KR101705879B1 - Glrx3 억제제를 포함하는 항암제에 대한 감수성 증진용 조성물 및 항암제 내성 진단을 위한 마커 - Google Patents

Abstract

본 발명은 GLRX3의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 포함하는 암세포 또는 암조직의 항암제에 대한 감수성 증진용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 객체에서 항암제에 대한 감수성을 증진시키며 결과적으로 항암제의 치료 효과를 높일 수 있고, 항암제에 대한 감수성 증진을 통해 병용으로 사용하는 항암제의 용량을 줄일 수 있게 함으로써 항암제 자체의 부작용을 감소시킬 수 있다. 본 발명은 환자의 시료를 이용하여 항암제 내성 마커인 GLRX3를 검출하는 방법 및 항암제 내성 분석용 키트를 제공하며, 이를 통해 GLRX3를 항암제 내성에 대한 예측 마커로서 활용할 수 있다. 본 발명은 GLRX3 억제제를 포함하는 항암제 내성을 보이는 암에 대한 치료용 조성물을 제공한다.

Description

GLRX3 억제제를 포함하는 항암제에 대한 감수성 증진용 조성물 및 항암제 내성 진단을 위한 마커{Composition for Enhancing Sensitivity for Anti-Cancer Drug Comprising GLRX3 Inhibitors and Diagnostic Marker for Resistance of Anti-Cancer Drug}

본 발명은 GLRX3 억제제를 포함하는 항암제에 대한 감수성 증진용 조성물, 항암제 내성 마커인 GLRX3를 검출하는 방법, 항암제 내성 분석용 키트 및 항암제 내성을 보이는 암에 대한 치료용 조성물에 관한 것이다.

췌장암은 5년 생존율이 1-4%, 중앙 생존기간이 5개월에 이르는 치명적인 암으로 인체 암 중에서 가장 불량한 예후를 가진다. 췌장암 환자의 90% 정도는 이미 근치적 수술을 시행할 수 없는 상태에서 발견되기 때문에 예후가 인체 암 중에서 가장 불량하며, 현재 사용되고 있는 5-FU, 젬시타빈(gemcitabine), 타세바(tarceva) 등의 치료 효과는 지극히 실망적이며 반응율은 20% 내외에 불과하다. 따라서 궁극적으로 췌장암 예후 향상을 위해서는 새로운 항암제 개발이 절실히 요구된다.

췌장암이 다른 암에 비해 현저히 항암 치료 반응율이 낮은 이유는 암세포들의 생물학적 특성상 항암약제에 대한 내성 출현이 조기에 빈번히 발생하기 때문이며, 따라서 치료 과정 중 항암제 내성 출현을 조기에 발견하고 내성을 극복할 수 있는 신개념 항암제 개발이 절실히 필요하다.

암 조직에도 암 조직을 유지하고 재생시키는 암줄기세포가 존재하며, 암줄기세포는 암의 발생을 물론 전이 및 재발에 관여한다고 알려져 있다. 최근에는 항암치료 실패의 주요 원인으로 암줄기세포의 항암제 저항성 때문이라는 사실들이 밝혀지면서 항암제 내성의 조기 감지는 물론 내성 극복을 위한 방안으로 암줄기세포 역할에 대한 연구들이 널리 시도되고 있다.

본 연구진은 췌장암 암줄기세포 특성을 가진 췌장암 신규 바이오마커로 GLRX3 단백을 도출하였다. GLRX3가 췌장암 세포주, 인체 유래 췌장암 조직 및 혈액에서 과별현되어 있음을 확인하였고, 또한 GLRX3를 shRNA 또는 siRNA로 발현저해 시켰을 때 발암 및 암세포의 증식, 전이 및 침윤 능력이 감소함을 규명하였다. GLRX3는 췌장암 뿐 아니라 대장암 및 폐암 (Cancer Epidemiology 33(3-4):281-287(2009), 그리고 유방암(The Journal of Clinical Investigation Qu Y,2011;121: 212-225)에서도 과발현 되고 있음이 보고된 바 있다. 따라서 GLRX3를 표적으로 하는 진단법 혹은 치료제 개발은 다양한 인체 유래 암의 진단 및 치료에 활용될 수 있을 것으로 예측된다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 암세포, 암조직 및 객체의 항암제에 대한 감수성 증진용 조성물을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 GLRX3(Glutaredoxin-3)의 억제제가 암세포 및 암조직에서 항암제에 대한 감수성을 증진시킨다는 것을 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 항암제에 대한 감수성 증진용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 항암제 내성 마커인 GLRX3를 검출하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 항암제 내성 분석용 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 항암제 내성을 보이는 암에 대한 치료용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 GLRX3의 억제제를 포함하는 항암제에 대한 감수성 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 암세포 또는 암조직의 항암제에 대한 감수성 증진용 조성물을 개발하고자 노력하였고 그 결과, 본 발명자들은 GLRX3의 억제제가 암세포 및 암조직에서 항암제에 대한 감수성을 증진시킨다는 것을 규명하였다.

본 발명의 조성물은 객체에서 항암제에 대한 감수성을 증진시키며 결과적으로 항암제의 치료 효과를 높일 수 있다. 또한, 항암제에 대한 감수성 증진에 의해 병용으로 사용하는 항암제의 용량을 줄일 수 있게 함으로써 항암제 자체의 부작용을 감소시킬 수 있다.

본 명세서에서 용어 “객체(subject)”는 암세포, 암 줄기세포, 항암제 내성 세포, 암조직 및 암 환자를 포함한다.

