CN112359111B - Prcc或其上调剂在肝癌治疗中的应用及prcc在肝癌诊断或预后中的应用 - Google Patents

Prcc或其上调剂在肝癌治疗中的应用及prcc在肝癌诊断或预后中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及PRCC或其上调剂在肝癌治疗中的应用及PRCC在肝癌诊断或预后中的应用。本发明对肝癌临床组织样本研究发现，PRCC在肝癌中高表达，且与患者预后不良有关。对肝癌和正常人的血清检测发现，PRCC可作为肝癌诊断指标，具备优异的灵敏度、特异性和准确度。进一步过表达或敲降PRCC研究发现，PRCC高表达能抑制肿瘤干细胞形成，在体外和体内均能抑制肝癌的成瘤和转移。本发明为肝癌的治疗、临床诊断及预后提供了一种新的思路。

Description

PRCC或其上调剂在肝癌治疗中的应用及PRCC在肝癌诊断或预 后中的应用
技术领域
本发明涉及疾病的诊断和治疗领域，具体地说，涉及PRCC或其上调剂在肝癌治疗中的应用及PRCC在肝癌诊断或预后中的应用。
背景技术
肝细胞癌(HCC)是目前最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率长期居高不下。肝癌术后高转移复发率、对放化疗不敏感、异质性高已成为进一步提高远期疗效的瓶颈。亟需开发新的肝癌治疗药物和有效的诊断及预后标志物，这方面的研究对临床治疗肝癌及预防肿瘤复发具有重要意义。
目前肝癌药物主要有靶向药物和免疫治疗药物。靶向药物用于癌细胞存在特定受体的肝癌治疗，以表皮生长因子受体(EGFR)抑制药物、血管内皮生长因子受体(VEGFR)拮抗药等为主。索拉非尼曾是我国唯一获批用于治疗晚期肝癌的分子靶向药物，至2018年，靶向药物仑伐替尼在我国也获批用于治疗晚期肝细胞癌，为肝癌患者提供了新的选择。免疫治疗主要包括免疫调节剂、免疫检查点抑制剂、肿瘤疫苗、细胞免疫治疗，这些治疗手段虽有一定的抗肿瘤作用，但用于临床之前尚需更多的研究验证。
目前肝癌诊断及预后判断指标匮乏。虽然研究发现多个基因异常表达被确定与肝癌的发生发展有关，但已确定的肝癌相关基因在肝癌中异常表达率并不高。这些指标的敏感性及特异性尚难以满足临床预测要求。富含脯氨酸的有丝分裂检查点控制因子PRCC(proline rich mitotic checkpoint control factor,Gene ID:5546)是参与pre-mRNA剪切过程的蛋白元件。在乳突状肾细胞癌中，PRCC与转录因子结合IGHM增强子3(transcription factor binding to IGHM enhancer 3,TFE3)形成的融合蛋白提高了转录因子TFE3的活性，促进了SERPINE1的启动子转录。PRCC与多个前体mRNA剪切因子相关，例如SM、SC35、PRL1以及CDC5。在Hela细胞核提取物中发现，突变NOMO前体mRNA(3'RNA截断)能增强它对磷酸化PRCC的招募，进而激活人剪切体B复合物。在对人剪切体A复合物的成分研究中发现，PRCC能够与SF3A2、CDC5、SRSF2、PRL1、Sm相互作用。PRCC能够与LSM2、PPIL2、RBM10、PRPF19和TOE1相互作用，参与剪切体形成。综上，参与pre-mRNA剪切过程是PRCC的主要生物功能之一。除此之外，有报道表明，PRCC在细胞中参与检验点控制、克隆形成及细胞死亡过程，属于有丝分裂检验点调节因子。PRCC能与类MAD2有丝分裂阻滞缺陷蛋白2(MAD2B)相互作用并将其转移至细胞核中发挥作用。PRCC的表达受急性感染、FOS、KRAS、SOS等的调控。也有研究表明，HNF4A转录因子能够与PRCC基因作用，调控其表达。
目前尚没有关于PRCC在肝癌中的作用及机制研究。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种新的肝癌治疗靶点及新的肝癌诊断、预后标志物。
第一方面，本发明提供了PRCC基因或蛋白或它们的上调剂在制备治疗肝癌的药物中的应用。
作为本发明的一个优选例，所述上调剂选自小分子化合物或生物大分子。
作为本发明的另一优选例，所述上调剂为PRCC的过表达载体。
第二方面，本发明提供了一种筛选抗肝癌潜在物质的方法，所述方法包括：
(1)用候选物质处理表达PRCC蛋白的体系；和
(2)检测所述体系中PRCC基因的转录或PRCC蛋白的表达或活性；
其中，若所述候选物质可促进PRCC基因的转录或促进PRCC蛋白的表达或活性，则表明该候选物质是抗肝癌的潜在物质。
第三方面，本发明提供了PRCC基因或蛋白或它们的上调剂在制备实验试剂中的用途，所述用途选自：
(1)体外抑制肝癌细胞的克隆形成能力；
