WO2022154601A1 - 신규 췌장암 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents

신규 췌장암 바이오마커 및 이의 용도 Download PDF

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WO2022154601A1
WO2022154601A1 PCT/KR2022/000778 KR2022000778W WO2022154601A1 WO 2022154601 A1 WO2022154601 A1 WO 2022154601A1 KR 2022000778 W KR2022000778 W KR 2022000778W WO 2022154601 A1 WO2022154601 A1 WO 2022154601A1
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WO
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mir
pancreatic cancer
seq
nucleotide sequence
expression
Prior art date
Application number
PCT/KR2022/000778
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English (en)
French (fr)
Inventor
송시영
정다운
박수빈
Original Assignee
연세대학교 산학협력단
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer

Definitions

  • the present invention relates to a composition for diagnosing pancreatic cancer, a kit comprising the same, and uses thereof.
  • Pancreatic cancer is one of the main causes of cancer-related death. Symptoms of pancreatic cancer rarely appear in the early stages of the disease, and are mostly discovered after the cancer has metastasized to other organs. According to cancer statistics in 2020, the 5-year survival rate of pancreatic cancer patients is only 9%, but based on patients diagnosed with pancreatic cancer between 2009 and 2015, the survival rate of patients with regional pancreatic cancer is over 37%.
  • Pancreatic cancer has no symptoms in the early stages, and symptoms such as pain and weight loss usually appear after systemic metastasis has already occurred. Most of the clinical symptoms are gradual onset, prone to weakness, and loss of appetite and weight loss are the most common symptoms. Pancreatic cancer is a deadly cancer with a 5-year survival rate of 1-4% and a median survival of 5 months, showing the poorest prognosis among cancers in the human body. In addition, since 80-90% of patients are found in a state where curative resection that is expected to be cured at the time of diagnosis is not possible, the prognosis is poor and treatment is mainly dependent on chemotherapy. have.
  • pancreatic cancer or pancreatic cancer precursor lesions For the diagnosis of pancreatic cancer or pancreatic cancer precursor lesions, blood tests, x-rays of the stomach and duodenum, biliary imaging through the skin and liver, and retrograde endoscopic cholangiopancreatography are used.
  • ultrasonography and computed tomography are frequently used, but the test methods up to now have disadvantages in that accuracy is low, and the method of performing the method is very inconvenient, such as pain to the patient.
  • pancreatic cancer is difficult to diagnose early but has a high mortality rate, and the test method is painful for patients. .
  • Another object of the present invention is to provide a kit for diagnosing pancreatic cancer comprising the composition for diagnosis.
  • Another object of the present invention is to provide a method for providing information for diagnosing pancreatic cancer.
  • Another object of the present invention is to provide a method for diagnosing pancreatic cancer.
  • One aspect of the present invention for achieving the above object is to measure the expression level of one or more miRNAs selected from the group consisting of miR-7154-5p, miR-4486, let-7b-5p and miR-4703-5p It relates to a composition for diagnosing pancreatic cancer, including an agent capable of doing so.
  • the miR-7154-5p consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4
  • the miR-4486 consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8
  • the let-7b-5p consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9
  • the miR-4703-5p may consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the diagnostic composition measures the expression level of one or more miRNAs selected from the group consisting of miR-155-5p, miR-4284, miR-346, miR-5100, miR-661 and miR-22-3p. It may be to further include an agent that can do it.
  • the miR-155-5p consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1
  • the miR-4284 consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2
  • the miR-346 consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3
  • the miR-5100 may consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5
  • the miR-661 may consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6
  • the miR-22-3p may consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7.
  • the pancreas is located behind the stomach and in the middle of the body and is about 20 cm long. It is surrounded by organs such as the stomach, duodenum, small intestine, large intestine, liver, gallbladder, and spleen. The total length is about 15 to 20 cm, the weight is about 100 g, and it is divided into a head, a body, and a tail.
  • the pancreas has an exocrine function that secretes digestive enzymes that break down carbohydrates, fats, and proteins in ingested food, and an endocrine function that secretes hormones such as insulin and glucagon that control blood sugar.
  • pancreas is thin, about 2 cm thick, and is surrounded by only a capsule, and it is in close contact with the superior mesenteric artery that supplies oxygen to the small intestine and the portal vein that transports nutrients absorbed from the intestine to the liver, so cancer invasion occurs easily.
  • it is characterized by early metastasis to the nerve bundles and lymph nodes in the back of the pancreas.
  • pancreatic cancer cells grow rapidly. Most of them live only 4 to 8 months at the time of onset, and the prognosis is poor.
  • pancreatic cancer is a mass consisting of cancer cells generated in the pancreas.
  • pancreatic cancer includes cystic cancer (cystic adenocarcinoma) and endocrine tumors along with pancreatic ductal adenocarcinoma, which accounts for about 90% of pancreatic ductal cells.
  • a biomarker with high accuracy and sensitivity capable of diagnosing pancreatic cancer as described above even before symptoms appear and developed as a diagnostic composition.
  • the "agent” is a substance that specifically binds to miRNA, and may be a primer, a probe, or an antisense nucleotide, but is not limited thereto.
  • the primer is a nucleic acid sequence with a short free 3' hydroxyl group, which can form a complementary template and base pair and serves as a starting point for template strand copying. refers to a nucleic acid sequence.
  • the primers can initiate DNA synthesis in the presence of different nucleoside triphosphates and reagents for polymerization (ie, DNA polymerase or reverse transcriptase) in an appropriate buffer and temperature.
  • miRNA refers to a non-coding RNA of 15 to 25 bases that is transcribed as an RNA precursor of a hairpin-shaped structure and can be involved in the translational inhibition of mRNA.
  • the miRNA of the present invention is miR-7154-5p, miR-4486, let-7b-5p, miR-4703-5p, miR-155-5p, miR-4284, miR-346, miR-5100, miR-661
  • miRBase release 20 http://www.mirbase.org/
  • miRBase release 20 http://www.mirbase.org/
  • miRNAs of SEQ ID NOs: 1 to 10 under stringent conditions. It may include miRNA having a nucleotide sequence.
  • the miRNA used herein may be a gene product of a miR gene, and this gene product is a mature miRNA (for example, a ratio of 15-25 bases or 19-25 bases involved in the translation inhibition of mRNA as described above) coding RNA) or miRNA precursors (eg, pre-miRNA or pri-miRNA as described above).
  • the present invention it is possible to diagnose pancreatic cancer by performing PCR amplification using the sense and antisense primers specifically binding to the one or more miRNAs to check the expression level.
  • PCR conditions the length of the sense and antisense primers can be modified based on what is known in the art.
  • the probe refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA corresponding to several bases to several tens of bases as short as possible.
  • the probe may be manufactured in the form of an oligonucleotide probe, a single stranded DNA probe, a double stranded DNA probe, an RNA probe, or the like.
  • it is possible to diagnose pancreatic cancer by performing hybridization using one or more of the above miRNAs and complementary probes to check the expression level. Selection of appropriate probes, hybridization conditions, and labeling may be modified based on those known in the art.
  • the antisense nucleotide means any form that includes nucleic acids such as RNA, DNA, and PNA capable of complementary binding to the miRNA of the present invention. can be applied.
  • composition for diagnosing pancreatic cancer of the present invention may include an agent capable of measuring the expression level of miR-7154-5p, miR-4486, let-7b-5p and miR-4703-5p.
  • miR-7154-5p, miR-4486, let-7b-5p, miR-4703-5p, miR-155-5p, miR-4284, miR-346, miR-5100, miR-661 and miR- It may include an agent capable of measuring the expression level for 22-3p.
  • miRNAs differentially expressed among pancreatic cancer patients, normal controls (non-cancer), and non-pancreatic cancers are selected, and the expression level of the selected miRNAs is measured using qRT-PCR. and verified.
  • miR-7154-5p, miR-4486, let-7b-5p and miR-4703-5p were discovered as novel pancreatic cancer biomarkers, and it was confirmed that pancreatic cancer can be diagnosed by confirming the differential expression of miRNA from normal controls. did.
  • composition for diagnosis may be characterized in that the diagnosis of pancreatic cancer and intrahepatic bile duct cancer in an early stage.
  • diagnosis refers to determining the susceptibility of an object, that is, a test subject, to a specific disease or disorder, determining whether an object currently has a specific disease or disorder, a specific disease or Determining the prognosis of a subject with a disease, or therametrics (eg, monitoring the condition of a subject to provide information about treatment efficacy).
  • it may include distinguishingly diagnosing pancreatic cancer and intrahepatic cholangiocarcinoma, and more specifically, includes diagnosing early before symptoms of pancreatic cancer and intrahepatic cholangiocarcinoma are recognized.
  • Another aspect of the present invention relates to a kit for diagnosing pancreatic cancer comprising the composition for diagnosing pancreatic cancer.
  • the kit of the present invention can be used to diagnose the onset of cancer by measuring the level of miRNA expressed in blood, serum, urine, etc. of an individual suspected of having pancreatic cancer, and a primer, probe capable of measuring the expression level of the miRNA , antisense nucleotides, etc., components necessary for measurement or analysis, solutions, devices, etc. may be included without limitation.