본 발명의 조성물에 의해 감수성이 증진되는 항암제는 특별히 제한되지 않으며, 예컨대, 토포이소머라아제 억제제(Topoisomerase inhibitor), 플라티넘(Platinum), 탁산(Taxanes) 또는 안트라사이클린(anthracycline) 항암제이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 토포이소머라아제 억제제(Topoisomerase inhibitor)는 에토포시드(etoposide), 토포테칸(topotecan), 캄토테칸(camptothecan), 하이캡타민(hycaptamine), 이리노테칸(irinotecan), 루비테칸(rubitecan), 6-에톡시프로피오닐-3′(6-ethoxypropionyl-3′), 4′-O-엑소-벤질리덴-샤르트레우신(,4′-O-exo-benzylidene-chartreusin), 루토테칸(lurtotecan), BNP1350, BNPI1100, BN80915, BN80942, 에토포시드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 소부족산(sobuzoxane), 2′-디메틸아미노-2′-디옥시-에토포시드(2′-dimethylamino-2′-deoxy-etoposide), GL331, 아술라크린(asulacrine) 및 라멜라린 D(lamellarin D)로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 플라티넘(Platinum) 항암제는 시스플라틴(cisplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin) 및 카르보플라틴(carboplatin)으로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 탁산(Taxanes) 항암제는 파크리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 라로탁셀(larotaxel) 및 카바지탁셀(cabazitaxel)로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 안트라사이클린 항암제는 독소루비신(doxorubicin), 다우노마이신(daunomycin), 에피루비신(epirubicin), 미톡산트론(mitoxantrone), 발루비신(valrubicin) 및 이다루비신(idarubicin)으로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 조성물에서 이용되는 GLRX3 억제제는 GLRX3 발현 억제제 또는 GLRX3 활성 억제제일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에서 이용될 수 있는 GLRX3의 발현 억제제는 shRNA, siRNA 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 “shRNA(small hairpin RNA 또는 short hairpin RNA)”는 견고한 헤어핀 턴을 만드는 RNA의 서열을 나타내며, 이는 RNA 간섭을 통해 유전자 발현을 사일런스시키는 데 이용될 수 있다. shRNA는 세포 도입용 벡터를 이용하며 shRNA를 발현할 수 있는 U6 프로모터를 주로 이용한다. 이러한 벡터는 항상 딸세포로 전달되어 유전자 사일런싱이 유전될 수 있도록 한다. shRNA 헤어핀 구조는 세포 내 기작(machinery)인 siRNA로 분해되어 RNA-유도 사일런싱 복합체(RNA-induced silencing complex)에 결합된다. 상술한 복합체는 이에 결합된 siRNA에 상응하는(matched) mRNA에 결합하여 분해시킨다. shRNA는 RNA 폴리머라제 III에 의해 전사되며, 포유동물 세포에서 shRNA 생산은 세포가 shRNA를 바이러스 공격으로 인식하여 방어 수단을 찾는 것처럼 인터페론 반응을 야기시킬 수도 있다. 또한, shRNA는 식물 및 다른 시스템에서도 이용될 수 있으며 U6 프로모터가 반드시 필요한 것은 아니다. 식물의 경우에는 매우 강력한 연속적인 발현 능력을 보유한 전통적인 프로모터인 CaMV(cauliflower mosaic virus) 35S 프로모터가 이용될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에서 이용되는 GLRX3의 발현 억제제는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 shRNA이다.

본 발명에서 용어 “siRNA(small interference RNA)”는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(참조: WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99/07409 및 WO 00/44914). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다. siRNA는 식물, 벌레, 초파리 및 기생충에서 처음으로 발견되었으나, 최근에 siRNA를 개발/이용하여 포유류 세포 연구에 응용되었다(Degot S, et al. 2002; Degot S, et al. 2004; Ballut L, et al. 2005).

본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥과 안티센스 가닥이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있다. 또한, 본 발명의 siRNA 분자는, 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 상보적은 100% 상보적인 경우뿐만 아니라 불완전한 상보성도 포괄하는 의미이며, 바람직하게는 90%의 상보성, 보다 바람직하게는 98%의 상보성, 가장 바람직하게는 100%의 상보성을 의미한다. 본 명세서에서 100% 상보성을 표현하는 경우에는 완전 상보적(completely complementary)으로 특별하게 기재된다. siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 70 염기이다.

siRNA 말단 구조는 GLRX3 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3’-말단 돌출 구조와 5’-말단 돌출 구조 모두 가능하다. 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 약 5-15 nt)이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프(stem-and-loop) 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에서 이용되는 GLRX3의 발현 억제제는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 siRNA이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물의 유효성분인 GLRX3 유전자에 특이적으로 결합하는 RNAi(RNA interference) 분자는 유전자 캐리어에 삽입되어 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 유전자 캐리어는 플라스미드, 재조합 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 배시니아 바이러스, 리포좀 또는 니오좀이며, 가장 바람직하게는 재조합 랜티바이러스이다.

(a) 아데노바이러스:

아데노바이러스는 중간 정도의 지놈 크기, 조작의 편의성, 높은 타이터, 광범위한 타깃세포 및 우수한 감염성 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다. 지놈의 양 말단은 100-200 bp의 ITR(inverted terminal repeat)를 포함하며, 이는 DNA 복제 및 패키징에 필수적인 시스 엘리먼트이다. 지놈의 E1 영역(E1A 및 E1B)은 전사 및 숙주 세포 유전자의 전사를 조절하는 단백질을 코딩한다. E2 영역(E2A 및 E2B)은 바이러스 DNA 복제에 관여하는 단백질을 코딩한다.

현재 개발된 아데노바이러스 벡터 중에서, E1 영역이 결여된 복제 불능 아데노바이러스가 많이 이용되고 있다.

한편, E3 영역은 통상적인 아데노바이러스 벡터에서 제거되어 외래 유전자가 삽입되는 자리를 제공한다(Thimmappaya, B. et al., Cell, 31:543-551(1982); 및 Riordan, J. R. et al., Science, 245:1066-1073(1989)). 따라서, Env 유전자 및 HPV L1 유전자는 결실된 E1 영역 또는 E3 영역에 삽입되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 결실된 E3 영역에 삽입된다. 또한, 상기 삽입 서열들은 결실된 E4 영역에도 삽입될 수 있다. 본 명세서에서 바이러스 지놈 서열과 관련하여 사용되는 용어, 결실은 해당 서열이 완전히 결실된 것뿐만 아니라, 부분적으로 결실된 것도 포함하는 의미를 가진다.

아데노바이러스는 42개의 상이한 혈청형 및 A-F의 서브그룹을 갖는다. 이 중에서, 서브그룹 C에 속하는 아데노바이러스 타입 5가 아데노바이러스 벡터를 얻기 위한 가장 바람직한 출발물질이다. 아데노바이러스 타입 5에 대한 생화학적 및 유전적 정보는 잘 알려져 있다.

아데노바이러스에 의해 운반되는 외래 유전자는 에피좀과 동일한 방식으로 복제되며, 이에 숙주세포에 대해 유전적독성이 매우 낮다.

(b) 배큘로바이러스:

배큘로바이러스는 막대 모양의 바이러스로서 인간 세포에서 곤충-특이 프로모터로부터 자신의 유전자를 발현하지 않는다. 이러한 이유 때문에, 배큘로바이러스는 바이러스 유전자 발현에 의한 면역반응을 유발하지 않기 때문에, 유전자 치료제의 기본 시스템으로서 주목을 받고 있다. 그러나, 포유동물 프로모터의 조절 하에 있으면 배큘로바이러스 벡터에 있는 외래 유전자의 발현이 높은 수준으로 일어난다. 배큘로바이러스에 의한 감염은 내인성 인간 바이러스의 복제를 촉발하지 않는 장점도 있다. 다른 유전자 치료제용 바이러스와 다르게 배큘로바이러스는 혈청-부재 배지에서 잘 성장할 수 있어 대량 생산에 적합한 이점이 있다.

