CN112608995B - 一种肺结核病特异性标志物及应用和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种肺结核病特异性标志物及应用和试剂盒。本发明涉及分子生物学技术领域。所述肺结核病特异性标志物为lncRNAs,所述lncRNAs包括以下任意一种:(1)LNC_001823;(2)LNC_001823和LNC_009202;(3)LNC_001823、LNC_009202和ENST00000560647.5。本发明提供了新的肺结核病特异性lncRNAs标志物,为结核病早期诊断提供了新的分子诊断方法,对控制肺结核病传播具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域,尤其是涉及一种肺结核病特异性标志物及应用和试剂盒。
背景技术
结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性感染性疾病,2019全球结核病报告显示,全世界新发结核病数量约为1000万例,新发耐药结核病约50万例,约有145.1万人死于结核病。因此,为了控制肺结核病传播,因尽早地发现、诊断及治疗结核病,这也是遏制肺结核病流行的最重要措施。
结核分枝杆菌参与诱导机体的免疫应答由多种免疫细胞及细胞因子参与,调控机制十分复杂。近年来,随着基因芯片及测序技术的发展和广泛应用,长链非编码RNA(longnon-coding RNA,lncRNA)也受到人们越来越多的关注。lncRNA是一类长度大于200nt的核酸分子,它一般无编码蛋白质的能力,但部分lncRNA可以编码短肽。lncRNA具有组织特异性及时空特异性,同时还具有低保守性。不同的lncRNA定位不同,丰度也不同。lncRNA在转录的沉默及激活、染色体的修饰、细胞的发育和分化等生物学过程中发挥着重要的作用。lncRNA在免疫系统中发挥的作用越来越受到重视,可参与免疫细胞的分化、细胞因子的表达、炎症相关通路的调节以及调控宿主抵御病原微生物的感染等。目前有研究表明,lncRNA参与机体的免疫应答在结核病的发病过程中起着十分重要的作用,如lncRNA可通过参与免疫细胞的分化或调控细胞自噬、凋亡通路等从而参与抗结核感染;另外,lncRNA还可通过影响巨噬细胞活性氧的产生从而直接参与对结核分枝杆菌的杀伤。此外,lncRNA分子在宿主感染结核分枝杆菌后的异常表达使其具备了成为诊断结核病候选标志物的潜质。因此,发现一种能够作为诊断结核病的特异性lncRNA分子标志物,具有重要的研究和临床意义。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肺结核病特异性标志物及应用和试剂盒。本发明提供了新的肺结核病特异性lncRNAs标志物,对研究控制肺结核病传播,降低肺结核病的发生率具有重要的意义。
本发明提供的技术方案如下:
在一方面,本发明提供了一种肺结核病特异性标志物,所述标志物为lncRNAs,包括以下任意一种:
(1)LNC_001823;
(2)LNC_001823和LNC_009202;
(3)LNC_001823、LNC_009202和ENST00000560647.5。
所述lncRNAs作为诊断肺结核病的特异性标志物。所述LNC_001823、LNC_009202和ENST00000560647.5为长链非编码RNA。所述LNC_001823的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示,所述LNC_009202的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示;所述ENST00000560647.5的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。ENST00000560647.5为从基因数据库中挑选的lncRNA,LNC_001823、LNC_009202为通过转录组学研究新发现的lncRNA。
在第二方面,本发明提供了lncRNAs在制备用于检测和/或诊断结核病的试剂/试剂盒中的用途,所述lncRNAs选自以下任意一种:
(1)LNC_001823;
(2)LNC_001823和LNC_009202;
(3)LNC_001823、LNC_009202和ENST00000560647.5。
本发明所提供的LNC_001823、LNC_009202和/或ENST00000560647.5可以作为结核病药物靶点。
在第三方面,本发明提供了检测lncRNAs的试剂在制备用于检测和/或诊断结核病的试剂/试剂盒中的用途,所述lncRNAs选自以下任意一种:
(1)LNC_001823;
(2)LNC_001823和LNC_009202;
(3)LNC_001823、LNC_009202和ENST00000560647.5。
在一个实施方案中,检测lncRNAs的试剂为能够检测所述lncRNA的表达和/或转录的产品。优选地,检测lncRNAs的试剂为对LNC_001823、LNC_009202和/或ENST00000560647.5的表达量进行定量的试剂。
在一个实施方案中,所述试剂含有检测LNC_001823、LNC_009202和/或ENST00000560647.5的特异性引物对或引物组;
优选地,用于检测LNC_001823的上下游引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示,用于检测LNC_009202的上下游引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示;和/或,用于检测ENST00000560647.5的上下游引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
