KR101080071B1

KR101080071B1 - 재조합 ｎ 단백질에 대한 단클론 항체를 이용한 리프트계곡열 경합적 효소결합면역측정법

Info

Publication number: KR101080071B1
Application number: KR1020090024360A
Authority: KR
Inventors: 김현주; 예정용; 문진산; 나진주; 권창희
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2009-03-23
Filing date: 2009-03-23
Publication date: 2011-11-08
Anticipated expiration: 2029-03-23
Also published as: KR20100105974A

Abstract

본 발명은 리프트계곡열 바이러스의 재조합 N 단백질에 대한 단클론항체 및 이를 이용한 경합적 효소결합면역측정법에 관한 것이다. 보다 자세하게는 리프트계곡열 바이러스의 재조합 N 단백질에 대한 단클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 및 재조합 N 단백질을 항원으로 사용하고 혈청 항체와 N 단백질에 대한 단일클론항체를 동시에 반응시키는 경합적 효소결합면역측정법을 적용하여 리프트계곡열 바이러스 항체를 신속하게 검출할 수 있는 진단방법에 관한 것이다.

리프트계곡열 바이러스, N 단백질, 단클론항체 ,경합적효소결합면역측정법

Description

재조합 Ｎ 단백질에 대한 단클론 항체를 이용한 리프트계곡열 경합적 효소결합면역측정법{Rift valley fever competition ELISA using monoclonal antibodies against recombinant N protein}

리프트계곡열은 생물학적 매개체인 모기에 의해 전파되는 전염병으로 반추류등 가축뿐만 아니라 사람에도 전파되어 출혈성 증상 또는 뇌염을 일으켜 사망에 이르게 하는 인수공통전염병이다. 이 질병은 주로 신생축과 어린 동물에서 높은 폐사율을 나타내며, 임신축의 유산이 주된 특징이다. 1931년 아프리카 케냐에서 처 음 발생한 이래 주로 아프리카에서 발생하여 왔으나, 2000년 9월 아프리카 밖에 위치한 사우디아라비아와 예멘 국경지대에서 발생하여 질병 확산 가능성을 보여주었고, 이후 아프리카에서 지속적으로 발생하고 있다. 이 질병은 국제적으로 발생한 국가의 축산업에 수출입 무역 중단뿐 아니라 공중보건 분야에도 큰 피해를 입힐 수 있어 과거 국제수역사무국 악성질병 A 리스트였으며, 국내 가축전염병예방법상 제1종 가축전염병으로 분류되어있는 악성 전염병이다.

그러므로, 리프트계곡열의 특성상 그 발생이 의심될 경우 신속한 진단을 통해 국가적 차원의 강력한 방역조치가 수행되어야만 이 질병으로 인한 축산업의 경제적 피해를 최소화할 수 있다. 리프트계곡열은 감염동물로부터 리프트계곡열바이러스 항원을 검출하는 방법(항원검사법)과 감염동물에서 감염으로 인하여 생성되는 면역산물인 리프트계곡열 항체를 검사하는 방법(항체검사법) 등 두 가지 방법에 의하여 진단이 이루어진다.

항원검사법으로는 폐사한 동물의 간, 비장, 뇌 또는 유산 태아 등을 검사시료로 하여 병원체 분리 및 동정, 역전사효소 중합효소연쇄반응(RT-PCR)법, 항원검출 효소결합면역측정법 등이 이용되고 있으나, 생체안전도 3 등급 (Biosafety Level 3)의 특수 밀폐실험실에서 진단을 수행하여야만 한다.

항체검사법으로는 바이러스 중화시험법, 효소결합면역측정법 등이 이용되고 있다. 생체안전도(Biosafety Level; BSL) 3등급의 실험실을 필요로 하는 바이러스 중화시험법과 달리, 효소결합면역측정법에 의한 진단은 일반 실험실에서도 수행 가능하다. 상기 목적으로 사용 중인 종래의 효소결합면역측정법(ELISA)의 경우 불활 화 바이러스 항원, 감염된 마우스간(Liver) 항원을 사용하였으나 최근 재조합 N 단백질 항원으로 대체되고 있다. 현재 상용화되어 판매되고 있는 항체진단키트의 경우 불활화 바이러스 항원을 사용하기 때문에 진단 항원 제작을 위해서는 생체안전도 3 등급 (Biosafety Level 3)의 특수 밀폐실험실이 필요하며, 캡쳐 항체를 플레이트에 코팅한 후 오버나잇시켜야 하는 등 진단 시간이 20여 시간 이상 소요된다.

