JP2021043216A - 疾患の診断用組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】インターロイキン29(Interleukin 29)のタンパク質又はタンパク質をコードする遺伝子のmRNAの発現水準を測定する製剤を含む、膵臓疾患の診断用組成物。タンパク質の発現水準を測定する製剤は、タンパク質に特異的に結合する抗体、オリゴペプチド、リガンド、PNA(peptide nucleic acid)及びアプタマー(aptamer)からなる群から選択された1種以上を含む、診断用組成物。mRNAの発現水準を測定する製剤は、mRNAに特異的に結合するプライマー、プローブ及びアンチセンスヌクレオチドからなる群から選択された1種以上を含む、診断用組成物。
【選択図】図3
Description
22 receptor、IL−22R)又は前記インターロイキン22受容体をコードする遺伝子のmRNAの発現水準を測定する製剤をさらに含むことにより、前記疾患を診断するのに正確度を高めることができる。
Flight Mass Spectrometry)分析、SELDI−TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)分析、放射線免疫分析、放射免疫拡散法、オクタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、組職免疫染色、補体結合分析法、2次元電気泳動分析、液相クロマトグラフィー質量分析(liquid chromatography−Mass Spectrometry、LC−MS)、LC−MS/MS(liquid chromatography−Mass Spectrometry/Mass Spectrometry)、ウエスタンブロット法及びELISA(enzyme linked immunosorbentassay)などがあるが、これに制限されるものではない。
et al,J.Mol.Biol.222:58、1−597,1991参照)を用いて製造されることができる。前記方法で製造された抗体はゲル電気泳動、透析、塩沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーなどの方法を用いて分離、精製されることができる。また、本発明の抗体は、2個の全長の軽鎖及び2個の全長の中鎖を有する完全な形態だけではなく、抗体分子の機能的な断片を含む。抗体分子の機能的な断片とは、少なくとも抗原結合機能を保有している断片を意味し、Fab、F(ab’)、F(ab’)2及びFvなどがある。
a combinatorial library”.Proc Natl Acad
Sci USA.95(24):142727(1998)]に詳細に開示されている。
RT−PCR)、実時間逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(Real−time RT−PCR)、RNase保護分析法(RPA;RNase protection assay)、ノーザンブロット法(Northern blotting)、DNAチップなどがあるが、これに制限されるものではない。
cancer)又は膵臓炎(pancreatitis)、より好ましくは膵臓癌の発病有無と発病可能性を比較的正確に診断及び予測することができる。
nucleic acid)及びアプタマー(aptamer)からなる群から選択された1種以上を含むことができる。
(b)前記患者に候補薬剤を投与する段階、及び
(c)前記候補薬剤の投与後、前記患者から分離された生検でインターロイキン10受容体、インターロイキン22受容体、インターロイキン22、インターロイキン29及びインターフェロンラムダ受容体1イソフォーム1からなる群から選択された1種以上のタンパク質又は前記タンパク質をコードする遺伝子のmRNAの発現水準を測定する段階を含む、疾患治療用薬物スクリーニング方法に関する。
disease)、ハシモト病(Hashimoto’s thyroiditis)、自己免疫リンパ球増殖性症候群(autoimmune lymphoproliferative syndrome、ALPS)、重症筋無力症(myasthenia gravis)、カワサキ病(Kawasaki disease)又は乾癬(psoriasis)などであり得るが、これに制限されるものではない。
cancer)又は膵臓炎(pancreatitis)、より好ましくは膵臓癌に対する治療用薬物の効用性又は感受性を比較的正確に予測することができる。
(b)前記患者に候補薬剤を投与する段階、及び
(c)前記候補薬剤の投与後、前記患者から分離された生検でインターロイキン10受容体、インターロイキン22受容体、インターロイキン22、インターロイキン29及びインターフェロンラムダ受容体1イソフォーム1からなる群から選択された1種以上のタンパク質又は前記タンパク質をコードする遺伝子のmRNAの発現水準を測定する段階を含む、疾患治療用薬物スクリーニング方法に関する。
以下、本発明を下記の実施例に基づいて詳細に説明する。ただ、下記実施例は本発明を例示するものであるだけ、本発明の内容が下記の実施例によって限定されるものではない。
