KR102521638B1 - 비알코올성 지방간질환의 진단용 마커 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 비알코올성 지방간질환의 진단용 마커에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 엑소좀 유래의 ApoA-1 (Exosomal ApoA-1) 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하여 높은 정확도로 비알코올성 지방간염 (Non-alcoholic steatohepatitis; NASH)을 진단할 수 있는 조성물 및 키트와 비알코올성 지방간염 치료제 투여후의 예후를 정확하게 예측할 수 있는 조성물 및 키트에 관한 것으로, 본 발명에 조성물 및 키트는 비알코올성 지방간질환의 진단, 비알코올성 지방간질환의 예후 예측 및 비알코올성 지방간질환 치료제의 스크리닝 제제로써 다양하게 활용될 수 있다.

Description

비알코올성 지방간질환의 진단용 마커 {A marker for diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease}
본 발명은 비알코올성 지방간질환의 진단용 마커에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 엑소좀 유래의 ApoA-1 (Exosomal ApoA-1) 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하여 높은 정확도로 비알코올성 지방간염 (Non-alcoholic steatohepatitis; NASH)을 진단할 수 있는 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것이다.
중간엽 줄기세포는 다분화능을 가진 기질세포로서 조골세포, 연골세포, 근육세포, 지방세포 등을 포함하는 다양한 세포로 분화할 수 있는 세포를 말한다. 중간엽 줄기세포는 연골이나 골조직, 인대, 골수 기질 등 다양한 결합조직으로 분화할 수 있으므로 관절염이나, 외상, 화상등에 의해 생긴 연부조직 결손을 치료하는 등 다양한 질환에 대한 치료 용도로 연구되고 있다.
한편, 비알코올성 지방간은 과도한 알콜 섭취 없이 간 세포에 중성지방인 트리글리세라이드가 축적되는 것이 특징이다. 비알코올성 지방간은 현대인의 고지방 및 고탄수화물 섭취와 관련된 영양 과다에 따라 계속 증가하고 있다. 비만, 당뇨인 경우 비알코올성 지방간이 흔히 관찰되지만, 다양한 인자가 비알코올성 지방간과 관련된 것으로 알려져 있다. 비알코올성 지방간을 지닌 성인의 80%가 인슐린 저항성 당뇨병 및 심장질환 등 대사이상 질환으로 발전된다고 보고되고 있다.
비알코올성 지방간은 비알코올성 단순 지방간 (non-alcoholic simple steatosis)과 염증을 동반한 비알코올성 지방간염 (non-alcoholic steatohepatitis; NASH)으로 분류되는데, 장기간 방치 시, 간염, 간섬유, 간경변 등의 심각한 간 질환으로 이행될 수 있다. 비알코올성 지방간은 간 세포 (hepatocyte)에서 지방의 축적 (지방 침윤)을 갖는 것을 특징으로 한다.
비알코올성 단순 지방간은 비알코올성 지방간염으로 진행할 수 있는데, 비알코올성 지방간염에서 지방 축적은 다양한 정도의 간의 염증 및 흉터와 관련되고, 많은 경우에 인슐린 저항성, 이상지질혈증 및 고혈압과 연관된다고 알려져 있다. 비알코올성 지방간염은 과체중, 높은 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 수치, 및/또는 인슐린 저항성을 갖는 사람들에서 종종 발생한다.
하지만, 최근 비만 인구의 증가와 더불어 비알코올성 지방간염 환자가 증가함에도 불구하고, 안전하고 장기 복용이 가능한 비알코올성 지방간염의 치료제의 개발은 아직 미미한 수준이며, 비알코올성 지방간염의 진단을 위한 제제나 키트의 개발실정은 만족스럽지 못한 상황이다. 따라서, 만성 질환인 비알코올성 지방간염의 진단에 적합하면서 정확하고 신속한 비알코올성 지방간염의 진단용 조성물 또는 키트의 개발과 비알코올성 지방간염 치료제 투여 후 예후 진단 조성물에 대한 요구가 커지고 있는 상황이다.
이에 본 발명자들은 비알코올성 지방간질환 (nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)의 진단 마커로서 엑소좀 유래의 ApoA-1 (Exosomal ApoA-1) 단백질을 통해 신속하고 정확하게 비알코올성 지방간질환을 진단할 수 있는 것을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 비알코올성 지방간질환의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 비알코올성 지방간질환의 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 비알코올성 지방간질환의 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 비알코올성 지방간질환 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 비알코올성 지방간질환의 예후 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 비알코올성 지방간질환의 예후 예측용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 비알코올성 지방간질환의 예후 예측 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 비알코올성 지방간질환의 진단용 마커에 관한 것으로, 본 발명에 따른 비알코올성 지방간질환의 진단용 조성물, 예후 예측용 조성물 또는 이들의 키트는 신속하고 정확하게 비알코올성 지방간질환을 진단할 수 있으며, 비알코올성 지방간질환치료제 투여 후의 예후를 정확하게 예측할 수 있다.
본 발명자들은 이에, 본 발명에 따른 엑소좀 유래의 ApoA-1 (Exosomal ApoA-1) 단백질의 수준을 측정하는 제제가 비알코올성 지방간질환을 기존 방법에 비해 정확하게 비알코올성 지방간질환을 진단 및 예후를 예측할 수 있음을 확인하였다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 비알코올성 지방간질환 (nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)이 발병되었거나 발병이 의심되는 개체에서, 엑소좀 유래의 ApoA-1 (Exosomal ApoA-1) 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 비알코올성 지방간질환 진단용 조성물이다.
본 명세서 상의 용어 "마커(marker)"는 비알코올성 지방간질환을 가진 개체를 정상군 개체와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 비알코올성 지방간질환을 갖는 개체에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산, 지질, 당지질, 당단백질 또는 당 등과 같은 유기 생체 분자들을 모두 포함할 수 있고, 예를 들어, 비알코올성 지방간질환을 갖는 개체에서 수준이 감소되는 단백질일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "엑소좀" 이란 세포가 세포 외로 분비하거나, 세포 내에 존재하는 지질-이중층으로 구성된 막 구조를 갖는 소낭 (membrane vesicle)으로, 거의 모든 진핵 생물의 체액에 존재한다. 엑소좀의 직경은 30-1000 nm 정도이며, 다중소포체 (multivesicular bodies)가 세포막과 융합될 때 세포로부터 방출되거나, 세포막으로부터 곧바로 방출된다. 엑소좀이 응고, 세포-세포간 커뮤니케이션 및 세포성 면역을 중재하는 기능적 역할을 수행하기 위해, 세포 내의 생체분자인 단백질, 생체활성 지질 및 RNA (miRNA)를 수송하는 역할을 하는 것은 잘 알려져 있다.
엑소좀은 미세소포체 (microvesicle)를 포괄하는 개념이다. 엑소좀의 마커 단백질로는 CD63, CD81 등이 알려져 있고, 그 외에는 EGFR과 같은 세포 표면의 수용체, 신호전달에 관련 분자, 세포 부착 관련 단백질, MSC 연관 항원, 열충격단백질 (heat shock protein), 소포 형성과 관련된 Alix 등의 단백질이 알려져 있다.
본 명세서 상의 용어 "ApoA-1 단백질"은 ApoA-1 유전자에 의해 암호화되는 단백질로, HDL 파티클의 주요 단백질 성분으로 지질대사에 있어서 특정한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. ApoA-1은 종종 심혈관 질환의 예측을 위한 바이오 마커로 사용되는 것으로 알려져 있으나, 엑소좀 유래의 ApoA-1 단백질의 바이오마커로서의 용도는 알려진 바가 없다. 본 발명의 발명자들은 개체의 혈장내에서 엑소좀 유래의 ApoA-1의 단백질 수준 측정을 통해 비알코올성 지방간질환이 발병되었거나 발병이 의심되는 개체의 발병여부를 정확하게 진단할 수 있음을 확인하였다.