在第四方面,本发明提供了一种结核病检测或诊断试剂盒,所述试剂盒含有对LNC_001823、LNC_009202和/或ENST00000560647.5的表达量进行定量的试剂。
在一个具体的实施方案中,所述试剂盒包含检测LNC_001823、LNC_009202和/或ENST00000560647.5的特异性引物或引物组。所述试剂盒优选含有能够实时荧光定量检测LNC_001823、LNC_009202和/或ENST00000560647.5的引物序列。
优选地,用于检测LNC_001823的上下游引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示;
用于检测LNC_009202的上下游引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示;
用于检测ENST00000560647.5的上下游引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
在一个实施方案中,所述试剂盒还可包括检测内参基因的上下游引物;可选地,所述内参基因为GAPDH。在一个可选的方案中,所述GAPDH的上下游引物如SEQ ID NO.7和SEQID NO.8所示。
在一个实施方案中,检测的样本为血液,优选外周血样本。
在本发明中,所述肺结核病可选自多种类型的肺结核病,优选活动性肺结核病。
在一个实施方案中,所述试剂盒还包括RNA提取缓冲液、总RNA反转录反应液和qPCR反应液。
在一个实施方案中,所述试剂盒还可包括DNA聚合酶、PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、水和核酸染料中的至少一种。
本发明中,所述LNC_001823的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示,所述LNC_009202的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示;所述ENST00000560647.5的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示;具体如下:
GTCTGGCTAGAGTTTCTCAAGGGTGTGCCCATGGGGATTAGTGGAAAGAGCTCTGTGCTTGGGTTGGGTGGTTTGCCCACTCCACCTTTTATTCTCCTTGGGTGGTTCATAGGAAGAGGCCAAGAGAGAGAGAAGGATGCTGTATTTATGGGAAAAGGCTACCAGAATTTCCATCCGAGAGAGAGGTCTGAGGATGAACTGCTTTCATCTTCTCGCTGTGTGATCTTGCACGGGTCCTTTCCTATCCCTCCTCTGCCACTCTTCTAGGACCGAAGGGGTTCGAGGGTGACCTTTCTGGCCACTTGCAATTGCTAAGAGTGTATTGATTTGAGAATTAAAGGAACGTGGCTCTTGAAATGTGTGTGCGGTAGAGGCCATCCAAAATAGCTAATGAAGAAACATCCTGGGGATTACGCCAAGTTCACAACGCATTTTAATGAGCCGTGAGTGTGTGTGAATGCGTGTGTCGACCACATGCACATTGATGGCTGTGGCAGGGAGGACGCTGTTTCTGAGAGTAGAGTCCTCACTTCTGAGAAACTTACAGAAGGTGGAACAGATCACGCCGTATTTCATAGCAGCCTAATTCTGACATGCATCTGCAAGCCTCATAAGTCGTGGTTTGGTCGGTGCTGCCCATCAAATCAACTTCCTGAACTTGTTTTCATCTGAACTCCAAGGCAGCCCAGGCGCGGGGGGAGCGCAATCGCTCGTGTCTGACTGGCTGCCTCTGAAGTCGTCCGTTACCAGTAGTCTGTTTAGAAGGTGGATTGTTAATTGTTTGATTTTTCTGCCAACAGGATTCCCTGCAAATTAGAATTGTAATCGCTGTGGGTATTTCCTGAATTAAAAGAAAATATATAATAAAATAAATAAATATTAGTTGTTTGGTTGTATAAGCTTTTGAGACCTGCGAGGCTCCTCATCAATTATTAAACTTGGCCGAAGATGACATTCCTAACTAGTGAGTGTGCCTGGAAAAAAAAAGACGCTGGCTAGAAAGCTTTGAGGCGCAAATTTCCACGTTCT。
本发明中,LNC_009202序列为SEQ ID NO:10,具体如下:
GGAGCATGTCCCTGCAGGAAGCCAAGAGTCTCGGAGGAGGACCAAGAATGGCTGGGCCTCAGCCCAGCCCCTAATCCCTCTGCACACCCTCCCTTCCCTAAGGATTTTCCCTTGGAAAAATGTGTTTAATTTTCTCAGCTCAGAGACAATGAATGGAGGATTTGGGGTGGGGTGAGGATGGGTGATGGAGGAGGCCCATGGAGTTTGCCATGGGAAAAGACGAGCAAATGGCAAAACCAGTTTCTGACATGCCCCCTCCTCAGAAAGAAGCTGGAAGCTCAAGCCTGACTATAGGACCAGCACAGCCCCTGGCCAGCCGCATGCTGCAGAGGCTCTGGCTGACTGTCTCTGCTCGCCTGTTCTGTTGTTTGCATGTTCTCAGAATAGGAGACCCCTAAAGACAGAAACTGCATGTGTCCTGCGCAGGAAATCTTGTATTGGTGAGTGTAATTACTGTGGTGGGGTGGACAGTGACAGAGGTGGTCATAGTGGTGGAGGCCACGGTGGGCGTGATGACGGTGACAGTGTAGTGGTGACGGGGGTGGTCATAGTCATGGAAAACCCTGAAACCATGATGAGCACGGGGAGAGGGGGCAGAGGTTGAGAGATGGGCTTCGTAACTTGACAAACCTGGGTGTCCATCCCAGGCCTATCTCTCTCTAGCAGTCACCTGGGCAAGTCAGCCTCTCTGAGTCTCACTTTCCTCATCGGAAAAATGGGATTCACAGGAGCTATTGTGGAGTGTAGGGATCTGAACACTGCTACCCAGGGTGGGCACTGACTCCCTCAGATTTTTTCATTTCATGGGGTTTATTAGCCCCTCTGTCTGCCCAAGAGCCTTCCCTTCCGCCCACAAACTTCCTCCAGTTGTTCCCACTAGCTCTTCCCTGAATCACCACCTCAATTCCTTCCTTCCTTCAGAGCCCCACACATTCTCAAAAAGAAGTCTACACACACTGCCTCTATTTCCTGACCTCCCACTTGTTCCTAGGCCCTCTCAGCAGCCTTCTGGTTCCAAACCCTATGGAAACTGCGCTCACCAAGTCAGCAGAGGCCTCCTCCTCTCAGCCTCAACTTCTTGGGGGAAATTGGTTCTAGGGCCAGCAAGACTTCCAAAGAGCCTCTTCCCAGCAGGTTCAACCTCCCATCATCTGAAAGTCTTTCTGCTCCCCTCAGGGATCCCCCACCAAGCCCTCTGCCCCTGAAGGTTGGTGCTCTGAGGGCATCCTCCTCTCTCTGTGCACTCGCCATCAGAGTGGTTTAGCTCCCCTTGTTCCAATTCCAGTTGGCCACAAGCAGCTCCCAAGTCAATTTCTCTGGTTCACTGTCCATTAGTTGACCCAGCTAGAACCCCACCCCTGGCTCCTGACGCCTCTCCTGCTGGACTCTTCAGCATGTTGGATGAAGGCCATTAGTGCTGAACTCACCATACTCTTCCAAGATCTGCCTGCTCCTCCCCATCACCCCAGAGCAAGCCCTTGGCTCCTCTCCCCTTCCTAGAAACTCCCACCAGTGTTGTCAGTTCTCTTGGGTCATGATTCCTTAAAAATGAACACAGAATCTAATTTTATTTTCAAAACATGAAAACAGTTCACCATTTAACTTTGCTCTTATTAAGTCTATTATCCTGATTCATCCTCTTTGGTATTAAAGTCAATAAATCGTATAAATCTTGAAACTTTTTTAACTCAGAAAAATAAATTCTGTTATGACAATCCTTGACATGTTAATCTGTGTTGTGTAAACTGTTAGCTTTAAAACACAAAATGCTTTTTTTAACATGGTTGTGTCTTAGAAACTTCCTGCACATCATTGTGCTTGCTTTTAGTAACAGCAGACTAGGTAATGGTGATCAACCTTCTTGCTGAGGGCAACTAGAAGAGCTATATATTTTTTTAAAAACTACCACTACCACCACAACACCAGACCATTTGAAGCATCTGAGCACTAATAAGACAAACAAGATAGTAGACAATTATTGAGCTAGGATATGGAGAGGACTGAGACTAGGGAGGTGAGCTTGGCTTTTAAATGCTTTTCCTCTGGGAATGGAGGGAGTGAGTGACTGAGAGGTTGAAAGGTTAATCAGCGCTTTTGAGGATCTGGGGATATGAGACAAAGCCTACCAAGAGGAGTATTTGGTAAACCTCCTTGCTTTGGATTGAGACCCCAAAGGGCTGTGCCTGAGGACTAAGGATAAACTGGAAGTAGACAGGTTCTTACAGTGACTGCCGCTCTGCTTAGACTCATCTCAATTCCTGAAATTGGATTAAGGCGATCCAATGTTGCTAGTGCCCTCAGGGTCTTGCAAATCCTCTCTGGAAGAAGATGTCATCCTGGTGTCAGATAATTTCTACAAACAACTTTGCACCTGCAATGTCCAGAACACACACACACACACACACACACACACACACACAAACAAAAACAACTCACAAAAAAACAAATAAAACACACACATACACACAACAAACCAAAACCAACACCAAAAACCAAACACATGAGACTGGACAACATGAACAAACATAAAAGCATATACAGCAGGGGTTCTAGATGTTGGAATTATCAGATGCAGATTTTATAATTAAAAAAACAGCAATGCTTATTATGTTCAAAGAGATAAAAATACATGATGGAAATAGACATGGTTTGAGAATTTTGGCAGGGAATTGAAACTTTGTTAAAAAAATTAAAATTCTAGAACTGAAAATTATAATACCCAAGACTAAGGATTCAATGGATAGGTTTAAAAGTATATGAAACATAGCTGAAGAAAGAATTACTGAATTAGAAGCTAGATTAGAAAAAATATCCAGGCCAGACATAGTAGCTCACGCCTGTAATCCCATCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGTGG。
本发明中,ENST00000560647.5序列为SEQ ID NO:11,具体如下:
CGGCCACGCCTTACCGAAAGGAGTCCTGACTCAGAGCTGCTGTGCCGTCCCTTCTCCTGTCCCTGCCTGGAAGAGGCCTATCAGGTTGACCAAGCTTTGCTCCCACCTGTGGATGAGAAGGGCAGGTGGCCGAGAGTGGGTGTGGAGGAGGAAGACTGGATGCCAATGATCCTGATCTCACTCTGTCACCAAGGCTGGAGTGCAGCAGCAGAATTTCAGCTCACTGCAACCTCGACTTGCTGGGTTCAAGGGATCTCCCAAGTAGCTGGGACTACAGGTGCACACCATCATGCCTGGCTAATTTTTTGTAGGGATGGGGTTTTACCATGCTGCCCAGGCTGGTCTTGAACTTCTGAGTTCAAGCGATCCTCCCTCCTGAGCCTCCTAAAGTGCTGGGATTACAGGTTTAAAAAATATCCTGGACTTTGGAAAATATTCTTATATAAAGAAGCAAAAAGAGGATGGAATAGACTTGTGCTAACACTGAAACTCCAGTCAAGTTGTAAACTGAAAAAGAACGTGTTGAAACAAGGAATTGCCCCATAGCCTTCACAGGTAATGCTGATGCTTCAAGTCTTGGAACCACACTTCGAGAATCACTGTTATAATGTACAGCAGAACTGCATGATCAGCTGTATGGTAGCCTTGAAAACCAACAGGCCACAATCACAGTGAAAACCTCAGGTTGGCAGCCACTGGAGG。
有益效果:
本发明通过提取活动性肺结核患者和健康人群外周血样本的RNA,设计特异性qPCR引物,验证lncRNA在两组人群中的特异性表达情况,结果显示,活动性肺结核患者中LNC_001823、LNC_009202的表达发生下调,而ENST00000560647.5的表达上调,结果在统计学上具有极显著性差异。由此说明,通过对LNC_001823、LNC_009202、ENST00000560647.5在外周血中表达量的检测,能够有效区分活动性结核患者和健康人群。
本发明首次发现并验证LNC_001823、LNC_009202、ENST00000560647.5可作为诊断活动性结核类疾病的分子标志物,三者各自单独可进行活动性结核类疾病筛查、诊断,且三者组合诊断能够提高结核病的诊断准确率,优于单一标志物诊断。
本发明分子标记物作为活动性肺结核的特异性标志物,易于检测且结果具有一定的稳定性和可靠性,组合诊断活动性肺结核准确率更高,重复性好,制备为诊断肺结核的试剂盒进行检测方便且高效,对肺结核病治疗效果的评价具有重要的意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为LNC_001823在肺结核病患者和正常健康人之间的差异表达图;
图2为LNC_009202在肺结核病患者和正常健康人之间的差异表达图;
图3为ENST00000560647.5在肺结核病患者和正常健康人之间的差异表达图;
图4为LNC_001823的ROC曲线图;
图5为LNC_009202的ROC曲线图;
图6为ENST00000560647.5的ROC曲线图;
图7为联合LNC_001823、LNC_009202、ENST00000560647.5三种lncRNA的ROC曲线图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例
对象:符合《WS 288-2008肺结核诊断标准》的活动性肺结核患者80例且排除糖尿病、HIV感染及其它自身免疫性疾病;正常健康人群组80例,满足TST试验、T-SPOT试验均为阴性,胸部影像学检查无明显异常者。
本发明的临床样本信息均来自首都医科大学附属北京胸科医院。
1、LNC_001823、LNC_009202、ENST00000560647.5在活动性结核患者和健康人群外周血中的表达
1.1外周血有核细胞的制备
采集活动性结核患者和正常健康人群的外周血2mL于肝素钠抗凝采血管中;按照新鲜全血:红细胞裂解液体积比为1:3,加入6mL红细胞裂解液(solarbio,货号R1010),颠倒混匀;冰上放置15min,期间再次颠倒混匀两次;450g,4℃离心10min,弃去上清液;再次向细胞沉淀中加入6mL红细胞裂解液,重悬白细胞,450g,4℃离心10min,彻底吸去上清液;向细胞沉淀中加入1mL Trizol试剂(Invitrogen,货号15596),吹打混匀,移入离心管中,于-80℃中保存,用于后续RNA的提取。
1.2RNA的提取及纯度测定
取出保存于-80℃中裂解的白细胞,室温下融化,加入0.2mL的氯仿,剧烈混匀15s,室温孵育3min,放入离心机12000g,4℃,离心15min;将离心管中上层的透明液体移入新的离心管中,随后向该透明液体中加入0.5mL异丙醇,颠倒混匀,室温孵育10min,随后12000g,4℃,离心10min;弃去上层悬液,向管内加入1mL 75%乙醇,7500g,4℃,离心5min,此步骤重复两次;弃去管内液体,干燥5min,加入40μL无RNase水溶解沉淀物;取提取的RNA样本1.0μL,经安捷伦生物分析仪器nanodrop-2000检测,测定结果RNA浓度均大于100ng/μL,A260/A280数值在1.5~2.0之间。
1.3反转录
采用TIANGEN公司的InRcute lncRNA cDNA第一链合成试剂盒(货号KR202-02),取此前提取的RNA,按照RNA终浓度800ng的量加入适量待反转录的RNA,加入5×g DNA Buffer2μL,再加入无RNase水补至总体积10μL,彻底混匀,简短离心,置于42℃,孵育3min,然后置于冰上;向混合液中加入10×lnR RT Buffer 2μL,lnR RT Enzyme Mix 1μL,lnR-RTPrimer Mix 2μL,无RNaes水5μL,充分混匀,42℃孵育15min,95℃孵育3min,随后将反转录得到的cDNA保存于-40℃中。