  • a primer, probe capable of measuring the expression level of the miRNA , antisense nucleotides, etc., components necessary for measurement or analysis, solutions, devices, etc.
  • it may include a reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) kit, a DNA chip kit, and the like, but is not limited thereto.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • the diagnostic kit may include a solution, a lyophilized powder, a frozen solution, or a strip form, and each form may be formulated in a conventional manner in the art. It may also include instructions for using the kit.
  • Another aspect of the present invention is a) the expression level of one or more miRNAs selected from the group consisting of miR-7154-5p, miR-4486, let-7b-5p and miR-4703-5p in a sample isolated from an individual measuring; And b) it relates to a method of providing information for diagnosing pancreatic cancer, comprising the step of comparing the miRNA expression level with the corresponding miRNA expression level of a normal control sample.
  • the miR-7154-5p consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4
  • the miR-4486 consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8
  • the let-7b-5p consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9
  • the miR-4703-5p may consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the expression of miR-7154-5p is decreased compared to the normal control; the expression of miR-4486 is increased compared to the normal control; the expression of let-7b-5p is increased compared to the normal control group;
  • the step of determining that the miR-4703-5p is pancreatic cancer may be further included.
  • step a) the expression level of one or more miRNAs selected from the group consisting of miR-155-5p, miR-4284, miR-346, miR-5100, miR-661 and miR-22-3p Additional measurements can be made.
  • the miR-155-5p consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1
  • the miR-4284 consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2
  • the miR-346 consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3
  • the miR-5100 may consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5
  • the miR-661 may consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6
  • the miR-22-3p may consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7.
  • the expression of miR-155-5p is decreased compared to the normal control; there is expression of said miR-4284; no expression of the miR-346; the expression of miR-5100 is increased compared to the normal control; the expression of miR-661 is decreased compared to the normal control;
  • the step of determining that it is pancreatic cancer may be further included.
  • step b) includes the age, sex, weight, eating habits, body mass, underlying disease, magnetic resonance imaging (MRI), single-photon emission computed tomography (SPECT), mini-mental status examination (MMSE) of the test subject.
  • MRI magnetic resonance imaging
  • SPECT single-photon emission computed tomography
  • MMSE mini-mental status examination
  • PET positron emission tomography
  • non-marker clinical information By further analyzing the non-marker clinical information as described above, information on the diagnosis or prognosis of pancreatic cancer can be obtained more specifically, and the non-marker clinical information is not limited thereto.
  • the sample may be blood, tissue, cell, whole blood, plasma, serum, saliva, sputum, lymph, cerebrospinal fluid, intercellular fluid, or urine, and if it corresponds to a sample applicable to the diagnosis of pancreatic cancer, it is limited to the above example and can be applied as a sample.
  • Another aspect of the present invention is a) the expression level of one or more miRNAs selected from the group consisting of miR-7154-5p, miR-4486, let-7b-5p and miR-4703-5p in a sample isolated from an individual measuring; and b) comparing the miRNA expression level with the corresponding miRNA expression level of a normal control sample, to a method for diagnosing pancreatic cancer.
  • miR-7154-5p consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4
  • the miR-4486 consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8
  • let-7b-5p consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 sequence
  • the miR-4703-5p may consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the expression of miR-7154-5p is decreased compared to the normal control in the above diagnostic method; the expression of miR-4486 is increased compared to the normal control; the expression of let-7b-5p is increased compared to the normal control group;
  • the step of determining that the miR-4703-5p is pancreatic cancer may be further included.
  • step a) in the diagnostic method is performed for one or more miRNAs selected from the group consisting of miR-155-5p, miR-4284, miR-346, miR-5100, miR-661 and miR-22-3p. Expression levels can be further measured.
  • miR-155-5p consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1
  • the miR-4284 consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2
  • miR-346 consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3
  • the miR-5100 consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5
  • the miR-661 consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6
  • the miR-22-3p consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7
  • the expression of miR-155-5p is decreased compared to the normal control in the diagnostic method; there is expression of said miR-4284; no expression of the miR-346; the expression of miR-5100 is increased compared to the normal control; the expression of miR-661 is decreased compared to the normal control;
  • the step of determining that the miR-22-3p is pancreatic cancer may be further included.
  • step b) in the diagnosis method includes the age, sex, weight, eating habits, body mass, underlying disease, magnetic resonance imaging (MRI), single-photon emission computed tomography (SPECT), MMSE (mini-) of the test subject. It may further include associating one or more non-marker clinical information selected from the group consisting of mental status examination and positron emission tomography (PET).
  • PET positron emission tomography
  • non-marker clinical information By further analyzing the non-marker clinical information as described above, information on the diagnosis or prognosis of pancreatic cancer can be obtained more specifically, and the non-marker clinical information is not limited thereto.
  • the sample may be blood, tissue, cell, whole blood, plasma, serum, saliva, sputum, lymph, cerebrospinal fluid, intercellular fluid, or urine, and if it corresponds to a sample applicable to the diagnosis of pancreatic cancer, it is limited to the above example and can be applied as a sample.
  • composition of the present invention enables early treatment of pancreatic cancer by enabling diagnosis of pancreatic cancer with high accuracy and sensitivity even in the early stages before symptoms appear, and thus has a very high potential for use in diagnosing pancreatic cancer.
  • 1 shows the results of confirming the difference in miRNA profiles between the patient group and the control group through principal component analysis ((a, b) 63 pancreatic cancer samples and 29 non-cancer samples; (c, d) 63 pancreatic cancer samples and 63 non-pancreatic cancer samples; (a, c) all miRNAs; (b, d) miRNAs selected with FDR ⁇ 0.05; non-cancer, non-cancer samples; PC, pancreatic cancer samples; v-ICC; validated intrahepatic cholangiocarcinoma sample; v-PC, validated pancreatic cancer sample; non-PC, non-pancreatic cancer sample).
  • Figure 2 shows the prediction performance based on the K highest marker.
  • Model prediction performance metrics including area under the curve (AUC), sensitivity and specificity in 200 iterations of the 5-fold cross-validation were averaged with a specific K.
  • Accuracy is the average of sensitivity and specificity.
  • FIG. 3 shows a Venn diagram of differentially expressed miRNAs and selected 39 biomarkers.
  • the top 39 miRNAs included 28 miRNAs differentially expressed between pancreatic cancer (PC) and non-cancer samples (FDR ⁇ 0.05) and 11 miRNAs differentially expressed between pancreatic cancer and non-pancreatic cancer (FDR ⁇ 0.05). included
  • FIG. 4 shows a receiver-operating characteristic (ROC) curve for the diagnosis of pancreatic cancer (PC) based on the diagnostic model of the present invention and CA19-9 ((a) the diagnostic model of the present invention; (b) CA19 -9 used diagnostic model). Confidence intervals of the ROC curves are shaded, and the dots represent the sensitivity and specificity based on predefined thresholds in each plot.
  • ROC receiver-operating characteristic
  • Figure 5 shows the miRNA expression level confirmed using qRT-PCR ((a) miR-155-5p; (b) miR-4284; (c) miR-346; (d) miR-7154-5p; ( e) miR-5100; (f) miR-661; (g) miR-22-3p; (h) miR-4486; (i) let-7b-5p; and (j) miR-4703-5p) (* , p -value ⁇ 0.05).
  • PC pancreatic cancer
  • ICC intrahepatic cholangiocarcinoma
  • NL normal control
  • a case-control study was designed to identify differentially expressed miRNAs (DEmiRNAs) between pancreatic cancer patients and control groups and to establish a diagnostic model for pancreatic cancer.
  • the design of this study complied with the ethical guidelines of the 1975 Declaration of Helsinki, and was approved by the ethics committee and institutional review committee of Yonsei University College of Medicine. Written informed consent was obtained from all participating patients and healthy subjects (IRB Approval Code 4-2012-0528, September 20, 2012).
  • PC pancreatic cancer
  • the control group consisted of two types.
  • the first type of control group consisted of 19 healthy subjects and 10 cholelithiasis (Ch) patients in the non-cancer group, and the second type of control group was the non-PC group, which was a non-cancer group.
  • cancer subjects and samples from other cancer patients were also included.
  • 25 pancreatic cancer (PC) and 81 intrahepatic cholangiocarcinoma (ICC) samples were set aside.
  • Table 1 The clinical characteristics and grouping details of the samples through the microarray experiment are shown in Table 1.
  • Each cancer stage was based on the staging of the American Joint Committee on Cancer 7th Edition, and variables were expressed as mean ⁇ standard deviation, median ⁇ standard deviation, or n (%) (PC, pancreatic cancer; ICC, intrahepatic cholangiocarcinoma; SC, gastric cancer; CRC, colorectal cancer; GIST, gastrointestinal stromal tumor; Ch, cholelithiasis; N, normal; SD, standard deviation; CA19-9, carbohydrate antigen 19-9.).