재조합 배큘로바이러스의 구축 및 곤충세포의 배양은 Summers and Smith. 1986. A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bull. No. 7555, College Station, Tex.; Luckow. 1991. In Prokop et al., Cloning and Expression of Heterologous Genes in Insect Cells with Baculovirus Vectors' Recombinant DNA Technology and Applications, 97-152; U.S. Pat. No. 4,745,051; 및 EP0340359에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

예를 들어, HERV Env 유전자 및 HPV L1 유전자를 포함하는 재조합 배큘로바이러스는 HERV Env 유전자 및 HPV L1 유전자를 운반하는 전이벡터를 세포에 형질전환 시킨다. HERV Env 유전자 및 HPV L1 유전자를 포함하는 발현 컨스트럭트는 트랜스포존 서열, 예컨대 Tn7으로 플랭킹 된다. 이러한 전이벡터를 미니-attTn7 타겟 위치를 갖는 백미드(배큘로바이러스 셔틀벡터) 및 트랜스포자아제(transposase) 유전자를 갖는 헬퍼 플라스미드를 포함하는 세포, 예컨대 E. coli에 형질전환 시킨다. 전이벡터가 상기 E. coli 세포에 형질전환 되면, 트랜스포지션이 발생하여 재조합 백미드가 만들어진다. 이어, 재조합 백미드를 분리하고 이를 적합한 곤충세포에 형질전환시켜 재조합 배큘로바이러스를 생성시킨다. 본 발명에 적합한 곤충세포는 특별하게 제한되지 않으며, 예를 들어, Sf9(Spodoptera frugiperda), Spodoptera exiaua, Choristoneura fumiferana, Trichoplusia ni 및 Spodoptera littoralis 및 Drosophila 등이 곤충세포로 이용될 수 있다.

(c) 레트로바이러스:

레트로바이러스는 자신의 유전자를 숙주의 지놈으로 삽입시키고, 대량의 외래 유전 물질을 운반할 수 있으며, 감염시킬 수 있는 세포의 스펙트럼이 넓기 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다.

레트로바이러스 벡터를 구축하기 위하여, Env 유전자 및 HPV L1 유전자는 레트로바이러스의 서열 대신에 레트로 바이러스 지놈에 삽입되어 복제 불능의 바이러스를 생산한다. 바이리온을 생산하기 위하여, gag, pol 및 env 유전자를 포함하지만 LTR (long terminal repeat)와 서열은 없는 패키징 세포주를 구축한다(Mann et al., Cell, 33:153-159(1983)). Env 유전자 및 HPV L1 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 상기 세포주에 이입하면, 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체의 생산을 가능하게 하며, 이 전사체는 바이러스로 패키징되고, 바이러스는 배지로 배출된다(Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513(1988)). 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고 농축하여 유전자 전달 시스템으로 이용한다.

2세대 레트로바이러스 벡터를 이용한 유전자 전달이 발표되었다. Kasahara et al. Science, 266:1373-1376(1994))는 몰로니 뮤라인 류케미아 바이러스의 변이체를 제조하였고, 여기에서 EPO(erythropoietin) 서열을 엔벨로프 부위에 삽입하여 새로운 결합 특성을 갖는 키메릭 단백질을 생산하였다. 본 발명의 DNA 백신도 이와 같은 2세대 레트로바이러스 벡터의 구축 전략에 따라 제조할 수 있다.

(d) AAV 벡터:

아데노-관련 바이러스(AAV)는 비분열 세포을 감염시킬 수 있고, 다양한 종류의 세포에 감염할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 적합하다. AAV 벡터의 제조 및 용도에 대한 상세한 설명은 미국 특허 제 5,139,941 호 및 제 4,797,368 호에 상세하게 개시되어 있다.

유전자 전달 시스템으로서의 AAV에 대한 연구는 LaFace et al, Viology, 162:483486(1988), Zhou et al., Exp. Hematol. (NY), 21:928-933(1993), Walsh et al, J. Clin. Invest., 94:1440-1448(1994) 및 Flotte et al., Gene Therapy, 2:29-37(1995)에 개시되어 있다. 최근에, AAV 벡터는 낭포성 섬유증의 치료제로서 임상 I을 실시하고 있다.

전형적으로, AAV 바이러스는 두 개의 AAV 말단 리피트가 옆에 위치되어 있는 목적의 유전자 서열(Env 유전자 및 HPV L1 유전자)을 포함하는 플라스미드 (McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963-1973(1988); 및 Samulski et al., J. Virol., 63:3822-3828(1989)) 및 말단 리피트가 없는 야생형 AAV 코딩 서열을 포함하는 발현 플라스미드(McCarty et al., J. Virol., 65:2936-2945( 1991))를 동시형질전환시켜 제조된다.

(e) 다른 바이러스 벡터:

다른 바이러스 벡터들도 본 발명의 DNA 백신에 이용할 수 있다. 배시니아 바이러스(Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999); Ridgeway, "Mammalian expression vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez and Denhardt, eds. Stoneham: Butterworth, 467-492(1988); Baichwal and Sugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148( 1986) 및 Coupar et al., Gene, 68:1-10(1988)), 렌티바이러스(Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999)) 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스(Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415(1995))로부터 유래된 벡터들도, Env 유전자 및 HPV L1 유전자를 세포내로 운반할 수 있는 운반 시스템으로 이용할 수 있다.

본 발명에서 용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드"란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제2서열의 GLRX3에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고, GLRX3 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 핵산의 길이는 6 내지 100 염기이고, 바람직하게는 8 내지 60 염기이고, 보다 바람직하게는 10 내 40 염기이다.

상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5(3):343-55(1995)). 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-me 피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오타이드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다(미국특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드의 경우, 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 한 예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 이용되는 GLRX3의 활성 억제제는 GLRX3의 활성을 억제하는 단백질, GLRX3에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드모방체, 기질유사체, 앱타머 및 항체이다.

본 발명에서 이용될 수 있는 GLRX3 단백질에 특이적으로 결합하는 활성을 갖는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. GLRX3 단백질에 대한 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 GLRX3 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

GLRX3에 특이적으로 결합하여 GLRX3의 활성을 억제할 수 있는 펩타이드는 당업계에 공지된 통상의 방법, 예를 들어 파아지 디스플레이 방식으로 얻을 수 있다(Smith GP, "Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface". Science 228 (4705):13151317(1985); Smith GP, Petrenko VA, "Phage display". Chem. Rev. 97(2):391410(1997)).