본 명세서 상의 용어 "비알코올성 지방간질환"은 만성 간 질환 중에서 가장 흔한 질환으로, 제2형 당뇨병, 비만 및 대사증후군과 밀접한 관계가 있다고 알려져 있으며, 단순 지방증 (simple steatosis)에서부터 비알코올성 지방간염 (nonalcoholic steatohepatitis, NASH) 나아가 간경변증까지를 포함하는 질환을 의미한다.
본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 비알코올성 지방간질환 발병 여부를 확인하는 것이다
본 발명의 일 구현예에서, 비알코올성 지방간질환은 비알코올성 지방간염 (Non-alcoholic steatohepatitis; NASH)인 것일 수 있다.
본 명세서 상의 용어 "비알콜성 지방간염"은 비알코올성 지방간질환의 하나로 지방간과 함께 염증 혹은 섬유화를 동반하는 것을 특징으로 하는 진행성 간질환이며, 간경변이나 간암을 유발하는 전구질환을 의미한다.
본 명세서 상의 용어 "단백질의 수준을 측정하는 제제"란, 시료에 포함된 표적 단백질의 수준을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 의미한다. 단백질의 수준을 측정하는 제제는 당업계에 공지된 단백질 검출 제제를 포함할 수 있고, 예를 들어, 웨스턴 블럿 (western blotting), ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석 (Radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 면역전기영동 (rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법 (immunohistochemical staining), 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법 (Complement Fixation Assay), 면역형광법 (immunofluorescence), 면역크로마토그래피법 (immunochromatography), FACS (fluorescenceactivated cell sorter analysis) 및 단백질 칩 분석법(protein chip technology assay) 등의 방법에 사용되는 항체를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 단백질의 수준을 측정하는 제제는 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 항체의 단편 및 재조합 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 명세서 상의 용어 "항체"는, 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미한다. 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 항체의 단편 또는 재조합 항체 등 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함된다. 본 발명에 있어서 항체에는 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라, 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함될 수 있다. 아울러, 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 될 수 있다.
본 명세서 상의 용어 "앱타머"란, 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 의미한다. 앱타머는 그 염기 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가질 수 있으며, 항원-항체 반응과 같이 특정 물질에 대하여 높은 친화력을 가질 수 있다. 앱타머는 소정의 표적 분자에 결합함으로써 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다.
본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 변형된 (modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 그 형태가 직쇄상 또는 환상 (環狀)일 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 본 발명의 앱타머는 PDK 4에 대하여 사용될 수 있다. PDK 4에 결합 활성을 갖는 앱타머는 각각의 염기 서열을 참조하여 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 공지의 방법에 따라 쉽게 제작될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는, 비알코올성 지방간질환이 발병되었거나 발병이 의심되는 개체에서, 엑소좀 유래의 ApoA-1 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 비알코올성 지방간질환 진단용 키트이다.
본 발명에 있어서 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기재, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다.
기재는 특별히 이에 제한되지 않으나 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 특별히 이에 제한되지 않으나 퍼옥시다아제 (peroxidase), 알칼라인 포스파타아제 (Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있다. 형광물질은 이에 제한되지 않으나 FITC, RITC 등이 될 수 있고, 발색 기질액은 특별히 이에 제한되지 않으나 ABTS (2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD (o-페닐렌디아민), TMB (테트라메틸 벤지딘)가 될 수 있다.
본 발명에 있어서 키트는 개체의 비알코올성 지방간질환 진단에 사용하기 위한 시약을 더 포함할 수 있다. 시약은 버퍼, 지시약, 또는 그 조합을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 키트는 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는, 비알코올성 지방간질환이 발병되었거나 발병이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 엑소좀 유래의 ApoA-1 단백질의 수준을 측정하는 측정 단계를 포함하는, 개체의 비알코올성 지방간질환 진단을 위한 정보제공방법이다.
본 발명의 일 구현예에서, 방법은 측정된 단백질의 수준을 정상 대조군의 시료로부터 측정된 값과 비교하는 비교 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 측정 단계는 ApoA-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 시료와 접촉시키는 접촉 단계를 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서 상의 용어 "개체"는 비알코올성 지방간질환이 발병되었거나 발병할 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다. 동물은 인간뿐만 아니라 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 명세서 상의 용어 "정상 대조군"이란, 비알코올성 지방간질환이 발병되지 않거나, 발병이 의심되지 않는 개체를 의미한다.
본 명세서상의 용어 "시료"란, 비알코올성 지방간질환이 발병된 환자로부터 분리되어 엑소좀 유래의 ApoA-1 단백질의 발현 수준을 측정하는 직접적인 대상을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에서, 개체로부터 분리된 조직, 세포, 전혈, 혈청 또는 혈장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 방법은 생물학적 시료에서 측정한 값이 정상 대조군 시료의 값보다 낮은 경우 비알코올성 지방간질환으로 판단하는 판단 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 비알코올성 지방간질환의 치료후보 물질을 질환이 발병된 개체로부터 분리되는 생물학적 시료에 처리하여 엑소좀 유래의 ApoA-1 단백질의 발현 정도를 측정하는 측정 단계, 및 측정한 단백질 발현 정도를 후보물질을 처리하지 않은 대조군의 발현 정도와 비교하는 비교 단계를 포함하는, 비알코올성 지방간질환 치료제 스크리닝 방법이다.
본 명세서 상의 용어 "치료후보 물질"이란, 개체의 시료에서 측정되는 엑소좀 내의 ApoA-1 단백질의 수준을 증가시키며, 비알코올성 지방간질환의 치료 가능성이 있는 물질로, 올리고 뉴클레오티드, 단백질, 화합물 등을 제한없이 포함한다.
본 명세서 상의 용어 "올리고 뉴클레오티드"는 수 개 내지 수십 개의 뉴클레오티드가 인산디에스테르 결합 (phosphodiester bond)으로 중합되어 형성된 중합체를 의미한다.
본 발명에 따른 스크리닝 방법의 비교 단계에서, 개체로부터 분리되는 생물학적 시료내의 엑소좀 유래 ApoA-1 단백질 수준이 대조군에 비해서 유의미하게 증가하는 경우, 후보물질은 비알코올성 지방간질환의 치료제로서 가능성이 있음을 의미한다.
본 발명의 또 다른 양태는, 비알코올성 지방간질환의 치료제를 투여받은 개체에서, 엑소좀 유래의 ApoA-1 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 비알코올성 지방간질환의 예후 예측용 조성물이다.
본 명세서 상의 용어 "비알코올성 지방간질환 치료제"는 비알코올성 지방간질환을 치료하거나, 비알코올성 지방간질환의 중증도 또는 관련 파라미터들을 개선시키거나 완화할 수 있는 모든 물질을 의미하며, 예를 들어, 본 발명자들은 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell; iPSC)-유래 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell; MSC)로부터 분리된 엑소좀이 기존의 임상에서 사용되는 치료제에 비해 비알코올성 지방간질환의 치료, 완화 개선 효과가 우수한 것을 확인하였다.
본 명세서 상의 용어 "예후"란, 질환의 경과 및 사망 또는 생존의 결과를 미리 예측하는 행위를 의미한다. 보다 구체적으로, 예후 또는 예후 예측이란 질환의 경과는 환자의 생리적 또는 환경적 상태에 따라 달라질 수 있으며, 이러한 환자의 상태를 종합적으로 고려하여 치료 전/후 병의 경과를 예측하는 모든 행위를 의미하는 것으로 해석될 수 있다. 본 발명의 목적상 예후는 비알코올성 지방간질환의 치료 전/후, 질환의 경과 및 완치여부를 미리 예상하여 비알코올성 지방간질환 환자의 무병생존율 또는 생존율을 예측하는 행위로 해석될 수 있다.
예를 들어, "예후가 좋다"라고 예측하는 것은 치료여부에 관계없이 비알코올성 지방간질환 환자의 생존율이 높은 수준 또는 지방간질환과 관련된 지표가 개선된 수준을 나타내어, 비알코올성 지방간질환 환자가 치료될 가능성이 높다는 것을 의미하고, "예후가 나쁘다"라고 예측하는 것은 비알코올성 지방간질환의 치료 후 환자의 생존율이 낮거나 지방간질환과 관련된 지표가 악화된 수준을 나타내는 것을 의미한다.
