CN113403390B - lncRNA在儿童心肌炎诊治中的应用 - Google Patents

lncRNA在儿童心肌炎诊治中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供lncRNA在儿童心肌炎诊治中的应用，属于生药医药和分子生物学技术领域。本发明首次发现lncRNA NONHSAT122636.2在儿童心肌炎患者外周血中明显下调表达，具有较高的诊断敏感性和特异性；且与炎症程度呈明显负相关，在一定程度上可以反映病情的严重程度。同时，上述检查方法简单易行，对受试者创伤性小，受试者顺从性更佳。LNCRNA NONHSAT122636.2作为儿童心肌炎的预测诊断标志物和潜在治疗靶点，能够在儿童心肌炎的诊断、治疗中发挥重要作用的潜力，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

lncRNA在儿童心肌炎诊治中的应用
技术领域
本发明属于生药医药和分子生物学技术领域，具体涉及lncRNA在儿童心肌炎诊治中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
儿童心肌炎是儿童常见的心血管疾病之一，重症患儿起病急、进展快，可在短时间内出现心力衰竭或心源性休克，严重者危及患儿生命。早期识别和诊断心肌炎是早期治疗的关键，可大大改善患儿治疗效果和预后。其诊断金标准为心内膜心肌活检，但由于是有创操作，在临床上应用并不多。目前临床上诊断心肌炎主要依靠临床表现、心肌损伤标志物、心电图、超声心动图、心脏磁共振等，但心肌炎患儿的临床表现差别较大，甚至部分无明显临床症状，而且现有辅助检查方法的诊断特异性和敏感性并不理想，这给临床工作带来的很大挑战。因此，亟需寻找一种微创而又特异灵敏的诊断方法。
近年来，关于儿童心肌炎的研究表明，其主要病理过程是细菌、病毒等感染因素导致的心肌炎症及免疫损伤，各种细胞因子参与其中。长链非编码RNA(lncRNA)是一种长度超过200个核苷酸的RNA，不具有编码蛋白功能，主要通过表观遗传学、转录调控、转录后调控、调节miRNA等方式参与炎症、免疫调节、细胞增殖和凋亡等多个病理生理过程。大量研究表明，lncRNA在多种疾病，尤其是炎症中具有成为诊断标志物的潜力。然而，目前lncRNA在儿童心肌炎中的作用的相关研究仍然较少。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供lncRNA在儿童心肌炎诊治中的应用。本发明首次发现外周血中的lncRNA NONHSAT122636.2的表达量与儿童心肌炎紧密相关，且lncRNA NONHSAT122636.2在儿童心肌炎中的诊断的灵敏性与特异性较高，进一步通过临床样本和细胞模型验证其参与炎症调节的功能。因此，lncRNA NONHSAT122636.2可作为儿童心肌炎的诊断标志物和潜在治疗靶点。
具体的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一个方面，提供lncRNA作为标志物在制备检测、诊断(辅助诊断)或预测儿童心肌炎进展的产品中的应用。
其中，所述lncRNA包括lncRNA NONHSAT122636.2。
本发明通过研究发现，lncRNA NONHSAT122636.2在儿童心肌炎患者的外周血中呈低表达。进一步绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线)并计算曲线下面积(AUC)，提示该lncRNA可以作为儿童心肌炎诊断标志物。进一步分析发现，其诊断儿童心肌炎的敏感度为84.6％，特异度为82.4％，具有良好的诊断价值，同时其与炎症程度呈明显负相关，从而在一定程度上可以反映病情的严重程度，因此可预测儿童心肌炎病情进展。
本发明的第二个方面，提供一种产品，所述产品包含上述用于检测lncRNA的物质，所述产品用于检测、诊断(辅助诊断)或预测儿童心肌炎进展。
其中，检测lncRNA的物质包括但不限于用于RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、基因芯片和基因测序检测lncRNA的表达水平的物质。
所述产品包括但不限于检测待测样品中所述lncRNA表达水平的引物、探针、芯片、核酸膜条、制剂或试剂盒。
所述待测样品可为人源样本，更具体的，所述待测样品包括受试者血液，进一步优选的，所述血液采自外周血。
本发明的第三个方面，提供一种用于检测、诊断(辅助诊断)或预测儿童心肌炎进展的系统，所述系统包括：
i)分析模块，所述分析模块包含：用于确定受试者的待测样品中选自上述lncRNA表达水平的检测物质，以及；
