CN114410796B - 用于肝癌辅助诊断和预后评估的试剂盒及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于肝癌辅助诊断和预后评估的试剂盒，包括检测C1qtnf1基因表达水平的引物和/或C1qtnf1基因编码蛋白含量检测试剂。通过对C1qtnf1表达水平进行检测，从而可以有效对肝病患者肝癌患病几率进行合理预测，即C1qtnf1基因的表达水平可以作为临床辅助诊断肝癌疾病的生物标志物。通过对受试者体内C1qtnf1基因表达水平进行检测，可以为预防乙肝或肝硬化等肝脏疾病向肝癌发展作提前准备工作，防止疾病的迅速发展和恶化对患者造成不可以的健康损害，也可对患者的预后进行合理评估，为治疗及康复提供合理有效的指导作用。同时也为人类攻克肝癌提供了一个新的药物治疗靶点，从而为后续的药物研发、临床治疗等提供了一个新的方向，具有极高的社会价值和市场应用前景。

Description

用于肝癌辅助诊断和预后评估的试剂盒及应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及肝癌辅助诊断和预后评估的试剂盒及应用。
背景技术
肝癌是世界第三大癌症相关死亡的疾病，慢性乙型病毒性肝炎是肝细胞癌的重要原因之一，我国是乙肝大国，乙肝肝硬化向肝癌转化时间长，医保花费高，费时费力，并且提前预警的生物学指标敏感性和特异性差。最新的观点认为疾病进展是一个动态过程，通常从正常状态通过小的或数量变化的逐渐积累，最终导致剧烈或定性表型转变为疾病状态。相当多的证据表明，就在许多疾病的正常状态和疾病状态之间的急剧转变之前，临界状态或临界点的存在。
近些年来，新的高通量组学技术，更加高级的动物模型为寻找关键癌基因及肿瘤因子提供了新的思路，特别是在研究疾病前状态及转变临界点方向上。因为疾病进展期间的临界点（或疾病前的过度状态）是临界状态，其中仍有可能恢复到正常状态，并且可以为即将发生的疾病状态的早期预警信号。因此在肝癌进展过程中，尤其是非肿瘤期，能够提前对肝癌的发生以及发展进行诊断或预测则具有十分重要的临床意义和社会价值。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中所存在的肝癌发病因素不明确、难以进行提前预防的技术问题，从而提供了一种用于肝癌辅助诊断和预后评估的试剂盒及应用。通过选择C1qtnf1基因作为标志物，能够用于对肝癌疾病的发生发展过程进行有效预测，从而筛选出肝癌的高发病人群，以进行合理的提前预防，显著降低疾病发生的概率及严重程度，减少对人体健康的损害。
为了解决上述技术问题，本发明是通过如下技术方案得以实现的。
本发明第一方面提供了一种用于肝癌辅助诊断和/或预后评估的试剂盒，包括检测C1qtnf1基因表达水平的引物对和/或C1qtnf1基因编码蛋白含量检测试剂。
作为优选地，所述引物对的正向引物序列如SEQ ID NO：1所示，反向引物序列如SEQ ID NO：2所示。
作为优选地，所述C1qtnf1基因编码蛋白含量检测试剂选自CTRP1单克隆抗体和/或CTRP1多克隆抗体。
作为优选地，所述C1qtnf1基因编码蛋白含量检测试剂选自 Monoclonal Anti-C1QTNF1 antibody（MilliporeSigma，#WH0114897M1）、C1qTNF1/CTRP1 Antibody（NovusBiologicals，#NBP1-76626）、Anti-CTRP1 antibody（Abcam，#ab25973）中的一种或多种。
作为优选地，所述试剂盒还包括PCR酶、PCR缓冲液、dNTPs、荧光底物中的一种或多种。
作为优选地，所述荧光底物选自Syber Green或荧光标记的探针。
本发明第二方面提供了一种组合物在制备用于肝癌辅助诊断和/或预后评估的试剂盒中的应用，所述组合物包括检测C1qtnf1基因表达水平的引物对和/或C1qtnf1基因编码蛋白含量检测试剂。