일 예로, 본 발명자들은 엑소좀 유래 ApoA-1 단백질의 수준을 측정하는 경우, 기존의 임상에서 사용되고 있는 혈청내의 ApoA-1 단백질의 수준을 측정하는 경우보다 비알코올성 지방간질환의 개선여부를 더욱 정확하게 파악할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 일 구현예에서, 비알코올성 지방간질환의 치료제는 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "줄기세포"는 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다. 본 발명의 줄기세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "유도만능줄기세포"는 체세포와 같은 이미 분화된 세포에 역분화 (dedifferentiation)를 유도하여 초기의 미분화된 상태로 돌아가, 전분화능 (pluripotency)을 가지게 된 세포를 의미한다.
상기 역분화는 특정 유전자 (예를 들어, Sox2, c-Myc, Klf4, Oct-4 등)를 도입하여 발현시키거나 상기 특정 유전자가 도입된 세포에서 만들어진 역분화 유도 단백질을 주입하여 유도될 수 있다.
상기 전분화능은 생체를 구성하는 3가지 배엽 (germ layer), 즉 내배엽 (endoderm), 중배엽 (mesoderm) 및 외배엽 (ectoderm) 기원의 조직 또는 기관으로 분화할 수 있는 능력을 의미한다.
본 명세서에서 용어 "중간엽 줄기세포"는 다분화능을 가진 세포로서 조골세포, 연골세포, 근육세포, 지방세포 등을 포함하는 다양한 세포로 분화할 수 있는 줄기세포를 말한다. 상기 중간엽 줄기세포는 골수 유래 중간엽 줄기세포가 가장 흔히 사용되나, 골수 외에도 제대 또는 제대혈, 지방조직, 양수, 어금니의 치아 돌기 (tooth bud)로부터 유래할 수 있다. 중간엽 줄기세포는 기질세포 (stromal cell)이라는 용어로도 불리운다.
상기 "유도만능줄기세포"는 분화된 세포들로부터 인위적인 역분화 과정을 통해 다능성 분화능을 가지도록 유도된 세포들을 일컫는 말로서 역분화 줄기세포 라고도 한다.
본 발명에 있어서, 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 전구세포는 SSEA-4 (stage-specific embryonic antigen 4) 단백질을 발현하지 않는 것일 수 있다.
본 명세서 상의 용어 "유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 전구세포"는 유도만능줄기세포에서 중간엽 줄기세포로 완전히 분화되기 직전 단계의 세포이고, 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 한 일종으로 볼 수 있으며, SSEA-4 단백질을 발현하지 않고, 추가 배양을 통해 완전한 중간엽 줄기세포의 성질을 갖게 되는 세포를 의미한다.
본 발명에 있어서 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포는 SSEA-4 단백질을 발현하지 않는 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 전구세포로부터 분화된 것일 수 있다.
상기 인위적인 역분화 과정은 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 센다이바이러스를 이용한 바이러스-매개 또는 비바이러스성 벡터 이용, 단백질 및 세포 추출물 등을 이용하는 비바이러스-매개 역분화 인자의 도입에 의해 수행되거나, 줄기세포 추출물, 화합물 등에 의한 역분화 과정을 포함한다.
상기 유도만능줄기세포는 배아줄기세포와 거의 같은 특성을 가지며, 구체적으로는 비슷한 세포 모양을 보여주고, 유전자 및 단백질 발현 패턴이 유사하며, in vitro 및 in vivo에서 전분화능을 가지고, 테라토마 (teratoma)를 형성하며, 생쥐의 배반포 (blastocyst)에 삽입시켰을 때 키메라 (chimera) 생쥐를 형성하고, 유전자의 생식선 전이 (germline transmission)가 가능하다.
본 발명의 유도만능줄기세포는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등 모든 포유동물 유래의 유도만능줄기세포를 포함하나, 바람직하게는 인간 유래의 유도만능줄기세포이다.
또한, 본 발명의 상기 유도만능줄기세포가 역분화 되기 전의 체세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 양수 또는 태반 등으로부터 유래된 체세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀은 상술한 유도만능줄기세포-유래 중간엽줄기세포 (BxC) 내에 존재하거나, BxC로부터 분비된 엑소좀을 의미한다.
본 명세서에서 용어, "유효성분으로 포함하는"이란 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀이 비알콜성 지방간질환의 예방 또는 치료 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에서, 비알코올성 지방간질환의 치료제는 전처리 물질로 전처리된, 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "전처리"란 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포의 전구세포의 배양 과정에서 전처리 물질이 첨가된 세포배양 배지를 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포의 전구세포에 접촉시키는 과정을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에서, 전처리 물질은 1-(벤조시아졸일설포닐)-5-클로로-1수소-인돌-2부탄산 [1-(6-benzothiazolylsulfonyl)-5-chloro-1H-indole-2-butanoic acid] 또는 엑센딘-4(Exendin-4)일 수 있다.
1-(벤조시아졸일설포닐)-5-클로로-1수소-인돌-2부탄산 [1-(6-benzothiazolylsulfonyl)-5-chloro-1H-indole-2-butanoic acid]은 "라니피브라노르 (Lanifibranor)"라는 명칭으로 사용될 수 있으며, 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체(peroxisome proliferator-activated receptors, PPARs)의 아고니스트이다.
본 발명의 일 구현예에서, 비알코올성 지방간질환의 치료제는 라니피브라노르로 전처리된, 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물 (BxC-V37e)일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 비알코올성 지방간질환은 비알코올성 지방간염인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 항체의 단편 및 재조합 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는, 비알코올성 지방간질환의 치료제를 투여받은 개체에서, 엑소좀 유래의 ApoA-1 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 비알코올성 지방간질환의 예후 예측용 키트이다.
본 발명의 일 구현예에서, 비알코올성 지방간질환은 비알코올성 지방간염인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 키트는 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는, 비알코올성 지방간질환의 치료제를 투여받은 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 엑소좀 유래의 ApoA-1 단백질의 수준을 측정하는 측정 단계를 포함하는, 비알코올성 지방간질환의 예후 예측을 위한 정보제공방법이다.
본 발명의 일 구현예에서, 방법은 측정된 단백질의 수준을 정상 대조군의 시료로부터 측정된 값과 비교하는 비교 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 측정 단계는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 시료와 접촉시키는 접촉 단계를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 생물학적 시료는 개체로부터 분리된 조직, 세포, 전혈, 혈청 또는 혈장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 방법은 비알코올성 지방간질환의 발병이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에서 측정된 엑소좀 유래의 ApoA-1 단백질의 수준이 정상 대조군의 시료로부터 분리된 시료에서 측정된 수준 보다 낮은 경우, 비알코올성 지방간질환의 발병 위험이 높거나, 비알코올성 지방간질환의 예후가 나쁘다고 판정하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 방법은 비알코올성 지방간질환의 발병이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에서 측정된 엑소좀 유래의 ApoA-1 단백질의 수준이 정상 대조군의 시료로부터 분리된 시료에서 측정된 수준 보다 낮은 경우, 비알코올성 지방간질환의 발병 위험이 높거나, 비알코올성 지방간질환의 예후가 나쁘다고 판정하는 판정 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 비알코올성 지방간질환은 비알코올성 지방간염 (Non-alcoholic steatohepatitis; NASH)인 것일 수 있다.
본 발명은 비알코올성 지방간질환의 진단용 마커에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 엑소좀 유래의 ApoA-1 (Exosomal ApoA-1) 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하여 높은 정확도로 비알코올성 지방간염 (Non-alcoholic steatohepatitis; NASH)을 진단할 수 있는 조성물 및 키트와 비알코올성 지방간염 치료제 투여후의 예후를 정확하게 예측할 수 있는 조성물 및 키트에 관한 것으로, 본 발명에 조성물 및 키트는 비알코올성 지방간질환의 진단, 비알코올성 지방간질환의 예후 예측 및 비알코올성 지방간질환 치료제의 스크리닝 제제로써 다양하게 활용될 수 있다.