GLRX3의 활성을 억제하는 작은 분자량의 화합물은 후술하는 스크리닝 방법을 통하여 용이하게 얻을 수 있다.

상기 펩티드 모방체(Peptide mimetics)는 GLRX3 단백질의 결합 도메인을 억제하여 GLRX3 단백질의 활성을 억제하는 것이다. 펩티드 모방체는 펩티드 또는 비펩티드일 수 있고, psi 결합(Benkirane, N., et al. J.Biol. Chem., 271:33218-33224, 1996)과 같은, 비펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산으로 구성될 수 있다. 또한, "구조적으로 강제된(conformationally constrained)" 펩티드, 사이클릭 모방체(cyclic mimetics), 적어도 하나의 엑소사이클릭 도메인(exocyclic domain), 결합 부분(결합 아미노산) 및 활성 부위를 포함하는 사이클릭 모방체일 수 있다. 펩티드 모방체는 항체(Park, B. W. et al. Nat Biotechnol 18, 194-198, 2000) 또는 수용성 수용체(Takasaki, W. et al. Nat Biotechnol 15, 1266-1270, 1997)와 같은 거대한 분자의 억제 특성을 모방할 수 있으며, 천연의 길항제와 동등한 효과로 작용할 수 있는 신규한 소분자일 수 있다(Wrighton, N. C. et al. Nat Biotechnol 15, 1261-1265, 1997).

상기 앱타머(aptamer)는 단일 사슬 DNA 또는 RNA 분자로서, SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라 불리는 올리고 뉴클레오타이드(oligonucleotide) 라이브러리를 이용한 진화적인 방법에 의해 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 올리고머를 분리하여 수득할 수 있다(C. Tuerand L. Gold, Science 249, 505 - 510, 2005; A. D. Ellington and J. W. Szostak, Nature 346, 818 - 822, 1990; M. Famulok, et. al., Acc. Chem. Res. 33, 591 - 599, 2000; D. S. Wilson and Szostak, Annu. Rev. Biochem. 68, 611 - 647, 1999). 앱타머는 표적에 특이적으로 결합하고 표적의 활성을 조정할 수 있는데, 예컨대, 결합을 통하여 표적의 기능을 차단할 수 있다.

상기 항체는 GLRX3에 특이적이고 직접적으로 결합하여 GLRX3의 활성을 효과적으로 억제할 수 있다. 상기 GLRX3에 특이적으로 결합하는 항체로는 폴리클로날(polyclonal) 항체 또는 모노클로날(monoclonal) 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 GLRX3에 특이적으로 결합하는 항체는 당업자에게 알려진 공지의 방법으로 제작하여도 무방하며, 상업적으로 알려진 GLRX3 항체를 구입하여 사용할 수 있다. 상기 항체는 당업자에게 알려진 종래 방법에 따라 면역원인 GLRX3 단백질을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 랫트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 포함한다. 면역원은 근육 내, 복강 내 또는 피하 주사방법으로 주사되며, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여할 수 있다. 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 형성된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하여 항체를 분리할 수 있다.

본 발명에 따른 GLRX3의 발현 또는 활성 억제제는 GLRX3의 발현 또는 활성을 억제하는 효과를 나타냄으로써, 객체의 항암제 감수성을 증진시킨다.

본 발명의 조성물을 적용하여 항암제의 감수성을 증진시킬 수 있는 암은 백혈병, 유방암, 피부암, 골암(bone cancer), 전립선암, 간암, 폐암, 뇌암, 후두암, 담낭암, 췌장암, 섬세포암, 직장암, 부갑상선암, 갑상선암, 부신암, 신경조직암, 두경부암, 결장암, 위암, 기관지암, 신장암, 기저세포 암종, 궤양형 및 유두형 둘 모두의 편평세포 암종, 전이성 피부 암종, 골육종, 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 베티컬럼(veticulum) 세포 육종, 골수종, 거대세포 종양, 소세포 폐종양, 섬세포 암종, 원발성 뇌종양, 급성 및 만성 림프구 및 과립구 종양, 털세포 종양, 선종, 과형성, 수질 암종, 갈색세포종, 점막 신경종, 장 신경절신경종, 과형성 각막 신경 종양, 마르파노이드(marfanoid) 체질 종양, 윌름 종양(Wilm's tumor), 생식세포종, 난소 종양, 레이오미오마터(leiomyomater) 종양, 경부 이형성 및 상피내암종, 신경모세포종, 망막모세포종, 연질조직 육종, 악성 카르시노이드, 국소적 피부 병변, 균상식육종, 횡문근육종, 카포시 육종, 골원성 및 그 밖의 육종, 악성 고칼슘혈증, 신장 세포 종양, 진성 적혈구증가증, 선암종, 다형성 아교모세포종, 백혈병, 림프종, 악성 흑색종 및 표피유사 암종으로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 조성물은 GLRX3의 발현 또는 활성 억제 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1 종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여, 점막 투여 및 점안 투여 등으로 투여할 수 있다. 바람직하게는 비경구 투여 방식으로 적용된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.0001-10000 /kg 범위 내이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 항암제 내성 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 환자의 시료를 이용하여 특이적 결합반응을 통해 항암제 내성 마커인 GLRX3를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 항암제 내성 마커 GLRX3를 검출하는 방법은 마이크로어레이 방식, 유전자 증폭 방식 또는 항원-항체 반응 방식으로 실시될 수 있다.

상기 마이크로어레이는 프로브를 이용하여 GLRX3의 존재를 확인한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며, 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다.

프라이머 또는 프로브 제작 시 GLRX3의 뉴클레오타이드 서열인 서열목록 제2서열을 참조하여 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기체(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화된다. 혼성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

본 발명의 GLRX3의 검출 방법은 혼성화에 기초하여 실시할 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 GLRX3의 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브가 이용된다.

상술한 본 발명의 GLRX3의 뉴클레오타이드 서열에 혼성화 되는 프로브를 이용하여 혼성화-기초 분석을 하여 항암제 내성 여부를 판단할 수 있다.

프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5 (Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P³² 및 S³⁵), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생시료(biosamples)에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있다. 상기 생시료는, 바람직하게는 암세포이다. 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.

프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO₄, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.

혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다. 따라서 본 발명의 GLRX3 검출 방법을 혼성화에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) 본 발명의 GLRX3의 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브를 핵산 시료에 혼성화시키는 단계; (ii) 상기 혼성화 반응 발생 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 혼성화 과정에 의한 혼성화 시그널의 세기를 분석함으로써, 항암제 내성 여부를 판단할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 GLRX3의 뉴클레오타이드 서열에 대한 혼성화 시그널이 정상 시료(예컨대, 암세포)보다 강하게 나오는 경우에는 항암제 내성을 갖는 것으로 진단된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 혼성화법으로 실시될 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 GLRX3에 특이적으로 결합하는 프로브를 이용하여 실시된다.

