CN115335087A - 用于减少同种异体细胞疗法中的移植物排斥的组合物和方法 - Google Patents

用于减少同种异体细胞疗法中的移植物排斥的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

本申请提供了经修饰的治疗细胞，其过表达免疫检查点配体如PD‑L1、CD155、CD112、FGL1、半乳凝素‑9、CD47、B7H3和B7H4，同时表达一种或多种主要组织相容性复合体(MHC)分子。本申请还提供了使用这些经修饰的治疗细胞的治疗方法。

Description

用于减少同种异体细胞疗法中的移植物排斥的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年4月1日提交的国际专利申请号PCT/CN2020/082759的优先权权益，将其内容通过援引以其全文并入本文。
序列表以ASCII文本文件提交
以下以ASCII文本文件提交的内容通过援引以其全文并入本文：计算机可读形式(CRF)的序列表(文件名：761422002341.txt，记录日期：2021年3月25日，大小：149KB)。
技术领域
本申请总体上涉及免疫疗法，并且更特别地涉及用于减少过继细胞疗法中不希望的免疫应答的组合物和方法。
背景技术
过继细胞疗法或过继细胞转移(ACT)正在成为越来越重要的治疗范例，特别是在癌症治疗中。ACT是指将治疗细胞(最典型的是免疫细胞)转移到患者体内。这些细胞可来源于患者(即，自体疗法)或来自相同物种的另一个体(即，同种异体疗法)。ACT的目标是改善患者免疫系统的功能和特征。特别地，在癌症免疫疗法中，ACT的目标是触发针对癌症的免疫应答。尽管T细胞在ACT中最常使用，但其他免疫细胞类型，如NK细胞、淋巴细胞(例如，肿瘤浸润性淋巴细胞或TIL)、树突状细胞和髓细胞也已被应用。
理想情况下，向接受ACT的患者输注(或在自体疗法的情况下重新输注)的治疗细胞将在该患者体内扩增并持续存在。为了改善ACT的疗效，通常使用淋巴细胞清除作为新辅助疗法，其可将可能重新填充免疫细胞空间的竞争性免疫细胞清除。这对于同种异体疗法尤其重要，因为适应性和先天性免疫系统都可针对输注的非自身细胞产生免疫应答。有时，也使用骨髓细胞清除，其应用大剂量化学疗法杀死骨髓中的细胞。然而，淋巴细胞清除或骨髓细胞清除是相当剧烈的措施，由于它们对免疫系统的影响，往往会导致严重的副作用。据此，预防或减少针对输注的ACT细胞的不希望的免疫应答将是有利的，这可以增加ACT细胞在体内的持久性并增强该疗法的益处。理想情况下，这种策略会使得对淋巴细胞清除或骨髓细胞清除的需求以及相关的副作用减少。
免疫系统已经发展出针对外来药剂的复杂且有效的机制。不希望的免疫应答是阻碍ACT、尤其是同种异体ACT(包括同种异体嵌合抗原受体(CAR)T细胞)成功的最大障碍。一个障碍是移植物抗宿主病(GvHD)，其中供体T细胞将患者的细胞识别为外来物，导致对患者健康组织的攻击。另一障碍是宿主抗移植物病(HvGD)，其中患者(即宿主)体内的T细胞将供体细胞识别为外来物，导致供体细胞受到攻击，引起移植物排斥。GvHD由供体T细胞表面的T细胞受体(TCR)介导，该TCR将宿主细胞上的人白细胞抗原(HLA)识别为外来物，并启动由供体T细胞进行的攻击。HvGD由宿主T细胞表面上的TCR介导，该TCR将供体细胞上的HLA识别为外来物，并启动由宿主T细胞进行的攻击。
为了缓解GvHD，已使用基因组编辑技术从供体CAR-T细胞的基因组中敲除TCR基因。许多公司还会将供体CAR-T细胞中的β-2微球蛋白(B2M)敲除，以减少由宿主T细胞引起的移植物排斥。最近开发的基因组编辑工具，如转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶和CRISPR-Cas9系统有效且易于操作。然而，由于经基因组编辑的细胞的免疫原性，临床上相关的人类体细胞的基因组编辑仍然是一个挑战。例如，将B2M敲除会增加自然杀伤(NK)细胞介导的移植物排斥的风险。迄今为止，同种异体αβT细胞疗法产品尚未取得有希望的临床结果(Sommer C等人,Mol Ther.(2019)27(6):1126-1138；MacLeod DT等人,MolTher.(2017)25(4):949-96；Sheridan C等人,Nat Biotechnol(2018)36,375-377；QasimW.Am J Hematol.2019；94:S50-S54)。因此，存在对适用于同种异体移植的治疗细胞的需求，其中不希望的免疫应答风险降低。
本文提到的所有出版物、专利、专利申请和公开的专利申请的披露内容通过援引以其全文特此并入本文。
发明内容
本申请提供了经修饰的治疗细胞及其使用方法，这些经修饰的治疗细胞适用于过继细胞疗法，其中不希望的免疫应答(例如，针对这些治疗细胞的移植物排斥)减少。
本申请的一方面提供了经修饰的治疗细胞，其包含编码免疫检查点配体(ICL)的第一异源核酸序列，其中该治疗细胞表达主要组织相容性复合体(MHC)分子。
本申请的一方面提供了在有需要的个体中减少同种异体治疗细胞的移植物排斥的方法，该方法包括向该个体施用有效量的同种异体治疗细胞，其中这些同种异体治疗细胞包含编码免疫检查点配体(ICL)的第一异源核酸序列，并且其中这些治疗细胞表达MHC分子。
在根据上述经修饰的治疗细胞或方法中任一个的一些实施例中，治疗细胞表达MHC I类分子。在一些实施例中，治疗细胞表达MHC II类分子。在一些实施例中，治疗细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因未经基因修饰。在一些实施例中，治疗细胞的MHC基因未经基因修饰。在一些实施例中，治疗细胞不会引起NK细胞的增殖或杀伤。
在根据上述经修饰的治疗细胞或方法中任一个的一些实施例中，ICL选自由以下组成的组：PD-L1、CD155、CD112、FGL1、半乳凝素-9、CD47、B7H3和B7H4。在一些实施例中，ICL是PD-L1。在一些实施例中，ICL是CD155。在一些实施例中，ICL是CD112。在一些实施例中，ICL是FGL1。在一些实施例中，ICL是半乳凝素-9。在一些实施例中，ICL是CD47。在一些实施例中，ICL是B7H3。在一些实施例中，ICL是B7H4。在一些实施例中，ICL包含与选自由SEQ IDNO:1-8组成的组的氨基酸序列具有至少约85％(例如，至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL包含选自由SEQ ID NO:1-8组成的组的氨基酸序列。
在根据上述经修饰的治疗细胞或方法中任一个的一些实施例中，治疗细胞是免疫细胞。在一些实施例中，免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、NK细胞、NK-T细胞、αβT细胞、γδT细胞、肿瘤浸润性T细胞、树突状细胞(DC)激活的T细胞、和外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施例中，治疗细胞是T细胞。在一些实施例中，治疗细胞是γδT细胞。在一些实施例中，治疗细胞是γ9δ2T细胞。在一些实施例中，治疗细胞是δ1T细胞。在一些实施例中，治疗细胞是δ3T细胞。在一些实施例中，治疗细胞是干细胞。在一些实施例中，治疗细胞是胚胎干细胞(ESC)。在一些实施例中，治疗细胞是造血干细胞(HSC)。
在根据上述经修饰的治疗细胞或方法中任一个的一些实施例中，治疗细胞进一步包含编码工程化受体的第二异源核酸序列。在一些实施例中，工程化受体选自由以下组成的组：嵌合抗原受体(CAR)、重组T细胞受体(TCR)、T细胞抗原偶联剂(TAC)受体和TCR融合蛋白(TFP)。在一些实施例中，治疗细胞是CAR-T细胞。在一些实施例中，工程化受体靶向肿瘤抗原，该肿瘤抗原选自由以下组成的组：CD19、BCMA、NY-ESO-1、VEGFR2、MAGE-A3、CD20、CD22、CD33、CD38、CEA、EGFR、GD2、HER2、IGF1R、间皮素、PSMA、ROR1、WT1、及其组合。在一些实施例中，工程化受体是抗BCMA CAR。在一些实施例中，工程化受体是抗CD19CAR。在一些实施例中，治疗细胞不具有除第一异源核酸序列和第二异源核酸序列之外的其他基因修饰。在一些实施例中，第一异源核酸序列和第二异源核酸序列可操作地连接至相同的启动子或不同的启动子。在一些实施例中，第一异源核酸序列和第二异源核酸序列存在于载体(例如，病毒载体，如慢病毒载体)中。在一些实施例中，第一异源核酸序列经由编码可自切割的接头的第三核酸序列与第二异源核酸序列融合。在一些实施例中，经修饰的治疗细胞包含核酸序列，该核酸序列编码选自由SEQ ID NO:12-27组成的组的氨基酸序列。
在根据上述经修饰的治疗细胞或方法中任一个的一些实施例中，与未经修饰的治疗细胞相比，ICL的表达水平升高。
本申请的一方面提供了药物组合物，其包含根据上述经修饰的治疗细胞中任一个的经修饰的治疗细胞。
本申请的一方面提供了治疗有需要的个体的疾病或病症的方法，该方法包括向该个体施用有效量的根据上述药物组合物中任一个的药物组合物。
在根据上述方法中任一个的一些实施例中，经修饰的治疗细胞是同种异体的。在一些实施例中，个体是人。
在根据上述方法中任一个的一些实施例中，个体的一个或多个人白细胞抗原(HLA)等位基因与经修饰的治疗细胞的那些相比具有错配的同种异型。在一些实施例中，HLA-A、HLA-B、HLA-C和HLA-DRB1的一个或多个(例如，8个中的8个、8个中的7个、或8个中的6个)等位基因与经修饰的治疗细胞的那些相比具有错配的同种异型。在一些实施例中，个体的所有测试的HLA等位基因与经修饰的治疗细胞的那些相比具有匹配的同种异型。
在根据上述方法中任一个的一些实施例中，与使用不包含编码ICL的第一异源核酸序列的治疗细胞的方法相比，该方法减少个体中针对治疗细胞的不希望的免疫应答。在一些实施例中，不希望的免疫应答包含宿主抗移植物(HvG)应答。
在根据上述方法中任一个的一些实施例中，与使用不包含编码ICL的第一异源核酸序列的治疗细胞的方法相比，该方法在个体中诱导对治疗细胞的免疫耐受。
在根据上述方法中任一个的一些实施例中，疾病或病症是癌症、感染性疾病、或自身免疫性疾病。
本申请的一方面提供了套件，其包含根据上述经修饰的治疗细胞中任一个的经修饰的治疗细胞、以及用于在有需要的个体中治疗疾病或病症的说明。在一些实施例中，经修饰的治疗细胞是同种异体的。在一些实施例中，经修饰的治疗细胞是同种异体CAR-T细胞。在一些实施例中，经修饰的治疗细胞是同种异体CAR-NK细胞。在一些实施例中，经修饰的治疗细胞是同种异体CAR-NKT细胞。在一些实施例中，经修饰的治疗细胞是同种异体CAR-γδT细胞。
还提供了包含本文所述的经修饰的治疗细胞中任一个的组合物、用途、套件和制品。
附图说明
图1A-1B显示了用于治疗免疫细胞(图1A)和经CAR修饰的免疫细胞(图1B)的构建体的示意图，这些构建体过表达免疫检查点蛋白(ICP)配体以减少移植物排斥。ICP配体可以是PD-L1、CD155、CD112、FGL1、半乳凝素-9、CD47、B7H3或B7H4。编码免疫检查点蛋白配体的转基因可以位于编码CAR的转基因的上游或下游。图1B中的构建体是同时编码CAR和ICP的一段连续的核酸。
图2A-2D显示了αβT细胞或γδT细胞上抗BCMA CAR(BSF17)、或抗CD19 CAR(CTL-019)、以及ICL配体PD-L1的表达水平。
图3A-3F显示了αβT细胞或γδT细胞上抗BCMA CAR(BSF17)、或抗CD19 CAR(CTL-019)、以及ICL配体PD-L1的短期体外杀伤水平和长期持久性。
图4A-4C显示了αβT细胞或γδT细胞上抗BCMA CAR(BSF17)、或抗CD19 CAR(CTL-019)、以及ICL配体PD-L1的情况下IFN-γ和TNF-α的产生水平。
图5A-5J显示了单向MLR结果，这些结果由以下展示：通过αβT细胞或γδT细胞上抗BCMA CAR(BSF17)、或抗CD19 CAR(CTL-019)、以及ICL配体PD-L1刺激的、以及对照组的同种异体αβT细胞或NK细胞增殖水平。
图6A-6C显示了在RPMI-8226(骨髓瘤)异种移植模型中，γδT细胞上抗BCMA CAR(BSF17)、以及ICL配体PD-L1的体内抗肿瘤功效和增殖。
具体实施方式
本申请提供了治疗细胞以及与减少不希望的免疫应答相关的治疗方法，这些方法通过在这些治疗细胞中过表达免疫检查点配体(ICL)进行，同时不抑制整个宿主免疫系统或引发针对这些治疗细胞的先天性免疫应答。在一些实施例中，治疗细胞是同种异体免疫细胞或干细胞。本文所述的组合物和方法可应用于广泛的过继细胞疗法，包括使用以下的疗法：适应性免疫细胞(如αβT细胞、γδT细胞、和自然杀伤T(NKT)细胞)、先天性免疫细胞(如NK细胞)、干细胞(如造血干细胞(HSC)、诱导性多能干细胞(iPSC)和胚胎干细胞(ESC))、以及经工程化受体(如经修饰的嵌合抗原受体(CAR))修饰的产物。
本申请至少部分上基于发明人的以下观察：过表达ICL的免疫细胞可以抑制MHC错配的PBMC中的T细胞增殖，但在可溶性ICL存在下与MHC错配的PBMC共培养的免疫细胞没有显示出类似的免疫抑制作用。不受任何理论或假设的束缚，当CAR-T细胞不表达MHC复合体时，它们不会被宿主T细胞识别，但这样的CAR-T细胞可以被NK细胞识别并清除。本文所述的组合物和方法可以同时减少由患者体内的T细胞和NK细胞导致的移植物排斥，诱导患者的外周免疫耐受，并提高细胞疗法的功效。
因此，本申请的一方面提供了经修饰的治疗细胞，其包含编码免疫检查点配体(ICL)的第一异源核酸序列，其中该治疗细胞表达主要组织相容性复合体(MHC)分子。在一些实施例中，ICL是PD-L1、CD155、CD112、FGL1、半乳凝素-9、CD47、B7H3或B7H4。
本申请的一方面提供了在有需要的个体中减少同种异体治疗细胞的移植物排斥的方法，该方法包括向该个体施用有效量的同种异体治疗细胞，其中这些同种异体治疗细胞包含编码免疫检查点配体(ICL)的第一异源核酸序列，并且其中这些治疗细胞表达MHC分子。
I.定义
如本文所用，“免疫检查点”、“免疫检查点蛋白”或“ICP”在本文中可互换地用于指免疫系统中增强信号(刺激性分子)或减弱信号(抑制性分子)的分子。免疫检查点蛋白调节并维持自身耐受以及生理性免疫应答的持续时间和幅度。刺激性检查点分子包括但不限于属于肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的CD27、CD40、OX40、GITR和CD137，以及属于B7-CD28超家族的CD28和ICOS。抑制性检查点分子包括但不限于程序性死亡受体1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、淋巴细胞激活基因3(LAG-3)、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)、T细胞活化V结构域Ig抑制因子(VISTA)、B7-H3、B7-H4、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、腺苷A2A受体、及其配体。已经广泛地研究了多种检查点蛋白，如CTLA-4及其配体CD80和CD86，以及PD-1及其配体PD-L1和PD-L2(参见例如，Pardoll,Nature Reviews Cancer 12:252-264(2012))。
术语“免疫检查点配体”、“免疫检查点蛋白配体”或“ICL”是指与免疫检查点分子特异性结合的天然配体或工程化配体。在一些实施例中，ICL是膜结合的。在一些实施例中，ICL是可溶性蛋白。
如本文所用，“治疗(treatment或treating)”是用于获得有益的或所希望的结果(包括临床结果)的方法。出于本发明的目的，有益的或所希望的临床结果包括但不限于以下中的一种或多种：缓解由疾病引起的一种或多种症状、减弱疾病的程度、稳定疾病(例如，预防或延迟疾病的恶化)、预防或延迟疾病的扩散(例如，转移)、预防或延迟疾病的复发、延迟或减缓疾病的进展、改善疾病状态、提供疾病的缓解(部分或全部)、减少治疗疾病所需的一种或多种其他药物的剂量、延迟疾病的进展、提高生活质量、和/或延长生存期。“治疗”还涵盖减少疾病的病理后果。本申请的方法考虑了这些治疗方面中的任一个或多个。
术语“预防(prevent)”和例如“预防(prevented、preventing)”等类似词语表示用于预防、抑制或降低疾病或病症(例如，癌症)复发的可能性的方法。它还指延迟疾病或病症的复发或延迟疾病或病症的症状的复发。如本文所用，“预防(prevention)”和类似词语还包括在疾病或病症复发之前降低疾病或病症的强度、作用，减少症状和/或负担。
如本文所用，“延迟”疾病的发展意指推迟、阻碍、减缓、减慢、稳定和/或延缓疾病的发展。这种延迟可以具有不同的时间长度，其取决于疾病的历史和/或被治疗的个体。与不使用该方法相比，“延迟”疾病的发展的方法是在给定的时间范围内降低疾病发展的可能性并且/或者在给定的时间范围内降低疾病程度的方法。这样的比较典型地基于使用统计学上显著数量的个体进行的临床研究。可以使用标准方法来检测疾病发展，这些标准方法包括但不限于计算机化轴向断层成像(CAT扫描)、磁共振成像(MRI)、腹部超声、凝血测试、动脉造影术、或活检。发展也可以指最初可能无法检测到的疾病进展，并且包括发生、复发和发作。
本文所用的术语“有效量”是指足以治疗特定障碍、病症或疾病(如改善、减轻、减少和/或延迟其一种或多种症状)的药剂的量。提到癌症时，有效量包含足以使肿瘤缩小并且/或者降低该肿瘤的生长速率(如抑制肿瘤生长)或防止或延迟其他不想要的细胞增殖的量。在一些实施例中，有效量是足以延迟发展的量。在一些实施例中，有效量是足以预防或延迟复发的量。有效量能够以一次或多次施用来进行施用。药物或组合物的有效量可以：(i)减少癌细胞的数量；(ii)减小肿瘤大小；(iii)在一定程度上抑制、减慢、减缓并且优选地阻止癌细胞浸润到外周器官中；(iv)抑制(即，在一定程度上减慢并且优选地阻止)肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)预防或延迟肿瘤的发生和/或复发；和/或(vii)在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。
如本文所用，“个体”或“受试者”是指哺乳动物，包括但不限于人、牛、马、猫、犬、啮齿动物或灵长类动物。在一些实施例中，个体是人。
如本文所用，术语“结合”、“特异性结合”或“对……有特异性”是指可测量和可再现的相互作用，如靶标与配体之间的结合，其决定了在异质分子(包括生物分子)群体存在时靶标的存在。例如，结合或特异性结合靶标的配体是与该靶标结合的配体，这种结合的亲和力、亲合力(avidity)、就绪性、和/或持续时间均优于与其他靶标的结合。在一个实施例中，如例如通过放射免疫测定法(RIA)测量的，配体与不相关靶标的结合程度小于该配体与靶标的结合的约10％。在某些实施例中，特异性结合靶标的配体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施例中，配体特异性结合来自不同物种的蛋白质中保守的蛋白质上的区域。在另一实施例中，特异性结合可以包括但不要求排他性结合。
术语“抗体”包括单克隆抗体、具有多表位特异性的抗体组合物、多特异性抗体(例如，双特异性抗体、双抗体和单链分子)、以及抗体片段(例如，Fab、F(ab')2、和Fv)。术语“免疫球蛋白(Ig)”与“抗体”在本文中可互换地使用。术语抗体包括常规的四链抗体和单域抗体，如仅有重链的抗体或其片段，例如VHH。
如本文所用，“嵌合抗原受体”或“CAR”是指可用于将一种或多种抗原特异性移植到免疫效应细胞(如T细胞)上的工程化受体。一些CAR也被称为“人工T细胞受体”、“嵌合T细胞受体”或“嵌合免疫受体”。在一些实施例中，CAR包含对一种或多种抗原(如肿瘤抗原)具有特异性的细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、以及T细胞的细胞内信号传导结构域和/或其他受体。“CAR-T”是指表达CAR的T细胞。
“UCAR-T”或“通用CAR-T细胞”是指可用于治疗有需要的同种异体患者的现成经CAR修饰的T细胞。UCAR-T包括除CAR构建体外还含有基因修饰的那些，以及除CAR构建体外不含有基因修饰的那些。
如本文所用，“T细胞受体”或“TCR”是指包含细胞外抗原结合结构域的内源或重组T细胞受体，该细胞外抗原结合结构域与MHC分子中结合的特异性抗原肽结合。在一些实施例中，TCR包含TCRα多肽链和TCRβ多肽链。在一些实施例中，TCR特异性结合肿瘤抗原。“TCR-T”是指表达重组TCR的T细胞。
如本文所用，“T细胞抗原偶联剂受体”或“TAC受体”是指工程化受体，该工程化受体包含与特异性抗原结合的细胞外抗原结合结构域以及共受体分子的T细胞受体(TCR)结合结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。TAC受体指定表达TAC受体的T细胞的内源TCR以引发针对靶细胞的抗原特异性T细胞应答。
如本文所用，“TCR融合蛋白”或“TFP”是指包含细胞外抗原结合结构域的工程化受体，该细胞外抗原结合结构域与特异性抗原结合，该特异性抗原与TCR复合体的亚基或其部分(包括TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ε、CD3δ、或CD3γ)融合。TCR复合体的亚基或其部分包含天然存在的TCR亚基的跨膜结构域和至少一部分细胞内结构域。在一些实施例中，TFP包含TCR亚基的细胞外结构域或其部分。在一些实施例中，TFP不包含TCR亚基的细胞外结构域。
关于多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同源性”定义为在比对序列并且引入空位(如果需要的话)以实现最大序列同一性百分比之后，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分时，候选序列中氨基酸残基与特定的多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比。可根据本领域技能内的多种方式，例如使用公众可获得的计算机软件(如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)软件)实现比对，以确定氨基酸序列同一性百分比。本领域技术人员可确定用于量测比对的适当参数，包括实现所比较的全长序列上的最大比对所需的任何算法。例如，考虑了与本文所述的特定多肽具有至少70％、85％、90％、95％、98％或99％同一性并且优选地表现出基本相同功能的多肽，以及编码这样的多肽的多核苷酸。
当核酸与另一核酸序列处于功能关系时，该核酸是“可操作地连接的”。例如，如果将前序列或分泌性前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则该前序列或分泌性前导序列的DNA可操作地连接至该多肽的DNA；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则该启动子或增强子可操作地连接至该序列；或者如果核糖体结合位点被定位以有助于翻译，则该核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。通常，“可操作地连接”意指所连接的DNA序列是连续的，并且在分泌性前导序列的情况下是连续的并处于阅读框中。然而，增强子不必是连续的。连接(Linking)是通过在方便的限制位点连接(ligation)来完成的。如果不存在此类位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
如本文所用，术语“载体”是指能够繁殖与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及掺入已引入载体的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够引导与其可操作地连接的核酸的表达。这样的载体在本文中称为“表达载体”。
如本文所用，术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已用外源核酸转染、转化或转导的细胞。
如本文所用，表达“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换地使用，并且所有这样的指代均包括后代。因此，词语“转染子”和“转染的细胞”包括原代主体细胞和由其衍生的培养物，而不考虑转移次数。还应理解，由于有意或无意的突变，并非所有后代的DNA含量都能完全相同。包括变体后代，该变体后代具有与在最初转化的细胞中筛选的相同功能或生物活性。
“原代细胞”是指直接取自活组织(即活检材料)并针对体外生长而建立的细胞，与连续致瘤性细胞系或人工永生化细胞系相比，这些细胞很少发生群体倍增，并因此更能代表衍生它们的组织的主要功能性组分和特征。
术语“体内”是指在获得细胞的生物体的体内。“离体”或“体外”意指在获得细胞的生物体的体外。
如本文所用，术语“自体的”是指衍生自同一个体的任何材料，其中该材料随后被重新引入该个体。
“同种异体的”是指衍生自相同物种的不同个体的移植物。
术语“重组”是指生物分子，例如基因或蛋白质，该生物分子(1)已从其天然存在的环境中移除，(2)与在自然界中发现该基因的多核苷酸的全部或部分不相关，(3)与在自然界中未连接的多核苷酸可操作地连接，或(4)自然界中不存在。术语“重组”可用于指克隆的DNA分离物、化学合成的多核苷酸类似物、或由异源系统生物合成的多核苷酸类似物、以及由这样的核酸编码的蛋白质和/或mRNA。
术语“表达”是指将DNA转录为RNA(例如，mRNA)、或将核酸翻译为蛋白质。蛋白质可以被表达并保留在细胞内，成为细胞表面膜的组分，或被分泌到细胞外基质或培养基中。
应当理解，本文所述的本申请的实施例包括“由实施例组成”和/或“基本上由实施例组成”。
本文对“约”值或参数的提及包括(并描述)针对该值或参数本身的变化。例如，涉及“约X”的描述包括“X”的描述。
如本文所用，对“不是”值或参数的提及通常意指并描述“不同于”值或参数。例如，方法不是用于治疗X型癌症，意味着该方法用于治疗不同于X型的癌症。
本文使用的术语“约X-Y”具有与“约X至约Y”相同的含义。
如本文和所附权利要求中所用，单数形式“一个/种(a/an)”和“该/所述(the)”包括复数指代物，除非上下文明确地指示其他的情况。
II.经修饰的治疗细胞
本申请提供了经修饰的治疗细胞(例如，同种异体免疫细胞或干细胞)，该经修饰的治疗细胞与减少的不希望的免疫应答相关，如减少的移植物排斥或宿主抗移植物病(HvGD)、增加的免疫耐受、和/或增加的治疗功效。本文所述的经修饰的治疗细胞包含编码一种或多种免疫检查点配体的一个或多个异源核酸序列，并表达一种或多种内源主要组织相容性(MHC)分子。
在一些实施例中，提供了经修饰的治疗细胞，该经修饰的治疗细胞包含编码ICL的第一异源核酸序列，其中该治疗细胞表达MHC分子。在一些实施例中，治疗细胞表达MHC I类分子。在一些实施例中，治疗细胞表达MHC II类分子。在一些实施例中，治疗细胞同时表达MHC I类分子和MHC II类分子。在一些实施例中，治疗细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因未经基因修饰。在一些实施例中，治疗细胞的MHC基因未经基因修饰。
合适的ICL分子包括但不限于PD-L1、CD155、CD112、FGL1、半乳凝素-9、CD47、B7H3和B7H4。在一些实施例中，治疗细胞包含编码ICL的第一异源核酸序列，该ICL选自由以下组成的组：PD-L1、CD155、CD112、FGL1、半乳凝素-9、CD47、B7H3和B7H4。在一些实施例中，治疗细胞包含编码单个ICL的第一异源核酸序列。在一些实施例中，治疗细胞包含编码两个或更多个ICL(如2、3、4、5、6、或更多个ICL中的任一个)的第一异源核酸序列。示例性ICL描述于下文的子部分“A.免疫检查点配体”中。
在一些实施例中，与未经修饰的治疗细胞相比，ICL的表达水平升高。例如，ICL在经修饰的治疗细胞中的表达水平比ICL在未经修饰的治疗细胞中的水平高至少约以下中的任一个：10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更高，包括这些水平之间的任何水平和范围。在一些实施例中，ICL在经修饰的治疗细胞中的表达水平比ICL在未经修饰的治疗细胞中的水平高约以下中的任一个：10％-50％、50％-100％、10％-100％、1倍至2倍、2倍至5倍、5倍至10倍、1倍至10倍、10倍至50倍、或1倍至100倍。在一些实施例中，ICL表达水平是mRNA水平。在一些实施例中，ICL表达水平是蛋白质水平。ICL表达水平可以使用本领域中任何已知的方法来测量。例如，mRNA的表达水平可以使用定量聚合酶链反应(qPCR)或荧光原位杂交(FISH)测定来确定。蛋白质的表达水平可以使用蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)或报告基因测定来确定。
在一些实施例中，提供了经修饰的治疗细胞，该经修饰的治疗细胞包含编码PD-L1的第一异源核酸序列，其中该治疗细胞表达MHC分子。在一些实施例中，治疗细胞表达MHC I类分子。在一些实施例中，治疗细胞表达MHC II类分子。在一些实施例中，治疗细胞同时表达MHC I类分子和MHC II类分子。在一些实施例中，治疗细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因未经基因修饰。在一些实施例中，治疗细胞的MHC基因未经基因修饰。在一些实施例中，ICL包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少约85％(例如，约90％、95％、98％或更高)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