도 1은 BxC-e (전처리되지 않은 BxC의 엑소좀) 및 BxC-V37e (라니피브라노르로 전처리된 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포에서 유래된 엑소좀)의 프로테오믹 시그니처를 나타낸 히트맵이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 BxC-V37e 엑소좀의 약물 시그니처를 나타내는 그래프이다.
도 3은 HepG2에서 BxC-V37e 시그니처의 KEGG 경로를 나타낸다. 빨간색 표기는 BxC-V37e의 시그니처 단백질을 나타내고, 파란색 표기는 BxC-V37e 처리에 의해 상향 조절된 시그니처 유전자를 나타내고, 검은색 표기는 BxC-V37e의 시그니처 약품과 관련된 표적을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 PBS 또는 BxC-V37e를 받은 정상 및 메티오닌/콜린 결핍 (MCD-diet) 식이 유도 NASH 마우스의 간 조직 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 PBS 또는 BxC-V37e를 투여받은 NASH 마우스의 혈청에서 측정한 ALT 수준을 나타낸 그래프이다. (정상 (normal); n = 6, MCD-diet; n = 5).
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 PBS 또는 BxC-V37e를 투여받은 NASH 마우스의 혈청에서 측정한 AST 수준을 나타낸 그래프이다. (정상 (normal); n = 6, MCD-diet; n = 5).
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 PBS 또는 BxC-V37e를 투여받은 MCD 식이 유도 마우스의 간 조직에서 헤마톡실린 및 에오신 염색결과를 나타낸 사진이다 (GLP-1R 작용제는 양성 대조군으로 사용되었으며, 스케일 바는 50 μm임).
도 8은 염증, 비대 및 지방증 지수의 지수를 사용하여 NAFLD 활성 지수 (NAFLD activity score; NAS)를 분석한 결과를 나타낸 그래프이다 (데이터는 평균 ± SEM으로 표시되었으며, * p <0.05; *** p <0.001)
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 PBS, GLP-1R 작용제 또는 BxC-V37e를 투여받은 NASH 마우스의 혈청에서 얻은 엑소좀 유래의 ApoA-1의 면역블롯분석 (웨스턴블랏) 결과를 나타낸 사진이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 PBS, GLP-1R 작용제 또는 BxC-V37e를 투여받은 NASH 마우스의 혈청에서 얻은 엑소좀 ApoA-1의 면역블롯분석 (웨스턴블랏) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 대조군 (n = 20) 및 비만 NAFLD 피험자의 혈청에서 2형 당뇨병이 있거나 (n = 16) 또는 없는 (n = 19) 인간 엑소좀 유래의 ApoA-1 수준을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12 내지 23은 본 발명의 일 실시예에 따라 인간 혈청내의 엑소좀 유래의 ApoA-1 단백질 수준과 대사 파라미터들 [BMI, ALT, AST, SBP (Systolic blood pressure), DBP (Diastolic blood pressure), Insulin, HOMA-IR, Hs-CRP, TG, TC, HIS 및 NAFLD liver fat score]간의 상관관계를 나타낸 그래프이다.
도 24 내지 35는 본 발명의 일 실시예에 따라 인간 혈청내의 ApoA-1 단백질 수준과 대사 파라미터들 [BMI, ALT, AST, SBP (Systolic blood pressure), DBP (Diastolic blood pressure), Insulin, HOMA-IR, Hs-CRP, TG, TC, HIS 및 NAFLD liver fat score]간의 상관관계를 나타낸 그래프이다.
도 36은 MCD-식이 마우스에 NASH 치료후보물질로 알려진 둘라글루타이드를 투여하고 PBS 투여 그룹대비 대비 혈청내 ApoA-1과 엑소좀 유래의 ApoA-1의 기존 NASH 관련 파라미터인 AST 수치 변화율의 상관관계를 나타내는 그래프이다.
도 37은 MCD-식이 마우스에 NASH 치료후보물질로 알려진 둘라글루타이드를 투여하고 PBS 투여 그룹대비 대비 혈청내 ApoA-1과 엑소좀 유래의 ApoA-1의 기존 NASH 관련 파라미터인 hs-CRP 수치 변화율의 상관관계를 나타내는 그래프이다.
도 38은 MCD-식이 마우스에 NASH 치료후보물질로 알려진 둘라글루타이드를 투여하고 PBS 투여 그룹대비 대비 혈청내 ApoA-1과 엑소좀 유래의 ApoA-1의 기존 NASH 관련 파라미터인 ACC1 수치 변화율의 상관관계를 나타내는 그래프이다.
도 39는 MCD-식이 마우스에 BxC-V37e 투여하고 PBS 투여 그룹대비 대비 혈청내 ApoA-1과 엑소좀 유래의 ApoA-1의 기존 NASH 관련 파라미터인 AST 수치 변화율의 상관관계를 나타내는 그래프이다.
도 40은 MCD-식이 마우스에 BxC-V37e 투여하고 PBS 투여 그룹대비 대비 혈청내 ApoA-1과 엑소좀 유래의 ApoA-1의 기존 NASH 관련 파라미터인 hs-CRP 수치 변화율의 상관관계를 나타내는 그래프이다.
도 41은 MCD-식이 마우스에 BxC-V37e 투여하고 PBS 투여 그룹대비 대비 혈청내 ApoA-1과 엑소좀 유래의 ApoA-1의 기존 NASH 관련 파라미터인 ACC1 수치 변화율의 상관관계를 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 재료 및 방법
1-1. 동물실험
6 주령 C57BL/6 수컷 야생형 (WT) 마우스는 Koatech Co., Ltd에서 입수하여 12 명 동안 Chow 식이 (n = 6) 또는 메티오닌/콜린 결핍식이 (MCD-diet) (n = 15)로 사육하였다. 동물 관리 및 절차는 대한민국의 주식회사 노터스 (Knotus Co., Ltd)의 설치류 동물 시설 구역의 승인을 받았다 (승인 번호: 19-KE-265). MCD-diet 식이 마우스는 18 주에 2 nmol/kg 둘라글루타이드 (dulaglutide, GLP-1 수용체 작용제)를 격일로 4 주 동안 피하 주사하고 두당 400μg의 BxC-V37e를 1 일 1 회, 주 3 회, 4 주 동안 정맥 주사했다. 실험이 끝날 때 마우스를 마취하고 혈청과 간 조직을 수집했다. 환경 조건은 다음을 유지하도록 설정했다: 온도, 23 ± 3 ℃상대 습도, 55 ± 15 %; 환기, 10 ~ 20 번의 시간 당 환기; 광도, 150 ~ 300 Lux; 12 시간 빛/12 시간 어두운 주기로 조절.
1-2. 세포 배양
세포 유지를 위해 인간 1 차 간세포 (human primary hepatocyte, ScienCell, Carlsbad, CA, USA)를 5% 우 태아 혈청 (FBS), 1% 페니실린 항생제 및 성장 보조제 (ScienCell) 및 THP-1 단핵구 (ATCC)와 함께 간세포 기본 배지 (Hepatocyte Basal Medium)에서 배양했다. 그리고, 성장 보조제 (ScienCell) 및 THP-1 단핵구 (ATCC, Manassas, VA, USA)를 RPMI 배지 (Gibco, Waltham, MA, USA)에서 10 % FBS (Hyclone, Chicago, IL, USA) 및 1 % 항생제/항진균제 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)와 함께 배양했다. NASH in vitro 모델을 만들기 위해 인간 1 차 간세포를 2 % FBS + DMEM에서 100mM FA (2 올레산:1 팔미트산)로 48 시간 동안 처리한 다음, 혈청이 없는 DMEM에 100mM FA가 포함된 100μg/mL BxC-V37e를 공급했다. 또한 500nM 탑시가르긴 (thapsigargin)을 무 혈청 DMEM에서 BxC-V37e로 24 시간 동안 동시에 처리하였다. 반면 THP-1 단핵구는 10 % FBS + RPMI에서 24 시간 동안 200ng/mL PMA, 100ng/mL LPS 및 20ng/mL IFNγ로 자극하였다. 그 후 100μg/mL BxC-V37e를 100ng/mL LPS 및 20ng/mL IFNγ로 무 혈청 DMEM에서 24 시간 동안 처리하였다. 두 세포 모두 5 % CO2 및 95 % 가습 인큐베이터에서 37 ℃에서 성장시켰다. 인산화 수준을 평가하기 위해 인간 1 차 간세포와 THP-1 대식세포를 100μg/mL BxC-V37e로 24 시간 동안 처리했다. 그 후, 100mM FA 또는 200ng/mL PMA, 100ng/mL LPS 및 20ng/mL IFNγ를 각각 1 차 간세포에 30 분 (phospho-Akt 및 phospho-AMPK) 또는 THP-1 대식세포에 10 분 (phospho-p65) 동안 첨가했다.