  • PC pancreatic cancer
  • ICC intrahepatic cholangiocarcinoma
  • SC gastric cancer
  • CRC colorectal cancer
  • GIST gastrointestinal stromal tumor
  • Ch cholelithiasis
  • N normal
  • SD standard deviation
  • CA19-9 carbohydrate antigen 19-9.
  • Samples were prospectively obtained from consenting individuals who underwent detailed clinical examination and diagnosis at Yonsei University College of Medicine Severance Hospital. Serum samples from 63 pancreatic cancer patients, 63 non-pancreatic cancer control subjects and another 25 pancreatic cancer patients and 81 intrahepatic cholangiocarcinoma patients were collected in 10 mL BD serum tubes. Samples were centrifuged at 3,000 x g for 20 min at 4 °C. The serum supernatant was then aliquoted and stored at -80 °C until further use.
  • RNA containing miRNA was extracted from the serum sample using a serum miRNA purification kit (Genolution, Seoul, Korea) according to the manufacturer's instructions, and the RNA was resuspended in 12 ⁇ L of RNase-free water and microarray or qRT - Stored at -80 °C until PCR analysis.
  • RNA purity and integrity were evaluated based on the OD260/280 ratio and analyzed using an Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). Analysis using the Affymetrix GeneChip miRNA 4.0 array (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) was performed according to the manufacturer's protocol. 130 ng of RNA samples were labeled using the FlashTag Biotin RNA Labeling Kit (Genisphere, Hatfield, PA, USA). Labeled RNA was quantified, fractionated, and hybridized to miRNA microarrays according to standard procedures provided by the manufacturer.
  • RNA-array hybridization was performed on an Affymetrix 450 Fluidics Station at 48° C. for 16 hours with agitation at 60 revolutions per minute.
  • the chip was washed and stained using a GeneChip Fluidics Station 450 (Affymetrix).
  • the chip was then scanned using an Affymetrix GCS 3000 scanner, and 232 cell files were analyzed and normalized using Expression Console software.
  • the Affymetrix GeneChip Micro 4.0 array provided 100% miRBase v20 coverage (www.mirbase.org) using a one-color approach.
  • pancreatic cancer samples and 29 non-cancer samples were compared in DEmiRNA analysis, and 103 miRNAs showing significant expression differences between the two groups (FDR ⁇ 0.05) were selected (Table 2).
  • miRNAs marked with * are markers differentially expressed between pancreatic cancer samples and non-pancreatic cancer samples, and other miRNAs are markers differentially expressed only between pancreatic cancer samples and non-cancer samples.
  • pancreatic cancer sample and the non-pancreatic cancer sample were compared for all miRNAs (all miRNAs), an overlapping pattern of principal components between the pancreatic cancer sample and the non-pancreatic cancer sample was found ( FIG. 1c ).
  • FIG. 1d When 149 miRNAs were targeted (FIG. 1d), it was confirmed that the clustering patterns of 63 pancreatic cancer samples (PC) and 63 non-pancreatic cancer samples were almost distinct.
  • the validated samples 25 v-PCs and 81 v-ICCs
  • miRNAs marked with * are markers differentially expressed between pancreatic cancer samples and non-cancer samples, and other miRNAs are markers differentially expressed only between pancreatic cancer samples and non-pancreatic cancer samples.
  • pancreatic cancer versus non-pancreatic cancer grouping was more suitable than the pancreatic cancer versus non-cancer grouping for the identification of pancreatic cancer-specific diagnostic markers.
  • miRNA biomarkers were selected from among 2,578 human mature miRNAs according to the following procedure.
  • Step 1 Allocate training/test data:
  • the first candidate miRNA was selected (FDR ⁇ 0.05).
  • the second candidate miRNA with a coefficient other than 0 was selected by applying a SCAD (smoothly clipped absolute deviation) penalty to the first candidate miRNA.
  • Step 4 selection of final variable through voting:
  • Step 5 Build a Predictive Model
  • a Radial Basis Function (RBF)-kernel SVM containing K top miRNAs was applied using the entire training data set.
  • SCAD is a non-concave penalty function, considered a sparse SVM with SCAD for feature selection.
  • the expression of the SCAD-penalty term for each coefficient t j is as follows.
  • Markers were ranked according to their frequency of selection. Based on these frequencies, an RBF kernel SVM model was constructed using the K best miRNAs. To determine the K value, through double cross-validation, the diagnostic performance of the model with the K highest miRNA was estimated by changing the K.
  • the top 39 miRNAs were selected as diagnostic markers for pancreatic cancer (Table 4).
  • miRNAs marked with * are markers differentially expressed between pancreatic cancer samples and non-cancer samples, and other miRNAs are markers differentially expressed only between pancreatic cancer samples and non-pancreatic cancer samples.
  • the optimal threshold value was determined to be 0.55 by comparing the performance results at the threshold values 0.5, 0.55, 0.6, 0.65 and 0.7.
  • pancreatic cancer-specific diagnostic model of the present invention was applied to another sample set, 25 pancreatic cancer and 81 intrahepatic cholangiocarcinoma sample sets.
  • pancreatic cancer-diagnosis probability in the diagnostic model was >0.55, it was diagnosed as having pancreatic cancer.
  • CA19-9 diagnosis was applied to the same sample, and when the CA19-9 value > 37, it was diagnosed as pancreatic cancer.
  • the area under the curve (AUC) of the diagnostic model of the present invention was about 1.5 times higher than that of the diagnostic model using CA19-9, and the sensitivity was about 1.3 times, specific It was confirmed that the specificity was about 2 times higher.
  • TaqMan Advanced miRNA cDNA synthesis kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) was used to synthesize cDNA according to the manufacturer's protocol, and TaqMan Advanced miRNA Assays (Applied Biosystems) and TaqMan Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems) were manufactured by the manufacturer. qRT-PCR was performed using the protocol of
  • qRT-PCR was performed using ABI Prism 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems), and primers were purchased from Applied Biosystems and TaqMan primers were used.
  • PCR amplification consisted of an initiation step at 95 °C for 10 min followed by 55 cycles of 20 s at 95 °C, 30 s at 56 °C and 15 s at 72 °C.
  • qRT-PCT analyzes were performed in triplicate, and total RNA samples from 17 patients with pancreatic cancer, 8 patients with intrahepatic cholangiocarcinoma, and 8 healthy individuals were included (each cancer stage is the stage of the American Joint Committee on Cancer 7th Edition). Based on classification, variables were expressed as mean ⁇ standard deviation, median ⁇ standard deviation, or n (%) (PC, pancreatic cancer; ICC, intrahepatic cholangiocarcinoma; N, normal; SD, standard deviation; CA19-9, carbohydrate). Carbohydrate antigen 19-9.).
  • miR-155-5p, miR-4284, miR-346, miR-7154-5p, miR-5100, miR-661, miR-22-3p, miR-4486, let-7b-5p, and miR- The expression level of 4703-5p was verified, and as a result, as shown in FIG. 5 , it was confirmed that differential expression appeared in the pancreatic cancer sample, the intrahepatic cholangiocarcinoma sample, and the normal control (healthy person) sample.
  • the expression of miR-155-5p, miR-7154-5p, miR-661 and miR-4703-5p was decreased in pancreatic cancer patient samples, and miR-5100, miR-22-3p, miR-4486 and let-7b-5p expression was increased.
  • miR-4284 was expressed only in pancreatic cancer and intrahepatic cholangiocarcinoma samples, but not in normal controls.
  • miR-346 was expressed only in intrahepatic cholangiocarcinoma samples and normal control samples, but not in pancreatic cancer patient samples.
  • the miRNA biomarker sequences capable of diagnosing pancreatic cancer of the present invention are summarized in Table 6 below.
  • the miRNA marker of the present invention can be utilized for early diagnosis of pancreatic cancer, and is expected to serve as a major platform for developing a commercial model capable of diagnosing pancreatic cancer.

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Abstract

본 발명은 췌장암의 진단용 조성물, 이를 포함하는 키트 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

신규 췌장암 바이오마커 및 이의 용도
본 발명은 췌장암 진단용 조성물, 이를 포함하는 키트 및 이의 용도에 관한 것이다.
췌장암 (pancreatic cancer, PC)은 암과 관련된 사망의 주요 원인 중 하나로, 췌장암의 증상은 질병의 초기 단계에는 거의 나타나지 않고, 상기 암이 대부분 다른 기관으로 전이된 후에 발견된다. 2020 년 암 통계에 따르면, 췌장암 환자의 5 년 생존율은 9 %에 불과하지만, 2009 년부터 2015 년까지 췌장암 진단을 받은 환자를 기준으로 국부 췌장암 환자의 생존율은 37 % 이상이다.
췌장암은 초기에는 별로 증세를 느끼지 않으며, 이미 전신 전이가 일어난 후에 통증과 체중 감소 등의 증세가 나타나는 것이 보통이어서, 더욱 치유율이 낮은 편이므로 정기적인 진단이 매우 중요하다. 임상 증세는 대부분이 서서히 발병하고, 허약해지기 쉬우며, 식욕 감퇴, 체중 감소는 가장 흔한 증세이다. 췌장암은 5년 생존율이 1~4 %, 중앙생존기간 5 개월에 이르는 치명적인 암으로 인체의 암 중에서 가장 불량한 예후를 보이고 있다. 또한, 80~90 % 환자에서 진단 시 완치를 기대하는 근치적 절제가 불가능한 상태에서 발견되기 때문에 예후가 불량하고 치료는 주로 항암 요법에 의존하고 있으므로, 그 어떤 인체 암보다도 조기 진단법 개발이 절실히 요구되고 있다.