(2)体外抑制肝癌细胞的成球能力；
(3)体外抑制肝癌细胞的迁移能力；
(4)抑制肝癌动物模型的成瘤大小；和
(5)抑制肝癌动物模型的成瘤数量。
第四方面，本发明提供了PRCC作为生物标志物在制备肝癌诊断试剂盒中的应用。
作为本发明的一个优选例，所述试剂盒检测的样本为肝癌组织、肝癌癌旁组织、血液、血浆或血清。
第五方面，本发明提供了PRCC作为生物标志物在制备肝癌预后试剂盒中的应用。
作为本发明的一个优选例，所述试剂盒检测的样本为肝癌组织、肝癌癌旁组织、血液、血浆或血清。
作为本发明的另一优选例，所述试剂盒用于预测肝癌患病个体的TNM分期或总生存期。
本发明优点在于：
1、本发明对肝癌临床组织样本进行研究，发现PRCC在肝癌患者的组织和血清中高表达，且与不良预后相关。高表达PRCC的肝癌患者总生存期显著低于低表达PRCC的患者。将肝癌患者和正常人血清ELISA检测结果结合临床诊断结果进行ROC曲线分析获得血清中PRCC蛋白含量的临界值为0.99μg/ml，若高于此值，则患者发生肝癌的可能性较大。PRCC的ROC曲线下面积为0.869(p<0.05)，PRCC作为肝癌诊断指标的灵敏度为84％，特异度为83％。与现在临床广泛使用的肝癌诊断指标甲胎蛋白AFP相比，PRCC在肝癌诊断的灵敏度和特异度均具有显著优势。因此，PRCC具有较高的作为替代或者辅助AFP用于肝癌临床诊断及预后预测的应用潜力。
2、本发明通过PRCC过表达或敲降实验意外地发现，PRCC的高表达抑制肿瘤干细胞形成，在体外和体内均能抑制肝癌的成瘤和转移，因此PRCC基因或蛋白或它们的上调剂可用于制备抗肝癌的药物，以及研究肝癌发生发展机制的实验试剂。
附图说明
图1.PRCC蛋白在肝癌中高表达且与患者的不良预后相关。A.Western blot检测PRCC在12对肝癌及癌旁组织中的蛋白表达情况；B.免疫组化检测66对肝癌组织及对应癌旁组织中PRCC的表达，Bar＝50μm；C-D.采用Log-rank(Mantel-Cox)分析PRCC高表达与肝癌患者预后总生存期及无病生存期的关系；E.ELISA分析105例肝癌患者及24例正常人血清中PRCC的表达情况，(***p<0.001)；F.ROC曲线分析PRCC作为肝癌诊断指标的灵敏度与特异度。
图2.PRCC对肝癌细胞增殖的影响。A.q-PCR检测不同肝癌细胞中PRCC的mRNA转录水平；B.Western blot检测不同肝癌细胞中PRCC蛋白的表达情况，条带下方的数字为PRCC与GAPDH条带的灰度值的比值；C.荧光显微观察显示PRCC定位于细胞核，Bar＝25μm；D.Western blot检测过表达及敲减细胞系中PRCC的表达情况，条带下方的数字为PRCC与GAPDH条带的灰度值的比值；E.CCK8实验结果显示PRCC对肝癌细胞的增殖能力无显著影响；F.克隆形成分析显示PRCC抑制肝癌细胞的克隆形成能力，(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。
图3.PRCC对肝癌细胞成球能力的影响。A.三维成球培养结果显示PRCC抑制肝癌细胞的成球能力，(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)；B.免疫荧光结果显示成球细胞中EpCAM、β-Catenin、CD44和CD133四个干细胞标志物表达呈阳性，Bar＝40μm。
图4.PRCC对肝癌细胞的迁移侵袭能力的影响。A-B.细胞划痕及Transwell实验证明PRCC抑制肝癌细胞的迁移及侵袭；C-D.A和B的定量分析结果(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)；E.q-PCR检测PRCC对肝癌细胞转移相关分子转录的影响(**p<0.01)；F.Westernblot检测PRCC对转移相关蛋白的影响，条带下方的数字分别为各个指标与GAPDH条带的灰度值的比值。
图5.体内实验验证PRCC过表达对肝癌细胞转移的影响。A.尾静脉分别注射Hep3B、Hep3B-EGFP和Hep3B-PRCC OE细胞30天后，裸鼠的肺组织；B.三组裸鼠肺组织转移灶数量的统计分析结果(***p<0.001)；C.对裸鼠的肺、肝和肾组织进行HE染色，并观察转移灶，Bar＝100μm。
图6.PRCC对肝癌细胞生物学行为的影响。A.CCK8实验结果显示PRCC对肝癌细胞的增殖无显著影响；B.克隆形成分析显示PRCC抑制肝癌细胞的克隆形成能力(*p<0.05)；C-D.细胞划痕及Transwell结果显示PRCC抑制肝癌细胞的迁移及侵袭能力，柱状图为定量分析结果(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的《分子克隆实验指南》(科学出版社，2002)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1
