CN116492463B - Cd155分子在肝纤维化领域中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开CD155分子在肝纤维化领域中的应用，具体公开抑制CD155分子表达的物质在制备用于治疗肝纤维化药物中的应用。本发明发现CD155分子在肝纤维化患者肝组织中表达升高，同时在肝纤维化和细胞纤维性变的小鼠中CD155分子表达水平显著上调。运用基因药物siRNA干扰序列沉默CD155分子可以显著降低促肝纤维化因子的表达水平，减轻细胞外基质的沉积；可以明显抑制肝星状细胞的迁移、增殖和分化，降低细胞外基质的沉积，最终减轻细胞纤维性变，具有很好地治疗作用。本发明以CD155分子作为肝纤维化的治疗靶点，以抑制CD155分子表达的物质用于制备治疗肝纤维化的药物，对肝纤维化的治疗具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及CD155分子在肝纤维化领域中的应用。
背景技术
肝纤维化是各种致病因素(包括但不限于病毒感染、血吸虫病、酒精中毒)引起的肝脏细胞外基质(ECM)弥漫性大量沉积的过程，是多种慢性肝病常见且共有的病理学现象。随着病情的加重，会进一步发展引起肝小叶异常、假小叶和结节的形成，逐步发展为肝硬化，引起肝脏功能障碍，最终诱发肝细胞癌肝衰竭。目前，确诊的肝纤维化患者尚没有明确的药物治疗方案，临床上治疗肝纤维化多以中药(复方鳖甲软肝片等)联合抗病毒药物(现有的抗肝纤维化药物大多是基于PDGF-α/β、VEGFR-2、TGF-β/Smad等经典纤维化效应因子)进行干预治疗，而进展较为顺利的抗肝纤维化中成药扶正化淤片也仅通过美国临床II期实验，至今仍未有FDA批准上市的特异性抗肝纤维化药物。因此，深入揭示全新的肝纤维化发病机理和分子机制、挖掘新的治疗和干预靶标对肝纤维化的早期诊断和治疗具有重要意义，同时也可为抗纤维化药物的研发提供坚实的理论基础。
CD155分子是脊髓灰质炎病毒受体(PVR)，是一种I型跨膜糖蛋白，最初被确定为脊髓灰质炎病毒感染所需的受体，是Nectin和Nectin样蛋白家族的第五个成员。CD155分子及其家族成员在细胞迁移和粘附中起关键作用。已有大量研究表明，CD155分子广泛在肿瘤细胞表面高表达，除了在细胞增殖、迁移等生理学进程中发挥调控作用之外，CD155分子通常也能够发挥类似免疫检查点的功能和作用，与免疫细胞及抗原递呈细胞表面的活化性受体(DNAM-1)或抑制性受体(TIGIT)相结合，进而干预免疫细胞的功能和活性，最终发挥抗肿瘤活性。但目前尚无CD155分子参与调控肝纤维化及CD155分子在肝纤维化领域中应用的相关报道。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供CD155分子在肝纤维化领域中的应用，旨在提供一种CD155分子的新应用，弥补CD155分子在肝纤维化领域应用的空白，同时为肝纤维化的治疗提供新的靶点和策略。
本发明的技术方案如下：
本发明的第一方面，提供了抑制CD155分子表达的物质在制备用于治疗肝纤维化药物中的应用。
本发明的第二方面，提供了抑制CD155分子表达的物质在制备用于抑制肝星状细胞迁移、增殖和分化的药物中的应用。
本发明的第三方面，提供了抑制CD155分子表达的物质在制备用于抑制促肝纤维化因子表达的药物中的应用。
可选地，所述促肝纤维化因子包括Collagen I、Collagen III、α-SMA、CTGF、ACTA2、FN1、TGF-β1中的至少一种。
可选地，所述降低CD155分子表达水平的物质包括针对CD155分子的siRNA。
本发明的第四方面，提供了CD155分子在制备用于辅助诊断肝纤维化产品中的应用。
本发明的第五方面，提供了检测CD155分子的试剂或试剂盒在制备用于辅助诊断肝纤维化产品中的应用。