본 발명의 GLRX3 검출 방법은 유전자 증폭법에 의해 실시될 수 있다.

본 명세서에 기재된 용어“증폭”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification; TMA, WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication, WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오타이드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences, 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction(CP-PCR), 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR), 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification(NASBA), 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명의 진단방법을 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 본 발명의 GLRX3의 뉴클레오타이드 서열의 발현 정도를 조사한다. 본 발명은 본 발명의 GLRX3의 뉴클레오타이드 서열의 발현 정도를 분석하는 것이기 때문에, 분석 대상의 시료(예컨대, 암세포)에서 본 발명의 GLRX3의 뉴클레오타이드 서열의 mRNA 양을 조사하여 본 발명의 GLRX3의 뉴클레오타이드 서열의 발현 정도를 결정한다.

따라서 본 발명은 원칙적으로 시료 내의 mRNA를 주형으로 하고 mRNA 또는 cDNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다.

mRNA를 얻기 위하여, 시료에서 총 RNA를 분리한다. 총 RNA를 분리하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol . Biol . Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem . 162:156(1987)). 예컨대, TRIzol을 이용하여 용이하게 세포내의 총 RNA를 분리할 수 있다. 이어, 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 증폭한다. 본 발명의 총 RNA는 인간의 시료로부터 분리되는 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 이어, 유전자 증폭 반응을 통하여 합성된 cDNA를 증폭한다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg^{2 +}와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 원하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서 어닐링은 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

이렇게 증폭된 본 발명의 GLRX3의 뉴클레오타이드 서열의 cDNA를 적합한 방법으로 분석하여 본 발명의 GLRX3의 뉴클레오타이드 서열의 발현 정도를 조사한다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 본 발명의 GLRX3의 뉴클레오타이드 서열의 발현 정도를 조사한다. 이러한 증폭 반응을 통하여, 체외로 분리된 환자의 시료에서 본 발명의 GLRX3의 뉴클레오타이드 서열의 발현이 정상 시료(암세포)보다 높게 나오는 경우에는 항암제 내성을 갖는 것으로 진단된다.

따라서 본 발명의 GLRX3 검출 방법은 cDNA를 이용하는 증폭반응에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) 본 발명의 GLRX3의 뉴클레오타이드 서열에 어닐링되는 프라이머를 이용하여 증폭 반응을 실시하는 단계; 및 (ii) 상기 증폭 반응의 산물을 분석하여 본 발명의 GLRX3의 뉴클레오타이드 서열의 발현정도를 결정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 GLRX3 검출 방법은 면역분석법에 의해 실시될 수 있다.

본 발명에서 이용되는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol . Biol ., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

본 발명의 방법을 항체를 이용하여 실시하는 경우, 본 발명은 통상적인 면역분석 방법에 따라 실시하여 항암제 내성을 진단하는 데 이용될 수 있다.

이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵)로 레이블링된 항체가 본 발명의 GLRX3 분자를 검출하는 데 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 미지의 세포 시료 분해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 GLRX3에 대한 항체와 상기 세포 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다.

상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P₄₅₀을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 본 발명의 GLRX3에 대한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획항체와 시료를 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, GLRX3 단백질에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P₄₅₀), 방사능물질((예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질( chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.

상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널이 검출은 본 발명의 GLRX3의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 항암제 내성을 진단할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 GLRX3에 대한 시그널이 정상 시료(예를 들어, 암세포) 보다 강하게 나오는 경우에는 항암제 내성을 갖는 것으로 진단된다.

본 발명의 GLRX3는 항암제 내성을 갖는 객체에서 고발현 되는 생체 분자이다. 이러한 GLRX3의 고발현은 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “고발현”은 조사 대상의 시료에서의 대상이 되는 뉴클레오타이드 서열의 발현 정도가 정상 시료와 비교하여 높은 경우를 의미한다. 예컨대, 당업계에서 통상적으로 이용되는 발현 분석 방법, 예컨대 RT-PCR 방법 또는 ELISA 방법(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))에 따라 발현 분석을 한 경우, 발현이 적은 것으로 분석되는 경우를 의미한다. 예를 들어, 상술한 분석 방법에 따라 분석한 결과, 본 발명의 GLRX3들이 정상 암세포와 비교하여 2-10 배 정도 고발현 되는 경우, 본 발명에서의 “고발현”으로 판정하고 항암제 내성을 갖는 것으로 판정한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 GLRX3 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제 또는 GLRX3의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 항암제 내성 분석용 키트를 제공한다.

본 발명에서 GLRX3 단백질은 바람직하게는 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 갖는 단백질이다.

본 발명에서 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제는 예를 들어, 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)이다.

본 발명에서 GLRX3 유전자는 GLRX3의 gDNA, mRNA 및 cDNA를 포함하며, 보다 바람직하게는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.

본 발명의 항암제 내성 분석용 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트, 마이크로어레이 키트 또는 유전자 증폭 키트이다.

본 발명의 항암제 내성 분석용 키트는 상기 언급된 마이크로어레이 방식, 유전자 증폭 방식 또는 항원-항체 반응 방식을 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 GLRX3(Glutaredoxin-3) 억제제를 포함하는 항암제 내성을 보이는 암에 대한 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 항암제 내성을 보이는 암에 대한 치료용 조성물은 상기 언급된 GLRX3 억제제를 이용하며, 적용되는 항암제는 상기 언급된 항암제와 동일하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 GLRX3의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 포함하는 암세포 또는 암조직의 항암제에 대한 감수성 증진용 조성물을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명의 조성물은 객체에서 항암제에 대한 감수성을 증진시키며 결과적으로 항암제의 치료 효과를 높일 수 있고, 항암제에 대한 감수성 증진을 통해 병용으로 사용하는 항암제의 용량을 줄일 수 있게 함으로써 항암제 자체의 부작용을 감소시킬 수 있다.

(ⅲ) 본 발명은 환자의 시료를 이용하여 항암제 내성 마커인 GLRX3를 검출하는 방법 및 항암제 내성 분석용 키트를 제공하며, 이를 통해 GLRX3를 항암제 내성에 대한 예측 마커로서 활용할 수 있다.

(ⅳ) 본 발명은 GLRX3 억제제를 포함하는 항암제 내성을 보이는 암에 대한 치료용 조성물을 제공한다.