1.4实时荧光定量PCR
1.4.1引物序列
1.4.2实时荧光定量PCR检测目的基因
以反转录步骤中取得的cDNA为模板,采用TIANGEN公司的lnRcute lncRNA qPCRKit(SYBR Green)试剂盒(货号FP402-02)检测LNC_001823、LNC_009202、ENST00000560647.5的表达水平,选择GAPDH作为内参基因,设置不加模板的阴性对照孔。
使用ABI 7500实时荧光定量PCR仪进行检测。反应体系如下:
反应条件为:95℃,3min;然后95℃5s,60℃32s共40个循环。
1.4.3数据处理及统计分析
根据实时荧光定量PCR的结果,以GAPDH基因为内参基因,通过2-△CT的方法计算出lncRNA在活动性结核病患者和正常健康人群组中的表达量,采用GraphPad Prism 8软件,Mann-Whitney检验分析数据。P<0.05时,认为结果在统计学上具有显著性差异,P<0.01时,结果在统计学上具有极显著性差异,绘制散点图及ROC曲线。
结果显示,在活动性结核病患者中,LNC_001823、LNC_009202的表达下调(见图1、图2),P<0.0001;ENST00000560647.5的表达上调(见图3),P<0.0001。图1至图3中,HC代表健康人群;TB代表活动性肺结核病患者。
通过ROC曲线分析,LNC_001823的曲线下面积为0.7296,特异性为70%,灵敏性为72.5%(见图4);LNC_009202的曲线下面积为0.6895,特异性为66.25%,灵敏性为67.5%(见图5);ENST00000560647.5曲线下面积为0.7933,特异性为81.25%,灵敏性为62.5%(见图6),将三种lncRNA联合后通过ROC曲线分析,曲线下面积为0.816,特异性为75%,灵敏性为80%(见图7)。
本发明中,LNC_001823、LNC_009202、ENST00000560647.5在活动性结核病患者和健康对照人群中具有显著性表达差异,说明LNC_001823、LNC_009202或ENST00000560647.5可以作为诊断活动性结核病的特异性标志物。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 首都医科大学附属北京胸科医院;北京市结核病胸部肿瘤研究所
<120> 一种肺结核病特异性标志物及应用和试剂盒
<130> PA20047855
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccatccgaga gagaggtctg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
accccttcgg tcctagaaga 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggaatggagg gagtgagtga 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccttagtcct caggcacagc 20
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gaggaggaag actggatg 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gctgaaattc tgctgctg 18
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tctggtaaag tggatattgt tgcc 24
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cctggaagat ggtgatggga t 21
<210> 9
<211> 1029
<212> DNA
<213> LNC_001823
<400> 9
gtctggctag agtttctcaa gggtgtgccc atggggatta gtggaaagag ctctgtgctt 60
gggttgggtg gtttgcccac tccacctttt attctccttg ggtggttcat aggaagaggc 120
caagagagag agaaggatgc tgtatttatg ggaaaaggct accagaattt ccatccgaga 180
gagaggtctg aggatgaact gctttcatct tctcgctgtg tgatcttgca cgggtccttt 240
cctatccctc ctctgccact cttctaggac cgaaggggtt cgagggtgac ctttctggcc 300
acttgcaatt gctaagagtg tattgatttg agaattaaag gaacgtggct cttgaaatgt 360
gtgtgcggta gaggccatcc aaaatagcta atgaagaaac atcctgggga ttacgccaag 420
ttcacaacgc attttaatga gccgtgagtg tgtgtgaatg cgtgtgtcga ccacatgcac 480
attgatggct gtggcaggga ggacgctgtt tctgagagta gagtcctcac ttctgagaaa 540
cttacagaag gtggaacaga tcacgccgta tttcatagca gcctaattct gacatgcatc 600
tgcaagcctc ataagtcgtg gtttggtcgg tgctgcccat caaatcaact tcctgaactt 660