췌장암 또는 췌장암 전구 병변의 진단은 혈액 검사, 위, 십이지장의 X선 조영검사, 피부 및 간을 통한 담도촬영과 역행성 내시경 담도촬영술 사용되고 있다. 추가적으로 초음파 촬영 및 전산화 단층 촬영이 많이 사용되고 있으나, 현재까지의 검사 방법들은 정확도가 떨어지거나, 환자에게 고통이 따르는 등 그 수행 방법이 매우 불편한 단점이 있다.
이와 같이 췌장암은 조기 진단이 어려우면서도 사망률이 높고, 검사 방법 역시 환자들에게 고통이 수반되는 바, 조기에 정확히 진단하면서도 검사시 환자의 고통이 감소될 수 있는 진단 방법의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
본 발명의 목적은 췌장암의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 진단용 조성물을 포함하는 췌장암의 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 췌장암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 췌장암 진단 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 측면은 miR-7154-5p, miR-4486, let-7b-5p 및 miR-4703-5p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA에 대한 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 췌장암 진단용 조성물에 관한 것이다.
구체적으로, 상기 miR-7154-5p는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지고, 상기 miR-4486은 서열번호 8의 염기서열로 이루어지고, 상기 let-7b-5p은 서열번호 9의 염기서열로 이루어지고, 상기 miR-4703-5p는 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한 구체적으로, 상기 진단용 조성물은 miR-155-5p, miR-4284, miR-346, miR-5100, miR-661 및 miR-22-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA에 대한 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
더욱 구체적으로, 상기 miR-155-5p는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지고, 상기 miR-4284는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지고, 상기 miR-346는 서열번호 3의 염기서열로 이루어지고, 상기 miR-5100는 서열번호 5의 염기서열로 이루어지고, 상기 miR-661는 서열번호 6의 염기서열로 이루어지고, 상기 miR-22-3p는 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
췌장은 위장의 뒤쪽, 몸의 가운데에 있으며 길이가 20 cm 정도로 길다. 위, 십이지장, 소장, 대장, 간, 담낭, 비장 등의 장기에 둘러싸여 있다. 전체 길이는 약 15 내지 20 cm, 무게는 100 g 정도이고, 두부(頭部), 체부(體部), 미부(尾部)로 구분된다. 췌장은 섭취한 음식물 중의 탄수화물, 지방, 단백질을 분해하는 소화 효소를 분비하는 외분비 기능과 혈당을 조절하는 인슐린과 글루카곤 등의 호르몬을 분비하는 내분비 기능을 갖는다.
또한 췌장은 두께가 2 cm 정도로 얇으며 피막만으로 싸여 있으며 소장에 산소를 공급하는 상장간막 동맥과 장에서 흡수한 영양분을 간으로 운반하는 간문맥 등과 밀착되어 있어 암의 침윤이 쉽게 일어난다. 또한 췌장 후면의 신경 다발과 임파선에도 조기에 전이가 발생하는 특징이 있다. 특히 췌장 암세포는 성장 속도가 빠르다. 발병시 4 개월 내지 8 개월밖에 살지 못하는 경우가 대부분으로, 예후가 좋지 않고, 수술에 성공하여 증상이 나아진다고 해도 5 년 이상 생존하는 비율이17 % 정도로 적은 편이다.
본 발명에서, “췌장암(pancreatic cancer)”은 췌장에 생긴 암세포로 이루어진 종괴이다. 췌장암에는 여러 가지 종류가 있으며 90 % 정도를 차지하고 있는 췌관 세포에서 발생한 췌관 선암종과 함께 낭종성암(낭선암), 내분비종양을 모두 포함한다.
본 발명에서 상기와 같은 췌장암을 증세가 나타나기 전이라도 진단할 수 있는 정확도 및 민감도가 높은 바이오마커를 규명하여 진단용 조성물로 개발하였다.
본 발명에서, 상기 “제제”는 miRNA에 특이적으로 결합하는 물질로서, 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 프라이머는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 갖는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시될 수 있다.
본 발명에서, “miRNA”는 통상 헤어핀 모양 구조의 RNA 전구체로서 전사되고, mRNA의 번역 억제에 관여할 수 있는 15~25 염기의 비코딩 RNA를 말한다. 또한, 본 발명의 miRNA는 miR-7154-5p, miR-4486, let-7b-5p, miR-4703-5p, miR-155-5p, miR-4284, miR-346, miR-5100, miR-661 또는 miR-22-3p의 특정 염기서열(또는 서열번호)로 나타내어지는 miRNA뿐만 아니라 상기 miRNA의 전구체(pre-miRNA, pri-miRNA), 이들과 생물학적 기능이 동등한 miRNA, 예를 들면 동족체(즉, 호몰로그 또는 오솔로그), 유전자다형 등의 변이체, 및 유도체도 포함한다. 이러한 전구체, 동족체, 변이체 또는 유도체로서는 구체적으로는 miRBase release 20(http://www.mirbase.org/)에 의해 동정할 수 있고, 엄격한 조건 하에서 서열번호 1 내지 10의 miRNA의 상보서열과 혼성화하는 염기서열을 갖는 miRNA를 포함할 수 있다.
또한, 본 명세서에서 사용하는 miRNA는 miR 유전자의 유전자 산물일 수 있으며, 이러한 유전자 산물은 성숙 miRNA(예를 들면, 상기와 같은 mRNA의 번역 억제에 관여하는 15~25 염기 또는 19~25 염기의 비코딩 RNA) 또는 miRNA 전구체(예를 들면, 상기와 같은 pre-miRNA 또는 pri-miRNA)를 포함할 수 있다.
본 발명에서는 상기 하나 이상의 miRNA에 특이적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 발현 수준을 확인함으로써 췌장암을 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
상기 프로브는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수십 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 말한다. 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 위 하나 이상의 miRNA와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여 발현 수준을 확인함으로써 췌장암을 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건, 라벨링 여부는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
상기 안티센스 뉴클레오티드는 본 발명의 miRNA에 대해 상보적으로 결합할 수 있는 RNA, DNA, PNA 등 핵산이 포함된 모든 형태를 의미하며, 안티센스 뉴클레오티드의 길이, 형태, 라벨링 여부 등은 필요에 따라 적절히 변형하여 적용할 수 있다.
본 발명 일 실시예에서는 상기 miR-155-5p, miR-4284, miR-346, miR-7154-5p, miR-5100, miR-661, miR-22-3p, miR-4486, let-7b-5p 및/또는 miR-4703-5p의 단독 및/또는 조합을 통해 높은 정확도 및 민감도로 췌장암을 진단할 수 있음을 확인하였다.
구체적으로, 본 발명의 췌장암 진단용 조성물은 miR-7154-5p, miR-4486, let-7b-5p 및 miR-4703-5p에 대한 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 것일 수 있다.
더욱 구체적으로, miR-7154-5p, miR-4486, let-7b-5p, miR-4703-5p, miR-155-5p, miR-4284, miR-346, miR-5100, miR-661 및 miR-22-3p에 대한 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명 일 실시예에서는 췌장암 환자, 정상 대조군(non-cancer), 비-췌장암(non-pancreatic cancer) 사이에 차등적으로 발현되는 miRNA를 선별하고, 선별된 miRNA의 발현 수준을 qRT-PCR을 이용하여 검증하였다. 이를 통해 신규 췌장암 바이오마커로서 miR-7154-5p, miR-4486, let-7b-5p 및 miR-4703-5p을 발굴하였으며, 정상 대조군과의 miRNA 차등 발현을 확인함으로써 췌장암이 진단될 수 있음을 확인하였다. 나아가, 상기 신규 miRNA 마커 외에도 miR-155-5p, miR-4284, miR-346, miR-5100, miR-661 및 miR-22-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA와의 조합을 통해 높은 정확도 및 민감도로 췌장암을 진단할 수 있음을 확인하였다.
또한, 상기 진단용 조성물은 췌장암 및 간내 담관암을 조기에 구분하여 진단하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명 일 실시예에서는 상기 miR-155-5p, miR-4284, miR-346, miR-7154-5p, miR-5100, miR-661, miR-22-3p, miR-4486, let-7b-5p 및/또는 miR-4703-5p의 발현이 췌장암 환자군과 간내 담관암 환자군 간 차이가 나타남을 확인하였는 바, 상기 miRNA의 단독 및/또는 조합을 통해 췌장암 및 간내 담관암을 조기에 구분하여 진단할 수 있다.
본 발명에서, “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체 즉 검사 대상자의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다. 특히, 췌장암 및 간내 담관암을 구분하여 진단하는 것을 포함할 수 있으며, 더욱 구체적으로는 췌장암 및 간내 담관암의 증상이 인지되기 전 초기에 진단하는 것으로 포함한다.