도 1은 shRNA 형질 감염을 통해 췌장암 세포주 CFPAC-1 및 HPAC에서 GLRX3 발현을 유도한 후, 이를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과이다.
도 2는 CFPAC-1에서 GLRX3 발현 저해 시, CPT-11 및 에토포시드(Etoposide)에 대한 감수성 증가를 보여주는 MTT 어세이 결과이다.
도 3a는 CFPAC-1에서 GLRX3 발현 저해 시, 옥살리플라틴(Oxaliplatin) 및 카르보플라틴(Carboplatin)에 대한 감수성 증가를 보여주는 MTT 어세이 결과이다.
도 3b는 HPAC에서 GLRX3 발현 저해 시, 옥살리플라틴 및 카르보플라틴에 대한 감수성 증가를 보여주는 MTT 어세이 결과이다.
도 4는 HPAC에서 GLRX3 발현 저해 시, 독소루비신(Doxorubicin) 및 에피루비신(Epirubicin)에 대한 감수성 증가를 보여주는 MTT 어세이 결과이다.
도 5는 HPAC에서 GLRX3 발현 저해 시, 파크리탁셀(Paclitaxel)에 대한 감수성 증가를 보여주는 MTT 어세이 결과이다.
도 6a는 CFPAC-1 및 HPAC의 젬시타빈 내성 세포주(GR)가 모세포주에 비해 젬시타빈에 대한 IC50이 증가되었음을 보여주는 MTT 어세이 결과이다.
도 6b는 젬시타빈 내성 세포주에서 GLRX3의 분비가 증가되어 있음을 보여주는 웨스턴 블롯 결과이다.
도 7은 젬시타빈 내성 췌장암 세포주에서 GLRX3 발현 억제가 항암제 감수성에 미치는 영향을 나타내는 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 방법

GLRX3 발현 저해 세포주 구축

GLRX3 발현 저해로 인한 효과를 보기 위해, GLRX3에 대한 shRNA(SABiosciences SureSilencingTM shRNA 플라스미드) 및 대조군 shRNA를 제작하여 HPAC 및 CFPAC-1 세포주에 영구 이입하여 GLRX3 녹-다운(k/d) 세포주를 수립하여, GLRX3 mRNA 및 단백질 발현을 조사하였다. GLRX3에 대한 shRNA의 서열은 GTG GAA ATT CTT CAC AAA CAT 이고, 대조군 shRNA의 서열은 GGA ATC TCA TTC GAT GCA TAC 이며, 선별 마커는 퓨로마이신(puromycin, 2.0 ㎍/㎖)이다. 동일한 수의 세포를 유전자이입 하루 전날 플레이트에 부착시킨 후, 유전자 이입 당일에는 GLRX3에 대한 shRNA 및 대조군 shRNA를 Lipofectamine2000(Invitrogen, Carlsbad, CA)과 섞어 세포에 이입하였다. 유전자 이입 후 24시간이 지난 후, 배양액을 2 μg/ml 퓨로마이신이 포함된 배양액으로 바꾸어준 후, 3일 이상 지속배양 하였다. 퓨로마이신 배양액에서 살아남은 세포는 다시 96웰 플레이트에 1세포/웰의 비율로 부착시킨 후 배양하였다. 각 웰에서 살아남아 증식된 세포에서 단백질을 추출하여 GLRX3 발현 변화를 웨스턴블럿으로 확인하여 최종적으로 GLRX3 k/d 세포주 클론과 대조군 클론을 확보하였다.

젬시타빈 내성 세포주 구축

젬시타빈 내성 세포주 구축을 위해 CFPAC-1과 HPAC 세포주 각각의 젬시타빈 IC50 값을 MTT 어세이 방법을 통해 구하고, IC50 농도의 젬시타빈을 3일 동안 세포에 처리한다. 3일 이후 약제가 없는 배지에서 세포를 키우면서 회복시킨다. 세포가 회복되면 2배 IC50 농도의 젬시타빈을 3일간 처리한 뒤 회복시킨다. 이후 [전단계 젬시타빈 농도의 2배: 3일간 처리-회복]을 반복하면서 1년 동안 유지시키는 과정을 통해 젬시타빈에 대한 내성 세포주를 구축한다. 젬시타빈에 대한 내성 여부는 MTT 어세이를 통해 확인한다.

젬시타빈 내성 세포주에서의 GLRX3 발현 억제 및 약제 민감성 어세이

젬시타빈 내성 췌장암 세포주 (CFGR)에서 GLRX3 발현 억제를 위해 siRNA (stealth^™siRNA)를 Invitogen에서 구입하여 사용하였다. 실험에 사용한 GLRX3 siRNA 시퀀스는 다음과 같다; (5' to 3') CAG AGU UAG CUA AAG AAC UCC CUC A. 대조군으로 stealth^™ RNAi medium GC duplex를 구입하여 사용하였다. 젬시타빈 내성 췌장암 세포주를 96웰-플레이트에 7x10³/웰로 분주하고, siRNA를 3 pmol/웰의 농도로 RNAiMAX와 상온에서 15분간 반응 후 처리하였다. 형질전환 24시간 후, 다양한 농도의 젬시타빈을 처리하고 3일간 배양하였다. 3일 뒤 배양액을 제거하고 MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide) 용액을 100 μl/웰씩 넣어주고 차광하여 4시간 동안 배양한다. 4시간 후 MTT 용액을 제거하고 DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 100 μl/웰 씩 넣은 후 570 nm에서 흡광도를 측정하여 준다. 약제를 처리하지 않은 각 세포군의 A570값을 100% 생존으로 하여 농도별 살아있는 세포의 생존율(% 대조군)을 계산하였다.

약제 민감성 어세이 ( Chemosensitivity assay)

GLRX3 발현 저해 세포주와 대조군 세포주를 각각 3-4 x10³ 개/웰씩 분주하여 하룻밤 부착시킨다. 세포 분주 다음 날, 각 웰의 배양액을 제거하고 다양한 농도의 항암제를 넣어주고 3일간 배양한다. 3일 뒤 배양액을 제거하고 MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide) 용액을 100 μl/웰씩 넣어주고 차광하여 4시간 동안 배양한다. 4시간 후 MTT 용액을 제거하고 DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 100 μl/웰 씩 넣은 후 570 nm에서 흡광도를 측정하여 준다. 약제를 처리하지 않은 각 세포군의 A570값을 100% 생존으로 하여 농도별 살아있는 세포의 생존율(% 대조군)를 계산하였다.

