WO2012096545A2 - 췌장암 암줄기세포 특성을 이용한 췌장암 신규 바이오마커 및 그의 용도 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a novel biomarker specific for pancreatic cancer cancer stem cells and its use. [Background technology]
  • Cancer stem cells (cancer stem eel Is or tumor initiating eel Is), like normal organs, are present in cancer tissues and not only are thought to be involved in the initial onset of cancer, Involvement in the regeneration of cancer cells has been reported to have a profound effect on cancer recurrence or metastasis and induction of chemotherapy resistance (BB Zhou et al. Nature Reviews Drug Discovery, 8: 806-823 (2009)). Therefore, in order to fundamentally diagnose and treat cancer, it is necessary to focus on cancer stem cells that occupy only a small part of cancer tissues and play a key role in the development, maintenance, and recurrence of cancer. It will also help to develop diagnostic markers.
  • Pancreatic cancer is a fatal cancer with a 5-year survival rate of 1_43 ⁇ 4 and a median survival of 5 months. It has the poorest prognosis among human cancers. In 80-90% of patients, the prognosis is poor and the treatment is expected to be curable, and the prognosis is poor, and treatment depends mainly on chemotherapy. Therefore, early diagnosis is more urgently needed than any human cancer.
  • the present inventors have made diligent research efforts to discover novel biomarkers that can rapidly and accurately molecularly diagnose pancreatic cancer stem cells and / or pancreatic cancer. As a result, the present inventors have completed the present invention by identifying the biomarkers discovered based on the biological characteristics of pancreatic cancer stem cell cells, in particular, early diagnosis of pancreatic cancer, markers for prognostic determination, and markers for future treatment targets. Was done.
  • an object of the present invention is to provide a kit for detecting pancreatic cancer stem cell specific biomarkers.
  • Another object of the present invention to provide a kit for diagnosis or prognosis of pancreatic cancer.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for detecting pancreatic cancer stem cell markers in order to provide information necessary for diagnosis or prognosis of pancreatic cancer.
  • Another object of the present invention to provide a method for detecting a pancreatic cancer marker in order to provide information necessary for the diagnosis or prognosis of pancreatic cancer.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for screening a substance for preventing or treating pancreatic cancer.
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer.
  • Another object of the present invention is to provide a method for inhibiting proliferation of cancer cells.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating cancer.
  • the invention has a Genbank access number
  • Genbank Accession Number CAD89908.1 Genbank Accession Number NP_001077415.1, Genbank Accession Number CAI21475.1, Genbank Accession Number NP_653337.1, Genbank Accession Number Protein with CAA27309.1, Protein with Genbank Accession Number EAW66403.1, Protein with Genbank Accession Number MQ63403.1, Protein with Genbank Accession Number AAB34148.1 Protein with Genbank Accession Number AAH47896.1, Genbank Accession Number NP_001619riad1 Protein, Genbank Accession Number 2PD5_A, Genbank Accession Number AAF72885 ⁇ 1, Genbank Accession Number NP_653280.1, Genbank Accession Number BAF83085.1 , Genbank Accession Number AAH70129.1 Protein, Genbank Accession Number 1X71_A, Protein with Genbank Accession Number BAB55338.1, Protein with Genbank Accession Number EAW68058.1, Protein with Genbank Accession Number BAF85629.1 , Protein with Genbank Accession Number B
  • pancreatic cancer stem cell markers comprising a PNA (Peptide nucleic acid) or an aptamer, or (ii) a primer or a probe that binds to the polynucleotides encoding the respective proteins.
  • PNA Peptide nucleic acid
  • aptamer a primer or a probe that binds to the polynucleotides encoding the respective proteins.
  • the present invention provides a protein of Genbank accession number AAH14372.2, a protein of Genbank accession number CAD89908.1, a protein of Genbank accession number NP_001077415.1, a protein of Genbank accession number CAI21475.1 , Protein with Genbank accession number NP_653337.1, Genbank accession number Protein with CAA27309.1, protein with Genbank accession number EAW66403.1, protein with Genbank accession number MQ63403.1, protein with Genbank accession number AAB34148.1, protein with Genbank accession number MH47896.1, Genbank accession number Protein with NP_001619.1, protein with Genbank accession number 2PD5_A, protein with Genbank accession number AAF72885.1, protein with Genbank accession number NP_653280.1, protein with Genbank accession number BAF83085.1, Genbank accession number AAH70129.
  • Protein 1 protein with Genbank accession number 1X71_A, protein with Genbank accession number BAB55338.1, protein with Genbank accession number EAW68058.1, protein with Genbank accession number BAF85629.1, with Genbank accession number BAB70777.1 Protein, Genbank Accession Number NP_109591.1, Genbank Accession Number AAD22767.1, Genbank Accession Number BAC04252.1 Protein, Genbank Accession Number EAW47735.1 (I) oligopeptides, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, chimeric antibodies, ligands, which specifically bind to at least one protein selected from the group consisting of proteins with a Genbank accession number EAW97581.1 Provided are a kit for diagnosing or prognostic pancreatic cancer comprising a PNA (Peptide nucleic acid) or an aptamer, or a primer or a probe (iO binding to a polynucleotide encoding each of the above proteins).
  • PNA Peptide nucle
  • the present inventors have made diligent efforts to discover novel biomarkers that can rapidly and accurately molecularly diagnose pancreatic cancer stem cells and / or pancreatic cancer. As a result, the discovered biomarkers diagnose pancreatic cancer stem cells, in particular pancreatic cancer early. In addition to being able to diagnose, it was identified that the marker can be used to determine the prognosis.
  • the present invention is a novel pancreatic cancer stem cell marker identified by identifying a protein specifically expressed from pancreatic cancer stem cells isolated from the pancreatic cancer cell line, and has the characteristics of early diagnosis and prognosis of pancreatic cancer very accurately.
  • kit for diagnosis or prognosis of pancreatic cancer means a kit including a composition for diagnosis or prognosis of pancreatic cancer.
  • kit for diagnosis or prognosis of pancreatic cancer And compositions used for diagnostic or prognostic analysis ".
  • diagnosis refers to determining the susceptibility of an object to a particular disease or condition, determining whether an object currently has a particular disease or condition, or having a particular disease or condition. Determining the prognosis of a subject (eg, identifying a pre-metastatic or metastatic cancer state, determining the stage of the cancer, or determining the response of the cancer to treatment), or therametrics (eg, therapeutic efficacy) Monitoring the status of an object to provide information about it).
  • pancreatic cancer refers to a cancer that originates in pancreatic cells.
  • pancreatic adenocarcinoma of the pancreatic ducts accounts for about 90% of the pancreatic cancer.
  • cystic cancers cystic adenocarcinoma
  • endocrine tumors ⁇ About 5-1 of pancreatic cancer patients have a genetic predisposition, and in the case of pancreatic cancer patients, about 7.8% have a family history of pancreatic cancer. It is more frequent than.
  • Pancreatic cancer has a very poor prognosis with a 5-year survival rate. The reason for this is that most cancers are detected after progression.
  • Surgical resection is possible within 20% at the time of discovery, and even if completely resected by the naked eye, the survival rate is small due to micrometastasis, and the response to chemotherapy and radiation treatment is poor. Therefore, the most important way to improve survival is to detect and operate early when there are no symptoms or nonspecific.
  • the inventors of the present invention confirmed that, using the marker of the present invention, a highly sensitive and reliable result can be obtained for the development of pancreatic cancer from an individual.
  • the term "diagnostic marker, diagnostic marker, or diagnostic marker” refers to a substance which can diagnose pancreatic cancer cells or tissues from normal cells or tissues, and has a pancreatic cancer cell or tissue as compared to normal cells.
  • Polypeptides or nucleic acids eg, mRNA, etc.
  • lipids eg, glycolipids, glycoproteins, organic biomolecules such as sugars (monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, etc.), and the like, which have increased in the
  • the pancreatic cancer diagnostic marker is a protein with Genbank accession number AAH14372.2, a protein with Genbank accession number CAD89908.1, a protein with Genbank accession number NP_001077415, 1, a protein with Genbank accession number CAI21475.1, a Genbank accession number NP— 653337 psychologist, Genbank Accession Number CAA27309.1, Genbank Accession Number EAW66403.1, Genbank Accession Number M
  • Protein 1 Protein with Genbank Accession Number AAH70129.1, Protein with Genbank Accession Number 1X71_A, Protein with Genbank Accession Number BAB55338.1, with Genbank Accession Number EAW68058 ⁇ 1 White matter, protein with Genbank accession number BAF85629.1, protein with Genbank accession number BAB70777.1, protein with Genbank accession number NP_109591 ⁇ 1, protein with Genbank accession number AAD22767.1, Genbank accession number BAC04252.1 At least one protein selected from the group consisting of a protein, a protein having a Genbank accession number EAW47735.1 and a protein having a Genbank accession number EAW97581.1, a protein having increased expression in pancreatic cancer stem cells.
  • markers include not only proteins but also DNAs or mRNAs encoding any one protein, and are preferably complex markers containing two or more of these markers.
  • the expression "measurement of protein expression level” used in diagnosing pancreatic cancer in the present invention is a process of confirming the presence and expression level of a protein expressed from the genes in a biological sample, preferably, for the protein of the gene. This means that the specific amount of the antibody is used to determine the amount of the protein.
  • an antibody is meant herein specific protein molecules directed against the antigenic site.
  • an antibody means an antibody that specifically binds to a marker protein, and includes all polyclonal antibodies, monoclonal antibodies and recombinant antibodies.
  • pancreatic cancer marker proteins Since new pancreatic cancer marker proteins have been identified as described above, the production of antibodies using them can be readily prepared using techniques well known in the art.
  • Polyclonal antibodies can be produced by methods well known in the art for injecting pancreatic cancer marker protein antigens described above into an animal and collecting blood from the animal to obtain serum comprising the antibody.
  • Such polyclonal antibodies can be prepared from any animal species host such as goats, rabbits, sheep, monkeys, horses, pigs, bovine dogs, etc.-Monoclonal antibodies are well known in the art of hybridoma method (Kohl). er 3 ⁇ 4 Mil stein (1976) European Jounral of Immunology 6: 511-519), or phage antibody libraries (Clackson et al, Nature, 352: 624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222 : 58, 1-597, 1991).
  • Antibodies prepared by the above method can be isolated and purified using methods such as gel electrophoresis, dialysis, salt precipitation, ion exchange chromatography, affinity chromatography, and the like.
  • Antibodies of the invention also include functional fragments of antibody molecules, as well as complete forms having two full-length light chains and two full-length heavy chains.
  • a functional fragment of an antibody molecule has at least antigen binding functions. Fragments, such as Fab, F (ab '), F (ab') 2 and FV,
  • the aptamer binding to the active form of the enzyme in the present invention is an oligonucleic acid or peptide molecule, the general content of the aptamer is described in Bock LC et al. , Nature 355 (6360): 564-6 (1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine”. / Mol Med. 78 (8): 426-30 (2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library ". Proc Natl Acad Sci USA. 95 (24): 14272-7 (1998).
  • the present invention provides oligopeptides, monoclonal antibodies, polyclonals that specifically bind to one or more proteins selected from the above protein group for diagnosing pancreatic cancer stem cells and / or pancreatic cancer.
  • the antibody is preferably an antibody conjugated with microparticles.
  • the microparticles are preferably colored latex or colloidal gold particles.
  • the antibody may be any antibody capable of measuring the expression level of a protein encoded by a known mRNA gene for the 20 markers described above, but preferably, the kit is immunoassay. ), Most preferably the kit is a Luminex assay kit, protein microarray kit or ELISA kit.
  • the LUMINEX assay kit, protein microarray kit, and ELISA kit may be a polyclonal antibody or monoclonal antibody against any one or more proteins selected from the above protein group, and the polyclonal antibody and monoclonal antibody to which a label is bound. Secondary antibodies against.
  • kits in the present invention examples include immunochromatography strip kits, luminex assay kits, protein microarray kits, eliza kits, or immunological dot kits. kind is not limited.
  • the kit may further include the necessary elements necessary to perform the ELISA.
  • ELISA kits include antibodies specific for the marker protein. Antibodies are antibodies with high specificity and affinity for each marker protein and little cross-reactivity to other proteins, such as monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, or recombinant antibodies. ELISA kits are also specific to the control protein. It may include an antibody. Other ELISA kits include reagents capable of detecting bound antibodies, such as labeled secondary antibodies, chromophores (( ⁇ ⁇ 0) ⁇ 0 ⁇ 3), enzymes (eg conjugated with antibodies) and their And other substances capable of binding to the substrate or the antibody.
  • the kit may additionally include the necessary elements necessary for performing protein microarrays to simultaneously analyze the complex markers.
  • the microarray kit includes antibodies specific for the marker protein bound to the solid phase. Antibodies are antibodies with high specificity and affinity for each marker protein and little cross-reactivity to other proteins, such as monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, or recombinant antibodies.
  • the protein microarray kit can also include antibodies specific for the control protein.
  • Other protein microarray kits include reagents that can detect bound antibodies, such as labeled secondary antibodies, chromophores, enzymes (such as fusions with antibodies) and their substrates or other materials that can bind to antibodies. And the like.
  • the protein is separated from the sample, and the separated protein is shaken with a protein chip to form an antigen-antibody complex, and the protein is read and checked for the presence or expression of the protein. It can provide information necessary for diagnosing pancreatic cancer.
  • Luminex Assay is a high-throughput quantitative method that can simultaneously measure up to 100 types of analytes in small quantities (without pre-treating 10-20 patient samples). It is good (pg unit), can be quantified in a short time (3-4 hours), and can replace the existing ELISA or ELISP0T. Assay is a multiplexed fluorescent microplate analysis method that can simultaneously analyze more than 100 biological samples from each well in a 96-well plate. By using the real-time signal transmission using the polystyrene bead of 100 different color groups to distinguish and quantify.
  • red fluorescence bead is divided into ten or more steps, the other
  • orange fluorescence bead is divided into ten stages, showing the difference in intensity, and beads between them have different ratios of red and orange. They make up a total of 100 color-coded bead sets.
  • each bead is attached to the antibody of the protein to be analyzed, it is possible to quantify the protein by immuno-antibody reaction using the same.
  • the sample is analyzed using two lasers, one laser detects the beads to find the bead identification number, and the other laser reacts with the antibody attached to the beads. It detects proteins in a sample.
  • loo eggplant in vivo at the same time in one well. This analysis has the advantage of being able to detect even a small sample of 15 ⁇ .
  • Luminex kits capable of performing the Luminex assay of the present invention include antibodies specific for the marker protein.
  • Antibodies are antibodies with high specificity and affinity for each marker protein and little cross-reactivity to other proteins. They are monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, or recombinant antibodies.
  • Luminex kits can also include antibodies specific for the control protein.
  • Other Luminex kits can also contain reagents that can detect bound antibodies, such as labeled secondary antibodies, chromophores, enzymes (eg, antibodies). Conjugated) with a substrate thereof or with other substances capable of binding to the antibody.
  • the antibody may be a conjugated antibody with a microparticle, and the microparticle may be colored. Colored latex or colloidal gold particles.
  • the pancreatic cancer diagnostic kit including the immunochromatography strip for pancreatic cancer diagnosis includes essential elements necessary for performing a rapid test in which the analysis result can be known within 5 minutes. It may be a diagnostic kit characterized in that.
  • the immunochromatography strip may include (a) a sample pad into which a sample is absorbed; (b) a conjugate pad that binds to a protein of any one or more genes selected from the 20 gene groups in the sample; (c) for proteins of any one or more genes selected from the above 20 gene groups A test membrane which has been treated with a test line and a control line including a monoclonal antibody; (d) an absorption pad into which the remaining amount of the sample is absorbed; And (e) a support. Rapid test kits, which also include immunochromatographic strips (I ⁇ unochromatographic strips), include antibodies specific for the marker protein. The antibody is an antibody having high specificity and affinity for each marker protein and having little cross-reactivity to other proteins.
  • the antibody is a monoclonal antibody, a polyclonal antibody or a recombinant antibody.
  • Rapid test kits may also include antibodies specific for the control protein.
  • Other rapid test kits include reagents capable of detecting bound antibodies, such as nitrocell membranes immobilized with specific antibodies and secondary antibodies, membranes bound to beads to which antibodies are bound, absorbent pads and samples. And other materials required for diagnosis, such as a pad.
  • Determination of protein expression levels by immunological dot assay in the present invention comprises the steps of (a) dotting a biological sample on the membrane; (b) reacting an antibody specific for a protein of any one or more genes selected from the group consisting of the 20 genes with the instilled membrane; And (C) adding and developing a secondary antibody conjugated with a marker to the reacted membrane, wherein the ELISA assay comprises (a) a gene group having base sequences for the 20 markers.
  • the amount of antigen-antibody complex formation in the normal control group and the amount of antigen-antibody complex formation in suspected pancreatic cancer patients can be compared, and whether there is a significant increase in the expression level of the pancreatic cancer marker gene to the protein. By judging, it is possible to diagnose whether the pancreatic cancer suspected patient actually develops pancreatic cancer.
  • the term “antigen-antibody complex” refers to a combination of a pancreatic cancer marker protein and an antibody specific thereto, and the amount of the antigen-antibody complex formed can be quantitatively measured through the size of a signal of a detection label. Do.
  • the detection label may be selected from the group consisting of enzymes, fluorescent materials, ligands, luminescent materials, microparticles, redox molecules and radioisotopes, but is not necessarily limited thereto.
  • enzymes include ⁇ -glucuronidase, -D-glucosidase, ⁇ -D-galactosidase, urease, peroxidase or alkaline phosphatase, acetylcholinestera Glucose oxidase, nucleokinase and GDPase, RNase, glucose oxidase and luciferase, phosphofructokinase, phosphoenolpyruvate carboxylase, aspartate aminotransferase, phosphphenolpyruvate decarboxyl Fluorescein, isothiocyanate, rhodamine, phycoerythrin, phycocyanin, allophycocyanin
  • Ligands include, but are not limited to, biotin derivatives.
  • Luminescent materials include, but are not limited to, acridinium ester, luciferin, luciferase, and the like.
  • Microparticles include, but are not limited to, colloidal gold, colored latex, and the like.
  • Redox molecules include ferrocene, ruthenium complex, biologen, quinone, Ti ion, Cs ion, diimide, 1,4-benzoquinone, hydroquinone, K4 W (CN) 8, [Os (bpy) 3] 2+, [U (bpy) 3] 2+, [MO (CN) 8] 4- and the like.
  • Radioisotopes include 3H, 14C, 32P, 35S, 36C1, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 1251, 1311, 186Re, and the like.
  • Protein expression level measurement is preferably by using an ELISA method.
  • ELISA is a direct ELISA using a labeled antibody that recognizes an antigen attached to a solid support, an indirect ELISA using a labeled antibody that recognizes a capture antibody in a complex of an antibody that recognizes an antigen attached to a solid support, attached to a solid support
  • Direct sandwich ELISA using another labeled antibody that recognizes the antigen in the antibody-antigen complex, a labeled antibody that recognizes the antibody after reacting with another antibody that recognizes the antigen in the complex of the antigen and the antibody attached to the solid support
  • Various ELISA methods including indirect sandwich ELISA using secondary antibodies.
  • the antibody is attached to a solid support and the sample is reacted, followed by the attachment of a labeled antibody that recognizes the antigen of the antigen-antibody complex to enzymatic color development or to an antibody that recognizes the antigen of the antigen-antibody complex.
  • Detection is by a sandwich ELISA method in which labeled secondary antibodies are attached and enzymatically developed.
  • Pancreatic cancer marker protein and antibody can be confirmed to determine the degree of complex formation, pancreatic cancer development.
  • Western blot using at least one antibody against the pancreatic cancer marker is also preferably, Western blot using at least one antibody against the pancreatic cancer marker.
  • the whole protein is separated from the sample, electrophoresed to separate the protein according to size, and then transferred to the nitrocellulose membrane to react with the antibody.
  • the detection method consists of a method of examining the expression level of the marker gene in the control group and the expression level of the marker gene in cells with pancreatic cancer.
  • mRNA or protein levels can be expressed as the absolute (eg, or relative (eg, relative intensity of a signal)) difference of the marker proteins described above.
  • immunohistostaining is performed using at least one antibody against the pancreatic cancer marker.
  • paraffin embedding blocks are well known in the art. To prepare. Make them into slices of a number; After attaching to a glass slide, it is reacted with a selected one of the above antibodies by a known method. Subsequently, the unreacted antibody is washed and labeled with one of the above-mentioned detection labels to read whether the antibody is labeled on the microscope.
  • At least one antibody against the pancreatic cancer marker is arranged at a predetermined position on the substrate to use a protein chip immobilized at a high density.
  • the protein is separated from the sample, and the separated protein is hybridized with the protein chip to form an antigen-antibody complex, which is read and checked for the presence or expression level of the protein.
  • Pancreatic cancer can be identified.
  • the biological sample in the present invention means tissue, cells, blood, serum, plasma, saliva cerebrospinal fluid or urine, preferably blood or serum, most preferably serum.
  • polynucleotide measurement used for diagnosing pancreatic cancer in the present invention refers to measuring the amount of polynucleotide by checking the presence and degree of expression of the polynucleotide encoding the protein marker of the present invention in a biological sample.
