞冷冻介质，然后以每分钟1°的速率将细胞冷冻至-80℃并存储在液氮贮槽的蒸气相中。可使用控制冷冻的其它方法，以及在液氮中在-20℃下不受控制地速冻。
在一些实施方案中，使冷冻保存的细胞解冻并如本文所述洗涤，且静置在室温下一小时，然后激活。
本申请中还涵盖当需要如本文所述的扩张的细胞时事先从受试者收集血液样品或单采血液成分术产物。因而，可在任何需要时间点收集有待扩张的细胞的来源，和所需细胞，例如T细胞，分离并冷冻，以供随后用于针对将得益于T细胞疗法的许多疾病或疾患，例如本文所述的疾病或疾患的T细胞疗法中。在一个实施方案中，从整体上健康的受试者获取血液样品或单采血液成分。在某些实施方案中，从整体上健康的处于显现疾病的风险下但还没有显现疾病的受试者获取血液样品或单采血液成分，且分离所关注的细胞并冷冻，以供随后使用。在某些实施方案中，T细胞可扩张，冷冻和稍后使用。在某些实施方案中，在诊断出如本文所述的具体疾病之后不久但在任何治疗之前，从患者收集样品。在另一实施方案中，从来自在许多相关治疗模式之前的受试者的血液样品或单采血液成分分离细胞，所述治疗模式包括但不限于用如下的剂治疗：那他珠单抗(natalizumab)、依法珠单抗(efalizumab)、抗病毒剂、化学疗法、放射线、免疫抑制剂(例如环孢菌素(cyclosporin)、咪唑硫嘌呤(azathioprine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、霉酚酸酯(mycophenolate)和FK506)、抗体或其它免疫烧蚀剂，例如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺(cytoxan)、氟达拉滨(fludarabine)、环孢菌素(cyclosporin)、FK506、雷帕霉素(rapamycin)、霉酚酸(mycophenolic acid)、类固醇、FR901228和辐照。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢霉素和FK506)或者抑制对于生长因子诱导的信号传导来说重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu等人，Cell 66：807-815，1991；Henderson等人，Immun 73：316-321，1991；Bierer等人，Curr.Opin.Immun.5：763-773，1993)。在另一实施方案中，针对患者分离细胞，并冷冻以供随后连同骨髓或干细胞移植、使用例如氟达拉滨的化学治疗剂、外部成束辐射疗法(XRT)、环磷酰胺或例如OKT3或CAMPATH的抗体的T细胞烧蚀疗法(例如先、同时或后)使用。在另一个实施方案中，事先分离细胞，且可冷冻以供随后在例如与CD20反应的剂，例如利妥昔(Rituxan)的B细胞烧蚀疗法后用于治疗。
在一些实施方案中，在治疗后直接从患者获得T细胞。关于此，已经注意到在某些癌症治疗、尤其是用损伤免疫系统的药物治疗后，在治疗之后不久在患者通常正从治疗中恢复期间，所获得的T细胞质量在离体扩张的能力方面可为最佳或有提高。同样，在使用本文所述的方法离体操控后，这些细胞可处于优选状态，从而增强移植和体内扩张。因此，本发明的上下文涵盖在此恢复期期间收集血细胞，包括T细胞、树突状细胞或造血谱系的其它细胞。此外，在某些实施方案中，动员(例如用GM-CSF动员)和调理方案可用于在受试者中特别是在疗法后的界定时间窗期间建立有利于具体的细胞类型再增殖、再循环、再生和/或扩张的条件。示例性细胞类型包括T细胞、B细胞、树突状细胞和免疫系统的其它细胞。
T细胞的激活和扩张
无论在用本文所述的嵌合受体、多特异性嵌合受体或双嵌合受体系统对T细胞进行基因修饰之前还是之后，一般可使用如例如以下中所述的方法激活和扩张T细胞：美国专利No.6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514、6,867,041和美国专利申请公布No.20060121005。
一般地，可通过与连接至刺激CD3/TCR复合物相关的信号的剂和刺激T细胞表面上协同刺激分子的配体的表面接触来扩张T细胞。具体地说，T细胞群体可如本文所述来刺激，例如通过与抗CD3抗体或其抗原结合片段或固定在表面上的抗CD2抗体接触或通过与蛋白激酶C激活剂(例如苔藓虫素)连同钙离子载体接触。为协同刺激T细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。举例来说，T细胞群体可与抗CD3抗体和抗CD28抗体在适合于刺激T细胞增殖的条件下接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone，Besancon，France)，可如本领域中通常已知的其它方法一样使用(Berg等人，Transplant Proc.30(8)：3975-3977，1998；Haanen等人，J.Exp.Med.190(9)：13191328，1999；Garland等人，J.Immunol Meth.227(1-2)：53-63，1999)。
在一些实施方案中，T细胞的主要刺激信号和协同刺激信号可通过不同的方案提供。举例来说，提供每种信号的剂可在溶液中或偶联至表面。当偶联至表面时，剂可偶联至相同表面(即呈“顺式”形式)或独立的表面(即呈“反式”形式)。可替代地，一种剂可偶联至表面且另一种剂在溶液中。在一个实施方案中，提供协同刺激信号的剂结合于细胞表面且提供主要激活信号的剂在溶液中或偶联至表面。在某些实施方案中，两种剂可都在溶液中。在另一个实施方案中，剂可呈可溶形式，接着交联至表面，例如表达Fc受体的细胞或将结合于所述剂的抗体或其它结合剂。关于此，关于预期用于在本发明中激活和扩张T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，参见例如美国专利申请公布No.20040101519和20060034810。
在一些实施方案中，将T细胞与用剂涂布的珠粒组合，随后分离珠粒和细胞，然后培养细胞。在一替代实施方案中，在培养前，用剂涂布的珠粒和细胞不分离，而是在一起培养。在另一实施方案中，首先通过施加力，例如磁力将珠粒和细胞浓缩，增加细胞表面标志物的连结，由此诱导细胞刺激。
举例来说，细胞表面蛋白可通过使抗CD3和抗CD28所连接的顺磁性珠粒(3×28珠粒)接触T细胞来连结。在一个实施方案中，细胞(例如104至109T细胞)和珠粒(例如
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M-450CD3/CD28 T顺磁性珠粒，比率1∶1)组合在缓冲液、优选PBS(没有二价阳离子，例如钙和镁)。再次，本领域的一般技术人员容易理解，可使用任何细胞浓度。举例来说，靶细胞在样品中可能非常稀少，且仅仅占样品的0.01％，整个样品(即100％)可包含所关注的靶细胞。因此，任何细胞数目都在本发明的背景内。在某些实施方案中，可能需要显著减少颗粒和细胞混合在一起的体积(即增加细胞浓度)，以确保细胞和颗粒最大程度地接触。举例来说，在一个实施方案中，使用约20亿细胞/毫升的浓度。在另一实施方案中，使用超过1亿细胞/毫升。在另一实施方案中，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万细胞/毫升的细胞浓度。在又一个实施方案中，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿细胞/毫升的细胞浓度。在另一实施方案中，可使用1.25亿或1.5亿细胞/毫升的浓度。使用高浓度可增加细胞产量、细胞激活和细胞扩张。此外，使用高细胞浓度允高效地捕获可能微弱地表达所关注的靶抗原的细胞，例如CD28阴性T细胞。这类细胞群体可具有治疗价值，并且在某些实施方案中需要获得。举例来说，使用高浓度的细胞允许更高效地选择通常具有较弱的CD28表达的CD8+T细胞。
在一些实施方案中，混合物可培养几个小时(约3小时)至约14天或两者之间任何小时整数值。在另一个实施方案中，混合物可培养21天。在本发明的一个实施方案中，珠粒和T细胞一起培养约八天。在另一个实施方案中，珠粒和T细胞一起培养2-3天。也可能需要几次刺激循环，以致T细胞的培养时间可为60天或更多天。适合于T细胞培养的条件包括可含有增殖和活力所必需的因子的适当培养基(例如最低必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15(Lonza))，所述因子包括血清(例如胎牛或人血清)、白细胞介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或熟练的技术人员已知的用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括(但不限于)表面活性剂、人血浆蛋白粉(plasmanate)和还原剂，例如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo15和X-Vivo 20、Optimizer，添加有氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充有适当量的血清(或血浆)或界定一组激素，和/或足够T细胞生长和扩张的量的细胞因子。例如青霉素和链霉素的抗生素仅仅包括在实验培养物中，不包括在将输注至受试者中的细胞培养物中。靶细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如适当的温度(例如37℃)和气氛(例如空气加5％CO2)。已经暴露于变化的刺激时间的T细胞可展现不同的特征。举例来说，典型的血液或单采血液成分的外周血单核细胞产物具有超过细胞毒性或抑制T细胞群体(TC，CD8)的辅助性T细胞群体(TH，CD4+)。通过刺激CD3和CD28受体离体扩增T细胞可产生T细胞群体，所述T细胞群体在约第8-9天之前主要由TH细胞组成，而在约第8-9天之后T细胞群体包含愈来愈大的TC细胞群体。因此，取决于治疗的目的，受试者输注主要由TH细胞构成的T细胞群体是有益的。类似地，如果已经分离TC细胞的抗原特异性子集，那么在更大程度上有益于扩张此子集。
此外，除CD4和CD8标志物外，其它表型标志物显著变化，但大部分在细胞扩张过程中可再现地变化。因此，这类可再现性能够使激活T细胞产物适于特定目的。
IV.药物组合物
本申请还提供了药物组合物，所述药物组合物包含任一种包含如本文所述的嵌合受体、多特异性嵌合受体或双嵌合受体系统中的任一种的工程化免疫效应细胞和药学上可接受的载剂。药物组合物可通过将具有所需纯度的多个工程化免疫效应细胞与任选的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.编辑(1980))混合，呈冻干制剂或水溶液形式制备。
可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度下对于接受者来说是无毒的，且包括缓冲剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E、焦亚硫酸钠；防腐剂、等张剂、稳定剂、金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；螯合剂，例如EDTA和/或非离子型表面活性剂。
缓冲剂用于控制pH值在使疗效最佳的范围内，特别是稳定性依赖于pH值的情况下。缓冲剂优选以约50mM至约250mM范围内的浓度存在。用于本发明的合适的缓冲剂包括有机酸和无机酸和其盐。举例来说，柠檬酸盐、磷酸盐、丁二酸盐、酒石酸盐、反丁烯二酸盐、葡糖酸盐、草酸盐、乳酸盐、乙酸盐。另外，缓冲剂可包含组氨酸和三甲胺盐，例如Tris。
加入防腐剂以延迟微生物生长，并典型地在0.2％-1.0％(w/v)范围内存在。用于本发明的合适防腐剂包括十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六羟季铵；卤化苯甲烃铵(例如氯化物、溴化物、碘化物)、氯化苄乙氧铵；硫柳汞、苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷酯，例如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇、3-戊醇和间甲酚。
存在张力剂，有时称为“稳定剂”，以调整或维持组合物中液体的张力。当用于大的带电生物分子如蛋白质和抗体时，其常常称为“稳定剂”，因为其可与氨基酸侧链的带电基团相互作用，由此降低分子间相互作用和分子内相互作用的可能性。考虑其它成分的相对量，张力剂的含量可介于按重量计0.1％至25％、优选1至5％之间。优选的张力剂包括多元糖醇，优选三元或更多元糖醇，例如甘油、赤藓醇、阿糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。
另外的赋形剂包括可用作以下中的一种或多种的剂：(1)膨胀剂、(2)溶解性增强剂、(3)稳定剂和(4)防止变性或粘附容器壁的剂。这类赋形剂包括：多元糖醇(以上列举)；氨基酸，例如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，例如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌糖、肌醇、半乳糖、半乳糖醇、丙三醇、环多醇(例如肌醇)、聚乙二醇；含硫还原剂，例如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量蛋白质，例如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其它免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；单糖(例如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖(例如乳糖、麦芽糖、蔗糖)；三糖，例如棉子糖；和多糖，例如糊精或葡聚糖。
存在非离子型表面活性剂或洗涤剂(又名“润湿剂”)以帮助溶解治疗剂以及保护治疗性蛋白质避免在搅动诱导下聚集，这也允许制剂暴露于剪切表面应力，而不引起活性治疗性蛋白质或抗体的变性。非离子型表面活性剂在约0.05mg/mL至约1.0mg/mL、优选约0.07mg/mL至约0.2mg/mL范围内存在。
合适的非离子型表面活性剂包括聚山梨酸酯(20、40、60、65、80等)、泊洛沙姆(polyoxamer)(184、188等)、
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多元醇、
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聚氧化乙烯脱水山梨糖醇单醚(
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-80等)、lauromacrogol 400、polyoxyl 40硬脂酸酯、聚氧化乙烯氢化蓖麻油10、50和60、单硬脂酸甘油酯、脂肪酸糖酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。可使用的阴离子洗涤剂包括十二烷基硫酸钠、磺基丁二酸二辛钠和磺酸二辛钠。阳离子洗涤剂包括氯化苯甲烃铵或氯化苄乙氧铵。
为了使药物组合物用于体内施用，其必须无菌。可通过经无菌过滤膜过滤使药物组合物无菌。一般将本文中的药物组合物放入具有无菌进入孔的容器中，所述无菌进入孔例如具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
施用途径是根据已知和公认的方法，例如通过在长时间内以合适的方式单次或多次推注或输注，方式例如通过皮下、静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、损害内或关节内途径注射或输注、局部施用、吸入或通过持续释放或延长释放方式。
本文所述的药物组合物还可含有超过一种作为所治疗的具体适应症的必需品的活性化合物或剂，优选具有互补活性的不会不利地影响彼此的活性化合物或剂。可替代地或此外，组合物可包含细胞毒性剂、化学治疗剂、细胞因子、免疫抑制剂或生长抑制剂。这类分子适合以有效达成预定目标的量组合存在。
V.治疗癌症的方法
本申请进一步涉及用于细胞免疫疗法中的方法和组合物。在一些实施方案中，细胞免疫疗法用于治疗癌症，包括但不限于血液恶性病和实体瘤。本文所述的嵌合受体、多特异性嵌合受体、双嵌合受体系统和工程化免疫效应细胞(例如工程化T细胞)中的任一种可用于治疗癌症的方法中。
