JP2018506278A - デルタ１３３ｐ５３ベータおよびデルタ１３３ｐ５３ガンマアイソフォームはがん幹細胞のバイオマーカーである - Google Patents

デルタ１３３ｐ５３ベータおよびデルタ１３３ｐ５３ガンマアイソフォームはがん幹細胞のバイオマーカーである Download PDF

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Abstract

本発明は、腫瘍学の分野、より詳細にはがん幹細胞の分野に属する。本発明は、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の過剰発現に基づくがん幹細胞を産生するための方法；化学療法抗がん剤を用いた処置が、がん罹患対象においてがん幹細胞を誘導するリスクを、前記対象のがん試料から予測するための方法であって、化学療法抗がん処置後のΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の増加の検出に基づく方法；化学療法抗がん剤と、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を減少させる薬剤との組み合わせの治療的使用；ならびに、抗がん幹細胞剤をスクリーニングするための方法に関する。

Description

本発明は、腫瘍学の分野、より詳細には、がん幹細胞の分野に属する。本発明は、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の過剰発現に基づくがん幹細胞を産生するための方法；化学療法抗がん剤を用いた処置が、がん罹患対象においてがん幹細胞を誘導するリスクを、前記対象のがん試料から予測するための方法であって、化学療法抗がん処置後のΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の増加の検出に基づく方法；化学療法抗がん剤と、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を減少させる薬剤との組み合わせの治療的使用；ならびに、抗がん幹細胞剤をスクリーニングするための方法に関する。
がん幹細胞（ＣＳＣ）は、自己再生を通じて永続化する能力および原腫瘍で見られる全ての別個の細胞型を生成する能力を有するがん細胞である。ＣＳＣは、通常、悪性腫瘍内のごく一部の細胞である。しかしながら、その自己再生能力および非対称分裂により、ＣＳＣは、無制限の腫瘍再生、不均一性、および標準的処置に対する耐性の源となると考えられる。
ＣＳＣ根絶は、ヒトにおける多くの種類のがんの最終的治癒のために必要と考えられることから、ＣＳＣの生物学をさらに理解することは非常に重要である。しかしながら、がん組織におけるＣＳＣの量は少ないために、研究が難しい。したがって、さらなる研究のために、十分な数のＣＳＣを生成するための方法が必要である。
腫瘍抑制因子ｐ５３は、主に遺伝子発現の調節を通じてその機能を発揮し、「ゲノムの守護者（ｇｕａｒｄｉａｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ）」となると提唱された（Lane, 1992）。しかしながら、ｐ５３の機能は、そのシグナル伝達経路の変異／混乱によって、がん細胞において偏在的に変化し、ｐ５３の活性の喪失は、がん発生の必要条件となっている。変異型ｐ５３は、浸潤の促進、がん細胞の原発腫瘍部位からの脱出および伝播の支持、最終的には転移形成の先導において決定的な役割を担っていると考えられている（Gadeaら, 2007a, b; Mullerら, 2009; Rogerら, 2010; Vinotら, 2008）。
最近の報告において、幹細胞の恒常性および多能性におけるｐ５３の役割が記録された。野生型（ｗｔ）ｐ５３は、体細胞の再プログラミングに対抗するが（Hongら, 2009; Kawamuraら, 2009; Liuら, 2009; Utikalら, 2009）、一方で変異型ｐ５３は、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の形成を刺激する（Sarigら, 2010）。最近のゲノムワイド研究により、ｐ５３が、マウスＥＳ細胞におけるおよそ３６００個の遺伝子を制御していることが実証された（Liら, 2012）。正に制御された遺伝子の群（約２０００個）では、細胞分化を担う遺伝子が濃縮されており、一方、負に制御された群（約１６００遺伝子）は、主にＥＳ細胞状態の維持に関与している。ｐ５３は、幹細胞表現型の重要な制御因子、例えばＯｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃ（Yamanaka factors, Liら, 2012）を抑制する。ＥＳ細胞におけるｐ５３シグナル伝達経路のストレス誘導活性化は、アポトーシスおよび細胞死よりも細胞分化につながる（Zhao and Xu, 2010）。したがってｐ５３は、ｐ２１シグナル伝達経路を通じて細胞の再プログラミングを妨害する（Hongら, 2009）。ｐ５３の枯渇は、細胞の再プログラミング効率を顕著に増加させ、Ｙａｍａｎａｋａカクテルの２つの因子のみ（ＳＯＸ２およびＯＣＴ３／４）を使用したｉＰＳ細胞再生を容易にする（Kawamuraら, 2009）。結論的に、ｐ５３は、ゲノムの守護者であるだけでなく、再プログラミングの守護者でもあると考えることができる。
これらの機能は全て、全長ｐ５３（つまり、ＴＡｐ５３αアイソフォーム）と関連している。しかしながら、ＴＰ５３遺伝子は、いくつかの機構、つまり選択的プロモーターの使用（ＴＡおよびΔ１３３アイソフォーム）、選択的イントロンスプライシング（イントロン２：Δ４０アイソフォームおよびイントロン９：α、βおよびγアイソフォーム）、ならびに選択的翻訳開始部位（Δ４０アイソフォームおよびΔ１６０アイソフォーム）を介して、少なくとも１２の様々な生理学的アイソフォーム［ＴＡｐ５３（α、βおよびγ）、Δ４０ｐ５３（α、βおよびγ）、Δ１３３ｐ５３（α、βおよびγ）ならびにΔ１６０ｐ５３（α、βおよびγ）］（Bourdon, 2007）をコードしている。ＴＡｐ５３のアイソフォームα、βおよびγ、Δ４０ｐ５３、およびΔ１３３ｐ５３の特徴をまとめた模式図を、図１Ａに示す。ＴＡｐ５３αアイソフォームは、最もよく記述され、古典的に文献においてｐ５３として言及されている。基本的に、ｐ５３アイソフォームは、トランス活性化ドメイン（ＴＡおよびΔ４０）を含む長いアイソフォームと、トランス活性化ドメインがない（Δ１３３およびΔ１６０）短いアイソフォームとの２つのグループに分けることができる。さらに、βおよびγアイソフォームは、古典的Ｃ末端オリゴマー化ドメインを含まないが、今日まで機能の知られていないさらなるドメインを含んでいる（Khoury and Bourdon, 2011）。
いくつかの臨床研究により、ｐ５３アイソフォームが、多くのヒトがん型において異常に発現していることが報告されている（Avery-Kiejdaら, 2014; Boldrupら, 2007; Bourdonら, 2005; Bourdonら, 2011; Hofstetterら, 2012）。ｐ５３アイソフォームの差次的発現は、ｐ５３腫瘍抑制因子の活性に影響を与えうるので、それらの発現の調節解除は、野生型ｐ５３を発現するがんの腫瘍形成に寄与しうる。例えば、Ｎ末端切断型アイソフォームΔ４０ｐ５３およびΔ１３３ｐ５３は、その標的遺伝子のトランス活性化を阻害することにより、およびｐ５３依存性増殖抑制を妨げることにより、野生型ｐ５３に対してドミナントネガティブ作用を奏する（Bourdonら, 2005; Davidsonら; Fujitaら, 2009）。さらに、Δ４０ｐ５３は、ｐ５３シグナル伝達を再配向することにより転写を調節することができる（Hafsiら, 2013; Takahashiら, 2014）。ｐ５３とそのＮ末端アイソフォームとの間の相互作用に対するこれらの結果は全て、特定の条件で、これらのアイソフォームが、ｐ５３活性の基礎レベルを上昇または低下させ、したがって、内因性または外因性刺激に対するｐ５３依存性応答の閾値の設定に寄与しうることを示唆する。
ＷＯ２００９／０２９０５４は、ｐ５３の発現または活性を調節する少なくとも１つのｐ５３アイソフォーム発現の減少または阻害、特に、全長ｐ５３のドミナントネガティブ制御因子として作用すると考えられるＮ末端切断型Δ１１３ｐ５３またはΔ１３３ｐ５３アイソフォームの発現の減少または阻害により、がんを処置または予防することを示唆している。Δ１１３ｐ５３およびΔ１３３ｐ５３アイソフォームの両方が言及されているが、データは、Δ１１３ｐ５３についてしか示されていない。さらに、ｐ５３の３つのΔ１３３アイソフォームの中でも、ＷＯ２００９／０２９０５４は、Δ１３３ｐ５３（Δ１３３ｐ５３αとも称される）の使用のみを示唆し、Δ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γのアイソフォームは示唆していない。
ＷＯ２０１１／０００８９１は、がん細胞におけるアイソフォームΔ１３３ｐ５３βの発現が、がん転移のリスク増加のマーカーであると記載している。これに基づき、本出願は、対象のがん試料におけるΔ１３３ｐ５３α（Δ１３３ｐ５３とも称される）、Δ１３３ｐ５３βまたはΔ１３３ｐ５３γの発現レベルの決定に基づいて、前記対象におけるがんの攻撃性を測定すること、および抗がん治療に対する前記対象の応答性を決定することを提唱する。抗がん治療に対する対象の応答性を決定する方法は、転移性がんを有する患者が、従来の抗がん治療に対してポジティブに応答しないことがよくあるという事実に基づく。ＷＯ２０１１／０００８９１は、さらに、Δ１３３ｐ５３α（Δ１３３ｐ５３とも称する）、Δ１３３ｐ５３βまたはΔ１３３ｐ５３γを発現する細胞において、Δ１３３ｐ５３α（Δ１３３ｐ５３とも称される）、Δ１３３ｐ５３βまたはΔ１３３ｐ５３γの発現レベルを低下させる試験化合物の能力に基づいて、潜在的な抗転移化合物をスクリーニングすることを提唱している。ＷＯ２０１１／０００８９１を参照すると、Δ１３３ｐ５３α、Δ１３３ｐ５３βまたはΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの少なくとも１つの発現の検出が転移性がんのリスクの指標となることは明らかにみえる。さらに、これらのアイソフォームが、細胞運動性の増大により細胞浸潤に関与しうることが示唆される。しかしながら、この文献は、前記細胞浸潤が、がん幹細胞の産生と関連することは示唆していない。
この点に関し、浸潤は転移にとって必要であるものの、がん幹細胞の産生と同義ではないことを明確にしておく必要がある。特に、浸潤とがん幹細胞はいずれも転移に関与するが、このことは、これらの２つの概念が同等であることを意味していない。
このことは、浸潤に関連することが知られている一部の遺伝子は、細胞を多能性に向けて再プログラミングするために有用であることが知られる転写因子、例えばＳｏｘ２、Ｏｃｔ３／４およびＮａｎｏｇの先行または同時の過剰発現誘導がなければ、特に単独で、がん幹細胞を生成することができないという事実によって説明される。
例えば、上で説明したように、ＷＯ２０１１／０００８９１は、Δ１３３ｐ５３α、Δ１３３ｐ５３βまたはΔ１３３ｐ５３γアイソフォームが、細胞運動性を増強することによって、細胞浸潤に関与しうることを示唆している。同様に、Bernardら, 2013も、特にΔ１３３ｐ５３αおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームが、血管形成を刺激し、それにより浸潤に関与するが、Δ１３３ｐ５３βはそうではないことを示唆している。一方、ＷＯ２０１２／０４４９７９は、Δ１３３ｐ５３（Δ１３３ｐ５３αとも称される）が、別の再プログラミング因子、例えばＯＣＴ４、ＳＯＸ２またはｃ−ｍｙｃなどと共発現するときにのみ、がん幹細胞の産生に使用されうることを示唆している。さらに、本発明者らは、Δ１３３ｐ５３αが、再プログラミング因子、例えばＯＣＴ４、ＳＯＸ２またはｃ−ｍｙｃが存在しないときに、実際上、がん幹細胞を生成できないことを見出した。
先行技術において、多能性に向けて細胞を再プログラミングするために有用であることが知られる転写因子、例えばＳｏｘ２、Ｏｃｔ３／４およびＮａｎｏｇの過剰発現が、がん細胞などの細胞を多能性に向けて再プログラミングするための必要な条件とみなされると一般に考えられていたことに留意すべきである。
それゆえ、先行技術において多くの遺伝子が浸潤および転移に関与しているとして開示されているものの、このことは、細胞を多能性に向かわせる再プログラミングに有用であることが知られる転写因子、例えばＳｏｘ２、Ｏｃｔ３／４およびＮａｎｏｇの先行または同時の過剰発現誘導なしにがん細胞を多能性に向けて再プログラムすることができる遺伝子、したがってがん幹細胞を生成することができる遺伝子を当業者が特定することに役立つものではない。
本発明の内容において、本発明者らは、Δ１３３ｐ５３αアイソフォーム（Δ１３３ｐ５３アイソフォームとも称される）でなく、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム（さらに程度は低いがΔ１３３ｐ５３γ）が、がん転移のリスクのマーカーであるだけでなく、実際にがん幹細胞表現型を促進することを見出した。特に、Δ１３３ｐ５３αアイソフォーム（Δ１３３ｐ５３アイソフォームとも称される）の発現でなく、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム（さらに程度は低いがΔ１３３ｐ５３γ）の発現が、がん細胞のスフェア形成活性を促進し、さらに、細胞を多能性に向けて再プログラミングするために有用であることが知られる転写因子Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４およびＮａｎｏｇ（ｃ−Ｍｙｃは除く）の発現を促進する。
この知見は、全ての転移リスクのマーカーが、がん幹細胞の発生に関与していないことから、予測されなかったことである。例えば、ＷＯ２０１１／０００８９１は、試験した患者が転移性がんを発症するリスクがあるかを決定するために、Δ１３３ｐ５３αアイソフォームの存在を検出することを示唆している。さらに他の著者（Bernardら, 2013）も、Δ１３３ｐ５３αアイソフォームが血管新生を刺激することができ、そのようにがん細胞浸潤に関与していることを示唆している。しかしながら、本発明において、本発明者らは、Δ１３３ｐ５３αアイソフォームが、がん幹細胞の発生を誘導することができないことを実証した。実際、ＣＳＣと転移発生とが密接に関連していることを示唆する証拠は増加しているものの、転移発生におけるＣＳＣの正確な役割に関する多くの問いが未解決なままである。
本発明者らによる上記知見は、多数のＣＳＣを製造する手段を提供し、したがって抗がん治療の改善のための決定的ポイントとなるＣＳＣの生物学の研究およびさらなる理解を可能にするものであるから、非常に重要である。
そのように、第１の態様では、本発明は、がん幹細胞を産生するための方法であって、
ａ）がん細胞に、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方を発現するベクターを形質導入することと、
ｂ）形質導入されたがん細胞を、形質導入されたがん細胞の増殖を補助する培地中で培養することと、
ｃ）がん幹細胞を単離することと
を含む方法に関する。
さらに本発明者らは、驚くべきことに、エトポシド（トポイソメラーゼＩＩ阻害剤）によるがん細胞の抗がん処置が、効率的でないだけでなく、幹細胞に特別に発現する転写因子、例えばＯｃｔ３／４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２の発現レベルをそれ自体増加させるΔ１３３ｐ５３βの発現レベルを増加させることによって、がん幹細胞性を促進させうることを見出した。結果として、がん患者をエトポシドで処置することは、ＣＳＣ形成を促進し、有用であるよりも、むしろ有害となりうる。
したがって、本発明は、化学療法抗がん剤を用いた処置が、がん罹患対象においてがん幹細胞を誘導するリスクを、前記対象のがん試料から予測するための方法であって、
ａ）化学療法抗がん剤で未処置の前記がん試料におけるΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することと、
ｂ）前記がん試料を前記化学療法抗がん剤で処置することと、
ｃ）既処置がん試料におけるΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することと、
ｄ）ステップａ）およびｃ）で取得した値を比較することと、
ｅ）（ｉ）ステップｃ）で測定されるΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、もしくはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルが、ステップａ）で測定されるΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、もしくはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルより高い場合には、前記化学療法抗がん剤を用いた処置が前記対象においてがん幹細胞を誘導する重大なリスクがある、または
（ｉｉ）ステップｃ）で測定されるΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、もしくはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルが、ステップａ）で測定されるΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、もしくはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルより低いもしくは同等である場合には、前記化学療法抗がん剤を用いた処置が前記対象においてがん幹細胞を誘導する重大なリスクはないと結論付けることと
を含む方法にさらに関する。
エトポシド（トポイソメラーゼＩＩ阻害剤）によるがん細胞による抗がん処置が、効率的でない（処置に耐性である）だけでなく、Δ１３３ｐ５３βの発現レベルを増加させることによって、がん幹細胞性を促進させうるという本発明者らの同じ知見に基づき、本発明は、がん罹患対象においてがんの処置に使用するための化学療法抗がん剤であって、Δ１３３ｐ５３βまたはΔ１３３ｐ５３γアイソフォーム発現を減少させる薬剤と組み合わせて前記対象に投与される化学療法抗がん剤にも関する。
同様に、本発明は、がん罹患対象におけるがんを処置するための方法であって、
ａ）治療有効量の、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を減少させる薬剤を、前記対象に投与することと、
ｂ）前記対象に治療有効量の化学療法抗がん処置を投与することと
を含む方法にも関する。
本発明者らにより得られた結果は、Δ１３３ｐ５３βまたはΔ１３３ｐ５３γアイソフォーム発現が、特に転写因子Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４およびＮａｎｏｇの発現を上方制御することにより、がん幹細胞潜在能力を促進させることを示し、Δ１３３ｐ５３βまたはΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの発現が、がん細胞をがん幹細胞へ向かわせる再プログラミングの初期事象でありえ、他のがん幹細胞の特徴の検出に加えてΔ１３３ｐ５３βまたはΔ１３３ｐ５３γアイソフォーム発現を検出することが、がん罹患対象におけるがん転移のリスク予測の信頼性を向上させうることを示唆する。
したがって、本発明はさらに、がん罹患対象におけるがん転移のリスクを、前記対象のがん試料から予測するための方法であって、
ａ）前記がん試料においてΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方を発現するスフェア形成がん細胞を検出することと、
ｂ）Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方を発現するスフェア形成がん細胞が検出される場合には、前記対象においてがん転移の重大なリスクがあり、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方を発現するスフェア形成がん細胞が検出されない場合には、前記対象においてがん転移の重大なリスクはないと結論付けることと
を含む方法にも関する。
がん幹細胞潜在能力を高めるΔ１３３ｐ５３βまたはΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの発現は、ほとんどのがん細胞を成功裡に消滅させた後の既処置がん対象におけるがん再発のリスクを予測するためにも使用することができる。
したがって、本発明はさらに、既処置がん対象におけるがん再発のリスクを、前記対象の細胞試料から予測するための方法であって、
ａ）Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を検出することと、
ｂ）Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現が検出された場合には、前記対象においてがん再発の重大なリスクがあり、Δ１３３ｐ５３βアイソフォームの発現またはΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの発現のいずれも検出されない場合には、前記対象においてがん再発の重大なリスクはないと結論付けることと
を含む方法に関する。
Δ１３３ｐ５３βまたはΔ１３３ｐ５３γアイソフォーム発現が、特に、転写因子Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４およびＮａｎｏｇの発現を上方制御することによりがん幹細胞潜在能力を促進し、Δ１３３ｐ５３βまたはΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの発現が、がん細胞をがん幹細胞へ向かわせる再プログラミングの初期事象でありうることが示唆されるという同じ知見に基づき、本発明はさらに、潜在的な抗がん幹細胞化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方を発現するスフェア形成がん幹細胞を用意することと、
ｂ）前記がん幹細胞を、試験化合物と接触させること、