  • Analytical methods for this purpose include reverse transcriptase polymerase reaction (RT-PCR), competitive reverse transcriptase polymerase reaction (Competitive RT-PCR), real-time reverse transcriptase polymerase reaction (Real-time RT-PCR), RNase protection assay (RPA; RNase protection) assays, Northern blotting, DNA chips, and the like.
  • the base sequences encoding respective protein markers selected from the above protein group used as markers in the present invention may include base sequences having homology with these sequences.
  • polynucleotide in the present invention means a fragment of DNA or mRNA.
  • the probe or primer used in the diagnostic kit of the present invention has a sequence complementary to the polynucleotide sequence and the polynucleotide sequence encoding the respective proteins.
  • “primer” of the present invention is meant a nucleic acid sequence having a short free 3-terminal hydroxyl group which can form base pairs with complementary templates and which serves as a starting point for template strand copying.
  • DNA synthesis can be initiated in the presence of reagents for polymerization (ie, DNA polymerase or reverse transcriptase) and four different nucleoside triphosphates at the appropriate complete solution and temperature.
  • the primers of the present invention are sense and antisense nucleic acids having 7 to 50 nucleotide sequences as primers specific for each marker gene. Primers can incorporate additional features that do not change the basic properties of the primers that serve as a starting point for DNA synthesis.
  • Primers of the invention can be chemically synthesized using phosphoramidite solid support methods, or other well known methods. Such nucleic acid sequences can also be modified using a number of means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include methylation, "capsulation", substitution with one or more homologs of natural nucleotides, and modifications between nucleotides, e.g. For example, modification to uncharged linkers (eg methyl phosphonate, phosphoroester, phosphoramidate, carbamate, etc.) or charged linkers (eg phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.). There is this.
  • uncharged linkers eg methyl phosphonate, phosphoroester, phosphoramidate, carbamate, etc.
  • charged linkers eg phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.
  • Nucleic acid may be one or more additional covalently linked residues, such as proteins (eg, nucleases, toxins, antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.), inserts (eg, acridine, psoralen, etc.). ), Chelating agents (eg, metals, radioactive metals, iron, oxidizing metals, etc.), and alkylating agents. Nucleic acid sequences of the invention can also be modified using a label that can provide a detectable signal directly or indirectly. Examples of labels include radioisotopes, fluorescent molecules, biotin, and the like.
  • probe refers to a linear oligomer of natural or modified monomers or linkages, includes deoxyribonucleotides and ribonucleotides, and can specifically hybridize to a target nucleotide sequence, naturally Or artificially synthesized.
  • the probe of the present invention is preferably single chain and oligodioxyribonucleotides.
  • probes are hybridized with cDNA molecules.
  • suitable isomerization conditions can be determined in a series of procedures by an optimization procedure. This procedure is carried out by a person skilled in the art in order to establish a protocol for use in the laboratory.
  • conditions such as temperature, concentration of components, shake and wash time, complete fluid components and their pH and ionic strength depend on various factors such as probe length and GC amount and target nucleotide sequence.
  • Detailed conditions for the shake are described in Joseph Sambrook, et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001); And MLM Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Ver lag New York Inc. N, Y '(1999).
  • the high stringency conditions are 0,5 M NaHP0 4 ( 7% sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA at 65 ° C condition, 0.1 x SSC (standard saline citrate) / Means to wash at 68 ° C in 0.1% SDS, or high stringency means to wash at 48 ° C in 6 X SSC / 0.05% sodium pyrophosphate. , Washing at 0.2 X SSC / 0.1% SDS at 42 ° C.
  • the present invention provides a Genbank in a biological sample of a human to provide information necessary for the diagnosis or prognosis of pancreatic cancer.
  • Protein with access number AAH14372.2 Genbank Protein with access number CAD89908.1 Protein with Genbank access number NP_001077415.1, Protein with Genbank access number CAI21475.1, Protein with Genbank access number NP_653337.1, Genbank access Numbered CAA27309 .1 Protein, Genbank Accession Number EAW66403.1, Protein Genbank Accession Number MQ63403.1, Protein Genbank Accession Number MB34148.1, Protein Genbank Accession Number AAH47896.1, Genbank Accession Number NP_001619 .1 protein, Genbank accession number 2PD5_A, protein with Genbank accession number MF72885.1, protein with Genbank accession number NP_653280,1, protein with Genbank accession number BAF83085.1, Genbank accession number MH70129.1 Protein, Genbank Accession Number 1X71_A, protein Genbank Accession Number BAB55338.1, Protein with Genbank Accession Number EAW68058.1, Protein with Genbank Accession Number BAF85629.1, Protein
  • Genbank Accession Number MB34148.1 Genbank Accession Number : AAH47896.1, Genbank Accession Number NP X31619.1 Protein, Genbank Accession Number 2PD5_A, Genbank Accession Number AAF72885.1 Protein, Genbank Accession Number NP— 653280.1, Protein with Genbank Accession Number BAF83085.1, Protein with Genbank Accession Number AAH70129.1, Protein with Genbank Accession Number 1X71_A, Protein with Genbank Accession Number BAB55338.1 , Protein with Genbank Accession Number E 68058.1, Protein with Genbank Accession Number BAF85629.1, Protein with Genbank Accession Number BAB70777.1, Protein with Genbank Accession Number NP ⁇ 109591.1, Protein with Genbank Accession Number AAD22767.1, Genbank At least one group selected from the group consisting of a protein with access number BAC04252.1, a protein with Genbank access number EAW47735.1 and a protein with Genbank access number EAW97581.1 A method of detecting pan
  • RNA chips As an analytical method for measuring the expression level of a protein selected from the group consisting of the protein group or polynucleotides encoding the protein thereof, a method known in the art can be used, for example RT-PCR, competitive RT-PCR , Real-time RT—PCR, RNase protection assay, Northern blotting, and DNA chips.
  • the method of the present invention for detecting pancreatic cancer diagnostic markers having cancer stem cells measures the expression level of a protein selected from the group consisting of proteins or polynucleotides encoding proteins thereof, respectively, from a human pancreatic cell sample, The expression level is performed by comparing the expression level of the protein or nucleotide of the normal control sample.
  • pancreatic cancer diagnostic markers having cancer stem cells of the present invention When the method for detecting pancreatic cancer diagnostic markers having cancer stem cells of the present invention is performed with a cell sample of a pancreatic cancer patient, the pancreatic cancer prognosis of the sampled patient can be determined.
  • the normal control sample is a pancreatic cell obtained from a human who does not have cancer, a normal pancreatic cell without cancer, a cancer stem cell, and is a known sample, for example, does not form a sphere under non-adhesive culture conditions.
  • Pancreatic cancer cell line samples identified as not containing cancer stem cells, or cell samples other than cancers of pancreatic cancer patients identified as not malignant include, but are not necessarily limited to.
  • the expression level of at least one protein selected from the protein consisting of the proteins in the normal control sample or each polynucleotide encoding them can also be measured using the same method as described above.
  • At least one protein selected from the proteins consisting of the proteins in the normal control group or at least one protein selected from the proteins consisting of the respective polynucleotide expressions encoding the proteins and the proteins consisting of the proteins in the pancreatic cancer patient for cancer stem cell detection may be compared, and the inclusion of cancer stem cells in the pancreatic cancer patient sample may be diagnosed by determining whether the expression levels are significantly changed.
  • the present invention provides a method for screening a substance for preventing or treating pancreatic cancer, comprising the following steps:
  • Genbank Accession Number NP_001077415.1 Genbank Accession Number CAI21475.1, Genbank Accession Number NP_653337.1, Genbank Accession Number CAA27309.1, Genbank Accession Number Protein with EAW66403.1, Protein with Genbank Accession Number MQ63403.1, Protein with Genbank Accession Number MB34148.1, Protein with Genbank Accession Number AAH47896.1, Protein with Genbank Accession Number NP_001619.1, Genbank Accession Number Protein with 2PD5_A, Protein with Genbank Accession Number AAF72885.1, Protein with Genbank Accession Number NP_653280.1, Protein with Genbank Accession Number BAF83085.1, Protein with Genbank Accession Number AAH70129.1, Genbank Accession Number 1X71_A Protein, Protein with Genbank Accession Number BAB55338.1, Protein with Genbank Accession Number EAW68058.1, Protein with Genbank Accession Number BAF85629.1, Protein with Genbank Accession Number BAB70777.1, Genbank It
  • step (b) measuring the expression level of at least one protein or each polynucleotide encoding the same in step (a), wherein each of the at least one protein or each polynucleotide encoding When the high expression is reduced, the sample is determined to be a substance for preventing or treating pancreatic cancer.
  • pancreatic cancer stem cells unlike normal pancreatic cancer cells.
  • pancreatic cancer stem cells unlike normal pancreatic cancer cells.
  • target proteins or polynucleotides encoding them only in pancreatic cancer stem cells indicates that they are essential for the survival of cancer stem cells.
  • stromal cells By inducing growth inhibition and death of stromal cells, it is determined to be a substance useful for the fundamental treatment of pancreatic cancer, that is, a pancreatic cancer therapeutic agent.
  • the pancreatic cancer therapeutic agent identified by the screening method of the present invention does not target only general cancer cells, which occupy most of the cancer tissue, but occupies only a small portion of the cancer tissue, but plays a key role in the development, maintenance, and recurrence of cancer. Since its target, it enables the fundamental treatment of pancreatic cancer.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising an active inhibitor or expression inhibitor of GLRX3 (Glutaredoxin-3) as an active ingredient.
  • the composition of the present invention comprises (a) a pharmaceutically effective amount of the above-described activity inhibitor or expression inhibitor of GLRX3 (Glutaredoxin-3) of the present invention; And (b) a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically effective amount herein refers to achieving the efficacy or activity of the activity inhibitor or expression inhibitor of GLRX3 (Glutaredoxin-3) described above. It means the amount that is divided.
  • the pharmaceutical composition of the present invention includes a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers contained in the pharmaceutical composition of the present invention are commonly used in the preparation, lactose, dextrose, sucrose, sorbbi, manny, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, Gelatin, Silicate Chest, Microcrystalline cellulose, polyvinylpyridone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oils, including but not limited to It doesn't happen.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like, in addition to the above components.
  • a lubricant e.g., talc, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mann
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and in the case of parenteral administration, it may be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, mucosal administration, and eyedrop administration. It is preferably applied by parenteral administration.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention will vary depending on factors such as formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response sensitivity of the patient. It may be prescribed. Typical dosages of the pharmaceutical compositions of the invention are in the range of 0.0001-10000 mg / kg on an adult basis.
  • compositions of the present invention may be prepared in unit dose form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or in the form of a solution, suspension, syrup or emulsion in an oil or aqueous medium or in the form of axes, powders, powders, granules, tablets or capsules. It may further comprise a dispersant or stabilizer.
  • GLRX3 activity inhibitors or GLRX3 expression inhibitors as used herein reduce cells expressing cancer stem cell markers CD24, CD44 and ESA, and reduce the proliferation rate and migration capacity characteristic of cancer stem cells. In addition, it is possible to reduce the formation of spear, thereby inhibiting the proliferation of cancer stem cells that are recognized as an early stage of cancer development.
  • the inhibitor of activity of GLRX3 used in the present invention is an antibody or peptide, a small molecular weight compound or a natural extract that specifically binds to GLRX3.
  • Antibodies having an activity that specifically binds to GLRX3 protein that can be used in the present invention are polyclonal or monoclonal antibodies, preferably monoclonal antibodies.
  • Antibodies to the GLRX3 protein can be prepared by methods conventionally practiced in the art, such as fusion methods (Kohler and Milstein, European Journal of I ⁇ unology, 6: 511-519 (1976)), recombinant DNA methods (US patents).
  • hybridoma cells producing monoclonal antibodies is accomplished by fusing immortalized cell lines with antibody-producing lymphocytes, and the techniques required for this process are well known to those skilled in the art and can be readily implemented.
  • Polyclonal antibodies can be obtained by injecting the GLRX3 protein antigen into a suitable animal, collecting the antiserum from the animal, and then separating the antibody from the antiserum using known affinity techniques.
  • Peptides that specifically bind to GLRX3 and inhibit the activity of GLRX3 can be obtained by conventional methods known in the art, for example, by phage display (Smith GP, "Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display c 1 oned antigens on the virion surface ".Science 228 (4705): 1315-1317 (1985); Smith GP, Petrenko VA," Phage display ". Chem. Rev. 97 (2): 391-410 (1997)) .
  • the small molecular weight compound which inhibits the activity of GLRX3 can be easily obtained through the screening method mentioned later.
  • GLRX3 expression inhibitors used in the present invention are antisense oligonucleotides or siRNA oligonucleotides or shRNAs that bind specifically to the GLRX3 gene.
  • antisense oligonucleotide refers to DNA or RNA or derivatives thereof that contain a nucleic acid sequence complementary to a sequence of a particular mRNA, and binds to a complementary sequence in the mRNA to inhibit translation of the mRNA into a protein. It works.
  • Antisense sequence refers to a DNA or RNA sequence that is complementary to GLRX3 mRNA and capable of binding to GLRX3 mRNA, and is essential for the translation of GLRX3 mRNA, translocat ion, maturation or any other overall biological function. May inhibit activity.
  • the antisense nucleic acid has a length of 6 to 100 bases, preferably 8 to 60 bases, and more preferably 10 to 40 bases.
  • the antisense nucleic acid can be modified at the position of one or more bases, sugars or backbones to enhance efficacy (De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5 (3): 343-55 (1995) .
  • Nucleic acid backbones can be modified with phosphorothioates, phosphoroesters, methyl phosphonates, short chain alkyls, cycloalkyls, short chain heteroatomics, heterocyclic sugar linkages, and the like.
  • antisense nucleic acids may include one or more substituted sugar moieties.
  • Antisense nucleic acids can include modified bases, including modified hypoxanthines, 6-methyladenine, 5-me pyrimidine (particularly 5-methylcytosine), 5-hydroxymethylcytosine (HMC), glycosyl HMC. , Gentobiosil HMC, 2-aminoadenine, 2-thiouracil, 2-thiothymine, 5-bromouracil, 5-hydroxymethyluracil, 8-azaguanine, 7-deazaguanine, N6 (6-amino Nucleus) adenine, 2, 6-diaminopurin spout ⁇
  • the antisense nucleic acids of the invention can also be chemically combined with one or more moieties or conjugates that enhance the activity and cell adsorption of the antisense nucleic acids.
  • the modified nucleic acid can increase stability to nucleases and increase the binding affinity of the antisense nucleic acid with the target mRNA.
  • Antisense oligonucleotides can be synthesized in vitro by conventional methods to be administered in vivo or to allow antisense oligonucleotides to be synthesized in vivo.
  • One example of synthesizing antisense oligonucleotides in vitro is using RNA polymerase I.
  • One example of allowing antisense RNA to be synthesized in vivo is to allow the antisense RNA to be transcribed using a vector whose origin of the recognition site (MCS) is in the opposite direction.
  • MCS origin of the recognition site
  • Such antisense RNA is preferably such that a translation stop codon is present in the sequence so that it is not translated into the peptide sequence.
  • antisense oligonucleotides that can be used in the present invention can be readily prepared according to methods known in the art with reference to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 (Weiss, B. (ed.): Ant i sense 01 i godeoxynuc 1 eot i des and Ant i sense RNA: Novel Pharmacological and Therapeutic Agents, CRC Press, Boca Raton, FL, 1997; Weiss, B., et al. Ant i sense RNA gene therapy for studying and modulating biological processes.Cell Mol.Life Sci., 55: 334-358 (1999).
  • the expression inhibitor of GLRX3 is siRNA or shRNA comprising a sequence complementary to the GLRX3 gene.
  • siRNA refers to a nucleic acid molecule capable of mediating RNA interference or gene silencing (W0 00/44895, W0 01/36646, W0 99/32619, W0 01/29058, W0 99 / 07409 and W0 00/44914).
  • siRNA is provided as an efficient gene knockdown method or gene therapy method because it can inhibit the expression of the target gene.
  • siRNA was first discovered in plants, worms, fruit flies, and parasitic layers, but has recently been used for mammalian cell research using siRNA.
  • siRNA molecule of the present invention may have a structure in which a sense strand (corresponding sequence to p53 mRNA sequence) and an antisense strand (sequence complementary to p53 mRNA sequence) are positioned opposite to each other to form a double strand. Further, according to another embodiment, siRNA molecules of the present invention are self-complementary (self- complementary) single stranded structure with sense and antisense strands.
  • siRNAs are not limited to the complete pairing of double-stranded RNA pairs paired with RA, but paired by mismatches (the corresponding bases are not complementary), bulges (no bases on one chain), and the like. May be included.
  • the total length is 10 to 100 bases, preferably 15 to 80 bases, more preferably 20 to 70 bases.
  • the siRNA terminal structure can be either blunt or cohesive, as long as the expression of the p53 gene can be suppressed by the RNAi effect.
  • the cohesive end structure is possible for both 3'-end protrusion structures and 5'-end protrusion structures.
  • the siRNA molecules of the invention may have a form in which a short nucleotide sequence (eg, about 5-15 nt) is inserted between a self-complementary sense and an antisense strand, in which case by expression of the nucleotide sequence
  • the siRNA molecules formed form a hampin structure by intramolecular shaking, and form a stem-and-loop structure as a whole. This stem-and-loop structure is processed in vitro or in vivo to produce active siRNA molecules that can mediate RNAi.
  • the siRNA is a sequence complementary to the 591th to 616th nucleotides of the GLRX3 gene of SEQ ID NO: 1, the siRNA described in SEQ ID NO: 2 and 3, wherein shRNA is A sequence complementary to the 496th to 516th nucleotides of the GLRX3 gene of SEQ ID NO: 1, which is a shRNA described in SEQ ID NO: 4.
  • the term 'comprising as an active ingredient' means to include an amount sufficient to achieve the efficacy or activity of the following activity inhibitors or expression inhibitors of GLRX3 (Glutaredoxin-3): GLRX3 included in the composition of the present invention.
  • the upper limit of the amount of the inhibitor of activity or expression inhibitor of (Glutaredoxin-3) can be selected and carried out by those skilled in the art within an appropriate range.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating cancer of the present invention is preferably, the cancer is cancer stem cells, more preferably the cancer is pancreatic cancer.
  • the invention provides a method for inhibiting the proliferation of cancer cells comprising the step of inhibiting the activity or expression of GLRX3 (Glutaredoxin-3).
  • the cancer cells are cancer stem cells.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer, comprising administering to a subject a pharmaceutically effective amount of an activity inhibitor or expression inhibitor of GLRX3 (Glutaredoxin-3).
  • the cancer is pancreatic cancer.
  • the present invention provides novel molecular markers, marker detection methods and screening methods for pancreatic cancer stem cells and pancreatic cancer.
  • the present invention is a marker discovered from a pancreatic cancer cell line, which is capable of detecting pancreatic cancer, particularly early pancreatic cancer through pancreatic cancer stem cell marker detection.
  • the marker of the present invention can be used to accurately diagnose pancreatic cancer and to analyze the prognosis.
  • Hpac human pancreatic cancer cell lines
  • CAPAN1 human pancreatic cancer cell lines
  • CAPAN2 sphere culture of human pancreatic cancer cell lines
  • CFPAC sphere culture of human pancreatic cancer cell lines
  • Figures 2a-2b analyze the expression of cancer stem cell-related genes in spear cells.
  • Figure 2a is the result of activation of Notch, Hedgehog and wnt signaling known as cancer stem cell signaling system in spear cells compared to Hpac adhesion.
  • Figure 2b shows the result of increasing ABGC2 known as oct4, nanog and cancer stem cell markers showing the multipotent capacity of stem cells.
  • Figure 3 analyzes the expression of cancer stem cell markers through flow cytometry in spear cells. CD44 and PR0M2 reported as cancer stem cell markers can be seen that the increase in the sphere.
  • Figures 4a-4c is a result confirming the suppression of sphere formation by a well-known stem cell signal blocking drug.
  • 4A is a micrograph showing suppression of spear formation by the drug.
  • Figure 4b is a graph showing the difference in the diameter of the spheres of the sphere when suppressing the sphere formation by the drug.
  • Figure 4c is a graph showing the number of spheres formed according to the drug. Spear formation was inhibited by stem cell signal blocking drugs based on these results, it can be seen that the diameter and number of spheres are reduced.
  • Figures 5a-5c is a result of confirming the difference in cancerous capacity of Hpac adherent cells and spear cells.
  • Figure 5a is an image showing the pancreas and lung metastasis of tumor-forming immune control mice.
  • 5B is an H & E immunostained image obtained by removing the pancreas and metastasis of the mouse.
  • Figure 5c graphically shows the tumor size difference between adherent cells and spear cells of Hpac.
  • Hpac-sphere implants with cancer stem cell characteristics showed high cancer formation ability, including lung and peritoneum. The results indicated that metastasis to organs and tissues was observed.
  • Figure 6 shows the expression of the secreted proteins identified by Western blot in the adhesion and sphere culture of Hpac and Capanl cells. It can be seen that AK 1B1, HSP90, ALDH, Vimentin and GLRX3 are increased in culture of Hpac sphere or CAPAN1 sphere.