在一些实施方案中，提供一种治疗个体(例如人类个体)的癌症(例如多发性骨髓瘤、急性淋巴母细胞性白血病或慢性淋巴细胞性白血病)的方法，所述方法包括向个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含：(1)包含嵌合受体的工程化免疫效应细胞(例如T细胞)，所述嵌合受体包含：(a)包含NKG2D结构域的胞外结构域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内信号传导结构域；以及(2)药学上可接受的载剂。在一些实施方案中，嵌合受体包含从N端至C端包含以下的多肽链：第一NKG2D结构域、第二NKG2D结构域、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、源自于4-1BB的协同刺激信号传导结构域和源自于CD3ζ的主要胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，提供一种治疗个体(例如人类个体)的癌症(例如多发性骨髓瘤、急性淋巴母细胞性白血病或慢性淋巴细胞性白血病)的方法，所述方法包括向个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含：(1)包含多特异性嵌合受体的工程化免疫效应细胞(例如T细胞)，所述多特异性嵌合受体包括包含以下的多肽链：(a)包含第一NKG2D结构域、第二NKG2D结构域和CD123结合域(例如IL-3结构域)的胞外结构域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内信号传导结构域；以及(2)药学上可接受的载剂。在一些实施方案中，CD123结合域为抗CD123抗体片段(例如scFv或VHH)。在一些实施方案中，CD123结合域为IL-3结构域。在一些实施方案中，多肽链从N端至C端包含：IL-3结构域、第一肽连接子、第一NKG2D结构域、第二肽连接子、第二NKG2D结构域、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、源自于4-1BB的协同刺激信号传导结构域和源自于CD3ζ的主要胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，提供一种治疗个体(例如人类个体)的癌症(例如多发性骨髓瘤、急性淋巴母细胞性白血病或慢性淋巴细胞性白血病)的方法，所述方法包括向个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含：(1)包含多特异性嵌合受体的工程化免疫效应细胞(例如T细胞)，所述多特异性嵌合受体包含第一多肽链和第二多肽链，每个多肽链包含：(a)包含NKG2D结构域和CD123结合域(例如IL-3结构域)的胞外结构域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内信号传导结构域；以及(2)药学上可接受的载剂。在一些实施方案中，第一多肽链的NKG2D结构域经由一个或多个二硫键与第二多肽链的NKG2D结构域交联。在一些实施方案中，第一多肽链和第二多肽链中的每一个从N端至C端包含：IL-3结构域、肽连接子、NKG2D结构域、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、源自于4-1BB的协同刺激信号传导结构域和源自于CD3ζ的主要胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，胞外结构域还包含位于NKG2D结构域与CD123结合域之间的二聚化基序(例如亮氨酸拉链或半胱氨酸拉链)。在一些实施方案中，第一多肽链和第二多肽链中的每一个从N端至C端包含：IL-3结构域、亮氨酸拉链、NKG2D结构域、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、源自于4-1BB的协同刺激信号传导结构域和源自于CD3ζ的主要胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，提供一种治疗个体(例如人类个体)中的癌症(例如多发性骨髓瘤、急性淋巴母细胞性白血病或慢性淋巴细胞性白血病)的方法，所述方法包括向个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含：(1)包含双嵌合受体系统的工程化免疫效应细胞(例如T细胞)，所述双嵌合受体系统包含：(i)包含第一多肽链和第二多肽链的第一嵌合受体，每个多肽链包含：(a)包含NKG2D结构域的第一胞外结构域；(b)第一跨膜结构域；和(c)第一胞内信号传导结构域；以及(ii)包含第三多肽链的第二嵌合受体，所述多肽链包含：(a)包含第二抗原结合域的第二胞外结构域；(b)第二跨膜结构域；和任选地(c)第二胞内信号传导结构域；以及(2)药学上可接受的载剂。在一些实施方案中，第一多肽链和第二多肽链中的每一个从N端至C端包含：NKG2D结构域、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、源自于4-1BB的协同刺激信号传导结构域和源自于CD3ζ的主要胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第二嵌合受体包含从N端至C端包含以下的多肽链：IL-3结构域、CD8α铰链区、CD8α跨膜区和任选地源自于4-1BB的协同刺激信号传导结构域。
本文所述的方法适合于治疗多种癌症，包括实体癌症和液体癌症。在一些实施方案中，癌症为多发性骨髓瘤、急性淋巴母细胞性白血病或慢性淋巴细胞性白血病。在一些实施方案中，癌症为难治性或复发性癌症。本文所述的方法可用作第一疗法、第二疗法、第三疗法或在辅助背景或新辅助背景下与本领域中已知的其它类型癌症疗法的组合疗法，所述癌症疗法例如化学疗法、外科手术、放射线、基因疗法、免疫疗法、骨髓移植、干细胞移植、靶向疗法、冷冻疗法、超声疗法、光动力疗法、射频消融等等。
药物组合物的施用可用任何合宜的方式进行，例如注射、输液、植入或移植。组合物可经动脉、皮下、皮内、经肿瘤内、结节内、髓内、肌肉内、静脉内或腹膜内施用于患者。在一些实施方案中，药物组合物全身施用。在一些实施方案中，药物组合物通过输注，例如静脉内输注施用于个体。本领域中已知免疫疗法的输注技术(参见例如Rosenberg等人，NewEng.J.of Med.319：1676(1988))。在一些实施方案中，组合物通过静脉内注射施用。
本发明的药物组合物的剂量和所需药物浓度可取决于设想的具体用途变化。普通的技术人员完全能够确定适当剂量或施用途径。动物实验提供了关于确定人类疗法的有效剂量的可靠指导。有效剂量的种间扩大可遵循以下制定的原理进行：Mordenti，J.和Chappell，W.“The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics，”Toxicokineticsand New Drug Development，Yacobi等人编辑，Pergamon Press，New York 1989，第42-46页。在本申请的范围内，不同的制剂将有效地用于不同的治疗和不同的病症，且意图治疗特定器官或组织的施用可能需要以不同于递送至另一器官或组织的方式递送。
在一些实施方案中，药物组合物的量有效地在个体中引起客观临床应答。在一些实施方案中，药物组合物的量有效地引起个体的疾病症状缓解(部分或完全)。在一些实施方案中，药物组合物的量有效地预防个体的癌症复发或疾病进展。在一些实施方案中，药物组合物的量有效延长个体的生存期(例如无病生存期)。在一些实施方案中，药物组合物有效提高个体的生活质量。
在一些实施方案中，药物组合物的量有效抑制实体瘤或淋巴肿瘤的生长或减小实体瘤或淋巴肿瘤的尺寸。在一些实施方案中，实体瘤或淋巴肿瘤的尺寸减小至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一百分比)。
在一些实施方案中，药物组合物的量有效抑制个体中的肿瘤转移。在一些实施方案中，抑制至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一百分比)转移。在一些实施方案中，提供一种抑制转移至淋巴结的方法。在一些实施方案中，提供一种抑制转移至肺的方法。转移可通过本领域中的任何已知方法，例如通过血液测试、骨骼扫描、x射线扫描、CT扫描、PET扫描和活组织检查评定。
VI.药盒和制品
还提供了包含本文所述的嵌合受体、多特异性嵌合受体、双嵌合受体系统或工程化免疫效应细胞中的任一种的药盒、单位剂量和制品。在一些实施方案中，提供一种药盒，所述药盒含有本文所述的任一种药物组合物并优选地提供其使用说明书。
本申请的药盒在合适的包装中。合适的包装包括(但不限于)小瓶、瓶、罐、软包装(例如密封Mylar或塑料袋)等等。药盒可任选地提供例如缓冲液等额外组分和说明性信息。因此，本申请还提供了包括小瓶(例如密封小瓶)、瓶、罐、软包装等制品。
制品可包含容器和在容器上或与容器相连的标签或包装说明书。合适容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可由例如玻璃或塑料的多种材料形成。一般地，容器保存有效治疗本文所述的疾病或病症(例如癌症)的组合物，且可具有无菌进入孔(例如容器可为具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。标签或包装说明书指示组合物用于治疗个体中的具体疾患。标签或包装说明书还包含关于组合物施用于个体的说明书。标签可指示关于复原和/或使用的指导。保存药物组合物的容器可为多用途小瓶，其允许重复施用(例如2-6次施用)复原的制剂。包装说明书是指照例包括在治疗产品的商业包装内的说明书，其含有有关适应症、使用、剂量、施用、禁忌症和/或关于此类治疗产品使用的警告的信息。另外，制品可进一步包含第二容器，该第二容器包含药学上可接受的缓冲液，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer′s solution)和右旋糖溶液。其还可包括其它从商业和使用者立场合意的物质，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、注射针和注射器。
药盒或制品可包括多个单位剂量的药物组合物和使用说明书，以足够药房、例如医院药房和配药药房存储和使用的量包装。
实施例
以下实施例仅仅意图示例本申请，因此不应视为以任何方式限制本发明。以下实施例和详细描述通过例示来提供而非限制。
实施例1.NKG2D×IL-3嵌合受体和双NKG2D/IL-3嵌合受体系统的制备
本实施例描述了示例性双特异性嵌合受体、双嵌合受体系统和工程化T细胞的设计和制备。
双特异性嵌合受体和双嵌合受体系统构建体的设计
表1和2展示七种构建体的组分和相应序列。
构建体1：单体NKG2D×IL-3嵌合受体(LIC2001).这种双特异性嵌合受体包含单个多肽链，所述多肽链从N端至C端包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其中胞外结构域从N端至C端包含对CD123结合具有特异性的IL-3结构域、第一肽连接子、在N端具有工程化精氨酸残基的第一NKG2D结构域、第二肽连接子和在C端具有工程化天冬氨酸残基的第二NKG2D结构域。NKG2D结构域负责在二聚后结合NKG2D配体。工程化精氨酸和天冬氨酸残基可彼此缔合，以防NKG2D二聚体与未结合于肿瘤细胞的游离的NKG2D配体结合。所述核酸构建体编码单一多肽链。
构建体2：单体NKG2D×IL-3嵌合受体(LIC2001-1).这种双特异性嵌合受体包含单个多肽链，所述多肽链从N端至C端包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其中胞外结构域从N端至C端包含对CD123结合具有特异性的IL-3结构域、第一肽连接子、第一NKG2D结构域、第二肽连接子和第二NKG2D结构域。NKG2D结构域负责在二聚后结合NKG2D配体。所述核酸构建体编码单一多肽链。为进行比较，构建单特异性NKG2D嵌合受体(LIC2001-2)，其从N端至C端包含：包含第一正向NKG2D结构域、肽连接子和第二正向NKG2D结构域的胞外结构域；跨膜结构域(CD8α)和胞内信号传导结构域(4-1BB和CD3ζ)。LIC2001-2的氨基酸序列为SEQ ID NO：33，且LIC2001-2的核酸序列为SEQ ID NO：38。
构建体3：具有亮氨酸拉链基序的二聚NKG2D×IL-3嵌合受体(LIC2002).这种双特异性嵌合受体包含两个相同的多肽链，每个多肽链从N端至C端包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其中胞外结构域从N端至C端包含对CD123结合具有特异性的IL-3结构域、亮氨酸拉链基序和负责在同二聚化后结合NKG2D配体的反向NKG2D结构域。所述核酸构建体编码多肽链的单个拷贝。
构建体4：不具有亮氨酸拉链基序的二聚NKG2D×IL-3嵌合受体(LIC2002-1).这种双特异性嵌合受体包含两个相同的多肽链，每个多肽链从N端至C端包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其中胞外结构域从N端至C端包含对CD123结合具有特异性的IL-3结构域、肽连接子和负责在同二聚化后结合NKG2D配体的反向NKG2D结构域。所述核酸构建体编码多肽链的单个拷贝。
构建体5：具有亮氨酸拉链基序的二聚NKG2D×IL-3嵌合受体(LIC2002-2).这种双特异性嵌合受体包含两个相同的多肽链，每个多肽链从N端至C端包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其中胞外结构域从N端至C端包含对CD123结合具有特异性的IL-3结构域、亮氨酸拉链基序和负责在同二聚化后结合NKG2D配体的正向NKG2D结构域。所述核酸构建体编码多肽链的单个拷贝。
构建体6：双NKG2D/IL-3嵌合受体系统(LIC2003).设计用于双NKG2D/IL-3嵌合受体系统的多顺反子核酸构建体。构建体编码从N端至C端包含以下的第一多肽：包含负责在同二聚化后结合NKG2D配体的反向NKG2D结构域和正向NKG2D结构域的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域；然后T2A自裂解肽，和从N端至C端包含以下的第二多肽：对CD123结合具有特异性的IL-3结构域、然后是跨膜结构域，不具有胞内信号传导结构域。在表达构建体后，第一多肽形成第一嵌合受体，且第二多肽形成第二嵌合受体。
构建体7：双NKG2D/IL-3嵌合受体系统(LIC2004).设计用于双NKG2D/IL-3嵌合受体系统的多顺反子核酸构建体。构建体编码从N端至C端包含以下的第一多肽：包含负责在同二聚化后结合NKG2D配体的正向NKG2D结构域的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域；然后T2A自裂解肽，和从N端至C端包含以下的第二多肽：对CD123结合具有特异性的IL-3结构域、然后跨膜结构域，不具有胞内信号传导结构域。在表达构建体后，第一多肽的两个拷贝形成二聚的第一嵌合受体，且第二多肽形成第二嵌合受体。构建单特异性NKG2D嵌合受体(LIC2004-1)，其从N端至C端包含：包含正向NKG2D结构域、CD8α铰链区的胞外结构域；跨膜结构域(CD8α)和胞内信号传导结构域(4-1BB和CD3ζ)。LIC2004-1的氨基酸序列为SEQ ID NO：35，且LIC2004-1的核酸序列为SEQ ID NO：40。
慢病毒表达载体的产生
简单地说，通过GenScript，使用pLVX-Puro(Clontech#632164)，利用EcoRI和XbaI用人延长因子1α启动子(hEF1α)基因置换原始启动子来修饰慢病毒载体。通过GenScript构建NKG2D×IL-3嵌合受体基因或NKG2D/IL-3双嵌合受体系统基因，并经由EcoRI/HpaI克隆至载体中，提供重组慢病毒表达质粒，使所述表达质粒进一步经受慢病毒包装程序。
将包括pMDLg/pRRE(Addgene#12251)、pRSV-Rev(Addgene#12253)和pMD2.G(Addgene#12259)的慢病毒包装质粒混合物预先与pLVX-NKG2D×IL-3嵌合受体/嵌合受体系统-Puro表达质粒以预先优化比率与聚醚酰亚胺(PEI)混合，然后适当混合并在室温下孵育5分钟。然后将转染混合物逐滴加入293FT细胞中并轻轻混合。然后，将细胞在37℃和5％CO2细胞孵育箱中孵育整夜。在4℃、500g下离心10分钟后收集上清液。在上清液经0.45μmPES过滤器过滤后，用20％蔗糖梯度超速离心法浓缩病毒上清液。在离心后，小心丢弃上清液，并将病毒团块用预先冷却的DPBS小心冲洗。然后测量病毒的浓度。将病毒适当等分，然后立即存储在-80℃下。通过p24，基于GenScript研发的HTRF试剂盒确定病毒效价。制备与上述七种构建体中的每一种相对应的以下重组慢病毒表达质粒：pLLV-LIC2001、pLLV-LIC2001-1、pLLV-LIC2002、pLLV-LIC2002-1、pLLV-LIC2002-2、pLLV-LIC2003和pLLV-LIC2004以及pLLV-LIC2001-2和pLLV-LIC2004-1。
PBMC制备
收集白细胞，并在R10培养基中将细胞浓度调至5×106细胞/毫升。然后将白细胞与0.9％NaCl溶液以1∶1(v/v)比率混合。将3mL lymphoprep培养基加入15mL离心管中，并将6mL稀淋巴细胞混合物慢慢地铺在lymphoprep顶部。将淋巴细胞混合物在20℃下在800g下离心30分钟，不减速。然后用200μL移液管收集淋巴细胞白膜层。将收获的部分用至少6倍的0.9％NaCl或R10稀释以降低溶液密度。然后将收获的部分在250g下在20℃下离心10分钟。完全吸出上清液，并将10mL R10加入细胞团块中。进一步将混合物在250g下在20℃下离心10分钟。然后吸出上清液。将预先温热的具有100IU/mL IL-2的2mL 37℃R10加入细胞团块中，且轻柔地使细胞团块再悬浮。然后计数细胞的数目，且PBMC样品备用于后面实验。
T细胞纯化
使用Miltenyi全T细胞分离试剂盒(目录号130-096-535)，根据如下制造商提供的方案，从PBMC纯化人T细胞。首先确定细胞数目。将细胞悬浮液在300g下离心10分钟。然后完全吸出上清液，并使细胞团块每107总细胞再悬浮于40μL缓冲液中。每107总细胞加入10μL全T细胞生物素-抗体混合物，彻底混合并在冰箱(2-8℃)中孵育约5分钟。然后每107细胞加入30μL缓冲液。每107细胞加入20μL全T细胞微珠混合物。将混合物充分混合，并在冰箱(2-8℃)中再孵育10分钟。磁性分离最少需要500μL。将LS柱放在合适的MACS分离器的磁场中。通过用3mL缓冲液冲洗来准备柱。然后将细胞悬浮液施加至柱上，并收集含有未标记细胞的流过物，代表富集T细胞部分。然后通过用3mL缓冲液洗涤柱，收集代表富集的T细胞的通过的未标记细胞并与来自前面步骤的流过物组合来收集T细胞。然后使T细胞再悬浮于R10+100IU/mL IL-2中。然后将原代T细胞用人T细胞激活/扩张试剂盒(Miltenyi#130-091-441)预先激活3天，然后转导。
将纯化的T细胞用每一种重组慢病毒载体转染，或通过电穿孔，用编码每一种嵌合受体构建体的mRNA转染，然后在37℃、5％CO2孵育箱中孵育过夜。制备本实施例中所述的七种构建体中的每一种构建体的工程化T细胞。
嵌合受体在工程化T细胞上的表达
通过电穿孔将编码LIC2002-2和LIC2004嵌合受体构建体的mRNA分子分别递送至T细胞。使用流式细胞测定法检测嵌合受体的表达。简单地说，收获经过电穿孔的T细胞，并用DPBS冲洗，然后再悬浮于100μL DPBS中，所述DPBS含有2μL用以检测NKG2D结构域的PE缀合的CD314蛋白(MILTENYI BIOTEC，130-111-645)或用以检测IL-3结构域的10μL PE缀合的抗IL-3抗体(MILTENYI BIOTEC，130-096-084)。将反应混合物在4℃下孵育20分钟。随后，将细胞用200μL DPBS洗涤，再悬浮于DPBS中，并通过流式细胞术分析。如图2所示，工程化T细胞表达具有NKG2D和IL-3结构域的嵌合受体。
体外细胞毒性测定
收获工程化T细胞并接种在384孔反应板中。靶细胞为人慢性骨髓性白血病(CML)细胞系K562-Luc和K562-CD123-Luc，所述细胞重组表达CD123。所有细胞系都在内部进行工程化以表达荧光虫荧光素酶。为测定工程化T细胞对肿瘤细胞的细胞毒性，将工程化T细胞与靶细胞以20∶1的效应细胞(工程化T细胞)与靶细胞比率(“E∶T比率”)共同孵育20小时。根据制造商的方案制备ONE-GLOTM发光荧光素酶测定试剂(Promega#E6110)，并加入共培养的细胞中以检测每个孔中的剩余荧光素酶活性。因为荧光素酶仅仅在靶细胞中表达，孔中的剩余荧光素酶活性与孔中的活靶细胞数目直接相关。通过在缺乏效应细胞下将培养基加入靶细胞中获得最大荧光素酶活性。通过加入1％最终浓度的Triton X-100作为阳性对照物，确定最低荧光素酶活性。根据下式计算特定溶解/细胞毒性：
特定溶解/细胞毒性％＝100％×[1-(LUC样品-LUCmin)/(LUCmax-LUCmin)]荧光素酶值(“LUC”或发光)与每个反应孔中的活细胞的量成比例。
如图3A所示，表达LIC2001-1的T细胞(76.63±4.58％)、表达LIC2002-2的T细胞(96.52±1.68％)和表达LTC2004的T细胞(96.89±0.70％)证明对K562-CD123-Luc的显著杀死作用。如图3B所示，对K562-Luc细胞也观察到杀死作用：表达LIC2001-1的T细胞(35.98±6.08％)、表达LIC2002-2的T细胞(94.42±2.66％)、表达LIC2004的T细胞(95.87±1.61％)。然而，表达各种NKG2D×IL-3嵌合受体构建体的工程化T细胞展示对K562-CD123-Luc细胞的细胞毒性高于K562-Luc细胞。