ｃ）処理された細胞における前記Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、もしくはΔ１３３ｐ５３βアイソフォームおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルならびに／または処理された細胞のスフェア形成能力をｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することと、
ｄ）処理された細胞における前記Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、もしくはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルが試験化合物を用いた処理の前よりも低い場合ならびに／または処理された細胞のスフェア形成能力が、試験化合物を用いた処理の前よりも低い場合には、前記試験化合物を、潜在的な抗がん幹細胞化合物として選択することと
を含む方法に関する。
図１は、ｐ５３アイソフォームの選択的枯渇は、ＭＣＦ−７細胞のスフェア形成能力に影響を与えることを示す図である。Ａ．本研究で使用される様々なｓｈＲＮＡ（Ｓｈ）の標的を有するｐ５３アイソフォームの模式図。様々なアイソフォームの計算された分子量を示す。ＴＡ：トランス活性化ドメイン；５’ＵＴＲ：５’非翻訳領域；ＤＢＤ：ＤＮＡ結合ドメイン；ＮＬＳ：核局在化配列；ＯＤ：オリゴマー化ドメイン。 Ｂ．ＭＣＦ−７細胞におけるＳｈ１、Ｓｈ２、Ｓｈ３、Ｓｈ４およびＳｈ５の形質導入後のマンモスフェア（Ｍａｍｍｏｓｐｈｅｒｅ）定量（ｎ＝３）。Ｃ、Ｄ．対応する細胞におけるｐ５３アイソフォーム枯渇のウェスタンブロット解析。 Ｅ．対応する細胞におけるｐ５３アイソフォーム枯渇のウェスタンブロット解析。Ｆ．およびＧ．Ｓｈ１およびＳｈ２の形質導入後のｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４およびＮａｎｏｇ（Ｆ）ならびにΔ１３３ｐ５３（α、βおよびγ）およびｐ５３βアイソフォーム（ｐ５３ＴＡβ、Δ４０ｐ５３β、Δ１３３ｐ５３βおよびΔ１６０ｐ５３β）（Ｇ）の発現レベルのＲＴ−ｑＰＣＲ定量（ｎ＝４）。 図２は、ｐ５３アイソフォームレベルの変化後の重要な多能性／再プログラミング遺伝子発現の解析を示す図である。Ａ．Ｓｈ１、Ｓｈ２、Ｓｈ３または／およびＳｈ４を用いたｐ５３アイソフォーム枯渇後および対照細胞での重要な多能性／再プログラミング因子（ｃ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２およびＯｃｔ３／４）の発現のウェスタンブロット解析。ＢおよびＣ．Ｓｈ６（ｎ＝３）を用いてｐ５３ノックダウンしたＭＣＦ−７細胞におけるマンモスフェア定量（Ｂ）および対応する細胞におけるｐ５３枯渇のウェスタンブロット解析（Ｃ）。 Ｄ．Δ１３３ｐ５３アイソフォームがＳｈ３を使用してノックダウンされたＳＷ４８０結腸癌腫細胞におけるコロスフェア（Ｃｏｌｏｓｐｈｅｒｅ）形成。 図３は、Δ１３３ｐ５３βは、ＭＣＦ−７細胞におけるがん幹細胞潜在能力を促進することを示す図である。ＡおよびＢ．Ｓｈ２（ＴＡおよびΔ４０アイソフォームに対するｓｈＲＮＡ）またはＳｈ２およびＳｈ６（αアイソフォームの３’端に対する）を用いたサイレンシング後のＭＣＦ−７細胞におけるマンモスフェア定量（Ａ）および対応する細胞培養物におけるｐ５３枯渇を確認するためのウェスタンブロット解析（Ｂ）（ｎ＝３）。Ｃ．Ｓｈ Ｌｕｃ（対照）、Ｓｈ２またはＳｈ２＋６を形質導入されたＭＣＦ−７におけるＣＤ２４およびＣＤ４４の二重標識に対する代表的ＦＡＣＳドットブロット。Ｄ．Δ１３３ｐ５３βまたはγの過剰発現後のＭＣＦ−７細胞におけるマンモスフェア定量（Ｄ）。 Ｅ．Δ１３３ｐ５３βまたはγの過剰発現後のＭＣＦ−７細胞におけるｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４およびＮａｎｏｇ（Ｅ）発現のＲＴ−ｑＰＣＲ解析（ｎ＝４）。Ｆ．原発性マンモスフェアの採取および再播種後のΔ１３３ｐ５３βを過剰発現しているＭＣＦ−７細胞におけるマンモスフェア定量。Ｇ．全てのｐ５３アイソフォームがＳｈ１でサイレンシングされたＭＣＦ−７細胞、および同じ細胞のＳｈ１耐性Δ１３３ｐ５３βの発現後におけるマンモスフェア定量（ｎ＝３）。 ＭＣＦ−７細胞における形質導入されたｐ５３アイソフォームのウェスタンブロット解析（Ｓａｐｕ抗体）を示す図である。 図５は、Ｃ３ＬＮＤ細胞株の誘導体化および特徴付けを示す図である。Ａ．ＭＤＡ−ＭＢ２３１ Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞株を起源とする高転移Ｃ３ＬＮＤサブクローンの誘導に使用されるアプローチの模式図である。Ｂ．ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞を起源とするＣ３ＬＮＤ単離で取得される部分クローンの主要な発がん性特徴。ＬＮ：リンパ節；Ａｘ／Ｂｒ：腋窩／鰓弓。Ｃ．原発腫瘍成長の定量（各群および時間点に対してｎ＝５）。Ｄ．腫瘍成長の間の生物発光の定量（各群および時間点に対してｎ＝５）。 Ｅ．Δ１３３ｐ５３βアイソフォームの過剰発現後のＣ３ＬＮＤ細胞におけるｃ−Ｍｙｃ、Ｏｃｔ３／４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２発現のＲＴ−ｑＰＣＲ解析（ｎ＝３）。Ｆ．ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ Ｃ３ＬＮＤにＳｈ３を形質導入した場合のｐ５３アイソフォームのウェスタンブロット解析。Ｇ．発光の定量（各群および時間点に対してｎ＝２）。 図６は、ＭＤＡ−ＭＢ２３１ Ｄ３Ｈ２ＬＮおよびＣ３ＬＮＤ細胞株のがん幹細胞特徴の評価を示す図である。Ａ．中程度の転移性、親ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ Ｄ３Ｈ２ＬＮ、および誘導された高転移性Ｃ３ＬＮＤ細胞株におけるマンモスフェア定量（ｎ＝３）。Ｂ．ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ Ｄ３Ｈ２ＬＮおよびＣ３ＬＮＤ細胞におけるΔ１３３ｐ５３（α、βおよびγ）アイソフォーム発現のＲＴ−ｑＰＣＲ解析（ｎ＝４）。Ｃ．ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ Ｄ３Ｈ２ＬＮおよびＣ３ＬＮＤ細胞におけるｃ−Ｍｙｃ、Ｏｃｔ３／４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２発現のＲＴ−ｑＰＣＲ定量（ｎ＝４）。Ｄ．ＭＤＡ−ＭＢ２３１ Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞に形質導入されたΔ１３３ｐ５３−Ｆｌａｇ（Ｆｌａｇ抗体）のウェスタンブロット解析。Ｅ．Δ１３３ｐ５３β過剰発現後のＭＤＡ−ＭＢ−２３１ Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞におけるｃ−Ｍｙｃ、Ｏｃｔ３／４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２発現のＲＴ−ｑＰＣＲ解析（ｎ＝４）。Ｆ．Δ１３３ｐ５３βを過剰発現しているＭＤＡ−ＭＢ−２３１ Ｄ３Ｈ２ＬＮ．細胞におけるマンモスフェア定量。Ｇ．Ｓｈ３を形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１ Ｃ３ＬＮＤにおけるマンモスフェア定量（ｎ＝３）。Ｈ．Ｓｈ３を形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１ Ｃ３ＬＮＤにおけるΔ１３３ｐ５３（α、βおよびγ）アイソフォーム発現のＲＴ−ｑＰＣＲ解析。 Ｉ．Ｓｈ３を形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１ Ｃ３ＬＮＤ細胞におけるｃ−Ｍｙｃ、Ｏｃｔ３／４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２発現のＲＴ−ｑＰＣＲ定量（ｎ＝４）。Ｊ．Ｓｈ Ｌｕｃ（対照）またはＳｈ３を形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１ Ｃ３ＬＮＤにおけるＣＤ４４およびＣＤ２４の二重標識に対する代表的ＦＡＣＳドットブロット。Ｋ．移植２５日後の生物発光画像（ｎ＝７／５）を使用した脳および大腿部における遠隔転移の定量。 図７は、ＭＣＦ−７乳がん細胞の化学療法処置は、Δ１３３ｐ５３アイソフォーム発現を上方制御し、重要な多能性遺伝子を活性化させることを示す図である。Ａ．エトポシドの用量を増加させながら１６時間処置した後のＭＣＦ−７細胞におけるｐ５３、ｐ２１およびｃ−Ｍｙｃ発現のウェスタンブロット解析（ＤＯ１抗体）。Ｂ．エトポシドの用量を増加させながら処置したＭＣＦ−７細胞におけるｃ−Ｍｙｃ発現のＲＴ−ｑＰＣＲ解析（ｎ＝４）。Ｃ．エトポシド処理後のＭＣＦ−７細胞におけるΔ１３３ｐ５３（α、βおよびγ）アイソフォーム発現のＲＴ−ｑＰＣＲ解析（ｎ＝４）。Ｄ．エトポシド処理後のＭＣＦ−７細胞におけるｐ５３アイソフォーム発現のウェスタンブロット解析。（Ｓａｐｕ抗体）。 Ｅ．エトポシドの用量を増加させながら処理したＭＣＦ−７細胞におけるＳｏｘ２、Ｏｃｔ３／４およびＮａｎｏｇ発現のＲＴ−ｑＰＣＲ解析（ｎ＝４）。Ｆ．対照および、Ｓｈ３を形質導入し、エトポシド処理したＭＣＦ−７細胞におけるΔ１３３ｐ５３（α、βおよびγ）、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４およびＮａｎｏｇ発現のＲＴ−ｑＰＣＲ解析（ｎ＝４）。 Ｇ．Ｓｈ２を形質導入し、５０ｎｇ／ｍｌ／日のエトポシドで７日間処理したＭＣＦ−７細胞におけるマンモスフェア定量（ｎ＝３）。ＨおよびＩ．Ｓｈ２を形質導入し、５０ｎｇ／ｍｌ／日のエトポシドで７日間処置したＭＣＦ−７細胞におけるｃ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４およびＳｏｘ２（Ｈ）ならびに１３３ｐ５３（α、βおよびγ）アイソフォーム（Ｉ）発現のＲＴ−ｑＰＣＲ解析（ｎ＝４）。 図８は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞のエトポシド処理は、Δ１３３ｐ５３アイソフォーム発現を上方制御し、重要な多能性遺伝子を活性化させることを示す図である。Ａ．エトポシドの用量を増加させながら１６時間処理した後のＭＤＡ−ＭＢ−２３１ Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞におけるｐ５３、ｐ２１およびｃ−Ｍｙｃ発現のウェスタンブロット解析。Ｂ．エトポシドの用量を増加させながら処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１ Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞におけるｃ−Ｍｙｃ発現のＲＴ−ｑＰＣＲ解析（ｎ＝４）。Ｃ．エトポシド処理後のＭＤＡ−ＭＢ−２３１ Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞におけるΔ１３３ｐ５３（α、βおよびγ）アイソフォーム発現のＲＴ−ｑＰＣＲ解析（ｎ＝４）。 Ｄ．エトポシドの用量を増加させながら処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１ Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞におけるＮａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４およびＳｏｘ２発現のＲＴ−ｑＰＣＲ解析（ｎ＝４）。
定義
Ｐ５３アイソフォーム
Ｐ５３アイソフォームを図１Ａに示す。さらに、下記表１に、全長ｐ５３（「ｐ５３」と記す）ならびにΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームのアミノ酸および核酸配列を示す。
がん、がん幹細胞、化学療法抗がん処置、抗がん幹細胞剤
本明細書では、「がん」は、調節解除されたまたは制御されていない細胞増殖によって特徴づけられる悪性新生物を指す。特に「がん細胞」は、調節解除されたまたは制御されていない細胞増殖を有する細胞を指す。
用語「がん」は、原発性悪性腫瘍（例えば、その細胞が、最初の腫瘍の部位以外の対象の身体部位に移動していない腫瘍）および二次悪性腫瘍（例えば、最初の腫瘍部位とは異なる二次的部位に腫瘍細胞が移動する転移から生じた腫瘍）を含む。そのようながんは、とりわけ、固形がんの群から選択され、特に乳がん、結腸直腸がん、卵巣がん、消化管がん（胃腸がんとも称され、結腸直腸がん、食道がん、胃がん、膵臓がん、肝細胞癌、胆管細胞がん、および奇形癌腫を含む）、膵臓がんおよび咽頭がんからなる群から選択されてもよく、特にヒト対象のがんでありえ、より好ましくは、乳がん、結腸直腸がん、胃腸がん、肺がんおよび前立腺がんであり、さらにより好ましくは、乳がんまたは結腸直腸がんである。そのようながんは、造血がんの群から選択されえ、特に白血病およびリンパ腫からなる群から選択されえ、特に、ヒト対象のがんでありうる。
本明細書では、「がん再発」は、改善の期間後にがんまたはその徴候および症状が戻ることを指す。
「がん試料」によって、がん細胞を含む任意の試料、例えば、限定されないが、がん生検、またはがんの全体もしくは一部の外科的切除物、または血液試料が意味される。実際、循環がん細胞が、血液中に存在していることは、当該分野において周知である。
「未処置がん試料」によって、化学療法抗がん剤を用いた処置を受けたことがないがん試料が意味される。対照的に、「既処置がん試料」によって、化学療法抗がん剤を用いた処置を受けたことがあるがん試料が意味される。
「非がん性細胞試料」によって、健常な非がん細胞を含むまたは含むはずの任意の試料、例えば、限定されないが、組織生検または血液試料が意味される。
本明細書では、「化学療法抗がん剤」は、抗がん治療に使用される任意の化学薬品を指す。化学療法抗がん剤は、米国がん協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ）によって列挙されている任意の化学療法抗がん剤であってもよい。そのような化学療法抗がん剤としては、とりわけ、以下の従来の抗がん処置：トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えば、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ミトキサントロンおよびアムサクリン）、抗チューブリン剤（例えば、パクリタキセルおよびドセタキセルなどのタキサン、ならびにビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビンなどのビンカアルカロイド）、抗代謝剤（例えば、ピリミジン類似体５−フルオロウラシル（５−ＦＵ））のいずれかが挙げられる。
本明細書では「がん幹細胞」（「ＣＳＣ」と略す）は、通常の幹細胞に関連する特徴、例えば特定のがん試料で見出せる全ての種類の細胞を生じさせることができる能力を有するがん細胞を指す。ＣＳＣは、さらに、幹細胞で特異的に発現している転写因子、例えばＯｃｔ３／４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２の発現；適切な条件下でスフェアを形成する能力、サイドポピュレーション（ＳＰ）の存在；ならびに／またはがん幹細胞に関連する表面マーカーの発現もしくは非発現によっても特徴づけられる。Tirinoら, 2013の教示に基づいて、様々ながん幹細胞の表面表現型、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２排出によるサイドポピュレーション（ＳＰ）表現型の検出、スフェア形成能力、および／またはアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）活性の検出を、下記表２ａに開示する。

下記表２ｂは、血液悪性腫瘍で特定されたＣＳＣの細胞表面表現型を示す。

所与のがん細胞集団の「幹細胞性」を実験的に検査するために、ヒト腫瘍生検由来がん部分集団を使用する免疫不全マウスにおける異種移植アッセイに依拠することが多く、上記のような特定の候補ＣＳＣマーカーまたは一連のマーカーの有無について選別が行われる（Schattonら, 2009）。がん幹細胞は、ゼブラフィッシュにおける異種移植によって定義されてもよい（Doveyら, 2009）。
従来的に、ＣＳＣは、マトリゲルまたは超低接着条件（Le Chengら, 2009）を用いた細胞培養物のスフェア形成を通じても特定されてきた。本明細書では、「スフェア」、「スフェロイド」または「腫瘍様塊」は、１つのがん細胞の増殖から発達した固形の球状の形成物を指す。そのようなスフェアは、単一または凝集細胞から容易に識別可能であり、その理由は、細胞が融合して一緒になり、個々の細胞が特定できないようになるためである。それらのサイズは、５０〜２５０μｍで変動しうる。スフェアを形成する能力は、がん幹細胞の存在に関連していると考えられる。本発明で定義されるそのようなスフェアは、例えばCharras(2008)によって定義されるような一般的に知られたブレブ（ｂｌｅｂｂｅ）とは異なる。特に、ブレブは、アクチン皮質からの細胞膜の一過性脱離またはアクチン皮質の破裂のいずれかが引き起こされる皮質のアクトミオシン収縮の結果である一細胞の細胞膜の隆起である。対照的に、スフェアは、いくつかの細胞の凝集により形成される。
様々な起源のＣＳＣについて上記表２ａおよび２ｂに定義される表面マーカーに加えて、ＣＳＣは、一般に、通常の幹細胞の表面マーカー、例えば、市販の抗ＴＲＡ−１−６０および抗ＴＲＡ−１−８１モノクローナル抗体によって認識される炭水化物エピトープＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１も発現する。
本明細書で使用するとき、「治療有効量」は、意図した使用のために十分な量を指す。化学療法抗がん剤については、がんの増殖または拡大を減少させるために十分な量を指す。Δ１３３ｐ５３βまたはΔ１３３ｐ５３γアイソフォーム発現を減少させる薬剤について、Δ１３３ｐ５３βまたはΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの発現レベルを有意に減少させるために十分な量を指す。
ベクター
本明細書で使用される「プラスミドベクター」は、複製可能なＤＮＡ構築物を指す。用語「ウイルスベクター」は、本明細書で使用するとき、ウイルスゲノムの少なくとも１つの要素を含む核酸ベクターを指し、ウイルス粒子にパッケージングされていてもよい。用語「ウイルス」、「ビリオン」、「ウイルス粒子」および「ウイルスベクター粒子」は、相互に交換可能に使用され、核酸ベクターが、ウイルス粒子の生成を可能にする適切な条件にしたがって適切な細胞または細胞株に形質導入されたときに形成されるウイルス粒子を指す。本発明の文脈では、用語「ウイルスベクター」は、核酸ベクター（例えば、ＤＮＡウイルスベクター）ならびにそれから生成したウイルス粒子を含むものとして広義に理解される。用語「感染性」は、ウイルスベクターが宿主細胞または対象に感染して進入する能力を指す。本明細書で使用するとき、用語「制御要素」または「制御配列」は、所与の宿主細胞または対象における核酸分子の発現、例えば、核酸またはその誘導体（つまり、ｍＲＮＡ）の複製、重複、転写、スプライシング、翻訳、安定性および／または輸送を可能にする、寄与するまたは調節する任意の要素を指す。
他の定義
本明細書では、用語「対象」は、哺乳動物、例えば、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、カンガルー、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラットおよび遺伝子導入非ヒト動物を指す。本発明の好ましい実施形態では、対象は、ヒト対象であり、乳がんの文脈ではより好ましくは女性である。
本明細書では、表現「ｉｎ ｖｉｔｒｏで測定」は、発現レベルが知られておらず（単にデータベースから検索することはできず）、実験室で実施されるいくつかの処理ステップで物理的に測定されなければならないことを意味する。用語「プライマー」は、本明細書で使用するとき、天然に存在するか（精製された制限消化物のように）または合成により製造されたものであって、適切な条件下に、つまりヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼなどの誘導剤の存在下の適切な温度およびｐＨ条件下に置かれたときに、核酸の相補鎖の合成を開始することができる、オリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよいが、誘導剤の存在下で所望の伸長産物の合成をプライムするために十分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、多くの因子、例えば、温度、プライマーの配列および／またはホモロジー、ならびに使用する方法などに依存する。例えば、診断適用において、オリゴヌクレオチドプライマーは、標的配列の複雑性に応じて、通常１０〜２５以上のヌクレオチドを含むが、より少ないヌクレオチドを含むものであってもよい。
がん幹細胞を産生するための方法
本発明の内容において、本発明者らは、Δ１３３ｐ５３αアイソフォーム（Δ１３３ｐ５３アイソフォームとも称される）でなく、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム（さらに程度は低いがΔ１３３ｐ５３γ）が、がん転移のリスクのマーカーであるだけでなく、実際にがん幹細胞表現型を促進することを見出した。特に、Δ１３３ｐ５３αアイソフォーム（Δ１３３ｐ５３アイソフォームとも称される）の発現でなく、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム（さらに程度は低いがΔ１３３ｐ５３γ）の発現が、がん細胞のスフェア形成活性を促進し、さらに多能性に向けて細胞を再プログラミングするために有用であることが知られる転写因子Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４およびＮａｎｏｇ（ｃ−Ｍｙｃは除く）の発現を促進する。
この知見は、多数のＣＳＣを製造する手段を提供し、したがって抗がん治療の改善のための決定的ポイントとなるＣＳＣの生物学を研究およびより良く理解することを可能にすることから、非常に重要である。
したがって、第１の態様では、本発明は、がん幹細胞を産生するための方法であって、