在一些实施例中，提供了经修饰的γδT细胞，该经修饰的γδT细胞包含编码PD-L1的第一异源核酸序列，其中该γδT细胞表达MHC分子。在一些实施例中，γδT细胞表达MHC I类分子。在一些实施例中，γδT细胞表达MHC II类分子。在一些实施例中，γδT细胞同时表达MHC I类分子和MHC II类分子。在一些实施例中，γδT细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因未经基因修饰。在一些实施例中，γδT细胞的MHC基因未经基因修饰。在一些实施例中，ICL包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少约85％(例如，约90％、95％、98％或更高)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施例中，γδT细胞是γ9δ2T细胞。在一些实施例中，γδT细胞是δ1T细胞。在一些实施例中，γδT细胞是δ3T细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的γδT细胞，该经修饰的γδT细胞包含编码PD-L1的第一异源核酸序列、以及编码工程化受体(例如，CAR)的第二异源核酸序列，其中该γδT细胞表达MHC分子。在一些实施例中，γδT细胞表达MHC I类分子。在一些实施例中，γδT细胞表达MHC II类分子。在一些实施例中，γδT细胞同时表达MHC I类分子和MHC II类分子。在一些实施例中，γδT细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因未经基因修饰。在一些实施例中，γδT细胞的MHC基因未经基因修饰。在一些实施例中，ICL包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少约85％(例如，约90％、95％、98％或更高)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施例中，工程化受体靶向肿瘤抗原，该肿瘤抗原选自由以下组成的组：CD19、BCMA、NY-ESO-1、VEGFR2、MAGE-A3、CD20、CD22、CD33、CD38、CEA、EGFR、GD2、HER2、IGF1R、间皮素、PSMA、ROR1、WT1、及其组合。在一些实施例中，工程化受体选自由以下组成的组：CAR、TCR、TAC受体和TFP。在一些实施例中，工程化受体是CAR。在一些实施例中，CAR是抗BCMA CAR。在一些实施例中，CAR从N-末端至C-末端包含抗BCMA抗原结合部分(例如，VHH)、铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域(例如，CD28或4-1BB)和CD3ζ细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗BCMA CAR是BSF17CAR。在一些实施例中，CAR是抗CD19CAR。在一些实施例中，CAR从N-末端至C-末端包含抗CD19抗原结合部分(例如，scFv)、铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域(例如，CD28或4-1BB)和CD3ζ细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗CD19 CAR是CTL-019CAR。在一些实施例中，γδT细胞是γ9δ2T细胞。在一些实施例中，γδT细胞是δ1T细胞。在一些实施例中，γδT细胞是δ3T细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的治疗细胞，该经修饰的治疗细胞包含编码CD155的第一异源核酸序列，其中该治疗细胞表达MHC分子。在一些实施例中，治疗细胞表达MHC I类分子。在一些实施例中，治疗细胞表达MHC II类分子。在一些实施例中，治疗细胞同时表达MHC I类分子和MHC II类分子。在一些实施例中，治疗细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因未经基因修饰。在一些实施例中，治疗细胞的MHC基因未经基因修饰。在一些实施例中，ICL包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少约85％(例如，约90％、95％、98％或更高)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在一些实施例中，提供了经修饰的γδT细胞，该经修饰的γδT细胞包含编码CD155的第一异源核酸序列，其中该γδT细胞表达MHC分子。在一些实施例中，γδT细胞表达MHC I类分子。在一些实施例中，γδT细胞表达MHC II类分子。在一些实施例中，γδT细胞同时表达MHC I类分子和MHC II类分子。在一些实施例中，γδT细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因未经基因修饰。在一些实施例中，γδT细胞的MHC基因未经基因修饰。在一些实施例中，ICL包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少约85％(例如，约90％、95％、98％或更高)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些实施例中，γδT细胞是γ9δ2T细胞。在一些实施例中，γδT细胞是δ1T细胞。在一些实施例中，γδT细胞是δ3T细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的γδT细胞，该经修饰的γδT细胞包含编码CD155的第一异源核酸序列、以及编码工程化受体(例如，CAR)的第二异源核酸序列，其中该γδT细胞表达MHC分子。在一些实施例中，γδT细胞表达MHC I类分子。在一些实施例中，γδT细胞表达MHC II类分子。在一些实施例中，γδT细胞同时表达MHC I类分子和MHC II类分子。在一些实施例中，γδT细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因未经基因修饰。在一些实施例中，γδT细胞的MHC基因未经基因修饰。在一些实施例中，ICL包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少约85％(例如，约90％、95％、98％或更高)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些实施例中，工程化受体靶向肿瘤抗原，该肿瘤抗原选自由以下组成的组：CD19、BCMA、NY-ESO-1、VEGFR2、MAGE-A3、CD20、CD22、CD33、CD38、CEA、EGFR、GD2、HER2、IGF1R、间皮素、PSMA、ROR1、WT1、及其组合。在一些实施例中，工程化受体选自由以下组成的组：CAR、TCR、TAC受体和TFP。在一些实施例中，工程化受体是CAR。在一些实施例中，CAR是抗BCMA CAR。在一些实施例中，CAR是抗CD19 CAR。在一些实施例中，γδT细胞是γ9δ2T细胞。在一些实施例中，γδT细胞是δ1T细胞。在一些实施例中，γδT细胞是δ3T细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的治疗细胞，该经修饰的治疗细胞包含编码CD112的第一异源核酸序列，其中该治疗细胞表达MHC分子。在一些实施例中，治疗细胞表达MHC I类分子。在一些实施例中，治疗细胞表达MHC II类分子。在一些实施例中，治疗细胞同时表达MHC I类分子和MHC II类分子。在一些实施例中，治疗细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因未经基因修饰。在一些实施例中，治疗细胞的MHC基因未经基因修饰。在一些实施例中，ICL包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少约85％(例如，约90％、95％、98％或更高)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
在一些实施例中，提供了经修饰的γδT细胞，该经修饰的γδT细胞包含编码CD112的第一异源核酸序列，其中该γδT细胞表达MHC分子。在一些实施例中，γδT细胞表达MHC I类分子。在一些实施例中，γδT细胞表达MHC II类分子。在一些实施例中，γδT细胞同时表达MHC I类分子和MHC II类分子。在一些实施例中，γδT细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因未经基因修饰。在一些实施例中，γδT细胞的MHC基因未经基因修饰。在一些实施例中，ICL包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少约85％(例如，约90％、95％、98％或更高)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些实施例中，γδT细胞是γ9δ2T细胞。在一些实施例中，γδT细胞是δ1T细胞。在一些实施例中，γδT细胞是δ3T细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的γδT细胞，该经修饰的γδT细胞包含编码CD112的第一异源核酸序列、以及编码工程化受体(例如，CAR)的第二异源核酸序列，其中该γδT细胞表达MHC分子。在一些实施例中，γδT细胞表达MHC I类分子。在一些实施例中，γδT细胞表达MHC II类分子。在一些实施例中，γδT细胞同时表达MHC I类分子和MHC II类分子。在一些实施例中，γδT细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因未经基因修饰。在一些实施例中，γδT细胞的MHC基因未经基因修饰。在一些实施例中，ICL包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少约85％(例如，约90％、95％、98％或更高)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些实施例中，工程化受体靶向肿瘤抗原，该肿瘤抗原选自由以下组成的组：CD19、BCMA、NY-ESO-1、VEGFR2、MAGE-A3、CD20、CD22、CD33、CD38、CEA、EGFR、GD2、HER2、IGF1R、间皮素、PSMA、ROR1、WT1、及其组合。在一些实施例中，工程化受体选自由以下组成的组：CAR、TCR、TAC受体和TFP。在一些实施例中，工程化受体是CAR。在一些实施例中，CAR是抗BCMA CAR。在一些实施例中，CAR是抗CD19 CAR。在一些实施例中，γδT细胞是γ9δ2T细胞。在一些实施例中，γδT细胞是δ1T细胞。在一些实施例中，γδT细胞是δ3T细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的治疗细胞，该经修饰的治疗细胞包含编码FGL1的第一异源核酸序列，其中该治疗细胞表达MHC分子。在一些实施例中，治疗细胞表达MHC I类分子。在一些实施例中，治疗细胞表达MHC II类分子。在一些实施例中，治疗细胞同时表达MHC I类分子和MHC II类分子。在一些实施例中，治疗细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因未经基因修饰。在一些实施例中，治疗细胞的MHC基因未经基因修饰。在一些实施例中，ICL包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少约85％(例如，约90％、95％、98％或更高)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在一些实施例中，提供了经修饰的γδT细胞，该经修饰的γδT细胞包含编码FGL1的第一异源核酸序列，其中该γδT细胞表达MHC分子。在一些实施例中，γδT细胞表达MHC I类分子。在一些实施例中，γδT细胞表达MHC II类分子。在一些实施例中，γδT细胞同时表达MHC I类分子和MHC II类分子。在一些实施例中，γδT细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因未经基因修饰。在一些实施例中，γδT细胞的MHC基因未经基因修饰。在一些实施例中，ICL包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少约85％(例如，约90％、95％、98％或更高)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施例中，γδT细胞是γ9δ2T细胞。在一些实施例中，γδT细胞是δ1T细胞。在一些实施例中，γδT细胞是δ3T细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的γδT细胞，该经修饰的γδT细胞包含编码FGL1的第一异源核酸序列、以及编码工程化受体(例如，CAR)的第二异源核酸序列，其中该γδT细胞表达MHC分子。在一些实施例中，γδT细胞表达MHC I类分子。在一些实施例中，γδT细胞表达MHC II类分子。在一些实施例中，γδT细胞同时表达MHC I类分子和MHC II类分子。在一些实施例中，γδT细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因未经基因修饰。在一些实施例中，γδT细胞的MHC基因未经基因修饰。在一些实施例中，ICL包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少约85％(例如，约90％、95％、98％或更高)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施例中，工程化受体靶向肿瘤抗原，该肿瘤抗原选自由以下组成的组：CD19、BCMA、NY-ESO-1、VEGFR2、MAGE-A3、CD20、CD22、CD33、CD38、CEA、EGFR、GD2、HER2、IGF1R、间皮素、PSMA、ROR1、WT1、及其组合。在一些实施例中，工程化受体选自由以下组成的组：CAR、TCR、TAC受体和TFP。在一些实施例中，工程化受体是CAR。在一些实施例中，CAR是抗BCMA CAR。在一些实施例中，CAR是抗CD19 CAR。在一些实施例中，γδT细胞是γ9δ2T细胞。在一些实施例中，γδT细胞是δ1T细胞。在一些实施例中，γδT细胞是δ3T细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的治疗细胞，该经修饰的治疗细胞包含编码半乳凝素-9的第一异源核酸序列，其中该治疗细胞表达MHC分子。在一些实施例中，治疗细胞表达MHC I类分子。在一些实施例中，治疗细胞表达MHC II类分子。在一些实施例中，治疗细胞同时表达MHC I类分子和MHC II类分子。在一些实施例中，治疗细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因未经基因修饰。在一些实施例中，治疗细胞的MHC基因未经基因修饰。在一些实施例中，ICL包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少约85％(例如，约90％、95％、98％或更高)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
在一些实施例中，提供了经修饰的γδT细胞，该经修饰的γδT细胞包含编码半乳凝素-9的第一异源核酸序列，其中该γδT细胞表达MHC分子。在一些实施例中，γδT细胞表达MHC I类分子。在一些实施例中，γδT细胞表达MHC II类分子。在一些实施例中，γδT细胞同时表达MHC I类分子和MHC II类分子。在一些实施例中，γδT细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因未经基因修饰。在一些实施例中，γδT细胞的MHC基因未经基因修饰。在一些实施例中，ICL包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少约85％(例如，约90％、95％、98％或更高)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在一些实施例中，γδT细胞是γ9δ2T细胞。在一些实施例中，γδT细胞是δ1T细胞。在一些实施例中，γδT细胞是δ3T细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的γδT细胞，该经修饰的γδT细胞包含编码半乳凝素-9的第一异源核酸序列、以及编码工程化受体(例如，CAR)的第二异源核酸序列，其中该γδT细胞表达MHC分子。在一些实施例中，γδT细胞表达MHC I类分子。在一些实施例中，γδT细胞表达MHC II类分子。在一些实施例中，γδT细胞同时表达MHC I类分子和MHC II类分子。在一些实施例中，γδT细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因未经基因修饰。在一些实施例中，γδT细胞的MHC基因未经基因修饰。在一些实施例中，ICL包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少约85％(例如，约90％、95％、98％或更高)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在一些实施例中，工程化受体靶向肿瘤抗原，该肿瘤抗原选自由以下组成的组：CD19、BCMA、NY-ESO-1、VEGFR2、MAGE-A3、CD20、CD22、CD33、CD38、CEA、EGFR、GD2、HER2、IGF1R、间皮素、PSMA、ROR1、WT1、及其组合。在一些实施例中，工程化受体选自由以下组成的组：CAR、TCR、TAC受体和TFP。在一些实施例中，工程化受体是CAR。在一些实施例中，CAR是抗BCMA CAR。在一些实施例中，CAR是抗CD19 CAR。在一些实施例中，γδT细胞是γ9δ2T细胞。在一些实施例中，γδT细胞是δ1T细胞。在一些实施例中，γδT细胞是δ3T细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的治疗细胞，该经修饰的治疗细胞包含编码CD47的第一异源核酸序列，其中该治疗细胞表达MHC分子。在一些实施例中，治疗细胞表达MHC I类分子。在一些实施例中，治疗细胞表达MHC II类分子。在一些实施例中，治疗细胞同时表达MHC I类分子和MHC II类分子。在一些实施例中，治疗细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因未经基因修饰。在一些实施例中，治疗细胞的MHC基因未经基因修饰。在一些实施例中，ICL包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少约85％(例如，约90％、95％、98％或更高)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
在一些实施例中，提供了经修饰的γδT细胞，该经修饰的γδT细胞包含编码CD47的第一异源核酸序列，其中该γδT细胞表达MHC分子。在一些实施例中，γδT细胞表达MHC I类分子。在一些实施例中，γδT细胞表达MHC II类分子。在一些实施例中，γδT细胞同时表达MHC I类分子和MHC II类分子。在一些实施例中，γδT细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因未经基因修饰。在一些实施例中，γδT细胞的MHC基因未经基因修饰。在一些实施例中，ICL包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少约85％(例如，约90％、95％、98％或更高)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施例中，γδT细胞是γ9δ2T细胞。在一些实施例中，γδT细胞是δ1T细胞。在一些实施例中，γδT细胞是δ3T细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的γδT细胞，该经修饰的γδT细胞包含编码CD47的第一异源核酸序列、以及编码工程化受体(例如，CAR)的第二异源核酸序列，其中该γδT细胞表达MHC分子。在一些实施例中，γδT细胞表达MHC I类分子。在一些实施例中，γδT细胞表达MHC II类分子。在一些实施例中，γδT细胞同时表达MHC I类分子和MHC II类分子。在一些实施例中，γδT细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因未经基因修饰。在一些实施例中，γδT细胞的MHC基因未经基因修饰。在一些实施例中，ICL包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少约85％(例如，约90％、95％、98％或更高)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施例中，工程化受体靶向肿瘤抗原，该肿瘤抗原选自由以下组成的组：CD19、BCMA、NY-ESO-1、VEGFR2、MAGE-A3、CD20、CD22、CD33、CD38、CEA、EGFR、GD2、HER2、IGF1R、间皮素、PSMA、ROR1、WT1、及其组合。在一些实施例中，工程化受体选自由以下组成的组：CAR、TCR、TAC受体和TFP。在一些实施例中，工程化受体是CAR。在一些实施例中，CAR是抗BCMA CAR。在一些实施例中，CAR是抗CD19 CAR。在一些实施例中，γδT细胞是γ9δ2T细胞。在一些实施例中，γδT细胞是δ1T细胞。在一些实施例中，γδT细胞是δ3T细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的治疗细胞，该经修饰的治疗细胞包含编码B7H3的第一异源核酸序列，其中该治疗细胞表达MHC分子。在一些实施例中，治疗细胞表达MHC I类分子。在一些实施例中，治疗细胞表达MHC II类分子。在一些实施例中，治疗细胞同时表达MHC I类分子和MHC II类分子。在一些实施例中，治疗细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因未经基因修饰。在一些实施例中，治疗细胞的MHC基因未经基因修饰。在一些实施例中，ICL包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少约85％(例如，约90％、95％、98％或更高)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
在一些实施例中，提供了经修饰的γδT细胞，该经修饰的γδT细胞包含编码B7H3的第一异源核酸序列，其中该γδT细胞表达MHC分子。在一些实施例中，γδT细胞表达MHC I类分子。在一些实施例中，γδT细胞表达MHC II类分子。在一些实施例中，γδT细胞同时表达MHC I类分子和MHC II类分子。在一些实施例中，γδT细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因未经基因修饰。在一些实施例中，γδT细胞的MHC基因未经基因修饰。在一些实施例中，ICL包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少约85％(例如，约90％、95％、98％或更高)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一些实施例中，γδT细胞是γ9δ2T细胞。在一些实施例中，γδT细胞是δ1T细胞。在一些实施例中，γδT细胞是δ3T细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的γδT细胞，该经修饰的γδT细胞包含编码B7H3的第一异源核酸序列、以及编码工程化受体(例如，CAR)的第二异源核酸序列，其中该γδT细胞表达MHC分子。在一些实施例中，γδT细胞表达MHC I类分子。在一些实施例中，γδT细胞表达MHC II类分子。在一些实施例中，γδT细胞同时表达MHC I类分子和MHC II类分子。在一些实施例中，γδT细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因未经基因修饰。在一些实施例中，γδT细胞的MHC基因未经基因修饰。在一些实施例中，ICL包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少约85％(例如，约90％、95％、98％或更高)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一些实施例中，工程化受体靶向肿瘤抗原，该肿瘤抗原选自由以下组成的组：CD19、BCMA、NY-ESO-1、VEGFR2、MAGE-A3、CD20、CD22、CD33、CD38、CEA、EGFR、GD2、HER2、IGF1R、间皮素、PSMA、ROR1、WT1、及其组合。在一些实施例中，工程化受体选自由以下组成的组：CAR、TCR、TAC受体和TFP。在一些实施例中，工程化受体是CAR。在一些实施例中，CAR是抗BCMA CAR。在一些实施例中，CAR是抗CD19 CAR。在一些实施例中，γδT细胞是γ9δ2T细胞。在一些实施例中，γδT细胞是δ1T细胞。在一些实施例中，γδT细胞是δ3T细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的治疗细胞，该经修饰的治疗细胞包含编码B7H4的第一异源核酸序列，其中该治疗细胞表达MHC分子。在一些实施例中，治疗细胞表达MHC I类分子。在一些实施例中，治疗细胞表达MHC II类分子。在一些实施例中，治疗细胞同时表达MHC I类分子和MHC II类分子。在一些实施例中，治疗细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因未经基因修饰。在一些实施例中，治疗细胞的MHC基因未经基因修饰。在一些实施例中，ICL包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少约85％(例如，约90％、95％、98％或更高)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在一些实施例中，提供了经修饰的γδT细胞，该经修饰的γδT细胞包含编码B7H4的第一异源核酸序列，其中该γδT细胞表达MHC分子。在一些实施例中，γδT细胞表达MHC I类分子。在一些实施例中，γδT细胞表达MHC II类分子。在一些实施例中，γδT细胞同时表达MHC I类分子和MHC II类分子。在一些实施例中，γδT细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因未经基因修饰。在一些实施例中，γδT细胞的MHC基因未经基因修饰。在一些实施例中，ICL包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少约85％(例如，约90％、95％、98％或更高)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施例中，γδT细胞是γ9δ2T细胞。在一些实施例中，γδT细胞是δ1T细胞。在一些实施例中，γδT细胞是δ3T细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的γδT细胞，该经修饰的γδT细胞包含编码B7H4的第一异源核酸序列、以及编码工程化受体(例如，CAR)的第二异源核酸序列，其中该γδT细胞表达MHC分子。在一些实施例中，γδT细胞表达MHC I类分子。在一些实施例中，γδT细胞表达MHC II类分子。在一些实施例中，γδT细胞同时表达MHC I类分子和MHC II类分子。在一些实施例中，γδT细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因未经基因修饰。在一些实施例中，γδT细胞的MHC基因未经基因修饰。在一些实施例中，ICL包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少约85％(例如，约90％、95％、98％或更高)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施例中，工程化受体靶向肿瘤抗原，该肿瘤抗原选自由以下组成的组：CD19、BCMA、NY-ESO-1、VEGFR2、MAGE-A3、CD20、CD22、CD33、CD38、CEA、EGFR、GD2、HER2、IGF1R、间皮素、PSMA、ROR1、WT1、及其组合。在一些实施例中，工程化受体选自由以下组成的组：CAR、TCR、TAC受体和TFP。在一些实施例中，工程化受体是CAR。在一些实施例中，CAR是抗BCMA CAR。在一些实施例中，CAR是抗CD19 CAR。在一些实施例中，γδT细胞是γ9δ2T细胞。在一些实施例中，γδT细胞是δ1T细胞。在一些实施例中，γδT细胞是δ3T细胞。