이에, 본 발명자들은 기존 진단법보다 안전하면서 신속하게 리프트계곡열을 진단할 필요성을 느끼게 되어 안전하게 재조합 N 단백질을 항원으로 사용하고 N 단백질에 대한 단클론 항체를 이용하여 진단시간을 단축시킬 수 있는 경합적 효소결합면역측정법을 연구하였다. 그 결과 재조합 N 단백질 항원을 코팅하고 이에 대한 단클론 항체와 검사시료혈청을 동시에 경합시켜 신속정확하게 리프트계곡열 항체를 검출할 수 있는 경합적 효소결합면역측정법을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 재조합 N 단백질과 이에 대한 단클론 항체와 검사시료혈청을 동시에 경합시켜 리프트계곡열에 대한 항체를 검출하는 새로운 ELISA법을 제공하는데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은 리프트계곡열 바이러스의 N 단 백질에 대한 단클론항체 1-59를 제공한다.

본 발명에 사용한 RVF N 유전자는 1944년 우간다에서 분리된 smithburn strain의 S segment 부위의 일부로서, smithburn strain은 현재 백신으로 만들어 반추류에서 사용되고 있는 순화된 바이러스주이다. 그 유전자 서열은 국제유전자은행(NCBI, Genbank) 등록번호 제 DQ380157호로 등록된 것으로서, N 단백질과 NSs 단백질을 코딩하며 이중 N 단백질을 코딩하는 유전자 염기서열은 917~1654의 738개 뉴클레오타이드(도 1)이다. 상기 N 단백질은 숙주세포내에서 뉴클레오캡시드를 구성하는 주된 단백질로서, 감염세포에서 바이러스 구조 단백질 중 가장 많이 생산되기 때문에 강한 체액성 및 세포성 면역반응을 유발한다. 또한 리프트계곡열 바이러스가 속해있는 플레보바이러스 속(phlebovirus genus) 간에는 매우 상이하면서 리프트계곡열 바이러스 strain 간에는 매우 유사성이 높은 부위이며, 면역원성과 항원성이 뛰어난 부위로 알려져 있다.

본 발명에서, 리프트계곡열 바이러스의 N 단백질은 바이러스로부터 직접 분리할 수 있지만, 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조하는 것이 바람직하다. 구체적으로, 리프트계곡열 바이러스의 N 단백질은 (a) N 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어 그의 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열을 포함하는 벡터에 삽입시키고, (b) 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환시키며, (c) 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건하에서 배양하고, (d) 배양물로부터 N 단백질을 분리하는 단계를 거쳐 생산할 수 있다.

상기 제조방법에서, 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다와 같은 곤충 세포를 이용하는 발현시스템을 사용할 수 있다. 또한, 아데노바이러스와 같은 바이러스를 이용하는 발현시스템을 사용할 수도 있다.

한 양태로서, 본 발명에서는 대장균 발현시스템을 이용하여 리프트계곡열 바이러스의 N 단백질을 생산하였다. 본 발명의 대장균벡터(이하 pQE/RVFN 이라 약칭함)는 게놈내에 리프트계곡열 바이러스의 N 단백질 유전자를 함유하고 있으며, 본 발명의 진단방법에 사용되는 진단항원 및 단클론항체를 생산하기 위하여 사용됨을 특징으로 한다. 또한, 상기에 의해 발현된 단백질 항원은 아미노산 말단부위 앞에 6개의 히스티딘(Histidine)을 융합시킨 형태의 재조합 N 단백질을 생산하도록 작성함으로써 단백질 발현확인 및 정제가 용이하다.

본원에서 사용된 용어'단클론항체'는 당해분야에 공지된 용어로서 단일 항원성 부위에 대해서 고도의 특이적인 항체를 의미한다. 통상적으로, 상이한 에피톱에 대해 특이적인 상이한 항체들을 포함하는 다클론항체와는 달리 단클론항체는 항원상의 단일 에피톱에 대해 특이적으로 결합한다. 단클론항체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단 및 분석 방법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한 융합 배양에 의해 합성되기 때문에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 또 다른 장점을 갖는다.