将表达LIC2002-2的T细胞和表达LIC2004的T细胞与人急性髓细胞性白血病(AML)细胞系KG1-Luc以10∶1、5∶1或2.5∶1的效应细胞(工程化T细胞)与靶细胞比率共同孵育，以评定针对KG1-Luc的体外细胞毒性。如图3C所示，观察对表达LIC2002-2的T细胞(83.68±7％、78.55±4％和60.87±10％)和表达LIC2004的T细胞(85.6±3％、76.89±4％和75.53±1％)的有效和剂量依赖性细胞毒性作用。
比较在各种效应细胞：靶细胞比率下表达LIC2002-2的T细胞、表达LIC2004的T细胞和表达LIC2004-1的的T细胞针对K562-CDl23-Luc的细胞毒活性。LIC2004-1构建体为LIC2004双嵌合受体系统中的NKG2D嵌合受体。结果展示于图4中。Y轴展示特定杀死百分比，且X轴展示效应细胞∶靶细胞比率(即工程化T细胞∶K562-CD123-Luc细胞)的自然对数。E∶T比率的对数相对于特定杀死百分比绘图，通过线性回归拟合成点线。拟合线的斜率越小，杀死能力越强。结果证明LIC2004双嵌合受体系统的功效高于对应单独的NKG2D嵌合受体(即LIC2004-1；p＝0.031)。双特异性嵌合受体构建体LIC2002-2与LIC2004的功效之间没有显著差异(p＝0.277)。使用Graphpad Prism 6进行统计分析。
作用机制
进行一系列体外细胞毒性测定，以研究表达NKG2D×IL-3嵌合受体构建体的工程化T细胞的机制。首先，将“NKG2D-CD123 T细胞”(表达LIC2004的T细胞)、“NKG2D T细胞”(表达NKG2D-CD8铰链-CD8TM-4-1BB-CD3ζ的T细胞)和“CD123结合T细胞”(表达IL3-CD8铰链-CD8TM的T细胞)与靶K562-CD123-luc和K562-luc细胞分别以20∶1的E∶T比率共培养。
如图5A所示，NKG2D-CD123 T细胞(70.59±1.5％)展示显著的肿瘤杀死作用，而NKG2D T细胞(42.14±8.4％)的肿瘤杀死作用弱得多，且CD123结合T细胞未展示针对靶肿瘤细胞的细胞毒性。在图5B中，NKG2D-CD123 T细胞还展示针对K562-luc细胞的显著的细胞毒性(88.28±6.58％)，而NKG2D T细胞展示较低的细胞毒性(66.68±2.87％)，且CD123结合T细胞对K562-Luc细胞没有细胞毒性(-46.98±11.22％)。这些结果表明NKG2D-CD123 T细胞比NKG2D T细胞有效。
此外，在可溶性MICA(NKG2D的同源配体)存在或缺乏下进行细胞毒性测定。当与靶细胞(K562-Luc或K562-CD123-Luc)以20∶1的E∶T比率共培养时将NKG2D-CD123 T细胞(LIC2002-2或LIC2004)分别用重组MICA蛋白或BSA蛋白阻断。将MICA或BSA以0ng/mL、100ng/mL或1000ng/mL的浓度加入共培养物中。未用mRNA穿孔的T细胞用作阴性对照物。
如图6A-6B所示，用测试的最高浓度的MICA处理能够阻断NKG2D结构域并降低表达LIC2002-2和LIC2004的T细胞的细胞毒活性。用非特定BSA处理不显著地影响工程化T细胞针对肿瘤细胞的细胞毒性。
如图7所示，将表达LIC2002-2的T细胞和表达LIC2004的T细胞与K562-CD123-Luc或K562-Luc细胞系以20∶1、10∶1、5∶1、2.5∶1、1.25∶1或0.625∶1的效应细胞(工程化T细胞)与靶细胞比率共同孵育。结果展示LIC2004和LIC2002-2对K562细胞系的剂量依赖性杀死作用。与仅仅表达NKG2D配体的K562细胞系相比，在表达NKG2D配体和CD123的K562细胞系上观察到更强的杀死作用。
IFNγ释放
将表达LIC2002-2、LIC2004或LIC2004-1构建体的工程化T细胞分别与K562-CD123-Luc、K562-Luc或KG1-Luc细胞系共同孵育20小时。从共培养物种收集上清液并进行评定，以确定细胞因子释放(例如干扰素γ、IFNγ释放)的水平。
图8A展示在工程化T细胞与CD123阳性K562-CD123-Luc共培养20小时后无细胞上清液中的IFNγ水平。分泌的IFNγ水平为1526.51±92.13pg/mL(LIC2002-2)、1089.36±8.06pg/mL(LIC2004)、687.62±31.65pg/mL(LIC2004-1)和64.15±16.56pg/mL(无RNA对照物)。在无T细胞对照物中未检测到IFNγ。
图8B展示在工程化T细胞与K562-Luc共培养20小时后无细胞上清液中的IFNγ水平。分泌的IFNγ水平为3416.67±71.15pg/mL(LIC2002-2)、3063.46±119.46pg/mL(LIC2004)、1841.41±222.18pg/mL(LIC2004-1)和3.99±11.57pg/mL(无RNA对照物)。在无T细胞对照物中未检测到IFNγ。
图8C展示在工程化T细胞与KG1-Luc共培养20小时后无细胞上清液中的IFNγ水平。分泌的IFNγ水平为267.75±34.33pg/mL(LIC2002-2)、265.87±12.19pg/mL(LIC2004)、236.56±16.45pg/mL(LIC2004-1)和220.56±80.5pg/mL(无RNA对照物)。在无T细胞对照物中未检测到IFNγ。
序列表
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<120> 包含NKG2D结构域的多特异性嵌合受体和其使用方法
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245 250 255
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Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu
420 425 430
Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn
435 440 445
Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Asp Asp Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
465 470 475 480
Gly Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
485 490 495
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala
500 505 510
Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
515 520 525
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
530 535 540
Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile
545 550 555 560
Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp
565 570 575
Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
580 585 590
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
595 600 605
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
610 615 620
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
625 630 635 640
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
645 650 655
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
660 665 670
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
675 680 685
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
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<210> 17
<211> 700
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
Met Ser Arg Leu Pro Val Leu Leu Leu Leu Gln Leu Leu Val Arg Pro
1 5 10 15
Gly Leu Gln Ala Pro Met Thr Gln Thr Thr Pro Leu Lys Thr Ser Trp
20 25 30
Val Asn Cys Ser Asn Met Ile Asp Glu Ile Ile Thr His Leu Lys Gln
35 40 45
Pro Pro Leu Pro Leu Leu Asp Phe Asn Asn Leu Asn Gly Glu Asp Gln
50 55 60
Asp Ile Leu Met Glu Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu Glu Ala Phe
65 70 75 80
Asn Arg Ala Val Lys Ser Leu Gln Asn Ala Ser Ala Ile Glu Ser Ile
85 90 95
Leu Lys Asn Leu Leu Pro Cys Leu Pro Leu Ala Thr Ala Ala Pro Thr
100 105 110
Arg His Pro Ile His Ile Lys Asp Gly Asp Trp Asn Glu Phe Arg Arg
115 120 125
Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Lys Thr Leu Glu Asn Ala Gln Ala Gln Gln
130 135 140
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145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
165 170 175
Val Thr Arg Gln Met Cys Ile Tyr Thr Asn Pro Thr Ser Cys Asn Glu
180 185 190
Ile Tyr Gly Lys Phe Ser Ser Ala Tyr Leu Ala Cys Asp Gly Lys Gln
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Tyr Ser Lys Val Leu Lys Leu Leu Asp Gln Asp Glu Lys Ser Tyr Val
245 250 255
Lys Leu Leu Ser Ala Asn Gln Ser Met Cys Ser Ala Gln Ser Glu Tyr
260 265 270
Trp Asn Lys Ser Glu Asp Phe Phe Gln Tyr Cys Asn Asn Lys Tyr Cys
275 280 285
Ile Trp Asn Lys Pro Cys Pro Gly Cys Tyr Ser Glu Thr Leu Pro Ile
290 295 300
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly
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340 345 350
Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser
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420 425 430
Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr
435 440 445
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450 455 460
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Thr Thr
465 470 475 480
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
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Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
500 505 510
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
515 520 525
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
530 535 540
Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
545 550 555 560
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
565 570 575
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
580 585 590
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
595 600 605
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
610 615 620
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
625 630 635 640
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
645 650 655
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
660 665 670
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
675 680 685
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
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<210> 18
<211> 552
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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545 550
<210> 19
<211> 527
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
Met Ser Arg Leu Pro Val Leu Leu Leu Leu Gln Leu Leu Val Arg Pro
1 5 10 15
Gly Leu Gln Ala Pro Met Thr Gln Thr Thr Pro Leu Lys Thr Ser Trp
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100 105 110
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115 120 125
Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Lys Thr Leu Glu Asn Ala Gln Ala Gln Gln
130 135 140
Thr Thr Leu Ser Leu Ala Ile Phe Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Ser Val Thr Arg Gln Met Cys Ile Tyr Thr Asn Pro Thr Ser Cys
180 185 190
Asn Glu Ile Tyr Gly Lys Phe Ser Ser Ala Tyr Leu Ala Cys Asp Gly
195 200 205
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210 215 220
Asp Glu Trp Gln Trp Ser Gly Asn Thr Pro Ile His Val Leu Gly Met
225 230 235 240
Trp His Tyr Ser Lys Val Leu Lys Leu Leu Asp Gln Asp Glu Lys Ser
245 250 255
Tyr Val Lys Leu Leu Ser Ala Asn Gln Ser Met Cys Ser Ala Gln Ser
260 265 270
Glu Tyr Trp Asn Lys Ser Glu Asp Phe Phe Gln Tyr Cys Asn Asn Lys
275 280 285
Tyr Cys Ile Trp Asn Lys Pro Cys Pro Gly Cys Tyr Ser Glu Thr Leu
290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
340 345 350
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355 360 365
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385 390 395 400
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
405 410 415
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420 425 430
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
435 440 445