作为优选地，所述引物对的正向引物序列如SEQ ID NO：1所示，反向引物序列如SEQ ID NO：2所示。
作为优选地，所述C1qtnf1基因编码蛋白含量检测试剂选自CTRP1单克隆抗体和/或CTRP1多克隆抗体。
作为优选地，所述C1qtnf1基因编码蛋白含量检测试剂选自 Monoclonal Anti-C1QTNF1 antibody（MilliporeSigma，#WH0114897M1）、C1qTNF1/CTRP1 Antibody（NovusBiologicals，#NBP1-76626）、Anti-CTRP1 antibody（Abcam，#ab25973）中的一种或多种。
作为优选地，所述试剂盒还包括PCR酶、PCR缓冲液、dNTPs、荧光底物中的一种或多种。
作为优选地，所述荧光底物选自Syber Green或荧光标记的探针。
本发明第三方面提供了一种检测C1qtnf1表达水平的试剂在制备用于肝癌辅助诊断和/或预后评估的产品中的应用。
作为优选地，所述检测C1qtnf1表达水平的试剂包括检测C1qtnf1基因表达水平的引物对和/或C1qtnf1基因编码蛋白含量检测试剂。
作为优选地，所述引物对的正向引物序列如SEQ ID NO：1所示，反向引物序列如SEQ ID NO：2所示。
作为优选地，所述C1qtnf1基因编码蛋白含量检测试剂选自CTRP1单克隆抗体和/或CTRP1多克隆抗体。
作为优选地，所述C1qtnf1基因编码蛋白含量检测试剂选自 Monoclonal Anti-C1QTNF1 antibody（MilliporeSigma，#WH0114897M1）、C1qTNF1/CTRP1 Antibody（NovusBiologicals，#NBP1-76626）、Anti-CTRP1 antibody（Abcam，#ab25973）中的一种或多种。
作为优选地，所述试剂盒还包括PCR酶、PCR缓冲液、dNTPs、荧光底物中的一种或多种。
作为优选地，所述荧光底物选自Syber Green或荧光标记的探针。
在没有特别说明的情况下，在本发明上下文中，所述引物和/或引物对组是指用于在PCR中合成C1qtnf1基因cDNA链的PCR引物，从而用于检测C1qtnf1基因的表达水平。
动态网络分子标记物（DNBs）是一组分子或分子模块，可以在复杂疾病的急剧恶化的临界点或关键时期作为信号。DNB 模型可以在网络级别利用分子信号的集体波动和相关性，用于预测即将到来的临界过渡状态或临界点。通过收集预测信息，在人工智能监督学习的情况后，建立乙肝肝硬化向肝癌转变的动态网络模型，可以找到生物学标志物和临床指标的预警网络系统，从而指导乙肝肝硬化患者在就诊时做到早期预警。
目前的一些研究证据支持 CTRP 家族在代谢相关疾病中的临床意义，在肿瘤相关的研究尚未发现。在 CTRP 家族中，CTRP1在这方面受到了极大的关注。基于啮齿动物和临床研究，CTRP1 功能可以根据对不同组织的影响分类如下：（1）肌肉：CTRP1通过Akt的磷酸化增加Glut4向肌管质膜的运动，因此增加葡萄糖摄取并随后降低血糖水平。 它还通过MAPK的磷酸化增加肌肉细胞中的脂肪酸氧化。（2）肝脏：CTRP1导致肝脏中HSL和ACC的上调，但它通过ACC的磷酸化和失活诱导脂肪酸氧化并抑制脂肪酸合成。（3）心脏： CTRP1 在心肌梗塞中发挥抗炎作用，通过抑制 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 的表达以及通过 SP1 激活发生的NF-κB 的磷酸化。（4）肾上腺皮质：CTRP1 通过上调 Nurr1 和 NGFIB1 增强醛固酮的产生，随后 CYP11B1。（5）血管：CTRP1 通过抑制血小板的聚集和激活发挥抗凝作用。