一、材料和方法
1.肝癌组织芯片及免疫组化检测分析
收集66对人肝癌及癌旁组织样本并制备肝癌组织芯片。本研究已通过伦理委员会审查并且患者已签署知情同意书。通过免疫组织化学(IHC)检测PRCC在肝癌及癌旁组织中的表达情况。利用ImageScope软件(Aperio公司)的AlgorithmS程序对组织芯片中的癌组织进行“阳性Pixel”计算，获得计算数据。每个组织的组化评分计算方法为Log10[255/Iavg]，其中Iavg表示平均强度。选择评分的中位数用于区分PRCC高或者低表达，结合病理及随访资料，分析PRCC表达水平与临床指标及生存期的相关性。
2.ELISA检测PRCC在肝癌患者血清中的含量及临床意义
收集24例正常人及105例HCC患者术前血清样本。本研究已通过伦理委员会审查并且患者已签署知情同意书。采用ELISA检测试剂盒(YX-H86033,Sinobestbio)检测PRCC表达量。按照试剂盒使用说明书操作。在反应终止后5min内测量OD450。结合患者临床诊断，做ROC分析以确定血清中PRCC含量能否作为肝癌诊断指标。
3.细胞系及培养方法
人肝癌细胞系Hep3B、Huh7、QGY-7701、HCC-LM3均由中科院干细胞库提供。细胞用10％FBS(Gibco,USA)的DMEM培养液孵育，置于37℃的CO2培养箱中培养。
4.过表达及敲低表达肝癌细胞株的构建
将PRCC的编码序列(NM_005973.5)通过酶切位点SmaI(N端)和NotI(C端)构建到pLV-EF1α-EGFP-N载体(Inovogen,VL3311)中，作为过表达载体。PRCC的编码序列如SEQ IDNO:13所示。
将shRNA构建到pLKO.1载体(Addgene,Plasmid#10878)中，作为敲低表达载体。shRNA1：CCGGGCTGGTGCTTATTATCAGGATCTCGAGATCCTGATAATAAGCACCAGCTTTTTG(SEQ ID NO:14)；shRNA2：CCGGACACCAGATCACATATCTTATCTCGAGATAAGATATGTGATCTGGTGTTTTTTG(SEQ IDNO:15)。包装慢病毒并感染目标细胞，用3μg/ml嘌呤霉素筛选阳性细胞。过表达细胞株和敲低表达细胞株可通过Western Blot检测确认。
5.qRT-PCR
用Trizol(Invitrogen)抽提细胞总RNA，反转录后经qRT-PCR检测，涉及引物如表1所示。
表1 qRT-PCR引物序列
Figure BDA0002768284020000051
6.细胞迁移及侵袭能力检测
在上室加入约3×104/200μl(迁移实验)或者6×104/200μl(侵袭实验)的细胞数分别用于细胞的迁移或侵袭实验(检测侵袭能力时Transwell小室提前用基质胶包被)。置于培养箱中培养48h后，用棉签将小室内残留的细胞抹去。将细胞用甲醛固定后经结晶紫染色，在显微镜下进行拍照记录。
7.动物实验
本研究已通过伦理委员会审查。将18只纯种Balb/c裸鼠分为3组：空白对照组(Hep3B)、阴性对照组(Hep3B-EGFP)和PRCC过表达组(Hep3B-PRCC OE)。每组6只，尾静脉注射相应细胞(8×105/150μl，PBS稀释)。观察各组肝癌细胞在动物体内成瘤及转移情况。30天后实施脱颈处死，解剖观察裸鼠的肺、肝和肾组织的成瘤情况，按组别进行拍照。将肺、肝、肾用福尔马林固定，用石蜡包埋切片并进行HE染色。
8.Spheroid assay及免疫荧光检测
将细胞分别以1000个/150μl(用DMEM稀释)与基质胶150μl混合均匀铺于24孔板中，培养一周左右即可见细胞球。经离散酶酶解，收集细胞球于载玻片上并烤干备用。
用4％甲醛固定细胞，加入曲拉通透膜10min，非免疫血清封闭30min，加入一抗室温反应1h。所用抗体及稀释比例如下：anti-GFP antibody(ab1218,dilution 1:500,Abcam,USA)，anti-EpCAM antibody(2929,dilution 1:100,CST,USA)，anti-β-Cateninantibody(8480,dilution1:100,CST,USA)，anti-CD44 antibody(A12410,dilution 1:100,ABclonal,CN)，anti-CD133antibody(A12711,dilution 1:100,ABclonal,CN)。加入荧光二抗，避光反应1h，DAPI染色10min，用防荧光淬灭封片剂封片，在荧光显微镜下拍照记录。