ii)评估模块，所述评估模块包含：根据i)中确定的所述lncRNA表达水平判断所述受试者是否患有儿童心肌炎和/或判断儿童心肌炎病情严重程度及预后评估；
所述步骤ii)评估模块具体评估流程包括：
与参照相比，所述受试者的待测样品中的lncRNA表达水平下调，则所述受试者为或候选为儿童心肌炎患者；反之，则所述受试者不为或不候选为儿童心肌炎患者；
进一步的，根据受试者的待测样品中的lncRNA表达水平下调情况，判断受试者儿童心肌炎病情严重程度，并进行预后评估。
本发明的第四个方面，提供一种检测、诊断(辅助诊断)或预测儿童心肌炎进展的方法，所述方法包括：
a)从受试者分离待测样品；
b)在所述受试者的待测样品中检测上述lncRNA表达水平，以及；
c)将样品中的表达水平与参照中的表达水平进行比较；
其中，与参照中的水平相比，样品中表达水平的下调，则所述受试者为或候选为儿童心肌炎患者；反之，则所述受试者不为或不候选为儿童心肌炎患者；
进一步的，根据受试者的待测样品中的lncRNA表达水平下调情况，判断受试者儿童心肌炎病情严重程度，并进行预后评估。
本发明的第五个方面，提供所述lncRNA作为靶点在儿童心肌炎治疗和/或筛选儿童心肌炎相关药物中的应用。
本发明的第六个方面，提供促进所述lncRNA的表达水平的物质在制备产品中的应用；
所述产品的功能为如下任意一种或多种：
(a1)抑制心肌损伤和/或保护心肌；
(a2)减轻炎症反应；
(a3)促进心肌细胞增殖；
(a4)抑制心肌细胞凋亡；
(a5)预防和/或治疗儿童心肌炎。
本发明的第七个方面，提供一种产品，其活性成分包括促进所述lncRNA的表达水平的物质；所述产品的功能为如下任意一种或多种：
(a1)抑制心肌损伤和/或保护心肌；
(a2)减轻炎症反应；
(a3)促进心肌细胞增殖；
(a4)抑制心肌细胞凋亡；
(a5)预防和/或治疗儿童心肌炎。
上述第六至第七方面中的产品可以为药物。
以上一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案首次发现lncRNA NONHSAT122636.2在儿童心肌炎患者外周血中明显下调表达，具有较高的诊断敏感性和特异性；且与炎症程度呈明显负相关，在一定程度上可以反映病情的严重程度。同时，上述检查方法简单易行，对受试者创伤性小，受试者顺从性更佳。
综上，LNCRNA NONHSAT122636.2作为儿童心肌炎的预测诊断标志物和潜在治疗靶点，具有在儿童心肌炎的诊断、治疗中发挥重要作用的潜力，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1是本发明实施例中lncRNA NONHSAT122636.2在心肌炎患儿中相对表达量及ROC曲线图，其中，A为lncRNA NONHSAT122636.2在心肌炎患儿中相对表达量；B为ROC曲线图。
图2为本发明实施例中lncRNA NONHSAT122636.2诊断儿童心肌炎临界值(cutoff)及对应的敏感度(se)、特异度(sp)。
图3是本发明实施例中lncRNA NONHSAT122636.2与临床诊断指标的相关性，其中，A为与HS-TnT相关性，B为与NT-proBNP相关性，C为与CKMB-mass相关性，D为与左室射血分数(LVEF)相关性。
图4是本发明实施例中lncRNA NONHSAT122636.2在细胞模型中相对表达量，其中，A、B、C分别为不同LPS浓度下lncRNA相对表达量变化(A)和炎症相关因子浓度变化(B、C)；D、E、F分别为不同LPS刺激时间下PCR检测lncRNA相对表达量结果(D)和ELISA检测炎症相关因子浓度结果(E、F)；G为最终确定的刺激条件。
图5为本发明实施例中功能验证结果图，其中，A为四组细胞中lncRNANONHSAT122636.2相对表达量，B、C为ELISA检测炎症相关因子浓度结果；D、E分别为PCR检测炎症相关因子相对表达量结果。
图6是本发明实施例中CCK-8和流式凋亡检测结果图，其中，A为CCK-8检测四组细胞活性结果，B为流式检测四组细胞凋亡结果。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如Sambrook等人，《分子克隆：实验手册》中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。
结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。