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
<210> 20
<211> 554
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
Met Ser Arg Leu Pro Val Leu Leu Leu Leu Gln Leu Leu Val Arg Pro
1 5 10 15
Gly Leu Gln Ala Pro Met Thr Gln Thr Thr Pro Leu Lys Thr Ser Trp
20 25 30
Val Asn Cys Ser Asn Met Ile Asp Glu Ile Ile Thr His Leu Lys Gln
35 40 45
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Leu Lys Asn Leu Leu Pro Cys Leu Pro Leu Ala Thr Ala Ala Pro Thr
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115 120 125
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130 135 140
Thr Thr Leu Ser Leu Ala Ile Phe Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Ser Lys Glu Glu Leu Glu Ala Glu Lys Arg Asp Leu Ile Arg Thr
180 185 190
Asn Glu Arg Leu Ser Gln Glu Leu Glu Tyr Leu Ile Pro Leu Thr Glu
195 200 205
Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn
210 215 220
Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala
225 230 235 240
Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu
245 250 255
Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu
260 265 270
Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile
275 280 285
Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys
290 295 300
Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr
305 310 315 320
Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro Ala
325 330 335
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
340 345 350
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
355 360 365
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
370 375 380
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
385 390 395 400
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
405 410 415
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
420 425 430
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
435 440 445
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
450 455 460
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
465 470 475 480
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
485 490 495
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
500 505 510
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
515 520 525
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
530 535 540
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
545 550
<210> 21
<211> 2112
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
atgagtagac tgcccgtgct gctgctgctg cagctgctgg tgcgccccgg actgcaggcc 60
ccaatgaccc agacaacacc tctgaaaacc tcttgggtga actgcagcaa tatgatcgac 120
gagatcatca cacacctgaa gcagccccct ctgccactgc tggatttcaa caatctgaac 180
ggcgaggacc aggatatcct gatggagaac aatctgagac ggcccaacct ggaggccttt 240
aatagggccg tgaagagcct gcagaacgcc agcgccatcg agtccatcct gaagaatctg 300
ctgccatgtc tgcctctggc aaccgcagca ccaacacgcc acccaatcca catcaaggac 360
ggcgattgga acgagttcag gcgcaagctg accttttacc tgaagacact ggagaatgcc 420
caggcccagc agaccacact gtccctggcc atcttcacct ccggcggcgg cggctctgga 480
ggaggaggaa gcggaggagg aggatctgga tctggcggag gaggctctcg gagagtgaca 540
cggcagatgt gcatctatac caaccccaca agctgtaatg agatctacgg caagtttagc 600
tccgcctatc tggcctgcga cggcaagcag atggagatca tcaccctgct gaacccttct 660
ctgatcagcg gcgatgagtg gcagtggtcc ggcaatacac caatccacgt gctgggcatg 720
tggcactact ctaaggtgct gaagctgctg gaccaggatg agaagtccta tgtgaagctg 780
ctgtctgcca accagtccat gtgctctgcc cagagcgagt actggaataa gagcgaggac 840
ttctttcagt actgcaacaa taagtattgt atctggaaca agccatgccc cggctgttat 900
tccgagacac tgcctatctc tggcggagga ggatccggcg gcggcggctc cggcggcgga 960
ggaagcggct ccggcggcgg cggcagcatc ccactgacag agtcctactg cggcccttgt 1020
ccaaagaatt ggatctgcta caagaacaac tgttaccagt tctttgatga gagcaagaac 1080
tggtatgagt cccaggcctc ttgcatgagc cagaatgcct ctctgctgaa ggtgtacagc 1140
aaggaggacc aggatctgct gaagctggtg aagagctatc actggatggg cctggtgcac 1200
atccccacca acggctcctg gcagtgggag gacggctcca tcctgtctcc taatctgctg 1260
acaatcatcg agatgcagaa gggcgattgt gccctgtacg cctctagctt caagggctat 1320
atcgagaact gctccacccc taatacatac atctgtatgc agcggaccgt ggacgattct 1380
ggcgggggag gcagtgggtc agggggaggg ggaagcggag gaggagggag cggcgggggg 1440
ggcaccacga cgccagcgcc gcgaccacca acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc 1500
ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg 1560
ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt 1620
ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc aaacggggca gaaagaaact cctgtatata 1680
ttcaaacaac catttatgag accagtacaa actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc 1740
cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt gaactgagag tgaagttcag caggagcgca 1800
gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac cagctctata acgagctcaa tctaggacga 1860
agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga cgtggccggg accctgagat ggggggaaag 1920
ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg 1980
gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc 2040
ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag gacacctacg acgcccttca catgcaggcc 2100
ctgccccctc gc 2112
<210> 22
<211> 2094
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
atgagccgac tgcccgtgct gctgctgctg cagctgctgg tgcgacccgg actgcaggcc 60
cccatgaccc agactacccc actgaaaacc tcttgggtga actgcagcaa tatgatcgac 120
gagatcatca cacacctgaa gcagccccct ctgccactgc tggatttcaa caatctgaac 180
ggcgaggacc aggatatcct gatggagaac aatctgagac ggcccaacct ggaggccttt 240
aatcgggccg tgaagagcct gcagaacgcc agcgccatcg agtccatcct gaagaatctg 300
ctgccatgtc tgcctctggc aaccgcagca ccaacaagac acccaatcca catcaaggac 360
ggcgattgga acgagttcag gcgcaagctg accttttacc tgaagacact ggagaatgcc 420
caggcccagc agaccacact gtccctggcc atcttcacct ccggcggcgg cggctctgga 480
ggaggaggaa gcggaggagg aggatctgga tctggcggag gaggctccgt gacaaggcag 540
atgtgcatct ataccaaccc cacatcttgt aatgagatct acggcaagtt tagctccgcc 600
tatctggcct gcgacggcaa gcagatggag atcatcaccc tgctgaaccc ttctctgatc 660
agcggcgatg agtggcagtg gagcggcaat acaccaatcc acgtgctggg catgtggcac 720
tactccaagg tgctgaagct gctggaccag gatgagaagt cctatgtgaa gctgctgtct 780
gccaaccagt ccatgtgctc tgcccagagc gagtactgga ataagtccga ggacttcttt 840
cagtactgca acaataagta ttgtatctgg aacaagccat gccccggctg ttattctgag 900
acactgccta tctctggcgg aggaggatcc ggcggcggcg gctccggcgg cggaggaagc 960
ggctccggcg gcggcggcag catcccactg acagagtcct actgcggccc ttgtccaaag 1020
aattggatct gctacaagaa caactgttac cagttctttg atgagagcaa gaactggtat 1080
gagtcccagg cctcttgcat gagccagaat gcctctctgc tgaaggtgta cagcaaggag 1140
gaccaggatc tgctgaagct ggtgaagtct tatcactgga tgggcctggt gcacatcccc 1200
accaacggca gctggcagtg ggaggacggc tccatcctgt ctcctaatct gctgacaatc 1260
atcgagatgc agaagggcga ttgtgccctg tacgcctcta gcttcaaggg ctatatcgag 1320
aactgctcca cccctaatac atacatctgt atgcagagaa ccgtgtctgg gggaggggga 1380
agcggaagtg gcggaggcgg ctctggcggg ggaggaagtg gagggaccac gacgccagcg 1440
ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag 1500
gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat 1560
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 1620
accctttact gcaaacgggg cagaaagaaa ctcctgtata tattcaaaca accatttatg 1680
agaccagtac aaactactca agaggaagat ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa 1740
gaaggaggat gtgaactgag agtgaagttc agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag 1800
cagggccaga accagctcta taacgagctc aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt 1860
ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag atggggggaa agccgagaag gaagaaccct 1920
caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt 1980
gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt 2040
acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc tcgc 2094
<210> 23
<211> 1656
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
atgagtagac tgcccgtgct gctgctgctg cagctgctgg tgcgccccgg actgcaggcc 60
ccaatgaccc agacaacccc actgaagacc tcttgggtga actgcagcaa tatgatcgac 120
gagatcatca cacacctgaa gcagccccct ctgccactgc tggatttcaa caatctgaac 180
ggcgaggacc aggatatcct gatggagaac aatctgagac ggcccaacct ggaggccttt 240
aatcgcgccg tgaagtctct gcagaacgcc agcgccatcg agtccatcct gaagaatctg 300
ctgccatgtc tgccactggc aaccgcagca cctacacggc acccaatcca catcaaggac 360
ggcgattgga acgagttcag gcgcaagctg accttttacc tgaagacact ggagaatgcc 420
caggcccagc agaccacact gagcctggcc atcttcacct ccggcggcgg cggctctgga 480
ggaggaggaa gcggcggagg aggaggaggc tctggcagcg gcggcggcgg ctctaaggag 540
gagctggagg ccgagaagcg ggacctgatc agaaccaatg agaggctgag ccaggagctg 600
gagtacctgg tgacacggca gatgtgcatc tataccaacc ctacatcctg taatgagatc 660