9.Western blot分析
细胞样品采用RIPA裂解液(包含1％PMSF，1％磷酸酶抑制剂和1％蛋白酶抑制剂)裂解。将蛋白样品于SDS-PAGE胶中进行电泳分离，然后进行常规的封闭、转膜，并与相应的一抗孵育，然后与HRP标记的二抗孵育，最后用化学发光法进行显色。所用抗体及稀释比例如下：anti-PRCC antibody(HPA019463,Sigma,USA.Dilution 1:200)，anti-E-Cadherinantibody(21473,SAB,USA.Dilution 1:1000)，anti-Vimentin antibody(A11952,ABclonal,CN.Dilution 1:800)，anti-N-Cadherin antibody(A0433,ABclonal,CN.Dilution 1:800)，anti-GAPDH antibody(KC5G5,Aksomics,CN.Dilution 1:5000)。
10.数据分析
采用Graphpad Prism 5和SPSS 19.0软件进行统计分析。数据以
Figure BDA0002768284020000061
表示。数据间比较采用Analysis of Variance(ANOVA)。灰度值采用Image-Pro Plus 6.0软件分析。统计图采用Graphpad Prism 5和Adobe IIIustrator CS5软件制作。以p<0.05表示差异具有统计学意义。
二、结果
1.PRCC在肝癌患者的癌组织和血清中高表达且与不良预后相关
通过Western blot检测了12对肝癌与癌旁组织总蛋白中PRCC的表达。结果显示，PRCC在其中10对样本中呈现癌组织中的表达量显著高于癌旁，在1对样本中呈现癌组织中的表达量略低于癌旁，在另外1对样本中其表达量变化不明显(图1中A)。通过免疫组化检测包含66例肝癌患者组织样本(包括癌与癌旁组织)的组织芯片，发现其中43(65.15％)例样本中PRCC在癌组织中的表达量高于癌旁，13(19.70％)例样本中其在癌组织中的表达量低于癌旁，其余10(15.15％)例样本中其表达没有明显差异(图1中B)。为了分析PRCC高表达与肝癌患者预后的相关性，采用ImageScope软件(Aperio公司)对癌组织中PRCC的表达量进行评分，将评分的中位值用于区分PRCC的高表达与低表达。结合患者病理及随访资料分析，发现PRCC与患者的AFP、PVTT及TNM分期显著相关(表2)。生存分析结果显示，高表达PRCC的肝癌患者总生存期显著低于低表达PRCC的患者。PRCC的表达量与无瘤生存期的相关性不显著(图1中C和D)。
表2临床病理资料
Figure BDA0002768284020000071
Figure BDA0002768284020000081
除此之外，用ELISA方法检测了105例肝癌患者血清和24例正常人血清中PRCC蛋白含量。检测结果显示，肝癌患者血清中PRCC含量显著高于正常组(p<0.05)，差异具有统计学意义(图1中E)。将检测结果结合临床诊断结果进行ROC曲线分析获得血清中PRCC蛋白含量的临界值为0.99μg/ml。若高于此值，则患者发生肝癌的可能性较大。PRCC的ROC曲线下面积为0.869(p<0.05)。PRCC作为肝癌诊断指标的灵敏度为84％，特异度为83％(图1中F)。与现在临床广泛使用的肝癌诊断指标甲胎蛋白AFP相比(根据随机收集的临床数据计算，AFP诊断灵敏度为59.05％，62/105)，PRCC在肝癌诊断的灵敏度和特异度均具有显著优势。因此，PRCC具有较高的作为替代或者辅助AFP用于肝癌临床诊断的应用潜力。
以上结果说明，PRCC在肝癌中表达普遍偏高，与患者的不良预后相关。并且在血清中可检测到。它作为肝癌诊断指标的敏感性及特异性都很高。PRCC可作为肝癌血清检测的候选指标。
2.PRCC的高表达对肝癌细胞增殖无显著影响
通过q-PCR及Western blot检测肝癌细胞系中PRCC的表达情况。结果显示，PRCC在肝癌细胞中表达量普遍高于永生化肝细胞WRL-68(图2中A和B)。通过慢病毒感染肝癌细胞，分别在Hep3B和Huh7细胞中稳定过表达PRCC(OE)。在QGY-7701和LM3细胞中稳定敲低PRCC表达(sh)。荧光显微观察显示，PRCC定位于细胞核(图2中C)。通过Western blot检测确认过表达及敲减有效(图2中D)。CCK8结果显示PRCC表达量高低对肝癌细胞的增殖能力没有显著影响(图2中E；图6中A)。然而，克隆形成实验结果显示PRCC可抑制肝癌细胞的克隆形成能力(图2中F；图6中B)。
3.PRCC高表达抑制肿瘤干细胞特征