1-3. pan-PPAR 작용제 전처리 iMSC의 배양 및 RNA-seq 분석
iMSC (계대수 4)는 T-75 플라스크 (Eppendorf, Hamburg, Germany)에서 37 ℃, 5 % CO2 및 95 % 습도조건으로 15 % 우 태아 혈청 (FBS), high glucose Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Hyclone, Chicago, IL, USA) 및 1 % 항생제/항진균제 (Hyclone, Chicago, IL, USA)에서 배양하였다. 90% 컨플루언시 (confluency)에 도달했을때 세포를 TryPLE Express (Thermo Fisher Science)로 분리하고 10,000 cells/cm2의 밀도로 4 층 Cell Factory System (Thermo Fisher science)에 접종했다. 다음날, 세포를 10 μM 라니피브라노르 (Lanifibranor) (Cayman, Ann Arbor, MI, USA)로 24 시간 동안 처리한 후, 배지를 흡인하고 Dulbecco의 DPBS (phosphate buffered saline) (Hyclone)로 세척했다.
RNA 시퀀스는 Macrogen Inc.의 응용 프로그램에 따라 RNA 시퀀싱 프로토콜을 적용하였다. 계층적 클러스터링은 |fold changes| ≥2 및 독립 t-test p < 0.05를 만족하는 차등 표현된 스크립트의 패턴을 제시하기 위한 유사성 척도로서 complete linkage 및 Euclidean distance 알고리즘을 사용하여 분석하였다. gProfiler (https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost) 및 KEGG 경로 (http://www.genome.jp/kegg/pathway)를 기반으로 중요한 유전자 목록에 대한 유전자 강화 및 경로 분석을 수행하였다.
1-4. PPAR 작용제-전처리된 iMSC 엑소좀의 분리
라니피브라노르 전처리 iMSC 유래의 엑소좀 (BxC-V37e)을 하기와 같이 분리하였다.
라니피브라노르 전처리된 iMSC 배지는 serum-free, xono-free StemPro MSC media (Gibco)로 대체하였다. 배양 3일 후 배양액을 수확하여 300g에서 10 분간 원심분리한 후 상층액을 2,000g에서 20 분간 원심분리하였다. 상청액을 10,000g에서 추가로 80 분 동안 원심 분리하였다. 이후, 0.2μm 진공 필터 (Merck Millipore, Burlington, MA, USA)를 통해 상층액을 여과했다. 마지막으로, 엑소좀은 100,000g에서 80 분 동안 초 원심분리에 의해 분리되었고, 펠렛은 이후 PBS로 세척하고 초 원심분리 (Beckman Coulter, CA, USA) 하였으며 엑소좀 펠릿을 PBS에 재현탁시켰다.
1-5. 극저온 투과 전자 현미경 (TEM)
포름바르/카본 (formvar/carbon) 필름으로 코팅 된 200-mesh 구리 그리드 (MiTeGen, Ithaca, NY, USA)를 친수성 처리했다. EV 서스펜션 (4μL)을 그리드에 놓고 각각 100 % 및 4 ℃의 습도와 온도로 1 분 30 초 동안 블롯팅했다. 그리드의 세포외 소포는 120kv에서 Talos L120C FEI TEM (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 36,000 배 배율로 시각화하였다.
1-6. 나노 입자 추적 분석 (NTA) 분석
BxC-V37e에 대한 입자 크기 분포 및 농도 측정은 NTA를 기반으로하는 nanosight NS300 기기 (Malvern Panalytical, Malvern, UK)로 수행하였다. 분석을 위해 BxC-V37e를 멸균 PBS (1:100)로 희석하여 NTA의 최적 부피에 도달시켰다. 측정은 23.0 ~ 25.2 ℃ 범위의 실온에서 Blue 488nm 레이저와 sCMOS 카메라를 여러 번 반복하여 수행했다. 샘플 분석은 셔터 600, 게인 250, 카메라 레벨 10, NTA 버전 3.0 0064 및 감지 임계 값 10과 같은 카메라 설정 및 처리 조건에서 10 분 동안 수행하였다.
1-7. DiR 및 DiD 및 형광 이미징으로 BxC-V37e 라벨링
BxC-V37e를 Lipophilic Tracers (Invitrogen, Waltham, MA, USA)의 프로토콜에 따라 37 ℃에서 10 분 동안 1μg/mL DiR 버퍼와 함께 배양하였다. 그런 다음 DiR 표지된 BxC-V37e를 100,000 xg 및 4 ℃에서 80 분 동안 원심 분리하고 PBS (Gibco)로 세척했다. 마지막으로, 200 또는 400 μg의 DiR 표지 된 BxC-V37e를 0.1 mL PBS에 재현탁하고 정맥 경로를 통해 C56BL/6 마우스에 주입했다. 24 시간 후 DiR 표지된 BxC-V37e를 In Vivo Imaging System (IVIS) (Caliper Life Sciences, Waltham, MA, USA)에 의해 740 nm의 여기파장 및 790 nm의 여기파장 및 790 nm의 방출파장에서 검출하였다. 관심영역 (ROI)의 강도는 steridian 당 센티미터 제곱 당 초당 최대 광자수 (p/s/cm2/sr) 단위로 표시하였다. DiD 표지된 BxC-V37e를 제조하는 절차는 위에서 설명한 방법과 동일하게 제조하였다. DiD-표지된 BxC-V37e를 인간 1 차 간세포 또는 THP-1 대식세포에 각각의 자극 유무에 관계없이 24 시간 동안 처리했다. 24 시간 후, DiD 표지 된 BxC-V37e는 Nikon Eclipse Ti2-U 형광 현미경 (Nikon, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
1-8. 생물정보학 분석
HepG2 세포에 100mM 지방산 (2 올레산: 2 팔미트산) 처리 6 시간 후 RNeasy 미니 키트 (Qiagen, Hilden, Germany)로 총 RNA를 회수했다. 회수된 RNA는 GeneChip® Human Gene 2.0 ST 어레이 (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 프로파일링하였다. 지방산 유도 차별 발현 유전자 (differentially expressed genes; DEGs)는 fold change 컷오프 1.5로 확인하였다. DEG는 FDR q-값 컷오프 0.05 (http://www.gsea-msigdb.org/gsea)에서 KEGG를 통한 유전자 세트의 강화 분석을 받았다. BxC-V37e 특징은 전사체 (transcriptomic), 단백질체 (proteomic) 및 Connectivity 맵 분석을 통해 구성되었다. BxC-V37e를 지방산처리 된 HepG2 세포에 적용하고, 전체 RNA를 전술한 바와 같이 프로파일링하였다. BxC-V37e에 의해 유도된 DEG는 fold change 컷오프 1.5로 확인하였다. BxC-V37e가 풍부한 단백질은 LC-MS/MS (연세 프로테옴 연구소, 서울)를 사용하여 정성 및 정량적으로 확인하였다. BxC-V37e에 의해 유도된 DEG는 연결성지도 분석을 거쳐 BxC-V37e와 유사한 전 사체 프로파일을 가진 약물과 그 표적 유전자를 확인하였다. BxC-V37e에 의해 유도된 DEG, BxC-V37e의 단백질 및 확인된 BxC-V37e 유사 약물의 표적 유전자는 BxC-V37e 시그니처로 확인되었다. 확립된 BxC-V37e 시그니처는 (https://string-db.org)와의 상호 작용 신뢰도 0.9에서 단백질-단백질 상호 작용 네트워크 및 기능적 강화 분석을 받았다.