tacggcaagt ttagctccgc ctatctggcc tgcgacggca agcagatgga gatcatcacc 720
ctgctgaacc cctccctgat ctctggcgat gagtggcagt ggagcggcaa tacacctatc 780
cacgtgctgg gcatgtggca ctactccaag gtgctgaagc tgctggacca ggatgagaag 840
tcctatgtga agctgctgtc tgccaaccag agcatgtgct ccgcccagtc tgagtactgg 900
aataagtccg aggatttctt tcagtattgt aacaacaaat actgcatctg gaacaaaccc 960
tgtcccggct gctactcaga gaccctgacc acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg 1020
gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg 1080
gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc 1140
ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgcaaacgg 1200
ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa caaccattta tgagaccagt acaaactact 1260
caagaggaag atggctgtag ctgccgattt ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg 1320
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 1380
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 1440
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 1500
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 1560
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 1620
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 1656
<210> 24
<211> 1581
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
atgagtagac tgcccgtgct gctgctgctg cagctgctgg tgcgccccgg actgcaggcc 60
ccaatgaccc agacaacccc actgaaaacc tcttgggtga actgcagcaa tatgatcgac 120
gagatcatca cacacctgaa gcagccccct ctgccactgc tggatttcaa caatctgaac 180
ggcgaggacc aggatatcct gatggagaac aatctgagac ggcccaacct ggaggccttt 240
aatcgggccg tgaagtccct gcagaacgcc agcgccatcg agtccatcct gaagaatctg 300
ctgccatgtc tgccactggc aaccgcagca cctacaaggc acccaatcca catcaaggac 360
ggcgattgga acgagttcag gcgcaagctg accttttacc tgaagacact ggagaatgcc 420
caggcccagc agaccacact gtctctggcc atcttcacct ccggcggcgg cggctctgga 480
ggaggaggaa gcggcggagg aggaggaggc tctggcagcg gcggcggcgg cagcgtgaca 540
cggcagatgt gcatctatac caaccctaca tcctgtaatg agatctacgg caagtttagc 600
tccgcctatc tggcctgcga cggcaagcag atggagatca tcaccctgct gaacccctcc 660
ctgatctctg gcgatgagtg gcagtggtct ggcaatacac ctatccacgt gctgggcatg 720
tggcactaca gcaaggtgct gaagctgctg gaccaggatg agaagtccta tgtgaagctg 780
ctgtctgcca accagagcat gtgctccgcc cagtctgagt actggaataa gagcgaggac 840
ttctttcagt attgtaacaa caagtattgc atttggaaca agccctgccc cgggtgctat 900
tctgaaacac tgaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg 960
tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac 1020
acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt 1080
ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc ctttactgca aacggggcag aaagaaactc 1140
ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 1200
tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc 1260
aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 1320
ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 1380
gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 1440
aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 1500
cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 1560
atgcaggccc tgccccctcg c 1581
<210> 25
<211> 1662
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
atgagtagac tgcccgtgct gctgctgctg cagctgctgg tgcgacccgg cctgcaggct 60
ccaatgaccc agacaacccc actgaagacc tcttgggtga actgcagcaa tatgatcgac 120
gagatcatca cacacctgaa gcagccccct ctgcctctgc tggatttcaa caatctgaac 180
ggcgaggacc aggatatcct gatggagaac aatctgagac ggcccaacct ggaggccttt 240
aatcgcgccg tgaagagcct gcagaacgcc agcgccatcg agtccatcct gaagaatctg 300
ctgccttgtc tgccactggc aaccgcagca ccaacacggc accctatcca catcaaggac 360
ggcgattgga acgagttcag gcgcaagctg accttttacc tgaagacact ggagaatgcc 420
caggcccagc agaccacact gtccctggcc atcttcacct ccggcggcgg cggctctgga 480
ggaggaggaa gcggcggagg aggaggaggc tctggcagcg gcggcggcgg ctctaaggag 540
gagctggagg ccgagaagcg ggacctgatc agaaccaacg agaggctgag ccaggagctg 600
gagtacctga tccccctgac agagtcctat tgcggcccat gtcccaagaa ttggatctgc 660
tacaagaaca actgttacca gttctttgat gagtccaaga actggtacga gtcccaggcc 720
tcttgcatga gccagaatgc ctccctgctg aaggtgtact ctaaggagga ccaggatctg 780
ctgaagctgg tgaagtctta tcactggatg ggcctggtgc acatcccaac caacggcagc 840
tggcagtggg aggacggctc catcctgtct cccaatctgc tgacaatcat cgagatgcag 900
aagggcgatt gtgccctgta tgccagctcc ttcaaagggt atatcgagaa ttgctccact 960
ccaaacactt acatctgtat gcagcggacc gtgaccacga cgccagcgcc gcgaccacca 1020
acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca 1080
gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg 1140
gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc 1200
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 1260
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 1320
gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 1380
cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 1440
cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg 1500
tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc 1560
gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag 1620
gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gc 1662
<210> 26
<211> 2295
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
atggctctgc ccgtgaccgc cctgctgctg cccctggctc tgctgctgca cgccgcccgc 60
cctgtgacaa gacagatgtg catctatacc aaccccacat cctgcaatga gatctacggc 120
aagttcagct ccgcctatct ggcctgtgac ggcaagcaga tggagatcat caccctgctg 180
aacccatctc tgatcagcgg cgatgagtgg cagtggtccg gcaatacacc catccacgtg 240
ctgggcatgt ggcactactc taaggtgctg aagctgctgg accaggatga gaagtcttat 300
gtgaagctgc tgagcgccaa ccagtccatg tgctctgccc agagcgagta ctggaataag 360
tccgaggact tctttcagta ctgcaacaat aagtattgta tctggaacaa gccatgcccc 420
ggctgttatt ctgagacact gcccatcagc ggaggaggag gatccggcgg aggaggctct 480
ggcggcggcg gctccggctc tggaggagga ggatccatcc ctctgacaga gtcttactgc 540
ggcccttgtc caaagaattg gatctgctac aagaacaact gttaccagtt ctttgatgag 600
tccaagaact ggtatgagtc ccaggcctct tgtatgagcc agaatgccag cctgctgaag 660
gtgtactcca aggaggacca ggatctgctg aagctggtga agagctatca ctggatgggc 720
ctggtgcaca tccctaccaa cggctcctgg cagtgggagg acggctccat cctgtctcca 780
aatctgctga caatcatcga gatgcagaag ggcgattgcg ccctgtacgc ctctagcttc 840
aagggctata tcgagaactg cagcacccca aatacataca tctgtatgca gcgcaccgtg 900
accacaaccc cagcacctcg gccccctacc ccagcaccaa caatcgcaag ccagcctctg 960
tccctgcgcc cagaggcatg taggccagca gcaggaggag cagtgcacac cagaggcctg 1020
gactttgcct gcgatatcta tatctgggca cctctggcag gaacctgtgg cgtgctgctg 1080
ctgagcctgg tcatcaccct gtactgcaag agaggcagga agaagctgct gtatatcttc 1140
aagcagccct ttatgcgccc tgtgcagaca acccaggagg aggacggctg ctcctgtagg 1200
ttcccagaag aggaggaggg aggatgtgag ctgagagtga agtttagcag gtccgccgat 1260
gcacctgcat accagcaggg acagaaccag ctgtataacg agctgaatct gggccggaga 1320
gaggagtacg acgtgctgga taagaggagg ggacgggacc ccgagatggg aggcaagcct 1380
cggagaaaga acccacagga gggcctgtac aatgagctgc agaaggacaa gatggccgag 1440
gcctattctg agatcggcat gaagggagag aggcgccggg gcaagggaca cgatggcctg 1500
taccagggcc tgagcaccgc cacaaaggac acctatgatg ccctgcacat gcaggccctg 1560
ccaccaagag gatctggaga gggaaggggc agcctgctga catgcggcga cgtggaggag 1620
aaccctggcc caatgagcag actgccagtg ctgctgctgc tgcagctgct ggtgaggccc 1680
ggcctgcagg cacctatgac ccagacaacc cccctgaaga caagctgggt gaactgttcc 1740
aatatgatcg acgagatcat cacccacctg aagcagcctc cactgcctct gctggatttc 1800
aacaatctga atggcgagga ccaggatatc ctgatggaga acaatctgag aaggccaaac 1860
ctggaggcct ttaatagagc cgtgaagtct ctgcagaacg cctctgccat cgagagcatc 1920
ctgaagaatc tgctgccttg cctgccactg gcaaccgcag caccaacaag gcaccccatc 1980
cacatcaagg acggcgattg gaacgagttc cgccggaagc tgacctttta cctgaagaca 2040
ctggagaatg cccaggccca gcagacaacc ctgagcctgg ccatcttcac aaccacacca 2100
gcacctcgcc ccccaactcc tgccccaaca atcgcatccc agccactgtc tctgcgcccc 2160
gaggcatgca ggcctgcagc aggcggcgcc gtgcacaccc ggggcctgga ctttgcctgt 2220
gatatctaca tctgggcccc cctggccgga acttgtggcg tcctgctgct gtccctggtc 2280
atcactctgt attgc 2295
<210> 27
<211> 1818
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
atggctctgc ccgtgactgc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgctgctcgc 60
ccaatccctc tgactgaatc atactgtggc ccatgcccca agaactggat ctgctacaag 120
aacaattgtt atcagttctt tgacgagtct aagaactggt acgagtccca ggcctcttgt 180
atgagccaga atgcctctct gctgaaggtg tacagcaagg aggaccagga tctgctgaag 240
ctggtgaaga gctatcactg gatgggcctg gtgcacatcc ccaccaacgg ctcctggcag 300
tgggaggacg gctccatcct gtctcctaat ctgctgacaa tcatcgagat gcagaagggc 360
gattgcgccc tgtacgccag ctccttcaag ggctatatcg agaactgcag caccccaaat 420
acatacatct gtatgcagag gaccgtgacc acaacccctg caccacggcc ccctacccca 480