经修饰的治疗细胞可衍生自多种细胞类型和细胞来源。本文考虑了来自任何哺乳动物物种的细胞，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴和人。在一些实施例中，治疗细胞是人细胞。
可以将经修饰的治疗细胞用作过继细胞疗法来治疗个体的疾病或病症，如癌症、自身免疫性疾病或感染性疾病。示例性过继细胞疗法包括但不限于肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、T细胞受体(TCR)修饰的T细胞(TCR-T)、嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、和造血干细胞(HSC)、以及树突状细胞(DC)或髓细胞疗法。在一些实施例中，经修饰的治疗细胞是αβT细胞。在一些实施例中，经修饰的治疗细胞是γδT细胞。在一些实施例中，经修饰的治疗细胞是γ9δ2T细胞。在一些实施例中，经修饰的治疗细胞是δ1T细胞。在一些实施例中，经修饰的治疗细胞是δ3T细胞。
在一些实施例中，治疗细胞是自体的，即，细胞衍生自接受治疗细胞的个体。在一些实施例中，治疗细胞是同基因的(即，供体和接受者是不同的个体，但是为同卵双胞胎、三胞胎或四胞胎等)。在一些实施例中，治疗细胞是同种异体的，即，细胞获自或衍生自属于相同物种、但不同于接受治疗细胞的个体的供体。在一些实施例中，同种异体治疗细胞是现成的治疗细胞，其是预先制造的、表征的，并且可用于向患者立即施用。在一些实施例中，同种异体治疗细胞是“通用”治疗细胞，其衍生自从一个或多个供体或细胞系获得的细胞，并且用于针对相同物种的其他个体的过继细胞疗法。
在一些实施例中，治疗细胞具有降低治疗细胞的免疫原性或同种异体反应性的基因修饰。在一些实施例中，治疗细胞未经基因修饰以降低治疗细胞的免疫原性或同种异体反应性。在一些实施例中，治疗细胞不具有影响其MHC复合体的基因修饰，包括例如B2M突变(例如，B2M基因的敲除)或MHC等位基因突变。在一些实施例中，治疗细胞不会引起NK细胞的增殖或细胞毒性。在一些实施例中，与具有MHC或B2M突变(例如，敲除)的治疗细胞相比，本文所述的经修饰的治疗细胞减少了由宿主NK细胞进行的识别，例如，将由NK细胞进行的增殖或杀伤减少至少约以下中的任一个：10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。
在一些实施例中，治疗细胞衍生自原代细胞。在一些实施例中，治疗细胞是分离自个体的原代细胞。在一些实施例中，治疗细胞从分离自个体的原代细胞繁殖(如，增殖和/或分化)而来。在一些实施例中，治疗细胞是造血谱系的细胞。在一些实施例中，原代细胞获自胸腺。在一些实施例中，原代细胞获自淋巴或淋巴结(如肿瘤引流淋巴结)。在一些实施例中，原代细胞获自脾。在一些实施例中，原代细胞获自骨髓。在一些实施例中，原代细胞获自血液，如外周血。在一些实施例中，原代细胞是外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施例中，原代细胞衍生自血浆。在一些实施例中，原代细胞衍生自肿瘤。在一些实施例中，原代细胞获自粘膜免疫系统。在一些实施例中，原代细胞获自活检样品。在一些实施例中，原代细胞获自脐带血。
在一些实施例中，治疗细胞衍生自细胞系。在一些实施例中，治疗细胞获自商业细胞系。在一些实施例中，治疗细胞从分离自个体的原代细胞建立的细胞系繁殖(如增殖和/或分化)而来。在一些实施例中，细胞系是非永生(mortal)细胞系。在一些实施例中，细胞系是永生化细胞系。在一些实施例中，细胞系是肿瘤细胞系，如白血病或淋巴瘤细胞系。在一些实施例中，细胞系是衍生自PBMC的细胞系。在一些实施例中，细胞系是干细胞系。在一些实施例中，细胞系是NK-92。
在一些实施例中，治疗细胞是免疫细胞或其祖细胞。可用于本发明的示例性免疫细胞包括但不限于树突状细胞(包括未成熟树突状细胞和成熟树突状细胞)、T淋巴细胞(如初始T细胞、效应T细胞、记忆T细胞、细胞毒性T淋巴细胞、辅助性T细胞、自然杀伤T细胞、Treg细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)和淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞)、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、γδT细胞(包括例如，γ9δ2T细胞、δ1T细胞、δ3T细胞)、αβT细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、粒细胞、及其组合。免疫细胞亚群可以通过本领域已知的一种或多种细胞表面标志物(例如，CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD11c、CD123、CD56、CD34、CD14、CD33等)的存在或不存在来定义。在药物组合物包含多个经修饰的治疗细胞的情况下，这些治疗细胞可以是免疫细胞类型的特定亚群、免疫细胞类型的亚群的组合、或者两种或更多种免疫细胞类型的组合。在一些实施例中，免疫细胞存在于同质细胞群中。在一些实施例中，免疫细胞存在于可在免疫细胞中增强的异质细胞群中。在一些实施例中，治疗细胞是淋巴细胞。在一些实施例中，治疗细胞不是淋巴细胞。在一些实施例中，治疗细胞适用于过继细胞疗法。在一些实施例中，治疗细胞是PBMC。在一些实施例中，治疗细胞是衍生自PBMC的免疫细胞。在一些实施例中，治疗细胞是T细胞。在一些实施例中，治疗细胞是CD4+T细胞(也称为辅助性T细胞)。在一些实施例中，治疗细胞是CD8+T细胞(也称为细胞毒性T细胞)。在一些实施例中，治疗细胞是表达TCRα和TCRβ链的T细胞(即αβT细胞)。在一些实施例中，治疗细胞是表达TCRγ和TCRδ链的T细胞(即γδT细胞)。在一些实施例中，治疗细胞是B细胞。在一些实施例中，治疗细胞是NK细胞。在一些实施例中，治疗细胞是NK-T细胞。在一些实施例中，治疗细胞是树突状细胞(DC)。在一些实施例中，治疗细胞是DC激活的T细胞。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是γ9δ2T细胞。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是δ1T细胞。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是δ3T细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞，该经修饰的免疫细胞包含编码ICL的第一异源核酸序列，该ICL选自由以下组成的组：PD-L1、CD155、CD112、FGL1、半乳凝素-9、CD47、B7H3和B7H4，其中该免疫细胞表达MHC分子。在一些实施例中，免疫细胞表达MHC I类分子。在一些实施例中，免疫细胞表达MHC II类分子。在一些实施例中，免疫细胞同时表达MHC I类分子和MHC II类分子。在一些实施例中，免疫细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因未经基因修饰。在一些实施例中，免疫细胞的MHC基因未经基因修饰。在一些实施例中，免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、NK细胞、NK-T细胞、αβT细胞、γδT细胞、肿瘤浸润性T细胞、树突状细胞(DC)激活的T细胞、和外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施例中，经修饰的治疗细胞是T细胞。在一些实施例中，经修饰的治疗细胞是γδT细胞。
在一些实施例中，经修饰的治疗细胞是干细胞或衍生自干细胞。在一些实施例中，干细胞是全能干细胞。在一些实施例中，干细胞是多能干细胞。在一些实施例中，干细胞是单能干细胞。在一些实施例中，干细胞是祖细胞。在一些实施例中，干细胞是胚胎干细胞(ESC)。在一些实施例中，干细胞是造血干细胞(HSC)。在一些实施例中，干细胞是间充质干细胞。在一些实施例中，干细胞是诱导性多能干细胞(iPSC)。
在一些实施例中，提供了经修饰的干细胞，该经修饰的干细胞包含编码ICL的第一异源核酸序列，该ICL选自由以下组成的组：PD-L1、CD155、CD112、FGL1、半乳凝素-9、CD47、B7H3和B7H4，其中该干细胞表达MHC分子。在一些实施例中，干细胞表达MHC I类分子。在一些实施例中，干细胞表达MHC II类分子。在一些实施例中，干细胞同时表达MHC I类分子和MHC II类分子。在一些实施例中，干细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因未经基因修饰。在一些实施例中，干细胞的MHC基因未经基因修饰。在一些实施例中，经修饰的干细胞是HSC。在一些实施例中，经修饰的干细胞是ESC。
在一些实施例中，经修饰的治疗细胞包含一个或多个异源核酸序列。经修饰的免疫细胞可包含任何数量(例如，1、2、3、4、5、10、50、100、1000个或更多个)的异源核酸序列。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含单拷贝的异源核酸序列。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含多拷贝的一个或多个异源核酸序列。
在一些实施例中，经修饰的治疗细胞(例如，免疫细胞或干细胞)进一步包含编码工程化受体的第二异源核酸序列。在一些实施例中，经修饰的治疗细胞表达两种或更多种工程化受体。在一些实施例中，经修饰的治疗细胞表达一种或多种工程化受体，该一种或多种工程化受体选自由以下组成的组：嵌合抗原受体(CAR)、重组T细胞受体(TCR)、T细胞抗原偶联剂(TAC)受体和TCR融合蛋白(TFP)。在一些实施例中，治疗细胞是CAR-T细胞。在一些实施例中，治疗细胞是同种异体CAR-T细胞。在一些实施例中，治疗细胞是UCAR-T细胞。在一些实施例中，治疗细胞是TCR-T细胞。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞表达CAR和TFP。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞表达CAR和重组TCR。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞表达CAR和TAC受体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞表达重组TCR和TAC受体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞进一步包含至少一个另外的异源核酸序列，例如，编码免疫调节剂如共刺激分子、细胞因子、和/或趋化因子的第三异源核酸序列。在一些实施例中，治疗细胞不具有除第一异源核酸序列和第二异源核酸序列之外的其他基因修饰。
在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞，该经修饰的免疫细胞包含编码ICL的第一异源核酸序列和编码工程化受体的第二异源核酸序列，该ICL选自由以下组成的组：PD-L1、CD155、CD112、FGL1、半乳凝素-9、CD47、B7H3和B7H4，其中该免疫细胞表达MHC分子。在一些实施例中，免疫细胞表达MHC I类分子。在一些实施例中，免疫细胞表达MHC II类分子。在一些实施例中，免疫细胞同时表达MHC I类分子和MHC II类分子。在一些实施例中，免疫细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因未经基因修饰。在一些实施例中，免疫细胞的MHC基因未经基因修饰。在一些实施例中，工程化受体选自由以下组成的组：嵌合抗原受体(CAR)、重组T细胞受体(TCR)、T细胞抗原偶联剂(TAC)受体和TCR融合蛋白(TFP)。在一些实施例中，工程化受体靶向肿瘤抗原，该肿瘤抗原选自由以下组成的组：CD19、BCMA、NY-ESO-1、VEGFR2、MAGE-A3、CD20、CD22、CD33、CD38、CEA、EGFR、GD2、HER2、IGF1R、间皮素、PSMA、ROR1、WT1、及其组合。
在一些实施例中，提供了经修饰的CAR-T细胞，该经修饰的CAR-T细胞包含编码ICL的第一异源核酸序列和编码CAR的第二异源核酸序列，该ICL选自由以下组成的组：PD-L1、CD155、CD112、FGL1、半乳凝素-9、CD47、B7H3和B7H4，其中该CAR-T细胞表达MHC分子。在一些实施例中，CAR-T细胞表达MHC I类分子。在一些实施例中，CAR-T细胞表达MHC II类分子。在一些实施例中，CAR-T细胞同时表达MHC I类分子和MHC II类分子。在一些实施例中，CAR-T细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因未经基因修饰。在一些实施例中，CAR-T细胞的MHC基因未经基因修饰。在一些实施例中，CAR靶向肿瘤抗原，该肿瘤抗原选自由以下组成的组：CD19、BCMA、NY-ESO-1、VEGFR2、MAGE-A3、CD20、CD22、CD33、CD38、CEA、EGFR、GD2、HER2、IGF1R、间皮素、PSMA、ROR1、WT1、及其组合。在一些实施例中，CAR是抗BCMA CAR。在一些实施例中，CAR是抗CD19 CAR。
在一些实施例中，提供了经修饰的γδT细胞，该经修饰的γδT细胞包含编码ICL的第一异源核酸序列，该ICL选自由以下组成的组：PD-L1、CD155、CD112、FGL1、半乳凝素-9、CD47、B7H3和B7H4，其中该γδT细胞表达MHC分子。在一些实施例中，γδT细胞表达MHC I类分子。在一些实施例中，γδT细胞表达MHC II类分子。在一些实施例中，γδT细胞同时表达MHC I类分子和MHC II类分子。在一些实施例中，γδT细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因未经基因修饰。在一些实施例中，γδT细胞的MHC基因未经基因修饰。在一些实施例中，γδT细胞是γ9δ2T细胞。在一些实施例中，γδT细胞是δ1T细胞。在一些实施例中，γδT细胞是δ3T细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的γδT细胞，该经修饰的γδT细胞包含编码ICL的第一异源核酸序列和编码工程化受体(例如，CAR)的第二异源核酸序列，该ICL选自由以下组成的组：PD-L1、CD155、CD112、FGL1、半乳凝素-9、CD47、B7H3和B7H4，其中该γδT细胞表达MHC分子。在一些实施例中，γδT细胞表达MHC I类分子。在一些实施例中，γδT细胞表达MHCII类分子。在一些实施例中，γδT细胞同时表达MHC I类分子和MHC II类分子。在一些实施例中，γδT细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因未经基因修饰。在一些实施例中，γδT细胞的MHC基因未经基因修饰。在一些实施例中，工程化受体靶向肿瘤抗原，该肿瘤抗原选自由以下组成的组：CD19、BCMA、NY-ESO-1、VEGFR2、MAGE-A3、CD20、CD22、CD33、CD38、CEA、EGFR、GD2、HER2、IGF1R、间皮素、PSMA、ROR1、WT1、及其组合。在一些实施例中，工程化受体选自由以下组成的组：嵌合抗原受体(CAR)、重组T细胞受体(TCR)、T细胞抗原偶联剂(TAC)受体和TCR融合蛋白(TFP)。在一些实施例中，工程化受体是CAR。在一些实施例中，CAR是抗BCMA CAR。在一些实施例中，CAR是抗CD19 CAR。在一些实施例中，γδT细胞是γ9δ2T细胞。
在一些实施例中，γδT细胞是δ1T细胞。在一些实施例中，γδT细胞是δ3T细胞。
在一些实施例中，经修饰的治疗细胞不具有降低个体中治疗细胞的免疫原性的任何基因修饰(例如，基因组修饰)。在一些实施例中，经修饰的治疗细胞具有降低个体中治疗细胞的免疫原性的一个或多个基因修饰(例如，基因组修饰)。在一些实施例中，基因修饰包括在基因方面破坏同种异体T细胞的TCR基因和/或HLA I类基因座。在一些实施例中，基因修饰包括敲除内源TCR基因，例如，TCRA(即，TCRα)、TCRB/(即，TCRβ)、TCRG(即，TCRγ)、和/或TCRD(即，TCRδ)基因。在一些实施例中，基因修饰包含敲除β2-微球蛋白(B2M)。在一些实施例中，基因修饰包含敲除免疫检查点分子，如PD-1或CTLA-4(也称为CD52)。
在一些实施例中，经修饰的治疗细胞是T细胞，如同种异体T细胞。在一些实施例中，治疗细胞是TCRαβ+T细胞。在一些实施例中，治疗细胞是TCRγδ+T细胞。在一些实施例中，治疗细胞是CAR-T细胞。在一些实施例中，治疗细胞表达抗BCMA CAR。在一些实施例中，治疗细胞是表达BSF17 CAR的CAR-T细胞。在一些实施例中，治疗细胞表达抗CD19 CAR。在一些实施例中，治疗细胞是表达CTL-019CAR的CAR-T细胞。在一些实施例中，治疗细胞是TCR-T细胞。在一些实施例中，治疗细胞是表达TAC受体的T细胞。在一些实施例中，治疗细胞是表达TFP的T细胞。在一些实施例中，治疗细胞是表达工程化受体的组合的T细胞，这些工程化受体选自由以下组成的组：CAR、TCR、TAC受体和TFP。在一些实施例中，治疗T细胞包含内源TCR。在一些实施例中，治疗T细胞不具有降低其免疫原性的基因修饰。在一些实施例中，治疗T细胞的内源TCR基因、HLA基因(例如，B2M)、和免疫检查点分子(例如，PD-1、CTLA-4等)未经基因修饰。在一些实施例中，治疗T细胞不具有除了ICL和工程化受体构建体之外的其他基因修饰。在一些实施例中，治疗细胞是表达BSF17 CAR和PD-L1的CAR-T细胞。在一些实施例中，治疗细胞是表达CTL-019CAR和PD-L1的CAR-T细胞。
在一些实施例中，治疗细胞是HSC，如同种异体HSC。在一些实施例中，治疗细胞是HSC，该HSC不具有除ICL之外的其他基因修饰。在一些实施例中，治疗细胞是表达一种或多种治疗剂的HSC。在一些实施例中，治疗细胞是表达一种或多种工程化受体的HSC，该一种或多种工程化受体选自由以下组成的组：CAR、TCR、TAC受体和TFP。在一些实施例中，治疗细胞是HSC，该HSC表达除工程化受体之外的一种或多种治疗剂。在一些实施例中，治疗细胞是病毒载体转导的HSC，如逆转录病毒或慢病毒转导的HSC。
在一些实施例中，治疗细胞是NK细胞。在一些实施例中，治疗细胞是表达一种或多种工程化受体的NK细胞，该一种或多种工程化受体选自由以下组成的组：CAR、TCR、TAC受体和TFP。
在一些实施例中，治疗细胞是NK-T细胞。在一些实施例中，治疗细胞是表达一种或多种工程化受体的NK-T细胞，该一种或多种工程化受体选自由以下组成的组：CAR、TCR、TAC受体和TFP。
在一些实施例中，与不表达ICL的治疗细胞相比，治疗细胞(例如CAR-T细胞)表达ICL(例如PD-L1)不会降低治疗细胞的细胞毒性，例如，降低50％、40％、30％、20％、10％或更少中的任一个。在一些实施例中，与不表达ICL的治疗细胞相比，治疗细胞(例如CAR-T细胞)表达ICL(例如PD-L1)不会降低治疗细胞的长期持久性，例如，降低50％、40％、30％、20％、10％或更少中的任一个。在一些实施例中，与不表达ICL的治疗细胞相比，治疗细胞(例如CAR-T细胞)表达ICL(例如PD-L1)不会改变(例如，提高或降低)治疗细胞的细胞因子产生特性，例如，改变50％、40％、30％、20％、10％或更少中的任一个。在一些实施例中，与不表达ICL的治疗细胞相比，治疗细胞(例如CAR-T细胞)表达ICL(例如PD-L1)不会改变(例如，提高或降低)治疗细胞的抗肿瘤功效，例如，改变50％、40％、30％、20％、10％或更少中的任一个。在一些实施例中，与不表达ICL的治疗细胞相比，治疗细胞(例如CAR-T细胞)表达ICL(例如PD-L1)不会改变(例如，增加或减少)治疗细胞的增殖，例如，改变50％、40％、30％、20％、10％或更少中的任一个。在一些实施例中，本段中所述的ICL表达的任一种作用都是在体外评估的。在一些实施例中，本段中所述的ICL表达的任一种作用都是在体内评估的。
在一些实施例中，与不表达ICL的治疗细胞相比，治疗细胞(例如CAR-T细胞)表达ICL(例如PD-L1)减少接受该治疗细胞的受试者的同种异体免疫细胞(例如，αβT细胞和/或NK细胞)的增殖，例如，减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高中的任一个。在一些实施例中，与不表达ICL的治疗细胞相比，治疗细胞(例如CAR-T细胞)表达ICL(例如PD-L1)减少接受该治疗细胞的受试者的同种异体αβT细胞的增殖，例如，减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高中的任一个。在一些实施例中，与不表达ICL的治疗细胞相比，治疗细胞(例如CAR-T细胞)表达ICL(例如PD-L1)减少接受该治疗细胞的受试者的同种异体ΝK细胞的增殖，例如，减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高中的任一个。
可以将包含本文所述的一个或多个异源核酸序列的一种或多种核酸瞬时或稳定掺入经修饰的治疗细胞中。在一些实施例中，一种或多种核酸在经修饰的治疗细胞中瞬时表达。例如，一种或多种核酸能以染色体外阵列存在于经修饰的治疗细胞的细胞核中。可以使用本领域已知的任何转染或转导方法(包括病毒或非病毒方法)，将一种或多种核酸引入经修饰的治疗细胞中。示例性非病毒转染方法包括但不限于基于化学的转染，如使用磷酸钙、树状聚合物、脂质体或阳离子聚合物(例如，DEAE-葡聚糖或聚乙烯亚胺)；非化学方法，如电穿孔、细胞挤压、声孔效应、光学转染、刺穿染、原生质体融合、水动力递送或转座子；基于粒子的方法，如使用基因枪、磁转染或磁辅助转染、粒子轰击；和混合方法，如核转染。
在一些实施例中，一个或多个异源核酸序列存在于经修饰的治疗细胞的基因组中。例如，可以通过本领域已知的任何方法将包含一个或多个异源核酸序列的一种或多种核酸整合到经修饰的治疗细胞的基因组中，这些方法包括但不限于病毒介导的整合、随机整合、同源重组方法、和定点整合方法，如使用位点特异性重组酶或整合酶、转座酶、转录激活因子样效应物核酸酶
Figure BDA0003864713290000321
CRISPR/Cas9、和锌指核酸酶。在一些实施例中，将一个或多个异源核酸序列整合到经修饰的治疗细胞的基因组的专门设计的基因座中。在一些实施例中，将一个或多个异源核酸序列整合到经修饰的治疗细胞的基因组的整合热点中。在一些实施例中，将一个或多个异源核酸序列整合到经修饰的治疗细胞的基因组的随机基因座中。在多拷贝的一个或多个异源核酸序列存在于单个经修饰的治疗细胞中的情况下，可以将异源核酸序列整合到经修饰的治疗细胞的基因组的多个基因座中。
可以使用本领域已知的多种方法制备前体免疫细胞。例如，原代免疫细胞(例如，T细胞)可获自多种来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在一些实施例中，可以使用本领域已知的多种技术(例如，FICOLLTM分离)从收集自个体的血液单位获得免疫细胞(例如，T细胞)。在一些实施例中，来自个体循环血的细胞是通过单采(apheresis)获得的。单采产物典型地含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一些实施例中，可以洗涤通过单采收集的细胞以去除血浆部分，并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中用于后续处理步骤。在一些实施例中，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)或缺乏二价阳离子(例如，钙和镁)的洗涤溶液洗涤。如本领域普通技术人员将容易理解的，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法完成，例如根据制造商的说明通过使用半自动化“流通式(flow-through)”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate或HaemoneticsCell Saver 5)。洗涤后，可将细胞重悬于各种生物相容性缓冲液中，例如像无Ca2+、无Mg2+的PBS、勃脉力A(PlasmaLyte A)或者含或不含缓冲液的其他盐水溶液。可替代地，可以去除单采样品的不希望的组分，并将细胞直接重悬于培养基中。
在一些实施例中，例如通过PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘析来裂解红细胞并消耗单核细胞以从外周血淋巴细胞分离原代T细胞。可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离T细胞的特定亚群，例如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA和CD45RO细胞。例如，在一个实施例中，通过与抗CD3/抗CD28(即，3×28)缀合的珠如
Figure BDA0003864713290000331
M-450 CD3/CD28T一起孵育足以阳性选择所希望的T细胞的时间段来分离T细胞。
在一些实施例中，可以使用针对阴性选择的细胞特有的表面标志物的抗体的组合通过阴性选择进一步富集T细胞群。例如，一种方法涉及经由阴性磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，该方法使用针对阴性选择的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物典型地包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些实施例中，可能希望富集或阳性选择典型地表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+的调节T细胞。
将载体或核酸引入治疗细胞(如前体免疫细胞)的方法是本领域已知的。可以通过物理、化学或生物方法将载体或核酸转移到治疗细胞中。
用于将一个或多个载体或一个或多个核酸引入治疗细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域熟知的。参见例如，Sambrook等人(2001)Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York。在一些实施例中，通过电穿孔将载体引入细胞中。
用于将一个或多个载体或一个或多个核酸引入治疗细胞中的生物方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体已成为用于将基因插入哺乳动物(例如人)细胞的最广泛使用的方法。
用于将一个或多个载体或一个或多个核酸引入治疗细胞中的化学方法包括胶体分散系统，如大分子复合体、纳米胶囊、微球、珠，和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。
在一些实施例中，将转导的或转染的前体免疫细胞在引入一个或多个异源核酸后离体繁殖。在一些实施例中，将转导的或转染的前体免疫细胞培养以繁殖至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天或14天中的任一个。在一些实施例中，将转导的或转染的前体免疫细胞培养不超过约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天或14天中的任一个。在一些实施例中，进一步评价或筛选转导的或转染的前体免疫细胞以选择经修饰的免疫细胞。
报告基因可用于鉴定可能转染的细胞和评价调节序列的功能性。通常，报告基因是在接受者生物体或组织中不存在或不表达的基因，并且该报告基因编码多肽，该多肽的表达通过一些易于检测的特性(例如，酶活性)来表现。报告基因的表达在DNA被引入接受者细胞后的合适的时间测定。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌性碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人FEBS Letters479:79-82(2000))。
证实前体免疫细胞中存在一个或多个异源核酸的其他方法包括例如本领域技术人员熟知的分子生物学测定，如DNA印迹法和RNA印迹法、RT-PCR和PCR；生物化学测定，如例如通过免疫学方法(如ELISA和蛋白质印迹)来检测特定肽的存在或不存在。
A.免疫检查点配体
本文所述的经修饰的治疗细胞过表达一种或多种免疫检查点配体(ICL)，包括但不限于PD-L1、CD155、CD112、FGL1、半乳凝素-9、CD47、B7H3和B7H4。
肿瘤细胞通过多种机制逃避免疫系统的检测和消除。免疫检查点通路用于维持自身耐受和控制T细胞激活，但癌细胞可以使用这些通路来抑制抗肿瘤应答并防止它们的破坏。不受任何理论或假设的束缚，移植物排斥是由患者T细胞和NK细胞介导的。适应性免疫的核心是T细胞上的αβT细胞抗原受体(TCR)与靶细胞上主要组织相容性复合体(MHC)分子(包括MHC I类和II类分子)呈递的肽之间的相互作用。NK细胞可以识别不表达MHC分子的靶细胞。当向MHC错配的患者施用同种异体细胞时，可能会导致移植物排斥。患者自身的T细胞和NK细胞可能会排斥输注的治疗细胞，从而导致治疗功效减弱。参见例如，Dao M等人,Cancer Res(2018)78:3588；Patel S等人Front Oncol.(2019)；9:196。激活的免疫细胞表达免疫检查点蛋白(ICP)，如PD-1、TIM-3、LAG-3、TIGIT和血小板应答蛋白-1。当ICP配体在免疫细胞上过表达时，ICP配体可以与免疫细胞上的ICP结合，并引起免疫细胞功能失调。