본 발명의 단클론항체는 리프트계곡열 바이러스의 N 단백질을 면역원으로 하여 동물을 면역화시키고, 면역화된 동물의 슬와임파절 유래 면역 B 세포를 골수종세포와 융합하여 하이브리도마를 생성하고, N 단백질을 선택적으로 인식하는 하이브리도마를 선별하며, 선별한 하이브리도마를 배양하고, 하이브리도마의 배양액으로부터 항체를 분리함으로써 제조할 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명의 단클론항체는 리프트계곡열 재조합 N 단백질을 마우스에 면역시키고, 이로부터 분리한 면역 B 세포와 마우스 골수종유래세포간의 융합세포 즉 하이브리도마 세포에 의해서 생산될 수 있으며, 이러한 하이브리도마 세포는 당업계에 통상적인 방법에 의해서 제조될 수 있고, 예를 들어 HAT 선택법 등을 이용하여 제조될 수 있다. 또한 N 단백질 항원에 대한 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포들 중에서, N 단백질 항원에 대한 결합능력이 우수하고, 면역원성이 강한 N 단백질상의 에피톱(Epitope)에 반응하는 단클론항체 1-59를 생산하는 하이브리도마 세포를 선택하여 사용할 수 있다. 그러한 하이브리도마 세포의 예로는 대한민국 서울시에 위치한 한국세포주은행에 2009년 2월 9일자로 기탁된 기탁번호 KCLRF-BP-00201의 하이브리도마 세포주를 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 리프트계곡열 바이러스의 N 단백질과 단클론항체 1-59를 이용한 효소결합면역측정법으로, 검사혈청과 단클론항체 1-59 간의 경합반응에 의하여 리프트계곡열 바이러스의 N 단백질에 대한 항체를 검출하는 것을 특징으로 하는 리프트계곡열의 진단방법을 제공한다(도 4).

본 발명의 진단방법에 있어서, '검사혈청'은 각종 반추류 등 가축류와 사람을 비롯한 모든 동물로부터 분리된 것일 수 있으며, 바람직하게는 소, 염소 또는 양으로부터 분리된 것이다.

본 발명의 진단방법은 한 양태로서,

(1) 효소결합면역측정법 플레이트에 리프트계곡열 재조합 N 단백질 항원을 부착시키는 단계;

(2) 상기 플레이트에 부착되지 않은 N 단백질 항원을 제거하는 단계;

(3) 검사혈청 및 리프트계곡열 바이러스의 재조합 N 단백질에 대한 단클론항체 1-59를 경합시키는 단계;

(4) 표지물질이 결합된 단클론항체에 대한 2차 항체를 반응시키는 단계;

(5) 검사혈청 중의 리프트계곡열 바이러스의 N 단백질에 대한 항체 수준을 측정하는 단계를 포함한다.

여기서, 표지물질은 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하며, 이의 예로는 효소, 형광물질, 방사선 물질 등이 예시될 수 있다. 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라아제, 글리코즈 옥시다아제, 헥소키나제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 등을 사용할 수 있다. 형광물로는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, 플루오르신이소티옥시아네이트 등을 사용할 수 있다. 방사성 동위원소로는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re 등이 있다. 그러나 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있은 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.

단계 (5)에서 항체 수준의 측정법은 표지물질에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 표지물질이 효소인 경우에는 효소와 기질의 반응을 통한 발색반응의 흡광도를 측정하여, 형광물질인 경우에는 형광강도를 측정하여, 방사선 물질인 경우에는 방사선 방출량을 측정함으로써 N 단백질에 대한 항체의 수준을 측정할 수 있다.

본 발명의 경합적 ELISA법은 진단의 특이도와 민감도가 우수하면서도 종래의 ELISA 방법보다 훨씬 안전하면서도 간단한 방법으로 진단시간을 단축하였다.

본 발명의 ELISA 항원인 재조합 N 단백질은 종래의 재조합 N 단백질처럼 바이러스에서 RNA를 추출하여 사용하지 않고, 인공적으로 합성하여 사용하였기 때문에 매우 안전하며 6개의 히스티딘이 융합되어 있어 항원을 생산할 때 항히스티딘 항체를 이용하여 재조합 단백질 발현 확인이나 동 단백질의 정제가 용이하다.