  • Figure 7 shows the expression of GLRX3 by extracting mRNA and protein from 8 kinds of pancreatic cancer cell lines and HPDE of AsPC-1, BxPC-3, Capan-1, Capan-2, Cfpac-1, HPAC, Panc-1 and Miapaca-2 Is the result of checking,
  • FIG. 8 shows pancreatic cancer cells fractionated into cells expressing cancer stem cell markers CD24, CD44 and ESA (CD24 + / CD44 + / ESA +) and cells not expressing all three markers (CD24 ⁇ / CD44 ⁇ / ESA ⁇ ). This is the result of confirming GLRX3 expression in one cell. 9 is a result of confirming the expression changes of three types of cancer stem cell markers (CD24 + / CD44 + / ESA +) when GLRX3 siRNA and con siRNA were introduced.
  • FIGS. 10A and 10B are GLRX3 knock-down (k / d).
  • Figure 10a is a result of Western blot confirming the mRNA and protein expression for GLRX3
  • Figure 10b and Figure 10c is a result confirming the cell proliferation rate.
  • Figure 11a and lib is a result of confirming the change of cancer stem cell-related characteristics according to GLRX3 knock-down
  • Figure 11a is a result of confirming the sphere formation ability of the GLRX3 knock-down cell line
  • Figure lib is a result confirming the survival rate and proliferation rate.
  • 12 is an image of secreted proteins by immunohistochemistry in human pancreatic cancer tissue microarray. Seven secreted proteins, including AGPAT4 and GLRX3, are the result of increased pancreatic cancer tissue.
  • FIG. 13 shows the expression of seven secreted proteins, including AGPAT4 and GLRX3, in human pancreatic and pancreatic cancer tissues. ⁇ All seven proteins show significantly higher expression in pancreatic cancer tissue than in normal pancreatic tissue.
  • Figure 14a-b is a result of confirming the CA 19-9 which is used as a pancreatic cancer marker in the serum of pancreatic cancer patients.
  • Figure 14b is a result of confirming the serum of the pancreatic cancer patient CEA which is conventionally used as a pancreatic cancer marker.
  • CA19-9 and CEA are currently used diagnostic markers for pancreatic cancer, the expression of CA19-9 and CEA differs significantly from patient to patient.
  • Figure 15a_15b is a result of detecting the expression of MSK2 protein in proteins secreted through Western blot after detecting the serum of normal, chronic pancreatitis and pancreatic cancer patients using MARSCMult iple aff ini ty removal column system.
  • 1 is a Western blot showing the expression of MSK2 protein.
  • Figure 15b is a graphical representation of the Western blot results of MSK2 protein measured with densitometry. This result is higher in pancreatic cancer serum than normal serum.
  • 16A-16B show serum of normal, chronic pancreatitis and pancreatic cancer patients using MARS and then secreted in Western blots. This is a result of confirming the expression of the vimentin protein.
  • 16A is Western blot results showing non-mentin protein expression.
  • Figure 16b is a graph of the Western blot results of non-mentin protein measured by densimetry. This result is higher in serum of pancreatic cancer than in normal and chronic pancreatitis.
  • Figures 17a-17b is a result of detecting the expression of ALDH protein in proteins secreted through Western blot after detecting the serum of patients with normal chronic pancreatitis and pancreatic cancer using MARS.
  • 17A is a Western blot result showing ALDH protein expression.
  • Figure 17b is a graphical representation of the Western blot results of ALDH protein measured in densitometry. The results are higher in the serum of pancreatic cancer than in the normal and chronic pancreatitis.
  • 18A-18B show the results of detecting the expression of GLRX3 protein in proteins secreted through Western blot after detecting serum of normal, chronic pancreatitis and pancreatic cancer patients using MARS.
  • 18A is a Western blot result showing GLRX3 protein expression.
  • Figure 18b is a graph showing the Western blot results of the GLRX3 protein measured by densimetry ⁇ is a result expressed higher in the pancreatic cancer serum compared to the serum of normal and chronic pancreatitis.
  • 19A and 19B show the results of confirming GLRX3 expression in the pancreatic cancer patients by ELISA.
  • 19A shows the results of comparing the expression of GLRX3 with blood from normal control patients, chronic pancreatitis patients and pancreatic cancer patients
  • FIG. 19B shows the expression level of GLRX3 of 1800 ng / m ⁇ or more and patients of 1800 ng / l or less. It is a graph comparing survival.
  • Human pancreatic cancer cell line 8 weeks (Hpac, Capanl, Capan2, Cfpacl, Aspcl,
  • Bxpc3, Miapaca2 and Panel were all purchased from the American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA) and cell lines were cultured in growth medium by the protocol presented by ATCC. That is, AsPC-1 and BxPC-3 cells were cultured in RPMI1640 (Invitrogen Gibco, Grand Island, NY) containing 10% fetal bovine serum (FBS; Hyclone, Logan, UT), Capan-1 and CFPAC-1 cells was incubated in IMDM (Invitrogen Gibco) containing 10% FBS.
  • ATCC American Type Culture Collection
  • FBS fetal bovine serum
  • Capan-1 and CFPAC-1 cells was incubated in IMDM (Invitrogen Gibco) containing 10% FBS.
  • Capan-2 cells were cultured in McCoy 5a (Invitrogen Gibco) containing 10% FBS and MIA PaCa-2 cells in DMEM (Invitrogen Gibco) containing 10% FBS and 2.5% horse serum (Hyclone). Hpac cells were cultured in DMEM / Ham F12 (D / F12; Invitrogen Gibco) containing 10% FBS and PANC-1 cells in DMEM containing 10% FBS.
  • Pancreatic cancer cell lines were cultivated for E. coli (10 ng / ml, R & D Systems Inc., Minneapolis, Li), bFGF (10 ng / ra ⁇ , R & D Systems Inc.), lDlTS (insulin transferring selenium, Gibco) and Incubated in 6-well ultra low cluster plates (Corning Inc., Corning NY) at a rate of 1000 cells / ⁇ ⁇ in serum free DMEM / F12 medium supplemented with 0.5% FBS for 7-10 days. Cells grown in an adherent state by attaching the same culture to a culture dish (Nalgene Nunc Int., Rochester, NY) were used as controls. Expression Analysis of Cancer Stem Cell Related Genes in Spear Cells
  • RNAeasy Mini kit QIAGEN, Valencia, CA. Reverse transcription was carried out for each RNA 2 fig extracted for one hour at 42 ° C through reaction of Superscript II (Gibco BRL, Grand Island, NY).
  • the expression of cancer stem cell-related genes in spear cells was analyzed by primers of cancer stem cell-related genes and PCR with Taq polymerase, and the expression of beta actin Bet a act in gene was used as a control. Primer base sequence PCR reaction temperature and the number of cycles of cancer cell-related genes are shown in Table 1 below.
  • Flow cytometry was performed using BD LSR II (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) and analyzed using BD FACSDiva software. Inhibition of sphere formation by stem cell signaling drugs
  • DAPT Calbiochem, San Diego, CA, USA
  • Cyclopamine-KAAD Calbiochem, San Diego, CA, USA
  • LiCl Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO
  • Spear culture was performed by adding ATRA (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO), 0V (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO) to the culture. After 7 days, it was confirmed whether the spear formation was inhibited. Confirmation of Hpac Sphere's Cancer
  • Adhesion and spear cells cultured from the human pancreatic cancer cell line Hpac were treated with 0.25% trypsin EDTA (Gibco BRL, Grand Island, NY) to prepare the same number of single cell suspensions. Subsequently, direct in situ transplantation into the pancreas of N0D-SCID immunocontrolled mice (Charles River, Japan) was used to observe the tumorigenic capacity between adherent and spear cells. Analysis of secretory proteins related to cancer stem cells in spear cells In order to analyze secreted proteins related to cancer stem cells in the culture medium of the cells forming the spheres, Hpac and Capan 1 cells were adhered or cultured for 0 days.
  • HRP horseradish peroxidase
  • RNA and protein from eight pancreatic cancer cell lines and Human Pancreatic Ductal Epithelial cells (HPDE), asPC-1, BxPC-3, Capan-1, Capan-2, Cfpac-1, HPAC, Pane— 1 and Miapaca-2 GLRX3 expression was confirmed.
  • Total RNA of the pancreatic cancer cell line was extracted using RNAeasy mini kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA), and each RNA was reverse transcribed through reaction of Superscript iKGibco BRL, Grand Island, NY).
  • the expression of GLRX3 gene in pancreatic cancer cell line was analyzed by PCR with GLRX3 primer and Taq polymerase.
  • the expression of beta actin ⁇ eta actin) gene was used as a control.
  • GLRX3 protein expression analysis in pancreatic cancer cell lines was performed on total cell proteins and secreted proteins.
  • Cell total protein was loaded with cell lysis buffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 25 mM ⁇ -glycerophosphate, 25 mM NaF, 0.5 M EDTA, 1 NP-40, 0.1 mM PMSF, 1% protease inhibitor cocktail (Roche)). Extracted using.
  • cell cultures cultured in serum-free conditions were centrifuged to remove cell by-products and precipitated with final 80% volume of ice-cold acetone.
  • the precipitated secreted protein was washed with 100% ice-cold acetone, dried with a centrifugal vacuum dryer, and then dissolved in cytolysis buffer. Total protein and secreted protein were loaded on 10% SDS-polyacrylamide gel by 25 iig by protein quantification, followed by electrophoresis. Proteins fractionated by size by electrophoresis were transferred to PVDF membranes (Millipore corporation, Billerica, Mass., USA), and then 5% to reduce nonspecific reactions. Blocking was performed for 1 hour in TBS-T (Tris-buf fered saline / 0.05% Tween-20) to which non-fat milk was added. The PVDF membrane was then reacted overnight at 4 ° C.
  • TBS-T Tris-buf fered saline / 0.05% Tween-20
  • CSCs to the cell fraction with the characteristics, the culture of pancreatic cancer cell line CFPAC-1 and HPAC Accu other kinase;: a treatment with (Accutase Sigma-Aldr ich, MO St. Louis) to prepare a single cell suspension of the same number of . 10 minutes staining on ice with PE_CD24 (BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA), APC-CD44 (BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA), and known as cancer stem cell markers, and FITC_ESA (BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA) It was.
  • PE_CD24 BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA
  • APC-CD44 BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA
  • FITC_ESA BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA
  • Isotype conduits of antibodies were stained using purified mouse IgGl, -FITC, IgG2a, c-PE and IgG2b, / c-APC (BD Biosciences PharMingen, San Diego, Calif., USA). Cell sorting was FACSAria. II (BD I ⁇ unocytochemistry system, Franklin Lakes, NJ, USA) was used. RNAeasy mini kits (QIAGEN, Valencia, CA) were prepared from fractional cells of cells expressing all three markers (CD24 + / CD44 + / ESA +) and cells not expressing all of the markers (CD24- / CD44- / ESA-). Total RNA was extracted from the pancreatic cancer cell line.
  • SiRNA invitrogen stealth TM siRNA duplex oligoribonucleotides against GLRX3 was used to inhibit GLRX3.
  • the sense siRNA is UGA GGG AGU UCU UUA GCU AAC UCU G
  • the antisense siRNA is CAG AGU UAG CUA AAG AAC UCC CUC A.
  • a control siRNA was used as a negative control Med GC of invitrogen. After incorporating GLRX3 or negative control siRNA into CFAPC-1 cells using RNAiMAXGnvtirogen, Carlsbad, CA, USA), the cells were cultured for 72 hours. Cultured cells were treated with accutase (Accutase; Sigma-Aldr ich, St.
  • shRNA SABiosciences SureSi lencingTM shRNA plasmid
  • control shRNA for GLRX3 were constructed and permanently introduced into HPAC cell line to establish GLRX3 knock-down (k / d) cell line, resulting in GLRX3 mRNA and Protein expression was examined.
  • the sequence of shRNA for GLRX3 is GTG GAA ATT CTT CAC AAA CAT
  • the sequence of control shRNA is GGA ATC TCA TTC GAT GCA TAC
  • the selection marker is puromycin (2.0 / zg / O).
  • the plate was attached to the plate, and on the day of transfection, the shRNA and control shRNA for GLRX3 were mixed with Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA) and introduced into the cells. It was changed to the culture medium containing 2 // g / ml puromycin, and continued culture for more than three days. The cells surviving in the puromycin culture was attached to the 96 well plate at a ratio of 1 cell / well and then cultured. MRNA and protein were extracted from proliferated cells in each well to confirm the expression of GLRX3 expression by PCR and Western blot.
  • Lipofectamine2000 Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA
  • Pancreatic tissue slides were deparaffinized in xylene and rehydrated in graded alcohol. Endogenous peroxidase activity was blocked with 0.3% hydrogen peroxide containing methanol solution at room temperature for 20 minutes. Microwave antigen search was performed for 4 minutes in citrate buffer (0.01 M, pH 6.0). The slides were then incubated with 10% normal donkey serum solution for 1 hour to reduce non-specific background staining.
  • the primary antibody reacted by diluting to 1: 200 was mouse monoclonal AGPAT4 (Abnova corporation, Taipei), mouse monoclonal AKRIBKsanta cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA, rabbit polyclonal HSP90 (santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA), Mouse monoclonal ALDH (BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA), rabbit polyclonal MSK2 (santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA), mouse monoclonal Viment in (santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA) and mouse monoclonal GLRX3 ( Abnova corporation, Taipei).
  • AGPAT4 Abnova corporation, Taipei
  • mouse monoclonal AKRIBKsanta cruz biotechnology Inc santa cruz, CA
  • rabbit polyclonal HSP90 santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA
  • pancreatic cancer stem cell-related secretion proteins was performed by Western blot in serum of normal, chronic pancreatitis and pancreatic cancer patients. In order to confirm the expression of secreted proteins found in the serum of normal, chronic pancreatitis and pancreatic cancer patients, 5 normal serum, 5 chronic pancreatits and 20 pancreatic cancer patients were selected. .
  • MERS multiple affinity removal column system
  • Each primary antibody used at a dilution of 1: 500 is rabbit polyclonal MSK2 (santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA), mouse monoclonal bimentin (santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA), mouse Monoclonal ALDH (BD Biosciences PharMingen, San Diego, Calif.) And mouse monoclonal GLRX3 (Abnova corporation, Taipei).
  • the primary antibody and the reacted membrane were washed with TBS-T buffer and then reacted with HRP-conjugated 2-inch "antibody (santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA) for 1 hour.
  • the protein was enhanced with an enhanced chemi luminescence system ( PIERCE, Rockford, IL) GLRX3 expression in the blood of pancreatic cancer patients
  • ELISA JSCN GLRX3 ELISA kit was performed to confirm GLRX3 expression in serum of actual clinical patients (28 normal control patients, 9 chronic pancreatitis patients and 57 pancreatic cancer patients). ELISA method was performed according to the protocol of the ELISA kit manufacturer. Patient serum was used after diluting 1:10 to PBS. Standard concentrations were prepared by diluting from 10 nM / 1/2. Diluted patient serum and standard concentrations were put in 96 wells of GLRX3 ELISA kit and reacted at 37 degrees for 2 hours. Detection reagent A was added at 100 / ⁇ and reacted again at 37 ° C for 1 hour. After removing all solutions, the solution was washed three times with a washing solution.
  • Reagent B was added in 100 ⁇ portions and reacted for 30 minutes at 37 ° C. Remove the solution, wash five times, add 90 substrate solutions, react at 37 degrees for 15-20 minutes, add 50 finished solutions, and measure color development at 450 nm.
  • Hpac-spheres are completely inhibited or reduced by well-known drugs that block stem cell signals (FIGS. 4A-4C; DAPT is a Notch inhibitor; KMD is an HH inhibitor; Licl is a GSK3b inhibitor; ATRA is an OcU inhibitor; 0V is a Nanog inhibitor.)
  • Hpac-spheres formed from spear culture from human pancreatic cancer cell line Hpac were transplanted in situ into the pancreas of N0D / SCID mice to compare the tumorigenic capacity.
  • cancer formation ability was high and metastasis to organs and tissues such as lung and peritoneum was observed (FIGS. 5A-5C).
  • Pancreatic cancer stem cell related secretory proteins were identified by performing MALDI-T0F on 41 of 55 spots that more than doubled in spear gels (Table 2).
  • the cancer cell fraction was changed due to inhibition of GLRX3 expression, and it was confirmed that the CD24 + / CD44 + / ESA + fraction decreased from 70.4% to 29.33 ⁇ 4> when treated with siRNA for GLRX3 compared to the control siRNA (FIG. 9). .
  • shRNA and control shRNA for GLRX3 were prepared and permanently introduced into HPAC cell line to establish GLRX3 knock-down (k / d) cell line.
  • the established GLRX3 k / d cell line was found to significantly reduce the mRNA and protein expression of GLRX3 compared to the control (FIG. 10 a).
  • Two or more positive clones were selected from each cell line for control and GLRX3 shRNAs to characterize them. Proliferation was reduced in GLRX3 k / d cells (sh3- G10 and sh3-H10) compared to the control group (Fig.
  • GLRX3 is not only a carcinogenic marker associated with pancreatic cancer stem cells, but also a target for treatment of pancreatic cancer due to inhibition of various cancer-related characteristics caused by GLRX3 inhibition.
  • AGPAT4 was expressed in pancreatic cancer tissue of 100% of pancreatic cancer patients in 15 cases of "++” and 14 cases of "+++” in a total of 29 observable TMA slides (Panel (A) in FIG. 12).
  • AKR1B1 was expressed in pancreatic cancer tissue of 62% 9% of pancreatic cancer patients in 10 cases of "-", 15 cases of "+”, and 2 cases of "++” in 27 TMA slides observed (Panel (B) in FIG. 12). .
  • HSP90 was expressed in pancreatic cancer tissues of 100% of pancreatic cancer patients in 1 case of "+", 19 cases of "++” and 8 cases of "+++” in a total of 28 observable TMA slides (Panel (C) in FIG. 12). .
  • pancreatic cancer tissue of 84.6% of pancreatic cancer patients (Panel (D) in FIG. 12).
  • MSK2 was expressed in pancreatic cancer tissue of 96.2% of pancreatic cancer patients in 5 cases of “-” 1 by “+”, 8 cases of “++” and 13 cases of “+++” in 27 TMA slides observed (FIG. 12).
  • the stained cells were estimated to things other than 'the cancer cells, but many that make up the tubular structure. Almost no staining was observed on the cytoplasm of cancer.
  • Focal staining was found in one of the 28 pancreatic cancer tissues (Panel (F) in FIG. 12).
  • GLRX3 was expressed in pancreatic cancer tissue of pancreatic cancer patient 57.6 in 11 cases of "-", 11 cases of "+”, and 4 cases of "++” in a total of 25 observable TMA slides (Panel (G) in FIG. 12).
  • pancreatic cancer stem cell-related secretory proteins Paraffin sections of resected tissues from pancreatic cancer patients were also examined for expression of pancreatic cancer stem cell-related secretory proteins by immunohistochemical staining. Seven pancreatic cancer stem cell-related secretion proteins, including HSP90 and ALDH, which have been previously reported to be associated with cancer stem cells, and GLRX3 from this study, are more strongly expressed in pancreatic cancer tissue than in normal pancreatic tissue. (Panels (A)-(G) in FIG. 13). Verification of the expression of excreted secretory proteins in serum of normal 'chronic pancreatitis and pancreatic cancer patients
  • pancreatic cancer patients In order to confirm the expression of secreted proteins found in the serum of normal, chronic pancreatitis and pancreatic cancer patients, 5 normal serum, 5 chronic pancreatits and 20 pancreatic cancer patients were selected. .
  • concentrations of CA19-9 and CEA in the serum of pancreatic cancer patients PC2-PC10 selected to compare the pancreatic cancer stem cell-related secretion proteins discovered in this study with CA 19-9 and CEA, which are used as markers for conventional pancreatic cancer. are shown in FIGS. 14A-14B.
  • Non-mentin and ALDH which are well known to be associated with cancer stem cells, showed higher expression levels in pancreatic cancer patients than in normal and chronic pancreatitis.
  • Pancreatic cancer stem cell secretion Protein GLRX3 was also expressed very low in normal serum, while higher than normal and chronic pancreatitis in the pancreatic cancer patient serum 50% or more (Figs. 15a to 18b). Expression of GLRX3 in the Blood of Pancreatic Cancer Patients
  • Cancer tissues have cancer stem cells that maintain and regenerate cancerous tissues like normal organs, and they play a key role in the recurrence or metastasis of cancers by participating in the regeneration and reduction of cancer cells after application of existing cancer treatments.
  • Cancer cells are heterogenous, and only some cells are known as cancer stem cells as tumor initiating cells that have cancer-forming ability. These cells form spheres in suspension culture in vitro, and cells obtained from sphere culture have been reported to have stronger cancer-forming ability than the original cell line (A, Dubrovska et al. Proc Natl Acad Sci USA., 106: 268-273 (2009)), and in these cells, some cancers and cancer stem cell-related genes and proteins are known to be strongly expressed as compared to the original cell line.
  • proteomic analysis was performed to link the role of cancer stem cells recognized as early stages of cancer development and to identify and verify proteins secreted during spear cell culture having cancer stem cell characteristics.
  • Proteomics results identified secretory proteins such as AGPAT4, AKR1B1, MSK2 and GLRX3, including HSP90, vimentin, HSP27 and ALDH.
  • the expression of these secretory proteins in pancreatic cancer tissues was confirmed to be significantly increased in pancreatic cancer tissues compared to normal tissues, and the expression of secretory proteins was higher in the serum of pancreatic cancer patients than normal.
  • Western blot expression was confirmed in serum, but the expression of secreted protein in this study was confirmed that the increase in serum of pancreatic cancer patients.