gcacctacaa tcgcaagcca gccactgtcc ctgcgccccg aggcatgtag gcctgcagca 540
ggcggcgccg tgcacaccag aggcctggac tttgcctgcg atatctatat ctgggcacct 600
ctggcaggaa cctgtggcgt gctgctgctg agcctggtca tcaccctgta ctgcaagaga 660
ggcaggaaga agctgctgta tatcttcaag cagcctttta tgcgcccagt gcagacaacc 720
caggaggagg acggctgctc ttgtcggttc ccagaggagg aggagggcgg ctgtgagctg 780
agagtgaagt tttctaggag cgccgatgca ccagcatacc agcagggaca gaaccagctg 840
tataacgagc tgaatctggg ccggagagag gagtacgacg tgctggataa gaggagggga 900
cgggaccccg agatgggagg caagccacgg agaaagaacc cccaggaggg cctgtacaat 960
gagctgcaga aggacaagat ggccgaggcc tattctgaga tcggcatgaa gggagagagg 1020
cgccggggca agggacacga tggcctgtac cagggcctga gcaccgccac aaaggacacc 1080
tatgatgccc tgcacatgca ggccctgcca ccaagaggat ccggagaggg caggggctct 1140
ctgctgacat gcggcgatgt ggaggagaac ccaggcccca tgtccagact gcctgtgctg 1200
ctgctgctgc agctgctggt gaggcctggc ctgcaggcac caatgaccca gacaacccca 1260
ctgaagacaa gctgggtgaa ctgttccaat atgatcgacg agatcatcac ccacctgaag 1320
cagcctccac tgcccctgct ggatttcaac aatctgaatg gcgaggacca ggatatcctg 1380
atggagaaca atctgagaag gcctaacctg gaggccttta atagagccgt gaagagcctg 1440
cagaacgcct ctgccatcga gagcatcctg aagaatctgc tgccatgcct gccactggca 1500
accgcagcac ccacaaggca ccctatccac atcaaggacg gcgattggaa cgagttccgc 1560
cggaagctga ccttttatct gaagacactg gagaatgccc aggcccagca gacaaccctg 1620
tccctggcca tcttcacaac cacacctgca ccacgccccc caactcctgc ccctacaatc 1680
gcatcccagc cactgtctct gcgccctgag gcatgtcggc cagccgccgg aggagccgtg 1740
cacacccggg gcctggattt cgcttgtgac atctacattt gggctcctct ggctggcacc 1800
tgtggggtcc tgctgctg 1818
<210> 28
<211> 1
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)...(1)
<223> 可呈至少1的重复序列存在
<400> 28
Gly
1
<210> 29
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)...(2)
<223> 可呈至少1的重复序列存在
<400> 29
Gly Ser
1
<210> 30
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)...(5)
<223> 可呈至少1的重复序列存在
<400> 30
Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 31
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)...(4)
<223> 可呈至少1的重复序列存在
<400> 31
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 32
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)...(5)
<223> 可呈至少1的重复序列存在
<400> 32
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 33
<211> 516
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys
20 25 30
Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp
35 40 45
Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn
50 55 60
Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys
65 70 75 80
Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn
85 90 95
Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu
100 105 110
Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser
115 120 125
Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys
130 135 140
Met Gln Arg Thr Val Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Ser Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys
165 170 175
Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp
180 185 190
Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn
195 200 205
Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys
210 215 220
Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn
225 230 235 240
Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu
245 250 255
Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser
260 265 270
Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys
275 280 285
Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro
290 295 300
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
305 310 315 320
Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
325 330 335
Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu
340 345 350
Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys
355 360 365
Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
370 375 380
Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly
385 390 395 400
Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
405 410 415
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
420 425 430
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
435 440 445
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
450 455 460
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
465 470 475 480
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
485 490 495
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
500 505 510
Leu Pro Pro Arg
515
<210> 34
<211> 523
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Val Thr Arg Gln Met Cys Ile Tyr Thr Asn Pro
20 25 30
Thr Ser Cys Asn Glu Ile Tyr Gly Lys Phe Ser Ser Ala Tyr Leu Ala
35 40 45
Cys Asp Gly Lys Gln Met Glu Ile Ile Thr Leu Leu Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Ile Ser Gly Asp Glu Trp Gln Trp Ser Gly Asn Thr Pro Ile His Val
65 70 75 80
Leu Gly Met Trp His Tyr Ser Lys Val Leu Lys Leu Leu Asp Gln Asp
85 90 95
Glu Lys Ser Tyr Val Lys Leu Leu Ser Ala Asn Gln Ser Met Cys Ser
100 105 110
Ala Gln Ser Glu Tyr Trp Asn Lys Ser Glu Asp Phe Phe Gln Tyr Cys
115 120 125
Asn Asn Lys Tyr Cys Ile Trp Asn Lys Pro Cys Pro Gly Cys Tyr Ser
130 135 140
Glu Thr Leu Pro Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Pro Leu Thr
165 170 175
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
180 185 190
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
195 200 205
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
210 215 220
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
225 230 235 240
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
245 250 255
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
260 265 270
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
275 280 285
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro
290 295 300
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
305 310 315 320
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
325 330 335
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
340 345 350
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
355 360 365
Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
370 375 380
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
385 390 395 400
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
405 410 415
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
420 425 430
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
435 440 445
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
450 455 460
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
465 470 475 480
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
485 490 495
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
500 505 510
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
515 520
<210> 35
<211> 372
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys
20 25 30
Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp
35 40 45
Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn
50 55 60
Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys
65 70 75 80
Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn
85 90 95
Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu
100 105 110
Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser
115 120 125
Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys
130 135 140
Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro
145 150 155 160
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
165 170 175
Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
180 185 190
Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu
195 200 205
Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys
210 215 220
Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
225 230 235 240
Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly
245 250 255
Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
260 265 270
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
275 280 285
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
290 295 300
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
305 310 315 320
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
325 330 335
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
340 345 350
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
355 360 365
Leu Pro Pro Arg
370
<210> 36
<211> 765
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Val Thr Arg Gln Met Cys Ile Tyr Thr Asn Pro
20 25 30
Thr Ser Cys Asn Glu Ile Tyr Gly Lys Phe Ser Ser Ala Tyr Leu Ala
35 40 45
Cys Asp Gly Lys Gln Met Glu Ile Ile Thr Leu Leu Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Ile Ser Gly Asp Glu Trp Gln Trp Ser Gly Asn Thr Pro Ile His Val