采用三维成球培养方法检测肝癌细胞的成球能力。结果显示Hep3B、Huh7、QGY-7701及LM3均能成球。而在PRCC过表达组，细胞的成球能力受到抑制。PRCC的敲减则促进肝癌细胞成球(图3中A)。通过免疫荧光染色观察Hep3B细胞球中干性相关指标的表达情况，发现EpCAM、β-Catenin、CD44和CD133四个干细胞标志物表达呈阳性(图3中B)。这说明成球细胞具有干细胞特征。综上，PRCC高表达对肝癌干细胞特征的维持具有抑制作用。
4.PRCC高表达在体外及体内均能抑制肝癌细胞转移
细胞划痕实验显示在Hep3B及Huh7细胞中，过表达PRCC导致细胞的迁移能力明显减弱。在QGY-7701和LM3细胞中敲低PRCC表达，则细胞迁移能力增强(图4中A和C；图6中C)。Transwell实验结果显示PRCC过表达，细胞的迁移及侵袭能力明显受到抑制(图4中B和D；图6中D)。q-PCR检测转移相关因子的表达，发现E-Cadherin的表达明显上调，Western blot实验得到了一致的结果(图4中E和F)。采用裸鼠尾静脉细胞注射模型验证PRCC高表达对肝癌细胞转移及成瘤性的影响。裸鼠尾静脉注射肝癌细胞30天后，处死并解剖检查。三组裸鼠体重未表现明显差异。对各组的肺组织HE染色发现Hep3B细胞和Hep3B-EGFP细胞在裸鼠肺部成瘤的大小及个数明显高于Hep3B-PRCC OE组(p<0.05)，差异具有统计学意义(图5中A和B)。HE染色显示三组裸鼠的肝肾组织状态良好，未发现转移灶(图5中C)。以上结果表明PRCC高表达在体外和体内均能抑制肝癌的转移及成瘤。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军海军军医大学第三附属医院
<120> PRCC或其上调剂在肝癌治疗中的应用及PRCC在肝癌诊断或预后中的应用
<130> /
<160> 15
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cctggggacg actacagcta 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcagccgctt aaatgcttcg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gacgccatca acaccgagtt 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctttgtcgtt ggttagctgg t 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tctatggtcc tcgccctgaa 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
catcgtccac cggactcaaa 20
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aaaggcccat ttcctaaaaa cct 23
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tgcgttctct atccagaggc t 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
agccaacctt aactgaggag t 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ggcaagttga ttggagggat g 21
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
acaactttgg tatcgtggaa gg 22
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gccatcacgc cacagtttc 19
<210> 13
<211> 1476
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
atgtcgctgg ttgcttacgc cagcagcgat gagagcgagc cggatgaggc tgagcccgag 60
ccggaggaag aggaggcggt ggctcctaca tctgggcccg ctttaggggg cttgttcgct 120
tctctccctg cgcccaaggg tccggccttg ctgcctccgc cccctcagat gctggcgcca 180