gttttcatct gaactccaag gcagcccagg cgcgggggga gcgcaatcgc tcgtgtctga 720
ctggctgcct ctgaagtcgt ccgttaccag tagtctgttt agaaggtgga ttgttaattg 780
tttgattttt ctgccaacag gattccctgc aaattagaat tgtaatcgct gtgggtattt 840
cctgaattaa aagaaaatat ataataaaat aaataaatat tagttgtttg gttgtataag 900
cttttgagac ctgcgaggct cctcatcaat tattaaactt ggccgaagat gacattccta 960
actagtgagt gtgcctggaa aaaaaaagac gctggctaga aagctttgag gcgcaaattt 1020
ccacgttct 1029
<210> 10
<211> 2874
<212> DNA
<213> LNC_009202
<400> 10
ggagcatgtc cctgcaggaa gccaagagtc tcggaggagg accaagaatg gctgggcctc 60
agcccagccc ctaatccctc tgcacaccct cccttcccta aggattttcc cttggaaaaa 120
tgtgtttaat tttctcagct cagagacaat gaatggagga tttggggtgg ggtgaggatg 180
ggtgatggag gaggcccatg gagtttgcca tgggaaaaga cgagcaaatg gcaaaaccag 240
tttctgacat gccccctcct cagaaagaag ctggaagctc aagcctgact ataggaccag 300
cacagcccct ggccagccgc atgctgcaga ggctctggct gactgtctct gctcgcctgt 360
tctgttgttt gcatgttctc agaataggag acccctaaag acagaaactg catgtgtcct 420
gcgcaggaaa tcttgtattg gtgagtgtaa ttactgtggt ggggtggaca gtgacagagg 480
tggtcatagt ggtggaggcc acggtgggcg tgatgacggt gacagtgtag tggtgacggg 540
ggtggtcata gtcatggaaa accctgaaac catgatgagc acggggagag ggggcagagg 600
ttgagagatg ggcttcgtaa cttgacaaac ctgggtgtcc atcccaggcc tatctctctc 660
tagcagtcac ctgggcaagt cagcctctct gagtctcact ttcctcatcg gaaaaatggg 720
attcacagga gctattgtgg agtgtaggga tctgaacact gctacccagg gtgggcactg 780
actccctcag attttttcat ttcatggggt ttattagccc ctctgtctgc ccaagagcct 840
tcccttccgc ccacaaactt cctccagttg ttcccactag ctcttccctg aatcaccacc 900
tcaattcctt ccttccttca gagccccaca cattctcaaa aagaagtcta cacacactgc 960
ctctatttcc tgacctccca cttgttccta ggccctctca gcagccttct ggttccaaac 1020
cctatggaaa ctgcgctcac caagtcagca gaggcctcct cctctcagcc tcaacttctt 1080
gggggaaatt ggttctaggg ccagcaagac ttccaaagag cctcttccca gcaggttcaa 1140
cctcccatca tctgaaagtc tttctgctcc cctcagggat cccccaccaa gccctctgcc 1200
cctgaaggtt ggtgctctga gggcatcctc ctctctctgt gcactcgcca tcagagtggt 1260
ttagctcccc ttgttccaat tccagttggc cacaagcagc tcccaagtca atttctctgg 1320
ttcactgtcc attagttgac ccagctagaa ccccacccct ggctcctgac gcctctcctg 1380
ctggactctt cagcatgttg gatgaaggcc attagtgctg aactcaccat actcttccaa 1440
gatctgcctg ctcctcccca tcaccccaga gcaagccctt ggctcctctc cccttcctag 1500
aaactcccac cagtgttgtc agttctcttg ggtcatgatt ccttaaaaat gaacacagaa 1560
tctaatttta ttttcaaaac atgaaaacag ttcaccattt aactttgctc ttattaagtc 1620
tattatcctg attcatcctc tttggtatta aagtcaataa atcgtataaa tcttgaaact 1680
tttttaactc agaaaaataa attctgttat gacaatcctt gacatgttaa tctgtgttgt 1740