术语“表达水平”是指在特定的时间点体内或样品中存在的基因产物的量。表达水平可以例如通过由基因表达的蛋白质或mRNA来测量/量化/检测。可以例如如下量化表达水平：用相同样品或参考样品(例如，在相同时间从同一个体得到的样品或相同样品的相同尺寸(重量、体积)的部分)中相同类型基因产物的总量(总蛋白质或mRNA)归一化样品中存在的目的基因产物的量，或者确定目的基因产物的量/限定的样品尺寸(重量、体积等)。可以通过本领域已知的任何方法来测量或检测表达水平，所述方法例如用于目的基因产物的直接检测和量化的方法(例如质谱)，或者通常通过目的基因产物与对目的基因产物具有特异性的一种或更多种不同分子或检测装置(例如，引物、探针、抗体、蛋白质支架)结合而工作的用于间接检测和测量目的基因产物的方法。技术人员还已知的是确定基因拷贝的水平，其还包括确定一个或更多个片段的不存在或存在(例如，通过核酸探针或引物，例如定量PCR、多重连接依赖性探针扩增(Multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)PCR)。
术语“指标”和“标志”在本发明中可互换使用，并且是指病症的体征或信号或者用于监测病症。这样的“病症”是指细胞、组织或器官的生物状态，或者是指个体的健康和/或疾病状态。指标可以是包括但不限于肽、蛋白质和核酸的分子的存在或不存在，或者可以是细胞、或组织、器官或个体中这样的分子的表达水平或模式变化。指标可以是个体中疾病的发生、发展或存在或者这样的疾病的进一步进展的体征。指标也可以是在个体中发生疾病的风险的体征。
术语指标的水平“上调”、“升高”或“提高”是指与参照相比，样品中这样的指标的水平降低。
术语指标的水平“下调”、“降低”或“下降”是指与参照相比，样品中这样的指标的水平降低。
在原理上，可以通过应用标准统计学方法基于给定lncRNA的平均值或中值来对本发明所指定的对象组或群组计算参考量。特别地，例如旨在或不旨在判断事件的方法的测试的精确度最好由其接受者操作特征(receiver-operating characteristic，ROC)来描述(尤其参见Zweig 1993，Clin.Chem.39：561-577)。ROC图是由在所观察到的整个数据范围上不断改变判定阈值获得的所有灵敏度相对于特异性对的图。诊断方法的临床表现取决于其精确度，即其将对象正确地分配到某种预后或诊断的能力。ROC图通过在适于区分的完整阈值范围将灵敏度相对于1-特异性绘图来表示两个分布之间的重叠。在y轴上是灵敏度或真阳性分数，其被定义为真阳性测试结果数与真阳性数和假阴性测试结果数之和的比率。这在疾病或病症的存在下也被称为阳性。其单独地由受影响的亚组计算。在x轴上是假阳性分数或1-特异性，其被定义为假阳性结果数与真阴性数和假阳性结果数之和的比率。其是特异性的指数，并且完全由未受影响的亚组计算。由于真和假阳性分数是完全单独地进行计算，因此通过使用来自两个不同亚组的测试结果，ROC图独立于群组中事件的普遍性。ROC图上的每个点表示对应于特定判定阈值的灵敏度/-特异性对。具有完美辨别(在两个结果分布中没有重叠)的测试具有经过左上角的ROC图，其中真阳性分数为1.0或100％(完美灵敏度)，假阳性分数为0(完美特异性)。没有辨别(两组结果的分布相同)的测试的理论图为从左下角到右上角的45°对角线。大多数图落在这两个极端之间。如果ROC图完全落在45°对角线之下，则这容易地通过将“阳性”标准从“大于”反转为“小于”来矫正，反之亦然。定性地，图越靠近左上角，测试的整体精确度就越高。根据期望的置信区间，可以从ROC曲线推导出阈值，允许分别用灵敏度和特异性的适当平衡诊断或预测给定事件。因此，可以优选地通过如上所述建立用于所述群组的ROC并从其推导出阈值量来生成用于本发明方法的参考。根据诊断方法的期望灵敏度和特异性，ROC图允许推导出合适的阈值。优选地，参考量位于这样的值范围内，其表示至少75％的灵敏度和至少45％的特异性、或者至少80％的灵敏度和至少40％的特异性、或者至少85％的灵敏度和至少33％的特异性、或者至少90％的灵敏度和至少25％的特异性。
本发明的一个具体实施方式中，提供lncRNA作为标志物在制备检测、诊断(辅助诊断)或预测儿童心肌炎进展的产品中的应用。