  • GLRX3 is not only increased in the serum of pancreatic cancer patients, but the survival time of pancreatic cancer patients with high GLRX3 expression is lower than that of pancreatic cancer patients with relatively low GLRX3 expression, various cancer-related characteristics and cancer stem cells when GLRX3 expression is inhibited.
  • the results showed that GLRX3 could be used as a prognostic marker for the treatment of pancreatic cancer as well as for the diagnosis of pancreatic cancer.
  • HSP90 L. Whitesell and SL Lindquist, Nat Rev Cancer, 5: 761-772 (2005)
  • epithelium for metastasis of mesenchymals associated with cancer stem cells epithelium for metastasis of mesenchymals associated with cancer stem cells
  • Pancreatic cancer is a fatal cancer with a 5-year survival rate of 1-4% and a median survival of 5 months. It has the poorest prognosis among cancers of the human body, and treatment is mainly dependent on chemotherapy. It is requested.
  • pancreatic cancer stem cell-associated secretion proteins discovered in this study, and to develop new methods for early diagnosis using cancer and to develop more meaningful methods using cancer stem cells through combination with existing markers. Shown. Furthermore, it is possible to establish the basis for developing new diagnostics and treatments using cancer stem cells by providing a target of new cancer treatment.
  • CD 133 expression is not restricted to stem cells, and both CD133 + and CD133 " metastatic colon cancer eel Is initiate tumors. / Clin Invest. 118: 2111-2120 (2008).

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Abstract

본 발명은 췌장암 줄기세포 및 췌장암에 대한 신규한 분자 마커, 마커 검출 방법 및 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명은 췌장암 세포주로부터 발굴된 마커로서, 췌장암 줄기세포 마커 검출을 통하여 췌장암, 특히 조기의 췌장암을 검출할 수 있는 마커이다. 또한, 본 발명의 마커를 이용하면 췌장암을 정확하게 진단 및 예후를 분석 할 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
췌장암 암즐기세포 특성을 이용한 췌장암 신규 바이오마커 및 그의 용도
【기술 분야】
본 발명은 췌장암 암줄기세포 특이 신규 바이오마커 및 그의 용도에 관한 것이다. 【배경 기술】
암 조직에도 일반 장기처럼 암 조직을 유지하고 재생하는 암 줄기세포 (cancer stem eel Is or tumor initiating eel Is)가 존재하며， 이것이 암의 최초 시작에 관여할 것으로 추측되고 있을 뿐 아니라, 암 치료 후 줄어든 암세포를 재생하는 데 관여함으로써 암의 재발이나 전이 및 항암치료 내성 유발에 깊은 영향을 미친다고 보고된 바 있다 (BB Zhou et al. Nature Reviews Drug Discovery, 8:806-823(2009)). 따라서 암을 근본적으로 진단 및 치료하기 위해서는, 암 조직의 극히 일부만 차지하면서도 암의 발병과 유지， 재발에 핵심 구실을 하는 암 줄기세포에 초점을 맞추어야 하며， 암 줄기세포에 대한 더 많은 이해는 조기 진단을 위한 진단용 마커 개발에도 도움이 될 것이다.
췌장암은 5 년 생존율이 1_4¾， 중앙생존기간 5 개월에 이르는 치명적인 암으로 인체의 암 중에서 가장 불량한 예후를 보이고 있다. 80- 90% 환자에서 진단시 완치를 기대하는 근치적 절제가 블가능한 상태에서 발견되기 때문에 예후가 불량하고 치료는 주로 항암요법에 의존하고 있으므로， 그 어떤 인체암보다도 조기 진단법 개발이 절실히 요망되고 있다. 현재까지 췌장암에 효과가 있다고 알려진 5-플루오로유라실， 젬시타민 (gemcitabine), 타르세바 (tarceva)를 포함한 몇 항암제의 치료 효과는 지극히 실망적이며， 항암치료에 대한 반웅율은 15% 내외에 불과하고 이러한 사실은 췌장암 환자의 예후를 향상시키기 위해서는 보다 효과적인 조기 진단법 및 치료법의 개발이 절실히 요구되고 있음을 시사한다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 내용】
【해결하려는 과제】
본 발명자들은 췌장암 암줄기세포 및 /또는 췌장암을 신속하고 정확하게 분자진단할 수 있는 신규한 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 발굴된 바이오마커들이 췌장암 암줄기세포 생물학적 특성에 근거한 진단， 특히 췌장암을 조기 진단할 수 있고， 예후를 판정할 수 있는 마커 및 향후 치료표적에 사용할 수 있는 표지자임을 규명함으로써， 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서， 본 발명의 목적은 췌장암 암줄기세포 특이 바이오마커 검출용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 췌장암의 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 췌장암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 췌장암 암줄기세포 마커를 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 췌장암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 췌장암 마커를 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 췌장암의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 세포의 증식 억제 방법을 제공하는 데 있다。
본 발명의 다른 목적은 암의 예방 또는 치료방법을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
【과제의 해결 수단】
본 발명의 일 양태에 따르면， 본 발명은 Genbank 접근번호가
AAH14372.2 인 단백질， Genbank 접근번호가 CAD89908.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_001077415.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 CAI21475.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 NP_653337.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 CAA27309.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 EAW66403.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 MQ63403.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 AAB34148.1 인 단백질 Genbank 접근번호가 AAH47896.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 NP_001619„1 인 단백질, Genbank 접근번호가 2PD5_A 인 단백질, Genbank 접근번호가 AAF72885ᅳ 1 인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_653280.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 BAF83085.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 AAH70129.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 1X71_A 인 단백질， Genbank 접근번호가 BAB55338.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 EAW68058.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 BAF85629.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 BAB70777.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 NP— 109591.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 AAD22767.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 BAC04252.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 EAW47735.1 인 단백질 및 Genbank 접근번호가 EAW97581.1 인 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질에 각각 특이적으로 결합하는 ( i ) 올리고템타이드， 모노클로날 항체， 폴리클로날 항체 , 키메릭 (chimeric) 항체， 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머 (aptamer), 또는 ( ii ) 상기 각각의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 췌장암 암줄기세포 마커 검출용 키트를 제공한다. 본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 Genbank 접근번호가 AAH14372.2 인 단백질， Genbank 접근번호가 CAD89908.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 NP_001077415.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 CAI21475.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_653337.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 CAA27309.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 EAW66403.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 MQ63403.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 AAB34148.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 MH47896.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 NP_001619.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 2PD5_A 인 단백질， Genbank 접근번호가 AAF72885.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 NP_653280.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 BAF83085.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 AAH70129.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 1X71_A 인 단백질， Genbank 접근번호가 BAB55338.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 EAW68058.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 BAF85629.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 BAB70777.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 NP_109591.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 AAD22767.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 BAC04252.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 EAW47735.1 인 단백질 및 Genbank 접근번호가 EAW97581.1 인 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질에 각각 특이적으로 결합하는 ( i ) 올리고펩타이드， 모노클로날 항체， 폴리클로날 항체， 키메릭 (ch ieric) 항체， 리간드， PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머 (aptamer), 또는 ( iO 상기 각각의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 췌장암 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공한다.
본 발명자들은 췌장암 암줄기세포 및 /또는 췌장암을 신속하고 정확하게 분자진단할 수 있는 신규한 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였으며, 그 결과， 발굴된 바이오마커들이 췌장암 암줄기세포를 진단， 특히 췌장암을 조기에 진단할 수 있을 뿐 만 아니라 예후를 판정할 수 있는 마커임을 규명하였다.
본 발명은 췌장암 세포주로부터 분리된 췌장암 암줄기세포로부터 특이적으로 발현하는 단백질을 동정하여 규명된 신규한 췌장암 암줄기세포 마커로서， 췌장암을 조기에 매우 정확하게 진단 및 예후를 분석할 수 있는 특징을 가진다.
본 명세서에서 표현 "췌장암의 진단 또는 예후 분석용 키트" 는 췌장암의 진단 또는 예후 분석용 조성물이 포함된 키트를 의미한다. 따라서, 상기 표현 "췌장암의 진단 또는 예후 분석용 키트" 는 "췌장암의 진단 또는 예후 분석용 조성물" 과 서로 교차 또는 흔용하여 사용이 가능하다.
본 명세서에서 용어 "진단" 은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성 (susceptibility)을 판정하는 것， 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것， 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후 (prognosis) (예컨대， 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정， 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반웅성 결정)를 판정하는 것， 또는 테라메트릭스 (therametrics) (예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.
본 발명에서 용어 "췌장암 (pancreatic cancer)" 이란 췌장 세포에서 기원하는 암을 의미한다. 췌장암에는 여러 가지 종류가 있는데 췌관세포에서 발생한 췌관 선암종이 90% 정도를 차지하고 있어 일반적으로 췌장암이라고 하면 췌관 선암종을 의미한다. 그 외에 낭종성암 (낭선암), 내분비종양 등이 있다ᅳ 췌장암 환자 중 약 5-1 는 유전 소인을 가지고 있는데， 췌장암 환자에서 췌장암의 가족력이 있는 경우는 약 7.8% 정도로 일반인에서의 췌장암 발생률 0.6%에 비해 빈도가 높다. 췌장암은 5 년 생존율이 이하로 예후가 매우 나쁜 암이다. 그 이유는 대부분 암이 진행된 후에 발견되기 때문에 발견 당시 수술 절제가 가능한 경우가 20% 이내이고， 육안으로 보기에 완전히 절제되었다 하더라도 미세 전이에 의해 생존율 향상이 적으며， 항암제 및 방사선 치료에 대한 반응이 낮기 때문이다, 따라서， 생존율을 향상시킬 수 있는 가장 중요한 방법은 증상이 없거나 비특이작일 때 조기 발견하여 수술하는 것이다.
본 발명자들은 본 발명의 마커를 사용하면， 개체로부터 췌장암의 발병여부에 대해 민감도 및 신뢰도가 높은 결과를 얻을 수 있음을 확인하였다.
본 발명에서 용어 "진단용 마커， 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커 (diagnosis marker)" 란 췌장암 세포 또는 조직을 정상 세포 또는 조직과 구분하여 진단할 수 있는 물질로， 정상 세포에 비하여 췌장암을 가진 세포 또는 조직에서 증가 양상을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산 (예: mRNA 등)， 지질 , 당지질， 당단백질, 당 (단당류, 이당류， 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상， 상기 췌장암 진단 마커는 Genbank 접근번호가 AAH14372.2 인 단백질， Genbank 접근번호가 CAD89908.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 NP_001077415, 1 인 단백질， Genbank 접근번호가 CAI21475.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 NP— 653337„1 인 단백질, Genbank 접근번호가 CAA27309.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 EAW66403.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 MQ63403.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 MB34148.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 AAH47896.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_001619.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 2PD5_A 인 단백질, Genbank 접근번호가 MF72885.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 NP_653280.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 BAF83085.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 AAH70129.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 1X71_A 인 단백질， Genbank 접근번호가 BAB55338.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 EAW68058ᅳ 1 인 단백질， Genbank 접근번호가 BAF85629.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 BAB70777.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_109591ᅳ 1 인 단백질， Genbank 접근번호가 AAD22767.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 BAC04252.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 EAW47735.1 인 단백질 및 Genbank 접근번호가 EAW97581.1 인 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질로서， 췌장암 암줄기세포에서 발현이 증가하는 단백질이다. 이러한 마커들은 단백질 뿐 만 아니라 어느 하나의 단백질을 코딩하는 DNA 또는 mRNA 을 포함하며 , 바람직하게는 이들 마커들이 둘 이상 포함된 복합 마커인 것이 좋다.
본 발명에서 췌장암을 진단에 있어서 사용되는 표현 "단백질 발현수준 측정" 은 생물학적 시료에서 상기 유전자들로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는， 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인하는 것을 의미한다。 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏， 앨라이자 (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) , 방사선면역분석 (RIA: Radioimmunoassay) , 방사 면역확산법 (radioi隱 unodi f fusion) , 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동， 조직면역염색， 면역침전 분석법(1隱111101)^(^1^13 011 Assay) , 보체 고정 분석법 (Complement Fixation Assay) , 유세포분석 (Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) , 단백질 칩 (protein chip) 등이 있으나 상기 예에 의해 본 발명의 분석방법이 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "항체 "란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며 , 다클론 항체， 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.
상기한 바와 같이 새로운 췌장암 마커 단백질이 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할수 있다.
다클론 항체는 상기한 췌장암 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소， 토끼， 양， 원숭이， 말， 돼지， 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다- 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법 (hybridoma method) (Kohl er ¾ Mil stein (1976) European Jounral of Immunology 6：511-519 참조)， 또는 파지 항체 라이브러리 (Clackson et al , Nature, 352:624-628, 1991； Marks et al , J. Mol. Biol. , 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전지영동， 투석 , 염 침전, 이온교환 크로마토그래피， 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리， 정제할 수 있다.
또한 본 발명의 항체는 2 개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라， 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다。 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며， Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 FV 등이 있다,
본 발명에서 효소의 활성형에 결합하는 앱타머는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며 , 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al. , Nature 355(6360) :564-6(1992)； Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine" . / Mol Med. 78(8) :426- 30(2000)； Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24) :14272-7(1998)에 상세하게 개시되어 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명은 췌장암 암줄기세포 및 /또는 췌장암을 진단하기 위하여 상기 단백질군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질과 각각 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체， 폴리클로날 항체， 키메릭 (chimeric) 항체， 리간드， PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머 (aptamer )을 포함하며 , 보다 바람직하게는 올리고펩타이드， 모노클로날 항체， 폴리클로날 항체 또는 키메릭 항체이고, 보다 더 바람직하게는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체이며， 가장 바람직하게는 모노클로날 항체이다.
본 발명에서， 상기 항체는 미소입자 (micro particle)와 접합된 항체 (conjugated antibody)인 것이 바람직하다. 또한 상기 미소입자는 착색된 라텍스 (colored latex) 또는 콜로이드성 금 입자 (colloidal gold particle)인 것이 바람직하다. 본 발명에서, 상기 항체는 상기 서술한 20 개의 마커에 대한 공지의 mRNA 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 어떠한 항체도 될 수 있으나， 바람직하게는， 상기 키트는 면역분석 (immunoassay)용 키트이며， 가장 바람직하게는 상기 키트는 루미넥스 분석 키트， 단백질 마이크로어레이 키트 또는 ELISA 키트이다. 상기 루미넥스 어세이 키트， 단백질 마이크로어레이 키트 및 엘라이자 키트는 상기 단백질군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 단백질에 대한 다클론 항체 및 단일클론 항체, 그리고 표지물질이 결합된 상기 다클론 항체와 단일클론 항체에 대한 2차 항체를 포함한다.
본 발명에서 키트의 종류의 예로는 면역크로마토그래피 스트립 키트， 루미넥스 어세이 키트, 단백질 마이크로어레이 키트， 엘라이자 키트， 또는 면역학적 도트 키트등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명에서 사용 가능한 키트의 종류가 제한되는 것은 아니다.
상기 키트는 ELISA 를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로， 단클론 항체， 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면， 표지된 2 차 항체， 발색단((±^0]±0^3)， 효소 (예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
또한， 상기 키트는 복합마커를 동시에 분석하기 위하여 단백질 마이크로어레이를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. 마이크로어레이 키트는 고체상에 결합된 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로， 단클론 항체， 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 단백질 마이크로어레이 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 단백질 마이크로어레이 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면， 표지된 2 차 항체, 발색단, 효소 (예: 항체와 융합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 단백질 마이크로어레이를 이용하여 시료를 분석하는 방법은， 시료에서 단백질을 분리하고， 분리한 단백질을 단백질 칩과 흔성화시켜서 항원 -항체 복합체를 형성시키고， 이를 판독하여， 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여， 췌장암 진단에 필요한 정보를 제공할 수 있다ᅳ
루미넥스 어세이 (Luminex Assay)는 소량 (10-20 의 환자 시료를 전 처리하지 않은 상태에서 최대 100 종류의 어낼라이트 (analyte)를 동시에 측정할 수 있는 고용량 (high-throughput) 정량분석방법으로서 감도가 좋고 (pg 단위)， 빠른 시간내에 정량이 가능하여 (3-4 시간), 기존의 엘라이자 (ELISA)나 엘리스팟 (ELISP0T)을 대체할 수 있는 분석방법이다. 상기 루미넥스 어세이 (Luminex Assay)는 96-웰 플레이트 (well plate)에 있는 각각의 웰에서 100 가지 이상의 생물학적 시료를 동시에 분석할 수 있는 멀티플렉스 형광 마이크로플레이트 (multiplexed fluorescent microplate) 분석방법으로 두 종류의 레이져 감지기 (laser detector)를 사용하여 실시간으로 신호전달을 진행시킴으로 100 개 이상의 다른 색깔 군의 폴리스티렌 비드 (polystyrene bead)를 구별하여 정량한다。 상기 100개의 비드는 다음과 같은 방법으로 구별되도록 구성된다. 한쪽은 붉은 형광 비드 (red fluorescence bead)가 열 단계 이상으로 나뉘어 있고, 다른 한 쪽은 오렌지 형광 비드 (orange fluorescence bead)가 열 단계로 나뉘어 강도 (intensity)의 차이를 보이며 그 사이의 비드 (bead)들은 레드 (red)와 오렌지 (orange)의 비율 (ratio)이 각각 다른 비율로 섞여 있어 전체적으로 100 개의 색 -코드 비드 세트 (color-coded bead set)를 구성하고 있다. 또한 각각의 비드에는 분석하고자 하는 단백질의 항체가 부착되어 있어 이를 이용한 면역항체반웅으로 단백질 정량이 가능하다. 이 시료는 두 개의 레이저 (laser)를 사용하여 분석하는데, 하나의 레이저 (laser)는 비드 (bead)를 감지 (detect ion)하여 비드 고유번호를 알아내고， 다른 레이저는 비드에 붙어 있는 항체와 반응한 시료 속의 단백질을 감지하게 된다. 따라서 한 웰에서 동시에 loo 가지의 생체 내 단백질 분석이 가능하다. 이 분석은 15≠ 정도의 적은 시료로도 감지가 가능한 장점이 있다.
본 발명의 루미넥스 (Luminex) 어세이를 수행할 수 있는 루미넥스 (Luminex) 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체， 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 루미넥스 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다。 그 외 루미넥스 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약， 예를 들면， 표지된 2차 항체， 발색단, 효소 (예: 항체와 접합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다。 상기 항체는 미소입자 (micro particle)와 접합된 항체 (conjugated antibody)일 수 있으며, 또한 상기 미소입자는 착색된 라텍스 (colored latex) 또는 콜로이드성 금 입자 (colloidal gold particle)일 수 있다.
본 발명의 췌장암 진단 또는 예후 분석용 키트에서， 상기 췌장암 진단용 면역크로마토그래피 스트립을 포함하는 췌장암 진단 키트는, 5 분내 분석결과를 알 수 있는 래피드 테스트 (Rapid test)를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. 상기 면역크로마토그래피 스트립은 (a) 시료가 흡수되는 샘플패드 (sample pad); (b) 시료 내의 상기 20 개의 유전자 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 단백질과 결합하는 결합 패드 (conjugate pad); (c) 상기 20 개의 유전자 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의ᅳ유전자의 단백질에 대한 단일클론 항체를 포함하는 반웅선 (test line) 및 대조선 (control line)이 처리되어 있는 반웅 막 (test membrane)； (d) 잔량의 시료가 흡수되는 흡수패드 (absorption pad); 및 (e) 지지체를 포함하는 것이 바람직하다. 또한 면역크로마토그래피 스트립 (I隱 unochromatographic strip)을 포함하는 래피드 테스트 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 상기 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로， 단클론 항체， 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 래피드 테스트 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 래피드 테스트 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약， 예를 들면， 특이항체와 2 차 항체가 고정된 나이트로셀를로오스 멤브레인, 항체가 결합된 비드에 결합된 멤브레인， 흡수 패드와 샘플 패드 등 진단에 필요한 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 본 발명에서 면역학적 도트 어세이에 의한 단백질 발현 수준의 측정은 (a) 막에 생물학적 시료를 점적 (dotting)하는 단계; (b) 상기 20 개의 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 단백질에 특이적인 항체를 상기 점적된 막에 반응시키는 단계; 및 (C) 상기 반응시킨 막에 표시체가 접합된 2 차 항체를 첨가하고 발색시키는 단계를 포함하는 것이 바람직하고， 상기 엘라이자 어세이는 (a) 상기 20 개의 마커에 대한 염기서열을 갖는 유전자 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 단백질에 특이적인 항체 1을 고상체에 흡착시키는 단계; (b) 상기 고상체에 흡착된 항체 1 과 췌장암 의심 환자의 생물학적 시료를 접촉시켜 항원 -항체 복합체 형성하는 단계; (c) 표지물질이 결합된 상기 20 개의 마커에 대한 염기서열을 갖는 유전자 군에서 선택된 1 개 이상의 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 특이적인 항체 2 를 처리하여 상기 복합체와 결합시키는 단계; 및 (d) 상기 표지물질을 검출하여 단백질의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 샌드위치 엘라이자 어세이인 것이 바람직하며, 상기 단백질 마이크로어레이 어세이는 (a) 상기 20 개의 마커로 구성된 유전자 군에서 선택된 1 개 이상의 유전자의 단백질에 특이적인 다클론 항체를 칩에 고정시키는 단계; (b) 상기 고정된 다클론 항체 1 을 췌장암 의심 환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원 -항체 복합체 형성하는 단계; (c) 표지물질이 결합된 상기 20 개의 마커에 대한 염기서열을 갖는 유전자 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 특이적인 단일클론 항체를 처리하여 상기' 복합체와 결합시키는 단계; 및
(d) 상기 표지물질을 검출하여 단백질의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 분석 방법들을 통하여， 정상 대조군에서의 항원 -항체 복합체의 형성량과 췌장암 의심 환자에서의 항원 -항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고， 췌장암 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량의 증가 여부를 판단하여， 췌장암 의심 환자의 실제 췌장암 발병 여부를 진단할 수 있다. 본 발명에서 용어 "항원 -항체 복합체" 란 췌장암 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고， 항원 -항체 복합체의 형성량은 검출 라벨 (detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.