本发明发明人通过大量临床及实验室研究发现，在许多肝癌患者体内许多基因的表达水平存在差异，从而推断特定基因及其编码蛋白的表达水平可能与肝癌的发生、发展、预后等具有高度关联系。进一步地，通过构建DNB模型以及生物信息学分析，发现C1qtnf1的表达水平与肝癌疾病的进展息息相关。随后，通过一系列体内体外实验进一步明确了C1qtnf1与肝癌发病和预后存在明显相关性，从而提供了一个特异性生物标志物以预测肝癌的发生和发展，从而有利于肝癌的提前预防。
本发明相对于现有技术具有如下技术效果：
（1）本发明对肝癌的发病、发展机制进行了深入研究，发现基因C1qtnf1的表达水平为与肝癌高度关联的因素；进而，通过对受试者C1qtnf1基因或其蛋白进行检测，获得其表达水平指标，从而可以有效对肝病患者尤其是乙肝及肝硬化患者的肝癌患病几率进行合理预测，即C1qtnf1基因的表达水平可以作为临床辅助诊断肝癌疾病的生物标志物。
（2）通过对受试者体内C1qtnf1基因表达水平进行检测，可以为预防乙肝或肝硬化等肝脏疾病向肝癌发展作提前准备工作，防止疾病的迅速发展和恶化对患者造成不可以的健康损害，也可对患者的预后进行合理评估，为治疗及康复提供合理有效的指导作用。
（3）本发明通过揭示C1qtnf1基因与肝癌疾病的关联性，为人类攻克肝癌提供了一个新的药物治疗靶点，从而为后续的药物研发、临床治疗等提供了一个新的方向，具有极高的社会价值和市场应用前景。
附图说明
图1为小鼠原发肝癌模型构建及组织HE染色结果示意图。
图2为基于差异表达基因 (DEG) 的聚类分析结果示意图。
图3为肿瘤形成过程中基因表达变化和网络结构的动态变化结果示意图。
图4为对小鼠基因表达谱分析结果示意图，其中纵坐标Ir代表小鼠基因表达与时间平均相关强度（average correlation strength）。
图5为HCC发生发展过程示意图。
图6为对小鼠模型DNB排名结果示意图。
图7为肝癌患者肿瘤及癌旁组织中C1qtnf1的表达情况结果示意图。
图8为CTRP1在肝癌及癌旁组织中的表达情况结果示意图。
图9为正常肝癌细胞系及肝癌细胞系中CTRP1的表达情况结果示意图。
图10为C1qtnf1过表达对肝癌细胞迁移及侵袭能力影响结果示意图。
图11为C1qtnf1过表达对肝癌细胞迁移及侵袭能力影响定量分析结果示意图。
图12为C1qtnf1过表达对肝癌细胞划痕实验结果示意图。
图13为C1qtnf1过表达对肝癌细胞划痕实验定量分析结果示意图。
图14为C1qtnf1过表达对肝癌细胞克隆能力影响结果示意图。
图15为C1qtnf1过表达对肝癌细胞克隆能力影响定量分析结果示意图。
图16为荷瘤小鼠示意图。
图17为小鼠肿瘤体积示意图。
图18为小鼠肿瘤生长曲线图。
图19为对肝癌患者及肝硬化患者外周血中CTRP1水平及AFP水平ROC曲线下面积分析结果示意图。
图20为对CTRP1高表达及低表达肝癌患者肝癌组织免疫组化分析结果示意图。
图21为对CTRP1高表达及低表达肝癌患者总生存时间及无病生存时间分析结果示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在无特别说明的情况下，本发明上下文中所列出的包括PC3、LNCaP和DU145等细胞系从American Type Culture Collection（ATCC、Manassas、VA、USA）购入并根据ATCC指南进行培养。所有细胞系均通过中国典型培养物保藏中心（武汉）的短串联重复分析鉴定，并使用PCR检测试剂盒（上海Biothrive Sci）验证是否存在支原体污染，同时在液氮中冷冻保存并用于后续实验。本发明所使用的试剂中，均通过市售获得。对于临床标本的使用，均与患者签署了知情同意书，相关程序及方法符合医学伦理学要求以及药物临床试验质量管理规范。本发明所使用的实验方法，例如DNB模型构建、生物信息学分析、DNA提取、基因组测序、引物设计、PCR、Western blot、肿瘤细胞培养、细胞迁移实验、细胞侵袭实验、细胞生存实验、动物实验、免疫组化等均为本领域的常规方法和技术。