其中，所述lncRNA包括lncRNA NONHSAT122636.2，其序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明通过研究发现，lncRNA NONHSAT122636.2在儿童心肌炎患者的外周血中呈低表达。进一步绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线)并计算曲线下面积(AUC)，提示该lncRNA可以作为儿童心肌炎诊断标志物。进一步分析发现，其诊断儿童心肌炎的敏感度为84.6％，特异度为82.4％，具有良好的诊断价值，同时其与炎症程度呈明显负相关，从而在一定程度上可以反映病情的严重程度，因此可预测儿童心肌炎病情进展。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种产品，所述产品包含上述用于检测lncRNA的物质，所述产品用于检测、诊断(辅助诊断)或预测儿童心肌炎进展。
其中，检测lncRNA的物质包括但不限于用于RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、基因芯片和基因测序检测lncRNA的表达水平的物质。
所述产品包括但不限于检测待测样品中所述lncRNA表达水平的引物、探针、芯片、核酸膜条、制剂或试剂盒。
所述待测样品优选为体液，所述体液可以为血液、淋巴液、尿液、胃液或唾液，优选为血液；所述血液可以为血清或血浆。特别地，lncRNA具有一定的组织特异性，病变部位表达的lncRNA可以通过外周血PCR检测到，也就是说外周血中lncRNA的表达水平与病变部位表达水平相关。因此本发明的一个具体实施方式中，所述待测样品为受试者的外周血，采用血液作为待测样品进行检测，对受试者创伤性小，受试者顺从性更佳，同时本发明的lncRNANONHSAT122636.2作为儿童心肌炎标志物在血液中同样具有较高的特异性和灵敏度。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于检测、诊断(辅助诊断)或预测儿童心肌炎进展的系统，所述系统包括：
i)分析模块，所述分析模块包含：用于确定受试者的待测样品中选自上述lncRNA表达水平的检测物质，以及；
ii)评估模块，所述评估模块包含：根据i)中确定的所述lncRNA表达水平判断所述受试者是否患有儿童心肌炎和/或判断儿童心肌炎病情严重程度及预后评估；
本发明的又一具体实施方式中，以上所述待测样品包括受试者体液，所述体液可以为血液、淋巴液、尿液、胃液或唾液，优选为血液；进一步可为外周血。
本发明的又一具体实施方式中，以上所述检测物质包括但不限于用于RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、基因芯片和基因测序检测lncRNA的表达水平的物质。
本发明的又一具体实施方式中，所述步骤ii)评估模块具体评估流程包括：
与参照相比，所述受试者的待测样品中的lncRNA表达水平下调，则所述受试者为或候选为儿童心肌炎患者；反之，则所述受试者不为或不候选为儿童心肌炎患者；
进一步的，根据受试者的待测样品中的lncRNA表达水平下调情况，判断受试者儿童心肌炎病情严重程度，并进行预后评估。
其中，“参照”可以是合适的对照样品，例如来自正常健康受试者的样品，其没有儿童心肌炎相关症状并且没有异常的生理及病理学发现，参照也可以是来自同一受试者的在表现出病症或疾病症状之前或在诊断出儿童心肌炎之前的样品。参照可以是经标化的样品，例如，包含来自若干健康受试者样品的材料或数据的样品，这些健康受试者没有儿童心肌炎症状，也没有相关生理及病理学发现。
本发明的用于诊断或辅助诊断儿童心肌炎的系统，可以是虚拟装置，只要能实现所述分析模块以及评估模块的功能即可。所述的分析模块可以是包括各种检测试剂材料和/或检测仪器设备等；所述评估模块可以是任何可以实现对分析模块的检测结果进行分析处理而得出儿童心肌炎患病风险评估状况的运算仪器、模块或是虚拟设备，例如可以是预先将各种可能的检测结果与对应的患病风险情况制定相应的数据图表，将检测单元的检测结果对照该数据图表即能得出儿童心肌炎发病风险评估结果。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种诊断或辅助诊断儿童心肌炎的方法，所述方法包括：
a)从受试者分离待测样品；
b)在所述受试者的待测样品中检测上述lncRNA表达水平，以及；
c)将样品中的表达水平与参照中的表达水平进行比较；
与参照中的水平相比，样品中表达水平的上调，则所述受试者为或候选为儿童心肌炎患者；反之，则所述受试者不为或不候选为儿童心肌炎患者；
进一步的，根据受试者的待测样品中的lncRNA表达水平下调情况，判断受试者儿童心肌炎病情严重程度，并进行预后评估。