이러한 검출 라벨은 효소, 형광물， 리간드， 발광물， 미소입자 (microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며， 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제， -D- 글루코시다제， β-D-갈락토시다제， 우레아제， 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제， 글루코즈 옥시다제， 핵소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제， 포스포프럭토키나제， 포스포에놀피루베이트 카복실라제， 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제， β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다。 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트， 로다민, 피코에리테린， 피코시아닌， 알로피코시아닌, 0-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르， 루시페린， 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센， 루테늄 착화합물， 바이올로젠, 퀴논， Ti 이온, Cs 이온， 디이미드， 1，4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN)8 ， [Os(bpy) 3 ] 2+ , [ U(bpy) 3 ] 2+， [MO(CN) 8 ] 4- 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36C1 , 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 1251, 1311 및 186Re 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다.
단백질 발현수준 측정은 바람직하게는， ELISA 법을 이용하는 것이다. ELISA 는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반웅시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2 차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는， 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반웅시킨 후 항원 -항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원 -항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2 차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 췌장암 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여， 췌장암 발병 여부를 확인할 수 있다.
또한， 바람직하게는， 상기 췌장암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고， 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음， 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반웅시킨다. 생성된 항원 -항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여， 췌장암 발병 여부를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 마커 유전자의 발현량과 췌장암이 발병한 세포에서의 마커 유전자의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. mRNA 또는 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적 (예 : 또는 상대적 (예 : 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.
또한, 바람직하게는， 상기 췌장암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역조직 염색을 실시하는 것이다ᄋ 정상 췌장 조직 및 췌장암으로 의심되는 조직을 채취 및 고정한 후， 당업계에서 널리 공지된 방법으로 파라핀 포매 블록을 제조한다. 이들을 수 ；皿 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙인 후 이와 상기의 항체 중 선택된 1 개와 공지의 방법에 의하여 반응시킨다. 이후， 반웅하지 못한 항체는 세척하고, 상기에 언급한 검출라벨 중의 하나로 표지하여 현미경 상에서 항체의 표지 여부를 판독한다.
또한， 바람직하게는, 상기 췌장암 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은， 시료에서 단백질을 분리하고， 분리한 단백질을 단백질 칩과 흔성화시켜서 항원 -항체 복합체를 형성시키고， 이를 판독하여， 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여 췌장암 발병 여부를 확인할 수 있다.
본 발명에서의 생물학적 시료는 조직, 세포， 혈액， 혈청， 혈장， 타액 뇌척수액 또는 뇨를 의미하고, 바람직하게는 혈액 또는 혈청을 의미하며， 가장 바람직하게는 혈청을 의미한다.
본 발명에서 췌장암을 진단하기 위하여 사용되는 표현 "폴리뉴클레오타이드 측정" 은 생물학적 시료에서 본원 발명의 단백질 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 폴리뉴클레오타이드의 양을 측정하는 것을 의미한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반웅 (RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반웅 (Competitive RT-PCR) , 실시간 역전사 중합효소반응 (Real-time RT-PCR) , RNase 보호 분석법 (RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅 (Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다。
본 발명에서 마커로 사용되는 상기 단백질군으로부터 선택되는 각각의 단백질 마커를 코딩하는 염기서열은, 이들 서열과 상동성을 갖는 염기서열을 포함할 수 있다ᅳ
바람직하게는， 본 발명에서의 폴리뉴클레오타이드는 DNA 또는 mRNA의 단편을 의미한다.
본 발명의 진단용 키트에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 상기 각각의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 및 폴리뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는다ᄋ 본 발명의 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트 (template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다ᅳ 프라이머는 적절한 완층용액 및 온도에서 중합반응 (즉， DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4 가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는， 각 마커 유전자 특이적인 프라이머로 7 개 내지 50 개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 흔입할 수 있다.
본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법， 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다ᅳ 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화， "캡화 "， 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환， 및 뉴클레오타이드 간의 변형， 예를 들면， 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트， 포스포트리에스테르， 포스포로아미데이트， 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예 : 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기， 예를 들면， 단백질 (예: 뉴클레아제， 독소， 항체， 시그날 펩타이드， 폴리 -L-리신 등), 삽입제 (예 : 아크리딘， 프소랄렌 등)， 킬레이트화제 (예 : 금속， 방사성 금속， 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그널을 직접 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소， 형광성 분자， 바이오틴 등이 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "프로브" 는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄 (linkages)의 선형 올리고머를 의미하며， 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 흔성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며， 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다. 프로브를 이용하는 경우， 프로브를 cDNA 분자와 흔성화시킨다. 본 발명에서， 적합한 흔성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어， 온도， 성분의 농도， 흔성화 및 세척 시간， 완층액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 흔성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al,, Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor , N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Ver lag New York Inc. N,Yᅳ (1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어， 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0,5 M NaHP04( 7% SDS( sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA 에서 65 °C 조건으로 흔성화하고， 0.1 x SSC( standard saline citrate)/0.1% SDS 에서 68°C 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는， 고 엄격조건은 6 X SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48°C 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어， 0.2 X SSC/0.1% SDS 에서 42°C 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 췌장암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 Genbank 접근번호가 AAH14372.2 인 단백질 Genbank 접근번호가 CAD89908.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_001077415.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 CAI21475.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_653337.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 CAA27309.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 EAW66403.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 MQ63403.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 MB34148.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 AAH47896.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 NP_001619.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 2PD5_A 인 단백질, Genbank 접근번호가 MF72885.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 NP_653280,1 인 단백질， Genbank 접근번호가 BAF83085.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 MH70129.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 1X71_A 인 단백질, Genbank 접근번호가 BAB55338.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 EAW68058.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 BAF85629.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 BAB70777.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 NP_109591.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 MD22767.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 BAC04252.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 EAW47735.1 인 단백질 및 Genbank 접근번호가 EAW97581.1 인 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이의 단백질을 각각 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 검출하는 단계를 통해 췌장암 줄기세포 마커를 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 췌장암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는
Genbank 접근번호가 AAH14372.2 인 단백질， Genbank 접근번호가 CAD89908.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 NP_001077415.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 CAI21475.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_653337„1 인 단백질， Genbank 접근번호가 CM27309.1 인 단백질， Genbank' 접근번호가 EAW66403.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 MQ63403ᅳ 1 인. 단백질， Genbank 접근번호가 MB34148.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 : AAH47896.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 NP X31619.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 2PD5_A 인 단백질, Genbank 접근번호가 AAF72885.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 NP— 653280.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 BAF83085.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 AAH70129.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 1X71_A 인 단백질, Genbank 접근번호가 BAB55338.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 E 68058.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 BAF85629.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 BAB70777.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 NPᅳ 109591.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 AAD22767.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 BAC04252.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 EAW47735.1 인 단백질 및 Genbank 접근번호가 EAW97581.1 인 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이의 단백질을 각각 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 검출하는 단계를 통해 췌장암 마커를 검출하는 방법을 제공한다. 상기 단백질군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 또는 이의 단백질을 각각 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 발현 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있으며， 예컨대 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT— PCR, RNase 보호 분석법 (RNase protection assay), 노던블롯팅 (Nothern blotting), DNA 칩 등이 있으나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다。
암줄기세포를 가지는 췌장암 진단 마커를 검출하는 본 발명의 방법은 인간의 췌장 세포 시료로부터 상기 단백질들로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 또는 이의 단백질을 각각 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 발현 수준을 측정하고， 상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군 시료의 단백질 또는 뉴클레오타이드 발현 수준과 비교하는 방법으로 수행된다.
본 발명의 암줄기세포를 가지는 췌장암 진단 마커를 검출하는 방법을 췌장암 환자의 세포 시료를 가지고 수행하는 경우, 시료를 채취한 환자의 췌장암 예후를 판단할 수 있게 된다ᅳ
상기 정상 대조군 시료란， 암에 걸리지 않은 인간으로부터 채취한 췌장 세포, 암이 없는 정상 췌장 세포， 암줄기세포를 포함하지 않는 것으로, 이미 확인된 시료로서， 예컨대 비 점착성 배양 조건 하에서 구를 형성하지 않는 등 암줄기세포를 포함하지 않는 것으로 확인된 췌장암 세포주 시료， 또는 악성이 아닌 것으로 확인된 췌장암 환자의 암 이외의 세포 시료 둥을 포함하며， 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 정상 대조군 시료 내 상기 단백질들로 이루어진 단백질로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이들을 코딩하는 각각의 폴리뉴클레오타이드의 발현 수준도 상술한 바와 동일한 방법을 사용하여 측정할 수 있다。
상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 상기 단백질들로 이루어진 단백질로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이들을 코딩하는 각각의 폴리뉴클레오타이드 발현량과 암줄기세포 검출 대상인 췌장암 환자에서의 상기 단백질들로 이루어진 단백질로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이들을 코딩하는 각각의 폴리뉴클레오타이드 발현량을 비교할 수 있으며, 상기 발현량의 유의한 변화 여부를 판단하여 췌장암 환자 시료 내 암줄기세포 포함여부를 진단할 수 있다. 구체적으로， 환자 시료의 상기 단백질들로 이루어진 단백질로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이들을 코딩하는 각각의 폴리뉴클레오타이드 발현 수준이 정상 대조군 시료의 상기 단백질들로 이루어진 단백질로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이들을 코딩하는 각각의 폴리뉴클레오타이드 발현 수준의 150% 이상인 경우 췌장암 암줄기세포를 포함하는 것으로 판단한다. 본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 췌장암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) Genbank 접근번호가 MH14372.2 인 단백질， Genbank 접근번호가
CAD89908.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 NP_001077415.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 CAI21475.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_653337.1인 단백질， Genbank 접근번호가 CAA27309.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 EAW66403.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 MQ63403.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 MB34148.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 AAH47896.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 NP_001619.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 2PD5_A 인 단백질， Genbank 접근번호가 AAF72885.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_653280.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 BAF83085.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 AAH70129.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 1X71_A 인 단백질, Genbank 접근번호가 BAB55338.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 EAW68058.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 BAF85629.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 BAB70777.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_109591.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 MD22767.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 BAC04252.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 EAW47735.1 인 단백질 및 Genbank 접근번호가 EAW97581.1 인 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는 세포 또는 조직에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계 ; 및
(b) 상기 단계 (a)에서의 하나 이상의 단백질 또는 이들을 코딩하는 각각의 폴리뉴클레오타이드의 발현량을 측정하는 단계로서, 상기 하나 이상의 단백질 또는 이들을 코딩하는 각각의 폴리뉴클레오타이드의 고발현을 감소시키는 경우에는 상기 시료는 췌장암의 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.
본 발명자들은 상기 단백질들로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 또는 이들을 코딩하는 각각의 폴리뉴클레오타이드의 경우， 일반 췌장 암세포와 달리 췌장암 암줄기세포 내에서 그 발현이 현저히 증가한다는 사실을 발견하였다. 일반 췌장 암세포와는 달리 췌장암 암줄기세포 내에서만 타겟 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 발현이 특이적으로 현저하게 증가한다는 것은 그것이 암줄기세포의 생존에 있어 필수적인 요소임을 지시하며 , 이의 발현을 차단하는 물질은 암줄기세포의 성장 억제 및 사멸을 유도함으로써 췌장암의 근본적 치료에 도움이 되는 물질， 즉 췌장암 치료제로 판정된다.
상기 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 동정되는 췌장암 치료제는 암 조직의 대부분을 차지하는 일반 암세포만를 타겟으로 하는 것이 아니라, 암 조직의 극히 일부만 차지하면서도 암의 발병과 유지， 재발에 핵심 구실을 하는 췌장암 암줄기세포를 그 타겟으로 하므로， 췌장암의 근본적인 치료를 가능하게 한다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 GLRX3(Glutaredoxin- 3)의 활성 억제제 또는 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다ᅳ
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 GLRX3(Glutaredoxin-3)의 활성 억제제 또는 발현 억제제의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다ᄋ 본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량" 은 상술한 GLRX3(Glutaredoxin-3)의 활성 억제제 또는 발현 억제제의 효능 또는 활성을 달성하는 데 층분한 양을 의미한다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스， 덱스트로스， 수크로스, 솔비를, 만니를， 전분， 아카시아 고무， 인산 칼슘， 알기네이트， 젤라틴， 규산 칼슴, 미세결정성 셀를로스, 폴리비닐피를리돈, 셀를로스, 물， 시럽, 메틸 셀를로스, 메틸히드록시벤조에이트， 프로필히드록시벤조에이트， 활석 , 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제， 습윤제， 감미제， 향미제， 유화제， 현탁제， 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며， 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입， 피하 주입， 근육 주입， 복강 주입， 경피 투여， 점막 투여 및 점안 투여 등으로 투여할 수 있다. 바람직하게는 비경구 투여 방식으로 적용된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령， 체중， 성， 병적 상태， 음식， 투여 시간， 투여 경로， 배설 속도 및 반응 감웅성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.0001- 10000 mg/kg 범위 내이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라， 약제학적으로 허용되는 담체 및 /또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다ᅳ 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액， 현탁액， 시럽제 또는 유화액 형태이거나 액스제, 산제, 분말제， 과립제, 정제 또는 캅샐제 형태일 수도 있으며， 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 GLRX3 활성 억제제 또는 GLRX3 발현 억제제는 암줄기세포 마커인 CD24, CD44 및 ESA 를 발현하는 세포를 감소시키며， 암줄기세포의 특징인 증식율 및 이동능을 감소시킨다. 또한， 스피어 형성을 감소시켜， 결과적으로 암 발생의 초기 현상으로 인식되는 암줄기세포의 증식을 억제 할 수 있다.
본 발명에서 이용되는 GLRX3(Glutaredoxin-3)의 활성 억제제는 GLRX3 에 특이적으로 결합하는 항체 또는 펩타이드, 작은 분자량 화합물 또는 천연추출물이다. 본 발명에서 이용될 수 있는 GLRX3 단백질에 특이적으로 결합하는 활성을 갖는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며， 바람직하게는 모노클로날 항체이다. GLRX3 단백질에 대한 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들， 예를 들어, 융합 방법 (Kohler and Milstein, European Journal of I隱 unology, 6:511-519(1976))， 재조합 DNA 방법 (미국 특허 제 4，816，56 호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법 (Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222： 58, 1- 597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D. , Using Antibodies: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Press , New York, 1999； Zola, H. , Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. , Boca Raton, Florida, 1984； 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991 에 상세하게 기재되어 있으며， 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어， 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체 -생산 림프구와 융합시켜 이루어지며， 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 GLRX3 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고， 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음， 공지의 친화성 (affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.
GLRX3 에 특이적으로 결합하여 GLRX3 의 활성을 억제할 수 있는 펩타이드는 당업계에 공지된 통상의 방법, 예를 들어 파아지 디스플레이 방식으로 얻을 수 있다 (Smith GP, "Filamentous fusion phage： novel expression vectors that display c 1 oned antigens on the virion surface" . Science 228 (4705)： 1315-1317(1985)； Smith GP, Petrenko VA, "Phage display". Chem. Rev. 97(2) :391-410(1997)) .
GLRX3 의 활성을 억제하는 작은 분자량의 화합물은 후술하는 스크리닝 방법을 통하여 용이하게 얻을 수 있다.
본 발명에서 이용되는 GLRX3 발현 억제제는 GLRX3 유전자에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 siRNA 올리고뉴클레오타이드 또는 shRNA을리고뉴클레오타이드이다. 본 명세서에서 용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드" 란 특정 mRNA 의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA 의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 서열은 GLRX3 mRNA에 상보적이고 GLRX3 mRNA 에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고， GLRX3 mRNA 의 번역， 세포질내로의 전위 (translocat ion)， 성숙 (maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 핵산의 길이는 6 내지 100 염기이고, 바람직하게는 8 내지 60 염기이고, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기이다.
상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격 (backbone)의 위치에서 변형될 수 있다 (De Mesmaeker et al. , Curr Opin Struct Biol. , 5(3) :343-55(1995)) . 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르， 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬， 시클로알킬， 단쇄 헤테로아토믹， 해테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한， 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티 (sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다, 변형된 염기에는 하이포크잔틴， 6-메틸아데닌， 5-me 피리미딘 (특히 5-메틸시토신)， 5-하이드록시메틸시토신 (HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌， 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실， 5- 하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌， 7-데아자구아닌， N6 (6- 아미노핵실)아데닌， 2, 6-디아미노퓨린 둥이 있다ᅳ 또한 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성올 향상시키는 하나 이상의 모이어티 (moiety) 또는 컨쥬게이트 (conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테를 모이어티， 콜레스테릴 모이어티， 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테를, 지방성 사슬， 인지질， 폴리아민， 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산， 팔미틸 모이어티， 옥타데실아민， 핵실아미노-카르보닐-옥시콜에스테를 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다。 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다 (미국특허 제 5,138,045호, 제 5,218,105호 및 제 5,459,255호) . 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드의 경우 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 한 예는 RNA 중합효소 I 를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA 가 합성되도록 하는 한 가지 예는 인식부위 (MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 백터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA 는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 이용될 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 디자인은 서열목록 제 1 서열의 뉴클레오타이드 서열을 참조하여 당업계에 공지된 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다 (Weiss, B. (ed.): Ant i sense 01 i godeoxynuc 1 eot i des and Ant i sense RNA ： Novel Pharmacological and Therapeutic Agents, CRC Press, Boca Raton, FL, 1997； Weiss, B. , et al . Ant i sense RNA gene therapy for studying and modulating biological processes. Cell. Mol. Life Sci., 55:334-358(1999).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， GLRX3 의 발현억제제는 GLRX3 유전자에 상보적인 서열을 포함하는 siRNA또는 shRNA이다.
본 발명에서 용어 "siRNA" 는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다 (참조: W0 00/44895, W0 01/36646, W0 99/32619, W0 01/29058, W0 99/07409 및 W0 00/44914) . siRNA 는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다. siRNA 는 식물, 벌레, 초파리 및 기생층에서 처음으로 발견되었으나， 최근에 siRNA 를 개발 /이용하여 포유류 세포 연구에 웅용되었다.
본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥 (p53 mRNA 서열에 상웅하는 (corresponding) 서열)과 안티센스 가닥 (p53 mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있다. 또한, 다른 구현예에 따르면， 본 발명의 siRNA 분자는， 자기-상보성 (self- complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다.
siRNA 는 R A 끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치 (대응하는 염기가 상보적이지 않음)， 벌지 (일방의 사슬에 대웅하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기， 바람직하게는 15 내지 80 염기， 더욱 바람직하게는 20 내지 70 염기이다.
siRNA 말단 구조는 p53 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활 (blunt) 말단 혹은 점착 (cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다. 본 발명의 siRNA 분자는， 자기-상보성 (self -complementary) 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오타이드 서열 (예컨대， 약 5-15 nt)이 삽입된 형태를 가질 수 있으며， 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 흔성화에 의하여 해어핀 구조를 형성하게 되며， 전체적으로는 스템 -앤드 -루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드- 루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi 를 매개할 수 있는 활성의 siRNA분자를 생성한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 상기 siRNA 는 서열목록 제 1서열의 GLRX3유전자의 591번째 내지 616 번째 뉴클레오타이드에 상보적인 서열로， 서열목록 제 2 서열 및 제 3 서열에 기재된 siRNA 이고， 상기 shRNA 는 서열목록 제 1 서열의 GLRX3 유전자의 496 번째 내지 516 번째 뉴클레오타이드에 상보적인 서열로， 서열목록 제 4 서열에 기재된 shRNA이다.
본 명세서에서 용어 '유효성분으로 포함하는' 이란 하기의 GLRX3(Glutaredoxin-3)의 활성 억제제 또는 발현 억제제의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양올 포함하는 것을 의미한다ᅳ 본 발명의 조성물에 포함된 GLRX3(Glutaredoxin-3)의 활성 억제제 또는 발현 억제제의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위내에서 선택하여 실시할 수 있다.
본 발명의 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 바람직하게는, 상기 암은 암줄기세포에 의한 것이고， 보다 바람직하게는 상기 암은 췌장암이다. 본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 GLRX3(Glutaredoxin-3)의 활성 또는 발현을 억제하는 단계를 포함하는 암 세포의 증식 억제 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 암 세포는 암줄기세포이다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 GLRX3(Glutaredoxin-3)의 활성 억제제 또는 발현 억제제의 약제학적 유효량을 대상 (subject)에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
바람직하게는， 상기 암은 췌장암이다.
【발명의 효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
( i ) 본 발명은 췌장암 줄기세포 및 췌장암에 대한 신규한 분자 마커， 마커 검출 방법 및 스크리닝 방법을 제공한다.