또한, 본 발명은 N 단백질 에피톱에 반응하는 단클론 항체를 사용하였으므로 리프트계곡열 진단에 있어서 항체검출 특이도와 민감도가 뛰어나다.

종래의 ELISA 진단방법은 다클론항체를 플레이트에 코팅한 후 오버나잇 반응시킨 뒤 블러킹 과정을 거친 다음 검사시료혈청을 각각 바이러스항원 및 컨트롤항 원과 섞어 반응시킨 후 다시 마우스 유래 리프트계곡열바이러스 양성혈청을 반응시키는 단계를 거치게 되어있다. 그러나 본 발명의 진단방법은 리프트계곡열 재조합 N 단백질을 항원으로 코팅한 다음 검사시료혈청과 N 단백질에 대한 단클론항체를 동시에 넣어주어 반응시키면 되기 때문에 반응 시간 및 단계를 축소시켰다. 즉, 종래의 ELISA 진단방법보다 2단계를 감소시켰으며 오버나잇 과정이 없어 진단시간은 약 3시간 30분 정도이며, 검사시료혈청을 바이러스항원과 컨트롤항원 각각에 넣어주어야 하는 번거로움도 없이 검사방법이 단순하여, 진단 검사를 수행하기가 용이하기 때문에 대단위 혈청시료를 신속히 검사하는데 적합하다.

또한 재조합 N 단백질 및 단클론항체는 지속적으로 생산 가능하기 때문에 키트를 외국에서 수입하여 사용하는 것보다 시간과 비용절감 효과가 있다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1]

리프트계곡열바이러스 N 단백질의 합성

1944년 우간다에서 분리되어 순화된 VF smithbrun strain의 S segment (NCBI accession number DQ380157)의 염기 서열 중 N 단백질에 해당하는 917~1654번까지의 738개 뉴클레오타이드에 대한 cDNA를 국내 유전자합성 회사인 Bioneer사에 의뢰하여 인공적으로 합성하였다.

[실시예 2]

리프트계곡열바이러스 N 단백질 유전자 증폭 및 클로닝

N 단백질 유전자에 대한 cDNA는 pCR4 TOPO 벡터에 삽입되어 있는 형태로 제공되었기 때문에 리프트계곡열바이러스 N 단백질을 발현하기 위해 먼저 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)을 실시하였다. cDNA, 서열번호 1의 포워드 프라이머(Forward primer), 서열번호 2의 리버스 프라이머(reverse primer)를 PCR premix kit(Bioneer) 튜브에 첨가하여 94℃에서 2분간 처리한 후 94℃에서 30초, 50℃에서 30초, 72℃에서 1분을 1사이클로 하여 PCR 증폭기에서 30사이클 반복하여 PCR 증폭을 실시한 후 마지막으로 72℃에서 10분간 DNA 합성을 실시하였다.

상기 PCR을 위하여 아래와 같은 프라이머를 제작하였다.

서열번호 1 (포워드 프라이머) : 5'-GCATGCATGGACAACTATCAAGAG-3'

서열번호 2 (리버스 프라이머) : 5'-GGTACCTTAGGCTGCTGTCTTGTA-3'

상기 프라이머 서열들은 이후 대장균 발현벡터를 작성하기 위하여 의도적으로 서열번호 1의 프라이머는 5' 말단의 ATG 상류에 Sph I 제한효소 작용부위를, 서 열번호 2의 프라이머는 5' 말단에 종료코돈 상류에 Kpn I 제한효소 작용부위를 삽입하였다.

상기에서 증폭된 N 단백질 유전자 단편은 바로 pGEM-Teasy(Promega, USA) 벡터에 클로닝하여 "pGEM/RVFN"을 작성하고, 염기서열분석 회사(Genotech)에 의뢰하여 도 1의 공지된 염기서열과 비교 분석함으로써 N 단백질 유전자의 올바른 삽입여부를 확인하였다.

[실시예 3]

리프트계곡열바이러스 N 단백질 유전자 발현벡터 작성

상기 2의 pGEM/RVFN 벡터를 Sph I 및 Kpn I로 처리하여 744bp DNA 단편을 추출하였다. 그 다음, 대장균 T5 프로모터를 가지며 6개의 Histidine(6xHis)이 융합형태로 발현될 수 있도록 제작된 pQE30 플라스미드(Qiagen)를 Sph I 및 Kpn I 제한효소로 처리하여 상기 744bp DNA 단편을 삽입함으로써 리프트계곡열 바이러스 N 단백질 유전자를 삽입한 대장균 발현벡터 pQE30/RVFN을 제작하였다. 대장균 발현벡터는 도 2와 같다.