65 70 75 80
Leu Gly Met Trp His Tyr Ser Lys Val Leu Lys Leu Leu Asp Gln Asp
85 90 95
Glu Lys Ser Tyr Val Lys Leu Leu Ser Ala Asn Gln Ser Met Cys Ser
100 105 110
Ala Gln Ser Glu Tyr Trp Asn Lys Ser Glu Asp Phe Phe Gln Tyr Cys
115 120 125
Asn Asn Lys Tyr Cys Ile Trp Asn Lys Pro Cys Pro Gly Cys Tyr Ser
130 135 140
Glu Thr Leu Pro Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Pro Leu Thr
165 170 175
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
180 185 190
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
195 200 205
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
210 215 220
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
225 230 235 240
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
245 250 255
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
260 265 270
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
275 280 285
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro
290 295 300
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
305 310 315 320
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
325 330 335
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
340 345 350
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
355 360 365
Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
370 375 380
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
385 390 395 400
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
405 410 415
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
420 425 430
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
435 440 445
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
450 455 460
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
465 470 475 480
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
485 490 495
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
500 505 510
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Glu Gly
515 520 525
Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
530 535 540
Met Ser Arg Leu Pro Val Leu Leu Leu Leu Gln Leu Leu Val Arg Pro
545 550 555 560
Gly Leu Gln Ala Pro Met Thr Gln Thr Thr Pro Leu Lys Thr Ser Trp
565 570 575
Val Asn Cys Ser Asn Met Ile Asp Glu Ile Ile Thr His Leu Lys Gln
580 585 590
Pro Pro Leu Pro Leu Leu Asp Phe Asn Asn Leu Asn Gly Glu Asp Gln
595 600 605
Asp Ile Leu Met Glu Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu Glu Ala Phe
610 615 620
Asn Arg Ala Val Lys Ser Leu Gln Asn Ala Ser Ala Ile Glu Ser Ile
625 630 635 640
Leu Lys Asn Leu Leu Pro Cys Leu Pro Leu Ala Thr Ala Ala Pro Thr
645 650 655
Arg His Pro Ile His Ile Lys Asp Gly Asp Trp Asn Glu Phe Arg Arg
660 665 670
Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Lys Thr Leu Glu Asn Ala Gln Ala Gln Gln
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Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
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725 730 735
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
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Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
755 760 765
<210> 37
<211> 606
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys
20 25 30
Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp
35 40 45
Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn
50 55 60
Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys
65 70 75 80
Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn
85 90 95
Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu
100 105 110
Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser
115 120 125
Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys
130 135 140
Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro
145 150 155 160
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
165 170 175
Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
180 185 190
Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu
195 200 205
Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys
210 215 220
Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
225 230 235 240
Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly
245 250 255
Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
260 265 270
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
275 280 285
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
290 295 300
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
305 310 315 320
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
325 330 335
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
340 345 350
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
355 360 365
Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys
370 375 380
Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ser Arg Leu Pro Val Leu
385 390 395 400
Leu Leu Leu Gln Leu Leu Val Arg Pro Gly Leu Gln Ala Pro Met Thr
405 410 415
Gln Thr Thr Pro Leu Lys Thr Ser Trp Val Asn Cys Ser Asn Met Ile
420 425 430
Asp Glu Ile Ile Thr His Leu Lys Gln Pro Pro Leu Pro Leu Leu Asp
435 440 445
Phe Asn Asn Leu Asn Gly Glu Asp Gln Asp Ile Leu Met Glu Asn Asn
450 455 460
Leu Arg Arg Pro Asn Leu Glu Ala Phe Asn Arg Ala Val Lys Ser Leu
465 470 475 480
Gln Asn Ala Ser Ala Ile Glu Ser Ile Leu Lys Asn Leu Leu Pro Cys
485 490 495
Leu Pro Leu Ala Thr Ala Ala Pro Thr Arg His Pro Ile His Ile Lys
500 505 510
Asp Gly Asp Trp Asn Glu Phe Arg Arg Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Lys
515 520 525
Thr Leu Glu Asn Ala Gln Ala Gln Gln Thr Thr Leu Ser Leu Ala Ile
530 535 540
Phe Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
545 550 555 560
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala
565 570 575
Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
580 585 590
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
595 600 605
<210> 38
<211> 1554
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
atggctctgc ccgtgactgc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgctgctcgc 60
ccaatccctc tgactgaatc atactgtggc ccatgcccca agaactggat ctgctacaag 120
aacaattgtt atcagttctt tgacgagtct aagaactggt acgagtccca ggcctcttgt 180
atgagccaga atgcctctct gctgaaggtg tacagcaagg aggaccagga tctgctgaag 240
ctggtgaaga gctatcactg gatgggcctg gtgcacatcc ccaccaacgg ctcctggcag 300
tgggaggacg gctccatcct gtctcctaat ctgctgacaa tcatcgagat gcagaagggc 360
gattgcgccc tgtacgccag ctccttcaag ggctatatcg agaactgcag caccccaaat 420
acatacatct gtatgcagag gaccgtggga ggaggaagcg gaggaggatc cggaggcggc 480
tctggcggcg gcagcatccc tctgactgaa tcatactgtg gcccatgccc caagaactgg 540
atctgctaca agaacaattg ttatcagttc tttgacgagt ctaagaactg gtacgagtcc 600
caggcctctt gtatgagcca gaatgcctct ctgctgaagg tgtacagcaa ggaggaccag 660
gatctgctga agctggtgaa gagctatcac tggatgggcc tggtgcacat ccccaccaac 720
ggctcctggc agtgggagga cggctccatc ctgtctccta atctgctgac aatcatcgag 780
atgcagaagg gcgattgcgc cctgtacgcc agctccttca agggctatat cgagaactgc 840
agcaccccaa atacatacat ctgtatgcag aggaccgtga ctagtaccac gacgccagcg 900
ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag 960
gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat 1020
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 1080
accctttact gcaaacgggg cagaaagaaa ctcctgtata tattcaaaca accatttatg 1140
agaccagtac aaactactca agaggaagat ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa 1200
gaaggaggat gtgaactgag agtgaagttc agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag 1260
cagggccaga accagctcta taacgagctc aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt 1320
ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag atggggggaa agccgagaag gaagaaccct 1380
caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt 1440
gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt 1500
acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc tcgc 1554
<210> 39
<211> 1569
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
atggctctgc ccgtgaccgc cctgctgctg cccctggctc tgctgctgca cgccgcccgc 60
cctgtgacaa gacagatgtg catctatacc aaccccacat cctgcaatga gatctacggc 120
aagttcagct ccgcctatct ggcctgtgac ggcaagcaga tggagatcat caccctgctg 180
aacccatctc tgatcagcgg cgatgagtgg cagtggtccg gcaatacacc catccacgtg 240
ctgggcatgt ggcactactc taaggtgctg aagctgctgg accaggatga gaagtcttat 300
gtgaagctgc tgagcgccaa ccagtccatg tgctctgccc agagcgagta ctggaataag 360
tccgaggact tctttcagta ctgcaacaat aagtattgta tctggaacaa gccatgcccc 420
ggctgttatt ctgagacact gcccatcagc ggaggaggag gatccggcgg aggaggctct 480
ggcggcggcg gctccggctc tggaggagga ggatccatcc ctctgacaga gtcttactgc 540