ａ）がん細胞に、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方を発現するベクターを形質導入することと、
ｂ）形質導入されたがん細胞を、形質導入されたがん細胞の増殖を補助する培地中で培養することと、
ｃ）がん幹細胞を単離することと
を含む方法に関する。
がん細胞
本発明のがん幹細胞を製造する方法では、がん細胞は、好ましくは固形がん細胞の群から選択され、特に、乳がん細胞、結腸直腸がん細胞 卵巣がん細胞、消化管がん細胞（胃腸がんとも称され、結腸直腸がん、食道がん、胃がん、膵臓がん、肝細胞癌、胆管細胞がんおよび奇形癌腫を含む）、膵臓がん細胞および咽頭がん細胞からなる群から選択され、特に、ヒト対象のがん細胞であり、より好ましくは、がん細胞は、乳がん細胞 結腸直腸がん細胞、胃腸がん細胞、肺がん細胞および前立腺がん細胞から選択され、さらにより好ましくは、がん細胞は、乳がん細胞または結腸直腸がん細胞である。
さらに、がん細胞は、造血がん細胞の群から選択され、特に白血病細胞およびリンパ腫細胞からなる群から選択されうる。好ましくは、造血がん細胞は、ヒト造血がん細胞である。
多くの種類のがん細胞が、Ｙａｍａｎａｋａ因子（Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃ）の少なくとも１つおよび好ましくは複数が形質導入されたときにＣＳＣを生じうることは、当該分野で既知である。このことが示されたがん細胞の例としては、以下が挙げられる：
・結腸（または結腸直腸）がん細胞（例えば、Oshimaら(2014)参照、この文献には、因子Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２およびＫＬＦ４を形質導入された結腸がん細胞が、マーカー遺伝子発現およびスフェア形成の観点において、顕著に増強されたＣＳＣ様式を示したことが記載されている）、
・胃腸がん細胞（結腸直腸がん、食道がん、胃がん、膵臓がん、肝細胞癌、胆管細胞がんおよび奇形癌腫の細胞を含む）。Miyoshiら(2010)は、上記胃腸がんから取得された、Ｎａｎｏｇ転写因子で誘導された細胞が、ＣＳＣのような多能性を顕在化したことを開示している。
・肺がん細胞（Chiouら, 2010参照、この文献は、肺腺癌細胞におけるＯｃｔ４およびＮａｎｏｇ転写因子の異所性発現がスフェア形成を誘導することを記載している）、ならびに
・前立腺がん細胞（Jeterら, 2011参照、この文献は、前立腺がん細胞株におけるテトラサイクリン誘導性Ｎａｎｏｇ過剰発現が、いくつかのＣＳＣ関連分子の発現を増強することにより、腫瘍再生を促進することを記載している）。
Δ１３３ｐ５３βアイソフォームまたはΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの形質導入は、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＯｃｔ３／４の発現を誘導するため、Ｙａｍａｎａｋａ因子（Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃ）の少なくとも１つおよび好ましくは複数が形質導入されたときにＣＳＣを生ずることが知られている任意のがん細胞へのその形質導入は、ＣＳＣを生ずると予測される。このことは、本発明者らにより、２つの別個の種類のがん細胞、つまり乳がん細胞および結腸がん細胞で実証された。そのようながん細胞は、任意のがん試料、例えば、がん生検、またはがんの全体もしくは一部の外科的切除物、または血液試料から取得されうる。実際、がん細胞（がん幹細胞を含む）は、血液中を循環することが周知である（Mavroudis-2010; Alix-Panabieresら,. 2013）。
アイソフォーム
がん幹細胞を産生するための本発明による方法の好ましい実施形態では、Δ１３３ｐ５３βアイソフォームまたはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方（好ましくはΔ１３３ｐ５３βアイソフォームのみ）が、ステップｂ）でがん細胞に形質導入される。実際、Δ１３３ｐ５３βアイソフォームの発現は、がん幹細胞の誘導と特に関連している。
Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方を発現するベクター（ステップｂ）
Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方を発現する任意の適切なベクターを使用しうる。
適切なベクターは、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方をコードする核酸分子およびその発現を可能にするために必要な要素を含む。
適切なベクターとしては、とりわけ、プラスミドベクターおよびウイルスベクターが挙げられる。
ウイルスベクターは、複製適格または複製選択的なもの（例えば、よりよく複製するようにもしくは特定の宿主細胞で選択的に複製するように改変されている）であってもよく、または、複製欠損もしくは複製不全であるように遺伝子的に障害が与えられたものであってもよい。通常、そのようなベクターは市販されており（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｒｏｍｅｇａなどにおいて）または米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）などの寄託機関から入手可能であり、または複数の文献で配列、組織、製造方法が記載されており、当業者がそれらを適用しうる。
一実施形態では、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方を発現するプラスミドベクターが使用される。
適切なプラスミドベクターの代表的な例としては、限定されないが、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＶＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｐＧＷｉｚ（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ）が挙げられる。
形質導入のために、プラスミドベクターは、脂質またはポリマーに複合体化されて、特定の構造物、例えば、リポソーム、リポプレックス、またはナノ粒子などを形成してもよい。
好ましい実施形態では、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方を発現するウイルスベクター（つまり、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βアイソフォームおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方をコードする核酸分子およびその発現を可能にするために必要な要素を含むウイルスベクター）が使用される。
適切なウイルスベクターの代表例は、多種多様なウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノウイルス−随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、泡沫状ウイルス、アルファウイルス、水疱性口内炎ウイルスなど）から生成される。上記のように、用語「ウイルスベクター」は、ベクターＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ならびにそれらから生成されたウイルス粒子、特に感染性ウイルス粒子を包含する。好ましい実施形態では、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｉｓｏｆｏｒｍ）の両方を発現するレトロウイルスベクター（つまり、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βアイソフォームおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方をコードする核酸分子およびその発現を可能にするために必要な要素を含むレトロウイルスベクター）が使用される。
レトロウイルスは、感染特性を有し、ほとんどの場合に細胞に統合されて細胞を分割し、この点に関し、がん幹細胞を製造するために本発明の内容において特に適切に使用される。適切なレトロウイルスは、一般に、ＬＴＲ配列、キャプシド形成領域、およびΔ１３３ｐ５３βまたはΔ１３３ｐ５３γアイソフォームをコードする核酸分子を含む。組み換えレトロウイルスは、任意の起源（マウス、霊長類、ネコ、ヒトなど）のレトロウイルスに由来するものでありえ、特に、ＭｏＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）、ＭＶＳ（マウス肉腫ウイルス）、Ｆｒｉｅｎｄマウスレトロウイルス（Ｆｂ２９）、マウス胚性幹細胞ウイルス（ＭＥＳＶ）、ＬＮウイルスまたはマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）に由来するものでありうる。組み換えレトロウイルスは、ウイルス粒子を構成するために必要なウイルスポリペプチドｇａｇ、ｐｏｌおよび／またはｅｎｖをトランスに供給することができるキャプシド形成細胞株に伝播される。そのような細胞株は、文献に記載されている（ＰＡ３１７、Ｐｓｉ ＣＲＩＰ ＧＰ＋Ａｍ−１２、ＨＥＫ２９３Ｔなど）。本発明によるレトロウイルスベクターは、修飾を含むことができ、特にＬＴＲに（プロモーター領域の真核生物プロモーターへの置き換え）またはキャプシド形成領域に（異種キャプシド形成領域への置き換え）含むことができる。
特に好ましい実施形態では、ステップｂ）でがん細胞に形質導入するために使用されるベクターは、マウス胚性幹細胞ウイルス（ＭＥＳＶ）由来のマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、およびＬＮレトロウイルスベクター（Grez, M.,ら 1990; Miller, A. D.ら 1989）である。とりわけ、形質導入ベクターは、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方をコードする分子を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈにより市販されているｐＭＳＣＶベクター、例えば、ｐＭＳＣＶｈｙｇ、ｐＭＳＣＶｎｅｏまたはｐＭＳＣＶｐｕｒｏにクローニングすることにより、取得しうる。
しかしながら、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方を発現する他の種類のウイルスベクターも使用しうる。
本発明の文脈で有用なウイルスベクターの例としては、様々なヒトまたは動物源（例えば、イヌ、ヒツジ、サルのアデノウイルスなど）に由来しうるアデノウイルスベクターが挙げられる。任意の血清型をヒトアデノウイルスに対して特に優先して使用することができ、亜属Ｃ、例えばＡｄ２、Ａｄ５、Ａｄ６、および亜属Ｂ、例えばＡｄ１１、Ａｄ３４およびＡｄ３５が特に優先される。参照したアデノウイルスはＡＴＣＣから入手可能であり、または複数の文献で配列、組織、製造方法が記載されており、当業者がそれらを適用しうる。アデノウイルスベクターが使用されるとき、およそ４５９〜３３２８位またはおよそ４５９〜３５１０位にわたるＥ１欠失を有するＥ１欠損アデノウイルスベクターであることが好ましい（ＧｅｎＢａｎｋにおいて受託番号Ｍ７３２６０．１で開示されるＡｄ５の配列を参照）。クローニング能力をさらに向上させるために、アデノウイルスゲノムのさらなる部分（非必須Ｅ３領域（例えばおよそ２７８６７〜３０７４３位の欠失）または他の必須Ｅ２および／もしくはＥ４領域の全部または一部）を欠失させてもよい。Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方をコードする核酸分子が、次いで、アデノウイルスゲノムの任意の位置に挿入されえ、ここでは、Ｅ１および／またはＥ３領域の置き換えの挿入が特に優先される。それらは検討領域の天然の転写方向に対してセンスまたはアンチセンス配向で配置しうる。
本発明の内容で使用しうるウイルスベクターの他の例としては、ポックスウイルスベクター、例えば、鶏痘ベクター（例えばＦＰ９）、カナリアポックスベクター（例えば、ＡＬＶＡＣ）およびワクシニアウイルスベクターが挙げられ、後者が好ましい。適切なワクシニアウイルスとしては、限定されないが、コペンハーゲン株、ワイス（Ｗｙｅｔｈ）株、ＮＹＶＡＣおよび改変アンカラ株が挙げられる。組み換えポックスウイルスの構築および製造のための一般的な条件としては、当該技術分野で周知である。Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方をコードする核酸分子は、好ましくは、非必須遺伝子座におけるポックスウイルスのゲノム内に挿入される。チミジンキナーゼ遺伝子は、コペンハーゲンワクシニアベクターにおける挿入、およびＭＶＡベクターにおける挿入について欠失ＩＩもしくはＩＩＩにおける挿入のために特に適切である。
本発明の内容に適切な他のウイルスベクターは、パラミクソウイルス科から取得することができるモルビリウイルスであり、特に麻疹ウイルスが優先される。Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方をコードする核酸分子のＰ遺伝子とＭ遺伝子との間またはＨ遺伝子とＬ遺伝子との間への挿入が特に好ましい。
上記ベクターでは、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方をコードする核酸分子は、がん細胞の発現に適切な形態であり、このことは、本明細書に示すそれぞれの核酸分子が適切な制御配列に操作可能に連結されていることを意味する。
当業者は、制御配列の選択が、ベクター自体および形質導入されるがん細胞などの因子に依存しうることを認識しており、当業者であれば、共通の一般常識およびこの点に関する刊行物に基づいて容易に選択をなしうる。真核生物系の構成的発現のために適切なプロモーターとしては、ウイルスプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時初期プロモーターまたはエンハンサー、アデノウイルス初期および後期プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）−１のチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターおよびレトロウイルス末端反復配列（例えば、ＭｏＭｕＬＶおよびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ）ならびに細胞プロモーター、例えばホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが挙げられる。マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）ベクターに適切なプロモーターの例としては、Ｃｌｏｎｔｅｃｈにより市販されているｐＭＳＣＶベクター、例えばｐＭＳＣＶｈｙｇ、ｐＭＳＣＶｎｅｏ、またはｐＭＳＣＶｐｕｒｏに存在しているものが挙げられる。
形質導入されたがん細胞の培養（ステップｂ）
ステップｂ）では、形質導入されたがん細胞が、その増殖を補助する培地中で培養される。そのような培地は、基本培地（無機塩、アミノ酸、ビタミンおよびグルコース、例えばＤＭＥＭを含む）でありえ、該培地は、還元剤（β−メルカプトエタノールなど）、少なくとも１つの抗生物質（ペニシリン−ストレプトマイシンなど）、および／または少なくとも形質導入されたがん細胞の種類の増殖を持続させることが可能な少なくとも１つの成長因子（例えば、限定されないが上皮成長因子（ＥＧＦ）および／または塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ））で補足されていてもよい。
乳がん細胞、およびより一般的に、上皮由来のがん細胞（癌腫由来のがん細胞）については、ステップｂ）の好ましい培地は、無機塩、アミノ酸、ビタミンおよびグルコース、β−メルカプトエタノール、少なくとも１つの抗生物質およびｂＦＧＦを含む基本培地を含みうる。
ステップｂ）は、形質導入されたがん細胞培養物からがん幹細胞を回収するために十分な期間実施される。適切な期間は、がん細胞のそれぞれの種類に応じて最適化されるべきであるが、一般に、３〜２１日間、特に７〜１４日間である。
がん幹細胞の単離（ステップｃ）
ステップｃ）では、がん幹細胞が、形質導入されたがん細胞培養物から単離される。形質導入されたがん細胞培養物では、がん幹細胞は、他のがん細胞と比較して、がん幹細胞に特異的な任意の特徴の選択に基づいて単離されうる。特に、がん細胞の種類に依存して、ＣＳＣは、以下の４つの方法の少なくとも１つにより同定および単離しうる。
ｉ）ＣＳＣ特異的細胞表面マーカーによる単離、
ｉｉ）ＤＮＡ色素排除によるサイドポピュレーション（ＳＰ）表現型に基づくフローサイトメトリーによる単離、
ｉｉｉ）高アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）活性に基づくフローサイトメトリーによる単離、ならびに
ｉｖ）スフェア形成アッセイへの投入およびスフェアの回収。
上記４つの方法の適性は、とりわけ、がん幹細胞の定義において上記に提供される情報（特に表２ａおよび２ｂにおける情報）に基づいてがん細胞の種類に応じて当業者により決定されうる。
方法ｉ）では、ＣＳＣは、ＣＳＣ特異的細胞表面マーカーに基づき単離される。この方法では、形質導入されたがん細胞は、１つ以上のＣＳＣ特異的細胞表面マーカーに対する抗体を使用して染色され、所望の表面マーカー表現型を有する細胞が選別される。当業者は、そのような表面細胞マーカーに基づく単離（ｓｉｏｌａｔｉｏｎ）の仕方を理解している。例えば、フローサイトメトリー細胞選別を使用することができ、形質導入されたがん細胞は、１つまたは複数のＣＳＣ特異的細胞表面マーカーに対する抗体で直接的または間接的に蛍光染色され、所望の表面マーカー表現型を有するフローサイトメーターレーザーにより検出される細胞が選別される。別の実施形態では、磁選が使用されうる。この場合には、抗体標識された形質導入がん細胞（ＣＳＣマーカーに対する抗体が使用される場合にはＣＳＣに対応し、ＣＳＣに特異的に発現しない抗体が使用される場合には非ＣＳＣに相当する）を、抗体に特異的に結合する磁気ビーズと接触させ（例えばアビジン／ビオチン相互作用を介してまたは抗体−抗原結合を介して）、抗体標識されていない形質導入がん細胞から分離する。ＣＳＣに特異的に発現するおよび発現しないマーカーに基づいて、数回の磁性精製（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を行ってもよい。
方法ｉｉ）では、ＣＳＣは、ＤＮＡ色素サイドポピュレーション（ＳＰ）表現型に基づくフローサイトメトリー細胞選別により単離される。この方法は、生細胞による細胞透過性ＤＮＡ色素の受動取込みおよびＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体を介した幹細胞のサイドポピュレーションによるそのようなＤＮＡ色素のポンプ排出に基づき、低いＤＮＡ色素蛍光を有するサイドポピュレーションを適切な波長で観察することを可能にする。ＡＢＣポンプは、ベラパミル（１００μＭの最終濃度）またはレセルピン（５μＭの最終濃度）などの薬物により特異的に阻害することができ、これらの薬物を使用して、ＳＰ表現型が検出されない対照試料を生成することができる。使用されうる適切な細胞透過性ＤＮＡ色素としては、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（主にこの目的のために主に使用されるＤＮＡ色素、Golebiewskaら, 2011参照）、および様々な蛍光で利用可能なＶｙｂｒａｎｔ（登録商標）ＤｙｅＣｙｃｌｅ（商標）染色（紫色、緑色、および橙色；Telfordら-2010参照）が挙げられる。
方法ｉｉｉ）では、ＣＳＣは、高ＡＬＤＨ活性に基づくフローサイトメトリー細胞選別により単離される。実際、いくつかの種類のＣＳＣは、高ＡＬＤＨ活性を示すことにより特徴づけられる。この方法では、形質導入されたがん細胞は、未処置および生細胞に自由に拡散する蛍光ＡＬＤＨ基質（例えば、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって市販されているＡＬＤＥＦＬＵＯＲ（商標）キットのＢＯＤＩＰＹ（商標）−アミノアセトアルデヒド（ＢＡＡＡ）試薬）と共にインキュベートされる。ＡＬＤＨの存在下、この蛍光基質は、蛍光代謝物（例えば、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって市販されているＡＬＤＥＦＬＵＯＲ（商標）キットのＢＯＤＩＰＹ（商標）−ＢＡＡＡから取得されるＢＯＤＩＰＹ（商標）−アミノアセテート（ａｍｉｎｏａｃａｔｅ）（ＢＡＡ）試薬）に変換され、細胞内に保持される。蛍光反応生成物の量は、細胞内のＡＬＤＨ活性に比例し、フローサイトメーターを使用して測定される。生ＡＬＤＨbright（ＡＬＤＨｂｒ）細胞は、原理的に、セルソーターを使用して単離しうる。反応生成物の能動排出は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ（商標）アッセイバッファー内の排出阻害剤によって阻害される。ＡＬＤＨの特別な阻害剤、例えばジエチルアミノベンズアルデヒド（ＤＥＡＢ）が、バックグラウンド蛍光を調整するために使用される。
方法ｉｖ）では、ＣＳＣは、形質導入されたがん細胞をスフェア形成アッセイにかけ、スフェアを回収することによって単離される。この方法は、無血清（および好ましくは低接着）培養条件下でスフェアを形成するがん幹細胞の優先的能力に依拠しており、バルク腫瘍細胞では、同じ条件下でスフェアを形成する能力は弱い。ＣＳＣの単離のために適切なスフェア形成アッセイは、
１）形質導入されたがん細胞を、無血清培地中に、好ましくは特別な成長因子（例えば、限定されないが、上皮成長因子（ＥＧＦ）および塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ））の存在下、再懸濁し、それらを、好ましくは哺乳動物細胞が十分に接着しない、組織培養皿に播種することと、
２）がん細胞を５〜２０日間インキュベートすることと、ならびに
３）スフェアを回収することと
を含みうる。