1-9. 유세포 분석
분리된 엑소좀은 MACSPlex Exosome Kit, human (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)을 사용하여 염색하고 Attune NxT 유세포 분석기 (Thermo Fisher Scientific)로 분석했다. 간세포 재생에 대한 엑소좀 효과를 분석하기 위해, 간세포를 엑소좀 처리 후 항-인간 CD90 APC-Cy7 (BioLegend, San Diego, CA, USA)로 염색하고 Attune NxT 유세포 분석기 (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 분석했다. iMSC가 MSC에 대한 전형적인 세포 표면 마커를 발현하는지 확인하기 위해 iMSC를 CD73 APC, CD105 PE, CD45 FITC, CD31 PE 및 CD34 APC (eBioscience, Waltham, MA, USA) 및 CD90 APC-Cy7 (BioLegend)로 염색했다. 분석은 Attune NxT 유세포 분석기 (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 수행하였다.
1-10. 혈청 생화학 검사
BxC-V37e 주사 4 주 후 혈청 샘플을 수집하고 blood biochemical analyzer (7180, Hitachi, Japan)를 통해 다음 매개 변수를 검사하였다: ALT (알라닌 트랜스 아미나제 (Alanine transaminase)), AST (아스파르테이트 트랜스아미나제 (Aspartate transaminase)), TG (트리글리세라이드 (Triglyceride)), 포도당, TC (총 콜레스테롤), HDL_C (고밀도 지단백 콜레스테롤), LDL_C (저밀도 지단백 콜레스테롤), LDH (젖산 탈수소 효소), GGT (Gamma-glutamyltransferase).
1-11. 실시간 qPCR (Real-time qPCR)
총 RNA는 TRIzol® (Ambion, Waltham, MA, USA)을 사용하여 간 조직 및 다양한 세포 유형에서 분리되었다. cDNA는 AccuPower® CycleScript RT PreMix dT20 (Bioneer, Daejeon, South Korea)와 함께 1μg의 총 RNA를 사용하여 합성하였다. 증폭반응은 제조업체의 프로토콜에 따라 PowerSYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)를 사용하여 수행하였다. 유전자 발현 수준은 QuantStudioTM 5 Real-Time RCR 시스템 (Applied Biosystems)을 사용하여 실시간 qPCR로 측정하였다.
GAPDH는 각 샘플의 mRNA 양의 차이를 정규화하기 위해 참조 유전자로 사용되었다. 상대적인 유전자 발현 수준은 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 분석하였으며, 각각의 실험은 세번 수행되었다.
1-12. 웨스턴 블롯 (Western blot)
세포 또는 조직은 프로테아제 억제제 (Thermo Fisher Scientific)가 보충된 NP40 용해 완충액 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)에서 용해하였다. 단백질 농도는 제조사의 프로토콜에 따라 Bradford AssayTM Reagent (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 결정하였다. 샘플을 4x Laemmli 버퍼 (Bio-Rad Laboratories)로 3:1로 희석하고 100 ℃에서 10 분 동안 가열했다. 단백질을 precast polyacrylamide Mini-PROTEAN TGX gels (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)에 로드 및 분리하고 PVDF 멤브레인 (Bio-Rad Laboratories)으로 옮겼다. 멤브레인을 EveryBlot Blocking Buffer (Bio-Rad Laboratories)로 5 분 동안 차단한 다음 1 차 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 배양했다. 모든 1 차 항체는 EveryBlot Blocking Buffer에서 희석되었다. 사용된 1 차 항체는 다음과 같다: anti-GM130, PCNA, AMPK, phospho-AMPK (Thr172), phospho-p65 (Ser536), Pan-Akt, Phospho-Akt (Thr308) (Cell Signaling Technology, Leiden, The Netherlands), anti-CD9, Calnexin, Abca1, IL-1β, p65, Annexin5, β-actin, GAPDH (Abcam, Cambridge, UK), anti-ApoA-1 (LSBio, Seattle, WA, USA), anti-TSG101, CD81 (Invitrogen), anti-TNF-α, PGC-1α, NRF2 및 CHOP (Novusbio, Centennial, CO, USA). CD81을 제외한 모든 표적 단백질은 환원 조건에서 수행되었다. 멤브레인을 10 분 동안 5 회 세척한 다음 2 차 항체와 함께 1 시간 동안 배양했다. 2 차 항체는 항-토끼 IgG와 항-마우스 IgG (Abcam)를 사용하였다. 멤브레인을 10 분 동안 5 회 세척한 후 ECL SelectTM Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare, Little Chalfont, UK)를 사용하여 표적 단백질을 검출하고 ChemiDoc Imaging System (Bio-Rad Laboratories)을 사용하여 이미지를 분석했다.
1-13. 효소 연결 면역 흡착제 분석 (ELISA)
ELISA 분석은 시판되는 마우스 ELISA 키트를 사용하여 수행하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 인슐린 (Novus bio), hs-CRP (R&D systems), FFA (유리 지방산) 및 ApoA-1 (Abcam) 분석을 수행하였다. 인슐린에 대한 분석 감도는 <0.19 ng/mL이었고 분석내 및 분석간 분산 계수는 <5.93 % 및 <6.35 % 였다. hs-CRP에 대한 분석 감도는 <0.015 ng/mL이었고 분석내 및 분석간 분산 계수는 <7.7 % 및 <10.8 %였다. ApoA-1에 대한 분석 감도는 11.2 pg/mL이었고 분석내 및 분석간 분산 계수는 각각 <4.7 % 및 <5.6 % 였다.
1-14. 조직 병리학적 분석
간 조직을 10 % 파라 포름 알데히드에 고정하고 절단, 탈수, 파라핀 포매와 같은 일반적인 조직 처리를 수행하였다. 5 μm의 간 조직단면 슬라이스를 슬라이드에 부착했으며, 자일렌을 사용하여 표본의 파라핀을 제거하였다. 에탄올로 재수화 된 조직을 헤마톡실린&에오신 (H&E)으로 염색하였다. 오일 레드 O (Oil red O) 염색의 경우 조직을 OCT 화합물 (Sakura Finetek, Torrance, CA, USA)을 사용하여 매립한 다음 cryotome (Leica, Wetzlar, Germany)를 사용하여 20μm에서 절편했다. 이 후, Zen 2.3 블루 에디션 이미지 분석기 (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)를 사용하여 조직 병리학적 샘플의 분석을 수행하고 총 면적별 염색 면적의 백분율로 정규화했다. NAFLD 활성 점수 (NAS)의 검사는 조직학적 기준에 따라 이루어졌으며, 전체 면적에 의한 점유 면적 관찰을 기준으로 대소포성 지방증, 미세 소포성 지방증 및 비대 수준은 0 ~ 3 점으로 평가하였다. 지방증과 비대는 모두 40-100 배율로 평가되었다. 염증 점수의 경우 5 개 영역을 무작위로 선택하고 0 ~ 3 점으로 평가되었다.
1-15. 면역조직화학 염색
간 조직 조각이 있는 슬라이드를 60 ℃로 유지되는 건조기에 넣고 1 시간 동안 건조시킨 다음 자일렌을 사용하여 파라핀을 제거했다. 에탄올과 물로 재수화 된 조직을 0.03 % 과산화 효소와 함께 15 분 동안 배양하여 내인성 과산화 효소를 차단했다. Pres-EDTA buffer (pH 9.0)를 121 ℃에서 압력 기구 (press cooker)를 이용하여 15 분간 반응시켜 항원 회수를 수행하였다. 비특이적 반응을 방지하기 위해 4 % BSA + Dextran을 30 분 동안 첨가했다. 그 후, 항 TNF-α (Abcam) 1 차 항체를 1 시간 동안 반응시킨 다음, 항 랫트 IgG H&L (Abcam) 2 차 항체와 함께 30 분 동안 실온에서 부드럽게 교반하면서 배양하였다. 샘플은 이후 BX53 생물학적 현미경 (Olympus, Tokyo, Japan)으로 이미징 하였으며, 분석을 위해 대표 이미지를 캡처했다.