生物学实验重复中选择具有代表性的结果呈现在上下文附图中，数据按照图示中规定的以mean±SD和mean±SEM展示。所有实验至少重复三次。数据采用GraphPad Prism5.0或SPSS 22.0软件进行分析。采用t检验、卡方检验、方差分析等常规医学统计学方法比较两组或两组以上的平均值差异。p＜0.05被认为是一个显著的差异。
实施例1 生物标志物的筛选
首先构建小鼠自发肝癌模型，具体步骤如下：
（1）取2周龄C57/B6L小鼠，腹腔注射N-亚硝基二乙基胺（DEN），30mg/kg；
（2）分别于注射后第30天、第60天、第90天、第120天、第150天、第180天、第210天和第240天取小鼠肝脏组织进行HE染色，并进行转录组测序。
结果如图1所示。结果显示，在原发小鼠肝癌模型中，从正常肝脏到肿瘤的发生历经约8个月时间，并且在肿瘤形成前会有肝纤维化的逐步进展。
通过对转录组测序数据的基于差异表达基因（DEG）的聚类分析发现，在经DEN诱导后的第6个月，小鼠肝脏基因表达方面没有聚集在一起而是分散的，其表明第6周（参见图2，Group F）的状态是特殊的，与其他时间点存在差异。进一步分析发现，与整个分子网络相比，肿瘤形成过程中基因表达变化和网络结构的动态变化在第6月满足DNB的标准（参见图3）。
通过对小鼠基因表达谱进行分析，明确了原发肿瘤关键转变发生在诱导后的第6周（参见图4）。通过分析肿瘤发生过程中的相变，可以明确肝癌进展可分为三个阶段：非肿瘤、肿瘤前（即临界状态）和肿瘤（参见图5）。一般而言，非肿瘤和肿瘤状态之间存在显着差异，然而，非肿瘤状态和肿瘤前状态之间没有明显区别，因为肿瘤前状态实际上是非肿瘤状态的一部分，因此传统生物标志物由于其静态特性而无法区分它们。肿瘤前状态的临界转变定性地改变生物系统的状态，从而在生物过程中起关键作用。
基于此，进一步对小鼠模型DNB进行排名，基于具有四个优先级的判定标准，在转移过程中，C1qtnf1被选为进一步功能测试的首选（参见图6）。
实施例2 人肝癌及癌旁组织中C1qtnf1表达水平研究
通过QPCR检测37对肝癌患者肿瘤及癌旁组织中C1qtnf1的表达情况，具体步骤如下：
（1）取50mg组织至1.5mL EP管中，加入1ml Trizol充分匀浆，室温静置5min；
（2）加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15-30s，静置2-3min；
（3）4℃离心，12000g×15min，吸取上层水相，大约400μL至无酶EP管中；
（4）加入等体积的异丙醇，将管中液体混匀，室温静置10min；
（5）4℃离心，12000g×15min，可见管底部白色羽毛状沉淀即为RNA；
（6）弃去上清，加入冰的75%乙醇1mL，轻轻弹拨管壁，使RNA漂浮其中，上下颠倒，充分洗涤；
（7）4℃离心，7500g×6min，小心吸取弃去上清，重复此步骤2-3次；
（8）加入适量的(20-40μL)无酶水，溶解RNA，取2μL测定浓度，其余放置于-80℃保存；
（9）根据测定的浓度吸取1.5μg RNA，采用Transcriptor First Strand cDNASynthesis Kit（Roche，货号：489703001），根据说明书逆转录为cDNA；
（10）使用GoTaq® qPCR Master Mix（promega，货号：A6002），根据说明书加样后，LightCycler® 480 II system (Roche， German)程序设定为95℃，5min；循环设定：95℃，10s-57℃， 10s-72℃， 10s，40个循环；72℃，10min；获得基因的CT值，β-actin 作为内参，计算2-ΔCT进行比较。
结果如图7所示，可见在肿瘤组织中C1qtnf1表达更低。