其中，“参照”可以是合适的对照样品，例如来自正常健康受试者的样品，其没有儿童心肌炎相关症状并且没有异常的生理及病理学发现，参照也可以是来自同一受试者的在表现出病症或疾病症状之前或在诊断出儿童心肌炎之前的样品。参照可以是经标化的样品，例如，包含来自若干健康受试者样品的材料或数据的样品，这些健康受试者没有儿童心肌炎症状，也没有相关生理及病理学发现。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述lncRNA作为靶点在儿童心肌炎治疗和/或筛选儿童心肌炎相关药物中的应用。
本发明的又一具体实施方式中，所述儿童心肌炎相关药物为预防和/或治疗儿童心肌炎的药物。
本发明的又一具体实施方式中，所述筛选儿童心肌炎相关药物的方法包括：
1)采用候选物质处理表达和/或含有所述lncRNA的体系；设置不采用候选物质处理的平行对照；
2)完成步骤1)后，检测体系中所述lncRNA的表达水平；与平行对照相比，如果采用候选物质处理的体系中所述DNA的表达量显著升高，所述候选物质可作为候选的儿童心肌炎药物。
本发明的又一具体实施方式中，所述体系可为细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
本发明的又一具体实施方式中，所述细胞体系中的细胞可以为心肌细胞；
本发明的又一具体实施方式中，所述组织体系中的组织可以为心肌组织；
本发明的又一具体实施方式中，所述器官体系中的器官可以为心脏；
本发明的又一具体实施方式中，所述动物体系中的动物可以为哺乳动物，如大鼠、小鼠、豚鼠、兔、猴、人等。
本发明的又一具体实施方式中，提供促进所述lncRNA的表达水平的物质在制备产品中的应用；
所述产品的功能为如下任意一种或多种：
(a1)抑制心肌损伤和/或保护心肌；
(a2)减轻炎症反应；
(a3)促进心肌细胞增殖；
(a4)抑制心肌细胞凋亡；
(a5)预防和/或治疗儿童心肌炎。
其中，
(a1)中抑制心肌损伤和/或保护心肌具体表现为心肌损伤标志物表达降低，所述心肌损伤标志物包括但不限于TnT、CKMB和BNP。
(a2)中减轻炎症反应具体表现为炎症因子表达降低，所述炎症因子包括但不限于IL-1、IL-6和TNF-α。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种产品，其活性成分包括促进所述lncRNA的表达水平的物质；所述产品的功能为如下任意一种或多种：
(a1)抑制心肌损伤和/或保护心肌；
(a2)减轻炎症反应；
(a3)促进心肌细胞增殖；
(a4)抑制心肌细胞凋亡；
(a5)预防和/或治疗儿童心肌炎。
(a1)中抑制心肌损伤和/或保护心肌具体表现为心肌损伤标志物表达降低，所述心肌损伤标志物包括但不限于TnT、CKMB和BNP。
(a2)中减轻炎症反应具体表现为炎症因子表达降低，所述炎症因子包括但不限于IL-1、IL-6和TNF-α。
本发明的又一具体实施方式中，促进所述lncRNA的表达水平的物质包括采用基于基因特异性Mimics技术上调lncRNA表达和/或促进其活性的物质；如上调lncRNA表达的启动子或者慢病毒；同时也包括化合物类促进剂。
本发明的又一具体实施方式中，上述产品可以为药物。
上述RNA具体为lncRNA NONHSAT122636.2。
所述药物还可包括药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体可为缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、防腐剂、赋形剂、填充剂、凝结剂与调和剂、界面活性剂、扩散剂或消泡剂。
所述药物还可包括可药用载体。所述可药用载体可为病毒、微囊、脂质体、纳米颗粒或聚合物及其任意组合。所述可药用载体的递送载剂可为脂质体、生物相容性聚合物(包括天然聚合物和合成聚合物)、脂蛋白、多肤、多糖、脂多糖、人工病毒包膜、无机(包括金属)颗粒、以及细菌或病毒(例如杆状病毒、腺病毒和逆转录病毒)、噬菌体、黏粒或质粒载体。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中NONHSAT122636.2序列如SEQ ID NO.1所示，NONHSAT122636.2扩展引物如SEQ ID NO.2-3所示。
实施例
1.研究对象
共收集在山东第一医科大学附属省立医院(山东省立医院)住院治疗的重症心肌炎患儿17例作为心肌炎组，健康儿童16例作为对照组，均抽取外周血各3-4ml。心肌炎组均符合儿童心肌炎诊断标准。其中3例心肌炎、3例健康儿童外周血进行高通量芯片测序，然后所有实验对象进行验证。
2.细胞培养、建模及转染
采用HCM细胞系，为贴壁细胞，培养条件37℃CO2 5％，培养基为含10％胎牛血清(FBS)培养基。细胞密度达到80％-100％时进行传代(1：2或1：3)。