[실시예 4]

리프트계곡열바이러스 N 단백질 발현 및 정제

재조합 대장균 pQE30/RVFN은 QIAexpressionist (Qiagen) 발현 시스템을 이용하여 작성하였다. 상기 3에서 작성한 pQE30/RVFN 벡터를 TOP10F' 대장균에 형질도 입하여 증폭시킨 후 DNA plasmid 추출 키트(QIAGEN miniprep kit)를 이용해 추출하였다. 추출된 pQE30/RVFN 벡터는 발현을 위해 다시 M15 세포(pREP4가 기 형질전환되어 있는 E.coli)에 형질전환시켜 가나마이신(25㎍/㎖)과 암피실린(100㎍/㎖)이 포함된 LB 배지에 증식시켜 선택 배양하였다. 형질전환된 콜로니는 LB 액상배지(가나마이신 및 암피실린 포함) 10㎖에 넣어 37℃에서 오버나이트 배양한 후 다음날 2.5㎖을 취해 이를 동일한 배지 50㎖에 넣어 4시간 교반시키면서 배양한 뒤 최종 1mM의 농도가 되게 아이피티지(IPTG :Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 넣어 4시간동안 발현을 유도하였다. 배양물을 3000rpm에서 30분간 원심시킨 후 상층액은 버리고 셀 펠렛만 수거하여 다시 라이시스버퍼(lysis buffer) 8㎖에 부유시켜 ProBondTM 정제시스템(Invitrogen)의 디네이쳐링(denaturing) 방법을 이용하여 재조합 N 단백질을 정제하였다. 도 3은 정제된 N 단백질의 항원성을 웨스턴블랏법에 의해 확인한 것이다. 정제된 N 단백질은 BCA 방법으로 농도를 확인하였다.

[실시예 5]

리프트계곡열 바이러스 N 단백질에 대한 항혈청의 생산 및 항체가수준 측정

정제된 리프트계곡열 바이러스 N 단백질은 1㎎/㎖로 만들어 동일 볼륨의 불완전 프루운드 어쥬반트(Freund's incomplete adjuvant)와 섞은 뒤 8개월령의 국내 토종염소 2마리의 피하에 각각 접종하였다. 접종 후 2주 간격으로 2회 재접종을 실시하였다. 샘플혈청을 접종전, 처음 접종으로부터 2주, 4주, 6주후에 모아 간접 ELISA를 실시하여 항체수준이 올라감을 확인한 뒤 처음접종 6주 후에 혈청을 수거 하였다. 생산된 항혈청의 N 단백질에 대한 항체가 수준을 확인하기 위하여 상용화되어 판매되고 있는 RVF inhibition ELISA (BDSL, UK)를 실시하였다. 실험은 진단 키트내 방법에 준하여 실시하였고, 그 결과 생산된 혈청은 PI(Percent inhibition)값이 대조군인 강양성혈청 기준과 동일하게 나타내어 N 단백질에 대한 고역가 면역혈청임을 확인하고 추후 본 발명의 ELISA의 양성대조혈청으로 사용하였다.

[실시예 6]

리프트계곡열바이러스 N 단백질에 대한 단클론항체를 생산하는 하이브리도마의 생산

단클론항체를 작성하기 위하여 정제 농축한 재조합 리프트계곡열바이러스 N 단백질을 이용하였다. N 단백질 항원은 1㎎/㎖ 농도로 만들어 불완전 프루운드 어쥬반트(Freund's incomplete adjuvant)와 동량으로 균질하게 혼합한 다음, 혼합액 0.1㎖을 발브시마우스(Balb/C mouse)의 양 발바닥(Foot-pad)에 나누어 접종하였다. 면역 후 12~13일 사이에 슬와임파절(Popliteal lymph node)을 채취하여 세포융합에 사용하였다.