随后，通过WB检测C1qtnf1所编码蛋白CTRP1在肝癌及癌旁组织中的表达情况，具体步骤如下：
（1）冰上剪取组织0.1g于干净的1.5ml离心管中；
（2）冰上配制蛋白提取液（1mL RIPA裂解液中含5μL蛋白酶抑制剂，5μL PMSF和5uL磷酸酶抑制剂）；
（3）加入预冷的含抑制剂的蛋白质提取液（250mg组织中加入1mL抽提试剂）；
（4）用匀浆器每次30秒低速匀浆，每次匀浆间隔冰浴1分钟，至组织完全裂解；
（5）裂解液于预冷的离心机中14000×g离心15分钟。上清液立刻转移入新的离心管中，取少量进行蛋白定量；
（6）加入上样缓冲液，100℃金属浴10min后放置于-80℃冰箱备用；
（7）使用PAGE凝胶制备试剂盒（雅酶，货号：PG113）根据说明书配制电泳凝胶；
（8）将凝胶板固定到电泳装置的上缓冲液室，放入电泳槽中，往外槽中加入1×SDS电泳缓冲液，往内槽中加入电泳缓冲液至刚好没过加样孔；
（9）根据蛋白定量浓度吸取相同质量的蛋白样品加入加样孔，空白孔加入，对照孔加入蛋白质分子量标准样品；
（10）连接电源，先在80V下电泳至溴酚蓝染料从积层胶进入分离胶，再将电压调至120V继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部为止；
（11）电泳结束，将凝胶从玻璃板上切取，覆盖PVDF膜，两边各覆盖6层滤纸，加入转膜三明治夹子中，放入转移槽内，加入预先配好的转移液，接通电极，250mA接通电流，电转移100min；
（12）电泳结束，将膜放置于TBST中，摇床上洗涤2次；
（13）将膜至于5%脱脂奶粉的TBST中，摇床上缓慢摇动1h进行封闭；
（14）封闭结束后，将PVDF膜放置于TBST中，摇床上洗涤3次；
（15）根据标准蛋白位置切取PVDF膜条带，放入预先配制好的一抗溶液中，4℃，摇床上缓慢摇动孵育过夜；
（16）取出孵育过一抗的PVDF膜，放置于TBST中，摇床上洗涤3次；
（17）将PVDF膜放置于二抗溶液中，室温摇床上缓慢摇动1h孵育；
（18）二抗结束后将PVDF膜放置于TBST中，摇床上洗涤3次；
（19）在全自动化学发光荧光分析系统（Tanon，货号5200 Multi）中滴加发光液，获得图像并分析。
结果如图8所示。结果显示，在癌旁组织（N）中CTRP1表达水平显著高于肝癌组织中CTRP1表达水平，提示CTRP1在正常组织中高表达，而在肝癌组织中低表达。
进一步地，通过WB检测正常肝癌细胞系（L02）及肝癌细胞系（Huh7、HepG2、SNU387、SNU449）中CTRP1的表达情况，具体方法同上。结果如图9所示，结果显示，CTRP1在正常肝细胞系中的表达水平明显高于其他肝癌细胞系中的表达水平，更进一步确认了CTRP1在正常细胞中高表达，而在肝癌细胞中低表达。
实施例3 C1qtnf1对肝癌细胞功能的影响
构建C1qtnf1过表达细胞系，并予以验证，具体步骤如下：
（1）利用市售的过表达C1qtnf1过表达病毒（吉凯基因，64476-1）及阴性对照病毒CON238（Ubi-MCS-3FLAG-SV 40-EGFP-IRES-puromycin）及配套的病毒促感剂，根据说明书用完全培养基稀释配制MOI50的病毒液；
（2）将处于对数生长期肝癌细胞系消化、重悬后计数并铺板于12孔板中，每孔5×104个细胞；
（3）待细胞贴壁后，每孔加入25μL稀释好的病毒液，20μL促感剂，及205μL完全培养基；
（4）37℃继续培养6h后更换为500μL完全培养基；第二天可镜下观察细胞内有病毒所带有的绿色荧光，则考虑转染成功；
（5）待细胞长满80%左右用含1μg/ml的嘌呤霉素的完全培养基培养3代左右，收取细胞蛋白，进行WB检测其蛋白表达，确定构建成功。
随后，利用构建好的C1qtnf1过表达肝癌细胞系进行细胞迁移及侵袭实验，具体步骤如下：
Transwell 细胞侵袭实验