ステップ１）では、がん細胞が、無血清培地（例えば、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａから入手可能なＭａｍｍｏＣｕｌｔ（登録商標）中に、好ましくは特別な成長因子、例えばＥＧＦおよびｂＦＧＦの存在下、再懸濁され、組織培養皿中に蒔かれる。好ましくは、哺乳動物細胞が十分に接着しない組織培養皿が選択される（例えば、Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｐｌａｔｅ、２４ウェル、平底、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ製）。このステップでは、播種密度は、好ましくは２５０〜２５００細胞／ｃｍ2に維持され、好ましくは各種のがん細胞に対して最適化される。
例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ（商標）Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ、ヒドロコルチゾンおよびヘパリン（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が濃縮されたＭａｍｍｏＣｕｌｔ（商標）培地における乳がん細胞の場合、Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｐｌａｔｅ、２４ウェル、平底（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ）に５００細胞／ウェルの播種密度が適切である。
ステップ２）では、がん細胞は、好ましくは約３７℃で、５％ＣＯ2雰囲気下、５〜２０日間、好ましくは７〜１５日間、インキュベートされる。
最後に、ステップ３）では、インキュベーションの間に形成された少なくとも５０μｍの大きさのスフェアを回収する。
上記方法の１つを使用して単離したＣＳＣは、その後、異種移植試験を使用して試験されてもよい。この場合に、単離されたＣＳＣ部分集団は、免疫不全マウス（例えば、ＳＣＩＤマウス、Schattonら, 2009参照）またはゼブラフィッシュ（Doveyら, 2009参照）、好ましくは免疫不全マウス（例えば、ＳＣＩＤマウス）に連続移植される。ＣＳＣ集団の移植後、得られた腫瘍は、原腫瘍の表現型異種性を反映しており、後の連続移植における自己再生能力が保存されたＣＳＣを含有していると予測される（Le Cheng, 2009）。
好ましい実施形態
がん幹細胞を製造するための本発明による方法の様々な一般的要素に対応する様々な好ましい特別な特徴は、この要素に特に関連する項目において上記で説明されている。本発明の内容において、特定の要素についての適切な特徴のそれぞれの列挙、および特定の要素について開示されたそれぞれの特別な特徴は、任意の一般的な他の要素、前記の他の要素についての適切な特徴の列挙、または前記他の要素について開示された任意の特別な特徴と組み合わされてもよい。
特に、がん幹細胞を製造するための本発明による方法の要素の好ましい実施形態は、任意の一般的な他の要素または前記他の要素の好ましい実施形態と組み合わされてもよい。
好ましい実施形態は、その少なくとも１つの要素が、下記表３に列挙されているような好ましい実施形態に限定される、実施形態に相当する。
がん幹細胞を産生するための本発明による方法の特に好ましい実施形態では、形質導入に使用されるがん細胞は乳がん細胞であり、がん細胞に形質導入されるＰ５３アイソフォームはΔ１３３ｐ５３βアイソフォームで、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）ベクターを使用して形質導入されており、ステップｂ）で使用される培地は、無機塩、アミノ酸、ビタミン、グルコース、β−メルカプトエタノール、少なくとも１つの抗生物質およびｂＦＧＦを含む基本培地であり、がん幹細胞は、表面マーカーまたはスフェア形成能力に基づく選択により、ステップｃ）で単離される。
化学療法抗がん処置によりがん罹患対象においてがん幹細胞が誘導されるリスクの予測
さらに本発明者らは、驚くべきことに、エトポシド（トポイソメラーゼＩＩ阻害剤）による、Δ１３３ｐ５３βアイソフォームを発現するがん細胞の抗がん処置が、効率的でない（処置に耐性である）だけでなく、Δ１３３ｐ５３βの発現レベルを増加させることによって、がん幹細胞性を促進させることを見いだした。結果として、がん患者を、Δ１３３ｐ５３β発現（Δ１３３ｐ５３β−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ）で処置することは、ＣＳＣ形成を促進し、有用であるよりも、むしろ有害となりうる。
したがって、本発明は、化学療法抗がん剤を用いた処置が、がん罹患対象においてがん幹細胞を誘導するリスクを、前記対象のがん試料から予測するための方法であって、
ａ）化学療法抗がん剤で未処置の前記がん試料におけるΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することと、
ｂ）前記がん試料を前記化学療法抗がん剤で処置することと、
ｃ）既処置がん試料におけるΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することと、
ｄ）ステップａ）およびｃ）で取得した値を比較することと、
ｅ）（ｉ）ステップｃ）で測定されるΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、もしくはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルが、ステップａ）で測定されるΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、もしくはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルより高い場合には、前記化学療法抗がん剤を用いた処置が前記対象においてがん幹細胞を誘導する重大なリスクがある、または
（ｉｉ）ステップｃ）で測定されるΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、もしくはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルが、ステップａ）で測定されるΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、もしくはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルより低いもしくは同等である場合には、前記化学療法抗がん剤を用いた処置が前記対象においてがん幹細胞を誘導する重大なリスクはないと結論付けることと
を含む方法にさらに関する。
化学療法抗がん処置
化学療法抗がん処置が、がん幹細胞を誘導するリスクを予測するための本発明による方法では、がん対象においてがん幹細胞の誘導を受けやすい化学療法抗がん剤は、好ましくは以下から選択される：
・トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えば、エトポシド、エトポシド、テノポシド、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ミトキサントロンおよびアムサクリン、
・抗チューブリン剤、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセルなどのタキサン、ならびにビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビンなどのビンカアルカロイド、
・抗代謝剤、例えば、ピリミジン類似体５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）。
好ましい実施形態では、がん対象においてがん幹細胞の誘導を受けやすい化学療法抗がん処置は、エトポシド、テノポシド、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ミトキサントロンおよびアムサクリンから選択されるトポイソメラーゼＩＩ阻害剤である。より好ましくは、がん対象において、がん幹細胞の誘導を受けやすい化学療法抗がん処置は、エトポシドである。
がんおよびがん試料
化学療法抗がん処置が、がん幹細胞を誘導するリスクを予測するための本発明による方法では、対象が罹患しているがんは、好ましくは固形がんの群から選択され、特に乳がん、結腸直腸がん、卵巣がん、消化管がん（胃腸がんとも称され、結腸直腸がん、食道がん、胃がん、膵臓がん、肝細胞癌、胆管細胞がんおよび奇形癌腫を含む）、膵臓がん、肺がん、前立腺がんおよび咽頭がんからなる群から選択され、特にヒト対象のがんであり、より好ましくは、乳がん、結腸直腸がん、胃腸がん、肺がんおよび前立腺がんであり、さらにより好ましくは、対象が罹患しているがん（ｔｈｅ ｃａｎｃｅｒ ｆｒｏｍ ｗｈｉｃｈ ｔｈｅ ｓｕｂｊｅｃｔ）は、乳がんまたは結腸直腸がんである。
さらに、がんは、造血がんの群から選択されえ、特に白血病およびリンパ腫からなる群から選択されうる。好ましくは、造血がんは、ヒト造血がんである。
多くの種類のがん細胞が、Ｙａｍａｎａｋａ因子（Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃ）の少なくとも１つおよび好ましくは複数が形質導入されたときにＣＳＣを生じうることは、当該分野で既知である。このことが示されたがん細胞の例としては、以下が挙げられる：
・結腸（または結腸直腸）がん細胞（例えば、Oshimaら(2014)参照、この文献には、因子Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２およびＫＬＦ４を形質導入された結腸がん細胞が、マーカー遺伝子発現およびスフェア形成の観点において、顕著に増強されたＣＳＣ様式を示したことが記載されている）、
・胃腸がん細胞（結腸直腸がん、食道がん、胃がん、膵臓がん、肝細胞癌、胆管細胞がんおよび奇形癌腫の細胞を含む）。Miyoshiら(2010)は、上記胃腸がんから取得された、Ｎａｎｏｇ転写因子で誘導された細胞が、ＣＳＣのような多能性を顕在化したことを開示している。
・肺がん細胞（Chiouら, 2010参照、この文献は、肺腺癌細胞におけるＯｃｔ４およびＮａｎｏｇ転写因子の異所性発現がスフェア形成を誘導することを記載している）、ならびに
・前立腺がん細胞（Jeterら, 2011参照、この文献は、前立腺がん細胞株におけるテトラサイクリン誘導性Ｎａｎｏｇ過剰発現が、いくつかのＣＳＣ関連分子の発現を増強することにより、腫瘍再生を促進することを記載している）。
Δ１３３ｐ５３βアイソフォームまたはΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの形質導入は、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＯｃｔ３／４の発現を誘導するため、Ｙａｍａｎａｋａ因子（Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃ）の少なくとも１つおよび好ましくは複数が形質導入されたときにＣＳＣを生ずることが知られている任意のがん細胞へのその形質導入は、ＣＳＣを生ずると予測される。このことは、本発明者らにより、２つの別個の種類のがん細胞、つまり乳がん細胞および結腸がん細胞で実証された。
ステップａ）でΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルが測定されるがん試料は、がん生検またはがん外科的切除物の全部もしくは一部でありうる。選択的に、ステップａ）でΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βアイソフォームおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルが測定されるがん試料は、血液試料でありうる。実際、がん細胞（がん幹細胞を含む）は、血液中を循環することが周知であり（Mavroudis-2010; Alix-Panabieresら,. 2013）、したがってΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βアイソフォームおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現は、がん患者の血液試料でも検出されうる。当業者は、Anensenら, (2006)から、ｐ５３アイソフォームが血液中で測定されうると分かる。
アイソフォーム
化学療法抗がん処置が、がん幹細胞を誘導するリスクを予測するための本発明による方法の好ましい実施形態では、Δ１３３ｐ５３βアイソフォームまたはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルがステップａ）で測定される。実際、Δ１３３ｐ５３βアイソフォームの発現は、化学療法抗がん処置を用いての既処置がん対象におけるがん幹細胞の誘導と特に関連している。
ステップａ）およびｃ）−未処置がん細胞（ステップａ）または既処置がん細胞（ステップｃ）におけるΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルの測定
ステップａ）では、化学療法抗がん剤で未処置の対象からのがん試料において、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルをｉｎ ｖｉｔｒｏで測定する。
ステップｃ）では、化学療法抗がん剤で既処置の対象からのがん試料において、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルをｉｎ ｖｉｔｒｏで測定する。
一部の実施形態では、化学療法抗がん処置が、がん幹細胞を誘導するリスクを予測するための本発明による方法は、対象からがん試料を取得する予備的ステップａ１）をさらに含んでもよい。
さらに、ステップａ）、ステップｃ）または両方は、未処置および既処置がん試料を形質転換する予備サブステップをさらに含んでもよく、このステップは、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルが、タンパク質レベルまたは核酸レベルで測定されるかに依存して様々でありうる。
Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルが、化学療法抗がん剤で処置される前および後の両方の対象のがん試料で測定されなければならないため、ならびにその測定が、未処置および既処置がん試料を形質転換する予備的サブステップを含みうるため、初回がん試料は、いくつかの部分に分割されてもよく、１つの部分が、ステップａ）で、化学療法抗がん剤で処置される前の、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルを測定するために使用されてもよく、別の１部分が、ステップｃ）で、化学療法抗がん剤で処置された後の、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルを測定するために使用されてもよい。次いで初回がん試料は、試料採取による何らかの偏重を防止または最小まで減少させるために、全ての部分ができるだけ（試料中に存在する細胞の数および種類）同様になるように分割してもよい。
タンパク質レベルでの測定
化学療法抗がん処置が、がん幹細胞を誘導するリスクを予測するための本発明による方法の一実施形態では、前記未処置および既処置がん試料におけるΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルが、タンパク質レベルで測定される。
この場合に、未処置および既処置がん試料を形質転換する予備的サブステップは、がん試料タンパク質抽出物におけるΔ１３３ｐ５３β、Δ１３３ｐ５３γ、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γタンパク質の両方の量をさらに測定するために、がん試料に存在するタンパク質を抽出するサブステップを含んでもよい。細胞または組織試料からタンパク質を抽出するための方法は、当業者にとって周知である。それにもかかわらず、タンパク質を抽出するそのような予備的サブステップは、使用する細胞または組織試料において特定のタンパク質の量を直接測定することができる一部の特定の技術の場合には、必ずしも必要でない。
前記未処置および既処置がん試料においてΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルをタンパク質レベルで測定するとき、タンパク質の発現レベルを測定するための当業者に既知の任意の適切な技術を使用しうる。適切な技術としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降、免疫組織化学、および免疫蛍光が挙げられる。
適切な技術のほとんどは、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方に結合することができる抗体を使用する。そのような抗体は、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム（抗Δ１３３ｐ５３β抗体）および／またはΔ１３３ｐ５３γアイソフォーム（抗Δ１３３ｐ５３γ抗体）に特異的に結合することができ、あるいはΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方を含むいくつかのｐ５３アイソフォームを認識することができる。タンパク質レベルで実施するとき、ステップａ）は、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方に結合することができる抗体、例えば、Δ１３３ｐ５３βおよび／またはΔ１３３ｐ５３γアイソフォームならびに他のｐ５３アイソフォームに結合することができる抗体、抗Δ１３３ｐ５３β抗体または抗Δ１３３ｐ５３γ抗体を使用して免疫アッセイにより実施することが好ましい。抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。好ましくは、前記抗体は、標識されている。
Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方ならびに他のｐ５３アイソフォームに結合する抗体（全てのｐ５３アイソフォームを結合する抗体を含む）を使用するとき、Δ１３３ｐ５３βまたはΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの相対量は、様々なｐ５３アイソフォームの別個の分子量に基づいて、ウェスタンブロット解析を使用して決定されうる（図１Ａ参照）。Δ１３３ｐ５３βおよび／またはΔ１３３ｐ５３γアイソフォームおよび他のｐ５３アイソフォームに結合するような抗体は、市販されており、例えば、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから利用可能なヒトｐ５３のアミノ酸１１−２５を認識するｐ５３（ＤＯ−１）：ｓｃ−１２６抗体が挙げられる。
抗Δ１３３ｐ５３βまたは抗Δ１３３ｐ５３γ特異的抗体を使用して、検出は、各種免疫アッセイのいずれかを使用して達成しうる。
例えば、抗体を放射活性標識することにより、抗体を、放射免疫アッセイを使用して検出することができる。放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）の記述は、Work T. S.ら, North Holland Publishing Company, NY(1978)によるLaboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biologyに見出すことができ、特に、Chard T.による「An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques」と題された章が参照されうる。放射性同位元素は、ガンマカウンターもしくはシンチレーションカウンターの使用などの手段によりまたはオートラジオグラフィーなどにより検出しうる。本発明の目的のために特に使用しうる同位体は、3Ｈ、131Ｉ、35Ｓ、１４Ｃ、好ましくは125Ｉである。
抗体を蛍光化合物で標識してもよい。蛍光標識抗体を、適切な波長の光に曝露するとき、その存在が、蛍光により検出されうる。中でも最も一般的に使用される蛍光標識化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、オルトフタルアルデヒド（ｏｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）およびフルオレサミンが挙げられる。抗体は、蛍光発光金属、例えば152Ｅｕまたは他のランタニド系列を使用して検出可能に標識することができる。これらの金属は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属キレート基を使用して抗体に結合することができる。
抗体は、化学発光化合物に結合することによっても検出可能に標識されうる。次いで、化学発光−タグ抗体の存在を、化学反応の経過を通じて生じる蛍光の存在を検出することにより決定する。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、ルシフェリン、イソルミノール、テロマティック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステルである。
同様に、生物発光化合物を使用して、本発明の抗体を標識してもよい。生物発光は、触媒タンパク質が、化学発光反応の効率を増加させる生物系で見られる化学発光の１種である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することにより決定される。標識の目的のための重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびエクオリンである。
本発明の検出アッセイにおいて、生物学的試料に対する抗体の結合量は、標識抗体により放出されるシグナルの強度および／または標識抗体に結合される生物学的試料における細胞の数により決定されうる。
がん試料におけるΔ１３３ｐ５３βまたはΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの発現レベルの検出は、とりわけ、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射定量アッセイ（ＩＲＭＡ）、および／または酵素免疫アッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））で決定されうる。