1-16. 활성 산소종 (Reactive oxygen species; ROS) 분석
1 차 간세포를 24 시간 동안 400μM H2O2로 자극하였다. 그 후, BxC-V37e를 무 혈청 DMEM 배양 배지에서 H2O2로 자극된 1 차 간세포에 24 시간 동안 처리한 후 DPBS로 세척했다. CellROX® Reagent (Life Technologies)를 무 혈청 DMEM에 최종 농도 5μM으로 세포에 첨가하고 37 ℃에서 30 분 동안 배양했다. 염색 후, 세포를 4 % 파라포름알데히드 (Fujifilm Wako Chemicals, Richmond, VA, USA)에 10 분 동안 고정한 다음 DPBS로 3 회 세척했다. 핵과 세포체는 각각 NucBlueTM Fixed Cell 염색 또는 CellTrackerTM (Life technologies)로 대조 염색되었다. 이 과정 후 모든 샘플을 Nikon Eclipse Ti2-U (Nikon, Tokyo, Japan)를 사용하여 관찰하고 핵 강도에 따른 ROS 양성 강도의 백분율로 분석했다.
1-17. 세포 생존력 분석
1 차 인간 간세포 (2x103 cell/mL)를 96 웰 플레이트에서 성장시키고 37 ℃ 및 5 % CO2 조건에서 무혈청 DMEM에 4 시간 동안 배양했다. 450nm에서의 흡광도 데이터 (OD 값)는 멀티 플레이트 리더 (multiplate reader) (Thermo Fisher Scientific)로 측정했다. BxC-V37e가 1 차 간세포의 생존력에 미치는 영향은 제조사의 프로토콜에 따라 Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 분석 (Enzo life sciences, Farmingdale, NY, USA)을 사용하여 측정하였다.
1-18. 인간 혈청의 대사 파라미터 (metabolic parameters) 및 엑소좀 ApoA-1 농도 측정
서울 아산 병원 기관 심의위원회 (승인 번호: 2008-0367)와 인하 대학교 병원 (승인 번호: 08-115, 2016-06-015)의 승인을 받은 연구 프로토콜하에서, 20 명의 건강한 피험자, 19 명의 비만 NAFLD 피험자 및 16 명의 제2형 당뇨병을 가진 비만 NAFLD 피험자로부터 혈청 샘플의 대사 특성을 확인하였다. 건강한 집단은 서울 아산 병원 산부인과에서 양성 질환으로 선택적 복부 수술을 받았다. 모든 비만 그룹은 복강경 RYGB 수술을 받았다. 악성 또는 중증 간 또는 신장 질환의 피험자와 임신 또는 수유중인 여성은 제외되었으며, 모든 피험자에게 등록 시 서면 동의를 제공받았다. NAFLD의 진단은 임상적 특징과 혈액 검사를 기반으로 진단했다. 채혈 3 일 전에 모든 피험자는 당뇨병과 고혈압 치료제를 중단했으며, 혈액 샘플은 12 시간 금식 후 채취되었고, 혈장과 혈청은 즉시 원심 분리로 분리되었다. ALT, AST, 공복 포도당, 인슐린, HOMA-IR, 콜레스테롤, 트리글리세리드, 간 지방증 지수 (Hepatic steatosis index; HIS) 및 NAFLD 간 지방 지수 (NAFLD liver fat score) 및 hs-CRP의 순환 농도를 당업계에 알려진 바와 같이 측정하였다. 엑소좀 유래의 ApoA-1 농도는 제조사의 프로토콜에 따라 인간 ELISA 키트 (Abcam)를 사용하여 측정하였다. ApoA-1에 대한 분석 감도는 < 3 ng/mL이었고 분석내 및 분석간 분산 계수는 각각 < 4 % 및 < 10 % 였다.
1-19. 통계 분석
통계 분석은 SPSS (IBM 용 버전 18.0, Chicago, IL, USA)를 사용하여 수행되었다. 세 개 이상의 그룹이 포함된 비교에서는 Tukey의 사후 검정에 대한 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 사용하여 통계 분석이 수행하였다. 비교에 두 그룹 만 포함된 경우에는 쌍을 이루는 단측 스튜던트 t 검정을 사용하였다. 데이터는 평균 ± 표준 오차 (SE)로 표현되었으며 0.05 미만의 p 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실시예 2: BxC-V37e 엑소좀의 NASH에 대한 효과 확인
2-1. NASH에 대한 BxC-V37e 특성 분석
LC-MS/MS를 통해 BxC-V37e가 풍부한 총 32 개의 단백질이 확인되었으며, 아포지단백 A-1 (apolipoprotein A-1) (풍부도=191.3), CD81 항원 (풍부도=183.8), 트롬보스폰딘-1 (thrombospondin-1) (풍부도=155.7), 콜라겐 알파-1 (collagen alpha-1) (풍부도=118.1) 및 알파-2-안티플라스민 (alpha-2-antiplasmin) (77.2)이 포함된 것으로 확인되었다 (도 1).
BxC-V37e의 약리학적 결과를 기능적으로 예측하기 위해 연결 맵 분석을 수행한 결과, 59 개의 표적 유전자와 관련된 18 개의 약물이 BxC-V37e의 전사체 프로파일과 유의하게 유사한 것으로 확인하였으며, 여기에는 트리시리빈 (AKT 억제제, Connectivity score = 99.75), EI-273 (PKC 억제제, 99.59), 4,5- 디아닐리노프 탈이미드 (EGFR 억제제, 98.63), BRD-A94297859 (XIAP 억제제, 98.49) 및 GW-0742 (PPAR 수용체 작용제, 94.6)가 포함된 것으로 확인되었다 (도 2). 또한, 기능적 농축은 BxC-V37e에 의해 110 개의 상향 조절된 유전자가 117 개의 표준 신호 경로에서 유의하게 풍부하다는 것을 보여주었다 (q <0.05). 따라서 BxC-V37e 시그니처는 단백체, 전사체 및 Connectivity map 분석을 통해 확인된 108 개의 유전자로 구성된 것을 확인하였다.
단백질-단백질 상호 작용 네트워크 및 기능적 강화 분석은 BxC-V37e 시그니처가 지방 대사, 섬유증, 국소부착을 포함하는 염증반응 (q = 5.7E-04), 케모카인 신호 전달 경로 (q = 5.5E-03), 비 알코올성 지방간 질환 (q = 6.2E-03), NF- kappa B 신호 전달 경로 (q = 8.7E-03), 인슐린 신호 전달 경로 (q = 1.1E-02) 및 PPAR 신호 전달 경로 (q = 4.2E-02)와 연관된 신호 전달 경로에서 상당히 강화됨을 보여주었으며 (도 3), 이러한 결과는 BxC-V37e를 간 지방증 및 염증에 적용할 가능성을 시사한다.
2-2. NASH 모델에서 BxC-V37e의 생체내 평가
BxC-V37e의 치료 기능을 MC-결핍 식이 (MC-deficient diet)에 의해 유도된 NASH의 마우스 모델을 사용하여 조사하였다. 간의 전체적인 형태를 조사한 결과, MCD-diet 마우스의 간은 정상 마우스에 비해 창백하게 변하는 것으로 나타났다 (도 4). 대조적으로, BxC-V37e로 처리된 NASH 마우스의 간은 대조군에서 볼 수 있는 것과 마찬가지로 더 어둡게 관찰되었다. 그리고, 둘라글루타이드 (Dulaglutide) 및 PBS 처리 동물의 간에서는 차이가 관찰되지 않았다. 간 전체의 무게는 PBS- 및 BxC-V37e- 처리된 NASH 마우스 사이에서 차이가 없었다 (데이터는 표시되지 않음; MCD + PBS, 5.78 ± 0.12 % 대 MCD + BxC-V37e, 5.33 ± 0.23 %). 혈청 분석은 PBS 처리된 동물에 비해 MCD + BxC-V37e 그룹의 혈청에서 간 기능 마커 (ALT 및 AST)의 농도가 유의하게 감소한 것으로 나타났다 (도 5 내지 6).