Histopaq 1077はSigmaから購入し、Brefeldin AはBiolegendから購入した。抗体として、Alexa 647抗−IL−22、及びPE抗−マウスIL−10RはBiolegendから購入し、PerCPマウスIL−22RはR&Dから購入した。また、FACSバッファー(buffer)としてはBSA(bovine serum albumin)が0.5%含まれたPBS(phosphate buffered solution)を使った。細胞固定用バッファー(fixation buffer)及びパーマ/ウォッシュバッファー(Perm/wash buffer)もBiolegendから購入した。
1.単核球(peripheral blood mononuclear cell;PBMC)の分離
膵臓癌患者3人、膵臓炎患者3人、正常対照群3人、肺癌患者3人、大膓癌患者3人からそれぞれ血液を採取して常温で保管した。血液の粘度が高い場合は単核球の分離が難しいので、1X PBSに1:1で希釈して準備した。15ml円錐管(conical tube)にフィコール(Histopaq 1077、sigma)を血液と同じ体積で準備した。フィコール上に血液サンプルが混じらないように添加した。加速と減速を最小にし、400gを30分間遠心分離した。中間に白い細胞層(単核球)を別に回収した後、PBSを添加し、400gを3分間遠心分離しながら洗浄した。洗浄された細胞を回収して50μl FACSバッファーに再浮遊させた後、PE抗−マウスIL−10R抗体及びPerCPマウスIL−22R抗体を添加し、アイス(ice)で1時間培養した。その後、FACSバッファーで2回洗浄し、FACSバッファー500μlに細胞を再浮遊させた。
収集した細胞を計数し、1×106cells/mlでペニシリン及びストレプトマイシンを2%含むRPMI1640培地に入れた後、Brefeldin Aを1Xで処理して6時間培養した。
培養された細胞を回収し、FACSバッファー(0.5%BSA in PBS)で2回洗浄した後、固定バッファーを500μlずつ入れ、アイスで30分間固定した。ついで、FACSバッファーで2回洗浄し、パーマバッファー1mlに再浮遊させた後、遠心分離を20分間2回遂行した。その後、細胞をまた回収してパーマバッファー50μlに再浮遊させた後、Alexa 647抗−IL−22抗体を添加し、アイスで1時間培養した。FACSで2回洗浄し、FACSバッファー500μlに再浮遊させた。
FACS Calibur(BD Biosciences、San Jose、CA)を使って総単核球細胞数に比べてIL−10R、IL−22R又はIL−22が発現する細胞数を%で示した。その結果は下記の表1及び図1〜3に示した。ただ、下記の表1で、データは平均±標準偏差で示し、統計的分析はDunn’s post hoc分析を用いたKruskal−Wallisテストを使って遂行した。
正常対照群4人、膵臓癌患者4人、胆管癌患者2人、胆嚢癌患者2人からそれぞれ血液を採取した後、前記実施例1と同様な方法で血液内単核球(PBMC)を分離し、正常対照群に比べて前記単核球でIL−10Rベータサブユニット(IL−10RB)とIL−22Rアルファサブユニット(IL−22RA)のmRNA発現水準の比率を測定し、その結果を図4及び図5に示した。
正常対照群4人、膵臓癌患者4人、胆管癌患者2人、胆嚢癌患者2人からそれぞれ血液を採取した後、前記実施例1と同様な方法で血液内単核球(PBMC)を分離し、正常対照群に比べて前記単核球でのIL−22とIL−29のmRNA発現水準の比率を測定し、その結果を図6及び図7に示した。
正常対照群4人、膵臓癌患者4人、胆管癌患者2人、胆嚢癌患者2人からそれぞれ血液を採取した後、前記実施例1と同様な方法で血液内単核球(PBMC)を分離し、正常対照群に比べて前記単核球でIL−29と結合するインターフェロン受容体1イソフォーム1(IFNLR1 isoform1)とインターフェロン受容体1イソフォーム3(IFNLR1 isoform3)のmRNA発現水準の比率を測定し、その結果を図8及び図9に示した。
膵臓癌切除術を受けた膵臓癌患者に対し、手術の前と後にそれぞれ血液を採取した後、前記実施例1と同様な方法で血液内単核球(PBMC)を分離し、FACS Calibur(BD Biosciences、San Jose、CA)を使って総単核球細胞数に比べてIL−10R、IL−22R又はIL−22が発現する細胞数を%で示した。その結果は下記の表2及び図10〜図12に示した。
膵臓癌切除術を受けた膵臓癌患者に対し、手術前と手術後3ヶ月が経過した時点で血液を採取した後、前記実施例1と同様な方法で血液内単核球(PBMC)を分離し、FACS Calibur(BD Biosciences、San Jose、CA)を使って総単核球細胞数に比べてIL−10R(marker C)が発現する細胞の頻度を測定した後、paired T testに分析し、その結果を図13に示した。