心肌炎建模：细胞传代24h细胞贴壁后，饥饿12h(用不含FBS培养基)，再加入脂多糖(LPS)进行刺激，根据实验需求选择不同的刺激浓度和时间，收集细胞(PCR)或上清(ELISA)进行下一步实验。
慢病毒转染：由吉凯基因公司构建lncRNA NONHSAT122636.2的过表达慢病毒载体，用于后续转染实验。先进性慢病毒转染预实验摸索转染条件，最终确定转染条件为MOI＝20，并加入P增强液。正式转染实验步骤如下：①第一天：接种细胞，密度3-5×104个/ml，加入六孔板，37℃培养16-24h，至细胞汇合度20％-30％；②第二天：感染，根据细胞MOI值(20)及病毒滴度加入相应病毒量，病毒体积＝(MOI×细胞数目)/病毒滴度，37℃培养12-16h，更换完全培养基，继续培养；③第3-4天：继续培养，中间可换液；④第5天：感染后约72h，通过高内涵成像仪观察感染效率(融合度70-80％)；⑤筛选稳定株：将细胞培养于含5ug/ml嘌呤霉素的培养液中，每3天更换一次含嘌呤霉素的培养液，直至感染病毒的对照组细胞被杀光，而感染病毒组再无细胞死亡，后将嘌呤霉素浓度降至维持浓度(原浓度1/2-1/4)，继续培养，同时收集细胞进行PCR验证，并将鉴定结果正常的细胞冻存留种，用于后续实验。
3.RNA提取及浓度测定
1)外周血样本准备：
①采集外周血样本3-4ml于EDTA抗凝管，颠倒数次，于1h内提取包细胞；
②将血标本转移至50毫升离心管，立即加入3倍体积红细胞裂解液，室温放置10min，期间颠倒混匀数次；
③1500g，离心10min，颠倒混匀数次；
④再加入1ml红细胞裂解液重悬沉淀，将其转移至1.5mlEP管，1500g，4℃离心5min，弃去上清；
⑤加入1ml trizol，重悬沉淀，室温放置5min；
⑥将其转移至冻存管后-80℃保存待用。
2)培养细胞处理
弃去细胞上清，向每个培养瓶(10cm2)中加入2ml trizol，吹打后转移至冻存管中-80℃备用。
3)RNA提取
①将上述备用样本取出解冻后，各转移1ml至EP管中，然后加入0.2ml氯仿，剧烈晃动15-30s，混合至溶液乳化呈乳白色，室温静置5min；
②12000g，4℃离心15-20min，分为三层：无色上清，中间白色蛋白层，下层黄色有机相；
③吸取上清液转移至另一新的EP管中，每管加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min；
④12000g，4℃离心10min，离心后EP管底部出现RNA沉淀；
⑤小心弃去上清，加入75％乙醇洗涤3次，然后弃去乙醇；
⑥将沉淀室温干燥10min，干燥后加入20-25μl DEPC水溶解混匀。
4)RNA浓度测定
用Nanodrop 2000进行RNA浓度测定。
4.反转录及RT-qPCR
用于检测lncRNA 、心肌损伤标志物(TnT、CKMB、BNP)、炎性因子(IL-1、IL-6、TNF-α)表达量检测。反转录使用Evo M-MLV预混型反转录试剂盒，RT-qPCR使用SYBR Green ProTaq HS预混型qPCR试剂盒，操作步骤严格按照说明书进行，仪器使用Roche 480 PCR仪，结果分析采用2-△△Ct法。
5.ELISA
用于检测心肌损伤标志物(TnT、CKMB、BNP)、炎性因子(IL-1、IL-6、TNF-α)浓度。采用Elabscience公司ELISA试剂盒，严格按照说明书进行操作。
6.CCK-8
用于检测细胞活性。采用CCK-8试剂盒，按照说明书步骤操作。
7.流式细胞术
用于检测细胞凋亡，采用PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I试剂盒，按照说明书进行操作。
二、实验结果
1.lncRNA NONHSAT122636.2在心肌炎患儿中表达情况。
通过分析高通量芯片测序结果，以差异倍数＞2或＜0.5，P＜0.05为标准，共发现3101个差异表达的lncRNA，其中1645个上调分子，1456个下调分子。然后通过KEGG、GO等功能分析，从中挑选参与细胞炎症、凋亡相关通路的lncRNAs进行验证，共挑选出3个候选分子(NONHSAT254241.1、NONHSAT243632.1、NONHSAT122636.2)。
扩大临床样本量，首先通过RT-qPCR进行表达量验证，仅NONHSAT122636.2符合测序结果，在心肌炎患儿中明显下调(图1A)，且与心肌损伤标志物(cTnT、CKMB、BNP)、炎症因子(IL-1、IL-6、TNF-α)呈负相关，与LVEF呈正相关(图3)。并通过绘制ROC曲线，发现曲线下面积(AUC)为0.89(图1B)，提示该lncRNA可以作为儿童心肌炎诊断标志物。进一步分析发现，其诊断儿童心肌炎的敏感度为84.6％，特异度为82.4％(图2)。