세포융합은 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 사용하는 일반적인 방법으로 다음과 같이 실시하였다. 상기 채취한 림프구는 무혈청 배지(Serum Free Medium, SFM)로 세척한 후 마우스 골수종양세포주(SP2/0-Ag14 mouse myeloma cell line)와 5:1 비율로 혼합한 후 PEG1500을 첨가하여 융합하였다. 융합이 완료된 세포는 HAT(Hypoxanthine Aminopterin Thymidine) 증식배지 (10% 우태아 혈청을 첨가한 D- MEM)에 적당히 희석한 후 미리 마우스복강세포가 배양되어 있는 96웰 마이크로플레이트에 100㎕씩 분주하여 37℃, 5% 이산화탄소 배양기내에서 배양하였다.

N 단백질에 대한 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주의 선발은 다음과 같이 실시하였다. 상기 세포융합의 결과로 하이브리도마 세포가 증식한 웰의 배양 상층액을 수거하여 간접 ELISA로 검사하였을 때, 상기 실시예 4의 재조합 N 단백질 항원에 양성반응을 보이는 웰의 하이브리도마 세포들을 마우스복강세포가 배양된 96웰 플레이트에 웰당 1개의 세포가 포함되도록 첨가하고 단클론(clone)이 형성될 때까지 배양하였다. N 단백질에 대한 항체를 생산하면서 단 하나의 클론만이 증식하는 웰의 하이브리도마를 선발하였다. 상기 선발된 하이브리도마 세포를 발브시 마우스(Balb/C mouse)의 복강에 접종하여 생성시킨 복수를 채취하여 실험에 사용하였다. 본 실험에서 선발된 리프트계곡열바이러스 N 단백질에 대한 단클론항체 생산 세포주의 특성은 표 1과 같다.

재조합 N단백질에 대한 단클론 항체의 특성확인

단클론항체	Isotype^a	웨스턴블랏 (NP Ag^b)	간접ELISA (NP Ag^c)
1-4	IgG, 2b	+	++
1-94	IgG, G1	+	++
1-99	IgG, G1	+	++
1-112	IgG, 2b	+	+
2-11	IgG, G1	+	++
2-51	IgG, G3	+	+
1-59	IgG, 2b	+	++
2-12	IgG, 2b	+	+
2-17	IgG, 2b	+	++
2-18	IgG, 2a	+	+

a : isostrip kit (Roche) 사용, b : 대장균 발현 N 단백질 항원

c: 대장균 발현 정제된 N단백질항원 (2㎍/㎖으로 희석하여 사용 )

단클론항체 1/60000 희석 이상에서도 흡광도 > 2.0 이상 : ++,

2.0> 흡광도>1.0 : +

[실시예 7]

경합적 ELISA의 진단항체용 단클론항체 1-59의 선발

상기 실시예 6의 단클론항체들 중에서, 리프트계곡열 바이러스 항원과 결합하는 단클론항체를 선발하기 위하여 상용화되어 판매되고 있는 RVF inhibition ELISA(BDSL,UK)를 실시하였다. 실험 방법은 detection antibody 반응단계에서 제공되어있는 mouse anti-virus 대신 생산된 단클론항체 10종을 각각 반응시키는 과정을 제외하고는 키트내 들어있는 키트방법과 동일하게 하였다. 컨트롤로 삼기 위하여 정상적으로 mouse anti-virus가 들어있는 실험도 실시하였다. 실험결과 IgG 2b 형태이면서 리프트계곡열바이러스 항원에도 반응성을 나타내는 단클론항체 1-59를 경합적 ELISA에 사용하기 위한 항체로 선발하였다. 단클론항체 1-59를 생산하는 하이브리도마 세포주에 대하여 대한민국 서울시에 위치한 한국세포주은행에 이 클론을 기탁하였으며, 이 기관으로부터 2009년 2월 9일자로 KCLRF-BP-00201의 수탁번호를 부여받았다.

[실시예 8]

리프트계곡열 진단을 위한 경합적 ELISA 방법

리프트계곡열바이러스 재조합 N 단백질과 이에 대한 단클론항체를 사용하는 경합적 효소결합면역측정법의 방법은 다음과 같다.

상기 실시예 5에서 제작된 정제된 재조합 N 단백질(1㎎/㎖)을 0.01M PBS(Phosphate buffered saline) 완충액으로 1,000배 희석(1㎍/㎖)하여, 96웰 마이크로플레이트(Nunc사, Maxisorp)에 웰당 50㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간동안 반응시켰다.