有益效果：本发明提供CD155分子在肝纤维化领域的新应用。本发明发现CD155分子在肝纤维化患者肝组织中表达升高，同时在成功诱导小鼠肝纤维化和细胞纤维性变的条件下，CD155分子表达水平显著上调。运用基因药物siRNA干扰序列沉默CD155分子可以显著降低Collagen I/III、FN1、CTGF和α-SMA的表达水平，减轻细胞外基质的沉积；同时沉默CD155分子可以明显抑制肝星状细胞的迁移、增殖和分化，有效抑制肝星状细胞的活化，降低细胞外基质的沉积，最终减轻细胞纤维性变，具有很好地治疗作用，因此，抑制CD155分子表达的物质可用于制备治疗肝纤维化的药物。本发明以CD155分子作为肝纤维化的治疗靶点，以抑制CD155分子表达的物质用于制备治疗肝纤维化的药物，对肝纤维化的治疗具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例1中正常人和肝纤维化患者肝组织中CD155分子的表达水平图；其中(A)为qRT-PCR实验所得CD155分子mRNA表达水平的结果图；(B)为Western Blot实验所得CD155分子蛋白表达水平的代表图；(C)为使用GraphPad Prism 9.0对图(B)进行统计分析的统计图。
图2为本发明实施例2中CD155分子在人肝星状细胞纤维性变中的表达水平图，其中(A)为Western Blot实验所得CD155分子在蛋白水平表达的代表图，(B)为使用GraphPadPrism 9.0对图(A)进行统计分析的统计图。
图3为本发明实施例2中人肝星状细胞纤维性变中细胞表面CD155分子表达丰度图，其中(A)为峰值图，(B)为使用GraphPad Prism 9.0对图(A)进行统计分析的统计图。
图4为本发明实施例3中CD155分子在小鼠纤维化模型中的表达水平图，其中(A)为Western Blot检测所得CD155分子在蛋白水平表达的代表图，(B)为使用GraphPad Prism9.0对图(A)进行统计分析的统计图。
图5为本发明实施例4中外源性过表达CD155分子对肝纤维化的促进作用结果图，其中(A)为Wound healing实验检测过表达CD155分子对细胞迁移能力影响的结果代表图，(B)为用GraphPad Prism 9.0对图(A)进行统计分析的统计图；(C)为EdU增殖实验检测过表达CD155分子对细胞增殖能力影响的代表图；(D)为用GraphPad Prism 9.0对图(C)进行统计分析的统计图；(E)为免疫荧光染色实验检测过表达CD155分子对细胞分化能力影响的染色图；(F)为qRT-PCR实验检测过表达CD155分子后纤维化相关标志物表达水平的结果图。
图6为CD155过表达质粒的载体图谱。
图7中(A)和(B)分别为本发明实施例5中Western Blot实验检测siRNA-CD155的敲减效率的代表图及其相应的统计图。
图8中(A)为本发明实施例5中Western Blot实验检测沉默CD155分子后纤维化相关蛋白表达水平的代表图，(B)为使用GraphPad Prism 9.0对图(A)进行统计分析的统计图。
图9中(A)为本发明实施例5中Wound healing实验检测沉默CD155分子后细胞迁移能力的代表图，(B)为使用GraphPad Prism 9.0对图(A)进行统计分析的统计图。
图10中(A)为本发明实施例5中EdU增殖实验检测沉默CD155分子对细胞增殖能力影响的代表图，(B)为使用GraphPad Prism 9.0对图(A)进行统计的统计图。
图11为本发明实施例6中Masson染色和天狼星红染色对小鼠肝脏病理切片染色代表图。
图12为本发明实施例6中Western Blot检测纤维化相关标志蛋白的表达水平结果图。
具体实施方式
本发明提供CD155分子在肝纤维化领域中的应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。