（1）实验前一天，将已经分装后的一管Matrigel基质胶从-20℃提前放入4℃冰箱过夜，使其从固体状态融化为液体状态；
（2）冰上配制10% Matrigel基质胶，取50μL包被transwell小室底部膜的上室面，放置于37℃，30min待基质胶凝固；
（3）将处于对数生长期的细胞胰酶消化后，基础培养基重悬成细胞悬液，并计数，调整细胞密度为5×105个/mL；
（4）将小室内及24孔板里的基础培养基吸取并弃去，取200μL细胞悬液加入transwell小室上室，24孔培养板下室内加入600μL完全培养基（基础培养基+10%胎牛血清）；
（5）培养板置于37℃的CO2培养箱中，继续培养16小时；
（6）取出小室，PBS淋洗2遍，在24孔板内4%多聚甲醛固定20min，结晶紫溶液染色15min；
（7）用棉签小心擦去小室微孔膜上层内的细胞及基质胶，倒置显微镜下拍照。
Transwell 细胞迁移实验
采用corning公司 transwell migration的8μm孔径的小室及24孔板。
（1）将小室放置于24孔板中，每孔加入1mL基础培养基润湿；
（2）将处于对数生长期的细胞胰酶消化后，基础培养基重悬成细胞悬液，并计数，调整细胞密度为5×105个/mL；
（3）将小室内及24孔板里的基础培养基吸取并弃去，取200μL细胞悬液加入transwell小室上室， 24孔培养板下室内加入600μL完全培养基（基础培养基+10%胎牛血清）；
（4）培养板置于37℃的CO2培养箱中，继续培养14小时；
（5）取出小室，PBS淋洗2遍，在24孔板内4%多聚甲醛固定20min，结晶紫溶液染色15min；
（6）用棉签小心擦去小室微孔膜上层内的细胞，倒置显微镜下拍照。
结果如图10-11所示。结果显示，过表达C1qtnf1的肝癌细胞迁移能力及侵袭能力相对于正常肝癌细胞明显更弱，差异具有统计学意义。
进一步地，利用构建好的C1qtnf1过表达肝癌细胞系进行细胞划痕实验，具体步骤如下：
（1）将处于对数生长期肝癌细胞系消化、重悬后计数；
（2）将细胞铺板于6孔板中，每孔加入约7×105个细胞，具体数量因细胞不同而不同，为过夜能铺满；
（3）第二天用10μL枪头比着直尺垂直于背后的横线划痕；
（4）用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基；
（5）放入37度5% CO2培养箱，培养，按0，6，12，24小时取样，拍照。
结果如图12-13所示。结果显示，过表达C1qtnf1的肝癌细胞划痕迁移速度相对于正常肝癌细胞明显更慢，差异具有统计学意义。
更进一步地，利用构建好的C1qtnf1过表达肝癌细胞系进行细胞单克隆形成实验，具体步骤如下：
（1）将处于对数生长期的细胞胰酶消化后，完全培养基（基础培养基+10%胎牛血清）重悬成细胞悬液，并计数；
（2）细胞接种：于6孔板培养板中各实验组接种800个细胞/孔；
（3）继续培养到14天，10天后可观察细胞状态；
（4）克隆完成后，然后PBS洗涤1次，每孔加入1mL 4%多聚甲醛固定30min，PBS洗涤1次；
（5）每孔加入结晶紫染液1mL，染细胞10-20min；
（6）PBS 洗涤细胞3次，晾干并拍照。
结果如图14-15所示。结果显示，过表达C1qtnf1的肝癌细胞单克隆形成能力相对于正常肝癌细胞明显更弱，差异具有统计学意义。
实施例4 C1qtnf1的体内功能研究
利用构建好的C1qtnf1过表达肝癌细胞系于裸鼠体内构建荷瘤小鼠模型，具体步骤如下：
（1）实验前一天，将已经分装后的一管Matrigel基质胶从-20℃提前放入4℃冰箱过夜，使其从固体状态融化为液体状态；
（2）取将处于对数生长期的过表达C1qtnf1肝癌细胞及对照病毒感染的肝癌细胞胰酶消化后，PBS重悬重悬成细胞悬液，计数，加入基质胶使配成含30%基质胶的细胞悬液，并调整细胞密度为2×107个/mL；
（3）混匀细胞悬液，吸取100μL接种于4周裸鼠右侧腹股沟皮下，即每只裸鼠皮下接种2×106个细胞；