正常対照群4人、膵臓癌患者4人、胆管癌患者2人、胆嚢癌患者2人からそれぞれ血液を採取した後、血漿(plasma)内の循環するエクソソーム(exosome)を分離し、正常対照群に比べて前記エクソソームでIL−10Rベータサブユニット(IL−10RB)、IL−22Rアルファ1(IL−22RA)及びインターフェロン受容体1イソフォーム1(IFNLR1 isoform1)のそれぞれのmRNA発現水準の比率を測定し、その結果を図14〜図16に示した。
配列番号2(IL−22RA):mrtlltiltvgslaahapedpsdllqhvkfqssnfeniltwdsgpegtpdtvysieyktygerdwvakkgcqritrkscnltvetgnltelyyarvtavsaggrsatkmtdrfsslqhttlkppdvtciskvrsiqmivhptptpiragdghrltledifhdlfyhlelqvnrtyqmhlggkqreyeffgltpdteflgtimicvptwakesapymcrvktlpdrtwtysfsgaflfsmgflvavlcylsyryvtkppappnslnvqrvltfqplrfiqehvlipvfdlsgpsslaqpvqysqirvsgprepagapqrhslseitylgqpdisilqpsnvpppqilsplsyapnaapevgppsyapqvtpeaqfpfyapqaiskvqpssyapqatpdswppsygvcmegsgkdsptgtlsspkhlrpkgqlqkeppagscmlgglslqevtslameesqeakslhqplgictdrtsdpnvlhsgeegtpqylkgqlpllssvqieghpmslplqppsrpcspsdqgpspwglleslvcpkdeakspapetsdleqpteldslfrglaltvqwes
配列番号3(IL−22):maalqksvssflmgtlatscllllallvqggaaapisshcrldksnfqqpyitnrtfmlakeasladnntdvrligeklfhgvsmsercylmkqvlnftleevlfpqsdrfqpymqevvpflarlsnrlstchiegddlhiqrnvqklkdtvkklgesgeikaigeldllfmslrnaci
配列番号4(IL−29):maaawtvvlvtlvlglavagpvptskptttgkgchigrfkslspqelasfkkardaleeslklknwscsspvfpgndlrllqvrerpvaleaelaltlkvleaaagpaledvldqplhtlhhilsqlqaciqpqptagprprgrlhhwlhrlqeapkkesagcleasvtfnlfrlltrdlkyvadgnlclrtsthpest
配列番号5(IFNLR1 isoform1):magperwgplllcllqaapgrprlappqnvtllsqnfsvyltwlpglgnpqdvtyfvayqssptrrrwreveecagtkellcsmmclkkqdlynkfkgrvrtvspsskspwveseyldylfevepappvlvltqteeilsanatyqlppcmppldlkyevafwkegagnktlfpvtphgqpvqitlqpaasehhclsartiytfsvpkyskfskptcfllevpeanwaflvlpsllilllviaaggviwktlmgnpwfqrakmpraldfsghthpvatfqpsrpesvndlflcpqkeltrgvrptprvrapatqqtrwkkdlaedeeeedeedtedgvsfqpyieppsflgqehqapghseaggvdsgrpraplvpsegssawdssdrswastvdsswdragssgylaekgpgqgpggdghqeslpppefskdsgfleelpednlsswatwgtlppepnlvpggppvslqtltfcwesspeeeeeareseiedsdagswgaestqrtedrgrtlghymar
Claims (22)
- インターロイキン10受容体(Interleukin 10 receptor、IL−10R)、インターロイキン22受容体(Interleukin 22 receptor、IL−22R)、インターロイキン22(Interleukin 22)、インターロイキン29(Interleukin 29)及びインターフェロンラムダ受容体1イソフォーム1(Interferon lambda receptor 1isoform1)からなる群から選択された1種以上のタンパク質又は前記タンパク質をコードする遺伝子のmRNAの発現水準を測定する製剤を含む、膵臓疾患の診断用組成物。
- 前記組成物は目的とする個体から分離された単核球に対するものである、請求項1に記載の膵臓疾患の診断用組成物。
- 前記組成物は、インターロイキン10受容体又はインターロイキン10受容体をコードする遺伝子のmRNAの発現水準を測定する製剤を含む、請求項1に記載の膵臓疾患の診断用組成物。
- 前記組成物は、インターロイキン22受容体又はインターロイキン22受容体をコードする遺伝子のmRNAの発現水準を測定する製剤をさらに含む、請求項3に記載の膵臓疾患の診断用組成物。