상기 반응이 끝난 후, ELISA 플레이트를 PBST로 3회 세척하고 검사시료혈청과 단클론항체를 분주하여 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 먼저 PBS에 5%가 되게 스킴밀크(skim milk)를 넣어 잘 녹여 블로킹 완충용액을 만들고, 이를 이용해 검사시료혈청은 10배 희석하여 각 혈청당 2 웰에 웰당 50㎕씩 분주하였다. 대조군은 컨쥬게이트 대조군, 음성, 약양성, 강양성 대조군, 단클론항체 대조군으로 나누어 각각에 해당하는 혈청을 넣어주었다. 컨쥬게이트 대조군에는 블로킹완충액, 음성 대조군에는 정상 염소혈청(Normal goat serum, Gibco), 약양성 대조군에는 상기 실시예 5에서 생산한 고역가 면역혈청을 정상 염소혈청으로 4배 희석해 놓은 혈청을, 강양성 대조군에는 상기 실시예 5에서 생산한 고역가면역혈청을, 단클론항체 대조군에는 블로킹완충액을, 각각 블로킹완충액으로 10배 희석하여 컨쥬게이트 및 음성 대조군은 2웰씩, 약양성과 강양성 그리고 단클론항체 대조군은 4웰씩 웰당 50㎕씩 넣어주었다. 단클론항체 1-59는 블로킹완충액으로 6,000배 희석(0.75㎍/㎖)하여 컨쥬게이트 대조군 웰을 제외한 모든 웰에 웰당 50㎕씩 넣어주었다. 컨쥬게이트 대조군에는 블로킹 완충액을 50㎕씩 넣어주었다. 혈청과 단클론항체를 모두 분주한 뒤 37℃에서 1시간동안 반응시켰다.

상기 반응이 끝난 후, ELISA 플레이트를 PBST로 3회 세척하고 페록시다아제-안티마우스 IgG 컨쥬게이트(Pierce)를 블로킹 완충용액으로 5,000배 희석하여 모든 웰에 50㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간동안 반응시켰다.

상기 반응이 끝난 후, ELISA 플레이트를 PBST로 5회 세척하고 OPD(O-PhemyleneDiamine) 용액(Sigma)을 각 웰에 50㎕씩 분주한 후 실온에서 약 10분간 발색시켰다. 그 후 1.25M 황산용액을 웰당 50㎕씩 분주함으로써 발색반응을 중지시키고 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 반응의 결과 판정은 발색저해도(Percent Inhibition, PI)가 30.84 이상인 경우 리프트계곡열 항체 양성반응으로 판정하였다.

[시험예 1]

리프트계곡열 음성 반추동물의 혈청에의 적용

국내 사육중이며 리프트계곡열 음성으로 확인된 소 및 산양 1,000두로부터 채취한 혈청을 대상으로 상기 실시예 8에 기재된 본 발명의 진단방법으로 검사하였다. 도 5는 본 발명의 경합적 ELISA에 의하여 상기 검사시료를 조사한 결과이며, 검사시료 1000점 중 996점이 음성(PI 30.84 이하)으로 판정되었다(도 5). 또한 모기매개질병(아까바네, 아이노, 츄잔, 이바라기, 소유행열)에 대한 항체양성혈청 96점을 본 발명의 진단방법으로 검사한 결과 모두 음성으로 판정되어 교차반응은 없는 것으로 확인되었다(도 6). 그러므로 본 발명의 진단방법인 경합적 ELISA의 특이도는 99.7% 이었다.

[시험예 2]

리프트계곡열 생백신 접종 소 및 산양에서의 진단효율 비교

리프트계곡열 생백신(OBP사)을 제조사의 매뉴얼에 따라 소 2마리와 염소 5마리에 각각 접종하여 일정간격으로 채취한 혈액을 대상으로 본 발명의 경합적 ELISA법을 수행하였다. 각 혈청에 대한 검사결과를 상용화된 RVF inhibition ELISA (BDSL ,UK)법과 비교하였다.