(ii) 본 발명은 췌장암 세포주로부터 발굴된 마커로서， 췌장암 줄기세포 마커 검출을 통하여 췌장암， 특히 조기의 췌장암을 검출할 수 있는 마커이다。
(iii) 또한, 본 발명의 마커를 이용하면 췌장암을 정확하게 진단 및 예후를 분석 할 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1 은 인체 췌장암 세포주 (Hpac, CAPAN1, CAPAN2, CFPAC, ASPC1, BXPC3, MIAPACA2 및 PANC1)들을 스피어 배양한 결과이다, Hpac, CAPAN1 및 CAPAN2에서 스피어가 형성되는 것을 결과를 나타내었다.
도 2a-2b 는 스피어 세포에서 암 줄기세포 관련 유전자들의 발현을 분석한 것이다。 도 2a 는 Hpac 접착에 비해 스피어 세포에서 암 줄기세포 신호 체계로 알려진 Notch, Hedgehog 및 wnt 시그널링이 활성화된 결과이다. 도 2b 는 줄기세포의 다분화 능력을 나타내는 oct4, nanog 및 암 줄기세포 마커로 알려진 ABGC2가증가하는 결과를 보여준다. 도 3 은 스피어 세포에서 유세포 분석을 통한 암 줄기세포 마커의 발현을 분석한 것이다. 암 줄기세포 마커로 보고된 CD44 및 PR0M2 등이 스피어 세포에서 증가되어 있음을 확인할 수 있다.
도 4a-4c 는 잘 알려진 줄기세포 신호 차단 약물에 의한 스피어 형성 억제를 확인한 결과이다. 도 4a 는 약물에 의해 스피어 형성 억제를 보여주는 현미경 사진이다. 도 4b 는 약물에 의한 스피어 형성 억제시 스피어 세포의 직경 차이를 그래프로 나타낸 것이다. 도 4c 는 약물에 따른 스피어 형성 개수를 그래프로 나타낸 것이다. 이와 같은 결과들을 토대로 줄기세포 신호 차단 약물에 의해 스피어 형성이 억제되었으며， 스피어의 직경 및 수도 줄어드는 것을 확인 할 수 있다.
도 5a-5c 는 Hpac 부착 세포와 스피어 세포의 암화 능력 차이를 확인한 결과 이미지이다. 도 5a 는 종양이 형성된 면역제어 마우스의 췌장과 폐전이를 보여주는 이미지이다. 도 5b는 마우스의 췌장 및 전이가 관찰된 기관을 떼어 내어 H&E 면역 염색한 이미지이다. 도 5c 는 Hpac 의 부착 세포와 스피어 세포의 종양 크기 차이를 그래프로 나타낸 것이다. Hpac 부착 세포와 스피어 세포를 면역제어 마우스에 in situ이식하여 종양 형성 능력을 비교하였을 때， 암 줄기세포의 특성을 지니는 Hpac-스피어를 이식한 그룹에서 암 형성능력이 높게 나타났고， 폐와 복막 등 기관 및 조직으로의 전이가 관찰되는 결과를 나타냈다.
도 6 은 동정된 분비 단백질들의 발현을 Hpac 과 Capanl 세포의 접착 및 스피어 배양액에서 웨스턴 블롯을 통하여 확인한 결과이다. AK 1B1, HSP90, ALDH, Vimentin 및 GLRX3 가 Hpac 스피어 또는 CAPAN1 스피어의 배양액에서 증가되어 있음을 알수 있다.
도 7 은 AsPC-l, BxPC-3, Capan-1, Capan-2, Cfpac-1, HPAC, Panc-1 및 Miapaca-2 의 8 종의 췌장암 세포주 및 HPDE 에서의 mRNA 및 단백질을 추출하여 GLRX3 발현을 확인한 결과이다,
도 8는 암줄기세포 마커인 CD24, CD44 및 ESA를 모두 발현하는 세포 (CD24+/CD44+/ESA+) 및 3 종류의 마커를 모두 발현하지 않는 세포 (CD24- /CD44-/ESA-)로 췌장암 세포를 분획한 세포에서 GLRX3 발현을 확인한 결과이다. 도 9 은 상기 결과는 GLRX3 siRNA 와 콘트를 siRNA 를 도입 했을 때 , 암줄기세포 마커 3 종류 (CD24+/CD44+/ESA+)의 발현 변화를 확인한 결과이다 도 10a 및 10b 는 GLRX3 녹 -다운 (k/d) 세포주에서 GLRX3 의 억제로 인한 변화를 확인한 결과로， 도 10a 는 GLRX3 에 대한 mRNA 및 단백질 발현을 확인한 웨스턴 블럿 결과이며 , 도 10b 및 도 10c 는 세포 증식율을 확인한 결과이다 .
도 11a 및 lib 는 GLRX3 녹-다운에 따른 암줄기세포 관련 특성 변화를 확인한 결과로， 도 11a 는 GLRX3 녹 -다운 세포주의 스피어 형성 능력은 확인한 결과이며， 도 lib 는 생존율 및 증식율을 확인한 결과이다 . 도 12 은 인체 췌장암 조직 마이크로 어 레이에서 면역조직 화학염 색을 통하여 분비 단백질들을 확인한 이미지 이다 . AGPAT4 및 GLRX3 를 포함한 7 개의 분비 단백질들이 췌장암 조직 에서 증가되어 있는 결과이다 .
도 13 는 인체 정상 췌장 조직과 췌장암 조직에서 AGPAT4 및 GLRX3 를 포함한 7 개의 분비 단백질들의 발현을 확인한 이미지이다ᅳ 7 개의 단백질 모두 정상 췌장조직에 비해 췌장암 조직에서 현저히 높은 발현을 보여주고 있다 .
도 14a-b 는 기존에 췌장암 마커로 사용되고 있는 CA 19-9 를 췌장암 환자의 혈청에서 확인한 결과이다 . 도 14b 는 기존에 췌장암 마커로 사용되고 있는 CEA 를 췌장암 환자의 혈청에서 확인한 결과이다 . CA19- 9 와 CEA 가 현재 사용되고 있는 췌장암 진단 마커 이지만 환자마다 CA19-9 및 CEA 의 발현이 확연히 차이가 나는 것을 확인할 수 있다 .
도 15a_15b 는 정상， 만성 췌장염 및 췌장암 환자들의 혈청을 MARSCMult iple aff ini ty removal column system)를 사용하여 검출한 후 웨스턴 블롯을 통하여 분비된 단백질 중 MSK2 단백질의 발현을 확인한 결과이다 . 도 1 는 MSK2 단백질의 발현을 보여주는 웨스턴 블롯 결과이다 . 도 15b 는 MSK2 단백질의 웨스턴 블롯 결과를 덴시토메트리로 측정하여 그래프로 나타낸 것 이다 . 정상인의 혈청에 비해 췌장암 혈청에서 높게 발현되는 결과이다。
도 16a-16b 는 정상 , 만성 췌장염 및 췌장암 환자들의 혈청을 MARS 를 사용하여 검출한 후 웨스턴 블롯을 통하여 분비된 단백질 중 비멘틴 (vimentin) 단백질의 발현을 확인한 결과이다. 도 16a 는 비멘틴 단백질 발현을 보여주는 웨스턴 블롯 결과이다. 도 16b 는 비멘틴 단백질의 웨스턴 블롯 결과를 덴시토메트리로 측정하여 그래프로 나타낸 것이다. 정상인과 만성 췌장염 환자의 혈청에 비해 췌장암 혈청에서 높게 발현되는 결과이다.
도 17a-17b는 정상 만성 췌장염 및 췌장암 환자들의 혈청을 MARS를 사용하여 검출한 후 웨스턴 블롯을 통하여 분비된 단백질 중 ALDH 단백질의 발현을 확인한 결과이다. 도 17a 는 ALDH 단백질 발현을 보여주는 웨스턴 블롯 결과이다. 도 17b 는 ALDH 단백질의 웨스턴 블롯 결과를 덴시토메트리로 측정하여 그래프로 나타낸 것이다. 정상인과 만성 췌장염의 혈청에 비해 췌장암 혈청에서 높게 발현되는 결과이다.
도 18a-18b는 정상, 만성 췌장염 및 췌장암 환자들의 혈청을 MARS를 사용하여 검출한 후 웨스턴 블롯을 통하여 분비된 단백질 중 GLRX3 단백질의 발현을 확인한 결과이다. 도 18a 는 GLRX3 단백질 발현을 보여주는 웨스턴 블롯 결과이다. 도 18b 는 GLRX3 단백질의 웨스턴 블롯 결과를 덴시토메트리로 측정하여 그래프로 나타낸 것이다ᅳ 정상인과 만성 췌장염의 혈청에 비해 췌장암 혈청에서 높게 발현되는 결과이다.
도 19a 및 19b 는 췌장암 환자 혈청에서 GLRX3 발현을 ELISA 를 통해 확인한 결과이다. 도 19a 는 정상 대조군 환자， 만성 췌장염 환자 및 췌장암 환자의 혈액을 분리하여 GLRX3 의 발현을 비교한 결과이고, 도 19b 는 GLRX3 의 발현 정도가 1800 ng/m^ 이상인 환자와 1800 ng/ l 이하인 환자의 생존기간을 비교한 그래프이다.
【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로， 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식올 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예 다른 별도의 언급이 없는 경우， 고체 /고체는 (중량 /중량) 부 또는 , 고체 /액체는 (중량 /부피) 부 또는 %， 그리고 액체 /액체는 (부피 /부피) 부 또는 %이다. 실험 재료 및 방법
인체 췌장암 세포주로부터 암 줄기세포의 특성을 갖는 스피어 분리 및 배양
인체 췌장암 세포주 8 주 (Hpac, Capanl, Capan2, Cfpacl, Aspcl,
Bxpc3 , Miapaca2 및 Panel)는 모두 ATCC (American Type Culture Collection; Manassas, VA)로부터 구입하였으며， ATCC 에 의해 제시된 프로토콜에 의해 세포주들을 성장 배지에서 배양하였다. 즉， AsPC-1 및 BxPC-3 세포는 10% 우태아혈청 (FBS; Hyclone, Logan, UT)을 포함하는 RPMI1640( Invitrogen Gibco, Grand Island, NY)에서 배양하였고， Capan-1 및 CFPAC-1 세포는 10% FBS 를 포함하는 IMDM( Invitrogen Gibco)에서 배양하였다. Capan-2 세포는 10% FBS 를 포함한 맥코이 5a( Invitrogen Gibco)에서， 그리고 MIA PaCa-2 세포는 10% FBS 및 2.5% 마혈청 (Hyclone)을 포함하는 DMEM( Invitrogen Gibco)에서 배양하였다. Hpac 세포는 10% FBS를 포함하는 DMEM/햄 F12(D/F12; Invitrogen Gibco)에서， 그리고 PANC-1 세포는 10% FBS를 포함하는 DMEM에서 배양하였다.
스피어 (Sphere) 배양을 위하여 췌장암 세포주들을 EGF(10 ng/ml， R&D Systems Inc., Minneapolis, 丽)， bFGF(10 ng/ ra^ , R&D Systems Inc.), lDlTS(insulin transferring selenium, Gibco) 및 0.5% FBS 을 보층한 혈청 프리 DMEM/F12 배지에 1000 세포 /ιι ^의 비율로 6-웰 울트라 로우 클러스터 플레이트 (Corning Inc., Corning NY)에 접종 후 7 일 -10 일 동안 배양하였다. 같은 배양액으로 배양 접시 (Nalgene Nunc Int., Rochester, NY)에 부착시켜 접합 (adherent) 상태에서 키운 세포를 대조군으로 하였다. 스피어 세포에서의 암 줄기세포 관련 유전자들의 발현 분석
RNAeasy Mini kit (QIAGEN, Valencia, CA)를 사용하여 Hpac 접착과 스피어 세포의 총 RNA 를 추출하였다. Superscript II (Gibco BRL, Grand Island, NY)의 반응을 통하여 42°C에서 한 시간 동안 추출된 각각의 RNA 2 fig를 역전사 반웅시켰다. 암 줄기세포 관련 유전자들의 프라이머와 Taq 폴리머라아제에 의한 PCR 을 통하여 스피어 세포에서의 암 줄기세포 관련 유전자들의 발현을 분석하였고， 베타 액틴 Bet a act in) 유전자의 발현을 대조군으로 하였다. 암 즐기세포 관련 유전자들의 프라이머 염기 서열 PCR 반웅 온도 및 싸이클수는 하기 표 1에 나타내었다.
【표 1】
Figure imgf000033_0001
스피어 세포에서 유세포 분석을 통한 암 줄기세포 마커들의 발현 분석
Hpac 세포로부터 접착 및 스피어 배양올 한 후， 아큐타아제 (Accutase; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)를 처리하여 동일한 수의 단일세포 현탁액을 제조하였다. 그 다음， 접착 및 스피어 세포를 암 줄기세포 마커 항체로 염색하였으며， FITC-CD44(BD Biosciences PharMingen: San Diego, CA)， PE-PR0M2(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA), PE-EphA2(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA), PE-CD130(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA) , PE_CD271(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA) , PE-CD24(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA), PE-CD133(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA) 및 PE- CD117(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA)을 각각의 마커 항체로 이용하였다.
유세포 분석은 BD LSR II (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)를 이용하여 실시하였으며， BD FACSDiva소프트웨어를 통하여 분석하였다. 줄기세포 신호차단 약물에의한스피어 형성 억제
잘 알려진 줄기세포 신호 차단 약물인 DAPT(Calbiochem, San Diego, CA, USA), Cyclopamine-KAAD (Calbiochem, San Diego, CA, USA), LiCl (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO), ATRA (Sigma-Aldrich, Inc. , St. Louis, MO), 0V (Sigma-Aldrich, Inc. , St. Louis, MO)를 배양액에 첨가하여 스피어 배양을 하였다. 7 일 후 스피어 형성 억제여부를 확인하였다. Hpac스피어의 암화능력 확인
인체 췌장암 세포주 Hpac 으로부터 배양된 접착과 스피어 세포를 0.25 % 트립신 EDTA (Gibco BRL, Grand Island, NY)으로 처리하여 동일한 수의 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 그 다음, N0D-SCID 면역제어 마우스 (Charles River, Japan)의 췌장에 직접 in situ 이식하여 접착 세포와 스피어 세포간의 종양 형성 능력을 관찰하였다. 스피어세포에서의 암줄기세포 관련 분비 단백질 분석 스피어를 형성하는 세포의 배양액에서 암 줄기세포와 관련된 분비 단백질을 분석하기 위하여, Hpac 과 Capan 1 세포를 그0 일간 접착 또는 스피어를 배양하였다. 그 다음， 무혈청 DMEM/F12 배지 (Gibco BRL, Grand Island, NY)로 교환한 후 다시 24 시간 동안 배양하였다. 접착 및 스피어의 배양 상층쌕을 원심분리와 필터를 이용하여 수집하였다.
다양한 분비 단백질들을 포함한 상층액을 3 kDa 분자 -매스 컷오프 (molecular-mass cut off: 匿 CO)를 가진 아미콘 울트라 센트리퓨갈 필터 디바이스를 사용하여 농축시킨 후， 프로테오믹스 분석 (2-D 젤 분석과 MALDI-TOF)을 실시하였다. 염색된 젤 이미지 분석 후 차이를 보이는 스팟은 트립신으로 절단시킨 후 MALDI-TOF( matrix assisted laser desor pt i on/ i on izat ion-time of flight) 분석을 통하여 동정하였다. 데이타베이스 검색엔진은 MASCOT 올 사용하였다 .(Na K et al., Proteomics (9) :3989-3999, 2009) . 스피어세포의 배양액에서 웨스턴 블롯 Oes tern blot)을 통한 췌장암 줄기세포 관련 분비 단백질의 발현 분석
프로테오믹스 분석에 의해 동정된 분비 단백질들의 발현을 Hpac 과 Capan 1 의 접착 및 스피어 배양액에서 검증하기 위하여， 접착 및 스피어 배양 상층액을 원심분리 및 필터를 이용하여 수집하였다。
3 kDa 분자ᅳ매스 컷오프 (molecular-mass cut off: MWC0)를 가진 아미콘 울트라 센트리퓨갈 필터 디바이스를 사용하여 농축시킨 후， 단백질 정량에 의해 25 씩 10% SDS-폴리아크릴아미드 젤에 로딩 (loading)한 후 전기영동하였다。 전기영동에 의해 크기별로 분획된 단백질들을 PVDF 멤브레인 (Millipore corporation, Billerica, MA, USA)으로 이동시킨 후， 비특이적 반웅을 감소시키기 위하여 5¾ 논-팻 밀크 (non-fat mi lk)를 첨가한 TBS-T(Tris-buffered saline/0,05% Tween-20)에 1 시간 동안 블록킹하였다. 그 다음， 각각의 멤브레인을 프로테오믹스 결과 동정된 분비 단백질들에 해당하는 1 차 항체와 4°C에서 하룻밤 반웅시켰다. 1 차 항체는 마우스 모노클로날 AKR1BK santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA) , 래빗 폴리클로날 HSP90( santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA) , 마우스 모노클로날 ALDH(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA), 마우스 모노클로날 비멘틴 (santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA) 및 마우스 모노클로날 GLRX3(Abnova corporation, Taipei)을 사용하였다.
1 차 항체와 반웅한 각각의 멤브레인을 TBS-T 버퍼에 세척시킨 후， HRP( horseradish peroxidase)—콘퓨게이티드 2 차 항체 (santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA)와 1 시간 동안 반응시켰다. 각각의 단백질을 Enhanced chemi luminescence system(PIERCE, Rockford, IL)을 이용하여 검출하였다. 췌장암세포주에서의 GLRX3 mRNA 및 단백질 발현 확인
AsPC-1, BxPC-3, Capan-1, Capan-2, Cfpac-1, HPAC, Pane— 1 및 Miapaca-2 의 8 종의 췌장암 세포주 및 HPDE(Human Pancreatic Ductal Epithelial cell)에서 mRNA 및 단백질을 추출하여 GLRX3 발현을 확인하였다. RNAeasy 미니 키트 (QIAGEN, Valencia, CA, 미국)를 사용하여 췌장암 세포주의 총 RNA 를 추출하고， Superscript iKGibco BRL, Grand Island, NY)의 반웅을 통하여 각각의 RNA를 역전사 반응시켰다. GLRX3프라이머와 Taq 폴리머라아제에 의한 PCR 을 통하여 췌장암 세포주에서의 GLRX3 유전자의 발현을 분석하였고， 베타 액틴^ eta actin) 유전자의 발현을 대조군으로 하였다. 췌장암 세포주에서의 GLRX3 단백질 발현 분석은 세포 총 단백질 및 분비단백질에서 실시하였다. 세포 총단백질은 세포 용해 버퍼 (50 mM Tris, 150 mM NaCl , 25 mM β -glycerophosphate, 25 mM NaF, 0.5 M EDTA, 1 NP-40, 0.1 mM PMSF, 1% 프로테아제 억제자 칵테일 (Roche))를 이용하여 추출하였다. 분비단백질 준비를 위해， 혈청이 없는 조건에서 배양한 세포배양액을 원심분리하여 세포 부산물들올 제거하고, 최종 80% 부피의 아이스-콜 ^(ice-cold) 아세톤으로 침전시켰다. 침전된 분비단백질은 100% 아이스 -콜드 아세톤으로 세척단계를 거친 후 원심진공건조기로 말린 후 다시 세포용해 버퍼로 용해하였다. 총단백질 및 분비단백질을 단백질 정량에 의해 25 iig 씩 10% SDS-폴리아크릴아미드 젤에 로딩 (loading)한 후 전기영동을 실시하였다. 전기영동에 의해 크기별로 분획된 단백질들을 PVDF 막 (Millipore corporation, Billerica, MA, USA)으로 이동시킨 후, 비특이적 반응을 감소시키기 위하여 5% 탈지분유 (non-fat mi lk)를 첨가한 TBS-T(Tris-buf fered saline/0.05% Tween-20)에 1 시간 동안 블로킹하였다. 그 다음, PVDF 막을 GLRX3 에 대한 1 차 항체 (Abnova corporation, Taipei, 중국)와 4°C에서 하룻밤 반웅시켰다. 1차 항체와 반웅한 각각의 PVDF 막을 TBS-T 버퍼에 세척시킨 후， HRP(horseradish peroxidase)-콘쥬게이티드 2 차 항체 (santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA, 미국)와 1 시간 동안 반응시켰다。 면역반웅이 있는 단백질은 West Pico chemi luminescent Substrate system(PIERCE, Rockford, IL)을 이용하여 검출하였다. 췌장암 암줄기세포의 특성을 가진 세포 분획에서의 GLRX3 과발현 확인
암줄기세포 특성을 가진 세포를 분획하기 위해， 배양한 췌장암 세포주 HPAC과 CFPAC-1 를 아큐타아제 (Accutase; Sigma-Aldr ich, St. Louis: MO)로 처리하여 동일한 수의 단일세포 현탁액을 제조하였다. 그 다음 암줄기세포 마커로 알려진 PE_CD24(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA), APC-CD44(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA) 및 FITC_ESA(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA)로 아이스에서 10분간 염색하였다. 항체의 아이소타입 컨드를로는 정제된 마우스 IgGl, -FITC, IgG2a, c-PE 및 IgG2b, /c-APC(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA, 미국)를 이용하여 염색하였다。 세포 분류는 FACSAria II (BD I匪 unocytochemistry system, Franklin Lakes , NJ, 미국)를 이용하였다. 3 종류의 마커를 모두 발현하는 세포 (CD24+/CD44+/ESA+)와 상기 마커를 모두 발현하지 않는 세포 (CD24-/CD44-/ESA-)의 분획 세포에서 RNAeasy 미니 키트 (QIAGEN, Valencia, CA)를 사용하여 췌장암 세포주의 총 RNA 를 추출하였다. Superscript iKGibco BRL, Grand Island, NY, 미국)의 반웅을 통하여 각각의 RNA 를 역전사 반응시킨 후， GL X3 프라이머 및 Taq 폴리머라아제에 의한 PCR 을 통하여 GLRX3 유전자의 발현을 분석하였고， 베타 액틴 {Bet a act in) 유전자의 발현을 대조군으로 하였다.