gtaaactgtt agctttaaaa cacaaaatgc tttttttaac atggttgtgt cttagaaact 1800
tcctgcacat cattgtgctt gcttttagta acagcagact aggtaatggt gatcaacctt 1860
cttgctgagg gcaactagaa gagctatata tttttttaaa aactaccact accaccacaa 1920
caccagacca tttgaagcat ctgagcacta ataagacaaa caagatagta gacaattatt 1980
gagctaggat atggagagga ctgagactag ggaggtgagc ttggctttta aatgcttttc 2040
ctctgggaat ggagggagtg agtgactgag aggttgaaag gttaatcagc gcttttgagg 2100
atctggggat atgagacaaa gcctaccaag aggagtattt ggtaaacctc cttgctttgg 2160
attgagaccc caaagggctg tgcctgagga ctaaggataa actggaagta gacaggttct 2220
tacagtgact gccgctctgc ttagactcat ctcaattcct gaaattggat taaggcgatc 2280
caatgttgct agtgccctca gggtcttgca aatcctctct ggaagaagat gtcatcctgg 2340
tgtcagataa tttctacaaa caactttgca cctgcaatgt ccagaacaca cacacacaca 2400
cacacacaca cacacacaca aacaaaaaca actcacaaaa aaacaaataa aacacacaca 2460
tacacacaac aaaccaaaac caacaccaaa aaccaaacac atgagactgg acaacatgaa 2520
caaacataaa agcatataca gcaggggttc tagatgttgg aattatcaga tgcagatttt 2580
ataattaaaa aaacagcaat gcttattatg ttcaaagaga taaaaataca tgatggaaat 2640
agacatggtt tgagaatttt ggcagggaat tgaaactttg ttaaaaaaat taaaattcta 2700
gaactgaaaa ttataatacc caagactaag gattcaatgg ataggtttaa aagtatatga 2760
aacatagctg aagaaagaat tactgaatta gaagctagat tagaaaaaat atccaggcca 2820
gacatagtag ctcacgcctg taatcccatc actttgggag gccgaggtgg gtgg 2874
<210> 11
<211> 702
<212> DNA
<213> ENST00000560647.5
<400> 11
cggccacgcc ttaccgaaag gagtcctgac tcagagctgc tgtgccgtcc cttctcctgt 60
ccctgcctgg aagaggccta tcaggttgac caagctttgc tcccacctgt ggatgagaag 120
ggcaggtggc cgagagtggg tgtggaggag gaagactgga tgccaatgat cctgatctca 180
ctctgtcacc aaggctggag tgcagcagca gaatttcagc tcactgcaac ctcgacttgc 240
tgggttcaag ggatctccca agtagctggg actacaggtg cacaccatca tgcctggcta 300
attttttgta gggatggggt tttaccatgc tgcccaggct ggtcttgaac ttctgagttc 360
aagcgatcct ccctcctgag cctcctaaag tgctgggatt acaggtttaa aaaatatcct 420
ggactttgga aaatattctt atataaagaa gcaaaaagag gatggaatag acttgtgcta 480
acactgaaac tccagtcaag ttgtaaactg aaaaagaacg tgttgaaaca aggaattgcc 540
ccatagcctt cacaggtaat gctgatgctt caagtcttgg aaccacactt cgagaatcac 600
tgttataatg tacagcagaa ctgcatgatc agctgtatgg tagccttgaa aaccaacagg 660
ccacaatcac agtgaaaacc tcaggttggc agccactgga gg 702
Claims (12)
1.一种肺结核病特异性标志物,所述标志物为lncRNAs,其特征在于,所述lncRNAs包括以下任意一种:
(1)LNC_001823;
(2)LNC_001823和LNC_009202;
(3)LNC_001823、LNC_009202和ENST00000560647.5;
所述LNC_001823的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示,所述LNC_009202的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示;所述ENST00000560647.5的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。