웨스턴 블롯 분석

구축된 젬시타빈 내성 세포주에서의 GLRX3 발현 확인을 위해, 모세포주인 HPAC과 CFPAC-1, 그리고 젬시타빈 내성 세포주인 HPGR 및 CFGR 세포주에서 총단백질 및 분비단백질을 분리하였다. 세포 총단백질은 세포 용해 버퍼(50 mM Tris, 150 mM NaCl, 25 mM β-글리세로포스페이트, 25 mM NaF, 0.5 M EDTA, 1% NP-40, 0.1 mM PMSF, 및 프로테아제 억제제 칵테일(Roche))를 이용하여 추출하였다. 분비단백질 준비를 위해 혈청이 없는 조건에서 배양한 세포배양액을 원심분리하여 세포 부산물들을 제거한 뒤 아세톤 침전(acetone precipitation)방법으로 농축하였다. 단백질들은 SDS-PAGE로 분리하고 PVDF 막 (Millipore, Billerica, MA)으로 옮긴다. 단백질이 블럿팅 된 막은 5%(w/v) 저지방 우유로 비특이적 반응을 막은 후 GLRX3에 대한 항체(1:1000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)를 반응시킨다. 면역반응이 있는 단백질은 West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce)로 가시화 한다.

실험결과

GLRX3 발현저해 췌장암 세포주 수립

췌장암 세포주 CFPAC-1 및 HPAC 에 shRNA 형질감염 방법을 통해 GLRX3 발현을 저해하는 세포주를 수립하였다(도 1).

GLRX3 발현저해로 유발되는 항암제감수성 증가

암줄기세포의 특성에는 자가 재생, 분화능력, 항암제 또는 방사선 내성 등의 특성이 알려져 있다. GLRX3는 췌장암 암줄기세포 특성을 이용하여 도출한 췌장암 신규 바이오 마커이다. 또한 GLRX3는 췌장암 암줄기세포의 유지와 관련되어 있다. 다양한 암줄기세포 특성 중 GLRX3 발현저해로 유발되는 항암제감수성을 확인하기 위해, GLRX3 발현저해 췌장암 세포주에 다양한 항암제를 사용하였다. 사용한 항암제는 표 1과 같다.

항암제 감수성 평가에 사용된 항암제

그룹	항암제
토포이소머라아제 억제제	이리노테칸(CPT-11), 에토포시드
플라티넘	옥살리플라틴, 카르포플라틴
탁산	파크리탁셀
안트라사이클린	톡소루비신, 에피루비신

CFPAC-1 세포주에서 GLRX3 발현 저해 시, 항암제인 CPT-11 및 에토포시드(Etoposide)에 대한 감수성이 대조군에 비해 증가하였고(도 2), CFPAC-1 및 HPAC 세포주에서 GLRX3 발현 저해 시, 항암제인 옥살리플라틴(Oxaliplatin) 및 카르보플라틴(Carboplatin)에 대한 감수성이 대조군에 비해 증가하였다(도 3a 및 도 3b). 또한, HPAC 세포주에서 GLRX3 발현 저해 시, 항암제인 독소루비신(Doxorubicin) 및 에피루비신(Epirubicin)에 대한 감수성이 대조군에 비해 증가하였고(도 4), 파크리탁셀(Paclitaxel)에 대한 감수성이 대조군에 비해 증가하였다(도 5).

젬시타빈 내성 세포주에서의 GLRX3 과발현

암줄기세포의 여러 특성 중 하나인 항암제 내성과 암줄기세포 신규 마커 GLRX3 간의 상관관계를 확인하기 위해, 소화기 암에서 주된 항암제로 사용하는 젬시타빈에 대한 항암제 내성 세포주를 췌장암 세포주에서 구축하였다(도 6a). 구축된 젬시타빈 내성 세포주에서 암줄기세포 마커인 GLRX3의 발현을 확인 한 결과, 모세포주인 CFPAC-1 및 HPAC 세포주에 비해 젬시타빈 내성 세포주에서 GLRX3의 발현 및 분비가 증가한 것을 확인하였다(도 6b).