GLRX3 를 저해하기 위해 GLRX3 에 대한 siRNA(invitrogen stealth™ siRNA duplex oligoribonucleotides)를 이용하였다. 센스 siRNA는 UGA GGG AGU UCU UUA GCU AAC UCU G 이고， 안티센스 siRNA 는 CAG AGU UAG CUA AAG AAC UCC CUC A 이다. 대조군 siRNA 는 invitrogen 사의 음성 대조군 Med GC 를 사용하였다. CFAPC-1 세포에 RNAiMAXGnvtirogen, Carlsbad, CA, 미국)를 이용하여 GLRX3또는 음성대조군 siRNA를 이입한 후， 72시간 동안 배양하였다. 배양된 세포는 아큐타아제 (Accutase; Sigma-Aldr ich, St. Louis, MO)를 처리하여 동일한 수의 단일세포 현탁액을 만든 후 PE-CD24(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA) , APC_CD44(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA) 및 FITC一 ESA(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA)로 염색하였다. 유세포 분석은 BD LSR II(BD Biosciences, Franklin Lakes , NJ)를 이용하여 실시하였으며, BD FACSDiva 소프트웨어를 통하여 분석하였다.
GLRX3 발현저해세포주 구축 및 특성 분석
GLRX3 발현 저해로 인한 효과를 보기 위해， GLRX3에 대한 shRNA(SABiosciences SureSi lencingTM shRNA 플라스미드) 및 대조군 shRNA를 제작하여 HPAC 세포주에 영구 이입하여 GLRX3 knock-down (k/d) 세포주를 수립하여， GLRX3 mRNA 및 단백질 발현을 조사하였다. GLRX3에 대한 shRNA의 서열은 GTG GAA ATT CTT CAC AAA CAT 이고， 대조군 shRNA의 서열은 GGA ATC TCA TTC GAT GCA TAC 이며， 선별 마커는 퓨로마이신 (puromycin, 2.0 /zg/ O이다. 동일한 수의 세포를 유전자이입 하루 전날 플레이트에 부착시킨 후， 유전자 이입 당일에는 GLRX3에 대한 shRNA 및 대조군 shRNA 를 Lipofectamine2000( Invitrogen, Carlsbad, CA, 미국)과 흔합하여 세포에 이입하였다. 유전자 이입 후 24시간이 지난 후， 배양액을 2 //g/ml 퓨로마이신이 포함된 배양액으로 바꾸어 준 후, 3일 이상 지속배양 하였다. 퓨로마이신 배양액에서 살아남은 세포는 다시 96웰 플레이트에 1세포 /웰의 비율로 부착시킨 후 배양하였다. 각 웰에서 살아남아 증식된 세포에서 mRNA 및 단백질을 추출하여 GLRX3 발현 변화를 PCR과 웨스턴블럿으로 확인하여 최종적으로 GLRX3 k/d 세포주 클론 2개와 대조군 클론 두개를 확보하였다ᅳ 확보된 GLRX3 k/d 의 암 관련 특성 변화를 확인하기 위해， 세포증식 속도와 세포증식이동분석 (wound-healing assay)를 수행하였다. 세포증식 속도는 각 클론의 세포를 1.25X104개씩 24웰- 플레이트에 부착시킨 후， 5일간 매일 일정시간에 세포를 0.25% trypsin- EDTA로 떼에서 세포계수기 (hematocytometer)에서 세포수를 측정하였다. 세포중식이동분석은 세포배양 시 세포의 수가 웰에 100% 가까이 채워지고 난 후 스크래치를 주고， 시간에 따른 스크래치 회복능력을 현미경하에서 관찰하면서 사진을 찍었다 (Olympus DP50).
GLRX3 발현 저해세포주의 암줄기세포 관련 특성 변화 분석
췌장암 암줄기세포 관련 단백질로 도출된 GLRX3 단백질이었으므로， GLRX3 k/d로 인해 유발되는 암줄기세포 관련 특성 변화를 확인하였다. 우선 GLRX3 k/d 세포주 및 대조군 세포주의 스피어 형성 능력을 확인하였다. 이를 위해 GLRX3 k/d 세포주 2클론과 대조군 세포주 2클론올 7일간 스피어 배양하였다. 집락형성 분석법 (clonogenic assay)은 세포배양액에 넣고 끓인 0.6% 아가 (Agar)를 24웰 -플레이트에 굳힌 후 (하층배지)， 그 위에 1000개 /웰의 세포를 0.3% 아가 -세포배양액 (상층배지)과 흔합하여 응고시킨다. 0,3% 상층 배지가 굳으면 그 위에 500 웰씩 배양액을 첨가하였다. 배양액을 3일에 한번씩 첨가해주면서 3-4주 동안 배양 후， 아가 상의 배양액을 제거하고 크리스탈바이올렛으로 염색한 다음 콜로니 수를 측정하였다.
면역조직 화학염색을 통한 인체 췌장암 조직에서의 췌장암 암줄기세포 관련 분비 단백질들의 발현 분석
췌장 조직 슬라이드를 자일렌 내에서 탈파라핀화시키고 등급별 알코올 내에서 재수화시켰다. 내생성 퍼옥시다제 활성을 상온에서 20 분 동안 0.3%의 과산화수소 포함 메탄올 용액으로 블록킹하였다. 마이크로웨이브 항원 검색을 시트레이트 완충액 (0.01M, pH 6.0)에서 4 분 동안 실시하였다ᅳ 그 다음, 슬라이드를 10% 노말 당나귀 혈청 용액으로 1 시간 동안 배양시켜서 비-특이적인 배경 염색을 감소시켰다. 1: 200으로 희석하여 반응시킨 1 차 항체는 마우스 모노클로날 AGPAT4 (Abnova corporation, Taipei ) , 마우스 모노클로날 AKRIBKsanta cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA) , 래빗 폴리클로날 HSP90(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA) , 마우스 모노클로날 ALDH(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA) , 래빗 폴리클로날 MSK2(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA) , 마우스 모노클로날 Viment in(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA) 및 마우스 모노클로날 GLRX3(Abnova corporation, Taipei)이다.
블록화된 섹션을 1 차 항체와 4°C에서 하룻밤 배양시켰다. 그 이후의 반웅은 Envision 키트 (DakoCytomation, Carpineter ia, CA, USA)에 포함된 권장 과정을 이용하여 실시하였다.
마지막으로, 슬라이드를 3 3' -디아미노벤지딘 (3, 3' - diaminobenzidinei DakoCytomat ion, Carpinter ia, CA, 1^)로'배양시키고， 변형된 해리스 헤마특실린 (Harris hematoxylin, Sigma-Aldr ich, Inc. , St.
Louis, MO)용액으로 대조 염색하였다.
염색의 강도는 각각 음성， 약한, 중간 및 강한 갈색 염색의 존재에 해당하는 -， +, ++ 및 +++로 평가하였다. 정상， 만성 췌장염 및 췌장암 환자 혈청에서 웨스턴 블롯 (¥estern blot)을 통한췌장암 암줄기세포 관련 분비 단백질의 발현 분석
정상, 만성 췌장염 및 췌장암 환자 혈청에서 웨스턴 블롯 (Western blot)을 통한 췌장암 줄기세포 관련 분비 단백질의 발현 분석을 실시하였다. 정상, 만성 췌장염 및 췌장암 환자의 혈청에서 발굴된 분비 단백질의 발현을 확인하기 위하여 정상 혈청 (normal) 5 예， 만성 췌장염 혈청 (chronic pancreatits) 5 예， 췌장암 환자 ¾¾ (pancreatic cancer) 20 예를 선정하였다.
선정된 총 30 예의 혈청들은 MARS(Multiple affinity removal column system)를 사용하여 혈청내의 6 개의 주요 단백질인 알부민, 트란스페린， IgG, IgA, 햅토그로빈 (haptoglobin), 항-트립신 (anti—trypsin)을 제거시킨 후， 3 kDa丽 CO molecularᅳ mass cut off)을 가진 아미콘 을트라 센트리퓨갈 필터 디바이스를 사용하여 농축하였고, 각 예의 단백질을 농도 40 /g씩 동일한 농도로 10% SDS-폴리아크릴아미드 젤에 로딩한 후 전기영동하였다. 전기영동에 의해 크기별로 분획된 단백질들을 PVDF 멤브레인 (Millipore corporation, Billerica, MA, USA)으로 이동시킨 후 비특이적 반웅을 감소시키기 위하여 5% 논-팻 밀크를 첨가한 TBS-T(Tris-buffered saline/0.05% Tween-20)에서 한시간 동안 블록킹 하였다. 그 다음， 각각의 1차 항체와 각각의 멤브레인들을 4°C에서 하룻밤 반응시켰다.
1:500 의 희석으로 사용된 각각의 1 차 항체는 래빗 폴리클로날 MSK2( santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA) , 마우스 모노클로날 비멘틴 (santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA) , 마우스 모노클로날 ALDH(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA) 및 마우스 모노클로날 GLRX3(Abnova corporation, Taipei) 이다.
1 차 항체와 반웅한 멤브레인을 TBS-T 버퍼로 세척한 후 HRP- 콘슈게이티드 2 치" 항체 (santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA)와 1 시간 동안 반웅시켰다. 단백질은 Enhanced chemi luminescence system (PIERCE, Rockford, IL)에 의해 검출되었다. 췌장암환자 혈액에서의 GLRX3 발현 확인
실제 임상환자 (정상 대조군 환자 28명， 만성 췌장염 환자 9명 및 췌장암 환자 57명)의 혈청에서 GLRX3 발현을 확인하기 위해 ELISA JSCN GLRX3 ELISA kit)를 수행하였다. ELISA 방법은 ELISA kit 제작회사의 프로토콜대로 수행하였다. 환자의 혈청은 PBS에 1:10으로 희석 후 사용하였다. 표준농도는 10 nM/ 부터 1/2씩 희석하여 준비하였다. 희석한 환자 혈청과 표준농도를 GLRX3 ELISA 키트 96웰에 각각 넣고 2시간 동안 37도에서 반웅하였다. 검출시약 A를 100 /^씩 넣고 다시 1시간 동안 37도에서 반웅하였다. 모든 용액을 제거한 후 세척용액으로 3회 세척하였다. 검출시약 B를 100 ^씩 넣고 37도에서 30분간 반웅하였다. 용액을 제거하고 5회 세척 후 90 씩의 기질용액을 넣고 37도에서 15- 20분동안 반웅한 후 50 씩의 종료용액을 넣고 450 nm에서 발색을 측정한다. 실험 결과
췌장암 세포주로부터 암 줄기세포의 특성을 갖는 스피어 분리 및 배양
암 줄기세포의 특성을 나타내는 스피어 형성 유무를 확인한 결과， 총
8 종의 췌장암 세포주 중 Hpac, Capanl 및 Capan2 의 세포주에서 스피어가 형성됨을 확인하였고， 그 중 Hpac 과 Capanl 을 선택하여 후속 실험을 진행하였다 (도 1). 스피어세포에서의 암줄기세포 관련 유전자들의 발현 분석
RT-PCR 을 수행한 결과 췌장암 세포주 Hpac 의 접착에 비해 스피어에서 Notch, Hedgehog 및 Wnt 등 줄기세포 관련 신호전달 체계가 활성화되어 있는 것을 확인하였다. 발생 초기에 증가하는 것으로 알려진 줄기세포의 다분화 능력을 나타내는 oct4, nanog 및 stat3 등의 유전자 발현도 증가하였으며， 이 외에도 ABCG2, PTEN 등 암 줄기세포 마커들의 발현도 증가함을 확인할 수 있었다 (도 2a-2b). 스피어 세포에서 유세포 분석을 통한 암 줄기세포 마커들의 발현 분석
유세포 분석을 통하여 기존에 알려진 암 줄기세포 마커들의 발현을 Hapc 과 Hpac-sphere 에서 확인한 결과 CD44, PR0M2, EphA2, CD130 및 CD2기이 증가되어 있음을 확인하였다 (도 3). 줄기세포신호차단 약물에 의한스피어 형성 억제
Hpac-스피어의 형성 능력이 잘 알려진 줄기세포 신호를 차단하는 약물에 의해서 완전히 억제되거나 감소되는 것을 확인하였다 (도 4a-4c; DAPT 는 Notch 억제제이고; KMD 는 HH 억제제이며; Licl 는 GSK3b 억제제이고; ATRA는 OcU 억제제이며; 0V는 Nanog 억제제임.)ᅳ
Hpac스피어의 암화능력 확인
인체 췌장암 세포주 Hpac 으로부터 스피어 배양을 통해 형성한 Hpac- 스피어를 N0D/SCID 마우스의 췌장에 in situ 이식하여 종양형성 능력을 비교하였을 때， Hpac 에 비해 암 줄기세포의 특성을 지니는 Hpac-스피어를 이식한 그룹에서 암 형성능력이 높게 나타났고， 폐와 복막 등 기관 및 조직으로의 전이가 관찰 되었다 (도 5a-5c).
Hpac 스피어 세포가 암 줄기세포와 관련된 유전자 및 마커들을 발현하고 있으며， 암화능력이 증가되어 있는 결과들 (도 l-5c)을 토대로, 스피어에서 분비되는 단백질 프로파일을 조사함으로써 췌장암 줄기세포 특이 표지자를 예측할 수 있을 것으로 판단되었다. 스피어 세포에서의 암 줄기세포 관련 분비 단백질 분석
Hpac 과 Capanl 의 접착과 스피어에서 587 개의 패어드 스팟 (paired spots)이 검출되었고， 이 중 접착 대비 스피어에서 2배 이상 증가한 스팟은 55개가 검출되었다.
스피어 젤에서 2 배 이상 증가한 스팟 55 개 중 41 개의 스팟에 대해 MALDI-T0F 를 수행하여 췌장암 줄기세포 관련 분비 단백질을 동정하였다 (표 2).
【표 2]
Figure imgf000043_0001
15687 2.3 GI :62414289 NP— 003371.2 viment in
15737 4.3 GI :24308169 NP_060009.1 dyne in, axonema 1 , heavy chain 3
15792 2.3 GI :4504025 NP_002055.1 glutaredoxin
15805 2.0 GI : 119586807 EA 66403.1 hCG2042304
15821 3.3 GI :34304594 AAQ63403.1 hypothet ical protein FL J 10808 i soform
15871 3.3 GI :998688 AAB34148.1 erythrocyte 26 S protease subuni t 12
15882 6.2 GI :28839796 AAH47896.1 RPS6 A4 protein (MSK2)
15890 2.1 GI :48257132 AAH14372.2 GLRX3 protein
15977 3.8 GI :4502049 NP_001619.1 aldo-keto reductase fami ly 1， member Bl
15978 3.4 GI :4502049 NP— 001619.1 aldo—keto reductase fami ly 1 (AKR1)
16000 2.3 GI： 171848760 2PD5— A Chain A, Human Aldose Reductase Mutant V47i
16026 2.5 GI :8118090 AAF72885.1 formin 2-1 ike protein
16051 17.0 GI :21389577 NPᅳ 653280.1 hypothet ical protein LIX146705
16087 4.4 GI： 157168362 NP_000261.2 nucleoside phosphorylase
16095 3.7 GI :4503143 NP— 001900.1 cathepsin D preproprotein
16139 2.1 GI : 158261815 BAF83085.1 unnamed protein product
16159 2.6 GI :47682755 AAH70129.1 ΓΡΙ 1 protein
16193 2.5 GI :662841 AAA62175.1 heat shock protein 27
16246 2.2 GI :60593959 1X71— A Chain A, Crystal Structure Of Siderocal in
16268 2.1 GI :544759 AAB29537.1 bi 1 iverdin-IX beta reductase i sozyme I
16288 2.0 GI : 14042653. BAB55338.1 unnamed protein product
16337 2.0 GI： 119588464 EM68058.1 tetraspanin 18， isoform CRA_a
16432 2.2 GI： 158259341 BAF85629.1 unnamed protein product
16528 2.5 GI： 16549206 BAB70777.1 unnamed protein product
16610 2.9 GI： 178375 AAB46377.1 aldehyde dehydrogenase (ALDH)
16625 5.6 GI : 13489087 NP_109591.1 serine (or cysteine) proteinase inhibi tor , clade B
16629 9.4 GI :4558862 AAD22767 1 A-kinase anchoring protein AKAP350
16640 2.4 GI :21752882 BAC04252 1 unnamed protein product
EAW47735 1 spectrin repeat containing, nuclear
16643 5.3 GI: 119568120
envelope 1
16650 2.3 GI: 119617987 EAW97581 1 hCG2015069 암 줄기 세포와 관련이 있는 것으로 보고된 바 있는 HSP90AB1, ALDH 및 비메틴 (vimentin) 등의 단백질들이 함께 동정됨으로써， 표 1 에 제시된 분비 단백질들이 췌장암 줄기세포 관련 분비 단백질의 가능성이 있음을 시사한다. 웨스턴 블롯 (Western blot)을 통한 췌장암 암줄기세 관련 분비 단백질의 발현검증
MALDI-T0F 분석에 의해 발굴된 췌장암 줄기세포 관련 분비 단백질의 검증을 위해， 상용화된 항체를 사용하여 Hpac 과 Capanl 세포의 접착 및 스피어 배양액에서 웨스턴 블롯을 실시하였다. GLRX3을 포함한 5개의 분비 단백질이 췌장암 세포주 Hpac 또는 Capanl 의 스피어 배양액에서 증가되어 있음을 검증하였다 (도 6). 췌장암세포주에서의 GLRX3 mRNA 및 단백질 발현 확인
AsPC-1, BxPC-3, Capan-1, Capan-2, Cfpac-1, HPAC, Panc-1 및 Miapaca— 2의 8종의 췌장암 세포주 및 HPDE Human Pancreatic Ductal Epithelial cell)에서의 mRNA 및 단백질을 추출하여 GLRX3 발현을 확인하였다, 그 결과， 정상 HPDE에 비해 8종의 췌장암 세포주에서 모두 GLRX3 mRNA이 고발현하는 것을 확인하였다. 또한， 8종의 췌장암 세포주에서 GLRX3 단백질을 발현하고 있으며, 배양액에서의 웨스턴 블럿을 통해 HPAC을 제외한 나머지 췌장암 세포주에서 GLRX3 단백을 세포 외로 분비함을 확인하였다 (도 7). 췌장암 암줄기세포의 특성을 가진 세포 분획에서의 GLRX3 과발현 확인
암줄기세포 마커로 알려진 CD24, CD44 및 ESA로 췌장암 세포주 HPAC을 형광염색 후 3 종류의 마커를 모두 발현하는 세포 (CD24+/CD44+/ESA+)와 상기 마커를 모두 발현하지 않는 세포 (CD24- /CD44-/ESA-)로 췌장암 세포를 분획하였을 때， CD24+/CD44+/ESA+ 분획의 세포가 CD24-/CD44-/ESA- 분획의 세포보다 GLRX3를 과발현하고 있음을 확인하였다ᅳ 이는 다른 췌장암 세포주인 CFPAC— 1에서도 동일한 결과를 확인하였다 (도 8).
또한 상기 암즐기세포 분획은 GLRX3 발현 저해로 인해 변화되는데， 대조군 siRNA에 비해 GLRX3에 대한 siRNA를 처리했을 때 CD24+/CD44+/ESA+ 분획이 70.4%에서 29.3¾>로 감소하는 것을 확인하였다 (도 9).
GLRX3 발현저해세포주 구축 및 특성 분석
GLRX3 발현 저해로 인한 효과를 보기 위해， GLRX3에 대한 shRNA 및 대조군 shRNA를 제작하여 HPAC 세포주에 영구 이입하여 GLRX3 녹 -다운 (k/d) 세포주를 수립하였다. 수립된 GLRX3 k/d 세포주는 대조군에 비해 GLRX3의 mRNA 및 단백질 발현이 현저히 감소해 있음을 확인하였다 (도 10 a). 대조군 및 GLRX3 shRNA에 대한 각각의 세포주에서 두 개 이상의 양성 클론을 골라 그 특성을 규명하였다. 대조군에 비해 GLRX3 k/d 세포 (sh3- G10 및 sh3-H10)에서 증식율이 감소되었음을 확인하였고 (도 10b), 세포의 증식 이동 능력을 동시에 볼 수 있는 세포증식이동 분석 (wound-healing assay) 결과 GLRX3 k/d 세포에서 세포증식이동 능력이 대조군에 비해 저하되어 있음을 확인하였다 (도 10c).