本发明实施例提供抑制CD155分子表达的物质在制备用于治疗肝纤维化药物中的应用。本发明通过实验发现CD155分子在肝纤维化患者肝组织中表达升高，同时在成功诱导小鼠肝纤维化和细胞纤维性变的条件下，CD155分子表达水平显著上调。运用基因药物siRNA干扰序列沉默CD155分子可以显著降低Collagen I/III、FN1、CTGF和α-SMA的表达水平(蛋白及mRNA水平)，减轻细胞外基质的沉积；同时沉默CD155分子可以明显抑制肝星状细胞的迁移、增殖和分化，有效抑制肝星状细胞的活化，降低细胞外基质的沉积，最终减轻细胞纤维性变，具有很好地治疗作用。因此，抑制CD155分子表达的物质可用于制备治疗肝纤维化的药物。本发明以CD155分子作为肝纤维化的治疗靶点，以抑制CD155分子表达的物质用于制备治疗肝纤维化的药物，对肝纤维化的治疗具有重要意义。
在一些实施方式中，所述抑制CD155分子表达水平的物质为针对CD155分子的siRNA。
本发明实施还提供抑制CD155分子表达的物质在制备用于抑制肝星状细胞迁移、增殖和分化的药物中的应用。进一步地，所述抑制CD155分子表达水平的物质为针对CD155分子的siRNA。
在肝纤维化进程中，肝星状细胞(Hepatic Stellate Cell，HSC)的激活是核心效应环节，HSC细胞过度增殖分化，引起ECM沉积和胶原分泌，重构肝脏组织结构完整性，加重纤维化的进程。激活的HSC可分泌多种细胞因子以维持长时间的激活状态，主要表现在增殖活性上调，收缩作用、纤维形成、基质降解改变、趋化聚焦和释放炎性信号。作为纤维化进程中的核心效应细胞，其异常活化和增殖受到多种细胞因子、细胞内信号传导途径调控，而本发明发现CD155分子过表达可以显著促进肝星状细胞的迁移、增殖和分化，同时沉默CD155分子可以显著抑制肝星状细胞的迁移、增殖和分化。因此，CD155分子是抑制肝星状细胞的迁移、增殖和分化的重要靶标。本发明实施例中，针对CD155分子的siRNA使CD155分子表达降低，沉默CD155分子可以明显抑制肝星状细胞的迁移和增殖活力及其分化，可以抑制肝星状细胞的活化，降低细胞外基质的沉积。本发明实施例通过运用基因药物siRNA干扰序列沉默CD155分子使得肝星状细胞的迁移、增殖和分化得到明显的抑制，因此，抑制CD155分子表达的物质(如针对CD155分子的siRNA)可以用于制备抑制肝星状细胞迁移、增殖和分化的药物。
本发明实施例还提供抑制CD155分子表达的物质在制备用于抑制促肝纤维化因子表达的药物中的应用。进一步地，所述抑制CD155分子表达的物质可以是针对CD155分子的siRNA，但不限于此。本发明实施例中，针对CD155分子的siRNA抑制CD155分子表达，沉默CD155可以显著降低Collagen I、Collagen III、α-SMA、CTGF、ACTA2、FN1、TGF-β1的蛋白及mRNA表达水平，减轻细胞外基质的沉积。
目前，诊断肝纤维化的标准方法仍是肝组织穿刺活检，但是有创检查存在并发症多、取样局限、难以动态监测、病人抵触、受观察者水平影响等缺点。近年来，各种无创性肝纤维化诊断方法已用于临床，显著提高了肝纤维化的诊断率。血清学指标的检测是目前常用的肝纤维化诊断方法，肝纤维血清标志物包含直接标志物和间接标志物两种，直接标志物表现出细胞外基质改变情况，间接标志物体现了肝脏功能的变化。但单一指标诊断纤维化作用有限，所以常常联合检测多项指标来判断肝纤维化，因此发现新的诊断标志物对肝纤维化诊断有重要意义。基于此，本发明实施还提供一种肝纤维化生物标志物，其中，所述肝纤维化生物标志物为CD155分子，本实施例实际上也提供了CD155分子作为肝纤维化生物标志物中的用途，对肝纤维化的早期诊断具有重要意义，如CD155分子在制备用于辅助诊断肝纤维化产品中的应用。