PD-L1
在一些实施例中，ICL是程序性细胞死亡配体1(PD-L1)。在一些实施例中，ICL是人PD-L1。PD-L1分子的序列是本领域已知的。参见例如，GenBank ID AAI13735.1和UniProtKBID Q9NZQ7。PD-L1也称为CD274、B7-H1和PDCD1配体1(PDCD1L1或PDCD1LG1)。在一些实施例中，人PD-L1具有下文显示的SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL包含与SEQID NO:1具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL是天然存在的PD-L1的功能性片段。在一些实施例中，ICL是全长天然存在的PD-L1。在一些实施例中，ICL包含信号肽。在一些实施例中，ICL不包含信号肽。在一些实施例中，ICL包含天然存在的PD-L1的细胞外结构域。在一些实施例中，ICL包含天然存在的PD-L1的细胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。在一些实施例中，ICL包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸19-290的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:1的氨基酸19-290具有至少约85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。
SEQ ID NO:1(全长人PD-L1氨基酸序列；信号肽加粗)
Figure BDA0003864713290000351
PD-L1/人程序性细胞死亡受体1(PD-1)通路是调节自身耐受和T细胞激活的免疫检查点。人PD-1存在于T细胞、NK细胞和其他免疫细胞上。PD-L1与PD-1的结合抑制T细胞和NK细胞增殖和细胞因子产生。PD-1/PD-L1抑制轴已被肿瘤压制，作为在抗肿瘤免疫应答背景下塑造肿瘤进化的自然选择过程的一部分。PD-L1还与B7-1(CD80)结合。B7-1是T细胞和NK细胞激活的另一负调节因子。因此，PD-L1在多种肿瘤类型中异常表达，并且肿瘤细胞上PD-L1表达的增加与多种癌症类型的较差预后相关。免疫激活和促炎细胞因子的产生导致PD-L1表达在免疫细胞和其他细胞类型的肿瘤微环境中也上调，这进一步有助于建立免疫抑制环境。
CD155
在一些实施例中，ICL是CD155。在一些实施例中，ICL是人CD155。CD155分子的序列是本领域已知的。参见例如，GenBank ID NP_006496.4和UniProtKB ID P15151。CD155也称为脊髓灰质炎病毒受体(PVR)或粘连蛋白样蛋白5(NECL-5)。在一些实施例中，人CD155具有下文显示的SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL包含与SEQ ID NO:2具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL是天然存在的CD155的功能性片段。在一些实施例中，ICL是全长天然存在的CD155。在一些实施例中，ICL包含信号肽。在一些实施例中，ICL不包含信号肽。在一些实施例中，ICL包含天然存在的CD155的细胞外结构域。在一些实施例中，ICL包含天然存在的CD155的细胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。在一些实施例中，ICL包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸21-417的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:2的氨基酸21-417具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2(全长人CD155氨基酸序列；信号肽加粗)
Figure BDA0003864713290000361
脊髓灰质炎病毒受体(PVR)样蛋白是一组新鉴定的具有T细胞共信号传导功能的免疫球蛋白超家族(IGSF)。这组分子在第一Ig可变样(IgV)结构域中共享PVR特征基序，并且最初已知其可介导上皮细胞-细胞接触。CD155(PVR)被鉴定为TIGIT(具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体)的反结构。据报告，CD155是至少两种其他受体(包括CD226(DNAM-1)和CD96(Tactile))的反结构。CD226和CD96是T细胞和NK细胞上表达的激活性受体，并且CD155可以通过这些受体触发T细胞和NK细胞激活。CD155在非造血组织中广泛表达，并且可以在大量肿瘤和转化的细胞类型中过表达。CD155与TIGIT接合以抑制T细胞和NK细胞针对肿瘤细胞的应答。
CD112
在一些实施例中，ICL是CD112。在一些实施例中，ICL是人CD112。CD112分子的序列是本领域已知的。参见例如，GenBank ID NP_002847.1和UniProtKB ID Q92692。CD112也称为粘连蛋白2、疱疹病毒侵入介导因子B(HveB)、粘连蛋白细胞粘附分子2(NECTIN2)、脊髓灰质炎病毒受体相关蛋白2(PRR2或PVRL2)。在一些实施例中，人CD112具有下文显示的SEQ IDNO:3的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL包含与SEQ ID NO:3具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL是天然存在的CD112的功能性片段。在一些实施例中，ICL是全长天然存在的CD112。在一些实施例中，ICL包含信号肽。在一些实施例中，ICL不包含信号肽。在一些实施例中，ICL包含天然存在的CD112的细胞外结构域。在一些实施例中，ICL包含天然存在的CD112的细胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。在一些实施例中，ICL包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸32-538的氨基酸序列、或与SEQ IDNO:3的氨基酸32-538具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3(全长人CD112氨基酸序列；信号肽加粗)
Figure BDA0003864713290000381
CD112是T细胞和NK细胞信号传导的调节剂。CD112(PVRL2/粘连蛋白-2)与CD226(DNAM-1)相互作用以共刺激T细胞和NK细胞。CD112还可以通过与另一共抑制受体TIGIT结合来抑制T细胞应答。
FGL1
在一些实施例中，ICL是纤维蛋白原样蛋白1(FGL1)。在一些实施例中，ICL是人FGL1。FGL1分子的序列是本领域已知的。参见例如，GenBank ID NP_963846.1和UniProtKBID Q08830。FGL1也称为HP-041、Hepassocin(HPS)、肝细胞衍生的纤维蛋白原相关蛋白1(HFREP-1)或肝纤维蛋白原相关蛋白1(LFIRE-1)。在一些实施例中，人FGL1具有下文显示的SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL包含与SEQ ID NO:4具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL是天然存在的FGL1的功能性片段。在一些实施例中，ICL是全长天然存在的FGL1。在一些实施例中，ICL包含信号肽。在一些实施例中，ICL不包含信号肽。在一些实施例中，ICL包含含有SEQ ID NO:4的氨基酸23-312的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:4的氨基酸23-312具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4(全长人FGL1氨基酸序列；信号肽加粗)
Figure BDA0003864713290000391
FGL1是免疫抑制分子，其通过充当LAG3的主要配体来抑制抗原特异性T细胞激活。FGL1负责LAG3 T细胞抑制功能。FGL1与LAG3的结合独立于MHC II类(MHC-II)。FGL1由肝细胞分泌并促进肝细胞的生长。
半乳凝素-9
在一些实施例中，ICL是半乳凝素-9。在一些实施例中，ICL是人半乳凝素-9。半乳凝素-9分子的序列是本领域已知的。参见例如，GenBank ID NP_002299.2和UniProtKB IDO00182。半乳凝素-9也称为Gal-9、ecalectin、LGALS9或肿瘤抗原HOM-HD-21。在一些实施例中，人半乳凝素-9具有下文显示的SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL包含与SEQ ID NO:5具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5(全长人半乳凝素-9氨基酸序列)
Figure BDA0003864713290000392
半乳凝素-9是免疫检查点分子HAVCR2(TIM3)的配体。半乳凝素-9与HAVCR2的结合诱导1型辅助性T淋巴细胞(Th1)死亡。半乳凝素-9也是P4HB的配体，它将P4HB保留在Th2 T辅助细胞的细胞表面，增加了质膜处的二硫键还原酶活性，从而改变质膜氧化还原状态并增强细胞迁移。半乳凝素-9是CD44的配体。它与CD44的相互作用增强SMAD3与FOXP3启动子的结合，促使FOXP3表达上调、诱导的调节性T(iTreg)细胞稳定性增加和抑制功能(通过相似性)增强。促进间充质基质细胞抑制T细胞增殖的能力。已知半乳凝素-9可扩增调节性T细胞，在病毒感染后诱导细胞毒性T细胞凋亡，并抑制NK细胞功能。
CD47
在一些实施例中，ICL是CD47。在一些实施例中，ICL是人CD47。PD-L1分子的序列是本领域已知的。参见例如，GenBank ID CEJ95640.1和UniProtKB ID Q08722。CD47也称为白细胞表面抗原CD47、抗原表面决定蛋白OA3、整合素相关蛋白(IAP)或MER6。在一些实施例中，人CD47具有下文显示的SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL包含与SEQ IDNO:6具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL是天然存在的CD47的功能性片段。在一些实施例中，ICL是全长天然存在的CD47。在一些实施例中，ICL包含信号肽。在一些实施例中，ICL不包含信号肽。在一些实施例中，ICL包含天然存在的CD47的一个或多个细胞外结构域。在一些实施例中，ICL包含天然存在的CD47的一个或多个细胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。在一些实施例中，ICL包含含有SEQ ID NO:6的氨基酸19-323的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:6的氨基酸19-323具有至少约85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6(全长人CD47氨基酸序列；信号肽加粗)
Figure BDA0003864713290000401
CD47是跨膜蛋白，其与整合素、一些反受体信号调节蛋白(SIRP)家族成员和分泌的血小板应答蛋白-1相互作用。CD47在免疫系统中具有两个已确立的作用。其与吞噬细胞和树突状细胞上的SIRPα的接合诱导抑制信号，这些抑制信号会限制表达CD47的细胞的吞噬作用和抗原呈递。已经开发了CD47靶向治疗剂以克服针对癌症治疗的该免疫检查点缺陷。另外，血小板应答蛋白-1与CD47的接合抑制T细胞和NK细胞激活。因此，CD47是同时调节先天性免疫和适应性免疫的免疫检查点配体。
B7H3
在一些实施例中，ICL是B7H3。在一些实施例中，ICL是人B7H3。B7H3分子的序列是本领域已知的。参见例如，GenBank ID NP_001316558.1和UniProtKB ID O00182。B7H3也称为B7同源物3、CD276抗原、4Ig-B7-H3和CD276。在一些实施例中，人B7H3具有下文显示的SEQID NO:7的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL包含与SEQ ID NO:7具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL是天然存在的B7H3的功能性片段。在一些实施例中，ICL是全长天然存在的B7H3。在一些实施例中，ICL包含信号肽。在一些实施例中，ICL不包含信号肽。在一些实施例中，ICL包含天然存在的B7H3的一个或多个细胞外结构域。在一些实施例中，ICL包含天然存在的B7H3的一个或多个细胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。在一些实施例中，ICL包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸29-534的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:7的氨基酸29-534具有至少约85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7(全长人B7H3氨基酸序列；信号肽加粗)
Figure BDA0003864713290000421
B7-H3(CD276)是免疫调节分子B7家族的成员，该家族中的很多成员与已知的免疫检查点蛋白(包括CTLA-4、PD-1和CD28)相互作用。B7H3对T细胞具有共抑制作用，并有助于肿瘤细胞的免疫逃避。发现B7-H3可抑制T细胞增殖。B7-H3还与IFN-γ、TNF-α和其他细胞因子的分泌减少有关，从而允许免疫逃逸。
B7H4
B7H4.在一些实施例中，ICL是人B7H4。B7H4分子的序列是本领域已知的。参见例如，GenBank ID NP_001240779.1.1和UniProtKB ID Q7Z7D3。B7H4也称为含V-set域T细胞激活抑制因子1(VTCN1)、B7同源物4、B7h.5、B7S1、和T细胞共刺激分子B7x。在一些实施例中，人B7H4具有下文显示的SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL包含与SEQ IDNO:8具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，ICL是天然存在的B7H4的功能性片段。在一些实施例中，ICL是全长天然存在的B7H4。在一些实施例中，ICL包含信号肽。在一些实施例中，ICL不包含信号肽。在一些实施例中，ICL包含天然存在的B7H4的一个或多个细胞外结构域。在一些实施例中，ICL包含天然存在的B7H4的一个或多个细胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。在一些实施例中，ICL包含含有SEQ ID NO:8的氨基酸25-282的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:8的氨基酸25-282具有至少约85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8(全长人B7H4氨基酸序列；信号肽加粗)
Figure BDA0003864713290000431
B7H4是免疫调节蛋白B7家族的成员。B7H4通过连接由激活的T细胞表达的未知受体来抑制T细胞增殖和细胞因子产生。值得注意的是，在多种恶性肿瘤中，在高比例的患者肿瘤中都观察到B7H4蛋白表达。B7H4特异性嵌合抗原受体(CAR)T细胞、抗体介导的B7H4阻断、以及抗B7H4药物缀合物的临床前研究已在小鼠模型中显示出抗肿瘤功效。
B.工程化受体
本文所述的经修饰的治疗细胞可以表达一种或多种工程化受体。示例性工程化受体包括但不限于CAR、重组TCR、TAC受体和TFP。在一些实施例中，工程化受体包含特异性结合抗原(例如，肿瘤抗原)的细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含初级细胞内信号传导结构域和/或共刺激结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含TCR共受体的细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，工程化受体由可操作地连接至启动子(如组成型启动子或诱导型启动子)的异源核酸编码。在一些实施例中，通过将蛋白质插入细胞膜中同时使细胞通过微流体系统(如CELL
Figure BDA0003864713290000432
)，将工程化受体引入经修饰的免疫细胞中(参见例如，美国专利申请公开号20140287509)。工程化受体可增强经修饰的治疗细胞的功能，如通过靶向经修饰的治疗细胞(例如，经修饰的免疫细胞)、通过转导信号、和/或通过增强经修饰的治疗细胞(例如，经修饰的免疫细胞)的细胞毒性。在一些实施例中，经修饰的治疗细胞不表达工程化受体，如CAR、TCR、TAC受体、或TFP。
在一些实施例中，工程化受体包含靶向至少一种肿瘤抗原的一个或多个特异性结合结构域，和一个或多个细胞内效应结构域，如一个或多个初级细胞内信号传导结构域和/或共刺激结构域。
在一些实施例中，工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)。许多嵌合抗原受体是本领域已知的并且可以适用于本发明的经修饰的治疗细胞。也可以通过使用例如抗体分子的抗原结合片段或抗体可变结构域将CAR构建为对任何细胞表面标志物具有特异性。本文可以使用产生CAR的任何方法。参见例如，US 6,410,319、US 7,446,191、US 7,514,537、US9765342 B2、WO 2002/077029、WO 2015/142675、US2010/065818、US 2010/025177、US2007/059298、WO 2017025038 A1以及Berger C. 等人,J.Clinical Investigation 118:1294-308(2008)，将这些文献通过援引特此并入。
在一些实施例中，CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，该细胞外结构域包含特异性结合至少一种肿瘤抗原的至少一个靶向结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域产生促进含CAR的细胞(例如，CAR-T细胞)的免疫效应子功能的信号。“免疫效应子功能或免疫效应子应答”是指增强或促进靶细胞的免疫攻击的例如免疫效应细胞的功能或应答。例如，免疫效应子功能或应答可以指促进靶细胞的杀伤或者靶细胞生长或增殖的抑制的T细胞或NK细胞的性质。例如在CAR-T细胞中的免疫效应子功能的实例包括细胞溶解活性(例如，抗体依赖性细胞毒性或ADCC)和辅助活性(例如，细胞因子的分泌)。在一些实施例中，CAR具有细胞内信号传导结构域，其具有减弱的免疫效应子功能。在一些实施例中，与具有全长和野生型CD3ζ以及任选的一个或多个共刺激结构域的CAR相比，该CAR具有不超过约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或更少中任一个的免疫效应子功能(例如，针对靶细胞的细胞溶解功能)的细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域产生促进含有CAR的细胞的增殖和/或存活的信号。在一些实施例中，CAR包含选自CD28、CD137、CD3、CD27、CD40、ICOS、GITR和OX40的信号传导结构域的一个或多个细胞内信号传导结构域。天然存在的分子的信号传导结构域可包含分子或其片段或衍生物的整个细胞内(即胞内)部分或整个天然细胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，CAR的细胞内信号传导结构域包含初级细胞内信号传导结构域。“初级细胞内信号传导结构域”是指以刺激性方式起作用以诱导免疫效应子功能的胞内信号传导序列。在一些实施例中，初级细胞内信号传导结构域含有称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM的信号传导基序。在一些实施例中，初级细胞内信号传导结构域包含选自由CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、常见FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεRib)、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10和DAP12组成的组的蛋白质的功能性信号传导结构域。在一些实施例中，初级细胞内信号传导结构域包含选自由CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、常见FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεRib)、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10和DAP12组成的组的蛋白质的非功能性或减弱的信号传导结构域。非功能性或减弱的信号传导结构域可以是具有减弱或消除一种或多种免疫效应子功能(例如，细胞溶解活性或辅助活性，包括抗体依赖性细胞毒性(ADCC))的点突变、插入或缺失的突变信号传导结构域。在一些实施例中，CAR包含非功能性或减弱的CD3ζ(即CD3ζ或CD3z)信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域不包含初级细胞内信号传导结构域。与具有相同构建体但具有野生型初级细胞内信号传导结构域的CAR相比，减弱的初级细胞内信号传导结构域可诱导不超过约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或更少中任一个的免疫效应子功能(例如，针对靶细胞的细胞溶解功能)。
在一些实施例中，CAR的细胞内信号传导结构域包含一个或多个(如1、2、3个或更多个中的任一个)共刺激结构域。“共刺激结构域”可以是共刺激分子的细胞内部分。术语“共刺激分子”是指免疫细胞(如T细胞)上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，从而介导免疫细胞的共刺激应答，例如但不限于增殖和存活。共刺激分子是除抗原受体或其配体以外的有助于高效免疫应答的细胞表面分子。共刺激分子可表示为以下蛋白质家族：TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)和激活性NK细胞受体。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体、以及OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。这样的共刺激分子的另外的实例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CDIOO(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和特异性结合CD83的配体。
在一些实施例中，CAR包含单个共刺激结构域。在一些实施例中，CAR包含两个或更多个共刺激结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含功能性初级细胞内信号传导结构域和一个或多个共刺激结构域。在一些实施例中，CAR不包含功能性初级细胞内信号传导结构域(如CD3ζ)。在一些实施例中，CAR包含由一个或多个共刺激结构域组成或基本上由一个或多个共刺激结构域组成的细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，CAR包含由非功能性或减弱的初级细胞内信号传导结构域(如突变CD3ζ)和一个或多个共刺激结构域组成、或基本上由非功能性或减弱的初级细胞内信号传导结构域(如突变CD3ζ)和一个或多个共刺激结构域组成的细胞内信号传导结构域。在靶向结构域与肿瘤抗原结合后，CAR的共刺激结构域可转导信号以增强具有CAR的工程化免疫细胞(如T细胞)的增殖、存活和分化，并抑制激活诱导的细胞死亡。在一些实施例中，一个或多个共刺激信号传导结构域衍生自一个或多个分子，该一个或多个分子选自由以下组成的组：CD27、CD28、4-1BB(即CD137)、OX40、CD30、CD40、CD3、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和特异性结合CD83的配体。
在一些实施例中，CAR的细胞内信号传导结构域包含衍生自CD28的共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含CD3ζ的胞内信号传导结构域和CD28的共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，本申请的嵌合受体中的细胞内信号传导结构域包含衍生自4-1BB(即CD137)的共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含CD3ζ的胞内信号传导结构域和4-1BB的共刺激信号传导结构域。
在一些实施例中，CAR的细胞内信号传导结构域包含CD28的共刺激信号传导结构域和4-1BB的共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含CD3ζ的胞内信号传导结构域、CD28的共刺激信号传导结构域和4-1BB的共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含多肽，该多肽从N-末端至C-末端包含：CD28的共刺激信号传导结构域、4-1BB的共刺激信号传导结构域和CD3ζ的胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，CAR包含多肽，该多肽从N-末端至C-末端包含：CD8前导序列、细胞外结合结构域、CD8铰链、CD8跨膜、4-1BB细胞内共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，CAR是含有嵌合信号传导结构域(“CMSD”)的嵌合抗原受体，其中该CMSD包含ITAM(本文也称为“CMSD ITAM”)和任选的接头(本文也称为“CMSD接头”)，这些ITAM和任选的接头以不同于任何天然存在的含ITAM的亲本分子的构型排列。例如，在一些实施例中，CMSD包含彼此直接连接的两个或更多个ITAM。在一些实施例中，CMSD包含通过一个或多个“异源接头”连接的ITAM，该一个或多个“异源接头”即如下的接头序列，这些接头序列不是衍生自含ITAM的亲本分子(例如，G/S接头)、或衍生自不同于衍生一种或多种CMSDITAM的含ITAM的亲本分子的含ITAM的亲本分子。在一些实施例中，CMSD包含两个或更多个(如2、3、4或更多个)相同的ITAM。在一些实施例中，CMSD ITAM中的至少两个彼此不同。在一些实施例中，CMSD ITAM中的至少一个不衍生自CD3ζ。在一些实施例中，CMSD ITAM中的至少一个不是CD3ζ的ITAM1或ITAM2。在一些实施例中，CMSD不包含CD3ζITAM1和/或CD3ζITAM2。在一些实施例中，CMSD ITAM中的至少一个是CD3ζITAM3。在一些实施例中，CMSD不包含来自CD3ζ的任何ITAM。在一些实施例中，CMSD ITAM中的至少两个衍生自相同的含ITAM的亲本分子。在一些实施例中，CMSD包含两个或更多个(如2、3、4或更多个)ITAM，其中CMSD ITAM中的至少两个各自衍生自不同的含ITAM的亲本分子。在一些实施例中，CMSD ITAM中的至少一个衍生自含ITAM的亲本分子，该含ITAM的亲本分子选自由以下组成的组：CD3ε、CD3δ、CD3γ、Igα(CD79a)、Igβ(CD79b)、FcεRIβ、FcεRIγ、DAP12、CNAIP/NFAM1、STAM-1、STAM-2和膜突蛋白。
在一些实施例中，CAR包含多肽，该多肽从N-末端至C-末端包含：CD8前导序列、细胞外结合结构域、CD8铰链、CD8跨膜、4-1BB细胞内共刺激结构域、以及一个或多个ITAM序列。
在一些实施例中，CAR的靶向结构域是抗体或抗体片段，例如scFv、Fv、Fab、(Fab’)2、单域抗体(sdAb)、或VHH结构域。在一些实施例中，CAR的靶向结构域是特异性结合肿瘤抗原的受体的配体或细胞外部分。在一些实施例中，CAR的一个或多个靶向结构域特异性结合单个肿瘤抗原。在一些实施例中，CAR是具有结合两种或更多种肿瘤抗原的靶向结构域的双特异性或多特异性CAR。在一些实施例中，肿瘤抗原选自由以下组成的组：CD19、BCMA、NY-ESO-1、VEGFR2、MAGE-A3、CD20、CD22、CD33、CD38、CEA、EGFR(例如EGFRvIII)、GD2、HER2、IGF1R、间皮素、PSMA、ROR1、WT1、和具有临床意义的其他肿瘤抗原、及其组合。