본 발명의 다른 일 측면은 상기 췌장암 진단용 조성물을 포함하는 췌장암 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 키트는 췌장암의 발병이 의심되는 개체의 혈액, 혈청, 뇨 등에서 발현되는 miRNA의 수준을 측정하여 암의 발병을 진단하는데 사용될 수 있으며, 상기 miRNA의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브, 안티센스 뉴클레오티드 등 측정 또는 분석에 필요한 성분, 용액, 장치 등을 제한없이 포함하여 구성할 수 있다. 일 예로, RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 진단용 키트는 용액, 동결건조 분말, 냉동 용액, 또는 스트립 형태를 포함할 수 있으며, 각각의 형태는 당업계에서 통상적인 방법으로 제제화할 수 있다. 또한 키트를 사용하기 위한 설명서를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 a) 개체로부터 분리된 시료에서 miR-7154-5p, miR-4486, let-7b-5p 및 miR-4703-5p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA에 대한 발현 수준을 측정하는 단계; 및 b) 상기 miRNA 발현 수준을 정상 대조군 시료의 해당 miRNA 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 췌장암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 상기 miR-7154-5p는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지고, 상기 miR-4486은 서열번호 8의 염기서열로 이루어지고, 상기 let-7b-5p은 서열번호 9의 염기서열로 이루어지고, 상기 miR-4703-5p는 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한 구체적으로, 상기 miR-7154-5p의 발현이 정상 대조군 대비 감소하거나; 상기 miR-4486의 발현이 정상 대조군 대비 증가하거나; 상기 let-7b-5p의 발현이 정상 대조군 대비 증가하거나; 상기 miR-4703-5p의 발현이 정상 대조군 대비 감소한 경우, 췌장암으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한 구체적으로, 상기 a) 단계는 miR-155-5p, miR-4284, miR-346, miR-5100, miR-661 및 miR-22-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA에 대한 발현 수준을 추가로 측정할 수 있다.
더욱 구체적으로, 상기 miR-155-5p는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지고, 상기 miR-4284는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지고, 상기 miR-346는 서열번호 3의 염기서열로 이루어지고, 상기 miR-5100는 서열번호 5의 염기서열로 이루어지고, 상기 miR-661는 서열번호 6의 염기서열로 이루어지고, 상기 miR-22-3p는 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
더욱 구체적으로, 상기 miR-155-5p의 발현이 정상 대조군 대비 감소하거나; 상기 miR-4284의 발현이 있거나; 상기 miR-346의 발현이 없거나; 상기 miR-5100의 발현이 정상 대조군 대비 증가하거나; 상기 miR-661의 발현이 정상 대조군 대비 감소하거나; 상기 miR-22-3p 의 발현이 정상 대조군 대비 증가한 경우, 췌장암으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한 구체적으로, 상기 b) 단계는 검사 대상자의 나이, 성별, 체중, 식습관, 체질량, 기저질환, 자기공명영상법(MRI), SPECT(single-photon emission computed tomography), MMSE(mini-mental status examination) 및 양전자 방사 단층촬영(positron emission tomography; PET)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 비마커 임상정보를 연관시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
상기와 같은 비마커 임상정보를 추가로 분석함으로써 췌장암의 진단 또는 예후 예측에 관한 정보를 보다 구체적으로 얻을 수 있으며, 이러한 비마커 임상정보는 상기에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 시료는 혈액, 조직, 세포, 전혈, 혈장, 혈청, 타액, 객담, 림프액, 뇌척수액, 세포간액 또는 뇨인 것일 수 있으며, 췌장암의 진단에 적용될 수 있는 시료에 해당하면 상기 예시에 제한되지 않고 시료로서 적용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 a) 개체로부터 분리된 시료에서 miR-7154-5p, miR-4486, let-7b-5p 및 miR-4703-5p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA에 대한 발현 수준을 측정하는 단계; 및 b) 상기 miRNA 발현 수준을 정상 대조군 시료의 해당 miRNA 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 췌장암 진단 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 상기 진단방법에서 miR-7154-5p는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지고, 상기 miR-4486은 서열번호 8의 염기서열로 이루어지고, 상기 let-7b-5p은 서열번호 9의 염기서열로 이루어지고, 상기 miR-4703-5p는 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한 구체적으로, 상기 진단방법에서 miR-7154-5p의 발현이 정상 대조군 대비 감소하거나; 상기 miR-4486의 발현이 정상 대조군 대비 증가하거나; 상기 let-7b-5p의 발현이 정상 대조군 대비 증가하거나; 상기 miR-4703-5p의 발현이 정상 대조군 대비 감소한 경우, 췌장암으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한 구체적으로, 상기 진단방법에서 a) 단계는 miR-155-5p, miR-4284, miR-346, miR-5100, miR-661 및 miR-22-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA에 대한 발현 수준을 추가로 측정할 수 있다.
더욱 구체적으로, 상기 진단방법에서 miR-155-5p는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지고, 상기 miR-4284는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지고, 상기 miR-346는 서열번호 3의 염기서열로 이루어지고, 상기 miR-5100는 서열번호 5의 염기서열로 이루어지고, 상기 miR-661는 서열번호 6의 염기서열로 이루어지고, 상기 miR-22-3p는 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
더욱 구체적으로, 상기 진단방법에서 miR-155-5p의 발현이 정상 대조군 대비 감소하거나; 상기 miR-4284의 발현이 있거나; 상기 miR-346의 발현이 없거나; 상기 miR-5100의 발현이 정상 대조군 대비 증가하거나; 상기 miR-661의 발현이 정상 대조군 대비 감소하거나; 상기 miR-22-3p의 발현이 정상 대조군 대비 증가한 경우, 췌장암으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한 구체적으로, 상기 진단방법에서 b) 단계는 검사 대상자의 나이, 성별, 체중, 식습관, 체질량, 기저질환, 자기공명영상법(MRI), SPECT(single-photon emission computed tomography), MMSE(mini-mental status examination) 및 양전자 방사 단층촬영(positron emission tomography; PET)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 비마커 임상정보를 연관시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
상기와 같은 비마커 임상정보를 추가로 분석함으로써 췌장암의 진단 또는 예후 예측에 관한 정보를 보다 구체적으로 얻을 수 있으며, 이러한 비마커 임상정보는 상기에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 시료는 혈액, 조직, 세포, 전혈, 혈장, 혈청, 타액, 객담, 림프액, 뇌척수액, 세포간액 또는 뇨인 것일 수 있으며, 췌장암의 진단에 적용될 수 있는 시료에 해당하면 상기 예시에 제한되지 않고 시료로서 적용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 증상이 나타나기 전 초기에도 높은 정확성과 민감도로 췌장암 진단이 이루어질 수 있도록 함으로써, 조기에 치료가 가능하도록 하는 바, 췌장암 진단에 대한 활용 가능성이 매우 높다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 주성분 분석을 통해 환자군 및 대조군 사이의 miRNA 프로파일의 차이를 확인한 결과를 나타낸 것이다((a, b) 63 개 췌장암 샘플 및 29 개의 비-암 샘플; (c, d) 63 개의 췌장암 샘플 및 63 개의 비-췌장암 샘플; (a, c) 모든 miRNA(all miRNA); (b, d) FDR < 0.05로 선별된 miRNA; non-cancer, 비-암 샘플; PC, 췌장암 샘플; v-ICC, 검증된 간내 담관암 샘플; v-PC, 검증된 췌장암 샘플; non-PC, 비-췌장암 샘플).
도 2는 K 최상위 마커를 기반으로 한 예측 성능을 나타낸 것이다. 5-폴드 교차 검증의 200 회 반복에서 곡선하면적(area under the curve, AUC), 민감도(sensitivity) 및 특이도(specificity)를 포함하는 모델 예측 성능 메트릭스(metrics)를 특정 K 로 평균화하였다. 정확도(accuracy)는 민감도 및 특이도의 평균이다.
도 3은 차등적으로 발현된 miRNA 및 선별된 39 개 바이오마커의 벤다이어그램을 나타낸 것이다. 상위 39 개 miRNA에는 췌장암(PC) 샘플 및 비-암 샘플 간에 차등적으로 발현된 28 개의 miRNA(FDR < 0.05) 및 췌장암과 비-췌장암 간에 차등적으로 발현된 11 개의 miRNA(FDR < 0.05)가 포함되었다.
도 4는 본 발명 진단 모델 및 CA19-9를 기반으로 한 췌장암(PC) 진단을 위한 수신자 조작 특성(Receiver-operating characteristic, ROC) 곡선을 나타낸 것이다((a) 본 발명 진단 모델; (b) CA19-9 이용 진단 모델). ROC 곡선의 신뢰 구간은 음영으로 표시하였으며, 점은 각 플롯에서 미리 정의된 임계값을 기반으로 하는 민감도와 특이도를 나타낸다.