2.心肌炎细胞模型建立
为进一步验证该lncRNA的功能，我们进行细胞层面的验证，按照上述实验方法建立心肌炎模型，并通过ELISA检测TnT、CKMB、BNP、IL-1、IL-6、TNF-α等心肌炎症相关分子，结果发现LPS刺激心肌细胞后，炎症相关因子明显增高，心肌炎模型建立成功。
3.lncRNA NONHSAT122636.2在心肌炎模型中表达情况
设立LPS浓度梯度(0μg/ml、10μg/ml、100μg/ml)和时间梯度(0h、6h、12h、18h、24h)。通过RT-qPCR进行表达量验证，发现随着LPS浓度增加，刺激时间的延长，lncRNANONHSAT122636.2表达量逐渐下降，最终当LPS浓度100μg/ml，刺激时间为24h时，lncRNA表达量明显下调(图4)。这一结果符合临床样本中验证结果。
4.功能验证结果
接下来在细胞模型中进行功能验证。因该lncRNA在心肌炎细胞模型中是下调的，所以组建过表达慢病毒载体。转染成功后，以LPS浓度100μg/ml，刺激时间为24h为条件，通过四组细胞进行下一步验证：Control、LPS、LPS+LV-NC、LPS+LV-NONHSAT122636.2。对上述四组细胞进行炎症表型的检测，通过RT-qPCR、ELISA两种方法分别检测TnT、CKMB、BNP、IL-1、IL-6、TNF-α的表达量和浓度，CCK-8检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡。结果发现，lncRNA过表达后，心肌损伤标志物、炎症因子有明显下降(图5)，细胞凋亡减少(图6B)，活性增加(图6A)。提示lncRNA NONHSAT122636.2具有保护心肌、减轻炎症的作用。这也解释了为什么lncRNA NONHSAT122636.2在心肌炎临床样本和细胞模型中下调的原因，证明了其作为儿童心肌炎诊断标志物的巨大潜力。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东第一医科大学附属省立医院（山东省立医院）
<120> lncRNA在儿童心肌炎诊治中的应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1800
<212> DNA
<213> lncRNA NONHSAT122636.2序列
<400> 1
ctattgctcc ccttctctct ttgtactcag aaaatccagg aaattcttcc tcaagaaagc 60
atgacccatt tcagcctaaa agcgtgcttt tctctggact gtgctggctt gagaacatat 120
ttcttttacc aaaaaatgag ttcacagtaa gtgactcaga agcatatgga tgaaatttcc 180
tttaagccac tcaagggatt agaaattaag ggaaagagtg cctggcaaaa tgcatttggg 240
gttttgccaa gcccaaacca actgagaaat agttaagaca caaggcagat ctcaaatgct 300
gccaagttta cccatcttag caggacaggg atttataatt agagctgctc agaaaagcac 360
tgccttacgg gtggcaaagg acaaaaaagg ctttgtcccc aacatctcca caggctgcgg 420
tttcccagat gggcccttaa cagtgtacac accctctcca tcgccagggt cctcaaagcc 480
accgcctcta ccaagcaagg ttcgacttct acaccacgcc cctgacattc tctccaggcc 540
tcttttgttt ctggcccagg ctggatgcat cacactgtga attcctggat gaggaagaac 600
aaatcttgcg gagtgttctg gaattacaga ggagagccat aatgggaaaa tgtgacaaag 660
caattccctt ctctgacata cacattttac ccctgtctct cacctttgtc acgtttcccc 720
attttttcac cttctgtggg tttctttttc tgtaaaatga agggattgga tctgctggtt 780
tcaaactgtg ctacctggag ccacttgcgg gcctggcggg gcccagtgga agtggatggg 840