在一些实施例中，CAR是抗CD19 CAR。在一些实施例中，CAR包含抗CD19 scFv。在一些实施例中，抗CD19 scFv衍生自抗CD19抗体，如FMC63。在一些实施例中，CAR是抗CD19CAR，该抗CD19 CAR包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9(CTL-019CAR；CD8αSP-CD19 scFv-CD8α铰链-CD8αTM-4-1BB-CD3ζ氨基酸序列；CD8αSP为斜体，CD8α铰链为方形，CD8αTM为斜体，4-1BB胞内加下划线，CD3ζ加粗)
Figure BDA0003864713290000481
在一些实施例中，CAR是抗BCMA CAR。多种抗原结合结构域序列可用作CAR的靶向结构域。参见例如WO 2017/025038，将该文献以其全文并入本文。在一些实施例中，CAR包含抗BCMA scFv。在一些实施例中，CAR包含抗BCMA sdAb，如VHH。在一些实施例中，CAR是抗BCMA CAR，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10(BSF17 CAR；CD8αSP-BCMA VHH-CD8α铰链-CD8αTM-4-1BB-CD3ζ氨基酸序列；CD8αSP为斜体，CD8α铰链为方形，CD8αTM为斜体，4-1BB胞内加下划线，CD3ζ加粗)
Figure BDA0003864713290000491
在一些实施例中，CAR的跨膜结构域包含选自以下的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154，KIRDS2，OX40，CD2，CD27，LFA-1(CD11a、CD18)，ICOS(CD278)，4-1BB(CD137)，GITR，CD40，BAFFR，HVEM(LIGHTR)，SLAMF7，NKp80(KLRFl)，CD160，CD19，IL-2Rβ，IL-2Rγ，IL-7Ra，ITGA1，VLA1，CD49a，ITGA4，IA4，CD49D，ITGA6，VLA-6，CD49f，ITGAD，CD11d，ITGAE，CD103，ITGAL，CD11a，LFA-1，ITGAM，CD11b，ITGAX，CD11c，ITGB1，CD29，ITGB2，CD18，LFA-1，ITGB7，TNFR2，DNAM1(CD226)，SLAMF4(CD244、2B4)，CD84，CD96(触觉)，CEACAM1，CRT AM，Ly9(CD229)，CD160(BY55)，PSGL1，CDIOO(SEMA4D)，SLAMF6(NTB-A、Lyl08)，SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)，BLAME(SLAMF8)，SELPLG(CD162)，LTBR，PAG/Cbp，NKp44，NKp30，NKp46，NKG2D和/或NKG2C的跨膜结构域。在一些实施例中，CAR的跨膜结构域是CD4、CD3、CD8α或CD28跨膜结构域。在一些实施例中，CAR的跨膜结构域包含CD8α的跨膜结构域。
在一些实施例中，细胞外结构域通过铰链区与跨膜结构域连接。在一个实施例中，铰链区包含CD8α的铰链区。
在一些实施例中，CAR包含信号肽，如CD8αSP。
本领域已知的或发明人开发的任何CAR包括PCT/CN 2017/096938和PCT/CN 2016/094408(这些文献的内容通过援引以其全文并入本文)中所述的CAR，可用于本文所述的方法中。CAR的示例性结构显示于PCT/CN 2017/096938的图15A-15D中。
在一些实施例中，工程化受体是重组T细胞受体。在一些实施例中，重组TCR对肿瘤抗原有特异性。在一些实施例中，肿瘤抗原选自由以下组成的组：CD19、BCMA、NY-ESO-1、VEGFR2、MAGE-A3、VEGFR2、MAGE-A3、CD20、CD22、CD33、CD38、CEA、EGFR(如EGFRvIII)、GD2、HER2、IGF1R、间皮素、PSMA、ROR1、WT1和具有临床意义的其他肿瘤抗原。在一些实施例中，肿瘤抗原衍生自肿瘤细胞的细胞内蛋白质。已经描述了许多对肿瘤抗原(包括肿瘤相关抗原)有特异性的TCR，包括例如NY-ESO-1癌-睾丸抗原，p53肿瘤抑制抗原，针对黑素瘤(例如，MARTI、gp 100)、白血病(例如，WT1、次要组织相容性抗原)和乳腺癌(例如，HER2、NY-BR1)中肿瘤抗原的TCR。本领域已知的任何TCR可用于本申请。在一些实施例中，TCR对肿瘤抗原具有增强的亲和力。例如在US 5830755和Kessels等人Immunotherapy through TCR genetransfer.Nat.Immunol.2,957-961(2001)中描述了示例性TCR和用于将这些TCR引入免疫细胞中的方法。在一些实施例中，经修饰的治疗细胞是TCR-T细胞。
TCR受体复合体是由可变TCR受体α和β链(在γδT细胞情况下为γ和δ链)与三个二聚体信号传导模块CD3δ/ε、CD3γ/ε和CD247(T细胞表面糖蛋白CD3ζ链)ζ/ζ或ζ/η形成的八聚体复合体。每个亚基的跨膜结构域中的可电离残基形成将复合体保持在一起的相互作用的极性网络。TCR复合体具有激活T细胞中信号传导级联的功能。
在一些实施例中，工程化受体是包含一种或多种T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的工程化TCR。例如在US 20170166622 A1中描述了示例性TFP，该文献通过援引并入本文。在一些实施例中，TFP包含TCR亚基的细胞外结构域，该TCR亚基包含选自由以下组成的组的蛋白质的细胞外结构域或其部分：TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、其功能性片段及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。在一些实施例中，TFP包含跨膜结构域，该跨膜结构域包含选自由以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域：TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、其功能性片段及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。在一些实施例中，TFP包含跨膜结构域，该跨膜结构域包含选自由以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域：TCRα链、TCRβ链、TCRζ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、其功能性片段、及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。
在一些实施例中，TFP包含TCR亚基和抗原结合结构域，该TCR亚基包含TCR细胞外结构域的至少一部分和含有来自CD3ε的细胞内信号传导结构域的刺激结构域的TCR细胞内结构域；其中该TCR亚基与该抗原结合结构域可操作地连接，并且其中当在T细胞中表达时，将该TFP掺入TCR中。
在一些实施例中，TFP包含TCR亚基和抗原结合结构域，该TCR亚基包含TCR细胞外结构域的至少一部分和含有来自CD3γ的细胞内信号传导结构域的刺激结构域的TCR细胞内结构域；其中该TCR亚基与该抗原结合结构域可操作地连接，并且其中当在T细胞中表达时，将该TFP掺入TCR中。
在一些实施例中，TFP包含TCR亚基和抗原结合结构域，该TCR亚基包含TCR细胞外结构域的至少一部分和含有来自CD3δ的细胞内信号传导结构域的刺激结构域的TCR细胞内结构域；其中该TCR亚基与该抗原结合结构域可操作地连接，并且其中当在T细胞中表达时，将该TFP掺入TCR中。
在一些实施例中，TFP包含TCR亚基和抗原结合结构域，该TCR亚基包含TCR细胞外结构域的至少一部分和含有来自TCRα的细胞内信号传导结构域的刺激结构域的TCR细胞内结构域；其中该TCR亚基与该抗原结合结构域可操作地连接，并且其中当在T细胞中表达时，将该TFP掺入TCR中。
在一些实施例中，TFP包含TCR亚基和抗原结合结构域，该TCR亚基包含TCR细胞外结构域的至少一部分和含有来自TCRβ的细胞内信号传导结构域的刺激结构域的TCR细胞内结构域；其中该TCR亚基与该抗原结合结构域可操作地连接，并且其中当在T细胞中表达时，将该TFP掺入TCR中。
在一些实施例中，工程化受体是T细胞抗原偶联剂(TAC)受体。例如在US20160368964 A1中描述了示例性TAC受体，该文献通过援引并入本文。在一些实施例中，TAC包含靶向结构域、特异性结合与TCR复合体相关的蛋白质的TCR结合结构域和T细胞受体信号传导结构域。在一些实施例中，靶向结构域是特异性结合肿瘤抗原的抗体片段，如scFv或VHH。在一些实施例中，靶向结构域是设计的锚蛋白重复序列(DARPin)多肽。在一些实施例中，肿瘤抗原选自由以下组成的组：CD19、BCMA、NY-ESO-1、VEGFR2、MAGE-A3、VEGFR2、MAGE-A3、CD20、CD22、CD33、CD38、CEA、EGFR(如EGFRvIII)、GD2、HER2、IGF1R、间皮素、PSMA、ROR1、WT1和具有临床意义的其他肿瘤抗原。在一些实施例中，与TCR复合体相关的蛋白质是CD3，如CD3ε。在一些实施例中，TCR结合结构域是单链抗体，如scFv或VHH。在一些实施例中，TCR结合结构域衍生自UCHT1。在一些实施例中，TAC受体包含胞质结构域和跨膜结构域。在一些实施例中，T细胞受体信号传导结构域包含衍生自TCR共受体的胞质结构域。示例性TCR共受体包括但不限于CD4、CD8、CD28、CD45、CD4、CD5、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD 154。在一些实施例中，TAC受体包含跨膜结构域和衍生自CD4的胞质结构域。在一些实施例中，TAC受体包含跨膜结构域和衍生自CD8(如CD8α)的胞质结构域。
T细胞共受体在T细胞上表达为膜蛋白。它们可以提供TCR:肽:MHC复合体的稳定性并促进信号转导。T细胞共受体的两种亚型CD4和CD8对特定MHC类型表现出强特异性。CD4共受体只能稳定TCR:MHC II复合体，而CD8共受体只能稳定TCR:MHC I复合体。CD4和CD8在不同T细胞类型上的差异表达导致不同的T细胞功能亚群。CD8+T细胞是细胞毒性T细胞。
CD4是在免疫细胞(例如，辅助性T细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞)的表面上表达的糖蛋白。CD4具有暴露于细胞外细胞表面的四个免疫球蛋白结构域(D1至D4)。CD4在其短胞内/细胞内尾上含有特定的氨基酸序列，其允许CD4尾募集酪氨酸激酶Lck并与该酪氨酸激酶Lck相互作用。当TCR复合体和CD4各自结合MHC II分子的不同区域时，TCR复合体与CD4之间的紧密接近允许与CD4的胞内尾结合的Lck对CD3的胞内结构域上的免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)进行酪氨酸磷酸化，从而扩增TCR产生的信号。
CD8是由两条α链组成的同源二聚体(较不常见)或由一条α链和一条β链组成的异源二聚体(较常见)的糖蛋白，它们各自包含通过细柄(thin stalk)与膜连接的免疫球蛋白可变(IgV)样细胞外结构域和细胞内尾。CD8主要在细胞毒性T细胞的表面上表达，但也可以在自然杀伤细胞、皮质胸腺细胞和树突状细胞上发现。CD8胞内尾与Lck相互作用，一旦TCR结合其特异性抗原就会使TCR复合体的胞内CD3和ζ链磷酸化。胞内CD3和ζ链上的酪氨酸磷酸化引发磷酸化级联，最终导致基因转录。
在一些实施例中，经修饰的治疗细胞表达多于一种工程化受体，如CAR、重组TCR、TAC受体和TFP的任何组合。
在一些实施例中，由经修饰的治疗细胞表达的工程化受体(如CAR、TCR、TAC或TFP)靶向一种或多种肿瘤抗原。肿瘤抗原是由可引发免疫应答、特别是T细胞介导的免疫应答的肿瘤细胞产生的蛋白质。本发明的靶向抗原的选择将取决于待治疗的癌症的特定类型。示例性肿瘤抗原包括例如神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CAIX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、p53、前列腺素、PSMA、HER2/neu、存活蛋白和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2(ephrinB2)、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。
在一些实施例中，肿瘤抗原包含与恶性肿瘤相关的一个或多个抗原癌症表位。恶性肿瘤表达许多可用作免疫攻击的靶抗原的蛋白质。这些分子包括但不限于组织特异性抗原，例如黑素瘤中的MART-1、酪氨酸酶和gp 100以及前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺特异性抗原(PSA)。其他靶分子属于转化相关分子组，如癌基因HER2/Neu/ErbB-2。另一组靶抗原是癌胚胎抗原，如癌胚抗原(CEA)。在B细胞淋巴瘤中，肿瘤特异性独特型免疫球蛋白构成个体肿瘤所特有的真正的肿瘤特异性免疫球蛋白抗原。B细胞分化抗原(如CD19、CD20和CD37)是B细胞淋巴瘤中靶抗原的其他候选物。
在一些实施例中，肿瘤抗原是肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。TSA是肿瘤细胞所特有的，并且不存在于体内的其他细胞上。TAA不是肿瘤细胞所特有的，相反，它也在不能诱导对抗原的免疫耐受状态的条件下在正常细胞上表达。抗原在肿瘤上的表达可以在使免疫系统能够对该抗原作出应答的条件下发生。TAA可以是在胚胎发育期间在正常细胞上表达的抗原，此时免疫系统不成熟且不能作出应答，或者它们可以是在正常细胞上通常以极低的水平存在但在肿瘤细胞上以高得多的水平表达的抗原。
TSA或TAA抗原的非限制性实例包括以下：分化抗原，例如MART-1/MelanA(MART-I)、gp 100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤特异性多谱系抗原，例如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5；过表达的胚胎抗原，例如CEA；过表达的癌基因和突变的肿瘤抑制基因，例如p53、Ras、HER2/neu；由染色体易位产生的独特肿瘤抗原，例如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；以及病毒抗原，例如艾伯斯坦-巴尔病毒抗原EBVA及人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其他基于蛋白质的大抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、pl85erbB2、pl80erbB-3、c-met、nm-23HI、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS 1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环素C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。
C.核酸
本文所述的经修饰的治疗细胞包含一种或多种核酸，该一种或多种核酸包含编码本文所述的免疫检查点配体(ICL)和/或工程化受体中任一种的一个或多个异源核酸序列。在一些实施例中，核酸是DNA。在一些实施例中，核酸是RNA。在一些实施例中，核酸是线性的。在一些实施例中，核酸是环状的。
一个或多个异源核酸序列可以与一个或多个调节序列可操作地连接。控制编码序列的转录和/或翻译的示例性调节序列是本领域已知的，并且可以包括但不限于启动子；用于转录的适当起始、调节和/或终止(例如，聚A转录终止序列)，mRNA转运(例如，核定位信号序列)、加工(例如，剪接信号)、稳定性(例如，内含子和非编码5’和3’序列)、翻译(例如，起始Met、三联体前导序列、IRES核糖体结合位点、信号肽等)的另外的元件；以及用于将插入物引入病毒载体中的插入位点。在一些实施例中，调节序列是启动子、转录增强子和/或允许ICL和/或工程化受体正确表达的序列。
术语“调节序列”或“控制序列”是指影响与其可操作地连接的编码序列的表达的DNA序列。此类调节序列的性质根据宿主生物体而不同。在原核生物中，调节序列通常包括启动子、核糖体结合位点和终止子。在真核生物中，调节序列包括启动子、终止子和在一些情况下的增强子、反式激活因子或转录因子。
术语“可操作地连接”是指其中所述组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系中的并置。与编码序列“可操作地连接”的调节序列以这样的方式连接，使得编码序列的表达在与调节序列相容的条件下完成。
如本文所用，“启动子”或“启动子区”是指控制与其可操作地连接的DNA或RNA的转录的DNA或RNA区段。启动子区包括涉及RNA聚合酶识别、结合和转录起始的特定序列。此外，启动子包括调节RNA聚合酶的识别、结合和转录起始活性(即，一种或多种转录因子的结合)的序列。这些序列可以是顺式作用的，或可以对反式作用因子有应答。根据调节的性质，启动子可以是组成型启动子或调节型启动子。调节型启动子可以是可诱导的或对环境有应答的(例如，对例如pH、厌氧条件、渗压剂、温度、光或细胞密度等诱因有应答)。许多这样的启动子序列是本领域已知的。参见例如，美国专利号4,980,285；5,631,150；5,707,928；5,759,828；5,888,783；5,919,670和Sambrook等人,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第2版,Cold Spring Harbor Press(1989)。
在一些实施例中，启动子是内源启动子。例如，可以使用本领域已知的任何方法(如CRISPR/Cas9方法)，将编码工程化受体的核酸序列在内源启动子下游敲入经修饰的免疫细胞的基因组中。在一些实施例中，内源启动子是丰度蛋白如β-肌动蛋白的启动子。在一些实施例中，内源启动子是诱导型启动子，例如可由经修饰的治疗细胞(例如，经修饰的免疫细胞)的内源激活信号诱导。在一些实施例中，其中经修饰的治疗细胞是T细胞，启动子是T细胞激活依赖性启动子(如IL-2启动子、NFAT启动子或NFκB启动子)。在一些实施例中，启动子是异源启动子。
已经探索了各种启动子以在哺乳动物细胞中进行基因表达，并且本领域已知的任何启动子都可用于本发明。启动子可大致分为组成型启动子或调节型启动子，如诱导型启动子。在一些实施例中，编码工程化受体的异源核酸序列与组成型启动子可操作地连接。在一些实施例中，编码工程化受体的异源核酸序列与诱导型启动子可操作地连接。
组成型启动子允许异源基因(也称为转基因)在宿主细胞中组成性地表达。本文考虑的示例性组成型启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子、人延伸因子-1α(hEF1α)、泛素C启动子(UbiC)、磷酸甘油激酶启动子(PGK)、猿猴病毒40早期启动子(SV40)以及与CMV早期增强子偶联的鸡β-肌动蛋白启动子(CAGG)。在许多研究中，已经广泛地比较了这样的组成型启动子对驱动转基因表达的效率。在一些实施例中，启动子是hEF1α启动子。
在一些实施例中，启动子是诱导型启动子。诱导型启动子属于调节型启动子的类别。诱导型启动子可以由一种或多种条件诱导，这些条件如物理条件、经修饰的治疗细胞(例如，经修饰的免疫细胞)的微环境、或经修饰的治疗细胞(例如，经修饰的免疫细胞)的生理状态、诱导物(即，诱导剂)、或其组合。在一些实施例中，诱导条件不诱导经修饰的治疗细胞(例如，经修饰的免疫细胞)和/或接受药物组合物的受试者中内源基因的表达。在一些实施例中，诱导条件选自由以下组成的组：诱导物、辐射(例如，电离辐射、光)、温度(例如，热)、氧化还原状态、肿瘤环境和经修饰的治疗细胞(例如，经修饰的免疫细胞)的激活状态。
在一些实施例中，启动子可由诱导物诱导。在一些实施例中，诱导物是小分子，例如化学化合物。在一些实施例中，小分子选自由强力霉素、四环素、醇、金属或类固醇组成的组。化学诱导的启动子得到了最广泛的探索。这样的启动子包括其转录活性受存在或不存在小分子化学物质(例如，强力霉素、四环素、醇、类固醇、金属和其他化合物)调节的启动子。具有反向四环素控制的反式激活因子(rtTA)和四环素应答元件启动子(TRE)的强力霉素诱导型系统是目前最成熟的系统。WO9429442描述了四环素应答启动子对真核细胞中基因表达的严格控制。WO 9601313披露了四环素调节的转录调节剂。另外，例如在TetSystems.com的网站上描述了Tet技术(例如，Tet-开系统)。任何已知的化学调节的启动子可用于驱动本申请的治疗蛋白的表达。
在一些实施例中，诱导物是多肽，例如生长因子、激素或细胞表面受体的配体，例如特异性结合肿瘤抗原的多肽。许多多肽诱导物也是本领域已知的，并且它们可适用于本发明。例如，基于蜕皮素受体的基因开关、基于孕酮受体的基因开关和基于雌激素受体的基因开关属于使用类固醇受体衍生的反式激活因子的基因开关(WO 9637609和WO 9738117等)。
在一些实施例中，诱导物同时包含小分子组分和一种或多种多肽。例如，依赖于多肽二聚化的诱导型启动子是本领域已知的，并且可以适用于本发明。1993年开发的第一个小分子CID系统使用FK1012(药物FK506的衍生物)诱导FKBP的同源二聚化。通过使用类似的策略，Wu等人通过使用Rapalog/FKPB-FRB*和赤霉素(Gibberelline)/GID1-GAI二聚化依赖性基因开关成功地使CAR-T细胞可通过打开开关(ON-switch)方式滴定(C.-Y.Wu等人,Science 350,aab4077(2015))。其他二聚化依赖性开关系统包括香豆霉素/GyrB-GyrB(Nature 383(6596):178-81)和HaXS/Snap-tag-HaloTag(Chemistry and Biology 20(4):549-57)。
在一些实施例中，启动子是光诱导型启动子，并且诱导条件是光。用于在哺乳动物细胞中调节基因表达的光诱导型启动子也是本领域熟知的(参见例如，Science 332,1565-1568(2011)；Nat.Methods 9,266-269(2012)；Nature 500:472-476(2013)；NatureNeuroscience 18:1202-1212(2015))。基于这样的基因调节系统对(1)DNA结合或(2)转录激活结构域募集到DNA结合蛋白的调节，这样的基因调节系统可大致分为两类。例如，在哺乳动物细胞中开发并测试了基于视黑蛋白的合成哺乳动物蓝光控制转录系统，该系统对蓝光(480nm)作出应答而触发细胞内钙增加，从而导致钙调磷酸酶介导的NFAT动员。最近，Motta-Mena等人描述了从天然存在的EL222转录因子开发的新的诱导型基因表达系统，该系统在人细胞系和斑马鱼胚胎中赋予对转录起始的高水平且蓝光敏感性控制(Nat.Chem.Biol.10(3):196-202(2014))。另外，利用红光诱导的拟南芥(Arabidopsisthaliana)的光感受器光敏色素B(PhyB)和光敏色素相互作用因子6(PIF6)的相互作用进行红光触发的基因表达调节。此外，还开发了紫外线B(UVB)诱导型基因表达系统并证明该基因表达系统在哺乳动物细胞中的靶基因转录中是高效的(Gene and Cell Therapy:Therapeutic Mechanisms and Strategies,第25章,第四版,CRC Press,2015年1月20日)。本文所述的任何光诱导型启动子可用于驱动本发明的治疗蛋白的表达。
在一些实施例中，启动子是由光诱导型分子和光的组合诱导的光诱导型启动子。例如，化学诱导物上的可光切割的光笼化基团(photocaged group)保持诱导物无活性，除非通过辐射或其他方式去除该光笼化基团。这样的光诱导型分子包括小分子化合物、寡核苷酸和蛋白质。例如，已经开发了笼化蜕皮素、与lac操纵子一起使用的笼化IPTG、用于核酶介导的基因表达的笼化丰加霉素、与Tet-开系统一起使用的笼化强力霉素以及用于光介导的FKBP/FRB二聚化的笼化Rapalog(参见例如，Curr Opin Chem Biol.16(3-4):292-299(2012))。
在一些实施例中，启动子是辐射诱导型启动子，并且诱导条件是辐射，例如电离辐射。辐射诱导型启动子也是本领域已知的，用以控制转基因表达。辐射细胞后发生基因表达的改变。例如，一组称为“立即早期基因(immediate early gene)”的基因可在电离辐射后迅速反应。示例性立即早期基因包括但不限于Erg-1、p21/WAF-1、GADD45α、t-PA、c-Fos、c-Jun、NF-κB和AP1。立即早期基因在其启动子区包含辐射应答序列。共有序列CC(A/T)6GG已在Erg-1启动子中发现，并且被称为血清应答元件或被称为CArG元件。已经深入研究了辐射诱导型启动子和转基因的组合，并证明其具有高效的治疗益处。参见例如，Cancer BiolTher.6(7):1005-12(2007)和Gene and Cell Therapy:Therapeutic Mechanisms andStrategies,第25章,第四版CRC Press,2015年1月20日。
在一些实施例中，启动子是热诱导型启动子，并且诱导条件是热。本领域还广泛研究了驱动转基因表达的热诱导型启动子。包括Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40、Hsp10等在内的热休克或应激蛋白(HSP)在热或其他物理和化学应激下在保护细胞方面起着重要作用。已经在临床前研究中尝试了几种热诱导型启动子，包括热休克蛋白(HSP)启动子以及生长停滞和DNA损伤(GADD)153启动子。1985年首次描述的人hsp70B基因的启动子似乎是最高效的热诱导型启动子之一。Huang等人报告，在引入hsp70B-EGFP、hsp70B-TNFα和hsp70B-IL12编码序列后，肿瘤细胞在热处理后表达极高的转基因表达，而在没有热处理的情况下，未检测到转基因的表达。在IL12转基因加热处理的小鼠组中，体内肿瘤生长显著延迟(CancerRes.60:3435(2000))。另一组科学家将HSV-tk自杀基因与hsp70B启动子连接，并在携带小鼠乳腺癌的裸鼠中测试该系统。与未进行热处理的对照相比，向其肿瘤施用了hsp70B-HSVtk编码序列并进行了热处理的小鼠显示出肿瘤消退和显著的存活率(Hum.GeneTher.11:2453(2000))。本领域已知的另外的热诱导型启动子可以在例如Gene and CellTherapy:Therapeutic Mechanisms and Strategies,第25章,第四版,CRC Press,2015年1月20日中找到。本文讨论的任何热诱导型启动子可用于驱动本发明的治疗蛋白的表达。
在一些实施例中，启动子可由氧化还原状态诱导。可由氧化还原状态诱导的示例性启动子包括诱导型启动子和低氧诱导型启动子。例如，Post DE等人开发了低氧诱导型因子(HIF)应答启动子，其特异性且强烈地诱导HIF活性肿瘤细胞中的转基因表达(GeneTher.8:1801-1807(2001)；Cancer Res.67:6872-6881(2007))。
在一些实施例中，启动子可由经修饰的治疗细胞(例如，经修饰的免疫细胞)的生理状态(如内源激活信号)诱导。在一些实施例中，其中经修饰的治疗细胞是T细胞，启动子是T细胞激活依赖性启动子，其可由经修饰的T细胞的内源激活信号诱导。在一些实施例中，经修饰的T细胞被诱导物(例如，乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)、离子霉素或植物血凝素)激活。在一些实施例中，通过经由工程化受体(例如，CAR、TCR或TAC)识别肿瘤细胞上的肿瘤抗原来激活经修饰的T细胞。在一些实施例中，T细胞激活依赖性启动子是IL-2启动子。在一些实施例中，T细胞激活依赖性启动子是NFAT启动子。在一些实施例中，T细胞激活依赖性启动子是NFκB启动子。
本文所述的一个或多个异源核酸序列可存在于异源基因表达盒中，该异源基因表达盒包含一个或多个蛋白质编码序列和任选的一个或多个启动子。在一些实施例中，异源基因表达盒包含单个蛋白质编码序列。在一些实施例中，异源基因表达盒包含由单个启动子驱动的两个或更多个蛋白质编码序列(即，多顺反子)。在一些实施例中，异源基因表达盒进一步包含一个或多个调节序列(如5’UTR、3’UTR、增强子序列、IRES、转录终止序列)、重组位点、一种或多种选择标志物(如抗生素抗性基因、报告基因等)、信号序列、或其组合。在一些实施例中，编码ICL的第一异源核酸序列经由编码可自切割的接头(如P2A、T2A、E2A或F2A肽)的第三核酸序列与编码工程化受体的第二异源核酸序列融合。在一些实施例中，可自切割的接头是P2A肽，该P2A肽包含氨基酸序列GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:11)。