（4）每日观察肿瘤大小，并于10日后处死小鼠，获取肿瘤并拍照。
结果如图16-18所示。结果显示，过表达C1qtnf1的肝癌细胞成瘤体积相对于正常肝癌细胞成瘤体积明显更小，且过表达C1qtnf1的肝癌细胞成瘤体积生长更加缓慢，差异具有统计学意义。
实施例5 C1qtnf1对肝癌患者预后的影响
分别搜集13位肝癌患者及13位肝硬化患者外周血，利用ELISA试剂盒检测外周血中CTRP1水平及AFP水平，AFP水平通过患者临床抽血检验获得，CTRP1表达水平检测方法如下：
（1）包被过程：将所用抗原（CTRP1）用包被稀释液稀释到适当浓度(一般所需抗原包被量为每孔20-200μg)，每孔抗原加入100μL，置37℃，4h弃去孔中液体；
（2）封闭酶标反应孔：5%小牛血清置37℃封闭40min；封闭时将封闭液加满各反应孔，并去除各孔中的气泡，封闭结束后用洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3min；洗涤方法：吸干孔内反应液，将洗涤液注满板孔，放置2min略作摇动，吸干孔内液，倾去液体后在吸水纸上拍干；
（3）加入待检测样品：检测时采用1:200的稀释度， 应采用较大稀释体积进行，一般保证样品吸取量＞20μl.将稀释好的样品加入酶标反应孔中，每样品至少加双孔，每孔100μL，置于37℃，40-60min.用洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3min；
（4）加入酶标抗体：酶标抗体根据酶结合物提供商提供的参考工作稀释度进行，37℃，30-60min之间，每孔加100μL；洗涤同前；
（5）加入底物液：首选TMB-过氧化氢尿素溶液，OPD-过氧化氢底物液系统次之；底物加入量：每孔100μL，置37℃避光放置3-5分钟，加入终止液显色；
（6）终止反应：每孔加入终止液50μL终止反应，于20min内测定实验结果；
（7）结果判断：OPD显色后采用492nm波长，TMB反应产物检测需要450nm波长.检测时一定要首先进行空白孔系统调零.用测定标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均值的比值(P/N)表示，当P/N大于2时作为抗体的效价。
结果发现，肝癌患者外周血中CTRP1水平明显低于肝硬化患者（图中未示出）。众所周知，甲胎蛋白（AFP）与肝癌及多种肿瘤的发生发展密切相关，在多种肿瘤中均可表现出较高浓度，可作为多种肿瘤的阳性检测指标。目前临床上主要作为原发性肝癌的血清标志物，用于原发性肝癌的诊断及疗效监测。通过对肝癌患者及肝硬化患者外周血中CTRP1水平ROC曲线下面积进一步分析发现（参见图19），CTRP1与AFP具有几乎相同的诊断准确性，意味着可以通过检测患者体内CTRP1表达水平从而对肝癌疾病进行早期诊断或辅助诊断。
进一步，搜集103位肝癌患者病理组织标本，进行免疫组化实验，根据免疫组化评分将上述患者分为CTRP1高表达组和CTRP1低表达组，并绘制总生存曲线及无病生存曲线，具体步骤如下：
（1）病理组织切片机将肝癌组织切片至4μm 厚度，展于防滑玻片上，65℃，2小时烤干备用；
（2）脱蜡：将载玻片依次放入二甲苯I中浸泡5min→二甲苯II中浸泡5min→二甲苯III中浸泡5min→无水乙醇I 5min→无水乙醇II 5min→95%乙醇5min→85%乙醇5min→75%乙醇5min→ddH2O I 3min→ddH2O II 3min；
（3）封闭过氧化物酶：3%过氧化氢中浸泡10min，PBS清洗5min；
（4）高压抗原修复；配置EDTA修复液加入高压锅中，将载玻片放入锅中，800W，20min后，放至自然冷却；
（5）PBS清洗载玻片2遍，每次3min，用小纸片吸干组织周围水分，组化油笔距离组织边界0.5cm画圈；