gagatggtga gaagggctct cttcaaaaaa agcaggaggg ggctccaaca tagcatttca 900
aggaaatcaa gggatccaaa gttaaacaat ttgaaaatca caagtctgga cgaagtctca 960
ttgttctttc caactgaaca ctgccggtgt ggtgtgcctc acttctcagt ctccattcac 1020
taacccaaat atccccaaag atgtgcacca atttttctgt ctagcattca tcagagtgct 1080
cctgtgtgcc aggccctctg ctaagcactg ggcatacagc agtgaacaga aaccccaggg 1140
ggctcataga ccagttggga agattggcat taaacaaatg aatatgtaaa tccaaatcaa 1200
gaggtatgaa caccatgaaa gacaaaatca tggttgaaag ttgagtgggc ctggggttgg 1260
agagatactg ccctaagcat ctcccctccc cacctggctt gccacttgcc cctttataga 1320
ataactaatc gttgttcagt ctttgatagt ttccactgaa aacatccctc ttctacctga 1380
cagaggaggg tcaagacacc cagagcacaa aggagctgat gggtttagtt agctgttact 1440
gcggaaagcc aagaggatga gcttgagaga acagactgag ggctttagat gggtgaatgt 1500
gagaaagtct acagtgcttg ctgtgctgag gaaaaaatcc aggtggatca cctggaggtg 1560
acccaaagtg ccaatgaagt gcatgtcaat ggccctcttc acatacttca ctactgtatc 1620
tggagctctc ctgaacatct ttctcccatt cctcactgag ttttgctaga catggcaaat 1680
gttaactcat taccaactct taattgtatt gctgtttctt tgcccctgtc tagctctttc 1740
tatttgtaca ttttgtaaag agaaaaggaa tttaaaaaat aaaaccaaaa caatctctgg 1800
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> lncRNA NONHSAT122636.2上游引物
<400> 2
gtcaagacac ccagagcaca a 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> lncRNA NONHSAT122636.2下游引物
<400> 3
gtagactttc tcacattcac cc 22

Claims (3)

1.检测lncRNA表达水平的物质在制备诊断儿童心肌炎的产品中的应用，其特征在于，所述lncRNA为lncRNA NONHSAT122636.2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示，所述lncRNA提取自外周血。
2.促进lncRNA表达水平的物质在制备儿童心肌炎治疗相关药物中的应用，其特征在于，所述lncRNA为lncRNA NONHSAT122636.2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示。
3.促进lncRNA表达水平的物质在制备产品中的应用，其特征在于，
所述产品的功能为如下任意一种或多种：
（a1）降低心肌细胞中心肌损伤标志物TnT、CKMB和BNP的表达水平；
（a2）降低心肌细胞中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平；
（a3）抑制心肌细胞凋亡；
其中，所述lncRNA为lncRNA NONHSAT122636.2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示。
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