发明人通过实验发现相比在正常人的肝组织中，CD155分子在肝纤维化患者肝组织中表达升高，同时在成功诱导小鼠肝纤维化和细胞纤维性变的条件下，CD155分子表达水平显著上调。因此，CD155分子有作为肝纤维化生物标志物的潜力。
本发明实施例还提供了检测CD155分子的试剂或试剂盒在制备用于辅助诊断肝纤维化产品中的应用。CD155分子可以作为肝纤维化生物标志物，因此，检测CD155分子的试剂盒可用于辅助诊断肝纤维化，进而可用于制备辅助诊断肝纤维化的产品。
下面通过具体的实施例进行详细说明。
以下实施例中数据通过GraphPad Prism 9.0进行分析，用平均值±SEM表示。应用Student’s t-test统计显著性水平。多组间用单因素方差分析(ANOVA)进行组间数据的比较。如果ANOVA分析有差异，再通过Bonferroni检验法评估各组是否有差异。P＜0.05认为有显著差异。
实施例1CD155分子在临床肝纤维化患者中的表达水平
收集5例正常人肝组织(n＝5)，以及7例肝纤维化患者的肝组织(n＝7)，利用qRT-PCR和Western Blot技术检测肝组织内CD155分子的表达水平。
qRT-PCR实验：分别提取正常人及肝纤维化患者的肝组织及细胞RNA样本，并用5×All-In-One RT Master Mix Kit将RNA逆转录成cDNA；参照Applied Biosystems的SYBRGreen PCR Master Mix试剂盒操作步骤进行PCR实验；数据分析应用循环值(Ct值)法计算目标基因的相对量2-ΔΔCt。
Western Blot实验：分别提取正常人及肝纤维化患者的肝组织及细胞蛋白，取适量的蛋白提取液与6×Loading Buffer充分混合并于100℃金属浴中进行热变性处理，变性7分钟。70V/110V恒压电泳后恒流300mA进行湿转，5％脱脂牛奶室温封闭2小时，一抗孵育过夜。次日，回收一抗并用PBST缓冲液充分清洗，在室温避光条件下孵育荧光二抗1小时。最后，将荧光显色的NC膜置于Li-COR扫描仪中进行显色，并用Image Studio进行图像分析和处理。
正常人和肝纤维化患者肝组织中CD155分子的表达水平结果如图1所示，结果表明，CD155分子在肝纤维化患者中的表达显著升高。其中，**表示相对于健康组具有显著统计学差异p<0.01。
由图1可知，相比正常人，CD155分子在肝纤维化患者中的表达显著升高。
实施例2CD155分子在肝纤维化进程中的表达变化
培养人肝星状细胞(LX-2)：将人肝星状细胞按常规培养于含10％胎牛血清的1640培养基中，置于5％ CO2、37℃培养箱内培养。当对数生长期的细胞融合至70％时，传代。移去培养基，加入0.25％胰蛋白酶消化至细胞分散，加入含10％胎牛血清的培养基重新悬浮混匀细胞，分瓶接种于培养瓶中。
人肝星状细胞加药：将上述人肝星状细胞置于含有2％胎牛血清的1640培养基，然后加入TGF-β1(作用终浓度为10ng/mL)，作用时间48小时，实现TGF-β1诱导细胞纤维性变。
为了研究CD155分子在肝纤维化进程中的表达变化，本实施例利用上述加药后的人肝星状细胞，在离体水平通过Western Blot和流式分析(FACS)技术检测CD155分子的表达水平。
Western Blot实验具体步骤参见上文，CD155分子蛋白的表达水平结果如图2中(A)和(B)所示，其中，***表示相对于Control组具有显著统计学差异p<0.001。
FACS实验检测细胞表面CD155分子的表达丰度：将上述培养后的人肝星状细胞以5.0×105密度接种于6孔细胞培养板中，次日随机将细胞分成两组分别作为对照组和加药组(TGF-β1加药浓度为10ng/mL，加药方法参见上文)，作用48小时后离心消化细胞，PBS清洗2次后，进行染色，每个样本用50μL染色体系(PBS稀释CD155，比例为1：100)，冰上染色20分钟，每10分钟摇匀拍打一次(避光)。染色结束后每个样本加入1mL PBS终止染色，摇匀后以1000rpm的转速离心5分钟；PBS洗涤2次，每次以1000rpm的转速离心5分钟；最后每管加入300μL PBS重悬上机检测。结果如图3中(A)和(B)所示，其中，**表示相对于Control组具有显著统计学差异p<0.01。