gcctttcccc cgccgctgtt gcttccccca cccaccggag accccaggct tcagcctcct 240
ccccccttgc ccttcggcct gggaggcttc cccccacctc caggcgtgag cccggctgaa 300
gcggcgggag ttggggaggg actgggattg gggttgccct cgccccgagg ccctggcctc 360
aatctgcccc ctccaattgg cggtgccggt cccccgctgg ggcttcccaa gccaaagaag 420
aggaaagagc ccgtgaagat cgcggcgccg gagttgcata agggagattc agattctgag 480
gaagatgaac ccacaaagaa gaaaactatc cttcagggat ccagtgaggg gactggtttg 540
tctgccttgc ttccccaacc taaaaacctg actgtgaaag agactaacag gttgctcctg 600
ccccatgcct tctcccgcaa accctcggat ggctcccctg atactaagcc ctccagactg 660
gcttctaaga ccaagacttc ctctcttgcc cctgttgtgg gcaccacaac caccactccg 720
tcgccctctg ctatcaaggc tgctgccaag agtgctgccc tgcaggtgac aaagcagatc 780
acgcaggaag aagacgacag tgatgaggaa gtagcccccg aaaacttttt ctccctccct 840
gaaaaggctg agccacctgg agttgagcca tacccttacc ccatccccac tgtccctgaa 900
gagctgcctc caggcacgga accagagccg gctttccagg acgatgcagc caatgccccc 960
cttgaattca agatggcagc aggttcaagt ggggcccctt ggatgcctaa gcctggggac 1020
gactacagct acaatcagtt ttccacatat ggcgatgcca atgccgctgg tgcttattat 1080
caggattatt acagtggtgg ctactatcct gcacaggacc cggccctggt ccccccccag 1140
gaaattgccc cagatgcctc cttcatcgat gacgaagcat ttaagcggct gcagggcaag 1200
aggaaccgag ggagagaaga aatcaacttt gtggagatca aaggtgatga ccagctcagt 1260
ggggcccagc aatggatgac taagtcattg acagaagaga aaaccatgaa gtcattcagc 1320
aaaaagaaag gtgagcagcc aacaggccag cagcggcgga aacaccagat cacatatctt 1380
attcatcagg ccaaggagcg ggagctggaa ctgaagaaca cctggtcaga gaacaagctc 1440
agccgccgtc agacccaagc caaatatgga ttctag 1476
<210> 14
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ccgggctggt gcttattatc aggatctcga gatcctgata ataagcacca gctttttg 58
<210> 15
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ccggacacca gatcacatat cttatctcga gataagatat gtgatctggt gttttttg 58

Claims (2)

1.PRCC基因的过表达载体在制备治疗肝癌的药物中的应用。
2.PRCC基因的过表达载体在制备实验试剂中的用途，其特征在于，所述实验试剂用于：
(1) 体外抑制肝癌细胞的克隆形成能力；
(2) 体外抑制肝癌细胞的成球能力；
(3) 体外抑制肝癌细胞的迁移能力；
(4) 抑制肝癌动物模型的成瘤大小；和
(5) 抑制肝癌动物模型的成瘤数量。
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