在一些实施例中，经修饰的治疗细胞包含核酸，该核酸包含编码ICL的第一异源核酸序列和编码工程化受体(例如，CAR)的第二异源核酸序列，其中该第一异源核酸序列经由编码2A肽(例如，P2A肽)的第三核酸序列与该第二异源核酸序列融合。在一些实施例中，第一异源核酸序列在第二异源核酸序列的5’。在一些实施例中，第一异源核酸序列在第二异源核酸序列的3’。
在一些实施例中，经修饰的治疗细胞包含异源核酸序列，该异源核酸序列编码SEQID NO:12-27中任一个的氨基酸序列、或该氨基酸序列的变体，该变体与选自由SEQ ID NO:12-27组成的组的氨基酸序列具有至少约85％(例如，至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性。
在一些实施例中，经修饰的治疗细胞包含异源核酸序列，该异源核酸序列编码SEQID NO:12的氨基酸序列、或该氨基酸序列的变体，该变体与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少约85％(例如，至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性。
在一些实施例中，经修饰的治疗细胞包含异源核酸序列，该异源核酸序列编码SEQID NO:20的氨基酸序列、或该氨基酸序列的变体，该变体与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少约85％(例如，至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性。
在一些实施例中，一个或多个异源核酸序列存在于载体中。在一些实施例中，经修饰的治疗细胞包含载体，该载体包含编码ICL的第一异源核酸序列。在一些实施例中，经修饰的治疗细胞包含载体，该载体包含编码ICL的第一异源核酸序列和编码工程化受体的第二异源核酸序列。
在一些实施例中，载体是病毒载体。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、牛痘载体、单纯疱疹病毒载体、及其衍生物。病毒载体技术是本领域熟知的，并且描述于例如Sambrook等人(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)以及其他病毒学和分子生物学手册中。
已经开发了用于将基因转移到哺乳动物细胞中的许多基于病毒的系统。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了便利的平台。可以使用本领域已知的技术将异源核酸插入载体并包装在逆转录病毒粒子中。然后可以分离重组病毒，并在体外或离体将其递送至治疗细胞(例如，经修饰的免疫细胞)。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施例中，使用腺病毒载体。在一些实施例中，使用慢病毒载体。在一些实施例中，使用自灭活的慢病毒载体。例如，可以用本领域已知的方案包装自灭活的慢病毒载体。可以使用本领域已知的方法，将所得的慢病毒载体用于转导哺乳动物细胞(例如，人T细胞)。
在一些实施例中，载体是非病毒载体(例如，质粒)或游离型表达载体。
在一些实施例中，载体是表达载体。“表达载体”是可用于转化所选宿主并提供编码序列在该所选宿主中表达的构建体。表达载体可以是例如克隆载体、二元载体或整合载体。表达包括优选地将核酸分子转录成可翻译的mRNA。确保在真核细胞中表达的调节元件是本领域技术人员熟知的。在真核细胞的情况下，它们通常包含确保转录起始的启动子以及任选的确保转录终止和转录物稳定的聚A信号。允许在真核宿主细胞中表达的调节元件的实例是酵母中的AOX1或GAL1启动子或者哺乳动物和其他动物细胞中的CMV-、SV40-、RSV-启动子(劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus))、CMV-增强子、SV40-增强子或珠蛋白内含子。此外，根据所使用的表达系统，可以将能够将多肽引导至细胞区室或将其分泌到介质中的前导序列添加到所述核酸序列的编码序列中，并且这些前导序列是本领域熟知的。将一个或多个前导序列在适当的阶段与翻译、起始和终止序列组装在一起，并且优选地，能够将翻译蛋白或其一部分的分泌引导到周质空间或细胞外介质中的前导序列。任选地，核酸序列可以编码融合蛋白，该融合蛋白包括赋予所希望的特征(例如，表达的重组产物的稳定化或简化纯化)的N-末端鉴定肽。合适的表达载体是本领域已知的，例如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pEF-Neo、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogen)、pEF-DHFR和pEF-ADA(Raum等人,Cancer Immunol Immunother(2001)50(3),141-150)或pSPORT1(GIBCO BRL)。
III.治疗方法
本申请的一方面涉及治疗个体的疾病或病症(如癌症)的方法，该方法包括向该个体施用有效量的本文所述的经修饰的治疗细胞中的任一种。本申请考虑了经修饰的治疗细胞，其可以单独施用或与另一疗法以任何组合施用，并且在至少一些方面，与药学上可接受的载剂或赋形剂一起施用。在一些实施例中，在施用之前，可以将经修饰的治疗细胞与本领域熟知的合适的药物载剂和赋形剂组合。
在一些实施例中，提供了治疗个体(例如，人)的疾病或病症(例如，癌症)的方法，该方法包括向该个体施用有效量的药物组合物，该药物组合物包含经修饰的治疗细胞(例如，经修饰的免疫细胞)和药学上可接受的载剂，其中该经修饰的治疗细胞包含编码ICL的第一异源核酸序列，其中该治疗细胞表达MHC分子。在一些实施例中，治疗细胞表达MHC I类分子。在一些实施例中，治疗细胞表达MHC II类分子。在一些实施例中，治疗细胞同时表达MHC I类分子和MHC II类分子。在一些实施例中，治疗细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因未经基因修饰。在一些实施例中，治疗细胞的MHC基因未经基因修饰。在一些实施例中，经修饰的治疗细胞是同种异体的。
在一些实施例中，提供了治疗个体(例如，人)的疾病或病症(例如，癌症)的方法，该方法包括向该个体施用有效量的药物组合物，该药物组合物包含经修饰的免疫细胞和药学上可接受的载剂，其中该经修饰的免疫细胞包含编码ICL的第一异源核酸序列，该ICL选自由以下组成的组：PD-L1、CD155、CD112、FGL1、半乳凝素-9、CD47、B7H3和B7H4，其中该免疫细胞表达MHC分子。在一些实施例中，免疫细胞表达MHC I类分子。在一些实施例中，免疫细胞表达MHC II类分子。在一些实施例中，免疫细胞同时表达MHC I类分子和MHC II类分子。在一些实施例中，免疫细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因未经基因修饰。在一些实施例中，免疫细胞的MHC基因未经基因修饰。在一些实施例中，免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、NK细胞、NK-T细胞、αβT细胞、γδT细胞、肿瘤浸润性T细胞、树突状细胞(DC)激活的T细胞、和外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施例中，经修饰的治疗细胞是T细胞。在一些实施例中，经修饰的治疗细胞是γδT细胞。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是同种异体的。
在一些实施例中，提供了治疗个体(例如，人)的疾病或病症(例如，癌症)的方法，该方法包括向该个体施用有效量的药物组合物，该药物组合物包含经修饰的干细胞和药学上可接受的载剂，其中该经修饰的干细胞包含编码ICL的第一异源核酸序列，该ICL选自由以下组成的组：PD-L1、CD155、CD112、FGL1、半乳凝素-9、CD47、B7H3和B7H4，其中该干细胞表达MHC分子。在一些实施例中，干细胞表达MHC I类分子。在一些实施例中，干细胞表达MHCII类分子。在一些实施例中，干细胞同时表达MHC I类分子和MHC II类分子。在一些实施例中，干细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因未经基因修饰。在一些实施例中，干细胞的MHC基因未经基因修饰。在一些实施例中，经修饰的干细胞是HSC。在一些实施例中，经修饰的干细胞是ESC。在一些实施例中，经修饰的干细胞是同种异体的。
在一些实施例中，提供了治疗个体(例如，人)的疾病或病症(例如，癌症)的方法，该方法包括向该个体施用有效量的药物组合物，该药物组合物包含经修饰的免疫细胞和药学上可接受的载剂，其中该经修饰的免疫细胞包含编码ICL的第一异源核酸序列和编码工程化受体的第二异源核酸序列，该ICL选自由以下组成的组：PD-L1、CD155、CD112、FGL1、半乳凝素-9、CD47、B7H3和B7H4，其中该免疫细胞表达MHC分子。在一些实施例中，免疫细胞表达MHC I类分子。在一些实施例中，免疫细胞表达MHC II类分子。在一些实施例中，免疫细胞同时表达MHC I类分子和MHC II类分子。在一些实施例中，免疫细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因未经基因修饰。在一些实施例中，免疫细胞的MHC基因未经基因修饰。在一些实施例中，工程化受体选自由以下组成的组：嵌合抗原受体(CAR)、重组T细胞受体(TCR)、T细胞抗原偶联剂(TAC)受体和TCR融合蛋白(TFP)。在一些实施例中，工程化受体靶向肿瘤抗原，该肿瘤抗原选自由以下组成的组：CD19、BCMA、NY-ESO-1、VEGFR2、MAGE-A3、CD20、CD22、CD33、CD38、CEA、EGFR、GD2、HER2、IGF1R、间皮素、PSMA、ROR1、WT1、及其组合。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是同种异体的。
在一些实施例中，提供了治疗个体(例如，人)的疾病或病症(例如，癌症)的方法，该方法包括向该个体施用有效量的药物组合物，该药物组合物包含CAR-T细胞和药学上可接受的载剂，其中该CAR-T细胞包含编码ICL的第一异源核酸序列和编码CAR的第二异源核酸序列，该ICL选自由以下组成的组：PD-L1、CD155、CD112、FGL1、半乳凝素-9、CD47、B7H3和B7H4，其中该免疫细胞表达MHC分子。在一些实施例中，CAR-T细胞表达MHC I类分子。在一些实施例中，CAR-T细胞表达MHC II类分子。在一些实施例中，CAR-T细胞同时表达MHC I类分子和MHC II类分子。在一些实施例中，CAR-T细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因未经基因修饰。在一些实施例中，CAR-T细胞的MHC基因未经基因修饰。在一些实施例中，CAR靶向肿瘤抗原，该肿瘤抗原选自由以下组成的组：CD19、BCMA、NY-ESO-1、VEGFR2、MAGE-A3、CD20、CD22、CD33、CD38、CEA、EGFR、GD2、HER2、IGF1R、间皮素、PSMA、ROR1、WT1、及其组合。在一些实施例中，CAR是抗BCMA CAR。在一些实施例中，CAR是抗CD19 CAR。在一些实施例中，ICL是PD-L1。在一些实施例中，CAR-T细胞是同种异体的。
在一些实施例中，提供了治疗个体(例如，人)的疾病或病症(例如，癌症)的方法，该方法包括向该个体施用有效量的药物组合物，该药物组合物包含CAR-T细胞和药学上可接受的载剂，其中该CAR-T细胞包含编码PD-L1的第一异源核酸序列和编码靶向BCMA的CAR的第二异源核酸序列，其中该免疫细胞表达MHC分子。在一些实施例中，CAR-T细胞表达MHCI类分子。在一些实施例中，CAR-T细胞表达MHC II类分子。在一些实施例中，CAR-T细胞同时表达MHC I类分子和MHC II类分子。在一些实施例中，CAR-T细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因未经基因修饰。在一些实施例中，CAR-T细胞的MHC基因未经基因修饰。在一些实施例中，CAR-T细胞是同种异体的。在一些实施例中，CAR是BSF17 CAR。在一些实施例中，CAR包含SEQID NO:10的氨基酸序列、或该氨基酸序列的变体，该变体与SEQ ID NO:10具有至少约85％(例如，至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性。在一些实施例中，PD-L1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列、或该氨基酸序列的变体，该变体与SEQ ID NO:1具有至少约85％(例如，至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性。在一些实施例中，CAR-T细胞包含核酸序列，该核酸序列编码SEQ ID NO:12的氨基酸序列、或该氨基酸序列的变体，该变体与SEQ ID NO:12具有至少约85％(例如，至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性。
本文所述的方法适用于治疗疾病或病症，如癌症、自身免疫性疾病、或感染性疾病。本文所述的方法可用于治疗多种癌症，这些癌症同时包括实体癌和液体癌。在一些实施例中，癌症选自由以下组成的组：白血病、淋巴瘤、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、骨癌、脑癌、胰腺癌和卵巢癌。这些方法可应用于所有阶段的癌症，包括早期癌症、非转移性癌症、原发性癌症、晚期癌症、局部晚期癌症、转移性癌症或缓解期癌症。本文所述的方法可以在辅助治疗或新辅助治疗中用作第一疗法、第二疗法、第三疗法或与本领域已知的其他类型的癌症疗法(例如，化学疗法、手术、激素疗法、辐射、基因疗法、免疫疗法、骨髓移植、干细胞移植、靶向疗法、冷冻疗法、超声疗法、光动力疗法、射频消融等)的组合疗法(即，该方法可在基本疗法/针对性疗法之前进行)。在一些实施例中，该方法用于治疗先前已被治疗的个体。在一些实施例中，癌症对于先前疗法是难治的。在一些实施例中，该方法用于治疗先前未被治疗的个体。在一些实施例中，该方法用于治疗血癌，例如白血病或淋巴瘤，包括浆细胞瘤和骨髓瘤。
在本文所述的方法中施用的经修饰的治疗细胞的有效量将取决于许多因素，如所治疗的疾病或病症(例如，癌症)的特定类型和阶段、施用途径、工程化受体的活性等。适当的剂量方案可由医师基于临床因素确定，这些临床因素包括患者的体型、体表面积、年龄、待施用的特定化合物、性别、施用时间和途径、一般健康状况以及同时施用的其他药物。在一些实施例中，药物组合物的有效量低于诱导毒理学效应(即，高于临床上可接受的毒性水平的效应)的水平，或在向个体施用药物组合物时处于可以控制或耐受潜在副作用的水平。在一些实施例中，药物组合物的有效量包含约105至约109个经修饰的治疗细胞/kg。
在一些实施例中，将药物组合物施用一次(例如，推注)。在一些实施例中，施用多次(例如2、3、4、5、6或更多次中的任一个)药物组合物。当多次施用药物组合物时，每次施用可以使用相同或不同的途径并且可以在相同部位或在可替代的部位进行。药物组合物可以以合适的频率施用，例如从每天到每年一次。通过监测患者的疾病体征并相应调整治疗，医学领域的技术人员可以容易地确定针对特定患者的最佳剂量和治疗方案。
在一些实施例中，待治疗的个体是哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于人、猴、大鼠、小鼠、仓鼠、豚鼠、狗、猫、兔、猪、绵羊、山羊、马、牛等。在一些实施例中，个体是人。
经修饰的治疗细胞同时适合于自体细胞疗法和同种异体细胞疗法。在一些实施例中，经修饰的治疗细胞对于待治疗的个体是同种异体的。在一些实施例中，经修饰的治疗细胞具有与待治疗的个体匹配的MHC同种异型。在一些实施例中，经修饰的治疗细胞具有与待治疗的个体错配的MHC同种异型。
涉及排斥外来器官的基因座被称为主要组织相容性复合体(MHC)，并且该MHC编码高度多态的细胞表面分子。人MHC被称为HLA(人白细胞抗原)。移植物排斥与针对同种异体白细胞的抗体的产生有关。
MHC I类分子在几乎所有有核细胞的表面上表达。I类HLA基因包括HLA-A、HLA-B和HLA-C，它们编码I类分子的重链。次要的I类HLA基因包括HLA-E、HLA-F和HLA-G。β2-微球蛋白与主要和次要基因亚基结合以产生HLA I类异源二聚体。
MHC II类分子在B淋巴细胞、抗原呈递细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞)和激活的T细胞上表达。II类HLA基因包括HLA-DP(即，编码α链的HLA-DPA1和编码β链的HLA-DPB1)、HLA-DQ(即，编码α链的HLA-DQA1和编码β链的HLA-DQB1)、和HLA-DR(即，编码α链的HLA-DRA、以及编码β链的HLA-DRB1、DRB3、DRB4和DRB5)。
HLA基因是高度多态的，并且每个HLA基因具有许多不同的等位基因。可以进行HLA分型、HLA抗体筛选和交叉匹配来评估经修饰的治疗细胞与被治疗的个体的那些相比是否具有错配的一个或多个HLA等位基因，因为该个体的T细胞识别外来HLA可以触发针对过继转移的细胞的免疫应答。HLA分型、抗体筛选和交叉匹配的方法是本领域已知的。参见例如，Choo，Yonsei Medical Journal,48(1):11-23(2007)和Althaf等人,World Journal ofTransplantation,2017,7(6):339-348，这些文献通过援引以其全文并入本文。
HLA分型可以使用血清学或分子分型方法进行。在血清学HLA分型测定中，使用含有血清的托盘，该血清具有针对多种已知HLA等位基因的抗体。为了分型，将接受者淋巴细胞引入接触血清、补体和染料的托盘孔中。在抗体可以与淋巴细胞表面的抗原结合的托盘孔中，补体被激活。这导致触发的补体途径导致细胞死亡，最终使染料进入细胞。然后在相差显微镜下鉴定具有显著细胞死亡的托盘孔。通过比较和消除阳性孔的过程，分配了HLA类型。外周血淋巴细胞(PBL)可用于HLA-A、HLA-B和HLA-C的血清学分型。从PBL中分离的B细胞可用于HLA II类(如HLA-DRB1)的血清学分型。分子HLA分型可以使用基于PCR的测定法(如序列特异性寡核苷酸探针(SSOP)或序列特异性引物(SSP)方法)或通过DNA测序进行。
在一些实施例中，个体的一个或多个HLA等位基因与经修饰的治疗细胞的那些相比具有错配的同种异型。在一些实施例中，错配的等位基因针对一个或多个I类HLA基因。在一些实施例中，错配的等位基因针对一个或多个II类HLA基因。在一些实施例中，个体的HLA-A、HLA-B、HLA-C和HLA-DRB1的不超过8、7、6、5、4、3、2或1个等位基因中的任一个与经修饰的治疗细胞的那些相比具有错配的同种异型。在一些实施例中，个体的所有测试的HLA等位基因(例如，HLA-A、HLA-B、HLA-C和/或HLA-DRB1)与经修饰的治疗细胞的那些相比具有错配的同种异型。在一些实施例中，个体的所有测试的HLA等位基因(例如，HLA-A、HLA-B、HLA-C和/或HLA-DRB1)与经修饰的治疗细胞的那些相比具有匹配的同种异型。
在一些实施例中，在治疗方法之前进行HLA抗体筛选。可以通过针对一组具有已知HLA类型的淋巴细胞测试个体的血清来检测预先形成的HLA抗体。补体介导的微量淋巴细胞毒性技术或抗人球蛋白(AHG)增强方法可用于HLA抗体筛选。结果表示为具有反应性的群体细胞的百分比，称为群体反应性抗体百分比(％PRA)。在一些实施例中，个体的PRA不超过约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、25％或更少中的任一个。
在一些实施例中，在个体与经修饰的治疗细胞之间进行交叉匹配。在一些实施例中，个体对于经修饰的治疗细胞是交叉匹配阴性的。在一些实施例中，个体对于经修饰的治疗细胞是交叉匹配阳性的。在一些实施例中，个体具有针对经修饰的治疗细胞的一个或多个HLA等位基因的预先形成的抗体。
在一些实施例中，与使用不包含编码ICL的第一异源核酸序列的治疗细胞的方法相比，该方法减少与经修饰的治疗细胞相关的不希望的免疫应答。在一些实施例中，该方法将个体中与经修饰的治疗细胞相关的不希望的免疫应答减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高中的任一个。在一些实施例中，不希望的免疫应答包括HvGD。在一些实施例中，该方法将HvGD预防至少约10、20、30、40、50、60或更多天中的任一个。在一些实施例中，不希望的免疫应答是由接受治疗细胞的个体中的同种异体αβT细胞介导的。在一些实施例中，不希望的免疫应答是由接受治疗细胞的个体中的同种异体ΝK细胞介导的。在一些实施例中，与使用不包含编码ICL的第一异源核酸序列的治疗细胞的方法相比，该方法将接受治疗细胞的个体中同种异体αβT细胞的增殖降低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高中的任一个。在一些实施例中，与使用不包含编码ICL的第一异源核酸序列的治疗细胞的方法相比，该方法将接受治疗细胞的个体中同种异体ΝK细胞的增殖降低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高中的任一个。在一些实施例中，不希望的免疫应答包括移植物排斥。在一些实施例中，该方法将移植物排斥预防至少约10、20、30、40、50、60或更多天中的任一个。在一些实施例中，不希望的免疫应答包含针对经修饰的治疗细胞的抗药物抗体(ADA)。在一些实施例中，该方法将针对经修饰的治疗细胞的ADA减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高中的任一个。在一些实施例中，与使用不包含编码ICL的第一异源核酸序列的治疗细胞的方法相比，该方法在个体中诱导对经修饰的治疗细胞的免疫耐受。在一些实施例中，该方法减少或抑制经修饰的治疗细胞的NK细胞介导的清除。在一些实施例中，该方法减少或抑制经修饰的治疗细胞的T细胞介导的清除。在一些实施例中，该方法同时减少或抑制经修饰的治疗细胞的NK细胞介导的清除和T细胞介导的清除。
在一些实施例中，提供了在有需要的个体中减少针对同种异体治疗细胞的移植物排斥的方法，该方法包括向该个体施用有效量的同种异体治疗细胞，其中这些同种异体治疗细胞包含编码ICL的第一异源核酸序列，并且其中这些治疗细胞表达MHC分子。在一些实施例中，ICL选自由以下组成的组：PD-L1、CD155、CD112、FGL1、半乳凝素-9、CD47、B7H3和B7H4。在一些实施例中，治疗细胞是免疫细胞，如细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、NK细胞、NK-T细胞、αβT细胞、γδT细胞、肿瘤浸润性T细胞、树突状细胞(DC)激活的T细胞、外周血单核细胞(PBMC)、或其组合。在一些实施例中，治疗细胞是干细胞，如HSC或ESC。在一些实施例中，治疗细胞进一步包含编码工程化受体(如CAR、重组TCR、TAC受体和/或TFP)的第二异源核酸序列。在一些实施例中，治疗细胞是CAR-T细胞。在一些实施例中，与未经修饰的治疗细胞相比，ICL的表达水平升高。在一些实施例中，ICL是PD-L1。在一些实施例中，治疗细胞是CAR-T细胞。
药物组合物
在一些实施例中，提供了包含本文所述的经修饰的治疗细胞中的任一种的组合物。组合物可以包含任何数量的经修饰的治疗细胞。在一些实施例中，组合物包含单拷贝的经修饰的治疗细胞。在一些实施例中，组合物包含至少约1、10、100、1000、104、105、106、107、108或更多个拷贝中任一个的经修饰的治疗细胞。在一些实施例中，提供了药物组合物，该药物组合物包含有效量的经修饰的治疗细胞(如同种异体CAR-T细胞)和药学上可接受的载剂。
还提供了用于本文所述的任一种方法中的组合物，以及该组合物在制备用于本文所述的任一种方法的药物中的用途。
如本文所用，“载剂”包括在所采用的剂量和浓度下对暴露于其的细胞或个体无毒的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂。生理学上可接受的载剂通常是pH缓冲水溶液。合适的药物载剂的实例是本领域熟知的，并且包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(如油/水乳液)、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒。
包含这样的载剂的药物组合物可通过熟知的常规方法配制。溶剂或稀释剂优选是等渗的、低渗的或弱高渗的，并且具有相对低的离子强度。代表性实例包括无菌水，生理盐水(例如，氯化钠)，林格氏溶液，葡萄糖、海藻糖或蔗糖溶液，汉克氏溶液(Hank'ssolution)和其他生理平衡盐水溶液(参见，例如最新版的Remington:The Science andPractice of Pharmacy,A.Gennaro,Lippincott,Williams&Wilkins)。
本文所述的药物组合物可以经由任何合适的途径施用。在一些实施例中，将药物组合物肠胃外、经皮(进入真皮)、腔内、动脉内(进入动脉)、肌内(进入肌肉)、鞘内或静脉内施用。在一些实施例中，将药物组合物皮下(在皮肤下)施用。在一些实施例中，将药物组合物静脉内施用。在一些实施例中，将药物组合物经由输注或注射向个体施用。在一些实施例中，将药物组合物直接施用至靶部位，例如通过生物射弹递送至内部或外部靶部位或者通过导管施用至动脉中的部位。在一些实施例中，将药物组合物局部(例如，瘤内)施用。施用可以使用常规的注射器和针头或本领域可获得的能够促进或改善一种或多种活性剂在受试者中的递送的任何化合物或装置。
用于肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯(如油酸乙酯)。水性载剂包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏溶液或固定油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏右旋糖的那些)等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，例如像抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。此外，本披露的药物组合物可以包含蛋白质载剂，像例如血清白蛋白或免疫球蛋白，优选人来源的。
在一些实施例中，药物组合物被适当地缓冲以供人使用。合适的缓冲液包括但不限于磷酸盐缓冲液(例如，PBS)、碳酸氢盐缓冲液和/或能够维持生理或弱碱性pH(例如，大约pH 7至大约pH 9)的Tris缓冲液。在一些实施例中，还可以通过添加合适的张力改性剂(如甘油)使药物组合物与血液等渗。
在一些实施例中，药物组合物包含在单次使用的小瓶(如单次使用的密封小瓶)中。在一些实施例中，药物组合物包含在多次使用的小瓶中。在一些实施例中，药物组合物以散装包含在容器中。
在一些实施例中，药物组合物必须满足用于向个体施用的某些标准。例如，美国食品与药品管理局已经发布了为基于细胞的免疫治疗产品设定标准的监管指南，包括21CFR610和21CFR 610.13。本领域已知评估药物组合物的外观、特性、纯度、安全性和/或效力的方法。在一些实施例中，药物组合物基本上不含能够产生过敏作用的外来蛋白质，例如细胞培养中使用的除治疗细胞之外的动物来源的蛋白质。在一些实施例中，“基本上不含”是小于药物组合物的总体积或重量的约10％、5％、1％、0.1％、0.01％、0.001％、1ppm或更少中的任一个。在一些实施例中，药物组合物在GMP级工作间(GMP-level workshop)中制备。在一些实施例中，对于肠胃外施用，药物组合物包含小于约5EU/kg体重/小时的内毒素。在一些实施例中，对于静脉内施用，药物组合物中至少约70％的治疗细胞是活的。在一些实施例中，当使用如美国药典(USP)中所述的14天直接接种测试方法评估时，药物组合物具有“无生长”结果。在一些实施例中，在施用药物组合物之前，同时包括治疗细胞和药学上可接受的赋形剂的样品应在最终收获前大致约48-72小时(或与培养物的最后再补料(re-feeding)同时)取出用于无菌测试。在一些实施例中，药物组合物不含支原体污染。在一些实施例中，药物组合物不含可检测的微生物剂。在一些实施例中，药物组合物不含传染病病原，例如HIV I型、HIV II型、HBV、HCV、人嗜T淋巴细胞病毒I型和人嗜T淋巴细胞病毒II型。
IV.套件和制品
还提供了包含本文所述的经修饰的治疗细胞中任一种的套件、单位剂量和制品。
在一些实施例中，提供了含有本文所述的药物组合物中任一种的套件，并且优选提供了其使用说明。在一些实施例中，提供了套件，其包含：(a)本文所述经修饰的治疗细胞中任一种；以及(b)用于本文所述的任一种方法中的说明。在一些实施例中，经修饰的治疗细胞是同种异体治疗细胞。在一些实施例中，经修饰的治疗细胞是经修饰的免疫细胞。
在一些实施例中，提供了套件，其包含：(a)包含同种异体CAR-T细胞的组合物，该同种异体CAR-T细胞包含编码ICL的第一异源核酸序列，其中该CAR-T细胞表达MHC分子；以及(b)用于治疗有需要的个体的疾病或病症(例如，癌症)的说明。在一些实施例中，同种异体CAR-T细胞是通用CAR-T细胞。在一些实施例中，同种异体CAR-T细胞靶向BCMA或CD19。在一些实施例中，同种异体CAR-T细胞未经基因修饰以降低个体中同种异体细胞的免疫原性。在一些实施例中，同种异体CAR-T细胞的MHC基因(例如，B2M基因)未经基因修饰。在一些实施例中，同种异体CAR-T细胞不具有除了CAR或ICL之外的基因修饰。在一些实施例中，ICL选自由以下组成的组：PD-L1、CD155、CD112、FGL1、半乳凝素-9、CD47、B7H3和B7H4。