「放射免疫アッセイ」は、抗原の放射活性標識形態（つまり、Δ１３３ｐ５３βまたはΔ１３３ｐ５３γポリペプチド）を使用して抗原の濃度を検出および測定するための技術である。抗原についての放射活性標識の例としては、3Ｈ、14Ｃおよび125Ｉが挙げられる。生物学的試料における抗原（Δ１３３ｐ５３βまたはΔ１３３ｐ５３γポリペプチド）の濃度は、試料中の非標識抗原を、放射活性標識抗原と、抗原に対する抗体（抗Δ１３３ｐ５３βまたは抗Δ１３３ｐ５３γ抗体）の結合について競合させることにより測定される。標識抗原と未標識抗原との間の競合結合を確実にするために、標識抗原は、抗体の結合部位を飽和させるために十分な濃度で存在する。試料中の抗原の濃度が高いほど、抗体に結合する標識抗原の濃度は低くなる。
放射免疫アッセイでは、抗体に結合した標識抗原の濃度を決定するために、抗原−抗体複合体を、遊離の抗原から分離しなければならない。抗原−抗体複合体を遊離抗原から分離するための一つの方法は、抗アイソタイプ抗血清を用いて抗原−抗体複合体を沈降させることによる。抗原−抗体複合体を遊離抗原から分離するための別の方法は、ホルマリン死黄色ブドウ球菌を用いて抗原−抗体複合体を沈降させることによる。抗原−抗体複合体を遊離の抗原から分離するさらに別の方法は、「固相放射免疫アッセイ」を実施することであり、抗体は、セファロースビーズ、ポリスチレンウェル、ポリビニルクロリドウェル、またはマイクロタイターウェルに連結（つまり共有結合）される。抗体に結合した標識抗原の濃度を、既知濃度の抗原を有する試料に基づく標準曲線と比較することにより、生物学的試料における抗原の濃度を決定することができる。
「免疫放射定量アッセイ」（ＩＲＭＡ）は、抗体試薬が放射活性標識されている免疫アッセイである。ＩＲＭＡは、タンパク質、例えば、ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）へのコンジュゲーションなどの技術による多価抗原コンジュゲートの生成を必要とする。多価抗原コンジュゲートは、１分子あたり少なくとも２つの抗原残基を有する必要があり、抗原残基は、抗原への少なくとも２つの抗体による結合を可能にするために十分な距離になければならない。例えば、ＩＲＭＡでは、多価抗原コンジュゲートは、プラスチックスフェアなどの固体表面に結合してもよい。
未標識「試料」抗原と、抗原に対する放射活性標識抗体とが、多価抗原コンジュゲート被覆スフェアを含有する試験管に添加される。試料中の抗原は、抗原抗体結合部位について、多価抗原コンジュゲートと競合する。適切なインキュベーション期間後、未結合反応物を洗浄により除去し、固相上の放射活性量を測定する。結合された放射活性抗体の量は、試料中の抗原の濃度と逆比例する。
最も一般的な酵素免疫アッセイは、「酵素結合免疫吸着アッセイ」（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）である。「酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）」は、抗体の標識された（つまり、酵素結合された）形態を使用して、抗原の濃度を検出および測定する技術である。
「サンドイッチＥＬＩＳＡ」では、抗体（抗Δ１３３ｐ５３βまたは抗Δ１３３ｐ５３γ抗体）が固相（つまり、マイクロタイタープレート）に連結され、抗原（Δ１３３ｐ５３βまたはΔ１３３ｐ５３γポリペプチド）を含む生物学的試料に曝露される。次いで固相を洗浄し、未結合の抗原を除去する。抗原に対する酵素結合抗体を、次いで、（存在すれば）結合抗原に結合させ、抗体−抗原−抗体サンドウィッチを形成する。抗体に結合しうる酵素の例は、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、ウレアーゼ、および３−ガラクトシダーゼである。酵素連結抗体を、基質と反応させ、アッセイ可能な呈色反応産物を生成する。
「競合的ＥＬＩＳＡ」では、抗体（抗Δ１３３ｐ５３βまたは抗Δ１３３ｐ５３γ抗体）が、抗原（Δ１３３ｐ５３βまたはΔ１３３ｐ５３γポリペプチド）を含有する試料とインキュベートされる。抗原−抗体混合物を、次いで、抗原被覆固相（つまり、マイクロタイタープレート）と接触させる。試料中に存在する抗原が多いほど、固相に結合することができる遊離抗体はより少なくなる。酵素連結二次抗体を、次いで固相に添加し、固相に結合した一次抗体の量を決定する。
「免疫組織化学アッセイ」では、組織の断片を、アッセイされるタンパク質に特異的な抗体に組織を曝露することにより、特異的なタンパク質について試験する。次いで、いくつかの方法のいずれかにより抗体を視覚化して、存在するタンパク質の存在および量を決定する。抗体を視覚化するために使用される方法の例は、例えば、抗体への酵素結合（例えば、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、もしくはＰ−ガラクトシダーゼ）、または化学的方法（例えば、ＤＡＢ／呈色基質）、または当業者に既知の多くの様々な方法のいずれかによる金、蛍光もしくは標識抗体を通じた方法が挙げられる。
核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ）レベルでの測定
化学療法抗がん処置が、がん幹細胞を誘導するリスクを予測するための本発明による方法の別の実施形態では、前記未処置および既処置がん試料におけるΔ１３３ｐ５３βまたはΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの発現レベルが、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方のｍＲＮＡもしくは対応するｃＤＮＡの量を測定することによって、核酸レベルで測定される。この場合に、未処置および既処置がん試料を形質転換する予備的サブステップは、がん試料に存在するｍＲＮＡを抽出し、その後に前記ｍＲＮＡをｃＤＮＡに変化させてもよい、サブステップを含んでもよい。細胞または組織試料からｍＲＮＡを抽出するための方法、ならびにｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換するための方法は、当業者にとって周知である。それにもかかわらず、ｍＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに変化させてもよい、そのような予備的サブステップは、使用する細胞または組織試料において特定のｍＲＮＡの量を直接測定することができる一部の特定の技術（例えば、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）の場合には、必ずしも必要でない。
前記未処置および既処置がん試料においてΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルを、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方のｍＲＮＡまたは対応するｃＤＮＡの量を測定することによって、核酸レベルで測定するとき、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ発現レベルを測定するための、当業者に既知の任意の適切な技術を使用しうる。適切な技術としては、核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ）マイクロアレイ、定量ＰＣＲ、次世代シーケンシング、および標識プローブを用いたハイブリダイゼーション（例えば、ノーザンハイブリダイゼーションおよびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）が挙げられる。
特に、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）が有用でありうる。ｑＲＴ−ＰＣＲは、当業者にとって周知であって容易に利用な可能な技術であり、詳細を記載する必要はない。ｑＲＴ−ＰＣＲをベースとする方法の例は、例えば、米国特許第７，１０１，６６３号に見ることができる。例えば、市販のｑＲＴ−ＰＣＲベースの方法（例えば，Ｔａｑｍａｎ（登録商標）Ａｒｒａｙ）を利用することができ、プライマーおよび／またはプローブは、上記表１に記載のΔ１３３ｐ５３βまたはΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの配列を基にして容易に設計しうる。本発明による予測方法の好ましい実施形態では、前記がん試料におけるΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βアイソフォームおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルが、核酸レベルで、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βアイソフォームおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方のｍＲＮＡまたは対応するｃＤＮＡの量をｑＲＴ−ＰＣＲにより測定することによって、測定される。
核酸アッセイまたはアレイも、がん試料におけるΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルをｉｎ ｖｉｔｒｏで評価するために、がん試料におけるΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの量をｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することにより、使用することができる。
一部の実施形態では、核酸マイクロアレイを調製または購入してもよい。アレイは、通常、固体支持体と、支持体に接触する少なくとも１つの核酸（ｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチド）とを含み、ここで該オリゴヌクレオチドは遺伝子の少なくとも１部に相当する。任意の適切なアッセイプラットフォームを、ｉｎ ｖｉｔｒｏでがん試料中のΔ１３３ｐ５３βまたはΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの量を測定するために使用することができる。例えば、アッセイは、膜、チップ、ディスク、試験紙、フィルター、マイクロスフェア、マルチウェルプレートなどの形態であってもよい。アッセイ系は、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、または１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに結合する核酸（ｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチド）が付着した固体支持体を有してもよい。固体支持体は、例えば、プラスチック、シリコン、金属、樹脂、またはガラスを含みうる。アッセイ成分は、遺伝子を検出するためのキットとして調製し、一緒にパッケージしてもよい。標的核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ）試料の発現プロファイルを決定するために、前記試料を標識し、ハイブリダイゼーション条件下でマイクロアレイと接触させ、マイクロアレイ表面に結合させたプローブ配列に相補的な標的核酸との間で複合体を形成させる。次いで、標識されたハイブリダイズされた複合体の存在が検出される。マイクロアレイハイブリダイゼーション技術の多くの変形が、当業者に利用可能である。
標識プローブを用いたハイブリダイゼーションを使用する他の技術を使用してもよい。標識プローブの配列は、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするように選択される。適切なプローブ配列の例は、下記表４に開示されている。標識プローブは、それに結合された標識基、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子を含む。
別の実施形態では、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ発現レベルのｉｎ ｖｉｔｒｏ測定は、がん試料から抽出されたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡをシーケンシングすることにより実施してもよい。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ試料を増幅させて、方法の検出感受性を増加させてもよい。そのような増幅は、当業者に既知の任意の適切な技術、例えば、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ反応を使用して実施しうる。この場合には、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォームまたはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの増幅を可能にするプライマーが使用される。前記プライマーは、とりわけ、下記表４に示される配列を有しうる。

ステップｂ）−前記化学療法抗がん剤を用いたがん試料の処置
ステップｂ）では、がん試料（またはその一部）が、前記化学療法抗がん剤で処置される。
ステップｄ） ステップａ）およびｃ）で測定される発現レベルの比較
ステップｄ）では、ステップｃ）で測定される、対象の既処置がん試料におけるΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルを、ステップａ）で測定される、対象の未処置がん試料におけるΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルと比較する。
より詳細には、ステップｃ）で測定される、対象の既処置がん試料におけるΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルが、
（ｉ）ステップａ）で測定される、対象の未処置がん試料におけるΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルより高いか、または、
（ｉｉ）ステップａ）で測定される、対象の未処置がん試料におけるΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルより低いまたは同等である。
ステップｅ）−がん幹細胞が誘導されるリスクの予測
ステップｅ）では、
（ｉ）ステップｃ）で測定されるΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルが、ステップａ）で測定されるΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルより高い場合には、前記化学療法抗がん剤を用いた処置が記対象においてがん幹細胞を誘導する重大なリスクがある、あるいは
（ｉｉ）ステップｃ）で測定されるΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルが、ステップａ）で測定されるΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルより低いまたは同等である場合には、前記化学療法抗がん剤を用いた処置が前記対象においてがん幹細胞を誘導する重大なリスクはない
と結論づけられる。
好ましい実施形態
化学療法抗がん剤を用いた処置が、がん罹患対象においてがん幹細胞を誘導するリスクを予測するための本発明による方法の様々な一般的要素に対応する様々な好ましい特別な特徴は、この要素に特に関連する項目において上記で説明されている。本発明の内容において、特定の要素についての適切な特徴のそれぞれの列挙、および特定の要素について開示されたそれぞれの特別な特徴は、任意の一般的な他の要素、前記の他の要素についての適切な特徴の列挙、または前記他の要素について開示された任意の特別な特徴と組み合わされてもよい。
特に、化学療法抗がん剤を用いた処置が、がん罹患対象においてがん幹細胞を誘導するリスクを予測するための本発明による方法の要素の好ましい実施形態は、任意の一般的な他の要素、または前記他の要素の好ましい実施形態と組み合わされてもよい。
好ましい実施形態は、その少なくとも１つの要素が、下記表５に列挙されているような好ましい実施形態に限定される、実施形態に相当する。
化学療法抗がん剤を用いた処置が、がん罹患対象においてがん幹細胞を誘導するリスクを予測するための本発明による方法の特に好ましい実施形態では、ステップａ）で提供されるがん細胞は乳がん細胞であり、ステップａ）およびｃ）で発現が測定されるＰ５３アイソフォームはΔ１３３ｐ５３βアイソフォームまたはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームであり、発現レベルは核酸レベルでｍＲＮＡまたは対応するｃＤＮＡの量を測定することにより測定される。
がん罹患対象におけるがんの処置
本発明者らは、エトポシド（トポイソメラーゼＩＩ阻害剤）によるがん細胞による抗がん処置が、効率的でない（処置に耐性である）だけでなく、Δ１３３ｐ５３βの発現レベルを増加させることによって、がん幹細胞性を促進させうるという同じ知見に基づき、本発明は、がん罹患対象においてがんの処置に使用するための化学療法抗がん剤であって、Δ１３３ｐ５３βまたはΔ１３３ｐ５３γアイソフォーム発現を減少させる薬剤と組み合わせて前記対象に投与される化学療法抗がん剤にも関する。
同様に、本発明は、がん罹患対象におけるがんを処置するための方法であって、
ａ）治療有効量の、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を減少させる薬剤を、前記対象に投与することと、
ｂ）治療有効量の化学療法抗がん処置を、前記対象に投与することと
を含む方法に関する。
化学療法抗がん処置
本発明による治療的使用において、がん対象に投与される化学療法抗がん剤は、米国がん協会によって列挙されている任意の化学療法抗がん剤であってもよい。好ましくは、化学療法抗がん剤は、
・トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えば、エトポシド、エトポシド、テノポシド、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ミトキサントロンおよびアムサクリン、
・抗チューブリン剤、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセルなどのタキサン、ならびにビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビンなどのビンカアルカロイド、
・抗代謝剤、例えば、ピリミジン類似体５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）
から選択される。
好ましい実施形態では、がん対象に投与される化学療法抗がん処置は、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、特にエトポシド、エトポシド、テノポシド、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ミトキサントロンおよびアムサクリンから選択されるトポイソメラーゼＩＩ阻害剤である。より好ましくは、がん対象に投与される化学療法抗がん処置は、エトポシドである。
Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を減少させる薬剤
Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を減少させる任意の薬剤を使用しうる。
Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を減少させる薬剤としては、アンチセンスＲＮＡまたは干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）、例えば、より詳細には、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が挙げられる。
Δ１３３ｐ５３βおよび／またはΔ１３３ｐ５３γアイソフォーム発現を減少させる特異的ｓｈＲＮＡにより標的とされる配列を、下記表６に示す。
Δ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームは、ｐ５３遺伝子の選択的スプライシングが起こるときに発現する。結果として、Δ１３３ｐ５３βおよび／またはΔ１３３ｐ５３γアイソフォーム発現を減少させる薬剤には、選択的スプライシングを標的とする薬剤、例えば、式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、（Ｉｆ）、（Ｉｇ）、（Ｉｈ）、（Ｉｉ）、（Ｉｊ）、（Ｉｋ）、（Ｉｌ）、（Ｉｍ）、（Ｉｏ）、（Ｉｐ）、（Ｉｑ）、（Ｉｒ）、（Ｉｅｅ）の化合物、より詳細にはＷＯ２０１０／１４３１６８に開示の化合物（１）〜（１６８）およびその薬学的に許容される塩も含まれる。化合物（６）、（１８）、（３０）、（３５）、（３６）、（３７）、（４５）、（４８）、（５１）、（５２）、（５３）、（５５）、（５６）、（５８）、（６１）、（６３）、（６４）、（１０９）、（１１０）、（１１２）、（１４３）、（１４４）および（１４８）が好ましい。
当業者は、本発明のスクリーニング方法を使用して、Δ１３３ｐ５３βおよび／またはΔ１３３ｐ５３γアイソフォーム発現を減少させる他の薬剤もスクリーニングすることができる。
投与レジメン
化学療法抗がん剤と、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を減少させる薬剤とは、治療有効量で投与される。
化学療法抗がん剤と、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を減少させる薬剤とは、同時に（同じ組成物でまたは２つの別個の組成物で）投与されてもよく、または連続的に投与されてもよく、または両方同時（同じ組成物でまたは２つの別個の組成物で）かつ連続的に投与されてもよい（つまり、両方の化合物がある期間に同時に投与されるが、１方または他方の化合物が同時投与期間の前および／または後に単独で投与される）。