由图2和图3可知，FACS和Western Blot实验证实，TGF-β1(作用浓度为10ng/mL)诱导后，人肝星状细胞总蛋白CD155及细胞表面CD155表达显著升高，说明CD155分子在肝纤维化进程中表达升高。
实施例3CD155分子在小鼠纤维化模型中的表达水平
CCl4诱导：6-8周龄的C57BL/6小鼠，术前禁食12小时；1.25％阿弗丁(按0.01mL麻药/g体重注射)，待小鼠麻醉成功后，腹腔注射CCl4(CCl4以1：9的比例溶解于玉米油，按1.0mL/kg体重注射)；每周注射2次，共6周。于最后一次注射CCl4后48小时取材作为实验组并以仅注射玉米油作为对照组进行Western Blot实验(Western Blot实验参见上文)。
结果如图4中(A)和(B)所示，**表示相对于对照组具有显著统计学差异p<0.01，结果表明在CCl4诱导的小鼠肝纤维化组织中，CD155分子表达同样也显著升高。
实施例4外源性过表达CD155分子对肝纤维化的促进作用
基于上述实施例2发现CD155分子在肝纤维化样本中显著高表达，本实施例进一步通过细胞功能实验(Wound healing、EdU增殖和免疫荧光染色、qRT-PCR)研究外源性过表达CD155分子对人肝星状细胞的作用。
(1)Wound healing实验：将人肝星状细胞以5.0×106的密度均匀地铺于6孔细胞培养板中，用10μL枪头垂直于培养板轻轻划过细胞，形成细胞伤口。用1640培养基清洗人肝星状细胞后，进行无血清培养4小时，进行饥饿处理；然后在避光条件下，根据需要在A管中加入100μL Opti-MEM和4μL lipofectamine2000，在B管中加入100μL Opti-MEM和2μgCD155过表达质粒(其图谱如图6所示，以下实施例中涉及到的CD155过表达质粒的图谱均如图6所示)；冰上静置5分钟后，将A、B两管液体充分混合，室温静置15分钟；将混合液均匀地加至上述细胞培养板中并置于培养箱中，6小时后更换为含有2％胎牛血清的1640培养基，分别于0、24小时拍照记录伤口愈合情况，同时将CD155过表达质粒替换为pcDNA3.1作为对照。实验结果用Image-Pro Plus进行数据分析。结果如图5中(A)和(B)所示，可知过表达CD155分子可以显著促进细胞迁移能力。
(2)EdU增殖实验：人肝星状细胞以2.0×105的密度接种于24孔细胞培养板中，将待转染的人肝星状细胞提前进行无血清培养4小时，进行饥饿处理；然后在避光条件下，在A管中加入100μL Opti-MEM和4μL lipofectamine 2000，在B管中加入100μL Opti-MEM和2μgCD155过表达质粒，冰上静置5分钟后，将A、B两管液体充分混合，室温静置15分钟；将混合液均匀地加至细胞培养板中并置于培养箱中，6小时后更换为含有2％胎牛血清的1640培养基，继续培养48小时后，按照Cell-Light EdU DNA cell proliferation kit(RiboBio，Guangzhou)试剂盒要求，配制Apollo染色反应液，细胞核用DAPI进行染色，荧光显微镜拍摄并进行图像分析，同时将CD155过表达质粒替换为pcDNA3.1作为对照。结果如图5中(C)所示，EdU增殖实验证实过表达CD155可以促进人肝星状细胞增殖。