（6）油化组织表面：将载玻片浸泡在0.1%PBST中，上下提拉并浸泡3min；
（7）一抗孵育：按说明书比例用抗体稀释液稀释抗体，50uL 4℃孵育过夜后，PBS洗3min，PBST洗3min；
（8）二抗孵育：DAKO二抗每组织1滴，覆盖组织表面，37℃孵育1小时后，PBS洗3min，PBST洗3min；
（9）配置DAB显色液：按比例配置显色液，甩干载玻片上液体后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，载玻片浸泡PBS终止显色；
（10）复染细胞核：终止DAB染色后的载玻片用苏木素复染3分钟左右，流水冲洗；
（11）加入20ul封片剂封片后，显微镜下计数CTRP1的数量；
（12）统计患者的临床预后生存（总生存时间和无病生存时间），根据CTRP1的表达高低分成高表达组和低表达组后，应用Kaplan-Meier计算累积的生存时间。
结果如图20-21所示。结果显示，无论是总生存时间还是无病生存时间，CTRP1高表达患者组均明显高于CTRP1低表达患者组，差异具有统计学意义。从而可以明确C1qtnf1或其所编码蛋白CTRP1的高表达将会使得肝癌患者具有更为良好的预后，显著提升患者的生存时间。
由上述结果可知，C1qtnf1在正常组织中高表达，而在肝癌组织中低表达，且肝癌患者外周血中CTRP1水平明显低于肝硬化患者，从而可以明确C1qtnf1或其编码的CTRP1蛋白能够用于肝癌疾病的提前诊断，其具有与AFP相似的诊断准确性。同时，体内CTRP1表达水平高的肝癌患者总生存时间和无病生存时间均高于CTRP1表达水平低的患者，因而可以通过检测患者体内CTRP1表达水平，对其预后进行合理预测，同时选择个性化治疗方案，以改善临床治疗效果。除此以外，在C1qtnf1高表达的肝癌细胞内，无论是细胞增殖、迁移还是侵袭性能相对于常规肝癌细胞均得到了明显抑制，由此可以确定C1qtnf1高表达能够对肝癌细胞产生显著的抑制作用，进而对肝癌的发生、发展、转移等起到显著的抑制活性，其为人类攻克肝癌等疾病提供一个新的药物治疗靶点，有助于为后续的药物研发、临床治疗等提供了一个新的方向，具有极高的社会价值和市场应用前景。
以上具体实施方式部分对本发明所涉及的分析方法进行了具体的介绍。应当注意的是，上述介绍仅是为了帮助本领域技术人员更好地理解本发明的方法及思路，而不是对相关内容的限制。在不脱离本发明原理的情况下，本领域技术人员还可以对本发明进行适当的调整或修改，上述调整和修改也应当属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 中山大学附属第三医院
<120> 用于肝癌辅助诊断和预后评估的试剂盒及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcctctactt cttcagcctc aacg 24
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcgaacaaga tcaccacctc ctc 23

Claims (3)

1.一种组合物在制备用于肝癌辅助诊断和/或预后评估的试剂盒中的应用，其特征在于，所述组合物包括检测C1qtnf1基因表达水平的引物对和/或检测C1qtnf1基因编码的蛋白含量的试剂。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述引物对的正向引物序列如SEQ ID NO：1所示，反向引物序列如SEQ ID NO：2所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测C1qtnf1基因编码的蛋白含量的试剂选自CTRP1单克隆抗体和/或CTRP1多克隆抗体。
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