2.权利要求1所述的lncRNAs在制备用于检测和/或诊断结核病的试剂/试剂盒中的应用。
3.检测权利要求1所述的lncRNAs的试剂在制备用于检测和/或诊断结核病的试剂/试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,检测lncRNAs的试剂为能够检测所述lncRNAs的表达和/或转录的产品。
5.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,检测lncRNAs的试剂为对LNC_001823、LNC_009202和/或ENST00000560647.5的表达量进行定量的试剂。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述试剂含有检测LNC_001823、LNC_009202和/或ENST00000560647.5的特异性引物对或引物组;用于检测LNC_001823的上下游引物如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示,用于检测LNC_009202的上下游引物如SEQ IDNO. 3和SEQ ID NO. 4所示;和/或,用于检测ENST00000560647.5的上下游引物如SEQ IDNO. 5和SEQ ID NO. 6所示。
7.一种结核病检测或诊断试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含检测权利要求1的所述lncRNAs的试剂。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含权利要求6的检测LNC_001823、LNC_009202和/或ENST00000560647.5的所述特异性引物对或所述引物组。
9.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包含检测内参基因的上下游引物。
10.根据权利要求9所述的试剂盒,其特征在于,所述内参基因为GAPDH。
11.根据权利要求10所述的试剂盒,其特征在于,检测所述内参基因GAPDH的上下游引物如SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 8所示。
12.根据权利要求7-11任一项所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括RNA提取缓冲液、总RNA反转录反应液和qPCR反应液。
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Applications Claiming Priority (1)
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CN112608995A CN112608995A (zh) | 2021-04-06 |
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Citations (2)
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CN107653315A (zh) * | 2017-10-16 | 2018-02-02 | 苏州大学附属第医院 | lncRNAs作为活动性肺结核病特异性标志物的应用 |
CN110029160A (zh) * | 2019-04-09 | 2019-07-19 | 李继承 | 一种基于血浆lncRNA组合物的肺结核病疗效评价试剂盒及其用途 |
-
2021
- 2021-01-13 CN CN202110042824.5A patent/CN112608995B/zh active Active
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN107653315A (zh) * | 2017-10-16 | 2018-02-02 | 苏州大学附属第医院 | lncRNAs作为活动性肺结核病特异性标志物的应用 |
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Title |
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Gene expression profiling of the TRIM protein family reveals potential biomarkers for indicating tuberculosis status;Yanqing Chen等;《Microbial Pathogenesis》;20171207;第114卷;第385-392页 * |
Long Noncoding RNA and Predictive Model To Improve Diagnosis of Clinically Diagnosed Pulmonary Tuberculosis;Xuejiao Hu等;《Journal of Clinical Microbiology》;20200624;第58卷(第7期);e01973-19 * |
Transcript:AC025580.2-203 ENST00000560647.5;无;《Ensemble》;20201130;1-2页 * |
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