도 5는 qRT-PCR을 사용하여 확인한 miRNA 발현 수준을 나타낸 것이다((a) miR-155-5p; (b) miR-4284; (c) miR-346; (d) miR-7154-5p; (e) miR-5100; (f) miR-661; (g) miR-22-3p; (h) miR-4486; (i) let-7b-5p; 및 (j) miR-4703-5p) (*, p-value < 0.05). 각 군 하단에 (miRNA 발현 샘플 수(Number Expression)/총 샘플 수(Number Total)를 나타내었다(PC, 췌장암; ICC, 간내 담관암; NL, 정상 대조군).
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 연구 설계 및 샘플 준비
1-1. 연구 설계
췌장암 환자와 대조군 그룹 사이에 차등적으로 발현된 miRNA(differentially expressed miRNA, DEmiRNA)를 식별하고 췌장암에 대한 진단 모델을 구축하기 위해 환자-대조군 연구를 설계하였다. 본 연구 설계는 1975 년 헬싱키 선언의 윤리 지침을 준수하였으며, 연세대학교 의과대학 윤리 위원회 및 기관 검토 위원회로부터 승인받았다. 모든 참여 환자 및 건강한 피험자로부터 서면 사전 동의서를 받았다(IRB 승인 코드 4-2012-0528, 2012 년 9 월 20 일).
환자의 경우, 63 명의 췌장암(pancreatic cancer, PC) 환자를 대상으로 하였으며, 대조군의 경우 두 가지 유형으로 구성하였다. 첫번째 유형의 대조군은 비-암군은 19 명의 건강한 피험자 및 10 명의 담석증(cholelithiasis, Ch) 환자로 구성하였으며, 두 번째 유형의 대조군은 비-췌장암군(non-PC group)으로서, 비-암(non cancer) 피험자 및 다른 암 환자의 샘플도 포함하였다. 특히, 20 명의 간내 담관암(intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC) 환자, 7 명의 위암(stomach cancer, SC) 환자, 5 명의 대장암(colorectal cancer, CRC) 환자, 2 명의 위장관기질종양(gastrointestinal stromal tumor, GIST) 환자를 포함하였다. 검증(validation) 을 위해 25 개 췌장암(PC) 및 81 개의 간내 담관암(ICC) 샘플을 따로 설정하였다. 마이크로어레이 실험을 통한 샘플의 임상적 특성과 그룹화 세부 사항은 표 1에 나타난 바와 같다. 각 암 단계는 American Joint Committee on Cancer 제 7판의 단계 분류를 기반으로 하였으며, 변수는 평균 ± 표준 편차, 중앙값 ± 표준 편차, 또는 n (%)로 표현하였다 (PC, 췌장암; ICC, 간내 담관암; SC, 위암; CRC, 대장암; GIST, 위장관기질종양; Ch, 담석증; N, 정상; SD, 표준편차; CA19-9, 탄수화물 항원(carbohydrate antigen) 19-9.).
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1-2. 샘플 수집 및 보관
샘플은 연세대학교 의과대학 세브란스 병원에서 상세한 임상 검사 및 진단을 받은 동의한 개인으로부터 전향적으로 획득하였다. 63 명의 췌장암 환자, 63 명의 비-췌장암 대조군 피험자 및 또 다른 25 명의 췌장암 환자 및 81 명의 간내 담관암 환자의 혈청 샘플을 10 mL BD 혈청 튜브에 수집하였다. 샘플은 3,000 x g에서 20 분동안 4 ℃에서 원심분리하였다. 이후 혈청의 상층액을 분취하고 추가 사용이 있을 때까지 -80 ℃에서 보관하였다.
1-3. miRNA 추출
miRNA를 포함하는 총 RNA를 혈청 miRNA 정제 키트(Genolution, Seoul, Korea)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 상기 혈청 샘플로부터 추출하고, 상기 RNA를 RNase가 없는 물 12 μL에 재현탁하고 마이크로어레이 또는 qRT-PCR 분석때까지 -80 ℃에서 보관하였다.
1-4. miRNA 마이크로어레이 실험
품질관리를 위해, RNA의 순도(purity) 및 무결성(integrity)을 OD260/280 비율을 기반으로 평가하고, Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)를 사용하여 분석하였다. Affymetrix GeneChip miRNA 4.0 array(Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)를 사용한 분석은 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. RNA 샘플 130 ng을 FlashTag Biotin RNA Labeling Kit(Genisphere, Hatfield, PA, USA)를 사용하여 라벨링하였다. 라벨링 된 RNA는 제조사가 제공한 표준 절차에 따라 정량화, 분획화 및 miRNA 마이크로어레이에 혼성화하였다.
다음으로, 상기 라벨링 된 RNA를 99 ℃에서 5 분 동안 가열한 다음 45 ℃에서 5 분 동안 가열하였다. RNA-어레이 혼성화는 Affymetrix 450 Fluidics Station 상에서 48 ℃에서 16 시간 동안 분당 60 회전으로 교반하면서 수행하였다. GeneChip Fluidics Station 450(Affymetrix)을 사용하여 상기 칩을 세척하고 염색하였다. 이후 Affymetrix GCS 3000 스캐너를 사용하여 칩을 스캔하고, Expression Console software를 사용하여 232 개의 세포 파일을 분석 및 정규화하였다. Affymetrix GeneChip Micro 4.0 어레이는 단색 접근법(one-color approach)을 사용하여 100 % miRBase v20 coverage (www.mirbase.org)를 제공하였다. 상기 칩은 내부 및 음성 대조군을 포함하는 미성숙(pre-mature) miRNA(n=2,025) 및 다른 스몰(small) RNA(n=1,996)가 포함된 6,658 개의 인간 프로브 세트를 포함하며, 추가 분석을 위해 모든 프로브 세트에서 2,578 개의 성숙한(mature) 인간 miRNA를 추출하였다.
실시예 2. 차등 발현 유전자(Differentially Expressed Genes, DEGs) 기반 주성분 분석(Principal components analysis, PCA)
환자군과 대조군 간의 발현 수준의 차이를 알아보기 위해 2,578 개의 인간 성숙 miRNA에 대한 Log2-변환 및 정규화된 강도를 분석하였다. DEmiRNA(Differentially Expressed miRNA)를 식별하기 위해 로지스틱 회귀 분석을 사용하였다. 오발견 비율(false discovery rate, FDR) 방법을 사용하여 통계적 유의성을 결정하였으며, FDR < 0.05를 유의한 것으로 간주하였다.
환자군 및 대조군 사이의 miRNA 프로파일의 차이를 조사하기 위해 주성분 분석 을 수행하였다. 상기 두 그룹의 주성분은 i) 모든 miRNA 및 ii) FDR < 0.05인 서로 다른 miRNA 세트를 기반으로 분석하였다. 검증(validation) 샘플((25 개의 췌장암 샘플 및 81 개의 간내 담관암 샘플) 역시 상기 PCA 모델을 기반으로 주성분을 예측하였다. 각 그룹의 패턴을 시각화하기 위해, 다변량 t 분포를 기반으로 PCA 플롯에서 주성분의 95 % 신뢰 타원을 추가하였다.
구체적으로, DEmiRNA 분석에서 63 개 췌장암 샘플 및 29 개의 비-암 샘플을 비교하였으며, 두 그룹(FDR < 0.05) 간의 상당한 발현의 차이를 보이는 103 개의 miRNA를 선별하였다(표 2).
또한, 도 1에 나타난 바와 같이 모든 miRNA(all miRNA)를 대상으로 췌장암 샘플 및 비-암 샘플을 비교한 경우(도 1a)에 비해, FDR < 0.05로 선별된 103 개의 miRNA를 대상으로 하였을 때(도 1b) 63 개의 췌장암 샘플(PC) 및 29 개의 비-암(non-cancer) 샘플의 구분이 보다 명확한 것을 확인하였다. 특히, 검증된 PC 샘플(v-PC)의 경우 도 1a 및 1b에 나타난 바와 같이 63 개의 췌장암 샘플과 유사한 패턴을 나타내는 것을 확인하였다.
반면, 81 개의 검증된 간내 담관암 샘플(v-ICC)의 경우 췌장암 샘플의 패턴과 겹치는 패턴이 나타났다. 따라서, 비-암 샘플만을 대조군으로 이용할 경우, 다수의 위양성이 유도될 수 있으며, 췌장암 특이적인 진단으로는 정확하지 않을 수 있다. 예를 들어, 간내 담관암 환자를 췌장암 환자로 진단할 수 있다.
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상기 표 2에서 *로 표시된 miRNA는 췌장암 샘플과 비-췌장암 샘플 간에도 차등적으로 발현된 마커이며, 그 외 miRNA는 췌장암 샘플 및 비-암 샘플 사이에서만 차등적으로 발현된 마커이다.
또한, DEmiRNA 분석에서 63 개의 췌장암 샘플 및 63 개의 비-췌장암 샘플을 비교하였으며, 두 그룹(FDR < 0.05) 간의 상당한 발현의 차이를 보이는 149 개의 miRNA를 선별하였다(표 3).