ggcccttgtc caaagaattg gatctgctac aagaacaact gttaccagtt ctttgatgag 600
tccaagaact ggtatgagtc ccaggcctct tgtatgagcc agaatgccag cctgctgaag 660
gtgtactcca aggaggacca ggatctgctg aagctggtga agagctatca ctggatgggc 720
ctggtgcaca tccctaccaa cggctcctgg cagtgggagg acggctccat cctgtctcca 780
aatctgctga caatcatcga gatgcagaag ggcgattgcg ccctgtacgc ctctagcttc 840
aagggctata tcgagaactg cagcacccca aatacataca tctgtatgca gcgcaccgtg 900
accacaaccc cagcacctcg gccccctacc ccagcaccaa caatcgcaag ccagcctctg 960
tccctgcgcc cagaggcatg taggccagca gcaggaggag cagtgcacac cagaggcctg 1020
gactttgcct gcgatatcta tatctgggca cctctggcag gaacctgtgg cgtgctgctg 1080
ctgagcctgg tcatcaccct gtactgcaag agaggcagga agaagctgct gtatatcttc 1140
aagcagccct ttatgcgccc tgtgcagaca acccaggagg aggacggctg ctcctgtagg 1200
ttcccagaag aggaggaggg aggatgtgag ctgagagtga agtttagcag gtccgccgat 1260
gcacctgcat accagcaggg acagaaccag ctgtataacg agctgaatct gggccggaga 1320
gaggagtacg acgtgctgga taagaggagg ggacgggacc ccgagatggg aggcaagcct 1380
cggagaaaga acccacagga gggcctgtac aatgagctgc agaaggacaa gatggccgag 1440
gcctattctg agatcggcat gaagggagag aggcgccggg gcaagggaca cgatggcctg 1500
taccagggcc tgagcaccgc cacaaaggac acctatgatg ccctgcacat gcaggccctg 1560
ccaccaaga 1569
<210> 40
<211> 1122
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 40
atggctctgc ccgtgactgc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgctgctcgc 60
ccaatccctc tgactgaatc atactgtggc ccatgcccca agaactggat ctgctacaag 120
aacaattgtt atcagttctt tgacgagtct aagaactggt acgagtccca ggcctcttgt 180
atgagccaga atgcctctct gctgaaggtg tacagcaagg aggaccagga tctgctgaag 240
ctggtgaaga gctatcactg gatgggcctg gtgcacatcc ccaccaacgg ctcctggcag 300
tgggaggacg gctccatcct gtctcctaat ctgctgacaa tcatcgagat gcagaagggc 360
gattgcgccc tgtacgccag ctccttcaag ggctatatcg agaactgcag caccccaaat 420
acatacatct gtatgcagag gaccgtgact agtaccacga cgccagcgcc gcgaccacca 480
acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca 540
gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg 600
gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc 660
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 720
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 780
gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 840
cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 900
cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg 960
tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc 1020
gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag 1080
gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gc 1122
<210> 41
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 41
Met Ser Arg Leu Pro Val Leu Leu Leu Leu Gln Leu Leu Val Arg Pro
1 5 10 15
Gly Leu Gln Ala Pro Met Thr Gln Thr Thr Pro Leu Lys Thr Ser Trp
20 25 30
Val Asn Cys Ser Asn Met Ile Asp Glu Ile Ile Thr His Leu Lys Gln
35 40 45
Pro Pro Leu Pro Leu Leu Asp Phe Asn Asn Leu Asn Gly Glu Asp Gln
50 55 60
Asp Ile Leu Met Glu Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu Glu Ala Phe
65 70 75 80
Asn Arg Ala Val Lys Ser Leu Gln Asn Ala Ser Ala Ile Glu Ser Ile
85 90 95
Leu Lys Asn Leu Leu Pro Cys Leu Pro Leu Ala Thr Ala Ala Pro Thr
100 105 110
Arg His Pro Ile His Ile Lys Asp Gly Asp Trp Asn Glu Phe Arg Arg
115 120 125
Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Lys Thr Leu Glu Asn Ala Gln Ala Gln Gln
130 135 140
Thr Thr Leu Ser Leu Ala Ile Phe Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
145 150 155 160
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
165 170 175
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
180 185 190
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
195 200 205
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
210 215 220
<210> 42
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 42
Met Ser Arg Leu Pro Val Leu Leu Leu Leu Gln Leu Leu Val Arg Pro
1 5 10 15
Gly Leu Gln Ala Pro Met Thr Gln Thr Thr Pro Leu Lys Thr Ser Trp
20 25 30
Val Asn Cys Ser Asn Met Ile Asp Glu Ile Ile Thr His Leu Lys Gln
35 40 45
Pro Pro Leu Pro Leu Leu Asp Phe Asn Asn Leu Asn Gly Glu Asp Gln
50 55 60
Asp Ile Leu Met Glu Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu Glu Ala Phe
65 70 75 80
Asn Arg Ala Val Lys Ser Leu Gln Asn Ala Ser Ala Ile Glu Ser Ile
85 90 95
Leu Lys Asn Leu Leu Pro Cys Leu Pro Leu Ala Thr Ala Ala Pro Thr
100 105 110
Arg His Pro Ile His Ile Lys Asp Gly Asp Trp Asn Glu Phe Arg Arg
115 120 125
Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Lys Thr Leu Glu Asn Ala Gln Ala Gln Gln
130 135 140
Thr Thr Leu Ser Leu Ala Ile Phe Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
145 150 155 160
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
165 170 175
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
180 185 190
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
195 200 205
Gly Val Leu Leu Leu
210
<210> 43
<211> 663
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 43
atgagcagac tgccagtgct gctgctgctg cagctgctgg tgaggcccgg cctgcaggca 60
cctatgaccc agacaacccc cctgaagaca agctgggtga actgttccaa tatgatcgac 120
gagatcatca cccacctgaa gcagcctcca ctgcctctgc tggatttcaa caatctgaat 180
ggcgaggacc aggatatcct gatggagaac aatctgagaa ggccaaacct ggaggccttt 240
aatagagccg tgaagtctct gcagaacgcc tctgccatcg agagcatcct gaagaatctg 300
ctgccttgcc tgccactggc aaccgcagca ccaacaaggc accccatcca catcaaggac 360
ggcgattgga acgagttccg ccggaagctg accttttacc tgaagacact ggagaatgcc 420
caggcccagc agacaaccct gagcctggcc atcttcacaa ccacaccagc acctcgcccc 480
ccaactcctg ccccaacaat cgcatcccag ccactgtctc tgcgccccga ggcatgcagg 540
cctgcagcag gcggcgccgt gcacacccgg ggcctggact ttgcctgtga tatctacatc 600
tgggcccccc tggccggaac ttgtggcgtc ctgctgctgt ccctggtcat cactctgtat 660
tgc 663
<210> 44
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
atgtccagac tgcctgtgct gctgctgctg cagctgctgg tgaggcctgg cctgcaggca 60
ccaatgaccc agacaacccc actgaagaca agctgggtga actgttccaa tatgatcgac 120
gagatcatca cccacctgaa gcagcctcca ctgcccctgc tggatttcaa caatctgaat 180
ggcgaggacc aggatatcct gatggagaac aatctgagaa ggcctaacct ggaggccttt 240
aatagagccg tgaagagcct gcagaacgcc tctgccatcg agagcatcct gaagaatctg 300
ctgccatgcc tgccactggc aaccgcagca cccacaaggc accctatcca catcaaggac 360
ggcgattgga acgagttccg ccggaagctg accttttatc tgaagacact ggagaatgcc 420
caggcccagc agacaaccct gtccctggcc atcttcacaa ccacacctgc accacgcccc 480
ccaactcctg cccctacaat cgcatcccag ccactgtctc tgcgccctga ggcatgtcgg 540
ccagccgccg gaggagccgt gcacacccgg ggcctggatt tcgcttgtga catctacatt 600
tgggctcctc tggctggcac ctgtggggtc ctgctgctg 639
<210> 45
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 45
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15

Claims (19)

1.一种多特异性嵌合受体，所述多特异性嵌合受体包括包含以下的多肽链：
(a)包含第一NKG2D结构域、第二NKG2D结构域和第二抗原结合结构域的胞外结构域；
(b)跨膜结构域；和
(c)胞内信号传导结构域；
其中，所述第一NKG2D结构域来源自于NKG2D的胞外结构域，所述第一NKG2D结构域是反向NKG2D结构域，
所述第二NKG2D结构域来源自于NKG2D的胞外结构域，所述第二NKG2D结构域是正向NKG2D结构域，所述正向NKG2D结构域氨基酸序列来源于野生型NKG2D结构域。
2.如权利要求1所述的多特异性嵌合受体，其中所述胞外结构域从N端至C端包含：所述第二抗原结合域、所述第一NKG2D结构域和所述第二NKG2D结构域。
3.如权利要求1所述的多特异性嵌合受体，其中所述第二抗原结合域经由肽连接子与所述第一NKG2D结构域融合。
4.如权利要求1所述的多特异性嵌合受体，其中所述第二抗原结合域为抗体片段。
5.如权利要求4所述的多特异性嵌合受体，其中所述抗体片段特异性地结合于选自由以下组成的组的抗原：CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、BCMA、CS1、ROR1、GPC3、CD123、CD138、c-Met、EGFR、EGFRvIII、HER2、HER3、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3和糖脂F77。
6.如权利要求1所述的多特异性嵌合受体，其中所述第二抗原结合域为配体或配体结合域。
7.如权利要求6所述的多特异性嵌合受体，其中所述配体或配体结合域源自于选自由以下组成的组的分子：NKG2A、NKG2C、NKG2F、IL-3、IL-13、LLT1、AICL、DNAM-1和NKp80。
8.如权利要求7所述的多特异性嵌合受体，其中所述第二抗原结合域为IL-3结构域。
9.如权利要求1-8中任一项所述的多特异性嵌合受体，其中所述第一NKG2D结构域和所述第二NKG2D结构域包含SEQ ID NO：7或8的氨基酸序列。
10.如权利要求1所述的多特异性嵌合受体，其中所述跨膜结构域源自于选自由以下组成的组的分子：CD8α、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152和PD1。
11.如权利要求1所述的多特异性嵌合受体，其中所述胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的主要胞内信号传导结构域。
12.如权利要求1所述的多特异性嵌合受体，其中所述胞内信号传导结构域包含协同刺激信号传导结构域。
13.如权利要求12所述的多特异性嵌合受体，其中所述协同刺激信号传导结构域源自于选自由以下组成的组的协同刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、ICOS、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83配体和它们的组合。
14.一种多特异性嵌合受体，所述多特异性嵌合受体包含选自由SEQ ID NO：16-17组成的组的氨基酸序列。
15.一种分离核酸，所述分离核酸包含编码如权利要求1-14中任一项所述的多特异性嵌合受体的核酸序列。
16.一种分离核酸，所述分离核酸包含选自由SEQ ID NO：21-22组成的组的核酸序列。
17.一种工程化免疫效应细胞，所述工程化免疫效应细胞包含如权利要求1-14中任一项所述的多特异性嵌合受体或如权利要求15或16所述的分离核酸。
18.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求17所述的工程化免疫效应细胞和药学上可接受的载剂。
19.如权利要求18所述的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中，所述癌症包括多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病。
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