또한, H&E 염색 및 BxC-V37e의 처리 후 형태 변화를 관찰한 결과, MCD + PBS 그룹에 비해 MCD + BxC-V37e 그룹에서 더 적은 수의 지방소적 (lipid droplet) 및 염증 세포의 침윤 감소가 발견되었으며 (도 7), NAFLD 심각도의 지표인 NAS 점수 분석은 MCD + BxC-V37e 그룹에서 감소하였다 (도 8). 종합하면, 이러한 데이터는 BxC-V37e가 일반적으로 NASH에서 간 기능을 개선한다는 것을 시사한다.
2-3. 엑소좀 유래의 ApoA-1 단백질을 통한 비알코올성 지방간질환 진단의 정확도 평가
면역 블롯 분석을 통해 BxC-V37e에서 ApoA-1 단백질 수준을 정량적 비교하였다. 분석 결과, 엑소좀 유래의 ApoA-1 단백질은 NASH 마우스에서는 감소한 반면 BxC-V37e를 투여받은 동물에서는 증가했다. (도 9 내지 10) 또한, 혈청내의 엑소좀 유래 ApoA-1은 대조군에 비해 NAFLD를 가진 비만 환자에서 감소되었다. (도 11)
그리고, ELISA assay를 통해 얻은 인간의 혈청 ApoA-1과 엑소좀 유래의 ApoA-1 수치와 비알코올성 지방간질환 관련 대사 파라미터 (metabolic parameter) 간의 상관관계를 SPSS 통계프로그램을 통해 spearman 방식으로 분석했다. R값이 (+)면 양의 상관관계를, (-)면 음의 상관관계를 의미하고, p값이 0.05이하면 통계적인 유의성을 띄는 것으로 간주하였다.
상관관계 분석결과, 인간의 혈청에서 ApoA-1과 대사 파라미터들과의 상관관계를 분석하였을 때 엑소좀 유래의 ApoA-1과 거의 모든 비알코올성 지방간질환 관련 대사 파라미터는 강한 음의 상관관계를 나타내었다 (도 12 내지 23). 그리고, 엑소좀 유래의 ApoA-1과 비알코올성 지방간질환의 관련 대사 파라미터간의 상관관계는 TC 지표를 제외하고는 모두 인간 혈청 ApoA-1과 대사 파라미터간의 상관관계보다 더 강력한 것으로 나타났다 (도 24 내지 35).
이러한 결과는, 엑소좀 유래의 ApoA-1 단백질을 통한 비알코올성 지방간질환의 진단이 기존 혈청내 ApoA-1 단백질을 마커로 이용하여 비알코올성 지방간질환을 진단하는 방법에 비해 월등히 높은 정확도로 해당 질환을 식별할 수 있음을 의미하며, 혈청내 엑소좀 유래의 ApoA-1이 비알코올성 지방간질환에 대한 새로운 바이오 마커로 이용될 수 있음을 시사한다.
2-4. 엑소좀 유래의 ApoA-1 단백질을 통한 비알코올성 지방간질환 예후 예측의 정확도 평가
NASH 치료제 투여후에 혈청내 ApoA-1과 엑소좀 유래의 ApoA-1이 기존 NASH 관련 파라미터의 변화를 얼마나 잘 반영하는지 테스트하여, 엑소좀 유래의 ApoA-1을 통한 예후 분석 정확도를 평가하였다.
MCD-식이 마우스에 NASH 치료후보물질로 알려진 둘라글루타이드 (Dulaglutide)와 BxC-V37e를 투여하고, PBS 그룹 대비 혈청내 ApoA-1과 엑소좀 유래의 ApoA-1의 기존 NASH 관련 파라미터인 AST, ACC1, hs-CRP 수치들의 변화율의 연관성을 계산한 뒤, SPSS 통계프로그램의 단순회귀분석 (simple regression analysis)을 통해 통계 분석하였다 (P 값이 0.05이하인 경우 통계적인 유의성을 띄는 것으로 간주함).
실험 결과, 도 36 내지 도 38에서 확인할 수 있듯이, MCD-식이 마우스의 둘라글루타이드 투여군의 PBS 그룹 대비 AST, ACC1, hs-CRP 수치의 변화율은 PBS 그룹과 둘라글루타이드 투여군 사이의 혈청내 ApoA-1의 변화율보다 PBS 그룹과 둘라글루타이드 사이의 엑소좀 유래 ApoA-1의 변화율과 더 유의한 상관관계를 가진 것으로 확인되었다.
그리고, 도 39 내지 도 41에서 확인할 수 있듯이, MCD-식이 마우스의 BxC-V37e 투여군의 PBS 그룹 대비 AST, ACC1, hs-CRP 수치의 변화율은 PBS 그룹과 BxC-V37e 투여군 사이의 혈청내 ApoA-1의 변화율보다 PBS 그룹과 BxC-V37e 사이의 엑소좀 유래 ApoA-1의 변화율과 더 유의한 상관관계를 가진 것으로 확인되었다.
이러한 결과들은, 둘라글루타이드 또는 BxC-V37e와 같은 치료제를 투여한 후에, 간기능 지표 및 지방생성 지표, 염증 지표의 변화 정도를 혈청내 ApoA-1 보다 엑소좀 유래의 ApoA-1이 더욱 정확하게 반영함을 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따른 비알코올성 지방간질환의 예후 예측용 조성물은 기존의 예후 예측 조성물 또는 예후 예측 방법보다 더욱 정확하게 비알코올성 지방간질환의 개선 정도를 정확하게 반영할 수 있으며, 비알코올성 지방간질환의 진단과 관련하여 다양하게 이용될 수 있음을 시사한다.

Claims (14)

  1. 비알코올성 지방간질환 (nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)이 발병되었거나 발병이 의심되는 개체에서, 엑소좀 유래의 ApoA-1 (Exosomal ApoA-1) 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 비알코올성 지방간질환 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 비알코올성 지방간질환은 비알코올성 지방간염 (Non-alcoholic steatohepatitis; NASH)인 것인, 비알코올성 지방간질환 진단용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머를 포함하는 것인, 비알코올성 지방간질환 진단용 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 항체의 단편 및 재조합 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 비알코올성 지방간질환 진단용 조성물.
  5. 비알코올성 지방간질환 (nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)이 발병되었거나 발병이 의심되는 개체에서, 엑소좀 유래의 ApoA-1 (Exosomal ApoA-1) 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 비알코올성 지방간질환 진단용 키트.
  6. 제5항에 있어서, 상기 비알코올성 지방간질환은 비알코올성 지방간염 (Non-alcoholic steatohepatitis; NASH)인 것인, 비알코올성 지방간질환 진단용 키트.
  7. 제5항에 있어서, 상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머를 포함하는 것인, 비알코올성 지방간질환 진단용 키트.
  8. 제5항에 있어서, 상기 키트는 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트인 것인, 비알코올성 지방간질환 진단용 키트.
  9. 비알코올성 지방간질환 (nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)이 발병되었거나 발병이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 엑소좀 유래의 ApoA-1 (Exosomal ApoA-1) 단백질의 수준을 측정하는 측정 단계를 포함하는, 개체의 비알코올성 지방간질환 (nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD) 진단을 위한 정보제공방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 방법은 측정된 단백질의 수준을 정상 대조군의 시료로부터 측정된 값과 비교하는 비교 단계를 더 포함하는 것인, 개체의 비알코올성 지방간질환 진단을 위한 정보제공방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 측정 단계는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 시료와 접촉시키는 접촉 단계를 포함하는 것인, 개체의 비알코올성 지방간질환 진단을 위한 정보제공방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 개체로부터 분리된 조직, 세포, 전혈, 혈청 또는 혈장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 개체의 비알코올성 지방간질환 진단을 위한 정보제공방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 방법은 생물학적 시료에서 측정한 값이 정상 대조군 시료의 값보다 낮은 경우 비알코올성 지방간질환으로 판단하는 판단 단계를 추가로 포함하는 것인, 개체의 비알코올성 지방간질환 진단을 위한 정보제공방법.
  14. 제9항에 있어서, 상기 비알코올성 지방간질환은 비알코올성 지방간염 (Non-alcoholic steatohepatitis; NASH)인 것인, 개체의 비알코올성 지방간질환 진단을 위한 정보제공방법.
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