(3)免疫荧光实验：人肝星状细胞以1.0×105的密度接种于24孔细胞培养板中，将待转染的人肝星状细胞提前进行无血清培养4小时，进行饥饿处理；然后在避光条件下，在A管中加入100μL Opti-MEM和4μL lipofectamine 2000，在B管中加入100μL Opti-MEM和2μgCD155过表达质粒，冰上静置5分钟后，将A、B两管液体充分混合，室温静置15分钟；将混合液均匀地加至细胞培养板中并置于培养箱中，6小时后更换为含有2％胎牛血清的1640培养基，继续培养48小时后收集细胞，PBS清洗3次后，每孔加入500μL多聚甲醛并在37度培养箱中静置固定10分钟；弃去固定液，PBS清洗3次；每孔加入500μL穿透液室温孵育5分钟，弃去穿透液，PBS清洗3次；每孔加入500μL封闭液室温孵育30分钟，弃去封闭液，PBS清洗3次；每孔加入200μL一抗稀释液(α-SMA，1：200)过夜孵育；次日回收一抗稀释液，PBS清洗3次；每孔加入200μL荧光二抗稀释液(Alexa488Phalloidin，1：200)室温避光孵育1小时，回收二抗稀释液，PBS清洗3次；每孔加入200μL DAPI染色液室温避光孵育10分钟，回收DAPI染色液，PBS清洗3次，荧光显微镜下观察并拍照记录。结果如图5中(E)所示，免疫荧光实验证实过表达CD155可以促进人肝星状细胞分化。
(4)qRT-PCR实验：人肝星状细胞以1.0×106的密度接种于12孔细胞培养板中，重复上述免疫荧光实验中细胞转染的步骤，进行细胞转染；转染后的细胞进行qRT-PCR实验(步骤参见实施例1)，并以pcDNA3.1作为对照。结果如图5中(F)所示，可见过表达CD155分子可促进纤维化相关标志物Collagen I/III、FN1、CTGF、ACTA2表达显著上调。
图5中，**表示相对于pcDNA3.1具有显著统计学差异p<0.01,****表示相对于pcDNA3.1具有显著统计学差异p<0.0001。
实施例5离体细胞水平沉默CD155对人肝星状细胞纤维性变的作用
本实施例构建了3条siRNA-CD155序列，希望在基因水平沉默CD155表达。siRNA-CD155-1/2/3#的序列如下表1所示。
表1 siRNACD155-1/2/3#的序列
| 名称 | 序列(5'→3') |
| siRNA-CD155-1# | CUGGUACCUUGGCCAGAAUTT |
| siRNA-CD155-2# | GGAGGUGACGCAUGUGUCATT |
| siRNA-CD155-2# | GAGGAUGAAGGCAACUACATT |
将待转染的人肝星状细胞提前进行无血清培养4小时，进行饥饿处理；然后在避光条件下，在A管中加入100μL Opti-MEM和4μL lipofectamine 2000，在B管中加入100μLOpti-MEM和2μg质粒(分别为siRNA-CD155-1#、siRNA-CD155-2#、siRNA-CD155-3#)；冰上静置5分钟后，将A、B两管液体充分混合，室温静置15分钟；将混合液均匀地加至细胞培养板中并置于培养箱中，6小时后更换为含有2％胎牛血清的1640培养基，继续培养48小时后，进行Western Blot实验(测试步骤参见上文)，并转染siRNA-NC为阴性对照。结果如图7中(A)和(B)所示，**表示相对于对照组(siRNA-NC)具有显著统计学差异p<0.01，由图7可知，siRNA-CD155-3#序列沉默效果最为显著，因此后续实验均选择siRNA-CD155-3#。
培养人肝星状细胞，在TGF-β1诱导的基础上，转染CD155-siRNA-3#，然后进行Western Blot实验(具体步骤参见上文)，结果如图8中(A)和(B)所示，其中，*表示相对于Control组或TGF-β1组具有统计学差异p<0.05，**表示相对于Control组或TGF-β1组具有显著统计学差异p<0.01，***表示相对于Control组或TGF-β1组具有显著统计学差异p<0.001，可见沉默CD155分子可以显著降低细胞Collagen I、α-SMA的表达水平。