一実施形態では、両方の化合物が、同時に（同じ組成物でまたは２つの別個の組成物で）投与される。別の実施形態では、両方の化合物が、連続的に投与される。この場合に、化学療法抗がん剤が、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を減少させる薬剤の前に投与されてもよく、あるいは、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を減少させる薬剤が、化学療法抗がん剤の前に投与されてもよい。
別の実施形態では、両方の化合物が、一定期間中に同時に投与されるが、１つまたは他の化合物が同時投与期間の前および／または後に単独で投与される。これには、以下が含まれる：
・化学療法抗がん剤単独の先行投与、続けて化学療法抗がん剤とΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を減少させる薬剤との同時投与、
・Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を減少させる薬剤単独の先行投与、続けて、化学療法抗がん剤とΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を減少させる薬剤との同時投与、
・化学療法抗がん剤とΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を減少させる薬剤との同時投与、続けて化学療法抗がん剤の単独投与、
・化学療法抗がん剤とΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を減少させる薬剤との同時投与、続けてΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を減少させる薬剤の単独投与。
・化学療法抗がん剤単独の先行投与、続けて化学療法抗がん剤とΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を減少させる薬剤との同時投与、続けて化学療法抗がん剤の単独投与、
・化学療法抗がん剤単独の先行投与、続けて化学療法抗がん剤とΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を減少させる薬剤との同時投与、続けてΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を減少させる薬剤の単独投与、
・Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を減少させる薬剤単独の先行投与、続けて化学療法抗がん剤とΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を減少させる薬剤との同時投与、続けて化学療法抗がん剤の単独投与、ならびに
・Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を減少させる薬剤単独の先行投与、続けて、化学療法抗がん剤とΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を減少させる薬剤との同時投与、続けてΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を減少させる薬剤の単独投与。
化学療法抗がん剤は、がん幹細胞の誘導を促進しうるので、好ましい投与レジメンは、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を減少させる薬剤が、化学療法抗がん剤と同時に（少なくともある期間内に同じ組成物でまたは２つの別個の組成物で）および／または化学療法抗がん剤の投与後に投与されるレジメンである。そのような好ましい投与レジメンとしては、以下が挙げられる：
・両方の化合物の同時投与、
・化学療法抗がん剤の単独投与、続けてΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を減少させる薬剤の単独投与、
・化学療法抗がん剤とΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を減少させる薬剤との同時投与、続けてΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を減少させる薬剤の単独投与、
・化学療法抗がん剤単独の先行投与、続けて化学療法抗がん剤とΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を減少させる薬剤との同時投与、続けてΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を減少させる薬剤の単独投与、ならびに
・Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を減少させる薬剤単独の先行投与、続けて化学療法抗がん剤とΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を減少させる薬剤との同時投与、続けてΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を減少させる薬剤の単独投与。
好ましい実施形態
化学療法抗がん剤と、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を減少させる薬剤との本発明による組み合わせの治療的使用の、様々な一般的要素に対応する様々な好ましい特別な特徴は、この要素に特に関連する項目において上記で説明されている。本発明の内容において、特定の要素についての適切な特徴のそれぞれの列挙、および特定の要素について開示されたそれぞれの特別な特徴は、任意の一般的な他の要素、前記の他の要素についての適切な特徴の列挙、または前記他の要素について開示された任意の特別な特徴と組み合わされてもよい。特に、化学療法抗がん剤と、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を減少させる薬剤との本発明による組み合わせの治療的使用の要素の好ましい実施形態は、任意の一般的な他の要素、または前記他の要素の好ましい実施形態と組み合わされてもよい。
好ましい実施形態は、その少なくとも１つの要素が、下記表７に列挙されているような好ましい実施形態に限定される、実施形態に相当する。
化学療法抗がん剤と、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を減少させる薬剤との本発明による組み合わせの治療的使用の特に好ましい実施形態では、がんは乳がんであり、化学療法抗がん剤はエトポシドであり、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方を減少させる薬剤は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、または式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、（Ｉｆ）、（Ｉｇ）、（Ｉｈ）、（Ｉｉ）、（Ｉｊ）、（Ｉｋ）、（Ｉｌ）、（Ｉｍ）、（Ｉｏ）、（Ｉｐ）、（Ｉｑ）、（Ｉｒ）、（Ｉｅｅ）の化合物、より詳細にはＷＯ２０１０／１４３１６８に開示の化合物（１）〜（１６８）およびその薬学的に許容される塩（特に化合物（６）、（１８）、（３０）、（３５）、（３６）、（３７）、（４５）、（４８）、（５１）、（５２）、（５３）、（５５）、（５６）、（５８）、（６１）、（６３）、（６４）、（１０９）、（１１０）、（１１２）、（１４３）、（１４４）および（１４８））の化合物から選択される選択的スプライシングを標的とする薬剤である。
転移のリスクの予測
本発明者らにより得られた結果は、Δ１３３ｐ５３βまたはΔ１３３ｐ５３γアイソフォーム発現が、特に、転写因子Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４およびＮａｎｏｇの発現を上方制御することにより、がん幹細胞潜在能力を促進することを示し、Δ１３３ｐ５３βまたはΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの発現が、がん細胞をがん幹細胞へ向かわせる再プログラミングの初期事象でありえ、Δ１３３ｐ５３βまたはΔ１３３ｐ５３γアイソフォーム発現の検出に加えて他のがん幹細胞の特徴を検出することが、がん罹患対象におけるがん転移のリスク予測の信頼性を向上させうることを示唆する。
したがって、本発明はさらに、がん罹患対象におけるがん転移のリスクを、前記対象のがん試料から予測するための方法であって、
ａ）前記がん試料においてΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方を発現するスフェア形成がん細胞を検出することと、
ｂ）Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方を発現するスフェア形成がん細胞が検出される場合には、前記対象においてがん転移の重大なリスクがあり、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方を発現するスフェア形成がん細胞が検出されない場合には、前記対象におけるがん転移の重大なリスクはないと結論付けることと
を含む方法に関する。
がんおよびがん試料
転移のリスクを予測するための本発明による方法では、対象が罹患しているがんは、好ましくは固形がんの群から選択され、特に乳がん、卵巣がん、消化管がん（胃腸がんとも称され、結腸直腸がん、食道がん、胃がん、膵臓がん、肝細胞癌、胆管細胞がんおよび奇形癌腫を含む）、膵臓がんおよび咽頭がんからなる群から選択され、特にヒト対象のがんであり、より好ましくは、乳がん、結腸直腸がん、胃腸がん、肺がんおよび前立腺がんであり、さらにより好ましくは、対象が罹患しているがんは、乳がんまたは結腸直腸がんである。
さらに、対象が罹患しているがんは、造血がんの群から選択されえ、特に白血病およびリンパ腫からなる群から選択されうる。好ましくは、造血がんは、ヒト造血がんである。
多くの種類のがん細胞が、Ｙａｍａｎａｋａ因子（Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃ）の少なくとも１つおよび好ましくは複数が形質導入されたときにＣＳＣを生じうることは、当該分野で既知である。このことが示されたがん細胞の例としては、以下が挙げられる：
・結腸（または結腸直腸）がん細胞（例えば、Oshimaら(2014)参照、この文献には、因子Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２およびＫＬＦ４を形質導入された結腸がん細胞が、マーカー遺伝子発現およびスフェア形成の観点において、顕著に増強されたＣＳＣ様式を示したことが記載されている）、
・胃腸がん細胞（結腸直腸がん、食道がん、胃がん、膵臓がん、肝細胞癌、胆管細胞がんおよび奇形癌腫の細胞を含む）。Miyoshiら(2010)は、上記胃腸がんから取得された、Ｎａｎｏｇ転写因子で誘導された細胞が、ＣＳＣのような多能性を顕在化したことを開示している、
・肺がん細胞（Chiouら, 2010参照、この文献は、肺腺癌細胞におけるＯｃｔ４およびＮａｎｏｇ転写因子の異所性発現がスフェア形成を誘導することを記載している）、ならびに
・前立腺がん細胞（Jeterら, 2011参照、この文献は、前立腺がん細胞株におけるテトラサイクリン誘導性Ｎａｎｏｇ過剰発現が、いくつかのＣＳＣ関連分子の発現を増強することにより、腫瘍再生を促進することを記載している）。
Δ１３３ｐ５３βアイソフォームまたはΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの形質導入は、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＯｃｔ３／４の発現を誘導するため、Ｙａｍａｎａｋａ因子（Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃ）の少なくとも１つおよび好ましくは複数が形質導入されたときにＣＳＣを生ずることが知られている任意のがん細胞へのその形質導入は、ＣＳＣを生ずると予測される。このことは、本発明者らにより、２つの別個の種類のがん細胞、つまり乳がん細胞および結腸がん細胞で実証された。ステップａ）でΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルが測定されるがん試料は、がん生検またはがん外科的切除物の全部もしくは一部でありうる。選択的に、ステップａ）でΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βアイソフォームおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルが測定されるがん試料は、血液試料でありうる。実際、がん細胞（がん幹細胞を含む）は、血液中を循環することが周知である（Mavroudis-2010;Alix-Panabieresら,. 2013）。
アイソフォーム
転移のリスクの本発明による方法の好ましい実施形態では、Δ１３３ｐ５３βアイソフォームまたはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルがステップａ）で測定される。実際、Δ１３３ｐ５３βアイソフォームの発現は、がん幹細胞の誘導と特に関連している。
Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現の検出
ステップａ）では、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現が検出される。
この目的のために、化学療法抗がん処置ががん幹細胞を誘導するリスクを予測するための本発明による方法に関連して開示されている任意の方法を使用しうる。
がん細胞スフェア形成能の検出
がん幹細胞表現型は、無血清（および好ましくは低接着）培養条件下でスフェアを形成するがん幹細胞の優先的能力によっても特徴づけられ、一方でバルク腫瘍細胞では、同じ条件下でスフェアを形成する能力は弱い。
がん細胞のスフェア形成能は、
ｉ）がん細胞を、無血清培地中に、好ましくは特別な成長因子（例えば、限定されないが、上皮成長因子（ＥＧＦ）および塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ））の存在下、再懸濁し、それらを、好ましくは哺乳動物細胞が十分に接着しない、組織培養皿に播種することと、
ｉｉ）がん細胞を、５〜２０日間インキュベートすることと、
ｉｉｉ）スフェアを計数することと
を含むアッセイを使用して試験されうる。
ステップｉ）では、がん細胞が、無血清培地（例えば、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａから入手可能なＭａｍｍｏＣｕｌｔ（登録商標）中に、好ましくは特別な成長因子、例えばＥＧＦおよびｂＦＧＦの存在下、再懸濁され、組織培養皿中に蒔かれる。好ましくは、哺乳動物細胞が十分に接着しない組織培養皿が選択される（例えば、Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｐｌａｔｅ、２４ウェル、平底、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ製）。このステップでは、播種密度は、好ましくは２５０〜２５００細胞／ｃｍ2に維持され、好ましくは各種のがん細胞に対して最適化される。
例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ（商標）Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ、ヒドロコルチゾンおよびヘパリン（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が濃縮されたＭａｍｍｏＣｕｌｔ（商標）培地における乳がん細胞の場合、Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｐｌａｔｅ、２４ウェル、平底（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ）に５００細胞／ウェルの播種密度が適切である。
ステップｉｉ）では、がん細胞は、好ましくは約３７℃で、５％ＣＯ2雰囲気下、５〜２０日間、好ましくは７〜１５日間、インキュベートされる。
最後に、ステップｃ）では、インキュベーションの間に形成されたスフェアを計数する。そのような計数は、好ましくは顕微鏡、好ましくは位相差顕微鏡を使用してなされ、好ましくは少なくとも５０μｍの大きさのスフェアを計数する。がん試料は、スフェアが少なくとも２５００細胞／ｃｍ2の最大播種密度で計数されうるとき、スフェア形成がん細胞を含むと考えられる。
好ましい実施形態
転移のリスクを予測するための本発明による方法の様々な一般的要素に対応する様々な好ましい特別な特徴は、この要素に特に関連する項目において上記で説明されている。本発明の内容において、特定の要素についての適切な特徴のそれぞれの列挙、および特定の要素について開示されたそれぞれの特別な特徴は、任意の一般的な他の要素、前記の他の要素についての適切な特徴の列挙、または前記他の要素について開示された任意の特別な特徴と組み合わされてもよい。
特に、転移のリスクを予測するための本発明による方法の要素の好ましい実施形態は、任意の一般的な他の要素、または前記他の要素の好ましい実施形態と組み合わされてもよい。
好ましい実施形態は、その少なくとも１つの要素が、下記表８に列挙されているような好ましい実施形態に限定される、実施形態に相当する。
転移のリスクを予測するための本発明による方法の特に好ましい実施形態では、がんは乳がんであり、ステップａ）で検出されるＰ５３アイソフォームは、Δ１３３ｐ５３βアイソフォームまたはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームであり、その／それらの発現レベルは、ｍＲＮＡまたは対応するｃＤＮＡの量を（好ましくはｑ−ＲＴ−ＰＣＲにより）測定することにより、核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ）レベルで測定され、スフェア形成能力は、上記表８に記載の好ましいアッセイにより検出される。
既処置がん患者におけるがん再発のリスクの予測
上記のように、本発明者らにより得られた結果は、Δ１３３ｐ５３βまたはΔ１３３ｐ５３γアイソフォーム発現が、特に、転写因子Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４およびＮａｎｏｇの発現を上方制御することによりがん幹細胞潜在能力を促進し、Δ１３３ｐ５３βまたはΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの発現が、がん細胞をがん幹細胞へ向かわせる再プログラミングの初期事象でありうることを示唆することを示す。したがって、ほとんどのがん細胞を成功裡に消滅させた既処置がん対象においてがんが再発するリスクを、前記対象から得られた細胞試料においてΔ１３３ｐ５３βまたはΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの１つまたは両方が発現しているかどうかで予測することができる。
したがって、本発明はさらに、既処置がん対象におけるがん再発のリスクを、前記対象の細胞試料から予測するための方法であって、
ａ）前記細胞試料において、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を検出することと、
ｂ）Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現が検出された場合には、前記対象においてがん再発の重大なリスクがあり、Δ１３３ｐ５３βアイソフォームまたはΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの発現のいずれも検出されない場合には、前記対象においてがん再発の重大なリスクはないと結論付けることと
を含む方法に関する。
既処置がん対象におけるがん再発のリスクを予測するための本発明による方法は、試験された細胞試料におけるΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を、前記既処置がん対象由来の先に試験されたがん試料における同じアイソフォームの発現と比較するさらなるステップｃ）を含んでもよい。
この方法は、がん再発の診断を確実にするために、予防的方法として、がんの処置の後に１回または複数回実施してもよい。
がんおよび非がん性細胞試料
がん再発のリスクを予測するための本発明による方法では、対象が成功裡に処置された（ほとんどのがん細胞を消滅させた）がんは、好ましくは固形がんの群から選択され、特に乳がん、卵巣がん、消化管がん（胃腸がんとも称され、結腸直腸がん、食道がん、胃がん、膵臓がん、肝細胞癌、胆管細胞がんおよび奇形癌腫を含む）、膵臓がんおよび咽頭がんからなる群から選択され、特にヒト対象のがんであり、より好ましくは、乳がん、結腸直腸がん、胃腸がん、肺がんおよび前立腺がんであり、さらにより好ましくは、がんは、乳がんまたは結腸直腸がんである。
さらに、がんは、造血がんの群から選択されえ、特に白血病およびリンパ腫からなる群から選択されうる。好ましくは、造血がんは、ヒト造血がんである。
多くの種類のがん細胞が、Ｙａｍａｎａｋａ因子（Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃ）の少なくとも１つおよび好ましくは複数が形質導入されたときにＣＳＣを生じうることは、当該分野で既知である。このことが示されたがん細胞の例としては、以下が挙げられる：
・結腸（または結腸直腸）がん細胞（例えば、Oshimaら(2014)参照、この文献には、因子Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２およびＫＬＦ４を形質導入された結腸がん細胞が、マーカー遺伝子発現およびスフェア形成の観点において、顕著に増強されたＣＳＣ様式を示したことが記載されている）、
・胃腸がん細胞（結腸直腸がん、食道がん、胃がん、膵臓がん、肝細胞癌、胆管細胞がんおよび奇形癌腫の細胞を含む）。Miyoshiら(2010)は、上記胃腸がんから取得された、Ｎａｎｏｇ転写因子で誘導された細胞が、ＣＳＣのような多能性を顕在化したことを開示している。
・肺がん細胞（Chiouら, 2010参照、この文献は、肺腺癌細胞におけるＯｃｔ４およびＮａｎｏｇ転写因子の異所性発現がスフェア形成を誘導することを記載している）、ならびに