在一些实施例中，套件进一步包含一种或多种淋巴细胞清除剂。在一些实施例中，套件进一步包含氟达拉滨(fludarabine)和环磷酰胺。在一些实施例中，除了经修饰的治疗细胞之外，套件进一步包含第二癌症疗法，例如化学疗法、激素疗法和/或免疫疗法。一个或多个套件可以针对个体的特定癌症进行定制，并且包含针对个体的相应的第二癌症疗法。
套件可以含有一种或多种另外的组分，例如容器、试剂、培养基、诱导物、细胞因子、缓冲液、抗体等，以允许经修饰的治疗细胞的繁殖或诱导。套件还可以含有用于施用药物组合物的装置。
本申请的套件在合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶、罐子、柔性包装(例如，密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。套件可以任选地提供另外的组分，例如缓冲液和解释信息。因此本申请还提供了制品，这些制品包括小瓶(如密封的小瓶)、瓶、罐子、柔性包装等。套件的一些组分可以以水性介质或以冻干形式包装。
制品可以包含容器和该容器上或与该容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如，瓶、小瓶、注射器等。容器可以由多种材料(如玻璃或塑料)形成。通常，容器容纳有效治疗本文所述的疾病或障碍(如癌症)的组合物，并且可具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。标签或包装插页指示组合物用于治疗个体的特定病症。标签或包装插页将进一步包含用于向个体施用组合物的说明。标签可指示用于重构和/或使用的指导。容纳药物组合物的容器可以是多次使用的小瓶，其允许重复施用(例如，2-6次施用)。包装插页是指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明，这些说明含有关于使用这样的治疗产品的适应证、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。另外，制品可进一步包含第二容器，该第二容器包含药学上可接受的缓冲液，如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。其可以进一步包括从商业和用户角度所希望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
套件或制品可包括多个单位剂量的药物组合物和使用说明，其包装的数量足以在药房(例如，医院药房和配药药房)中储存和使用。
实例
以下实例和示例性实施例仅旨在作为本发明的示例，并因此不应视为以任何方式限制本发明。以下实例和详细描述是作为说明而不是作为限制而提供的。
实例1：质粒构建和病毒产生
编码以下的构建体的设计如图1A和1B所显示：免疫检查点配体(ICL)(如PD-L1、CD155、CD112、FGL1、半乳凝素-9、CD47、B7H3或B7H4)、具有共表达的ICL的嵌合抗原受体(CAR)(本文也称为“装甲的(armored)CAR”)、或不具有共表达的ICL的对照CAR(本文也称为“无装甲的CAR”)。SEQ ID NO:1-8是ICL的示例性序列。SEQ ID NO:9-10是CAR的示例性序列。SEQ ID NO:12-27是ICL装甲的CAR的示例性序列。通过将原始启动子替换为人类延伸因子1α启动子(hEF1α)并通过用EcoRI和BamHI去除嘌呤霉素抗性基因来修饰慢病毒载体pLVX-Puro(Clontech编号632164)，以提供PLVX-EF1A。将各个构建体克隆到PLVX-EF1A中，然后使其经历如下所述的慢病毒包装程序。
为了产生包含上述靶构建体的核酸的病毒粒子，将包括pMDLg/pRRE(Addgene编号11251)、pRSV-Rev(Addgene编号11253)和pMD2.G(Addgene编号11259)的慢病毒包装质粒混合物与PLVX-EF1A载体(包括靶构建体)以预先优化的比率与聚醚酰亚胺(PEI)预先混合，适当混合并在室温下孵育5分钟。将转染混合物逐滴添加滴至293-T细胞中并轻轻混合。将转染的293-T细胞在37℃和5％CO2下孵育过夜。转染后二十四小时，收集上清液，并在4℃、500g下离心10分钟以去除任何细胞碎片。将离心后的上清液通过0.45μm PES过滤器过滤，通过超速离心浓缩病毒上清液。离心后，小心丢弃上清液，并用预冷的DPBS冲洗病毒沉淀。测量病毒的浓度。将病毒等分并储存在-80℃。通过标准T细胞系的功能性转导确定病毒滴度。
以下实例表明了表达作为代表性免疫检查点配体的PD-L1的CAR-T细胞用于治疗作为示例性适应证的多发性骨髓瘤和B细胞恶性肿瘤的功效，CAR构建体分别经由BCMA和CD-19靶向这些适应证。因此，选择编码所述设计(即，对应于SEQ ID NO:9、10、12和20)的病毒用于同时转导αβT细胞和γδT细胞。
实例2：T细胞转导和转导的T细胞的FACS分析
αβT细胞转导
在R10培养基中收集αβ白细胞，然后将其与0.9％NaCl溶液以1:1(v/v)的比率混合。将3mL的Lymphoprep培养基添加到15mL离心管中，使其缓慢分层以形成6mL稀释的淋巴细胞混合液。将淋巴细胞混合液在20℃下以800g不停地离心30分钟。然后用200μL移液器收集淋巴细胞血沉棕黄层。使用0.9％NaCl或R10将收获的部分稀释至少6倍以降低溶液的密度，然后进一步在20℃下以250g离心10分钟。将上清液完全吸出，并将10mL的R10添加到细胞沉淀物中。将混合物在20℃下以250g进一步离心10分钟。然后将上清液吸出。将两毫升R10在37℃下预热并补充100IU/mL的IL-2，将其添加到细胞沉淀物中以轻轻地重悬该细胞沉淀物。将细胞定量并且准备好PBMC样品用于实验。使用Miltenyi泛T细胞分离套件(目录号130-096-535)从PBMC中纯化人T细胞。
随后用人T细胞激活/扩增套件(Milteny编号130-091-441)通过每两个细胞使用一个加载的抗生物素MACSiBead粒子(珠与细胞的比率为1:2)来预激活制备的αβT细胞48小时。
收集预激活的αβT细胞并重悬于含有300IU/mL IL-2的1640培养基中。将各个编码实例1的构建体的慢病毒载体用相同的培养基稀释至MOI＝5并用于感染106个预激活的αβT细胞。在8μg/ml聚凝胺存在下，用慢病毒原液转导预激活的T细胞，在32℃下以1000g离心1h。接着将转导的细胞转移至细胞培养箱中，以在合适条件下表达转基因。第二天，将转导的细胞离心并更换新鲜培养基。每隔一天测量细胞密度，并添加新鲜培养基以使扩增继续。
γδT细胞转导
通过密度离心(lymphoprep)从白细胞去除术材料中分离PBMC并冷冻保存。将PBMC复苏并在补充有IL-2(1000IU/ml)和5％人AB血清的细胞培养基AIM-V中用唑来膦酸(5μΜ)激活，并且保存在加湿室(37℃，5％CO2)中。激活后四十八小时，在MOI为5且存在5pg/ml聚凝胺时，用编码实例1中所述的构建体的慢病毒载体转导细胞。第二天重复这种转导程序，随后在第二次转导后的当天补充含有IL-2(1000IU/ml)的新鲜培养基。在加湿室中在补充有IL-2(1000IU/ml)的AIM-V培养基中培养细胞，通过培养基的pH来确定培养基的定期更换，以实现进一步扩增。转导后10天收获细胞，并确定细胞的总数、纯度和转导效率。在将来应用或冷冻保存之前，用阴性TCRγ/δ+T细胞分离套件(Miltenyi Biotec)进一步富集细胞。
实例3：转基因表达的定量
在转导后第7天，通过流式细胞术评价细胞对以下的表达：实例1指示的构建体的嵌合抗原受体和ICL装甲。从培养物中收集等分的细胞，将其洗涤、沉淀并重悬于在50-100μl的PBS+0.5％FBS/样品中稀释因子为100的稀释的抗体(eBioscience抗人TCRβPE、抗CARAb或抗ICP配体抗体)中。将细胞在4℃下孵育30分钟。然后根据制造商的说明添加活力染料eFluor780或SYTOX蓝活力染色剂。孵育后，将细胞在PBS中洗涤两次并重悬于100至200μl的PBS中进行分析。通过流式细胞术定量系统的平均荧光。
对于ICL染色，将细胞用PE标记的抗体(eBioscience，PD-L1，目录号12-5983-42)染色。对于抗BCMA CAR-T染色，将细胞用Alexa Fluor 488标记的小鼠抗骆驼sdAb抗体(Genscript)染色。对于抗CD19 CAR-T染色，将细胞用Alexa Fluor 488标记的人CD19蛋白(Genscript)染色。使用FlowJo(Tree Star,Inc.)进行流式细胞术分析。可以使用PE标记的抗体对表达以下其他ICL配体的细胞进行染色：eBioscience，CD155，目录号12-1550-41；CD112，目录号12-1121-82；半乳凝素-9，目录号25-9211-82；FGL1，目录号PA5-30030；CD47，目录号25-0471-80；B7H3，目录号12-5973-80；以及B7H4，目录号12-5949-41。
结果显示于图2中。抗BCMA和抗CD19 CAR都可在αβT细胞或γδT细胞中以足够的水平表达，CAR阳性率>30％(图2A和2C)。此外，在CAR+细胞中，对于装甲的构建体，确定了PD-L1装甲表达为>95％，较未装甲时的<20％增加了(图2B和2D)。
实例4：体外杀伤和细胞因子释放
αβT细胞的细胞毒性测定
在20h共培养测定中确定了CAR-T细胞以及对应的对照αβT细胞的细胞毒性。在实验中，通过离心收集效应细胞，然后将其用补充有2％热灭活的FBS(Invitrogen)的1640无酚红培养基(Invitrogen)稀释到所希望的浓度。选择了RPMI-8226(一种表达靶抗原BCMA的人B淋巴细胞)作为抗BCMA CAR-T细胞的靶细胞系。选择了Raji(一种表达靶抗原CD19的人B淋巴细胞)作为抗CD19 CAR-T细胞的靶细胞系。将效应细胞和对应的靶细胞以不同的效应细胞与靶细胞比率(对于RPMI-8226，E:T＝2:1、1:1、0.5:1、0.25:1和0:1，并且对于Raji，E:T＝1:1、0.5:1、0.25:1和0:1)在37℃下在96孔板中共培养20h。对照孔仅含有测定缓冲液(1640无酚红培养基加2％hiFBS)、仅含有靶细胞(T)、仅含有效应细胞(E)和最大释放量的靶细胞(1％Triton-X 100溶液)。每种条件以一式三份重复，并且通过乳酸脱氢酶(LDH)测定套件(Roche)检测效应细胞的细胞毒性。完成20h的共培养后，将测定板离心，并将上清液转移至新的96孔板中。根据制造商的手册，用等体积的LDH测定试剂稀释上清液。将测定板在15℃-25℃下孵育约30min。使用Flexstation读数器(Molecular Devices)在492nm和650nm处测量板的吸光度，以提供针对每种条件的相对细胞毒性。为了进一步确定长期持久性，使这些效应细胞经历多轮靶细胞刺激，以确定其在重复抗原刺激的背景下的抗肿瘤毒性水平。
γδT细胞的细胞毒性测定
在转导后七天对用含有实例1的构建体的慢病毒载体转导的γδT细胞的细胞毒性进行评估。特别地，将转导的或未转导的γδT细胞与BCMA或CD19阳性靶细胞系RPMI-8226或Raji一起孵育，并使用如上所述的LDH测定套件(Roche)评价γδT细胞的细胞毒性作用。类似地，为了进一步确定长期持久性，使这些效应细胞经历多轮靶细胞刺激，以确定其在重复抗原刺激的背景下的抗肿瘤毒性水平。
结果显示于图3中。我们证明了对于抗BCMA设计，在指定的E:T比率下在αβT细胞或γδT细胞中，与未装甲的BSF17 CAR相比，PD-L1装甲的BSF17CAR对RPMI-8226细胞展现出类似的细胞毒性水平(图3A和3B)。此外，对于抗CD19设计，在指定的E:T比率下在γδT细胞中，与未装甲的CTL-019CAR相比，PD-L1装甲的CRL-019CAR对Raji细胞展现出类似的细胞毒性水平(图3C)。为了进一步评估这些细胞的长期持久性，进行了重复刺激。我们发现，对于抗BCMA设计，在指定的E:T比率下在αβT细胞或γδT细胞中，与未装甲的BSF17 CAR相比，PD-L1装甲的BSF17 CAR对RPMI-8226细胞展现出类似的长期持久性水平(图3D和3E)。此外，对于抗CD19设计，在指定的E:T比率下在γδT细胞中，与未装甲的CTL-019CAR相比，PD-L1装甲的CTL-019CAR对Raji细胞展现出类似的长期持久性水平(图3F)。总之，这些结果表明，添加PD-L1装甲不会减弱CAR-T的短期细胞毒性或改变其在体外的长期持久性。
实例5：细胞因子释放
收集细胞毒性测定板的上清液以用于使用商业套件(人IFNγ套件，Cisbio，目录号62HIFNGPEH；人TNFα套件，Cisbio，目录号62HTNFAPEH)进行细胞因子释放分析。可使用其他商业套件来评估另外的细胞因子的释放：人IL6套件，Cisbio，目录号62HIL06PEG；和人IL2套件，Cisbio，目录号62HIL02PEH。将细胞上清液和ELISA标准品直接分配到测定板中，以使用
Figure BDA0003864713290000771
试剂进行细胞因子检测。将用HTRF供体和受体标记的抗体预先混合，并在单个分配步骤中添加。
使用四参数逻辑(4PL)曲线生成ELISA标准曲线。与线性分析相比，使用标准曲线的回归能在更大的浓度范围内准确确定未知样品浓度，其适用于分析生物系统，如细胞因子释放。可应用的测定套件包括人IFNγ套件(Cisbio，目录号62HIFNGPEH)和人TNFα套件(Cisbio，目录号62HTNFAPEH)。
结果显示于图4中。我们发现，对于抗BCMA设计，在指定的E:T比率下在αβT细胞或γδT细胞中，与未装甲的BSF17 CAR相比，PD-L1装甲的BSF17CAR展现出类似的TNF-α和IFN-γ细胞因子产生水平(图4A和4B)。此外，对于抗CD19设计，在指定的E:T比率下在γδT细胞中，与未装甲的CTL-019CAR相比，PD-L1装甲的CTL-019CAR展现出类似的TNF-α和IFN-γ细胞因子产生水平(图4C)。总之，这些结果表明，添加PD-L1装甲不会改变体外CAR-T细胞因子产生特性。
实例6：体外HvGD测定
经由单向混合淋巴细胞反应(MLR)测定评估了HvGD。简言之，PD-L1装甲的BSF17-CAR-γδT细胞(SEQ ID NO:20)、未装甲的BSF17-CAR-γδT细胞(SEQ ID NO:10)和未转导的γδT细胞经γ辐照并与来自两个不同供体的CFSE标记的HLA错配的同种异体PBMC一起共孵育持续7天的时间段。在实验结束时，通过流式细胞术评价每种条件下同种异体αβT细胞的增殖。
图5A、5C、5E、5G和5I显示了对照组的结果，这些对照组包括用CD3珠处理的PBMC(针对αβT细胞增殖的阳性对照)、用IL-18处理的PBMC(针对NK细胞增殖的阳性对照)或未经处理的、表明测定的可靠性的PBMC。为了评估PBMC中同种异体αβT细胞的增殖，例如，在图5A的右分图中，PBMC中96.9％的αβT细胞显示出弱的CFSE染色，这是由于CD3刺激导致αβT细胞增殖而稀释了CFSE染料。相比之下，在图5A的左分图中，当PBMC未经处理时，PBMC中99.2％的αβT细胞显示出强的CFSE染色，这是因为在刺激不存在的情况下很少甚至没有发生αβT细胞增殖。类似地，为了评估PBMC中同种异体NK细胞的增殖，在图5C的右分图中，PBMC中92.9％的NK细胞显示出弱的CFSE染色，这是由于IL-18(一种公认的人NK细胞刺激物)刺激导致αβT细胞增殖而稀释了CFSE染料。相比之下，在图5A的左分图中，当PBMC未经处理时，PBMC中99.9％的NK细胞显示出强的CFSE染色，这是因为在刺激不存在的情况下很少甚至没有发生NK细胞增殖。因此，当同种异体PBMC与αβT细胞或γδT细胞共培养时，较高的HvGD对应于强度较弱的CFSE染色，因为αβT细胞或γδT细胞刺激了同种异体PBMC中αβT细胞或NK细胞的增殖。
我们首先证明了αβT细胞和γδT细胞上具有抗BCMA(BSF17-CAR)的ICL装甲的潜在益处。如图5B和5F所显示，对于两种PBMC供体，PD-L1在αβCAR-T细胞或γδCAR-T细胞中的共表达大幅减少了同种异体αβT细胞的增殖。特别地，在图5F中，对于错配的供体1，当γδCAR-T细胞用PD-L1装甲时，观察到增殖减少超过60％(从52.4％到22.7％)。对于错配的供体2，当γδCAR-T细胞用PD-L1装甲时，观察到增殖减少超过80％(从19.9％到3.37％)。值得注意的是，对于错配的供体2，PD-L1装甲的γδT显示出3.37％的最低增殖水平，这与自体供体PBMC中的αβT细胞增殖的水平(3.51％)相当。在这种特定的情况下，HvGD在体外被完全消除。当αβCAR-T细胞用PD-L1装甲时，观察到类似但程度较低的效果。特别地，在图5B中，对于错配的供体1，当αβCAR-T细胞用PD-L1装甲时，观察到增殖减少40％左右(从65.5％到41.8％)。对于错配的供体2，当αβCAR-T细胞用PD-L1装甲时，观察到增殖减少约15％(从60.5％到51.5％)。另一方面，我们还证明了PD-L1装甲可以减少PBMC中同种异体NK增殖。如图5D和5H中所显示，当αβCAR-T细胞用PD-L1装甲时，观察到增殖减少50％左右(从28.2％到13.6％)。同时，当γδCAR-T细胞用PD-L1装甲时，观察到增殖减少大约60％(从31.2％到12.6％)。总体而言，这些数据表明，γδCAR-T细胞或αβCAR-T细胞上的PD-L1装甲可以经由抑制同种异体αβT细胞和NK细胞的增殖在体外显著降低HvGD。
γδT细胞上PD-L1装甲的CTL-019CAR的结果进一步支持了这些发现。在图5J中，我们证明，PD-L1在γδCAR-T细胞中的共表达大幅减少了同种异体αβT细胞的增殖。特别地，当γδCAR-T细胞用PD-L1装甲时，观察到增殖减少约60％(从52.4％到23.1％)。该结果进一步扩大了该装甲在其他适应证或分子设计中的效用。
总之，我们显示了在CAR-αβT细胞或γδT细胞上添加ICL配体(特别是PD-L1)可以大幅降低体内HvGD的风险，从而突出其在同种异体现成细胞疗法产品中的潜在治疗用途。
实例7：ICL装甲的CAR-T细胞的体内抗肿瘤功效
在RPMI-8226(骨髓瘤)异种移植模型中对示例性抗BCMA CAR-T的抗肿瘤活性进行了体内评估。简言之，在第0天，将一百万(1×106)个稳定表达萤火虫荧光素酶报告基因的RPMI-8226细胞经皮下或静脉内植入NOD/SCID IL-2RγCnull(NSG)小鼠中。肿瘤接种后十四天，将小鼠进行如下处理：静脉内注射1×106个ICL装甲的CAR-αβT细胞或CAR-γδT细胞、未转导的对照T细胞、或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。每周一次通过生物发光成像(BLI)监测肿瘤进展。此外，经由对经处理的小鼠的血浆样品的FACS分析监测T细胞增殖。此外，经由对经处理的小鼠的血浆样品的FACS分析监测T细胞增殖。
结果显示于图6中。我们证明了对于抗BCMA设计，在γδT细胞中，与未装甲的BSF17CAR相比，PD-L1装甲的BSF17 CAR展现出类似的体内功效水平(图6A和6B)。与对照组相比，两种设计都显示出优异的抗肿瘤细胞毒性，因为用任一细胞处理的小鼠均达到了无肿瘤状态持续至少两周，而对照组由于肿瘤过度生长而不得不被处死。此外，在γδT细胞中，与未装甲的BSF17 CAR相比，PD-L1装甲的BSF17 CAR展现出类似的体内增殖水平，两组都在治疗后7天左右达到峰值，外周血中CAR-T在1.5％左右(图6C)。总之，这些结果表明，添加PD-L1装甲不会改变体内CAR-T抗肿瘤功效或增殖。
此外，在Raji(伯基特淋巴瘤)异种移植模型中对示例性抗CD19 CAR-T的抗肿瘤活性进行了体内评估。简言之，在第0天，将一百万(1×106)个稳定表达萤火虫荧光素酶报告基因的Raji细胞经皮下或静脉内植入NOD/SCID IL-2RγCnull(NSG)小鼠中。肿瘤接种后七天，将小鼠进行如下处理：静脉内注射1×106个ICL装甲的CAR-αβT细胞或CAR-γδT细胞、未转导的对照T细胞、或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。每周一次通过生物发光成像(BLI)监测肿瘤进展。此外，经由对经处理的小鼠的血浆样品的FACS分析监测T细胞增殖。
实例8：针对CAR-T细胞的体内HvGD
还在小鼠模型中对HvGD进行了评价，其中将HLA错配的PBMC与CAR-T细胞在小鼠体内共孵育。简言之，将2×106个HLA-A2-PBMC静脉内注射到NCG小鼠体内。四天后，将5×106个HLA-A2+CAR-T细胞(ICL装甲的或未装甲的)、或未转导的对照T细胞静脉内注射到小鼠体内。进行流式细胞术和血常规测定以确定每组小鼠中HvGD的严重程度。
序列表
<110> 南京传奇生物科技有限公司
<120> 用于减少同种异体细胞疗法中的移植物排斥的组合物和方法
<130> IDC220292
<150> PCT/CN2020/082759
<151> 2020-04-01
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405 410 415
Gln Gly Leu Phe Asp Val His Ser Val Leu Arg Val Val Leu Gly Ala
420 425 430
Asn Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asn Pro Val Leu Gln Gln Asp
435 440 445
Ala His Gly Ser Val Thr Ile Thr Gly Gln Pro Met Thr Phe Pro Pro
450 455 460
Glu Ala Leu Trp Val Thr Val Gly Leu Ser Val Cys Leu Ile Ala Leu
465 470 475 480
Leu Val Ala Leu Ala Phe Val Cys Trp Arg Lys Ile Lys Gln Ser Cys
485 490 495
Glu Glu Glu Asn Ala Gly Ala Glu Asp Gln Asp Gly Glu Gly Glu Gly
500 505 510
Ser Lys Thr Ala Leu Gln Pro Leu Lys His Ser Asp Ser Lys Glu Asp
515 520 525
Asp Gly Gln Glu Ile Ala
530
<210> 8
<211> 282
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 8
Met Ala Ser Leu Gly Gln Ile Leu Phe Trp Ser Ile Ile Ser Ile Ile
1 5 10 15
Ile Ile Leu Ala Gly Ala Ile Ala Leu Ile Ile Gly Phe Gly Ile Ser
20 25 30
Gly Arg His Ser Ile Thr Val Thr Thr Val Ala Ser Ala Gly Asn Ile
35 40 45
Gly Glu Asp Gly Ile Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro Asp Ile Lys Leu
50 55 60
Ser Asp Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys Glu Gly Val Leu Gly Leu Val
65 70 75 80
His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Glu Leu Ser Glu Gln Asp Glu Met
85 90 95
Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Ala Asp Gln Val Ile Val Gly Asn
100 105 110
Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln Leu Thr Asp Ala Gly Thr Tyr
115 120 125
Lys Cys Tyr Ile Ile Thr Ser Lys Gly Lys Gly Asn Ala Asn Leu Glu
130 135 140
Tyr Lys Thr Gly Ala Phe Ser Met Pro Glu Val Asn Val Asp Tyr Asn
145 150 155 160
Ala Ser Ser Glu Thr Leu Arg Cys Glu Ala Pro Arg Trp Phe Pro Gln
165 170 175
Pro Thr Val Val Trp Ala Ser Gln Val Asp Gln Gly Ala Asn Phe Ser
180 185 190
Glu Val Ser Asn Thr Ser Phe Glu Leu Asn Ser Glu Asn Val Thr Met
195 200 205
Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn Val Thr Ile Asn Asn Thr Tyr Ser
210 215 220
Cys Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala Lys Ala Thr Gly Asp Ile Lys Val
225 230 235 240
Thr Glu Ser Glu Ile Lys Arg Arg Ser His Leu Gln Leu Leu Asn Ser
245 250 255
Lys Ala Ser Leu Cys Val Ser Ser Phe Phe Ala Ile Ser Trp Ala Leu
260 265 270
Leu Pro Leu Ser Pro Tyr Leu Met Leu Lys
275 280
<210> 9
<211> 486
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 9
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr
50 55 60
Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly
100 105 110
Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
130 135 140
Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser
145 150 155 160
Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
165 170 175
Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly
180 185 190
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
195 200 205
Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys
210 215 220
Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys
225 230 235 240
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
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260 265 270
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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385 390 395 400
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
405 410 415
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420 425 430
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
435 440 445
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
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485
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 10
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35 40 45
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65 70 75 80
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195 200 205
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305 310 315 320
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly
325 330 335
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420 425 430
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
435 440 445
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450 455 460
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485
<210> 11
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 11
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1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 12
<211> 798
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 12
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
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Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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340 345 350
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Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
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420 425 430
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
435 440 445
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
450 455 460
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465 470 475 480
Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu
485 490 495
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500 505 510
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545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val Asn Ala
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Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro Val Thr
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660 665 670
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770 775 780
Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu Glu Thr
785 790 795
<210> 13
<211> 925
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 13
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr
50 55 60
Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro
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Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
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100 105 110
Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
130 135 140
Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser
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165 170 175
Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly
180 185 190
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
275 280 285
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
290 295 300
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
305 310 315 320
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg
325 330 335
Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
340 345 350
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355 360 365
Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
370 375 380
Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
385 390 395 400
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
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420 425 430
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
435 440 445
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
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485 490 495
Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Arg Ala
500 505 510
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515 520 525
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580 585 590
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595 600 605
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Ser Gly Thr Val Thr Val Thr Ser Leu Trp Ile Leu Val Pro Ser Ser
705 710 715 720
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740 745 750
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755 760 765
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770 775 780
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915 920 925
<210> 14
<211> 1046
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 14
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser
145 150 155 160
Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
165 170 175
Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly
180 185 190
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
195 200 205
Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys
210 215 220
Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys
225 230 235 240
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
275 280 285
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
290 295 300
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
305 310 315 320
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
385 390 395 400
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
405 410 415
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
420 425 430
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
435 440 445
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
450 455 460
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
465 470 475 480
Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu
485 490 495
Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Arg Ala
500 505 510
Ala Ala Leu Leu Pro Ser Arg Ser Pro Pro Thr Pro Leu Leu Trp Pro
515 520 525
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Glu Thr Gly Ala Gln Asp Val Arg Val
530 535 540
Gln Val Leu Pro Glu Val Arg Gly Gln Leu Gly Gly Thr Val Glu Leu
545 550 555 560
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565 570 575
Thr Trp Gln Arg Pro Asp Ala Pro Ala Asn His Gln Asn Val Ala Ala
580 585 590
Phe His Pro Lys Met Gly Pro Ser Phe Pro Ser Pro Lys Pro Gly Ser
595 600 605
Glu Arg Leu Ser Phe Val Ser Ala Lys Gln Ser Thr Gly Gln Asp Thr
610 615 620
Glu Ala Glu Leu Gln Asp Ala Thr Leu Ala Leu His Gly Leu Thr Val
625 630 635 640
Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys Glu Phe Ala Thr Phe Pro Lys Gly
645 650 655
Ser Val Arg Gly Met Thr Trp Leu Arg Val Ile Ala Lys Pro Lys Asn
660 665 670
Gln Ala Glu Ala Gln Lys Val Thr Phe Ser Gln Asp Pro Thr Thr Val
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<213> 智人（Homo sapiens）
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Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln
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<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 20
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<212> PRT
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<400> 22
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<211> 821
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 23
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
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195 200 205
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245 250 255
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275 280 285
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
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<210> 24
<211> 864
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 24
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<210> 25
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<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 25
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<210> 26
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<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 26
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770 775 780
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820 825 830
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<210> 27
<211> 791
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 27
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245 250 255
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Lys Glu Gly Lys Asp Glu Leu Ser Glu Gln Asp Glu Met Phe Arg Gly
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Ile Ile Thr Ser Lys Gly Lys Gly Asn Ala Asn Leu Glu Tyr Lys Thr
645 650 655
Gly Ala Phe Ser Met Pro Glu Val Asn Val Asp Tyr Asn Ala Ser Ser
660 665 670
Glu Thr Leu Arg Cys Glu Ala Pro Arg Trp Phe Pro Gln Pro Thr Val
675 680 685
Val Trp Ala Ser Gln Val Asp Gln Gly Ala Asn Phe Ser Glu Val Ser
690 695 700
Asn Thr Ser Phe Glu Leu Asn Ser Glu Asn Val Thr Met Lys Val Val
705 710 715 720
Ser Val Leu Tyr Asn Val Thr Ile Asn Asn Thr Tyr Ser Cys Met Ile
725 730 735
Glu Asn Asp Ile Ala Lys Ala Thr Gly Asp Ile Lys Val Thr Glu Ser
740 745 750
Glu Ile Lys Arg Arg Ser His Leu Gln Leu Leu Asn Ser Lys Ala Ser
755 760 765
Leu Cys Val Ser Ser Phe Phe Ala Ile Ser Trp Ala Leu Leu Pro Leu
770 775 780
Ser Pro Tyr Leu Met Leu Lys
785 790

Claims (43)

1.一种经修饰的治疗细胞，其包含编码免疫检查点配体(ICL)的第一异源核酸序列，其中所述治疗细胞表达主要组织相容性复合体(MHC)分子。
2.如权利要求1所述的经修饰的治疗细胞，其中所述治疗细胞表达MHC I类分子。
3.如权利要求1或2所述的经修饰的治疗细胞，其中所述治疗细胞表达MHCII类分子。
4.如权利要求1-3中任一项所述的经修饰的治疗细胞，其中所述治疗细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因未经基因修饰。
5.如权利要求4所述的经修饰的治疗细胞，其中所述治疗细胞的MHC基因未经基因修饰。
6.如权利要求1-5中任一项所述的经修饰的治疗细胞，其中所述ICL选自由以下组成的组：PD-L1、CD155、CD112、FGL1、半乳凝素-9、CD47、B7H3和B7H4。
7.如权利要求6所述的经修饰的治疗细胞，其中所述ICL是PD-L1。
8.如权利要求1-6中任一项所述的经修饰的治疗细胞，其中所述ICL包含选自由SEQ IDNO:1-8组成的组的氨基酸序列、或其变体，所述变体包含与选自由SEQ ID NO:1-8组成的组的氨基酸序列具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列。
9.如权利要求1-8中任一项所述的经修饰的治疗细胞，其中所述治疗细胞是免疫细胞。
10.如权利要求9所述的经修饰的治疗细胞，其中所述免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、NK细胞、NK-T细胞、αβT细胞、γδT细胞、肿瘤浸润性T细胞、树突状细胞(DC)激活的T细胞、和外周血单核细胞(PBMC)。
11.如权利要求10所述的经修饰的治疗细胞，其中所述治疗细胞是T细胞。
12.如权利要求11所述的经修饰的治疗细胞，其中所述治疗细胞是γδT细胞。
13.如权利要求12所述的经修饰的治疗细胞，其中所述治疗细胞是γ9δ2T细胞。
14.如权利要求12所述的经修饰的治疗细胞，其中所述治疗细胞是δ1T细胞。
15.如权利要求12所述的经修饰的治疗细胞，其中所述治疗细胞是δ3T细胞。
16.如权利要求1-8中任一项所述的经修饰的治疗细胞，其中所述治疗细胞是干细胞。
17.如权利要求16所述的经修饰的治疗细胞，其中所述治疗细胞是胚胎干细胞。
18.如权利要求16所述的经修饰的治疗细胞，其中所述治疗细胞是造血干细胞(HSC)。
19.如权利要求1-18中任一项所述的经修饰的治疗细胞，其进一步包含编码工程化受体的第二异源核酸序列。
20.如权利要求19所述的经修饰的治疗细胞，其中所述工程化受体选自由以下组成的组：嵌合抗原受体(CAR)、重组T细胞受体(TCR)、T细胞抗原偶联剂(TAC)受体和TCR融合蛋白(TFP)。
21.如权利要求20所述的经修饰的治疗细胞，其中所述治疗细胞是CAR-T细胞。
22.如权利要求19-21中任一项所述的经修饰的治疗细胞，其中所述工程化受体靶向肿瘤抗原，所述肿瘤抗原选自由以下组成的组：CD19、BCMA、NY-ESO-1、VEGFR2、MAGE-A3、CD20、CD22、CD33、CD38、CEA、EGFR、GD2、HER2、IGF1R、间皮素、PSMA、ROR1、WT1、及其组合。
23.如权利要求22所述的经修饰的治疗细胞，其中所述工程化受体是抗BCMA CAR。
24.如权利要求22所述的经修饰的治疗细胞，其中所述工程化受体是抗CD19CAR。
25.如权利要求19-24中任一项所述的经修饰的治疗细胞，其中所述治疗细胞不具有除所述第一异源核酸序列和所述第二异源核酸序列之外的其他基因修饰。
26.如权利要求19-25中任一项所述的经修饰的治疗细胞，其中所述第一异源核酸序列和所述第二异源核酸序列可操作地连接至相同的启动子或不同的启动子。
27.如权利要求19-26中任一项所述的经修饰的治疗细胞，其中所述第一异源核酸序列和所述第二异源核酸序列存在于载体中。
28.如权利要求19-27中任一项所述的经修饰的治疗细胞，其中所述第一异源核酸序列经由编码可自切割的接头的第三核酸序列与所述第二异源核酸序列融合。
29.如权利要求28所述的经修饰的治疗细胞，其包含核酸序列，所述核酸序列编码选自由SEQ ID NO:12-27组成的组的氨基酸序列。
30.如权利要求1-29中任一项所述的经修饰的治疗细胞，其中与未经修饰的治疗细胞相比，所述ICL的表达水平升高。
31.一种药物组合物，其包含如权利要求1-30中任一项所述的经修饰的治疗细胞。
32.一种治疗有需要的个体的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的如权利要求31所述的药物组合物。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述经修饰的治疗细胞是同种异体的。
34.如权利要求32或33所述的方法，其中所述个体是人。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述个体的一个或多个人白细胞抗原(HLA)等位基因与所述经修饰的治疗细胞的那些相比具有错配的同种异型。
36.如权利要求35所述的方法，其中HLA-A、HLA-B、HLA-C和HLA-DRB1的一个或多个等位基因与所述经修饰的治疗细胞的那些相比具有错配的同种异型。
37.如权利要求34所述的方法，其中所述个体的所有测试的HLA等位基因与所述经修饰的治疗细胞的那些相比具有匹配的同种异型。
38.如权利要求32-37中任一项所述的方法，其中与使用不包含所述编码ICL的第一异源核酸序列的治疗细胞的方法相比，所述方法减少所述个体中针对所述治疗细胞的不希望的免疫应答。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述不希望的免疫应答包含宿主抗移植物(HvG)应答。
40.如权利要求32-39中任一项所述的方法，其中与使用不包含所述编码ICL的第一异源核酸序列的治疗细胞的方法相比，所述方法在所述个体中诱导对所述治疗细胞的免疫耐受。
41.如权利要求32-40中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症、感染性疾病、或自身免疫性疾病。
42.一种在有需要的个体中减少同种异体治疗细胞的移植物排斥的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的所述同种异体治疗细胞，其中所述同种异体治疗细胞包含编码免疫检查点配体(ICL)的第一异源核酸序列，并且其中所述治疗细胞表达MHC分子。
43.一种套件，其包含如权利要求1-30中任一项所述的经修饰的治疗细胞以及用于在有需要的个体中治疗疾病或病症的说明。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116492463A (zh) * 2023-03-31 2023-07-28 珠海市人民医院 Cd155分子在肝纤维化领域中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20200040059A1 (en) * 2016-10-20 2020-02-06 Alpine Immune Sciences, Inc. Secretable variant immunomodulatory proteins and engineered cell therapy
CN110869494A (zh) * 2017-06-12 2020-03-06 西奈卫生系统公司 无需全身性免疫遏制的同种异体移植物耐受

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017133175A1 (en) * 2016-02-04 2017-08-10 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Engineered mammalian cells for cancer therapy
WO2017177204A1 (en) * 2016-04-09 2017-10-12 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Leveraging immune memory from common childhood vaccines to fight disease
WO2020041662A1 (en) * 2018-08-24 2020-02-27 The Trustees Of Princeton University Immunotherapy with metabolic enzyme expression
US11866494B2 (en) * 2018-08-31 2024-01-09 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. CAR T therapy through uses of co-stimulation
CN110305906B (zh) * 2019-07-18 2021-11-12 山东大学第二医院 一种靶向pdl1的car嵌合受体的慢病毒载体及pdl1-car-t细胞

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20200040059A1 (en) * 2016-10-20 2020-02-06 Alpine Immune Sciences, Inc. Secretable variant immunomodulatory proteins and engineered cell therapy
CN110869494A (zh) * 2017-06-12 2020-03-06 西奈卫生系统公司 无需全身性免疫遏制的同种异体移植物耐受

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116492463A (zh) * 2023-03-31 2023-07-28 珠海市人民医院 Cd155分子在肝纤维化领域中的应用
CN116492463B (zh) * 2023-03-31 2023-11-17 珠海市人民医院 Cd155分子在肝纤维化领域中的应用

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