젬시타빈 내성 췌장암 세포주에서 GLRX3 발현 억제가 항암제 감수성에 미치는 영향

구축된 젬시타빈 내성 췌장암 세포주(CFGR)에서 과발현되는 GLRX3의 발현을 siRNA 도입을 통해 억제시킨 결과(도 7a), 대조군 siRNA에 비해 GLRX3에 대한 siRNA를 이입한 젬시타빈 내성 췌장암 세포주에서 젬시타빈에 대한 감수성이 증가한 것을 확인하였다 (도 7b).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Composition for Enhancing Sensitivity for Anti-Cancer Drug Comprising GLRX3 Expression or Activity Inhibitor <130> PN140311 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLRX3 shRNA <400> 1 gtggaaattc ttcacaaaca t 21 <210> 2 <211> 1365 <212> DNA <213> GLRX3 <400> 2 acatccggcc gccggcactg gattgcttct gtctggcggc ggcagcatgg cggcgggggc 60 ggctgaggca gctgtagcgg ccgtggagga ggtcggctca gccgggcagt ttgaggagct 120 gctgcgcctc aaagccaagt ccctccttgt ggtccatttc tgggcaccat gggctccaca 180 gtgtgcacag atgaacgaag ttatggcaga gttagctaaa gaactccctc aagtttcatt 240 tgtgaagttg gaagctgaag gtgttcctga agtatctgaa aaatatgaaa ttagctctgt 300 tcccactttt ctgtttttca agaattctca gaaaatcgac cgattagatg gtgcacatgc 360 cccagagttg accaaaaaag ttcagcgaca tgcatctagt ggctccttcc tacccagcgc 420 taatgaacat cttaaagaag atctcaacct tcgcttgaag aaattgactc atgctgcccc 480 ctgcatgctg tttatgaaag gaactcctca agaaccacgc tgtggtttca gcaagcagat 540 ggtggaaatt cttcacaaac ataatattca gtttagcagt tttgatatct tctcagatga 600 agaggttcga cagggactca aagcctattc cagttggcct acctatcctc agctctatgt 660 ttctggagag ctcataggag gacttgatat aattaaggag ctagaagcat ctgaagaact 720 agatacaatt tgtcccaaag ctcccaaatt agaggaaagg ctcaaagtgc tgacaaataa 780 agcttctgtg atgctcttta tgaaaggaaa caaacaggaa gcaaaatgtg gattcagcaa 840 acaaattctg gaaatactaa atagtactgg tgttgaatat gaaacattcg atatattgga 900 ggatgaagaa gttcggcaag gattaaaagc ttactcaaat tggccaacat accctcagct 960 gtatgtgaaa ggggagctgg tgggaggatt ggatattgtg aaggaactga aagaaaatgg 1020 tgaattgctg cctatactga gaggagaaaa ttaataaatc ttaaacttgg tgcccaacta 1080 ttacggggtc tggctctgtc acccaggctg gagtgcagtg gcacgattat ggctcattgc 1140 agcctcgact tctcggggcc aagcgatcct cctgcctcag ccttctgagt agctgggacc 1200 acaggcgtgc accaccatgc ccacctaatt ttttatttct tgtagagatg aggtctcctg 1260 cctcagcctc ccaaagtgct ggaatttaca ggtaggacca ccacacttgg tccacttact 1320 tataataaac attgatttgg tcgttcaggt tcaaaaaaaa aaaaa 1365 <210> 3 <211> 335 <212> PRT <213> GLRX3 <400> 3 Met Ala Ala Gly Ala Ala Glu Ala Ala Val Ala Ala Val Glu Glu Val 1 5 10 15 Gly Ser Ala Gly Gln Phe Glu Glu Leu Leu Arg Leu Lys Ala Lys Ser 20 25 30 Leu Leu Val Val His Phe Trp Ala Pro Trp Ala Pro Gln Cys Ala Gln 35 40 45 Met Asn Glu Val Met Ala Glu Leu Ala Lys Glu Leu Pro Gln Val Ser 50 55 60 Phe Val Lys Leu Glu Ala Glu Gly Val Pro Glu Val Ser Glu Lys Tyr 65 70 75 80 Glu Ile Ser Ser Val Pro Thr Phe Leu Phe Phe Lys Asn Ser Gln Lys 85 90 95 Ile Asp Arg Leu Asp Gly Ala His Ala Pro Glu Leu Thr Lys Lys Val 100 105 110 Gln Arg His Ala Ser Ser Gly Ser Phe Leu Pro Ser Ala Asn Glu His 115 120 125 Leu Lys Glu Asp Leu Asn Leu Arg Leu Lys Lys Leu Thr His Ala Ala 130 135 140 Pro Cys Met Leu Phe Met Lys Gly Thr Pro Gln Glu Pro Arg Cys Gly 145 150 155 160 Phe Ser Lys Gln Met Val Glu Ile Leu His Lys His Asn Ile Gln Phe 165 170 175 Ser Ser Phe Asp Ile Phe Ser Asp Glu Glu Val Arg Gln Gly Leu Lys 180 185 190 Ala Tyr Ser Ser Trp Pro Thr Tyr Pro Gln Leu Tyr Val Ser Gly Glu 195 200 205 Leu Ile Gly Gly Leu Asp Ile Ile Lys Glu Leu Glu Ala Ser Glu Glu 210 215 220 Leu Asp Thr Ile Cys Pro Lys Ala Pro Lys Leu Glu Glu Arg Leu Lys 225 230 235 240 Val Leu Thr Asn Lys Ala Ser Val Met Leu Phe Met Lys Gly Asn Lys 245 250 255 Gln Glu Ala Lys Cys Gly Phe Ser Lys Gln Ile Leu Glu Ile Leu Asn 260 265 270 Ser Thr Gly Val Glu Tyr Glu Thr Phe Asp Ile Leu Glu Asp Glu Glu 275 280 285 Val Arg Gln Gly Leu Lys Ala Tyr Ser Asn Trp Pro Thr Tyr Pro Gln 290 295 300 Leu Tyr Val Lys Gly Glu Leu Val Gly Gly Leu Asp Ile Val Lys Glu 305 310 315 320 Leu Lys Glu Asn Gly Glu Leu Leu Pro Ile Leu Arg Gly Glu Asn 325 330 335 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Control shRNA <400> 4 ggaatctcat tcgatgcata c 21 <210> 5 <211> 25 <212> RNA <213> GLRX3 siRNA <400> 5 cagaguuagc uaaagaacuc ccuca 25

Claims (11)

1. GLRX3(Glutaredoxin-3) 발현 억제제를 포함하는 객체(subject)의 항암제에 대한 감수성 증진용 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 항암제는 토포이소머라아제 억제제(Topoisomerase inhibitor), 플라티넘(Platinum), 탁산(Taxanes), 안트라사이클린(anthracycline) 또는 젬시타빈(Gemcitabine)인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
3. 제 2 항에 있어서, 상기 토포이소머라아제 억제제는 에토포시드(etoposide), 토포테칸(topotecan), 캄토테칸(camptothecan), 하이캡타민(hycaptamine), 이리노테칸(irinotecan), 루비테칸(rubitecan), 6-에톡시프로피오닐-3′(6-ethoxypropionyl-3′), 4′-O-엑소-벤질리덴-샤르트레우신(,4′-O-exo-benzylidene-chartreusin), 루토테칸(lurtotecan), BNP1350, BNPI1100, BN80915, BN80942, 에토포시드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 소부족산(sobuzoxane), 2′-디메틸아미노-2′-디옥시-에토포시드(2′-dimethylamino-2′-deoxy-etoposide), GL331, 아술라크린(asulacrine) 및 라멜라린 D(lamellarin D)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
4. 제 2 항에 있어서, 상기 플라티넘은 시스플라틴(cisplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin) 및 카르보플라틴(carboplatin)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
5. 제 2 항에 있어서, 상기 탁산은 파크리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 라로탁셀(larotaxel) 및 카바지탁셀(cabazitaxel)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
6. 제 2 항에 있어서, 상기 안트라사이클린은 독소루비신(doxorubicin), 다우노마이신(daunomycin), 에피루비신(epirubicin), 미톡산트론(mitoxantrone), 발루비신(valrubicin) 및 이다루비신(idarubicin)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
7. 항암제 내성 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 환자의 시료로부터 항암제 내성 마커인 GLRX3를 검출하는 방법으로서 상기 항암제는 토포이소머라아제 억제제(Topoisomerase inhibitor), 플라티넘(Platinum), 탁산(Taxanes), 안트라사이클린(anthracycline) 또는 젬시타빈(Gemcitabine)인 것을 특징으로 하는 방법.
   
8. 제 7 항에 있어서, 상기 방법은 마이크로어레이 방식, 유전자 증폭 방식 또는 항원-항체 반응 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
   
9. GLRX3 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제 또는 GLRX3의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 항암제 내성 분석용 키트로서 상기 결합제는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)인 것을 특징으로 하는 키트.
   
10. 제 9 항에 있어서, 상기 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트, 마이크로어레이 키트 또는 유전자 증폭 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
    
11. GLRX3(Glutaredoxin-3) 발현 억제제 및 항암제로서 토포이소머라아제 억제제(Topoisomerase inhibitor), 플라티넘(Platinum), 탁산(Taxanes), 안트라사이클린(anthracycline) 또는 젬시타빈(Gemcitabine)을 포함하는 상기 항암제에 대하여 내성을 보이는 암에 대한 치료용 조성물.

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