도 7은 상기 리프트계곡열 생백신 접종 소 및 산양에서 본 발명의 경합적 ELISA로 리프트계곡열에 대한 항체를 조사한 결과를 나타낸다. 종래의 ELISA법과 유사하거나 그 이상으로 신속하게 리프트계곡열 항체를 진단할 수 있었기 때문에 리프트계곡열 바이러스 진단을 수행하는데 민감도가 우수함을 보여주고 있다.

도 1은 본 발명의 인공 합성된 리프트계곡열 바이러스(Smithburn strain) N 단백질을 코딩하는 유전자이다.

도 2는 인공 합성된 리프트계곡열 바이러스 N 단백질 코딩 유전자를 삽입하여 작성한 재조합 발현벡터 pQE/RVFN의 모식도이다.

도 3은 리프트계곡열 바이러스 재조합 N 단백질의 발현 및 항원성을 웨스턴블랏(Western blot) 방법으로 확인한 사진이다.

레인 M : 단백질분자량 크기 마커

레인 1 : 재조합 N 단백질을 마우스 유래 리프트계곡열바이러스 양성혈청과 반응시킨 결과

레인 2 : 재조합 N 단백질을 염소 유래 리프트계곡열바이러스 양성혈청과 반응시킨 결과

도 4는 본 발명의 경합적 ELISA에 의해 진단하는 방법을 나타낸 모식도이다

도 5는 리프트계곡열 음성시료를 대상으로 경합적 ELISA를 적용한 결과를 나타내는 도면이다.

도 6은 모기매개질병 양성혈청시료를 대상으로 경합적 ELISA를 적용한 결과 를 나타내는 도면이다.

C++ : 강양성 대조혈청

C+ : 약양성 대조혈청

C- : 음성 대조혈청

Akabane, Aino, Chuzan, Bovine ephemeral fever, Ibaraki : 모기매개질병명

도 7은 리프트계곡열바이러스(Smithburn strain) 생백신을 소 및 염소에 접종 후 일정 간격으로 채취한 시료를 대상으로 본 발명의 경합적 ELISA와 상업화된 RVF inhibition ELISA (I-ELISA : BDSL, UK) 키트간 항체 검출 결과를 비교한 도면이다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(Management : Ministry for Food, Agriculture, Forestry and Fisheries. National Veterinary Research and Quarantine Service(NVRQS)) <120> Rift valley fever competition ELISA using monoclonal antibodies against recombinant N protein <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gcatgcatgg acaactatca agag 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ggtaccttag gctgctgtct tgta 24

Claims

리프트계곡열 바이러스의 재조합 N 단백질과 단클론항체 1-59를 이용한 경합적 효소결합면역측정법으로,

검사혈청과 단클론항체 1-59 간의 경합반응에 의하여 리프트계곡열 바이러스의 N 단백질에 대한 항체를 검출하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 동물의 리프트계곡열의 진단방법.
제 1항에 있어서,

(1) 효소결합면역측정법 플레이트에 리프트계곡열 바이러스의 재조합 N 단백질 항원을 부착시키는 단계;

(2) 상기 플레이트에 부착되지 않은 재조합 N 단백질 항원을 제거하는 단계;

(3) 검사혈청 및 리프트계곡열 바이러스의 재조합 N 단백질에 대한 단클론항체 1-59를 경합시키는 단계;

(4) 표지물질이 결합된 단클론항체에 대한 2차 항체를 반응시키는 단계;

(5) 검사혈청 중의 리프트계곡열 바이러스의 N 단백질에 대한 항체 수준을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 리프트계곡열의 진단방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,

상기 단클론항체 1-59는 하이브리도마(기탁번호 KCLRF-BP-00201)로부터 생산 된 것임을 특징으로 하는 진단방법.
제 2항에 있어서,

표지물질이 효소인 경우에는 효소와 기질의 반응을 통한 발색반응의 흡광도를 측정하여, 발색저해도로 검사혈청 중의 리프트계곡열에 대한 항체를 측정하는 것을 특징으로 하는 진단방법.
제 1항 또는 제2항에 있어서,

재조합 N 단백질 항원은 6개의 히스티딘이 융합된 형태로 생산된 것을 특징으로 하는 진단방법.
제 5항에 있어서,

재조합 N 단백질 항원은 도 1에 나타낸 염기서열을 포함하는 재조합 대장균 벡터 pQE30/RVFV로 형질전환된 M15세포로부터 IPTG 유도를 통해 생산된 것을 특징으로 하는 진단방법.
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