GLRX3 발현저해세포주의 암줄기세포 관련 특성 변화 분석
췌장암 암줄기세포 관련 단백질로 도출된 GLRX3 단백질이었으므로， GLRX3 k/d 으로 인해 유발되는 암줄기세포 관련 특성 변화를 확인하였다. 우선 GLRX3 k/d 세포주 및 대조군 세포주의 스피어 형성 능력을 확인하였다 (도 11a). 그 결과 GLRX3 k/d 세포들은 모두 스피어를 형성하지 못하였다. 반면， 대조군 세포주는 모두 스피어를 잘 형성함을 보여주었다. 이는 스피어 배양 시 GLRX3 발현이 증가했던 결과와 동일 선상의 결과를 보여주는 것이다. 또한， 생존능 및 증식 능력을 보는 집락형성 분석 (clonogenic assay) 결과, GLRX3 k/d 세포들이 대조군 세포들에 비해 적은 수의 콜로니를 형성하였다 (도 lib).
이상의 결과는 GLRX3 이 췌장암 암줄기세포와 관련된 발암관련 마커로서의 가능성 뿐 아니라, GLRX3 저해로 유발되는 여러 암관련 특성 저해로 보아 췌장암 치료제 타겟으로서의 가능성을 보여주고 있다. 인체 췌장암 조직에서의 췌장암 암줄기세포 관련 분비 단백질들의 발현 검증
AGPAT4 의 경우 관찰 가능한 총 29 명의 TMA 슬라이드에서 "++" 15 예와 "+++" 14 예로 췌장암 환자 100%의 췌장암 조직에서 발현되었다 (도 12에서 패널 (A)).
AKR1B1 의 경우 관찰 가능한 총 27 명의 TMA 슬라이드에서 "-" 10예， "+" 15예 및 "++" 2 예로 췌장암 환자 62ᅳ 9%의 췌장암 조직에서 발현되었다 (도 12에서 패널 (B)).
HSP90의 경우 관찰 가능한 총 28 명의 TMA슬라이드에서 "+" 1예 , "++" 19 예 및 "+++" 8 예로 췌장암 환자 100%의 췌장암 조직에서 발현되었다 (도 12에서 패널 (C)).
ALDH 의 경우 관찰 가능한 총 26 명의 TMA슬라이드에서 "-" 4 예，
"+" 8 예, "++" 7 예 및 "+++" 7 예로 췌장암 환자 84.6%의 췌장암 조직에서 발현되었다 (도 12에서 패널 (D)).
MSK2 의 경우 관찰 가능한 총 27 명의 TMA슬라이드에서 "-" 1 여 "+" 5 예, "++" 8 예 및 "+++" 13 예로 췌장암 환자 96.2%의 췌장암 조직에서 발현되었다 (도 12에서 패널 (Ε))·
비멘틴의 경우 세포 외부 인터스티움 (interstitium)에 주로 염색되었다. 염색된 세포들은 관상구조를 이루고 있는 것들이 많았으나， '암세포는 아닌 것으로 추정되었다. 암의 사이토플라즘에는 거의 염색되지 않았다ᅳ 28 예의 췌장암 조직 중 1 예에서 포컬 (focal)염색되었다 (도 12에서 패널 (F))„ GLRX3의 경우 관찰 가능한 총 25 명의 TMA슬라이드에서 "-" 11예， "+" 11 예 및 "++" 4 예로 췌장암 환자 57.6 )의 췌장암 조직에서 발현되었다 (도 12에서 패널 (G)).
췌장암 환자의 수술을 통한 절제조직의 파라핀 절편에서도 면역조직 화학염색을 통하여 췌장암 줄기세포 관련 분비 단백질들의 발현을 검증하였다. 이미 암줄기 세포와 연관이 있는 것으로 보고된 HSP90 과 ALDH, 그리고 본 연구에서 발굴한 GLRX3 를 포함한 7 개의 췌장암 줄기세포 관련 분비 단백질들 모두 정상 췌장 조직에 비해 췌장암 조직에서 강하게 발현되고 있음을 확인할 수 있다 (도 13에서 패널 (A)-(G)). 정상' 만성 췌장염 및 췌장암 환자 혈청에서의 발굴된 분비 단백질들의 발현 검증
발굴된 분비 단백질에 대한 상용화된 ELISA 키트의 부재로， 일부 단백질에 대해 웨스턴 블롯을 통하여 발현 검증을 수행하였다.
정상， 만성 췌장염 및 췌장암 환자의 혈청에서 발굴된 분비 단백질의 발현을 확인하기 위하여 정상 혈청 (normal) 5예， 만성 췌장염 혈청 (chronic pancreatits) 5 예, 췌장암 환자 ¾¾ (pancreatic cancer) 20 예를 선정하였다. 본 연구에서 발굴된 췌장암 줄기세포 관련 분비 단백질들과 기존의 췌장암 마커로 사용되고 있는 CA 19-9 와 CEA 를 비교하기 위하여 선정된 췌장암 환자들 (PC2-PC10)의 혈청 내 CA19-9 및 CEA 의 농도를 도 14a-14b에 나타내었다.
발굴한 분비 단백질의 발현을 웨스턴 블롯을 통해 검증하기에 앞서， 선정된 총 30 예의 혈청들은 MA S(Multiple affinity removal column system)를 사용하여 혈청내의 6 개의 주요 단백질인 알부민， 트란스페린， IgG, IgA, 햅토그로빈 (haptoglobin), 항-트립신 (ant i-trypsin)을 제거한 후， 3 kDa 丽 C0(molecular-mass cut off)을 가진 아미콘 울트라 센트리퓨갈 필터 디바이스를 사용하여 농축하였고， 각 예의 단백질을 동일한 농도로 웨스턴 블롯에 사용하였다.
분비 단백질 중 암 줄기세포와의 연관성이 잘 알려진 비멘틴과 ALDH 의 경우， 정상과 만성 췌장염 환자의 혈청에 비해 췌장암 환자의 혈청에서 많이 발현하는 결과를 보여 주었다. 췌장암 암줄기세포 분비 단백질로 발굴된 GLRX3 역시 정상 혈청에서는 매우 낮게 발현되는 반면， 췌장암 환자 혈청 50% 이상에서 정상 및 만성 췌장염보다 높은 발현을 나타내었다 (도 15a 내지 도 18b). 췌장암환자 혈액에서의 GLRX3 발현 확인
실제 임상환자의 혈액에서 GLRX3 발현을 확인하기 위해 ELISA JSCN GLRX3 ELISA kit)를 수행하였다. 정상 대조군 환자 28명， 만성 췌장염 환자 9명 및 췌장암 환자 57명에 대해 수행한 결과， 췌장암 환자의 혈액에서 GLRX3 발현이 높게 나타나는 것으로 확인 되었다 (도 19a). 특히 수술하지 않고 방사선 치료 혹은 약물치료만 받은 환자 29명 중 GLRX3 레벨이 1800 ng/i 이상인 환자는 생존기간이 155일인 반면， 1800 ng/m£ 이하 환자의 경우 생존기간이 463일로 GLRX3 레벨에 따라 생존기간의 차이를 나타내었다 (도 19b). 검토
암 조직에는 일반 장기처럼 암 조직을 유지하고 재생하는 암 줄기세포가 존재하며, 이것이 암의 발생은 물론 기존의 암 치료법이 적용된 후 줄어든 암세포를 재생하는데 관여함으로써 암의 재발이나 전이에 핵심적인 역할을 한다고 보고된바 있다 (BB Zhou et al . Nat Rev Drug Discov', 8:806-823(2009)). 그리고 암세포는 이종접합 (heterogenous)하며， 이중 일부 세포만이 암 형성 능력을 가지는 종양 개시세포 (tumor initiating cell)로 암 줄기세포라고 알려져 있다. 이들 세포들은 vitro 에서 부유 배양시 스피어를 형성하게 되고， 스피어 배양으로 얻은 세포는 원 세포주에 비해 강력한 암 형성 능력을 가진다고 보고된 바 있으며 (A, Dubrovska et al. Proc Natl Acad Sci USA. , 106:268- 273(2009)), 또한 이들 세포에서는 원 세포주에 비해서 일부 암 및 암 줄기세포 관련 유전자 및 단백질들이 강하게 발현된다고 알려져 있다.
본 연구에서는 췌장암 세포주로부터 형성된 스피어들은 서브- 스피어 (sub-sphere)를 형성하여 줄기세포의 자가 재생 (self renewal)한 특성을 지님을 확인하였고， 암 발생 줄기세포 특성 유지에 관여하는 Notch, Hedgehog 및 wnt 시그널등 잘 알려진 줄기세포 관련 신호체계 (T. Reya et al . Nature, 414: 105-111(2001))가 활성화되어 있었으며 , 발생 초기에 증가하는 것으로 알려져 있으며 줄기세포의 다분화 능력을 나타내는 OCt4 및 /23/20§"유전자의 발현이 증가됨을 확인할 수 있었다. 그 외에도 암 줄기세포의 생존 및 유지에 중요한 역할을 하는 의 발현도 증가되어 있어 즐기세포 관련 이전의 보고들과 일치되는 결과를 보여주었다 (J. Zhou et al. Proc Natl Acad Sci USA., 104：16158-16163(2007)). 유세포 분석을 통하여 Hapc 과 Hpac-스피어의 줄기세포 표지자를 비교한 결과， 스피어에서 CD44, PR0M2, EphA2, CD 130 및 CD271 등 잘 알려진 줄기세포 표지자들과 또는 암의 악성도와 연관된 단백질들을 발현하는 세포수가 증가되어 있음을 알수 있었다.
위의 결과들을 토대로 암 발생과정의 초기 현상으로 인식되는 암 줄기세포의 역할을 연계하고 암 줄기세포의 특성을 갖는 스피어 세포 배양시 분비되는 단백질을 동정 및 검증하기 위하여 프로테오믹스 분석을 수행하였으며， 이를 통하여 췌장암 환자에서 특이적으로 분비되는 단백질에 대한 검증을 하였다ᅳ
프로테오믹스 결과 HSP90, 비멘틴， HSP27 및 ALDH 를 비롯한 AGPAT4, AKR1B1, MSK2 및 GLRX3 등의 분비 단백질들이 동정되었다. 췌장암 조직에서 이들 분비 단백질들의 발현을 확인한 결과 정상 조직에 비해 췌장암 조직에서 현저히 증가되어 있음을 확인하였고， 분비 단백질들의 발현이 췌장암 환자의 혈청에서 정상에 비해 높게 나타나는 결과를 나타내었다。 비록 ELISA 키트의 부재로 웨스턴 블롯에 의해 혈청에서의 발현을 확인하였으나， 본 연구에서 발굴한 분비 단백질의 발현이 췌장암 환자의 혈청에서 증가해 있음을 검증할 수 있었다.
특히 GLRX3 는 췌장암 환자의 혈청에서 증가해 있을 뿐 아니라 GLRX3 발현이 높은 췌장암 환자의 생존기간이 GLRX3 발현이 상대적으로 적은 췌장암 환자의 생존기간보다 낮게 나타나는 현상, GLRX3 발현 저해시 여러 암관련 특성 및 암줄기세포 특성이 감소하는 결과들로 보아 GLRX3는 췌장암 진단 뿐 아니라 치료용 타겟 흑은 예후마커로 활용될 수 있음을 검증하였다. 또한， 여러 암의 치료학적 타겟 (therapeutic target)으로 보고된 HSP90 (L. Whitesell and S.L. Lindquist, Nat Rev Cancer, 5： 761- 772(2005)), 암 줄기세포와 관련된 중간엽의 전이에 대한 상피 (Epithelial to Mesenchymal transition) 마커인 비멘틴 (JM. Lee et al . / Cell Biol. , 172:973-981(2006); PB. Gupta et al. Cell. , 138：645-659(2009)), 암 줄기세포의 특성인 항암제 내성에 관련된 단백질인 HSP27(S. Oesterreich et al. Cancer Res., 53:4443-4448(1993)), 최근에 암 줄기세포 마커로 대두되고 있는 ALDH C. Jauffret et al. Clin Cancer Res. , 16:45- 55(2010)) 등이 함께 동정됨은 본 연구에서 발굴한 분비 단백질들이 암 줄기세포 관련 분비 단백질의 가능성올 시사한다고 보여진다.
췌장암은 5 년 생존율이 1-4%， 중앙생존기간 5 개월에 이르는 치명적인 암으로 인체의 암 중에서 가장 불량한 예후를 보이고， 치료는 주로 항암요법에 의존하고 있으므로 그 어떤 인체암보다도 조기 진단법 개발이 절실히 요망되고 있다.
현재까지 췌장암에 효과가 있다고 알려진 5-플루오로유라실, 젬시타빈， 및 타르세바를 포함한 항암제 치료에 대한 반응율은 15% 내외에 불과하고， 이러한 사실은 췌장암 환자의 예후를 향상시키기 위해서는 보다 효과적인 조기 진단법의 개발이 절실히 요구되고 있음을 시사한다.
따라서 본 연구에서 발굴한 췌장암 줄기세포 연관 분비 단백질에 대한 연구를 지속하여 이를 이용한 새로운 암 조기 진단법의 개발 및 기존의 마커와의 조합을 통하여 보다 더 의미 있는 암 줄기세포를 이용한 진단법의 개발이 가능할 것으로 보여진다. 더 나아가서 새로운 암치료의 표적을 제공하여 암 줄기세포를 이용한 새로운 진단법 및 치료 개발의 근간을 수립하는 것이 가능할 것으로 사료된다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며， 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 참고문헌
1. BB Zhou, et al. Tumour-initiating cells: challenges and opportunities for anticancer drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 8:806-823(2009). 2. A. Dubrovska, et al . , The role of PTEN/Akt/PI3K signaling in the maintenance and viability of prostate cancer stem— like cell populations. Proc Natl Acad Sci USA. 106:268-273(2009).
3. MM Ho, et al., Side populat ion in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stemᅳ like cancer cells. Cancer Res.
67:4827-4833(2007).
4. T eya, et al . , Stem cells, cancer , and cancer stem cells. Nature, 414： 105-111(2001).
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Cancer Stem Cells by High—Throughput Screening. Cell . 138: 645ᅳ 659(2009).
10. S. Oesterreich, et al . , The small heat shock protein hsp27 is correlated with growth and drug resistance in human breast cancer cell lines. Cancer Res. 53:4443-4448(1993).
11. C. Jauf fret , et al . , Aldehyde Dehydrogenase 1-positive cancer stem eel Is mediate metastasis and poor clinical outcome in inflammatory breast cancer, CI in Cancer Res. 16:45—55(2010),
12. Na K, Lee EY, Lee HJ , et al. Human plasma carboxylesterase 1 a novel serologic biomarker candidate for hepatocellular carcinoma.
Proteomics 9:3989-3999(2009).

Claims

【특허청구범위】
【청구항 1]
Genbank 접근번호가 AAH14372.2 인 단백질， Genbank 접근번호가 CAD89908.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 NP_001077415.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 CAI21475.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 NPᅳ 653337.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 CM27309.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 E 66403.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 MQ63403.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 MB34148.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 AAH47896.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 NP_001619.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 2PD5_A 인 단백질， Genbank 접근번호가 MF72885.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 ΝΡ_653280·1 인 단백질， Genbank 접근번호가 BAF83085.1 인 단.백질， Genbank 접근번호가 AAH70129.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 1X71_A 인 단백질， Genbank 접근번호가 BAB55338.1 인 단백질 Genbank 접근번호가 EAW68058.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 BAF85629.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 BAB70777.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 NP_109591.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 AAD22767.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 BAC04252.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 EAW47735.1 인 단백질 및 Genbank 접근번호가 EAW97581.1 인 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질에 각각 특이적으로 결합하는 ( i ) 을리고펩타이드， 모노클로날 항체， 폴리클로날 항체， 키메릭 (chimeric) 항체 , 리간드， PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머 (aptamer), 또는 ( ii ) 상기 각각의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 췌장암 암줄기세포 마커 검출용 키트ᅳ
【청구항 2]
Genbank 접근번호가 AAH14372.2 인 단백질， Genbank 접근번호가 CAD89908.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_001077415.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 CAI21475.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 NP_653337.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 CAA27309.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 EAW66403.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 MQ63403.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 MB34148.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 AAH47896.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_001619.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 2PD5_A 인 단백질， Genbank 접근번호가 MF72885.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_653280.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 BAF83085.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 AAH70129.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 1X71_A 인 단백질， Genbank 접근번호가 BAB55338.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 EAW68058.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 BAF85629.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 BAB70777.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 NP_109591.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 AAD22767.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 BAC04252.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 EAW47735.1 인 단백질 및 Genbank 접근번호가 E 97581.1 인 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질에 각각 특이적으로 결합하는 ( i ) 올리고펩타이드， 모노클로날 항체， 폴리클로날 항체， 키메릭 (chimeric) 항체， 리간드， PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머 (aptamer)， 또는 (ii) 상기 각각의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 췌장암 진단 또는 예후 분석용 키트.
【청구항 3】
제 1 항 또는 게 2 항에 있어서, 상기 키트는 면역분석 (immunoassay)용 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
【청구항 4]
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 키트는 루미넥스 분석 키트， 단백질 마이크로어레이 키트 또는 ELISA 키트인 것을 특징으로 하는 키트ᅳ
【청구항 5]
인간의 생물학적 시료에 있는 Genbank 접근번호가 AAH14372.2 인 단백질, Genbank 접근번호가 CAD89908.1 인 단백질 Genbank 접근번호가 NP_001077415.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 CAI21475.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 NP_653337.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 CAA27309.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 EAW66403.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 MQ63403.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 AAB34148.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 AAH47896.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 NP_001619„1 인 단백질， Genbank 접근번호가 2PD5_A 인 단백질, Genbank 접근번호가 AAF72885.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 NP— 653280.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 BAF83085.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 AAH70129.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 1X71_A 인 단백질， Genbank 접근번호가 BAB55338.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 EAW68058.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 BAF85629.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 BAB70777.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_109591.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 AAD22767.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 BAC04252.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 EAM7735.1 인 단백질 및 Genbank 접근번호가 EAW97581.1 인 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이의 단백질을 각각 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 검출하는 단계를 통해 췌장암 암줄기세포의 검출 방법.
【청구항 6】
인간의 생물학적 시료에 있는 Genbank 접근번호가 MH14372.2 인 단백질， Genbank 접근번호가 CAD89908.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 NP_001077415„1 인 단백질, Genbank 접근번호가 CAI21475.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 NP_653337,1 인 단백질， Genbank 접근번호가 CAA27309.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 E 66403.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 MQ63403.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 AAB34148.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 MH47896.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 NP_001619.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 2PD5ᅳ A 인 단백질， Genbank 접근번호가 AAF72885.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_653280.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 BAF83085.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 AAH70129.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 1X71_A 인 단백질， Genbank 접근번호가 BAB55338.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 E 68058.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 BAF85629.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 BAB70777.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_109591.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 MD22767.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 BAC04252.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 EAW47735.1 인 단백질 및 Genbank 접근번호가 EAW97581.1 인 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이의 단백질을 각각 코딩하는 폴리뉴클레오타이드을 검출하는 단계를 포함하는 췌장암 진단 방법 .
【청구항 7】
제 5 항 또는 제 6 항에 있어서， 상기 방법은 항원 -항체 반웅 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 8】
제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액 또는 혈청인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 9】
다음의 단계를 포함하는 췌장암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법:
(a) Genbank 접근번호가 AAH14372.2 인 단백질 Genbank 접근번호가 CAD89908.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_001077415„ 1 인 단백질， Genbank 접근번호가 CAI21475.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 NP_653337.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 CAA27309.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 EAW66403.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 AAQ63403.1 인 단백질ᅳ Genbank 접근번호가 AAB34148.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 AAH47896.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 NP_001619.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 2PD5_A 인 단백질， Genbank 접근번호가 AAF72885JL 인 단백질， Genbank 접근번호가 NP_653280.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 BAF83085.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 AAH70129,1 인 단백질, Genbank 접근번호가 1X71_A 인 단백질, Genbank 접근번호가 BAB55338.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 EAW68058.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 BAF85629.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 BAB70777.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_109591.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 MD22767.1 인 단백질， Genbank 접근번호가 BAC04252.1 인 단백질, Genbank 접근번호가 EAW47735.1 인 단백질 및 Genbank 접근번호가 EAW97581.1 인 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는 세포 또는 조직에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계 ; 및
(b) 상기 단계 (a)에서의 하나 이상의 단백질 또는 이들을 코딩하는 각각의 폴리뉴클레오타이드의 발현량을 측정하는 단계로서， 상기 하나 이상의 단백질 또는 이들을 코딩하는 각각의 폴리뉴클레오타이드의 고발현을 감소시키는 경우에는 상기 시료는 췌장암의 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.
【청구항 10】
GLRX3(Glutaredoxin-3)의 활성 억제제 또는 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방또는 치료용 약제학적 조성물.
【청구항 11]
제 10 항에 있어서， 상기 암은 암줄기세포에 의한 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 12】
제 10 항에 있어서， 상기 암은 췌장암인 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 13】
제 10 항에 있어서， 상기 유효성분은 GLRX3 유전자에 상보적인 서열을 포함하는 siRNA또는 shRNA인 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 14]
GLRX3(Glutaredoxin-3)의 활성 또는 발현을 억제하는 단계를 포함하는 암 세포의 증식 억제 방법 .
【청구항 15]
제 14 항에 있어서， 상기 암 세포는 암줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 16]
GLRX3(Glutaredoxin-3)의 활성 억제제 또는 발현 억제제의 약제학적 유효량을 대상 (subject)에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법.
【청구항 17】
제 16 항에 있어서 , 상기 암은 췌장암인 것을 특징으로 하는 방법 .
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