・前立腺がん細胞（Jeterら, 2011参照、この文献は、前立腺がん細胞株におけるテトラサイクリン誘導性Ｎａｎｏｇ過剰発現が、いくつかのＣＳＣ関連分子の発現を増強することにより、腫瘍再生を促進することを記載している）。
Δ１３３ｐ５３βアイソフォームまたはΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの形質導入は、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＯｃｔ３／４の発現を誘導するため、Ｙａｍａｎａｋａ因子（Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃ）の少なくとも１つおよび好ましくは複数が形質導入されたときにＣＳＣを生ずることが知られている任意のがん細胞へのその形質導入は、ＣＳＣを生ずると予測される。このことは、本発明者らにより、２つの別個の種類のがん細胞、つまり乳がん細胞および結腸がん細胞で実証された。
ステップａ）でΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルが測定される細胞試料は、上記の細胞試料のがんにより先に影響を受けた組織またはその下部組織の生検でありうる。選択的に、ステップａ）でΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルが測定されるがん試料は、血液試料でありうる。実際、がん細胞（がん幹細胞を含む）は、血液中を循環することが周知である（Mavroudis-2010; Alix-Panabieresら,. 2013）。
アイソフォーム
がん再発のリスクの本発明による方法の好ましい実施形態では、Δ１３３ｐ５３βアイソフォームまたはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルがステップａ）で測定される。実際、Δ１３３ｐ５３βアイソフォームの発現は、がん幹細胞の誘導と特に関連している。
Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現の検出
ステップａ）では、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現が検出される。
この目的のために、化学療法抗がん処置ががん幹細胞を誘導するリスクを予測するための本発明による方法に関連して開示されている、任意の方法を使用しうる。
好ましい実施形態
転移のリスクを予測するための本発明による方法の様々な一般的要素に対応する様々な好ましい特別な特徴は、この要素に特に関連する項目において上記で説明されている。本発明の内容において、特定の要素についての適切な特徴のそれぞれの列挙、および特定の要素について開示されたそれぞれの特別な特徴は、任意の一般的な他の要素、前記の他の要素についての適切な特徴の列挙、または前記他の要素について開示された任意の特別な特徴と組み合わされてもよい。
特に、治癒患者のがんの再発リスクを予測するための本発明による方法の要素の好ましい実施形態は、任意の一般的な他の要素、または前記他の要素の好ましい実施形態と組み合わされてもよい。
好ましい実施形態は、その少なくとも１つの要素が、下記表８ａに列挙されているような好ましい実施形態に限定される、実施形態に相当する。
がん治癒対象の再発のリスクを予測するための本発明による方法の特に好ましい実施形態では、がんは乳がんであり、ステップａ）で検出されるＰ５３アイソフォームは、Δ１３３ｐ５３βアイソフォームまたはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームであり、その／それらの発現レベルは、非がん性細胞組織試料におけるｍＲＮＡまたは対応するｃＤＮＡの量を（好ましくはｑ−ＲＴ−ＰＣＲにより）測定することにより、核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ）レベルで測定される。
抗がん幹細胞剤のスクリーニング
Δ１３３ｐ５３βまたはΔ１３３ｐ５３γアイソフォーム発現が、特に、転写因子Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４およびＮａｎｏｇの発現を上方制御することによりがん幹細胞潜在能力を促進し、Δ１３３ｐ５３βまたはΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの発現が、がん細胞をがん幹細胞へ向かわせる再プログラミングの初期事象でありうることが示唆されるという同じ知見に基づき、本発明は、さらに、潜在的な抗がん幹細胞化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方を発現するスフェア形成がん幹細胞を用意することと、
ｂ）前記がん幹細胞を、試験化合物と接触させること、
ｃ）処理された細胞における前記Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、もしくはΔ１３３ｐ５３βアイソフォームおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルならびに／または処理された細胞のスフェア形成能力をｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することと、
ｄ）処理された細胞における前記Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、もしくはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルが試験化合物を用いた処理の前よりも低い場合ならびに／または処理された細胞のスフェア形成能力が、試験化合物を用いた処理の前よりも低い場合には、前記試験化合物を、潜在的な抗がん幹細胞化合物として選択することと
を含む方法に関する。
Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方を発現するスフェア形成がん幹細胞
ステップａ）で用意する、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方を発現するスフェア形成がん幹細胞は、がん試料から精製してもよく、またはがん幹細胞を製造するための本発明による方法により製造してもよい。
がん試料から精製されるとき、それらは、がん試料のバルクがん細胞を、スフェア形成アッセイにかけ、アッセイで取得されたスフェアを回収し、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現について検査する方法により取得されてもよい。
試験化合物
抗がん幹細胞剤をスクリーニングするための本発明による方法において試験される化合物の種類は特に制限されず、任意の種類の化学的または生物学的化合物を使用することができる。
試験化合物の例としては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、および選択的スプライシングを標的とする薬剤が挙げられる。
前記Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルの測定
ステップｃ）では、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルはｉｎ ｖｉｔｒｏで測定されうる。
この目的のために、化学療法抗がん処置ががん幹細胞を誘導するリスクを予測するための本発明による方法に関連して開示されている、任意の方法を使用しうる。
処理された細胞のスフェア形成能力の測定
ステップｃ）では、処理された細胞のスフェア形成能力が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで測定されうる。この目的のために、転移のリスクを予測するための本発明による方法に関連する上記アッセイが、好ましくは使用される。
好ましい実施形態
抗がん幹細胞剤をスクリーニングするための本発明による方法の様々な一般的要素に対応する様々な好ましい特別な特徴は、この要素に特に関連する項目において上記で説明されている。本発明の内容において、特定の要素についての適切な特徴のそれぞれの列挙、および特定の要素について開示されたそれぞれの特別な特徴は、任意の一般的な他の要素、前記の他の要素についての適切な特徴の列挙、または前記他の要素について開示された任意の特別な特徴と組み合わされてもよい。
特に、抗がん幹細胞剤をスクリーニングする本発明による方法の要素の好ましい実施形態は、任意の一般的な他の要素、または前記他の要素の好ましい実施形態と組み合わされてもよい。
好ましい実施形態は、その少なくとも１つの要素が、下記表９に列挙されているような好ましい実施形態に限定される、実施形態に相当する。
抗がん幹細胞剤をスクリーニングする本発明による方法の特に好ましい実施形態では、がんは乳がんであり、ステップａ）で検出されるＰ５３アイソフォームは、Δ１３３ｐ５３βアイソフォームまたはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームであり、その／それらの発現レベルは、ｍＲＮＡまたは対応するｃＤＮＡの量を（好ましくはｑ−ＲＴ−ＰＣＲにより）測定することにより、核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ）レベルで測定され、スフェア形成能力は、上記表９に記載の好ましいアッセイにより検出される。
以下の実施例は、本発明を例証することのみが意図されている。
（例１）
材料および方法
以下は、下記実施例で使用した材料および方法の詳細である。
プラスミド
ヒトΔ１３３ｐ５３アイソフォーム（α、βおよびγ）を、レトロウイルス作製用ｐＭＳＣＶｈｙｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）プラスミドに３’融合Ｆｌａｇタグあり（Ｓｈ１耐性バリアント）またはなしでクローニングした。Ｓｈ１耐性ｐ５３アイソフォームを取得するための部位特異的変異誘発は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）部位特異的変異誘発キットを使用して実施した。サイレント変異を、以下のオリゴヌクレオチドを使用して導入した。：
５’−ＣＡＴＣＡＣＡＣＴＧＧＡＡＧＡＴＴＣＴＡＧＣＧＧＣＡＡＴＣＴＡＣＴＧＧＧＡＣＧ−３’（配列番号１７）
（下線の付された領域が、Ｓｈ１により標的化される）。
ＳｈＲＮＡ（Ｓｈ）を、ＲＮＡｉ−Ｒｅａｄｙ ｐＳＩＲＥＮ−Ｒｅｔｒｏ Ｑプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にクローン化した。この試験で使用したＳｈ配列は、以下の通りである（図１も参照）：
Ｓｈ１：５’−ＧＡＣＴＣＣＡＧＴＧＧＴＡＡＴＣＴＡＣ−３’（配列番号１３）
Ｓｈ２：５’−ＧＴＣＣＡＧＡＴＧＡＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡＡ−３’（配列番号１８）
Ｓｈ３：５’−ＧＧＡＧＧＴＧＣＴＴＡＣＡＣＡＴＧＴＴ−３’（配列番号１４）
Ｓｈ４：５’−ＣＴＴＧＴＧＣＣＣＴＧＡＣＴＴＴＣＡＡ−３’（配列番号１５）
Ｓｈ５：５’−ＧＧＡＣＣＡＧＡＣＣＡＧＣＴＴＴＣＡ−３’（配列番号１６）
Ｓｈ６：５’−ＧＴＧＡＧＣＧＣＴＴＣＧＡＧＡＴＧＴＴ−３’（配列番号１９）
全てのプラスミドは使用前に配列決定によって検証した。
細胞培養
ヒト乳がん細胞株ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ２３１ Ｄ３Ｈ２ＬＮおよびＣ３ＬＮＤを、１０％ＦＣＳ、ピルビン酸ナトリウムおよびグルタミンを補足したＭＥＭで増殖させた。ウイルス感染後、細胞は、２４〜４８時間後に使用した、または２μｇ／ｍｌのピューロマイシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）もしくは３００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて２日間の選択にかけた。エトポシド処置を、１２．５、２５および５０ｎｇ／ｍｌの最終用量で１６時間実施し、５０ｎｇ／ｍｌ／日で７日間、実施した。
マンモスフェア形成のために、１０００細胞／ｍｌ（５００細胞／ウェル）を、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ（商標）Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ、ヒドロコルチゾンおよびヘパリン（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が濃縮されたＭａｍｍｏＣｕｌｔ（商標）培地を有するＵｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｐｌａｔｅ、２４ウェル、平底（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ）に播種し、１５日間培養した。全てのマンモスフェアアッセイについて、各条件について少なくとも３回の独立した実験を実施し、８〜１２回、繰り返した。自己再生実験について、遺伝子導入した細胞を、マンモスフェア形成の最初のサイクルにかけた。１５日間培養した後すぐに、生成したマンモスフェアを解離し、細胞を同一の条件で再播種して、第１の播種とした。同じプロトコルを、ヒト結腸癌腫細胞株ＳＷ４８０で使用した。
ＭＤＡ−ＭＢ２３１ Ｃ３ＬＮＤ細胞株樹立
Ｃ３ＬＮＤ細胞株は、ヌードマウスで２回ｉｎ ｖｉｖｏ継代した後のＭＤＡ−ＭＢ２３１−ｌｕｃ−Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞株の遠隔転移物から誘導した。簡単には、動物あたり１×１０6細胞を、胸腺欠損ヌードマウス（Ｈｓｄ：Ａｔｈｙｍｉｃ Ｎｕｄｅ−Ｆｏｘｎ１、Ｈａｒｌａｎ）の心臓内注射（１回目の濃縮サイクル）のために滅菌ＰＢＳ中に、または下部左乳腺脂肪体内注射（２回目の濃縮サイクル）のために５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）中に再懸濁した。腫瘍進行および転移までの時間を、全身生物発光イメージングにより毎週追跡した。次いで、浸潤された器官を切除し、腫瘍細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで単離および増殖させた。
Ｉｎ ｖｉｖｏ実験
全てのｉｎ ｖｉｖｏ実験は、実験動物についての仏国規制および倫理ガイドラインを遵守し、認定施設で実施した（規約番号Ｃ３４−１７２−２７）。２．１０6対照またはＳｈ３処置Ｃ３ＬＮＤがん細胞を、６週齢の雌胸腺欠損マウス（Ｈａｒｌａｎ、Ｌｅ Ｍａｌｏｕｒｌｅｔ、仏国）に、心臓内注射（ｎ＝５〜７／群）によって移植した。生物発光検出を使用して、頭部および脚における腫瘍成長および遠隔転移形成を観測した。関心領域（ＲＯＩ）を、腫瘍部位の周囲で線引きし、ＲＯＩにおける全フラックス（ｐｈ／ｓ）を測定した。
抗体、免疫ブロッティングおよび免疫蛍光
以下の抗体を免疫ブロッティングに使用した：抗ｃ−Ｍｙｃ（９Ｅ１０マウスハイブリドーマクローン）、−Ｎａｎｏｇ（ｓｃ−８１９６１、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、−Ｏｃｔ３／４（ｓｃ−８６３０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、−Ｓｏｘ２（ｓｃ−１７３２０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、−ｐ５３（ＤＯ−１； ｓｃ−１２６ Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、−ｐ５３Ｓａｐｕ（Ｖｏｊｔｅｓｅｋら １９９５）、−α−チューブリン（クローンＤＭ１Ａ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、−β−アクチン（クローンＡＣ−７４ Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、−ｐ２１（ｓｃ−３９７ Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）および−Ｆｌａｇ（クローンＭ２；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。二次ＨＲＰコンジュゲート抗体は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製であった。発光定量のために、細胞を段階希釈し、０．５ｍＭのＤ−ルシフェリン（Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートした。発光を、Ｐｏｌａｒｓｔａｒ Ｏｍｅｇａ機器（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ）を使用して定量した。
フローサイトメトリー解析
単一細胞懸濁液を、氷上で、ＣＤ２４−ＦＩＴＣと、ＣＤ４４−ＰＥと、１０％ＦＢＳを含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の製造業者によって示される希釈度の各アイソタイプ対照（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）とを用いて、３０分間標識した。次いで細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ／１０％ＦＢＳ中に再懸濁した。全ての試料を、Ｓｙｔｏｘ Ｂｌｕｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＣｙＡｎ分析機（Ｂｅｃｔｏｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｃ）で分析し、細胞生存度を観測した。
ＲＮＡ抽出およびＲＴ−ｑＰＣＲ
全ＲＮＡを抽出（Ｑｉａｇｅｎ）し、逆転写（ＲＴ）を、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して５０℃で１〜５μｇの全ＲＮＡに実施した。様々なレベルのｍＲＮＡを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０装置（Ｒｏｃｈｅ）でリアルタイムｑＰＣＲによって定量した。簡単に述べると、２０ｎｇのｃＤＮＡを、ｐ５３アイソフォームについて０．１６８μＭの各プライマー、０．２μＭのプローブ（表４）および１Ｘ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０プローブＭａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）を使用し、または他の遺伝子について市販のプライマー（Ｑｉａｇｅｎ）および１Ｘ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０Ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、増幅させた。データを、内部標準ＴＢＰに対して正規化した。使用する様々なプライマーおよび対応する配列は、以前に記載されている（Bourdonら, 2005）。それぞれの単一ウェルの増幅反応について、閾値サイクル数（Ｃｔ）を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０プログラム（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、増幅の対数期で計算した。遺伝子発現における相対変化を、２ΔΔＣｔ方法を使用して決定し、対照と比較して報告した。全ての定量試験は、少なくとも３回の独立した実験を、各条件に対して２回繰り返して、実施した。データは、算術平均±ＳＥＭとして表す。
統計解析
全てのデータは、算術平均±ＳＥＭとして表す。統計解析は、Ｐｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）でノンパラメトリックＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔ検定を用いて実施した。
（例２）
マンモスフェア形成に影響を与えるｐ５３アイソフォームの発現の変化
様々なｐ５３アイソフォームのＣＳＣ潜在能力における役割を調べるために、アイソフォームの特定の群を選択的にサイレンシングするｓｈＲＮＡ（Ｓｈ）を設計した（図１Ａ）。簡単に述べると、Ｓｈ１は、全てのｐ５３アイソフォームをノックダウンするが、一方でＳｈ２は、長ＴＡｐ５３（トランス活性化）およびΔ４０ｐ５３アイソフォームを標的とする。Ｓｈ３およびＳｈ４は、Δ１３３アイソフォーム（α、βおよびγ）の５’ＵＴＲを標的とするが、Ｓｈ５およびＳｈ６は、それぞれβおよびαアイソフォームの３’端を標的とする。
最初に本発明者らはＭＣＦ−７細胞がマンモスフェアを形成する能力を試験した。このアッセイは、ＣＳＣ潜在能力をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価するために広く使用されている。全てのｐ５３アイソフォームの（Ｓｈ１を用いた）サイレンシングは、対照細胞と比較して、マンモスフェア形成の顕著な減少をもたらしたが、一方でＴＡｐ５３およびΔ４０ｐ５３アイソフォームのノックダウン（Ｓｈ２）は効果がなかった（図１ＢおよびＣ）。
並行して、本発明者らは、細胞多能性の重要な制御因子であるｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４およびＮａｎｏｇのｍＲＮＡ（図１Ｆ）およびタンパク質（図２Ａ）発現を測定した。ＴＡｐ５３およびΔ４０ｐ５３（Ｓｈ２）のサイレンシングは、Ｏｃｔ３／４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２の発現を増加させたが、ｃ−Ｍｙｃの発現は増加させず、全てのｐ５３アイソフォームの枯渇は（Ｓｈ１）は効果がなかった。ＴＡｐ５３およびΔ４０ｐ５３（Ｓｈ２）の枯渇は、Δ１３３アイソフォームの発現を増加させた（図１Ｇ）。