- 前記組成物は、インターロイキン22、インターロイキン29及びインターフェロンラムダ受容体1イソフォーム1からなる群から選択された1種以上のタンパク質又は前記タンパク質をコードする遺伝子のmRNAの発現水準を測定する製剤をさらに含む、請求項3に記載の膵臓疾患の診断用組成物。
- 前記タンパク質の発現水準を測定する製剤は、前記タンパク質に特異的に結合する抗体、オリゴペプチド、リガンド、PNA(peptide nucleic acid)及びアプタマー(aptamer)からなる群から選択された1種以上を含む、請求項1に記載の膵臓疾患の診断用組成物。
- 前記mRNAの発現水準を測定する製剤は、前記mRNAに特異的に結合するプライマー、プローブ及びアンチセンスヌクレオチドからなる群から選択された1種以上を含む、請求項1に記載の膵臓疾患の診断用組成物。
- 前記膵臓疾患は膵臓癌である、請求項1に記載の膵臓疾患の診断用組成物。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の診断用組成物を含む、膵臓疾患の診断用キット。
- 前記キットは、RT−PCRキット、DNAチップキット、ELISAキット、プロテインチップキット、ラピッド(rapid)キット又はMRM(Multiple reaction monitoring)キットである、請求項9に記載の膵臓疾患の診断用キット。
- 目的とする個体から分離された生検に対して、インターロイキン10受容体(Interleukin 10 receptor、IL−10R)、インターロイキン22受容体(Interleukin 22 receptor、IL−22R)、インターロイキン22(Interleukin 22)、インターロイキン29(Interleukin 29)及びインターフェロンラムダ受容体1イソフォーム1(Interferon lambda receptor 1isoform1)からなる群から選択された1種以上のタンパク質又は前記タンパク質をコードする遺伝子のmRNAの発現水準を測定する段階を含む、膵臓疾患の診断のための情報提供方法。
- 前記生検は、個体から分離された血液、血清及び血漿からなる群から選択された1種以上である、請求項11に記載の情報提供方法。
- 前記生検は、個体から分離された単核球及びエクソソームの1種以上を含む、請求項12に記載の情報提供方法。
- 前記生検からインターロイキン10受容体又はインターロイキン10受容体をコードする遺伝子のmRNAの発現水準を測定する段階を含む、請求項11に記載の情報提供方法。
- 前記生検でインターロイキン22受容体又は前記インターロイキン22受容体をコードする遺伝子のmRNAの発現水準を測定する段階をさらに含む、請求項14に記載の情報提供方法。
- 前記生検でインターロイキン22、インターロイキン29及びインターフェロンラムダ受容体1イソフォーム1からなる群から選択された1種以上のタンパク質又は前記タンパク質をコードする遺伝子のmRNAの発現水準を測定する段階をさらに含む、請求項14に記載の情報提供方法。
- 前記目的とする個体から分離された生検で測定された前記タンパク質又は前記mRNAの発現水準が正常対照群での発現水準より高い場合、膵臓疾患の発病可能性が高いと判定する、請求項11に記載の情報提供方法。
- 前記目的とする個体から分離された生検で測定されたインターロイキン10受容体又は前記インターロイキン10受容体をコードする遺伝子のmRNAの発現水準が正常対照群での発現水準の2倍以上の場合、膵臓疾患の発病可能性が高いと判定する、請求項14に記載の情報提供方法。
- 前記目的とする個体から分離された生検で測定された前記インターロイキン22受容体又は前記インターロイキン22受容体をコードする遺伝子のmRNAの発現水準が正常対照群での発現水準より高い場合、膵臓疾患の発病可能性が高いと判定する、請求項15に記載の情報提供方法。
- 前記目的とする個体から分離された生検で測定された前記インターロイキン22受容体又は前記インターロイキン22受容体をコードする遺伝子のmRNAの発現水準が正常対照群での発現水準の1.5倍以上の場合、膵臓疾患の発病可能性が高いと判定する、請求項19に記載の情報提供方法。
- 前記膵臓疾患は膵臓癌である、請求項11に記載の情報提供方法。
- (a)疾患患者から分離された生検でインターロイキン10受容体、インターロイキン22受容体、インターロイキン22、インターロイキン29及びインターフェロンラムダ受容体1イソフォーム1からなる群から選択された1種以上のタンパク質又は前記タンパク質をコードする遺伝子のmRNAの発現水準を測定する段階、
(b)前記患者に候補薬剤を投与する段階、及び
(c)前記候補薬剤の投与後、前記患者から分離された生検でインターロイキン10受容体、インターロイキン22受容体、インターロイキン22、インターロイキン29及びインターフェロンラムダ受容体1イソフォーム1からなる群から選択された1種以上のタンパク質又は前記タンパク質をコードする遺伝子のmRNAの発現水準を測定する段階を含む、疾患治療用薬物スクリーニング方法。
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