培养人肝星状细胞，在TGF-β1诱导的基础上，转染CD155 siRNA-3#，进行细胞功能实验(Wound healing、EdU增殖实验和免疫荧光染色，具体步骤可参见上文所述)，结果分别如图9中(A)和(B)、图10中(A)和(B)所示，其中，**表示相对于Control组或TGF-β1组具有显著统计学差异p<0.01，由图9和10可知，基因水平沉默CD155分子可以显著减轻肝星状细胞的迁移和增殖能力。
实施例6在体水平沉默CD155分子对小鼠肝纤维化的影响
为了在动物水平测试沉默CD155分子对肝纤维化的保护作用。在CD155 KO小鼠(购买于南方模式动物中心，经配种繁育鉴定后可直接使用，下同)腹腔注射CCl4(以1：9的比例溶解于玉米油，按1.0mL/kg体重注射)，每周注射2次，共6周，在CD155 KO小鼠的基础上诱导小鼠肝纤维化。取CD155 KO小鼠肝组织进行病理学切片染色实验(Masson染色和天狼星红染色)和Western Blot实验。
Masson染色：将小鼠肝组织切片脱蜡，苏木素染色8分钟，盐酸酒精分化，流水冲洗，蓝化染液5分钟，蒸馏水洗，丽春红酸性品红液中染5分钟，0.2％冰醋酸工作液清洗1分钟，1％磷钼酸中染2分钟，苯胺蓝液染色5分钟，置于55℃温箱中烘干，封固。并以Wide-type野生型小鼠(WT)作为对照。
天狼星红染色：将小鼠肝组织切片脱蜡后，蒸馏水洗2分钟，Hariis苏木素染液染4分钟，水洗后天狼星红染色染30分钟，去离子水冲洗后脱水，透明，封片。将处理好的切片置于55℃烘箱中烤干，封固，镜检。并以Wide-type野生型小鼠(WT)作为对照。
Masson和天狼星红染色结果如图11所示，Masson和天狼星红染色测试证明，CD155KO小鼠肝纤维化水平显著降低。
取CD155 KO小鼠肝组织进行Western Blot实验，并以Wide-type野生型小鼠(WT)作为对照。结果如图12所示，CCl4诱导后，野生型小鼠纤维化标志物Collagen I/III和α-SMA表达显著上调，但CD155 KO小鼠纤维化相关标志物Collagen I/III和α-SMA表达则显著降低。
通过以上实施例可知，CD155分子在肝纤维化患者肝组织中表达升高，同时在成功诱导小鼠肝纤维化和细胞纤维性变的条件下，CD155分子表达水平显著上调。沉默CD155分子可以显著降低由TGF-β1诱导的Collagen I/III、FN1、CTGF、ACAT2和α-SMA蛋白及mRNA水平的升高，减轻细胞外基质的沉积；同时细胞功能表型实验证实，体外沉默CD155分子可以明显抑制肝星状细胞的迁移和增殖活力及分化，可以抑制肝星状细胞的活化，降低细胞外基质的沉积，最终减轻细胞纤维性变，具有很好地治疗作用。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (3)
1.抑制CD155分子表达的物质在制备用于治疗肝纤维化药物中的应用，所述抑制CD155分子表达的物质为针对CD155分子的siRNA，所述siRNA的序列为GAGGAUGAAGGCAACUACATT。
2.抑制CD155分子表达的物质在制备用于抑制肝星状细胞迁移、增殖和分化的药物中的应用，所述抑制CD155分子表达的物质为针对CD155分子的siRNA，所述siRNA的序列为GAGGAUGAAGGCAACUACATT。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制CD155分子表达的物质用于抑制促肝纤维化因子表达；
所述促肝纤维化因子为Collagen I、α-SMA中的至少一种。
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