모든 miRNA(all miRNA)를 대상으로 췌장암 샘플 및 비-췌장암 샘플을 비교한 경우 췌장암 샘플 및 비-췌장암 샘플 간 주성분의 중복 패턴이 나타났으며(도 1c), 이에 비해, FDR < 0.05로 선별된 149 개의 miRNA를 대상으로 하였을 때(도 1d) 63 개의 췌장암 샘플(PC) 및 63 개의 비-췌장암 샘플의 클러스터링 패턴이 거의 구별되는 것을 확인하였다. 특히, 검증된 샘플(25 개 v-PC 및 81 개 v-ICC)의 경우 도 1d에 나타난 바와 같이 트레이닝(training) 환자-대조군 샘플과 유사한 패턴을 나타내는 것을 확인하였다.
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상기 표 3에서 *로 표시된 miRNA는 췌장암 샘플 및 비-암 샘플 간에도 차등적으로 발현된 마커이며, 그 외 miRNA는 췌장암 샘플 및 비-췌장암 샘플 사이에서만 차등적으로 발현된 마커이다.
따라서, 췌장암 대 비-췌장암 그룹화가 췌장암 특이적 진단 마커의 식별에 있어서 췌장암 대 비-암 그룹화보다 더 적합한 것을 확인하였다.
실시예 3. miRNA 마커 선별 및 진단모델 구축
3-1. 진단을 위한 바이오마커 선별
췌장암 진단을 위해 2,578 개의 인간 성숙 miRNA 중에서 miRNA 바이오마커를 다음 절차에 따라 선택하였다.
1) 1단계(트레이닝/테스트 데이터 할당):
- 전체 데이터를 대략적으로 동일한 크기의 서브세트(폴드) 5 개로 무작위로 분류하였다.
- 상기 5 개 폴드 각각을 테스트 데이터로 간주하고 나머지 폴드를 트레이닝 데이터로 지정하였다(5-폴드 교차 검증).
2) 2단계(후보 변수 선택):
- 개별적으로 할당된 트레이닝 데이터를 사용하여 로지스틱 회귀 분석을 수행하고, 각 miRNA에 대한 p-값 및 조정된 p-값(FDR)을 계산하였다.
- 첫 번째 후보 miRNA를 선별하였다(FDR < 0.05).
- 첫 번째 후보 miRNA에 SCAD(smoothly clipped absolute deviation) 패널티를 적용하여 계수가 0이 아닌 두 번째 후보 miRNA를 선별하였다.
3) 3단계 (반복):
- 상기 1단계 및 2단계를 무작위 시드로 200 회 반복하였다.
- 후보 miRNA 1,000 개 세트(5-폴드 CV * 200 회 반복)를 얻었다.
4) 4단계 (투표(voting)를 통한 최종 변수 선택):
- 후보 miRNA 100 개 세트로부터, 각 후보 miRNA의 빈도를 계산하였다.
- 후보 miRNA는 빈도별로 분류하였다.
5) 5 단계 (예측 모델 구축):
- 상위 K 등급 miRNA로부터 방사형 기저 함수(radial basis function, RBF) 커널 SVM(Support Vector Machines) 모델을 구축하였다(K = 2,...,50).
- 각 모델 (K=2,...,50)에서 최적의 하이퍼파라미터와 성능을 이중 교차-검증을 사용하여 계산하였다.
- 각 모델의 성능에 따라 최적의 K를 결정하였다.
- 최종 모델로, 전체 트레이닝 데이터 세트를 사용하여 K 개의 최상위 miRNA가 포함된 RBF(Radial Basis Function)-커널(kernel) SVM을 적용하였다.
3-2. 이중 교차 검증
진단 모델의 파라미터화 및 검증을 위해, 내부 및 외부 교차 검증으로 구성된 이중 교차-검증을 사용하였다. 최적의 K 값을 결정하기 위해 외부 5-폴드 교차 검증 및 SVM의 하이퍼파라미터 할당에 대한 내부 5-폴드 교차 검증을 수행하였다. 내부 5-폴드 교차 검증에서 핵심 하이퍼파라미터의 그리드 서치를 위해 -2-10 부터 210 (-2-10, 2-9,… 29, 210) 범위의 감마 값 및 -2-7 부터 27 (2-7, 2-6,…, 26, 27) 범위의 비용 값을 할당하였다. 외부 5폴드 교차 검증에서 K 최상위 miRNA가 있는 진단 모델을 테스트 데이터에 적용하고, 곡선 아래 면적 (AUC), 민감도, 및 특이성을 각 폴드에 대해 계산하였다. 여러 K 값 (K = 2,…, 50)에 대해 이러한 성능을 계산하였다. 상기 이중 교차 검증은 무작위 시드에서 20 회 반복하였다. 그런 다음 성능 메트릭스(metrics)는 5-폴드 20 회 반복에 대하여 평균화하였다. 이 성능을 기반으로, 최종 바이오마커 수(=K)를 결정하였다.
3-3. SCAD(Smoothly clipped absolute deviation, SCAD) 패널티
SCAD는 비-오목형 패널티 함수로, 특징 선택을 위한 SCAD가 있는 희소 SVM으로 간주된다. 각 계수 t j에 대한 SCAD-패널티 항의 수식은 다음과 같다.
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본 발명에서는 Fan, J., & Li, R., J. Am. Stat. Assoc. 2001, 96, 1348-1360, 「 Variable Selection via Nonconcave Penalized Likelihood and its Oracle Properties」를 참고하여 a 값을 3.7로 적용하였다. 매개변수 μ는 대략적인 일반화된 교차 검증 통계를 최소화하여 할당되었다. 특징 선택에 대한 다양한 패널티 방법 중, SCAD를 선택하였다. SCAD는 큰 계수에 대해 거의 편향되지 않은 추정치를 생성하고, SCAD를 사용하여 선택한 세트의 특징은 실제 신호 특징 세트와 점근적으로 동일하여, SCAD는 oracle 속성을 충족하기 때문이다. 연구의 이중 교차-검증에서 다중 miRNA 선택을 위해 SCAD 패널티를 포함하는 패널티 SVM을 수행하였다.
3-4. 선별 miRNA 마커 기반 진단 모델 구축 및 검증
진단 모델을 구축하기 위해, 췌장암 환자 샘플과 대조군으로 다른 암 환자의 샘플을 포함한 비-췌장암 환자 샘플 간의 비교 결과를 사용하였다. 진단 마커를 선택하기 위해 200 회 반복되는 5폴드 교차 검증을 사용하였다. 교차 검증의 각 폴드에서, 공변량 없이 로지스틱 회귀 분석을 수행하고, FDR이 0.05 보다 적은 후보 miRNA 마커 세트를 선택하였다. 그런 다음, SCAD 패널티 함수와 함께 SVM을 사용하여, 후보 마커를 0이 아닌 계수를 가진 마커로 좁혔다.
선택 빈도에 따라 마커의 순위를 매겼다. 이러한 빈도를 기반으로 K 최상의 miRNA를 사용하여 RBF 커널 SVM 모델을 구축하였다. K 값을 결정하기 위해, 이중 교차-검증을 통하여, K를 변경함으로써 K 최상위 miRNA를 갖는 모델의 진단 성능을 추정하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, K가 증가함에 따라 성능 측정 값이 증가하고 K가 39 일 때, AUC 0.98 및 정확도(accuracy) 0.93에서 포화되기 시작하였다. 따라서, 후보 miRNA 중 췌장암에 대한 진단 마커로서 상위 39 개의 miRNA를 선택하였다(표 4).
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상기 표 4에서 *로 표시된 miRNA는 췌장암 샘플 및 비-암 샘플 간에도 차등적으로 발현된 마커이며, 그 외 miRNA는 췌장암 샘플 및 비-췌장암 샘플 사이에서만 차등적으로 발현된 마커이다.
도 2에 나타난 바와 같이, K = 39에서 진단 모델의 평균 민감도(sensitivity) 및 특이도(specificity)는 최적의 결정 임계 값이 주어졌을 때, 각각 0.93 및 0.93이었다. 상기 최적 임계값은 임계값 0.5, 0.55, 0.6, 0.65 및 0.7 일 때의 성능 결과를 비교하여 0.55로 결정하였다.
또한, 도 3에 나타난 바와 같이 39 개 miRNA 중 28 개의 miRNA가 췌장암 샘플 및 비-암 샘플 간에 차등적으로 발현되었으며(FDR < 0.05), 11 개의 miRNA가 췌장암 샘플 및 비-췌장암 샘플 간에 차등적으로 발현되었다(FDR < 0.05).
검증을 위해, 상기 본 발명의 췌장암 특이적 진단 모델을 다른 샘플 세트인 25 개의 췌장암 및 81 개의 간내 담관암 샘플 세트에 적용하였다. 진단 모델에서 췌장암-진단 확률이 > 0.55일 때, 췌장암인 것으로 진단하였다. 또한 비교를 위해 동일한 샘플에 CA19-9 진단을 적용하였으며, CA19-9 값 > 37일 때, 췌장암인 것으로 진단하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 진단 모델의 곡선하면적(AUC)은 CA19-9를 이용한 진단 모델에 비해 약 1.5 배 높게 나타났으며, 민감도(sensitivity)는 약 1.3 배, 특이도(specificity)는 약 2 배 높게 나타남을 확인하였다.
실시예 4. qRT-PCR을 통한 검증
qRT-PCR을 사용하여 39 개의 마커 중 10 개의 miRNA를 검증하였다.