これらの結果は、ＭＣＦ−７細胞におけるＣＳＣ潜在能力が、幹細胞性の抑制因子として先に特定されていたＴＡｐ５３αによってのみ制御されているのではないことを示唆する。この仮説を精査するために、本発明者らは、２つの異なるｓｈＲＮＡ（Ｓｈ３および４）を使用して、全てのΔ１３３アイソフォームを枯渇させた。両方のｓｈＲＮＡが、単独または組み合わせのいずれで使用しても、ＭＣＦ−７細胞におけるマンモスフェア形成を顕著に減少させ、これらのΔ１３３アイソフォームがＣＳＣ潜在能力における重要な制御因子であることを示唆する（図１ＢおよびＤ）。したがって、Ｏｃｔ３／４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２は、Δ１３３アイソフォームがサイレンシングされた細胞において顕著に下方制御された（図２Ａ）。再度、ｃ−Ｍｙｃ発現は、影響を受けなかった。本発明者らは、次いで、βおよびαアイソフォームのサイレンシングの効果を評価した。マンモスフェア形成は、βアイソフォームがノックダウンされた細胞において、顕著に減少した（Ｓｈ５；図１Ａ）。全てのαアイソフォームのサイレンシング（Ｓｈ６）は、マンモスフェア形成に影響を及ぼさなかった（Ｓｈ６；図２Ｂおよび２Ｃ）。これらの知見をまとめると、Δ１３３ｐ５３（α、β、γ）アイソフォームが、ＭＣＦ−７細胞におけるＣＳＣ潜在能力の制御に関与していることが示唆される。
本発明者らは、Δ１３３ｐ５３βアイソフォームが結腸癌腫細胞ＳＷ４８０におけるＣＳＣ潜在能力を促進させる能力についても精査した。そのために、上記Δ１３３ｐ５３アイソフォームで説明したように、ｓｈＲＮＡ（Ｓｈ３）を使用してＳＷ４８０結腸癌腫細胞でノックダウンした。ＭＣＦ−７乳がん細胞株で先に実証したように、結腸癌腫細胞株ＳＷ４８０（図２Ｄ）で得られた結果も、Δ１３３ｐ５３β発現のサイレンシングが、これらの細胞において、対照ｓｈＬｕｃと比較して、コロスフェア形成を有意に減少させることを示唆し、これらのアイソフォームが、結腸がんにおいてもＣＳＣ潜在能力の重要な制御因子であることを示す。
同じ結果は、転写因子Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４および／またはＮａｎｏｇが、がん細胞から誘導されるＣＳＣに関与することが実証された全てのがんで予測されうる。
（例３）
Δ１３３ｐ５３βアイソフォームは、ＭＣＦ−７細胞におけるがん幹細胞潜在能力を促進する
実際、Ｓｈ２およびＳｈ６を同時形質導入後にΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームのみを発現するＭＣＦ−７においてマンモスフェア形成は顕著に増加しており（図３Ａおよび３Ｂ）、Δ１３３ｐ５３αアイソフォームの阻害的効果が示唆される。スフェア増加が、ＣＳＣ表現型の指標であることを確認するために、本発明者らは、ＣＤ４４+／ＣＤ２４-細胞の割合を解析した。なぜなら、がん細胞のこの部分集団がＣＳＣ特性を有すると考えられるためである。マンモスフェア形成の変化と同様に、ＣＤ４４+／ＣＤ２４-細胞の割合は、Ｓｈ２を用いたＴＡｐ５３およびΔ４０ｐ５３アイソフォームサイレンシングによって影響をうけないが、一方で、Ｓｈ２およびＳｈ６の同時形質導入によって増加した（図３Ｃ）。マンモスフェア形成の促進におけるΔ１３３ｐ５３（βおよびγ）アイソフォームの特別な寄与を判断するために、本発明者らはそれらを別個に過剰発現させた。先の結果と一致して、Δ１３３ｐ５３βの過剰発現は、顕著にマンモスフェア形成を促進し、一方でγアイソフォームの過剰発現の効果はより軽度である（図３Ｄおよび図４）。さらに、Δ１３３ｐ５３β過剰発現は、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＯｃｔ３／４発現の顕著な増加をもたらしたが、ｃ−Ｍｙｃの増加はもたらさなかった（図３Ｅ）。さらに、Δ１３３ｐ５３βを用いて形成されたマンモスフェアは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＳＣ表現型を刺激するゴールドスタンダード実験で検討されるように（図３Ｆ）、原発性マンモスフェアの回収および再播種後においてより高かった。
最後に、ＭＣＦ−７細胞におけるＣＳＣ潜在能力を促進するΔ１３３ｐ５３βアイソフォームの役割を確認するために、本発明者らは、Ｓｈ１を用いて全てのｐ５３アイソフォームをノックダウンさせたＭＣＦ−７細胞において、Ｓｈ１耐性Δ１３３ｐ５３βアイソフォームを過剰発現させた。予測されるように、Ｓｈ１耐性Δ１３３ｐ５３βの発現は、マンモスフェア形成を救済した（図３Ｇ）。
これらの結果をまとめると、Δ１３３ｐ５３βアイソフォームが、ＭＣＦ−７乳がん細胞におけるＣＳＣ潜在能力を正に制御することが示される。
（例４）
Δ１３３ｐ５３の高レベルは、転移能およびマンモスフェア形成能の増加と相関している
ＣＳＣ表現型と転移発生とが密接に関連していることを示唆する証拠は増加している。それゆえ本発明者らは、乳がん細胞の転移能が、ＣＳＣ潜在能力およびΔ１３３ｐ５３アイソフォーム発現と関連しているかを判断することにした。この目的のために、本発明者らは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞を使用した。この細胞は、免疫不全マウスに移植されたとき、低い肺転移度で生じさせることができ、がん易発性が高く、非常に転移性のＣ３ＬＮＤ細胞株を誘導することができる（例１の方法参照）（図５Ａ）。この株をヌードマウスでの同所移植実験に使用したとき、転移検出時間が、（親Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞を用いた）８２日間から２０日間に減少し、肺転移が全ての移植動物で検出された（図５Ｂ）。原発腫瘍成長は、両方の細胞株で同等であるが（図５Ｃ）、転移発生は生物発光定量で示されるように、Ｃ３ＬＮＤ細胞において顕著に加速されている（図５Ｄ）。
Ｄ３Ｈ２ＬＮおよびＣ３ＬＮＤ細胞におけるマンモスフェア形成の評価により、後者の細胞が２倍多くマンモスフェアを形成したことが示された（図６Ａ）。同様に、Ｃ３ＬＮＤにおいて、Δ１３３ｐ５３アイソフォーム発現は３倍高く、Ｏｃｔ３／４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２レベルは２〜３倍高かった（図６ＢおよびＣ）。ｃ−Ｍｙｃ発現は、２つの細胞株において同等であった。次いで本発明者らは、多能性因子の発現が、Δ１３３ｐ５３発現の変化によって影響を受けるかどうかを追究した。Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞におけるΔ１３３ｐ５３βの過剰発現は、Ｏｃｔ３／４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２発現の顕著な増加に至ったが、一方でｃ−Ｍｙｃレベルは影響をうけず、ＭＣＦ−７細胞で取得されたデータと一致した（図６Ｄおよび６Ｅ）。同様の結果が、Ｃ３ＬＮＤ細胞で取得された（図５Ｆ）。ＭＣＦ−７における観察と完全に一致して、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞におけるΔ１３３ｐ５３β過剰発現は、マンモスフェア形成の顕著な増加に至った（図６Ｆ）。
逆に、Ｃ３ＬＮＤ細胞におけるＳｈ３媒介のΔ１３３ｐ５３アイソフォームのノックダウンは、スフェア形成を顕著に減少させるとともにＯｃｔ３／４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２発現を大きく低下させ、ｃ−Ｍｙｃレベルをわずかに増加させたが（図６Ｇ、ＨおよびＩ）、一方でΔ１３３ｐ５３形質導入はそれらを増加させた（図５Ｆ）。一致して、Ｓｈ３の形質導入は、ＣＤ４４+／ＣＤ２４-細胞の割合を減少させた（図６Ｊ）。最後に、胸腺欠損マウスにおける心臓内注射後、Ｓｈ３形質導入Ｃ３ＬＮＤ細胞は、対照細胞と比較して、遠隔部位へ転移し難くなった（図６Ｌ、図５Ｇおよび５Ｌ）。まとめると、より転移性のＣ３ＬＮＤ細胞株は、マンモスフェア形成、および親Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞株と比較して増加したΔ１３３ｐ５３ならびにＯｃｔ３／４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２（ｃ−Ｍｙｃは除く）の発現によって示されるように、より高いＣＳＣ潜在能力によって特徴づけられる。Δ１３３ｐ５３過剰発現は、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞の多能性潜在能力を増加させる一方で、そのノックダウンは反対の効果を生じさせ、マウスに移植したとき、これらの細胞の転移性潜在能力を顕著に減少させた。これらのデータをまとめると、Δ１３３ｐ５３βアイソフォームが、細胞の多能性および再プログラミングの維持における重要な役者（つまり、Ｏｃｔ３／４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２）の発現の調節を通じて、ＣＳＣ活性および転移形成を特別に制御していることが示唆される。
（例５）
乳がん細胞株の化学療法処置は、Δ１３３ｐ５３アイソフォームの発現を上方制御し、重要な再プログラミング遺伝子を活性化する
トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（エトポシド−ＶＰ１６およびドキソルビシン）は、いくつかのがんの種類に対し、単独でまたは他の薬剤（ほとんどの場合にシスプラチン）との組み合わせで、補助化学療法処置として使用されることが多い。トポイソメラーゼＩＩ阻害剤は、二本鎖ＤＮＡ切断、つまりｐ５３シグナル伝達を強く活性化する遺伝毒性ストレスを誘導する。ＴＡｐ５３の上方制御は、細胞周期停止、アポトーシスを誘導し、細胞再プログラミングを負に制御するその能力により、有益であるはずである。したがって本発明者らは、エトポシドが、乳がん細胞株において、Δ１３３ｐ５３発現およびＣＳＣ潜在能力に影響を与えるかを評価した。エトポシドの濃度増加は、ＭＣＦ−７におけるＴＡｐ５３αの安定化に至った。予測されたように、ｐ２１発現（ｐ５３によって正に制御される）は増加し、一方でｃ−Ｍｙｃ発現（ｐ５３によって負に制御される）は減少し（図７Ａ）、これはＲＴ−ｑＰＣＲ定量によっても確認された（図７Ｂ）。さらにＲＴ−ｑＰＣＲおよびウェスタンブロット解析は、エトポシド処置に応じて、Δ１３３ｐ５３アイソフォーム（図７Ｃおよび７Ｄ）ならびにＯｃｔ３／４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２（図７Ｅ）が、用量依存的様式で強く上方制御されたことを示した。この最後の結果は、特に興味深い。なぜなら、多能性／再プログラミング遺伝子の負の制御因子と考えられるＴＡｐ５３αが安定化され、転写的に活性であるためである。
この条件のＯｃｔ３／４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２の上方調節がΔ１３３ｐ５３発現を必要とするかを決定するために、Ｓｈ３をＭＣＦ−７細胞に形質導入し、特にそれらをノックダウンした。Ｏｃｔ３／４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２の発現は、Δ１３３ｐ５３サイレンシング後にエトポシドで処理された細胞および処理されていない細胞の両方で減少しており（図７Ｆ）、細胞の多能性／再プログラミングに関与する遺伝子の制御におけるΔ１３３ｐ５３アイソフォームの特別な役割を確証づける。
最後に、Ｓｈ２−形質導入されたＭＣＦ−７細胞のマンモスフェア形成に対するエトポシド処理の効果を評価した。対照細胞（活性ＴＡｐ５３）におけるエトポシド処理は、顕著にマンモスフェア形成を減少させたが、Ｓｈ２−形質導入細胞においては何ら顕著な効果を示さなかった（図７Ｇ）。さらにΔ１３３ｐ５３レベルは、再プログラミング遺伝子の発現と相関していた（図７Ｈおよび７Ｉ）。これらのデータは、ＴＡｐ５３およびΔ１３３ｐ５３βが、スフェア形成において拮抗作用を有することを示す。
次いで本発明者らは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞におけるエトポシド処理の効果を評価した。この細胞株は、ｐ５３Ｒ２８０Ｋ変異を保有しており、トリプルネガティブ乳がん型に相当する。この変異は、ＴＡｐ５３に存在し、さらにΔ１３３ｐ５３アイソフォームにも存在する。増加濃度のエトポシドとのインキュベーションは、ＴＡｐ５３発現に影響を与えず、ｐ２１発現はわずかに増加したにすぎなかった（図８Ａ）。ｐ２１発現に対する変異型ｐ５３タンパク質のこの効果は、既に文献に記載されている（Biegingら, 2014）。興味深いことに、ｃ−Ｍｙｃ発現は、顕著に下方制御された（図８Ａおよび８Ｂ）。Δ１３３ｐ５３アイソフォームの発現は上方制御されたが（図８Ａおよび８Ｃ）、ＭＣＦ−７細胞で観察されたように、用量依存的様式ではなかった。同様に、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２およびＯｃｔ３／４の発現（図８Ｄ）も、Δ１３３ｐ５３アイソフォームと同様に、エトポシドとのインキュベーション後に上方制御された。
これらのデータを全てまとめると、ヒト乳がん細胞において、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤エトポシドが、Δ１３３ｐ５３発現を増加させ、再プログラミング遺伝子Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２およびＯｃｔ３／４の活性化をもたらすことが示唆される。
参考文献

Claims (16)

  1. がん幹細胞を産生するための方法であって、
    ａ）がん細胞に、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方を発現するベクターを形質導入することと、
    ｂ）形質導入されたがん細胞を、形質導入されたがん細胞の増殖を補助する培地中で培養することと、
    ｃ）がん幹細胞を単離することと
    を含む方法。
  2. がん細胞が、固形がん細胞から、好ましくは、乳がん細胞、結腸直腸がん細胞、卵巣がん細胞、消化管がん細胞、膵臓がん細胞、肺がん細胞、前立腺がん細胞および咽頭がん細胞から；または造血がん細胞から、好ましくは白血病細胞もしくはリンパ腫細胞から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方を発現するベクターが、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方をコードする核酸分子およびその発現を可能にするために必要な要素を含むレトロウイルスベクター、好ましくはマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）ベクターである、請求項１または２に記載の方法。
  4. ステップｂ）の培地が、無機塩、アミノ酸、ビタミン、グルコース、β−メルカプトエタノール、少なくとも１つの抗生物質、およびｂＦＧＦを含む基本培地である、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
  5. がん幹細胞が、表面マーカーまたはスフェア形成能力に基づく選択により単離される、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
  6. ステップｂ）で使用されるベクターが、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方、好ましくはΔ１３３ｐ５３βアイソフォームのみを発現する、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
  7. 化学療法抗がん剤を用いた処置が、がん罹患対象においてがん幹細胞を誘導するリスクを、前記対象のがん試料から予測するための方法であって、
    ａ）化学療法抗がん剤で未処置の前記がん試料におけるΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することと、
    ｂ）前記がん試料を前記化学療法抗がん剤で処置することと、
    ｃ）既処置がん試料におけるΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することと、
    ｄ）ステップａ）およびｃ）で取得した値を比較することと、
    ｅ）（ｉ）ステップｃ）で測定されるΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、もしくはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルが、ステップａ）で測定されるΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、もしくはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルより高い場合には、前記化学療法抗がん剤を用いた処置が、前記対象においてがん幹細胞を誘導するリスクがある、または
    （ｉｉ）ステップｃ）で測定されるΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、もしくはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルが、ステップａ）で測定されるΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、もしくはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルより低いもしくは同等である場合には、前記化学療法抗がん剤を用いた処置が、前記対象においてがん幹細胞を誘導する重大なリスクはないと予測することと
    を含む方法。
  8. 前記がん試料におけるΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルが、タンパク質レベルで、好ましくは、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方に結合することができる抗体を使用して、測定される、請求項６に記載の方法。
  9. 前記がん試料におけるΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルが、核酸レベルで、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方のｍＲＮＡまたは対応するｃＤＮＡの量を、好ましくはｑＲＴ−ＰＣＲにより測定することによって、測定される、請求項６に記載の方法。
  10. Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルが、ステップａ）で測定される、請求項７から９までのいずれか１項に記載の方法。
  11. がん罹患対象においてがんの処置に使用するための化学療法抗がん剤であって、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を減少させる薬剤と組み合わせて前記対象に投与される化学療法抗がん剤。
  12. 前記化学療法抗がん処置が、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、抗チューブリン剤、および抗代謝剤から選択される、請求項１１に記載の使用のための化学療法抗がん剤。
  13. がん罹患対象におけるがん転移のリスクを、前記対象のがん試料から予測するための方法であって、
    ａ）前記がん試料においてΔ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方を発現するスフェア形成がん細胞を検出することと、
    ｂ）Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方を発現するスフェア形成がん細胞が検出される場合には、前記対象におけるがん転移の重大なリスクがあり、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方を発現するスフェア形成がん細胞が検出されない場合には、前記対象におけるがん転移の重大なリスクはないと結論付けることと
    を含む方法。
  14. 前記がん試料においてΔ１３３ｐ５３βアイソフォームまたはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方を発現するスフェア形成がん細胞がステップａ）で検出される、請求項１３に記載の方法。
  15. 既処置がん対象におけるがん再発のリスクを、前記対象の細胞試料から予測するための方法であって、
    ａ）前記細胞試料において、Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現を検出することと、
    ｂ）Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現が検出された場合には、前記対象においてがん再発の重大なリスクがあり、Δ１３３ｐ５３βアイソフォームの発現もΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの発現も検出されない場合には、前記対象においてがん再発の重大なリスクはないと結論付けることと
    を含む方法。
  16. 潜在的な抗がん幹細胞化合物をスクリーニングするための方法であって、
    ａ）Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、またはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方を発現するスフェア形成がん幹細胞を用意することと、
    ｂ）前記がん幹細胞を、試験化合物と接触させること、
    ｃ）処理された細胞における前記Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、もしくはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルならびに／または処理された細胞のスフェア形成能力をｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することと、
    ｄ）処理された細胞における前記Δ１３３ｐ５３βアイソフォーム、Δ１３３ｐ５３γアイソフォーム、もしくはΔ１３３ｐ５３βおよびΔ１３３ｐ５３γアイソフォームの両方の発現レベルが試験化合物を用いた処理の前よりも低い場合ならびに／または処理された細胞のスフェア形成能力が、試験化合物を用いた処理の前よりも低い場合には、前記試験化合物を、潜在的な抗がん幹細胞化合物として選択することと
    を含む方法。
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