TaqMan Advanced miRNA cDNA 합성 키트(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 cDNA를 합성하였으며, TaqMan Advanced miRNA Assays(Applied Biosystems) 및 TaqMan Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 qRT-PCR을 수행하였다.
qRT-PCR은 ABI Prism 7300 Sequence Detection System(Applied Biosystems)을 사용하여 수행하였고, 프라이머는 Applied Biosystems에서 TaqMan 프라이머를 구입하여 사용하였다.
PCR 증폭은 95 ℃에서 10 분 동안의 개시 단계, 이어서 95 ℃에서 20 초 , 56 ℃에서 30 초 및 72 ℃에서 15 초를 55 사이클로 이루어졌다.
모든 qRT-PCT 분석은 3 회 반복 수행하였으며, 17 명의 췌장암 환자, 8 명의 간내 담관암 환자, 8 명의 건강한 사람의 총 RNA 샘플을 대상으로 하였다(각 암 단계는 American Joint Committee on Cancer 제 7판의 단계 분류를 기반으로 하였으며, 변수는 평균 ± 표준 편차, 중앙값 ± 표준 편차, 또는 n (%)로 표현하였다 (PC, 췌장암; ICC, 간내 담관암; N, 정상; SD, 표준편차; CA19-9, 탄수화물 항원(carbohydrate antigen) 19-9.).
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통계 분석은 GraphPad 5(GraphPad Software)를 사용하여 분석하였다. 그룹 간의 miRNA 발현은 일원분산분석(One-way ANOVA) 및 본페로니(Bonferroni) 사후 검정을 통해 계산하였다.
구체적으로, miR-155-5p, miR-4284, miR-346, miR-7154-5p, miR-5100, miR-661, miR-22-3p, miR-4486, let-7b-5p, 및 miR-4703-5p의 발현 수준을 검증하였으며, 그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 췌장암 샘플, 간내 담관암 샘플 및 정상 대조군(건강한 사람) 샘플에서 차등적인 발현이 나타남을 확인하였다. 췌장암 환자 샘플에서 miR-155-5p, miR-7154-5p, miR-661 및 miR-4703-5p의 발현이 감소하였으며, miR-5100, miR-22-3p, miR-4486 및 let-7b-5p의 발현이 증가하였다. miR-4284는 췌장암 및 간내 담관암 샘플에서만 발현이 나타났으며, 정상 대조군에서는 발현이 나타나지 않았다. 또한, miR-346는 간내 담관암 샘플 및 정상 대조군 샘플에서만 발현이 나타났으며, 췌장암 환자 샘플에서는 발현되지 않았다.
본 발명의 췌장암을 진단해낼 수 있는 miRNA 바이오마커 서열은 하기 표 6에 정리된 바와 같다.
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이와 같은 본 발명의 miRNA 마커는 췌장암의 조기 진단에 활용될 수 있으며, 이를 통해 췌장암의 진단을 할 수 있는 상용 모델 개발의 주요 플랫폼 역할을 할 것으로 기대된다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (23)

  1. miR-7154-5p, miR-4486, let-7b-5p 및 miR-4703-5p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA에 대한 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 췌장암 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 miR-7154-5p는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지고,
    상기 miR-4486은 서열번호 8의 염기서열로 이루어지고,
    상기 let-7b-5p은 서열번호 9의 염기서열로 이루어지고,
    상기 miR-4703-5p는 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 것인, 췌장암 진단용 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 진단용 조성물은,
    miR-155-5p, miR-4284, miR-346, miR-5100, miR-661 및 miR-22-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA에 대한 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 추가로 포함하는 것인, 췌장암 진단용 조성물.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 miR-155-5p는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지고,
    상기 miR-4284는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지고,
    상기 miR-346는 서열번호 3의 염기서열로 이루어지고,
    상기 miR-5100는 서열번호 5의 염기서열로 이루어지고,
    상기 miR-661는 서열번호 6의 염기서열로 이루어지고,
    상기 miR-22-3p는 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 것인, 췌장암 진단용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    miRNA에 대한 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 miRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오타이드인 것인, 췌장암 진단용 조성물.
  6. 제 1항에 있어서,
    miR-7154-5p, miR-4486, let-7b-5p 및 miR-4703-5p에 대한 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 췌장암 진단용 조성물.
  7. 제2항에 있어서,
    miR-7154-5p, miR-4486, let-7b-5p, miR-4703-5p, miR-155-5p, miR-4284, miR-346, miR-5100, miR-661 및 miR-22-3p에 대한 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 췌장암 진단용 조성물.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 진단용 조성물은 췌장암 및 간내 담관암을 조기에 구분하여 진단하는 것을 특징으로 하는, 췌장암 진단용 조성물.
  9. 제 1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 췌장암 진단용 키트.
  10. a) 개체로부터 분리된 시료에서 miR-7154-5p, miR-4486, let-7b-5p 및 miR-4703-5p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA에 대한 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    b) 상기 miRNA 발현 수준을 정상 대조군 시료의 해당 miRNA 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 췌장암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 miR-7154-5p는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지고,
    상기 miR-4486은 서열번호 8의 염기서열로 이루어지고,
    상기 let-7b-5p은 서열번호 9의 염기서열로 이루어지고,
    상기 miR-4703-5p는 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 것인, 췌장암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  12. 제 10항에 있어서,
    상기 miR-7154-5p의 발현이 정상 대조군 대비 감소하거나;
    상기 miR-4486의 발현이 정상 대조군 대비 증가하거나;
    상기 let-7b-5p의 발현이 정상 대조군 대비 증가하거나;
    상기 miR-4703-5p의 발현이 정상 대조군 대비 감소한 경우, 췌장암으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 췌장암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 a) 단계는 miR-155-5p, miR-4284, miR-346, miR-5100, miR-661 및 miR-22-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA에 대한 발현 수준을 추가로 측정하는, 췌장암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 miR-155-5p는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지고,
    상기 miR-4284는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지고,
    상기 miR-346는 서열번호 3의 염기서열로 이루어지고,
    상기 miR-5100는 서열번호 5의 염기서열로 이루어지고,
    상기 miR-661는 서열번호 6의 염기서열로 이루어지고,
    상기 miR-22-3p는 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 것인, 췌장암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 miR-155-5p의 발현이 정상 대조군 대비 감소하거나;
    상기 miR-4284의 발현이 있거나;
    상기 miR-346의 발현이 없거나;
    상기 miR-5100의 발현이 정상 대조군 대비 증가하거나;
    상기 miR-661의 발현이 정상 대조군 대비 감소하거나;
    상기 miR-22-3p의 발현이 정상 대조군 대비 증가한 경우, 췌장암으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 췌장암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  16. 제 10항에 있어서,
    상기 b) 단계는 검사 대상자의 나이, 성별, 체중, 식습관, 체질량, 기저질환, 자기공명영상법(MRI), SPECT(single-photon emission computed tomography), MMSE(mini-mental status examination) 및 양전자 방사 단층촬영(positron emission tomography; PET)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 비마커 임상정보를 연관시키는 것을 추가로 포함하는, 췌장암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  17. 제 10항에 있어서,
    상기 시료는 혈액, 조직, 세포, 전혈, 혈장, 혈청, 타액, 객담, 림프액, 뇌척수액, 세포간액 또는 뇨인 것인, 췌장암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  18. a) 개체로부터 분리된 시료에서 miR-7154-5p, miR-4486, let-7b-5p 및 miR-4703-5p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA에 대한 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    b) 상기 miRNA 발현 수준을 정상 대조군 시료의 해당 miRNA 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 췌장암 진단 방법.
  19. 제 18항에 있어서,
    상기 miR-7154-5p는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지고,
    상기 miR-4486은 서열번호 8의 염기서열로 이루어지고,
    상기 let-7b-5p은 서열번호 9의 염기서열로 이루어지고,
    상기 miR-4703-5p는 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 것인, 췌장암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 a) 단계는 miR-155-5p, miR-4284, miR-346, miR-5100, miR-661 및 miR-22-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA에 대한 발현 수준을 추가로 측정하는, 췌장암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 miR-155-5p는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지고,
    상기 miR-4284는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지고,
    상기 miR-346는 서열번호 3의 염기서열로 이루어지고,
    상기 miR-5100는 서열번호 5의 염기서열로 이루어지고,
    상기 miR-661는 서열번호 6의 염기서열로 이루어지고,
    상기 miR-22-3p는 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 것인, 췌장암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  22. 제 18항에 있어서,
    상기 b) 단계는 검사 대상자의 나이, 성별, 체중, 식습관, 체질량, 기저질환, 자기공명영상법(MRI), SPECT(single-photon emission computed tomography), MMSE(mini-mental status examination) 및 양전자 방사 단층촬영(positron emission tomography; PET)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 비마커 임상정보를 연관시키는 것을 추가로 포함하는, 췌장암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  23. 제 18항에 있어서,
    상기 시료는 혈액, 조직, 세포, 전혈, 혈장, 혈청, 타액, 객담, 림프액, 뇌척수액, 세포간액 또는 뇨인 것인, 췌장암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
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